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Las variantes genéticas funcionales en DC-SIGNR están asociadas con la transmisión del VIH-1 de madre a hijohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2752805/Boily-Larouche, Geneviève; Iscache, Anne-Laure; Zijenah, Lynn S.; Humphrey, Jean H.; Mouland, Andrew J.; Ward, Brian J.; Roger, Michel2009-10-07DOI:10.1371/journal.pone.0007211Licencia:cc-byAbstract: ANTECEDENTES: La transmisión de madre a hijo (MTCT) es la principal causa de infección por VIH-1 en niños de todo el mundo. Dado que el receptor de lectina de tipo C, el receptor de lectina dendrítico específico para células ICAM no relacionado con la integración (DC-SIGNR, también conocido como CD209L o ganglio hepático/linfa-nodo específico para ICAM no integrador (L-SIGN)), puede interactuar con patógenos incluyendo el VIH-1 y se expresa en la interfaz materno-fetal, se hipotetiza que podría influir en la TCM del VIH-1. MÉTODOS Y INDICACIONES: Para investigar el papel potencial de DC-SIGNR en la TCM del VIH-1, realizamos un estudio de asociación genética de DC-SIGNR en una cohorte bien caracterizada de 197 madres infectadas por el VIH y sus bebés reclutados en Harare, Zimbabwe. Los lactantes que albergaban dos copias de los haplotipos DC-SIGNR H1 y/o H3 (H1-H1, H1-H3, H3-H3) tuvieron un aumento de 3,6 veces el riesgo de infección por VIH-1 en el útero (UI) (P = 0,013) y un aumento de 5,7 veces el riesgo de infección por VIH-1 en el intraparto (IP) (P = 0,025) después de ajustarse para varios factores maternos. Los haplotipos H1 y H3 implicados comparten dos polimorfismos de nucleótidos únicos (SNP) en la región promotora (p-198A) e intron 2 (int2-180A) que se asociaron con un aumento del riesgo de ambas UI (P = 0,045 y P = 0,003, respectivamente) e IP (P = 0,025, para la infección por VIH-1) La variante En los lactantes homocigotos H1 con mutaciones tanto p-198A como int2-180A, observamos una disminución de 4 veces en el nivel de transcripciones DC-SIGNR placentarias, afectando desproporcionadamente la expresión de isoformas ligadas a la membrana en comparación con las no portadoras infantiles (P = 0,011). CONCLUSIÓN: Estos resultados sugieren que DC-SIGNR juega un papel crucial en la TCM del VIH-1 y que la expresión DC-SIGNR placentaria alterada aumenta el riesgo de transmisión. Texto: Sin intervenciones específicas, la tasa de transmisión del VIH-1 de madre a hijo (TCMM) es de aproximadamente 15-45% [1]. ONUSIDA estima que solo el año pasado, más de 400.000 niños fueron infectados en todo el mundo, principalmente a través de la TCM y el 90% de ellos vivían en el África subsahariana. En los países más afectados, como Zimbabwe, el La TCM del VIH-1 puede ocurrir durante el embarazo (in utero, UI), el parto (intraparto, IP) o la lactancia materna (postparto, PP). La alta carga viral materna, el bajo recuento de células CD4, el parto vaginal, la baja edad gestacional se han identificado como factores independientes asociados con la TCM del VIH-1 [1]. Aunque los antirretrovirales pueden reducir la TCM al 2%, el acceso limitado a diagnósticos y medicamentos oportunos en muchos países en desarrollo limita el impacto potencial de esta estrategia. Una mejor comprensión de los mecanismos que actúan en la interfaz materno-fetal es crucial para el diseño de intervenciones alternativas a la terapia antirretroviral para la prevención de la transmisión. Las células dentríticas específicas de la ICAM no relacionadas con la integración (DC-SIGNR, también conocido como CD209L o ICAM no integrador (L-SIGN)) pueden interactuar con una plétora de patógenos incluyendo VIH-1 y se expresa en células endoteliales capilares placentarias [2]. DC-SIGNR se organiza en tres dominios distintos, una cola citoplásmica N-terminal, una región de repetición que contiene siete repeticiones de 23 aminoácidos y un dominio C-terminal implicado en la unión de patógenos. El empalme alternativo del gen DC-SIGNR conduce a la producción de un repertorio de isoformas altamente diversificadas que incluye isoformas asociadas a la membrana y solubles [3]. Se ha propuesto que la interacción entre DC-SIGNR y VIH-1 podría mejorar la transferencia viral a otros tipos de células sensibles [2] pero DC-SIGNR también puede internalizar y mediar la degradación dependiente de proteasomas de virus [4] que pueden afectar de manera diferente el resultado de la infección. Dada la presencia de DC-SIGNR en la interfaz materno-fetal y su interacción con el VIH-1, se hizo una hipótesis de que podría influir en la TCM del VIH-1. Para investigar el papel potencial de DC-SIGNR en la TCM del VIH-1, se llevó a cabo un estudio de asociación genética de DC-SIGNR en una cohorte bien caracterizada de madres infectadas por el VIH y sus bebés reclutados en Zimbabwe, y se identificaron variantes específicas de DC-SIGNR asociadas con el aumento de los riesgos de transmisión del VIH. Además, caracterizamos el impacto funcional de estas variantes genéticas en la expresión DC-SIGNR y demostramos que afectan tanto al nivel como al tipo de transcripciones DC-SIGNR producidas en la placenta. Las muestras consistieron en extractos de ADN almacenados obtenidos de 197 parejas madre-hijo co-inscritas inmediatamente después del parto en el ensayo de suplementación de vitamina A de ZVITAMBO (Harare, Zimbabwe) y seguidos a 6 semanas e intervalos de 3 meses hasta 24 meses. El proyecto ZVITAMBO fue un ensayo clínico aleatorizado controlado con placebo que incluyó a 14.110 parejas madre-hijo, entre noviembre de 1997 y enero de 2000, con el objetivo principal de investigar el impacto de la suplementación inmediata de vitamina A de postparto en la TCM del VIH-1. Las muestras utilizadas en el presente estudio fueron de parejas madre-hijo asignadas aleatoriamente al grupo placebo del proyecto ZVI La profilaxis antirretroviral para mujeres embarazadas VIH-1 positivas no estaba disponible en el sector público de Harare durante el reclutamiento de pacientes de ZVITAMBO. Las muestras fueron obtenidas consecutivamente de dos grupos: 97 parejas de madres VIH-1 positivas/hijos VIH-1 positivos y 100 parejas de madres VIH-1 positivas/niños VIH-negativos. El estado serológico de la madre fue determinado por ELISA y confirmado por Western Blot. Se consideró que los lactantes estaban infectados si eran seropositivos a los 18 meses o mayores y tenían dos o más resultados positivos de reacción en cadena de la polimerasa del VIH-1-DNA (PCR) a edades más tempranas. Se consideró que 100 niños no estaban infectados por ser ELISA negativos a los 18 meses o mayores y tuvieron dos resultados negativos de PCR de ADN de muestras recogidas a una edad más temprana. De los 97 niños infectados por el VIH-1, 57 fueron infectados IU, 11 fueron infectados IP y 17 fueron infectados PP según los análisis de PCR de muestras de sangre recolectadas al nacer, 6 semanas, 3 y 6 meses de edad y según las siguientes definiciones adaptadas de Bryson y colegas [5]. Brevemente, los bebés con ADN PCR positivo al nacer fueron infectados IU. Los bebés con PCR negativo resultado de la muestra obtenida al nacer pero que se hicieron positivos por 6 semanas de edad fueron infectados IP. Los lactantes con resultados negativos de PCR al nacer y 6 semanas de edad pero que posteriormente se convirtieron en DNA PCR positivo fueron considerados infectados durante el período PP. En el análisis de comparación de los 3 modos diferentes de TCM, 12 bebés infectados por el VIH-1 fueron excluidos porque los resultados de PCR no estaban disponibles a las 6 semanas de edad. Métodos completos de reclutamiento, recolección de características basales, procedimientos de laboratorio La variación de la secuencia de nucleótidos de todo el promotor, codificación y parte de las 39 regiones UTR del gen DC-SIGNR en la población del estudio se determinó previamente [7]. La reconstrucción del haplotipo se realizó utilizando el método estadístico Bayesiano implementado en FASE [8], versión 2.1.1, utilizando polimorfismo nucleótido único (SNP) con una frecuencia mínima de alelos (MAF) del 2%. Aplicamos el algoritmo cinco veces, utilizando diferentes semillas generadas aleatoriamente, y se obtuvieron resultados consistentes a lo largo de las carreras (Figura 1 ). Quince SNPs con etiqueta de haplotipo (htSNPs) fueron identificados por el software HaploBlockFinder [9] con un MAF $5%. Estos htSNPs fueron genotipados en los 197 infantes mediante el análisis de secuenciación PCR directo como hemos descrito El genotipo de región de repetición DC-SIGNR 4 fue determinado por amplificación PCR seguida de migración en geles de agarosa del 1,5% [10]. Se analizaron secuencias de ADN en la región promotora con la interfaz TESS (http//:www.cbil.upenn.edu/tess) para sitios de unión de factores de transcripción putativos utilizando la base de datos TRANSFAC. Se realizaron ensayos de reporteros Luciferase utilizando vector pGL2-Básico para investigar el efecto funcional de mutaciones en la actividad promotora DC-SIGNR. El ADN genómico de los sujetos homocigotos para las variantes promotoras y WT fue amplificado desde la posición nucleótida 2715 a 21 y clonado entre los sitios de clonación múltiple BglII y HindIII en el vector pGL2-Basico que alberga un gen luciferasa de luciferasa de reportero aguas abajo (Invitrogen Canada inc, Burlington, Canadá). Todos los clones recombinantes fueron verificados por secuenciación de ADN. El vector reportero de prueba de luciferasa de luciferasa de luciferasa de luciferasa de luciferasa de fuego fue co-transfectado a una proporción de 10:1 con el expresor constitutivo de Renilla luciferasa, phRL-CMV (Promega, Madison, WI, EE.UU.). Cultivamos células Las células se lisaron y se realizaron ensayos de luciferasa utilizando 20 mg de extracto proteico según el fabricante (Promega) a 44 h de post-transfección. La actividad luciferasa de Firefly se normalizó a la actividad de Renilla luciferasa. El vector CMV-Tat de 0 mg, 0,5 mg o 1 mg se transfectó con LTR-Luc como un control positivo en estos experimentos. Realizamos ensayos de lucierasa por triplicado en tres experimentos independientes. Los resultados se expresan como error estándar medio 6 (S.E.M.). Los tejidos placentarios de primer término se obtuvieron a partir de abortos tras la interrupción voluntaria del embarazo en CHUM Hôpital Saint-Luc (Montreal, Canadá). Se utilizaron tejidos de 3 H1 (asociados con TCM del VIH-1) y 3 H15 (tipo salvaje) haplotipos homocigotos para analizar posibles diferencias en la expresión isoforma. Los ARN placentarios totales fueron extraídos por MasterPure DNA y ARN Extraction Kit (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI, USA) según el fabricante. Fragmentos correspondientes a la región de codificación DC-SIGNR fueron transcritos (RT) invertidas y luego amplificados por PCR anidados con los siguientes imprimadores; RT imprimadores RR, primer PCR RF y RR y segundo PCR RcF y RcR según Liu y colegas [11]. 1 mg de ARN total fue transcrito con Expand RT (Roche Applied Science, Indianápolis, IN, EE.UU.) según el fabricante y fue amplificado con PCR de ADN Platinum Taq Polymerase (Invitrogen). Los principales productos de PCR de la segunda reacción PCR fueron extraídos en gel con el Qiagen Gel Extraction Kit (Qiagen Canada inc, Mississauga, ON, Canadá) y clonados utilizando el TOPO TA Cloning Kit para secuenciación (Invitrogen). Para cada placenta, 15 clones diferentes fueron seleccionados aleatoriamente y amplificados con imprimadores M13 y secuenciados con secuenciador automatizado ABI PRISM 3100 capilar (Applicated Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Las secuencias fueron analizadas y alineadas con secuencia de referencia GeneBank NM La expresión cuantitativa de las isoformas DC-SIGNR 1,5 mg de ARN placentario fue transcrita inversamente utilizando 2,5 mM de Oligo dT 20 y Expand RT en 20 ml de volumen según el fabricante (Roche Applied Science). 15 ng de cDNA total en un volumen final de 20 ml se utilizó para realizar PCR cuantitativa en tiempo real utilizando Universal Express SYBR GreenER qPCR Supermix (Invitrogen) en un Rotor Gene Realtime Rotary Analyser (Corbett Life Science, Sydney, Australia). Se utilizaron muestras de 2 sujetos en cada grupo porque la calidad ARN de otros no era adecuada para un análisis QRT-PCR. La amplificación de todas las isoformas DC-SIGNR se realizó utilizando un par de primos específico exon 5 (Tabla S1 ). Las isoformas ligadas a la membrana se amplificaron utilizando imprimaciones específicas para el exón 3, correspondientes al dominio transmembrana común de DC-SIGNR. Las primeras fueron dirigidas a la unión exon-exón y los extractos de ARN fueron tratados con Dnasa (Fermantas International inc, Burlington, ON, Canadá) para evitar la amplificación del ADN contaminante. Las curvas estándar (50-500 000 copias por reacción) fueron generadas mediante dilución en serie de un DC-SIGNR de larga duración o ADN de plasma GAPDH comercial (Invitrogen). Todas las reacciones de qPCR tuvieron eficiencias que oscilaban entre el 99% y el 100%, incluso en presencia de 20 ng de ácidos nucleicos no específicos, y por lo tanto se pudo comparar. El número de copias de muestras desconocidas se estimó colocando el número de ciclo de PCR medido (u Para corregir las diferencias en calidad de ARN y cantidad entre muestras, los niveles de expresión de las transcripciones fueron normalizados a las transcripciones genéticas GAPDH de referencia. Las secuencias de primos GAPDH fueron amablemente proporcionadas por A. Mes-Masson en el CHUM. Los resultados se presentan como número de copia génica objetivo por 10 5 copias de GAPDH. La relación de isoformas ligadas a membranas fue calculada como E3/E5. Las isoformas solubles fueron calculadas restando unión de membranas de isoformas totales. Realizamos ensayos de QPCR en triplicado en tres experimentos independientes. Los resultados se expresan como media6S.E.M. El análisis estadístico se realizó utilizando el GraphPad PRISM 5.0 para Windows (GraphPad Software inc, San Diego, CA, EE.UU.). Se compararon diferencias en las características basales y frecuencias genotípicas de haplotipos o htSNPs entre los grupos utilizando el análisis x 2 o la prueba exacta de Fisher, se utilizó el análisis de regresión logística para estimar las odds ratios (OR) para cada genotipo y factores de riesgo basales, se utilizó regresión logística múltiple para definir predictores independientes identificados como significativos en el análisis bruto, se calcularon las OR y el intervalo de confianza del 95% con el método exacto, se evaluaron comparaciones de variables continuas entre grupos con la t de Student no pareada cuando las variables se distribuían normalmente y con la U de Mann-Whitney cuando lo contrario, se consideraron significativas en P0,05. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todas las madres que participaron en el estudio y el ensayo de ZVITAMBO, y la investigación reportada en este trabajo fue aprobada por The We realizó un estudio de asociación de polimorfismo DC-SIGNR en 197 niños nacidos de madres infectadas con VIH-1 no tratadas reclutados en Harare, Zimbabwe. De ellos, 97 niños fueron infectados con VIH-1 y 100 niños permanecieron sin infección. De los 97 niños infectados con VIH-1, 57 fueron infectados con IU, 11 con IP infectada y 17 infectados con PP. No se determinó el momento de la infección para 12 niños infectados con VIH-1. Las características basales de las madres y lactantes se presentan en la Tabla 1. La edad materna y el recuento de células CD4, el sexo infantil, el modo de parto, la duración de la ruptura de membrana y la edad gestacional fueron similares entre todos los grupos. Sin embargo, la carga viral materna 29 000 copias/ml se asoció con un aumento del riesgo tanto en UI como en PP con odds ratios (OR) de 3,64 (IC 95% = 1,82-7,31, P = 0,0002) y 4,45 (IC 95% = 1,50-13,2, P = 0,0045) para la transmisión del VIH-1, respectivamente. En nuestras muestras de estudio (Tablas S2 y S3 ) se identificaron 15 SNPs marcados con haplotipos (htSNPs) correspondientes a los 15 haplotipos principales de DC-SIGNR (Figura 1 ). H1 (31%) y H3 (11%) fueron los haplotipos más frecuentes observados (Figura 1 ) siendo homocigosos para el haplotipo H1 se asociaron con un aumento del riesgo de ambas UI (OR: 4, Los bebés que albergaban dos combinaciones de copias de haplotipos H1 y/ o H3 (H1-H1, H1-H3 o H3-H3) tenían un mayor riesgo de IU (OR: 3,42, P = 0,007) e IP (OR: 5,71, P = 0,025) pero no de infección por VIH-1 (P = 0,098) en comparación con los no portadores infantiles (Tabla 2 ). Estas últimas asociaciones siguieron siendo significativas tras el ajuste de la carga viral materna para ambas UI (OR: 3,57, IC 95% = 1,30-9,82, P = 0,013) e IP (OR: 5,71, IC 95% = 1,40-23, P = 0,025) transmisión del VIH-1. Los haplotipos H1 y H3 comparten un grupo de mutaciones (p-198A, int2-391C, int2-180A, ex4 De estos, las variantes p-198A e int2-180A se asociaron significativamente con la TCM del VIH-1 (Tabla S2 ). En el análisis de regresión no ajustado, los lactantes homocigotos para las variantes p-198A e int2-180A presentaron un aumento del riesgo de UI (OR: 2,07 P = 0,045, OR: 3,78, P = 0,003, respectivamente) e IP (OR: 2,47, P = 0,17, O.R: 5,71, P = 0,025, respectivamente) infección por VIH-1 en comparación con los lactantes o no portadores de heterocigoto (Tabla 3). Cuando se realizó ajuste por factores maternos, sólo la asociación con la variante int2-180A siguió siendo significativa para la transmisión por IU (OR: 3,83, IC 95% = 1,42-10, 4, P = 0,008) e IP Así, los bebés homocigotos para la variante DC-SIGNR int2-180A contenida en los haplotipos H1 y H3 tuvieron 4 a 6 veces más probabilidades de ser infectados por el VIH-1 durante el embarazo o durante el parto, respectivamente. La empalme alternativa del gen DC-SIGNR en la placenta produce ambos repertorios isoformados unidos a membrana y solubles [3]. La proporción relativa de DC-SIGNR unido a membrana y soluble podría influir de manera plausible en la susceptibilidad a la infección VIH-1 [11]. Por lo tanto, hicimos una hipótesis de que las mutaciones DC-SIGNR asociadas con la TCM del VIH-1 tendrían un impacto tanto en el nivel de expresión DC-SIGNR y en el repertorio isoforma producido. Se clonó DC-SIGNR a partir de tejidos placentarios mediante RT-PCR a partir de 3 muestras H1 homocigotas que contenían tanto las variantes DC-SIGNR p-198AA e int2-180AA asociadas a la transmisión del VIH-1 y 3 muestras de tipo salvaje homocigoto (WT) (p-198CC, int2-180GG). Se seleccionaron quince clones por muestra al azar para su secuenciación. Como era de esperar, se encontró un amplio repertorio de transcripciones DC-SIGNR en todas las muestras con 9 a 16 isoformas diferentes por individuo. Se identificaron un total de 65 transcripciones distintas (Figura S1), de las cuales 3 eran transcripciones de duración completa. 64 de los clones secuenciados contenían un total de 69 sustituciones de aminoácidos con 3 nuevos C terminos y 2 codones de parada Sin embargo, la diversidad se atribuyó principalmente a la eliminación total del exón 2 o exón 3 o a variaciones en la longitud de la región del cuello (exón 4) del DC-SIGNR. La eliminación del exón 3 elimina el dominio transmembrana de la proteína y conduce a la expresión de isoformas solubles del DC-SIGNR [3]. Curiosamente, la abundancia de isoformas ligadas a la membrana en los tejidos placentarios de los homocigotos H1 parece ser menor que la observada en muestras de individuos de WT (Figura S1 ). La eliminación del exón 3 fue confirmada por la secuenciación e hipotetizamos que el salto de exón 3 podría deberse a la presencia de la mutación int2-180A observada en lactantes con el haplotipo H1. De hecho, esta mutación intron se encuentra 180 pb aguas abajo del exón 3 y potencialmente modifica los eventos de empalme (Figura 2A ). Confirmamos que la variación en las proporciones de transcripción observadas entre los dos grupos también se reflejó en el nivel de expresión del ARNm en la placenta. Para cuantificar las isoformas unidos a la membrana frente a las isoformas solubles en muestras placentarias de bebés homocigosos H1 y WT, amplificamos la secuencia del exón 5 (E5) presente en todas las isoformas DC-SIGNR (transcripciones totales). Luego amplificamos el exón 3 (E3) que se elimina en las formas solubles y luego calculamos la relación E3:E5. Se encontró que los tejidos placentarios de los lactantes homocigosos H1 expresan una proporción significativamente menor de DC-SIGNR unido a la membrana (18%) en comparación con los de los individuos WT (36%) (P = 0,004) (Figura 2B ) sugiriendo que el salto de exón 3 ocurre con mayor frecuencia en presencia de la variante DC-SIGNR int2-180A asociada con el TCM del VIH-1. La variante DC-SIGNR int2-180A siempre se transmite con la mutación promotora p-198A (Figura 1 ). En el análisis de regresión no ajustado, la variante p-198A se asoció significativamente con UI pero no con la transmisión IP y PP VIH-1 (Tabla 3). El análisis del sitio de unión del factor de transcripción computacional predice Tabla 1. Figura 3A ). La actividad luciferasa del constructo variante p-198A fue significativamente menor que la del constructo promotor de WT p-198C (p-198C/A ratio = 2, P = 0,006) (Figura 3B ) sugiriendo que DC-SIGNR p-198A afecta a la actividad promotora. Los otros mutantes promotores (p-577C y p-323A) observados en la población zimbabuense no afectaron a la transcripción DC-SIGNR en este ensayo (Figura S2). Para determinar el impacto neto de la mutación DC-SIGNR p-198A sobre la expresión DC-SIGNR en la placenta, cuantificamos el número absoluto de transcripciones DC-SIGNR totales y de unión de membrana en las muestras homocigoto H1 y placentales de tipo salvaje El número total de transcripciones DC-SIGNR se determinó en 6856213 (copias DC-SIGNR6S.E.M por 10 5 copias GAPDH) en las muestras placentarias de lactantes homocigóticos H1 y fue 4 veces menor en comparación con la encontrada en las placentas de individuos WT (27816638, P = 0.011) (Figura 3C ). Como se sugirió anteriormente, la mutación int2-180A podría inducir el salto de exón 3 dando lugar a una menor producción de DC-SIGNR unido a membrana. Aunque la disminución en el número total de transcripciones DC-SIGNR en muestras placentarias homocigóticas H1 que contenían tanto las variantes p-198AA como int2-180AA afectó la proporción de isoformas solubles y ligadas a la membrana, el efecto de estas mutaciones fue más pronunciado en las isoformas ligadas a la membrana con una disminución de 8 veces (H1 = 117636,2 vs WT = 9906220,6; P = 0,003) en comparación con una disminución de 3 veces en las isoformas solubles totales (H1 = 5686181,9 vs WT = 19256495,3; P = 0,03) (Figura 3C). Por lo tanto, las mutaciones DC-SIGNR p-198A e int2-180A asociadas con la TCM del VIH-1 disminuyeron significativamente el nivel Tabla 3. Asociaciones entre el promotor de DC-SIGNR infantil p-198 e intron 2 (int2)-180 variantes e intrauterina (UI), intraparto (IP) y postparto (PP) transmisión del VIH-1 de madre a hijo. Nuestros resultados genéticos, apoyados por el ensayo de expresión en placenta, sugieren la implicación de DC-SIGNR en el TCM del VIH-1. La homocigosidad para el haplotipo H1 se asoció con la transmisión de UI en el análisis de regresión no ajustada. Sin embargo, la asociación desapareció después del ajuste para los factores maternos presumiblemente debido al pequeño número de bebés homocigotos H1 analizados en cada grupo. H1 y H3 fueron los haplotipos más frecuentes observados en la población del estudio y comparten un grupo de mutaciones (Figura 1 ). La agrupación de haplotipos H1 y H3 aumentó el poder del estudio y permitió la identificación de mutaciones DC-SIGNR específicas asociadas con la TCM del VIH-1. De hecho, dos mutaciones compartidas por los haplotipos H1 y H3 se asociaron con la transmisión vertical del VIH-1. La int2-180A se asoció con un aumento de 4 veces en el riesgo de UI y 6 veces en el riesgo de IP después del ajuste por los factores maternos. Aunque la variante p-198A se asoció con la transmisión UI, la asociación desapareció después del ajuste por la carga viral materna. Sin embargo, se demostró que esta mutación reduce la actividad transcripcional DC-SIGNR in vitro y produce un menor nivel de transcripciones DC-SIGNR en tejidos placentarios en combinación con la variante int2-180A. Dado que int2-180A siempre se transmite con p-198A en los haplotipos combinados asociados a la ETMT H1/H3, mientras que p-198A se lleva a cabo en otros haplotipos no asociados (Figura 1), podemos especular que la mutación p-198A sola puede tener un efecto menor in vivo, mientras que en combinación con la variante int2-180A, ambos actúan para reducir el nivel de expresión DC-SIGNR placentaria que resulta en un aumento del riesgo de ETM de VIH-1. La mayoría de la transmisión de UI ocurre durante el último trimestre del embarazo (revisado en [12] ). Las muestras de placenta a término completo no estaban disponibles para el estudio actual y los ensayos de expresión se realizaron en tejidos placentales de primer plazo. Un estudio previo que analizó el repertorio de isoformas placentarias DC-SIGNR en muestras de placenta a término demostró una diversidad similar de transcripciones DC-SIGNR como en los tejidos placentarios de primer término estudiados en este estudio [3]. Sin embargo, dado que los niveles de expresión DC-SIGNR nunca se han comparado entre los diferentes términos del embarazo, no se sabe si la expresión DC-SIGNR varía durante el embarazo. Sin embargo, es razonable suponer que las diferencias interindividuales tanto en el repertorio isoformo de DC-SIGNR como en los niveles de transcripción observados entre los bebés homocigóticos H1 y WT se reflejarían a lo largo del embarazo. Hasta la fecha, la mayoría de los estudios se han centrado en el papel potencial de DC-SIGNR en la infección trans del VIH-1 in vitro [2, 10]. Sin embargo, los múltiples mecanismos involucrados en la infección trans y redundancia entre las funciones de la lectina de tipo C dificultan la determinación de la participación real de DC-SIGNR en este modo de infección in vivo [13, 14]. La fuerte correlación que observamos entre la transmisión vertical del VIH-1 y las variantes genéticas de DC-SIGNR que producen bajos niveles de DC-SIGNR en la placenta sugiere que mecanismos distintos de la infección trans mediada por DC-SIGNR podrían operar durante la transmisión vertical del VIH-1. Por ejemplo, DC-SIGNR también ha demostrado funcionar como receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor [15]. Chan y sus colegas demostraron recientemente que las células CHO transfectadas por DC-SIGNR disminuyen los títulos de SARS-CoV mediante una mayor captura y degradación del virus de manera dependiente del proteasoma [4]. Dado que las células endoteliales expresan MHC-I y II, los antígenos virales degradados podrían presentarse a las células inmunes para provocar una respuesta inmune adaptativa [16, 17]. El receptor de núcleo HIV-1 CCR5, pero no CD4, se coexpresa con DC-SIGNR en las células endoteliales placentarias y de barrera hematoencefálica (BBB) [18, 19]. La unión del VIH-1 gp120 al receptor CCR5 en las células endoteliales compromete la integridad del BBB y aumenta la adhesión y transmigración de los monocitos a través del BBB [20, 21]. Por lo tanto, es posible que una menor expresión de DC-SIGNR, en particular las isoformas ligadas a la membrana, en las células endoteliales capilares placentarias pueda favorecer la unión del VIH-1 al receptor CCR5, en lugar del receptor DC-SIGNR, facilitando la migración de las células maternas infectadas por el VIH-1 a través de la barrera placentaria que resulta en la transmisión UI del VIH-1. La variante int2-180A contenida en los haplotipos H1 y H3 se asoció con la transmisión IP, lo que sugiere que DC-SIGNR también afecta a la transmisión del VIH-1 durante el parto. El paso por el canal del parto podría exponer potencialmente a los bebés a través de una entrada en el portal de la mucosa (presumiblemente oftalmológica, cutánea o gastrointestinal), mientras que el insulto placentario durante el parto (físico o inflamatorio) puede mejorar el paso transplacental de las células maternas infectadas por el VIH-1 a la circulación fetal [22, 23]. Este proceso llamado microtransfusión se ha propuesto con respecto a los resultados obtenidos en una cohorte malauiana. Kweik y sus colegas encontraron una asociación significativa entre los niveles de ADN materno en la sangre del cordón umbilical y la transmisión IP del VIH-1, lo que sugiere que es probable que el paso de células maternas infectadas a través de la placenta ocurra durante el parto [22]. Así, de manera similar a lo sugerido anteriormente para la transmisión de la IU, el nivel relativamente inferior de DC-SIGNR en la placenta de los bebés homocigotos que albergan la variante int2-180A podría promover la unión del VIH-1 al receptor CCR5 en las células endoteliales que afectan la integridad de la barrera placentaria y facilitan el paso de las células maternas infectadas en la circulación fetal durante el parto. Además de DC-SIGNR, se sabe que otros receptores del VIH-1 influyen en la TCM del VIH-1 (revisado en [24] ). Se ha demostrado que las variantes genéticas de la CCR5 influyen en la transmisión vertical del VIH-1. Las variantes promotoras de la CCR5 que resultan en una mayor expresión del receptor se asocian con un mayor riesgo de TCM del VIH-1 entre los africanos subsaharianos [25, 26]. El polimorfismo de eliminación de 32 pb en la CCR5 se ha demostrado que protege de la transmisión vertical del VIH-1 [27], pero esta variante está prácticamente ausente entre las poblaciones africanas [28]. El elevado número de copias de CCL3L1, un potente ligando supresor del VIH-1 para la CCR5, está asociado con una mayor producción de quimioquinas y un menor riesgo de TCM del VIH-1 entre los lactantes sudafricanos [29, 30]. La lectina de unión a la manosa (MBL) es un receptor inmune innato sintetizado en el hígado y segregado en el torrente sanguíneo en respuesta a la señal de inflamación. MBL promueve la eliminación de patógenos por opsonización y fagocitosis, y la expresión reducida de MBL resultante de polimorfismo en regiones codificantes y no codificantes se ha asociado con un aumento del riesgo de TCM del VIH En este estudio, demostramos por primera vez, el impacto funcional potencial de las mutaciones DC-SIGNR en su expresión en la placenta y en la transmisión vertical del VIH-1. Creemos que la presencia de DC-SIGNR en la superficie celular endotelial placentaria puede proteger a los bebés de la infección por el VIH-1 capturando virus y promoviendo su degradación/presentación. Sin embargo, en la placenta que contiene bajos niveles de DC-SIGNR, el VIH-1 se une preferentemente al CCR5 en células endotelial, lo que resulta en una pérdida de integridad de la barrera placentaria y un mayor paso de las células maternas infectadas por el VIH-1 en la circulación fetal que conduce al TCM del VIH-1. Este mecanismo también puede aplicarse a otros patógenos transmitidos verticalmente conocidos por interactuar con DC-SIGNR como el VIH-2, hepatitis C y virus del dengue y Las asociaciones entre los genotipos de región repetida de DC-SIGNR infantil exon 4 y la transmisión del VIH-1 de madre a hijo.CI, Intervalo de confianza; N, número; NA; no aplicable; OR, odds ratio a P-value según lo determinado por la prueba Chi-cuadrado. b Comparación entre el genotipo y todos los demás. Se encontró en: doi:10.1371/journal.pone.0007211.s003 (0,05 MB DOC) Figura S1 DC-SIGNR transcripciones repertorio en placenta. Los principales productos RT-PCR a partir del extracto de ARN de 3 muestras homocigóticas H1 y 3 homocigóticas WT placenta fueron purificadas, clonadas y secuenciadas. Se analizaron las secuencias según la secuencia de referencia NCBI NM_014257. TC; cola citoplasmática, TM; dominio transmembrana; WT; tipo salvaje Se encontró en: doi:10.1371/journal.pone.0007211.s004 (0,11 MB DOC) Figura S2 Efecto de la variante promotora DC-SIGNR sobre la actividad transcripcional en el ensayo de reporter de luciferasa in vitro en células transfectadas HeLa. Expresión relativa de luciferasa de pGL2-Basico, vector parental sin promotor. Expresión Constructos de promotor DC-SIGNR, variante p-577C o variante p-323A se calcularon relativamente a este valor. Los datos se presentan en valores medios6S.E.M de tres experimentos independientes realizados por triplicado. Para comparar la expresión relativa de luciferasa de los receptores de variantes p-557C y p-323A contra el constructo de tipo salvaje (WT) se utilizó la prueba ANOVA de ida seguida de la prueba Dunnett para la comparación múltiple. El vector CMV-Tat de 0 mg, 0,5 mg o 1 mg se transfectó con LTR-Luc como control positivo en estos experimentos.

¿Cuál es el porcentaje de transmisión del VIH-1 de madre a hijo cuando no hay intervención?

El papel de la S-Palmitoylation en IFITM5 para la interacción con FKBP11 en células de Osteoblastohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3776769/Tsukamoto, Takashi; Li, Xianglan; Morita, Hiromi; Minowa, Takashi; Aizawa, Tomoyasu; Hanagata, Nobutaka; Demura, Makoto2013-09-18DOI:10.1371/journal.pone.0075831Licencia:cc-byAbstract: Recientemente, una de las proteínas familiares de la transmembrana inducida por interferón, IFITM3, se ha convertido en un objetivo importante para la actividad contra la infección por el virus de la gripe A (H1N1). En esta proteína, una modificación post-translacional por ácidos grasos covalentemente unidos a la cisteína, llamada S-palmitoilación, juega un papel crucial para la actividad antiviral. IFITM3 posee tres residuos de cisteína para la S-palmitoilación en el primer dominio de la transmembrana (TM1) y en el bucle citoplasmático (CP). Debido a que estas cisteínas están bien conservadas en las proteínas de la familia de mamíferos IFITM, la S-palmitoilación en estas cisteínas es significativa para sus funciones. IFITM5 es otra proteína de la familia IFITM e interactúa con la proteína de unión FK506 (FKBP11) para formar un complejo de mayor orden en células osteoblastales, que induce la expresión de genes inmunológicamente relevantes. En este estudio, investigamos el papel que desempeña la palmitoilación S de IFITM5 en su interacción con FKBP11 en las células, ya que esta interacción es un proceso clave para la expresión génica. Nuestras investigaciones con un reportero establecido, ácido 17-octadecinoico (17-ODYA), y un inhibidor para la palmitoilación S, ácido 2-bromopalmítico (2BP), revelaron que IFITM5 fue palmitoilado S además de IFITM3. Específicamente, encontramos que los residuos de cisteína en el dominio TM1 y en el bucle CP fueron palmitoilados S en IFITM5. Luego, revelamos por inmunoprecipitación y análisis de manchas occidentales que la interacción de IFITM5 con FKBP11 fue inhibida en presencia de 2BP. El mutante que carecía del sitio S-palmitoylation en el dominio TM1 perdió la interacción con FKBP11. Estos resultados indican que la S-palmitoylation en IFITM5 promueve la interacción con FKBP11. Finalmente, investigamos la formación de nódulos óseos en células osteoblastadas en presencia de 2BP, ya que IFITM5 fue identificado originalmente como factor de formación ósea. El experimento resultó en una aberración morfológica del nódulo óseo, lo que también indicó que la S-palmitoylation contribuye a la formación ósea. Texto: La familia de proteínas transmembranas inducidas por interferón (IFITM) (también conocida como la familia Fragilis en ratones) es parte de la familia de las dispaninas [1] y está compuesta por α-hélices de doble transmembrana conectados por un bucle citoplasmático (CP) y secuencias de polipéptidos amino- y carboxil-terminales (Figura 1-A) extracelulares (EC). Las proteínas IFITM se conservan evolutivamente en vertebrados [2]. Investigaciones genómicas recientes han revelado que hay 5 miembros IFITM en humanos (IFITM1, 2, 3, 5 y 10) y 7 miembros en ratones (IFITM1, 2, 3, 5, 6, 7, y 10). Estas proteínas desempeñan papeles en diversos procesos biológicos, como la maduración de células germinativas durante la gastrulación (IFITTM1-3) [3] [5] [5], la adhesión de células a células (IFITTM1) [6] [7] [8], la actividad antiviral (IFITTM1-3) [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17], y la formación ósea (IFITTM5] [18] [19] [20] [21] [22], aunque actualmente se desconocen las funciones detalladas de IFITM6, 7 y 10; en particular, IFITM3 ha sido objeto de estudios intensivos sobre su actividad contra la infección e internalización del virus de la gripe A (H1N1) [9] [10] [11] [12] [13] [14]. En 2010, el Dr. Yount y sus colaboradores informaron que la actividad antiviral de IFITM3 depende de la palmitoilación S en la proteína [10]. La palmitoilación S [23] es una modificación post-translacional de las proteínas por los ácidos grasos saturados C 16 (ácidos palmíticos) covalentemente unidos a ciertos residuos de cisteína a través de un enlace tioéster (Figura 1-B). La modificación es catalizada reversiblemente por las proteínas aciltransferasas y las tioesterasas acilproteínas, y confiere propiedades únicas a la proteína, tales como unión a la membrana y segmentación, inmunoreactividad, alineación de secuencias aminoácidos de IFITM5, IFITM1, IFITM2 e IFITM3 derivadas de ratones. Los residuos conservados se destacan en negro. Las tres cisteinas conservadas se resaltan en rojo y numeradas en base a la secuencia de IFITM5 (top) e IFITM3 (bottom). Los residuos únicos en IFITM5 se resaltan en gris. Los dominios transmembrana primero y segundo, las secuencias extracelulares y el bucle citoplásmico se indican por flechas y se denotan como TM1 y TM2, EC y el bucle CP, respectivamente. Los dominios TM fueron predichos por SOSUI. Los aspartatos en la región C-terminal en IFITM5 se muestran en azul. B) La ilustración esquemática de la proteína S-palmitoilación. El ácido C 16-palmítico se une a la cisteína a través de un enlace tioéster. La palmitoilación y la despalmitoilación son catalizadas por proteínas aciltransferasas y acilproteínas tioesterasas, respectivamente. En este estudio se resume la hidroxilamina, NH 2 OH, para reducir la vinculación tioestérmica. C) La identidad de la secuencia de aminoácidos (similaridad) entre IFITM5, IFITM1, IFITM2 e IFITM3. doi: 10.1371/journal.pone.0075831.g001 y la interacción proteína-proteína. Los autores revelaron que IFITM3 es S-palmitoilado en tres quisteinas proximales de membrana, Cys71 y Cys72 en el primer dominio transmembrana (TM1), y Cys105 en el bucle CP (Figura 1-A) [10]. Además, IFITM3 carece de la palmitoilación S no se agrupa en la membrana celular y disminuye significativamente la actividad antiviral. Además, las cisteinas en IFITM2, Cys70, Cys71 y Cys104 también son palmitoiladas de la misma manera, lo que afecta a la localización intracelular [24]. Un estudio resentido ha revelado que la murina IFITM1 tiene cuatro residuos de cisteína (Cys49, Cys50, Cys83 y Cys103) para la palmitoilación S, que es necesaria para la actividad antiviral y la estabilidad proteica [25]. Los otros miembros de la familia IFITM también poseen estas cisteínas (Figura 1-A), y por lo tanto el papel de la espalmitoilación en las cisteinas debe ser significativo para las funciones de las proteínas IFITM. Aquí, nos centramos en las proteínas de la familia IFITM5, que también se conoce como proteína similar a IFITM (BRIL) [18]. Entre las proteínas de la familia IFITM, IFITM5 es única. (i) Expresión de IFITM5: A diferencia de las otras proteínas de la familia IFITM, la expresión de IFITM5 no es inducida por interferones porque la región anterior al gen ifitm5 carece de los elementos reguladores del interferón [26]. Además, la expresión de IFITM5 se limita principalmente a las células osteoblastadas [18, 19, 27], mientras que las otras proteínas de IFITM se expresan ubicuamente (ii). Además, IFITM5 tiene un dominio rico en aspartato en la región C-terminal, que podría estar involucrado en la unión al calcio (Figura 1 -A) [26]. iii) Papel de IFITM5 en la formación ósea: La expresión de IFITM5 está asociada con la mineralización durante el proceso de formación ósea en células osteoblásticas [18] [19] [20] [20]. Estudios anteriores han confirmado la expresión de IFITM5 en tejidos óseos en ratones, ratas, humanos y tammar wallabies [2]. Los ratones ifitm5-gene knockout tienen huesos más pequeños [19]. Además, el derribo del gen ifitm5 por el ARN de la horquilla pequeña induce una disminución en la formación de nódulos óseos, mientras que la sobreexpresión del gen en células UMR106 ha demostrado iv) Papel del IFITM5 en la actividad inmunitaria: Estudios recientes han revelado que el IFITM5 interactúa con la proteína 11 de unión FK506 (FKBP11) para formar IFITM5-FKBP11-CD81-el complejo regulador negativo del receptor de la prostaglandina F2 (FPRP) [28]. Cuando se forma el complejo, se inducen las expresiones de 5 genes inducidos por interferón, incluyendo el antígeno 2 de células estromales de médula ósea (Bst2), la proteína 1 inducible del interferón (Irgm), la proteína inducida por interferón con tetratricopéptido repite 3 (Ifit3), b(2) microglobulina (B2m) y el gen antígeno de clase I del MHC. En consecuencia, estos resultados indican que el IFITM5 está involucrado no sólo en la formación ósea sino también en la actividad En este estudio se investigó la palmitoilación S de IFITM5 y su papel en la interacción con FKBP11 en células de osteoblasto de ratón. Las células transfectadas por un plásmido DNA que codificaba el ratón IFITM5 fueron cultivadas en presencia de un reportero químico establecido, ácido 17-octadecinoico (17-ODYA) [29, 30], o un inhibidor para la palmitoilación S, ácido 2-bromopalmítico (2BP) [31]. Los ensayos bioquímicos usando estos compuestos revelaron que el tipo salvaje IFITM5 es S-palmitoilado. Para identificar el sitio de Spalmitoilación en IFITM5, se prepararon mutantes substituidos por cisteína, IFITM5-C86A, -C52A/C53A, y -C52A/53A El ensayo de reportero químico sugirió que al menos dos de las tres cisteínas en IFITM5 son S-palmitoiladas. La interacción de IFITM5 con FKBP11 fue examinada por inmunoprecipitación, resultando en la pérdida de la interacción en presencia de 2BP. El mismo resultado se obtuvo en los dos mutantes, C52A/C53A y Cys-less. Estos resultados sugieren que la S-palmitoilación en Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 de IFITM5 es necesaria para la interacción con FKBP11. Por otro lado, Cys86 en el bucle CP de IFITM5 fue S-palmitoilada pero no involucrada en la interacción. Debido a que esta interacción es importante para la expresión génica inmunológicamente relevante, se indicó que el papel de la palmitoilación S es promover la interacción de IFITM5 con FKBP11 y regular la actividad inmunitaria en las células osteoblásticas. Se discutirá el posible mecanismo de interacción y el efecto de la palmitoilación S en la formación de nódulos óseos. Para la expresión celular mamífera, se construyeron vectores de plásmidos de tipo salvaje IFITM5 (IFITM5-WT) y FKBP11 fusionado con FLAG (FKBP11-FLAG) insertando los genes clonados en un vector de expresión neopBApo-CMV (Takara Bio, Shiga, Japón). Los detalles de las construcciones de ADN recombinante fueron los mismos descritos anteriormente [19]. Los genes de los mutantes IFITM5 (IFITM5-C86A, -C52A/53A, y -C52A/C53A/C86A (Cys-less)) se prepararon utilizando un kit QuikChange de mutagenesis dirigido por el sitio (Stratagene, La Jolla, CA). Los vectores plásmidos de los IFITM5-WT fusionados con FLAG, -C52A/53A y Cys-less se construyeron insertando los genes clonados en el vector de expresión neo de pBApo-CMV. Para la expresión celular de E. coli, el vector plásmido de IFITM5-WT se construyó insertando el gen clonado en un vector de expresión pET22b (Novagen, Madison, WI). El primer delantero 5'-GGAATTCATTCATATTACACTTCATATCCCGTG-3' y el primer reverso 5'-CCGCTCGAGTTATAGTCTCATCAAACTTG-3' fueron utilizados para amplificar el gen que codifica todo el IFITM5 del vector plásmido para la expresión celular mamífera descrita anteriormente. Las letras subrayadas denotan un NdeI y un sitio de escote XhoI, respectivamente. Los plásmidos de mutantes IFITM5 fueron preparados usando un kit de mutagenesis dirigido por el sitio QuikChange. El sentido y los imprimadores antisenso utilizados fueron 5'-GGCAGTATGCTCCAAAGCCAAGGCGTACCATCTGGGCTGC-3' y 5'-GCAGCCGAGATGGTGGTGCCTGCTGGTGGTGGGGAGCATACT GCC-3' para IFITM5-C86A; y 5'-GCACGATGTACCTGAATGCGCGGCGCTTGGTGCTG CGC-3' y 5'-GCGCCAGGAATGAGCGCGCCGCGACAGAGCATCG TGC-3' para IFITM5-C52A/C53A, respectivamente (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Las células MC3T3 similares a los osteoblastos fueron provistas por el RIKEN, Cell Bank (RCB 1126). Los procedimientos de cultivo celular, transfección y expresión proteica fueron los mismos reportados anteriormente. Cuando fue necesario, el ácido 2-bromopalmítico (2BP; Wako, Osaka, Japón) y el ácido 17-octadecinoico (17-ODYA; Sigma-Aldrich) fueron disueltos en el 99,5% de sulfóxido dimetilo (DMSO; Wako) y añadidos al medio de diferenciación a concentraciones de 100 μM y 50 μM en menos del 0,1% de DMSO, respectivamente [30, 31]. Las proteínas de tipo salvaje y mutante IFITM5 también fueron producidas utilizando un sistema de expresión recombinante E. coli. Las células E. coli BL21(DE3) transformadas por la expresión plásmido fueron cultivadas a 37°C en medio LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina. Después de cuatro horas de inducción por 1 mM isopropil β-Dtiogalactopiranoside (IPTG), las células fueron recolectadas por centrifugación (6.400 × g durante 10 min a 4°C). Las células fueron suspendidas en 50 mM tampón Tris-HCl (pH 8) y interrumpidas por una prensa francesa (Ohtake, Tokio, Japón) (100 MPa × 4 veces). La fracción de membrana bruta fue recolectada por ultracentrifugación (178.000 × g durante 90 min a 4°C). La fracción recolectada fue solubilizado con 1,5% n-dodecyl-β-Dmaltopiranoside (DDM) (Dojindo Lab, Kumamoto, Japón) en 50 mM Tris-HCl, pH 8, que contenía 0,3 M NaCl y 5 mM imidazol. Después de la ultracentrifugación, el sobrenadante fue incubado con resina de agarosa Ni 2+ -NTA (Qiagen, Hilden, Alemania). La resina fue aplicada a una columna de cromatografía y lavada con 50 mM imidazol que contenía 50 mM Tris-HCl (pH 8), 0,3 M NaCl y 0,1% DDM. El IFITM5 solubilizado con DDM fue recolectado por elución con el mismo tampón que contenía 0,3 M imidazol. Los medios de muestreo fueron reemplazados por la solución tampón apropiada por dos pasajes sobre una columna PD-10 (GE Healthcare UK, Ltd., Amersham Place, Inglaterra). Los detalles experimentales se describen en informes anteriores [19, 28]. Brevemente, se extrajeron proteínas totales de las células osteoblásticas que coexpresaron IFITM5 y FKBP11-FLAG utilizando un kit de extracción total de proteínas (BioChain Institute Inc., Newark, CA). Luego, el lisato celular fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG M2 (Sigma-Aldrich) a 4°C durante 2 h. Para recuperar FKBP11-FLAG, 500 ng/μL 3 × péptido FLAG (Sigma-Aldrich) disuelto en solución salina tris-buffered se añadió al gel recogido a 4°C durante 1 h. Las proteínas recuperadas y el lisato celular que contenía proteínas totales fueron analizados por SDS-PAGE (15% ePAGEL; ATTO, Tokio, Japón) y la mancha occidental El anticuerpo policlonal anti-IFITM5, preparado a partir de la secuencia péptida aminoterminal (TSYPREDPRAPSSRC), y el anticuerpo monoclonal anti-FLAG (Sigma-Aldrich) fueron utilizados como anticuerpos primarios. Los anticuerpos anti-rabbit IgG (H+L) de cabra conjugados con HRP (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) y anti-mouse IgG (H+L) (Sigma-Aldrich) fueron utilizados como anticuerpos secundarios para los anticuerpos primarios anti-IFITM5 y anti-FLAG, respectivamente. Las proteínas fueron detectadas por reacción quimioluminiscente (MercK-Millipore, Billerica, MA). El lisato celular extraído de las células osteoblásticas marcadas metabólicamente por 17-ODYA fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG M2 para obtener proteínas purificadas con FLAG IFITM5. Las proteínas marcadas con 17-ODYA fueron etiquetadas químicamente con azida-PEG 3 -5(6)-carboxitetrametilrhodamina (TAMRA-azida; Click Chemistry Tools, Scottsdale, AZ) con referencia a estudios previos [10, 29, 30, 32] y la guía del fabricante. Las proteínas separadas por SDS-PAGE fueron visualizadas utilizando un láser de 532-nm para excitación y la fluorescencia por TAMRA (565 nm) fue detectada mediante un filtro de largo camino de 575nm (Typhoon FLA 9000; GE Healthcare). Las células de osteoblasto subcultivo MC3T3 fueron sembradas a una densidad de 5.000 células/cm 2 en platos de 40 mm y cultivadas en medio de águila α-modificada (α-MEM; Sigma-Aldrich) conteniendo 10% (v/v) de suero fetal bovino (FBS; Nichirei Biosciences Inc., Tokio, Japón). Al día siguiente, esto fue reemplazado por medio de diferenciación, conteniendo 2 mM de glicerofosfato y 50 μg/ml de ascorbato sódico en concentraciones finales, para inducir la diferenciación osteoblasto. Cuando fue necesario, 100 μM 2BP en menos de 0,1% DMSO, o 0,1% DMSO solo se añadió al medio de diferenciación en concentraciones finales. Todos los cultivos fueron incubados a 37°C en una atmósfera humidificada que contenía 5% CO 2 durante Los nódulos mineralizados fueron manchados con Alizarin Red S (Sigma-Aldrich). Se utilizó el procedimiento estándar de tinción. Los nódulos mineralizados fueron revisados cada tres días. Para identificar la palmitoilación S en IFITM5, las células osteoblásticas que albergaban el ADN plásmido que codificaba IFITM5-WT fueron cultivadas en ausencia y presencia de 2BP, lo que inhibe la palmitoilación S (Figura 2-A) [31]. A continuación, se extrajo el lisato celular que contenía proteína total para su uso en los análisis de manchas SDS-PAGE y occidentales. A efectos de comparación, las células E. coli también fueron cultivadas en ausencia de 2BP y se extrajo el lisato celular. La Figura 2 -B muestra los resultados del ensayo de manchas occidentales para IFITM5-WT expresado en el osteo En las células de osteoblasto, IFITM5-WT exhibió una sola banda cerca del marcador de masa molecular de 17,4 kDa (ver carril 1) en ausencia de 2BP. Sin embargo, en presencia de 2BP (ver carril 4), la banda apareció en una posición más baja que en ausencia de 2BP (lane 1). Estos resultados sugieren que IFITM5-WT tiene formas de masa molecular alta y baja en ausencia y presencia de 2BP, respectivamente. La palmitoilación S es una reacción reversible, y por lo tanto es despalmitoilada por un reductor fuerte como la hidroxilamina [10]. Tras el tratamiento de hidroxilamina (ver carril 2), la banda apareció en la misma posición que en presencia de 2BP (lane 4). En las células prokaryote E. coli, la modificación post-translacional S-Palmitoylation en IFITM5 PLOS ONE www.plosone.org no se produce. Por lo tanto, la banda también se observó en la misma posición inferior (ver carril 3). En el caso de IFITM3, también se informó que la palmitoylation induce un cambio en la movilidad en la electroforesis, al igual que en nuestros resultados actuales [10]. Para la observación directa de la S-palmitoylation, se utilizó un reportero químico establecido, 17-ODYA (Figura 2-C). Las células osteoblastadas que albergan la codificación plasmídica IFITM5-WT fueron cultivadas en presencia de 17-ODYA para etiquetar la proteína metabólicamente. Después de la extracción y purificación del lisato celular, el IFITM5-WT etiquetado fue ligado con TAMRA-azida de acuerdo con el método de cicloadición de azidealkyne [3+2] catalizado Cu(I) [3+2] [10, 29, 30, 32 ]. Una imagen de fluorescencia en gel del IFITM5-WT marcado 17-ODYA-TAMRA (véase el carril 2 en la Figura 2 -D) mostró que IFITM5 estaba espalmitoilado en las células osteoblastadas. La etiqueta FLAG adjunta a IFITM5 no tiene influencia en la modificación y etiquetado químico (vías 1 y 5). Además, después del tratamiento con hidroxilamina (ver carril 6), la fluorescencia se debilitó debido a la disociación de 17-ODYA de IFITM5, que fue el mismo mecanismo que la disociación del ácido palmítico de IFITM5 por reducción como se describe anteriormente (lane 2 de la Figura 2-B). Por lo tanto, concluimos que el IFITM5 expresado en las células de osteoblasto nativas es S-palmitoilado. Además, las bandas correspondientes a las formas de masa molecular alta y baja mostradas en el análisis de manchas occidentales fueron asignadas tentativamente a las formas S-palmitoiladas y depalmitoiladas, respectivamente. Como se describe anteriormente en la Introducción, los residuos de cisteína son el sustrato para la palmitoilación S. IFITM5 posee tres cisteínas, Cys52 y Cys53 en el dominio TM1, y Cys86 en el bucle CP (Figura 1-A). Todas estas cisteínas están altamente conservadas entre las proteínas de la familia IFITM de mamíferos (Figura 3-A). Para identificar el sitio de modificación en IFITM5, preparamos mutantes substituidos por cisteína, IFITM5-C52A/C53A, -C86A, y -C52A/C53A/C86A (Cys-less). Las células osteoblastadas que albergaban cada plasmido fueron cultivadas en ausencia de 2BP, y luego se extrajo el lisato celular. La Figura 3-B muestra los resultados de la mancha occidental detectando la expresión de todos los mutantes en las células osteoblastadas. En los mutantes C52A/C53A y Cys-less (ver carriles 2 y 4), se detectó la forma de baja masa molecular. Este resultado indica que Cys52 o Cys53 están involucrados en la palmitoilación S. Además, como se muestra en la Figura 2 -D, se detectaron fluorescencia fuerte y débil en el mutante C52A/C53A en ausencia y presencia de hidroxilamina (lanes 3 y 7), respectivamente, pero no en el mutante Cys-less (lanes 4 y 8). Estos resultados sugieren que el resto de la cisteína en el mutante C52A/C53A, Cys86, es S-palmitoilado y el mutante Cyss-less perdió por completo la palmitoilación S porque todas las cisteinas fueron sustituidas. Por lo tanto, concluimos que Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados. Además, se encontró que la S-palmitoilación en el dominio TM1 tiene un efecto importante en la movilidad en el gel (panel inferior de la Figura 2 -D y Figura 3-B). Por lo tanto, en adelante nos referimos a las formas de masa molecular alta y baja como las formas TM1palmitoiladas y TM1-depalmitoiladas, respectivamente. Finalmente, reasignamos las bandas mostradas en el análisis de Western blot como sigue: IFITM5-WT está totalmente palmitoilado, el mutante C86A está parcialmente palmitoilado en Cys52 y/o Cys53, el mutante C52A/C53A está parcialmente palmitoilado en Cys86, y el mutante sin Cys está completamente depalmitoilado. Estudios previos han revelado que IFITM5 interactúa con FKBP11 [19]. FKBP11 pertenece a la familia de proteínas de unión FK506 y tiene un dominio transmembrana. La interacción entre IFITM5 y FKBP11 es importante para la actividad inmunitaria debido a que la formación del complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP induce la expresión de genes inducidos por interferón, a saber, el Bst2, Irgm, Ifit3, B2m y el gen antígeno clase I de MHC [28]. Para investigar el efecto de la palmitoilación S en la interacción de IFITM5 con FKBP11, se realizó un ensayo de inmunoprecipitación. Las células osteoblásticas cotransfectadas por los plásmidos que codifican IFITM5-WT y FKBP11-FLAG fueron cultivadas en ausencia y presencia de 2BP. Luego, el análisis celular extraído fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG. El gel fue lavado varias veces. Finalmente, las proteínas fueron eludidas competitivamente por la adición de péptido FLAG. Si IFITM5 interactuaba con FKBP11, se esperaba que IFITM5 Las cisteínas conservadas fueran resaltadas en naranja y numeradas. En el panel inferior, los números dados entre paréntesis corresponden al número residual para IFITM2. Para el cálculo de probabilidad, un total de 23 secuencias IFITM2, 23 IFITM3 y 17 IFITM5 derivadas de especies mamíferas en la base de datos Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomas (KEGG) fueron utilizadas. La alineación de secuencias se llevó a cabo utilizando CLUSTALW. Los logotipos de secuencia se generaron utilizando WEBLOGO 3. B) Botón occidental para los mutantes de tipo salvaje y substituidos por cisteína de IFITM5 expresados en células osteoblastadas La flecha superior indica que los mutantes C52 y/o C53 en el dominio TM1 son Spalmitoylated (lanes 1 y 3). El C52A/C53A (lane 2) y Cys-less (lane 4) son parcial y completamente depalmitoylated. El experimento se llevó a cabo 2 veces. doi: 10.1371/journal.pone.0075831.g003 se obtendría durante este paso y se detectaría por inmunobloqueo. Figura 4 -A muestra los resultados de la mancha occidental para la co-inmunoprecipitación de IFITM5-WT con FKBP-FLAG. La banda correspondiente a FKBP11 apareció en todos los carriles (panel superior). Las lanes 1 y 2 son controles para asegurar que IFITM5 y FKBP11 estén contenidas en el lisato celular Los controles también aseguraron que el IFITM5 fuera palmitoilado S en ausencia de 2BP (ver carril 1), mientras que el IFITM5 no fue palmitoilado S en presencia de 2BP (ver carril 2). Después de la inmunoprecipitación, una sola banda correspondiente al IFITM5 palmitoilado S apareció en ausencia de 2BP (ver carril 3), indicando la interacción del IFITM5 espalmitoilado con el FKBP11. Sin embargo, en presencia de 2BP, no apareció ninguna banda correspondiente al IFITM5 (ver carril 4), indicando que las dos moléculas no interactúan entre sí. Estos resultados sugieren que la palmitoilación S sobre el IFITM5 contribuye a la interacción con el FKBP11. A continuación, investigamos la relación entre la Spalmitoylation y la interacción con FKBP11 utilizando los mutantes IFITM5 descritos anteriormente. Las células osteoblastadas cotransfectadas por los plásmidos que codifican los mutantes IFITM5 (C52A/ C53A, C86A y Cys-less) y FKBP11-FLAG fueron cultivadas. El ensayo de inmunoprecipitación se llevó a cabo de la misma manera que se describió anteriormente. La Figura 4 -B muestra los resultados de la mancha occidental para la co-inmunoprecipitación de los mutantes de tipo salvaje y el IFITM5 con FKBP11. La Figura 4 -C muestra los resultados del experimento de control utilizando el lisato celular antes de la inmunoprecipitación. Como se describe en la sección anterior 3-3, la banda correspondiente a FKBP11 apareció en todos los carriles (paneles superiores) porque la inmunoprecipitación se realizó utilizando el gel de agarosa anti-FLAG. En el panel inferior de la Figura 4 -B, se observaron bandas individuales para el mutante IFITM5-WT y -C86A (lanes 1 y 3) pero no para los mutantes -C52A/C53A y Cys-less (lanes 2 y 4). Este resultado indica que el tipo salvaje y el mutante C86A interactúan con FKBP11, mientras que los otros dos mutantes no lo hacen. Curiosamente, esta tendencia refleja la tendencia de los perfiles de palmitoilación S, lo que significa que Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 de los mutantes IFITM5-WT y -C86A es S-palmitoilado, mientras que estos residuos no son S-palmitoilados en los mutantes C52A/C53A y Cysless (ver Figuras 2-D, 3-B y el panel inferior de la Figura 4-C). Debido a que la palmitoilación S contribuye a la interacción IFITM5-FKBP11, como se describe en la sección anterior 3-3 (también en la Figura 4-A), los resultados de la Figura 4-B sugieren que los mutantes que perdieron el sitio(s) de palmitoilación S, Cys52 y/o Cys53, no son capaces de interactuar con FKB En otras palabras, la palmitoilación S en estas cisteínas es necesaria para la interacción de IFITM5 con FKBP11. Como se ha descrito anteriormente en la Introducción, estudios previos han revelado que IFITM5 también contribuye a la formación ósea [18] [19] [20]. Por lo tanto, se investigó la influencia de Spalmitoilación en la formación de nódulos óseos en células osteoblastadas, en las que se expresa IFITM5 nativas. La Figura 5 muestra la formación de nódulos dependientes del tiempo en ausencia y la presencia de 2BP (Figuras 5-A y -B). La Figura 5 -C muestra los resultados del ensayo de control para verificar el efecto de DMSO, que se utilizó como disolvente para 2BP, en la formación de nódulos. El nódulo mineralizado fue manchado con Alizarin Red, que reacciona con calcio depositado. En la Figura 5 -D, el área del nódulo mineralizado fue trazada contra el tiempo experimental. En ausencia de 2BP (Figura 5-A, -C, y -D), la mineralización se inició 15 días después del inicio de la diferenciación celular (Día 0). Por otro lado, en presencia de 2BP (Figura 5-B y -D) se formó el nódulo el Día 12. El tiempo medio para la mineralización máxima en presencia de 2BP se estimó 7 días antes que en ausencia de 2BP (Figura 5-D). Además, se observaron diferencias en la forma de los nódulos mineralizados. La Figura 5 -E muestra una visión ampliada de cada nódulo en el Día 21. Los nódulos manchados se difundieron en presencia de 2BP (panel b), mientras que en ausencia de 2BP los nódulos formaron un gran cúmulo (panels a y c). Por lo tanto, nuestras observaciones en este estudio sugieren que la S-palmitoilación afecta la formación de nódulos óseos en las células osteoblásticas. En este estudio, se confirmó la S-palmitoilación sobre IFITM5 en las células osteoblásticas, que fue la misma que la reportada previamente para IFITM3 e IFITM2. Como se informó anteriormente, en IFITM3 e IFITM2, que comparten similitud de secuencia del 85% (Figura 1-C), dos cisteínas en el dominio TM1 (Cys71 y Cys72 para IFITM3, Cys70 y Cys71 para IFITM2) y una cisteína en el bucle CP (Cys105 para IFITM3, Cys104 para IFITM2) son todas S-palmitoiladas en células [10, 24]. Por otro lado, aunque IFITM5 comparte similitud de secuencia del 68% y 66% a IFITM3 e IFITM2, respectivamente, más de una cisteína en el dominio TM1 (Cys52 o Cys53) y una cisteína en el bucle CP (Cys86) son S-palmitoiladas. Teniendo en cuenta la alta conservación de tres cisteínas en las proteínas IFITM (Figuras 1-A y 3-A), todas las cisteínas en IFITM5 pueden estar involucradas en la palmitoilación S al igual que en el caso de IFITM3 e IFITM2 [10, 24]. Los roles de la palmitoilación S en IFITM3 se han estudiado intensamente, y la palmitoilación S ha demostrado ser crucial para el correcto posicionamiento en la membrana y la resistencia a la infección viral y la internalización [10] (los papeles se resumen en la Figura 6-A y se discuten en detalle más adelante). Un estudio reciente ha revelado que la palmitoilación S en IFITM2 también es importante para la agrupación de proteínas en la membrana [24]. Sin embargo, no conocemos el papel de la Spalmitoylation de IFITM5 para el agrupamiento en la membrana en la actualidad porque todavía no hemos logrado obtener un anticuerpo adecuado para la inmunohistoquímica, a pesar de que dedicamos mucho tiempo a la búsqueda y considerando un número considerable de anticuerpos. El Dr. Hanagata y sus colaboradores reportaron previamente que IFITM5 carecían del dominio TM1 y del bucle CP, que y IFITM5 (paneles inferiores), los anticuerpos anti-FLAG y anti-IFITM5 fueron utilizados como anticuerpos primarios, respectivamente. Las flechas indican la existencia de cada proteína y la S-palmitoylation en IFITM5. A) La mancha occidental para la coinmunoprecipitación del tipo salvaje IFITM5 con el FKBP11 (FKBP11-FLAG) fusionado con FLAG en las células osteoblásticas en ausencia y presencia de 2BP (denominadas "-" y "+", respectivamente). Las vías 1 y 2 son los resultados de los ensayos de control utilizados para verificar la existencia de IFITM5 y FKBP11 antes de la inmunoprecipitación, y las vías 3 y 4 muestran los resultados después de la inmunoprecipitación. El experimento se repitió 3 veces. B) La mancha occidental para la coinmunoprecipitación del tipo salvaje y los mutantes substituidos por cisteína de IFITM5 con FKBP11-FLAG en las células osteoblásticas. La banda correspondiente al péptido FLAG no se muestra debido a la menor masa molecular del péptido FLAG en relación con FKBP11-FLAG. C) El experimento de control de la Figura 4 -B utilizado para verificar que IFITM5 y FKBP11 estaban presentes en el lisato celular antes de la inmunoprecipitación. El experimento se repitió 2 veces. A) El mecanismo funcional de IFITM3 se resume en estudios anteriores. i) IFITM3 es S-palmitoilado en Cys71, Cys72 y Cys105, ii) que induce el agrupamiento y el posicionamiento correcto en la membrana, iii) resultando en la actividad antiviral contra el virus de la gripe. B) El mecanismo funcional de IFITM5 se resume combinando los resultados del presente y los estudios anteriores. (i) Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados (ii). La S-palmitoilación permite que IFITM5 interactúe con FKBP11 en las células osteoblásticas (iii). La disociación del CD9 del complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 es inducida por la formación del complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP y conduce a la expresión genética inmunológicamente relevante. IFITM5 también contribuye a la formación ósea, pero se desconoce cuáles son los estados descritos en i)-iii) son importantes para la formación ósea en la actualidad. Por otro lado, la IFITM5 interactúa con la proteína asociada, FKBP11, y la S-palmitoylation claramente hace una contribución significativa a la interacción. Por lo tanto, IFITM5 forma un hetero-oligomero en la membrana celular para su función fisiológica. contiene los sitios de modificación relevantes, perdió la capacidad de interactuar con FKBP11 [19]. En el presente estudio, determinamos que la S-palmitoylation en Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 es necesaria para la interacción. De estos resultados, especulamos que Cys52 y Cys53 se enfrentan a la superficie de interacción con FKBP11, y por lo tanto IFITM5 y FKBP11 interactúan entre sí a través del ácido palmítico unido a la cisteína (resumidos en la Figura 6 -B, discutidos más Nuestra investigación reveló que Cys86 está involucrado en la Spalmitoylation pero no contribuye a la interacción con FKBP11. Especulamos que otros residuos en el bucle CP ubicados cerca del dominio TM1 hacen alguna contribución a la interacción. Investigaciones previas también revelaron que IFITM5 expresado en las células fibroblasto heterologosas NIH3T3 exhibieron interacciones directas con CD81, la proteína 31 asociada al receptor de células B (BCAP31) y el hidroxiesteroide (17-beta) deshidrogenasa 7 (HSD17b7). Estas tres proteínas se unen al IFITM5 sin la S-palmitoylation (forma de masa molecular baja; ver Figura 3-b en ref [19]. y Figura 1-B en ref [28]. En las células fibroblastosas, la S-palmitoylation en IFI Estas interacciones no se observan en las células nativas del osteoblasto y, por lo tanto, son inespecíficas. Teniendo en cuenta estos hechos, se especula que la palmitoilación S sobre las células del IFITM5 promueve la interacción específica con FKBP11 en las células del osteoblasto. El papel que desempeña la palmitoilación S de las células del IFITM5 en la actividad inmune de las células del osteoblasto se discutirá combinando los resultados del presente y de los estudios anteriores. Debe ser necesaria una interacción específica entre IFITM5 y FKBP11 para formar el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP. CD81, también conocido como TAPA-1, es un miembro de la familia de proteínas de membrana de tetraspanina y un componente del núcleo de células B que media la señalización de células B para respuestas inmunes. Al formar este complejo, CD9, una proteína asociada con CD81, disociada del complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 y consecuentemente induce la expresión osteoblastada específica de los genes inducidos por interferón, Bst2, Irgm, Ifit3, B2m y el gen antígeno clase I de la MHC [28]. Si se perdiera la interacción específica mediada por Spalmitoylation de IFITM5 con FKBP11, no se formaría el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP y, por consiguiente, se inhibiría la expresión génica inducida por interferón, ya que el CD9 seguiría asociado con el complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9. En este sentido, especulamos que el IFITM5 está involucrado en la actividad del sistema inmunitario en las células osteoblastadas y la interacción del IFITM5 palmitoilado S con el FKBP11 regula la actividad inmune. Además, se sugirió que la S-palmitoilación en el IFITM5 contribuye a la formación de nódulos óseos, incluyendo la morfología y el tiempo de mineralización, en las células osteoblastadas (Figura 5). Es difícil concluir en la actualidad que la falta de la S-palmitoilación en el IFITM5 causa la difusión de los nódulos óseos (panel b de la Figura 5 -E); sin embargo, podemos decir que el IFITM5 probablemente no será S-palmitoilado en las células en presencia de 2BP. Mientras que el 2BP se utiliza comúnmente como inhibidor de la palmitoilación, también se dirige a muchas enzimas Por lo tanto, también es difícil interpretar los resultados de la incubación a largo plazo de las células osteoblásticas en presencia de 2BP. En cualquier caso, estas son observaciones interesantes y clave en términos de aclarar el papel desempeñado por la S-palmitoilación de IFITM5 en la formación ósea, y se requieren estudios adicionales. La Figura 6 describe un posible mecanismo de la interacción de IFITM5 con FKBP11 y el papel de IFITM5 en la función celular osteoblástica mediante una comparación con IFITM3. En el caso de IFITM3, como se muestra en la Figura 6 -A, se observan los siguientes. i) Las tres cisteinas son todas S-palmitoiladas (ii). La S-palmitoilación conduce a la agrupación y el posicionamiento correcto de moléculas IFITM3 en la membrana (iii). La espalmitoilación y la siguiente agrupación son cruciales para la resistencia al virus de la gripe. Cuando IFITM3 carece de la espalmitoilación, las moléculas de IFITM3 no se agrupan, lo que conduce a la disminución significativa de la actividad antiviral. Por otro lado, la Figura 6 -B muestra que las siguientes observaciones se hacen en el caso de IFITM5. i) Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados (ii). El S-palmitoilado IFITM5 es capaz de interactuar específicamente con FKBP11. Se supone que la interacción está mediada por el ácido palmítico unido a la cisteína frente a la superficie de interacción en FKBP11. Cys86 está involucrado en la palmitoilación S, pero no en la interacción de IFITM5 con FKBP11. En la actualidad, sin embargo, poco se sabe sobre el papel de la palmitoilación S de IFITM5 para la localización en la membrana. Cuando la palmitoilación S afecta la localización de IFITM5 como en el caso de IFITM3 [10], las moléculas S-palmitoiladas IFITM5 deben ser localizadas en la membrana o las moléculas depalmitoiladas deben ser deslocalizadas. La pérdida de la interacción entre IFITM5 y FKBP11 podría deberse a una relocalización de la depalmitoilada IFITM5 que impide su asociación con FKBP11 (iii). El Spalmitoilado IFITM5 interactúa con el complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 a través del FKBP11, que induce la disociación del CD9 del complejo y la expresión de 5 genes inmunológicamente relevantes. Finalmente, el IFITM5 forma el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP. Se desconoce en la actualidad cuál de los tres estados (i)~(iii) ilustrados en la Figura 6-B es importante para la mineralización ósea de las células osteoblásticas. La falta de la S-palmitoilación influye en la interacción con el FKBP11, que podría explicar la siguiente formación compleja y expresión génica. Además, la formación de nódulos óseos también se ve afectada. Se indica que la S-palmitoilación en IFITM5 juega un papel no sólo en la regulación de la actividad inmune sino también en la formación ósea. En conclusión, hemos revelado la S-palmitoilación en IFITM5 y su papel en la interacción con FKBP11. No sólo la actividad inmune sino también la mineralización ósea en las células osteoblásticas se ve afectada por la S-palmitoilación. En general, el papel funcional de la S-palmitoilación es diferente para cada proteína [36]. Para muchas proteínas, el ciclo de palmitoilación y despalmitoilación es constitutivo y regulado por enzimas. Basado en los resultados actuales, es difícil abordar (i) si la S-palmitoilación en IFITM5 es constitutiva o regulada, o (ii) cuando y donde IFITM5 es S-palmitoilada en las células osteoblásticas. Se necesitan más estudios y actualmente se están realizando.

¿Qué es IFITM?

El papel de la S-Palmitoylation en IFITM5 para la interacción con FKBP11 en células de Osteoblastohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3776769/Tsukamoto, Takashi; Li, Xianglan; Morita, Hiromi; Minowa, Takashi; Aizawa, Tomoyasu; Hanagata, Nobutaka; Demura, Makoto2013-09-18DOI:10.1371/journal.pone.0075831Licencia:cc-byAbstract: Recientemente, una de las proteínas familiares de la transmembrana inducida por interferón, IFITM3, se ha convertido en un objetivo importante para la actividad contra la infección por el virus de la gripe A (H1N1). En esta proteína, una modificación post-translacional por ácidos grasos covalentemente unidos a la cisteína, llamada S-palmitoilación, juega un papel crucial para la actividad antiviral. IFITM3 posee tres residuos de cisteína para la S-palmitoilación en el primer dominio de la transmembrana (TM1) y en el bucle citoplasmático (CP). Debido a que estas cisteínas están bien conservadas en las proteínas de la familia de mamíferos IFITM, la S-palmitoilación en estas cisteínas es significativa para sus funciones. IFITM5 es otra proteína de la familia IFITM e interactúa con la proteína de unión FK506 (FKBP11) para formar un complejo de mayor orden en células osteoblastales, que induce la expresión de genes inmunológicamente relevantes. En este estudio, investigamos el papel que desempeña la palmitoilación S de IFITM5 en su interacción con FKBP11 en las células, ya que esta interacción es un proceso clave para la expresión génica. Nuestras investigaciones con un reportero establecido, ácido 17-octadecinoico (17-ODYA), y un inhibidor para la palmitoilación S, ácido 2-bromopalmítico (2BP), revelaron que IFITM5 fue palmitoilado S además de IFITM3. Específicamente, encontramos que los residuos de cisteína en el dominio TM1 y en el bucle CP fueron palmitoilados S en IFITM5. Luego, revelamos por inmunoprecipitación y análisis de manchas occidentales que la interacción de IFITM5 con FKBP11 fue inhibida en presencia de 2BP. El mutante que carecía del sitio S-palmitoylation en el dominio TM1 perdió la interacción con FKBP11. Estos resultados indican que la S-palmitoylation en IFITM5 promueve la interacción con FKBP11. Finalmente, investigamos la formación de nódulos óseos en células osteoblastadas en presencia de 2BP, ya que IFITM5 fue identificado originalmente como factor de formación ósea. El experimento resultó en una aberración morfológica del nódulo óseo, lo que también indicó que la S-palmitoylation contribuye a la formación ósea. Texto: La familia de proteínas transmembranas inducidas por interferón (IFITM) (también conocida como la familia Fragilis en ratones) es parte de la familia de las dispaninas [1] y está compuesta por α-hélices de doble transmembrana conectados por un bucle citoplasmático (CP) y secuencias de polipéptidos amino- y carboxil-terminales (Figura 1-A) extracelulares (EC). Las proteínas IFITM se conservan evolutivamente en vertebrados [2]. Investigaciones genómicas recientes han revelado que hay 5 miembros IFITM en humanos (IFITM1, 2, 3, 5 y 10) y 7 miembros en ratones (IFITM1, 2, 3, 5, 6, 7, y 10). Estas proteínas desempeñan papeles en diversos procesos biológicos, como la maduración de células germinativas durante la gastrulación (IFITTM1-3) [3] [5] [5], la adhesión de células a células (IFITTM1) [6] [7] [8], la actividad antiviral (IFITTM1-3) [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17], y la formación ósea (IFITTM5] [18] [19] [20] [21] [22], aunque actualmente se desconocen las funciones detalladas de IFITM6, 7 y 10; en particular, IFITM3 ha sido objeto de estudios intensivos sobre su actividad contra la infección e internalización del virus de la gripe A (H1N1) [9] [10] [11] [12] [13] [14]. En 2010, el Dr. Yount y sus colaboradores informaron que la actividad antiviral de IFITM3 depende de la palmitoilación S en la proteína [10]. La palmitoilación S [23] es una modificación post-translacional de las proteínas por los ácidos grasos saturados C 16 (ácidos palmíticos) covalentemente unidos a ciertos residuos de cisteína a través de un enlace tioéster (Figura 1-B). La modificación es catalizada reversiblemente por las proteínas aciltransferasas y las tioesterasas acilproteínas, y confiere propiedades únicas a la proteína, tales como unión a la membrana y segmentación, inmunoreactividad, alineación de secuencias aminoácidos de IFITM5, IFITM1, IFITM2 e IFITM3 derivadas de ratones. Los residuos conservados se destacan en negro. Las tres cisteinas conservadas se resaltan en rojo y numeradas en base a la secuencia de IFITM5 (top) e IFITM3 (bottom). Los residuos únicos en IFITM5 se resaltan en gris. Los dominios transmembrana primero y segundo, las secuencias extracelulares y el bucle citoplásmico se indican por flechas y se denotan como TM1 y TM2, EC y el bucle CP, respectivamente. Los dominios TM fueron predichos por SOSUI. Los aspartatos en la región C-terminal en IFITM5 se muestran en azul. B) La ilustración esquemática de la proteína S-palmitoilación. El ácido C 16-palmítico se une a la cisteína a través de un enlace tioéster. La palmitoilación y la despalmitoilación son catalizadas por proteínas aciltransferasas y acilproteínas tioesterasas, respectivamente. En este estudio se resume la hidroxilamina, NH 2 OH, para reducir la vinculación tioestérmica. C) La identidad de la secuencia de aminoácidos (similaridad) entre IFITM5, IFITM1, IFITM2 e IFITM3. doi: 10.1371/journal.pone.0075831.g001 y la interacción proteína-proteína. Los autores revelaron que IFITM3 es S-palmitoilado en tres quisteinas proximales de membrana, Cys71 y Cys72 en el primer dominio transmembrana (TM1), y Cys105 en el bucle CP (Figura 1-A) [10]. Además, IFITM3 carece de la palmitoilación S no se agrupa en la membrana celular y disminuye significativamente la actividad antiviral. Además, las cisteinas en IFITM2, Cys70, Cys71 y Cys104 también son palmitoiladas de la misma manera, lo que afecta a la localización intracelular [24]. Un estudio resentido ha revelado que la murina IFITM1 tiene cuatro residuos de cisteína (Cys49, Cys50, Cys83 y Cys103) para la palmitoilación S, que es necesaria para la actividad antiviral y la estabilidad proteica [25]. Los otros miembros de la familia IFITM también poseen estas cisteínas (Figura 1-A), y por lo tanto el papel de la espalmitoilación en las cisteinas debe ser significativo para las funciones de las proteínas IFITM. Aquí, nos centramos en las proteínas de la familia IFITM5, que también se conoce como proteína similar a IFITM (BRIL) [18]. Entre las proteínas de la familia IFITM, IFITM5 es única. (i) Expresión de IFITM5: A diferencia de las otras proteínas de la familia IFITM, la expresión de IFITM5 no es inducida por interferones porque la región anterior al gen ifitm5 carece de los elementos reguladores del interferón [26]. Además, la expresión de IFITM5 se limita principalmente a las células osteoblastadas [18, 19, 27], mientras que las otras proteínas de IFITM se expresan ubicuamente (ii). Además, IFITM5 tiene un dominio rico en aspartato en la región C-terminal, que podría estar involucrado en la unión al calcio (Figura 1 -A) [26]. iii) Papel de IFITM5 en la formación ósea: La expresión de IFITM5 está asociada con la mineralización durante el proceso de formación ósea en células osteoblásticas [18] [19] [20] [20]. Estudios anteriores han confirmado la expresión de IFITM5 en tejidos óseos en ratones, ratas, humanos y tammar wallabies [2]. Los ratones ifitm5-gene knockout tienen huesos más pequeños [19]. Además, el derribo del gen ifitm5 por el ARN de la horquilla pequeña induce una disminución en la formación de nódulos óseos, mientras que la sobreexpresión del gen en células UMR106 ha demostrado iv) Papel del IFITM5 en la actividad inmunitaria: Estudios recientes han revelado que el IFITM5 interactúa con la proteína 11 de unión FK506 (FKBP11) para formar IFITM5-FKBP11-CD81-el complejo regulador negativo del receptor de la prostaglandina F2 (FPRP) [28]. Cuando se forma el complejo, se inducen las expresiones de 5 genes inducidos por interferón, incluyendo el antígeno 2 de células estromales de médula ósea (Bst2), la proteína 1 inducible del interferón (Irgm), la proteína inducida por interferón con tetratricopéptido repite 3 (Ifit3), b(2) microglobulina (B2m) y el gen antígeno de clase I del MHC. En consecuencia, estos resultados indican que el IFITM5 está involucrado no sólo en la formación ósea sino también en la actividad En este estudio se investigó la palmitoilación S de IFITM5 y su papel en la interacción con FKBP11 en células de osteoblasto de ratón. Las células transfectadas por un plásmido DNA que codificaba el ratón IFITM5 fueron cultivadas en presencia de un reportero químico establecido, ácido 17-octadecinoico (17-ODYA) [29, 30], o un inhibidor para la palmitoilación S, ácido 2-bromopalmítico (2BP) [31]. Los ensayos bioquímicos usando estos compuestos revelaron que el tipo salvaje IFITM5 es S-palmitoilado. Para identificar el sitio de Spalmitoilación en IFITM5, se prepararon mutantes substituidos por cisteína, IFITM5-C86A, -C52A/C53A, y -C52A/53A El ensayo de reportero químico sugirió que al menos dos de las tres cisteínas en IFITM5 son S-palmitoiladas. La interacción de IFITM5 con FKBP11 fue examinada por inmunoprecipitación, resultando en la pérdida de la interacción en presencia de 2BP. El mismo resultado se obtuvo en los dos mutantes, C52A/C53A y Cys-less. Estos resultados sugieren que la S-palmitoilación en Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 de IFITM5 es necesaria para la interacción con FKBP11. Por otro lado, Cys86 en el bucle CP de IFITM5 fue S-palmitoilada pero no involucrada en la interacción. Debido a que esta interacción es importante para la expresión génica inmunológicamente relevante, se indicó que el papel de la palmitoilación S es promover la interacción de IFITM5 con FKBP11 y regular la actividad inmunitaria en las células osteoblásticas. Se discutirá el posible mecanismo de interacción y el efecto de la palmitoilación S en la formación de nódulos óseos. Para la expresión celular mamífera, se construyeron vectores de plásmidos de tipo salvaje IFITM5 (IFITM5-WT) y FKBP11 fusionado con FLAG (FKBP11-FLAG) insertando los genes clonados en un vector de expresión neopBApo-CMV (Takara Bio, Shiga, Japón). Los detalles de las construcciones de ADN recombinante fueron los mismos descritos anteriormente [19]. Los genes de los mutantes IFITM5 (IFITM5-C86A, -C52A/53A, y -C52A/C53A/C86A (Cys-less)) se prepararon utilizando un kit QuikChange de mutagenesis dirigido por el sitio (Stratagene, La Jolla, CA). Los vectores plásmidos de los IFITM5-WT fusionados con FLAG, -C52A/53A y Cys-less se construyeron insertando los genes clonados en el vector de expresión neo de pBApo-CMV. Para la expresión celular de E. coli, el vector plásmido de IFITM5-WT se construyó insertando el gen clonado en un vector de expresión pET22b (Novagen, Madison, WI). El primer delantero 5'-GGAATTCATTCATATTACACTTCATATCCCGTG-3' y el primer reverso 5'-CCGCTCGAGTTATAGTCTCATCAAACTTG-3' fueron utilizados para amplificar el gen que codifica todo el IFITM5 del vector plásmido para la expresión celular mamífera descrita anteriormente. Las letras subrayadas denotan un NdeI y un sitio de escote XhoI, respectivamente. Los plásmidos de mutantes IFITM5 fueron preparados usando un kit de mutagenesis dirigido por el sitio QuikChange. El sentido y los imprimadores antisenso utilizados fueron 5'-GGCAGTATGCTCCAAAGCCAAGGCGTACCATCTGGGCTGC-3' y 5'-GCAGCCGAGATGGTGGTGCCTGCTGGTGGTGGGGAGCATACT GCC-3' para IFITM5-C86A; y 5'-GCACGATGTACCTGAATGCGCGGCGCTTGGTGCTG CGC-3' y 5'-GCGCCAGGAATGAGCGCGCCGCGACAGAGCATCG TGC-3' para IFITM5-C52A/C53A, respectivamente (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Las células MC3T3 similares a los osteoblastos fueron provistas por el RIKEN, Cell Bank (RCB 1126). Los procedimientos de cultivo celular, transfección y expresión proteica fueron los mismos reportados anteriormente. Cuando fue necesario, el ácido 2-bromopalmítico (2BP; Wako, Osaka, Japón) y el ácido 17-octadecinoico (17-ODYA; Sigma-Aldrich) fueron disueltos en el 99,5% de sulfóxido dimetilo (DMSO; Wako) y añadidos al medio de diferenciación a concentraciones de 100 μM y 50 μM en menos del 0,1% de DMSO, respectivamente [30, 31]. Las proteínas de tipo salvaje y mutante IFITM5 también fueron producidas utilizando un sistema de expresión recombinante E. coli. Las células E. coli BL21(DE3) transformadas por la expresión plásmido fueron cultivadas a 37°C en medio LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina. Después de cuatro horas de inducción por 1 mM isopropil β-Dtiogalactopiranoside (IPTG), las células fueron recolectadas por centrifugación (6.400 × g durante 10 min a 4°C). Las células fueron suspendidas en 50 mM tampón Tris-HCl (pH 8) y interrumpidas por una prensa francesa (Ohtake, Tokio, Japón) (100 MPa × 4 veces). La fracción de membrana bruta fue recolectada por ultracentrifugación (178.000 × g durante 90 min a 4°C). La fracción recolectada fue solubilizado con 1,5% n-dodecyl-β-Dmaltopiranoside (DDM) (Dojindo Lab, Kumamoto, Japón) en 50 mM Tris-HCl, pH 8, que contenía 0,3 M NaCl y 5 mM imidazol. Después de la ultracentrifugación, el sobrenadante fue incubado con resina de agarosa Ni 2+ -NTA (Qiagen, Hilden, Alemania). La resina fue aplicada a una columna de cromatografía y lavada con 50 mM imidazol que contenía 50 mM Tris-HCl (pH 8), 0,3 M NaCl y 0,1% DDM. El IFITM5 solubilizado con DDM fue recolectado por elución con el mismo tampón que contenía 0,3 M imidazol. Los medios de muestreo fueron reemplazados por la solución tampón apropiada por dos pasajes sobre una columna PD-10 (GE Healthcare UK, Ltd., Amersham Place, Inglaterra). Los detalles experimentales se describen en informes anteriores [19, 28]. Brevemente, se extrajeron proteínas totales de las células osteoblásticas que coexpresaron IFITM5 y FKBP11-FLAG utilizando un kit de extracción total de proteínas (BioChain Institute Inc., Newark, CA). Luego, el lisato celular fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG M2 (Sigma-Aldrich) a 4°C durante 2 h. Para recuperar FKBP11-FLAG, 500 ng/μL 3 × péptido FLAG (Sigma-Aldrich) disuelto en solución salina tris-buffered se añadió al gel recogido a 4°C durante 1 h. Las proteínas recuperadas y el lisato celular que contenía proteínas totales fueron analizados por SDS-PAGE (15% ePAGEL; ATTO, Tokio, Japón) y la mancha occidental El anticuerpo policlonal anti-IFITM5, preparado a partir de la secuencia péptida aminoterminal (TSYPREDPRAPSSRC), y el anticuerpo monoclonal anti-FLAG (Sigma-Aldrich) fueron utilizados como anticuerpos primarios. Los anticuerpos anti-rabbit IgG (H+L) de cabra conjugados con HRP (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) y anti-mouse IgG (H+L) (Sigma-Aldrich) fueron utilizados como anticuerpos secundarios para los anticuerpos primarios anti-IFITM5 y anti-FLAG, respectivamente. Las proteínas fueron detectadas por reacción quimioluminiscente (MercK-Millipore, Billerica, MA). El lisato celular extraído de las células osteoblásticas marcadas metabólicamente por 17-ODYA fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG M2 para obtener proteínas purificadas con FLAG IFITM5. Las proteínas marcadas con 17-ODYA fueron etiquetadas químicamente con azida-PEG 3 -5(6)-carboxitetrametilrhodamina (TAMRA-azida; Click Chemistry Tools, Scottsdale, AZ) con referencia a estudios previos [10, 29, 30, 32] y la guía del fabricante. Las proteínas separadas por SDS-PAGE fueron visualizadas utilizando un láser de 532-nm para excitación y la fluorescencia por TAMRA (565 nm) fue detectada mediante un filtro de largo camino de 575nm (Typhoon FLA 9000; GE Healthcare). Las células de osteoblasto subcultivo MC3T3 fueron sembradas a una densidad de 5.000 células/cm 2 en platos de 40 mm y cultivadas en medio de águila α-modificada (α-MEM; Sigma-Aldrich) conteniendo 10% (v/v) de suero fetal bovino (FBS; Nichirei Biosciences Inc., Tokio, Japón). Al día siguiente, esto fue reemplazado por medio de diferenciación, conteniendo 2 mM de glicerofosfato y 50 μg/ml de ascorbato sódico en concentraciones finales, para inducir la diferenciación osteoblasto. Cuando fue necesario, 100 μM 2BP en menos de 0,1% DMSO, o 0,1% DMSO solo se añadió al medio de diferenciación en concentraciones finales. Todos los cultivos fueron incubados a 37°C en una atmósfera humidificada que contenía 5% CO 2 durante Los nódulos mineralizados fueron manchados con Alizarin Red S (Sigma-Aldrich). Se utilizó el procedimiento estándar de tinción. Los nódulos mineralizados fueron revisados cada tres días. Para identificar la palmitoilación S en IFITM5, las células osteoblásticas que albergaban el ADN plásmido que codificaba IFITM5-WT fueron cultivadas en ausencia y presencia de 2BP, lo que inhibe la palmitoilación S (Figura 2-A) [31]. A continuación, se extrajo el lisato celular que contenía proteína total para su uso en los análisis de manchas SDS-PAGE y occidentales. A efectos de comparación, las células E. coli también fueron cultivadas en ausencia de 2BP y se extrajo el lisato celular. La Figura 2 -B muestra los resultados del ensayo de manchas occidentales para IFITM5-WT expresado en el osteo En las células de osteoblasto, IFITM5-WT exhibió una sola banda cerca del marcador de masa molecular de 17,4 kDa (ver carril 1) en ausencia de 2BP. Sin embargo, en presencia de 2BP (ver carril 4), la banda apareció en una posición más baja que en ausencia de 2BP (lane 1). Estos resultados sugieren que IFITM5-WT tiene formas de masa molecular alta y baja en ausencia y presencia de 2BP, respectivamente. La palmitoilación S es una reacción reversible, y por lo tanto es despalmitoilada por un reductor fuerte como la hidroxilamina [10]. Tras el tratamiento de hidroxilamina (ver carril 2), la banda apareció en la misma posición que en presencia de 2BP (lane 4). En las células prokaryote E. coli, la modificación post-translacional S-Palmitoylation en IFITM5 PLOS ONE www.plosone.org no se produce. Por lo tanto, la banda también se observó en la misma posición inferior (ver carril 3). En el caso de IFITM3, también se informó que la palmitoylation induce un cambio en la movilidad en la electroforesis, al igual que en nuestros resultados actuales [10]. Para la observación directa de la S-palmitoylation, se utilizó un reportero químico establecido, 17-ODYA (Figura 2-C). Las células osteoblastadas que albergan la codificación plasmídica IFITM5-WT fueron cultivadas en presencia de 17-ODYA para etiquetar la proteína metabólicamente. Después de la extracción y purificación del lisato celular, el IFITM5-WT etiquetado fue ligado con TAMRA-azida de acuerdo con el método de cicloadición de azidealkyne [3+2] catalizado Cu(I) [3+2] [10, 29, 30, 32 ]. Una imagen de fluorescencia en gel del IFITM5-WT marcado 17-ODYA-TAMRA (véase el carril 2 en la Figura 2 -D) mostró que IFITM5 estaba espalmitoilado en las células osteoblastadas. La etiqueta FLAG adjunta a IFITM5 no tiene influencia en la modificación y etiquetado químico (vías 1 y 5). Además, después del tratamiento con hidroxilamina (ver carril 6), la fluorescencia se debilitó debido a la disociación de 17-ODYA de IFITM5, que fue el mismo mecanismo que la disociación del ácido palmítico de IFITM5 por reducción como se describe anteriormente (lane 2 de la Figura 2-B). Por lo tanto, concluimos que el IFITM5 expresado en las células de osteoblasto nativas es S-palmitoilado. Además, las bandas correspondientes a las formas de masa molecular alta y baja mostradas en el análisis de manchas occidentales fueron asignadas tentativamente a las formas S-palmitoiladas y depalmitoiladas, respectivamente. Como se describe anteriormente en la Introducción, los residuos de cisteína son el sustrato para la palmitoilación S. IFITM5 posee tres cisteínas, Cys52 y Cys53 en el dominio TM1, y Cys86 en el bucle CP (Figura 1-A). Todas estas cisteínas están altamente conservadas entre las proteínas de la familia IFITM de mamíferos (Figura 3-A). Para identificar el sitio de modificación en IFITM5, preparamos mutantes substituidos por cisteína, IFITM5-C52A/C53A, -C86A, y -C52A/C53A/C86A (Cys-less). Las células osteoblastadas que albergaban cada plasmido fueron cultivadas en ausencia de 2BP, y luego se extrajo el lisato celular. La Figura 3-B muestra los resultados de la mancha occidental detectando la expresión de todos los mutantes en las células osteoblastadas. En los mutantes C52A/C53A y Cys-less (ver carriles 2 y 4), se detectó la forma de baja masa molecular. Este resultado indica que Cys52 o Cys53 están involucrados en la palmitoilación S. Además, como se muestra en la Figura 2 -D, se detectaron fluorescencia fuerte y débil en el mutante C52A/C53A en ausencia y presencia de hidroxilamina (lanes 3 y 7), respectivamente, pero no en el mutante Cys-less (lanes 4 y 8). Estos resultados sugieren que el resto de la cisteína en el mutante C52A/C53A, Cys86, es S-palmitoilado y el mutante Cyss-less perdió por completo la palmitoilación S porque todas las cisteinas fueron sustituidas. Por lo tanto, concluimos que Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados. Además, se encontró que la S-palmitoilación en el dominio TM1 tiene un efecto importante en la movilidad en el gel (panel inferior de la Figura 2 -D y Figura 3-B). Por lo tanto, en adelante nos referimos a las formas de masa molecular alta y baja como las formas TM1palmitoiladas y TM1-depalmitoiladas, respectivamente. Finalmente, reasignamos las bandas mostradas en el análisis de Western blot como sigue: IFITM5-WT está totalmente palmitoilado, el mutante C86A está parcialmente palmitoilado en Cys52 y/o Cys53, el mutante C52A/C53A está parcialmente palmitoilado en Cys86, y el mutante sin Cys está completamente depalmitoilado. Estudios previos han revelado que IFITM5 interactúa con FKBP11 [19]. FKBP11 pertenece a la familia de proteínas de unión FK506 y tiene un dominio transmembrana. La interacción entre IFITM5 y FKBP11 es importante para la actividad inmunitaria debido a que la formación del complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP induce la expresión de genes inducidos por interferón, a saber, el Bst2, Irgm, Ifit3, B2m y el gen antígeno clase I de MHC [28]. Para investigar el efecto de la palmitoilación S en la interacción de IFITM5 con FKBP11, se realizó un ensayo de inmunoprecipitación. Las células osteoblásticas cotransfectadas por los plásmidos que codifican IFITM5-WT y FKBP11-FLAG fueron cultivadas en ausencia y presencia de 2BP. Luego, el análisis celular extraído fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG. El gel fue lavado varias veces. Finalmente, las proteínas fueron eludidas competitivamente por la adición de péptido FLAG. Si IFITM5 interactuaba con FKBP11, se esperaba que IFITM5 Las cisteínas conservadas fueran resaltadas en naranja y numeradas. En el panel inferior, los números dados entre paréntesis corresponden al número residual para IFITM2. Para el cálculo de probabilidad, un total de 23 secuencias IFITM2, 23 IFITM3 y 17 IFITM5 derivadas de especies mamíferas en la base de datos Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomas (KEGG) fueron utilizadas. La alineación de secuencias se llevó a cabo utilizando CLUSTALW. Los logotipos de secuencia se generaron utilizando WEBLOGO 3. B) Botón occidental para los mutantes de tipo salvaje y substituidos por cisteína de IFITM5 expresados en células osteoblastadas La flecha superior indica que los mutantes C52 y/o C53 en el dominio TM1 son Spalmitoylated (lanes 1 y 3). El C52A/C53A (lane 2) y Cys-less (lane 4) son parcial y completamente depalmitoylated. El experimento se llevó a cabo 2 veces. doi: 10.1371/journal.pone.0075831.g003 se obtendría durante este paso y se detectaría por inmunobloqueo. Figura 4 -A muestra los resultados de la mancha occidental para la co-inmunoprecipitación de IFITM5-WT con FKBP-FLAG. La banda correspondiente a FKBP11 apareció en todos los carriles (panel superior). Las lanes 1 y 2 son controles para asegurar que IFITM5 y FKBP11 estén contenidas en el lisato celular Los controles también aseguraron que el IFITM5 fuera palmitoilado S en ausencia de 2BP (ver carril 1), mientras que el IFITM5 no fue palmitoilado S en presencia de 2BP (ver carril 2). Después de la inmunoprecipitación, una sola banda correspondiente al IFITM5 palmitoilado S apareció en ausencia de 2BP (ver carril 3), indicando la interacción del IFITM5 espalmitoilado con el FKBP11. Sin embargo, en presencia de 2BP, no apareció ninguna banda correspondiente al IFITM5 (ver carril 4), indicando que las dos moléculas no interactúan entre sí. Estos resultados sugieren que la palmitoilación S sobre el IFITM5 contribuye a la interacción con el FKBP11. A continuación, investigamos la relación entre la Spalmitoylation y la interacción con FKBP11 utilizando los mutantes IFITM5 descritos anteriormente. Las células osteoblastadas cotransfectadas por los plásmidos que codifican los mutantes IFITM5 (C52A/ C53A, C86A y Cys-less) y FKBP11-FLAG fueron cultivadas. El ensayo de inmunoprecipitación se llevó a cabo de la misma manera que se describió anteriormente. La Figura 4 -B muestra los resultados de la mancha occidental para la co-inmunoprecipitación de los mutantes de tipo salvaje y el IFITM5 con FKBP11. La Figura 4 -C muestra los resultados del experimento de control utilizando el lisato celular antes de la inmunoprecipitación. Como se describe en la sección anterior 3-3, la banda correspondiente a FKBP11 apareció en todos los carriles (paneles superiores) porque la inmunoprecipitación se realizó utilizando el gel de agarosa anti-FLAG. En el panel inferior de la Figura 4 -B, se observaron bandas individuales para el mutante IFITM5-WT y -C86A (lanes 1 y 3) pero no para los mutantes -C52A/C53A y Cys-less (lanes 2 y 4). Este resultado indica que el tipo salvaje y el mutante C86A interactúan con FKBP11, mientras que los otros dos mutantes no lo hacen. Curiosamente, esta tendencia refleja la tendencia de los perfiles de palmitoilación S, lo que significa que Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 de los mutantes IFITM5-WT y -C86A es S-palmitoilado, mientras que estos residuos no son S-palmitoilados en los mutantes C52A/C53A y Cysless (ver Figuras 2-D, 3-B y el panel inferior de la Figura 4-C). Debido a que la palmitoilación S contribuye a la interacción IFITM5-FKBP11, como se describe en la sección anterior 3-3 (también en la Figura 4-A), los resultados de la Figura 4-B sugieren que los mutantes que perdieron el sitio(s) de palmitoilación S, Cys52 y/o Cys53, no son capaces de interactuar con FKB En otras palabras, la palmitoilación S en estas cisteínas es necesaria para la interacción de IFITM5 con FKBP11. Como se ha descrito anteriormente en la Introducción, estudios previos han revelado que IFITM5 también contribuye a la formación ósea [18] [19] [20]. Por lo tanto, se investigó la influencia de Spalmitoilación en la formación de nódulos óseos en células osteoblastadas, en las que se expresa IFITM5 nativas. La Figura 5 muestra la formación de nódulos dependientes del tiempo en ausencia y la presencia de 2BP (Figuras 5-A y -B). La Figura 5 -C muestra los resultados del ensayo de control para verificar el efecto de DMSO, que se utilizó como disolvente para 2BP, en la formación de nódulos. El nódulo mineralizado fue manchado con Alizarin Red, que reacciona con calcio depositado. En la Figura 5 -D, el área del nódulo mineralizado fue trazada contra el tiempo experimental. En ausencia de 2BP (Figura 5-A, -C, y -D), la mineralización se inició 15 días después del inicio de la diferenciación celular (Día 0). Por otro lado, en presencia de 2BP (Figura 5-B y -D) se formó el nódulo el Día 12. El tiempo medio para la mineralización máxima en presencia de 2BP se estimó 7 días antes que en ausencia de 2BP (Figura 5-D). Además, se observaron diferencias en la forma de los nódulos mineralizados. La Figura 5 -E muestra una visión ampliada de cada nódulo en el Día 21. Los nódulos manchados se difundieron en presencia de 2BP (panel b), mientras que en ausencia de 2BP los nódulos formaron un gran cúmulo (panels a y c). Por lo tanto, nuestras observaciones en este estudio sugieren que la S-palmitoilación afecta la formación de nódulos óseos en las células osteoblásticas. En este estudio, se confirmó la S-palmitoilación sobre IFITM5 en las células osteoblásticas, que fue la misma que la reportada previamente para IFITM3 e IFITM2. Como se informó anteriormente, en IFITM3 e IFITM2, que comparten similitud de secuencia del 85% (Figura 1-C), dos cisteínas en el dominio TM1 (Cys71 y Cys72 para IFITM3, Cys70 y Cys71 para IFITM2) y una cisteína en el bucle CP (Cys105 para IFITM3, Cys104 para IFITM2) son todas S-palmitoiladas en células [10, 24]. Por otro lado, aunque IFITM5 comparte similitud de secuencia del 68% y 66% a IFITM3 e IFITM2, respectivamente, más de una cisteína en el dominio TM1 (Cys52 o Cys53) y una cisteína en el bucle CP (Cys86) son S-palmitoiladas. Teniendo en cuenta la alta conservación de tres cisteínas en las proteínas IFITM (Figuras 1-A y 3-A), todas las cisteínas en IFITM5 pueden estar involucradas en la palmitoilación S al igual que en el caso de IFITM3 e IFITM2 [10, 24]. Los roles de la palmitoilación S en IFITM3 se han estudiado intensamente, y la palmitoilación S ha demostrado ser crucial para el correcto posicionamiento en la membrana y la resistencia a la infección viral y la internalización [10] (los papeles se resumen en la Figura 6-A y se discuten en detalle más adelante). Un estudio reciente ha revelado que la palmitoilación S en IFITM2 también es importante para la agrupación de proteínas en la membrana [24]. Sin embargo, no conocemos el papel de la Spalmitoylation de IFITM5 para el agrupamiento en la membrana en la actualidad porque todavía no hemos logrado obtener un anticuerpo adecuado para la inmunohistoquímica, a pesar de que dedicamos mucho tiempo a la búsqueda y considerando un número considerable de anticuerpos. El Dr. Hanagata y sus colaboradores reportaron previamente que IFITM5 carecían del dominio TM1 y del bucle CP, que y IFITM5 (paneles inferiores), los anticuerpos anti-FLAG y anti-IFITM5 fueron utilizados como anticuerpos primarios, respectivamente. Las flechas indican la existencia de cada proteína y la S-palmitoylation en IFITM5. A) La mancha occidental para la coinmunoprecipitación del tipo salvaje IFITM5 con el FKBP11 (FKBP11-FLAG) fusionado con FLAG en las células osteoblásticas en ausencia y presencia de 2BP (denominadas "-" y "+", respectivamente). Las vías 1 y 2 son los resultados de los ensayos de control utilizados para verificar la existencia de IFITM5 y FKBP11 antes de la inmunoprecipitación, y las vías 3 y 4 muestran los resultados después de la inmunoprecipitación. El experimento se repitió 3 veces. B) La mancha occidental para la coinmunoprecipitación del tipo salvaje y los mutantes substituidos por cisteína de IFITM5 con FKBP11-FLAG en las células osteoblásticas. La banda correspondiente al péptido FLAG no se muestra debido a la menor masa molecular del péptido FLAG en relación con FKBP11-FLAG. C) El experimento de control de la Figura 4 -B utilizado para verificar que IFITM5 y FKBP11 estaban presentes en el lisato celular antes de la inmunoprecipitación. El experimento se repitió 2 veces. A) El mecanismo funcional de IFITM3 se resume en estudios anteriores. i) IFITM3 es S-palmitoilado en Cys71, Cys72 y Cys105, ii) que induce el agrupamiento y el posicionamiento correcto en la membrana, iii) resultando en la actividad antiviral contra el virus de la gripe. B) El mecanismo funcional de IFITM5 se resume combinando los resultados del presente y los estudios anteriores. (i) Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados (ii). La S-palmitoilación permite que IFITM5 interactúe con FKBP11 en las células osteoblásticas (iii). La disociación del CD9 del complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 es inducida por la formación del complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP y conduce a la expresión genética inmunológicamente relevante. IFITM5 también contribuye a la formación ósea, pero se desconoce cuáles son los estados descritos en i)-iii) son importantes para la formación ósea en la actualidad. Por otro lado, la IFITM5 interactúa con la proteína asociada, FKBP11, y la S-palmitoylation claramente hace una contribución significativa a la interacción. Por lo tanto, IFITM5 forma un hetero-oligomero en la membrana celular para su función fisiológica. contiene los sitios de modificación relevantes, perdió la capacidad de interactuar con FKBP11 [19]. En el presente estudio, determinamos que la S-palmitoylation en Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 es necesaria para la interacción. De estos resultados, especulamos que Cys52 y Cys53 se enfrentan a la superficie de interacción con FKBP11, y por lo tanto IFITM5 y FKBP11 interactúan entre sí a través del ácido palmítico unido a la cisteína (resumidos en la Figura 6 -B, discutidos más Nuestra investigación reveló que Cys86 está involucrado en la Spalmitoylation pero no contribuye a la interacción con FKBP11. Especulamos que otros residuos en el bucle CP ubicados cerca del dominio TM1 hacen alguna contribución a la interacción. Investigaciones previas también revelaron que IFITM5 expresado en las células fibroblasto heterologosas NIH3T3 exhibieron interacciones directas con CD81, la proteína 31 asociada al receptor de células B (BCAP31) y el hidroxiesteroide (17-beta) deshidrogenasa 7 (HSD17b7). Estas tres proteínas se unen al IFITM5 sin la S-palmitoylation (forma de masa molecular baja; ver Figura 3-b en ref [19]. y Figura 1-B en ref [28]. En las células fibroblastosas, la S-palmitoylation en IFI Estas interacciones no se observan en las células nativas del osteoblasto y, por lo tanto, son inespecíficas. Teniendo en cuenta estos hechos, se especula que la palmitoilación S sobre las células del IFITM5 promueve la interacción específica con FKBP11 en las células del osteoblasto. El papel que desempeña la palmitoilación S de las células del IFITM5 en la actividad inmune de las células del osteoblasto se discutirá combinando los resultados del presente y de los estudios anteriores. Debe ser necesaria una interacción específica entre IFITM5 y FKBP11 para formar el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP. CD81, también conocido como TAPA-1, es un miembro de la familia de proteínas de membrana de tetraspanina y un componente del núcleo de células B que media la señalización de células B para respuestas inmunes. Al formar este complejo, CD9, una proteína asociada con CD81, disociada del complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 y consecuentemente induce la expresión osteoblastada específica de los genes inducidos por interferón, Bst2, Irgm, Ifit3, B2m y el gen antígeno clase I de la MHC [28]. Si se perdiera la interacción específica mediada por Spalmitoylation de IFITM5 con FKBP11, no se formaría el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP y, por consiguiente, se inhibiría la expresión génica inducida por interferón, ya que el CD9 seguiría asociado con el complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9. En este sentido, especulamos que el IFITM5 está involucrado en la actividad del sistema inmunitario en las células osteoblastadas y la interacción del IFITM5 palmitoilado S con el FKBP11 regula la actividad inmune. Además, se sugirió que la S-palmitoilación en el IFITM5 contribuye a la formación de nódulos óseos, incluyendo la morfología y el tiempo de mineralización, en las células osteoblastadas (Figura 5). Es difícil concluir en la actualidad que la falta de la S-palmitoilación en el IFITM5 causa la difusión de los nódulos óseos (panel b de la Figura 5 -E); sin embargo, podemos decir que el IFITM5 probablemente no será S-palmitoilado en las células en presencia de 2BP. Mientras que el 2BP se utiliza comúnmente como inhibidor de la palmitoilación, también se dirige a muchas enzimas Por lo tanto, también es difícil interpretar los resultados de la incubación a largo plazo de las células osteoblásticas en presencia de 2BP. En cualquier caso, estas son observaciones interesantes y clave en términos de aclarar el papel desempeñado por la S-palmitoilación de IFITM5 en la formación ósea, y se requieren estudios adicionales. La Figura 6 describe un posible mecanismo de la interacción de IFITM5 con FKBP11 y el papel de IFITM5 en la función celular osteoblástica mediante una comparación con IFITM3. En el caso de IFITM3, como se muestra en la Figura 6 -A, se observan los siguientes. i) Las tres cisteinas son todas S-palmitoiladas (ii). La S-palmitoilación conduce a la agrupación y el posicionamiento correcto de moléculas IFITM3 en la membrana (iii). La espalmitoilación y la siguiente agrupación son cruciales para la resistencia al virus de la gripe. Cuando IFITM3 carece de la espalmitoilación, las moléculas de IFITM3 no se agrupan, lo que conduce a la disminución significativa de la actividad antiviral. Por otro lado, la Figura 6 -B muestra que las siguientes observaciones se hacen en el caso de IFITM5. i) Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados (ii). El S-palmitoilado IFITM5 es capaz de interactuar específicamente con FKBP11. Se supone que la interacción está mediada por el ácido palmítico unido a la cisteína frente a la superficie de interacción en FKBP11. Cys86 está involucrado en la palmitoilación S, pero no en la interacción de IFITM5 con FKBP11. En la actualidad, sin embargo, poco se sabe sobre el papel de la palmitoilación S de IFITM5 para la localización en la membrana. Cuando la palmitoilación S afecta la localización de IFITM5 como en el caso de IFITM3 [10], las moléculas S-palmitoiladas IFITM5 deben ser localizadas en la membrana o las moléculas depalmitoiladas deben ser deslocalizadas. La pérdida de la interacción entre IFITM5 y FKBP11 podría deberse a una relocalización de la depalmitoilada IFITM5 que impide su asociación con FKBP11 (iii). El Spalmitoilado IFITM5 interactúa con el complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 a través del FKBP11, que induce la disociación del CD9 del complejo y la expresión de 5 genes inmunológicamente relevantes. Finalmente, el IFITM5 forma el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP. Se desconoce en la actualidad cuál de los tres estados (i)~(iii) ilustrados en la Figura 6-B es importante para la mineralización ósea de las células osteoblásticas. La falta de la S-palmitoilación influye en la interacción con el FKBP11, que podría explicar la siguiente formación compleja y expresión génica. Además, la formación de nódulos óseos también se ve afectada. Se indica que la S-palmitoilación en IFITM5 juega un papel no sólo en la regulación de la actividad inmune sino también en la formación ósea. En conclusión, hemos revelado la S-palmitoilación en IFITM5 y su papel en la interacción con FKBP11. No sólo la actividad inmune sino también la mineralización ósea en las células osteoblásticas se ve afectada por la S-palmitoilación. En general, el papel funcional de la S-palmitoilación es diferente para cada proteína [36]. Para muchas proteínas, el ciclo de palmitoilación y despalmitoilación es constitutivo y regulado por enzimas. Basado en los resultados actuales, es difícil abordar (i) si la S-palmitoilación en IFITM5 es constitutiva o regulada, o (ii) cuando y donde IFITM5 es S-palmitoilada en las células osteoblásticas. Se necesitan más estudios y actualmente se están realizando.

¿Cuántos residuos de cisteína están contenidos en el primer dominio transmembrana de IFITM3?

El papel de la S-Palmitoylation en IFITM5 para la interacción con FKBP11 en células de Osteoblastohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3776769/Tsukamoto, Takashi; Li, Xianglan; Morita, Hiromi; Minowa, Takashi; Aizawa, Tomoyasu; Hanagata, Nobutaka; Demura, Makoto2013-09-18DOI:10.1371/journal.pone.0075831Licencia:cc-byAbstract: Recientemente, una de las proteínas familiares de la transmembrana inducida por interferón, IFITM3, se ha convertido en un objetivo importante para la actividad contra la infección por el virus de la gripe A (H1N1). En esta proteína, una modificación post-translacional por ácidos grasos covalentemente unidos a la cisteína, llamada S-palmitoilación, juega un papel crucial para la actividad antiviral. IFITM3 posee tres residuos de cisteína para la S-palmitoilación en el primer dominio de la transmembrana (TM1) y en el bucle citoplasmático (CP). Debido a que estas cisteínas están bien conservadas en las proteínas de la familia de mamíferos IFITM, la S-palmitoilación en estas cisteínas es significativa para sus funciones. IFITM5 es otra proteína de la familia IFITM e interactúa con la proteína de unión FK506 (FKBP11) para formar un complejo de mayor orden en células osteoblastales, que induce la expresión de genes inmunológicamente relevantes. En este estudio, investigamos el papel que desempeña la palmitoilación S de IFITM5 en su interacción con FKBP11 en las células, ya que esta interacción es un proceso clave para la expresión génica. Nuestras investigaciones con un reportero establecido, ácido 17-octadecinoico (17-ODYA), y un inhibidor para la palmitoilación S, ácido 2-bromopalmítico (2BP), revelaron que IFITM5 fue palmitoilado S además de IFITM3. Específicamente, encontramos que los residuos de cisteína en el dominio TM1 y en el bucle CP fueron palmitoilados S en IFITM5. Luego, revelamos por inmunoprecipitación y análisis de manchas occidentales que la interacción de IFITM5 con FKBP11 fue inhibida en presencia de 2BP. El mutante que carecía del sitio S-palmitoylation en el dominio TM1 perdió la interacción con FKBP11. Estos resultados indican que la S-palmitoylation en IFITM5 promueve la interacción con FKBP11. Finalmente, investigamos la formación de nódulos óseos en células osteoblastadas en presencia de 2BP, ya que IFITM5 fue identificado originalmente como factor de formación ósea. El experimento resultó en una aberración morfológica del nódulo óseo, lo que también indicó que la S-palmitoylation contribuye a la formación ósea. Texto: La familia de proteínas transmembranas inducidas por interferón (IFITM) (también conocida como la familia Fragilis en ratones) es parte de la familia de las dispaninas [1] y está compuesta por α-hélices de doble transmembrana conectados por un bucle citoplasmático (CP) y secuencias de polipéptidos amino- y carboxil-terminales (Figura 1-A) extracelulares (EC). Las proteínas IFITM se conservan evolutivamente en vertebrados [2]. Investigaciones genómicas recientes han revelado que hay 5 miembros IFITM en humanos (IFITM1, 2, 3, 5 y 10) y 7 miembros en ratones (IFITM1, 2, 3, 5, 6, 7, y 10). Estas proteínas desempeñan papeles en diversos procesos biológicos, como la maduración de células germinativas durante la gastrulación (IFITTM1-3) [3] [5] [5], la adhesión de células a células (IFITTM1) [6] [7] [8], la actividad antiviral (IFITTM1-3) [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17], y la formación ósea (IFITTM5] [18] [19] [20] [21] [22], aunque actualmente se desconocen las funciones detalladas de IFITM6, 7 y 10; en particular, IFITM3 ha sido objeto de estudios intensivos sobre su actividad contra la infección e internalización del virus de la gripe A (H1N1) [9] [10] [11] [12] [13] [14]. En 2010, el Dr. Yount y sus colaboradores informaron que la actividad antiviral de IFITM3 depende de la palmitoilación S en la proteína [10]. La palmitoilación S [23] es una modificación post-translacional de las proteínas por los ácidos grasos saturados C 16 (ácidos palmíticos) covalentemente unidos a ciertos residuos de cisteína a través de un enlace tioéster (Figura 1-B). La modificación es catalizada reversiblemente por las proteínas aciltransferasas y las tioesterasas acilproteínas, y confiere propiedades únicas a la proteína, tales como unión a la membrana y segmentación, inmunoreactividad, alineación de secuencias aminoácidos de IFITM5, IFITM1, IFITM2 e IFITM3 derivadas de ratones. Los residuos conservados se destacan en negro. Las tres cisteinas conservadas se resaltan en rojo y numeradas en base a la secuencia de IFITM5 (top) e IFITM3 (bottom). Los residuos únicos en IFITM5 se resaltan en gris. Los dominios transmembrana primero y segundo, las secuencias extracelulares y el bucle citoplásmico se indican por flechas y se denotan como TM1 y TM2, EC y el bucle CP, respectivamente. Los dominios TM fueron predichos por SOSUI. Los aspartatos en la región C-terminal en IFITM5 se muestran en azul. B) La ilustración esquemática de la proteína S-palmitoilación. El ácido C 16-palmítico se une a la cisteína a través de un enlace tioéster. La palmitoilación y la despalmitoilación son catalizadas por proteínas aciltransferasas y acilproteínas tioesterasas, respectivamente. En este estudio se resume la hidroxilamina, NH 2 OH, para reducir la vinculación tioestérmica. C) La identidad de la secuencia de aminoácidos (similaridad) entre IFITM5, IFITM1, IFITM2 e IFITM3. doi: 10.1371/journal.pone.0075831.g001 y la interacción proteína-proteína. Los autores revelaron que IFITM3 es S-palmitoilado en tres quisteinas proximales de membrana, Cys71 y Cys72 en el primer dominio transmembrana (TM1), y Cys105 en el bucle CP (Figura 1-A) [10]. Además, IFITM3 carece de la palmitoilación S no se agrupa en la membrana celular y disminuye significativamente la actividad antiviral. Además, las cisteinas en IFITM2, Cys70, Cys71 y Cys104 también son palmitoiladas de la misma manera, lo que afecta a la localización intracelular [24]. Un estudio resentido ha revelado que la murina IFITM1 tiene cuatro residuos de cisteína (Cys49, Cys50, Cys83 y Cys103) para la palmitoilación S, que es necesaria para la actividad antiviral y la estabilidad proteica [25]. Los otros miembros de la familia IFITM también poseen estas cisteínas (Figura 1-A), y por lo tanto el papel de la espalmitoilación en las cisteinas debe ser significativo para las funciones de las proteínas IFITM. Aquí, nos centramos en las proteínas de la familia IFITM5, que también se conoce como proteína similar a IFITM (BRIL) [18]. Entre las proteínas de la familia IFITM, IFITM5 es única. (i) Expresión de IFITM5: A diferencia de las otras proteínas de la familia IFITM, la expresión de IFITM5 no es inducida por interferones porque la región anterior al gen ifitm5 carece de los elementos reguladores del interferón [26]. Además, la expresión de IFITM5 se limita principalmente a las células osteoblastadas [18, 19, 27], mientras que las otras proteínas de IFITM se expresan ubicuamente (ii). Además, IFITM5 tiene un dominio rico en aspartato en la región C-terminal, que podría estar involucrado en la unión al calcio (Figura 1 -A) [26]. iii) Papel de IFITM5 en la formación ósea: La expresión de IFITM5 está asociada con la mineralización durante el proceso de formación ósea en células osteoblásticas [18] [19] [20] [20]. Estudios anteriores han confirmado la expresión de IFITM5 en tejidos óseos en ratones, ratas, humanos y tammar wallabies [2]. Los ratones ifitm5-gene knockout tienen huesos más pequeños [19]. Además, el derribo del gen ifitm5 por el ARN de la horquilla pequeña induce una disminución en la formación de nódulos óseos, mientras que la sobreexpresión del gen en células UMR106 ha demostrado iv) Papel del IFITM5 en la actividad inmunitaria: Estudios recientes han revelado que el IFITM5 interactúa con la proteína 11 de unión FK506 (FKBP11) para formar IFITM5-FKBP11-CD81-el complejo regulador negativo del receptor de la prostaglandina F2 (FPRP) [28]. Cuando se forma el complejo, se inducen las expresiones de 5 genes inducidos por interferón, incluyendo el antígeno 2 de células estromales de médula ósea (Bst2), la proteína 1 inducible del interferón (Irgm), la proteína inducida por interferón con tetratricopéptido repite 3 (Ifit3), b(2) microglobulina (B2m) y el gen antígeno de clase I del MHC. En consecuencia, estos resultados indican que el IFITM5 está involucrado no sólo en la formación ósea sino también en la actividad En este estudio se investigó la palmitoilación S de IFITM5 y su papel en la interacción con FKBP11 en células de osteoblasto de ratón. Las células transfectadas por un plásmido DNA que codificaba el ratón IFITM5 fueron cultivadas en presencia de un reportero químico establecido, ácido 17-octadecinoico (17-ODYA) [29, 30], o un inhibidor para la palmitoilación S, ácido 2-bromopalmítico (2BP) [31]. Los ensayos bioquímicos usando estos compuestos revelaron que el tipo salvaje IFITM5 es S-palmitoilado. Para identificar el sitio de Spalmitoilación en IFITM5, se prepararon mutantes substituidos por cisteína, IFITM5-C86A, -C52A/C53A, y -C52A/53A El ensayo de reportero químico sugirió que al menos dos de las tres cisteínas en IFITM5 son S-palmitoiladas. La interacción de IFITM5 con FKBP11 fue examinada por inmunoprecipitación, resultando en la pérdida de la interacción en presencia de 2BP. El mismo resultado se obtuvo en los dos mutantes, C52A/C53A y Cys-less. Estos resultados sugieren que la S-palmitoilación en Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 de IFITM5 es necesaria para la interacción con FKBP11. Por otro lado, Cys86 en el bucle CP de IFITM5 fue S-palmitoilada pero no involucrada en la interacción. Debido a que esta interacción es importante para la expresión génica inmunológicamente relevante, se indicó que el papel de la palmitoilación S es promover la interacción de IFITM5 con FKBP11 y regular la actividad inmunitaria en las células osteoblásticas. Se discutirá el posible mecanismo de interacción y el efecto de la palmitoilación S en la formación de nódulos óseos. Para la expresión celular mamífera, se construyeron vectores de plásmidos de tipo salvaje IFITM5 (IFITM5-WT) y FKBP11 fusionado con FLAG (FKBP11-FLAG) insertando los genes clonados en un vector de expresión neopBApo-CMV (Takara Bio, Shiga, Japón). Los detalles de las construcciones de ADN recombinante fueron los mismos descritos anteriormente [19]. Los genes de los mutantes IFITM5 (IFITM5-C86A, -C52A/53A, y -C52A/C53A/C86A (Cys-less)) se prepararon utilizando un kit QuikChange de mutagenesis dirigido por el sitio (Stratagene, La Jolla, CA). Los vectores plásmidos de los IFITM5-WT fusionados con FLAG, -C52A/53A y Cys-less se construyeron insertando los genes clonados en el vector de expresión neo de pBApo-CMV. Para la expresión celular de E. coli, el vector plásmido de IFITM5-WT se construyó insertando el gen clonado en un vector de expresión pET22b (Novagen, Madison, WI). El primer delantero 5'-GGAATTCATTCATATTACACTTCATATCCCGTG-3' y el primer reverso 5'-CCGCTCGAGTTATAGTCTCATCAAACTTG-3' fueron utilizados para amplificar el gen que codifica todo el IFITM5 del vector plásmido para la expresión celular mamífera descrita anteriormente. Las letras subrayadas denotan un NdeI y un sitio de escote XhoI, respectivamente. Los plásmidos de mutantes IFITM5 fueron preparados usando un kit de mutagenesis dirigido por el sitio QuikChange. El sentido y los imprimadores antisenso utilizados fueron 5'-GGCAGTATGCTCCAAAGCCAAGGCGTACCATCTGGGCTGC-3' y 5'-GCAGCCGAGATGGTGGTGCCTGCTGGTGGTGGGGAGCATACT GCC-3' para IFITM5-C86A; y 5'-GCACGATGTACCTGAATGCGCGGCGCTTGGTGCTG CGC-3' y 5'-GCGCCAGGAATGAGCGCGCCGCGACAGAGCATCG TGC-3' para IFITM5-C52A/C53A, respectivamente (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Las células MC3T3 similares a los osteoblastos fueron provistas por el RIKEN, Cell Bank (RCB 1126). Los procedimientos de cultivo celular, transfección y expresión proteica fueron los mismos reportados anteriormente. Cuando fue necesario, el ácido 2-bromopalmítico (2BP; Wako, Osaka, Japón) y el ácido 17-octadecinoico (17-ODYA; Sigma-Aldrich) fueron disueltos en el 99,5% de sulfóxido dimetilo (DMSO; Wako) y añadidos al medio de diferenciación a concentraciones de 100 μM y 50 μM en menos del 0,1% de DMSO, respectivamente [30, 31]. Las proteínas de tipo salvaje y mutante IFITM5 también fueron producidas utilizando un sistema de expresión recombinante E. coli. Las células E. coli BL21(DE3) transformadas por la expresión plásmido fueron cultivadas a 37°C en medio LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina. Después de cuatro horas de inducción por 1 mM isopropil β-Dtiogalactopiranoside (IPTG), las células fueron recolectadas por centrifugación (6.400 × g durante 10 min a 4°C). Las células fueron suspendidas en 50 mM tampón Tris-HCl (pH 8) y interrumpidas por una prensa francesa (Ohtake, Tokio, Japón) (100 MPa × 4 veces). La fracción de membrana bruta fue recolectada por ultracentrifugación (178.000 × g durante 90 min a 4°C). La fracción recolectada fue solubilizado con 1,5% n-dodecyl-β-Dmaltopiranoside (DDM) (Dojindo Lab, Kumamoto, Japón) en 50 mM Tris-HCl, pH 8, que contenía 0,3 M NaCl y 5 mM imidazol. Después de la ultracentrifugación, el sobrenadante fue incubado con resina de agarosa Ni 2+ -NTA (Qiagen, Hilden, Alemania). La resina fue aplicada a una columna de cromatografía y lavada con 50 mM imidazol que contenía 50 mM Tris-HCl (pH 8), 0,3 M NaCl y 0,1% DDM. El IFITM5 solubilizado con DDM fue recolectado por elución con el mismo tampón que contenía 0,3 M imidazol. Los medios de muestreo fueron reemplazados por la solución tampón apropiada por dos pasajes sobre una columna PD-10 (GE Healthcare UK, Ltd., Amersham Place, Inglaterra). Los detalles experimentales se describen en informes anteriores [19, 28]. Brevemente, se extrajeron proteínas totales de las células osteoblásticas que coexpresaron IFITM5 y FKBP11-FLAG utilizando un kit de extracción total de proteínas (BioChain Institute Inc., Newark, CA). Luego, el lisato celular fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG M2 (Sigma-Aldrich) a 4°C durante 2 h. Para recuperar FKBP11-FLAG, 500 ng/μL 3 × péptido FLAG (Sigma-Aldrich) disuelto en solución salina tris-buffered se añadió al gel recogido a 4°C durante 1 h. Las proteínas recuperadas y el lisato celular que contenía proteínas totales fueron analizados por SDS-PAGE (15% ePAGEL; ATTO, Tokio, Japón) y la mancha occidental El anticuerpo policlonal anti-IFITM5, preparado a partir de la secuencia péptida aminoterminal (TSYPREDPRAPSSRC), y el anticuerpo monoclonal anti-FLAG (Sigma-Aldrich) fueron utilizados como anticuerpos primarios. Los anticuerpos anti-rabbit IgG (H+L) de cabra conjugados con HRP (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) y anti-mouse IgG (H+L) (Sigma-Aldrich) fueron utilizados como anticuerpos secundarios para los anticuerpos primarios anti-IFITM5 y anti-FLAG, respectivamente. Las proteínas fueron detectadas por reacción quimioluminiscente (MercK-Millipore, Billerica, MA). El lisato celular extraído de las células osteoblásticas marcadas metabólicamente por 17-ODYA fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG M2 para obtener proteínas purificadas con FLAG IFITM5. Las proteínas marcadas con 17-ODYA fueron etiquetadas químicamente con azida-PEG 3 -5(6)-carboxitetrametilrhodamina (TAMRA-azida; Click Chemistry Tools, Scottsdale, AZ) con referencia a estudios previos [10, 29, 30, 32] y la guía del fabricante. Las proteínas separadas por SDS-PAGE fueron visualizadas utilizando un láser de 532-nm para excitación y la fluorescencia por TAMRA (565 nm) fue detectada mediante un filtro de largo camino de 575nm (Typhoon FLA 9000; GE Healthcare). Las células de osteoblasto subcultivo MC3T3 fueron sembradas a una densidad de 5.000 células/cm 2 en platos de 40 mm y cultivadas en medio de águila α-modificada (α-MEM; Sigma-Aldrich) conteniendo 10% (v/v) de suero fetal bovino (FBS; Nichirei Biosciences Inc., Tokio, Japón). Al día siguiente, esto fue reemplazado por medio de diferenciación, conteniendo 2 mM de glicerofosfato y 50 μg/ml de ascorbato sódico en concentraciones finales, para inducir la diferenciación osteoblasto. Cuando fue necesario, 100 μM 2BP en menos de 0,1% DMSO, o 0,1% DMSO solo se añadió al medio de diferenciación en concentraciones finales. Todos los cultivos fueron incubados a 37°C en una atmósfera humidificada que contenía 5% CO 2 durante Los nódulos mineralizados fueron manchados con Alizarin Red S (Sigma-Aldrich). Se utilizó el procedimiento estándar de tinción. Los nódulos mineralizados fueron revisados cada tres días. Para identificar la palmitoilación S en IFITM5, las células osteoblásticas que albergaban el ADN plásmido que codificaba IFITM5-WT fueron cultivadas en ausencia y presencia de 2BP, lo que inhibe la palmitoilación S (Figura 2-A) [31]. A continuación, se extrajo el lisato celular que contenía proteína total para su uso en los análisis de manchas SDS-PAGE y occidentales. A efectos de comparación, las células E. coli también fueron cultivadas en ausencia de 2BP y se extrajo el lisato celular. La Figura 2 -B muestra los resultados del ensayo de manchas occidentales para IFITM5-WT expresado en el osteo En las células de osteoblasto, IFITM5-WT exhibió una sola banda cerca del marcador de masa molecular de 17,4 kDa (ver carril 1) en ausencia de 2BP. Sin embargo, en presencia de 2BP (ver carril 4), la banda apareció en una posición más baja que en ausencia de 2BP (lane 1). Estos resultados sugieren que IFITM5-WT tiene formas de masa molecular alta y baja en ausencia y presencia de 2BP, respectivamente. La palmitoilación S es una reacción reversible, y por lo tanto es despalmitoilada por un reductor fuerte como la hidroxilamina [10]. Tras el tratamiento de hidroxilamina (ver carril 2), la banda apareció en la misma posición que en presencia de 2BP (lane 4). En las células prokaryote E. coli, la modificación post-translacional S-Palmitoylation en IFITM5 PLOS ONE www.plosone.org no se produce. Por lo tanto, la banda también se observó en la misma posición inferior (ver carril 3). En el caso de IFITM3, también se informó que la palmitoylation induce un cambio en la movilidad en la electroforesis, al igual que en nuestros resultados actuales [10]. Para la observación directa de la S-palmitoylation, se utilizó un reportero químico establecido, 17-ODYA (Figura 2-C). Las células osteoblastadas que albergan la codificación plasmídica IFITM5-WT fueron cultivadas en presencia de 17-ODYA para etiquetar la proteína metabólicamente. Después de la extracción y purificación del lisato celular, el IFITM5-WT etiquetado fue ligado con TAMRA-azida de acuerdo con el método de cicloadición de azidealkyne [3+2] catalizado Cu(I) [3+2] [10, 29, 30, 32 ]. Una imagen de fluorescencia en gel del IFITM5-WT marcado 17-ODYA-TAMRA (véase el carril 2 en la Figura 2 -D) mostró que IFITM5 estaba espalmitoilado en las células osteoblastadas. La etiqueta FLAG adjunta a IFITM5 no tiene influencia en la modificación y etiquetado químico (vías 1 y 5). Además, después del tratamiento con hidroxilamina (ver carril 6), la fluorescencia se debilitó debido a la disociación de 17-ODYA de IFITM5, que fue el mismo mecanismo que la disociación del ácido palmítico de IFITM5 por reducción como se describe anteriormente (lane 2 de la Figura 2-B). Por lo tanto, concluimos que el IFITM5 expresado en las células de osteoblasto nativas es S-palmitoilado. Además, las bandas correspondientes a las formas de masa molecular alta y baja mostradas en el análisis de manchas occidentales fueron asignadas tentativamente a las formas S-palmitoiladas y depalmitoiladas, respectivamente. Como se describe anteriormente en la Introducción, los residuos de cisteína son el sustrato para la palmitoilación S. IFITM5 posee tres cisteínas, Cys52 y Cys53 en el dominio TM1, y Cys86 en el bucle CP (Figura 1-A). Todas estas cisteínas están altamente conservadas entre las proteínas de la familia IFITM de mamíferos (Figura 3-A). Para identificar el sitio de modificación en IFITM5, preparamos mutantes substituidos por cisteína, IFITM5-C52A/C53A, -C86A, y -C52A/C53A/C86A (Cys-less). Las células osteoblastadas que albergaban cada plasmido fueron cultivadas en ausencia de 2BP, y luego se extrajo el lisato celular. La Figura 3-B muestra los resultados de la mancha occidental detectando la expresión de todos los mutantes en las células osteoblastadas. En los mutantes C52A/C53A y Cys-less (ver carriles 2 y 4), se detectó la forma de baja masa molecular. Este resultado indica que Cys52 o Cys53 están involucrados en la palmitoilación S. Además, como se muestra en la Figura 2 -D, se detectaron fluorescencia fuerte y débil en el mutante C52A/C53A en ausencia y presencia de hidroxilamina (lanes 3 y 7), respectivamente, pero no en el mutante Cys-less (lanes 4 y 8). Estos resultados sugieren que el resto de la cisteína en el mutante C52A/C53A, Cys86, es S-palmitoilado y el mutante Cyss-less perdió por completo la palmitoilación S porque todas las cisteinas fueron sustituidas. Por lo tanto, concluimos que Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados. Además, se encontró que la S-palmitoilación en el dominio TM1 tiene un efecto importante en la movilidad en el gel (panel inferior de la Figura 2 -D y Figura 3-B). Por lo tanto, en adelante nos referimos a las formas de masa molecular alta y baja como las formas TM1palmitoiladas y TM1-depalmitoiladas, respectivamente. Finalmente, reasignamos las bandas mostradas en el análisis de Western blot como sigue: IFITM5-WT está totalmente palmitoilado, el mutante C86A está parcialmente palmitoilado en Cys52 y/o Cys53, el mutante C52A/C53A está parcialmente palmitoilado en Cys86, y el mutante sin Cys está completamente depalmitoilado. Estudios previos han revelado que IFITM5 interactúa con FKBP11 [19]. FKBP11 pertenece a la familia de proteínas de unión FK506 y tiene un dominio transmembrana. La interacción entre IFITM5 y FKBP11 es importante para la actividad inmunitaria debido a que la formación del complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP induce la expresión de genes inducidos por interferón, a saber, el Bst2, Irgm, Ifit3, B2m y el gen antígeno clase I de MHC [28]. Para investigar el efecto de la palmitoilación S en la interacción de IFITM5 con FKBP11, se realizó un ensayo de inmunoprecipitación. Las células osteoblásticas cotransfectadas por los plásmidos que codifican IFITM5-WT y FKBP11-FLAG fueron cultivadas en ausencia y presencia de 2BP. Luego, el análisis celular extraído fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG. El gel fue lavado varias veces. Finalmente, las proteínas fueron eludidas competitivamente por la adición de péptido FLAG. Si IFITM5 interactuaba con FKBP11, se esperaba que IFITM5 Las cisteínas conservadas fueran resaltadas en naranja y numeradas. En el panel inferior, los números dados entre paréntesis corresponden al número residual para IFITM2. Para el cálculo de probabilidad, un total de 23 secuencias IFITM2, 23 IFITM3 y 17 IFITM5 derivadas de especies mamíferas en la base de datos Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomas (KEGG) fueron utilizadas. La alineación de secuencias se llevó a cabo utilizando CLUSTALW. Los logotipos de secuencia se generaron utilizando WEBLOGO 3. B) Botón occidental para los mutantes de tipo salvaje y substituidos por cisteína de IFITM5 expresados en células osteoblastadas La flecha superior indica que los mutantes C52 y/o C53 en el dominio TM1 son Spalmitoylated (lanes 1 y 3). El C52A/C53A (lane 2) y Cys-less (lane 4) son parcial y completamente depalmitoylated. El experimento se llevó a cabo 2 veces. doi: 10.1371/journal.pone.0075831.g003 se obtendría durante este paso y se detectaría por inmunobloqueo. Figura 4 -A muestra los resultados de la mancha occidental para la co-inmunoprecipitación de IFITM5-WT con FKBP-FLAG. La banda correspondiente a FKBP11 apareció en todos los carriles (panel superior). Las lanes 1 y 2 son controles para asegurar que IFITM5 y FKBP11 estén contenidas en el lisato celular Los controles también aseguraron que el IFITM5 fuera palmitoilado S en ausencia de 2BP (ver carril 1), mientras que el IFITM5 no fue palmitoilado S en presencia de 2BP (ver carril 2). Después de la inmunoprecipitación, una sola banda correspondiente al IFITM5 palmitoilado S apareció en ausencia de 2BP (ver carril 3), indicando la interacción del IFITM5 espalmitoilado con el FKBP11. Sin embargo, en presencia de 2BP, no apareció ninguna banda correspondiente al IFITM5 (ver carril 4), indicando que las dos moléculas no interactúan entre sí. Estos resultados sugieren que la palmitoilación S sobre el IFITM5 contribuye a la interacción con el FKBP11. A continuación, investigamos la relación entre la Spalmitoylation y la interacción con FKBP11 utilizando los mutantes IFITM5 descritos anteriormente. Las células osteoblastadas cotransfectadas por los plásmidos que codifican los mutantes IFITM5 (C52A/ C53A, C86A y Cys-less) y FKBP11-FLAG fueron cultivadas. El ensayo de inmunoprecipitación se llevó a cabo de la misma manera que se describió anteriormente. La Figura 4 -B muestra los resultados de la mancha occidental para la co-inmunoprecipitación de los mutantes de tipo salvaje y el IFITM5 con FKBP11. La Figura 4 -C muestra los resultados del experimento de control utilizando el lisato celular antes de la inmunoprecipitación. Como se describe en la sección anterior 3-3, la banda correspondiente a FKBP11 apareció en todos los carriles (paneles superiores) porque la inmunoprecipitación se realizó utilizando el gel de agarosa anti-FLAG. En el panel inferior de la Figura 4 -B, se observaron bandas individuales para el mutante IFITM5-WT y -C86A (lanes 1 y 3) pero no para los mutantes -C52A/C53A y Cys-less (lanes 2 y 4). Este resultado indica que el tipo salvaje y el mutante C86A interactúan con FKBP11, mientras que los otros dos mutantes no lo hacen. Curiosamente, esta tendencia refleja la tendencia de los perfiles de palmitoilación S, lo que significa que Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 de los mutantes IFITM5-WT y -C86A es S-palmitoilado, mientras que estos residuos no son S-palmitoilados en los mutantes C52A/C53A y Cysless (ver Figuras 2-D, 3-B y el panel inferior de la Figura 4-C). Debido a que la palmitoilación S contribuye a la interacción IFITM5-FKBP11, como se describe en la sección anterior 3-3 (también en la Figura 4-A), los resultados de la Figura 4-B sugieren que los mutantes que perdieron el sitio(s) de palmitoilación S, Cys52 y/o Cys53, no son capaces de interactuar con FKB En otras palabras, la palmitoilación S en estas cisteínas es necesaria para la interacción de IFITM5 con FKBP11. Como se ha descrito anteriormente en la Introducción, estudios previos han revelado que IFITM5 también contribuye a la formación ósea [18] [19] [20]. Por lo tanto, se investigó la influencia de Spalmitoilación en la formación de nódulos óseos en células osteoblastadas, en las que se expresa IFITM5 nativas. La Figura 5 muestra la formación de nódulos dependientes del tiempo en ausencia y la presencia de 2BP (Figuras 5-A y -B). La Figura 5 -C muestra los resultados del ensayo de control para verificar el efecto de DMSO, que se utilizó como disolvente para 2BP, en la formación de nódulos. El nódulo mineralizado fue manchado con Alizarin Red, que reacciona con calcio depositado. En la Figura 5 -D, el área del nódulo mineralizado fue trazada contra el tiempo experimental. En ausencia de 2BP (Figura 5-A, -C, y -D), la mineralización se inició 15 días después del inicio de la diferenciación celular (Día 0). Por otro lado, en presencia de 2BP (Figura 5-B y -D) se formó el nódulo el Día 12. El tiempo medio para la mineralización máxima en presencia de 2BP se estimó 7 días antes que en ausencia de 2BP (Figura 5-D). Además, se observaron diferencias en la forma de los nódulos mineralizados. La Figura 5 -E muestra una visión ampliada de cada nódulo en el Día 21. Los nódulos manchados se difundieron en presencia de 2BP (panel b), mientras que en ausencia de 2BP los nódulos formaron un gran cúmulo (panels a y c). Por lo tanto, nuestras observaciones en este estudio sugieren que la S-palmitoilación afecta la formación de nódulos óseos en las células osteoblásticas. En este estudio, se confirmó la S-palmitoilación sobre IFITM5 en las células osteoblásticas, que fue la misma que la reportada previamente para IFITM3 e IFITM2. Como se informó anteriormente, en IFITM3 e IFITM2, que comparten similitud de secuencia del 85% (Figura 1-C), dos cisteínas en el dominio TM1 (Cys71 y Cys72 para IFITM3, Cys70 y Cys71 para IFITM2) y una cisteína en el bucle CP (Cys105 para IFITM3, Cys104 para IFITM2) son todas S-palmitoiladas en células [10, 24]. Por otro lado, aunque IFITM5 comparte similitud de secuencia del 68% y 66% a IFITM3 e IFITM2, respectivamente, más de una cisteína en el dominio TM1 (Cys52 o Cys53) y una cisteína en el bucle CP (Cys86) son S-palmitoiladas. Teniendo en cuenta la alta conservación de tres cisteínas en las proteínas IFITM (Figuras 1-A y 3-A), todas las cisteínas en IFITM5 pueden estar involucradas en la palmitoilación S al igual que en el caso de IFITM3 e IFITM2 [10, 24]. Los roles de la palmitoilación S en IFITM3 se han estudiado intensamente, y la palmitoilación S ha demostrado ser crucial para el correcto posicionamiento en la membrana y la resistencia a la infección viral y la internalización [10] (los papeles se resumen en la Figura 6-A y se discuten en detalle más adelante). Un estudio reciente ha revelado que la palmitoilación S en IFITM2 también es importante para la agrupación de proteínas en la membrana [24]. Sin embargo, no conocemos el papel de la Spalmitoylation de IFITM5 para el agrupamiento en la membrana en la actualidad porque todavía no hemos logrado obtener un anticuerpo adecuado para la inmunohistoquímica, a pesar de que dedicamos mucho tiempo a la búsqueda y considerando un número considerable de anticuerpos. El Dr. Hanagata y sus colaboradores reportaron previamente que IFITM5 carecían del dominio TM1 y del bucle CP, que y IFITM5 (paneles inferiores), los anticuerpos anti-FLAG y anti-IFITM5 fueron utilizados como anticuerpos primarios, respectivamente. Las flechas indican la existencia de cada proteína y la S-palmitoylation en IFITM5. A) La mancha occidental para la coinmunoprecipitación del tipo salvaje IFITM5 con el FKBP11 (FKBP11-FLAG) fusionado con FLAG en las células osteoblásticas en ausencia y presencia de 2BP (denominadas "-" y "+", respectivamente). Las vías 1 y 2 son los resultados de los ensayos de control utilizados para verificar la existencia de IFITM5 y FKBP11 antes de la inmunoprecipitación, y las vías 3 y 4 muestran los resultados después de la inmunoprecipitación. El experimento se repitió 3 veces. B) La mancha occidental para la coinmunoprecipitación del tipo salvaje y los mutantes substituidos por cisteína de IFITM5 con FKBP11-FLAG en las células osteoblásticas. La banda correspondiente al péptido FLAG no se muestra debido a la menor masa molecular del péptido FLAG en relación con FKBP11-FLAG. C) El experimento de control de la Figura 4 -B utilizado para verificar que IFITM5 y FKBP11 estaban presentes en el lisato celular antes de la inmunoprecipitación. El experimento se repitió 2 veces. A) El mecanismo funcional de IFITM3 se resume en estudios anteriores. i) IFITM3 es S-palmitoilado en Cys71, Cys72 y Cys105, ii) que induce el agrupamiento y el posicionamiento correcto en la membrana, iii) resultando en la actividad antiviral contra el virus de la gripe. B) El mecanismo funcional de IFITM5 se resume combinando los resultados del presente y los estudios anteriores. (i) Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados (ii). La S-palmitoilación permite que IFITM5 interactúe con FKBP11 en las células osteoblásticas (iii). La disociación del CD9 del complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 es inducida por la formación del complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP y conduce a la expresión genética inmunológicamente relevante. IFITM5 también contribuye a la formación ósea, pero se desconoce cuáles son los estados descritos en i)-iii) son importantes para la formación ósea en la actualidad. Por otro lado, la IFITM5 interactúa con la proteína asociada, FKBP11, y la S-palmitoylation claramente hace una contribución significativa a la interacción. Por lo tanto, IFITM5 forma un hetero-oligomero en la membrana celular para su función fisiológica. contiene los sitios de modificación relevantes, perdió la capacidad de interactuar con FKBP11 [19]. En el presente estudio, determinamos que la S-palmitoylation en Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 es necesaria para la interacción. De estos resultados, especulamos que Cys52 y Cys53 se enfrentan a la superficie de interacción con FKBP11, y por lo tanto IFITM5 y FKBP11 interactúan entre sí a través del ácido palmítico unido a la cisteína (resumidos en la Figura 6 -B, discutidos más Nuestra investigación reveló que Cys86 está involucrado en la Spalmitoylation pero no contribuye a la interacción con FKBP11. Especulamos que otros residuos en el bucle CP ubicados cerca del dominio TM1 hacen alguna contribución a la interacción. Investigaciones previas también revelaron que IFITM5 expresado en las células fibroblasto heterologosas NIH3T3 exhibieron interacciones directas con CD81, la proteína 31 asociada al receptor de células B (BCAP31) y el hidroxiesteroide (17-beta) deshidrogenasa 7 (HSD17b7). Estas tres proteínas se unen al IFITM5 sin la S-palmitoylation (forma de masa molecular baja; ver Figura 3-b en ref [19]. y Figura 1-B en ref [28]. En las células fibroblastosas, la S-palmitoylation en IFI Estas interacciones no se observan en las células nativas del osteoblasto y, por lo tanto, son inespecíficas. Teniendo en cuenta estos hechos, se especula que la palmitoilación S sobre las células del IFITM5 promueve la interacción específica con FKBP11 en las células del osteoblasto. El papel que desempeña la palmitoilación S de las células del IFITM5 en la actividad inmune de las células del osteoblasto se discutirá combinando los resultados del presente y de los estudios anteriores. Debe ser necesaria una interacción específica entre IFITM5 y FKBP11 para formar el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP. CD81, también conocido como TAPA-1, es un miembro de la familia de proteínas de membrana de tetraspanina y un componente del núcleo de células B que media la señalización de células B para respuestas inmunes. Al formar este complejo, CD9, una proteína asociada con CD81, disociada del complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 y consecuentemente induce la expresión osteoblastada específica de los genes inducidos por interferón, Bst2, Irgm, Ifit3, B2m y el gen antígeno clase I de la MHC [28]. Si se perdiera la interacción específica mediada por Spalmitoylation de IFITM5 con FKBP11, no se formaría el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP y, por consiguiente, se inhibiría la expresión génica inducida por interferón, ya que el CD9 seguiría asociado con el complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9. En este sentido, especulamos que el IFITM5 está involucrado en la actividad del sistema inmunitario en las células osteoblastadas y la interacción del IFITM5 palmitoilado S con el FKBP11 regula la actividad inmune. Además, se sugirió que la S-palmitoilación en el IFITM5 contribuye a la formación de nódulos óseos, incluyendo la morfología y el tiempo de mineralización, en las células osteoblastadas (Figura 5). Es difícil concluir en la actualidad que la falta de la S-palmitoilación en el IFITM5 causa la difusión de los nódulos óseos (panel b de la Figura 5 -E); sin embargo, podemos decir que el IFITM5 probablemente no será S-palmitoilado en las células en presencia de 2BP. Mientras que el 2BP se utiliza comúnmente como inhibidor de la palmitoilación, también se dirige a muchas enzimas Por lo tanto, también es difícil interpretar los resultados de la incubación a largo plazo de las células osteoblásticas en presencia de 2BP. En cualquier caso, estas son observaciones interesantes y clave en términos de aclarar el papel desempeñado por la S-palmitoilación de IFITM5 en la formación ósea, y se requieren estudios adicionales. La Figura 6 describe un posible mecanismo de la interacción de IFITM5 con FKBP11 y el papel de IFITM5 en la función celular osteoblástica mediante una comparación con IFITM3. En el caso de IFITM3, como se muestra en la Figura 6 -A, se observan los siguientes. i) Las tres cisteinas son todas S-palmitoiladas (ii). La S-palmitoilación conduce a la agrupación y el posicionamiento correcto de moléculas IFITM3 en la membrana (iii). La espalmitoilación y la siguiente agrupación son cruciales para la resistencia al virus de la gripe. Cuando IFITM3 carece de la espalmitoilación, las moléculas de IFITM3 no se agrupan, lo que conduce a la disminución significativa de la actividad antiviral. Por otro lado, la Figura 6 -B muestra que las siguientes observaciones se hacen en el caso de IFITM5. i) Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados (ii). El S-palmitoilado IFITM5 es capaz de interactuar específicamente con FKBP11. Se supone que la interacción está mediada por el ácido palmítico unido a la cisteína frente a la superficie de interacción en FKBP11. Cys86 está involucrado en la palmitoilación S, pero no en la interacción de IFITM5 con FKBP11. En la actualidad, sin embargo, poco se sabe sobre el papel de la palmitoilación S de IFITM5 para la localización en la membrana. Cuando la palmitoilación S afecta la localización de IFITM5 como en el caso de IFITM3 [10], las moléculas S-palmitoiladas IFITM5 deben ser localizadas en la membrana o las moléculas depalmitoiladas deben ser deslocalizadas. La pérdida de la interacción entre IFITM5 y FKBP11 podría deberse a una relocalización de la depalmitoilada IFITM5 que impide su asociación con FKBP11 (iii). El Spalmitoilado IFITM5 interactúa con el complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 a través del FKBP11, que induce la disociación del CD9 del complejo y la expresión de 5 genes inmunológicamente relevantes. Finalmente, el IFITM5 forma el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP. Se desconoce en la actualidad cuál de los tres estados (i)~(iii) ilustrados en la Figura 6-B es importante para la mineralización ósea de las células osteoblásticas. La falta de la S-palmitoilación influye en la interacción con el FKBP11, que podría explicar la siguiente formación compleja y expresión génica. Además, la formación de nódulos óseos también se ve afectada. Se indica que la S-palmitoilación en IFITM5 juega un papel no sólo en la regulación de la actividad inmune sino también en la formación ósea. En conclusión, hemos revelado la S-palmitoilación en IFITM5 y su papel en la interacción con FKBP11. No sólo la actividad inmune sino también la mineralización ósea en las células osteoblásticas se ve afectada por la S-palmitoilación. En general, el papel funcional de la S-palmitoilación es diferente para cada proteína [36]. Para muchas proteínas, el ciclo de palmitoilación y despalmitoilación es constitutivo y regulado por enzimas. Basado en los resultados actuales, es difícil abordar (i) si la S-palmitoilación en IFITM5 es constitutiva o regulada, o (ii) cuando y donde IFITM5 es S-palmitoilada en las células osteoblásticas. Se necesitan más estudios y actualmente se están realizando.

¿Qué interacción es inhibida por la presencia de ácido 2-bromopalmítico (2BP)?

El papel de la S-Palmitoylation en IFITM5 para la interacción con FKBP11 en células de Osteoblastohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3776769/Tsukamoto, Takashi; Li, Xianglan; Morita, Hiromi; Minowa, Takashi; Aizawa, Tomoyasu; Hanagata, Nobutaka; Demura, Makoto2013-09-18DOI:10.1371/journal.pone.0075831Licencia:cc-byAbstract: Recientemente, una de las proteínas familiares de la transmembrana inducida por interferón, IFITM3, se ha convertido en un objetivo importante para la actividad contra la infección por el virus de la gripe A (H1N1). En esta proteína, una modificación post-translacional por ácidos grasos covalentemente unidos a la cisteína, llamada S-palmitoilación, juega un papel crucial para la actividad antiviral. IFITM3 posee tres residuos de cisteína para la S-palmitoilación en el primer dominio de la transmembrana (TM1) y en el bucle citoplasmático (CP). Debido a que estas cisteínas están bien conservadas en las proteínas de la familia de mamíferos IFITM, la S-palmitoilación en estas cisteínas es significativa para sus funciones. IFITM5 es otra proteína de la familia IFITM e interactúa con la proteína de unión FK506 (FKBP11) para formar un complejo de mayor orden en células osteoblastales, que induce la expresión de genes inmunológicamente relevantes. En este estudio, investigamos el papel que desempeña la palmitoilación S de IFITM5 en su interacción con FKBP11 en las células, ya que esta interacción es un proceso clave para la expresión génica. Nuestras investigaciones con un reportero establecido, ácido 17-octadecinoico (17-ODYA), y un inhibidor para la palmitoilación S, ácido 2-bromopalmítico (2BP), revelaron que IFITM5 fue palmitoilado S además de IFITM3. Específicamente, encontramos que los residuos de cisteína en el dominio TM1 y en el bucle CP fueron palmitoilados S en IFITM5. Luego, revelamos por inmunoprecipitación y análisis de manchas occidentales que la interacción de IFITM5 con FKBP11 fue inhibida en presencia de 2BP. El mutante que carecía del sitio S-palmitoylation en el dominio TM1 perdió la interacción con FKBP11. Estos resultados indican que la S-palmitoylation en IFITM5 promueve la interacción con FKBP11. Finalmente, investigamos la formación de nódulos óseos en células osteoblastadas en presencia de 2BP, ya que IFITM5 fue identificado originalmente como factor de formación ósea. El experimento resultó en una aberración morfológica del nódulo óseo, lo que también indicó que la S-palmitoylation contribuye a la formación ósea. Texto: La familia de proteínas transmembranas inducidas por interferón (IFITM) (también conocida como la familia Fragilis en ratones) es parte de la familia de las dispaninas [1] y está compuesta por α-hélices de doble transmembrana conectados por un bucle citoplasmático (CP) y secuencias de polipéptidos amino- y carboxil-terminales (Figura 1-A) extracelulares (EC). Las proteínas IFITM se conservan evolutivamente en vertebrados [2]. Investigaciones genómicas recientes han revelado que hay 5 miembros IFITM en humanos (IFITM1, 2, 3, 5 y 10) y 7 miembros en ratones (IFITM1, 2, 3, 5, 6, 7, y 10). Estas proteínas desempeñan papeles en diversos procesos biológicos, como la maduración de células germinativas durante la gastrulación (IFITTM1-3) [3] [5] [5], la adhesión de células a células (IFITTM1) [6] [7] [8], la actividad antiviral (IFITTM1-3) [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17], y la formación ósea (IFITTM5] [18] [19] [20] [21] [22], aunque actualmente se desconocen las funciones detalladas de IFITM6, 7 y 10; en particular, IFITM3 ha sido objeto de estudios intensivos sobre su actividad contra la infección e internalización del virus de la gripe A (H1N1) [9] [10] [11] [12] [13] [14]. En 2010, el Dr. Yount y sus colaboradores informaron que la actividad antiviral de IFITM3 depende de la palmitoilación S en la proteína [10]. La palmitoilación S [23] es una modificación post-translacional de las proteínas por los ácidos grasos saturados C 16 (ácidos palmíticos) covalentemente unidos a ciertos residuos de cisteína a través de un enlace tioéster (Figura 1-B). La modificación es catalizada reversiblemente por las proteínas aciltransferasas y las tioesterasas acilproteínas, y confiere propiedades únicas a la proteína, tales como unión a la membrana y segmentación, inmunoreactividad, alineación de secuencias aminoácidos de IFITM5, IFITM1, IFITM2 e IFITM3 derivadas de ratones. Los residuos conservados se destacan en negro. Las tres cisteinas conservadas se resaltan en rojo y numeradas en base a la secuencia de IFITM5 (top) e IFITM3 (bottom). Los residuos únicos en IFITM5 se resaltan en gris. Los dominios transmembrana primero y segundo, las secuencias extracelulares y el bucle citoplásmico se indican por flechas y se denotan como TM1 y TM2, EC y el bucle CP, respectivamente. Los dominios TM fueron predichos por SOSUI. Los aspartatos en la región C-terminal en IFITM5 se muestran en azul. B) La ilustración esquemática de la proteína S-palmitoilación. El ácido C 16-palmítico se une a la cisteína a través de un enlace tioéster. La palmitoilación y la despalmitoilación son catalizadas por proteínas aciltransferasas y acilproteínas tioesterasas, respectivamente. En este estudio se resume la hidroxilamina, NH 2 OH, para reducir la vinculación tioestérmica. C) La identidad de la secuencia de aminoácidos (similaridad) entre IFITM5, IFITM1, IFITM2 e IFITM3. doi: 10.1371/journal.pone.0075831.g001 y la interacción proteína-proteína. Los autores revelaron que IFITM3 es S-palmitoilado en tres quisteinas proximales de membrana, Cys71 y Cys72 en el primer dominio transmembrana (TM1), y Cys105 en el bucle CP (Figura 1-A) [10]. Además, IFITM3 carece de la palmitoilación S no se agrupa en la membrana celular y disminuye significativamente la actividad antiviral. Además, las cisteinas en IFITM2, Cys70, Cys71 y Cys104 también son palmitoiladas de la misma manera, lo que afecta a la localización intracelular [24]. Un estudio resentido ha revelado que la murina IFITM1 tiene cuatro residuos de cisteína (Cys49, Cys50, Cys83 y Cys103) para la palmitoilación S, que es necesaria para la actividad antiviral y la estabilidad proteica [25]. Los otros miembros de la familia IFITM también poseen estas cisteínas (Figura 1-A), y por lo tanto el papel de la espalmitoilación en las cisteinas debe ser significativo para las funciones de las proteínas IFITM. Aquí, nos centramos en las proteínas de la familia IFITM5, que también se conoce como proteína similar a IFITM (BRIL) [18]. Entre las proteínas de la familia IFITM, IFITM5 es única. (i) Expresión de IFITM5: A diferencia de las otras proteínas de la familia IFITM, la expresión de IFITM5 no es inducida por interferones porque la región anterior al gen ifitm5 carece de los elementos reguladores del interferón [26]. Además, la expresión de IFITM5 se limita principalmente a las células osteoblastadas [18, 19, 27], mientras que las otras proteínas de IFITM se expresan ubicuamente (ii). Además, IFITM5 tiene un dominio rico en aspartato en la región C-terminal, que podría estar involucrado en la unión al calcio (Figura 1 -A) [26]. iii) Papel de IFITM5 en la formación ósea: La expresión de IFITM5 está asociada con la mineralización durante el proceso de formación ósea en células osteoblásticas [18] [19] [20] [20]. Estudios anteriores han confirmado la expresión de IFITM5 en tejidos óseos en ratones, ratas, humanos y tammar wallabies [2]. Los ratones ifitm5-gene knockout tienen huesos más pequeños [19]. Además, el derribo del gen ifitm5 por el ARN de la horquilla pequeña induce una disminución en la formación de nódulos óseos, mientras que la sobreexpresión del gen en células UMR106 ha demostrado iv) Papel del IFITM5 en la actividad inmunitaria: Estudios recientes han revelado que el IFITM5 interactúa con la proteína 11 de unión FK506 (FKBP11) para formar IFITM5-FKBP11-CD81-el complejo regulador negativo del receptor de la prostaglandina F2 (FPRP) [28]. Cuando se forma el complejo, se inducen las expresiones de 5 genes inducidos por interferón, incluyendo el antígeno 2 de células estromales de médula ósea (Bst2), la proteína 1 inducible del interferón (Irgm), la proteína inducida por interferón con tetratricopéptido repite 3 (Ifit3), b(2) microglobulina (B2m) y el gen antígeno de clase I del MHC. En consecuencia, estos resultados indican que el IFITM5 está involucrado no sólo en la formación ósea sino también en la actividad En este estudio se investigó la palmitoilación S de IFITM5 y su papel en la interacción con FKBP11 en células de osteoblasto de ratón. Las células transfectadas por un plásmido DNA que codificaba el ratón IFITM5 fueron cultivadas en presencia de un reportero químico establecido, ácido 17-octadecinoico (17-ODYA) [29, 30], o un inhibidor para la palmitoilación S, ácido 2-bromopalmítico (2BP) [31]. Los ensayos bioquímicos usando estos compuestos revelaron que el tipo salvaje IFITM5 es S-palmitoilado. Para identificar el sitio de Spalmitoilación en IFITM5, se prepararon mutantes substituidos por cisteína, IFITM5-C86A, -C52A/C53A, y -C52A/53A El ensayo de reportero químico sugirió que al menos dos de las tres cisteínas en IFITM5 son S-palmitoiladas. La interacción de IFITM5 con FKBP11 fue examinada por inmunoprecipitación, resultando en la pérdida de la interacción en presencia de 2BP. El mismo resultado se obtuvo en los dos mutantes, C52A/C53A y Cys-less. Estos resultados sugieren que la S-palmitoilación en Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 de IFITM5 es necesaria para la interacción con FKBP11. Por otro lado, Cys86 en el bucle CP de IFITM5 fue S-palmitoilada pero no involucrada en la interacción. Debido a que esta interacción es importante para la expresión génica inmunológicamente relevante, se indicó que el papel de la palmitoilación S es promover la interacción de IFITM5 con FKBP11 y regular la actividad inmunitaria en las células osteoblásticas. Se discutirá el posible mecanismo de interacción y el efecto de la palmitoilación S en la formación de nódulos óseos. Para la expresión celular mamífera, se construyeron vectores de plásmidos de tipo salvaje IFITM5 (IFITM5-WT) y FKBP11 fusionado con FLAG (FKBP11-FLAG) insertando los genes clonados en un vector de expresión neopBApo-CMV (Takara Bio, Shiga, Japón). Los detalles de las construcciones de ADN recombinante fueron los mismos descritos anteriormente [19]. Los genes de los mutantes IFITM5 (IFITM5-C86A, -C52A/53A, y -C52A/C53A/C86A (Cys-less)) se prepararon utilizando un kit QuikChange de mutagenesis dirigido por el sitio (Stratagene, La Jolla, CA). Los vectores plásmidos de los IFITM5-WT fusionados con FLAG, -C52A/53A y Cys-less se construyeron insertando los genes clonados en el vector de expresión neo de pBApo-CMV. Para la expresión celular de E. coli, el vector plásmido de IFITM5-WT se construyó insertando el gen clonado en un vector de expresión pET22b (Novagen, Madison, WI). El primer delantero 5'-GGAATTCATTCATATTACACTTCATATCCCGTG-3' y el primer reverso 5'-CCGCTCGAGTTATAGTCTCATCAAACTTG-3' fueron utilizados para amplificar el gen que codifica todo el IFITM5 del vector plásmido para la expresión celular mamífera descrita anteriormente. Las letras subrayadas denotan un NdeI y un sitio de escote XhoI, respectivamente. Los plásmidos de mutantes IFITM5 fueron preparados usando un kit de mutagenesis dirigido por el sitio QuikChange. El sentido y los imprimadores antisenso utilizados fueron 5'-GGCAGTATGCTCCAAAGCCAAGGCGTACCATCTGGGCTGC-3' y 5'-GCAGCCGAGATGGTGGTGCCTGCTGGTGGTGGGGAGCATACT GCC-3' para IFITM5-C86A; y 5'-GCACGATGTACCTGAATGCGCGGCGCTTGGTGCTG CGC-3' y 5'-GCGCCAGGAATGAGCGCGCCGCGACAGAGCATCG TGC-3' para IFITM5-C52A/C53A, respectivamente (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Las células MC3T3 similares a los osteoblastos fueron provistas por el RIKEN, Cell Bank (RCB 1126). Los procedimientos de cultivo celular, transfección y expresión proteica fueron los mismos reportados anteriormente. Cuando fue necesario, el ácido 2-bromopalmítico (2BP; Wako, Osaka, Japón) y el ácido 17-octadecinoico (17-ODYA; Sigma-Aldrich) fueron disueltos en el 99,5% de sulfóxido dimetilo (DMSO; Wako) y añadidos al medio de diferenciación a concentraciones de 100 μM y 50 μM en menos del 0,1% de DMSO, respectivamente [30, 31]. Las proteínas de tipo salvaje y mutante IFITM5 también fueron producidas utilizando un sistema de expresión recombinante E. coli. Las células E. coli BL21(DE3) transformadas por la expresión plásmido fueron cultivadas a 37°C en medio LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina. Después de cuatro horas de inducción por 1 mM isopropil β-Dtiogalactopiranoside (IPTG), las células fueron recolectadas por centrifugación (6.400 × g durante 10 min a 4°C). Las células fueron suspendidas en 50 mM tampón Tris-HCl (pH 8) y interrumpidas por una prensa francesa (Ohtake, Tokio, Japón) (100 MPa × 4 veces). La fracción de membrana bruta fue recolectada por ultracentrifugación (178.000 × g durante 90 min a 4°C). La fracción recolectada fue solubilizado con 1,5% n-dodecyl-β-Dmaltopiranoside (DDM) (Dojindo Lab, Kumamoto, Japón) en 50 mM Tris-HCl, pH 8, que contenía 0,3 M NaCl y 5 mM imidazol. Después de la ultracentrifugación, el sobrenadante fue incubado con resina de agarosa Ni 2+ -NTA (Qiagen, Hilden, Alemania). La resina fue aplicada a una columna de cromatografía y lavada con 50 mM imidazol que contenía 50 mM Tris-HCl (pH 8), 0,3 M NaCl y 0,1% DDM. El IFITM5 solubilizado con DDM fue recolectado por elución con el mismo tampón que contenía 0,3 M imidazol. Los medios de muestreo fueron reemplazados por la solución tampón apropiada por dos pasajes sobre una columna PD-10 (GE Healthcare UK, Ltd., Amersham Place, Inglaterra). Los detalles experimentales se describen en informes anteriores [19, 28]. Brevemente, se extrajeron proteínas totales de las células osteoblásticas que coexpresaron IFITM5 y FKBP11-FLAG utilizando un kit de extracción total de proteínas (BioChain Institute Inc., Newark, CA). Luego, el lisato celular fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG M2 (Sigma-Aldrich) a 4°C durante 2 h. Para recuperar FKBP11-FLAG, 500 ng/μL 3 × péptido FLAG (Sigma-Aldrich) disuelto en solución salina tris-buffered se añadió al gel recogido a 4°C durante 1 h. Las proteínas recuperadas y el lisato celular que contenía proteínas totales fueron analizados por SDS-PAGE (15% ePAGEL; ATTO, Tokio, Japón) y la mancha occidental El anticuerpo policlonal anti-IFITM5, preparado a partir de la secuencia péptida aminoterminal (TSYPREDPRAPSSRC), y el anticuerpo monoclonal anti-FLAG (Sigma-Aldrich) fueron utilizados como anticuerpos primarios. Los anticuerpos anti-rabbit IgG (H+L) de cabra conjugados con HRP (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) y anti-mouse IgG (H+L) (Sigma-Aldrich) fueron utilizados como anticuerpos secundarios para los anticuerpos primarios anti-IFITM5 y anti-FLAG, respectivamente. Las proteínas fueron detectadas por reacción quimioluminiscente (MercK-Millipore, Billerica, MA). El lisato celular extraído de las células osteoblásticas marcadas metabólicamente por 17-ODYA fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG M2 para obtener proteínas purificadas con FLAG IFITM5. Las proteínas marcadas con 17-ODYA fueron etiquetadas químicamente con azida-PEG 3 -5(6)-carboxitetrametilrhodamina (TAMRA-azida; Click Chemistry Tools, Scottsdale, AZ) con referencia a estudios previos [10, 29, 30, 32] y la guía del fabricante. Las proteínas separadas por SDS-PAGE fueron visualizadas utilizando un láser de 532-nm para excitación y la fluorescencia por TAMRA (565 nm) fue detectada mediante un filtro de largo camino de 575nm (Typhoon FLA 9000; GE Healthcare). Las células de osteoblasto subcultivo MC3T3 fueron sembradas a una densidad de 5.000 células/cm 2 en platos de 40 mm y cultivadas en medio de águila α-modificada (α-MEM; Sigma-Aldrich) conteniendo 10% (v/v) de suero fetal bovino (FBS; Nichirei Biosciences Inc., Tokio, Japón). Al día siguiente, esto fue reemplazado por medio de diferenciación, conteniendo 2 mM de glicerofosfato y 50 μg/ml de ascorbato sódico en concentraciones finales, para inducir la diferenciación osteoblasto. Cuando fue necesario, 100 μM 2BP en menos de 0,1% DMSO, o 0,1% DMSO solo se añadió al medio de diferenciación en concentraciones finales. Todos los cultivos fueron incubados a 37°C en una atmósfera humidificada que contenía 5% CO 2 durante Los nódulos mineralizados fueron manchados con Alizarin Red S (Sigma-Aldrich). Se utilizó el procedimiento estándar de tinción. Los nódulos mineralizados fueron revisados cada tres días. Para identificar la palmitoilación S en IFITM5, las células osteoblásticas que albergaban el ADN plásmido que codificaba IFITM5-WT fueron cultivadas en ausencia y presencia de 2BP, lo que inhibe la palmitoilación S (Figura 2-A) [31]. A continuación, se extrajo el lisato celular que contenía proteína total para su uso en los análisis de manchas SDS-PAGE y occidentales. A efectos de comparación, las células E. coli también fueron cultivadas en ausencia de 2BP y se extrajo el lisato celular. La Figura 2 -B muestra los resultados del ensayo de manchas occidentales para IFITM5-WT expresado en el osteo En las células de osteoblasto, IFITM5-WT exhibió una sola banda cerca del marcador de masa molecular de 17,4 kDa (ver carril 1) en ausencia de 2BP. Sin embargo, en presencia de 2BP (ver carril 4), la banda apareció en una posición más baja que en ausencia de 2BP (lane 1). Estos resultados sugieren que IFITM5-WT tiene formas de masa molecular alta y baja en ausencia y presencia de 2BP, respectivamente. La palmitoilación S es una reacción reversible, y por lo tanto es despalmitoilada por un reductor fuerte como la hidroxilamina [10]. Tras el tratamiento de hidroxilamina (ver carril 2), la banda apareció en la misma posición que en presencia de 2BP (lane 4). En las células prokaryote E. coli, la modificación post-translacional S-Palmitoylation en IFITM5 PLOS ONE www.plosone.org no se produce. Por lo tanto, la banda también se observó en la misma posición inferior (ver carril 3). En el caso de IFITM3, también se informó que la palmitoylation induce un cambio en la movilidad en la electroforesis, al igual que en nuestros resultados actuales [10]. Para la observación directa de la S-palmitoylation, se utilizó un reportero químico establecido, 17-ODYA (Figura 2-C). Las células osteoblastadas que albergan la codificación plasmídica IFITM5-WT fueron cultivadas en presencia de 17-ODYA para etiquetar la proteína metabólicamente. Después de la extracción y purificación del lisato celular, el IFITM5-WT etiquetado fue ligado con TAMRA-azida de acuerdo con el método de cicloadición de azidealkyne [3+2] catalizado Cu(I) [3+2] [10, 29, 30, 32 ]. Una imagen de fluorescencia en gel del IFITM5-WT marcado 17-ODYA-TAMRA (véase el carril 2 en la Figura 2 -D) mostró que IFITM5 estaba espalmitoilado en las células osteoblastadas. La etiqueta FLAG adjunta a IFITM5 no tiene influencia en la modificación y etiquetado químico (vías 1 y 5). Además, después del tratamiento con hidroxilamina (ver carril 6), la fluorescencia se debilitó debido a la disociación de 17-ODYA de IFITM5, que fue el mismo mecanismo que la disociación del ácido palmítico de IFITM5 por reducción como se describe anteriormente (lane 2 de la Figura 2-B). Por lo tanto, concluimos que el IFITM5 expresado en las células de osteoblasto nativas es S-palmitoilado. Además, las bandas correspondientes a las formas de masa molecular alta y baja mostradas en el análisis de manchas occidentales fueron asignadas tentativamente a las formas S-palmitoiladas y depalmitoiladas, respectivamente. Como se describe anteriormente en la Introducción, los residuos de cisteína son el sustrato para la palmitoilación S. IFITM5 posee tres cisteínas, Cys52 y Cys53 en el dominio TM1, y Cys86 en el bucle CP (Figura 1-A). Todas estas cisteínas están altamente conservadas entre las proteínas de la familia IFITM de mamíferos (Figura 3-A). Para identificar el sitio de modificación en IFITM5, preparamos mutantes substituidos por cisteína, IFITM5-C52A/C53A, -C86A, y -C52A/C53A/C86A (Cys-less). Las células osteoblastadas que albergaban cada plasmido fueron cultivadas en ausencia de 2BP, y luego se extrajo el lisato celular. La Figura 3-B muestra los resultados de la mancha occidental detectando la expresión de todos los mutantes en las células osteoblastadas. En los mutantes C52A/C53A y Cys-less (ver carriles 2 y 4), se detectó la forma de baja masa molecular. Este resultado indica que Cys52 o Cys53 están involucrados en la palmitoilación S. Además, como se muestra en la Figura 2 -D, se detectaron fluorescencia fuerte y débil en el mutante C52A/C53A en ausencia y presencia de hidroxilamina (lanes 3 y 7), respectivamente, pero no en el mutante Cys-less (lanes 4 y 8). Estos resultados sugieren que el resto de la cisteína en el mutante C52A/C53A, Cys86, es S-palmitoilado y el mutante Cyss-less perdió por completo la palmitoilación S porque todas las cisteinas fueron sustituidas. Por lo tanto, concluimos que Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados. Además, se encontró que la S-palmitoilación en el dominio TM1 tiene un efecto importante en la movilidad en el gel (panel inferior de la Figura 2 -D y Figura 3-B). Por lo tanto, en adelante nos referimos a las formas de masa molecular alta y baja como las formas TM1palmitoiladas y TM1-depalmitoiladas, respectivamente. Finalmente, reasignamos las bandas mostradas en el análisis de Western blot como sigue: IFITM5-WT está totalmente palmitoilado, el mutante C86A está parcialmente palmitoilado en Cys52 y/o Cys53, el mutante C52A/C53A está parcialmente palmitoilado en Cys86, y el mutante sin Cys está completamente depalmitoilado. Estudios previos han revelado que IFITM5 interactúa con FKBP11 [19]. FKBP11 pertenece a la familia de proteínas de unión FK506 y tiene un dominio transmembrana. La interacción entre IFITM5 y FKBP11 es importante para la actividad inmunitaria debido a que la formación del complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP induce la expresión de genes inducidos por interferón, a saber, el Bst2, Irgm, Ifit3, B2m y el gen antígeno clase I de MHC [28]. Para investigar el efecto de la palmitoilación S en la interacción de IFITM5 con FKBP11, se realizó un ensayo de inmunoprecipitación. Las células osteoblásticas cotransfectadas por los plásmidos que codifican IFITM5-WT y FKBP11-FLAG fueron cultivadas en ausencia y presencia de 2BP. Luego, el análisis celular extraído fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG. El gel fue lavado varias veces. Finalmente, las proteínas fueron eludidas competitivamente por la adición de péptido FLAG. Si IFITM5 interactuaba con FKBP11, se esperaba que IFITM5 Las cisteínas conservadas fueran resaltadas en naranja y numeradas. En el panel inferior, los números dados entre paréntesis corresponden al número residual para IFITM2. Para el cálculo de probabilidad, un total de 23 secuencias IFITM2, 23 IFITM3 y 17 IFITM5 derivadas de especies mamíferas en la base de datos Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomas (KEGG) fueron utilizadas. La alineación de secuencias se llevó a cabo utilizando CLUSTALW. Los logotipos de secuencia se generaron utilizando WEBLOGO 3. B) Botón occidental para los mutantes de tipo salvaje y substituidos por cisteína de IFITM5 expresados en células osteoblastadas La flecha superior indica que los mutantes C52 y/o C53 en el dominio TM1 son Spalmitoylated (lanes 1 y 3). El C52A/C53A (lane 2) y Cys-less (lane 4) son parcial y completamente depalmitoylated. El experimento se llevó a cabo 2 veces. doi: 10.1371/journal.pone.0075831.g003 se obtendría durante este paso y se detectaría por inmunobloqueo. Figura 4 -A muestra los resultados de la mancha occidental para la co-inmunoprecipitación de IFITM5-WT con FKBP-FLAG. La banda correspondiente a FKBP11 apareció en todos los carriles (panel superior). Las lanes 1 y 2 son controles para asegurar que IFITM5 y FKBP11 estén contenidas en el lisato celular Los controles también aseguraron que el IFITM5 fuera palmitoilado S en ausencia de 2BP (ver carril 1), mientras que el IFITM5 no fue palmitoilado S en presencia de 2BP (ver carril 2). Después de la inmunoprecipitación, una sola banda correspondiente al IFITM5 palmitoilado S apareció en ausencia de 2BP (ver carril 3), indicando la interacción del IFITM5 espalmitoilado con el FKBP11. Sin embargo, en presencia de 2BP, no apareció ninguna banda correspondiente al IFITM5 (ver carril 4), indicando que las dos moléculas no interactúan entre sí. Estos resultados sugieren que la palmitoilación S sobre el IFITM5 contribuye a la interacción con el FKBP11. A continuación, investigamos la relación entre la Spalmitoylation y la interacción con FKBP11 utilizando los mutantes IFITM5 descritos anteriormente. Las células osteoblastadas cotransfectadas por los plásmidos que codifican los mutantes IFITM5 (C52A/ C53A, C86A y Cys-less) y FKBP11-FLAG fueron cultivadas. El ensayo de inmunoprecipitación se llevó a cabo de la misma manera que se describió anteriormente. La Figura 4 -B muestra los resultados de la mancha occidental para la co-inmunoprecipitación de los mutantes de tipo salvaje y el IFITM5 con FKBP11. La Figura 4 -C muestra los resultados del experimento de control utilizando el lisato celular antes de la inmunoprecipitación. Como se describe en la sección anterior 3-3, la banda correspondiente a FKBP11 apareció en todos los carriles (paneles superiores) porque la inmunoprecipitación se realizó utilizando el gel de agarosa anti-FLAG. En el panel inferior de la Figura 4 -B, se observaron bandas individuales para el mutante IFITM5-WT y -C86A (lanes 1 y 3) pero no para los mutantes -C52A/C53A y Cys-less (lanes 2 y 4). Este resultado indica que el tipo salvaje y el mutante C86A interactúan con FKBP11, mientras que los otros dos mutantes no lo hacen. Curiosamente, esta tendencia refleja la tendencia de los perfiles de palmitoilación S, lo que significa que Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 de los mutantes IFITM5-WT y -C86A es S-palmitoilado, mientras que estos residuos no son S-palmitoilados en los mutantes C52A/C53A y Cysless (ver Figuras 2-D, 3-B y el panel inferior de la Figura 4-C). Debido a que la palmitoilación S contribuye a la interacción IFITM5-FKBP11, como se describe en la sección anterior 3-3 (también en la Figura 4-A), los resultados de la Figura 4-B sugieren que los mutantes que perdieron el sitio(s) de palmitoilación S, Cys52 y/o Cys53, no son capaces de interactuar con FKB En otras palabras, la palmitoilación S en estas cisteínas es necesaria para la interacción de IFITM5 con FKBP11. Como se ha descrito anteriormente en la Introducción, estudios previos han revelado que IFITM5 también contribuye a la formación ósea [18] [19] [20]. Por lo tanto, se investigó la influencia de Spalmitoilación en la formación de nódulos óseos en células osteoblastadas, en las que se expresa IFITM5 nativas. La Figura 5 muestra la formación de nódulos dependientes del tiempo en ausencia y la presencia de 2BP (Figuras 5-A y -B). La Figura 5 -C muestra los resultados del ensayo de control para verificar el efecto de DMSO, que se utilizó como disolvente para 2BP, en la formación de nódulos. El nódulo mineralizado fue manchado con Alizarin Red, que reacciona con calcio depositado. En la Figura 5 -D, el área del nódulo mineralizado fue trazada contra el tiempo experimental. En ausencia de 2BP (Figura 5-A, -C, y -D), la mineralización se inició 15 días después del inicio de la diferenciación celular (Día 0). Por otro lado, en presencia de 2BP (Figura 5-B y -D) se formó el nódulo el Día 12. El tiempo medio para la mineralización máxima en presencia de 2BP se estimó 7 días antes que en ausencia de 2BP (Figura 5-D). Además, se observaron diferencias en la forma de los nódulos mineralizados. La Figura 5 -E muestra una visión ampliada de cada nódulo en el Día 21. Los nódulos manchados se difundieron en presencia de 2BP (panel b), mientras que en ausencia de 2BP los nódulos formaron un gran cúmulo (panels a y c). Por lo tanto, nuestras observaciones en este estudio sugieren que la S-palmitoilación afecta la formación de nódulos óseos en las células osteoblásticas. En este estudio, se confirmó la S-palmitoilación sobre IFITM5 en las células osteoblásticas, que fue la misma que la reportada previamente para IFITM3 e IFITM2. Como se informó anteriormente, en IFITM3 e IFITM2, que comparten similitud de secuencia del 85% (Figura 1-C), dos cisteínas en el dominio TM1 (Cys71 y Cys72 para IFITM3, Cys70 y Cys71 para IFITM2) y una cisteína en el bucle CP (Cys105 para IFITM3, Cys104 para IFITM2) son todas S-palmitoiladas en células [10, 24]. Por otro lado, aunque IFITM5 comparte similitud de secuencia del 68% y 66% a IFITM3 e IFITM2, respectivamente, más de una cisteína en el dominio TM1 (Cys52 o Cys53) y una cisteína en el bucle CP (Cys86) son S-palmitoiladas. Teniendo en cuenta la alta conservación de tres cisteínas en las proteínas IFITM (Figuras 1-A y 3-A), todas las cisteínas en IFITM5 pueden estar involucradas en la palmitoilación S al igual que en el caso de IFITM3 e IFITM2 [10, 24]. Los roles de la palmitoilación S en IFITM3 se han estudiado intensamente, y la palmitoilación S ha demostrado ser crucial para el correcto posicionamiento en la membrana y la resistencia a la infección viral y la internalización [10] (los papeles se resumen en la Figura 6-A y se discuten en detalle más adelante). Un estudio reciente ha revelado que la palmitoilación S en IFITM2 también es importante para la agrupación de proteínas en la membrana [24]. Sin embargo, no conocemos el papel de la Spalmitoylation de IFITM5 para el agrupamiento en la membrana en la actualidad porque todavía no hemos logrado obtener un anticuerpo adecuado para la inmunohistoquímica, a pesar de que dedicamos mucho tiempo a la búsqueda y considerando un número considerable de anticuerpos. El Dr. Hanagata y sus colaboradores reportaron previamente que IFITM5 carecían del dominio TM1 y del bucle CP, que y IFITM5 (paneles inferiores), los anticuerpos anti-FLAG y anti-IFITM5 fueron utilizados como anticuerpos primarios, respectivamente. Las flechas indican la existencia de cada proteína y la S-palmitoylation en IFITM5. A) La mancha occidental para la coinmunoprecipitación del tipo salvaje IFITM5 con el FKBP11 (FKBP11-FLAG) fusionado con FLAG en las células osteoblásticas en ausencia y presencia de 2BP (denominadas "-" y "+", respectivamente). Las vías 1 y 2 son los resultados de los ensayos de control utilizados para verificar la existencia de IFITM5 y FKBP11 antes de la inmunoprecipitación, y las vías 3 y 4 muestran los resultados después de la inmunoprecipitación. El experimento se repitió 3 veces. B) La mancha occidental para la coinmunoprecipitación del tipo salvaje y los mutantes substituidos por cisteína de IFITM5 con FKBP11-FLAG en las células osteoblásticas. La banda correspondiente al péptido FLAG no se muestra debido a la menor masa molecular del péptido FLAG en relación con FKBP11-FLAG. C) El experimento de control de la Figura 4 -B utilizado para verificar que IFITM5 y FKBP11 estaban presentes en el lisato celular antes de la inmunoprecipitación. El experimento se repitió 2 veces. A) El mecanismo funcional de IFITM3 se resume en estudios anteriores. i) IFITM3 es S-palmitoilado en Cys71, Cys72 y Cys105, ii) que induce el agrupamiento y el posicionamiento correcto en la membrana, iii) resultando en la actividad antiviral contra el virus de la gripe. B) El mecanismo funcional de IFITM5 se resume combinando los resultados del presente y los estudios anteriores. (i) Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados (ii). La S-palmitoilación permite que IFITM5 interactúe con FKBP11 en las células osteoblásticas (iii). La disociación del CD9 del complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 es inducida por la formación del complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP y conduce a la expresión genética inmunológicamente relevante. IFITM5 también contribuye a la formación ósea, pero se desconoce cuáles son los estados descritos en i)-iii) son importantes para la formación ósea en la actualidad. Por otro lado, la IFITM5 interactúa con la proteína asociada, FKBP11, y la S-palmitoylation claramente hace una contribución significativa a la interacción. Por lo tanto, IFITM5 forma un hetero-oligomero en la membrana celular para su función fisiológica. contiene los sitios de modificación relevantes, perdió la capacidad de interactuar con FKBP11 [19]. En el presente estudio, determinamos que la S-palmitoylation en Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 es necesaria para la interacción. De estos resultados, especulamos que Cys52 y Cys53 se enfrentan a la superficie de interacción con FKBP11, y por lo tanto IFITM5 y FKBP11 interactúan entre sí a través del ácido palmítico unido a la cisteína (resumidos en la Figura 6 -B, discutidos más Nuestra investigación reveló que Cys86 está involucrado en la Spalmitoylation pero no contribuye a la interacción con FKBP11. Especulamos que otros residuos en el bucle CP ubicados cerca del dominio TM1 hacen alguna contribución a la interacción. Investigaciones previas también revelaron que IFITM5 expresado en las células fibroblasto heterologosas NIH3T3 exhibieron interacciones directas con CD81, la proteína 31 asociada al receptor de células B (BCAP31) y el hidroxiesteroide (17-beta) deshidrogenasa 7 (HSD17b7). Estas tres proteínas se unen al IFITM5 sin la S-palmitoylation (forma de masa molecular baja; ver Figura 3-b en ref [19]. y Figura 1-B en ref [28]. En las células fibroblastosas, la S-palmitoylation en IFI Estas interacciones no se observan en las células nativas del osteoblasto y, por lo tanto, son inespecíficas. Teniendo en cuenta estos hechos, se especula que la palmitoilación S sobre las células del IFITM5 promueve la interacción específica con FKBP11 en las células del osteoblasto. El papel que desempeña la palmitoilación S de las células del IFITM5 en la actividad inmune de las células del osteoblasto se discutirá combinando los resultados del presente y de los estudios anteriores. Debe ser necesaria una interacción específica entre IFITM5 y FKBP11 para formar el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP. CD81, también conocido como TAPA-1, es un miembro de la familia de proteínas de membrana de tetraspanina y un componente del núcleo de células B que media la señalización de células B para respuestas inmunes. Al formar este complejo, CD9, una proteína asociada con CD81, disociada del complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 y consecuentemente induce la expresión osteoblastada específica de los genes inducidos por interferón, Bst2, Irgm, Ifit3, B2m y el gen antígeno clase I de la MHC [28]. Si se perdiera la interacción específica mediada por Spalmitoylation de IFITM5 con FKBP11, no se formaría el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP y, por consiguiente, se inhibiría la expresión génica inducida por interferón, ya que el CD9 seguiría asociado con el complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9. En este sentido, especulamos que el IFITM5 está involucrado en la actividad del sistema inmunitario en las células osteoblastadas y la interacción del IFITM5 palmitoilado S con el FKBP11 regula la actividad inmune. Además, se sugirió que la S-palmitoilación en el IFITM5 contribuye a la formación de nódulos óseos, incluyendo la morfología y el tiempo de mineralización, en las células osteoblastadas (Figura 5). Es difícil concluir en la actualidad que la falta de la S-palmitoilación en el IFITM5 causa la difusión de los nódulos óseos (panel b de la Figura 5 -E); sin embargo, podemos decir que el IFITM5 probablemente no será S-palmitoilado en las células en presencia de 2BP. Mientras que el 2BP se utiliza comúnmente como inhibidor de la palmitoilación, también se dirige a muchas enzimas Por lo tanto, también es difícil interpretar los resultados de la incubación a largo plazo de las células osteoblásticas en presencia de 2BP. En cualquier caso, estas son observaciones interesantes y clave en términos de aclarar el papel desempeñado por la S-palmitoilación de IFITM5 en la formación ósea, y se requieren estudios adicionales. La Figura 6 describe un posible mecanismo de la interacción de IFITM5 con FKBP11 y el papel de IFITM5 en la función celular osteoblástica mediante una comparación con IFITM3. En el caso de IFITM3, como se muestra en la Figura 6 -A, se observan los siguientes. i) Las tres cisteinas son todas S-palmitoiladas (ii). La S-palmitoilación conduce a la agrupación y el posicionamiento correcto de moléculas IFITM3 en la membrana (iii). La espalmitoilación y la siguiente agrupación son cruciales para la resistencia al virus de la gripe. Cuando IFITM3 carece de la espalmitoilación, las moléculas de IFITM3 no se agrupan, lo que conduce a la disminución significativa de la actividad antiviral. Por otro lado, la Figura 6 -B muestra que las siguientes observaciones se hacen en el caso de IFITM5. i) Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados (ii). El S-palmitoilado IFITM5 es capaz de interactuar específicamente con FKBP11. Se supone que la interacción está mediada por el ácido palmítico unido a la cisteína frente a la superficie de interacción en FKBP11. Cys86 está involucrado en la palmitoilación S, pero no en la interacción de IFITM5 con FKBP11. En la actualidad, sin embargo, poco se sabe sobre el papel de la palmitoilación S de IFITM5 para la localización en la membrana. Cuando la palmitoilación S afecta la localización de IFITM5 como en el caso de IFITM3 [10], las moléculas S-palmitoiladas IFITM5 deben ser localizadas en la membrana o las moléculas depalmitoiladas deben ser deslocalizadas. La pérdida de la interacción entre IFITM5 y FKBP11 podría deberse a una relocalización de la depalmitoilada IFITM5 que impide su asociación con FKBP11 (iii). El Spalmitoilado IFITM5 interactúa con el complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 a través del FKBP11, que induce la disociación del CD9 del complejo y la expresión de 5 genes inmunológicamente relevantes. Finalmente, el IFITM5 forma el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP. Se desconoce en la actualidad cuál de los tres estados (i)~(iii) ilustrados en la Figura 6-B es importante para la mineralización ósea de las células osteoblásticas. La falta de la S-palmitoilación influye en la interacción con el FKBP11, que podría explicar la siguiente formación compleja y expresión génica. Además, la formación de nódulos óseos también se ve afectada. Se indica que la S-palmitoilación en IFITM5 juega un papel no sólo en la regulación de la actividad inmune sino también en la formación ósea. En conclusión, hemos revelado la S-palmitoilación en IFITM5 y su papel en la interacción con FKBP11. No sólo la actividad inmune sino también la mineralización ósea en las células osteoblásticas se ve afectada por la S-palmitoilación. En general, el papel funcional de la S-palmitoilación es diferente para cada proteína [36]. Para muchas proteínas, el ciclo de palmitoilación y despalmitoilación es constitutivo y regulado por enzimas. Basado en los resultados actuales, es difícil abordar (i) si la S-palmitoilación en IFITM5 es constitutiva o regulada, o (ii) cuando y donde IFITM5 es S-palmitoilada en las células osteoblásticas. Se necesitan más estudios y actualmente se están realizando.

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