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Ensayo de eficacia controlada que confirma la resistencia al toltrazuril en un campo aislado de ovinos Eimeria spp. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6034276/SHA: ef000d8cdab3895e23212886f16cce2b8aea458d1Autores: Odden, Ane; Enemark, Heidi L.; Ruiz, Antonio; Robertson, Lucy J.; Ersdal, Cecilie; Nes, Silje K.; Tømmerberg, Vibeke; Stuen, SnorreFecha: 2018-07-05DOI: 10.1186/s13071-018-2976-4Licencia: cc-byAbstract: ANTEGRADO: Coccidiosis debida a Eimeria spp. La resistencia anticoccidial en aves de corral y cerdos, y recientemente describimos la reducción de la eficacia del toltrazuril en ovinos Eimeria spp. en algunas explotaciones ovinas noruegas utilizando una prueba de reducción del recuento de ooquistes fecales recientemente desarrollada (FOCRT), el objetivo del presente estudio fue utilizar un ensayo de eficacia controlada para evaluar la eficacia del toltrazuril frente a un aislado de campo sospechoso de ser resistente. MÉTODOS: Veinte corderos, de 17 a 22 días de edad y criados protegidos contra la exposición a coccidia, fueron infectados con un aislado de campo de 100.000 Eimeria spp. ooquistes. Este aislado se obtuvo de una granja con una eficacia farmacológica previamente calculada del 56% (intervalo de confianza del 95%: -433,9 a 96,6%). En el día 7 de la postinfección, 10 de los corderos fueron tratados por vía oral con 20 mg/kg de toltrazuril (Baycox Sheep vet., Bayer Animal Health), mientras que los otros 10 corderos (controles) recibieron solución salina fisiológica; se realizaron exámenes clínicos y se registraron aumentos de peso; se obtuvieron muestras fecales diarias de diarrea en una escala de 1 a 5 y se determinó la excreción de ooquiste mediante una técnica modificada de McMaster; se identificaron morfológicamente los ooquistes a nivel de especie; a los 17 a 24 días después de la infección, los corderos fueron eutanizados y necropsiados. RESULTADOS: El aislado de Eimeria probado fue resistente contra el toltrazuril, y se observó resistencia tanto en especies patógenas como no patógenas; además, no se La E. ovinoidalis patógena fue la especie dominante, y no se encontró diferencia significativa en la prevalencia individual de E. ovinoidalis post-tratamiento entre corderos tratados (66,9%) y corderos de control (61,9%). Otras especies identificadas incluyeron E. crandallis/weybridgensis, E. parva, E. marsica, E. faurei, E. pallida, E. ahsata y E. bakuensis. CONCLUSIONES: Este estudio confirma la resistencia al toltrazuril en ovinos Eimeria spp. ; además, los datos apoyan el uso de FOCRT como herramienta apropiada para la evaluación de campo de la eficacia anticoccidial. Debido a las limitadas alternativas de tratamiento anticoccidial, estos hallazgos pueden tener implicaciones importantes para la industria ovina, particularmente en el norte de Europa. MATERIAL COMPLEMENTARIO ELECTRÓNICO: La versión en línea de este artículo (10.1186/s13071-018-2976-4) contiene material suplementario, que está disponible para los usuarios autorizados. Texto: Resistencia anticoccidial (ACR), que se desarrolla principalmente como resultado del uso intensivo a largo plazo de fármacos anticoccidiales, se produce ampliamente en la producción avícola y también se ha identificado en Cystoisospora suis en lechones [1] [2] [3] [4] [5]. Además, se ha desarrollado recientemente un método de campo para la evaluación de la eficacia anticoccidial reducida (ECA) en ovinos Eimeria spp., la prueba de reducción del recuento de ooquisto fecal (FOCRT), e indicó que la eficacia del toltrazuril se reduce en algunas manadas de ovejas noruegas [6]. Infecciones con Eimeria spp. En cambio, el tratamiento de la coccidiosis clínica se considera ineficiente debido a los extensos daños intestinales ya causados por la infección [20, 21]. Por lo tanto, la pérdida de sensibilidad al toltrazuril, el único anticoccidial registrado para su uso en ovinos en los países nórdicos [22] [23] [24], debe ser motivo de grave preocupación para la producción de cordero. Las directrices de la Asociación Mundial para el Avance de la Parasitología Veterinaria para la evaluación de la ECA en mamíferos [25], declaran que es necesario contar con métodos verificados para la evaluación de la ECA. Métodos de campo para la evaluación de la eficacia de los fármacos, como el FOCRT [6] y la prueba de reducción del recuento de óvulos fecales utilizada para evaluar la eficacia antihelmíntica [26], dan sólo una indicación de una reducción de la eficacia y necesitan ser verificados mediante ensayos de eficacia controlada (CET) [27, 28]. Además, debido a la variación de patogenicidad entre Eimeria El objetivo del presente estudio fue realizar una ETC para determinar si diferentes especies en un campo aislado de ovinos Eimeria spp. con sospecha de ACR, basado en la FOCRT [6], realmente demostraron resistencia al toltrazuril. Un total de 20 corderos de 8 ovejas de la raza blanca noruega ("Norsk kvit sau") fueron incluidos en el estudio, que fue aprobado por la Autoridad Noruega de Investigación Animal (ID: 11657). Las ovejas fueron sincronizadas usando Chronogest® CR y PMSG® (MSD Animal Health, Buckinghamshire, Reino Unido) y servidas por apareamiento natural. Los corderos fueron arrebatados al nacer (n = 16) o entregados por cesáreas (n = 4) durante un período de 6 días, y posteriormente criados artificialmente. Inmediatamente después del nacimiento, todos los corderos fueron lavados con jabón Optima pH 4 (Optima Produkter AS, Norheimsund, Noruega) y secados antes de ser colocados en cajas con suelos metálicos expandidos, en grupos de cuatro. Durante todo el ensayo se utilizaron calentadores infrarrojos. Una visión general de los grupos de estudio, incluyendo la edad del cordero, el peso al nacer y el género se puede encontrar en el archivo adicional 1: Tabla S1. Los corderos recibieron calostro ovino de ovejas vacunadas contra Clostridium spp. (Covexin-8, Zoetis) durante los primeros 30 minutos de vida, seguidos por calostro de vacas vacunadas (Covexin-8, Zoetis) durante las próximas 24 h. Para evitar casos de anemia hemolítica, el calostro de vaca había sido probado previamente en corderos criados de forma natural. Los corderos fueron alimentados ad libitum con un sustituto comercial de leche (Denkamilk, Denkavit, Fiskå, Mølle, Stavanger), utilizando un sistema de alimentación automática (Holm & Laue, Godkalven, Figgjo, Noruega). Los corderos tenían acceso ad libitum al agua, heno y concentrado comercial de arranque de cordero (FORMEL lam vår, Felleskjøpet, Noruega). Para asegurar que la transmisión de Eimeria a los corderos a través de calostro contaminado y heno no podía ocurrir, ambos fueron congelados a -75°C durante un mínimo de 24 h, antes de la provisión a los corderos. El campo aislado de Eimeria spp. se obtuvo de una de las manadas (ID 35) que participaron en el reciente estudio FOCRT [6]. De acuerdo con los resultados de la FOCRT, toltrazuril había reducido la eficacia frente a Eimeria en dos rebaños. Sin embargo, ninguno de estos rebaños estaba disponible para el CET, por razones geográficas y prácticas. Así, se encontró que el tratamiento con toltrazuril en el rebaño seleccionado tenía una eficacia del 56,0%, pero los resultados fueron clasificados como inconclusos, debido al amplio intervalo de confianza del 95% (IC) de -433,9 y 96,6% [6]. Para obtener suficientes eimeria ooquistes de este aislado de campo mixto (llamado "NMBU ID 35") para el presente estudio, se obtuvieron muestras fecales de 35 corderos en este rebaño 9 días después del tratamiento con toltrazuril (Baycox® Sheep vet., Bayer Animal Health, Oslo, Noray). En resumen, las heces se mezclaron 1:1 con agua y se filtraron. El filtrado de la mezcla fecal se mezcló 1:1 con solución de azúcar saturada (densidad: 1,5 g/l) en un recipiente de plástico y se dejó flotar sobre un portaobjetos de vidrio. El portaobjetos se lavó cada dos horas con agua desionizada durante tres días consecutivos y los lavados se recolectaron. Los lavados se centrifugaron a 2300× g durante 20 minutos, el sobrenadante se desecharon y el sedimento se mezcló 1:1 con agua desionizada en un matraz de vidrio con aireación constante. Los ooquistes del frasco se dejaron esporular durante 7 días a temperatura ambiente. Los ooquistes esporulados se almacenaron durante 18 días a 4°C. Basándose en la morfología [30], vista por microscopía ligera a 400× magnificación (véase también la sección de muestras fecales), y la clasificación de 300 ooquistes, el aislado de campo consistía en E. parva (32%), E. crandallis/ weybridgensis (25%), E. ovinoidalis (24%), E. faurei (9%), E. marsica (8%), E. pallida (1%), E. ahsata (< 1%) y E. bakuensis (< 1 %). Todos los corderos estaban infectados (día 0) a los 17-22 días de edad, utilizando un tubo esofágico. Se administró a cada uno de los 20 corderos una dosis de aproximadamente 100.000 ooquistes esporulados, diluidos en agua hasta un volumen total de 5 ml. A continuación, se trataron por vía oral (día 7) dos corderos seleccionados aleatoriamente (de cada grupo de cuatro) con 0,4 ml/kg de toltrazuril (baycox® ovejero. 50 mg/ml, Bayer Animal Health) y los corderos restantes (controles) se administraron 0,4 ml/kg de NaCl al 0,9% (B. Braun Medical AS, Vestskogen, Noruega). Durante el ensayo se realizaron exámenes clínicos diarios. La temperatura rectal se midió a los días 0, 1, 2 y 7, y al día a partir del día 14, y las temperaturas > 40,5°C se consideraron fiebre. Los corderos se pesaron una vez a la semana utilizando un peso calibrado (Kruuse, Drøbak Norway) con sensibilidad de 0,1 kg, hasta 14 días después de la infección, y posteriormente tres veces por semana. Dos corderos (controles) fueron tratados por vía oral con trimetoprim/sulphamethoxasole (Bactrim, Roche, Etterstad, Noruega) durante los tres primeros días de vida debido a sospecha de infección por Escherichia coli, de la que ambos se recuperaron a las 48 h. Seis corderos, dos controles y cuatro tratados con toltrazuril, desarrollaron cojera debido a absceso interdigital, y Streptococcus aureus fue detectado en dos corderos. Cuatro corderos recuperados sin tratamiento, y dos de los corderos recuperados después del tratamiento con bencilpenicilinaprocaína (Penovet vet., Boehringer Ingelheim Vetmedica, Copenhague, Dinamarca) administrados por vía intramuscular durante tres días. En el examen clínico, se prestó especial atención a los signos clínicos asociados con infecciones por Eimeria spp., Deshidratación, pirexia, debilidad, anorexia y, en particular, la presencia de diarrea. Diarrea hemorrágica grave y deshidratación en un cordero en el día 17, llevó a la eutanasia de todo ese grupo de cuatro corderos. En el día 18, otro cordero mostró signos de diarrea hemorrágica, y todos los corderos de este grupo también fueron eutanasia. Los tres grupos restantes fueron eutanasiados en los días 21, 23 y 24. Se extrajeron muestras de sangre de v. yugularis utilizando tubos vacuette (tratados con EDTA; BD, Franklin Lakes, EE.UU.) a 48 ± 2 h después del nacimiento y a los días 0, 7 y en eutanasia. La hematología se realizó utilizando el sistema de hemotología ADVIA 120 (Bayer Diagnostics, Leverku Se consideró la deshidratación con un hematocrito (hct) de > 45,0% [31]. Se centrifugaron tubos sanguíneos enteros, se extrajo y se almacenó el suero a -20°C hasta un análisis posterior. El análisis bioquímico fue realizado por ABX Pentra 400 (Horiba, Les Ulis, Francia), e incluyó análisis de hierro, proteína total, albúmina, urea, creatinina, gamma-glutamil transferasa, deshidrogenasa de glutamato y ácido betahidroxibutírico. Se obtuvieron muestras fecales individuales de cada cordero diariamente desde el día 10 de vida hasta el final del experimento. Se realizó la puntuación visual de la consistencia fecal en una escala de uno a cinco (1: normal, pelado; 2: blando; 3: líquido; 4: acuoso; 5: acuoso con sangre y/o tejido intestinal Una puntuación ≥ 3 fue considerada como diarrea. Las muestras fueron recolectadas utilizando una "cuchara fecal" interna [6] y las muestras fecales fueron puestas en bolsas con cierre de cremallera, las cuales fueron empaquetadas al vacío (Fresh'n'easy, OBH Nordica, Sundbyberg, Suecia), almacenadas a 4°C, y analizadas en 37 días. La tasa de excreción de ooquiste se determinó mediante una técnica modificada de McMaster con una sensibilidad teórica de 5 ooquistes por gramo (OPG) [6]. Cien ooquistes de Eimeria de todas las muestras ≥ 1000 OPG fueron examinados mediante microscopía ligera a 400× magnificación e identificados a nivel de especie, utilizando criterios morfológicos [30]. Sin embargo, debido a su similitud morfológica, los ooquistes de E. cranda Los recuentos de ocyst fueron analizados por la FOCRT [6], que consiste en un procedimiento en dos etapas. Primero, se evaluó el tiempo de tratamiento y muestreo, seguido de la evaluación de la eficacia del tratamiento, comparando muestras fecales de corderos tratados después del tratamiento con muestras equivalentes de controles no tratados. Se obtuvieron muestras pretratamiento (muestra 1) en el día 7 (día de tratamiento), y muestras posttratamiento (muestra 2) en los días 14-18; luego se realizó la FOCRT utilizando los recuentos de oocyst post-tratamiento para los cinco intervalos de tiempo posibles (7-11 días) entre muestras 1 y 2. Se analizaron muestras fecales obtenidas en eutanasia para rotavirus, coronavirus, Cryptosporidium spp. y bacteriología general. Se realizaron pruebas adicionales para Cryptosporidium spp. en corderos diarreicos en el momento de la infección (día Se analizaron frotis fecales en el Instituto Veterinario Noruego de Oslo para Cryptosporidium mediante análisis de inmunofluorescencia directa (Crypt-a-GloTM, Waterborne Inc., Nueva Orleans, EE.UU.), mientras que la presencia de rotavirus y coronavirus se probó mediante métodos diagnósticos estándar. Se obtuvieron muestras de análisis bacteriológicos a partir de la mitad del yeyuno y la espiral del colon, se esparcieron en placas de agar de sangre de oveja, y se incubaron en condiciones anaeróbicas y anaeróbicas para las 24-48 h a 37°C y el 5% de CO 2. En casos de diarrea hemorrágica, se obtuvieron muestras adicionales de cisteína de lactosa azul bromotimol agar (brolactina/CLED agar) para la posible identificación de Salmonella [33] Los corderos fueron eutanasiados en los días 17-24, por inyección intravenosa con pentobarbital (Euthasol vet., Virbac, Sollihøgda, Noruega) a 140 mg/kg. Inmediatamente después se realizó la necropsia estándar, con énfasis en los intestinos. Se tomaron muestras histológicas del íleo medio, proximal y distal, medio y base de cecum, espiral de colon y colon distal, además del corazón, pulmón, hígado y riñón. Las muestras fueron fijas por inmersión en un 4% de formaldehído, parafina embebidos, y manchadas con hematoxilina y eosina (HE). La evaluación histológica se realizó mediante microscopía ligera y se realizó una evaluación semi-cuantitativa ciega (evaluador único) para evaluar la patología intestinal. Los parámetros de evaluación incluyeron cambios en: i) velli, ii) epitelio superficial (atrofia/atenuación), iii) grado de infección por Eimeria, iv) hiperemia, v) edema, vi) infiltración de células inflamatorias y vii) abscesos en criptas, y fueron anotados de la siguiente manera: 0 = mínimo; 1 = pequeño; 2 = moderado; 3 = severo, incluyendo la clasificación de medio paso. Además, la presencia de necrosis epitelial se clasificó como presente (1) o ausente (0). Se calculó una puntuación histológica total para cada tejido mediante la suma de todos los parámetros evaluados (i-vii). Los datos fueron gestionados en Excel 2013 (Microsoft Inc., Redmond, EE.UU.), y posteriormente analizados en R [34] y Stata 14 (Statata Statistical Para los cálculos de significancia basados en la media, se utilizó una prueba t. P < 0,05 se consideró significativa; las tasas medias de crecimiento fueron superiores a 300 g/día hasta los días 14-16, con lo cual la tasa media de crecimiento disminuyó a alrededor de 0 g/día (fig. 1); las tasas de crecimiento volvieron a aumentar a partir del día 21; se observó el mismo patrón tanto en corderos tratados como en corderos de control; desde el día 15, tanto tratados como control tuvieron una puntuación fecal media ≥ 3, indicando diarrea; la puntuación fecal media máxima se observó en el día 17 (3,9 ± 0,2) y el día 18 (4,4 ± 0,3) en los grupos tratados y control, respectivamente; se observó diarrea hemorrágica a partir del día 14, en dos corderos tratados y cinco de control, y se observó tenesmo en dos corderos de control (día 17). Se observó un aumento de la temperatura rectal desde el día 14, con temperaturas máximas medidas en el día 18 (40,4 ± 0,4 °C) y 16 (40,9 ± 0,4 °C) en los grupos tratados y control, respectivamente; la duración media de la fiebre (> 40,5 °C) fue de 2,3 ± 0,5 días y 1,9 ± 0,4 días para los grupos tratados y control, respectivamente; para estos parámetros, no se observaron diferencias significativas entre los grupos en ningún momento; en la eutanasia, la media de hct fue de 39,2 ± 1,7% y 41,4 ± 1,9% en los grupos tratados y control, respectivamente; sin embargo, la deshidratación (hct > 45,0%) sólo se observó en 3 corderos, de los cuales uno había sido tratado con toltrazuril; la media de proteína sérica total disminuyó en ambos grupos desde La excreción de oocisto se registró por primera vez en un cordero tratado en el día 10 (10 OPG), seguido por la excreción de oocisto en todos los corderos en ambos grupos desde el día 14 en adelante. La excreción máxima de oocisto se observó en el grupo tratado en el día 20 (media de OPG: 5.438.500) y en el grupo control en el día 21 después de la infección (media de OPG: 3.630.850) (Fig. 2). Posteriormente, la excreción de oocisto disminuyó. No hubo diferencia significativa en la excreción de oocisto y la distribución de especies entre los grupos en ningún momento. Todas las especies presentes en el aislado de campo fueron aisladas de las muestras fecales de todos los 20 corderos infectados. E. ovinoidalis fue la especie más prevalente tanto en corderos tratados como en corderos de control (Ta La eficacia, según la FOCRT, se evaluó con confianza si la pendiente era ≥ 0,75 y con precaución si la pendiente era ≥ 0,5 y < 0,75 [6]. La pendiente osciló entre 1,24 y 1,69 para la excreción total de ooquistes en los corderos de control. En la Tabla 2 se presentan pendientes, estimaciones de máxima probabilidad y IC 95% para la eficacia media geométrica de todos los ooquistes, E. ovinoidalis, E. crandallis/weybridgensis, y la Eimeria spp. no patógena; la eficacia reducida de toltrazuril es aparente tanto frente a especies patógenas como no patógenas. La pendiente fue ≥ 0,75 para todos los intervalos de tiempo y especies, excepto para cuatro de los cinco intervalos de tiempo de E. crandallis/weybridgensis. Las muestras analizadas para Cryptosporidium spp., Salmonella, coronavirus y rotavirus fueron todas negativas. Los análisis bacteriológicos mostraron una flora mixta, dominada por coliformes y Enterococcus spp. Los hallazgos patológicos brutos incluyeron mucosa ileal engrosada y plegada difusa (7 controles tratados y 7 controles), y contenido ileal fibrinos en dos corderos (uno tratado y otro controlado). Se observaron focos nodulares o plasmáticos en la mucosa ileal en 4 corderos tratados y 6 de control (fig. 3a ). Los ganglios linfáticos distales yeyunos regionales aumentaron moderadamente en tamaño y edematosos en 5 corderos tratados y 6 de control. Finalmente, se observó contenido abomasal acuoso en > 50 % de los animales de ambos grupos. La evaluación de la microscopía mostró lesiones, principalmente en el íleo, el cecum y el colon, con lesiones menores en el yeyuno (fig. 3b-f ); sin embargo, no hubo diferencias significativas con respecto a los puntajes histológicos entre los grupos tratados y control en cualquiera de los segmentos intestinales; la puntuación histológica calculada más alta se encontró en el íleo proximal y en la base del cecum (fig. 4); la puntuación media para cada parámetro se puede encontrar en el archivo adicional 2: Tabla S2 ; se observaron diferentes cantidades de estadios de Eimeria intracelular en todos los segmentos intestinales, excepto en el jejunum, y se localizaron principalmente en el epitelio vil, con menos parásitos en la cripta epitelio y lamina propia, y pocos en los vasos submucosa y linfáticos. Tanto en los corderos tratados como en los de control, los cambios en las superficies intestinales variaron desde la atrofia de la luz del epitelio yeyuno y el rompimiento de las vellosidades ileales afectadas (Fig. 3b), hasta las áreas de aplanamiento total, atenuación del epitelio superficial (Fig. 3e) y necrosis (Fig. 3d). Se encontraron parches de necrosis epitelial en todos los corderos.La infiltración de células inflamatorias incluyó principalmente monocitos y eosinófilos, pero también neutrófilos y macrófagos, y se encontró tanto en la lámina propia como en la submucosa.Se observaron diferentes grados de edema, hiperemia y hemorragia en todas las secciones tisulares examinadas, así como en los corderos tratados y controlados. 3b) fueron encontrados en diverso grado en todos los corderos, y contenían células inflamatorias, escombros y diferentes etapas de Eimeria spp. Por lo que sabemos, este es el primer informe de resistencia toltrazuril confirmada experimentalmente en un campo aislado de Eimeria spp. Los resultados también apoyan el uso de FOCRT como herramienta para evaluar ECA en el campo. Aunque diez de los 20 corderos infectados experimentalmente con Eimeria fueron tratados metafilácticamente con la dosis recomendada de 20 mg/kg de toltrazuril (Baycox® Sheep vet., Bayer Animal Health), este tratamiento no resultó en una reducción significativa de la excreción de oocitos en los animales tratados, en comparación con los controles. Además, no se observaron diferencias significativas en la presentación clínica, patología bruta y hallazgos histopatológicos. Los datos de especiación mostraron que tanto las especies patógenas como las no patógenas de Eimeria en este aislado eran resistentes al toltrazuril. Los corderos excretaron un alto número de ooquistes, como se ha registrado previamente en infecciones experimentales con múltiples Eimeria spp. [35]. Aunque la excreción de ooquiste disminuyó alrededor del día 20 después de la infección, no se pudo determinar la duración total de la excreción, ya que los corderos fueron eutanizados. El patrón de excreción observado aquí, con un aumento exponencial, una fase de meseta y una disminución, se ha observado previamente en infecciones experimentales [35] [36]. Sin embargo, debido a la reinfección continua en condiciones de campo natural, la excreción de ooquiste puede ser más larga [38, 39] que la observada en el presente estudio, lo que también podría explicar La resistencia de varias especies, como se observa aquí, también se ha observado en aislados de campo de Eimeria spp. aviar [3, 40]. Notas: Las estimaciones se basaron en los recuentos de ooquistes post-tratamiento durante cinco intervalos de tiempo entre la muestra 1 (día 7 después de la infección) y la muestra 2, y se calcularon de acuerdo con la FOCRT [6]. Se evaluó con precaución una pendiente ≥ 0,5 y < 0,75, mientras que una pendiente < 0,5 se interpretó como inválida a Cuatro corderos se eutanalizaron en el día 17 Abreviaturas: E. ovi, E. ovinoidalis; E. c/w, E. crandallis/weybridgensis; No patogénica, todas las especies excepto E. ovinoidalis y E. crandallis/weybridgensisDe especial importancia en este estudio es Como esta especie es una de las más patógenas Eimeria spp. en ovinos [41, 42], la resistencia contra el fármaco anticoccidial más comúnmente utilizado indica que puede esperarse que la coccidiosis clínica grave ocurra en manadas resistentes. Aunque E. ovinoidalis fue la especie dominante excretada, la especie más prevalente en el inóculo de aislamiento de campo original fue E. parva. Esto podría reflejar similitudes entre E. ovinoidalis y E. ninakholyakimovae en cabras, esta última de las cuales desarrolla macroesquizontes en células endoteliales, resultando en la liberación de miles de merozoitas [42, 43]. Así, el grado de multiplicación/ replicación intracelular, que presumiblemente también está relacionado con la extensión de patogenicidad asociada con esta especie, es mayor para E. Para E. crandallis/weybridgensis, los cálculos de la FOCRT mostraron resultados no válidos de tres de los cinco puntos de tiempo de muestreo, probablemente debido a que las pruebas se realizaron demasiado pronto en la infección. La excreción de E. crandallis/weybridgensis aumentó predominantemente desde el día 16 en adelante, y la eutanasia se realizó en los días 17-24. Así, los períodos de prepatentes más largos para estas especies en comparación con E. ovinoidalis [44] probablemente explican estos resultados. Este es un hallazgo importante, ya que el número de granjas inválidas probadas en la FOCRT [6] podría haber sido menor si la muestra 2 hubiera sido recogida 10-11 días después de la muestra 1. Estos hallazgos también destacan el hecho de que aunque Eimeria spp. se considera a menudo como un grupo relativamente uniforme, son en realidad especies separadas con diferencias potencialmente importantes en Dos de los corderos fueron tratados con trimetoprim/ sulfa durante sus primeros días de vida, preparados que han demostrado ser eficaces en el tratamiento de la coccidiosis ovina [45, 46]. Sin embargo, los períodos de espera para medicamentos comparables autorizados en el ganado bovino son de 10-15 días para la carne [47], y estos corderos fueron tratados > 17 días antes de la infección experimental. Además, estos corderos tratados estaban en el grupo control, y por lo tanto este tratamiento no debería haber afectado los resultados del estudio. Signos clínicos similares como los observados aquí podrían ser causados por Cryptosporidium spp., coronavirus, rotavirus y Salmonella spp., pero ninguno de estos patógenos fueron detectados. Además, los hallazgos de coliformes y Enterococcus spp. pueden ser considerados como flora intestinal normal de corderos [48]. Los signos clínicos observados fueron, por lo tanto, casi seguramente causados por Eimeria spp., particularmente las dos principales especies patógenas, E. ovinoidalis y E. crandallis [35, 36]. La mucosa ileal engrosada se observa a menudo en corderos infectados con E. ovinoidalis [49]. Además, los cambios histológicos, como las vellosidades embotadas y la necrosis superficial, así como la presencia de coccidia, hiperemia, edema, infiltración de células inflamatorias y abscesos de criptas, también están de acuerdo con informes anteriores [42, 50, 51]. Para mejorar nuestro estudio, un grupo adicional de corderos no infectados podría haber sido ventajoso ya que esto habría permitido una mejor comparación entre el aumento de peso y los cambios histopatológicos. Sin embargo, esto no era factible en el momento del Además, debido a la falta de valores de corte definidos para la ECA, podría haber sido ventajoso incluir un aislado de ooquiste de una granja no sospechada (es decir, un aislado susceptible) [25]. Esto habría permitido comparar diferentes parámetros, como la excreción de ooquiste, entre corderos tratados y controlados infectados con Eimeria spp susceptible o resistente. Sin embargo, debido a la falta de herramientas para la selección de estos aislados de ovinos sensibles, optamos por restringir nuestro CET a los corderos infectados con el aislado "NMBU ID 35" como primer paso en la caracterización de la resistencia anticoccidial en Eimeria spp. Aunque los valores iniciales de eficacia no han sido previstos para toltrazuril por el fabricante, varios estudios han investigado su efecto sobre la excreción de ooquiste. Por ejemplo, su eficacia ha sido del 96,9-99,9% en el período de 7 a 98 días después del primer tratamiento, en un estudio en el que los corderos fueron tratados cada 14 días [52]. Otros estudios han mostrado eficacias toltrazuriles [proporcionadas en la publicación o calculadas como 1-(grupo tratado con OPG medio)/(grupo de control de OPG medio) a partir de los datos de la publicación] que oscilan entre 90,0 y 100,0% en el período de dos a tres semanas después del tratamiento [13, 18, 19, [53] [55] [55]. Estas eficacias son mucho más altas que las calculadas en el presente estudio, y por lo tanto los datos comparativos proporcionan una indicación más clara de resistencia en el aislado "NMBU ID 35". Toltrazuril ha sido comercializado para el tratamiento anticoccidial en ovinos desde los años 80, y su uso ha aumentado en los últimos años, tanto en Noruega [57] como en el Reino Unido (Dr. Gillian Diesel, comunicación personal). El uso extensivo de un medicamento puede dar lugar a una disminución de la eficacia, posiblemente debido a las etapas haploides de Eimeria, que seleccionan inmediatamente la resistencia [1, 5]. Dado que toltrazuril es el único anticoccidial registrado para ovinos en varios países, el desarrollo de la resistencia en especies ovinas Eimeria puede dar lugar a que haya pocas opciones de tratamiento disponibles para los ovinos, especialmente en Europa septentrional [22] [23] [24]. Diclazuril es un anticoccidial que ha sido registrado para el tratamiento de ovinos en varios países, pero como puede compartir un modo de acción común al de toltrazuril [58], la resistencia cruzada entre estos dos derivados de triazina en ovinos Eimeria spp. parece muy probable y debe ser investigada. De hecho, la resistencia cruzada entre diclazuril y toltrazuril fue reportada para un aislado de Eimeria spp. aviar hace más de 20 años [3]. Nuestros resultados indican que existe una clara necesidad de herramientas para evaluar la ECA, tales que se pueden evitar tratamientos ineficientes y, por lo tanto, el potencial de reducción del bienestar animal y la productividad. Tales herramientas están disponibles para aves de corral, utilizando diferentes métricas, tales como índice de ooquiste, ganancia de peso corporal, ganancia relativa de peso, puntuaciones de lesión e índice anticoccidia Sin embargo, aún no se han establecido tales métodos para su uso en rumiantes [25], con la figura 4 Parcelas de caja y silbato con valores atípicos que ilustran la puntuación histológica. La puntuación fue una suma de todos los parámetros histológicos evaluados (ver texto) en los 20 corderos infectados por Eimeria spp., rojos: tratados con toltrazuril y azules: controla la excepción de la recién publicada FOCRT [6]. Aunque la FOCRT puede servir como herramienta para la evaluación de campo de la ECA, existe un claro requisito para seguir probando su uso en diferentes entornos. La confirmación del espectro de resistencia en especies de Eimeria ovina aumenta la urgencia de identificar tratamientos alternativos y optimizar otras estrategias de control. Los efectos anticoccidiales de diferentes plantas y extractos naturales, como la sainfoína (Onobrichis viciifolia), las vainas de algarroba (Ceratonia siliqua), el extracto de cáscara de granada (Punica granatum), los extractos de proantocianidina de semillas de uva y diferentes antioxidantes naturales, han sido investigados in vivo e in vitro en diferentes hospedadores [60] [61] [62] [64]. Sin embargo, ninguna de estas sustancias bioactivas ha sido, hasta ahora, comercializada para la prevención de la coccidiosis clínica. Además, existen vacunas disponibles para Eimeria spp. aviar [65, 66], y la inmunización exitosa de los cabritos de cabra con Eimeria spp. atenuada se ha realizado [67]. Por lo tanto, los esfuerzos actuales deben centrarse en identificar la ECA y mantener la eficacia del toltrazuril en rebaños sensibles. Las estrategias de manejo que reduzcan la necesidad de anticoccidiales reduciendo la presión de infección, posiblemente lograda mediante la aplicación de estrictas medidas higiénicas, y la mejora del manejo de rebaños y pastos deben ser activamente fomentadas por veterinarios e incentivos de política agrícola [11]. Además, los agricultores deben ser informados sobre la importancia de las técnicas correctas de dragado, incluyendo la estimación de dosis y calibración de pistolas, ya que se ha demostrado que éstas son inadecuadas en varias granjas [12]. Hasta nuestro conocimiento, este es el primer informe de ACR contra toltrazuril en un aislado de campo de Eimeria ovino, que incluyó la especie altamente patógena, E. ovinoidalis. Los resultados también apoyan el uso de FOCRT para la evaluación de En el futuro, las dificultades en el manejo de la coccidiosis sin quimioterapia, debido a las pocas opciones de tratamiento disponibles, pueden afectar gravemente tanto el bienestar animal como la economía de la industria ovina. Fichero adicional 1: Tabla S1. Información sobre los 20 corderos infectados con Eimeria spp. en el día 0. (PDF 22 kb) Fichero adicional 2: Tabla S2. Hallazgos histopatológicos de corderos tratados con toltrazuril y controles eutanizados 17-24 días después de la infección con 100.000 Eimeria oocists. (PDF 118 kb) Abreviaturas ECA: eficacia anticoccidial; ACR: resistencia anticoccidial; CET: ensayo de eficacia controlada; FOCRT: prueba de reducción del recuento de ooquiste fecal; hct: hematocrito; OPG: oocysts per gram

¿Qué se usa toltrazuril para tratar?

Imágenes multimodales en un cúmulo inusual de síndrome de múltiples puntos blancos evanescenteshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5444036/SHA: ee3cc22161595e8774507882a52950fd179672Autores: Gal-Or, Orly; Priel, Ethan; Rosenblatt, Irit; Shulman, Shiri; Kramer, MichalFecha: 2017-05-11DOI: 10.1155/2017/75353Licencias: cc-byAbstract: OBJETIVO: describir un grupo inusual de síndrome de puntos blancos evanescentes múltiples (MEWDS) encontrado en un período de 3 meses.MÉTODOS: Este estudio de observación retrospectiva está compuesto por siete pacientes que se presentaron con MEWDS en un período de 3 meses en el RESULTADOS: Seis mujeres y un hombre de edad media 31,5 ± 7,2 años. Tres relataron un precedente de infección viral, todos con disminución unilateral de la visión, la funduscopía reveló granularidad foveal. IMÁGENES PRINCIPALES: manchas hiperfluorescentes en la autofluorescencia azul (BAF), manchas hipofluorescentes en la angiografía verde indocyanina, lesiones oscuras en fotos infrarrojas, e irregularidades de la zona elipsoide en la tomografía de coherencia óptica de dominio espectral (SD-OCT). Resolución de los puntos en la BAF correlacionados con la anatómica (SD-OCT) y recuperación visual. La angiografía OCT realizada después de la etapa de convalecencia demostró un flujo retiniano y coroida intacto. Los hallazgos serológicos fueron inconclusos. CONCLUSIÓN: Se describe meticulosamente un grupo único de pacientes con SMED presentado en un corto período de tiempo. Los hallazgos de SME-OCT de alteración de la zona elipsoidal en combinación con otras modalidades de imagen multimodal se describen meticulosamente. Reconocer estas características de imagen junto con un alto índice de sospecha clínica es importante para el diagnóstico del SMEWD. Las pruebas serológicas podrían ser consideradas en pacientes futuros. Texto: El síndrome del punto blanco múltiple evanescente (SMEWDS) fue descrito por primera vez en 1984 como un inicio raro y repentino de corioretinopatía unilateral, con el signo predominante de manchas multifocales amarillas-blancas en toda la retina [1, 2]. El espectro clínico del SMEWD se ha expandido a lo largo de los años para incluir bilateralidad y recurrencias [3] o una presentación atípica que involucra la fo Se ha reportado una enfermedad similar a la gripe prodrómica en hasta el 50% de los casos [1]. Un informe describió a un paciente con niveles elevados de IgG sérico total durante el curso de la enfermedad y hallazgos negativos de IgM al herpes zoster, herpes simple, parotiditis y sarampión [5]. Aunque se sospecha que el MEWDS se produce como consecuencia de una infección similar a la vírica en individuos genéticamente susceptibles, su patogénesis precisa permanece desconocida. La recuperación es gradual, de semanas a meses, y el pronóstico visual es muy favorable [2]. Generalmente no se requiere tratamiento. Se desconoce la incidencia del MEWDS. En la literatura [4] [5] [6] [7] [7] [9] [11] [12]. Uno de los 34 pacientes afectados más grandes descritos revisados durante varios años [1, 13, 14]. El objetivo del presente informe fue describir un grupo inusual de siete casos de SMDS encontrados en un período de 3 meses, con énfasis en la presentación clínica y los hallazgos de imágenes multimodales. El grupo nos llevó a buscar una asociación infecciosa común. Se realizó un estudio observacional retrospectivo en siete pacientes que se presentaron con SMDS entre julio y septiembre de 2013 en dos centros médicos terciarios en el centro de Israel. Los datos sobre los parámetros de antecedentes, clínicos y de laboratorio fueron recolectados de los archivos médicos. El estudio fue aprobado por la junta de revisión de ética institucional. Todos los pacientes fueron sometidos a un examen oftalmológico completo y pruebas de imagen multimodal, incluyendo autofluorescencia azul (BAF), angiografía de fluoresceína (FA) y/ o angiografía verde de indocianina (ICGA), fotografía de infrarrojos (IR) y tomografía de coherencia óptica de dominio espectral (SD- Las imágenes se adquirieron con los dispositivos HRA-2 y Spectralis HRA + OCT (Heidelberg Engineering, Heidelberg, Alemania) en las siguientes longitudes de onda: BAFexcitation 488 nm, barrera de corte 496 nm; IR-820 nm; ICGA-excitation 790 nm, emisión 800 nm; y SD-OCT superluminiscente fuente de luz 870 nm. La opción de exploración de volumen se utilizó para adquirir múltiples exploraciones SD-OCT (25-49 exploraciones horizontales en una región de 6 mm que cubre el área de patología). El registro preciso entre los hallazgos vistos en IR o BAF y SD-OCT fue habilitado por el sistema de seguimiento ocular láser de doble haz, donde se utiliza un láser para fotografiar la retina y el otro láser para realizar las exploraciones OCT. La reescáner precisa en áreas de interés fue garantizada por la función de seguimiento Spectralis, que automáticamente coloca los escaneos posteriores en la misma ubicación que las anteriores. Las imágenes de angiografía OCT se adquirieron utilizando la RTVue XR Avanti con AngioVue (Optovue Inc., Fremont, California, EE.UU.), con una tasa de escaneo A de 70 000 exploraciones por segundo, una fuente de luz de 840 nm, y un ancho de banda de 45 nm. Se adquirieron cubos maculares (3 × 3 mm), cada cubo compuesto por 304 grupos de 2 escáneres B repetidos que contenían 304 escáneres A cada uno. Se utilizó la tecnología de decoración de amplitud de espectro dividido para mejorar la relación señal-ruido dividiendo el espectro para generar múltiples cuadros OCT repetidos a partir de 2 marcos OCT repetidos originales [15]. La corrección del movimiento se realizó mediante el registro de 2 volúmenes de imágenes captadas ortogonalmente. La segmentación automática de las capas retinales fue realizada por el software de visualización y se utilizó para generar imágenes de proyección facial después de ajustar el nivel de la capa segmentada en los escáneres B. Se realizaron pruebas serológicas para virus comúnmente presentes en el momento de la presentación de los pacientes, a saber, inmunoglobulina IgG e IgM para el virus herpes simplex (VHS) I-II, virus varicela zoster (VZV), virus del Nilo Occidental, coxsackievirus, ecovirus (subgrupo de enterovirus) y virus corona. Hallazgos. Hubo un hombre y seis mujeres pacientes de edad media 31,5 ± 7,2 años (rango 22-41 años). Tabla 1 resume los datos demográficos. Tres pacientes reportaron una infección por virus prodromal La mejor agudeza visual corregida en la presentación varió de 6/9 a 6/30 en el ojo afectado; ninguno de los pacientes presentó signos de inflamación anterior o vítrea en el ojo afectado; los hallazgos funduscópicos en la presentación incluyeron granularidad foveal en seis pacientes; en cuatro pacientes (pacientes 1, 4, 5 y 6), fue el único hallazgo patológico de la retina (Figura 1); y en tres pacientes (pacientes 2, 3 y 7), la granularidad foveal se asoció con leves lesiones blancas de la retina (Figura 2 ), localizadas principalmente en la retina medioperiferal que se extendía a la periferia; el paciente 6 tuvo un disco hinchado y signos leves de neuropatía óptica (desaturación roja leve, mancha ciega agrandada en el campo visual); el paciente 6 fue sometido a evaluación neurológica debido a una presentación La evaluación neurológica incluyendo examen neurológico completo y neuroimagen excluyó el déficit neurológico adicional, antes de establecer el diagnóstico del SMEDS. Los hallazgos clínicos se resumen en la Tabla 2. 3.2. Hallazgos de imágenes multimodales. Los pacientes sometidos a imágenes menos de 2 semanas desde el inicio de los síntomas tuvieron los hallazgos más típicos. La FAB reveló lesiones hiperautofluorescentes en la mácula entre y a lo largo de las arcadas en cuatro pacientes (pacientes 1, 3, 6 y 7). Las fotos de IR mostraron lesiones oscuras en lugares similares, aunque no idénticos (Figura 3 ). Los pacientes 1 y 6, que se sometieron a ICGA, presentaron lesiones hipofluorescentes en números típicamente superiores a los detectados por ambas modalidades de imagen. La banda hiperrreflexiva de la zona elipsoide en el SD-OCT se correlaciona anatómicamente con el segmento interno de los fotorreceptores, sección elipsoide densamente llena de mitocondrias [16]. La interrupción transitoria de la zona elipsoide foveal en el SD-OCT correspondió a la granularidad foveal clínicamente aparente. En el paciente 5, que presentó un único hallazgo de granularidad retinal y fuga leve de disco óptico en la FA, el hallazgo del SD-OCT de alteración de la zona elipsoide fue el principal signo para el diagnóstico MEWDS (Figura 1 ). Se observó hiperrreflexividad foveal encontrada en 3 pacientes (pacientes 1, 4 y 7) extendiéndose a las capas retinianas internas (Figura 4 ). Las lesiones identificadas en las imágenes BAF, IR e ICGA correspondían a las áreas de alteración de la zona elipsoidal, en las exploraciones SD-OCT (Figura 3 ). La FA demostró lesiones hiperfluorescentes tempranas de punctato inespecíficas inespecíficas, con leve tinción durante la fase inicial, en cuatro pacientes (pacientes 2, 3, 6 y 7); estas lesiones no correspondían a los hallazgos de las modalidades de imágenes clínicas u otras; no se observó patología en el área foveal a pesar de la presencia de granularidad foveal típica; se evidenció una fuga leve de disco óptico en cuatro pacientes (pacientes 1, 4, 5 y 6); durante el curso de la enfermedad, las áreas hiperautofluorescentes disminuyeron en número y desaparecieron sin dejar anomalías hipoautofluorescentes; la resolución de las lesiones BAF correspondió a La hiperreflectividad foveal también desapareció (Figura 5). Figura 6. Cuatro pacientes (pacientes 1, 4, 6 y 7) fueron sometidos a pruebas serológicas con resultados negativos excepto por un resultado común de elevación del título de IgG a VZV. Después de 6 meses de seguimiento, la mejor agudeza visual corregida varió de 6/6 a 6/6.6 (Tabla 2). Aunque MEDWS es tradicionalmente considerado como un síndrome raro [2], reportamos un grupo inusual de siete pacientes que se presentaron en un período de tres meses. Todos los pacientes estaban de otro modo sanos y todos se presentaron con disminución de la visión en un ojo. Este grupo de casos podría romper hasta cierto grado la improbabilidad estadística de la rareza de la enfermedad. La presentación atípica en la mayoría de nuestros pacientes podría sugerir que MEWDS está infradiagnosado. Sin embargo, puede estar en línea con la especulación de que a veces los hallazgos atípicos pueden simplemente reflejar el momento en que los pacientes fueron examinados y no son una verdadera presentación atípica [4]. En su descripción original por Jampol et al. [2], los casos de MEWDS fueron unilaterales con presentación de fondo incluyendo numerosos puntos blancos dispersos en el polo posterior y más allá de las arcadas. Durante el curso de la enfermedad, la aparición de granularidad de la mácula se desarrolla en la mayoría de los casos y, cuando se ve, determina el diagnóstico. El número de manchas blancas es muy variable, y de hecho, pueden estar ausentes. Dado que los puntos blancos característicos no estaban presentes en cuatro pacientes (pacientes 1, 4, 5 y 6), fuimos guiados por otras características de fondo, en particular granularidad foveal, síntomas, imágenes multimodales y curso clínico. Si bien la supuesta patogénesis del MEWDS implica una infección viral, sólo pocos informes hasta la fecha han descrito una búsqueda del patógeno [5, [17] [18] [19]. El presente grupo de casos nos brindó una oportunidad única para buscar un denominador viral común. Las pruebas serológicas sólo dieron lugar a un título elevado de IgG a VZV, lo que a menudo indica una infección o vacunación VZV pasada; por lo tanto, no pudimos hacer ninguna generalización con respecto a estos hallazgos. La imagen multimodal (BAF, SD-OCT, IR, FA e ICGA) ha demostrado tener un alto valor en el diagnóstico desafiante del MEWDS. La mayoría de los hallazgos observados aquí se han descrito por separado en informes anteriores [7-9, 11, 12]. Sin embargo, el presente estudio ofreció dos ventajas importantes. Pudimos examinar a todos los pacientes con imágenes adquiridas simultáneamente, y fueron posibles múltiples correla Además, el tamaño relativamente grande de la cohorte y los escaneos repetidos nos permitieron verificar los hallazgos de imágenes en esta rara enfermedad. Observamos las ubicaciones correspondientes de las manchas oscuras en las imágenes IR, las manchas hiperautofluorescentes en las imágenes BAF, y los focos de patología de la retina externa en las imágenes SD-OCT. Pequeños puntos hiperreflectantes, ubicados en la capa celular del ganglio, la zona elipsoidea, y los coriocapilares, han sido observados y descritos en "en la cara" EDI SD-OCT [20]. Sin embargo, observamos un hallazgo único de hiperreflectividad foveal que se extiende a las capas retinianas internas. Nuestro hallazgo refuerza un hallazgo recientemente descrito en la literatura [14] que se cree que es patognomónico para MEWDS. Durante el curso de la enfermedad, tanto el IR como los hallazgos de la FAB se desvanecieron en concordancia con la resolución anatómica de la interrupción en la zona elipsoide y la lesión hiperrreflectante fetal en el SD-OCT. Así, las imágenes de la IR pueden proporcionar una modalidad de imagen fácil y ampliamente disponible para el seguimiento de pacientes con SME. Aunque los cambios autofluorescentes de la IR fueron descritos recientemente en pacientes con SME [21, 22], esta modalidad no está ampliamente disponible, mientras que la imagen de la IR se realiza de forma rutinaria. Además, sobre la base de nuestros hallazgos con imágenes multimodales, sugerimos que el diagnóstico de SME se pueda establecer con el uso simultáneo de técnicas no invasivas tales como FAB, IR y TCE. ICGA y FA pueden reservarse para uso secundario, cuando los hallazgos son equívocas. OCTA es una modalidad de imagen no invasiva relativamente nueva que demuestra las características de flujo de la red vascular dentro de la circulación regional para construir imágenes no invasivas de la red vascular. Las imágenes faciales generadas por OCTA también nos permiten estudiar las relaciones espaciales entre la vasculatura y las capas retinianas/coroidales adyacentes con mayor precisión que la angiografía tintaria, y los hallazgos de OCTA no mostraron deterioro del flujo en la vasculatura retinal y coroidal de los pacientes escaneados después de la etapa de convalecencia. No podemos sobreestimar el papel de la imagen multimodal en estos pacientes, ya que no con demasiada frecuencia el diagnóstico se confunde con la neuritis óptica, y los hallazgos clínicos son muy sutiles.Las limitaciones del estudio fueron la variabilidad en el tiempo desde el inicio de la enfermedad hasta las pruebas serológicas, por lo que los resultados de la IgM Además, se requiere una investigación futura utilizando la angiografía OCT para estudiar la naturaleza de los puntos en pacientes con SME y su correlación con otras modalidades de imagen multimodal en la etapa aguda y convaleciente. En conclusión, se presenta un gran grupo único de pacientes que presentaron SME en un corto período Figura 6 : Imágenes OCTA siguiendo la etapa de convalecencia del ojo derecho (a-b) y del ojo izquierdo (c-d) de los pacientes. Las líneas verde y roja representan los ejes x e y. Paciente 7 después de episodios recurrentes. Angiograma OCT de 3 × 3 mm del coriocapilaris (a1), capa superficial (a2) y capa profunda (a3) centradas en la mácula sin compromiso de flujo. Correspondiente al eje x B-escáner estructural OCT (b1) obtenido simultáneamente durante la misma exploración que el angiograma OCT con superposición de flujo en la sección transversal demostrada por la línea verde en (a1). SD-OCT (b2) demostrando anatomía normal de la retina externa 6 meses después del primer episodio agudo. Paciente 6, 3× 3 mm angiograma OCT de la coriocapilaris (c1), capa superficial (c2) y capa profunda (c3) centrada en la mácula sin compromiso de flujo. 3 × 3 mm en cara OCT estructural (d1) de la coriocapilaris centrada en la mácula como en c1. Esta imagen se obtuvo simultáneamente durante la misma exploración que el angiograma OCT en (c). En la cara OCT estructural de la profunda (d2) y la retina externa (d3) del tiempo. Según nuestro conocimiento, tal clúster no fue reportado previamente en la literatura ni encontrado por nosotros en diferentes estaciones. El diagnóstico fue apoyado por la presencia de características clave de granularidad foveal y alteración de la zona elipsoidea en el OCT y su correlación con las lesiones hiperautofluorescentes identificadas en el FAB. La atención también debe dirigirse a las manchas oscuras demostradas en imágenes IR, que pueden servir como una pista diagnóstica adicional proporcionada por una modalidad de imagen no invasiva. El curso de la enfermedad en nuestros pacientes fue típico para el SMDS, con recuperación casi completa de la agudeza visual. La patogénesis específica del SMDS es desconocida pero se cree que es una condición inflamatoria después de una infección viral. Sugerimos pruebas serológicas continuas en pacientes que cumplen los criterios clínicos. Los signos clínicos del SMDS son sutiles, de tal manera que el diagnóstico se basa en

¿Qué precede aproximadamente a la mitad de los casos reportados de MEWDS?

Imágenes multimodales en un cúmulo inusual de síndrome de múltiples puntos blancos evanescenteshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5444036/SHA: ee3cc22161595e8774507882a52950fd179672Autores: Gal-Or, Orly; Priel, Ethan; Rosenblatt, Irit; Shulman, Shiri; Kramer, MichalFecha: 2017-05-11DOI: 10.1155/2017/75353Licencias: cc-byAbstract: OBJETIVO: describir un grupo inusual de síndrome de puntos blancos evanescentes múltiples (MEWDS) encontrado en un período de 3 meses.MÉTODOS: Este estudio de observación retrospectiva está compuesto por siete pacientes que se presentaron con MEWDS en un período de 3 meses en el RESULTADOS: Seis mujeres y un hombre de edad media 31,5 ± 7,2 años. Tres relataron un precedente de infección viral, todos con disminución unilateral de la visión, la funduscopía reveló granularidad foveal. IMÁGENES PRINCIPALES: manchas hiperfluorescentes en la autofluorescencia azul (BAF), manchas hipofluorescentes en la angiografía verde indocyanina, lesiones oscuras en fotos infrarrojas, e irregularidades de la zona elipsoide en la tomografía de coherencia óptica de dominio espectral (SD-OCT). Resolución de los puntos en la BAF correlacionados con la anatómica (SD-OCT) y recuperación visual. La angiografía OCT realizada después de la etapa de convalecencia demostró un flujo retiniano y coroida intacto. Los hallazgos serológicos fueron inconclusos. CONCLUSIÓN: Se describe meticulosamente un grupo único de pacientes con SMED presentado en un corto período de tiempo. Los hallazgos de SME-OCT de alteración de la zona elipsoidal en combinación con otras modalidades de imagen multimodal se describen meticulosamente. Reconocer estas características de imagen junto con un alto índice de sospecha clínica es importante para el diagnóstico del SMEWD. Las pruebas serológicas podrían ser consideradas en pacientes futuros. Texto: El síndrome del punto blanco múltiple evanescente (SMEWDS) fue descrito por primera vez en 1984 como un inicio raro y repentino de corioretinopatía unilateral, con el signo predominante de manchas multifocales amarillas-blancas en toda la retina [1, 2]. El espectro clínico del SMEWD se ha expandido a lo largo de los años para incluir bilateralidad y recurrencias [3] o una presentación atípica que involucra la fo Se ha reportado una enfermedad similar a la gripe prodrómica en hasta el 50% de los casos [1]. Un informe describió a un paciente con niveles elevados de IgG sérico total durante el curso de la enfermedad y hallazgos negativos de IgM al herpes zoster, herpes simple, parotiditis y sarampión [5]. Aunque se sospecha que el MEWDS se produce como consecuencia de una infección similar a la vírica en individuos genéticamente susceptibles, su patogénesis precisa permanece desconocida. La recuperación es gradual, de semanas a meses, y el pronóstico visual es muy favorable [2]. Generalmente no se requiere tratamiento. Se desconoce la incidencia del MEWDS. En la literatura [4] [5] [6] [7] [7] [9] [11] [12]. Uno de los 34 pacientes afectados más grandes descritos revisados durante varios años [1, 13, 14]. El objetivo del presente informe fue describir un grupo inusual de siete casos de SMDS encontrados en un período de 3 meses, con énfasis en la presentación clínica y los hallazgos de imágenes multimodales. El grupo nos llevó a buscar una asociación infecciosa común. Se realizó un estudio observacional retrospectivo en siete pacientes que se presentaron con SMDS entre julio y septiembre de 2013 en dos centros médicos terciarios en el centro de Israel. Los datos sobre los parámetros de antecedentes, clínicos y de laboratorio fueron recolectados de los archivos médicos. El estudio fue aprobado por la junta de revisión de ética institucional. Todos los pacientes fueron sometidos a un examen oftalmológico completo y pruebas de imagen multimodal, incluyendo autofluorescencia azul (BAF), angiografía de fluoresceína (FA) y/ o angiografía verde de indocianina (ICGA), fotografía de infrarrojos (IR) y tomografía de coherencia óptica de dominio espectral (SD- Las imágenes se adquirieron con los dispositivos HRA-2 y Spectralis HRA + OCT (Heidelberg Engineering, Heidelberg, Alemania) en las siguientes longitudes de onda: BAFexcitation 488 nm, barrera de corte 496 nm; IR-820 nm; ICGA-excitation 790 nm, emisión 800 nm; y SD-OCT superluminiscente fuente de luz 870 nm. La opción de exploración de volumen se utilizó para adquirir múltiples exploraciones SD-OCT (25-49 exploraciones horizontales en una región de 6 mm que cubre el área de patología). El registro preciso entre los hallazgos vistos en IR o BAF y SD-OCT fue habilitado por el sistema de seguimiento ocular láser de doble haz, donde se utiliza un láser para fotografiar la retina y el otro láser para realizar las exploraciones OCT. La reescáner precisa en áreas de interés fue garantizada por la función de seguimiento Spectralis, que automáticamente coloca los escaneos posteriores en la misma ubicación que las anteriores. Las imágenes de angiografía OCT se adquirieron utilizando la RTVue XR Avanti con AngioVue (Optovue Inc., Fremont, California, EE.UU.), con una tasa de escaneo A de 70 000 exploraciones por segundo, una fuente de luz de 840 nm, y un ancho de banda de 45 nm. Se adquirieron cubos maculares (3 × 3 mm), cada cubo compuesto por 304 grupos de 2 escáneres B repetidos que contenían 304 escáneres A cada uno. Se utilizó la tecnología de decoración de amplitud de espectro dividido para mejorar la relación señal-ruido dividiendo el espectro para generar múltiples cuadros OCT repetidos a partir de 2 marcos OCT repetidos originales [15]. La corrección del movimiento se realizó mediante el registro de 2 volúmenes de imágenes captadas ortogonalmente. La segmentación automática de las capas retinales fue realizada por el software de visualización y se utilizó para generar imágenes de proyección facial después de ajustar el nivel de la capa segmentada en los escáneres B. Se realizaron pruebas serológicas para virus comúnmente presentes en el momento de la presentación de los pacientes, a saber, inmunoglobulina IgG e IgM para el virus herpes simplex (VHS) I-II, virus varicela zoster (VZV), virus del Nilo Occidental, coxsackievirus, ecovirus (subgrupo de enterovirus) y virus corona. Hallazgos. Hubo un hombre y seis mujeres pacientes de edad media 31,5 ± 7,2 años (rango 22-41 años). Tabla 1 resume los datos demográficos. Tres pacientes reportaron una infección por virus prodromal La mejor agudeza visual corregida en la presentación varió de 6/9 a 6/30 en el ojo afectado; ninguno de los pacientes presentó signos de inflamación anterior o vítrea en el ojo afectado; los hallazgos funduscópicos en la presentación incluyeron granularidad foveal en seis pacientes; en cuatro pacientes (pacientes 1, 4, 5 y 6), fue el único hallazgo patológico de la retina (Figura 1); y en tres pacientes (pacientes 2, 3 y 7), la granularidad foveal se asoció con leves lesiones blancas de la retina (Figura 2 ), localizadas principalmente en la retina medioperiferal que se extendía a la periferia; el paciente 6 tuvo un disco hinchado y signos leves de neuropatía óptica (desaturación roja leve, mancha ciega agrandada en el campo visual); el paciente 6 fue sometido a evaluación neurológica debido a una presentación La evaluación neurológica incluyendo examen neurológico completo y neuroimagen excluyó el déficit neurológico adicional, antes de establecer el diagnóstico del SMEDS. Los hallazgos clínicos se resumen en la Tabla 2. 3.2. Hallazgos de imágenes multimodales. Los pacientes sometidos a imágenes menos de 2 semanas desde el inicio de los síntomas tuvieron los hallazgos más típicos. La FAB reveló lesiones hiperautofluorescentes en la mácula entre y a lo largo de las arcadas en cuatro pacientes (pacientes 1, 3, 6 y 7). Las fotos de IR mostraron lesiones oscuras en lugares similares, aunque no idénticos (Figura 3 ). Los pacientes 1 y 6, que se sometieron a ICGA, presentaron lesiones hipofluorescentes en números típicamente superiores a los detectados por ambas modalidades de imagen. La banda hiperrreflexiva de la zona elipsoide en el SD-OCT se correlaciona anatómicamente con el segmento interno de los fotorreceptores, sección elipsoide densamente llena de mitocondrias [16]. La interrupción transitoria de la zona elipsoide foveal en el SD-OCT correspondió a la granularidad foveal clínicamente aparente. En el paciente 5, que presentó un único hallazgo de granularidad retinal y fuga leve de disco óptico en la FA, el hallazgo del SD-OCT de alteración de la zona elipsoide fue el principal signo para el diagnóstico MEWDS (Figura 1 ). Se observó hiperrreflexividad foveal encontrada en 3 pacientes (pacientes 1, 4 y 7) extendiéndose a las capas retinianas internas (Figura 4 ). Las lesiones identificadas en las imágenes BAF, IR e ICGA correspondían a las áreas de alteración de la zona elipsoidal, en las exploraciones SD-OCT (Figura 3 ). La FA demostró lesiones hiperfluorescentes tempranas de punctato inespecíficas inespecíficas, con leve tinción durante la fase inicial, en cuatro pacientes (pacientes 2, 3, 6 y 7); estas lesiones no correspondían a los hallazgos de las modalidades de imágenes clínicas u otras; no se observó patología en el área foveal a pesar de la presencia de granularidad foveal típica; se evidenció una fuga leve de disco óptico en cuatro pacientes (pacientes 1, 4, 5 y 6); durante el curso de la enfermedad, las áreas hiperautofluorescentes disminuyeron en número y desaparecieron sin dejar anomalías hipoautofluorescentes; la resolución de las lesiones BAF correspondió a La hiperreflectividad foveal también desapareció (Figura 5). Figura 6. Cuatro pacientes (pacientes 1, 4, 6 y 7) fueron sometidos a pruebas serológicas con resultados negativos excepto por un resultado común de elevación del título de IgG a VZV. Después de 6 meses de seguimiento, la mejor agudeza visual corregida varió de 6/6 a 6/6.6 (Tabla 2). Aunque MEDWS es tradicionalmente considerado como un síndrome raro [2], reportamos un grupo inusual de siete pacientes que se presentaron en un período de tres meses. Todos los pacientes estaban de otro modo sanos y todos se presentaron con disminución de la visión en un ojo. Este grupo de casos podría romper hasta cierto grado la improbabilidad estadística de la rareza de la enfermedad. La presentación atípica en la mayoría de nuestros pacientes podría sugerir que MEWDS está infradiagnosado. Sin embargo, puede estar en línea con la especulación de que a veces los hallazgos atípicos pueden simplemente reflejar el momento en que los pacientes fueron examinados y no son una verdadera presentación atípica [4]. En su descripción original por Jampol et al. [2], los casos de MEWDS fueron unilaterales con presentación de fondo incluyendo numerosos puntos blancos dispersos en el polo posterior y más allá de las arcadas. Durante el curso de la enfermedad, la aparición de granularidad de la mácula se desarrolla en la mayoría de los casos y, cuando se ve, determina el diagnóstico. El número de manchas blancas es muy variable, y de hecho, pueden estar ausentes. Dado que los puntos blancos característicos no estaban presentes en cuatro pacientes (pacientes 1, 4, 5 y 6), fuimos guiados por otras características de fondo, en particular granularidad foveal, síntomas, imágenes multimodales y curso clínico. Si bien la supuesta patogénesis del MEWDS implica una infección viral, sólo pocos informes hasta la fecha han descrito una búsqueda del patógeno [5, [17] [18] [19]. El presente grupo de casos nos brindó una oportunidad única para buscar un denominador viral común. Las pruebas serológicas sólo dieron lugar a un título elevado de IgG a VZV, lo que a menudo indica una infección o vacunación VZV pasada; por lo tanto, no pudimos hacer ninguna generalización con respecto a estos hallazgos. La imagen multimodal (BAF, SD-OCT, IR, FA e ICGA) ha demostrado tener un alto valor en el diagnóstico desafiante del MEWDS. La mayoría de los hallazgos observados aquí se han descrito por separado en informes anteriores [7-9, 11, 12]. Sin embargo, el presente estudio ofreció dos ventajas importantes. Pudimos examinar a todos los pacientes con imágenes adquiridas simultáneamente, y fueron posibles múltiples correla Además, el tamaño relativamente grande de la cohorte y los escaneos repetidos nos permitieron verificar los hallazgos de imágenes en esta rara enfermedad. Observamos las ubicaciones correspondientes de las manchas oscuras en las imágenes IR, las manchas hiperautofluorescentes en las imágenes BAF, y los focos de patología de la retina externa en las imágenes SD-OCT. Pequeños puntos hiperreflectantes, ubicados en la capa celular del ganglio, la zona elipsoidea, y los coriocapilares, han sido observados y descritos en "en la cara" EDI SD-OCT [20]. Sin embargo, observamos un hallazgo único de hiperreflectividad foveal que se extiende a las capas retinianas internas. Nuestro hallazgo refuerza un hallazgo recientemente descrito en la literatura [14] que se cree que es patognomónico para MEWDS. Durante el curso de la enfermedad, tanto el IR como los hallazgos de la FAB se desvanecieron en concordancia con la resolución anatómica de la interrupción en la zona elipsoide y la lesión hiperrreflectante fetal en el SD-OCT. Así, las imágenes de la IR pueden proporcionar una modalidad de imagen fácil y ampliamente disponible para el seguimiento de pacientes con SME. Aunque los cambios autofluorescentes de la IR fueron descritos recientemente en pacientes con SME [21, 22], esta modalidad no está ampliamente disponible, mientras que la imagen de la IR se realiza de forma rutinaria. Además, sobre la base de nuestros hallazgos con imágenes multimodales, sugerimos que el diagnóstico de SME se pueda establecer con el uso simultáneo de técnicas no invasivas tales como FAB, IR y TCE. ICGA y FA pueden reservarse para uso secundario, cuando los hallazgos son equívocas. OCTA es una modalidad de imagen no invasiva relativamente nueva que demuestra las características de flujo de la red vascular dentro de la circulación regional para construir imágenes no invasivas de la red vascular. Las imágenes faciales generadas por OCTA también nos permiten estudiar las relaciones espaciales entre la vasculatura y las capas retinianas/coroidales adyacentes con mayor precisión que la angiografía tintaria, y los hallazgos de OCTA no mostraron deterioro del flujo en la vasculatura retinal y coroidal de los pacientes escaneados después de la etapa de convalecencia. No podemos sobreestimar el papel de la imagen multimodal en estos pacientes, ya que no con demasiada frecuencia el diagnóstico se confunde con la neuritis óptica, y los hallazgos clínicos son muy sutiles.Las limitaciones del estudio fueron la variabilidad en el tiempo desde el inicio de la enfermedad hasta las pruebas serológicas, por lo que los resultados de la IgM Además, se requiere una investigación futura utilizando la angiografía OCT para estudiar la naturaleza de los puntos en pacientes con SME y su correlación con otras modalidades de imagen multimodal en la etapa aguda y convaleciente. En conclusión, se presenta un gran grupo único de pacientes que presentaron SME en un corto período Figura 6 : Imágenes OCTA siguiendo la etapa de convalecencia del ojo derecho (a-b) y del ojo izquierdo (c-d) de los pacientes. Las líneas verde y roja representan los ejes x e y. Paciente 7 después de episodios recurrentes. Angiograma OCT de 3 × 3 mm del coriocapilaris (a1), capa superficial (a2) y capa profunda (a3) centradas en la mácula sin compromiso de flujo. Correspondiente al eje x B-escáner estructural OCT (b1) obtenido simultáneamente durante la misma exploración que el angiograma OCT con superposición de flujo en la sección transversal demostrada por la línea verde en (a1). SD-OCT (b2) demostrando anatomía normal de la retina externa 6 meses después del primer episodio agudo. Paciente 6, 3× 3 mm angiograma OCT de la coriocapilaris (c1), capa superficial (c2) y capa profunda (c3) centrada en la mácula sin compromiso de flujo. 3 × 3 mm en cara OCT estructural (d1) de la coriocapilaris centrada en la mácula como en c1. Esta imagen se obtuvo simultáneamente durante la misma exploración que el angiograma OCT en (c). En la cara OCT estructural de la profunda (d2) y la retina externa (d3) del tiempo. Según nuestro conocimiento, tal clúster no fue reportado previamente en la literatura ni encontrado por nosotros en diferentes estaciones; el diagnóstico fue apoyado por la presencia de características clave de granularidad foveal y alteración de la zona elipsoidea en el OCT y su correlación con las lesiones hiperautofluorescentes identificadas en el FAB; también se debe prestar atención a las manchas oscuras demostradas en imágenes IR, que pueden servir como una pista diagnóstica adicional proporcionada por una modalidad de imagen no invasiva; el curso de la enfermedad en nuestros pacientes fue típico para el SMDS, con recuperación casi completa de la agudeza visual; la patogénesis específica del SMDS es desconocida pero se cree que es una condición inflamatoria tras una infección viral; sugerimos pruebas serológicas continuas en pacientes que cumplen los criterios clínicos; los signos clínicos del SMDS son sutiles, de manera que el diagnóstico se basa en un alto índice de

¿Qué tipo de prueba clínica puede diferenciar el síndrome de punto blanco evanescente múltiple (MEWDS) de la neuritis óptica?

Etiología de las infecciones del tracto respiratorio en la comunidad y la clínica en Ilorin, Nigeriahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5719735/SHA: f2e835d2cde5f42054dbd0c20d4060721135c518Autores: Kolawole, Olatunji; Oguntoye, Michael; Dam, Tina; Chunara, RumiFecha: 2017-12-07DOI: 10.1186/s13104-017-3063-1Licencia: cc-byAbstract: OBJETIVO: Reconociendo el creciente interés en la vigilancia de enfermedades comunitarias a nivel mundial, el objetivo de este estudio fue investigar si los virus respiratorios que circulan en la comunidad pueden estar representados a través de la vigilancia clínica (hospitalaria RESULTADOS: Los niños fueron seleccionados mediante muestreo de conveniencia de comunidades y un centro de atención terciaria (n = 91) durante la primavera de 2017 en Ilorin, Nigeria. Se recogieron y probaron hisopos nasales utilizando reacción en cadena de la polimerasa. La mayoría (79,1%) de los sujetos eran menores de 6 años, de los cuales 46 estaban infectados (63,9%). Un total de 33 de los 91 sujetos tenían uno o más virus del tracto respiratorio; hubo 10 casos de triple infección y 5 de cuádruple. El virus de la parainfluenza 4, el virus sincitial respiratorio B y el enterovirus fueron los virus más comunes en la muestra clínica; presentes en el 93,8% (15/16) de los sujetos clínicos, y el 6,7% (5/75) de los sujetos comunitarios (diferencia significativa, p < 0,001). Coronavirus OC43 fue el virus más común detectado en miembros de la Una cepa diferente, Coronavirus OC 229 E/NL63 fue detectada entre los sujetos de la clínica (2/16) y no detectada en la comunidad. Este estudio piloto proporciona evidencia de que los datos de la comunidad pueden potencialmente representar información diferente a la obtenida clínicamente, sugiriendo la necesidad de vigilancia comunitaria para mejorar los esfuerzos de salud pública y la comprensión científica de las infecciones respiratorias. Texto: Infecciones respiratorias agudas (ARIs) (la causa tanto de infecciones del tracto respiratorio superior (URIs) como de infecciones del tracto respiratorio inferior (IRS)) son una causa importante de muerte entre los niños menores de 5 años, particularmente en los países en desarrollo donde la carga de enfermedad es 2-5 veces mayor que en los países desarrollados [1]. Si bien estos virus suelen causar síntomas leves de tipo frío y pueden ser autolimitados, en los últimos años nuevos coronavirus como el síndrome respiratorio agudo grave (SARS) y el síndrome respiratorio del Oriente Medio En la actualidad, la mayoría de los brotes de enfermedades infecciosas registrados por la Organización Mundial de la Salud (OMS) se producen en el continente africano, donde existe un alto riesgo de transmisión [3, 4]. Además, en las zonas en desarrollo (tanto rurales como urbanas) hay factores de riesgo cada vez mayores, como las interfaces humano-animal (debido a la proximidad residencial al ganado). Estos cambios en los patrones epidemiológicos han dado lugar a una mejora de la vigilancia de las IRA, especialmente en los lugares de alto riesgo de transmisión [5]. Nigeria es uno de esos lugares con una alta prevalencia de muchos de los factores de riesgo implicados en las IRA entre los niños, entre ellos: edad, sexo, hacinamiento, estado nutricional, situación socioeconómica, y donde el estudio de las IRA es actualmente limitado [6]. Estos factores de riesgo amplios junto con recursos limitados han indicado la necesidad de iniciativas comunitarias de vigilancia e intervenciones [6, 7]. En Nigeria, los hospitales sólo son visitados cuando los síntomas son muy graves. Por lo tanto, se supone que la información viral del muestreo clínico es insuficiente para captar la incidencia de enfermedades en la población general o su previsibilidad a partir de los síntomas [8]. En todo el mundo, incluso en África oriental y meridional, se han centrado los esfuerzos en el desarrollo de métodos de vigilancia participativa de enfermedades basados en la comunidad [9] [10] [11] [12] [13]. Se han demostrado enfoques basados en la comunidad que son útiles para aprender más sobre las infecciones respiratorias emergentes, como la evaluación de la infrarreportación [14], los tipos de virus prevalentes en las comunidades [10], y la predicción de epidemias [15]. Al mismo tiempo, los avances en los métodos de identificación molecular han permitido realizar estudios sobre la aparición y epidemiología de virus ARI en muchos lugares (por ejemplo, los datos clínicos representan los casos más graves, y poliomavirus novedosos en Australia [16, 17], Centro Médico Erasmus del coronavirus humano (HCoV-EMC) en Oriente Medio y Reino Unido [18, 19], SARS en Canadá y China [20] [21] [22] ), sin embargo, la investigación sobre la epidemiología molecular de los virus ARI en Nigeria es limitada. Los métodos de diagnóstico disponibles y otras limitaciones tienen estudios limitados allí a encuestas serológicas de sólo unos pocos de estos virus y sólo en poblaciones clínicas [23, 24]. Así, la utilidad de la vigilancia basada en la comunidad puede ser apropiada en contextos como en Nigeria, y el propósito de este estudio piloto fue investigar si los casos clínicos pueden describir la imagen completa de ARI entre los niños en Nigeria. Realizamos un estudio transversal en tres centros comunitarios y uno clínico en Ilorin, Nigeria. Ilorin se encuentra en el estado de Kwara y es la sexta ciudad más grande de Nigeria por población [25]. Tres áreas de gobierno local (Ilorin East, Ilorin South e Ilorin West LGAs) fueron los sitios comunitarios y el Hospital de Especialistas Infantiles, Ilorin el sitio clínico. Se utilizó el muestreo de conveniencia para los fines de este estudio piloto, y se obtuvieron muestras del 28 de marzo al 5 de abril de 2017. Los criterios de inclusión fueron: niños menores de 14 años que tenían síntomas visibles de IRA dentro de las comunidades o aquellos confirmados en el hospital con IRA. Los criterios de exclusión fueron: niños de 14 años o más, sin mostrar signos de IRA y sujetos cuyos padres no dieron consentimiento. Veinticinco niños con síntomas fueron seleccionados cada uno de los tres lugares de la comunidad, mientras que 16 niños sintomáticos fueron muestreados del hospital. Se registró el tamaño total de la muestra (n = 91) con base en materiales y limitaciones de costos de procesamiento, así como para proporcionar muestras suficientes para permitir la comprensión descriptiva de los patrones de circulación viral estimados en otros estudios comunitarios [10]. Los Oficiales de Vigilancia y Notificación de Enfermedades, empleados por el Ministerio de Salud del Estado y familiarizados con las comunidades en este estudio, realizaron la recolección de muestras y datos. Se consideraron síntomas derivados de otros esfuerzos de vigilancia de IRA: dolor de garganta, fiebre, sofá, nariz, vómitos, dolor corporal, dolor en las piernas, náuseas, escalofríos, falta de aliento [10, 26]. Género y edad, tipo de área residencial (rural/urbana), nivel educativo, proximidad de residencia al ganado, proximidad a una carretera inalterada y número de personas que duermen en la misma habitación. La diferencia general entre los dos entornos fue que los del hospital tenían enfermedades graves, mientras que los de la comunidad eran generalmente "saludables" pero exhibiendo síntomas de IRA (es decir, enfermedad leve). Los hisopos nasales fueron recolectados de los sujetos y almacenados en escudo de ADN/ARN (Zymo Research, Irvine, California). Las muestras recolectadas fueron clavadas y el hisopo extraído. Los residuos que contenían las muestras nasales fueron almacenados a -20 °C antes del análisis molecular. El ARN viral fue aislado usando ZR Viral ARN TM Kit (Zymo Research, Irvine, California) por instrucciones del fabricante (http://www.zymoresearch.com/downloads/dl/file/ id/147/r1034i.pdf ). El PCR en tiempo real (reacción en cadena de la polimerasa), comúnmente utilizado en los estudios ARI [10, 19, 27], se llevó a cabo entonces utilizando el kit de detección RV15 One Step ACE, los números de catálogo RV0716K01008007 y RV0717B011008001 (Seegene, Seúl, Corea del Sur) para la detección de 15 virus humanos: virus de la parainfluenza 1, 2, 3 y 4 (PIV1-4), virus respiratorios sincitiales (RSV) A y B, influenza A y B (FLUA, FLUB), rinovirus tipo A-C, adenovirus (ADV), coronavirus (OC 229 E/NL63, OC43), enterovirus (HEV), enterovirus (hMPV) y bocavirus (BoV). Los reactivos fueron validados en el lugar experimental utilizando un protocolo de validación incorporado para confirmar problemas de falsos resultados negativos y falsos positivos no fueron motivo de preocupación. La reacción de amplificación fue realizada según lo descrito por el fabricante: transcripción inversa 50 °C-30′, activación inicial 94°-15′, 45 ciclos: desnaturalización 94°-30′′, recocido 60°-1′ 30′′, extensión 72°-1, extensión final 72°-10′, retención 4°. La visualización se realizó utilizando electroforesis en un gel de agarosa del 2% en TBE 1X con EtBr, en presencia de marcadores RV15 OneStep A/B/C; marcador de peso molecular. El procesamiento del espectro no fue cegado ya que no hubo riesgo de sesgo experimental. Se utilizaron procedimientos estandarizados para el muestreo comunitario y clínico. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando la versión R 3.2.4. Se describen estadísticas univa Se evaluó la estadística bivariada (diferencia en proporciones) mediante una prueba de z de dos proporciones. Se consideró significativo un valor de p < 0,001. En este estudio no se observaron datos de ausencia para el análisis. La demografía básica de los participantes se resumió en los resultados de PCR que mostraron diez virus diferentes (influenza A, coronavirus OC 229 E/NL63, RSVA, RSV B, parainfluenza 1-4). La figura 1 muestra cómo estas infecciones se distribuyeron entre los tipos de virus, así como en las muestras de la comunidad frente a la clínica. En suma, un total de 33 de los 91 sujetos encuestados presentaron uno o más virus del tracto respiratorio (36,3%, IC 95% 26,6-47,0%, Fig. 1 ). Además, 10 de estos casos fueron infecciones triples y 5 fueron infecciones cuádruples (iltradas por color de barras en la figura 1 La figura 2 indica la frecuencia con la que se encontró cada par de virus en el mismo participante; las coinfecciones fueron más comunes entre el enterovirus y el virus de la parainfluenza 4 (fig. 2) ; además, se compararon y contrastaron los resultados clínicos y comunitarios; el virus de la parainfluenza 4, el virus respiratorio sincitial B y el enterovirus fueron los virus más comunes en la muestra clínica; estas tres infecciones resultaron en 41 virus detectados en 15 sujetos clínicamente y ocho infecciones detectadas en cinco personas de la comunidad; en conjunto infectaron al 94% (15/16, IC 95% 67-7-99,7 %) de los sujetos clínicos y al 7% (5/75, IC 95% 2,5-15,5%) de la comunidad (diferencia significativa, p < 0,001). El virus más común detectado en muestras comunitarias fue el coronavirus OC43; este virus se detectó en el 13,3% (95% IC 6,9-23,6%) de Sin embargo, se detectó una cepa diferente, el coronavirus OC 229 E/NL63 en el 12,5% de los sujetos clínicos (2/16, IC 95% 2,2-39,6%) y no detectados en la comunidad. Las infecciones dobles, triples y cuádruples fueron otra característica común de la nota. Se identificaron diez virus del tracto respiratorio diferentes entre los sujetos como se muestra en la figura 1. Las muestras recogidas en el hospital especializado para niños mostraron una tasa de prevalencia del 100% de infección con uno o más virus, lo que podría no ser sorprendente, ya que la diferencia básica entre la comunidad y las muestras clínicas fue un aumento de la gravedad de la enfermedad en la muestra clínica, lo que también puede explicar el alto nivel de coinfección encontrado entre los sujetos clínicos. Además, hubo una diferencia significativa entre la prevalencia de los virus más comunes en la muestra clínica (parainfluenza virus 4, sincitial respiratorio virus B y enterovirus) y su prevalencia en la comunidad. Finalmente, algunos de los virus detectados en este estudio no han sido detectados e implicados con IRAs en Nigeria. No hay reporte, a nuestro entender, que implique coronavirus en IRAs en Nigeria, y fue detectado en 12 sujetos en este estudio. Aunque los casos de infecciones dobles y triples fueron observados en un estudio en Nigeria en 2011 [28], por lo que sabemos, los reportes de infecciones cuádruples son raros y no han sido reportados anteriormente en Nigeria. Debido a la naturaleza única de los datos generados en este estudio y la novedad del trabajo en el entorno, no es posible comparar exactamente los resultados con otros estudios. Por ejemplo, aunque encontramos un estudio similar sobre IRAs en sujetos clínicos en Burkina Faso [27], debido al pequeño tamaño de la muestra de este estudio no sería posible inferir o comparar las tasas de prevalencia. Los estudios de etiología de ARI se han enfocado generalmente en áreas del mundo más desarrolladas [29], y es importante señalar que la disponibilidad de métodos de diagnóstico molecular empleados en este estudio mejora sustancialmente la capacidad de detectar virus que hasta ahora no se han detectado en Nigeria. Además, los hallazgos de este trabajo también se suman al creciente cuerpo de investigación que muestra el valor de los datos comunitarios en la vigilancia de enfermedades infecciosas [8]. Como la mayor parte del trabajo hasta la fecha ha sido en áreas de recursos más altos del mundo, este estudio añade perspectiva desde un área donde los recursos sanitarios son menores. En conclusión, los resultados de este estudio proporcionan evidencia para la vigilancia comunitaria activa para mejorar la vigilancia de la salud pública y la comprensión científica de Esto se debe no sólo a que una minoría de niños con infección grave son ingresados en el hospital en áreas como esta en Nigeria, sino también a los hallazgos de este estudio piloto que indican que la circulación viral en la comunidad no puede ser detectada clínicamente [29]. Este estudio piloto indica que en áreas de Nigeria, la etiología de las IRAs comprobadas a partir de muestras clínicas puede no representar a todas las IRAs que circulan en la comunidad. La principal limitación del estudio es el tamaño de la muestra. En particular, la muestra no es igual de representativa en todas las edades. Sin embargo, el tamaño de la muestra fue lo suficientemente grande como para determinar diferencias significativas en virus de origen comunitario y clínico, y proporciona una comprensión cualitativa de la etiología viral en muestras de la comunidad y clínica. Además, la muestra se concentró en gran medida en sujetos menores de 6 años, que se encuentran entre los grupos con mayor riesgo de Además, este estudio resultó en hallazgos únicos Dado que los recursos son limitados para la investigación y la práctica, esperamos que estos resultados piloto puedan motivar investigaciones sistemáticas adicionales sobre la mejor manera de utilizar los datos generados por la comunidad en la vigilancia de ARI. Los resultados de este estudio pueden informar a un estudio más amplio, representativo a través de la demografía y los lugares para evaluar sistemáticamente la etiología de las infecciones y las diferencias en las cohortes clínicas y comunitarias. Un estudio más amplio también permitirá tener en cuenta posibles factores de riesgo ambiental. Finalmente, aunque puede ser intuitivo, los resultados de este estudio piloto arrojaron luz sobre el alcance de las diferencias en los patrones de ARI, incluyendo diferentes tipos y cepas de virus circulantes. Además, debido a que se utilizó PCR para la detección viral, el estudio se limitó a la detección de virus en los conjuntos de primovacunación. El estudio fue concebido por RC y OK. RC y OK, MO y TD participaron en el diseño del estudio, que fue realizado por MO y TD. RC y OK analizaron los datos. RC y OK escribieron y revisaron el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

¿Cuál fue el virus más común detectado en los miembros de la comunidad en esta muestra?

Etiología de las infecciones del tracto respiratorio en la comunidad y la clínica en Ilorin, Nigeriahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5719735/SHA: f2e835d2cde5f42054dbd0c20d4060721135c518Autores: Kolawole, Olatunji; Oguntoye, Michael; Dam, Tina; Chunara, RumiFecha: 2017-12-07DOI: 10.1186/s13104-017-3063-1Licencia: cc-byAbstract: OBJETIVO: Reconociendo el creciente interés en la vigilancia de enfermedades comunitarias a nivel mundial, el objetivo de este estudio fue investigar si los virus respiratorios que circulan en la comunidad pueden estar representados a través de la vigilancia clínica (hospitalaria RESULTADOS: Los niños fueron seleccionados mediante muestreo de conveniencia de comunidades y un centro de atención terciaria (n = 91) durante la primavera de 2017 en Ilorin, Nigeria. Se recogieron y probaron hisopos nasales utilizando reacción en cadena de la polimerasa. La mayoría (79,1%) de los sujetos eran menores de 6 años, de los cuales 46 estaban infectados (63,9%). Un total de 33 de los 91 sujetos tenían uno o más virus del tracto respiratorio; hubo 10 casos de triple infección y 5 de cuádruple. El virus de la parainfluenza 4, el virus sincitial respiratorio B y el enterovirus fueron los virus más comunes en la muestra clínica; presentes en el 93,8% (15/16) de los sujetos clínicos, y el 6,7% (5/75) de los sujetos comunitarios (diferencia significativa, p < 0,001). Coronavirus OC43 fue el virus más común detectado en miembros de la Una cepa diferente, Coronavirus OC 229 E/NL63 fue detectada entre los sujetos de la clínica (2/16) y no detectada en la comunidad. Este estudio piloto proporciona evidencia de que los datos de la comunidad pueden potencialmente representar información diferente a la obtenida clínicamente, sugiriendo la necesidad de vigilancia comunitaria para mejorar los esfuerzos de salud pública y la comprensión científica de las infecciones respiratorias. Texto: Infecciones respiratorias agudas (ARIs) (la causa tanto de infecciones del tracto respiratorio superior (URIs) como de infecciones del tracto respiratorio inferior (IRS)) son una causa importante de muerte entre los niños menores de 5 años, particularmente en los países en desarrollo donde la carga de enfermedad es 2-5 veces mayor que en los países desarrollados [1]. Si bien estos virus suelen causar síntomas leves de tipo frío y pueden ser autolimitados, en los últimos años nuevos coronavirus como el síndrome respiratorio agudo grave (SARS) y el síndrome respiratorio del Oriente Medio En la actualidad, la mayoría de los brotes de enfermedades infecciosas registrados por la Organización Mundial de la Salud (OMS) se producen en el continente africano, donde existe un alto riesgo de transmisión [3, 4]. Además, en las zonas en desarrollo (tanto rurales como urbanas) hay factores de riesgo cada vez mayores, como las interfaces humano-animal (debido a la proximidad residencial al ganado). Estos cambios en los patrones epidemiológicos han dado lugar a una mejora de la vigilancia de las IRA, especialmente en los lugares de alto riesgo de transmisión [5]. Nigeria es uno de esos lugares con una alta prevalencia de muchos de los factores de riesgo implicados en las IRA entre los niños, entre ellos: edad, sexo, hacinamiento, estado nutricional, situación socioeconómica, y donde el estudio de las IRA es actualmente limitado [6]. Estos factores de riesgo amplios junto con recursos limitados han indicado la necesidad de iniciativas comunitarias de vigilancia e intervenciones [6, 7]. En Nigeria, los hospitales sólo son visitados cuando los síntomas son muy graves. Por lo tanto, se supone que la información viral del muestreo clínico es insuficiente para captar la incidencia de enfermedades en la población general o su previsibilidad a partir de los síntomas [8]. En todo el mundo, incluso en África oriental y meridional, se han centrado los esfuerzos en el desarrollo de métodos de vigilancia participativa de enfermedades basados en la comunidad [9] [10] [11] [12] [13]. Se han demostrado enfoques basados en la comunidad que son útiles para aprender más sobre las infecciones respiratorias emergentes, como la evaluación de la infrarreportación [14], los tipos de virus prevalentes en las comunidades [10], y la predicción de epidemias [15]. Al mismo tiempo, los avances en los métodos de identificación molecular han permitido realizar estudios sobre la aparición y epidemiología de virus ARI en muchos lugares (por ejemplo, los datos clínicos representan los casos más graves, y poliomavirus novedosos en Australia [16, 17], Centro Médico Erasmus del coronavirus humano (HCoV-EMC) en Oriente Medio y Reino Unido [18, 19], SARS en Canadá y China [20] [21] [22] ), sin embargo, la investigación sobre la epidemiología molecular de los virus ARI en Nigeria es limitada. Los métodos de diagnóstico disponibles y otras limitaciones tienen estudios limitados allí a encuestas serológicas de sólo unos pocos de estos virus y sólo en poblaciones clínicas [23, 24]. Así, la utilidad de la vigilancia basada en la comunidad puede ser apropiada en contextos como en Nigeria, y el propósito de este estudio piloto fue investigar si los casos clínicos pueden describir la imagen completa de ARI entre los niños en Nigeria. Realizamos un estudio transversal en tres centros comunitarios y uno clínico en Ilorin, Nigeria. Ilorin se encuentra en el estado de Kwara y es la sexta ciudad más grande de Nigeria por población [25]. Tres áreas de gobierno local (Ilorin East, Ilorin South e Ilorin West LGAs) fueron los sitios comunitarios y el Hospital de Especialistas Infantiles, Ilorin el sitio clínico. Se utilizó el muestreo de conveniencia para los fines de este estudio piloto, y se obtuvieron muestras del 28 de marzo al 5 de abril de 2017. Los criterios de inclusión fueron: niños menores de 14 años que tenían síntomas visibles de IRA dentro de las comunidades o aquellos confirmados en el hospital con IRA. Los criterios de exclusión fueron: niños de 14 años o más, sin mostrar signos de IRA y sujetos cuyos padres no dieron consentimiento. Veinticinco niños con síntomas fueron seleccionados cada uno de los tres lugares de la comunidad, mientras que 16 niños sintomáticos fueron muestreados del hospital. Se registró el tamaño total de la muestra (n = 91) con base en materiales y limitaciones de costos de procesamiento, así como para proporcionar muestras suficientes para permitir la comprensión descriptiva de los patrones de circulación viral estimados en otros estudios comunitarios [10]. Los Oficiales de Vigilancia y Notificación de Enfermedades, empleados por el Ministerio de Salud del Estado y familiarizados con las comunidades en este estudio, realizaron la recolección de muestras y datos. Se consideraron síntomas derivados de otros esfuerzos de vigilancia de IRA: dolor de garganta, fiebre, sofá, nariz, vómitos, dolor corporal, dolor en las piernas, náuseas, escalofríos, falta de aliento [10, 26]. Género y edad, tipo de área residencial (rural/urbana), nivel educativo, proximidad de residencia al ganado, proximidad a una carretera inalterada y número de personas que duermen en la misma habitación. La diferencia general entre los dos entornos fue que los del hospital tenían enfermedades graves, mientras que los de la comunidad eran generalmente "saludables" pero exhibiendo síntomas de IRA (es decir, enfermedad leve). Los hisopos nasales fueron recolectados de los sujetos y almacenados en escudo de ADN/ARN (Zymo Research, Irvine, California). Las muestras recolectadas fueron clavadas y el hisopo extraído. Los residuos que contenían las muestras nasales fueron almacenados a -20 °C antes del análisis molecular. El ARN viral fue aislado usando ZR Viral ARN TM Kit (Zymo Research, Irvine, California) por instrucciones del fabricante (http://www.zymoresearch.com/downloads/dl/file/ id/147/r1034i.pdf ). El PCR en tiempo real (reacción en cadena de la polimerasa), comúnmente utilizado en los estudios ARI [10, 19, 27], se llevó a cabo entonces utilizando el kit de detección RV15 One Step ACE, los números de catálogo RV0716K01008007 y RV0717B011008001 (Seegene, Seúl, Corea del Sur) para la detección de 15 virus humanos: virus de la parainfluenza 1, 2, 3 y 4 (PIV1-4), virus respiratorios sincitiales (RSV) A y B, influenza A y B (FLUA, FLUB), rinovirus tipo A-C, adenovirus (ADV), coronavirus (OC 229 E/NL63, OC43), enterovirus (HEV), enterovirus (hMPV) y bocavirus (BoV). Los reactivos fueron validados en el lugar experimental utilizando un protocolo de validación incorporado para confirmar problemas de falsos resultados negativos y falsos positivos no fueron motivo de preocupación. La reacción de amplificación fue realizada según lo descrito por el fabricante: transcripción inversa 50 °C-30′, activación inicial 94°-15′, 45 ciclos: desnaturalización 94°-30′′, recocido 60°-1′ 30′′, extensión 72°-1, extensión final 72°-10′, retención 4°. La visualización se realizó utilizando electroforesis en un gel de agarosa del 2% en TBE 1X con EtBr, en presencia de marcadores RV15 OneStep A/B/C; marcador de peso molecular. El procesamiento del espectro no fue cegado ya que no hubo riesgo de sesgo experimental. Se utilizaron procedimientos estandarizados para el muestreo comunitario y clínico. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando la versión R 3.2.4. Se describen estadísticas univa Se evaluó la estadística bivariada (diferencia en proporciones) mediante una prueba de z de dos proporciones. Se consideró significativo un valor de p < 0,001. En este estudio no se observaron datos de ausencia para el análisis. La demografía básica de los participantes se resumió en los resultados de PCR que mostraron diez virus diferentes (influenza A, coronavirus OC 229 E/NL63, RSVA, RSV B, parainfluenza 1-4). La figura 1 muestra cómo estas infecciones se distribuyeron entre los tipos de virus, así como en las muestras de la comunidad frente a la clínica. En suma, un total de 33 de los 91 sujetos encuestados presentaron uno o más virus del tracto respiratorio (36,3%, IC 95% 26,6-47,0%, Fig. 1 ). Además, 10 de estos casos fueron infecciones triples y 5 fueron infecciones cuádruples (iltradas por color de barras en la figura 1 La figura 2 indica la frecuencia con la que se encontró cada par de virus en el mismo participante; las coinfecciones fueron más comunes entre el enterovirus y el virus de la parainfluenza 4 (fig. 2) ; además, se compararon y contrastaron los resultados clínicos y comunitarios; el virus de la parainfluenza 4, el virus respiratorio sincitial B y el enterovirus fueron los virus más comunes en la muestra clínica; estas tres infecciones resultaron en 41 virus detectados en 15 sujetos clínicamente y ocho infecciones detectadas en cinco personas de la comunidad; en conjunto infectaron al 94% (15/16, IC 95% 67-7-99,7 %) de los sujetos clínicos y al 7% (5/75, IC 95% 2,5-15,5%) de la comunidad (diferencia significativa, p < 0,001). El virus más común detectado en muestras comunitarias fue el coronavirus OC43; este virus se detectó en el 13,3% (95% IC 6,9-23,6%) de Sin embargo, se detectó una cepa diferente, el coronavirus OC 229 E/NL63 en el 12,5% de los sujetos clínicos (2/16, IC 95% 2,2-39,6%) y no detectados en la comunidad. Las infecciones dobles, triples y cuádruples fueron otra característica común de la nota. Se identificaron diez virus del tracto respiratorio diferentes entre los sujetos como se muestra en la figura 1. Las muestras recogidas en el hospital especializado para niños mostraron una tasa de prevalencia del 100% de infección con uno o más virus, lo que podría no ser sorprendente, ya que la diferencia básica entre la comunidad y las muestras clínicas fue un aumento de la gravedad de la enfermedad en la muestra clínica, lo que también puede explicar el alto nivel de coinfección encontrado entre los sujetos clínicos. Además, hubo una diferencia significativa entre la prevalencia de los virus más comunes en la muestra clínica (parainfluenza virus 4, sincitial respiratorio virus B y enterovirus) y su prevalencia en la comunidad. Finalmente, algunos de los virus detectados en este estudio no han sido detectados e implicados con IRAs en Nigeria. No hay reporte, a nuestro entender, que implique coronavirus en IRAs en Nigeria, y fue detectado en 12 sujetos en este estudio. Aunque los casos de infecciones dobles y triples fueron observados en un estudio en Nigeria en 2011 [28], por lo que sabemos, los reportes de infecciones cuádruples son raros y no han sido reportados anteriormente en Nigeria. Debido a la naturaleza única de los datos generados en este estudio y la novedad del trabajo en el entorno, no es posible comparar exactamente los resultados con otros estudios. Por ejemplo, aunque encontramos un estudio similar sobre IRAs en sujetos clínicos en Burkina Faso [27], debido al pequeño tamaño de la muestra de este estudio no sería posible inferir o comparar las tasas de prevalencia. Los estudios de etiología de ARI se han enfocado generalmente en áreas del mundo más desarrolladas [29], y es importante señalar que la disponibilidad de métodos de diagnóstico molecular empleados en este estudio mejora sustancialmente la capacidad de detectar virus que hasta ahora no se han detectado en Nigeria. Además, los hallazgos de este trabajo también se suman al creciente cuerpo de investigación que muestra el valor de los datos comunitarios en la vigilancia de enfermedades infecciosas [8]. Como la mayor parte del trabajo hasta la fecha ha sido en áreas de recursos más altos del mundo, este estudio añade perspectiva desde un área donde los recursos sanitarios son menores. En conclusión, los resultados de este estudio proporcionan evidencia para la vigilancia comunitaria activa para mejorar la vigilancia de la salud pública y la comprensión científica de Esto se debe no sólo a que una minoría de niños con infección grave son ingresados en el hospital en áreas como esta en Nigeria, sino también a los hallazgos de este estudio piloto que indican que la circulación viral en la comunidad no puede ser detectada clínicamente [29]. Este estudio piloto indica que en áreas de Nigeria, la etiología de las IRAs comprobadas a partir de muestras clínicas puede no representar a todas las IRAs que circulan en la comunidad. La principal limitación del estudio es el tamaño de la muestra. En particular, la muestra no es igual de representativa en todas las edades. Sin embargo, el tamaño de la muestra fue lo suficientemente grande como para determinar diferencias significativas en virus de origen comunitario y clínico, y proporciona una comprensión cualitativa de la etiología viral en muestras de la comunidad y clínica. Además, la muestra se concentró en gran medida en sujetos menores de 6 años, que se encuentran entre los grupos con mayor riesgo de Además, este estudio resultó en hallazgos únicos Dado que los recursos son limitados para la investigación y la práctica, esperamos que estos resultados piloto puedan motivar investigaciones sistemáticas adicionales sobre la mejor manera de utilizar los datos generados por la comunidad en la vigilancia de ARI. Los resultados de este estudio pueden informar a un estudio más amplio, representativo a través de la demografía y los lugares para evaluar sistemáticamente la etiología de las infecciones y las diferencias en las cohortes clínicas y comunitarias. Un estudio más amplio también permitirá tener en cuenta posibles factores de riesgo ambiental. Finalmente, aunque puede ser intuitivo, los resultados de este estudio piloto arrojaron luz sobre el alcance de las diferencias en los patrones de ARI, incluyendo diferentes tipos y cepas de virus circulantes. Además, debido a que se utilizó PCR para la detección viral, el estudio se limitó a la detección de virus en los conjuntos de primovacunación. El estudio fue concebido por RC y OK. RC y OK, MO y TD participaron en el diseño del estudio, que fue realizado por MO y TD. RC y OK analizaron los datos. RC y OK escribieron y revisaron el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

¿Dónde se producen la mayoría de los brotes de enfermedades infecciosas?

Etiología de las infecciones del tracto respiratorio en la comunidad y la clínica en Ilorin, Nigeriahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5719735/SHA: f2e835d2cde5f42054dbd0c20d4060721135c518Autores: Kolawole, Olatunji; Oguntoye, Michael; Dam, Tina; Chunara, RumiFecha: 2017-12-07DOI: 10.1186/s13104-017-3063-1Licencia: cc-byAbstract: OBJETIVO: Reconociendo el creciente interés en la vigilancia de enfermedades comunitarias a nivel mundial, el objetivo de este estudio fue investigar si los virus respiratorios que circulan en la comunidad pueden estar representados a través de la vigilancia clínica (hospitalaria RESULTADOS: Los niños fueron seleccionados mediante muestreo de conveniencia de comunidades y un centro de atención terciaria (n = 91) durante la primavera de 2017 en Ilorin, Nigeria. Se recogieron y probaron hisopos nasales utilizando reacción en cadena de la polimerasa. La mayoría (79,1%) de los sujetos eran menores de 6 años, de los cuales 46 estaban infectados (63,9%). Un total de 33 de los 91 sujetos tenían uno o más virus del tracto respiratorio; hubo 10 casos de triple infección y 5 de cuádruple. El virus de la parainfluenza 4, el virus sincitial respiratorio B y el enterovirus fueron los virus más comunes en la muestra clínica; presentes en el 93,8% (15/16) de los sujetos clínicos, y el 6,7% (5/75) de los sujetos comunitarios (diferencia significativa, p < 0,001). Coronavirus OC43 fue el virus más común detectado en miembros de la Una cepa diferente, Coronavirus OC 229 E/NL63 fue detectada entre los sujetos de la clínica (2/16) y no detectada en la comunidad. Este estudio piloto proporciona evidencia de que los datos de la comunidad pueden potencialmente representar información diferente a la obtenida clínicamente, sugiriendo la necesidad de vigilancia comunitaria para mejorar los esfuerzos de salud pública y la comprensión científica de las infecciones respiratorias. Texto: Infecciones respiratorias agudas (ARIs) (la causa tanto de infecciones del tracto respiratorio superior (URIs) como de infecciones del tracto respiratorio inferior (IRS)) son una causa importante de muerte entre los niños menores de 5 años, particularmente en los países en desarrollo donde la carga de enfermedad es 2-5 veces mayor que en los países desarrollados [1]. Si bien estos virus suelen causar síntomas leves de tipo frío y pueden ser autolimitados, en los últimos años nuevos coronavirus como el síndrome respiratorio agudo grave (SARS) y el síndrome respiratorio del Oriente Medio En la actualidad, la mayoría de los brotes de enfermedades infecciosas registrados por la Organización Mundial de la Salud (OMS) se producen en el continente africano, donde existe un alto riesgo de transmisión [3, 4]. Además, en las zonas en desarrollo (tanto rurales como urbanas) hay factores de riesgo cada vez mayores, como las interfaces humano-animal (debido a la proximidad residencial al ganado). Estos cambios en los patrones epidemiológicos han dado lugar a una mejora de la vigilancia de las IRA, especialmente en los lugares de alto riesgo de transmisión [5]. Nigeria es uno de esos lugares con una alta prevalencia de muchos de los factores de riesgo implicados en las IRA entre los niños, entre ellos: edad, sexo, hacinamiento, estado nutricional, situación socioeconómica, y donde el estudio de las IRA es actualmente limitado [6]. Estos factores de riesgo amplios junto con recursos limitados han indicado la necesidad de iniciativas comunitarias de vigilancia e intervenciones [6, 7]. En Nigeria, los hospitales sólo son visitados cuando los síntomas son muy graves. Por lo tanto, se supone que la información viral del muestreo clínico es insuficiente para captar la incidencia de enfermedades en la población general o su previsibilidad a partir de los síntomas [8]. En todo el mundo, incluso en África oriental y meridional, se han centrado los esfuerzos en el desarrollo de métodos de vigilancia participativa de enfermedades basados en la comunidad [9] [10] [11] [12] [13]. Se han demostrado enfoques basados en la comunidad que son útiles para aprender más sobre las infecciones respiratorias emergentes, como la evaluación de la infrarreportación [14], los tipos de virus prevalentes en las comunidades [10], y la predicción de epidemias [15]. Al mismo tiempo, los avances en los métodos de identificación molecular han permitido realizar estudios sobre la aparición y epidemiología de virus ARI en muchos lugares (por ejemplo, los datos clínicos representan los casos más graves, y poliomavirus novedosos en Australia [16, 17], Centro Médico Erasmus del coronavirus humano (HCoV-EMC) en Oriente Medio y Reino Unido [18, 19], SARS en Canadá y China [20] [21] [22] ), sin embargo, la investigación sobre la epidemiología molecular de los virus ARI en Nigeria es limitada. Los métodos de diagnóstico disponibles y otras limitaciones tienen estudios limitados allí a encuestas serológicas de sólo unos pocos de estos virus y sólo en poblaciones clínicas [23, 24]. Así, la utilidad de la vigilancia basada en la comunidad puede ser apropiada en contextos como en Nigeria, y el propósito de este estudio piloto fue investigar si los casos clínicos pueden describir la imagen completa de ARI entre los niños en Nigeria. Realizamos un estudio transversal en tres centros comunitarios y uno clínico en Ilorin, Nigeria. Ilorin se encuentra en el estado de Kwara y es la sexta ciudad más grande de Nigeria por población [25]. Tres áreas de gobierno local (Ilorin East, Ilorin South e Ilorin West LGAs) fueron los sitios comunitarios y el Hospital de Especialistas Infantiles, Ilorin el sitio clínico. Se utilizó el muestreo de conveniencia para los fines de este estudio piloto, y se obtuvieron muestras del 28 de marzo al 5 de abril de 2017. Los criterios de inclusión fueron: niños menores de 14 años que tenían síntomas visibles de IRA dentro de las comunidades o aquellos confirmados en el hospital con IRA. Los criterios de exclusión fueron: niños de 14 años o más, sin mostrar signos de IRA y sujetos cuyos padres no dieron consentimiento. Veinticinco niños con síntomas fueron seleccionados cada uno de los tres lugares de la comunidad, mientras que 16 niños sintomáticos fueron muestreados del hospital. Se registró el tamaño total de la muestra (n = 91) con base en materiales y limitaciones de costos de procesamiento, así como para proporcionar muestras suficientes para permitir la comprensión descriptiva de los patrones de circulación viral estimados en otros estudios comunitarios [10]. Los Oficiales de Vigilancia y Notificación de Enfermedades, empleados por el Ministerio de Salud del Estado y familiarizados con las comunidades en este estudio, realizaron la recolección de muestras y datos. Se consideraron síntomas derivados de otros esfuerzos de vigilancia de IRA: dolor de garganta, fiebre, sofá, nariz, vómitos, dolor corporal, dolor en las piernas, náuseas, escalofríos, falta de aliento [10, 26]. Género y edad, tipo de área residencial (rural/urbana), nivel educativo, proximidad de residencia al ganado, proximidad a una carretera inalterada y número de personas que duermen en la misma habitación. La diferencia general entre los dos entornos fue que los del hospital tenían enfermedades graves, mientras que los de la comunidad eran generalmente "saludables" pero exhibiendo síntomas de IRA (es decir, enfermedad leve). Los hisopos nasales fueron recolectados de los sujetos y almacenados en escudo de ADN/ARN (Zymo Research, Irvine, California). Las muestras recolectadas fueron clavadas y el hisopo extraído. Los residuos que contenían las muestras nasales fueron almacenados a -20 °C antes del análisis molecular. El ARN viral fue aislado usando ZR Viral ARN TM Kit (Zymo Research, Irvine, California) por instrucciones del fabricante (http://www.zymoresearch.com/downloads/dl/file/ id/147/r1034i.pdf ). El PCR en tiempo real (reacción en cadena de la polimerasa), comúnmente utilizado en los estudios ARI [10, 19, 27], se llevó a cabo entonces utilizando el kit de detección RV15 One Step ACE, los números de catálogo RV0716K01008007 y RV0717B011008001 (Seegene, Seúl, Corea del Sur) para la detección de 15 virus humanos: virus de la parainfluenza 1, 2, 3 y 4 (PIV1-4), virus respiratorios sincitiales (RSV) A y B, influenza A y B (FLUA, FLUB), rinovirus tipo A-C, adenovirus (ADV), coronavirus (OC 229 E/NL63, OC43), enterovirus (HEV), enterovirus (hMPV) y bocavirus (BoV). Los reactivos fueron validados en el lugar experimental utilizando un protocolo de validación incorporado para confirmar problemas de falsos resultados negativos y falsos positivos no fueron motivo de preocupación. La reacción de amplificación fue realizada según lo descrito por el fabricante: transcripción inversa 50 °C-30′, activación inicial 94°-15′, 45 ciclos: desnaturalización 94°-30′′, recocido 60°-1′ 30′′, extensión 72°-1, extensión final 72°-10′, retención 4°. La visualización se realizó utilizando electroforesis en un gel de agarosa del 2% en TBE 1X con EtBr, en presencia de marcadores RV15 OneStep A/B/C; marcador de peso molecular. El procesamiento del espectro no fue cegado ya que no hubo riesgo de sesgo experimental. Se utilizaron procedimientos estandarizados para el muestreo comunitario y clínico. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando la versión R 3.2.4. Se describen estadísticas univa Se evaluó la estadística bivariada (diferencia en proporciones) mediante una prueba de z de dos proporciones. Se consideró significativo un valor de p < 0,001. En este estudio no se observaron datos de ausencia para el análisis. La demografía básica de los participantes se resumió en los resultados de PCR que mostraron diez virus diferentes (influenza A, coronavirus OC 229 E/NL63, RSVA, RSV B, parainfluenza 1-4). La figura 1 muestra cómo estas infecciones se distribuyeron entre los tipos de virus, así como en las muestras de la comunidad frente a la clínica. En suma, un total de 33 de los 91 sujetos encuestados presentaron uno o más virus del tracto respiratorio (36,3%, IC 95% 26,6-47,0%, Fig. 1 ). Además, 10 de estos casos fueron infecciones triples y 5 fueron infecciones cuádruples (iltradas por color de barras en la figura 1 La figura 2 indica la frecuencia con la que se encontró cada par de virus en el mismo participante; las coinfecciones fueron más comunes entre el enterovirus y el virus de la parainfluenza 4 (fig. 2) ; además, se compararon y contrastaron los resultados clínicos y comunitarios; el virus de la parainfluenza 4, el virus respiratorio sincitial B y el enterovirus fueron los virus más comunes en la muestra clínica; estas tres infecciones resultaron en 41 virus detectados en 15 sujetos clínicamente y ocho infecciones detectadas en cinco personas de la comunidad; en conjunto infectaron al 94% (15/16, IC 95% 67-7-99,7 %) de los sujetos clínicos y al 7% (5/75, IC 95% 2,5-15,5%) de la comunidad (diferencia significativa, p < 0,001). El virus más común detectado en muestras comunitarias fue el coronavirus OC43; este virus se detectó en el 13,3% (95% IC 6,9-23,6%) de Sin embargo, se detectó una cepa diferente, el coronavirus OC 229 E/NL63 en el 12,5% de los sujetos clínicos (2/16, IC 95% 2,2-39,6%) y no detectados en la comunidad. Las infecciones dobles, triples y cuádruples fueron otra característica común de la nota. Se identificaron diez virus del tracto respiratorio diferentes entre los sujetos como se muestra en la figura 1. Las muestras recogidas en el hospital especializado para niños mostraron una tasa de prevalencia del 100% de infección con uno o más virus, lo que podría no ser sorprendente, ya que la diferencia básica entre la comunidad y las muestras clínicas fue un aumento de la gravedad de la enfermedad en la muestra clínica, lo que también puede explicar el alto nivel de coinfección encontrado entre los sujetos clínicos. Además, hubo una diferencia significativa entre la prevalencia de los virus más comunes en la muestra clínica (parainfluenza virus 4, sincitial respiratorio virus B y enterovirus) y su prevalencia en la comunidad. Finalmente, algunos de los virus detectados en este estudio no han sido detectados e implicados con IRAs en Nigeria. No hay reporte, a nuestro entender, que implique coronavirus en IRAs en Nigeria, y fue detectado en 12 sujetos en este estudio. Aunque los casos de infecciones dobles y triples fueron observados en un estudio en Nigeria en 2011 [28], por lo que sabemos, los reportes de infecciones cuádruples son raros y no han sido reportados anteriormente en Nigeria. Debido a la naturaleza única de los datos generados en este estudio y la novedad del trabajo en el entorno, no es posible comparar exactamente los resultados con otros estudios. Por ejemplo, aunque encontramos un estudio similar sobre IRAs en sujetos clínicos en Burkina Faso [27], debido al pequeño tamaño de la muestra de este estudio no sería posible inferir o comparar las tasas de prevalencia. Los estudios de etiología de ARI se han enfocado generalmente en áreas del mundo más desarrolladas [29], y es importante señalar que la disponibilidad de métodos de diagnóstico molecular empleados en este estudio mejora sustancialmente la capacidad de detectar virus que hasta ahora no se han detectado en Nigeria. Además, los hallazgos de este trabajo también se suman al creciente cuerpo de investigación que muestra el valor de los datos comunitarios en la vigilancia de enfermedades infecciosas [8]. Como la mayor parte del trabajo hasta la fecha ha sido en áreas de recursos más altos del mundo, este estudio añade perspectiva desde un área donde los recursos sanitarios son menores. En conclusión, los resultados de este estudio proporcionan evidencia para la vigilancia comunitaria activa para mejorar la vigilancia de la salud pública y la comprensión científica de Esto se debe no sólo a que una minoría de niños con infección grave son ingresados en el hospital en áreas como esta en Nigeria, sino también a los hallazgos de este estudio piloto que indican que la circulación viral en la comunidad no puede ser detectada clínicamente [29]. Este estudio piloto indica que en áreas de Nigeria, la etiología de las IRAs comprobadas a partir de muestras clínicas puede no representar a todas las IRAs que circulan en la comunidad. La principal limitación del estudio es el tamaño de la muestra. En particular, la muestra no es igual de representativa en todas las edades. Sin embargo, el tamaño de la muestra fue lo suficientemente grande como para determinar diferencias significativas en virus de origen comunitario y clínico, y proporciona una comprensión cualitativa de la etiología viral en muestras de la comunidad y clínica. Además, la muestra se concentró en gran medida en sujetos menores de 6 años, que se encuentran entre los grupos con mayor riesgo de Además, este estudio resultó en hallazgos únicos Dado que los recursos son limitados para la investigación y la práctica, esperamos que estos resultados piloto puedan motivar investigaciones sistemáticas adicionales sobre la mejor manera de utilizar los datos generados por la comunidad en la vigilancia de ARI. Los resultados de este estudio pueden informar a un estudio más amplio, representativo a través de la demografía y los lugares para evaluar sistemáticamente la etiología de las infecciones y las diferencias en las cohortes clínicas y comunitarias. Un estudio más amplio también permitirá tener en cuenta posibles factores de riesgo ambiental. Finalmente, aunque puede ser intuitivo, los resultados de este estudio piloto arrojaron luz sobre el alcance de las diferencias en los patrones de ARI, incluyendo diferentes tipos y cepas de virus circulantes. Además, debido a que se utilizó PCR para la detección viral, el estudio se limitó a la detección de virus en los conjuntos de primovacunación. El estudio fue concebido por RC y OK. RC y OK, MO y TD participaron en el diseño del estudio, que fue realizado por MO y TD. RC y OK analizaron los datos. RC y OK escribieron y revisaron el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

¿Cuáles son algunos factores de riesgo para que los países experimenten una alta prevalencia de infecciones respiratorias agudas?

Etiología de las infecciones del tracto respiratorio en la comunidad y la clínica en Ilorin, Nigeriahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5719735/SHA: f2e835d2cde5f42054dbd0c20d4060721135c518Autores: Kolawole, Olatunji; Oguntoye, Michael; Dam, Tina; Chunara, RumiFecha: 2017-12-07DOI: 10.1186/s13104-017-3063-1Licencia: cc-byAbstract: OBJETIVO: Reconociendo el creciente interés en la vigilancia de enfermedades comunitarias a nivel mundial, el objetivo de este estudio fue investigar si los virus respiratorios que circulan en la comunidad pueden estar representados a través de la vigilancia clínica (hospitalaria RESULTADOS: Los niños fueron seleccionados mediante muestreo de conveniencia de comunidades y un centro de atención terciaria (n = 91) durante la primavera de 2017 en Ilorin, Nigeria. Se recogieron y probaron hisopos nasales utilizando reacción en cadena de la polimerasa. La mayoría (79,1%) de los sujetos eran menores de 6 años, de los cuales 46 estaban infectados (63,9%). Un total de 33 de los 91 sujetos tenían uno o más virus del tracto respiratorio; hubo 10 casos de triple infección y 5 de cuádruple. El virus de la parainfluenza 4, el virus sincitial respiratorio B y el enterovirus fueron los virus más comunes en la muestra clínica; presentes en el 93,8% (15/16) de los sujetos clínicos, y el 6,7% (5/75) de los sujetos comunitarios (diferencia significativa, p < 0,001). Coronavirus OC43 fue el virus más común detectado en miembros de la Una cepa diferente, Coronavirus OC 229 E/NL63 fue detectada entre los sujetos de la clínica (2/16) y no detectada en la comunidad. Este estudio piloto proporciona evidencia de que los datos de la comunidad pueden potencialmente representar información diferente a la obtenida clínicamente, sugiriendo la necesidad de vigilancia comunitaria para mejorar los esfuerzos de salud pública y la comprensión científica de las infecciones respiratorias. Texto: Infecciones respiratorias agudas (ARIs) (la causa tanto de infecciones del tracto respiratorio superior (URIs) como de infecciones del tracto respiratorio inferior (IRS)) son una causa importante de muerte entre los niños menores de 5 años, particularmente en los países en desarrollo donde la carga de enfermedad es 2-5 veces mayor que en los países desarrollados [1]. Si bien estos virus suelen causar síntomas leves de tipo frío y pueden ser autolimitados, en los últimos años nuevos coronavirus como el síndrome respiratorio agudo grave (SARS) y el síndrome respiratorio del Oriente Medio En la actualidad, la mayoría de los brotes de enfermedades infecciosas registrados por la Organización Mundial de la Salud (OMS) se producen en el continente africano, donde existe un alto riesgo de transmisión [3, 4]. Además, en las zonas en desarrollo (tanto rurales como urbanas) hay factores de riesgo cada vez mayores, como las interfaces humano-animal (debido a la proximidad residencial al ganado). Estos cambios en los patrones epidemiológicos han dado lugar a una mejora de la vigilancia de las IRA, especialmente en los lugares de alto riesgo de transmisión [5]. Nigeria es uno de esos lugares con una alta prevalencia de muchos de los factores de riesgo implicados en las IRA entre los niños, entre ellos: edad, sexo, hacinamiento, estado nutricional, situación socioeconómica, y donde el estudio de las IRA es actualmente limitado [6]. Estos factores de riesgo amplios junto con recursos limitados han indicado la necesidad de iniciativas comunitarias de vigilancia e intervenciones [6, 7]. En Nigeria, los hospitales sólo son visitados cuando los síntomas son muy graves. Por lo tanto, se supone que la información viral del muestreo clínico es insuficiente para captar la incidencia de enfermedades en la población general o su previsibilidad a partir de los síntomas [8]. En todo el mundo, incluso en África oriental y meridional, se han centrado los esfuerzos en el desarrollo de métodos de vigilancia participativa de enfermedades basados en la comunidad [9] [10] [11] [12] [13]. Se han demostrado enfoques basados en la comunidad que son útiles para aprender más sobre las infecciones respiratorias emergentes, como la evaluación de la infrarreportación [14], los tipos de virus prevalentes en las comunidades [10], y la predicción de epidemias [15]. Al mismo tiempo, los avances en los métodos de identificación molecular han permitido realizar estudios sobre la aparición y epidemiología de virus ARI en muchos lugares (por ejemplo, los datos clínicos representan los casos más graves, y poliomavirus novedosos en Australia [16, 17], Centro Médico Erasmus del coronavirus humano (HCoV-EMC) en Oriente Medio y Reino Unido [18, 19], SARS en Canadá y China [20] [21] [22] ), sin embargo, la investigación sobre la epidemiología molecular de los virus ARI en Nigeria es limitada. Los métodos de diagnóstico disponibles y otras limitaciones tienen estudios limitados allí a encuestas serológicas de sólo unos pocos de estos virus y sólo en poblaciones clínicas [23, 24]. Así, la utilidad de la vigilancia basada en la comunidad puede ser apropiada en contextos como en Nigeria, y el propósito de este estudio piloto fue investigar si los casos clínicos pueden describir la imagen completa de ARI entre los niños en Nigeria. Realizamos un estudio transversal en tres centros comunitarios y uno clínico en Ilorin, Nigeria. Ilorin se encuentra en el estado de Kwara y es la sexta ciudad más grande de Nigeria por población [25]. Tres áreas de gobierno local (Ilorin East, Ilorin South e Ilorin West LGAs) fueron los sitios comunitarios y el Hospital de Especialistas Infantiles, Ilorin el sitio clínico. Se utilizó el muestreo de conveniencia para los fines de este estudio piloto, y se obtuvieron muestras del 28 de marzo al 5 de abril de 2017. Los criterios de inclusión fueron: niños menores de 14 años que tenían síntomas visibles de IRA dentro de las comunidades o aquellos confirmados en el hospital con IRA. Los criterios de exclusión fueron: niños de 14 años o más, sin mostrar signos de IRA y sujetos cuyos padres no dieron consentimiento. Veinticinco niños con síntomas fueron seleccionados cada uno de los tres lugares de la comunidad, mientras que 16 niños sintomáticos fueron muestreados del hospital. Se registró el tamaño total de la muestra (n = 91) con base en materiales y limitaciones de costos de procesamiento, así como para proporcionar muestras suficientes para permitir la comprensión descriptiva de los patrones de circulación viral estimados en otros estudios comunitarios [10]. Los Oficiales de Vigilancia y Notificación de Enfermedades, empleados por el Ministerio de Salud del Estado y familiarizados con las comunidades en este estudio, realizaron la recolección de muestras y datos. Se consideraron síntomas derivados de otros esfuerzos de vigilancia de IRA: dolor de garganta, fiebre, sofá, nariz, vómitos, dolor corporal, dolor en las piernas, náuseas, escalofríos, falta de aliento [10, 26]. Género y edad, tipo de área residencial (rural/urbana), nivel educativo, proximidad de residencia al ganado, proximidad a una carretera inalterada y número de personas que duermen en la misma habitación. La diferencia general entre los dos entornos fue que los del hospital tenían enfermedades graves, mientras que los de la comunidad eran generalmente "saludables" pero exhibiendo síntomas de IRA (es decir, enfermedad leve). Los hisopos nasales fueron recolectados de los sujetos y almacenados en escudo de ADN/ARN (Zymo Research, Irvine, California). Las muestras recolectadas fueron clavadas y el hisopo extraído. Los residuos que contenían las muestras nasales fueron almacenados a -20 °C antes del análisis molecular. El ARN viral fue aislado usando ZR Viral ARN TM Kit (Zymo Research, Irvine, California) por instrucciones del fabricante (http://www.zymoresearch.com/downloads/dl/file/ id/147/r1034i.pdf ). El PCR en tiempo real (reacción en cadena de la polimerasa), comúnmente utilizado en los estudios ARI [10, 19, 27], se llevó a cabo entonces utilizando el kit de detección RV15 One Step ACE, los números de catálogo RV0716K01008007 y RV0717B011008001 (Seegene, Seúl, Corea del Sur) para la detección de 15 virus humanos: virus de la parainfluenza 1, 2, 3 y 4 (PIV1-4), virus respiratorios sincitiales (RSV) A y B, influenza A y B (FLUA, FLUB), rinovirus tipo A-C, adenovirus (ADV), coronavirus (OC 229 E/NL63, OC43), enterovirus (HEV), enterovirus (hMPV) y bocavirus (BoV). Los reactivos fueron validados en el lugar experimental utilizando un protocolo de validación incorporado para confirmar problemas de falsos resultados negativos y falsos positivos no fueron motivo de preocupación. La reacción de amplificación fue realizada según lo descrito por el fabricante: transcripción inversa 50 °C-30′, activación inicial 94°-15′, 45 ciclos: desnaturalización 94°-30′′, recocido 60°-1′ 30′′, extensión 72°-1, extensión final 72°-10′, retención 4°. La visualización se realizó utilizando electroforesis en un gel de agarosa del 2% en TBE 1X con EtBr, en presencia de marcadores RV15 OneStep A/B/C; marcador de peso molecular. El procesamiento del espectro no fue cegado ya que no hubo riesgo de sesgo experimental. Se utilizaron procedimientos estandarizados para el muestreo comunitario y clínico. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando la versión R 3.2.4. Se describen estadísticas univa Se evaluó la estadística bivariada (diferencia en proporciones) mediante una prueba de z de dos proporciones. Se consideró significativo un valor de p < 0,001. En este estudio no se observaron datos de ausencia para el análisis. La demografía básica de los participantes se resumió en los resultados de PCR que mostraron diez virus diferentes (influenza A, coronavirus OC 229 E/NL63, RSVA, RSV B, parainfluenza 1-4). La figura 1 muestra cómo estas infecciones se distribuyeron entre los tipos de virus, así como en las muestras de la comunidad frente a la clínica. En suma, un total de 33 de los 91 sujetos encuestados presentaron uno o más virus del tracto respiratorio (36,3%, IC 95% 26,6-47,0%, Fig. 1 ). Además, 10 de estos casos fueron infecciones triples y 5 fueron infecciones cuádruples (iltradas por color de barras en la figura 1 La figura 2 indica la frecuencia con la que se encontró cada par de virus en el mismo participante; las coinfecciones fueron más comunes entre el enterovirus y el virus de la parainfluenza 4 (fig. 2) ; además, se compararon y contrastaron los resultados clínicos y comunitarios; el virus de la parainfluenza 4, el virus respiratorio sincitial B y el enterovirus fueron los virus más comunes en la muestra clínica; estas tres infecciones resultaron en 41 virus detectados en 15 sujetos clínicamente y ocho infecciones detectadas en cinco personas de la comunidad; en conjunto infectaron al 94% (15/16, IC 95% 67-7-99,7 %) de los sujetos clínicos y al 7% (5/75, IC 95% 2,5-15,5%) de la comunidad (diferencia significativa, p < 0,001). El virus más común detectado en muestras comunitarias fue el coronavirus OC43; este virus se detectó en el 13,3% (95% IC 6,9-23,6%) de Sin embargo, se detectó una cepa diferente, el coronavirus OC 229 E/NL63 en el 12,5% de los sujetos clínicos (2/16, IC 95% 2,2-39,6%) y no detectados en la comunidad. Las infecciones dobles, triples y cuádruples fueron otra característica común de la nota. Se identificaron diez virus del tracto respiratorio diferentes entre los sujetos como se muestra en la figura 1. Las muestras recogidas en el hospital especializado para niños mostraron una tasa de prevalencia del 100% de infección con uno o más virus, lo que podría no ser sorprendente, ya que la diferencia básica entre la comunidad y las muestras clínicas fue un aumento de la gravedad de la enfermedad en la muestra clínica, lo que también puede explicar el alto nivel de coinfección encontrado entre los sujetos clínicos. Además, hubo una diferencia significativa entre la prevalencia de los virus más comunes en la muestra clínica (parainfluenza virus 4, sincitial respiratorio virus B y enterovirus) y su prevalencia en la comunidad. Finalmente, algunos de los virus detectados en este estudio no han sido detectados e implicados con IRAs en Nigeria. No hay reporte, a nuestro entender, que implique coronavirus en IRAs en Nigeria, y fue detectado en 12 sujetos en este estudio. Aunque los casos de infecciones dobles y triples fueron observados en un estudio en Nigeria en 2011 [28], por lo que sabemos, los reportes de infecciones cuádruples son raros y no han sido reportados anteriormente en Nigeria. Debido a la naturaleza única de los datos generados en este estudio y la novedad del trabajo en el entorno, no es posible comparar exactamente los resultados con otros estudios. Por ejemplo, aunque encontramos un estudio similar sobre IRAs en sujetos clínicos en Burkina Faso [27], debido al pequeño tamaño de la muestra de este estudio no sería posible inferir o comparar las tasas de prevalencia. Los estudios de etiología de ARI se han enfocado generalmente en áreas del mundo más desarrolladas [29], y es importante señalar que la disponibilidad de métodos de diagnóstico molecular empleados en este estudio mejora sustancialmente la capacidad de detectar virus que hasta ahora no se han detectado en Nigeria. Además, los hallazgos de este trabajo también se suman al creciente cuerpo de investigación que muestra el valor de los datos comunitarios en la vigilancia de enfermedades infecciosas [8]. Como la mayor parte del trabajo hasta la fecha ha sido en áreas de recursos más altos del mundo, este estudio añade perspectiva desde un área donde los recursos sanitarios son menores. En conclusión, los resultados de este estudio proporcionan evidencia para la vigilancia comunitaria activa para mejorar la vigilancia de la salud pública y la comprensión científica de Esto se debe no sólo a que una minoría de niños con infección grave son ingresados en el hospital en áreas como esta en Nigeria, sino también a los hallazgos de este estudio piloto que indican que la circulación viral en la comunidad no puede ser detectada clínicamente [29]. Este estudio piloto indica que en áreas de Nigeria, la etiología de las IRAs comprobadas a partir de muestras clínicas puede no representar a todas las IRAs que circulan en la comunidad. La principal limitación del estudio es el tamaño de la muestra. En particular, la muestra no es igual de representativa en todas las edades. Sin embargo, el tamaño de la muestra fue lo suficientemente grande como para determinar diferencias significativas en virus de origen comunitario y clínico, y proporciona una comprensión cualitativa de la etiología viral en muestras de la comunidad y clínica. Además, la muestra se concentró en gran medida en sujetos menores de 6 años, que se encuentran entre los grupos con mayor riesgo de Además, este estudio resultó en hallazgos únicos Dado que los recursos son limitados para la investigación y la práctica, esperamos que estos resultados piloto puedan motivar investigaciones sistemáticas adicionales sobre la mejor manera de utilizar los datos generados por la comunidad en la vigilancia de ARI. Los resultados de este estudio pueden informar a un estudio más amplio, representativo a través de la demografía y los lugares para evaluar sistemáticamente la etiología de las infecciones y las diferencias en las cohortes clínicas y comunitarias. Un estudio más amplio también permitirá tener en cuenta posibles factores de riesgo ambiental. Finalmente, aunque puede ser intuitivo, los resultados de este estudio piloto arrojaron luz sobre el alcance de las diferencias en los patrones de ARI, incluyendo diferentes tipos y cepas de virus circulantes. Además, debido a que se utilizó PCR para la detección viral, el estudio se limitó a la detección de virus en los conjuntos de primovacunación. El estudio fue concebido por RC y OK. RC y OK, MO y TD participaron en el diseño del estudio, que fue realizado por MO y TD. RC y OK analizaron los datos. RC y OK escribieron y revisaron el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

¿Cuál fue el virus más común detectado en muestras comunitarias en Ilorin, Nigeria?

Etiología de las infecciones del tracto respiratorio en la comunidad y la clínica en Ilorin, Nigeriahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5719735/SHA: f2e835d2cde5f42054dbd0c20d4060721135c518Autores: Kolawole, Olatunji; Oguntoye, Michael; Dam, Tina; Chunara, RumiFecha: 2017-12-07DOI: 10.1186/s13104-017-3063-1Licencia: cc-byAbstract: OBJETIVO: Reconociendo el creciente interés en la vigilancia de enfermedades comunitarias a nivel mundial, el objetivo de este estudio fue investigar si los virus respiratorios que circulan en la comunidad pueden estar representados a través de la vigilancia clínica (hospitalaria RESULTADOS: Los niños fueron seleccionados mediante muestreo de conveniencia de comunidades y un centro de atención terciaria (n = 91) durante la primavera de 2017 en Ilorin, Nigeria. Se recogieron y probaron hisopos nasales utilizando reacción en cadena de la polimerasa. La mayoría (79,1%) de los sujetos eran menores de 6 años, de los cuales 46 estaban infectados (63,9%). Un total de 33 de los 91 sujetos tenían uno o más virus del tracto respiratorio; hubo 10 casos de triple infección y 5 de cuádruple. El virus de la parainfluenza 4, el virus sincitial respiratorio B y el enterovirus fueron los virus más comunes en la muestra clínica; presentes en el 93,8% (15/16) de los sujetos clínicos, y el 6,7% (5/75) de los sujetos comunitarios (diferencia significativa, p < 0,001). Coronavirus OC43 fue el virus más común detectado en miembros de la Una cepa diferente, Coronavirus OC 229 E/NL63 fue detectada entre los sujetos de la clínica (2/16) y no detectada en la comunidad. Este estudio piloto proporciona evidencia de que los datos de la comunidad pueden potencialmente representar información diferente a la obtenida clínicamente, sugiriendo la necesidad de vigilancia comunitaria para mejorar los esfuerzos de salud pública y la comprensión científica de las infecciones respiratorias. Texto: Infecciones respiratorias agudas (ARIs) (la causa tanto de infecciones del tracto respiratorio superior (URIs) como de infecciones del tracto respiratorio inferior (IRS)) son una causa importante de muerte entre los niños menores de 5 años, particularmente en los países en desarrollo donde la carga de enfermedad es 2-5 veces mayor que en los países desarrollados [1]. Si bien estos virus suelen causar síntomas leves de tipo frío y pueden ser autolimitados, en los últimos años nuevos coronavirus como el síndrome respiratorio agudo grave (SARS) y el síndrome respiratorio del Oriente Medio En la actualidad, la mayoría de los brotes de enfermedades infecciosas registrados por la Organización Mundial de la Salud (OMS) se producen en el continente africano, donde existe un alto riesgo de transmisión [3, 4]. Además, en las zonas en desarrollo (tanto rurales como urbanas) hay factores de riesgo cada vez mayores, como las interfaces humano-animal (debido a la proximidad residencial al ganado). Estos cambios en los patrones epidemiológicos han dado lugar a una mejora de la vigilancia de las IRA, especialmente en los lugares de alto riesgo de transmisión [5]. Nigeria es uno de esos lugares con una alta prevalencia de muchos de los factores de riesgo implicados en las IRA entre los niños, entre ellos: edad, sexo, hacinamiento, estado nutricional, situación socioeconómica, y donde el estudio de las IRA es actualmente limitado [6]. Estos factores de riesgo amplios junto con recursos limitados han indicado la necesidad de iniciativas comunitarias de vigilancia e intervenciones [6, 7]. En Nigeria, los hospitales sólo son visitados cuando los síntomas son muy graves. Por lo tanto, se supone que la información viral del muestreo clínico es insuficiente para captar la incidencia de enfermedades en la población general o su previsibilidad a partir de los síntomas [8]. En todo el mundo, incluso en África oriental y meridional, se han centrado los esfuerzos en el desarrollo de métodos de vigilancia participativa de enfermedades basados en la comunidad [9] [10] [11] [12] [13]. Se han demostrado enfoques basados en la comunidad que son útiles para aprender más sobre las infecciones respiratorias emergentes, como la evaluación de la infrarreportación [14], los tipos de virus prevalentes en las comunidades [10], y la predicción de epidemias [15]. Al mismo tiempo, los avances en los métodos de identificación molecular han permitido realizar estudios sobre la aparición y epidemiología de virus ARI en muchos lugares (por ejemplo, los datos clínicos representan los casos más graves, y poliomavirus novedosos en Australia [16, 17], Centro Médico Erasmus del coronavirus humano (HCoV-EMC) en Oriente Medio y Reino Unido [18, 19], SARS en Canadá y China [20] [21] [22] ), sin embargo, la investigación sobre la epidemiología molecular de los virus ARI en Nigeria es limitada. Los métodos de diagnóstico disponibles y otras limitaciones tienen estudios limitados allí a encuestas serológicas de sólo unos pocos de estos virus y sólo en poblaciones clínicas [23, 24]. Así, la utilidad de la vigilancia basada en la comunidad puede ser apropiada en contextos como en Nigeria, y el propósito de este estudio piloto fue investigar si los casos clínicos pueden describir la imagen completa de ARI entre los niños en Nigeria. Realizamos un estudio transversal en tres centros comunitarios y uno clínico en Ilorin, Nigeria. Ilorin se encuentra en el estado de Kwara y es la sexta ciudad más grande de Nigeria por población [25]. Tres áreas de gobierno local (Ilorin East, Ilorin South e Ilorin West LGAs) fueron los sitios comunitarios y el Hospital de Especialistas Infantiles, Ilorin el sitio clínico. Se utilizó el muestreo de conveniencia para los fines de este estudio piloto, y se obtuvieron muestras del 28 de marzo al 5 de abril de 2017. Los criterios de inclusión fueron: niños menores de 14 años que tenían síntomas visibles de IRA dentro de las comunidades o aquellos confirmados en el hospital con IRA. Los criterios de exclusión fueron: niños de 14 años o más, sin mostrar signos de IRA y sujetos cuyos padres no dieron consentimiento. Veinticinco niños con síntomas fueron seleccionados cada uno de los tres lugares de la comunidad, mientras que 16 niños sintomáticos fueron muestreados del hospital. Se registró el tamaño total de la muestra (n = 91) con base en materiales y limitaciones de costos de procesamiento, así como para proporcionar muestras suficientes para permitir la comprensión descriptiva de los patrones de circulación viral estimados en otros estudios comunitarios [10]. Los Oficiales de Vigilancia y Notificación de Enfermedades, empleados por el Ministerio de Salud del Estado y familiarizados con las comunidades en este estudio, realizaron la recolección de muestras y datos. Se consideraron síntomas derivados de otros esfuerzos de vigilancia de IRA: dolor de garganta, fiebre, sofá, nariz, vómitos, dolor corporal, dolor en las piernas, náuseas, escalofríos, falta de aliento [10, 26]. Género y edad, tipo de área residencial (rural/urbana), nivel educativo, proximidad de residencia al ganado, proximidad a una carretera inalterada y número de personas que duermen en la misma habitación. La diferencia general entre los dos entornos fue que los del hospital tenían enfermedades graves, mientras que los de la comunidad eran generalmente "saludables" pero exhibiendo síntomas de IRA (es decir, enfermedad leve). Los hisopos nasales fueron recolectados de los sujetos y almacenados en escudo de ADN/ARN (Zymo Research, Irvine, California). Las muestras recolectadas fueron clavadas y el hisopo extraído. Los residuos que contenían las muestras nasales fueron almacenados a -20 °C antes del análisis molecular. El ARN viral fue aislado usando ZR Viral ARN TM Kit (Zymo Research, Irvine, California) por instrucciones del fabricante (http://www.zymoresearch.com/downloads/dl/file/ id/147/r1034i.pdf ). El PCR en tiempo real (reacción en cadena de la polimerasa), comúnmente utilizado en los estudios ARI [10, 19, 27], se llevó a cabo entonces utilizando el kit de detección RV15 One Step ACE, los números de catálogo RV0716K01008007 y RV0717B011008001 (Seegene, Seúl, Corea del Sur) para la detección de 15 virus humanos: virus de la parainfluenza 1, 2, 3 y 4 (PIV1-4), virus respiratorios sincitiales (RSV) A y B, influenza A y B (FLUA, FLUB), rinovirus tipo A-C, adenovirus (ADV), coronavirus (OC 229 E/NL63, OC43), enterovirus (HEV), enterovirus (hMPV) y bocavirus (BoV). Los reactivos fueron validados en el lugar experimental utilizando un protocolo de validación incorporado para confirmar problemas de falsos resultados negativos y falsos positivos no fueron motivo de preocupación. La reacción de amplificación fue realizada según lo descrito por el fabricante: transcripción inversa 50 °C-30′, activación inicial 94°-15′, 45 ciclos: desnaturalización 94°-30′′, recocido 60°-1′ 30′′, extensión 72°-1, extensión final 72°-10′, retención 4°. La visualización se realizó utilizando electroforesis en un gel de agarosa del 2% en TBE 1X con EtBr, en presencia de marcadores RV15 OneStep A/B/C; marcador de peso molecular. El procesamiento del espectro no fue cegado ya que no hubo riesgo de sesgo experimental. Se utilizaron procedimientos estandarizados para el muestreo comunitario y clínico. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando la versión R 3.2.4. Se describen estadísticas univa Se evaluó la estadística bivariada (diferencia en proporciones) mediante una prueba de z de dos proporciones. Se consideró significativo un valor de p < 0,001. En este estudio no se observaron datos de ausencia para el análisis. La demografía básica de los participantes se resumió en los resultados de PCR que mostraron diez virus diferentes (influenza A, coronavirus OC 229 E/NL63, RSVA, RSV B, parainfluenza 1-4). La figura 1 muestra cómo estas infecciones se distribuyeron entre los tipos de virus, así como en las muestras de la comunidad frente a la clínica. En suma, un total de 33 de los 91 sujetos encuestados presentaron uno o más virus del tracto respiratorio (36,3%, IC 95% 26,6-47,0%, Fig. 1 ). Además, 10 de estos casos fueron infecciones triples y 5 fueron infecciones cuádruples (iltradas por color de barras en la figura 1 La figura 2 indica la frecuencia con la que se encontró cada par de virus en el mismo participante; las coinfecciones fueron más comunes entre el enterovirus y el virus de la parainfluenza 4 (fig. 2) ; además, se compararon y contrastaron los resultados clínicos y comunitarios; el virus de la parainfluenza 4, el virus respiratorio sincitial B y el enterovirus fueron los virus más comunes en la muestra clínica; estas tres infecciones resultaron en 41 virus detectados en 15 sujetos clínicamente y ocho infecciones detectadas en cinco personas de la comunidad; en conjunto infectaron al 94% (15/16, IC 95% 67-7-99,7 %) de los sujetos clínicos y al 7% (5/75, IC 95% 2,5-15,5%) de la comunidad (diferencia significativa, p < 0,001). El virus más común detectado en muestras comunitarias fue el coronavirus OC43; este virus se detectó en el 13,3% (95% IC 6,9-23,6%) de Sin embargo, se detectó una cepa diferente, el coronavirus OC 229 E/NL63 en el 12,5% de los sujetos clínicos (2/16, IC 95% 2,2-39,6%) y no detectados en la comunidad. Las infecciones dobles, triples y cuádruples fueron otra característica común de la nota. Se identificaron diez virus del tracto respiratorio diferentes entre los sujetos como se muestra en la figura 1. Las muestras recogidas en el hospital especializado para niños mostraron una tasa de prevalencia del 100% de infección con uno o más virus, lo que podría no ser sorprendente, ya que la diferencia básica entre la comunidad y las muestras clínicas fue un aumento de la gravedad de la enfermedad en la muestra clínica, lo que también puede explicar el alto nivel de coinfección encontrado entre los sujetos clínicos. Además, hubo una diferencia significativa entre la prevalencia de los virus más comunes en la muestra clínica (parainfluenza virus 4, sincitial respiratorio virus B y enterovirus) y su prevalencia en la comunidad. Finalmente, algunos de los virus detectados en este estudio no han sido detectados e implicados con IRAs en Nigeria. No hay reporte, a nuestro entender, que implique coronavirus en IRAs en Nigeria, y fue detectado en 12 sujetos en este estudio. Aunque los casos de infecciones dobles y triples fueron observados en un estudio en Nigeria en 2011 [28], por lo que sabemos, los reportes de infecciones cuádruples son raros y no han sido reportados anteriormente en Nigeria. Debido a la naturaleza única de los datos generados en este estudio y la novedad del trabajo en el entorno, no es posible comparar exactamente los resultados con otros estudios. Por ejemplo, aunque encontramos un estudio similar sobre IRAs en sujetos clínicos en Burkina Faso [27], debido al pequeño tamaño de la muestra de este estudio no sería posible inferir o comparar las tasas de prevalencia. Los estudios de etiología de ARI se han enfocado generalmente en áreas del mundo más desarrolladas [29], y es importante señalar que la disponibilidad de métodos de diagnóstico molecular empleados en este estudio mejora sustancialmente la capacidad de detectar virus que hasta ahora no se han detectado en Nigeria. Además, los hallazgos de este trabajo también se suman al creciente cuerpo de investigación que muestra el valor de los datos comunitarios en la vigilancia de enfermedades infecciosas [8]. Como la mayor parte del trabajo hasta la fecha ha sido en áreas de recursos más altos del mundo, este estudio añade perspectiva desde un área donde los recursos sanitarios son menores. En conclusión, los resultados de este estudio proporcionan evidencia para la vigilancia comunitaria activa para mejorar la vigilancia de la salud pública y la comprensión científica de Esto se debe no sólo a que una minoría de niños con infección grave son ingresados en el hospital en áreas como esta en Nigeria, sino también a los hallazgos de este estudio piloto que indican que la circulación viral en la comunidad no puede ser detectada clínicamente [29]. Este estudio piloto indica que en áreas de Nigeria, la etiología de las IRAs comprobadas a partir de muestras clínicas puede no representar a todas las IRAs que circulan en la comunidad. La principal limitación del estudio es el tamaño de la muestra. En particular, la muestra no es igual de representativa en todas las edades. Sin embargo, el tamaño de la muestra fue lo suficientemente grande como para determinar diferencias significativas en virus de origen comunitario y clínico, y proporciona una comprensión cualitativa de la etiología viral en muestras de la comunidad y clínica. Además, la muestra se concentró en gran medida en sujetos menores de 6 años, que se encuentran entre los grupos con mayor riesgo de Además, este estudio resultó en hallazgos únicos Dado que los recursos son limitados para la investigación y la práctica, esperamos que estos resultados piloto puedan motivar investigaciones sistemáticas adicionales sobre la mejor manera de utilizar los datos generados por la comunidad en la vigilancia de ARI. Los resultados de este estudio pueden informar a un estudio más amplio, representativo a través de la demografía y los lugares para evaluar sistemáticamente la etiología de las infecciones y las diferencias en las cohortes clínicas y comunitarias. Un estudio más amplio también permitirá tener en cuenta posibles factores de riesgo ambiental. Finalmente, aunque puede ser intuitivo, los resultados de este estudio piloto arrojaron luz sobre el alcance de las diferencias en los patrones de ARI, incluyendo diferentes tipos y cepas de virus circulantes. Además, debido a que se utilizó PCR para la detección viral, el estudio se limitó a la detección de virus en los conjuntos de primovacunación. El estudio fue concebido por RC y OK. RC y OK, MO y TD participaron en el diseño del estudio, que fue realizado por MO y TD. RC y OK analizaron los datos. RC y OK escribieron y revisaron el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

¿Cuál fue la prevalencia del Coronavirus OC 229 E/NL63 en sujetos clínicos en Ilorin, Nigeria?

Etiología de las infecciones del tracto respiratorio en la comunidad y la clínica en Ilorin, Nigeriahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5719735/SHA: f2e835d2cde5f42054dbd0c20d4060721135c518Autores: Kolawole, Olatunji; Oguntoye, Michael; Dam, Tina; Chunara, RumiFecha: 2017-12-07DOI: 10.1186/s13104-017-3063-1Licencia: cc-byAbstract: OBJETIVO: Reconociendo el creciente interés en la vigilancia de enfermedades comunitarias a nivel mundial, el objetivo de este estudio fue investigar si los virus respiratorios que circulan en la comunidad pueden estar representados a través de la vigilancia clínica (hospitalaria RESULTADOS: Los niños fueron seleccionados mediante muestreo de conveniencia de comunidades y un centro de atención terciaria (n = 91) durante la primavera de 2017 en Ilorin, Nigeria. Se recogieron y probaron hisopos nasales utilizando reacción en cadena de la polimerasa. La mayoría (79,1%) de los sujetos eran menores de 6 años, de los cuales 46 estaban infectados (63,9%). Un total de 33 de los 91 sujetos tenían uno o más virus del tracto respiratorio; hubo 10 casos de triple infección y 5 de cuádruple. El virus de la parainfluenza 4, el virus sincitial respiratorio B y el enterovirus fueron los virus más comunes en la muestra clínica; presentes en el 93,8% (15/16) de los sujetos clínicos, y el 6,7% (5/75) de los sujetos comunitarios (diferencia significativa, p < 0,001). Coronavirus OC43 fue el virus más común detectado en miembros de la Una cepa diferente, Coronavirus OC 229 E/NL63 fue detectada entre los sujetos de la clínica (2/16) y no detectada en la comunidad. Este estudio piloto proporciona evidencia de que los datos de la comunidad pueden potencialmente representar información diferente a la obtenida clínicamente, sugiriendo la necesidad de vigilancia comunitaria para mejorar los esfuerzos de salud pública y la comprensión científica de las infecciones respiratorias. Texto: Infecciones respiratorias agudas (ARIs) (la causa tanto de infecciones del tracto respiratorio superior (URIs) como de infecciones del tracto respiratorio inferior (IRS)) son una causa importante de muerte entre los niños menores de 5 años, particularmente en los países en desarrollo donde la carga de enfermedad es 2-5 veces mayor que en los países desarrollados [1]. Si bien estos virus suelen causar síntomas leves de tipo frío y pueden ser autolimitados, en los últimos años nuevos coronavirus como el síndrome respiratorio agudo grave (SARS) y el síndrome respiratorio del Oriente Medio En la actualidad, la mayoría de los brotes de enfermedades infecciosas registrados por la Organización Mundial de la Salud (OMS) se producen en el continente africano, donde existe un alto riesgo de transmisión [3, 4]. Además, en las zonas en desarrollo (tanto rurales como urbanas) hay factores de riesgo cada vez mayores, como las interfaces humano-animal (debido a la proximidad residencial al ganado). Estos cambios en los patrones epidemiológicos han dado lugar a una mejora de la vigilancia de las IRA, especialmente en los lugares de alto riesgo de transmisión [5]. Nigeria es uno de esos lugares con una alta prevalencia de muchos de los factores de riesgo implicados en las IRA entre los niños, entre ellos: edad, sexo, hacinamiento, estado nutricional, situación socioeconómica, y donde el estudio de las IRA es actualmente limitado [6]. Estos factores de riesgo amplios junto con recursos limitados han indicado la necesidad de iniciativas comunitarias de vigilancia e intervenciones [6, 7]. En Nigeria, los hospitales sólo son visitados cuando los síntomas son muy graves. Por lo tanto, se supone que la información viral del muestreo clínico es insuficiente para captar la incidencia de enfermedades en la población general o su previsibilidad a partir de los síntomas [8]. En todo el mundo, incluso en África oriental y meridional, se han centrado los esfuerzos en el desarrollo de métodos de vigilancia participativa de enfermedades basados en la comunidad [9] [10] [11] [12] [13]. Se han demostrado enfoques basados en la comunidad que son útiles para aprender más sobre las infecciones respiratorias emergentes, como la evaluación de la infrarreportación [14], los tipos de virus prevalentes en las comunidades [10], y la predicción de epidemias [15]. Al mismo tiempo, los avances en los métodos de identificación molecular han permitido realizar estudios sobre la aparición y epidemiología de virus ARI en muchos lugares (por ejemplo, los datos clínicos representan los casos más graves, y poliomavirus novedosos en Australia [16, 17], Centro Médico Erasmus del coronavirus humano (HCoV-EMC) en Oriente Medio y Reino Unido [18, 19], SARS en Canadá y China [20] [21] [22] ), sin embargo, la investigación sobre la epidemiología molecular de los virus ARI en Nigeria es limitada. Los métodos de diagnóstico disponibles y otras limitaciones tienen estudios limitados allí a encuestas serológicas de sólo unos pocos de estos virus y sólo en poblaciones clínicas [23, 24]. Así, la utilidad de la vigilancia basada en la comunidad puede ser apropiada en contextos como en Nigeria, y el propósito de este estudio piloto fue investigar si los casos clínicos pueden describir la imagen completa de ARI entre los niños en Nigeria. Realizamos un estudio transversal en tres centros comunitarios y uno clínico en Ilorin, Nigeria. Ilorin se encuentra en el estado de Kwara y es la sexta ciudad más grande de Nigeria por población [25]. Tres áreas de gobierno local (Ilorin East, Ilorin South e Ilorin West LGAs) fueron los sitios comunitarios y el Hospital de Especialistas Infantiles, Ilorin el sitio clínico. Se utilizó el muestreo de conveniencia para los fines de este estudio piloto, y se obtuvieron muestras del 28 de marzo al 5 de abril de 2017. Los criterios de inclusión fueron: niños menores de 14 años que tenían síntomas visibles de IRA dentro de las comunidades o aquellos confirmados en el hospital con IRA. Los criterios de exclusión fueron: niños de 14 años o más, sin mostrar signos de IRA y sujetos cuyos padres no dieron consentimiento. Veinticinco niños con síntomas fueron seleccionados cada uno de los tres lugares de la comunidad, mientras que 16 niños sintomáticos fueron muestreados del hospital. Se registró el tamaño total de la muestra (n = 91) con base en materiales y limitaciones de costos de procesamiento, así como para proporcionar muestras suficientes para permitir la comprensión descriptiva de los patrones de circulación viral estimados en otros estudios comunitarios [10]. Los Oficiales de Vigilancia y Notificación de Enfermedades, empleados por el Ministerio de Salud del Estado y familiarizados con las comunidades en este estudio, realizaron la recolección de muestras y datos. Se consideraron síntomas derivados de otros esfuerzos de vigilancia de IRA: dolor de garganta, fiebre, sofá, nariz, vómitos, dolor corporal, dolor en las piernas, náuseas, escalofríos, falta de aliento [10, 26]. Género y edad, tipo de área residencial (rural/urbana), nivel educativo, proximidad de residencia al ganado, proximidad a una carretera inalterada y número de personas que duermen en la misma habitación. La diferencia general entre los dos entornos fue que los del hospital tenían enfermedades graves, mientras que los de la comunidad eran generalmente "saludables" pero exhibiendo síntomas de IRA (es decir, enfermedad leve). Los hisopos nasales fueron recolectados de los sujetos y almacenados en escudo de ADN/ARN (Zymo Research, Irvine, California). Las muestras recolectadas fueron clavadas y el hisopo extraído. Los residuos que contenían las muestras nasales fueron almacenados a -20 °C antes del análisis molecular. El ARN viral fue aislado usando ZR Viral ARN TM Kit (Zymo Research, Irvine, California) por instrucciones del fabricante (http://www.zymoresearch.com/downloads/dl/file/ id/147/r1034i.pdf ). El PCR en tiempo real (reacción en cadena de la polimerasa), comúnmente utilizado en los estudios ARI [10, 19, 27], se llevó a cabo entonces utilizando el kit de detección RV15 One Step ACE, los números de catálogo RV0716K01008007 y RV0717B011008001 (Seegene, Seúl, Corea del Sur) para la detección de 15 virus humanos: virus de la parainfluenza 1, 2, 3 y 4 (PIV1-4), virus respiratorios sincitiales (RSV) A y B, influenza A y B (FLUA, FLUB), rinovirus tipo A-C, adenovirus (ADV), coronavirus (OC 229 E/NL63, OC43), enterovirus (HEV), enterovirus (hMPV) y bocavirus (BoV). Los reactivos fueron validados en el lugar experimental utilizando un protocolo de validación incorporado para confirmar problemas de falsos resultados negativos y falsos positivos no fueron motivo de preocupación. La reacción de amplificación fue realizada según lo descrito por el fabricante: transcripción inversa 50 °C-30′, activación inicial 94°-15′, 45 ciclos: desnaturalización 94°-30′′, recocido 60°-1′ 30′′, extensión 72°-1, extensión final 72°-10′, retención 4°. La visualización se realizó utilizando electroforesis en un gel de agarosa del 2% en TBE 1X con EtBr, en presencia de marcadores RV15 OneStep A/B/C; marcador de peso molecular. El procesamiento del espectro no fue cegado ya que no hubo riesgo de sesgo experimental. Se utilizaron procedimientos estandarizados para el muestreo comunitario y clínico. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando la versión R 3.2.4. Se describen estadísticas univa Se evaluó la estadística bivariada (diferencia en proporciones) mediante una prueba de z de dos proporciones. Se consideró significativo un valor de p < 0,001. En este estudio no se observaron datos de ausencia para el análisis. La demografía básica de los participantes se resumió en los resultados de PCR que mostraron diez virus diferentes (influenza A, coronavirus OC 229 E/NL63, RSVA, RSV B, parainfluenza 1-4). La figura 1 muestra cómo estas infecciones se distribuyeron entre los tipos de virus, así como en las muestras de la comunidad frente a la clínica. En suma, un total de 33 de los 91 sujetos encuestados presentaron uno o más virus del tracto respiratorio (36,3%, IC 95% 26,6-47,0%, Fig. 1 ). Además, 10 de estos casos fueron infecciones triples y 5 fueron infecciones cuádruples (iltradas por color de barras en la figura 1 La figura 2 indica la frecuencia con la que se encontró cada par de virus en el mismo participante; las coinfecciones fueron más comunes entre el enterovirus y el virus de la parainfluenza 4 (fig. 2) ; además, se compararon y contrastaron los resultados clínicos y comunitarios; el virus de la parainfluenza 4, el virus respiratorio sincitial B y el enterovirus fueron los virus más comunes en la muestra clínica; estas tres infecciones resultaron en 41 virus detectados en 15 sujetos clínicamente y ocho infecciones detectadas en cinco personas de la comunidad; en conjunto infectaron al 94% (15/16, IC 95% 67-7-99,7 %) de los sujetos clínicos y al 7% (5/75, IC 95% 2,5-15,5%) de la comunidad (diferencia significativa, p < 0,001). El virus más común detectado en muestras comunitarias fue el coronavirus OC43; este virus se detectó en el 13,3% (95% IC 6,9-23,6%) de Sin embargo, se detectó una cepa diferente, el coronavirus OC 229 E/NL63 en el 12,5% de los sujetos clínicos (2/16, IC 95% 2,2-39,6%) y no detectados en la comunidad. Las infecciones dobles, triples y cuádruples fueron otra característica común de la nota. Se identificaron diez virus del tracto respiratorio diferentes entre los sujetos como se muestra en la figura 1. Las muestras recogidas en el hospital especializado para niños mostraron una tasa de prevalencia del 100% de infección con uno o más virus, lo que podría no ser sorprendente, ya que la diferencia básica entre la comunidad y las muestras clínicas fue un aumento de la gravedad de la enfermedad en la muestra clínica, lo que también puede explicar el alto nivel de coinfección encontrado entre los sujetos clínicos. Además, hubo una diferencia significativa entre la prevalencia de los virus más comunes en la muestra clínica (parainfluenza virus 4, sincitial respiratorio virus B y enterovirus) y su prevalencia en la comunidad. Finalmente, algunos de los virus detectados en este estudio no han sido detectados e implicados con IRAs en Nigeria. No hay reporte, a nuestro entender, que implique coronavirus en IRAs en Nigeria, y fue detectado en 12 sujetos en este estudio. Aunque los casos de infecciones dobles y triples fueron observados en un estudio en Nigeria en 2011 [28], por lo que sabemos, los reportes de infecciones cuádruples son raros y no han sido reportados anteriormente en Nigeria. Debido a la naturaleza única de los datos generados en este estudio y la novedad del trabajo en el entorno, no es posible comparar exactamente los resultados con otros estudios. Por ejemplo, aunque encontramos un estudio similar sobre IRAs en sujetos clínicos en Burkina Faso [27], debido al pequeño tamaño de la muestra de este estudio no sería posible inferir o comparar las tasas de prevalencia. Los estudios de etiología de ARI se han enfocado generalmente en áreas del mundo más desarrolladas [29], y es importante señalar que la disponibilidad de métodos de diagnóstico molecular empleados en este estudio mejora sustancialmente la capacidad de detectar virus que hasta ahora no se han detectado en Nigeria. Además, los hallazgos de este trabajo también se suman al creciente cuerpo de investigación que muestra el valor de los datos comunitarios en la vigilancia de enfermedades infecciosas [8]. Como la mayor parte del trabajo hasta la fecha ha sido en áreas de recursos más altos del mundo, este estudio añade perspectiva desde un área donde los recursos sanitarios son menores. En conclusión, los resultados de este estudio proporcionan evidencia para la vigilancia comunitaria activa para mejorar la vigilancia de la salud pública y la comprensión científica de Esto se debe no sólo a que una minoría de niños con infección grave son ingresados en el hospital en áreas como esta en Nigeria, sino también a los hallazgos de este estudio piloto que indican que la circulación viral en la comunidad no puede ser detectada clínicamente [29]. Este estudio piloto indica que en áreas de Nigeria, la etiología de las IRAs comprobadas a partir de muestras clínicas puede no representar a todas las IRAs que circulan en la comunidad. La principal limitación del estudio es el tamaño de la muestra. En particular, la muestra no es igual de representativa en todas las edades. Sin embargo, el tamaño de la muestra fue lo suficientemente grande como para determinar diferencias significativas en virus de origen comunitario y clínico, y proporciona una comprensión cualitativa de la etiología viral en muestras de la comunidad y clínica. Además, la muestra se concentró en gran medida en sujetos menores de 6 años, que se encuentran entre los grupos con mayor riesgo de Además, este estudio resultó en hallazgos únicos Dado que los recursos son limitados para la investigación y la práctica, esperamos que estos resultados piloto puedan motivar investigaciones sistemáticas adicionales sobre la mejor manera de utilizar los datos generados por la comunidad en la vigilancia de ARI. Los resultados de este estudio pueden informar a un estudio más amplio, representativo a través de la demografía y los lugares para evaluar sistemáticamente la etiología de las infecciones y las diferencias en las cohortes clínicas y comunitarias. Un estudio más amplio también permitirá tener en cuenta posibles factores de riesgo ambiental. Finalmente, aunque puede ser intuitivo, los resultados de este estudio piloto arrojaron luz sobre el alcance de las diferencias en los patrones de ARI, incluyendo diferentes tipos y cepas de virus circulantes. Además, debido a que se utilizó PCR para la detección viral, el estudio se limitó a la detección de virus en los conjuntos de primovacunación. El estudio fue concebido por RC y OK. RC y OK, MO y TD participaron en el diseño del estudio, que fue realizado por MO y TD. RC y OK analizaron los datos. RC y OK escribieron y revisaron el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

¿Cuál fue la diferencia entre los casos comunitarios y clínicos de infecciones respiratorias agudas?

Etiología de las infecciones del tracto respiratorio en la comunidad y la clínica en Ilorin, Nigeriahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5719735/SHA: f2e835d2cde5f42054dbd0c20d4060721135c518Autores: Kolawole, Olatunji; Oguntoye, Michael; Dam, Tina; Chunara, RumiFecha: 2017-12-07DOI: 10.1186/s13104-017-3063-1Licencia: cc-byAbstract: OBJETIVO: Reconociendo el creciente interés en la vigilancia de enfermedades comunitarias a nivel mundial, el objetivo de este estudio fue investigar si los virus respiratorios que circulan en la comunidad pueden estar representados a través de la vigilancia clínica (hospitalaria RESULTADOS: Los niños fueron seleccionados mediante muestreo de conveniencia de comunidades y un centro de atención terciaria (n = 91) durante la primavera de 2017 en Ilorin, Nigeria. Se recogieron y probaron hisopos nasales utilizando reacción en cadena de la polimerasa. La mayoría (79,1%) de los sujetos eran menores de 6 años, de los cuales 46 estaban infectados (63,9%). Un total de 33 de los 91 sujetos tenían uno o más virus del tracto respiratorio; hubo 10 casos de triple infección y 5 de cuádruple. El virus de la parainfluenza 4, el virus sincitial respiratorio B y el enterovirus fueron los virus más comunes en la muestra clínica; presentes en el 93,8% (15/16) de los sujetos clínicos, y el 6,7% (5/75) de los sujetos comunitarios (diferencia significativa, p < 0,001). Coronavirus OC43 fue el virus más común detectado en miembros de la Una cepa diferente, Coronavirus OC 229 E/NL63 fue detectada entre los sujetos de la clínica (2/16) y no detectada en la comunidad. Este estudio piloto proporciona evidencia de que los datos de la comunidad pueden potencialmente representar información diferente a la obtenida clínicamente, sugiriendo la necesidad de vigilancia comunitaria para mejorar los esfuerzos de salud pública y la comprensión científica de las infecciones respiratorias. Texto: Infecciones respiratorias agudas (ARIs) (la causa tanto de infecciones del tracto respiratorio superior (URIs) como de infecciones del tracto respiratorio inferior (IRS)) son una causa importante de muerte entre los niños menores de 5 años, particularmente en los países en desarrollo donde la carga de enfermedad es 2-5 veces mayor que en los países desarrollados [1]. Si bien estos virus suelen causar síntomas leves de tipo frío y pueden ser autolimitados, en los últimos años nuevos coronavirus como el síndrome respiratorio agudo grave (SARS) y el síndrome respiratorio del Oriente Medio En la actualidad, la mayoría de los brotes de enfermedades infecciosas registrados por la Organización Mundial de la Salud (OMS) se producen en el continente africano, donde existe un alto riesgo de transmisión [3, 4]. Además, en las zonas en desarrollo (tanto rurales como urbanas) hay factores de riesgo cada vez mayores, como las interfaces humano-animal (debido a la proximidad residencial al ganado). Estos cambios en los patrones epidemiológicos han dado lugar a una mejora de la vigilancia de las IRA, especialmente en los lugares de alto riesgo de transmisión [5]. Nigeria es uno de esos lugares con una alta prevalencia de muchos de los factores de riesgo implicados en las IRA entre los niños, entre ellos: edad, sexo, hacinamiento, estado nutricional, situación socioeconómica, y donde el estudio de las IRA es actualmente limitado [6]. Estos factores de riesgo amplios junto con recursos limitados han indicado la necesidad de iniciativas comunitarias de vigilancia e intervenciones [6, 7]. En Nigeria, los hospitales sólo son visitados cuando los síntomas son muy graves. Por lo tanto, se supone que la información viral del muestreo clínico es insuficiente para captar la incidencia de enfermedades en la población general o su previsibilidad a partir de los síntomas [8]. En todo el mundo, incluso en África oriental y meridional, se han centrado los esfuerzos en el desarrollo de métodos de vigilancia participativa de enfermedades basados en la comunidad [9] [10] [11] [12] [13]. Se han demostrado enfoques basados en la comunidad que son útiles para aprender más sobre las infecciones respiratorias emergentes, como la evaluación de la infrarreportación [14], los tipos de virus prevalentes en las comunidades [10], y la predicción de epidemias [15]. Al mismo tiempo, los avances en los métodos de identificación molecular han permitido realizar estudios sobre la aparición y epidemiología de virus ARI en muchos lugares (por ejemplo, los datos clínicos representan los casos más graves, y poliomavirus novedosos en Australia [16, 17], Centro Médico Erasmus del coronavirus humano (HCoV-EMC) en Oriente Medio y Reino Unido [18, 19], SARS en Canadá y China [20] [21] [22] ), sin embargo, la investigación sobre la epidemiología molecular de los virus ARI en Nigeria es limitada. Los métodos de diagnóstico disponibles y otras limitaciones tienen estudios limitados allí a encuestas serológicas de sólo unos pocos de estos virus y sólo en poblaciones clínicas [23, 24]. Así, la utilidad de la vigilancia basada en la comunidad puede ser apropiada en contextos como en Nigeria, y el propósito de este estudio piloto fue investigar si los casos clínicos pueden describir la imagen completa de ARI entre los niños en Nigeria. Realizamos un estudio transversal en tres centros comunitarios y uno clínico en Ilorin, Nigeria. Ilorin se encuentra en el estado de Kwara y es la sexta ciudad más grande de Nigeria por población [25]. Tres áreas de gobierno local (Ilorin East, Ilorin South e Ilorin West LGAs) fueron los sitios comunitarios y el Hospital de Especialistas Infantiles, Ilorin el sitio clínico. Se utilizó el muestreo de conveniencia para los fines de este estudio piloto, y se obtuvieron muestras del 28 de marzo al 5 de abril de 2017. Los criterios de inclusión fueron: niños menores de 14 años que tenían síntomas visibles de IRA dentro de las comunidades o aquellos confirmados en el hospital con IRA. Los criterios de exclusión fueron: niños de 14 años o más, sin mostrar signos de IRA y sujetos cuyos padres no dieron consentimiento. Veinticinco niños con síntomas fueron seleccionados cada uno de los tres lugares de la comunidad, mientras que 16 niños sintomáticos fueron muestreados del hospital. Se registró el tamaño total de la muestra (n = 91) con base en materiales y limitaciones de costos de procesamiento, así como para proporcionar muestras suficientes para permitir la comprensión descriptiva de los patrones de circulación viral estimados en otros estudios comunitarios [10]. Los Oficiales de Vigilancia y Notificación de Enfermedades, empleados por el Ministerio de Salud del Estado y familiarizados con las comunidades en este estudio, realizaron la recolección de muestras y datos. Se consideraron síntomas derivados de otros esfuerzos de vigilancia de IRA: dolor de garganta, fiebre, sofá, nariz, vómitos, dolor corporal, dolor en las piernas, náuseas, escalofríos, falta de aliento [10, 26]. Género y edad, tipo de área residencial (rural/urbana), nivel educativo, proximidad de residencia al ganado, proximidad a una carretera inalterada y número de personas que duermen en la misma habitación. La diferencia general entre los dos entornos fue que los del hospital tenían enfermedades graves, mientras que los de la comunidad eran generalmente "saludables" pero exhibiendo síntomas de IRA (es decir, enfermedad leve). Los hisopos nasales fueron recolectados de los sujetos y almacenados en escudo de ADN/ARN (Zymo Research, Irvine, California). Las muestras recolectadas fueron clavadas y el hisopo extraído. Los residuos que contenían las muestras nasales fueron almacenados a -20 °C antes del análisis molecular. El ARN viral fue aislado usando ZR Viral ARN TM Kit (Zymo Research, Irvine, California) por instrucciones del fabricante (http://www.zymoresearch.com/downloads/dl/file/ id/147/r1034i.pdf ). El PCR en tiempo real (reacción en cadena de la polimerasa), comúnmente utilizado en los estudios ARI [10, 19, 27], se llevó a cabo entonces utilizando el kit de detección RV15 One Step ACE, los números de catálogo RV0716K01008007 y RV0717B011008001 (Seegene, Seúl, Corea del Sur) para la detección de 15 virus humanos: virus de la parainfluenza 1, 2, 3 y 4 (PIV1-4), virus respiratorios sincitiales (RSV) A y B, influenza A y B (FLUA, FLUB), rinovirus tipo A-C, adenovirus (ADV), coronavirus (OC 229 E/NL63, OC43), enterovirus (HEV), enterovirus (hMPV) y bocavirus (BoV). Los reactivos fueron validados en el lugar experimental utilizando un protocolo de validación incorporado para confirmar problemas de falsos resultados negativos y falsos positivos no fueron motivo de preocupación. La reacción de amplificación fue realizada según lo descrito por el fabricante: transcripción inversa 50 °C-30′, activación inicial 94°-15′, 45 ciclos: desnaturalización 94°-30′′, recocido 60°-1′ 30′′, extensión 72°-1, extensión final 72°-10′, retención 4°. La visualización se realizó utilizando electroforesis en un gel de agarosa del 2% en TBE 1X con EtBr, en presencia de marcadores RV15 OneStep A/B/C; marcador de peso molecular. El procesamiento del espectro no fue cegado ya que no hubo riesgo de sesgo experimental. Se utilizaron procedimientos estandarizados para el muestreo comunitario y clínico. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando la versión R 3.2.4. Se describen estadísticas univa Se evaluó la estadística bivariada (diferencia en proporciones) mediante una prueba de z de dos proporciones. Se consideró significativo un valor de p < 0,001. En este estudio no se observaron datos de ausencia para el análisis. La demografía básica de los participantes se resumió en los resultados de PCR que mostraron diez virus diferentes (influenza A, coronavirus OC 229 E/NL63, RSVA, RSV B, parainfluenza 1-4). La figura 1 muestra cómo estas infecciones se distribuyeron entre los tipos de virus, así como en las muestras de la comunidad frente a la clínica. En suma, un total de 33 de los 91 sujetos encuestados presentaron uno o más virus del tracto respiratorio (36,3%, IC 95% 26,6-47,0%, Fig. 1 ). Además, 10 de estos casos fueron infecciones triples y 5 fueron infecciones cuádruples (iltradas por color de barras en la figura 1 La figura 2 indica la frecuencia con la que se encontró cada par de virus en el mismo participante; las coinfecciones fueron más comunes entre el enterovirus y el virus de la parainfluenza 4 (fig. 2) ; además, se compararon y contrastaron los resultados clínicos y comunitarios; el virus de la parainfluenza 4, el virus respiratorio sincitial B y el enterovirus fueron los virus más comunes en la muestra clínica; estas tres infecciones resultaron en 41 virus detectados en 15 sujetos clínicamente y ocho infecciones detectadas en cinco personas de la comunidad; en conjunto infectaron al 94% (15/16, IC 95% 67-7-99,7 %) de los sujetos clínicos y al 7% (5/75, IC 95% 2,5-15,5%) de la comunidad (diferencia significativa, p < 0,001). El virus más común detectado en muestras comunitarias fue el coronavirus OC43; este virus se detectó en el 13,3% (95% IC 6,9-23,6%) de Sin embargo, se detectó una cepa diferente, el coronavirus OC 229 E/NL63 en el 12,5% de los sujetos clínicos (2/16, IC 95% 2,2-39,6%) y no detectados en la comunidad. Las infecciones dobles, triples y cuádruples fueron otra característica común de la nota. Se identificaron diez virus del tracto respiratorio diferentes entre los sujetos como se muestra en la figura 1. Las muestras recogidas en el hospital especializado para niños mostraron una tasa de prevalencia del 100% de infección con uno o más virus, lo que podría no ser sorprendente, ya que la diferencia básica entre la comunidad y las muestras clínicas fue un aumento de la gravedad de la enfermedad en la muestra clínica, lo que también puede explicar el alto nivel de coinfección encontrado entre los sujetos clínicos. Además, hubo una diferencia significativa entre la prevalencia de los virus más comunes en la muestra clínica (parainfluenza virus 4, sincitial respiratorio virus B y enterovirus) y su prevalencia en la comunidad. Finalmente, algunos de los virus detectados en este estudio no han sido detectados e implicados con IRAs en Nigeria. No hay reporte, a nuestro entender, que implique coronavirus en IRAs en Nigeria, y fue detectado en 12 sujetos en este estudio. Aunque los casos de infecciones dobles y triples fueron observados en un estudio en Nigeria en 2011 [28], por lo que sabemos, los reportes de infecciones cuádruples son raros y no han sido reportados anteriormente en Nigeria. Debido a la naturaleza única de los datos generados en este estudio y la novedad del trabajo en el entorno, no es posible comparar exactamente los resultados con otros estudios. Por ejemplo, aunque encontramos un estudio similar sobre IRAs en sujetos clínicos en Burkina Faso [27], debido al pequeño tamaño de la muestra de este estudio no sería posible inferir o comparar las tasas de prevalencia. Los estudios de etiología de ARI se han enfocado generalmente en áreas del mundo más desarrolladas [29], y es importante señalar que la disponibilidad de métodos de diagnóstico molecular empleados en este estudio mejora sustancialmente la capacidad de detectar virus que hasta ahora no se han detectado en Nigeria. Además, los hallazgos de este trabajo también se suman al creciente cuerpo de investigación que muestra el valor de los datos comunitarios en la vigilancia de enfermedades infecciosas [8]. Como la mayor parte del trabajo hasta la fecha ha sido en áreas de recursos más altos del mundo, este estudio añade perspectiva desde un área donde los recursos sanitarios son menores. En conclusión, los resultados de este estudio proporcionan evidencia para la vigilancia comunitaria activa para mejorar la vigilancia de la salud pública y la comprensión científica de Esto se debe no sólo a que una minoría de niños con infección grave son ingresados en el hospital en áreas como esta en Nigeria, sino también a los hallazgos de este estudio piloto que indican que la circulación viral en la comunidad no puede ser detectada clínicamente [29]. Este estudio piloto indica que en áreas de Nigeria, la etiología de las IRAs comprobadas a partir de muestras clínicas puede no representar a todas las IRAs que circulan en la comunidad. La principal limitación del estudio es el tamaño de la muestra. En particular, la muestra no es igual de representativa en todas las edades. Sin embargo, el tamaño de la muestra fue lo suficientemente grande como para determinar diferencias significativas en virus de origen comunitario y clínico, y proporciona una comprensión cualitativa de la etiología viral en muestras de la comunidad y clínica. Además, la muestra se concentró en gran medida en sujetos menores de 6 años, que se encuentran entre los grupos con mayor riesgo de Además, este estudio resultó en hallazgos únicos Dado que los recursos son limitados para la investigación y la práctica, esperamos que estos resultados piloto puedan motivar investigaciones sistemáticas adicionales sobre la mejor manera de utilizar los datos generados por la comunidad en la vigilancia de ARI. Los resultados de este estudio pueden informar a un estudio más amplio, representativo a través de la demografía y los lugares para evaluar sistemáticamente la etiología de las infecciones y las diferencias en las cohortes clínicas y comunitarias. Un estudio más amplio también permitirá tener en cuenta posibles factores de riesgo ambiental. Finalmente, aunque puede ser intuitivo, los resultados de este estudio piloto arrojaron luz sobre el alcance de las diferencias en los patrones de ARI, incluyendo diferentes tipos y cepas de virus circulantes. Además, debido a que se utilizó PCR para la detección viral, el estudio se limitó a la detección de virus en los conjuntos de primovacunación. El estudio fue concebido por RC y OK. RC y OK, MO y TD participaron en el diseño del estudio, que fue realizado por MO y TD. RC y OK analizaron los datos. RC y OK escribieron y revisaron el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

¿Cómo pueden los países mejorar la vigilancia de la salud pública?

Etiología de las infecciones agudas del tracto respiratorio en niños hospitalizados en Chiprehttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4720120/SHA: efd27ff0ac04dd6083266386aaebb5df80f4fa9Autores: Richter, Jan; Panayiotou, Christakis; Tryfonos, Christina; Koptides, Dana; Koliou, Maria; Kalogirou, Nikolas; Georgiou, Eleni; Christodoulou, ChristinaFecha: 2016-01-13DOI: 10.1371/journal.pone.0147041Licencia: cc-byAbstract: Para mejorar la gestión clínica y la prevención de las infecciones virales en niños hospitalizados se necesita una mejor comprensión etiológica. El objetivo del presente estudio fue evaluar el espectro de patógenos virales respiratorios en niños ingresados en el hospital con infecciones agudas de las vías respiratorias en Chipre, para lo cual se recogieron muestras de hisopos nasofaríngeos de 424 niños menores de 12 años con infecciones agudas de las vías respiratorias durante tres temporadas epidémicas y se analizaron para detectar la presencia de los 15 virus respiratorios más comunes; se identificó un patógeno viral en el 86% de las muestras, observándose múltiples infecciones en casi el 20% de las muestras; los virus detectados con mayor frecuencia fueron VRS (30,4%) y Rhinovirus (27,4%). El VRS mostró una estacionalidad clara con picos marcados en enero/febrero, mientras que las infecciones por rinovirus no mostraron una estacionalidad pronunciada casi a lo largo del año; mientras que la incidencia de VRS y PIV3 disminuyó significativamente con la edad, Los datos presentados amplían nuestra comprensión de la epidemiología de las infecciones de las vías respiratorias virales en los niños chipriotas y serán útiles para los médicos e investigadores interesados en el tratamiento y control de las infecciones de las vías respiratorias virales. Texto: Las infecciones de las vías respiratorias virales (IRT) representan un importante problema de salud pública debido a su incidencia mundial, facilidad de transmisión y morbilidad y mortalidad considerables que afectan a personas de todas las edades. Los niños son, en promedio, infectados dos o tres veces más frecuentemente que los adultos, siendo las ITR agudas la infección más común en la infancia [1,2]. Las enfermedades causadas por virus respiratorios incluyen, entre otras, resfriados comunes, faringitis, crup, bronquiolitis, neumonía viral y otitis media. El diagnóstico rápido es importante no sólo para la intervención terapéutica oportuna sino también para la identificación de una epidemia de gripe inicial y la evitación del tratamiento antibiótico innecesario [3 La ITR aguda es más común en niños menores de 5 años y representa entre el 30% y el 50% de las admisiones médicas pediátricas, así como entre el 20% y el 40% de las hospitalizaciones en niños. Las infecciones respiratorias se agrupan durante el invierno y principios de los meses de primavera. Entre los principales agentes virales figuran el virus sincitial respiratorio (VSR), los virus influenza A y B (INF-A, INF-B), los virus parainfluenza (VPI) y los adenovirus humanos (VHAd). Además, hay una lista cada vez mayor de nuevos virus respiratorios que contribuyen significativamente a la carga de infecciones respiratorias agudas, como el metapneumovirus humano (VPH) recientemente identificado y el Bocavirus humano (VHBo) [5]. Las ITR agudas se clasifican como ITR superior (UTRI) e inferior (ITR), según la localización anatómica Las URTIs causan epidemias no graves pero generalizadas que son responsables de la circulación continua de patógenos en la comunidad. Las LRTIs han sido clasificadas como neumonía franca y bronquiolitis con características clínicas, radiológicas y etiológicas que normalmente se superponen [6, 7]. Los virus son nuevamente los principales agentes de las LRTIs a menudo mal diagnosticadas como bacterias de origen y, por lo tanto, tratadas con antibióticos innecesariamente [8]. El objetivo principal de este estudio fue determinar la etiología de las infecciones respiratorias agudas en niños chipriotas y evaluar la epidemiología de los patógenos virales identificados durante tres temporadas epidémicas. El estudio fue aprobado por el Comité Nacional de Bioética de Chipre. Entre noviembre de 2010 y octubre de 2013, se recogieron 485 muestras de hisopos nasofaríngeos de niños de hasta 12 años de edad, que habían sido hospitalizados con infección aguda del tracto respiratorio en el hospital Arzobispo Makarios III de Nicosia. Se registraron datos clínicos y demográficos que incluían síntomas, duración de la hospitalización, diagnóstico y tratamiento. Se recogieron muestras de hisopos nasales utilizando el kit de recogida de transporte viral universal de BD. Se extrajo ARN/DNA viral de 400 μl de muestra utilizando el kit de virus iPrep PureLink en un instrumento de purificación iPrep (Invitrogen). Se estableció y validó un conjunto de cuatro ensayos multiplex de RT-PCR en tiempo real para la detección de los 15 virus respiratorios más comunes de la siguiente manera: ensayo 1: influenzavirus A y B, RSV, ensayo 2: parainfluenzavirus 1-4, ensayo 3: HAdV, enterovirus, HMPV y HBoV y ensayo 4: rinovirus y los coronavirus humanos OC43, NL63 y 229E (Tabla 1). Se utilizaron conjuntos de imprimación y sonda publicados como base para diseñar los ensayos, sin embargo, todas las secuencias de primos/sondas fueron verificadas con alineaciones de secuencias de nueva construcción de todos los virus probados y fueron modificadas, si fuera necesario, para tener en cuenta posibles variaciones de secuencia. Para ello, se obtuvieron todas las secuencias del genoma completo disponibles para cada virus de GenBank, importadas en el Editor de Alineación de Secuencias de BioEdit v7.1.7 y alineadas utilizando ClustalX. En caso de desajustes entre las secuencias de primos/sondas publicadas y las secuencias de destino, se aplicaron modificaciones, como se indica en la Tabla 1. Las alineaciones para los virus, que requerían cambios en los primos/sondas están disponibles en Fasta-Format como suplemento S1-S4 Files. Las concentraciones de primos y las condiciones de reacción para los cuatro ensayos se optimizaron posteriormente para multiplexar. Para evaluar la sensibilidad y especificidad de los ensayos, el laboratorio inscrito durante dos años consecutivos en Control de Calidad para Diagnósticos Moleculares (QCMD) esquemas de evaluación de calidad externa para todos los virus, excepto Bocavirus, que no Se evaluó una posible correlación de prevalencia de virus y edad de infección mediante análisis univariados, se utilizó la prueba exacta de Fisher donde se encontraron recuentos celulares menores de 5 años; de lo contrario, se realizó la prueba de chi-cuadrado; se utilizaron las mismas pruebas estadísticas para comparar la frecuencia de sujetos con infecciones únicas o múltiples entre grupos de edad; además, se utilizó la correlación de Pearson para examinar coinfecciones de diferentes virus; todos los análisis estadísticos se realizaron con StataSE 12 (StatCorp. 2007. College Station, TX, EE.UU.); el presente estudio fue una investigación prospectiva de niños hospitalizados con infecciones respiratorias agudas entre noviembre de 2010 y octubre de 2013 en Chipre; la mediana de edad de los niños fue de 15 meses (rango: 0-140 meses) con 243 hombres y 181 mujeres (proporción masculino/ femenino 1.34). La distribución de la edad se muestra en la figura Los resultados se resumen en la Tabla 2.Los virus más comúnmente detectados fueron el VRS, que se encontró en 129 (30,4%) pacientes y rinovirus en 116 (27,4%) que representan en conjunto casi el 60% de todas las detecciones; con frecuencia moderada se ha detectado VHAd en 31 (7,3%) pacientes, influenza A en 28 (6,6%), HBoV en 24 (5,7%), enterovirus y IVP 3 en 23 (5,4%) pacientes respectivamente, y Influenza B en 21 (5,0%); una baja frecuencia fue exhibida por VPHM con 16 (3,8%) muestras positivas, coronavirus humano OC43 con 13 (3,1%), IVP 1 con 12 (2,8%), IVP 4 con 9 (2,1%), IVP 2 con 7 (1,7%) y VPH NL63 con 6 (1,4%). Coronavirus 229E sólo se pudo detectar en una sola muestra. Las coinfecciones con dos o más virus fueron observadas en 84 de las 364 muestras positivas (ver Tabla 2 ). Las infecciones duales representaron el 17% de todas las muestras positivas y tres virus fueron detectados en el 2,7% de las muestras). Una muestra de un solo paciente mostró una infección cuádruple siendo simultáneamente positiva para VRS, rinovirus, HBoV e influenza B. La Tabla 3 resume la frecuencia de cada virus en infecciones individuales vs. múltiples, así como el número de co-ocurrencias de virus para cada posible combinación de virus. En términos absolutos la combinación más común observada fue VRS/rhinovirus. Sin embargo, como porcentaje, el virus que aparece con mayor frecuencia en infecciones fue VHBo, que se encontró en más del 70% de los casos junto con otro virus, seguido por coronavirus HCoV OC43 y HCoV NL63 con 61% y 67%, respectivamente Por otro lado, los virus más raramente observados en las coinfecciones fueron los virus influenza A y B, así como el VRS. Se calcularon coeficientes de correlación de Pearson para examinar la probabilidad de coinfecciones de diferentes virus. Los resultados del análisis se resumen en la Tabla 1 en la Tabla S1. Se observó correlación significativa (valor P < 0,05) principalmente para coinfecciones con VRS, sin embargo las correlaciones fueron muy débiles (r<0,3) y negativas. Este hallazgo puede explicarse probablemente por el hecho de que las infecciones por VRS ocurrieron predominantemente en los más jóvenes, donde las coinfecciones fueron menos frecuentes. Por otro lado, se observó una correlación positiva significativa para enterovirus y coinfección por rinovirus, lo que puede indicar similitudes en los patrones de circulación y/o modos de transmisión. En cuanto a la estacionalidad, se observaron diferentes patrones de circulación para el VRS, rinovirus y virus influenza (combinados A y B) (Fig 2), con una estacionalidad clara del VRS y la gripe con picos marcados en enero/febrero, mientras que las infecciones por rinovirus no mostraron una estacionalidad pronunciada casi a lo largo del año. Sin embargo, como se han identificado más de 100 cepas diferentes de rinovirus que circulan en todo el mundo en paralelo y sucesivamente, una estacionalidad potencial de serotipos individuales de rinovirus puede ser enmascarada por patrones superpuestos [18, 19]. Los datos fueron analizados con respecto a la distribución por edades de la infección viral (ver Tabla 2 ). En lactantes de hasta 3 meses de edad, el VRS fue con diferencia el patógeno más común (58,1%), seguido por el rinovirus (20,3%) y La incidencia de VRS, sin embargo, disminuye significativamente con el aumento de la edad (valor p < 0,0001) bajando al 13% en niños mayores de 3 años, mientras que la relación inversa se observa para Influenza A y B y HAdV. Los rinovirus, HBoV y enterovirus se observan con mayor frecuencia en niños de 4 meses a 3 años de edad. La dependencia de la edad de la incidencia del virus se visualiza en la figura 3 para los siete virus más frecuentemente observados. La tasa de positividad también mostró una tendencia según el grupo de edad descendiendo del 90,5% en niños menores de 3 meses al 78,3% en niños de 4-12 años (valor p = 0,020). Esto puede indicar un papel creciente de patógenos no incluidos en los ensayos, tales como infecciones bacterianas en niños mayores. En cuanto a las infecciones múltiples, los niños menores de 3 meses de edad y los mayores de 4 años tenían un riesgo significativamente menor de presentar infecciones múltiples en comparación con los otros dos grupos de edad (valor p = 0,014). Esto puede deberse a que los niños muy pequeños tienen un contacto limitado con otros, lo que reduce la posibilidad de una coinfección, mientras que los niños mayores de 3 años ya establecieron inmunidad a un número cada vez mayor de virus encontrados anteriormente. Este estudio examinó por primera vez la etiología de las infecciones respiratorias agudas en niños hospitalizados en Chipre. Se desarrollaron cuatro ensayos multiplex de RT-PCR en tiempo real con el fin de detectar los patógenos virales respiratorios más comunes de manera rápida y rentable. La alta tasa de muestras positivas (85,8%) es prueba de la alta sensibilidad de los ensayos multiplex utilizados y de que la gama de virus incluidos en el análisis es exhaustiva. Muchos estudios previos han mostrado tasas de detección que oscilan entre el 50% y el 75% [20] [22] [23] [24]. Los virus más comunes detectados fueron el VRS y el rinovirus que representan casi el 60% de todos los casos. Ambos virus fueron reportados anteriormente por otros como la mayor etiología para infecciones virales respiratorias en niños pequeños con rinovirus siendo cada vez más reconocidos por su papel en infecciones del tracto respiratorio inferior [20, [25] [26] [28] [30]. Nuestros datos apoyan los resultados de estudios similares realizados en la región de Oriente Medio. Un estudio publicado recientemente encontró que el VRS fue el virus más comúnmente detectado en hisopos nasofaríngeos de niños que presentaban síntomas de ITR y además mostró que las infecciones por VRS siguen un patrón de circulación similar que alcanzó su punto máximo entre diciembre y marzo [31]. Otro estudio ha revelado que la incidencia de VRS y IVP3 disminuye significativamente con la edad, mientras que lo contrario se observa para las infecciones por influenza y adenovirus, tendencia que también se observó en nuestro estudio [26]. Se observaron infecciones mixtas en aproximadamente el 20% de todas las muestras, lo que se encuentra en medio de tasas previamente reportadas que oscilan entre el 10 y casi el 40%. Se encontró HBoV, HCoV y EV con mayor frecuencia en las coinfecciones. Los tres subtipos de VHCo fueron codetectados con varios otros virus, mientras que HBoV fue codetectado principalmente con VHR y VRS. En el caso de infecciones por EV, el EV estuvo casi asociado con la VHR. También se observó la rara presencia de virus InfA e InfB en múltiples infecciones observadas en nuestro estudio [32, 33]. A pesar de que este estudio no permitió investigar una posible asociación entre infecciones múltiples y gravedad de la enfermedad, una revisión de la literatura muestra que tal posible asociación sigue siendo objeto de controversia, ya que hay informes que muestran que no hay relación de infección por virus múltiples con la gravedad de la enfermedad de respiración por un lado o una asociación significativa por el otro. Los estudios han demostrado que la coinfección viral estuvo significativamente asociada con la mayor duración de los síntomas de la enfermedad, pero con una disminución de la gravedad en niños hospitalizados con respecto a la necesidad de oxígeno y la admisión en unidades de cuidados intensivos, mientras que los hallazgos de otros estudios han indicado que los fenotipos clínicos graves fueron más prevalentes en pacientes de coinfección, especialmente en coinfección por VRS que pueden aumentar la gravedad de la enfermedad asociada con VRS en niños [25, [34] [36] [37] [39] [39] [40]. Las infecciones respiratorias virales Dado que los síntomas clínicos de los pacientes con infecciones agudas de las vías respiratorias no suelen permitir una discriminación de la etiología viral o bacteriana, se requieren herramientas de diagnóstico rápidas y fiables para una mejor administración de antibióticos y la aplicación de medidas adecuadas de control de las infecciones [4, 41]. Los datos presentados amplían nuestra comprensión de la epidemiología de las infecciones virales de las vías respiratorias en los niños chipriotas y serán útiles para los médicos e investigadores interesados en el tratamiento y control de las infecciones de las vías respiratorias virales.

¿Cuál es la infección más común en la infancia?

Etiología de las infecciones agudas del tracto respiratorio en niños hospitalizados en Chiprehttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4720120/SHA: efd27ff0ac04dd6083266386aaebb5df80f4fa9Autores: Richter, Jan; Panayiotou, Christakis; Tryfonos, Christina; Koptides, Dana; Koliou, Maria; Kalogirou, Nikolas; Georgiou, Eleni; Christodoulou, ChristinaFecha: 2016-01-13DOI: 10.1371/journal.pone.0147041Licencia: cc-byAbstract: Para mejorar la gestión clínica y la prevención de las infecciones virales en niños hospitalizados se necesita una mejor comprensión etiológica. El objetivo del presente estudio fue evaluar el espectro de patógenos virales respiratorios en niños ingresados en el hospital con infecciones agudas de las vías respiratorias en Chipre, para lo cual se recogieron muestras de hisopos nasofaríngeos de 424 niños menores de 12 años con infecciones agudas de las vías respiratorias durante tres temporadas epidémicas y se analizaron para detectar la presencia de los 15 virus respiratorios más comunes; se identificó un patógeno viral en el 86% de las muestras, observándose múltiples infecciones en casi el 20% de las muestras; los virus detectados con mayor frecuencia fueron VRS (30,4%) y Rhinovirus (27,4%). El VRS mostró una estacionalidad clara con picos marcados en enero/febrero, mientras que las infecciones por rinovirus no mostraron una estacionalidad pronunciada casi a lo largo del año; mientras que la incidencia de VRS y PIV3 disminuyó significativamente con la edad, Los datos presentados amplían nuestra comprensión de la epidemiología de las infecciones de las vías respiratorias virales en los niños chipriotas y serán útiles para los médicos e investigadores interesados en el tratamiento y control de las infecciones de las vías respiratorias virales. Texto: Las infecciones de las vías respiratorias virales (IRT) representan un importante problema de salud pública debido a su incidencia mundial, facilidad de transmisión y morbilidad y mortalidad considerables que afectan a personas de todas las edades. Los niños son, en promedio, infectados dos o tres veces más frecuentemente que los adultos, siendo las ITR agudas la infección más común en la infancia [1,2]. Las enfermedades causadas por virus respiratorios incluyen, entre otras, resfriados comunes, faringitis, crup, bronquiolitis, neumonía viral y otitis media. El diagnóstico rápido es importante no sólo para la intervención terapéutica oportuna sino también para la identificación de una epidemia de gripe inicial y la evitación del tratamiento antibiótico innecesario [3 La ITR aguda es más común en niños menores de 5 años y representa entre el 30% y el 50% de las admisiones médicas pediátricas, así como entre el 20% y el 40% de las hospitalizaciones en niños. Las infecciones respiratorias se agrupan durante el invierno y principios de los meses de primavera. Entre los principales agentes virales figuran el virus sincitial respiratorio (VSR), los virus influenza A y B (INF-A, INF-B), los virus parainfluenza (VPI) y los adenovirus humanos (VHAd). Además, hay una lista cada vez mayor de nuevos virus respiratorios que contribuyen significativamente a la carga de infecciones respiratorias agudas, como el metapneumovirus humano (VPH) recientemente identificado y el Bocavirus humano (VHBo) [5]. Las ITR agudas se clasifican como ITR superior (UTRI) e inferior (ITR), según la localización anatómica Las URTIs causan epidemias no graves pero generalizadas que son responsables de la circulación continua de patógenos en la comunidad. Las LRTIs han sido clasificadas como neumonía franca y bronquiolitis con características clínicas, radiológicas y etiológicas que normalmente se superponen [6, 7]. Los virus son nuevamente los principales agentes de las LRTIs a menudo mal diagnosticadas como bacterias de origen y, por lo tanto, tratadas con antibióticos innecesariamente [8]. El objetivo principal de este estudio fue determinar la etiología de las infecciones respiratorias agudas en niños chipriotas y evaluar la epidemiología de los patógenos virales identificados durante tres temporadas epidémicas. El estudio fue aprobado por el Comité Nacional de Bioética de Chipre. Entre noviembre de 2010 y octubre de 2013, se recogieron 485 muestras de hisopos nasofaríngeos de niños de hasta 12 años de edad, que habían sido hospitalizados con infección aguda del tracto respiratorio en el hospital Arzobispo Makarios III de Nicosia. Se registraron datos clínicos y demográficos que incluían síntomas, duración de la hospitalización, diagnóstico y tratamiento. Se recogieron muestras de hisopos nasales utilizando el kit de recogida de transporte viral universal de BD. Se extrajo ARN/DNA viral de 400 μl de muestra utilizando el kit de virus iPrep PureLink en un instrumento de purificación iPrep (Invitrogen). Se estableció y validó un conjunto de cuatro ensayos multiplex de RT-PCR en tiempo real para la detección de los 15 virus respiratorios más comunes de la siguiente manera: ensayo 1: influenzavirus A y B, RSV, ensayo 2: parainfluenzavirus 1-4, ensayo 3: HAdV, enterovirus, HMPV y HBoV y ensayo 4: rinovirus y los coronavirus humanos OC43, NL63 y 229E (Tabla 1). Se utilizaron conjuntos de imprimación y sonda publicados como base para diseñar los ensayos, sin embargo, todas las secuencias de primos/sondas fueron verificadas con alineaciones de secuencias de nueva construcción de todos los virus probados y fueron modificadas, si fuera necesario, para tener en cuenta posibles variaciones de secuencia. Para ello, se obtuvieron todas las secuencias del genoma completo disponibles para cada virus de GenBank, importadas en el Editor de Alineación de Secuencias de BioEdit v7.1.7 y alineadas utilizando ClustalX. En caso de desajustes entre las secuencias de primos/sondas publicadas y las secuencias de destino, se aplicaron modificaciones, como se indica en la Tabla 1. Las alineaciones para los virus, que requerían cambios en los primos/sondas están disponibles en Fasta-Format como suplemento S1-S4 Files. Las concentraciones de primos y las condiciones de reacción para los cuatro ensayos se optimizaron posteriormente para multiplexar. Para evaluar la sensibilidad y especificidad de los ensayos, el laboratorio inscrito durante dos años consecutivos en Control de Calidad para Diagnósticos Moleculares (QCMD) esquemas de evaluación de calidad externa para todos los virus, excepto Bocavirus, que no Se evaluó una posible correlación de prevalencia de virus y edad de infección mediante análisis univariados, se utilizó la prueba exacta de Fisher donde se encontraron recuentos celulares menores de 5 años; de lo contrario, se realizó la prueba de chi-cuadrado; se utilizaron las mismas pruebas estadísticas para comparar la frecuencia de sujetos con infecciones únicas o múltiples entre grupos de edad; además, se utilizó la correlación de Pearson para examinar coinfecciones de diferentes virus; todos los análisis estadísticos se realizaron con StataSE 12 (StatCorp. 2007. College Station, TX, EE.UU.); el presente estudio fue una investigación prospectiva de niños hospitalizados con infecciones respiratorias agudas entre noviembre de 2010 y octubre de 2013 en Chipre; la mediana de edad de los niños fue de 15 meses (rango: 0-140 meses) con 243 hombres y 181 mujeres (proporción masculino/ femenino 1.34). La distribución de la edad se muestra en la figura Los resultados se resumen en la Tabla 2.Los virus más comúnmente detectados fueron el VRS, que se encontró en 129 (30,4%) pacientes y rinovirus en 116 (27,4%) que representan en conjunto casi el 60% de todas las detecciones; con frecuencia moderada se ha detectado VHAd en 31 (7,3%) pacientes, influenza A en 28 (6,6%), HBoV en 24 (5,7%), enterovirus y IVP 3 en 23 (5,4%) pacientes respectivamente, y Influenza B en 21 (5,0%); una baja frecuencia fue exhibida por VPHM con 16 (3,8%) muestras positivas, coronavirus humano OC43 con 13 (3,1%), IVP 1 con 12 (2,8%), IVP 4 con 9 (2,1%), IVP 2 con 7 (1,7%) y VPH NL63 con 6 (1,4%). Coronavirus 229E sólo se pudo detectar en una sola muestra. Las coinfecciones con dos o más virus fueron observadas en 84 de las 364 muestras positivas (ver Tabla 2 ). Las infecciones duales representaron el 17% de todas las muestras positivas y tres virus fueron detectados en el 2,7% de las muestras). Una muestra de un solo paciente mostró una infección cuádruple siendo simultáneamente positiva para VRS, rinovirus, HBoV e influenza B. La Tabla 3 resume la frecuencia de cada virus en infecciones individuales vs. múltiples, así como el número de co-ocurrencias de virus para cada posible combinación de virus. En términos absolutos la combinación más común observada fue VRS/rhinovirus. Sin embargo, como porcentaje, el virus que aparece con mayor frecuencia en infecciones fue VHBo, que se encontró en más del 70% de los casos junto con otro virus, seguido por coronavirus HCoV OC43 y HCoV NL63 con 61% y 67%, respectivamente Por otro lado, los virus más raramente observados en las coinfecciones fueron los virus influenza A y B, así como el VRS. Se calcularon coeficientes de correlación de Pearson para examinar la probabilidad de coinfecciones de diferentes virus. Los resultados del análisis se resumen en la Tabla 1 en la Tabla S1. Se observó correlación significativa (valor P < 0,05) principalmente para coinfecciones con VRS, sin embargo las correlaciones fueron muy débiles (r<0,3) y negativas. Este hallazgo puede explicarse probablemente por el hecho de que las infecciones por VRS ocurrieron predominantemente en los más jóvenes, donde las coinfecciones fueron menos frecuentes. Por otro lado, se observó una correlación positiva significativa para enterovirus y coinfección por rinovirus, lo que puede indicar similitudes en los patrones de circulación y/o modos de transmisión. En cuanto a la estacionalidad, se observaron diferentes patrones de circulación para el VRS, rinovirus y virus influenza (combinados A y B) (Fig 2), con una estacionalidad clara del VRS y la gripe con picos marcados en enero/febrero, mientras que las infecciones por rinovirus no mostraron una estacionalidad pronunciada casi a lo largo del año. Sin embargo, como se han identificado más de 100 cepas diferentes de rinovirus que circulan en todo el mundo en paralelo y sucesivamente, una estacionalidad potencial de serotipos individuales de rinovirus puede ser enmascarada por patrones superpuestos [18, 19]. Los datos fueron analizados con respecto a la distribución por edades de la infección viral (ver Tabla 2 ). En lactantes de hasta 3 meses de edad, el VRS fue con diferencia el patógeno más común (58,1%), seguido por el rinovirus (20,3%) y La incidencia de VRS, sin embargo, disminuye significativamente con el aumento de la edad (valor p < 0,0001) bajando al 13% en niños mayores de 3 años, mientras que la relación inversa se observa para Influenza A y B y HAdV. Los rinovirus, HBoV y enterovirus se observan con mayor frecuencia en niños de 4 meses a 3 años de edad. La dependencia de la edad de la incidencia del virus se visualiza en la figura 3 para los siete virus más frecuentemente observados. La tasa de positividad también mostró una tendencia según el grupo de edad descendiendo del 90,5% en niños menores de 3 meses al 78,3% en niños de 4-12 años (valor p = 0,020). Esto puede indicar un papel creciente de patógenos no incluidos en los ensayos, tales como infecciones bacterianas en niños mayores. En cuanto a las infecciones múltiples, los niños menores de 3 meses de edad y los mayores de 4 años tenían un riesgo significativamente menor de presentar infecciones múltiples en comparación con los otros dos grupos de edad (valor p = 0,014). Esto puede deberse a que los niños muy pequeños tienen un contacto limitado con otros, lo que reduce la posibilidad de una coinfección, mientras que los niños mayores de 3 años ya establecieron inmunidad a un número cada vez mayor de virus encontrados anteriormente. Este estudio examinó por primera vez la etiología de las infecciones respiratorias agudas en niños hospitalizados en Chipre. Se desarrollaron cuatro ensayos multiplex de RT-PCR en tiempo real con el fin de detectar los patógenos virales respiratorios más comunes de manera rápida y rentable. La alta tasa de muestras positivas (85,8%) es prueba de la alta sensibilidad de los ensayos multiplex utilizados y de que la gama de virus incluidos en el análisis es exhaustiva. Muchos estudios previos han mostrado tasas de detección que oscilan entre el 50% y el 75% [20] [22] [23] [24]. Los virus más comunes detectados fueron el VRS y el rinovirus que representan casi el 60% de todos los casos. Ambos virus fueron reportados anteriormente por otros como la mayor etiología para infecciones virales respiratorias en niños pequeños con rinovirus siendo cada vez más reconocidos por su papel en infecciones del tracto respiratorio inferior [20, [25] [26] [28] [30]. Nuestros datos apoyan los resultados de estudios similares realizados en la región de Oriente Medio. Un estudio publicado recientemente encontró que el VRS fue el virus más comúnmente detectado en hisopos nasofaríngeos de niños que presentaban síntomas de ITR y además mostró que las infecciones por VRS siguen un patrón de circulación similar que alcanzó su punto máximo entre diciembre y marzo [31]. Otro estudio ha revelado que la incidencia de VRS y IVP3 disminuye significativamente con la edad, mientras que lo contrario se observa para las infecciones por influenza y adenovirus, tendencia que también se observó en nuestro estudio [26]. Se observaron infecciones mixtas en aproximadamente el 20% de todas las muestras, lo que se encuentra en medio de tasas previamente reportadas que oscilan entre el 10 y casi el 40%. Se encontró HBoV, HCoV y EV con mayor frecuencia en las coinfecciones. Los tres subtipos de VHCo fueron codetectados con varios otros virus, mientras que HBoV fue codetectado principalmente con VHR y VRS. En el caso de infecciones por EV, el EV estuvo casi asociado con la VHR. También se observó la rara presencia de virus InfA e InfB en múltiples infecciones observadas en nuestro estudio [32, 33]. A pesar de que este estudio no permitió investigar una posible asociación entre infecciones múltiples y gravedad de la enfermedad, una revisión de la literatura muestra que tal posible asociación sigue siendo objeto de controversia, ya que hay informes que muestran que no hay relación de infección por virus múltiples con la gravedad de la enfermedad de respiración por un lado o una asociación significativa por el otro. Los estudios han demostrado que la coinfección viral estuvo significativamente asociada con la mayor duración de los síntomas de la enfermedad, pero con una disminución de la gravedad en niños hospitalizados con respecto a la necesidad de oxígeno y la admisión en unidades de cuidados intensivos, mientras que los hallazgos de otros estudios han indicado que los fenotipos clínicos graves fueron más prevalentes en pacientes de coinfección, especialmente en coinfección por VRS que pueden aumentar la gravedad de la enfermedad asociada con VRS en niños [25, [34] [36] [37] [39] [39] [40]. Las infecciones respiratorias virales Dado que los síntomas clínicos de los pacientes con infecciones agudas de las vías respiratorias no suelen permitir una discriminación de la etiología viral o bacteriana, se requieren herramientas de diagnóstico rápidas y fiables para una mejor administración de antibióticos y la aplicación de medidas adecuadas de control de las infecciones [4, 41]. Los datos presentados amplían nuestra comprensión de la epidemiología de las infecciones virales de las vías respiratorias en los niños chipriotas y serán útiles para los médicos e investigadores interesados en el tratamiento y control de las infecciones de las vías respiratorias virales.

¿Qué pueden causar los virus respiratorios?

Etiología de las infecciones agudas del tracto respiratorio en niños hospitalizados en Chiprehttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4720120/SHA: efd27ff0ac04dd6083266386aaebb5df80f4fa9Autores: Richter, Jan; Panayiotou, Christakis; Tryfonos, Christina; Koptides, Dana; Koliou, Maria; Kalogirou, Nikolas; Georgiou, Eleni; Christodoulou, ChristinaFecha: 2016-01-13DOI: 10.1371/journal.pone.0147041Licencia: cc-byAbstract: Para mejorar la gestión clínica y la prevención de las infecciones virales en niños hospitalizados se necesita una mejor comprensión etiológica. El objetivo del presente estudio fue evaluar el espectro de patógenos virales respiratorios en niños ingresados en el hospital con infecciones agudas de las vías respiratorias en Chipre, para lo cual se recogieron muestras de hisopos nasofaríngeos de 424 niños menores de 12 años con infecciones agudas de las vías respiratorias durante tres temporadas epidémicas y se analizaron para detectar la presencia de los 15 virus respiratorios más comunes; se identificó un patógeno viral en el 86% de las muestras, observándose múltiples infecciones en casi el 20% de las muestras; los virus detectados con mayor frecuencia fueron VRS (30,4%) y Rhinovirus (27,4%). El VRS mostró una estacionalidad clara con picos marcados en enero/febrero, mientras que las infecciones por rinovirus no mostraron una estacionalidad pronunciada casi a lo largo del año; mientras que la incidencia de VRS y PIV3 disminuyó significativamente con la edad, Los datos presentados amplían nuestra comprensión de la epidemiología de las infecciones de las vías respiratorias virales en los niños chipriotas y serán útiles para los médicos e investigadores interesados en el tratamiento y control de las infecciones de las vías respiratorias virales. Texto: Las infecciones de las vías respiratorias virales (IRT) representan un importante problema de salud pública debido a su incidencia mundial, facilidad de transmisión y morbilidad y mortalidad considerables que afectan a personas de todas las edades. Los niños son, en promedio, infectados dos o tres veces más frecuentemente que los adultos, siendo las ITR agudas la infección más común en la infancia [1,2]. Las enfermedades causadas por virus respiratorios incluyen, entre otras, resfriados comunes, faringitis, crup, bronquiolitis, neumonía viral y otitis media. El diagnóstico rápido es importante no sólo para la intervención terapéutica oportuna sino también para la identificación de una epidemia de gripe inicial y la evitación del tratamiento antibiótico innecesario [3 La ITR aguda es más común en niños menores de 5 años y representa entre el 30% y el 50% de las admisiones médicas pediátricas, así como entre el 20% y el 40% de las hospitalizaciones en niños. Las infecciones respiratorias se agrupan durante el invierno y principios de los meses de primavera. Entre los principales agentes virales figuran el virus sincitial respiratorio (VSR), los virus influenza A y B (INF-A, INF-B), los virus parainfluenza (VPI) y los adenovirus humanos (VHAd). Además, hay una lista cada vez mayor de nuevos virus respiratorios que contribuyen significativamente a la carga de infecciones respiratorias agudas, como el metapneumovirus humano (VPH) recientemente identificado y el Bocavirus humano (VHBo) [5]. Las ITR agudas se clasifican como ITR superior (UTRI) e inferior (ITR), según la localización anatómica Las URTIs causan epidemias no graves pero generalizadas que son responsables de la circulación continua de patógenos en la comunidad. Las LRTIs han sido clasificadas como neumonía franca y bronquiolitis con características clínicas, radiológicas y etiológicas que normalmente se superponen [6, 7]. Los virus son nuevamente los principales agentes de las LRTIs a menudo mal diagnosticadas como bacterias de origen y, por lo tanto, tratadas con antibióticos innecesariamente [8]. El objetivo principal de este estudio fue determinar la etiología de las infecciones respiratorias agudas en niños chipriotas y evaluar la epidemiología de los patógenos virales identificados durante tres temporadas epidémicas. El estudio fue aprobado por el Comité Nacional de Bioética de Chipre. Entre noviembre de 2010 y octubre de 2013, se recogieron 485 muestras de hisopos nasofaríngeos de niños de hasta 12 años de edad, que habían sido hospitalizados con infección aguda del tracto respiratorio en el hospital Arzobispo Makarios III de Nicosia. Se registraron datos clínicos y demográficos que incluían síntomas, duración de la hospitalización, diagnóstico y tratamiento. Se recogieron muestras de hisopos nasales utilizando el kit de recogida de transporte viral universal de BD. Se extrajo ARN/DNA viral de 400 μl de muestra utilizando el kit de virus iPrep PureLink en un instrumento de purificación iPrep (Invitrogen). Se estableció y validó un conjunto de cuatro ensayos multiplex de RT-PCR en tiempo real para la detección de los 15 virus respiratorios más comunes de la siguiente manera: ensayo 1: influenzavirus A y B, RSV, ensayo 2: parainfluenzavirus 1-4, ensayo 3: HAdV, enterovirus, HMPV y HBoV y ensayo 4: rinovirus y los coronavirus humanos OC43, NL63 y 229E (Tabla 1). Se utilizaron conjuntos de imprimación y sonda publicados como base para diseñar los ensayos, sin embargo, todas las secuencias de primos/sondas fueron verificadas con alineaciones de secuencias de nueva construcción de todos los virus probados y fueron modificadas, si fuera necesario, para tener en cuenta posibles variaciones de secuencia. Para ello, se obtuvieron todas las secuencias del genoma completo disponibles para cada virus de GenBank, importadas en el Editor de Alineación de Secuencias de BioEdit v7.1.7 y alineadas utilizando ClustalX. En caso de desajustes entre las secuencias de primos/sondas publicadas y las secuencias de destino, se aplicaron modificaciones, como se indica en la Tabla 1. Las alineaciones para los virus, que requerían cambios en los primos/sondas están disponibles en Fasta-Format como suplemento S1-S4 Files. Las concentraciones de primos y las condiciones de reacción para los cuatro ensayos se optimizaron posteriormente para multiplexar. Para evaluar la sensibilidad y especificidad de los ensayos, el laboratorio inscrito durante dos años consecutivos en Control de Calidad para Diagnósticos Moleculares (QCMD) esquemas de evaluación de calidad externa para todos los virus, excepto Bocavirus, que no Se evaluó una posible correlación de prevalencia de virus y edad de infección mediante análisis univariados, se utilizó la prueba exacta de Fisher donde se encontraron recuentos celulares menores de 5 años; de lo contrario, se realizó la prueba de chi-cuadrado; se utilizaron las mismas pruebas estadísticas para comparar la frecuencia de sujetos con infecciones únicas o múltiples entre grupos de edad; además, se utilizó la correlación de Pearson para examinar coinfecciones de diferentes virus; todos los análisis estadísticos se realizaron con StataSE 12 (StatCorp. 2007. College Station, TX, EE.UU.); el presente estudio fue una investigación prospectiva de niños hospitalizados con infecciones respiratorias agudas entre noviembre de 2010 y octubre de 2013 en Chipre; la mediana de edad de los niños fue de 15 meses (rango: 0-140 meses) con 243 hombres y 181 mujeres (proporción masculino/ femenino 1.34). La distribución de la edad se muestra en la figura Los resultados se resumen en la Tabla 2.Los virus más comúnmente detectados fueron el VRS, que se encontró en 129 (30,4%) pacientes y rinovirus en 116 (27,4%) que representan en conjunto casi el 60% de todas las detecciones; con frecuencia moderada se ha detectado VHAd en 31 (7,3%) pacientes, influenza A en 28 (6,6%), HBoV en 24 (5,7%), enterovirus y IVP 3 en 23 (5,4%) pacientes respectivamente, y Influenza B en 21 (5,0%); una baja frecuencia fue exhibida por VPHM con 16 (3,8%) muestras positivas, coronavirus humano OC43 con 13 (3,1%), IVP 1 con 12 (2,8%), IVP 4 con 9 (2,1%), IVP 2 con 7 (1,7%) y VPH NL63 con 6 (1,4%). Coronavirus 229E sólo se pudo detectar en una sola muestra. Las coinfecciones con dos o más virus fueron observadas en 84 de las 364 muestras positivas (ver Tabla 2 ). Las infecciones duales representaron el 17% de todas las muestras positivas y tres virus fueron detectados en el 2,7% de las muestras). Una muestra de un solo paciente mostró una infección cuádruple siendo simultáneamente positiva para VRS, rinovirus, HBoV e influenza B. La Tabla 3 resume la frecuencia de cada virus en infecciones individuales vs. múltiples, así como el número de co-ocurrencias de virus para cada posible combinación de virus. En términos absolutos la combinación más común observada fue VRS/rhinovirus. Sin embargo, como porcentaje, el virus que aparece con mayor frecuencia en infecciones fue VHBo, que se encontró en más del 70% de los casos junto con otro virus, seguido por coronavirus HCoV OC43 y HCoV NL63 con 61% y 67%, respectivamente Por otro lado, los virus más raramente observados en las coinfecciones fueron los virus influenza A y B, así como el VRS. Se calcularon coeficientes de correlación de Pearson para examinar la probabilidad de coinfecciones de diferentes virus. Los resultados del análisis se resumen en la Tabla 1 en la Tabla S1. Se observó correlación significativa (valor P < 0,05) principalmente para coinfecciones con VRS, sin embargo las correlaciones fueron muy débiles (r<0,3) y negativas. Este hallazgo puede explicarse probablemente por el hecho de que las infecciones por VRS ocurrieron predominantemente en los más jóvenes, donde las coinfecciones fueron menos frecuentes. Por otro lado, se observó una correlación positiva significativa para enterovirus y coinfección por rinovirus, lo que puede indicar similitudes en los patrones de circulación y/o modos de transmisión. En cuanto a la estacionalidad, se observaron diferentes patrones de circulación para el VRS, rinovirus y virus influenza (combinados A y B) (Fig 2), con una estacionalidad clara del VRS y la gripe con picos marcados en enero/febrero, mientras que las infecciones por rinovirus no mostraron una estacionalidad pronunciada casi a lo largo del año. Sin embargo, como se han identificado más de 100 cepas diferentes de rinovirus que circulan en todo el mundo en paralelo y sucesivamente, una estacionalidad potencial de serotipos individuales de rinovirus puede ser enmascarada por patrones superpuestos [18, 19]. Los datos fueron analizados con respecto a la distribución por edades de la infección viral (ver Tabla 2 ). En lactantes de hasta 3 meses de edad, el VRS fue con diferencia el patógeno más común (58,1%), seguido por el rinovirus (20,3%) y La incidencia de VRS, sin embargo, disminuye significativamente con el aumento de la edad (valor p < 0,0001) bajando al 13% en niños mayores de 3 años, mientras que la relación inversa se observa para Influenza A y B y HAdV. Los rinovirus, HBoV y enterovirus se observan con mayor frecuencia en niños de 4 meses a 3 años de edad. La dependencia de la edad de la incidencia del virus se visualiza en la figura 3 para los siete virus más frecuentemente observados. La tasa de positividad también mostró una tendencia según el grupo de edad descendiendo del 90,5% en niños menores de 3 meses al 78,3% en niños de 4-12 años (valor p = 0,020). Esto puede indicar un papel creciente de patógenos no incluidos en los ensayos, tales como infecciones bacterianas en niños mayores. En cuanto a las infecciones múltiples, los niños menores de 3 meses de edad y los mayores de 4 años tenían un riesgo significativamente menor de presentar infecciones múltiples en comparación con los otros dos grupos de edad (valor p = 0,014). Esto puede deberse a que los niños muy pequeños tienen un contacto limitado con otros, lo que reduce la posibilidad de una coinfección, mientras que los niños mayores de 3 años ya establecieron inmunidad a un número cada vez mayor de virus encontrados anteriormente. Este estudio examinó por primera vez la etiología de las infecciones respiratorias agudas en niños hospitalizados en Chipre. Se desarrollaron cuatro ensayos multiplex de RT-PCR en tiempo real con el fin de detectar los patógenos virales respiratorios más comunes de manera rápida y rentable. La alta tasa de muestras positivas (85,8%) es prueba de la alta sensibilidad de los ensayos multiplex utilizados y de que la gama de virus incluidos en el análisis es exhaustiva. Muchos estudios previos han mostrado tasas de detección que oscilan entre el 50% y el 75% [20] [22] [23] [24]. Los virus más comunes detectados fueron el VRS y el rinovirus que representan casi el 60% de todos los casos. Ambos virus fueron reportados anteriormente por otros como la mayor etiología para infecciones virales respiratorias en niños pequeños con rinovirus siendo cada vez más reconocidos por su papel en infecciones del tracto respiratorio inferior [20, [25] [26] [28] [30]. Nuestros datos apoyan los resultados de estudios similares realizados en la región de Oriente Medio. Un estudio publicado recientemente encontró que el VRS fue el virus más comúnmente detectado en hisopos nasofaríngeos de niños que presentaban síntomas de ITR y además mostró que las infecciones por VRS siguen un patrón de circulación similar que alcanzó su punto máximo entre diciembre y marzo [31]. Otro estudio ha revelado que la incidencia de VRS y IVP3 disminuye significativamente con la edad, mientras que lo contrario se observa para las infecciones por influenza y adenovirus, tendencia que también se observó en nuestro estudio [26]. Se observaron infecciones mixtas en aproximadamente el 20% de todas las muestras, lo que se encuentra en medio de tasas previamente reportadas que oscilan entre el 10 y casi el 40%. Se encontró HBoV, HCoV y EV con mayor frecuencia en las coinfecciones. Los tres subtipos de VHCo fueron codetectados con varios otros virus, mientras que HBoV fue codetectado principalmente con VHR y VRS. En el caso de infecciones por EV, el EV estuvo casi asociado con la VHR. También se observó la rara presencia de virus InfA e InfB en múltiples infecciones observadas en nuestro estudio [32, 33]. A pesar de que este estudio no permitió investigar una posible asociación entre infecciones múltiples y gravedad de la enfermedad, una revisión de la literatura muestra que tal posible asociación sigue siendo objeto de controversia, ya que hay informes que muestran que no hay relación de infección por virus múltiples con la gravedad de la enfermedad de respiración por un lado o una asociación significativa por el otro. Los estudios han demostrado que la coinfección viral estuvo significativamente asociada con la mayor duración de los síntomas de la enfermedad, pero con una disminución de la gravedad en niños hospitalizados con respecto a la necesidad de oxígeno y la admisión en unidades de cuidados intensivos, mientras que los hallazgos de otros estudios han indicado que los fenotipos clínicos graves fueron más prevalentes en pacientes de coinfección, especialmente en coinfección por VRS que pueden aumentar la gravedad de la enfermedad asociada con VRS en niños [25, [34] [36] [37] [39] [39] [40]. Las infecciones respiratorias virales Dado que los síntomas clínicos de los pacientes con infecciones agudas de las vías respiratorias no suelen permitir una discriminación de la etiología viral o bacteriana, se requieren herramientas de diagnóstico rápidas y fiables para una mejor administración de antibióticos y la aplicación de medidas adecuadas de control de las infecciones [4, 41]. Los datos presentados amplían nuestra comprensión de la epidemiología de las infecciones virales de las vías respiratorias en los niños chipriotas y serán útiles para los médicos e investigadores interesados en el tratamiento y control de las infecciones de las vías respiratorias virales.

¿Cuál es la infección viral más común para bebés de hasta 3 meses de edad?

Etiología de las infecciones agudas del tracto respiratorio en niños hospitalizados en Chiprehttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4720120/SHA: efd27ff0ac04dd6083266386aaebb5df80f4fa9Autores: Richter, Jan; Panayiotou, Christakis; Tryfonos, Christina; Koptides, Dana; Koliou, Maria; Kalogirou, Nikolas; Georgiou, Eleni; Christodoulou, ChristinaFecha: 2016-01-13DOI: 10.1371/journal.pone.0147041Licencia: cc-byAbstract: Para mejorar la gestión clínica y la prevención de las infecciones virales en niños hospitalizados se necesita una mejor comprensión etiológica. El objetivo del presente estudio fue evaluar el espectro de patógenos virales respiratorios en niños ingresados en el hospital con infecciones agudas de las vías respiratorias en Chipre, para lo cual se recogieron muestras de hisopos nasofaríngeos de 424 niños menores de 12 años con infecciones agudas de las vías respiratorias durante tres temporadas epidémicas y se analizaron para detectar la presencia de los 15 virus respiratorios más comunes; se identificó un patógeno viral en el 86% de las muestras, observándose múltiples infecciones en casi el 20% de las muestras; los virus detectados con mayor frecuencia fueron VRS (30,4%) y Rhinovirus (27,4%). El VRS mostró una estacionalidad clara con picos marcados en enero/febrero, mientras que las infecciones por rinovirus no mostraron una estacionalidad pronunciada casi a lo largo del año; mientras que la incidencia de VRS y PIV3 disminuyó significativamente con la edad, Los datos presentados amplían nuestra comprensión de la epidemiología de las infecciones de las vías respiratorias virales en los niños chipriotas y serán útiles para los médicos e investigadores interesados en el tratamiento y control de las infecciones de las vías respiratorias virales. Texto: Las infecciones de las vías respiratorias virales (IRT) representan un importante problema de salud pública debido a su incidencia mundial, facilidad de transmisión y morbilidad y mortalidad considerables que afectan a personas de todas las edades. Los niños son, en promedio, infectados dos o tres veces más frecuentemente que los adultos, siendo las ITR agudas la infección más común en la infancia [1,2]. Las enfermedades causadas por virus respiratorios incluyen, entre otras, resfriados comunes, faringitis, crup, bronquiolitis, neumonía viral y otitis media. El diagnóstico rápido es importante no sólo para la intervención terapéutica oportuna sino también para la identificación de una epidemia de gripe inicial y la evitación del tratamiento antibiótico innecesario [3 La ITR aguda es más común en niños menores de 5 años y representa entre el 30% y el 50% de las admisiones médicas pediátricas, así como entre el 20% y el 40% de las hospitalizaciones en niños. Las infecciones respiratorias se agrupan durante el invierno y principios de los meses de primavera. Entre los principales agentes virales figuran el virus sincitial respiratorio (VSR), los virus influenza A y B (INF-A, INF-B), los virus parainfluenza (VPI) y los adenovirus humanos (VHAd). Además, hay una lista cada vez mayor de nuevos virus respiratorios que contribuyen significativamente a la carga de infecciones respiratorias agudas, como el metapneumovirus humano (VPH) recientemente identificado y el Bocavirus humano (VHBo) [5]. Las ITR agudas se clasifican como ITR superior (UTRI) e inferior (ITR), según la localización anatómica Las URTIs causan epidemias no graves pero generalizadas que son responsables de la circulación continua de patógenos en la comunidad. Las LRTIs han sido clasificadas como neumonía franca y bronquiolitis con características clínicas, radiológicas y etiológicas que normalmente se superponen [6, 7]. Los virus son nuevamente los principales agentes de las LRTIs a menudo mal diagnosticadas como bacterias de origen y, por lo tanto, tratadas con antibióticos innecesariamente [8]. El objetivo principal de este estudio fue determinar la etiología de las infecciones respiratorias agudas en niños chipriotas y evaluar la epidemiología de los patógenos virales identificados durante tres temporadas epidémicas. El estudio fue aprobado por el Comité Nacional de Bioética de Chipre. Entre noviembre de 2010 y octubre de 2013, se recogieron 485 muestras de hisopos nasofaríngeos de niños de hasta 12 años de edad, que habían sido hospitalizados con infección aguda del tracto respiratorio en el hospital Arzobispo Makarios III de Nicosia. Se registraron datos clínicos y demográficos que incluían síntomas, duración de la hospitalización, diagnóstico y tratamiento. Se recogieron muestras de hisopos nasales utilizando el kit de recogida de transporte viral universal de BD. Se extrajo ARN/DNA viral de 400 μl de muestra utilizando el kit de virus iPrep PureLink en un instrumento de purificación iPrep (Invitrogen). Se estableció y validó un conjunto de cuatro ensayos multiplex de RT-PCR en tiempo real para la detección de los 15 virus respiratorios más comunes de la siguiente manera: ensayo 1: influenzavirus A y B, RSV, ensayo 2: parainfluenzavirus 1-4, ensayo 3: HAdV, enterovirus, HMPV y HBoV y ensayo 4: rinovirus y los coronavirus humanos OC43, NL63 y 229E (Tabla 1). Se utilizaron conjuntos de imprimación y sonda publicados como base para diseñar los ensayos, sin embargo, todas las secuencias de primos/sondas fueron verificadas con alineaciones de secuencias de nueva construcción de todos los virus probados y fueron modificadas, si fuera necesario, para tener en cuenta posibles variaciones de secuencia. Para ello, se obtuvieron todas las secuencias del genoma completo disponibles para cada virus de GenBank, importadas en el Editor de Alineación de Secuencias de BioEdit v7.1.7 y alineadas utilizando ClustalX. En caso de desajustes entre las secuencias de primos/sondas publicadas y las secuencias de destino, se aplicaron modificaciones, como se indica en la Tabla 1. Las alineaciones para los virus, que requerían cambios en los primos/sondas están disponibles en Fasta-Format como suplemento S1-S4 Files. Las concentraciones de primos y las condiciones de reacción para los cuatro ensayos se optimizaron posteriormente para multiplexar. Para evaluar la sensibilidad y especificidad de los ensayos, el laboratorio inscrito durante dos años consecutivos en Control de Calidad para Diagnósticos Moleculares (QCMD) esquemas de evaluación de calidad externa para todos los virus, excepto Bocavirus, que no Se evaluó una posible correlación de prevalencia de virus y edad de infección mediante análisis univariados, se utilizó la prueba exacta de Fisher donde se encontraron recuentos celulares menores de 5 años; de lo contrario, se realizó la prueba de chi-cuadrado; se utilizaron las mismas pruebas estadísticas para comparar la frecuencia de sujetos con infecciones únicas o múltiples entre grupos de edad; además, se utilizó la correlación de Pearson para examinar coinfecciones de diferentes virus; todos los análisis estadísticos se realizaron con StataSE 12 (StatCorp. 2007. College Station, TX, EE.UU.); el presente estudio fue una investigación prospectiva de niños hospitalizados con infecciones respiratorias agudas entre noviembre de 2010 y octubre de 2013 en Chipre; la mediana de edad de los niños fue de 15 meses (rango: 0-140 meses) con 243 hombres y 181 mujeres (proporción masculino/ femenino 1.34). La distribución de la edad se muestra en la figura Los resultados se resumen en la Tabla 2.Los virus más comúnmente detectados fueron el VRS, que se encontró en 129 (30,4%) pacientes y rinovirus en 116 (27,4%) que representan en conjunto casi el 60% de todas las detecciones; con frecuencia moderada se ha detectado VHAd en 31 (7,3%) pacientes, influenza A en 28 (6,6%), HBoV en 24 (5,7%), enterovirus y IVP 3 en 23 (5,4%) pacientes respectivamente, y Influenza B en 21 (5,0%); una baja frecuencia fue exhibida por VPHM con 16 (3,8%) muestras positivas, coronavirus humano OC43 con 13 (3,1%), IVP 1 con 12 (2,8%), IVP 4 con 9 (2,1%), IVP 2 con 7 (1,7%) y VPH NL63 con 6 (1,4%). Coronavirus 229E sólo se pudo detectar en una sola muestra. Las coinfecciones con dos o más virus fueron observadas en 84 de las 364 muestras positivas (ver Tabla 2 ). Las infecciones duales representaron el 17% de todas las muestras positivas y tres virus fueron detectados en el 2,7% de las muestras). Una muestra de un solo paciente mostró una infección cuádruple siendo simultáneamente positiva para VRS, rinovirus, HBoV e influenza B. La Tabla 3 resume la frecuencia de cada virus en infecciones individuales vs. múltiples, así como el número de co-ocurrencias de virus para cada posible combinación de virus. En términos absolutos la combinación más común observada fue VRS/rhinovirus. Sin embargo, como porcentaje, el virus que aparece con mayor frecuencia en infecciones fue VHBo, que se encontró en más del 70% de los casos junto con otro virus, seguido por coronavirus HCoV OC43 y HCoV NL63 con 61% y 67%, respectivamente Por otro lado, los virus más raramente observados en las coinfecciones fueron los virus influenza A y B, así como el VRS. Se calcularon coeficientes de correlación de Pearson para examinar la probabilidad de coinfecciones de diferentes virus. Los resultados del análisis se resumen en la Tabla 1 en la Tabla S1. Se observó correlación significativa (valor P < 0,05) principalmente para coinfecciones con VRS, sin embargo las correlaciones fueron muy débiles (r<0,3) y negativas. Este hallazgo puede explicarse probablemente por el hecho de que las infecciones por VRS ocurrieron predominantemente en los más jóvenes, donde las coinfecciones fueron menos frecuentes. Por otro lado, se observó una correlación positiva significativa para enterovirus y coinfección por rinovirus, lo que puede indicar similitudes en los patrones de circulación y/o modos de transmisión. En cuanto a la estacionalidad, se observaron diferentes patrones de circulación para el VRS, rinovirus y virus influenza (combinados A y B) (Fig 2), con una estacionalidad clara del VRS y la gripe con picos marcados en enero/febrero, mientras que las infecciones por rinovirus no mostraron una estacionalidad pronunciada casi a lo largo del año. Sin embargo, como se han identificado más de 100 cepas diferentes de rinovirus que circulan en todo el mundo en paralelo y sucesivamente, una estacionalidad potencial de serotipos individuales de rinovirus puede ser enmascarada por patrones superpuestos [18, 19]. Los datos fueron analizados con respecto a la distribución por edades de la infección viral (ver Tabla 2 ). En lactantes de hasta 3 meses de edad, el VRS fue con diferencia el patógeno más común (58,1%), seguido por el rinovirus (20,3%) y La incidencia de VRS, sin embargo, disminuye significativamente con el aumento de la edad (valor p < 0,0001) bajando al 13% en niños mayores de 3 años, mientras que la relación inversa se observa para Influenza A y B y HAdV. Los rinovirus, HBoV y enterovirus se observan con mayor frecuencia en niños de 4 meses a 3 años de edad. La dependencia de la edad de la incidencia del virus se visualiza en la figura 3 para los siete virus más frecuentemente observados. La tasa de positividad también mostró una tendencia según el grupo de edad descendiendo del 90,5% en niños menores de 3 meses al 78,3% en niños de 4-12 años (valor p = 0,020). Esto puede indicar un papel creciente de patógenos no incluidos en los ensayos, tales como infecciones bacterianas en niños mayores. En cuanto a las infecciones múltiples, los niños menores de 3 meses de edad y los mayores de 4 años tenían un riesgo significativamente menor de presentar infecciones múltiples en comparación con los otros dos grupos de edad (valor p = 0,014). Esto puede deberse a que los niños muy pequeños tienen un contacto limitado con otros, lo que reduce la posibilidad de una coinfección, mientras que los niños mayores de 3 años ya establecieron inmunidad a un número cada vez mayor de virus encontrados anteriormente. Este estudio examinó por primera vez la etiología de las infecciones respiratorias agudas en niños hospitalizados en Chipre. Se desarrollaron cuatro ensayos multiplex de RT-PCR en tiempo real con el fin de detectar los patógenos virales respiratorios más comunes de manera rápida y rentable. La alta tasa de muestras positivas (85,8%) es prueba de la alta sensibilidad de los ensayos multiplex utilizados y de que la gama de virus incluidos en el análisis es exhaustiva. Muchos estudios previos han mostrado tasas de detección que oscilan entre el 50% y el 75% [20] [22] [23] [24]. Los virus más comunes detectados fueron el VRS y el rinovirus que representan casi el 60% de todos los casos. Ambos virus fueron reportados anteriormente por otros como la mayor etiología para infecciones virales respiratorias en niños pequeños con rinovirus siendo cada vez más reconocidos por su papel en infecciones del tracto respiratorio inferior [20, [25] [26] [28] [30]. Nuestros datos apoyan los resultados de estudios similares realizados en la región de Oriente Medio. Un estudio publicado recientemente encontró que el VRS fue el virus más comúnmente detectado en hisopos nasofaríngeos de niños que presentaban síntomas de ITR y además mostró que las infecciones por VRS siguen un patrón de circulación similar que alcanzó su punto máximo entre diciembre y marzo [31]. Otro estudio ha revelado que la incidencia de VRS y IVP3 disminuye significativamente con la edad, mientras que lo contrario se observa para las infecciones por influenza y adenovirus, tendencia que también se observó en nuestro estudio [26]. Se observaron infecciones mixtas en aproximadamente el 20% de todas las muestras, lo que se encuentra en medio de tasas previamente reportadas que oscilan entre el 10 y casi el 40%. Se encontró HBoV, HCoV y EV con mayor frecuencia en las coinfecciones. Los tres subtipos de VHCo fueron codetectados con varios otros virus, mientras que HBoV fue codetectado principalmente con VHR y VRS. En el caso de infecciones por EV, el EV estuvo casi asociado con la VHR. También se observó la rara presencia de virus InfA e InfB en múltiples infecciones observadas en nuestro estudio [32, 33]. A pesar de que este estudio no permitió investigar una posible asociación entre infecciones múltiples y gravedad de la enfermedad, una revisión de la literatura muestra que tal posible asociación sigue siendo objeto de controversia, ya que hay informes que muestran que no hay relación de infección por virus múltiples con la gravedad de la enfermedad de respiración por un lado o una asociación significativa por el otro. Los estudios han demostrado que la coinfección viral estuvo significativamente asociada con la mayor duración de los síntomas de la enfermedad, pero con una disminución de la gravedad en niños hospitalizados con respecto a la necesidad de oxígeno y la admisión en unidades de cuidados intensivos, mientras que los hallazgos de otros estudios han indicado que los fenotipos clínicos graves fueron más prevalentes en pacientes de coinfección, especialmente en coinfección por VRS que pueden aumentar la gravedad de la enfermedad asociada con VRS en niños [25, [34] [36] [37] [39] [39] [40]. Las infecciones respiratorias virales Dado que los síntomas clínicos de los pacientes con infecciones agudas de las vías respiratorias no suelen permitir una discriminación de la etiología viral o bacteriana, se requieren herramientas de diagnóstico rápidas y fiables para una mejor administración de antibióticos y la aplicación de medidas adecuadas de control de las infecciones [4, 41]. Los datos presentados amplían nuestra comprensión de la epidemiología de las infecciones virales de las vías respiratorias en los niños chipriotas y serán útiles para los médicos e investigadores interesados en el tratamiento y control de las infecciones de las vías respiratorias virales.

¿Cuál es la incidencia de VRS en niños mayores de 3 años?

Incidencia de la tos ferina basada en la población y factores de riesgo en lactantes menores de 6 meses en Nepalhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5907881/SHA: ef821e34873d4752ecae41cd9dfc08a5e6db45e2Autores: Hughes, Michelle M; Englund, Janet A; Kuypers, Jane; Tielsch, James M; Khatry, Subarna K; Shrestha, Laxman; LeClerq, Steven C; Steinhoff, Mark; Katz, JoanneFecha: 2017-03-01DOI: 10.1093/jpids/piw079Licencia: cc-byAbstract: ANTEGRANO: Se estima que la tos ferina La vacunación materna durante el embarazo puede ser eficaz para prevenir la tos ferina en lactantes pequeños, pero faltan estimaciones poblacionales de la carga de la enfermedad en lactantes, especialmente en países de bajos ingresos. El objetivo de este estudio fue estimar la incidencia de la tos ferina en lactantes menores de 6 meses de edad en el distrito de Sarlahi, Nepal. MÉTODOS: Anidados en un ensayo controlado aleatorizado de base poblacional de vacunación contra la gripe durante el embarazo, los bebés fueron visitados semanalmente desde el nacimiento hasta los 6 meses para evaluar enfermedades respiratorias en la semana anterior. Si se había producido algún síntoma respiratorio, se recogió un hisopo nasal y se probó con un ensayo multiobjetivo de reacción en cadena de la pertussis polimerasa (PCR). El estudio prospectivo de cohorte incluye a los bebés observados entre mayo de 2011 y agosto de 2014. RESULTADOS: La incidencia de la tos ferina de Bordetella confirmada por la PCR fue de 13,3 casos por 1000 lactantes-año (intervalo de confianza del 95%, 7,7-21,3) en una cohorte de 3.483 lactantes con al menos 1 día de seguimiento. CONCLUSIONES: En una vigilancia activa en el hogar basada en la población para enfermedades respiratorias, se estimó un bajo riesgo de tos ferina en lactantes de las zonas rurales de Nepal. El programa de inmunización de Nepal, que incluye una vacuna antipertussis de células enteras de la infancia, puede ser eficaz para controlar la tos ferina en lactantes. Texto: En varios países en los últimos años se ha producido un resurgimiento de la tos ferina en varios grupos de edad [1]. Los países de ingresos medios y altos que utilizan una vacuna antipertussis acelular para la serie de vacunación primaria han sido particularmente afectados [2, 3], y los lactantes y adolescentes han experimentado Los factores que pueden contribuir al aumento del riesgo de tos ferina incluyen la rápida disminución de la inmunidad de los vacunados con vacunas acelulares [1, 5, 6], la transmisión asintomática de los individuos vacunados con vacunas acelulares [7], la adaptación genética de Bordetella pertussis [8], el retraso o rechazo de la vacunación [9], la mejora de la capacidad de vigilancia y de laboratorio [2], y el aumento general del conocimiento de la continuidad de la circulación de la tos ferina B [1]. Algunos países que experimentan tos ferina epidémica, como los Estados Unidos, el Reino Unido y la Argentina, ahora recomiendan la inmunización de la tos ferina en el embarazo y la vacunación de contactos estrechos [10, 11] para proteger a los lactantes más jóvenes de la tos ferina antes de que puedan vacunarse ellos mismos [12]. En esta región, la vacunación contra la tos ferina materna durante el embarazo puede ser una forma de proteger a los lactantes, similar a la vacuna antitetánica. Sin embargo, a nivel mundial sólo se ha realizado una estimación basada en la población de la tos ferina desde el nacimiento (Senegal) [15], y se carece de capacidad de vigilancia y laboratorio en Asia [16, 17]. La Organización Mundial de la Salud (OMS) recomendó recientemente que los países que utilizan vacunas contra la tos ferina celular completa siguieran haciéndolo a la luz de los datos recientes que indican que las vacunas contra la tos ferina acelular son menos eficaces que las vacunas contra la tos ferina completa [18]. Se necesitan datos basados en la población, especialmente en entornos de bajos ingresos, para proporcionar una estimación más precisa de la carga de la tos ferina en los lactantes para informar sobre las políticas de inmunización materna e infantil [19, 20]. El objetivo fue proporcionar una estimación poblacional de la incidencia de tos ferina confirmada por laboratorio en niños menores de 6 meses de edad en el distrito de Sarlahi, Nepal. El estudio fue anidado en 2 ensayos controlados aleatorios consecutivos de vacunación materna contra la gripe durante el embarazo establecidos en el distrito de Sarlahi, ubicado en la región central de Terai (planicies bajas) de Nepal [21]. Al inicio del ensayo, se identificaron embarazos prevalentes mediante un censo de todos los hogares de la zona de captación. Durante el ensayo, los trabajadores sobre el terreno visitaron todos los hogares de las comunidades, cada 5 semanas, donde residían mujeres casadas (15-40 años), para la vigilancia de embarazos de incidentes. Una vez identificado el embarazo, las mujeres dieron su consentimiento y fueron matriculadas. Desde el 25 de abril de 2011 hasta el 9 de septiembre de 2013, las mujeres de 17 a 34 semanas de gestación fueron al azar y vacunadas El estudio fue una cohorte prospectiva basada en la población de lactantes seguida desde el nacimiento hasta 6 meses después del parto. Se obtuvo la aprobación para el estudio de las Juntas de Revisión Institucional de la Escuela Johns Hopkins Bloomberg de Salud Pública, el Centro Médico Infantil Cincinnati, el Instituto de Medicina de la Universidad Tribhuvan, Katmandú, y el Consejo de Investigación Sanitaria de Nepal. Los ensayos se registran en Clinicaltrials.gov (NCT01034254). En la línea de base, se recopiló información sobre la estructura del hogar, el estado socioeconómico y la demografía. En la inscripción, fecha del último período menstrual y los datos de la historia del embarazo se recogieron. Si un bebé presentaba alguno de los siguientes síntomas, se recolectó un hisopo de nailon medio nasal en masa: fiebre, tos, sibilancia, dificultad para respirar o infección del oído. A partir del 17 de agosto de 2012, se añadieron nuevos síntomas, más específicos para la tos ferina, a la visita semanal de morbilidad: apnea, cianosis, tos con vómito o tos ferina. Los hisopos se almacenaron hasta 1 semana a temperatura ambiente en el medio de transporte molecular de PrimeStore (Longhorn Diagnostics LLC, Bethesda, MD). Además de estos signos, se preguntó a las madres cuáles, en su caso, se recibieron vacunas para lactantes en los últimos 7 días, incluyendo la vacunación contra la tosferina [22]. También se recogieron hisopos medios nasales semanalmente de madres matriculadas a través de 6 meses después del parto que Todos los hisopos nasales recolectados de lactantes fueron analizados para detectar la tos ferina B, Bordetella parapertussis y Bordetella bronchispetica. Sólo los hisopos nasales de madres cuyos bebés dieron positivo para cualquiera de estos patógenos fueron probados para los mismos patógenos. En el Laboratorio de Virología Molecular de la Universidad de Washington se realizaron pruebas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real de acuerdo con métodos publicados previamente [23]. Se utilizó PCR de dos dianas para evaluar la presencia de 3 especies de Bordetella: pertussis B, B parapertussis y B bronchiseptica. Los objetivos amplificados fueron secuencia de inserción repetida cromosómica IS481 (IS) y la región promotora de la tos ferina polimórfica ptxA (PT). Después de la amplificación, los puntos de fusión de los amplicones se midieron en un iCycler (Bio-Rad). Una muestra se interpretó como positiva cuando el objetivo o objetivos tenían una temperatura de fusión dentro del rango aceptable específico de la especie y una tomografía computarizada ≤42. Una muestra fue negativa si ninguno de los objetivos probados positivo o un único objetivo positivo no era reproducible. Se probaron hisopos nasales maternos para aquellas madres cuyos bebés dieron positivo para cualquier especie de BordetellaReacción en cadena de la polimerasa también se realizó para varias infecciones virales (influenza, rinovirus [RV], virus respiratorio sincitial [RSV], bocavirus [BoV], metapneumovirus humano, coronavirus, adenovirus y parainfluenza [1] [3] [4] ) como se describió anteriormente [21]. De las 3693 mujeres matriculadas, 3646 lactantes nacieron vivos de 3621 mujeres (Figura 1 Suplementaria ). Los lactantes fueron incluidos en este análisis si fueron seguidos durante cualquier período de seguimiento (0 a 180 días); la mediana del seguimiento total fue de 146 días por niño (Figura 2 Suplementaria ). El conjunto de datos finales consta de 3483 lactantes, aportando 1280 años-lactante de observación, con al menos 1 visita de seguimiento durante los primeros 6 meses, lo que incluye a los lactantes de todo el período de prueba, tanto antes como después de adiciones más específicas a la tos ferina en el cuestionario semanal de síntomas. En la base, se recogieron datos sobre la estructura de los hogares. En la inscripción, las mujeres informaron de su estado de alfabetización (binario) y antecedentes de embarazo. Las mujeres fueron clasificadas como nulíparas o multiparosas. Se calcularon las respuestas a 25 preguntas sobre construcción del hogar, agua y saneamiento, y los bienes del hogar para desarrollar un índice para medir el estado socioeconómico de los hogares. Se calcularon variables binarias para cada una de las 25 preguntas y una puntuación media del SES para cada hogar. Se midió la edad gestacional utilizando el informe de la mujer sobre la fecha del último período menstrual durante la vigilancia del embarazo. El peso del nacimiento se recolectó tan pronto como fue posible después del nacimiento mediante una escala digital (Talita modelo BD-585, precisión a los 10 gramos más cercanos). Los pesos del nacimiento recolectados > 72 horas después del nacimiento fueron excluidos del análisis. Se preguntó a las mujeres dentro de las horas de inicio de la lactancia materna y se crearon categorías binarias de lactancia materna (≤1 hora frente a >1 hora después del parto), se calculó la incidencia como el número de casos de tos ferina por cada 1.000 lactantes en riesgo, se construyeron intervalos exactos de confianza de Poisson del 95% (IC), se compararon las características de los casos de tos ferina infantil con los casos de no tos ferina utilizando regresión de Poisson bivariada, se compararon las características de todos los episodios respiratorios de tos ferina con los episodios respiratorios de no tos ferina, se utilizaron pruebas t para predictores continuos y se utilizaron pruebas exactas de Fisher para asociaciones categóricas debido al bajo número de episodios de tos ferina, se realizaron todos los análisis estadísticos en Stata/SE 14.1. Un total de 3483 lactantes presentaron 4283 episodios de enfermedades respiratorias entre el 18 de mayo de 2011 y el 30 La incidencia de enfermedad respiratoria fue de 3,6 episodios por infante-año (IC 95%, 3,5-3,7). La duración media del episodio fue de 4,7 días (IC 95%, 4,6-4,9). Se identificaron 17 casos de tos ferina B a partir de 19 hisopos nasales (hisopos nasales positivos en 2 semanas consecutivas para 2 lactantes) y la incidencia de tos ferina B confirmada por PCR fue de 13,3 casos por 1000 años de infante (IC 95%, 7,7-21,3). Se detectaron 5 casos de parapertussis B con una incidencia de 3,9 casos por 1000 años de infante (IC 95%, 1,3-9,1). No se identificaron casos de bronquiseptica; la duración media del episodio de tos ferina fue de 8 días (rango, 2-33) (Tabla 1 ). La edad media de aparición de los síntomas fue de 83 días (rango, 19-137) (mediana, 80; rango intercuartílico, 63-109). Los síntomas más comunes fueron tos, dificultad para respirar y tos con vómito. Ninguno de los síntomas adicionales relacionados con la tos que se añadieron en el año 2 (cianosis, apnea, tos con vómito y whoop) dio lugar a la recolección de hisopos nasales basados únicamente en estos síntomas adicionales. Los episodios de tos fueron estadísticamente significativamente más propensos a incluir dificultad para respirar, tos con vómito y whoop en comparación con otras enfermedades respiratorias. Seis bebés tuvieron al menos una vacunación de pertussis antes de la aparición de la enfermedad de pertussis (tres < 2 semanas y tres > 2 semanas antes de la enfermedad de pertussis) con una media de 18 días de vacunación a la enfermedad en comparación con 49 días para episodios de no pertus Cinco infantes recibieron la primera vacunación contra la tos ferina postpertussis, mientras que 6 infantes no recibieron la vacunación contra la tos ferina en los primeros 180 días. Tres cuartas partes de los episodios de tos ferina fueron coinfectados con al menos 1 virus, con RV y BoV los más frecuentes. Los casos de tos ferina fueron más propensos a ser infectados con BoV que los casos respiratorios por causas distintas de la tos ferina. La mayoría de los casos ocurrieron entre febrero de 2013 y enero de 2014 (Figura 1). No se documentaron diferencias estadísticamente significativas entre los factores de riesgo de tos ferina y los casos de no tos ferina (Tabla 2). Dado el bajo número de casos de tos ferina, la falta de asociación estadística no es evidencia de no asociación. De las 8 madres de niños con tos ferina B positiva que recibieron un hisopo nasal (14 hisopos nasales totales) durante su propio seguimiento, ninguna fue positiva para ninguna especie de tos ferina. Los casos de parapertussis 5 B fueron principalmente masculinos cuyas madres eran primíparas, alfabetizadas y etnia pahadí (Tabla 1 Suplementaria). Ninguna madre de niños con parapertussis B tuvo un hisopo nasal recolectado durante el seguimiento. La duración media del episodio de parapertussis B fue de 4 días (Tabla 2 Suplementaria). La edad media de inicio de los síntomas fue de 58 días con un rango de 7 a 95 días. Los síntomas más comunes fueron tos y sibilancias. Rhinovirus y VSR fueron las únicas coinfecciones observadas. Todos los casos de parapertussis B ocurrieron entre septiembre de 2011 y febrero de 2012 (Figura 1 Se encontró una baja incidencia de tos ferina y una presentación clínica generalmente leve en niños menores de 6 meses en Nepal. Según nuestro conocimiento, esta es una de las primeras pruebas de vigilancia activa de la tos ferina confirmada por la población en niños pequeños en Asia. Los ensayos de la vacuna antipertussis acelular realizados en la década de 1990 encontraron que la incidencia media de tos ferina en los grupos de vacunación de células enteras oscilaba entre 1 y 37 casos por 1.000 infantes [26]. Nuestro hallazgo de 13 casos de tos ferina B por 1.000 infantes/niños se encontraba en el extremo inferior de este rango. En los Estados Unidos en 2014, la incidencia estimada de tos ferina en niños menores de 6 meses fue de 2 casos por 1.000 infantes/niños [27], mucho menor de lo observado en nuestro estudio; sin embargo, este sistema de vigilancia pasiva probablemente subestima enormemente la incidencia de tos ferina. Además, dado nuestro método de detección de casos altamente sensibles, muchos de nuestros casos de tos ferina probablemente no se habrían detectado en los ensayos previos de la vacuna antipertussis acelular. Los criterios más estrictos de los síntomas respiratorios habrían reducido aún más nuestra estimación de la incidencia.La baja incidencia se encontró en una población donde la vacuna pentavalente (Pentavac: Difteria, Tétanos, Pertussis [Célula Completa], Hepatitis-B y Haemophilus Tipo b Vacuna Conjugar; Serum Institute of India Pvt. Ltd), programada para su administración a las 6, 10 y 14 semanas, se recibe con retrasos significativos (el 7% de los lactantes recibió las 3 vacunas antipertussis recomendadas por 6 meses) [22]. Estos datos apoyan la recomendación de la OMS de que los países que utilizan la vacuna antipertussis celular completa sigan haciéndolo dado que la mayoría de los brotes se Estudios recientes sugieren que la protección de la vacuna contra la tos ferina acelular no es tan fuerte o de larga duración como la que confiere la vacuna contra la tos ferina completa [6, 28]. Otro factor que contribuye a la baja incidencia de tos ferina observada podría ser que la vigilancia se realizó durante un período de baja transmisión de la tos ferina. La tos ferina es una enfermedad cíclica, que se cree que alcanza su punto máximo cada 2 a 4 años, y que podemos haber captado la carga en un período de baja circulación [6]. Observamos más del 70% de nuestros casos de tos ferina B durante un período de 1 año. Este aumento de períodos de observación anteriores podría indicar un aumento temporal de la tos ferina consistente con su patrón cíclico o un verdadero aumento de la carga basal. La duración y gravedad de los síntomas de tos pertussis fueron leves en comparación con la presentación clásica del caso de tos pertussis. Sólo 3 de los 17 casos cumplieron los criterios de la OMS, lo que requiere un mínimo de 2 semanas de tos, tos ferina o vómitos posttusivos [31]. Los estudios sobre la tos en lactantes generalmente han sido clínicos, hospitalarios o en un brote, lo que requirió una cierta gravedad de enfermedad para que los padres reconocieran la necesidad de atención médica [29, 30, 32]. Por lo tanto, estos diseños de estudio y los esfuerzos de vigilancia pasiva pueden haber faltado a los casos de tos más leve [33]. Nuestro estudio, que requirió sólo 1 síntoma respiratorio para la recolección de un hisopo nasal, tuvo una mayor sensibilidad para detectar una gama de presentaciones de casos de tos ferina. Aunque la tos, la dificultad para respirar y la tos con vómito fueron los síntomas más comunes, no hubo ningún síntoma en todos los casos de tos B. Durante un período epidémico en el estado de Washington, entre los niños < 1 año, que tuvieron un mínimo de 14 días de tos más un síntoma adicional, el 82% tuvieron emesis posttusiva, el 29% tuvieron apnea, el 26% tuvieron whoop y el 42% tuvieron cianosis [32]. Un estudio de neonatos estadounidenses con pertussis mostró que la prevalencia de síntomas era del 97% para la tos, el 91% para la cianosis, el 58% para la apnea y el 3% para la fiebre [34]. Nuestro estudio encontró una prevalencia de síntomas menor o igual con la excepción de la fiebre. La prevalencia de fiebre fue mayor en nuestro estudio, similar a la encontrada en el Perú [29]. Aunque no son estadísticamente significativos, los bebés con tos ferina tenían más probabilidades de haber nacido pretérmino, bajo peso al nacer y SGA, y sus madres tenían más probabilidades de ser primíparas. Estos hallazgos son similares a estudios previos que no muestran diferencias en casos de tos ferina por sexo [29, 35, 36] o multitud [35] pero que muestran diferencias por peso al nacer [36]. Coinfections fueron comunes, consistentes con los hallazgos de otros estudios hospitalarios [33]. Codetección de la tos ferina B y la parapertussis B con virus respiratorios puede deberse al transporte asintomático de la tos ferina. La incidencia de parapertussis B de 4 casos por 1000 personas-año fue comparable a la de 2 por 1000 personas-año encontrada en el ensayo italiano de la vacuna acelular de la tos ferina en 1992-1993 [37]. La duración de la enfermedad fue más corta para la parapertussis B con una duración máxima de 6 días en comparación con un máximo de 33 días para la pertussis B. Una presentación más leve es consistente con el conocimiento clínico de la infección por parapertussis B [37, 38]. Los casos de Bordetella parapertussis ocurrieron sólo durante un período de 5 meses. Hubo varias limitaciones en el diseño del estudio. No podemos estar seguros de si los síntomas reportados fueron causados por la pertussis, otro organismo, o si los síntomas estaban relacionados con 2 o más agentes etiológicos. No pudimos realizar un modelo de regresión multivariable para las características asociadas con la enfermedad por pertussis y casos de pertussis debido al pequeño número de casos que detectamos. Los síntomas respiratorios infantiles fueron reportados por los padres, quienes pudieron haber omitido signos que podrían haber sido observados por un trabajador sanitario. Sin embargo, los criterios Sin embargo, la apnea y la cianosis pueden haber sido difíciles de identificar para los padres, aunque los criterios para la recolección de muestras cambiaron en el año 2, ningún niño experimentó un síntoma específico de la tos ferina en aislamiento sin tener uno de los síntomas respiratorios originalmente especificados. Estos datos respaldan nuestra suposición de que era poco probable que nos hubiéramos perdido casos de tos ferina en el año 1 con nuestros criterios menos sensibles de síntomas respiratorios. Se recolectaron hisopos nasales en la región medianatal para la detección del virus de la gripe, lo que puede haber reducido la sensibilidad de la detección de la tos ferina. Aunque los hisopos nasofaríngeos o los aspirados nasofaríngeos son el método recomendado de recolección de muestras [39], la región nasofaríngea fue establecida como el área de recolección de elección cuando la medida diagnóstica fue el cultivo, que tiene baja sensibilidad. Datos recientes demostraron la comparabilidad del uso de hisopos nasofaríngeos en la detección de la tos ferina PCR [40]. Las fortalezas del estudio incluyeron ser un estudio prospectivo basado en la población, con tasas de rechazo muy bajas. Factores de riesgo, síntomas clínicos y coinfecciones fueron identificados prospectivamente sin el sesgo potencial que puede ocurrir cuando estos datos se recopilan retrospectivamente o en entornos clínicos. El diseño basado en la comunidad permite generalizar estos resultados a toda la población y no sólo a aquellos que buscan atención en un centro de salud o en una situación de brote. El distrito de Sarlahi se encuentra en la región de Terai, donde reside la mayoría de los nepaleses, y tiene una demografía similar a toda la población de Nepal [41]. La ubicación de Sarlahi cerca del nivel del mar y en la frontera con la India apoya la generalización de estos resultados a muchas poblaciones que viven en el subcontinente indio. La vigilancia activa semanal con criterios sensibles para las pruebas de tos ferina fue capaz de detectar casos de tos ferina leves y atípicos, que pueden no haber sido detectados por vigilancia tradicional previa. El método PCR multiobjetivo permitió la detección altamente sensible y específica de 2 especies adicionales de Bordetella más allá del objetivo de tos ferina primaria. Observamos una baja incidencia de tos ferina en lactantes en un ambiente de vacunación celular completa. Los casos de tos ferina fueron generalmente más leves que las definiciones clínicas tradicionales de tos ferina. Estos datos Los responsables políticos de Nepal tendrán que sopesar el beneficio de una vacuna adicional de tos ferina prenatal o un cambio a una vacuna acelular de tos ferina primaria con la baja carga de tos ferina en bebés menores de 6 meses. Nuestro estudio demostró que los hisopos nasales medios fueron capaces de detectar la tos ferina utilizando un PCR sensible multiobjetivo. La hisopo nasal medio nasal menos invasivo es una alternativa atractiva para la recolección de hisopos nasales de tos ferina, y se necesitan más investigaciones para comparar este sitio de recolección con hisopos nasofaríngeos. En el futuro, este método puede mejorar los esfuerzos de vigilancia basados en la población.

¿Qué tipo de vacuna contra la tos ferina se utiliza en los países de ingresos medios y altos?

Incidencia de la tos ferina basada en la población y factores de riesgo en lactantes menores de 6 meses en Nepalhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5907881/SHA: ef821e34873d4752ecae41cd9dfc08a5e6db45e2Autores: Hughes, Michelle M; Englund, Janet A; Kuypers, Jane; Tielsch, James M; Khatry, Subarna K; Shrestha, Laxman; LeClerq, Steven C; Steinhoff, Mark; Katz, JoanneFecha: 2017-03-01DOI: 10.1093/jpids/piw079Licencia: cc-byAbstract: ANTEGRANO: Se estima que la tos ferina La vacunación materna durante el embarazo puede ser eficaz para prevenir la tos ferina en lactantes pequeños, pero faltan estimaciones poblacionales de la carga de la enfermedad en lactantes, especialmente en países de bajos ingresos. El objetivo de este estudio fue estimar la incidencia de la tos ferina en lactantes menores de 6 meses de edad en el distrito de Sarlahi, Nepal. MÉTODOS: Anidados en un ensayo controlado aleatorizado de base poblacional de vacunación contra la gripe durante el embarazo, los bebés fueron visitados semanalmente desde el nacimiento hasta los 6 meses para evaluar enfermedades respiratorias en la semana anterior. Si se había producido algún síntoma respiratorio, se recogió un hisopo nasal y se probó con un ensayo multiobjetivo de reacción en cadena de la pertussis polimerasa (PCR). El estudio prospectivo de cohorte incluye a los bebés observados entre mayo de 2011 y agosto de 2014. RESULTADOS: La incidencia de la tos ferina de Bordetella confirmada por la PCR fue de 13,3 casos por 1000 lactantes-año (intervalo de confianza del 95%, 7,7-21,3) en una cohorte de 3.483 lactantes con al menos 1 día de seguimiento. CONCLUSIONES: En una vigilancia activa en el hogar basada en la población para enfermedades respiratorias, se estimó un bajo riesgo de tos ferina en lactantes de las zonas rurales de Nepal. El programa de inmunización de Nepal, que incluye una vacuna antipertussis de células enteras de la infancia, puede ser eficaz para controlar la tos ferina en lactantes. Texto: En varios países en los últimos años se ha producido un resurgimiento de la tos ferina en varios grupos de edad [1]. Los países de ingresos medios y altos que utilizan una vacuna antipertussis acelular para la serie de vacunación primaria han sido particularmente afectados [2, 3], y los lactantes y adolescentes han experimentado Los factores que pueden contribuir al aumento del riesgo de tos ferina incluyen la rápida disminución de la inmunidad de los vacunados con vacunas acelulares [1, 5, 6], la transmisión asintomática de los individuos vacunados con vacunas acelulares [7], la adaptación genética de Bordetella pertussis [8], el retraso o rechazo de la vacunación [9], la mejora de la capacidad de vigilancia y de laboratorio [2], y el aumento general del conocimiento de la continuidad de la circulación de la tos ferina B [1]. Algunos países que experimentan tos ferina epidémica, como los Estados Unidos, el Reino Unido y la Argentina, ahora recomiendan la inmunización de la tos ferina en el embarazo y la vacunación de contactos estrechos [10, 11] para proteger a los lactantes más jóvenes de la tos ferina antes de que puedan vacunarse ellos mismos [12]. En esta región, la vacunación contra la tos ferina materna durante el embarazo puede ser una forma de proteger a los lactantes, similar a la vacuna antitetánica. Sin embargo, a nivel mundial sólo se ha realizado una estimación basada en la población de la tos ferina desde el nacimiento (Senegal) [15], y se carece de capacidad de vigilancia y laboratorio en Asia [16, 17]. La Organización Mundial de la Salud (OMS) recomendó recientemente que los países que utilizan vacunas contra la tos ferina celular completa siguieran haciéndolo a la luz de los datos recientes que indican que las vacunas contra la tos ferina acelular son menos eficaces que las vacunas contra la tos ferina completa [18]. Se necesitan datos basados en la población, especialmente en entornos de bajos ingresos, para proporcionar una estimación más precisa de la carga de la tos ferina en los lactantes para informar sobre las políticas de inmunización materna e infantil [19, 20]. El objetivo fue proporcionar una estimación poblacional de la incidencia de tos ferina confirmada por laboratorio en niños menores de 6 meses de edad en el distrito de Sarlahi, Nepal. El estudio fue anidado en 2 ensayos controlados aleatorios consecutivos de vacunación materna contra la gripe durante el embarazo establecidos en el distrito de Sarlahi, ubicado en la región central de Terai (planicies bajas) de Nepal [21]. Al inicio del ensayo, se identificaron embarazos prevalentes mediante un censo de todos los hogares de la zona de captación. Durante el ensayo, los trabajadores sobre el terreno visitaron todos los hogares de las comunidades, cada 5 semanas, donde residían mujeres casadas (15-40 años), para la vigilancia de embarazos de incidentes. Una vez identificado el embarazo, las mujeres dieron su consentimiento y fueron matriculadas. Desde el 25 de abril de 2011 hasta el 9 de septiembre de 2013, las mujeres de 17 a 34 semanas de gestación fueron al azar y vacunadas El estudio fue una cohorte prospectiva basada en la población de lactantes seguida desde el nacimiento hasta 6 meses después del parto. Se obtuvo la aprobación para el estudio de las Juntas de Revisión Institucional de la Escuela Johns Hopkins Bloomberg de Salud Pública, el Centro Médico Infantil Cincinnati, el Instituto de Medicina de la Universidad Tribhuvan, Katmandú, y el Consejo de Investigación Sanitaria de Nepal. Los ensayos se registran en Clinicaltrials.gov (NCT01034254). En la línea de base, se recopiló información sobre la estructura del hogar, el estado socioeconómico y la demografía. En la inscripción, fecha del último período menstrual y los datos de la historia del embarazo se recogieron. Si un bebé presentaba alguno de los siguientes síntomas, se recolectó un hisopo de nailon medio nasal en masa: fiebre, tos, sibilancia, dificultad para respirar o infección del oído. A partir del 17 de agosto de 2012, se añadieron nuevos síntomas, más específicos para la tos ferina, a la visita semanal de morbilidad: apnea, cianosis, tos con vómito o tos ferina. Los hisopos se almacenaron hasta 1 semana a temperatura ambiente en el medio de transporte molecular de PrimeStore (Longhorn Diagnostics LLC, Bethesda, MD). Además de estos signos, se preguntó a las madres cuáles, en su caso, se recibieron vacunas para lactantes en los últimos 7 días, incluyendo la vacunación contra la tosferina [22]. También se recogieron hisopos medios nasales semanalmente de madres matriculadas a través de 6 meses después del parto que Todos los hisopos nasales recolectados de lactantes fueron analizados para detectar la tos ferina B, Bordetella parapertussis y Bordetella bronchispetica. Sólo los hisopos nasales de madres cuyos bebés dieron positivo para cualquiera de estos patógenos fueron probados para los mismos patógenos. En el Laboratorio de Virología Molecular de la Universidad de Washington se realizaron pruebas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real de acuerdo con métodos publicados previamente [23]. Se utilizó PCR de dos dianas para evaluar la presencia de 3 especies de Bordetella: pertussis B, B parapertussis y B bronchiseptica. Los objetivos amplificados fueron secuencia de inserción repetida cromosómica IS481 (IS) y la región promotora de la tos ferina polimórfica ptxA (PT). Después de la amplificación, los puntos de fusión de los amplicones se midieron en un iCycler (Bio-Rad). Una muestra se interpretó como positiva cuando el objetivo o objetivos tenían una temperatura de fusión dentro del rango aceptable específico de la especie y una tomografía computarizada ≤42. Una muestra fue negativa si ninguno de los objetivos probados positivo o un único objetivo positivo no era reproducible. Se probaron hisopos nasales maternos para aquellas madres cuyos bebés dieron positivo para cualquier especie de BordetellaReacción en cadena de la polimerasa también se realizó para varias infecciones virales (influenza, rinovirus [RV], virus respiratorio sincitial [RSV], bocavirus [BoV], metapneumovirus humano, coronavirus, adenovirus y parainfluenza [1] [3] [4] ) como se describió anteriormente [21]. De las 3693 mujeres matriculadas, 3646 lactantes nacieron vivos de 3621 mujeres (Figura 1 Suplementaria ). Los lactantes fueron incluidos en este análisis si fueron seguidos durante cualquier período de seguimiento (0 a 180 días); la mediana del seguimiento total fue de 146 días por niño (Figura 2 Suplementaria ). El conjunto de datos finales consta de 3483 lactantes, aportando 1280 años-lactante de observación, con al menos 1 visita de seguimiento durante los primeros 6 meses, lo que incluye a los lactantes de todo el período de prueba, tanto antes como después de adiciones más específicas a la tos ferina en el cuestionario semanal de síntomas. En la base, se recogieron datos sobre la estructura de los hogares. En la inscripción, las mujeres informaron de su estado de alfabetización (binario) y antecedentes de embarazo. Las mujeres fueron clasificadas como nulíparas o multiparosas. Se calcularon las respuestas a 25 preguntas sobre construcción del hogar, agua y saneamiento, y los bienes del hogar para desarrollar un índice para medir el estado socioeconómico de los hogares. Se calcularon variables binarias para cada una de las 25 preguntas y una puntuación media del SES para cada hogar. Se midió la edad gestacional utilizando el informe de la mujer sobre la fecha del último período menstrual durante la vigilancia del embarazo. El peso del nacimiento se recolectó tan pronto como fue posible después del nacimiento mediante una escala digital (Talita modelo BD-585, precisión a los 10 gramos más cercanos). Los pesos del nacimiento recolectados > 72 horas después del nacimiento fueron excluidos del análisis. Se preguntó a las mujeres dentro de las horas de inicio de la lactancia materna y se crearon categorías binarias de lactancia materna (≤1 hora frente a >1 hora después del parto), se calculó la incidencia como el número de casos de tos ferina por cada 1.000 lactantes en riesgo, se construyeron intervalos exactos de confianza de Poisson del 95% (IC), se compararon las características de los casos de tos ferina infantil con los casos de no tos ferina utilizando regresión de Poisson bivariada, se compararon las características de todos los episodios respiratorios de tos ferina con los episodios respiratorios de no tos ferina, se utilizaron pruebas t para predictores continuos y se utilizaron pruebas exactas de Fisher para asociaciones categóricas debido al bajo número de episodios de tos ferina, se realizaron todos los análisis estadísticos en Stata/SE 14.1. Un total de 3483 lactantes presentaron 4283 episodios de enfermedades respiratorias entre el 18 de mayo de 2011 y el 30 La incidencia de enfermedad respiratoria fue de 3,6 episodios por infante-año (IC 95%, 3,5-3,7). La duración media del episodio fue de 4,7 días (IC 95%, 4,6-4,9). Se identificaron 17 casos de tos ferina B a partir de 19 hisopos nasales (hisopos nasales positivos en 2 semanas consecutivas para 2 lactantes) y la incidencia de tos ferina B confirmada por PCR fue de 13,3 casos por 1000 años de infante (IC 95%, 7,7-21,3). Se detectaron 5 casos de parapertussis B con una incidencia de 3,9 casos por 1000 años de infante (IC 95%, 1,3-9,1). No se identificaron casos de bronquiseptica; la duración media del episodio de tos ferina fue de 8 días (rango, 2-33) (Tabla 1 ). La edad media de aparición de los síntomas fue de 83 días (rango, 19-137) (mediana, 80; rango intercuartílico, 63-109). Los síntomas más comunes fueron tos, dificultad para respirar y tos con vómito. Ninguno de los síntomas adicionales relacionados con la tos que se añadieron en el año 2 (cianosis, apnea, tos con vómito y whoop) dio lugar a la recolección de hisopos nasales basados únicamente en estos síntomas adicionales. Los episodios de tos fueron estadísticamente significativamente más propensos a incluir dificultad para respirar, tos con vómito y whoop en comparación con otras enfermedades respiratorias. Seis bebés tuvieron al menos una vacunación de pertussis antes de la aparición de la enfermedad de pertussis (tres < 2 semanas y tres > 2 semanas antes de la enfermedad de pertussis) con una media de 18 días de vacunación a la enfermedad en comparación con 49 días para episodios de no pertus Cinco infantes recibieron la primera vacunación contra la tos ferina postpertussis, mientras que 6 infantes no recibieron la vacunación contra la tos ferina en los primeros 180 días. Tres cuartas partes de los episodios de tos ferina fueron coinfectados con al menos 1 virus, con RV y BoV los más frecuentes. Los casos de tos ferina fueron más propensos a ser infectados con BoV que los casos respiratorios por causas distintas de la tos ferina. La mayoría de los casos ocurrieron entre febrero de 2013 y enero de 2014 (Figura 1). No se documentaron diferencias estadísticamente significativas entre los factores de riesgo de tos ferina y los casos de no tos ferina (Tabla 2). Dado el bajo número de casos de tos ferina, la falta de asociación estadística no es evidencia de no asociación. De las 8 madres de niños con tos ferina B positiva que recibieron un hisopo nasal (14 hisopos nasales totales) durante su propio seguimiento, ninguna fue positiva para ninguna especie de tos ferina. Los casos de parapertussis 5 B fueron principalmente masculinos cuyas madres eran primíparas, alfabetizadas y etnia pahadí (Tabla 1 Suplementaria). Ninguna madre de niños con parapertussis B tuvo un hisopo nasal recolectado durante el seguimiento. La duración media del episodio de parapertussis B fue de 4 días (Tabla 2 Suplementaria). La edad media de inicio de los síntomas fue de 58 días con un rango de 7 a 95 días. Los síntomas más comunes fueron tos y sibilancias. Rhinovirus y VSR fueron las únicas coinfecciones observadas. Todos los casos de parapertussis B ocurrieron entre septiembre de 2011 y febrero de 2012 (Figura 1 Se encontró una baja incidencia de tos ferina y una presentación clínica generalmente leve en niños menores de 6 meses en Nepal. Según nuestro conocimiento, esta es una de las primeras pruebas de vigilancia activa de la tos ferina confirmada por la población en niños pequeños en Asia. Los ensayos de la vacuna antipertussis acelular realizados en la década de 1990 encontraron que la incidencia media de tos ferina en los grupos de vacunación de células enteras oscilaba entre 1 y 37 casos por 1.000 infantes [26]. Nuestro hallazgo de 13 casos de tos ferina B por 1.000 infantes/niños se encontraba en el extremo inferior de este rango. En los Estados Unidos en 2014, la incidencia estimada de tos ferina en niños menores de 6 meses fue de 2 casos por 1.000 infantes/niños [27], mucho menor de lo observado en nuestro estudio; sin embargo, este sistema de vigilancia pasiva probablemente subestima enormemente la incidencia de tos ferina. Además, dado nuestro método de detección de casos altamente sensibles, muchos de nuestros casos de tos ferina probablemente no se habrían detectado en los ensayos previos de la vacuna antipertussis acelular. Los criterios más estrictos de los síntomas respiratorios habrían reducido aún más nuestra estimación de la incidencia.La baja incidencia se encontró en una población donde la vacuna pentavalente (Pentavac: Difteria, Tétanos, Pertussis [Célula Completa], Hepatitis-B y Haemophilus Tipo b Vacuna Conjugar; Serum Institute of India Pvt. Ltd), programada para su administración a las 6, 10 y 14 semanas, se recibe con retrasos significativos (el 7% de los lactantes recibió las 3 vacunas antipertussis recomendadas por 6 meses) [22]. Estos datos apoyan la recomendación de la OMS de que los países que utilizan la vacuna antipertussis celular completa sigan haciéndolo dado que la mayoría de los brotes se Estudios recientes sugieren que la protección de la vacuna contra la tos ferina acelular no es tan fuerte o de larga duración como la que confiere la vacuna contra la tos ferina completa [6, 28]. Otro factor que contribuye a la baja incidencia de tos ferina observada podría ser que la vigilancia se realizó durante un período de baja transmisión de la tos ferina. La tos ferina es una enfermedad cíclica, que se cree que alcanza su punto máximo cada 2 a 4 años, y que podemos haber captado la carga en un período de baja circulación [6]. Observamos más del 70% de nuestros casos de tos ferina B durante un período de 1 año. Este aumento de períodos de observación anteriores podría indicar un aumento temporal de la tos ferina consistente con su patrón cíclico o un verdadero aumento de la carga basal. La duración y gravedad de los síntomas de tos pertussis fueron leves en comparación con la presentación clásica del caso de tos pertussis. Sólo 3 de los 17 casos cumplieron los criterios de la OMS, lo que requiere un mínimo de 2 semanas de tos, tos ferina o vómitos posttusivos [31]. Los estudios sobre la tos en lactantes generalmente han sido clínicos, hospitalarios o en un brote, lo que requirió una cierta gravedad de enfermedad para que los padres reconocieran la necesidad de atención médica [29, 30, 32]. Por lo tanto, estos diseños de estudio y los esfuerzos de vigilancia pasiva pueden haber faltado a los casos de tos más leve [33]. Nuestro estudio, que requirió sólo 1 síntoma respiratorio para la recolección de un hisopo nasal, tuvo una mayor sensibilidad para detectar una gama de presentaciones de casos de tos ferina. Aunque la tos, la dificultad para respirar y la tos con vómito fueron los síntomas más comunes, no hubo ningún síntoma en todos los casos de tos B. Durante un período epidémico en el estado de Washington, entre los niños < 1 año, que tuvieron un mínimo de 14 días de tos más un síntoma adicional, el 82% tuvieron emesis posttusiva, el 29% tuvieron apnea, el 26% tuvieron whoop y el 42% tuvieron cianosis [32]. Un estudio de neonatos estadounidenses con pertussis mostró que la prevalencia de síntomas era del 97% para la tos, el 91% para la cianosis, el 58% para la apnea y el 3% para la fiebre [34]. Nuestro estudio encontró una prevalencia de síntomas menor o igual con la excepción de la fiebre. La prevalencia de fiebre fue mayor en nuestro estudio, similar a la encontrada en el Perú [29]. Aunque no son estadísticamente significativos, los bebés con tos ferina tenían más probabilidades de haber nacido pretérmino, bajo peso al nacer y SGA, y sus madres tenían más probabilidades de ser primíparas. Estos hallazgos son similares a estudios previos que no muestran diferencias en casos de tos ferina por sexo [29, 35, 36] o multitud [35] pero que muestran diferencias por peso al nacer [36]. Coinfections fueron comunes, consistentes con los hallazgos de otros estudios hospitalarios [33]. Codetección de la tos ferina B y la parapertussis B con virus respiratorios puede deberse al transporte asintomático de la tos ferina. La incidencia de parapertussis B de 4 casos por 1000 personas-año fue comparable a la de 2 por 1000 personas-año encontrada en el ensayo italiano de la vacuna acelular de la tos ferina en 1992-1993 [37]. La duración de la enfermedad fue más corta para la parapertussis B con una duración máxima de 6 días en comparación con un máximo de 33 días para la pertussis B. Una presentación más leve es consistente con el conocimiento clínico de la infección por parapertussis B [37, 38]. Los casos de Bordetella parapertussis ocurrieron sólo durante un período de 5 meses. Hubo varias limitaciones en el diseño del estudio. No podemos estar seguros de si los síntomas reportados fueron causados por la pertussis, otro organismo, o si los síntomas estaban relacionados con 2 o más agentes etiológicos. No pudimos realizar un modelo de regresión multivariable para las características asociadas con la enfermedad por pertussis y casos de pertussis debido al pequeño número de casos que detectamos. Los síntomas respiratorios infantiles fueron reportados por los padres, quienes pudieron haber omitido signos que podrían haber sido observados por un trabajador sanitario. Sin embargo, los criterios Sin embargo, la apnea y la cianosis pueden haber sido difíciles de identificar para los padres, aunque los criterios para la recolección de muestras cambiaron en el año 2, ningún niño experimentó un síntoma específico de la tos ferina en aislamiento sin tener uno de los síntomas respiratorios originalmente especificados. Estos datos respaldan nuestra suposición de que era poco probable que nos hubiéramos perdido casos de tos ferina en el año 1 con nuestros criterios menos sensibles de síntomas respiratorios. Se recolectaron hisopos nasales en la región medianatal para la detección del virus de la gripe, lo que puede haber reducido la sensibilidad de la detección de la tos ferina. Aunque los hisopos nasofaríngeos o los aspirados nasofaríngeos son el método recomendado de recolección de muestras [39], la región nasofaríngea fue establecida como el área de recolección de elección cuando la medida diagnóstica fue el cultivo, que tiene baja sensibilidad. Datos recientes demostraron la comparabilidad del uso de hisopos nasofaríngeos en la detección de la tos ferina PCR [40]. Las fortalezas del estudio incluyeron ser un estudio prospectivo basado en la población, con tasas de rechazo muy bajas. Factores de riesgo, síntomas clínicos y coinfecciones fueron identificados prospectivamente sin el sesgo potencial que puede ocurrir cuando estos datos se recopilan retrospectivamente o en entornos clínicos. El diseño basado en la comunidad permite generalizar estos resultados a toda la población y no sólo a aquellos que buscan atención en un centro de salud o en una situación de brote. El distrito de Sarlahi se encuentra en la región de Terai, donde reside la mayoría de los nepaleses, y tiene una demografía similar a toda la población de Nepal [41]. La ubicación de Sarlahi cerca del nivel del mar y en la frontera con la India apoya la generalización de estos resultados a muchas poblaciones que viven en el subcontinente indio. La vigilancia activa semanal con criterios sensibles para las pruebas de tos ferina fue capaz de detectar casos de tos ferina leves y atípicos, que pueden no haber sido detectados por vigilancia tradicional previa. El método PCR multiobjetivo permitió la detección altamente sensible y específica de 2 especies adicionales de Bordetella más allá del objetivo de tos ferina primaria. Observamos una baja incidencia de tos ferina en lactantes en un ambiente de vacunación celular completa. Los casos de tos ferina fueron generalmente más leves que las definiciones clínicas tradicionales de tos ferina. Estos datos Los responsables políticos de Nepal tendrán que sopesar el beneficio de una vacuna adicional de tos ferina prenatal o un cambio a una vacuna acelular de tos ferina primaria con la baja carga de tos ferina en bebés menores de 6 meses. Nuestro estudio demostró que los hisopos nasales medios fueron capaces de detectar la tos ferina utilizando un PCR sensible multiobjetivo. La hisopo nasal medio nasal menos invasivo es una alternativa atractiva para la recolección de hisopos nasales de tos ferina, y se necesitan más investigaciones para comparar este sitio de recolección con hisopos nasofaríngeos. En el futuro, este método puede mejorar los esfuerzos de vigilancia basados en la población.

¿Cuáles son los síntomas clínicos de la tos ferina?

Incidencia de la tos ferina basada en la población y factores de riesgo en lactantes menores de 6 meses en Nepalhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5907881/SHA: ef821e34873d4752ecae41cd9dfc08a5e6db45e2Autores: Hughes, Michelle M; Englund, Janet A; Kuypers, Jane; Tielsch, James M; Khatry, Subarna K; Shrestha, Laxman; LeClerq, Steven C; Steinhoff, Mark; Katz, JoanneFecha: 2017-03-01DOI: 10.1093/jpids/piw079Licencia: cc-byAbstract: ANTEGRANO: Se estima que la tos ferina La vacunación materna durante el embarazo puede ser eficaz para prevenir la tos ferina en lactantes pequeños, pero faltan estimaciones poblacionales de la carga de la enfermedad en lactantes, especialmente en países de bajos ingresos. El objetivo de este estudio fue estimar la incidencia de la tos ferina en lactantes menores de 6 meses de edad en el distrito de Sarlahi, Nepal. MÉTODOS: Anidados en un ensayo controlado aleatorizado de base poblacional de vacunación contra la gripe durante el embarazo, los bebés fueron visitados semanalmente desde el nacimiento hasta los 6 meses para evaluar enfermedades respiratorias en la semana anterior. Si se había producido algún síntoma respiratorio, se recogió un hisopo nasal y se probó con un ensayo multiobjetivo de reacción en cadena de la pertussis polimerasa (PCR). El estudio prospectivo de cohorte incluye a los bebés observados entre mayo de 2011 y agosto de 2014. RESULTADOS: La incidencia de la tos ferina de Bordetella confirmada por la PCR fue de 13,3 casos por 1000 lactantes-año (intervalo de confianza del 95%, 7,7-21,3) en una cohorte de 3.483 lactantes con al menos 1 día de seguimiento. CONCLUSIONES: En una vigilancia activa en el hogar basada en la población para enfermedades respiratorias, se estimó un bajo riesgo de tos ferina en lactantes de las zonas rurales de Nepal. El programa de inmunización de Nepal, que incluye una vacuna antipertussis de células enteras de la infancia, puede ser eficaz para controlar la tos ferina en lactantes. Texto: En varios países en los últimos años se ha producido un resurgimiento de la tos ferina en varios grupos de edad [1]. Los países de ingresos medios y altos que utilizan una vacuna antipertussis acelular para la serie de vacunación primaria han sido particularmente afectados [2, 3], y los lactantes y adolescentes han experimentado Los factores que pueden contribuir al aumento del riesgo de tos ferina incluyen la rápida disminución de la inmunidad de los vacunados con vacunas acelulares [1, 5, 6], la transmisión asintomática de los individuos vacunados con vacunas acelulares [7], la adaptación genética de Bordetella pertussis [8], el retraso o rechazo de la vacunación [9], la mejora de la capacidad de vigilancia y de laboratorio [2], y el aumento general del conocimiento de la continuidad de la circulación de la tos ferina B [1]. Algunos países que experimentan tos ferina epidémica, como los Estados Unidos, el Reino Unido y la Argentina, ahora recomiendan la inmunización de la tos ferina en el embarazo y la vacunación de contactos estrechos [10, 11] para proteger a los lactantes más jóvenes de la tos ferina antes de que puedan vacunarse ellos mismos [12]. En esta región, la vacunación contra la tos ferina materna durante el embarazo puede ser una forma de proteger a los lactantes, similar a la vacuna antitetánica. Sin embargo, a nivel mundial sólo se ha realizado una estimación basada en la población de la tos ferina desde el nacimiento (Senegal) [15], y se carece de capacidad de vigilancia y laboratorio en Asia [16, 17]. La Organización Mundial de la Salud (OMS) recomendó recientemente que los países que utilizan vacunas contra la tos ferina celular completa siguieran haciéndolo a la luz de los datos recientes que indican que las vacunas contra la tos ferina acelular son menos eficaces que las vacunas contra la tos ferina completa [18]. Se necesitan datos basados en la población, especialmente en entornos de bajos ingresos, para proporcionar una estimación más precisa de la carga de la tos ferina en los lactantes para informar sobre las políticas de inmunización materna e infantil [19, 20]. El objetivo fue proporcionar una estimación poblacional de la incidencia de tos ferina confirmada por laboratorio en niños menores de 6 meses de edad en el distrito de Sarlahi, Nepal. El estudio fue anidado en 2 ensayos controlados aleatorios consecutivos de vacunación materna contra la gripe durante el embarazo establecidos en el distrito de Sarlahi, ubicado en la región central de Terai (planicies bajas) de Nepal [21]. Al inicio del ensayo, se identificaron embarazos prevalentes mediante un censo de todos los hogares de la zona de captación. Durante el ensayo, los trabajadores sobre el terreno visitaron todos los hogares de las comunidades, cada 5 semanas, donde residían mujeres casadas (15-40 años), para la vigilancia de embarazos de incidentes. Una vez identificado el embarazo, las mujeres dieron su consentimiento y fueron matriculadas. Desde el 25 de abril de 2011 hasta el 9 de septiembre de 2013, las mujeres de 17 a 34 semanas de gestación fueron al azar y vacunadas El estudio fue una cohorte prospectiva basada en la población de lactantes seguida desde el nacimiento hasta 6 meses después del parto. Se obtuvo la aprobación para el estudio de las Juntas de Revisión Institucional de la Escuela Johns Hopkins Bloomberg de Salud Pública, el Centro Médico Infantil Cincinnati, el Instituto de Medicina de la Universidad Tribhuvan, Katmandú, y el Consejo de Investigación Sanitaria de Nepal. Los ensayos se registran en Clinicaltrials.gov (NCT01034254). En la línea de base, se recopiló información sobre la estructura del hogar, el estado socioeconómico y la demografía. En la inscripción, fecha del último período menstrual y los datos de la historia del embarazo se recogieron. Si un bebé presentaba alguno de los siguientes síntomas, se recolectó un hisopo de nailon medio nasal en masa: fiebre, tos, sibilancia, dificultad para respirar o infección del oído. A partir del 17 de agosto de 2012, se añadieron nuevos síntomas, más específicos para la tos ferina, a la visita semanal de morbilidad: apnea, cianosis, tos con vómito o tos ferina. Los hisopos se almacenaron hasta 1 semana a temperatura ambiente en el medio de transporte molecular de PrimeStore (Longhorn Diagnostics LLC, Bethesda, MD). Además de estos signos, se preguntó a las madres cuáles, en su caso, se recibieron vacunas para lactantes en los últimos 7 días, incluyendo la vacunación contra la tosferina [22]. También se recogieron hisopos medios nasales semanalmente de madres matriculadas a través de 6 meses después del parto que Todos los hisopos nasales recolectados de lactantes fueron analizados para detectar la tos ferina B, Bordetella parapertussis y Bordetella bronchispetica. Sólo los hisopos nasales de madres cuyos bebés dieron positivo para cualquiera de estos patógenos fueron probados para los mismos patógenos. En el Laboratorio de Virología Molecular de la Universidad de Washington se realizaron pruebas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real de acuerdo con métodos publicados previamente [23]. Se utilizó PCR de dos dianas para evaluar la presencia de 3 especies de Bordetella: pertussis B, B parapertussis y B bronchiseptica. Los objetivos amplificados fueron secuencia de inserción repetida cromosómica IS481 (IS) y la región promotora de la tos ferina polimórfica ptxA (PT). Después de la amplificación, los puntos de fusión de los amplicones se midieron en un iCycler (Bio-Rad). Una muestra se interpretó como positiva cuando el objetivo o objetivos tenían una temperatura de fusión dentro del rango aceptable específico de la especie y una tomografía computarizada ≤42. Una muestra fue negativa si ninguno de los objetivos probados positivo o un único objetivo positivo no era reproducible. Se probaron hisopos nasales maternos para aquellas madres cuyos bebés dieron positivo para cualquier especie de BordetellaReacción en cadena de la polimerasa también se realizó para varias infecciones virales (influenza, rinovirus [RV], virus respiratorio sincitial [RSV], bocavirus [BoV], metapneumovirus humano, coronavirus, adenovirus y parainfluenza [1] [3] [4] ) como se describió anteriormente [21]. De las 3693 mujeres matriculadas, 3646 lactantes nacieron vivos de 3621 mujeres (Figura 1 Suplementaria ). Los lactantes fueron incluidos en este análisis si fueron seguidos durante cualquier período de seguimiento (0 a 180 días); la mediana del seguimiento total fue de 146 días por niño (Figura 2 Suplementaria ). El conjunto de datos finales consta de 3483 lactantes, aportando 1280 años-lactante de observación, con al menos 1 visita de seguimiento durante los primeros 6 meses, lo que incluye a los lactantes de todo el período de prueba, tanto antes como después de adiciones más específicas a la tos ferina en el cuestionario semanal de síntomas. En la base, se recogieron datos sobre la estructura de los hogares. En la inscripción, las mujeres informaron de su estado de alfabetización (binario) y antecedentes de embarazo. Las mujeres fueron clasificadas como nulíparas o multiparosas. Se calcularon las respuestas a 25 preguntas sobre construcción del hogar, agua y saneamiento, y los bienes del hogar para desarrollar un índice para medir el estado socioeconómico de los hogares. Se calcularon variables binarias para cada una de las 25 preguntas y una puntuación media del SES para cada hogar. Se midió la edad gestacional utilizando el informe de la mujer sobre la fecha del último período menstrual durante la vigilancia del embarazo. El peso del nacimiento se recolectó tan pronto como fue posible después del nacimiento mediante una escala digital (Talita modelo BD-585, precisión a los 10 gramos más cercanos). Los pesos del nacimiento recolectados > 72 horas después del nacimiento fueron excluidos del análisis. Se preguntó a las mujeres dentro de las horas de inicio de la lactancia materna y se crearon categorías binarias de lactancia materna (≤1 hora frente a >1 hora después del parto), se calculó la incidencia como el número de casos de tos ferina por cada 1.000 lactantes en riesgo, se construyeron intervalos exactos de confianza de Poisson del 95% (IC), se compararon las características de los casos de tos ferina infantil con los casos de no tos ferina utilizando regresión de Poisson bivariada, se compararon las características de todos los episodios respiratorios de tos ferina con los episodios respiratorios de no tos ferina, se utilizaron pruebas t para predictores continuos y se utilizaron pruebas exactas de Fisher para asociaciones categóricas debido al bajo número de episodios de tos ferina, se realizaron todos los análisis estadísticos en Stata/SE 14.1. Un total de 3483 lactantes presentaron 4283 episodios de enfermedades respiratorias entre el 18 de mayo de 2011 y el 30 La incidencia de enfermedad respiratoria fue de 3,6 episodios por infante-año (IC 95%, 3,5-3,7). La duración media del episodio fue de 4,7 días (IC 95%, 4,6-4,9). Se identificaron 17 casos de tos ferina B a partir de 19 hisopos nasales (hisopos nasales positivos en 2 semanas consecutivas para 2 lactantes) y la incidencia de tos ferina B confirmada por PCR fue de 13,3 casos por 1000 años de infante (IC 95%, 7,7-21,3). Se detectaron 5 casos de parapertussis B con una incidencia de 3,9 casos por 1000 años de infante (IC 95%, 1,3-9,1). No se identificaron casos de bronquiseptica; la duración media del episodio de tos ferina fue de 8 días (rango, 2-33) (Tabla 1 ). La edad media de aparición de los síntomas fue de 83 días (rango, 19-137) (mediana, 80; rango intercuartílico, 63-109). Los síntomas más comunes fueron tos, dificultad para respirar y tos con vómito. Ninguno de los síntomas adicionales relacionados con la tos que se añadieron en el año 2 (cianosis, apnea, tos con vómito y whoop) dio lugar a la recolección de hisopos nasales basados únicamente en estos síntomas adicionales. Los episodios de tos fueron estadísticamente significativamente más propensos a incluir dificultad para respirar, tos con vómito y whoop en comparación con otras enfermedades respiratorias. Seis bebés tuvieron al menos una vacunación de pertussis antes de la aparición de la enfermedad de pertussis (tres < 2 semanas y tres > 2 semanas antes de la enfermedad de pertussis) con una media de 18 días de vacunación a la enfermedad en comparación con 49 días para episodios de no pertus Cinco infantes recibieron la primera vacunación contra la tos ferina postpertussis, mientras que 6 infantes no recibieron la vacunación contra la tos ferina en los primeros 180 días. Tres cuartas partes de los episodios de tos ferina fueron coinfectados con al menos 1 virus, con RV y BoV los más frecuentes. Los casos de tos ferina fueron más propensos a ser infectados con BoV que los casos respiratorios por causas distintas de la tos ferina. La mayoría de los casos ocurrieron entre febrero de 2013 y enero de 2014 (Figura 1). No se documentaron diferencias estadísticamente significativas entre los factores de riesgo de tos ferina y los casos de no tos ferina (Tabla 2). Dado el bajo número de casos de tos ferina, la falta de asociación estadística no es evidencia de no asociación. De las 8 madres de niños con tos ferina B positiva que recibieron un hisopo nasal (14 hisopos nasales totales) durante su propio seguimiento, ninguna fue positiva para ninguna especie de tos ferina. Los casos de parapertussis 5 B fueron principalmente masculinos cuyas madres eran primíparas, alfabetizadas y etnia pahadí (Tabla 1 Suplementaria). Ninguna madre de niños con parapertussis B tuvo un hisopo nasal recolectado durante el seguimiento. La duración media del episodio de parapertussis B fue de 4 días (Tabla 2 Suplementaria). La edad media de inicio de los síntomas fue de 58 días con un rango de 7 a 95 días. Los síntomas más comunes fueron tos y sibilancias. Rhinovirus y VSR fueron las únicas coinfecciones observadas. Todos los casos de parapertussis B ocurrieron entre septiembre de 2011 y febrero de 2012 (Figura 1 Se encontró una baja incidencia de tos ferina y una presentación clínica generalmente leve en niños menores de 6 meses en Nepal. Según nuestro conocimiento, esta es una de las primeras pruebas de vigilancia activa de la tos ferina confirmada por la población en niños pequeños en Asia. Los ensayos de la vacuna antipertussis acelular realizados en la década de 1990 encontraron que la incidencia media de tos ferina en los grupos de vacunación de células enteras oscilaba entre 1 y 37 casos por 1.000 infantes [26]. Nuestro hallazgo de 13 casos de tos ferina B por 1.000 infantes/niños se encontraba en el extremo inferior de este rango. En los Estados Unidos en 2014, la incidencia estimada de tos ferina en niños menores de 6 meses fue de 2 casos por 1.000 infantes/niños [27], mucho menor de lo observado en nuestro estudio; sin embargo, este sistema de vigilancia pasiva probablemente subestima enormemente la incidencia de tos ferina. Además, dado nuestro método de detección de casos altamente sensibles, muchos de nuestros casos de tos ferina probablemente no se habrían detectado en los ensayos previos de la vacuna antipertussis acelular. Los criterios más estrictos de los síntomas respiratorios habrían reducido aún más nuestra estimación de la incidencia.La baja incidencia se encontró en una población donde la vacuna pentavalente (Pentavac: Difteria, Tétanos, Pertussis [Célula Completa], Hepatitis-B y Haemophilus Tipo b Vacuna Conjugar; Serum Institute of India Pvt. Ltd), programada para su administración a las 6, 10 y 14 semanas, se recibe con retrasos significativos (el 7% de los lactantes recibió las 3 vacunas antipertussis recomendadas por 6 meses) [22]. Estos datos apoyan la recomendación de la OMS de que los países que utilizan la vacuna antipertussis celular completa sigan haciéndolo dado que la mayoría de los brotes se Estudios recientes sugieren que la protección de la vacuna contra la tos ferina acelular no es tan fuerte o de larga duración como la que confiere la vacuna contra la tos ferina completa [6, 28]. Otro factor que contribuye a la baja incidencia de tos ferina observada podría ser que la vigilancia se realizó durante un período de baja transmisión de la tos ferina. La tos ferina es una enfermedad cíclica, que se cree que alcanza su punto máximo cada 2 a 4 años, y que podemos haber captado la carga en un período de baja circulación [6]. Observamos más del 70% de nuestros casos de tos ferina B durante un período de 1 año. Este aumento de períodos de observación anteriores podría indicar un aumento temporal de la tos ferina consistente con su patrón cíclico o un verdadero aumento de la carga basal. La duración y gravedad de los síntomas de tos pertussis fueron leves en comparación con la presentación clásica del caso de tos pertussis. Sólo 3 de los 17 casos cumplieron los criterios de la OMS, lo que requiere un mínimo de 2 semanas de tos, tos ferina o vómitos posttusivos [31]. Los estudios sobre la tos en lactantes generalmente han sido clínicos, hospitalarios o en un brote, lo que requirió una cierta gravedad de enfermedad para que los padres reconocieran la necesidad de atención médica [29, 30, 32]. Por lo tanto, estos diseños de estudio y los esfuerzos de vigilancia pasiva pueden haber faltado a los casos de tos más leve [33]. Nuestro estudio, que requirió sólo 1 síntoma respiratorio para la recolección de un hisopo nasal, tuvo una mayor sensibilidad para detectar una gama de presentaciones de casos de tos ferina. Aunque la tos, la dificultad para respirar y la tos con vómito fueron los síntomas más comunes, no hubo ningún síntoma en todos los casos de tos B. Durante un período epidémico en el estado de Washington, entre los niños < 1 año, que tuvieron un mínimo de 14 días de tos más un síntoma adicional, el 82% tuvieron emesis posttusiva, el 29% tuvieron apnea, el 26% tuvieron whoop y el 42% tuvieron cianosis [32]. Un estudio de neonatos estadounidenses con pertussis mostró que la prevalencia de síntomas era del 97% para la tos, el 91% para la cianosis, el 58% para la apnea y el 3% para la fiebre [34]. Nuestro estudio encontró una prevalencia de síntomas menor o igual con la excepción de la fiebre. La prevalencia de fiebre fue mayor en nuestro estudio, similar a la encontrada en el Perú [29]. Aunque no son estadísticamente significativos, los bebés con tos ferina tenían más probabilidades de haber nacido pretérmino, bajo peso al nacer y SGA, y sus madres tenían más probabilidades de ser primíparas. Estos hallazgos son similares a estudios previos que no muestran diferencias en casos de tos ferina por sexo [29, 35, 36] o multitud [35] pero que muestran diferencias por peso al nacer [36]. Coinfections fueron comunes, consistentes con los hallazgos de otros estudios hospitalarios [33]. Codetección de la tos ferina B y la parapertussis B con virus respiratorios puede deberse al transporte asintomático de la tos ferina. La incidencia de parapertussis B de 4 casos por 1000 personas-año fue comparable a la de 2 por 1000 personas-año encontrada en el ensayo italiano de la vacuna acelular de la tos ferina en 1992-1993 [37]. La duración de la enfermedad fue más corta para la parapertussis B con una duración máxima de 6 días en comparación con un máximo de 33 días para la pertussis B. Una presentación más leve es consistente con el conocimiento clínico de la infección por parapertussis B [37, 38]. Los casos de Bordetella parapertussis ocurrieron sólo durante un período de 5 meses. Hubo varias limitaciones en el diseño del estudio. No podemos estar seguros de si los síntomas reportados fueron causados por la pertussis, otro organismo, o si los síntomas estaban relacionados con 2 o más agentes etiológicos. No pudimos realizar un modelo de regresión multivariable para las características asociadas con la enfermedad por pertussis y casos de pertussis debido al pequeño número de casos que detectamos. Los síntomas respiratorios infantiles fueron reportados por los padres, quienes pudieron haber omitido signos que podrían haber sido observados por un trabajador sanitario. Sin embargo, los criterios Sin embargo, la apnea y la cianosis pueden haber sido difíciles de identificar para los padres, aunque los criterios para la recolección de muestras cambiaron en el año 2, ningún niño experimentó un síntoma específico de la tos ferina en aislamiento sin tener uno de los síntomas respiratorios originalmente especificados. Estos datos respaldan nuestra suposición de que era poco probable que nos hubiéramos perdido casos de tos ferina en el año 1 con nuestros criterios menos sensibles de síntomas respiratorios. Se recolectaron hisopos nasales en la región medianatal para la detección del virus de la gripe, lo que puede haber reducido la sensibilidad de la detección de la tos ferina. Aunque los hisopos nasofaríngeos o los aspirados nasofaríngeos son el método recomendado de recolección de muestras [39], la región nasofaríngea fue establecida como el área de recolección de elección cuando la medida diagnóstica fue el cultivo, que tiene baja sensibilidad. Datos recientes demostraron la comparabilidad del uso de hisopos nasofaríngeos en la detección de la tos ferina PCR [40]. Las fortalezas del estudio incluyeron ser un estudio prospectivo basado en la población, con tasas de rechazo muy bajas. Factores de riesgo, síntomas clínicos y coinfecciones fueron identificados prospectivamente sin el sesgo potencial que puede ocurrir cuando estos datos se recopilan retrospectivamente o en entornos clínicos. El diseño basado en la comunidad permite generalizar estos resultados a toda la población y no sólo a aquellos que buscan atención en un centro de salud o en una situación de brote. El distrito de Sarlahi se encuentra en la región de Terai, donde reside la mayoría de los nepaleses, y tiene una demografía similar a toda la población de Nepal [41]. La ubicación de Sarlahi cerca del nivel del mar y en la frontera con la India apoya la generalización de estos resultados a muchas poblaciones que viven en el subcontinente indio. La vigilancia activa semanal con criterios sensibles para las pruebas de tos ferina fue capaz de detectar casos de tos ferina leves y atípicos, que pueden no haber sido detectados por vigilancia tradicional previa. El método PCR multiobjetivo permitió la detección altamente sensible y específica de 2 especies adicionales de Bordetella más allá del objetivo de tos ferina primaria. Observamos una baja incidencia de tos ferina en lactantes en un ambiente de vacunación celular completa. Los casos de tos ferina fueron generalmente más leves que las definiciones clínicas tradicionales de tos ferina. Estos datos Los responsables políticos de Nepal tendrán que sopesar el beneficio de una vacuna adicional de tos ferina prenatal o un cambio a una vacuna acelular de tos ferina primaria con la baja carga de tos ferina en bebés menores de 6 meses. Nuestro estudio demostró que los hisopos nasales medios fueron capaces de detectar la tos ferina utilizando un PCR sensible multiobjetivo. La hisopo nasal medio nasal menos invasivo es una alternativa atractiva para la recolección de hisopos nasales de tos ferina, y se necesitan más investigaciones para comparar este sitio de recolección con hisopos nasofaríngeos. En el futuro, este método puede mejorar los esfuerzos de vigilancia basados en la población.

¿Con qué frecuencia los brotes de tos ferina alcanzan su punto máximo?

Estimación de la sensibilidad de las pruebas de laboratorio para la gripe en Canadá mediante el modeladohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2722738/SHA: f3a5b128f4800dbbb0f49ee409acb2c0216e24dcAutores: Schanzer, Dena L.; Garner, Michael J.; Hatchette, Todd F.; Langley, Joanne M.; Aziz, Samina; Tam, Theresa W. S.Fecha: 2009-08-18DOI: 10.1371/journal.pone.0006681Licencia: cc-byResumen: ANTEGRADO: La proporción semanal de pruebas de laboratorio que son positivas para la gripe se utiliza en los sistemas de vigilancia de la salud pública para identificar períodos de actividad El objetivo fue estimar la sensibilidad de las pruebas de influenza en Canadá a partir de los resultados de un sistema nacional de vigilancia del virus respiratorio.MÉTODOS Y CONCLUSIONES: El número semanal de pruebas de influenza negativas de 1999 a 2006 se modeló en función de las pruebas positivas confirmadas por laboratorio para la gripe, el virus sincitial respiratorio (RSV), el adenovirus y los virus de la parainfluenza, la estacionalidad y la tendencia utilizando la regresión de Poisson. La sensibilidad se calculó como el número de pruebas positivas de gripe divididas por el número de pruebas positivas de gripe más el número estimado por modelo de pruebas negativas falsas. La sensibilidad de las pruebas de gripe se estimó en el 33% (IC95% 32-34%), variando entre el 30-40% dependiendo de la temporada y la región. CONCLUSIONES: La sensibilidad estimada de las pruebas de gripe reportadas a este sistema nacional de vigilancia de laboratorio es considerablemente Una serie de factores pueden explicar esta diferencia, incluyendo la calidad de la muestra y los problemas de obtención de muestras, así como las características de las pruebas. Un mejor diagnóstico permitiría una mejor estimación de la carga de la gripe. Texto: Aunque la infección por el virus de la gripe está asociada con una morbilidad y mortalidad considerables [1] [2] [3], la confirmación de laboratorio de la enfermedad clínica es la excepción más que la regla. Los médicos no buscan rutinariamente la confirmación de laboratorio por varias razones: el diagnóstico a menudo no alterará el manejo del paciente, una escasez de métodos de prueba en tiempo real, precisos y baratos [4] y porque la gripe no se reconoce como la etiología de la presentación clínica [5]. Sin embargo, el diagnóstico exacto de la enfermedad similar a la gripe podría mejorar la atención clínica mediante un uso reducido de antibióticos y pruebas auxiliares, y un uso más apropiado de la terapia antiviral [6]. Nuevas tecnologías con una sensibilidad mejorada, como la reacción en cadena de la polimerasa de la transcriptasa inversa (RT-PCR) [8], así como el uso de sistemas de recogida más eficaces, como el hisopo nasofaríngeo voluminoso en comparación con los hisopos de las heridas de rayón tradicionales, y la recomendación de recoger muestras más ideales, como los hisopos nasofaríngeos en lugar de los hisopos de garganta, es probable que mejoren la sensibilidad diagnóstica [9] [10] [11] [12]. Las características de rendimiento de las pruebas de influenza actualmente disponibles varían considerablemente y las sensibilidades generales de estas pruebas cuando se utilizan en la práctica rutinaria también dependen del tipo de muestra recogida, la edad del paciente y el punto de su enfermedad en la que se toman muestras [4, 9, [13] [14] [15]. Se obtuvieron identificaciones semanales del virus respiratorio de septiembre de 1999 a agosto de 2006 del Sistema de Vigilancia de la Detección de Virus Respiratorios (RVDSS), Agencia de Salud Pública del Canadá [19, 20]. El RVDSS recopila, coteja e informa semanalmente de los datos de los laboratorios participantes sobre el número de pruebas realizadas y el número de especímenes confirmados positivos para la gripe, el virus respiratorio sincitial (RSV), el virus para-influenza (PIV) y el adenovirus. Generalmente, los pacientes son presentados a los laboratorios por médicos en el curso de la atención clínica, y por clínicos que participan en uno de nuestros programas nacionales de vigilancia de la gripe (FluWatch [20] ). Los indicadores de la actividad gripal se informan semanalmente al programa FluWatch. El RVDSS se complementa con informes de casos positivos para la gripe [19, 21] De los informes de casos, se confirmó la influenza A en todos los grupos de edad y se confirmaron casos esporádicos en los meses fuera de temporada de junio a septiembre. Los lactantes y niños menores de 5 años representaron el 25% de las pruebas positivas de gripe A, y las personas mayores de 65 años el 35%. Desafortunadamente, los datos de vigilancia de FluWatch no proporcionan el número total de pruebas por edad. Se sabe que las prácticas de prueba son variadas [22, 23]. Los métodos de prueba predominantes utilizados para la detección de la gripe variaron considerablemente según la provincia o el laboratorio y con el tiempo. Para la temporada 2005/06, un estudio de las técnicas de laboratorio en uso actual indicó que el cultivo representaba el 44% de las pruebas diagnósticas con RT-PCR, pruebas de antígeno rápido y análisis directo de anticuerpos fluorescentes (DFA) que representaban el 21%, el 19% y el Se modeló el número semanal de pruebas negativas para influenza, utilizando la regresión de Poisson, en función de las identificaciones virales para influenza, VRS, adenovirus y IVP, así como una base de referencia consistente en variables de estacionalidad, tendencia y vacaciones.La base estimada explica implícitamente las pruebas de influenza en especímenes tomados de pacientes con infecciones respiratorias debido a patógenos respiratorios distintos de los cuatro virus capturados en el RVDSS, siempre y cuando tanto el comportamiento de prueba de clínicos como las enfermedades respiratorias causadas por otros patógenos respiratorios sigan un patrón estacional consistente según lo prescrito por el modelo (ver más adelante,El modelo de regresión de Poisson con función de enlace lineal se estimó utilizando SAS [24] PROC GENMOD: Coeficientes b 5 a b 9 son multiplicadores. El número semanal de pruebas negativas de gripe estimadas como falsas negativas es dado por b 5 InflA w + b 6 InflB w. El número semanal de pruebas negativas de gripe atribuidas a RSV es dado por b 7 RSVp w, y de manera similar para adenovirus y PIV. Para cada prueba positiva de influenza A, se realizaron otras 5 pruebas por encima del valor basal y se encontraron negativas. Al especificar un enlace lineal, un valor de 0,33, digamos, para el coeficiente b 5, significa que para cada prueba para la que se confirmó la influenza A, se realizaron 0,33 pruebas adicionales, en promedio, con muestras verdaderamente positivas de gripe A y se encontró negativo, lo que corresponde a una sensibilidad del 75%. Se calculó la sensibilidad como el número de pruebas positivas de gripe divididas por el número de pruebas positivas de gripe más el número estimado en el modelo de pruebas negativas falsas, o equivalentemente, las estimaciones de sensibilidad para la gripe A y B se dan por 1/ (1+b 5 ) y 1/(1+b 6 ) respectivamente. La tasa negativa falsa es 1 menos sensibilidad. Mientras que el valor nulo para b 5 es cero, lo que indica que no hay asociación estadística entre el número de pruebas positivas de gripe y el número de pruebas negativas de gripe, el valor nulo correspondiente para la sensibilidad es 1. Para cada prueba confirmada positiva para el VRS, en promedio b 7 se realizaron pruebas para la gripe y se encontraron negativas para la gripe. Estas pruebas b 7 se atribuyen a una infección por VRS, sin embargo se desconoce el número de pruebas negativas de gripe que realmente dieron positivo para el VRS. Si todos los especímenes hubieran sido probados para los mismos virus (pruebas de panel), 1/b 7 correspondería a la sensibilidad para las pruebas de VRS, y la sensibilidad para el adenovirus y la IVP dada por 1/b 8 y 1/b 9 respectivamente. Algunos laboratorios son conocidos por probar virus secuencialmente [22], por lo que 1/b 7 -1/b 9 no se interpretaron como estimaciones de la sensibilidad para otros virus. Las pruebas secuenciales pueden ocurrir si una prueba rápida de influenza es negativa y el laboratorio realiza pruebas de PCR o cultivo. Del mismo modo, en los niños pequeños con una enfermedad respiratoria en invierno, las pruebas rápidas de infección por VRS pueden realizarse primero, y sólo los especímenes con resultados negativos presentados para las pruebas posteriores de gripe u otros virus respiratorios [25]. Por el contrario, muchos laboratorios realizan pruebas de panel para múltiples virus para facilitar el manejo, disminuir el muestreo de pacientes y reconocer que puede Cualquier prueba secuencial no sesgaría la estimación de sensibilidad aplicable a los resultados de la prueba reportados al RVDSS, aunque el uso significativo de pruebas de antígeno rápido en los laboratorios que reportan al RVDSS reduciría la sensibilidad global. Como un solo espécimen puede ser sometido a múltiples pruebas, se espera que la tasa de falsos negativos aplicable a un espécimen que ha sido sometido a múltiples pruebas sea muy inferior a la media del sistema para las pruebas individuales. Los parámetros b 1. a b 4 explican las tendencias y la estacionalidad de los especímenes verdaderamente negativos (pacientes que presentan otras infecciones respiratorias agudas). Se notificaron más de 50.000 pruebas de gripe al RVDSS cada año, alcanzando en 2004/05 a 101.000. En general, el 10% de las pruebas de gripe fueron positivas para la gripe, que oscilaban entre el 4% y el 13% dependiendo de la temporada. Como se observa en la Figura 1, no se identificó ningún virus en el 75% de los especímenes sometidos a pruebas (área blanca bajo la curva), ni siquiera en los meses de invierno de diciembre a abril se identificó uno de estos 4 virus en promedio en no más del 30% de los especímenes. La sincronización fuerte y consistente de las pruebas negativas con las pruebas positivas contra la gripe, como se observa en la Figura 1, sugiere que los falsos resultados negativos contribuyeron al gran número de pruebas negativas durante los períodos de actividad de la gripe. La sensibilidad para la prueba contra la gripe A promedió un 33,7% (con intervalos de confianza del 95% estimados en el modelo de 33,3-34.1) para el período 1999/2000-2005/06. Las pruebas contra la gripe B tuvieron una sensibilidad similar estimada en 34,7 (IC del 95% 33,4-36.1). La estratificación por provincia o estación produjo estimaciones similares para la sensibilidad de la prueba de influenza A: 32% (IC del 95% 30-34) y 36% (IC del 95% 33-41), respectivamente. Las estimaciones de sensibilidad basadas en los resultados de las pruebas comunicadas al RVDSS para laboratorios individuales con datos suficientes para adaptarse al modelo mostraron variaciones significativas, con estimaciones de sensibilidad que oscilaban entre el 25 y el 65 %. Como era de esperar, los laboratorios que utilizaban principalmente pruebas de antígeno rápido tenían sensibilidades estimadas menores, y los laboratorios que utilizaban métodos de PCR tenían estimaciones de sensibilidad más altas. Sin embargo, la información sobre los procedimientos de prueba se limita principalmente a la encuesta de 2005/06. También se observaron irregularidades adicionales en los datos de laboratorio y no todos los laboratorios proporcionaron datos suficientes para ajustarse al modelo. La figura 2 ilustra un buen ajuste del modelo donde el número semanal de pruebas negativas de gripe se explica bien por el modelo covariable, con En primer lugar, es evidente que se probaron especímenes adicionales durante el período del SARS, como lo indica el período en el que el número de pruebas negativas semanales de gripe superó el número esperado, o equivalentemente, un período de residuos positivos sucesivos. Los residuos normalmente capturan variaciones aleatorias; por lo tanto, representan pruebas que no pueden asignarse con arreglo al modelo especificado. Además del período del SARS, las pruebas parecen haber sido elevadas durante varias semanas en enero de 2000 durante el máximo de la temporada 1999/2000 A/ Sydney/05/97 (H3N2) en la que las admisiones respiratorias fueron inusualmente elevadas [26, 27], y en diciembre de 2003, cuando se identificó en los Estados Unidos un riesgo elevado de muertes pediátricas asociadas con la cepa A/Fugian/411/02 (H3N2) [28]. Como esos períodos correspondían a un período de mayor conciencia pública debido a brotes graves de gripe, se re La exclusión de estos puntos de datos no alteró la estimación de sensibilidad para la gripe. La atribución de resultados negativos de la prueba de influenza a la gripe y otros virus se ilustra en la Figura 3. La curva de referencia es la estimación del modelo del número de pruebas que probablemente fueron realmente negativas para los cuatro virus probados. Una reducción en la recolección de muestras y pruebas, principalmente para virus distintos de la gripe, también es evidente durante el período de Navidad (Figura 3). La proporción semanal de pruebas confirmadas positivas para la gripe alcanzó un máximo de cada estación del 15 al 30%. La contabilidad para el modelo estimada tasa negativa falsa sugiere que durante los períodos de actividad máxima de la gripe, 40-90% de las pruebas se realizaron en especímenes tomados de personas recientemente infectadas con gripe. La gripe se confirmó en sólo el 14% de los especímenes enviados para pruebas durante el período de invierno, mientras que la estimación de sensibilidad implicaría que hasta 40% de las pruebas Las cifras correspondientes a todo el año indican que el 10% de los especímenes fueron confirmados positivos para la gripe y el 30% de las pruebas de influenza podrían ser modelos atribuidos a una infección de gripe anualmente. A pesar de un número relativamente grande de pruebas en la temporada baja, el número de pruebas positivas para la gripe fue casi insignificante; sugiriendo que la tasa falsa positiva aplicable a las pruebas de gripe RVDSS es mínima. El modelo estimado de sensibilidad basado en los resultados de las pruebas de gripe reportados al RVDSS del 30-40% es muy inferior a las sensibilidades de ensayo estándar documentadas en la literatura. Las sensibilidades estándar para los procedimientos de diagnóstico utilizados por los laboratorios participantes oscilaron entre el 64% para las pruebas de antígeno rápido y el 95% para las pruebas RT-PCR, con un promedio del 75% para el período de estudio [23]. Como las características de rendimiento de las pruebas específicas se basan generalmente en muestras de alta calidad, A diferencia de los estudios de validación, nuestras muestras se toman de una variedad de entornos clínicos y se procesan con una variedad de procedimientos en todo el país. Además, la variación en las indicaciones para las pruebas diagnósticas puede variar en todo el país. Como hay muchos otros patógenos respiratorios que no se prueban de forma rutinaria o no se reportan al RVDSS, incluyendo metapneumovirus humano (hMPV), coronavirus y rinovirus para los cuales los pacientes pueden buscar atención médica y presentar enfermedad similar a la gripe [29] [30] [31], se esperaba una gran proporción de resultados negativos de las pruebas. El ajuste general del modelo, y la coherencia general de las estimaciones de sensibilidad, sugieren que estos muchos virus respiratorios fueron razonablemente contabilizados por la base estacional y que la fuerte asociación entre el número de pruebas positivas y negativas de gripe sobre una base semanal es indicativa de un número significativo de Sin embargo, para sesgar significativa y consistentemente la estimación, el grado de sincronización tendría que ser bastante fuerte, persistir durante todo el período de estudio, y ocurrir en todas las provincias. No se observó sincronización entre los virus RVDSS (influenza A, influenza B, VRS, adenovirus y IVP), y otros virus como rinovirus, coronavirus y HMPV, que sólo representaron una pequeña proporción de las identificaciones virales y no se encontró sincronizada con influenza [33]. Asimismo, los pacientes pueden presentarse para el cuidado debido a una infección bacteriana secundaria. Si bien cualquier espécimen probablemente probaría negativo ya que el virus, en este punto, es probable que no sea detectable, el modelo atribuiría estadísticamente una prueba negativa en este caso a la infección primaria; uno de los cuatro virus RVDSS o a la base estacional que representa otras infecciones respiratorias, dependiendo del nivel de actividad viral en el momento de la prueba, lo que no se considera una fuente de sesgo. La gran variación en las tasas falsas negativas estimadas para los laboratorios que informan al RVDSS sugiere que la estandarización de la obtención de muestras, pruebas y procedimientos de notificación probablemente reduciría la tasa global falsa negativa. Se sabe que la exactitud de las pruebas diagnósticas se ve afectada por la calidad del espécimen [10, 11], su manejo, el tiempo de recolección después del inicio de los síntomas, y la edad del paciente [14, 15]. Incluso con las metodologías moleculares más sensibles, el rendimiento se mostró fuertemente relacionado con el tiempo transcurrido desde el inicio de los síntomas [9, 14], con una disminución de 3 veces en proporción positiva dentro de los 3 a 5 días posteriores al inicio de los síntomas tanto para RT-PCR como para los procedimientos de cultivo. Para la mayoría de las pruebas de laboratorio, se recomienda la obtención de muestras dentro de las 72 horas desde el inicio de los síntomas [6], aunque los pacientes a menudo se presentan mucho más tarde en el curso de la enfermedad. Las estimaciones del tiempo medio desde el inicio de los síntomas sugieren un retraso de 3 y 5 días para pacientes ambulatorios e internos respectivamente [15], sin embargo estas estimaciones se limitan a los pacientes con gripe confirmada en laboratorio. Además, hay diferencias inherentes en las características de rendimiento de las pruebas diagnósticas actualmente utilizadas [4, 6, 8, [34] [36] [37] [38]. El uso rutinario de las pruebas RT-PCR sólo se ha hecho disponible recientemente en Canadá (sólo el 20% de las pruebas utilizaron métodos RT-PCR a partir de 2005/2006 [23] ), pero se espera que el mayor uso de esta modalidad mejore la precisión. Las estimaciones de sensibilidad a nivel de población o sistema que incluyen los efectos de la calidad de la muestra son limitadas. Grijalva y colegas [39] estimaron la sensibilidad diagnóstica en un estudio de captura de niños hospitalizados por complicaciones respiratorias en un 69% para un sistema basado en RT-PCR y en un 39% para un sistema basado en laboratorio clínico (vigilancia pasiva de las pruebas realizadas durante la práctica clínica y utilizando una variedad de pruebas disponibles comercialmente). Cooper y sus colegas [33] atribuyeron el 22% de las llamadas telefónicas de salud para el resfriado/gripe a la gripe durante dos años relativamente leves, y en otros lugares el 20% de las admisiones para infecciones respiratorias agudas (incluida la gripe) en adultos de 20 a 64 años se atribuyeron a la gripe, y el 42% para personas mayores [1]. Si bien hay limitaciones con este enfoque, no hay otras alternativas simples para ayudar en la interpretación de los datos del RVDSS. Habría sido útil analizar los datos basados en cada espécimen enviado a pruebas. Con sólo el número de pruebas semanales y el número de resultados positivos, no pudimos calcular el número de especímenes que realmente se encontraron negativos para los cuatro virus, o estimar el alcance de la coinfección. La coinfección, que no fue contabilizada en nuestro modelo, podría resultar en una subestimación del número de pruebas falsamente negativas, ya que la atribución de una prueba negativa de gripe que en realidad fue coinfectada con gripe y otro virus respiratorio tendría que ser dividida entre los virus. Con información auxiliar asociada a cada espécimen, estimaciones modelo de tasas negativas falsas basadas, por ejemplo, en el tipo de prueba, el tiempo desde el inicio de los síntomas, la edad del paciente o la presentación clínica nos habrían permitido explorar las razones de las altas tasas negativas falsas. Como la tasa negativa falsa parece depender del laboratorio (datos no mostrados), este rango estimado es aplicable sólo al RVDSS para el período de estudio. Se prevé una reducción significativa de la tasa negativa falsa a medida que los métodos se estandarizan y con la absorción de los nuevos métodos RT-PCR. Como los resultados positivos, particularmente para cultivo, se obtienen a menudo una semana o más después de la recepción del espécimen, algunos resultados positivos pueden haber sido reportados en una semana diferente a la prueba. Múltiples resultados de pruebas para un solo espécimen también pueden haber contribuido a reportar irregularidades. Estas irregularidades tenderían a sesgar el parámetro estimado hacia cero, y por lo tanto la sensibilidad estimada hacia 1. Considerando el ajuste general del modelo y la gravedad relativa de la gripe [1], concluimos que nuestra estimación de sensibilidad puede ser ligeramente sobreestimada (número de falsos negativos infraestimados). La baja sensibilidad de las pruebas contribuye a la subestimación crónica de la carga de la gripe en la población general. Aunque nuestra estimación de sensibilidad sólo es aplicable a la interpretación de los datos del RVDSS durante el período de estudio, estimaciones similares para cohortes específicas o procedimientos de laboratorio pueden ayudar a orientar la investigación sobre las razones del gran número de falsos resultados negativos de las pruebas.La capacidad para mejorar la precisión diagnóstica mejorará en última instancia nuestra comprensión de la epidemiología de la gripe.

¿Qué utiliza el Sistema Canadiense de Salud Pública para identificar los períodos de actividad de la gripe?

No se puede RIDD de virushttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4061530/SHA: ef58c6e2790539f30df14acc260ae2af4b5f3d1fAutores: Bhattacharyya, SankarFecha: 2014-06-18DOI: 10.3389/fmicb.2014.00292Licencia: cc-byAbstract: El genoma mamífero ha evolucionado para codificar una batería de mecanismos, para mitigar una progresión en el ciclo de vida de un patógeno viral invasivo. Aunque aparentemente desfavorecidos por su dependencia de los procesos biosintéticos del huésped, una tasa de evolución inmensamente más rápida proporciona a los virus una ventaja en este conflicto. En esta revisión, he discutido la actividad antivirus potencial de la enzima requiriente de inositol 1 (IRE1), un efector bien caracterizado de la respuesta homeostática celular a una sobrecarga de la capacidad de plegado de proteínas del retículo endoplasmático (ER). IRE1, una ribonucleasa residente de membrana ER (RNase), tras la activación catalizas escisión regulada de ARN de huésped selectos codificantes de proteínas y no codificantes, utilizando un dominio de RNase que es homólogo al del conocido efector antiviral RNaseL. Este último opera como parte del sistema de mecanismo de defensa antiviral OAS/RNaseL Oligoadenylate sintetasa. Los sustratos de ARN codificante de proteínas son tratados diferencialmente por la RNASa IRE1 para aumentar, a través del empalme citoplasmático de un intron en la transcripción Xbp1, o suprimir la expresión génica. Esta referida supresión de la expresión génica es mediada a través de escisión degradativa de una cohorte selecta de transcripciones de ARN celular, iniciando la vía regulada de decaimiento dependiente de IRE1 (RIDD). La revisión primero discute el mecanismo antiviral del sistema OEA/RNaseL y las tácticas de evasión empleadas por diferentes virus. Esto es seguido por una revisión de la vía RIDD y su efecto potencial sobre la estabilidad de los ARN virales. Concluyo con una comparación de la actividad enzimática de las dos RNases seguida de deliberaciones sobre las consecuencias fisiológicas de su activación. Texto: Establecimiento de la infección por un virus, incluso en las células huésped permisivas, se asedia con una plétora de desafíos de las vías innata-antiviral y celular-muerte. Por lo tanto, la respuesta del huésped a una infección por el virus podría resultar inhibitoria para el ciclo de vida viral de una manera directa o indirecta. El mecanismo directo implica la expresión de múltiples genes antivirales que han evolucionado para reconocer, reaccionar, y así librar al huésped infectado del ácido nucleico viral (Zhou et al., 1997; Thompson et al., 2011). Por otro lado, las vías, por ejemplo, los que culminan en iniciar una muerte apoptótica para la célula huésped, sirven indirectamente para limitar la propagación del virus (Roulston et al., 1999). Una diferencia importante entre estos dos mecanismos es que mientras que la primera respuesta es transmisible a células vecinas no infectadas a través de la señalización del interferón (IFN), esta última se observa principalmente en cis. Sin embargo, informes recientes han demostrado la transmisión de una señal apoptótica entre células que están en contacto a través de uniones de brecha, aunque tal señalización de una célula huésped infectada por virus a una no infectada no se conoce todavía (Cusato et al., 2003; Udawatte y Ripps, 2005; Kameritsch et al., 2013). Patógenos virales exitosos, a través de un proceso de selección activa, han evolucionado para replicarse y simultáneamente evadir o bloquear cualquiera de estas respuestas del huésped. Los ácidos nucleicos virales que podrían ser el genoma (virus de ARN monostrando de sentido positivo) o ARN derivado de la transcripción del genoma [ARN de sentido negativo o ARN de doble sentido (ARN de sentido positivo) o virus de ADN], ofrecen objetivos críticos para la detección y la erradicación.El ácido nucleico viral dirigido a los armamentos en el arsenal del huésped incluyen aquellos que reconocen los patrones moleculares asociados como receptores de peaje (TLR), DDX58 (o RIG-1), IFIH1 (o MDA5), proteínas IFIT [ genes estimulados por IFN (ISG)56 e ISF54], etc. (Aoshi et al., 2011; Bowzard et al., 2011; Jensen y Thomsen, 2012). A esto le sigue la señalización de IFN y la expresión o activación de factores que apuntan al inductor para la degradación o modificación como el sistema OAS/ribonucleasa L (RNaseL), APOBEC3, MCPIP1, el sistema ZC3HAV1/exosome y las vías RNAi (Gao et al., 2002; Sheehy et al., 2002; Guo et al., 2007; Daffis et al., 2010; Sidahmed and Wilkie, 2010; Schmidt et al., 2012; Cho et al., 2013a; Lin et al., 2013). En esta revisión nos centramos en dos proteínas que contienen dominios homólogos de la RNASA, RNASAL con una función antiviral directa conocida y enzima Inositolrequiriendo 1 (IRE1 o ERN1) que tiene un dominio similar a RNASAL con un papel conocido en la respuesta homeostática a las proteínas desplegadas en el retículo endoplasmático (ER) y un potencial para funcionar como antiviral (Figura 1 ; Tirasophon et al., 2000). En las células de mamíferos se detectan los signos de la infección por el virus del ARN, como la presencia de ARN citosólico con 5-ppp o extensos (>30 bp) dsRNA por receptores de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs) o receptores de reconocimiento de patrones (PRRs) en la célula huésped, como RIG-1, MDA5, y la familia IFIT de proteínas (Aoshi et al., 2011; Bowzard et al., 2011; Vabret y Blander, 2013). La transducción de una señal de este reconocimiento resulta en la expresión de los genes IFN los productos www.fronterizosin.org FIGURE 1 Representación esquemática de la actividad ribonucleasa de IRE1 y RNaseL que muestran conversaciones cruzadas entre las vías catalizadas por las enzimas. La figura muestra la activación de la actividad de la RNASA después de la dimerización desencadenada por la acumulación de proteínas desplegadas en el ER-lumen o síntesis de 2-5A por la enzima OEA, respectivamente, para IRE1 y RNASAL. El escote de Xbp1u por IRE1 libera un intron generando Xbp1s. Los objetivos de IRE1 en la vía RIDD o todos los sustratos de RNASAL se muestran sometidos a escote degradativo. Los productos de escote generados por la degradación del sustrato respectivo se muestran potencialmente interaccionar con RIG-I, lo que conduce a la secreción de Interferón y transactivación de genes de Oas a través de la señalización de Interferón. Abreviaturas: RIG-I = ácido retinoico gen-I inducible, Ifnb = interferón beta gen loci, IFN = interferones, ISG = genes sensibles al interferón, 2-5A = 2 -5 oligoadenilatos. de los cuales al momento de la secreción fuera de la célula se unen a los receptores del cognato, iniciando la señalización posterior (Figura 1 ; Randall y Goodbourn, 2008). Los genes regulados como resultado de la señalización de IFN se denominan genes estimulados o regulados por IFN (ISGs o IRGs; Sen y Sarkar, 2007; Schoggins y Rice, 2011). Oligoadenylato sintetasa o genes de la OEA son ISG canónicos que convierten ATP en 2-5 oligoadenylatos vinculados (2-5A) por un mecanismo enzimático único (Figura 1 ; Hartmann et al., 2003). Además, son proteínas de unión al ARN que funcionan como PRRs, de tal manera que la actividad sintetizadora 2-5A necesita ser inducida a través de una interacción con dsRNA (Minks et al., 1979; Hartmann et al., 2003). En una célula huésped infectada por un virus de ARN, tal dsRNA está presente en forma de mediates de replicación (RI), que son sintetizados por las polimerasas ARN dependientes del virus codificadas por ARN (RdRp) y posteriormente utilizados por la misma enzima para sintetizar más ARN genómico, a través de la transcripción asimétrica (Weber et al., 2006). Sin embargo, los complejos de replicaciones (RCs) que albergan estas moléculas de RI se encuentran aislados dentro de las vesículas derivadas de la membrana huésped, al menos en virus de ARN de cadena positiva, un grupo que contiene muchos patógenos humanos (Uchil y Satchidanandam, 2003; Denison, 2008). Informes de diferentes grupos sugieren que las proteínas de la OEA se distribuyan tanto en el citoplasma como en fracciones asociadas a la membrana, indicando tal vez una evolución de las metodologías antivirales del huésped hacia la detección de los dsRNA virales asociados a la membrana (Marie et al., 1990; Lin et al., 2009). Los virus del ADN, por otro lado, producen dsRNA mediante la recocido de ARN derivado de la transcripción de ambos hilos en los mismos loci genómicos virales, que probablemente son detectados por el pool citoplasmático de proteínas de la OEA (Jacobs y Langland, 1996; Weber et al., 2006). Después de la activación, las enzimas de la OEA sintetizan moléculas de 2-5A en una reacción no procesadora que produce oligómeros que, aunque potencialmente varían en tamaño desde dimérico a multimérico, son funcionalmente activas sólo en una forma trimérica o tetramérica (Dong et al., 1994; Sarkar et al., 1999; Silverman, 2007). Estos pequeños ligandos, que llevan grupos de fosfato (1-3) en los 5 extremos y grupos de hidroxilo en las 2 y 3 posiciones, sirven como cofactor que puede interactuar específicamente con moléculas de Rnasel existentes (Knight et al., 1980; Zhou et al., 1997 Zhou et al., 2005 Sarkar et al., 1999). Como parte de un sistema de control fisiológico, estos oligómeros 2-5A son bastante inestables, ya que son muy susceptibles a la degradación celular por 5 -fosfatasas y PDE12 (2 -fosfodiesterasa; Silverman et al., 1981; Johnston and Hearl, 1987; Kubota et al., 2004; Schmidt et al., 2012). Las estrategias virales para evadir o superar este mecanismo de defensa del huésped varían de prevenir la señalización de IFN que obstaculizaría la inducción de la expresión de la OEA o frustraría la activación de las proteínas expresadas de la OEA, ya sea protegiendo al dsRNA viral de interactuar con él o modulando la vía del huésped para sintetizar derivados inactivos 2-5A (Cayley et al., 1984; Hersh et al., 1984; Rice et al., 1985; Maitra et al., 1994; Beattie et al., 1995; Rivas et al., 1998; Child et al., 2004; Min and Krug, 2006; Sanchez and Mohr, 2007; Sorgeloos et al., 2013). Es posible proteger el ARN viral de la interacción con la OEA a través del recinto de intermedios de replicación de dsRNA en compartimentos cerrados de membranas, como se observa en muchos flavivirus (Ahlquist, 2006; Miller y Krijnse-Locker, 2008; Miorin et al., 2013). Rnasel es una proteína de 741 aminoácidos que contiene tres regiones predominantemente estructuradas, un dominio de repetición de anquirina N-terminal (ARD), una pseudo-quinasa catalíticamente inactiva (PK) y un dominio de Rnasa C-terminal (Figura 2A; Hassel et al., 1993; Zhou et al., 1993). La actividad del dominio RNase está regulada negativamente por el ARD, que se alivia al unirse de moléculas de 2-5A a anquirina repite 2 y 4 seguido de una alteración conformacional (Figura 1 ; Hassel et al., 1993; Tanaka et al., 2004; Nakanishi et al., 2005). En apoyo de esta afirmación, se ha demostrado que la eliminación del ARD produce RNaseL constitutivamente activo, aunque con una actividad de RNase dramáticamente menor (Dong y Silverman, 1997). Sin embargo, informes recientes sugieren que mientras que 2-5A vincula las repeticiones de anquirina de moléculas adyacentes que conducen a la formación de estructuras de orden dímero y superior, a concentraciones suficientemente altas in vitro, el RNaseL podría oligomerizar incluso en ausencia de 2-5A. Sin embargo, in vivo la actividad de la nucleasa RNASAL parece estar todavía bajo la única regulación de 2-5A (Al-Saif y Khabar, 2012). Para explotar esta dependencia, múltiples virus como el virus de la hepatitis del ratón (MHV) y el grupo de rotavirus A (RVA) han evolucionado para codificar fosfodiesterasis capaces de hidrolizar los enlaces 2-5 en 2-5A y así atenuar la actividad de división de RNASAL (Zhao et al., 2012; Zhang et al., 2013). Además de 5 -fosfatasas y 2 -fosfodiesterasas para reducir la alineación ClustalW de la secuencia primaria de un segmento del dominio PK que indica residuos de aminoácidos que son importantes para la interacción con cofactores de nucleótidos. Se subrayan los residuos de lisina conservados, críticos para esta interacción (K599 para IRE1 y K392 en RNASAL). (C) Alineación de los dominios KEN en RNASAL e IRE1. Los aminoácidos resaltados y numerados en IRE1 son críticos para la actividad de RNASA IRE1 (Tirasophon et al., 2000). los niveles endógenos 2-5A, genomas mamíferos codifican inhibidores posttranscritos y post-traducción de la actividad de RNASAL en forma de microRNA-29 y la proteína ABCE1 (inhibidor de RNASAL o RLI), respectivamente (Bisbal et al., 1995; Lee et al., 2013). La inhibición directa de la función RNASAL también se observa tras la infección por Picornavirus a través de, ya sea la inducción de la expresión de ABCE1 o el ejercicio de una propiedad inhibidora única de un segmento del ARN viral (Martinand et al., 1998 (Martinand et al.,, 1999 Townsend et al., 2008; Sorgeloos et al., 2013). Una vez activada por 2-5A, RNASAL puede degradar el ARN de una sola cadena independientemente de su origen (virus o huésped), aunque parece existir un sesgo hacia la división del ARN viral (Wreschner et al., 1981a; Silverman et al., 1983; Li et al., 1998). Las secuencias de ARN que son predominantemente escindidos por RNASAL son U-rich con los puntos de escote siendo típicamente en el 3 extremo de UA o UG o UU di-nucleótidos, dejando un 5 -OH y un 3 -monofosfato en el producto de escote (Floyd-Smith et al., 1981; Wreschner et al., 1981b). Un informe reciente muestra un consenso más general de 5 -UNN-3 con el punto de escote entre el segundo y el tercer nucleótido (Han et al., 2014). Los objetivos celulares de RNASAL incluyen tanto el ARN ribosomal (ARNr) como los mRNAs, que representan predominantemente genes involucrados en la biosíntesis proteica (Wreschner et al., 1981a; Al-Ahmadi et al., 2009; Andersen et al., 2009). Además, la actividad de RNASAL también puede degradar las transcripciones específicas del ARNmSG y, por lo tanto, atenuar el efecto de la señalización de IFN (Li et al., 2000). Probablemente se observa una evolución hacia la expresión génica aislante de la actividad de RNASA en la región de codificación de genes mamíferos donde la frecuencia de dinucleótidos de UU/UA es más rara (Bisbal et al., 2000; Khabar et al., 2003; Al-Saif y Khabar, 2012). Tal vez no sorprendentemente, con una tasa de evolución mucho más rápida, se han hecho observaciones similares con respecto a la evasión de RNASAL mediada por ARNs virales también (Han y Barton, 2002; Washenberger et al., 2007). Además, las modificaciones nucleósidas en los ARNm del huésped, raramente observadas en ARNs virales, también se han demostrado que confieren protección de RNASAL (Anderson et al., 2011). Además de dirigir directamente el ARN viral, la reducción de ribosomas funcionales y el ARNm de proteína ribosomal afecta a la síntesis y replicación de proteínas virales de manera indirecta. Probablemente, como reflejo de estos efectos sobre los ARNs celulares, RNASAL está implicado como uno de los factores que determinan el efecto antiproliferativo de la actividad IFN. La actividad antiviral de RNASAL se extiende más allá de la escisión directa del ARN viral, a través de la estimulación de RIG-I por el producto de escisión (Malathi et al., 2007 (Malathi et al., 2010. Un efecto global de RNASAL se observa en forma de autofagia inducida por la c-jun N-terminal cinasa (JNK) y la apoptosis, probablemente como consecuencia de la escisión del ARN (Li et al., 2004; Chakrabarti et al., 2012; Siddiqui y Malathi, 2012). También se ha demostrado que la RnasaL desempeña un papel en la muerte celular apoptótica iniciada por agentes farmacológicos que extienden el papel fisiológico de esta vía más allá del límite de ser sólo un mecanismo antiviral (Castelli et al., 1997 (Castelli et al., 1998 ). La ER sirve como conducto para la maduración de proteínas celulares que están secretadas o destinadas a estar asociadas con una membrana para su función. Un microambiente exclusivo (hijo de calcio alto y proporción única de glutatión reducida a oxidadada) junto con una batería de enzimas residentes en el ER-lumen (foldasas, chaperonas y lectinas) catalizan/median las reacciones necesarias de plegado, desulfuro y glucosilación (Schroder y Kaufman, 2005). Una perturbación de la capacidad de plegado, ya sea por trastornos fisiológicos o infección por virus, puede conducir a una acumulación de proteínas desplegadas en el lúmen ER, que señala una respuesta proteica desplegada (UPR). UPR abarca un programa de transcripción en red y expresión génica traslacional, iniciado por tres sensores residentes de membrana ER, a saber, IRE1 o ERN1, PKR-como ER Kinase (PERK o EIF2AK3) y activando el factor de transcripción 6 (ATF6; Hetz, 2012). IRE1 es una proteína transmembrana de paso único tipo I en la que, al igual que se observa con RNaseL, el N-terminal residente en la lumen ER sirve como sensor y el C-terminal citosólico como efector (Figura 1 ; Chen y Brandizzi, El gen codificador IRE1 está presente en genomas que van desde la levadura hasta los mamíferos y en este último se expresa ubicuamente en todos los tejidos (Tirasophon et al., 1998). La transducción de señales por IRE1 estimulado inicia múltiples vías de regulación genética con consecuencias pro-supervivientes o pro-apoptóticas (Kaufman, 1999). Durante la homeostasis o condiciones no estresadas las moléculas del sensor son monoméricas, un estado mantenido de forma cooperativa por la "ausencia" de proteínas desplegadas y la "presencia" de HSPA5 (GRP78 o Bip, una chaperona residente de ER) moléculas unidas a un segmento de membrana-proximal desordenado de la proteína en el ER-lumen-residente Nterminus (Credle et al., 2005). Proteínas desdobladas acumuladas en el lumen desencadenan el acoplamiento de este dominio desde moléculas de sensores adyacentes a través de una combinación de (a) titulación de las moléculas de chaperona HSPA5 ligadas y (b) unión directa por moléculas de proteínas mal plegadas (Shamu y Walter, 1996; Credle et al., 2005; Aragon et al., 2009; Korennykh et al., 2009). Atadura de los dominios luminales yuxtapone los segmentos citosólicos C-terminales, llevando a una agregación de las moléculas IRE1 en distintos focos ER-membrana (Kimata et al., 2007; Li et al., 2010). El segmento C-terminal tiene un dominio de serina/treonina quinasa y un dominio de RNase homólogo al de RNaseL (Figura 1 ; Tirasophon et al., 1998 Tirasophon et al.,, 2000. Una sobre-autofosforilación por el dominio de cinasa activa alostéricamente el dominio de RNase (Tirasophon et al., 2000; Lee et al., 2008; Korennykh et al., 2009). De hecho, la sobre-expresión exógena de IRE1 en células de mamíferos lleva a la activación sugiriendo que, bajo condiciones homeostáticas, la no-juxtaposición de dominios citosólicos mantiene una IR1 inactiva (Tirasophon et al., 1998). Una vez activada, IRE1 realiza escisión de una variedad de sustratos de ARN mediados por su dominio RNASA, además de fosforilar y así activar JNK (Cox y Walter, 1996; Urano et al., 2000). Dependiendo del sustrato de ARN, la escisión catalizada por IRE1 RNASA produce consecuencia diferencial. Aunque la escisión de la transcripción de Xbp1 mRNA en dos posiciones internas es seguida por empalme del segmento interno a través de ligadura de los productos de escisión terminal, que en todos los otros ARN objetivo IRE1 conocidos es seguido por degradación (Figura 1 ; Sidrauski y Walter, 1997; Calfon et al., 2002). Este último modo de regulación negativa de la expresión génica se denomina la vía regulada de desintegración dependiente de IRE1 (RIDD) (Hollien and Weissman, 2006; Oikawa et al., 2007; Iqbal et al., 2008; Lipson et al., 2008). Las transcripciones de genes reguladas por la vía RIDD incluyen la de IRE1 (es decir, autotranscritos), probablemente en un mecanismo de bucle de retroalimentación negativa (Tirasophon et al., 2000). Además de la codificación de proteínas ARN, la vía RIDD regula el nivel de un huésped de precursores de microRNA (pre-miRNAs) y puede cortarse potencialmente en el bucle de anticodón de TRNA Phe (Korennykh et al., 2011; Upton et al., 2012). El dominio IRE1 RNase corta la transcripción del ARNm Xbp1u (u para un spliced) en dos posiciones internas precisas dentro del marco de lectura abierto (ORF) generando tres segmentos, el terminal dos de los cuales son ligados por una ligasa tRNA en levadura y por una ligasa desconocida en células de mamíferos, para producir la transcripción del ARNm Xbp1s (s para un spliced) (Figura 1 ; Yoshida et al., 2001). Los Xbp1s así generados tienen un ORF más largo, que es creado por un cambio de marco en la secuencia de codificación abajo del sitio del empalme (Cox y Walter, 1996; Calfon et al., 2002). También se observa una escisión endonucleolítica dual similar para iniciar la degradación dependiente de XRN1 y Ski2-3-8 de las transcripciones en la vía de degradación RIDD (Hollien y Weissman, 2006). Los genes de transcripción objetivo RIDD son predominantemente aquellos que codifican proteínas secretas o asociadas a membranas y que no son necesarios para las reacciones de plegado de proteínas ER (Hollien y Weissman, 2006). El escote de Xbp1 y las transcripciones diana RIDD constituyen respuesta homeostática o pro-superviviente por IRE1 ya que XBP1S activa genes que codifican múltiples chaperonas (para plegar proteínas desdobladas) y los genes de la vía ERAD (para degradar proteínas mal dobladas terminalmente) mientras que RIDD reduce el flujo de polipéptidos que entran en el lumen de ER (Lee et al., 2003; Hollien y Weissman, 2006). Por otro lado, el escote de transcripciones pre-miRNA que se procesan en la célula para generar CASPASE-2 mRNA (Casp2) controlando miRNAs, constituye la función pro-apoptótica de IRE1 (Upton et al., 2012). Otra señal pro-apoptótica de IRE1 emana de la señalización a través de la fosforilación de JNK1 (Urano et al., 2000). Aunque en la fase inicial la actividad RIDD no corta los ARNm codificando proteínas esenciales de ER, en etapas posteriores de la EPU crónica tales transcripciones se vuelven susceptibles a la degradación promoviendo la inducción de la apoptosis (Han et al., 2009; Bhattacharyya et al., 2014). La infección de células mamíferas por una multitud de virus induce un EPU que a veces se caracteriza por la supresión de la señalización por uno o más de los tres sensores; Su et al., 2002; Tardif et al., 2002; He, 2006; Yu et al., 2006 Yu et al.,, 2013 Medigeshi et al., 2007; Zhang et al., 2010; Merqui Entre estos al menos dos virus de diversas familias, HCMV (un virus de ADN) y virus de hepatitis C (un hepacivirus), interfieren con la señalización IRE1 por diferentes mecanismos (Tardif et al., 2004; Stahl et al., 2013 ). Una inhibición observada de cualquier función celular por una infección viral podría sugerir una función antivirus potencial para ella, que el virus ha evolucionado para evadir mediante el bloqueo de algunos pasos críticos. En ambos casos mencionados anteriormente, la estabilidad de las proteínas virales parece estar afectada por la degradación mediada por ERAD, aunque otros efectos antivirales potenciales de la activación IRE1 no están claros todavía (Isler et al., 2005; Saeed et al., 2011). Curiosamente, fragmentos de mRNA de huésped producidos después de la activación IRE1 durante la infección bacteriana, se ha demostrado que activan la señalización RIG-I (Fi Teóricamente, otras funciones de IRE1 también pueden tener un efecto antiviral que requiere su inhibición para la replicación viral desinhibida. Sin embargo, todavía no está claro si IRE1 es capaz de cortar cualquier ARN viral (o ARNm) de una manera similar a la de otros objetivos RIDD (Figura 1). Las posibilidades de tal función antiviral directa son alentadas por el hecho de que todos estos virus codifican al menos una proteína que, como parte de su proceso de maduración, requiere glucosilación y formación de unión de disulfuros. Tal necesidad implicaría la traducción de la codificación de ARNm tal proteína, que en caso de virus de ARN monotirado de sentido positivo significaría el genoma, en asociación con la ER-membrana (Figura 1 ; Lerner et al., 2003). Además para muchos virus de ARN, los complejos de replicación se alojan en estructuras vesiculares derivadas de ER (Denison, 2008; den Boon et al., 2010). Considerando la proximidad de IRE1 y estos ARN derivados de virus, es tentador especular que probablemente en algún momento del ciclo de vida viral uno o más ARN asociados al virus serían susceptibles a la escisión por IRE1. Sin embargo, estudios con al menos dos virus han demostrado que en lugar de aumentar el título viral, la inhibición de la actividad de la RNASA de IRE1 activada tiene un efecto opuesto (Hassan et al., 2012; Bhattacharyya et al., 2014). Esto implica beneficios potenciales de la activación de IRE1 a través de una o más de las siguientes, a) expresión de chaperonas u otras moléculas provirales aguas abajo de XBP1Supregulación o activación de JNK, b) escisión de potenciales transcripciones del gen antiviral mRNA por la actividad RIDD. Sin embargo, el modo de protección del ARN viral de la actividad RIDD todavía no está claro. Es posible que las proteínas virales creen un subdominio dentro de la membrana ER, que a través de algún mecanismo excluye IRE1 de diseminar cerca del ARN genómico, protegiendo así los complejos de replicación (Denison, 2008). Por lo tanto, probablemente no es sorprendente que los virus de ARN monotirado más sentido codifican una poliproteína, que produce complejos de replicación en cis, promoviendo la formación de tales subdominios (Egger y El hecho de que IRE1 forme oligómeros voluminosos de mayor orden probablemente agrava tal exclusión de las moléculas del sensor activado de las proximidades de los complejos de replicación viral. La señalización UPR eventualmente atenua durante el estrés crónico de RE y ya que es lo que imita un EPR inducido por virus, probablemente el ARN viral necesita protección sólo durante la fase inicial de activación de EPR (Lin et al., 2007). Dado que la elección del objetivo RIDD parece estar muy dirigida hacia los ARNm que codifican ER-transitory pero no son proteínas esenciales de ER, también es posible que una o más proteínas virales hayan evolucionado para imitar una proteína huésped cuya transcripción es resistente a RIDD (Hollien y Weissman, 2006). Se observa que la mayor parte del ARNm objetivo RIDD está asociado a la membrana ER, la proximidad a la asociación facilitadora y escote IRE1 (Figura 1 ; Hollien y Weissman, 2006). Aunque la asociación ER para un ARNm es posible sin la mediación de ribosomas, Gaddam y compañeros de trabajo informaron que la asociación continua con polisomas para un ARNm unido a la membrana puede conferir protección contra la escote IRE1 (Cui et al., 2012; Gaddam et al., 2013). Esto sugeriría implicaciones importantes para la naturaleza refractaria observada del virus de la encefalitis japonesa (JEV) y el ARN del virus de la gripe a la escote RIDD (Hassan et al., 2012; Bhattacharyya et al., 2014). A diferencia del virus de la gripe, los flavivirus (que incluyen JEV) no suprimen la síntesis de proteínas del huésped, lo que implica la ausencia de una inhibición global de la traducción como se esperaría durante la EPU (Clyde et al., 2006; Edgil et al., 2006). Por lo tanto, una traducción continua del ARN viral a pesar de la activación de la EPU puede, en principio, conferir protección del patrón de escisión del ARN observado en la vía RIDD. IRE1 y RNaseL, además de similitudes bioquímicas en el dominio de la proteína quinasa y similitudes estructurales en su dominio RNase, comparten las consecuencias funcionales de su activación al iniciar la apoptosis celular a través de la señalización JNK (Tabla 1 y Figura 2 ; Liu y Lin, 2005; Dhanasekaran y Reddy, 2008). Aunque los descubrimientos iniciales se hicieron en el contexto del papel homeostático y antiviral para el primero y el segundo, las diferencias entre las vías se reducen por nuevos avances en la investigación. En la misma vena, mientras que la inhibición de la señalización IRE1 en las células infectadas por el virus indica un papel antiviral potencial, www.bordersin.org (Tirasophon et al., 1998; Dong and Silverman, 1999; Papa et al., 2003; Lin et al., 2007) Naturaleza de los sustratos de la RNASa Tanto el ARNr 28S como los mRNAs IRE1β pueden cortar tanto el ARNrn 28S y el mRNA, mientras que los sustratos de la IRE1α incluyen solamente los mRNAs (Iwawaki et al., 2001) DisecuenciasSustratos de la Cleavage Beside 28S rRNA, predominantemente separa los mRNAs codificando proteínas ribosomal (Andersen et al., 2009) Xbp1u y otros mRNA Bioquímicamente, la similitud en sus dominios RNASA no se extiende a la elección de sustratos o punto de escote, que son aguas abajo de UU o UA en RNASAL y aguas abajo de G (predominantemente) para IRE1 (Figura 2C; Yoshida et al., 2001; Hollien y Weissman, 2006; Upton et al., 2012). Además, mientras que RNASAL se corta predominantemente en región de una sola cadena, IRE1 parece cortar igualmente bien en región de una sola y doble cadena (Upton et al., 2012). Sin embargo, un informe reciente sugiere un sitio de escote consensuado con la secuencia ONU/N, en objetivos de RNASAL y en aquellos ARNm que son cortados por IRE1 como parte de la vía RIDD (Han et al., 2014). El acceso a sustrato de escote potencial para RNASAL se conjetura para ser facilitado a través de su asociación con poliribosomas, mientras que no se conoce tal asociación para IRE1 (Salehzada et al., 1991). Existen posibilidades de que IRE1 tenga distribución preferencial en la ER áspera que, al activarse, le daría acceso listo a mRNAs para iniciar la vía RIDD. En el contexto de una infección por virus, la vía que conduce a ambas proteínas tiene el potencial de conducir a la muerte celular. A pesar de que esta podría ser una manera eficiente de eliminar el virus, también augura resultados patológicos para el organismo infectado. La investigación futura probablemente conduciría al diseño de fármacos dirigidos a estas proteínas a partir de la homología estructural de sus dominios efectores, regulando el desenlace patológico de su activación sin comprometer sus funciones antivirales o antivirales potenciales.

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Secuencia casi completa del genoma de un ecovirus 30 cepas de un grupo de casos de meningitis aséptica en California, septiembre de 2017https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6953510/SHA: f0c4d40e1879dd1a049298f151940ac168b5f5a7Autores: Pan, Chao-Yang; Huynh, Thalia; Padilla, Tasha; Chen, Alice; Ng, Terry Fei Fan; Marine, Rachel L.; Castro, Christina J.; Nix, W. Allan; Wadford, Debra A. Fecha: 2019-10-31DOI: 10.1128/mra.01085-19Licencia: cc-byAbstract: En septiembre de 2017, reportamos la secuencia casi completa del genoma de un enterovirus humano, una cepa de ecovirus 30, obtenida de un ejemplar de líquido cefalorraquídeo de un paciente adolescente con meningitis aséptica. Texto: Los chovirus E son miembros de la especie enterovirus B del género enterovirus (EV) en la familia Picornaviridae de virus ARN no envueltos, de una sola cadena y de un sentido positivo. Los ecovirus fueron nombrados a partir del acrónimo de virus huérfano humano entérico citopático en el momento de su descubrimiento en la década de 1950, pero más tarde se encontraron asociados con enfermedades respiratorias, enfermedad de pies y bocas, y meningitis aséptica, similar a otros enterovirus (1). De acuerdo con el Código de Reglamento de California, los casos de meningitis son reportables al Departamento de Salud Pública de California (CDPH) dentro de un día de identificación de la etiología (2). En el otoño de 2017, un grupo de casos de meningitis aséptica de una escuela secundaria del norte de California fueron reportados al CDPH. El Laboratorio de Enfermedad Viral y Rickettsial (VRDL) en el CDPH detectaron EV de 19 de 30 pacientes (63%) por transcripción inversa en tiempo real-PCR (RT-PCR), como se describió previamente (3). Generamos y analizamos secuencias de capsid parcial (proteína viral 1 [VP1]) utilizando métodos desarrollados por Minnaar et al. (4). Quince de 19 (79%) pacientes positivos para el EV tenían ecovirus 30 (E-30), utilizando muestras de líquido cefalorraquídeo (CSF). Este grupo de casos de meningitis E-30 es similar a los casos de meningitis aséptica E-30 previamente reportados (5, 6) en síntomas y epidemiología. Aquí, reportamos una secuencia casi completa del genoma de una de las muestras de LCR E-30 positivas. El LCR fue procesado por centrifugación, filtración de 0,45-m y tratamiento de nucleasa antes de la extracción utilizando el sistema NucliSENS easyMAG (bioMérieux, Durham, NC) (7). Los ácidos nucleicos extraídos fueron tratados con Dnasa para producir ARN, el cual fue sometido a transcripción inversa aleatoria y PCR (7). La biblioteca de secuenciación de próxima generación (NGS) fue preparada utilizando un kit de Nextera XT y secuenciado en una plataforma MiSeq de 300 ciclos en pares (Ilumina, San Diego, CA). Los datos del NGS fueron analizados utilizando una tubería interna de Centros para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC) que incluye la eliminación de secuencias de host usando bowtie2/2.3.3.1, eliminación de imprimación, baja calidad (por debajo de Q20) y longitud de lectura (50 nucleótidos) filtrando usando cutadapt 1.18, eliminación de duplicación de lectura utilizando un script Dedup.py, ensamblaje de novo utilizando parámetros predeterminados SPAdes 3.7 y búsqueda BLAST de los contigs resultantes (8). Hubo un total de 141.329 lecturas de FASTQ postprocesamiento. El genoma de consenso final fue inspeccionado y anotado usando Geneious v10.0.9 (9). El contig fue construido a partir de 15.712 lecturas, ensamblado a un genoma de referencia E-30 (número de adhesión del GenBank JX976773), y considerado El contenido total de GC es de 48,3% para 7.155 bases. La cobertura media de lectura fue de 260 veces para el genoma E-30. La secuencia del genoma fue designada E-30 USA/2017/CA-RGDS-1005. Su secuencia VP1 fue confirmada por el Laboratorio de Picornavirus CDC como casi idéntica a las de E-30 identificadas en un brote de meningitis aséptica que ocurrió en el otoño de 2017 en Nevada; también tiene mayor identidad nucleótida del 99% a las secuencias VP1 de cepas E-30 del sur de Estados Unidos identificadas por el CDC en mayo de 2017 (números de adhesión de GenBank MG584831 y MG584832), medidos utilizando la versión en línea de blastn (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). La secuencia del genoma de E-30 USA/2017/CA-RGDS-1005 comparte menos del 89% de identidad de nucleótidos (NI) y menos del 98% de identidad de aminoácidos (AI) con otras secuencias E-30 públicamente disponibles. La secuencia contiene la región completa de codificación de proteínas, sin secciones cortas en las regiones no traducidas (UTR) debido a la falta de cobertura de lectura (aproximadamente 182 y 90 nucleótidos de los 5= y 3= UTR, respectivamente). La poliproteína del enterovirus se puede dividir en una estructural (P1-capsid) y dos no estructurales (P2 y P3). Las regiones de poliproteínas del genoma E-30 reportadas aquí comparten 96%, 88% y 84% NI (P1, P2 y P3, respectivamente) con otras secuencias E-30 en GenBank. Disponibilidad de datos. La secuencia E-30 de USA/2017/CA-RGDS-1005 ha sido depositada en GenBank bajo el número de adhesión MK238483. Las lecturas FASTQ filtradas de calidad han sido depositadas en el archivo de la secuencia con el número de adhesión SRR10082176. Las contribuciones del Departamento de Salud Pública de California Viral y Rickettsial Disease Laboratory fueron apoyadas en parte por el Acuerdo Cooperativo de Epidemiología y Capacidad de Laboratorio para Enfermedades Infecciosas número 6 NU50CK000410 de los EE.UU. Centros para el Control y Prevención de Enfermedades. Este trabajo fue financiado en parte por asignaciones federales a los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades, a través de la línea de la Iniciativa de Detección Molecular Avanzada. Los hallazgos y conclusiones en este informe son los de los autores y no representan necesariamente la posición oficial de los Centros para el Control y

En California, ¿a dónde se reportan los casos de meningitis según el Código de Reglamentos de California?

Secuencia casi completa del genoma de un ecovirus 30 cepas de un grupo de casos de meningitis aséptica en California, septiembre de 2017https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6953510/SHA: f0c4d40e1879dd1a049298f151940ac168b5f5a7Autores: Pan, Chao-Yang; Huynh, Thalia; Padilla, Tasha; Chen, Alice; Ng, Terry Fei Fan; Marine, Rachel L.; Castro, Christina J.; Nix, W. Allan; Wadford, Debra A. Fecha: 2019-10-31DOI: 10.1128/mra.01085-19Licencia: cc-byAbstract: En septiembre de 2017, reportamos la secuencia casi completa del genoma de un enterovirus humano, una cepa de ecovirus 30, obtenida de un ejemplar de líquido cefalorraquídeo de un paciente adolescente con meningitis aséptica. Texto: Los chovirus E son miembros de la especie enterovirus B del género enterovirus (EV) en la familia Picornaviridae de virus ARN no envueltos, de una sola cadena y de un sentido positivo. Los ecovirus fueron nombrados a partir del acrónimo de virus huérfano humano entérico citopático en el momento de su descubrimiento en la década de 1950, pero más tarde se encontraron asociados con enfermedades respiratorias, enfermedad de pies y bocas, y meningitis aséptica, similar a otros enterovirus (1). De acuerdo con el Código de Reglamento de California, los casos de meningitis son reportables al Departamento de Salud Pública de California (CDPH) dentro de un día de identificación de la etiología (2). En el otoño de 2017, un grupo de casos de meningitis aséptica de una escuela secundaria del norte de California fueron reportados al CDPH. El Laboratorio de Enfermedad Viral y Rickettsial (VRDL) en el CDPH detectaron EV de 19 de 30 pacientes (63%) por transcripción inversa en tiempo real-PCR (RT-PCR), como se describió previamente (3). Generamos y analizamos secuencias de capsid parcial (proteína viral 1 [VP1]) utilizando métodos desarrollados por Minnaar et al. (4). Quince de 19 (79%) pacientes positivos para el EV tenían ecovirus 30 (E-30), utilizando muestras de líquido cefalorraquídeo (CSF). Este grupo de casos de meningitis E-30 es similar a los casos de meningitis aséptica E-30 previamente reportados (5, 6) en síntomas y epidemiología. Aquí, reportamos una secuencia casi completa del genoma de una de las muestras de LCR E-30 positivas. El LCR fue procesado por centrifugación, filtración de 0,45-m y tratamiento de nucleasa antes de la extracción utilizando el sistema NucliSENS easyMAG (bioMérieux, Durham, NC) (7). Los ácidos nucleicos extraídos fueron tratados con Dnasa para producir ARN, el cual fue sometido a transcripción inversa aleatoria y PCR (7). La biblioteca de secuenciación de próxima generación (NGS) fue preparada utilizando un kit de Nextera XT y secuenciado en una plataforma MiSeq de 300 ciclos en pares (Ilumina, San Diego, CA). Los datos del NGS fueron analizados utilizando una tubería interna de Centros para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC) que incluye la eliminación de secuencias de host usando bowtie2/2.3.3.1, eliminación de imprimación, baja calidad (por debajo de Q20) y longitud de lectura (50 nucleótidos) filtrando usando cutadapt 1.18, eliminación de duplicación de lectura utilizando un script Dedup.py, ensamblaje de novo utilizando parámetros predeterminados SPAdes 3.7 y búsqueda BLAST de los contigs resultantes (8). Hubo un total de 141.329 lecturas de FASTQ postprocesamiento. El genoma de consenso final fue inspeccionado y anotado usando Geneious v10.0.9 (9). El contig fue construido a partir de 15.712 lecturas, ensamblado a un genoma de referencia E-30 (número de adhesión del GenBank JX976773), y considerado El contenido total de GC es de 48,3% para 7.155 bases. La cobertura media de lectura fue de 260 veces para el genoma E-30. La secuencia del genoma fue designada E-30 USA/2017/CA-RGDS-1005. Su secuencia VP1 fue confirmada por el Laboratorio de Picornavirus CDC como casi idéntica a las de E-30 identificadas en un brote de meningitis aséptica que ocurrió en el otoño de 2017 en Nevada; también tiene mayor identidad nucleótida del 99% a las secuencias VP1 de cepas E-30 del sur de Estados Unidos identificadas por el CDC en mayo de 2017 (números de adhesión de GenBank MG584831 y MG584832), medidos utilizando la versión en línea de blastn (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). La secuencia del genoma de E-30 USA/2017/CA-RGDS-1005 comparte menos del 89% de identidad de nucleótidos (NI) y menos del 98% de identidad de aminoácidos (AI) con otras secuencias E-30 públicamente disponibles. La secuencia contiene la región completa de codificación de proteínas, sin secciones cortas en las regiones no traducidas (UTR) debido a la falta de cobertura de lectura (aproximadamente 182 y 90 nucleótidos de los 5= y 3= UTR, respectivamente). La poliproteína del enterovirus se puede dividir en una estructural (P1-capsid) y dos no estructurales (P2 y P3). Las regiones de poliproteínas del genoma E-30 reportadas aquí comparten 96%, 88% y 84% NI (P1, P2 y P3, respectivamente) con otras secuencias E-30 en GenBank. Disponibilidad de datos. La secuencia E-30 de USA/2017/CA-RGDS-1005 ha sido depositada en GenBank bajo el número de adhesión MK238483. Las lecturas FASTQ filtradas de calidad han sido depositadas en el archivo de la secuencia con el número de adhesión SRR10082176. Las contribuciones del Departamento de Salud Pública de California Viral y Rickettsial Disease Laboratory fueron apoyadas en parte por el Acuerdo Cooperativo de Epidemiología y Capacidad de Laboratorio para Enfermedades Infecciosas número 6 NU50CK000410 de los EE.UU. Centros para el Control y Prevención de Enfermedades. Este trabajo fue financiado en parte por asignaciones federales a los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades, a través de la línea de la Iniciativa de Detección Molecular Avanzada. Los hallazgos y conclusiones en este informe son los de los autores y no representan necesariamente la posición oficial de los Centros para el Control y

¿Dónde se encuentra el Laboratorio de Enfermedades Viral y Rickettsial?

Secuencia casi completa del genoma de un ecovirus 30 cepas de un grupo de casos de meningitis aséptica en California, septiembre de 2017https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6953510/SHA: f0c4d40e1879dd1a049298f151940ac168b5f5a7Autores: Pan, Chao-Yang; Huynh, Thalia; Padilla, Tasha; Chen, Alice; Ng, Terry Fei Fan; Marine, Rachel L.; Castro, Christina J.; Nix, W. Allan; Wadford, Debra A. Fecha: 2019-10-31DOI: 10.1128/mra.01085-19Licencia: cc-byAbstract: En septiembre de 2017, reportamos la secuencia casi completa del genoma de un enterovirus humano, una cepa de ecovirus 30, obtenida de un ejemplar de líquido cefalorraquídeo de un paciente adolescente con meningitis aséptica. Texto: Los chovirus E son miembros de la especie enterovirus B del género enterovirus (EV) en la familia Picornaviridae de virus ARN no envueltos, de una sola cadena y de un sentido positivo. Los ecovirus fueron nombrados a partir del acrónimo de virus huérfano humano entérico citopático en el momento de su descubrimiento en la década de 1950, pero más tarde se encontraron asociados con enfermedades respiratorias, enfermedad de pies y bocas, y meningitis aséptica, similar a otros enterovirus (1). De acuerdo con el Código de Reglamento de California, los casos de meningitis son reportables al Departamento de Salud Pública de California (CDPH) dentro de un día de identificación de la etiología (2). En el otoño de 2017, un grupo de casos de meningitis aséptica de una escuela secundaria del norte de California fueron reportados al CDPH. El Laboratorio de Enfermedad Viral y Rickettsial (VRDL) en el CDPH detectaron EV de 19 de 30 pacientes (63%) por transcripción inversa en tiempo real-PCR (RT-PCR), como se describió previamente (3). Generamos y analizamos secuencias de capsid parcial (proteína viral 1 [VP1]) utilizando métodos desarrollados por Minnaar et al. (4). Quince de 19 (79%) pacientes positivos para el EV tenían ecovirus 30 (E-30), utilizando muestras de líquido cefalorraquídeo (CSF). Este grupo de casos de meningitis E-30 es similar a los casos de meningitis aséptica E-30 previamente reportados (5, 6) en síntomas y epidemiología. Aquí, reportamos una secuencia casi completa del genoma de una de las muestras de LCR E-30 positivas. El LCR fue procesado por centrifugación, filtración de 0,45-m y tratamiento de nucleasa antes de la extracción utilizando el sistema NucliSENS easyMAG (bioMérieux, Durham, NC) (7). Los ácidos nucleicos extraídos fueron tratados con Dnasa para producir ARN, el cual fue sometido a transcripción inversa aleatoria y PCR (7). La biblioteca de secuenciación de próxima generación (NGS) fue preparada utilizando un kit de Nextera XT y secuenciado en una plataforma MiSeq de 300 ciclos en pares (Ilumina, San Diego, CA). Los datos del NGS fueron analizados utilizando una tubería interna de Centros para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC) que incluye la eliminación de secuencias de host usando bowtie2/2.3.3.1, eliminación de imprimación, baja calidad (por debajo de Q20) y longitud de lectura (50 nucleótidos) filtrando usando cutadapt 1.18, eliminación de duplicación de lectura utilizando un script Dedup.py, ensamblaje de novo utilizando parámetros predeterminados SPAdes 3.7 y búsqueda BLAST de los contigs resultantes (8). Hubo un total de 141.329 lecturas de FASTQ postprocesamiento. El genoma de consenso final fue inspeccionado y anotado usando Geneious v10.0.9 (9). El contig fue construido a partir de 15.712 lecturas, ensamblado a un genoma de referencia E-30 (número de adhesión del GenBank JX976773), y considerado El contenido total de GC es de 48,3% para 7.155 bases. La cobertura media de lectura fue de 260 veces para el genoma E-30. La secuencia del genoma fue designada E-30 USA/2017/CA-RGDS-1005. Su secuencia VP1 fue confirmada por el Laboratorio de Picornavirus CDC como casi idéntica a las de E-30 identificadas en un brote de meningitis aséptica que ocurrió en el otoño de 2017 en Nevada; también tiene mayor identidad nucleótida del 99% a las secuencias VP1 de cepas E-30 del sur de Estados Unidos identificadas por el CDC en mayo de 2017 (números de adhesión de GenBank MG584831 y MG584832), medidos utilizando la versión en línea de blastn (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). La secuencia del genoma de E-30 USA/2017/CA-RGDS-1005 comparte menos del 89% de identidad de nucleótidos (NI) y menos del 98% de identidad de aminoácidos (AI) con otras secuencias E-30 públicamente disponibles. La secuencia contiene la región completa de codificación de proteínas, sin secciones cortas en las regiones no traducidas (UTR) debido a la falta de cobertura de lectura (aproximadamente 182 y 90 nucleótidos de los 5= y 3= UTR, respectivamente). La poliproteína del enterovirus se puede dividir en una estructural (P1-capsid) y dos no estructurales (P2 y P3). Las regiones de poliproteínas del genoma E-30 reportadas aquí comparten 96%, 88% y 84% NI (P1, P2 y P3, respectivamente) con otras secuencias E-30 en GenBank. Disponibilidad de datos. La secuencia E-30 de USA/2017/CA-RGDS-1005 ha sido depositada en GenBank bajo el número de adhesión MK238483. Las lecturas FASTQ filtradas de calidad han sido depositadas en el archivo de la secuencia con el número de adhesión SRR10082176. Las contribuciones del Departamento de Salud Pública de California Viral y Rickettsial Disease Laboratory fueron apoyadas en parte por el Acuerdo Cooperativo de Epidemiología y Capacidad de Laboratorio para Enfermedades Infecciosas número 6 NU50CK000410 de los EE.UU. Centros para el Control y Prevención de Enfermedades. Este trabajo fue financiado en parte por asignaciones federales a los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades, a través de la línea de la Iniciativa de Detección Molecular Avanzada. Los hallazgos y conclusiones en este informe son los de los autores y no representan necesariamente la posición oficial de los Centros para el Control y

¿Qué tipo de genoma de referencia se utilizó en el estudio?

Secuencia casi completa del genoma de un ecovirus 30 cepas de un grupo de casos de meningitis aséptica en California, septiembre de 2017https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6953510/SHA: f0c4d40e1879dd1a049298f151940ac168b5f5a7Autores: Pan, Chao-Yang; Huynh, Thalia; Padilla, Tasha; Chen, Alice; Ng, Terry Fei Fan; Marine, Rachel L.; Castro, Christina J.; Nix, W. Allan; Wadford, Debra A. Fecha: 2019-10-31DOI: 10.1128/mra.01085-19Licencia: cc-byAbstract: En septiembre de 2017, reportamos la secuencia casi completa del genoma de un enterovirus humano, una cepa de ecovirus 30, obtenida de un ejemplar de líquido cefalorraquídeo de un paciente adolescente con meningitis aséptica. Texto: Los chovirus E son miembros de la especie enterovirus B del género enterovirus (EV) en la familia Picornaviridae de virus ARN no envueltos, de una sola cadena y de un sentido positivo. Los ecovirus fueron nombrados a partir del acrónimo de virus huérfano humano entérico citopático en el momento de su descubrimiento en la década de 1950, pero más tarde se encontraron asociados con enfermedades respiratorias, enfermedad de pies y bocas, y meningitis aséptica, similar a otros enterovirus (1). De acuerdo con el Código de Reglamento de California, los casos de meningitis son reportables al Departamento de Salud Pública de California (CDPH) dentro de un día de identificación de la etiología (2). En el otoño de 2017, un grupo de casos de meningitis aséptica de una escuela secundaria del norte de California fueron reportados al CDPH. El Laboratorio de Enfermedad Viral y Rickettsial (VRDL) en el CDPH detectaron EV de 19 de 30 pacientes (63%) por transcripción inversa en tiempo real-PCR (RT-PCR), como se describió previamente (3). Generamos y analizamos secuencias de capsid parcial (proteína viral 1 [VP1]) utilizando métodos desarrollados por Minnaar et al. (4). Quince de 19 (79%) pacientes positivos para el EV tenían ecovirus 30 (E-30), utilizando muestras de líquido cefalorraquídeo (CSF). Este grupo de casos de meningitis E-30 es similar a los casos de meningitis aséptica E-30 previamente reportados (5, 6) en síntomas y epidemiología. Aquí, reportamos una secuencia casi completa del genoma de una de las muestras de LCR E-30 positivas. El LCR fue procesado por centrifugación, filtración de 0,45-m y tratamiento de nucleasa antes de la extracción utilizando el sistema NucliSENS easyMAG (bioMérieux, Durham, NC) (7). Los ácidos nucleicos extraídos fueron tratados con Dnasa para producir ARN, el cual fue sometido a transcripción inversa aleatoria y PCR (7). La biblioteca de secuenciación de próxima generación (NGS) fue preparada utilizando un kit de Nextera XT y secuenciado en una plataforma MiSeq de 300 ciclos en pares (Ilumina, San Diego, CA). Los datos del NGS fueron analizados utilizando una tubería interna de Centros para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC) que incluye la eliminación de secuencias de host usando bowtie2/2.3.3.1, eliminación de imprimación, baja calidad (por debajo de Q20) y longitud de lectura (50 nucleótidos) filtrando usando cutadapt 1.18, eliminación de duplicación de lectura utilizando un script Dedup.py, ensamblaje de novo utilizando parámetros predeterminados SPAdes 3.7 y búsqueda BLAST de los contigs resultantes (8). Hubo un total de 141.329 lecturas de FASTQ postprocesamiento. El genoma de consenso final fue inspeccionado y anotado usando Geneious v10.0.9 (9). El contig fue construido a partir de 15.712 lecturas, ensamblado a un genoma de referencia E-30 (número de adhesión del GenBank JX976773), y considerado El contenido total de GC es de 48,3% para 7.155 bases. La cobertura media de lectura fue de 260 veces para el genoma E-30. La secuencia del genoma fue designada E-30 USA/2017/CA-RGDS-1005. Su secuencia VP1 fue confirmada por el Laboratorio de Picornavirus CDC como casi idéntica a las de E-30 identificadas en un brote de meningitis aséptica que ocurrió en el otoño de 2017 en Nevada; también tiene mayor identidad nucleótida del 99% a las secuencias VP1 de cepas E-30 del sur de Estados Unidos identificadas por el CDC en mayo de 2017 (números de adhesión de GenBank MG584831 y MG584832), medidos utilizando la versión en línea de blastn (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). La secuencia del genoma de E-30 USA/2017/CA-RGDS-1005 comparte menos del 89% de identidad de nucleótidos (NI) y menos del 98% de identidad de aminoácidos (AI) con otras secuencias E-30 públicamente disponibles. La secuencia contiene la región completa de codificación de proteínas, sin secciones cortas en las regiones no traducidas (UTR) debido a la falta de cobertura de lectura (aproximadamente 182 y 90 nucleótidos de los 5= y 3= UTR, respectivamente). La poliproteína del enterovirus se puede dividir en una estructural (P1-capsid) y dos no estructurales (P2 y P3). Las regiones de poliproteínas del genoma E-30 reportadas aquí comparten 96%, 88% y 84% NI (P1, P2 y P3, respectivamente) con otras secuencias E-30 en GenBank. Disponibilidad de datos. La secuencia E-30 de USA/2017/CA-RGDS-1005 ha sido depositada en GenBank bajo el número de adhesión MK238483. Las lecturas FASTQ filtradas de calidad han sido depositadas en el archivo de la secuencia con el número de adhesión SRR10082176. Las contribuciones del Departamento de Salud Pública de California Viral y Rickettsial Disease Laboratory fueron apoyadas en parte por el Acuerdo Cooperativo de Epidemiología y Capacidad de Laboratorio para Enfermedades Infecciosas número 6 NU50CK000410 de los EE.UU. Centros para el Control y Prevención de Enfermedades. Este trabajo fue financiado en parte por asignaciones federales a los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades, a través de la línea de la Iniciativa de Detección Molecular Avanzada. Los hallazgos y conclusiones en este informe son los de los autores y no representan necesariamente la posición oficial de los Centros para el Control y

¿Cuál fue la cobertura leída del genoma E-30 en este estudio?

iNR-Drug: Predicting the Interaction of Drugs with Nuclear Receptors in Celular Networkinghttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3975431/SHA: ee55aea26f816403476a7cb7118b8ecb1110329Autores: Fan, Yue-Nong; Xiao, Xuan; Min, Jian-Liang; Chou, Kuo-ChenFecha: 2014-03-19DOI: 10.3390/ijms15034915Licencia: cc-byAbstract: Los receptores nucleares (NRs) están estrechamente asociados con diversas enfermedades importantes como el cáncer, la diabetes, las enfermedades inflamatorias y la osteoporosis. Durante el proceso de desarrollo de fármacos contra estas enfermedades, apuntando a los NRs, a menudo nos enfrentamos a un problema: Dado un NR y un compuesto químico, ¿podemos identificar si realmente están en interacción entre sí en una célula? Para abordar este problema, se desarrolló un predictor llamado “iNR-Drug”. En el predictor, el compuesto fármaco en cuestión fue formulado por un vector 256-D (dimensional) derivado de su huella molecular, y el NR por un vector 500-D formado por la incorporación de su información de evolución secuencial y características fisicoquímicas en la forma general de composición de pseudo aminoácidos, y el motor de predicción fue operado por el algoritmo SVM (máquina vector de soporte). En comparación con los métodos de predicción existentes en esta área, iNR-Drug no sólo puede producir una mayor tasa de éxito, sino que también es presentado por un servidor web fácil de usar establecido en http://www.jci-bioinfo.cn/iNR-Drug/, que es particularmente útil para la mayoría de los científicos experimentales para obtener sus datos deseados de manera oportuna. Se prevé que el servidor iNR-Drug puede convertirse en una herramienta útil de alto rendimiento tanto para la investigación básica como para el desarrollo de fármacos, y que el enfoque actual puede ampliarse fácilmente para estudiar las interacciones de los medicamentos con otros objetivos también. Texto: Con la capacidad de unirse directamente al ADN (Figura 1 ) y regular la expresión de genes adyacentes, los receptores nucleares (NR) son una clase de factores de transcripción ligando-inducibles. Regulan varios procesos biológicos, como la homeostasis, la diferenciación, el desarrollo embrio La superfamilia NR se ha clasificado en siete familias: NR0 (knirps o DAX like) [4, 5] ; NR1 (como la hormona tiroidea), NR2 (como el HNF4-like), NR3 (como el estrógeno), NR4 (como el factor de crecimiento nervioso IB), NR5 (como el fushi Tarazu-F1) y NR6 (como el factor nuclear de células germinales). Dado que están implicados en casi todos los aspectos de la fisiología humana y están implicados en muchas enfermedades importantes como el cáncer, la diabetes y la osteoporosis, los receptores nucleares se han convertido en objetivos principales de los fármacos [6, 7], junto con los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17], los canales de iones [18] [19] [20] y las proteínas cinasas [21] [22] [23] [24]. La identificación de las interacciones diana-fármacos es uno de los pasos más importantes para el nuevo desarrollo de la medicina [25, 26]. El método generalmente adoptado en este paso es la simulación del acoplamiento molecular [27] [28] [30] [31] [32] [34] [36] [37] [38] [39] [40] [42] [43] [43] Sin embargo, para que el estudio de acoplamiento molecular sea factible, una estructura 3D confiable (tres dimensiones) de la proteína diana es la condición previa. Aunque la cristalografía de rayos X es una herramienta poderosa para determinar las estructuras 3D de la proteína, es costosa y lleva mucho tiempo. En particular, no todas las proteínas se pueden cristalizar con éxito. Por ejemplo, las proteínas de membrana son muy difíciles de cristalizar y la mayoría de ellas no se disolverán en disolventes normales. Por lo tanto, hasta ahora se han determinado muy pocas estructuras 3D de la proteína de membrana. Aunque la NMR (Resonancia Magnética Nuclear) es efectivamente una herramienta muy poderosa para determinar las estructuras 3D de las proteínas de membrana, como lo indica una serie de publicaciones recientes (véase, por ejemplo, [44] [46] [47] [48] [49] [49] [50] [51] y un artículo de revisión [20] ), también consume mucho Para adquirir oportunamente la información estructural en 3D, es necesario recurrir a diversas herramientas bioinformáticas estructurales (véase, por ejemplo, [37] ), en particular el enfoque de modelado homólogo utilizado para una serie de receptores de proteínas que se necesitan con urgencia durante el proceso de desarrollo de fármacos [19, [52] [53] [55] [56] [57]. Lamentablemente, el número de plantillas fiables para desarrollar estructuras 3D de alta calidad mediante el modelado de la homología es muy limitado [37]. Para superar los problemas mencionados, sería útil desarrollar un método computacional para predecir las interacciones de los fármacos con los receptores nucleares en las redes celulares sobre la base de la información de secuencias de estos últimos. Los resultados así obtenidos pueden utilizarse para preexcluir los compuestos identificados que no están en interacción con los receptores nucleares, a fin de dejar oportunamente de desperdiciar tiempo y dinero en esos compuestos no prometedores [58] En realidad, sobre la base de los grupos funcionales y las características biológicas, se ha desarrollado recientemente un poderoso método [59] para este fin; sin embargo, se necesita un mayor desarrollo a este respecto debido a las siguientes razones. a) He et al. [59] no proporcionaron un servidor web de acceso público para su método, y por lo tanto su valor práctico de aplicación es bastante limitado, especialmente para los científicos experimentales de amplio alcance; b) la calidad de la predicción puede mejorarse aún más incorporando algunas características clave en la formulación de muestras de NR-fármacos (receptores nucleares y drogas) mediante la forma general de composición de pseudo aminoácidos [60]. El presente estudio se inició con un intento de desarrollar un nuevo método para predecir la interacción de fármacos con receptores nucleares abordando los dos puntos. Como lo demuestra una serie de publicaciones recientes [10, 18, [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67] [68] [69] [70] y resumido en una revisión exhaustiva [60], para establecer un predictor estadístico realmente eficaz para un sistema biomédico, necesitamos considerar los siguientes pasos: a) seleccionar o construir un conjunto de datos de referencia válido para entrenar y probar el predictor; b) representar las muestras estadísticas con una formulación eficaz que pueda reflejar verdaderamente su correlación intrínseca con el objeto que se va a predecir; c) introducir o desarrollar un potente algoritmo o motor para operar la predicción; d) realizar adecuadamente pruebas de validación cruzada para evaluar objetivamente la exactitud prevista del predictor; e) establecer un servidor web fácil de usar para el predictor que sea accesible al público. Los datos utilizados en el estudio actual fueron recolectados de KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomas) [71] en http://www.kegg.jp/kegg/. KEGG es un recurso de base de datos para comprender las funciones de alto nivel y las utilidades del sistema biológico, como la célula, el organismo y el ecosistema, a partir de información a nivel molecular, especialmente conjuntos de datos moleculares a gran escala generados por la secuenciación del genoma y otras tecnologías experimentales de alto rendimiento.Aquí, el conjunto de datos de referencia puede formularse como el subconjunto positivo que consiste en los pares interactivos fármaco-NR solamente, mientras que el subconjunto negativo que contiene los pares farmaco-NR no interactivos solamente, y el símbolo representa la unión en la teoría de conjuntos. El denominado par "interactivo" aquí significa el par cuyas dos contrapartes están interactuando entre sí en las redes de destino de la droga, tal como se define en la base de datos KEGG [71] ; mientras que el par "no interactivo" significa que sus dos contrapartes no están interactuando entre sí en las redes de destino de la droga. El conjunto de datos positivos contiene 86 pares fármaco-NR, que fueron tomados de He et al. [59]. El conjunto de datos negativos contiene 172 pares fármaco-NR no interactivos, que se derivaron de acuerdo con los siguientes procedimientos: (a) separando cada uno de los pares en un solo fármaco y NR; (b) reagrupando cada uno de los fármacos individuales con cada uno de los NR en pares de una manera que ninguno de ellos ocurrió en ; (c) recogiendo aleatoriamente los pares así formados hasta alcanzar el número dos veces más Los 86 pares farmaco-NR interactivos y 172 pares farmaco-NR no interactivos se dan en Información Suplementaria S1, de los cuales podemos ver que los 86 + 172 = 258 pares en el conjunto de datos de referencia actual están realmente formados por 25 NR diferentes y 53 compuestos diferentes. Ya que cada una de las muestras en el sistema de red actual contiene un fármaco (compuesto) y un NR (proteína), se tomaron los siguientes procedimientos para representar la muestra de par fármaco-NR. Primero, para la parte farmacológica en el conjunto de datos de referencia actual, podemos utilizar un vector 256-D para formularlo como dado por donde D representa el vector para un compuesto farmaco, y d i-th (i = 1,2,, 256) componente que puede derivarse siguiendo el "procedimiento de huella digital molecular 2D" como se ha elaborado en [10]. Las secuencias proteicas de los 25 diferentes NR en se enumeran en Información Suplementaria S3. Supongamos que la secuencia de una proteína del receptor nuclear P con residuos L se expresa generalmente por donde 1 R representa el 1er residuo de la secuencia proteica P, 2 R el 2do residuo, y así sucesivamente. Ahora el problema es cómo representar efectivamente la secuencia de la Ecuación (3) con un modelo no secuencial o discreto [72]. Esto se debe a que todos los motores de operación existentes, como el discriminante de covarianza (CD) [17, 65, [73] [74] [75] [76] [77] [78] [79], red neuronal [80] [81] [82], máquina vectorial de soporte (SVM) [62] [63] [64] 83], bosque aleatorio [84, 85], campo aleatorio condicional [66], vecino más cercano (NN) [86, 87] ; vecino K-nearest (KNN) [88] [89] [90], OET-KNN [91] [92] [93], y vecino Fuzzy K-nearest [10, 12, 18, 69, 95], solo pueden manejar muestras vectoriales pero no secuenciales. Sin embargo, un vector definido en un modelo discreto puede perder completamente toda la información de orden secuencial y, por lo tanto, limitar la calidad de la predicción. Ante tal dilema, ¿podemos encontrar un enfoque para incorporar parcialmente los efectos de orden secuencial? En realidad, uno de los problemas más difíciles en la biología computacional es cómo formular una secuencia biológica con un modelo discreto o un vector, sin embargo, mantener considerable información de orden secuencial. Para evitar perder completamente la información de orden secuencial para proteínas, se propuso la composición de pseudo aminoácidos [96, 97] o PseAAC de Chou [98]. Desde que se propuso el concepto de PseAAC en 2001 [96], ha penetrado en casi todas las áreas de la proteómica computacional, tales como la predicción de los péptidos anticancerosos [99], la predicción de la ubicación de las proteínas subcelulares [100] [101] [102] [103] [104] [105], la predicción de los tipos de proteína de membrana [107, 108], la predicción de la ubicación de las proteínas subendondrias [109] [109] [119], la predicción de las proteínas receptoras GABA(A] [113], la predicción de las clases de subfamilias enzimáticas [114], la predicción de los péptidos antibacterianos [115], la predicción de la estructura supersecundaria [116] [116], la predicción de las proteínas virulentas bacterianas [117], la predicción de Además, el concepto de PseAAC se amplió para representar los vectores característicos de los nucleótidos [65], así como otras muestras biológicas (véase, por ejemplo, [130] [131] [132] ). Debido a que se ha utilizado ampliamente y cada vez más, recientemente se han creado dos potentes softwares, llamados "PseAAC-Builder" [133] y "propio" [134], para generar varias composiciones especiales de pseudoaminoácidos de Chou, además del servidor web "PseAAC" [135] construido en 2008. De acuerdo con una revisión exhaustiva [60], la forma general de PseAAC para una secuencia proteica P se formula por medio de donde el subíndice es un entero, y su valor así como los componentes ( 1, 2,, ) u u dependerán de cómo extraer la información deseada de la secuencia de aminoácidos de P (cf. Ecuación (3)). A continuación, vamos a describir cómo extraer información útil para definir los componentes de PseAAC para las muestras NR en cuestión. Primero, muchos estudios anteriores (véase, por ejemplo, [136] [137] [138] [139] [140] [141] ) han indicado que la composición de aminoácidos (AAC) de una proteína juega un papel importante en la determinación de sus atributos. Así, estos 20 componentes del AAC fueron utilizados aquí para definir los primeros 20 elementos en la Ecuación (4); es decir, (1) ( 1, 2,, 20) ii fi (5) donde f i (1) es la frecuencia de ocurrencia normalizada del aminoácido nativo del tipo i-th en el receptor nuclear en cuestión. Puesto que el AAC no contenía ninguna información de orden secuencial, se tomaron las siguientes medidas para compensar esta deficiencia. Para evitar la pérdida completa de la información de orden secuencial local o de corto alcance, consideramos el acercamiento de la composición de dipéptidos. Contenía 20 × 20 = 400 componentes [142]. Estos 400 componentes se utilizaron para definir los siguientes 400 elementos en la Ecuación (4); es decir, (2) 20 ( 1, 2,, 400) jj fjwhere (2) j f es la frecuencia de ocurrencia normalizada de los dipéptidos j-th en el receptor nuclear en cuestión Para incorporar la información de orden de secuencia global o de largo alcance, consideremos el siguiente enfoque: según la evolución molecular, todas las secuencias biológicas se han desarrollado a partir de un número muy limitado de muestras ancestrales. Impulsadas por diversas fuerzas evolutivas tales como mutación, recombinación, conversión génica, deriva genética y selección, han sufrido muchos cambios, incluyendo cambios de residuos únicos, inserciones y deleciones de varios residuos [143], duplicación génica y fusión génica. Con la acumulación de estos cambios durante un largo período de tiempo, muchas similitudes originales entre las secuencias de aminoácidos iniciales y resultantes se desvanecen gradualmente, pero las proteínas correspondientes todavía pueden compartir muchos atributos comunes [37], tales como tener básicamente la misma función biológica y residir en una misma ubicación subcelular [144, 145]. Para extraer la información de evolución secuencial y utilizarla para definir los componentes de la Ecuación (4), Según Schaffer [146], la información sobre la evolución de la secuencia de una proteína del receptor nuclear P con residuos de aminoácidos L puede ser expresada por una matriz de 20 L­, tal como se indica en el punto 7) mediante el uso de PSI-BLAST [147] para buscar en la base de datos UniProtKB/Swiss-Prot (The Universal Protein Resource (UniProt); http://www.uniprot.org/) a través de tres iteraciones con 0,001 como límite de valor E para la alineación de secuencias múltiples contra la secuencia del receptor nuclear de que se trate. Con el fin de hacer que cada elemento de la Ecuación (7) sea escalado de sus rangos de puntuación originales en la región de [0, 1], realizamos una conversión a través de la función sigmoide estándar para que se convierta.Ahora extraemos la información útil de la Ecuación (8) Además, utilizamos el enfoque del modelo de sistema gris tal como se elaboró en [68] para definir más a fondo los siguientes 60 componentes de la Ecuación (4) (1, 2,, 20)En la ecuación anterior, w 1, w 2, y w 3 son factores de peso, que se fijaron en 1 en el estudio actual; f j (1) tiene el mismo significado que en la Ecuación (5), en la que se definen bien los elementos de las Ecuaciones (5), (6), (10) y (12), descubrimos que el número total de componentes obtenidos mediante el enfoque actual para el PseAAC de la Ecuación (4) En aras de la comodidad, utilicemos x i (i = 1, 2,, 756) para representar los 756 componentes de la Ecuación (19); es decir, (20) Para optimizar la calidad de la predicción con un enfoque de ahorro de tiempo, similar al tratamiento [148] [149] [150], convirtamos la Ecuación (20) adonde el símbolo significa tomar el promedio de la cantidad en ella, y SD significa la derivación estándar correspondiente. En este estudio, la SVM (máquina vectora de soporte) se utilizó como motor de operación. SVM ha sido ampliamente utilizado en el ámbito de la bioinformática (véase, por ejemplo, [62] [63] [64] [152] [153] [154] ). La idea básica de SVM es transformar los datos en un espacio de características dimensionales altas, y luego determinar el hiperplano de separación óptima utilizando una función de núcleo Para una breve formulación de SVM y cómo funciona, ver los artículos [155, 156] ; para más detalles sobre SVM, ver una monografía [157]. En este estudio, el paquete LIBSVM [158] se utilizó como una implementación de SVM, que se puede descargar de http://www.csie.ntu.edu.tw/~cjlin/libsvm/, la función de base radial popular (RBF) se tomó como función del núcleo. Para el clasificador actual de SVM, había dos parámetros inciertos: el parámetro de penalización C y el parámetro del núcleo. El método de cómo determinar los dos parámetros se dará más adelante. El predictor obtenido a través del procedimiento mencionado se llama iNR-Drug, donde "i" significa identificar, y "NR-Drug" significa la interacción entre el receptor nuclear y el compuesto farmacológico. Para proporcionar una imagen global intuitiva, se proporciona un diagrama de flujo en la Figura 2 para mostrar el proceso de cómo funciona el predictor en la identificación de las interacciones entre los receptores nucleares y los compuestos farmacológicos. Para proporcionar un método más intuitivo y fácil de entender para medir la calidad de la predicción, se adoptó el siguiente conjunto de métricas basado en la formulación utilizada por Chou [159] [160] [161] para predecir los péptidos de señal. Según la formulación de Chou, la sensibilidad, la especificidad, la exactitud global y el coeficiente de correlación de Mateo se pueden expresar respectivamente como [62, [65] [66] [67] Sn 1donde N es el número total de los pares interactivos de NR-fármacos investigados, mientras que N • • el número de los pares interactivos de NR-fármacos incorrectamente predichos como los pares no interactivos de NR-fármacos; N • el número total de pares no interactivos de NR-fármacos investigados, mientras que N • • el número de pares no interactivos de NR-fármacos incorrectamente predichos como los pares interactivos de NR-fármacos. De acuerdo con la ecuación (23) podemos ver fácilmente lo siguiente. Cuando 0 N â € ¬ significa que ninguno de los pares interactivos de NR-fármacos fue mal predicho para ser un par no-interactivo de NR-fármacos, tenemos la sensibilidad Sn = 1; mientras que NN â € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € Es instructivo señalar que las métricas tal como se definen en la Ecuación (23) son válidas para sistemas de etiquetas únicas; para los sistemas de etiquetas múltiples, se debe utilizar un conjunto de métricas más complicadas como se indica en [162]. La forma adecuada de probar un predictor para sus tasas de éxito previstas es muy importante para su desarrollo, así como su valor potencial de aplicación. En términos generales, los tres métodos de validación cruzada siguientes a menudo se utilizan para examinar la calidad de un predictor y su eficacia en la aplicación práctica: prueba independiente de conjunto de datos, submuestreo o K-fold (como cinco veces, siete veces o 10 veces) prueba de cruce y prueba de navaja [163]. Sin embargo, tal como se describe en un análisis penetrante en [164], existe una considerable arbitrariedad en el conjunto de datos independiente. Además, como se ha demostrado en [165], la prueba de submuestreo (o validación del cruce K-fold) tampoco puede evitar la arbitrariedad. Sólo la prueba de jackknife es la menos arbitraria que siempre puede dar un resultado único para un conjunto de datos de referencia dado [73, 74, 156, [166] [167] [168]. Por lo tanto, la prueba de jackknife ha sido ampliamente reconocida y cada vez más utilizada por los investigadores para examinar la calidad de diversos predictores (véase, por ejemplo, [14, 15, 68, 99, 106, 107, 124, 169, 170] ). Por consiguiente, en este estudio también se adoptó la prueba de jackknife para evaluar la exactitud del predictor actual. Como se ha mencionado anteriormente, el motor de operación SVM contiene dos parámetros inciertos C y C. Para encontrar sus valores óptimos, se realizó Los resultados así obtenidos se muestran en la Figura 3, de la cual se puede observar que el predictor iNR-Drug alcanza su estado óptimo cuando C = 2 3 y 9 2 â € €. Las tasas correspondientes para las cuatro métricas (cf. Ecuación (23)) se dan en la Tabla 1, donde para facilitar la comparación, la precisión global Acc reportada por He et al. [59] en el mismo conjunto de datos de referencia también se da, aunque no fueron reportados resultados por ellos para Sn, Sp y MCC. Se puede observar de la tabla que la exactitud global obtenida por iNR-Drug es notablemente mayor que la de He et al. [59], y que las tasas alcanzadas por iNR-Drug para las otras tres métricas también son bastante mayores. Estos hechos indican que el predictor actual no sólo puede producir mayor precisión global de Como se mencionó anteriormente (Sección 3.2), la prueba jackknife es el método más objetivo para examinar la calidad de un predictor. Sin embargo, como demostración para mostrar cómo utilizar prácticamente el predictor actual, tomamos 41 pares de fármacos NR del estudio de Yamanisi y otros [171] que habían sido confirmados por experimentos como pares interactivos. Para este conjunto de datos independiente, 34 fueron correctamente identificados por iNR-Drug como pares interactivos, es decir, Sn = 34 / 41 = 82,92%, lo que es bastante consistente con la tasa de 79,07% alcanzada por el predictor en el conjunto de datos de referencia a través de la prueba jackknife como se indica en la Tabla 1. Se prevé que el predictor iNR-Drugor desarrollado en este artículo puede convertirse en una herramienta útil de alto rendimiento tanto para la investigación básica como para el desarrollo de fármacos, y que Dado que los servidores web de fácil acceso al usuario y al público representan la dirección futura para el desarrollo de predictores prácticamente más útiles [98, 172], se estableció un servidor web de acceso público para iNR-Drug. Para la comodidad de la gran mayoría de biólogos y científicos farmacéuticos, aquí vamos a proporcionar una guía paso a paso para mostrar cómo los usuarios pueden obtener fácilmente el resultado deseado utilizando el servidor web de iNR-Drug sin la necesidad de seguir las complicadas ecuaciones matemáticas presentadas en este artículo para el proceso de desarrollo del predictor y su integridad. Paso 1. Abra el servidor web en el sitio http://www.jci-bioinfo.cn/iNR-Drug/ y verá la página superior del predictor en la pantalla de su ordenador, como se muestra en la Figura 4. Haga clic en el botón Leer Me para ver una breve introducción sobre el predictor de iNR-Drug y la gevat cuando Cada par de consulta consta de dos partes: una es para la secuencia del receptor nuclear, y la otra para el medicamento. La secuencia NR debe estar en formato FASTA, mientras que la droga en el código KEGG comienza con el símbolo #. Ejemplos de la entrada de pares de consulta y la salida correspondiente se pueden ver haciendo clic en el botón Ejemplo justo encima de la caja de entrada. Paso 3. Haga clic en el botón Enviar para ver el resultado predicho. Por ejemplo, si usa los tres pares de consultas en la ventana Ejemplo como entrada, después de hacer clic en el botón Enviar, verá en su pantalla que el medicamento "hsa:2099" NR y el medicamento "D00066" son un par interactivo, y que el medicamento "hsa:2908" NR y el medicamento "D00088" son también un par interactivo, pero que el medicamento "hsa:5468" NR y el medicamento "D00279" no son un par interactivo. Todos estos resultados son totalmente consistentes con las observaciones experimentales. Se tarda unos 3 minutos antes de que cada uno de estos resultados se muestre en la pantalla; por supuesto, los pares de consultas más que hay, el tiempo que se necesita generalmente. Paso 4. Haga clic en el botón Citation para encontrar el papel relevante que documenta el desarrollo detallado y algoritmo de iNR-Durg. Paso 5. Haga clic en el botón Datos para descargar el conjunto de datos de referencia utilizado para entrenar y probar el predictor iNR-Durg. Paso 6. El código del programa también está disponible haciendo clic en el botón descargar en el panel inferior de la Figura 4.

¿Cuántas familias hay en la superfamilia NR?

iNR-Drug: Predicting the Interaction of Drugs with Nuclear Receptors in Celular Networkinghttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3975431/SHA: ee55aea26f816403476a7cb7118b8ecb1110329Autores: Fan, Yue-Nong; Xiao, Xuan; Min, Jian-Liang; Chou, Kuo-ChenFecha: 2014-03-19DOI: 10.3390/ijms15034915Licencia: cc-byAbstract: Los receptores nucleares (NRs) están estrechamente asociados con diversas enfermedades importantes como el cáncer, la diabetes, las enfermedades inflamatorias y la osteoporosis. Durante el proceso de desarrollo de fármacos contra estas enfermedades, apuntando a los NRs, a menudo nos enfrentamos a un problema: Dado un NR y un compuesto químico, ¿podemos identificar si realmente están en interacción entre sí en una célula? Para abordar este problema, se desarrolló un predictor llamado “iNR-Drug”. En el predictor, el compuesto fármaco en cuestión fue formulado por un vector 256-D (dimensional) derivado de su huella molecular, y el NR por un vector 500-D formado por la incorporación de su información de evolución secuencial y características fisicoquímicas en la forma general de composición de pseudo aminoácidos, y el motor de predicción fue operado por el algoritmo SVM (máquina vector de soporte). En comparación con los métodos de predicción existentes en esta área, iNR-Drug no sólo puede producir una mayor tasa de éxito, sino que también es presentado por un servidor web fácil de usar establecido en http://www.jci-bioinfo.cn/iNR-Drug/, que es particularmente útil para la mayoría de los científicos experimentales para obtener sus datos deseados de manera oportuna. Se prevé que el servidor iNR-Drug puede convertirse en una herramienta útil de alto rendimiento tanto para la investigación básica como para el desarrollo de fármacos, y que el enfoque actual puede ampliarse fácilmente para estudiar las interacciones de los medicamentos con otros objetivos también. Texto: Con la capacidad de unirse directamente al ADN (Figura 1 ) y regular la expresión de genes adyacentes, los receptores nucleares (NR) son una clase de factores de transcripción ligando-inducibles. Regulan varios procesos biológicos, como la homeostasis, la diferenciación, el desarrollo embrio La superfamilia NR se ha clasificado en siete familias: NR0 (knirps o DAX like) [4, 5] ; NR1 (como la hormona tiroidea), NR2 (como el HNF4-like), NR3 (como el estrógeno), NR4 (como el factor de crecimiento nervioso IB), NR5 (como el fushi Tarazu-F1) y NR6 (como el factor nuclear de células germinales). Dado que están implicados en casi todos los aspectos de la fisiología humana y están implicados en muchas enfermedades importantes como el cáncer, la diabetes y la osteoporosis, los receptores nucleares se han convertido en objetivos principales de los fármacos [6, 7], junto con los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17], los canales de iones [18] [19] [20] y las proteínas cinasas [21] [22] [23] [24]. La identificación de las interacciones diana-fármacos es uno de los pasos más importantes para el nuevo desarrollo de la medicina [25, 26]. El método generalmente adoptado en este paso es la simulación del acoplamiento molecular [27] [28] [30] [31] [32] [34] [36] [37] [38] [39] [40] [42] [43] [43] Sin embargo, para que el estudio de acoplamiento molecular sea factible, una estructura 3D confiable (tres dimensiones) de la proteína diana es la condición previa. Aunque la cristalografía de rayos X es una herramienta poderosa para determinar las estructuras 3D de la proteína, es costosa y lleva mucho tiempo. En particular, no todas las proteínas se pueden cristalizar con éxito. Por ejemplo, las proteínas de membrana son muy difíciles de cristalizar y la mayoría de ellas no se disolverán en disolventes normales. Por lo tanto, hasta ahora se han determinado muy pocas estructuras 3D de la proteína de membrana. Aunque la NMR (Resonancia Magnética Nuclear) es efectivamente una herramienta muy poderosa para determinar las estructuras 3D de las proteínas de membrana, como lo indica una serie de publicaciones recientes (véase, por ejemplo, [44] [46] [47] [48] [49] [49] [50] [51] y un artículo de revisión [20] ), también consume mucho Para adquirir oportunamente la información estructural en 3D, es necesario recurrir a diversas herramientas bioinformáticas estructurales (véase, por ejemplo, [37] ), en particular el enfoque de modelado homólogo utilizado para una serie de receptores de proteínas que se necesitan con urgencia durante el proceso de desarrollo de fármacos [19, [52] [53] [55] [56] [57]. Lamentablemente, el número de plantillas fiables para desarrollar estructuras 3D de alta calidad mediante el modelado de la homología es muy limitado [37]. Para superar los problemas mencionados, sería útil desarrollar un método computacional para predecir las interacciones de los fármacos con los receptores nucleares en las redes celulares sobre la base de la información de secuencias de estos últimos. Los resultados así obtenidos pueden utilizarse para preexcluir los compuestos identificados que no están en interacción con los receptores nucleares, a fin de dejar oportunamente de desperdiciar tiempo y dinero en esos compuestos no prometedores [58] En realidad, sobre la base de los grupos funcionales y las características biológicas, se ha desarrollado recientemente un poderoso método [59] para este fin; sin embargo, se necesita un mayor desarrollo a este respecto debido a las siguientes razones. a) He et al. [59] no proporcionaron un servidor web de acceso público para su método, y por lo tanto su valor práctico de aplicación es bastante limitado, especialmente para los científicos experimentales de amplio alcance; b) la calidad de la predicción puede mejorarse aún más incorporando algunas características clave en la formulación de muestras de NR-fármacos (receptores nucleares y drogas) mediante la forma general de composición de pseudo aminoácidos [60]. El presente estudio se inició con un intento de desarrollar un nuevo método para predecir la interacción de fármacos con receptores nucleares abordando los dos puntos. Como lo demuestra una serie de publicaciones recientes [10, 18, [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67] [68] [69] [70] y resumido en una revisión exhaustiva [60], para establecer un predictor estadístico realmente eficaz para un sistema biomédico, necesitamos considerar los siguientes pasos: a) seleccionar o construir un conjunto de datos de referencia válido para entrenar y probar el predictor; b) representar las muestras estadísticas con una formulación eficaz que pueda reflejar verdaderamente su correlación intrínseca con el objeto que se va a predecir; c) introducir o desarrollar un potente algoritmo o motor para operar la predicción; d) realizar adecuadamente pruebas de validación cruzada para evaluar objetivamente la exactitud prevista del predictor; e) establecer un servidor web fácil de usar para el predictor que sea accesible al público. Los datos utilizados en el estudio actual fueron recolectados de KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomas) [71] en http://www.kegg.jp/kegg/. KEGG es un recurso de base de datos para comprender las funciones de alto nivel y las utilidades del sistema biológico, como la célula, el organismo y el ecosistema, a partir de información a nivel molecular, especialmente conjuntos de datos moleculares a gran escala generados por la secuenciación del genoma y otras tecnologías experimentales de alto rendimiento.Aquí, el conjunto de datos de referencia puede formularse como el subconjunto positivo que consiste en los pares interactivos fármaco-NR solamente, mientras que el subconjunto negativo que contiene los pares farmaco-NR no interactivos solamente, y el símbolo representa la unión en la teoría de conjuntos. El denominado par "interactivo" aquí significa el par cuyas dos contrapartes están interactuando entre sí en las redes de destino de la droga, tal como se define en la base de datos KEGG [71] ; mientras que el par "no interactivo" significa que sus dos contrapartes no están interactuando entre sí en las redes de destino de la droga. El conjunto de datos positivos contiene 86 pares fármaco-NR, que fueron tomados de He et al. [59]. El conjunto de datos negativos contiene 172 pares fármaco-NR no interactivos, que se derivaron de acuerdo con los siguientes procedimientos: (a) separando cada uno de los pares en un solo fármaco y NR; (b) reagrupando cada uno de los fármacos individuales con cada uno de los NR en pares de una manera que ninguno de ellos ocurrió en ; (c) recogiendo aleatoriamente los pares así formados hasta alcanzar el número dos veces más Los 86 pares farmaco-NR interactivos y 172 pares farmaco-NR no interactivos se dan en Información Suplementaria S1, de los cuales podemos ver que los 86 + 172 = 258 pares en el conjunto de datos de referencia actual están realmente formados por 25 NR diferentes y 53 compuestos diferentes. Ya que cada una de las muestras en el sistema de red actual contiene un fármaco (compuesto) y un NR (proteína), se tomaron los siguientes procedimientos para representar la muestra de par fármaco-NR. Primero, para la parte farmacológica en el conjunto de datos de referencia actual, podemos utilizar un vector 256-D para formularlo como dado por donde D representa el vector para un compuesto farmaco, y d i-th (i = 1,2,, 256) componente que puede derivarse siguiendo el "procedimiento de huella digital molecular 2D" como se ha elaborado en [10]. Las secuencias proteicas de los 25 diferentes NR en se enumeran en Información Suplementaria S3. Supongamos que la secuencia de una proteína del receptor nuclear P con residuos L se expresa generalmente por donde 1 R representa el 1er residuo de la secuencia proteica P, 2 R el 2do residuo, y así sucesivamente. Ahora el problema es cómo representar efectivamente la secuencia de la Ecuación (3) con un modelo no secuencial o discreto [72]. Esto se debe a que todos los motores de operación existentes, como el discriminante de covarianza (CD) [17, 65, [73] [74] [75] [76] [77] [78] [79], red neuronal [80] [81] [82], máquina vectorial de soporte (SVM) [62] [63] [64] 83], bosque aleatorio [84, 85], campo aleatorio condicional [66], vecino más cercano (NN) [86, 87] ; vecino K-nearest (KNN) [88] [89] [90], OET-KNN [91] [92] [93], y vecino Fuzzy K-nearest [10, 12, 18, 69, 95], solo pueden manejar muestras vectoriales pero no secuenciales. Sin embargo, un vector definido en un modelo discreto puede perder completamente toda la información de orden secuencial y, por lo tanto, limitar la calidad de la predicción. Ante tal dilema, ¿podemos encontrar un enfoque para incorporar parcialmente los efectos de orden secuencial? En realidad, uno de los problemas más difíciles en la biología computacional es cómo formular una secuencia biológica con un modelo discreto o un vector, sin embargo, mantener considerable información de orden secuencial. Para evitar perder completamente la información de orden secuencial para proteínas, se propuso la composición de pseudo aminoácidos [96, 97] o PseAAC de Chou [98]. Desde que se propuso el concepto de PseAAC en 2001 [96], ha penetrado en casi todas las áreas de la proteómica computacional, tales como la predicción de los péptidos anticancerosos [99], la predicción de la ubicación de las proteínas subcelulares [100] [101] [102] [103] [104] [105], la predicción de los tipos de proteína de membrana [107, 108], la predicción de la ubicación de las proteínas subendondrias [109] [109] [119], la predicción de las proteínas receptoras GABA(A] [113], la predicción de las clases de subfamilias enzimáticas [114], la predicción de los péptidos antibacterianos [115], la predicción de la estructura supersecundaria [116] [116], la predicción de las proteínas virulentas bacterianas [117], la predicción de Además, el concepto de PseAAC se amplió para representar los vectores característicos de los nucleótidos [65], así como otras muestras biológicas (véase, por ejemplo, [130] [131] [132] ). Debido a que se ha utilizado ampliamente y cada vez más, recientemente se han creado dos potentes softwares, llamados "PseAAC-Builder" [133] y "propio" [134], para generar varias composiciones especiales de pseudoaminoácidos de Chou, además del servidor web "PseAAC" [135] construido en 2008. De acuerdo con una revisión exhaustiva [60], la forma general de PseAAC para una secuencia proteica P se formula por medio de donde el subíndice es un entero, y su valor así como los componentes ( 1, 2,, ) u u dependerán de cómo extraer la información deseada de la secuencia de aminoácidos de P (cf. Ecuación (3)). A continuación, vamos a describir cómo extraer información útil para definir los componentes de PseAAC para las muestras NR en cuestión. Primero, muchos estudios anteriores (véase, por ejemplo, [136] [137] [138] [139] [140] [141] ) han indicado que la composición de aminoácidos (AAC) de una proteína juega un papel importante en la determinación de sus atributos. Así, estos 20 componentes del AAC fueron utilizados aquí para definir los primeros 20 elementos en la Ecuación (4); es decir, (1) ( 1, 2,, 20) ii fi (5) donde f i (1) es la frecuencia de ocurrencia normalizada del aminoácido nativo del tipo i-th en el receptor nuclear en cuestión. Puesto que el AAC no contenía ninguna información de orden secuencial, se tomaron las siguientes medidas para compensar esta deficiencia. Para evitar la pérdida completa de la información de orden secuencial local o de corto alcance, consideramos el acercamiento de la composición de dipéptidos. Contenía 20 × 20 = 400 componentes [142]. Estos 400 componentes se utilizaron para definir los siguientes 400 elementos en la Ecuación (4); es decir, (2) 20 ( 1, 2,, 400) jj fjwhere (2) j f es la frecuencia de ocurrencia normalizada de los dipéptidos j-th en el receptor nuclear en cuestión Para incorporar la información de orden de secuencia global o de largo alcance, consideremos el siguiente enfoque: según la evolución molecular, todas las secuencias biológicas se han desarrollado a partir de un número muy limitado de muestras ancestrales. Impulsadas por diversas fuerzas evolutivas tales como mutación, recombinación, conversión génica, deriva genética y selección, han sufrido muchos cambios, incluyendo cambios de residuos únicos, inserciones y deleciones de varios residuos [143], duplicación génica y fusión génica. Con la acumulación de estos cambios durante un largo período de tiempo, muchas similitudes originales entre las secuencias de aminoácidos iniciales y resultantes se desvanecen gradualmente, pero las proteínas correspondientes todavía pueden compartir muchos atributos comunes [37], tales como tener básicamente la misma función biológica y residir en una misma ubicación subcelular [144, 145]. Para extraer la información de evolución secuencial y utilizarla para definir los componentes de la Ecuación (4), Según Schaffer [146], la información sobre la evolución de la secuencia de una proteína del receptor nuclear P con residuos de aminoácidos L puede ser expresada por una matriz de 20 L­, tal como se indica en el punto 7) mediante el uso de PSI-BLAST [147] para buscar en la base de datos UniProtKB/Swiss-Prot (The Universal Protein Resource (UniProt); http://www.uniprot.org/) a través de tres iteraciones con 0,001 como límite de valor E para la alineación de secuencias múltiples contra la secuencia del receptor nuclear de que se trate. Con el fin de hacer que cada elemento de la Ecuación (7) sea escalado de sus rangos de puntuación originales en la región de [0, 1], realizamos una conversión a través de la función sigmoide estándar para que se convierta.Ahora extraemos la información útil de la Ecuación (8) Además, utilizamos el enfoque del modelo de sistema gris tal como se elaboró en [68] para definir más a fondo los siguientes 60 componentes de la Ecuación (4) (1, 2,, 20)En la ecuación anterior, w 1, w 2, y w 3 son factores de peso, que se fijaron en 1 en el estudio actual; f j (1) tiene el mismo significado que en la Ecuación (5), en la que se definen bien los elementos de las Ecuaciones (5), (6), (10) y (12), descubrimos que el número total de componentes obtenidos mediante el enfoque actual para el PseAAC de la Ecuación (4) En aras de la comodidad, utilicemos x i (i = 1, 2,, 756) para representar los 756 componentes de la Ecuación (19); es decir, (20) Para optimizar la calidad de la predicción con un enfoque de ahorro de tiempo, similar al tratamiento [148] [149] [150], convirtamos la Ecuación (20) adonde el símbolo significa tomar el promedio de la cantidad en ella, y SD significa la derivación estándar correspondiente. En este estudio, la SVM (máquina vectora de soporte) se utilizó como motor de operación. SVM ha sido ampliamente utilizado en el ámbito de la bioinformática (véase, por ejemplo, [62] [63] [64] [152] [153] [154] ). La idea básica de SVM es transformar los datos en un espacio de características dimensionales altas, y luego determinar el hiperplano de separación óptima utilizando una función de núcleo Para una breve formulación de SVM y cómo funciona, ver los artículos [155, 156] ; para más detalles sobre SVM, ver una monografía [157]. En este estudio, el paquete LIBSVM [158] se utilizó como una implementación de SVM, que se puede descargar de http://www.csie.ntu.edu.tw/~cjlin/libsvm/, la función de base radial popular (RBF) se tomó como función del núcleo. Para el clasificador actual de SVM, había dos parámetros inciertos: el parámetro de penalización C y el parámetro del núcleo. El método de cómo determinar los dos parámetros se dará más adelante. El predictor obtenido a través del procedimiento mencionado se llama iNR-Drug, donde "i" significa identificar, y "NR-Drug" significa la interacción entre el receptor nuclear y el compuesto farmacológico. Para proporcionar una imagen global intuitiva, se proporciona un diagrama de flujo en la Figura 2 para mostrar el proceso de cómo funciona el predictor en la identificación de las interacciones entre los receptores nucleares y los compuestos farmacológicos. Para proporcionar un método más intuitivo y fácil de entender para medir la calidad de la predicción, se adoptó el siguiente conjunto de métricas basado en la formulación utilizada por Chou [159] [160] [161] para predecir los péptidos de señal. Según la formulación de Chou, la sensibilidad, la especificidad, la exactitud global y el coeficiente de correlación de Mateo se pueden expresar respectivamente como [62, [65] [66] [67] Sn 1donde N es el número total de los pares interactivos de NR-fármacos investigados, mientras que N • • el número de los pares interactivos de NR-fármacos incorrectamente predichos como los pares no interactivos de NR-fármacos; N • el número total de pares no interactivos de NR-fármacos investigados, mientras que N • • el número de pares no interactivos de NR-fármacos incorrectamente predichos como los pares interactivos de NR-fármacos. De acuerdo con la ecuación (23) podemos ver fácilmente lo siguiente. Cuando 0 N â € ¬ significa que ninguno de los pares interactivos de NR-fármacos fue mal predicho para ser un par no-interactivo de NR-fármacos, tenemos la sensibilidad Sn = 1; mientras que NN â € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € € Es instructivo señalar que las métricas tal como se definen en la Ecuación (23) son válidas para sistemas de etiquetas únicas; para los sistemas de etiquetas múltiples, se debe utilizar un conjunto de métricas más complicadas como se indica en [162]. La forma adecuada de probar un predictor para sus tasas de éxito previstas es muy importante para su desarrollo, así como su valor potencial de aplicación. En términos generales, los tres métodos de validación cruzada siguientes a menudo se utilizan para examinar la calidad de un predictor y su eficacia en la aplicación práctica: prueba independiente de conjunto de datos, submuestreo o K-fold (como cinco veces, siete veces o 10 veces) prueba de cruce y prueba de navaja [163]. Sin embargo, tal como se describe en un análisis penetrante en [164], existe una considerable arbitrariedad en el conjunto de datos independiente. Además, como se ha demostrado en [165], la prueba de submuestreo (o validación del cruce K-fold) tampoco puede evitar la arbitrariedad. Sólo la prueba de jackknife es la menos arbitraria que siempre puede dar un resultado único para un conjunto de datos de referencia dado [73, 74, 156, [166] [167] [168]. Por lo tanto, la prueba de jackknife ha sido ampliamente reconocida y cada vez más utilizada por los investigadores para examinar la calidad de diversos predictores (véase, por ejemplo, [14, 15, 68, 99, 106, 107, 124, 169, 170] ). Por consiguiente, en este estudio también se adoptó la prueba de jackknife para evaluar la exactitud del predictor actual. Como se ha mencionado anteriormente, el motor de operación SVM contiene dos parámetros inciertos C y C. Para encontrar sus valores óptimos, se realizó Los resultados así obtenidos se muestran en la Figura 3, de la cual se puede observar que el predictor iNR-Drug alcanza su estado óptimo cuando C = 2 3 y 9 2 â € €. Las tasas correspondientes para las cuatro métricas (cf. Ecuación (23)) se dan en la Tabla 1, donde para facilitar la comparación, la precisión global Acc reportada por He et al. [59] en el mismo conjunto de datos de referencia también se da, aunque no fueron reportados resultados por ellos para Sn, Sp y MCC. Se puede observar de la tabla que la exactitud global obtenida por iNR-Drug es notablemente mayor que la de He et al. [59], y que las tasas alcanzadas por iNR-Drug para las otras tres métricas también son bastante mayores. Estos hechos indican que el predictor actual no sólo puede producir mayor precisión global de Como se mencionó anteriormente (Sección 3.2), la prueba jackknife es el método más objetivo para examinar la calidad de un predictor. Sin embargo, como demostración para mostrar cómo utilizar prácticamente el predictor actual, tomamos 41 pares de fármacos NR del estudio de Yamanisi y otros [171] que habían sido confirmados por experimentos como pares interactivos. Para este conjunto de datos independiente, 34 fueron correctamente identificados por iNR-Drug como pares interactivos, es decir, Sn = 34 / 41 = 82,92%, lo que es bastante consistente con la tasa de 79,07% alcanzada por el predictor en el conjunto de datos de referencia a través de la prueba jackknife como se indica en la Tabla 1. Se prevé que el predictor iNR-Drugor desarrollado en este artículo puede convertirse en una herramienta útil de alto rendimiento tanto para la investigación básica como para el desarrollo de fármacos, y que Dado que los servidores web de fácil acceso al usuario y al público representan la dirección futura para el desarrollo de predictores prácticamente más útiles [98, 172], se estableció un servidor web de acceso público para iNR-Drug. Para la comodidad de la gran mayoría de biólogos y científicos farmacéuticos, aquí vamos a proporcionar una guía paso a paso para mostrar cómo los usuarios pueden obtener fácilmente el resultado deseado utilizando el servidor web de iNR-Drug sin la necesidad de seguir las complicadas ecuaciones matemáticas presentadas en este artículo para el proceso de desarrollo del predictor y su integridad. Paso 1. Abra el servidor web en el sitio http://www.jci-bioinfo.cn/iNR-Drug/ y verá la página superior del predictor en la pantalla de su ordenador, como se muestra en la Figura 4. Haga clic en el botón Leer Me para ver una breve introducción sobre el predictor de iNR-Drug y la gevat cuando Cada par de consulta consta de dos partes: una es para la secuencia del receptor nuclear, y la otra para el medicamento. La secuencia NR debe estar en formato FASTA, mientras que la droga en el código KEGG comienza con el símbolo #. Ejemplos de la entrada de pares de consulta y la salida correspondiente se pueden ver haciendo clic en el botón Ejemplo justo encima de la caja de entrada. Paso 3. Haga clic en el botón Enviar para ver el resultado predicho. Por ejemplo, si usa los tres pares de consultas en la ventana Ejemplo como entrada, después de hacer clic en el botón Enviar, verá en su pantalla que el medicamento "hsa:2099" NR y el medicamento "D00066" son un par interactivo, y que el medicamento "hsa:2908" NR y el medicamento "D00088" son también un par interactivo, pero que el medicamento "hsa:5468" NR y el medicamento "D00279" no son un par interactivo. Todos estos resultados son totalmente consistentes con las observaciones experimentales. Se tarda unos 3 minutos antes de que cada uno de estos resultados se muestre en la pantalla; por supuesto, los pares de consultas más que hay, el tiempo que se necesita generalmente. Paso 4. Haga clic en el botón Citation para encontrar el papel relevante que documenta el desarrollo detallado y algoritmo de iNR-Durg. Paso 5. Haga clic en el botón Datos para descargar el conjunto de datos de referencia utilizado para entrenar y probar el predictor iNR-Durg. Paso 6. El código del programa también está disponible haciendo clic en el botón descargar en el panel inferior de la Figura 4.

¿Qué tipos de proteínas son difíciles de cristalizar?

Caracterización de un nuevo miembro del alfacoronavirus con características genómicas únicas en los murciélagos de Rhinolophushttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6521148/SHA: ee14de143337eec0e9708f8139bfac2b7b8fdd27Autores: Wang, Ning; Luo, Chuming; Liu, Haizhou; Yang, Xinglou; Hu, Ben; Zhang, Wei; Li, Bei; Zhu, Yan; Zhu, Guangjian; Shen, Xurui; Peng, Cheng; Shi, ZhengliFecha: 2019-04-24DOI: 10.3390/v11040379Licencia: cc-byAbstract: Los murciélagos han sido identificados como Varios de ellos han causado enfermedades en humanos y animales domésticos por transmisión de interespecies. Teniendo en cuenta la diversidad de coronavirus de murciélagos, especies de murciélagos y poblaciones, esperamos descubrir más CoV de murciélagos a través de la vigilancia del virus. En este estudio, describimos un nuevo miembro de alfaCoV (BtCoV/Rh/YN2012) en murciélagos con características únicas del genoma. Se encontraron genes accesorios únicos, ORF4a y ORF4b entre el gen de pico y el gen de sobre, mientras que el gen ORF8 se encontró aguas abajo del gen nucleocápsido. Todos los genes putativos fueron confirmados por análisis de transcripción inversa. Un gen único en el 3’ final del genoma BtCoV/Rh/YN2012, ORF9, muestra ~30% identidad de aminoácidos a ORF7a del corona El análisis funcional mostró que la proteína ORF4a puede activar la producción de IFN-β, mientras que ORF3a puede regular la producción de NF-B. También examinamos la entrada de virus mediados por picos utilizando el sistema de retrovirus pseudotipados, aunque no encontramos células totalmente permisivas. Nuestros resultados amplían el conocimiento sobre la diversidad genética de los coronavirus de murciélagos. La exploración continua de virus de murciélagos nos ayudará a entender más el importante papel que desempeñan los murciélagos en la evolución y transmisión del coronavirus. Texto: Los miembros de la familia Coronaviridae son virus de ARN de cadena positiva no segmentados con tamaños de genoma que van desde 26-32 kb [1]. Estos virus se clasifican en dos subfamilias: Letovirinae, que contiene el único género: Alphaletovirus; y Orthocoronavirinae (CoV), que consiste en alfa, beta, gamma y deltacoronavirus (CoVs) [2, 3]. Alfa y betacoronavirus infectan principalmente mamíferos y causan enfermedades humanas y animales. Gamma-y delta-CoVs infectan principalmente aves, pero algunos también pueden infectar mamíferos [4, 5]. Se sabe que seis CoVs humanos (HCoVs) causan enfermedades humanas. HCoV-HKU1, HCoV-OC43, HCoV-229E y HCoV-NL63 suelen causar enfermedades respiratorias leves o infecciones asintomáticas; sin embargo, el síndrome respiratorio agudo grave coronavirus (SARS-CoV) y todos los procedimientos de muestreo fueron realizados por veterinarios, con la aprobación del Comité de Ética Animal del Instituto de Virología Wuhan (WIVH5210201). El estudio se llevó a cabo de acuerdo con la Guía para el cuidado y uso de mamíferos silvestres en la investigación de la República Popular China. Las muestras de hisopos fecales y pellets de murciélagos se recolectaron de noviembre de 2004 a noviembre de 2014 en diferentes estaciones en el sur de China, como se describió anteriormente [16]. El ARN viral se extrajo de 200 μL de muestras de hisopos fecales o pellets utilizando el kit de A El ARN fue eludido en 50 μL de tampón de elución, alícuota, y almacenado en -80 • C. Se empleó PCR (Invitrogen, San Diego, CA, EE.UU.) de hemi-nedificado en un solo paso para detectar el coronavirus, como se describió anteriormente [17, 18]. Para confirmar la especie de murciélago de una muestra individual, nosotros PCR amplificamos el citocromo b (Cytob) y/o el gen de la subunidad 1 (ND1) de la deshidrogenasa NADH utilizando ADN extraído de las heces o hisopos [19, 20]. Las secuencias genéticas fueron ensambladas excluyendo las secuencias de imprimación. BLASTN fue utilizado para identificar especies de huésped basadas en las secuencias más estrechamente relacionadas con la mayor cobertura de consulta y una identidad mínima del Las secuencias genómicas completas fueron determinadas por PCR de un solo paso (Invitrogen, San Diego, CA, USA) amplificación con imprimaciones degeneradas (Tabla S1) diseñadas sobre la base de múltiples alineaciones de secuencias alfa-CoV disponibles depositadas en GenBank o amplificadas con SuperScript IV Transcriptasa Reversa (Invitrogen) y Expand Long Template PCR System (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) con imprimaciones específicas (secuencias primarias están disponibles bajo petición). Las secuencias de los extremos genómicos 5' y 3' fueron obtenidas por amplificación rápida de 5' y 3' de los extremos de cDNA (SMARTE Viruses 2019, 11, 379 3 de 19 RACE 5'/3' Kit; Clontech, Mountain View, CA, USA), respectivamente. Los productos PCR fueron Los productos PCR de más de 5kb fueron sometidos a secuenciación profunda utilizando el sistema Hiseq2500. Para algunos fragmentos, los productos PCR fueron clonados en el pGEM-T Easy Vector (Promega, Madison, WI, USA) para secuenciación. Al menos cinco clones independientes fueron secuenciados para obtener una secuencia de consenso. Los datos de la secuenciación de la siguiente generación (NGS) fueron filtrados y mapeados a la secuencia de referencia de BatCoV HKU10 (número de adhesión de GenBank NC_018871) usando Geneious 7.1.8 [21]. Los genomas fueron ensamblados preliminarmente usando DNAStar lasergene V7 (DNAStar, Madison, WI, USA). Se predijeron marcos de lectura abierta (ORF) Putativos utilizando el buscador de ORF de NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ orffinder/) con una longitud mínima de 150 nt, seguido de una inspección manual. Se definieron las secuencias de la región 5' no traducida (5'-UTR) y 3'-UTR, y la secuencia líder, la secuencia reguladora de transcripción corporal y líder (TRS) fueron identificadas como previamente descritas [22]. La escisión de las 16 proteínas no estructurales codificadas por ORF1ab fue determinada por la alineación de secuencias aa de otras CoVs y el patrón de reconocimiento de la proteinasasa 3C y la proteinasasa similar a la papaína. Los árboles filogenéticos basados en secuencias nt o aa fueron construidos utilizando el algoritmo de máxima probabilidad con valores de bootstrap determinados por 1000 réplicas en el paquete de software MEGA 6 [23]. Las secuencias de genoma de larga duración obtenidas en este estudio fueron alineadas con las de alfa-CoVs previamente reportadas usando MUSCLE [24]. Las secuencias alineadas fueron escaneadas para eventos de recombinación mediante el Programa de Detección de Recombinación [25]. Los eventos potenciales de recombinación como sugieren los fuertes p-valores (<10 -20 ) fueron confirmados mediante diagrama de similitud y análisis bootscan implementados en Simplot 3.5.1 [26]. El número de sustituciones sinónimas por sitio sinónimas, Ks, y el número de sustituciones sinónimas por sitio sinónimas, Ka, para cada región de codificación, se calcularon utilizando la herramienta de cálculo Ka/Ks de la Plataforma Norwegian Bioinformática (http://services.cuib.no/tools/kaks) con parámetros por defecto [27]. La detección de homología de proteínas se analizó utilizando HHpred (https://toolkit.tuebingen.mpg.de/#/tools/hpred) con parámetros por defecto [28]. Se utilizó un conjunto de RT-PCRs anidados para determinar la presencia de mRNA subgenómica viral en las muestras positivas de CoV [29]. Los imprimadores delanteros se diseñaron con la secuencia líder al Células primarias de murciélago o inmortalizadas (Rhinolophus sinicus riñón inmortalizado, RsKT; Rhinolophus sinicus células primarias de pulmón, RsLu4323; Rhinolophus sinicus cerebro inmortalizado, RsBrT; Rhinolophus affinis células primarias de riñón, RaK4324; Rousetus leschenaultii células inmortalizadas de riñón, RlKT; Hipposideros pratti células inmortalizadas de pulmón, HpLuT) generadas en nuestro laboratorio fueron cultivadas en DMEM/F12 con 15% FBS. Las células renales de Pteropus alecto (Paki) se mantuvieron en DMEM/F12 complementadas con 10% FBS. Otras células fueron mantenidas según las recomendaciones de American Type Culture Collection (ATCC, www.atcc.org). Los genes accesorios putativos del virus recién detectado fueron generados por RT-PCR a partir de ARN viral extraído de muestras fecales, como se describió anteriormente [30]. El plásmido del virus influenza NS1 fue generado en nuestro laboratorio [31]. El bocavirus humano (HBoV) VP2 plásmido fue amablemente proporcionado por el prof. Hanzhong Wang del Instituto de Virología Wuhan, Academia China de Ciencias. SRAS-CoV ORF7a fue sintetizado por Sangon Biotech. Las transfecciones fueron realizadas con Lipofectamine 3000 Reagent (Life Technologies). La expresión de estos genes accesorios fue analizada por Western blotting usando un mAb (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim Brevemente, el sobrenadante fecal fue adquirido mediante centrifugación de gradiente y luego agregado a las células Vero E6, 1:10 diluidas en DMEM. Después de la incubación a 37°C durante 1 h el inóculo fue reemplazado por DMEM fresco que contenía 2% FBS y el antibiótico antimicótico (Gibco, Grand Island, NY, EE.UU.). Se realizaron tres pasajes ciegos. Las células fueron revisadas diariamente para detectar el efecto citopático. Tanto el sobrenadante de cultivo como el pellet celular fueron examinados para CoV por RT-PCR [17]. La Apoptosis fue analizada como se describió previamente [18]. Brevemente, las células 293T en placas de 12 pocillos fueron transfectadas con 3 μg de plasma de expresión o vector vacío, y las células fueron recolectadas 24 h después de la transfección La apoptosis fue detectada por citometría de flujo utilizando el kit de detección de apoptosis V-FITC/PI de la anexina (YEASEN, Shanghai, China) siguiendo las instrucciones del fabricante.Células anexina-V-positivas y IP-negativas se consideraron en la fase apoptótica temprana y se consideró que las teñidas para la apoptosis o necrosis tardía de la anexina V y la IP se sometieron a apoptosis o necrosis tardía.Todos los experimentos se repitieron tres veces. Las células HEK 293T fueron sembradas en placas de 24 pocillos y luego cotransfectadas con plásmidos reporteros (pRL-TK y pIFN-βIFN-o pNF-B-Luc) [30], así como plásmidos que expresan genes accesorios, plásmidos vectoriales vacíos pcAGGS, virus influenza NS1 [32], SARS-CoV ORF7a [33], o HBoV VP2 [34]. A las 24 h después de la transfección, las células fueron tratadas con el virus Sendai (SeV) (100 unidades de hemaglutinina [HAU]/ml) o el factor de necrosis tumoral humano alfa (TNF-α; sistema R&D) durante 6 h para activar IFNβ o NF- Se prepararon lisatos celulares y se midió la actividad de luciferasa utilizando el kit de ensayo de doble luciferasa (Promega, Madison, WI, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utilizaron retrovirus pseudotipados con BtCoV/Rh/YN2012 RsYN1, RsYN3, RaGD, o pico MERS-CoV, o ningún pico (mock) para infectar células humanas, murciélagos u otras células de mamíferos en placas de 96 pozos. Las partículas de pseudovirus fueron confirmadas con electromicroscopía de borrado occidental y de mancha negativa. El proceso de producción, mediciones de infección y actividad de luciferasa se llevaron a cabo, como se describió anteriormente [35, 36]. Las secuencias nucleótidas del genoma completo de las cepas BtCoV/Rh/YN2012 RsYN1, RsYN2, RsYN3, y RaGD obtenidas en este estudio han sido sometidas al GenBank bajo MG916901 a MG916904. La vigilancia se realizó entre noviembre de 2004 y noviembre de 2014 en 19 provincias de China. En total, se recolectaron 2061 muestras fecales de al menos 12 especies de murciélago Rhinolophus (Figura 1A ). Se detectaron COVs en 209 de estas muestras (Figura 1B y Tabla 1 ). Cinco de estos virus están relacionados con especies conocidas: Mi-BatCoV 1 (> 94% nt identity), Mi-BatCoV HKU8 [37] (> 93% nt identity), BtRf-AlphaCoV/HuB2013 [11] (> 99% nt identity), SRASr-CoV [38] (> 89% nt identity) y HKU2 related CoV [39] (> 85% nt identity). Mientras que las otras tres secuencias de CoV mostraron menos de 83% nt identity a especies conocidas de CoV. Estos tres virus deben representar nuevas especies de CoV. El aislamiento del virus se realizó como se describió previamente [12], pero no tuvo éxito. identidad). Mientras que las otras tres secuencias de CoV mostraron menos de 83% nt identity a especies conocidas de CoV. Estos tres virus deben representar nuevas especies A continuación caracterizamos una novela alfa-CoV, BtCoV/Rh/YN2012. Fue detectada en 3 R.affinis y 6 R.sinicus, respectivamente. Con base en las secuencias, definimos tres genotipos, que fueron representados por RsYN1, RsYN3, y RaGD, respectivamente. Strain RsYN2 fue clasificado en el genotipo RsYN3. Se obtuvieron cuatro genomas de longitud completa. Tres de ellos fueron de R.sinicus (Strain RsYN1, RsYN2 y RsYN3), mientras que el otro fue de R.affinis (Strain RaGD). Los tamaños de estos 4 genomas son entre 28.715 y 29.102, con contenidos de G+C entre el 39,0% y el 41,3%. Los genomas presentan estructuras similares y secuencias reguladoras de transcripción (TRS) que son idénticas a las de otros alfa-CoVs (Figura 2 y Tabla 2). Se observaron excepciones incluyendo tres ORF adicionales (ORF3b, ORF4a y ORF4b). Todas las 4 cepas tienen ORF4a y ORF4b, mientras que sólo la cepa RsYN1 tiene ORF3b. El gen de réplicas, ORF1ab, ocupa~20.4 kb del genoma. El gen de réplicas, ORF1ab, ocupa~20.4 kb del genoma. Codifica las poliproteínas 1a y 1ab, las cuales podrían separarse en 16 proteínas no estructurales (Nsp1-Nsp16). El 3'-fin de los sitios de escote reconocidos por la proteinasa similar a 3C (Nsp4-Nsp10, Nsp12-Nsp16) y la proteinasa similar a papaína (Nsp1-Nsp3) fueron confirmados. Las proteínas incluyendo Nsp3 (papain-like 2 proteas, PL2pro), Nsp5 (quimotripsina-like proteasa, 3CLpro), Nsp12 (RdRp), Nsp13 (helicase), y otras proteínas de función desconocida (Tabla 3 ). Los 7 dominios concatenados de poliproteína 1 comparten la identidad de secuencia <90% aa con los de otros alfa-CoV conocidos (Tabla 2 ), sugiriendo que estos virus representan una nueva especie de CoV dentro de la alfa-CoV. Las especies de CoV más cercanas asignadas a BtCoV/Rh/YN2012 son BtCoV-HKU10 y BtRf-AlphaCoV/Hub2013. Las tres cepas de la provincia de Yunnan fueron agrupadas en dos genotipos (83% identidad del genoma) correlacionados con su localización de muestreo. El tercer genotipo representado por la cepa RaGD fue aislado a las cepas encontradas en Yunnan (<75,4% identidad del genoma). Luego examinamos los genes individuales (Tabla 2). Todos los genes mostraron una baja identidad de secuencia aa a CoV conocidos. Las cuatro cepas de BtCoV/Rh/YN2012 mostraron diversidad genética entre todos los genes diferentes excepto ORF1ab (>83,7% aa identidad). Cabe destacar que las proteínas de pico son muy divergentes entre estas cepas. Otras proteínas de estructura (E, M La comparación de los genes accesorios entre estas cuatro cepas reveló que las cepas del mismo genotipo compartían un ORF3a 100% idéntico. Sin embargo, las proteínas codificadas por ORF3as eran altamente divergentes entre los diferentes genotipos (<65% aa identity). Los genes accesorios putativos también fueron BLASTed contra los registros de GenBank. La mayoría de los genes accesorios no tienen homólogos en GenBank-database, excepto ORF3a (52,0-55,5% aa identity with BatCoV HKU10 ORF3) y ORF9 (28,1-32,0% aa identity with SARSr-CoV ORF7a). Analizamos la homología proteica con el software HHpred. Los resultados mostraron que ORF9s y SARS-CoV OR7a son homólogos (posibilidad: 100%, Para confirmar la presencia de ARN subgenómico, diseñamos un conjunto de imprimaciones dirigidas a todos los ORF predichos como se describe. Los amplicones fueron confirmados primero a través de electroforesis de agarosa-gel y luego secuenciación (Figura 3 y Tabla 2 ). Las secuencias mostraron que todos los ORFs, excepto ORF4b, tenían un TRS anterior. Por lo tanto, el ORF4b puede ser traducido a partir de mRNAs bicistrónicos. En RsYN1, se encontró un ARN subgenómico adicional a partir del interior del ORF3a a través de la secuenciación, lo que llevó a un ORF3b único. Para confirmar la presencia de ARN subgenómico, diseñamos un conjunto de imprimaciones dirigidas a todos los ORFs predichos como se describe. Los amplicones fueron confirmados primero a través de electroforesis gel de agarosa y luego secuenciación (Figura 3 y Tabla 2 ). Las secuencias mostraron que todos los ORF, excepto ORF4b, tenían TRS anteriores. Por lo tanto, los ORF4b pueden ser traducidos de ARNm bicistrónicos. En RsYN1, se encontró un ARN subgenómico adicional a partir del interior del ORF3a a través de secuenciación, lo que llevó a un ORF3b único. Los árboles filogenéticos fueron construidos usando las secuencias aa de RdRp y S de BtCoV/Rh/YN2012 y otras CoVs representativas (Figura 4). En ambos árboles, todos los BtCoV/Rh/YN2012 fueron agrupados juntos y formaron un linaje distinto a otras especies conocidas del corona Dentro de BtCoV/Rh/YN2012 se observaron dos sublineamientos distintos.Uno fue de Ra muestreado en Guangdong, mientras que el otro fue de Rs muestreado en Yunnan Entre las cepas de Yunnan, RsYN2 y RsYN3 fueron agrupadas, mientras que RsYN1 fue aislado. La topología de estas cuatro cepas fue correlacionada con el lugar de muestreo. Las ramas relativamente largas reflejan una alta diversidad entre estas cepas, lo que indica una larga evolución independiente. Los árboles filogenéticos fueron construidos usando las secuencias aa de RdRp y S de BtCoV/Rh/YN2012 y otras CoV representativas (Figura 4). En ambos árboles, todos BtCoV/Rh/YN2012 fueron agrupados y formaron un linaje distinto a otras especies conocidas de coronavirus. Dentro de BtCoV/Rh/YN2012 se observaron dos sublineamientos distintos.Uno fue de Ra muestreado en Guangdong, mientras que el otro fue de Rs muestreado en Yunnan Entre las cepas de Yunnan, RsYN2 y RsYN3 fueron agrupadas, mientras que RsYN1 fue aislado. La topología de estas cuatro cepas fue correlacionada con el lugar de muestreo. Las ramas relativamente largas reflejan una alta diversidad entre estas cepas, lo que indica una larga evolución independiente. Los árboles filogenéticos fueron construidos usando las secuencias aa de RdRp y S de BtCoV/Rh/YN2012 y otras CoV representativas (Figura 4). En ambos árboles, todos BtCoV/Rh/YN2012 fueron agrupados y formaron un linaje distinto a otras especies conocidas de coronavirus. En BtCoV/Rh/YN2012 se observaron dos sublineamientos distintos, uno de Ra en Guangdong, mientras que el otro de Rs en Yunnan Entre las cepas de Yunnan, RsYN2 y RsYN3 se agruparon, mientras que RsYN1 se aisló. La topología de estas cuatro cepas se correlacionó con el lugar de muestreo. Las ramas relativamente largas reflejan una gran diversidad entre estas cepas, lo que indica un largo historial de evolución independiente. Las ratios Ka/Ks (Ks es el número de sustituciones sinónimos por sitios sinónimos y Ka es el número de sustituciones no sinónimos por sitio sinónimos) fueron calculadas para todos los genes. Las ratios Ka/Ks para la mayoría de los genes fueron generalmente bajas, lo que indica que estos genes estaban bajo selección purificada. Sin embargo, las ratios Ka/Ks de ORF4a, ORF4b y ORF9 (0,727, 0,623 y 0,843, respectivamente) fueron significativamente más altas que las de otros ORFs (Tabla 4 ). Para la evaluación de la presión de selección adicional del gen ORF4a y ORF4b, secuenciamos otros cuatro genes ORF4a y ORF4b (estreno Rs4223, Rs4236, Rs4240 y Ra13576 se mostró en la Figura 1B Como SARS-CoV ORF7a fue reportado para inducir apoptosis, realizamos análisis de apoptosis en BtCoV/Rh/YN 2012 ORF9, a~30% aa homólogo de identidad de SARSr-CoV ORF7a. Transfectamos transitoriamente ORF9 de BtCoV/Rh/YN2012 a células HEK293T para examinar si esta ORF9 desencadena apoptosis. Se realizó Western blot para confirmar la expresión de ORF9 y SARS-CoV ORF7a (Figura S1). ORF9 no pudo inducir apoptosis como la ORF7a de SARS-CoV Tor2 (Figura S2). Los resultados indicaron que BtCoV/Rh/YN2012 ORF9 no estuvo involucrado en la inducción de la apoptosis. Para determinar si estas proteínas accesorias modulan la inducción de IFN, transfectamos plasmidos reporteros (pIFNβ-Luc y pRL-TK) y plasmidos de expresión a células 293T. Todas las células que sobreexpresaban los genes accesorios, así como el virus influenza NS1 (tramo PR8), HBoV VP2, o el vector vacío fueron probados para la actividad de luciferasa después de la infección por SeV. La actividad luciferasa estimulada por SeV fue notablemente superior a la esperada sin tratamiento con SeV. El virus influenza NS1 inhibe la expresión del promotor de IFN, mientras que HBoV VP2 activa la expresión. En comparación con esos controles, las proteínas ORF4a exhiben un efecto activo como HBoV VP2 (Figura 5A ). Otras proteínas accesorias no mostraron ningún efecto en la producción de IFN (Figura S3 ). La expresión de estos genes accesorios fue confirmada por Western blot (Figura S1 ). fue notablemente mayor que sin tratamiento con SeV como se esperaba. El virus influenza En comparación con estos controles, las proteínas ORF4a presentan un efecto activo como HBoV VP2 (Figura 5A ). Otras proteínas accesorias no mostraron ningún efecto en la producción de IFN (Figura S3 ). La expresión de estos genes accesorios fue confirmada por Western blot (Figura S1 ). Las muestras fueron recolectadas a las 6 h de postinfección, seguidas por el ensayo de doble luciferasa. Los resultados fueron expresados como el valor luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la lucifera de la Las células 293T fueron transfectadas con 100 ng pNF-B-Luc, 10 ng pRL-TK, vector vacío (500 ng), un plásmido NS1 que expresaba (500 ng), un plásmido ORF7a de expresión SARS-CoV (500 ng), o plásmidos ORF3a de expresión ORF (500 ng). Después de 24 h, las células fueron tratadas con TNF-α. La actividad de la doble luciferasa se determinó después de 6 h. Los resultados se expresaron como la actividad de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la Los asteriscos indican diferencias significativas entre los grupos (en comparación con el vector-NC vacío, p < 0,05, según lo determinado por la prueba t del estudiante). NF-B juega un papel importante en la regulación de la respuesta inmune a la infección viral y es también un factor clave frecuentemente dirigido por virus para hacerse cargo de la célula huésped. En este estudio, se probó si estas proteínas accesorias podían modular las células NF-B. 293T fueron cotransfectadas con reportero Las muestras fueron recolectadas a 6 h de postinfección, seguidas de ensayo de doble luciferasa. Los resultados se expresaron como el valor de luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la lucifera de la lucifera de la lucifera de la lucifera de la lucifera de la lu Las células 293T fueron transfectadas con 100 ng pNF-B-Luc, 10 ng pRL-TK, vector vacío (500 ng), un plásmido NS1 que expresaba (500 ng), un plásmido ORF7a de expresión SARS-CoV (500 ng), o plásmidos ORF3a de expresión ORF (500 ng). Después de 24 h, las células fueron tratadas con TNF-α. La actividad de la doble luciferasa se determinó después de 6 h. Los resultados se expresaron como la actividad de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la Los asteriscos indican diferencias significativas entre los grupos (en comparación con el vector-NC vacío, p < 0,05, según lo determinado por la prueba t del estudiante). El NF-B desempeña un papel importante en la regulación de la respuesta inmunitaria a la infección viral y es también un factor clave frecuentemente dirigido por virus para hacerse cargo de la célula huésped. En este estudio, probamos si estas proteínas accesorias podían modular las células NF-B. 293T fueron cotransfectadas con plásmidos reporteros (pNF-B-Luc y pRL-TK), así como los plasmidos o controles de expresión de proteínas accesorios (vector vacío, NS1, SARS-CoV Tor2-ORF7a). Las células fueron tratadas con TNF-α durante 6 h a 24 h después de la transfección. Se determinó la actividad luciferasa. RsYN1-ORF3a y RaGD-ORF3a activaron NF-B como SARS-CoV ORF7a, mientras que RsYN2-ORF3a inhibió NF-B como NS1 (Figura 5B ). Las expresiones de ORF3as fueron confirmadas con Western blot (Figura S1 ). Otras proteínas accesorias no modularon la producción de NF-B (Figura S4 ). Para comprender la infectividad de estos nuevos BtCoV/Rh/YN2012, seleccionamos las proteínas de pico RsYN1, RsYN3 y RaGD para estudios de entrada de pseudovirus mediados por picos. Tanto el análisis de manchas occidentales como la observación de microscopía electrónica de mancha negativa confirmaron con éxito la preparación de BtCoV/Rh Un total de 11 líneas celulares humanas, 8 células de murciélagos y otras 9 líneas celulares de mamíferos fueron probadas, y no se encontró ningún fuerte positivo (Tabla S2). En este estudio, una nueva especie alfa-CoV, BtCoV/Rh/YN2012, fue identificada en dos especies Rhinolophus. Las 4 cepas con genoma de largo alcance fueron secuencias. Los 7 dominios de replicación conservados de estos virus poseían una identidad secuencial <90% aa a los de otros alfa-CoV conocidos, lo que define una nueva especie de acuerdo con el estándar de taxonomía ICTV [42]. Estos nuevos alfa-CoV mostraron una alta diversidad genética en sus genes estructurales y no estructurales. La cepa RaGD de R. affinis, recolectada en la provincia de Guangdong, formó una rama independiente divergente de las otras 3 cepas de R. sinicus, muestreadas en la provincia de Yunnan, indicando un proceso de evolución independiente asociado con el aislamiento geográfico y la restricción del huésped. Aunque recolectadas de la misma provincia, estas tres cepas de virus formaron dos genotipos correlacionados con lugares de muestreo. Estos dos genotipos tenían una baja identidad de secuencia del genoma, especialmente en el gen S y genes accesorios. Teniendo en cuenta la ubicación geográfica remota del hábitat del murciélago huésped, el tropismo anfitrión y la diversidad del virus, suponemos que BtCoV/Rh/YN2012 puede haberse diseminado en estas dos provincias con una larga historia de circulación en su reservorio natural, los murciélagos Rhinolophus. Con la evidencia de secuencia, suponemos que En primer lugar, se identificaron nuevos genes accesorios, que no tenían homólogos en los genomas. En segundo lugar, se encontraron múltiples TRS entre los genes S y E, mientras que otros alfacoronavirus solo tenían un TRS allí. Estos TRS preceden a ORF3a, ORF3b (sólo en RsYN1) y ORF4a/b respectivamente. En tercer lugar, el gen accesorio ORF9 mostró homología con los de otras especies conocidas de CoV en otro género de coronavirus, especialmente con genes accesorios de SRASr-CoV. Los genes accesorios suelen estar involucrados en interacciones virus-anfitriones durante la infección por CoV [43]. En la mayoría de los CoVs, los genes accesorios son dispensables para la replicación del virus. Sin embargo, se requirió un gen 3c intacto de felina CoV para la replicación viral en el intestino [44] [45] [4 La supresión de los genes específicos del género en el virus de la hepatitis del ratón llevó a una reducción de la virulencia [47]. SARS-CoV ORF7a, que fue identificado como involucrado en la supresión del silenciamiento del ARN [48], inhibición de la síntesis de proteínas celulares [49], bloqueo del ciclo celular [50], e inducción de la apoptosis [51, 52]. En este estudio, encontramos que BtCoV/Rh/YN2012 ORF9 comparte ~ 30% aa identidad secuencial con SARS-CoV ORF7a. Curiosamente, BtCoV/Rh/YN2012 y SRASr-CoV fueron detectados en R. sinicus de la misma cueva. Suponemos que el SARS-CoV y el BtCoV/Rh/YN2012 pueden haber adquirido ORF7a o ORF9 de un ancestro común a través de la recombinación del genoma o la transferencia horizontal de genes. Mientras que el ORF9 de BtCoV/Rh/YN2012 no indujo la apoptosis ni activaron la producción de NF-Karabaj, estas diferencias pueden ser inducidas por la evolución divergente de estas proteínas en diferentes presiones. Aunque diferentes BtCoV/Rh/YN2012 ORF4a comparten < 64,4% de identidad de aminoácidos, todos ellos podrían activar IFN-β. El ORF3a de RsYN1 y RaGD incrementan la patogenicidad del virus con una vía diferente. A pesar de la falta de líneas celulares intestinales del huésped natural de BtCoV/Rh/YN2012, examinamos el tropismo celular de su proteína de pico a través de la entrada de retrovirus pseudotipados con líneas celulares humanas, murciélagos y otras células de mamíferos. La mayoría de las líneas celulares examinadas fueron insospechables a BtCoV/Rh/YN2012, lo que indica un bajo riesgo de transmisión de interespecies a humanos y otros animales. Múltiples razones pueden conducir a una infección fallida del sistema retrovirus de pico de coronavirus-pseudotipo, incluyendo ausencia de receptor en células diana, reconocimiento fallido al homólogo receptor de especies no huésped, mala adaptación en células no huésped durante la maduración de pico o entrada de virus, o la limitación del sistema retrovirus en la entrada de coronavirus estimulante. La débil infectividad del retrovirus pseudotipado RsYN1 en células Huh-7 podría explicarse por la unión de la proteína de pico a polisacárido secretada a la superficie. La suposición debe ser confirmada por experimentos. Nuestras vigilancias a largo plazo sugieren que los murciélagos Rhinolophus parecen albergar una amplia diversidad de CoVs. Coincidentemente, los dos agentes altamente patógenos, SRAS-CoV y Rh-BatCoV HKU2 ambos se originaron de murciélagos Rhinolophus. Teniendo en cuenta la diversidad de CoVs transportados por este género de murciélagos y su amplia distribución geográfica, puede haber un bajo riesgo de derrame de estos virus a otros animales y humanos. Vigilanciaes a largo plazo y estudios de patogénesis ayudarán a prevenir futuras enfermedades humanas y animales causadas por estos murciélagos CoVs. Materiales complementarios: Los siguientes están disponibles en línea en http://www.mdpi.com/1999-4915/11/4/379/s1, Figura S1 : análisis de manchas occidentales de la expresión de proteínas accesorias. Figura S2 : análisis de Apoptosis de proteínas ORF9 de BtCoV/Rh/YN2012. Figura S3 : análisis funcional de proteínas ORF3a, ORF3b, ORF4b, ORF8 y ORF9 en la producción de interferón de tipo I. Figura S4 : análisis funcional de ORF3b, ORF4a, ORF4b, ORF8 y ORF9 en la producción de NF- Tabla S2 : Primeros para la detección de ARNm sugbenómicos virales. Tabla S3

¿Quién realizó los procedimientos de muestreo?

Caracterización de un nuevo miembro del alfacoronavirus con características genómicas únicas en los murciélagos de Rhinolophushttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6521148/SHA: ee14de143337eec0e9708f8139bfac2b7b8fdd27Autores: Wang, Ning; Luo, Chuming; Liu, Haizhou; Yang, Xinglou; Hu, Ben; Zhang, Wei; Li, Bei; Zhu, Yan; Zhu, Guangjian; Shen, Xurui; Peng, Cheng; Shi, ZhengliFecha: 2019-04-24DOI: 10.3390/v11040379Licencia: cc-byAbstract: Los murciélagos han sido identificados como Varios de ellos han causado enfermedades en humanos y animales domésticos por transmisión de interespecies. Teniendo en cuenta la diversidad de coronavirus de murciélagos, especies de murciélagos y poblaciones, esperamos descubrir más CoV de murciélagos a través de la vigilancia del virus. En este estudio, describimos un nuevo miembro de alfaCoV (BtCoV/Rh/YN2012) en murciélagos con características únicas del genoma. Se encontraron genes accesorios únicos, ORF4a y ORF4b entre el gen de pico y el gen de sobre, mientras que el gen ORF8 se encontró aguas abajo del gen nucleocápsido. Todos los genes putativos fueron confirmados por análisis de transcripción inversa. Un gen único en el 3’ final del genoma BtCoV/Rh/YN2012, ORF9, muestra ~30% identidad de aminoácidos a ORF7a del corona El análisis funcional mostró que la proteína ORF4a puede activar la producción de IFN-β, mientras que ORF3a puede regular la producción de NF-B. También examinamos la entrada de virus mediados por picos utilizando el sistema de retrovirus pseudotipados, aunque no encontramos células totalmente permisivas. Nuestros resultados amplían el conocimiento sobre la diversidad genética de los coronavirus de murciélagos. La exploración continua de virus de murciélagos nos ayudará a entender más el importante papel que desempeñan los murciélagos en la evolución y transmisión del coronavirus. Texto: Los miembros de la familia Coronaviridae son virus de ARN de cadena positiva no segmentados con tamaños de genoma que van desde 26-32 kb [1]. Estos virus se clasifican en dos subfamilias: Letovirinae, que contiene el único género: Alphaletovirus; y Orthocoronavirinae (CoV), que consiste en alfa, beta, gamma y deltacoronavirus (CoVs) [2, 3]. Alfa y betacoronavirus infectan principalmente mamíferos y causan enfermedades humanas y animales. Gamma-y delta-CoVs infectan principalmente aves, pero algunos también pueden infectar mamíferos [4, 5]. Se sabe que seis CoVs humanos (HCoVs) causan enfermedades humanas. HCoV-HKU1, HCoV-OC43, HCoV-229E y HCoV-NL63 suelen causar enfermedades respiratorias leves o infecciones asintomáticas; sin embargo, el síndrome respiratorio agudo grave coronavirus (SARS-CoV) y todos los procedimientos de muestreo fueron realizados por veterinarios, con la aprobación del Comité de Ética Animal del Instituto de Virología Wuhan (WIVH5210201). El estudio se llevó a cabo de acuerdo con la Guía para el cuidado y el uso de mamíferos silvestres en la investigación de la República Popular China. Las muestras de hisopos fecales y pellets de murciélagos se recolectaron de noviembre de 2004 a noviembre de 2014 en diferentes estaciones en el sur de China, como se describió anteriormente [16]. El ARN viral se extrajo de 200 μL de muestras de hisopos fecales o pellets utilizando el kit de El ARN fue eludido en 50 μL de tampón de elución, alícuota, y almacenado en -80 • C. Se empleó PCR (Invitrogen, San Diego, CA, EE.UU.) de hemi-nedificado en un solo paso para detectar el coronavirus, como se describió anteriormente [17, 18]. Para confirmar la especie de murciélago de una muestra individual, nosotros PCR amplificamos el citocromo b (Cytob) y/o el gen de la subunidad 1 (ND1) de la deshidrogenasa NADH utilizando ADN extraído de las heces o hisopos [19, 20]. Las secuencias genéticas fueron ensambladas excluyendo las secuencias de imprimación. BLASTN fue utilizado para identificar especies de huésped basadas en las secuencias más estrechamente relacionadas con la mayor cobertura de consulta y una identidad mínima del Las secuencias genómicas completas se determinaron mediante PCR de un solo paso (Invitrogen, San Diego, CA, USA) amplificación con imprimaciones degeneradas (Tabla S1) diseñadas sobre la base de múltiples alineaciones de secuencias alfa-CoV disponibles depositadas en GenBank o amplificadas con SuperScript IV Transcriptasa Inversa (Invitrogen) y Expand Long Template PCR System (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) con imprimaciones específicas (secuencias primarias disponibles bajo petición). Las secuencias de los extremos genómicos 5' y 3' se obtuvieron mediante amplificación rápida de 5' y 3' de los extremos de cDNA (SMARTER Viruses 2019, 11, 379 3 de 19 RACE 5'/3' Kit; Clontech, Mountain View, CA, USA), respectivamente. Los productos PCR fueron Los productos PCR de más de 5kb fueron sometidos a secuenciación profunda utilizando el sistema Hiseq2500. Para algunos fragmentos, los productos PCR fueron clonados en el pGEM-T Easy Vector (Promega, Madison, WI, USA) para secuenciación. Al menos cinco clones independientes fueron secuenciados para obtener una secuencia de consenso. Los datos de la secuenciación de la siguiente generación (NGS) fueron filtrados y mapeados a la secuencia de referencia de BatCoV HKU10 (número de adhesión de GenBank NC_018871) usando Geneious 7.1.8 [21]. Los genomas fueron ensamblados preliminarmente usando DNAStar lasergene V7 (DNAStar, Madison, WI, USA). Se predijeron marcos de lectura abierta (ORF) Putativos utilizando el buscador de ORF de NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ orffinder/) con una longitud mínima de 150 nt, seguido de una inspección manual. Se definieron las secuencias de la región 5' no traducida (5'-UTR) y 3'-UTR, y la secuencia líder, la secuencia reguladora de transcripción corporal y líder (TRS) fueron identificadas como previamente descritas [22]. La escisión de las 16 proteínas no estructurales codificadas por ORF1ab fue determinada por la alineación de secuencias aa de otras CoVs y el patrón de reconocimiento de la proteinasasa 3C y la proteinasasa similar a la papaína. Los árboles filogenéticos basados en secuencias nt o aa fueron construidos utilizando el algoritmo de máxima probabilidad con valores de bootstrap determinados por 1000 réplicas en el paquete de software MEGA 6 [23]. Las secuencias de genoma de larga duración obtenidas en este estudio fueron alineadas con las de alfa-CoVs previamente reportadas usando MUSCLE [24]. Las secuencias alineadas fueron escaneadas para eventos de recombinación mediante el Programa de Detección de Recombinación [25]. Los eventos potenciales de recombinación como sugieren los fuertes p-valores (<10 -20 ) fueron confirmados mediante diagrama de similitud y análisis bootscan implementados en Simplot 3.5.1 [26]. El número de sustituciones sinónimas por sitio sinónimas, Ks, y el número de sustituciones sinónimas por sitio sinónimas, Ka, para cada región de codificación, se calcularon utilizando la herramienta de cálculo Ka/Ks de la Plataforma Norwegian Bioinformática (http://services.cuib.no/tools/kaks) con parámetros por defecto [27]. La detección de homología de proteínas se analizó utilizando HHpred (https://toolkit.tuebingen.mpg.de/#/tools/hpred) con parámetros por defecto [28]. Se utilizó un conjunto de RT-PCRs anidados para determinar la presencia de mRNA subgenómica viral en las muestras positivas de CoV [29]. Los imprimadores delanteros se diseñaron con la secuencia líder al Células primarias de murciélago o inmortalizadas (Rhinolophus sinicus riñón inmortalizado, RsKT; Rhinolophus sinicus células primarias de pulmón, RsLu4323; Rhinolophus sinicus cerebro inmortalizado, RsBrT; Rhinolophus affinis células primarias de riñón, RaK4324; Rousetus leschenaultii células inmortalizadas de riñón, RlKT; Hipposideros pratti células inmortalizadas de pulmón, HpLuT) generadas en nuestro laboratorio fueron cultivadas en DMEM/F12 con 15% FBS. Las células renales de Pteropus alecto (Paki) se mantuvieron en DMEM/F12 complementadas con 10% FBS. Otras células fueron mantenidas según las recomendaciones de American Type Culture Collection (ATCC, www.atcc.org). Los genes accesorios putativos del virus recién detectado fueron generados por RT-PCR a partir de ARN viral extraído de muestras fecales, como se describió anteriormente [30]. El plásmido del virus influenza NS1 fue generado en nuestro laboratorio [31]. El bocavirus humano (HBoV) VP2 plásmido fue amablemente proporcionado por el prof. Hanzhong Wang del Instituto de Virología Wuhan, Academia China de Ciencias. SRAS-CoV ORF7a fue sintetizado por Sangon Biotech. Las transfecciones fueron realizadas con Lipofectamine 3000 Reagent (Life Technologies). La expresión de estos genes accesorios fue analizada por Western blotting usando un mAb (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim Brevemente, el sobrenadante fecal fue adquirido mediante centrifugación de gradiente y luego agregado a las células Vero E6, 1:10 diluidas en DMEM. Después de la incubación a 37°C durante 1 h el inóculo fue reemplazado por DMEM fresco que contenía 2% FBS y el antibiótico antimicótico (Gibco, Grand Island, NY, EE.UU.). Se realizaron tres pasajes ciegos. Las células fueron revisadas diariamente para detectar el efecto citopático. Tanto el sobrenadante de cultivo como el pellet celular fueron examinados para CoV por RT-PCR [17]. La Apoptosis fue analizada como se describió previamente [18]. Brevemente, las células 293T en placas de 12 pocillos fueron transfectadas con 3 μg de plasma de expresión o vector vacío, y las células fueron recolectadas 24 h después de la transfección La apoptosis fue detectada por citometría de flujo utilizando el kit de detección de apoptosis V-FITC/PI de la anexina (YEASEN, Shanghai, China) siguiendo las instrucciones del fabricante.Células anexina-V-positivas y IP-negativas se consideraron en la fase apoptótica temprana y se consideró que las teñidas para la apoptosis o necrosis tardía de la anexina V y la IP se sometieron a apoptosis o necrosis tardía.Todos los experimentos se repitieron tres veces. Las células HEK 293T fueron sembradas en placas de 24 pocillos y luego cotransfectadas con plásmidos reporteros (pRL-TK y pIFN-βIFN-o pNF-B-Luc) [30], así como plásmidos que expresan genes accesorios, plásmidos vectoriales vacíos pcAGGS, virus influenza NS1 [32], SARS-CoV ORF7a [33], o HBoV VP2 [34]. A las 24 h después de la transfección, las células fueron tratadas con el virus Sendai (SeV) (100 unidades de hemaglutinina [HAU]/ml) o el factor de necrosis tumoral humano alfa (TNF-α; sistema R&D) durante 6 h para activar IFNβ o NF- Se prepararon lisatos celulares y se midió la actividad de luciferasa utilizando el kit de ensayo de doble luciferasa (Promega, Madison, WI, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utilizaron retrovirus pseudotipados con BtCoV/Rh/YN2012 RsYN1, RsYN3, RaGD, o pico MERS-CoV, o ningún pico (mock) para infectar células humanas, murciélagos u otras células de mamíferos en placas de 96 pozos. Las partículas de pseudovirus fueron confirmadas con electromicroscopía de borrado occidental y de mancha negativa. El proceso de producción, mediciones de infección y actividad de luciferasa se llevaron a cabo, como se describió anteriormente [35, 36]. Las secuencias nucleótidas del genoma completo de las cepas BtCoV/Rh/YN2012 RsYN1, RsYN2, RsYN3, y RaGD obtenidas en este estudio han sido sometidas al GenBank bajo MG916901 a MG916904. La vigilancia se realizó entre noviembre de 2004 y noviembre de 2014 en 19 provincias de China. En total, se recolectaron 2061 muestras fecales de al menos 12 especies de murciélago Rhinolophus (Figura 1A ). Se detectaron COVs en 209 de estas muestras (Figura 1B y Tabla 1 ). Cinco de estos virus están relacionados con especies conocidas: Mi-BatCoV 1 (> 94% nt identity), Mi-BatCoV HKU8 [37] (> 93% nt identity), BtRf-AlphaCoV/HuB2013 [11] (> 99% nt identity), SRASr-CoV [38] (> 89% nt identity) y HKU2 related CoV [39] (> 85% nt identity). Mientras que las otras tres secuencias de CoV mostraron menos de 83% nt identity a especies conocidas de CoV. Estos tres virus deben representar nuevas especies de CoV. El aislamiento del virus se realizó como se describió previamente [12], pero no tuvo éxito. identidad). Mientras que las otras tres secuencias de CoV mostraron menos de 83% nt identity a especies conocidas de CoV. Estos tres virus deben representar nuevas especies A continuación caracterizamos una novela alfa-CoV, BtCoV/Rh/YN2012. Fue detectada en 3 R.affinis y 6 R.sinicus, respectivamente. Con base en las secuencias, definimos tres genotipos, que fueron representados por RsYN1, RsYN3, y RaGD, respectivamente. Strain RsYN2 fue clasificado en el genotipo RsYN3. Se obtuvieron cuatro genomas de longitud completa. Tres de ellos fueron de R.sinicus (Strain RsYN1, RsYN2 y RsYN3), mientras que el otro fue de R.affinis (Strain RaGD). Los tamaños de estos 4 genomas son entre 28.715 y 29.102, con contenidos de G+C entre el 39,0% y el 41,3%. Los genomas presentan estructuras similares y secuencias reguladoras de transcripción (TRS) que son idénticas a las de otros alfa-CoVs (Figura 2 y Tabla 2). Se observaron excepciones incluyendo tres ORF adicionales (ORF3b, ORF4a y ORF4b). Todas las 4 cepas tienen ORF4a y ORF4b, mientras que sólo la cepa RsYN1 tiene ORF3b. El gen de réplicas, ORF1ab, ocupa~20.4 kb del genoma. El gen de réplicas, ORF1ab, ocupa~20.4 kb del genoma. Codifica las poliproteínas 1a y 1ab, las cuales podrían separarse en 16 proteínas no estructurales (Nsp1-Nsp16). El 3'-fin de los sitios de escote reconocidos por la proteinasa similar a 3C (Nsp4-Nsp10, Nsp12-Nsp16) y la proteinasa similar a papaína (Nsp1-Nsp3) fueron confirmados. Las proteínas incluyendo Nsp3 (papain-like 2 proteas, PL2pro), Nsp5 (quimotripsina-like proteasa, 3CLpro), Nsp12 (RdRp), Nsp13 (helicase), y otras proteínas de función desconocida (Tabla 3 ). Los 7 dominios concatenados de poliproteína 1 comparten la identidad de secuencia <90% aa con los de otros alfa-CoV conocidos (Tabla 2 ), sugiriendo que estos virus representan una nueva especie de CoV dentro de la alfa-CoV. Las especies de CoV más cercanas asignadas a BtCoV/Rh/YN2012 son BtCoV-HKU10 y BtRf-AlphaCoV/Hub2013. Las tres cepas de la provincia de Yunnan fueron agrupadas en dos genotipos (83% identidad del genoma) correlacionados con su localización de muestreo. El tercer genotipo representado por la cepa RaGD fue aislado a las cepas encontradas en Yunnan (<75,4% identidad del genoma). Luego examinamos los genes individuales (Tabla 2). Todos los genes mostraron una baja identidad de secuencia aa a CoV conocidos. Las cuatro cepas de BtCoV/Rh/YN2012 mostraron diversidad genética entre todos los genes diferentes excepto ORF1ab (>83,7% aa identidad). Cabe destacar que las proteínas de pico son muy divergentes entre estas cepas. Otras proteínas de estructura (E, M La comparación de los genes accesorios entre estas cuatro cepas reveló que las cepas del mismo genotipo compartían un ORF3a 100% idéntico. Sin embargo, las proteínas codificadas por ORF3as eran altamente divergentes entre los diferentes genotipos (<65% aa identity). Los genes accesorios putativos también fueron BLASTed contra los registros de GenBank. La mayoría de los genes accesorios no tienen homólogos en GenBank-database, excepto ORF3a (52,0-55,5% aa identity with BatCoV HKU10 ORF3) y ORF9 (28,1-32,0% aa identity with SARSr-CoV ORF7a). Analizamos la homología proteica con el software HHpred. Los resultados mostraron que ORF9s y SARS-CoV OR7a son homólogos (posibilidad: 100%, Para confirmar la presencia de ARN subgenómico, diseñamos un conjunto de imprimaciones dirigidas a todos los ORF predichos como se describe. Los amplicones fueron confirmados primero a través de electroforesis de agarosa-gel y luego secuenciación (Figura 3 y Tabla 2 ). Las secuencias mostraron que todos los ORFs, excepto ORF4b, tenían un TRS anterior. Por lo tanto, el ORF4b puede ser traducido a partir de mRNAs bicistrónicos. En RsYN1, se encontró un ARN subgenómico adicional a partir del interior del ORF3a a través de la secuenciación, lo que llevó a un ORF3b único. Para confirmar la presencia de ARN subgenómico, diseñamos un conjunto de imprimaciones dirigidas a todos los ORFs predichos como se describe. Los amplicones fueron confirmados primero a través de electroforesis gel de agarosa y luego secuenciación (Figura 3 y Tabla 2 ). Las secuencias mostraron que todos los ORF, excepto ORF4b, tenían TRS anteriores. Por lo tanto, los ORF4b pueden ser traducidos de ARNm bicistrónicos. En RsYN1, se encontró un ARN subgenómico adicional a partir del interior del ORF3a a través de secuenciación, lo que llevó a un ORF3b único. Los árboles filogenéticos fueron construidos usando las secuencias aa de RdRp y S de BtCoV/Rh/YN2012 y otras CoVs representativas (Figura 4). En ambos árboles, todos los BtCoV/Rh/YN2012 fueron agrupados juntos y formaron un linaje distinto a otras especies conocidas del corona Dentro de BtCoV/Rh/YN2012 se observaron dos sublineamientos distintos.Uno fue de Ra muestreado en Guangdong, mientras que el otro fue de Rs muestreado en Yunnan Entre las cepas de Yunnan, RsYN2 y RsYN3 fueron agrupadas juntas, mientras que RsYN1 fue aislado. La topología de estas cuatro cepas fue correlacionada con el lugar de muestreo. Las ramas relativamente largas reflejan una alta diversidad entre estas cepas, lo que indica una larga evolución independiente. Los árboles filogenéticos fueron construidos usando las secuencias aa de RdRp y S de BtCoV/Rh/YN2012 y otras CoV representativas (Figura 4). En ambos árboles, todos BtCoV/Rh/YN2012 fueron agrupados y formaron un linaje distinto a otras especies conocidas de coronavirus. Dentro de BtCoV/Rh/YN2012 se observaron dos sublineamientos distintos.Uno fue de Ra muestreado en Guangdong, mientras que el otro fue de Rs muestreado en Yunnan Entre las cepas de Yunnan, RsYN2 y RsYN3 fueron agrupadas juntas, mientras que RsYN1 fue aislado. La topología de estas cuatro cepas fue correlacionada con el lugar de muestreo. Las ramas relativamente largas reflejan una alta diversidad entre estas cepas, lo que indica una larga evolución independiente. Los árboles filogenéticos fueron construidos usando las secuencias aa de RdRp y S de BtCoV/Rh/YN2012 y otras CoV representativas (Figura 4). En ambos árboles, todos BtCoV/Rh/YN2012 fueron agrupados y formaron un linaje distinto a otras especies conocidas de coronavirus. En BtCoV/Rh/YN2012 se observaron dos sublineamientos distintos, uno de Ra en Guangdong, mientras que el otro de Rs en Yunnan Entre las cepas de Yunnan, RsYN2 y RsYN3 se agruparon, mientras que RsYN1 se aisló. La topología de estas cuatro cepas se correlacionó con el lugar de muestreo. Las ramas relativamente largas reflejan una gran diversidad entre estas cepas, lo que indica un largo historial de evolución independiente. Las ratios Ka/Ks (Ks es el número de sustituciones sinónimos por sitios sinónimos y Ka es el número de sustituciones no sinónimos por sitio sinónimos) fueron calculadas para todos los genes. Las ratios Ka/Ks para la mayoría de los genes fueron generalmente bajas, lo que indica que estos genes estaban bajo selección purificada. Sin embargo, las ratios Ka/Ks de ORF4a, ORF4b y ORF9 (0,727, 0,623 y 0,843, respectivamente) fueron significativamente más altas que las de otros ORFs (Tabla 4 ). Para la evaluación de la presión de selección adicional del gen ORF4a y ORF4b, secuenciamos otros cuatro genes ORF4a y ORF4b (estreno Rs4223, Rs4236, Rs4240 y Ra13576 se mostró en la Figura 1B Como SARS-CoV ORF7a fue reportado para inducir apoptosis, realizamos análisis de apoptosis en BtCoV/Rh/YN 2012 ORF9, a~30% aa homólogo de identidad de SARSr-CoV ORF7a. Transfectamos transitoriamente ORF9 de BtCoV/Rh/YN2012 a células HEK293T para examinar si esta ORF9 desencadena apoptosis. Se realizó Western blot para confirmar la expresión de ORF9 y SARS-CoV ORF7a (Figura S1). ORF9 no pudo inducir apoptosis como la ORF7a de SARS-CoV Tor2 (Figura S2). Los resultados indicaron que BtCoV/Rh/YN2012 ORF9 no estuvo involucrado en la inducción de la apoptosis. Para determinar si estas proteínas accesorias modulan la inducción de IFN, transfectamos plasmidos reporteros (pIFNβ-Luc y pRL-TK) y plasmidos de expresión a células 293T. Todas las células que sobreexpresaban los genes accesorios, así como el virus influenza NS1 (tramo PR8), HBoV VP2, o el vector vacío fueron probados para la actividad de luciferasa después de la infección por SeV. La actividad luciferasa estimulada por SeV fue notablemente superior a la esperada sin tratamiento con SeV. El virus influenza NS1 inhibe la expresión del promotor de IFN, mientras que HBoV VP2 activa la expresión. En comparación con esos controles, las proteínas ORF4a exhiben un efecto activo como HBoV VP2 (Figura 5A ). Otras proteínas accesorias no mostraron ningún efecto en la producción de IFN (Figura S3 ). La expresión de estos genes accesorios fue confirmada por Western blot (Figura S1 ). fue notablemente mayor que sin tratamiento con SeV como se esperaba. El virus influenza En comparación con estos controles, las proteínas ORF4a presentan un efecto activo como HBoV VP2 (Figura 5A ). Otras proteínas accesorias no mostraron ningún efecto en la producción de IFN (Figura S3 ). La expresión de estos genes accesorios fue confirmada por Western blot (Figura S1 ). Las muestras fueron recolectadas a las 6 h de postinfección, seguidas por el ensayo de doble luciferasa. Los resultados fueron expresados como el valor luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la lucifera de la Las células 293T fueron transfectadas con 100 ng pNF-B-Luc, 10 ng pRL-TK, vector vacío (500 ng), un plásmido NS1 que expresaba (500 ng), un plásmido ORF7a de expresión SARS-CoV (500 ng), o plásmidos ORF3a de expresión ORF (500 ng). Después de 24 h, las células fueron tratadas con TNF-α. La actividad de la doble luciferasa se determinó después de 6 h. Los resultados se expresaron como la actividad de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la Los asteriscos indican diferencias significativas entre los grupos (en comparación con el vector-NC vacío, p < 0,05, según lo determinado por la prueba t del estudiante). NF-B juega un papel importante en la regulación de la respuesta inmune a la infección viral y es también un factor clave frecuentemente dirigido por virus para hacerse cargo de la célula huésped. En este estudio, se probó si estas proteínas accesorias podían modular las células NF-B. 293T fueron cotransfectadas con reportero Las muestras fueron recolectadas a 6 h de postinfección, seguidas de ensayo de doble luciferasa. Los resultados se expresaron como el valor de luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la lucifera de la lucifera de la lucifera de la lucifera de la lucifera de la lu Las células 293T fueron transfectadas con 100 ng pNF-B-Luc, 10 ng pRL-TK, vector vacío (500 ng), un plásmido NS1 que expresaba (500 ng), un plásmido ORF7a de expresión SARS-CoV (500 ng), o plásmidos ORF3a de expresión ORF (500 ng). Después de 24 h, las células fueron tratadas con TNF-α. La actividad de la doble luciferasa se determinó después de 6 h. Los resultados se expresaron como la actividad de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la Los asteriscos indican diferencias significativas entre los grupos (en comparación con el vector-NC vacío, p < 0,05, según lo determinado por la prueba t del estudiante). El NF-B desempeña un papel importante en la regulación de la respuesta inmunitaria a la infección viral y es también un factor clave frecuentemente dirigido por virus para hacerse cargo de la célula huésped. En este estudio, probamos si estas proteínas accesorias podían modular las células NF-B. 293T fueron cotransfectadas con plásmidos reporteros (pNF-B-Luc y pRL-TK), así como los plasmidos o controles de expresión de proteínas accesorios (vector vacío, NS1, SARS-CoV Tor2-ORF7a). Las células fueron tratadas con TNF-α durante 6 h a 24 h después de la transfección. Se determinó la actividad luciferasa. RsYN1-ORF3a y RaGD-ORF3a activaron NF-B como SARS-CoV ORF7a, mientras que RsYN2-ORF3a inhibió NF-B como NS1 (Figura 5B ). Las expresiones de ORF3as fueron confirmadas con Western blot (Figura S1 ). Otras proteínas accesorias no modularon la producción de NF-B (Figura S4 ). Para comprender la infectividad de estos nuevos BtCoV/Rh/YN2012, seleccionamos las proteínas de pico RsYN1, RsYN3 y RaGD para estudios de entrada de pseudovirus mediados por picos. Tanto el análisis de manchas occidentales como la observación de microscopía electrónica de mancha negativa confirmaron con éxito la preparación de BtCoV/Rh Un total de 11 líneas celulares humanas, 8 células de murciélagos y otras 9 líneas celulares de mamíferos fueron probadas, y no se encontró ningún fuerte positivo (Tabla S2). En este estudio, una nueva especie alfa-CoV, BtCoV/Rh/YN2012, fue identificada en dos especies Rhinolophus. Las 4 cepas con genoma de largo alcance fueron secuencias. Los 7 dominios de replicación conservados de estos virus poseían una identidad secuencial <90% aa a los de otros alfa-CoV conocidos, lo que define una nueva especie de acuerdo con el estándar de taxonomía ICTV [42]. Estos nuevos alfa-CoV mostraron una alta diversidad genética en sus genes estructurales y no estructurales. La cepa RaGD de R. affinis, recolectada en la provincia de Guangdong, formó una rama independiente divergente de las otras 3 cepas de R. sinicus, muestreadas en la provincia de Yunnan, indicando un proceso de evolución independiente asociado con el aislamiento geográfico y la restricción del huésped. Aunque recolectadas de la misma provincia, estas tres cepas de virus formaron dos genotipos correlacionados con lugares de muestreo. Estos dos genotipos tenían una baja identidad de secuencia del genoma, especialmente en el gen S y genes accesorios. Teniendo en cuenta la ubicación geográfica remota del hábitat del murciélago huésped, el tropismo anfitrión y la diversidad del virus, suponemos que BtCoV/Rh/YN2012 puede haberse diseminado en estas dos provincias con una larga historia de circulación en su reservorio natural, los murciélagos Rhinolophus. Con la evidencia de secuencia, suponemos que En primer lugar, se identificaron nuevos genes accesorios, que no tenían homólogos en los genomas. En segundo lugar, se encontraron múltiples TRS entre los genes S y E, mientras que otros alfacoronavirus solo tenían un TRS allí. Estos TRS preceden a ORF3a, ORF3b (sólo en RsYN1) y ORF4a/b respectivamente. En tercer lugar, el gen accesorio ORF9 mostró homología con los de otras especies conocidas de CoV en otro género de coronavirus, especialmente con genes accesorios de SRASr-CoV. Los genes accesorios suelen estar involucrados en interacciones virus-anfitriones durante la infección por CoV [43]. En la mayoría de los CoVs, los genes accesorios son dispensables para la replicación del virus. Sin embargo, se requirió un gen 3c intacto de felina CoV para la replicación viral en el intestino [44] [45] [4 La supresión de los genes específicos del género en el virus de la hepatitis del ratón llevó a una reducción de la virulencia [47]. SARS-CoV ORF7a, que fue identificado como involucrado en la supresión del silenciamiento del ARN [48], inhibición de la síntesis de proteínas celulares [49], bloqueo del ciclo celular [50], e inducción de la apoptosis [51, 52]. En este estudio, encontramos que BtCoV/Rh/YN2012 ORF9 comparte ~ 30% aa identidad secuencial con SARS-CoV ORF7a. Curiosamente, BtCoV/Rh/YN2012 y SRASr-CoV fueron detectados en R. sinicus de la misma cueva. Suponemos que el SARS-CoV y el BtCoV/Rh/YN2012 pueden haber adquirido ORF7a o ORF9 de un ancestro común a través de la recombinación del genoma o la transferencia horizontal de genes. Mientras que el ORF9 de BtCoV/Rh/YN2012 no indujo la apoptosis ni activaron la producción de NF-Karabaj, estas diferencias pueden ser inducidas por la evolución divergente de estas proteínas en diferentes presiones. Aunque diferentes BtCoV/Rh/YN2012 ORF4a comparten < 64,4% de identidad de aminoácidos, todos ellos podrían activar IFN-β. El ORF3a de RsYN1 y RaGD incrementan la patogenicidad del virus con una vía diferente. A pesar de la falta de líneas celulares intestinales del huésped natural de BtCoV/Rh/YN2012, examinamos el tropismo celular de su proteína de pico a través de la entrada de retrovirus pseudotipados con líneas celulares humanas, murciélagos y otras células de mamíferos. La mayoría de las líneas celulares examinadas fueron insospechables a BtCoV/Rh/YN2012, lo que indica un bajo riesgo de transmisión de interespecies a humanos y otros animales. Múltiples razones pueden conducir a una infección fallida del sistema retrovirus de pico de coronavirus-pseudotipo, incluyendo ausencia de receptor en células diana, reconocimiento fallido al homólogo receptor de especies no huésped, mala adaptación en células no huésped durante la maduración de pico o entrada de virus, o la limitación del sistema retrovirus en la entrada de coronavirus estimulante. La débil infectividad del retrovirus pseudotipado RsYN1 en células Huh-7 podría explicarse por la unión de la proteína de pico a polisacárido secretada a la superficie. La suposición debe ser confirmada por experimentos. Nuestras vigilancias a largo plazo sugieren que los murciélagos Rhinolophus parecen albergar una amplia diversidad de CoVs. Coincidentemente, los dos agentes altamente patógenos, SRAS-CoV y Rh-BatCoV HKU2 ambos se originaron de murciélagos Rhinolophus. Teniendo en cuenta la diversidad de CoVs transportados por este género de murciélagos y su amplia distribución geográfica, puede haber un bajo riesgo de derrame de estos virus a otros animales y humanos. Vigilanciaes a largo plazo y estudios de patogénesis ayudarán a prevenir futuras enfermedades humanas y animales causadas por estos murciélagos CoVs. Materiales complementarios: Los siguientes están disponibles en línea en http://www.mdpi.com/1999-4915/11/4/379/s1, Figura S1 : análisis de manchas occidentales de la expresión de proteínas accesorias. Figura S2 : análisis de Apoptosis de proteínas ORF9 de BtCoV/Rh/YN2012. Figura S3 : análisis funcional de proteínas ORF3a, ORF3b, ORF4b, ORF8 y ORF9 en la producción de interferón de tipo I. Figura S4 : análisis funcional de ORF3b, ORF4a, ORF4b, ORF8 y ORF9 en la producción de NF- Tabla S2 : Primeros para la detección de ARNm sugbenómicos virales. Tabla S3

¿Cuándo se recogieron las muestras fecales?

Caracterización de un nuevo miembro del alfacoronavirus con características genómicas únicas en los murciélagos de Rhinolophushttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6521148/SHA: ee14de143337eec0e9708f8139bfac2b7b8fdd27Autores: Wang, Ning; Luo, Chuming; Liu, Haizhou; Yang, Xinglou; Hu, Ben; Zhang, Wei; Li, Bei; Zhu, Yan; Zhu, Guangjian; Shen, Xurui; Peng, Cheng; Shi, ZhengliFecha: 2019-04-24DOI: 10.3390/v11040379Licencia: cc-byAbstract: Los murciélagos han sido identificados como Varios de ellos han causado enfermedades en humanos y animales domésticos por transmisión de interespecies. Teniendo en cuenta la diversidad de coronavirus de murciélagos, especies de murciélagos y poblaciones, esperamos descubrir más CoV de murciélagos a través de la vigilancia del virus. En este estudio, describimos un nuevo miembro de alfaCoV (BtCoV/Rh/YN2012) en murciélagos con características únicas del genoma. Se encontraron genes accesorios únicos, ORF4a y ORF4b entre el gen de pico y el gen de sobre, mientras que el gen ORF8 se encontró aguas abajo del gen nucleocápsido. Todos los genes putativos fueron confirmados por análisis de transcripción inversa. Un gen único en el 3’ final del genoma BtCoV/Rh/YN2012, ORF9, muestra ~30% identidad de aminoácidos a ORF7a del corona El análisis funcional mostró que la proteína ORF4a puede activar la producción de IFN-β, mientras que ORF3a puede regular la producción de NF-B. También examinamos la entrada de virus mediados por picos utilizando el sistema de retrovirus pseudotipados, aunque no encontramos células totalmente permisivas. Nuestros resultados amplían el conocimiento sobre la diversidad genética de los coronavirus de murciélagos. La exploración continua de virus de murciélagos nos ayudará a entender más el importante papel que desempeñan los murciélagos en la evolución y transmisión del coronavirus. Texto: Los miembros de la familia Coronaviridae son virus de ARN de cadena positiva no segmentados con tamaños de genoma que van desde 26-32 kb [1]. Estos virus se clasifican en dos subfamilias: Letovirinae, que contiene el único género: Alphaletovirus; y Orthocoronavirinae (CoV), que consiste en alfa, beta, gamma y deltacoronavirus (CoVs) [2, 3]. Alfa y betacoronavirus infectan principalmente mamíferos y causan enfermedades humanas y animales. Gamma-y delta-CoVs infectan principalmente aves, pero algunos también pueden infectar mamíferos [4, 5]. Se sabe que seis CoVs humanos (HCoVs) causan enfermedades humanas. HCoV-HKU1, HCoV-OC43, HCoV-229E y HCoV-NL63 suelen causar enfermedades respiratorias leves o infecciones asintomáticas; sin embargo, el síndrome respiratorio agudo grave coronavirus (SARS-CoV) y todos los procedimientos de muestreo fueron realizados por veterinarios, con la aprobación del Comité de Ética Animal del Instituto de Virología Wuhan (WIVH5210201). El estudio se llevó a cabo de acuerdo con la Guía para el cuidado y uso de mamíferos silvestres en la investigación de la República Popular China. Las muestras de hisopos fecales y pellets de murciélagos se recolectaron de noviembre de 2004 a noviembre de 2014 en diferentes estaciones en el sur de China, como se describió anteriormente [16]. El ARN viral se extrajo de 200 μL de muestras de hisopos fecales o pellets utilizando el kit de A El ARN fue eludido en 50 μL de tampón de elución, alícuota, y almacenado en -80 • C. Se empleó PCR (Invitrogen, San Diego, CA, EE.UU.) de hemi-nedificado en un solo paso para detectar el coronavirus, como se describió anteriormente [17, 18]. Para confirmar la especie de murciélago de una muestra individual, nosotros PCR amplificamos el citocromo b (Cytob) y/o el gen de la subunidad 1 (ND1) de la deshidrogenasa NADH utilizando ADN extraído de las heces o hisopos [19, 20]. Las secuencias genéticas fueron ensambladas excluyendo las secuencias de imprimación. BLASTN fue utilizado para identificar especies de huésped basadas en las secuencias más estrechamente relacionadas con la mayor cobertura de consulta y una identidad mínima del Las secuencias genómicas completas fueron determinadas por PCR de un solo paso (Invitrogen, San Diego, CA, USA) amplificación con imprimaciones degeneradas (Tabla S1) diseñadas sobre la base de múltiples alineaciones de secuencias alfa-CoV disponibles depositadas en GenBank o amplificadas con SuperScript IV Transcriptasa Reversa (Invitrogen) y Expand Long Template PCR System (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) con imprimaciones específicas (secuencias primarias están disponibles bajo petición). Las secuencias de los extremos genómicos 5' y 3' fueron obtenidas por amplificación rápida de 5' y 3' de los extremos de cDNA (SMARTE Viruses 2019, 11, 379 3 de 19 RACE 5'/3' Kit; Clontech, Mountain View, CA, USA), respectivamente. Los productos PCR fueron Los productos PCR de más de 5kb fueron sometidos a secuenciación profunda utilizando el sistema Hiseq2500. Para algunos fragmentos, los productos PCR fueron clonados en el pGEM-T Easy Vector (Promega, Madison, WI, USA) para secuenciación. Al menos cinco clones independientes fueron secuenciados para obtener una secuencia de consenso. Los datos de la secuenciación de la siguiente generación (NGS) fueron filtrados y mapeados a la secuencia de referencia de BatCoV HKU10 (número de adhesión de GenBank NC_018871) usando Geneious 7.1.8 [21]. Los genomas fueron ensamblados preliminarmente usando DNAStar lasergene V7 (DNAStar, Madison, WI, USA). Se predijeron marcos de lectura abierta (ORF) Putativos utilizando el buscador de ORF de NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ orffinder/) con una longitud mínima de 150 nt, seguido de una inspección manual. Se definieron las secuencias de la región 5' no traducida (5'-UTR) y 3'-UTR, y la secuencia líder, la secuencia reguladora de transcripción corporal y líder (TRS) fueron identificadas como previamente descritas [22]. La escisión de las 16 proteínas no estructurales codificadas por ORF1ab fue determinada por la alineación de secuencias aa de otras CoVs y el patrón de reconocimiento de la proteinasasa 3C y la proteinasasa similar a la papaína. Los árboles filogenéticos basados en secuencias nt o aa fueron construidos utilizando el algoritmo de máxima probabilidad con valores de bootstrap determinados por 1000 réplicas en el paquete de software MEGA 6 [23]. Las secuencias de genoma de larga duración obtenidas en este estudio fueron alineadas con las de alfa-CoVs previamente reportadas usando MUSCLE [24]. Las secuencias alineadas fueron escaneadas para eventos de recombinación mediante el Programa de Detección de Recombinación [25]. Los eventos potenciales de recombinación como sugieren los fuertes p-valores (<10 -20 ) fueron confirmados mediante diagrama de similitud y análisis bootscan implementados en Simplot 3.5.1 [26]. El número de sustituciones sinónimas por sitio sinónimas, Ks, y el número de sustituciones sinónimas por sitio sinónimas, Ka, para cada región de codificación, se calcularon utilizando la herramienta de cálculo Ka/Ks de la Plataforma Norwegian Bioinformática (http://services.cuib.no/tools/kaks) con parámetros por defecto [27]. La detección de homología de proteínas se analizó utilizando HHpred (https://toolkit.tuebingen.mpg.de/#/tools/hpred) con parámetros por defecto [28]. Se utilizó un conjunto de RT-PCRs anidados para determinar la presencia de mRNA subgenómica viral en las muestras positivas de CoV [29]. Los imprimadores delanteros se diseñaron con la secuencia líder al Células primarias de murciélago o inmortalizadas (Rhinolophus sinicus riñón inmortalizado, RsKT; Rhinolophus sinicus células primarias de pulmón, RsLu4323; Rhinolophus sinicus cerebro inmortalizado, RsBrT; Rhinolophus affinis células primarias de riñón, RaK4324; Rousetus leschenaultii células inmortalizadas de riñón, RlKT; Hipposideros pratti células inmortalizadas de pulmón, HpLuT) generadas en nuestro laboratorio fueron cultivadas en DMEM/F12 con 15% FBS. Las células renales de Pteropus alecto (Paki) se mantuvieron en DMEM/F12 complementadas con 10% FBS. Otras células fueron mantenidas según las recomendaciones de American Type Culture Collection (ATCC, www.atcc.org). Los genes accesorios putativos del virus recién detectado fueron generados por RT-PCR a partir de ARN viral extraído de muestras fecales, como se describió anteriormente [30]. El plásmido del virus influenza NS1 fue generado en nuestro laboratorio [31]. El bocavirus humano (HBoV) VP2 plásmido fue amablemente proporcionado por el prof. Hanzhong Wang del Instituto de Virología Wuhan, Academia China de Ciencias. SRAS-CoV ORF7a fue sintetizado por Sangon Biotech. Las transfecciones fueron realizadas con Lipofectamine 3000 Reagent (Life Technologies). La expresión de estos genes accesorios fue analizada por Western blotting usando un mAb (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim Brevemente, el sobrenadante fecal fue adquirido mediante centrifugación de gradiente y luego agregado a las células Vero E6, 1:10 diluidas en DMEM. Después de la incubación a 37°C durante 1 h el inóculo fue reemplazado por DMEM fresco que contenía 2% FBS y el antibiótico antimicótico (Gibco, Grand Island, NY, EE.UU.). Se realizaron tres pasajes ciegos. Las células fueron revisadas diariamente para detectar el efecto citopático. Tanto el sobrenadante de cultivo como el pellet celular fueron examinados para CoV por RT-PCR [17]. La Apoptosis fue analizada como se describió previamente [18]. Brevemente, las células 293T en placas de 12 pocillos fueron transfectadas con 3 μg de plasma de expresión o vector vacío, y las células fueron recolectadas 24 h después de la transfección La apoptosis fue detectada por citometría de flujo utilizando el kit de detección de apoptosis V-FITC/PI de la anexina (YEASEN, Shanghai, China) siguiendo las instrucciones del fabricante.Células anexina-V-positivas y IP-negativas se consideraron en la fase apoptótica temprana y se consideró que las teñidas para la apoptosis o necrosis tardía de la anexina V y la IP se sometieron a apoptosis o necrosis tardía.Todos los experimentos se repitieron tres veces. Las células HEK 293T fueron sembradas en placas de 24 pocillos y luego cotransfectadas con plásmidos reporteros (pRL-TK y pIFN-βIFN-o pNF-B-Luc) [30], así como plásmidos que expresan genes accesorios, plásmidos vectoriales vacíos pcAGGS, virus influenza NS1 [32], SARS-CoV ORF7a [33], o HBoV VP2 [34]. A las 24 h después de la transfección, las células fueron tratadas con el virus Sendai (SeV) (100 unidades de hemaglutinina [HAU]/ml) o el factor de necrosis tumoral humano alfa (TNF-α; sistema R&D) durante 6 h para activar IFNβ o NF- Se prepararon lisatos celulares y se midió la actividad de luciferasa utilizando el kit de ensayo de doble luciferasa (Promega, Madison, WI, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utilizaron retrovirus pseudotipados con BtCoV/Rh/YN2012 RsYN1, RsYN3, RaGD, o pico MERS-CoV, o ningún pico (mock) para infectar células humanas, murciélagos u otras células de mamíferos en placas de 96 pozos. Las partículas de pseudovirus fueron confirmadas con electromicroscopía de borrado occidental y de mancha negativa. El proceso de producción, mediciones de infección y actividad de luciferasa se llevaron a cabo, como se describió anteriormente [35, 36]. Las secuencias nucleótidas del genoma completo de las cepas BtCoV/Rh/YN2012 RsYN1, RsYN2, RsYN3, y RaGD obtenidas en este estudio han sido sometidas al GenBank bajo MG916901 a MG916904. La vigilancia se realizó entre noviembre de 2004 y noviembre de 2014 en 19 provincias de China. En total, se recolectaron 2061 muestras fecales de al menos 12 especies de murciélago Rhinolophus (Figura 1A ). Se detectaron COVs en 209 de estas muestras (Figura 1B y Tabla 1 ). Cinco de estos virus están relacionados con especies conocidas: Mi-BatCoV 1 (> 94% nt identity), Mi-BatCoV HKU8 [37] (> 93% nt identity), BtRf-AlphaCoV/HuB2013 [11] (> 99% nt identity), SRASr-CoV [38] (> 89% nt identity) y HKU2 related CoV [39] (> 85% nt identity). Mientras que las otras tres secuencias de CoV mostraron menos de 83% nt identity a especies conocidas de CoV. Estos tres virus deben representar nuevas especies de CoV. El aislamiento del virus se realizó como se describió previamente [12], pero no tuvo éxito. identidad). Mientras que las otras tres secuencias de CoV mostraron menos de 83% nt identity a especies conocidas de CoV. Estos tres virus deben representar nuevas especies A continuación caracterizamos una novela alfa-CoV, BtCoV/Rh/YN2012. Fue detectada en 3 R.affinis y 6 R.sinicus, respectivamente. Con base en las secuencias, definimos tres genotipos, que fueron representados por RsYN1, RsYN3, y RaGD, respectivamente. Strain RsYN2 fue clasificado en el genotipo RsYN3. Se obtuvieron cuatro genomas de longitud completa. Tres de ellos fueron de R.sinicus (Strain RsYN1, RsYN2 y RsYN3), mientras que el otro fue de R.affinis (Strain RaGD). Los tamaños de estos 4 genomas son entre 28.715 y 29.102, con contenidos de G+C entre el 39,0% y el 41,3%. Los genomas presentan estructuras similares y secuencias reguladoras de transcripción (TRS) que son idénticas a las de otros alfa-CoVs (Figura 2 y Tabla 2). Se observaron excepciones incluyendo tres ORF adicionales (ORF3b, ORF4a y ORF4b). Todas las 4 cepas tienen ORF4a y ORF4b, mientras que sólo la cepa RsYN1 tiene ORF3b. El gen de réplicas, ORF1ab, ocupa~20.4 kb del genoma. El gen de réplicas, ORF1ab, ocupa~20.4 kb del genoma. Codifica las poliproteínas 1a y 1ab, las cuales podrían separarse en 16 proteínas no estructurales (Nsp1-Nsp16). El 3'-fin de los sitios de escote reconocidos por la proteinasa similar a 3C (Nsp4-Nsp10, Nsp12-Nsp16) y la proteinasa similar a papaína (Nsp1-Nsp3) fueron confirmados. Las proteínas incluyendo Nsp3 (papain-like 2 proteas, PL2pro), Nsp5 (quimotripsina-like proteasa, 3CLpro), Nsp12 (RdRp), Nsp13 (helicase), y otras proteínas de función desconocida (Tabla 3 ). Los 7 dominios concatenados de poliproteína 1 comparten la identidad de secuencia <90% aa con los de otros alfa-CoV conocidos (Tabla 2 ), sugiriendo que estos virus representan una nueva especie de CoV dentro de la alfa-CoV. Las especies de CoV más cercanas asignadas a BtCoV/Rh/YN2012 son BtCoV-HKU10 y BtRf-AlphaCoV/Hub2013. Las tres cepas de la provincia de Yunnan fueron agrupadas en dos genotipos (83% identidad del genoma) correlacionados con su localización de muestreo. El tercer genotipo representado por la cepa RaGD fue aislado a las cepas encontradas en Yunnan (<75,4% identidad del genoma). Luego examinamos los genes individuales (Tabla 2). Todos los genes mostraron una baja identidad de secuencia aa a CoV conocidos. Las cuatro cepas de BtCoV/Rh/YN2012 mostraron diversidad genética entre todos los genes diferentes excepto ORF1ab (>83,7% aa identidad). Cabe destacar que las proteínas de pico son muy divergentes entre estas cepas. Otras proteínas de estructura (E, M La comparación de los genes accesorios entre estas cuatro cepas reveló que las cepas del mismo genotipo compartían un ORF3a 100% idéntico. Sin embargo, las proteínas codificadas por ORF3as eran altamente divergentes entre los diferentes genotipos (<65% aa identity). Los genes accesorios putativos también fueron BLASTed contra los registros de GenBank. La mayoría de los genes accesorios no tienen homólogos en GenBank-database, excepto ORF3a (52,0-55,5% aa identity with BatCoV HKU10 ORF3) y ORF9 (28,1-32,0% aa identity with SARSr-CoV ORF7a). Analizamos la homología proteica con el software HHpred. Los resultados mostraron que ORF9s y SARS-CoV OR7a son homólogos (posibilidad: 100%, Para confirmar la presencia de ARN subgenómico, diseñamos un conjunto de imprimaciones dirigidas a todos los ORF predichos como se describe. Los amplicones fueron confirmados primero a través de electroforesis de agarosa-gel y luego secuenciación (Figura 3 y Tabla 2 ). Las secuencias mostraron que todos los ORFs, excepto ORF4b, tenían un TRS anterior. Por lo tanto, el ORF4b puede ser traducido a partir de mRNAs bicistrónicos. En RsYN1, se encontró un ARN subgenómico adicional a partir del interior del ORF3a a través de la secuenciación, lo que llevó a un ORF3b único. Para confirmar la presencia de ARN subgenómico, diseñamos un conjunto de imprimaciones dirigidas a todos los ORFs predichos como se describe. Los amplicones fueron confirmados primero a través de electroforesis gel de agarosa y luego secuenciación (Figura 3 y Tabla 2 ). Las secuencias mostraron que todos los ORF, excepto ORF4b, tenían TRS anteriores. Por lo tanto, los ORF4b pueden ser traducidos de ARNm bicistrónicos. En RsYN1, se encontró un ARN subgenómico adicional a partir del interior del ORF3a a través de secuenciación, lo que llevó a un ORF3b único. Los árboles filogenéticos fueron construidos usando las secuencias aa de RdRp y S de BtCoV/Rh/YN2012 y otras CoVs representativas (Figura 4). En ambos árboles, todos los BtCoV/Rh/YN2012 fueron agrupados juntos y formaron un linaje distinto a otras especies conocidas del corona Dentro de BtCoV/Rh/YN2012 se observaron dos sublineamientos distintos.Uno fue de Ra muestreado en Guangdong, mientras que el otro fue de Rs muestreado en Yunnan Entre las cepas de Yunnan, RsYN2 y RsYN3 fueron agrupadas, mientras que RsYN1 fue aislado. La topología de estas cuatro cepas fue correlacionada con el lugar de muestreo. Las ramas relativamente largas reflejan una alta diversidad entre estas cepas, lo que indica una larga evolución independiente. Los árboles filogenéticos fueron construidos usando las secuencias aa de RdRp y S de BtCoV/Rh/YN2012 y otras CoV representativas (Figura 4). En ambos árboles, todos BtCoV/Rh/YN2012 fueron agrupados y formaron un linaje distinto a otras especies conocidas de coronavirus. Dentro de BtCoV/Rh/YN2012 se observaron dos sublineamientos distintos.Uno fue de Ra muestreado en Guangdong, mientras que el otro fue de Rs muestreado en Yunnan Entre las cepas de Yunnan, RsYN2 y RsYN3 fueron agrupadas, mientras que RsYN1 fue aislado. La topología de estas cuatro cepas fue correlacionada con el lugar de muestreo. Las ramas relativamente largas reflejan una alta diversidad entre estas cepas, lo que indica una larga evolución independiente. Los árboles filogenéticos fueron construidos usando las secuencias aa de RdRp y S de BtCoV/Rh/YN2012 y otras CoV representativas (Figura 4). En ambos árboles, todos BtCoV/Rh/YN2012 fueron agrupados y formaron un linaje distinto a otras especies conocidas de coronavirus. En BtCoV/Rh/YN2012 se observaron dos sublineamientos distintos, uno de Ra en Guangdong, mientras que el otro de Rs en Yunnan Entre las cepas de Yunnan, RsYN2 y RsYN3 se agruparon, mientras que RsYN1 se aisló. La topología de estas cuatro cepas se correlacionó con el lugar de muestreo. Las ramas relativamente largas reflejan una gran diversidad entre estas cepas, lo que indica un largo historial de evolución independiente. Las ratios Ka/Ks (Ks es el número de sustituciones sinónimos por sitios sinónimos y Ka es el número de sustituciones no sinónimos por sitio sinónimos) fueron calculadas para todos los genes. Las ratios Ka/Ks para la mayoría de los genes fueron generalmente bajas, lo que indica que estos genes estaban bajo selección purificada. Sin embargo, las ratios Ka/Ks de ORF4a, ORF4b y ORF9 (0,727, 0,623 y 0,843, respectivamente) fueron significativamente más altas que las de otros ORFs (Tabla 4 ). Para la evaluación de la presión de selección adicional del gen ORF4a y ORF4b, secuenciamos otros cuatro genes ORF4a y ORF4b (estreno Rs4223, Rs4236, Rs4240 y Ra13576 se mostró en la Figura 1B Como SARS-CoV ORF7a fue reportado para inducir apoptosis, realizamos análisis de apoptosis en BtCoV/Rh/YN 2012 ORF9, a~30% aa homólogo de identidad de SARSr-CoV ORF7a. Transfectamos transitoriamente ORF9 de BtCoV/Rh/YN2012 a células HEK293T para examinar si esta ORF9 desencadena apoptosis. Se realizó Western blot para confirmar la expresión de ORF9 y SARS-CoV ORF7a (Figura S1). ORF9 no pudo inducir apoptosis como la ORF7a de SARS-CoV Tor2 (Figura S2). Los resultados indicaron que BtCoV/Rh/YN2012 ORF9 no estuvo involucrado en la inducción de la apoptosis. Para determinar si estas proteínas accesorias modulan la inducción de IFN, transfectamos plasmidos reporteros (pIFNβ-Luc y pRL-TK) y plasmidos de expresión a células 293T. Todas las células que sobreexpresaban los genes accesorios, así como el virus influenza NS1 (tramo PR8), HBoV VP2, o el vector vacío fueron probados para la actividad de luciferasa después de la infección por SeV. La actividad luciferasa estimulada por SeV fue notablemente superior a la esperada sin tratamiento con SeV. El virus influenza NS1 inhibe la expresión del promotor de IFN, mientras que HBoV VP2 activa la expresión. En comparación con esos controles, las proteínas ORF4a exhiben un efecto activo como HBoV VP2 (Figura 5A ). Otras proteínas accesorias no mostraron ningún efecto en la producción de IFN (Figura S3 ). La expresión de estos genes accesorios fue confirmada por Western blot (Figura S1 ). fue notablemente mayor que sin tratamiento con SeV como se esperaba. El virus influenza En comparación con estos controles, las proteínas ORF4a presentan un efecto activo como HBoV VP2 (Figura 5A ). Otras proteínas accesorias no mostraron ningún efecto en la producción de IFN (Figura S3 ). La expresión de estos genes accesorios fue confirmada por Western blot (Figura S1 ). Las muestras fueron recolectadas a las 6 h de postinfección, seguidas por el ensayo de doble luciferasa. Los resultados fueron expresados como el valor luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la lucifera de la Las células 293T fueron transfectadas con 100 ng pNF-B-Luc, 10 ng pRL-TK, vector vacío (500 ng), un plásmido NS1 que expresaba (500 ng), un plásmido ORF7a de expresión SARS-CoV (500 ng), o plásmidos ORF3a de expresión ORF (500 ng). Después de 24 h, las células fueron tratadas con TNF-α. La actividad de la doble luciferasa se determinó después de 6 h. Los resultados se expresaron como la actividad de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la Los asteriscos indican diferencias significativas entre los grupos (en comparación con el vector-NC vacío, p < 0,05, según lo determinado por la prueba t del estudiante). NF-B juega un papel importante en la regulación de la respuesta inmune a la infección viral y es también un factor clave frecuentemente dirigido por virus para hacerse cargo de la célula huésped. En este estudio, se probó si estas proteínas accesorias podían modular las células NF-B. 293T fueron cotransfectadas con reportero Las muestras fueron recolectadas a 6 h de postinfección, seguidas de ensayo de doble luciferasa. Los resultados se expresaron como el valor de luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la lucifera de la lucifera de la lucifera de la lucifera de la lucifera de la lu Las células 293T fueron transfectadas con 100 ng pNF-B-Luc, 10 ng pRL-TK, vector vacío (500 ng), un plásmido NS1 que expresaba (500 ng), un plásmido ORF7a de expresión SARS-CoV (500 ng), o plásmidos ORF3a de expresión ORF (500 ng). Después de 24 h, las células fueron tratadas con TNF-α. La actividad de la doble luciferasa se determinó después de 6 h. Los resultados se expresaron como la actividad de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la Los asteriscos indican diferencias significativas entre los grupos (en comparación con el vector-NC vacío, p < 0,05, según lo determinado por la prueba t del estudiante). El NF-B desempeña un papel importante en la regulación de la respuesta inmunitaria a la infección viral y es también un factor clave frecuentemente dirigido por virus para hacerse cargo de la célula huésped. En este estudio, probamos si estas proteínas accesorias podían modular las células NF-B. 293T fueron cotransfectadas con plásmidos reporteros (pNF-B-Luc y pRL-TK), así como los plasmidos o controles de expresión de proteínas accesorios (vector vacío, NS1, SARS-CoV Tor2-ORF7a). Las células fueron tratadas con TNF-α durante 6 h a 24 h después de la transfección. Se determinó la actividad luciferasa. RsYN1-ORF3a y RaGD-ORF3a activaron NF-B como SARS-CoV ORF7a, mientras que RsYN2-ORF3a inhibió NF-B como NS1 (Figura 5B ). Las expresiones de ORF3as fueron confirmadas con Western blot (Figura S1 ). Otras proteínas accesorias no modularon la producción de NF-B (Figura S4 ). Para comprender la infectividad de estos nuevos BtCoV/Rh/YN2012, seleccionamos las proteínas de pico RsYN1, RsYN3 y RaGD para estudios de entrada de pseudovirus mediados por picos. Tanto el análisis de manchas occidentales como la observación de microscopía electrónica de mancha negativa confirmaron con éxito la preparación de BtCoV/Rh Un total de 11 líneas celulares humanas, 8 células de murciélagos y otras 9 líneas celulares de mamíferos fueron probadas, y no se encontró ningún fuerte positivo (Tabla S2). En este estudio, una nueva especie alfa-CoV, BtCoV/Rh/YN2012, fue identificada en dos especies Rhinolophus. Las 4 cepas con genoma de largo alcance fueron secuencias. Los 7 dominios de replicación conservados de estos virus poseían una identidad secuencial <90% aa a los de otros alfa-CoV conocidos, lo que define una nueva especie de acuerdo con el estándar de taxonomía ICTV [42]. Estos nuevos alfa-CoV mostraron una alta diversidad genética en sus genes estructurales y no estructurales. La cepa RaGD de R. affinis, recolectada en la provincia de Guangdong, formó una rama independiente divergente de las otras 3 cepas de R. sinicus, muestreadas en la provincia de Yunnan, indicando un proceso de evolución independiente asociado con el aislamiento geográfico y la restricción del huésped. Aunque recolectadas de la misma provincia, estas tres cepas de virus formaron dos genotipos correlacionados con lugares de muestreo. Estos dos genotipos tenían una baja identidad de secuencia del genoma, especialmente en el gen S y genes accesorios. Teniendo en cuenta la ubicación geográfica remota del hábitat del murciélago huésped, el tropismo anfitrión y la diversidad del virus, suponemos que BtCoV/Rh/YN2012 puede haberse diseminado en estas dos provincias con una larga historia de circulación en su reservorio natural, los murciélagos Rhinolophus. Con la evidencia de secuencia, suponemos que En primer lugar, se identificaron nuevos genes accesorios, que no tenían homólogos en los genomas. En segundo lugar, se encontraron múltiples TRS entre los genes S y E, mientras que otros alfacoronavirus solo tenían un TRS allí. Estos TRS preceden a ORF3a, ORF3b (sólo en RsYN1) y ORF4a/b respectivamente. En tercer lugar, el gen accesorio ORF9 mostró homología con los de otras especies conocidas de CoV en otro género de coronavirus, especialmente con genes accesorios de SRASr-CoV. Los genes accesorios suelen estar involucrados en interacciones virus-anfitriones durante la infección por CoV [43]. En la mayoría de los CoVs, los genes accesorios son dispensables para la replicación del virus. Sin embargo, se requirió un gen 3c intacto de felina CoV para la replicación viral en el intestino [44] [45] [4 La supresión de los genes específicos del género en el virus de la hepatitis del ratón llevó a una reducción de la virulencia [47]. SARS-CoV ORF7a, que fue identificado como involucrado en la supresión del silenciamiento del ARN [48], inhibición de la síntesis de proteínas celulares [49], bloqueo del ciclo celular [50], e inducción de la apoptosis [51, 52]. En este estudio, encontramos que BtCoV/Rh/YN2012 ORF9 comparte ~ 30% aa identidad secuencial con SARS-CoV ORF7a. Curiosamente, BtCoV/Rh/YN2012 y SRASr-CoV fueron detectados en R. sinicus de la misma cueva. Suponemos que el SARS-CoV y el BtCoV/Rh/YN2012 pueden haber adquirido ORF7a o ORF9 de un ancestro común a través de la recombinación del genoma o la transferencia horizontal de genes. Mientras que el ORF9 de BtCoV/Rh/YN2012 no indujo la apoptosis ni activaron la producción de NF-Karabaj, estas diferencias pueden ser inducidas por la evolución divergente de estas proteínas en diferentes presiones. Aunque diferentes BtCoV/Rh/YN2012 ORF4a comparten < 64,4% de identidad de aminoácidos, todos ellos podrían activar IFN-β. El ORF3a de RsYN1 y RaGD incrementan la patogenicidad del virus con una vía diferente. A pesar de la falta de líneas celulares intestinales del huésped natural de BtCoV/Rh/YN2012, examinamos el tropismo celular de su proteína de pico a través de la entrada de retrovirus pseudotipados con líneas celulares humanas, murciélagos y otras células de mamíferos. La mayoría de las líneas celulares examinadas fueron insospechables a BtCoV/Rh/YN2012, lo que indica un bajo riesgo de transmisión de interespecies a humanos y otros animales. Múltiples razones pueden conducir a una infección fallida del sistema retrovirus de pico de coronavirus-pseudotipo, incluyendo ausencia de receptor en células diana, reconocimiento fallido al homólogo receptor de especies no huésped, mala adaptación en células no huésped durante la maduración de pico o entrada de virus, o la limitación del sistema retrovirus en la entrada de coronavirus estimulante. La débil infectividad del retrovirus pseudotipado RsYN1 en células Huh-7 podría explicarse por la unión de la proteína de pico a polisacárido secretada a la superficie. La suposición debe ser confirmada por experimentos. Nuestras vigilancias a largo plazo sugieren que los murciélagos Rhinolophus parecen albergar una amplia diversidad de CoVs. Coincidentemente, los dos agentes altamente patógenos, SRAS-CoV y Rh-BatCoV HKU2 ambos se originaron de murciélagos Rhinolophus. Teniendo en cuenta la diversidad de CoVs transportados por este género de murciélagos y su amplia distribución geográfica, puede haber un bajo riesgo de derrame de estos virus a otros animales y humanos. Vigilanciaes a largo plazo y estudios de patogénesis ayudarán a prevenir futuras enfermedades humanas y animales causadas por estos murciélagos CoVs. Materiales complementarios: Los siguientes están disponibles en línea en http://www.mdpi.com/1999-4915/11/4/379/s1, Figura S1 : análisis de manchas occidentales de la expresión de proteínas accesorias. Figura S2 : análisis de Apoptosis de proteínas ORF9 de BtCoV/Rh/YN2012. Figura S3 : análisis funcional de proteínas ORF3a, ORF3b, ORF4b, ORF8 y ORF9 en la producción de interferón de tipo I. Figura S4 : análisis funcional de ORF3b, ORF4a, ORF4b, ORF8 y ORF9 en la producción de NF- Tabla S2 : Primeros para la detección de ARNm sugbenómicos virales. Tabla S3

¿Qué genoma de referencia se utilizó en el estudio?

Caracterización de un nuevo miembro del alfacoronavirus con características genómicas únicas en los murciélagos de Rhinolophushttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6521148/SHA: ee14de143337eec0e9708f8139bfac2b7b8fdd27Autores: Wang, Ning; Luo, Chuming; Liu, Haizhou; Yang, Xinglou; Hu, Ben; Zhang, Wei; Li, Bei; Zhu, Yan; Zhu, Guangjian; Shen, Xurui; Peng, Cheng; Shi, ZhengliFecha: 2019-04-24DOI: 10.3390/v11040379Licencia: cc-byAbstract: Los murciélagos han sido identificados como Varios de ellos han causado enfermedades en humanos y animales domésticos por transmisión de interespecies. Teniendo en cuenta la diversidad de coronavirus de murciélagos, especies de murciélagos y poblaciones, esperamos descubrir más CoV de murciélagos a través de la vigilancia del virus. En este estudio, describimos un nuevo miembro de alfaCoV (BtCoV/Rh/YN2012) en murciélagos con características únicas del genoma. Se encontraron genes accesorios únicos, ORF4a y ORF4b entre el gen de pico y el gen de sobre, mientras que el gen ORF8 se encontró aguas abajo del gen nucleocápsido. Todos los genes putativos fueron confirmados por análisis de transcripción inversa. Un gen único en el 3’ final del genoma BtCoV/Rh/YN2012, ORF9, muestra ~30% identidad de aminoácidos a ORF7a del corona El análisis funcional mostró que la proteína ORF4a puede activar la producción de IFN-β, mientras que ORF3a puede regular la producción de NF-B. También examinamos la entrada de virus mediados por picos utilizando el sistema de retrovirus pseudotipados, aunque no encontramos células totalmente permisivas. Nuestros resultados amplían el conocimiento sobre la diversidad genética de los coronavirus de murciélagos. La exploración continua de virus de murciélagos nos ayudará a entender más el importante papel que desempeñan los murciélagos en la evolución y transmisión del coronavirus. Texto: Los miembros de la familia Coronaviridae son virus de ARN de cadena positiva no segmentados con tamaños de genoma que van desde 26-32 kb [1]. Estos virus se clasifican en dos subfamilias: Letovirinae, que contiene el único género: Alphaletovirus; y Orthocoronavirinae (CoV), que consiste en alfa, beta, gamma y deltacoronavirus (CoVs) [2, 3]. Alfa y betacoronavirus infectan principalmente mamíferos y causan enfermedades humanas y animales. Gamma-y delta-CoVs infectan principalmente aves, pero algunos también pueden infectar mamíferos [4, 5]. Se sabe que seis CoVs humanos (HCoVs) causan enfermedades humanas. HCoV-HKU1, HCoV-OC43, HCoV-229E y HCoV-NL63 suelen causar enfermedades respiratorias leves o infecciones asintomáticas; sin embargo, el síndrome respiratorio agudo grave coronavirus (SARS-CoV) y todos los procedimientos de muestreo fueron realizados por veterinarios, con la aprobación del Comité de Ética Animal del Instituto de Virología Wuhan (WIVH5210201). El estudio se llevó a cabo de acuerdo con la Guía para el cuidado y el uso de mamíferos silvestres en la investigación de la República Popular China. Las muestras de hisopos fecales y pellets de murciélagos se recolectaron de noviembre de 2004 a noviembre de 2014 en diferentes estaciones en el sur de China, como se describió anteriormente [16]. El ARN viral se extrajo de 200 μL de muestras de hisopos fecales o pellets utilizando el kit de El ARN fue eludido en 50 μL de tampón de elución, alícuota, y almacenado en -80 • C. Se empleó PCR (Invitrogen, San Diego, CA, EE.UU.) de hemi-nedificado en un solo paso para detectar el coronavirus, como se describió anteriormente [17, 18]. Para confirmar la especie de murciélago de una muestra individual, nosotros PCR amplificamos el citocromo b (Cytob) y/o el gen de la subunidad 1 (ND1) de la deshidrogenasa NADH utilizando ADN extraído de las heces o hisopos [19, 20]. Las secuencias genéticas fueron ensambladas excluyendo las secuencias de imprimación. BLASTN fue utilizado para identificar especies de huésped basadas en las secuencias más estrechamente relacionadas con la mayor cobertura de consulta y una identidad mínima del Las secuencias genómicas completas fueron determinadas por PCR de un solo paso (Invitrogen, San Diego, CA, USA) amplificación con imprimaciones degeneradas (Tabla S1) diseñadas sobre la base de múltiples alineaciones de secuencias alfa-CoV disponibles depositadas en GenBank o amplificadas con SuperScript IV Transcriptasa Reversa (Invitrogen) y Expand Long Template PCR System (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) con imprimaciones específicas (secuencias primarias están disponibles bajo petición). Las secuencias de los extremos genómicos 5' y 3' fueron obtenidas por amplificación rápida de 5' y 3' de los extremos de cDNA (SMARTE Viruses 2019, 11, 379 3 de 19 RACE 5'/3' Kit; Clontech, Mountain View, CA, USA), respectivamente. Los productos PCR fueron Los productos PCR de más de 5kb fueron sometidos a secuenciación profunda utilizando el sistema Hiseq2500. Para algunos fragmentos, los productos PCR fueron clonados en el pGEM-T Easy Vector (Promega, Madison, WI, USA) para secuenciación. Al menos cinco clones independientes fueron secuenciados para obtener una secuencia de consenso. Los datos de la secuenciación de la siguiente generación (NGS) fueron filtrados y mapeados a la secuencia de referencia de BatCoV HKU10 (número de adhesión de GenBank NC_018871) usando Geneious 7.1.8 [21]. Los genomas fueron ensamblados preliminarmente usando DNAStar lasergene V7 (DNAStar, Madison, WI, USA). Se predijeron marcos de lectura abierta (ORF) Putativos utilizando el buscador de ORF de NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ orffinder/) con una longitud mínima de 150 nt, seguido de una inspección manual. Se definieron las secuencias de la región 5' no traducida (5'-UTR) y 3'-UTR, y la secuencia líder, la secuencia reguladora de transcripción corporal y líder (TRS) fueron identificadas como previamente descritas [22]. La escisión de las 16 proteínas no estructurales codificadas por ORF1ab fue determinada por la alineación de secuencias aa de otras CoVs y el patrón de reconocimiento de la proteinasasa 3C y la proteinasasa similar a la papaína. Los árboles filogenéticos basados en secuencias nt o aa fueron construidos utilizando el algoritmo de máxima probabilidad con valores de bootstrap determinados por 1000 réplicas en el paquete de software MEGA 6 [23]. Las secuencias de genoma de larga duración obtenidas en este estudio fueron alineadas con las de alfa-CoVs previamente reportadas usando MUSCLE [24]. Las secuencias alineadas fueron escaneadas para eventos de recombinación mediante el Programa de Detección de Recombinación [25]. Los eventos potenciales de recombinación como sugieren los fuertes p-valores (<10 -20 ) fueron confirmados mediante diagrama de similitud y análisis bootscan implementados en Simplot 3.5.1 [26]. El número de sustituciones sinónimas por sitio sinónimas, Ks, y el número de sustituciones sinónimas por sitio sinónimas, Ka, para cada región de codificación, se calcularon utilizando la herramienta de cálculo Ka/Ks de la Plataforma Norwegian Bioinformática (http://services.cuib.no/tools/kaks) con parámetros por defecto [27]. La detección de homología de proteínas se analizó utilizando HHpred (https://toolkit.tuebingen.mpg.de/#/tools/hpred) con parámetros por defecto [28]. Se utilizó un conjunto de RT-PCRs anidados para determinar la presencia de mRNA subgenómica viral en las muestras positivas de CoV [29]. Los imprimadores delanteros se diseñaron con la secuencia líder al Células primarias de murciélago o inmortalizadas (Rhinolophus sinicus riñón inmortalizado, RsKT; Rhinolophus sinicus células primarias de pulmón, RsLu4323; Rhinolophus sinicus cerebro inmortalizado, RsBrT; Rhinolophus affinis células primarias de riñón, RaK4324; Rousetus leschenaultii células inmortalizadas de riñón, RlKT; Hipposideros pratti células inmortalizadas de pulmón, HpLuT) generadas en nuestro laboratorio fueron cultivadas en DMEM/F12 con 15% FBS. Las células renales de Pteropus alecto (Paki) se mantuvieron en DMEM/F12 complementadas con 10% FBS. Otras células fueron mantenidas según las recomendaciones de American Type Culture Collection (ATCC, www.atcc.org). Los genes accesorios putativos del virus recién detectado fueron generados por RT-PCR a partir de ARN viral extraído de muestras fecales, como se describió anteriormente [30]. El plásmido del virus influenza NS1 fue generado en nuestro laboratorio [31]. El bocavirus humano (HBoV) VP2 plásmido fue amablemente proporcionado por el prof. Hanzhong Wang del Instituto de Virología Wuhan, Academia China de Ciencias. SRAS-CoV ORF7a fue sintetizado por Sangon Biotech. Las transfecciones fueron realizadas con Lipofectamine 3000 Reagent (Life Technologies). La expresión de estos genes accesorios fue analizada por Western blotting usando un mAb (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim Brevemente, el sobrenadante fecal fue adquirido mediante centrifugación de gradiente y luego agregado a las células Vero E6, 1:10 diluidas en DMEM. Después de la incubación a 37°C durante 1 h el inóculo fue reemplazado por DMEM fresco que contenía 2% FBS y el antibiótico antimicótico (Gibco, Grand Island, NY, EE.UU.). Se realizaron tres pasajes ciegos. Las células fueron revisadas diariamente para detectar el efecto citopático. Tanto el sobrenadante de cultivo como el pellet celular fueron examinados para CoV por RT-PCR [17]. La Apoptosis fue analizada como se describió previamente [18]. Brevemente, las células 293T en placas de 12 pocillos fueron transfectadas con 3 μg de plasma de expresión o vector vacío, y las células fueron recolectadas 24 h después de la transfección La apoptosis fue detectada por citometría de flujo utilizando el kit de detección de apoptosis V-FITC/PI de la anexina (YEASEN, Shanghai, China) siguiendo las instrucciones del fabricante.Células anexina-V-positivas y IP-negativas se consideraron en la fase apoptótica temprana y se consideró que las teñidas para la apoptosis o necrosis tardía de la anexina V y la IP se sometieron a apoptosis o necrosis tardía.Todos los experimentos se repitieron tres veces. Las células HEK 293T fueron sembradas en placas de 24 pocillos y luego cotransfectadas con plásmidos reporteros (pRL-TK y pIFN-βIFN-o pNF-B-Luc) [30], así como plásmidos que expresan genes accesorios, plásmidos vectoriales vacíos pcAGGS, virus influenza NS1 [32], SARS-CoV ORF7a [33], o HBoV VP2 [34]. A las 24 h después de la transfección, las células fueron tratadas con el virus Sendai (SeV) (100 unidades de hemaglutinina [HAU]/ml) o el factor de necrosis tumoral humano alfa (TNF-α; sistema R&D) durante 6 h para activar IFNβ o NF- Se prepararon lisatos celulares y se midió la actividad de luciferasa utilizando el kit de ensayo de doble luciferasa (Promega, Madison, WI, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utilizaron retrovirus pseudotipados con BtCoV/Rh/YN2012 RsYN1, RsYN3, RaGD, o pico MERS-CoV, o ningún pico (mock) para infectar células humanas, murciélagos u otras células de mamíferos en placas de 96 pozos. Las partículas de pseudovirus fueron confirmadas con electromicroscopía de borrado occidental y de mancha negativa. El proceso de producción, mediciones de infección y actividad de luciferasa se llevaron a cabo, como se describió anteriormente [35, 36]. Las secuencias nucleótidas del genoma completo de las cepas BtCoV/Rh/YN2012 RsYN1, RsYN2, RsYN3, y RaGD obtenidas en este estudio han sido sometidas al GenBank bajo MG916901 a MG916904. La vigilancia se realizó entre noviembre de 2004 y noviembre de 2014 en 19 provincias de China. En total, se recolectaron 2061 muestras fecales de al menos 12 especies de murciélago Rhinolophus (Figura 1A ). Se detectaron COVs en 209 de estas muestras (Figura 1B y Tabla 1 ). Cinco de estos virus están relacionados con especies conocidas: Mi-BatCoV 1 (> 94% nt identity), Mi-BatCoV HKU8 [37] (> 93% nt identity), BtRf-AlphaCoV/HuB2013 [11] (> 99% nt identity), SRASr-CoV [38] (> 89% nt identity) y HKU2 related CoV [39] (> 85% nt identity). Mientras que las otras tres secuencias de CoV mostraron menos de 83% nt identity a especies conocidas de CoV. Estos tres virus deben representar nuevas especies de CoV. El aislamiento del virus se realizó como se describió previamente [12], pero no tuvo éxito. identidad). Mientras que las otras tres secuencias de CoV mostraron menos de 83% nt identity a especies conocidas de CoV. Estos tres virus deben representar nuevas especies A continuación caracterizamos una novela alfa-CoV, BtCoV/Rh/YN2012. Fue detectada en 3 R.affinis y 6 R.sinicus, respectivamente. Con base en las secuencias, definimos tres genotipos, que fueron representados por RsYN1, RsYN3, y RaGD, respectivamente. Strain RsYN2 fue clasificado en el genotipo RsYN3. Se obtuvieron cuatro genomas de longitud completa. Tres de ellos fueron de R.sinicus (Strain RsYN1, RsYN2 y RsYN3), mientras que el otro fue de R.affinis (Strain RaGD). Los tamaños de estos 4 genomas son entre 28.715 y 29.102, con contenidos de G+C entre el 39,0% y el 41,3%. Los genomas presentan estructuras similares y secuencias reguladoras de transcripción (TRS) que son idénticas a las de otros alfa-CoVs (Figura 2 y Tabla 2). Se observaron excepciones incluyendo tres ORF adicionales (ORF3b, ORF4a y ORF4b). Todas las 4 cepas tienen ORF4a y ORF4b, mientras que sólo la cepa RsYN1 tiene ORF3b. El gen de réplicas, ORF1ab, ocupa~20.4 kb del genoma. El gen de réplicas, ORF1ab, ocupa~20.4 kb del genoma. Codifica las poliproteínas 1a y 1ab, las cuales podrían separarse en 16 proteínas no estructurales (Nsp1-Nsp16). El 3'-fin de los sitios de escote reconocidos por la proteinasa similar a 3C (Nsp4-Nsp10, Nsp12-Nsp16) y la proteinasa similar a papaína (Nsp1-Nsp3) fueron confirmados. Las proteínas incluyendo Nsp3 (papain-like 2 proteas, PL2pro), Nsp5 (quimotripsina-like proteasa, 3CLpro), Nsp12 (RdRp), Nsp13 (helicase), y otras proteínas de función desconocida (Tabla 3 ). Los 7 dominios concatenados de poliproteína 1 comparten la identidad de secuencia <90% aa con los de otros alfa-CoV conocidos (Tabla 2 ), sugiriendo que estos virus representan una nueva especie de CoV dentro de la alfa-CoV. Las especies de CoV más cercanas asignadas a BtCoV/Rh/YN2012 son BtCoV-HKU10 y BtRf-AlphaCoV/Hub2013. Las tres cepas de la provincia de Yunnan fueron agrupadas en dos genotipos (83% identidad del genoma) correlacionados con su localización de muestreo. El tercer genotipo representado por la cepa RaGD fue aislado a las cepas encontradas en Yunnan (<75,4% identidad del genoma). Luego examinamos los genes individuales (Tabla 2). Todos los genes mostraron una baja identidad de secuencia aa a CoV conocidos. Las cuatro cepas de BtCoV/Rh/YN2012 mostraron diversidad genética entre todos los genes diferentes excepto ORF1ab (>83,7% aa identidad). Cabe destacar que las proteínas de pico son muy divergentes entre estas cepas. Otras proteínas de estructura (E, M La comparación de los genes accesorios entre estas cuatro cepas reveló que las cepas del mismo genotipo compartían un ORF3a 100% idéntico. Sin embargo, las proteínas codificadas por ORF3as eran altamente divergentes entre los diferentes genotipos (<65% aa identity). Los genes accesorios putativos también fueron BLASTed contra los registros de GenBank. La mayoría de los genes accesorios no tienen homólogos en GenBank-database, excepto ORF3a (52,0-55,5% aa identity with BatCoV HKU10 ORF3) y ORF9 (28,1-32,0% aa identity with SARSr-CoV ORF7a). Analizamos la homología proteica con el software HHpred. Los resultados mostraron que ORF9s y SARS-CoV OR7a son homólogos (posibilidad: 100%, Para confirmar la presencia de ARN subgenómico, diseñamos un conjunto de imprimaciones dirigidas a todos los ORF predichos como se describe. Los amplicones fueron confirmados primero a través de electroforesis de agarosa-gel y luego secuenciación (Figura 3 y Tabla 2 ). Las secuencias mostraron que todos los ORFs, excepto ORF4b, tenían un TRS anterior. Por lo tanto, el ORF4b puede ser traducido a partir de mRNAs bicistrónicos. En RsYN1, se encontró un ARN subgenómico adicional a partir del interior del ORF3a a través de la secuenciación, lo que llevó a un ORF3b único. Para confirmar la presencia de ARN subgenómico, diseñamos un conjunto de imprimaciones dirigidas a todos los ORFs predichos como se describe. Los amplicones fueron confirmados primero a través de electroforesis gel de agarosa y luego secuenciación (Figura 3 y Tabla 2 ). Las secuencias mostraron que todos los ORF, excepto ORF4b, tenían TRS anteriores. Por lo tanto, los ORF4b pueden ser traducidos de ARNm bicistrónicos. En RsYN1, se encontró un ARN subgenómico adicional a partir del interior del ORF3a a través de secuenciación, lo que llevó a un ORF3b único. Los árboles filogenéticos fueron construidos usando las secuencias aa de RdRp y S de BtCoV/Rh/YN2012 y otras CoVs representativas (Figura 4). En ambos árboles, todos los BtCoV/Rh/YN2012 fueron agrupados juntos y formaron un linaje distinto a otras especies conocidas del corona Dentro de BtCoV/Rh/YN2012 se observaron dos sublineamientos distintos.Uno fue de Ra muestreado en Guangdong, mientras que el otro fue de Rs muestreado en Yunnan Entre las cepas de Yunnan, RsYN2 y RsYN3 fueron agrupadas, mientras que RsYN1 fue aislado. La topología de estas cuatro cepas fue correlacionada con el lugar de muestreo. Las ramas relativamente largas reflejan una alta diversidad entre estas cepas, lo que indica una larga evolución independiente. Los árboles filogenéticos fueron construidos usando las secuencias aa de RdRp y S de BtCoV/Rh/YN2012 y otras CoV representativas (Figura 4). En ambos árboles, todos BtCoV/Rh/YN2012 fueron agrupados y formaron un linaje distinto a otras especies conocidas de coronavirus. Dentro de BtCoV/Rh/YN2012 se observaron dos sublineamientos distintos.Uno fue de Ra muestreado en Guangdong, mientras que el otro fue de Rs muestreado en Yunnan Entre las cepas de Yunnan, RsYN2 y RsYN3 fueron agrupadas, mientras que RsYN1 fue aislado. La topología de estas cuatro cepas fue correlacionada con el lugar de muestreo. Las ramas relativamente largas reflejan una alta diversidad entre estas cepas, lo que indica una larga evolución independiente. Los árboles filogenéticos fueron construidos usando las secuencias aa de RdRp y S de BtCoV/Rh/YN2012 y otras CoV representativas (Figura 4). En ambos árboles, todos BtCoV/Rh/YN2012 fueron agrupados y formaron un linaje distinto a otras especies conocidas de coronavirus. En BtCoV/Rh/YN2012 se observaron dos sublineamientos distintos, uno de Ra en Guangdong, mientras que el otro de Rs en Yunnan Entre las cepas de Yunnan, RsYN2 y RsYN3 se agruparon, mientras que RsYN1 se aisló. La topología de estas cuatro cepas se correlacionó con el lugar de muestreo. Las ramas relativamente largas reflejan una gran diversidad entre estas cepas, lo que indica un largo historial de evolución independiente. Las ratios Ka/Ks (Ks es el número de sustituciones sinónimos por sitios sinónimos y Ka es el número de sustituciones no sinónimos por sitio sinónimos) fueron calculadas para todos los genes. Las ratios Ka/Ks para la mayoría de los genes fueron generalmente bajas, lo que indica que estos genes estaban bajo selección purificada. Sin embargo, las ratios Ka/Ks de ORF4a, ORF4b y ORF9 (0,727, 0,623 y 0,843, respectivamente) fueron significativamente más altas que las de otros ORFs (Tabla 4 ). Para la evaluación de la presión de selección adicional del gen ORF4a y ORF4b, secuenciamos otros cuatro genes ORF4a y ORF4b (estreno Rs4223, Rs4236, Rs4240 y Ra13576 se mostró en la Figura 1B Como SARS-CoV ORF7a fue reportado para inducir apoptosis, realizamos análisis de apoptosis en BtCoV/Rh/YN 2012 ORF9, a~30% aa homólogo de identidad de SARSr-CoV ORF7a. Transfectamos transitoriamente ORF9 de BtCoV/Rh/YN2012 a células HEK293T para examinar si esta ORF9 desencadena apoptosis. Se realizó Western blot para confirmar la expresión de ORF9 y SARS-CoV ORF7a (Figura S1). ORF9 no pudo inducir apoptosis como la ORF7a de SARS-CoV Tor2 (Figura S2). Los resultados indicaron que BtCoV/Rh/YN2012 ORF9 no estuvo involucrado en la inducción de la apoptosis. Para determinar si estas proteínas accesorias modulan la inducción de IFN, transfectamos plasmidos reporteros (pIFNβ-Luc y pRL-TK) y plasmidos de expresión a células 293T. Todas las células que sobreexpresaban los genes accesorios, así como el virus influenza NS1 (tramo PR8), HBoV VP2, o el vector vacío fueron probados para la actividad de luciferasa después de la infección por SeV. La actividad luciferasa estimulada por SeV fue notablemente superior a la esperada sin tratamiento con SeV. El virus influenza NS1 inhibe la expresión del promotor de IFN, mientras que HBoV VP2 activa la expresión. En comparación con esos controles, las proteínas ORF4a exhiben un efecto activo como HBoV VP2 (Figura 5A ). Otras proteínas accesorias no mostraron ningún efecto en la producción de IFN (Figura S3 ). La expresión de estos genes accesorios fue confirmada por Western blot (Figura S1 ). fue notablemente mayor que sin tratamiento con SeV como se esperaba. El virus influenza En comparación con estos controles, las proteínas ORF4a presentan un efecto activo como HBoV VP2 (Figura 5A ). Otras proteínas accesorias no mostraron ningún efecto en la producción de IFN (Figura S3 ). La expresión de estos genes accesorios fue confirmada por Western blot (Figura S1 ). Las muestras fueron recolectadas a las 6 h de postinfección, seguidas por el ensayo de doble luciferasa. Los resultados fueron expresados como el valor luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la lucifera de la Las células 293T fueron transfectadas con 100 ng pNF-B-Luc, 10 ng pRL-TK, vector vacío (500 ng), un plásmido NS1 que expresaba (500 ng), un plásmido ORF7a de expresión SARS-CoV (500 ng), o plásmidos ORF3a de expresión ORF (500 ng). Después de 24 h, las células fueron tratadas con TNF-α. La actividad de la doble luciferasa se determinó después de 6 h. Los resultados se expresaron como la actividad de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la Los asteriscos indican diferencias significativas entre los grupos (en comparación con el vector-NC vacío, p < 0,05, según lo determinado por la prueba t del estudiante). NF-B juega un papel importante en la regulación de la respuesta inmune a la infección viral y es también un factor clave frecuentemente dirigido por virus para hacerse cargo de la célula huésped. En este estudio, se probó si estas proteínas accesorias podían modular las células NF-B. 293T fueron cotransfectadas con reportero Las muestras fueron recolectadas a 6 h de postinfección, seguidas de ensayo de doble luciferasa. Los resultados se expresaron como el valor de luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la lucifera de la lucifera de la lucifera de la lucifera de la lucifera de la lu Las células 293T fueron transfectadas con 100 ng pNF-B-Luc, 10 ng pRL-TK, vector vacío (500 ng), un plásmido NS1 que expresaba (500 ng), un plásmido ORF7a de expresión SARS-CoV (500 ng), o plásmidos ORF3a de expresión ORF (500 ng). Después de 24 h, las células fueron tratadas con TNF-α. La actividad de la doble luciferasa se determinó después de 6 h. Los resultados se expresaron como la actividad de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la Los asteriscos indican diferencias significativas entre los grupos (en comparación con el vector-NC vacío, p < 0,05, según lo determinado por la prueba t del estudiante). El NF-B desempeña un papel importante en la regulación de la respuesta inmunitaria a la infección viral y es también un factor clave frecuentemente dirigido por virus para hacerse cargo de la célula huésped. En este estudio, se probó si estas proteínas accesorias podían modular las células NF-B. 293T fueron cotransfectadas con plásmidos reporteros (pNF-B-Luc y pRL-TK), así como con plasmidos que expresan proteínas accesorias, o controles (vector vacío, NS1, SARS-CoV Tor2-ORF7a). Las células fueron tratadas con TNF-α durante 6 h a 24 h después de la transfección. Se determinó la actividad luciferasa. RsYN1-ORF3a y RaGD-ORF3a activaron NF-B como SARS-CoV ORF7a, mientras que RsYN2-ORF3a inhibió NF-B como NS1 (Figura 5B ). Las expresiones de ORF3as fueron confirmadas con Western blot (Figura S1 ). Otras proteínas accesorias no modularon la producción de NF-B (Figura S4 ). Para comprender la infectividad de estos nuevos BtCoV/Rh/YN2012, seleccionamos las proteínas de pico RsYN1, RsYN3 y RaGD para estudios de entrada de pseudovirus mediados por picos. Tanto el análisis de manchas occidentales como la observación de microscopía electrónica de mancha negativa confirmaron con éxito la preparación de BtCoV/Rh Un total de 11 líneas celulares humanas, 8 células de murciélagos y otras 9 líneas celulares de mamíferos fueron probadas, y no se encontró ningún fuerte positivo (Tabla S2). En este estudio, una nueva especie alfa-CoV, BtCoV/Rh/YN2012, fue identificada en dos especies Rhinolophus. Las 4 cepas con genoma de largo alcance fueron secuencias. Los 7 dominios de replicación conservados de estos virus poseían una identidad secuencial <90% aa a los de otros alfa-CoV conocidos, lo que define una nueva especie de acuerdo con el estándar de taxonomía ICTV [42]. Estos nuevos alfa-CoV mostraron una alta diversidad genética en sus genes estructurales y no estructurales. La cepa RaGD de R. affinis, recolectada en la provincia de Guangdong, formó una rama independiente divergente de las otras 3 cepas de R. sinicus, muestreadas en la provincia de Yunnan, indicando un proceso de evolución independiente asociado con el aislamiento geográfico y la restricción del huésped. Aunque recolectadas de la misma provincia, estas tres cepas de virus formaron dos genotipos correlacionados con lugares de muestreo. Estos dos genotipos tenían una baja identidad de secuencia del genoma, especialmente en el gen S y genes accesorios. Teniendo en cuenta la ubicación geográfica remota del hábitat del murciélago huésped, el tropismo anfitrión y la diversidad del virus, suponemos que BtCoV/Rh/YN2012 puede haberse diseminado en estas dos provincias con una larga historia de circulación en su reservorio natural, los murciélagos Rhinolophus. Con la evidencia de secuencia, suponemos que En primer lugar, se identificaron nuevos genes accesorios, que no tenían homólogos en los genomas. En segundo lugar, se encontraron múltiples TRS entre los genes S y E, mientras que otros alfacoronavirus solo tenían un TRS allí. Estos TRS preceden a ORF3a, ORF3b (sólo en RsYN1) y ORF4a/b respectivamente. En tercer lugar, el gen accesorio ORF9 mostró homología con los de otras especies conocidas de CoV en otro género de coronavirus, especialmente con genes accesorios de SRASr-CoV. Los genes accesorios suelen estar involucrados en interacciones virus-anfitriones durante la infección por CoV [43]. En la mayoría de los CoVs, los genes accesorios son dispensables para la replicación del virus. Sin embargo, se requirió un gen 3c intacto de felina CoV para la replicación viral en el intestino [44] [45] [4 La supresión de los genes específicos del género en el virus de la hepatitis del ratón llevó a una reducción de la virulencia [47]. SARS-CoV ORF7a, que fue identificado como involucrado en la supresión del silenciamiento del ARN [48], inhibición de la síntesis de proteínas celulares [49], bloqueo del ciclo celular [50], e inducción de la apoptosis [51, 52]. En este estudio, encontramos que BtCoV/Rh/YN2012 ORF9 comparte ~ 30% aa identidad secuencial con SARS-CoV ORF7a. Curiosamente, BtCoV/Rh/YN2012 y SRASr-CoV fueron detectados en R. sinicus de la misma cueva. Suponemos que el SARS-CoV y el BtCoV/Rh/YN2012 pueden haber adquirido ORF7a o ORF9 de un ancestro común a través de la recombinación del genoma o la transferencia horizontal de genes. Mientras que el ORF9 de BtCoV/Rh/YN2012 no indujo la apoptosis ni activaron la producción de NF-Karabaj, estas diferencias pueden ser inducidas por la evolución divergente de estas proteínas en diferentes presiones. Aunque diferentes BtCoV/Rh/YN2012 ORF4a comparten < 64,4% de identidad de aminoácidos, todos ellos podrían activar IFN-β. El ORF3a de RsYN1 y RaGD incrementan la patogenicidad del virus con una vía diferente. A pesar de la falta de líneas celulares intestinales del huésped natural de BtCoV/Rh/YN2012, examinamos el tropismo celular de su proteína de pico a través de la entrada de retrovirus pseudotipados con líneas celulares humanas, murciélagos y otras células de mamíferos. La mayoría de las líneas celulares examinadas fueron insospechables a BtCoV/Rh/YN2012, lo que indica un bajo riesgo de transmisión de interespecies a humanos y otros animales. Múltiples razones pueden conducir a una infección fallida del sistema retrovirus de pico de coronavirus-pseudotipo, incluyendo ausencia de receptor en células diana, reconocimiento fallido al homólogo receptor de especies no huésped, mala adaptación en células no huésped durante la maduración de pico o entrada de virus, o la limitación del sistema retrovirus en la entrada de coronavirus estimulante. La débil infectividad del retrovirus pseudotipado RsYN1 en células Huh-7 podría explicarse por la unión de la proteína de pico a polisacárido secretada a la superficie. La suposición debe ser confirmada por experimentos. Nuestras vigilancias a largo plazo sugieren que los murciélagos Rhinolophus parecen albergar una amplia diversidad de CoVs. Coincidentemente, los dos agentes altamente patógenos, SRAS-CoV y Rh-BatCoV HKU2 ambos se originaron de murciélagos Rhinolophus. Teniendo en cuenta la diversidad de CoVs transportados por este género de murciélagos y su amplia distribución geográfica, puede haber un bajo riesgo de derrame de estos virus a otros animales y humanos. Vigilanciaes a largo plazo y estudios de patogénesis ayudarán a prevenir futuras enfermedades humanas y animales causadas por estos murciélagos CoVs. Materiales complementarios: Los siguientes están disponibles en línea en http://www.mdpi.com/1999-4915/11/4/379/s1, Figura S1 : análisis de manchas occidentales de la expresión de proteínas accesorias. Figura S2 : análisis de Apoptosis de proteínas ORF9 de BtCoV/Rh/YN2012. Figura S3 : análisis funcional de proteínas ORF3a, ORF3b, ORF4b, ORF8 y ORF9 en la producción de interferón de tipo I. Figura S4 : análisis funcional de ORF3b, ORF4a, ORF4b, ORF8 y ORF9 en la producción de NF- Tabla S2 : Primeros para la detección de ARNm sugbenómicos virales. Tabla S3

¿Qué tipo de coronavirus se detectó en las especies R. affinis y R. sinicus?

Caracterización de un nuevo miembro del alfacoronavirus con características genómicas únicas en los murciélagos de Rhinolophushttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6521148/SHA: ee14de143337eec0e9708f8139bfac2b7b8fdd27Autores: Wang, Ning; Luo, Chuming; Liu, Haizhou; Yang, Xinglou; Hu, Ben; Zhang, Wei; Li, Bei; Zhu, Yan; Zhu, Guangjian; Shen, Xurui; Peng, Cheng; Shi, ZhengliFecha: 2019-04-24DOI: 10.3390/v11040379Licencia: cc-byAbstract: Los murciélagos han sido identificados como Varios de ellos han causado enfermedades en humanos y animales domésticos por transmisión de interespecies. Teniendo en cuenta la diversidad de coronavirus de murciélagos, especies de murciélagos y poblaciones, esperamos descubrir más CoV de murciélagos a través de la vigilancia del virus. En este estudio, describimos un nuevo miembro de alfaCoV (BtCoV/Rh/YN2012) en murciélagos con características únicas del genoma. Se encontraron genes accesorios únicos, ORF4a y ORF4b entre el gen de pico y el gen de sobre, mientras que el gen ORF8 se encontró aguas abajo del gen nucleocápsido. Todos los genes putativos fueron confirmados por análisis de transcripción inversa. Un gen único en el 3’ final del genoma BtCoV/Rh/YN2012, ORF9, muestra ~30% identidad de aminoácidos a ORF7a del corona El análisis funcional mostró que la proteína ORF4a puede activar la producción de IFN-β, mientras que ORF3a puede regular la producción de NF-B. También examinamos la entrada de virus mediados por picos utilizando el sistema de retrovirus pseudotipados, aunque no encontramos células totalmente permisivas. Nuestros resultados amplían el conocimiento sobre la diversidad genética de los coronavirus de murciélagos. La exploración continua de virus de murciélagos nos ayudará a entender más el importante papel que desempeñan los murciélagos en la evolución y transmisión del coronavirus. Texto: Los miembros de la familia Coronaviridae son virus de ARN de cadena positiva no segmentados con tamaños de genoma que van desde 26-32 kb [1]. Estos virus se clasifican en dos subfamilias: Letovirinae, que contiene el único género: Alphaletovirus; y Orthocoronavirinae (CoV), que consiste en alfa, beta, gamma y deltacoronavirus (CoVs) [2, 3]. Alfa y betacoronavirus infectan principalmente mamíferos y causan enfermedades humanas y animales. Gamma-y delta-CoVs infectan principalmente aves, pero algunos también pueden infectar mamíferos [4, 5]. Se sabe que seis CoVs humanos (HCoVs) causan enfermedades humanas. HCoV-HKU1, HCoV-OC43, HCoV-229E y HCoV-NL63 suelen causar enfermedades respiratorias leves o infecciones asintomáticas; sin embargo, el síndrome respiratorio agudo grave coronavirus (SARS-CoV) y todos los procedimientos de muestreo fueron realizados por veterinarios, con la aprobación del Comité de Ética Animal del Instituto de Virología Wuhan (WIVH5210201). El estudio se llevó a cabo de acuerdo con la Guía para el cuidado y el uso de mamíferos silvestres en la investigación de la República Popular China. Las muestras de hisopos fecales y pellets de murciélagos se recolectaron de noviembre de 2004 a noviembre de 2014 en diferentes estaciones en el sur de China, como se describió anteriormente [16]. El ARN viral se extrajo de 200 μL de muestras de hisopos fecales o pellets utilizando el kit de El ARN fue eludido en 50 μL de tampón de elución, alícuota, y almacenado en -80 • C. Se empleó PCR (Invitrogen, San Diego, CA, EE.UU.) de hemi-nedificado en un solo paso para detectar el coronavirus, como se describió anteriormente [17, 18]. Para confirmar la especie de murciélago de una muestra individual, nosotros PCR amplificamos el citocromo b (Cytob) y/o el gen de la subunidad 1 (ND1) de la deshidrogenasa NADH utilizando ADN extraído de las heces o hisopos [19, 20]. Las secuencias genéticas fueron ensambladas excluyendo las secuencias de imprimación. BLASTN fue utilizado para identificar especies de huésped basadas en las secuencias más estrechamente relacionadas con la mayor cobertura de consulta y una identidad mínima del Las secuencias genómicas completas se determinaron mediante PCR de un solo paso (Invitrogen, San Diego, CA, USA) amplificación con imprimaciones degeneradas (Tabla S1) diseñadas sobre la base de múltiples alineaciones de secuencias alfa-CoV disponibles depositadas en GenBank o amplificadas con SuperScript IV Transcriptasa Inversa (Invitrogen) y Expand Long Template PCR System (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) con imprimaciones específicas (secuencias primarias disponibles bajo petición). Las secuencias de los extremos genómicos 5' y 3' se obtuvieron mediante amplificación rápida de 5' y 3' de los extremos de cDNA (SMARTER Viruses 2019, 11, 379 3 de 19 RACE 5'/3' Kit; Clontech, Mountain View, CA, USA), respectivamente. Los productos PCR fueron Los productos PCR de más de 5kb fueron sometidos a secuenciación profunda utilizando el sistema Hiseq2500. Para algunos fragmentos, los productos PCR fueron clonados en el pGEM-T Easy Vector (Promega, Madison, WI, USA) para secuenciación. Al menos cinco clones independientes fueron secuenciados para obtener una secuencia de consenso. Los datos de la secuenciación de la siguiente generación (NGS) fueron filtrados y mapeados a la secuencia de referencia de BatCoV HKU10 (número de adhesión de GenBank NC_018871) usando Geneious 7.1.8 [21]. Los genomas fueron ensamblados preliminarmente usando DNAStar lasergene V7 (DNAStar, Madison, WI, USA). Se predijeron marcos de lectura abierta (ORF) Putativos utilizando el buscador de ORF de NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ orffinder/) con una longitud mínima de 150 nt, seguido de una inspección manual. Se definieron las secuencias de la región 5' no traducida (5'-UTR) y 3'-UTR, y la secuencia líder, la secuencia reguladora de transcripción corporal y líder (TRS) fueron identificadas como previamente descritas [22]. La escisión de las 16 proteínas no estructurales codificadas por ORF1ab fue determinada por la alineación de secuencias aa de otras CoVs y el patrón de reconocimiento de la proteinasasa 3C y la proteinasasa similar a la papaína. Los árboles filogenéticos basados en secuencias nt o aa fueron construidos utilizando el algoritmo de máxima probabilidad con valores de bootstrap determinados por 1000 réplicas en el paquete de software MEGA 6 [23]. Las secuencias de genoma de larga duración obtenidas en este estudio fueron alineadas con las de alfa-CoVs previamente reportadas usando MUSCLE [24]. Las secuencias alineadas fueron escaneadas para eventos de recombinación mediante el Programa de Detección de Recombinación [25]. Los eventos potenciales de recombinación como sugieren los fuertes p-valores (<10 -20 ) fueron confirmados mediante diagrama de similitud y análisis bootscan implementados en Simplot 3.5.1 [26]. El número de sustituciones sinónimas por sitio sinónimas, Ks, y el número de sustituciones sinónimas por sitio sinónimas, Ka, para cada región de codificación, se calcularon utilizando la herramienta de cálculo Ka/Ks de la Plataforma Norwegian Bioinformática (http://services.cuib.no/tools/kaks) con parámetros por defecto [27]. La detección de homología de proteínas se analizó utilizando HHpred (https://toolkit.tuebingen.mpg.de/#/tools/hpred) con parámetros por defecto [28]. Se utilizó un conjunto de RT-PCRs anidados para determinar la presencia de mRNA subgenómica viral en las muestras positivas de CoV [29]. Los imprimadores delanteros se diseñaron con la secuencia líder al Células primarias de murciélago o inmortalizadas (Rhinolophus sinicus riñón inmortalizado, RsKT; Rhinolophus sinicus células primarias de pulmón, RsLu4323; Rhinolophus sinicus cerebro inmortalizado, RsBrT; Rhinolophus affinis células primarias de riñón, RaK4324; Rousetus leschenaultii células inmortalizadas de riñón, RlKT; Hipposideros pratti células inmortalizadas de pulmón, HpLuT) generadas en nuestro laboratorio fueron cultivadas en DMEM/F12 con 15% FBS. Las células renales de Pteropus alecto (Paki) se mantuvieron en DMEM/F12 complementadas con 10% FBS. Otras células fueron mantenidas según las recomendaciones de American Type Culture Collection (ATCC, www.atcc.org). Los genes accesorios putativos del virus recién detectado fueron generados por RT-PCR a partir de ARN viral extraído de muestras fecales, como se describió anteriormente [30]. El plásmido del virus influenza NS1 fue generado en nuestro laboratorio [31]. El bocavirus humano (HBoV) VP2 plásmido fue amablemente proporcionado por el prof. Hanzhong Wang del Instituto de Virología Wuhan, Academia China de Ciencias. SRAS-CoV ORF7a fue sintetizado por Sangon Biotech. Las transfecciones fueron realizadas con Lipofectamine 3000 Reagent (Life Technologies). La expresión de estos genes accesorios fue analizada por Western blotting usando un mAb (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim Brevemente, el sobrenadante fecal fue adquirido mediante centrifugación de gradiente y luego agregado a las células Vero E6, 1:10 diluidas en DMEM. Después de la incubación a 37°C durante 1 h el inóculo fue reemplazado por DMEM fresco que contenía 2% FBS y el antibiótico antimicótico (Gibco, Grand Island, NY, EE.UU.). Se realizaron tres pasajes ciegos. Las células fueron revisadas diariamente para detectar el efecto citopático. Tanto el sobrenadante de cultivo como el pellet celular fueron examinados para CoV por RT-PCR [17]. La Apoptosis fue analizada como se describió previamente [18]. Brevemente, las células 293T en placas de 12 pocillos fueron transfectadas con 3 μg de plasma de expresión o vector vacío, y las células fueron recolectadas 24 h después de la transfección La apoptosis fue detectada por citometría de flujo utilizando el kit de detección de apoptosis V-FITC/PI de la anexina (YEASEN, Shanghai, China) siguiendo las instrucciones del fabricante.Células anexina-V-positivas y IP-negativas se consideraron en la fase apoptótica temprana y se consideró que las teñidas para la apoptosis o necrosis tardía de la anexina V y la IP se sometieron a apoptosis o necrosis tardía.Todos los experimentos se repitieron tres veces. Las células HEK 293T fueron sembradas en placas de 24 pocillos y luego cotransfectadas con plásmidos reporteros (pRL-TK y pIFN-βIFN-o pNF-B-Luc) [30], así como plásmidos que expresan genes accesorios, plásmidos vectoriales vacíos pcAGGS, virus influenza NS1 [32], SARS-CoV ORF7a [33], o HBoV VP2 [34]. A las 24 h después de la transfección, las células fueron tratadas con el virus Sendai (SeV) (100 unidades de hemaglutinina [HAU]/ml) o el factor de necrosis tumoral humano alfa (TNF-α; sistema R&D) durante 6 h para activar IFNβ o NF- Se prepararon lisatos celulares y se midió la actividad de luciferasa utilizando el kit de ensayo de doble luciferasa (Promega, Madison, WI, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utilizaron retrovirus pseudotipados con BtCoV/Rh/YN2012 RsYN1, RsYN3, RaGD, o pico MERS-CoV, o ningún pico (mock) para infectar células humanas, murciélagos u otras células de mamíferos en placas de 96 pozos. Las partículas de pseudovirus fueron confirmadas con electromicroscopía de borrado occidental y de mancha negativa. El proceso de producción, mediciones de infección y actividad de luciferasa se llevaron a cabo, como se describió anteriormente [35, 36]. Las secuencias nucleótidas del genoma completo de las cepas BtCoV/Rh/YN2012 RsYN1, RsYN2, RsYN3, y RaGD obtenidas en este estudio han sido sometidas al GenBank bajo MG916901 a MG916904. La vigilancia se realizó entre noviembre de 2004 y noviembre de 2014 en 19 provincias de China. En total, se recolectaron 2061 muestras fecales de al menos 12 especies de murciélago Rhinolophus (Figura 1A ). Se detectaron COVs en 209 de estas muestras (Figura 1B y Tabla 1 ). Cinco de estos virus están relacionados con especies conocidas: Mi-BatCoV 1 (> 94% nt identity), Mi-BatCoV HKU8 [37] (> 93% nt identity), BtRf-AlphaCoV/HuB2013 [11] (> 99% nt identity), SRASr-CoV [38] (> 89% nt identity) y HKU2 related CoV [39] (> 85% nt identity). Mientras que las otras tres secuencias de CoV mostraron menos de 83% nt identity a especies conocidas de CoV. Estos tres virus deben representar nuevas especies de CoV. El aislamiento del virus se realizó como se describió previamente [12], pero no tuvo éxito. identidad). Mientras que las otras tres secuencias de CoV mostraron menos de 83% nt identity a especies conocidas de CoV. Estos tres virus deben representar nuevas especies A continuación caracterizamos una novela alfa-CoV, BtCoV/Rh/YN2012. Fue detectada en 3 R.affinis y 6 R.sinicus, respectivamente. Con base en las secuencias, definimos tres genotipos, que fueron representados por RsYN1, RsYN3, y RaGD, respectivamente. Strain RsYN2 fue clasificado en el genotipo RsYN3. Se obtuvieron cuatro genomas de longitud completa. Tres de ellos fueron de R.sinicus (Strain RsYN1, RsYN2 y RsYN3), mientras que el otro fue de R.affinis (Strain RaGD). Los tamaños de estos 4 genomas son entre 28.715 y 29.102, con contenidos de G+C entre el 39,0% y el 41,3%. Los genomas presentan estructuras similares y secuencias reguladoras de transcripción (TRS) que son idénticas a las de otros alfa-CoVs (Figura 2 y Tabla 2). Se observaron excepciones incluyendo tres ORF adicionales (ORF3b, ORF4a y ORF4b). Todas las 4 cepas tienen ORF4a y ORF4b, mientras que sólo la cepa RsYN1 tiene ORF3b. El gen de réplicas, ORF1ab, ocupa~20.4 kb del genoma. El gen de réplicas, ORF1ab, ocupa~20.4 kb del genoma. Codifica las poliproteínas 1a y 1ab, las cuales podrían separarse en 16 proteínas no estructurales (Nsp1-Nsp16). El 3'-fin de los sitios de escote reconocidos por la proteinasa similar a 3C (Nsp4-Nsp10, Nsp12-Nsp16) y la proteinasa similar a papaína (Nsp1-Nsp3) fueron confirmados. Las proteínas incluyendo Nsp3 (papain-like 2 proteas, PL2pro), Nsp5 (quimotripsina-like proteasa, 3CLpro), Nsp12 (RdRp), Nsp13 (helicase), y otras proteínas de función desconocida (Tabla 3 ). Los 7 dominios concatenados de poliproteína 1 comparten la identidad de secuencia <90% aa con los de otros alfa-CoV conocidos (Tabla 2 ), sugiriendo que estos virus representan una nueva especie de CoV dentro de la alfa-CoV. Las especies de CoV más cercanas asignadas a BtCoV/Rh/YN2012 son BtCoV-HKU10 y BtRf-AlphaCoV/Hub2013. Las tres cepas de la provincia de Yunnan fueron agrupadas en dos genotipos (83% identidad del genoma) correlacionados con su localización de muestreo. El tercer genotipo representado por la cepa RaGD fue aislado a las cepas encontradas en Yunnan (<75,4% identidad del genoma). Luego examinamos los genes individuales (Tabla 2). Todos los genes mostraron una baja identidad de secuencia aa a CoV conocidos. Las cuatro cepas de BtCoV/Rh/YN2012 mostraron diversidad genética entre todos los genes diferentes excepto ORF1ab (>83,7% aa identidad). Cabe destacar que las proteínas de pico son muy divergentes entre estas cepas. Otras proteínas de estructura (E, M La comparación de los genes accesorios entre estas cuatro cepas reveló que las cepas del mismo genotipo compartían un ORF3a 100% idéntico. Sin embargo, las proteínas codificadas por ORF3as eran altamente divergentes entre los diferentes genotipos (<65% aa identity). Los genes accesorios putativos también fueron BLASTed contra los registros de GenBank. La mayoría de los genes accesorios no tienen homólogos en GenBank-database, excepto ORF3a (52,0-55,5% aa identity with BatCoV HKU10 ORF3) y ORF9 (28,1-32,0% aa identity with SARSr-CoV ORF7a). Analizamos la homología proteica con el software HHpred. Los resultados mostraron que ORF9s y SARS-CoV OR7a son homólogos (posibilidad: 100%, Para confirmar la presencia de ARN subgenómico, diseñamos un conjunto de imprimaciones dirigidas a todos los ORF predichos como se describe. Los amplicones fueron confirmados primero a través de electroforesis de agarosa-gel y luego secuenciación (Figura 3 y Tabla 2 ). Las secuencias mostraron que todos los ORFs, excepto ORF4b, tenían un TRS anterior. Por lo tanto, el ORF4b puede ser traducido a partir de mRNAs bicistrónicos. En RsYN1, se encontró un ARN subgenómico adicional a partir del interior del ORF3a a través de la secuenciación, lo que llevó a un ORF3b único. Para confirmar la presencia de ARN subgenómico, diseñamos un conjunto de imprimaciones dirigidas a todos los ORFs predichos como se describe. Los amplicones fueron confirmados primero a través de electroforesis gel de agarosa y luego secuenciación (Figura 3 y Tabla 2 ). Las secuencias mostraron que todos los ORF, excepto ORF4b, tenían TRS anteriores. Por lo tanto, los ORF4b pueden ser traducidos de ARNm bicistrónicos. En RsYN1, se encontró un ARN subgenómico adicional a partir del interior del ORF3a a través de secuenciación, lo que llevó a un ORF3b único. Los árboles filogenéticos fueron construidos usando las secuencias aa de RdRp y S de BtCoV/Rh/YN2012 y otras CoVs representativas (Figura 4). En ambos árboles, todos los BtCoV/Rh/YN2012 fueron agrupados juntos y formaron un linaje distinto a otras especies conocidas del corona Dentro de BtCoV/Rh/YN2012 se observaron dos sublineamientos distintos.Uno fue de Ra muestreado en Guangdong, mientras que el otro fue de Rs muestreado en Yunnan Entre las cepas de Yunnan, RsYN2 y RsYN3 fueron agrupadas, mientras que RsYN1 fue aislado. La topología de estas cuatro cepas fue correlacionada con el lugar de muestreo. Las ramas relativamente largas reflejan una alta diversidad entre estas cepas, lo que indica una larga evolución independiente. Los árboles filogenéticos fueron construidos usando las secuencias aa de RdRp y S de BtCoV/Rh/YN2012 y otras CoV representativas (Figura 4). En ambos árboles, todos BtCoV/Rh/YN2012 fueron agrupados y formaron un linaje distinto a otras especies conocidas de coronavirus. Dentro de BtCoV/Rh/YN2012 se observaron dos sublineamientos distintos.Uno fue de Ra muestreado en Guangdong, mientras que el otro fue de Rs muestreado en Yunnan Entre las cepas de Yunnan, RsYN2 y RsYN3 fueron agrupadas, mientras que RsYN1 fue aislado. La topología de estas cuatro cepas fue correlacionada con el lugar de muestreo. Las ramas relativamente largas reflejan una alta diversidad entre estas cepas, lo que indica una larga evolución independiente. Los árboles filogenéticos fueron construidos usando las secuencias aa de RdRp y S de BtCoV/Rh/YN2012 y otras CoV representativas (Figura 4). En ambos árboles, todos BtCoV/Rh/YN2012 fueron agrupados y formaron un linaje distinto a otras especies conocidas de coronavirus. En BtCoV/Rh/YN2012 se observaron dos sublineamientos distintos, uno de Ra en Guangdong, mientras que el otro de Rs en Yunnan Entre las cepas de Yunnan, RsYN2 y RsYN3 se agruparon, mientras que RsYN1 se aisló. La topología de estas cuatro cepas se correlacionó con el lugar de muestreo. Las ramas relativamente largas reflejan una gran diversidad entre estas cepas, lo que indica un largo historial de evolución independiente. Las ratios Ka/Ks (Ks es el número de sustituciones sinónimos por sitios sinónimos y Ka es el número de sustituciones no sinónimos por sitio sinónimos) fueron calculadas para todos los genes. Las ratios Ka/Ks para la mayoría de los genes fueron generalmente bajas, lo que indica que estos genes estaban bajo selección purificada. Sin embargo, las ratios Ka/Ks de ORF4a, ORF4b y ORF9 (0,727, 0,623 y 0,843, respectivamente) fueron significativamente más altas que las de otros ORFs (Tabla 4 ). Para la evaluación de la presión de selección adicional del gen ORF4a y ORF4b, secuenciamos otros cuatro genes ORF4a y ORF4b (estreno Rs4223, Rs4236, Rs4240 y Ra13576 se mostró en la Figura 1B Como SARS-CoV ORF7a fue reportado para inducir apoptosis, realizamos análisis de apoptosis en BtCoV/Rh/YN 2012 ORF9, a~30% aa homólogo de identidad de SARSr-CoV ORF7a. Transfectamos transitoriamente ORF9 de BtCoV/Rh/YN2012 a células HEK293T para examinar si esta ORF9 desencadena apoptosis. Se realizó Western blot para confirmar la expresión de ORF9 y SARS-CoV ORF7a (Figura S1). ORF9 no pudo inducir apoptosis como la ORF7a de SARS-CoV Tor2 (Figura S2). Los resultados indicaron que BtCoV/Rh/YN2012 ORF9 no estuvo involucrado en la inducción de la apoptosis. Para determinar si estas proteínas accesorias modulan la inducción de IFN, transfectamos plasmidos reporteros (pIFNβ-Luc y pRL-TK) y plasmidos de expresión a células 293T. Todas las células que sobreexpresaban los genes accesorios, así como el virus influenza NS1 (tramo PR8), HBoV VP2, o el vector vacío fueron probados para la actividad de luciferasa después de la infección por SeV. La actividad luciferasa estimulada por SeV fue notablemente superior a la esperada sin tratamiento con SeV. El virus influenza NS1 inhibe la expresión del promotor de IFN, mientras que HBoV VP2 activa la expresión. En comparación con esos controles, las proteínas ORF4a exhiben un efecto activo como HBoV VP2 (Figura 5A ). Otras proteínas accesorias no mostraron ningún efecto en la producción de IFN (Figura S3 ). La expresión de estos genes accesorios fue confirmada por Western blot (Figura S1 ). fue notablemente mayor que sin tratamiento con SeV como se esperaba. El virus influenza En comparación con estos controles, las proteínas ORF4a presentan un efecto activo como HBoV VP2 (Figura 5A ). Otras proteínas accesorias no mostraron ningún efecto en la producción de IFN (Figura S3 ). La expresión de estos genes accesorios fue confirmada por Western blot (Figura S1 ). Las muestras fueron recolectadas a las 6 h de postinfección, seguidas por el ensayo de doble luciferasa. Los resultados fueron expresados como el valor luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la lucifera de la Las células 293T fueron transfectadas con 100 ng pNF-B-Luc, 10 ng pRL-TK, vector vacío (500 ng), un plásmido NS1 que expresaba (500 ng), un plásmido ORF7a de expresión SARS-CoV (500 ng), o plásmidos ORF3a de expresión ORF (500 ng). Después de 24 h, las células fueron tratadas con TNF-α. La actividad de la doble luciferasa se determinó después de 6 h. Los resultados se expresaron como la actividad de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la Los asteriscos indican diferencias significativas entre los grupos (en comparación con el vector-NC vacío, p < 0,05, según lo determinado por la prueba t del estudiante). NF-B juega un papel importante en la regulación de la respuesta inmune a la infección viral y es también un factor clave frecuentemente dirigido por virus para hacerse cargo de la célula huésped. En este estudio, se probó si estas proteínas accesorias podían modular las células NF-B. 293T fueron cotransfectadas con reportero Las muestras fueron recolectadas a 6 h de postinfección, seguidas de ensayo de doble luciferasa. Los resultados se expresaron como el valor de luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la lucifera de la lucifera de la lucifera de la lucifera de la lucifera de la lu Las células 293T fueron transfectadas con 100 ng pNF-B-Luc, 10 ng pRL-TK, vector vacío (500 ng), un plásmido NS1 que expresaba (500 ng), un plásmido ORF7a de expresión SARS-CoV (500 ng), o plásmidos ORF3a de expresión ORF (500 ng). Después de 24 h, las células fueron tratadas con TNF-α. La actividad de la doble luciferasa se determinó después de 6 h. Los resultados se expresaron como la actividad de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la Los asteriscos indican diferencias significativas entre los grupos (en comparación con el vector-NC vacío, p < 0,05, según lo determinado por la prueba t del estudiante). El NF-B desempeña un papel importante en la regulación de la respuesta inmunitaria a la infección viral y es también un factor clave frecuentemente dirigido por virus para hacerse cargo de la célula huésped. En este estudio, se probó si estas proteínas accesorias podían modular las células NF-B. 293T fueron cotransfectadas con plásmidos reporteros (pNF-B-Luc y pRL-TK), así como con plasmidos que expresan proteínas accesorias, o controles (vector vacío, NS1, SARS-CoV Tor2-ORF7a). Las células fueron tratadas con TNF-α durante 6 h a 24 h después de la transfección. Se determinó la actividad luciferasa. RsYN1-ORF3a y RaGD-ORF3a activaron NF-B como SARS-CoV ORF7a, mientras que RsYN2-ORF3a inhibió NF-B como NS1 (Figura 5B ). Las expresiones de ORF3as fueron confirmadas con Western blot (Figura S1 ). Otras proteínas accesorias no modularon la producción de NF-B (Figura S4 ). Para comprender la infectividad de estos nuevos BtCoV/Rh/YN2012, seleccionamos las proteínas de pico RsYN1, RsYN3 y RaGD para estudios de entrada de pseudovirus mediados por picos. Tanto el análisis de manchas occidentales como la observación de microscopía electrónica de mancha negativa confirmaron con éxito la preparación de BtCoV/Rh Un total de 11 líneas celulares humanas, 8 células de murciélagos y otras 9 líneas celulares de mamíferos fueron probadas, y no se encontró ningún fuerte positivo (Tabla S2). En este estudio, una nueva especie alfa-CoV, BtCoV/Rh/YN2012, fue identificada en dos especies Rhinolophus. Las 4 cepas con genoma de largo alcance fueron secuencias. Los 7 dominios de replicación conservados de estos virus poseían una identidad secuencial <90% aa a los de otros alfa-CoV conocidos, lo que define una nueva especie de acuerdo con el estándar de taxonomía ICTV [42]. Estos nuevos alfa-CoV mostraron una alta diversidad genética en sus genes estructurales y no estructurales. La cepa RaGD de R. affinis, recolectada en la provincia de Guangdong, formó una rama independiente divergente de las otras 3 cepas de R. sinicus, muestreadas en la provincia de Yunnan, indicando un proceso de evolución independiente asociado con el aislamiento geográfico y la restricción del huésped. Aunque recolectadas de la misma provincia, estas tres cepas de virus formaron dos genotipos correlacionados con lugares de muestreo. Estos dos genotipos tenían una baja identidad de secuencia del genoma, especialmente en el gen S y genes accesorios. Teniendo en cuenta la ubicación geográfica remota del hábitat del murciélago huésped, el tropismo anfitrión y la diversidad del virus, suponemos que BtCoV/Rh/YN2012 puede haberse diseminado en estas dos provincias con una larga historia de circulación en su reservorio natural, los murciélagos Rhinolophus. Con la evidencia de secuencia, suponemos que En primer lugar, se identificaron nuevos genes accesorios, que no tenían homólogos en los genomas. En segundo lugar, se encontraron múltiples TRS entre los genes S y E, mientras que otros alfacoronavirus solo tenían un TRS allí. Estos TRS preceden a ORF3a, ORF3b (sólo en RsYN1) y ORF4a/b respectivamente. En tercer lugar, el gen accesorio ORF9 mostró homología con los de otras especies conocidas de CoV en otro género de coronavirus, especialmente con genes accesorios de SRASr-CoV. Los genes accesorios suelen estar involucrados en interacciones virus-anfitriones durante la infección por CoV [43]. En la mayoría de los CoVs, los genes accesorios son dispensables para la replicación del virus. Sin embargo, se requirió un gen 3c intacto de felina CoV para la replicación viral en el intestino [44] [45] [4 La supresión de los genes específicos del género en el virus de la hepatitis del ratón llevó a una reducción de la virulencia [47]. SARS-CoV ORF7a, que fue identificado como involucrado en la supresión del silenciamiento del ARN [48], inhibición de la síntesis de proteínas celulares [49], bloqueo del ciclo celular [50], e inducción de la apoptosis [51, 52]. En este estudio, encontramos que BtCoV/Rh/YN2012 ORF9 comparte ~ 30% aa identidad secuencial con SARS-CoV ORF7a. Curiosamente, BtCoV/Rh/YN2012 y SRASr-CoV fueron detectados en R. sinicus de la misma cueva. Suponemos que el SARS-CoV y el BtCoV/Rh/YN2012 pueden haber adquirido ORF7a o ORF9 de un ancestro común a través de la recombinación del genoma o la transferencia horizontal de genes. Mientras que el ORF9 de BtCoV/Rh/YN2012 no indujo la apoptosis ni activaron la producción de NF-Karabaj, estas diferencias pueden ser inducidas por la evolución divergente de estas proteínas en diferentes presiones. Aunque diferentes BtCoV/Rh/YN2012 ORF4a comparten < 64,4% de identidad de aminoácidos, todos ellos podrían activar IFN-β. El ORF3a de RsYN1 y RaGD incrementan la patogenicidad del virus con una vía diferente. A pesar de la falta de líneas celulares intestinales del huésped natural de BtCoV/Rh/YN2012, examinamos el tropismo celular de su proteína de pico a través de la entrada de retrovirus pseudotipados con líneas celulares humanas, murciélagos y otras células de mamíferos. La mayoría de las líneas celulares examinadas fueron insospechables a BtCoV/Rh/YN2012, lo que indica un bajo riesgo de transmisión de interespecies a humanos y otros animales. Múltiples razones pueden conducir a una infección fallida del sistema retrovirus de pico de coronavirus-pseudotipo, incluyendo ausencia de receptor en células diana, reconocimiento fallido al homólogo receptor de especies no huésped, mala adaptación en células no huésped durante la maduración de pico o entrada de virus, o la limitación del sistema retrovirus en la entrada de coronavirus estimulante. La débil infectividad del retrovirus pseudotipado RsYN1 en células Huh-7 podría explicarse por la unión de la proteína de pico a polisacárido secretada a la superficie. La suposición debe ser confirmada por experimentos. Nuestras vigilancias a largo plazo sugieren que los murciélagos Rhinolophus parecen albergar una amplia diversidad de CoVs. Coincidentemente, los dos agentes altamente patógenos, SRAS-CoV y Rh-BatCoV HKU2 ambos se originaron de murciélagos Rhinolophus. Teniendo en cuenta la diversidad de CoVs transportados por este género de murciélagos y su amplia distribución geográfica, puede haber un bajo riesgo de derrame de estos virus a otros animales y humanos. Vigilanciaes a largo plazo y estudios de patogénesis ayudarán a prevenir futuras enfermedades humanas y animales causadas por estos murciélagos CoVs. Materiales complementarios: Los siguientes están disponibles en línea en http://www.mdpi.com/1999-4915/11/4/379/s1, Figura S1 : análisis de manchas occidentales de la expresión de proteínas accesorias. Figura S2 : análisis de Apoptosis de proteínas ORF9 de BtCoV/Rh/YN2012. Figura S3 : análisis funcional de proteínas ORF3a, ORF3b, ORF4b, ORF8 y ORF9 en la producción de interferón de tipo I. Figura S4 : análisis funcional de ORF3b, ORF4a, ORF4b, ORF8 y ORF9 en la producción de NF- Tabla S2 : Primeros para la detección de ARNm sugbenómicos virales. Tabla S3

¿Cuál es el tamaño del genoma del coronavirus?

Caracterización de un nuevo miembro del alfacoronavirus con características genómicas únicas en los murciélagos de Rhinolophushttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6521148/SHA: ee14de143337eec0e9708f8139bfac2b7b8fdd27Autores: Wang, Ning; Luo, Chuming; Liu, Haizhou; Yang, Xinglou; Hu, Ben; Zhang, Wei; Li, Bei; Zhu, Yan; Zhu, Guangjian; Shen, Xurui; Peng, Cheng; Shi, ZhengliFecha: 2019-04-24DOI: 10.3390/v11040379Licencia: cc-byAbstract: Los murciélagos han sido identificados como Varios de ellos han causado enfermedades en humanos y animales domésticos por transmisión de interespecies. Teniendo en cuenta la diversidad de coronavirus de murciélagos, especies de murciélagos y poblaciones, esperamos descubrir más CoV de murciélagos a través de la vigilancia del virus. En este estudio, describimos un nuevo miembro de alfaCoV (BtCoV/Rh/YN2012) en murciélagos con características únicas del genoma. Se encontraron genes accesorios únicos, ORF4a y ORF4b entre el gen de pico y el gen de sobre, mientras que el gen ORF8 se encontró aguas abajo del gen nucleocápsido. Todos los genes putativos fueron confirmados por análisis de transcripción inversa. Un gen único en el 3’ final del genoma BtCoV/Rh/YN2012, ORF9, muestra ~30% identidad de aminoácidos a ORF7a del corona El análisis funcional mostró que la proteína ORF4a puede activar la producción de IFN-β, mientras que ORF3a puede regular la producción de NF-B. También examinamos la entrada de virus mediados por picos utilizando el sistema de retrovirus pseudotipados, aunque no encontramos células totalmente permisivas. Nuestros resultados amplían el conocimiento sobre la diversidad genética de los coronavirus de murciélagos. La exploración continua de virus de murciélagos nos ayudará a entender más el importante papel que desempeñan los murciélagos en la evolución y transmisión del coronavirus. Texto: Los miembros de la familia Coronaviridae son virus de ARN de cadena positiva no segmentados con tamaños de genoma que van desde 26-32 kb [1]. Estos virus se clasifican en dos subfamilias: Letovirinae, que contiene el único género: Alphaletovirus; y Orthocoronavirinae (CoV), que consiste en alfa, beta, gamma y deltacoronavirus (CoVs) [2, 3]. Alfa y betacoronavirus infectan principalmente mamíferos y causan enfermedades humanas y animales. Gamma-y delta-CoVs infectan principalmente aves, pero algunos también pueden infectar mamíferos [4, 5]. Se sabe que seis CoVs humanos (HCoVs) causan enfermedades humanas. HCoV-HKU1, HCoV-OC43, HCoV-229E y HCoV-NL63 suelen causar enfermedades respiratorias leves o infecciones asintomáticas; sin embargo, el síndrome respiratorio agudo grave coronavirus (SARS-CoV) y todos los procedimientos de muestreo fueron realizados por veterinarios, con la aprobación del Comité de Ética Animal del Instituto de Virología Wuhan (WIVH5210201). El estudio se llevó a cabo de acuerdo con la Guía para el cuidado y el uso de mamíferos silvestres en la investigación de la República Popular China. Las muestras de hisopos fecales y pellets de murciélagos se recolectaron de noviembre de 2004 a noviembre de 2014 en diferentes estaciones en el sur de China, como se describió anteriormente [16]. El ARN viral se extrajo de 200 μL de muestras de hisopos fecales o pellets utilizando el kit de El ARN fue eludido en 50 μL de tampón de elución, alícuota, y almacenado en -80 • C. Se empleó PCR (Invitrogen, San Diego, CA, EE.UU.) de hemi-nedificado en un solo paso para detectar el coronavirus, como se describió anteriormente [17, 18]. Para confirmar la especie de murciélago de una muestra individual, nosotros PCR amplificamos el citocromo b (Cytob) y/o el gen de la subunidad 1 (ND1) de la deshidrogenasa NADH utilizando ADN extraído de las heces o hisopos [19, 20]. Las secuencias genéticas fueron ensambladas excluyendo las secuencias de imprimación. BLASTN fue utilizado para identificar especies de huésped basadas en las secuencias más estrechamente relacionadas con la mayor cobertura de consulta y una identidad mínima del Las secuencias genómicas completas se determinaron mediante PCR de un solo paso (Invitrogen, San Diego, CA, USA) amplificación con imprimaciones degeneradas (Tabla S1) diseñadas sobre la base de múltiples alineaciones de secuencias alfa-CoV disponibles depositadas en GenBank o amplificadas con SuperScript IV Transcriptasa Inversa (Invitrogen) y Expand Long Template PCR System (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) con imprimaciones específicas (secuencias primarias disponibles bajo petición). Las secuencias de los extremos genómicos 5' y 3' se obtuvieron mediante amplificación rápida de 5' y 3' de los extremos de cDNA (SMARTER Viruses 2019, 11, 379 3 de 19 RACE 5'/3' Kit; Clontech, Mountain View, CA, USA), respectivamente. Los productos PCR fueron Los productos PCR de más de 5kb fueron sometidos a secuenciación profunda utilizando el sistema Hiseq2500. Para algunos fragmentos, los productos PCR fueron clonados en el pGEM-T Easy Vector (Promega, Madison, WI, USA) para secuenciación. Al menos cinco clones independientes fueron secuenciados para obtener una secuencia de consenso. Los datos de la secuenciación de la siguiente generación (NGS) fueron filtrados y mapeados a la secuencia de referencia de BatCoV HKU10 (número de adhesión de GenBank NC_018871) usando Geneious 7.1.8 [21]. Los genomas fueron ensamblados preliminarmente usando DNAStar lasergene V7 (DNAStar, Madison, WI, USA). Se predijeron marcos de lectura abierta (ORF) Putativos utilizando el buscador de ORF de NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ orffinder/) con una longitud mínima de 150 nt, seguido de una inspección manual. Se definieron las secuencias de la región 5' no traducida (5'-UTR) y 3'-UTR, y la secuencia líder, la secuencia reguladora de transcripción corporal y líder (TRS) fueron identificadas como previamente descritas [22]. La escisión de las 16 proteínas no estructurales codificadas por ORF1ab fue determinada por la alineación de secuencias aa de otras CoVs y el patrón de reconocimiento de la proteinasasa 3C y la proteinasasa similar a la papaína. Los árboles filogenéticos basados en secuencias nt o aa fueron construidos utilizando el algoritmo de máxima probabilidad con valores de bootstrap determinados por 1000 réplicas en el paquete de software MEGA 6 [23]. Las secuencias de genoma de larga duración obtenidas en este estudio fueron alineadas con las de alfa-CoVs previamente reportadas usando MUSCLE [24]. Las secuencias alineadas fueron escaneadas para eventos de recombinación mediante el Programa de Detección de Recombinación [25]. Los eventos potenciales de recombinación como sugieren los fuertes p-valores (<10 -20 ) fueron confirmados mediante diagrama de similitud y análisis bootscan implementados en Simplot 3.5.1 [26]. El número de sustituciones sinónimas por sitio sinónimas, Ks, y el número de sustituciones sinónimas por sitio sinónimas, Ka, para cada región de codificación, se calcularon utilizando la herramienta de cálculo Ka/Ks de la Plataforma Norwegian Bioinformática (http://services.cuib.no/tools/kaks) con parámetros por defecto [27]. La detección de homología de proteínas se analizó utilizando HHpred (https://toolkit.tuebingen.mpg.de/#/tools/hpred) con parámetros por defecto [28]. Se utilizó un conjunto de RT-PCRs anidados para determinar la presencia de mRNA subgenómica viral en las muestras positivas de CoV [29]. Los imprimadores delanteros se diseñaron con la secuencia líder al Células primarias de murciélago o inmortalizadas (Rhinolophus sinicus riñón inmortalizado, RsKT; Rhinolophus sinicus células primarias de pulmón, RsLu4323; Rhinolophus sinicus cerebro inmortalizado, RsBrT; Rhinolophus affinis células primarias de riñón, RaK4324; Rousetus leschenaultii células inmortalizadas de riñón, RlKT; Hipposideros pratti células inmortalizadas de pulmón, HpLuT) generadas en nuestro laboratorio fueron cultivadas en DMEM/F12 con 15% FBS. Las células renales de Pteropus alecto (Paki) se mantuvieron en DMEM/F12 complementadas con 10% FBS. Otras células fueron mantenidas según las recomendaciones de American Type Culture Collection (ATCC, www.atcc.org). Los genes accesorios putativos del virus recién detectado fueron generados por RT-PCR a partir de ARN viral extraído de muestras fecales, como se describió anteriormente [30]. El plásmido del virus influenza NS1 fue generado en nuestro laboratorio [31]. El bocavirus humano (HBoV) VP2 plásmido fue amablemente proporcionado por el prof. Hanzhong Wang del Instituto de Virología Wuhan, Academia China de Ciencias. SRAS-CoV ORF7a fue sintetizado por Sangon Biotech. Las transfecciones fueron realizadas con Lipofectamine 3000 Reagent (Life Technologies). La expresión de estos genes accesorios fue analizada por Western blotting usando un mAb (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim Brevemente, el sobrenadante fecal fue adquirido mediante centrifugación de gradiente y luego agregado a las células Vero E6, 1:10 diluidas en DMEM. Después de la incubación a 37°C durante 1 h el inóculo fue reemplazado por DMEM fresco que contenía 2% FBS y el antibiótico antimicótico (Gibco, Grand Island, NY, EE.UU.). Se realizaron tres pasajes ciegos. Las células fueron revisadas diariamente para detectar el efecto citopático. Tanto el sobrenadante de cultivo como el pellet celular fueron examinados para CoV por RT-PCR [17]. La Apoptosis fue analizada como se describió previamente [18]. Brevemente, las células 293T en placas de 12 pocillos fueron transfectadas con 3 μg de plasma de expresión o vector vacío, y las células fueron recolectadas 24 h después de la transfección La apoptosis fue detectada por citometría de flujo utilizando el kit de detección de apoptosis V-FITC/PI de la anexina (YEASEN, Shanghai, China) siguiendo las instrucciones del fabricante.Células anexina-V-positivas y IP-negativas se consideraron en la fase apoptótica temprana y se consideró que las teñidas para la apoptosis o necrosis tardía de la anexina V y la IP se sometieron a apoptosis o necrosis tardía.Todos los experimentos se repitieron tres veces. Las células HEK 293T fueron sembradas en placas de 24 pocillos y luego cotransfectadas con plásmidos reporteros (pRL-TK y pIFN-βIFN-o pNF-B-Luc) [30], así como plásmidos que expresan genes accesorios, plásmidos vectoriales vacíos pcAGGS, virus influenza NS1 [32], SARS-CoV ORF7a [33], o HBoV VP2 [34]. A las 24 h después de la transfección, las células fueron tratadas con el virus Sendai (SeV) (100 unidades de hemaglutinina [HAU]/ml) o el factor de necrosis tumoral humano alfa (TNF-α; sistema R&D) durante 6 h para activar IFNβ o NF- Se prepararon lisatos celulares y se midió la actividad de luciferasa utilizando el kit de ensayo de doble luciferasa (Promega, Madison, WI, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utilizaron retrovirus pseudotipados con BtCoV/Rh/YN2012 RsYN1, RsYN3, RaGD, o pico MERS-CoV, o ningún pico (mock) para infectar células humanas, murciélagos u otras células de mamíferos en placas de 96 pozos. Las partículas de pseudovirus fueron confirmadas con electromicroscopía de borrado occidental y de mancha negativa. El proceso de producción, mediciones de infección y actividad de luciferasa se llevaron a cabo, como se describió anteriormente [35, 36]. Las secuencias nucleótidas del genoma completo de las cepas BtCoV/Rh/YN2012 RsYN1, RsYN2, RsYN3, y RaGD obtenidas en este estudio han sido sometidas al GenBank bajo MG916901 a MG916904. La vigilancia se realizó entre noviembre de 2004 y noviembre de 2014 en 19 provincias de China. En total, se recolectaron 2061 muestras fecales de al menos 12 especies de murciélago Rhinolophus (Figura 1A ). Se detectaron COVs en 209 de estas muestras (Figura 1B y Tabla 1 ). Cinco de estos virus están relacionados con especies conocidas: Mi-BatCoV 1 (> 94% nt identity), Mi-BatCoV HKU8 [37] (> 93% nt identity), BtRf-AlphaCoV/HuB2013 [11] (> 99% nt identity), SRASr-CoV [38] (> 89% nt identity) y HKU2 related CoV [39] (> 85% nt identity). Mientras que las otras tres secuencias de CoV mostraron menos de 83% nt identity a especies conocidas de CoV. Estos tres virus deben representar nuevas especies de CoV. El aislamiento del virus se realizó como se describió previamente [12], pero no tuvo éxito. identidad). Mientras que las otras tres secuencias de CoV mostraron menos de 83% nt identity a especies conocidas de CoV. Estos tres virus deben representar nuevas especies A continuación caracterizamos una novela alfa-CoV, BtCoV/Rh/YN2012. Fue detectada en 3 R.affinis y 6 R.sinicus, respectivamente. Con base en las secuencias, definimos tres genotipos, que fueron representados por RsYN1, RsYN3, y RaGD, respectivamente. Strain RsYN2 fue clasificado en el genotipo RsYN3. Se obtuvieron cuatro genomas de longitud completa. Tres de ellos fueron de R.sinicus (Strain RsYN1, RsYN2 y RsYN3), mientras que el otro fue de R.affinis (Strain RaGD). Los tamaños de estos 4 genomas son entre 28.715 y 29.102, con contenidos de G+C entre el 39,0% y el 41,3%. Los genomas presentan estructuras similares y secuencias reguladoras de transcripción (TRS) que son idénticas a las de otros alfa-CoVs (Figura 2 y Tabla 2). Se observaron excepciones incluyendo tres ORF adicionales (ORF3b, ORF4a y ORF4b). Todas las 4 cepas tienen ORF4a y ORF4b, mientras que sólo la cepa RsYN1 tiene ORF3b. El gen de réplicas, ORF1ab, ocupa~20.4 kb del genoma. El gen de réplicas, ORF1ab, ocupa~20.4 kb del genoma. Codifica las poliproteínas 1a y 1ab, las cuales podrían separarse en 16 proteínas no estructurales (Nsp1-Nsp16). El 3'-fin de los sitios de escote reconocidos por la proteinasa similar a 3C (Nsp4-Nsp10, Nsp12-Nsp16) y la proteinasa similar a papaína (Nsp1-Nsp3) fueron confirmados. Las proteínas incluyendo Nsp3 (papain-like 2 proteas, PL2pro), Nsp5 (quimotripsina-like proteasa, 3CLpro), Nsp12 (RdRp), Nsp13 (helicase), y otras proteínas de función desconocida (Tabla 3 ). Los 7 dominios concatenados de poliproteína 1 comparten la identidad de secuencia <90% aa con los de otros alfa-CoV conocidos (Tabla 2 ), sugiriendo que estos virus representan una nueva especie de CoV dentro de la alfa-CoV. Las especies de CoV más cercanas asignadas a BtCoV/Rh/YN2012 son BtCoV-HKU10 y BtRf-AlphaCoV/Hub2013. Las tres cepas de la provincia de Yunnan fueron agrupadas en dos genotipos (83% identidad del genoma) correlacionados con su localización de muestreo. El tercer genotipo representado por la cepa RaGD fue aislado a las cepas encontradas en Yunnan (<75,4% identidad del genoma). Luego examinamos los genes individuales (Tabla 2). Todos los genes mostraron una baja identidad de secuencia aa a CoV conocidos. Las cuatro cepas de BtCoV/Rh/YN2012 mostraron diversidad genética entre todos los genes diferentes excepto ORF1ab (>83,7% aa identidad). Cabe destacar que las proteínas de pico son muy divergentes entre estas cepas. Otras proteínas de estructura (E, M La comparación de los genes accesorios entre estas cuatro cepas reveló que las cepas del mismo genotipo compartían un ORF3a 100% idéntico. Sin embargo, las proteínas codificadas por ORF3as eran altamente divergentes entre los diferentes genotipos (<65% aa identity). Los genes accesorios putativos también fueron BLASTed contra los registros de GenBank. La mayoría de los genes accesorios no tienen homólogos en GenBank-database, excepto ORF3a (52,0-55,5% aa identity with BatCoV HKU10 ORF3) y ORF9 (28,1-32,0% aa identity with SARSr-CoV ORF7a). Analizamos la homología proteica con el software HHpred. Los resultados mostraron que ORF9s y SARS-CoV OR7a son homólogos (posibilidad: 100%, Para confirmar la presencia de ARN subgenómico, diseñamos un conjunto de imprimaciones dirigidas a todos los ORF predichos como se describe. Los amplicones fueron confirmados primero a través de electroforesis de agarosa-gel y luego secuenciación (Figura 3 y Tabla 2 ). Las secuencias mostraron que todos los ORFs, excepto ORF4b, tenían un TRS anterior. Por lo tanto, el ORF4b puede ser traducido a partir de mRNAs bicistrónicos. En RsYN1, se encontró un ARN subgenómico adicional a partir del interior del ORF3a a través de la secuenciación, lo que llevó a un ORF3b único. Para confirmar la presencia de ARN subgenómico, diseñamos un conjunto de imprimaciones dirigidas a todos los ORFs predichos como se describe. Los amplicones fueron confirmados primero a través de electroforesis gel de agarosa y luego secuenciación (Figura 3 y Tabla 2 ). Las secuencias mostraron que todos los ORF, excepto ORF4b, tenían TRS anteriores. Por lo tanto, los ORF4b pueden ser traducidos de ARNm bicistrónicos. En RsYN1, se encontró un ARN subgenómico adicional a partir del interior del ORF3a a través de secuenciación, lo que llevó a un ORF3b único. Los árboles filogenéticos fueron construidos usando las secuencias aa de RdRp y S de BtCoV/Rh/YN2012 y otras CoVs representativas (Figura 4). En ambos árboles, todos los BtCoV/Rh/YN2012 fueron agrupados juntos y formaron un linaje distinto a otras especies conocidas del corona Dentro de BtCoV/Rh/YN2012 se observaron dos sublineamientos distintos.Uno fue de Ra muestreado en Guangdong, mientras que el otro fue de Rs muestreado en Yunnan Entre las cepas de Yunnan, RsYN2 y RsYN3 fueron agrupadas, mientras que RsYN1 fue aislado. La topología de estas cuatro cepas fue correlacionada con el lugar de muestreo. Las ramas relativamente largas reflejan una alta diversidad entre estas cepas, lo que indica una larga evolución independiente. Los árboles filogenéticos fueron construidos usando las secuencias aa de RdRp y S de BtCoV/Rh/YN2012 y otras CoV representativas (Figura 4). En ambos árboles, todos BtCoV/Rh/YN2012 fueron agrupados y formaron un linaje distinto a otras especies conocidas de coronavirus. Dentro de BtCoV/Rh/YN2012 se observaron dos sublineamientos distintos.Uno fue de Ra muestreado en Guangdong, mientras que el otro fue de Rs muestreado en Yunnan Entre las cepas de Yunnan, RsYN2 y RsYN3 fueron agrupadas, mientras que RsYN1 fue aislado. La topología de estas cuatro cepas fue correlacionada con el lugar de muestreo. Las ramas relativamente largas reflejan una alta diversidad entre estas cepas, lo que indica una larga evolución independiente. Los árboles filogenéticos fueron construidos usando las secuencias aa de RdRp y S de BtCoV/Rh/YN2012 y otras CoV representativas (Figura 4). En ambos árboles, todos BtCoV/Rh/YN2012 fueron agrupados y formaron un linaje distinto a otras especies conocidas de coronavirus. En BtCoV/Rh/YN2012 se observaron dos sublineamientos distintos, uno de Ra en Guangdong, mientras que el otro de Rs en Yunnan Entre las cepas de Yunnan, RsYN2 y RsYN3 se agruparon, mientras que RsYN1 se aisló. La topología de estas cuatro cepas se correlacionó con el lugar de muestreo. Las ramas relativamente largas reflejan una gran diversidad entre estas cepas, lo que indica un largo historial de evolución independiente. Las ratios Ka/Ks (Ks es el número de sustituciones sinónimos por sitios sinónimos y Ka es el número de sustituciones no sinónimos por sitio sinónimos) fueron calculadas para todos los genes. Las ratios Ka/Ks para la mayoría de los genes fueron generalmente bajas, lo que indica que estos genes estaban bajo selección purificada. Sin embargo, las ratios Ka/Ks de ORF4a, ORF4b y ORF9 (0,727, 0,623 y 0,843, respectivamente) fueron significativamente más altas que las de otros ORFs (Tabla 4 ). Para la evaluación de la presión de selección adicional del gen ORF4a y ORF4b, secuenciamos otros cuatro genes ORF4a y ORF4b (estreno Rs4223, Rs4236, Rs4240 y Ra13576 se mostró en la Figura 1B Como SARS-CoV ORF7a fue reportado para inducir apoptosis, realizamos análisis de apoptosis en BtCoV/Rh/YN 2012 ORF9, a~30% aa homólogo de identidad de SARSr-CoV ORF7a. Transfectamos transitoriamente ORF9 de BtCoV/Rh/YN2012 a células HEK293T para examinar si esta ORF9 desencadena apoptosis. Se realizó Western blot para confirmar la expresión de ORF9 y SARS-CoV ORF7a (Figura S1). ORF9 no pudo inducir apoptosis como la ORF7a de SARS-CoV Tor2 (Figura S2). Los resultados indicaron que BtCoV/Rh/YN2012 ORF9 no estuvo involucrado en la inducción de la apoptosis. Para determinar si estas proteínas accesorias modulan la inducción de IFN, transfectamos plasmidos reporteros (pIFNβ-Luc y pRL-TK) y plasmidos de expresión a células 293T. Todas las células que sobreexpresaban los genes accesorios, así como el virus influenza NS1 (tramo PR8), HBoV VP2, o el vector vacío fueron probados para la actividad de luciferasa después de la infección por SeV. La actividad luciferasa estimulada por SeV fue notablemente superior a la esperada sin tratamiento con SeV. El virus influenza NS1 inhibe la expresión del promotor de IFN, mientras que HBoV VP2 activa la expresión. En comparación con esos controles, las proteínas ORF4a exhiben un efecto activo como HBoV VP2 (Figura 5A ). Otras proteínas accesorias no mostraron ningún efecto en la producción de IFN (Figura S3 ). La expresión de estos genes accesorios fue confirmada por Western blot (Figura S1 ). fue notablemente mayor que sin tratamiento con SeV como se esperaba. El virus influenza En comparación con estos controles, las proteínas ORF4a presentan un efecto activo como HBoV VP2 (Figura 5A ). Otras proteínas accesorias no mostraron ningún efecto en la producción de IFN (Figura S3 ). La expresión de estos genes accesorios fue confirmada por Western blot (Figura S1 ). Las muestras fueron recolectadas a las 6 h de postinfección, seguidas por el ensayo de doble luciferasa. Los resultados fueron expresados como el valor luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la lucifera de la Las células 293T fueron transfectadas con 100 ng pNF-B-Luc, 10 ng pRL-TK, vector vacío (500 ng), un plásmido NS1 que expresaba (500 ng), un plásmido ORF7a de expresión SARS-CoV (500 ng), o plásmidos ORF3a de expresión ORF (500 ng). Después de 24 h, las células fueron tratadas con TNF-α. La actividad de la doble luciferasa se determinó después de 6 h. Los resultados se expresaron como la actividad de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la Los asteriscos indican diferencias significativas entre los grupos (en comparación con el vector-NC vacío, p < 0,05, según lo determinado por la prueba t del estudiante). NF-B juega un papel importante en la regulación de la respuesta inmune a la infección viral y es también un factor clave frecuentemente dirigido por virus para hacerse cargo de la célula huésped. En este estudio, se probó si estas proteínas accesorias podían modular las células NF-B. 293T fueron cotransfectadas con reportero Las muestras fueron recolectadas a 6 h de postinfección, seguidas de ensayo de doble luciferasa. Los resultados se expresaron como el valor de luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la lucifera de la lucifera de la lucifera de la lucifera de la lucifera de la lu Las células 293T fueron transfectadas con 100 ng pNF-B-Luc, 10 ng pRL-TK, vector vacío (500 ng), un plásmido NS1 que expresaba (500 ng), un plásmido ORF7a de expresión SARS-CoV (500 ng), o plásmidos ORF3a de expresión ORF (500 ng). Después de 24 h, las células fueron tratadas con TNF-α. La actividad de la doble luciferasa se determinó después de 6 h. Los resultados se expresaron como la actividad de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la Los asteriscos indican diferencias significativas entre los grupos (en comparación con el vector-NC vacío, p < 0,05, según lo determinado por la prueba t del estudiante). El NF-B desempeña un papel importante en la regulación de la respuesta inmunitaria a la infección viral y es también un factor clave frecuentemente dirigido por virus para hacerse cargo de la célula huésped. En este estudio, se probó si estas proteínas accesorias podían modular las células NF-B. 293T fueron cotransfectadas con plásmidos reporteros (pNF-B-Luc y pRL-TK), así como con plasmidos que expresan proteínas accesorias, o controles (vector vacío, NS1, SARS-CoV Tor2-ORF7a). Las células fueron tratadas con TNF-α durante 6 h a 24 h después de la transfección. Se determinó la actividad luciferasa. RsYN1-ORF3a y RaGD-ORF3a activaron NF-B como SARS-CoV ORF7a, mientras que RsYN2-ORF3a inhibió NF-B como NS1 (Figura 5B ). Las expresiones de ORF3as fueron confirmadas con Western blot (Figura S1 ). Otras proteínas accesorias no modularon la producción de NF-B (Figura S4 ). Para comprender la infectividad de estos nuevos BtCoV/Rh/YN2012, seleccionamos las proteínas de pico RsYN1, RsYN3 y RaGD para estudios de entrada de pseudovirus mediados por picos. Tanto el análisis de manchas occidentales como la observación de microscopía electrónica de mancha negativa confirmaron con éxito la preparación de BtCoV/Rh Un total de 11 líneas celulares humanas, 8 células de murciélagos y otras 9 líneas celulares de mamíferos fueron probadas, y no se encontró ningún fuerte positivo (Tabla S2). En este estudio, una nueva especie alfa-CoV, BtCoV/Rh/YN2012, fue identificada en dos especies Rhinolophus. Las 4 cepas con genoma de largo alcance fueron secuencias. Los 7 dominios de replicación conservados de estos virus poseían una identidad secuencial <90% aa a los de otros alfa-CoV conocidos, lo que define una nueva especie de acuerdo con el estándar de taxonomía ICTV [42]. Estos nuevos alfa-CoV mostraron una alta diversidad genética en sus genes estructurales y no estructurales. La cepa RaGD de R. affinis, recolectada en la provincia de Guangdong, formó una rama independiente divergente de las otras 3 cepas de R. sinicus, muestreadas en la provincia de Yunnan, indicando un proceso de evolución independiente asociado con el aislamiento geográfico y la restricción del huésped. Aunque recolectadas de la misma provincia, estas tres cepas de virus formaron dos genotipos correlacionados con lugares de muestreo. Estos dos genotipos tenían una baja identidad de secuencia del genoma, especialmente en el gen S y genes accesorios. Teniendo en cuenta la ubicación geográfica remota del hábitat del murciélago huésped, el tropismo anfitrión y la diversidad del virus, suponemos que BtCoV/Rh/YN2012 puede haberse diseminado en estas dos provincias con una larga historia de circulación en su reservorio natural, los murciélagos Rhinolophus. Con la evidencia de secuencia, suponemos que En primer lugar, se identificaron nuevos genes accesorios, que no tenían homólogos en los genomas. En segundo lugar, se encontraron múltiples TRS entre los genes S y E, mientras que otros alfacoronavirus solo tenían un TRS allí. Estos TRS preceden a ORF3a, ORF3b (sólo en RsYN1) y ORF4a/b respectivamente. En tercer lugar, el gen accesorio ORF9 mostró homología con los de otras especies conocidas de CoV en otro género de coronavirus, especialmente con genes accesorios de SRASr-CoV. Los genes accesorios suelen estar involucrados en interacciones virus-anfitriones durante la infección por CoV [43]. En la mayoría de los CoVs, los genes accesorios son dispensables para la replicación del virus. Sin embargo, se requirió un gen 3c intacto de felina CoV para la replicación viral en el intestino [44] [45] [4 La supresión de los genes específicos del género en el virus de la hepatitis del ratón llevó a una reducción de la virulencia [47]. SARS-CoV ORF7a, que fue identificado como involucrado en la supresión del silenciamiento del ARN [48], inhibición de la síntesis de proteínas celulares [49], bloqueo del ciclo celular [50], e inducción de la apoptosis [51, 52]. En este estudio, encontramos que BtCoV/Rh/YN2012 ORF9 comparte ~ 30% aa identidad secuencial con SARS-CoV ORF7a. Curiosamente, BtCoV/Rh/YN2012 y SRASr-CoV fueron detectados en R. sinicus de la misma cueva. Suponemos que el SARS-CoV y el BtCoV/Rh/YN2012 pueden haber adquirido ORF7a o ORF9 de un ancestro común a través de la recombinación del genoma o la transferencia horizontal de genes. Mientras que el ORF9 de BtCoV/Rh/YN2012 no indujo la apoptosis ni activaron la producción de NF-Karabaj, estas diferencias pueden ser inducidas por la evolución divergente de estas proteínas en diferentes presiones. Aunque diferentes BtCoV/Rh/YN2012 ORF4a comparten < 64,4% de identidad de aminoácidos, todos ellos podrían activar IFN-β. El ORF3a de RsYN1 y RaGD incrementan la patogenicidad del virus con una vía diferente. A pesar de la falta de líneas celulares intestinales del huésped natural de BtCoV/Rh/YN2012, examinamos el tropismo celular de su proteína de pico a través de la entrada de retrovirus pseudotipados con líneas celulares humanas, murciélagos y otras células de mamíferos. La mayoría de las líneas celulares examinadas fueron insospechables a BtCoV/Rh/YN2012, lo que indica un bajo riesgo de transmisión de interespecies a humanos y otros animales. Múltiples razones pueden conducir a una infección fallida del sistema retrovirus de pico de coronavirus-pseudotipo, incluyendo ausencia de receptor en células diana, reconocimiento fallido al homólogo receptor de especies no huésped, mala adaptación en células no huésped durante la maduración de pico o entrada de virus, o la limitación del sistema retrovirus en la entrada de coronavirus estimulante. La débil infectividad del retrovirus pseudotipado RsYN1 en células Huh-7 podría explicarse por la unión de la proteína de pico a polisacárido secretada a la superficie. La suposición debe ser confirmada por experimentos. Nuestras vigilancias a largo plazo sugieren que los murciélagos Rhinolophus parecen albergar una amplia diversidad de CoVs. Coincidentemente, los dos agentes altamente patógenos, SRAS-CoV y Rh-BatCoV HKU2 ambos se originaron de murciélagos Rhinolophus. Teniendo en cuenta la diversidad de CoVs transportados por este género de murciélagos y su amplia distribución geográfica, puede haber un bajo riesgo de derrame de estos virus a otros animales y humanos. Vigilanciaes a largo plazo y estudios de patogénesis ayudarán a prevenir futuras enfermedades humanas y animales causadas por estos murciélagos CoVs. Materiales complementarios: Los siguientes están disponibles en línea en http://www.mdpi.com/1999-4915/11/4/379/s1, Figura S1 : análisis de manchas occidentales de la expresión de proteínas accesorias. Figura S2 : análisis de Apoptosis de proteínas ORF9 de BtCoV/Rh/YN2012. Figura S3 : análisis funcional de proteínas ORF3a, ORF3b, ORF4b, ORF8 y ORF9 en la producción de interferón de tipo I. Figura S4 : análisis funcional de ORF3b, ORF4a, ORF4b, ORF8 y ORF9 en la producción de NF- Tabla S2 : Primeros para la detección de ARNm sugbenómicos virales. Tabla S3

¿Qué animales infectan principalmente el gammavirus y el delta coronavirus?

Caracterización de un nuevo miembro del alfacoronavirus con características genómicas únicas en los murciélagos de Rhinolophushttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6521148/SHA: ee14de143337eec0e9708f8139bfac2b7b8fdd27Autores: Wang, Ning; Luo, Chuming; Liu, Haizhou; Yang, Xinglou; Hu, Ben; Zhang, Wei; Li, Bei; Zhu, Yan; Zhu, Guangjian; Shen, Xurui; Peng, Cheng; Shi, ZhengliFecha: 2019-04-24DOI: 10.3390/v11040379Licencia: cc-byAbstract: Los murciélagos han sido identificados como Varios de ellos han causado enfermedades en humanos y animales domésticos por transmisión de interespecies. Teniendo en cuenta la diversidad de coronavirus de murciélagos, especies de murciélagos y poblaciones, esperamos descubrir más CoV de murciélagos a través de la vigilancia del virus. En este estudio, describimos un nuevo miembro de alfaCoV (BtCoV/Rh/YN2012) en murciélagos con características únicas del genoma. Se encontraron genes accesorios únicos, ORF4a y ORF4b entre el gen de pico y el gen de sobre, mientras que el gen ORF8 se encontró aguas abajo del gen nucleocápsido. Todos los genes putativos fueron confirmados por análisis de transcripción inversa. Un gen único en el 3’ final del genoma BtCoV/Rh/YN2012, ORF9, muestra ~30% identidad de aminoácidos a ORF7a del corona El análisis funcional mostró que la proteína ORF4a puede activar la producción de IFN-β, mientras que ORF3a puede regular la producción de NF-B. También examinamos la entrada de virus mediados por picos utilizando el sistema de retrovirus pseudotipados, aunque no encontramos células totalmente permisivas. Nuestros resultados amplían el conocimiento sobre la diversidad genética de los coronavirus de murciélagos. La exploración continua de virus de murciélagos nos ayudará a entender más el importante papel que desempeñan los murciélagos en la evolución y transmisión del coronavirus. Texto: Los miembros de la familia Coronaviridae son virus de ARN de cadena positiva no segmentados con tamaños de genoma que van desde 26-32 kb [1]. Estos virus se clasifican en dos subfamilias: Letovirinae, que contiene el único género: Alphaletovirus; y Orthocoronavirinae (CoV), que consiste en alfa, beta, gamma y deltacoronavirus (CoVs) [2, 3]. Alfa y betacoronavirus infectan principalmente mamíferos y causan enfermedades humanas y animales. Gamma-y delta-CoVs infectan principalmente aves, pero algunos también pueden infectar mamíferos [4, 5]. Se sabe que seis CoVs humanos (HCoVs) causan enfermedades humanas. HCoV-HKU1, HCoV-OC43, HCoV-229E y HCoV-NL63 suelen causar enfermedades respiratorias leves o infecciones asintomáticas; sin embargo, el síndrome respiratorio agudo grave coronavirus (SARS-CoV) y todos los procedimientos de muestreo fueron realizados por veterinarios, con la aprobación del Comité de Ética Animal del Instituto de Virología Wuhan (WIVH5210201). El estudio se llevó a cabo de acuerdo con la Guía para el cuidado y el uso de mamíferos silvestres en la investigación de la República Popular China. Las muestras de hisopos fecales y pellets de murciélagos se recolectaron de noviembre de 2004 a noviembre de 2014 en diferentes estaciones en el sur de China, como se describió anteriormente [16]. El ARN viral se extrajo de 200 μL de muestras de hisopos fecales o pellets utilizando el kit de El ARN fue eludido en 50 μL de tampón de elución, alícuota, y almacenado en -80 • C. Se empleó PCR (Invitrogen, San Diego, CA, EE.UU.) de hemi-nedificado en un solo paso para detectar el coronavirus, como se describió anteriormente [17, 18]. Para confirmar la especie de murciélago de una muestra individual, nosotros PCR amplificamos el citocromo b (Cytob) y/o el gen de la subunidad 1 (ND1) de la deshidrogenasa NADH utilizando ADN extraído de las heces o hisopos [19, 20]. Las secuencias genéticas fueron ensambladas excluyendo las secuencias de imprimación. BLASTN fue utilizado para identificar especies de huésped basadas en las secuencias más estrechamente relacionadas con la mayor cobertura de consulta y una identidad mínima del Las secuencias genómicas completas se determinaron mediante PCR de un solo paso (Invitrogen, San Diego, CA, USA) amplificación con imprimaciones degeneradas (Tabla S1) diseñadas sobre la base de múltiples alineaciones de secuencias alfa-CoV disponibles depositadas en GenBank o amplificadas con SuperScript IV Transcriptasa Inversa (Invitrogen) y Expand Long Template PCR System (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) con imprimaciones específicas (secuencias primarias disponibles bajo petición). Las secuencias de los extremos genómicos 5' y 3' se obtuvieron mediante amplificación rápida de 5' y 3' de los extremos de cDNA (SMARTER Viruses 2019, 11, 379 3 de 19 RACE 5'/3' Kit; Clontech, Mountain View, CA, USA), respectivamente. Los productos PCR fueron Los productos PCR de más de 5kb fueron sometidos a secuenciación profunda utilizando el sistema Hiseq2500. Para algunos fragmentos, los productos PCR fueron clonados en el pGEM-T Easy Vector (Promega, Madison, WI, USA) para secuenciación. Al menos cinco clones independientes fueron secuenciados para obtener una secuencia de consenso. Los datos de la secuenciación de la siguiente generación (NGS) fueron filtrados y mapeados a la secuencia de referencia de BatCoV HKU10 (número de adhesión de GenBank NC_018871) usando Geneious 7.1.8 [21]. Los genomas fueron ensamblados preliminarmente usando DNAStar lasergene V7 (DNAStar, Madison, WI, USA). Se predijeron marcos de lectura abierta (ORF) Putativos utilizando el buscador de ORF de NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ orffinder/) con una longitud mínima de 150 nt, seguido de una inspección manual. Se definieron las secuencias de la región 5' no traducida (5'-UTR) y 3'-UTR, y la secuencia líder, la secuencia reguladora de transcripción corporal y líder (TRS) fueron identificadas como previamente descritas [22]. La escisión de las 16 proteínas no estructurales codificadas por ORF1ab fue determinada por la alineación de secuencias aa de otras CoVs y el patrón de reconocimiento de la proteinasasa 3C y la proteinasasa similar a la papaína. Los árboles filogenéticos basados en secuencias nt o aa fueron construidos utilizando el algoritmo de máxima probabilidad con valores de bootstrap determinados por 1000 réplicas en el paquete de software MEGA 6 [23]. Las secuencias de genoma de larga duración obtenidas en este estudio fueron alineadas con las de alfa-CoVs previamente reportadas usando MUSCLE [24]. Las secuencias alineadas fueron escaneadas para eventos de recombinación mediante el Programa de Detección de Recombinación [25]. Los eventos potenciales de recombinación como sugieren los fuertes p-valores (<10 -20 ) fueron confirmados mediante diagrama de similitud y análisis bootscan implementados en Simplot 3.5.1 [26]. El número de sustituciones sinónimas por sitio sinónimas, Ks, y el número de sustituciones sinónimas por sitio sinónimas, Ka, para cada región de codificación, se calcularon utilizando la herramienta de cálculo Ka/Ks de la Plataforma Norwegian Bioinformática (http://services.cuib.no/tools/kaks) con parámetros por defecto [27]. La detección de homología de proteínas se analizó utilizando HHpred (https://toolkit.tuebingen.mpg.de/#/tools/hpred) con parámetros por defecto [28]. Se utilizó un conjunto de RT-PCRs anidados para determinar la presencia de mRNA subgenómica viral en las muestras positivas de CoV [29]. Los imprimadores delanteros se diseñaron con la secuencia líder al Células primarias de murciélago o inmortalizadas (Rhinolophus sinicus riñón inmortalizado, RsKT; Rhinolophus sinicus células primarias de pulmón, RsLu4323; Rhinolophus sinicus cerebro inmortalizado, RsBrT; Rhinolophus affinis células primarias de riñón, RaK4324; Rousetus leschenaultii células inmortalizadas de riñón, RlKT; Hipposideros pratti células inmortalizadas de pulmón, HpLuT) generadas en nuestro laboratorio fueron cultivadas en DMEM/F12 con 15% FBS. Las células renales de Pteropus alecto (Paki) se mantuvieron en DMEM/F12 complementadas con 10% FBS. Otras células fueron mantenidas según las recomendaciones de American Type Culture Collection (ATCC, www.atcc.org). Los genes accesorios putativos del virus recién detectado fueron generados por RT-PCR a partir de ARN viral extraído de muestras fecales, como se describió anteriormente [30]. El plásmido del virus influenza NS1 fue generado en nuestro laboratorio [31]. El bocavirus humano (HBoV) VP2 plásmido fue amablemente proporcionado por el prof. Hanzhong Wang del Instituto de Virología Wuhan, Academia China de Ciencias. SRAS-CoV ORF7a fue sintetizado por Sangon Biotech. Las transfecciones fueron realizadas con Lipofectamine 3000 Reagent (Life Technologies). La expresión de estos genes accesorios fue analizada por Western blotting usando un mAb (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim Brevemente, el sobrenadante fecal fue adquirido mediante centrifugación de gradiente y luego agregado a las células Vero E6, 1:10 diluidas en DMEM. Después de la incubación a 37°C durante 1 h el inóculo fue reemplazado por DMEM fresco que contenía 2% FBS y el antibiótico antimicótico (Gibco, Grand Island, NY, EE.UU.). Se realizaron tres pasajes ciegos. Las células fueron revisadas diariamente para detectar el efecto citopático. Tanto el sobrenadante de cultivo como el pellet celular fueron examinados para CoV por RT-PCR [17]. La Apoptosis fue analizada como se describió previamente [18]. Brevemente, las células 293T en placas de 12 pocillos fueron transfectadas con 3 μg de plasma de expresión o vector vacío, y las células fueron recolectadas 24 h después de la transfección La apoptosis fue detectada por citometría de flujo utilizando el kit de detección de apoptosis V-FITC/PI de la anexina (YEASEN, Shanghai, China) siguiendo las instrucciones del fabricante.Células anexina-V-positivas y IP-negativas se consideraron en la fase apoptótica temprana y se consideró que las teñidas para la apoptosis o necrosis tardía de la anexina V y la IP se sometieron a apoptosis o necrosis tardía.Todos los experimentos se repitieron tres veces. Las células HEK 293T fueron sembradas en placas de 24 pocillos y luego cotransfectadas con plásmidos reporteros (pRL-TK y pIFN-βIFN-o pNF-B-Luc) [30], así como plásmidos que expresan genes accesorios, plásmidos vectoriales vacíos pcAGGS, virus influenza NS1 [32], SARS-CoV ORF7a [33], o HBoV VP2 [34]. A las 24 h después de la transfección, las células fueron tratadas con el virus Sendai (SeV) (100 unidades de hemaglutinina [HAU]/ml) o el factor de necrosis tumoral humano alfa (TNF-α; sistema R&D) durante 6 h para activar IFNβ o NF- Se prepararon lisatos celulares y se midió la actividad de luciferasa utilizando el kit de ensayo de doble luciferasa (Promega, Madison, WI, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utilizaron retrovirus pseudotipados con BtCoV/Rh/YN2012 RsYN1, RsYN3, RaGD, o pico MERS-CoV, o ningún pico (mock) para infectar células humanas, murciélagos u otras células de mamíferos en placas de 96 pozos. Las partículas de pseudovirus fueron confirmadas con electromicroscopía de borrado occidental y de mancha negativa. El proceso de producción, mediciones de infección y actividad de luciferasa se llevaron a cabo, como se describió anteriormente [35, 36]. Las secuencias nucleótidas del genoma completo de las cepas BtCoV/Rh/YN2012 RsYN1, RsYN2, RsYN3, y RaGD obtenidas en este estudio han sido sometidas al GenBank bajo MG916901 a MG916904. La vigilancia se realizó entre noviembre de 2004 y noviembre de 2014 en 19 provincias de China. En total, se recolectaron 2061 muestras fecales de al menos 12 especies de murciélago Rhinolophus (Figura 1A ). Se detectaron COVs en 209 de estas muestras (Figura 1B y Tabla 1 ). Cinco de estos virus están relacionados con especies conocidas: Mi-BatCoV 1 (> 94% nt identity), Mi-BatCoV HKU8 [37] (> 93% nt identity), BtRf-AlphaCoV/HuB2013 [11] (> 99% nt identity), SRASr-CoV [38] (> 89% nt identity) y HKU2 related CoV [39] (> 85% nt identity). Mientras que las otras tres secuencias de CoV mostraron menos de 83% nt identity a especies conocidas de CoV. Estos tres virus deben representar nuevas especies de CoV. El aislamiento del virus se realizó como se describió previamente [12], pero no tuvo éxito. identidad). Mientras que las otras tres secuencias de CoV mostraron menos de 83% nt identity a especies conocidas de CoV. Estos tres virus deben representar nuevas especies A continuación caracterizamos una novela alfa-CoV, BtCoV/Rh/YN2012. Fue detectada en 3 R.affinis y 6 R.sinicus, respectivamente. Con base en las secuencias, definimos tres genotipos, que fueron representados por RsYN1, RsYN3, y RaGD, respectivamente. Strain RsYN2 fue clasificado en el genotipo RsYN3. Se obtuvieron cuatro genomas de longitud completa. Tres de ellos fueron de R.sinicus (Strain RsYN1, RsYN2 y RsYN3), mientras que el otro fue de R.affinis (Strain RaGD). Los tamaños de estos 4 genomas son entre 28.715 y 29.102, con contenidos de G+C entre el 39,0% y el 41,3%. Los genomas presentan estructuras similares y secuencias reguladoras de transcripción (TRS) que son idénticas a las de otros alfa-CoVs (Figura 2 y Tabla 2). Se observaron excepciones incluyendo tres ORF adicionales (ORF3b, ORF4a y ORF4b). Todas las 4 cepas tienen ORF4a y ORF4b, mientras que sólo la cepa RsYN1 tiene ORF3b. El gen de réplicas, ORF1ab, ocupa~20.4 kb del genoma. El gen de réplicas, ORF1ab, ocupa~20.4 kb del genoma. Codifica las poliproteínas 1a y 1ab, las cuales podrían separarse en 16 proteínas no estructurales (Nsp1-Nsp16). El 3'-fin de los sitios de escote reconocidos por la proteinasa similar a 3C (Nsp4-Nsp10, Nsp12-Nsp16) y la proteinasa similar a papaína (Nsp1-Nsp3) fueron confirmados. Las proteínas incluyendo Nsp3 (papain-like 2 proteas, PL2pro), Nsp5 (quimotripsina-like proteasa, 3CLpro), Nsp12 (RdRp), Nsp13 (helicase), y otras proteínas de función desconocida (Tabla 3 ). Los 7 dominios concatenados de poliproteína 1 comparten la identidad de secuencia <90% aa con los de otros alfa-CoV conocidos (Tabla 2 ), sugiriendo que estos virus representan una nueva especie de CoV dentro de la alfa-CoV. Las especies de CoV más cercanas asignadas a BtCoV/Rh/YN2012 son BtCoV-HKU10 y BtRf-AlphaCoV/Hub2013. Las tres cepas de la provincia de Yunnan fueron agrupadas en dos genotipos (83% identidad del genoma) correlacionados con su localización de muestreo. El tercer genotipo representado por la cepa RaGD fue aislado a las cepas encontradas en Yunnan (<75,4% identidad del genoma). Luego examinamos los genes individuales (Tabla 2). Todos los genes mostraron una baja identidad de secuencia aa a CoV conocidos. Las cuatro cepas de BtCoV/Rh/YN2012 mostraron diversidad genética entre todos los genes diferentes excepto ORF1ab (>83,7% aa identidad). Cabe destacar que las proteínas de pico son muy divergentes entre estas cepas. Otras proteínas de estructura (E, M La comparación de los genes accesorios entre estas cuatro cepas reveló que las cepas del mismo genotipo compartían un ORF3a 100% idéntico. Sin embargo, las proteínas codificadas por ORF3as eran altamente divergentes entre los diferentes genotipos (<65% aa identity). Los genes accesorios putativos también fueron BLASTed contra los registros de GenBank. La mayoría de los genes accesorios no tienen homólogos en GenBank-database, excepto ORF3a (52,0-55,5% aa identity with BatCoV HKU10 ORF3) y ORF9 (28,1-32,0% aa identity with SARSr-CoV ORF7a). Analizamos la homología proteica con el software HHpred. Los resultados mostraron que ORF9s y SARS-CoV OR7a son homólogos (posibilidad: 100%, Para confirmar la presencia de ARN subgenómico, diseñamos un conjunto de imprimaciones dirigidas a todos los ORF predichos como se describe. Los amplicones fueron confirmados primero a través de electroforesis de agarosa-gel y luego secuenciación (Figura 3 y Tabla 2 ). Las secuencias mostraron que todos los ORFs, excepto ORF4b, tenían un TRS anterior. Por lo tanto, el ORF4b puede ser traducido a partir de mRNAs bicistrónicos. En RsYN1, se encontró un ARN subgenómico adicional a partir del interior del ORF3a a través de la secuenciación, lo que llevó a un ORF3b único. Para confirmar la presencia de ARN subgenómico, diseñamos un conjunto de imprimaciones dirigidas a todos los ORFs predichos como se describe. Los amplicones fueron confirmados primero a través de electroforesis gel de agarosa y luego secuenciación (Figura 3 y Tabla 2 ). Las secuencias mostraron que todos los ORF, excepto ORF4b, tenían TRS anteriores. Por lo tanto, los ORF4b pueden ser traducidos de ARNm bicistrónicos. En RsYN1, se encontró un ARN subgenómico adicional a partir del interior del ORF3a a través de secuenciación, lo que llevó a un ORF3b único. Los árboles filogenéticos fueron construidos usando las secuencias aa de RdRp y S de BtCoV/Rh/YN2012 y otras CoVs representativas (Figura 4). En ambos árboles, todos los BtCoV/Rh/YN2012 fueron agrupados juntos y formaron un linaje distinto a otras especies conocidas del corona Dentro de BtCoV/Rh/YN2012 se observaron dos sublineamientos distintos.Uno fue de Ra muestreado en Guangdong, mientras que el otro fue de Rs muestreado en Yunnan Entre las cepas de Yunnan, RsYN2 y RsYN3 fueron agrupadas, mientras que RsYN1 fue aislado. La topología de estas cuatro cepas fue correlacionada con el lugar de muestreo. Las ramas relativamente largas reflejan una alta diversidad entre estas cepas, lo que indica una larga evolución independiente. Los árboles filogenéticos fueron construidos usando las secuencias aa de RdRp y S de BtCoV/Rh/YN2012 y otras CoV representativas (Figura 4). En ambos árboles, todos BtCoV/Rh/YN2012 fueron agrupados y formaron un linaje distinto a otras especies conocidas de coronavirus. Dentro de BtCoV/Rh/YN2012 se observaron dos sublineamientos distintos.Uno fue de Ra muestreado en Guangdong, mientras que el otro fue de Rs muestreado en Yunnan Entre las cepas de Yunnan, RsYN2 y RsYN3 fueron agrupadas, mientras que RsYN1 fue aislado. La topología de estas cuatro cepas fue correlacionada con el lugar de muestreo. Las ramas relativamente largas reflejan una alta diversidad entre estas cepas, lo que indica una larga evolución independiente. Los árboles filogenéticos fueron construidos usando las secuencias aa de RdRp y S de BtCoV/Rh/YN2012 y otras CoV representativas (Figura 4). En ambos árboles, todos BtCoV/Rh/YN2012 fueron agrupados y formaron un linaje distinto a otras especies conocidas de coronavirus. En BtCoV/Rh/YN2012 se observaron dos sublineamientos distintos, uno de Ra en Guangdong, mientras que el otro de Rs en Yunnan Entre las cepas de Yunnan, RsYN2 y RsYN3 se agruparon, mientras que RsYN1 se aisló. La topología de estas cuatro cepas se correlacionó con el lugar de muestreo. Las ramas relativamente largas reflejan una gran diversidad entre estas cepas, lo que indica un largo historial de evolución independiente. Las ratios Ka/Ks (Ks es el número de sustituciones sinónimos por sitios sinónimos y Ka es el número de sustituciones no sinónimos por sitio sinónimos) fueron calculadas para todos los genes. Las ratios Ka/Ks para la mayoría de los genes fueron generalmente bajas, lo que indica que estos genes estaban bajo selección purificada. Sin embargo, las ratios Ka/Ks de ORF4a, ORF4b y ORF9 (0,727, 0,623 y 0,843, respectivamente) fueron significativamente más altas que las de otros ORFs (Tabla 4 ). Para la evaluación de la presión de selección adicional del gen ORF4a y ORF4b, secuenciamos otros cuatro genes ORF4a y ORF4b (estreno Rs4223, Rs4236, Rs4240 y Ra13576 se mostró en la Figura 1B Como SARS-CoV ORF7a fue reportado para inducir apoptosis, realizamos análisis de apoptosis en BtCoV/Rh/YN 2012 ORF9, a~30% aa homólogo de identidad de SARSr-CoV ORF7a. Transfectamos transitoriamente ORF9 de BtCoV/Rh/YN2012 a células HEK293T para examinar si esta ORF9 desencadena apoptosis. Se realizó Western blot para confirmar la expresión de ORF9 y SARS-CoV ORF7a (Figura S1). ORF9 no pudo inducir apoptosis como la ORF7a de SARS-CoV Tor2 (Figura S2). Los resultados indicaron que BtCoV/Rh/YN2012 ORF9 no estuvo involucrado en la inducción de la apoptosis. Para determinar si estas proteínas accesorias modulan la inducción de IFN, transfectamos plasmidos reporteros (pIFNβ-Luc y pRL-TK) y plasmidos de expresión a células 293T. Todas las células que sobreexpresaban los genes accesorios, así como el virus influenza NS1 (tramo PR8), HBoV VP2, o el vector vacío fueron probados para la actividad de luciferasa después de la infección por SeV. La actividad luciferasa estimulada por SeV fue notablemente superior a la esperada sin tratamiento con SeV. El virus influenza NS1 inhibe la expresión del promotor de IFN, mientras que HBoV VP2 activa la expresión. En comparación con esos controles, las proteínas ORF4a exhiben un efecto activo como HBoV VP2 (Figura 5A ). Otras proteínas accesorias no mostraron ningún efecto en la producción de IFN (Figura S3 ). La expresión de estos genes accesorios fue confirmada por Western blot (Figura S1 ). fue notablemente mayor que sin tratamiento con SeV como se esperaba. El virus influenza En comparación con estos controles, las proteínas ORF4a presentan un efecto activo como HBoV VP2 (Figura 5A ). Otras proteínas accesorias no mostraron ningún efecto en la producción de IFN (Figura S3 ). La expresión de estos genes accesorios fue confirmada por Western blot (Figura S1 ). Las muestras fueron recolectadas a las 6 h de postinfección, seguidas por el ensayo de doble luciferasa. Los resultados fueron expresados como el valor luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la lucifera de la Las células 293T fueron transfectadas con 100 ng pNF-B-Luc, 10 ng pRL-TK, vector vacío (500 ng), un plásmido NS1 que expresaba (500 ng), un plásmido ORF7a de expresión SARS-CoV (500 ng), o plásmidos ORF3a de expresión ORF (500 ng). Después de 24 h, las células fueron tratadas con TNF-α. La actividad de la doble luciferasa se determinó después de 6 h. Los resultados se expresaron como la actividad de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la Los asteriscos indican diferencias significativas entre los grupos (en comparación con el vector-NC vacío, p < 0,05, según lo determinado por la prueba t del estudiante). NF-B juega un papel importante en la regulación de la respuesta inmune a la infección viral y es también un factor clave frecuentemente dirigido por virus para hacerse cargo de la célula huésped. En este estudio, se probó si estas proteínas accesorias podían modular las células NF-B. 293T fueron cotransfectadas con reportero Las muestras fueron recolectadas a 6 h de postinfección, seguidas de ensayo de doble luciferasa. Los resultados se expresaron como el valor de luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la lucifera de la lucifera de la lucifera de la lucifera de la lucifera de la lu Las células 293T fueron transfectadas con 100 ng pNF-B-Luc, 10 ng pRL-TK, vector vacío (500 ng), un plásmido NS1 que expresaba (500 ng), un plásmido ORF7a de expresión SARS-CoV (500 ng), o plásmidos ORF3a de expresión ORF (500 ng). Después de 24 h, las células fueron tratadas con TNF-α. La actividad de la doble luciferasa se determinó después de 6 h. Los resultados se expresaron como la actividad de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la Los asteriscos indican diferencias significativas entre los grupos (en comparación con el vector-NC vacío, p < 0,05, según lo determinado por la prueba t del estudiante). El NF-B desempeña un papel importante en la regulación de la respuesta inmunitaria a la infección viral y es también un factor clave frecuentemente dirigido por virus para hacerse cargo de la célula huésped. En este estudio, se probó si estas proteínas accesorias podían modular las células NF-B. 293T fueron cotransfectadas con plásmidos reporteros (pNF-B-Luc y pRL-TK), así como con plasmidos que expresan proteínas accesorias, o controles (vector vacío, NS1, SARS-CoV Tor2-ORF7a). Las células fueron tratadas con TNF-α durante 6 h a 24 h después de la transfección. Se determinó la actividad luciferasa. RsYN1-ORF3a y RaGD-ORF3a activaron NF-B como SARS-CoV ORF7a, mientras que RsYN2-ORF3a inhibió NF-B como NS1 (Figura 5B ). Las expresiones de ORF3as fueron confirmadas con Western blot (Figura S1 ). Otras proteínas accesorias no modularon la producción de NF-B (Figura S4 ). Para comprender la infectividad de estos nuevos BtCoV/Rh/YN2012, seleccionamos las proteínas de pico RsYN1, RsYN3 y RaGD para estudios de entrada de pseudovirus mediados por picos. Tanto el análisis de manchas occidentales como la observación de microscopía electrónica de mancha negativa confirmaron con éxito la preparación de BtCoV/Rh Un total de 11 líneas celulares humanas, 8 células de murciélagos y otras 9 líneas celulares de mamíferos fueron probadas, y no se encontró ningún fuerte positivo (Tabla S2). En este estudio, una nueva especie alfa-CoV, BtCoV/Rh/YN2012, fue identificada en dos especies Rhinolophus. Las 4 cepas con genoma de largo alcance fueron secuencias. Los 7 dominios de replicación conservados de estos virus poseían una identidad secuencial <90% aa a los de otros alfa-CoV conocidos, lo que define una nueva especie de acuerdo con el estándar de taxonomía ICTV [42]. Estos nuevos alfa-CoV mostraron una alta diversidad genética en sus genes estructurales y no estructurales. La cepa RaGD de R. affinis, recolectada en la provincia de Guangdong, formó una rama independiente divergente de las otras 3 cepas de R. sinicus, muestreadas en la provincia de Yunnan, indicando un proceso de evolución independiente asociado con el aislamiento geográfico y la restricción del huésped. Aunque recolectadas de la misma provincia, estas tres cepas de virus formaron dos genotipos correlacionados con lugares de muestreo. Estos dos genotipos tenían una baja identidad de secuencia del genoma, especialmente en el gen S y genes accesorios. Teniendo en cuenta la ubicación geográfica remota del hábitat del murciélago huésped, el tropismo anfitrión y la diversidad del virus, suponemos que BtCoV/Rh/YN2012 puede haberse diseminado en estas dos provincias con una larga historia de circulación en su reservorio natural, los murciélagos Rhinolophus. Con la evidencia de secuencia, suponemos que En primer lugar, se identificaron nuevos genes accesorios, que no tenían homólogos en los genomas. En segundo lugar, se encontraron múltiples TRS entre los genes S y E, mientras que otros alfacoronavirus solo tenían un TRS allí. Estos TRS preceden a ORF3a, ORF3b (sólo en RsYN1) y ORF4a/b respectivamente. En tercer lugar, el gen accesorio ORF9 mostró homología con los de otras especies conocidas de CoV en otro género de coronavirus, especialmente con genes accesorios de SRASr-CoV. Los genes accesorios suelen estar involucrados en interacciones virus-anfitriones durante la infección por CoV [43]. En la mayoría de los CoVs, los genes accesorios son dispensables para la replicación del virus. Sin embargo, se requirió un gen 3c intacto de felina CoV para la replicación viral en el intestino [44] [45] [4 La supresión de los genes específicos del género en el virus de la hepatitis del ratón llevó a una reducción de la virulencia [47]. SARS-CoV ORF7a, que fue identificado como involucrado en la supresión del silenciamiento del ARN [48], inhibición de la síntesis de proteínas celulares [49], bloqueo del ciclo celular [50], e inducción de la apoptosis [51, 52]. En este estudio, encontramos que BtCoV/Rh/YN2012 ORF9 comparte ~ 30% aa identidad secuencial con SARS-CoV ORF7a. Curiosamente, BtCoV/Rh/YN2012 y SRASr-CoV fueron detectados en R. sinicus de la misma cueva. Suponemos que el SARS-CoV y el BtCoV/Rh/YN2012 pueden haber adquirido ORF7a o ORF9 de un ancestro común a través de la recombinación del genoma o la transferencia horizontal de genes. Mientras que el ORF9 de BtCoV/Rh/YN2012 no indujo la apoptosis ni activaron la producción de NF-Karabaj, estas diferencias pueden ser inducidas por la evolución divergente de estas proteínas en diferentes presiones. Aunque diferentes BtCoV/Rh/YN2012 ORF4a comparten < 64,4% de identidad de aminoácidos, todos ellos podrían activar IFN-β. ORF3a a partir de RsYN1 y RaGD incrementan la patogenicidad del virus con una vía diferente. A pesar de la falta de líneas celulares intestinales del huésped natural de BtCoV/Rh/YN2012, examinamos el tropismo celular de su proteína de pico a través de la entrada de retrovirus pseudotipados con líneas celulares humanas, murciélagos y otras células de mamíferos. La mayoría de las líneas celulares examinadas fueron insospechables a BtCoV/Rh/YN2012, lo que indica un bajo riesgo de transmisión de interespecies a humanos y otros animales. Múltiples razones pueden conducir a una infección fallida del sistema retrovirus de pico de coronavirus-pseudotipo, incluyendo ausencia de receptor en células diana, reconocimiento fallido al homólogo receptor de especies no huésped, mala adaptación en células no huésped durante la maduración de pico o entrada de virus, o la limitación del sistema retrovirus en la entrada de coronavirus estimulante. La débil infectividad del retrovirus pseudotipado RsYN1 en células Huh-7 podría explicarse por la unión de la proteína de pico a polisacárido secretada a la superficie. La suposición debe ser confirmada por experimentos. Nuestras vigilancias a largo plazo sugieren que los murciélagos Rhinolophus parecen albergar una amplia diversidad de CoVs. Coincidentemente, los dos agentes altamente patógenos, SRAS-CoV y Rh-BatCoV HKU2 ambos se originaron de murciélagos Rhinolophus. Teniendo en cuenta la diversidad de CoVs transportados por este género de murciélagos y su amplia distribución geográfica, puede haber un bajo riesgo de derrame de estos virus a otros animales y humanos. Vigilanciaes a largo plazo y estudios de patogénesis ayudarán a prevenir futuras enfermedades humanas y animales causadas por estos murciélagos CoVs. Materiales complementarios: Los siguientes están disponibles en línea en http://www.mdpi.com/1999-4915/11/4/379/s1, Figura S1 : análisis de manchas occidentales de la expresión de proteínas accesorias. Figura S2 : análisis de Apoptosis de proteínas ORF9 de BtCoV/Rh/YN2012. Figura S3 : análisis funcional de proteínas ORF3a, ORF3b, ORF4b, ORF8 y ORF9 en la producción de interferón de tipo I. Figura S4 : análisis funcional de ORF3b, ORF4a, ORF4b, ORF8 y ORF9 en la producción de NF- Tabla S2 : Primeros para la detección de ARNm sugbenómicos virales. Tabla S3

¿Qué desempeña un papel en la regulación de la respuesta inmune a una infección viral?

Actividad antiviral en Vitro de la triple hélice circular que forma el ARN del oligonucleótido hacia la replicación felina del virus de la peritonitis infecciosahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3950953/SHA: f5ad2323eb387f6e271e2842bb2cc4a33504fde3Autores: Choong, Oi Kuan; Mehrbod, Parvaneh; Tejo, Bimo Ario; Omar, Abdul RahmanFecha: 2014-02-20DOI: 10.1155/2014/654712Licencia: cc-byResumen: La peritonitis felina infecciosa (FIP) es una enfermedad inmunoagumentada grave en la población de gatos. Es causada por el virus FIP (FIPV), una cepa mutante virulenta del Coronavirus Entérico Felino (FECV). Los tratamientos actuales y los profilácticos no son efectivos. Las propiedades antivirales in vitro de cinco ARNs circulares de triple hélice que forman oligonucleótidos (TFO) (TFO1 a TFO5), que se dirigen a las diferentes regiones del coronavirus felino virulento (FCoV) de la cepa FIPV WSU 79-1146, se probaron en células de riñón felino Crandell-Rees (CRFK) infectadas por FIPV. Los resultados de RT-qPCR mostraron que los ARNs circulares de TFO, excepto TFO2, inhiben la replicación de FIPV, donde los números de copias del genoma viral disminuyeron significativamente por 5 veces log(10) de 10(14) Además, la unión del ARN del TFO circular con el segmento del genoma viral objetivo también fue confirmada mediante el ensayo de desplazamiento electroforético de la movilidad. La fuerza de la cinética de unión entre los ARN del TFO y sus regiones objetivo fue demostrada por el ensayo de NanoITC. En conclusión, los TFO circulares tienen el potencial de ser desarrollados como agentes antivirales contra la infección por FIPV. Texto: Virus de Peritonitis Infecciosa Felina (FIPV) es un virus envuelto con un genoma de ARN sin segmentación, sentido positivo, de una sola cadena. FIPV se agrupa como coronavirus felino (FCoV), bajo la familia Coronaviridae. FCoV se divide en dos biotipos, a saber, Coronavirus Entérico Felino (FECV), un biotipo entérico ubicuro de FCoV, y FIPV, un La relación entre estos dos biotipos aún no está clara. Se han propuesto dos hipótesis: i) teoría de mutaciones internas y ii) teoría de virulenta-baja virulenta circulante. La teoría de mutaciones internas declaró que el desarrollo de FIP se debe a la exposición del gato a variantes de FCoV que se han mutado al adquirir la capacidad de replicarse dentro de los macrófagos [2], mientras que la teoría de virulencia-baja virulenta circulante explica la existencia de linajes distintivos patógenos y benignos de virus dentro de la población de gatos [3]. El estudio ha demostrado que alrededor del 40-80% de los gatos se detectan con el derrame FECV en sus heces [4]. Alrededor del 12% de estos gatos positivos FECV han desarrollado una enfermedad FIP mortal inmunomediada [4]. La prevalencia de FIP entre los felinos se debe a ciclos continuos de infección y reinfección de FECV y síntomas clínicos indiscernibles de gatos infectados con FECV en una etapa temprana antes del desarrollo progresivo de FIPV. La vacunación contra FIPV con una cepa atenuada y sensible a la temperatura de tipo II FIPV induce un bajo título de anticuerpos en gatitos que no han estado expuestos a FCoV. Sin embargo, existe una considerable controversia sobre la seguridad y eficacia de esta vacuna, ya que la vacuna contiene cepa tipo 2, mientras que los virus tipo 1 son más prevalentes en el campo [4]. Además, los anticuerpos contra FIPV no protegen a los gatos infectados, sino que aumentan la infección de monocitos y macrófagos a través de un mecanismo conocido como Mejora Anticuerpo-Dependente [1]. Además de las vacunas, se han utilizado varios fármacos antivirales como ribavirina, 2 interferones BioMed Research International y fármacos inmunosupresores como tratamientos para gatos infectados por FIPV, principalmente para suprimir la respuesta inmune inflamatoria y perjudicial [5] [7] [8]. Sin embargo, esos tratamientos fueron ineficaces. Por lo tanto, todavía hay una necesidad médica no satisfecha significativa de desarrollar tratamientos eficaces y profilácticos para la infección por FIPV. Triple Helix Forming Oligonucleótido (TFO) se define como homopirimidina oligonucleótidos, que pueden formar una triple hélice secuencia específica por Hoogsteen enlaces a la ranura principal de un tramo complementario homopirimidinhomopurine en ADN dúplex [9]. Además, los híbridos de ARN o ADN-ARN doble pueden ser dirigidos como plantilla para la formación de triple hélice, una vez que se determine la composición de Por lo tanto, el TFO se ha utilizado para impedir las expresiones génicas mediante la inhibición de la transcripción de genes virales u oncogenes [11] [12] [13] [14] [15] [16]. El propósito principal de este estudio es desarrollar y evaluar las propiedades antivirales in vitro de los ARN circulares del TFO frente a la replicación del FIPV. La cepa del serotipo II WSU 79-1146 (No ATCC VR-1777) fue cultivada en células CRFK. Se preparó una dilución en serie de FIPV 10 veces a partir del material de trabajo. Se inoculó la placa de 96 pocillos confluentes con 100 L de cada dilución/pozo del virus. La placa fue incubada en una incubadora humidificada a 37 °C, 5% CO 2. Se observaron efectos citopáticos (CPE). Los resultados fueron registrados después de 72 horas y se calculó la dosis infecciosa del cultivo tisular del virus 50 (TCID 50 ) utilizando el método de Reed y Muench [17]. ARN del Oligonucleótido. La Triple Helix Forming Oligonucleótidos (TFOs) fue diseñada sobre la base de la secuencia del genoma del serotipo II de FIPV cepa WSU 79-1146 (Adhesión no: AY994055) [18]. Los TFOs, que se dirigen específicamente a las diferentes regiones del genoma FIPV, y se construyó un TFO no relacionado (Tabla 1 ). La especificidad de los TFOs fue identificada utilizando la búsqueda BLAST en la base de datos NCBI. Los TFOs lineales diseñados fueron sintetizados por Dharmacon Research (USA), donde los extremos 5 y 3 de los TFO Estas modificaciones fueron necesarias para la circularización del TFO lineal. El proceso de circularización, utilizando el T4 ARN ligasa 1 (ssRNA ligasa) (New England Biolabs Inc., Inglaterra), se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de la ligadura, los ARN TFO circular se recuperaron por precipitación de etanol y la pureza de los ARN TFO circular se midió mediante espectrofotómetro. La desnaturalización de la electroforesis de gel de poliacrilamida de urea se realizó como se describió antes [19] con modificación. Brevemente, el 20% del gel de urea poliacrilamida desnaturalizado se preparó y polimerizó durante 30 minutos. Luego, el gel se prerun a 20 a 40 V durante 45 minutos. Cinco L de ARN TFO mezclado con 5 L de tampón de Finalmente, el gel fue manchado con bromuro de etidium (Sigma, EE.UU.) y visto con un sistema Bio-Rad Gel Doc XR (CA, EE.UU.). (EMSA). Las regiones objetivo del genoma FIPV fueron sintetizadas por Dharmacon Research (EE.UU.) (Tabla 1). Cada ARN de TFO fue mezclado con la región objetivo en un tampón de unión 1X que contenía 25 mM Tris-HCl, 6 mM MgCl 2 y 10 mMNaCl en un volumen final de 10 L y posteriormente incubado a 37°C durante 2 horas. La muestra se ejecutó con gel de poliacrilamida nativo al 15% a 80 V, en estado fresco. El gel manchado fue visto por un sistema Bio-Rad Gel Doc XR. Regiones. La resistencia a la unión se midió mediante un Calorímetro de Titación Nano Isotérmica (ITC) (Instrumentos AT, Newcastle, Reino Unido). Las mezclas de muestras de ARN, consistentes en TFO circulares (0,0002 mM), fueron incubadas con sus respectivas regiones de destino sintético (0,015 mM) utilizando como diluyente el tampón de unión 1X. El experimento se realizó a 37°C con 2 L/inyección, para un total de 25 inyecciones. Los datos fueron recolectados cada 250 segundos y analizados mediante el software NanoAnalyze v2.3.6 proporcionado por el fabricante. Este experimento se realizó en células CRFK, donde 3 × 10 4 células/pozo fue sembrado en placa de 96 pocillos para alcanzar una confluencia del 80% 24 horas antes de la transfección. 100 nM de ARN de TFO se transfectó por separado en las células CRFK utilizando un reactivo de transfección HiPerFect (Qiagen, Alemania), según el protocolo del fabricante. La placa fue incubada a 37°C con un 5% de CO2 durante 6 horas. Luego, los cultivos fueron infectados con 100TCID 50 de la cepa de serotipo II FIPV WSU 79-1146 durante 1 hora a 37°C (100 L/well). Finalmente, el inóculo viral fue reemplazado por medios de mantenimiento frescos (MEM conteniendo 1% de FBS y 1% de pluma/estrep). Las células infectadas por virus y no infectadas se mantuvieron como controles positivos y negativos, respectivamente. La morfología de los cultivos se registró 72 horas después de la infección y las muestras fueron recolectadas en este momento y almacenadas en −80°C antes de la extracción de ARN. Inhibición. Las diferentes concentraciones de ARN TFO1 circular (25 nM, 50 nM, 100 nM y 500 nM) fueron transfectadas a células CRFK. La placa fue incubada durante 6 horas seguidas de inoculación del virus durante 1 hora a 37 °C con 5% de CO2. Las células fueron procesadas como se describe anteriormente. Célula de riñón canino de Madin-Darby (MDCK) (No. de ATCC CCL-34), a una concentración de 4 × 10 4 células/bien, fue sembrada en placa de 96 pocillos hasta alcanzar el 80% de confluencia 24 horas antes de la transfección. Se realizó la misma transfección que antes. Se transfectó 100 nM de ARN TFO circular en células MDCK. Después de 6 horas ORF1a/1b y 530-541ORF1a/1b y 7399-7411ORF1a/1b y 14048-14061- * Destacado en negrita indica la región de unión. * * Circular no relacionada TFO. [20, 21], respectivamente. La transcriptasa inversa cuantitativa PCR en tiempo real (RT-qPCR) se realizó utilizando un sistema de Bio-Rad CFX96 en tiempo real (BioRad, EE.UU.). La reacción se amplió en un volumen final de 25 L utilizando un SensiMix SYBR No-ROX One-Step Kit (Bioline, UK), que consistía en 12,5 L 2X SensiMix SYBR No-Rox One-Step buffer de reacción, 10 M hacia adelante e inversos, 10 unidades de inhibidor de Ri Se utilizó el enfoque de cuantificación absoluta para cuantificar los resultados de qPCR donde se trazó una curva estándar de dilución serial de virus antes de la cuantificación, se cuantificó la cantidad del virus en las muestras en base a esta curva estándar, se realizó análisis estadístico con SPSS 18,0, se representaron los datos como promedio ± SE de tres pruebas independientes, se utilizó ANOVA de ida, prueba post hoc de Tukey para analizar el nivel significativo entre los datos, se consideró significativo ≤ 0,05, se seleccionaron los genomas, que juegan un papel importante en la replicación viral, como sitios de unión objetivo para la formación del triplex, las regiones objetivo fueron 5 regiones no traducidas (5 UTR), marcos de lectura abiertos (ORF) 1a y 1b, y 3 regiones no traducidas (3 UTR) (Tabla 1 ). Ambos extremos de los TFO dúplex se ligaron con una secuencia de enlace o pinzas (C-C) para construir ARN TFO circular. El ensayo de desnaturalización de PAGE se llevó a cabo después del proceso de ligadura para determinar la formación del TFO circular. Como se muestra en la Figura 1, los ARN TFO circular migraron más rápido que los ARN TFO lineales, cuando se sometieron a la PÁGINA de desnaturalización del 20%. Región de destino. La capacidad de encuadernación se determinó utilizando Assay de Movilidad Electroforética (EMSA) [23]. La aparición de la banda de movilidad lenta indica la hibridación exitosa del ARN TFO circular con su región de destino. La capacidad de encuadernación de diferentes ARN TFO (TFO1 a TFO5) contra sus regiones de destino fue determinada por EMSA ( TFO1, TFO3, TFO4 y TFO5 mostraron banda de movilidad lenta, mientras que TFO2 mostró la falta de una banda de desplazamiento ascendente, lo que indica la posesión de capacidad de unión triplex para todos los ARN circulares de TFO, excepto TFO2. TFO ARN. El estudio sobre la interacción e hibridación de TFO hacia su región de destino es crucial, ya que cuanto más fuerte es la unión, más estables son las formas de estructura triplex. Como se muestra en la Figura 1 suplementaria (Tabla 3). El efecto antiviral de los ARN circulares de TFO fue investigado por RT-qPCR a las 72 horas después de la transfección. Los resultados mostraron números de copia del genoma del ARN viral de 3,65 × 10 9, 3,22 × 10 14, 5,04 × 10 9, 5,01 × 10 9, 4,41 × 10 9, y 3,96 × 10 14 en células tratadas con TFO1, TFO2, TFO3, TFO4, TFO5 y TFO7, respectivamente. Los datos analizados mediante ANOVA de un solo sentido, prueba post hoc de Tukey mostraron un número significativo de copia del genoma del ARN viral alto de 4,03 × 10 14 para células inoculadas por virus en comparación con tratamientos circulares TFO1, TFO3, TFO4 y TFO5 ( ≤ 0,05). Las copias de ARN viral de las células transfectadas circulares TFO2, TFO3 lineal y TFO4 y ARN circulares no relacionadas TFO7 también mostraron altos números de copias de ARN viral que no mostraron diferencias significativas con las células infectadas ( ≥ 0.05) (Figura 3). Los cambios morfológicos de las células también fueron capturados 72 horas después de la transfección. Las células transfectadas con TFO1, TFO3, TFO4 y TFO5 circulares parecían estar en buenas condiciones después de la inoculación del virus, mientras que las células transfectadas con TFO2 circular y TFO3 lineal y TFO4 mostraron un efecto citopático visible (ECP), lo mismo que las células inoculadas virales (Figura complementaria 2). Además, las células transfectadas con TFO sólo siguen siendo viables, lo que indica que el tratamiento con TFO no es generalmente Por lo tanto, estos resultados ilustraron la capacidad de los ARN circulares del TFO (excepto TFO2) para inhibir la replicación del FIPV. Concentraciones en la replicación del FIPV. Se utilizó la circular TFO1 para examinar la relación dosis-respuesta como representativa de otros TFO. Las condiciones experimentales fueron idénticas a las del experimento anterior, excepto para las concentraciones del TFO1 de 25 nM, 50 nM, 100 nM y 500 nM. No hubo una reducción significativa en las copias del genoma del ARN viral utilizando la concentración de 25 nM TFO1. Las otras concentraciones causaron reducciones significativas en los números de copia en comparación con las células infectadas por el virus. Sin embargo, no se detectaron diferencias significativas en los números de copia de todas estas concentraciones (Figura 4 ). La especificidad del TFO hacia el FIPV se probó, utilizando TFO1 y TFO5, como los representantes Los datos analizados utilizando ANOVA de una vía, prueba post hoc de Tukey, no mostraron reducciones significativas en las copias de ARN viral para ambos TFO en comparación con las células inoculadas por el virus influenza ( ≥ 0.05) (figura complementaria 3). Estructura compleja G4/Cir4 Figura 2 : análisis EMSA. El análisis EMSA ilustró la unión de TFO circular 1, 3, 4 y 5 a las regiones objetivo como evidencia el desplazamiento de banda ascendente. La unión de cada TFO circular excepto TFO circular2 a sus respectivos objetivos forma un complejo que migra más lento que el TFO desconectado. G1 a G5 representan la región objetivo para la circular TFO1 a TFO5 y Cir1 a Cir5 representan la circular TFO1 a TFO5, respectivamente. en el proceso de replicación [24]. Mientras tanto, el ORF1a/1b de FIPV se traduce en poliproteínas que se escinden en proteínas no estructurales que se ensamblan en complejos de replicación de transcripción junto con otras proteínas virales [24]. Por lo tanto, el desarrollo de terapia molecular dirigida a estas regiones críticas puede proporcionar la posibilidad de inhibir la replicación de FIPV. El desarrollo de terapias antivirales contra el FIPV utilizando siRNA [25] e inhibidores de la proteasa viral [26] Figura 4 : Estudio de respuesta a la dosis de TFO1 para inhibir la replicación de FIPV. Las concentraciones de 50 nM y superiores mostraron efectos antivirales significativos. 50 nM de ARN TFO1 circular fue capaz de reducir el número de copias virales por 5 veces el log 10 de 10 14 a 10 9, mientras que 100 y 500 nM mostraron una reducción de 4 veces. En este estudio se diseñaron y evaluaron los ARN de Oligonucleótidos (TFO) de triple hélice circular, dirigidos específicamente a las regiones cortas del genoma viral para la formación de triplex. TFO1 y TFO2 se dirigieron a los 5 y 3 UTRs del genoma viral, respectivamente. TFO3 a TFO5 se dirigieron a diferentes regiones del genoma FIPV. Antes del estudio antiviral in vitro, los TFOs circulares ligados fueron evaluados mediante análisis PAGE. Todos los TFO circularizados mostraron un patrón de migración más rápido en comparación con el TFO lineal; sin embargo, sólo se detectaron ligeras variaciones para algunos de los TFO (Figura 1 ). La razón de esto no es clara, pero probablemente debido a las diferencias en la longitud y las estructuras terciarias de los TFOs que llevaron a diferencias en la tasa de migración. Se utilizó la EMSA para mostrar la capacidad de unión de cada TFO circular hacia la región diana en el genoma FIPV excepto para el TFO2 que mostró falta de formación de estructura compleja tras la hibridación (Figura 2). El resultado de la EMSA también estuvo de acuerdo con el estudio antiviral, donde todos los TFO circular (excepto TFO2) fueron capaces de demostrar una reducción significativa en el número de copias del genoma del ARN viral por 5 veces el log 10 de 10 14 en células inoculadas por virus a 10 9 en células transfectadas por TFO (Figura 3 ). Sin embargo, no se detectaron propiedades antivirales a partir de los TFO lineales y ARN circular no relacionado con el TFO7, confirmando que la actividad antiviral está asociada con la unión específica de TFO circular hacia las regiones destinatarias. Además, la unión del TFO circular a la región diana fue confirmada por el análisis nanoITC; donde el bajo valor y la alta estabilidad permitieron a los TFO competir eficazmente con las regiones diana para inhibir la transcripción en sistemas libres de células. Puesto que el TFO1 muestra el valor más bajo (tabla 3), las propiedades antivirales de este TFO fueron evaluadas en el estudio de respuesta a la dosis. Como se muestra en la Figura 4, 50 y 100 nM de TFO1 mostraron efectos antivirales similares que indican la posible aplicación terapéutica de TFO1 en la replicación FIPV. Sin embargo, el aumento de la concentración de TFO1 a 500 nm no logró reducir aún más la carga viral probablemente debido a la ineficiencia del reactivo de transfección para transfectar el TFO en las células. Además, el virus tiene una rápida tasa de replicación sobre la infección in vitro, donde estudios previos sobre el crecimiento de FIPV en células CRFK mostraron que por 2 horas aproximadamente el 67% de FIPV 79-1146 fueron internalizados por células CRFK por endocitosis aumentando a más del 70% a las 3 horas [27, 28]. El hallazgo anterior probablemente también explicó la razón por la cual no se detectó ningún efecto antiviral cuando se realizó la transfección del TFO en células infectadas por el virus (datos no mostrados).Las propiedades antivirales, como lo demuestran los TFO circulares, fueron probablemente asociadas con la unión del TFO a la región diana, basado tanto en los enlaces de hidrógeno Watson-Crick y Hoogsteen, que mejoran la estabilidad en términos de entalpy, lo que se produce al unir dos de los tres hilos de la triple hélice en la orientación adecuada Por lo tanto, la formación del triplex está estrechamente unida y no es fácil de separar. Además, los TFO circulares fueron diseñados de tal manera que la presencia de donantes y aceptadores de enlace de hidrógeno en las purinas es capaz de formar dos enlaces de hidrógeno, mientras que las bases de la pirimidina sólo pueden formar un enlace adicional de hidrógeno con terceras bases entrantes [30]. Sin embargo, hay varios factores que pueden limitar la actividad de los TFO en células como la degradación intracelular del TFO y la accesibilidad limitada del TFO a los sitios objetivo que pueden prevenir la formación del triplex [31]. Estos hallazgos también pueden explicar la incapacidad del TFO1 diseñado para inhibir la replicación del virus en el estudio de dosis-respuesta (Figura 4). Se han desarrollado y probado varias terapias moleculares contra enfermedades infecciosas y cáncer. Sin embargo, sólo la terapia basada en siRNA Recientemente, McDonagh et al. [25] desarrollaron siRNA con actividad antiviral frente al FIPV 79-1146, donde el siRNA diseñado fue capaz de reducir el número de copias del genoma viral en comparación con las células infectadas por el virus. También se ha reportado la posible aplicación terapéutica de los TFOs, como el TFO lineal conjugado con psoralen para inhibir la transcripción del provirus de inmunodeficiencia humana [13] y el TFO para inhibir la transcripción del colágeno 1(I) en fibroblastos de rata [14]. Además, el corto TFO conjugado con daunomicina dirigido a la región promotora de oncogenes ha sido diseñado y evaluado en células cancerosas humanas [31]. Estos estudios indicaron la flexibilidad de usar oligocnucleótidos a base de TFO como una terapia potencial basada en la molecular. En este estudio, se demostró que los ARN del TFO circular corto entre 28 y 34 metros (Tabla 1), que son capaces de inhibir la replicación del FIPV mediante la unión a regiones específicas del genoma del FIPV. Todos los TFO circulares diseñados (excepto TFO2) mostraron efectos inhibidores significativos frente a la replicación del FIPV. Los TFO que formaron estructuras triplex mostraron efectos antivirales hacia la replicación del FIPV. La razón por la cual el TFO2 no mostró ninguna interacción con la región objetivo o actividad antiviral se debe probablemente a la longitud del TFO2 (es decir, 24 metros), que podría ser insuficiente para una formación del triplex tras la hibridación (Figura 2), ser lo suficientemente eficaz para suprimir la transcripción del ARN viral y eventualmente inhibir la replicación del virus. Sin embargo, no se puede descartar la incapacidad del TFO2 de mostrar efecto El estudio antiviral in vitro que no mostró ninguna propiedad antiviral para el TFO no relacionado (TFO7) y la incapacidad de la circular TFO1 y TFO5 para inhibir las células infectadas por el virus influenza A H1N1 confirma la especificidad de la actividad de los TFOs. En conclusión, el ARN del TFO circular tiene el potencial de ser desarrollado como terapia contra la FIPV en gatos. Sin embargo, estudios adicionales sobre la especificidad del TFO, mecanismo real del ARN del TFO circular en la alteración de transcripción consecuencia de la inhibición del proceso de transcripción viral, y estudios in vivo en animales son importantes para que este enfoque funcione como terapia en el futuro.

¿Por qué su controversia en torno a la vacuna FIPV?

Actividad antiviral en Vitro de la triple hélice circular que forma el ARN del oligonucleótido hacia la replicación felina del virus de la peritonitis infecciosahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3950953/SHA: f5ad2323eb387f6e271e2842bb2cc4a33504fde3Autores: Choong, Oi Kuan; Mehrbod, Parvaneh; Tejo, Bimo Ario; Omar, Abdul RahmanFecha: 2014-02-20DOI: 10.1155/2014/654712Licencia: cc-byResumen: La peritonitis felina infecciosa (FIP) es una enfermedad inmunoagumentada grave en la población de gatos. Es causada por el virus FIP (FIPV), una cepa mutante virulenta del Coronavirus Entérico Felino (FECV). Los tratamientos actuales y los profilácticos no son efectivos. Las propiedades antivirales in vitro de cinco ARNs circulares de triple hélice que forman oligonucleótidos (TFO) (TFO1 a TFO5), que se dirigen a las diferentes regiones del coronavirus felino virulento (FCoV) de la cepa FIPV WSU 79-1146, se probaron en células de riñón felino Crandell-Rees (CRFK) infectadas por FIPV. Los resultados de RT-qPCR mostraron que los ARNs circulares de TFO, excepto TFO2, inhiben la replicación de FIPV, donde los números de copias del genoma viral disminuyeron significativamente por 5 veces log(10) de 10(14) Además, la unión del ARN del TFO circular con el segmento del genoma viral objetivo también fue confirmada mediante el ensayo de desplazamiento electroforético de la movilidad. La fuerza de la cinética de unión entre los ARN del TFO y sus regiones objetivo fue demostrada por el ensayo de NanoITC. En conclusión, los TFO circulares tienen el potencial de ser desarrollados como agentes antivirales contra la infección por FIPV. Texto: Virus de Peritonitis Infecciosa Felina (FIPV) es un virus envuelto con un genoma de ARN sin segmentación, sentido positivo, de una sola cadena. FIPV se agrupa como coronavirus felino (FCoV), bajo la familia Coronaviridae. FCoV se divide en dos biotipos, a saber, Coronavirus Entérico Felino (FECV), un biotipo entérico ubicuro de FCoV, y FIPV, un La relación entre estos dos biotipos aún no está clara. Se han propuesto dos hipótesis: i) teoría de mutaciones internas y ii) teoría de virulenta-baja virulenta circulante. La teoría de mutaciones internas declaró que el desarrollo de FIP se debe a la exposición del gato a variantes de FCoV que se han mutado al adquirir la capacidad de replicarse dentro de los macrófagos [2], mientras que la teoría de virulencia-baja virulenta circulante explica la existencia de linajes distintivos patógenos y benignos de virus dentro de la población de gatos [3]. El estudio ha demostrado que alrededor del 40-80% de los gatos se detectan con el derrame FECV en sus heces [4]. Alrededor del 12% de estos gatos positivos FECV han desarrollado una enfermedad FIP mortal inmunomediada [4]. La prevalencia de FIP entre los felinos se debe a ciclos continuos de infección y reinfección de FECV y síntomas clínicos indiscernibles de gatos infectados con FECV en una etapa temprana antes del desarrollo progresivo de FIPV. La vacunación contra FIPV con una cepa atenuada y sensible a la temperatura de tipo II FIPV induce un bajo título de anticuerpos en gatitos que no han estado expuestos a FCoV. Sin embargo, existe una considerable controversia sobre la seguridad y eficacia de esta vacuna, ya que la vacuna contiene cepa tipo 2, mientras que los virus tipo 1 son más prevalentes en el campo [4]. Además, los anticuerpos contra FIPV no protegen a los gatos infectados, sino que aumentan la infección de monocitos y macrófagos a través de un mecanismo conocido como Mejora Anticuerpo-Dependente [1]. Además de las vacunas, se han utilizado varios fármacos antivirales como ribavirina, 2 interferones BioMed Research International y fármacos inmunosupresores como tratamientos para gatos infectados por FIPV, principalmente para suprimir la respuesta inmune inflamatoria y perjudicial [5] [7] [8]. Sin embargo, esos tratamientos fueron ineficaces. Por lo tanto, todavía hay una necesidad médica no satisfecha significativa de desarrollar tratamientos eficaces y profilácticos para la infección por FIPV. Triple Helix Forming Oligonucleótido (TFO) se define como homopirimidina oligonucleótidos, que pueden formar una triple hélice secuencia específica por Hoogsteen enlaces a la ranura principal de un tramo complementario homopirimidinhomopurine en ADN dúplex [9]. Además, los híbridos de ARN o ADN-ARN doble pueden ser dirigidos como plantilla para la formación de triple hélice, una vez que se determine la composición de Por lo tanto, el TFO se ha utilizado para impedir las expresiones génicas mediante la inhibición de la transcripción de genes virales u oncogenes [11] [12] [13] [14] [15] [16]. El propósito principal de este estudio es desarrollar y evaluar las propiedades antivirales in vitro de los ARN circulares del TFO frente a la replicación del FIPV. La cepa del serotipo II WSU 79-1146 (No ATCC VR-1777) fue cultivada en células CRFK. Se preparó una dilución en serie de FIPV 10 veces a partir del material de trabajo. Se inoculó la placa de 96 pocillos confluentes con 100 L de cada dilución/pozo del virus. La placa fue incubada en una incubadora humidificada a 37 °C, 5% CO 2. Se observaron efectos citopáticos (CPE). Los resultados fueron registrados después de 72 horas y se calculó la dosis infecciosa del cultivo tisular del virus 50 (TCID 50 ) utilizando el método de Reed y Muench [17]. ARN del Oligonucleótido. La Triple Helix Forming Oligonucleótidos (TFOs) fue diseñada sobre la base de la secuencia del genoma del serotipo II de FIPV cepa WSU 79-1146 (Adhesión no: AY994055) [18]. Los TFOs, que se dirigen específicamente a las diferentes regiones del genoma FIPV, y se construyó un TFO no relacionado (Tabla 1 ). La especificidad de los TFOs fue identificada utilizando la búsqueda BLAST en la base de datos NCBI. Los TFOs lineales diseñados fueron sintetizados por Dharmacon Research (USA), donde los extremos 5 y 3 de los TFO Estas modificaciones fueron necesarias para la circularización del TFO lineal. El proceso de circularización, utilizando el T4 ARN ligasa 1 (ssRNA ligasa) (New England Biolabs Inc., Inglaterra), se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de la ligadura, los ARN TFO circular se recuperaron por precipitación de etanol y la pureza de los ARN TFO circular se midió mediante espectrofotómetro. La desnaturalización de la electroforesis de gel de poliacrilamida de urea se realizó como se describió antes [19] con modificación. Brevemente, el 20% del gel de urea poliacrilamida desnaturalizado se preparó y polimerizó durante 30 minutos. Luego, el gel se prerun a 20 a 40 V durante 45 minutos. Cinco L de ARN TFO mezclado con 5 L de tampón de Finalmente, el gel fue manchado con bromuro de etidium (Sigma, EE.UU.) y visto con un sistema Bio-Rad Gel Doc XR (CA, EE.UU.). (EMSA). Las regiones objetivo del genoma FIPV fueron sintetizadas por Dharmacon Research (EE.UU.) (Tabla 1). Cada ARN de TFO fue mezclado con la región objetivo en un tampón de unión 1X que contenía 25 mM Tris-HCl, 6 mM MgCl 2 y 10 mMNaCl en un volumen final de 10 L y posteriormente incubado a 37°C durante 2 horas. La muestra se ejecutó con gel de poliacrilamida nativo al 15% a 80 V, en estado fresco. El gel manchado fue visto por un sistema Bio-Rad Gel Doc XR. Regiones. La resistencia a la unión se midió mediante un Calorímetro de Titación Nano Isotérmica (ITC) (Instrumentos AT, Newcastle, Reino Unido). Las mezclas de muestras de ARN, consistentes en TFO circulares (0,0002 mM), fueron incubadas con sus respectivas regiones de destino sintético (0,015 mM) utilizando como diluyente el tampón de unión 1X. El experimento se realizó a 37°C con 2 L/inyección, para un total de 25 inyecciones. Los datos fueron recolectados cada 250 segundos y analizados mediante el software NanoAnalyze v2.3.6 proporcionado por el fabricante. Este experimento se realizó en células CRFK, donde 3 × 10 4 células/pozo fue sembrado en placa de 96 pocillos para alcanzar una confluencia del 80% 24 horas antes de la transfección. 100 nM de ARN de TFO se transfectó por separado en las células CRFK utilizando un reactivo de transfección HiPerFect (Qiagen, Alemania), según el protocolo del fabricante. La placa fue incubada a 37°C con un 5% de CO2 durante 6 horas. Luego, los cultivos fueron infectados con 100TCID 50 de la cepa de serotipo II FIPV WSU 79-1146 durante 1 hora a 37°C (100 L/well). Finalmente, el inóculo viral fue reemplazado por medios de mantenimiento frescos (MEM conteniendo 1% de FBS y 1% de pluma/estrep). Las células infectadas por virus y no infectadas se mantuvieron como controles positivos y negativos, respectivamente. La morfología de los cultivos se registró 72 horas después de la infección y las muestras fueron recolectadas en este momento y almacenadas en −80°C antes de la extracción de ARN. Inhibición. Las diferentes concentraciones de ARN TFO1 circular (25 nM, 50 nM, 100 nM y 500 nM) fueron transfectadas a células CRFK. La placa fue incubada durante 6 horas seguidas de inoculación del virus durante 1 hora a 37 °C con 5% de CO2. Las células fueron procesadas como se describe anteriormente. Célula de riñón canino de Madin-Darby (MDCK) (No. de ATCC CCL-34), a una concentración de 4 × 10 4 células/bien, fue sembrada en placa de 96 pocillos hasta alcanzar el 80% de confluencia 24 horas antes de la transfección. Se realizó la misma transfección que antes. Se transfectó 100 nM de ARN TFO circular en células MDCK. Después de 6 horas ORF1a/1b y 530-541ORF1a/1b y 7399-7411ORF1a/1b y 14048-14061- * Destacado en negrita indica la región de unión. * * Circular no relacionada TFO. [20, 21], respectivamente. La transcriptasa inversa cuantitativa PCR en tiempo real (RT-qPCR) se realizó utilizando un sistema de Bio-Rad CFX96 en tiempo real (BioRad, EE.UU.). La reacción se amplió en un volumen final de 25 L utilizando un SensiMix SYBR No-ROX One-Step Kit (Bioline, UK), que consistía en 12,5 L 2X SensiMix SYBR No-Rox One-Step buffer de reacción, 10 M hacia adelante e inversos, 10 unidades de inhibidor de Ri Se utilizó el enfoque de cuantificación absoluta para cuantificar los resultados de qPCR donde se trazó una curva estándar de dilución serial de virus antes de la cuantificación, se cuantificó la cantidad del virus en las muestras en base a esta curva estándar, se realizó análisis estadístico con SPSS 18,0, se representaron los datos como promedio ± SE de tres pruebas independientes, se utilizó ANOVA de ida, prueba post hoc de Tukey para analizar el nivel significativo entre los datos, se consideró significativo ≤ 0,05, se seleccionaron los genomas, que juegan un papel importante en la replicación viral, como sitios de unión objetivo para la formación del triplex, las regiones objetivo fueron 5 regiones no traducidas (5 UTR), marcos de lectura abiertos (ORF) 1a y 1b, y 3 regiones no traducidas (3 UTR) (Tabla 1 ). Ambos extremos de los TFO dúplex se ligaron con una secuencia de enlace o pinzas (C-C) para construir ARN TFO circular. El ensayo de desnaturalización de PAGE se llevó a cabo después del proceso de ligadura para determinar la formación del TFO circular. Como se muestra en la Figura 1, los ARN TFO circular migraron más rápido que los ARN TFO lineales, cuando se sometieron a la PÁGINA de desnaturalización del 20%. Región de destino. La capacidad de encuadernación se determinó utilizando Assay de Movilidad Electroforética (EMSA) [23]. La aparición de la banda de movilidad lenta indica la hibridación exitosa del ARN TFO circular con su región de destino. La capacidad de encuadernación de diferentes ARN TFO (TFO1 a TFO5) contra sus regiones de destino fue determinada por EMSA ( TFO1, TFO3, TFO4 y TFO5 mostraron banda de movilidad lenta, mientras que TFO2 mostró la falta de una banda de desplazamiento ascendente, lo que indica la posesión de capacidad de unión triplex para todos los ARN circulares de TFO, excepto TFO2. TFO ARN. El estudio sobre la interacción e hibridación de TFO hacia su región de destino es crucial, ya que cuanto más fuerte es la unión, más estables son las formas de estructura triplex. Como se muestra en la Figura 1 suplementaria (Tabla 3). El efecto antiviral de los ARN circulares de TFO fue investigado por RT-qPCR a las 72 horas después de la transfección. Los resultados mostraron números de copia del genoma del ARN viral de 3,65 × 10 9, 3,22 × 10 14, 5,04 × 10 9, 5,01 × 10 9, 4,41 × 10 9, y 3,96 × 10 14 en células tratadas con TFO1, TFO2, TFO3, TFO4, TFO5 y TFO7, respectivamente. Los datos analizados mediante ANOVA de un solo sentido, prueba post hoc de Tukey mostraron un número significativo de copia del genoma del ARN viral alto de 4,03 × 10 14 para células inoculadas por virus en comparación con tratamientos circulares TFO1, TFO3, TFO4 y TFO5 ( ≤ 0,05). Las copias de ARN viral de las células transfectadas circulares TFO2, TFO3 lineal y TFO4 y ARN circulares no relacionadas TFO7 también mostraron altos números de copias de ARN viral que no mostraron diferencias significativas con las células infectadas ( ≥ 0.05) (Figura 3). Los cambios morfológicos de las células también fueron capturados 72 horas después de la transfección. Las células transfectadas con TFO1, TFO3, TFO4 y TFO5 circulares parecían estar en buenas condiciones después de la inoculación del virus, mientras que las células transfectadas con TFO2 circular y TFO3 lineal y TFO4 mostraron un efecto citopático visible (ECP), lo mismo que las células inoculadas virales (Figura complementaria 2). Además, las células transfectadas con TFO sólo siguen siendo viables, lo que indica que el tratamiento con TFO no es generalmente Por lo tanto, estos resultados ilustraron la capacidad de los ARN circulares del TFO (excepto TFO2) para inhibir la replicación del FIPV. Concentraciones en la replicación del FIPV. Se utilizó la circular TFO1 para examinar la relación dosis-respuesta como representativa de otros TFO. Las condiciones experimentales fueron idénticas a las del experimento anterior, excepto para las concentraciones del TFO1 de 25 nM, 50 nM, 100 nM y 500 nM. No hubo una reducción significativa en las copias del genoma del ARN viral utilizando la concentración de 25 nM TFO1. Las otras concentraciones causaron reducciones significativas en los números de copia en comparación con las células infectadas por el virus. Sin embargo, no se detectaron diferencias significativas en los números de copia de todas estas concentraciones (Figura 4 ). La especificidad del TFO hacia el FIPV se probó, utilizando TFO1 y TFO5, como los representantes Los datos analizados utilizando ANOVA de una vía, prueba post hoc de Tukey, no mostraron reducciones significativas en las copias de ARN viral para ambos TFO en comparación con las células inoculadas por el virus influenza ( ≥ 0.05) (figura complementaria 3). Estructura compleja G4/Cir4 Figura 2 : análisis EMSA. El análisis EMSA ilustró la unión de TFO circular 1, 3, 4 y 5 a las regiones objetivo como evidencia el desplazamiento de banda ascendente. La unión de cada TFO circular excepto TFO circular2 a sus respectivos objetivos forma un complejo que migra más lento que el TFO desconectado. G1 a G5 representan la región objetivo para la circular TFO1 a TFO5 y Cir1 a Cir5 representan la circular TFO1 a TFO5, respectivamente. en el proceso de replicación [24]. Mientras tanto, el ORF1a/1b de FIPV se traduce en poliproteínas que se escinden en proteínas no estructurales que se ensamblan en complejos de replicación de transcripción junto con otras proteínas virales [24]. Por lo tanto, el desarrollo de terapia molecular dirigida a estas regiones críticas puede proporcionar la posibilidad de inhibir la replicación de FIPV. El desarrollo de terapias antivirales contra el FIPV utilizando siRNA [25] e inhibidores de la proteasa viral [26] Figura 4 : Estudio de respuesta a la dosis de TFO1 para inhibir la replicación de FIPV. Las concentraciones de 50 nM y superiores mostraron efectos antivirales significativos. 50 nM de ARN TFO1 circular fue capaz de reducir el número de copias virales por 5 veces el log 10 de 10 14 a 10 9, mientras que 100 y 500 nM mostraron una reducción de 4 veces. En este estudio se diseñaron y evaluaron los ARN de Oligonucleótidos (TFO) de triple hélice circular, dirigidos específicamente a las regiones cortas del genoma viral para la formación de triplex. TFO1 y TFO2 se dirigieron a los 5 y 3 UTRs del genoma viral, respectivamente. TFO3 a TFO5 se dirigieron a diferentes regiones del genoma FIPV. Antes del estudio antiviral in vitro, los TFOs circulares ligados fueron evaluados mediante análisis PAGE. Todos los TFO circularizados mostraron un patrón de migración más rápido en comparación con el TFO lineal; sin embargo, sólo se detectaron ligeras variaciones para algunos de los TFO (Figura 1 ). La razón de esto no es clara, pero probablemente debido a las diferencias en la longitud y las estructuras terciarias de los TFOs que llevaron a diferencias en la tasa de migración. Se utilizó la EMSA para mostrar la capacidad de unión de cada TFO circular hacia la región diana en el genoma FIPV excepto para el TFO2 que mostró falta de formación de estructura compleja tras la hibridación (Figura 2). El resultado de la EMSA también estuvo de acuerdo con el estudio antiviral, donde todos los TFO circular (excepto TFO2) fueron capaces de demostrar una reducción significativa en el número de copias del genoma del ARN viral por 5 veces el log 10 de 10 14 en células inoculadas por virus a 10 9 en células transfectadas por TFO (Figura 3 ). Sin embargo, no se detectaron propiedades antivirales a partir de los TFO lineales y ARN circular no relacionado con el TFO7, confirmando que la actividad antiviral está asociada con la unión específica de TFO circular hacia las regiones destinatarias. Además, la unión del TFO circular a la región diana fue confirmada por el análisis nanoITC; donde el bajo valor y la alta estabilidad permitieron a los TFO competir eficazmente con las regiones diana para inhibir la transcripción en sistemas libres de células. Puesto que el TFO1 muestra el valor más bajo (tabla 3), las propiedades antivirales de este TFO fueron evaluadas en el estudio de respuesta a la dosis. Como se muestra en la Figura 4, 50 y 100 nM de TFO1 mostraron efectos antivirales similares que indican la posible aplicación terapéutica de TFO1 en la replicación FIPV. Sin embargo, el aumento de la concentración de TFO1 a 500 nm no logró reducir aún más la carga viral probablemente debido a la ineficiencia del reactivo de transfección para transfectar el TFO en las células. Además, el virus tiene una rápida tasa de replicación sobre la infección in vitro, donde estudios previos sobre el crecimiento de FIPV en células CRFK mostraron que por 2 horas aproximadamente el 67% de FIPV 79-1146 fueron internalizados por células CRFK por endocitosis aumentando a más del 70% a las 3 horas [27, 28]. El hallazgo anterior probablemente también explicó la razón por la cual no se detectó ningún efecto antiviral cuando se realizó la transfección del TFO en células infectadas por el virus (datos no mostrados).Las propiedades antivirales, como lo demuestran los TFO circulares, fueron probablemente asociadas con la unión del TFO a la región diana, basado tanto en los enlaces de hidrógeno Watson-Crick y Hoogsteen, que mejoran la estabilidad en términos de entalpy, lo que se produce al unir dos de los tres hilos de la triple hélice en la orientación adecuada Por lo tanto, la formación del triplex está estrechamente unida y no es fácil de separar. Además, los TFO circulares fueron diseñados de tal manera que la presencia de donantes y aceptadores de enlace de hidrógeno en las purinas es capaz de formar dos enlaces de hidrógeno, mientras que las bases de la pirimidina sólo pueden formar un enlace adicional de hidrógeno con terceras bases entrantes [30]. Sin embargo, hay varios factores que pueden limitar la actividad de los TFO en células como la degradación intracelular del TFO y la accesibilidad limitada del TFO a los sitios objetivo que pueden prevenir la formación del triplex [31]. Estos hallazgos también pueden explicar la incapacidad del TFO1 diseñado para inhibir la replicación del virus en el estudio de dosis-respuesta (Figura 4). Se han desarrollado y probado varias terapias moleculares contra enfermedades infecciosas y cáncer. Sin embargo, sólo la terapia basada en siRNA Recientemente, McDonagh et al. [25] desarrollaron siRNA con actividad antiviral frente al FIPV 79-1146, donde el siRNA diseñado fue capaz de reducir el número de copias del genoma viral en comparación con las células infectadas por el virus. También se ha reportado la posible aplicación terapéutica de los TFOs, como el TFO lineal conjugado con psoralen para inhibir la transcripción del provirus de inmunodeficiencia humana [13] y el TFO para inhibir la transcripción del colágeno 1(I) en fibroblastos de rata [14]. Además, el corto TFO conjugado con daunomicina dirigido a la región promotora de oncogenes ha sido diseñado y evaluado en células cancerosas humanas [31]. Estos estudios indicaron la flexibilidad de usar oligocnucleótidos a base de TFO como una terapia potencial basada en la molecular. En este estudio, se demostró que los ARN del TFO circular corto entre 28 y 34 metros (Tabla 1), que son capaces de inhibir la replicación del FIPV mediante la unión a regiones específicas del genoma del FIPV. Todos los TFO circulares diseñados (excepto TFO2) mostraron efectos inhibidores significativos frente a la replicación del FIPV. Los TFO que formaron estructuras triplex mostraron efectos antivirales hacia la replicación del FIPV. La razón por la cual el TFO2 no mostró ninguna interacción con la región objetivo o actividad antiviral se debe probablemente a la longitud del TFO2 (es decir, 24 metros), que podría ser insuficiente para una formación del triplex tras la hibridación (Figura 2), ser lo suficientemente eficaz para suprimir la transcripción del ARN viral y eventualmente inhibir la replicación del virus. Sin embargo, no se puede descartar la incapacidad del TFO2 de mostrar efecto El estudio antiviral in vitro que no mostró ninguna propiedad antiviral para el TFO no relacionado (TFO7) y la incapacidad de la circular TFO1 y TFO5 para inhibir las células infectadas por el virus influenza A H1N1 confirma la especificidad de la actividad de los TFOs. En conclusión, el ARN del TFO circular tiene el potencial de ser desarrollado como terapia contra la FIPV en gatos. Sin embargo, estudios adicionales sobre la especificidad del TFO, mecanismo real del ARN del TFO circular en la alteración de transcripción consecuencia de la inhibición del proceso de transcripción viral, y estudios in vivo en animales son importantes para que este enfoque funcione como terapia en el futuro.

¿Por cuánto tiempo fue polimerizado el gel poliacrilamida desnaturalizado?

Efecto inhibidor y posible mecanismo de acción del alcohol pachulí contra la gripe A (H2N2) Virushttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6264369/SHA: f2d842780b9928cc70f38a4458553f2431877603Autores: Wu, Huaxing; Li, Beili; Wang, Xue; Jin, Mingyuan; Wang, GuonianFecha: 2011-08-03DOI: 10.3390/moléculas16086489Licenciado: cc-byAbstract: En el presente estudio, se estudió in vitro, in vivo y en silico la actividad antiinfluenza A (H2N2) del alcohol pachulí fue superior a 20 μM. El alcohol pachulí podría inhibir el virus de la gripe con un IC(50) de 4,03 ± 0,23 μM. El ensayo de MTT mostró que la inhibición por el alcohol pachulí aparece fuertemente después de la penetración del virus en la célula. En el modelo de ratón de gripe, el alcohol pachulí mostró una protección obvia contra la infección viral a una dosis de 5 mg/kg/día. Las simulaciones de acoplamiento flexible y dinámica molecular indicaron que el alcohol pachulí se unía a la proteína neuraminidasa del virus de la gripe, con una energía de interacción de –40,38 kcal mol(–1). Los residuos invariantes clave del sitio activo Asp151, Arg152, Glu119, Glu276 y Tyr406 jugaron papeles importantes durante el proceso de unión. Los resultados presentados aquí sugieren que el alcohol pachulí posee propiedades del virus anti-influenza A (H2N2), y por lo tanto es una fuente potencial de agentes anti-influenza para la industria farmacéutica. Texto: El virus de la gripe, que es una de las principales causas de infecciones respiratorias agudas en los seres humanos, puede conducir a epidemias anuales y pandemias poco frecuentes. Las dos pandemias de gripe del siglo XX, "Influenza asiática (1957/H2N2)" y "Hong Kong Influenza (1968/H3N2)" resultaron en la muerte de unas 2-3 millones de personas en todo el mundo [1, 2]. Hoy en día, sus descendientes siguen causando la mayoría de las infecciones de gripe en los seres humanos [3]. Hasta donde se sabe que el fármaco antiviral más eficaz es el inhibidor de la neuraminidasa (NA), que se dirige a las g La liberación de nuevos viriones de la célula infectada es un paso clave en el ciclo de vida de la gripe y necesita neuraminidasa (NA) para cortar el vínculo α-cetosídico entre el ácido siálico terminal y un residuo de azúcar adyacente [6]. Los inhibidores de la NA fueron diseñados para evitar el paso clave bloqueando el sitio activo de la enzima y así dar tiempo suficiente para que los sistemas inmunes anfitriones eliminen los virus infectados [7]. Se han dedicado esfuerzos constantes al desarrollo de inhibidores de la NA, utilizando la estructura cristalina de la proteína N2 subtipo NA [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15]. De hecho, oseltamivir (Tamiflu) es el inhibidor de la NA representativo que ha demostrado ser un fármaco oral de aplicación exclusiva en la práctica clínica para el tratamiento de la infección por gripe [4, 8, 9 Sin embargo, con un aumento en el uso médico, las cepas resistentes a oseltamivir se han encontrado y probablemente conducen a un brote a gran escala de nueva gripe pandémica [16, 17]. El alcohol pachulí (Figura 1 ) ha sido bien conocido durante más de un siglo. Es un componente importante del aceite pungente del arbusto de la India oriental Pogostemon cablin (Blanco) Benth, y ampliamente utilizado en fragancias. El aceite pachulí es un aceite esencial importante en la industria del perfume, utilizado para dar una base y carácter duradero a una fragancia [16, 17]. El aceite esencial es muy apreciado por su característico olor leñoso, terroso y alcanforácea agradable y duradero, así como por sus propiedades fijadoras, siendo adecuado para su uso en jabones y productos cosméticos [16, 17]. La parte aérea de Pogostemon cablin se ha utilizado salvajemente para el tratamiento del resfriado común y como agente antifúngico en China [16, 17]. Además, la planta es ampliamente utilizada en la Medicina Tradicional China, ya que presenta varios tipos de actividad farmacológica según la composición del aceite [16, 17]. El alcohol pachulí, como principal componente volátil del aceite pachulí, se ha encontrado que inhibe fuertemente la replicación H1N1 e inhibe débilmente la replicación B/Ibaraki/2/85 [18]. Hasta donde sabemos, las actividades del virus anti-influenza (H2N2) del alcohol pachulí todavía no han sido evaluadas. Por lo tanto, el objetivo del presente estudio fue evaluar la actividad anti-influenza A virus (H2N2) de alcohol pachulí por MTT assay y modelo de gripe por ratón. Sobre esta base, se aplicaron métodos explícitamente solvatados de acoplamiento y dinámico molecular (MD) para investigar el modo de unión del alcohol pachulí con la proteína NA del virus influenza. Prevemos que la comprensión del mecanismo de inhibición será de valor en el diseño racional de nuevos fármacos anti-influenza. Primero se examinó la eficacia del alcohol pachulí en la replicación del virus influenza A (H2N2) y la viabilidad celular. CC 50 se utilizó para expresar la citotoxicidad del alcohol pachulí en MDCK. El CC 50 de alcohol pachulí estaba por encima de 20 mM, lo que indicó que el alcohol pachulí no afectó el crecimiento de MDCK (Tabla 1). Así, parece que los efectos antivirales del alcohol pachulí no se debieron a la citotoxicidad. Además, se encontró que el alcohol pachulí inhibió el virus influenza A (H2N2) con un Con base en los valores de IC 50 y CC 50, el índice de selectividad (SI) fue calculado como >4,96. Se reporta que un SI de 4 o más es apropiado para un agente antiviral [18], sugiriendo que el alcohol pachulí puede ser considerado con actividad anti-influenza A (H2N2). Hasta ahora, se ha encontrado que el alcohol pachulí mostró actividad anti-influenza dependiente de la dosis (A/PR/8/34, H1N1), con un valor IC 50 de 2.635 μM. Además, mostró actividad débil frente a B/Ibaraki/2/85 (IC 50 = 40,82 μM) [19]. Con la adición de la actividad inhibitoria H2N2 anterior, tenemos una visión integral de la actividad anti-influenza del alcohol pachulí. Las células fueron pretratadas con alcohol pachulí antes de la infección viral (células de pretratamiento), los virus fueron pretratados antes de la infección (virus de pretratamiento), y el alcohol pachulí fue añadido durante el período de adsorción (adsorción) o después de la penetración de los virus en las células (replicación).Los experimentos se repitieron de forma independiente tres veces y los datos presentados son el promedio de tres experimentos.Los símbolos * indicaron una diferencia muy significativa p < 0,01 con respecto a otro modo (virus de pretratamiento, adsorción y célula de pretratamiento). Se observó mejor actividad antiviral cuando se añadió a una concentración de 8 μM durante el período de replicación con inhibición de la replicación viral de 97,68% ± 2,09% para la gripe A (H2N2) a 72 h. Sin embargo, no se detectó ningún efecto significativo cuando se utilizó alcohol pachulí para el pretratamiento de células o virus o cuando sólo se añadió alcohol pachulí durante la fase de adsorción. Estos resultados sugieren que la inhibición del virus influenza A (H2N2) por el alcohol pachulí parece ocurrir mucho más fuerte después de la penetración del virus en la célula. Además, estudios bioquímicos han indicado que la bioactividad de la proteína NA es determinante esencial después de la replicación del virus influenza A (H2N2) [20] [21] [22]. Por lo tanto, se concluye que la función de la proteína NA puede ser suprimida por el alcohol Para evaluar la toxicidad del alcohol pachulí, se analizó estadísticamente el valor medio del peso corporal de los ratones en cada grupo. Los pesos medios de los ratones administrados en los ratones de 2 mg/kg/dosis oseltamivir, 2 mg/kg/dosis de alcohol pachulí y 10 mg/kg/dosis de alcohol pachulí una vez al día durante 7 días no fueron significativamente diferentes en comparación con los ratones control normales, no mostrando toxicidad del alcohol pachulí y oseltamivir dentro de la concentración de prueba (P > 0,05). Se observó estado fisiológico en ratones infectados por virus. Tres días después de la infección viral, algunos ratones, especialmente ratones en el grupo control infectado con H2N2, mostraron cambios en el comportamiento, como una tendencia a acurrucarse, disminución de la vitalidad, y pelaje escurrido, etc. En el modelo de gripe por ratón, la infección viral conduce a la Por lo tanto, la eficacia del alcohol pachulí y oseltamivir se evaluó sobre la base de la tasa de supervivencia medida durante 15 días después de la infección, en animales infectados tratados en relación con animales infectados (control) no tratados. Una comparación de la eficacia del alcohol pachulí y oseltamivir en vivo modelo de gripe por ratón (tratamiento oral) mostró que a una dosis de 5 mg/kg/día, el alcohol pachulí mostró una protección evidente contra el virus de la gripe, ya que el día medio hasta la muerte se detectó como 11,8 ± 1,1 (Tabla 2). Cuando la dosis se redujo a 1 mg/kg/día, el alcohol pachulí mostró una protección más débil (medida por los sobrevivientes/total) que la de 5 mg/kg/día, la media del día hasta la muerte fue de 7,5 ± 1,8. En el grupo de control infectado con H2N2 no hubo sobrevivientes. Teniendo en cuenta los datos in vitro e in vivo, se concluye que el alcohol pachulí podría ser utilizado en el tratamiento de infecciones por virus de la gripe humana. Basándose en los datos del experimento anterior, se determina que el alcohol pachulí se une a la proteína NA. Como indican las energías totales y las desviaciones radiculares medias cuadradas (RMSD) de la columna vertebral en la Figura 3, el complejo de alcohol pachulí minimizado en energía ha estado en equilibrio desde cerca de 0,5 ns, y luego se mantiene bastante estable en las últimas 19,5 ns. Es consistente con los resultados de MD anteriores de otros inhibidores de la NA [23] [24] [26] [27]. Por lo tanto, los análisis geométricos y energéticos se realizaron sobre las estructuras medias de 0,5 ~ 20.0 ns de las La energía de interacción (E inter ) del alcohol pachulí con NA se calculó en −40,38 kcal mol −1, donde se encontró que las interacciones VDW más que electrostáticas desempeñaban un papel dominante, contribuyendo a alrededor del 72% (−29,18 kcal mol −1 ). Como se muestra en la Figura 4, el alcohol pachulí se unía al sitio activo que también se unía a oseltamivir y zanamivir [28]. Como muestra la Figura 5, el átomo de oxígeno del alcohol pachulí se orientó hacia las cadenas laterales de residuos Glu119 y Tyr406, con un lazo H formado con cada residuo. Los valores de distancias en la Figura 6 revelan además que el complejo acoplado permanece bastante estable a lo largo de la simulación, con las distancias medias de Glu119:OE2patchouli alcohol:O y Tyr406:OH -patchouli alcohol:O menos de 2,8 Å. Las contribuciones de la suma (E sum ) de residuos Glu119 y Tyr406 ascendieron a −8,46 y −7,37 kcal mol −1, respectivamente (Tabla 3). Además, el alcohol pachulí fue estabilizado por residuos Arg118, Asp151, Arg152, Trp178, Ala246, Glu276, Arg292, Asn294 y Gln347, especialmente residuos Asp151, Arg152 y Glu276 (Figura 5 y Tabla 3 ). De hecho, los residuos Asp151, Arg152, Glu119, Glu276 y Tyr406 de la proteína NA ya han recibido suficiente atención de los diseños racionales de fármacos [14, 30, 31]. Los residuos catalíticos Asp151, Arg152 y Glu276 son cruciales para las funciones NA y los residuos Glu119 y Tyr406 son importantes para estabilizar los sitios activos de NA [32, 33]. Sugiere que las funciones NA se verán afectadas por la presencia de alcohol pachulí, consistente con los experimentos anteriores. El alcohol pachulí coincide con el sitio activo de NA y tiene una energía de interacción aceptable. Teniendo en cuenta las obvias discrepancias de estructura con los inhibidores de NA actuales, representa un compuesto de plomo ideal para los diseños de nuevos agentes anti-influenza. El alcohol pachulí y oseltamivir se obtuvieron de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EE.UU., pureza > 99%) y se almacenaron en viales de vidrio con tapas selladas de Teflon a −20 ± 0,5 °C en ausencia de luz. MDCK (Reniño Canino Madin-Darby) fue comprado al Harbin Veterinary Research Institute (Harbin, Heilongjiang, China). Las células fueron cultivadas en cultivo monocapa con el medio esencial mínimo de Águila (EMEM) complementado con suero fetal de pantorla (FCS), penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 μg/ml. Las monocapas fueron retiradas de sus superficies plásticas y pasaban serialmente cada vez que llegaban a ser confluentes. La cepa de gripe A/Leningrad/134/17/1957 H2N2) fue comprada al Instituto Nacional de Control de Bioproductos Veterinarios y Farmacéuticos (Beijing, China). El virus se cultivaba rutinariamente en células MDCK. Los cultivos se preparaban a partir de sobrenadantes de células infectadas y se almacenaban a −80 °C. La toxicidad celular del alcohol pachulí en las células MDCK fue evaluada por el método MTT. Brevemente, las células fueron sembradas en una placa microtitular en ausencia o presencia de varias concentraciones (20 μM -0.0098 μM) de alcohol pachulí (ocho réplicas) e incubadas a 37 °C en una atmósfera humidificada de 5% de CO 2 durante 72 h. Los sobrenadantes fueron desechados, lavados con PBS dos veces y reactivo MTT (5 mg/ml en PBS) fue agregado a cada pozo. Después de la incubación a 37 °C durante 4 h, los sobrenadantes fueron eliminados, luego 200 μL DMSO fue añadido e incubado a 37 °C durante otros 30 min. Después de que las placas fueron leídas en un lector de ELISA (Thermo Molecular Devices Co., Union City, EE.UU.) a 570/630 nm. La media de los pozos de La concentración máxima no tóxica (TD 0 ) y la concentración citotóxica del 50% (CC 50 ) fueron calculadas mediante análisis de regresión lineal de las curvas de respuesta a la dosis generadas a partir de los datos. La inhibición de la replicación vírica fue medida por el método MTT. La dilución serial del virus tratado fue adsorbida a las células durante 1 h a 37 °C. El inóculo residual se dispersó y se añadieron células infectadas con EMEM que contenían 2% FCS. Cada ensayo se realizó en ocho réplicas. Después de la incubación durante 72 h a 37 °C, los cultivos fueron medidos por el método MTT como se describe anteriormente. La concentración de alcohol pachulí y oseltamivir que inhibió el número de virus en un 50% (IC 50 ) se determinó a partir de curvas de dosis-respuesta. Las células y los virus fueron in Las células fueron tratadas previamente con alcohol pachulí antes de la infección viral, los virus fueron incubados con alcohol pachulí antes de la infección y las células y los virus fueron incubados junto con alcohol pachulí durante la adsorción o después de la penetración del virus en las células huésped. El alcohol pachulí siempre se utilizó en la concentración no tóxica. Las monocapas celulares fueron pretratadas con alcohol pachulí antes de la inoculación con el virus añadiendo alcohol pachulí al medio de cultivo e incubación durante 1 h a 37 °C. El compuesto fue aspirado y las células fueron lavados inmediatamente antes de la adición del inóculo influenza A (H2N2). Para el virus pretratamiento, Influenza A (H2N2) fue incubada en medio que contenía alcohol pachulí durante 1 hora a temperatura ambiente antes de la infección de las células MDCK. Para el análisis de la inhibición anti-influenza A (H2N2) durante el período de adsorción, la misma cantidad de influenza A (H2N2) se mezcló con el fármaco y se añadió a las células inmediatamente. Después de 1 h de adsorción a 37 °C, se eliminó el inóculo y se añadió a las células un 2 % de FCS. El efecto del alcohol pachulí contra la gripe A (H2N2) también se probó durante el período de replicación al añadirlo después de la adsorción, como típico realizado en estudios de susceptibilidad anti-influenza A (H2N2). Cada ensayo se realizó en ocho réplicas. Se adquirieron ratones Kunming de 18-22 g (6 semanas de edad) de Harbin Veterinary Research Institute Animal Co., Ltd. (Harbin, Heilongjiang, China). En primer lugar, la toxicidad del alcohol pachulí y oseltamivir se evaluó en ratones sanos por la pérdida de peso corporal en comparación con el grupo control (2% de DMSO en solución salina fisiológica), los ratones se administraron por vía oral con 10 mg/kg/dosis de alcohol pachulí, 2 mg/kg/dosis de alcohol pachulí o 2 mg/kg/dosis de oseltamivir (disuelto en 2% de DMSO en solución salina fisiológica) una vez al día durante 7 días, se determinó el peso de los ratones diariamente, se realizaron procedimientos de acuerdo con el Principio de Cuidado de Animales de Laboratorio (NIH Publicación No 85-23, revisada en 1985) y las directrices del Comité de Investigación Animal de la Universidad de Peking. Los ratones Kunming fueron anestesiados con isoflurano y expuestos al virus (A/Leningrad/134/17/1957) por instilación intra Los fármacos se prepararon en un 2% de DMSO en solución fisiológica salina y se administraron 4 h antes de la exposición al virus y continuaron diariamente durante 5 días. Todos los ratones se observaron diariamente para cambios en el peso y para cualquier muerte. Los parámetros para la evaluación de la actividad antiviral incluyeron la pérdida de peso, la reducción de la mortalidad y/o el aumento en la media del día hasta la muerte (MDD) determinado a lo largo de 15 días. La estructura cristalina de N2 subtipo neuraminidasa (PDB código 1IVD) se obtuvo del RCSB Protein Data Bank [34]. Para mayor comodidad, la estructura se denomina NA en adelante. La geometría y las cargas atómicas parciales del alcohol pachulí (Figura 1) se calcularon con el módulo Discover 3.0 (Insight II 2005) [35] mediante la aplicación del algoritmo BFGS [36] y el campo de fuerza Las simulaciones de acoplamiento y dinámica molecular (MD) fueron realizadas por los protocolos generales en los paquetes de software Insight II 2005, consistentes con las literaturas anteriores [24, 26, 28, 35, [37] [38]. Durante las simulaciones de MD, el conjunto canónico (NVT) fue empleado a temperatura normal (300 K). La temperatura MD fue controlada por el termostato de escalado de velocidad [40]. Las integraciones de las ecuaciones clásicas de movimiento fueron logradas usando el algoritmo Verlet. Los sistemas fueron solvados en una gran esfera de moléculas de agua TIP3P [40] con el radio de 35,0 Å, que es suficiente para sostener los conjuntos [40]. Las trayectorias de MD fueron generadas utilizando un paso de tiempo de 1,0 fs para un total de 20,0 ns, ahorradas a intervalos de 5,0 ps. Las energías de interacción del alcohol pachulí con NA y los residuos respectivos en el sitio activo de NA fueron calculadas por el módulo de acoplamiento [35], sobre las trayectorias de MD de 0,5 ~ 20,0 ns. Todos los resultados se expresan como valores medios ± desviaciones estándar (SDs) (n = 3). La significación de la diferencia fue calculada por el análisis de varianza en un solo sentido, y los valores p < 0,001 fueron considerados significativos. En conclusión, el alcohol pachulí posee actividad del virus anti-influenza A (H2N2) mediante interferencia con la función NA que separa el enlace α-glucosídico entre el ácido siálico y el glucoconjugado. Nuestros resultados proporcionan la información prometedora para el uso potencial del alcohol pachulí en el tratamiento de la enfermedad infecciosa del virus influenza A (H2N2). Se necesitan más estudios

¿Cuál fue la prueba del nivel de citotoxicidad utilizado en este estudio?

La amplificación isotérmica mediante un dispositivo de calentamiento químico para la detección en el punto de cuidado del VIH-1https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3285652/SHA: ef7110a9022bac2e50c995b0f6b826ff071e48f8Autores: Curtis, Kelly A.; Rudolph, Donna L.; Nejad, Irene; Singleton, Jered; Beddoe, Andy; Weigl, Bernhard; LaBarre, Paul; Owen, S. MicheleFecha: 2012-02-23DOI: 10.1371/journal.pone.0031432Licencia: cc0Abstracto: ANTERIOR: Hasta la fecha, el uso de pruebas tradicionales de amplificación del ácido nucleico (NA La disponibilidad de un NAAT rápido con aplicabilidad para entornos de límite de recursos o punto de atención (POC) cubriría una gran necesidad en el diagnóstico del VIH, permitiendo el diagnóstico oportuno o la confirmación del estado de infección, así como facilitar el diagnóstico de infección aguda, detección y evaluación de los bebés nacidos de madres infectadas por el VIH. Métodos de amplificación isotérmica, como la transcriptación inversa, la amplificación isotérmica mediada por bucles (RT-LAMP), exhiben características ideales para los ajustes de COP, ya que normalmente son más rápidos, fáciles de realizar y permiten la integración en dispositivos de calefacción portátiles de baja tecnología. METODOLOGÍA/SIGNIFICANTES METODOLOGÍA: En este estudio, evaluamos el ensayo RT-LAMP de VIH-1 utilizando dispositivos de amplificación de ácido nucleico (NINA) portátiles y no instrumentales que generan calor a partir de la reacción Los aparatos de calefacción NINA mostraron temperaturas estables a lo largo de la reacción de amplificación y resultados de amplificación consistentes entre tres dispositivos separados y un ciclo térmico.El rendimiento de los calentadores NINA fue validado utilizando muestras de sangre entera de pacientes infectados por VIH-1. CONCLUSIÓN: El método de amplificación isotérmica RT-LAMP utilizado junto con un dispositivo de calentamiento químico proporciona una plataforma NAAT portátil, rápida y robusta que tiene el potencial de facilitar la prueba del VIH-1 en entornos limitados de recursos y COP. Texto: Las pruebas de diagnóstico del VIH-1 se llevan a cabo con un alto nivel de rendimiento, ya que el diagnóstico tiene un impacto directo en el cuidado del paciente y la reducción de la transmisión. A pesar de los avances tecnológicos en el campo del diagnóstico del VIH y la alta sensibilidad y especificidad asociadas con la mayoría de las pruebas de diagnóstico del VIH que están disponibles actualmente, se estima que aproximadamente el 20% de las personas infectadas Además, los sitios de pruebas han informado de que entre el 35 y el 50% de las personas con un resultado positivo inicial no regresarán para un diagnóstico confirmatorio si se requieren pruebas de laboratorio de seguimiento [2]. Las pruebas rápidas basadas en anticuerpos contra el VIH, que pueden realizarse con un entrenamiento mínimo y normalmente proporcionan resultados en menos de 30 minutos [3], han facilitado las pruebas de VIH en el punto de atención y posteriormente han aumentado el número de personas conscientes de su serostatus [4]. Las pruebas rápidas son actualmente un componente clave de la detección del VIH en el punto de atención (POC), ampliando significativamente las capacidades diagnósticas de los sitios de pruebas en los países desarrollados, así como los entornos limitados de recursos. A pesar de los avances realizados por la disponibilidad generalizada de pruebas rápidas, todas las pruebas basadas en anticuerpos para la detección del VIH presentan algunas limitaciones. Los anticuerpos específicos del VIH normalmente comienzan a aparecer alrededor de tres semanas después de la La ventana de tiempo antes o durante la seroconversión temprana puede conducir a resultados falsos negativos en individuos recientemente infectados. Además, el diagnóstico preciso de bebés nacidos de madres infectadas por VIH puede ser difícil si se basa únicamente en la positividad de anticuerpos, ya que los anticuerpos maternos transferidos verticalmente pueden persistir durante 12-18 meses después del nacimiento [6, 7]. Para el diagnóstico confirmatorio de infección temprana por VIH o diagnóstico infantil, se prefieren pruebas de amplificación de ácido nucleico (NAAT), ya que el ARN del VIH-1 se puede detectar tan pronto como 10-12 días después de la infección y el ADN y/o ARN del VIH-1 son indicadores definitivos de infección activa [5]. Sin embargo, en su forma actual, los ARN del NAAT no son factibles para las pruebas de COP, porque son lentos, costosos y técnicamente complicados. Hasta la fecha, el ensayo Aptima HIV-1 ARN (Gen-Probe, Inc., http://www.fda.gov/ BiologicsBloodVaccines/BloodBloodProducts/ ApprovedProducts/ LicensedProductsBLAs/BloodDonorScreening/InfectiousDisase/ UCM080466) es el único NAAT aprobado por la FDA para el diagnóstico o la confirmación de la infección por VIH-1 y sólo es adecuado para pruebas de laboratorio. Para satisfacer las necesidades de diagnóstico del VIH-1 en el COP, un NAAT rápido que puede realizarse con un entrenamiento mínimo, un equipo limitado y un tiempo de respuesta relativamente corto (1,1 hora) es deseable [8]. El desarrollo de un NAAT rápido ha demostrado ser especialmente difícil ya que la tecnología implicada en la simplificación del procedimiento de Además, la reducción de la complejidad técnica no debe comprometer la sensibilidad y especificidad de las pruebas.Para una mayor aplicabilidad en el POC, se ha desarrollado un número creciente de nuevas técnicas de amplificación isotérmica [9]. La amplificación isotérmica es una alternativa atractiva a la PCR tradicional o RT-PCR, ya que no es necesario el termociclismo, lo que permite una mayor versatilidad en términos de dispositivos de calentamiento o amplificación. Uno de estos métodos de amplificación, denominado amplificación isotérmica mediada por lazo (LAMP) [10], se ha optimizado para la detección de ADN y/o ARN (RT-LAMP) a partir de una amplia gama de patógenos bacterianos y virales [11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19], incluido el VIH [20, 21]. La reacción de amplificación requiere seis imprimaciones específicas para ocho regiones separadas dentro de la secuencia diana, contribuyendo a la alta especificidad del método de amplificación. El material amplificado puede ser típicamente detectado dentro de 15-60 minutos cuando se incuba a una temperatura de reacción constante de 60-65uC [22]. LaMP también ha demostrado ser menos sensible a los inhibidores biológicos que la PCR [23, 24], lo que permite la amplificación directa de especímenes clínicos, eliminando así la necesidad de un paso adicional de extracción de ácido nucleico. La amplificación directa del plasma, sangre entera y líquido oral ha sido previamente demostrada para el VIH-1 [20, 21, 25]. Por último, la detección visual inmediata de productos amplificados es facilitada por la gran cantidad de ADN que se genera por cada reacción. Varios grupos han incorporado métodos de detección fluorescente en el ensayo de LAMP para la detección en tiempo real o inmediata de ojo desnudo [ La simplicidad y la naturaleza isotérmica del procedimiento LAMP abre la puerta para la evaluación de dispositivos integrados de baja tecnología o nuevos elementos de calefacción, adecuados para entornos de bajo recurso, donde no se pueden obtener equipos y electricidad costosos. En este estudio, el ensayo de HIV-1 RT-LAMP se evaluó utilizando dispositivos de amplificación de ácido nucleico (NINA) no instrumentalizados y portátiles que generan calor a partir de la reacción exotérmica del óxido de calcio y el agua [27, 28]. Demostramos la estabilidad de temperatura de los dispositivos de calentamiento NINA y la viabilidad para la prueba de COP de muestras enteras de sangre de individuos infectados por el VIH-1. Los calentadores de Prototipo NINA fueron diseñados y proporcionados por el Programa de Tecnología Apropiada en Salud (PATH, Seattle, WA), como se describe [27, 28]. Brevemente, la reacción exotérmica del óxido de calcio (CaO; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y el agua proporcionaban una temperatura de amplificación de aproximadamente 60uC. Los aparatos de calefacción, que contenían la reacción química, se diseñaron utilizando botes de acero inoxidable aislantes térmicamente con tapas de rosca de plástico (Fig. 1). Las tapas se modificaron para contener tres pozos de muestra que se ajustaban a los tubos PCR estándar de 200 ml y se llenaban con un material de cambio de fase propietario (PCM) que se utilizaba para amortiguar el calor derivado de la reacción exotérmica, proporcionando así una temperatura constante. Por último, se diseñaron tapas de plástico que contenían aislamiento de espuma para caber en la parte superior de las tapas de bote. Los perfiles térmicos de los pozos de muestra se midieron y registraron mediante un te Se prepararon paneles de linealidad de ADN y ARN para determinar la sensibilidad del ensayo RT-LAMP específico para el VIH. Se generó un panel de ADN a partir del ADN extraído de la línea celular monocítica humana OM-10.1 [29], utilizando un kit de sangre de ADN QIAamp (QIAGEN, Valencia, CA). Se utilizó el recuento celular para cuantificar el número de copia de ADN de entrada, ya que en cada célula se contiene un único provirus integrado [29]. El ADN extraído se diluyó diez veces en agua libre de RNase para crear un panel de linealidad, que va desde 10 5 copias/ml hasta 10 3 copias/ml. Se obtuvo un panel de linealidad de ARN comercialmente (PRD801; SeraCare Life Sciences, Mil- ford, MA) y varió de 2.9610 6 copias/ml a 8 copias/ml, según lo determinado por Roche AMPLICOR HIV MONITOR TM v 1.5, Bayer VERSANT HIV-1 ARN bDNA 3.0 Ensayo, bioMerieux NucliSensH HIV-1 QT, y Abbott Real Time HIV-1 m2000 TM. El ARN se extrajo de los miembros del panel utilizando un mini kit de ARN viral (QIAGEN). Los controles negativos incluyeron ADN extraído de PBMC infectado con VIH-2 SLRHC [30] y ARN extraído del virus purificado por HIV-2 NIH-Z (Advanced Biotechnologies Inc., Columbia, MD). Se recolectó sangre entera de individuos infectados por el VIH-1 como parte de un estudio independiente, aprobado por el IRB [31], u obtenida comercialmente (SeraCare Life Sciences). Todas las muestras seropositivas fueron confirmadas utilizando las siguientes pruebas: Sistemas Genéticos VIH-1/ VIH-2 más O EIA (Bio-Rad Laboratories, Redmond, WA), GS HIV-1 Western blot (Bio-Rad Laboratories), Aptima HIV-1 ARN assay (Gen-Probe, Inc., San Diego, CA) y Amplicor HIV-1 DNA assay (Roche Diagnostics, Branchburg, NJ ). Se desconocen las cargas virales y provirales, ya que las muestras fueron probadas con ensayos cualitativos basados en ácido nucleico. Todos los especímenes clínicos evaluados en este estudio fueron obtenidos Como control negativo, se incluyeron muestras de sangre seronegativa del VIH-1 (SeraCare Life Sciences) en todos los experimentos que involucraban sangre completa. Un control positivo incluyó sangre seronegativa del VIH-1 con 5610 6 partículas virales/ml de VIH-1 BaL (Advanced Biotechnologies Inc.). Los imprimadores RT-LAMP específicos del VIH-1 fueron diseñados para reconocer una secuencia conservada dentro del gen de la transcriptasa inversa (RT). Los seis imprimadores necesarios para la reacción RT-LAMP, externa hacia adelante (F3), externa hacia atrás (B3), interna hacia adelante (FIP), interna hacia atrás (BIP), y los imprimadores de bucle (LoopF y LoopB), fueron diseñados utilizando el software PrimerExplorer V4 (Eiken Chemical Co. Ltd.; http:// primerexplorer.j Los imprimadores LAMP y el ciclo de amplificación han sido descritos en detalle por Nagamine et al. [32]. Otras modificaciones incluyen una secuencia de enlace de cuatro timidinas insertadas entre las secuencias F2 y F1c del imprimador FIP, como se describe [20], y la adición de la molécula fluorescente HEX al extremo 59 del imprimador LoopF. El imprimador etiquetado, junto con una sonda de apagador, permitió la detección visual inmediata de productos amplificados [21]. La sonda de apagador consistía en la secuencia complementaria del imprimador LoopF con Black Hole Quencher-1 (BHQ-1) añadido al extremo 39. La secuencia HXB2 del HIV-1 (número de adhesión de GenBank AF033819) se utilizó como referencia para generar los primeros RT-LAMP. La reacción RT-LAMP se realizó utilizando la siguiente mezcla de reacción: 0,2 mM (concentración final) de cada primer F3 y B3, 1,6 mM de cada primer FIP y BIP, 0,8 mM de cada primer LoopF y HEX-LoopB, 0,8 M betaína (Sigma-Aldrich), 10 mM MgSO 4, 1,4 mM dNTPs, 16 ThermoPol Reaction Buffer (New England Biolabs, Ipswich, MA), 16 U Bst ADN polimerasa (New England Biolabs) y 2 U AMV transcriptasase inversa (Invitrogen, Carlsbad, CA). La reacción se realizó en un volumen total de 25 ml para amplificación del ácido nucleico extraído, 10 ml de los cuales constituye la muestra. Para la amplificación de muestras de sangre entera, se utilizó un volumen de reacción de 100 ml para facilitar la detección visual de productos amplificados. La sangre entera se añadió directamente a la reacción a un volumen total de 40 ml, después de una dilución de 1:4 con tampón de lisis de glóbulos rojos (2,5 mM KHCO 3, 37,5 mM NH 4 Cl, y 0,025 mM EDTA), como se ha descrito anteriormente [21]. La mezcla de reacción se incubaba a 60uC durante 60 minutos, utilizando un sistema GeneAmpH PCR (Applicated Biosystems, Foster City, CA) o los calentadores NINA. Para las reacciones amplificadas en el termocilcer, se añadió un paso de calentamiento adicional de dos minutos de 80uC al final del ciclo de amplificación para terminar la reacción. Los tubos de reacción fueron evaluados para la presencia de amplificación, después de la adición de la sonda de enfriamiento en una relación de 2:1 de apagador a primer etiquetado, como se describió previamente [21]. La amplificación fue determinada visualmente observando fluorescencia en los tubos de reacción, utilizando la lámpara UV de un sistema ChemiDoc XRS (Bio-Rad Laboratories, Hércules, CA). La amplificación fue confirmada por electroforesis utilizando un gel de agarosa del 1,2% que contenía mancha de gel seguro SYBRH (Invitrogen), que posteriormente fue visualizada mediante el sistema ChemiDoc XRS. Para comparar la temperatura y la consistencia de amplificación, se probaron tres calentadores NINA en paralelo. La reacción de calentamiento se inició añadiendo 18 g de CaO a cada bote NINA, seguido de 6 ml de agua. La tapa Después de añadir 200 ml de agua a cada uno de los pozos de la muestra, se inició el registro de temperatura. Se añadieron tubos de reacción a los pozos de la muestra una vez que cada cámara de reacción alcanzó una temperatura de 58,5 uC. Para todas las muestras incubadas en el calentador NINA, se añadieron 15 ml de aceite mineral al tubo de reacción durante la preparación de la mezcla de reacción. Las muestras se incubaron en los calentadores durante un total de 60 minutos. Todas las reacciones se llevaron a cabo en un laboratorio controlado por la temperatura con una temperatura ambiente de 28 uC, a menos que se indique lo contrario. Después de la reacción de amplificación, las muestras se incubaron durante dos minutos en un bloque de calor a 80 uC. Después de cada ciclo de amplificación, se analizó el perfil de temperatura de cada dispositivo mediante el cálculo de la media de temperatura, desviación estándar, mediana, mínima y máxima a partir de los datos La estabilidad de los calentadores NINA a temperaturas extremas bajas y altas fue evaluada colocando los recipientes en un refrigerador a 4uC o una incubadora de 37uC durante la duración de la reacción de amplificación. Los perfiles de temperatura fueron registrados y comparados con los de las reacciones que ocurrieron a la temperatura ambiente de laboratorio de 28uC. Para determinar la sensibilidad de la reacción RT-LAMP utilizando imprimaciones RTespecíficas, se probaron paneles de linealidad de ADN y ARN en un ciclo térmico. El límite de detección del ADN VIH-1 fue de 10 copias/reacción. Para el panel de linealidad ARN, la muestra conteniendo 1700 copias/reacción fue detectada en las tres réplicas, mientras que la muestra conteniendo 140 copias/reacción fue detectada en tres de cinco réplicas (60%). En cuanto a la positividad, los resultados de amplificación fueron consistentes entre los tres calentadores y el ciclo térmico (Tabla 2). Dado que el ensayo RT-LAMP requiere una temperatura constante de 60uC para la duración de la reacción de amplificación, se compararon los perfiles de temperatura de los pozos de muestra durante la incubación y entre los tres calentadores NINA. En la Figura 2 se muestra un perfil de temperatura representativo, mostrando una temperatura de reacción constante a o cerca de 60uC para la duración de la reacción de amplificación. Durante la incubación de 60 minutos, la temperatura media de cada dispositivo fue de 60.2, 59.8 y 59.7 (Tabla 3 ). La temperatura mínima alcanzada durante la reacción refleja el hecho de que la temperatura del puerto de muestra descendió temporalmente después de que los tubos de muestra se añaden al dispositivo, como se muestra en la Figura 2. La temperatura máxima de los dispositivos se desvió de la temperatura de reacción deseada de 60uC en menos de un grado. La capacidad de los calentadores NINA para mantener una temperatura de reacción constante en una amplia gama de temperaturas ambientes es esencial para las pruebas de COP, ya se refiera a un laboratorio climatizado o sitio de campo de alta temperatura. Para evaluar el rendimiento de los calentadores NINA a temperaturas extremas bajas o altas, los botes se colocaron en una nevera 4uC o una incubadora 37uC para la duración de la reacción de amplificación. El límite de detección para los paneles de linealidad de ADN y ARN fue similar a los resultados obtenidos en nuestro laboratorio controlado por temperatura (28uC; Tabla 2 ). El mayor grado de variación de temperatura de los pozos muestra se observó a la temperatura ambiente de 4uC (Tabla 3 ). La temperatura media fue aproximadamente dos grados menor que la temperatura de reacción deseada de 60uC. Además, la temperatura de los dispositivos tendió a disminuir desde su estado estacionario durante los últimos 20 minutos de la reacción (datos no mostrados). Los perfiles de temperatura a la temperatura ambiente de 37uC, sin embargo, fueron similares a los de 28uC. Las muestras de sangre entera de los individuos infectados por el VIH-1 se añadieron directamente a la reacción RT-LAMP y se probaron en los calentadores NINA. La positividad de los especímenes clínicos fue consistente entre el ciclo térmico y los dispositivos (Tabla 4 ). La consistencia de amplificación fue más evidente con dos de las muestras de pacientes (paciente #4 y #5) que fueron sólo positivas en una de las tres réplicas, Todas las muestras de sangre HIVnegative, incluidas en cada reacción, fueron negativas (datos no mostrados). En la Figura 3 se muestra un experimento representativo utilizando los calentadores NINA, que muestra la detección por gel de agarosa y la identificación visual de fluorescencia en los tubos de reacción. En este estudio, se demuestra el rendimiento de los calentadores NINA de ácido nucleico portátiles, económicos y no instrumentales para amplificación del VIH-1 mediante RT-LAMP. La reacción de amplificación isotérmica acoplada con un dispositivo que genera calor a partir de una reacción química exotérmica, en lugar de electricidad de red o energía de batería, comprende un NAAT de punto de cuidado que es práctico para su uso en entornos limitados a recursos. Los dispositivos de calefacción requieren un entrenamiento mínimo y experiencia técnica para operar y tomar aproximadamente 10-15 minutos para alcanzar una temperatura de reacción de 60uC una vez iniciada la reacción Además, la temperatura de los pozos muestra se mantiene relativamente estable a la temperatura de reacción deseada de 60uC a lo largo de toda la reacción de amplificación, como lo demuestran los perfiles de calentamiento y la consistencia en la amplificación entre los dispositivos y el ciclo térmico. Dado que los ensayos en el punto de cuidado pueden referirse a un laboratorio climatizado o a un sitio de campo con altas temperaturas y humedad, la estabilidad de la temperatura generada por los dispositivos de calentamiento debe ser fiable. Aunque los perfiles de temperatura a una temperatura de frío representativa de 4uC indicaron una pérdida de temperatura de reacción hacia el final de la incubación de 60 minutos, las fluctuaciones de temperatura no fueron lo suficientemente significativas como para afectar la reacción de amplificación. Sin embargo, este efecto térmico podría mitigarse con pequeñas modificaciones en el dispositivo para reducir la pérdida de calor a temperaturas más bajas. Debería ser posible ampliar el rango de temperatura de los calentadores NINA a 4uC y más abajo Es más preocupante el rendimiento de los calentadores NINA en sitios de campo de alta temperatura, donde el control de temperatura no es una opción. No demostramos ninguna diferencia en la estabilidad de temperatura de los calentadores NINA y la consistencia de amplificación a una temperatura ambiente de 37uC en comparación con nuestro laboratorio controlado por temperatura. Para una mayor aplicabilidad para el uso en el POC, se pueden hacer varias modificaciones a los calentadores NINA. Los dispositivos prototipo evaluados en este estudio contenían sólo tres pozos de muestra; sin embargo, hasta 16 pozos de muestra se pueden añadir a la tapa de los botes aislados para un volumen de prueba mayor. En este estudio, se retiraron muestras de los calentadores NINA después de la reacción de amplificación y se calentaron durante dos minutos adicionales en un bloque de calor 80uC para terminar la reacción. Si bien el paso de calentamiento adicional no es necesario para observar los productos amplificados a partir del ácido nucleico extraído, la incubación corta y de alta temperatura facilita la observación visual de la etiqueta fluorescente en las muestras de sangre enteras. Se pueden realizar modificaciones al método de preparación de la muestra de sangre para eliminar la necesidad del paso de calentamiento. Alternativamente, se puede añadir un segundo compartimento moderador de temperatura al extremo alternativo de los botes NINA, de modo que las muestras puedan retirarse del compartimento de amplificación y reinsertarse en el compartimento 80uC. Por último, el registrador de datos DaqPRO se utilizó en este estudio únicamente con fines de validación y no sería necesario para el producto final POC. Se ha demostrado la viabilidad de utilizar el LAMP como método de diagnóstico en entornos limitados de recursos para la tuberculosis [33]. Para reducir el error de preparación y tiempo de uso, los autores describen el uso de tubos de reacción Para el uso de POC, se desea una manipulación limitada de muestras y preparación de reactivos y, por lo tanto, se espera que el procedimiento de prueba del producto final incluya la reconstitución de los reactivos de amplificación en el agua y la adición de la muestra directamente al tubo de reacción. Demostramos el uso de los calentadores NINA para amplificación directamente de muestras de sangre entera, eliminando la necesidad de un procedimiento de extracción de ácido nucleico que consume mucho tiempo y reduciendo el volumen de muestra necesario para la reacción de amplificación. Se añadió un volumen total de 10 ml de sangre entera a cada tubo de reacción, que se puede obtener fácilmente mediante un dedo-stick en entornos donde la venopuntura no es factible. Además, nuestro método de detección fluorescente permite la visualización inmediata de productos amplificados en ausencia de equipos especializados. Para evitar la contaminación cruzada de material amplificado, se prefiere que los tubos de reacción permanezcan cerrados después de la amplificación Las futuras modificaciones incluirán la optimización de las secuencias de primer/quencher etiquetados para que todos los componentes puedan ser añadidos a la mezcla de reacción antes de la amplificación. Debido a la disponibilidad, el sistema Bio-Rad ChemiDoc fue utilizado como fuente UV en este estudio; sin embargo, una luz de llavero barata sería más adecuada para la detección de ojos desnudos en el POC. Para la detección sensible y específica de diversos aislados del VIH-1, incluyendo subtipos no-B, la identificación del conjunto o conjuntos óptimos de imprimadores es un paso clave en el desarrollo del ensayo RT-LAMP. Aunque todos los experimentos realizados en este estudio involucran estándares y especímenes subtipo B, la investigación en curso implica el desarrollo continuo y la optimización de los primos RT-LAMP basados en regiones del genoma del VIH-1 que se conservan entre diversos subtipos. En resumen, el método de amplificación isotérmica RT-LAMP utilizado junto con un dispositivo de calentamiento químico simplificado exhibe características que son ideales para un NAAT rápido para las pruebas de POC. El ensayo simplificado y portátil tiene el potencial de llenar un vacío importante en el diagnóstico del VIH-1, proporcionando conocimiento inmediato o confirmación del estado de infección por VIH-1 en el POC.

¿Qué se utilizó para medir el rendimiento de los calentadores NINA?

La amplificación isotérmica mediante un dispositivo de calentamiento químico para la detección en el punto de cuidado del VIH-1https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3285652/SHA: ef7110a9022bac2e50c995b0f6b826ff071e48f8Autores: Curtis, Kelly A.; Rudolph, Donna L.; Nejad, Irene; Singleton, Jered; Beddoe, Andy; Weigl, Bernhard; LaBarre, Paul; Owen, S. MicheleFecha: 2012-02-23DOI: 10.1371/journal.pone.0031432Licencia: cc0Abstracto: ANTERIOR: Hasta la fecha, el uso de pruebas tradicionales de amplificación del ácido nucleico (NA La disponibilidad de un NAAT rápido con aplicabilidad para entornos de límite de recursos o punto de atención (POC) cubriría una gran necesidad en el diagnóstico del VIH, permitiendo el diagnóstico oportuno o la confirmación del estado de infección, así como facilitar el diagnóstico de infección aguda, detección y evaluación de los bebés nacidos de madres infectadas por el VIH. Métodos de amplificación isotérmica, como la transcriptación inversa, la amplificación isotérmica mediada por bucles (RT-LAMP), exhiben características ideales para los ajustes de COP, ya que normalmente son más rápidos, fáciles de realizar y permiten la integración en dispositivos de calefacción portátiles de baja tecnología. METODOLOGÍA/SIGNIFICANTES METODOLOGÍA: En este estudio, evaluamos el ensayo RT-LAMP de VIH-1 utilizando dispositivos de amplificación de ácido nucleico (NINA) portátiles y no instrumentales que generan calor a partir de la reacción Los aparatos de calefacción NINA mostraron temperaturas estables a lo largo de la reacción de amplificación y resultados de amplificación consistentes entre tres dispositivos separados y un ciclo térmico.El rendimiento de los calentadores NINA fue validado utilizando muestras de sangre entera de pacientes infectados por VIH-1. CONCLUSIÓN: El método de amplificación isotérmica RT-LAMP utilizado junto con un dispositivo de calentamiento químico proporciona una plataforma NAAT portátil, rápida y robusta que tiene el potencial de facilitar la prueba del VIH-1 en entornos limitados de recursos y COP. Texto: Las pruebas de diagnóstico del VIH-1 se llevan a cabo con un alto nivel de rendimiento, ya que el diagnóstico tiene un impacto directo en el cuidado del paciente y la reducción de la transmisión. A pesar de los avances tecnológicos en el campo del diagnóstico del VIH y la alta sensibilidad y especificidad asociadas con la mayoría de las pruebas de diagnóstico del VIH que están disponibles actualmente, se estima que aproximadamente el 20% de las personas infectadas Además, los sitios de pruebas han informado de que entre el 35 y el 50% de las personas con un resultado positivo inicial no regresarán para un diagnóstico confirmatorio si se requieren pruebas de laboratorio de seguimiento [2]. Las pruebas rápidas basadas en anticuerpos contra el VIH, que pueden realizarse con un entrenamiento mínimo y normalmente proporcionan resultados en menos de 30 minutos [3], han facilitado las pruebas de VIH en el punto de atención y posteriormente han aumentado el número de personas conscientes de su serostatus [4]. Las pruebas rápidas son actualmente un componente clave de la detección del VIH en el punto de atención (POC), ampliando significativamente las capacidades diagnósticas de los sitios de pruebas en los países desarrollados, así como los entornos limitados de recursos. A pesar de los avances realizados por la disponibilidad generalizada de pruebas rápidas, todas las pruebas basadas en anticuerpos para la detección del VIH presentan algunas limitaciones. Los anticuerpos específicos del VIH normalmente comienzan a aparecer alrededor de tres semanas después de la La ventana de tiempo antes o durante la seroconversión temprana puede conducir a resultados falsos negativos en individuos recientemente infectados. Además, el diagnóstico preciso de bebés nacidos de madres infectadas por VIH puede ser difícil si se basa únicamente en la positividad de anticuerpos, ya que los anticuerpos maternos transferidos verticalmente pueden persistir durante 12-18 meses después del nacimiento [6, 7]. Para el diagnóstico confirmatorio de infección temprana por VIH o diagnóstico infantil, se prefieren pruebas de amplificación de ácido nucleico (NAAT), ya que el ARN del VIH-1 se puede detectar tan pronto como 10-12 días después de la infección y el ADN y/o ARN del VIH-1 son indicadores definitivos de infección activa [5]. Sin embargo, en su forma actual, los ARN del NAAT no son factibles para las pruebas de COP, porque son lentos, costosos y técnicamente complicados. Hasta la fecha, el ensayo Aptima HIV-1 ARN (Gen-Probe, Inc., http://www.fda.gov/ BiologicsBloodVaccines/BloodBloodProducts/ ApprovedProducts/ LicensedProductsBLAs/BloodDonorScreening/InfectiousDisase/ UCM080466) es el único NAAT aprobado por la FDA para el diagnóstico o la confirmación de la infección por VIH-1 y sólo es adecuado para pruebas de laboratorio. Para satisfacer las necesidades de diagnóstico del VIH-1 en el COP, un NAAT rápido que puede realizarse con un entrenamiento mínimo, un equipo limitado y un tiempo de respuesta relativamente corto (1,1 hora) es deseable [8]. El desarrollo de un NAAT rápido ha demostrado ser especialmente difícil ya que la tecnología implicada en la simplificación del procedimiento de Además, la reducción de la complejidad técnica no debe comprometer la sensibilidad y especificidad de las pruebas.Para una mayor aplicabilidad en el POC, se ha desarrollado un número creciente de nuevas técnicas de amplificación isotérmica [9]. La amplificación isotérmica es una alternativa atractiva a la PCR tradicional o RT-PCR, ya que no es necesario el termociclismo, lo que permite una mayor versatilidad en términos de dispositivos de calentamiento o amplificación. Uno de estos métodos de amplificación, denominado amplificación isotérmica mediada por lazo (LAMP) [10], se ha optimizado para la detección de ADN y/o ARN (RT-LAMP) a partir de una amplia gama de patógenos bacterianos y virales [11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19], incluido el VIH [20, 21]. La reacción de amplificación requiere seis imprimaciones específicas para ocho regiones separadas dentro de la secuencia diana, contribuyendo a la alta especificidad del método de amplificación. El material amplificado puede ser típicamente detectado dentro de 15-60 minutos cuando se incuba a una temperatura de reacción constante de 60-65uC [22]. LaMP también ha demostrado ser menos sensible a los inhibidores biológicos que la PCR [23, 24], lo que permite la amplificación directa de especímenes clínicos, eliminando así la necesidad de un paso adicional de extracción de ácido nucleico. La amplificación directa del plasma, sangre entera y líquido oral ha sido previamente demostrada para el VIH-1 [20, 21, 25]. Por último, la detección visual inmediata de productos amplificados es facilitada por la gran cantidad de ADN que se genera por cada reacción. Varios grupos han incorporado métodos de detección fluorescente en el ensayo de LAMP para la detección en tiempo real o inmediata de ojo desnudo [ La simplicidad y la naturaleza isotérmica del procedimiento LAMP abre la puerta para la evaluación de dispositivos integrados de baja tecnología o nuevos elementos de calefacción, adecuados para entornos de bajo recurso, donde no se pueden obtener equipos y electricidad costosos. En este estudio, el ensayo de HIV-1 RT-LAMP se evaluó utilizando dispositivos de amplificación de ácido nucleico (NINA) no instrumentalizados y portátiles que generan calor a partir de la reacción exotérmica del óxido de calcio y el agua [27, 28]. Demostramos la estabilidad de temperatura de los dispositivos de calentamiento NINA y la viabilidad para la prueba de COP de muestras enteras de sangre de individuos infectados por el VIH-1. Los calentadores de Prototipo NINA fueron diseñados y proporcionados por el Programa de Tecnología Apropiada en Salud (PATH, Seattle, WA), como se describe [27, 28]. Brevemente, la reacción exotérmica del óxido de calcio (CaO; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y el agua proporcionaban una temperatura de amplificación de aproximadamente 60uC. Los aparatos de calefacción, que contenían la reacción química, se diseñaron utilizando botes de acero inoxidable aislantes térmicamente con tapas de rosca de plástico (Fig. 1). Las tapas se modificaron para contener tres pozos de muestra que se ajustaban a los tubos PCR estándar de 200 ml y se llenaban con un material de cambio de fase propietario (PCM) que se utilizaba para amortiguar el calor derivado de la reacción exotérmica, proporcionando así una temperatura constante. Por último, se diseñaron tapas de plástico que contenían aislamiento de espuma para caber en la parte superior de las tapas de bote. Los perfiles térmicos de los pozos de muestra se midieron y registraron mediante un te Se prepararon paneles de linealidad de ADN y ARN para determinar la sensibilidad del ensayo RT-LAMP específico para el VIH. Se generó un panel de ADN a partir del ADN extraído de la línea celular monocítica humana OM-10.1 [29], utilizando un kit de sangre de ADN QIAamp (QIAGEN, Valencia, CA). Se utilizó el recuento celular para cuantificar el número de copia de ADN de entrada, ya que en cada célula se contiene un único provirus integrado [29]. El ADN extraído se diluyó diez veces en agua libre de RNase para crear un panel de linealidad, que va desde 10 5 copias/ml hasta 10 3 copias/ml. Se obtuvo un panel de linealidad de ARN comercialmente (PRD801; SeraCare Life Sciences, Mil- ford, MA) y varió de 2.9610 6 copias/ml a 8 copias/ml, según lo determinado por Roche AMPLICOR HIV MONITOR TM v 1.5, Bayer VERSANT HIV-1 ARN bDNA 3.0 Ensayo, bioMerieux NucliSensH HIV-1 QT, y Abbott Real Time HIV-1 m2000 TM. El ARN se extrajo de los miembros del panel utilizando un mini kit de ARN viral (QIAGEN). Los controles negativos incluyeron ADN extraído de PBMC infectado con VIH-2 SLRHC [30] y ARN extraído del virus purificado por HIV-2 NIH-Z (Advanced Biotechnologies Inc., Columbia, MD). Se recolectó sangre entera de individuos infectados por el VIH-1 como parte de un estudio independiente, aprobado por el IRB [31], u obtenida comercialmente (SeraCare Life Sciences). Todas las muestras seropositivas fueron confirmadas utilizando las siguientes pruebas: Sistemas Genéticos VIH-1/ VIH-2 más O EIA (Bio-Rad Laboratories, Redmond, WA), GS HIV-1 Western blot (Bio-Rad Laboratories), Aptima HIV-1 ARN assay (Gen-Probe, Inc., San Diego, CA) y Amplicor HIV-1 DNA assay (Roche Diagnostics, Branchburg, NJ ). Se desconocen las cargas virales y provirales, ya que las muestras fueron probadas con ensayos cualitativos basados en ácido nucleico. Todos los especímenes clínicos evaluados en este estudio fueron obtenidos Como control negativo, se incluyeron muestras de sangre seronegativa del VIH-1 (SeraCare Life Sciences) en todos los experimentos que involucraban sangre completa. Un control positivo incluyó sangre seronegativa del VIH-1 con 5610 6 partículas virales/ml de VIH-1 BaL (Advanced Biotechnologies Inc.). Los imprimadores RT-LAMP específicos del VIH-1 fueron diseñados para reconocer una secuencia conservada dentro del gen de la transcriptasa inversa (RT). Los seis imprimadores necesarios para la reacción RT-LAMP, externa hacia adelante (F3), externa hacia atrás (B3), interna hacia adelante (FIP), interna hacia atrás (BIP), y los imprimadores de bucle (LoopF y LoopB), fueron diseñados utilizando el software PrimerExplorer V4 (Eiken Chemical Co. Ltd.; http:// primerexplorer.j Los imprimadores LAMP y el ciclo de amplificación han sido descritos en detalle por Nagamine et al. [32]. Otras modificaciones incluyen una secuencia de enlace de cuatro timidinas insertadas entre las secuencias F2 y F1c del imprimador FIP, como se describe [20], y la adición de la molécula fluorescente HEX al extremo 59 del imprimador LoopF. El imprimador etiquetado, junto con una sonda de apagador, permitió la detección visual inmediata de productos amplificados [21]. La sonda de apagador consistía en la secuencia complementaria del imprimador LoopF con Black Hole Quencher-1 (BHQ-1) añadido al extremo 39. La secuencia HXB2 del HIV-1 (número de adhesión de GenBank AF033819) se utilizó como referencia para generar los primeros RT-LAMP. La reacción RT-LAMP se realizó utilizando la siguiente mezcla de reacción: 0,2 mM (concentración final) de cada primer F3 y B3, 1,6 mM de cada primer FIP y BIP, 0,8 mM de cada primer LoopF y HEX-LoopB, 0,8 M betaína (Sigma-Aldrich), 10 mM MgSO 4, 1,4 mM dNTPs, 16 ThermoPol Reaction Buffer (New England Biolabs, Ipswich, MA), 16 U Bst ADN polimerasa (New England Biolabs) y 2 U AMV transcriptasase inversa (Invitrogen, Carlsbad, CA). La reacción se realizó en un volumen total de 25 ml para amplificación del ácido nucleico extraído, 10 ml de los cuales constituye la muestra. Para la amplificación de muestras de sangre entera, se utilizó un volumen de reacción de 100 ml para facilitar la detección visual de productos amplificados. La sangre entera se añadió directamente a la reacción a un volumen total de 40 ml, después de una dilución de 1:4 con tampón de lisis de glóbulos rojos (2,5 mM KHCO 3, 37,5 mM NH 4 Cl, y 0,025 mM EDTA), como se ha descrito anteriormente [21]. La mezcla de reacción se incubaba a 60uC durante 60 minutos, utilizando un sistema GeneAmpH PCR (Applicated Biosystems, Foster City, CA) o los calentadores NINA. Para las reacciones amplificadas en el termocilcer, se añadió un paso de calentamiento adicional de dos minutos de 80uC al final del ciclo de amplificación para terminar la reacción. Los tubos de reacción fueron evaluados para la presencia de amplificación, después de la adición de la sonda de enfriamiento en una relación de 2:1 de apagador a primer etiquetado, como se describió previamente [21]. La amplificación fue determinada visualmente observando fluorescencia en los tubos de reacción, utilizando la lámpara UV de un sistema ChemiDoc XRS (Bio-Rad Laboratories, Hércules, CA). La amplificación fue confirmada por electroforesis utilizando un gel de agarosa del 1,2% que contenía mancha de gel seguro SYBRH (Invitrogen), que posteriormente fue visualizada mediante el sistema ChemiDoc XRS. Para comparar la temperatura y la consistencia de amplificación, se probaron tres calentadores NINA en paralelo. La reacción de calentamiento se inició añadiendo 18 g de CaO a cada bote NINA, seguido de 6 ml de agua. La tapa Después de añadir 200 ml de agua a cada uno de los pozos de la muestra, se inició el registro de temperatura. Se añadieron tubos de reacción a los pozos de la muestra una vez que cada cámara de reacción alcanzó una temperatura de 58,5 uC. Para todas las muestras incubadas en el calentador NINA, se añadieron 15 ml de aceite mineral al tubo de reacción durante la preparación de la mezcla de reacción. Las muestras se incubaron en los calentadores durante un total de 60 minutos. Todas las reacciones se llevaron a cabo en un laboratorio controlado por la temperatura con una temperatura ambiente de 28 uC, a menos que se indique lo contrario. Después de la reacción de amplificación, las muestras se incubaron durante dos minutos en un bloque de calor a 80 uC. Después de cada ciclo de amplificación, se analizó el perfil de temperatura de cada dispositivo mediante el cálculo de la media de temperatura, desviación estándar, mediana, mínima y máxima a partir de los datos La estabilidad de los calentadores NINA a temperaturas extremas bajas y altas fue evaluada colocando los recipientes en un refrigerador a 4uC o una incubadora de 37uC durante la duración de la reacción de amplificación. Los perfiles de temperatura fueron registrados y comparados con los de las reacciones que ocurrieron a la temperatura ambiente de laboratorio de 28uC. Para determinar la sensibilidad de la reacción RT-LAMP utilizando imprimaciones RTespecíficas, se probaron paneles de linealidad de ADN y ARN en un ciclo térmico. El límite de detección del ADN VIH-1 fue de 10 copias/reacción. Para el panel de linealidad ARN, la muestra conteniendo 1700 copias/reacción fue detectada en las tres réplicas, mientras que la muestra conteniendo 140 copias/reacción fue detectada en tres de cinco réplicas (60%). En cuanto a la positividad, los resultados de amplificación fueron consistentes entre los tres calentadores y el ciclo térmico (Tabla 2). Dado que el ensayo RT-LAMP requiere una temperatura constante de 60uC para la duración de la reacción de amplificación, se compararon los perfiles de temperatura de los pozos de muestra durante la incubación y entre los tres calentadores NINA. En la Figura 2 se muestra un perfil de temperatura representativo, mostrando una temperatura de reacción constante a o cerca de 60uC para la duración de la reacción de amplificación. Durante la incubación de 60 minutos, la temperatura media de cada dispositivo fue de 60.2, 59.8 y 59.7 (Tabla 3 ). La temperatura mínima alcanzada durante la reacción refleja el hecho de que la temperatura del puerto de muestra descendió temporalmente después de que los tubos de muestra se añaden al dispositivo, como se muestra en la Figura 2. La temperatura máxima de los dispositivos se desvió de la temperatura de reacción deseada de 60uC en menos de un grado. La capacidad de los calentadores NINA para mantener una temperatura de reacción constante en una amplia gama de temperaturas ambientes es esencial para las pruebas de COP, ya se refiera a un laboratorio climatizado o sitio de campo de alta temperatura. Para evaluar el rendimiento de los calentadores NINA a temperaturas extremas bajas o altas, los botes se colocaron en una nevera 4uC o una incubadora 37uC para la duración de la reacción de amplificación. El límite de detección para los paneles de linealidad de ADN y ARN fue similar a los resultados obtenidos en nuestro laboratorio controlado por temperatura (28uC; Tabla 2 ). El mayor grado de variación de temperatura de los pozos muestra se observó a la temperatura ambiente de 4uC (Tabla 3 ). La temperatura media fue aproximadamente dos grados menor que la temperatura de reacción deseada de 60uC. Además, la temperatura de los dispositivos tendió a disminuir desde su estado estacionario durante los últimos 20 minutos de la reacción (datos no mostrados). Los perfiles de temperatura a la temperatura ambiente de 37uC, sin embargo, fueron similares a los de 28uC. Las muestras de sangre entera de los individuos infectados por el VIH-1 se añadieron directamente a la reacción RT-LAMP y se probaron en los calentadores NINA. La positividad de los especímenes clínicos fue consistente entre el ciclo térmico y los dispositivos (Tabla 4 ). La consistencia de amplificación fue más evidente con dos de las muestras de pacientes (paciente #4 y #5) que fueron sólo positivas en una de las tres réplicas, Todas las muestras de sangre HIVnegative, incluidas en cada reacción, fueron negativas (datos no mostrados). En la Figura 3 se muestra un experimento representativo utilizando los calentadores NINA, que muestra la detección por gel de agarosa y la identificación visual de fluorescencia en los tubos de reacción. En este estudio, se demuestra el rendimiento de los calentadores NINA de ácido nucleico portátiles, económicos y no instrumentales para amplificación del VIH-1 mediante RT-LAMP. La reacción de amplificación isotérmica acoplada con un dispositivo que genera calor a partir de una reacción química exotérmica, en lugar de electricidad de red o energía de batería, comprende un NAAT de punto de cuidado que es práctico para su uso en entornos limitados a recursos. Los dispositivos de calefacción requieren un entrenamiento mínimo y experiencia técnica para operar y tomar aproximadamente 10-15 minutos para alcanzar una temperatura de reacción de 60uC una vez iniciada la reacción Además, la temperatura de los pozos muestra se mantiene relativamente estable a la temperatura de reacción deseada de 60uC a lo largo de toda la reacción de amplificación, como lo demuestran los perfiles de calentamiento y la consistencia en la amplificación entre los dispositivos y el ciclo térmico. Dado que los ensayos en el punto de cuidado pueden referirse a un laboratorio climatizado o a un sitio de campo con altas temperaturas y humedad, la estabilidad de la temperatura generada por los dispositivos de calentamiento debe ser fiable. Aunque los perfiles de temperatura a una temperatura de frío representativa de 4uC indicaron una pérdida de temperatura de reacción hacia el final de la incubación de 60 minutos, las fluctuaciones de temperatura no fueron lo suficientemente significativas como para afectar la reacción de amplificación. Sin embargo, este efecto térmico podría mitigarse con pequeñas modificaciones en el dispositivo para reducir la pérdida de calor a temperaturas más bajas. Debería ser posible ampliar el rango de temperatura de los calentadores NINA a 4uC y más abajo Es más preocupante el rendimiento de los calentadores NINA en sitios de campo de alta temperatura, donde el control de temperatura no es una opción. No demostramos ninguna diferencia en la estabilidad de temperatura de los calentadores NINA y la consistencia de amplificación a una temperatura ambiente de 37uC en comparación con nuestro laboratorio controlado por temperatura. Para una mayor aplicabilidad para el uso en el POC, se pueden hacer varias modificaciones a los calentadores NINA. Los dispositivos prototipo evaluados en este estudio contenían sólo tres pozos de muestra; sin embargo, hasta 16 pozos de muestra se pueden añadir a la tapa de los botes aislados para un volumen de prueba mayor. En este estudio, se retiraron muestras de los calentadores NINA después de la reacción de amplificación y se calentaron durante dos minutos adicionales en un bloque de calor 80uC para terminar la reacción. Si bien el paso de calentamiento adicional no es necesario para observar los productos amplificados a partir del ácido nucleico extraído, la incubación corta y de alta temperatura facilita la observación visual de la etiqueta fluorescente en las muestras de sangre enteras. Se pueden realizar modificaciones al método de preparación de la muestra de sangre para eliminar la necesidad del paso de calentamiento. Alternativamente, se puede añadir un segundo compartimento moderador de temperatura al extremo alternativo de los botes NINA, de modo que las muestras puedan retirarse del compartimento de amplificación y reinsertarse en el compartimento 80uC. Por último, el registrador de datos DaqPRO se utilizó en este estudio únicamente con fines de validación y no sería necesario para el producto final POC. Se ha demostrado la viabilidad de utilizar el LAMP como método de diagnóstico en entornos limitados de recursos para la tuberculosis [33]. Para reducir el error de preparación y tiempo de uso, los autores describen el uso de tubos de reacción Para el uso de POC, se desea una manipulación limitada de muestras y preparación de reactivos y, por lo tanto, se espera que el procedimiento de prueba del producto final incluya la reconstitución de los reactivos de amplificación en el agua y la adición de la muestra directamente al tubo de reacción. Demostramos el uso de los calentadores NINA para amplificación directamente de muestras de sangre entera, eliminando la necesidad de un procedimiento de extracción de ácido nucleico que consume mucho tiempo y reduciendo el volumen de muestra necesario para la reacción de amplificación. Se añadió un volumen total de 10 ml de sangre entera a cada tubo de reacción, que se puede obtener fácilmente mediante un dedo-stick en entornos donde la venopuntura no es factible. Además, nuestro método de detección fluorescente permite la visualización inmediata de productos amplificados en ausencia de equipos especializados. Para evitar la contaminación cruzada de material amplificado, se prefiere que los tubos de reacción permanezcan cerrados después de la amplificación Las futuras modificaciones incluirán la optimización de las secuencias de primer/quencher etiquetados para que todos los componentes puedan ser añadidos a la mezcla de reacción antes de la amplificación. Debido a la disponibilidad, el sistema Bio-Rad ChemiDoc fue utilizado como fuente UV en este estudio; sin embargo, una luz de llavero barata sería más adecuada para la detección de ojos desnudos en el POC. Para la detección sensible y específica de diversos aislados del VIH-1, incluyendo subtipos no-B, la identificación del conjunto o conjuntos óptimos de imprimadores es un paso clave en el desarrollo del ensayo RT-LAMP. Aunque todos los experimentos realizados en este estudio involucran estándares y especímenes subtipo B, la investigación en curso implica el desarrollo continuo y la optimización de los primos RT-LAMP basados en regiones del genoma del VIH-1 que se conservan entre diversos subtipos. En resumen, el método de amplificación isotérmica RT-LAMP utilizado junto con un dispositivo de calentamiento químico simplificado exhibe características que son ideales para un NAAT rápido para las pruebas de POC. El ensayo simplificado y portátil tiene el potencial de llenar un vacío importante en el diagnóstico del VIH-1, proporcionando conocimiento inmediato o confirmación del estado de infección por VIH-1 en el POC.

¿Qué porcentaje de personas infectadas por el VIH no son detectadas en los Estados Unidos?

La coinfección viral y bacteriana en neumonía grave desencadena respuestas inmunes innatas y mejora específicamente IP-10: un estudio traslacionalhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5138590/SHA: ef3d6cabc804e5eb587b34249b539c1b5efa4cc4Autores: Hoffmann, Jonathan; Machado, Daniela; Terrier, Olivier; Pouzol, Stephane; Messaoudi, Mélina; Basualdo, Wilma; Espínola, Emilio E; Guillen, Rosa M.; Rosa-Calatrava, Manuel; Picot, Valentina; Bénet, Thomas; Endtz, Hubert; Russomando, Graciela; Paranhos-Baccalà En este estudio se investigaron microARN, mRNA y perfil de secreción de citoquinas/quimoquinas para los macrófagos humanos infectados in vitro por el virus de la influenza A/H1N1 y/o Streptococcus pneumoniae. Se observó que la coinfección in vitro sinérgicamente aumentó la expresión inducida por interferón-γ-10 (CXCL10, IP-10) en comparación con las condiciones de las células infectadas por separado. Se demostró que el miRNA-200a-3p endógeno, cuya expresión fue inducida sinérgicamente después de la coinfección, regula indirectamente la expresión CXCL10 mediante el supresor de la señal de citocina-6 (SOCS-6), un conocido regulador de la vía de señalización JAK-STAT. Además, en un estudio clínico piloto posterior, se evaluaron los niveles de inmunomoduladores en muestras de 74 niños (≤5 años) hospitalizados con neumonía viral y/o bacteriana adquirida en la comunidad. Clínicamente, entre los 74 casos de neumonía, los pacientes con detección mixta identificada tuvieron niveles séricos IP-10 significativamente más altos (3,6 veces) que aquellos con una única detección (P = 0,03), y se asociaron significativamente con neumonía grave (P < 0,01). Este estudio demuestra que la coinfección viral y bacteriana modula la vía de señalización JAK-STAT y conduce a una expresión exacerbada IP-10, que podría desempeñar un papel importante en la patogénesis de la neumonía. Texto: Scientific RepoRts 6:38532 DOI: 10.1038/srep38532 patogénesis de varias enfermedades y se ha sugerido como un potencial biomarcador de infección viral 10, 11, infección bacteriana de inicio tardío en lactantes prematuros 12, y un prometedor biomarcador de sepsis y shock séptico 13, 14. El análisis combinado de IP-10 e IFN-γ también se ha notificado como un biomarcador útil para el diagnóstico y el seguimiento de la eficacia terapéutica en pacientes con tuberculosis activa [15] [16] [17], y ambos permanecen detectables en la orina de pacientes con enfermedades pulmonares en ausencia de disfunción renal 18. Con las células epiteliales de las vías respiratorias 19, los macrófagos alveolares residentes (AMs) y los macrófagos derivados de los monocitos de la sangre (reclutados en los tejidos bajo condiciones inflamatorias 20, 21 ) representan una línea principal de defensa contra ambos neumocócicos (a través de su alta capacidad fagocítica [22] [23] ) y la infección por gripe 25, 26. Hasta ahora, ningún estudio se ha centrado en los mecanismos intracelulares que regulan IP-10 en leucocitos sanguíneos humanos durante la infección mixta por VAI y SP. Varios estudios indicaron que los pequeños ARN no codificantes (incluidos los microARNs) pueden funcionar como inmunomoduladores regulando varios procesos intracelulares pivotales, como la respuesta inmune innata 27 y la actividad antiviral 28, 29 ; ambos procesos están estrechamente En este estudio se investigaron en primer lugar los mecanismos intracelulares in vitro que median la respuesta inmune innata en los macrófagos humanos infectados por monocitos IAV y/o SP (MDMs). Utilizando este enfoque, se observó que la infección mixta de MDMs induce una producción sinérgica de IP-10 que puede estar relacionada con una vía reguladora miRNA-200a/JAK-STAT/SOCS-6. Posteriormente, en un análisis retrospectivo de muestras clínicas recogidas de niños ≤ 5 años hospitalizados con neumonía, se confirmó que el nivel sérico IP-10 podría estar relacionado tanto con etiologías virales y/o bacterianas como con severidad de la enfermedad. En primer lugar, la replicación activa del VAI fue evaluada por qRT-PCR y cuantificación de nuevas partículas virales infecciosas en los sobrenadantes celulares (fig. 1a,b ). El título del VAI aumentó con el tiempo después de una única infección con VAI y se correlacionó con el aumento de la producción de ARN IAV de cadena negativa. La replicación viral máxima se observó a las 18-24 horas después de la infección, después de lo cual disminuyó tanto la replicación de ARN como la cantidad de partículas infecciosas. En este modelo in vitro, el posterior desafío de los MDM infectados con VAI con SP no tuvo un impacto significativo en la producción de nuevas partículas virales infecciosas (fig. 1b). Juntos, estos resultados indican una infección permisiva y productiva de MDM por el VAI. En segundo lugar, evaluamos si los MDM son permisivos tanto para la infección La presencia de neumococos dentro de los MDMs primarios infectados por el VAI y el SP se confirmó a las 8 h postinfección (fig. 1c), sugiriendo que los MDM son permisivos para la coinfección viral y bacteriana en los primeros pasos de infección. Es importante destacar que la codetección confocal de los VAI y SP mixtos sólo fue efectiva después de 8 h postinfección debido al impacto bactericida de la internalización del SP dentro de los macrófagos humanos (después de 24 h, datos no mostrados). En tercer lugar, evaluamos el impacto de la infección única y mixta con el VAI y el SP en la viabilidad del MDM. La infección mixta disminuyó significativamente la viabilidad celular (65,2 ± 4,5% muerte celular total a las 48 horas postinfección; P < 0,0001) en comparación con la infección única por SP e IAV Tomados en conjunto, estos resultados confirmados MDM humanos son permisivos a la infección viral y bacteriana mixta. mRNA, microRNA y perfil de expresión proteica revelan una inducción global de la respuesta inmune innata del huésped después de la infección IAV y/o SP de MDMs. Para investigar la respuesta inmune innata orquestada por MDMs humanos infectados por IAV y SP, primero evaluamos la expresión de 84 genes involucrados en las respuestas inmunes innatas y adaptativas (Tabla S1); los principales genes expresados diferencialmente se resumen en la Fig. 2a. El perfil de expresión indicó una inducción global de genes relacionados con las vías de señalización JAK-STAT, NF- De hecho, todos los genes estimulados por interferón (ISG) examinados, incluyendo CXCL10 (cambio doble [FC] = 240.9), CCL-2 (FC = 34.2) y MX-1 (FC = 151.4) fueron regulados después de una infección mixta en comparación con las células no infectadas, la mayoría de las cuales están estrechamente relacionadas con STAT-1 (FC = 52.3), IRF-7 (FC = 6.8) e IFNB1 (FC = 5.2) también se encontraron regulados en células infectadas mixtas. En segundo lugar, investigamos los perfiles de expresión de microRNA endógeno de MDM infectados por VAI y SP. Una selección de microRNA que se encontraron expresados diferencialmente bajo diferentes condiciones de infección se muestran en la Fig. 2b y la Tabla S2. El miRNA-200a-3p fue sobreexpresado después de la respuesta inmune innata a la coinfección viral y bacteriana (FC = 6,9), el único SP (FC = 3,7) y la mezcla de infección IAV/SP (FC = 7,3), lo que indica que este miRNA puede jugar un papel en la respuesta inmune innata a la coinfección viral y bacteriana. Se obtuvieron perfiles similares de disregulación miRNA-200a-3p después de infecciones IAV y/o SP de macrófagos humanos (macrófagos derivados de monocitos THP-1) o MDM primarios (datos no mostrados). En tercer lugar, los niveles segregados de diversos antivirales, proinflamatorios e inmunomoduladores citoquinas/quimoquinas fueron evaluados en sobrenadantes de células IAV- y SP-infectadas-THP De hecho, el nivel de IP-10 se incrementó sinérgicamente en el sobrenadante de MDM TPH-1 infectados por el VAI expuesto a SP (media: 30.589 ± 16.484 pg ml −1 ) en comparación con la infección única por el VAI (1.439 ± 566.5 pg ml −1 ) y la infección única por SP (4.472 ± 2.001 pg ml −1 ; P≤ 0.05; Fig. 2c ) a las 24 horas después de la infección. En esas células, la expresión IP-10 se redujo con el tiempo (48 a 72 horas), coincidiendo con una proporción significativamente mayor de células necróticas y apoptotóticas (fig. 1d). La expresión sinérgica del IP-10 se observó de manera similar a las 24 horas después de la infección utilizando MDM primarias (fig. 2d) No se observó una secreción significativamente mayor de las otras citoquinas y quimioquinas probadas después de la infección, incluso en MDMs infectados mixtos (Fig. S1 ). Curiosamente, se observó una producción significativa de IP-10 en sobrenadantes de células epiteliales primarias de la vía aérea humana (HAEC) infectadas mixtamente por VAI y SP en comparación con las infecciones únicas (Fig. 2e). Tomadas juntas, los resultados del análisis de ARNm y proteínas sugieren que la infección viral y bacteriana mixta de MDMs induce una respuesta proinflamatoria sinérgica relacionada con las vías de señalización tipo 1 del interferón y JAK-STAT, con IP-10 como firma de coinfección del VIA/SP. Entre todos los microARN analizados, miR-200a-3p fue el más Scientific RepoRts 6:38532 DOI: 10.1038/srep38532 sobreexpresado en la coinfección IAV/SP de MDMs humanos. En el resto de este estudio, decidimos investigar la interconexión entre la expresión miR-200a-3p y la respuesta inmune innata. La expresión miRNA-200a-3p endógena correlaciona con la inducción CXCL10 (IP-10) después de la infección mixta IAV y SP de MDMs humanos. Utilizando un ensayo específico de la sonda Taqman dirigido a miR-200a-3p, confirmamos una regulación significativa de miR-200a-3p después de la infección mixta IAV y SP de MDMs humanos (Fig. 3a). En este experimento, se observó una regulación más marcada de miR-200a-3p después de IAV+ SP en comparación con los resultados obtenidos previamente (Fig. 2b). Esta discrepancia se ha atribuido al uso de dos enfoques diferentes para cuantificar la expresión miR-200a-3p. El uso de un imprimador de transcripción inversa de tallo específico en la Fig. 3a permite una mejor sensibilidad de detección de miR-200a-3p en comparación con el tinte fluorescente no específico utilizado en la Fig. 2b. Como la tendencia general fue sugerente de una inducción sinérgica de miR-200a-3p en respuesta a la infección mixta (Fig. 3a), podemos hipotetizar el microRNA-200a-3p puede jugar un papel en la regulación de CXCL10 (IP-10), que también fue sinérgicamente regulado en MDMs infectados mixtos (fig 2c y d) y HAEC primario (los análisis estadísticos se realizaron utilizando ANOVA de dos vías con la prueba post-hoc de Tukey; *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001. RepoRts científicos 6:38532 DOI: 10.1038/srep38532 CXCL10 (Fig. 3d). Estos resultados sugieren que miR-200a-3p regula indirectamente CXCL10 y nos lleva a hipotetizar que miR-200a-3p controla un potencial represor de la vía de señalización JAK-STAT.. A las 18 h después de la transfección, los MDM fueron infectados por separado o mezclados como se describió anteriormente. A las 8 h post-IAV y/o infección SP, el mRNA total fue extraído y amplificado por Los valores representan la mediana ± IQR (a, c) o media ± SEM (d, e) de tres réplicas biológicas.Los análisis estadísticos se realizaron utilizando una prueba Kruskal-Wallis (no paramétrica, ANOVA unidireccional con la prueba post-hoc de Dunn) para los datos presentados en (a, c).Se utilizó una ANOVA bidireccional ordinaria (con la prueba de comparación múltiple post-hoc de Tukey) para los datos presentados en (d, e). *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001. MiRNA-200a-3p regula indirectamente la expresión IP-10 dirigiéndose a SOCS6. 2a, varios genes de la vía de señalización de JAK-STAT fueron desregulados en MDM humanos mixtos infectados por IAV y SP; por lo tanto, hipotetizamos que miR-200a-3p regula directamente un regulador de la vía de señalización de JAK-STAT. El análisis predictivo del objetivo indicó que el 3' UTR del supresor de la señal de citocina-6 (SOCS6) puede ser dirigido por miR-200a-3p (Fig. 3b). Las proteínas SOCS constituyen una clase de reguladores negativos de las vías de señalización de JAK-STAT que son inducidas por citoquinas y TLR señalización. MiRNA-200a-3p no fue predicho para apuntar a cualquiera de los otros seis miembros de la familia de genes SOCS. Transfección de MDMs humanos con SOCS MIM-200a regulados a la baja (FC = 0,57) mientras que la inhibición de miR-200a-3p (INH-200a) SOCS 6 regulados a la baja (FC = 1,55), confirmando que miR-200a-3p regula efectivamente la expresión de SOCS6 (Fig. 3e). Además, el SOCS6 fue regulado a la baja sinérgicamente en MDMs infectados por AVIA o AVIA/SP sobreexpresando miRNA-200a (Fig. 3e), sugiriendo que tanto la infección como el SOC-200a-3p regulan negativamente la expresión de SOCS6. Por último, Western blotting confirmó que la expresión de SOCS-6 se redujo bruscamente después de la infección, especialmente después de la infección mixta por AVIA Estos resultados indican que miR-200a-3p es fuertemente inducido en respuesta a la coinfección viral y bacteriana mixta, lo que a su vez conduce a la disminución de la regulación de la JAK-STAT SOCS-6 tanto en los niveles de ARNm y proteínas y posterior upregulation de IP-10. análisis demostraron infección mixta IAV y SP de MDMs humanos y HAEC inducido producción significativa de IP-10. Como leucocitos sanguíneos y células epiteliales del tracto respiratorio contribuyen activamente a la inflamación durante la neumonía, se hipotetiza que el nivel de IP-10 en el suero de paciente con neumonía puede ser tanto indicativo de infección respiratoria mixta y gravedad de la enfermedad. Como parte de un estudio prospectivo, hospitalario, multicéntrico de control de casos sobre la etiología de la neumonía en niños menores de 5 años, un total de 74 pacientes (44 hombres, 30 mujeres) fueron incluidos en esta evaluación piloto. De acuerdo con las directrices de la OMS, el análisis retrospectivo indicó que 44 (59,5%) niños tenían signos clínicos de neumonía no grave y 30 (40,5%) niños tenían signos de neumonía grave. Las principales características de los pacientes al momento de la inclusión se muestran en la Tabla 1. Los pacientes con neumonía grave presentaron episodios de disnea significativamente más registrados (P < 0,001), cianosis (P = 0,03), injerencia en el pecho inferior (P < 0,001), embolia a percusión (P < 0,001) y letargo (P < 0,001) durante el examen torácico que los pacientes con neumonía no grave. Además, las efusiones pleurales fueron significativamente más observadas entre los pacientes críticamente enfermos y la duración de la hospitalización fue significativamente mayor para los niños con neumonía grave que para aquellos con neumonía no grave (P = 0,0015). La evaluación de la respuesta inflamatoria sistémica de los 74 casos se muestra en la Tabla 2. Los niveles séricos de PCR, IP-10, PCT, G-CSF, IL-6, IL-8 y MIP-1β fueron significativamente más elevados en muestras séricas de pacientes críticamente enfermos. Los pacientes con neumonía grave tenían niveles séricos IP-10 significativamente más altos (4,2 veces) que aquellos con neumonía no grave (P < 0,001) sugiriendo IP-10 como marcador pronóstico prometedor en neumonía. Las medidas de precisión diagnóstica para predecir la gravedad de la neumonía utilizando biomarcadores basados en sangre se resumen en la Tabla S3. Brevemente, en este estudio, el valor óptimo de corte IP-10 para identificar paciente con neumonía grave fue de 4.240 pg ml-1, con un área bajo la curva característica operativa del receptor de 0,69 (IC 95%, 0,57 a 0,82, P < Definir como positivo un nivel de IP-10 sérico por encima de este corte resultó en una sensibilidad de 63,3%, especificidad de 63,6% y una relación de probabilidad positiva de 1,74. Los valores pronósticos de IP-10 se cerraron a procalcitonina (PCT; AUC = 0,70; IC 95%, 0,58 a 0,82, P < 0,001) e IL-6 (AUC = 0,70; IC 95%, 0,58-0,83; P < 0,001). Los exámenes multiples basados en PCR de muestras respiratorias y sanguíneas revelan una alta variedad de asociaciones de patógenos (Tabla 3). Se detectaron virus respiratorios en los aspirados nasales (NAs) de 63/74 pacientes (85,1%). Las bacterias etiológicas de la neumonía (S. pneumoniae, n = 19; S. aureus, n = 1; o H. influenzae tipo B, n = 7) fueron identificadas a través de PCR en tiempo real en las muestras sanguíneas de 27/74 (36,5 %) de los pacientes. Los ensayos multiplex de PCR permitieron la identificación de bacterias respiratorias en la sangre de 19 pacientes con resultados negativos en los cultivos sanguíneos.De los 74 casos PCR positivos para patógenos respiratorios, se detectó un único virus o bacteria en los pacientes de 7 (9,4%) y 3 (4,0%), respectivamente; estos casos 10/74 (13,5%) fueron definidos como el único grupo infectado. El grupo de infección mixta incluyó los 62/74 (83,8%) casos en los que (1) se identificaron múltiples virus y/o bacterias en NA (38/74; 51,3%) sin ninguna bacteria identificada en muestras de sangre o (2) uno o más virus y/o bacterias fueron identificados en NA y asociados con una bacteremia sanguínea (24/74; 32,4%). Se evaluó si el nivel sérico IP-10 podría correlacionarse con las etiologías virales y bacterianas de la neumonía. Los pacientes con infección mixta tuvieron un nivel sérico IP-10 significativamente mayor (3,6 veces) que el paciente con detección única (P = 0,03; Tabla 4 ). Un análisis estratificado revela que se observó el nivel sérico IP-10 más alto entre los pacientes con varios patógenos respiratorios identificados (grupo de detección mixta) y neumonía grave (14,427 pg ml −1, IQR (3,981-82,994). En detalle, se observó un notable nivel sérico IP-10 (142,531 pg ml −1 ), que representa 33 veces más alto valor de corte que predice la gravedad de la neumonía en el paciente con RVH en NA codetectado con S. pneumoniae (serotipo 14) en derrame pleural y sangre. De acuerdo con nuestro modelo in vitro de coinfección, se cuantificó un nivel IP-10 significativo (90,338 pg ml −1 ) en la muestra de sangre de paciente con neumonía neumocócica bacterémica grave (serotipo 14) con una codetección positiva del virus Influenza B en NA. Tomados conjuntamente, estos resultados sugieren que los niveles séricos elevados de IP-10 están significativamente asociados con la detección viral y bacteriana mixta y también relacionados con la patogénesis de la neumonía. Este estudio proporciona datos in vitro y clínicos adicionales para mejorar nuestra comprensión de la inmunopatología de la neumonía viral y bacteriana mixta (Fig. 4). El modelo in vitro de la gripe y la superinfección neumocócica de MDM humanos demostró que la liberación sinérgica de la quimioquina proinflamatoria IP-10 inducida por infección mixta, sugiere fuertemente RepoRts Científicos humanos 6:38532 DOI: 10.1038/srep38532 leucocitos en sangre contribuyen a la inmunopatología de la neumonía. Además, los análisis transcriptómicos y omics proporcionaron nuevos datos sobre las vías inflamatorias que se activan durante la infección mixta y están relacionados con la inducción sinérgica de la quimioquina proinflamatoria IP-10 en células infectadas mixtas. Nuestras observaciones son consistentes con un estudio reciente que describe la inducción IP-10 como firma host-proteoma de infecciones De los genes diferencialmente expresados observados en los MDMs infectados mixtos, los factores de transcripción STAT-1 e IRF-7 parecen jugar un papel crucial en la regulación de genes estimulados por interferón, incluyendo CXCL10 (IP-10). Al centrarse en los mecanismos intracelulares que regulan las vías inflamatorias, demostramos un papel novedoso para el miRNA-200a-3p en la regulación de CXCL10 (IP-10). Estas observaciones son consistentes con informes anteriores que muestran que la infección por el virus del ARN aumenta miR-155 en macrófagos y células dendríticas y también regula el supresor de la señal de citocina 1 (SOCS1), sugiriendo la existencia de una vía reguladora miRNA/JAK-STAT/SOCS durante la infección viral 29. Nuestro estudio sugiere que la co-infección conduce a la sobreexpresión de miR-200a-3p, que a su vez se dirige y desregula el regulador JAK-STAT SOCS-6 y, en consecuencia, aumenta la expresión CXCL10 (IP-10). Curiosamente, un enfoque complementario in-silico revela que varios microARNs que se encontraron disregulados en nuestros experimentos de co-infección IAV y SP de MDMs o HAEC, podrían dirigirse a varios genes de la familia SOCS y jugar un papel similar a miR-200a-3p. De hecho, miRNA-142-3p podría dirigirse a SOCS4, 5, 6 mRNA mientras que miRNA-194-5p podría dirigirse a SOCS2, 3, 4, 5 y 7 mRNA. Estas observaciones subrayan que la regulación intracelular de IP-10 no se limita a la contribución de un único microARN. Se produce una compleja interrelación entre numerosos microRNAs huésped e inhibidores de la vía de señalización JAK-STAT para controlar la respuesta inflamatoria innata del huésped frente a infecciones virales y/o bacterianas. Clínicamente, la mayoría de los casos de CAP pediátrica en este estudio se asociaron con detección positiva viral y/o bacteriana. Se detectaron microorganismos respiratorios en el 97% de los casos; 51,3% de los cuales fueron virales, virales, bacteriales o bacteriales codetectados sólo en aspirados nasales, 32,4% de los cuales fueron codetectados en aspirados nasales y muestras de sangre. Estos datos son consistentes con estudios etiológicos previos de CAP 3.31-33. S. pneumoniae fue la principal bacteria identificada en sangre (19/74; 25,7%) y principalmente codetectada con virus respiratorios en NAs (16/19; 84,2%). Se observó una gran diversidad de asociaciones virales y bacterianas en muestras biológicas de niños con neumonía. En comparación con la combinación IAV y SP14 evaluadas in-vitro, no hubo casos de neumonía por separado infectados por influenza y neumocococo, y no se ha observado una codetección similar con esos dos patógenos. Sin embargo, la combinación de Influenza B (IVB) fue identificada en 5 pacientes y dos de ellos tuvieron una codetección positiva de SP en sangre (una cepa no tipable y un serotipo 14 utilizando nuestra prueba de mecanografía molecular). La combinación IVB y SP14 parece ser la codetección de patógenos más cercana a la que se investigó in-vitro. Clínicamente, esta codetección se asoció con una expresión IP-10 muy alta y una definición de caso de neumonía muy severa. Curiosamente, nuestra evaluación piloto traslacional revela que Como la respuesta inmunitaria a cada patógeno es diferente, se necesitan más investigaciones in vitro utilizando diferentes asociaciones de patógenos para caracterizar mejor los mecanismos involucrados en la inmunopatología de la neumonía. En esta cohorte, se identificaron los niveles séricos más altos de IP-10 entre los pacientes con varios patógenos detectados y neumonía grave, lo que sugiere un papel significativo de IP-10 en la patogénesis de la neumonía. De hecho, se han notificado niveles plasmáticos elevados de IP-10 en pacientes con sepsis 12, y se asociaron con una alta tasa de mortalidad, especialmente entre los pacientes con CAP 34. Además, el eje IP-10-CXCR3 se ha relacionado con lesiones pulmonares inmunitarias agudas y apoptosis linfocítica durante el desarrollo de síndrome respiratorio agudo severo (SARS) 35, 36. Además, un estudio in vivo que modeló la gripe y la sobreinfección neumocócica en ratones indicó que las quimioquinas proinflamatorias, incluyendo IP-10, desempeñan un papel crucial en la susceptibilidad inducida por la gripe a la neutrofilia pulmonar, inmunopatología grave y mortalidad 37. En este estudio, se cuantificaron en la muestra sérica de un niño que murió, en el que se identificó S. pneumoniae (serotipo 9 V) en la sangre (PCR y cultivo sanguíneo) y se codetectó con Haemophilus influenzae tipo B en aspirado nasal, una relación entre la codetección, la elevación de la IP-10 sérica y la patogénesis de la neumonía. Es necesario reconocer varias limitaciones de este estudio experimental traslacional antes de concluir que la infección mixta está relacionada con la elevación de la IP-10 y la gravedad de la enfermedad. De hecho, aunque el derrame viral (por ejemplo, de VFC y VHB) es común en niños asintomáticos, no pudimos evaluar los niveles de inmunomoduladores en las muestras séricas de un grupo control. Además, aunque las muestras se recogieron dentro de las primeras 24 horas después del ingreso, sólo se procesó una muestra de sangre única para cada paciente. Por lo tanto, será necesario un estudio longitudinal más amplio sobre la etiología y la gravedad de la neumonía para confirmar estos resultados. En conclusión, los hallazgos actuales sugieren que las infecciones respiratorias mixtas e IP-10 pueden desempeñar papeles importantes e interconectados en la patogénesis de la neumonía. Clínicamente, la evaluación y el seguimiento del nivel sérico inducido IP-10 pueden ayudar a los médicos a mejorar el Los 10 ng ml −1 M-CSF (Miltenyi Biotec). THP− 1 MDM se obtuvieron mediante el cultivo de células con 10 ng ml -1 acetato de miristato de forbol (PMA; Invivogen, Toulouse, Francia) durante 72 horas. Las células epiteliales de las vías respiratorias humanas (HAEC, tipo de célula bronquial) originadas en una mujer de 54 años de edad sin patología reportada (número de lote MD056501) fueron proporcionadas por Mucilair (Epithelix, Ginebra, Suiza). La esterilidad, integridad tisular (TEER), la producción de mucosidad y la frecuencia de batir ciliares han sido certificadas por la empresa. Perfil de expresión genética. El mRNA total fue purificado utilizando el kit RNeasy (Qiagen, Hilden, Alemania La expresión de 84 genes involucrados en las respuestas inmunes innatas y adaptativas humanas se evaluó utilizando el perfilador RT 2 TM PCR Array (SAbiociencias) según las recomendaciones del fabricante. El método Δ Δ Ct se aplicó para calcular los cambios en la expresión génica de cada gen en relación con las células de control no infectadas utilizando el software de análisis de datos de perfil RT 2 PCR Array (SAbiociencias). Matriz de perfil de microRNA. Los microRNA celulares totales se purificaron utilizando el kit miRNeasy Mini (Qiagen) y se transcriben inversamente utilizando el kit de transcripción inversa miScript (Qiagen). El perfil de 84 miRNAs se realizó utilizando el kit de matriz de miRNA miRNA de Inmunopatología Humana (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los datos fueron analizados utilizando el portal web de análisis de datos de miRNA miRNA de miScript. En la predicción de objetivo de miRNA de silico se recuperaron y compilaron genes objetivo de miRNA usando TargetScan 38 y recurso microRNA.org 39. Las interacciones entre miRNAs y vías intracelulares fueron predichas usando DIANA-miRPath v2.0 40. Los MDM de THP-1 fueron sembrados en placas de 24 pozos (0,5 × 10 6 por pozo) por triplicado, expuestos al virus H1N1 de Influenza A (A/Islas Salomón/3/2006) bajo condiciones libres de suero durante 1 hora y luego cultiva Se añadió el serotipo 14 de Streptococcus pneumoniae (SP) a las 4 horas después de la infección por el VAI. Gentamicina (10 μ g ml −1 ) se añadió 2 horas después de la infección por el VSP (es decir, 6 horas después de la infección por la gripe) y se mantuvo en los medios de cultivo durante todo el experimento para matar bacterias extracelulares y limitar el crecimiento bacteriano. La viabilidad celular se determinó mediante la citometría de flujo utilizando el kit de detección de apoptosis FITC/Anexina V (BD Biosciences), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. #4427975). En este ensayo, los cambios de pliegues se han definido mediante el método Δ Δ Ct utilizando el control RNU-44 y -48 como microARNs de referencia. El ARNm total se purificó a partir de MDM transfectados e infectados utilizando el kit RNeasy (Qiagen) y se utilizaron imprimaciones específicas para amplificar el factor de crecimiento transformador beta-2 (TGFB2; F: 5′ -CCATCCGCCCACTTTCTAC-3′, R: 5′ -AGCTCAATCCGTTGTTCAGGC-3′ ), SOCS6 (F: 5′ -AAGAATCATCCCTTTGGAGTAAC-3′, R: 5′ -CAGACTGGAGGTGGAA-3′ ) 41 43, y 3) ausencia de sibilancia en la auscultación, y 4) primeros síntomas que aparecieron en los últimos 14 días, y 5) confirmación radiológica de neumonía según las directrices de la OMS 44. Con base en estos criterios primarios que definen los casos de neumonía, los 74 casos fueron reevaluados retrospectivamente de acuerdo con el "Pocket book of hospital care for children" de la OMS 45 criterios para evaluar la gravedad de la neumonía. Los casos que murieron durante el estudio, o que tuvieron al menos un signo clínico adicional incluyendo cianosis central, embotamiento a la percusión durante el examen torácico, postración/letargo, derrame pleural observado en la radiografía torácica fueron incluidos retrospectivamente en el grupo de neumonía grave. Los pacientes sin ninguno de estos signos clínicos adicionales fueron incluidos en el grupo de neumonía no grave. Tabla 4. Los valores de IP-10 se expresan en pg ml -1. Las diferencias de concentración IP-10 entre los grupos fueron comparadas mediante pruebas de Mann-Whitney no pareadas; cambios significativos (P < 0,05) son en negri A partir de muestras de sangre completa se obtuvieron muestras de Nasofaringe Aspirados (NAs) y sangre completa de niños dentro de las 24 horas siguientes al ingreso. Se utilizaron muestras de sangre completa para recuentos sanguíneos completos, cultivos sanguíneos y PCR multiplex en tiempo real para identificar Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae y Haemophilus influenzae tipo B 46. Se definieron serotipos de S. pneumoniae utilizando un ensayo de PCR multiplex en tiempo real dirigido a los 40 serotipos o serogrupos representados con mayor frecuencia según el protocolo desarrollado por Messaoudi y otros 47. Se utilizó PCR multiplex no cuantitativo en tiempo real (Fast-Track Diagnostic, Sliema, Malta) para detectar 19 virus y cinco bacterias en las muestras respiratorias (NAs y derrames pleurales).Se definió la detección mixta como 1) PCR positivo para múltiples virus en NAs, 2) cultivo sanguíneo positivo o PCR positivo para múltiples bacterias en sangre o 3) PCR positivo para uno o múltiples virus en NAs y una o múltiples bacterias en sangre (identificado por PCR y cultivo sanguíneo).Aprobación ética.El protocolo del estudio, declaración de consentimiento informado, formulario de investigación clínica, cualquier modificación y todos los demás documentos del estudio fueron presentados y aprobados por el Comité Ético del Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud, la Universidad Nacional de Asunción (IICS-UNA) y el Hospital Pediátrico Niños de Acosta Ñu. La investigación clínica se realizó de acuerdo con los principios expresados en la Declaración de Helsinki. Análisis estadístico. Se utilizó la prueba de Chi-cuadrado y la prueba exacta de Fisher para comparar variables categóricas; se compararon variables continuas y datos no distribuidos normalmente utilizando la prueba U de Mann-Whitney; se compararon datos normalmente distribuidos utilizando pruebas t sin emparejar. Se realizaron análisis comparativos entre condiciones experimentales (es decir, MOCK, IAV, SP o IAV + SP) utilizando ANOVA de una vía con la prueba posthoc de Tukey o el análisis de Kruskal-Wallis con las pruebas posthoc de Dunn. Se utilizó el análisis de la curva operativa del receptor (ROC) para determinar el valor óptimo de corte para IP-10 para diferenciar entre los casos de neumonía no grave y grave. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism (La Jolla, California, Estados Unidos).

¿Qué seguimiento es necesario para confirmar los resultados del estudio actual?

La coinfección viral y bacteriana en neumonía grave desencadena respuestas inmunes innatas y mejora específicamente IP-10: un estudio traslacionalhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5138590/SHA: ef3d6cabc804e5eb587b34249b539c1b5efa4cc4Autores: Hoffmann, Jonathan; Machado, Daniela; Terrier, Olivier; Pouzol, Stephane; Messaoudi, Mélina; Basualdo, Wilma; Espínola, Emilio E; Guillen, Rosa M.; Rosa-Calatrava, Manuel; Picot, Valentina; Bénet, Thomas; Endtz, Hubert; Russomando, Graciela; Paranhos-Baccalà En este estudio se investigaron microARN, mRNA y perfil de secreción de citoquinas/quimoquinas para los macrófagos humanos infectados in vitro por el virus de la influenza A/H1N1 y/o Streptococcus pneumoniae. Se observó que la coinfección in vitro sinérgicamente aumentó la expresión inducida por interferón-γ-10 (CXCL10, IP-10) en comparación con las condiciones de las células infectadas por separado. Se demostró que el miRNA-200a-3p endógeno, cuya expresión fue inducida sinérgicamente después de la coinfección, regula indirectamente la expresión CXCL10 mediante el supresor de la señal de citocina-6 (SOCS-6), un conocido regulador de la vía de señalización JAK-STAT. Además, en un estudio clínico piloto posterior, se evaluaron los niveles de inmunomoduladores en muestras de 74 niños (≤5 años) hospitalizados con neumonía viral y/o bacteriana adquirida en la comunidad. Clínicamente, entre los 74 casos de neumonía, los pacientes con detección mixta identificada tuvieron niveles séricos IP-10 significativamente más altos (3,6 veces) que aquellos con una única detección (P = 0,03), y se asociaron significativamente con neumonía grave (P < 0,01). Este estudio demuestra que la coinfección viral y bacteriana modula la vía de señalización JAK-STAT y conduce a una expresión exacerbada IP-10, que podría desempeñar un papel importante en la patogénesis de la neumonía. Texto: Scientific RepoRts 6:38532 DOI: 10.1038/srep38532 patogénesis de varias enfermedades y se ha sugerido como un potencial biomarcador de infección viral 10, 11, infección bacteriana de inicio tardío en lactantes prematuros 12, y un prometedor biomarcador de sepsis y shock séptico 13, 14. El análisis combinado de IP-10 e IFN-γ también se ha notificado como un biomarcador útil para el diagnóstico y el seguimiento de la eficacia terapéutica en pacientes con tuberculosis activa [15] [16] [17], y ambos permanecen detectables en la orina de pacientes con enfermedades pulmonares en ausencia de disfunción renal 18. Con las células epiteliales de las vías respiratorias 19, los macrófagos alveolares residentes (AMs) y los macrófagos derivados de los monocitos de la sangre (reclutados en los tejidos bajo condiciones inflamatorias 20, 21 ) representan una línea principal de defensa contra ambos neumocócicos (a través de su alta capacidad fagocítica [22] [23] ) y la infección por gripe 25, 26. Hasta ahora, ningún estudio se ha centrado en los mecanismos intracelulares que regulan IP-10 en leucocitos sanguíneos humanos durante la infección mixta por VAI y SP. Varios estudios indicaron que los pequeños ARN no codificantes (incluidos los microARNs) pueden funcionar como inmunomoduladores regulando varios procesos intracelulares pivotales, como la respuesta inmune innata 27 y la actividad antiviral 28, 29 ; ambos procesos están estrechamente En este estudio se investigaron en primer lugar los mecanismos intracelulares in vitro que median la respuesta inmune innata en los macrófagos humanos infectados por monocitos IAV y/o SP (MDMs). Utilizando este enfoque, se observó que la infección mixta de MDMs induce una producción sinérgica de IP-10 que puede estar relacionada con una vía reguladora miRNA-200a/JAK-STAT/SOCS-6. Posteriormente, en un análisis retrospectivo de muestras clínicas recogidas de niños ≤ 5 años hospitalizados con neumonía, se confirmó que el nivel sérico IP-10 podría estar relacionado tanto con etiologías virales y/o bacterianas como con severidad de la enfermedad. En primer lugar, la replicación activa del VAI fue evaluada por qRT-PCR y cuantificación de nuevas partículas virales infecciosas en los sobrenadantes celulares (fig. 1a,b ). El título del VAI aumentó con el tiempo después de una única infección con VAI y se correlacionó con el aumento de la producción de ARN IAV de cadena negativa. La replicación viral máxima se observó a las 18-24 horas después de la infección, después de lo cual disminuyó tanto la replicación de ARN como la cantidad de partículas infecciosas. En este modelo in vitro, el posterior desafío de los MDM infectados con VAI con SP no tuvo un impacto significativo en la producción de nuevas partículas virales infecciosas (fig. 1b). Juntos, estos resultados indican una infección permisiva y productiva de MDM por el VAI. En segundo lugar, evaluamos si los MDM son permisivos tanto para la infección La presencia de neumococos dentro de los MDMs primarios infectados por el VAI y el SP se confirmó a las 8 h postinfección (fig. 1c), sugiriendo que los MDM son permisivos para la coinfección viral y bacteriana en los primeros pasos de infección. Es importante destacar que la codetección confocal de los VAI y SP mixtos sólo fue efectiva después de 8 h postinfección debido al impacto bactericida de la internalización del SP dentro de los macrófagos humanos (después de 24 h, datos no mostrados). En tercer lugar, evaluamos el impacto de la infección única y mixta con el VAI y el SP en la viabilidad del MDM. La infección mixta disminuyó significativamente la viabilidad celular (65,2 ± 4,5% muerte celular total a las 48 horas postinfección; P < 0,0001) en comparación con la infección única por SP e IAV Tomados en conjunto, estos resultados confirmados MDM humanos son permisivos a la infección viral y bacteriana mixta. mRNA, microRNA y perfil de expresión proteica revelan una inducción global de la respuesta inmune innata del huésped después de la infección IAV y/o SP de MDMs. Para investigar la respuesta inmune innata orquestada por MDMs humanos infectados por IAV y SP, primero evaluamos la expresión de 84 genes involucrados en las respuestas inmunes innatas y adaptativas (Tabla S1); los principales genes expresados diferencialmente se resumen en la Fig. 2a. El perfil de expresión indicó una inducción global de genes relacionados con las vías de señalización JAK-STAT, NF- De hecho, todos los genes estimulados por interferón (ISG) examinados, incluyendo CXCL10 (cambio doble [FC] = 240.9), CCL-2 (FC = 34.2) y MX-1 (FC = 151.4) fueron regulados después de una infección mixta en comparación con las células no infectadas, la mayoría de las cuales están estrechamente relacionadas con STAT-1 (FC = 52.3), IRF-7 (FC = 6.8) e IFNB1 (FC = 5.2) también se encontraron regulados en células infectadas mixtas. En segundo lugar, investigamos los perfiles de expresión de microRNA endógeno de MDM infectados por VAI y SP. Una selección de microRNA que se encontraron expresados diferencialmente bajo diferentes condiciones de infección se muestran en la Fig. 2b y la Tabla S2. El miRNA-200a-3p fue sobreexpresado después de la respuesta inmune innata a la coinfección viral y bacteriana (FC = 6,9), el único SP (FC = 3,7) y la mezcla de infección IAV/SP (FC = 7,3), lo que indica que este miRNA puede jugar un papel en la respuesta inmune innata a la coinfección viral y bacteriana. Se obtuvieron perfiles similares de disregulación miRNA-200a-3p después de infecciones IAV y/o SP de macrófagos humanos (macrófagos derivados de monocitos THP-1) o MDM primarios (datos no mostrados). En tercer lugar, los niveles segregados de diversos antivirales, proinflamatorios e inmunomoduladores citoquinas/quimoquinas fueron evaluados en sobrenadantes de células IAV- y SP-infectadas-THP De hecho, el nivel de IP-10 se incrementó sinérgicamente en el sobrenadante de MDM TPH-1 infectados por el VAI expuesto a SP (media: 30.589 ± 16.484 pg ml −1 ) en comparación con la infección única por el VAI (1.439 ± 566,5 pg ml −1 ) y la infección única por SP (4.472 ± 2.001 pg ml −1 ; P≤ 0.05; Fig. 2c ) a las 24 horas después de la infección. En esas células, la expresión IP-10 se redujo a lo largo del tiempo (48 a 72 horas), coincidiendo con una proporción significativamente mayor de células necróticas y apoptóticas (fig. 1d). La expresión sinérgica del IP-10 se observó de manera similar a las 24 horas después de la infección mediante MDM primarias (fig. 2d) No se observó una secreción significativamente mayor de las otras citoquinas y quimioquinas probadas después de la infección, incluso en MDMs infectados mixtos (Fig. S1 ). Curiosamente, se observó una producción significativa de IP-10 en sobrenadantes de células epiteliales primarias de la vía aérea humana (HAEC) infectadas mixtamente por VAI y SP en comparación con las infecciones únicas (Fig. 2e). Tomadas juntas, los resultados del análisis de ARNm y proteínas sugieren que la infección viral y bacteriana mixta de MDMs induce una respuesta proinflamatoria sinérgica relacionada con las vías de señalización tipo 1 del interferón y JAK-STAT, con IP-10 como firma de coinfección del VIA/SP. Entre todos los microARN analizados, miR-200a-3p fue el más Scientific RepoRts 6:38532 DOI: 10.1038/srep38532 sobreexpresado en la coinfección IAV/SP de MDMs humanos. En el resto de este estudio, decidimos investigar la interconexión entre la expresión miR-200a-3p y la respuesta inmune innata. La expresión miRNA-200a-3p endógena correlaciona con la inducción CXCL10 (IP-10) después de la infección mixta IAV y SP de MDMs humanos. Utilizando un ensayo específico de la sonda Taqman dirigido a miR-200a-3p, confirmamos una regulación significativa de miR-200a-3p después de la infección mixta IAV y SP de MDMs humanos (Fig. 3a). En este experimento, se observó una regulación más marcada de miR-200a-3p después de IAV+ SP en comparación con los resultados obtenidos previamente (Fig. 2b). Esta discrepancia se ha atribuido al uso de dos enfoques diferentes para cuantificar la expresión miR-200a-3p. El uso de un imprimador de transcripción inversa de tallo específico en la Fig. 3a permite una mejor sensibilidad de detección de miR-200a-3p en comparación con el tinte fluorescente no específico utilizado en la Fig. 2b. Como la tendencia general fue sugerente de una inducción sinérgica de miR-200a-3p en respuesta a la infección mixta (Fig. 3a), podemos hipotetizar el microRNA-200a-3p puede jugar un papel en la regulación de CXCL10 (IP-10), que también fue sinérgicamente regulado en MDMs infectados mixtos (fig 2c y d) y HAEC primario (Los análisis estadísticos se realizaron utilizando ANOVA de dos vías con la prueba post-hoc de Tukey; *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001. RepoRts científicos 6:38532 DOI: 10.1038/srep38532 CXCL10 (Fig. 3d). Estos resultados sugieren que miR-200a-3p regula indirectamente CXCL10 y nos lleva a hipotetizar que miR-200a-3p controla un potencial represor de la vía de señalización JAK-STAT.. A las 18 h después de la transfección, los MDM fueron infectados por separado o mezclados como se describió anteriormente. A las 8 h post-IAV y/o infección SP, el mRNA total fue extraído y amplificado por Los valores representan la mediana ± IQR (a, c) o media ± SEM (d, e) de tres réplicas biológicas.Los análisis estadísticos se realizaron utilizando una prueba Kruskal-Wallis (no paramétrica, ANOVA unidireccional con la prueba post-hoc de Dunn) para los datos presentados en (a, c).Se utilizó una ANOVA bidireccional ordinaria (con la prueba de comparación múltiple post-hoc de Tukey) para los datos presentados en (d, e). *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001. MiRNA-200a-3p regula indirectamente la expresión IP-10 dirigiéndose a SOCS6. 2a, varios genes de la vía de señalización de JAK-STAT fueron desregulados en MDM humanos mixtos infectados por IAV y SP; por lo tanto, hipotetizamos que miR-200a-3p regula directamente un regulador de la vía de señalización de JAK-STAT. El análisis predictivo del objetivo indicó que el 3' UTR del supresor de la señal de citocina-6 (SOCS6) puede ser dirigido por miR-200a-3p (Fig. 3b). Las proteínas SOCS constituyen una clase de reguladores negativos de las vías de señalización de JAK-STAT que son inducidas por citoquinas y TLR señalización. MiRNA-200a-3p no fue predicho para apuntar a cualquiera de los otros seis miembros de la familia de genes SOCS. Transfección de MDMs humanos con SOCS MIM-200a regulados a la baja (FC = 0,57) mientras que la inhibición de miR-200a-3p (INH-200a) SOCS 6 regulados a la baja (FC = 1,55), confirmando que miR-200a-3p regula efectivamente la expresión de SOCS6 (Fig. 3e). Además, el SOCS6 fue regulado a la baja sinérgicamente en MDMs infectados por AVIA o AVIA/SP sobreexpresando miRNA-200a (Fig. 3e), sugiriendo que tanto la infección como el SOC-200a-3p regulan negativamente la expresión de SOCS6. Por último, Western blotting confirmó que la expresión de SOCS-6 se redujo bruscamente después de la infección, especialmente después de la infección mixta por AVIA Estos resultados indican que miR-200a-3p es fuertemente inducido en respuesta a la coinfección viral y bacteriana mixta, lo que a su vez conduce a la disminución de la regulación de la JAK-STAT SOCS-6 tanto en los niveles de ARNm y proteínas y posterior upregulation de IP-10. análisis demostraron infección mixta IAV y SP de MDMs humanos y HAEC inducido producción significativa de IP-10. Como leucocitos sanguíneos y células epiteliales del tracto respiratorio contribuyen activamente a la inflamación durante la neumonía, se hipotetiza que el nivel de IP-10 en el suero de paciente con neumonía puede ser tanto indicativo de infección respiratoria mixta y gravedad de la enfermedad. Como parte de un estudio prospectivo, hospitalario, multicéntrico de control de casos sobre la etiología de la neumonía en niños menores de 5 años, un total de 74 pacientes (44 hombres, 30 mujeres) fueron incluidos en esta evaluación piloto. De acuerdo con las directrices de la OMS, el análisis retrospectivo indicó que 44 (59,5%) niños tenían signos clínicos de neumonía no grave y 30 (40,5%) niños tenían signos de neumonía grave. Las principales características de los pacientes al momento de la inclusión se muestran en la Tabla 1. Los pacientes con neumonía grave presentaron episodios de disnea significativamente más registrados (P < 0,001), cianosis (P = 0,03), injerencia en el pecho inferior (P < 0,001), embolia a percusión (P < 0,001) y letargo (P < 0,001) durante el examen torácico que los pacientes con neumonía no grave. Además, las efusiones pleurales fueron significativamente más observadas entre los pacientes críticamente enfermos y la duración de la hospitalización fue significativamente mayor para los niños con neumonía grave que para aquellos con neumonía no grave (P = 0,0015). La evaluación de la respuesta inflamatoria sistémica de los 74 casos se muestra en la Tabla 2. Los niveles séricos de PCR, IP-10, PCT, G-CSF, IL-6, IL-8 y MIP-1β fueron significativamente más elevados en muestras séricas de pacientes críticamente enfermos. Los pacientes con neumonía grave tenían niveles séricos IP-10 significativamente más altos (4,2 veces) que aquellos con neumonía no grave (P < 0,001) sugiriendo IP-10 como marcador pronóstico prometedor en neumonía. Las medidas de precisión diagnóstica para predecir la gravedad de la neumonía utilizando biomarcadores basados en sangre se resumen en la Tabla S3. Brevemente, en este estudio, el valor óptimo de corte IP-10 para identificar paciente con neumonía grave fue de 4.240 pg ml-1, con un área bajo la curva característica operativa del receptor de 0,69 (IC 95%, 0,57 a 0,82, P < Definir como positivo un nivel de IP-10 sérico por encima de este corte resultó en una sensibilidad de 63,3%, especificidad de 63,6% y una relación de probabilidad positiva de 1,74. Los valores pronósticos de IP-10 se cerraron a procalcitonina (PCT; AUC = 0,70; IC 95%, 0,58 a 0,82, P < 0,001) e IL-6 (AUC = 0,70; IC 95%, 0,58-0,83; P < 0,001). Los exámenes multiples basados en PCR de muestras respiratorias y sanguíneas revelan una alta variedad de asociaciones de patógenos (Tabla 3). Se detectaron virus respiratorios en los aspirados nasales (NAs) de 63/74 pacientes (85,1%). Las bacterias etiológicas de la neumonía (S. pneumoniae, n = 19; S. aureus, n = 1; o H. influenzae tipo B, n = 7) fueron identificadas a través de PCR en tiempo real en las muestras sanguíneas de 27/74 (36,5 %) de los pacientes. Los ensayos multiplex de PCR permitieron la identificación de bacterias respiratorias en la sangre de 19 pacientes con resultados negativos en los cultivos sanguíneos.De los 74 casos PCR positivos para patógenos respiratorios, se detectó un único virus o bacteria en los pacientes de 7 (9,4%) y 3 (4,0%), respectivamente; estos casos 10/74 (13,5%) fueron definidos como el único grupo infectado. El grupo de infección mixta incluyó los 62/74 (83,8%) casos en los que (1) se identificaron múltiples virus y/o bacterias en NA (38/74; 51,3%) sin ninguna bacteria identificada en muestras de sangre o (2) uno o más virus y/o bacterias fueron identificados en NA y asociados con una bacteremia sanguínea (24/74; 32,4%). Se evaluó si el nivel sérico IP-10 podría correlacionarse con las etiologías virales y bacterianas de la neumonía. Los pacientes con infección mixta tuvieron un nivel sérico IP-10 significativamente mayor (3,6 veces) que el paciente con detección única (P = 0,03; Tabla 4 ). Un análisis estratificado revela que se observó el nivel sérico IP-10 más alto entre los pacientes con varios patógenos respiratorios identificados (grupo de detección mixta) y neumonía grave (14,427 pg ml −1, IQR (3,981-82,994). En detalle, se observó un notable nivel sérico IP-10 (142,531 pg ml −1 ), que representa 33 veces más alto valor de corte que predice la gravedad de la neumonía en el paciente con RVH en NA codetectado con S. pneumoniae (serotipo 14) en derrame pleural y sangre. De acuerdo con nuestro modelo in vitro de coinfección, se cuantificó un nivel IP-10 significativo (90,338 pg ml −1 ) en la muestra de sangre de paciente con neumonía neumocócica bacterémica grave (serotipo 14) con una codetección positiva del virus Influenza B en NA. Tomados conjuntamente, estos resultados sugieren que los niveles séricos elevados de IP-10 están significativamente asociados con la detección viral y bacteriana mixta y también relacionados con la patogénesis de la neumonía. Este estudio proporciona datos in vitro y clínicos adicionales para mejorar nuestra comprensión de la inmunopatología de la neumonía viral y bacteriana mixta (Fig. 4). El modelo in vitro de la gripe y la superinfección neumocócica de MDM humanos demostró que la liberación sinérgica de la quimioquina proinflamatoria IP-10 inducida por infección mixta, sugiere fuertemente RepoRts Científicos humanos 6:38532 DOI: 10.1038/srep38532 leucocitos en sangre contribuyen a la inmunopatología de la neumonía. Además, los análisis transcriptómicos y omics proporcionaron nuevos datos sobre las vías inflamatorias que se activan durante la infección mixta y están relacionados con la inducción sinérgica de la quimioquina proinflamatoria IP-10 en células infectadas mixtas. Nuestras observaciones son consistentes con un estudio reciente que describe la inducción IP-10 como firma host-proteoma de infecciones De los genes diferencialmente expresados observados en los MDMs infectados mixtos, los factores de transcripción STAT-1 e IRF-7 parecen jugar un papel crucial en la regulación de genes estimulados por interferón, incluyendo CXCL10 (IP-10). Al centrarse en los mecanismos intracelulares que regulan las vías inflamatorias, demostramos un papel novedoso para el miRNA-200a-3p en la regulación de CXCL10 (IP-10). Estas observaciones son consistentes con informes anteriores que muestran que la infección por el virus del ARN aumenta miR-155 en macrófagos y células dendríticas y también regula el supresor de la señal de citocina 1 (SOCS1), sugiriendo la existencia de una vía reguladora miRNA/JAK-STAT/SOCS durante la infección viral 29. Nuestro estudio sugiere que la co-infección conduce a la sobreexpresión de miR-200a-3p, que a su vez se dirige y desregula el regulador JAK-STAT SOCS-6 y, en consecuencia, aumenta la expresión CXCL10 (IP-10). Curiosamente, un enfoque complementario in-silico revela que varios microARNs que se encontraron disregulados en nuestros experimentos de co-infección IAV y SP de MDMs o HAEC, podrían dirigirse a varios genes de la familia SOCS y jugar un papel similar a miR-200a-3p. De hecho, miRNA-142-3p podría dirigirse a SOCS4, 5, 6 mRNA mientras que miRNA-194-5p podría dirigirse a SOCS2, 3, 4, 5 y 7 mRNA. Estas observaciones subrayan que la regulación intracelular de IP-10 no se limita a la contribución de un único microARN. Se produce una compleja interrelación entre numerosos microRNAs huésped e inhibidores de la vía de señalización JAK-STAT para controlar la respuesta inflamatoria innata del huésped frente a infecciones virales y/o bacterianas. Clínicamente, la mayoría de los casos de CAP pediátrica en este estudio se asociaron con detección positiva viral y/o bacteriana. Se detectaron microorganismos respiratorios en el 97% de los casos; 51,3% de los cuales fueron virales, virales, bacteriales o bacteriales codetectados sólo en aspirados nasales, 32,4% de los cuales fueron codetectados en aspirados nasales y muestras de sangre. Estos datos son consistentes con estudios etiológicos previos de CAP 3.31-33. S. pneumoniae fue la principal bacteria identificada en sangre (19/74; 25,7%) y principalmente codetectada con virus respiratorios en NAs (16/19; 84,2%). Se observó una gran diversidad de asociaciones virales y bacterianas en muestras biológicas de niños con neumonía. En comparación con la combinación IAV y SP14 evaluadas in-vitro, no hubo casos de neumonía por separado infectados por influenza y neumocococo, y no se ha observado una codetección similar con esos dos patógenos. Sin embargo, la combinación de Influenza B (IVB) fue identificada en 5 pacientes y dos de ellos tuvieron una codetección SP positiva en sangre (una cepa no tipable y un serotipo 14 utilizando nuestra prueba de mecanografía molecular). La combinación IVB y SP14 parece ser la codetección de patógenos más cercana a la que se investigó in-vitro. Clínicamente, esta codetección se asoció con una expresión IP-10 muy alta y una definición de caso de neumonía muy severa. Curiosamente, nuestra evaluación piloto traslacional revela que la Como la respuesta inmunitaria a cada patógeno es diferente, se necesitan más investigaciones in vitro utilizando diferentes asociaciones de patógenos para caracterizar mejor los mecanismos involucrados en la inmunopatología de la neumonía. En esta cohorte, se identificaron los niveles séricos más altos de IP-10 entre los pacientes con varios patógenos detectados y neumonía grave, lo que sugiere un papel significativo de IP-10 en la patogénesis de la neumonía. De hecho, se han notificado niveles plasmáticos elevados de IP-10 en pacientes con sepsis 12, y se asociaron con una alta tasa de mortalidad, especialmente entre los pacientes con CAP 34. Además, el eje IP-10-CXCR3 se ha relacionado con lesiones pulmonares inmunitarias agudas y apoptosis linfocítica durante el desarrollo de síndrome respiratorio agudo severo (SARS) 35, 36. Además, un estudio in vivo que modeló la gripe y la sobreinfección neumocócica en ratones indicó que las quimioquinas proinflamatorias, incluyendo IP-10, desempeñan un papel crucial en la susceptibilidad inducida por la gripe a la neutrofilia pulmonar, inmunopatología grave y mortalidad 37. En este estudio, se cuantificaron en la muestra sérica de un niño que murió, en el que se identificó S. pneumoniae (serotipo 9 V) en la sangre (PCR y cultivo sanguíneo) y se codetectó con Haemophilus influenzae tipo B en aspirado nasal, una relación entre la codetección, la elevación de la IP-10 sérica y la patogénesis de la neumonía. Es necesario reconocer varias limitaciones de este estudio experimental traslacional antes de concluir que la infección mixta está relacionada con la elevación de la IP-10 y la gravedad de la enfermedad. De hecho, aunque el derrame viral (por ejemplo, de VFC y VHB) es común en niños asintomáticos, no pudimos evaluar los niveles de inmunomoduladores en las muestras séricas de un grupo control. Además, aunque las muestras se recogieron dentro de las primeras 24 horas después del ingreso, sólo se procesó una muestra de sangre única para cada paciente. Por lo tanto, será necesario un estudio longitudinal más amplio sobre la etiología y la gravedad de la neumonía para confirmar estos resultados. En conclusión, los hallazgos actuales sugieren que las infecciones respiratorias mixtas e IP-10 pueden desempeñar papeles importantes e interconectados en la patogénesis de la neumonía. Clínicamente, la evaluación y el seguimiento del nivel sérico inducido IP-10 pueden ayudar a los médicos a mejorar el Los 10 ng ml −1 M-CSF (Miltenyi Biotec). THP− 1 MDM se obtuvieron mediante el cultivo de células con 10 ng ml -1 acetato de miristato de forbol (PMA; Invivogen, Toulouse, Francia) durante 72 horas. Las células epiteliales de las vías respiratorias humanas (HAEC, tipo de célula bronquial) originadas en una mujer de 54 años de edad sin patología reportada (número de lote MD056501) fueron proporcionadas por Mucilair (Epithelix, Ginebra, Suiza). La esterilidad, integridad tisular (TEER), la producción de mucosidad y la frecuencia de batir ciliares han sido certificadas por la empresa. Perfil de expresión genética. El mRNA total fue purificado utilizando el kit RNeasy (Qiagen, Hilden, Alemania La expresión de 84 genes involucrados en las respuestas inmunes innatas y adaptativas humanas se evaluó utilizando el perfilador RT 2 TM PCR Array (SAbiociencias) según las recomendaciones del fabricante. El método Δ Δ Ct se aplicó para calcular los cambios en la expresión génica de cada gen en relación con las células de control no infectadas utilizando el software de análisis de datos de perfil RT 2 PCR Array (SAbiociencias). Matriz de perfil de microRNA. Los microRNA celulares totales se purificaron utilizando el kit miRNeasy Mini (Qiagen) y se transcriben inversamente utilizando el kit de transcripción inversa miScript (Qiagen). El perfil de 84 miRNAs se realizó utilizando el kit de matriz de miRNA miRNA de Inmunopatología Humana (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los datos fueron analizados utilizando el portal web de análisis de datos de miRNA miRNA de miScript. En la predicción de objetivo de miRNA de silico se recuperaron y compilaron genes objetivo de miRNA usando TargetScan 38 y recurso microRNA.org 39. Las interacciones entre miRNAs y vías intracelulares fueron predichas usando DIANA-miRPath v2.0 40. Los MDM de THP-1 fueron sembrados en placas de 24 pozos (0,5 × 10 6 por pozo) por triplicado, expuestos al virus H1N1 de Influenza A (A/Islas Salomón/3/2006) bajo condiciones libres de suero durante 1 hora y luego cultiva Se añadió el serotipo 14 de Streptococcus pneumoniae (SP) a las 4 horas después de la infección por el VAI. Gentamicina (10 μ g ml −1 ) se añadió 2 horas después de la infección por el VSP (es decir, 6 horas después de la infección por la gripe) y se mantuvo en los medios de cultivo durante todo el experimento para matar bacterias extracelulares y limitar el crecimiento bacteriano. La viabilidad celular se determinó mediante la citometría de flujo utilizando el kit de detección de apoptosis FITC/Anexina V (BD Biosciences), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. #4427975). En este ensayo, los cambios de pliegues se han definido mediante el método Δ Δ Ct utilizando el control RNU-44 y -48 como microARNs de referencia. El ARNm total se purificó a partir de MDM transfectados e infectados utilizando el kit RNeasy (Qiagen) y se utilizaron imprimaciones específicas para amplificar el factor de crecimiento transformador beta-2 (TGFB2; F: 5′ -CCATCCGCCCACTTTCTAC-3′, R: 5′ -AGCTCAATCCGTTGTTCAGGC-3′ ), SOCS6 (F: 5′ -AAGAATCATCCCTTTGGAGTAAC-3′, R: 5′ -CAGACTGGAGGTGGAA-3′ ) 41 43, y 3) ausencia de sibilancia en la auscultación, y 4) primeros síntomas que aparecieron en los últimos 14 días, y 5) confirmación radiológica de neumonía según las directrices de la OMS 44. Con base en estos criterios primarios que definen los casos de neumonía, los 74 casos fueron reevaluados retrospectivamente de acuerdo con el "Pocket book of hospital care for children" de la OMS 45 criterios para evaluar la gravedad de la neumonía. Los casos que murieron durante el estudio, o que tuvieron al menos un signo clínico adicional incluyendo cianosis central, embotamiento a la percusión durante el examen torácico, postración/letargo, derrame pleural observado en la radiografía torácica fueron incluidos retrospectivamente en el grupo de neumonía grave. Los pacientes sin ninguno de estos signos clínicos adicionales fueron incluidos en el grupo de neumonía no grave. Tabla 4. Los valores de IP-10 se expresan en pg ml -1. Las diferencias de concentración IP-10 entre los grupos fueron comparadas mediante pruebas de Mann-Whitney no pareadas; cambios significativos (P < 0,05) son en negri A partir de muestras de sangre completa se obtuvieron muestras de Nasofaringe Aspirados (NAs) y sangre completa de niños dentro de las 24 horas siguientes al ingreso. Se utilizaron muestras de sangre completa para recuentos sanguíneos completos, cultivos sanguíneos y PCR multiplex en tiempo real para identificar Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae y Haemophilus influenzae tipo B 46. Se definieron serotipos de S. pneumoniae utilizando un ensayo de PCR multiplex en tiempo real dirigido a los 40 serotipos o serogrupos representados con mayor frecuencia según el protocolo desarrollado por Messaoudi y otros 47. Se utilizó PCR multiplex no cuantitativo en tiempo real (Fast-Track Diagnostic, Sliema, Malta) para detectar 19 virus y cinco bacterias en las muestras respiratorias (NAs y derrames pleurales).Se definió la detección mixta como 1) PCR positivo para múltiples virus en NAs, 2) cultivo sanguíneo positivo o PCR positivo para múltiples bacterias en sangre o 3) PCR positivo para uno o múltiples virus en NAs y una o múltiples bacterias en sangre (identificado por PCR y cultivo sanguíneo).Aprobación ética.El protocolo del estudio, declaración de consentimiento informado, formulario de investigación clínica, cualquier modificación y todos los demás documentos del estudio fueron presentados y aprobados por el Comité Ético del Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud, la Universidad Nacional de Asunción (IICS-UNA) y el Hospital Pediátrico Niños de Acosta Ñu. La investigación clínica se realizó de acuerdo con los principios expresados en la Declaración de Helsinki. Análisis estadístico. Se utilizó la prueba de Chi-cuadrado y la prueba exacta de Fisher para comparar variables categóricas; se compararon variables continuas y datos no distribuidos normalmente utilizando la prueba U de Mann-Whitney; se compararon datos normalmente distribuidos utilizando pruebas t sin emparejar. Se realizaron análisis comparativos entre condiciones experimentales (es decir, MOCK, IAV, SP o IAV + SP) utilizando ANOVA de una vía con la prueba posthoc de Tukey o el análisis de Kruskal-Wallis con las pruebas posthoc de Dunn. Se utilizó el análisis de la curva operativa del receptor (ROC) para determinar el valor óptimo de corte para IP-10 para diferenciar entre los casos de neumonía no grave y grave. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism (La Jolla, California, Estados Unidos).

¿Cuál es la conclusión de este estudio?

La coinfección viral y bacteriana en neumonía grave desencadena respuestas inmunes innatas y mejora específicamente IP-10: un estudio traslacionalhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5138590/SHA: ef3d6cabc804e5eb587b34249b539c1b5efa4cc4Autores: Hoffmann, Jonathan; Machado, Daniela; Terrier, Olivier; Pouzol, Stephane; Messaoudi, Mélina; Basualdo, Wilma; Espínola, Emilio E; Guillen, Rosa M.; Rosa-Calatrava, Manuel; Picot, Valentina; Bénet, Thomas; Endtz, Hubert; Russomando, Graciela; Paranhos-Baccalà En este estudio se investigaron microARN, mRNA y perfil de secreción de citoquinas/quimoquinas para los macrófagos humanos infectados in vitro por el virus de la influenza A/H1N1 y/o Streptococcus pneumoniae. Se observó que la coinfección in vitro sinérgicamente aumentó la expresión inducida por interferón-γ-10 (CXCL10, IP-10) en comparación con las condiciones de las células infectadas por separado. Se demostró que el miRNA-200a-3p endógeno, cuya expresión fue inducida sinérgicamente después de la coinfección, regula indirectamente la expresión CXCL10 mediante el supresor de la señal de citocina-6 (SOCS-6), un conocido regulador de la vía de señalización JAK-STAT. Además, en un estudio clínico piloto posterior, se evaluaron los niveles de inmunomoduladores en muestras de 74 niños (≤5 años) hospitalizados con neumonía viral y/o bacteriana adquirida en la comunidad. Clínicamente, entre los 74 casos de neumonía, los pacientes con detección mixta identificada tuvieron niveles séricos IP-10 significativamente más altos (3,6 veces) que aquellos con una única detección (P = 0,03), y se asociaron significativamente con neumonía grave (P < 0,01). Este estudio demuestra que la coinfección viral y bacteriana modula la vía de señalización JAK-STAT y conduce a una expresión exacerbada IP-10, que podría desempeñar un papel importante en la patogénesis de la neumonía. Texto: Scientific RepoRts 6:38532 DOI: 10.1038/srep38532 patogénesis de varias enfermedades y se ha sugerido como un potencial biomarcador de infección viral 10, 11, infección bacteriana de inicio tardío en lactantes prematuros 12, y un prometedor biomarcador de sepsis y shock séptico 13, 14. El análisis combinado de IP-10 e IFN-γ también se ha notificado como un biomarcador útil para el diagnóstico y el seguimiento de la eficacia terapéutica en pacientes con tuberculosis activa [15] [16] [17], y ambos permanecen detectables en la orina de pacientes con enfermedades pulmonares en ausencia de disfunción renal 18. Con las células epiteliales de las vías respiratorias 19, los macrófagos alveolares residentes (AMs) y los macrófagos derivados de los monocitos de la sangre (reclutados en los tejidos bajo condiciones inflamatorias 20, 21 ) representan una línea principal de defensa contra ambos neumocócicos (a través de su alta capacidad fagocítica [22] [23] ) y la infección por gripe 25, 26. Hasta ahora, ningún estudio se ha centrado en los mecanismos intracelulares que regulan IP-10 en leucocitos sanguíneos humanos durante la infección mixta por VAI y SP. Varios estudios indicaron que los pequeños ARN no codificantes (incluidos los microARNs) pueden funcionar como inmunomoduladores regulando varios procesos intracelulares pivotales, como la respuesta inmune innata 27 y la actividad antiviral 28, 29 ; ambos procesos están estrechamente En este estudio se investigaron en primer lugar los mecanismos intracelulares in vitro que median la respuesta inmune innata en los macrófagos humanos infectados por monocitos IAV y/o SP (MDMs). Utilizando este enfoque, se observó que la infección mixta de MDMs induce una producción sinérgica de IP-10 que puede estar relacionada con una vía reguladora miRNA-200a/JAK-STAT/SOCS-6. Posteriormente, en un análisis retrospectivo de muestras clínicas recogidas de niños ≤ 5 años hospitalizados con neumonía, se confirmó que el nivel sérico IP-10 podría estar relacionado tanto con etiologías virales y/o bacterianas como con severidad de la enfermedad. En primer lugar, la replicación activa del VAI fue evaluada por qRT-PCR y cuantificación de nuevas partículas virales infecciosas en los sobrenadantes celulares (fig. 1a,b ). El título del VAI aumentó con el tiempo después de una única infección con VAI y se correlacionó con el aumento de la producción de ARN IAV de cadena negativa. La replicación viral máxima se observó a las 18-24 horas después de la infección, después de lo cual disminuyó tanto la replicación de ARN como la cantidad de partículas infecciosas. En este modelo in vitro, el posterior desafío de los MDM infectados con VAI con SP no tuvo un impacto significativo en la producción de nuevas partículas virales infecciosas (fig. 1b). Juntos, estos resultados indican una infección permisiva y productiva de MDM por el VAI. En segundo lugar, evaluamos si los MDM son permisivos tanto para la infección La presencia de neumococos dentro de los MDMs primarios infectados por el VAI y el SP se confirmó a las 8 h postinfección (fig. 1c), sugiriendo que los MDM son permisivos para la coinfección viral y bacteriana en los primeros pasos de infección. Es importante destacar que la codetección confocal de los VAI y SP mixtos sólo fue efectiva después de 8 h postinfección debido al impacto bactericida de la internalización del SP dentro de los macrófagos humanos (después de 24 h, datos no mostrados). En tercer lugar, evaluamos el impacto de la infección única y mixta con el VAI y el SP en la viabilidad del MDM. La infección mixta disminuyó significativamente la viabilidad celular (65,2 ± 4,5% muerte celular total a las 48 horas postinfección; P < 0,0001) en comparación con la infección única por SP e IAV Tomados en conjunto, estos resultados confirmados MDM humanos son permisivos a la infección viral y bacteriana mixta. mRNA, microRNA y perfil de expresión proteica revelan una inducción global de la respuesta inmune innata del huésped después de la infección IAV y/o SP de MDMs. Para investigar la respuesta inmune innata orquestada por MDMs humanos infectados por IAV y SP, primero evaluamos la expresión de 84 genes involucrados en las respuestas inmunes innatas y adaptativas (Tabla S1); los principales genes expresados diferencialmente se resumen en la Fig. 2a. El perfil de expresión indicó una inducción global de genes relacionados con las vías de señalización JAK-STAT, NF- De hecho, todos los genes estimulados por interferón (ISG) examinados, incluyendo CXCL10 (cambio doble [FC] = 240.9), CCL-2 (FC = 34.2) y MX-1 (FC = 151.4) fueron regulados después de una infección mixta en comparación con las células no infectadas, la mayoría de las cuales están estrechamente relacionadas con STAT-1 (FC = 52.3), IRF-7 (FC = 6.8) e IFNB1 (FC = 5.2) también se encontraron regulados en células infectadas mixtas. En segundo lugar, investigamos los perfiles de expresión de microRNA endógeno de MDM infectados por VAI y SP. Una selección de microRNA que se encontraron expresados diferencialmente bajo diferentes condiciones de infección se muestran en la Fig. 2b y la Tabla S2. El miRNA-200a-3p fue sobreexpresado después de la respuesta inmune innata a la coinfección viral y bacteriana (FC = 6,9), el único SP (FC = 3,7) y la mezcla de infección IAV/SP (FC = 7,3), lo que indica que este miRNA puede jugar un papel en la respuesta inmune innata a la coinfección viral y bacteriana. Se obtuvieron perfiles similares de disregulación miRNA-200a-3p después de infecciones IAV y/o SP de macrófagos humanos (macrófagos derivados de monocitos THP-1) o MDM primarios (datos no mostrados). En tercer lugar, los niveles segregados de diversos antivirales, proinflamatorios e inmunomoduladores citoquinas/quimoquinas fueron evaluados en sobrenadantes de células IAV- y SP-infectadas-THP De hecho, el nivel de IP-10 se incrementó sinérgicamente en el sobrenadante de MDM TPH-1 infectados por el VAI expuesto a SP (media: 30.589 ± 16.484 pg ml −1 ) en comparación con la infección única por el VAI (1.439 ± 566.5 pg ml −1 ) y la infección única por SP (4.472 ± 2.001 pg ml −1 ; P≤ 0.05; Fig. 2c ) a las 24 horas después de la infección. En esas células, la expresión IP-10 se redujo con el tiempo (48 a 72 horas), coincidiendo con una proporción significativamente mayor de células necróticas y apoptotóticas (fig. 1d). La expresión sinérgica del IP-10 se observó de manera similar a las 24 horas después de la infección utilizando MDM primarias (fig. 2d) No se observó una secreción significativamente mayor de las otras citoquinas y quimioquinas probadas después de la infección, incluso en MDMs infectados mixtos (Fig. S1 ). Curiosamente, se observó una producción significativa de IP-10 en sobrenadantes de células epiteliales primarias de la vía aérea humana (HAEC) infectadas mixtamente por VAI y SP en comparación con las infecciones únicas (Fig. 2e). Tomadas juntas, los resultados del análisis de ARNm y proteínas sugieren que la infección viral y bacteriana mixta de MDMs induce una respuesta proinflamatoria sinérgica relacionada con las vías de señalización tipo 1 del interferón y JAK-STAT, con IP-10 como firma de coinfección del VIA/SP. Entre todos los microARN analizados, miR-200a-3p fue el más Scientific RepoRts 6:38532 DOI: 10.1038/srep38532 sobreexpresado en la coinfección IAV/SP de MDMs humanos. En el resto de este estudio, decidimos investigar la interconexión entre la expresión miR-200a-3p y la respuesta inmune innata. La expresión miRNA-200a-3p endógena correlaciona con la inducción CXCL10 (IP-10) después de la infección mixta IAV y SP de MDMs humanos. Utilizando un ensayo específico de la sonda Taqman dirigido a miR-200a-3p, confirmamos una regulación significativa de miR-200a-3p después de la infección mixta IAV y SP de MDMs humanos (Fig. 3a). En este experimento, se observó una regulación más marcada de miR-200a-3p después de IAV+ SP en comparación con los resultados obtenidos previamente (Fig. 2b). Esta discrepancia se ha atribuido al uso de dos enfoques diferentes para cuantificar la expresión miR-200a-3p. El uso de un imprimador de transcripción inversa de tallo específico en la Fig. 3a permite una mejor sensibilidad de detección de miR-200a-3p en comparación con el tinte fluorescente no específico utilizado en la Fig. 2b. Como la tendencia general fue sugerente de una inducción sinérgica de miR-200a-3p en respuesta a la infección mixta (Fig. 3a), podemos hipotetizar el microRNA-200a-3p puede jugar un papel en la regulación de CXCL10 (IP-10), que también fue sinérgicamente regulado en MDMs infectados mixtos (fig 2c y d) y HAEC primario (los análisis estadísticos se realizaron utilizando ANOVA de dos vías con la prueba post-hoc de Tukey; *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001. RepoRts científicos 6:38532 DOI: 10.1038/srep38532 CXCL10 (Fig. 3d). Estos resultados sugieren que miR-200a-3p regula indirectamente CXCL10 y nos lleva a hipotetizar que miR-200a-3p controla un potencial represor de la vía de señalización JAK-STAT.. A las 18 h después de la transfección, los MDM fueron infectados por separado o mezclados como se describió anteriormente. A las 8 h post-IAV y/o infección SP, el mRNA total fue extraído y amplificado por Los valores representan la mediana ± IQR (a, c) o media ± SEM (d, e) de tres réplicas biológicas.Los análisis estadísticos se realizaron utilizando una prueba Kruskal-Wallis (no paramétrica, ANOVA unidireccional con la prueba post-hoc de Dunn) para los datos presentados en (a, c).Se utilizó una ANOVA bidireccional ordinaria (con la prueba de comparación múltiple post-hoc de Tukey) para los datos presentados en (d, e). *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001. MiRNA-200a-3p regula indirectamente la expresión IP-10 dirigiéndose a SOCS6. 2a, varios genes de la vía de señalización de JAK-STAT fueron desregulados en MDM humanos mixtos infectados por IAV y SP; por lo tanto, hipotetizamos que miR-200a-3p regula directamente un regulador de la vía de señalización de JAK-STAT. El análisis predictivo del objetivo indicó que el 3' UTR del supresor de la señal de citocina-6 (SOCS6) puede ser dirigido por miR-200a-3p (Fig. 3b). Las proteínas SOCS constituyen una clase de reguladores negativos de las vías de señalización de JAK-STAT que son inducidas por citoquinas y TLR señalización. MiRNA-200a-3p no fue predicho para apuntar a cualquiera de los otros seis miembros de la familia de genes SOCS. Transfección de MDMs humanos con SOCS MIM-200a regulados a la baja (FC = 0,57) mientras que la inhibición de miR-200a-3p (INH-200a) SOCS 6 regulados a la baja (FC = 1,55), confirmando que miR-200a-3p regula efectivamente la expresión de SOCS6 (Fig. 3e). Además, el SOCS6 fue regulado a la baja sinérgicamente en MDMs infectados por AVIA o AVIA/SP sobreexpresando miRNA-200a (Fig. 3e), sugiriendo que tanto la infección como el SOC-200a-3p regulan negativamente la expresión de SOCS6. Por último, Western blotting confirmó que la expresión de SOCS-6 se redujo bruscamente después de la infección, especialmente después de la infección mixta por AVIA Estos resultados indican que miR-200a-3p es fuertemente inducido en respuesta a la coinfección viral y bacteriana mixta, lo que a su vez conduce a la disminución de la regulación de la JAK-STAT SOCS-6 tanto en los niveles de ARNm y proteínas y posterior upregulation de IP-10. análisis demostraron infección mixta IAV y SP de MDMs humanos y HAEC inducido producción significativa de IP-10. Como leucocitos sanguíneos y células epiteliales del tracto respiratorio contribuyen activamente a la inflamación durante la neumonía, se hipotetiza que el nivel de IP-10 en el suero de paciente con neumonía puede ser tanto indicativo de infección respiratoria mixta y gravedad de la enfermedad. Como parte de un estudio prospectivo, hospitalario, multicéntrico de control de casos sobre la etiología de la neumonía en niños menores de 5 años, un total de 74 pacientes (44 hombres, 30 mujeres) fueron incluidos en esta evaluación piloto. De acuerdo con las directrices de la OMS, el análisis retrospectivo indicó que 44 (59,5%) niños tenían signos clínicos de neumonía no grave y 30 (40,5%) niños tenían signos de neumonía grave. Las principales características de los pacientes al momento de la inclusión se muestran en la Tabla 1. Los pacientes con neumonía grave presentaron episodios de disnea significativamente más registrados (P < 0,001), cianosis (P = 0,03), injerencia en el pecho inferior (P < 0,001), embolia a percusión (P < 0,001) y letargo (P < 0,001) durante el examen torácico que los pacientes con neumonía no grave. Además, las efusiones pleurales fueron significativamente más observadas entre los pacientes críticamente enfermos y la duración de la hospitalización fue significativamente mayor para los niños con neumonía grave que para aquellos con neumonía no grave (P = 0,0015). La evaluación de la respuesta inflamatoria sistémica de los 74 casos se muestra en la Tabla 2. Los niveles séricos de PCR, IP-10, PCT, G-CSF, IL-6, IL-8 y MIP-1β fueron significativamente más elevados en muestras séricas de pacientes críticamente enfermos. Los pacientes con neumonía grave tenían niveles séricos IP-10 significativamente más altos (4,2 veces) que aquellos con neumonía no grave (P < 0,001) sugiriendo IP-10 como marcador pronóstico prometedor en neumonía. Las medidas de precisión diagnóstica para predecir la gravedad de la neumonía utilizando biomarcadores basados en sangre se resumen en la Tabla S3. Brevemente, en este estudio, el valor óptimo de corte IP-10 para identificar paciente con neumonía grave fue de 4.240 pg ml-1, con un área bajo la curva característica operativa del receptor de 0,69 (IC 95%, 0,57 a 0,82, P < Definir como positivo un nivel de IP-10 sérico por encima de este corte resultó en una sensibilidad de 63,3%, especificidad de 63,6% y una relación de probabilidad positiva de 1,74. Los valores pronósticos de IP-10 se cerraron a procalcitonina (PCT; AUC = 0,70; IC 95%, 0,58 a 0,82, P < 0,001) e IL-6 (AUC = 0,70; IC 95%, 0,58-0,83; P < 0,001). Los exámenes multiples basados en PCR de muestras respiratorias y sanguíneas revelan una alta variedad de asociaciones de patógenos (Tabla 3). Se detectaron virus respiratorios en los aspirados nasales (NAs) de 63/74 pacientes (85,1%). Las bacterias etiológicas de la neumonía (S. pneumoniae, n = 19; S. aureus, n = 1; o H. influenzae tipo B, n = 7) fueron identificadas a través de PCR en tiempo real en las muestras sanguíneas de 27/74 (36,5 %) de los pacientes. Los ensayos multiplex de PCR permitieron la identificación de bacterias respiratorias en la sangre de 19 pacientes con resultados negativos en los cultivos sanguíneos.De los 74 casos PCR positivos para patógenos respiratorios, se detectó un único virus o bacteria en los pacientes de 7 (9,4%) y 3 (4,0%), respectivamente; estos casos 10/74 (13,5%) fueron definidos como el único grupo infectado. El grupo de infección mixta incluyó los 62/74 (83,8%) casos en los que (1) se identificaron múltiples virus y/o bacterias en NA (38/74; 51,3%) sin ninguna bacteria identificada en muestras de sangre o (2) uno o más virus y/o bacterias fueron identificados en NA y asociados con una bacteremia sanguínea (24/74; 32,4%). Se evaluó si el nivel sérico IP-10 podría correlacionarse con las etiologías virales y bacterianas de la neumonía. Los pacientes con infección mixta tuvieron un nivel sérico IP-10 significativamente mayor (3,6 veces) que el paciente con detección única (P = 0,03; Tabla 4 ). Un análisis estratificado revela que se observó el nivel sérico IP-10 más alto entre los pacientes con varios patógenos respiratorios identificados (grupo de detección mixta) y neumonía grave (14,427 pg ml −1, IQR (3,981-82,994). En detalle, se observó un notable nivel sérico IP-10 (142,531 pg ml −1 ), que representa 33 veces más alto valor de corte que predice la gravedad de la neumonía en el paciente con RVH en NA codetectado con S. pneumoniae (serotipo 14) en derrame pleural y sangre. De acuerdo con nuestro modelo in vitro de coinfección, se cuantificó un nivel IP-10 significativo (90,338 pg ml −1 ) en la muestra de sangre de paciente con neumonía neumocócica bacterémica grave (serotipo 14) con una codetección positiva del virus Influenza B en NA. Tomados conjuntamente, estos resultados sugieren que los niveles séricos elevados de IP-10 están significativamente asociados con la detección viral y bacteriana mixta y también relacionados con la patogénesis de la neumonía. Este estudio proporciona datos in vitro y clínicos adicionales para mejorar nuestra comprensión de la inmunopatología de la neumonía viral y bacteriana mixta (Fig. 4). El modelo in vitro de la gripe y la superinfección neumocócica de MDM humanos demostró que la liberación sinérgica de la quimioquina proinflamatoria IP-10 inducida por infección mixta, sugiere fuertemente RepoRts Científicos humanos 6:38532 DOI: 10.1038/srep38532 leucocitos en sangre contribuyen a la inmunopatología de la neumonía. Además, los análisis transcriptómicos y omics proporcionaron nuevos datos sobre las vías inflamatorias que se activan durante la infección mixta y están relacionados con la inducción sinérgica de la quimioquina proinflamatoria IP-10 en células infectadas mixtas. Nuestras observaciones son consistentes con un estudio reciente que describe la inducción IP-10 como firma host-proteoma de infecciones De los genes diferencialmente expresados observados en los MDMs infectados mixtos, los factores de transcripción STAT-1 e IRF-7 parecen jugar un papel crucial en la regulación de genes estimulados por interferón, incluyendo CXCL10 (IP-10). Al centrarse en los mecanismos intracelulares que regulan las vías inflamatorias, demostramos un papel novedoso para el miRNA-200a-3p en la regulación de CXCL10 (IP-10). Estas observaciones son consistentes con informes anteriores que muestran que la infección por el virus del ARN aumenta miR-155 en macrófagos y células dendríticas y también regula el supresor de la señal de citocina 1 (SOCS1), sugiriendo la existencia de una vía reguladora miRNA/JAK-STAT/SOCS durante la infección viral 29. Nuestro estudio sugiere que la co-infección conduce a la sobreexpresión de miR-200a-3p, que a su vez se dirige y desregula el regulador JAK-STAT SOCS-6 y, en consecuencia, aumenta la expresión CXCL10 (IP-10). Curiosamente, un enfoque complementario in-silico revela que varios microARNs que se encontraron disregulados en nuestros experimentos de co-infección IAV y SP de MDMs o HAEC, podrían dirigirse a varios genes de la familia SOCS y jugar un papel similar a miR-200a-3p. De hecho, miRNA-142-3p podría dirigirse a SOCS4, 5, 6 mRNA mientras que miRNA-194-5p podría dirigirse a SOCS2, 3, 4, 5 y 7 mRNA. Estas observaciones subrayan que la regulación intracelular de IP-10 no se limita a la contribución de un único microARN. Se produce una compleja interrelación entre numerosos microRNAs huésped e inhibidores de la vía de señalización JAK-STAT para controlar la respuesta inflamatoria innata del huésped frente a infecciones virales y/o bacterianas. Clínicamente, la mayoría de los casos de CAP pediátrica en este estudio se asociaron con detección positiva viral y/o bacteriana. Se detectaron microorganismos respiratorios en el 97% de los casos; 51,3% de los cuales fueron virales, virales, bacteriales o bacteriales codetectados sólo en aspirados nasales, 32,4% de los cuales fueron codetectados en aspirados nasales y muestras de sangre. Estos datos son consistentes con estudios etiológicos previos de CAP 3.31-33. S. pneumoniae fue la principal bacteria identificada en sangre (19/74; 25,7%) y principalmente codetectada con virus respiratorios en NAs (16/19; 84,2%). Se observó una gran diversidad de asociaciones virales y bacterianas en muestras biológicas de niños con neumonía. En comparación con la combinación IAV y SP14 evaluadas in-vitro, no hubo casos de neumonía por separado infectados por influenza y neumocococo, y no se ha observado una codetección similar con esos dos patógenos. Sin embargo, la combinación de Influenza B (IVB) fue identificada en 5 pacientes y dos de ellos tuvieron una codetección positiva de SP en sangre (una cepa no tipable y un serotipo 14 utilizando nuestra prueba de mecanografía molecular). La combinación IVB y SP14 parece ser la codetección de patógenos más cercana a la que se investigó in-vitro. Clínicamente, esta codetección se asoció con una expresión IP-10 muy alta y una definición de caso de neumonía muy severa. Curiosamente, nuestra evaluación piloto traslacional revela que Como la respuesta inmunitaria a cada patógeno es diferente, se necesitan más investigaciones in vitro utilizando diferentes asociaciones de patógenos para caracterizar mejor los mecanismos involucrados en la inmunopatología de la neumonía. En esta cohorte, se identificaron los niveles séricos más altos de IP-10 entre los pacientes con varios patógenos detectados y neumonía grave, lo que sugiere un papel significativo de IP-10 en la patogénesis de la neumonía. De hecho, se han notificado niveles plasmáticos elevados de IP-10 en pacientes con sepsis 12, y se asociaron con una alta tasa de mortalidad, especialmente entre los pacientes con CAP 34. Además, el eje IP-10-CXCR3 se ha relacionado con lesiones pulmonares inmunitarias agudas y apoptosis linfocítica durante el desarrollo de síndrome respiratorio agudo severo (SARS) 35, 36. Además, un estudio in vivo que modeló la gripe y la sobreinfección neumocócica en ratones indicó que las quimioquinas proinflamatorias, incluyendo IP-10, desempeñan un papel crucial en la susceptibilidad inducida por la gripe a la neutrofilia pulmonar, inmunopatología grave y mortalidad 37. En este estudio, se cuantificaron en la muestra sérica de un niño que murió, en el que se identificó S. pneumoniae (serotipo 9 V) en la sangre (PCR y cultivo sanguíneo) y se codetectó con Haemophilus influenzae tipo B en aspirado nasal, una relación entre la codetección, la elevación de la IP-10 sérica y la patogénesis de la neumonía. Es necesario reconocer varias limitaciones de este estudio experimental traslacional antes de concluir que la infección mixta está relacionada con la elevación de la IP-10 y la gravedad de la enfermedad. De hecho, aunque el derrame viral (por ejemplo, de VFC y VHB) es común en niños asintomáticos, no pudimos evaluar los niveles de inmunomoduladores en las muestras séricas de un grupo control. Además, aunque las muestras se recogieron dentro de las primeras 24 horas después del ingreso, sólo se procesó una muestra de sangre única para cada paciente. Por lo tanto, será necesario un estudio longitudinal más amplio sobre la etiología y la gravedad de la neumonía para confirmar estos resultados. En conclusión, los hallazgos actuales sugieren que las infecciones respiratorias mixtas e IP-10 pueden desempeñar papeles importantes e interconectados en la patogénesis de la neumonía. Clínicamente, la evaluación y el seguimiento del nivel sérico inducido IP-10 pueden ayudar a los médicos a mejorar el Los 10 ng ml −1 M-CSF (Miltenyi Biotec). THP− 1 MDM se obtuvieron mediante el cultivo de células con 10 ng ml -1 acetato de miristato de forbol (PMA; Invivogen, Toulouse, Francia) durante 72 horas. Las células epiteliales de las vías respiratorias humanas (HAEC, tipo de célula bronquial) originadas en una mujer de 54 años de edad sin patología reportada (número de lote MD056501) fueron proporcionadas por Mucilair (Epithelix, Ginebra, Suiza). La esterilidad, integridad tisular (TEER), la producción de mucosidad y la frecuencia de batir ciliares han sido certificadas por la empresa. Perfil de expresión genética. El mRNA total fue purificado utilizando el kit RNeasy (Qiagen, Hilden, Alemania La expresión de 84 genes involucrados en las respuestas inmunes innatas y adaptativas humanas se evaluó utilizando el perfilador RT 2 TM PCR Array (SAbiociencias) según las recomendaciones del fabricante. El método Δ Δ Ct se aplicó para calcular los cambios en la expresión génica de cada gen en relación con las células de control no infectadas utilizando el software de análisis de datos de perfil RT 2 PCR Array (SAbiociencias). Matriz de perfil de microRNA. Los microRNA celulares totales se purificaron utilizando el kit miRNeasy Mini (Qiagen) y se transcriben inversamente utilizando el kit de transcripción inversa miScript (Qiagen). El perfil de 84 miRNAs se realizó utilizando el kit de matriz de miRNA miRNA de Inmunopatología Humana (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los datos fueron analizados utilizando el portal web de análisis de datos de miRNA miRNA de miScript. En la predicción de objetivo de miRNA de silico se recuperaron y compilaron genes objetivo de miRNA usando TargetScan 38 y recurso microRNA.org 39. Las interacciones entre miRNAs y vías intracelulares fueron predichas usando DIANA-miRPath v2.0 40. Los MDM de THP-1 fueron sembrados en placas de 24 pozos (0,5 × 10 6 por pozo) por triplicado, expuestos al virus H1N1 de Influenza A (A/Islas Salomón/3/2006) bajo condiciones libres de suero durante 1 hora y luego cultiva Se añadió el serotipo 14 de Streptococcus pneumoniae (SP) a las 4 horas después de la infección por el VAI. Gentamicina (10 μ g ml −1 ) se añadió 2 horas después de la infección por el VSP (es decir, 6 horas después de la infección por la gripe) y se mantuvo en los medios de cultivo durante todo el experimento para matar bacterias extracelulares y limitar el crecimiento bacteriano. La viabilidad celular se determinó mediante la citometría de flujo utilizando el kit de detección de apoptosis FITC/Anexina V (BD Biosciences), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. #4427975). En este ensayo, los cambios de pliegues se han definido mediante el método Δ Δ Ct utilizando el control RNU-44 y -48 como microARNs de referencia. El ARNm total se purificó a partir de MDM transfectados e infectados utilizando el kit RNeasy (Qiagen) y se utilizaron imprimaciones específicas para amplificar el factor de crecimiento transformador beta-2 (TGFB2; F: 5′ -CCATCCGCCCACTTTCTAC-3′, R: 5′ -AGCTCAATCCGTTGTTCAGGC-3′ ), SOCS6 (F: 5′ -AAGAATCATCCCTTTGGAGTAAC-3′, R: 5′ -CAGACTGGAGGTGGAA-3′ ) 41 43, y 3) ausencia de sibilancia en la auscultación, y 4) primeros síntomas que aparecieron en los últimos 14 días, y 5) confirmación radiológica de neumonía según las directrices de la OMS 44. Con base en estos criterios primarios que definen los casos de neumonía, los 74 casos fueron reevaluados retrospectivamente de acuerdo con el "Pocket book of hospital care for children" de la OMS 45 criterios para evaluar la gravedad de la neumonía. Los casos que murieron durante el estudio, o que tuvieron al menos un signo clínico adicional incluyendo cianosis central, embotamiento a la percusión durante el examen torácico, postración/letargo, derrame pleural observado en la radiografía torácica fueron incluidos retrospectivamente en el grupo de neumonía grave. Los pacientes sin ninguno de estos signos clínicos adicionales fueron incluidos en el grupo de neumonía no grave. Tabla 4. Los valores de IP-10 se expresan en pg ml -1. Las diferencias de concentración IP-10 entre los grupos fueron comparadas mediante pruebas de Mann-Whitney no pareadas; cambios significativos (P < 0,05) son en negri A partir de muestras de sangre completa se obtuvieron muestras de Nasofaringe Aspirados (NAs) y sangre completa de niños dentro de las 24 horas siguientes al ingreso. Se utilizaron muestras de sangre completa para recuentos sanguíneos completos, cultivos sanguíneos y PCR multiplex en tiempo real para identificar Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae y Haemophilus influenzae tipo B 46. Se definieron serotipos de S. pneumoniae utilizando un ensayo de PCR multiplex en tiempo real dirigido a los 40 serotipos o serogrupos representados con mayor frecuencia según el protocolo desarrollado por Messaoudi y otros 47. Se utilizó PCR multiplex no cuantitativo en tiempo real (Fast-Track Diagnostic, Sliema, Malta) para detectar 19 virus y cinco bacterias en las muestras respiratorias (NAs y derrames pleurales).Se definió la detección mixta como 1) PCR positivo para múltiples virus en NAs, 2) cultivo sanguíneo positivo o PCR positivo para múltiples bacterias en sangre o 3) PCR positivo para uno o múltiples virus en NAs y una o múltiples bacterias en sangre (identificado por PCR y cultivo sanguíneo).Aprobación ética.El protocolo del estudio, declaración de consentimiento informado, formulario de investigación clínica, cualquier modificación y todos los demás documentos del estudio fueron presentados y aprobados por el Comité Ético del Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud, la Universidad Nacional de Asunción (IICS-UNA) y el Hospital Pediátrico Niños de Acosta Ñu. La investigación clínica se realizó de acuerdo con los principios expresados en la Declaración de Helsinki. Análisis estadístico. Se utilizó la prueba de Chi-cuadrado y la prueba exacta de Fisher para comparar variables categóricas; se compararon variables continuas y datos no distribuidos normalmente utilizando la prueba U de Mann-Whitney; se compararon datos normalmente distribuidos utilizando pruebas t sin emparejar. Se realizaron análisis comparativos entre condiciones experimentales (es decir, MOCK, IAV, SP o IAV + SP) utilizando ANOVA de una vía con la prueba posthoc de Tukey o el análisis de Kruskal-Wallis con las pruebas posthoc de Dunn. Se utilizó el análisis de la curva operativa del receptor (ROC) para determinar el valor óptimo de corte para IP-10 para diferenciar entre los casos de neumonía no grave y grave. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism (La Jolla, California, Estados Unidos).

¿Qué sugiere que la IP-10 juega un papel significativo en la patogénesis de la neumonía?

La actividad bacteriana de 4- y 5-Chloro-2-hidroxi-N-[1-oxo-1-(fenilamino)alkan-2-il]benzamidas frente a MRSAhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4321674/SHA: f0e6cef57dbae030aea2f324e21e00945ac659cfAutores: Zadrazilova, Iveta; Pospisilova, Sarka; Pauk, Karel; Imramovsky, Ales; Vinsova, Jarmila; Cizek, Alois; Jampilek, JosefFecha: 2015-01-15DOI: 10.1155/2015/349534Licencia: cc-byAbstract: Una serie de nueve aislados clínicos de 2-hidroxi La concentración bactericida mínima se determinó mediante la subcultura de alícuotas desde la determinación del CMI hasta las placas de agar libres de sustancia. La cinética bactericida de los compuestos 5-cloro-2-hidroxi-N-[(2S)-3-metil-1-oxo-1-{[4-(trifluorometil)fenil]amino}butan-2-il]benzamida (1f), N-{(2S)-1-[(4-bromofenil)amino]-3-metil-1-oxobutan-2-il}-4-cloro-2-hidroxibenzamida (1g), y 4-cloro-N-{2S)-1-[(3,4-diclorofenil)amino]-3-metil-1-oxobutan-2-il}-2-hidroxibenzamida (1h) se estableció mediante un ensayo de determinación del tiempo con una concentración final del compuesto igual a 1x, 2x y 4x MIC; los alícumos se eliminaron en 0, 4, 6, 8 y 24 h. El agente bactericida más potente fue el compuesto 1f con un notable efecto bactericida rápido dependiente de la concentración, incluso a 2 veces MIC a 4, 6 y 8 h (con una reducción en el recuento bacteriano que va de 3,08 a 3,75 log(10) UFC/ml) y a 4 veces MIC a 4, 6, 8 y 24 h (5,30 log(10) UFC/ml reducción en el recuento bacteriano) después de la incubación frente a MRSA 637118. El efecto bactericida fiable frente a otras cepas se mantuvo a 4 veces MIC a 24 h.Texto: La resistencia antibiótica de patógenos invasores se ha convertido en uno de los problemas de salud más difíciles y persistentes [1]. Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA) se ha convertido en el patógeno multirresistente clínicamente más común [2] La prevalencia del MRSA está aumentando en todo el mundo y, según la información más reciente del Centro Europeo para la Prevención y el Control de Enfermedades a partir de 2012 [4], puede considerarse alarmante en algunos países europeos, especialmente en Portugal y Rumanía, donde ≥50% de todos los aislados de S. aureus de infecciones invasivas fueron identificados como MRSA en 2012 (aunque, por ejemplo, en Rumanía la prevalencia del MRSA fue de 25-50% en 2010), seguido por Italia, Grecia y Polonia, con 25-50% de aislados de MRSA en 2012 (para comparación, en Polonia, los aislados de MRSA constituyeron 10-25% de todos los aislados de S. aureus en 2010). El fracaso del tratamiento de la vancomicina, el agente terapéutico anti-MRSA de elección, debido a las cepas con valores elevados de concentración mínima inhibitoria de vancomicina (MIC) (es decir, la concentración más baja de un antimicrobiano que inhibirá el crecimiento visible de un microorganismo) dentro del rango susceptible se describió previamente [5, 6]. Así, la aparición de MRSA (y S. aureus resistente a la vancomicina en los últimos años también [7] ) hace que el descubrimiento de nuevos andamios moleculares sea una prioridad, y la situación actual incluso requiere la reingeniería y reposicionamiento de algunas antiguas familias de fármacos para lograr un control adecuado de estas bacterias [8]. Sin embargo, para el tratamiento de las infecciones del torrente sanguíneo de S. aureus, los agentes antimicrobianos bactericidas se consideran superiores a los medicamentos La historia del uso clínico de salicilanilidas (2-hidroxi-N-fenilbenzamidas) se remonta a la década de 1940 en terapia de la capitis tinea, seguida por el descubrimiento de sus propiedades antihelmínticas a mediados de la década de 1950 [10]. Hoy en día, las salicilanilidas (SAL) son una clase de compuestos aromáticos que poseen una amplia gama de interesantes actividades farmacológicas, como la antihelmíntica [11], la antibacteriana [12, 13], la antimicobacteriana [13], la antifúngica [14] y la antiviral [15, 16], entre otras. A pesar de ser estudiada desde la década de 1960, el mecanismo de acción responsable de las actividades biológicas de estos compuestos no se ha explicado hasta ahora. Los últimos estudios los especificaron también como inhibidores selectivos de la producción de interleucina-12p40 que desempeña un papel específico en la iniciación, expansión y control de la respuesta celular a la tuberculosis [18]. Además, las salicilanilidas han sido reconocidas como inhibidores de algunas enzimas bacterianas, como sortasa A de S. aureus [19], d-alanina-d-alanina ligasa [20], o transglicosilasas de S. aureus (pero no de M. tuberculosis) [12]. Estas enzimas participan en la secreción de diversas proteínas o en la biosíntesis de la pared celular bacteriana. Recientemente, los derivados similares a salicilanilidas fueron descritos para inhibir dos enzimas esenciales para la micobacteria: (i) metionina aminopeptidasa, catalizando un paso clave de la modificación posttranslacional de las proteínas nacientes, y (ii) isocitrato liasa, que es esencial para el metabolismo de los ácidos grasos [21]. Así, las SAL parecen ser candidatos prometedores para el desarrollo de nuevos agentes antibacterianos con un nuevo mecanismo de acción. Estos nuevos agentes podrían ser una solución a los desafíos de resistencia. Este estudio es un documento de seguimiento de un artículo publicado recientemente [13]. La síntesis de la serie de nuevos derivados de salicilamidas, 4 y 5-cloro-2-hidroxi-N-[1-oxo-1-(fenilamino)alkan-2-il]benzamidas, llamadas diamidas debido a su esqueleto (para la estructura general ver Tabla 1 ), fue descrita previamente [13, 22], y se reportaron sus actividades antimicobacterianas y antibacterianas contra diversas especies bacterianas [13]. Como estos compuestos expresaron una actividad antibacteriana muy significativa con bajos valores de CMI frente a aislados clínicos de MRSA como representantes de bacterias multirresistentes, decidimos ampliar el conocimiento sobre las propiedades antibacterianas de estos compuestos frente a MRSA. El objetivo del presente estudio fue evaluar la actividad bactericida in vitro global de nueve diamidas recientemente sintetizadas en dependencia del tiempo y de la concentración frente a aislados clínicos de MRSA como representantes de bacterias multirresistentes, siendo el primer estudio que se refiere a la evaluación de las características microbiológicas nuevas de los análogos de SAL y revelando su efecto bactericida. La vía sintética de la serie de nuevas diamidas fue descrita recientemente [13, 22] y sus estructuras (véase el cuadro 1) fueron confirmadas por la espectrometría IR, NMR y MS, y la pureza de los compuestos fue verificada por el análisis CHN [13, 22]. [27] ; y MRSA SA 3202 [27] (Instituto Nacional de Salud Pública, Praga, República Checa) ambos de origen humano. Las colonias sospechadas fueron confirmadas por PCR; se detectó un fragmento de 108 pb específico para S. aureus [28]. Todos los aislados fueron probados para la presencia del gen mecA que codificaba la resistencia a la meticilina [29]. Estos tres aislados clínicos fueron clasificados como vancomicina-susceptible (pero con un CMI más alto de vancomicina igual a 2 g/ml (VA2-MRSA) dentro del rango susceptible para MRSA 63718) meticilina-resistente S. aureus (VS-MRSA). Para los CMI de vancomicina, ver Tabla 1. Vancomicina-susceptible meticilina-susceptible Staphylococcus aureus (VS-MSSA) ATCC 29213, obtenido de la American Type Culture Collection, se utilizó como cepa Las bacterias fueron almacenadas en −80oC y se mantuvieron en placas de agar de sangre (base de agar de Columbia con 5% de sangre de ovino) entre experimentos. (MBCs) Los MBCs (es decir, las concentraciones más bajas de agentes antibacterianos requeridas para matar una bacteria particular) fueron determinados subculturbando alícuotas (20 L) de pozos sin crecimiento bacteriano visible y de pozos de control de la determinación del MIC en placas de agar de Mueller-Hinton (MHA) libres de sustancia. Las placas fueron incubadas aeróbicamente a 37oC durante 24 horas para el recuento de colonias. El MBC se definió como la concentración más baja de sustancia, que produjo ≥99,9% de muerte Tabla 1 : Estructuras químicas y valores in vitro de MIC y MBC [ g/mL] de 5 y 4-cloro-2-hidroxi-N-[1-oxo-1-(fenilamino)alkan-2-il]benzamidas probadas (efecto bacterial de compuestos individuales frente a cepas particulares marcadas en negrita). después de 24 h de incubación en comparación con el recuento de colonias del inóculo inicial [30]. Para garantizar la reproducibilidad, cada ensayo de MBC se realizó por lo menos triplicado en ocasiones separadas. N H O H N O OH 1 2 R 1 R 3 R 2 Comp. R 1 R 2 3 MIC [ g/mL] MBC [ g/mL] 1 2 3 4 2 3 4 1a 5-Cl 4-CH 3 (S)-CH 3 >256 >256 >256 >256 128 >256 1c 5-Cl 4-CH 3 (S)-bencil >256 >256 >256 >256 >256 >256 -256 1d 5-CH 3 (R)-CH 2 -indolyl >256 >256 >256 >256 >256 >4-C -256 1e 5-Cl 4 (S) 4 (S) 1 CH 3 256 356 >1 556 >456 >456 >1 5-C Brevemente, los frascos que contienen caldo fresco estéril Mueller-Hinton (MHB) con el agente antimicrobiano apropiado fueron inoculados con el organismo de ensayo en fase de crecimiento logarítmico para obtener el inóculo inicial con una concentración de aproximadamente 7,5 × 10 6 UFC/ml (las concentraciones reales de inóculo oscilaron entre 0,9 × 10 5 y 2,9 × 10 6 UFC/ml) y una concentración final del antibiótico igual a 1x, 2x y 4x MIC en volumen de 10 ml. Para la determinación de los recuentos viables, se eliminaron alícuotas en 0, 4, 6, 8 y 24 h puntos de tiempo después de la inoculación, se diluyeron en serie en solución salina estéril tamponada, y se plasmó alícuota (20 L) en placas MHA en duplicado. Se realizaron recuentos El transporte antimicrobiano fue controlado por dilución e inspección visual de la distribución de colonias en las placas con la observación de una posible inhibición del crecimiento en el sitio de las rayas iniciales. Las placas fueron incubadas a 37oC durante 24 a 48 horas, y se determinó el número de colonias. Para asegurar la reproducibilidad, cada experimento de matar el tiempo se realizó en duplicado en ocasiones separadas con resultados presentados como la media de todos los experimentos. El control del crecimiento sin la adición de agentes antimicrobianos y el control conteniendo DMSO sin ningún agente antimicrobiano para excluir la actividad antibacteriana de este disolvente fueron incluidos. Se construyeron curvas de habilidad del tiempo trazando el registro 10 UFC por mililitro versus tiempo (más de 24 h), y se determinó el cambio en la concentración bacteriana. Los resultados fueron analizados evaluando el número de cepas que produjeron valores de Δ(log 10 UFC/ml) de −1 (correspondiente al 90% de muerte), −2 (99% de muerte) y −3 (99,9% de muerte) a 4, 6, 8 y 24 h en comparación con los recuentos a 0 h. La actividad bactericida se definió como una reducción de al menos 99,9% (≥3 log 10 ) del recuento total de UFC/ml en el inóculo original. Las diamidas parecen ser candidatos prometedores para agentes antibacterianos con una actividad anti-MRSA muy fuerte, como se publicó recientemente [13]. En el presente estudio se evaluó la serie de nueve diamidas recientemente sintetizadas como agentes bactericidas prospectivos frente a los representantes de bacterias multirresistentes, tres aislados clínicos de MRSA y Staphylococcus aureus ATCC 29213 (meticilina-sosceptible) como cepa de referencia y control de calidad, ya que las SAL y sus análogos se conocen como compuestos con efecto bacteriostático [31], este es el primer estudio en el que se consideraron compuestos similares a las SAL como agentes bactericidas prospectivos y se evaluó la dependencia del efecto bactericida de estos compuestos en el tiempo y la concentración, por lo que se revelaron características microbiológicas absolutamente novedosas de estos compuestos en el presente estudio. Recientemente se publicaron valores MIC de diamidas expresados como concentraciones molares en mol/L [13]. Para permitir la comparación con los valores de MBC del presente estudio, se calcularon los MIC en g/ml y se registraron en la Tabla 1 junto con la actividad de los fármacos antibacterianos de referencia, ampicilina, ciprofloxacino y vancomicina. La actividad bactericida potencial de las diamidas se evaluó utilizando el ensayo de MBC [26]. Los valores de MBC de todos los compuestos probados también se registran en la Tabla 1. Basándose en los resultados obtenidos, todos los compuestos evaluados como activos según los valores de MIC de nuestro estudio anterior (1f-i) mostraron valores de MBC bajos o moderados frente a las cuatro cepas. Los valores de MBC de estos compuestos no superaron la concentración de fármaco más alta probada y variaron de 1 a 16 g/ml. En todos los casos, hubo valores comparables de MBC para los aislados clínicos de MRSA y La actividad bactericida se define como una relación de MBC a MIC de ≤4 [32]. La tabla 1 se expresa en negrita. Como se mencionó anteriormente, se sabe que las sales de sal presentan un efecto bacteriostático [31], por lo que fue muy interesante descubrir que las diamidas poseen actividad bactericida. El enlace amida (-CONH-) puede causar interacciones con una variedad de enzimas [33] ; por lo tanto, la presencia de dos enlaces amidas podría ser responsable del efecto bactericida de las diamidas contra el MRSA. La actividad de las sales de sal y sus análogos resulta de múltiples mecanismos, que todavía están en investigación; por ejemplo, se encontró que las sales de sal son capaces de inhibir las transglucosilasas en etapas posteriores de la biosíntesis de pared celular de S. aureus (incluyendo MRSA Estas enzimas catalizan el paso previo a la transpeptidación en la biosíntesis del peptidoglicano y son responsables de la polimerización del lípido II, que ocurre en la cara externa de la membrana [12]. Dado que los agentes antibacterianos dirigidos a la biosíntesis de la pared celular actúan como agentes bactericidas [30, 34], el fallo en la biosíntesis de la pared celular debido a la inhibición de las transglicosilasas podría ser responsable de la actividad bactericida de las diamidas frente al MRSA. Basándose en estos hallazgos, las diamidas activas antibacterianas con efecto bactericida frente a las cuatro cepas probadas como agentes bactericidas prospectivos fueron seleccionadas para estudios de curva timehabilidad posteriores para determinar la dependencia real del efecto bactericida de la concentración a lo largo del tiempo. 1-oxobutan-2-il}-2-hidroxibenzamida (1h) se probaron en estudios de time-kill a 1x, 2x y 4x MIC frente a todos los aislados de MRSA y la cepa de referencia S. aureus. El efecto antibacteriano de DMSO [35] utilizado como disolvente de los compuestos probados se excluyó en este ensayo, ya que las curvas de time-kill de este disolvente eran idénticas o muy similares a las del control de crecimiento. El grado de muerte bacteriana se estimó por el número de estas cepas que mostraban una disminución de 1 a 3 log 10 UFC/ml en el recuento celular viable en diferentes momentos después de la incubación. Se presenta un resumen de estos datos en la Tabla 2. Basándose en estos datos se puede concluir que la potencia bactericida de las diamidas probadas contra las cuatro cepas disminuyó No se observó actividad bactericida (es decir, disminución de ≥3 log 10 UFC/ml) a 1x MIC para ninguna cepa y tiempo después de la incubación ensayada. A 4x MIC de las cuatro cepas, los compuestos 1f, 1g y 1h mataron 2, 1, y 2 cepas, respectivamente, a 8 h después de la incubación y 4, 2 y 2 cepas, respectivamente, a 24 h después de la incubación. Los hallazgos de estudios de time-kill para cada una de las cuatro cepas de estafilococos en exposición a los compuestos 1f, 1g y 1h se resumen en la Tabla 3. La actividad bactericida (es decir, disminución de ≥3 log 10 UFC/ml) se expresa en negrita. El tiempo no fue el factor predictivo que influyó en la actividad antibacteriana porque las diferencias logarítmicas en la UFC/ml desde el inóculo inicial fueron las mismas para 4 veces CMI (con la mayor eficiencia con una reducción en el recuento bacteriano de 5,30 log 10 UFC/ml) o muy similares para 2 veces CMI (con un crecimiento moderado después de 24 h causando una pérdida de actividad bactericida) a lo largo de 24 h. El efecto bactericida se mantuvo incluso a 2 veces CMI a las 4 h después de la incubación de esta cepa (reducción de 3,08 log 10 UFC/ml). Para las cepas restantes, se registraron aislados clínicos de MRSA SA 630, MRSA SA 3202 y S. aureus ATCC 29213, efecto bactericida fiable a 4x MIC a las 24 h después de la incubación para todas estas cepas con una reducción del recuento bacteriano de 3,22, 3,30 y 3,65 log 10 UFC/mL, respectivamente. Para el efecto bactericida compuesto 1g frente a MRSA 63718, se observó 2x MIC a las 6 y 8 h después de la incubación y 4x MIC a las 4, 6 y 8 h después de la incubación con una reducción del recuento bacteriano de 3,10 a 3,58 log 10 UFC/mL. La muerte más eficaz se logró a 6 h para ambas concentraciones. Como en el caso del compuesto 1f, se observó un recrecimiento después de 24 h después Para los aislados restantes de MRSA, SA 630 y SA 3202, el efecto bactericida se produjo sólo a 4 veces MIC a las 24 h después de la incubación con una reducción del recuento bacteriano de 3,38 y 4,01 log 10 UFC/ml, respectivamente. El efecto bactericida más alto se registró para MRSA SA 3202 a 4 veces MIC a las 24 h después de la incubación. Se observó una reducción consistente con el efecto bacteriostático (0,03 a 2,37 log 10 UFC/ml) en otras concentraciones a lo largo del tiempo para ambos aislados. No se observó ningún efecto bactericida para la cepa de referencia de S. aureus; el compuesto 1g demostró un patrón de actividad bacteriostática frente a esta cepa con una reducción del recuento bacteriano de 0,07 a 2,33 log 10 UFC/ml a 4 veces MIC En otros casos, se observó un ligero aumento de los recuentos bacterianos (es decir, sobrecrecimiento) en comparación con el inóculo inicial, con valores que oscilaban entre 0,10 y 1,57 log 10 UFC/ml para esta cepa de referencia. Para el efecto bactericida 1h compuesto frente a MRSA 63718 se mantuvo a 4 veces MIC a 6 y 8 horas después de la incubación con una reducción del recuento bacteriano de 3,54 y 3,31 log 10 UFC/ml, respectivamente. Al igual que para 1 g, el efecto bactericida más potente se mantuvo a 6 horas después de la incubación. El recrecimiento a 24 horas después de la incubación se registró una pérdida de actividad bactericida similar a la de compuestos anteriores. Lo más probable es que la selección de mutantes resistentes sea responsable de este fenómeno [30] ; no se asume la degradación del fármaco en el medio de crecimiento, ya que el rebrote fue Número de cepas que mostraron el siguiente log 10 UFC/ml disminución a en el tiempo de incubación designado no observado para ninguna otra cepa probada. Para MRSA SA 630 la muerte dependiente de la concentración se registró en 4x MIC a las 6, 8 y 24 h después de la incubación con el log 10 diferencias en UFC/ml desde que el inóculo inicial fue muy similar con el tiempo (de 3,18 a 3,39 log 10 UFC/ml). Para MRSA SA 3202 el efecto bactericida confiable se mantuvo sólo a las 4x MIC a las 24 h después de la incubación con una reducción en el recuento bacterial de 3,02 log 10 UFC/ml. En cuanto al compuesto 1g, se observó actividad bacteriostática frente a la cepa de referencia S. aureus con una reducción del recuento bacteriano que variaba de 0,34 a 2,62 log 10 UFC/ml a 2x y 4x MIC. Se registró sobrecrecimiento (valores que van de 0,04 a 1,43 log 10 UFC/ml) a 1x MIC para esta cepa. Es de notar que en todas las cepas de estafilococos con similares MICs y MBCs para compuestos 1g y 1h la respuesta a la actividad antibacteriana de estos compuestos variaba con cepas clínicas de MRSA siendo eficazmente eliminadas y la cepa de referencia que no se ve afectada a 4x MIC. Existe una discrepancia entre los resultados bactericidas del ensayo de MBC en comparación con la cinética del tiempo-kill. Esta diferencia podría ser causada por la comparación de microtiter (ensayo de MBC) con diluciones de macrobrotes (ensayo de matar el tiempo) [36]. Por otra parte, aunque los ensayos de matar el tiempo son más intensivos en el trabajo y consumen más tiempo que los ensayos de MBC, se reconoce que proporcionan un mayor grado de caracterización del potencial de erradicación celular de los agentes antibacterianos [37]. En cuanto al efecto antibacteriano, no es generalmente importante si el agente antibacteriano es también bactericida a concentraciones más altas, porque la inhibición de la proliferación bacteriana generalmente logra un efecto terapéutico; el sistema inmunitario del paciente es capaz de hacer frente a la infección entonces [34]. Sin embargo, la terapia bactericida podría producir un mejor resultado en el tratamiento mediante una rápida reducción de la carga bacteriana [38]. Los agentes bactericidas están inequívocamente indicados. Teniendo en cuenta el aumento constante del número de pacientes inmunocomprometidos con endocarditis, meningitis o osteomielitis en los últimos años, es necesario lograr la muerte bacteriana y ampliar el espectro de agentes antimicrobianos con compuestos activos bactericidas [30]. El resultado clínico de la bacteriemia por MRSA está influenciado significativamente por vancomicina MIC. El fracaso del tratamiento superior al 60% para S. aureus con vancomicina MIC de 4 g/ml dio lugar al cambio del punto de ruptura de susceptibilidad de 4 g/ml a 2 g/ml por el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) en 2006 [23] así como por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) en 2008 [39]. Se ha recomendado que para las infecciones causadas por cepas de MRSA con niveles elevados de vancomicina MICs (2 g/mL), se considere tratamiento alternativo [40]. Cabe señalar que, en base a los ensayos de determinación del tiempo realizados en el presente estudio, todas las diamidas probadas (particularmente las compuestas 1f que presentaban un efecto rápido dependiente de la concentración bactericida incluso a 2 veces MIC) fueron más eficaces frente al MRSA aislado 63718, que es la cepa con un valor elevado de vancomicina MIC de 2 g/mL. La actividad frente a los aislamientos restantes con un valor de vancomicina MIC de 1 g/mL fue menor. Teniendo en cuenta la aparición de una susceptibilidad decreciente de vancomicina de los aislados de MRSA y, por tanto, la eficacia terapéutica del tratamiento con vancomicina, nuestro A partir de los resultados obtenidos, las diamidas pueden ser candidatas idóneas para estos compuestos activos bactericidas novedosos, presentando un prometedor punto de partida para futuras investigaciones para determinar la actividad real in vivo y el mecanismo exacto de acción. El presente estudio es la primera evidencia del efecto bactericida de los análogos de la SAL. Contra otras cepas, el efecto bactericida confiable se mantuvo en 4x MIC a las 24 h después de la incubación. Teniendo en cuenta la necesidad de ampliar el espectro de agentes bactericidas, las diamidas del presente estudio con un nuevo mecanismo de acción podrían presentar una solución muy prometedora e interesante a este desafío para el futuro.

¿Cuál es el patógeno multirresistente más común y clínicamente relevante tanto en la atención médica como en las infecciones adquiridas en la comunidad?

La actividad bacteriana de 4- y 5-Chloro-2-hidroxi-N-[1-oxo-1-(fenilamino)alkan-2-il]benzamidas frente a MRSAhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4321674/SHA: f0e6cef57dbae030aea2f324e21e00945ac659cfAutores: Zadrazilova, Iveta; Pospisilova, Sarka; Pauk, Karel; Imramovsky, Ales; Vinsova, Jarmila; Cizek, Alois; Jampilek, JosefFecha: 2015-01-15DOI: 10.1155/2015/349534Licencia: cc-byAbstract: Una serie de nueve aislados clínicos de 2-hidroxi La concentración bactericida mínima se determinó mediante la subcultura de alícuotas desde la determinación del CMI hasta las placas de agar libres de sustancia. La cinética bactericida de los compuestos 5-cloro-2-hidroxi-N-[(2S)-3-metil-1-oxo-1-{[4-(trifluorometil)fenil]amino}butan-2-il]benzamida (1f), N-{(2S)-1-[(4-bromofenil)amino]-3-metil-1-oxobutan-2-il}-4-cloro-2-hidroxibenzamida (1g), y 4-cloro-N-{2S)-1-[(3,4-diclorofenil)amino]-3-metil-1-oxobutan-2-il}-2-hidroxibenzamida (1h) se estableció mediante un ensayo de determinación del tiempo con una concentración final del compuesto igual a 1x, 2x y 4x MIC; los alícumos se eliminaron en 0, 4, 6, 8 y 24 h. El agente bactericida más potente fue el compuesto 1f con un notable efecto bactericida rápido dependiente de la concentración, incluso a 2 veces MIC a 4, 6 y 8 h (con una reducción en el recuento bacteriano que va de 3,08 a 3,75 log(10) UFC/ml) y a 4 veces MIC a 4, 6, 8 y 24 h (5,30 log(10) UFC/ml reducción en el recuento bacteriano) después de la incubación frente a MRSA 637118. El efecto bactericida fiable frente a otras cepas se mantuvo a 4 veces MIC a 24 h.Texto: La resistencia antibiótica de patógenos invasores se ha convertido en uno de los problemas de salud más difíciles y persistentes [1]. Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA) se ha convertido en el patógeno multirresistente clínicamente más común [2] La prevalencia del MRSA está aumentando en todo el mundo y, según la información más reciente del Centro Europeo para la Prevención y el Control de Enfermedades a partir de 2012 [4], puede considerarse alarmante en algunos países europeos, especialmente en Portugal y Rumanía, donde ≥50% de todos los aislados de S. aureus de infecciones invasivas fueron identificados como MRSA en 2012 (aunque, por ejemplo, en Rumanía la prevalencia del MRSA fue de 25-50% en 2010), seguido por Italia, Grecia y Polonia, con 25-50% de aislados de MRSA en 2012 (para comparación, en Polonia, los aislados de MRSA constituyeron 10-25% de todos los aislados de S. aureus en 2010). El fracaso del tratamiento de la vancomicina, el agente terapéutico anti-MRSA de elección, debido a las cepas con valores elevados de concentración mínima inhibitoria de vancomicina (MIC) (es decir, la concentración más baja de un antimicrobiano que inhibirá el crecimiento visible de un microorganismo) dentro del rango susceptible se describió previamente [5, 6]. Así, la aparición de MRSA (y S. aureus resistente a la vancomicina en los últimos años también [7] ) hace que el descubrimiento de nuevos andamios moleculares sea una prioridad, y la situación actual incluso requiere la reingeniería y reposicionamiento de algunas antiguas familias de fármacos para lograr un control adecuado de estas bacterias [8]. Sin embargo, para el tratamiento de las infecciones del torrente sanguíneo de S. aureus, los agentes antimicrobianos bactericidas se consideran superiores a los medicamentos La historia del uso clínico de salicilanilidas (2-hidroxi-N-fenilbenzamidas) se remonta a la década de 1940 en terapia de la capitis tinea, seguida por el descubrimiento de sus propiedades antihelmínticas a mediados de la década de 1950 [10]. Hoy en día, las salicilanilidas (SAL) son una clase de compuestos aromáticos que poseen una amplia gama de interesantes actividades farmacológicas, como la antihelmíntica [11], la antibacteriana [12, 13], la antimicobacteriana [13], la antifúngica [14] y la antiviral [15, 16], entre otras. A pesar de ser estudiada desde la década de 1960, el mecanismo de acción responsable de las actividades biológicas de estos compuestos no se ha explicado hasta ahora. Los últimos estudios los especificaron también como inhibidores selectivos de la producción de interleucina-12p40 que desempeña un papel específico en la iniciación, expansión y control de la respuesta celular a la tuberculosis [18]. Además, las salicilanilidas han sido reconocidas como inhibidores de algunas enzimas bacterianas, como sortasa A de S. aureus [19], d-alanina-d-alanina ligasa [20], o transglicosilasas de S. aureus (pero no de M. tuberculosis) [12]. Estas enzimas participan en la secreción de diversas proteínas o en la biosíntesis de la pared celular bacteriana. Recientemente, los derivados similares a salicilanilidas fueron descritos para inhibir dos enzimas esenciales para la micobacteria: (i) metionina aminopeptidasa, catalizando un paso clave de la modificación posttranslacional de las proteínas nacientes, y (ii) isocitrato liasa, que es esencial para el metabolismo de los ácidos grasos [21]. Así, las SAL parecen ser candidatos prometedores para el desarrollo de nuevos agentes antibacterianos con un nuevo mecanismo de acción. Estos nuevos agentes podrían ser una solución a los desafíos de resistencia. Este estudio es un documento de seguimiento de un artículo publicado recientemente [13]. La síntesis de la serie de nuevos derivados de salicilamidas, 4 y 5-cloro-2-hidroxi-N-[1-oxo-1-(fenilamino)alkan-2-il]benzamidas, llamadas diamidas debido a su esqueleto (para la estructura general ver Tabla 1 ), fue descrita previamente [13, 22], y se reportaron sus actividades antimicobacterianas y antibacterianas contra diversas especies bacterianas [13]. Como estos compuestos expresaron una actividad antibacteriana muy significativa con bajos valores de CMI frente a aislados clínicos de MRSA como representantes de bacterias multirresistentes, decidimos ampliar el conocimiento sobre las propiedades antibacterianas de estos compuestos frente a MRSA. El objetivo del presente estudio fue evaluar la actividad bactericida in vitro global de nueve diamidas recientemente sintetizadas en dependencia del tiempo y de la concentración frente a aislados clínicos de MRSA como representantes de bacterias multirresistentes, siendo el primer estudio que se refiere a la evaluación de las características microbiológicas nuevas de los análogos de SAL y revelando su efecto bactericida. La vía sintética de la serie de nuevas diamidas fue descrita recientemente [13, 22] y sus estructuras (véase el cuadro 1) fueron confirmadas por la espectrometría IR, NMR y MS, y la pureza de los compuestos fue verificada por el análisis CHN [13, 22]. [27] ; y MRSA SA 3202 [27] (Instituto Nacional de Salud Pública, Praga, República Checa) ambos de origen humano. Las colonias sospechadas fueron confirmadas por PCR; se detectó un fragmento de 108 pb específico para S. aureus [28]. Todos los aislados fueron probados para la presencia del gen mecA que codificaba la resistencia a la meticilina [29]. Estos tres aislados clínicos fueron clasificados como vancomicina-susceptible (pero con un CMI más alto de vancomicina igual a 2 g/ml (VA2-MRSA) dentro del rango susceptible para MRSA 63718) meticilina-resistente S. aureus (VS-MRSA). Para los CMI de vancomicina, ver Tabla 1. Vancomicina-susceptible meticilina-susceptible Staphylococcus aureus (VS-MSSA) ATCC 29213, obtenido de la American Type Culture Collection, se utilizó como cepa Las bacterias fueron almacenadas en −80oC y se mantuvieron en placas de agar de sangre (base de agar de Columbia con 5% de sangre de ovino) entre experimentos. (MBCs) Los MBCs (es decir, las concentraciones más bajas de agentes antibacterianos requeridas para matar una bacteria particular) fueron determinados subculturbando alícuotas (20 L) de pozos sin crecimiento bacteriano visible y de pozos de control de la determinación del MIC en placas de agar de Mueller-Hinton (MHA) libres de sustancia. Las placas fueron incubadas aeróbicamente a 37oC durante 24 horas para el recuento de colonias. El MBC se definió como la concentración más baja de sustancia, que produjo ≥99,9% de muerte Tabla 1 : Estructuras químicas y valores in vitro de MIC y MBC [ g/mL] de 5 y 4-cloro-2-hidroxi-N-[1-oxo-1-(fenilamino)alkan-2-il]benzamidas probadas (efecto bacterial de compuestos individuales frente a cepas particulares marcadas en negrita). después de 24 h de incubación en comparación con el recuento de colonias del inóculo inicial [30]. Para garantizar la reproducibilidad, cada ensayo de MBC se realizó por lo menos triplicado en ocasiones separadas. N H O H N O OH 1 2 R 1 R 3 R 2 Comp. R 1 R 2 3 MIC [ g/mL] MBC [ g/mL] 1 2 3 4 2 3 4 1a 5-Cl 4-CH 3 (S)-CH 3 >256 >256 >256 >256 128 >256 1c 5-Cl 4-CH 3 (S)-bencil >256 >256 >256 >256 >256 >256 -256 1d 5-CH 3 (R)-CH 2 -indolyl >256 >256 >256 >256 >256 >4-C -256 1e 5-Cl 4 (S) 4 (S) 1 CH 3 256 356 >1 556 >456 >456 >1 5-C Brevemente, los frascos que contienen caldo fresco estéril Mueller-Hinton (MHB) con el agente antimicrobiano apropiado fueron inoculados con el organismo de ensayo en fase de crecimiento logarítmico para obtener el inóculo inicial con una concentración de aproximadamente 7,5 × 10 6 UFC/ml (las concentraciones reales de inóculo oscilaron entre 0,9 × 10 5 y 2,9 × 10 6 UFC/ml) y una concentración final del antibiótico igual a 1x, 2x y 4x MIC en volumen de 10 ml. Para la determinación de los recuentos viables, se eliminaron alícuotas en 0, 4, 6, 8 y 24 h puntos de tiempo después de la inoculación, se diluyeron en serie en solución salina estéril tamponada, y se plasmó alícuota (20 L) en placas MHA en duplicado. Se realizaron recuentos El transporte antimicrobiano fue controlado por dilución e inspección visual de la distribución de colonias en las placas con la observación de una posible inhibición del crecimiento en el sitio de las rayas iniciales. Las placas fueron incubadas a 37oC durante 24 a 48 horas, y se determinó el número de colonias. Para asegurar la reproducibilidad, cada experimento de matar el tiempo se realizó en duplicado en ocasiones separadas con resultados presentados como la media de todos los experimentos. El control del crecimiento sin la adición de agentes antimicrobianos y el control conteniendo DMSO sin ningún agente antimicrobiano para excluir la actividad antibacteriana de este disolvente fueron incluidos. Se construyeron curvas de habilidad del tiempo trazando el registro 10 UFC por mililitro versus tiempo (más de 24 h), y se determinó el cambio en la concentración bacteriana. Los resultados fueron analizados evaluando el número de cepas que produjeron valores de Δ(log 10 UFC/ml) de −1 (correspondiente al 90% de muerte), −2 (99% de muerte) y −3 (99,9% de muerte) a 4, 6, 8 y 24 h en comparación con los recuentos a 0 h. La actividad bactericida se definió como una reducción de al menos 99,9% (≥3 log 10 ) del recuento total de UFC/ml en el inóculo original. Las diamidas parecen ser candidatos prometedores para agentes antibacterianos con una actividad anti-MRSA muy fuerte, como se publicó recientemente [13]. En el presente estudio se evaluó la serie de nueve diamidas recientemente sintetizadas como agentes bactericidas prospectivos frente a los representantes de bacterias multirresistentes, tres aislados clínicos de MRSA y Staphylococcus aureus ATCC 29213 (meticilina-sosceptible) como cepa de referencia y control de calidad, ya que las SAL y sus análogos se conocen como compuestos con efecto bacteriostático [31], este es el primer estudio en el que se consideraron compuestos similares a las SAL como agentes bactericidas prospectivos y se evaluó la dependencia del efecto bactericida de estos compuestos en el tiempo y la concentración, por lo que se revelaron características microbiológicas absolutamente novedosas de estos compuestos en el presente estudio. Recientemente se publicaron valores MIC de diamidas expresados como concentraciones molares en mol/L [13]. Para permitir la comparación con los valores de MBC del presente estudio, se calcularon los MIC en g/ml y se registraron en la Tabla 1 junto con la actividad de los fármacos antibacterianos de referencia, ampicilina, ciprofloxacino y vancomicina. La actividad bactericida potencial de las diamidas se evaluó utilizando el ensayo de MBC [26]. Los valores de MBC de todos los compuestos probados también se registran en la Tabla 1. Basándose en los resultados obtenidos, todos los compuestos evaluados como activos según los valores de MIC de nuestro estudio anterior (1f-i) mostraron valores de MBC bajos o moderados frente a las cuatro cepas. Los valores de MBC de estos compuestos no superaron la concentración de fármaco más alta probada y variaron de 1 a 16 g/ml. En todos los casos, hubo valores comparables de MBC para los aislados clínicos de MRSA y La actividad bactericida se define como una relación de MBC a MIC de ≤4 [32]. La tabla 1 se expresa en negrita. Como se mencionó anteriormente, se sabe que las sales de sal presentan un efecto bacteriostático [31], por lo que fue muy interesante descubrir que las diamidas poseen actividad bactericida. El enlace amida (-CONH-) puede causar interacciones con una variedad de enzimas [33] ; por lo tanto, la presencia de dos enlaces amidas podría ser responsable del efecto bactericida de las diamidas contra el MRSA. La actividad de las sales de sal y sus análogos resulta de múltiples mecanismos, que todavía están en investigación; por ejemplo, se encontró que las sales de sal son capaces de inhibir las transglucosilasas en etapas posteriores de la biosíntesis de pared celular de S. aureus (incluyendo MRSA Estas enzimas catalizan el paso previo a la transpeptidación en la biosíntesis del peptidoglicano y son responsables de la polimerización del lípido II, que ocurre en la cara externa de la membrana [12]. Dado que los agentes antibacterianos dirigidos a la biosíntesis de la pared celular actúan como agentes bactericidas [30, 34], el fallo en la biosíntesis de la pared celular debido a la inhibición de las transglicosilasas podría ser responsable de la actividad bactericida de las diamidas frente al MRSA. Basándose en estos hallazgos, las diamidas activas antibacterianas con efecto bactericida frente a las cuatro cepas probadas como agentes bactericidas prospectivos fueron seleccionadas para estudios de curva timehabilidad posteriores para determinar la dependencia real del efecto bactericida de la concentración a lo largo del tiempo. 1-oxobutan-2-il}-2-hidroxibenzamida (1h) se probaron en estudios de time-kill a 1x, 2x y 4x MIC frente a todos los aislados de MRSA y la cepa de referencia S. aureus. El efecto antibacteriano de DMSO [35] utilizado como disolvente de los compuestos probados se excluyó en este ensayo, ya que las curvas de time-kill de este disolvente eran idénticas o muy similares a las del control de crecimiento. El grado de muerte bacteriana se estimó por el número de estas cepas que mostraban una disminución de 1 a 3 log 10 UFC/ml en el recuento celular viable en diferentes momentos después de la incubación. Se presenta un resumen de estos datos en la Tabla 2. Basándose en estos datos se puede concluir que la potencia bactericida de las diamidas probadas contra las cuatro cepas disminuyó No se observó actividad bactericida (es decir, disminución de ≥3 log 10 UFC/ml) a 1x MIC para ninguna cepa y tiempo después de la incubación ensayada. A 4x MIC de las cuatro cepas, los compuestos 1f, 1g y 1h mataron 2, 1, y 2 cepas, respectivamente, a 8 h después de la incubación y 4, 2 y 2 cepas, respectivamente, a 24 h después de la incubación. Los hallazgos de estudios de time-kill para cada una de las cuatro cepas de estafilococos en exposición a los compuestos 1f, 1g y 1h se resumen en la Tabla 3. La actividad bactericida (es decir, disminución de ≥3 log 10 UFC/ml) se expresa en negrita. El tiempo no fue el factor predictivo que influyó en la actividad antibacteriana porque las diferencias logarítmicas en la UFC/ml desde el inóculo inicial fueron las mismas para 4 veces CMI (con la mayor eficiencia con una reducción en el recuento bacteriano de 5,30 log 10 UFC/ml) o muy similares para 2 veces CMI (con un crecimiento moderado después de 24 h causando una pérdida de actividad bactericida) a lo largo de 24 h. El efecto bactericida se mantuvo incluso a 2 veces CMI a las 4 h después de la incubación de esta cepa (reducción de 3,08 log 10 UFC/ml). Para las cepas restantes, se registraron aislados clínicos de MRSA SA 630, MRSA SA 3202 y S. aureus ATCC 29213, efecto bactericida fiable a 4x MIC a las 24 h después de la incubación para todas estas cepas con una reducción del recuento bacteriano de 3,22, 3,30 y 3,65 log 10 UFC/mL, respectivamente. Para el efecto bactericida compuesto 1g frente a MRSA 63718, se observó 2x MIC a las 6 y 8 h después de la incubación y 4x MIC a las 4, 6 y 8 h después de la incubación con una reducción del recuento bacteriano de 3,10 a 3,58 log 10 UFC/mL. La muerte más eficaz se logró a 6 h para ambas concentraciones. Como en el caso del compuesto 1f, se observó un recrecimiento después de 24 h después Para los aislados restantes de MRSA, SA 630 y SA 3202, el efecto bactericida se produjo sólo a 4 veces MIC a las 24 h después de la incubación con una reducción del recuento bacteriano de 3,38 y 4,01 log 10 UFC/ml, respectivamente. El efecto bactericida más alto se registró para MRSA SA 3202 a 4 veces MIC a las 24 h después de la incubación. Se observó una reducción consistente con el efecto bacteriostático (0,03 a 2,37 log 10 UFC/ml) en otras concentraciones a lo largo del tiempo para ambos aislados. No se observó ningún efecto bactericida para la cepa de referencia de S. aureus; el compuesto 1g demostró un patrón de actividad bacteriostática frente a esta cepa con una reducción del recuento bacteriano de 0,07 a 2,33 log 10 UFC/ml a 4 veces MIC En otros casos, se observó un ligero aumento de los recuentos bacterianos (es decir, sobrecrecimiento) en comparación con el inóculo inicial, con valores que oscilaban entre 0,10 y 1,57 log 10 UFC/ml para esta cepa de referencia. Para el efecto bactericida 1h compuesto frente a MRSA 63718 se mantuvo a 4 veces MIC a 6 y 8 horas después de la incubación con una reducción del recuento bacteriano de 3,54 y 3,31 log 10 UFC/ml, respectivamente. Al igual que para 1 g, el efecto bactericida más potente se mantuvo a 6 horas después de la incubación. El recrecimiento a 24 horas después de la incubación se registró una pérdida de actividad bactericida similar a la de compuestos anteriores. Lo más probable es que la selección de mutantes resistentes sea responsable de este fenómeno [30] ; no se asume la degradación del fármaco en el medio de crecimiento, ya que el rebrote fue Número de cepas que mostraron el siguiente log 10 UFC/ml disminución a en el tiempo de incubación designado no observado para ninguna otra cepa probada. Para MRSA SA 630 la muerte dependiente de la concentración se registró en 4x MIC a las 6, 8 y 24 h después de la incubación con el log 10 diferencias en UFC/ml desde que el inóculo inicial fue muy similar con el tiempo (de 3,18 a 3,39 log 10 UFC/ml). Para MRSA SA 3202 el efecto bactericida confiable se mantuvo sólo a las 4x MIC a las 24 h después de la incubación con una reducción en el recuento bacterial de 3,02 log 10 UFC/ml. En cuanto al compuesto 1g, se observó actividad bacteriostática frente a la cepa de referencia S. aureus con una reducción del recuento bacteriano que variaba de 0,34 a 2,62 log 10 UFC/ml a 2x y 4x MIC. Se registró sobrecrecimiento (valores que van de 0,04 a 1,43 log 10 UFC/ml) a 1x MIC para esta cepa. Es de notar que en todas las cepas de estafilococos con similares MICs y MBCs para compuestos 1g y 1h la respuesta a la actividad antibacteriana de estos compuestos variaba con cepas clínicas de MRSA siendo eficazmente eliminadas y la cepa de referencia que no se ve afectada a 4x MIC. Existe una discrepancia entre los resultados bactericidas del ensayo de MBC en comparación con la cinética del tiempo-kill. Esta diferencia podría ser causada por la comparación de microtiter (ensayo de MBC) con diluciones de macrobrotes (ensayo de matar el tiempo) [36]. Por otra parte, aunque los ensayos de matar el tiempo son más intensivos en el trabajo y consumen más tiempo que los ensayos de MBC, se reconoce que proporcionan un mayor grado de caracterización del potencial de erradicación celular de los agentes antibacterianos [37]. En cuanto al efecto antibacteriano, no es generalmente importante si el agente antibacteriano es también bactericida a concentraciones más altas, porque la inhibición de la proliferación bacteriana generalmente logra un efecto terapéutico; el sistema inmunitario del paciente es capaz de hacer frente a la infección entonces [34]. Sin embargo, la terapia bactericida podría producir un mejor resultado en el tratamiento mediante una rápida reducción de la carga bacteriana [38]. Los agentes bactericidas están inequívocamente indicados. Teniendo en cuenta el aumento constante del número de pacientes inmunocomprometidos con endocarditis, meningitis o osteomielitis en los últimos años, es necesario lograr la muerte bacteriana y ampliar el espectro de agentes antimicrobianos con compuestos activos bactericidas [30]. El resultado clínico de la bacteriemia por MRSA está influenciado significativamente por vancomicina MIC. El fracaso del tratamiento superior al 60% para S. aureus con vancomicina MIC de 4 g/ml dio lugar al cambio del punto de ruptura de susceptibilidad de 4 g/ml a 2 g/ml por el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) en 2006 [23] así como por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) en 2008 [39]. Se ha recomendado que para las infecciones causadas por cepas de MRSA con niveles elevados de vancomicina MICs (2 g/mL), se considere tratamiento alternativo [40]. Cabe señalar que, en base a los ensayos de determinación del tiempo realizados en el presente estudio, todas las diamidas probadas (particularmente las compuestas 1f que presentaban un efecto rápido dependiente de la concentración bactericida incluso a 2 veces MIC) fueron más eficaces frente al MRSA aislado 63718, que es la cepa con un valor elevado de vancomicina MIC de 2 g/mL. La actividad frente a los aislamientos restantes con un valor de vancomicina MIC de 1 g/mL fue menor. Teniendo en cuenta la aparición de una susceptibilidad decreciente de vancomicina de los aislados de MRSA y, por tanto, la eficacia terapéutica del tratamiento con vancomicina, nuestro A partir de los resultados obtenidos, las diamidas pueden ser candidatas idóneas para estos compuestos activos bactericidas novedosos, presentando un prometedor punto de partida para futuras investigaciones para determinar la actividad real in vivo y el mecanismo exacto de acción. El presente estudio es la primera evidencia del efecto bactericida de los análogos de la SAL. Contra otras cepas, el efecto bactericida confiable se mantuvo en 4x MIC a las 24 h después de la incubación. Teniendo en cuenta la necesidad de ampliar el espectro de agentes bactericidas, las diamidas del presente estudio con un nuevo mecanismo de acción podrían presentar una solución muy prometedora e interesante a este desafío para el futuro.

¿Cuál es el tratamiento de elección para las infecciones por MRSA?

La actividad bacteriana de 4- y 5-Chloro-2-hidroxi-N-[1-oxo-1-(fenilamino)alkan-2-il]benzamidas frente a MRSAhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4321674/SHA: f0e6cef57dbae030aea2f324e21e00945ac659cfAutores: Zadrazilova, Iveta; Pospisilova, Sarka; Pauk, Karel; Imramovsky, Ales; Vinsova, Jarmila; Cizek, Alois; Jampilek, JosefFecha: 2015-01-15DOI: 10.1155/2015/349534Licencia: cc-byAbstract: Una serie de nueve aislados clínicos de 2-hidroxi La concentración bactericida mínima se determinó mediante la subcultura de alícuotas desde la determinación del CMI hasta las placas de agar libres de sustancia. La cinética bactericida de los compuestos 5-cloro-2-hidroxi-N-[(2S)-3-metil-1-oxo-1-{[4-(trifluorometil)fenil]amino}butan-2-il]benzamida (1f), N-{(2S)-1-[(4-bromofenil)amino]-3-metil-1-oxobutan-2-il}-4-cloro-2-hidroxibenzamida (1g), y 4-cloro-N-{2S)-1-[(3,4-diclorofenil)amino]-3-metil-1-oxobutan-2-il}-2-hidroxibenzamida (1h) se estableció mediante un ensayo de determinación del tiempo con una concentración final del compuesto igual a 1x, 2x y 4x MIC; los alícumos se eliminaron en 0, 4, 6, 8 y 24 h. El agente bactericida más potente fue el compuesto 1f con un notable efecto bactericida rápido dependiente de la concentración, incluso a 2 veces MIC a 4, 6 y 8 h (con una reducción en el recuento bacteriano que va de 3,08 a 3,75 log(10) UFC/ml) y a 4 veces MIC a 4, 6, 8 y 24 h (5,30 log(10) UFC/ml reducción en el recuento bacteriano) después de la incubación frente a MRSA 637118. El efecto bactericida fiable frente a otras cepas se mantuvo a 4 veces MIC a 24 h.Texto: La resistencia antibiótica de patógenos invasores se ha convertido en uno de los problemas de salud más difíciles y persistentes [1]. Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA) se ha convertido en el patógeno multirresistente clínicamente más común [2] La prevalencia del MRSA está aumentando en todo el mundo y, según la información más reciente del Centro Europeo para la Prevención y el Control de Enfermedades a partir de 2012 [4], puede considerarse alarmante en algunos países europeos, especialmente en Portugal y Rumanía, donde ≥50% de todos los aislados de S. aureus de infecciones invasivas fueron identificados como MRSA en 2012 (aunque, por ejemplo, en Rumanía la prevalencia del MRSA fue de 25-50% en 2010), seguido por Italia, Grecia y Polonia, con 25-50% de aislados de MRSA en 2012 (para comparación, en Polonia, los aislados de MRSA constituyeron 10-25% de todos los aislados de S. aureus en 2010). El fracaso del tratamiento de la vancomicina, el agente terapéutico anti-MRSA de elección, debido a las cepas con valores elevados de concentración mínima inhibitoria de vancomicina (MIC) (es decir, la concentración más baja de un antimicrobiano que inhibirá el crecimiento visible de un microorganismo) dentro del rango susceptible se describió previamente [5, 6]. Así, la aparición de MRSA (y S. aureus resistente a la vancomicina en los últimos años también [7] ) hace que el descubrimiento de nuevos andamios moleculares sea una prioridad, y la situación actual incluso requiere la reingeniería y reposicionamiento de algunas antiguas familias de fármacos para lograr un control adecuado de estas bacterias [8]. Sin embargo, para el tratamiento de las infecciones del torrente sanguíneo de S. aureus, los agentes antimicrobianos bactericidas se consideran superiores a los medicamentos La historia del uso clínico de salicilanilidas (2-hidroxi-N-fenilbenzamidas) se remonta a la década de 1940 en terapia de la capitis tinea, seguida por el descubrimiento de sus propiedades antihelmínticas a mediados de la década de 1950 [10]. Hoy en día, las salicilanilidas (SAL) son una clase de compuestos aromáticos que poseen una amplia gama de interesantes actividades farmacológicas, como la antihelmíntica [11], la antibacteriana [12, 13], la antimicobacteriana [13], la antifúngica [14] y la antiviral [15, 16], entre otras. A pesar de ser estudiada desde la década de 1960, el mecanismo de acción responsable de las actividades biológicas de estos compuestos no se ha explicado hasta ahora. Los últimos estudios los especificaron también como inhibidores selectivos de la producción de interleucina-12p40 que desempeña un papel específico en la iniciación, expansión y control de la respuesta celular a la tuberculosis [18]. Además, las salicilanilidas han sido reconocidas como inhibidores de algunas enzimas bacterianas, como sortasa A de S. aureus [19], d-alanina-d-alanina ligasa [20], o transglicosilasas de S. aureus (pero no de M. tuberculosis) [12]. Estas enzimas participan en la secreción de diversas proteínas o en la biosíntesis de la pared celular bacteriana. Recientemente, los derivados similares a salicilanilidas fueron descritos para inhibir dos enzimas esenciales para la micobacteria: (i) metionina aminopeptidasa, catalizando un paso clave de la modificación posttranslacional de las proteínas nacientes, y (ii) isocitrato liasa, que es esencial para el metabolismo de los ácidos grasos [21]. Así, las SAL parecen ser candidatos prometedores para el desarrollo de nuevos agentes antibacterianos con un nuevo mecanismo de acción. Estos nuevos agentes podrían ser una solución a los desafíos de resistencia. Este estudio es un documento de seguimiento de un artículo publicado recientemente [13]. La síntesis de la serie de nuevos derivados de salicilamidas, 4 y 5-cloro-2-hidroxi-N-[1-oxo-1-(fenilamino)alkan-2-il]benzamidas, llamadas diamidas debido a su esqueleto (para la estructura general ver Tabla 1 ), fue descrita previamente [13, 22], y se reportaron sus actividades antimicobacterianas y antibacterianas contra diversas especies bacterianas [13]. Como estos compuestos expresaron una actividad antibacteriana muy significativa con bajos valores de CMI frente a aislados clínicos de MRSA como representantes de bacterias multirresistentes, decidimos ampliar el conocimiento sobre las propiedades antibacterianas de estos compuestos frente a MRSA. El objetivo del presente estudio fue evaluar la actividad bactericida in vitro global de nueve diamidas recientemente sintetizadas en dependencia del tiempo y de la concentración frente a aislados clínicos de MRSA como representantes de bacterias multirresistentes, siendo el primer estudio que se refiere a la evaluación de las características microbiológicas nuevas de los análogos de SAL y revelando su efecto bactericida. La vía sintética de la serie de nuevas diamidas fue descrita recientemente [13, 22] y sus estructuras (véase el cuadro 1) fueron confirmadas por la espectrometría IR, NMR y MS, y la pureza de los compuestos fue verificada por el análisis CHN [13, 22]. [27] ; y MRSA SA 3202 [27] (Instituto Nacional de Salud Pública, Praga, República Checa) ambos de origen humano. Las colonias sospechadas fueron confirmadas por PCR; se detectó un fragmento de 108 pb específico para S. aureus [28]. Todos los aislados fueron probados para la presencia del gen mecA que codificaba la resistencia a la meticilina [29]. Estos tres aislados clínicos fueron clasificados como vancomicina-susceptible (pero con un CMI más alto de vancomicina igual a 2 g/ml (VA2-MRSA) dentro del rango susceptible para MRSA 63718) meticilina-resistente S. aureus (VS-MRSA). Para los CMI de vancomicina, ver Tabla 1. Vancomicina-susceptible meticilina-susceptible Staphylococcus aureus (VS-MSSA) ATCC 29213, obtenido de la American Type Culture Collection, se utilizó como cepa Las bacterias fueron almacenadas en −80oC y se mantuvieron en placas de agar de sangre (base de agar de Columbia con 5% de sangre de ovino) entre experimentos. (MBCs) Los MBCs (es decir, las concentraciones más bajas de agentes antibacterianos requeridas para matar una bacteria particular) fueron determinados subculturbando alícuotas (20 L) de pozos sin crecimiento bacteriano visible y de pozos de control de la determinación del MIC en placas de agar de Mueller-Hinton (MHA) libres de sustancia. Las placas fueron incubadas aeróbicamente a 37oC durante 24 horas para el recuento de colonias. El MBC se definió como la concentración más baja de sustancia, que produjo ≥99,9% de muerte Tabla 1 : Estructuras químicas y valores in vitro de MIC y MBC [ g/mL] de 5 y 4-cloro-2-hidroxi-N-[1-oxo-1-(fenilamino)alkan-2-il]benzamidas probadas (efecto bacterial de compuestos individuales frente a cepas particulares marcadas en negrita). después de 24 h de incubación en comparación con el recuento de colonias del inóculo inicial [30]. Para garantizar la reproducibilidad, cada ensayo de MBC se realizó por lo menos triplicado en ocasiones separadas. N H O H N O OH 1 2 R 1 R 3 R 2 Comp. R 1 R 2 3 MIC [ g/mL] MBC [ g/mL] 1 2 3 4 2 3 4 1a 5-Cl 4-CH 3 (S)-CH 3 >256 >256 >256 >256 128 >256 1c 5-Cl 4-CH 3 (S)-bencil >256 >256 >256 >256 >256 >256 -256 1d 5-CH 3 (R)-CH 2 -indolyl >256 >256 >256 >256 >256 >4-C -256 1e 5-Cl 4 (S) 4 (S) 1 CH 3 256 356 >1 556 >456 >456 >1 5-C Brevemente, los frascos que contienen caldo fresco estéril Mueller-Hinton (MHB) con el agente antimicrobiano apropiado fueron inoculados con el organismo de ensayo en fase de crecimiento logarítmico para obtener el inóculo inicial con una concentración de aproximadamente 7,5 × 10 6 UFC/ml (las concentraciones reales de inóculo oscilaron entre 0,9 × 10 5 y 2,9 × 10 6 UFC/ml) y una concentración final del antibiótico igual a 1x, 2x y 4x MIC en volumen de 10 ml. Para la determinación de los recuentos viables, se eliminaron alícuotas en 0, 4, 6, 8 y 24 h puntos de tiempo después de la inoculación, se diluyeron en serie en solución salina estéril tamponada, y se plasmó alícuota (20 L) en placas MHA en duplicado. Se realizaron recuentos El transporte antimicrobiano fue controlado por dilución e inspección visual de la distribución de colonias en las placas con la observación de una posible inhibición del crecimiento en el sitio de las rayas iniciales. Las placas fueron incubadas a 37oC durante 24 a 48 horas, y se determinó el número de colonias. Para asegurar la reproducibilidad, cada experimento de matar el tiempo se realizó en duplicado en ocasiones separadas con resultados presentados como la media de todos los experimentos. El control del crecimiento sin la adición de agentes antimicrobianos y el control conteniendo DMSO sin ningún agente antimicrobiano para excluir la actividad antibacteriana de este disolvente fueron incluidos. Se construyeron curvas de habilidad del tiempo trazando el registro 10 UFC por mililitro versus tiempo (más de 24 h), y se determinó el cambio en la concentración bacteriana. Los resultados fueron analizados evaluando el número de cepas que produjeron valores de Δ(log 10 UFC/ml) de −1 (correspondiente al 90% de muerte), −2 (99% de muerte) y −3 (99,9% de muerte) a 4, 6, 8 y 24 h en comparación con los recuentos a 0 h. La actividad bactericida se definió como una reducción de al menos 99,9% (≥3 log 10 ) del recuento total de UFC/ml en el inóculo original. Las diamidas parecen ser candidatos prometedores para agentes antibacterianos con una actividad anti-MRSA muy fuerte, como se publicó recientemente [13]. En el presente estudio se evaluó la serie de nueve diamidas recientemente sintetizadas como agentes bactericidas prospectivos frente a los representantes de bacterias multirresistentes, tres aislados clínicos de MRSA y Staphylococcus aureus ATCC 29213 (meticilina-sosceptible) como cepa de referencia y control de calidad, ya que las SAL y sus análogos se conocen como compuestos con efecto bacteriostático [31], este es el primer estudio en el que se consideraron compuestos similares a las SAL como agentes bactericidas prospectivos y se evaluó la dependencia del efecto bactericida de estos compuestos en el tiempo y la concentración, por lo que se revelaron características microbiológicas absolutamente novedosas de estos compuestos en el presente estudio. Recientemente se publicaron valores MIC de diamidas expresados como concentraciones molares en mol/L [13]. Para permitir la comparación con los valores de MBC del presente estudio, se calcularon los MIC en g/ml y se registraron en la Tabla 1 junto con la actividad de los fármacos antibacterianos de referencia, ampicilina, ciprofloxacino y vancomicina. La actividad bactericida potencial de las diamidas se evaluó utilizando el ensayo de MBC [26]. Los valores de MBC de todos los compuestos probados también se registran en la Tabla 1. Basándose en los resultados obtenidos, todos los compuestos evaluados como activos según los valores de MIC de nuestro estudio anterior (1f-i) mostraron valores de MBC bajos o moderados frente a las cuatro cepas. Los valores de MBC de estos compuestos no superaron la concentración de fármaco más alta probada y variaron de 1 a 16 g/ml. En todos los casos, hubo valores comparables de MBC para los aislados clínicos de MRSA y La actividad bactericida se define como una relación de MBC a MIC de ≤4 [32]. La tabla 1 se expresa en negrita. Como se mencionó anteriormente, se sabe que las sales de sal presentan un efecto bacteriostático [31], por lo que fue muy interesante descubrir que las diamidas poseen actividad bactericida. El enlace amida (-CONH-) puede causar interacciones con una variedad de enzimas [33] ; por lo tanto, la presencia de dos enlaces amidas podría ser responsable del efecto bactericida de las diamidas contra el MRSA. La actividad de las sales de sal y sus análogos resulta de múltiples mecanismos, que todavía están en investigación; por ejemplo, se encontró que las sales de sal son capaces de inhibir las transglucosilasas en etapas posteriores de la biosíntesis de pared celular de S. aureus (incluyendo MRSA Estas enzimas catalizan el paso previo a la transpeptidación en la biosíntesis del peptidoglicano y son responsables de la polimerización del lípido II, que ocurre en la cara externa de la membrana [12]. Dado que los agentes antibacterianos dirigidos a la biosíntesis de la pared celular actúan como agentes bactericidas [30, 34], el fallo en la biosíntesis de la pared celular debido a la inhibición de las transglicosilasas podría ser responsable de la actividad bactericida de las diamidas frente al MRSA. Basándose en estos hallazgos, las diamidas activas antibacterianas con efecto bactericida frente a las cuatro cepas probadas como agentes bactericidas prospectivos fueron seleccionadas para estudios de curva timehabilidad posteriores para determinar la dependencia real del efecto bactericida de la concentración a lo largo del tiempo. 1-oxobutan-2-il}-2-hidroxibenzamida (1h) se probaron en estudios de time-kill a 1x, 2x y 4x MIC frente a todos los aislados de MRSA y la cepa de referencia S. aureus. El efecto antibacteriano de DMSO [35] utilizado como disolvente de los compuestos probados se excluyó en este ensayo, ya que las curvas de time-kill de este disolvente eran idénticas o muy similares a las del control de crecimiento. El grado de muerte bacteriana se estimó por el número de estas cepas que mostraban una disminución de 1 a 3 log 10 UFC/ml en el recuento celular viable en diferentes momentos después de la incubación. Se presenta un resumen de estos datos en la Tabla 2. Basándose en estos datos se puede concluir que la potencia bactericida de las diamidas probadas contra las cuatro cepas disminuyó No se observó actividad bactericida (es decir, disminución de ≥3 log 10 UFC/ml) a 1x MIC para ninguna cepa y tiempo después de la incubación ensayada. A 4x MIC de las cuatro cepas, los compuestos 1f, 1g y 1h mataron 2, 1, y 2 cepas, respectivamente, a 8 h después de la incubación y 4, 2 y 2 cepas, respectivamente, a 24 h después de la incubación. Los hallazgos de estudios de time-kill para cada una de las cuatro cepas de estafilococos en exposición a los compuestos 1f, 1g y 1h se resumen en la Tabla 3. La actividad bactericida (es decir, disminución de ≥3 log 10 UFC/ml) se expresa en negrita. El tiempo no fue el factor predictivo que influyó en la actividad antibacteriana porque las diferencias logarítmicas en la UFC/ml desde el inóculo inicial fueron las mismas para 4 veces CMI (con la mayor eficiencia con una reducción en el recuento bacteriano de 5,30 log 10 UFC/ml) o muy similares para 2 veces CMI (con un crecimiento moderado después de 24 h causando una pérdida de actividad bactericida) a lo largo de 24 h. El efecto bactericida se mantuvo incluso a 2 veces CMI a las 4 h después de la incubación de esta cepa (reducción de 3,08 log 10 UFC/ml). Para las cepas restantes, se registraron aislados clínicos de MRSA SA 630, MRSA SA 3202 y S. aureus ATCC 29213, efecto bactericida fiable a 4x MIC a las 24 h después de la incubación para todas estas cepas con una reducción del recuento bacteriano de 3,22, 3,30 y 3,65 log 10 UFC/mL, respectivamente. Para el efecto bactericida compuesto 1g frente a MRSA 63718, se observó 2x MIC a las 6 y 8 h después de la incubación y 4x MIC a las 4, 6 y 8 h después de la incubación con una reducción del recuento bacteriano de 3,10 a 3,58 log 10 UFC/mL. La muerte más eficaz se logró a 6 h para ambas concentraciones. Como en el caso del compuesto 1f, se observó un recrecimiento después de 24 h después Para los aislados restantes de MRSA, SA 630 y SA 3202, el efecto bactericida se produjo sólo a 4 veces MIC a las 24 h después de la incubación con una reducción del recuento bacteriano de 3,38 y 4,01 log 10 UFC/ml, respectivamente. El efecto bactericida más alto se registró para MRSA SA 3202 a 4 veces MIC a las 24 h después de la incubación. Se observó una reducción consistente con el efecto bacteriostático (0,03 a 2,37 log 10 UFC/ml) en otras concentraciones a lo largo del tiempo para ambos aislados. No se observó ningún efecto bactericida para la cepa de referencia de S. aureus; el compuesto 1g demostró un patrón de actividad bacteriostática frente a esta cepa con una reducción del recuento bacteriano de 0,07 a 2,33 log 10 UFC/ml a 4 veces MIC En otros casos, se observó un ligero aumento de los recuentos bacterianos (es decir, sobrecrecimiento) en comparación con el inóculo inicial, con valores que oscilaban entre 0,10 y 1,57 log 10 UFC/ml para esta cepa de referencia. Para el efecto bactericida 1h compuesto frente a MRSA 63718 se mantuvo a 4 veces MIC a 6 y 8 horas después de la incubación con una reducción del recuento bacteriano de 3,54 y 3,31 log 10 UFC/ml, respectivamente. Al igual que para 1 g, el efecto bactericida más potente se mantuvo a 6 horas después de la incubación. El recrecimiento a 24 horas después de la incubación se registró una pérdida de actividad bactericida similar a la de compuestos anteriores. Lo más probable es que la selección de mutantes resistentes sea responsable de este fenómeno [30] ; no se asume la degradación del fármaco en el medio de crecimiento, ya que el rebrote fue Número de cepas que mostraron el siguiente log 10 UFC/ml disminución a en el tiempo de incubación designado no observado para ninguna otra cepa probada. Para MRSA SA 630 la muerte dependiente de la concentración se registró en 4x MIC a las 6, 8 y 24 h después de la incubación con el log 10 diferencias en UFC/ml desde que el inóculo inicial fue muy similar con el tiempo (de 3,18 a 3,39 log 10 UFC/ml). Para MRSA SA 3202 el efecto bactericida confiable se mantuvo sólo a las 4x MIC a las 24 h después de la incubación con una reducción en el recuento bacterial de 3,02 log 10 UFC/ml. En cuanto al compuesto 1g, se observó actividad bacteriostática frente a la cepa de referencia S. aureus con una reducción del recuento bacteriano que variaba de 0,34 a 2,62 log 10 UFC/ml a 2x y 4x MIC. Se registró sobrecrecimiento (valores que van de 0,04 a 1,43 log 10 UFC/ml) a 1x MIC para esta cepa. Es de notar que en todas las cepas de estafilococos con similares MICs y MBCs para compuestos 1g y 1h la respuesta a la actividad antibacteriana de estos compuestos variaba con cepas clínicas de MRSA siendo eficazmente eliminadas y la cepa de referencia que no se ve afectada a 4x MIC. Existe una discrepancia entre los resultados bactericidas del ensayo de MBC en comparación con la cinética del tiempo-kill. Esta diferencia podría ser causada por la comparación de microtiter (ensayo de MBC) con diluciones de macrobrotes (ensayo de matar el tiempo) [36]. Por otra parte, aunque los ensayos de matar el tiempo son más intensivos en el trabajo y consumen más tiempo que los ensayos de MBC, se reconoce que proporcionan un mayor grado de caracterización del potencial de erradicación celular de los agentes antibacterianos [37]. En cuanto al efecto antibacteriano, no es generalmente importante si el agente antibacteriano es también bactericida a concentraciones más altas, porque la inhibición de la proliferación bacteriana generalmente logra un efecto terapéutico; el sistema inmunitario del paciente es capaz de hacer frente a la infección entonces [34]. Sin embargo, la terapia bactericida podría producir un mejor resultado en el tratamiento mediante una rápida reducción de la carga bacteriana [38]. Los agentes bactericidas están inequívocamente indicados. Teniendo en cuenta el aumento constante del número de pacientes inmunocomprometidos con endocarditis, meningitis o osteomielitis en los últimos años, es necesario lograr la muerte bacteriana y ampliar el espectro de agentes antimicrobianos con compuestos activos bactericidas [30]. El resultado clínico de la bacteriemia por MRSA está influenciado significativamente por vancomicina MIC. El fracaso del tratamiento superior al 60% para S. aureus con vancomicina MIC de 4 g/ml dio lugar al cambio del punto de ruptura de susceptibilidad de 4 g/ml a 2 g/ml por el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) en 2006 [23] así como por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) en 2008 [39]. Se ha recomendado que para las infecciones causadas por cepas de MRSA con niveles elevados de vancomicina MICs (2 g/mL), se considere tratamiento alternativo [40]. Cabe señalar que, en base a los ensayos de determinación del tiempo realizados en el presente estudio, todas las diamidas probadas (particularmente las compuestas 1f que presentaban un efecto rápido dependiente de la concentración bactericida incluso a 2 veces MIC) fueron más eficaces frente al MRSA aislado 63718, que es la cepa con un valor elevado de vancomicina MIC de 2 g/mL. La actividad frente a los aislamientos restantes con un valor de vancomicina MIC de 1 g/mL fue menor. Teniendo en cuenta la aparición de una susceptibilidad decreciente de vancomicina de los aislados de MRSA y, por tanto, la eficacia terapéutica del tratamiento con vancomicina, nuestro A partir de los resultados obtenidos, las diamidas pueden ser candidatas idóneas para estos compuestos activos bactericidas novedosos, presentando un prometedor punto de partida para futuras investigaciones para determinar la actividad real in vivo y el mecanismo exacto de acción. El presente estudio es la primera evidencia del efecto bactericida de los análogos de la SAL. Contra otras cepas, el efecto bactericida confiable se mantuvo en 4x MIC a las 24 h después de la incubación. Teniendo en cuenta la necesidad de ampliar el espectro de agentes bactericidas, las diamidas del presente estudio con un nuevo mecanismo de acción podrían presentar una solución muy prometedora e interesante a este desafío para el futuro.

¿Qué enzima es esencial para el metabolismo de los ácidos grasos?

El tratamiento de la infección por el virus de la hepatitis C (VHC) ha cambiado drásticamente con el advenimiento de agentes antivirales de acción directa (DAAs) en pacientes infectados del genotipo 1 uruguayoshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6112080/SHA: f01ad3545245b4f884b48aa2b69c9deb942c3e77Autores: Aldunate, Fabián; Echeverría, Natalia; Chiodi, Daniela; López, Pablo; Sánchez-Cicerón, Adriana; Fajardo, Alvaro; Soñora, Martín; Cristina, Juan; Hernández, Nelia; Moreno, PilarFecha: 2018-08-14DOI: 10.1155/2018/2514901Li Sin embargo, la eficacia de los ADA puede ser atenuada por la presencia de sustituciones asociadas a la resistencia (RASs) antes y después del tratamiento. De hecho, los ASA detectados en pacientes infectados por el VHC no tratados previamente por el DAA podrían ser útiles para el manejo clínico y la predicción de los resultados. Aunque la frecuencia de NS5A y NS5B del VHC se ha abordado en muchos países, sólo hay unos pocos informes sobre su prevalencia en la región sudamericana. El objetivo de este estudio fue investigar la presencia de RASs a los inhibidores NS5A y NS5B en un tratamiento DAA cohorte naive de pacientes uruguayos infectados con hepatitis C crónica y compararlos con informes de otros países sudamericanos. Aquí se encontró que las sustituciones naturales que confieren resistencia a los inhibidores del NS5A y NS5B estaban presentes en el Es importante destacar que las sustituciones basales en NS5A y NS5B aquí identificadas difieren de los estudios previamente reportados en Brasil. Además, las cepas uruguayas subtipo 1a agrupadas dentro de todos los principales clados mundiales, demostrando que las variantes del VHC que circulan actualmente en este país se caracterizan por una notable diversidad genética. Texto: Tratamiento de infección por el virus de la hepatitis C (VHC) ha mejorado dramáticamente gracias a la introducción de agentes antivirales de acción directa (DAAs). Estos antivirales han aumentado significativamente las tasas de respuesta (hasta el 98%) y reducido considerablemente la duración del tratamiento [1]. En la actualidad, los ADA disponibles se clasifican en cuatro categorías, dados sus objetivos moleculares en el ciclo de replicación del VHC: (1) los inhibidores de la proteasa NS3/4A (IP) se unen al sitio activo de la proteasa NS3/4A; (2) los inhibidores de la NS5A interactúan con el dominio 1 del dímero NS5A, aunque el mecanismo exacto de inhibición del NS5A sigue estando totalmente elucidado; (3) los inhibidores análogos de la polimerasa NS5B nucleosidos se incorporan a la cadena de ARN naciente, lo que da lugar a la terminación de la cadena al comprometer la unión del nucleótido entrante; (4) los inhibidores de la polimerasa NS5B no nucleósidos interactúan con el dominio del pulgar 1, pulgar 2, palma 1 o palma 2 de NS5B e inhiben la actividad Sin embargo, la mutación extrema y las altas tasas de replicación del VHC, junto con la presión del sistema inmunitario, conducen a una notable variabilidad genética que puede comprometer las altas tasas de respuesta a los AAD debido a la preexistencia de sustituciones asociadas a la resistencia (RASs) [5, 6]. Cada fármaco o clase de AAD se caracteriza por perfiles de resistencia específicos.La probabilidad de que un AAD seleccione y permita el crecimiento de poblaciones virales portadoras de RAS depende de la barrera genética del AAD a la resistencia (el número y tipo de mutaciones necesarias para generar una sustitución de aminoácidos que confiere resistencia), la aptitud viral (capacidad replicativa) de la variante resistente, y los genotipos virales y subtipos [7, 8]. La prevalencia de RAS en pacientes no tratados previamente ha sido ampliamente reportada en todo el mundo [9] [10] [11] [11] [14] [16] Sin embargo, aparte de Brasil y Argentina, este tema aún no ha sido tratado plenamente en otros países sudamericanos [9, [17] [18] [19]. La falta de información en relación con los SRAs basales preexistentes, sumados al alto costo de estos nuevos fármacos, son los principales factores limitantes para la amplia implementación de estas nuevas terapias en Uruguay, así como en otros países latinoamericanos (ingreso bajo o bajo medio) [20]. En este estudio, exploramos la presencia de variantes de resistencia a inhibidores NS5A y NS5B en una cohorte de tratamiento de la DAA naïve de pacientes uruguayas crónicamente infectados con hepatitis C. Aquí, nos propusimos contribuir al conocimiento de la circulación de variantes resistentes al VHC en la región sudamericana. Se obtuvieron muestras séricas de 31 pacientes con marcadores serológicos del VHC, que fueron reclutados entre 2015 y 2017 en la Clínica de Gastroenterología del Hospital de Clínicas, Montevideo, Uruguay. La infección por VHC fue confirmada por Abbott en tiempo real VHC (Abbott Molecular Inc., Des Plaines, EE.UU.). Los pacientes seleccionados para este estudio fueron infectados crónicamente con genotipo 1 del VHC y DAA no tratados previamente en el momento de la extracción de sangre. Se obtuvo el consentimiento informado escrito de todos los pacientes. Los estudios se han realizado de acuerdo con la Declaración de la Asociación Médica Mundial de Helsinki y fueron aprobados por la junta institucional correspondiente (Comité ético Hospital de Clínicas). 2.2. Extracción de ARN, síntesis de cDNA y amplificación NS5A y NS5B. El ARN viral se extrajo de 140 μl de suero utilizando el kit de ARN viral QIAamp (QIAgen, Hilden, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ARN viral se calentó a 65°C durante 5 minutos y se utilizó como plantilla para una reacción de transcripción inversa. La mezcla de reacción de transcripción inversa contenía 5 μl de la plantilla de ARN, 1 μl de hexamero aleatorio 100 ng/μl (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.), 1 μl de dNTP mix (10 mM cada uno), 4 μl de búfer de primera cadena 5X, 2 μl de 0,1 M DTT, 1 μl de SuperScript II transcriptasa inversa (200 U/μl) (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.), y 1 μl (40 U/μl) RNaseOUT (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.). La transcripción inversa se realizó a 42 °C durante 50 min, y luego la enzima de transcriptasa inversa fue inactivada a 70 La amplificación PCR de las regiones del genoma NS5A y NS5B se realizó utilizando imprimaciones y condiciones descritas previamente [10]. Los amplificadores fueron purificados utilizando el kit de purificación de ADN y banda de gel Illustra GFX PCR (GE Healthcare Life Science, Buckinghamshire, Reino Unido) de acuerdo con el protocolo del fabricante. 2.3. Secuenciación NS5A y NS5B. El producto purificado fue secuenciado entonces utilizando los mismos conjuntos de imprimaciones utilizados para amplificación PCR. La secuenciación Sanger bidireccional fue realizada por Macrogen Korea (http://www.macrogen.com). 2.4. Determinación del Genotipo NS5A y NS5B. Las secuencias de consenso VHC NS5A y NS5B obtenidas de pacientes uruguayos fueron alineadas con secuencias del VHC que representaban todos Estas secuencias se obtuvieron de la base de datos de secuencias de VHC de Los Alamos y de la base de datos y recurso de análisis de virus patógenos de NIAID (ViPR) [21, 22]. Para las cepas incluidas en estos estudios, ver Tabla de Material Suplementario S1. Las secuencias se alinearon utilizando el software CLUSTAL W [23]. Una vez alineado, el mejor modelo evolutivo que describió nuestros datos de secuencias se evaluó utilizando el programa ModelGenerator [24]. Utilizando el modelo GTR + G + I (tiempo general reversible + gamma + sitios invariantes), se construyeron árboles filogenéticos de máxima probabilidad tanto para NS5A como NS5B mediante el software MEGA 5.0 [25]. Para NS5A, se incluyeron 953 nucleótidos (posiciones 6367 a 7319, relativas a la cepa de referencia VHC 1a, H77 NC_004102) en el análisis filogenético, mientras que para NS5B, sólo se incluyeron 361 nucleótidos correspondientes a la región de Okamoto (posiciones 8265 a 8625, relativas a la cepa H77 NC_004102). Como medida de la robustez de cada nodo, se utilizó el método de arranque (1000 pseudoreplicados).Para NS5A 1a secuencias uruguayas (n = 20), se generó un segundo alineamiento y un árbol filogenético de máxima probabilidad para analizar las relaciones evolutivas del VHC entre cepas uruguayas, brasileñas y mundiales.Para las cepas no uruguayas incluidas en este análisis, véase la Tabla de Material Suplementa Para identificar adecuadamente los cambios de sustitución en las regiones NS5A y NS5B de cepas VHC que circulan en pacientes uruguayos, se generaron secuencias de consenso mundial para subtipos 1a y 1b utilizando una amplia gama de secuencias NS5A y NS5B de cepas VHC aisladas en todo el mundo. Para ello, se recuperaron secuencias de genes NS5A correspondientes a subtipos 1a (n = 160) y 1b (n = 88) de la base de datos de secuencias VHC de Los Alamos y de la NIAID ViPR [21, 22]. Asimismo, se generaron series de datos de 150 y 124 secuencias NS5B para subtipos 1a y 1b, respectivamente. Utilizando el programa Seqman, implementado en el paquete DNASTAR 5.01 (DNASTAR, Madison Cada secuencia uruguaya fue posteriormente alineada a las secuencias de referencia correspondientes, y luego traducida en silico. Las secuencias de aminoácidos obtenidas se compararon para explorar la presencia de RAS así como la presencia de polimorfismos en una posición RAS (RAP) en cepas uruguayas del VHC. Los RAP se definen como cualquier cambio de la secuencia de referencia para un genotipo específico en una posición asociada con resistencia NS5A [26]. Para estudiar la variabilidad genética de las regiones NS5A y NS5B de cepas del VHC que circulan en pacientes uruguayos, las secuencias de estas regiones (números de adhesión MH070029-MH070090) se alinearon con las secuencias correspondientes de 59 cepas del VHC aisladas en otros lugares, representando todos los genotipos y subtipos principales Los resultados de estos estudios se muestran en la Figura 1 Se asignaron todas las cepas en las filogenias de acuerdo a su genotipo, y cada grupo fue apoyado por valores de bootstrap muy altos para ambas regiones analizadas. Se asignaron cepas aisladas de pacientes uruguayos (n = 31) al genotipo 1, 20 de las cuales correspondían al subtipo 1a y 11 al subtipo 1b. Los resultados de NS5A (Figura 1 a)) y NS5B (Figura 1 Genotipo 1b análisis filogenéticos fueron concordantes para ambas regiones genómicas en las 31 secuencias, sugiriendo no eventos de recombinación entre estas regiones. Para analizar más a fondo las relaciones evolutivas entre las cepas uruguayas y las que circulan en Brasil y en otras partes, se construyó un árbol filogenético de segunda probabilidad máxima de secuencia Las secuencias brasileñas agrupadas en un gran grupo de secuencias relacionadas dentro del clado 1 [9]. Mientras que las cepas uruguayas NS5A (en rojo) no se agruparon en un determinado clado, sino que se agruparon dispersamente dentro de todos los principales clados mundiales. Con el propósito de estudiar las sustituciones de aminoácidos (AA) a lo largo de la proteína NS5A, se identificaron secuencias VHC AA uruguayas alineadas con secuencias de consenso mundial NS5A (residuos 23 a 354 en relación con la secuencia de proteína NS5A). Se identificaron sustituciones AA en posiciones que anteriormente se encontraban potencialmente asociadas con resistencia a inhibidores NS5A, así como polimorfismos en una posición RAS. Estos resultados se resumen en la Tabla 1. Se encontraron RAP en 3 cepas (subtipo 1a): 2 exhibieron la sustitución H58P y 1 la sustitución K24Q. Aunque estas sustituciones no fueron reportadas como resistentes, algunos cambios en estas posiciones fueron descritos previamente como RAS en el subtipo 1a, a saber, H58D y K24R [27, 28]. Finalmente, la sustitución E62D se encontró en una cepa subtipo 1a. Este cambio se considera como una sustitución secundaria porque, aunque no confiere resistencia por sí misma, cuando se combina con un RAS conocido que sí lo hace. De hecho, confiere un nivel de resistencia más alto que el alcanzado por el RAS solo [26]. Además, también se detectaron varios polimorfismos que no han sido reportados previamente como asociados con un fenotipo resistente (ver Tabla de Material Suplementario S3 ). Para estudiar las sustituciones a lo largo de la proteína NS5B, las secuencias VHC AA uruguayas se alinearon a las secuencias de consenso mundial NS5B. Se obtuvieron secuencias AA de casi toda la longitud en 26 de las 31 cepas analizadas. Se observaron residuos de 23 secuencias que abarcan 36 a 539, mientras que los restantes residuos de 3 lapsos de 36 a 557 de la proteína NS5B. Esta cuestión limitó nuestros estudios, ya que muchos de los RAS descritos se observaron como residuos 553. Es importante destacar que se observaron RAS a inhibidores NS5B (Tabla 2) en 5 cepas de 26 muestras secuenciadas (19,2%). Se encontró C451R en dos aislados, mientras que se encontró A421V en sólo uno. En 2 de las 3 cepas para las cuales pudimos obtener secuencias más largas, se observaron S556G RAS Finalmente, encontramos dos RAP: A421V (en cepas subtipo 1b de 2) y A553G (en cepa subtipo 1a de 1). Aunque A421V se ha asociado con resistencia a beclabuvir (BCV) en pacientes infectados con subtipo 1a de VHC, este fenotipo resistente no ha sido probado en cepas subtipo 1b [29]. En la posición 553, la sustitución reportada como resistente fue A553T [8]. Al igual que en el caso de NS5A, también se detectaron diferentes polimorfismos no asociados previamente con un fenotipo resistente en NS5B (ver Tabla de Material Suplementario S4 ). El advenimiento de las terapias DAAs constituye uno de los mayores avances en el manejo de pacientes infectados por VHC. Sin embargo, estas nuevas opciones de tratamiento están lejos de ser universalmente disponibles, Los principales factores limitantes para el acceso mundial a los ADA en nuestra región son el alto costo, la inadecuada gestión de los sistemas públicos de salud, el limitado acceso de las poblaciones de bajos ingresos o no aseguradas a los proveedores de salud, y la falta de información epidemiológica precisa [20, [30] [31] [32]. En Uruguay, estas terapias se hicieron recientemente disponibles, y aunque algunas han sido aprobadas para su uso por las autoridades de salud pública (terapias de Viekira pak y sofosbuvir/ledipasvir), actualmente no están cubiertas financieramente, excepto en casos específicos. A pesar de las altas tasas de respuesta viral logradas con los tratamientos basados en DAA, todavía 1-10% de los pacientes no logran eliminar la infección, y en estos casos, las variantes de resistencia basal y emergente resultan ser factores clave que contribuyen al fracaso del tratamiento [5, 17, 33]. Desafortunadamente, actualmente no podemos evaluar adecuadamente el número de personas infectadas por el VHC en Uruguay y aún más para averiguar la frecuencia y el tipo de SRA que circulan, hechos que podrían comprometer la efectividad de estas nuevas terapias en nuestro país. Hemos reportado anteriormente que existen sustituciones naturales que confieren resistencia a inhibidores del NS3 en una proporción significativa de pacientes uruguayos infectados con el genotipo 1 del VHC, y hemos demostrado que esta frecuencia parecía ser mayor que en otros países sudamericanos (Brasil y Argentina) [34]. El presente estudio describe la prevalencia de NS5A y NS5B RAS basales en pacientes infectados por el VHC genotipo 1 no infectados por DAA en una cohorte uruguaya. La presencia de sustituciones que confieren resistencia a los inhibidores de NS5A ha sido ampliamente reportada tanto en pacientes no tratados previamente como en pacientes con recaídas de Europa [10, 33, [35] [37] [37], EE.UU. [37, 39, 40], y Asia [42] [42]. Sin embargo, las secuencias de NS5A de América del Sur todavía están mal analizadas [9, 44]. Estudios recientes han revelado que la prevalencia media de NS5A genotipo 1 basal RASs a diferentes inhibidores oscila entre el 6% y el 16% utilizando secuenciación poblacional o secuenciación profunda [27, 37, 45, 46]. Es importante destacar que la prevalencia y el tipo de NS5A basales varía ligeramente según las regiones geográficas. Por ejemplo, se encontró L31M en el 2,2% de los pacientes infectados con genotipo 1a en Europa, en el 4,1% de los de Oceanía, y sorprendentemente en ningún paciente de los EE.UU. [27]. Por esta razón, creemos que es necesario aportar datos de nuestra región, para los cuales todavía no tenemos suficiente información, aparte de Brasil [9, 44]. Los resultados de este estudio indican la presencia de DAA NS5A RAS en 2 cepas del VHC (8% de los pacientes incluidos en este estudio), con RAS basal detectada en la posición 31 (ver Tabla 1 ). La sustitución L31M confiere resistencia a daclatasvir (DCV), ledipasvir (LDV) y elbasvir (EBV) en los subtipos 1a y 1b [5, 6, 8, 28, 47, 48], mientras que la sustitución L31V lo hace a DCV en los subtipos 1a y 1b, a LDV en el subtipo 1b y a EBV en el subtipo 1a [5, 6, 28]. Dado que tanto el L31V como el L31M son RAS clínicamente relevantes, su detección al inicio puede influir en la elección de regímenes de tratamiento de primera línea [28]. Las sustituciones H58P y K24Q encontradas en dos pacientes se consideran polimorfismos asociados a la resistencia (RAPs). Los RAS caracterizados en estas posiciones fueron H58D y K24G/N/R [5, 6, La sustitución H58P se encontró como RAP basal en recidivas a LDV (prescripción HARVONI, https://www.gilead.com/-/media/files/pdfs/medicaments/liver-diseasa/harvoni/harvoni_pi. pdf?la=en). Sin embargo, a veces se considera como una sustitución RAS [10, 51], a pesar de conferir solo un cambio de 1,2 veces en la resistencia en estudios in vitro utilizando el sistema 1a replicon [39]. No encontramos sustituciones M28T/V, Q30R/H, o Y93H, ya que se habían reportado previamente en Brasil y en todo el mundo [9, 27, 44]. La sustitución de aminoácidos E62H se encontró en un paciente uruguayo. Aunque este cambio no confiere resistencia por sí mismo sino La presencia de NS5A RAS basales impacta el resultado del tratamiento en algunos grupos de pacientes al afectar las tasas de RVS. La detección de NS5A preexistentes puede jugar un papel relevante en la elección de regímenes de tratamiento de primera línea o en la simplificación/acortamiento de los regímenes recomendados, con el fin de acercar las tasas de RVS a las más altas alcanzables [27, 38, 41, 53], en particular en países como Uruguay, donde sólo se aprueban dos regímenes de tratamiento diferentes que contienen DAA para su uso. En cuanto al gen NS5B, el análisis global (con excepción de Sudamérica [17, 19] ) reveló que las sustituciones de resistencia NS5B DAA son infrecuentes [14]. Las sustituciones encontradas en este trabajo fueron A421V y S556G asociadas en el subtipo 1a con resistencia a BCV y dasabuvir (DSV), respectivamente [8, 28, 29, 54, 55] y Q556R asociadas con resistencia a DSV tanto en el genotipo 1a como en el 1b [12, 28]. La sustitución C451R, observada en dos pacientes uruguayos, fue reportada previamente en pacientes que no lograron eliminar la infección después del tratamiento con OBV/PTV/r + DSV ± RBV. En estos casos, apareció en combinación con G558R (Trial Coral I-Cohort 2: http://www.hcv-trials.com/showStudy.asp?Study=86). También se encontraron RAP en las posiciones 421 y 553 (A421V en dos aislados del subtipo 1b y A553G en un aislado del subtipo 1b). Aunque A421V se ha asociado con resistencia a BCV en pacientes con subtipo 1a, este fenotipo no se ha demostrado en cepas del subtipo 1b [29]. En la posición 553, las sustituciones reportadas como resistentes son A553T en el subtipo 1a [8] y A553V en el subtipo 1b [54], lo que confiere resistencia a DSV. A diferencia de nuestros resultados, Noble y compañeros de trabajo (2016) reportaron la presencia de V321A, A421G, M414V, Y448H, L159F y C316N en aislados brasileños [17], sin embargo no se encontró ninguna de estas mutaciones en este estudio, probablemente debido a la diversidad encontrada entre cepas uruguayas y brasileñas (Figura 2 ). Sin embargo, se encontró sustitución A421V en Brasil [17], Argentina [19], y Uruguay. El RAS S282T no fue detectado ni en informes brasileños ni en este trabajo actual (Uruguay) [17, 18, 56]. Nuestros hallazgos confirman y complementan estudios previos que evidenciaron una baja prevalencia de esta sustitución in vivo, probablemente debido a su baja aptitud replicativa [14, 18, 57]. A pesar de nuestros resultados, no se ha demostrado que la presencia de NS5B RAS basales que confieren resistencia a los inhibidores de nucleótidos o no nucleósidos NS5B tenga ningún impacto en las respuestas virológicas hasta el momento [53, 58]. Estos resultados muestran tanto diversidad en los polimorfismos basales encontrados en diferentes países latinoamericanos como en las relaciones evolutivas de los aislados uruguayos (Figura 2 ). Este hecho podría estar relacionado no sólo con la región geográfica de los aislados y sus características intrínsecas virales sino también con el fondo genético del huésped. Vale la pena mencionar que vivimos en un vasto continente habitado por poblaciones con diferentes características genotípicas que, dependiendo de la situación, podrían requerir diferentes enfoques al tratamiento. De hecho, recientemente hemos encontrado que las frecuencias de alelo y genotipo en el locus IL28B de En conjunto, creemos que podría ser importante realizar estudios en toda la región sudamericana con el fin de establecer la prevalencia de RAS en NS5A y NS5B en diferentes países. De hecho, esto ayudará a entender que no todos los regímenes de tratamiento podrían ser adecuados para cada paciente y país. Los datos que presentamos aquí podrían guiar no sólo a los médicos en la toma de decisiones terapéuticas, sino también a las autoridades de salud pública en la aprobación de combinaciones de tratamiento más diversas. Estas formulaciones de tratamiento cubrirían la mayoría de las cepas circulantes en nuestra región, una región con una población de antecedentes genéticos muy diversa. Actualmente no está claro si las variantes virales preexistentes con menor susceptibilidad a los ADA son clínicamente relevantes para la predicción del fracaso del tratamiento virológico. Sin embargo, la terapia de DAA individualizada basada en el análisis de resistencia basal puede ser beneficiosa para optimizar la eficacia del tratamiento en pacientes con infección por VHC genotipo 1 y factores de riesgo para el fracaso del tratamiento. Por lo tanto, el papel potencial de las pruebas de resistencia basal sigue siendo un área de investigación crítica y preguntas clínicas.Los datos utilizados para apoyar los hallazgos de este estudio se incluyen en el artículo.Los autores declaran que no tienen conflictos de interés. Fabián Aldunate y Natalia Echeverría contribuyeron igualmente a este trabajo. Material Suplementario Tabla S2 : Secuencias del subtipo 1a del Virus de la hepatitis C NS5A utilizadas para revelar relaciones evolutivas entre cepas uruguayas y otras aisladas en otros lugares. Se indica su país de aislamiento correspondiente y número de adhesión de GenBank. Material Suplementario Tabla S3 : sustituciones de aminoácidos en proteína NS5A no previamente asociadas con resistencia a inhibidores de NS5A. Material Suplementario Tabla S4 : sustituciones de aminoácidos en proteína NS5B no previamente asociadas con resistencia a inhibidores de polimerasa. (Materiales Suplementarios)

¿Cómo puede disminuirse la eficacia de los ADA?

El tratamiento de la infección por el virus de la hepatitis C (VHC) ha cambiado drásticamente con el advenimiento de agentes antivirales de acción directa (DAAs) en pacientes infectados del genotipo 1 uruguayoshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6112080/SHA: f01ad3545245b4f884b48aa2b69c9deb942c3e77Autores: Aldunate, Fabián; Echeverría, Natalia; Chiodi, Daniela; López, Pablo; Sánchez-Cicerón, Adriana; Fajardo, Alvaro; Soñora, Martín; Cristina, Juan; Hernández, Nelia; Moreno, PilarFecha: 2018-08-14DOI: 10.1155/2018/2514901Li Sin embargo, la eficacia de los ADA puede ser atenuada por la presencia de sustituciones asociadas a la resistencia (RASs) antes y después del tratamiento. De hecho, los ASA detectados en pacientes infectados por el VHC no tratados previamente por el DAA podrían ser útiles para el manejo clínico y la predicción de los resultados. Aunque la frecuencia de NS5A y NS5B del VHC se ha abordado en muchos países, sólo hay unos pocos informes sobre su prevalencia en la región sudamericana. El objetivo de este estudio fue investigar la presencia de RASs a los inhibidores NS5A y NS5B en un tratamiento DAA cohorte naive de pacientes uruguayos infectados con hepatitis C crónica y compararlos con informes de otros países sudamericanos. Aquí se encontró que las sustituciones naturales que confieren resistencia a los inhibidores del NS5A y NS5B estaban presentes en el Es importante destacar que las sustituciones basales en NS5A y NS5B aquí identificadas difieren de los estudios previamente reportados en Brasil. Además, las cepas uruguayas subtipo 1a agrupadas dentro de todos los principales clados mundiales, demostrando que las variantes del VHC que circulan actualmente en este país se caracterizan por una notable diversidad genética. Texto: Tratamiento de infección por el virus de la hepatitis C (VHC) ha mejorado dramáticamente gracias a la introducción de agentes antivirales de acción directa (DAAs). Estos antivirales han aumentado significativamente las tasas de respuesta (hasta el 98%) y reducido considerablemente la duración del tratamiento [1]. En la actualidad, los ADA disponibles se clasifican en cuatro categorías, dados sus objetivos moleculares en el ciclo de replicación del VHC: (1) los inhibidores de la proteasa NS3/4A (IP) se unen al sitio activo de la proteasa NS3/4A; (2) los inhibidores de la NS5A interactúan con el dominio 1 del dímero NS5A, aunque el mecanismo exacto de inhibición del NS5A sigue estando totalmente elucidado; (3) los inhibidores análogos de la polimerasa NS5B nucleosidos se incorporan a la cadena de ARN naciente, lo que da lugar a la terminación de la cadena al comprometer la unión del nucleótido entrante; (4) los inhibidores de la polimerasa NS5B no nucleósidos interactúan con el dominio del pulgar 1, pulgar 2, palma 1 o palma 2 de NS5B e inhiben la actividad Sin embargo, la mutación extrema y las altas tasas de replicación del VHC, junto con la presión del sistema inmunitario, conducen a una notable variabilidad genética que puede comprometer las altas tasas de respuesta a los AAD debido a la preexistencia de sustituciones asociadas a la resistencia (RASs) [5, 6]. Cada fármaco o clase de AAD se caracteriza por perfiles de resistencia específicos.La probabilidad de que un AAD seleccione y permita el crecimiento de poblaciones virales portadoras de RAS depende de la barrera genética del AAD a la resistencia (el número y tipo de mutaciones necesarias para generar una sustitución de aminoácidos que confiere resistencia), la aptitud viral (capacidad replicativa) de la variante resistente, y los genotipos virales y subtipos [7, 8]. La prevalencia de RAS en pacientes no tratados previamente ha sido ampliamente reportada en todo el mundo [9] [10] [11] [11] [14] [16] Sin embargo, aparte de Brasil y Argentina, este tema aún no ha sido tratado plenamente en otros países sudamericanos [9, [17] [18] [19]. La falta de información en relación con los SRAs basales preexistentes, sumados al alto costo de estos nuevos fármacos, son los principales factores limitantes para la amplia implementación de estas nuevas terapias en Uruguay, así como en otros países latinoamericanos (ingreso bajo o bajo medio) [20]. En este estudio, exploramos la presencia de variantes de resistencia a inhibidores NS5A y NS5B en una cohorte de tratamiento de la DAA naïve de pacientes uruguayas crónicamente infectados con hepatitis C. Aquí, nos propusimos contribuir al conocimiento de la circulación de variantes resistentes al VHC en la región sudamericana. Se obtuvieron muestras séricas de 31 pacientes con marcadores serológicos del VHC, que fueron reclutados entre 2015 y 2017 en la Clínica de Gastroenterología del Hospital de Clínicas, Montevideo, Uruguay. La infección por VHC fue confirmada por Abbott en tiempo real VHC (Abbott Molecular Inc., Des Plaines, EE.UU.). Los pacientes seleccionados para este estudio fueron infectados crónicamente con genotipo 1 del VHC y DAA no tratados previamente en el momento de la extracción de sangre. Se obtuvo el consentimiento informado escrito de todos los pacientes. Los estudios se han realizado de acuerdo con la Declaración de la Asociación Médica Mundial de Helsinki y fueron aprobados por la junta institucional correspondiente (Comité ético Hospital de Clínicas). 2.2. Extracción de ARN, síntesis de cDNA y amplificación NS5A y NS5B. El ARN viral se extrajo de 140 μl de suero utilizando el kit de ARN viral QIAamp (QIAgen, Hilden, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ARN viral se calentó a 65°C durante 5 minutos y se utilizó como plantilla para una reacción de transcripción inversa. La mezcla de reacción de transcripción inversa contenía 5 μl de la plantilla de ARN, 1 μl de hexamero aleatorio 100 ng/μl (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.), 1 μl de dNTP mix (10 mM cada uno), 4 μl de búfer de primera cadena 5X, 2 μl de 0,1 M DTT, 1 μl de SuperScript II transcriptasa inversa (200 U/μl) (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.), y 1 μl (40 U/μl) RNaseOUT (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.). La transcripción inversa se realizó a 42 °C durante 50 min, y luego la enzima de transcriptasa inversa fue inactivada a 70 La amplificación PCR de las regiones del genoma NS5A y NS5B se realizó utilizando imprimaciones y condiciones descritas previamente [10]. Los amplificadores fueron purificados utilizando el kit de purificación de ADN y banda de gel Illustra GFX PCR (GE Healthcare Life Science, Buckinghamshire, Reino Unido) de acuerdo con el protocolo del fabricante. 2.3. Secuenciación NS5A y NS5B. El producto purificado fue secuenciado entonces utilizando los mismos conjuntos de imprimaciones utilizados para amplificación PCR. La secuenciación Sanger bidireccional fue realizada por Macrogen Korea (http://www.macrogen.com). 2.4. Determinación del Genotipo NS5A y NS5B. Las secuencias de consenso VHC NS5A y NS5B obtenidas de pacientes uruguayos fueron alineadas con secuencias del VHC que representaban todos Estas secuencias se obtuvieron de la base de datos de secuencias de VHC de Los Alamos y de la base de datos y recurso de análisis de virus patógenos de NIAID (ViPR) [21, 22]. Para las cepas incluidas en estos estudios, ver Tabla de Material Suplementario S1. Las secuencias se alinearon utilizando el software CLUSTAL W [23]. Una vez alineado, el mejor modelo evolutivo que describió nuestros datos de secuencias se evaluó utilizando el programa ModelGenerator [24]. Utilizando el modelo GTR + G + I (tiempo general reversible + gamma + sitios invariantes), se construyeron árboles filogenéticos de máxima probabilidad tanto para NS5A como NS5B mediante el software MEGA 5.0 [25]. Para NS5A, se incluyeron 953 nucleótidos (posiciones 6367 a 7319, relativas a la cepa de referencia VHC 1a, H77 NC_004102) en el análisis filogenético, mientras que para NS5B, sólo se incluyeron 361 nucleótidos correspondientes a la región de Okamoto (posiciones 8265 a 8625, relativas a la cepa H77 NC_004102). Como medida de la robustez de cada nodo, se utilizó el método de arranque (1000 pseudoreplicados).Para NS5A 1a secuencias uruguayas (n = 20), se generó un segundo alineamiento y un árbol filogenético de máxima probabilidad para analizar las relaciones evolutivas del VHC entre cepas uruguayas, brasileñas y mundiales.Para las cepas no uruguayas incluidas en este análisis, véase la Tabla de Material Suplementa Para identificar adecuadamente los cambios de sustitución en las regiones NS5A y NS5B de cepas VHC que circulan en pacientes uruguayos, se generaron secuencias de consenso mundial para subtipos 1a y 1b utilizando una amplia gama de secuencias NS5A y NS5B de cepas VHC aisladas en todo el mundo. Para ello, se recuperaron secuencias de genes NS5A correspondientes a subtipos 1a (n = 160) y 1b (n = 88) de la base de datos de secuencias VHC de Los Alamos y de la NIAID ViPR [21, 22]. Asimismo, se generaron series de datos de 150 y 124 secuencias NS5B para subtipos 1a y 1b, respectivamente. Utilizando el programa Seqman, implementado en el paquete DNASTAR 5.01 (DNASTAR, Madison Cada secuencia uruguaya fue posteriormente alineada a las secuencias de referencia correspondientes, y luego traducida en silico. Las secuencias de aminoácidos obtenidas se compararon para explorar la presencia de RAS así como la presencia de polimorfismos en una posición RAS (RAP) en cepas uruguayas del VHC. Los RAP se definen como cualquier cambio de la secuencia de referencia para un genotipo específico en una posición asociada con resistencia NS5A [26]. Para estudiar la variabilidad genética de las regiones NS5A y NS5B de cepas del VHC que circulan en pacientes uruguayos, las secuencias de estas regiones (números de adhesión MH070029-MH070090) se alinearon con las secuencias correspondientes de 59 cepas del VHC aisladas en otros lugares, representando todos los genotipos y subtipos principales Los resultados de estos estudios se muestran en la Figura 1 Se asignaron todas las cepas en las filogenias de acuerdo a su genotipo, y cada grupo fue apoyado por valores de bootstrap muy altos para ambas regiones analizadas. Se asignaron cepas aisladas de pacientes uruguayos (n = 31) al genotipo 1, 20 de las cuales correspondían al subtipo 1a y 11 al subtipo 1b. Los resultados de NS5A (Figura 1 a)) y NS5B (Figura 1 Genotipo 1b análisis filogenéticos fueron concordantes para ambas regiones genómicas en las 31 secuencias, sugiriendo no eventos de recombinación entre estas regiones. Para analizar más a fondo las relaciones evolutivas entre las cepas uruguayas y las que circulan en Brasil y en otras partes, se construyó un árbol filogenético de segunda probabilidad máxima de secuencia Las secuencias brasileñas agrupadas en un gran grupo de secuencias relacionadas dentro del clado 1 [9]. Mientras que las cepas uruguayas NS5A (en rojo) no se agruparon en un determinado clado, sino que se agruparon dispersamente dentro de todos los principales clados mundiales. Con el propósito de estudiar las sustituciones de aminoácidos (AA) a lo largo de la proteína NS5A, se identificaron secuencias VHC AA uruguayas alineadas con secuencias de consenso mundial NS5A (residuos 23 a 354 en relación con la secuencia de proteína NS5A). Se identificaron sustituciones AA en posiciones que anteriormente se encontraban potencialmente asociadas con resistencia a inhibidores NS5A, así como polimorfismos en una posición RAS. Estos resultados se resumen en la Tabla 1. Se encontraron RAP en 3 cepas (subtipo 1a): 2 exhibieron la sustitución H58P y 1 la sustitución K24Q. Aunque estas sustituciones no fueron reportadas como resistentes, algunos cambios en estas posiciones fueron descritos previamente como RAS en el subtipo 1a, a saber, H58D y K24R [27, 28]. Finalmente, la sustitución E62D se encontró en una cepa subtipo 1a. Este cambio se considera como una sustitución secundaria porque, aunque no confiere resistencia por sí misma, cuando se combina con un RAS conocido que sí lo hace. De hecho, confiere un nivel de resistencia más alto que el alcanzado por el RAS solo [26]. Además, también se detectaron varios polimorfismos que no han sido reportados previamente como asociados con un fenotipo resistente (ver Tabla de Material Suplementario S3 ). Para estudiar las sustituciones a lo largo de la proteína NS5B, las secuencias VHC AA uruguayas se alinearon a las secuencias de consenso mundial NS5B. Se obtuvieron secuencias AA de casi toda la longitud en 26 de las 31 cepas analizadas. Se observaron residuos de 23 secuencias que abarcan 36 a 539, mientras que los restantes residuos de 3 lapsos de 36 a 557 de la proteína NS5B. Esta cuestión limitó nuestros estudios, ya que muchos de los RAS descritos se observaron como residuos 553. Es importante destacar que se observaron RAS a inhibidores NS5B (Tabla 2) en 5 cepas de 26 muestras secuenciadas (19,2%). Se encontró C451R en dos aislados, mientras que se encontró A421V en sólo uno. En 2 de las 3 cepas para las cuales pudimos obtener secuencias más largas, se observaron S556G RAS Finalmente, encontramos dos RAP: A421V (en cepas subtipo 1b de 2) y A553G (en cepa subtipo 1a de 1). Aunque A421V se ha asociado con resistencia a beclabuvir (BCV) en pacientes infectados con subtipo 1a de VHC, este fenotipo resistente no ha sido probado en cepas subtipo 1b [29]. En la posición 553, la sustitución reportada como resistente fue A553T [8]. Al igual que en el caso de NS5A, también se detectaron diferentes polimorfismos no asociados previamente con un fenotipo resistente en NS5B (ver Tabla de Material Suplementario S4 ). El advenimiento de las terapias DAAs constituye uno de los mayores avances en el manejo de pacientes infectados por VHC. Sin embargo, estas nuevas opciones de tratamiento están lejos de ser universalmente disponibles, Los principales factores limitantes para el acceso mundial a los ADA en nuestra región son el alto costo, la inadecuada gestión de los sistemas públicos de salud, el limitado acceso de las poblaciones de bajos ingresos o no aseguradas a los proveedores de salud, y la falta de información epidemiológica precisa [20, [30] [31] [32]. En Uruguay, estas terapias se hicieron recientemente disponibles, y aunque algunas han sido aprobadas para su uso por las autoridades de salud pública (terapias de Viekira pak y sofosbuvir/ledipasvir), actualmente no están cubiertas financieramente, excepto en casos específicos. A pesar de las altas tasas de respuesta viral logradas con los tratamientos basados en DAA, todavía 1-10% de los pacientes no logran eliminar la infección, y en estos casos, las variantes de resistencia basal y emergente resultan ser factores clave que contribuyen al fracaso del tratamiento [5, 17, 33]. Desafortunadamente, actualmente no podemos evaluar adecuadamente el número de personas infectadas por el VHC en Uruguay y aún más para averiguar la frecuencia y el tipo de SRA que circulan, hechos que podrían comprometer la efectividad de estas nuevas terapias en nuestro país. Hemos reportado anteriormente que existen sustituciones naturales que confieren resistencia a inhibidores del NS3 en una proporción significativa de pacientes uruguayos infectados con el genotipo 1 del VHC, y hemos demostrado que esta frecuencia parecía ser mayor que en otros países sudamericanos (Brasil y Argentina) [34]. El presente estudio describe la prevalencia de NS5A y NS5B RAS basales en pacientes infectados por el VHC genotipo 1 no infectados por DAA en una cohorte uruguaya. La presencia de sustituciones que confieren resistencia a los inhibidores de NS5A ha sido ampliamente reportada tanto en pacientes no tratados previamente como en pacientes con recaídas de Europa [10, 33, [35] [37] [37], EE.UU. [37, 39, 40], y Asia [42] [42]. Sin embargo, las secuencias de NS5A de América del Sur todavía están mal analizadas [9, 44]. Estudios recientes han revelado que la prevalencia media de NS5A genotipo 1 basal RASs a diferentes inhibidores oscila entre el 6% y el 16% utilizando secuenciación poblacional o secuenciación profunda [27, 37, 45, 46]. Es importante destacar que la prevalencia y el tipo de NS5A basales varía ligeramente según las regiones geográficas. Por ejemplo, se encontró L31M en el 2,2% de los pacientes infectados con genotipo 1a en Europa, en el 4,1% de los de Oceanía, y sorprendentemente en ningún paciente de los EE.UU. [27]. Por esta razón, creemos que es necesario aportar datos de nuestra región, para los cuales todavía no tenemos suficiente información, aparte de Brasil [9, 44]. Los resultados de este estudio indican la presencia de DAA NS5A RAS en 2 cepas del VHC (8% de los pacientes incluidos en este estudio), con RAS basal detectada en la posición 31 (ver Tabla 1 ). La sustitución L31M confiere resistencia a daclatasvir (DCV), ledipasvir (LDV) y elbasvir (EBV) en los subtipos 1a y 1b [5, 6, 8, 28, 47, 48], mientras que la sustitución L31V lo hace a DCV en los subtipos 1a y 1b, a LDV en el subtipo 1b y a EBV en el subtipo 1a [5, 6, 28]. Dado que tanto el L31V como el L31M son RAS clínicamente relevantes, su detección al inicio puede influir en la elección de regímenes de tratamiento de primera línea [28]. Las sustituciones H58P y K24Q encontradas en dos pacientes se consideran polimorfismos asociados a la resistencia (RAPs). Los RAS caracterizados en estas posiciones fueron H58D y K24G/N/R [5, 6, La sustitución H58P se encontró como RAP basal en recidivas a LDV (prescripción HARVONI, https://www.gilead.com/-/media/files/pdfs/medicaments/liver-diseasa/harvoni/harvoni_pi. pdf?la=en). Sin embargo, a veces se considera como una sustitución RAS [10, 51], a pesar de conferir solo un cambio de 1,2 veces en la resistencia en estudios in vitro utilizando el sistema 1a replicon [39]. No encontramos sustituciones M28T/V, Q30R/H, o Y93H, ya que se habían reportado previamente en Brasil y en todo el mundo [9, 27, 44]. La sustitución de aminoácidos E62H se encontró en un paciente uruguayo. Aunque este cambio no confiere resistencia por sí mismo sino La presencia de NS5A RAS basales impacta el resultado del tratamiento en algunos grupos de pacientes al afectar las tasas de RVS. La detección de NS5A preexistentes puede jugar un papel relevante en la elección de regímenes de tratamiento de primera línea o en la simplificación/acortamiento de los regímenes recomendados, con el fin de acercar las tasas de RVS a las más altas alcanzables [27, 38, 41, 53], en particular en países como Uruguay, donde sólo se aprueban dos regímenes de tratamiento diferentes que contienen DAA para su uso. En cuanto al gen NS5B, el análisis global (con excepción de Sudamérica [17, 19] ) reveló que las sustituciones de resistencia NS5B DAA son infrecuentes [14]. Las sustituciones encontradas en este trabajo fueron A421V y S556G asociadas en el subtipo 1a con resistencia a BCV y dasabuvir (DSV), respectivamente [8, 28, 29, 54, 55] y Q556R asociadas con resistencia a DSV tanto en el genotipo 1a como en el 1b [12, 28]. La sustitución C451R, observada en dos pacientes uruguayos, fue reportada previamente en pacientes que no lograron eliminar la infección después del tratamiento con OBV/PTV/r + DSV ± RBV. En estos casos, apareció en combinación con G558R (Trial Coral I-Cohort 2: http://www.hcv-trials.com/showStudy.asp?Study=86). También se encontraron RAP en las posiciones 421 y 553 (A421V en dos aislados del subtipo 1b y A553G en un aislado del subtipo 1b). Aunque A421V se ha asociado con resistencia a BCV en pacientes con subtipo 1a, este fenotipo no se ha demostrado en cepas del subtipo 1b [29]. En la posición 553, las sustituciones reportadas como resistentes son A553T en el subtipo 1a [8] y A553V en el subtipo 1b [54], lo que confiere resistencia a DSV. A diferencia de nuestros resultados, Noble y compañeros de trabajo (2016) reportaron la presencia de V321A, A421G, M414V, Y448H, L159F y C316N en aislados brasileños [17], sin embargo no se encontró ninguna de estas mutaciones en este estudio, probablemente debido a la diversidad encontrada entre cepas uruguayas y brasileñas (Figura 2 ). Sin embargo, se encontró sustitución A421V en Brasil [17], Argentina [19], y Uruguay. El RAS S282T no fue detectado ni en informes brasileños ni en este trabajo actual (Uruguay) [17, 18, 56]. Nuestros hallazgos confirman y complementan estudios previos que evidenciaron una baja prevalencia de esta sustitución in vivo, probablemente debido a su baja aptitud replicativa [14, 18, 57]. A pesar de nuestros resultados, no se ha demostrado que la presencia de NS5B RAS basales que confieren resistencia a los inhibidores de nucleótidos o no nucleósidos NS5B tenga ningún impacto en las respuestas virológicas hasta el momento [53, 58]. Estos resultados muestran tanto diversidad en los polimorfismos basales encontrados en diferentes países latinoamericanos como en las relaciones evolutivas de los aislados uruguayos (Figura 2 ). Este hecho podría estar relacionado no sólo con la región geográfica de los aislados y sus características intrínsecas virales sino también con el fondo genético del huésped. Vale la pena mencionar que vivimos en un vasto continente habitado por poblaciones con diferentes características genotípicas que, dependiendo de la situación, podrían requerir diferentes enfoques al tratamiento. De hecho, recientemente hemos encontrado que las frecuencias de alelo y genotipo en el locus IL28B de En conjunto, creemos que podría ser importante realizar estudios en toda la región sudamericana con el fin de establecer la prevalencia de RAS en NS5A y NS5B en diferentes países. De hecho, esto ayudará a entender que no todos los regímenes de tratamiento podrían ser adecuados para cada paciente y país. Los datos que presentamos aquí podrían guiar no sólo a los médicos en la toma de decisiones terapéuticas, sino también a las autoridades de salud pública en la aprobación de combinaciones de tratamiento más diversas. Estas formulaciones de tratamiento cubrirían la mayoría de las cepas circulantes en nuestra región, una región con una población de antecedentes genéticos muy diversa. Actualmente no está claro si las variantes virales preexistentes con menor susceptibilidad a los ADA son clínicamente relevantes para la predicción del fracaso del tratamiento virológico. Sin embargo, la terapia de DAA individualizada basada en el análisis de resistencia basal puede ser beneficiosa para optimizar la eficacia del tratamiento en pacientes con infección por VHC genotipo 1 y factores de riesgo para el fracaso del tratamiento. Por lo tanto, el papel potencial de las pruebas de resistencia basal sigue siendo un área de investigación crítica y preguntas clínicas.Los datos utilizados para apoyar los hallazgos de este estudio se incluyen en el artículo.Los autores declaran que no tienen conflictos de interés. Fabián Aldunate y Natalia Echeverría contribuyeron igualmente a este trabajo. Material Suplementario Tabla S2 : Secuencias del subtipo 1a del Virus de la hepatitis C NS5A utilizadas para revelar relaciones evolutivas entre cepas uruguayas y otras aisladas en otros lugares. Se indica su país de aislamiento correspondiente y número de adhesión de GenBank. Material Suplementario Tabla S3 : sustituciones de aminoácidos en proteína NS5A no previamente asociadas con resistencia a inhibidores de NS5A. Material Suplementario Tabla S4 : sustituciones de aminoácidos en proteína NS5B no previamente asociadas con resistencia a inhibidores de polimerasa. (Materiales Suplementarios)

¿Fue la tasa de respuesta del virus de la hepatitis C a los tratamientos antivirales de acción directa?

El tratamiento de la infección por el virus de la hepatitis C (VHC) ha cambiado drásticamente con el advenimiento de agentes antivirales de acción directa (DAAs) en pacientes infectados del genotipo 1 uruguayoshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6112080/SHA: f01ad3545245b4f884b48aa2b69c9deb942c3e77Autores: Aldunate, Fabián; Echeverría, Natalia; Chiodi, Daniela; López, Pablo; Sánchez-Cicerón, Adriana; Fajardo, Alvaro; Soñora, Martín; Cristina, Juan; Hernández, Nelia; Moreno, PilarFecha: 2018-08-14DOI: 10.1155/2018/2514901Li Sin embargo, la eficacia de los ADA puede ser atenuada por la presencia de sustituciones asociadas a la resistencia (RASs) antes y después del tratamiento. De hecho, los ASA detectados en pacientes infectados por el VHC no tratados previamente por el DAA podrían ser útiles para el manejo clínico y la predicción de los resultados. Aunque la frecuencia de NS5A y NS5B del VHC se ha abordado en muchos países, sólo hay unos pocos informes sobre su prevalencia en la región sudamericana. El objetivo de este estudio fue investigar la presencia de RASs a los inhibidores NS5A y NS5B en un tratamiento DAA cohorte naive de pacientes uruguayos infectados con hepatitis C crónica y compararlos con informes de otros países sudamericanos. Aquí se encontró que las sustituciones naturales que confieren resistencia a los inhibidores del NS5A y NS5B estaban presentes en el Es importante destacar que las sustituciones basales en NS5A y NS5B aquí identificadas difieren de los estudios previamente reportados en Brasil. Además, las cepas uruguayas subtipo 1a agrupadas dentro de todos los principales clados mundiales, demostrando que las variantes del VHC que circulan actualmente en este país se caracterizan por una notable diversidad genética. Texto: Tratamiento de infección por el virus de la hepatitis C (VHC) ha mejorado dramáticamente gracias a la introducción de agentes antivirales de acción directa (DAAs). Estos antivirales han aumentado significativamente las tasas de respuesta (hasta el 98%) y reducido considerablemente la duración del tratamiento [1]. En la actualidad, los ADA disponibles se clasifican en cuatro categorías, dados sus objetivos moleculares en el ciclo de replicación del VHC: (1) los inhibidores de la proteasa NS3/4A (IP) se unen al sitio activo de la proteasa NS3/4A; (2) los inhibidores de la NS5A interactúan con el dominio 1 del dímero NS5A, aunque el mecanismo exacto de inhibición del NS5A sigue estando totalmente elucidado; (3) los inhibidores análogos de la polimerasa NS5B nucleosidos se incorporan a la cadena de ARN naciente, lo que da lugar a la terminación de la cadena al comprometer la unión del nucleótido entrante; (4) los inhibidores de la polimerasa NS5B no nucleósidos interactúan con el dominio del pulgar 1, pulgar 2, palma 1 o palma 2 de NS5B e inhiben la actividad Sin embargo, la mutación extrema y las altas tasas de replicación del VHC, junto con la presión del sistema inmunitario, conducen a una notable variabilidad genética que puede comprometer las altas tasas de respuesta a los AAD debido a la preexistencia de sustituciones asociadas a la resistencia (RASs) [5, 6]. Cada fármaco o clase de AAD se caracteriza por perfiles de resistencia específicos.La probabilidad de que un AAD seleccione y permita el crecimiento de poblaciones virales portadoras de RAS depende de la barrera genética del AAD a la resistencia (el número y tipo de mutaciones necesarias para generar una sustitución de aminoácidos que confiere resistencia), la aptitud viral (capacidad replicativa) de la variante resistente, y los genotipos virales y subtipos [7, 8]. La prevalencia de RAS en pacientes no tratados previamente ha sido ampliamente reportada en todo el mundo [9] [10] [11] [11] [14] [16] Sin embargo, aparte de Brasil y Argentina, este tema aún no ha sido tratado plenamente en otros países sudamericanos [9, [17] [18] [19]. La falta de información en relación con los SRAs basales preexistentes, sumados al alto costo de estos nuevos fármacos, son los principales factores limitantes para la amplia implementación de estas nuevas terapias en Uruguay, así como en otros países latinoamericanos (ingreso bajo o bajo medio) [20]. En este estudio, exploramos la presencia de variantes de resistencia a inhibidores NS5A y NS5B en una cohorte de tratamiento de la DAA naïve de pacientes uruguayas crónicamente infectados con hepatitis C. Aquí, nos propusimos contribuir al conocimiento de la circulación de variantes resistentes al VHC en la región sudamericana. Se obtuvieron muestras séricas de 31 pacientes con marcadores serológicos del VHC, que fueron reclutados entre 2015 y 2017 en la Clínica de Gastroenterología del Hospital de Clínicas, Montevideo, Uruguay. La infección por VHC fue confirmada por Abbott en tiempo real VHC (Abbott Molecular Inc., Des Plaines, EE.UU.). Los pacientes seleccionados para este estudio fueron infectados crónicamente con genotipo 1 del VHC y DAA no tratados previamente en el momento de la extracción de sangre. Se obtuvo el consentimiento informado escrito de todos los pacientes. Los estudios se han realizado de acuerdo con la Declaración de la Asociación Médica Mundial de Helsinki y fueron aprobados por la junta institucional correspondiente (Comité ético Hospital de Clínicas). 2.2. Extracción de ARN, síntesis de cDNA y amplificación NS5A y NS5B. El ARN viral se extrajo de 140 μl de suero utilizando el kit de ARN viral QIAamp (QIAgen, Hilden, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ARN viral se calentó a 65°C durante 5 minutos y se utilizó como plantilla para una reacción de transcripción inversa. La mezcla de reacción de transcripción inversa contenía 5 μl de la plantilla de ARN, 1 μl de hexamero aleatorio 100 ng/μl (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.), 1 μl de dNTP mix (10 mM cada uno), 4 μl de búfer de primera cadena 5X, 2 μl de 0,1 M DTT, 1 μl de SuperScript II transcriptasa inversa (200 U/μl) (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.), y 1 μl (40 U/μl) RNaseOUT (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.). La transcripción inversa se realizó a 42 °C durante 50 min, y luego la enzima de transcriptasa inversa fue inactivada a 70 La amplificación PCR de las regiones del genoma NS5A y NS5B se realizó utilizando imprimaciones y condiciones descritas previamente [10]. Los amplificadores fueron purificados utilizando el kit de purificación de ADN y banda de gel Illustra GFX PCR (GE Healthcare Life Science, Buckinghamshire, Reino Unido) de acuerdo con el protocolo del fabricante. 2.3. Secuenciación NS5A y NS5B. El producto purificado fue secuenciado entonces utilizando los mismos conjuntos de imprimaciones utilizados para amplificación PCR. La secuenciación Sanger bidireccional fue realizada por Macrogen Korea (http://www.macrogen.com). 2.4. Determinación del Genotipo NS5A y NS5B. Las secuencias de consenso VHC NS5A y NS5B obtenidas de pacientes uruguayos fueron alineadas con secuencias del VHC que representaban todos Estas secuencias se obtuvieron de la base de datos de secuencias de VHC de Los Alamos y de la base de datos y recurso de análisis de virus patógenos de NIAID (ViPR) [21, 22]. Para las cepas incluidas en estos estudios, ver Tabla de Material Suplementario S1. Las secuencias se alinearon utilizando el software CLUSTAL W [23]. Una vez alineado, el mejor modelo evolutivo que describió nuestros datos de secuencias se evaluó utilizando el programa ModelGenerator [24]. Utilizando el modelo GTR + G + I (tiempo general reversible + gamma + sitios invariantes), se construyeron árboles filogenéticos de máxima probabilidad tanto para NS5A como NS5B mediante el software MEGA 5.0 [25]. Para NS5A, se incluyeron 953 nucleótidos (posiciones 6367 a 7319, relativas a la cepa de referencia VHC 1a, H77 NC_004102) en el análisis filogenético, mientras que para NS5B, sólo se incluyeron 361 nucleótidos correspondientes a la región de Okamoto (posiciones 8265 a 8625, relativas a la cepa H77 NC_004102). Como medida de la robustez de cada nodo, se utilizó el método de arranque (1000 pseudoreplicados).Para NS5A 1a secuencias uruguayas (n = 20), se generó un segundo alineamiento y un árbol filogenético de máxima probabilidad para analizar las relaciones evolutivas del VHC entre cepas uruguayas, brasileñas y mundiales.Para las cepas no uruguayas incluidas en este análisis, véase la Tabla de Material Suplementa Para identificar adecuadamente los cambios de sustitución en las regiones NS5A y NS5B de cepas VHC que circulan en pacientes uruguayos, se generaron secuencias de consenso mundial para subtipos 1a y 1b utilizando una amplia gama de secuencias NS5A y NS5B de cepas VHC aisladas en todo el mundo. Para ello, se recuperaron secuencias de genes NS5A correspondientes a subtipos 1a (n = 160) y 1b (n = 88) de la base de datos de secuencias VHC de Los Alamos y de la NIAID ViPR [21, 22]. Asimismo, se generaron series de datos de 150 y 124 secuencias NS5B para subtipos 1a y 1b, respectivamente. Utilizando el programa Seqman, implementado en el paquete DNASTAR 5.01 (DNASTAR, Madison Cada secuencia uruguaya fue posteriormente alineada a las secuencias de referencia correspondientes, y luego traducida en silico. Las secuencias de aminoácidos obtenidas se compararon para explorar la presencia de RAS así como la presencia de polimorfismos en una posición RAS (RAP) en cepas uruguayas del VHC. Los RAP se definen como cualquier cambio de la secuencia de referencia para un genotipo específico en una posición asociada con resistencia NS5A [26]. Para estudiar la variabilidad genética de las regiones NS5A y NS5B de cepas del VHC que circulan en pacientes uruguayos, las secuencias de estas regiones (números de adhesión MH070029-MH070090) se alinearon con las secuencias correspondientes de 59 cepas del VHC aisladas en otros lugares, representando todos los genotipos y subtipos principales Los resultados de estos estudios se muestran en la Figura 1 Se asignaron todas las cepas en las filogenias de acuerdo a su genotipo, y cada grupo fue apoyado por valores de bootstrap muy altos para ambas regiones analizadas. Se asignaron cepas aisladas de pacientes uruguayos (n = 31) al genotipo 1, 20 de las cuales correspondían al subtipo 1a y 11 al subtipo 1b. Los resultados de NS5A (Figura 1 a)) y NS5B (Figura 1 Genotipo 1b análisis filogenéticos fueron concordantes para ambas regiones genómicas en las 31 secuencias, sugiriendo no eventos de recombinación entre estas regiones. Para analizar más a fondo las relaciones evolutivas entre las cepas uruguayas y las que circulan en Brasil y en otras partes, se construyó un árbol filogenético de segunda probabilidad máxima de secuencia Las secuencias brasileñas agrupadas en un gran grupo de secuencias relacionadas dentro del clado 1 [9]. Mientras que las cepas uruguayas NS5A (en rojo) no se agruparon en un determinado clado, sino que se agruparon dispersamente dentro de todos los principales clados mundiales. Con el propósito de estudiar las sustituciones de aminoácidos (AA) a lo largo de la proteína NS5A, se identificaron secuencias VHC AA uruguayas alineadas con secuencias de consenso mundial NS5A (residuos 23 a 354 en relación con la secuencia de proteína NS5A). Se identificaron sustituciones AA en posiciones que anteriormente se encontraban potencialmente asociadas con resistencia a inhibidores NS5A, así como polimorfismos en una posición RAS. Estos resultados se resumen en la Tabla 1. Se encontraron RAP en 3 cepas (subtipo 1a): 2 exhibieron la sustitución H58P y 1 la sustitución K24Q. Aunque estas sustituciones no fueron reportadas como resistentes, algunos cambios en estas posiciones fueron descritos previamente como RAS en el subtipo 1a, a saber, H58D y K24R [27, 28]. Finalmente, la sustitución E62D se encontró en una cepa subtipo 1a. Este cambio se considera como una sustitución secundaria porque, aunque no confiere resistencia por sí misma, cuando se combina con un RAS conocido que sí lo hace. De hecho, confiere un nivel de resistencia más alto que el alcanzado por el RAS solo [26]. Además, también se detectaron varios polimorfismos que no han sido reportados previamente como asociados con un fenotipo resistente (ver Tabla de Material Suplementario S3 ). Para estudiar las sustituciones a lo largo de la proteína NS5B, las secuencias VHC AA uruguayas se alinearon a las secuencias de consenso mundial NS5B. Se obtuvieron secuencias AA de casi toda la longitud en 26 de las 31 cepas analizadas. Se observaron residuos de 23 secuencias que abarcan 36 a 539, mientras que los restantes residuos de 3 lapsos de 36 a 557 de la proteína NS5B. Esta cuestión limitó nuestros estudios, ya que muchos de los RAS descritos se observaron como residuos 553. Es importante destacar que se observaron RAS a inhibidores NS5B (Tabla 2) en 5 cepas de 26 muestras secuenciadas (19,2%). Se encontró C451R en dos aislados, mientras que se encontró A421V en sólo uno. En 2 de las 3 cepas para las cuales pudimos obtener secuencias más largas, se observaron S556G RAS Finalmente, encontramos dos RAP: A421V (en cepas subtipo 1b de 2) y A553G (en cepa subtipo 1a de 1). Aunque A421V se ha asociado con resistencia a beclabuvir (BCV) en pacientes infectados con subtipo 1a de VHC, este fenotipo resistente no ha sido probado en cepas subtipo 1b [29]. En la posición 553, la sustitución reportada como resistente fue A553T [8]. Al igual que en el caso de NS5A, también se detectaron diferentes polimorfismos no asociados previamente con un fenotipo resistente en NS5B (ver Tabla de Material Suplementario S4 ). El advenimiento de las terapias DAAs constituye uno de los mayores avances en el manejo de pacientes infectados por VHC. Sin embargo, estas nuevas opciones de tratamiento están lejos de ser universalmente disponibles, Los principales factores limitantes para el acceso mundial a los ADA en nuestra región son el alto costo, la inadecuada gestión de los sistemas públicos de salud, el limitado acceso de las poblaciones de bajos ingresos o no aseguradas a los proveedores de salud, y la falta de información epidemiológica precisa [20, [30] [31] [32]. En Uruguay, estas terapias se hicieron recientemente disponibles, y aunque algunas han sido aprobadas para su uso por las autoridades de salud pública (terapias de Viekira pak y sofosbuvir/ledipasvir), actualmente no están cubiertas financieramente, excepto en casos específicos. A pesar de las altas tasas de respuesta viral logradas con los tratamientos basados en DAA, todavía 1-10% de los pacientes no logran eliminar la infección, y en estos casos, las variantes de resistencia basal y emergente resultan ser factores clave que contribuyen al fracaso del tratamiento [5, 17, 33]. Desafortunadamente, actualmente no podemos evaluar adecuadamente el número de personas infectadas por el VHC en Uruguay y aún más para averiguar la frecuencia y el tipo de SRA que circulan, hechos que podrían comprometer la efectividad de estas nuevas terapias en nuestro país. Hemos reportado anteriormente que existen sustituciones naturales que confieren resistencia a inhibidores del NS3 en una proporción significativa de pacientes uruguayos infectados con el genotipo 1 del VHC, y hemos demostrado que esta frecuencia parecía ser mayor que en otros países sudamericanos (Brasil y Argentina) [34]. El presente estudio describe la prevalencia de NS5A y NS5B RAS basales en pacientes infectados por el VHC genotipo 1 no infectados por DAA en una cohorte uruguaya. La presencia de sustituciones que confieren resistencia a los inhibidores de NS5A ha sido ampliamente reportada tanto en pacientes no tratados previamente como en pacientes con recaídas de Europa [10, 33, [35] [37] [37], EE.UU. [37, 39, 40], y Asia [42] [42]. Sin embargo, las secuencias de NS5A de América del Sur todavía están mal analizadas [9, 44]. Estudios recientes han revelado que la prevalencia media de NS5A genotipo 1 basal RASs a diferentes inhibidores oscila entre el 6% y el 16% utilizando secuenciación poblacional o secuenciación profunda [27, 37, 45, 46]. Es importante destacar que la prevalencia y el tipo de NS5A basales varía ligeramente según las regiones geográficas. Por ejemplo, se encontró L31M en el 2,2% de los pacientes infectados con genotipo 1a en Europa, en el 4,1% de los de Oceanía, y sorprendentemente en ningún paciente de los EE.UU. [27]. Por esta razón, creemos que es necesario aportar datos de nuestra región, para los cuales todavía no tenemos suficiente información, aparte de Brasil [9, 44]. Los resultados de este estudio indican la presencia de DAA NS5A RAS en 2 cepas del VHC (8% de los pacientes incluidos en este estudio), con RAS basal detectada en la posición 31 (ver Tabla 1 ). La sustitución L31M confiere resistencia a daclatasvir (DCV), ledipasvir (LDV) y elbasvir (EBV) en los subtipos 1a y 1b [5, 6, 8, 28, 47, 48], mientras que la sustitución L31V lo hace a DCV en los subtipos 1a y 1b, a LDV en el subtipo 1b y a EBV en el subtipo 1a [5, 6, 28]. Dado que tanto el L31V como el L31M son RAS clínicamente relevantes, su detección al inicio puede influir en la elección de regímenes de tratamiento de primera línea [28]. Las sustituciones H58P y K24Q encontradas en dos pacientes se consideran polimorfismos asociados a la resistencia (RAPs). Los RAS caracterizados en estas posiciones fueron H58D y K24G/N/R [5, 6, La sustitución H58P se encontró como RAP basal en recidivas a LDV (prescripción HARVONI, https://www.gilead.com/-/media/files/pdfs/medicaments/liver-diseasa/harvoni/harvoni_pi. pdf?la=en). Sin embargo, a veces se considera como una sustitución RAS [10, 51], a pesar de conferir solo un cambio de 1,2 veces en la resistencia en estudios in vitro utilizando el sistema 1a replicon [39]. No encontramos sustituciones M28T/V, Q30R/H, o Y93H, ya que se habían reportado previamente en Brasil y en todo el mundo [9, 27, 44]. La sustitución de aminoácidos E62H se encontró en un paciente uruguayo. Aunque este cambio no confiere resistencia por sí mismo sino La presencia de NS5A RAS basales impacta el resultado del tratamiento en algunos grupos de pacientes al afectar las tasas de RVS. La detección de NS5A preexistentes puede jugar un papel relevante en la elección de regímenes de tratamiento de primera línea o en la simplificación/acortamiento de los regímenes recomendados, con el fin de acercar las tasas de RVS a las más altas alcanzables [27, 38, 41, 53], en particular en países como Uruguay, donde sólo se aprueban dos regímenes de tratamiento diferentes que contienen DAA para su uso. En cuanto al gen NS5B, el análisis global (con excepción de Sudamérica [17, 19] ) reveló que las sustituciones de resistencia NS5B DAA son infrecuentes [14]. Las sustituciones encontradas en este trabajo fueron A421V y S556G asociadas en el subtipo 1a con resistencia a BCV y dasabuvir (DSV), respectivamente [8, 28, 29, 54, 55] y Q556R asociadas con resistencia a DSV tanto en el genotipo 1a como en el 1b [12, 28]. La sustitución C451R, observada en dos pacientes uruguayos, fue reportada previamente en pacientes que no lograron eliminar la infección después del tratamiento con OBV/PTV/r + DSV ± RBV. En estos casos, apareció en combinación con G558R (Trial Coral I-Cohort 2: http://www.hcv-trials.com/showStudy.asp?Study=86). También se encontraron RAP en las posiciones 421 y 553 (A421V en dos aislados del subtipo 1b y A553G en un aislado del subtipo 1b). Aunque A421V se ha asociado con resistencia a BCV en pacientes con subtipo 1a, este fenotipo no se ha demostrado en cepas del subtipo 1b [29]. En la posición 553, las sustituciones reportadas como resistentes son A553T en el subtipo 1a [8] y A553V en el subtipo 1b [54], lo que confiere resistencia a DSV. A diferencia de nuestros resultados, Noble y compañeros de trabajo (2016) reportaron la presencia de V321A, A421G, M414V, Y448H, L159F y C316N en aislados brasileños [17], sin embargo no se encontró ninguna de estas mutaciones en este estudio, probablemente debido a la diversidad encontrada entre cepas uruguayas y brasileñas (Figura 2 ). Sin embargo, se encontró sustitución A421V en Brasil [17], Argentina [19], y Uruguay. El RAS S282T no fue detectado ni en informes brasileños ni en este trabajo actual (Uruguay) [17, 18, 56]. Nuestros hallazgos confirman y complementan estudios previos que evidenciaron una baja prevalencia de esta sustitución in vivo, probablemente debido a su baja aptitud replicativa [14, 18, 57]. A pesar de nuestros resultados, no se ha demostrado que la presencia de NS5B RAS basales que confieren resistencia a los inhibidores de nucleótidos o no nucleósidos NS5B tenga ningún impacto en las respuestas virológicas hasta el momento [53, 58]. Estos resultados muestran tanto diversidad en los polimorfismos basales encontrados en diferentes países latinoamericanos como en las relaciones evolutivas de los aislados uruguayos (Figura 2 ). Este hecho podría estar relacionado no sólo con la región geográfica de los aislados y sus características intrínsecas virales sino también con el fondo genético del huésped. Vale la pena mencionar que vivimos en un vasto continente habitado por poblaciones con diferentes características genotípicas que, dependiendo de la situación, podrían requerir diferentes enfoques al tratamiento. De hecho, recientemente hemos encontrado que las frecuencias de alelo y genotipo en el locus IL28B de En conjunto, creemos que podría ser importante realizar estudios en toda la región sudamericana con el fin de establecer la prevalencia de RAS en NS5A y NS5B en diferentes países. De hecho, esto ayudará a entender que no todos los regímenes de tratamiento podrían ser adecuados para cada paciente y país. Los datos que presentamos aquí podrían guiar no sólo a los médicos en la toma de decisiones terapéuticas, sino también a las autoridades de salud pública en la aprobación de combinaciones de tratamiento más diversas. Estas formulaciones de tratamiento cubrirían la mayoría de las cepas circulantes en nuestra región, una región con una población de antecedentes genéticos muy diversa. Actualmente no está claro si las variantes virales preexistentes con menor susceptibilidad a los ADA son clínicamente relevantes para la predicción del fracaso del tratamiento virológico. Sin embargo, la terapia de DAA individualizada basada en el análisis de resistencia basal puede ser beneficiosa para optimizar la eficacia del tratamiento en pacientes con infección por VHC genotipo 1 y factores de riesgo para el fracaso del tratamiento. Por lo tanto, el papel potencial de las pruebas de resistencia basal sigue siendo un área de investigación crítica y preguntas clínicas.Los datos utilizados para apoyar los hallazgos de este estudio se incluyen en el artículo.Los autores declaran que no tienen conflictos de interés. Fabián Aldunate y Natalia Echeverría contribuyeron igualmente a este trabajo. Material Suplementario Tabla S2 : Secuencias del subtipo 1a del Virus de la hepatitis C NS5A utilizadas para revelar relaciones evolutivas entre cepas uruguayas y otras aisladas en otros lugares. Se indica su país de aislamiento correspondiente y número de adhesión de GenBank. Material Suplementario Tabla S3 : sustituciones de aminoácidos en proteína NS5A no previamente asociadas con resistencia a inhibidores de NS5A. Material Suplementario Tabla S4 : sustituciones de aminoácidos en proteína NS5B no previamente asociadas con resistencia a inhibidores de polimerasa. (Materiales Suplementarios)

¿Cuántos pacientes fueron estudiados?

El tratamiento de la infección por el virus de la hepatitis C (VHC) ha cambiado drásticamente con el advenimiento de agentes antivirales de acción directa (DAAs) en pacientes infectados del genotipo 1 uruguayoshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6112080/SHA: f01ad3545245b4f884b48aa2b69c9deb942c3e77Autores: Aldunate, Fabián; Echeverría, Natalia; Chiodi, Daniela; López, Pablo; Sánchez-Cicerón, Adriana; Fajardo, Alvaro; Soñora, Martín; Cristina, Juan; Hernández, Nelia; Moreno, PilarFecha: 2018-08-14DOI: 10.1155/2018/2514901Li Sin embargo, la eficacia de los ADA puede ser atenuada por la presencia de sustituciones asociadas a la resistencia (RASs) antes y después del tratamiento. De hecho, los ASA detectados en pacientes infectados por el VHC no tratados previamente por el DAA podrían ser útiles para el manejo clínico y la predicción de los resultados. Aunque la frecuencia de NS5A y NS5B del VHC se ha abordado en muchos países, sólo hay unos pocos informes sobre su prevalencia en la región sudamericana. El objetivo de este estudio fue investigar la presencia de RASs a los inhibidores NS5A y NS5B en un tratamiento DAA cohorte naive de pacientes uruguayos infectados con hepatitis C crónica y compararlos con informes de otros países sudamericanos. Aquí se encontró que las sustituciones naturales que confieren resistencia a los inhibidores del NS5A y NS5B estaban presentes en el Es importante destacar que las sustituciones basales en NS5A y NS5B aquí identificadas difieren de los estudios previamente reportados en Brasil. Además, las cepas uruguayas subtipo 1a agrupadas dentro de todos los principales clados mundiales, demostrando que las variantes del VHC que circulan actualmente en este país se caracterizan por una notable diversidad genética. Texto: Tratamiento de infección por el virus de la hepatitis C (VHC) ha mejorado dramáticamente gracias a la introducción de agentes antivirales de acción directa (DAAs). Estos antivirales han aumentado significativamente las tasas de respuesta (hasta el 98%) y reducido considerablemente la duración del tratamiento [1]. En la actualidad, los ADA disponibles se clasifican en cuatro categorías, dados sus objetivos moleculares en el ciclo de replicación del VHC: (1) los inhibidores de la proteasa NS3/4A (IP) se unen al sitio activo de la proteasa NS3/4A; (2) los inhibidores de la NS5A interactúan con el dominio 1 del dímero NS5A, aunque el mecanismo exacto de inhibición del NS5A sigue estando totalmente elucidado; (3) los inhibidores análogos de la polimerasa NS5B nucleosidos se incorporan a la cadena de ARN naciente, lo que da lugar a la terminación de la cadena al comprometer la unión del nucleótido entrante; (4) los inhibidores de la polimerasa NS5B no nucleósidos interactúan con el dominio del pulgar 1, pulgar 2, palma 1 o palma 2 de NS5B e inhiben la actividad Sin embargo, la mutación extrema y las altas tasas de replicación del VHC, junto con la presión del sistema inmunitario, conducen a una notable variabilidad genética que puede comprometer las altas tasas de respuesta a los AAD debido a la preexistencia de sustituciones asociadas a la resistencia (RASs) [5, 6]. Cada fármaco o clase de AAD se caracteriza por perfiles de resistencia específicos.La probabilidad de que un AAD seleccione y permita el crecimiento de poblaciones virales portadoras de RAS depende de la barrera genética del AAD a la resistencia (el número y tipo de mutaciones necesarias para generar una sustitución de aminoácidos que confiere resistencia), la aptitud viral (capacidad replicativa) de la variante resistente, y los genotipos virales y subtipos [7, 8]. La prevalencia de RAS en pacientes no tratados previamente ha sido ampliamente reportada en todo el mundo [9] [10] [11] [11] [14] [16] Sin embargo, aparte de Brasil y Argentina, este tema aún no ha sido tratado plenamente en otros países sudamericanos [9, [17] [18] [19]. La falta de información en relación con los SRAs basales preexistentes, sumados al alto costo de estos nuevos fármacos, son los principales factores limitantes para la amplia implementación de estas nuevas terapias en Uruguay, así como en otros países latinoamericanos (ingreso bajo o bajo medio) [20]. En este estudio, exploramos la presencia de variantes de resistencia a inhibidores NS5A y NS5B en una cohorte de tratamiento de la DAA naïve de pacientes uruguayas crónicamente infectados con hepatitis C. Aquí, nos propusimos contribuir al conocimiento de la circulación de variantes resistentes al VHC en la región sudamericana. Se obtuvieron muestras séricas de 31 pacientes con marcadores serológicos del VHC, que fueron reclutados entre 2015 y 2017 en la Clínica de Gastroenterología del Hospital de Clínicas, Montevideo, Uruguay. La infección por VHC fue confirmada por Abbott en tiempo real VHC (Abbott Molecular Inc., Des Plaines, EE.UU.). Los pacientes seleccionados para este estudio fueron infectados crónicamente con genotipo 1 del VHC y DAA no tratados previamente en el momento de la extracción de sangre. Se obtuvo el consentimiento informado escrito de todos los pacientes. Los estudios se han realizado de acuerdo con la Declaración de la Asociación Médica Mundial de Helsinki y fueron aprobados por la junta institucional correspondiente (Comité ético Hospital de Clínicas). 2.2. Extracción de ARN, síntesis de cDNA y amplificación NS5A y NS5B. El ARN viral se extrajo de 140 μl de suero utilizando el kit de ARN viral QIAamp (QIAgen, Hilden, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ARN viral se calentó a 65°C durante 5 minutos y se utilizó como plantilla para una reacción de transcripción inversa. La mezcla de reacción de transcripción inversa contenía 5 μl de la plantilla de ARN, 1 μl de hexamero aleatorio 100 ng/μl (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.), 1 μl de dNTP mix (10 mM cada uno), 4 μl de búfer de primera cadena 5X, 2 μl de 0,1 M DTT, 1 μl de SuperScript II transcriptasa inversa (200 U/μl) (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.), y 1 μl (40 U/μl) RNaseOUT (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.). La transcripción inversa se realizó a 42 °C durante 50 min, y luego la enzima de transcriptasa inversa fue inactivada a 70 La amplificación PCR de las regiones del genoma NS5A y NS5B se realizó utilizando imprimaciones y condiciones descritas previamente [10]. Los amplificadores fueron purificados utilizando el kit de purificación de ADN y banda de gel Illustra GFX PCR (GE Healthcare Life Science, Buckinghamshire, Reino Unido) de acuerdo con el protocolo del fabricante. 2.3. Secuenciación NS5A y NS5B. El producto purificado fue secuenciado entonces utilizando los mismos conjuntos de imprimaciones utilizados para amplificación PCR. La secuenciación Sanger bidireccional fue realizada por Macrogen Korea (http://www.macrogen.com). 2.4. Determinación del Genotipo NS5A y NS5B. Las secuencias de consenso VHC NS5A y NS5B obtenidas de pacientes uruguayos fueron alineadas con secuencias del VHC que representaban todos Estas secuencias se obtuvieron de la base de datos de secuencias de VHC de Los Alamos y de la base de datos y recurso de análisis de virus patógenos de NIAID (ViPR) [21, 22]. Para las cepas incluidas en estos estudios, ver Tabla de Material Suplementario S1. Las secuencias se alinearon utilizando el software CLUSTAL W [23]. Una vez alineado, el mejor modelo evolutivo que describió nuestros datos de secuencias se evaluó utilizando el programa ModelGenerator [24]. Utilizando el modelo GTR + G + I (tiempo general reversible + gamma + sitios invariantes), se construyeron árboles filogenéticos de máxima probabilidad tanto para NS5A como NS5B mediante el software MEGA 5.0 [25]. Para NS5A, se incluyeron 953 nucleótidos (posiciones 6367 a 7319, relativas a la cepa de referencia VHC 1a, H77 NC_004102) en el análisis filogenético, mientras que para NS5B, sólo se incluyeron 361 nucleótidos correspondientes a la región de Okamoto (posiciones 8265 a 8625, relativas a la cepa H77 NC_004102). Como medida de la robustez de cada nodo, se utilizó el método de arranque (1000 pseudoreplicados).Para NS5A 1a secuencias uruguayas (n = 20), se generó un segundo alineamiento y un árbol filogenético de máxima probabilidad para analizar las relaciones evolutivas del VHC entre cepas uruguayas, brasileñas y mundiales.Para las cepas no uruguayas incluidas en este análisis, véase la Tabla de Material Suplementa Para identificar adecuadamente los cambios de sustitución en las regiones NS5A y NS5B de cepas VHC que circulan en pacientes uruguayos, se generaron secuencias de consenso mundial para subtipos 1a y 1b utilizando una amplia gama de secuencias NS5A y NS5B de cepas VHC aisladas en todo el mundo. Para ello, se recuperaron secuencias de genes NS5A correspondientes a subtipos 1a (n = 160) y 1b (n = 88) de la base de datos de secuencias VHC de Los Alamos y de la NIAID ViPR [21, 22]. Asimismo, se generaron series de datos de 150 y 124 secuencias NS5B para subtipos 1a y 1b, respectivamente. Utilizando el programa Seqman, implementado en el paquete DNASTAR 5.01 (DNASTAR, Madison Cada secuencia uruguaya fue posteriormente alineada a las secuencias de referencia correspondientes, y luego traducida en silico. Las secuencias de aminoácidos obtenidas se compararon para explorar la presencia de RAS así como la presencia de polimorfismos en una posición RAS (RAP) en cepas uruguayas del VHC. Los RAP se definen como cualquier cambio de la secuencia de referencia para un genotipo específico en una posición asociada con resistencia NS5A [26]. Para estudiar la variabilidad genética de las regiones NS5A y NS5B de cepas del VHC que circulan en pacientes uruguayos, las secuencias de estas regiones (números de adhesión MH070029-MH070090) se alinearon con las secuencias correspondientes de 59 cepas del VHC aisladas en otros lugares, representando todos los genotipos y subtipos principales Los resultados de estos estudios se muestran en la Figura 1 Se asignaron todas las cepas en las filogenias de acuerdo a su genotipo, y cada grupo fue apoyado por valores de bootstrap muy altos para ambas regiones analizadas. Se asignaron cepas aisladas de pacientes uruguayos (n = 31) al genotipo 1, 20 de las cuales correspondían al subtipo 1a y 11 al subtipo 1b. Los resultados de NS5A (Figura 1 a)) y NS5B (Figura 1 Genotipo 1b análisis filogenéticos fueron concordantes para ambas regiones genómicas en las 31 secuencias, sugiriendo no eventos de recombinación entre estas regiones. Para analizar más a fondo las relaciones evolutivas entre las cepas uruguayas y las que circulan en Brasil y en otras partes, se construyó un árbol filogenético de segunda probabilidad máxima de secuencia Las secuencias brasileñas agrupadas en un gran grupo de secuencias relacionadas dentro del clado 1 [9]. Mientras que las cepas uruguayas NS5A (en rojo) no se agruparon en un determinado clado, sino que se agruparon dispersamente dentro de todos los principales clados mundiales. Con el propósito de estudiar las sustituciones de aminoácidos (AA) a lo largo de la proteína NS5A, se identificaron secuencias VHC AA uruguayas alineadas con secuencias de consenso mundial NS5A (residuos 23 a 354 en relación con la secuencia de proteína NS5A). Se identificaron sustituciones AA en posiciones que anteriormente se encontraban potencialmente asociadas con resistencia a inhibidores NS5A, así como polimorfismos en una posición RAS. Estos resultados se resumen en la Tabla 1. Se encontraron RAP en 3 cepas (subtipo 1a): 2 exhibieron la sustitución H58P y 1 la sustitución K24Q. Aunque estas sustituciones no fueron reportadas como resistentes, algunos cambios en estas posiciones fueron descritos previamente como RAS en el subtipo 1a, a saber, H58D y K24R [27, 28]. Finalmente, la sustitución E62D se encontró en una cepa subtipo 1a. Este cambio se considera como una sustitución secundaria porque, aunque no confiere resistencia por sí misma, cuando se combina con un RAS conocido que sí lo hace. De hecho, confiere un nivel de resistencia más alto que el alcanzado por el RAS solo [26]. Además, también se detectaron varios polimorfismos que no han sido reportados previamente como asociados con un fenotipo resistente (ver Tabla de Material Suplementario S3 ). Para estudiar las sustituciones a lo largo de la proteína NS5B, las secuencias VHC AA uruguayas se alinearon a las secuencias de consenso mundial NS5B. Se obtuvieron secuencias AA de casi toda la longitud en 26 de las 31 cepas analizadas. Se observaron residuos de 23 secuencias que abarcan 36 a 539, mientras que los restantes residuos de 3 lapsos de 36 a 557 de la proteína NS5B. Esta cuestión limitó nuestros estudios, ya que muchos de los RAS descritos se observaron como residuos 553. Es importante destacar que se observaron RAS a inhibidores NS5B (Tabla 2) en 5 cepas de 26 muestras secuenciadas (19,2%). Se encontró C451R en dos aislados, mientras que se encontró A421V en sólo uno. En 2 de las 3 cepas para las cuales pudimos obtener secuencias más largas, se observaron S556G RAS Finalmente, encontramos dos RAP: A421V (en cepas subtipo 1b de 2) y A553G (en cepa subtipo 1a de 1). Aunque A421V se ha asociado con resistencia a beclabuvir (BCV) en pacientes infectados con subtipo 1a de VHC, este fenotipo resistente no ha sido probado en cepas subtipo 1b [29]. En la posición 553, la sustitución reportada como resistente fue A553T [8]. Al igual que en el caso de NS5A, también se detectaron diferentes polimorfismos no asociados previamente con un fenotipo resistente en NS5B (ver Tabla de Material Suplementario S4 ). El advenimiento de las terapias DAAs constituye uno de los mayores avances en el manejo de pacientes infectados por VHC. Sin embargo, estas nuevas opciones de tratamiento están lejos de ser universalmente disponibles, Los principales factores limitantes para el acceso mundial a los ADA en nuestra región son el alto costo, la inadecuada gestión de los sistemas públicos de salud, el limitado acceso de las poblaciones de bajos ingresos o no aseguradas a los proveedores de salud, y la falta de información epidemiológica precisa [20, [30] [31] [32]. En Uruguay, estas terapias se hicieron recientemente disponibles, y aunque algunas han sido aprobadas para su uso por las autoridades de salud pública (terapias de Viekira pak y sofosbuvir/ledipasvir), actualmente no están cubiertas financieramente, excepto en casos específicos. A pesar de las altas tasas de respuesta viral logradas con los tratamientos basados en DAA, todavía 1-10% de los pacientes no logran eliminar la infección, y en estos casos, las variantes de resistencia basal y emergente resultan ser factores clave que contribuyen al fracaso del tratamiento [5, 17, 33]. Desafortunadamente, actualmente no podemos evaluar adecuadamente el número de personas infectadas por el VHC en Uruguay y aún más para averiguar la frecuencia y el tipo de SRA que circulan, hechos que podrían comprometer la efectividad de estas nuevas terapias en nuestro país. Hemos reportado anteriormente que existen sustituciones naturales que confieren resistencia a inhibidores del NS3 en una proporción significativa de pacientes uruguayos infectados con el genotipo 1 del VHC, y hemos demostrado que esta frecuencia parecía ser mayor que en otros países sudamericanos (Brasil y Argentina) [34]. El presente estudio describe la prevalencia de NS5A y NS5B RAS basales en pacientes infectados por el VHC genotipo 1 no infectados por DAA en una cohorte uruguaya. La presencia de sustituciones que confieren resistencia a los inhibidores de NS5A ha sido ampliamente reportada tanto en pacientes no tratados previamente como en pacientes con recaídas de Europa [10, 33, [35] [37] [37], EE.UU. [37, 39, 40], y Asia [42] [42]. Sin embargo, las secuencias de NS5A de América del Sur todavía están mal analizadas [9, 44]. Estudios recientes han revelado que la prevalencia media de NS5A genotipo 1 basal RASs a diferentes inhibidores oscila entre el 6% y el 16% utilizando secuenciación poblacional o secuenciación profunda [27, 37, 45, 46]. Es importante destacar que la prevalencia y el tipo de NS5A basales varía ligeramente según las regiones geográficas. Por ejemplo, se encontró L31M en el 2,2% de los pacientes infectados con genotipo 1a en Europa, en el 4,1% de los de Oceanía, y sorprendentemente en ningún paciente de los EE.UU. [27]. Por esta razón, creemos que es necesario aportar datos de nuestra región, para los cuales todavía no tenemos suficiente información, aparte de Brasil [9, 44]. Los resultados de este estudio indican la presencia de DAA NS5A RAS en 2 cepas del VHC (8% de los pacientes incluidos en este estudio), con RAS basal detectada en la posición 31 (ver Tabla 1 ). La sustitución L31M confiere resistencia a daclatasvir (DCV), ledipasvir (LDV) y elbasvir (EBV) en los subtipos 1a y 1b [5, 6, 8, 28, 47, 48], mientras que la sustitución L31V lo hace a DCV en los subtipos 1a y 1b, a LDV en el subtipo 1b y a EBV en el subtipo 1a [5, 6, 28]. Dado que tanto el L31V como el L31M son RAS clínicamente relevantes, su detección al inicio puede influir en la elección de regímenes de tratamiento de primera línea [28]. Las sustituciones H58P y K24Q encontradas en dos pacientes se consideran polimorfismos asociados a la resistencia (RAPs). Los RAS caracterizados en estas posiciones fueron H58D y K24G/N/R [5, 6, La sustitución H58P se encontró como RAP basal en recidivas a LDV (prescripción HARVONI, https://www.gilead.com/-/media/files/pdfs/medicaments/liver-diseasa/harvoni/harvoni_pi. pdf?la=en). Sin embargo, a veces se considera como una sustitución RAS [10, 51], a pesar de conferir solo un cambio de 1,2 veces en la resistencia en estudios in vitro utilizando el sistema 1a replicon [39]. No encontramos sustituciones M28T/V, Q30R/H, o Y93H, ya que se habían reportado previamente en Brasil y en todo el mundo [9, 27, 44]. La sustitución de aminoácidos E62H se encontró en un paciente uruguayo. Aunque este cambio no confiere resistencia por sí mismo sino La presencia de NS5A RAS basales impacta el resultado del tratamiento en algunos grupos de pacientes al afectar las tasas de RVS. La detección de NS5A preexistentes puede jugar un papel relevante en la elección de regímenes de tratamiento de primera línea o en la simplificación/acortamiento de los regímenes recomendados, con el fin de acercar las tasas de RVS a las más altas alcanzables [27, 38, 41, 53], en particular en países como Uruguay, donde sólo se aprueban dos regímenes de tratamiento diferentes que contienen DAA para su uso. En cuanto al gen NS5B, el análisis global (con excepción de Sudamérica [17, 19] ) reveló que las sustituciones de resistencia NS5B DAA son infrecuentes [14]. Las sustituciones encontradas en este trabajo fueron A421V y S556G asociadas en el subtipo 1a con resistencia a BCV y dasabuvir (DSV), respectivamente [8, 28, 29, 54, 55] y Q556R asociadas con resistencia a DSV tanto en el genotipo 1a como en el 1b [12, 28]. La sustitución C451R, observada en dos pacientes uruguayos, fue reportada previamente en pacientes que no lograron eliminar la infección después del tratamiento con OBV/PTV/r + DSV ± RBV. En estos casos, apareció en combinación con G558R (Trial Coral I-Cohort 2: http://www.hcv-trials.com/showStudy.asp?Study=86). También se encontraron RAP en las posiciones 421 y 553 (A421V en dos aislados del subtipo 1b y A553G en un aislado del subtipo 1b). Aunque A421V se ha asociado con resistencia a BCV en pacientes con subtipo 1a, este fenotipo no se ha demostrado en cepas del subtipo 1b [29]. En la posición 553, las sustituciones reportadas como resistentes son A553T en el subtipo 1a [8] y A553V en el subtipo 1b [54], lo que confiere resistencia a DSV. A diferencia de nuestros resultados, Noble y compañeros de trabajo (2016) reportaron la presencia de V321A, A421G, M414V, Y448H, L159F y C316N en aislados brasileños [17], sin embargo no se encontró ninguna de estas mutaciones en este estudio, probablemente debido a la diversidad encontrada entre cepas uruguayas y brasileñas (Figura 2 ). Sin embargo, se encontró sustitución A421V en Brasil [17], Argentina [19], y Uruguay. El RAS S282T no fue detectado ni en informes brasileños ni en este trabajo actual (Uruguay) [17, 18, 56]. Nuestros hallazgos confirman y complementan estudios previos que evidenciaron una baja prevalencia de esta sustitución in vivo, probablemente debido a su baja aptitud replicativa [14, 18, 57]. A pesar de nuestros resultados, no se ha demostrado que la presencia de NS5B RAS basales que confieren resistencia a los inhibidores de nucleótidos o no nucleósidos NS5B tenga ningún impacto en las respuestas virológicas hasta el momento [53, 58]. Estos resultados muestran tanto diversidad en los polimorfismos basales encontrados en diferentes países latinoamericanos como en las relaciones evolutivas de los aislados uruguayos (Figura 2 ). Este hecho podría estar relacionado no sólo con la región geográfica de los aislados y sus características intrínsecas virales sino también con el fondo genético del huésped. Vale la pena mencionar que vivimos en un vasto continente habitado por poblaciones con diferentes características genotípicas que, dependiendo de la situación, podrían requerir diferentes enfoques al tratamiento. De hecho, recientemente hemos encontrado que las frecuencias de alelo y genotipo en el locus IL28B de En conjunto, creemos que podría ser importante realizar estudios en toda la región sudamericana con el fin de establecer la prevalencia de RAS en NS5A y NS5B en diferentes países. De hecho, esto ayudará a entender que no todos los regímenes de tratamiento podrían ser adecuados para cada paciente y país. Los datos que presentamos aquí podrían guiar no sólo a los médicos en la toma de decisiones terapéuticas, sino también a las autoridades de salud pública en la aprobación de combinaciones de tratamiento más diversas. Estas formulaciones de tratamiento cubrirían la mayoría de las cepas circulantes en nuestra región, una región con una población de antecedentes genéticos muy diversa. Actualmente no está claro si las variantes virales preexistentes con menor susceptibilidad a los ADA son clínicamente relevantes para la predicción del fracaso del tratamiento virológico. Sin embargo, la terapia de DAA individualizada basada en el análisis de resistencia basal puede ser beneficiosa para optimizar la eficacia del tratamiento en pacientes con infección por VHC genotipo 1 y factores de riesgo para el fracaso del tratamiento. Por lo tanto, el papel potencial de las pruebas de resistencia basal sigue siendo un área de investigación crítica y preguntas clínicas.Los datos utilizados para apoyar los hallazgos de este estudio se incluyen en el artículo.Los autores declaran que no tienen conflictos de interés. Fabián Aldunate y Natalia Echeverría contribuyeron igualmente a este trabajo. Material Suplementario Tabla S2 : Secuencias del subtipo 1a del Virus de la hepatitis C NS5A utilizadas para revelar relaciones evolutivas entre cepas uruguayas y otras aisladas en otros lugares. Se indica su país de aislamiento correspondiente y número de adhesión de GenBank. Material Suplementario Tabla S3 : sustituciones de aminoácidos en proteína NS5A no previamente asociadas con resistencia a inhibidores de NS5A. Material Suplementario Tabla S4 : sustituciones de aminoácidos en proteína NS5B no previamente asociadas con resistencia a inhibidores de polimerasa. (Materiales Suplementarios)

¿Cuánto de la plantilla de ARN estaba en la mezcla de reacción de transcripción inversa?

Generación eficiente de virus de ARN recombinante utilizando mutagenesis mediada por recombinación dirigida de cromosomas artificiales bacterianos que contienen cDNA de larga duraciónhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3840674/SHA: ef38ed2f4cc96e16ce011623cc5d15d2d8ca58c3Autores: Rasmussen, Thomas Bruun; Risager, Peter Christian; Fahnøe, Ulrik; Friis, Martin Barfred; Belsham, Graham J; Höper, Dirk; Reimann, Ilona; Beer, MartinFecha: 2013-11-22DOI: 10.1186/1471-2164-14-819Licencia: cc-byAbstract: ANTEGRON: Los clones infecciosos Aquí se describe una estrategia para facilitar la manipulación y el rescate de los virus de la peste porcina clásica (VFC) de los CDNA de larga duración presentes en los cromosomas artificiales bacterianos (BACs). Esta estrategia permite la manipulación del ADNc viral mediante mutagenesis mediada por recombinación dirigida dentro de las bacterias. RESULTADOS: Se ha construido una nueva CSFV-BAC (pBeloR26) derivada de la cepa de la vacuna Riems y posteriormente modificada en la secuencia de codificación E2, utilizando la estrategia de recombinación dirigida para permitir el rescate de los pestivirus quiméricos (vR26_E2gif y vR26_TAV) con potencial como nuevos candidatos a la vacuna marcadora. La secuenciación de los BAC reveló una alta estabilidad genética durante los pasajes dentro de las bacterias. Las secuencias del genoma completo de los virus rescatados, después Se observó una única sustitución de aminoácidos (D3431G) en la polimerasa dependiente del ARN en los virus rescatados vR26_E2gif y vR26, que fue reversión a la secuencia de Riems parentales. CONCLUSIONES: Estos resultados muestran que la mutagénesis dirigida mediada por recombinación proporciona una poderosa herramienta para acelerar la construcción de nuevos genomas del ARN y debe ser aplicable a la manipulación de otros virus del ARN. Texto: Los cromosomas artificiales bacterianos (BAC) son ideales para el mantenimiento estable de grandes secuencias de ADN derivadas de genomas virales [1]. Se han establecido un número considerable de sistemas de BAC para grandes virus del ADN; en particular muchos genomas del herpesvirus han sido clonados en BACs (ver revisión [2] ). Se han descrito los primeros sistemas BAC que utilizan CDNAs del virus ARN para los coronavirus [3] [4] [5] [6] y recientemente se han insertado en los BACs los primeros BAC que contienen un ADNc de larga duración para un virus ARN negativo [7]. Del mismo modo, se han insertado CDNAs correspondientes a los genomas de larga duración de miembros de la familia Flaviviridae (virus de la encefalitis japonesa [8] y virus del dengue [9] ). Recientemente se han establecido BACs que contienen cDNAs de larga duración de pestivirus (también dentro de los Flaviviridae), incluyendo el virus de la diarrea viral bovina (VDVB) y el virus de la peste porcina clásica (VFC) [10, 11]. Los pestivirus infecciosos se pueden rescatar utilizando transcripciones de ARN derivadas de estos BACs. Los pestivirus tienen genomas de ARN de sentidos positivos aislados, de aproximadamente 12,3 kb de longitud, que incluye un único marco de lectura abierto largo, codificando una poliproteína grande, flanqueada por 5′ y 3′ regiones no traducidas (UTRs) que son críticas para la replicación autónoma del genoma [12, 13]. La poliproteína está dividida por proteasas celulares y virales en cuatro proteínas estructurales (proteína C nucleocápsida, glucoproteínas envolventes E rns, E1 y E2) y ocho proteínas no estructurales (N pro, p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B). La disponibilidad de BACs de pestivirus genéticamente definidos y estables facilita el estudio funcional de las proteínas virales o estructuras de ARN y también el desarrollo de nuevos candidatos a A lo largo de los años se han desarrollado varias vacunas CSFV con propiedades marcadoras basadas en pestivirus quiméricos [14]. En particular, se han descrito los pestivirus quiméricos con sustitución de toda la proteína E2 [15] [16] [17], pero también los mutantes con modificaciones más sutiles, como la modificación del importante epítopo de TAV [18] dentro de la proteína CSFV-E2 [19, 20] son candidatos prometedores a la vacuna marcadora. La manipulación de los BAC utilizando procedimientos tradicionales de clonación puede ser difícil (por ejemplo, debido a la falta de sitios de restricción enzimática convenientes) y, por lo tanto, se ha desarrollado una gama de metodologías que aplican la genética bacteriana, incluida la recombinación homóloga (por ejemplo, la recombinación roja/ET homóloga) dentro del huésped E. coli, (para su El uso de la recombinación homóloga permite la mutagenesis de los BAC dirigida por el sitio [22] y, mediante un esquema de contraselección, se pueden obtener modificaciones específicas sin dejar secuencias residuales "extranjeras" [23]. La principal ventaja de este método es que no hay limitaciones de objetivo (por ejemplo, basadas en el tamaño o la ubicación) y no hay necesidad de sitios de restricción adecuados. La integración de la secuencia modificada se realiza in vivo (dentro de E. coli) por lo que potencialmente es más precisa que los enfoques in vitro como los métodos basados en PCR. Aunque los enfoques de clonación in vitro basados en el uso de polimerasas de alta fidelidad para la amplificación de PCR han mejorado significativamente en los últimos años, el uso de enfoques in vivo debe permitir un método más preciso de mutagenesis debido al uso de los propios sistemas de replicación de alta fidelidad que incluyen Mientras que la recombinación BAC se ha utilizado comúnmente para modificar virus de ADN, hay muy pocos reportes sobre el uso de esta tecnología para virus de ARN [7, 24, 25]. Aquí, una estrategia generalmente aplicable para la manipulación y rescate de pestivirus quiméricos de BACs se describe como un modelo, y la flexibilidad de este enfoque se demuestra generando diferentes modificaciones en el ADNc viral del nuevo CSFV-BAC, pBeloR26, derivado de la cepa de vacuna viva modificada "C-train Riems". La mutagenesis mediada por recombinación dirigida descrita aquí incluye la sustitución del 9 aminoácido (aa) epítopo TAV lineal (TAVSPTTLR) presente en la proteína E2 por la región correspondiente (TTVSTSTLA) de un pestivirus heterólogo (virus de la enfermedad fronteriza, BDV, cepa "Gifhorn") y también la sustitución de toda la región de codificación de la proteína CSFV E2 por toda la región de codificación E2 de la misma BDV, para generar virus vacunales marcados que pueden ser discriminados utilizando anticuerpos monoclonales específicos anti-E2. También se han evaluado las estabilidades genéticas de los constructos BAC (dentro de E. coli) y los virus rescatados. El riñón porcino (PK15) y las células timoides fetales de oveja (SFT-R) fueron cultivadas a 37°C (con 5% (v/v) CO 2) en el medio esencial mínimo (DMEM) de Dulbecco, complementado con 5% (v/v) suero de ternera fetal libre de pestivirus. El virus de un cebo que contiene la vacuna viva modificada CSFV "C-strain Riems" (Riemser Arzneimittel AG, Alemania) se propagó una vez en células PK15 y se llamó vRiemser. El ARN obtenido de la cepa BDV "Gifhorn" [26] se utilizó para amplificar la secuencia de codificación de Gifhorn E2. Los imprimadores de oligonucleótido utilizados se enumeran en el archivo adicional 1: Tabla S1. El constructo de BAC, pBeloR26, fue construido usando el largo método RT-PCR descrito anteriormente [11] utilizando ARN derivado de los "Riems de transmisión C". Brevemente, los CDNA virales de larga duración flanqueados por sitios de NotI fueron amplificados por RT-PCR largos usando imprimadores 5′Cstrain_T7_Not1 (que incluye un promotor T7 para la transcripción in vitro, un sitio de NotI y una región correspondiente a los primeros 44 nt del genoma) y 3′CSFV_Not1 (que contiene un sitio de NotI y secuencia complementaria al 3′-terminal 35 nt del genoma que se conservan entre muchos CSFVs incluyendo el Cstrain). El producto (ca. 12,3 kbp) fue digerido con NotI e insertado en pBeloBAC11 (New England Biolabs, GenBank accessing U51113). Todos los BAC fueron modificados y mantenidos en células E. coli DH10B (Invitrogen) cultivadas a 37°C en un medio LB que contenía cloranfenicol (Cam, 15 μg/ml). La electroporación de bacterias se realizó en cubetas de 0,1 cm utilizando 1 pulso a 1800 V, 25 μF y 200 Los BAC necesarios para la secuenciación directa del genoma fueron purificados a partir de cultivos de 500 ml utilizando el kit de construcción grande (Qiagen). Se realizaron modificaciones al CSFV cDNA de longitud completa en E. coli DH10B (resistente a la estreptomicina, Strep R ) utilizando el Kit de Modificación de BAC de Counter Selection (Gene Bridges, Heidelberg, Alemania). La recombinación Red/ET involucró tres pasos (i-iii). Paso i) el plásmido de expresión pRedET sensible a la temperatura (Gene Bridges) fue introducido en células E.coli DH10B electroporacioncompetentes que contenían el BAC parental (fenotipo Cam R, Strep R ). El pRedET expresa las proteínas de fage lambda rojoα, rojoβ y rojoγ, bajo control del promotor de pBAD inducible con arabinosa, permitiendo la recombinación homóloga. Inmediatamente después de la electroporación, se añadió un medio LB precalentado sin antibióticos (1 ml) a las células que luego fueron incubadas a 30°C durante 1 hora, antes de propagarse sobre placas de agar que contenían Cam (15 μg/ml) y tetraciclina (Tet) (3 μg/ml) y luego se incubaron a 30°C durante la noche para mantener el pRedET. La presencia del plásmido pRedET (conferring Tet R ) se verificó mediante una inspección visual de las preparaciones BAC-DNA de las colonias Cam R / Tet R utilizando electroforesis de gel de Paso ii) los cassettes de marcadores de contraselección con un sitio extra de NotI para fines de cribado (rpsL-neo, 1325 bp) fueron amplificados por PCR utilizando imprimaciones con extensiones de 30 nt o 50 nt que eran homólogas al sitio objetivo en el BAC utilizando el plásmido rpsL-neo (Gene Bridges) como plantilla y la Phusion Hot Start II HF ADN polimerasa (Thermo Scientific) con condiciones de ciclismo como sigue: 98°C para 30s, seguido de 35 ciclos de 98°C para 10s, 60°C para 20s, 72°C para 60s, y 1 ciclo a 72°C durante 4 min. Los productos de PCR (ca. 1400 bp) fueron aislados en geles de agarosa TBE 1% (w/v) y purificados Las muestras (30 μl), de un cultivo de E. coli que contenía pRedET y el BAC parental cultivado durante la noche a 30 °C en medio LB (Cam, Tet), se utilizaron para inocular 1,4 ml de medio LB fresco con los mismos antibióticos para obtener bacterias de crecimiento exponencial a 30 °C. Las proteínas de recombinación rojo/ET se indujeron añadiendo 50 μl de 10% (w/v) L-arabinosa (Sigma). El producto PCR (200 ng) que contenía el cassette rpsL-neo se introdujo en estas bacterias mediante electroporación (como anteriormente). Después de la electroporación, las células fueron cultivadas a 37 °C durante 70 minutos (para permitir la recombinación) y luego seleccionadas en placas que contenían Cam (15 μg/ml), Tet (3 μg/ml) y kanamicina (Kan, 15 μg/ml) durante la noche a 30 °C para mantener el pRedET. Nota: el cassette rpsL confiere sensibilidad a la Streptomicina (Estrep S ) en la cepa resistente DH10B y la neoconfiere resistencia a la Kanamicina (Kan R ). El fenotipo correcto (Cam R, Kan R, Tet R, Strep S ) de las colonias resultantes fue confirmado por rayar las colonias en placas que contenían Cam (15 μg/ml), Tet (3 μg/ml) y Kan (15 Es importante destacar que, para el tercer paso, la sustitución del cassette rpsL-neo (utilizando la contraselección), las colonias seleccionadas también fueron estriadas en placas que contenían Cam (15 μg/ml) más Strep (50 μg/ml) y se demostró que era Strep S indicando la incorporación de un gen funcional rpsL. Las estructuras de los BAC intermedios fueron verificadas mediante análisis de enzimas de restricción y secuenciación alrededor de las inserciones. Paso iii) el reemplazo de los cassettes de selección rpsL-neo de los constructos intermedios utilizando fragmentos de ADN lineales se logró mediante la contraselección y la recombinación Red/ET. De nuevo, las secuencias homólogas al final del fragmento de ADN fueron utilizadas para eventos de recombinación mediada Red/ET para reemplazar el cassette rpsL La contraselección contra el cassette de rpsL-neo (fenotipo Cam R, Kan R, Tet R, Strep S ) se utilizó utilizando medios que contenían Cam (15 μg/ml) y Strep (50 μg/ml) para aislar los derivados requeridos (fenotipo Cam R y Strep R ). Inicialmente, el constructo intermedio, pBeloR26_E2rpsLneo (Figura 1 ), se generó utilizando la recombinación Red/ET mediante la inserción del cassette de rpsL-neo con un sitio extra de Noti para propósitos de screening que fue amplificado con los primers Criems-TAVfor y Criems-TAVrev (Archivo adicional 1: Tabla S1 ) en lugar de la secuencia de codificación TAVSPTTLR ( En segundo lugar, el cassette rpsL-neo en este constructo intermedio fue reemplazado por la contraselección Red/ ET recombinación utilizando un oligonucleótido de una sola cadena, Riems_TAV_Gifhorn (Archivo adicional 1: Tabla S1 ) con los mismos brazos homológicos utilizados para el cassette rpsL-neo, para introducir la secuencia de codificación para la secuencia de epítopo BDV "Gifhorn" (TTVSTLA). El constructo resultante fue nombrado pBeloR26_TAV (Figura 1 ). El constructo intermedio inicial (con rpsL-neo) fue utilizado entonces para producir el constructo pBeloR26_E2gif (Figura 1 ). Para ello, la secuencia de codificación E2 fue amplificada a partir de cDNA preparada a partir de ARN BDV "Gifhorn" utilizando dos pares de imprimación diferentes, uno con brazos homológicos de 50 nt (Criems_E2_gifFlong/Criems_E2_gifRlong) y otro con secuencias homólogas de 30 nt (Criems_E2_gifF/Criems_E2_gifR). Para la generación de BACs con sustitución de todas las secuencias de codificación E2, los productos PCR consistentes en la secuencia de interés flanqueado con brazos homológicos idénticos al área objetivo fueron generados por PCR (como para el cassette rpsLneo). El precalentamiento de los oligonucleótidos de una sola cadena a 95°C durante 2 minutos seguido de congelación por snap, antes de la electroporación, mostró empíricamente los mejores resultados. En cada caso, las moléculas de ADN fueron introducidas en E. coli que contenía los derivados BAC incluyendo los cassettes de rpsL-neo junto con el plásmido pRedET por electroporación como se describe anteriormente. Las estructuras de los BAC modificados fueron verificadas mediante análisis de enzimas de restricción y posterior secuenciación de genoma completo (ver abajo). El ADN BAC (1 μg) fue linealizado con NotI o 1 μl El ADN BAC fue utilizado como plantilla para la amplificación de PCR largo usando imprimaciones 5′C-strain_T7_Not1 y 3′CSFV (Fichero adicional 1: Tabla S1 ). Los BAC linealizados o productos PCR fueron purificados con el kit de purificación GeneJet PCR (Thermo Scientific) y transcrito in vitro utilizando un kit Megascript T7 (Invitrogen). Los virus fueron rescatados de las transcripciones de ARN (1 a 5 μg) por electroporación de células porcinas (PK15) o ovinas (SFT-R) esencialmente como se describió anteriormente [24]. Las células fueron analizadas utilizando microscopía de inmunofluorescencia (típicamente después de 3 días) para la expresión de proteínas NS3 y E2 utilizando anticuerpos monoclonales específicos (mAbs), estos fueron anti-NS3 (WB103/105, pan-pestivirus), anti-CSFV E2 (WH211, WH303, ambos específicos de CSFV) y anti-BDV E2 (WB166, BVDV/BDV específico) (AHVLA Scientific, Reino Unido) junto con el anticuerpo IgG de cabra conjugado Alexa 488 (sondas moleculares, Invitrogen). Los núcleos de células fueron visualizados utilizando DAPI (Vector Laboratories) y las imágenes fueron grabadas utilizando un microscopio de fluorescencia BX63 (Olympus). Para la tinción de la peroxidasa, las células fueron fijas y teñidas para la presencia de antígenos del pestivirus utilizando anti-CSFV/BVDV policlonal IgG seguido de peroxidasa de rábano picante conjugada con avidina (eBioscience) como se describió anteriormente [27]. El mismo procedimiento de tinción también se realizó utilizando el anti-E2 mAbs. Las muestras que contenían células virales positivas fueron pasadas a nuevas células. Las curvas de crecimiento del virus fueron generadas como se describió anteriormente [24]. Brevemente, las células PK15 o SFT-R fueron infectadas a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,1 pfu/células y cultivadas durante tres días. Las DNA BAC (5 μg), purificadas utilizando el kit de construcción grande (Qiagen) o productos PCR (1 μg) amplificados a partir del ADNc viral o de los BACs utilizando el método de PCR largo (como anteriormente) fueron secuenciadas por consenso utilizando un 454 FLX (Roche) o un PGM Ion (Life Technologies). Tanto Newbler (Roche) como el algoritmo de alineación bwa.bwasw [28] se utilizaron para mapear las lecturas a la secuencia esperada. Una combinación de Samtools [29] y LoFreq SNV-caller [30] se utilizó para el análisis de la variante nucleótida única (NSV) aguas abajo. Finalmente, las secuencias de consenso clones se alinearon utilizando MAFFT en la plataforma de software Geneious (Biomaterias). La generación de un BAC que contiene ADNc de larga duración correspondiente a la vacuna viva modificada Riems "C-train" Los BACs que contienen el ADNc de larga duración correspondiente al vRiemser parental ("Riems C-train") se construyeron de acuerdo con el método descrito anteriormente para la cepa "Paderborn" de CSFV [11]. Los BACs que contienen el CSFV cDNAs completos se identificaron mediante restricción Figura 1 Representación esquemática de la organización del genoma del CSFV y los BACs construidos y utilizados en este estudio. Se muestran las posiciones de nucleotida (nt) y aminoácido (aa) dentro de R26 para los termini de 5′ y 3′, junto con los codones de inicio y parada traslacionales de la región de codificación de poliproteínas más los sitios de escote utilizados para fabricar las proteínas individuales (N pro, C, E rns, E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B). Se indica la inserción del rpsL-neo en lugar del TAV-epitope dentro del E2 del CSFV para el constructo intermedio (R26_rpsLneo) y el reemplazo posterior con la secuencia TTVSTSTLA (R26_TAV) y la sustitución completa de la secuencia E2 (R26_E2gif). Los nombres de los constructos BAC comienzan con "pBelo" y los virus rescatados con "v" (p. ej. pBeloR26 y vR26). El paso de cultivo celular no. del virus se indica con "/P" (p. ej. vR26/P-4). análisis de digest y posterior linealización por NotI, las transcripciones del ARN fueron producidas y electroporadas en células PK15. Este cribado resultó en la identificación de un BAC conteniendo un inserto de cDNA de 12316 nt, pBeloR26 (Figura 1), que produjo virus infecciosos, llamado vR26, que podría propagarse en células SFT-R (Figura 2, paneles superiores) y en células PK15 (Figura 3 ). El vR26 rescatado mostró una tasa de crecimiento más alta en la etapa inicial (una diferencia de 10 veces en el rendimiento del virus a las 24 h) en comparación con el virus de la vacuna parental, pero después de 48 horas se obtuvieron títulos similares del virus (Figura 3). La secuenciación del genoma completo de la plantilla de BAC clonada, pBeloR26, reveló una serie de diferencias a lo largo del genoma cuando se comparó con la secuencia de consenso de duración completa del ADNc utilizado para el procedimiento de clonación (véase Tabla 1 ). Estas diferencias son variantes no representativas dentro del ADNc. En general, la secuencia de BAC difería de la secuencia de ADNc en 18 posiciones, 9 de ellas conducen a sustituciones de aminoácidos predichas dentro de la poliproteína; una en cada una de N pro, E rns, E1, E2 y NS3 y cuatro sustituciones En comparación con la secuencia de referencia publicada (adhesión de GenBank AY259122.1), la secuencia BAC pBeloR26 difería en 11 posiciones adicionales, 1 de ellas conduce a una sustitución predicha de aminoácidos y hubo una gran inserción (27 nt) en la región hipervariable de la 3′-UTR (archivo adicional 2: Tabla S2). Para determinar la utilidad del sistema de recombinación mediada de mutagenesis para los pestivirus, se generaron dos modificaciones diferentes de la secuencia de codificación de proteínas E2 dentro de pBeloR26 utilizando la metodología de recombinación Red/ET. Inicialmente, la secuencia codificando el TAV-epitope lineal (TAVSPTTLR) dentro del CSFV-E2 fue sustituida por la secuencia codificando la región correspondiente (encodificación TTVSTLA) de la cepa Más del 90% de las colonias obtenidas con este procedimiento contenían los patrones de reacción anticuerpos de células infectadas con pestivirus BACanti-CSFV E2 requeridos (WH211) Figura 2 Patrones de reacción anticuerpo de células infectadas con pestivirus. Las células SFT-R fueron infectadas con vR26 y sus dos derivados vR26_E2gif y vR26_TAV más vGhorn [26]. Después de 72 h, las células fueron fijas y manchadas con anticuerpos monoclonales contra la proteína NS3 (WB103/105, columna izquierda), la proteína CSFV E2 (WH303 y WH211, columnas medias) y la proteína BDV E2 (WB166, columna derecha) según lo indicado y visto mediante un microscopio de fluorescencia. Estructura determinada por Digestiones Noti. Se han verificado las secuencias completas del Además, la secuencia de codificación completa (1119 nt) de la proteína CSFV-E2 fue sustituida por la secuencia correspondiente de BDV "Gifhorn". De nuevo más del 90% de las colonias obtenidas contenían el BAC requerido y la misma proporción de BAC correctamente recombinados se obtuvo utilizando brazos homológicos de 30 nt o 50 nt. Se designó el BAC quimérico, pBeloR26_E2gif y se verificó la secuencia completa del genoma del virus (cDNA) (datos no mostrados). Después de la electroporación con transcripciones de ARN derivadas de pBeloR26_TAV o pBeloR26_E2gif se pudo observar un gran número de células positivas de CSFV NS3 (datos no mostrados) y existencias de virus quiméricos, llamadas vR26_TAV y v Las células infectadas con estos virus y con las cepas parentales vR26 y vGifhorn fueron teñidas con mAbs dirigida contra la proteína NS3 (Figura 2 ). Sin embargo, en contraste con el virus parental vR26, los virus quiméricos rescatados de los BACs recombinados no fueron reconocidos por las proteínas anti-E2 mAbs específicas para las proteínas CSFV-E2 (Figura 2 ) y por lo tanto, de acuerdo con su estructura, mostraron el mismo patrón de reacción de anticuerpos que vGifhorn. Dos diferentes anti-CSFV E2 mAbs, WH211 y WH303, fueron utilizados para la tinción y este último ha sido demostrado previamente para dirigir el TAV-epitope [18]. Como era de esperar, las células infectadas con el vGifhorn o con el quimérico vR26_E2gif pudieron ser mostradas para expresar la proteína "Gifhorn" E2 usando tinción con un anti-BDV mAb (Figura 2 ). La presencia del epítopo BDV TTVSTLA en vR26_ TAV fue insuficiente para permitir el reconocimiento eficiente por este anti-BDV mab, aunque se observó una señal débil en algunas células. Los constructos de BAC pBeloR26 y pBeloR26_E2gif fueron analizados para la estabilidad genética del cDNA para determinar la idoneidad del vector BAC para mantener el pestivirus cDNAs de larga duración. Las células E. coli DH10B que contenían los BAC fueron pasadas 15 veces, por crecimiento nocturno, y los cDNAs virales completos dentro de los BACs fueron secuenciados después del paso 1o y 15o. No se observaron mutaciones dentro de las secuencias de cDNA del virus 12316 nt después de esta extensa propagación de los BACs en el huésped bacteriano, indicando un sistema altamente estable para el mantenimiento de secuencias de cDNA del pestivirus completo. Los virus, vR26 y vR26_E2gif, rescatados de sus respectivos constructos BAC, también fueron probados para su estabilidad genética dentro de las células mamíferas. El ADN BAC lineal fue transcrito in vitro y el ARN fue electroporado en células PK15. Tres días después de la electroporación las células fueron manchadas con el anticuerpo anti-NS3 para detectar Las muestras que contenían células virales positivas se pasaron a nuevas células, este proceso *La posición Nt 10665 en vR26/P-12 se revierte de A a G como en el ADNc parental. se repitió durante 12 pasajes separados (cada uno de tres días).El título del virus (como TCID 50/ml) se determinó para cada pasaje. El paso del virus quimérico vR26_E2gif rescatado en células PK15 dio lugar a una rápida disminución de los títulos del virus y se interrumpió después del segundo pasaje (Figura 4A ). En cambio, el paso posterior de este virus quimérico se realizó en células SFT-R ovinas (el tipo de célula preferido para BDV) y resultó en títulos mucho más altos del virus quimérico. Los títulos del virus alcanzaron más de 10 6 TCID 50/ml después del primer pasaje y permanecieron estables El vR26 rescatado también se propagó eficientemente en las células SFT-R, pero mantuvo un título ligeramente más bajo que el virus quimérico vR26_E2gif (Figura 4A ). Para comprobar que los virus conservaron sus propiedades de reacción de anticuerpos (Figura 2 ) después de estos pasajes, las células fueron infectadas con virus del paso del cultivo celular SFT-R 12 (denominado vR26/P-12 y vR26_E2gif/P-12) y manchadas con un suero anti-pestivirus policlonal y con mAbs específicos dirigidos contra las proteínas CSFV-E2 y BDV-E2 (Figura 4B ). Las células infectadas con el vR26/P-12 o el vR26_E2gif/P-12 quimérico fueron detectadas cada una por el suero anti-pesti Los anti-CSFV-E2 mAb detectaron células infectadas con vR26/P-12 pero no células infectadas por el virus quimérico que contiene la proteína BDV-E2 (consistente con los resultados mostrados en la Figura 2). En contraste, los anti-BDV-E2 mAb detectaron específicamente infección por el vR26_E2gif/P-12 y no reconocieron células infectadas con vR26/P-12. Cada resultado está de acuerdo con la estructura de los virus. El cuarto paso de vR26 (vR26/P-4) mostró una tasa de crecimiento más lenta que el virus obtenido después de 12 pasajes (ver Figura 5A ). También tuvo una tasa de crecimiento reducida en comparación con los vR26_E2gif/P-4 y vR26_E2gif/P-12. La secuencia completa de pBeloR26 había revelado diez mutaciones no silenciosas en comparación con la secuencia de referencia (AY25 9122.1) para este virus (archivo adicional 2: Tabla S2). Cualquiera de estas mutaciones podría ser responsable del deterioro del crecimiento actuando solo o en concierto. Para una investigación más profunda de este problema, cDNAs de longitud completa preparados a partir de vR26/ P-4, vR26/P-12, vR26_E2gif/P-4 y vR26_E2gif/P-12 se secuenciaron profundamente utilizando las plataformas 454 FLX e Ion PGM para la comparación y para determinar la distribución de cuasiespecies (archivo adicional 3: Figura S1 y archivo adicional 4: Figura S2 ). Los datos de secuenciación de ambas plataformas revelaron que tanto el vR26/P-12 como el vR26_E2gif/P-12 fueron casi 100% cambiados en la posición nt A10665G en comparación con los clones BAC (resultando en la sustitución predicha de aminoácidos D3431G dentro de la proteína NS5B, la ARN polimerasa dependiente de ARN, ver Figura 5B ). Esta adaptación es una reversión a la secuencia cDNA del consenso del virus vacuna parental, vRiemser (Fichero Adicional 2: Tabla S2 ). Además, vR26/P-4 y vR26_E2gif/P-4 ya mostraron evidencia de que esta reversión está presente en la población. Para vR26/P-4, el nivel de reversión fue del 57%, mientras que para vR26_E2gif/P-4 En este estudio, hemos establecido el primer BAC que contiene el ADNc de larga duración de una cepa vacunal CSFV. El BAC difería de la secuencia de ADNc parental en 18 posiciones que conducen a 9 sustituciones aa (Tabla 1 ). El método que se ha utilizado para la generación de pBeloR26 se basa en la amplificación del genoma completo del ADNc seguido de clonación directa para obtener los BACs [11]. Este enfoque resulta en clones cDNA que reflejan la composición cuasiespecífica del ARN viral parental y por lo tanto no está garantizado obtener clones de ADNc correspondientes a la secuencia de consenso del ADNc utilizado. Sin embargo, es posible corregir las mutaciones utilizando el enfoque de recombinación BAC si se necesita un clon de consenso. Para demostrar la utilidad del método de recombinación mediada por Red/ET hemos generado una serie de BACs modificados derivados de este CSFV cDNA de longitud completa. Estos incluyen BACs con sustitución del epítopo TAV lineal presente en la proteína E2 y también BACs con sustitución de la proteína E2 completa con secuencias de pestivirus heterólogos. También hemos utilizado el mismo enfoque para una gama de diferentes modificaciones dirigidas dentro de CSFV BACs incluyendo deleciones específicas y sustituciones en la 5′UTR de CSFV [24] y para inserciones de secuencias de reporteros heterólogos en replicos de CSFV [25]. Utilizando Red/ET recombinationmediated mutagenesis para el diseño específico, el trabajo puede acelerarse y centrarse, en principio, en cualquier secuencia dentro del genoma viral y no depende del uso de sitios Los resultados demuestran que la mutagenesis mediada por Red/ ET de los BAC cDNAs pestivirus proporciona una herramienta útil para avanzar en la construcción de pestivirus modificados. Las células infectadas con el virus vR26 parental fueron reconocidas por los dos mAbs anti-E2 (WH211 y WH303) específicos para las proteínas CSFV-E2, en las células de contraste infectadas con los virus modificados vR26_TAV y vR26_E2gif, rescatadas de los BACs recombinados, no fueron detectadas por estos mAbs. Además, como se esperaba, las células infectadas con el vR26_E2gif fueron reconocidas por el anti-BDV mAb (WB166) mientras que no se observó tinción con este anticuerpo en células infectadas vR26 o en células con vR26_TAV. El mAb WH303 reconoce el epítopo TAV de CSFV [18] y la diferencia en 4 aa entre el epítopo TAV y la secuencia correspondiente de la cepa BDV "Gifhorn" es suficiente para abolir completamente el reconocimiento por este mAb. La falta de tinción de las células infectadas por vR26_TAV por el WH211 indicó que la secuencia TAV también es importante para el epítopo reconocido por este mAb. Así, los pestivirus quiméricos, vR26_TAV y vR26_E2gif, que contienen secuencias E2 heterólogas, pueden ser discriminados fácilmente de la vR26 utilizando anticuerpos monoclonales específicos anti-E2. Estos nuevos pestivirus quiméricos representan candidatos a vacunas marcadas basadas en Cstrain con las características deseadas para vacunas DIVA seguras y eficaces contra De hecho, los cerdos vacunados con vR26_E2gif podrían ser discriminados eficazmente de los cerdos vacunados con C-cetra y de los cerdos infectados con CSFV utilizando anticuerpos específicos ELISAs (Rasmussen et al., resultados inéditos).Los datos de secuencia de nucleótida para el pBeloR26 mostraron una serie de cambios de la secuencia de referencia publicada para "C-cetra Riems".Algunas de estas diferencias están presentes en el ADNc derivado de la población vacunal a un nivel detectable, mientras que otras pueden representar variantes de bajo nivel dentro del ADNc o errores introducidos por la amplificación RT-PCR. La secuenciación completa reveló que no se produjeron cambios en el ADNc durante la propagación extensiva en E. coli DH10B del pBeloR26 y el derivado E2chimeric, pBeloR26_E2gif, lo que indica una muy alta estabilidad de estos CSFV cDNAs cerrados por BAC. Esto es esencial para que este sistema sea útil para la clonación y la manipulación de secuencias, y contrasta con problemas de estabilidad encontrados con plásmidos convencionales que contienen pásmidos que contienen pestivirus cDNAs de larga duración [31]. La estabilidad de estos BACs es consistente con informes anteriores sobre la estabilidad de los BACs que contienen otros virus de la familia Flaviviridae en E. coli [8, 10].

El BAC difería de la secuencia de ADNc parental por qué sustituciones de aminoácidos?

¿Qué tipo de operación del proveedor importa los volúmenes? Asociaciones entre el riesgo de infección del sitio quirúrgico de CABG y el hospital y los volúmenes de operación del cirujano entre los centros médicos de Taiwánhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4459823/SHA: f3cbc0503581249a834895fc94cd3bae24714a0dAutores: Yu, Tsung-Hsien; Tung, Yu-Chi; Chung, Kuo-PiaoFecha: 2015-06-08DOI: 10.1371/journal.pone.0129178Licencia: cc-byResumen: ANTEGRADO: Las relaciones de infección por volumen han sido examinadas para procedimientos quirúrgicos de alto riesgo, pero las conclusiones siguen siendo controvertidas. La inconsistencia puede deberse a la identificación inexacta de los casos de infección y a diferentes métodos de categorización de los volúmenes de servicio. Este estudio toma como ejemplo las infecciones del sitio quirúrgico de bypass de arteria coronaria (CABG) como un ejemplo para examinar si existe una relación entre los volúmenes de operación y las ISS, cuando se implementaron diferentes identificaciones, definiciones y métodos de categorización de los volúmenes de operación. MÉTODOS: Se realizó un estudio multinivel basado en la población. Un total de 7.007 pacientes que recibieron cirugía CABG entre 2006 y 2008 de19 centros médicos de Taiwán fueron reclutados. Se utilizaron dos definiciones de los volúmenes de cirugía cirujana y hospitalaria: (1) los volúmenes acumulativos de la operación CABG en el período del estudio; (2) los volúmenes acumulativos de la operación CABG en el año anterior a cada cirugía CABG. Los volúmenes de la operación fueron tratados de tres maneras diferentes: (1) una variable continua; (2) una variable categórica basada en el cuartil; y (3) una variable categórica basada en datos basada en algoritmo de agrupamiento k-medias. Además, también se realizó un análisis de subgrupos para las comorbilidades. RESULTADOS: Este estudio mostró que los volúmenes hospitalarios no estaban significativamente asociados con las SSI, sin importar qué definiciones o métodos de categorización del volumen de la operación, o enfoques de identificación de casos SSI. Por el contrario, las relaciones entre los volúmenes del cirujano variaron. La mayoría de los modelos demostraron que los cirujanos de bajo volumen tenían mayor riesgo que los cirujano CONCLUSIÓN: Los volúmenes de cirujanos fueron más importantes que los volúmenes hospitalarios en la exploración de la relación entre los volúmenes de operación de CABG y los SSI en Taiwán. Sin embargo, las relaciones no fueron sólidas. Las definiciones y los métodos de categorización del volumen de operación y la identificación correcta de las SSI son cuestiones importantes para futuras investigaciones. Texto: los datos, que deben utilizar modelos jerárquicos, pueden dar lugar a una estimación sesgada de la variación y también conducir a conclusiones incorrectas. Los SSI tras los procedimientos de bypass coronario (CABG) suponen una pesada carga para los pacientes y los sistemas de salud. [20, 21] En 2008, los Centros para Medicare y Medicaid de los Estados Unidos de América implementaron la política de "Never Event", donde los hospitales ya no recibirían pagos más altos por los costos adicionales asociados con el tratamiento de pacientes para ciertas infecciones adquiridas por el cuidado de la salud, incluyendo aquellas relacionadas con CABG. En vista de la exactitud de la identificación de los SSI y la heterogeneidad de los métodos de definición y categorización, ningún estudio existente ha utilizado diferentes identificaciones de casos de infección ni definiciones y métodos de categorización de volumen de operación simultáneamente para explorar la relación entre volúmenes de operación e infección. El estudio actual toma los SSI de CABG como un ejemplo para examinar si existe una relación entre los volúmenes de operación y los SSI, dada la identificación de diferentes casos de SSI, definiciones de volumen de operación y métodos de categorización. Este estudio retrospectivo y transversal adoptó un diseño multinivel para examinar El NHIRD, publicado por el Instituto Nacional de Investigaciones Sanitarias de Taiwán, incluye todos los datos de reclamaciones originales y los archivos de registro de los beneficiarios inscritos en el programa del Seguro Nacional de Salud (NHI). La base de datos cubre los 23 millones de taiwaneses inscritos (aproximadamente el 98% de la población) en el programa del NHI. Es una base de datos secundaria no identificada que contiene información demográfica y administrativa a nivel de paciente; sin embargo, los ítems de tratamiento son agregados y sin información clínica y relacionada con el tiempo. Los datos se publican con fines de investigación. El protocolo para el estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Hospital Universitario Nacional de Taiwán (protocol #201001027R). El conjunto de datos que usamos en este estudio fue datos secundarios; toda la información fue desidentificada por los propietarios de datos. En este estudio, se adoptaron los códigos ICD-9-CM SSI (en adelante, el modelo basado en ICD-9-CM) y el modelo de Clasificación y Regresión de Árboles (CART), desarrollados en nuestro trabajo anterior [11] para identificar los casos de SSI. Como mencionamos anteriormente, los códigos ICD-9-CM SSI fueron la herramienta más popular para identificar los casos de SSI en los datos de reclamaciones. En el modelo basado en ICD-9-CM, los casos de SSI se dividieron en dos categorías: eventos de hospitalización índice y eventos posteriores a la descarga (es decir, SSI que ocurrieron dentro de un año después del alta y requirieron readmisión a un hospital y/o el uso de servicios ambulatorios). Siguiendo a Wu et al [13], este estudio adoptó los códigos de diagnóstico ICD-9-CM secundario para eventos de hospitalización índice (código ICD-9-CM: 996.03, 996.61, 996.72 y 998.5), y los códigos de diagnóstico primario y secundario para eventos post-descarga (código ICD-9-CM: 038.0-038.4) como criterios para la identificación de SSI, con el fin de evitar casos en los que la infección existía antes de la hospitalización. Si un caso tenía un evento de hospitalización índice o un evento post-descarga, entonces él / ella será identificado como SSI por el modelo basado en ICD-9-CM. En el modelo CART, adoptamos el tipo de antibióticos, dosis de cefazolina, duración de la estancia, y número de vasos obstruidos (como indicador proxy de la duración de la operación) como los parámetros para identificar las SSI, de [11] En nuestro trabajo anterior, se utilizaron los datos de las reclamaciones del Seguro Nacional de Salud 2005-2008 y los datos de vigilancia de infecciones asociadas a la atención médica de dos centros médicos para el desarrollo de modelos y la verificación de modelos.Los casos de infección basados en la vigilancia fueron identificados por el personal de control de infecciones si el paciente cumplía los criterios de los CDC de Taiwán, que son los mismos que los adoptados en los CDC de EE.UU. Revisan manualmente los registros médicos de todos los pacientes en riesgo de infección asociada a la atención médica especificada.Los algoritmos de clasificación, el modelo de regresión multivariable y el modelo de extracción de datos fueron adoptados para desarrollar modelos alternativos basados en indicadores sustitutos para identificar los casos de SSI de CABG y comparar el desempeño entre estos modelos y el modelo basado en CAI-9. Para los algoritmos de clasificación, los investigadores construyen varios criterios, y si un caso satisface (o excede) un número específico Para el modelo de regresión multivariable, los investigadores generalmente calcularon una puntuación de riesgo por el modelo de regresión logística, y el punto de corte óptimo se determinó de acuerdo con la curva de características operativas del receptor resultante.En cuanto al enfoque de extracción de datos, que es ampliamente utilizado para predecir y clasificar objetos, las características son: descubrimiento automático de patrones, predicción de resultados probables, creación de información accionable y enfoque en grandes conjuntos de datos y bases de datos.El modelo de clasificación y árbol de regresión (TARC), que es el enfoque más popular como se aplica en nuestro trabajo, y el crecimiento, parada y poda del árbol fueron determinados por las medidas de mejora de Gini. [22, 23] Después de referirse a la literatura y conferir con especialistas en enfermedades infecciosas, adoptamos los siguientes siete parámetros: tipo de antibiótico, dosis de antibiótico, dosis de cefazolina, uso de antibióticos de segunda línea, duración de la estancia, y número de Además, también se utilizó la validación cruzada, donde se utilizaron datos de un centro médico para el desarrollo de modelos, y otro para la validación de modelos. Los resultados de nuestro trabajo anterior revelaron que el modelo CART ofrecía un mejor rendimiento que el de los otros modelos de identificación o el modelo basado en ICD-9-CM, especialmente en el valor predictivo positivo (>70 %), que sólo se encontró en un 20% en el modelo basado en ICD-9-CM. (Tabla 1 ) Los resultados también implicaron que el CART era una herramienta decididamente mejor para identificar casos de SSI en la base de datos del Seguro Nacional de Salud de Taiwán. Por lo tanto, este estudio también adoptó el modelo CART para identificar SSIs CABG. Para asegurar la homogeneidad, el estudio actual analizó 7.007 pacientes de 19 centros médicos de Taiwán que se sometieron a cirugía CABG (códigos 36.1x-36.2x Se excluyeron en este estudio los pacientes con CABG menores de 18 años o mayores de 85 años, en los cuales se identificaron 302 casos como SSI por el modelo basado en CIE-9-CM, y se identificaron 107 casos como SSI por el modelo CART. En este estudio se utilizaron las siguientes dos definiciones para definir los volúmenes de operación: (1) los volúmenes de operación acumulados por cada cirujano y hospital en el período de estudio, que fue la definición más común en la literatura; y (2) siguiendo el estudio de Yasunaga et al., [24] volúmenes de operación acumulativos por cada cirujano y hospital en el año anterior para cada cirugía. Sin embargo, nuestros datos fueron sesgados, lo que no siguió una distribución normal, por lo que se realizaron las transformaciones logarísticas en los volúmenes de operación. El trabajo actual trató los volúmenes de operación de tres maneras diferentes: (1) una variable continua; (2) una variable categórica basada en el primer y tercer cuartil como puntos de corte (el método más común para categorizar los volúmenes de servicio/operación) [25] [26] [28] ; y (3) una variable categórica basada en datos basada en algoritmo de agrupamiento de k-medias. Este estudio clasificó los volúmenes de cirujano y hospital en grupos de volumen bajo, medio y alto por método cuartil y algoritmo de agrupamiento de kmeos. En el método cuartil, el valor de corte (transformado por logaritmo) del primer cuartil (<25%) para volúmenes hospitalarios fue 5,65, y el tercer cuartil (>75 %) fue 6,43. En términos de volúmenes de cirujano, el primer cuartil fue 4,38 y el tercero fue 5,35, cuando se utilizaron los volúmenes de operación Mientras que la definición cambió, el primer cuartil (<25%) para los volúmenes hospitalarios fue de 4.66, y el tercer cuartil (>75%) fue de 5.31. En términos de volúmenes cirujanos, el primer cuartil fue de 3.40, y el tercero fue de 4.32. El agrupamiento de medios K es un algoritmo de aprendizaje automático no supervisado introducido por MacQueen en la década de 1960. Este método no es sólo un método simple y muy confiable en la categorización/clasificación, sino que también es reconocido como uno de los 10 algoritmos más importantes en la minería de datos. [29] Este método se ha aplicado a menudo en muchos campos. [30] [31] [32] Yu y sus colegas incluso lo aplicaron para definir la calidad del cuidado CABG, y para explorar la relación entre el estado de ingresos del paciente, el nivel de calidad de la atención y la mortalidad hospitalaria. [33] La idea principal de este método es particionar los puntos de datos observados en los clústeres k no superpuestos minimizando la suma de cuadrados dentro del grupo. Cada punto se asigna a la media de su clúster utilizando la distancia Euclidiana. En primer lugar, los centros de clúster k fueron generados aleatoriamente. Los estudios anteriores normalmente dividían cirujanos y hospitales en grupos de volumen bajo, medio y alto; por lo tanto, también predeterminamos los volúmenes de los servicios de cirujano y hospital en 3 grupos (k = 3). Luego, los participantes fueron asignados al clúster con la distancia más corta a estos centros de clúster. Finalmente, los centros de clúster fueron recomputados utilizando la nueva asignación de clústeres y estos pasos serían iterados hasta que se lograra la convergencia. [34] Los valores de corte de los volúmenes hospitalarios fueron 5,21 y 5,69, Asimismo, cuando se utilizaron como definición los volúmenes de operación acumulativos antes de cada cirugía, los valores de corte fueron 4,11 y 4,89 para los volúmenes hospitalarios, y 2,64 y 3,91 para los volúmenes quirúrgicos. Todos los valores de corte fueron transformados por logaritmo. Los resultados del agrupamiento de medias-k se muestran en las Figs 1-4. Como los resultados muestran, los volúmenes de operación se dividieron en tres grupos por separado. Además de los volúmenes quirúrgicos y hospitalarios y SSI, se recogieron datos a nivel de paciente, cirujano y hospital. En primer lugar, las variables a nivel de paciente incluyeron edad, sexo, duración de la permanencia en la UCI, número de vasos obstruidos que estuvieron involucrados en la operación quirúrgica, y la presencia de enfermedades subyacentes importantes (p. ej., diabetes mellitus, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), insuficiencia cardíaca, insuficiencia renal e insuficiencia renal, que En tercer lugar, las variables de nivel hospitalario incluyeron la propiedad hospitalaria y la ubicación geográfica; todos los análisis estadísticos de la relación volumen-infección se realizaron utilizando SAS (versión 9.2, SAS Institution Inc., Cary, NC, EE.UU.). En las pruebas estadísticas, se consideró estadísticamente significativo un valor p de dos caras 0,05; las propiedades distributivas de las variables continuas se expresaron por media ± desviación estándar (DE), mientras que las variables categóricas se presentaron por frecuencia y porcentaje; en el análisis univariado, se examinaron los potenciales predictores de tres niveles de SSI utilizando prueba de chi-cuadrado o prueba t de dos muestras, según corresponda; a continuación, para tener en cuenta las correlaciones dentro del cirujano (nivel 2) y del hospital (nivel-3), se realizó un análisis multivariado mediante el ajuste de modelos de regresión logística de efectos mixtos a los datos de cada paciente para estimar los efectos Además, se realizó un análisis de subgrupos para las comorbilidades, en la Tabla 2 se muestra que hubo 7.007 pacientes con CABG realizados por 199 cirujanos en 19 hospitales de Taiwán durante el período 2006-2008; la mayoría de los pacientes eran varones (77,5%), y la edad media de los pacientes era de 65,3 años; el promedio de permanencia en la UCI fue de 6,05 días, el promedio de vasos obstruidos fue de 1,6, mientras que el 51,8% de los pacientes tenían diabetes mellitus, el 33,3% tenía insuficiencia cardiaca, el 14,1% tenía insuficiencia renal y el 22,0% tenía EPOC; se identificaron trescientos dos pacientes (4,31%) con los códigos SSI ICD-9-CM; sin embargo, la identificación por el modelo CART solo reveló 107 casos de infección, y 94 casos fueron identificados en ambos modelos. La mayoría de los casos fueron operados por cirujanos masculinos, con una edad media de 45 años, y los volúmenes de operación promedio del cirujano en el período de estudio fueron 151,64, mientras que los volúmenes de operación promedio antes de la cirugía fueron 52,18; más de la mitad de los casos fueron realizados con CABG en hospitales sin fines de lucro, y los volúmenes de operación promedio de los hospitales en el período de estudio fueron 473,60, mientras que los volúmenes de operación promedio antes de cada cirugía fueron 158,79; además, la mayoría de los pacientes recibieron sus cirugías por cirujanos y hospitales de alto volumen, cuando se utilizó el algoritmo de k-medias para categorización, independientemente de la definición de volúmenes de operación utilizada; la Tabla 3 muestra los resultados de los modelos multinivel de efecto mixto, identificando los SSI mediante códigos ICD-9-CM, y los volúmenes de operación definidos como volúmenes acumulativos dentro del período de Los resultados del Modelo 1 (continuo) revelan que los volúmenes del cirujano se asociaron negativamente con las ISS, mientras que los volúmenes del hospital no se asociaron con las infecciones del sitio quirúrgico ISS. El Modelo 2 (cuartil) sugiere que los cirujanos de bajo volumen tuvieron mayor riesgo de ISS (OR = 2.220, valor p = 0.022) que los cirujanos de alto volumen. Tampoco hubo asociación entre los volúmenes de operación del hospital y las ISS. El Modelo 3 (media k) muestra que la asociación no existió entre los volúmenes del hospital/cirujano y las ISS. La Tabla 4 muestra los resultados de los modelos multinivel de efecto mixto, en los que las ISS fueron identificadas por el modelo CART, y los volúmenes de operación también fueron definidos como los volúmenes acumulativos dentro del período del estudio. El Modelo 1 nuevamente indicó una asociación negativa entre los volúmenes del cirujano y las ISS, y En el Modelo 2, los resultados mostraron que la relación entre los volúmenes hospitalarios/cirujanos y las ISS no existía.En el Modelo 3, los resultados mostraron que los cirujanos de bajo volumen tenían mayor riesgo (OR = 1,691, p = 0,002) que los cirujanos de alto volumen.La Tabla 5 muestra los resultados de los modelos multinivel de efecto mixto, en los que las ISS fueron identificadas por códigos ICD-9-CM, pero los volúmenes de operación fueron definidos como el volumen acumulativo en el año anterior para cada cirugía.El Modelo 1 también indicó una asociación negativa entre los volúmenes del cirujano y las ISS, y los volúmenes del hospital no se encontraron asociados con las ISS.En el Modelo 2, los resultados mostraron que la relación entre los volúmenes del hospital/cirujano y las ISS no existía.En el Modelo 3, los resultados también revelaron que los cirujanos de bajo volumen tenían mayor riesgo (OR = 1,642 En la Tabla 6 se muestran los resultados de los modelos multinivel de efecto mixto, en los que las IES fueron identificadas por el modelo CART, y los volúmenes de operación fueron definidos como el volumen acumulativo en un año anterior para cada cirugía. En el Modelo 1, diferente a los hallazgos anteriores, no hubo asociación entre los volúmenes hospitalarios/cirujanos y los IES. En el Modelo 2, los resultados mostraron que la relación entre los volúmenes hospitalarios/cirujanos y los IES no existía. En el Modelo 3, los resultados también revelaron que los cirujanos de bajo volumen tenían mayor riesgo (OR = 1,163, p = 0,020) que los cirujanos de alto volumen. Examinamos además las asociaciones de los volúmenes cirujanos y hospitalarios con los IES en los análisis de estratificación por enfermedades subyacentes. (Tabla 7 ) Sin embargo, cuando los volúmenes de la operación fueron definidos como los volúmenes de la operación acumulada en el año anterior para cada cirugía, los resultados sugieren que hubo una asociación negativa entre los volúmenes del cirujano y los SSI en el grupo de la diabetes, excepto que los volúmenes fueron tratados como variables continuas y los casos de infección fueron identificados por códigos ICD-9. En términos de volúmenes de la operación hospitalaria, la asociación no existió. (Tabla 8 ) No se han realizado estudios que evalúen cómo diferentes definiciones de los volúmenes de servicio/operación y métodos de categorización afectan a las relaciones de infección por volumen. Además, varios estudios han señalado la inadecuación de identificar los casos de infección utilizando los códigos ICD-9-CM en los datos de reclamos. Nuestros hallazgos mostraron que las relaciones entre los volúmenes hospitalarios y los SSI no existían, independientemente de las definiciones, mehods de categorización o enfoques de identificación de casos SSI. Por el contrario, las relaciones entre los volúmenes cirujanos y los SSI no eran sólidas en nuestros datos. Podría verse afectada por diferentes definiciones y métodos de categorización de volúmenes de operación, y también por diferentes enfoques de identificación de casos SSI. En resumen, la mayoría de los modelos demostraron que los cirujanos de bajo volumen tenían mayor riesgo que los cirujanos de alto volumen, y también mostraron que los riesgos eran similares entre los cirujanos de volumen medio y alto. Sin embargo, ¿por qué el volumen de cirujano se relacionaba con los SSI, pero el volumen hospitalario no? Excepto por los temas que nos preocupaban en este estudio, hay algunos desacuerdos en la literatura. [12, 35] O "¿Es el volumen del proveedor el único predictor para el resultado del cuidado?" [35, 36] Estos temas son dignos de más discusión, pero están fuera del alcance de este estudio.Los volúmenes de servicio/operación se tratan como un indicador proxy para las experiencias; estudios anteriores lo utilizaron para examinar si la práctica mejora o no. Pero, excepto las experiencias del proveedor, los SSI también se ven afectados por muchos factores, como factores ambientales y clínicos. Wu et al. una vez utilizaron Taiwán 2001 NHI afirma datos para explorar la relación entre los volúmenes de operación del proveedor CABG y los SSI. [13] Encontraron que los volúmenes hospitalarios tenían un efecto mayor que los volúmenes del cirujano y afirmaron que esto podría implicar que el trabajo en equipo del hospital es más importante que el cirujano individual. Sin embargo, nuestros hallazgos demostraron que no había relación entre los volúmenes del hospital y los SSI. Wu et al. Los resultados variaron entre las diferentes definiciones y el método de categorización de los volúmenes de operación, y se adoptaron los volúmenes de operación acumulados dentro del período de estudio como definición, e identificaron las ICS por medio de códigos ICD-9-CM. Excepto que hubo dos diferencias entre nuestro trabajo y Wu et al., que fueron la duración y el año de los datos; nuestros datos fueron más largos y actualizados que los de ellos. Además, cabe señalar que hubo un brote de síndrome respiratorio agudo severo (SARS) en Taiwán en 2003, después de lo cual se revisó y rediseñó el sistema de control de infecciones hospitalarias en Taiwán. Los datos de Wu et al. fueron anteriores al SARS, por lo que estos esfuerzos también pudieron haber mejorado el nivel de control de las ISS en los hospitales, lo que dio lugar a diferentes hallazgos en este estudio. Por último, los resultados de los análisis de estratificación mostraron que el cirujano de bajo volumen tenía mayor riesgo que el cirujano de alto volumen en el grupo de la diabetes mellitus, cuando se utilizó la operación acumulativa en el año anterior antes de la cirugía como definición. Un gran número de estudios han indicado que la diabetes mellitus está asociada con un mayor riesgo de SSI, [37] [38] [39] y los resultados de este estudio sugieren que los pacientes con CABG con diabetes mellitus deben ser atendidos por cirujanos experimentados. Se aplicó un análisis multinivel para manejar los factores anidados, y se adoptaron dos definiciones de volumen de operación junto con tres métodos de categorización del volumen de operación diferentes para examinar la relación entre el volumen y las SSI bajo dos tipos de abordajes de identificación de las SSI. Sin embargo, el estudio sufrió varias limitaciones importantes. En primer lugar, la exactitud de la identificación de los SSI seguía siendo un problema. Aunque el rendimiento del modelo de CART para identificar los SSI de CABG fue mejor que los códigos ICD-9-CM en Taiwán, no alcanzó el escenario perfecto. La precisión de la identificación de los SSI seguía siendo un desafío en nuestro trabajo. La segunda limitación se refiere a variables no medidas, como la duración de la estancia antes de la operación, la condición de infección, la extirpación del cabello, la información clínica (por ejemplo, el nivel de glucosa en sangre, el microorganismo causal), la información relacionada con el tiempo (por ejemplo, la duración de la operación), el medio ambiente, las habilidades quirúrgicas, el uso de drenajes postoperatorios, el número de operaciones involucradas, y la atención quirúrgica del sitio y la herida, etc. [40] Además, no se disponía de información sobre el tipo (electivo o urgente) y el En conclusión, los hallazgos de este estudio sugieren que diferentes definiciones y métodos de categorización de volúmenes de operación, y diferentes enfoques de identificación de SSI podrían conducir a diferentes hallazgos, aunque los volúmenes de cirujano eran más importantes que los volúmenes hospitalarios en la exploración de las relaciones entre los volúmenes de operación de CABG y SSI en Taiwán, pero todavía no eran robustos. Definiciones y métodos de categorización de volúmenes de operación, y la identificación correcta de SSI son cuestiones importantes para futuras investigaciones.

¿Cuál es el propósito de este estudio de investigación?

¿Qué tipo de operación del proveedor importa los volúmenes? Asociaciones entre el riesgo de infección del sitio quirúrgico de CABG y el hospital y los volúmenes de operación del cirujano entre los centros médicos de Taiwánhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4459823/SHA: f3cbc0503581249a834895fc94cd3bae24714a0dAutores: Yu, Tsung-Hsien; Tung, Yu-Chi; Chung, Kuo-PiaoFecha: 2015-06-08DOI: 10.1371/journal.pone.0129178Licencia: cc-byResumen: ANTEGRADO: Las relaciones de infección por volumen han sido examinadas para procedimientos quirúrgicos de alto riesgo, pero las conclusiones siguen siendo controvertidas. La inconsistencia puede deberse a la identificación inexacta de los casos de infección y a diferentes métodos de categorización de los volúmenes de servicio. Este estudio toma como ejemplo las infecciones del sitio quirúrgico de bypass de arteria coronaria (CABG) como un ejemplo para examinar si existe una relación entre los volúmenes de operación y las ISS, cuando se implementaron diferentes identificaciones, definiciones y métodos de categorización de los volúmenes de operación. MÉTODOS: Se realizó un estudio multinivel basado en la población. Un total de 7.007 pacientes que recibieron cirugía CABG entre 2006 y 2008 de19 centros médicos de Taiwán fueron reclutados. Se utilizaron dos definiciones de los volúmenes de cirugía cirujana y hospitalaria: (1) los volúmenes acumulativos de la operación CABG en el período del estudio; (2) los volúmenes acumulativos de la operación CABG en el año anterior a cada cirugía CABG. Los volúmenes de la operación fueron tratados de tres maneras diferentes: (1) una variable continua; (2) una variable categórica basada en el cuartil; y (3) una variable categórica basada en datos basada en algoritmo de agrupamiento k-medias. Además, también se realizó un análisis de subgrupos para las comorbilidades. RESULTADOS: Este estudio mostró que los volúmenes hospitalarios no estaban significativamente asociados con las SSI, sin importar qué definiciones o métodos de categorización del volumen de la operación, o enfoques de identificación de casos SSI. Por el contrario, las relaciones entre los volúmenes del cirujano variaron. La mayoría de los modelos demostraron que los cirujanos de bajo volumen tenían mayor riesgo que los cirujano CONCLUSIÓN: Los volúmenes de cirujanos fueron más importantes que los volúmenes hospitalarios en la exploración de la relación entre los volúmenes de operación de CABG y los SSI en Taiwán. Sin embargo, las relaciones no fueron sólidas. Las definiciones y los métodos de categorización del volumen de operación y la identificación correcta de las SSI son cuestiones importantes para futuras investigaciones. Texto: los datos, que deben utilizar modelos jerárquicos, pueden dar lugar a una estimación sesgada de la variación y también conducir a conclusiones incorrectas. Los SSI tras los procedimientos de bypass coronario (CABG) suponen una pesada carga para los pacientes y los sistemas de salud. [20, 21] En 2008, los Centros para Medicare y Medicaid de los Estados Unidos de América implementaron la política de "Never Event", donde los hospitales ya no recibirían pagos más altos por los costos adicionales asociados con el tratamiento de pacientes para ciertas infecciones adquiridas por el cuidado de la salud, incluyendo aquellas relacionadas con CABG. En vista de la exactitud de la identificación de los SSI y la heterogeneidad de los métodos de definición y categorización, ningún estudio existente ha utilizado diferentes identificaciones de casos de infección ni definiciones y métodos de categorización de volumen de operación simultáneamente para explorar la relación entre volúmenes de operación e infección. El estudio actual toma los SSI de CABG como un ejemplo para examinar si existe una relación entre los volúmenes de operación y los SSI, dada la identificación de diferentes casos de SSI, definiciones de volumen de operación y métodos de categorización. Este estudio retrospectivo y transversal adoptó un diseño multinivel para examinar El NHIRD, publicado por el Instituto Nacional de Investigaciones Sanitarias de Taiwán, incluye todos los datos de reclamaciones originales y los archivos de registro de los beneficiarios inscritos en el programa del Seguro Nacional de Salud (NHI). La base de datos cubre los 23 millones de taiwaneses inscritos (aproximadamente el 98% de la población) en el programa del NHI. Es una base de datos secundaria no identificada que contiene información demográfica y administrativa a nivel de paciente; sin embargo, los ítems de tratamiento son agregados y sin información clínica y relacionada con el tiempo. Los datos se publican con fines de investigación. El protocolo para el estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Hospital Universitario Nacional de Taiwán (protocol #201001027R). El conjunto de datos que usamos en este estudio fue datos secundarios; toda la información fue desidentificada por los propietarios de datos. En este estudio, se adoptaron los códigos ICD-9-CM SSI (en adelante, el modelo basado en ICD-9-CM) y el modelo de Clasificación y Regresión de Árboles (CART), desarrollados en nuestro trabajo anterior [11] para identificar los casos de SSI. Como mencionamos anteriormente, los códigos ICD-9-CM SSI fueron la herramienta más popular para identificar los casos de SSI en los datos de reclamaciones. En el modelo basado en ICD-9-CM, los casos de SSI se dividieron en dos categorías: eventos de hospitalización índice y eventos posteriores a la descarga (es decir, SSI que ocurrieron dentro de un año después del alta y requirieron readmisión a un hospital y/o el uso de servicios ambulatorios). Siguiendo a Wu et al [13], este estudio adoptó los códigos de diagnóstico ICD-9-CM secundario para eventos de hospitalización índice (código ICD-9-CM: 996.03, 996.61, 996.72 y 998.5), y los códigos de diagnóstico primario y secundario para eventos post-descarga (código ICD-9-CM: 038.0-038.4) como criterios para la identificación de SSI, con el fin de evitar casos en los que la infección existía antes de la hospitalización. Si un caso tenía un evento de hospitalización índice o un evento post-descarga, entonces él / ella será identificado como SSI por el modelo basado en ICD-9-CM. En el modelo CART, adoptamos el tipo de antibióticos, dosis de cefazolina, duración de la estancia, y número de vasos obstruidos (como indicador proxy de la duración de la operación) como los parámetros para identificar las SSI, de [11] En nuestro trabajo anterior, se utilizaron los datos de las reclamaciones del Seguro Nacional de Salud 2005-2008 y los datos de vigilancia de infecciones asociadas a la atención médica de dos centros médicos para el desarrollo de modelos y la verificación de modelos.Los casos de infección basados en la vigilancia fueron identificados por el personal de control de infecciones si el paciente cumplía los criterios de los CDC de Taiwán, que son los mismos que los adoptados en los CDC de EE.UU. Revisan manualmente los registros médicos de todos los pacientes en riesgo de infección asociada a la atención médica especificada.Los algoritmos de clasificación, el modelo de regresión multivariable y el modelo de extracción de datos fueron adoptados para desarrollar modelos alternativos basados en indicadores sustitutos para identificar los casos de SSI de CABG y comparar el desempeño entre estos modelos y el modelo basado en CAI-9. Para los algoritmos de clasificación, los investigadores construyen varios criterios, y si un caso satisface (o excede) un número específico Para el modelo de regresión multivariable, los investigadores generalmente calcularon una puntuación de riesgo por el modelo de regresión logística, y el punto de corte óptimo se determinó de acuerdo con la curva de características operativas del receptor resultante.En cuanto al enfoque de extracción de datos, que es ampliamente utilizado para predecir y clasificar objetos, las características son: descubrimiento automático de patrones, predicción de resultados probables, creación de información accionable y enfoque en grandes conjuntos de datos y bases de datos.El modelo de clasificación y árbol de regresión (TARC), que es el enfoque más popular como se aplica en nuestro trabajo, y el crecimiento, parada y poda del árbol fueron determinados por las medidas de mejora de Gini. [22, 23] Después de referirse a la literatura y conferir con especialistas en enfermedades infecciosas, adoptamos los siguientes siete parámetros: tipo de antibiótico, dosis de antibiótico, dosis de cefazolina, uso de antibióticos de segunda línea, duración de la estancia, y número de Además, también se utilizó la validación cruzada, donde se utilizaron datos de un centro médico para el desarrollo de modelos, y otro para la validación de modelos. Los resultados de nuestro trabajo anterior revelaron que el modelo CART ofrecía un mejor rendimiento que el de los otros modelos de identificación o el modelo basado en ICD-9-CM, especialmente en el valor predictivo positivo (>70 %), que sólo se encontró en un 20% en el modelo basado en ICD-9-CM. (Tabla 1 ) Los resultados también implicaron que el CART era una herramienta decididamente mejor para identificar casos de SSI en la base de datos del Seguro Nacional de Salud de Taiwán. Por lo tanto, este estudio también adoptó el modelo CART para identificar SSIs CABG. Para asegurar la homogeneidad, el estudio actual analizó 7.007 pacientes de 19 centros médicos de Taiwán que se sometieron a cirugía CABG (códigos 36.1x-36.2x Se excluyeron en este estudio los pacientes con CABG menores de 18 años o mayores de 85 años, en los cuales se identificaron 302 casos como SSI por el modelo basado en CIE-9-CM, y se identificaron 107 casos como SSI por el modelo CART. En este estudio se utilizaron las siguientes dos definiciones para definir los volúmenes de operación: (1) los volúmenes de operación acumulados por cada cirujano y hospital en el período de estudio, que fue la definición más común en la literatura; y (2) siguiendo el estudio de Yasunaga et al., [24] volúmenes de operación acumulativos por cada cirujano y hospital en el año anterior para cada cirugía. Sin embargo, nuestros datos fueron sesgados, lo que no siguió una distribución normal, por lo que se realizaron las transformaciones logarísticas en los volúmenes de operación. El trabajo actual trató los volúmenes de operación de tres maneras diferentes: (1) una variable continua; (2) una variable categórica basada en el primer y tercer cuartil como puntos de corte (el método más común para categorizar los volúmenes de servicio/operación) [25] [26] [28] ; y (3) una variable categórica basada en datos basada en algoritmo de agrupamiento de k-medias. Este estudio clasificó los volúmenes de cirujano y hospital en grupos de volumen bajo, medio y alto por método cuartil y algoritmo de agrupamiento de kmeos. En el método cuartil, el valor de corte (transformado por logaritmo) del primer cuartil (<25%) para volúmenes hospitalarios fue 5,65, y el tercer cuartil (>75 %) fue 6,43. En términos de volúmenes de cirujano, el primer cuartil fue 4,38 y el tercero fue 5,35, cuando se utilizaron los volúmenes de operación Mientras que la definición cambió, el primer cuartil (<25%) para los volúmenes hospitalarios fue de 4.66, y el tercer cuartil (>75%) fue de 5.31. En términos de volúmenes cirujanos, el primer cuartil fue de 3.40, y el tercero fue de 4.32. El agrupamiento de medios K es un algoritmo de aprendizaje automático no supervisado introducido por MacQueen en la década de 1960. Este método no es sólo un método simple y muy confiable en la categorización/clasificación, sino que también es reconocido como uno de los 10 algoritmos más importantes en la minería de datos. [29] Este método se ha aplicado a menudo en muchos campos. [30] [31] [32] Yu y sus colegas incluso lo aplicaron para definir la calidad del cuidado CABG, y para explorar la relación entre el estado de ingresos del paciente, el nivel de calidad de la atención y la mortalidad hospitalaria. [33] La idea principal de este método es particionar los puntos de datos observados en los clústeres k no superpuestos minimizando la suma de cuadrados dentro del grupo. Cada punto se asigna a la media de su clúster utilizando la distancia Euclidiana. En primer lugar, los centros de clúster k fueron generados aleatoriamente. Los estudios anteriores normalmente dividían cirujanos y hospitales en grupos de volumen bajo, medio y alto; por lo tanto, también predeterminamos los volúmenes de los servicios de cirujano y hospital en 3 grupos (k = 3). Luego, los participantes fueron asignados al clúster con la distancia más corta a estos centros de clúster. Finalmente, los centros de clúster fueron recomputados utilizando la nueva asignación de clústeres y estos pasos serían iterados hasta que se lograra la convergencia. [34] Los valores de corte de los volúmenes hospitalarios fueron 5,21 y 5,69, Asimismo, cuando se utilizaron como definición los volúmenes de operación acumulativos antes de cada cirugía, los valores de corte fueron 4,11 y 4,89 para los volúmenes hospitalarios, y 2,64 y 3,91 para los volúmenes quirúrgicos. Todos los valores de corte fueron transformados por logaritmo. Los resultados del agrupamiento de medias-k se muestran en las Figs 1-4. Como los resultados muestran, los volúmenes de operación se dividieron en tres grupos por separado. Además de los volúmenes quirúrgicos y hospitalarios y SSI, se recogieron datos a nivel de paciente, cirujano y hospital. En primer lugar, las variables a nivel de paciente incluyeron edad, sexo, duración de la permanencia en la UCI, número de vasos obstruidos que estuvieron involucrados en la operación quirúrgica, y la presencia de enfermedades subyacentes importantes (p. ej., diabetes mellitus, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), insuficiencia cardíaca, insuficiencia renal e insuficiencia renal, que En tercer lugar, las variables de nivel hospitalario incluyeron la propiedad hospitalaria y la ubicación geográfica; todos los análisis estadísticos de la relación volumen-infección se realizaron utilizando SAS (versión 9.2, SAS Institution Inc., Cary, NC, EE.UU.). En las pruebas estadísticas, se consideró estadísticamente significativo un valor p de dos caras 0,05; las propiedades distributivas de las variables continuas se expresaron por media ± desviación estándar (DE), mientras que las variables categóricas se presentaron por frecuencia y porcentaje; en el análisis univariado, se examinaron los potenciales predictores de tres niveles de SSI utilizando prueba de chi-cuadrado o prueba t de dos muestras, según corresponda; a continuación, para tener en cuenta las correlaciones dentro del cirujano (nivel 2) y del hospital (nivel-3), se realizó un análisis multivariado mediante el ajuste de modelos de regresión logística de efectos mixtos a los datos de cada paciente para estimar los efectos Además, se realizó un análisis de subgrupos para las comorbilidades, en la Tabla 2 se muestra que hubo 7.007 pacientes con CABG realizados por 199 cirujanos en 19 hospitales de Taiwán durante el período 2006-2008; la mayoría de los pacientes eran varones (77,5%), y la edad media de los pacientes era de 65,3 años; el promedio de permanencia en la UCI fue de 6,05 días, el promedio de vasos obstruidos fue de 1,6, mientras que el 51,8% de los pacientes tenían diabetes mellitus, el 33,3% tenía insuficiencia cardiaca, el 14,1% tenía insuficiencia renal y el 22,0% tenía EPOC; se identificaron trescientos dos pacientes (4,31%) con los códigos SSI ICD-9-CM; sin embargo, la identificación por el modelo CART solo reveló 107 casos de infección, y 94 casos fueron identificados en ambos modelos. La mayoría de los casos fueron operados por cirujanos masculinos, con una edad media de 45 años, y los volúmenes de operación promedio del cirujano en el período de estudio fueron 151,64, mientras que los volúmenes de operación promedio antes de la cirugía fueron 52,18; más de la mitad de los casos fueron realizados con CABG en hospitales sin fines de lucro, y los volúmenes de operación promedio de los hospitales en el período de estudio fueron 473,60, mientras que los volúmenes de operación promedio antes de cada cirugía fueron 158,79; además, la mayoría de los pacientes recibieron sus cirugías por cirujanos y hospitales de alto volumen, cuando se utilizó el algoritmo de k-medias para categorización, independientemente de la definición de volúmenes de operación utilizada; la Tabla 3 muestra los resultados de los modelos multinivel de efecto mixto, identificando los SSI mediante códigos ICD-9-CM, y los volúmenes de operación definidos como volúmenes acumulativos dentro del período de Los resultados del Modelo 1 (continuo) revelan que los volúmenes del cirujano se asociaron negativamente con las ISS, mientras que los volúmenes del hospital no se asociaron con las infecciones del sitio quirúrgico ISS. El Modelo 2 (cuartil) sugiere que los cirujanos de bajo volumen tuvieron mayor riesgo de ISS (OR = 2.220, valor p = 0.022) que los cirujanos de alto volumen. Tampoco hubo asociación entre los volúmenes de operación del hospital y las ISS. El Modelo 3 (media k) muestra que la asociación no existió entre los volúmenes del hospital/cirujano y las ISS. La Tabla 4 muestra los resultados de los modelos multinivel de efecto mixto, en los que las ISS fueron identificadas por el modelo CART, y los volúmenes de operación también fueron definidos como los volúmenes acumulativos dentro del período del estudio. El Modelo 1 nuevamente indicó una asociación negativa entre los volúmenes del cirujano y las ISS, y En el Modelo 2, los resultados mostraron que la relación entre los volúmenes hospitalarios/cirujanos y las ISS no existía.En el Modelo 3, los resultados mostraron que los cirujanos de bajo volumen tenían mayor riesgo (OR = 1,691, p = 0,002) que los cirujanos de alto volumen.La Tabla 5 muestra los resultados de los modelos multinivel de efecto mixto, en los que las ISS fueron identificadas por códigos ICD-9-CM, pero los volúmenes de operación fueron definidos como el volumen acumulativo en el año anterior para cada cirugía.El Modelo 1 también indicó una asociación negativa entre los volúmenes del cirujano y las ISS, y los volúmenes del hospital no se encontraron asociados con las ISS.En el Modelo 2, los resultados mostraron que la relación entre los volúmenes del hospital/cirujano y las ISS no existía.En el Modelo 3, los resultados también revelaron que los cirujanos de bajo volumen tenían mayor riesgo (OR = 1,642 En la Tabla 6 se muestran los resultados de los modelos multinivel de efecto mixto, en los que las IES fueron identificadas por el modelo CART, y los volúmenes de operación fueron definidos como el volumen acumulativo en un año anterior para cada cirugía. En el Modelo 1, diferente a los hallazgos anteriores, no hubo asociación entre los volúmenes hospitalarios/cirujanos y los IES. En el Modelo 2, los resultados mostraron que la relación entre los volúmenes hospitalarios/cirujanos y los IES no existía. En el Modelo 3, los resultados también revelaron que los cirujanos de bajo volumen tenían mayor riesgo (OR = 1,163, p = 0,020) que los cirujanos de alto volumen. Examinamos además las asociaciones de los volúmenes cirujanos y hospitalarios con los IES en los análisis de estratificación por enfermedades subyacentes. (Tabla 7 ) Sin embargo, cuando los volúmenes de la operación fueron definidos como los volúmenes de la operación acumulada en el año anterior para cada cirugía, los resultados sugieren que hubo una asociación negativa entre los volúmenes del cirujano y los SSI en el grupo de la diabetes, excepto que los volúmenes fueron tratados como variables continuas y los casos de infección fueron identificados por códigos ICD-9. En términos de volúmenes de la operación hospitalaria, la asociación no existió. (Tabla 8 ) No se han realizado estudios que evalúen cómo diferentes definiciones de los volúmenes de servicio/operación y métodos de categorización afectan a las relaciones de infección por volumen. Además, varios estudios han señalado la inadecuación de identificar los casos de infección utilizando los códigos ICD-9-CM en los datos de reclamos. Nuestros hallazgos mostraron que las relaciones entre los volúmenes hospitalarios y los SSI no existían, independientemente de las definiciones, mehods de categorización o enfoques de identificación de casos SSI. Por el contrario, las relaciones entre los volúmenes cirujanos y los SSI no eran sólidas en nuestros datos. Podría verse afectada por diferentes definiciones y métodos de categorización de volúmenes de operación, y también por diferentes enfoques de identificación de casos SSI. En resumen, la mayoría de los modelos demostraron que los cirujanos de bajo volumen tenían mayor riesgo que los cirujanos de alto volumen, y también mostraron que los riesgos eran similares entre los cirujanos de volumen medio y alto. Sin embargo, ¿por qué el volumen de cirujano se relacionaba con los SSI, pero el volumen hospitalario no? Excepto por los temas que nos preocupaban en este estudio, hay algunos desacuerdos en la literatura. [12, 35] O "¿Es el volumen del proveedor el único predictor para el resultado del cuidado?" [35, 36] Estos temas son dignos de más discusión, pero están fuera del alcance de este estudio.Los volúmenes de servicio/operación se tratan como un indicador proxy para las experiencias; estudios anteriores lo utilizaron para examinar si la práctica mejora o no. Pero, excepto las experiencias del proveedor, los SSI también se ven afectados por muchos factores, como factores ambientales y clínicos. Wu et al. una vez utilizaron Taiwán 2001 NHI afirma datos para explorar la relación entre los volúmenes de operación del proveedor CABG y los SSI. [13] Encontraron que los volúmenes hospitalarios tenían un efecto mayor que los volúmenes del cirujano y afirmaron que esto podría implicar que el trabajo en equipo del hospital es más importante que el cirujano individual. Sin embargo, nuestros hallazgos demostraron que no había relación entre los volúmenes del hospital y los SSI. Wu et al. Los resultados variaron entre las diferentes definiciones y el método de categorización de los volúmenes de operación, y se adoptaron los volúmenes de operación acumulados dentro del período de estudio como definición, e identificaron las ICS por medio de códigos ICD-9-CM. Excepto que hubo dos diferencias entre nuestro trabajo y Wu et al., que fueron la duración y el año de los datos; nuestros datos fueron más largos y actualizados que los de ellos. Además, cabe señalar que hubo un brote de síndrome respiratorio agudo severo (SARS) en Taiwán en 2003, después de lo cual se revisó y rediseñó el sistema de control de infecciones hospitalarias en Taiwán. Los datos de Wu et al. fueron anteriores al SARS, por lo que estos esfuerzos también pudieron haber mejorado el nivel de control de las ISS en los hospitales, lo que dio lugar a diferentes hallazgos en este estudio. Por último, los resultados de los análisis de estratificación mostraron que el cirujano de bajo volumen tenía mayor riesgo que el cirujano de alto volumen en el grupo de la diabetes mellitus, cuando se utilizó la operación acumulativa en el año anterior antes de la cirugía como definición. Un gran número de estudios han indicado que la diabetes mellitus está asociada con un mayor riesgo de SSI, [37] [38] [39] y los resultados de este estudio sugieren que los pacientes con CABG con diabetes mellitus deben ser atendidos por cirujanos experimentados. Se aplicó un análisis multinivel para manejar los factores anidados, y se adoptaron dos definiciones de volumen de operación junto con tres métodos de categorización del volumen de operación diferentes para examinar la relación entre el volumen y las SSI bajo dos tipos de abordajes de identificación de las SSI. Sin embargo, el estudio sufrió varias limitaciones importantes. En primer lugar, la exactitud de la identificación de los SSI seguía siendo un problema. Aunque el rendimiento del modelo de CART para identificar los SSI de CABG fue mejor que los códigos ICD-9-CM en Taiwán, no alcanzó el escenario perfecto. La precisión de la identificación de los SSI seguía siendo un desafío en nuestro trabajo. La segunda limitación se refiere a variables no medidas, como la duración de la estancia antes de la operación, la condición de infección, la extirpación del cabello, la información clínica (por ejemplo, el nivel de glucosa en sangre, el microorganismo causal), la información relacionada con el tiempo (por ejemplo, la duración de la operación), el medio ambiente, las habilidades quirúrgicas, el uso de drenajes postoperatorios, el número de operaciones involucradas, y la atención quirúrgica del sitio y la herida, etc. [40] Además, no se disponía de información sobre el tipo (electivo o urgente) y el En conclusión, los hallazgos de este estudio sugieren que diferentes definiciones y métodos de categorización de volúmenes de operación, y diferentes enfoques de identificación de SSI podrían conducir a diferentes hallazgos, aunque los volúmenes de cirujano eran más importantes que los volúmenes hospitalarios en la exploración de las relaciones entre los volúmenes de operación de CABG y SSI en Taiwán, pero todavía no eran robustos. Definiciones y métodos de categorización de volúmenes de operación, y la identificación correcta de SSI son cuestiones importantes para futuras investigaciones.

¿De cuántos centros médicos se estudiaron los pacientes?

Secuencias del genoma del virus de la diarrea epidémica porcina: In Vivo and In Vitro Phenotypeshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4056290/SHA: f6d6d7efc1686a7d219ecfc55f9a48ce72d4fb00Autores: Lawrence, Paulraj K.; Bumgardner, Eric; Bey, Russell F.; Stine, Douglas; Bumgarner, Roger E.Fecha: 2014-06-12DOI: 10.1128/genomea.00503-14Licencia: cc-byAbstract: Desde el brote del virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV) en mayo de 2013, los productores de cerdos estadounidenses han perdido casi cinco millones de cerdos. En un intento de entender la evolución de PEDV en los Estados Unidos y posiblemente desarrollar una estrategia de control, comparamos las secuencias del genoma de una cepa PEDV aislada de un cerdito infectado con su versión adaptada in vitro. La cepa PEDV original fue cultivada en células Vero y pasó 10 veces en serie en una línea celular MARC145. El análisis de la secuencia de la cepa PEDV nativa y el virus in vitro pasaje muestra que la adaptación del cultivo celular modifica específicamente la proteína PEDV pico mientras que el marco de lectura abierto 1a/b (ORF1a/b) codificada poliproteína, la nucleoproteína, NS3B (ORF3) y proteínas de membrana y envoltura permanecen inalteradas. Texto: enfermedad porcina altamente contagiosa. Mientras que los cerdos mayores tienen una probabilidad de supervivencia, entre el 80 y el 100 por ciento de los cerditos infectados por PEDV mueren Una vez que el virus se internaliza, destruye el revestimiento de los intestinos de los lechones, haciéndolos incapaces de digerir y derivar nutrición de la leche y el alimento (1). El virus causa diarrea, vómitos y muerte por deshidratación y hambre (2). PEDV es un miembro de la subfamilia Coronavirinae y pertenece al género Alphacoronavirus. Su tamaño genómico varía de aproximadamente 26 a 32 kb, que es relativamente grande para un virus ARN. Aunque existen vacunas para PEDV en China, Japón y Corea del Sur, no hay vacuna aprobada en los Estados Unidos o Europa (3). Además, PEDV sigue evolucionando dentro de la población porcina de EE.UU. Este informe describe brevemente la comparación de secuencias del genoma de una cepa PEDV aislada de muestras de intestino delgado de un lechon infectado y su versión adaptada in vitro. La cepa original de PEDV fue llamada NPL-PEDV/2013, cultivada en células de Vero, y pasó 10 veces en una línea celular MARC145. La cepa de paso in vitro serial fue llamada NPL-PEDV/2013/P10. El ARN viral total fue extraído por reactivo TRIzol LS y secuenciado por secuenciación de dideoxi Sanger usando una técnica de primer paso. Las secuencias en bruto fueron importadas al ensamblador Geneious (Biomatters, CA), ensambladas, anotadas, y comparadas entre sí usando USA/Colorado/2013 (adhesión de GenBank no. KF272920) como secuencia de referencia. Las secuencias de genoma completo de NPL-PEDV/2013 y NPL-PEDV/2013/P10 contienen 28,038 y 28,025 nucleótidos (nt), respectivamente, El genoma de NPL-PEDV/2013 comparte una identidad del 99% con todos los aislados de EE.UU. secuenciados hasta la fecha y muchos aislados chinos también. Los tres primeros éxitos de BLAST fueron contra aislados de EE.UU., USA/Colora-do/2013 (adhesión de GenBank no. KF272920), IA1 (adhesión de GenBank no. KF468753.1) y un aislado de Iowa, 13-019349 (adhesión de GenBank no. KF267450.1). El aislado de NPL-PEDV/2013 también comparte una identidad del 99% con el aislado de brote chino AH2012 (adhesión de GenBank no. KC210145). Cuando se comparó la cepa NPL-PEDV/2013/P10 con la NPL-PEDV/2013, se encontró que el marco de lectura abierto 1a/b (ORF1a/b) poliproteína, la nucleoproteína, NS3B y proteínas de membrana y envoltura eran 100% idénticos a nivel de aminoácidos. En contraste, el gen de la púa contiene seis polimorfismos de nucleótidos individuales no sinónimos, resultando en sustituciones de aminoácidos (aa) en las siguientes posiciones: 375 (F!L), 486 (T¡P), 856 (D!E), 1081 (A.V), 1099 (A.S), y 1253 (Y.D). El dominio S1 de proteína de púas contiene 2 sustituciones aa, mientras que el dominio S2 contiene 4 sustituciones aa. Se ha demostrado que el PEDV utiliza la aminopeptidasa N porcina (pAPN) como principal receptor de entrada celular (4, 5). Sin embargo, las células Vero y MARC145 carecen de pAPN, lo que indica claramente que otros receptores o vías receptor-independientes pueden ser utilizados para la entrada (6). La proteína de pico en su conformación trimérica interactúa con el receptor celular y contiene numerosos epítopos de unión a anticuerpos neutralizantes (7). El análisis del pico por PeptideCutter (http://web.expasy.org/ péptido_cutter/) muestra que la proteína de pico nativa de NPL-PEDV/2013 tiene 63 sitios de tripsina y 2 sitios de escisión de quimotripsina con una eficiencia del 100%, mientras que NPL-PEDV/2013/P10 ha perdido un sitio de escisión Esto indica que la adaptación del cultivo celular modifica específicamente la proteína del pico del PEDV; sin embargo, se desconocen las implicaciones inmunológicas. Números de adhesión de la secuencia de nucleótidos. Las secuencias del genoma completo de las cepas NPL-PEDV/2013 y NPL-PEDV/2013/P10 se han depositado en DDBJ/EMBL/GenBank bajo los números de adhesión KJ778615 y KJ778616.

¿Cómo causa la enfermedad el PEDV?

Secuencias del genoma del virus de la diarrea epidémica porcina: In Vivo and In Vitro Phenotypeshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4056290/SHA: f6d6d7efc1686a7d219ecfc55f9a48ce72d4fb00Autores: Lawrence, Paulraj K.; Bumgardner, Eric; Bey, Russell F.; Stine, Douglas; Bumgarner, Roger E.Fecha: 2014-06-12DOI: 10.1128/genomea.00503-14Licencia: cc-byAbstract: Desde el brote del virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV) en mayo de 2013, los productores de cerdos estadounidenses han perdido casi cinco millones de cerdos. En un intento de entender la evolución de PEDV en los Estados Unidos y posiblemente desarrollar una estrategia de control, comparamos las secuencias del genoma de una cepa PEDV aislada de un cerdito infectado con su versión adaptada in vitro. La cepa PEDV original fue cultivada en células Vero y pasó 10 veces en serie en una línea celular MARC145. El análisis de la secuencia de la cepa PEDV nativa y el virus in vitro pasaje muestra que la adaptación del cultivo celular modifica específicamente la proteína PEDV pico mientras que el marco de lectura abierto 1a/b (ORF1a/b) codificada poliproteína, la nucleoproteína, NS3B (ORF3) y proteínas de membrana y envoltura permanecen inalteradas. Texto: enfermedad porcina altamente contagiosa. Mientras que los cerdos mayores tienen una probabilidad de supervivencia, entre el 80 y el 100 por ciento de los cerditos infectados por PEDV mueren Una vez que el virus se internaliza, destruye el revestimiento de los intestinos de los lechones, haciéndolos incapaces de digerir y derivar nutrición de la leche y el alimento (1). El virus causa diarrea, vómitos y muerte por deshidratación y hambre (2). PEDV es un miembro de la subfamilia Coronavirinae y pertenece al género Alphacoronavirus. Su tamaño genómico varía de aproximadamente 26 a 32 kb, que es relativamente grande para un virus ARN. Aunque existen vacunas para PEDV en China, Japón y Corea del Sur, no hay vacuna aprobada en los Estados Unidos o Europa (3). Además, PEDV sigue evolucionando dentro de la población porcina de EE.UU. Este informe describe brevemente la comparación de secuencias del genoma de una cepa PEDV aislada de muestras de intestino delgado de un lechon infectado y su versión adaptada in vitro. La cepa original de PEDV fue llamada NPL-PEDV/2013, cultivada en células de Vero, y pasó 10 veces en una línea celular MARC145. La cepa de paso in vitro serial fue llamada NPL-PEDV/2013/P10. El ARN viral total fue extraído por reactivo TRIzol LS y secuenciado por secuenciación de dideoxi Sanger usando una técnica de primer paso. Las secuencias en bruto fueron importadas al ensamblador Geneious (Biomatters, CA), ensambladas, anotadas, y comparadas entre sí usando USA/Colorado/2013 (adhesión de GenBank no. KF272920) como secuencia de referencia. Las secuencias de genoma completo de NPL-PEDV/2013 y NPL-PEDV/2013/P10 contienen 28,038 y 28,025 nucleótidos (nt), respectivamente, El genoma de NPL-PEDV/2013 comparte una identidad del 99% con todos los aislados de EE.UU. secuenciados hasta la fecha y muchos aislados chinos también. Los tres primeros éxitos de BLAST fueron contra aislados de EE.UU., USA/Colora-do/2013 (adhesión de GenBank no. KF272920), IA1 (adhesión de GenBank no. KF468753.1) y un aislado de Iowa, 13-019349 (adhesión de GenBank no. KF267450.1). El aislado de NPL-PEDV/2013 también comparte una identidad del 99% con el aislado de brote chino AH2012 (adhesión de GenBank no. KC210145). Cuando se comparó la cepa NPL-PEDV/2013/P10 con la NPL-PEDV/2013, se encontró que el marco de lectura abierto 1a/b (ORF1a/b) poliproteína, la nucleoproteína, NS3B y proteínas de membrana y envoltura eran 100% idénticos a nivel de aminoácidos. En contraste, el gen de la púa contiene seis polimorfismos de nucleótidos individuales no sinónimos, resultando en sustituciones de aminoácidos (aa) en las siguientes posiciones: 375 (F!L), 486 (T¡P), 856 (D!E), 1081 (A.V), 1099 (A.S), y 1253 (Y.D). El dominio S1 de proteína de púas contiene 2 sustituciones aa, mientras que el dominio S2 contiene 4 sustituciones aa. Se ha demostrado que el PEDV utiliza la aminopeptidasa N porcina (pAPN) como principal receptor de entrada celular (4, 5). Sin embargo, las células Vero y MARC145 carecen de pAPN, lo que indica claramente que otros receptores o vías receptor-independientes pueden ser utilizados para la entrada (6). La proteína de pico en su conformación trimérica interactúa con el receptor celular y contiene numerosos epítopos de unión a anticuerpos neutralizantes (7). El análisis del pico por PeptideCutter (http://web.expasy.org/ péptido_cutter/) muestra que la proteína de pico nativa de NPL-PEDV/2013 tiene 63 sitios de tripsina y 2 sitios de escisión de quimotripsina con una eficiencia del 100%, mientras que NPL-PEDV/2013/P10 ha perdido un sitio de escisión Esto indica que la adaptación del cultivo celular modifica específicamente la proteína del pico del PEDV; sin embargo, se desconocen las implicaciones inmunológicas. Números de adhesión de la secuencia de nucleótidos. Las secuencias del genoma completo de las cepas NPL-PEDV/2013 y NPL-PEDV/2013/P10 se han depositado en DDBJ/EMBL/GenBank bajo los números de adhesión KJ778615 y KJ778616.

¿Cuál es el tamaño del genoma del PEDV?

Ensayos serológicos basados en proteínas virales recombinantes para el diagnóstico de heces hemorrágicas del virus Arenahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3497043/SHA: f1d308db379b3c293bcfc8fe251c043fe8842358Autores: Fukushi, Shuetsu; Tani, Hideki; Yoshikawa, Tomoki; Saijo, Masayuki; Morikawa, ShigeruFecha: 2012-10-12DOI: 10.3390/v4102097Licencia: cc-byAbstract: La familia Arenaviridae, género Arenavirus, consta de dos grupos filogenéticamente independientes: Complejos del Viejo Mundo (OW) y del Nuevo Mundo (NW). Los virus Lassa y Lujo en el complejo OW y los virus Guanarito, Junin, Machupo, Sabia y Chapare en el complejo NW causan fiebre hemorrágica viral (VHF) en los seres humanos, provocando graves preocupaciones de salud pública. Estos virus también son considerados agentes bioterroristas potenciales. Por lo tanto, es de gran importancia detectar estos patógenos de forma rápida y específica para minimizar el riesgo y la escala de brotes de virus de arena. Sin embargo, estos virus de arena se clasifican como patógenos BSL-4, lo que dificulta el desarrollo de técnicas diagnósticas para estas infecciones por virus en institutos sin instalaciones BSL-4. Para superar estas dificultades, se desarrollaron sistemas de detección de anticuerpos en forma de un ensayo inmunosorbente enzimático (ELISA) y un ensayo indirecto de inmunofluorescencia utilizando nucleoproteínas recombinantes (rNPs) derivados Además, se desarrollaron varios ensayos de detección de antígenos; por ejemplo, se desarrollaron nuevos anticuerpos monoclonales (mAbs) frente a los rNP de los virus Lassa y Junin. Los ELISAs a base de antígenos Sandwich (Ag-capture) utilizando estos mAbs como anticuerpos de captura fueron confirmados como sensibles y específicos para la detección de los respectivos NPs de los Arenavirus. Estos ensayos basados en rNP fueron propuestos para ser útiles no sólo para un diagnóstico etiológico de los VHFs, sino también para estudios seroepidemiológicos sobre los VHFs. Recientemente desarrollamos ensayos de neutralización de este virus utilizando pseudotipos de estomatitis vesiculares basados en VSV que contienen glucoproteínas recombinantes por el virus arena. El objetivo de este artículo es revisar los avances recientes en el desarrollo de ensayos diagnósticos de laboratorio basados en proteínas virales recombinantes para el diagnóstico de los VHF y estudios epidemiológicos sobre los VHF causados por los arenavirus. Texto: El virus Arenaviridae consiste en sólo un género, pero la mayoría de los virus dentro de este género se pueden dividir en dos grupos diferentes: los Viejos Mundos arenavirus y los Nuevos Mundo arenavirus (también conocidos como el complejo Tacaribé) [1, 2]. Las diferencias entre los dos grupos se han establecido mediante el uso de ensayos serológicos. La mayoría de los arenavirus causan infección persistente en roedores sin ningún síntoma, y los seres humanos adquieren una variedad de enfermedades cuando zoonópticamente infectados. También se han notificado infecciones por LCMV congénitas [4, 5]. Lo más importante es que la fiebre hemorrágica viral (VHF) puede ser causada por varios estadiovirus. La fiebre de Lassa, causada por el virus de Lassa (LASV), un virus de arena del Viejo Mundo, es uno de los VHF más devastadores en humanos [6]. La hemorragia y el fallo de órganos ocurren en un subconjunto de pacientes infectados con este virus, y se asocia con una alta mortalidad. Muchos casos de fiebre de Lassa ocurren en África occidental en países como Guinea, Sierra Leona y Nigeria [7] [9] [10] [11] [12] [13]. El linaje complejo de Tacaribé B del Nuevo Mundo arenavirus consiste en el virus Junin (JUNV), el virus Guanarito (GUNV), el virus Sabia (SABV) y el virus Machupo (MACV), los agentes etiológicos de las fiebres hemorrágicas argentinas, venezolanas, brasileñas y bolivianas, respectivamente [14, 15]. Aunque genéticamente distintos entre sí, parecen producir síntomas similares, acompañados de hemorragias en humanos [14, 15]. Estas especies patógenas del Nuevo Mundo arenavirus están estrechamente asociadas con una especie específica de roedores [6]. Los seres humanos suelen estar infectados con arenavirus patógenos a través del contacto directo con tejido o sangre, o después de inhalar partículas aerosolizadas de orina, heces y saliva de roedores infectados. Después de un período de incubación de 1-3 semanas, los individuos infectados desarrollan bruscamente fiebre, dolor retroesternal, dolor de garganta, dolor de espalda, tos, dolor abdominal, vómitos, diarrea, conjuntivitis, hinchazón facial, proteinuria y hemorragia mucosa. También se han descrito problemas neurológicos, incluyendo pérdida auditiva, temblores y encefalitis. Debido a que los síntomas de enfermedad relacionada con el estadio patógeno son variados y no específicos, el diagnóstico clínico es a menudo difícil [14, 16]. La transmisión humana a humana puede ocurrir a través de contacto cutáneo o mucosa, o a través de contaminación nosocomial [14, 16]. Estos virus también se consideran agentes potenciales de bioterrorismo [2]. Recientemente se han descubierto varias especies de este tipo de virus como resultado de estudios de roedores y brotes de enfermedades [17] [18] [20] [22] [23] [25] [ Un nuevo virus patógeno de la arena del Nuevo Mundo, el virus Chapare (CHPV), ha sido aislado de un caso fatal de VHF en Bolivia [20]. Además, se han reportado cinco casos de VHF en Sudáfrica, y un nuevo virus de la arena, llamado Virus Lujo, fue aislado de un paciente [17]. El virus Lujo está más distantemente relacionado con los otros virus de la arena del Viejo Mundo [17]. Hasta la fecha, no hay información sobre el huésped vertebrado de los virus Chapare y Lujo. Hay alguna evidencia de endemicidad del virus Lassa en los países vecinos [27, 28]. Sin embargo, como la magnitud del comercio internacional y los viajes está aumentando continuamente, y la perturbación del medio ambiente (debido a la actividad humana o a cambios ecológicos naturales) puede resultar en cambios de comportamiento de los roedores del reservorio, los virus de la arena altamente patógenos podrían introducirse De hecho, se han notificado más de veinte casos de fiebre de Lassa fuera de la región endémica en áreas como EE.UU., Canadá, Europa y Japón [29] [30] [31] [32] [33]. Es de gran importancia detectar estos patógenos de forma rápida y específica para minimizar el riesgo y la escala de brotes de VHF causados por virus de arena. Sin embargo, estos virus de arena se clasifican como patógenos de nivel de bioseguridad (BSL)-4, lo que dificulta el desarrollo de técnicas diagnósticas para estas infecciones virales en laboratorios sin instalaciones BSL-4. Para superar estas dificultades, se han establecido ensayos serológicos basados en nucleoproteínas virales recombinantes (NPRs), como el ensayo inmunosorbentes IgG-enzima (ELISA), el ensayo de inmunofluorescencia indirecta (IFA) y el análisis de antígenos (Ag)-captura ELISA para el diagnóstico de los VHF causados por los arenavirus altamente patógenos. Además, se han desarrollado ensayos de neutralización de virus utilizando GPs del virus portador pseudotipo. En esta revisión, se describe la utilidad de tales ensayos diagnósticos basados en proteínas recombinantes para el diagnóstico de los VHFs causados por los estadios. En brotes de VHFs, las infecciones son confirmadas por diversos métodos de diagnóstico de laboratorio. La detección de virus se realiza por aislamiento del virus, reacción inversa de transcripción-polimerasa (RT-PCR) y ELISA antígeno-captura. Se ha demostrado que los paneles de anticuerpos monoclonales contra los arenavirus patógenos son útiles para detectar antígenos virales en las células infectadas por el virus, así como para investigar las relaciones antigénicas de los arenavirus [34] [35] [36]. La detección del genoma del virus es adecuada para un diagnóstico rápido y sensible de los pacientes con VHF en la fase temprana de la enfermedad, y se han descrito extensas revisiones de tales ensayos RT-PCR [37, 38]. Más recientemente, también se han notificado avances en el método RT-PCR que abarca las variaciones genéticas de los virus de la fiebre hemorrágica (HFVs) [39, 40] y un microarray de oligonucleótido multiplexado para el diagnóstico diferencial de los VHFs [41]. Por otro lado, los anticuerpos contra estos virus pueden ser detectados mediante el ensayo indirecto de inmunofluorescencia (IFA Una IFA detecta el anticuerpo en el suero, que es capaz de unirse a la monocapa fija de las células infectadas por el virus. Aunque la interpretación de los resultados de inmunofluorescencia requiere experiencia, el ensayo tiene ventajas sobre otros métodos, ya que cada virus genera un patrón de fluorescencia característico que añade especificidad al ensayo en comparación con una simple lectura de ELISA. Un diagnóstico serológico mediante la detección de anticuerpos IgM e IgG específicos a los VHFs debe ser sensible, específico y confiable, ya que un diagnóstico erróneo puede llevar al pánico en la población general. Una ELISA específica de IgM es adecuada para detectar infecciones recientes, pero la relevancia de las pruebas IgM para la VHF aguda depende del virus y la duración de la enfermedad; la IgM específica no está presente a menudo en la etapa muy temprana de la enfermedad, y los pacientes que mueren de VHF a menudo no logran seroconvert. Una ELISA específica de IgG es eficaz, no sólo en el diagnóstico de un gran número de casos de VHF, especialmente durante la convalecencia, sino también para estudios epidemiológicos en las regiones endémicas.Los métodos detallados utilizados para las IFA e IgG- e IgM-ELISA para el diagnóstico de VHF utilizando auténticos antígenos virus [42] [43] [44] [44]. Los virus de Arena tienen un genoma de ARN bisegmentado, de sentido negativo, de un solo canal con una estrategia de codificación ambisense única que produce sólo cuatro proteínas conocidas: una glucoproteína, una nucleoproteína (NP), una proteína matriz (Z) y una polimerasa (L) [46]. De estas proteínas, la NP es la más abundante en células infectadas por virus. La tecnología de proteínas recombinantes podría satisfacer la demanda de un sistema de prueba de VHF sencillo y fiable, y se ha demostrado que el NP recombinante (rNP) es útil para los estudios serológicos de anticuerpos IgM e IgG contra los arenavirus [47] [48] [48] [49]. Los baculovirus recombinantes que expresan el rNP completo de los arenavirus se han generado [48, 50, 51]. El método utilizado para la purificación del rNP de arenavirus de células Tn5 infectadas con baculovirus recombinantes es eficaz y sencillo en comparación con los del Ébola, Marburg y los virus hemorrágicos del virus de la fiebre de Crimea-Congo [51] [52] [53] [55]. La mayoría de los rNPs de arenavirus expresados en células de insectos que utilizan los baculovirus recombinantes se cristalizan [56] y se solubilizan en PBS que contienen urea 8M. Dado que la mayoría de las proteínas celulares de Tn5 se solubilizan en PBS que contienen urea 2M, los rNPs de arenavirus en la fracción insoluble en PBS que contienen urea 2M pueden solubilizarse por sonación en PBS que contienen urea 8M. Después de una centrifugación simple de los lisatos en PBS que contienen urea 8M, las fracciones sobrenadantes pueden utilizarse como antígenos rNP purificados sin más pasos de purificación [51]. El antígeno de control se produce a partir de células Tn5 infectadas por baculovirus que carecen del gen poliedrín (ΔP) de la misma manera La expresión y la eficiencia de purificación del rNP de arenavirus fueron analizadas por electroforesis de gel dodecil-poliacrilamida (SDS-PAGE) tras tinción de los geles con azul Coomassie. Se muestran antígenos NP purificados con un peso molecular aproximado de 62 kDa de Luna, LCM, Lassa, Lujo, Junin, Machupo, Guanarito, Sabia y Chapare y el antígeno de control negativo purificado (ΔP). Como se ha descrito anteriormente, los baculovirus recombinantes permiten la entrega de antígenos rNP sin utilizar virus vivos infecciosos. Se utiliza una placa ELISA recubierta con la cantidad óptima predeterminada de rNPs purificados (aproximadamente 100 ng/well) para el ensayo de detección de anticuerpos IgG. Una ventaja del uso de rNP recombinante para el IgG-ELISA es que permite una comparación directa de la reactividad cruzada de anticuerpos entre los rNPs de la arenavirus, ya que los preparados de antígenos de todos los rNPs de la arenavirus probados se realizan utilizando el mismo método [51]. Rabbit anti-sera planteado frente a LCMV-rNP y LASV-rNP muestran reactividad cruzada a LASV-rNP y LCMV-rNP, respectivamente, lo que indica que los anticuerpos de conejo contra rNPs de la arenavirus del Viejo Mundo reaccionan de forma cruzada con rNPs de otras arenavirus del Viejo Mundo (Tabla 1 ) [51]. Del mismo modo, los anti-sera de conejo generados frente a JUNV-NP muestran reactividad cruzada a LASV-rNP y LCMV-rNP Sin embargo, los anti-sera de conejos contra LASV-NP y LCMV-NP muestran una reacción negativa al JUNV-rNP (Tabla 1 ) [51], lo que indica que los anticuerpos de conejos contra JUNV (un patógeno New World arenavirus) NP podrían reaccionar de forma cruzada con el Old World arenavirus NP, mientras que los anticuerpos contra Old World arenavirus NPs pueden no ser capaces de reaccionar con patógenos New World arenavirus NPs. El rNP basado en IgG-ELISA también se ha utilizado para la caracterización de un anticuerpo monoclonal de ratón (MAb). Nakauchi et al. [50] han investigado la reactividad cruzada de MAbs contra JUNV rNP a patógenos New World arenavirus rNPs, así como LASV rNP. MAb C11-12 reacciona al mismo nivel con los rNPs de todos los virus patógenos de la arena del Nuevo Mundo, incluyendo JUNV, GTOV, MACV, SABV y CHPV, indicando que este MAb reconoce un epitope conservado entre los virus patógenos de la arena del Nuevo Mundo. Otro MAb, C6-9, reacciona específicamente con el rNP de JUNV, pero no reacciona con los de los otros virus patógenos de la arena del Nuevo Mundo [50]. Esto indica que MAb C6-9 reconoce un epitope específico de JUNV. Ninguno de estos MAbs reacciona con el rNP del virus patógeno humano de la arena del Viejo Mundo LASV. Así, el MAb C11-12 se considera un MAb ampliamente reactivo contra los virus de la arena del Nuevo Mundo, mientras que MAb C6-9 es específico de JUNV. Estos hallazgos han sido confirmados por análisis detallados de epítopos utilizando mapeo péptido [50]. Del mismo modo, se ha analizado la reactividad cruzada de MAbs frente a LASV rNP [51]. La reacción cruzada de MAb 4A5 con el virus Mopeia (MOPV) pero no con el LCMV rNP. La reacción cruzada de MAb 6C11 con LCMV rNP, mientras que la reacción cruzada de MAb 2-11 no se produce con LCMV rNP [51]. Tabla 1. La reactividad antiserum para rNPs de diferentes arenavirus en IgG ELISAs. La reactividad para rNP de LASV LCMV JUNV anti-LASV NPIt es importante para evaluar si la ELISA basada en rNP es útil para el diagnóstico de casos de La especificidad de la IgG ELISA basada en LASV-rNP se ha confirmado utilizando sera obtenida de pacientes con fiebre de Lassa [51]. La sera de los pacientes con fiebre de Lassa muestra una reacción altamente positiva en la IgG-ELISA basada en LASV-rNP, pero sera de pacientes con fiebre hemorrágica argentina (AHF), causada por JUNV, no. El suero de un paciente con IC mostró una reacción altamente positiva en la IgG-ELISA basada en JUNV-rNP [49]. Además, se demostró que, utilizando sera obtenida de casos de IC, los resultados de la IgG ELISA basada en JUNV se correlacionan bien con una auténtica IgG ELISA basada en antígenos JUNV [49]. Para evitar el uso de virus altamente patógenos para la preparación de antígenos, se han desarrollado células mamíferas que expresan rNP recombinante [51, 57, 66] [67] [68]. El antígeno NP del virus de Lassa para la AFI puede prepararse simplemente como se describe [51]. Brevemente, el procedimiento consiste en (1) transfeccionar las células HeLa con un vector de expresión celular de mamíferos insertado con el ADNc del ADNc del NP clonado; (2) expandir las células de expresión NP estables mediante selección de antibióticos; (3) mezclar las células que expresan rNP con células HeLa no transfectadas (en una proporción de 1:1); (4) manchar las mezclas celulares en diapositivas de vidrio, luego secarlas y fijarlas en acetona. En la AFI específica para LASV-NP, los sera anticuerpos positivos muestran patrones tinción granular característicos en el citoplasma (figura 2 ) [69], lo que facilita la distinción entre muestras positivas y negativas. La especificidad del ensayo también ha sido confirmada mediante el uso de sera obtenida de pacientes con fiebre de Además, se ha desarrollado una IFA que utiliza células HeLa que expresan rNP de JUNV para detectar anticuerpos contra JUNV, y el ensayo ha sido evaluado utilizando sera de pacientes con HF [70]. Se sugiere que los sistemas de detección de anticuerpos basados en rNP de LASV, como ELISA e IFA, son útiles no sólo para el diagnóstico de fiebre de Lassa, sino también para estudios seroepidemiológicos de infección por LASV. En nuestro estudio preliminar, aproximadamente el 15% de los sera recolectados de 334 ghaneses y menos del 3% de 280 zambianos mostraron reacciones positivas en el IgG ELISA basado en rNP de LASV [58]. Estos resultados concuerdan con el hecho de que la fiebre de Lassa es endémica en la región de África Occidental, incluida Ghana, pero menos en la región de África Oriental. Para el diagnóstico de muchas infecciones virales, se ha demostrado que los ensayos de PCR tienen una excelente sensibilidad analítica, pero las técnicas establecidas están limitadas por su requerimiento de equipos costosos y experiencia técnica. Además, el alto grado de variabilidad genética de los virus ARN, incluyendo el arenavirus y el bunyavirus, plantea dificultades para seleccionar imprimaciones para ensayos RT-PCR que puedan detectar todas las cepas del virus. Puesto que la sensibilidad de la Ag-capture ELISA es comparable a la de la RT-PCR para varias enfermedades infecciosas mediadas por virus, incluyendo fiebre de Lassa y fiebre hemorrágica del filovirus [51, [71] [72] [73], la Ag-capture ELISA es un enfoque sofisticado que puede utilizarse para el diagnóstico de infecciones virales. Las ELISAs de captura de Ag se han aplicado ampliamente para detectar diversos virus, ya que son los antígenos virales más abundantes y tienen secuencias de aminoácidos altamente conservadas [50, 51, 54, 71, 72, 74, 75]. Antisera policlonal o una mezcla de MAbs presentes en los fluidos ascéticos de animales inmunizados para VHFs se han utilizado para la captura-anticuerpos en la ELISA de captura de Ag [36, [76] [77] [78] [79]. Los MAbs que reconocen los epítopos conservados del rNP también se utilizan como anticuerpos de captura, ya que tienen una alta especificidad para los antígenos, y una identificación de los epítopos de estos MAbs es de importancia crucial para la evaluación de la especificidad y la reactividad cruzada del sistema de ensayo [50, 51, 53, 54, 71, 75]. Para desarrollar una prueba de diagnóstico sensible para la fiebre de Lassa y la AHF, se han preparado rNPs de LASV y JUNV (véase más arriba), y se han caracterizado y utilizado MAbs recién establecidos contra ellos para el Ag-capture ELISAs [50, 51]. Se ha confirmado que el Ag-capture ELISA utilizando MAb 4A5 es útil para la detección de antígeno LASV auténtico en sera recolectado serialmente a partir de hámsteres infectados con LASV [51] La sensibilidad de la ELISA basada en Ag-captura de MAb 4A5 fue similar a la de la RT-PCR convencional, sugiriendo que la ELISA de Ag-captura puede ser utilizada eficientemente en el diagnóstico de la fiebre de Lassa [51]. Por lo tanto, la ELISA basada en Ag-captura de MAb 4A5 se considera útil en el diagnóstico de la fiebre de Lassa. Además, mediante el uso de MAbs levantados contra el rNP de JUNV, Ag-capture ELISAs específico para JUNV y ampliamente reactivos a los patógenos humanos New World arenavirus se han desarrollado [50]. La ELISA de Ag-captura utilizando MAb E4-2 y C11-12 detectó los Ags de todos los patógenos New World arenavirus probados, incluyendo JUNV. Por otro lado, la ELISA de Ag-captura utilizando Teniendo en cuenta que los síntomas de la infección por el virus JUNV en humanos son indistinguibles de los que se deben a otros virus patógenos de la arena del Nuevo Mundo, la captura de Ag ELISA utilizando MAb C6-9 puede ser una herramienta de diagnóstico útil, especialmente para la AHF [50]. El ensayo de neutralización del virus se acepta como el ensayo serodiagnóstico "estándar de oro" para cuantificar la respuesta de anticuerpos a la infección y la vacunación de una amplia variedad de virus asociados con enfermedades humanas [80] [81] [82] [83] [84] [85] [86]. La presencia de anticuerpos neutralizantes es un indicador fiable de inmunidad protectora contra la VHF [87] [88] [89]. Sin embargo, debido a la alta patogenicidad de los VHF para los seres humanos y a la estricta regulación de determinados agentes, sólo un número limitado de laboratorios son capaces de realizar tales pruebas de neutralización.Para muchos VHF, partículas virales incompetentes de pseudotipos de replicación con proteína de envoltura viral (GP) se ha demostrado que imitan las respectivas infecciones por VHF, por lo que los ensayos de neutralización utilizando los pseudotipos pueden ser ventajosos en algunos entornos de laboratorio para la detección de anticuerpos contra los VHF sin necesidad de mayores requisitos de biocontención.El vector basado en VSV ya se ha utilizado para generar VSV recombinantes con capacidad de replicación para estudiar el papel de los GP de varios virus [90] [91] [92]. Los recientes avances en la producción de partículas de virus pseudotipo han permitido investigar la entrada de células víricas, el tropismo viral y el efecto de los inhibidores de la entrada, así como la medición de los títulos de neutralización, mediante el uso de vectores basados en virus de inmunodeficiencia humana, virus de inmunodeficiencia felina, virus de leucemia murina o VSV [86, [93] [94] [95] [96] [97] [98] [99] [101] [102] [103]. Los pseudotipos basados en VSV tienen ventajas en comparación con otros pseudotipos basados en retrovirus por las siguientes razones. En primer lugar, el título de virus pseudotipo obtenido con el sistema VSV es generalmente superior al del sistema retrovirus pseudotipo [104]. En segundo lugar, la infección de células diana con un pseudotipo de VSV puede detectarse fácilmente como células fluorescentes verdes (GFP) positivas a 7-16 h después de la infección debido al alto nivel de expresión de GFP en el sistema VSV [104, 105]. En cambio, el tiempo requerido para la infección en el sistema retrovirus pseudotipo es de 48 h [106, 107], lo que es similar al tiempo necesario para que los virus infecciosos se reproduzcan a un nivel que resulta en la formación de placas o efectos citopáticos en las células infectadas. También se ha desarrollado un ensayo de alto rendimiento para determinar títulos de anticuerpos neutralizantes utilizando pseudotipos VSV que expresan fosfatasa alcalina secretada [108, 109] o luciferasa (Figura 3 ). Recientemente hemos desarrollado un pseudotipo basado en VSV portando el virus de Lassa GP (VSV-LAS-GP) para la detección de anticuerpos neutralizantes en el suero obtenido de un paciente con fiebre de Lassa. Se muestra un ejemplo del ensayo de neutralización de LASV utilizando el pseudotipo de VSV (Figura 4 ). En presencia de suero de pacientes con fiebre de Lassa, el número de células GFP positivas (infectividad de VSV-LAS-GP) se reduce significativamente en comparación con el número en ausencia del suero del paciente (Figura 4A ). El pseudotipo de control VSV portando VSV GP (VSV-VSV-G) no es neutralizado por ningún sera. Cuando la dilución sérica de corte se fija en un 50% de inhibición de la infectividad en comparación con la infectividad en ausencia del suero de prueba, el título de neutralización del suero de este paciente para VSV-LAS-GP se calcula en 75 (Figura 4B ). Asimismo, se ha desarrollado un pseudotipo basado en VSV con el virus Junin GP para la detección de anticuerpos neutralizantes de los sueros de pacientes con AHF. La exactitud de los resultados de los ensayos de neutralización basados en VSV se ha confirmado en comparación con los resultados del ensayo de neutralización utilizando el virus Junin vivo [70]. El virus Lujo es un nuevo miembro de la familia de virus de la arena hemorrágica asociada a la fiebre de Zambia y el sur de África, y el virus se clasifica como un patógeno BSL-4 [17]. El análisis de la secuencia del genoma del virus Lu Para estudiar la infectividad de este nuevo virus arena identificado, hemos desarrollado recientemente un pseudotipo de VSV que expresa luciferasa portando el virus Lujo GPC (VSV-Lujo-GP). Como se muestra en la Figura 3, la infección con VSV-Lujo-GPC es específicamente neutralizada por el suero anti-Lujo GPC del conejo. Así, el VSV-Lujo-GP puede ser una herramienta útil no sólo para determinar el título de anticuerpos neutralizantes dentro del suero, sino también para explorar receptores celulares aún por definir para la infección por el virus Lujo o para detectar inhibidores de la entrada celular mediada por el virus Lujo. Los brotes de fiebre hemorrágica causados por los virus arena patógenos resultan en altas tasas de mortalidad. Un diagnóstico rápido y preciso es un primer paso crítico en cualquier brote. Los métodos de diagnóstico serológico de la ICV más frecuentemente emplean un ensayo de ELISA, IFA y/o neutralización del virus. Se han desarrollado métodos de diagnóstico utilizando proteínas virales recombinantes y se han revisado sus utilidades para el diagnóstico de la ICV. Las IgG- e IgM-ELISA y las IFAs que utilizan rNPs como antígenos son útiles para la detección de anticuerpos inducidos en los sueros de los pacientes. Estos métodos también son útiles para las encuestas seroepidemiológicas para los VHF. Las ELISAs de captura de Ag utilizando MAbs para el virus arena son específicas para la especie del virus o pueden ser ampliamente reactivas para los virus de arena del Nuevo Mundo, dependiendo del MAb utilizado. Además, el sistema de pseudotipo basado en VSV proporciona una herramienta segura y rápida para medir los títulos de anticuerpos neutralizadores de virus, así como un modelo para analizar la entrada de los respectivos virus arena en células sensibles sin usar virus arena vivos.Los recientes descubrimientos de nuevas especies de virus arena [17, 26, 110] y su potencial para evolucionar predominantemente a través del cambio de host, en lugar de con sus anfitriones [110, 111], sugieren que un virus arena patogénico desconocido puede surgir en el futuro, y que los métodos diagnósticos de VHF causados por los virus arena deben así desarrollarse y mejorarse.

¿Cómo se pueden diferenciar los Arenavirus del Viejo Mundo y del Nuevo Mundo?

Ensayos serológicos basados en proteínas virales recombinantes para el diagnóstico de heces hemorrágicas del virus Arenahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3497043/SHA: f1d308db379b3c293bcfc8fe251c043fe8842358Autores: Fukushi, Shuetsu; Tani, Hideki; Yoshikawa, Tomoki; Saijo, Masayuki; Morikawa, ShigeruFecha: 2012-10-12DOI: 10.3390/v4102097Licencia: cc-byAbstract: La familia Arenaviridae, género Arenavirus, consta de dos grupos filogenéticamente independientes: Complejos del Viejo Mundo (OW) y del Nuevo Mundo (NW). Los virus Lassa y Lujo en el complejo OW y los virus Guanarito, Junin, Machupo, Sabia y Chapare en el complejo NW causan fiebre hemorrágica viral (VHF) en los seres humanos, provocando graves preocupaciones de salud pública. Estos virus también son considerados agentes bioterroristas potenciales. Por lo tanto, es de gran importancia detectar estos patógenos de forma rápida y específica para minimizar el riesgo y la escala de brotes de virus de arena. Sin embargo, estos virus de arena se clasifican como patógenos BSL-4, lo que dificulta el desarrollo de técnicas diagnósticas para estas infecciones por virus en institutos sin instalaciones BSL-4. Para superar estas dificultades, se desarrollaron sistemas de detección de anticuerpos en forma de un ensayo inmunosorbente enzimático (ELISA) y un ensayo indirecto de inmunofluorescencia utilizando nucleoproteínas recombinantes (rNPs) derivados Además, se desarrollaron varios ensayos de detección de antígenos; por ejemplo, se desarrollaron nuevos anticuerpos monoclonales (mAbs) frente a los rNP de los virus Lassa y Junin. Los ELISAs a base de antígenos Sandwich (Ag-capture) utilizando estos mAbs como anticuerpos de captura fueron confirmados como sensibles y específicos para la detección de los respectivos NPs de los Arenavirus. Estos ensayos basados en rNP fueron propuestos para ser útiles no sólo para un diagnóstico etiológico de los VHFs, sino también para estudios seroepidemiológicos sobre los VHFs. Recientemente desarrollamos ensayos de neutralización de este virus utilizando pseudotipos de estomatitis vesiculares basados en VSV que contienen glucoproteínas recombinantes por el virus arena. El objetivo de este artículo es revisar los avances recientes en el desarrollo de ensayos diagnósticos de laboratorio basados en proteínas virales recombinantes para el diagnóstico de los VHF y estudios epidemiológicos sobre los VHF causados por los arenavirus. Texto: El virus Arenaviridae consiste en sólo un género, pero la mayoría de los virus dentro de este género se pueden dividir en dos grupos diferentes: los Viejos Mundos arenavirus y los Nuevos Mundo arenavirus (también conocidos como el complejo Tacaribé) [1, 2]. Las diferencias entre los dos grupos se han establecido mediante el uso de ensayos serológicos. La mayoría de los arenavirus causan infección persistente en roedores sin ningún síntoma, y los seres humanos adquieren una variedad de enfermedades cuando zoonópticamente infectados. También se han notificado infecciones por LCMV congénitas [4, 5]. Lo más importante es que la fiebre hemorrágica viral (VHF) puede ser causada por varios estadiovirus. La fiebre de Lassa, causada por el virus de Lassa (LASV), un virus de arena del Viejo Mundo, es uno de los VHF más devastadores en humanos [6]. La hemorragia y el fallo de órganos ocurren en un subconjunto de pacientes infectados con este virus, y se asocia con una alta mortalidad. Muchos casos de fiebre de Lassa ocurren en África occidental en países como Guinea, Sierra Leona y Nigeria [7] [9] [10] [11] [12] [13]. El linaje complejo de Tacaribé B del Nuevo Mundo arenavirus consiste en el virus Junin (JUNV), el virus Guanarito (GUNV), el virus Sabia (SABV) y el virus Machupo (MACV), los agentes etiológicos de las fiebres hemorrágicas argentinas, venezolanas, brasileñas y bolivianas, respectivamente [14, 15]. Aunque genéticamente distintos entre sí, parecen producir síntomas similares, acompañados de hemorragias en humanos [14, 15]. Estas especies patógenas del Nuevo Mundo arenavirus están estrechamente asociadas con una especie específica de roedores [6]. Los seres humanos suelen estar infectados con arenavirus patógenos a través del contacto directo con tejido o sangre, o después de inhalar partículas aerosolizadas de orina, heces y saliva de roedores infectados. Después de un período de incubación de 1-3 semanas, los individuos infectados desarrollan bruscamente fiebre, dolor retroesternal, dolor de garganta, dolor de espalda, tos, dolor abdominal, vómitos, diarrea, conjuntivitis, hinchazón facial, proteinuria y hemorragia mucosa. También se han descrito problemas neurológicos, incluyendo pérdida auditiva, temblores y encefalitis. Debido a que los síntomas de enfermedad relacionada con el estadio patógeno son variados y no específicos, el diagnóstico clínico es a menudo difícil [14, 16]. La transmisión humana a humana puede ocurrir a través de contacto cutáneo o mucosa, o a través de contaminación nosocomial [14, 16]. Estos virus también se consideran agentes potenciales de bioterrorismo [2]. Recientemente se han descubierto varias especies de este tipo de virus como resultado de estudios de roedores y brotes de enfermedades [17] [18] [20] [22] [23] [25] [ Un nuevo virus patógeno de la arena del Nuevo Mundo, el virus Chapare (CHPV), ha sido aislado de un caso fatal de VHF en Bolivia [20]. Además, se han reportado cinco casos de VHF en Sudáfrica, y un nuevo virus de la arena, llamado Virus Lujo, fue aislado de un paciente [17]. El virus Lujo está más distantemente relacionado con los otros virus de la arena del Viejo Mundo [17]. Hasta la fecha, no hay información sobre el huésped vertebrado de los virus Chapare y Lujo. Hay alguna evidencia de endemicidad del virus Lassa en los países vecinos [27, 28]. Sin embargo, como la magnitud del comercio internacional y los viajes está aumentando continuamente, y la perturbación del medio ambiente (debido a la actividad humana o a cambios ecológicos naturales) puede resultar en cambios de comportamiento de los roedores del reservorio, los virus de la arena altamente patógenos podrían introducirse De hecho, se han notificado más de veinte casos de fiebre de Lassa fuera de la región endémica en áreas como EE.UU., Canadá, Europa y Japón [29] [30] [31] [32] [33]. Es de gran importancia detectar estos patógenos de forma rápida y específica para minimizar el riesgo y la escala de brotes de VHF causados por virus de arena. Sin embargo, estos virus de arena se clasifican como patógenos de nivel de bioseguridad (BSL)-4, lo que dificulta el desarrollo de técnicas diagnósticas para estas infecciones virales en laboratorios sin instalaciones BSL-4. Para superar estas dificultades, se han establecido ensayos serológicos basados en nucleoproteínas virales recombinantes (NPRs), como el ensayo inmunosorbentes IgG-enzima (ELISA), el ensayo de inmunofluorescencia indirecta (IFA) y el análisis de antígenos (Ag)-captura ELISA para el diagnóstico de los VHF causados por los arenavirus altamente patógenos. Además, se han desarrollado ensayos de neutralización de virus utilizando GPs del virus portador pseudotipo. En esta revisión, se describe la utilidad de tales ensayos diagnósticos basados en proteínas recombinantes para el diagnóstico de los VHFs causados por los estadios. En brotes de VHFs, las infecciones son confirmadas por diversos métodos de diagnóstico de laboratorio. La detección de virus se realiza por aislamiento del virus, reacción inversa de transcripción-polimerasa (RT-PCR) y ELISA antígeno-captura. Se ha demostrado que los paneles de anticuerpos monoclonales contra los arenavirus patógenos son útiles para detectar antígenos virales en las células infectadas por el virus, así como para investigar las relaciones antigénicas de los arenavirus [34] [35] [36]. La detección del genoma del virus es adecuada para un diagnóstico rápido y sensible de los pacientes con VHF en la fase temprana de la enfermedad, y se han descrito extensas revisiones de tales ensayos RT-PCR [37, 38]. Más recientemente, también se han notificado avances en el método RT-PCR que abarca las variaciones genéticas de los virus de la fiebre hemorrágica (HFVs) [39, 40] y un microarray de oligonucleótido multiplexado para el diagnóstico diferencial de los VHFs [41]. Por otro lado, los anticuerpos contra estos virus pueden ser detectados mediante el ensayo indirecto de inmunofluorescencia (IFA Una IFA detecta el anticuerpo en el suero, que es capaz de unirse a la monocapa fija de las células infectadas por el virus. Aunque la interpretación de los resultados de inmunofluorescencia requiere experiencia, el ensayo tiene ventajas sobre otros métodos, ya que cada virus genera un patrón de fluorescencia característico que añade especificidad al ensayo en comparación con una simple lectura de ELISA. Un diagnóstico serológico mediante la detección de anticuerpos IgM e IgG específicos a los VHFs debe ser sensible, específico y confiable, ya que un diagnóstico erróneo puede llevar al pánico en la población general. Una ELISA específica de IgM es adecuada para detectar infecciones recientes, pero la relevancia de las pruebas IgM para la VHF aguda depende del virus y la duración de la enfermedad; la IgM específica no está presente a menudo en la etapa muy temprana de la enfermedad, y los pacientes que mueren de VHF a menudo no logran seroconvert. Una ELISA específica de IgG es eficaz, no sólo en el diagnóstico de un gran número de casos de VHF, especialmente durante la convalecencia, sino también para estudios epidemiológicos en las regiones endémicas.Los métodos detallados utilizados para las IFA e IgG- e IgM-ELISA para el diagnóstico de VHF utilizando auténticos antígenos virus [42] [43] [44] [44]. Los virus de Arena tienen un genoma de ARN bisegmentado, de sentido negativo, de un solo canal con una estrategia de codificación ambisense única que produce sólo cuatro proteínas conocidas: una glucoproteína, una nucleoproteína (NP), una proteína matriz (Z) y una polimerasa (L) [46]. De estas proteínas, la NP es la más abundante en células infectadas por virus. La tecnología de proteínas recombinantes podría satisfacer la demanda de un sistema de prueba de VHF sencillo y fiable, y se ha demostrado que el NP recombinante (rNP) es útil para los estudios serológicos de anticuerpos IgM e IgG contra los arenavirus [47] [48] [48] [49]. Los baculovirus recombinantes que expresan el rNP completo de los arenavirus se han generado [48, 50, 51]. El método utilizado para la purificación del rNP de arenavirus de células Tn5 infectadas con baculovirus recombinantes es eficaz y sencillo en comparación con los del Ébola, Marburg y los virus hemorrágicos del virus de la fiebre de Crimea-Congo [51] [52] [53] [55]. La mayoría de los rNPs de arenavirus expresados en células de insectos que utilizan los baculovirus recombinantes se cristalizan [56] y se solubilizan en PBS que contienen urea 8M. Dado que la mayoría de las proteínas celulares de Tn5 se solubilizan en PBS que contienen urea 2M, los rNPs de arenavirus en la fracción insoluble en PBS que contienen urea 2M pueden solubilizarse por sonación en PBS que contienen urea 8M. Después de una centrifugación simple de los lisatos en PBS que contienen urea 8M, las fracciones sobrenadantes pueden utilizarse como antígenos rNP purificados sin más pasos de purificación [51]. El antígeno de control se produce a partir de células Tn5 infectadas por baculovirus que carecen del gen poliedrín (ΔP) de la misma manera La expresión y la eficiencia de purificación del rNP de arenavirus fueron analizadas por electroforesis de gel dodecil-poliacrilamida (SDS-PAGE) tras tinción de los geles con azul Coomassie. Se muestran antígenos NP purificados con un peso molecular aproximado de 62 kDa de Luna, LCM, Lassa, Lujo, Junin, Machupo, Guanarito, Sabia y Chapare y el antígeno de control negativo purificado (ΔP). Como se ha descrito anteriormente, los baculovirus recombinantes permiten la entrega de antígenos rNP sin utilizar virus vivos infecciosos. Se utiliza una placa ELISA recubierta con la cantidad óptima predeterminada de rNPs purificados (aproximadamente 100 ng/well) para el ensayo de detección de anticuerpos IgG. Una ventaja del uso de rNP recombinante para el IgG-ELISA es que permite una comparación directa de la reactividad cruzada de anticuerpos entre los rNPs de la arenavirus, ya que los preparados de antígenos de todos los rNPs de la arenavirus probados se realizan utilizando el mismo método [51]. Rabbit anti-sera planteado frente a LCMV-rNP y LASV-rNP muestran reactividad cruzada a LASV-rNP y LCMV-rNP, respectivamente, lo que indica que los anticuerpos de conejo contra rNPs de la arenavirus del Viejo Mundo reaccionan de forma cruzada con rNPs de otras arenavirus del Viejo Mundo (Tabla 1 ) [51]. Del mismo modo, los anti-sera de conejo generados frente a JUNV-NP muestran reactividad cruzada a LASV-rNP y LCMV-rNP Sin embargo, los anti-sera de conejos contra LASV-NP y LCMV-NP muestran una reacción negativa al JUNV-rNP (Tabla 1 ) [51], lo que indica que los anticuerpos de conejos contra JUNV (un patógeno New World arenavirus) NP podrían reaccionar de forma cruzada con el Old World arenavirus NP, mientras que los anticuerpos contra Old World arenavirus NPs pueden no ser capaces de reaccionar con patógenos New World arenavirus NPs. El rNP basado en IgG-ELISA también se ha utilizado para la caracterización de un anticuerpo monoclonal de ratón (MAb). Nakauchi et al. [50] han investigado la reactividad cruzada de MAbs contra JUNV rNP a patógenos New World arenavirus rNPs, así como LASV rNP. MAb C11-12 reacciona al mismo nivel con los rNPs de todos los virus patógenos de la arena del Nuevo Mundo, incluyendo JUNV, GTOV, MACV, SABV y CHPV, indicando que este MAb reconoce un epitope conservado entre los virus patógenos de la arena del Nuevo Mundo. Otro MAb, C6-9, reacciona específicamente con el rNP de JUNV, pero no reacciona con los de los otros virus patógenos de la arena del Nuevo Mundo [50]. Esto indica que MAb C6-9 reconoce un epitope específico de JUNV. Ninguno de estos MAbs reacciona con el rNP del virus patógeno humano de la arena del Viejo Mundo LASV. Así, el MAb C11-12 se considera un MAb ampliamente reactivo contra los virus de la arena del Nuevo Mundo, mientras que MAb C6-9 es específico de JUNV. Estos hallazgos han sido confirmados por análisis detallados de epítopos utilizando mapeo péptido [50]. Del mismo modo, se ha analizado la reactividad cruzada de MAbs frente a LASV rNP [51]. La reacción cruzada de MAb 4A5 con el virus Mopeia (MOPV) pero no con el LCMV rNP. La reacción cruzada de MAb 6C11 con LCMV rNP, mientras que la reacción cruzada de MAb 2-11 no se produce con LCMV rNP [51]. Tabla 1. La reactividad antiserum para rNPs de diferentes arenavirus en IgG ELISAs. La reactividad para rNP de LASV LCMV JUNV anti-LASV NPIt es importante para evaluar si la ELISA basada en rNP es útil para el diagnóstico de casos de La especificidad de la IgG ELISA basada en LASV-rNP se ha confirmado utilizando sera obtenida de pacientes con fiebre de Lassa [51]. La sera de los pacientes con fiebre de Lassa muestra una reacción altamente positiva en la IgG-ELISA basada en LASV-rNP, pero sera de pacientes con fiebre hemorrágica argentina (AHF), causada por JUNV, no. El suero de un paciente con IC mostró una reacción altamente positiva en la IgG-ELISA basada en JUNV-rNP [49]. Además, se demostró que, utilizando sera obtenida de casos de IC, los resultados de la IgG ELISA basada en JUNV se correlacionan bien con una auténtica IgG ELISA basada en antígenos JUNV [49]. Para evitar el uso de virus altamente patógenos para la preparación de antígenos, se han desarrollado células mamíferas que expresan rNP recombinante [51, 57, 66] [67] [68]. El antígeno NP del virus de Lassa para la AFI puede prepararse simplemente como se describe [51]. Brevemente, el procedimiento consiste en (1) transfeccionar las células HeLa con un vector de expresión celular de mamíferos insertado con el ADNc del ADNc del NP clonado; (2) expandir las células de expresión NP estables mediante selección de antibióticos; (3) mezclar las células que expresan rNP con células HeLa no transfectadas (en una proporción de 1:1); (4) manchar las mezclas celulares en diapositivas de vidrio, luego secarlas y fijarlas en acetona. En la AFI específica para LASV-NP, los sera anticuerpos positivos muestran patrones tinción granular característicos en el citoplasma (figura 2 ) [69], lo que facilita la distinción entre muestras positivas y negativas. La especificidad del ensayo también ha sido confirmada mediante el uso de sera obtenida de pacientes con fiebre de Además, se ha desarrollado una IFA que utiliza células HeLa que expresan rNP de JUNV para detectar anticuerpos contra JUNV, y el ensayo ha sido evaluado utilizando sera de pacientes con HF [70]. Se sugiere que los sistemas de detección de anticuerpos basados en rNP de LASV, como ELISA e IFA, son útiles no sólo para el diagnóstico de fiebre de Lassa, sino también para estudios seroepidemiológicos de infección por LASV. En nuestro estudio preliminar, aproximadamente el 15% de los sera recolectados de 334 ghaneses y menos del 3% de 280 zambianos mostraron reacciones positivas en el IgG ELISA basado en rNP de LASV [58]. Estos resultados concuerdan con el hecho de que la fiebre de Lassa es endémica en la región de África Occidental, incluida Ghana, pero menos en la región de África Oriental. Para el diagnóstico de muchas infecciones virales, se ha demostrado que los ensayos de PCR tienen una excelente sensibilidad analítica, pero las técnicas establecidas están limitadas por su requerimiento de equipos costosos y experiencia técnica. Además, el alto grado de variabilidad genética de los virus ARN, incluyendo el arenavirus y el bunyavirus, plantea dificultades para seleccionar imprimaciones para ensayos RT-PCR que puedan detectar todas las cepas del virus. Puesto que la sensibilidad de la Ag-capture ELISA es comparable a la de la RT-PCR para varias enfermedades infecciosas mediadas por virus, incluyendo fiebre de Lassa y fiebre hemorrágica del filovirus [51, [71] [72] [73], la Ag-capture ELISA es un enfoque sofisticado que puede utilizarse para el diagnóstico de infecciones virales. Las ELISAs de captura de Ag se han aplicado ampliamente para detectar diversos virus, ya que son los antígenos virales más abundantes y tienen secuencias de aminoácidos altamente conservadas [50, 51, 54, 71, 72, 74, 75]. Antisera policlonal o una mezcla de MAbs presentes en los fluidos ascéticos de animales inmunizados para VHFs se han utilizado para la captura-anticuerpos en la ELISA de captura de Ag [36, [76] [77] [78] [79]. Los MAbs que reconocen los epítopos conservados del rNP también se utilizan como anticuerpos de captura, ya que tienen una alta especificidad para los antígenos, y una identificación de los epítopos de estos MAbs es de importancia crucial para la evaluación de la especificidad y la reactividad cruzada del sistema de ensayo [50, 51, 53, 54, 71, 75]. Para desarrollar una prueba de diagnóstico sensible para la fiebre de Lassa y la AHF, se han preparado rNPs de LASV y JUNV (véase más arriba), y se han caracterizado y utilizado MAbs recién establecidos contra ellos para el Ag-capture ELISAs [50, 51]. Se ha confirmado que el Ag-capture ELISA utilizando MAb 4A5 es útil para la detección de antígeno LASV auténtico en sera recolectado serialmente a partir de hámsteres infectados con LASV [51] La sensibilidad de la ELISA basada en Ag-captura de MAb 4A5 fue similar a la de la RT-PCR convencional, sugiriendo que la ELISA de Ag-captura puede ser utilizada eficientemente en el diagnóstico de la fiebre de Lassa [51]. Por lo tanto, la ELISA basada en Ag-captura de MAb 4A5 se considera útil en el diagnóstico de la fiebre de Lassa. Además, mediante el uso de MAbs levantados contra el rNP de JUNV, Ag-capture ELISAs específico para JUNV y ampliamente reactivos a los patógenos humanos New World arenavirus se han desarrollado [50]. La ELISA de Ag-captura utilizando MAb E4-2 y C11-12 detectó los Ags de todos los patógenos New World arenavirus probados, incluyendo JUNV. Por otro lado, la ELISA de Ag-captura utilizando Teniendo en cuenta que los síntomas de la infección por el virus JUNV en humanos son indistinguibles de los que se deben a otros virus patógenos de la arena del Nuevo Mundo, la captura de Ag ELISA utilizando MAb C6-9 puede ser una herramienta de diagnóstico útil, especialmente para la AHF [50]. El ensayo de neutralización del virus se acepta como el ensayo serodiagnóstico "estándar de oro" para cuantificar la respuesta de anticuerpos a la infección y la vacunación de una amplia variedad de virus asociados con enfermedades humanas [80] [81] [82] [83] [84] [85] [86]. La presencia de anticuerpos neutralizantes es un indicador fiable de inmunidad protectora contra la VHF [87] [88] [89]. Sin embargo, debido a la alta patogenicidad de los VHF para los seres humanos y a la estricta regulación de determinados agentes, sólo un número limitado de laboratorios son capaces de realizar tales pruebas de neutralización.Para muchos VHF, partículas virales incompetentes de pseudotipos de replicación con proteína de envoltura viral (GP) se ha demostrado que imitan las respectivas infecciones por VHF, por lo que los ensayos de neutralización utilizando los pseudotipos pueden ser ventajosos en algunos entornos de laboratorio para la detección de anticuerpos contra los VHF sin necesidad de mayores requisitos de biocontención.El vector basado en VSV ya se ha utilizado para generar VSV recombinantes con capacidad de replicación para estudiar el papel de los GP de varios virus [90] [91] [92]. Los recientes avances en la producción de partículas de virus pseudotipo han permitido investigar la entrada de células víricas, el tropismo viral y el efecto de los inhibidores de la entrada, así como la medición de los títulos de neutralización, mediante el uso de vectores basados en virus de inmunodeficiencia humana, virus de inmunodeficiencia felina, virus de leucemia murina o VSV [86, [93] [94] [95] [96] [97] [98] [99] [101] [102] [103]. Los pseudotipos basados en VSV tienen ventajas en comparación con otros pseudotipos basados en retrovirus por las siguientes razones. En primer lugar, el título de virus pseudotipo obtenido con el sistema VSV es generalmente superior al del sistema retrovirus pseudotipo [104]. En segundo lugar, la infección de células diana con un pseudotipo de VSV puede detectarse fácilmente como células fluorescentes verdes (GFP) positivas a 7-16 h después de la infección debido al alto nivel de expresión de GFP en el sistema VSV [104, 105]. En cambio, el tiempo requerido para la infección en el sistema retrovirus pseudotipo es de 48 h [106, 107], lo que es similar al tiempo necesario para que los virus infecciosos se reproduzcan a un nivel que resulta en la formación de placas o efectos citopáticos en las células infectadas. También se ha desarrollado un ensayo de alto rendimiento para determinar títulos de anticuerpos neutralizantes utilizando pseudotipos VSV que expresan fosfatasa alcalina secretada [108, 109] o luciferasa (Figura 3 ). Recientemente hemos desarrollado un pseudotipo basado en VSV portando el virus de Lassa GP (VSV-LAS-GP) para la detección de anticuerpos neutralizantes en el suero obtenido de un paciente con fiebre de Lassa. Se muestra un ejemplo del ensayo de neutralización de LASV utilizando el pseudotipo de VSV (Figura 4 ). En presencia de suero de pacientes con fiebre de Lassa, el número de células GFP positivas (infectividad de VSV-LAS-GP) se reduce significativamente en comparación con el número en ausencia del suero del paciente (Figura 4A ). El pseudotipo de control VSV portando VSV GP (VSV-VSV-G) no es neutralizado por ningún sera. Cuando la dilución sérica de corte se fija en un 50% de inhibición de la infectividad en comparación con la infectividad en ausencia del suero de prueba, el título de neutralización del suero de este paciente para VSV-LAS-GP se calcula en 75 (Figura 4B ). Asimismo, se ha desarrollado un pseudotipo basado en VSV con el virus Junin GP para la detección de anticuerpos neutralizantes de los sueros de pacientes con AHF. La exactitud de los resultados de los ensayos de neutralización basados en VSV se ha confirmado en comparación con los resultados del ensayo de neutralización utilizando el virus Junin vivo [70]. El virus Lujo es un nuevo miembro de la familia de virus de la arena hemorrágica asociada a la fiebre de Zambia y el sur de África, y el virus se clasifica como un patógeno BSL-4 [17]. El análisis de la secuencia del genoma del virus Lu Para estudiar la infectividad de este nuevo virus arena identificado, hemos desarrollado recientemente un pseudotipo de VSV que expresa luciferasa portando el virus Lujo GPC (VSV-Lujo-GP). Como se muestra en la Figura 3, la infección con VSV-Lujo-GPC es específicamente neutralizada por el suero anti-Lujo GPC del conejo. Así, el VSV-Lujo-GP puede ser una herramienta útil no sólo para determinar el título de anticuerpos neutralizantes dentro del suero, sino también para explorar receptores celulares aún por definir para la infección por el virus Lujo o para detectar inhibidores de la entrada celular mediada por el virus Lujo. Los brotes de fiebre hemorrágica causados por los virus arena patógenos resultan en altas tasas de mortalidad. Un diagnóstico rápido y preciso es un primer paso crítico en cualquier brote. Los métodos de diagnóstico serológico de la ICV más frecuentemente emplean un ensayo de ELISA, IFA y/o neutralización del virus. Se han desarrollado métodos de diagnóstico utilizando proteínas virales recombinantes y se han revisado sus utilidades para el diagnóstico de la ICV. Las IgG- e IgM-ELISA y las IFAs que utilizan rNPs como antígenos son útiles para la detección de anticuerpos inducidos en los sueros de los pacientes. Estos métodos también son útiles para las encuestas seroepidemiológicas para los VHF. Las ELISAs de captura de Ag utilizando MAbs para el virus arena son específicas para la especie del virus o pueden ser ampliamente reactivas para los virus de arena del Nuevo Mundo, dependiendo del MAb utilizado. Además, el sistema de pseudotipo basado en VSV proporciona una herramienta segura y rápida para medir los títulos de anticuerpos neutralizadores de virus, así como un modelo para analizar la entrada de los respectivos virus arena en células sensibles sin usar virus arena vivos.Los recientes descubrimientos de nuevas especies de virus arena [17, 26, 110] y su potencial para evolucionar predominantemente a través del cambio de host, en lugar de con sus anfitriones [110, 111], sugieren que un virus arena patogénico desconocido puede surgir en el futuro, y que los métodos diagnósticos de VHF causados por los virus arena deben así desarrollarse y mejorarse.

¿Cuál es el período de incubación del Arenavirus?

Ensayos serológicos basados en proteínas virales recombinantes para el diagnóstico de heces hemorrágicas del virus Arenahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3497043/SHA: f1d308db379b3c293bcfc8fe251c043fe8842358Autores: Fukushi, Shuetsu; Tani, Hideki; Yoshikawa, Tomoki; Saijo, Masayuki; Morikawa, ShigeruFecha: 2012-10-12DOI: 10.3390/v4102097Licencia: cc-byAbstract: La familia Arenaviridae, género Arenavirus, consta de dos grupos filogenéticamente independientes: Complejos del Viejo Mundo (OW) y del Nuevo Mundo (NW). Los virus Lassa y Lujo en el complejo OW y los virus Guanarito, Junin, Machupo, Sabia y Chapare en el complejo NW causan fiebre hemorrágica viral (VHF) en los seres humanos, provocando graves preocupaciones de salud pública. Estos virus también son considerados agentes bioterroristas potenciales. Por lo tanto, es de gran importancia detectar estos patógenos de forma rápida y específica para minimizar el riesgo y la escala de brotes de virus de arena. Sin embargo, estos virus de arena se clasifican como patógenos BSL-4, lo que dificulta el desarrollo de técnicas diagnósticas para estas infecciones por virus en institutos sin instalaciones BSL-4. Para superar estas dificultades, se desarrollaron sistemas de detección de anticuerpos en forma de un ensayo inmunosorbente enzimático (ELISA) y un ensayo indirecto de inmunofluorescencia utilizando nucleoproteínas recombinantes (rNPs) derivados Además, se desarrollaron varios ensayos de detección de antígenos; por ejemplo, se desarrollaron nuevos anticuerpos monoclonales (mAbs) frente a los rNP de los virus Lassa y Junin. Los ELISAs a base de antígenos Sandwich (Ag-capture) utilizando estos mAbs como anticuerpos de captura fueron confirmados como sensibles y específicos para la detección de los respectivos NPs de los Arenavirus. Estos ensayos basados en rNP fueron propuestos para ser útiles no sólo para un diagnóstico etiológico de los VHFs, sino también para estudios seroepidemiológicos sobre los VHFs. Recientemente desarrollamos ensayos de neutralización de este virus utilizando pseudotipos de estomatitis vesiculares basados en VSV que contienen glucoproteínas recombinantes por el virus arena. El objetivo de este artículo es revisar los avances recientes en el desarrollo de ensayos diagnósticos de laboratorio basados en proteínas virales recombinantes para el diagnóstico de los VHF y estudios epidemiológicos sobre los VHF causados por los arenavirus. Texto: El virus Arenaviridae consiste en sólo un género, pero la mayoría de los virus dentro de este género se pueden dividir en dos grupos diferentes: los Viejos Mundos arenavirus y los Nuevos Mundo arenavirus (también conocidos como el complejo Tacaribé) [1, 2]. Las diferencias entre los dos grupos se han establecido mediante el uso de ensayos serológicos. La mayoría de los arenavirus causan infección persistente en roedores sin ningún síntoma, y los seres humanos adquieren una variedad de enfermedades cuando zoonópticamente infectados. También se han notificado infecciones por LCMV congénitas [4, 5]. Lo más importante es que la fiebre hemorrágica viral (VHF) puede ser causada por varios estadiovirus. La fiebre de Lassa, causada por el virus de Lassa (LASV), un virus de arena del Viejo Mundo, es uno de los VHF más devastadores en humanos [6]. La hemorragia y el fallo de órganos ocurren en un subconjunto de pacientes infectados con este virus, y se asocia con una alta mortalidad. Muchos casos de fiebre de Lassa ocurren en África occidental en países como Guinea, Sierra Leona y Nigeria [7] [9] [10] [11] [12] [13]. El linaje complejo de Tacaribé B del Nuevo Mundo arenavirus consiste en el virus Junin (JUNV), el virus Guanarito (GUNV), el virus Sabia (SABV) y el virus Machupo (MACV), los agentes etiológicos de las fiebres hemorrágicas argentinas, venezolanas, brasileñas y bolivianas, respectivamente [14, 15]. Aunque genéticamente distintos entre sí, parecen producir síntomas similares, acompañados de hemorragias en humanos [14, 15]. Estas especies patógenas del Nuevo Mundo arenavirus están estrechamente asociadas con una especie específica de roedores [6]. Los seres humanos suelen estar infectados con arenavirus patógenos a través del contacto directo con tejido o sangre, o después de inhalar partículas aerosolizadas de orina, heces y saliva de roedores infectados. Después de un período de incubación de 1-3 semanas, los individuos infectados desarrollan bruscamente fiebre, dolor retroesternal, dolor de garganta, dolor de espalda, tos, dolor abdominal, vómitos, diarrea, conjuntivitis, hinchazón facial, proteinuria y hemorragia mucosa. También se han descrito problemas neurológicos, incluyendo pérdida auditiva, temblores y encefalitis. Debido a que los síntomas de enfermedad relacionada con el estadio patógeno son variados y no específicos, el diagnóstico clínico es a menudo difícil [14, 16]. La transmisión humana a humana puede ocurrir a través de contacto cutáneo o mucosa, o a través de contaminación nosocomial [14, 16]. Estos virus también se consideran agentes potenciales de bioterrorismo [2]. Recientemente se han descubierto varias especies de este tipo de virus como resultado de estudios de roedores y brotes de enfermedades [17] [18] [20] [22] [23] [25] [ Un nuevo virus patógeno de la arena del Nuevo Mundo, el virus Chapare (CHPV), ha sido aislado de un caso fatal de VHF en Bolivia [20]. Además, se han reportado cinco casos de VHF en Sudáfrica, y un nuevo virus de la arena, llamado Virus Lujo, fue aislado de un paciente [17]. El virus Lujo está más distantemente relacionado con los otros virus de la arena del Viejo Mundo [17]. Hasta la fecha, no hay información sobre el huésped vertebrado de los virus Chapare y Lujo. Hay alguna evidencia de endemicidad del virus Lassa en los países vecinos [27, 28]. Sin embargo, como la magnitud del comercio internacional y los viajes está aumentando continuamente, y la perturbación del medio ambiente (debido a la actividad humana o a cambios ecológicos naturales) puede resultar en cambios de comportamiento de los roedores del reservorio, los virus de la arena altamente patógenos podrían introducirse De hecho, se han notificado más de veinte casos de fiebre de Lassa fuera de la región endémica en áreas como EE.UU., Canadá, Europa y Japón [29] [30] [31] [32] [33]. Es de gran importancia detectar estos patógenos de forma rápida y específica para minimizar el riesgo y la escala de brotes de VHF causados por virus de arena. Sin embargo, estos virus de arena se clasifican como patógenos de nivel de bioseguridad (BSL)-4, lo que dificulta el desarrollo de técnicas diagnósticas para estas infecciones virales en laboratorios sin instalaciones BSL-4. Para superar estas dificultades, se han establecido ensayos serológicos basados en nucleoproteínas virales recombinantes (NPRs), como el ensayo inmunosorbentes IgG-enzima (ELISA), el ensayo de inmunofluorescencia indirecta (IFA) y el análisis de antígenos (Ag)-captura ELISA para el diagnóstico de los VHF causados por los arenavirus altamente patógenos. Además, se han desarrollado ensayos de neutralización de virus utilizando GPs del virus portador pseudotipo. En esta revisión, se describe la utilidad de tales ensayos diagnósticos basados en proteínas recombinantes para el diagnóstico de los VHFs causados por los estadios. En brotes de VHFs, las infecciones son confirmadas por diversos métodos de diagnóstico de laboratorio. La detección de virus se realiza por aislamiento del virus, reacción inversa de transcripción-polimerasa (RT-PCR) y ELISA antígeno-captura. Se ha demostrado que los paneles de anticuerpos monoclonales contra los arenavirus patógenos son útiles para detectar antígenos virales en las células infectadas por el virus, así como para investigar las relaciones antigénicas de los arenavirus [34] [35] [36]. La detección del genoma del virus es adecuada para un diagnóstico rápido y sensible de los pacientes con VHF en la fase temprana de la enfermedad, y se han descrito extensas revisiones de tales ensayos RT-PCR [37, 38]. Más recientemente, también se han notificado avances en el método RT-PCR que abarca las variaciones genéticas de los virus de la fiebre hemorrágica (HFVs) [39, 40] y un microarray de oligonucleótido multiplexado para el diagnóstico diferencial de los VHFs [41]. Por otro lado, los anticuerpos contra estos virus pueden ser detectados mediante el ensayo indirecto de inmunofluorescencia (IFA Una IFA detecta el anticuerpo en el suero, que es capaz de unirse a la monocapa fija de las células infectadas por el virus. Aunque la interpretación de los resultados de inmunofluorescencia requiere experiencia, el ensayo tiene ventajas sobre otros métodos, ya que cada virus genera un patrón de fluorescencia característico que añade especificidad al ensayo en comparación con una simple lectura de ELISA. Un diagnóstico serológico mediante la detección de anticuerpos IgM e IgG específicos a los VHFs debe ser sensible, específico y confiable, ya que un diagnóstico erróneo puede llevar al pánico en la población general. Una ELISA específica de IgM es adecuada para detectar infecciones recientes, pero la relevancia de las pruebas IgM para la VHF aguda depende del virus y la duración de la enfermedad; la IgM específica no está presente a menudo en la etapa muy temprana de la enfermedad, y los pacientes que mueren de VHF a menudo no logran seroconvert. Una ELISA específica de IgG es eficaz, no sólo en el diagnóstico de un gran número de casos de VHF, especialmente durante la convalecencia, sino también para estudios epidemiológicos en las regiones endémicas.Los métodos detallados utilizados para las IFA e IgG- e IgM-ELISA para el diagnóstico de VHF utilizando auténticos antígenos virus [42] [43] [44] [44]. Los virus de Arena tienen un genoma de ARN bisegmentado, de sentido negativo, de un solo canal con una estrategia de codificación ambisense única que produce sólo cuatro proteínas conocidas: una glucoproteína, una nucleoproteína (NP), una proteína matriz (Z) y una polimerasa (L) [46]. De estas proteínas, la NP es la más abundante en células infectadas por virus. La tecnología de proteínas recombinantes podría satisfacer la demanda de un sistema de prueba de VHF sencillo y fiable, y se ha demostrado que el NP recombinante (rNP) es útil para los estudios serológicos de anticuerpos IgM e IgG contra los arenavirus [47] [48] [48] [49]. Los baculovirus recombinantes que expresan el rNP completo de los arenavirus se han generado [48, 50, 51]. El método utilizado para la purificación del rNP de arenavirus de células Tn5 infectadas con baculovirus recombinantes es eficaz y sencillo en comparación con los del Ébola, Marburg y los virus hemorrágicos del virus de la fiebre de Crimea-Congo [51] [52] [53] [55]. La mayoría de los rNPs de arenavirus expresados en células de insectos que utilizan los baculovirus recombinantes se cristalizan [56] y se solubilizan en PBS que contienen urea 8M. Dado que la mayoría de las proteínas celulares de Tn5 se solubilizan en PBS que contienen urea 2M, los rNPs de arenavirus en la fracción insoluble en PBS que contienen urea 2M pueden solubilizarse por sonación en PBS que contienen urea 8M. Después de una centrifugación simple de los lisatos en PBS que contienen urea 8M, las fracciones sobrenadantes pueden utilizarse como antígenos rNP purificados sin más pasos de purificación [51]. El antígeno de control se produce a partir de células Tn5 infectadas por baculovirus que carecen del gen poliedrín (ΔP) de la misma manera La expresión y la eficiencia de purificación del rNP de arenavirus fueron analizadas por electroforesis de gel dodecil-poliacrilamida (SDS-PAGE) tras tinción de los geles con azul Coomassie. Se muestran antígenos NP purificados con un peso molecular aproximado de 62 kDa de Luna, LCM, Lassa, Lujo, Junin, Machupo, Guanarito, Sabia y Chapare y el antígeno de control negativo purificado (ΔP). Como se ha descrito anteriormente, los baculovirus recombinantes permiten la entrega de antígenos rNP sin utilizar virus vivos infecciosos. Se utiliza una placa ELISA recubierta con la cantidad óptima predeterminada de rNPs purificados (aproximadamente 100 ng/well) para el ensayo de detección de anticuerpos IgG. Una ventaja del uso de rNP recombinante para el IgG-ELISA es que permite una comparación directa de la reactividad cruzada de anticuerpos entre los rNPs de la arenavirus, ya que los preparados de antígenos de todos los rNPs de la arenavirus probados se realizan utilizando el mismo método [51]. Rabbit anti-sera planteado frente a LCMV-rNP y LASV-rNP muestran reactividad cruzada a LASV-rNP y LCMV-rNP, respectivamente, lo que indica que los anticuerpos de conejo contra rNPs de la arenavirus del Viejo Mundo reaccionan de forma cruzada con rNPs de otras arenavirus del Viejo Mundo (Tabla 1 ) [51]. Del mismo modo, los anti-sera de conejo generados frente a JUNV-NP muestran reactividad cruzada a LASV-rNP y LCMV-rNP Sin embargo, los anti-sera de conejos contra LASV-NP y LCMV-NP muestran una reacción negativa al JUNV-rNP (Tabla 1 ) [51], lo que indica que los anticuerpos de conejos contra JUNV (un patógeno New World arenavirus) NP podrían reaccionar de forma cruzada con el Old World arenavirus NP, mientras que los anticuerpos contra Old World arenavirus NPs pueden no ser capaces de reaccionar con patógenos New World arenavirus NPs. El rNP basado en IgG-ELISA también se ha utilizado para la caracterización de un anticuerpo monoclonal de ratón (MAb). Nakauchi et al. [50] han investigado la reactividad cruzada de MAbs contra JUNV rNP a patógenos New World arenavirus rNPs, así como LASV rNP. MAb C11-12 reacciona al mismo nivel con los rNPs de todos los virus patógenos de la arena del Nuevo Mundo, incluyendo JUNV, GTOV, MACV, SABV y CHPV, indicando que este MAb reconoce un epitope conservado entre los virus patógenos de la arena del Nuevo Mundo. Otro MAb, C6-9, reacciona específicamente con el rNP de JUNV, pero no reacciona con los de los otros virus patógenos de la arena del Nuevo Mundo [50]. Esto indica que MAb C6-9 reconoce un epitope específico de JUNV. Ninguno de estos MAbs reacciona con el rNP del virus patógeno humano de la arena del Viejo Mundo LASV. Así, el MAb C11-12 se considera un MAb ampliamente reactivo contra los virus de la arena del Nuevo Mundo, mientras que MAb C6-9 es específico de JUNV. Estos hallazgos han sido confirmados por análisis detallados de epítopos utilizando mapeo péptido [50]. Del mismo modo, se ha analizado la reactividad cruzada de MAbs frente a LASV rNP [51]. La reacción cruzada de MAb 4A5 con el virus Mopeia (MOPV) pero no con el LCMV rNP. La reacción cruzada de MAb 6C11 con LCMV rNP, mientras que la reacción cruzada de MAb 2-11 no se produce con LCMV rNP [51]. Tabla 1. La reactividad antiserum para rNPs de diferentes arenavirus en IgG ELISAs. La reactividad para rNP de LASV LCMV JUNV anti-LASV NPIt es importante para evaluar si la ELISA basada en rNP es útil para el diagnóstico de casos de La especificidad de la IgG ELISA basada en LASV-rNP se ha confirmado utilizando sera obtenida de pacientes con fiebre de Lassa [51]. La sera de los pacientes con fiebre de Lassa muestra una reacción altamente positiva en la IgG-ELISA basada en LASV-rNP, pero sera de pacientes con fiebre hemorrágica argentina (AHF), causada por JUNV, no. El suero de un paciente con IC mostró una reacción altamente positiva en la IgG-ELISA basada en JUNV-rNP [49]. Además, se demostró que, utilizando sera obtenida de casos de IC, los resultados de la IgG ELISA basada en JUNV se correlacionan bien con una auténtica IgG ELISA basada en antígenos JUNV [49]. Para evitar el uso de virus altamente patógenos para la preparación de antígenos, se han desarrollado células mamíferas que expresan rNP recombinante [51, 57, 66] [67] [68]. El antígeno NP del virus de Lassa para la AFI puede prepararse simplemente como se describe [51]. Brevemente, el procedimiento consiste en (1) transfeccionar las células HeLa con un vector de expresión celular de mamíferos insertado con el ADNc del ADNc del NP clonado; (2) expandir las células de expresión NP estables mediante selección de antibióticos; (3) mezclar las células que expresan rNP con células HeLa no transfectadas (en una proporción de 1:1); (4) manchar las mezclas celulares en diapositivas de vidrio, luego secarlas y fijarlas en acetona. En la AFI específica para LASV-NP, los sera anticuerpos positivos muestran patrones tinción granular característicos en el citoplasma (figura 2 ) [69], lo que facilita la distinción entre muestras positivas y negativas. La especificidad del ensayo también ha sido confirmada mediante el uso de sera obtenida de pacientes con fiebre de Además, se ha desarrollado una IFA que utiliza células HeLa que expresan rNP de JUNV para detectar anticuerpos contra JUNV, y el ensayo ha sido evaluado utilizando sera de pacientes con HF [70]. Se sugiere que los sistemas de detección de anticuerpos basados en rNP de LASV, como ELISA e IFA, son útiles no sólo para el diagnóstico de fiebre de Lassa, sino también para estudios seroepidemiológicos de infección por LASV. En nuestro estudio preliminar, aproximadamente el 15% de los sera recolectados de 334 ghaneses y menos del 3% de 280 zambianos mostraron reacciones positivas en el IgG ELISA basado en rNP de LASV [58]. Estos resultados concuerdan con el hecho de que la fiebre de Lassa es endémica en la región de África Occidental, incluida Ghana, pero menos en la región de África Oriental. Para el diagnóstico de muchas infecciones virales, se ha demostrado que los ensayos de PCR tienen una excelente sensibilidad analítica, pero las técnicas establecidas están limitadas por su requerimiento de equipos costosos y experiencia técnica. Además, el alto grado de variabilidad genética de los virus ARN, incluyendo el arenavirus y el bunyavirus, plantea dificultades para seleccionar imprimaciones para ensayos RT-PCR que puedan detectar todas las cepas del virus. Puesto que la sensibilidad de la Ag-capture ELISA es comparable a la de la RT-PCR para varias enfermedades infecciosas mediadas por virus, incluyendo fiebre de Lassa y fiebre hemorrágica del filovirus [51, [71] [72] [73], la Ag-capture ELISA es un enfoque sofisticado que puede utilizarse para el diagnóstico de infecciones virales. Las ELISAs de captura de Ag se han aplicado ampliamente para detectar diversos virus, ya que son los antígenos virales más abundantes y tienen secuencias de aminoácidos altamente conservadas [50, 51, 54, 71, 72, 74, 75]. Antisera policlonal o una mezcla de MAbs presentes en los fluidos ascéticos de animales inmunizados para VHFs se han utilizado para la captura-anticuerpos en la ELISA de captura de Ag [36, [76] [77] [78] [79]. Los MAbs que reconocen los epítopos conservados del rNP también se utilizan como anticuerpos de captura, ya que tienen una alta especificidad para los antígenos, y una identificación de los epítopos de estos MAbs es de importancia crucial para la evaluación de la especificidad y la reactividad cruzada del sistema de ensayo [50, 51, 53, 54, 71, 75]. Para desarrollar una prueba de diagnóstico sensible para la fiebre de Lassa y la AHF, se han preparado rNPs de LASV y JUNV (véase más arriba), y se han caracterizado y utilizado MAbs recién establecidos contra ellos para el Ag-capture ELISAs [50, 51]. Se ha confirmado que el Ag-capture ELISA utilizando MAb 4A5 es útil para la detección de antígeno LASV auténtico en sera recolectado serialmente a partir de hámsteres infectados con LASV [51] La sensibilidad de la ELISA basada en Ag-captura de MAb 4A5 fue similar a la de la RT-PCR convencional, sugiriendo que la ELISA de Ag-captura puede ser utilizada eficientemente en el diagnóstico de la fiebre de Lassa [51]. Por lo tanto, la ELISA basada en Ag-captura de MAb 4A5 se considera útil en el diagnóstico de la fiebre de Lassa. Además, mediante el uso de MAbs levantados contra el rNP de JUNV, Ag-capture ELISAs específico para JUNV y ampliamente reactivos a los patógenos humanos New World arenavirus se han desarrollado [50]. La ELISA de Ag-captura utilizando MAb E4-2 y C11-12 detectó los Ags de todos los patógenos New World arenavirus probados, incluyendo JUNV. Por otro lado, la ELISA de Ag-captura utilizando Teniendo en cuenta que los síntomas de la infección por el virus JUNV en humanos son indistinguibles de los que se deben a otros virus patógenos de la arena del Nuevo Mundo, la captura de Ag ELISA utilizando MAb C6-9 puede ser una herramienta de diagnóstico útil, especialmente para la AHF [50]. El ensayo de neutralización del virus se acepta como el ensayo serodiagnóstico "estándar de oro" para cuantificar la respuesta de anticuerpos a la infección y la vacunación de una amplia variedad de virus asociados con enfermedades humanas [80] [81] [82] [83] [84] [85] [86]. La presencia de anticuerpos neutralizantes es un indicador fiable de inmunidad protectora contra la VHF [87] [88] [89]. Sin embargo, debido a la alta patogenicidad de los VHF para los seres humanos y a la estricta regulación de determinados agentes, sólo un número limitado de laboratorios son capaces de realizar tales pruebas de neutralización.Para muchos VHF, partículas virales incompetentes de pseudotipos de replicación con proteína de envoltura viral (GP) se ha demostrado que imitan las respectivas infecciones por VHF, por lo que los ensayos de neutralización utilizando los pseudotipos pueden ser ventajosos en algunos entornos de laboratorio para la detección de anticuerpos contra los VHF sin necesidad de mayores requisitos de biocontención.El vector basado en VSV ya se ha utilizado para generar VSV recombinantes con capacidad de replicación para estudiar el papel de los GP de varios virus [90] [91] [92]. Los recientes avances en la producción de partículas de virus pseudotipo han permitido investigar la entrada de células víricas, el tropismo viral y el efecto de los inhibidores de la entrada, así como la medición de los títulos de neutralización, mediante el uso de vectores basados en virus de inmunodeficiencia humana, virus de inmunodeficiencia felina, virus de leucemia murina o VSV [86, [93] [94] [95] [96] [97] [98] [99] [101] [102] [103]. Los pseudotipos basados en VSV tienen ventajas en comparación con otros pseudotipos basados en retrovirus por las siguientes razones. En primer lugar, el título de virus pseudotipo obtenido con el sistema VSV es generalmente superior al del sistema retrovirus pseudotipo [104]. En segundo lugar, la infección de células diana con un pseudotipo de VSV puede detectarse fácilmente como células fluorescentes verdes (GFP) positivas a 7-16 h después de la infección debido al alto nivel de expresión de GFP en el sistema VSV [104, 105]. En cambio, el tiempo requerido para la infección en el sistema retrovirus pseudotipo es de 48 h [106, 107], lo que es similar al tiempo necesario para que los virus infecciosos se reproduzcan a un nivel que resulta en la formación de placas o efectos citopáticos en las células infectadas. También se ha desarrollado un ensayo de alto rendimiento para determinar títulos de anticuerpos neutralizantes utilizando pseudotipos VSV que expresan fosfatasa alcalina secretada [108, 109] o luciferasa (Figura 3 ). Recientemente hemos desarrollado un pseudotipo basado en VSV portando el virus de Lassa GP (VSV-LAS-GP) para la detección de anticuerpos neutralizantes en el suero obtenido de un paciente con fiebre de Lassa. Se muestra un ejemplo del ensayo de neutralización de LASV utilizando el pseudotipo de VSV (Figura 4 ). En presencia de suero de pacientes con fiebre de Lassa, el número de células GFP positivas (infectividad de VSV-LAS-GP) se reduce significativamente en comparación con el número en ausencia del suero del paciente (Figura 4A ). El pseudotipo de control VSV portando VSV GP (VSV-VSV-G) no es neutralizado por ningún sera. Cuando la dilución sérica de corte se fija en un 50% de inhibición de la infectividad en comparación con la infectividad en ausencia del suero de prueba, el título de neutralización del suero de este paciente para VSV-LAS-GP se calcula en 75 (Figura 4B ). Asimismo, se ha desarrollado un pseudotipo basado en VSV con el virus Junin GP para la detección de anticuerpos neutralizantes de los sueros de pacientes con AHF. La exactitud de los resultados de los ensayos de neutralización basados en VSV se ha confirmado en comparación con los resultados del ensayo de neutralización utilizando el virus Junin vivo [70]. El virus Lujo es un nuevo miembro de la familia de virus de la arena hemorrágica asociada a la fiebre de Zambia y el sur de África, y el virus se clasifica como un patógeno BSL-4 [17]. El análisis de la secuencia del genoma del virus Lu Para estudiar la infectividad de este nuevo virus arena identificado, hemos desarrollado recientemente un pseudotipo de VSV que expresa luciferasa portando el virus Lujo GPC (VSV-Lujo-GP). Como se muestra en la Figura 3, la infección con VSV-Lujo-GPC es específicamente neutralizada por el suero anti-Lujo GPC del conejo. Así, el VSV-Lujo-GP puede ser una herramienta útil no sólo para determinar el título de anticuerpos neutralizantes dentro del suero, sino también para explorar receptores celulares aún por definir para la infección por el virus Lujo o para detectar inhibidores de la entrada celular mediada por el virus Lujo. Los brotes de fiebre hemorrágica causados por los virus arena patógenos resultan en altas tasas de mortalidad. Un diagnóstico rápido y preciso es un primer paso crítico en cualquier brote. Los métodos de diagnóstico serológico de la ICV más frecuentemente emplean un ensayo de ELISA, IFA y/o neutralización del virus. Se han desarrollado métodos de diagnóstico utilizando proteínas virales recombinantes y se han revisado sus utilidades para el diagnóstico de la ICV. Las IgG- e IgM-ELISA y las IFAs que utilizan rNPs como antígenos son útiles para la detección de anticuerpos inducidos en los sueros de los pacientes. Estos métodos también son útiles para las encuestas seroepidemiológicas para los VHF. Las ELISAs de captura de Ag utilizando MAbs para el virus arena son específicas para la especie del virus o pueden ser ampliamente reactivas para los virus de arena del Nuevo Mundo, dependiendo del MAb utilizado. Además, el sistema de pseudotipo basado en VSV proporciona una herramienta segura y rápida para medir los títulos de anticuerpos neutralizadores de virus, así como un modelo para analizar la entrada de los respectivos virus arena en células sensibles sin usar virus arena vivos.Los recientes descubrimientos de nuevas especies de virus arena [17, 26, 110] y su potencial para evolucionar predominantemente a través del cambio de host, en lugar de con sus anfitriones [110, 111], sugieren que un virus arena patogénico desconocido puede surgir en el futuro, y que los métodos diagnósticos de VHF causados por los virus arena deben así desarrollarse y mejorarse.

¿Qué proteínas produce el Arenavirus?

Glicirrizina ejerce efectos antioxidantes en las células infectadas por el virus H5N1 Influenza A e inhibe la replicación del virus y la expresión génica proinflamatoriohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3096629/SHA: f3b7f4469ac01f1ce916d24172570c43c537627eAutores: Michaelis, Martin; Geiler, Janina; Naczk, Patrizia; Sithisarn, Patchima; Leutz, Anke; Doerr, Hans Wilhelm; Cinatl, JindrichFecha: 2011-05-17DOI: 10.1371/journal.pone.001705Licencia: cc-byAbstract: Glicirrizinina es conocida por ejercer efectos antivirales En este caso, se investigaron los efectos de un preparado de glicirrhizina parenteral aprobado (Stronger Neo-Minophafen C) sobre la replicación del virus H5N1 de la gripe altamente patógena, la apoptosis inducida por H5N1 y las respuestas proinflamatorias inducidas por H5N1 en células epiteliales pulmonares (A549). Las concentraciones terapéuticas de glicirrizina inhibieron sustancialmente la expresión inducida por H5N1 de las moléculas proinflamatorias CXCL10, interleucina 6, CCL2 y CCL5 (concentración efectiva de glicirrizina 25 a 50 μg/ml), pero interfirieron con la replicación de H5N1 y la apoptosis inducida por H5N1 en menor grado (concentración efectiva de glicirrizina 100 μg El mecanismo por el cual la glicirrizina interfiere con la replicación de H5N1 y la expresión génica proinflamatoria inducida por H5N1 incluye la inhibición de la formación inducida por H5N1 de especies de oxígeno reactivo y (a su vez) la reducción de la activación de la gripe H5B, JNK y p38, los eventos de señalización sensibles a la redox conocidos como relevantes para la replicación del virus influenza A. Por lo tanto, la glicirrizina puede complementar el arsenal de fármacos potenciales para el tratamiento de la enfermedad H5N1. Texto: Los virus H5N1 altamente patógenos se consideran progenitores potenciales de pandemias de gripe [1] [3] [4] [5] [6]. Al menos para la primera ola de una pandemia de H5N1 no se dispondrá de cantidades suficientes de vacunas adecuadas [1] [2] [4] [6] [7] [7] [8]. Por lo tanto, la terapia antiviral para los virus de la gripe A, incluidas las cepas altamente patógenas del virus H5N1 sigue siendo de gran importancia para la defensa de primera línea contra el virus [1] [2] [3] [4] 6, 9]. Los inhibidores de la neuraminidasa oseltamivir y zanamivir, así como los adamantanes amantadin y rimantadin que interfieren con la proteína de la gripe M2 están autorizados para el tratamiento de la gripe [1] [2] [3] [4] 6]. Sin embargo, el uso de ambas clases de fármacos está limitado por la aparición de cepas de virus resistentes. En las cepas de gripe estacional, la mayoría de los virus H3N2 y una gran proporción de virus H1N1 en humanos se consideran ahora resistentes a la amantadina y a la rimantadina [10] [11] [12] [13]. Además, durante la temporada de gripe 2007/08 se ha notificado un aumento drástico de los virus H1N1 resistentes a oseltamivir en el hemisferio norte [14] [15] [16] [17]. Datos preliminares de los Estados Unidos predicen un aumento adicional para la temporada 2008/09, lo que puede dar lugar a que más del 90% de las cepas circulantes de H1N1 sean resistentes a oseltamivir [14]. Las cepas del virus H5N1 parezcan ser generalmente menos sensibles al tratamiento antiviral que las cepas estacionales del virus A y las cepas H5N1 resistentes al tratamiento surjan [1] [2] [3] [4] 6, [18] [19] [20] [21]. Más aún, faltan agentes parenterales para el tratamiento de pacientes gravemente enfermos. Se ha encontrado que interfiere con la replicación y/o la inducción del efecto citopatógeno (ECP) de muchos virus incluyendo virus respiratorios tales como virus respiratorios sincitiales, coronavirus SARS, virus del VIH y virus de la gripe [22] [23] [25] [26] [27]. Además, las propiedades antiinflamatorias e inmunomoduladoras fueron atribuidas a la glicirrhizina [26]. La gravedad de la enfermedad humana H5N1 se ha asociado con hipercitokinemia (''citokine storm'') [29, 30]. El tratamiento antiviral más inmunomodulador retardado redujo la mortalidad inducida por H5N1 en ratones [31]. Por lo tanto, los efectos antiinflamatorios e inmunomoduladores ejercidos por la glicirrizina pueden ser beneficiosos para el tratamiento de H5N1. Además, la glicirrhizina es un antioxidante conocido [26] y los antioxidantes ya han demostrado interferir con la replicación del virus influenza A y las respuestas proinflamatorias inducidas por el virus [32] [33]. El Neo-Minophagen C (SNMC) es un preparado de glicirrizina (disponible como tabletas o formulación parenteral) que está aprobado en Japón para el tratamiento de enfermedades hepáticas crónicas y se comercializa en Japón, China, Corea, Taiwán, Indonesia, India y Mongolia. Aquí, investigamos la influencia de la SNMC en la replicación H5N1, en la expresión citoquina inducida por H5N1, en el estrés oxidativo celular inducido por H5N1 y en eventos críticos de señalización celular inducidos por H5N1 en neumocitos humanos (línea celular A549). La cepa de gripe A/Vietnam/1203/04 (H5N1) fue recibida del Centro de Influenza de la OMS (Instituto Nacional de Investigación Médica, Londres, Reino Unido). La cepa de gripe H5N1 A/Tailandia/ 1(Kan-1)/04 fue obtenida del Prof. Pilaipan Puthavathana (Universidad de Mahidol, Bangkok, Tailandia). Las existencias de virus se prepararon mediante la infección de células de Vero (Renino de mono verde africano; ATCC, Manassas, VA) y alícuotas se almacenaron en 280uC. Los títulos de virus se determinaron como dosis infecciosa del 50% de cultivo tisular (TCID 50/ml) en células de Vero confluentes en placas de microtiros de 96well. Las células A549 (carcinoma de pulmón humano; ATCC: CCL-185, obtenidas de LGC Standards GmbH, Wesel, Alemania) fueron cultivadas a 37uC en medio esencial mínimo (MEM) complementado con un 10% de FBS, 100 UI/ml de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina. Los monocitos humanos fueron aislados de capas buffy de donantes sanos, obtenidos del Instituto de Medicina de Transfusión y Hematología Inmune, Centro Alemán de Donantes de Sangre de la Cruz Roja, Johann Wolfgang Goethe-University, Frankfurt am Main. Después de la centrifugación en Ficoll (Biocoll)-Hypaque gradiente de densidad (Biochrom AG, Berlín, Alemania), las células mononucleares fueron recogidas de la interfaz y lavadas con PBS. Luego, Los monocitos fueron cultivados en IMDM complementado con 10% de suero humano agrupado, 100 UI/ml de penicilina, y 100 mg/ml de estreptomicina. La viabilidad celular fue evaluada en capas de células confluentes con CellTiter-GloH Ensayo de Viabilidad Celular Luminiscente (Promega GmbH, Mannheim, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La viabilidad celular se expresó como porcentaje del control no tratado. Para determinar la localización de NP intracelular, H5N1 infectada A549 se fijaron 8 horas p.i. durante 15 minutos con acetona/ metanol helado (40:60, Mallinckrodt Baker B.V., Deventer, Países Bajos) y se mancharon con un anticuerpo monoclonal de ratón (1 h de incubación, 1:1000 en PBS) dirigido contra la nucle Se utilizó como anticuerpo secundario un IgG (H&L) antimouse de cabra Alexa Fluor 488 (Invitrogen, Eugene, Oregon, EE.UU.) (1 h de incubación, 1:1000 en PBS). Nuclei se tiñó utilizando 49,6-diamidin-2fenilindol (DAPI) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Munich, Alemania). Se visualizó la fluorescencia utilizando el microscopio de fluorescencia Olympus IX 1 (Olympus, Planegg, Alemania). Para el análisis citométrico del flujo se utilizaron los mismos anticuerpos. El ensayo de reducción del efecto citopatógeno (CPE) se realizó como se describe anteriormente [34]. Los monocapas de células A549 confluentes cultivados en placas de microtitre de 96 pocillos fueron infectados con cepas de influenza A en las multiplicidades de Después de un período de adsorción de una hora, las células fueron lavadas para eliminar el virus no desechado. La EPC inducida por el virus se registró a las 24 h después de la infección (p.i.). Salvo que se indique lo contrario, las células A549 fueron tratadas continuamente con glicirrizina a partir de un período de pre-incubación de 1 h. Para los experimentos de tiempo de adición, la glicirrizina se añadió exclusivamente durante el período de pre-incubación de 1 h, exclusivamente durante el período de adsorción de 1 h, o después exclusivamente después de la eliminación del virus de entrada. El ARN total se aisló de cultivos celulares utilizando reactivo TRI (Sigma-Aldrich, Munich, Alemania). Se utilizaron los siguientes imprimadores: sentido 59 acg tat gac tac ccg cag tat tca g 39; antisense 59 aga cca gcy acc atg att gc 39; sonda 6-FAM-tca aca gtg gcg agct cta gca-TAMRA. La fracción de células con contenido de ADN fraccionado (sub-G1' subpoblación celular) indica citotoxicidad. Las células sub-G1 se consideran células muertas (generalmente apoptóticas). Las células se fijaron con un 70% de etanol durante dos horas a 220uC. El ADN celular se tiñó utilizando propidium ioduro (20 mg/ml) y se analizó mediante citometría de flujo (FacsCalibur, BD Biosciences, Heidelberg, Alemania). Se midió la activación de caspasa utilizando los ensayos Caspasa-Glo 8, 9 ó 3/7 (Promega, Mannheim, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se recogieron y congelaron sobrenadantes del cultivo celular a 280uC. Se cuantificaron citoquinas/quimioquinas mediante conjuntos específicos ELISA Duo (R&D Systems GmbH, Wiesbaden, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. La actividad NFkB se investigó en células infectadas por H5N1 (MOI 0,01) mediante la cuantificación de las subunidades NFkB Rel A (p65) y NFkB1 (p50) a partir de extractos nucleares utilizando el factor de transcripción TransAM TM ELISAs (Active Motif, Rixensart, Bélgica). El extracto nuclear se preparó utilizando el kit de extracto nuclear (Motif activo, Carlsbad, CA, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se investigaron sobrenadantes del cultivo celular para la actividad quimiotáctica mediante la medición de la actividad para inducir la migración de monocitos a través de insertos de membrana en placas de 24 pocillos (tamaño de poro 8 mm; BD Biosciences, Heidelberg, Alemania). Se añadieron monocitos (1610 6 en 100 ml de IMDM con 10% de suero humano agrupado) a los insertos de cultivo celular (cámara superior) y sobrenadantes de cultivo celular (300 ml), a la cámara inferior del pozo. Después de un período de incubación de 48 h, las células se fijaron con paraformaldehído al 4% y permeabilizadas con PBS que contenían un 0,3% de Tritron X- La parte superior de la membrana se limpió con un hisopo húmedo para extraer las células, mientras que la parte inferior de la membrana se enjuagó con PBS. El número de células en la parte inferior de cada membrana se cuantificó mediante el recuento de células de tres secciones elegidas al azar (3,7 mm 2) utilizando un microscopio de fluorescencia Olympus IX 1 (Olympus, Planegg, Alemania). Las células se lisaron en tampón de muestra de Triton X y se separaron por SDS-PAGE. El extracto nuclear se preparó utilizando el kit de extracto nuclear (Motif activo, Carlsbad, CA, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las proteínas se detectaron utilizando anticuerpos específicos contra la bactina (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Munich, Alemania), JNK, fosforilado JNK, p38, o fosforilado p38, (todos comprados a New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main, Alemania) y fueron visualizados mediante una quimioluminiscencia mejorada utilizando un kit disponible comercialmente (Amersham, Friburgo, Alemania). Se detectaron especies de oxígeno reactivas (ROS) utilizando el Kit de Especies de Oxígeno Verde Reactivo Image-iT LIVE (sondas moleculares, distribuidas por Invitrogen, Karlsruhe, Alemania). Se compararon dos grupos por t-test. Se compararon más grupos por ANOVA con la siguiente prueba de Student-Newman-Keuls. La línea celular A549, derivada de un adenocarcinoma pulmonar humano, es un modelo establecido para los neumocitos tipo II [36], y se utiliza comúnmente para la investigación del efecto de los virus de la gripe en este tipo de células [ver por ejemplo 6,37,38]. Si no se indica lo contrario, la glicirrizina estuvo continuamente presente en los medios de cultivo celular a partir de un período de preinfección de 1 h. La glicirrizina 200 mg/ml (la concentración máxima probada) no afectó a la viabilidad celular de A549 (datos no mostrados) pero disminuyó claramente la formación de CPE en células A549 infectadas con la cepa de gripe H5N1 A/Tailandia/1(Kan-1)/04 en MOIs de 0,01, 0,1 ó 1 (figura 1A ). Se obtuvieron resultados similares en células A549 infectadas con la cepa A La tinción de células A549 para la nucleoproteína A de gripe 24 h después de la infección con la cepa H5N1 A/Tailandia/1(Kan-1)/04 indicó que la glicirrhizina 200 mg/ml reduce significativamente el número de células positivas de nucleoproteína A de gripe (Figura 1B). Para examinar la influencia de la glicirrizina en la progenie vírica, las células A549 fueron infectadas con la cepa H5N1 de gripe A/ Tailandia/1(Kan-1)/04 en el MOI 0,01 o el MOI 1 y se determinaron títulos de virus infecciosos 24 h después de la infección (Figura 1C ). Si bien la glicirrizina en concentraciones de hasta 50 mg/ml no afectó a la replicación de H5N1, los efectos moderados fueron ejercidos por la glicirrizina 100 mg/ ml y efectos más pronunciados por la glicirrizina 200 mg/ml (MOI 0,01: reducción de 13 veces, MOI 1: reducción de 10 veces). A continuación, la influencia de la glicirrizina en la replicación de H5N1 fue confirmada por la detección de ARN viral (H5) utilizando PCR cuantitativo. Sólo las concentraciones de glicirrizina 100 mg/ml disminuyeron significativamente Figura 1B) o H5N1 A/Vietnam/1203/04-infectado (Suplemento Figura 1C ) Células A549 (MOI 0,01) 24 h después de la infección. La adición de glicirrizina después de la infección mostró efectos antivirales reducidos mientras que la preincubación sola o la adición de glicirrizina durante el período de adsorción no afectó significativamente la replicación de H5N1.Para la investigación de la expresión de citocina inducida por H5N1, se eligieron cinco genes proinflamatorios que se habían correlacionado con la gravedad de la enfermedad por gripe: CXCL10 (también conocido como proteína 10, IP-10), interleucina 6 (IL6), interleucina 8, (IL8; también conocido como CXCL8), CCL2 (también conocido como proteína monocito quimioatractiva 1, MCP-1) y CCL5 (también conocido como RANTES). Las células A549 fueron infectadas con H5N1 A/Tailandia/ 1(Kan-1)/04 o H5N1 A/Vietnam/12 El tratamiento con glicirrizina se realizó con 25, 50, 100 ó 200 mg/ml. Se detectó la expresión citoquina 24 h después de la infección por ELISA. La glicirrizina no afectó a la expresión citoquina de células no infectadas (datos no mostrados) pero inhibió la expresión de todas las citoquinas investigadas en células infectadas por H5N1 de forma dosis-dependiente (figura 2, figura 3A ). Los efectos fueron más pronunciados en los MOI inferiores. Cabe destacar que la expresión de todas las citoquinas excepto IL8 fue significativamente inhibida después del tratamiento con glicirrizina 50 mg/ml Figura 3A ) aunque estas concentraciones de glicirrizina no tuvieron efecto sobre la replicación de H5N1 en células A549 (figura 1, figura S1 ). La expresión de citoquinas por influenza Las células respiratorias infectadas por el virus A causan el reclutamiento de monocitos de sangre periférica en los pulmones de los pacientes en los que se diferencian de los macrófagos que se cree que contribuyen a la patogenicidad del virus A de la gripe [5, 39]. En un ensayo de quimiotaxis, se investigó la influencia de la glicirrizina en la migración de monocitos hacia sobrenadantes de células infectadas por H5N1 A/Tailandia/1(Kan-1)/04 (MOI 0,1) infectadas por A549 células a través de filtros de 8 mm. La migración de monocitos hacia sobrenadantes de células infectadas por H5N1 aumentó fuertemente en relación con la migración hacia sobrenadantes de células no infectadas. Se ha demostrado que los virus de la gripe, incluyendo H5N1, inducen apoptosis dependiente de caspasa en las células de las vías respiratorias y esta apoptosis se ha correlacionado con la patogenicidad del virus [40, 41]. Las concentraciones de glicirrizina hasta 200 mg/ml no afectaron a la activación de caspasa en las células no infectadas (Figura 4A-C). Concentraciones de glicirrizina 100 mg/ml inhibidas H5N1 A/Tailandia/1(Kan-1)/04 (MOI 0,01) inducidas por la activación de las caspas iniciadoras 8 y 9 así como de las caspas efectoras 3/7 en las células A549 determinadas 24 h después de la infección (Figura 4A-C). La detección de células en la fase sub-G1 resultó en hallazgos similares (Figura 4D ). Sustancias que inhiben la activación de la caspasa inducida por H5N1 incluyendo inhibidores de la caspasa 3 causan retención nuclear de complejos de RNP [34, 42]. De acuerdo, la glicirrizina también interfirió con la exportación nuclear RNP en el MOI 1 (Figura S2 ). Resultados similares se obtuvieron en las células infectadas por MOI 0,01 H5N1 A/Tailandia/1(Kan-1)/04 (Figura S3 ). Influencia de la glicirrizina en la activación inducida por H5N1 del factor nuclear kB (NFkB), p38, y en la formación de especies celulares reactivas de oxígeno inducida por H5N1 (ROS) La activación de NFkB, p38 y JNK se ha asociado con la replicación del virus influenza A y la expresión génica proinflamatoria inducida por virus [44, [44] [45] [46] [47]. Si bien la glicirrizina no influyó en la actividad NFkB en células A549 no infectadas en las concentraciones probadas (datos no mostrados), la glicirrizina inhibió la activación NFkB en células infectadas por H5N1 (figura 5A ). Además, la glicirrizina inhibió la fosforilación inducida por H5N1 de los MAPKs p38 y Además de sus funciones durante la replicación del virus influenza A y la expresión citoquina/quimoquina inducida por el virus, NFkB, p38 y JNK son componentes de las vías de señalización sensibles a la redox [48] [49] [50] [51]. Ya se había descubierto que los antioxidantes interferían con la señalización inducida por el virus influenza A a través de NFkB, p38 y JNK, con la replicación del virus influenza A, y con la expresión proinflamatoria del virus A [32] [34]. Dado que se sabe que la glicirrhizina ejerce efectos antioxidantes [26], especulamos que la glicirrizina puede interferir con la formación de ROS inducida por el virus H5N1. De hecho, la glicirrhizina ejerció efectos antioxidantes claros en las células infectadas por H5N1 (MOI 0.01) (Figura 5C ) causando una reducción significativa de la formación de ROS ya a una concentración de 25 mg/ml (Figura 5D ). Aquí, se muestra que la glicirrizina inhibe la replicación del virus H5N1 influenza A altamente patógeno, la apoptosis inducida por H5N1 y la expresión inducida por H5N1 de citoquinas proinflamatorias en células A549 derivadas de los pulmones. Después de la administración intravenosa, las concentraciones plasmáticas alcanzables de glicirrizina se han descrito como alrededor de 100 mg/ml [52]. Por lo tanto, las concentraciones de glicirrizina encontradas para interferir con la replicación de H5N1 y la expresión génica proinflamatoria inducida por H5N En particular, aunque se necesitaron concentraciones más altas de glicirrizina para interferir con la replicación del coronavirus del SARS [22] que con la replicación del H5N1, se reportaron resultados beneficiosos en pacientes con SARS tratados con glicirrizina (SNMC) en comparación con pacientes con SARS que no recibieron glicirrizina [23]. En particular, la investigación de diferentes derivados de la glicirrizina contra el coronavirus del SARS llevó a la identificación de compuestos con mayor actividad antiviral [53]. Por lo tanto, la glicirrizina también podría servir como estructura de plomo para el desarrollo de nuevos fármacos anti-influenza. Los resultados experimentales sugieren que la glicirrizina podría afectar a la gripe estacional Enfermedad del virus A por efectos antivirales e inmunomoduladores [26, 27]. El mecanismo fue sugerido como inducción de interferón-c en células T por glicirrhizin [54]. Además, se demostró que la glicirrizin influyó en la replicación del virus A estacional a través de la interacción con la membrana celular [25, 28]. Sin embargo, estos efectos se observaron sólo en concentraciones de 200 mg/ml cuando se añadió glicirrizin durante el período de adsorción del virus. Dado que la adición de glicirrizin durante el período de adsorción no influyó en la replicación de H5N1 en nuestros experimentos, no parece probable que los efectos de membrana contribuyan a los efectos anti-H5N1 detectados aquí en concentraciones más bajas. Nuestros resultados sugieren más bien que la glicirrizin interfiere con el estrés oxidativo inducido por H5N1. Se encontró que los antioxidantes inhiben la replicación del virus influenza A y la expresión génica proinflamatoria inducida por el virus influenza A [32] [33] y se sabe que la glicirrizina ejerce efectos antioxidantes [26]. En este caso, la glicirrizina interfirió con la activación inducida por el virus H5N1 de NFkB, p38 y JNK que representa eventos de señalización sensibles al redox [48] [49] [49] [50] [51] implicada en la replicación del virus influenza A y la producción de citoquinas/quimioquinas celulares inducidas por el virus A [34, [43] [44] [45] [46] 55]. La glicirrizina 50 mg/ml redujo significativamente la activación inducida por el H5N1 de NFkB. Además, las concentraciones de glicirrhizina tan bajas como 25 mg/ml interfirieron eficazmente con la formación de ROS inducida por H5N1 y con la fosforilación de los MAPKs sensibles al redox p38 y JNK. En nuestro modelo, la activación de p38 parece ser crítica para la señalización redox asociada al H5N1, ya que la inhibición del p38 se había mostrado antes para imitar los efectos antioxidantes de la N-acetil-cisteína (NAC) [34]. Curiosamente y en contraste con la glicirrizina, el NAC no inhibió la replicación del H5N1 o la expresión citoquina/quimioquina inducida por H5N1 en concentraciones terapéuticamente relevantes. La glicirrhizina disminuyó la producción de citocinas/quimioquinas celulares inducidas por H5N1 en concentraciones (#50 mg/ml) que no interfirieron con la replicación de H5N1, aunque se ha descrito que las vías de señalización sensibles al redox están implicadas en ambos procesos. Por lo tanto, la expresión proinflamatoria inducida por H5N1 parece ser más sensible a la inhibición de la formación de ROS que la replicación de H5N1. De hecho, se ha demostrado que los virus de la gripe inducen vías celulares a través de eventos dependientes de replicación e independientes [56]. En un informe anterior, se pudo demostrar que concentraciones similares de glicirrizina como las investigadas aquí interfirieron con la expresión de genes proinflamatorios inducidas por H5N1 pero no con replicación de H5N1 en macrófagos derivados de monocitos humanos [ Además, otros regímenes de tratamiento inmunomodulador que no influyeron en la replicación de H5N1 redujeron la mortalidad en ratones infectados por H5N1 [31, 58]. Por lo tanto, la glicirrizina representa una posible opción de tratamiento adicional que interfiere con la replicación de H5N1 y la expresión inducida por H5N1 de citocinas proinflamatorias en células pulmonares. La interferencia con las respuestas inmunes también puede resultar en la pérdida del control de la replicación de virus por células inmunes citotóxicas incluyendo células asesinas naturales y CD8 citotóxicos + linfocitos T. Los inmunosupresores globales como los corticosteroides no pudieron proteger de la infección por el virus de la gripe letal [59]. Además, los fármacos antivirales pueden interferir con las células citotóxicas que controlan la replicación de virus como se demostró para ribavirina que En este contexto, ya se ha demostrado que la glicirrhizina no afecta a la actividad celular mortal natural en las concentraciones utilizadas aquí [57]. En conclusión, en este informe se muestra que las concentraciones terapéuticas de glicirrizina (utilizada como preparado parenteral aprobado clínicamente SNMC) interfieren con la replicación altamente patógena del virus H5N1 influenza A y la expresión génica proinflamatoria inducida por H5N1 al menos en parte a través de la interferencia con la formación de ROS inducida por H5N1 y, a su vez, con la reducción de la activación de p38, JNK y NFkB en las células pulmonares. Se considera que los agentes antiinflamatorios e inmunomoduladores son candidatos importantes como componentes de estrategias de tratamiento anti-influenza que pueden salvar vidas en una situación de pandemia de gripe [61]. Por lo tanto, la glicirrizina puede complementar el arsenal de fármacos potenciales para el tratamiento de la enfermedad causada por H5N1.

¿Cuál es el efecto de oseltamivir y zanamivir?

Glicirrizina ejerce efectos antioxidantes en las células infectadas por el virus H5N1 Influenza A e inhibe la replicación del virus y la expresión génica proinflamatoriohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3096629/SHA: f3b7f4469ac01f1ce916d24172570c43c537627eAutores: Michaelis, Martin; Geiler, Janina; Naczk, Patrizia; Sithisarn, Patchima; Leutz, Anke; Doerr, Hans Wilhelm; Cinatl, JindrichFecha: 2011-05-17DOI: 10.1371/journal.pone.001705Licencia: cc-byAbstract: Glicirrizinina es conocida por ejercer efectos antivirales En este caso, se investigaron los efectos de un preparado de glicirrhizina parenteral aprobado (Stronger Neo-Minophafen C) sobre la replicación del virus H5N1 de la gripe altamente patógena, la apoptosis inducida por H5N1 y las respuestas proinflamatorias inducidas por H5N1 en células epiteliales pulmonares (A549). Las concentraciones terapéuticas de glicirrizina inhibieron sustancialmente la expresión inducida por H5N1 de las moléculas proinflamatorias CXCL10, interleucina 6, CCL2 y CCL5 (concentración efectiva de glicirrizina 25 a 50 μg/ml), pero interfirieron con la replicación de H5N1 y la apoptosis inducida por H5N1 en menor grado (concentración efectiva de glicirrizina 100 μg El mecanismo por el cual la glicirrizina interfiere con la replicación de H5N1 y la expresión génica proinflamatoria inducida por H5N1 incluye la inhibición de la formación inducida por H5N1 de especies de oxígeno reactivo y (a su vez) la reducción de la activación de la gripe H5B, JNK y p38, los eventos de señalización sensibles a la redox conocidos como relevantes para la replicación del virus influenza A. Por lo tanto, la glicirrizina puede complementar el arsenal de fármacos potenciales para el tratamiento de la enfermedad H5N1. Texto: Los virus H5N1 altamente patógenos se consideran progenitores potenciales de pandemias de gripe [1] [3] [4] [5] [6]. Al menos para la primera ola de una pandemia de H5N1 no se dispondrá de cantidades suficientes de vacunas adecuadas [1] [2] [4] [6] [7] [7] [8]. Por lo tanto, la terapia antiviral para los virus de la gripe A, incluidas las cepas altamente patógenas del virus H5N1 sigue siendo de gran importancia para la defensa de primera línea contra el virus [1] [2] [3] [4] 6, 9]. Los inhibidores de la neuraminidasa oseltamivir y zanamivir, así como los adamantanes amantadin y rimantadin que interfieren con la proteína de la gripe M2 están autorizados para el tratamiento de la gripe [1] [2] [3] [4] 6]. Sin embargo, el uso de ambas clases de fármacos está limitado por la aparición de cepas de virus resistentes. En las cepas de gripe estacional, la mayoría de los virus H3N2 y una gran proporción de virus H1N1 en humanos se consideran ahora resistentes a la amantadina y a la rimantadina [10] [11] [12] [13]. Además, durante la temporada de gripe 2007/08 se ha notificado un aumento drástico de los virus H1N1 resistentes a oseltamivir en el hemisferio norte [14] [15] [16] [17]. Datos preliminares de los Estados Unidos predicen un aumento adicional para la temporada 2008/09, lo que puede dar lugar a que más del 90% de las cepas circulantes de H1N1 sean resistentes a oseltamivir [14]. Las cepas del virus H5N1 parezcan ser generalmente menos sensibles al tratamiento antiviral que las cepas estacionales del virus A y las cepas H5N1 resistentes al tratamiento surjan [1] [2] [3] [4] 6, [18] [19] [20] [21]. Más aún, faltan agentes parenterales para el tratamiento de pacientes gravemente enfermos. Se ha encontrado que interfiere con la replicación y/o la inducción del efecto citopatógeno (ECP) de muchos virus incluyendo virus respiratorios tales como virus respiratorios sincitiales, coronavirus SARS, virus del VIH y virus de la gripe [22] [23] [25] [26] [27]. Además, las propiedades antiinflamatorias e inmunomoduladoras fueron atribuidas a la glicirrhizina [26]. La gravedad de la enfermedad humana H5N1 se ha asociado con hipercitokinemia (''citokine storm'') [29, 30]. El tratamiento antiviral más inmunomodulador retardado redujo la mortalidad inducida por H5N1 en ratones [31]. Por lo tanto, los efectos antiinflamatorios e inmunomoduladores ejercidos por la glicirrizina pueden ser beneficiosos para el tratamiento de H5N1. Además, la glicirrhizina es un antioxidante conocido [26] y los antioxidantes ya han demostrado interferir con la replicación del virus influenza A y las respuestas proinflamatorias inducidas por el virus [32] [33]. El Neo-Minophagen C (SNMC) es un preparado de glicirrizina (disponible como tabletas o formulación parenteral) que está aprobado en Japón para el tratamiento de enfermedades hepáticas crónicas y se comercializa en Japón, China, Corea, Taiwán, Indonesia, India y Mongolia. Aquí, investigamos la influencia de la SNMC en la replicación H5N1, en la expresión citoquina inducida por H5N1, en el estrés oxidativo celular inducido por H5N1 y en eventos críticos de señalización celular inducidos por H5N1 en neumocitos humanos (línea celular A549). La cepa de gripe A/Vietnam/1203/04 (H5N1) fue recibida del Centro de Influenza de la OMS (Instituto Nacional de Investigación Médica, Londres, Reino Unido). La cepa de gripe H5N1 A/Tailandia/ 1(Kan-1)/04 fue obtenida del Prof. Pilaipan Puthavathana (Universidad de Mahidol, Bangkok, Tailandia). Las existencias de virus se prepararon mediante la infección de células de Vero (Renino de mono verde africano; ATCC, Manassas, VA) y alícuotas se almacenaron en 280uC. Los títulos de virus se determinaron como dosis infecciosa del 50% de cultivo tisular (TCID 50/ml) en células de Vero confluentes en placas de microtiros de 96well. Las células A549 (carcinoma de pulmón humano; ATCC: CCL-185, obtenidas de LGC Standards GmbH, Wesel, Alemania) fueron cultivadas a 37uC en medio esencial mínimo (MEM) complementado con un 10% de FBS, 100 UI/ml de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina. Los monocitos humanos fueron aislados de capas buffy de donantes sanos, obtenidos del Instituto de Medicina de Transfusión y Hematología Inmune, Centro Alemán de Donantes de Sangre de la Cruz Roja, Johann Wolfgang Goethe-University, Frankfurt am Main. Después de la centrifugación en Ficoll (Biocoll)-Hypaque gradiente de densidad (Biochrom AG, Berlín, Alemania), las células mononucleares fueron recogidas de la interfaz y lavadas con PBS. Luego, Los monocitos fueron cultivados en IMDM complementado con 10% de suero humano agrupado, 100 UI/ml de penicilina, y 100 mg/ml de estreptomicina. La viabilidad celular fue evaluada en capas de células confluentes con CellTiter-GloH Ensayo de Viabilidad Celular Luminiscente (Promega GmbH, Mannheim, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La viabilidad celular se expresó como porcentaje del control no tratado. Para determinar la localización de NP intracelular, H5N1 infectada A549 se fijaron 8 horas p.i. durante 15 minutos con acetona/ metanol helado (40:60, Mallinckrodt Baker B.V., Deventer, Países Bajos) y se mancharon con un anticuerpo monoclonal de ratón (1 h de incubación, 1:1000 en PBS) dirigido contra la nucle Se utilizó como anticuerpo secundario un IgG (H&L) antimouse de cabra Alexa Fluor 488 (Invitrogen, Eugene, Oregon, EE.UU.) (1 h de incubación, 1:1000 en PBS). Nuclei se tiñó utilizando 49,6-diamidin-2fenilindol (DAPI) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Munich, Alemania). Se visualizó la fluorescencia utilizando el microscopio de fluorescencia Olympus IX 1 (Olympus, Planegg, Alemania). Para el análisis citométrico de flujo se utilizaron los mismos anticuerpos. El ensayo de reducción del efecto citopatógeno (CPE) se realizó como se describe anteriormente [34]. Los monocapas de células A549 confluentes cultivados en placas de microtitre de 96 pocillos fueron infectados con cepas de influenza A en las multiplicidades de Después de un período de adsorción de una hora, las células fueron lavadas para eliminar el virus no desechado. La EPC inducida por el virus se registró a las 24 h después de la infección (p.i.). Salvo que se indique lo contrario, las células A549 fueron tratadas continuamente con glicirrizina a partir de un período de pre-incubación de 1 h. Para los experimentos de tiempo de adición, la glicirrizina se añadió exclusivamente durante el período de pre-incubación de 1 h, exclusivamente durante el período de adsorción de 1 h, o después exclusivamente después de la eliminación del virus de entrada. El ARN total se aisló de cultivos celulares utilizando reactivo TRI (Sigma-Aldrich, Munich, Alemania). Se utilizaron los siguientes imprimadores: sentido 59 acg tat gac tac ccg cag tat tca g 39; antisense 59 aga cca gcy acc atg att gc 39; sonda 6-FAM-tca aca gtg gcg agct cta gca-TAMRA. La fracción de células con contenido de ADN fraccionado (sub-G1' subpoblación celular) indica citotoxicidad. Las células sub-G1 se consideran células muertas (generalmente apoptóticas). Las células se fijaron con un 70% de etanol durante dos horas a 220uC. El ADN celular se tiñó utilizando propidium ioduro (20 mg/ml) y se analizó mediante citometría de flujo (FacsCalibur, BD Biosciences, Heidelberg, Alemania). Se midió la activación de caspasa utilizando los ensayos Caspasa-Glo 8, 9 ó 3/7 (Promega, Mannheim, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se recogieron y congelaron sobrenadantes del cultivo celular a 280uC. Se cuantificaron citoquinas/quimioquinas mediante conjuntos específicos ELISA Duo (R&D Systems GmbH, Wiesbaden, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. La actividad NFkB se investigó en células infectadas por H5N1 (MOI 0,01) mediante la cuantificación de las subunidades NFkB Rel A (p65) y NFkB1 (p50) a partir de extractos nucleares utilizando el factor de transcripción TransAM TM ELISAs (Active Motif, Rixensart, Bélgica). El extracto nuclear se preparó utilizando el kit de extracto nuclear (Motif activo, Carlsbad, CA, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se investigaron sobrenadantes del cultivo celular para la actividad quimiotáctica mediante la medición de la actividad para inducir la migración de monocitos a través de insertos de membrana en placas de 24 pocillos (tamaño de poro 8 mm; BD Biosciences, Heidelberg, Alemania). Se añadieron monocitos (1610 6 en 100 ml de IMDM con 10% de suero humano agrupado) a los insertos de cultivo celular (cámara superior) y sobrenadantes de cultivo celular (300 ml), a la cámara inferior del pozo. Después de un período de incubación de 48 h, las células se fijaron con paraformaldehído al 4% y permeabilizadas con PBS que contenían un 0,3% de Tritron X- La parte superior de la membrana se limpió con un hisopo húmedo para extraer las células, mientras que la parte inferior de la membrana se enjuagó con PBS. El número de células en la parte inferior de cada membrana se cuantificó mediante el recuento de células de tres secciones elegidas al azar (3,7 mm 2) utilizando un microscopio de fluorescencia Olympus IX 1 (Olympus, Planegg, Alemania). Las células se lisaron en tampón de muestra de Triton X y se separaron por SDS-PAGE. El extracto nuclear se preparó utilizando el kit de extracto nuclear (Motif activo, Carlsbad, CA, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las proteínas se detectaron utilizando anticuerpos específicos contra la bactina (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Munich, Alemania), JNK, fosforilado JNK, p38, o fosforilado p38, (todos comprados a New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main, Alemania) y fueron visualizados mediante una quimioluminiscencia mejorada utilizando un kit disponible comercialmente (Amersham, Friburgo, Alemania). Se detectaron especies de oxígeno reactivas (ROS) utilizando el Kit de Especies de Oxígeno Verde Reactivo Image-iT LIVE (sondas moleculares, distribuidas por Invitrogen, Karlsruhe, Alemania). Se compararon dos grupos por t-test. Se compararon más grupos por ANOVA con la siguiente prueba de Student-Newman-Keuls. La línea celular A549, derivada de un adenocarcinoma pulmonar humano, es un modelo establecido para los neumocitos tipo II [36], y se utiliza comúnmente para la investigación del efecto de los virus de la gripe en este tipo de células [ver por ejemplo 6,37,38]. Si no se indica lo contrario, la glicirrizina estuvo continuamente presente en los medios de cultivo celular a partir de un período de preinfección de 1 h. La glicirrizina 200 mg/ml (la concentración máxima probada) no afectó a la viabilidad celular de A549 (datos no mostrados) pero disminuyó claramente la formación de CPE en células A549 infectadas con la cepa de gripe H5N1 A/Tailandia/1(Kan-1)/04 en MOIs de 0,01, 0,1 ó 1 (figura 1A ). Se obtuvieron resultados similares en células A549 infectadas con la cepa A La tinción de células A549 para la nucleoproteína A de gripe 24 h después de la infección con la cepa H5N1 A/Tailandia/1(Kan-1)/04 indicó que la glicirrhizina 200 mg/ml reduce significativamente el número de células positivas de nucleoproteína A de gripe (Figura 1B). Para examinar la influencia de la glicirrizina en la progenie vírica, las células A549 fueron infectadas con la cepa H5N1 de gripe A/ Tailandia/1(Kan-1)/04 en el MOI 0,01 o el MOI 1 y se determinaron títulos de virus infecciosos 24 h después de la infección (Figura 1C ). Si bien la glicirrizina en concentraciones de hasta 50 mg/ml no afectó a la replicación de H5N1, los efectos moderados fueron ejercidos por la glicirrizina 100 mg/ ml y efectos más pronunciados por la glicirrizina 200 mg/ml (MOI 0,01: reducción de 13 veces, MOI 1: reducción de 10 veces). A continuación, la influencia de la glicirrizina en la replicación de H5N1 fue confirmada por la detección de ARN viral (H5) utilizando PCR cuantitativo. Sólo las concentraciones de glicirrizina 100 mg/ml disminuyeron significativamente Figura 1B) o H5N1 A/Vietnam/1203/04-infectado (Suplemento Figura 1C ) Células A549 (MOI 0,01) 24 h después de la infección. La adición de glicirrizina después de la infección mostró efectos antivirales reducidos mientras que la preincubación sola o la adición de glicirrizina durante el período de adsorción no afectó significativamente a la replicación de H5N1.Para la investigación de la expresión de citocina inducida por H5N1, se eligieron cinco genes proinflamatorios que se habían correlacionado con la gravedad de la enfermedad por gripe: CXCL10 (también conocido como proteína 10, IP-10), interleucina 6 (IL6), interleucina 8, (IL8; también conocido como CXCL8), CCL2 (también conocido como proteína monocito quimioatractante 1, MCP-1) y CCL5 (también conocido como RANTES). Las células A549 fueron infectadas con H5N1 A/Tailandia/ 1(Kan-1)/04 o H5N1 A/Vietnam El tratamiento con glicirrizina se realizó con 25, 50, 100 ó 200 mg/ml. Se detectó la expresión citoquina 24 h después de la infección por ELISA. La glicirrizina no afectó a la expresión citoquina de células no infectadas (datos no mostrados) pero inhibió la expresión de todas las citoquinas investigadas en células infectadas por H5N1 de forma dosis-dependiente (figura 2, figura 3A ). Los efectos fueron más pronunciados en los MOI inferiores. Cabe destacar que la expresión de todas las citoquinas excepto IL8 fue significativamente inhibida después del tratamiento con glicirrizina 50 mg/ml Figura 3A ) aunque estas concentraciones de glicirrizina no tuvieron efecto sobre la replicación de H5N1 en células A549 (figura 1, figura S1 ). La expresión de citoquinas por influenza Las células respiratorias infectadas por el virus A causan el reclutamiento de monocitos de sangre periférica en los pulmones de los pacientes en los que se diferencian de los macrófagos que se cree que contribuyen a la patogenicidad del virus A de la gripe [5, 39]. En un ensayo de quimiotaxis, se investigó la influencia de la glicirrizina en la migración de monocitos hacia sobrenadantes de células infectadas por H5N1 A/Tailandia/1(Kan-1)/04 (MOI 0,1) infectadas por A549 células a través de filtros de 8 mm. La migración de monocitos hacia sobrenadantes de células infectadas por H5N1 aumentó fuertemente en relación con la migración hacia sobrenadantes de células no infectadas. Se ha demostrado que los virus de la gripe, incluyendo H5N1, inducen apoptosis dependiente de caspasa en las células de las vías respiratorias y esta apoptosis se ha correlacionado con la patogenicidad del virus [40, 41]. Las concentraciones de glicirrizina hasta 200 mg/ml no afectaron a la activación de caspasa en las células no infectadas (Figura 4A-C). Concentraciones de glicirrizina 100 mg/ml inhibidas H5N1 A/Tailandia/1(Kan-1)/04 (MOI 0,01) inducidas por la activación de las caspas iniciadoras 8 y 9 así como de las caspas efectoras 3/7 en las células A549 determinadas 24 h después de la infección (Figura 4A-C). La detección de células en la fase sub-G1 resultó en hallazgos similares (Figura 4D ). Sustancias que inhiben la activación de la caspasa inducida por H5N1 incluyendo inhibidores de la caspasa 3 causan retención nuclear de complejos de RNP [34, 42]. De acuerdo, la glicirrizina también interfirió con la exportación nuclear RNP en el MOI 1 (Figura S2 ). Resultados similares se obtuvieron en las células infectadas por MOI 0,01 H5N1 A/Tailandia/1(Kan-1)/04 (Figura S3 ). Influencia de la glicirrizina en la activación inducida por H5N1 del factor nuclear kB (NFkB), p38, y en la formación de especies celulares reactivas de oxígeno inducida por H5N1 (ROS) La activación de NFkB, p38 y JNK se ha asociado con la replicación del virus influenza A y la expresión génica proinflamatoria inducida por virus [44, [44] [45] [46] [47]. Si bien la glicirrizina no influyó en la actividad NFkB en células A549 no infectadas en las concentraciones probadas (datos no mostrados), la glicirrizina inhibió la activación NFkB en células infectadas por H5N1 (figura 5A ). Además, la glicirrizina inhibió la fosforilación inducida por H5N1 de los MAPKs p38 y Además de sus funciones durante la replicación del virus influenza A y la expresión citoquina/quimoquina inducida por el virus, NFkB, p38 y JNK son componentes de las vías de señalización sensibles a la redox [48] [49] [50] [51]. Ya se había descubierto que los antioxidantes interferían con la señalización inducida por el virus influenza A a través de NFkB, p38 y JNK, con la replicación del virus influenza A, y con la expresión proinflamatoria del virus A [32] [34]. Dado que se sabe que la glicirrhizina ejerce efectos antioxidantes [26], especulamos que la glicirrizina puede interferir con la formación de ROS inducida por el virus H5N1. De hecho, la glicirrhizina ejerció efectos antioxidantes claros en las células infectadas por H5N1 (MOI 0.01) (Figura 5C ) causando una reducción significativa de la formación de ROS ya a una concentración de 25 mg/ml (Figura 5D ). Aquí, se muestra que la glicirrizina inhibe la replicación del virus H5N1 influenza A altamente patógeno, la apoptosis inducida por H5N1 y la expresión inducida por H5N1 de citoquinas proinflamatorias en células A549 derivadas de los pulmones. Después de la administración intravenosa, las concentraciones plasmáticas alcanzables de glicirrizina se han descrito como alrededor de 100 mg/ml [52]. Por lo tanto, las concentraciones de glicirrizina encontradas para interferir con la replicación de H5N1 y la expresión génica proinflamatoria inducida por H5N En particular, aunque se necesitaron concentraciones más altas de glicirrizina para interferir con la replicación del coronavirus del SARS [22] que con la replicación del H5N1, se reportaron resultados beneficiosos en pacientes con SARS tratados con glicirrizina (SNMC) en comparación con pacientes con SARS que no recibieron glicirrizina [23]. En particular, la investigación de diferentes derivados de la glicirrizina contra el coronavirus del SARS llevó a la identificación de compuestos con mayor actividad antiviral [53]. Por lo tanto, la glicirrizina también podría servir como estructura de plomo para el desarrollo de nuevos fármacos anti-influenza. Los resultados experimentales sugieren que la glicirrizina podría afectar a la gripe estacional Enfermedad del virus A por efectos antivirales e inmunomoduladores [26, 27]. El mecanismo fue sugerido como inducción de interferón-c en células T por glicirrhizin [54]. Además, se demostró que la glicirrizin influyó en la replicación del virus A estacional a través de la interacción con la membrana celular [25, 28]. Sin embargo, estos efectos se observaron sólo en concentraciones de 200 mg/ml cuando se añadió glicirrizin durante el período de adsorción del virus. Dado que la adición de glicirrizin durante el período de adsorción no influyó en la replicación de H5N1 en nuestros experimentos, no parece probable que los efectos de membrana contribuyan a los efectos anti-H5N1 detectados aquí en concentraciones más bajas. Nuestros resultados sugieren más bien que la glicirrizin interfiere con el estrés oxidativo inducido por H5N1. Se encontró que los antioxidantes inhiben la replicación del virus influenza A y la expresión génica proinflamatoria inducida por el virus influenza A [32] [33] y se sabe que la glicirrizina ejerce efectos antioxidantes [26]. En este caso, la glicirrizina interfirió con la activación inducida por el virus H5N1 de NFkB, p38 y JNK que representa eventos de señalización sensibles al redox [48] [49] [49] [50] [51] implicada en la replicación del virus influenza A y la producción de citoquinas/quimioquinas celulares inducidas por el virus A [34, [43] [44] [45] [46] 55]. La glicirrizina 50 mg/ml redujo significativamente la activación inducida por el H5N1 de NFkB. Además, las concentraciones de glicirrhizina tan bajas como 25 mg/ml interfirieron eficazmente con la formación de ROS inducida por H5N1 y con la fosforilación de los MAPKs sensibles al redox p38 y JNK. En nuestro modelo, la activación de p38 parece ser crítica para la señalización redox asociada al H5N1, ya que la inhibición del p38 se había mostrado antes para imitar los efectos antioxidantes de la N-acetil-cisteína (NAC) [34]. Curiosamente y en contraste con la glicirrizina, el NAC no inhibió la replicación del H5N1 o la expresión citoquina/quimioquina inducida por H5N1 en concentraciones terapéuticamente relevantes. La glicirrhizina disminuyó la producción de citocinas/quimioquinas celulares inducidas por H5N1 en concentraciones (#50 mg/ml) que no interfirieron con la replicación de H5N1, aunque se ha descrito que las vías de señalización sensibles al redox están implicadas en ambos procesos. Por lo tanto, la expresión proinflamatoria inducida por H5N1 parece ser más sensible a la inhibición de la formación de ROS que la replicación de H5N1. De hecho, se ha demostrado que los virus de la gripe inducen vías celulares a través de eventos dependientes de replicación e independientes [56]. En un informe anterior, se pudo demostrar que concentraciones similares de glicirrizina como las investigadas aquí interfirieron con la expresión de genes proinflamatorios inducidas por H5N1 pero no con replicación de H5N1 en macrófagos derivados de monocitos humanos [ Además, otros regímenes de tratamiento inmunomodulador que no influyeron en la replicación de H5N1 redujeron la mortalidad en ratones infectados por H5N1 [31, 58]. Por lo tanto, la glicirrizina representa una posible opción de tratamiento adicional que interfiere con la replicación de H5N1 y la expresión inducida por H5N1 de citocinas proinflamatorias en células pulmonares. La interferencia con las respuestas inmunes también puede resultar en la pérdida del control de la replicación de virus por células inmunes citotóxicas incluyendo células asesinas naturales y CD8 citotóxicos + linfocitos T. Los inmunosupresores globales como los corticosteroides no pudieron proteger de la infección por el virus de la gripe letal [59]. Además, los fármacos antivirales pueden interferir con las células citotóxicas que controlan la replicación de virus como se demostró para ribavirina que En este contexto, ya se ha demostrado que la glicirrhizina no afecta a la actividad celular mortal natural en las concentraciones utilizadas aquí [57]. En conclusión, en este informe se muestra que las concentraciones terapéuticas de glicirrizina (utilizada como preparado parenteral aprobado clínicamente SNMC) interfieren con la replicación altamente patógena del virus H5N1 influenza A y la expresión génica proinflamatoria inducida por H5N1 al menos en parte a través de la interferencia con la formación de ROS inducida por H5N1 y, a su vez, con la reducción de la activación de p38, JNK y NFkB en las células pulmonares. Se considera que los agentes antiinflamatorios e inmunomoduladores son candidatos importantes como componentes de estrategias de tratamiento anti-influenza que pueden salvar vidas en una situación de pandemia de gripe [61]. Por lo tanto, la glicirrizina puede complementar el arsenal de fármacos potenciales para el tratamiento de la enfermedad causada por H5N1.

¿Qué se ha correlacionado con la patogenicidad de la infección por H5N1?

El síndrome de distrés respiratorio agudo emergente causado por el adenovirus tipo 55 en adultos inmunocompetentes en 2013: un estudio observacional prospectivohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4243941/SHA: f5b706d0529bfcf7e2d1dfc037df5b6f95fc5ec0Autores: Sun, Bing; He, Hangyong; Wang, Zheng; Qu, Jiuxin; Li, Xuyan; Ban, Chengjun; Wan, Jun; Cao, Bin; Tong, Zhaohui; Wang, ChenFecha: 2014-08-12DOI: 10.1186/s13054-014-0456-6Licencia: cc-byAbstract: Introducción: Desde 2008, se han Las características clínicas y los resultados de los pacientes más críticamente enfermos con síndrome de distrés respiratorio agudo severo (ARDS) causado por HAdV-55 que requieren ventilación mecánica invasiva (IVM) y/o oxigenación de membrana extracorpórea (ECMO). MÉTODOS: Se realizó un estudio observacional prospectivo, unicéntrico de neumonía con SDRA en adultos inmunocompetentes ingresados en nuestra UCI respiratoria. Se recogieron y analizaron prospectivamente características clínicas, de laboratorio, radiológicas, pruebas secuenciales de carga viral en vías respiratorias y sangre, tratamientos y resultados. RESULTADOS: Se incluyeron los resultados de un total de cinco pacientes consecutivos con SDRA grave con infección confirmada por HAdV-55. Los cinco pacientes fueron varones jóvenes inmunocompetentes con mediana de edad de 32 años. El tiempo medio desde el inicio a la disnea fue de 5 días. La presión parcial media de oxígeno/fracción de oxígeno inspirado fue de 58,1; la duración media desde el inicio hasta la consolidación de un lóbulo mostrado en las radiografías de tórax (CXR) y, desde el primer CXR positivo hasta los infiltrados pulmonares multilobares bilaterales, fue de 2 días y 4,8 días respectivamente; la carga viral fue superior a 1 × 10(8) copias en tres pacientes y fue de 1 × 10(4) en un paciente; fue negativa en el único paciente que sobrevivió; la duración media para el fallo no invasivo de la ventilación por presión positiva (PNPV) y el fallo de la VMI fue de 30,8 horas y 6,2 días, respectivamente; cuatro pacientes recibieron ECMO venoso. Cuatro (80%) de los cinco pacientes fallecieron a pesar de recibir el apoyo respiratorio adecuado. CONCLUSIONES: HAdV-55 puede causar EDA grave en hombres jóvenes inmunocompete La fiebre alta persistente, la disnea y la rápida progresión a la insuficiencia respiratoria en el plazo de 2 semanas, junto con las consolidaciones bilaterales y los infiltrados, son las manifestaciones clínicas más frecuentes de SDRA grave inducida por HAdV-55. La monitorización de la carga viral puede ayudar a predecir la gravedad y el desenlace de la enfermedad. Las tasas de fallo del NPPV y de la VMI fueron muy altas, pero el ECMO puede seguir siendo la terapia de apoyo respiratorio de elección. REGISTRO TRIAL: Clinicaltrials.gov NCT01585922. Registrado 20 de abril de 2012Texto: Los adenovirus humanos (VHAd) son patógenos notorios en personas con función inmune comprometida y una causa frecuente de brotes de enfermedad respiratoria aguda entre niños pequeños. El adenovirus humano tipo 55 (HAdV-55), que está emergiendo como un patógeno altamente virulento para la neumonía adenoviral mortal aguda entre adultos inmunocompetentes en China, ha ganado cada vez más atención [6]. HAdV-55 es un patógeno de enfermedad respiratoria aguda emergente recientemente identificado que causó dos brotes recientes en China en 2006 [7] y en Singapur en 2005 [8]. En 2011, este patógeno aparentemente resurgió en Beijing, China, causando varios casos de neumonía grave adquirida por la comunidad [9]. Este patógeno se caracterizó plenamente por la secuenciación del genoma completo [10]. Estudios comparativos mostraron que la capacidad de HAdV para causar enfermedad grave puede relacionarse con los serotipos de HAdVs. La neumonía adenoviral grave inducida por HAdV-55 ha sido reportada como más cercana a los casos severos comparados con otros serotipos (HAdV-3, HAdV-7 y HAdV-14) [6]. El conocimiento actual del síndrome de distrés respiratorio agudo (ARDS) inducido por HAdV-55 que requiere ventilación mecánica invasiva y/o apoyo a la oxigenación de membrana extracorpórea (ECMO) en adultos inmunocompetentes se deriva de informes de casos individuales o series relativamente pequeñas de un solo centro. Como resultado, se dispone de poca información sobre neumonía HAdV-55 complicada con ARDS graves, cuya frecuencia se espera que aumente en los próximos años. Aquí describimos las características clínicas y los resultados de cinco casos prospectivos de neumonía por HAdV-55 complicada con ARDS graves en adultos inmunocompetentes en nuestra UCI. A partir de mayo de 2012, se realizó en nuestro centro un ensayo aleatorizado de ventilación no invasiva por presión positiva (NPPV) en pacientes con SDRA (ClinicalTrials.gov ID: NCT01585922). De mayo de 2012 a abril de 2014, todos los pacientes adultos con SDRA causados por neumonía que fueron ingresados en la UCI respiratoria del Hospital Chao-Yang de Beijing fueron incluidos de forma prospectiva. Los datos fueron analizados de forma anónima según la definición de Berlín: 1) desarrollo en el plazo de una semana de un insulto clínico conocido o de nuevos síntomas respiratorios o empeoramiento de los mismos; 2) opacidades bilaterales no plenamente explicadas por efusiones, lobar y/o colapso pulmonar, o nódulos; 3) insuficiencia respiratoria no plenamente explicada por insuficiencia cardiaca o sobrecarga de líquidos; 4) presión parcial de oxígeno/ fracción de oxígeno inspirado (PaO 2 /FiO 2 ) ≤100 mmHg con presión terminal de extinción positiva (PEEP) ≥5 cmH 2 O; y 5) radiografía torácica con tres o cuatro cuadrantes con opacidades. Cada paciente dio su consentimiento informado por escrito para que sus datos fueran utilizados para la investigación y publicación.La información clínica recolectada por investigadores con un formulario de datos estandarizado incluyó: características demográficas (edad y sexo), comorbilidades, síntomas clínicos (fiebre, tos, esputo, disnea, dolor torácico, erupción cutánea, náuseas, vómitos, dolor abdominal, diarrea y dolor de cabeza), signos (temperatura corporal, frecuencia cardíaca, frecuencia respiratoria, presión arterial y crepitaciones en los pulmones), pruebas de laboratorio (conteo de células de sangre entera y química de la sangre) e hallazgos microbiológicos e imágenes del pulmón (rayos X del tórax (CXR) y tomografía computarizada).Medicamentos concomitantes, apoyo respiratorio, complicaciones y resultados. Se realizaron pruebas microbiológicas en el Departamento de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica en nuestro centro, y se describieron los métodos de detección utilizados en nuestro informe anterior [6]. Los virus comunes causantes de enfermedades respiratorias fueron analizados mediante un kit con 15 ensayos virales diferentes. Se utilizaron muestras séricas para Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae y anticuerpos Legionella pneumophila. Todos los pacientes tuvieron su infección HAdV-55 confirmada por el ensayo RT-PCR. Se analizaron secuencias parciales del gen hexano para teclear la filogenia de cepas HAdV-55. La carga adenoviral también se realizó tanto en muestras respiratorias como en sangre mediante el ensayo multiplex RT-PCR. Se diagnosticó neumonía viral en base a la presencia de HAdV detectada en muestras de esputo o de tor Las variables continuas fueron resumidas como media ± desviación estándar (DE) o mediana (rango intercuartil), durante el período de estudio fueron ingresados en nuestra UTI un total de ocho pacientes diagnosticados con infección por HAdV e insuficiencia respiratoria, y siete de ellos recibieron un diagnóstico de SDRA. Cinco pacientes consecutivos con SDRA grave con infección confirmada por HAdV-55 fueron ingresados en nuestra UTI entre abril y julio de 2013. Fueron incluidos en el análisis; los otros dos pacientes tenían SDRA leve y estaban infectados con otros tipos de VHAd. Los cinco pacientes eran jóvenes inmunocompetentes con mediana edad de 32 años (rango, 28 a 40 años). Todos los pacientes compartían un tipo de sangre B y provenían de la misma ciudad: Ciudad Baoding, provincia de Hebei, norte de China. Todos los pacientes no tenían exposición a animales de granja, maíz o heno. El paciente 3 tenía pleuritis tu Sus análisis de sangre, incluyendo el ensayo de tuberculosis T-SPOT (Oxford Immunotec, Marlborough, MA, EE.UU.) y el anticuerpo de Mycobacterium tuberculosis, fueron negativos. Los síntomas de gripe, como fiebre, tos y poco esputo, se observaron comúnmente al inicio de la enfermedad. Todos los pacientes presentaron fiebre alta, con una temperatura corporal media de 39,5°C (rango, 39,0°C a 40,0°C), que persistió durante 8 días (rango, 6 a 11 días). Se observó tos productiva en dos pacientes. También se observó dolor torácico y sarpullido leves en dos pacientes. Todos los pacientes presentaron disnea. El tiempo medio desde el inicio a la disnea fue de 5 días (rango, 1 a 10 días). Después de la aparición de disnea, los pacientes generalmente evolucionaron a insuficiencia respiratoria o hipoxemia. El tiempo medio desde el inicio hasta el ingreso en la UTI fue de 9,6 días (rango, 8 a 11 días) (Tabla 1). Todos los pacientes presentaron taquipnea cuando ingresaron en la UTI, con una tasa media de 43 respiraciones por minuto (rango = 38 a 52); el análisis de gases arteriales en el ingreso en la UTI reveló hipoxia profunda, con una media de PaO 2/FiO 2 de 58,1 (rango = 49 a 62,5). El recuento de glóbulos blancos fue bajo o en el rango normal. Todos los pacientes presentaron niveles elevados de aspartato aminotransferasa sérica (AST), lactato deshidrogenasa (LDH) e hidroxibutirato deshidrogenasa (HBDH) (Tabla 1). Al ingreso, los niveles de inmunoglobulina (inmunoglobulinas Los CXRs revelaron consolidación múltiple de lobar bilateral o segmento en los pulmones de los cinco pacientes, y las lesiones radiográficas evolucionaron rápidamente después del ingreso en la UTI (Figura 1 ). Tres pacientes fueron examinados por tomografía computarizada de alta resolución (TCDH). Se encontraron consolidaciones unilaterales o bilaterales e infiltrados en las exploraciones de la ETCH de los tres pacientes. Las consolidaciones dentro de un solo lóbulo o varios lóbulos con un borde claro y broncograma de aire fueron los hallazgos más comunes en las exploraciones de la ETCH. Nódulos, parches, derrame pleural, absceso y cavidad también fueron visualizadas por la ETCH (Figura 2 ). La duración media desde el inicio hasta la consolidación de un solo lóbulo en las RCC fue de 2 días (rango = 1 a 5 días). La duración media desde el primer CXR positivo hasta Todos los pacientes presentaban viremia HAdV-55; en cuatro de los cinco pacientes se detectó por primera vez en muestras de aspirado endotraqueal (ETA), el tiempo entre la recolección inicial de muestras de adenovirus ETA y los resultados positivos del ácido nucleico HAdV-55 en sangre fue de 1 a 10 días (tabla 3), se determinaron copias de ADN del virus en ETA para todos los pacientes durante su estancia en la UTI, la carga viral fue superior a 1 × 10 8 copias en tres pacientes y 1 × 10 4 en un solo paciente, la carga viral se volvió negativa en el único paciente que sobrevivió; en los cuatro pacientes que no sobrevivieron, las copias de ADN no disminuyeron, incluso con terapia antiviral (figura 3 ). La oxigenación no se mantuvo con el soporte convencional NPPV o IMV en ninguno de los pacientes. La duración media hasta el fallo del NPPV fue de 30,8 horas (rango = 22 a 48 horas), y el tiempo medio hasta el fallo del IMV fue de 6,2 días (rango 2 = a 13 días) (Tabla 1). Cuatro pacientes recibieron ECMO venovenoso para mantener la saturación de oxígeno, y un paciente rechazó el soporte del ECMO y recibió ventilación oscilatoria de alta frecuencia. La Tabla 4 da los datos de oxigenación de los pacientes antes y después del ECMO venovenoso. Todos los pacientes recibieron terapia antiviral, incluyendo aciclovir (10 mg/kg, cada 8 horas, goteo intravenoso), ganciclovir (5 mg/kg, cada 12 horas, goteo intravenoso) y ribavirina (250 mg, dos veces al día, goteo intravenoso). Teniendo en cuenta que la coinfección bacteriana puede combinarse con una infección viral grave, Cuatro (80%) de los cinco pacientes fallecieron; de los cuatro pacientes que recibieron ECMO venovenoso, sólo un paciente sobrevivió; los otros cuatro murieron por ARDS, coinfección por Aspergillus fumigatus, shock séptico e infección del torrente sanguíneo relacionada con catéter debido a Acinetobacter baumannii, respectivamente; según nuestro conocimiento, este es el primer estudio observacional de cohorte sobre las características clínicas de los pacientes con ARDS grave causado por la infección emergente por HAdV-55 y también el primero en la evaluación de una prueba de carga viral para monitorear la reacción al tratamiento y para predecir el desenlace del paciente; los siguientes son los principales hallazgos de este estudio (1) HAdV-55 pueden causar ARDS grave en hombres jóvenes inmunocompetentes con sangre tipo B. Todos nuestros pacientes eran de la misma ciudad de la provincia de Hebei, en el norte de China. (2) La fiebre alta persistente, la disnea y la progresión rápida a la insuficiencia respiratoria en un plazo de 2 semanas, junto con las consolidaciones bilaterales y los infiltrados al mismo tiempo, son las manifestaciones clínicas más frecuentes de la SDRA inducida por HAdV-55 grave. (3) La monitorización de la carga viral puede ayudar a predecir la gravedad de la enfermedad y el desenlace de los pacientes. (4) Las tasas de fallo del VPN y de la VMI fueron muy elevadas, y el ECMO puede ser el último método de apoyo para este grupo de pacientes. (5) La DSRA grave inducida por HAdV-55 tiene una tasa de mortalidad muy alta (80%) a pesar de un apoyo respiratorio adecuado. La HAdV-55 se caracterizó por primera vez por completo en Shaanxi, China [7] y luego resurgió en Hebei, una provincia cercana a Beijing, donde causó varios casos de enfermedad respiratoria aguda [9]. Se presumió que la HAdV-55 era una forma recombinante de las especies B2 de HAdV-14 y HAdV-11 [7, 15] debido a que compartía un gen hexano con el chasis HAdV-11 y HAdV-14 [16]. Los resultados de nuestro estudio muestran que la HAdV-55, como patógeno emergente entre adultos inmunocompetentes, puede causar EDA severa. La prevalencia de neumonía adenoviral grave y fatal inducida por la HAdV-55 en nuestro estudio es algo similar a la descrita por Cao y colegas [6]. Todos los casos de HAdV-55 reportados en nuestro estudio eran de la misma ciudad: Baoding, Los pacientes con enfermedad grave también procedían de la misma región y fueron tratados durante un período de tiempo similar, lo que sugiere que el HAdV-55 puede ser un importante patógeno viral derivado de esta región. Los resultados de nuestro estudio sugieren que las siguientes pueden ser características clínicas del SDRA causadas por el HAdV-55: fiebre alta persistente, progresión rápida de la disnea, necesidad de soporte de ventilación mecánica, nivel AST elevado y progresión rápida de infiltrados unilaterales a consolidaciones bilaterales. Estas características clínicas son muy similares a las del SDRA causadas por otros tipos de VHAd descritos en informes anteriores [6, 9]. Estudios recientes han demostrado que el sistema inmunitario juega un papel crucial en el aclaramiento de la viremia del VHAdV y la supervivencia del huésped [17]. Chen et al. En la fase aguda de la infección por HAdV-55, los pacientes con enfermedad grave pueden tener altos niveles de células dendríticas y células Th17 [18]. En nuestro estudio, el único paciente que se recuperó de una infección grave tuvo un recuento de células T más alto. Tres de los cinco pacientes tenían recuentos de células T relativamente bajos cuando fueron admitidos. Nuestros resultados sugieren que estos tres pacientes pueden haber sido relativamente inmunocomprometidos y que un recuento de células T más bajo puede ser un factor de riesgo para la infección por HAdV-55 en adultos jóvenes. El ADN de HAdV-55 se notificó previamente en el 41,2% de los pacientes con infección grave [18]. En nuestro estudio, el ADN de HAdV-55 fue detectado y monitorizado en todos los pacientes con SDRA grave. La carga viral inicial y la tendencia de las copias del ADN del HAdV-55 en las muestras de las vías respiratorias y la sangre pueden sugerir la gravedad de la infección y pueden predecir tanto la reacción al tratamiento como el resultado del paciente. El uso de ventilación mecánica y ECMO en pacientes con SDRA causada por el HAdV-55 no ha sido detallado en estudios previos. En nuestra cohorte, encontramos que la infección grave del HAdV-55 podría causar una rápida progresión de la insuficiencia respiratoria, con una tasa de fallo muy alta para el NPPV y el IMV. Esta tasa de fracaso puede ser el resultado de la gran área de consolidación que indujo una derivación severa en el pulmón, lo que puede conducir a la falta de respuesta a la ventilación de presión positiva. Para los pacientes con SDRA grave, el ECMO debe ser considerado una mejor opción para la oxigenación. Se trata de un estudio observacional sin grupo de comparación, por lo que la diferencia entre las infecciones graves y modestas no pudo ser aclarada en términos de estado inmune, características clínicas, hallazgos radiológicos, carga viral y efectos de tratamiento en el soporte respiratorio y terapia antiviral. Se necesita un análisis dinámico secuencial para determinar la relación entre la viremia HAdV-55 y la respuesta al tratamiento.

¿Cuál es la duración media del tiempo desde la consolidación de lóbulo único hasta infiltrados pulmonares multilobares bilaterales en adenovirus humano tipo 55 (HAdV-55)?

El síndrome de distrés respiratorio agudo emergente causado por el adenovirus tipo 55 en adultos inmunocompetentes en 2013: un estudio observacional prospectivohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4243941/SHA: f5b706d0529bfcf7e2d1dfc037df5b6f95fc5ec0Autores: Sun, Bing; He, Hangyong; Wang, Zheng; Qu, Jiuxin; Li, Xuyan; Ban, Chengjun; Wan, Jun; Cao, Bin; Tong, Zhaohui; Wang, ChenFecha: 2014-08-12DOI: 10.1186/s13054-014-0456-6Licencia: cc-byAbstract: Introducción: Desde 2008, se han Las características clínicas y los resultados de los pacientes más críticamente enfermos con síndrome de distrés respiratorio agudo severo (ARDS) causado por HAdV-55 que requieren ventilación mecánica invasiva (IVM) y/o oxigenación de membrana extracorpórea (ECMO). MÉTODOS: Se realizó un estudio observacional prospectivo, unicéntrico de neumonía con SDRA en adultos inmunocompetentes ingresados en nuestra UCI respiratoria. Se recogieron y analizaron prospectivamente características clínicas, de laboratorio, radiológicas, pruebas secuenciales de carga viral en vías respiratorias y sangre, tratamientos y resultados. RESULTADOS: Se incluyeron los resultados de un total de cinco pacientes consecutivos con SDRA grave con infección confirmada por HAdV-55. Los cinco pacientes fueron varones jóvenes inmunocompetentes con mediana de edad de 32 años. El tiempo medio desde el inicio a la disnea fue de 5 días. La presión parcial media de oxígeno/fracción de oxígeno inspirado fue de 58,1; la duración media desde el inicio hasta la consolidación de un lóbulo mostrado en las radiografías de tórax (CXR) y, desde el primer CXR positivo hasta los infiltrados pulmonares multilobares bilaterales, fue de 2 días y 4,8 días respectivamente; la carga viral fue superior a 1 × 10(8) copias en tres pacientes y fue de 1 × 10(4) en un paciente; fue negativa en el único paciente que sobrevivió; la duración media para el fallo no invasivo de la ventilación por presión positiva (PNPV) y el fallo de la VMI fue de 30,8 horas y 6,2 días, respectivamente; cuatro pacientes recibieron ECMO venoso. Cuatro (80%) de los cinco pacientes fallecieron a pesar de recibir el apoyo respiratorio adecuado. CONCLUSIONES: HAdV-55 puede causar EDA grave en hombres jóvenes inmunocompete La fiebre alta persistente, la disnea y la rápida progresión a la insuficiencia respiratoria en el plazo de 2 semanas, junto con las consolidaciones bilaterales y los infiltrados, son las manifestaciones clínicas más frecuentes de SDRA grave inducida por HAdV-55. La monitorización de la carga viral puede ayudar a predecir la gravedad y el desenlace de la enfermedad. Las tasas de fallo del NPPV y de la VMI fueron muy altas, pero el ECMO puede seguir siendo la terapia de apoyo respiratorio de elección. REGISTRO TRIAL: Clinicaltrials.gov NCT01585922. Registrado 20 de abril de 2012Texto: Los adenovirus humanos (VHAd) son patógenos notorios en personas con función inmune comprometida y una causa frecuente de brotes de enfermedad respiratoria aguda entre niños pequeños. El adenovirus humano tipo 55 (HAdV-55), que está emergiendo como un patógeno altamente virulento para la neumonía adenoviral mortal aguda entre adultos inmunocompetentes en China, ha ganado cada vez más atención [6]. HAdV-55 es un patógeno de enfermedad respiratoria aguda emergente recientemente identificado que causó dos brotes recientes en China en 2006 [7] y en Singapur en 2005 [8]. En 2011, este patógeno aparentemente resurgió en Beijing, China, causando varios casos de neumonía grave adquirida por la comunidad [9]. Este patógeno se caracterizó plenamente por la secuenciación del genoma completo [10]. Estudios comparativos mostraron que la capacidad de HAdV para causar enfermedad grave puede relacionarse con los serotipos de HAdVs. La neumonía adenoviral grave inducida por HAdV-55 ha sido reportada como más cercana a los casos severos comparados con otros serotipos (HAdV-3, HAdV-7 y HAdV-14) [6]. El conocimiento actual del síndrome de distrés respiratorio agudo (ARDS) inducido por HAdV-55 que requiere ventilación mecánica invasiva y/o apoyo a la oxigenación de membrana extracorpórea (ECMO) en adultos inmunocompetentes se deriva de informes de casos individuales o series relativamente pequeñas de un solo centro. Como resultado, se dispone de poca información sobre neumonía HAdV-55 complicada con ARDS graves, cuya frecuencia se espera que aumente en los próximos años. Aquí describimos las características clínicas y los resultados de cinco casos prospectivos de neumonía por HAdV-55 complicada con ARDS graves en adultos inmunocompetentes en nuestra UCI. A partir de mayo de 2012, se realizó en nuestro centro un ensayo aleatorizado de ventilación no invasiva por presión positiva (NPPV) en pacientes con SDRA (ClinicalTrials.gov ID: NCT01585922). De mayo de 2012 a abril de 2014, todos los pacientes adultos con SDRA causados por neumonía que fueron ingresados en la UCI respiratoria del Hospital Chao-Yang de Beijing fueron incluidos de forma prospectiva. Los datos fueron analizados de forma anónima según la definición de Berlín: 1) desarrollo en el plazo de una semana de un insulto clínico conocido o de nuevos síntomas respiratorios o empeoramiento de los mismos; 2) opacidades bilaterales no plenamente explicadas por efusiones, lobar y/o colapso pulmonar, o nódulos; 3) insuficiencia respiratoria no plenamente explicada por insuficiencia cardiaca o sobrecarga de líquidos; 4) presión parcial de oxígeno/ fracción de oxígeno inspirado (PaO 2 /FiO 2 ) ≤100 mmHg con presión terminal de extinción positiva (PEEP) ≥5 cmH 2 O; y 5) radiografía torácica con tres o cuatro cuadrantes con opacidades. Cada paciente dio su consentimiento informado por escrito para que sus datos fueran utilizados para la investigación y publicación.La información clínica recolectada por investigadores con un formulario de datos estandarizado incluyó: características demográficas (edad y sexo), comorbilidades, síntomas clínicos (fiebre, tos, esputo, disnea, dolor torácico, erupción cutánea, náuseas, vómitos, dolor abdominal, diarrea y dolor de cabeza), signos (temperatura corporal, frecuencia cardíaca, frecuencia respiratoria, presión arterial y crepitaciones en los pulmones), pruebas de laboratorio (conteo de células de sangre entera y química de la sangre) e hallazgos microbiológicos e imágenes del pulmón (rayos X del tórax (CXR) y tomografía computarizada).Medicamentos concomitantes, apoyo respiratorio, complicaciones y resultados. Se realizaron pruebas microbiológicas en el Departamento de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica en nuestro centro, y se describieron los métodos de detección utilizados en nuestro informe anterior [6]. Los virus comunes causantes de enfermedades respiratorias fueron analizados mediante un kit con 15 ensayos virales diferentes. Se utilizaron muestras séricas para Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae y anticuerpos Legionella pneumophila. Todos los pacientes tuvieron su infección HAdV-55 confirmada por el ensayo RT-PCR. Se analizaron secuencias parciales del gen hexano para teclear la filogenia de cepas HAdV-55. La carga adenoviral también se realizó tanto en muestras respiratorias como en sangre mediante el ensayo multiplex RT-PCR. Se diagnosticó neumonía viral en base a la presencia de HAdV detectada en muestras de esputo o de tor Las variables continuas fueron resumidas como media ± desviación estándar (DE) o mediana (rango intercuartil), durante el período de estudio fueron ingresados en nuestra UTI un total de ocho pacientes diagnosticados con infección por HAdV e insuficiencia respiratoria, y siete de ellos recibieron un diagnóstico de SDRA. Cinco pacientes consecutivos con SDRA grave con infección confirmada por HAdV-55 fueron ingresados en nuestra UTI entre abril y julio de 2013. Fueron incluidos en el análisis; los otros dos pacientes tenían SDRA leve y estaban infectados con otros tipos de VHAd. Los cinco pacientes eran jóvenes inmunocompetentes con mediana edad de 32 años (rango, 28 a 40 años). Todos los pacientes compartían un tipo de sangre B y provenían de la misma ciudad: Ciudad Baoding, provincia de Hebei, norte de China. Todos los pacientes no tenían exposición a animales de granja, maíz o heno. El paciente 3 tenía pleuritis tu Sus análisis de sangre, incluyendo el ensayo de tuberculosis T-SPOT (Oxford Immunotec, Marlborough, MA, EE.UU.) y el anticuerpo de Mycobacterium tuberculosis, fueron negativos. Los síntomas de gripe, como fiebre, tos y poco esputo, se observaron comúnmente al inicio de la enfermedad. Todos los pacientes presentaron fiebre alta, con una temperatura corporal media de 39,5°C (rango, 39,0°C a 40,0°C), que persistió durante 8 días (rango, 6 a 11 días). Se observó tos productiva en dos pacientes. También se observó dolor torácico y sarpullido leves en dos pacientes. Todos los pacientes presentaron disnea. El tiempo medio desde el inicio a la disnea fue de 5 días (rango, 1 a 10 días). Después de la aparición de disnea, los pacientes generalmente evolucionaron a insuficiencia respiratoria o hipoxemia. El tiempo medio desde el inicio hasta el ingreso en la UTI fue de 9,6 días (rango, 8 a 11 días) (Tabla 1). Todos los pacientes presentaron taquipnea cuando ingresaron en la UTI, con una tasa media de 43 respiraciones por minuto (rango = 38 a 52); el análisis de gases arteriales en el ingreso en la UTI reveló hipoxia profunda, con una media de PaO 2/FiO 2 de 58,1 (rango = 49 a 62,5). El recuento de glóbulos blancos fue bajo o en el rango normal. Todos los pacientes presentaron niveles elevados de aspartato aminotransferasa sérica (AST), lactato deshidrogenasa (LDH) e hidroxibutirato deshidrogenasa (HBDH) (Tabla 1). Al ingreso, los niveles de inmunoglobulina (inmunoglobulinas Los CXRs revelaron consolidación múltiple de lobar bilateral o segmento en los pulmones de los cinco pacientes, y las lesiones radiográficas evolucionaron rápidamente después del ingreso en la UTI (Figura 1 ). Tres pacientes fueron examinados por tomografía computarizada de alta resolución (TCDH). Se encontraron consolidaciones unilaterales o bilaterales e infiltrados en las exploraciones de la ETCH de los tres pacientes. Las consolidaciones dentro de un solo lóbulo o varios lóbulos con un borde claro y broncograma de aire fueron los hallazgos más comunes en las exploraciones de la ETCH. Nódulos, parches, derrame pleural, absceso y cavidad también fueron visualizadas por la ETCH (Figura 2 ). La duración media desde el inicio hasta la consolidación de un solo lóbulo en las RCC fue de 2 días (rango = 1 a 5 días). La duración media desde el primer CXR positivo hasta Todos los pacientes presentaban viremia HAdV-55; en cuatro de los cinco pacientes se detectó por primera vez en muestras de aspirado endotraqueal (ETA), el tiempo entre la recolección inicial de muestras de adenovirus ETA y los resultados positivos del ácido nucleico HAdV-55 en sangre fue de 1 a 10 días (tabla 3), se determinaron copias de ADN del virus en ETA para todos los pacientes durante su estancia en la UTI, la carga viral fue superior a 1 × 10 8 copias en tres pacientes y 1 × 10 4 en un solo paciente, la carga viral se volvió negativa en el único paciente que sobrevivió; en los cuatro pacientes que no sobrevivieron, las copias de ADN no disminuyeron, incluso con terapia antiviral (figura 3 ). La oxigenación no se mantuvo con el soporte convencional NPPV o IMV en ninguno de los pacientes. La duración media hasta el fallo del NPPV fue de 30,8 horas (rango = 22 a 48 horas), y el tiempo medio hasta el fallo del IMV fue de 6,2 días (rango 2 = a 13 días) (Tabla 1). Cuatro pacientes recibieron ECMO venovenoso para mantener la saturación de oxígeno, y un paciente rechazó el soporte del ECMO y recibió ventilación oscilatoria de alta frecuencia. La Tabla 4 da los datos de oxigenación de los pacientes antes y después del ECMO venovenoso. Todos los pacientes recibieron terapia antiviral, incluyendo aciclovir (10 mg/kg, cada 8 horas, goteo intravenoso), ganciclovir (5 mg/kg, cada 12 horas, goteo intravenoso) y ribavirina (250 mg, dos veces al día, goteo intravenoso). Teniendo en cuenta que la coinfección bacteriana puede combinarse con una infección viral grave, Cuatro (80%) de los cinco pacientes fallecieron; de los cuatro pacientes que recibieron ECMO venovenoso, sólo un paciente sobrevivió; los otros cuatro murieron por ARDS, coinfección por Aspergillus fumigatus, shock séptico e infección del torrente sanguíneo relacionada con catéter debido a Acinetobacter baumannii, respectivamente; según nuestro conocimiento, este es el primer estudio observacional de cohorte sobre las características clínicas de los pacientes con ARDS grave causado por la infección emergente por HAdV-55 y también el primero en la evaluación de una prueba de carga viral para monitorear la reacción al tratamiento y para predecir el desenlace del paciente; los siguientes son los principales hallazgos de este estudio (1) HAdV-55 pueden causar ARDS grave en hombres jóvenes inmunocompetentes con sangre tipo B. Todos nuestros pacientes eran de la misma ciudad de la provincia de Hebei, en el norte de China. (2) La fiebre alta persistente, la disnea y la progresión rápida a la insuficiencia respiratoria en un plazo de 2 semanas, junto con las consolidaciones bilaterales y los infiltrados al mismo tiempo, son las manifestaciones clínicas más frecuentes de la SDRA inducida por HAdV-55 grave. (3) La monitorización de la carga viral puede ayudar a predecir la gravedad de la enfermedad y el desenlace de los pacientes. (4) Las tasas de fallo del VPN y de la VMI fueron muy elevadas, y el ECMO puede ser el último método de apoyo para este grupo de pacientes. (5) La DSRA grave inducida por HAdV-55 tiene una tasa de mortalidad muy alta (80%) a pesar de un apoyo respiratorio adecuado. La HAdV-55 se caracterizó por primera vez por completo en Shaanxi, China [7] y luego resurgió en Hebei, una provincia cercana a Beijing, donde causó varios casos de enfermedad respiratoria aguda [9]. Se presumió que la HAdV-55 era una forma recombinante de las especies B2 de HAdV-14 y HAdV-11 [7, 15] debido a que compartía un gen hexano con el chasis HAdV-11 y HAdV-14 [16]. Los resultados de nuestro estudio muestran que la HAdV-55, como patógeno emergente entre adultos inmunocompetentes, puede causar EDA severa. La prevalencia de neumonía adenoviral grave y fatal inducida por la HAdV-55 en nuestro estudio es algo similar a la descrita por Cao y colegas [6]. Todos los casos de HAdV-55 reportados en nuestro estudio eran de la misma ciudad: Baoding, Los pacientes con enfermedad grave también procedían de la misma región y fueron tratados durante un período de tiempo similar, lo que sugiere que el HAdV-55 puede ser un importante patógeno viral derivado de esta región. Los resultados de nuestro estudio sugieren que las siguientes pueden ser características clínicas del SDRA causadas por el HAdV-55: fiebre alta persistente, progresión rápida de la disnea, necesidad de soporte de ventilación mecánica, nivel AST elevado y progresión rápida de infiltrados unilaterales a consolidaciones bilaterales. Estas características clínicas son muy similares a las del SDRA causadas por otros tipos de VHAd descritos en informes anteriores [6, 9]. Estudios recientes han demostrado que el sistema inmunitario juega un papel crucial en el aclaramiento de la viremia del VHAdV y la supervivencia del huésped [17]. Chen et al. En la fase aguda de la infección por HAdV-55, los pacientes con enfermedad grave pueden tener altos niveles de células dendríticas y células Th17 [18]. En nuestro estudio, el único paciente que se recuperó de una infección grave tuvo un recuento de células T más alto. Tres de los cinco pacientes tenían recuentos de células T relativamente bajos cuando fueron admitidos. Nuestros resultados sugieren que estos tres pacientes pueden haber sido relativamente inmunocomprometidos y que un recuento de células T más bajo puede ser un factor de riesgo para la infección por HAdV-55 en adultos jóvenes. El ADN de HAdV-55 se notificó previamente en el 41,2% de los pacientes con infección grave [18]. En nuestro estudio, el ADN de HAdV-55 fue detectado y monitorizado en todos los pacientes con SDRA grave. La carga viral inicial y la tendencia de las copias del ADN del HAdV-55 en las muestras de las vías respiratorias y la sangre pueden sugerir la gravedad de la infección y pueden predecir tanto la reacción al tratamiento como el resultado del paciente. El uso de ventilación mecánica y ECMO en pacientes con SDRA causada por el HAdV-55 no ha sido detallado en estudios previos. En nuestra cohorte, encontramos que la infección grave del HAdV-55 podría causar una rápida progresión de la insuficiencia respiratoria, con una tasa de fallo muy alta para el NPPV y el IMV. Esta tasa de fracaso puede ser el resultado de la gran área de consolidación que indujo una derivación severa en el pulmón, lo que puede conducir a la falta de respuesta a la ventilación de presión positiva. Para los pacientes con SDRA grave, el ECMO debe ser considerado una mejor opción para la oxigenación. Se trata de un estudio observacional sin grupo de comparación, por lo que la diferencia entre las infecciones graves y modestas no pudo ser aclarada en términos de estado inmune, características clínicas, hallazgos radiológicos, carga viral y efectos de tratamiento en el soporte respiratorio y terapia antiviral. Se necesita un análisis dinámico secuencial para determinar la relación entre la viremia HAdV-55 y la respuesta al tratamiento.

¿Cuál es la duración media del tiempo desde la primera radiografía de tórax positiva hasta infiltrados pulmonares multilobares bilaterales en adenovirus humano tipo 55 (HAdV-55)?

El síndrome de distrés respiratorio agudo emergente causado por el adenovirus tipo 55 en adultos inmunocompetentes en 2013: un estudio observacional prospectivohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4243941/SHA: f5b706d0529bfcf7e2d1dfc037df5b6f95fc5ec0Autores: Sun, Bing; He, Hangyong; Wang, Zheng; Qu, Jiuxin; Li, Xuyan; Ban, Chengjun; Wan, Jun; Cao, Bin; Tong, Zhaohui; Wang, ChenFecha: 2014-08-12DOI: 10.1186/s13054-014-0456-6Licencia: cc-byAbstract: Introducción: Desde 2008, se han Las características clínicas y los resultados de los pacientes más críticamente enfermos con síndrome de distrés respiratorio agudo severo (ARDS) causado por HAdV-55 que requieren ventilación mecánica invasiva (IVM) y/o oxigenación de membrana extracorpórea (ECMO). MÉTODOS: Se realizó un estudio observacional prospectivo, unicéntrico de neumonía con SDRA en adultos inmunocompetentes ingresados en nuestra UCI respiratoria. Se recogieron y analizaron prospectivamente características clínicas, de laboratorio, radiológicas, pruebas secuenciales de carga viral en vías respiratorias y sangre, tratamientos y resultados. RESULTADOS: Se incluyeron los resultados de un total de cinco pacientes consecutivos con SDRA grave con infección confirmada por HAdV-55. Los cinco pacientes fueron varones jóvenes inmunocompetentes con mediana de edad de 32 años. El tiempo medio desde el inicio a la disnea fue de 5 días. La presión parcial media de oxígeno/fracción de oxígeno inspirado fue de 58,1; la duración media desde el inicio hasta la consolidación de un lóbulo mostrado en las radiografías de tórax (CXR) y, desde el primer CXR positivo hasta los infiltrados pulmonares multilobares bilaterales, fue de 2 días y 4,8 días respectivamente; la carga viral fue superior a 1 × 10(8) copias en tres pacientes y fue de 1 × 10(4) en un paciente; fue negativa en el único paciente que sobrevivió; la duración media para el fallo no invasivo de la ventilación por presión positiva (PNPV) y el fallo de la VMI fue de 30,8 horas y 6,2 días, respectivamente; cuatro pacientes recibieron ECMO venoso. Cuatro (80%) de los cinco pacientes fallecieron a pesar de recibir el apoyo respiratorio adecuado. CONCLUSIONES: HAdV-55 puede causar EDA grave en hombres jóvenes inmunocompete La fiebre alta persistente, la disnea y la rápida progresión a la insuficiencia respiratoria en el plazo de 2 semanas, junto con las consolidaciones bilaterales y los infiltrados, son las manifestaciones clínicas más frecuentes de SDRA grave inducida por HAdV-55. La monitorización de la carga viral puede ayudar a predecir la gravedad y el desenlace de la enfermedad. Las tasas de fallo del NPPV y de la VMI fueron muy altas, pero el ECMO puede seguir siendo la terapia de apoyo respiratorio de elección. REGISTRO TRIAL: Clinicaltrials.gov NCT01585922. Registrado 20 de abril de 2012Texto: Los adenovirus humanos (VHAd) son patógenos notorios en personas con función inmune comprometida y una causa frecuente de brotes de enfermedad respiratoria aguda entre niños pequeños. El adenovirus humano tipo 55 (HAdV-55), que está emergiendo como un patógeno altamente virulento para la neumonía adenoviral mortal aguda entre adultos inmunocompetentes en China, ha ganado cada vez más atención [6]. HAdV-55 es un patógeno de enfermedad respiratoria aguda emergente recientemente identificado que causó dos brotes recientes en China en 2006 [7] y en Singapur en 2005 [8]. En 2011, este patógeno aparentemente resurgió en Beijing, China, causando varios casos de neumonía grave adquirida por la comunidad [9]. Este patógeno se caracterizó plenamente por la secuenciación del genoma completo [10]. Estudios comparativos mostraron que la capacidad de HAdV para causar enfermedad grave puede relacionarse con los serotipos de HAdVs. La neumonía adenoviral grave inducida por HAdV-55 ha sido reportada como más cercana a los casos severos comparados con otros serotipos (HAdV-3, HAdV-7 y HAdV-14) [6]. El conocimiento actual del síndrome de distrés respiratorio agudo (ARDS) inducido por HAdV-55 que requiere ventilación mecánica invasiva y/o apoyo a la oxigenación de membrana extracorpórea (ECMO) en adultos inmunocompetentes se deriva de informes de casos individuales o series relativamente pequeñas de un solo centro. Como resultado, se dispone de poca información sobre neumonía HAdV-55 complicada con ARDS graves, cuya frecuencia se espera que aumente en los próximos años. Aquí describimos las características clínicas y los resultados de cinco casos prospectivos de neumonía por HAdV-55 complicada con ARDS graves en adultos inmunocompetentes en nuestra UCI. A partir de mayo de 2012, se realizó en nuestro centro un ensayo aleatorizado de ventilación no invasiva por presión positiva (NPPV) en pacientes con SDRA (ClinicalTrials.gov ID: NCT01585922). De mayo de 2012 a abril de 2014, todos los pacientes adultos con SDRA causados por neumonía que fueron ingresados en la UCI respiratoria del Hospital Chao-Yang de Beijing fueron incluidos de forma prospectiva. Los datos fueron analizados de forma anónima según la definición de Berlín: 1) desarrollo en el plazo de una semana de un insulto clínico conocido o de nuevos síntomas respiratorios o empeoramiento de los mismos; 2) opacidades bilaterales no plenamente explicadas por efusiones, lobar y/o colapso pulmonar, o nódulos; 3) insuficiencia respiratoria no plenamente explicada por insuficiencia cardiaca o sobrecarga de líquidos; 4) presión parcial de oxígeno/ fracción de oxígeno inspirado (PaO 2 /FiO 2 ) ≤100 mmHg con presión terminal de extinción positiva (PEEP) ≥5 cmH 2 O; y 5) radiografía torácica con tres o cuatro cuadrantes con opacidades. Cada paciente dio su consentimiento informado por escrito para que sus datos fueran utilizados para la investigación y publicación.La información clínica recolectada por investigadores con un formulario de datos estandarizado incluyó: características demográficas (edad y sexo), comorbilidades, síntomas clínicos (fiebre, tos, esputo, disnea, dolor torácico, erupción cutánea, náuseas, vómitos, dolor abdominal, diarrea y dolor de cabeza), signos (temperatura corporal, frecuencia cardíaca, frecuencia respiratoria, presión arterial y crepitaciones en los pulmones), pruebas de laboratorio (conteo de células de sangre entera y química de la sangre) e hallazgos microbiológicos e imágenes del pulmón (rayos X del tórax (CXR) y tomografía computarizada).Medicamentos concomitantes, apoyo respiratorio, complicaciones y resultados. Se realizaron pruebas microbiológicas en el Departamento de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica en nuestro centro, y se describieron los métodos de detección utilizados en nuestro informe anterior [6]. Los virus comunes causantes de enfermedades respiratorias fueron analizados mediante un kit con 15 ensayos virales diferentes. Se utilizaron muestras séricas para Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae y anticuerpos Legionella pneumophila. Todos los pacientes tuvieron su infección HAdV-55 confirmada por el ensayo RT-PCR. Se analizaron secuencias parciales del gen hexano para teclear la filogenia de cepas HAdV-55. La carga adenoviral también se realizó tanto en muestras respiratorias como en sangre mediante el ensayo multiplex RT-PCR. Se diagnosticó neumonía viral en base a la presencia de HAdV detectada en muestras de esputo o de tor Las variables continuas fueron resumidas como media ± desviación estándar (DE) o mediana (rango intercuartil), durante el período de estudio fueron ingresados en nuestra UTI un total de ocho pacientes diagnosticados con infección por HAdV e insuficiencia respiratoria, y siete de ellos recibieron un diagnóstico de SDRA. Cinco pacientes consecutivos con SDRA grave con infección confirmada por HAdV-55 fueron ingresados en nuestra UTI entre abril y julio de 2013. Fueron incluidos en el análisis; los otros dos pacientes tenían SDRA leve y estaban infectados con otros tipos de VHAd. Los cinco pacientes eran jóvenes inmunocompetentes con mediana edad de 32 años (rango, 28 a 40 años). Todos los pacientes compartían un tipo de sangre B y provenían de la misma ciudad: Ciudad Baoding, provincia de Hebei, norte de China. Todos los pacientes no tenían exposición a animales de granja, maíz o heno. El paciente 3 tenía pleuritis tu Sus análisis de sangre, incluyendo el ensayo de tuberculosis T-SPOT (Oxford Immunotec, Marlborough, MA, EE.UU.) y el anticuerpo de Mycobacterium tuberculosis, fueron negativos. Los síntomas de gripe, como fiebre, tos y poco esputo, se observaron comúnmente al inicio de la enfermedad. Todos los pacientes presentaron fiebre alta, con una temperatura corporal media de 39,5°C (rango, 39,0°C a 40,0°C), que persistió durante 8 días (rango, 6 a 11 días). Se observó tos productiva en dos pacientes. También se observó dolor torácico y sarpullido leves en dos pacientes. Todos los pacientes presentaron disnea. El tiempo medio desde el inicio a la disnea fue de 5 días (rango, 1 a 10 días). Después de la aparición de disnea, los pacientes generalmente evolucionaron a insuficiencia respiratoria o hipoxemia. El tiempo medio desde el inicio hasta el ingreso en la UTI fue de 9,6 días (rango, 8 a 11 días) (Tabla 1). Todos los pacientes presentaron taquipnea cuando ingresaron en la UTI, con una tasa media de 43 respiraciones por minuto (rango = 38 a 52); el análisis de gases arteriales en el ingreso en la UTI reveló hipoxia profunda, con una media de PaO 2/FiO 2 de 58,1 (rango = 49 a 62,5). El recuento de glóbulos blancos fue bajo o en el rango normal. Todos los pacientes presentaron niveles elevados de aspartato aminotransferasa sérica (AST), lactato deshidrogenasa (LDH) e hidroxibutirato deshidrogenasa (HBDH) (Tabla 1). Al ingreso, los niveles de inmunoglobulina (inmunoglobulinas Los CXRs revelaron consolidación múltiple de lobar bilateral o segmento en los pulmones de los cinco pacientes, y las lesiones radiográficas evolucionaron rápidamente después del ingreso en la UTI (Figura 1 ). Tres pacientes fueron examinados por tomografía computarizada de alta resolución (TCDH). Se encontraron consolidaciones unilaterales o bilaterales e infiltrados en las exploraciones de la ETCH de los tres pacientes. Las consolidaciones dentro de un solo lóbulo o varios lóbulos con un borde claro y broncograma de aire fueron los hallazgos más comunes en las exploraciones de la ETCH. Nódulos, parches, derrame pleural, absceso y cavidad también fueron visualizadas por la ETCH (Figura 2 ). La duración media desde el inicio hasta la consolidación de un solo lóbulo en las RCC fue de 2 días (rango = 1 a 5 días). La duración media desde el primer CXR positivo hasta Todos los pacientes presentaban viremia HAdV-55; en cuatro de los cinco pacientes se detectó por primera vez en muestras de aspirado endotraqueal (ETA), el tiempo entre la recolección inicial de muestras de adenovirus ETA y los resultados positivos del ácido nucleico HAdV-55 en sangre fue de 1 a 10 días (tabla 3), se determinaron copias de ADN del virus en ETA para todos los pacientes durante su estancia en la UTI, la carga viral fue superior a 1 × 10 8 copias en tres pacientes y 1 × 10 4 en un solo paciente, la carga viral se volvió negativa en el único paciente que sobrevivió; en los cuatro pacientes que no sobrevivieron, las copias de ADN no disminuyeron, incluso con terapia antiviral (figura 3 ). La oxigenación no se mantuvo con el soporte convencional NPPV o IMV en ninguno de los pacientes. La duración media hasta el fallo del NPPV fue de 30,8 horas (rango = 22 a 48 horas), y el tiempo medio hasta el fallo del IMV fue de 6,2 días (rango 2 = a 13 días) (Tabla 1). Cuatro pacientes recibieron ECMO venovenoso para mantener la saturación de oxígeno, y un paciente rechazó el soporte del ECMO y recibió ventilación oscilatoria de alta frecuencia. La Tabla 4 da los datos de oxigenación de los pacientes antes y después del ECMO venovenoso. Todos los pacientes recibieron terapia antiviral, incluyendo aciclovir (10 mg/kg, cada 8 horas, goteo intravenoso), ganciclovir (5 mg/kg, cada 12 horas, goteo intravenoso) y ribavirina (250 mg, dos veces al día, goteo intravenoso). Teniendo en cuenta que la coinfección bacteriana puede combinarse con una infección viral grave, Cuatro (80%) de los cinco pacientes fallecieron; de los cuatro pacientes que recibieron ECMO venovenoso, sólo un paciente sobrevivió; los otros cuatro murieron por ARDS, coinfección por Aspergillus fumigatus, shock séptico e infección del torrente sanguíneo relacionada con catéter debido a Acinetobacter baumannii, respectivamente; según nuestro conocimiento, este es el primer estudio observacional de cohorte sobre las características clínicas de los pacientes con ARDS grave causado por la infección emergente por HAdV-55 y también el primero en la evaluación de una prueba de carga viral para monitorear la reacción al tratamiento y para predecir el desenlace del paciente; los siguientes son los principales hallazgos de este estudio (1) HAdV-55 pueden causar ARDS grave en hombres jóvenes inmunocompetentes con sangre tipo B. Todos nuestros pacientes eran de la misma ciudad de la provincia de Hebei, en el norte de China. (2) La fiebre alta persistente, la disnea y la progresión rápida a la insuficiencia respiratoria en un plazo de 2 semanas, junto con las consolidaciones bilaterales y los infiltrados al mismo tiempo, son las manifestaciones clínicas más frecuentes de la SDRA inducida por HAdV-55 grave. (3) La monitorización de la carga viral puede ayudar a predecir la gravedad de la enfermedad y el desenlace de los pacientes. (4) Las tasas de fallo del VPN y de la VMI fueron muy elevadas, y el ECMO puede ser el último método de apoyo para este grupo de pacientes. (5) La DSRA grave inducida por HAdV-55 tiene una tasa de mortalidad muy alta (80%) a pesar de un apoyo respiratorio adecuado. La HAdV-55 se caracterizó por primera vez por completo en Shaanxi, China [7] y luego resurgió en Hebei, una provincia cercana a Beijing, donde causó varios casos de enfermedad respiratoria aguda [9]. Se presumió que la HAdV-55 era una forma recombinante de las especies B2 de HAdV-14 y HAdV-11 [7, 15] debido a que compartía un gen hexano con el chasis HAdV-11 y HAdV-14 [16]. Los resultados de nuestro estudio muestran que la HAdV-55, como patógeno emergente entre adultos inmunocompetentes, puede causar EDA severa. La prevalencia de neumonía adenoviral grave y fatal inducida por la HAdV-55 en nuestro estudio es algo similar a la descrita por Cao y colegas [6]. Todos los casos de HAdV-55 reportados en nuestro estudio eran de la misma ciudad: Baoding, Los pacientes con enfermedad grave también procedían de la misma región y fueron tratados durante un período de tiempo similar, lo que sugiere que el HAdV-55 puede ser un importante patógeno viral derivado de esta región. Los resultados de nuestro estudio sugieren que las siguientes pueden ser características clínicas del SDRA causadas por el HAdV-55: fiebre alta persistente, progresión rápida de la disnea, necesidad de soporte de ventilación mecánica, nivel AST elevado y progresión rápida de infiltrados unilaterales a consolidaciones bilaterales. Estas características clínicas son muy similares a las del SDRA causadas por otros tipos de VHAd descritos en informes anteriores [6, 9]. Estudios recientes han demostrado que el sistema inmunitario juega un papel crucial en el aclaramiento de la viremia del VHAdV y la supervivencia del huésped [17]. Chen et al. En la fase aguda de la infección por HAdV-55, los pacientes con enfermedad grave pueden tener altos niveles de células dendríticas y células Th17 [18]. En nuestro estudio, el único paciente que se recuperó de una infección grave tuvo un recuento de células T más alto. Tres de los cinco pacientes tenían recuentos de células T relativamente bajos cuando fueron admitidos. Nuestros resultados sugieren que estos tres pacientes pueden haber sido relativamente inmunocomprometidos y que un recuento de células T más bajo puede ser un factor de riesgo para la infección por HAdV-55 en adultos jóvenes. El ADN de HAdV-55 se notificó previamente en el 41,2% de los pacientes con infección grave [18]. En nuestro estudio, el ADN de HAdV-55 fue detectado y monitorizado en todos los pacientes con SDRA grave. La carga viral inicial y la tendencia de las copias del ADN del HAdV-55 en las muestras de las vías respiratorias y la sangre pueden sugerir la gravedad de la infección y pueden predecir tanto la reacción al tratamiento como el resultado del paciente. El uso de ventilación mecánica y ECMO en pacientes con SDRA causada por el HAdV-55 no ha sido detallado en estudios previos. En nuestra cohorte, encontramos que la infección grave del HAdV-55 podría causar una rápida progresión de la insuficiencia respiratoria, con una tasa de fallo muy alta para el NPPV y el IMV. Esta tasa de fracaso puede ser el resultado de la gran área de consolidación que indujo una derivación severa en el pulmón, lo que puede conducir a la falta de respuesta a la ventilación de presión positiva. Para los pacientes con SDRA grave, el ECMO debe ser considerado una mejor opción para la oxigenación. Se trata de un estudio observacional sin grupo de comparación, por lo que la diferencia entre las infecciones graves y modestas no pudo ser aclarada en términos de estado inmune, características clínicas, hallazgos radiológicos, carga viral y efectos de tratamiento en el soporte respiratorio y terapia antiviral. Se necesita un análisis dinámico secuencial para determinar la relación entre la viremia HAdV-55 y la respuesta al tratamiento.

¿Cuál es el tiempo medio desde el inicio de los síntomas hasta la disnea en el adenovirus humano tipo 55 (HAdV-55)?

El síndrome de distrés respiratorio agudo emergente causado por el adenovirus tipo 55 en adultos inmunocompetentes en 2013: un estudio observacional prospectivohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4243941/SHA: f5b706d0529bfcf7e2d1dfc037df5b6f95fc5ec0Autores: Sun, Bing; He, Hangyong; Wang, Zheng; Qu, Jiuxin; Li, Xuyan; Ban, Chengjun; Wan, Jun; Cao, Bin; Tong, Zhaohui; Wang, ChenFecha: 2014-08-12DOI: 10.1186/s13054-014-0456-6Licencia: cc-byAbstract: Introducción: Desde 2008, se han Las características clínicas y los resultados de los pacientes más críticamente enfermos con síndrome de distrés respiratorio agudo severo (ARDS) causado por HAdV-55 que requieren ventilación mecánica invasiva (IVM) y/o oxigenación de membrana extracorpórea (ECMO). MÉTODOS: Se realizó un estudio observacional prospectivo, unicéntrico de neumonía con SDRA en adultos inmunocompetentes ingresados en nuestra UCI respiratoria. Se recogieron y analizaron prospectivamente características clínicas, de laboratorio, radiológicas, pruebas secuenciales de carga viral en vías respiratorias y sangre, tratamientos y resultados. RESULTADOS: Se incluyeron los resultados de un total de cinco pacientes consecutivos con SDRA grave con infección confirmada por HAdV-55. Los cinco pacientes fueron varones jóvenes inmunocompetentes con mediana de edad de 32 años. El tiempo medio desde el inicio a la disnea fue de 5 días. La presión parcial media de oxígeno/fracción de oxígeno inspirado fue de 58,1; la duración media desde el inicio hasta la consolidación de un lóbulo mostrado en las radiografías de tórax (CXR) y, desde el primer CXR positivo hasta los infiltrados pulmonares multilobares bilaterales, fue de 2 días y 4,8 días respectivamente; la carga viral fue superior a 1 × 10(8) copias en tres pacientes y fue de 1 × 10(4) en un paciente; fue negativa en el único paciente que sobrevivió; la duración media para el fallo no invasivo de la ventilación por presión positiva (PNPV) y el fallo de la VMI fue de 30,8 horas y 6,2 días, respectivamente; cuatro pacientes recibieron ECMO venoso. Cuatro (80%) de los cinco pacientes fallecieron a pesar de recibir el apoyo respiratorio adecuado. CONCLUSIONES: HAdV-55 puede causar EDA grave en hombres jóvenes inmunocompete La fiebre alta persistente, la disnea y la rápida progresión a la insuficiencia respiratoria en el plazo de 2 semanas, junto con las consolidaciones bilaterales y los infiltrados, son las manifestaciones clínicas más frecuentes de SDRA grave inducida por HAdV-55. La monitorización de la carga viral puede ayudar a predecir la gravedad y el desenlace de la enfermedad. Las tasas de fallo del NPPV y de la VMI fueron muy altas, pero el ECMO puede seguir siendo la terapia de apoyo respiratorio de elección. REGISTRO TRIAL: Clinicaltrials.gov NCT01585922. Registrado 20 de abril de 2012Texto: Los adenovirus humanos (VHAd) son patógenos notorios en personas con función inmune comprometida y una causa frecuente de brotes de enfermedad respiratoria aguda entre niños pequeños. El adenovirus humano tipo 55 (HAdV-55), que está emergiendo como un patógeno altamente virulento para la neumonía adenoviral mortal aguda entre adultos inmunocompetentes en China, ha ganado cada vez más atención [6]. HAdV-55 es un patógeno de enfermedad respiratoria aguda emergente recientemente identificado que causó dos brotes recientes en China en 2006 [7] y en Singapur en 2005 [8]. En 2011, este patógeno aparentemente resurgió en Beijing, China, causando varios casos de neumonía grave adquirida por la comunidad [9]. Este patógeno se caracterizó plenamente por la secuenciación del genoma completo [10]. Estudios comparativos mostraron que la capacidad de HAdV para causar enfermedad grave puede relacionarse con los serotipos de HAdVs. La neumonía adenoviral grave inducida por HAdV-55 ha sido reportada como más cercana a los casos severos comparados con otros serotipos (HAdV-3, HAdV-7 y HAdV-14) [6]. El conocimiento actual del síndrome de distrés respiratorio agudo (ARDS) inducido por HAdV-55 que requiere ventilación mecánica invasiva y/o apoyo a la oxigenación de membrana extracorpórea (ECMO) en adultos inmunocompetentes se deriva de informes de casos individuales o series relativamente pequeñas de un solo centro. Como resultado, se dispone de poca información sobre neumonía HAdV-55 complicada con ARDS graves, cuya frecuencia se espera que aumente en los próximos años. Aquí describimos las características clínicas y los resultados de cinco casos prospectivos de neumonía por HAdV-55 complicada con ARDS graves en adultos inmunocompetentes en nuestra UCI. A partir de mayo de 2012, se realizó en nuestro centro un ensayo aleatorizado de ventilación no invasiva por presión positiva (NPPV) en pacientes con SDRA (ClinicalTrials.gov ID: NCT01585922). De mayo de 2012 a abril de 2014, todos los pacientes adultos con SDRA causados por neumonía que fueron ingresados en la UCI respiratoria del Hospital Chao-Yang de Beijing fueron incluidos de forma prospectiva. Los datos fueron analizados de forma anónima según la definición de Berlín: 1) desarrollo en el plazo de una semana de un insulto clínico conocido o de nuevos síntomas respiratorios o empeoramiento de los mismos; 2) opacidades bilaterales no plenamente explicadas por efusiones, lobar y/o colapso pulmonar, o nódulos; 3) insuficiencia respiratoria no plenamente explicada por insuficiencia cardiaca o sobrecarga de líquidos; 4) presión parcial de oxígeno/ fracción de oxígeno inspirado (PaO 2 /FiO 2 ) ≤100 mmHg con presión terminal de extinción positiva (PEEP) ≥5 cmH 2 O; y 5) radiografía torácica con tres o cuatro cuadrantes con opacidades. Cada paciente dio su consentimiento informado por escrito para que sus datos fueran utilizados para la investigación y publicación.La información clínica recolectada por investigadores con un formulario de datos estandarizado incluyó: características demográficas (edad y sexo), comorbilidades, síntomas clínicos (fiebre, tos, esputo, disnea, dolor torácico, erupción cutánea, náuseas, vómitos, dolor abdominal, diarrea y dolor de cabeza), signos (temperatura corporal, frecuencia cardíaca, frecuencia respiratoria, presión arterial y crepitaciones en los pulmones), pruebas de laboratorio (conteo de células de sangre entera y química de la sangre) e hallazgos microbiológicos e imágenes del pulmón (rayos X del tórax (CXR) y tomografía computarizada).Medicamentos concomitantes, apoyo respiratorio, complicaciones y resultados. Se realizaron pruebas microbiológicas en el Departamento de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica en nuestro centro, y se describieron los métodos de detección utilizados en nuestro informe anterior [6]. Los virus comunes causantes de enfermedades respiratorias fueron analizados mediante un kit con 15 ensayos virales diferentes. Se utilizaron muestras séricas para Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae y anticuerpos Legionella pneumophila. Todos los pacientes tuvieron su infección HAdV-55 confirmada por el ensayo RT-PCR. Se analizaron secuencias parciales del gen hexano para teclear la filogenia de cepas HAdV-55. La carga adenoviral también se realizó tanto en muestras respiratorias como en sangre mediante el ensayo multiplex RT-PCR. Se diagnosticó neumonía viral en base a la presencia de HAdV detectada en muestras de esputo o de tor Las variables continuas fueron resumidas como media ± desviación estándar (DE) o mediana (rango intercuartil), durante el período de estudio fueron ingresados en nuestra UTI un total de ocho pacientes diagnosticados con infección por HAdV e insuficiencia respiratoria, y siete de ellos recibieron un diagnóstico de SDRA. Cinco pacientes consecutivos con SDRA grave con infección confirmada por HAdV-55 fueron ingresados en nuestra UTI entre abril y julio de 2013. Fueron incluidos en el análisis; los otros dos pacientes tenían SDRA leve y estaban infectados con otros tipos de VHAd. Los cinco pacientes eran jóvenes inmunocompetentes con mediana edad de 32 años (rango, 28 a 40 años). Todos los pacientes compartían un tipo de sangre B y provenían de la misma ciudad: Ciudad Baoding, provincia de Hebei, norte de China. Todos los pacientes no tenían exposición a animales de granja, maíz o heno. El paciente 3 tenía pleuritis tu Sus análisis de sangre, incluyendo el ensayo de tuberculosis T-SPOT (Oxford Immunotec, Marlborough, MA, EE.UU.) y el anticuerpo de Mycobacterium tuberculosis, fueron negativos. Los síntomas de gripe, como fiebre, tos y poco esputo, se observaron comúnmente al inicio de la enfermedad. Todos los pacientes presentaron fiebre alta, con una temperatura corporal media de 39,5°C (rango, 39,0°C a 40,0°C), que persistió durante 8 días (rango, 6 a 11 días). Se observó tos productiva en dos pacientes. También se observó dolor torácico y sarpullido leves en dos pacientes. Todos los pacientes presentaron disnea. El tiempo medio desde el inicio a la disnea fue de 5 días (rango, 1 a 10 días). Después de la aparición de disnea, los pacientes generalmente evolucionaron a insuficiencia respiratoria o hipoxemia. El tiempo medio desde el inicio hasta el ingreso en la UTI fue de 9,6 días (rango, 8 a 11 días) (Tabla 1). Todos los pacientes presentaron taquipnea cuando ingresaron en la UTI, con una tasa media de 43 respiraciones por minuto (rango = 38 a 52); el análisis de gases arteriales en el ingreso en la UTI reveló hipoxia profunda, con una media de PaO 2/FiO 2 de 58,1 (rango = 49 a 62,5). El recuento de glóbulos blancos fue bajo o en el rango normal. Todos los pacientes presentaron niveles elevados de aspartato aminotransferasa sérica (AST), lactato deshidrogenasa (LDH) e hidroxibutirato deshidrogenasa (HBDH) (Tabla 1). Al ingreso, los niveles de inmunoglobulina (inmunoglobulinas Los CXRs revelaron consolidación múltiple de lobar bilateral o segmento en los pulmones de los cinco pacientes, y las lesiones radiográficas evolucionaron rápidamente después del ingreso en la UTI (Figura 1 ). Tres pacientes fueron examinados por tomografía computarizada de alta resolución (TCDH). Se encontraron consolidaciones unilaterales o bilaterales e infiltrados en las exploraciones de la ETCH de los tres pacientes. Las consolidaciones dentro de un solo lóbulo o varios lóbulos con un borde claro y broncograma de aire fueron los hallazgos más comunes en las exploraciones de la ETCH. Nódulos, parches, derrame pleural, absceso y cavidad también fueron visualizadas por la ETCH (Figura 2 ). La duración media desde el inicio hasta la consolidación de un solo lóbulo en las RCC fue de 2 días (rango = 1 a 5 días). La duración media desde el primer CXR positivo hasta Todos los pacientes presentaban viremia HAdV-55; en cuatro de los cinco pacientes se detectó por primera vez en muestras de aspirado endotraqueal (ETA), el tiempo entre la recolección inicial de muestras de adenovirus ETA y los resultados positivos del ácido nucleico HAdV-55 en sangre fue de 1 a 10 días (tabla 3), se determinaron copias de ADN del virus en ETA para todos los pacientes durante su estancia en la UTI, la carga viral fue superior a 1 × 10 8 copias en tres pacientes y 1 × 10 4 en un solo paciente, la carga viral se volvió negativa en el único paciente que sobrevivió; en los cuatro pacientes que no sobrevivieron, las copias de ADN no disminuyeron, incluso con terapia antiviral (figura 3 ). La oxigenación no se mantuvo con el soporte convencional NPPV o IMV en ninguno de los pacientes. La duración media hasta el fallo del NPPV fue de 30,8 horas (rango = 22 a 48 horas), y el tiempo medio hasta el fallo del IMV fue de 6,2 días (rango 2 = a 13 días) (Tabla 1). Cuatro pacientes recibieron ECMO venovenoso para mantener la saturación de oxígeno, y un paciente rechazó el soporte del ECMO y recibió ventilación oscilatoria de alta frecuencia. La Tabla 4 da los datos de oxigenación de los pacientes antes y después del ECMO venovenoso. Todos los pacientes recibieron terapia antiviral, incluyendo aciclovir (10 mg/kg, cada 8 horas, goteo intravenoso), ganciclovir (5 mg/kg, cada 12 horas, goteo intravenoso) y ribavirina (250 mg, dos veces al día, goteo intravenoso). Teniendo en cuenta que la coinfección bacteriana puede combinarse con una infección viral grave, Cuatro (80%) de los cinco pacientes fallecieron; de los cuatro pacientes que recibieron ECMO venovenoso, sólo un paciente sobrevivió; los otros cuatro murieron por ARDS, coinfección por Aspergillus fumigatus, shock séptico e infección del torrente sanguíneo relacionada con catéter debido a Acinetobacter baumannii, respectivamente; según nuestro conocimiento, este es el primer estudio observacional de cohorte sobre las características clínicas de los pacientes con ARDS grave causado por la infección emergente por HAdV-55 y también el primero en la evaluación de una prueba de carga viral para monitorear la reacción al tratamiento y para predecir el desenlace del paciente; los siguientes son los principales hallazgos de este estudio (1) HAdV-55 pueden causar ARDS grave en hombres jóvenes inmunocompetentes con sangre tipo B. Todos nuestros pacientes eran de la misma ciudad de la provincia de Hebei, en el norte de China. (2) La fiebre alta persistente, la disnea y la progresión rápida a la insuficiencia respiratoria en un plazo de 2 semanas, junto con las consolidaciones bilaterales y los infiltrados al mismo tiempo, son las manifestaciones clínicas más frecuentes de la SDRA inducida por HAdV-55 grave. (3) La monitorización de la carga viral puede ayudar a predecir la gravedad de la enfermedad y el desenlace de los pacientes. (4) Las tasas de fallo del VPN y de la VMI fueron muy elevadas, y el ECMO puede ser el último método de apoyo para este grupo de pacientes. (5) La DSRA grave inducida por HAdV-55 tiene una tasa de mortalidad muy alta (80%) a pesar de un apoyo respiratorio adecuado. La HAdV-55 se caracterizó por primera vez por completo en Shaanxi, China [7] y luego resurgió en Hebei, una provincia cercana a Beijing, donde causó varios casos de enfermedad respiratoria aguda [9]. Se presumió que la HAdV-55 era una forma recombinante de las especies B2 de HAdV-14 y HAdV-11 [7, 15] debido a que compartía un gen hexano con el chasis HAdV-11 y HAdV-14 [16]. Los resultados de nuestro estudio muestran que la HAdV-55, como patógeno emergente entre adultos inmunocompetentes, puede causar EDA severa. La prevalencia de neumonía adenoviral grave y fatal inducida por la HAdV-55 en nuestro estudio es algo similar a la descrita por Cao y colegas [6]. Todos los casos de HAdV-55 reportados en nuestro estudio eran de la misma ciudad: Baoding, Los pacientes con enfermedad grave también procedían de la misma región y fueron tratados durante un período de tiempo similar, lo que sugiere que el HAdV-55 puede ser un importante patógeno viral derivado de esta región. Los resultados de nuestro estudio sugieren que las siguientes pueden ser características clínicas del SDRA causadas por el HAdV-55: fiebre alta persistente, progresión rápida de la disnea, necesidad de soporte de ventilación mecánica, nivel AST elevado y progresión rápida de infiltrados unilaterales a consolidaciones bilaterales. Estas características clínicas son muy similares a las del SDRA causadas por otros tipos de VHAd descritos en informes anteriores [6, 9]. Estudios recientes han demostrado que el sistema inmunitario juega un papel crucial en el aclaramiento de la viremia del VHAdV y la supervivencia del huésped [17]. Chen et al. En la fase aguda de la infección por HAdV-55, los pacientes con enfermedad grave pueden tener altos niveles de células dendríticas y células Th17 [18]. En nuestro estudio, el único paciente que se recuperó de una infección grave tuvo un recuento de células T más alto. Tres de los cinco pacientes tenían recuentos de células T relativamente bajos cuando fueron admitidos. Nuestros resultados sugieren que estos tres pacientes pueden haber sido relativamente inmunocomprometidos y que un recuento de células T más bajo puede ser un factor de riesgo para la infección por HAdV-55 en adultos jóvenes. El ADN de HAdV-55 se notificó previamente en el 41,2% de los pacientes con infección grave [18]. En nuestro estudio, el ADN de HAdV-55 fue detectado y monitorizado en todos los pacientes con SDRA grave. La carga viral inicial y la tendencia de las copias del ADN del HAdV-55 en las muestras de las vías respiratorias y la sangre pueden sugerir la gravedad de la infección y pueden predecir tanto la reacción al tratamiento como el resultado del paciente. El uso de ventilación mecánica y ECMO en pacientes con SDRA causada por el HAdV-55 no ha sido detallado en estudios previos. En nuestra cohorte, encontramos que la infección grave del HAdV-55 podría causar una rápida progresión de la insuficiencia respiratoria, con una tasa de fallo muy alta para el NPPV y el IMV. Esta tasa de fracaso puede ser el resultado de la gran área de consolidación que indujo una derivación severa en el pulmón, lo que puede conducir a la falta de respuesta a la ventilación de presión positiva. Para los pacientes con SDRA grave, el ECMO debe ser considerado una mejor opción para la oxigenación. Se trata de un estudio observacional sin grupo de comparación, por lo que la diferencia entre las infecciones graves y modestas no pudo ser aclarada en términos de estado inmune, características clínicas, hallazgos radiológicos, carga viral y efectos de tratamiento en el soporte respiratorio y terapia antiviral. Se necesita un análisis dinámico secuencial para determinar la relación entre la viremia HAdV-55 y la respuesta al tratamiento.

¿Cuál es el tiempo medio de aparición de los síntomas de ingreso en la UTI en el adenovirus humano tipo 55 (HAdV-55)?

El síndrome de distrés respiratorio agudo emergente causado por el adenovirus tipo 55 en adultos inmunocompetentes en 2013: un estudio observacional prospectivohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4243941/SHA: f5b706d0529bfcf7e2d1dfc037df5b6f95fc5ec0Autores: Sun, Bing; He, Hangyong; Wang, Zheng; Qu, Jiuxin; Li, Xuyan; Ban, Chengjun; Wan, Jun; Cao, Bin; Tong, Zhaohui; Wang, ChenFecha: 2014-08-12DOI: 10.1186/s13054-014-0456-6Licencia: cc-byAbstract: Introducción: Desde 2008, se han Las características clínicas y los resultados de los pacientes más críticamente enfermos con síndrome de distrés respiratorio agudo severo (ARDS) causado por HAdV-55 que requieren ventilación mecánica invasiva (IVM) y/o oxigenación de membrana extracorpórea (ECMO). MÉTODOS: Se realizó un estudio observacional prospectivo, unicéntrico de neumonía con SDRA en adultos inmunocompetentes ingresados en nuestra UCI respiratoria. Se recogieron y analizaron prospectivamente características clínicas, de laboratorio, radiológicas, pruebas secuenciales de carga viral en vías respiratorias y sangre, tratamientos y resultados. RESULTADOS: Se incluyeron los resultados de un total de cinco pacientes consecutivos con SDRA grave con infección confirmada por HAdV-55. Los cinco pacientes fueron varones jóvenes inmunocompetentes con mediana de edad de 32 años. El tiempo medio desde el inicio a la disnea fue de 5 días. La presión parcial media de oxígeno/fracción de oxígeno inspirado fue de 58,1; la duración media desde el inicio hasta la consolidación de un lóbulo mostrado en las radiografías de tórax (CXR) y, desde el primer CXR positivo hasta los infiltrados pulmonares multilobares bilaterales, fue de 2 días y 4,8 días respectivamente; la carga viral fue superior a 1 × 10(8) copias en tres pacientes y fue de 1 × 10(4) en un paciente; fue negativa en el único paciente que sobrevivió; la duración media para el fallo no invasivo de la ventilación por presión positiva (PNPV) y el fallo de la VMI fue de 30,8 horas y 6,2 días, respectivamente; cuatro pacientes recibieron ECMO venoso. Cuatro (80%) de los cinco pacientes fallecieron a pesar de recibir el apoyo respiratorio adecuado. CONCLUSIONES: HAdV-55 puede causar EDA grave en hombres jóvenes inmunocompete La fiebre alta persistente, la disnea y la rápida progresión a la insuficiencia respiratoria en el plazo de 2 semanas, junto con las consolidaciones bilaterales y los infiltrados, son las manifestaciones clínicas más frecuentes de SDRA grave inducida por HAdV-55. La monitorización de la carga viral puede ayudar a predecir la gravedad y el desenlace de la enfermedad. Las tasas de fallo del NPPV y de la VMI fueron muy altas, pero el ECMO puede seguir siendo la terapia de apoyo respiratorio de elección. REGISTRO TRIAL: Clinicaltrials.gov NCT01585922. Registrado 20 de abril de 2012Texto: Los adenovirus humanos (VHAd) son patógenos notorios en personas con función inmune comprometida y una causa frecuente de brotes de enfermedad respiratoria aguda entre niños pequeños. El adenovirus humano tipo 55 (HAdV-55), que está emergiendo como un patógeno altamente virulento para la neumonía adenoviral mortal aguda entre adultos inmunocompetentes en China, ha ganado cada vez más atención [6]. HAdV-55 es un patógeno de enfermedad respiratoria aguda emergente recientemente identificado que causó dos brotes recientes en China en 2006 [7] y en Singapur en 2005 [8]. En 2011, este patógeno aparentemente resurgió en Beijing, China, causando varios casos de neumonía grave adquirida por la comunidad [9]. Este patógeno se caracterizó plenamente por la secuenciación del genoma completo [10]. Estudios comparativos mostraron que la capacidad de HAdV para causar enfermedad grave puede relacionarse con los serotipos de HAdVs. La neumonía adenoviral grave inducida por HAdV-55 ha sido reportada como más cercana a los casos severos comparados con otros serotipos (HAdV-3, HAdV-7 y HAdV-14) [6]. El conocimiento actual del síndrome de distrés respiratorio agudo (ARDS) inducido por HAdV-55 que requiere ventilación mecánica invasiva y/o apoyo a la oxigenación de membrana extracorpórea (ECMO) en adultos inmunocompetentes se deriva de informes de casos individuales o series relativamente pequeñas de un solo centro. Como resultado, se dispone de poca información sobre neumonía HAdV-55 complicada con ARDS graves, cuya frecuencia se espera que aumente en los próximos años. Aquí describimos las características clínicas y los resultados de cinco casos prospectivos de neumonía por HAdV-55 complicada con ARDS graves en adultos inmunocompetentes en nuestra UCI. A partir de mayo de 2012, se realizó en nuestro centro un ensayo aleatorizado de ventilación no invasiva por presión positiva (NPPV) en pacientes con SDRA (ClinicalTrials.gov ID: NCT01585922). De mayo de 2012 a abril de 2014, todos los pacientes adultos con SDRA causados por neumonía que fueron ingresados en la UCI respiratoria del Hospital Chao-Yang de Beijing fueron incluidos de forma prospectiva. Los datos fueron analizados de forma anónima según la definición de Berlín: 1) desarrollo en el plazo de una semana de un insulto clínico conocido o de nuevos síntomas respiratorios o empeoramiento de los mismos; 2) opacidades bilaterales no plenamente explicadas por efusiones, lobar y/o colapso pulmonar, o nódulos; 3) insuficiencia respiratoria no plenamente explicada por insuficiencia cardiaca o sobrecarga de líquidos; 4) presión parcial de oxígeno/ fracción de oxígeno inspirado (PaO 2 /FiO 2 ) ≤100 mmHg con presión terminal de extinción positiva (PEEP) ≥5 cmH 2 O; y 5) radiografía torácica con tres o cuatro cuadrantes con opacidades. Cada paciente dio su consentimiento informado por escrito para que sus datos fueran utilizados para la investigación y publicación.La información clínica recolectada por investigadores con un formulario de datos estandarizado incluyó: características demográficas (edad y sexo), comorbilidades, síntomas clínicos (fiebre, tos, esputo, disnea, dolor torácico, erupción cutánea, náuseas, vómitos, dolor abdominal, diarrea y dolor de cabeza), signos (temperatura corporal, frecuencia cardíaca, frecuencia respiratoria, presión arterial y crepitaciones en los pulmones), pruebas de laboratorio (conteo de células de sangre entera y química de la sangre) e hallazgos microbiológicos e imágenes del pulmón (rayos X del tórax (CXR) y tomografía computarizada).Medicamentos concomitantes, apoyo respiratorio, complicaciones y resultados. Se realizaron pruebas microbiológicas en el Departamento de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica en nuestro centro, y se describieron los métodos de detección utilizados en nuestro informe anterior [6]. Los virus comunes causantes de enfermedades respiratorias fueron analizados mediante un kit con 15 ensayos virales diferentes. Se utilizaron muestras séricas para Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae y anticuerpos Legionella pneumophila. Todos los pacientes tuvieron su infección HAdV-55 confirmada por el ensayo RT-PCR. Se analizaron secuencias parciales del gen hexano para teclear la filogenia de cepas HAdV-55. La carga adenoviral también se realizó tanto en muestras respiratorias como en sangre mediante el ensayo multiplex RT-PCR. Se diagnosticó neumonía viral en base a la presencia de HAdV detectada en muestras de esputo o de tor Las variables continuas fueron resumidas como media ± desviación estándar (DE) o mediana (rango intercuartil), durante el período de estudio fueron ingresados en nuestra UTI un total de ocho pacientes diagnosticados con infección por HAdV e insuficiencia respiratoria, y siete de ellos recibieron un diagnóstico de SDRA. Cinco pacientes consecutivos con SDRA grave con infección confirmada por HAdV-55 fueron ingresados en nuestra UTI entre abril y julio de 2013. Fueron incluidos en el análisis; los otros dos pacientes tenían SDRA leve y estaban infectados con otros tipos de VHAd. Los cinco pacientes eran jóvenes inmunocompetentes con mediana edad de 32 años (rango, 28 a 40 años). Todos los pacientes compartían un tipo de sangre B y provenían de la misma ciudad: Ciudad Baoding, provincia de Hebei, norte de China. Todos los pacientes no tenían exposición a animales de granja, maíz o heno. El paciente 3 tenía pleuritis tu Sus análisis de sangre, incluyendo el ensayo de tuberculosis T-SPOT (Oxford Immunotec, Marlborough, MA, EE.UU.) y el anticuerpo de Mycobacterium tuberculosis, fueron negativos. Los síntomas de gripe, como fiebre, tos y poco esputo, se observaron comúnmente al inicio de la enfermedad. Todos los pacientes presentaron fiebre alta, con una temperatura corporal media de 39,5°C (rango, 39,0°C a 40,0°C), que persistió durante 8 días (rango, 6 a 11 días). Se observó tos productiva en dos pacientes. También se observó dolor torácico y sarpullido leves en dos pacientes. Todos los pacientes presentaron disnea. El tiempo medio desde el inicio a la disnea fue de 5 días (rango, 1 a 10 días). Después de la aparición de disnea, los pacientes generalmente evolucionaron a insuficiencia respiratoria o hipoxemia. El tiempo medio desde el inicio hasta el ingreso en la UTI fue de 9,6 días (rango, 8 a 11 días) (Tabla 1). Todos los pacientes presentaron taquipnea cuando ingresaron en la UTI, con una tasa media de 43 respiraciones por minuto (rango = 38 a 52); el análisis de gases arteriales en el ingreso en la UTI reveló hipoxia profunda, con una media de PaO 2/FiO 2 de 58,1 (rango = 49 a 62,5). El recuento de glóbulos blancos fue bajo o en el rango normal. Todos los pacientes presentaron niveles elevados de aspartato aminotransferasa sérica (AST), lactato deshidrogenasa (LDH) e hidroxibutirato deshidrogenasa (HBDH) (Tabla 1). Al ingreso, los niveles de inmunoglobulina (inmunoglobulinas Los CXRs revelaron consolidación múltiple de lobar bilateral o segmento en los pulmones de los cinco pacientes, y las lesiones radiográficas evolucionaron rápidamente después del ingreso en la UTI (Figura 1 ). Tres pacientes fueron examinados por tomografía computarizada de alta resolución (TCDH). Se encontraron consolidaciones unilaterales o bilaterales e infiltrados en las exploraciones de la ETCH de los tres pacientes. Las consolidaciones dentro de un solo lóbulo o varios lóbulos con un borde claro y broncograma de aire fueron los hallazgos más comunes en las exploraciones de la ETCH. Nódulos, parches, derrame pleural, absceso y cavidad también fueron visualizadas por la ETCH (Figura 2 ). La duración media desde el inicio hasta la consolidación de un solo lóbulo en las RCC fue de 2 días (rango = 1 a 5 días). La duración media desde el primer CXR positivo hasta Todos los pacientes presentaban viremia HAdV-55; en cuatro de los cinco pacientes se detectó por primera vez en muestras de aspirado endotraqueal (ETA), el tiempo entre la recolección inicial de muestras de adenovirus ETA y los resultados positivos del ácido nucleico HAdV-55 en sangre fue de 1 a 10 días (tabla 3), se determinaron copias de ADN del virus en ETA para todos los pacientes durante su estancia en la UTI, la carga viral fue superior a 1 × 10 8 copias en tres pacientes y 1 × 10 4 en un solo paciente, la carga viral se volvió negativa en el único paciente que sobrevivió; en los cuatro pacientes que no sobrevivieron, las copias de ADN no disminuyeron, incluso con terapia antiviral (figura 3 ). La oxigenación no se mantuvo con el soporte convencional NPPV o IMV en ninguno de los pacientes. La duración media hasta el fallo del NPPV fue de 30,8 horas (rango = 22 a 48 horas), y el tiempo medio hasta el fallo del IMV fue de 6,2 días (rango 2 = a 13 días) (Tabla 1). Cuatro pacientes recibieron ECMO venovenoso para mantener la saturación de oxígeno, y un paciente rechazó el soporte del ECMO y recibió ventilación oscilatoria de alta frecuencia. La Tabla 4 da los datos de oxigenación de los pacientes antes y después del ECMO venovenoso. Todos los pacientes recibieron terapia antiviral, incluyendo aciclovir (10 mg/kg, cada 8 horas, goteo intravenoso), ganciclovir (5 mg/kg, cada 12 horas, goteo intravenoso) y ribavirina (250 mg, dos veces al día, goteo intravenoso). Teniendo en cuenta que la coinfección bacteriana puede combinarse con una infección viral grave, Cuatro (80%) de los cinco pacientes fallecieron; de los cuatro pacientes que recibieron ECMO venovenoso, sólo un paciente sobrevivió; los otros cuatro murieron por ARDS, coinfección por Aspergillus fumigatus, shock séptico e infección del torrente sanguíneo relacionada con catéter debido a Acinetobacter baumannii, respectivamente; según nuestro conocimiento, este es el primer estudio observacional de cohorte sobre las características clínicas de los pacientes con ARDS grave causado por la infección emergente por HAdV-55 y también el primero en la evaluación de una prueba de carga viral para monitorear la reacción al tratamiento y para predecir el desenlace del paciente; los siguientes son los principales hallazgos de este estudio (1) HAdV-55 pueden causar ARDS grave en hombres jóvenes inmunocompetentes con sangre tipo B. Todos nuestros pacientes eran de la misma ciudad de la provincia de Hebei, en el norte de China. (2) La fiebre alta persistente, la disnea y la progresión rápida a la insuficiencia respiratoria en un plazo de 2 semanas, junto con las consolidaciones bilaterales y los infiltrados al mismo tiempo, son las manifestaciones clínicas más frecuentes de la SDRA inducida por HAdV-55 grave. (3) La monitorización de la carga viral puede ayudar a predecir la gravedad de la enfermedad y el desenlace de los pacientes. (4) Las tasas de fallo del VPN y de la VMI fueron muy elevadas, y el ECMO puede ser el último método de apoyo para este grupo de pacientes. (5) La DSRA grave inducida por HAdV-55 tiene una tasa de mortalidad muy alta (80%) a pesar de un apoyo respiratorio adecuado. La HAdV-55 se caracterizó por primera vez por completo en Shaanxi, China [7] y luego resurgió en Hebei, una provincia cercana a Beijing, donde causó varios casos de enfermedad respiratoria aguda [9]. Se presumió que la HAdV-55 era una forma recombinante de las especies B2 de HAdV-14 y HAdV-11 [7, 15] debido a que compartía un gen hexano con el chasis HAdV-11 y HAdV-14 [16]. Los resultados de nuestro estudio muestran que la HAdV-55, como patógeno emergente entre adultos inmunocompetentes, puede causar EDA severa. La prevalencia de neumonía adenoviral grave y fatal inducida por la HAdV-55 en nuestro estudio es algo similar a la descrita por Cao y colegas [6]. Todos los casos de HAdV-55 reportados en nuestro estudio eran de la misma ciudad: Baoding, Los pacientes con enfermedad grave también procedían de la misma región y fueron tratados durante un período de tiempo similar, lo que sugiere que el HAdV-55 puede ser un importante patógeno viral derivado de esta región. Los resultados de nuestro estudio sugieren que las siguientes pueden ser características clínicas del SDRA causadas por el HAdV-55: fiebre alta persistente, progresión rápida de la disnea, necesidad de soporte de ventilación mecánica, nivel AST elevado y progresión rápida de infiltrados unilaterales a consolidaciones bilaterales. Estas características clínicas son muy similares a las del SDRA causadas por otros tipos de VHAd descritos en informes anteriores [6, 9]. Estudios recientes han demostrado que el sistema inmunitario juega un papel crucial en el aclaramiento de la viremia del VHAdV y la supervivencia del huésped [17]. Chen et al. En la fase aguda de la infección por HAdV-55, los pacientes con enfermedad grave pueden tener altos niveles de células dendríticas y células Th17 [18]. En nuestro estudio, el único paciente que se recuperó de una infección grave tuvo un recuento de células T más alto. Tres de los cinco pacientes tenían recuentos de células T relativamente bajos cuando fueron admitidos. Nuestros resultados sugieren que estos tres pacientes pueden haber sido relativamente inmunocomprometidos y que un recuento de células T más bajo puede ser un factor de riesgo para la infección por HAdV-55 en adultos jóvenes. El ADN de HAdV-55 se notificó previamente en el 41,2% de los pacientes con infección grave [18]. En nuestro estudio, el ADN de HAdV-55 fue detectado y monitorizado en todos los pacientes con SDRA grave. La carga viral inicial y la tendencia de las copias del ADN del HAdV-55 en las muestras de las vías respiratorias y la sangre pueden sugerir la gravedad de la infección y pueden predecir tanto la reacción al tratamiento como el resultado del paciente. El uso de ventilación mecánica y ECMO en pacientes con SDRA causada por el HAdV-55 no ha sido detallado en estudios previos. En nuestra cohorte, encontramos que la infección grave del HAdV-55 podría causar una rápida progresión de la insuficiencia respiratoria, con una tasa de fallo muy alta para el NPPV y el IMV. Esta tasa de fracaso puede ser el resultado de la gran área de consolidación que indujo una derivación severa en el pulmón, lo que puede conducir a la falta de respuesta a la ventilación de presión positiva. Para los pacientes con SDRA grave, el ECMO debe ser considerado una mejor opción para la oxigenación. Se trata de un estudio observacional sin grupo de comparación, por lo que la diferencia entre las infecciones graves y modestas no pudo ser aclarada en términos de estado inmune, características clínicas, hallazgos radiológicos, carga viral y efectos de tratamiento en el soporte respiratorio y terapia antiviral. Se necesita un análisis dinámico secuencial para determinar la relación entre la viremia HAdV-55 y la respuesta al tratamiento.

¿Cuál es la tasa media de respiración al ingresar en la UTI cuando se ingresa por adenovirus humano tipo 55 (HAdV-55)?

El síndrome de distrés respiratorio agudo emergente causado por el adenovirus tipo 55 en adultos inmunocompetentes en 2013: un estudio observacional prospectivohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4243941/SHA: f5b706d0529bfcf7e2d1dfc037df5b6f95fc5ec0Autores: Sun, Bing; He, Hangyong; Wang, Zheng; Qu, Jiuxin; Li, Xuyan; Ban, Chengjun; Wan, Jun; Cao, Bin; Tong, Zhaohui; Wang, ChenFecha: 2014-08-12DOI: 10.1186/s13054-014-0456-6Licencia: cc-byAbstract: Introducción: Desde 2008, se han Las características clínicas y los resultados de los pacientes más críticamente enfermos con síndrome de distrés respiratorio agudo severo (ARDS) causado por HAdV-55 que requieren ventilación mecánica invasiva (IVM) y/o oxigenación de membrana extracorpórea (ECMO). MÉTODOS: Se realizó un estudio observacional prospectivo, unicéntrico de neumonía con SDRA en adultos inmunocompetentes ingresados en nuestra UCI respiratoria. Se recogieron y analizaron prospectivamente características clínicas, de laboratorio, radiológicas, pruebas secuenciales de carga viral en vías respiratorias y sangre, tratamientos y resultados. RESULTADOS: Se incluyeron los resultados de un total de cinco pacientes consecutivos con SDRA grave con infección confirmada por HAdV-55. Los cinco pacientes fueron varones jóvenes inmunocompetentes con mediana de edad de 32 años. El tiempo medio desde el inicio a la disnea fue de 5 días. La presión parcial media de oxígeno/fracción de oxígeno inspirado fue de 58,1; la duración media desde el inicio hasta la consolidación de un lóbulo mostrado en las radiografías de tórax (CXR) y, desde el primer CXR positivo hasta los infiltrados pulmonares multilobares bilaterales, fue de 2 días y 4,8 días respectivamente; la carga viral fue superior a 1 × 10(8) copias en tres pacientes y fue de 1 × 10(4) en un paciente; fue negativa en el único paciente que sobrevivió; la duración media para el fallo no invasivo de la ventilación por presión positiva (PNPV) y el fallo de la VMI fue de 30,8 horas y 6,2 días, respectivamente; cuatro pacientes recibieron ECMO venoso. Cuatro (80%) de los cinco pacientes fallecieron a pesar de recibir el apoyo respiratorio adecuado. CONCLUSIONES: HAdV-55 puede causar EDA grave en hombres jóvenes inmunocompete La fiebre alta persistente, la disnea y la rápida progresión a la insuficiencia respiratoria en el plazo de 2 semanas, junto con las consolidaciones bilaterales y los infiltrados, son las manifestaciones clínicas más frecuentes de SDRA grave inducida por HAdV-55. La monitorización de la carga viral puede ayudar a predecir la gravedad y el desenlace de la enfermedad. Las tasas de fallo del NPPV y de la VMI fueron muy altas, pero el ECMO puede seguir siendo la terapia de apoyo respiratorio de elección. REGISTRO TRIAL: Clinicaltrials.gov NCT01585922. Registrado 20 de abril de 2012Texto: Los adenovirus humanos (VHAd) son patógenos notorios en personas con función inmune comprometida y una causa frecuente de brotes de enfermedad respiratoria aguda entre niños pequeños. El adenovirus humano tipo 55 (HAdV-55), que está emergiendo como un patógeno altamente virulento para la neumonía adenoviral mortal aguda entre adultos inmunocompetentes en China, ha ganado cada vez más atención [6]. HAdV-55 es un patógeno de enfermedad respiratoria aguda emergente recientemente identificado que causó dos brotes recientes en China en 2006 [7] y en Singapur en 2005 [8]. En 2011, este patógeno aparentemente resurgió en Beijing, China, causando varios casos de neumonía grave adquirida por la comunidad [9]. Este patógeno se caracterizó plenamente por la secuenciación del genoma completo [10]. Estudios comparativos mostraron que la capacidad de HAdV para causar enfermedad grave puede relacionarse con los serotipos de HAdVs. La neumonía adenoviral grave inducida por HAdV-55 ha sido reportada como más cercana a los casos severos comparados con otros serotipos (HAdV-3, HAdV-7 y HAdV-14) [6]. El conocimiento actual del síndrome de distrés respiratorio agudo (ARDS) inducido por HAdV-55 que requiere ventilación mecánica invasiva y/o apoyo a la oxigenación de membrana extracorpórea (ECMO) en adultos inmunocompetentes se deriva de informes de casos individuales o series relativamente pequeñas de un solo centro. Como resultado, se dispone de poca información sobre neumonía HAdV-55 complicada con ARDS graves, cuya frecuencia se espera que aumente en los próximos años. Aquí describimos las características clínicas y los resultados de cinco casos prospectivos de neumonía por HAdV-55 complicada con ARDS graves en adultos inmunocompetentes en nuestra UCI. A partir de mayo de 2012, se realizó en nuestro centro un ensayo aleatorizado de ventilación no invasiva por presión positiva (NPPV) en pacientes con SDRA (ClinicalTrials.gov ID: NCT01585922). De mayo de 2012 a abril de 2014, todos los pacientes adultos con SDRA causados por neumonía que fueron ingresados en la UCI respiratoria del Hospital Chao-Yang de Beijing fueron incluidos de forma prospectiva. Los datos fueron analizados de forma anónima según la definición de Berlín: 1) desarrollo en el plazo de una semana de un insulto clínico conocido o de nuevos síntomas respiratorios o empeoramiento de los mismos; 2) opacidades bilaterales no plenamente explicadas por efusiones, lobar y/o colapso pulmonar, o nódulos; 3) insuficiencia respiratoria no plenamente explicada por insuficiencia cardiaca o sobrecarga de líquidos; 4) presión parcial de oxígeno/ fracción de oxígeno inspirado (PaO 2 /FiO 2 ) ≤100 mmHg con presión terminal de extinción positiva (PEEP) ≥5 cmH 2 O; y 5) radiografía torácica con tres o cuatro cuadrantes con opacidades. Cada paciente dio su consentimiento informado por escrito para que sus datos fueran utilizados para la investigación y publicación.La información clínica recolectada por investigadores con un formulario de datos estandarizado incluyó: características demográficas (edad y sexo), comorbilidades, síntomas clínicos (fiebre, tos, esputo, disnea, dolor torácico, erupción cutánea, náuseas, vómitos, dolor abdominal, diarrea y dolor de cabeza), signos (temperatura corporal, frecuencia cardíaca, frecuencia respiratoria, presión arterial y crepitaciones en los pulmones), pruebas de laboratorio (conteo de células de sangre entera y química de la sangre) e hallazgos microbiológicos e imágenes del pulmón (rayos X del tórax (CXR) y tomografía computarizada).Medicamentos concomitantes, apoyo respiratorio, complicaciones y resultados. Se realizaron pruebas microbiológicas en el Departamento de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica en nuestro centro, y se describieron los métodos de detección utilizados en nuestro informe anterior [6]. Los virus comunes causantes de enfermedades respiratorias fueron analizados mediante un kit con 15 ensayos virales diferentes. Se utilizaron muestras séricas para Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae y anticuerpos Legionella pneumophila. Todos los pacientes tuvieron su infección HAdV-55 confirmada por el ensayo RT-PCR. Se analizaron secuencias parciales del gen hexano para teclear la filogenia de cepas HAdV-55. La carga adenoviral también se realizó tanto en muestras respiratorias como en sangre mediante el ensayo multiplex RT-PCR. Se diagnosticó neumonía viral en base a la presencia de HAdV detectada en muestras de esputo o de tor Las variables continuas fueron resumidas como media ± desviación estándar (DE) o mediana (rango intercuartil), durante el período de estudio fueron ingresados en nuestra UTI un total de ocho pacientes diagnosticados con infección por HAdV e insuficiencia respiratoria, y siete de ellos recibieron un diagnóstico de SDRA. Cinco pacientes consecutivos con SDRA grave con infección confirmada por HAdV-55 fueron ingresados en nuestra UTI entre abril y julio de 2013. Fueron incluidos en el análisis; los otros dos pacientes tenían SDRA leve y estaban infectados con otros tipos de VHAd. Los cinco pacientes eran jóvenes inmunocompetentes con mediana edad de 32 años (rango, 28 a 40 años). Todos los pacientes compartían un tipo de sangre B y provenían de la misma ciudad: Ciudad Baoding, provincia de Hebei, norte de China. Todos los pacientes no tenían exposición a animales de granja, maíz o heno. El paciente 3 tenía pleuritis tu Sus análisis de sangre, incluyendo el ensayo de tuberculosis T-SPOT (Oxford Immunotec, Marlborough, MA, EE.UU.) y el anticuerpo de Mycobacterium tuberculosis, fueron negativos. Los síntomas de gripe, como fiebre, tos y poco esputo, se observaron comúnmente al inicio de la enfermedad. Todos los pacientes presentaron fiebre alta, con una temperatura corporal media de 39,5°C (rango, 39,0°C a 40,0°C), que persistió durante 8 días (rango, 6 a 11 días). Se observó tos productiva en dos pacientes. También se observó dolor torácico y sarpullido leves en dos pacientes. Todos los pacientes presentaron disnea. El tiempo medio desde el inicio a la disnea fue de 5 días (rango, 1 a 10 días). Después de la aparición de disnea, los pacientes generalmente evolucionaron a insuficiencia respiratoria o hipoxemia. El tiempo medio desde el inicio hasta el ingreso en la UTI fue de 9,6 días (rango, 8 a 11 días) (Tabla 1). Todos los pacientes presentaron taquipnea cuando ingresaron en la UTI, con una tasa media de 43 respiraciones por minuto (rango = 38 a 52); el análisis de gases arteriales en el ingreso en la UTI reveló hipoxia profunda, con una media de PaO 2/FiO 2 de 58,1 (rango = 49 a 62,5). El recuento de glóbulos blancos fue bajo o en el rango normal. Todos los pacientes presentaron niveles elevados de aspartato aminotransferasa sérica (AST), lactato deshidrogenasa (LDH) e hidroxibutirato deshidrogenasa (HBDH) (Tabla 1). Al ingreso, los niveles de inmunoglobulina (inmunoglobulinas Los CXRs revelaron consolidación múltiple de lobar bilateral o segmento en los pulmones de los cinco pacientes, y las lesiones radiográficas evolucionaron rápidamente después del ingreso en la UTI (Figura 1 ). Tres pacientes fueron examinados por tomografía computarizada de alta resolución (TCDH). Se encontraron consolidaciones unilaterales o bilaterales e infiltrados en las exploraciones de la ETCH de los tres pacientes. Las consolidaciones dentro de un solo lóbulo o varios lóbulos con un borde claro y broncograma de aire fueron los hallazgos más comunes en las exploraciones de la ETCH. Nódulos, parches, derrame pleural, absceso y cavidad también fueron visualizadas por la ETCH (Figura 2 ). La duración media desde el inicio hasta la consolidación de un solo lóbulo en las RCC fue de 2 días (rango = 1 a 5 días). La duración media desde el primer CXR positivo hasta Todos los pacientes presentaban viremia HAdV-55; en cuatro de los cinco pacientes se detectó por primera vez en muestras de aspirado endotraqueal (ETA), el tiempo entre la recolección inicial de muestras de adenovirus ETA y los resultados positivos del ácido nucleico HAdV-55 en sangre fue de 1 a 10 días (tabla 3), se determinaron copias de ADN del virus en ETA para todos los pacientes durante su estancia en la UTI, la carga viral fue superior a 1 × 10 8 copias en tres pacientes y 1 × 10 4 en un solo paciente, la carga viral se volvió negativa en el único paciente que sobrevivió; en los cuatro pacientes que no sobrevivieron, las copias de ADN no disminuyeron, incluso con terapia antiviral (figura 3 ). La oxigenación no se mantuvo con el soporte convencional NPPV o IMV en ninguno de los pacientes. La duración media hasta el fallo del NPPV fue de 30,8 horas (rango = 22 a 48 horas), y el tiempo medio hasta el fallo del IMV fue de 6,2 días (rango 2 = a 13 días) (Tabla 1). Cuatro pacientes recibieron ECMO venovenoso para mantener la saturación de oxígeno, y un paciente rechazó el soporte del ECMO y recibió ventilación oscilatoria de alta frecuencia. La Tabla 4 da los datos de oxigenación de los pacientes antes y después del ECMO venovenoso. Todos los pacientes recibieron terapia antiviral, incluyendo aciclovir (10 mg/kg, cada 8 horas, goteo intravenoso), ganciclovir (5 mg/kg, cada 12 horas, goteo intravenoso) y ribavirina (250 mg, dos veces al día, goteo intravenoso). Teniendo en cuenta que la coinfección bacteriana puede combinarse con una infección viral grave, Cuatro (80%) de los cinco pacientes fallecieron; de los cuatro pacientes que recibieron ECMO venovenoso, sólo un paciente sobrevivió; los otros cuatro murieron por ARDS, coinfección por Aspergillus fumigatus, shock séptico e infección del torrente sanguíneo relacionada con catéter debido a Acinetobacter baumannii, respectivamente; según nuestro conocimiento, este es el primer estudio observacional de cohorte sobre las características clínicas de los pacientes con ARDS grave causado por la infección emergente por HAdV-55 y también el primero en la evaluación de una prueba de carga viral para monitorear la reacción al tratamiento y para predecir el desenlace del paciente; los siguientes son los principales hallazgos de este estudio (1) HAdV-55 pueden causar ARDS grave en hombres jóvenes inmunocompetentes con sangre tipo B. Todos nuestros pacientes eran de la misma ciudad de la provincia de Hebei, en el norte de China. (2) La fiebre alta persistente, la disnea y la progresión rápida a la insuficiencia respiratoria en un plazo de 2 semanas, junto con las consolidaciones bilaterales y los infiltrados al mismo tiempo, son las manifestaciones clínicas más frecuentes de la SDRA inducida por HAdV-55 grave. (3) La monitorización de la carga viral puede ayudar a predecir la gravedad de la enfermedad y el desenlace de los pacientes. (4) Las tasas de fallo del VPN y de la VMI fueron muy elevadas, y el ECMO puede ser el último método de apoyo para este grupo de pacientes. (5) La DSRA grave inducida por HAdV-55 tiene una tasa de mortalidad muy alta (80%) a pesar de un apoyo respiratorio adecuado. La HAdV-55 se caracterizó por primera vez por completo en Shaanxi, China [7] y luego resurgió en Hebei, una provincia cercana a Beijing, donde causó varios casos de enfermedad respiratoria aguda [9]. Se presumió que la HAdV-55 era una forma recombinante de las especies B2 de HAdV-14 y HAdV-11 [7, 15] debido a que compartía un gen hexano con el chasis HAdV-11 y HAdV-14 [16]. Los resultados de nuestro estudio muestran que la HAdV-55, como patógeno emergente entre adultos inmunocompetentes, puede causar EDA severa. La prevalencia de neumonía adenoviral grave y fatal inducida por la HAdV-55 en nuestro estudio es algo similar a la descrita por Cao y colegas [6]. Todos los casos de HAdV-55 reportados en nuestro estudio eran de la misma ciudad: Baoding, Los pacientes con enfermedad grave también procedían de la misma región y fueron tratados durante un período de tiempo similar, lo que sugiere que el HAdV-55 puede ser un importante patógeno viral derivado de esta región. Los resultados de nuestro estudio sugieren que las siguientes pueden ser características clínicas del SDRA causadas por el HAdV-55: fiebre alta persistente, progresión rápida de la disnea, necesidad de soporte de ventilación mecánica, nivel AST elevado y progresión rápida de infiltrados unilaterales a consolidaciones bilaterales. Estas características clínicas son muy similares a las del SDRA causadas por otros tipos de VHAd descritos en informes anteriores [6, 9]. Estudios recientes han demostrado que el sistema inmunitario juega un papel crucial en el aclaramiento de la viremia del VHAdV y la supervivencia del huésped [17]. Chen et al. En la fase aguda de la infección por HAdV-55, los pacientes con enfermedad grave pueden tener altos niveles de células dendríticas y células Th17 [18]. En nuestro estudio, el único paciente que se recuperó de una infección grave tuvo un recuento de células T más alto. Tres de los cinco pacientes tenían recuentos de células T relativamente bajos cuando fueron admitidos. Nuestros resultados sugieren que estos tres pacientes pueden haber sido relativamente inmunocomprometidos y que un recuento de células T más bajo puede ser un factor de riesgo para la infección por HAdV-55 en adultos jóvenes. El ADN de HAdV-55 se notificó previamente en el 41,2% de los pacientes con infección grave [18]. En nuestro estudio, el ADN de HAdV-55 fue detectado y monitorizado en todos los pacientes con SDRA grave. La carga viral inicial y la tendencia de las copias del ADN del HAdV-55 en las muestras de las vías respiratorias y la sangre pueden sugerir la gravedad de la infección y pueden predecir tanto la reacción al tratamiento como el resultado del paciente. El uso de ventilación mecánica y ECMO en pacientes con SDRA causada por el HAdV-55 no ha sido detallado en estudios previos. En nuestra cohorte, encontramos que la infección grave del HAdV-55 podría causar una rápida progresión de la insuficiencia respiratoria, con una tasa de fallo muy alta para el NPPV y el IMV. Esta tasa de fracaso puede ser el resultado de la gran área de consolidación que indujo una derivación severa en el pulmón, lo que puede conducir a la falta de respuesta a la ventilación de presión positiva. Para los pacientes con SDRA grave, el ECMO debe ser considerado una mejor opción para la oxigenación. Se trata de un estudio observacional sin grupo de comparación, por lo que la diferencia entre las infecciones graves y modestas no pudo ser aclarada en términos de estado inmune, características clínicas, hallazgos radiológicos, carga viral y efectos de tratamiento en el soporte respiratorio y terapia antiviral. Se necesita un análisis dinámico secuencial para determinar la relación entre la viremia HAdV-55 y la respuesta al tratamiento.

¿Cuál es el recuento de glóbulos blancos en casos graves de adenovirus humano tipo 55 (HAdV-55)?

El síndrome de distrés respiratorio agudo emergente causado por el adenovirus tipo 55 en adultos inmunocompetentes en 2013: un estudio observacional prospectivohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4243941/SHA: f5b706d0529bfcf7e2d1dfc037df5b6f95fc5ec0Autores: Sun, Bing; He, Hangyong; Wang, Zheng; Qu, Jiuxin; Li, Xuyan; Ban, Chengjun; Wan, Jun; Cao, Bin; Tong, Zhaohui; Wang, ChenFecha: 2014-08-12DOI: 10.1186/s13054-014-0456-6Licencia: cc-byAbstract: Introducción: Desde 2008, se han Las características clínicas y los resultados de los pacientes más críticamente enfermos con síndrome de distrés respiratorio agudo severo (ARDS) causado por HAdV-55 que requieren ventilación mecánica invasiva (IVM) y/o oxigenación de membrana extracorpórea (ECMO). MÉTODOS: Se realizó un estudio observacional prospectivo, unicéntrico de neumonía con SDRA en adultos inmunocompetentes ingresados en nuestra UCI respiratoria. Se recogieron y analizaron prospectivamente características clínicas, de laboratorio, radiológicas, pruebas secuenciales de carga viral en vías respiratorias y sangre, tratamientos y resultados. RESULTADOS: Se incluyeron los resultados de un total de cinco pacientes consecutivos con SDRA grave con infección confirmada por HAdV-55. Los cinco pacientes fueron varones jóvenes inmunocompetentes con mediana de edad de 32 años. El tiempo medio desde el inicio a la disnea fue de 5 días. La presión parcial media de oxígeno/fracción de oxígeno inspirado fue de 58,1; la duración media desde el inicio hasta la consolidación de un lóbulo mostrado en las radiografías de tórax (CXR) y, desde el primer CXR positivo hasta los infiltrados pulmonares multilobares bilaterales, fue de 2 días y 4,8 días respectivamente; la carga viral fue superior a 1 × 10(8) copias en tres pacientes y fue de 1 × 10(4) en un paciente; fue negativa en el único paciente que sobrevivió; la duración media para el fallo no invasivo de la ventilación por presión positiva (PNPV) y el fallo de la VMI fue de 30,8 horas y 6,2 días, respectivamente; cuatro pacientes recibieron ECMO venoso. Cuatro (80%) de los cinco pacientes fallecieron a pesar de recibir el apoyo respiratorio adecuado. CONCLUSIONES: HAdV-55 puede causar EDA grave en hombres jóvenes inmunocompete La fiebre alta persistente, la disnea y la rápida progresión a la insuficiencia respiratoria en el plazo de 2 semanas, junto con las consolidaciones bilaterales y los infiltrados, son las manifestaciones clínicas más frecuentes de SDRA grave inducida por HAdV-55. La monitorización de la carga viral puede ayudar a predecir la gravedad y el desenlace de la enfermedad. Las tasas de fallo del NPPV y de la VMI fueron muy altas, pero el ECMO puede seguir siendo la terapia de apoyo respiratorio de elección. REGISTRO TRIAL: Clinicaltrials.gov NCT01585922. Registrado 20 de abril de 2012Texto: Los adenovirus humanos (VHAd) son patógenos notorios en personas con función inmune comprometida y una causa frecuente de brotes de enfermedad respiratoria aguda entre niños pequeños. El adenovirus humano tipo 55 (HAdV-55), que está emergiendo como un patógeno altamente virulento para la neumonía adenoviral mortal aguda entre adultos inmunocompetentes en China, ha ganado cada vez más atención [6]. HAdV-55 es un patógeno de enfermedad respiratoria aguda emergente recientemente identificado que causó dos brotes recientes en China en 2006 [7] y en Singapur en 2005 [8]. En 2011, este patógeno aparentemente resurgió en Beijing, China, causando varios casos de neumonía grave adquirida por la comunidad [9]. Este patógeno se caracterizó plenamente por la secuenciación del genoma completo [10]. Estudios comparativos mostraron que la capacidad de HAdV para causar enfermedad grave puede relacionarse con los serotipos de HAdVs. La neumonía adenoviral grave inducida por HAdV-55 ha sido reportada como más cercana a los casos severos comparados con otros serotipos (HAdV-3, HAdV-7 y HAdV-14) [6]. El conocimiento actual del síndrome de distrés respiratorio agudo (ARDS) inducido por HAdV-55 que requiere ventilación mecánica invasiva y/o apoyo a la oxigenación de membrana extracorpórea (ECMO) en adultos inmunocompetentes se deriva de informes de casos individuales o series relativamente pequeñas de un solo centro. Como resultado, se dispone de poca información sobre neumonía HAdV-55 complicada con ARDS graves, cuya frecuencia se espera que aumente en los próximos años. Aquí describimos las características clínicas y los resultados de cinco casos prospectivos de neumonía por HAdV-55 complicada con ARDS graves en adultos inmunocompetentes en nuestra UCI. A partir de mayo de 2012, se realizó en nuestro centro un ensayo aleatorizado de ventilación no invasiva por presión positiva (NPPV) en pacientes con SDRA (ClinicalTrials.gov ID: NCT01585922). De mayo de 2012 a abril de 2014, todos los pacientes adultos con SDRA causados por neumonía que fueron ingresados en la UCI respiratoria del Hospital Chao-Yang de Beijing fueron incluidos de forma prospectiva. Los datos fueron analizados de forma anónima según la definición de Berlín: 1) desarrollo en el plazo de una semana de un insulto clínico conocido o de nuevos síntomas respiratorios o empeoramiento de los mismos; 2) opacidades bilaterales no plenamente explicadas por efusiones, lobar y/o colapso pulmonar, o nódulos; 3) insuficiencia respiratoria no plenamente explicada por insuficiencia cardiaca o sobrecarga de líquidos; 4) presión parcial de oxígeno/ fracción de oxígeno inspirado (PaO 2 /FiO 2 ) ≤100 mmHg con presión terminal de extinción positiva (PEEP) ≥5 cmH 2 O; y 5) radiografía torácica con tres o cuatro cuadrantes con opacidades. Cada paciente dio su consentimiento informado por escrito para que sus datos fueran utilizados para la investigación y publicación.La información clínica recolectada por investigadores con un formulario de datos estandarizado incluyó: características demográficas (edad y sexo), comorbilidades, síntomas clínicos (fiebre, tos, esputo, disnea, dolor torácico, erupción cutánea, náuseas, vómitos, dolor abdominal, diarrea y dolor de cabeza), signos (temperatura corporal, frecuencia cardíaca, frecuencia respiratoria, presión arterial y crepitaciones en los pulmones), pruebas de laboratorio (conteo de células de sangre entera y química de la sangre) e hallazgos microbiológicos e imágenes del pulmón (rayos X del tórax (CXR) y tomografía computarizada).Medicamentos concomitantes, apoyo respiratorio, complicaciones y resultados. Se realizaron pruebas microbiológicas en el Departamento de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica en nuestro centro, y se describieron los métodos de detección utilizados en nuestro informe anterior [6]. Los virus comunes causantes de enfermedades respiratorias fueron analizados mediante un kit con 15 ensayos virales diferentes. Se utilizaron muestras séricas para Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae y anticuerpos Legionella pneumophila. Todos los pacientes tuvieron su infección HAdV-55 confirmada por el ensayo RT-PCR. Se analizaron secuencias parciales del gen hexano para teclear la filogenia de cepas HAdV-55. La carga adenoviral también se realizó tanto en muestras respiratorias como en sangre mediante el ensayo multiplex RT-PCR. Se diagnosticó neumonía viral en base a la presencia de HAdV detectada en muestras de esputo o de tor Las variables continuas fueron resumidas como media ± desviación estándar (DE) o mediana (rango intercuartil), durante el período de estudio fueron ingresados en nuestra UTI un total de ocho pacientes diagnosticados con infección por HAdV e insuficiencia respiratoria, y siete de ellos recibieron un diagnóstico de SDRA. Cinco pacientes consecutivos con SDRA grave con infección confirmada por HAdV-55 fueron ingresados en nuestra UTI entre abril y julio de 2013. Fueron incluidos en el análisis; los otros dos pacientes tenían SDRA leve y estaban infectados con otros tipos de VHAd. Los cinco pacientes eran jóvenes inmunocompetentes con mediana edad de 32 años (rango, 28 a 40 años). Todos los pacientes compartían un tipo de sangre B y provenían de la misma ciudad: Ciudad Baoding, provincia de Hebei, norte de China. Todos los pacientes no tenían exposición a animales de granja, maíz o heno. El paciente 3 tenía pleuritis tu Sus análisis de sangre, incluyendo el ensayo de tuberculosis T-SPOT (Oxford Immunotec, Marlborough, MA, EE.UU.) y el anticuerpo de Mycobacterium tuberculosis, fueron negativos. Los síntomas de gripe, como fiebre, tos y poco esputo, se observaron comúnmente al inicio de la enfermedad. Todos los pacientes presentaron fiebre alta, con una temperatura corporal media de 39,5°C (rango, 39,0°C a 40,0°C), que persistió durante 8 días (rango, 6 a 11 días). Se observó tos productiva en dos pacientes. También se observó dolor torácico y sarpullido leves en dos pacientes. Todos los pacientes presentaron disnea. El tiempo medio desde el inicio a la disnea fue de 5 días (rango, 1 a 10 días). Después de la aparición de disnea, los pacientes generalmente evolucionaron a insuficiencia respiratoria o hipoxemia. El tiempo medio desde el inicio hasta el ingreso en la UTI fue de 9,6 días (rango, 8 a 11 días) (Tabla 1). Todos los pacientes presentaron taquipnea cuando ingresaron en la UTI, con una tasa media de 43 respiraciones por minuto (rango = 38 a 52); el análisis de gases arteriales en el ingreso en la UTI reveló hipoxia profunda, con una media de PaO 2/FiO 2 de 58,1 (rango = 49 a 62,5). El recuento de glóbulos blancos fue bajo o en el rango normal. Todos los pacientes presentaron niveles elevados de aspartato aminotransferasa sérica (AST), lactato deshidrogenasa (LDH) e hidroxibutirato deshidrogenasa (HBDH) (Tabla 1). Al ingreso, los niveles de inmunoglobulina (inmunoglobulinas Los CXRs revelaron consolidación múltiple de lobar bilateral o segmento en los pulmones de los cinco pacientes, y las lesiones radiográficas evolucionaron rápidamente después del ingreso en la UTI (Figura 1 ). Tres pacientes fueron examinados por tomografía computarizada de alta resolución (TCDH). Se encontraron consolidaciones unilaterales o bilaterales e infiltrados en las exploraciones de la ETCH de los tres pacientes. Las consolidaciones dentro de un solo lóbulo o varios lóbulos con un borde claro y broncograma de aire fueron los hallazgos más comunes en las exploraciones de la ETCH. Nódulos, parches, derrame pleural, absceso y cavidad también fueron visualizadas por la ETCH (Figura 2 ). La duración media desde el inicio hasta la consolidación de un solo lóbulo en las RCC fue de 2 días (rango = 1 a 5 días). La duración media desde el primer CXR positivo hasta Todos los pacientes presentaban viremia HAdV-55; en cuatro de los cinco pacientes se detectó por primera vez en muestras de aspirado endotraqueal (ETA), el tiempo entre la recolección inicial de muestras de adenovirus ETA y los resultados positivos del ácido nucleico HAdV-55 en sangre fue de 1 a 10 días (tabla 3), se determinaron copias de ADN del virus en ETA para todos los pacientes durante su estancia en la UTI, la carga viral fue superior a 1 × 10 8 copias en tres pacientes y 1 × 10 4 en un solo paciente, la carga viral se volvió negativa en el único paciente que sobrevivió; en los cuatro pacientes que no sobrevivieron, las copias de ADN no disminuyeron, incluso con terapia antiviral (figura 3 ). La oxigenación no se mantuvo con el soporte convencional NPPV o IMV en ninguno de los pacientes. La duración media hasta el fallo del NPPV fue de 30,8 horas (rango = 22 a 48 horas), y el tiempo medio hasta el fallo del IMV fue de 6,2 días (rango 2 = a 13 días) (Tabla 1). Cuatro pacientes recibieron ECMO venovenoso para mantener la saturación de oxígeno, y un paciente rechazó el soporte del ECMO y recibió ventilación oscilatoria de alta frecuencia. La Tabla 4 da los datos de oxigenación de los pacientes antes y después del ECMO venovenoso. Todos los pacientes recibieron terapia antiviral, incluyendo aciclovir (10 mg/kg, cada 8 horas, goteo intravenoso), ganciclovir (5 mg/kg, cada 12 horas, goteo intravenoso) y ribavirina (250 mg, dos veces al día, goteo intravenoso). Teniendo en cuenta que la coinfección bacteriana puede combinarse con una infección viral grave, Cuatro (80%) de los cinco pacientes fallecieron; de los cuatro pacientes que recibieron ECMO venovenoso, sólo un paciente sobrevivió; los otros cuatro murieron por ARDS, coinfección por Aspergillus fumigatus, shock séptico e infección del torrente sanguíneo relacionada con catéter debido a Acinetobacter baumannii, respectivamente; según nuestro conocimiento, este es el primer estudio observacional de cohorte sobre las características clínicas de los pacientes con ARDS grave causado por la infección emergente por HAdV-55 y también el primero en la evaluación de una prueba de carga viral para monitorear la reacción al tratamiento y para predecir el desenlace del paciente; los siguientes son los principales hallazgos de este estudio (1) HAdV-55 pueden causar ARDS grave en hombres jóvenes inmunocompetentes con sangre tipo B. Todos nuestros pacientes eran de la misma ciudad de la provincia de Hebei, en el norte de China. (2) La fiebre alta persistente, la disnea y la progresión rápida a la insuficiencia respiratoria en un plazo de 2 semanas, junto con las consolidaciones bilaterales y los infiltrados al mismo tiempo, son las manifestaciones clínicas más frecuentes de la SDRA inducida por HAdV-55 grave. (3) La monitorización de la carga viral puede ayudar a predecir la gravedad de la enfermedad y el desenlace de los pacientes. (4) Las tasas de fallo del VPN y de la VMI fueron muy elevadas, y el ECMO puede ser el último método de apoyo para este grupo de pacientes. (5) La DSRA grave inducida por HAdV-55 tiene una tasa de mortalidad muy alta (80%) a pesar de un apoyo respiratorio adecuado. La HAdV-55 se caracterizó por primera vez por completo en Shaanxi, China [7] y luego resurgió en Hebei, una provincia cercana a Beijing, donde causó varios casos de enfermedad respiratoria aguda [9]. Se presumió que la HAdV-55 era una forma recombinante de las especies B2 de HAdV-14 y HAdV-11 [7, 15] debido a que compartía un gen hexano con el chasis HAdV-11 y HAdV-14 [16]. Los resultados de nuestro estudio muestran que la HAdV-55, como patógeno emergente entre adultos inmunocompetentes, puede causar EDA severa. La prevalencia de neumonía adenoviral grave y fatal inducida por la HAdV-55 en nuestro estudio es algo similar a la descrita por Cao y colegas [6]. Todos los casos de HAdV-55 reportados en nuestro estudio eran de la misma ciudad: Baoding, Los pacientes con enfermedad grave también procedían de la misma región y fueron tratados durante un período de tiempo similar, lo que sugiere que el HAdV-55 puede ser un importante patógeno viral derivado de esta región. Los resultados de nuestro estudio sugieren que las siguientes pueden ser características clínicas del SDRA causadas por el HAdV-55: fiebre alta persistente, progresión rápida de la disnea, necesidad de soporte de ventilación mecánica, nivel AST elevado y progresión rápida de infiltrados unilaterales a consolidaciones bilaterales. Estas características clínicas son muy similares a las del SDRA causadas por otros tipos de VHAd descritos en informes anteriores [6, 9]. Estudios recientes han demostrado que el sistema inmunitario juega un papel crucial en el aclaramiento de la viremia del VHAdV y la supervivencia del huésped [17]. Chen et al. En la fase aguda de la infección por HAdV-55, los pacientes con enfermedad grave pueden tener altos niveles de células dendríticas y células Th17 [18]. En nuestro estudio, el único paciente que se recuperó de una infección grave tuvo un recuento de células T más alto. Tres de los cinco pacientes tenían recuentos de células T relativamente bajos cuando fueron admitidos. Nuestros resultados sugieren que estos tres pacientes pueden haber sido relativamente inmunocomprometidos y que un recuento de células T más bajo puede ser un factor de riesgo para la infección por HAdV-55 en adultos jóvenes. El ADN de HAdV-55 se notificó previamente en el 41,2% de los pacientes con infección grave [18]. En nuestro estudio, el ADN de HAdV-55 fue detectado y monitorizado en todos los pacientes con SDRA grave. La carga viral inicial y la tendencia de las copias del ADN del HAdV-55 en las muestras de las vías respiratorias y la sangre pueden sugerir la gravedad de la infección y pueden predecir tanto la reacción al tratamiento como el resultado del paciente. El uso de ventilación mecánica y ECMO en pacientes con SDRA causada por el HAdV-55 no ha sido detallado en estudios previos. En nuestra cohorte, encontramos que la infección grave del HAdV-55 podría causar una rápida progresión de la insuficiencia respiratoria, con una tasa de fallo muy alta para el NPPV y el IMV. Esta tasa de fracaso puede ser el resultado de la gran área de consolidación que indujo una derivación severa en el pulmón, lo que puede conducir a la falta de respuesta a la ventilación de presión positiva. Para los pacientes con SDRA grave, el ECMO debe ser considerado una mejor opción para la oxigenación. Se trata de un estudio observacional sin grupo de comparación, por lo que la diferencia entre las infecciones graves y modestas no pudo ser aclarada en términos de estado inmune, características clínicas, hallazgos radiológicos, carga viral y efectos de tratamiento en el soporte respiratorio y terapia antiviral. Se necesita un análisis dinámico secuencial para determinar la relación entre la viremia HAdV-55 y la respuesta al tratamiento.

¿Cuánto tiempo les tomó a los pacientes con adenovirus humano positivo tipo 55 (HAdV-55) para desarrollar una viremia mensurable?

La exactitud diagnóstica de la proteína C reactiva y la procalcitonina en los adultos sospechosos de neumonía adquirida en la comunidad que visitan el departamento de emergencia y tienen una tomografía computarizada torácica sistemáticahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4608327/SHA: f3d150545162ff3cc253c235011a02a91ee676cbAutores: Le Bel, Josselin; Hausfater, Pierre; Chenevier-Gobeaux, Camille; Blanc, François-Xavier; Benjoar, Mikhael; Ficko, Cécile; Ray, Patrick; Choquet, Christophe; Duval, Xavier; Claessens, Yann-ErickFecha: 2015-10-16DO Se ha evaluado la mejoría del diagnóstico de la CAP bacteriana por biomarcadores mediante infiltrado de rayos X de tórax como estándar oro de la CAP, produciendo resultados contradictorios.Se ha analizado la exactitud diagnóstica de los biomarcadores en pacientes adultos sospechosos de la CAP que visitan los departamentos de emergencia para los que se estableció el diagnóstico de la CAP por un comité de adjudicación que fundó su juicio sobre una tomografía computarizada torácica multidetector sistemática.MÉTODOS: En un estudio auxiliar de un estudio prospectivo multicéntrico que evaluó el impacto de la tomografía computarizada torácica sistemática en el diagnóstico de la CAP, se evaluaron la sensibilidad y especificidad de la proteína C reactiva (PCR) y la procalcitonina (PCT). El comité de adjudicación clasificó a 98 pacientes (49,0%) como CAP definida, 8 (4,0%) como probable, 23 (11,5 %) como posible y excluido en 71 (35,5 %, incluyendo 29 pacientes con infiltrados pulmonares en rayos X de tórax). Entre los pacientes con infiltrado pulmonar radiológico, el 23% fueron finalmente clasificados como excluidos. Los virus fueron identificados por PCR en el 29 % de los pacientes clasificados como definidos. El área bajo la curva fue de 0,787 [intervalo de confianza del 95 % (IC del 95 %)), 0,717 a 0,857] para PCR y 0,655 (IC del 95 %, 0,570 a 0,739) para PCT para detectar CAP definida. El umbral de PCR a 50 mg/L resultó en un valor predictivo positivo de 0,76 y un valor predictivo negativo de 0,75. CONCLUSIONES: Para los pacientes con sospecha de CAP que visitan los servicios de emergencia, la precisión diagnóstica de PCR y PCT es insuficiente para confirmar el diagnóstico de la CAP establecido utilizando un estándar de oro que incluye la tomografía computarizada torácica. La precisión diagnóstica de estos biomarcadores también es insuficiente para distinguir la CAP bacteriana de la CAP viral. REGISTRO TRIAL: ClinicalTrials.gov register NCT01574066 (7 de febrero de 2012) Electrónicamente suplemental MATERIAL: La versión en línea de este artículo (doi:10.1186/s13054-015-1083-6) contiene material suplementario, que está disponible para usuarios autorizados. Texto: La neumonía adquirida en la comunidad (CAP) es una enfermedad frecuentemente vista, con alta morbilidad y mortalidad, que representa 600.000 hospitalizaciones cada año. Representa la séptima causa principal de El pronóstico de la CAP depende de la rapidez del tratamiento específico, que idealmente debería iniciarse dentro de las cuatro horas y a más tardar ocho horas después del diagnóstico [2, 3]. El diagnóstico de la CAP se basa en la agrupación de síntomas pulmonares y generales no específicos [4, 5], un aumento de biomarcadores que reflejan el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIR) y la presencia de nuevos infiltrados parénquimales en la radiografía de tórax. Sin embargo, el diagnóstico de la CAP sigue siendo incierto en muchos casos con diagnósticos alternativos, como insuficiencia cardiaca, bronquitis aguda, exacerbaciones de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), embolia pulmonar, neoplasia y sepsis [6, 7]. Parte de la incertidumbre del diagnóstico de la CAP puede deberse a la alta tasa de mal diagnóstico de los rayos X del tórax [8, 9] ; sobre el diagnóstico de la CAP es frecuente cuando los infiltrados de origen no infeccioso coexisten con síntomas pulmonares o generales, y el diagnóstico de la CAP a menudo se ignora cuando los infiltrados pulmonares se encuentran en el límite de visibilidad o se ocultan debido a la superposición [10]. Recientemente se publicó un estudio en el que se realizó sistemáticamente una tomografía computarizada torácica en una población de pacientes clínicamente sospechosos que visitaban el servicio de emergencia de la CAP (estudio ESCAPED) [11]. Demostramos que el diagnóstico de la CAP basado en la radiografía de tórax condujo a un falso diagnóstico de la CAP en muchos pacientes: entre los pacientes sospechosos de la CAP con infiltrado pulmonar radiológico, el diagnóstico de la CAP se excluyó en alrededor del 30% de También reportamos el aislamiento de virus en un tercio de los pacientes [11, 12]. Se han realizado varios intentos para mejorar el diagnóstico de la CAP con base en biomarcadores, como la proteína C-reactiva (PCR) y la procalcitonina (PCT); sin embargo, existen datos contradictorios sobre su confiabilidad [13] [14] [15] [16] [17]. Esto podría deberse a la consideración del diagnóstico de la CAP con base en la radiografía torácica como el establecimiento de infección pulmonar.En el presente estudio, se pretende analizar los valores de la PCR y PCT en la población del estudio ESCAPED reportado anteriormente para quien el diagnóstico de la CAP fue establecido por un comité de adjudicación que fundó su juicio sobre todos los datos habituales disponibles, la tomografía computarizada multidetector sistemática realizada al momento de la inclusión, y los resultados de un seguimiento del día 28. También analizamos si la etiología viral de la CAP definida basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) multiplex nasofaríngea interfería con la precisión de los biomarcadores. Setting ESCAPED fue un estudio multicéntrico, prospectivo, intervencionista, titulado "Early Thoracic CT-Scan for Community-Adquired Pneumony at the Emergency Department (ESCAPED)" [11], realizado entre noviembre de 2011 y enero de 2013, en cuatro departamentos de emergencia (ED) de cuatro hospitales de enseñanza terciaria en París, Francia, diseñado para medir el impacto de la tomografía torácica en la decisión clínica. El estudio fue patrocinado y supervisado por los hospitales públicos de salud de París, y financiado por el Ministerio de Salud de Francia. El protocolo fue registrado en el sitio web clinicaltrial.gov bajo el acrónimo PACSCAN, la traducción al francés del acrónimo inglés ESCAPED (NCT01574066). El Comité de Ética de Ile de France (Comité de Protección des Personnes. Paris N°2 011-oct-1274) aprobó el protocolo del estudio. El objetivo principal fue comparar los valores de PCR y PCT en las cuatro diferentes categorías de nivel de certeza de la PAC utilizando la clasificación del comité de adjudicación del día-28. Las cuatro categorías fueron: 1) ausencia de CAP en adelante referido como diagnóstico de CAP excluido; 2) posible CAP; 3) probable CAP; y 4) definitiva CAP. Los objetivos secundarios fueron evaluar si la PCR y la PCT se asociaron al diagnóstico de la CAP mediante análisis de sensibilidad en tres subgrupos sucesivos elegidos a priori; 1) cuando se consideró específicamente a los pacientes clasificados como excluidos del diagnóstico de la CAP y de la CAP definida (es decir, los pacientes para los que el nivel de certeza era más alto); 2) cuando los pacientes con diagnóstico de la CAP excluida y enfermedad infecciosa extrapulmonar diagnosticada (que puede aumentar los valores de biomarcadores) no se tuvieron en cuenta en el grupo de la CAP excluida; y 3) cuando los pacientes clasificados como CAP viral no se tuvieron en cuenta en el grupo de la CAP definida, ya que la PCT ha sido reportada como menor en infecciones virales en comparación con las infecciones bacterianas [18]. Adultos consecutivos ([19]. Los cuatro niveles de probabilidad de CAP según la tomografía computarizada se definieron como definidos (condensación alveolar sistémica, condensación alveolar con opacidades periféricas y localizadas de vidrio molido, micronódulos focales bronquiolares o multifocales), probables (condensación alveolar periférica, condensación alveolar sistemática retráctil o o opacidades difusas de vidrio molido), posibles (infarto pulmonar), o excluidas (masa pulmonar, otras anormalidades o imágenes normales). Se grabaron las vistas de exploración en un DVD. Sobre la base de los datos recogidos de los formularios de reporte de casos estandarizados de referencia, el DVD grabó imágenes de rayos X y CTscan, y cegó a las interpretaciones locales, un comité de adjudicación compuesto por tres expertos superiores independientes en enfermedades infecciosas, neumología y radiología asignaron retrospectivamente la probabilidad de diagnóstico de CAP utilizando la misma escala Likert de 4 niveles, con todos los datos disponibles, incluyendo el resumen del alta de pacientes, y los datos de seguimiento obtenidos por investigadores auxiliares que contactaron por teléfono al paciente, familiares o médicos generales en el día 28. Para este estudio, el estándar oro de la CAP fue el diagnóstico evaluado por este comité de adjudicación. Se establecieron diagnósticos alternativos para la CAP excluida y clasificadas como enfermedades pulmonares no CAP y enfermedades infecciosas extrapulmonares y otras. Las concentraciones de PCT y PCT se midieron a posteriori en la recogida plasmática (ver ficha adicional 1 para la metodología), excepto en los pacientes en los que la dosis de marcadores fue realizada por el médico de urgencias por iniciativa propia. Se recogieron hisopos nasofaríngeos en la inscripción y se colocaron en un medio de transporte MWE Viroculto Medio (Sigma®). Las muestras se mantuvieron a temperatura ambiente y se enviaron al laboratorio de virología del Hospital Bichat -Claude Bernard (París) tan pronto como fue posible después de la recogida. PCR multiplex (ensayo RespiFinder-19 (Pathofinder®, Maastricht, Países Bajos)) se realizó en hisopos nasofaríngeos para detectar 15 virus respiratorios -coronavirus 229E, NL63, OC43, metapneumovirus humano (hMPV), influenza A, A (H1N1) pdm2009 y virus B, virus parainfluenza 1, 2, 3 y 4, virus sincitial respiratorio (RSV) A y B, rinovirus, adenovirus y 4 bacterias intracelulares -Bordetella pertussis, Chlamydophila pneumoniae, Legionella pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, en una reacción. También se realizaron exámenes microbiológicos rutinarios a criterio de los médicos de emergencia e incluyeron hemocultivo, cultivo de esputo y antígenouria (ver ficha adicional 1 para la metodología). La CAP, clasificada como definida, fue considerada de origen viral cuando la PCR múltiple fue positiva para al menos uno de los 15 virus respiratorios y no se encontraron bacterias utilizando PCR y muestras microbiológicas bacterianas rutinarias (esputo, cultivo de sangre, antígenouria) cuando se realizó. Las características basales y de seguimiento fueron descritas por medio y desviaciones estándar (DE) o por mediana e intercuartílico (IQR) para variables continuas normalmente distribuidas o con distribución sesgada, respectivamente, y por porcentajes para variables categóricas, para la población total del estudio y para los grupos de estudio. Se realizaron pruebas exactas de chi-cuadrado o Fisher cuando fue apropiado para variables cualitativas, y las pruebas de Student o Mann-Whitney para variables continuas con distribuciones sesgadas para comparar las características basales de los pacientes y los resultados del estudio entre los grupos de estudio. Los valores de distribución de los biomarcadores se determinaron en las diferentes poblaciones de pacientes utilizando boxplots. Los resultados de PCR y PCT en la predicción de la CAP definida fueron evaluados mediante análisis de sensibilidad (CAP definida vs CAP excluida). La PCR fue evaluada en varios puntos de corte de 20 mg/L, 30 mg/L, 50 mg/L, 70 mg/L y 100 mg/L, valores utilizados en estudios previos [15, 20, 21]. Se seleccionaron varios puntos de corte para PCT a un nivel de 0,10 μg/L [18], y a los dos niveles de sospecha de infección bacteriana según lo indicado por el fabricante, es decir, 0,25 μg/L y 0,50 μg/L. Se calcularon sensibilidades, especificidades, valores predictivos positivos (VPP), valores predictivos negativos (VPN) y relación de probabilidad. Se dibujaron curvas de característica operativa del receptor (ROC), área bajo la curva AUC se calculó y se identificó un corte óptimo mediante la maximización del índice de Youden, comparando los valores de biomarcador en pacientes con CAP excluido y CAP definido. A partir de estos cortes óptimos para PCT y PCT, se realizaron análisis de sensibilidad combinando los cortes de PCT y PCT. Se construyó un modelo de regresión logística multivariable para identificar factores asociados a tener una CAP definida en comparación con un diagnóstico de CAP excluido. Excluimos del grupo de diagnóstico de CAP excluido, pacientes con una enfermedad infecciosa extrapulmonar. Todas las variables con un valor de p < 0,25 en el análisis bivariado fueron ingresadas en una regresión logística multivariable con una aproximación escalonada hacia atrás; la discriminación fue evaluada por el índice C y su intervalo de confianza del 95% (IC 95%) y la calibración fue evaluada por la prueba de bondad de ajuste de Hosmer Lemeshow. Todas las pruebas fueron de dos lados, y se consideraron valores de p por debajo de 0,05 para denotar significancia estadística. Doscientos pacientes con sospecha de CAP de los 319 del estudio ESCAPED fueron incluidos en el presente estudio, para los cuales se disponía de pruebas de PCR y PCT y hisopo nasofaríngeo para PCR múltiple (fig. 1). Las características de los 200 pacientes (edad, edad superior a 65 años, sexo, probabilidad de diagnóstico de PCR por el comité de adjudicación) no fueron significativamente diferentes de las de los 119 pacientes del estudio ESCAPED y se resumen en la Tabla 1. Los ensayos de PCR y PCT se realizaron por iniciativa propia del médico de urgencia en 70 pacientes para PCR y 131 para PCT, o a posteriori en muestras plasmáticas de los pacientes restantes. La relación de sexo fue de aproximadamente 1. Más de la mitad de los pacientes (54%) tenían 65 años o más. Los infiltrados pulmonares se observaron en rayos X de tórax en 127 pacientes (63,5 %). La TAC torácica excluyó un diagnóstico de CAP en el 16,5 % de estos 127 pacientes; por el contrario, la tomografía torácica reveló un infiltrado parénquima en el 27 % de los 73 pacientes sin infiltrarse en la radiografía de tórax. Basándose en todos los datos disponibles, incluyendo resultados de la tomografía computarizada multidetectora (pero excluyendo los resultados de la PCR), la adjudicación Las distribuciones de PCR y PCT en los 200 pacientes se presentan en la Fig. 2 Se demostró una diferencia estadísticamente significativa entre los dos grupos (excluida la CAP frente a la CAP definida) para varios puntos de corte para la PCR y la PCT (Tabla 2 ). Para la PCR, el valor de 50 mg/L resultó en una PPV de 0,76 y una VPN de 0,75. Para la PCT, ningún valor resultó en un PPV o NPV satisfactorio. El AUC fue de 0,787 (IC 95% 0,717-0,857), corte óptimo = 45,9 mg/L para PCT (Fig. 3 ) y 0,655 (IC 95% 0,570-0,739), corte óptimo = 0,13 μg/L para PCT (Fig. 4). Los análisis de sensibilidad para la combinación de PCR y PCT, utilizando estos cortes óptimos, dieron lugar a un PPV de 0,74 y un NPV de 0,58. El uso de los otros cortes de PCT no dio lugar a una mejor PPV o NPV (Tabla 2). El presente estudio es novedoso ya que los pacientes se beneficiaron prospectivamente de una extensa investigación para determinar el diagnóstico de CAP en la DE, incluyendo tanto el comité de adjudicación de la TC torácica multidetector precoz como el del día 28. En estos pacientes ampliamente caracterizados, tanto la PCR como la PCT carecían de precisión operativa para permitir que el proceso de toma de decisiones descartara o confirmara el diagnóstico de CAP incluso en subgrupos seleccionados. Las características clínicas de los pacientes incluidos en este subestudio son consistentes con las de la literatura actual. Como se informó anteriormente, los pacientes tenían con frecuencia antecedentes de trastornos respiratorios, cáncer e insuficiencia cardíaca congestiva [21, 22]. El diseño del estudio ESCAPED requirió la exclusión de pacientes dentro de las categorías más altas de CRB 65, lo que limitó la inclusión de pacientes mayores de 65 años. Esto puede explicar por qué la edad media de nuestros pacientes (64 años) cae dentro de los valores más bajos de los reportados en otras partes [19]. Los datos para identificar el agente microbiano responsable de la enfermedad fueron recolectados por las técnicas habituales y PCR múltiplex. La identificación viral mediante PCR nasofaríngeo que reveló infección respiratoria viral en aproximadamente un tercio de los casos fue concordante con los valores reportados en la literatura [23], por lo que creemos que nuestros resultados pueden ser extrapolados a la mayoría de los pacientes de emergencia con CAP. En el presente estudio, los pacientes fueron reclutados sobre la base de la evaluación clínica inicial para el diagnóstico de CAP. Por lo tanto, creemos que las características de los pacientes corresponden estrechamente a las que llevan a los profesionales a considerar un posible diagnóstico de CAP. En estos pacientes, el diseño de nuestro estudio nos permitió confirmar o refutar el diagnóstico de CAP con un alto nivel de certeza. Los resultados confirmaron el escaso valor predictivo de los síntomas clínicos (nuevo inicio de características sistémicas y síntomas de una enfermedad aguda del tracto respiratorio inferior) en la identificación de pacientes con CAP [21]. Además, el diseño también reveló que la combinación de los síntomas clínicos y los resultados de las radiografías torácicas condujo a un mal diagnóstico de CAP en un alto número de pacientes, incluyendo los 98 cuyo diagnóstico de CAP fue excluido por el comité de adjudicación y que habrían sido considerados como posible, probable o definido CAP sin el uso de la tomografía computarizada. Esta baja especificidad de la evaluación radiológica clínica estándar llevó a la consideración de enfermedades pulmonares no infecciosas (como, insuficiencia cardíaca, embolia pulmonar, neoplasia pulmonar o bronquitis) o enfermedades infecciosas extrapulmonares como CAP. Cabe destacar que algunas de estas enfermedades también están asociadas con el aumento de los valores de biomarcadores, lo que suscita preocupación por las evaluaciones previas de biomarcadores en pacientes sospechosos de CAP, que utilizaron evaluaciones clínicas y radiológicas estándar (rayos X de tórax) como estándar de oro para el diagnóstico de CAP [15]. Se ha defendido el uso de biomarcadores para mejorar el diagnóstico y el manejo de pacientes con infecciones del tracto respiratorio inferior [14]. Sin embargo, esta cuestión sigue sin resolverse [24], con posiciones conflictivas [14, 15, 25, 26]. En nuestro estudio, mientras que la mediana de los valores de ambos biomarcadores aumentó con el nivel de certeza para el diagnóstico de la CAP, no pudimos establecer valores discriminatorios para la PCT. Datos recientes sugieren que la PCR podría ser de mayor ayuda para ayudar en el diagnóstico de infecciones del tracto respiratorio inferior (LRTI) [15, 27, 28]. En nuestro estudio, aunque la PCR parece más discriminatoria que la PCT, ni la exclusión experimental de infecciones bacterianas extrapulmonares del grupo de la CAP excluido, ni la exclusión de la CAP viral del grupo de pacientes con CAP definido, hicieron posible la determinación de un corte discriminante. La combinación de PCR Un algoritmo operativo ha sido liberado para ayudar a los médicos a prescribir terapia antimicrobiana [14, 26, 29]. De acuerdo con esta estrategia, una concentración de PCT superior a 0,25 μg/L debería impulsar la administración de antibióticos a pacientes con sospecha de ITRL. En nuestro estudio, este valor se asoció con un bajo rendimiento. Además, los niveles medios de PCT permanecieron por encima de este umbral tanto en pacientes excluidos de la CAP sin trastornos infecciosos como en la CAP definida presumiblemente relacionada con el virus. Por lo tanto, el estándar oro para el diagnóstico de la CAP puede influir en el desempeño y utilidad de la TCP en este entorno. Este estudio tiene algunas limitaciones. Primero, el comité de adjudicación no fue cegado al valor de los biomarcadores medidos en la cama en algunos pacientes (70 para la PCR y 131 para la PCT) y su clasificación de la CAP podría Sin embargo, la falta de diferencias estadísticamente significativas en los valores medios de PCR y PCT en los casos definidos de CAP, independientemente de que estos biomarcadores estuvieran o no disponibles para el comité de adjudicación, argumenta contra un gran impacto de estos resultados en la clasificación del comité de adjudicación. Segundo, otro punto crítico es la prescripción de terapia antibiótica (34 %) antes de la inclusión. No podemos excluir que estos pacientes previamente tratados con CAP puedan tener un rendimiento biomarcador alterado y reducir el rendimiento de cultivos bacterianos, aunque tal población refleje la práctica habitual del departamento de emergencia. Tercero, se realizó PCR multiplex en el muestreo nasofaríngeo y no en muestras del tracto respiratorio inferior, lo que no permite una confirmación definitiva del origen viral de la CAP. Sin embargo, un estudio reciente de gran envergadura sobre pacientes con CAP que reportaron una etiología viral de la CAP a una tasa comparable, no encontró derrame del tracto respiratorio superior en una Finalmente, incluso si la tomografía computarizada torácica multidetector es un examen por imágenes mejor que la radiografía para explorar el tórax, sólo muestras microbiológicas locales invasivas habrían proporcionado un diagnóstico con certeza. Dada la diversidad de las presentaciones de la CAP clínica y radiológica, el diagnóstico de la CAP es a menudo incierto.En nuestra población de pacientes tratados en la sala de urgencias con síntomas clínicos que evocan la CAP, ni los valores de corte de PCT ni PCT tenían suficiente peso para confirmar o refutar el diagnóstico de la CAP en la cama; esto subraya que estos biomarcadores son testigos de la respuesta inflamatoria del huésped a la intrusión de microorganismos independientes del lugar de la infección.Estos resultados, basados en una evaluación sistemática de la tomografía computarizada torácica de pacientes sospechosos de la CAP, no argumentan el uso de la PCR y la PCT en el cuidado rutinario para diagnosticar la CAP

¿Cuántos pacientes con neumonía adquirida en la comunidad son hospitalizados cada año?

La exactitud diagnóstica de la proteína C reactiva y la procalcitonina en los adultos sospechosos de neumonía adquirida en la comunidad que visitan el departamento de emergencia y tienen una tomografía computarizada torácica sistemáticahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4608327/SHA: f3d150545162ff3cc253c235011a02a91ee676cbAutores: Le Bel, Josselin; Hausfater, Pierre; Chenevier-Gobeaux, Camille; Blanc, François-Xavier; Benjoar, Mikhael; Ficko, Cécile; Ray, Patrick; Choquet, Christophe; Duval, Xavier; Claessens, Yann-ErickFecha: 2015-10-16DO Se ha evaluado la mejoría del diagnóstico de la CAP bacteriana por biomarcadores mediante infiltrado de rayos X de tórax como estándar oro de la CAP, produciendo resultados contradictorios.Se ha analizado la exactitud diagnóstica de los biomarcadores en pacientes adultos sospechosos de la CAP que visitan los departamentos de emergencia para los que se estableció el diagnóstico de la CAP por un comité de adjudicación que fundó su juicio sobre una tomografía computarizada torácica multidetector sistemática.MÉTODOS: En un estudio auxiliar de un estudio prospectivo multicéntrico que evaluó el impacto de la tomografía computarizada torácica sistemática en el diagnóstico de la CAP, se evaluaron la sensibilidad y especificidad de la proteína C reactiva (PCR) y la procalcitonina (PCT). El comité de adjudicación clasificó a 98 pacientes (49,0%) como CAP definida, 8 (4,0%) como probable, 23 (11,5 %) como posible y excluido en 71 (35,5 %, incluyendo 29 pacientes con infiltrados pulmonares en rayos X de tórax). Entre los pacientes con infiltrado pulmonar radiológico, el 23% fueron finalmente clasificados como excluidos. Los virus fueron identificados por PCR en el 29 % de los pacientes clasificados como definidos. El área bajo la curva fue de 0,787 [intervalo de confianza del 95 % (IC del 95 %)), 0,717 a 0,857] para PCR y 0,655 (IC del 95 %, 0,570 a 0,739) para PCT para detectar CAP definida. El umbral de PCR a 50 mg/L resultó en un valor predictivo positivo de 0,76 y un valor predictivo negativo de 0,75. CONCLUSIONES: Para los pacientes con sospecha de CAP que visitan los servicios de emergencia, la precisión diagnóstica de PCR y PCT es insuficiente para confirmar el diagnóstico de la CAP establecido utilizando un estándar de oro que incluye la tomografía computarizada torácica. La precisión diagnóstica de estos biomarcadores también es insuficiente para distinguir la CAP bacteriana de la CAP viral. REGISTRO TRIAL: ClinicalTrials.gov register NCT01574066 (7 de febrero de 2012) Electrónicamente suplemental MATERIAL: La versión en línea de este artículo (doi:10.1186/s13054-015-1083-6) contiene material suplementario, que está disponible para usuarios autorizados. Texto: La neumonía adquirida en la comunidad (CAP) es una enfermedad frecuentemente vista, con alta morbilidad y mortalidad, que representa 600.000 hospitalizaciones cada año. Representa la séptima causa principal de El pronóstico de la CAP depende de la rapidez del tratamiento específico, que idealmente debería iniciarse dentro de las cuatro horas y a más tardar ocho horas después del diagnóstico [2, 3]. El diagnóstico de la CAP se basa en la agrupación de síntomas pulmonares y generales no específicos [4, 5], un aumento de biomarcadores que reflejan el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIR) y la presencia de nuevos infiltrados parénquimales en la radiografía de tórax. Sin embargo, el diagnóstico de la CAP sigue siendo incierto en muchos casos con diagnósticos alternativos, como insuficiencia cardiaca, bronquitis aguda, exacerbaciones de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), embolia pulmonar, neoplasia y sepsis [6, 7]. Parte de la incertidumbre del diagnóstico de la CAP puede deberse a la alta tasa de mal diagnóstico de los rayos X del tórax [8, 9] ; sobre el diagnóstico de la CAP es frecuente cuando los infiltrados de origen no infeccioso coexisten con síntomas pulmonares o generales, y el diagnóstico de la CAP a menudo se ignora cuando los infiltrados pulmonares se encuentran en el límite de visibilidad o se ocultan debido a la superposición [10]. Recientemente se publicó un estudio en el que se realizó sistemáticamente una tomografía computarizada torácica en una población de pacientes clínicamente sospechosos que visitaban el servicio de emergencia de la CAP (estudio ESCAPED) [11]. Demostramos que el diagnóstico de la CAP basado en la radiografía de tórax condujo a un falso diagnóstico de la CAP en muchos pacientes: entre los pacientes sospechosos de la CAP con infiltrado pulmonar radiológico, el diagnóstico de la CAP se excluyó en alrededor del 30% de También reportamos el aislamiento de virus en un tercio de los pacientes [11, 12]. Se han realizado varios intentos para mejorar el diagnóstico de la CAP con base en biomarcadores, como la proteína C-reactiva (PCR) y la procalcitonina (PCT); sin embargo, existen datos contradictorios sobre su confiabilidad [13] [14] [15] [16] [17]. Esto podría deberse a la consideración del diagnóstico de la CAP con base en la radiografía torácica como el establecimiento de infección pulmonar.En el presente estudio, se pretende analizar los valores de la PCR y PCT en la población del estudio ESCAPED reportado anteriormente para quien el diagnóstico de la CAP fue establecido por un comité de adjudicación que fundó su juicio sobre todos los datos habituales disponibles, la tomografía computarizada multidetector sistemática realizada al momento de la inclusión, y los resultados de un seguimiento del día 28. También analizamos si la etiología viral de la CAP definida basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) multiplex nasofaríngea interfería con la precisión de los biomarcadores. Setting ESCAPED fue un estudio multicéntrico, prospectivo, intervencionista, titulado "Early Thoracic CT-Scan for Community-Adquired Pneumony at the Emergency Department (ESCAPED)" [11], realizado entre noviembre de 2011 y enero de 2013, en cuatro departamentos de emergencia (ED) de cuatro hospitales de enseñanza terciaria en París, Francia, diseñado para medir el impacto de la tomografía torácica en la decisión clínica. El estudio fue patrocinado y supervisado por los hospitales públicos de salud de París, y financiado por el Ministerio de Salud de Francia. El protocolo fue registrado en el sitio web clinicaltrial.gov bajo el acrónimo PACSCAN, la traducción al francés del acrónimo inglés ESCAPED (NCT01574066). El Comité de Ética de Ile de France (Comité de Protección des Personnes. Paris N°2 011-oct-1274) aprobó el protocolo del estudio. El objetivo principal fue comparar los valores de PCR y PCT en las cuatro diferentes categorías de nivel de certeza de la PAC utilizando la clasificación del comité de adjudicación del día-28. Las cuatro categorías fueron: 1) ausencia de CAP en adelante referido como diagnóstico de CAP excluido; 2) posible CAP; 3) probable CAP; y 4) definitiva CAP. Los objetivos secundarios fueron evaluar si la PCR y la PCT se asociaron al diagnóstico de la CAP mediante análisis de sensibilidad en tres subgrupos sucesivos elegidos a priori; 1) cuando se consideró específicamente a los pacientes clasificados como excluidos del diagnóstico de la CAP y de la CAP definida (es decir, los pacientes para los que el nivel de certeza era más alto); 2) cuando los pacientes con diagnóstico de la CAP excluida y enfermedad infecciosa extrapulmonar diagnosticada (que puede aumentar los valores de biomarcadores) no se tuvieron en cuenta en el grupo de la CAP excluida; y 3) cuando los pacientes clasificados como CAP viral no se tuvieron en cuenta en el grupo de la CAP definida, ya que la PCT ha sido reportada como menor en infecciones virales en comparación con las infecciones bacterianas [18]. Adultos consecutivos ([19]. Los cuatro niveles de probabilidad de CAP según la tomografía computarizada se definieron como definidos (condensación alveolar sistémica, condensación alveolar con opacidades periféricas y localizadas de vidrio molido, micronódulos focales bronquiolares o multifocales), probables (condensación alveolar periférica, condensación alveolar sistemática retráctil o o opacidades difusas de vidrio molido), posibles (infarto pulmonar), o excluidas (masa pulmonar, otras anormalidades o imágenes normales). Se grabaron las vistas de exploración en un DVD. Sobre la base de los datos recogidos de los formularios de reporte de casos estandarizados de referencia, el DVD grabó imágenes de rayos X y CTscan, y cegó a las interpretaciones locales, un comité de adjudicación compuesto por tres expertos superiores independientes en enfermedades infecciosas, neumología y radiología asignaron retrospectivamente la probabilidad de diagnóstico de CAP utilizando la misma escala Likert de 4 niveles, con todos los datos disponibles, incluyendo el resumen del alta de pacientes, y los datos de seguimiento obtenidos por investigadores auxiliares que contactaron por teléfono al paciente, familiares o médicos generales en el día 28. Para este estudio, el estándar oro de la CAP fue el diagnóstico evaluado por este comité de adjudicación. Se establecieron diagnósticos alternativos para la CAP excluida y clasificadas como enfermedades pulmonares no CAP y enfermedades infecciosas extrapulmonares y otras. Las concentraciones de PCT y PCT se midieron a posteriori en la recogida plasmática (ver ficha adicional 1 para la metodología), excepto en los pacientes en los que la dosis de marcadores fue realizada por el médico de urgencias por iniciativa propia. Se recogieron hisopos nasofaríngeos en la inscripción y se colocaron en un medio de transporte MWE Viroculto Medio (Sigma®). Las muestras se mantuvieron a temperatura ambiente y se enviaron al laboratorio de virología del Hospital Bichat -Claude Bernard (París) tan pronto como fue posible después de la recogida. PCR multiplex (ensayo RespiFinder-19 (Pathofinder®, Maastricht, Países Bajos)) se realizó en hisopos nasofaríngeos para detectar 15 virus respiratorios -coronavirus 229E, NL63, OC43, metapneumovirus humano (hMPV), influenza A, A (H1N1) pdm2009 y virus B, virus parainfluenza 1, 2, 3 y 4, virus sincitial respiratorio (RSV) A y B, rinovirus, adenovirus y 4 bacterias intracelulares -Bordetella pertussis, Chlamydophila pneumoniae, Legionella pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, en una reacción. También se realizaron exámenes microbiológicos rutinarios a criterio de los médicos de emergencia e incluyeron hemocultivo, cultivo de esputo y antígenouria (ver ficha adicional 1 para la metodología). La CAP, clasificada como definida, fue considerada de origen viral cuando la PCR múltiple fue positiva para al menos uno de los 15 virus respiratorios y no se encontraron bacterias utilizando PCR y muestras microbiológicas bacterianas rutinarias (esputo, cultivo de sangre, antígenouria) cuando se realizó. Las características basales y de seguimiento fueron descritas por medio y desviaciones estándar (DE) o por mediana e intercuartílico (IQR) para variables continuas normalmente distribuidas o con distribución sesgada, respectivamente, y por porcentajes para variables categóricas, para la población total del estudio y para los grupos de estudio. Se realizaron pruebas exactas de chi-cuadrado o Fisher cuando fue apropiado para variables cualitativas, y las pruebas de Student o Mann-Whitney para variables continuas con distribuciones sesgadas para comparar las características basales de los pacientes y los resultados del estudio entre los grupos de estudio. Los valores de distribución de los biomarcadores se determinaron en las diferentes poblaciones de pacientes utilizando boxplots. Los resultados de PCR y PCT en la predicción de la CAP definida fueron evaluados mediante análisis de sensibilidad (CAP definida vs CAP excluida). La PCR fue evaluada en varios puntos de corte de 20 mg/L, 30 mg/L, 50 mg/L, 70 mg/L y 100 mg/L, valores utilizados en estudios previos [15, 20, 21]. Se seleccionaron varios puntos de corte para PCT a un nivel de 0,10 μg/L [18], y a los dos niveles de sospecha de infección bacteriana según lo indicado por el fabricante, es decir, 0,25 μg/L y 0,50 μg/L. Se calcularon sensibilidades, especificidades, valores predictivos positivos (VPP), valores predictivos negativos (VPN) y relación de probabilidad. Se dibujaron curvas de característica operativa del receptor (ROC), área bajo la curva AUC se calculó y se identificó un corte óptimo mediante la maximización del índice de Youden, comparando los valores de biomarcador en pacientes con CAP excluido y CAP definido. A partir de estos cortes óptimos para PCT y PCT, se realizaron análisis de sensibilidad combinando los cortes de PCT y PCT. Se construyó un modelo de regresión logística multivariable para identificar factores asociados a tener una CAP definida en comparación con un diagnóstico de CAP excluido. Excluimos del grupo de diagnóstico de CAP excluido, pacientes con una enfermedad infecciosa extrapulmonar. Todas las variables con un valor de p < 0,25 en el análisis bivariado fueron ingresadas en una regresión logística multivariable con una aproximación escalonada hacia atrás; la discriminación fue evaluada por el índice C y su intervalo de confianza del 95% (IC 95%) y la calibración fue evaluada por la prueba de bondad de ajuste de Hosmer Lemeshow. Todas las pruebas fueron de dos lados, y se consideraron valores de p por debajo de 0,05 para denotar significancia estadística. Doscientos pacientes con sospecha de CAP de los 319 del estudio ESCAPED fueron incluidos en el presente estudio, para los cuales se disponía de pruebas de PCR y PCT y hisopo nasofaríngeo para PCR múltiple (fig. 1). Las características de los 200 pacientes (edad, edad superior a 65 años, sexo, probabilidad de diagnóstico de PCR por el comité de adjudicación) no fueron significativamente diferentes de las de los 119 pacientes del estudio ESCAPED y se resumen en la Tabla 1. Los ensayos de PCR y PCT se realizaron por iniciativa propia del médico de urgencia en 70 pacientes para PCR y 131 para PCT, o a posteriori en muestras plasmáticas de los pacientes restantes. La relación de sexo fue de aproximadamente 1. Más de la mitad de los pacientes (54%) tenían 65 años o más. Los infiltrados pulmonares se observaron en rayos X de tórax en 127 pacientes (63,5 %). La TAC torácica excluyó un diagnóstico de CAP en el 16,5 % de estos 127 pacientes; por el contrario, la tomografía torácica reveló un infiltrado parénquima en el 27 % de los 73 pacientes sin infiltrarse en la radiografía de tórax. Basándose en todos los datos disponibles, incluyendo resultados de la tomografía computarizada multidetectora (pero excluyendo los resultados de la PCR), la adjudicación Las distribuciones de PCR y PCT en los 200 pacientes se presentan en la Fig. 2 Se demostró una diferencia estadísticamente significativa entre los dos grupos (excluida la CAP frente a la CAP definida) para varios puntos de corte para la PCR y la PCT (Tabla 2 ). Para la PCR, el valor de 50 mg/L resultó en una PPV de 0,76 y una VPN de 0,75. Para la PCT, ningún valor resultó en un PPV o NPV satisfactorio. El AUC fue de 0,787 (IC 95% 0,717-0,857), corte óptimo = 45,9 mg/L para PCT (Fig. 3 ) y 0,655 (IC 95% 0,570-0,739), corte óptimo = 0,13 μg/L para PCT (Fig. 4). Los análisis de sensibilidad para la combinación de PCR y PCT, utilizando estos cortes óptimos, dieron lugar a un PPV de 0,74 y un NPV de 0,58. El uso de los otros cortes de PCT no dio lugar a una mejor PPV o NPV (Tabla 2). El presente estudio es novedoso ya que los pacientes se beneficiaron prospectivamente de una extensa investigación para determinar el diagnóstico de CAP en la DE, incluyendo tanto el comité de adjudicación de la TC torácica multidetector precoz como el del día 28. En estos pacientes ampliamente caracterizados, tanto la PCR como la PCT carecían de precisión operativa para permitir que el proceso de toma de decisiones descartara o confirmara el diagnóstico de CAP incluso en subgrupos seleccionados. Las características clínicas de los pacientes incluidos en este subestudio son consistentes con las de la literatura actual. Como se informó anteriormente, los pacientes tenían con frecuencia antecedentes de trastornos respiratorios, cáncer e insuficiencia cardíaca congestiva [21, 22]. El diseño del estudio ESCAPED requirió la exclusión de pacientes dentro de las categorías más altas de CRB 65, lo que limitó la inclusión de pacientes mayores de 65 años. Esto puede explicar por qué la edad media de nuestros pacientes (64 años) cae dentro de los valores más bajos de los reportados en otras partes [19]. Los datos para identificar el agente microbiano responsable de la enfermedad fueron recolectados por las técnicas habituales y PCR múltiplex. La identificación viral mediante PCR nasofaríngeo que reveló infección respiratoria viral en aproximadamente un tercio de los casos fue concordante con los valores reportados en la literatura [23], por lo que creemos que nuestros resultados pueden ser extrapolados a la mayoría de los pacientes de emergencia con CAP. En el presente estudio, los pacientes fueron reclutados sobre la base de la evaluación clínica inicial para el diagnóstico de CAP. Por lo tanto, creemos que las características de los pacientes corresponden estrechamente a las que llevan a los profesionales a considerar un posible diagnóstico de CAP. En estos pacientes, el diseño de nuestro estudio nos permitió confirmar o refutar el diagnóstico de CAP con un alto nivel de certeza. Los resultados confirmaron el escaso valor predictivo de los síntomas clínicos (nuevo inicio de características sistémicas y síntomas de una enfermedad aguda del tracto respiratorio inferior) en la identificación de pacientes con CAP [21]. Además, el diseño también reveló que la combinación de los síntomas clínicos y los resultados de las radiografías torácicas condujo a un mal diagnóstico de CAP en un alto número de pacientes, incluyendo los 98 cuyo diagnóstico de CAP fue excluido por el comité de adjudicación y que habrían sido considerados como posible, probable o definido CAP sin el uso de la tomografía computarizada. Esta baja especificidad de la evaluación radiológica clínica estándar llevó a la consideración de enfermedades pulmonares no infecciosas (como, insuficiencia cardíaca, embolia pulmonar, neoplasia pulmonar o bronquitis) o enfermedades infecciosas extrapulmonares como CAP. Cabe destacar que algunas de estas enfermedades también están asociadas con el aumento de los valores de biomarcadores, lo que suscita preocupación por las evaluaciones previas de biomarcadores en pacientes sospechosos de CAP, que utilizaron evaluaciones clínicas y radiológicas estándar (rayos X de tórax) como estándar de oro para el diagnóstico de CAP [15]. Se ha defendido el uso de biomarcadores para mejorar el diagnóstico y el manejo de pacientes con infecciones del tracto respiratorio inferior [14]. Sin embargo, esta cuestión sigue sin resolverse [24], con posiciones conflictivas [14, 15, 25, 26]. En nuestro estudio, mientras que la mediana de los valores de ambos biomarcadores aumentó con el nivel de certeza para el diagnóstico de la CAP, no pudimos establecer valores discriminatorios para la PCT. Datos recientes sugieren que la PCR podría ser de mayor ayuda para ayudar en el diagnóstico de infecciones del tracto respiratorio inferior (LRTI) [15, 27, 28]. En nuestro estudio, aunque la PCR parece más discriminatoria que la PCT, ni la exclusión experimental de infecciones bacterianas extrapulmonares del grupo de la CAP excluido, ni la exclusión de la CAP viral del grupo de pacientes con CAP definido, hicieron posible la determinación de un corte discriminante. La combinación de PCR Un algoritmo operativo ha sido liberado para ayudar a los médicos a prescribir terapia antimicrobiana [14, 26, 29]. De acuerdo con esta estrategia, una concentración de PCT superior a 0,25 μg/L debería impulsar la administración de antibióticos a pacientes con sospecha de ITRL. En nuestro estudio, este valor se asoció con un bajo rendimiento. Además, los niveles medios de PCT permanecieron por encima de este umbral tanto en pacientes excluidos de la CAP sin trastornos infecciosos como en la CAP definida presumiblemente relacionada con el virus. Por lo tanto, el estándar oro para el diagnóstico de la CAP puede influir en el desempeño y utilidad de la TCP en este entorno. Este estudio tiene algunas limitaciones. Primero, el comité de adjudicación no fue cegado al valor de los biomarcadores medidos en la cama en algunos pacientes (70 para la PCR y 131 para la PCT) y su clasificación de la CAP podría Sin embargo, la falta de diferencias estadísticamente significativas en los valores medios de PCR y PCT en los casos definidos de CAP, independientemente de que estos biomarcadores estuvieran o no disponibles para el comité de adjudicación, argumenta contra un gran impacto de estos resultados en la clasificación del comité de adjudicación. Segundo, otro punto crítico es la prescripción de terapia antibiótica (34 %) antes de la inclusión. No podemos excluir que estos pacientes previamente tratados con CAP puedan tener un rendimiento biomarcador alterado y reducir el rendimiento de cultivos bacterianos, aunque tal población refleje la práctica habitual del departamento de emergencia. Tercero, se realizó PCR multiplex en el muestreo nasofaríngeo y no en muestras del tracto respiratorio inferior, lo que no permite una confirmación definitiva del origen viral de la CAP. Sin embargo, un estudio reciente de gran envergadura sobre pacientes con CAP que reportaron una etiología viral de la CAP a una tasa comparable, no encontró derrame del tracto respiratorio superior en una Finalmente, incluso si la tomografía computarizada torácica multidetector es un examen por imágenes mejor que la radiografía para explorar el tórax, sólo muestras microbiológicas locales invasivas habrían proporcionado un diagnóstico con certeza. Dada la diversidad de las presentaciones de la CAP clínica y radiológica, el diagnóstico de la CAP es a menudo incierto.En nuestra población de pacientes tratados en la sala de urgencias con síntomas clínicos que evocan la CAP, ni los valores de corte de PCT ni PCT tenían suficiente peso para confirmar o refutar el diagnóstico de la CAP en la cama; esto subraya que estos biomarcadores son testigos de la respuesta inflamatoria del huésped a la intrusión de microorganismos independientes del lugar de la infección.Estos resultados, basados en una evaluación sistemática de la tomografía computarizada torácica de pacientes sospechosos de la CAP, no argumentan el uso de la PCR y la PCT en el cuidado rutinario para diagnosticar la CAP

¿Qué hallazgos de rayos X en el tórax son típicamente indicativos de neumonía adquirida en la comunidad?

Pandemic Influenza Debido a pH1N1/2009 Virus: Estimación de la Carga de Infección en la Isla de la Reunión a través de una Prospectiva Serosurvey, Austral Winter 2009https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3183080/SHA: ee6d70a53e3262cea6f85b8b226f6b4b8b5f64bAutores: Dellagi, Koussay; Rollot, Olivier; Temmam, Sarah; Salez, Nicolas; Guernier, Vanina; Pascalis, Hervé; Gérardin, Marie-Christine; Fianu, Adrian; Lapidus, Nathanael; Naty, Nadège; Tortosa, Pablo; Boussaïd, Karim; Jaff El objetivo de este estudio fue evaluar a través de un estudio prospectivo, la tasa de ataque del virus pH1N1/2009 en Isla Reunión y los factores de riesgo de infección, durante la temporada 2009. METODOLOGÍA/PRINCIPAL DEFINICIONES: Durante el invierno austral de 2009 se realizó una serosurvey, en el marco de un estudio prospectivo de población. Se recolectaron pares de sera de 1687 individuos pertenecientes a 772 hogares, durante y después del paso de la onda pandémica. Se titularon anticuerpos a pH1N1/2009v utilizando el ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HIA) con títulos ≥1/40 considerados positivos. Seroprevalencia durante las dos primeras semanas de detección de pH1N1/2009v en Isla Reunión fue del 29,8% en personas menores de 20 años, del 35,6% en adultos (20-59 años) y del 73,3% en ancianos (≥ Las tasas de incidencia acumulada corregidas basales fueron 42,9%, 13,9% y 0% en estos grupos de edad, respectivamente (P<0,0001). Una disminución significativa en los títulos de anticuerpos ocurrió poco después del paso de la ola epidémica. Las tasas de seroconversión al pH1N1/2009 se correlacionaron negativamente con la edad: 63,2%, 39,4% y 16,7%, en cada grupo de edad respectivamente (P<0,0001). La seroconversión ocurrió en el 65,2% de los individuos que fueron seronegativos en la inclusión en comparación con el 6,8% en los que fueron inicialmente seropositivos. CONCLUSIONES: La seroincidencia de la infección por pH1N1/2009v fue tres veces mayor que la estimada a partir de la vigilancia clínica, lo que indica que casi dos tercios de las infecciones ocurridas a nivel comunitario han escapado a la detección médica. Texto: En abril de 2009, se produjeron los primeros casos de infecciones respiratorias agudas causadas por un nuevo virus de la gripe triple reafirmante, pH1N1/ 2009v, en México y los Estados Unidos [1]. La rápida propagación de la infección a otros continentes llevó a la Organización Mundial de la Salud (OMS) a declarar el 11 de junio de 2009 que se estaba produciendo una pandemia de gripe por pH1N1/2009v, lo que suscitó una gran preocupación internacional por el riesgo de alta morbilidad y letalidad y el potencial de impacto socioeconómico grave. En realidad, el impacto potencial de esta primera pandemia de gripe de tercer milenio se ha revisado a la baja, ya que las tasas de morbilidad y mortalidad fueron menos graves de lo previsto inicialmente [2]. Los datos de vigilancia de enfermedades no permiten una estimación precisa de la verdadera tasa de infección por gripe, ya que una proporción sustancial de infecciones son asintomáticas o leves [3]. Las encuestas serológicas pueden superar esta limitación, pero deben tener en cuenta que una proporción significativa de la población que presentó títulos de anticuerpos cruzados de protección antes de la circulación del pH1N1/2009v [4]. Esta llamada "inmunidad de base" debe restarse de la seroprevalencia observada después de la ola pandémica, para determinar la seroincidencia en los serocidios [5] [6] [7] [8]. Sin embargo, excepto en pocos estudios [9] [10] [11], la mayoría de estos serocidios no utilizaron mediciones en serie en la misma persona, lo que permite una mejor comprensión de la cinética de anticuerpos y la dinámica de infección en individuos y comunidades. La Isla Reunión (805.500 habitantes) es un departamento francés de ultramar situado en el Océano Índico sudoccidental, a 700 km al este de Madagascar y a 200 km al suroeste de Mauricio. El primer caso importado de pH1N1/2009v se identificó el 5 de julio de 2009 (semana 29) en un viajero que regresaba de Australia. El primer caso que indicaba la transmisión comunitaria se detectó el 21 de julio (semana 30). El pH1N1/2009v se convirtió en el virus de la gripe circulante predominante en las cuatro semanas siguientes a su primera detección, su actividad alcanzó su máximo durante la semana 35 (24) (25) (26) (28) (28) (29) (30) y terminó en la semana 38 [12]. Contrariamente a los temores iniciales, el sistema de atención de la salud no se vio abrumado, ya que las tasas de morbilidad y mortalidad fueron inferiores a las previstas [12] [13] [14]. Para evaluar a nivel comunitario, la magnitud real de la pandemia de pH1N1/2009v y el alcance de la inmunidad de los rebaños adquirida tras el paso de la ola epidémica, se realizó una seroencuesta poblacional prospectiva en la Isla Reunión durante el paso de la ola epidémica en la temporada de invierno austral de 2009 (julio-diciembre de 2009): la prevalencia de la infección se evaluó semanalmente y las tasas de seroconversión se midieron utilizando sera emparejada. El CoPanFLu-RUN formó parte del proyecto internacional CoPanFLu, un consorcio entre el Instituto Nacional Francés de Salud e Investigación Médica (INSERM), el Instituto de Investigación para el Desarrollo (IRD) y la Fundación Mérieux, en el marco de la promoción de la Escuela de Estudios Avanzados en Salud Pública (HEESP). Para permitir la rápida implementación del estudio en previsión de la inminente propagación de la ola pandémica, se utilizó una muestra preexistente de 2442 hogares establecida en octubre de 2006 para la investigación del brote de Chikungunya (SEROCHIK) y actualizada en mayo de 2008 a lo largo de una encuesta telefónica de seguimiento (TELECHIK) sobre la base de 1148 hogares [15, 16]. Se prestó especial atención a seleccionar hogares que representan una amplia gama de ubicaciones geográficas con el fin de minimizar el sesgo de repartición. La fase de inclusión comenzó el 21 de julio (semana 30) y continuó hasta la semana 44, a lo largo de la ola epidémica y más allá. Se obtuvo una primera muestra sérica (muestra 1) de cada miembro del hogar. A continuación se realizó una investigación telefónica activa dos veces por semana para registrar síntomas compatibles con la enfermedad similar a la gripe (ILI) en los hogares. El informe de la ILI (fiebre $37.8uC asociada con cualquier síntoma respiratorio o sistémico) llevó a tres visitas consecutivas de una enfermera al caso de incidencia (en el día 0, +3 y +8 post-informe) para registrar síntomas y recoger muestras nasales de todos los miembros de la familia (para la detección de QRT-PCR de pH1N1/2009v. En la semana 45, se suspendió la investigación activa y se obtuvo una segunda muestra sérica (pos-epidémico) (muestra 2) (semanas 45-52) para determinar las tasas de seroconversión. Se alió y se almacenó en 280uC. El protocolo se llevó a cabo de conformidad con la Declaración de Helsinki y la ley francesa para la investigación biomédica (Nu ID RCB AFSSAPS: 2009-A00689-48) y fue aprobado por el Comité de Protección de las La detección del genoma viral por RT-PCR. El ARN viral se extrajo de 140 mL de eluato de hisopo nasal utilizando el kit de ARN viral QIAamp (Qiagen) y se procesó para su detección por TaqMan qRT-PCR, dirigido al gen HA de la heamagglutinina (SuperScript III Platinum en un solo paso sistema QRT-PCR, Invitrogen) de acuerdo con las recomendaciones del Instituto Pasteur (Van der Werf S. & Enouf V., SOP/FluA/130509). La infección confirmada por pH1N1/2009v se definió como una detección positiva del gen QRT-PCR en al menos un hisopo nasal. Ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HIA). Se adaptó una técnica estándar de inhibición de la hemaglutinación para detectar y cuantificar anticuerpos de pH1N1/2009v [17]. El antígeno se preparó diluyendo un sobrenadante de cultivo celular no inactivado que produce una cepa de Pdm H1N1v (cepa OPYFLU-1 aislada de un paciente joven que regresaba de México a principios de mayo de 2009) [18]. Brevemente, el virus se propagó a las células MDCK bajo condiciones estándar. El último paso (utilizado para la preparación de antígenos) se realizó en ausencia de tripsina y ht-FBS. El sobrenadante fue recogido en el día siete p.i. clarificado por centrifugación a 8006 g durante 10 min a temperatura ambiente, alícuota y conservado a 280uC. El título hemaglutinante del antígeno viral no La dilución que proporcionaba 5,33 unidades hemagglutinantes en un volumen de 25 mL se utilizó para la posterior HIA. Se inactivaron seras a 56uC durante 30 minutos antes de su uso. Se realizaron diluciones secuenciales de dos veces en PBS (1/10 a 1/1280) en volúmenes de 25 mL y se distribuyeron en microplacas de fondo en V 96 bien. Se utilizaron glóbulos rojos humanos (RBC) para experimentos de hemaglutinación. La detección y cuantificación de anticuerpos a pH1N1/2009v se realizó de la siguiente manera: 25 mL de suspensión viral se añadió a la dilución sérica (25 mL) e incubado durante 1 hora a temperatura ambiente. Cada pozo fue llenado con 25 mL de suspensión de RBC al 1% en PBS (v/v: 0,33%), seguido de otra incubación a temperatura ambiente de 30 min. Se determinó que el título de la HIA era la última dilución que proporcionaba una clara inhibición de la hemaglutinación; todos los experimentos se realizaron en presencia de los mismos controles negativos y positivos, incluyendo sera con títulos de anticuerpos 1/40, 1/80, 1/160 y 1/320; los resultados reportados en este estudio se basaron únicamente en el análisis serológico de los sueros emparejados; para el análisis, se identificaron cuatro fases sucesivas a lo largo de la onda pandémica: fase A (semanas 30-31) correspondió al tiempo temprano de epidemia, fase B (W32-39) a la epidemia que se desarrollaba, fase C (W40-44) a la etapa inmediatamente post-epidémico y fase D (W45-52) a la etapa tardía post-epidémico. La seropositividad se definió como un título de HIA de 1/ 40 o más. La tasa de seropre La tasa de incidencia acumulativa de infección midió el aumento entre la tasa de seroprevalencia bruta en cualquier momento dado durante las fases epidémicas (S2pi) y la tasa de seroprevalencia basal de proxy específica por edad (S1pA) (s2 pi -s1 pA ). La seroconversión se definió como un cambio de seronegativo en la inclusión (muestra 1: HIA,1/40) a seropositivo en el seguimiento (muestra 2: HIA $ 1/40), o para sera seropositivo en el análisis de seropositivo en la inclusión como un aumento de cuatro veces de los títulos de la HIA entre la muestra 1 y la muestra 2 sueros emparejados. También calculamos la proporción de sueros que probaron seropositivos en la muestra 1 para los cuales el título de HIA disminuyó cuatro veces y pasó bajo el valor de corte de Se calculó el tamaño de la muestra para identificar los factores de riesgo en el estudio prospectivo de cohorte, considerando en promedio tres individuos por hogar, una correlación intrafamiliar de 0,3, una potencia superior al 80%, con un tamaño de muestra de 840 con 2500 individuos, asumiendo niveles de exposición que oscilaban entre el 10% y el 90% y un riesgo relativo superior a 1,3.Con 2.500 sujetos, el estudio permitió una precisión absoluta del 1-2 % en torno a los valores estimados para las tasas de seroconversión.En la entrada de datos se utilizó EpiData versión 3.1 (The Epidata Association, Odense, Dinamarca).Se utilizó la versión 9.1 del SAS (SAS Inc., Cary, NC, EE.UU.) para el análisis estadístico.Las características de la cohorte del estudio se compararon con las de la población de Isla Reunión y se utilizó una prueba de Chi2 (o prueba exacta de Fisher cuando no se aplica) Se estandarizaron las tasas de seroincidencia) y seroconversión según la estructura etaria de la comunidad (fuente del Instituto Nacional de Estadística y Estudios Económicos de Francia (INSEE), se expresó en porcentajes la seroprevalencia de proxy basal, las tasas de incidencia acumulada de infección, así como las tasas de seroconversión y seronegación, se utilizaron curvas acumulativas de distribución inversa para mostrar la distribución de títulos de anticuerpos; en todas las pruebas se consideró significativo un valor de P,0,05; se estimaron intervalos de confianza (IC) del 95% de proporciones utilizando una técnica de arranque de racimo con 1000 remuestras [19]. Después del arranque, se utilizó un modelo ANOVA para comparar las proporciones medias de incidencia acumulativa entre fases pandémicas, dentro de cada grupo de edad. Se utilizó un modelo de regresión logística alterna (ALR) con log intercambiable Odds Ratio (OR) para probar la asociación de correlación intrafamiliar ajustada entre los factores y el resultado de la seroconversión. Se analizaron los datos con respecto a la edad del sujeto. Inicialmente, se consideraron cuatro grupos de edad: niños y adolescentes (,20 años), adultos jóvenes (20-39 años), adultos de mediana edad (40-59 años) y adultos ancianos (60 años). Como la incidencia acumulada de infección del segundo y tercer grupo fue muy cercana, ambos grupos se fusionaron en un grupo de adultos (20-59 años). Por lo tanto, en nuestro estudio nos referimos más adelante a tres grupos de edad: niños y adolescentes (,20 años), adultos (20-59 años), ancianos (60 años). Un total de 2.164 individuos de 772 hogares se inscribieron entre las semanas 30 y 44 en la cohorte CoPanFlu-RUN, permitiendo la recolección de 1.932 sueros al momento de la inclusión (muestra 1). Durante este período, 136 hogares (17,7% de los hogares) que contenían 464 individuos (21,4% de los individuos) reportaron al menos un caso de ILI. Sesenta sujetos entre los 464 individuos (12,9%, pertenecientes a 33 hogares [24,3%)) fueron qRT-PCR positivos, lo que documentó la infección por pH1N1/2009v. No se pudo detectar qRT-PCR positivo después de la semana 37 y no se informó de ILI después de la semana 40, el final de la ola epidémica. La segunda muestra sérica de seguimiento (muestra 2) se obtuvo para 1.759 sujetos al menos cinco semanas después del final de la ola epidémica (se El perfil de la cohorte y los principales resultados se muestran en la Figura 1. En la Tabla 1 se detallan las inclusiones y el cronograma de la muestra sérica con respecto a la circulación de pH1N1/2009v sobre la isla. En la Tabla 1 se detallan las características sociodemográficas y espacio-tiempo de la cohorte. En comparación con la comunidad de Isla Reunión, la muestra de 1.687 individuos para los que se disponía de paresera, fue mayor (,20 años: 27% vs 35% y $60 años: 17,9% vs 11,3%) y se compuso de un ligero exceso de mujeres (54,1% vs 51,5%), el desequilibrio se debió a un déficit en sujetos menores de 40 años, reflejando a los hombres en el trabajo y el hecho de que los padres declinaron el segundo suero para niños menores de cinco años. En la muestra 1 (Tabla 2) se midieron los valores basales de proxy (pre-epidemia) al pH1N1/ 2009v, obtenidos de 249 sujetos (103 hogares) reclutados al inicio de la investigación durante las semanas 30 y 31 (fase A, Figura 2 ), cuando la actividad epidémica en la cohorte seguía siendo muy baja; la distribución de la edad en este grupo fue similar a la de toda la cohorte (datos no mostrados); en general, la tasa de seroprevalencia de proxy basal (HIA $1/40), sobre todas las edades, fue del 43,4% (IC95%: 37,4%-49,6%); sin embargo, la mayoría de los sera positivos tenían títulos de anticuerpos bajos, con el valor de corte para confirmación (es decir, = 1/40); las proporciones de sura con título de HIA.1/40 fueron del 0%, Estos resultados indican que la reactividad cruzada de anticuerpos preepidémicos basales fue más fuerte en las personas de edad avanzada (60 años) y más débil en niños y adolescentes (20 años) y adultos (20-59 años), con diferencias altamente significativas entre los grupos de edad (P,0,0001). Las curvas de distribución acumulada inversa de los títulos de HIA se muestran para cada grupo de edad y para toda la cohorte en la Figura 3. La proporción de sueros seropositivos (HI $ 1/40) aumentó constantemente durante el desarrollo de la epidemia (fase B, W32-39), y en el período inmediatamente posterior a la epidemia (fase C, W40-44) cuando alcanzó su nivel máximo, luego disminuyó en el período posterior a la epidemia (fase D, W45-52). Esta disminución fue lo suficientemente significativa como para devolver la curva de distribución acumulativa inversa a los niveles basales en las personas de edad avanzada. Las tasas de incidencia acumulada, obtenidas tras la sustracción de la seroprevalencia basal de la seroprevalencia bruta de cada fase de la epidemia específica por edad, se muestran en la Tabla 2 (obsérvese que las tasas de incidencia acumulada de infección representadas para el grupo ''todas las edades'' fueron estandarizadas según la estructura de edad de la comunidad). Las tasas de incidencia acumulada fueron mucho más altas en niños y adolescentes (,20 años), lo que indica una transmisión muy activa de la infección dentro de este grupo de edad. Como se mencionó anteriormente, las tasas de incidencia acumulada alcanzaron un máximo en la fase C (W40-44), y luego disminuyeron indicando alguna labilidad de la respuesta inmune humoral frente al pH1N1/2009v. La diferencia relacionada con la edad observada en las tasas de incidencia fue altamente significativa (P,0,0001). Para estimar de manera más adecuada la disminución de títulos de anticuerpos que se produjo después del pico de la respuesta humoral al pH1N1/ 2009v, se consideró la suero emparejado del grupo de 264 sujetos para los que se obtuvo la primera muestra sérica (muestra 1) justo después de la onda epidémica (fase C, W40-44), y la segunda muestra correspondiente fue recolectada al final de la encuesta (fase D, W45-52). Las tasas de seronegación fueron del 27,0% (61/226) para todos los grupos de edad, del 17,4% (12/69) en niños y adolescentes (,20 años), del 32,3% (41/127) en adultos (20-59 años) y del 26,7% (8/30) en ancianos (60 años). Las diferencias entre las tasas de seronegación según la edad fueron estadísticamente significativas (p = 0,0671). A continuación, se consideraron los 1687 individuos para los que había sera emparejado y se midieron las tasas de seroconversión según la edad y el momento de la primera recolección de muestras séricas (fase A, B o C). Los criterios de seroconversión se definieron en la sección del método. Como se muestra en la tabla 3, hubo una fuerte disminución de las tasas de seroconversión en todos los grupos de edad, dependiendo de si los participantes fueron incluidos durante la fase A, fase B o fase C (P,0,0001). Para interpretar estos datos, se debe recordar que los anticuerpos a niveles seroprotectores (HIA $ 1/40), en las muestras séricas 1 recogidas durante la fase B de la epidemia o la fase C posterior temprana podrían representar anticuerpos cruzados reactivos de línea base o anticuerpos específicos de pH1N1/2009 en aumento debido a una infección reciente o en curso. Esta ambigüedad podría llevar a subestimar la tasa de seroconversión de los sujetos incluidos en las fases B y C. Para resolver esta ambigüedad, se consideró específicamente el grupo de 249 sujetos en los que se detectaron anticuerpos reactivos cruzados en el momento de la fase A (W30-31). La tasa de seroconversión de este grupo es la más indicativa de la exposición de los individuos a toda la onda epidémica. Fue la más alta (63,2%, P,0,0001) en niños y adolescentes (,20 años), y aún significativamente alta en adultos (39,4%, P,0,0001). Luego se probó en este grupo particular, el impacto de anticuerpos reactivos cruzados preepidémicos en la tasa de seroconversión al pH1N1/2009 (Tabla 4). Ningún sujeto con título de HIA superior a 1/40 tuvo evidencia de seroconversión al pH1N1/2009. La tasa de seroconversión en individuos con título de AIH igual a 1/40 se relacionó con la edad, siendo más importante en niños y adolescentes (,20 años); la tasa más alta de seroconversión (56%) se registró en sujetos con título de AIH inferior a 1/40, particularmente en menores de 20 años donde alcanzó el 85%; por lo tanto, el riesgo de seroconversión disminuyó cuando el título de AIH preepidémico fue alto después de controlar para la edad (P,0,0001) (Figura 4) ; la relación de odds ajustados multivariables para la seroconversión fue de 0,15 (IC95%: 0,06-0,37, P,0,0001) por dos veces el título basal, 1,79 (IC95%: 1,23-2,59, P,0.003) por otros miembros del hogar que seroconvirtieron, 5,33 (IC95%: 1,56 La figura 1 detalla las tres fases del protocolo: i) inclusión (semanas 30-44) y recolección de muestras séricas S1; ii) seguimiento para la detección de ILI en hogares, qRT-PCR en hisopos nasales y estimación de las tasas de seroincidencia acumulada; iii) final del estudio (semanas 45-52) y recolección de muestras S2. La HIA en sueros emparejados (S1+S2) permitió estimar las tasas de seroconversión. doi:10.1371/journal.pone.0025738.g001 Bp (baseline-proxy) se estimaron las tasas de seroprevalencia en las semanas 30-31 en cada grupo de edad. b Las tasas de incidencia acumulativa midieron el aumento entre las tasas de seroprevalencia en bruto y la tasa de seroprevalencia en valores basales específicos de edad. En el grupo doi:10.1371/journal.pone.002 Los datos son números, porcentajes (intervalos de confianza del 95%) y prueba de parámetros ALR valor P para la comparación de las proporciones de seroconversión según el tiempo de recolección de la primera muestra (S1) en la inclusión, en cada grupo de edad, después de controlar la selección del hogar. En el grupo ''Todas las edades'', las tasas de seroconversión se estandarizaron según la estructura de edad de la comunidad. NA: no evaluada. Seroconversión se definió como un cambio de seronegativo en la inclusión (es decir, título de HIA,1/40) a seropositivo en la muestra de seguimiento, o como un aumento de 4 veces del título recíproco de HIA entre la primera y la segunda muestras emparejadas para seropositiva en la inclusión (es decir, título de HIA $ 1/40). Para la edad,20 años (vs edad $60 años) y 11,35 (IC95%: 0.41-4.47, P = 0.62) para la edad 20-60 años (vs edad $60 años). Se muestran las tasas de seroconversión observadas y previstas de acuerdo con la edad y el título basal de la HIA Figura 4. Finalmente, se consideró a los 46 sujetos que habían sido infectados por el virus pandémico durante el transcurso del estudio, verificados por un hisopo nasal qRT-PCR positivo, y para los cuales se disponía de sueros emparejados. Los títulos iniciales de anticuerpos de la HIA en este grupo fueron,1/40, La cohorte CoPanFlu-RUN fue creada para realizar un estudio prospectivo basado en la población investigando la inmunidad de rebaño inducida por el virus de gripe pandémico 2009 e identificando los factores de La mayoría de los trabajos publicados hasta la fecha han utilizado seroencuestas transversales extensas en muestras de suero independientes pre y post epidémicas, siendo la inmunidad basal evaluada a partir de muestras congeladas almacenadas [5, 7, 8], o cohortes adultas no representativas (militares, trabajadores de la salud, pacientes de larga duración). Los títulos de anticuerpos fueron medidos por la AIS utilizando un valor de corte establecido en 1/40 como se recomienda clásicamente. Este título de la AIS en 1/40 se considera protector, es decir, otorgando una protección del 50% contra un desafío viral [20]. Nuestro ensayo ha introducido algunos cambios en el protocolo experimental en comparación con el clásico. El uso de un antígeno viral no inactivado, es decir, un virus nativo, con epítopos no desnaturalizados, probablemente permite la detección de anticuerpos a epítopos de la hemaglutinina no detectado Esto puede inducir ligeras diferencias en la sensibilidad a la detección de anticuerpos de reacción cruzada, pero esto no modifica la cinética de Ab y la evolución epidemiológica de la seroprevalencia y no pone en peligro la comparabilidad global de los resultados serológicos, lo que se confirma por el hecho de que nuestro ensayo de IH detectó títulos de anticuerpos seroprotectores en el 93,5% y dio evidencia de seroconversión en el 73,9% de la gripe pH1N1/2009 confirmada por qRT-PCR, todas cifras cercanas a las reportadas en la literatura [5, 21]. Consideramos que los títulos de 1/40, en sera recolectados de individuos inscritos durante las semanas 30 y 31 fueron anticuerpos reactivos cruzados y no anticuerpos de novo desencadenados por el virus pandémico y por lo tanto los utilizamos como sustitutos de la inmunidad basal previa a la epidemia. Varios argumentos apoyan esta suposición: i) el primer caso que indica la transmisión autóctona en Isla Reunión fue reportado por el departamento de vigilancia epidemiológica de La Reunión el 21 de julio (semana 30), es decir, el mismo día en que se inició la inclusión en nuestra cohorte de estudio; ii) se requiere de 7 a 15 días para desarrollar una respuesta de anticuerpos después de la infección viral; iii) En las semanas 30 y 31, la actividad epidémica debido al virus pandémico fue muy baja en nuestra cohorte de estudio y se hizo significativa sólo después de la semana 32. Por lo tanto, durante las semanas 30-31, 103 hogares fueron reclutados y sólo 2 hogares reportaron casos de ILI. Los hisopos nasales recolectados de estos 2 individuos fueron probados qRT-PCR negativo al virus pandémico, mientras que uno tenía evidencia de coronavirus y rinovirus utilizando un multiplex RT-PCR a virus respiratorio En contraste, durante las semanas 32 a 39, 199 individuos pertenecientes a 99 hogares reportaron ILI, entre los cuales 60 individuos habían documentado infección por el virus pandémico.Nuestro estudio muestra que una proporción sustancial de la población de la Isla Reunión tenía inmunidad preexistente al virus pandémico de la gripe de 2009 con la tasa de seroprevalencia de proxy basal más alta observada entre adultos de 60 años o más.Otros estudios de todos los continentes también habían reportado altas tasas de seropositividad preepidémico entre los ancianos [5, 6, 8, [22] [24] [25] [26], aunque existen grandes variaciones entre países [10, 11, 23, 27, 28]. Estos anticuerpos reactivos cruzados se han interpretado como la firma residual de la exposición a distancia de estos individuos a virus H1N1 que circulaban antes de 1957 [24, 25, 29, 30]. El 30%-35% fueron notablemente más altos que los reportados en otras partes del mundo [6, 8, 22, 23, [31] [33]. Sin embargo, se debe notar que estos anticuerpos basales fueron de título bajo, justo al nivel del umbral de la AIS (es decir, 1/40). Varios factores podrían haber contribuido a esta tasa basal comparativamente alta encontrada en nuestro estudio: i) Puede reflejar el hecho de que la prueba de IH utilizada en nuestro estudio fue ligeramente más sensible que la clásica [17] ; ii) Algunos individuos ya pueden haber sido infectados con el virus pH1N1/ 2009 en las semanas 30 y 31 y pueden haber desencadenado una respuesta anticuerpo al virus. Esta hipótesis parece poco probable en vista de los argumentos presentados anteriormente y de una proporción similar de sera titering HIA = 1/40 entre 122 sera de pacientes adultos enviados para fines diagnósticos al laboratorio microbiológico del Hospital Regional, durante el primer semestre Sin embargo, no podemos excluir formalmente esta hipótesis en vista de un estudio recientemente reportado desde Taiwán [11] que mostró evidencia de transmisión comunitaria subclínica con seroconversión demostrada varias semanas antes del informe del primer caso documentado en la isla. También se extrajo una conclusión similar de Australia [34] ; iii) nuestra prueba serológica podría detectar anticuerpos de reacción cruzada desencadenados por la reciente vacunación con vacuna trivalente estacional contra la gripe como se informó [4, [35] [37] [38]. Sin embargo, las vacunas estacionales contra la gripe fueron de uso bastante limitado en la Isla Reunión, especialmente en niños y adultos jóvenes; iv) Por último, los títulos basales altos pueden reflejar la historia infecciosa de los individuos a virus estacionales contragénicos con el virus pH1N1/2009, como se sugirió recientemente para la infección estacional por H1N1 [40]. Esta serosurvey indica que una gran parte de la población de Los jóvenes han pagado el tributo principal a la epidemia ya que casi dos tercios muestran evidencia de seroconversión, confirmando reportes clínicos anteriores de la isla [12] y acumulando reportes de otros países [17, 32, 41, 42] y sugiriendo que los escolares probablemente han jugado un papel central en la difusión epidémica del virus pandémico. Se encontraron tasas de infección más bajas en adultos y las tasas más bajas se registraron en ancianos. Basados en casos clínicos reportados a los servicios de vigilancia epidemiológica [12], se estimó que 66.915 personas en Isla Reunión que consultaron a un médico fueron infectadas por el virus pH1N1/2009 durante las 9 semanas de la epidemia, dando una tasa de ataque acumulativa de 8,26%. Teniendo en cuenta a aquellos que no consultaron a un médico, el número de personas infectadas sintomáticas se estimó en 104.067 (tasa de ataque: 12.85%). De hecho, la tasa de ataque de infección por pH1N1/2009 en nuestra seroencuesta fue de alrededor del 42%-44% en el pico de la respuesta de anticuerpos (es decir, semanas 40-44), cifra que es por lo menos 3 a 4 veces superior a las tasas de infección basadas en casos clínicos La gran brecha entre las dos estimaciones indica que una gran fracción (casi dos tercios) de los infectados por el virus pH1N1/2009 escapó de la detección médica, probablemente porque desarrollaron enfermedad leve o infección asintomática, una indicación adicional de la naturaleza benigna del virus, al menos a nivel comunitario. En Inglaterra, Baguelin et al. [43] estimaron que las tasas de incidencia acumulada de infección por el virus pandémico en niños fueron de 20 a 40 veces superiores a las estimadas por la vigilancia clínica. Nuestro estudio, al igual que otros [6], indica que los anticuerpos reactivos cruzados preexistentes al pH1N1/2009 en títulos $1/40 prevenían de la seroconversión en respuesta al virus pandémico. Este nivel de inmunidad reactiva cruzada preexistente probablemente confiere una verdadera protección frente a la infección como cerca de dos tercios y un tercio de la infección documentada (qRT-PCR positivo) en nuestra serie se han producido en individuos con títulos basales del HIA,1/40 y = 1/ 40, respectivamente, y menos del 5% de las infecciones documentadas ocurrieron en individuos con títulos de línea base.1/40. La protección fue efectiva no sólo en adultos mayores sino también en personas más jóvenes, lo que indica que la protección fue conferida no sólo por anticuerpos reactivos cruzados basales desencadenados por virus cercanos del pH1N1/2009 que circularon antes de 1957 (como en los ancianos), sino también por anticuerpos que Las tasas de seroconversión observadas dependen de la edad, después de ajustar los títulos basales de pH1N1/2009. El papel protector del aumento de la edad puede explicarse por una mayor inmunidad cruzada en adultos y ancianos o por una mayor exposición de sujetos jóvenes al virus durante la epidemia de 2009 (debido a contactos sociales y patrones de mezcla). También puede indicar que mecanismos inmunes distintos de los anticuerpos reactivos cruzados detectados por la AIS (es decir, la inmunidad a los epitopes de neuraminidasa y células T conservadas [44] podrían desarrollarse a lo largo de toda la vida, proporcionando protección adicional contra infecciones o enfermedades graves, especialmente en los ancianos. Curiosamente, se observa evidencia una disminución de los títulos de anticuerpos, que ocurrió poco después del paso de la onda epidémica. Los títulos de HI $1/40) en la fase inmediatamente posterior a la epidemia a niveles bajo el valor de corte en la segunda muestra sérica. Esta descomposición explica la observación de que los adultos mayores ($60 años) en la cohorte del estudio se salvaron casi por completo de la epidemia si se considera solamente las tasas de incidencia acumulada derivadas de la valoración de IHA en las muestras 2 (semanas 45-52). De hecho, la tasa de incidencia acumulada en adultos mayores medida justo después del pico epidémico (es decir, semanas 40-44) fue del 20,4%. Resultados similares de la decaimiento temprano de anticuerpos fueron reportados recientemente [10, 45]. Más generalmente, estos datos muestran que las seroencuestas realizadas meses después del paso de la epidemia, probablemente subestiman la magnitud real de la infección por pH1N1/2009, en comparación con la valoración de anticuerpos realizada anteriormente, cuando las respuestas humorales están en su Sin embargo, cabe señalar que no hubo segunda ola epidémica en la Isla Reunión durante las siguientes temporadas de invierno austral en 2010 y 2011. La gripe durante el invierno 2010 no fue superior a los pasajes habituales de la gripe estacional, aunque casi dos tercios de los casos documentados en 2010 también se debieron al pH1N1/2009v [46]. Además, durante el invierno austral 2011 se observaron muchos menos aislados de virus pandémicos, lo que sugiere fuertemente que la primera ola epidémica había conferido una sólida inmunidad de rebaño, a nivel comunitario. Nuestro estudio tiene algunas limitaciones. El hecho de que la progresión epidémica coincidió con la implementación del estudio prospectivo, no pudimos recolectar, en sentido estricto, sueros preepidémicos de los miembros de la cohorte. Esto puede sobreestimar la inmunidad de la línea base si la transmisión comunitaria subclínica hubiera ocurrido antes de que se notificaran los primeros casos de gripe por pH1N1/2009. Los anticuerpos al virus pandémico fueron detectados por la AISH, una prueba que tiene una buena especificidad pero una sensibilidad bastante baja [46]. Por lo tanto, el umbral de 1/40 puede subestimar el número de individuos infectados. Sin embargo, las tasas de seroconversión, la prueba estándar de oro serológico basada en sueros emparejados, probablemente dio la imagen más precisa de la pandemia a nivel comunitario en la Isla Reunión.

¿Cuándo declaró la OMS una pandemia de gripe por pH1N1/2009v?

Pandemic Influenza Debido a pH1N1/2009 Virus: Estimación de la Carga de Infección en la Isla de la Reunión a través de una Prospectiva Serosurvey, Austral Winter 2009https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3183080/SHA: ee6d70a53e3262cea6f85b8b226f6b4b8b5f64bAutores: Dellagi, Koussay; Rollot, Olivier; Temmam, Sarah; Salez, Nicolas; Guernier, Vanina; Pascalis, Hervé; Gérardin, Marie-Christine; Fianu, Adrian; Lapidus, Nathanael; Naty, Nadège; Tortosa, Pablo; Boussaïd, Karim; Jaff El objetivo de este estudio fue evaluar a través de un estudio prospectivo, la tasa de ataque del virus pH1N1/2009 en Isla Reunión y los factores de riesgo de infección, durante la temporada 2009. METODOLOGÍA/PRINCIPAL DEFINICIONES: Durante el invierno austral de 2009 se realizó una serosurvey, en el marco de un estudio prospectivo de población. Se recolectaron pares de sera de 1687 individuos pertenecientes a 772 hogares, durante y después del paso de la onda pandémica. Se titularon anticuerpos a pH1N1/2009v utilizando el ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HIA) con títulos ≥1/40 considerados positivos. Seroprevalencia durante las dos primeras semanas de detección de pH1N1/2009v en Isla Reunión fue del 29,8% en personas menores de 20 años, del 35,6% en adultos (20-59 años) y del 73,3% en ancianos (≥ Las tasas de incidencia acumulada corregidas basales fueron 42,9%, 13,9% y 0% en estos grupos de edad, respectivamente (P<0,0001). Una disminución significativa en los títulos de anticuerpos ocurrió poco después del paso de la ola epidémica. Las tasas de seroconversión al pH1N1/2009 se correlacionaron negativamente con la edad: 63,2%, 39,4% y 16,7%, en cada grupo de edad respectivamente (P<0,0001). La seroconversión ocurrió en el 65,2% de los individuos que fueron seronegativos en la inclusión en comparación con el 6,8% en los que fueron inicialmente seropositivos. CONCLUSIONES: La seroincidencia de la infección por pH1N1/2009v fue tres veces mayor que la estimada a partir de la vigilancia clínica, lo que indica que casi dos tercios de las infecciones ocurridas a nivel comunitario han escapado a la detección médica. Texto: En abril de 2009, se produjeron los primeros casos de infecciones respiratorias agudas causadas por un nuevo virus de la gripe triple reafirmante, pH1N1/ 2009v, en México y los Estados Unidos [1]. La rápida propagación de la infección a otros continentes llevó a la Organización Mundial de la Salud (OMS) a declarar el 11 de junio de 2009 que se estaba produciendo una pandemia de gripe por pH1N1/2009v, lo que suscitó una gran preocupación internacional por el riesgo de alta morbilidad y letalidad y el potencial de impacto socioeconómico grave. En realidad, el impacto potencial de esta primera pandemia de gripe de tercer milenio se ha revisado a la baja, ya que las tasas de morbilidad y mortalidad fueron menos graves de lo previsto inicialmente [2]. Los datos de vigilancia de enfermedades no permiten una estimación precisa de la verdadera tasa de infección por gripe, ya que una proporción sustancial de infecciones son asintomáticas o leves [3]. Las encuestas serológicas pueden superar esta limitación, pero deben tener en cuenta que una proporción significativa de la población que presentó títulos de anticuerpos cruzados de protección antes de la circulación del pH1N1/2009v [4]. Esta llamada "inmunidad de base" debe restarse de la seroprevalencia observada después de la ola pandémica, para determinar la seroincidencia en los serocidios [5] [6] [7] [8]. Sin embargo, excepto en pocos estudios [9] [10] [11], la mayoría de estos serocidios no utilizaron mediciones en serie en la misma persona, lo que permite una mejor comprensión de la cinética de anticuerpos y la dinámica de infección en individuos y comunidades. La Isla Reunión (805.500 habitantes) es un departamento francés de ultramar situado en el Océano Índico sudoccidental, a 700 km al este de Madagascar y a 200 km al suroeste de Mauricio. El primer caso importado de pH1N1/2009v se identificó el 5 de julio de 2009 (semana 29) en un viajero que regresaba de Australia. El primer caso que indicaba la transmisión comunitaria se detectó el 21 de julio (semana 30). El pH1N1/2009v se convirtió en el virus de la gripe circulante predominante en las cuatro semanas siguientes a su primera detección, su actividad alcanzó su máximo durante la semana 35 (24) (25) (26) (28) (28) (29) (30) y terminó en la semana 38 [12]. Contrariamente a los temores iniciales, el sistema de atención de la salud no se vio abrumado, ya que las tasas de morbilidad y mortalidad fueron inferiores a las previstas [12] [13] [14]. Para evaluar a nivel comunitario, la magnitud real de la pandemia de pH1N1/2009v y el alcance de la inmunidad de los rebaños adquirida tras el paso de la ola epidémica, se realizó una seroencuesta poblacional prospectiva en la Isla Reunión durante el paso de la ola epidémica en la temporada de invierno austral de 2009 (julio-diciembre de 2009): la prevalencia de la infección se evaluó semanalmente y las tasas de seroconversión se midieron utilizando sera emparejada. El CoPanFLu-RUN formó parte del proyecto internacional CoPanFLu, un consorcio entre el Instituto Nacional Francés de Salud e Investigación Médica (INSERM), el Instituto de Investigación para el Desarrollo (IRD) y la Fundación Mérieux, en el marco de la promoción de la Escuela de Estudios Avanzados en Salud Pública (HEESP). Para permitir la rápida implementación del estudio en previsión de la inminente propagación de la ola pandémica, se utilizó una muestra preexistente de 2442 hogares establecida en octubre de 2006 para la investigación del brote de Chikungunya (SEROCHIK) y actualizada en mayo de 2008 a lo largo de una encuesta telefónica de seguimiento (TELECHIK) sobre la base de 1148 hogares [15, 16]. Se prestó especial atención a seleccionar hogares que representan una amplia gama de ubicaciones geográficas con el fin de minimizar el sesgo de repartición. La fase de inclusión comenzó el 21 de julio (semana 30) y continuó hasta la semana 44, a lo largo de la ola epidémica y más allá. Se obtuvo una primera muestra sérica (muestra 1) de cada miembro del hogar. A continuación se realizó una investigación telefónica activa dos veces por semana para registrar síntomas compatibles con la enfermedad similar a la gripe (ILI) en los hogares. El informe de la ILI (fiebre $37.8uC asociada con cualquier síntoma respiratorio o sistémico) llevó a tres visitas consecutivas de una enfermera al caso de incidencia (en el día 0, +3 y +8 post-informe) para registrar síntomas y recoger muestras nasales de todos los miembros de la familia (para la detección de QRT-PCR de pH1N1/2009v. En la semana 45, se suspendió la investigación activa y se obtuvo una segunda muestra sérica (pos-epidémico) (muestra 2) (semanas 45-52) para determinar las tasas de seroconversión. Se alió y se almacenó en 280uC. El protocolo se llevó a cabo de conformidad con la Declaración de Helsinki y la ley francesa para la investigación biomédica (Nu ID RCB AFSSAPS: 2009-A00689-48) y fue aprobado por el Comité de Protección de las La detección del genoma viral por RT-PCR. El ARN viral se extrajo de 140 mL de eluato de hisopo nasal utilizando el kit de ARN viral QIAamp (Qiagen) y se procesó para su detección por TaqMan qRT-PCR, dirigido al gen HA de la heamagglutinina (SuperScript III Platinum en un solo paso sistema QRT-PCR, Invitrogen) de acuerdo con las recomendaciones del Instituto Pasteur (Van der Werf S. & Enouf V., SOP/FluA/130509). La infección confirmada por pH1N1/2009v se definió como una detección positiva del gen QRT-PCR en al menos un hisopo nasal. Ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HIA). Se adaptó una técnica estándar de inhibición de la hemaglutinación para detectar y cuantificar anticuerpos de pH1N1/2009v [17]. El antígeno se preparó diluyendo un sobrenadante de cultivo celular no inactivado que produce una cepa Pdm H1N1v (cepa OPYFLU-1 aislada de un paciente joven que regresaba de México a principios de mayo de 2009) [18]. Brevemente, el virus se propagó a las células MDCK bajo condiciones estándar. El último paso (utilizado para la preparación de antígenos) se realizó en ausencia de tripsina y ht-FBS. El sobrenadante se recogió en el día siete p.i. clarificado por centrifugación a 8006 g durante 10 min a temperatura ambiente, alícuota y conservado a 280uC. El título hemaglutinante del antígeno viral no in La dilución que proporcionaba 5,33 unidades hemagglutinantes en un volumen de 25 mL se utilizó para la posterior HIA. Se inactivaron seras a 56uC durante 30 minutos antes de su uso. Se realizaron diluciones secuenciales de dos veces en PBS (1/10 a 1/1280) en volúmenes de 25 mL y se distribuyeron en microplacas de fondo en V 96 bien. Se utilizaron glóbulos rojos humanos (RBC) para experimentos de hemaglutinación. La detección y cuantificación de anticuerpos a pH1N1/2009v se realizó de la siguiente manera: 25 mL de suspensión viral se añadió a la dilución sérica (25 mL) e incubado durante 1 hora a temperatura ambiente. Cada pozo fue llenado con 25 mL de suspensión de RBC al 1% en PBS (v/v: 0,33%), seguido de otra incubación a temperatura ambiente de 30 min. Se determinó que el título de la HIA era la última dilución que proporcionaba una clara inhibición de la hemaglutinación; todos los experimentos se realizaron en presencia de los mismos controles negativos y positivos, incluyendo sera con títulos de anticuerpos 1/40, 1/80, 1/160 y 1/320; los resultados reportados en este estudio se basaron únicamente en el análisis serológico de sueros emparejados; para el análisis, se identificaron cuatro fases sucesivas a lo largo de la onda pandémica: fase A (semanas 30-31) correspondió al tiempo temprano de epidemia, fase B (W32-39) a la epidemia que se desarrollaba, fase C (W40-44) a la etapa inmediatamente post-epidémico y fase D (W45-52) a la etapa tardía post-epidémico; la seropositividad se definió como un título de HIA de 1/ 40 o más. La tasa de seroprevalencia La tasa de incidencia acumulativa de infección midió el aumento entre la tasa de seroprevalencia bruta en cualquier momento dado durante las fases epidémicas (S2pi) y la tasa de seroprevalencia basal de proxy específica por edad (S1pA) (s2 pi -s1 pA ). La seroconversión se definió como un cambio de seronegativo en la inclusión (muestra 1: HIA,1/40) a seropositivo en el seguimiento (muestra 2: HIA $ 1/40), o para sera seropositivo en el análisis de seropositivo en la inclusión como un aumento de cuatro veces de los títulos de la HIA entre la muestra 1 y la muestra 2 sueros emparejados. También calculamos la proporción de sueros que probaron seropositivos en la muestra 1 para los cuales el título de HIA disminuyó cuatro veces y pasó bajo el valor de corte de Se calculó el tamaño de la muestra para identificar los factores de riesgo en el estudio prospectivo de cohorte, considerando en promedio tres individuos por hogar, una correlación intrafamiliar de 0,3, una potencia superior al 80%, con un tamaño de muestra de 840 con 2500 individuos, asumiendo niveles de exposición que oscilaban entre el 10% y el 90% y un riesgo relativo superior a 1,3.Con 2.500 sujetos, el estudio permitió una precisión absoluta del 1-2 % en torno a los valores estimados para las tasas de seroconversión.En la entrada de datos se utilizó EpiData versión 3.1 (The Epidata Association, Odense, Dinamarca).Se utilizó la versión 9.1 del SAS (SAS Inc., Cary, NC, EE.UU.) para el análisis estadístico.Las características de la cohorte del estudio se compararon con las de la población de Isla Reunión y se utilizó una prueba de Chi2 (o prueba exacta de Fisher cuando no se aplica) Se estandarizaron las tasas de seroincidencia) y seroconversión según la estructura etaria de la comunidad (fuente del Instituto Nacional de Estadística y Estudios Económicos de Francia (INSEE), se expresó en porcentajes la seroprevalencia de proxy basal, las tasas de incidencia acumulada de infección, así como las tasas de seroconversión y seronegación, se utilizaron curvas acumulativas de distribución inversa para mostrar la distribución de títulos de anticuerpos; en todas las pruebas se consideró significativo un valor de P,0,05; se estimaron intervalos de confianza (IC) del 95% de proporciones utilizando una técnica de arranque de racimo con 1000 remuestras [19]. Después del arranque, se utilizó un modelo ANOVA para comparar las proporciones medias de incidencia acumulativa entre fases pandémicas, dentro de cada grupo de edad. Se utilizó un modelo de regresión logística alterna (ALR) con log intercambiable Odds Ratio (OR) para probar la asociación de correlación intrafamiliar ajustada entre los factores y el resultado de la seroconversión. Se analizaron los datos con respecto a la edad del sujeto. Inicialmente, se consideraron cuatro grupos de edad: niños y adolescentes (,20 años), adultos jóvenes (20-39 años), adultos de mediana edad (40-59 años) y adultos ancianos (60 años). Como la incidencia acumulada de infección del segundo y tercer grupo fue muy cercana, ambos grupos se fusionaron en un grupo de adultos (20-59 años). Por lo tanto, en nuestro estudio nos referimos más adelante a tres grupos de edad: niños y adolescentes (,20 años), adultos (20-59 años), ancianos (60 años). Un total de 2.164 individuos de 772 hogares se inscribieron entre las semanas 30 y 44 en la cohorte CoPanFlu-RUN, permitiendo la recolección de 1.932 sueros al momento de la inclusión (muestra 1). Durante este período, 136 hogares (17,7% de los hogares) que contenían 464 individuos (21,4% de los individuos) reportaron al menos un caso de ILI. Sesenta sujetos entre los 464 individuos (12,9%, pertenecientes a 33 hogares [24,3%)) fueron QRT-PCR positivos, lo que documentó la infección por pH1N1/2009v. No se pudo detectar qRT-PCR positivo después de la semana 37 y no se informó de ILI después de la semana 40, el final de la ola epidémica. La segunda muestra sérica de seguimiento (muestra 2) se obtuvo para 1.759 sujetos al menos cinco semanas después del final de la ola epidémica (se El perfil de la cohorte y los principales resultados se muestran en la Figura 1. En la Tabla 1 se detallan las inclusiones y el cronograma de la muestra sérica con respecto a la circulación de pH1N1/2009v sobre la isla. En la Tabla 1 se detallan las características sociodemográficas y espacio-tiempo de la cohorte. En comparación con la comunidad de Isla Reunión, la muestra de 1.687 individuos para los que se disponía de paresera, fue mayor (,20 años: 27% vs 35% y $60 años: 17,9% vs 11,3%) y se compuso de un ligero exceso de mujeres (54,1% vs 51,5%), el desequilibrio se debió a un déficit en sujetos menores de 40 años, reflejando a los hombres en el trabajo y el hecho de que los padres declinaron el segundo suero para niños menores de cinco años. En la muestra 1 (Tabla 2) se midieron los valores basales de proxy (pre-epidemia) al pH1N1/ 2009v, obtenidos de 249 sujetos (103 hogares) reclutados al inicio de la investigación durante las semanas 30 y 31 (fase A, Figura 2 ), cuando la actividad epidémica en la cohorte seguía siendo muy baja; la distribución de la edad en este grupo fue similar a la de toda la cohorte (datos no mostrados); en general, la tasa de seroprevalencia de proxy basal (HIA $1/40), sobre todas las edades, fue del 43,4% (IC95%: 37,4%-49,6%); sin embargo, la mayoría de los sera positivos tenían títulos de anticuerpos bajos, con el valor de corte para confirmación (es decir, = 1/40); las proporciones de sura con título de HIA.1/40 fueron del 0%, Estos resultados indican que la reactividad cruzada de anticuerpos preepidémicos basales fue más fuerte en las personas de edad avanzada (60 años) y más débil en niños y adolescentes (20 años) y adultos (20-59 años), con diferencias altamente significativas entre los grupos de edad (P,0,0001). Las curvas de distribución acumulativa inversa de los títulos de HIA se muestran para cada grupo de edad y para toda la cohorte en la Figura 3. La proporción de sueros seropositivos (HI $ 1/40) aumentó constantemente durante el desarrollo de la epidemia (fase B, W32-39), y en el período inmediatamente posterior a la epidemia (fase C, W40-44) cuando alcanzó su nivel máximo, luego disminuyó en el período posterior a la epidemia (fase D, W45-52). Esta disminución fue lo suficientemente significativa como para devolver la curva de distribución acumulativa inversa a los niveles basales en las personas de edad avanzada Las tasas de incidencia acumulada, obtenidas tras la sustracción de la seroprevalencia basal de la seroprevalencia bruta de cada fase de la epidemia específica por edad, se muestran en la Tabla 2 (obsérvese que las tasas de incidencia acumulada de infección representadas para el grupo ''todas las edades'' fueron estandarizadas según la estructura de edad de la comunidad). Las tasas de incidencia acumulada fueron mucho más altas en niños y adolescentes (,20 años), lo que indica una transmisión muy activa de la infección dentro de este grupo de edad. Como se mencionó anteriormente, las tasas de incidencia acumulada alcanzaron un máximo en la fase C (W40-44), y luego disminuyeron indicando alguna labilidad de la respuesta inmune humoral frente al pH1N1/2009v. La diferencia relacionada con la edad observada en las tasas de incidencia fue altamente significativa (P,0,0001). Para estimar de manera más adecuada la disminución de títulos de anticuerpos que se produjo después del pico de la respuesta humoral al pH1N1/ 2009v, se consideró la suero emparejado del grupo de 264 sujetos para los que se obtuvo la primera muestra sérica (muestra 1) justo después de la onda epidémica (fase C, W40-44), y la segunda muestra correspondiente fue recolectada al final de la encuesta (fase D, W45-52). Las tasas de seronegación fueron del 27,0% (61/226) para todos los grupos de edad, del 17,4% (12/69) en niños y adolescentes (,20 años), del 32,3% (41/127) en adultos (20-59 años) y del 26,7% (8/30) en ancianos (60 años). Las diferencias entre las tasas de seronegación según la edad fueron estadísticamente significativas (p = 0,0671). A continuación, se consideraron los 1687 individuos para los que había sera emparejado y se midieron las tasas de seroconversión según la edad y el momento de la primera recolección de muestras séricas (fase A, B o C). Los criterios de seroconversión se definieron en la sección del método. Como se muestra en la tabla 3, hubo una fuerte disminución de las tasas de seroconversión en todos los grupos de edad, dependiendo de si los participantes fueron incluidos durante la fase A, fase B o fase C (P,0,0001). Para interpretar estos datos, se debe recordar que los anticuerpos a niveles seroprotectores (HIA $ 1/40), en las muestras séricas 1 recogidas durante la fase B de la epidemia o la fase C posterior temprana podrían representar anticuerpos cruzados reactivos de línea base o anticuerpos específicos de pH1N1/2009 en aumento debido a una infección reciente o en curso. Esta ambigüedad podría llevar a subestimar la tasa de seroconversión de los sujetos incluidos en las fases B y C. Para resolver esta ambigüedad, se consideró específicamente el grupo de 249 sujetos en los que se detectaron anticuerpos reactivos cruzados en el momento de la fase A (W30-31). La tasa de seroconversión de este grupo es la más indicativa de la exposición de los individuos a toda la onda epidémica. Fue la más alta (63,2%, P,0,0001) en niños y adolescentes (,20 años), y aún significativamente alta en adultos (39,4%, P,0,0001). Luego se probó en este grupo particular, el impacto de anticuerpos reactivos cruzados preepidémicos en la tasa de seroconversión al pH1N1/2009 (Tabla 4). Ningún sujeto con título de HIA superior a 1/40 tuvo evidencia de seroconversión al pH1N1/2009. La tasa de seroconversión en individuos con título de AIH igual a 1/40 se relacionó con la edad, siendo más importante en niños y adolescentes (,20 años); la tasa más alta de seroconversión (56%) se registró en sujetos con título de AIH inferior a 1/40, particularmente en menores de 20 años donde alcanzó el 85%; por lo tanto, el riesgo de seroconversión disminuyó cuando el título de AIH preepidémico fue alto después de controlar para la edad (P,0,0001) (Figura 4) ; la relación de odds ajustados multivariables para la seroconversión fue de 0,15 (IC95%: 0,06-0,37, P,0,0001) por dos veces el título basal, 1,79 (IC95%: 1,23-2,59, P,0.003) por otros miembros del hogar que seroconvirtieron, 5,33 (IC95%: 1,56 La figura 1 detalla las tres fases del protocolo: i) inclusión (semanas 30-44) y recolección de muestras séricas S1; ii) seguimiento para la detección de ILI en hogares, qRT-PCR en hisopos nasales y estimación de las tasas de seroincidencia acumulada; iii) final del estudio (semanas 45-52) y recolección de muestras S2. La HIA en sueros emparejados (S1+S2) permitió estimar las tasas de seroconversión. doi:10.1371/journal.pone.0025738.g001 Bp (baseline-proxy) se estimaron las tasas de seroprevalencia en las semanas 30-31 en cada grupo de edad. b Las tasas de incidencia acumulativa midieron el aumento entre las tasas de seroprevalencia en bruto y la tasa de seroprevalencia en valores basales específicos de edad. En el grupo doi:10.1371/journal.pone.002 Los datos son números, porcentajes (intervalos de confianza del 95%) y prueba de parámetros ALR valor P para la comparación de las proporciones de seroconversión según el tiempo de recolección de la primera muestra (S1) en la inclusión, en cada grupo de edad, después de controlar la selección del hogar. En el grupo ''Todas las edades'', las tasas de seroconversión se estandarizaron según la estructura de edad de la comunidad. NA: no evaluada. Seroconversión se definió como un cambio de seronegativo en la inclusión (es decir, título de HIA,1/40) a seropositivo en la muestra de seguimiento, o como un aumento de 4 veces del título recíproco de HIA entre la primera y la segunda muestras emparejadas para seropositiva en la inclusión (es decir, título de HIA $ 1/40). Para la edad,20 años (vs edad $60 años) y 11,35 (IC95%: 0.41-4.47, P = 0.62) para la edad 20-60 años (vs edad $60 años). Se muestran las tasas de seroconversión observadas y previstas de acuerdo con la edad y el título basal de la HIA Figura 4. Finalmente, se consideró a los 46 sujetos que habían sido infectados por el virus pandémico durante el transcurso del estudio, verificados por un hisopo nasal qRT-PCR positivo, y para los cuales se disponía de sueros emparejados. Los títulos iniciales de anticuerpos de la HIA en este grupo fueron,1/40, La cohorte CoPanFlu-RUN fue creada para realizar un estudio prospectivo basado en la población investigando la inmunidad de rebaño inducida por el virus de gripe pandémico 2009 e identificando los factores de La mayoría de los trabajos publicados hasta la fecha han utilizado seroencuestas transversales extensas en muestras de suero independientes pre y post epidémicas, siendo la inmunidad basal evaluada a partir de muestras congeladas almacenadas [5, 7, 8], o cohortes adultas no representativas (militares, trabajadores de la salud, pacientes de larga duración). Los títulos de anticuerpos fueron medidos por la AIS utilizando un valor de corte establecido en 1/40 como se recomienda clásicamente. Este título de la AIS en 1/40 se considera protector, es decir, otorgando una protección del 50% contra un desafío viral [20]. Nuestro ensayo ha introducido algunos cambios en el protocolo experimental en comparación con el clásico. El uso de un antígeno viral no inactivado, es decir, un virus nativo, con epítopos no desnaturalizados, probablemente permite la detección de anticuerpos a epítopos de la hemaglutinina no detectado Esto puede inducir ligeras diferencias en la sensibilidad a la detección de anticuerpos de reacción cruzada, pero esto no modifica la cinética de Ab y la evolución epidemiológica de la seroprevalencia y no pone en peligro la comparabilidad global de los resultados serológicos, lo que se confirma por el hecho de que nuestro ensayo de IH detectó títulos de anticuerpos seroprotectores en el 93,5% y dio evidencia de seroconversión en el 73,9% de la gripe pH1N1/2009 confirmada por qRT-PCR, todas cifras cercanas a las reportadas en la literatura [5, 21]. Consideramos que los títulos de 1/40, en sera recolectados de individuos inscritos durante las semanas 30 y 31 fueron anticuerpos reactivos cruzados y no anticuerpos de novo desencadenados por el virus pandémico y por lo tanto los utilizamos como sustitutos de la inmunidad basal previa a la epidemia. Varios argumentos apoyan esta suposición: i) el primer caso que indica la transmisión autóctona en Isla Reunión fue reportado por el departamento de vigilancia epidemiológica de La Reunión el 21 de julio (semana 30), es decir, el mismo día en que se inició la inclusión en nuestra cohorte de estudio; ii) se requiere de 7 a 15 días para desarrollar una respuesta de anticuerpos después de la infección viral; iii) En las semanas 30 y 31, la actividad epidémica debido al virus pandémico fue muy baja en nuestra cohorte de estudio y se hizo significativa sólo después de la semana 32. Por lo tanto, durante las semanas 30-31, 103 hogares fueron reclutados y sólo 2 hogares reportaron casos de ILI. Los hisopos nasales recolectados de estos 2 individuos fueron probados qRT-PCR negativo al virus pandémico, mientras que uno tenía evidencia de coronavirus y rinovirus utilizando un multiplex RT-PCR a virus respiratorio En contraste, durante las semanas 32 a 39, 199 individuos pertenecientes a 99 hogares reportaron ILI, entre los cuales 60 individuos habían documentado infección por el virus pandémico.Nuestro estudio muestra que una proporción sustancial de la población de la Isla Reunión tenía inmunidad preexistente al virus pandémico de la gripe de 2009 con la tasa de seroprevalencia de proxy basal más alta observada entre adultos de 60 años o más.Otros estudios de todos los continentes también habían reportado altas tasas de seropositividad preepidémico entre los ancianos [5, 6, 8, [22] [24] [25] [26], aunque existen grandes variaciones entre países [10, 11, 23, 27, 28]. Estos anticuerpos reactivos cruzados se han interpretado como la firma residual de la exposición a distancia de estos individuos a virus H1N1 que circulaban antes de 1957 [24, 25, 29, 30]. El 30%-35% fueron notablemente más altos que los reportados en otras partes del mundo [6, 8, 22, 23, [31] [33]. Sin embargo, se debe notar que estos anticuerpos basales fueron de título bajo, justo al nivel del umbral de la AIS (es decir, 1/40). Varios factores podrían haber contribuido a esta tasa basal comparativamente alta encontrada en nuestro estudio: i) Puede reflejar el hecho de que la prueba de IH utilizada en nuestro estudio fue ligeramente más sensible que la clásica [17] ; ii) Algunos individuos ya pueden haber sido infectados con el virus pH1N1/ 2009 en las semanas 30 y 31 y pueden haber desencadenado una respuesta anticuerpo al virus. Esta hipótesis parece poco probable en vista de los argumentos presentados anteriormente y de una proporción similar de sera titering HIA = 1/40 entre 122 sera de pacientes adultos enviados para fines diagnósticos al laboratorio microbiológico del Hospital Regional, durante el primer semestre Sin embargo, no podemos excluir formalmente esta hipótesis en vista de un estudio recientemente reportado desde Taiwán [11] que mostró evidencia de transmisión comunitaria subclínica con seroconversión demostrada varias semanas antes del informe del primer caso documentado en la isla. También se extrajo una conclusión similar de Australia [34] ; iii) nuestra prueba serológica podría detectar anticuerpos de reacción cruzada desencadenados por la reciente vacunación con vacuna trivalente estacional contra la gripe como se informó [4, [35] [37] [38]. Sin embargo, las vacunas estacionales contra la gripe fueron de uso bastante limitado en la Isla Reunión, especialmente en niños y adultos jóvenes; iv) Por último, los títulos basales altos pueden reflejar la historia infecciosa de los individuos a virus estacionales contragénicos con el virus pH1N1/2009, como se sugirió recientemente para la infección estacional por H1N1 [40]. Esta serosurvey indica que una gran parte de la población de Los jóvenes han pagado el tributo principal a la epidemia ya que casi dos tercios muestran evidencia de seroconversión, confirmando reportes clínicos anteriores de la isla [12] y acumulando reportes de otros países [17, 32, 41, 42] y sugiriendo que los escolares probablemente han jugado un papel central en la difusión epidémica del virus pandémico. Se encontraron tasas de infección más bajas en adultos y las tasas más bajas se registraron en ancianos. Basados en casos clínicos reportados a los servicios de vigilancia epidemiológica [12], se estimó que 66.915 personas en Isla Reunión que consultaron a un médico fueron infectadas por el virus pH1N1/2009 durante las 9 semanas de la epidemia, dando una tasa de ataque acumulativa de 8,26%. Teniendo en cuenta a aquellos que no consultaron a un médico, el número de personas infectadas sintomáticas se estimó en 104.067 (tasa de ataque: 12.85%). De hecho, la tasa de ataque de infección por pH1N1/2009 en nuestra seroencuesta fue de alrededor del 42%-44% en el pico de la respuesta de anticuerpos (es decir, semanas 40-44), cifra que es por lo menos 3 a 4 veces superior a las tasas de infección basadas en casos clínicos La gran brecha entre las dos estimaciones indica que una gran fracción (casi dos tercios) de los infectados por el virus pH1N1/2009 escapó de la detección médica, probablemente porque desarrollaron enfermedad leve o infección asintomática, una indicación adicional de la naturaleza benigna del virus, al menos a nivel comunitario. En Inglaterra, Baguelin et al. [43] estimaron que las tasas de incidencia acumulada de infección por el virus pandémico en niños fueron de 20 a 40 veces superiores a las estimadas por la vigilancia clínica. Nuestro estudio, al igual que otros [6], indica que los anticuerpos reactivos cruzados preexistentes al pH1N1/2009 en títulos $1/40 prevenían de la seroconversión en respuesta al virus pandémico. Este nivel de inmunidad reactiva cruzada preexistente probablemente confiere una verdadera protección contra la infección como cerca de dos tercios y un tercio de la infección documentada (qRT-PCR positivo) en nuestra serie se han producido en individuos con títulos basales del HIA,1/40 y = 1/ 40, respectivamente, y menos del 5% de las infecciones documentadas ocurrieron en individuos con títulos de línea base.1/40. La protección fue efectiva no sólo en adultos mayores sino también en personas más jóvenes, lo que indica que la protección fue conferida no sólo por anticuerpos reactivos cruzados basales desencadenados por virus cercanos del pH1N1/2009 que circularon antes de 1957 (como en los ancianos), sino también por anticuerpos que probablemente Las tasas de seroconversión observadas dependen de la edad, después de ajustar los títulos basales de pH1N1/2009. El papel protector del aumento de la edad puede explicarse por una mayor inmunidad cruzada en adultos y ancianos o por una mayor exposición de sujetos jóvenes al virus durante la epidemia de 2009 (debido a contactos sociales y patrones de mezcla). También puede indicar que mecanismos inmunes distintos de los anticuerpos reactivos cruzados detectados por la AIS (es decir, la inmunidad a los epitopes de neuraminidasa y células T conservadas [44] podrían desarrollarse a lo largo de toda la vida, proporcionando protección adicional contra infecciones o enfermedades graves, especialmente en los ancianos. Curiosamente, se observa evidencia una disminución de los títulos de anticuerpos, que ocurrió poco después del paso de la onda epidémica. Los títulos de HI $1/40) en la fase inmediatamente posterior a la epidemia a niveles bajo el valor de corte en la segunda muestra sérica. Esta descomposición explica la observación de que los adultos mayores ($60 años) en la cohorte del estudio se salvaron casi por completo de la epidemia si se considera solamente las tasas de incidencia acumulada derivadas de la valoración de IHA en las muestras 2 (semanas 45-52). De hecho, la tasa de incidencia acumulada en adultos mayores medida justo después del pico epidémico (es decir, semanas 40-44) fue del 20,4%. Resultados similares de la decaimiento temprano de anticuerpos fueron reportados recientemente [10, 45]. Más generalmente, estos datos muestran que las seroencuestas realizadas meses después del paso de la epidemia, probablemente subestiman la magnitud real de la infección por pH1N1/2009, en comparación con la valoración de anticuerpos realizada anteriormente, cuando las respuestas humorales están en su Sin embargo, cabe señalar que no hubo segunda ola epidémica en la Isla Reunión durante las siguientes temporadas de invierno austral en 2010 y 2011. La gripe durante el invierno 2010 no fue superior a los pasajes habituales de la gripe estacional, aunque casi dos tercios de los casos documentados en 2010 también se debieron al pH1N1/2009v [46]. Además, durante el invierno austral 2011 se observaron muchos menos aislados de virus pandémicos, lo que sugiere fuertemente que la primera ola epidémica había conferido una sólida inmunidad de rebaño, a nivel comunitario. Nuestro estudio tiene algunas limitaciones. El hecho de que la progresión epidémica coincidió con la implementación del estudio prospectivo, no pudimos recolectar, en sentido estricto, sueros preepidémicos de los miembros de la cohorte. Esto puede sobreestimar la inmunidad de la línea base si la transmisión comunitaria subclínica hubiera ocurrido antes de que se notificaran los primeros casos de gripe por pH1N1/2009. Los anticuerpos al virus pandémico fueron detectados por la AISH, una prueba que tiene una buena especificidad pero una sensibilidad bastante baja [46]. Por lo tanto, el umbral de 1/40 puede subestimar el número de individuos infectados. Sin embargo, las tasas de seroconversión, la prueba estándar de oro serológico basada en sueros emparejados, probablemente dio la imagen más precisa de la pandemia a nivel comunitario en la Isla Reunión.

¿Cuál es el valor de corte clásico para los títulos de anticuerpos?

Pandemic Influenza Debido a pH1N1/2009 Virus: Estimación de la Carga de Infección en la Isla de la Reunión a través de una Prospectiva Serosurvey, Austral Winter 2009https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3183080/SHA: ee6d70a53e3262cea6f85b8b226f6b4b8b5f64bAutores: Dellagi, Koussay; Rollot, Olivier; Temmam, Sarah; Salez, Nicolas; Guernier, Vanina; Pascalis, Hervé; Gérardin, Marie-Christine; Fianu, Adrian; Lapidus, Nathanael; Naty, Nadège; Tortosa, Pablo; Boussaïd, Karim; Jaff El objetivo de este estudio fue evaluar a través de un estudio prospectivo, la tasa de ataque del virus pH1N1/2009 en Isla Reunión y los factores de riesgo de infección, durante la temporada 2009. METODOLOGÍA/PRINCIPAL DEFINICIONES: Durante el invierno austral de 2009 se realizó una serosurvey, en el marco de un estudio prospectivo de población. Se recolectaron pares de sera de 1687 individuos pertenecientes a 772 hogares, durante y después del paso de la onda pandémica. Se titularon anticuerpos a pH1N1/2009v utilizando el ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HIA) con títulos ≥1/40 considerados positivos. Seroprevalencia durante las dos primeras semanas de detección de pH1N1/2009v en Isla Reunión fue del 29,8% en personas menores de 20 años, del 35,6% en adultos (20-59 años) y del 73,3% en ancianos (≥ Las tasas de incidencia acumulada corregidas basales fueron 42,9%, 13,9% y 0% en estos grupos de edad, respectivamente (P<0,0001). Una disminución significativa en los títulos de anticuerpos ocurrió poco después del paso de la ola epidémica. Las tasas de seroconversión al pH1N1/2009 se correlacionaron negativamente con la edad: 63,2%, 39,4% y 16,7%, en cada grupo de edad respectivamente (P<0,0001). La seroconversión ocurrió en el 65,2% de los individuos que fueron seronegativos en la inclusión en comparación con el 6,8% en los que fueron inicialmente seropositivos. CONCLUSIONES: La seroincidencia de la infección por pH1N1/2009v fue tres veces mayor que la estimada a partir de la vigilancia clínica, lo que indica que casi dos tercios de las infecciones ocurridas a nivel comunitario han escapado a la detección médica. Texto: En abril de 2009, se produjeron los primeros casos de infecciones respiratorias agudas causadas por un nuevo virus de la gripe triple reafirmante, pH1N1/ 2009v, en México y los Estados Unidos [1]. La rápida propagación de la infección a otros continentes llevó a la Organización Mundial de la Salud (OMS) a declarar el 11 de junio de 2009 que se estaba produciendo una pandemia de gripe por pH1N1/2009v, lo que suscitó una gran preocupación internacional por el riesgo de alta morbilidad y letalidad y el potencial de impacto socioeconómico grave. En realidad, el impacto potencial de esta primera pandemia de gripe de tercer milenio se ha revisado a la baja, ya que las tasas de morbilidad y mortalidad fueron menos graves de lo previsto inicialmente [2]. Los datos de vigilancia de enfermedades no permiten una estimación precisa de la verdadera tasa de infección por gripe, ya que una proporción sustancial de infecciones son asintomáticas o leves [3]. Las encuestas serológicas pueden superar esta limitación, pero deben tener en cuenta que una proporción significativa de la población que presentó títulos de anticuerpos cruzados de protección antes de la circulación del pH1N1/2009v [4]. Esta llamada "inmunidad de base" debe restarse de la seroprevalencia observada después de la ola pandémica, para determinar la seroincidencia en los serocidios [5] [6] [7] [8]. Sin embargo, excepto en pocos estudios [9] [10] [11], la mayoría de estos serocidios no utilizaron mediciones en serie en la misma persona, lo que permite una mejor comprensión de la cinética de anticuerpos y la dinámica de infección en individuos y comunidades. La Isla Reunión (805.500 habitantes) es un departamento francés de ultramar situado en el Océano Índico sudoccidental, a 700 km al este de Madagascar y a 200 km al suroeste de Mauricio. El primer caso importado de pH1N1/2009v se identificó el 5 de julio de 2009 (semana 29) en un viajero que regresaba de Australia. El primer caso que indicaba la transmisión comunitaria se detectó el 21 de julio (semana 30). El pH1N1/2009v se convirtió en el virus de la gripe circulante predominante en las cuatro semanas siguientes a su primera detección, su actividad alcanzó su máximo durante la semana 35 (24) (25) (26) (28) (28) (29) (30) y terminó en la semana 38 [12]. Contrariamente a los temores iniciales, el sistema de atención de la salud no se vio abrumado, ya que las tasas de morbilidad y mortalidad fueron inferiores a las previstas [12] [13] [14]. Para evaluar a nivel comunitario, la magnitud real de la pandemia de pH1N1/2009v y el alcance de la inmunidad de los rebaños adquirida tras el paso de la ola epidémica, se realizó una seroencuesta poblacional prospectiva en la Isla Reunión durante el paso de la ola epidémica en la temporada de invierno austral de 2009 (julio-diciembre de 2009): la prevalencia de la infección se evaluó semanalmente y las tasas de seroconversión se midieron utilizando sera emparejada. El CoPanFLu-RUN formó parte del proyecto internacional CoPanFLu, un consorcio entre el Instituto Nacional Francés de Salud e Investigación Médica (INSERM), el Instituto de Investigación para el Desarrollo (IRD) y la Fundación Mérieux, en el marco de la promoción de la Escuela de Estudios Avanzados en Salud Pública (HEESP). Para permitir la rápida implementación del estudio en previsión de la inminente propagación de la ola pandémica, se utilizó una muestra preexistente de 2442 hogares establecida en octubre de 2006 para la investigación del brote de Chikungunya (SEROCHIK) y actualizada en mayo de 2008 a lo largo de una encuesta telefónica de seguimiento (TELECHIK) sobre la base de 1148 hogares [15, 16]. Se prestó especial atención a seleccionar hogares que representan una amplia gama de ubicaciones geográficas con el fin de minimizar el sesgo de repartición. La fase de inclusión comenzó el 21 de julio (semana 30) y continuó hasta la semana 44, a lo largo de la ola epidémica y más allá. Se obtuvo una primera muestra sérica (muestra 1) de cada miembro del hogar. A continuación se realizó una investigación telefónica activa dos veces por semana para registrar síntomas compatibles con la enfermedad similar a la gripe (ILI) en los hogares. El informe de la ILI (fiebre $37.8uC asociada con cualquier síntoma respiratorio o sistémico) llevó a tres visitas consecutivas de una enfermera al caso de incidencia (en el día 0, +3 y +8 post-informe) para registrar síntomas y recoger muestras nasales de todos los miembros de la familia (para la detección de QRT-PCR de pH1N1/2009v. En la semana 45, se suspendió la investigación activa y se obtuvo una segunda muestra sérica (pos-epidémico) (muestra 2) (semanas 45-52) para determinar las tasas de seroconversión. Se alió y se almacenó en 280uC. El protocolo se llevó a cabo de conformidad con la Declaración de Helsinki y la ley francesa para la investigación biomédica (Nu ID RCB AFSSAPS: 2009-A00689-48) y fue aprobado por el Comité de Protección de las La detección del genoma viral por RT-PCR. El ARN viral se extrajo de 140 mL de eluato de hisopo nasal utilizando el kit de ARN viral QIAamp (Qiagen) y se procesó para su detección por TaqMan qRT-PCR, dirigido al gen HA de la heamagglutinina (SuperScript III Platinum en un solo paso sistema QRT-PCR, Invitrogen) de acuerdo con las recomendaciones del Instituto Pasteur (Van der Werf S. & Enouf V., SOP/FluA/130509). La infección confirmada por pH1N1/2009v se definió como una detección positiva del gen QRT-PCR en al menos un hisopo nasal. Ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HIA). Se adaptó una técnica estándar de inhibición de la hemaglutinación para detectar y cuantificar anticuerpos de pH1N1/2009v [17]. El antígeno se preparó diluyendo un sobrenadante de cultivo celular no inactivado que produce una cepa Pdm H1N1v (cepa OPYFLU-1 aislada de un paciente joven que regresaba de México a principios de mayo de 2009) [18]. Brevemente, el virus se propagó a las células MDCK bajo condiciones estándar. El último paso (utilizado para la preparación de antígenos) se realizó en ausencia de tripsina y ht-FBS. El sobrenadante se recogió en el día siete p.i. clarificado por centrifugación a 8006 g durante 10 min a temperatura ambiente, alícuota y conservado a 280uC. El título hemaglutinante del antígeno viral no in La dilución que proporcionaba 5,33 unidades hemagglutinantes en un volumen de 25 mL se utilizó para la posterior HIA. Se inactivaron seras a 56uC durante 30 minutos antes de su uso. Se realizaron diluciones secuenciales de dos veces en PBS (1/10 a 1/1280) en volúmenes de 25 mL y se distribuyeron en microplacas de fondo en V 96 bien. Se utilizaron glóbulos rojos humanos (RBC) para experimentos de hemaglutinación. La detección y cuantificación de anticuerpos a pH1N1/2009v se realizó de la siguiente manera: 25 mL de suspensión viral se añadió a la dilución sérica (25 mL) e incubado durante 1 hora a temperatura ambiente. Cada pozo fue llenado con 25 mL de suspensión de RBC al 1% en PBS (v/v: 0,33%), seguido de otra incubación a temperatura ambiente de 30 min. Se determinó que el título de la HIA era la última dilución que proporcionaba una clara inhibición de la hemaglutinación; todos los experimentos se realizaron en presencia de los mismos controles negativos y positivos, incluyendo sera con títulos de anticuerpos 1/40, 1/80, 1/160 y 1/320; los resultados reportados en este estudio se basaron únicamente en el análisis serológico de sueros emparejados; para el análisis, se identificaron cuatro fases sucesivas a lo largo de la onda pandémica: fase A (semanas 30-31) correspondió al tiempo temprano de epidemia, fase B (W32-39) a la epidemia que se desarrollaba, fase C (W40-44) a la etapa inmediatamente post-epidémico y fase D (W45-52) a la etapa tardía post-epidémico; la seropositividad se definió como un título de HIA de 1/ 40 o más. La tasa de seroprevalencia La tasa de incidencia acumulativa de infección midió el aumento entre la tasa de seroprevalencia bruta en cualquier momento dado durante las fases epidémicas (S2pi) y la tasa de seroprevalencia basal de proxy específica por edad (S1pA) (s2 pi -s1 pA ). La seroconversión se definió como un cambio de seronegativo en la inclusión (muestra 1: HIA,1/40) a seropositivo en el seguimiento (muestra 2: HIA $ 1/40), o para sera seropositivo en el análisis de seropositivo en la inclusión como un aumento de cuatro veces de los títulos de la HIA entre la muestra 1 y la muestra 2 sueros emparejados. También calculamos la proporción de sueros que probaron seropositivos en la muestra 1 para los cuales el título de HIA disminuyó cuatro veces y pasó bajo el valor de corte de Se calculó el tamaño de la muestra para identificar los factores de riesgo en el estudio prospectivo de cohorte, considerando en promedio tres individuos por hogar, una correlación intrafamiliar de 0,3, una potencia superior al 80%, con un tamaño de muestra de 840 con 2500 individuos, asumiendo niveles de exposición que oscilaban entre el 10% y el 90% y un riesgo relativo superior a 1,3.Con 2.500 sujetos, el estudio permitió una precisión absoluta del 1-2 % en torno a los valores estimados para las tasas de seroconversión.En la entrada de datos se utilizó EpiData versión 3.1 (The Epidata Association, Odense, Dinamarca).Se utilizó la versión 9.1 del SAS (SAS Inc., Cary, NC, EE.UU.) para el análisis estadístico.Las características de la cohorte del estudio se compararon con las de la población de Isla Reunión y se utilizó una prueba de Chi2 (o prueba exacta de Fisher cuando no se aplica) Se estandarizaron las tasas de seroincidencia) y seroconversión según la estructura etaria de la comunidad (fuente del Instituto Nacional de Estadística y Estudios Económicos de Francia (INSEE), se expresó en porcentajes la seroprevalencia de proxy basal, las tasas de incidencia acumulada de infección, así como las tasas de seroconversión y seronegación, se utilizaron curvas acumulativas de distribución inversa para mostrar la distribución de títulos de anticuerpos; en todas las pruebas se consideró significativo un valor de P,0,05; se estimaron intervalos de confianza (IC) del 95% de proporciones utilizando una técnica de arranque de racimo con 1000 remuestras [19]. Después del arranque, se utilizó un modelo ANOVA para comparar las proporciones medias de incidencia acumulativa entre fases pandémicas, dentro de cada grupo de edad. Se utilizó un modelo de regresión logística alterna (ALR) con log intercambiable Odds Ratio (OR) para probar la asociación de correlación intrafamiliar ajustada entre los factores y el resultado de la seroconversión. Se analizaron los datos con respecto a la edad del sujeto. Inicialmente, se consideraron cuatro grupos de edad: niños y adolescentes (,20 años), adultos jóvenes (20-39 años), adultos de mediana edad (40-59 años) y adultos ancianos (60 años). Como la incidencia acumulada de infección del segundo y tercer grupo fue muy cercana, ambos grupos se fusionaron en un grupo de adultos (20-59 años). Por lo tanto, en nuestro estudio nos referimos más adelante a tres grupos de edad: niños y adolescentes (,20 años), adultos (20-59 años), ancianos (60 años). Un total de 2.164 individuos de 772 hogares se inscribieron entre las semanas 30 y 44 en la cohorte CoPanFlu-RUN, permitiendo la recolección de 1.932 sueros al momento de la inclusión (muestra 1). Durante este período, 136 hogares (17,7% de los hogares) que contenían 464 individuos (21,4% de los individuos) reportaron al menos un caso de ILI. Sesenta sujetos entre los 464 individuos (12,9%, pertenecientes a 33 hogares [24,3%)) fueron QRT-PCR positivos, lo que documentó la infección por pH1N1/2009v. No se pudo detectar qRT-PCR positivo después de la semana 37 y no se informó de ILI después de la semana 40, el final de la ola epidémica. La segunda muestra sérica de seguimiento (muestra 2) se obtuvo para 1.759 sujetos al menos cinco semanas después del final de la ola epidémica (se El perfil de la cohorte y los principales resultados se muestran en la Figura 1. En la Tabla 1 se detallan las inclusiones y el cronograma de la muestra sérica con respecto a la circulación de pH1N1/2009v sobre la isla. En la Tabla 1 se detallan las características sociodemográficas y espacio-tiempo de la cohorte. En comparación con la comunidad de Isla Reunión, la muestra de 1.687 individuos para los que se disponía de paresera, fue mayor (,20 años: 27% vs 35% y $60 años: 17,9% vs 11,3%) y se compuso de un ligero exceso de mujeres (54,1% vs 51,5%), el desequilibrio se debió a un déficit en sujetos menores de 40 años, reflejando a los hombres en el trabajo y el hecho de que los padres declinaron el segundo suero para niños menores de cinco años. En la muestra 1 (Tabla 2) se midieron los valores basales de proxy (pre-epidemia) al pH1N1/ 2009v, obtenidos de 249 sujetos (103 hogares) reclutados al inicio de la investigación durante las semanas 30 y 31 (fase A, Figura 2 ), cuando la actividad epidémica en la cohorte seguía siendo muy baja; la distribución de la edad en este grupo fue similar a la de toda la cohorte (datos no mostrados); en general, la tasa de seroprevalencia de proxy basal (HIA $1/40), sobre todas las edades, fue del 43,4% (IC95%: 37,4%-49,6%); sin embargo, la mayoría de los sera positivos tenían títulos de anticuerpos bajos, con el valor de corte para confirmación (es decir, = 1/40); las proporciones de sura con título de HIA.1/40 fueron del 0%, Estos resultados indican que la reactividad cruzada de anticuerpos preepidémicos basales fue más fuerte en las personas de edad avanzada (60 años) y más débil en niños y adolescentes (20 años) y adultos (20-59 años), con diferencias altamente significativas entre los grupos de edad (P,0,0001). Las curvas de distribución acumulativa inversa de los títulos de HIA se muestran para cada grupo de edad y para toda la cohorte en la Figura 3. La proporción de sueros seropositivos (HI $ 1/40) aumentó constantemente durante el desarrollo de la epidemia (fase B, W32-39), y en el período inmediatamente posterior a la epidemia (fase C, W40-44) cuando alcanzó su nivel máximo, luego disminuyó en el período posterior a la epidemia (fase D, W45-52). Esta disminución fue lo suficientemente significativa como para devolver la curva de distribución acumulativa inversa a los niveles basales en las personas de edad avanzada Las tasas de incidencia acumulada, obtenidas tras la sustracción de la seroprevalencia basal de la seroprevalencia bruta de cada fase de la epidemia específica por edad, se muestran en la Tabla 2 (obsérvese que las tasas de incidencia acumulada de infección representadas para el grupo ''todas las edades'' fueron estandarizadas según la estructura de edad de la comunidad). Las tasas de incidencia acumulada fueron mucho más altas en niños y adolescentes (,20 años), lo que indica una transmisión muy activa de la infección dentro de este grupo de edad. Como se mencionó anteriormente, las tasas de incidencia acumulada alcanzaron un máximo en la fase C (W40-44), y luego disminuyeron indicando alguna labilidad de la respuesta inmune humoral frente al pH1N1/2009v. La diferencia relacionada con la edad observada en las tasas de incidencia fue altamente significativa (P,0,0001). Para estimar de manera más adecuada la disminución de títulos de anticuerpos que se produjo después del pico de la respuesta humoral al pH1N1/ 2009v, se consideró la suero emparejado del grupo de 264 sujetos para los que se obtuvo la primera muestra sérica (muestra 1) justo después de la onda epidémica (fase C, W40-44), y la segunda muestra correspondiente fue recolectada al final de la encuesta (fase D, W45-52). Las tasas de seronegación fueron del 27,0% (61/226) para todos los grupos de edad, del 17,4% (12/69) en niños y adolescentes (,20 años), del 32,3% (41/127) en adultos (20-59 años) y del 26,7% (8/30) en ancianos (60 años). Las diferencias entre las tasas de seronegación según la edad fueron estadísticamente significativas (p = 0,0671). A continuación, se consideraron los 1687 individuos para los que había sera emparejado y se midieron las tasas de seroconversión según la edad y el momento de la primera recolección de muestras séricas (fase A, B o C). Los criterios de seroconversión se definieron en la sección del método. Como se muestra en la tabla 3, hubo una fuerte disminución de las tasas de seroconversión en todos los grupos de edad, dependiendo de si los participantes fueron incluidos durante la fase A, fase B o fase C (P,0,0001). Para interpretar estos datos, se debe recordar que los anticuerpos a niveles seroprotectores (HIA $ 1/40), en las muestras séricas 1 recogidas durante la fase B de la epidemia o la fase C posterior temprana podrían representar anticuerpos cruzados reactivos de línea base o anticuerpos específicos de pH1N1/2009 en aumento debido a una infección reciente o en curso. Esta ambigüedad podría llevar a subestimar la tasa de seroconversión de los sujetos incluidos en las fases B y C. Para resolver esta ambigüedad, se consideró específicamente el grupo de 249 sujetos en los que se detectaron anticuerpos reactivos cruzados en el momento de la fase A (W30-31). La tasa de seroconversión de este grupo es la más indicativa de la exposición de los individuos a toda la onda epidémica. Fue la más alta (63,2%, P,0,0001) en niños y adolescentes (,20 años), y aún significativamente alta en adultos (39,4%, P,0,0001). Luego se probó en este grupo particular, el impacto de anticuerpos reactivos cruzados preepidémicos en la tasa de seroconversión al pH1N1/2009 (Tabla 4). Ningún sujeto con título de HIA superior a 1/40 tuvo evidencia de seroconversión al pH1N1/2009. La tasa de seroconversión en individuos con título de AIH igual a 1/40 se relacionó con la edad, siendo más importante en niños y adolescentes (,20 años); la tasa más alta de seroconversión (56%) se registró en sujetos con título de AIH inferior a 1/40, particularmente en menores de 20 años donde alcanzó el 85%; por lo tanto, el riesgo de seroconversión disminuyó cuando el título de AIH preepidémico fue alto después de controlar para la edad (P,0,0001) (Figura 4) ; la relación de odds ajustados multivariables para la seroconversión fue de 0,15 (IC95%: 0,06-0,37, P,0,0001) por dos veces el título basal, 1,79 (IC95%: 1,23-2,59, P,0.003) por otros miembros del hogar que seroconvirtieron, 5,33 (IC95%: 1,56 La figura 1 detalla las tres fases del protocolo: i) inclusión (semanas 30-44) y recolección de muestras séricas S1; ii) seguimiento para la detección de ILI en hogares, qRT-PCR en hisopos nasales y estimación de las tasas de seroincidencia acumulada; iii) final del estudio (semanas 45-52) y recolección de muestras S2. La HIA en sueros emparejados (S1+S2) permitió estimar las tasas de seroconversión. doi:10.1371/journal.pone.0025738.g001 Bp (baseline-proxy) se estimaron las tasas de seroprevalencia en las semanas 30-31 en cada grupo de edad. b Las tasas de incidencia acumulativa midieron el aumento entre las tasas de seroprevalencia en bruto y la tasa de seroprevalencia en valores basales específicos de edad. En el grupo doi:10.1371/journal.pone.002 Los datos son números, porcentajes (intervalos de confianza del 95%) y prueba de parámetros ALR valor P para la comparación de las proporciones de seroconversión según el tiempo de recolección de la primera muestra (S1) en la inclusión, en cada grupo de edad, después de controlar la selección del hogar. En el grupo ''Todas las edades'', las tasas de seroconversión se estandarizaron según la estructura de edad de la comunidad. NA: no evaluada. Seroconversión se definió como un cambio de seronegativo en la inclusión (es decir, título de HIA,1/40) a seropositivo en la muestra de seguimiento, o como un aumento de 4 veces del título recíproco de HIA entre la primera y la segunda muestras emparejadas para seropositiva en la inclusión (es decir, título de HIA $ 1/40). Para la edad,20 años (vs edad $60 años) y 11,35 (IC95%: 0.41-4.47, P = 0.62) para la edad 20-60 años (vs edad $60 años). Se muestran las tasas de seroconversión observadas y previstas de acuerdo con la edad y el título basal de la HIA Figura 4. Finalmente, se consideró a los 46 sujetos que habían sido infectados por el virus pandémico durante el transcurso del estudio, verificados por un hisopo nasal qRT-PCR positivo, y para los cuales se disponía de sueros emparejados. Los títulos iniciales de anticuerpos de la HIA en este grupo fueron,1/40, La cohorte CoPanFlu-RUN fue creada para realizar un estudio prospectivo basado en la población investigando la inmunidad de rebaño inducida por el virus de gripe pandémico 2009 e identificando los factores de La mayoría de los trabajos publicados hasta la fecha han utilizado seroencuestas transversales extensas en muestras de suero independientes pre y post epidémicas, siendo la inmunidad basal evaluada a partir de muestras congeladas almacenadas [5, 7, 8], o cohortes adultas no representativas (militares, trabajadores de la salud, pacientes de larga duración). Los títulos de anticuerpos fueron medidos por la AIS utilizando un valor de corte establecido en 1/40 como se recomienda clásicamente. Este título de la AIS en 1/40 se considera protector, es decir, otorgando una protección del 50% contra un desafío viral [20]. Nuestro ensayo ha introducido algunos cambios en el protocolo experimental en comparación con el clásico. El uso de un antígeno viral no inactivado, es decir, un virus nativo, con epítopos no desnaturalizados, probablemente permite la detección de anticuerpos a epítopos de la hemaglutinina no detectado Esto puede inducir ligeras diferencias en la sensibilidad a la detección de anticuerpos de reacción cruzada, pero esto no modifica la cinética de Ab y la evolución epidemiológica de la seroprevalencia y no pone en peligro la comparabilidad global de los resultados serológicos, lo que se confirma por el hecho de que nuestro ensayo de IH detectó títulos de anticuerpos seroprotectores en el 93,5% y dio evidencia de seroconversión en el 73,9% de la gripe pH1N1/2009 confirmada por qRT-PCR, todas cifras cercanas a las reportadas en la literatura [5, 21]. Consideramos que los títulos de 1/40, en sera recolectados de individuos inscritos durante las semanas 30 y 31 fueron anticuerpos reactivos cruzados y no anticuerpos de novo desencadenados por el virus pandémico y por lo tanto los utilizamos como sustitutos de la inmunidad basal previa a la epidemia. Varios argumentos apoyan esta suposición: i) el primer caso que indica la transmisión autóctona en Isla Reunión fue reportado por el departamento de vigilancia epidemiológica de La Reunión el 21 de julio (semana 30), es decir, el mismo día en que se inició la inclusión en nuestra cohorte de estudio; ii) se requiere de 7 a 15 días para desarrollar una respuesta de anticuerpos después de la infección viral; iii) En las semanas 30 y 31, la actividad epidémica debido al virus pandémico fue muy baja en nuestra cohorte de estudio y se hizo significativa sólo después de la semana 32. Por lo tanto, durante las semanas 30-31, 103 hogares fueron reclutados y sólo 2 hogares reportaron casos de ILI. Los hisopos nasales recolectados de estos 2 individuos fueron probados qRT-PCR negativo al virus pandémico, mientras que uno tenía evidencia de coronavirus y rinovirus utilizando un multiplex RT-PCR a virus respiratorio En contraste, durante las semanas 32 a 39, 199 individuos pertenecientes a 99 hogares reportaron ILI, entre los cuales 60 individuos habían documentado infección por el virus pandémico.Nuestro estudio muestra que una proporción sustancial de la población de la Isla Reunión tenía inmunidad preexistente al virus pandémico de la gripe de 2009 con la tasa de seroprevalencia de proxy basal más alta observada entre adultos de 60 años o más.Otros estudios de todos los continentes también habían reportado altas tasas de seropositividad preepidémico entre los ancianos [5, 6, 8, [22] [24] [25] [26], aunque existen grandes variaciones entre países [10, 11, 23, 27, 28]. Estos anticuerpos reactivos cruzados se han interpretado como la firma residual de la exposición a distancia de estos individuos a virus H1N1 que circulaban antes de 1957 [24, 25, 29, 30]. El 30%-35% fueron notablemente más altos que los reportados en otras partes del mundo [6, 8, 22, 23, [31] [33]. Sin embargo, se debe notar que estos anticuerpos basales fueron de título bajo, justo al nivel del umbral de la AIS (es decir, 1/40). Varios factores podrían haber contribuido a esta tasa basal comparativamente alta encontrada en nuestro estudio: i) Puede reflejar el hecho de que la prueba de IH utilizada en nuestro estudio fue ligeramente más sensible que la clásica [17] ; ii) Algunos individuos ya pueden haber sido infectados con el virus pH1N1/ 2009 en las semanas 30 y 31 y pueden haber desencadenado una respuesta anticuerpo al virus. Esta hipótesis parece poco probable en vista de los argumentos presentados anteriormente y de una proporción similar de sera titering HIA = 1/40 entre 122 sera de pacientes adultos enviados para fines diagnósticos al laboratorio microbiológico del Hospital Regional, durante el primer semestre Sin embargo, no podemos excluir formalmente esta hipótesis en vista de un estudio recientemente reportado desde Taiwán [11] que mostró evidencia de transmisión comunitaria subclínica con seroconversión demostrada varias semanas antes del informe del primer caso documentado en la isla. También se extrajo una conclusión similar de Australia [34] ; iii) nuestra prueba serológica podría detectar anticuerpos de reacción cruzada desencadenados por la reciente vacunación con vacuna trivalente estacional contra la gripe como se informó [4, [35] [37] [38]. Sin embargo, las vacunas estacionales contra la gripe fueron de uso bastante limitado en la Isla Reunión, especialmente en niños y adultos jóvenes; iv) Por último, los títulos basales altos pueden reflejar la historia infecciosa de los individuos a virus estacionales contragénicos con el virus pH1N1/2009, como se sugirió recientemente para la infección estacional por H1N1 [40]. Esta serosurvey indica que una gran parte de la población de Los jóvenes han pagado el tributo principal a la epidemia ya que casi dos tercios muestran evidencia de seroconversión, confirmando reportes clínicos anteriores de la isla [12] y acumulando reportes de otros países [17, 32, 41, 42] y sugiriendo que los escolares probablemente han jugado un papel central en la difusión epidémica del virus pandémico. Se encontraron tasas de infección más bajas en adultos y las tasas más bajas se registraron en ancianos. Basados en casos clínicos reportados a los servicios de vigilancia epidemiológica [12], se estimó que 66.915 personas en Isla Reunión que consultaron a un médico fueron infectadas por el virus pH1N1/2009 durante las 9 semanas de la epidemia, dando una tasa de ataque acumulativa de 8,26%. Teniendo en cuenta a aquellos que no consultaron a un médico, el número de personas infectadas sintomáticas se estimó en 104.067 (tasa de ataque: 12.85%). De hecho, la tasa de ataque de infección por pH1N1/2009 en nuestra seroencuesta fue de alrededor del 42%-44% en el pico de la respuesta de anticuerpos (es decir, semanas 40-44), cifra que es por lo menos 3 a 4 veces superior a las tasas de infección basadas en casos clínicos La gran brecha entre las dos estimaciones indica que una gran fracción (casi dos tercios) de los infectados por el virus pH1N1/2009 escapó de la detección médica, probablemente porque desarrollaron enfermedad leve o infección asintomática, una indicación adicional de la naturaleza benigna del virus, al menos a nivel comunitario. En Inglaterra, Baguelin et al. [43] estimaron que las tasas de incidencia acumulada de infección por el virus pandémico en niños fueron de 20 a 40 veces superiores a las estimadas por la vigilancia clínica. Nuestro estudio, al igual que otros [6], indica que los anticuerpos reactivos cruzados preexistentes al pH1N1/2009 en títulos $1/40 previnieron de la seroconversión en respuesta al virus pandémico. Este nivel de inmunidad reactiva cruzada preexistente probablemente confiere una verdadera protección contra la infección como cerca de dos tercios y un tercio de la infección documentada (qRT-PCR positivo) en nuestra serie se han producido en individuos con títulos basales del HIA,1/40 y = 1/ 40, respectivamente, y menos del 5% de las infecciones documentadas ocurrieron en individuos con títulos de línea base.1/40. La protección fue efectiva no sólo en adultos mayores sino también en personas más jóvenes, lo que indica que la protección fue conferida no sólo por anticuerpos reactivos cruzados basales desencadenados por virus cercanos del pH1N1/2009 que circularon antes de 1957 (como en los ancianos), sino también por anticuerpos que probablemente Las tasas de seroconversión observadas dependen de la edad, después de ajustar los títulos basales de pH1N1/2009. El papel protector del aumento de la edad puede explicarse por una mayor inmunidad cruzada en adultos y ancianos o por una mayor exposición de sujetos jóvenes al virus durante la epidemia de 2009 (debido a contactos sociales y patrones de mezcla). También puede indicar que mecanismos inmunes distintos de los anticuerpos reactivos cruzados detectados por la AIS (es decir, la inmunidad a los epitopes de neuraminidasa y células T conservadas [44] podrían desarrollarse a lo largo de toda la vida, proporcionando protección adicional contra infecciones o enfermedades graves, especialmente en los ancianos. Curiosamente, se observa evidencia una disminución de los títulos de anticuerpos, que ocurrió poco después del paso de la onda epidémica. Los títulos de HI $1/40) en la fase inmediatamente posterior a la epidemia a niveles bajo el valor de corte en la segunda muestra sérica. Esta descomposición explica la observación de que los adultos mayores ($60 años) en la cohorte del estudio se salvaron casi por completo de la epidemia si se considera solamente las tasas de incidencia acumulada derivadas de la valoración de IHA en las muestras 2 (semanas 45-52). De hecho, la tasa de incidencia acumulada en adultos mayores medida justo después del pico epidémico (es decir, semanas 40-44) fue del 20,4%. Resultados similares de la decaimiento temprano de anticuerpos fueron reportados recientemente [10, 45]. Más generalmente, estos datos muestran que las seroencuestas realizadas meses después del paso de la epidemia, probablemente subestiman la magnitud real de la infección por pH1N1/2009, en comparación con la valoración de anticuerpos realizada anteriormente, cuando las respuestas humorales están en su Sin embargo, cabe señalar que no hubo segunda ola epidémica en la Isla Reunión durante las siguientes temporadas de invierno austral en 2010 y 2011. La gripe durante el invierno 2010 no fue superior a los pasajes habituales de la gripe estacional, aunque casi dos tercios de los casos documentados en 2010 también se debieron al pH1N1/2009v [46]. Además, durante el invierno austral 2011 se observaron muchos menos aislados de virus pandémicos, lo que sugiere fuertemente que la primera ola epidémica había conferido una sólida inmunidad de rebaño, a nivel comunitario. Nuestro estudio tiene algunas limitaciones. El hecho de que la progresión epidémica coincidió con la implementación del estudio prospectivo, no pudimos recolectar, en sentido estricto, sueros preepidémicos de los miembros de la cohorte. Esto puede sobreestimar la inmunidad de la línea base si la transmisión comunitaria subclínica hubiera ocurrido antes de que se notificaran los primeros casos de gripe por pH1N1/2009. Los anticuerpos al virus pandémico fueron detectados por la AISH, una prueba que tiene una buena especificidad pero una sensibilidad bastante baja [46]. Por lo tanto, el umbral de 1/40 puede subestimar el número de individuos infectados. Sin embargo, las tasas de seroconversión, la prueba estándar de oro serológico basada en sueros emparejados, probablemente dio la imagen más precisa de la pandemia a nivel comunitario en la Isla Reunión.

¿Cuánto tiempo duró el brote viral de pH1N1/2009?

La alta carga de los virus no-influenza en enfermedades similares a la gripe en las primeras semanas de la epidemia H1N1v en Franciahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3157400/SHA: f4c1afe385e9e31eb5678e15a3c280ba97326554Autores: Schnepf, Nathalie; Resche-Rigon, Matthieu; Chaillon, Antoine; Scemla, Anne; Gras, Guillaume; Semoun, Oren; Taboulet, Pierre; Molina, Jean-Michel; Simon, François; Goudeau, Alain; LeGoff, JérômeFecha: 2011-08-17DOI: 10.1371/journal.pone.0023514 El uso limitado de herramientas moleculares subestima el papel de otros patógenos comunes. OBJETIVOS: Durante las primeras semanas de la pandemia de gripe 2009-2010, se realizó una encuesta clínica y virológica en pacientes adultos y pediátricos con IDI referidos a dos hospitales universitarios franceses en París y Tours. Se investigaron los diferentes patógenos involucrados en la IDI y describir los síntomas asociados. MÉTODOS: Se realizó un diagnóstico de gripe pandémica H1N1v con ensayo RT-PCR en tiempo real. Se investigaron otras etiologías virales mediante el ensayo multiplex molecular RespiFinder19®. Los datos clínicos fueron recolectados prospectivamente por los médicos utilizando un cuestionario estándar. RESULTADOS: De la semana 35 a 44, se recolectaron hisopos endonales en 413 pacientes. En general, 68 muestras (16,5%) fueron positivas para H1N1v. En 13 de ellos también se detectaron otros patógenos respiratorios, de los cuales 213 (61,9%) fueron positivos para diversos agentes respiratorios, 190 en infecciones únicas y 23 en infecciones mixtas; los virus más prevalentes en infecciones únicas negativas de H1N1v fueron rinovirus (62,6%), seguidos de virus de parainfluenza (24,2%) y adenovirus (5,3%); el 70,6% de los casos de H1N1v fueron identificados en pacientes menores de 40 años y ninguno después de 65 años; no hubo diferencia entre los síntomas clínicos observados en pacientes infectados con H1N1v o con otros patógenos. CONCLUSIÓN: Nuestros resultados destacan la alta frecuencia de virus no-influenza involucrados en el ILI durante el período preepidémico de alerta de gripe y la falta de signos clínicos específicos asociados con infecciones por gripe. El diagnóstico rápido de un gran panel de patógenos respiratorios puede ser crítico para definir y analizar la situación de la epidemia y proporcionar información crítica para la gestión del paciente. Texto: Para monitorear la propagación de la gripe y los manipuladores de la salud alerta, se han desarrollado varias herramientas epidemiológicas. En Francia, una red de 1300 médicos generales, ''Réseau Sentinelles'', que trabajan en todo el país, proporciona datos clínicos en tiempo real utilizados para evaluar la propagación regional y nacional de la gripe [1,2]. Los criterios utilizados por esta red para definir la enfermedad similar a la gripe clínica (ILI) son la aparición de una fiebre repentina por encima de 39uC con mialgia y signos respiratorios. En general no se lleva a cabo un diagnóstico viral formal. El Grupo Régionaux d'Observation de la Grippe (GROG) es una segunda red francesa que examina la aparición y la propagación de los virus de la Esta red se basa en la vigilancia clínica de las infecciones respiratorias agudas y el análisis de laboratorio de muestras nasales recogidas de adultos y niños por médicos generales voluntarios y pediatras. Según los criterios de la red centinela, las autoridades sanitarias francesas proclamaron que el nivel de epidemia de gripe se alcanzó durante la segunda semana de septiembre de 2009 (semana 37) [5, 6]. Por el contrario, los datos proporcionados por la GROG mostraron sólo actividad esporádica H1N1v hasta la última semana de octubre (semana 44) [6, 7]. Así, se hizo rápidamente evidente que circulaban diversos virus en la comunidad y que estaba en juego una sobreestimación de la infección por mixovirus [8, 9, 10, 11]. Como un mejor conocimiento del estado epidémico era una característica clave para la organización nacional de la salud, la preparación hospitalaria, el manejo de pacientes y el control de enfermedades, el diagnóstico viral inequívoco En Francia, los datos sobre las etiologías virales asociadas a la ILI eran, en el mejor de los casos, esporádicos y a menudo faltaban correlaciones con los síntomas clínicos; no se disponía de amplios ensayos moleculares de detección de virus respiratorios en todo el país para el diagnóstico de rutina; por lo tanto, el patrón epidemiológico de patógenos respiratorios con estacionalidad superpuesta era poco conocido; el objetivo del presente estudio era investigar los patógenos respiratorios involucrados en la ILI durante las primeras semanas de la difusión del H1N1v 2009-2010 en Francia (semanas 35 a 44) y describir los síntomas asociados en poblaciones pediátricas y adultas; este estudio fue un estudio no intervencionista sin adición a las procedimientos habituales; se obtuvieron datos biológicos y clínicos sólo para el diagnóstico viral estándar tras las prescripciones médicas (sin muestreo específico, sin modificación del protocolo de muestreo, sin pregunta complementaria en el cuestionario nacional estandarizado); Según la Ley Pública Francesa de Salud (artículo L 1121-1.1), dicho protocolo no requiere la aprobación de un comité de ética y está exento de la aplicación del consentimiento informado. En los dos hospitales académicos, el hospital Saint-Louis (SLS) de París y el hospital Tours (TRS), la enfermedad pseudogripal (ILI) se definió como un paciente con al menos un síntoma general (fiebre superior a 38uC, astenia, mialgia, escalofríos o dolor de cabeza) y un síntoma respiratorio (tos, disnea, rinitis o faringitis), de acuerdo con las directrices del Instituto Francés de Veille Sanitaire (InVS), una institución gubernamental responsable de la vigilancia y la alerta en todos los ámbitos de la salud pública [12]. Los criterios para la presentación clínica severa fueron temperatura por debajo de 35uC o por encima de 39uC a pesar de antipiréticos, frecuencia cardíaca superior a 120/min, frecuencia respiratoria superior a 30/min, dificultad respiratoria, presión arterial sistólica inferior a 90 mmHg o alteración de la conciencia. Los factores de predisposición de la enfermedad crítica fueron niños menores de un año, mujeres embarazadas, diabetes, enfermedad crónica preexistente (como enfermedades respiratorias, cardiovasculares, neurológicas, renales, hepáticas o hematológicas) e inmunosupresión (asociada con infección por VIH, trasplante de órganos o células madre hematopoyéticas, recepción de quimioterapia o corticosteroides) [13, 14]. En las dos instituciones se recomendó la prescripción de la prueba molecular H1N1v para pacientes con III y con una presentación clínica severa, un factor de riesgo subyacente de complicaciones o una condición que no estaba mejorando en el tratamiento antiviral. También se recomendó la investigación de casos sospechosos agrupados. Desde la semana 35 (última semana de agosto) hasta 44 (última semana de octubre), se recolectaron 413 hisopos endonacionales en 3 ml de medio de transporte universal (Copan Diagnostics Inc, Murrieta, CA) de adultos y niños vistos en salas de emergencia para ILI sospechada (tabla 1 ) y enviados a laboratorios SLS y TRS para la detección de H1N1v. Los dos laboratorios de microbiología participaron en la red de laboratorios de referencia para la detección de gripe pandémica H1N1v. Los datos clínicos fueron recolectados en el momento de la atención médica Este cuestionario incluyó la presencia o ausencia de los principales síntomas generales y respiratorios asociados con el ILI (fiebre, astenia, mialgia, escalofríos, dolor de cabeza, tos, rinitis, faringitis, aparición repentina) [12]. El ácido nucleico total se extrajo de 400 mL de medio de transporte universal utilizando el EasyMag System (Biomérieux, Marcy l'Etoile, Francia) en SLS o el EZ1 Advanced XL (Qiagen, Courtaboeuf, Francia) en TRS, según las instrucciones del fabricante (volumen de la dilución: 100 mL en SLS o 90 mL en TRS). Antes de la extracción, se añadió a la muestra 5 ml de un Control de Amplificación Interna (IAC) que contenía una transcripción del ARN del virus de encefalomyocarditis ( La infección pandémica por H1N1v se diagnosticó mediante el ensayo de transcripción inversa en tiempo real PCR (RT-PCR) en un sistema PCR en tiempo real 7500 (Applicated Biosystems, Foster City, CA) según el protocolo de los Centros para el Control de Enfermedades (CDC) [16]. Otras infecciones respiratorias fueron investigadas mediante un ensayo molecular multiplex basado en la tecnología de amplificación de la sonda dependiente de la ligadura múltiple (MLPA) (RespiFinder19H, Pathofinder, Maastricht, Países Bajos) que permite la detección y diferenciación de 14 virus respiratorios, incluyendo virus influenza A (InfA), virus influenza B (InfB), rinovirus (RHV), virus parainfluenza 1 a 4 (PIV-1 a PIV-4), metapneumovirus humano (hMPV), adenovirus (ADV), virus respiratorio sincitial A (RSVA), virus respiratorio sincitial B (RSVB) y coronavirus humanos 229E, OC43 y NL63 (Cor-229E, Cor-OC43, Cor-NL63) [17]. La prueba también permite la detección del virus de la gripe A H5N1 y de cuatro bacterias: Chlamydophila pneumoniae (CP), Mycoplasma pneumoniae (MP), Legionella pneumophila (LP) y Bordetella pertussis (BP). Los productos MLPA amplificados fueron analizados en un analizador genético ABI 3100 (Applicated Biosystems, Foster City, CA). El análisis del tamaño del fragmento fue realizado con el software GeneMarker (SoftGenetics, LLC, State College, PA). Otras pruebas para H1N1v fueron realizadas con Simplexa TM Influenza A H1N1 (2009) (Focus Diagnostics, Cypress, California) cuando el ensayo RT-PCR en tiempo real del CDC fue negativo para H1N1 y el ensayo RespiFinder19H Si este último ensayo fue negativo, se realizó la mecanografía H3N2 tal como se describió anteriormente [18]. Los datos de nuestro estudio se resumen como frecuencias y porcentajes para variables categóricas. Las variables cuantitativas se presentan como medianas, percentiles 25 y 75. Para comparar esas variables de acuerdo con el estado de infección viral, pruebas Fisher Mediante el ensayo de referencia de CDC, se detectó H1N1v en 66 muestras de 413 (16,6%), con más frecuencia en SLS (38 muestras) que en TRS (28 muestras) (p,10 24 ). En general, el porcentaje semanal de hisopos endonasal positivos de H1N1v permaneció por debajo del 10% hasta la semana 41 y aumentó significativamente después (Tendencia P,0,0001) (Figura 1 ). La tasa de detección de H1N1v alcanzó el 30% en SLS en la semana En conjunto, esta tasa estuvo de acuerdo con los resultados proporcionados por la red GROG, mostrando un inicio anterior de la epidemia de H1N1v en el área de París [7, 19]. Los 413 extractos de ácido nucleico fueron analizados utilizando el ensayo RespiFinder19H (Figura 2 ). Sesenta y seis pacientes probaron H1N1v positivo con CDC en tiempo real RT-PCR fueron confirmados con el ensayo multiplex. Trece también fueron coinfectados por uno o dos otros patógenos respiratorios (infecciones múltiples) (Figura 2 ). Tres de las 347 muestras negativas H1N1v no pudieron ser estudiadas con el ensayo multiplex porque contenían inhibidores RT-PCR (sin amplificación del control interno). Doscientas y quince (62,5%) de las 344 muestras negativas H1N1v restantes se encontraron positivas para al menos un patógeno Doscientos doce fueron positivos para patógenos no gripales (189 infecciones únicas y 23 infecciones mixtas con dos, tres o cuatro virus) y tres infecciones únicas adicionales por influenza A fueron identificadas en SLS, incluyendo dos por pandemia H1N1v y una por estacional H3N2, según se determinó después de la mecanografía molecular (datos no mostrados). En total, 68 pacientes (16,5%) fueron positivos para H1N1v, uno para H3N2 y 212 para patógenos no gripales. Hubo 245 infecciones únicas (55 con H1N1v y 190 con otros patógenos respiratorios) y 36 infecciones mixtas (13 con H1N1v y 23 sin H1N1v) (figura 2 ). Entre las infecciones únicas negativas de H1N1v, los virus más prevalentes fueron el rinovirus (62,6%, 119 pacientes), seguidos del virus de la parainfluenza 1 a 4 (24,2%, 46 pacientes), el adenovirus (5,3%, 10 pacientes), el coronavirus humano 229E, OC43 y NL63 (3,2%, 6 pacientes) y el virus respiratorio sincitial A y B (2,6%, 5 pacientes) (Figura 2 ). Además, el ensayo de RespiFinder19H identificó tres pacientes con infección bacteriana, dos con Mycoplasma pneumoniae (una mujer de 25 años en SLS y una mujer de 39 años en TRS) y uno con Bordetella pertussis (un hombre de 60 años en SLS). No se identificó infección única por influenza B, hMPV, Chlamydophila pneumoniae o Legionella pneumophila (Figura 2 Para analizar si las coinfecciones virales ocurrieron con mayor frecuencia para algunos virus, se realizó una comparación de dos en dos, que mostró una mayor proporción de coinfección sólo para ADV (p = 0,05). Los virus respiratorios no-influenza presentaron un perfil epidémico diferente en comparación con H1N1v. En general, en ambos hospitales, la tasa semanal de virus respiratorios no-H1N1v, ya sea solo o involucrado en la coinfección, aumentó entre las semanas 37 y 39 (del 51,4% al 81,3%) y luego disminuyó constantemente (Figura 3 ). Las infecciones por VHR que representaron casi la mitad de las infecciones virales no-H1N1v (141 de 213, 66 En ambos hospitales, la aparición de casos de H1N1v se asoció con una rápida disminución de la tasa de infección por VHR de 50-60% a menos de 20% con una diferencia de una a dos semanas entre SLS y SRT. Datos sobre la edad (En ambas instituciones, 85,5% (106/124) los niños menores de 15 años estaban infectados por al menos un patógeno respiratorio (Tabla 2 ). Los pacientes infectados por H1N1v no eran significativamente menores que los pacientes no infectados por H1N1v (27 años frente a 25 años, p = 0,80) (Figura 4). Sin embargo, el 70,6% (48/68) de los casos de H1N1v se identificaron en pacientes menores de 40 años (22 en SLS y 26 en STR) y no se observó ningún caso en pacientes mayores de 65 años (Tabla 2). En consecuencia, la VIP y la ADV fueron detectadas con mayor frecuencia en la población más joven de TRS versus SLS (p,10 24 y p,10 23, respectivamente). En contraste, aunque los individuos con infección por VHR fueron ligeramente más jóvenes que los sin (mediana edad = 24 vs. 29 para los pacientes sin VHR, p = 0,05) (figura 4), la enfermedad similar a la gripe asociada con VHR fue más frecuente en SLS que en SLS (p = 0,012). Finalmente, los pacientes con infección viral múltiple fueron significativamente más jóvenes que los con infección única (mediana, IDR: 4, 2-18,5 vs. 25, 6-43) y las tasas de infección mixta En el momento de la atención médica se recogieron 383 (92,7%) cuestionarios clínicos estandarizados de 413 pacientes, cuatro de los cuales no pudieron ser explotados por ser demasiado incompleto Una revisión de los 379 cuestionarios viables mostró que el 90,8% (344/379) de los pacientes incluidos en este estudio cumplían los criterios de III definidos anteriormente, y el 52,5% tenían una presentación clínica severa o un factor de riesgo subyacente de complicaciones (45,9%, 174/379), o estaban en un grupo sospechoso de casos agrupados (6,6%, 25/379). En general, la mayoría de los pacientes tenían fiebre (93,9%) y tos (86,1%). Otros signos clínicos clásicos asociados con III como astenia, mialgia, escalofríos, dolor de cabeza, rinitis o faringitis fueron menos frecuentes. También se describió un inicio repentino en el 59,2% de los casos. Sólo el 32,5% de los pacientes tenían una temperatura superior a 39uC; la edad de estos pacientes varió de cero a 86 años, con una mediana de edad de 32 años y una media de edad de 34 años ( En los pacientes infectados por H1N1v (incluyendo infecciones únicas y múltiples), los principales síntomas fueron también fiebre (98,2%) y tos (89,5%) (A continuación, se compararon las características clínicas entre los pacientes positivos para H1N1v, los pacientes positivos para otros patógenos respiratorios y negativos para H1N1v y los pacientes sin detección de patógenos respiratorios (como se detectó con RespiFin-der19H) (Tabla 3). No hubo diferencia entre los tres grupos excepto para fiebre, tos, faringitis; sin embargo, para estos últimos síntomas, la comparación entre los pacientes positivos para H1N1v y los positivos para otros patógenos respiratorios o entre los pacientes positivos para H1N1v y los que no detectaron patógenos respiratorios, no mostró diferencia alguna excepto para faringitis, que fue menos frecuente en los pacientes positivos para H1N1v que en los pacientes Como el VHR fue la etiología más frecuente en la ILI, también se compararon los síntomas clínicos observados en pacientes con una única infección por VHR o por H1N1v (datos no mostrados), no hubo diferencia excepto que la rinitis y la faringitis fueron significativamente más frecuentes en la infección por VHR (62,7% vs. 34,1% [p = 0,006] y 39,0% vs. 10,0% [p = 0,001], respectivamente).La infección múltiple viral (incluyendo muestras con H1N1v) no se asoció con una presentación clínica diferente.La fiebre y la tos se observaron en más del 90% de los pacientes (90,6% y 90,3%, respectivamente), pero sólo el 33,3% de estos pacientes tenían una temperatura superior a 39uC, que no fue diferente de los pacientes con infección viral única (28,6%). Nuestros resultados destacan la alta frecuencia de virus no-influenza involucrados en infecciones respiratorias agudas durante el período epidémico de una alerta de gripe definida por el Réseau Sentinelles de acuerdo con la definición de ILI (fiebre súbita por encima de 39uC acompañada de mialgia y signos respiratorios). Estos datos alcanzan observaciones previas en Europa reportando alta prevalencia de infecciones por VHR antes de la gripe estacional [4, 20] o en 2009, antes de la gripe pandémica H1N1v [1, 8, 9, 11, 21]. Confirmamos que el VHR representa la etiología más frecuente de las infecciones respiratorias agudas Tabla 2. Edad de pacientes con muestras respiratorias positivas para H1N1v, positivas para otros patógenos respiratorios o negativas. infecciones tanto en poblaciones adultas como pediátricas y pueden representar más del 50% de los casos. Se observaron diferencias entre los dos hospitales, con una mayor frecuencia de infecciones por parainfluenza y ADV en Tours en contraste con una mayor frecuencia de VHR en París, probablemente explicada por la mayor proporción de muestras pediátricas recogidas en Tours. Sin embargo, a pesar de la distancia entre las dos instituciones (unos 250 km) y las diferencias entre las dos poblaciones, ambos presentaron patrones similares de alta frecuencia de virus no-influenza en infecciones respiratorias agudas antes de la ola epidémica de la gripe y una disminución cuando la gripe alcanzó niveles epidémicos. En las dos ciudades, se observaron altas frecuencias de VHR al mismo nivel con una probable evolución diferente, con un aumento y disminución repentinos de SLS y una variación más progresiva en el STR. En ambas instituciones, hubo una disminución en la proporción y el número de diagnósticos de VHR aproximadamente en paralelo con el aumento de los diagnósticos de Estos datos son consistentes con la interacción negativa de las dos epidemias a nivel poblacional. Anteriormente se había supuesto que la epidemia de VHR podría interferir con la propagación de la gripe pandémica [20, 21, 22]. Pocos datos in vitro respaldan esta hipótesis. Se ha reportado que la producción de interferón y otras citocinas por células infectadas por el VHR indujo un estado refractario a la infección viral Estos datos incluyen a los tres pacientes cuyas muestras respiratorias no pudieron ser estudiadas con el ensayo multiplex debido a inhibidores RT-PCR. de células vecinas [23]. Es necesario seguir trabajando para confirmar in vitro e in vivo tales interacciones negativas y si las interferencias virales se traducen realmente a un nivel poblacional. El análisis de las epidemias de rinovirus y gripe en años anteriores también debería ayudar a determinar si se observaron interferencias similares con la gripe estacional y elaborar modelos y predicciones de la propagación de la Con este fin, se han observado muy pocas infecciones por VRS en contraste con la epidemiología habitual, que se caracterizó en los últimos cuatro años por un inicio de epidemias en las semanas 44-45 [1]. Otros laboratorios y el InVS francés han confirmado que la epidemia de VRS 2009-10 se retrasó y tuvo un menor impacto en comparación con la temporada de invierno anterior [1, 24]. La propagación tardía y reducida del VRS puede deberse a interferencia viral entre el VRS y la gripe. Otra posible explicación es un mejor comportamiento de prevención de las infecciones respiratorias, como recomienda una campaña nacional que incluye recomendaciones para lavarse las manos después del estornudo y el uso de máscara [1]. Las infecciones por gripe se detectaron principalmente en pacientes menores de 40 años y no se encontró ningún caso en pacientes mayores de 65 años. Estos resultados corroboran datos anteriores que sugieren que las infecciones estacionales por H1N1 o la vacunación Anteriormente se ha demostrado que los títulos neutralizantes frente al virus pandémico H1N1v se correlacionan significativamente con los títulos neutralizantes frente al virus estacional H1N1, y que el título neutralizante del virus pandémico de la gripe H1N1v fue significativamente mayor en sujetos que habían sido inoculados recientemente por una vacuna trivalente de gripe estacional [26]. Las coinfecciones virales se observaron predominantemente en pacientes pediátricos, como se ha descrito anteriormente [4, 27, 28, 29], tanto en casos de gripe como en no gripe a una tasa similar. No hubo evidencia de impacto respiratorio más pronunciado en estos pacientes, nuestros resultados mostraron la falta de signos clínicos específicos asociados con infecciones probadas de H1N1v. Las características clínicas no difirieron entre infecciones por gripe u otras infecciones virales. En particular, la proporción de pacientes con fiebre superior a 39uC no fue mayor en Además, los pacientes sin evidencia de infecciones víricas respiratorias no presentaron síntomas diferentes; estos pacientes pueden haber sido infectados con otros virus no incluidos en el ensayo multiplex (bocavirus humano, coronavirus HKU1) [9, 10, 11] o se observaron demasiado tarde en el momento de la eliminación viral [30]. Sin embargo, para determinar cuán específicos son los síntomas para la gripe se requeriría evaluar también la distribución de patógenos respiratorios (H1N1v y otros virus respiratorios) y síntomas relacionados en pacientes presentados en los departamentos de emergencia en SLS y TRS con síndromes respiratorios, pero no probados para H1N1v. Además, a pesar de algunas condiciones subyacentes que se asociaban con complicaciones no observadas previamente en la gripe estacional, la mayoría de las enfermedades causadas por el virus H1N1v fueron agudas y autolimitadas [13, 31]. La mayor proporción de virus no influenza reportados en el ILI en 2009 fue, por lo tanto, consecuencia de visitas más frecuentes a un médico para infecciones de las vías respiratorias que generalmente observadas por miedo a la pandemia de gripe. La falta general de diferencia en los síntomas en el contexto particular de la pandemia de H1N1v debe ser considerada con precaución y no excluye que puedan surgir diferencias más significativas en futuras epidemias de gripe con otros virus de gripe. Nuestros datos confirman que puede ser virtualmente imposible reconocer síntomas que anuncien infecciones de H1N1v y que los datos virológicos deben ser útiles junto con informes clínicos para monitorear la epidemia de gripe [10]. La detección molecular múltiplex ha surgido recientemente como una potente herramienta de diagnóstico para determinar las etiologías de las infecciones respiratorias agudas [11, 32, 33]. Estos datos muestran que la detección molecular múltiplex sensible de virus respiratorios es factible y eficiente para la detección de virus involucrados en Nuestros resultados confirman el desempeño de RespiFinder19H para la detección de virus respiratorios en la población general, como se ha demostrado recientemente en pacientes trasplantados con ILI [34]. RespiFinder19H confirmó todas las infecciones H1N1 detectadas por el ensayo de referencia CDC y fue capaz de identificar dos casos adicionales de H1N1 que sugieren una alta sensibilidad de este ensayo multiplex para detectar infecciones por influenza A. En conclusión, nuestros resultados destacan que brotes sucesivos y mixtos de infecciones virales respiratorias pueden afectar a la epidemiología de la gripe y pueden conducir a una mala interpretación del desarrollo temprano de una epidemia de gripe.

¿Qué red de médicos proporciona datos clínicos en tiempo real sobre la propagación de la gripe en Francia?

La alta carga de los virus no-influenza en enfermedades similares a la gripe en las primeras semanas de la epidemia H1N1v en Franciahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3157400/SHA: f4c1afe385e9e31eb5678e15a3c280ba97326554Autores: Schnepf, Nathalie; Resche-Rigon, Matthieu; Chaillon, Antoine; Scemla, Anne; Gras, Guillaume; Semoun, Oren; Taboulet, Pierre; Molina, Jean-Michel; Simon, François; Goudeau, Alain; LeGoff, JérômeFecha: 2011-08-17DOI: 10.1371/journal.pone.0023514 El uso limitado de herramientas moleculares subestima el papel de otros patógenos comunes. OBJETIVOS: Durante las primeras semanas de la pandemia de gripe 2009-2010, se realizó una encuesta clínica y virológica en pacientes adultos y pediátricos con IDI referidos a dos hospitales universitarios franceses en París y Tours. Se investigaron los diferentes patógenos involucrados en la IDI y describir los síntomas asociados. MÉTODOS: Se realizó un diagnóstico de gripe pandémica H1N1v con ensayo RT-PCR en tiempo real. Se investigaron otras etiologías virales mediante el ensayo multiplex molecular RespiFinder19®. Los datos clínicos fueron recolectados prospectivamente por los médicos utilizando un cuestionario estándar. RESULTADOS: De la semana 35 a 44, se recolectaron hisopos endonales en 413 pacientes. En general, 68 muestras (16,5%) fueron positivas para H1N1v. En 13 de ellos también se detectaron otros patógenos respiratorios, de los cuales 213 (61,9%) fueron positivos para diversos agentes respiratorios, 190 en infecciones únicas y 23 en infecciones mixtas; los virus más prevalentes en infecciones únicas negativas de H1N1v fueron rinovirus (62,6%), seguidos de virus de parainfluenza (24,2%) y adenovirus (5,3%); el 70,6% de los casos de H1N1v fueron identificados en pacientes menores de 40 años y ninguno después de 65 años; no hubo diferencia entre los síntomas clínicos observados en pacientes infectados con H1N1v o con otros patógenos. CONCLUSIÓN: Nuestros resultados destacan la alta frecuencia de virus no-influenza involucrados en el ILI durante el período preepidémico de alerta de gripe y la falta de signos clínicos específicos asociados con infecciones por gripe. El diagnóstico rápido de un gran panel de patógenos respiratorios puede ser crítico para definir y analizar la situación de la epidemia y proporcionar información crítica para la gestión del paciente. Texto: Para monitorear la propagación de la gripe y los manipuladores de la salud alerta, se han desarrollado varias herramientas epidemiológicas. En Francia, una red de 1300 médicos generales, ''Réseau Sentinelles'', que trabajan en todo el país, proporciona datos clínicos en tiempo real utilizados para evaluar la propagación regional y nacional de la gripe [1,2]. Los criterios utilizados por esta red para definir la enfermedad similar a la gripe clínica (ILI) son la aparición de una fiebre repentina por encima de 39uC con mialgia y signos respiratorios. En general no se lleva a cabo un diagnóstico viral formal. El Grupo Régionaux d'Observation de la Grippe (GROG) es una segunda red francesa que examina la aparición y la propagación de los virus de la Esta red se basa en la vigilancia clínica de las infecciones respiratorias agudas y el análisis de laboratorio de muestras nasales recogidas de adultos y niños por médicos generales voluntarios y pediatras. Según los criterios de la red centinela, las autoridades sanitarias francesas proclamaron que el nivel de epidemia de gripe se alcanzó durante la segunda semana de septiembre de 2009 (semana 37) [5, 6]. Por el contrario, los datos proporcionados por la GROG mostraron sólo actividad esporádica H1N1v hasta la última semana de octubre (semana 44) [6, 7]. Así, se hizo rápidamente evidente que circulaban diversos virus en la comunidad y que estaba en juego una sobreestimación de la infección por mixovirus [8, 9, 10, 11]. Como un mejor conocimiento del estado epidémico era una característica clave para la organización nacional de la salud, la preparación hospitalaria, el manejo de pacientes y el control de enfermedades, el diagnóstico viral inequívoco En Francia, los datos sobre las etiologías virales asociadas a la ILI eran, en el mejor de los casos, esporádicos y a menudo faltaban correlaciones con los síntomas clínicos; no se disponía de amplios ensayos moleculares de detección de virus respiratorios en todo el país para el diagnóstico de rutina; por lo tanto, el patrón epidemiológico de patógenos respiratorios con estacionalidad superpuesta era poco conocido; el objetivo del presente estudio era investigar los patógenos respiratorios involucrados en la ILI durante las primeras semanas de la difusión del H1N1v 2009-2010 en Francia (semanas 35 a 44) y describir los síntomas asociados en poblaciones pediátricas y adultas; este estudio fue un estudio no intervencionista sin adición a las procedimientos habituales; se obtuvieron datos biológicos y clínicos sólo para el diagnóstico viral estándar tras las prescripciones médicas (sin muestreo específico, sin modificación del protocolo de muestreo, sin pregunta complementaria en el cuestionario nacional estandarizado); Según la Ley Pública Francesa de Salud (artículo L 1121-1.1), dicho protocolo no requiere la aprobación de un comité de ética y está exento de la aplicación del consentimiento informado. En los dos hospitales académicos, el hospital Saint-Louis (SLS) de París y el hospital Tours (TRS), la enfermedad pseudogripal (ILI) se definió como un paciente con al menos un síntoma general (fiebre superior a 38uC, astenia, mialgia, escalofríos o dolor de cabeza) y un síntoma respiratorio (tos, disnea, rinitis o faringitis), de acuerdo con las directrices del Instituto Francés de Veille Sanitaire (InVS), una institución gubernamental responsable de la vigilancia y la alerta en todos los ámbitos de la salud pública [12]. Los criterios para la presentación clínica severa fueron temperatura por debajo de 35uC o por encima de 39uC a pesar de antipiréticos, frecuencia cardíaca superior a 120/min, frecuencia respiratoria superior a 30/min, dificultad respiratoria, presión arterial sistólica inferior a 90 mmHg o alteración de la conciencia. Los factores de predisposición de la enfermedad crítica fueron niños menores de un año, mujeres embarazadas, diabetes, enfermedad crónica preexistente (como enfermedades respiratorias, cardiovasculares, neurológicas, renales, hepáticas o hematológicas) e inmunosupresión (asociada con infección por VIH, trasplante de órganos o células madre hematopoyéticas, recepción de quimioterapia o corticosteroides) [13, 14]. En las dos instituciones se recomendó la prescripción de la prueba molecular H1N1v para pacientes con III y con una presentación clínica severa, un factor de riesgo subyacente de complicaciones o una condición que no estaba mejorando en el tratamiento antiviral. También se recomendó la investigación de casos sospechosos agrupados. Desde la semana 35 (última semana de agosto) hasta 44 (última semana de octubre), se recolectaron 413 hisopos endonacionales en 3 ml de medio de transporte universal (Copan Diagnostics Inc, Murrieta, CA) de adultos y niños vistos en salas de emergencia para ILI sospechada (tabla 1 ) y enviados a laboratorios SLS y TRS para la detección de H1N1v. Los dos laboratorios de microbiología participaron en la red de laboratorios de referencia para la detección de gripe pandémica H1N1v. Los datos clínicos fueron recolectados en el momento de la atención médica Este cuestionario incluyó la presencia o ausencia de los principales síntomas generales y respiratorios asociados con el ILI (fiebre, astenia, mialgia, escalofríos, dolor de cabeza, tos, rinitis, faringitis, aparición repentina) [12]. El ácido nucleico total se extrajo de 400 mL de medio de transporte universal utilizando el EasyMag System (Biomérieux, Marcy l'Etoile, Francia) en SLS o el EZ1 Advanced XL (Qiagen, Courtaboeuf, Francia) en TRS, según las instrucciones del fabricante (volumen de la dilución: 100 mL en SLS o 90 mL en TRS). Antes de la extracción, se añadió a la muestra 5 ml de un Control de Amplificación Interna (IAC) que contenía una transcripción del ARN del virus de encefalomyocarditis ( La infección pandémica por H1N1v se diagnosticó mediante el ensayo de transcripción inversa en tiempo real PCR (RT-PCR) en un sistema PCR en tiempo real 7500 (Applicated Biosystems, Foster City, CA) según el protocolo de los Centros para el Control de Enfermedades (CDC) [16]. Otras infecciones respiratorias fueron investigadas mediante un ensayo molecular multiplex basado en la tecnología de amplificación de la sonda dependiente de la ligadura múltiple (MLPA) (RespiFinder19H, Pathofinder, Maastricht, Países Bajos) que permite la detección y diferenciación de 14 virus respiratorios, incluyendo virus influenza A (InfA), virus influenza B (InfB), rinovirus (RHV), virus parainfluenza 1 a 4 (PIV-1 a PIV-4), metapneumovirus humano (hMPV), adenovirus (ADV), virus respiratorio sincitial A (RSVA), virus respiratorio sincitial B (RSVB) y coronavirus humanos 229E, OC43 y NL63 (Cor-229E, Cor-OC43, Cor-NL63) [17]. La prueba también permite la detección del virus de la gripe A H5N1 y de cuatro bacterias: Chlamydophila pneumoniae (CP), Mycoplasma pneumoniae (MP), Legionella pneumophila (LP) y Bordetella pertussis (BP). Los productos MLPA amplificados fueron analizados en un analizador genético ABI 3100 (Applicated Biosystems, Foster City, CA). El análisis del tamaño del fragmento fue realizado con el software GeneMarker (SoftGenetics, LLC, State College, PA). Otras pruebas para H1N1v fueron realizadas con Simplexa TM Influenza A H1N1 (2009) (Focus Diagnostics, Cypress, California) cuando el ensayo RT-PCR en tiempo real del CDC fue negativo para H1N1 y el ensayo RespiFinder19H Si este último ensayo fue negativo, se realizó la mecanografía H3N2 tal como se describió anteriormente [18]. Los datos de nuestro estudio se resumen como frecuencias y porcentajes para variables categóricas. Las variables cuantitativas se presentan como medianas, percentiles 25 y 75. Para comparar esas variables de acuerdo con el estado de infección viral, pruebas Fisher Mediante el ensayo de referencia de CDC, se detectó H1N1v en 66 muestras de 413 (16,6%), con más frecuencia en SLS (38 muestras) que en TRS (28 muestras) (p,10 24 ). En general, el porcentaje semanal de hisopos endonasal positivos de H1N1v permaneció por debajo del 10% hasta la semana 41 y aumentó significativamente después (Tendencia P,0,0001) (Figura 1 ). La tasa de detección de H1N1v alcanzó el 30% en SLS en la semana En conjunto, esta tasa estuvo de acuerdo con los resultados proporcionados por la red GROG, mostrando un inicio anterior de la epidemia de H1N1v en el área de París [7, 19]. Los 413 extractos de ácido nucleico fueron analizados utilizando el ensayo RespiFinder19H (Figura 2 ). Sesenta y seis pacientes probaron H1N1v positivo con CDC en tiempo real RT-PCR fueron confirmados con el ensayo multiplex. Trece también fueron coinfectados por uno o dos otros patógenos respiratorios (infecciones múltiples) (Figura 2 ). Tres de las 347 muestras negativas H1N1v no pudieron ser estudiadas con el ensayo multiplex porque contenían inhibidores RT-PCR (sin amplificación del control interno). Doscientas y quince (62,5%) de las 344 muestras negativas H1N1v restantes se encontraron positivas para al menos un patógeno Doscientos doce fueron positivos para patógenos no gripales (189 infecciones únicas y 23 infecciones mixtas con dos, tres o cuatro virus) y tres infecciones únicas adicionales por influenza A fueron identificadas en SLS, incluyendo dos por pandemia H1N1v y una por estacional H3N2, según se determinó después de la mecanografía molecular (datos no mostrados). En total, 68 pacientes (16,5%) fueron positivos para H1N1v, uno para H3N2 y 212 para patógenos no gripales. Hubo 245 infecciones únicas (55 con H1N1v y 190 con otros patógenos respiratorios) y 36 infecciones mixtas (13 con H1N1v y 23 sin H1N1v) (figura 2 ). Entre las infecciones únicas negativas de H1N1v, los virus más prevalentes fueron el rinovirus (62,6%, 119 pacientes), seguidos del virus de la parainfluenza 1 a 4 (24,2%, 46 pacientes), el adenovirus (5,3%, 10 pacientes), el coronavirus humano 229E, OC43 y NL63 (3,2%, 6 pacientes) y el virus respiratorio sincitial A y B (2,6%, 5 pacientes) (Figura 2 ). Además, el ensayo de RespiFinder19H identificó tres pacientes con infección bacteriana, dos con Mycoplasma pneumoniae (una mujer de 25 años en SLS y una mujer de 39 años en TRS) y uno con Bordetella pertussis (un hombre de 60 años en SLS). No se identificó infección única por influenza B, hMPV, Chlamydophila pneumoniae o Legionella pneumophila (Figura 2 Para analizar si las coinfecciones virales ocurrieron con mayor frecuencia para algunos virus, se realizó una comparación de dos en dos, que mostró una mayor proporción de coinfección sólo para ADV (p = 0,05). Los virus respiratorios no-influenza presentaron un perfil epidémico diferente en comparación con H1N1v. En general, en ambos hospitales, la tasa semanal de virus respiratorios no-H1N1v, ya sea solo o involucrado en la coinfección, aumentó entre las semanas 37 y 39 (del 51,4% al 81,3%) y luego disminuyó constantemente (Figura 3 ). Las infecciones por VHR que representaron casi la mitad de las infecciones virales no-H1N1v (141 de 213, 66 En ambos hospitales, la aparición de casos de H1N1v se asoció con una rápida disminución de la tasa de infección por VHR de 50-60% a menos de 20% con una diferencia de una a dos semanas entre SLS y SRT. Datos sobre la edad (En ambas instituciones, 85,5% (106/124) los niños menores de 15 años estaban infectados por al menos un patógeno respiratorio (Tabla 2 ). Los pacientes infectados por H1N1v no eran significativamente menores que los pacientes no infectados por H1N1v (27 años frente a 25 años, p = 0,80) (Figura 4). Sin embargo, el 70,6% (48/68) de los casos de H1N1v se identificaron en pacientes menores de 40 años (22 en SLS y 26 en STR) y no se observó ningún caso en pacientes mayores de 65 años (Tabla 2). En consecuencia, la VIP y la ADV fueron detectadas con mayor frecuencia en la población más joven de TRS versus SLS (p,10 24 y p,10 23, respectivamente). En contraste, aunque los individuos con infección por VHR fueron ligeramente más jóvenes que los sin (mediana edad = 24 vs. 29 para los pacientes sin VHR, p = 0,05) (figura 4), la enfermedad similar a la gripe asociada con VHR fue más frecuente en SLS que en SLS (p = 0,012). Finalmente, los pacientes con infección viral múltiple fueron significativamente más jóvenes que los con infección única (mediana, IDR: 4, 2-18,5 vs. 25, 6-43) y las tasas de infección mixta En el momento de la atención médica se recogieron 383 (92,7%) cuestionarios clínicos estandarizados de 413 pacientes, cuatro de los cuales no pudieron ser explotados por ser demasiado incompleto Una revisión de los 379 cuestionarios viables mostró que el 90,8% (344/379) de los pacientes incluidos en este estudio cumplían los criterios de III definidos anteriormente, y el 52,5% tenían una presentación clínica severa o un factor de riesgo subyacente de complicaciones (45,9%, 174/379), o estaban en un grupo sospechoso de casos agrupados (6,6%, 25/379). En general, la mayoría de los pacientes tenían fiebre (93,9%) y tos (86,1%). Otros signos clínicos clásicos asociados con III como astenia, mialgia, escalofríos, dolor de cabeza, rinitis o faringitis fueron menos frecuentes. También se describió un inicio repentino en el 59,2% de los casos. Sólo el 32,5% de los pacientes tenían una temperatura superior a 39uC; la edad de estos pacientes varió de cero a 86 años, con una mediana de edad de 32 años y una media de edad de 34 años ( En los pacientes infectados por H1N1v (incluyendo infecciones únicas y múltiples), los principales síntomas fueron también fiebre (98,2%) y tos (89,5%) (A continuación, se compararon las características clínicas entre los pacientes positivos para H1N1v, los pacientes positivos para otros patógenos respiratorios y negativos para H1N1v y los pacientes sin detección de patógenos respiratorios (como se detectó con RespiFin-der19H) (Tabla 3 ). No hubo diferencia entre los tres grupos excepto por fiebre, tos, faringitis; sin embargo, para estos últimos síntomas, la comparación entre los pacientes positivos para H1N1v y los positivos para otros patógenos respiratorios o entre los pacientes positivos para H1N1v y los que no detectaron patógenos respiratorios, no mostró diferencia alguna excepto por faringitis, que fue menos frecuente en los pacientes positivos para H1N1v que en los Como el VHR fue la etiología más frecuente en la ILI, también se compararon los síntomas clínicos observados en pacientes con una única infección por VHR o por H1N1v (datos no mostrados), no hubo diferencia excepto que la rinitis y la faringitis fueron significativamente más frecuentes en la infección por VHR (62,7% vs. 34,1% [p = 0,006] y 39,0% vs. 10,0% [p = 0,001], respectivamente).La infección múltiple viral (incluyendo muestras con H1N1v) no se asoció con una presentación clínica diferente.La fiebre y la tos se observaron en más del 90% de los pacientes (90,6% y 90,3%, respectivamente), pero sólo el 33,3% de estos pacientes tenían una temperatura superior a 39uC, que no fue diferente de los pacientes con infección viral única (28,6%). Nuestros resultados destacan la alta frecuencia de virus no-influenza involucrados en infecciones respiratorias agudas durante el período epidémico de una alerta de gripe definida por el Réseau Sentinelles de acuerdo con la definición de ILI (fiebre súbita por encima de 39uC acompañada de mialgia y signos respiratorios). Estos datos alcanzan observaciones previas en Europa reportando alta prevalencia de infecciones por VHR antes de la gripe estacional [4, 20] o en 2009, antes de la gripe pandémica H1N1v [1, 8, 9, 11, 21]. Confirmamos que el VHR representa la etiología más frecuente de las infecciones respiratorias agudas Tabla 2. Edad de pacientes con muestras respiratorias positivas para H1N1v, positivas para otros patógenos respiratorios o negativas. infecciones tanto en poblaciones adultas como pediátricas y pueden representar más del 50% de los casos. Se observaron diferencias entre los dos hospitales, con una mayor frecuencia de infecciones por parainfluenza y ADV en Tours en contraste con una mayor frecuencia de VHR en París, probablemente explicada por la mayor proporción de muestras pediátricas recogidas en Tours. Sin embargo, a pesar de la distancia entre las dos instituciones (unos 250 km) y las diferencias entre las dos poblaciones, ambos presentaron patrones similares de alta frecuencia de virus no-influenza en infecciones respiratorias agudas antes de la ola epidémica de la gripe y una disminución cuando la gripe alcanzó niveles epidémicos. En las dos ciudades, se observaron altas frecuencias de VHR al mismo nivel con una probable evolución diferente, con un aumento y disminución repentinos de SLS y una variación más progresiva en el STR. En ambas instituciones, hubo una disminución en la proporción y el número de diagnósticos de VHR aproximadamente en paralelo con el aumento de los diagnósticos de Estos datos son consistentes con la interacción negativa de las dos epidemias a nivel poblacional. Anteriormente se había supuesto que la epidemia de VHR podría interferir con la propagación de la gripe pandémica [20, 21, 22]. Pocos datos in vitro respaldan esta hipótesis. Se ha reportado que la producción de interferón y otras citocinas por células infectadas por el VHR indujo un estado refractario a la infección viral Estos datos incluyen a los tres pacientes cuyas muestras respiratorias no pudieron ser estudiadas con el ensayo multiplex debido a inhibidores RT-PCR. de células vecinas [23]. Es necesario seguir trabajando para confirmar in vitro e in vivo tales interacciones negativas y si las interferencias virales se traducen realmente a un nivel poblacional. El análisis de las epidemias de rinovirus y gripe en años anteriores también debería ayudar a determinar si se observaron interferencias similares con la gripe estacional y elaborar modelos y predicciones de la propagación de la Con este fin, se han observado muy pocas infecciones por VRS en contraste con la epidemiología habitual, que se caracterizó en los últimos cuatro años por un inicio de epidemias en las semanas 44-45 [1]. Otros laboratorios y el InVS francés han confirmado que la epidemia de VRS 2009-10 se retrasó y tuvo un menor impacto en comparación con la temporada de invierno anterior [1, 24]. La propagación tardía y reducida del VRS puede deberse a interferencia viral entre el VRS y la gripe. Otra posible explicación es un mejor comportamiento de prevención de las infecciones respiratorias, como recomienda una campaña nacional que incluye recomendaciones para lavarse las manos después del estornudo y el uso de máscara [1]. Las infecciones por gripe se detectaron principalmente en pacientes menores de 40 años y no se encontró ningún caso en pacientes mayores de 65 años. Estos resultados corroboran datos anteriores que sugieren que las infecciones estacionales por H1N1 o vacunación pueden Anteriormente se ha demostrado que los títulos neutralizantes frente al virus pandémico H1N1v se correlacionan significativamente con los títulos neutralizantes frente al virus estacional H1N1, y que el título neutralizante del virus pandémico de la gripe H1N1v fue significativamente mayor en sujetos que habían sido inoculados recientemente por una vacuna trivalente de gripe estacional [26]. Las coinfecciones virales se observaron predominantemente en pacientes pediátricos, como se ha descrito anteriormente [4, 27, 28, 29], tanto en casos de gripe como en no gripe a una tasa similar. No hubo evidencia de impacto respiratorio más pronunciado en estos pacientes, nuestros resultados mostraron la falta de signos clínicos específicos asociados con infecciones probadas de H1N1v. Las características clínicas no difirieron entre infecciones por gripe u otras infecciones virales. En particular, la proporción de pacientes con fiebre superior a 39uC no fue mayor en Además, los pacientes sin evidencia de infecciones víricas respiratorias no presentaron síntomas diferentes; estos pacientes pueden haber sido infectados con otros virus no incluidos en el ensayo multiplex (bocavirus humano, coronavirus HKU1) [9, 10, 11] o se observaron demasiado tarde en el momento de la eliminación viral [30]. Sin embargo, para determinar cuán específicos son los síntomas para la gripe se requeriría evaluar también la distribución de patógenos respiratorios (H1N1v y otros virus respiratorios) y síntomas relacionados en pacientes presentados en los departamentos de emergencia en SLS y TRS con síndromes respiratorios, pero no probados para H1N1v. Además, a pesar de algunas condiciones subyacentes que se asociaban con complicaciones no observadas previamente en la gripe estacional, la mayoría de las enfermedades causadas por el virus H1N1v fueron agudas y autolimitadas [13, 31]. La mayor proporción de virus no influenza reportados en el ILI en 2009 fue, por lo tanto, consecuencia de visitas más frecuentes a un médico para infecciones de las vías respiratorias que generalmente observadas por miedo a la pandemia de gripe. La falta general de diferencia en los síntomas en el contexto particular de la pandemia de H1N1v debe ser considerada con precaución y no excluye que puedan surgir diferencias más significativas en futuras epidemias de gripe con otros virus de gripe. Nuestros datos confirman que puede ser virtualmente imposible reconocer síntomas que anuncien infecciones de H1N1v y que los datos virológicos deben ser útiles junto con informes clínicos para monitorear la epidemia de gripe [10]. La detección molecular múltiplex ha surgido recientemente como una potente herramienta de diagnóstico para determinar las etiologías de las infecciones respiratorias agudas [11, 32, 33]. Estos datos muestran que la detección molecular múltiplex sensible de virus respiratorios es factible y eficiente para la detección de virus involucrados en Nuestros resultados confirman el desempeño de RespiFinder19H para la detección de virus respiratorios en la población general, como se ha demostrado recientemente en pacientes trasplantados con ILI [34]. RespiFinder19H confirmó todas las infecciones H1N1 detectadas por el ensayo de referencia CDC y fue capaz de identificar dos casos adicionales de H1N1 que sugieren una alta sensibilidad de este ensayo multiplex para detectar infecciones por influenza A. En conclusión, nuestros resultados destacan que brotes sucesivos y mixtos de infecciones virales respiratorias pueden afectar a la epidemiología de la gripe y pueden conducir a una mala interpretación del desarrollo temprano de una epidemia de gripe.

¿Cuál fue el virus más común entre los pacientes H1N1v negativos?

Drogas y enfermedades ganaderas: La combinación fatal detrás del fracaso de la crianza en los buitres de barba amenazadahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2994777/SHA: f4f804bac7b32c84ad6572776df684df2a2e5fdaAutores: Blanco, Guillermo; Lemus, Jesús A. Fecha: 2010-11-30DOI: 10.1371/journal.pone.0014163Licencia: cc-byAbstract: Existe una creciente preocupación por el impacto de las drogas veterinarias y los patógenos del ganado como factores perjudiciales para la salud de la vida silvestre, especialmente de los scavengers aviares amenazados que se alimentan de canales de ganado medicamentoso. Se realizó un estudio exhaustivo de los huevos fracasados y los nidos muertos en buitres barbudos (Gypaetus barbatus) para tratar de dilucidar las causas próximas del fracaso de la cría tras la reciente disminución de la productividad en los Pirineos españoles. Se encontraron altas concentraciones de múltiples medicamentos veterinarios, principalmente fluoroquinolonas, en la mayoría de los huevos y nidos fracasados, asociados con múltiples daños en órganos internos y patógenos del ganado que causan enfermedades, especialmente septicemia por patógenos porcinos y enfermedad bursal infecciosa. El impacto combinado de los medicamentos y enfermedades como factores estocásticos puede resultar en efectos potencialmente devastadores exacerbando un riesgo ya alto de extinción y debe ser considerado en los actuales programas de conservación de buitres barbudos y otras especies de cigüeña, especialmente en lo que respecta a medicamentos veterinarios peligrosos y virus altamente patógenos de aves de corral. Texto: Los contaminantes ambientales están cada vez más documentados como un motor de peligro para la vida silvestre debido a su papel en el daño a los órganos, la alteración hormonal y la alteración del sistema inmunitario [1, 2]. La enfermedad también puede facilitar la amenaza y la extinción a escala mundial y local, especialmente cuando los patógenos interactúan con otros factores como los contaminantes [3]. Hay una creciente preocupación por el impacto de los medicamentos veterinarios y los patógenos del ganado como factores que dañan la salud de la vida silvestre [4] [5] [6], e incluso causando disminuciones que se aproximan a la extinción [7]. Estas amenazas pueden ser especialmente perjudiciales para la vida silvestre ya que cada vez conviven e interactúan como consecuencia de la eliminación de residuos de ganado que contienen productos farmacéuticos veterinarios y patógenos resistentes debido a las crecientes operaciones intensivas de ganado en todo el mundo [6, 8, 9]. En particular, la ingestión de antimicrobianos, principalmente fluoroquinolonas, se ha relacionado recientemente con la adquisición mediada por la inmunodepresión de patógenos y enfermedades oportunistas, así como con el daño a los órganos en buitres anidantes [6, 10, 11]. Los residuos de fluoroquinolona también se han encontrado en huevos de hueva aviares y están asociados con graves alteraciones en el desarrollo del cartílago y los huesos embrionarios que podrían impedir el movimiento embrionario y su posterior desarrollo normal, la posición pre-hatch y el éxito de la incubación [12]. Por lo tanto, los antimicrobianos y otros fármacos pueden afectar negativamente a la salud embrionaria y a la anidación con consecuencias potencialmente devastadoras para el éxito de la cría y la conservación de buitres y otros scavengers aviares amenazados. En los Pirineos españoles se han registrado recientemente descensos crecientes de la productividad (número medio de crías incipientes por pareja territorial) asociados a procesos de saturación del hábitat [13, 14]. Dado que los buitres barbudos pueden aumentar sólo un intento de cría, esta disminución de la productividad debe estar relacionada con un creciente fracaso de la cría cuando la proporción de parejas territoriales que se reproducen no varía mucho con el tiempo [15]. Se han investigado los mecanismos próximos por los que la densidad puede afectar a la productividad, incluida la heterogeneidad del hábitat, con el uso de territorios progresivamente más pobres, la contracción del territorio y la interferencia con criadores y flotadores [13]. Sin embargo, las causas próximas del fracaso de la cría son poco conocidas a pesar de los intereses a largo plazo en la conservación de esta especie [16]. Para evaluar estas causas, es imprescindible el examen de los huevos fracasados y los nidos muertos, incluyendo el estudio de la presencia y el impacto de lesiones, problemas de desarrollo, mal estado nutricional, contaminantes, daño a los órganos, patógenos causantes de enfermedades, etc. Para determinar la causa más probable del fracaso de la cría, se realizó un estudio exhaustivo de los huevos fracasados y buitres barbudos muertos recogidos durante los últimos años en los Pirineos. Tanto las tasas de productividad y supervivencia de adultos y aves jóvenes han alcanzado los valores más bajos desde la crisis de la encefalopatía espongiforme bovina (EEB) [13, 14, 17]. Este declive temporal podría estar relacionado con envenenamiento ilegal [17] y cambios recientes en la abundancia, distribución y calidad de la carroña disponible para los carroñeros de aves como consecuencia de la normativa de la UE derivada de la crisis de la EEB [6, [18] [19] [ En particular, la crisis de la EEB causó la falta o escasez de ganado inestable disponible para los carroñeros y su posterior aumento en el consumo de carne de ganado estable, que es intensamente medicado [21]. Por lo tanto, nos centramos específicamente en determinar si el fracaso de la cría de buitres barbudos está relacionado con la ingestión de medicamentos veterinarios a partir de la carne de ganado estable, como se documenta en otras especies de carroñeros aviares [12]. También evaluamos los posibles efectos de los medicamentos veterinarios sobre el daño embrionario y la inmunodepresión, aumentando la probabilidad de adquisición y proliferación de patógenos causantes de enfermedades mortales [6, [10] [11] [12] 21]. Debido a que los medicamentos veterinarios deben adquirirse exclusivamente a partir de la ingestión de carne de ganado medicado para combatir la enfermedad, predecimos que su presencia debe estar asociada a la de patógenos adquiridos del mismo ganado, Alternativamente, si la disminución temporal de la productividad se asoció principalmente con el fracaso de la cría debido a los efectos de los procesos de saturación del hábitat [13, 17], debemos esperar que la mortalidad por huevo y nido esté directamente relacionada con problemas nutricionales y de desarrollo que indiquen territorios progresivamente de menor calidad (por ejemplo, emaciación embrionaria, inanición de nidos) e interferencias por parte de ambos conspectivos y heteroespecíficos (por ejemplo, fallo en la incubación, lesión debido a intentos de depredación o perturbación).Huevos fallidos (n = 5) y nidos muertos (n = 4) fueron recolectados de nidos buitres barbudos ubicados en los Pirineos españoles entre 2005 y 2008. El estudio de este material no requirió la aprobación de un comité ético porque fue recolectado después del fracaso de la cría (egg o muerte de nido) Se recogieron huevos y nidrillas después de un fallo en la cría y se congelaron. Se realizaron necropsias en todos los especímenes de acuerdo con los protocolos estándar [12]. Se estimó la edad de embriones y nidrillas según su tamaño y desarrollo. Se fijaron muestras de hígado, riñón, bazo, intestinos gruesos y delgados, pulmones, cerebro, órganos linfoides (timo, bursa de Fabricius, parches de Peyer) y articulaciones de rodilla en formalina amortiguada al 10%, seccionadas a 4 mm y manchadas para análisis histopatológico [10, 12]. Para la determinación de la presencia de medicamentos veterinarios, como fluoroquinolonas (enrofloxacino y ciprofloxacino), otros antimicrobianos (amoxicilina y oxitetraciclina), antiinflamatorios no esteroideos (AINE) como diclofenaco, flunixina meglumina, ketoprofeno, ibuprofeno, meloxicam, salicilato sódico, acetaminofeno y antiparasitarios (metronidazol, diclazuril, fenbendazol, ivermectina) como se ha descrito anteriormente [12]. Los límites de cuantificación, porcentaje de recuperación y la reproducibilidad intra-ensayo fueron adecuados [10, 12]. Se determinaron otros contaminantes que podrían afectar a óvulos y embriones en el hígado, incluidos metales pesados (Cd, Zn, Pb y Hg), después de Blanco y otros [23], ditiocarbamato tiram, disulfuram, éteres de difenilo polibromados, organoclorados y pirorretardantes bromados, después de Lemus y otros [12] y plaguicidas carbamato y organofosfato (carbofurano, aldicarb y fentión) después de Elliot y otros [24]. Medimos la actividad de colinesterasa cerebral para evaluar la exposición temprana a plaguicidas anticolinesterasa [25]. La posible contaminación se evaluó en comparación con los niveles de aves silvestres aparentemente normales de otras especies [26] en ausencia de niveles basales para buitres barbudos. La determinación de patógenos bacterianos y fúngicos se realizó mediante muestreo de orofaringe, pulmón, hígado, riñón, bazo e intestino con hisopos estériles y cultivados mediante protocolos de microbiología estándar [10, 12, 27, 28]. Se determinaron serotipos de Salmonella y tipos de fagos en el Laboratorio de Referencia Español (Laboratorio Central Veterinario, Algete, Madrid). Para la confirmación de la identificación del estreptocococo alfa hemolítico pneumoniae se utilizó una prueba de identificación específica (Accuprobe, Salem, MA) basada en la detección de secuencias específicas de ARN ribosómicos. Además, se determinó la presencia de patógenos aviares seleccionados, incluidos patógenos bacterianos, virales, fúngicos y protozoarios mediante métodos basados en PCR (véase el cuadro S1 para más detalles). La presencia de Chlamyophila psittaci y Mycoplasma sp. en sangre se determinó como se ha descrito anteriormente [29, 30]. La presencia de poxvirus, el paramixovirus causante de la enfermedad de Newcastle, los serotipos H5, H7 y H9 de gripe aviar, halcon adenovirus, circovirus, herpesvirus, poliomavirus, reovirus y el virus del Nilo Occidental se determinaron siguiendo los métodos basados en PCR disponibles en la literatura [31] [32] [34] [36] [37] [38] [39]. También buscamos helmintos y protozoos en el tracto gastrointestinal mediante observaciones macroscópicas y microscópicas utilizando protocolos estándar [40]. Se utilizaron procedimientos inmunocitoquímicos específicos para la detección del virus mielodepresor, incluyendo el alfaherpesvirus causante de la enfermedad de Marek [41] en riñón y bursa de Fabricius, el girovirus causante de la anemia infecciosa de pollo [42] en timo y médula ósea, el birnavirus causante de la enfermedad de bursal infecciosa (IBD, [43] ) en bursa de Fabricius, y el coronavirus causante de la bronquitis infecciosa de pollo en riñón [44]. Además, se llevó a cabo un procedimiento inmunocitoquímico específico para la detección de antígenos del virus del Nilo Occidental [45] en cerebro, médula espinal, timo y tiroides. Todos los análisis de inmunohistoquímica se realizaron en el Departamento de Anatomía Veterinaria, Facultad Veterinaria, Universidad Complutense de Madrid, España y en el Departamento de Patología de la Facultad Veterinaria, Universidad de Utrecht, Países Bajos. La presencia de estos virus también fue determinada por métodos basados en PCR [43, [46] [47]. Todos los nidos muertos y tres de los cinco embriones sin enganche mostraron de dos a seis fármacos veterinarios diferentes en el hígado (nido) y yema de huevo (embriones); además, los dos embriones con fluoroquinolonas en la yema también los tenían en el hígado (Tabla 1). Las fluoroquinolonas fueron los fármacos más prevalentes y mostraron las concentraciones más altas (Tabla 1). Otros compuestos tóxicos fueron detectados en menor prevalencia y concentraciones (ver Tabla 1 para los valores más relevantes; todos los insecticidas fueron encontrados en concentraciones,0,001 ppb), que fue apoyado además por niveles basales de colinesterasa cerebral (Tabla 1). Los embriones muertos y los nidos mostraron un estado nutricional moderado a bueno. Las lesiones histopatológicas mayores fueron localizadas principalmente en el riñón, incluyendo glomerulonefritis y/o glomerulonefrisis presentes en todos los individuos con fluoroquinolonas, pero no en aquellos sin fármacos (Tabla 1 ). Todos los individuos con fluoroquinolonas también mostraron lesiones articulares, incluyendo artritis y/ o artrosis de las articulaciones óseas largas, así como estroma óseo masivo de los huesos esponjosos. Enterotoxigenic Escherichia coli y Salmonella spp. fueron aislados en cuatro casos (Tabla 1 (cont.) * Muestras del mismo territorio en diferentes años. 1 Medicamentos veterinarios. EN: enrofloxacino (mg/g), IC: ciprofloxacino (mg/g), OX: oxitetraciclina (mg/g), FL: flunixina meglumina (mg/g), AS: salicilato de sodio (ng/g), IV: Ivermectina (mg/g). 2 Otros tóxicos. O: organoclorina (ng/g), Pb: plomo (ng/g). 12. z29 (tres casos, véase el Cuadro 1). Un individuo mostró infección por Salmonella enterica enteritidis (ver arriba) y enterotoxigenic Escherichia coli O86 en todos los órganos examinados (septicemia) excepto en el cerebro, que rechazó la posibilidad de contaminación post mortem. Pasteurella multocida fue aislada en un solo individuo que también mostró enterotoxigenic Escherichia coli O86 (Tabla 1) ; todos estos individuos contenían fluoroquinolonas. Uno de los embriones fracasados sin medicamentos veterinarios mostró miocarditis supurativa, múltiples microabscesos en los músculos de la cabeza, leptomeningitis supurativa, así como inflamación gangrenasa de mandíbula inferior con pérdida del estroma óseo debido a una infección mixta con Streptococcus suis y Streptococcus pneumoniae en cerebro, meninges y músculos del cuello; este embrión también Tanto la inmunocitoquímica para la detección de virus avícolas como el estudio de patógenos PCR fueron positivos para el IBDV en seis individuos con fluoroquinolonas (Tabla 1). Los procedimientos inmunocitoquímicos no detectaron antígenos del virus del Nilo Occidental en individuos en los que la PCR para este virus había sido positiva. La parasitología fue negativa para todos los helmintos, huevos helmintos y protozoos. Encontramos múltiples medicamentos veterinarios, principalmente fluoroquinolonas, en la mayoría de los huevos fracasados y buitres barbudos anidados muertos de los Pirineos. También mostraron múltiples daños en órganos internos y patógenos potencialmente adquiridos a partir de la carroña medicada, especialmente virus que a menudo infectan a las aves de corral. Los AINE y los antiparasitarios se encontraron en menor prevalencia que las fluoroquinolonas, pero en mayor concentración que los encontrados en otros escavengers aviares, especialmente para flunixina meglumina y salicilato de sodio [6, 12, 21]. Por el contrario, no encontramos óvulos estériles, malas condiciones nutricionales o lesiones en ningún embrión o anidación fallidos. Otros contaminantes se encontraron en baja prevalencia y concentraciones que presentan bajo riesgo para la salud embrionaria y de los nidificantes. Las fluoroquinolonas pueden causar daño generalizado directo al desarrollo que impide la incubación de embriones, alteraciones fisiológicas debido a su impacto en el hígado y el riñón e inmunodepresión, reduciendo la resistencia a patógenos oportunistas [6, [10] [11] [12] 21]. Estos patógenos pueden adquirirse al mismo tiempo que se ingeren los fármacos utilizados para tratar el ganado enfermo Por lo tanto, a pesar del tamaño relativamente pequeño de la muestra resultante de la baja abundancia, peligrosidad y dificultades logísticas para llegar a los nidos de esta especie, los resultados proporcionan evidencia de un impacto combinado de medicamentos veterinarios y enfermedad ganadera como la causa principal del fracaso de la cría en los individuos muestreados.La presencia del virus del Nilo Occidental no es probable que se asocie con la enfermedad de anidación o la mortalidad debido a la falta de lesiones en tejidos diana y partículas de antígeno viral en el estudio de inmunohistoquímica.La septicemia fatal causada por Streptococcus suis, uno de los patógenos porcinos más importantes del mundo [49], en combinación con la septicemia por Streptococcus pneumoniae y la infección por el virus de la bronquitis infecciosa de pollo se encontraron en un solo embrión.Esta concentración de patógenos del ganado no Otros patógenos registrados en embriones y nidos, incluyendo los serotipos de Salmonella y los fagos típicos del ganado [50], y la enterotoxigénica Escherichia coli O86 que causa septicemia, fueron potencialmente transmitidos por el consumo de canales de aves de corral infectadas y otros animales [22, 27, 28]. Además, encontramos que el virus de la EII infectaba a la mayoría de los individuos solo o junto con otros patógenos potencialmente adquiridos a partir de la carroña del ganado. Este virus causa una enfermedad inmunosupresora altamente contagiosa bursal en aves de corral [51] y puede transmitirse a la fauna silvestre en contacto con los residuos de aves de corral o por ingestión de canales [22, 52]. Los nidos son especialmente susceptibles a la EII debido al papel principal de bursa de Fabricius en el desarrollo de la función inmune a esta edad. De hecho, la inmunosupresión debida a la IBD fue indicada por la inflamación, necrosis y pérdida de linfocitos en la bursa de Fabricius junto con la presencia de antígenos virales registrados mediante procedimientos inmunocitoquímicos.El impacto potencial de los virus altamente patógenos y contagiosos de las aves de corral ha sido previamente reconocido como una amenaza para la salud de la fauna silvestre debido al creciente contacto de la fauna silvestre con las operaciones ganaderas en general, y las granjas avícolas y sus residuos en particular, en áreas naturales de todo el mundo [52] [53] [54]. Sin embargo, el daño causado por el virus de la IBD en la bursa de Fabricius representa, hasta nuestro conocimiento, la primera evidencia de enfermedad clínica compatible con la muerte causada por este virus avícola en la vida silvestre.La presencia de IBD no ha sido previamente registrada en embriones de Este sorprendente y preocupante resultado podría estar relacionado con el mayor desarrollo de óvulos e incubación de buitres barbudos en comparación con aves de corral, y/o debido a condiciones ambientales contrastantes durante la incubación entre buitres barbudos y aves de corral. Así, la infección embrionaria con IBD puede ocurrir a través de la hembra o durante la incubación como consecuencia del contacto de huevos entre el huevo y las aves de corral permanecen en los nidos de buitres barbudos, lo que requiere más investigación. A pesar de sus posibles efectos en la dinámica y conservación de la población a través de una reducción de la productividad y cambios en el comportamiento del apareamiento [13, 14], los procesos de saturación del hábitat aparentemente no estaban directamente relacionados con causas próximas particulares de fracaso del huevo y la anidación en este estudio o en estos individuos muestreados. Como explicación alternativa no mutuamente exclusiva, sugerimos que la reciente disminución de la productividad también podría estar relacionada con la creciente ingestión de medicamentos veterinarios y la adquisición de patógenos a partir de canales de ganado medicadas estables debido a la disminución de la disponibilidad de canales de ganado inestables -el alimento primario tradicional de buitres barbudos [16] desde la crisis de la EEB [21], acompañado de un posible aumento del uso de antibióticos en las operaciones de ganado estable. En este sentido, es notable que los buitres barbudos se alimentan principalmente de huesos de ganado, que son uno de los principales tejidos objetivo de las fluoroquinolonas en animales medicados [56], por lo que esta especie es especialmente sensible a las consecuencias de un aumento del consumo de ganado medicado intensamente estable. La presencia de medicamentos veterinarios en huevos implica su presencia previa al menos en hembras reproductoras [12], pero también probablemente en machos reproductores y no reproductores frecuentemente utilizando lugares de alimentación artificial y vertederos de canales de ganado [17], donde los medicamentos veterinarios pueden ser ingeridos a partir de canales de ganado medicamentoso [10, 21]. Por lo tanto, es necesario seguir investigando el impacto de los medicamentos veterinarios y las enfermedades del ganado en la aptitud de las personas adultas, incluidos los efectos potencialmente sutiles, subletales o indirectos de estos factores en la dinámica de la población.El vínculo entre los medicamentos veterinarios y las enfermedades del ganado debe investigarse más a fondo en las especies carroñeros, porque ambas amenazas pueden coincidir en los alimentos y porque los efectos inmunodepresivos y otras alteraciones fisiológicas causados por los medicamentos pueden facilitar la adquisición y proliferación de patógenos [6, 11, 21]. Dado que ambas amenazas que actúan juntas pueden contribuir en gran medida a reducir la productividad reproductiva, su potencial como factores estocásticos con efectos potencialmente devastadores que aumentan el riesgo de extinción no debe pasarse por alto en los actuales programas de conservación de buitres barbudos y otras especies carroñeros, especialmente en lo que respecta a los medicamentos veterinarios peligrosos y los virus altamente patógenos que frecuentemente infectan a las aves de corral. Además, una distribución geográfica restringida y una baja variabilidad genética [57] común a muchas especies amenazadas pueden favorecer la transmisión de patógenos y reducir la capacidad de un sistema inmunitario ingenuo para luchar contra nuevos patógenos [3, 28, 58], haciéndolos especialmente vulnerables a la posible transmisión de cepas de virus altamente virulentos capaces de causar brotes importantes, como se ha informado en aves de corral [59] [60] [61]. Estos procesos pueden facilitar el contacto e interacciones específicas que también pueden aumentar las tasas de transmisión intra e interespecíficas de patógenos en las zonas de reproducción y alimentación, especialmente de enfermedades avícolas altamente contagiosas [22], lo que podría mejorarse con el número artificialmente elevado de buitres barbudos y otros carroñeros atraídos a los puntos de alimentación y a los vertederos de basuras de canal, tanto como resultado de la gestión como debido a la escasez de canales de ganado inestables desde la crisis de la EEB [17, 21]. Cualquiera que sea la contribución potencial de los mecanismos finales subyacentes que reducen la productividad, nuestros resultados ponen de relieve la necesidad de determinar las causas próximas del fallo en la reproducción y la mortalidad en las poblaciones de fauna y flora silvestres a fin de comprender los procesos que regulan la demografía desde una perspectiva ecológica.

¿Dónde se encuentra comúnmente el buitre barbudo (Gypaetus barbatus)?

El complejo Schiff Base-Derived Copper (II) es un potente inductor de Apoptosis en las células cancerosas de colon al activar la ruta intrínsecahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3967396/SHA: f1f24521928f5d8565a15a17bd7f79239a3d4116Autores: Hajrezaie, Maryam; Paydar, Mohammadjavad; Zorofchian Moghadamtousi, Soheil; Hassandarvish, Pouya; Gwaram, Nura Suleiman; Zahedifard, Maryam; Rouhollahi, Elham; Karimian, Hamed; Looi, Chung Yeng; Ali, Hapipah Mood; Abdul Majid, Nazia En las últimas décadas, las bases de Schiff y sus complejos se han hecho bien conocidos por su extenso potencial biológico. En el presente estudio, se examinó el efecto antiproliferativo de un complejo de cobre (II) sobre las células cancerosas de colon HT-29. El compuesto base de Cu(BrHAP)(2 ) Schiff demostró un potente efecto antiproliferativo en las células HT-29, con un valor IC(50) de 2,87 μg/ml después de 72 h de tratamiento. Las células HT-29 tratadas con complejos de Cu (II) sufrieron muerte por apoptosis, como se muestra por una elevación progresiva en la proporción de la población celular G(1 ). A una concentración de 6,25 μg/ml, el compuesto Cu(BrHAP)(2 ) causó una elevación significativa en la producción de ROS tras la perturbación del potencial de membrana mitocondrial y la liberación del citocromo c, evaluada mediante la medición de la intensidad de fluorescencia en las células manchadas. Además, la activación de las caspas 3/7 y 9 fue parte de la apoptosis inducida por complejos Cu (II), que confirmó la implicación de la apoptosis mediada por mitocondrial. Mientras tanto, no hubo activación significativa de la caspasa-8. Tomada en conjunto, estos resultados implican que el compuesto Cu(BrHAP)(2 ) es un candidato potencial para estudios adicionales de cáncer de colon in vivo y clínico para desarrollar nuevos agentes quimioterapéuticos derivados de agentes metálicos. Texto: El cáncer es una enfermedad debilitante que afecta a una parte sustancial de la población mundial en todas las generaciones y es un importante problema de salud de preocupación mundial [1]. Entre los diversos tipos de cáncer, el cáncer colorrectal es el segundo y tercer cáncer más prevalente entre hombres y mujeres en los Estados Unidos, respectivamente. A pesar de todos los avances considerables en los métodos de protección y las recientes mejoras en las técnicas de detección y quimioterapia, las tasas de supervivencia relativas de 1 y 5 años para los pacientes que padecen cáncer colorrectal son del 83,2% y 64,3%, respectivamente [2]. Además, debido a la amarga controversia sobre los métodos óptimos para la detección temprana, el pleno cumplimiento de las recomendaciones de detección sigue siendo un obstáculo importante para el diagnóstico en las etapas tempranas del desarrollo del cáncer. El desarrollo de resistencia a la quimioterapia también representa un problema crítico para el cual el tratamiento simultáneo con diversas clases de terapéuticas para reducir la resistencia ha Además, los numerosos efectos secundarios de los fármacos quimioterapéuticos en pacientes con cáncer, incluyendo pérdida de cabello, diarrea, sangrado e inmunosupresión, han hecho el proceso 2El Scientific World Journal de tratamiento más complicado [4]. El proceso altamente regulado de muerte celular programada de la apoptosis es una cuestión de gran interés en oncología y terapia contra el cáncer y representa una vía molecular común para la resistencia a fármacos y carcinogénesis [5]. El mantenimiento de un número celular constante en la mucosa colónica está altamente regulado a través del equilibrio entre la apoptosis y la proliferación celular. La perturbación en este equilibrio conduce a una fuga de homeostasis número celular normal y se asocia con la progresión de células cancerosas [6, 7]. Así, la supresión de la proliferación y elevación de la apoptosis en estas células aberantes se sugiere como el mecanismo esencial para la inhibición del cáncer de colon. Además, la apoptosis y los factores involucrados en su mecanismo de acción también presentan una ventana que puede ser explotada para la mejora de agentes terapéuticos potenciales con alta efectividad y menos efectos secundarios adversos [8]. Por lo tanto, la detección de compuestos novedosos capaces de inducir apoptosis en células de cáncer de colon que puedan ser utilizados solos o en combinación con otros fármacos quimioterapéuticos es una necesidad significativa y representa un desafío crítico en la química medicinal. Los complejos metálicos han sido ampliamente utilizados en clínicas durante siglos y han atraído a numerosos químicos inorgánicos para analizarlos, con el foco principal en aplicaciones médicas [9, 10]. El cobre, un oligoelemento esencial de naturaleza oxidativa y actividad bioesencial en el metabolismo humano, no existe en forma iónica en los sistemas biológicos. Así, la medición del cobre en el cuerpo se evalúa en forma de complejos con compuestos orgánicos [11]. Las bases Schiff son una clase crítica de compuestos en química médica que han demostrado una aplicación quimioterapéutica y antibacteriana significativa [12, 13]. Los complejos Schiff base Cu(II) revelaron un gran potencial para la actividad antiproliferativa, antibacteriana y gastroprotectora [14] [15] [16] [17] [18]. Este estudio evaluó el potencial anticanceroso de un complejo de cobre (II) derivado de N,N - dimetiletilen diamina y 2-hidroxiacetofenona Schiff base ligand, Cu(BrHAP) 2. Además, también se examinó el posible mecanismo apoptótico subyacente a esta actividad. Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Life Technologies, Inc., Rockville, MD) que contiene 10% de suero bovino fetal, 100 g/ml de estreptomicina y 100 U/ml de penicilina G a 37 °C en una atmósfera humidificada de 5% de CO 2 /95% de aire. Las células fueron chapadas a una densidad de ajuste en frascos de cultivo de tejidos (Corning, EE.UU.) según cada escala experimental. La viabilidad celular fue medida mediante un ensayo convencional de reducción de MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difeniltetrazolio bromuro]. Después de 48 h de exposición a seis concentraciones de Cu(BrHAP) 2, las células fueron tratadas con solución de MTT (2 mg/ml) durante 2 h. Los cristales formazanos oscuros formados en células intactas fueron disueltos en DMSO, y la absorbancia se midió a 570 nm y 650 nm como fondo utilizando un lector de microplacas (Hidex, Turku, Finlandia). El valor IC 50 se determinó como la concentración de Cu(BrHAP) 2 necesaria para reducir la absorción de células tratadas al 50% de las células de control tratadas con DMSO. Todas las muestras se prepararon por triplicados. Ensayo. Medición de la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) es un biomarcador para determinar la citotoxicidad de un compuesto. Brevemente, las células HT-29 fueron tratadas con diferentes concentraciones de Cu(BrHAP) 2 y Triton X-100 (control positivo) durante 48 h, y los sobrenadantes de las células no tratadas y tratadas fueron transferidos a una nueva placa de 96 pocillos para el análisis de actividad LDH. A continuación, se añadieron 100 L de solución de reacción LDH a cada pozo, la placa fue incubada a temperatura ambiente durante 30 min, y la absorbancia fue leída a 490 nm utilizando un lector de microplacas Tecan Infinite 200 Pro (Tecan, Männedorf, Suiza). La cantidad de sal formazana y la intensidad de color rojo en muestras tratadas y no tratadas fueron representadas como la actividad LDH de las células. El nivel de liberación LDH en células tratadas con Cu(BrHAP) 2 se expresó como un porcentaje del control positivo. Para la detección de la apoptosis en las células tratadas se realizó un ensayo de doble tinción de propidium y naranja acridina (AO) mediante un microscopio fluorescente (Leica conectado con el software Q-Floro) de acuerdo con un procedimiento estándar. Las células HT-29 (5 × 10 4 células/ml en un matraz de cultivo de 25 mL) fueron chapadas, tratadas con Cu(BrHAP) 2 en la concentración IC 50, e incubadas durante 24, 48 y 72 h. Después de la recolección de las células, fueron manchadas con colorantes fluorescentes y observadas bajo un microscopio fluorescente UV (Olympus BX51) en un plazo de 30 min. En resumen, las células HT-29 (1 × 10 4 células/pozo en placa de 96 pocillos) fueron suplementadas con Cu(BrHAP) 2 (2 g/ml) o DMSO (control negativo) durante 24 h. Las células vivas fueron incubadas con tintes BrdU y Phospho-Histone H3 durante 30 min. Después de que las células fueron fijas y manchadas según lo descrito por las instrucciones del fabricante, fueron visualizadas y analizadas utilizando el lector de HCS Cellomics ArrayScan (Thermo Scientific). Las intensidades de fluorescencia de los tintes fueron medidas mediante un módulo de bioaplicación de activación diana. Para confirmar el resultado del análisis del ciclo celular de fluorescencia, las células HT-29 (5 × 10 4 células/ml) fueron tratadas con Cu(BrHAP) 2 para 24, 48 y 72 h para el Después de la incubación, las células HT-29 fueron giradas a 1800 rpm durante 5 min. A continuación, se realizó la fijación de una población celular para el análisis de citometría de flujo para restaurar la integridad. En resumen, los pellets celulares fueron fijados mezclándolos con 700 L de etanol frío (90%) y luego se mantuvieron a 4 °C durante la noche. Las células HT-29 tratadas fueron giradas y el etanol fue desechado. Después de lavar y suspender las células en PBS, 25 L de Rnasa A (10 mg/ml) y 50 L de propidium iodide (PI) (1 mg/ml) fueron añadidas a las células fijas durante 1 h a 37 °C. La RNase A añadida limitó la capacidad de PI para unirse únicamente a moléculas de ADN. Al final, el contenido de ADN de las células fue analizado por un citometro de flujo ( El ensayo de la capacidad antioxidante radical de oxígeno (ORAC) se realizó en base a los protocolos descritos en detalle anteriormente [19]. En resumen, se utilizó Cu(BrHAP) 2 a la concentración de 100 g/ml para este ensayo en un volumen de reacción total de 200 L. El experimento se realizó en una microplaca negra de 96 pocillos con 25 L de compuesto, en blanco (solvente/PBS), estándar (trolox), o control positivo (quercetina). La placa fue suplementada con la solución de fluoresceína de trabajo (150 L), seguida de una incubación de 5 minutos a 37 °. El volumen total de 200 L se compuso sumando 25 L de solución de trabajo AAPH. La intensidad de fluorescencia se midió a una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 538 nm cada 2 min durante 2 h. El resultado se cuantificó calculando las diferencias de área bajo la curva de descomposición de fluorescencia (AUC) de muestras y en blanco. Los valores fueron equivalentes Trolox (TE). En resumen, las células HT-29 (1 × 10 4 células/ml) fueron sembradas en placas de 96 pocillos y tratadas con diferentes concentraciones de Cu(BrHAP) 2 y DMSO (control negativo) durante 24 h. Después de 30 min de tratamiento con tinte dihidroetidium (DHE), las células fueron fijas y lavadas con tampón de lavado según las instrucciones del fabricante. En presencia de superóxidos, el tinte DHE se oxida a etidium. La intensidad de fluorescencia fue determinada por un lector de placas fluorescente a una longitud de onda de extensión de 520 nm y una longitud de onda de emisión de 620 nm. Los factores críticos para monitorear la salud celular, a saber, pérdida celular, cambios en la permeabilidad celular, liberación citocroma, cambios potenciales en la membrana mitocondrial, tamaño nuclear y cambios morfológicos, fueron estudiados utilizando un kit de citotoxicidad multiparamétrica Cellomics 3 como se describe en detalle anteriormente [20]. Las placas con células manchadas fueron analizadas utilizando el sistema ArrayScan HCS (Cellomics, PA, USA). Caspas 3/7, -8 y 9 actividades fueron determinadas utilizando el kit comercial caspasa-Glo 3/7, 8 y 9 de ensayo (Promega, Madison, WI). Las células HT-29 (1,0 × 10 4 células/pozo) fueron sembradas durante la noche en placas de 96 pocillos de pared blanca y tratadas con diferentes concentraciones de Cu(BrHAP) 2 durante 24 h. Según el protocolo del fabricante, las células tratadas fueron suplementadas con reactivo caspasa-Glo (100 L) e incubadas a temperatura ambiente durante 30 min. Las caspas activas de células apoptóticas causaron la escisión del tetrapéptido sintético marcado con aminoluciferina, lo que llevó a la liberación de sustrato para la enzima luciferasa. Las actividades de caspas se analizaron mediante un lector de microplacas Tecan Infinite 200 Pro (Tecan, Männedorf, Suiza). En resumen, las células HT-29 (1,0 × 10 4 células/pozo en una placa de 96 pocillos) fueron tratadas con diferentes concentraciones de Cu(BrHAP) 2 durante 3 h, seguidas de estimulación con TNF-(1 ng/ml) durante 30 min. Después de desechar el medio, las células fueron fijas y manchadas utilizando un kit de activación del núcleo Cellomics factor-B (NF-B) (Thermo Scientific) según las instrucciones del fabricante. A continuación, se utilizó un Array Scan HCS Reader para la evaluación de la placa. Las relaciones de intensidad NF-B citoplasmática y nuclear se calcularon utilizando el software de bioaplicación Cytoplasma a Nucleus Translocation. Se determinó la intensidad media de 200 células/pozo. Se compararon las proporciones de células no tratadas, tratadas y estimuladas por TNF. Todos los experimentos Los resultados se presentaron como la media ± desviación estándar (DE) del número de experimentos mostrados en las leyendas. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) utilizando el paquete estadístico prisma (GraphPad Software, EE.UU.). < 0,05 se consideró estadísticamente significativo. Células del colon. Inicialmente, la citotoxicidad de Cu(BrHAP) 2 se probó en líneas celulares HT-29 y CCD 841. Los valores IC 50 del compuesto base Schiff se determinaron a partir del resultado recogido de tres experimentos MTT independientes. Como se indica en la Tabla 1, Cu(BrHAP) 2 produjo un efecto citotoxicidad significativo e inhibidor celular después de 24, 48 y 72 h de tratamiento en células HT-29. 2 - Liberación LDH inducida. La liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) en el medio es un marcador que muestra la pérdida de integridad de la membrana, apoptosis o necrosis. La citotoxicidad del compuesto Cu(BrHAP) 2, determinado por el ensayo de liberación de LDH, se cuantificó en células HT-29 tratadas con diversas concentraciones del compuesto base de Schiff durante 48 h. Cu(BrHAP) 2 indujo una elevación significativa en la liberación de LDH, demostrando citotoxicidad en las concentraciones de 6,25 y 12,5 g/ml en comparación con las células de control (Figura 2 ). Microscopía y doble tinción AO/PI. Se observaron cambios morfológicos en células HT-29 tratadas con Cu(BrHAP) 2 bajo un microscopio fluorescente a las 24, 48 y 72 h. Las células fueron puntuadas bajo un microscopio fluorescente para analizar células La apoptosis temprana, definida como OA interviniente dentro del ADN fragmentado, se observó bajo fluorescencia verde brillante, al mismo tiempo que se visualizaron células de control con una estructura nuclear verde intacta. Después de 24 y 48 h de tratamiento con Cu(BrHAP) 2, se observó apoptosis moderada en forma de blebing y condensación nuclear de cromatina. Además, en la etapa tardía de la apoptosis, se observaron cambios, como la presencia de color rojizo-naranja debido a la unión de PI al ADN desnaturalizado, después de 72 h de tratamiento (Figura 3). Los resultados mostraron que el compuesto de Cu(BrHAP) 2 indujo características morfológicas de la apoptosis de manera dependiente del tiempo. Figura 4, demostró que no existe parada del ciclo celular en las fases S/M. La falta de parada del ciclo celular en las fases S/M sugirió una posible parada del ciclo celular en las fases G 1 / G 2. Para determinar la fase exacta detenida, se analizaron células HT-29 tratadas para la progresión del ciclo celular utilizando citometría de flujo. Como era de esperar, no hubo parada significativa en las fases S/M. Mientras tanto, se observó parada significativa del ciclo celular en la fase G 1 para las células HT-29 después de 24 y 48 h de tratamiento (Figura 5). Ensayo. La capacidad antioxidante se midió mediante ensayo ORAC, que es el único ensayo que implica el uso de peroxil radical como actividad prooxidante y cuantificada a través del área bajo la técnica de curva (AUC). En nuestro experimento, la quercetina se utilizó como control positivo. El resultado demostró que Cu(BrHAP) 2 mostró actividad antioxidante baja a moderada en comparación con la quercetina (Tabla 2) Las células HT-29 fueron tratadas con diferentes concentraciones de Cu(BrHAP) 2 durante 24 h y teñidas con tinte DHE para determinar la influencia del compuesto base de Schiff en la producción de ROS. Las intensidades de fluorescencia de la oxidación de DHE por ROS fueron cuantificadas utilizando un lector de microplacas de fluorescencia. Como se muestra en la Figura 6, la exposición al compuesto base de Schiff causó una elevación significativa en los niveles de ROS de las células HT-29 tratadas a la concentración de 6,25 g/ml. Para investigar la inducción de la apoptosis por Cu(BrHAP) 2, los cambios morfológicos nucleares en las células HT-29 fueron analizados mediante la detección de condensación nuclear. Como se muestra en la Figura 7, la tinción de Hoechst 33342 demostró que la condensación nuclear, que está directamente relacionada con los cambios de la cromatina apoptótica, surgió en algunas células después del tratamiento con Cu(BrHAP) 2. Mientras tanto, la permeabilidad de las células tratadas también fue elevada. Las mitocondrias son la principal fuente para la producción de ROS y trifosfato de adenosina (ATP) y son críticas para controlar la muerte y supervivencia de las células. La reducción de la intensidad de fluorescencia representada en la Figura 6 Cu(BrHAP) 2 desencadenó la translocación de citocromo de mitocondria en el citosol durante la apoptosis en células HT-29. Activación. La elevación en la producción de ROS asociada con un colapso en MMP puede conducir a la activación de Para investigar la activación de la caspasa, las intensidades bioluminiscentes que representan caspas 3/7, 8 y 9 actividades fueron cuantificadas en células HT-29 tratadas con diferentes concentraciones de Cu(BrHAP) 2 durante 24 h. Como se muestra en la Figura 8, se observó una elevación significativa en la actividad de caspasa-3/7 en la concentración de 6,25 g/mL y caspasa-9 en las concentraciones de 6,25 y 12,5 g/mL en las células tratadas de Cu(BrHAP), mientras que no se detectó ningún cambio significativo en la actividad de caspasa-8 entre células HT-29 tratadas y no tratadas. Así, la apoptosis inducida por el compuesto base de Schiff en células HT-29 posiblemente se media a través de la vía intrínseca, pero no de la vía extrínseca. es un factor de transcripción que tiene un papel crítico en la La activación NF-B y la translocación al núcleo para permitir la actividad de unión al ADN y facilitar la expresión génica diana están mediadas por citocinas inflamatorias como el factor de necrosis tumoral (TNF-). El compuesto base de Cu(BrHAP) 2 Schiff no mostró ningún efecto inhibidor en la translocación del TNF--NF-B estimulado en células tratadas con HT-29, y el TNF--estimulación llevó a la translocación del NF-B del citoplasma al núcleo (Figura 9). La carcinogénesis es un proceso multietapa en el que la proliferación celular no regulada, así como una reducción en la incidencia de apoptosis, sirve como caracterización inicial para su progresión [21]. Uno de los procedimientos de defensa en organismos multicelulares es la destrucción del desarrollo celular indeseable, que se define como muerte celular programada. La apoptosis es el mecanismo de muerte celular programado más notorio y se caracteriza por cambios morfológicos distintos como la permeabilidad de la membrana, la contracción celular, la interrupción de la membrana mitocondrial y la condensación de la cromatina [22, 23]. La interrupción de la homeostasis celular entre la muerte celular y la proliferación celular conduce a la incidencia de cáncer [24], y se sabe que los agentes que pueden inducir apoptosis tienen efectos potenciales contra el cáncer [25, 26]. Las vías de apoptosis son objetivos eficaces para la terapia del cáncer así como la quimioprevención. Se han determinado numerosos fármacos quimiopreventivos para regular eventos clave o moléculas en las vías de transducción de señales que inducen apoptosis [27]. En el presente estudio, se evaluó el compuesto básico Cu(BrHAP) 2 Schiff por su Las células HT-29 se han caracterizado recientemente como un modelo adecuado para estudios de cáncer de colon [28] [30]. células de cáncer de colon humano de forma dependiente del tiempo y de la dosis. Mientras tanto, la línea celular de colon no tumorígena (CCD 841) no mostró citotoxicidad después del tratamiento con el compuesto. El efecto citotóxico del compuesto Cu(II) también fue confirmado mediante la medición del nivel de liberación de LDH de las células tratadas. La liberación de LDH significativamente elevada mostró que la citotoxicidad del compuesto Cu(BrHAP) 2 posiblemente ocurrió a través de la pérdida de integridad de la membrana, ya sea mediante la activación de la apoptosis o la vía de necrosis [31]. La observación de la apoptosis temprana y la apoptosis tardía mediante microscopía fluorescente y doble tinción AO/PI después del tratamiento de las células HT-29 con el compuesto incluyó algunos signos de apoptosis, a saber, contracción citoplasmática, blebbing de membrana y fragmentación del ADN [32, 33]. Encontramos que el número de células con características de apoptosis temprana fue mayor en etapas tempranas del tratamiento. Sin embargo, cuando el tiempo de tratamiento aumentó a 72 h, las caracterizaciones de apoptosis tardía o necrosis fueron dominantes entre las células HT-29 tratadas. La detección concomitante de apoptosis tardía o necrosis es científicamente posible porque las células HT-29 tratadas sometidas a apoptosis pueden haber progresado en necrosis debido a la incubación prolongada con el compuesto base Schiff. Para dilucidar los mecanismos subyacentes al efecto antiproliferativo observado del complejo Cu(II) sobre las células cancerosas, se analizó la distribución del ciclo celular utilizando la tinción BrdU y Phospho-Histone H3 junto con la citometría de flujo [34] [35]. El tinte BrdU puede unirse al ADN sintetizado de las células replicantes durante la fase S del ciclo celular, mientras que las células tinturas Phospho-Histone H3 en diferentes estadios mitóticos. El ciclo celular resulta del ensayo de doble tinción BrdU y Phospho-Histone H3 indicó que no hubo cambios significativos en el número de células en las fases S/M después de la exposición de células HT-29 al compuesto base Schiff, lo que sugiere la posibilidad de que las células fueran detenidas en la fase G 1 o G 2 del ciclo celular. Así, el análisis de citometría de flujo del ciclo celular fue realizado para determinar la fase exacta detenida, y los resultados demostraron una parada significativa del ciclo celular en G 1 después de 24 y 48 h de tratamiento, sugiriendo supresión proliferativa por inducción de apoptosis [37, 38]. La perturbación del potencial de membrana mitocondrial es uno de los eventos intracelulares más tempranos que ocurren después de la inducción de la apoptosis [39]. Como fuente principal de ROS celular y trifosfato de adenosina (ATP), las mitocondrias son los reguladores clave de los mecanismos que controlan la supervivencia o muerte de las células. Después de confirmar que el compuesto base de Cu(BrHAP) 2 Schiff no tenía capacidad antioxidante significativa en células cancerosas HT-29 utilizando el ensayo ORAC, se analizó la inducción de la producción de ROS en células tratadas. De acuerdo con nuestro estudio, después de exponer el compuesto Cu(II) a células HT-29 y analizar los niveles de ROS, se demostró que el nivel de ROS en células HT-29 tratadas fue significativamente elevado a una concentración compuesta de 6,25 g/ml. En la apoptosis inducida por metales, las mitocondrias tienen el papel crucial en mediar la apoptosis a través de ROS inducida por metales [40]. La vía de señalización intrínseca o dependiente de mitocondrial involucra diferentes factores de estímulos no mediados por receptores que inducen señales intracelulares. Estas señales, principalmente a través de la proteína p53, actúan sobre los eventos mitocondrializados. La producción excesiva de ROS es una señal negativa que puede resultar en el fracaso de la supresión de los factores antiapoptoticos, desencadenando así la apoptosis. Por lo tanto, utilizamos sondas fluorescentes de potencial de membrana mitocondrial (MMP) para examinar el efecto de la producción elevada de ROS en la función de las mitocondrias en células tratadas HT-29. Como se muestra en la Figura 7, los cambios en el MMP después del tratamiento con el compuesto base Cu(BrHAP) 2 Schiff que llevó a la despolarización de la membrana de las mitocondrias fueron demostrados por la liberación de Rhodamine 123 al citoplasma de la matriz mitocondria. El resultado implica que la inducción de los complejos base de Schiff por Cu(II) Schiff puede estar asociada con la vía mitocondrial [26, 41, 42]. Una de las señales importantes para iniciar el procedimiento de la apoptosis es citocromo citosólico. La liberación de citocromo en el citosol y la reducción de sus niveles en las mitocondrias se han demostrado como resultado de los cambios en el MMP [30]. Como el resultado ilustrado, el compuesto de base sintético Schiff también llevó a un aumento en el nivel de citocromo en el citosol en comparación con el control. La producción excesiva de ROS de mitocondrias y el colapso de MMP puede activar las moléculas de caspasa aguas abajo y consecuentemente conducir a la muerte celular apoptótica. Después de la unión del citocromo al factor activador apoptótico-1, la caspasa-9 se activa a través de la formación de apoptosomas, que conduce a la caspasa activa-3/7, la caspasa más eficaz con muchos objetivos celulares [43]. En la vía extrínseca, la apoptosis es mediada por receptores de muerte. Como ejemplo, el ligando FAS interactúa con el receptor FAS, lo que conduce a la activación de la caspasa-8 [44]. La activación Caspasa-8 se corta y activa caspas del verdugo aguas abajo como caspasa-3/7 [45, 46]. En nuestro estudio, el compuesto base Cu(BrHAP) 2 Schiff indujo una elevación significativa en las caspas 3/7 y 9 actividades en comparación con el control. Mientras tanto, no hubo activación de caspasa-8, lo que sugiere que la apoptosis inducida en las células HT-29 fue mediada a través de la vía mitocondrial intrínseca, pero no la vía extrínseca, receptor de muerte ligada a la caspasa-8. La evidencia de soporte de liberación de LDH, producción de ROS, supresión de MMP, elevación en el nivel de citocromo, y activación de caspas 3/7 y 9 demostró la prometedora actividad anticancerosa del compuesto base de Cu(BrHAP) 2 Schiff contra la línea celular de cáncer de colon HT-29 a través de la vía mitocondrial intrínseca.

¿Cuál fue el enfoque de este estudio?

El complejo Schiff Base-Derived Copper (II) es un potente inductor de Apoptosis en las células cancerosas de colon al activar la ruta intrínsecahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3967396/SHA: f1f24521928f5d8565a15a17bd7f79239a3d4116Autores: Hajrezaie, Maryam; Paydar, Mohammadjavad; Zorofchian Moghadamtousi, Soheil; Hassandarvish, Pouya; Gwaram, Nura Suleiman; Zahedifard, Maryam; Rouhollahi, Elham; Karimian, Hamed; Looi, Chung Yeng; Ali, Hapipah Mood; Abdul Majid, Nazia En las últimas décadas, las bases de Schiff y sus complejos se han hecho bien conocidos por su extenso potencial biológico. En el presente estudio, se examinó el efecto antiproliferativo de un complejo de cobre (II) sobre las células cancerosas de colon HT-29. El compuesto base de Cu(BrHAP)(2 ) Schiff demostró un potente efecto antiproliferativo en las células HT-29, con un valor IC(50) de 2,87 μg/ml después de 72 h de tratamiento. Las células HT-29 tratadas con complejos de Cu (II) sufrieron muerte por apoptosis, como se muestra por una elevación progresiva en la proporción de la población celular G(1 ). A una concentración de 6,25 μg/ml, el compuesto Cu(BrHAP)(2 ) causó una elevación significativa en la producción de ROS tras la perturbación del potencial de membrana mitocondrial y la liberación del citocromo c, evaluada mediante la medición de la intensidad de fluorescencia en las células manchadas. Además, la activación de las caspas 3/7 y 9 fue parte de la apoptosis inducida por complejos Cu (II), que confirmó la implicación de la apoptosis mediada por mitocondrial. Mientras tanto, no hubo activación significativa de la caspasa-8. Tomada en conjunto, estos resultados implican que el compuesto Cu(BrHAP)(2 ) es un candidato potencial para estudios adicionales de cáncer de colon in vivo y clínico para desarrollar nuevos agentes quimioterapéuticos derivados de agentes metálicos. Texto: El cáncer es una enfermedad debilitante que afecta a una parte sustancial de la población mundial en todas las generaciones y es un importante problema de salud de preocupación mundial [1]. Entre los diversos tipos de cáncer, el cáncer colorrectal es el segundo y tercer cáncer más prevalente entre hombres y mujeres en los Estados Unidos, respectivamente. A pesar de todos los avances considerables en los métodos de protección y las recientes mejoras en las técnicas de detección y quimioterapia, las tasas de supervivencia relativas de 1 y 5 años para los pacientes que padecen cáncer colorrectal son del 83,2% y 64,3%, respectivamente [2]. Además, debido a la amarga controversia sobre los métodos óptimos para la detección temprana, el pleno cumplimiento de las recomendaciones de detección sigue siendo un obstáculo importante para el diagnóstico en las etapas tempranas del desarrollo del cáncer. El desarrollo de resistencia a la quimioterapia también representa un problema crítico para el cual el tratamiento simultáneo con diversas clases de terapéuticas para reducir la resistencia ha Además, los numerosos efectos secundarios de los fármacos quimioterapéuticos en pacientes con cáncer, incluyendo pérdida de cabello, diarrea, sangrado e inmunosupresión, han hecho el proceso 2El Scientific World Journal de tratamiento más complicado [4]. El proceso altamente regulado de muerte celular programada de la apoptosis es una cuestión de gran interés en oncología y terapia contra el cáncer y representa una vía molecular común para la resistencia a fármacos y carcinogénesis [5]. El mantenimiento de un número celular constante en la mucosa colónica está altamente regulado a través del equilibrio entre la apoptosis y la proliferación celular. La perturbación en este equilibrio conduce a una fuga de homeostasis número celular normal y se asocia con la progresión de células cancerosas [6, 7]. Así, la supresión de la proliferación y elevación de la apoptosis en estas células aberantes se sugiere como el mecanismo esencial para la inhibición del cáncer de colon. Además, la apoptosis y los factores involucrados en su mecanismo de acción también presentan una ventana que puede ser explotada para la mejora de agentes terapéuticos potenciales con alta efectividad y menos efectos secundarios adversos [8]. Por lo tanto, la detección de compuestos novedosos capaces de inducir apoptosis en células de cáncer de colon que puedan ser utilizados solos o en combinación con otros fármacos quimioterapéuticos es una necesidad significativa y representa un desafío crítico en la química medicinal. Los complejos metálicos han sido ampliamente utilizados en clínicas durante siglos y han atraído a numerosos químicos inorgánicos para analizarlos, con el foco principal en aplicaciones médicas [9, 10]. El cobre, un oligoelemento esencial de naturaleza oxidativa y actividad bioesencial en el metabolismo humano, no existe en forma iónica en los sistemas biológicos. Así, la medición del cobre en el cuerpo se evalúa en forma de complejos con compuestos orgánicos [11]. Las bases Schiff son una clase crítica de compuestos en química médica que han demostrado una aplicación quimioterapéutica y antibacteriana significativa [12, 13]. Los complejos Schiff base Cu(II) revelaron un gran potencial para la actividad antiproliferativa, antibacteriana y gastroprotectora [14] [15] [16] [17] [18]. Este estudio evaluó el potencial anticanceroso de un complejo de cobre (II) derivado de N,N - dimetiletilen diamina y 2-hidroxiacetofenona Schiff base ligand, Cu(BrHAP) 2. Además, también se examinó el posible mecanismo apoptótico subyacente a esta actividad. Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Life Technologies, Inc., Rockville, MD) que contiene 10% de suero bovino fetal, 100 g/ml de estreptomicina y 100 U/ml de penicilina G a 37 °C en una atmósfera humidificada de 5% de CO 2 /95% de aire. Las células fueron chapadas a una densidad de ajuste en frascos de cultivo de tejidos (Corning, EE.UU.) según cada escala experimental. La viabilidad celular fue medida mediante un ensayo convencional de reducción de MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difeniltetrazolio bromuro]. Después de 48 h de exposición a seis concentraciones de Cu(BrHAP) 2, las células fueron tratadas con solución de MTT (2 mg/ml) durante 2 h. Los cristales formazanos oscuros formados en células intactas fueron disueltos en DMSO, y la absorbancia se midió a 570 nm y 650 nm como fondo utilizando un lector de microplacas (Hidex, Turku, Finlandia). El valor IC 50 se determinó como la concentración de Cu(BrHAP) 2 necesaria para reducir la absorción de células tratadas al 50% de las células de control tratadas con DMSO. Todas las muestras se prepararon por triplicados. Ensayo. Medición de la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) es un biomarcador para determinar la citotoxicidad de un compuesto. Brevemente, las células HT-29 fueron tratadas con diferentes concentraciones de Cu(BrHAP) 2 y Triton X-100 (control positivo) durante 48 h, y los sobrenadantes de las células no tratadas y tratadas fueron transferidos a una nueva placa de 96 pocillos para el análisis de actividad LDH. A continuación, se añadieron 100 L de solución de reacción LDH a cada pozo, la placa fue incubada a temperatura ambiente durante 30 min, y la absorbancia fue leída a 490 nm utilizando un lector de microplacas Tecan Infinite 200 Pro (Tecan, Männedorf, Suiza). La cantidad de sal formazana y la intensidad de color rojo en muestras tratadas y no tratadas fueron representadas como la actividad LDH de las células. El nivel de liberación LDH en células tratadas con Cu(BrHAP) 2 se expresó como un porcentaje del control positivo. Para la detección de la apoptosis en las células tratadas se realizó un ensayo de doble tinción de propidium y naranja acridina (AO) mediante un microscopio fluorescente (Leica conectado con el software Q-Floro) de acuerdo con un procedimiento estándar. Las células HT-29 (5 × 10 4 células/ml en un matraz de cultivo de 25 mL) fueron chapadas, tratadas con Cu(BrHAP) 2 en la concentración IC 50, e incubadas durante 24, 48 y 72 h. Después de la recolección de las células, fueron manchadas con colorantes fluorescentes y observadas bajo un microscopio fluorescente UV (Olympus BX51) en un plazo de 30 min. En resumen, las células HT-29 (1 × 10 4 células/pozo en placa de 96 pocillos) fueron suplementadas con Cu(BrHAP) 2 (2 g/ml) o DMSO (control negativo) durante 24 h. Las células vivas fueron incubadas con tintes BrdU y Phospho-Histone H3 durante 30 min. Después de que las células fueron fijas y manchadas según lo descrito por las instrucciones del fabricante, fueron visualizadas y analizadas utilizando el lector de HCS Cellomics ArrayScan (Thermo Scientific). Las intensidades de fluorescencia de los tintes fueron medidas mediante un módulo de bioaplicación de activación diana. Para confirmar el resultado del análisis del ciclo celular de fluorescencia, las células HT-29 (5 × 10 4 células/ml) fueron tratadas con Cu(BrHAP) 2 para 24, 48 y 72 h para el Después de la incubación, las células HT-29 fueron giradas a 1800 rpm durante 5 min. A continuación, se realizó la fijación de una población celular para el análisis de citometría de flujo para restaurar la integridad. En resumen, los pellets celulares fueron fijados mezclándolos con 700 L de etanol frío (90%) y luego se mantuvieron a 4 °C durante la noche. Las células HT-29 tratadas fueron giradas y el etanol fue desechado. Después de lavar y suspender las células en PBS, 25 L de Rnasa A (10 mg/ml) y 50 L de propidium iodide (PI) (1 mg/ml) fueron añadidas a las células fijas durante 1 h a 37 °C. La RNase A añadida limitó la capacidad de PI para unirse únicamente a moléculas de ADN. Al final, el contenido de ADN de las células fue analizado por un citometro de flujo ( El ensayo de la capacidad antioxidante radical de oxígeno (ORAC) se realizó en base a los protocolos descritos en detalle anteriormente [19]. En resumen, se utilizó Cu(BrHAP) 2 a la concentración de 100 g/ml para este ensayo en un volumen de reacción total de 200 L. El experimento se realizó en una microplaca negra de 96 pocillos con 25 L de compuesto, en blanco (solvente/PBS), estándar (trolox), o control positivo (quercetina). La placa fue suplementada con la solución de fluoresceína de trabajo (150 L), seguida de una incubación de 5 minutos a 37 °. El volumen total de 200 L se compuso sumando 25 L de solución de trabajo AAPH. La intensidad de fluorescencia se midió a una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 538 nm cada 2 min durante 2 h. El resultado se cuantificó calculando las diferencias de área bajo la curva de descomposición de fluorescencia (AUC) de muestras y en blanco. Los valores fueron equivalentes Trolox (TE). En resumen, las células HT-29 (1 × 10 4 células/ml) fueron sembradas en placas de 96 pocillos y tratadas con diferentes concentraciones de Cu(BrHAP) 2 y DMSO (control negativo) durante 24 h. Después de 30 min de tratamiento con tinte dihidroetidium (DHE), las células fueron fijas y lavadas con tampón de lavado según las instrucciones del fabricante. En presencia de superóxidos, el tinte DHE se oxida a etidium. La intensidad de fluorescencia fue determinada por un lector de placas fluorescente a una longitud de onda de extensión de 520 nm y una longitud de onda de emisión de 620 nm. Los factores críticos para monitorear la salud celular, a saber, pérdida celular, cambios en la permeabilidad celular, liberación citocroma, cambios potenciales en la membrana mitocondrial, tamaño nuclear y cambios morfológicos, fueron estudiados utilizando un kit de citotoxicidad multiparamétrica Cellomics 3 como se describe en detalle anteriormente [20]. Las placas con células manchadas fueron analizadas utilizando el sistema ArrayScan HCS (Cellomics, PA, USA). Caspas 3/7, -8 y 9 actividades fueron determinadas utilizando el kit comercial caspasa-Glo 3/7, 8 y 9 de ensayo (Promega, Madison, WI). Las células HT-29 (1,0 × 10 4 células/pozo) fueron sembradas durante la noche en placas de 96 pocillos de pared blanca y tratadas con diferentes concentraciones de Cu(BrHAP) 2 durante 24 h. Según el protocolo del fabricante, las células tratadas fueron suplementadas con reactivo caspasa-Glo (100 L) e incubadas a temperatura ambiente durante 30 min. Las caspas activas de células apoptóticas causaron la escisión del tetrapéptido sintético marcado con aminoluciferina, lo que llevó a la liberación de sustrato para la enzima luciferasa. Las actividades de caspas se analizaron mediante un lector de microplacas Tecan Infinite 200 Pro (Tecan, Männedorf, Suiza). En resumen, las células HT-29 (1,0 × 10 4 células/pozo en una placa de 96 pocillos) fueron tratadas con diferentes concentraciones de Cu(BrHAP) 2 durante 3 h, seguidas de estimulación con TNF-(1 ng/ml) durante 30 min. Después de desechar el medio, las células fueron fijas y manchadas utilizando un kit de activación del núcleo Cellomics factor-B (NF-B) (Thermo Scientific) según las instrucciones del fabricante. A continuación, se utilizó un Array Scan HCS Reader para la evaluación de la placa. Las relaciones de intensidad NF-B citoplasmática y nuclear se calcularon utilizando el software de bioaplicación Cytoplasma a Nucleus Translocation. Se determinó la intensidad media de 200 células/pozo. Se compararon las proporciones de células no tratadas, tratadas y estimuladas por TNF. Todos los experimentos Los resultados se presentaron como la media ± desviación estándar (DE) del número de experimentos mostrados en las leyendas. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) utilizando el paquete estadístico prisma (GraphPad Software, EE.UU.). < 0,05 se consideró estadísticamente significativo. Células del colon. Inicialmente, la citotoxicidad de Cu(BrHAP) 2 se probó en líneas celulares HT-29 y CCD 841. Los valores IC 50 del compuesto base Schiff se determinaron a partir del resultado recogido de tres experimentos MTT independientes. Como se indica en la Tabla 1, Cu(BrHAP) 2 produjo un efecto citotoxicidad significativo e inhibidor celular después de 24, 48 y 72 h de tratamiento en células HT-29. 2 - Liberación LDH inducida. La liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) en el medio es un marcador que muestra la pérdida de integridad de la membrana, apoptosis o necrosis. La citotoxicidad del compuesto Cu(BrHAP) 2, determinado por el ensayo de liberación de LDH, se cuantificó en células HT-29 tratadas con diversas concentraciones del compuesto base de Schiff durante 48 h. Cu(BrHAP) 2 indujo una elevación significativa en la liberación de LDH, demostrando citotoxicidad en las concentraciones de 6,25 y 12,5 g/ml en comparación con las células de control (Figura 2 ). Microscopía y doble tinción AO/PI. Se observaron cambios morfológicos en células HT-29 tratadas con Cu(BrHAP) 2 bajo un microscopio fluorescente a las 24, 48 y 72 h. Las células fueron puntuadas bajo un microscopio fluorescente para analizar células La apoptosis temprana, definida como OA interviniente dentro del ADN fragmentado, se observó bajo fluorescencia verde brillante, al mismo tiempo que se visualizaron células de control con una estructura nuclear verde intacta. Después de 24 y 48 h de tratamiento con Cu(BrHAP) 2, se observó apoptosis moderada en forma de blebing y condensación nuclear de cromatina. Además, en la etapa tardía de la apoptosis, se observaron cambios, como la presencia de color rojizo-naranja debido a la unión de PI al ADN desnaturalizado, después de 72 h de tratamiento (Figura 3). Los resultados mostraron que el compuesto de Cu(BrHAP) 2 indujo características morfológicas de la apoptosis de manera dependiente del tiempo. Figura 4, demostró que no existe parada del ciclo celular en las fases S/M. La falta de parada del ciclo celular en las fases S/M sugirió una posible parada del ciclo celular en las fases G 1 / G 2. Para determinar la fase exacta detenida, se analizaron células HT-29 tratadas para la progresión del ciclo celular utilizando citometría de flujo. Como era de esperar, no hubo parada significativa en las fases S/M. Mientras tanto, se observó parada significativa del ciclo celular en la fase G 1 para las células HT-29 después de 24 y 48 h de tratamiento (Figura 5). Ensayo. La capacidad antioxidante se midió mediante ensayo ORAC, que es el único ensayo que implica el uso de peroxil radical como actividad prooxidante y cuantificada a través del área bajo la técnica de curva (AUC). En nuestro experimento, la quercetina se utilizó como control positivo. El resultado demostró que Cu(BrHAP) 2 mostró actividad antioxidante baja a moderada en comparación con la quercetina (Tabla 2) Las células HT-29 fueron tratadas con diferentes concentraciones de Cu(BrHAP) 2 durante 24 h y teñidas con tinte DHE para determinar la influencia del compuesto base de Schiff en la producción de ROS. Las intensidades de fluorescencia de la oxidación de DHE por ROS fueron cuantificadas utilizando un lector de microplacas de fluorescencia. Como se muestra en la Figura 6, la exposición al compuesto base de Schiff causó una elevación significativa en los niveles de ROS de las células HT-29 tratadas a la concentración de 6,25 g/ml. Para investigar la inducción de la apoptosis por Cu(BrHAP) 2, los cambios morfológicos nucleares en las células HT-29 fueron analizados mediante la detección de condensación nuclear. Como se muestra en la Figura 7, la tinción de Hoechst 33342 demostró que la condensación nuclear, que está directamente relacionada con los cambios de la cromatina apoptótica, surgió en algunas células después del tratamiento con Cu(BrHAP) 2. Mientras tanto, la permeabilidad de las células tratadas también fue elevada. Las mitocondrias son la principal fuente para la producción de ROS y trifosfato de adenosina (ATP) y son críticas para controlar la muerte y supervivencia de las células. La reducción de la intensidad de fluorescencia representada en la Figura 6 Cu(BrHAP) 2 desencadenó la translocación de citocromo de mitocondria en el citosol durante la apoptosis en células HT-29. Activación. La elevación en la producción de ROS asociada con un colapso en MMP puede conducir a la activación de Para investigar la activación de la caspasa, las intensidades bioluminiscentes que representan caspas 3/7, 8 y 9 actividades fueron cuantificadas en células HT-29 tratadas con diferentes concentraciones de Cu(BrHAP) 2 durante 24 h. Como se muestra en la Figura 8, se observó una elevación significativa en la actividad de caspasa-3/7 en la concentración de 6,25 g/mL y caspasa-9 en las concentraciones de 6,25 y 12,5 g/mL en las células tratadas de Cu(BrHAP), mientras que no se detectó ningún cambio significativo en la actividad de caspasa-8 entre células HT-29 tratadas y no tratadas. Así, la apoptosis inducida por el compuesto base de Schiff en células HT-29 posiblemente se media a través de la vía intrínseca, pero no de la vía extrínseca. es un factor de transcripción que tiene un papel crítico en la La activación NF-B y la translocación al núcleo para permitir la actividad de unión al ADN y facilitar la expresión génica diana están mediadas por citocinas inflamatorias como el factor de necrosis tumoral (TNF-). El compuesto base de Cu(BrHAP) 2 Schiff no mostró ningún efecto inhibidor en la translocación del TNF--NF-B estimulado en células tratadas con HT-29, y el TNF--estimulación llevó a la translocación del NF-B del citoplasma al núcleo (Figura 9). La carcinogénesis es un proceso multietapa en el que la proliferación celular no regulada, así como una reducción en la incidencia de apoptosis, sirve como caracterización inicial para su progresión [21]. Uno de los procedimientos de defensa en organismos multicelulares es la destrucción del desarrollo celular indeseable, que se define como muerte celular programada. La apoptosis es el mecanismo de muerte celular programado más notorio y se caracteriza por cambios morfológicos distintos como la permeabilidad de la membrana, la contracción celular, la interrupción de la membrana mitocondrial y la condensación de la cromatina [22, 23]. La interrupción de la homeostasis celular entre la muerte celular y la proliferación celular conduce a la incidencia de cáncer [24], y se sabe que los agentes que pueden inducir apoptosis tienen efectos potenciales contra el cáncer [25, 26]. Las vías de apoptosis son objetivos eficaces para la terapia del cáncer así como la quimioprevención. Se han determinado numerosos fármacos quimiopreventivos para regular eventos clave o moléculas en las vías de transducción de señales que inducen apoptosis [27]. En el presente estudio, se evaluó el compuesto básico Cu(BrHAP) 2 Schiff por su Las células HT-29 se han caracterizado recientemente como un modelo adecuado para estudios de cáncer de colon [28] [30]. células de cáncer de colon humano de forma dependiente del tiempo y de la dosis. Mientras tanto, la línea celular de colon no tumorígena (CCD 841) no mostró citotoxicidad después del tratamiento con el compuesto. El efecto citotóxico del compuesto Cu(II) también fue confirmado mediante la medición del nivel de liberación de LDH de las células tratadas. La liberación de LDH significativamente elevada mostró que la citotoxicidad del compuesto Cu(BrHAP) 2 posiblemente ocurrió a través de la pérdida de integridad de la membrana, ya sea mediante la activación de la apoptosis o la vía de necrosis [31]. La observación de la apoptosis temprana y la apoptosis tardía mediante microscopía fluorescente y doble tinción AO/PI después del tratamiento de las células HT-29 con el compuesto incluyó algunos signos de apoptosis, a saber, contracción citoplasmática, blebbing de membrana y fragmentación del ADN [32, 33]. Encontramos que el número de células con características de apoptosis temprana fue mayor en etapas tempranas del tratamiento. Sin embargo, cuando el tiempo de tratamiento aumentó a 72 h, las caracterizaciones de apoptosis tardía o necrosis fueron dominantes entre las células HT-29 tratadas. La detección concomitante de apoptosis tardía o necrosis es científicamente posible porque las células HT-29 tratadas sometidas a apoptosis pueden haber progresado en necrosis debido a la incubación prolongada con el compuesto base Schiff. Para dilucidar los mecanismos subyacentes al efecto antiproliferativo observado del complejo Cu(II) sobre las células cancerosas, se analizó la distribución del ciclo celular utilizando la tinción BrdU y Phospho-Histone H3 junto con la citometría de flujo [34] [35]. El tinte BrdU puede unirse al ADN sintetizado de las células replicantes durante la fase S del ciclo celular, mientras que las células tinturas Phospho-Histone H3 en diferentes estadios mitóticos. El ciclo celular resulta del ensayo de doble tinción BrdU y Phospho-Histone H3 indicó que no hubo cambios significativos en el número de células en las fases S/M después de la exposición de células HT-29 al compuesto base Schiff, lo que sugiere la posibilidad de que las células fueran detenidas en la fase G 1 o G 2 del ciclo celular. Así, el análisis de citometría de flujo del ciclo celular fue realizado para determinar la fase exacta detenida, y los resultados demostraron una parada significativa del ciclo celular en G 1 después de 24 y 48 h de tratamiento, sugiriendo supresión proliferativa por inducción de apoptosis [37, 38]. La perturbación del potencial de membrana mitocondrial es uno de los eventos intracelulares más tempranos que ocurren después de la inducción de la apoptosis [39]. Como fuente principal de ROS celular y trifosfato de adenosina (ATP), las mitocondrias son los reguladores clave de los mecanismos que controlan la supervivencia o muerte de las células. Después de confirmar que el compuesto base de Cu(BrHAP) 2 Schiff no tenía capacidad antioxidante significativa en células cancerosas HT-29 utilizando el ensayo ORAC, se analizó la inducción de la producción de ROS en células tratadas. De acuerdo con nuestro estudio, después de exponer el compuesto Cu(II) a células HT-29 y analizar los niveles de ROS, se demostró que el nivel de ROS en células HT-29 tratadas fue significativamente elevado a una concentración compuesta de 6,25 g/ml. En la apoptosis inducida por metales, las mitocondrias tienen el papel crucial en mediar la apoptosis a través de ROS inducida por metales [40]. La vía de señalización intrínseca o dependiente de mitocondrial involucra diferentes factores de estímulos no mediados por receptores que inducen señales intracelulares. Estas señales, principalmente a través de la proteína p53, actúan sobre los eventos mitocondrializados. La producción excesiva de ROS es una señal negativa que puede resultar en el fracaso de la supresión de los factores antiapoptoticos, desencadenando así la apoptosis. Por lo tanto, utilizamos sondas fluorescentes de potencial de membrana mitocondrial (MMP) para examinar el efecto de la producción elevada de ROS en la función de las mitocondrias en células tratadas HT-29. Como se muestra en la Figura 7, los cambios en el MMP después del tratamiento con el compuesto base Cu(BrHAP) 2 Schiff que llevó a la despolarización de la membrana de las mitocondrias fueron demostrados por la liberación de Rhodamine 123 al citoplasma de la matriz mitocondria. El resultado implica que la inducción de los complejos base de Schiff por Cu(II) Schiff puede estar asociada con la vía mitocondrial [26, 41, 42]. Una de las señales importantes para iniciar el procedimiento de la apoptosis es citocromo citosólico. La liberación de citocromo en el citosol y la reducción de sus niveles en las mitocondrias se han demostrado como resultado de los cambios en el MMP [30]. Como el resultado ilustrado, el compuesto de base sintético Schiff también llevó a un aumento en el nivel de citocromo en el citosol en comparación con el control. La producción excesiva de ROS de mitocondrias y el colapso de MMP puede activar las moléculas de caspasa aguas abajo y consecuentemente conducir a la muerte celular apoptótica. Después de la unión del citocromo al factor activador apoptótico-1, la caspasa-9 se activa a través de la formación de apoptosomas, que conduce a la caspasa activa-3/7, la caspasa más eficaz con muchos objetivos celulares [43]. En la vía extrínseca, la apoptosis es mediada por receptores de muerte. Como ejemplo, el ligando FAS interactúa con el receptor FAS, lo que conduce a la activación de la caspasa-8 [44]. La activación Caspasa-8 se corta y activa caspas del verdugo aguas abajo como caspasa-3/7 [45, 46]. En nuestro estudio, el compuesto base Cu(BrHAP) 2 Schiff indujo una elevación significativa en las caspas 3/7 y 9 actividades en comparación con el control. Mientras tanto, no hubo activación de caspasa-8, lo que sugiere que la apoptosis inducida en las células HT-29 fue mediada a través de la vía mitocondrial intrínseca, pero no la vía extrínseca, receptor de muerte ligada a la caspasa-8. La evidencia de soporte de liberación de LDH, producción de ROS, supresión de MMP, elevación en el nivel de citocromo, y activación de caspas 3/7 y 9 demostró la prometedora actividad anticancerosa del compuesto base de Cu(BrHAP) 2 Schiff contra la línea celular de cáncer de colon HT-29 a través de la vía mitocondrial intrínseca.

¿Cuál es el tercer cáncer más prevalente en mujeres en los Estados Unidos?

El complejo Schiff Base-Derived Copper (II) es un potente inductor de Apoptosis en las células cancerosas de colon al activar la ruta intrínsecahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3967396/SHA: f1f24521928f5d8565a15a17bd7f79239a3d4116Autores: Hajrezaie, Maryam; Paydar, Mohammadjavad; Zorofchian Moghadamtousi, Soheil; Hassandarvish, Pouya; Gwaram, Nura Suleiman; Zahedifard, Maryam; Rouhollahi, Elham; Karimian, Hamed; Looi, Chung Yeng; Ali, Hapipah Mood; Abdul Majid, Nazia En las últimas décadas, las bases de Schiff y sus complejos se han hecho bien conocidos por su extenso potencial biológico. En el presente estudio, se examinó el efecto antiproliferativo de un complejo de cobre (II) sobre las células cancerosas de colon HT-29. El compuesto base de Cu(BrHAP)(2 ) Schiff demostró un potente efecto antiproliferativo en las células HT-29, con un valor IC(50) de 2,87 μg/ml después de 72 h de tratamiento. Las células HT-29 tratadas con complejos de Cu (II) sufrieron muerte por apoptosis, como se muestra por una elevación progresiva en la proporción de la población celular G(1 ). A una concentración de 6,25 μg/ml, el compuesto Cu(BrHAP)(2 ) causó una elevación significativa en la producción de ROS tras la perturbación del potencial de membrana mitocondrial y la liberación del citocromo c, evaluada mediante la medición de la intensidad de fluorescencia en las células manchadas. Además, la activación de las caspas 3/7 y 9 fue parte de la apoptosis inducida por complejos Cu (II), que confirmó la implicación de la apoptosis mediada por mitocondrial. Mientras tanto, no hubo activación significativa de la caspasa-8. Tomada en conjunto, estos resultados implican que el compuesto Cu(BrHAP)(2 ) es un candidato potencial para estudios adicionales de cáncer de colon in vivo y clínico para desarrollar nuevos agentes quimioterapéuticos derivados de agentes metálicos. Texto: El cáncer es una enfermedad debilitante que afecta a una parte sustancial de la población mundial en todas las generaciones y es un importante problema de salud de preocupación mundial [1]. Entre los diversos tipos de cáncer, el cáncer colorrectal es el segundo y tercer cáncer más prevalente entre hombres y mujeres en los Estados Unidos, respectivamente. A pesar de todos los avances considerables en los métodos de protección y las recientes mejoras en las técnicas de detección y quimioterapia, las tasas de supervivencia relativas de 1 y 5 años para los pacientes que padecen cáncer colorrectal son del 83,2% y 64,3%, respectivamente [2]. Además, debido a la amarga controversia sobre los métodos óptimos para la detección temprana, el pleno cumplimiento de las recomendaciones de detección sigue siendo un obstáculo importante para el diagnóstico en las etapas tempranas del desarrollo del cáncer. El desarrollo de resistencia a la quimioterapia también representa un problema crítico para el cual el tratamiento simultáneo con diversas clases de terapéuticas para reducir la resistencia ha Además, los numerosos efectos secundarios de los fármacos quimioterapéuticos en pacientes con cáncer, incluyendo pérdida de cabello, diarrea, sangrado e inmunosupresión, han hecho el proceso 2El Scientific World Journal de tratamiento más complicado [4]. El proceso altamente regulado de muerte celular programada de la apoptosis es una cuestión de gran interés en oncología y terapia contra el cáncer y representa una vía molecular común para la resistencia a fármacos y carcinogénesis [5]. El mantenimiento de un número celular constante en la mucosa colónica está altamente regulado a través del equilibrio entre la apoptosis y la proliferación celular. La perturbación en este equilibrio conduce a una fuga de homeostasis número celular normal y se asocia con la progresión de células cancerosas [6, 7]. Así, la supresión de la proliferación y elevación de la apoptosis en estas células aberantes se sugiere como el mecanismo esencial para la inhibición del cáncer de colon. Además, la apoptosis y los factores involucrados en su mecanismo de acción también presentan una ventana que puede ser explotada para la mejora de agentes terapéuticos potenciales con alta efectividad y menos efectos secundarios adversos [8]. Por lo tanto, la detección de compuestos novedosos capaces de inducir apoptosis en células de cáncer de colon que puedan ser utilizados solos o en combinación con otros fármacos quimioterapéuticos es una necesidad significativa y representa un desafío crítico en la química medicinal. Los complejos metálicos han sido ampliamente utilizados en clínicas durante siglos y han atraído a numerosos químicos inorgánicos para analizarlos, con el foco principal en aplicaciones médicas [9, 10]. El cobre, un oligoelemento esencial de naturaleza oxidativa y actividad bioesencial en el metabolismo humano, no existe en forma iónica en los sistemas biológicos. Así, la medición del cobre en el cuerpo se evalúa en forma de complejos con compuestos orgánicos [11]. Las bases Schiff son una clase crítica de compuestos en química médica que han demostrado una aplicación quimioterapéutica y antibacteriana significativa [12, 13]. Los complejos Schiff base Cu(II) revelaron un gran potencial para la actividad antiproliferativa, antibacteriana y gastroprotectora [14] [15] [16] [17] [18]. Este estudio evaluó el potencial anticanceroso de un complejo de cobre (II) derivado de N,N - dimetiletilen diamina y 2-hidroxiacetofenona Schiff base ligand, Cu(BrHAP) 2. Además, también se examinó el posible mecanismo apoptótico subyacente a esta actividad. Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Life Technologies, Inc., Rockville, MD) que contiene 10% de suero bovino fetal, 100 g/ml de estreptomicina y 100 U/ml de penicilina G a 37 °C en una atmósfera humidificada de 5% de CO 2 /95% de aire. Las células fueron chapadas a una densidad de ajuste en frascos de cultivo de tejidos (Corning, EE.UU.) según cada escala experimental. La viabilidad celular fue medida mediante un ensayo convencional de reducción de MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difeniltetrazolio bromuro]. Después de 48 h de exposición a seis concentraciones de Cu(BrHAP) 2, las células fueron tratadas con solución de MTT (2 mg/ml) durante 2 h. Los cristales formazanos oscuros formados en células intactas fueron disueltos en DMSO, y la absorbancia se midió a 570 nm y 650 nm como fondo utilizando un lector de microplacas (Hidex, Turku, Finlandia). El valor IC 50 se determinó como la concentración de Cu(BrHAP) 2 necesaria para reducir la absorción de células tratadas al 50% de las células de control tratadas con DMSO. Todas las muestras se prepararon por triplicados. Ensayo. Medición de la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) es un biomarcador para determinar la citotoxicidad de un compuesto. Brevemente, las células HT-29 fueron tratadas con diferentes concentraciones de Cu(BrHAP) 2 y Triton X-100 (control positivo) durante 48 h, y los sobrenadantes de las células no tratadas y tratadas fueron transferidos a una nueva placa de 96 pocillos para el análisis de actividad LDH. A continuación, se añadieron 100 L de solución de reacción LDH a cada pozo, la placa fue incubada a temperatura ambiente durante 30 min, y la absorbancia fue leída a 490 nm utilizando un lector de microplacas Tecan Infinite 200 Pro (Tecan, Männedorf, Suiza). La cantidad de sal formazana y la intensidad de color rojo en muestras tratadas y no tratadas fueron representadas como la actividad LDH de las células. El nivel de liberación LDH en células tratadas con Cu(BrHAP) 2 se expresó como un porcentaje del control positivo. Para la detección de la apoptosis en las células tratadas se realizó un ensayo de doble tinción de propidium y naranja acridina (AO) mediante un microscopio fluorescente (Leica conectado con el software Q-Floro) de acuerdo con un procedimiento estándar. Las células HT-29 (5 × 10 4 células/ml en un matraz de cultivo de 25 mL) fueron chapadas, tratadas con Cu(BrHAP) 2 en la concentración IC 50, e incubadas durante 24, 48 y 72 h. Después de la recolección de las células, fueron manchadas con colorantes fluorescentes y observadas bajo un microscopio fluorescente UV (Olympus BX51) en un plazo de 30 min. En resumen, las células HT-29 (1 × 10 4 células/pozo en placa de 96 pocillos) fueron suplementadas con Cu(BrHAP) 2 (2 g/ml) o DMSO (control negativo) durante 24 h. Las células vivas fueron incubadas con tintes BrdU y Phospho-Histone H3 durante 30 min. Después de que las células fueron fijas y manchadas según lo descrito por las instrucciones del fabricante, fueron visualizadas y analizadas utilizando el lector de HCS Cellomics ArrayScan (Thermo Scientific). Las intensidades de fluorescencia de los tintes fueron medidas mediante un módulo de bioaplicación de activación diana. Para confirmar el resultado del análisis del ciclo celular de fluorescencia, las células HT-29 (5 × 10 4 células/ml) fueron tratadas con Cu(BrHAP) 2 para 24, 48 y 72 h para el Después de la incubación, las células HT-29 fueron giradas a 1800 rpm durante 5 min. A continuación, se realizó la fijación de una población celular para el análisis de citometría de flujo para restaurar la integridad. En resumen, los pellets celulares fueron fijados mezclándolos con 700 L de etanol frío (90%) y luego se mantuvieron a 4 °C durante la noche. Las células HT-29 tratadas fueron giradas y el etanol fue desechado. Después de lavar y suspender las células en PBS, 25 L de Rnasa A (10 mg/ml) y 50 L de propidium iodide (PI) (1 mg/ml) fueron añadidas a las células fijas durante 1 h a 37 °C. La RNase A añadida limitó la capacidad de PI para unirse únicamente a moléculas de ADN. Al final, el contenido de ADN de las células fue analizado por un citometro de flujo ( El ensayo de la capacidad antioxidante radical de oxígeno (ORAC) se realizó en base a los protocolos descritos en detalle anteriormente [19]. En resumen, se utilizó Cu(BrHAP) 2 a la concentración de 100 g/ml para este ensayo en un volumen de reacción total de 200 L. El experimento se realizó en una microplaca negra de 96 pocillos con 25 L de compuesto, en blanco (solvente/PBS), estándar (trolox), o control positivo (quercetina). La placa fue suplementada con la solución de fluoresceína de trabajo (150 L), seguida de una incubación de 5 minutos a 37 °. El volumen total de 200 L se compuso sumando 25 L de solución de trabajo AAPH. La intensidad de fluorescencia se midió a una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 538 nm cada 2 min durante 2 h. El resultado se cuantificó calculando las diferencias de área bajo la curva de descomposición de fluorescencia (AUC) de muestras y en blanco. Los valores fueron equivalentes Trolox (TE). En resumen, las células HT-29 (1 × 10 4 células/ml) fueron sembradas en placas de 96 pocillos y tratadas con diferentes concentraciones de Cu(BrHAP) 2 y DMSO (control negativo) durante 24 h. Después de 30 min de tratamiento con tinte dihidroetidium (DHE), las células fueron fijas y lavadas con tampón de lavado según las instrucciones del fabricante. En presencia de superóxidos, el tinte DHE se oxida a etidium. La intensidad de fluorescencia fue determinada por un lector de placas fluorescente a una longitud de onda de extensión de 520 nm y una longitud de onda de emisión de 620 nm. Los factores críticos para monitorear la salud celular, a saber, pérdida celular, cambios en la permeabilidad celular, liberación citocroma, cambios potenciales en la membrana mitocondrial, tamaño nuclear y cambios morfológicos, fueron estudiados utilizando un kit de citotoxicidad multiparamétrica Cellomics 3 como se describe en detalle anteriormente [20]. Las placas con células manchadas fueron analizadas utilizando el sistema ArrayScan HCS (Cellomics, PA, USA). Caspas 3/7, -8 y 9 actividades fueron determinadas utilizando el kit comercial caspasa-Glo 3/7, 8 y 9 de ensayo (Promega, Madison, WI). Las células HT-29 (1,0 × 10 4 células/pozo) fueron sembradas durante la noche en placas de 96 pocillos de pared blanca y tratadas con diferentes concentraciones de Cu(BrHAP) 2 durante 24 h. Según el protocolo del fabricante, las células tratadas fueron suplementadas con reactivo caspasa-Glo (100 L) e incubadas a temperatura ambiente durante 30 min. Las caspas activas de células apoptóticas causaron la escisión del tetrapéptido sintético marcado con aminoluciferina, lo que llevó a la liberación de sustrato para la enzima luciferasa. Las actividades de caspas se analizaron mediante un lector de microplacas Tecan Infinite 200 Pro (Tecan, Männedorf, Suiza). En resumen, las células HT-29 (1,0 × 10 4 células/pozo en una placa de 96 pocillos) fueron tratadas con diferentes concentraciones de Cu(BrHAP) 2 durante 3 h, seguidas de estimulación con TNF-(1 ng/ml) durante 30 min. Después de desechar el medio, las células fueron fijas y manchadas utilizando un kit de activación del núcleo Cellomics factor-B (NF-B) (Thermo Scientific) según las instrucciones del fabricante. A continuación, se utilizó un Array Scan HCS Reader para la evaluación de la placa. Las relaciones de intensidad NF-B citoplasmática y nuclear se calcularon utilizando el software de bioaplicación Cytoplasma a Nucleus Translocation. Se determinó la intensidad media de 200 células/pozo. Se compararon las proporciones de células no tratadas, tratadas y estimuladas por TNF. Todos los experimentos Los resultados se presentaron como la media ± desviación estándar (DE) del número de experimentos mostrados en las leyendas. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) utilizando el paquete estadístico prisma (GraphPad Software, EE.UU.). < 0,05 se consideró estadísticamente significativo. Células del colon. Inicialmente, la citotoxicidad de Cu(BrHAP) 2 se probó en líneas celulares HT-29 y CCD 841. Los valores IC 50 del compuesto base Schiff se determinaron a partir del resultado recogido de tres experimentos MTT independientes. Como se indica en la Tabla 1, Cu(BrHAP) 2 produjo un efecto citotoxicidad significativo e inhibidor celular después de 24, 48 y 72 h de tratamiento en células HT-29. 2 - Liberación LDH inducida. La liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) en el medio es un marcador que muestra la pérdida de integridad de la membrana, apoptosis o necrosis. La citotoxicidad del compuesto Cu(BrHAP) 2, determinado por el ensayo de liberación de LDH, se cuantificó en células HT-29 tratadas con diversas concentraciones del compuesto base de Schiff durante 48 h. Cu(BrHAP) 2 indujo una elevación significativa en la liberación de LDH, demostrando citotoxicidad en las concentraciones de 6,25 y 12,5 g/ml en comparación con las células de control (Figura 2 ). Microscopía y doble tinción AO/PI. Se observaron cambios morfológicos en células HT-29 tratadas con Cu(BrHAP) 2 bajo un microscopio fluorescente a las 24, 48 y 72 h. Las células fueron puntuadas bajo un microscopio fluorescente para analizar células La apoptosis temprana, definida como OA interviniente dentro del ADN fragmentado, se observó bajo fluorescencia verde brillante, al mismo tiempo que se visualizaron células de control con una estructura nuclear verde intacta. Después de 24 y 48 h de tratamiento con Cu(BrHAP) 2, se observó apoptosis moderada en forma de blebing y condensación nuclear de cromatina. Además, en la etapa tardía de la apoptosis, se observaron cambios, como la presencia de color rojizo-naranja debido a la unión de PI al ADN desnaturalizado, después de 72 h de tratamiento (Figura 3). Los resultados mostraron que el compuesto de Cu(BrHAP) 2 indujo características morfológicas de la apoptosis de manera dependiente del tiempo. Figura 4, demostró que no existe parada del ciclo celular en las fases S/M. La falta de parada del ciclo celular en las fases S/M sugirió una posible parada del ciclo celular en las fases G 1 / G 2. Para determinar la fase exacta detenida, se analizaron células HT-29 tratadas para la progresión del ciclo celular utilizando citometría de flujo. Como era de esperar, no hubo parada significativa en las fases S/M. Mientras tanto, se observó parada significativa del ciclo celular en la fase G 1 para las células HT-29 después de 24 y 48 h de tratamiento (Figura 5). Ensayo. La capacidad antioxidante se midió mediante ensayo ORAC, que es el único ensayo que implica el uso de peroxil radical como actividad prooxidante y cuantificada a través del área bajo la técnica de curva (AUC). En nuestro experimento, la quercetina se utilizó como control positivo. El resultado demostró que Cu(BrHAP) 2 mostró actividad antioxidante baja a moderada en comparación con la quercetina (Tabla 2) Las células HT-29 fueron tratadas con diferentes concentraciones de Cu(BrHAP) 2 durante 24 h y teñidas con tinte DHE para determinar la influencia del compuesto base de Schiff en la producción de ROS. Las intensidades de fluorescencia de la oxidación de DHE por ROS fueron cuantificadas utilizando un lector de microplacas de fluorescencia. Como se muestra en la Figura 6, la exposición al compuesto base de Schiff causó una elevación significativa en los niveles de ROS de las células HT-29 tratadas a la concentración de 6,25 g/ml. Para investigar la inducción de la apoptosis por Cu(BrHAP) 2, los cambios morfológicos nucleares en las células HT-29 fueron analizados mediante la detección de condensación nuclear. Como se muestra en la Figura 7, la tinción de Hoechst 33342 demostró que la condensación nuclear, que está directamente relacionada con los cambios de la cromatina apoptótica, surgió en algunas células después del tratamiento con Cu(BrHAP) 2. Mientras tanto, la permeabilidad de las células tratadas también fue elevada. Las mitocondrias son la principal fuente para la producción de ROS y trifosfato de adenosina (ATP) y son críticas para controlar la muerte y supervivencia de las células. La reducción de la intensidad de fluorescencia representada en la Figura 6 Cu(BrHAP) 2 desencadenó la translocación de citocromo de mitocondria en el citosol durante la apoptosis en células HT-29. Activación. La elevación en la producción de ROS asociada con un colapso en MMP puede conducir a la activación de Para investigar la activación de la caspasa, las intensidades bioluminiscentes que representan caspas 3/7, 8 y 9 actividades fueron cuantificadas en células HT-29 tratadas con diferentes concentraciones de Cu(BrHAP) 2 durante 24 h. Como se muestra en la Figura 8, se observó una elevación significativa en la actividad de caspasa-3/7 en la concentración de 6,25 g/mL y caspasa-9 en las concentraciones de 6,25 y 12,5 g/mL en las células tratadas de Cu(BrHAP), mientras que no se detectó ningún cambio significativo en la actividad de caspasa-8 entre células HT-29 tratadas y no tratadas. Así, la apoptosis inducida por el compuesto base de Schiff en células HT-29 posiblemente se media a través de la vía intrínseca, pero no de la vía extrínseca. es un factor de transcripción que tiene un papel crítico en la La activación NF-B y la translocación al núcleo para permitir la actividad de unión al ADN y facilitar la expresión génica diana están mediadas por citocinas inflamatorias como el factor de necrosis tumoral (TNF-). El compuesto base de Cu(BrHAP) 2 Schiff no mostró ningún efecto inhibidor en la translocación del TNF--NF-B estimulado en células tratadas con HT-29, y el TNF--estimulación llevó a la translocación del NF-B del citoplasma al núcleo (Figura 9). La carcinogénesis es un proceso multietapa en el que la proliferación celular no regulada, así como una reducción en la incidencia de apoptosis, sirve como caracterización inicial para su progresión [21]. Uno de los procedimientos de defensa en organismos multicelulares es la destrucción del desarrollo celular indeseable, que se define como muerte celular programada. La apoptosis es el mecanismo de muerte celular programado más notorio y se caracteriza por cambios morfológicos distintos como la permeabilidad de la membrana, la contracción celular, la interrupción de la membrana mitocondrial y la condensación de la cromatina [22, 23]. La interrupción de la homeostasis celular entre la muerte celular y la proliferación celular conduce a la incidencia de cáncer [24], y se sabe que los agentes que pueden inducir apoptosis tienen efectos potenciales contra el cáncer [25, 26]. Las vías de apoptosis son objetivos eficaces para la terapia del cáncer así como la quimioprevención. Se han determinado numerosos fármacos quimiopreventivos para regular eventos clave o moléculas en las vías de transducción de señales que inducen apoptosis [27]. En el presente estudio, se evaluó el compuesto básico Cu(BrHAP) 2 Schiff por su Las células HT-29 se han caracterizado recientemente como un modelo adecuado para estudios de cáncer de colon [28] [30]. células de cáncer de colon humano de forma dependiente del tiempo y de la dosis. Mientras tanto, la línea celular de colon no tumorígena (CCD 841) no mostró citotoxicidad después del tratamiento con el compuesto. El efecto citotóxico del compuesto Cu(II) también fue confirmado mediante la medición del nivel de liberación de LDH de las células tratadas. La liberación de LDH significativamente elevada mostró que la citotoxicidad del compuesto Cu(BrHAP) 2 posiblemente ocurrió a través de la pérdida de integridad de la membrana, ya sea mediante la activación de la apoptosis o la vía de necrosis [31]. La observación de la apoptosis temprana y la apoptosis tardía mediante microscopía fluorescente y doble tinción AO/PI después del tratamiento de las células HT-29 con el compuesto incluyó algunos signos de apoptosis, a saber, contracción citoplasmática, blebbing de membrana y fragmentación del ADN [32, 33]. Encontramos que el número de células con características de apoptosis temprana fue mayor en etapas tempranas del tratamiento. Sin embargo, cuando el tiempo de tratamiento aumentó a 72 h, las caracterizaciones de apoptosis tardía o necrosis fueron dominantes entre las células HT-29 tratadas. La detección concomitante de apoptosis tardía o necrosis es científicamente posible porque las células HT-29 tratadas sometidas a apoptosis pueden haber progresado en necrosis debido a la incubación prolongada con el compuesto base Schiff. Para dilucidar los mecanismos subyacentes al efecto antiproliferativo observado del complejo Cu(II) sobre las células cancerosas, se analizó la distribución del ciclo celular utilizando la tinción BrdU y Phospho-Histone H3 junto con la citometría de flujo [34] [35]. El tinte BrdU puede unirse al ADN sintetizado de las células replicantes durante la fase S del ciclo celular, mientras que las células tinturas Phospho-Histone H3 en diferentes estadios mitóticos. El ciclo celular resulta del ensayo de doble tinción BrdU y Phospho-Histone H3 indicó que no hubo cambios significativos en el número de células en las fases S/M después de la exposición de células HT-29 al compuesto base Schiff, lo que sugiere la posibilidad de que las células fueran detenidas en la fase G 1 o G 2 del ciclo celular. Así, el análisis de citometría de flujo del ciclo celular fue realizado para determinar la fase exacta detenida, y los resultados demostraron una parada significativa del ciclo celular en G 1 después de 24 y 48 h de tratamiento, sugiriendo supresión proliferativa por inducción de apoptosis [37, 38]. La perturbación del potencial de membrana mitocondrial es uno de los eventos intracelulares más tempranos que ocurren después de la inducción de la apoptosis [39]. Como fuente principal de ROS celular y trifosfato de adenosina (ATP), las mitocondrias son los reguladores clave de los mecanismos que controlan la supervivencia o muerte de las células. Después de confirmar que el compuesto base de Cu(BrHAP) 2 Schiff no tenía capacidad antioxidante significativa en células cancerosas HT-29 utilizando el ensayo ORAC, se analizó la inducción de la producción de ROS en células tratadas. De acuerdo con nuestro estudio, después de exponer el compuesto Cu(II) a células HT-29 y analizar los niveles de ROS, se demostró que el nivel de ROS en células HT-29 tratadas fue significativamente elevado a una concentración compuesta de 6,25 g/ml. En la apoptosis inducida por metales, las mitocondrias tienen el papel crucial en mediar la apoptosis a través de ROS inducida por metales [40]. La vía de señalización intrínseca o dependiente de mitocondrial involucra diferentes factores de estímulos no mediados por receptores que inducen señales intracelulares. Estas señales, principalmente a través de la proteína p53, actúan sobre los eventos mitocondrializados. La producción excesiva de ROS es una señal negativa que puede resultar en el fracaso de la supresión de los factores antiapoptoticos, desencadenando así la apoptosis. Por lo tanto, utilizamos sondas fluorescentes de potencial de membrana mitocondrial (MMP) para examinar el efecto de la producción elevada de ROS en la función de las mitocondrias en células tratadas HT-29. Como se muestra en la Figura 7, los cambios en el MMP después del tratamiento con el compuesto base Cu(BrHAP) 2 Schiff que llevó a la despolarización de la membrana de las mitocondrias fueron demostrados por la liberación de Rhodamine 123 al citoplasma de la matriz mitocondria. El resultado implica que la inducción de los complejos base de Schiff por Cu(II) Schiff puede estar asociada con la vía mitocondrial [26, 41, 42]. Una de las señales importantes para iniciar el procedimiento de la apoptosis es citocromo citosólico. La liberación de citocromo en el citosol y la reducción de sus niveles en las mitocondrias se han demostrado como resultado de los cambios en el MMP [30]. Como el resultado ilustrado, el compuesto de base sintético Schiff también llevó a un aumento en el nivel de citocromo en el citosol en comparación con el control. La producción excesiva de ROS de mitocondrias y el colapso de MMP puede activar las moléculas de caspasa aguas abajo y consecuentemente conducir a la muerte celular apoptótica. Después de la unión del citocromo al factor activador apoptótico-1, la caspasa-9 se activa a través de la formación de apoptosomas, que conduce a la caspasa activa-3/7, la caspasa más eficaz con muchos objetivos celulares [43]. En la vía extrínseca, la apoptosis es mediada por receptores de muerte. Como ejemplo, el ligando FAS interactúa con el receptor FAS, lo que conduce a la activación de la caspasa-8 [44]. La activación Caspasa-8 se corta y activa caspas del verdugo aguas abajo como caspasa-3/7 [45, 46]. En nuestro estudio, el compuesto base Cu(BrHAP) 2 Schiff indujo una elevación significativa en las caspas 3/7 y 9 actividades en comparación con el control. Mientras tanto, no hubo activación de caspasa-8, lo que sugiere que la apoptosis inducida en las células HT-29 fue mediada a través de la vía mitocondrial intrínseca, pero no la vía extrínseca, receptor de muerte ligada a la caspasa-8. La evidencia de soporte de liberación de LDH, producción de ROS, supresión de MMP, elevación en el nivel de citocromo, y activación de caspas 3/7 y 9 demostró la prometedora actividad anticancerosa del compuesto base de Cu(BrHAP) 2 Schiff contra la línea celular de cáncer de colon HT-29 a través de la vía mitocondrial intrínseca.

¿Cuál es la tasa de supervivencia a 1 año para los pacientes con cáncer colorrectal?

El complejo Schiff Base-Derived Copper (II) es un potente inductor de Apoptosis en las células cancerosas de colon al activar la ruta intrínsecahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3967396/SHA: f1f24521928f5d8565a15a17bd7f79239a3d4116Autores: Hajrezaie, Maryam; Paydar, Mohammadjavad; Zorofchian Moghadamtousi, Soheil; Hassandarvish, Pouya; Gwaram, Nura Suleiman; Zahedifard, Maryam; Rouhollahi, Elham; Karimian, Hamed; Looi, Chung Yeng; Ali, Hapipah Mood; Abdul Majid, Nazia En las últimas décadas, las bases de Schiff y sus complejos se han hecho bien conocidos por su extenso potencial biológico. En el presente estudio, se examinó el efecto antiproliferativo de un complejo de cobre (II) sobre las células cancerosas de colon HT-29. El compuesto base de Cu(BrHAP)(2 ) Schiff demostró un potente efecto antiproliferativo en las células HT-29, con un valor IC(50) de 2,87 μg/ml después de 72 h de tratamiento. Las células HT-29 tratadas con complejos de Cu (II) sufrieron muerte por apoptosis, como se muestra por una elevación progresiva en la proporción de la población celular G(1 ). A una concentración de 6,25 μg/ml, el compuesto Cu(BrHAP)(2 ) causó una elevación significativa en la producción de ROS tras la perturbación del potencial de membrana mitocondrial y la liberación del citocromo c, evaluada mediante la medición de la intensidad de fluorescencia en las células manchadas. Además, la activación de las caspas 3/7 y 9 fue parte de la apoptosis inducida por complejos Cu (II), que confirmó la implicación de la apoptosis mediada por mitocondrial. Mientras tanto, no hubo activación significativa de la caspasa-8. Tomada en conjunto, estos resultados implican que el compuesto Cu(BrHAP)(2 ) es un candidato potencial para estudios adicionales de cáncer de colon in vivo y clínico para desarrollar nuevos agentes quimioterapéuticos derivados de agentes metálicos. Texto: El cáncer es una enfermedad debilitante que afecta a una parte sustancial de la población mundial en todas las generaciones y es un importante problema de salud de preocupación mundial [1]. Entre los diversos tipos de cáncer, el cáncer colorrectal es el segundo y tercer cáncer más prevalente entre hombres y mujeres en los Estados Unidos, respectivamente. A pesar de todos los avances considerables en los métodos de protección y las recientes mejoras en las técnicas de detección y quimioterapia, las tasas de supervivencia relativas de 1 y 5 años para los pacientes que padecen cáncer colorrectal son del 83,2% y 64,3%, respectivamente [2]. Además, debido a la amarga controversia sobre los métodos óptimos para la detección temprana, el pleno cumplimiento de las recomendaciones de detección sigue siendo un obstáculo importante para el diagnóstico en las etapas tempranas del desarrollo del cáncer. El desarrollo de resistencia a la quimioterapia también representa un problema crítico para el cual el tratamiento simultáneo con diversas clases de terapéuticas para reducir la resistencia ha Además, los numerosos efectos secundarios de los fármacos quimioterapéuticos en pacientes con cáncer, incluyendo pérdida de cabello, diarrea, sangrado e inmunosupresión, han hecho el proceso 2El Scientific World Journal de tratamiento más complicado [4]. El proceso altamente regulado de muerte celular programada de la apoptosis es una cuestión de gran interés en oncología y terapia contra el cáncer y representa una vía molecular común para la resistencia a fármacos y carcinogénesis [5]. El mantenimiento de un número celular constante en la mucosa colónica está altamente regulado a través del equilibrio entre la apoptosis y la proliferación celular. La perturbación en este equilibrio conduce a una fuga de homeostasis número celular normal y se asocia con la progresión de células cancerosas [6, 7]. Así, la supresión de la proliferación y elevación de la apoptosis en estas células aberantes se sugiere como el mecanismo esencial para la inhibición del cáncer de colon. Además, la apoptosis y los factores involucrados en su mecanismo de acción también presentan una ventana que puede ser explotada para la mejora de agentes terapéuticos potenciales con alta efectividad y menos efectos secundarios adversos [8]. Por lo tanto, la detección de compuestos novedosos capaces de inducir apoptosis en células de cáncer de colon que puedan ser utilizados solos o en combinación con otros fármacos quimioterapéuticos es una necesidad significativa y representa un desafío crítico en la química medicinal. Los complejos metálicos han sido ampliamente utilizados en clínicas durante siglos y han atraído a numerosos químicos inorgánicos para analizarlos, con el foco principal en aplicaciones médicas [9, 10]. El cobre, un oligoelemento esencial de naturaleza oxidativa y actividad bioesencial en el metabolismo humano, no existe en forma iónica en los sistemas biológicos. Así, la medición del cobre en el cuerpo se evalúa en forma de complejos con compuestos orgánicos [11]. Las bases Schiff son una clase crítica de compuestos en química médica que han demostrado una aplicación quimioterapéutica y antibacteriana significativa [12, 13]. Los complejos Schiff base Cu(II) revelaron un gran potencial para la actividad antiproliferativa, antibacteriana y gastroprotectora [14] [15] [16] [17] [18]. Este estudio evaluó el potencial anticanceroso de un complejo de cobre (II) derivado de N,N - dimetiletilen diamina y 2-hidroxiacetofenona Schiff base ligand, Cu(BrHAP) 2. Además, también se examinó el posible mecanismo apoptótico subyacente a esta actividad. Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Life Technologies, Inc., Rockville, MD) que contiene 10% de suero bovino fetal, 100 g/ml de estreptomicina y 100 U/ml de penicilina G a 37 °C en una atmósfera humidificada de 5% de CO 2 /95% de aire. Las células fueron chapadas a una densidad de ajuste en frascos de cultivo de tejidos (Corning, EE.UU.) según cada escala experimental. La viabilidad celular fue medida mediante un ensayo convencional de reducción de MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difeniltetrazolio bromuro]. Después de 48 h de exposición a seis concentraciones de Cu(BrHAP) 2, las células fueron tratadas con solución de MTT (2 mg/ml) durante 2 h. Los cristales formazanos oscuros formados en células intactas fueron disueltos en DMSO, y la absorbancia se midió a 570 nm y 650 nm como fondo utilizando un lector de microplacas (Hidex, Turku, Finlandia). El valor IC 50 se determinó como la concentración de Cu(BrHAP) 2 necesaria para reducir la absorción de células tratadas al 50% de las células de control tratadas con DMSO. Todas las muestras se prepararon por triplicados. Ensayo. Medición de la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) es un biomarcador para determinar la citotoxicidad de un compuesto. Brevemente, las células HT-29 fueron tratadas con diferentes concentraciones de Cu(BrHAP) 2 y Triton X-100 (control positivo) durante 48 h, y los sobrenadantes de las células no tratadas y tratadas fueron transferidos a una nueva placa de 96 pocillos para el análisis de actividad LDH. A continuación, se añadieron 100 L de solución de reacción LDH a cada pozo, la placa fue incubada a temperatura ambiente durante 30 min, y la absorbancia fue leída a 490 nm utilizando un lector de microplacas Tecan Infinite 200 Pro (Tecan, Männedorf, Suiza). La cantidad de sal formazana y la intensidad de color rojo en muestras tratadas y no tratadas fueron representadas como la actividad LDH de las células. El nivel de liberación LDH en células tratadas con Cu(BrHAP) 2 se expresó como un porcentaje del control positivo. Para la detección de la apoptosis en las células tratadas se realizó un ensayo de doble tinción de propidium y naranja acridina (AO) mediante un microscopio fluorescente (Leica conectado con el software Q-Floro) de acuerdo con un procedimiento estándar. Las células HT-29 (5 × 10 4 células/ml en un matraz de cultivo de 25 mL) fueron chapadas, tratadas con Cu(BrHAP) 2 en la concentración IC 50, e incubadas durante 24, 48 y 72 h. Después de la recolección de las células, fueron manchadas con colorantes fluorescentes y observadas bajo un microscopio fluorescente UV (Olympus BX51) en un plazo de 30 min. En resumen, las células HT-29 (1 × 10 4 células/pozo en placa de 96 pocillos) fueron suplementadas con Cu(BrHAP) 2 (2 g/ml) o DMSO (control negativo) durante 24 h. Las células vivas fueron incubadas con tintes BrdU y Phospho-Histone H3 durante 30 min. Después de que las células fueron fijas y manchadas según lo descrito por las instrucciones del fabricante, fueron visualizadas y analizadas utilizando el lector de HCS Cellomics ArrayScan (Thermo Scientific). Las intensidades de fluorescencia de los tintes fueron medidas mediante un módulo de bioaplicación de activación diana. Para confirmar el resultado del análisis del ciclo celular de fluorescencia, las células HT-29 (5 × 10 4 células/ml) fueron tratadas con Cu(BrHAP) 2 para 24, 48 y 72 h para el Después de la incubación, las células HT-29 fueron giradas a 1800 rpm durante 5 min. A continuación, se realizó la fijación de una población celular para el análisis de citometría de flujo para restaurar la integridad. En resumen, los pellets celulares fueron fijados mezclándolos con 700 L de etanol frío (90%) y luego se mantuvieron a 4 °C durante la noche. Las células HT-29 tratadas fueron giradas y el etanol fue desechado. Después de lavar y suspender las células en PBS, 25 L de Rnasa A (10 mg/ml) y 50 L de propidium iodide (PI) (1 mg/ml) fueron añadidas a las células fijas durante 1 h a 37 °C. La RNase A añadida limitó la capacidad de PI para unirse únicamente a moléculas de ADN. Al final, el contenido de ADN de las células fue analizado por un citometro de flujo ( El ensayo de la capacidad antioxidante radical de oxígeno (ORAC) se realizó en base a los protocolos descritos en detalle anteriormente [19]. En resumen, se utilizó Cu(BrHAP) 2 a la concentración de 100 g/ml para este ensayo en un volumen de reacción total de 200 L. El experimento se realizó en una microplaca negra de 96 pocillos con 25 L de compuesto, en blanco (solvente/PBS), estándar (trolox), o control positivo (quercetina). La placa fue suplementada con la solución de fluoresceína de trabajo (150 L), seguida de una incubación de 5 minutos a 37 °. El volumen total de 200 L se compuso sumando 25 L de solución de trabajo AAPH. La intensidad de fluorescencia se midió a una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 538 nm cada 2 min durante 2 h. El resultado se cuantificó calculando las diferencias de área bajo la curva de descomposición de fluorescencia (AUC) de muestras y en blanco. Los valores fueron equivalentes Trolox (TE). En resumen, las células HT-29 (1 × 10 4 células/ml) fueron sembradas en placas de 96 pocillos y tratadas con diferentes concentraciones de Cu(BrHAP) 2 y DMSO (control negativo) durante 24 h. Después de 30 min de tratamiento con tinte dihidroetidium (DHE), las células fueron fijas y lavadas con tampón de lavado según las instrucciones del fabricante. En presencia de superóxidos, el tinte DHE se oxida a etidium. La intensidad de fluorescencia fue determinada por un lector de placas fluorescente a una longitud de onda de extensión de 520 nm y una longitud de onda de emisión de 620 nm. Los factores críticos para monitorear la salud celular, a saber, pérdida celular, cambios en la permeabilidad celular, liberación citocroma, cambios potenciales en la membrana mitocondrial, tamaño nuclear y cambios morfológicos, fueron estudiados utilizando un kit de citotoxicidad multiparamétrica Cellomics 3 como se describe en detalle anteriormente [20]. Las placas con células manchadas fueron analizadas utilizando el sistema ArrayScan HCS (Cellomics, PA, USA). Caspas 3/7, -8 y 9 actividades fueron determinadas utilizando el kit comercial caspasa-Glo 3/7, 8 y 9 de ensayo (Promega, Madison, WI). Las células HT-29 (1,0 × 10 4 células/pozo) fueron sembradas durante la noche en placas de 96 pocillos de pared blanca y tratadas con diferentes concentraciones de Cu(BrHAP) 2 durante 24 h. Según el protocolo del fabricante, las células tratadas fueron suplementadas con reactivo caspasa-Glo (100 L) e incubadas a temperatura ambiente durante 30 min. Las caspas activas de células apoptóticas causaron la escisión del tetrapéptido sintético marcado con aminoluciferina, lo que llevó a la liberación de sustrato para la enzima luciferasa. Las actividades de caspas se analizaron mediante un lector de microplacas Tecan Infinite 200 Pro (Tecan, Männedorf, Suiza). En resumen, las células HT-29 (1,0 × 10 4 células/pozo en una placa de 96 pocillos) fueron tratadas con diferentes concentraciones de Cu(BrHAP) 2 durante 3 h, seguidas de estimulación con TNF-(1 ng/ml) durante 30 min. Después de desechar el medio, las células fueron fijas y manchadas utilizando un kit de activación del núcleo Cellomics factor-B (NF-B) (Thermo Scientific) según las instrucciones del fabricante. A continuación, se utilizó un Array Scan HCS Reader para la evaluación de la placa. Las relaciones de intensidad NF-B citoplasmática y nuclear se calcularon utilizando el software de bioaplicación Cytoplasma a Nucleus Translocation. Se determinó la intensidad media de 200 células/pozo. Se compararon las proporciones de células no tratadas, tratadas y estimuladas por TNF. Todos los experimentos Los resultados se presentaron como la media ± desviación estándar (DE) del número de experimentos mostrados en las leyendas. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) utilizando el paquete estadístico prisma (GraphPad Software, EE.UU.). < 0,05 se consideró estadísticamente significativo. Células del colon. Inicialmente, la citotoxicidad de Cu(BrHAP) 2 se probó en líneas celulares HT-29 y CCD 841. Los valores IC 50 del compuesto base Schiff se determinaron a partir del resultado recogido de tres experimentos MTT independientes. Como se indica en la Tabla 1, Cu(BrHAP) 2 produjo un efecto citotoxicidad significativo e inhibidor celular después de 24, 48 y 72 h de tratamiento en células HT-29. 2 - Liberación LDH inducida. La liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) en el medio es un marcador que muestra la pérdida de integridad de la membrana, apoptosis o necrosis. La citotoxicidad del compuesto Cu(BrHAP) 2, determinado por el ensayo de liberación de LDH, se cuantificó en células HT-29 tratadas con diversas concentraciones del compuesto base de Schiff durante 48 h. Cu(BrHAP) 2 indujo una elevación significativa en la liberación de LDH, demostrando citotoxicidad en las concentraciones de 6,25 y 12,5 g/ml en comparación con las células de control (Figura 2 ). Microscopía y doble tinción AO/PI. Se observaron cambios morfológicos en células HT-29 tratadas con Cu(BrHAP) 2 bajo un microscopio fluorescente a las 24, 48 y 72 h. Las células fueron puntuadas bajo un microscopio fluorescente para analizar células La apoptosis temprana, definida como OA interviniente dentro del ADN fragmentado, se observó bajo fluorescencia verde brillante, al mismo tiempo que se visualizaron células de control con una estructura nuclear verde intacta. Después de 24 y 48 h de tratamiento con Cu(BrHAP) 2, se observó apoptosis moderada en forma de blebing y condensación nuclear de cromatina. Además, en la etapa tardía de la apoptosis, se observaron cambios, como la presencia de color rojizo-naranja debido a la unión de PI al ADN desnaturalizado, después de 72 h de tratamiento (Figura 3). Los resultados mostraron que el compuesto de Cu(BrHAP) 2 indujo características morfológicas de la apoptosis de manera dependiente del tiempo. Figura 4, demostró que no existe parada del ciclo celular en las fases S/M. La falta de parada del ciclo celular en las fases S/M sugirió una posible parada del ciclo celular en las fases G 1 / G 2. Para determinar la fase exacta detenida, se analizaron células HT-29 tratadas para la progresión del ciclo celular utilizando citometría de flujo. Como era de esperar, no hubo parada significativa en las fases S/M. Mientras tanto, se observó parada significativa del ciclo celular en la fase G 1 para las células HT-29 después de 24 y 48 h de tratamiento (Figura 5). Ensayo. La capacidad antioxidante se midió mediante ensayo ORAC, que es el único ensayo que implica el uso de peroxil radical como actividad prooxidante y cuantificada a través del área bajo la técnica de curva (AUC). En nuestro experimento, la quercetina se utilizó como control positivo. El resultado demostró que Cu(BrHAP) 2 mostró actividad antioxidante baja a moderada en comparación con la quercetina (Tabla 2) Las células HT-29 fueron tratadas con diferentes concentraciones de Cu(BrHAP) 2 durante 24 h y teñidas con tinte DHE para determinar la influencia del compuesto base de Schiff en la producción de ROS. Las intensidades de fluorescencia de la oxidación de DHE por ROS fueron cuantificadas utilizando un lector de microplacas de fluorescencia. Como se muestra en la Figura 6, la exposición al compuesto base de Schiff causó una elevación significativa en los niveles de ROS de las células HT-29 tratadas a la concentración de 6,25 g/ml. Para investigar la inducción de la apoptosis por Cu(BrHAP) 2, los cambios morfológicos nucleares en las células HT-29 fueron analizados mediante la detección de condensación nuclear. Como se muestra en la Figura 7, la tinción de Hoechst 33342 demostró que la condensación nuclear, que está directamente relacionada con los cambios de la cromatina apoptótica, surgió en algunas células después del tratamiento con Cu(BrHAP) 2. Mientras tanto, la permeabilidad de las células tratadas también fue elevada. Las mitocondrias son la principal fuente para la producción de ROS y trifosfato de adenosina (ATP) y son críticas para controlar la muerte y supervivencia de las células. La reducción de la intensidad de fluorescencia representada en la Figura 6 Cu(BrHAP) 2 desencadenó la translocación de citocromo de mitocondria en el citosol durante la apoptosis en células HT-29. Activación. La elevación en la producción de ROS asociada con un colapso en MMP puede conducir a la activación de Para investigar la activación de la caspasa, las intensidades bioluminiscentes que representan caspas 3/7, 8 y 9 actividades fueron cuantificadas en células HT-29 tratadas con diferentes concentraciones de Cu(BrHAP) 2 durante 24 h. Como se muestra en la Figura 8, se observó una elevación significativa en la actividad de caspasa-3/7 en la concentración de 6,25 g/mL y caspasa-9 en las concentraciones de 6,25 y 12,5 g/mL en las células tratadas de Cu(BrHAP), mientras que no se detectó ningún cambio significativo en la actividad de caspasa-8 entre células HT-29 tratadas y no tratadas. Así, la apoptosis inducida por el compuesto base de Schiff en células HT-29 posiblemente se media a través de la vía intrínseca, pero no de la vía extrínseca. es un factor de transcripción que tiene un papel crítico en la La activación NF-B y la translocación al núcleo para permitir la actividad de unión al ADN y facilitar la expresión génica diana están mediadas por citocinas inflamatorias como el factor de necrosis tumoral (TNF-). El compuesto base de Cu(BrHAP) 2 Schiff no mostró ningún efecto inhibidor en la translocación del TNF--NF-B estimulado en células tratadas con HT-29, y el TNF--estimulación llevó a la translocación del NF-B del citoplasma al núcleo (Figura 9). La carcinogénesis es un proceso multietapa en el que la proliferación celular no regulada, así como una reducción en la incidencia de apoptosis, sirve como caracterización inicial para su progresión [21]. Uno de los procedimientos de defensa en organismos multicelulares es la destrucción del desarrollo celular indeseable, que se define como muerte celular programada. La apoptosis es el mecanismo de muerte celular programado más notorio y se caracteriza por cambios morfológicos distintos como la permeabilidad de la membrana, la contracción celular, la interrupción de la membrana mitocondrial y la condensación de la cromatina [22, 23]. La interrupción de la homeostasis celular entre la muerte celular y la proliferación celular conduce a la incidencia de cáncer [24], y se sabe que los agentes que pueden inducir apoptosis tienen efectos potenciales contra el cáncer [25, 26]. Las vías de apoptosis son objetivos eficaces para la terapia del cáncer así como la quimioprevención. Se han determinado numerosos fármacos quimiopreventivos para regular eventos clave o moléculas en las vías de transducción de señales que inducen apoptosis [27]. En el presente estudio, se evaluó el compuesto básico Cu(BrHAP) 2 Schiff por su Las células HT-29 se han caracterizado recientemente como un modelo adecuado para estudios de cáncer de colon [28] [30]. células de cáncer de colon humano de forma dependiente del tiempo y de la dosis. Mientras tanto, la línea celular de colon no tumorígena (CCD 841) no mostró citotoxicidad después del tratamiento con el compuesto. El efecto citotóxico del compuesto Cu(II) también fue confirmado mediante la medición del nivel de liberación de LDH de las células tratadas. La liberación de LDH significativamente elevada mostró que la citotoxicidad del compuesto Cu(BrHAP) 2 posiblemente ocurrió a través de la pérdida de integridad de la membrana, ya sea mediante la activación de la apoptosis o la vía de necrosis [31]. La observación de la apoptosis temprana y la apoptosis tardía mediante microscopía fluorescente y doble tinción AO/PI después del tratamiento de las células HT-29 con el compuesto incluyó algunos signos de apoptosis, a saber, contracción citoplasmática, blebbing de membrana y fragmentación del ADN [32, 33]. Encontramos que el número de células con características de apoptosis temprana fue mayor en etapas tempranas del tratamiento. Sin embargo, cuando el tiempo de tratamiento aumentó a 72 h, las caracterizaciones de apoptosis tardía o necrosis fueron dominantes entre las células HT-29 tratadas. La detección concomitante de apoptosis tardía o necrosis es científicamente posible porque las células HT-29 tratadas sometidas a apoptosis pueden haber progresado en necrosis debido a la incubación prolongada con el compuesto base Schiff. Para dilucidar los mecanismos subyacentes al efecto antiproliferativo observado del complejo Cu(II) sobre las células cancerosas, se analizó la distribución del ciclo celular utilizando la tinción BrdU y Phospho-Histone H3 junto con la citometría de flujo [34] [35]. El tinte BrdU puede unirse al ADN sintetizado de las células replicantes durante la fase S del ciclo celular, mientras que las células tinturas Phospho-Histone H3 en diferentes estadios mitóticos. El ciclo celular resulta del ensayo de doble tinción BrdU y Phospho-Histone H3 indicó que no hubo cambios significativos en el número de células en las fases S/M después de la exposición de células HT-29 al compuesto base Schiff, lo que sugiere la posibilidad de que las células fueran detenidas en la fase G 1 o G 2 del ciclo celular. Así, el análisis de citometría de flujo del ciclo celular fue realizado para determinar la fase exacta detenida, y los resultados demostraron una parada significativa del ciclo celular en G 1 después de 24 y 48 h de tratamiento, sugiriendo supresión proliferativa por inducción de apoptosis [37, 38]. La perturbación del potencial de membrana mitocondrial es uno de los eventos intracelulares más tempranos que ocurren después de la inducción de la apoptosis [39]. Como fuente principal de ROS celular y trifosfato de adenosina (ATP), las mitocondrias son los reguladores clave de los mecanismos que controlan la supervivencia o muerte de las células. Después de confirmar que el compuesto base de Cu(BrHAP) 2 Schiff no tenía capacidad antioxidante significativa en células cancerosas HT-29 utilizando el ensayo ORAC, se analizó la inducción de la producción de ROS en células tratadas. De acuerdo con nuestro estudio, después de exponer el compuesto Cu(II) a células HT-29 y analizar los niveles de ROS, se demostró que el nivel de ROS en células HT-29 tratadas fue significativamente elevado a una concentración compuesta de 6,25 g/ml. En la apoptosis inducida por metales, las mitocondrias tienen el papel crucial en mediar la apoptosis a través de ROS inducida por metales [40]. La vía de señalización intrínseca o dependiente de mitocondrial involucra diferentes factores de estímulos no mediados por receptores que inducen señales intracelulares. Estas señales, principalmente a través de la proteína p53, actúan sobre los eventos mitocondrializados. La producción excesiva de ROS es una señal negativa que puede resultar en el fracaso de la supresión de los factores antiapoptoticos, desencadenando así la apoptosis. Por lo tanto, utilizamos sondas fluorescentes de potencial de membrana mitocondrial (MMP) para examinar el efecto de la producción elevada de ROS en la función de las mitocondrias en células tratadas HT-29. Como se muestra en la Figura 7, los cambios en el MMP después del tratamiento con el compuesto base Cu(BrHAP) 2 Schiff que llevó a la despolarización de la membrana de las mitocondrias fueron demostrados por la liberación de Rhodamine 123 al citoplasma de la matriz mitocondria. El resultado implica que la inducción de los complejos base de Schiff por Cu(II) Schiff puede estar asociada con la vía mitocondrial [26, 41, 42]. Una de las señales importantes para iniciar el procedimiento de la apoptosis es citocromo citosólico. La liberación de citocromo en el citosol y la reducción de sus niveles en las mitocondrias se han demostrado como resultado de los cambios en el MMP [30]. Como el resultado ilustrado, el compuesto de base sintético Schiff también llevó a un aumento en el nivel de citocromo en el citosol en comparación con el control. La producción excesiva de ROS de mitocondrias y el colapso de MMP puede activar las moléculas de caspasa aguas abajo y consecuentemente conducir a la muerte celular apoptótica. Después de la unión del citocromo al factor activador apoptótico-1, la caspasa-9 se activa a través de la formación de apoptosomas, que conduce a la caspasa activa-3/7, la caspasa más eficaz con muchos objetivos celulares [43]. En la vía extrínseca, la apoptosis es mediada por receptores de muerte. Como ejemplo, el ligando FAS interactúa con el receptor FAS, lo que conduce a la activación de la caspasa-8 [44]. La activación Caspasa-8 se corta y activa caspas del verdugo aguas abajo como caspasa-3/7 [45, 46]. En nuestro estudio, el compuesto base Cu(BrHAP) 2 Schiff indujo una elevación significativa en las caspas 3/7 y 9 actividades en comparación con el control. Mientras tanto, no hubo activación de caspasa-8, lo que sugiere que la apoptosis inducida en las células HT-29 fue mediada a través de la vía mitocondrial intrínseca, pero no la vía extrínseca, receptor de muerte ligada a la caspasa-8. La evidencia de soporte de liberación de LDH, producción de ROS, supresión de MMP, elevación en el nivel de citocromo, y activación de caspas 3/7 y 9 demostró la prometedora actividad anticancerosa del compuesto base de Cu(BrHAP) 2 Schiff contra la línea celular de cáncer de colon HT-29 a través de la vía mitocondrial intrínseca.

¿Cuál es la tasa de supervivencia a 5 años para los pacientes con cáncer colorrectal?

El complejo Schiff Base-Derived Copper (II) es un potente inductor de Apoptosis en las células cancerosas de colon al activar la ruta intrínsecahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3967396/SHA: f1f24521928f5d8565a15a17bd7f79239a3d4116Autores: Hajrezaie, Maryam; Paydar, Mohammadjavad; Zorofchian Moghadamtousi, Soheil; Hassandarvish, Pouya; Gwaram, Nura Suleiman; Zahedifard, Maryam; Rouhollahi, Elham; Karimian, Hamed; Looi, Chung Yeng; Ali, Hapipah Mood; Abdul Majid, Nazia En las últimas décadas, las bases de Schiff y sus complejos se han hecho bien conocidos por su extenso potencial biológico. En el presente estudio, se examinó el efecto antiproliferativo de un complejo de cobre (II) sobre las células cancerosas de colon HT-29. El compuesto base de Cu(BrHAP)(2 ) Schiff demostró un potente efecto antiproliferativo en las células HT-29, con un valor IC(50) de 2,87 μg/ml después de 72 h de tratamiento. Las células HT-29 tratadas con complejos de Cu (II) sufrieron muerte por apoptosis, como se muestra por una elevación progresiva en la proporción de la población celular G(1 ). A una concentración de 6,25 μg/ml, el compuesto Cu(BrHAP)(2 ) causó una elevación significativa en la producción de ROS tras la perturbación del potencial de membrana mitocondrial y la liberación del citocromo c, evaluada mediante la medición de la intensidad de fluorescencia en las células manchadas. Además, la activación de las caspas 3/7 y 9 fue parte de la apoptosis inducida por complejos Cu (II), que confirmó la implicación de la apoptosis mediada por mitocondrial. Mientras tanto, no hubo activación significativa de la caspasa-8. Tomada en conjunto, estos resultados implican que el compuesto Cu(BrHAP)(2 ) es un candidato potencial para estudios adicionales de cáncer de colon in vivo y clínico para desarrollar nuevos agentes quimioterapéuticos derivados de agentes metálicos. Texto: El cáncer es una enfermedad debilitante que afecta a una parte sustancial de la población mundial en todas las generaciones y es un importante problema de salud de preocupación mundial [1]. Entre los diversos tipos de cáncer, el cáncer colorrectal es el segundo y tercer cáncer más prevalente entre hombres y mujeres en los Estados Unidos, respectivamente. A pesar de todos los avances considerables en los métodos de protección y las recientes mejoras en las técnicas de detección y quimioterapia, las tasas de supervivencia relativas de 1 y 5 años para los pacientes que padecen cáncer colorrectal son del 83,2% y 64,3%, respectivamente [2]. Además, debido a la amarga controversia sobre los métodos óptimos para la detección temprana, el pleno cumplimiento de las recomendaciones de detección sigue siendo un obstáculo importante para el diagnóstico en las etapas tempranas del desarrollo del cáncer. El desarrollo de resistencia a la quimioterapia también representa un problema crítico para el cual el tratamiento simultáneo con diversas clases de terapéuticas para reducir la resistencia ha Además, los numerosos efectos secundarios de los fármacos quimioterapéuticos en pacientes con cáncer, incluyendo pérdida de cabello, diarrea, sangrado e inmunosupresión, han hecho el proceso 2El Scientific World Journal de tratamiento más complicado [4]. El proceso altamente regulado de muerte celular programada de la apoptosis es una cuestión de gran interés en oncología y terapia contra el cáncer y representa una vía molecular común para la resistencia a fármacos y carcinogénesis [5]. El mantenimiento de un número celular constante en la mucosa colónica está altamente regulado a través del equilibrio entre la apoptosis y la proliferación celular. La perturbación en este equilibrio conduce a una fuga de homeostasis número celular normal y se asocia con la progresión de células cancerosas [6, 7]. Así, la supresión de la proliferación y elevación de la apoptosis en estas células aberantes se sugiere como el mecanismo esencial para la inhibición del cáncer de colon. Además, la apoptosis y los factores involucrados en su mecanismo de acción también presentan una ventana que puede ser explotada para la mejora de agentes terapéuticos potenciales con alta efectividad y menos efectos secundarios adversos [8]. Por lo tanto, la detección de compuestos novedosos capaces de inducir apoptosis en células de cáncer de colon que puedan ser utilizados solos o en combinación con otros fármacos quimioterapéuticos es una necesidad significativa y representa un desafío crítico en la química medicinal. Los complejos metálicos han sido ampliamente utilizados en clínicas durante siglos y han atraído a numerosos químicos inorgánicos para analizarlos, con el foco principal en aplicaciones médicas [9, 10]. El cobre, un oligoelemento esencial de naturaleza oxidativa y actividad bioesencial en el metabolismo humano, no existe en forma iónica en los sistemas biológicos. Así, la medición del cobre en el cuerpo se evalúa en forma de complejos con compuestos orgánicos [11]. Las bases Schiff son una clase crítica de compuestos en química médica que han demostrado una aplicación quimioterapéutica y antibacteriana significativa [12, 13]. Los complejos Schiff base Cu(II) revelaron un gran potencial para la actividad antiproliferativa, antibacteriana y gastroprotectora [14] [15] [16] [17] [18]. Este estudio evaluó el potencial anticanceroso de un complejo de cobre (II) derivado de N,N - dimetiletilen diamina y 2-hidroxiacetofenona Schiff base ligand, Cu(BrHAP) 2. Además, también se examinó el posible mecanismo apoptótico subyacente a esta actividad. Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Life Technologies, Inc., Rockville, MD) que contiene 10% de suero bovino fetal, 100 g/ml de estreptomicina y 100 U/ml de penicilina G a 37 °C en una atmósfera humidificada de 5% de CO 2 /95% de aire. Las células fueron chapadas a una densidad de ajuste en frascos de cultivo de tejidos (Corning, EE.UU.) según cada escala experimental. La viabilidad celular fue medida mediante un ensayo convencional de reducción de MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difeniltetrazolio bromuro]. Después de 48 h de exposición a seis concentraciones de Cu(BrHAP) 2, las células fueron tratadas con solución de MTT (2 mg/ml) durante 2 h. Los cristales formazanos oscuros formados en células intactas fueron disueltos en DMSO, y la absorbancia se midió a 570 nm y 650 nm como fondo utilizando un lector de microplacas (Hidex, Turku, Finlandia). El valor IC 50 se determinó como la concentración de Cu(BrHAP) 2 necesaria para reducir la absorción de células tratadas al 50% de las células de control tratadas con DMSO. Todas las muestras se prepararon por triplicados. Ensayo. Medición de la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) es un biomarcador para determinar la citotoxicidad de un compuesto. Brevemente, las células HT-29 fueron tratadas con diferentes concentraciones de Cu(BrHAP) 2 y Triton X-100 (control positivo) durante 48 h, y los sobrenadantes de las células no tratadas y tratadas fueron transferidos a una nueva placa de 96 pocillos para el análisis de actividad LDH. A continuación, se añadieron 100 L de solución de reacción LDH a cada pozo, la placa fue incubada a temperatura ambiente durante 30 min, y la absorbancia fue leída a 490 nm utilizando un lector de microplacas Tecan Infinite 200 Pro (Tecan, Männedorf, Suiza). La cantidad de sal formazana y la intensidad de color rojo en muestras tratadas y no tratadas fueron representadas como la actividad LDH de las células. El nivel de liberación LDH en células tratadas con Cu(BrHAP) 2 se expresó como un porcentaje del control positivo. Para la detección de la apoptosis en las células tratadas se realizó un ensayo de doble tinción de propidium y naranja acridina (AO) mediante un microscopio fluorescente (Leica conectado con el software Q-Floro) de acuerdo con un procedimiento estándar. Las células HT-29 (5 × 10 4 células/ml en un matraz de cultivo de 25 mL) fueron chapadas, tratadas con Cu(BrHAP) 2 en la concentración IC 50, e incubadas durante 24, 48 y 72 h. Después de la recolección de las células, fueron manchadas con colorantes fluorescentes y observadas bajo un microscopio fluorescente UV (Olympus BX51) en un plazo de 30 min. En resumen, las células HT-29 (1 × 10 4 células/pozo en placa de 96 pocillos) fueron suplementadas con Cu(BrHAP) 2 (2 g/ml) o DMSO (control negativo) durante 24 h. Las células vivas fueron incubadas con tintes BrdU y Phospho-Histone H3 durante 30 min. Después de que las células fueron fijas y manchadas según lo descrito por las instrucciones del fabricante, fueron visualizadas y analizadas utilizando el lector de HCS Cellomics ArrayScan (Thermo Scientific). Las intensidades de fluorescencia de los tintes fueron medidas mediante un módulo de bioaplicación de activación diana. Para confirmar el resultado del análisis del ciclo celular de fluorescencia, las células HT-29 (5 × 10 4 células/ml) fueron tratadas con Cu(BrHAP) 2 para 24, 48 y 72 h para el Después de la incubación, las células HT-29 fueron giradas a 1800 rpm durante 5 min. A continuación, se realizó la fijación de una población celular para el análisis de citometría de flujo para restaurar la integridad. En resumen, los pellets celulares fueron fijados mezclándolos con 700 L de etanol frío (90%) y luego se mantuvieron a 4 °C durante la noche. Las células HT-29 tratadas fueron giradas y el etanol fue desechado. Después de lavar y suspender las células en PBS, 25 L de Rnasa A (10 mg/ml) y 50 L de propidium iodide (PI) (1 mg/ml) fueron añadidas a las células fijas durante 1 h a 37 °C. La RNase A añadida limitó la capacidad de PI para unirse únicamente a moléculas de ADN. Al final, el contenido de ADN de las células fue analizado por un citometro de flujo ( El ensayo de la capacidad antioxidante radical de oxígeno (ORAC) se realizó en base a los protocolos descritos en detalle anteriormente [19]. En resumen, se utilizó Cu(BrHAP) 2 a la concentración de 100 g/ml para este ensayo en un volumen de reacción total de 200 L. El experimento se realizó en una microplaca negra de 96 pocillos con 25 L de compuesto, en blanco (solvente/PBS), estándar (trolox), o control positivo (quercetina). La placa fue suplementada con la solución de fluoresceína de trabajo (150 L), seguida de una incubación de 5 minutos a 37 °. El volumen total de 200 L se compuso sumando 25 L de solución de trabajo AAPH. La intensidad de fluorescencia se midió a una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 538 nm cada 2 min durante 2 h. El resultado se cuantificó calculando las diferencias de área bajo la curva de descomposición de fluorescencia (AUC) de muestras y en blanco. Los valores fueron equivalentes Trolox (TE). En resumen, las células HT-29 (1 × 10 4 células/ml) fueron sembradas en placas de 96 pocillos y tratadas con diferentes concentraciones de Cu(BrHAP) 2 y DMSO (control negativo) durante 24 h. Después de 30 min de tratamiento con tinte dihidroetidium (DHE), las células fueron fijas y lavadas con tampón de lavado según las instrucciones del fabricante. En presencia de superóxidos, el tinte DHE se oxida a etidium. La intensidad de fluorescencia fue determinada por un lector de placas fluorescente a una longitud de onda de extensión de 520 nm y una longitud de onda de emisión de 620 nm. Los factores críticos para monitorear la salud celular, a saber, pérdida celular, cambios en la permeabilidad celular, liberación citocroma, cambios potenciales en la membrana mitocondrial, tamaño nuclear y cambios morfológicos, fueron estudiados utilizando un kit de citotoxicidad multiparamétrica Cellomics 3 como se describe en detalle anteriormente [20]. Las placas con células manchadas fueron analizadas utilizando el sistema ArrayScan HCS (Cellomics, PA, USA). Caspas 3/7, -8 y 9 actividades fueron determinadas utilizando el kit comercial caspasa-Glo 3/7, 8 y 9 de ensayo (Promega, Madison, WI). Las células HT-29 (1,0 × 10 4 células/pozo) fueron sembradas durante la noche en placas de 96 pocillos de pared blanca y tratadas con diferentes concentraciones de Cu(BrHAP) 2 durante 24 h. Según el protocolo del fabricante, las células tratadas fueron suplementadas con reactivo caspasa-Glo (100 L) e incubadas a temperatura ambiente durante 30 min. Las caspas activas de células apoptóticas causaron la escisión del tetrapéptido sintético marcado con aminoluciferina, lo que llevó a la liberación de sustrato para la enzima luciferasa. Las actividades de caspas se analizaron mediante un lector de microplacas Tecan Infinite 200 Pro (Tecan, Männedorf, Suiza). En resumen, las células HT-29 (1,0 × 10 4 células/pozo en una placa de 96 pocillos) fueron tratadas con diferentes concentraciones de Cu(BrHAP) 2 durante 3 h, seguidas de estimulación con TNF-(1 ng/ml) durante 30 min. Después de desechar el medio, las células fueron fijas y manchadas utilizando un kit de activación del núcleo Cellomics factor-B (NF-B) (Thermo Scientific) según las instrucciones del fabricante. A continuación, se utilizó un Array Scan HCS Reader para la evaluación de la placa. Las relaciones de intensidad NF-B citoplasmática y nuclear se calcularon utilizando el software de bioaplicación Cytoplasma a Nucleus Translocation. Se determinó la intensidad media de 200 células/pozo. Se compararon las proporciones de células no tratadas, tratadas y estimuladas por TNF. Todos los experimentos Los resultados se presentaron como la media ± desviación estándar (DE) del número de experimentos mostrados en las leyendas. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) utilizando el paquete estadístico prisma (GraphPad Software, EE.UU.). < 0,05 se consideró estadísticamente significativo. Células del colon. Inicialmente, la citotoxicidad de Cu(BrHAP) 2 se probó en líneas celulares HT-29 y CCD 841. Los valores IC 50 del compuesto base Schiff se determinaron a partir del resultado recogido de tres experimentos MTT independientes. Como se indica en la Tabla 1, Cu(BrHAP) 2 produjo un efecto citotoxicidad significativo e inhibidor celular después de 24, 48 y 72 h de tratamiento en células HT-29. 2 - Liberación LDH inducida. La liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) en el medio es un marcador que muestra la pérdida de integridad de la membrana, apoptosis o necrosis. La citotoxicidad del compuesto Cu(BrHAP) 2, determinado por el ensayo de liberación de LDH, se cuantificó en células HT-29 tratadas con diversas concentraciones del compuesto base de Schiff durante 48 h. Cu(BrHAP) 2 indujo una elevación significativa en la liberación de LDH, demostrando citotoxicidad en las concentraciones de 6,25 y 12,5 g/ml en comparación con las células de control (Figura 2 ). Microscopía y doble tinción AO/PI. Se observaron cambios morfológicos en células HT-29 tratadas con Cu(BrHAP) 2 bajo un microscopio fluorescente a las 24, 48 y 72 h. Las células fueron puntuadas bajo un microscopio fluorescente para analizar células La apoptosis temprana, definida como OA interviniente dentro del ADN fragmentado, se observó bajo fluorescencia verde brillante, al mismo tiempo que se visualizaron células de control con una estructura nuclear verde intacta. Después de 24 y 48 h de tratamiento con Cu(BrHAP) 2, se observó apoptosis moderada en forma de blebing y condensación nuclear de cromatina. Además, en la etapa tardía de la apoptosis, se observaron cambios, como la presencia de color rojizo-naranja debido a la unión de PI al ADN desnaturalizado, después de 72 h de tratamiento (Figura 3). Los resultados mostraron que el compuesto de Cu(BrHAP) 2 indujo características morfológicas de la apoptosis de manera dependiente del tiempo. Figura 4, demostró que no existe parada del ciclo celular en las fases S/M. La falta de parada del ciclo celular en las fases S/M sugirió una posible parada del ciclo celular en las fases G 1 / G 2. Para determinar la fase exacta detenida, se analizaron células HT-29 tratadas para la progresión del ciclo celular utilizando citometría de flujo. Como era de esperar, no hubo parada significativa en las fases S/M. Mientras tanto, se observó parada significativa del ciclo celular en la fase G 1 para las células HT-29 después de 24 y 48 h de tratamiento (Figura 5). Ensayo. La capacidad antioxidante se midió mediante ensayo ORAC, que es el único ensayo que implica el uso de peroxil radical como actividad prooxidante y cuantificada a través del área bajo la técnica de curva (AUC). En nuestro experimento, la quercetina se utilizó como control positivo. El resultado demostró que Cu(BrHAP) 2 mostró actividad antioxidante baja a moderada en comparación con la quercetina (Tabla 2) Las células HT-29 fueron tratadas con diferentes concentraciones de Cu(BrHAP) 2 durante 24 h y teñidas con tinte DHE para determinar la influencia del compuesto base de Schiff en la producción de ROS. Las intensidades de fluorescencia de la oxidación de DHE por ROS fueron cuantificadas utilizando un lector de microplacas de fluorescencia. Como se muestra en la Figura 6, la exposición al compuesto base de Schiff causó una elevación significativa en los niveles de ROS de las células HT-29 tratadas a la concentración de 6,25 g/ml. Para investigar la inducción de la apoptosis por Cu(BrHAP) 2, los cambios morfológicos nucleares en las células HT-29 fueron analizados mediante la detección de condensación nuclear. Como se muestra en la Figura 7, la tinción de Hoechst 33342 demostró que la condensación nuclear, que está directamente relacionada con los cambios de la cromatina apoptótica, surgió en algunas células después del tratamiento con Cu(BrHAP) 2. Mientras tanto, la permeabilidad de las células tratadas también fue elevada. Las mitocondrias son la principal fuente para la producción de ROS y trifosfato de adenosina (ATP) y son críticas para controlar la muerte y supervivencia de las células. La reducción de la intensidad de fluorescencia representada en la Figura 6 Cu(BrHAP) 2 desencadenó la translocación de citocromo de mitocondria en el citosol durante la apoptosis en células HT-29. Activación. La elevación en la producción de ROS asociada con un colapso en MMP puede conducir a la activación de Para investigar la activación de la caspasa, las intensidades bioluminiscentes que representan caspas 3/7, 8 y 9 actividades fueron cuantificadas en células HT-29 tratadas con diferentes concentraciones de Cu(BrHAP) 2 durante 24 h. Como se muestra en la Figura 8, se observó una elevación significativa en la actividad de caspasa-3/7 en la concentración de 6,25 g/mL y caspasa-9 en las concentraciones de 6,25 y 12,5 g/mL en las células tratadas de Cu(BrHAP), mientras que no se detectó ningún cambio significativo en la actividad de caspasa-8 entre células HT-29 tratadas y no tratadas. Así, la apoptosis inducida por el compuesto base de Schiff en células HT-29 posiblemente se media a través de la vía intrínseca, pero no de la vía extrínseca. es un factor de transcripción que tiene un papel crítico en la La activación NF-B y la translocación al núcleo para permitir la actividad de unión al ADN y facilitar la expresión génica diana están mediadas por citocinas inflamatorias como el factor de necrosis tumoral (TNF-). El compuesto base de Cu(BrHAP) 2 Schiff no mostró ningún efecto inhibidor en la translocación del TNF--NF-B estimulado en células tratadas con HT-29, y el TNF--estimulación llevó a la translocación del NF-B del citoplasma al núcleo (Figura 9). La carcinogénesis es un proceso multietapa en el que la proliferación celular no regulada, así como una reducción en la incidencia de apoptosis, sirve como caracterización inicial para su progresión [21]. Uno de los procedimientos de defensa en organismos multicelulares es la destrucción del desarrollo celular indeseable, que se define como muerte celular programada. La apoptosis es el mecanismo de muerte celular programado más notorio y se caracteriza por cambios morfológicos distintos como la permeabilidad de la membrana, la contracción celular, la interrupción de la membrana mitocondrial y la condensación de la cromatina [22, 23]. La interrupción de la homeostasis celular entre la muerte celular y la proliferación celular conduce a la incidencia de cáncer [24], y se sabe que los agentes que pueden inducir apoptosis tienen efectos potenciales contra el cáncer [25, 26]. Las vías de apoptosis son objetivos eficaces para la terapia del cáncer así como la quimioprevención. Se han determinado numerosos fármacos quimiopreventivos para regular eventos clave o moléculas en las vías de transducción de señales que inducen apoptosis [27]. En el presente estudio, se evaluó el compuesto básico Cu(BrHAP) 2 Schiff por su Las células HT-29 se han caracterizado recientemente como un modelo adecuado para estudios de cáncer de colon [28] [30]. células de cáncer de colon humano de forma dependiente del tiempo y de la dosis. Mientras tanto, la línea celular de colon no tumorígena (CCD 841) no mostró citotoxicidad después del tratamiento con el compuesto. El efecto citotóxico del compuesto Cu(II) también fue confirmado mediante la medición del nivel de liberación de LDH de las células tratadas. La liberación de LDH significativamente elevada mostró que la citotoxicidad del compuesto Cu(BrHAP) 2 posiblemente ocurrió a través de la pérdida de integridad de la membrana, ya sea mediante la activación de la apoptosis o la vía de necrosis [31]. La observación de la apoptosis temprana y la apoptosis tardía mediante microscopía fluorescente y doble tinción AO/PI después del tratamiento de las células HT-29 con el compuesto incluyó algunos signos de apoptosis, a saber, contracción citoplasmática, blebbing de membrana y fragmentación del ADN [32, 33]. Encontramos que el número de células con características de apoptosis temprana fue mayor en etapas tempranas del tratamiento. Sin embargo, cuando el tiempo de tratamiento aumentó a 72 h, las caracterizaciones de apoptosis tardía o necrosis fueron dominantes entre las células HT-29 tratadas. La detección concomitante de apoptosis tardía o necrosis es científicamente posible porque las células HT-29 tratadas sometidas a apoptosis pueden haber progresado en necrosis debido a la incubación prolongada con el compuesto base Schiff. Para dilucidar los mecanismos subyacentes al efecto antiproliferativo observado del complejo Cu(II) sobre las células cancerosas, se analizó la distribución del ciclo celular utilizando la tinción BrdU y Phospho-Histone H3 junto con la citometría de flujo [34] [35]. El tinte BrdU puede unirse al ADN sintetizado de las células replicantes durante la fase S del ciclo celular, mientras que las células tinturas Phospho-Histone H3 en diferentes estadios mitóticos. El ciclo celular resulta del ensayo de doble tinción BrdU y Phospho-Histone H3 indicó que no hubo cambios significativos en el número de células en las fases S/M después de la exposición de células HT-29 al compuesto base Schiff, lo que sugiere la posibilidad de que las células fueran detenidas en la fase G 1 o G 2 del ciclo celular. Así, el análisis de citometría de flujo del ciclo celular fue realizado para determinar la fase exacta detenida, y los resultados demostraron una parada significativa del ciclo celular en G 1 después de 24 y 48 h de tratamiento, sugiriendo supresión proliferativa por inducción de apoptosis [37, 38]. La perturbación del potencial de membrana mitocondrial es uno de los eventos intracelulares más tempranos que ocurren después de la inducción de la apoptosis [39]. Como fuente principal de ROS celular y trifosfato de adenosina (ATP), las mitocondrias son los reguladores clave de los mecanismos que controlan la supervivencia o muerte de las células. Después de confirmar que el compuesto base de Cu(BrHAP) 2 Schiff no tenía capacidad antioxidante significativa en células cancerosas HT-29 utilizando el ensayo ORAC, se analizó la inducción de la producción de ROS en células tratadas. De acuerdo con nuestro estudio, después de exponer el compuesto Cu(II) a células HT-29 y analizar los niveles de ROS, se demostró que el nivel de ROS en células HT-29 tratadas fue significativamente elevado a una concentración compuesta de 6,25 g/ml. En la apoptosis inducida por metales, las mitocondrias tienen el papel crucial en mediar la apoptosis a través de ROS inducida por metales [40]. La vía de señalización intrínseca o dependiente de mitocondrial involucra diferentes factores de estímulos no mediados por receptores que inducen señales intracelulares. Estas señales, principalmente a través de la proteína p53, actúan sobre los eventos mitocondrializados. La producción excesiva de ROS es una señal negativa que puede resultar en el fracaso de la supresión de los factores antiapoptoticos, desencadenando así la apoptosis. Por lo tanto, utilizamos sondas fluorescentes de potencial de membrana mitocondrial (MMP) para examinar el efecto de la producción elevada de ROS en la función de las mitocondrias en células tratadas HT-29. Como se muestra en la Figura 7, los cambios en el MMP después del tratamiento con el compuesto base Cu(BrHAP) 2 Schiff que llevó a la despolarización de la membrana de las mitocondrias fueron demostrados por la liberación de Rhodamine 123 al citoplasma de la matriz mitocondria. El resultado implica que la inducción de los complejos base de Schiff por Cu(II) Schiff puede estar asociada con la vía mitocondrial [26, 41, 42]. Una de las señales importantes para iniciar el procedimiento de la apoptosis es citocromo citosólico. La liberación de citocromo en el citosol y la reducción de sus niveles en las mitocondrias se han demostrado como resultado de los cambios en el MMP [30]. Como el resultado ilustrado, el compuesto de base sintético Schiff también llevó a un aumento en el nivel de citocromo en el citosol en comparación con el control. La producción excesiva de ROS de mitocondrias y el colapso de MMP puede activar las moléculas de caspasa aguas abajo y consecuentemente conducir a la muerte celular apoptótica. Después de la unión del citocromo al factor activador apoptótico-1, la caspasa-9 se activa a través de la formación de apoptosomas, que conduce a la caspasa activa-3/7, la caspasa más eficaz con muchos objetivos celulares [43]. En la vía extrínseca, la apoptosis es mediada por receptores de muerte. Como ejemplo, el ligando FAS interactúa con el receptor FAS, lo que conduce a la activación de la caspasa-8 [44]. La activación Caspasa-8 se corta y activa caspas del verdugo aguas abajo como caspasa-3/7 [45, 46]. En nuestro estudio, el compuesto base Cu(BrHAP) 2 Schiff indujo una elevación significativa en las caspas 3/7 y 9 actividades en comparación con el control. Mientras tanto, no hubo activación de caspasa-8, lo que sugiere que la apoptosis inducida en las células HT-29 fue mediada a través de la vía mitocondrial intrínseca, pero no la vía extrínseca, receptor de muerte ligada a la caspasa-8. La evidencia de soporte de liberación de LDH, producción de ROS, supresión de MMP, elevación en el nivel de citocromo, y activación de caspas 3/7 y 9 demostró la prometedora actividad anticancerosa del compuesto base de Cu(BrHAP) 2 Schiff contra la línea celular de cáncer de colon HT-29 a través de la vía mitocondrial intrínseca.

¿Cómo se midieron los cambios morfológicos nucleares en las células HT-29?

La ingeniería metabólica de Escherichia coli en una plataforma de glicosilación versátil: producción de glucósidos de quercetina bioactivoshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4573293/SHA: f4cd52975e6a33e8c947082eda9b261952b0f8fAutores: De Bruyn, Frederik; Van Brempt, Maartens; Maertens, Jo; Van Bellegem, Wouter; Duchi, Dries; De Mey, MarjanFecha: 2015-09-16DOI: 10.1186/s12934-015-0326-1Licencia: cc-byAbstract: ANTEGRADO: Los flavonoides son metabolitos de plantas especializadas bioactivas que se producen principalmente como Debido a la creciente demanda del mercado, se han desarrollado diversos enfoques biotecnológicos que utilizan Escherichia coli como catalizador microbiano para la glucosilación estereoespecífica de flavonoides. A pesar de estos esfuerzos, la mayoría de los procesos todavía muestran bajas tasas de producción y títulos, que los hacen inadecuados para aplicaciones a gran escala. RESULTADOS: En esta contribución, ampliamos una plataforma de glucosilación in vivo previamente desarrollada en E. coli W, en un sistema eficiente de galactosilación selectiva y rhamnosilación. La racionalidad de la nueva estrategia de ingeniería metabólica constituye la introducción de un metabolismo alternativo de sacarosa en forma de una fosforilasa de sacarosa, que deja la sacarosa en fructosa y la glucosa 1-fosfato como precursora de la UDP-glucosa. Para preservar estos intermedios para fines de glucosilación, las reacciones de Debido al papel central de la UDP-glucosa, la sobreexpresión de las enzimas interconvertidoras galE y MUM4 aseguró la formación de tanto UDP-galactosa y UDP-rhamnosa, respectivamente. Al suministrar adicionalmente quercetina alimentada exógenamente y sobreexpresión de una flavonol galactosiltransferasa (F3GT) o una rhamnosiltransferasa (RhaGT), 0,94 g/L hiperósido (quercetina 3-O-galactósido) y 1,12 g/L quercitrina (quercetina 3-O-rhamnosido), respectivamente. Además, ambas cepas mostraron actividad hacia otros flavonols dietéticos prometedores como kaempferol, fisetina, morina y mirictina. CONCLUSIONES: Se diseñaron dos mutantes E. coli W que podrían producir eficazmente los glucósidos de flavonol bioactivos hiperósidos y quercitrina a partir de los sustratos baratos sacarosa y quercetina. Esta nueva estrategia de glucosilación basada en fermentación permitirá la producción económicamente viable de varios glucósidos. MATERIAL SUPLEMENTO ELECTRÓNICO: La versión en línea de este artículo (doi:10.1186/s12934-015-0326-1) contiene material suplementario, que está disponible para los usuarios autorizados. Texto: Los flavonoides son una clase de metabolitos secundarios de plantas, que se caracterizan químicamente por una columna vertebral de 15 carbono que consiste en dos anillos de fenilo y un anillo heterocíclico. Hasta la fecha, más de 10.000 flavonoides se han caracterizado por varias plantas, que se clasifican según su estructura química, es decir, el número y la presencia de grupos hidroxilos y otras modificaciones de grupos funcionales en varios subgrupos, como las antoxantinas, las flavanonas y los flavanonales [1, 2]. En los últimos años los flavonoides han recibido mucha atención de diversos dominios de aplicación debido a los diversos efectos beneficiosos sobre la salud humana que se les han atribuido, como los anticancerosos [3] y antioxidantes [4] a los efectos antiinflamatorios [5], antimicrobianos [6] y antivirales [6, 7]. Como paso final en su biosíntesis, los flavonoides suelen ser glucosilados, lo que tiene un profundo efecto en su solubilidad, estabilidad y bioactividad [8, 9]. Por ejemplo, el flavonol quercetina mejor estudiado, que constituye hasta el 75 % de nuestra ingesta diaria de flavonoides, se presenta predominantemente como glucósidos diferentes. Hasta la fecha se han notificado más de 350 glicoformas diferentes de quercetina con diversas propiedades farmacológicas [10, 11]. En este contexto, el hiperósido (quercetina 3-O-galactósido) y la quercitrina (quercetina 3-O-rhamósido) (fig. 1) han ganado mucha atención como productos valiosos para la industria farmacéutica, por ejemplo, como potentes antioxidantes con efectos citoprotectores [12] [13] [14] [15] y como agentes antivirales prometedores que bloquean la replicación del virus de la gripe [16] o inhiben los virus hepatitis B [17] y SARS [18]. Además, se les han atribuido actividades antiinflamatorias [19, 20], antidepresivos [21, 22], apoptóticos [23] y antifúngicos [24], lo que las hace interesantes terapéuticas que resultan en un aumento constante de la demanda del mercado. Hasta la fecha, la mayoría de la quercetina y sus glucósidos se extraen del material vegetal, lo que generalmente es un proceso laborioso y de bajo rendimiento que requiere muchos pasos de purificación [25]. Los cultivos de plantas in vitro o plantas diseñadas pueden utilizarse para superar los bajos rendimientos y mejorar la producción [26] [27], sin embargo, dado que la ingeniería metabólica de las plantas es a la vez muy controvertida y aún en su infancia [29], este enfoque se limita a menudo a la producción a pequeña escala. Aunque la síntesis química de quercetina (glicósidos) ha demostrado ser factible [30] [31] [32], la formación estereoselectiva de enlaces glicosídicos se ve a menudo obstaculizada por la presencia de varios grupos reactivos [33], lo que requiere muchas medidas de protección y desprotección [34]. Además, la generación de residuos tóxicos y una baja atomeficiencia [35] hacen que estos procesos de producción no sean sostenibles ni económicamente viables. Como resultado, en las últimas dos décadas se han invertido enormes esfuerzos en el desarrollo de métodos de producción alternativos para estos metabolitos vegetales especializados (secundarios) [36]. Los avances en los campos de la ingeniería proteica, los sistemas y la biología sintética han acelerado estos esfuerzos para transformar organismos modelo como Escherichia coli y Saccharomyces cerevisiae en fábricas de células microbianas reales para la producción sostenible de flavon Posteriormente, también se han desarrollado estrategias para la glicosiltransferasa in vivo de flavonoides, que se basan en la sobreexpresión de glucosiltransferasas específicas, que transfieren un residuo de azúcar de un nucleótido activado a un aglicón de forma estereo y regioselectiva, así como en la ingeniería o introducción de la vía nucleótida dirigida al azúcar. De esta manera, Fig. 1 Transformación de E. coli W en una plataforma de galactosilación basada en sacarosa y rhamnosilación. La estrategia de ingeniería metabólica aplicada utiliza varias deleciones genéticas (indicadas en rojo) y sobreexpresiones de genes (indicadas en verde). Se aplica el racional de un metabolismo dividido, por el cual la sacarosa se divide por fosforilasa de sacarosa (BaSP) en fructosa para ser utilizada para el crecimiento y Esta última es una molécula pivote universal para la formación de UDP-galactosa y UDP-rhamnosa, interconversiones catalizadas por las enzimas GalE y MUM4, respectivamente. Para asegurar la producción acoplada al crecimiento, varios genes, involucrados en la metabolización de estos UDPsugars y sus precursores, fueron eliminados (mostrados en rojo). La producción de los glucósidos de quercetina bioactivos hiperósidos y quercitrina fue elegida para evaluar la versatilidad de la plataforma de producción diseñada. Por último, la introducción de los glicosiltransferasa F3GT o RhaGT garantiza la galactosilación eficiente o la rhamnosilación, respectivamente, ya se han producido varios glucósidos de quercetina en E. coli, como el 3-O-glucósido [40], el 3-O-xilosido [41] y el 3,7-O-bisrhamnosido [42], o la quercetina 3-O-(6-deoxitalosa) de nueva naturaleza [43]. Sin embargo, a pesar de estos esfuerzos de ingeniería, las tasas de producto y los títulos reportados siguen en la gama de miligramos, haciendo que estos hospedadores microbianos no sean adecuados para aplicaciones industriales. Los procesos de producción desarrollados son típicamente procesos de bioconversión bifásicos utilizando células en reposo, lo que dificulta mejorar las tasas de producción [44] Además, estos sistemas a menudo implican medios de crecimiento costosos o la adición de inductores enzimáticos, haciendo el proceso general muy costoso. Para abordar estos problemas, previamente desarrollamos una plataforma eficiente para la glucosilación de pequeñas moléculas en E. coli W [45]. Mediante la ingeniería metabólica, se creó un mutante que combina la producción de glucósidos con el crecimiento, utilizando la sacarosa como una fuente de carbono barata y sostenible. Al introducir la sacarosa fosforilasa de Bifidobacterium teennis (BaSP) la sacarosa se puede dividir en fructosa para ser utilizada con fines de crecimiento y la glucosa 1-fosfato (glc1P) para ser utilizada como precursora de la formación de UDP-glucosa (UDP-glc) (fig. 1). Para impedir la conversión de glc1P en precursores de biomasa, varios genes endógenos implicados en su metabolización, como la fosfoglucomutasa (pgm) y la glucosa-1-fosfatasa (agp) fueron eliminados. Posteriormente, el glc1P puede canalizarse eficientemente hacia UDP-glc al sobreexpresar la uridyltransferasa de Bifidobacterium bifidum (ugpA). La metabolización del UDP-glc se evita al eliminar la hidrolasa UDP-azúcar (ushA) y el operón de galactosa (galETKM). Sin embargo, en vista del papel central de UDP-glc en la producción de una gran variedad de UDP-sugars, este sistema de glucosilación se puede extender fácilmente hacia otros UDP-sugars, tales como UDP-galactosa (UDP-gal), UDPrhamnosa (UDP-rha) y UDP-glucuronato. En la presente contribución, esta plataforma basada en E. coli W basada en E. coli glucosilación se transforma en una plataforma para galactosilación y rhamnosilación (fig. 1), cuyo potencial se demuestra utilizando la galactosilación y la rhamnosilación de quercetina alimentada exógenamente que produce hiperósido y quercitrina, respectivamente, como estudio de caso. Escherichia coli W es una cepa no patógena de rápido crecimiento que tolera el estrés osmótico, las condiciones ácidas, y puede cultivarse a altas densidades celulares, lo que la convierte en un hospedador atractivo para las fermentaciones industriales [46]. Además, E. coli W es capaz de crecer con sacarosa como única fuente de carbono [46], que es una materia prima emergente para la producción de bioproductos. Por lo tanto, E. coli W fue seleccionado como hospedador para la glucosilación in vivo basada en sacarosa. Antes de la producción de los glucósidos hiperósidos y quercitrina en E. coli W, se investigó la toxicidad de su aglicón quercetina. Con este fin, la cepa de tipo salvaje (WT) se cultivaba en un medio mínimo de sacarosa que contenía diferentes concentraciones de quercetina (0, 0,15 y 1,5 g/L). Las tasas de crecimiento específicas (h −1 ) (0,96 ± 0,06, 0,92 ± 0,05 y 0,87 ± 0,06, respectivamente) no fueron significativamente diferentes (p ANOVA = 0,12) ni de la determinada previamente para el WT [45] (p = 0,69, p = 0,98 y p = 0,68, respectivamente). Por otro lado, la densidad óptica a 600 nm después de la incubación de 24 h (6,36 ± 0,12, 5,18 ± 0,16 y 4,77 ± 0,20, respectivamente) fue menor (alrededor del 20 %) cuando se añadió quercetina (p = 0,0002 y p = 0,0001). No se pudo observar diferencia significativa en la densidad óptica entre 0,15 y 1,5 g/L de quercetina (p = 0,14). En vista de lo anterior, se optó por añadir 1,5 g/L de quercetina para Para evaluar el potencial de glicosilación in vivo, las cepas sGAL1 y sRHA1, que expresan constitutivamente la flavonol 3-O-galactosiltransferasa de Petunia híbrida y la flavonol 3-O-rhamnosiltransferasa de A. taliana, respectivamente, fueron cultivadas en medio mínimo con 1,5 g/L de quercetina durante 16 h. El análisis de los sobrenadantes de ambos cultivos en el TLC produjo dos nuevos puntos amarillos del producto. La mancha de TLC obtenida del cultivo sGAL1, que tuvo el mismo tiempo de retención que el estándar hiperósido (R f = 0,5), fue posteriormente purificada y analizada. Sin embargo, el punto del producto obtenido del cultivo sRHA1 tenía un factor de retención diferente (R f = 0,55) que el estándar de quercitrina (R f = 0,74), y fue identificado como isoquercitrina (quercetina 3-O-glucósido). A diferencia de otros informes sobre cepas silvestres de tipo E. coli que expresaban RhaGT, que simultáneamente producían quercitrina (quercetina 3-O-rhamnosido) e isoquercitrina [47, 48], no se pudo detectar rhamnosido. El examen del genoma de E. coli W reveló que el grupo genético responsable de la producción endógena de dTDP-rhamnosa, que funciona como rhamnosildonante alternativo para RhaGT en E. coli B y K12 [47], no estaba presente [46, 49]. En un experimento de seguimiento, sGAL1 y sRHA1 fueron cultivados en medio mínimo con dos concentraciones diferentes (0,15 y 1,5 g/L) de quercetina. Se monitorizó el crecimiento y la formación de glucósidos durante 30 h. Los títulos finales (C p ) y las productividades específicas (q p ) se muestran en la figura 2. Cabe destacar que un aumento de la concentración de quercetina dio lugar a un aumento de dos a tres veces en la productividad y el título, lo que indica que el suministro de quercetina es limitador de velocidad y crucial para una glucosilación in vivo eficiente. Sin embargo, mientras que sGAL1 produjo hiperósidos continuamente durante la fase exponencial, lo que también se refleja en la productividad específica relativamente alta, sRHA1 sólo comenzó a acumular cantidades significativas de isoquercitrina al final de la fase exponencial. Este inicio de producción coincide con una reducción de la tasa de crecimiento específica, que bajó de 0,35 ± 0,04 a 0,06 ± 0,01 h −1. Como se describe en detalle en la sección de fondo, previamente se diseñó metabólicamente E. coli W para crear una plataforma para la glucosilación in vivo de pequeñas moléculas [45]. En la cepa de glucosilación de base original, la sacarosa fosforilasa codificada por BaSP se encontraba en un plásmido mediocopia y transcrita a partir de un promotor constitutivo medio fuerte (P22) [50]. Por razones de comparación y flexibilidad, se optó por integrar BaSP en el genoma de E. coli W. Además, la integración cromosómica es ventajosa debido a un aumento significativo de la estabilidad genética. Dado que el nivel de expresión génica puede verse considerablemente afectado por el sitio de integración del genoma [51] debido a diferencias estructurales como las regiones de ADN supercoiling, se evaluaron dos sitios de ADN diferentes para la integración de BaSP, es decir, mela y glgC, que codifican una α-galactosidasa y una glucosa-1-fosfato adeniltransferasa, respectivamente. Para ello, se aplicó un procedimiento de knockout adaptado para fragmentos de ADN grandes, que se muestra esquemáticamente en el archivo adicional 1: Figura S2. El BaSP bajo control del promotor P22 fue golpeado en los dos loci diferentes en E. coli W ΔcscAR, lo que resultó en las cepas E. coli W ΔcscAR ΔmelA::L4-P22-BaSP-L5 y ΔcscAR ΔggC::L4-P22-BaSP-L5. Su tasa máxima de crecimiento específico (μ max ) en medio mínimo de sacarosa, que se muestra en la Fig. 3, se comparó con la cepa original ΔcscAR + pBaSP. La influencia del locus tokin en la tasa máxima de crecimiento específico es clara. Interesantemente, la integración en el locus melA resultó en una cepa con un máximo de μ que no fue significativamente diferente de la cepa de referencia ΔcscAR + pBaSP. En vista de esta última y teniendo en cuenta el objetivo de producción acoplada al crecimiento, se optó por integrar BaSP en el locus melA que conduce a la cepa de base de producción final E. coli W ΔcscAR Δpgm Δagp ΔushA ΔlacZYA::P22-lacY ΔgalETKM ΔmelA::L4-P22-BaSP-L5 (sGLYC) (sGLYC) como se muestra en el cuadro 1. En la naturaleza, UDP-glc sirve como molécula pivotante en la formación de una variedad de UDP-sugars [44]. Por ejemplo, utilizando las enzimas de interconversión UDP-glucosa 4-epimerasa (GALE) y UDP-rhamnosa syntasa (MUM4) UDP-glc se puede convertir en UDP-gal y UDP-rha, respectivamente. Aunque GalE está nativamente presente en E. coli W, una epimerasa homóloga alternativa (GALE2) de B. bifidum también se seleccionó y clonó debido a la Fig. 2 Comparación de las productividades específicas de glucósidos (q p ) y títulos de glucósidos (C p ) para cepas sGAL1, que produce el 3-O-galactósido, y sRHA1, que produce el 3-O-glucósido, cuando se cultiva durante 30 h en medio mínimo que contiene 0,15 o 1,5 Las barras de error representan desviaciones estándar regulación estricta y compleja de la expresión de GalE en E. coli W. Por otro lado, la síntesis UDP-rhamnosa está restringida a las plantas. Debido a la falta del cúmulo de rfb [46] E. coli W es incluso incapaz de formar dTDP-rhamnosa endógena como donante alternativo de rhamnosil. Por lo tanto, el gen MUM4 de A. thaliana se expresó desde plásmido pMUM4 para lograr la formación de UDP-rhamnosa en E. coli (Fig. 1). Las cepas construidas de galactosilación (sGAL) y rhamnosilación (sRHA) fueron cultivadas en medio mínimo con dos niveles (0.15 y 1.5 g/L) de quercetina. El crecimiento y la producción fueron monitoreados para determinar las productividades específicas Una vez más, las concentraciones de quercetina extracelulares más altas dieron lugar a un aumento de cinco veces en q p. Sin embargo, no se observó diferencia significativa en la productividad entre sGAL2 y sGAL3 a 1,5 g/L de quercetina, lo que indica que la formación de galactosa UDP es tan eficiente con ambos homólogos GalE y no es probable que el paso limitante de la velocidad. Con sGAL3, se obtuvo la mayor productividad hiperósida (68,7 mg/g CDW/h) y título (0,94 g/L), siendo este último 3,5 veces más alto que con sGAL1. En contraste con sRA1, el análisis de TLC del sobrenadante de los cultivos de sRHA2 y sRHA3 dio lugar a un punto del producto con un factor de retención que corresponde a la quercitrina, que Se obtuvo un título de quercitrina de 1,18 g/l y una productividad específica de 47,8 mg/g CDW/h después de 30 h de incubación de sRHA3 cuando se añadió 1,5 g/l de quercetina al medio, que correspondía a una conversión del 53%. También se produjeron 51 mg/l de isoquercitrina extracelularmente, lo que corresponde a una relación de producción de quercitrina:isoquercitrina de 24:1. Esto sugiere la preferencia de RhaGT por UDP-rhamnosa cuando están presentes diferentes donantes UDP-azúcar. Posibles explicaciones para la productividad específica significativamente menor (cinco veces menor) de sRHA2 en comparación con sRHA3 son o una carga metabólica mayor [52] causada por el sistema de dos plásmidos o una actividad demasiado limitada de la GalU nativa, que podría ser Para demostrar la escalabilidad del bioproceso desarrollado, la cepa sGAL3 se cultivó en un bioreactor de 1-L, que también asegura un pH constante a 6,80 y evita la limitación del oxígeno. En la figura 5 se ofrece una visión detallada del consumo de sacarosa, crecimiento e hiperósidos. Después de una fase de retraso, la cepa mostró una tasa de crecimiento de 0,32 ± 0,02 h −1 mientras producía simultáneamente hiperósido. La productividad específica observada (65,9 ± 2,6 mg/g CDW/h) fue comparable a la obtenida en la escala del frasco de batidos. Cuando casi toda la quercetina se convirtió, la formación de hiperósidos disminuyó, lo que puede explicarse por la correlación observada entre la concentración de quercetina y q p, o por la reversibilidad reportada de F3GT [53]. Es probable que se puedan lograr mejoras adicionales en el título y la productividad optimizando el suministro de quercetina utilizando un sistema de fed-batch. Según nuestro conocimiento, los resultados obtenidos en este estudio con las cepas sGAL y sRHA para la producción de hiperósidos y quercitrina son los más altos reportados hasta la fecha tanto en términos de título como de tasa de producción. La tasa máxima de producción obtenida en esta contribución fue de 6 a 50 veces mayor que las tasas máximas de producción (r p,max ) de los procesos reportados en la literatura [47, 54], como se ilustra en la Fig. 6. El aumento del rendimiento, en términos de título y productividad, obtenido con la plataforma desarrollada, puede atribuirse al uso de un metabolismo dividido en combinación con un desvío óptimo del flujo de glucosa 1-fosfato hacia UDP-galactosa y UDP-rhamnosa. La conversión no deseada de los azúcares activados en biomasa Fig. 3 Efecto del locus de integración cromosómica de la knokin de BaSP sobre la tasa de crecimiento. Las cepas fueron cultivadas en frascos de batido y las tasas de crecimiento máximas resultantes (μ max ) fueron comparadas con E. coli W ΔcscAR con expresión BaSP a base de plásmido (+pBaSP). Las barras de error representan desviaciones estándar se ve obstaculizada por deleciones genéticas, lo que garantiza un alto rendimiento del producto. Además, ya que la formación de biomasa, alimentada por la fracción fructosa de sacarosa, y la síntesis de glucósidos van de la mano y posteriormente se realizan al mismo tiempo a una alta tasa, una alta productividad está igualmente garantizada (proceso de fermentación en un solo paso). Además de quercetina también otros flavonoles como el kaempferol, fisetina, morina y miricetina contribuyen significativamente a nuestra ingesta diaria de flavonoide, que también tienen efectos beneficiosos muy diversos [55, 56]. Como la moiedad del azúcar es un importante determinante de la absorción intestinal de los flavonoides dietéticos y su posterior bioactividad [57, 58], las cepas sGAL3 y sRHA3 fueron cultivadas en tubos con un medio mínimo de 5 mL, cada uno conteniendo 1,5 g/L de kaempferol, miricetina, morina o fisetina. El crecimiento y la producción fueron monitoreados a lo largo de 48 h y varios puntos fueron observados en TLC con factores de retención similares como hiperósido y quercitrina. Se utilizó espectrometría de masas para identificar los compuestos producidos, lo que confirmó la galactosilación in vivo de miricetina, kaempferol, morina y fisetina (Tabla 2 ). Todos los compuestos ocurrieron con una m/z de [M + 114], debido a la complejidad con ácido trifluoroacético de la fase móvil. El galactosido de morina se produjo a un ritmo lento, lo que está de acuerdo con la muy baja actividad in vitro de F3GT hacia este flavonol [53]. Una posible explicación de esta actividad limitada puede ser la presencia de un grupo hidroxilo inusual en la posición 2′, que puede obstaculizar estericamente la deprotonación y la consiguiente galactosilación de morina en el grupo hidroxi 3 [59]. La incubación de sRHA3 con los diferentes flavonoles investigados mostró dos puntos glucósidos distintos en el TLC, que correspondían al 3-O-rhamnosido y al 3-O-glucósido. Kaempferol demostró ser el mejor sustrato para RhaGT y fue predominantemente rhamnosilado (8:1 ratio), con un título superior a 400 mg/L, que es dos veces superior a lo reportado anteriormente [47]. Fisetin por otro lado fue eficientemente glucosilado, sin embargo la formación de su rhamnosilado no fue tan eficiente, con un título inferior a 5 mg/L. También se observó una preferencia similar hacia la formación de glucósidos con mirictina y morina, lo que indica que el posicionamiento de los grupos hidroxilo es el factor determinante para la glucosilación con Rha La producción de los rhamnosidos, galactósidos o glucósidos deseados puede mejorarse considerablemente utilizando UGTs más específicos para ciertos flavonols y UDP-sugars. La transformación de los UGTs correspondientes en las cepas de glicosilación in vivo desarrolladas presenta una alternativa prometedora para la producción a gran escala de varias glicoformas de flavonol, que hasta la fecha se extraen principalmente del material de la planta. Por otro lado, debido al papel central de UDP-glc, se pueden formar varios otros UDP-sugars in vivo (por ejemplo, UDP-glucuronato, UDP-xilosa, UDP-arabinosa). En combinación con la modularidad de la plataforma de glucosilación desarrollada, que permite la introducción rápida de cualquier vía UGT o UDP-sugar, prácticamente Por lo tanto, esto demuestra que la plataforma microbiana propuesta es una fábrica de células microbianas robusta, versátil y eficiente para la glicosilación (por ejemplo, glucosilación, rhamnosilación, galactosilación) de moléculas pequeñas. Aunque las productividades obtenidas son las más altas reportadas hoy en día y compiten con los procesos de producción actuales, la mejora adicional puede ser limitada debido a problemas de solubilidad del aglicón o del glucósido. Para este fin la investigación de seguimiento puede centrarse en la ingeniería metabólica adicional (por ejemplo, la introducción de la vía aglicón que permite la producción in vivo gradual del aglicón) o en la optimización del proceso [por ejemplo, la fermentación de 2 fases (bicapas) que permite la recuperación in situ] para mejorar estos problemas. En esta contribución, se desarrolló una plataforma biotecnológica para la galactosilación y rhamnosilación de moléculas pequeñas, tales como productos secundarios de metabolitos naturales, a partir de un huésped de glucosilación previamente creado. Para este fin, se introdujeron las rutas para convertir la UDP-glucosa en UDP-galactosa y UDP-rhamnosa, respectivamente. Como prueba de concepto, se seleccionó la flavonol quercetina bioactiva para galactosilación y rhamnosilación, produciendo hiperósido (quercetina 3-O-galactósido) y quercitrina (quercetina 3-O-rhamnosido), respectivamente. A continuación, la flavonol 3-O-galactosiltransferasa (F3GT) de Petunia híbrida y la flavonol 3-O-rhamnosiltransferasa de Arabidopsis thaliana (RhaGT) fueron sobreexpresadas en los mutantes de E. coli W de ingeniería metabólica. Las cepas creadas fueron capaces de producir 940 mg/L de hiperósido y 1176 mg/L de quercitrina a tasas específicas de producción de 68,7 mg/g de CDW/h y 47,8 mg/g de CDW/h, respectivamente, que son las más altas reportadas hasta la fecha. Curiosamente, ambos GT mostraron actividad in vivo hacia otros flavonoles dietéticos, por lo que por ejemplo, más de 400 mg/L de kaempferol 3-O-rhamnosido Todos los plasmidos utilizados fueron construidos utilizando el ensamblaje de Gibson [60] o CLIVA [61]. Todos los fragmentos de PCR fueron amplificados utilizando polimerasa Q5 de New England Biolabs (Ipswich, Massachusetts). Oligonucleótidos fueron comprados a IDT (Leuven, Bélgica). Los plasmidos y cepas bacterianas utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla 1. Una lista de imprimaciones para la creación de knockouts/knockins de genes y para la clonación de los plasmidos de expresión se da en el archivo adicional 2: Tabla S1. E. coli DH5α se utilizó para clonación y propagación de plasmidos, mientras que E. coli W se utilizó para la expresión de los plasmidos de producción y la creación de knockouts y knockins de genes El hiperósido, la quercitrina, la isoquercitrina, el kaempferol y la miricetina fueron comprados a Carbosynth (Berkshire, Reino Unido). Todas las demás sustancias químicas utilizadas fueron compradas a Sigma Aldrich (Alemania) a menos que se indique lo contrario. La expresión plásmidos para la prod uction del hiperósido y la quercitrina se construyeron como se describe en el archivo adicional 3: Figura S1A Figura S1D ). Las secuencias galE [Genbank: JW0742] y galE2 [Genbank: KJ543703] fueron amplificadas a partir del ADN genómico de E. coli y Bifidobacterium bifidum, respectivamente. El conjunto CLIVA resultó en el plásmido intermedio pBaSP/F3GT/UgpA (Figura S1A ), que posteriormente fue utilizado para la amplificación de la columna vertebral F3GT/UgpA. El ensamblaje Gibson de los insertos GalE o GalE2 con esta columna vertebral resultó en los plásmidos de galactosilación final pGalE/F3GT/UgpA y pGalE2/F3GT/UgpA, respectivamente (Figura S1B ). Del mismo modo, MUM4 y RhaGT fueron introducidos utilizando un ensamblaje Gibson de 3 piezas (Figura S1C ), resultando en el plásmido final rhamnosylation pMUM4/RhaGT/UgpA. Los mutantes de knockout E La estrategia para la integración cromosómica de BaSP bajo control del promotor constitutivo P22 flanqueado por L4 y L5 en los loci mela y glgC se describe y explica en el archivo adicional 1: Figura S2. Los transformadores se plasmaron en placas de agar medio de sacarosa mínima y se cultivaron durante la noche para su cribado. La cepa interna E. coli W ΔcscAR Δpgm Δagp ΔushA ΔlacZYA:::P22-lacY ΔgalETKM [45] se utilizó para la integración cromosómica de L4-P22-BaSP-L5 en el sitio melA, produciendo la cepa base sGLYC (Tabla 1). Esta cepa y el tipo silvestre E. coli W se transformaron con los plásmidos de producción descritos anteriormente, resultando en las cepas galactosilación (sGAL) y rhamnosilación (sRA) indicadas en el cuadro 1. La composición de LB y medio de sacarosa mínimo se describió previamente [45]. Las placas de agar medio mínimo con sacarosa (50 g/L) tenían la misma composición que el medio de sacarosa mínimo, pero contenían además 15 g/L de agarosa. La agarosa y las sales se autoclavearon por separado a 121 °C durante 21 min. La sacarosa fue filtrada esterilizada a través de un filtro de cornización de 0,22 μm (Fisher, Bélgica) y calentada durante 1 min en un horno de microondas a 800 W antes de mezclarla con la agarosa caliente y las soluciones de sal. Antes de verter las placas se añadió estérilmente 1 mL/L de solución mineral [45]. Se cultivaron precultivos mutantes Escherichia coli W en medio LB de 5 mL con los antibióticos (50 μg/mL de kanamicina o carbenicilina) necesarios para el mantenimiento y selección de los plásmidos. Los cultivos se cultivaron durante 16 h a 37 °C y 200 rpm y se utilizaron para la inoculación del 2 % de 100 mL de medio mínimo de sacarosa en matraces de agitación de 500 mL. Para la producción de hiperósidos y quercitrina, se añadió quercetina al medio mínimo a una concentración de 0,15 o 1,5 g/L. Las condiciones de crecimiento fueron las mismas que se habían descrito anteriormente [45]. Las muestras se tomaron a intervalos regulares del caldo y, tras la centrifugación, Para el análisis de quercetina y sus glucósidos, se recogieron 200 μL del cultivo y se extrajeron con acetato de etilo de 800 μL. La capa orgánica fue recolectada, evaporada en un concentrador de vacío SpeedVac TM (Thermo Fisher, USA) y disuelta en 200 μL de DMSO para la cuantificación de HPLC. Las condiciones de montaje y fermentación del biorreactor son las mismas que se han descrito anteriormente [45]. Los experimentos de producción se realizaron en medio mínimo de sacarosa sin amortiguador MOPS y con la adición de quercetina como aceptor. Las muestras de cultivo fueron analizadas principalmente por TLC en placas prerevestidas de gel de sílice 60 F 254 (Merck, Alemania). Todas las placas fueron ejecutadas en una cámara de TLC cerrada y desarrolladas utilizando técnicas y agentes de visualización estándar: fluorescencia UV (254 nm) o por tinción con 10 % (v/v) H 2 SO 4 y posterior carbonización. La fase móvil para la detección de los diversos flavonols y glucósidos correspondientes consistió en un acetato de etilo:ácido acético:ácido formínico:agua (100:11:11:27 v/v) mezcla [63]. Las intensidades puntuales del producto de otros glucósidos de flavonol fueron procesadas y cuantificadas utilizando ImageJ [64]. La cuantificación HPLC de sacarosa, fructosa y glucosa se realizó utilizando una columna Amida de puente X (35 μm, Waters, USA) como se describió anteriormente [45]. Quercetina, hiperósido, [41] utilizando un sistema Varian HPLC (Tecnologías Agilent, California). La espectrometría de masas para la determinación de los diversos glucósidos de flavonol se realizó con un Quattro LC de Micromasa (McKinley Scientific, EE.UU.). La detección se realizó en modo negativo ESI-224 MS con una tensión capilar de 2,53 kV, una tensión cono de 20 V, flujos de gas cono y desintoxicación de 93 y 420 L/h, y temperaturas de fuente y cono de 150 y 350 °C, respectivamente. Los glucósidos de Quercetina se extrajeron del caldo con un volumen igual de acetato de etilo después de lo cual la capa orgánica fue evaporada a sequedad. La banda que contiene hiperósido (R f 0.53) o quercitrina (R f 0.75) fue raspada, extraída con acetato de etilo y evaporada para producir un polvo amarillo brillante. Los productos fueron confirmados por NMR. Se notificaron espectros en otros lugares [47, 65].

¿Cuál fue la conclusión de este estudio?

La ingeniería metabólica de Escherichia coli en una plataforma de glicosilación versátil: producción de glucósidos de quercetina bioactivoshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4573293/SHA: f4cd52975e6a33e8c947082eda9b261952b0f8fAutores: De Bruyn, Frederik; Van Brempt, Maartens; Maertens, Jo; Van Bellegem, Wouter; Duchi, Dries; De Mey, MarjanFecha: 2015-09-16DOI: 10.1186/s12934-015-0326-1Licencia: cc-byAbstract: ANTEGRADO: Los flavonoides son metabolitos de plantas especializadas bioactivas que se producen principalmente como Debido a la creciente demanda del mercado, se han desarrollado diversos enfoques biotecnológicos que utilizan Escherichia coli como catalizador microbiano para la glucosilación estereoespecífica de flavonoides. A pesar de estos esfuerzos, la mayoría de los procesos todavía muestran bajas tasas de producción y títulos, que los hacen inadecuados para aplicaciones a gran escala. RESULTADOS: En esta contribución, ampliamos una plataforma de glucosilación in vivo previamente desarrollada en E. coli W, en un sistema eficiente de galactosilación selectiva y rhamnosilación. La racionalidad de la nueva estrategia de ingeniería metabólica constituye la introducción de un metabolismo alternativo de sacarosa en forma de una fosforilasa de sacarosa, que deja la sacarosa en fructosa y la glucosa 1-fosfato como precursora de la UDP-glucosa. Para preservar estos intermedios para fines de glucosilación, las reacciones de Debido al papel central de la UDP-glucosa, la sobreexpresión de las enzimas interconvertidoras galE y MUM4 aseguró la formación de tanto UDP-galactosa y UDP-rhamnosa, respectivamente. Al suministrar adicionalmente quercetina alimentada exógenamente y sobreexpresión de una flavonol galactosiltransferasa (F3GT) o una rhamnosiltransferasa (RhaGT), 0,94 g/L hiperósido (quercetina 3-O-galactósido) y 1,12 g/L quercitrina (quercetina 3-O-rhamnosido), respectivamente. Además, ambas cepas mostraron actividad hacia otros flavonols dietéticos prometedores como kaempferol, fisetina, morina y mirictina. CONCLUSIONES: Se diseñaron dos mutantes E. coli W que podrían producir eficazmente los glucósidos de flavonol bioactivos hiperósidos y quercitrina a partir de los sustratos baratos sacarosa y quercetina. Esta nueva estrategia de glucosilación basada en fermentación permitirá la producción económicamente viable de varios glucósidos. MATERIAL SUPLEMENTO ELECTRÓNICO: La versión en línea de este artículo (doi:10.1186/s12934-015-0326-1) contiene material suplementario, que está disponible para los usuarios autorizados. Texto: Los flavonoides son una clase de metabolitos secundarios de plantas, que se caracterizan químicamente por una columna vertebral de 15 carbono que consiste en dos anillos de fenilo y un anillo heterocíclico. Hasta la fecha, más de 10.000 flavonoides se han caracterizado por diversas plantas, que se clasifican según su estructura química, es decir, el número y la presencia de grupos hidroxilos y otras modificaciones de grupos funcionales en diversos subgrupos, como las antoxantinas, las flavanonas y los flavanonales [1, 2]. En los últimos años los flavonoides han recibido mucha atención de diversos dominios de aplicación debido a los diversos efectos beneficiosos sobre la salud humana que se les han atribuido, como los anticancerosos [3] y antioxidantes [4] a los efectos antiinflamatorios [5], antimicrobianos [6] y antivirales [6, 7]. Como paso final en su biosíntesis, los flavonoides suelen ser glucosilados, lo que tiene un profundo efecto en su solubilidad, estabilidad y bioactividad [8, 9]. Por ejemplo, el flavonol quercetina mejor estudiado, que constituye hasta el 75 % de nuestra ingesta diaria de flavonoides, se presenta predominantemente como glucósidos diferentes. Hasta la fecha se han notificado más de 350 glicoformas diferentes de quercetina con diversas propiedades farmacológicas [10, 11]. En este contexto, el hiperósido (quercetina 3-O-galactósido) y la quercitrina (quercetina 3-O-rhamósido) (fig. 1) han ganado mucha atención como productos valiosos para la industria farmacéutica, por ejemplo, como potentes antioxidantes con efectos citoprotectores [12] [13] [14] [15] y como agentes antivirales prometedores que bloquean la replicación del virus de la gripe [16] o inhiben los virus hepatitis B [17] y SARS [18]. Además, se les han atribuido actividades antiinflamatorias [19, 20], antidepresivos [21, 22], apoptóticos [23] y antifúngicos [24], lo que las hace interesantes terapéuticas que resultan en un aumento constante de la demanda del mercado. Hasta la fecha, la mayoría de la quercetina y sus glucósidos se extraen del material vegetal, lo que generalmente es un proceso laborioso y de bajo rendimiento que requiere muchos pasos de purificación [25]. Los cultivos de plantas in vitro o plantas diseñadas pueden utilizarse para superar los bajos rendimientos y mejorar la producción [26] [27], sin embargo, dado que la ingeniería metabólica de las plantas es a la vez muy controvertida y aún en su infancia [29], este enfoque se limita a menudo a la producción a pequeña escala. Aunque la síntesis química de quercetina (glicósidos) ha demostrado ser factible [30] [31] [32], la formación estereoselectiva de enlaces glicosídicos se ve a menudo obstaculizada por la presencia de varios grupos reactivos [33], lo que requiere muchas medidas de protección y desprotección [34]. Además, la generación de residuos tóxicos y una baja atomeficiencia [35] hacen que estos procesos de producción no sean sostenibles ni económicamente viables. Como resultado, en las últimas dos décadas se han invertido enormes esfuerzos en el desarrollo de métodos de producción alternativos para estos metabolitos vegetales especializados (secundarios) [36]. Los avances en los campos de la ingeniería proteica, los sistemas y la biología sintética han acelerado estos esfuerzos para transformar organismos modelo como Escherichia coli y Saccharomyces cerevisiae en fábricas de células microbianas reales para la producción sostenible de flavon Posteriormente, también se han desarrollado estrategias para la glicosiltransferasa in vivo de flavonoides, que se basan en la sobreexpresión de glucosiltransferasas específicas, que transfieren un residuo de azúcar de un nucleótido activado a un aglicón de forma estereo y regioselectiva, así como en la ingeniería o introducción de la vía nucleótida dirigida al azúcar. De esta manera, Fig. 1 Transformación de E. coli W en una plataforma de galactosilación basada en sacarosa y rhamnosilación. La estrategia de ingeniería metabólica aplicada utiliza varias deleciones genéticas (indicadas en rojo) y sobreexpresiones de genes (indicadas en verde). Se aplica el racional de un metabolismo dividido, por el cual la sacarosa se divide por fosforilasa de sacarosa (BaSP) en fructosa para ser utilizada para el crecimiento y Esta última es una molécula pivote universal para la formación de UDP-galactosa y UDP-rhamnosa, interconversiones catalizadas por las enzimas GalE y MUM4, respectivamente. Para asegurar la producción acoplada al crecimiento, varios genes, involucrados en la metabolización de estos UDPsugars y sus precursores, fueron eliminados (mostrados en rojo). La producción de los glucósidos de quercetina bioactivos hiperósidos y quercitrina fue elegida para evaluar la versatilidad de la plataforma de producción diseñada. Por último, la introducción de los glicosiltransferasa F3GT o RhaGT garantiza la galactosilación eficiente o la rhamnosilación, respectivamente, ya se han producido varios glucósidos de quercetina en E. coli, como el 3-O-glucósido [40], el 3-O-xilosido [41] y el 3,7-O-bisrhamnosido [42], o la quercetina 3-O-(6-deoxitalosa) de nueva naturaleza [43]. Sin embargo, a pesar de estos esfuerzos de ingeniería, las tasas de producto y los títulos reportados siguen en la gama de miligramos, haciendo que estos hospedadores microbianos no sean adecuados para aplicaciones industriales. Los procesos de producción desarrollados son típicamente procesos de bioconversión bifásicos utilizando células en reposo, lo que dificulta mejorar las tasas de producción [44] Además, estos sistemas a menudo implican medios de crecimiento costosos o la adición de inductores enzimáticos, haciendo el proceso general muy costoso. Para abordar estos problemas, previamente desarrollamos una plataforma eficiente para la glucosilación de pequeñas moléculas en E. coli W [45]. Mediante la ingeniería metabólica, se creó un mutante que combina la producción de glucósidos con el crecimiento, utilizando la sacarosa como una fuente de carbono barata y sostenible. Al introducir la sacarosa fosforilasa de Bifidobacterium teennis (BaSP) la sacarosa se puede dividir en fructosa para ser utilizada con fines de crecimiento y la glucosa 1-fosfato (glc1P) para ser utilizada como precursora de la formación de UDP-glucosa (UDP-glc) (fig. 1). Para impedir la conversión de glc1P en precursores de biomasa, varios genes endógenos implicados en su metabolización, como la fosfoglucomutasa (pgm) y la glucosa-1-fosfatasa (agp) fueron eliminados. Posteriormente, el glc1P puede canalizarse eficientemente hacia UDP-glc al sobreexpresar la uridyltransferasa de Bifidobacterium bifidum (ugpA). La metabolización del UDP-glc se evita al eliminar la hidrolasa UDP-azúcar (ushA) y el operón de galactosa (galETKM). Sin embargo, en vista del papel central de UDP-glc en la producción de una gran variedad de UDP-sugars, este sistema de glucosilación se puede extender fácilmente hacia otros UDP-sugars, tales como UDP-galactosa (UDP-gal), UDPrhamnosa (UDP-rha) y UDP-glucuronato. En la presente contribución, esta plataforma basada en E. coli W basada en E. coli glucosilación se transforma en una plataforma para galactosilación y rhamnosilación (fig. 1), cuyo potencial se demuestra utilizando la galactosilación y la rhamnosilación de quercetina alimentada exógenamente que produce hiperósido y quercitrina, respectivamente, como estudio de caso. Escherichia coli W es una cepa no patógena de rápido crecimiento que tolera el estrés osmótico, las condiciones ácidas, y puede cultivarse a altas densidades celulares, lo que la convierte en un hospedador atractivo para las fermentaciones industriales [46]. Además, E. coli W es capaz de crecer con sacarosa como única fuente de carbono [46], que es una materia prima emergente para la producción de bioproductos. Por lo tanto, E. coli W fue seleccionado como hospedador para la glucosilación in vivo basada en sacarosa. Antes de la producción de los glucósidos hiperósidos y quercitrina en E. coli W, se investigó la toxicidad de su aglicón quercetina. Con este fin, la cepa de tipo salvaje (WT) se cultivaba en un medio mínimo de sacarosa que contenía diferentes concentraciones de quercetina (0, 0,15 y 1,5 g/L). Las tasas de crecimiento específicas (h −1 ) (0,96 ± 0,06, 0,92 ± 0,05 y 0,87 ± 0,06, respectivamente) no fueron significativamente diferentes (p ANOVA = 0,12) ni de la determinada previamente para el WT [45] (p = 0,69, p = 0,98 y p = 0,68, respectivamente). Por otro lado, la densidad óptica a 600 nm después de la incubación de 24 h (6,36 ± 0,12, 5,18 ± 0,16 y 4,77 ± 0,20, respectivamente) fue menor (alrededor del 20 %) cuando se añadió quercetina (p = 0,0002 y p = 0,0001). No se pudo observar diferencia significativa en la densidad óptica entre 0,15 y 1,5 g/L de quercetina (p = 0,14). En vista de lo anterior, se optó por añadir 1,5 g/L de quercetina para Para evaluar el potencial de glicosilación in vivo, las cepas sGAL1 y sRHA1, que expresan constitutivamente la flavonol 3-O-galactosiltransferasa de Petunia híbrida y la flavonol 3-O-rhamnosiltransferasa de A. taliana, respectivamente, fueron cultivadas en medio mínimo con 1,5 g/L de quercetina durante 16 h. El análisis de los sobrenadantes de ambos cultivos en el TLC produjo dos nuevos puntos amarillos del producto. La mancha de TLC obtenida del cultivo sGAL1, que tuvo el mismo tiempo de retención que el estándar hiperósido (R f = 0,5), fue posteriormente purificada y analizada. Sin embargo, el punto del producto obtenido del cultivo sRHA1 tenía un factor de retención diferente (R f = 0,55) que el estándar de quercitrina (R f = 0,74), y fue identificado como isoquercitrina (quercetina 3-O-glucósido). A diferencia de otros informes sobre cepas silvestres de tipo E. coli que expresaban RhaGT, que simultáneamente producían quercitrina (quercetina 3-O-rhamnosido) e isoquercitrina [47, 48], no se pudo detectar rhamnosido. El examen del genoma de E. coli W reveló que el grupo genético responsable de la producción endógena de dTDP-rhamnosa, que funciona como rhamnosildonante alternativo para RhaGT en E. coli B y K12 [47], no estaba presente [46, 49]. En un experimento de seguimiento, sGAL1 y sRHA1 fueron cultivados en medio mínimo con dos concentraciones diferentes (0,15 y 1,5 g/L) de quercetina. Se monitorizó el crecimiento y la formación de glucósidos durante 30 h. Los títulos finales (C p ) y las productividades específicas (q p ) se muestran en la figura 2. Cabe destacar que un aumento de la concentración de quercetina dio lugar a un aumento de dos a tres veces en la productividad y el título, lo que indica que el suministro de quercetina es limitador de velocidad y crucial para una glucosilación in vivo eficiente. Sin embargo, mientras que sGAL1 produjo hiperósidos continuamente durante la fase exponencial, lo que también se refleja en la productividad específica relativamente alta, sRHA1 sólo comenzó a acumular cantidades significativas de isoquercitrina al final de la fase exponencial. Este inicio de producción coincide con una reducción de la tasa de crecimiento específica, que bajó de 0,35 ± 0,04 a 0,06 ± 0,01 h −1. Como se describe en detalle en la sección de fondo, previamente se diseñó metabólicamente E. coli W para crear una plataforma para la glucosilación in vivo de pequeñas moléculas [45]. En la cepa de glucosilación de base original, la sacarosa fosforilasa codificada por BaSP se encontraba en un plásmido mediocopia y transcrita a partir de un promotor constitutivo medio fuerte (P22) [50]. Por razones de comparación y flexibilidad, se optó por integrar BaSP en el genoma de E. coli W. Además, la integración cromosómica es ventajosa debido a un aumento significativo de la estabilidad genética. Dado que el nivel de expresión génica puede verse considerablemente afectado por el sitio de integración del genoma [51] debido a diferencias estructurales como las regiones de ADN supercoiling, se evaluaron dos sitios de ADN diferentes para la integración de BaSP, es decir, mela y glgC, que codifican una α-galactosidasa y una glucosa-1-fosfato adeniltransferasa, respectivamente. Para ello, se aplicó un procedimiento de knockout adaptado para fragmentos de ADN grandes, que se muestra esquemáticamente en el archivo adicional 1: Figura S2. El BaSP bajo control del promotor P22 fue golpeado en los dos loci diferentes en E. coli W ΔcscAR, lo que resultó en las cepas E. coli W ΔcscAR ΔmelA::L4-P22-BaSP-L5 y ΔcscAR ΔggC::L4-P22-BaSP-L5. Su tasa máxima de crecimiento específico (μ max ) en medio mínimo de sacarosa, que se muestra en la Fig. 3, se comparó con la cepa original ΔcscAR + pBaSP. La influencia del locus tokin en la tasa máxima de crecimiento específico es clara. Interesantemente, la integración en el locus melA resultó en una cepa con un máximo de μ que no fue significativamente diferente de la cepa de referencia ΔcscAR + pBaSP. En vista de esta última y teniendo en cuenta el objetivo de producción acoplada al crecimiento, se optó por integrar BaSP en el locus melA que conduce a la cepa de base de producción final E. coli W ΔcscAR Δpgm Δagp ΔushA ΔlacZYA::P22-lacY ΔgalETKM ΔmelA::L4-P22-BaSP-L5 (sGLYC) (sGLYC) como se muestra en el cuadro 1. En la naturaleza, UDP-glc sirve como molécula pivotante en la formación de una variedad de UDP-sugars [44]. Por ejemplo, utilizando las enzimas de interconversión UDP-glucosa 4-epimerasa (GALE) y UDP-rhamnosa syntasa (MUM4) UDP-glc se puede convertir en UDP-gal y UDP-rha, respectivamente. Aunque GalE está nativamente presente en E. coli W, una epimerasa homóloga alternativa (GALE2) de B. bifidum también se seleccionó y clonó debido a la Fig. 2 Comparación de las productividades específicas de glucósidos (q p ) y títulos de glucósidos (C p ) para cepas sGAL1, que produce el 3-O-galactósido, y sRHA1, que produce el 3-O-glucósido, cuando se cultiva durante 30 h en medio mínimo que contiene 0,15 o 1,5 Las barras de error representan desviaciones estándar regulación estricta y compleja de la expresión de GalE en E. coli W. Por otro lado, la síntesis UDP-rhamnosa está restringida a las plantas. Debido a la falta del cúmulo de rfb [46] E. coli W es incluso incapaz de formar dTDP-rhamnosa endógena como donante alternativo de rhamnosil. Por lo tanto, el gen MUM4 de A. thaliana se expresó desde plásmido pMUM4 para lograr la formación de UDP-rhamnosa en E. coli (Fig. 1). Las cepas construidas de galactosilación (sGAL) y rhamnosilación (sRHA) fueron cultivadas en medio mínimo con dos niveles (0.15 y 1.5 g/L) de quercetina. El crecimiento y la producción fueron monitoreados para determinar las productividades específicas Una vez más, las concentraciones de quercetina extracelulares más altas dieron lugar a un aumento de cinco veces en q p. Sin embargo, no se observó diferencia significativa en la productividad entre sGAL2 y sGAL3 a 1,5 g/L de quercetina, lo que indica que la formación de galactosa UDP es tan eficiente con ambos homólogos GalE y no es probable que el paso limitante de la velocidad. Con sGAL3, se obtuvo la mayor productividad hiperósida (68,7 mg/g CDW/h) y título (0,94 g/L), siendo este último 3,5 veces más alto que con sGAL1. En contraste con sRA1, el análisis de TLC del sobrenadante de los cultivos de sRHA2 y sRHA3 dio lugar a un punto del producto con un factor de retención que corresponde a la quercitrina, que Se obtuvo un título de quercitrina de 1,18 g/l y una productividad específica de 47,8 mg/g CDW/h después de 30 h de incubación de sRHA3 cuando se añadió 1,5 g/l de quercetina al medio, que correspondía a una conversión del 53%. También se produjeron 51 mg/l de isoquercitrina extracelularmente, lo que corresponde a una relación de producción de quercitrina:isoquercitrina de 24:1. Esto sugiere la preferencia de RhaGT por UDP-rhamnosa cuando están presentes diferentes donantes UDP-azúcar. Posibles explicaciones para la productividad específica significativamente menor (cinco veces menor) de sRHA2 en comparación con sRHA3 son o una carga metabólica mayor [52] causada por el sistema de dos plásmidos o una actividad demasiado limitada de la GalU nativa, que podría ser Para demostrar la escalabilidad del bioproceso desarrollado, la cepa sGAL3 se cultivó en un bioreactor de 1-L, que también asegura un pH constante a 6,80 y evita la limitación del oxígeno. En la figura 5 se ofrece una visión detallada del consumo de sacarosa, crecimiento e hiperósidos. Después de una fase de retraso, la cepa mostró una tasa de crecimiento de 0,32 ± 0,02 h −1 mientras producía simultáneamente hiperósido. La productividad específica observada (65,9 ± 2,6 mg/g CDW/h) fue comparable a la obtenida en la escala del frasco de batidos. Cuando casi toda la quercetina se convirtió, la formación de hiperósidos disminuyó, lo que puede explicarse por la correlación observada entre la concentración de quercetina y q p, o por la reversibilidad reportada de F3GT [53]. Es probable que se puedan lograr mejoras adicionales en el título y la productividad optimizando el suministro de quercetina utilizando un sistema de fed-batch. Según nuestro conocimiento, los resultados obtenidos en este estudio con las cepas sGAL y sRHA para la producción de hiperósidos y quercitrina son los más altos reportados hasta la fecha tanto en términos de título como de tasa de producción. La tasa máxima de producción obtenida en esta contribución fue de 6 a 50 veces mayor que las tasas máximas de producción (r p,max ) de los procesos reportados en la literatura [47, 54], como se ilustra en la Fig. 6. El aumento del rendimiento, en términos de título y productividad, obtenido con la plataforma desarrollada, puede atribuirse al uso de un metabolismo dividido en combinación con un desvío óptimo del flujo de glucosa 1-fosfato hacia UDP-galactosa y UDP-rhamnosa. La conversión no deseada de los azúcares activados en biomasa Fig. 3 Efecto del locus de integración cromosómica de la knokin de BaSP sobre la tasa de crecimiento. Las cepas fueron cultivadas en frascos de batido y las tasas de crecimiento máximas resultantes (μ max ) fueron comparadas con E. coli W ΔcscAR con expresión BaSP a base de plásmido (+pBaSP). Las barras de error representan desviaciones estándar se ve obstaculizada por deleciones genéticas, lo que garantiza un alto rendimiento del producto. Además, ya que la formación de biomasa, alimentada por la fracción fructosa de sacarosa, y la síntesis de glucósidos van de la mano y posteriormente se realizan al mismo tiempo a una alta tasa, una alta productividad está igualmente garantizada (proceso de fermentación en un solo paso). Además de quercetina también otros flavonoles como el kaempferol, fisetina, morina y miricetina contribuyen significativamente a nuestra ingesta diaria de flavonoide, que también tienen efectos beneficiosos muy diversos [55, 56]. Como la moiedad del azúcar es un importante determinante de la absorción intestinal de los flavonoides dietéticos y su posterior bioactividad [57, 58], las cepas sGAL3 y sRHA3 fueron cultivadas en tubos con un medio mínimo de 5 mL, cada uno conteniendo 1,5 g/L de kaempferol, miricetina, morina o fisetina. El crecimiento y la producción fueron monitoreados a lo largo de 48 h y varios puntos fueron observados en TLC con factores de retención similares como hiperósido y quercitrina. Se utilizó espectrometría de masas para identificar los compuestos producidos, lo que confirmó la galactosilación in vivo de miricetina, kaempferol, morina y fisetina (Tabla 2 ). Todos los compuestos ocurrieron con una m/z de [M + 114], debido a la complejidad con ácido trifluoroacético de la fase móvil. El galactosido de morina se produjo a un ritmo lento, lo que está de acuerdo con la muy baja actividad in vitro de F3GT hacia este flavonol [53]. Una posible explicación de esta actividad limitada puede ser la presencia de un grupo hidroxilo inusual en la posición 2′, que puede obstaculizar estericamente la deprotonación y la consiguiente galactosilación de morina en el grupo hidroxi 3 [59]. La incubación de sRHA3 con los diferentes flavonoles investigados mostró dos puntos glucósidos distintos en el TLC, que correspondían al 3-O-rhamnosido y al 3-O-glucósido. Kaempferol demostró ser el mejor sustrato para RhaGT y fue predominantemente rhamnosilado (8:1 ratio), con un título superior a 400 mg/L, que es dos veces superior a lo reportado anteriormente [47]. Fisetin por otro lado fue eficientemente glucosilado, sin embargo la formación de su rhamnosilado no fue tan eficiente, con un título inferior a 5 mg/L. También se observó una preferencia similar hacia la formación de glucósidos con mirictina y morina, lo que indica que el posicionamiento de los grupos hidroxilo es el factor determinante para la glucosilación con Rha La producción de los rhamnosidos, galactósidos o glucósidos deseados puede mejorarse considerablemente utilizando UGTs más específicos para ciertos flavonols y UDP-sugars. La transformación de los UGTs correspondientes en las cepas de glicosilación in vivo desarrolladas presenta una alternativa prometedora para la producción a gran escala de varias glicoformas de flavonol, que hasta la fecha se extraen principalmente del material de la planta. Por otro lado, debido al papel central de UDP-glc, se pueden formar varios otros UDP-sugars in vivo (por ejemplo, UDP-glucuronato, UDP-xilosa, UDP-arabinosa). En combinación con la modularidad de la plataforma de glucosilación desarrollada, que permite la introducción rápida de cualquier vía UGT o UDP-sugar, prácticamente Por lo tanto, esto demuestra que la plataforma microbiana propuesta es una fábrica de células microbianas robusta, versátil y eficiente para la glicosilación (por ejemplo, glucosilación, rhamnosilación, galactosilación) de moléculas pequeñas. Aunque las productividades obtenidas son las más altas reportadas hoy en día y compiten con los procesos de producción actuales, la mejora adicional puede ser limitada debido a problemas de solubilidad del aglicón o del glucósido. Para este fin la investigación de seguimiento puede centrarse en la ingeniería metabólica adicional (por ejemplo, la introducción de la vía aglicón que permite la producción in vivo gradual del aglicón) o en la optimización del proceso [por ejemplo, la fermentación de 2 fases (bicapas) que permite la recuperación in situ] para mejorar estos problemas. En esta contribución, se desarrolló una plataforma biotecnológica para la galactosilación y rhamnosilación de moléculas pequeñas, tales como productos secundarios de metabolitos naturales, a partir de un huésped de glucosilación previamente creado. Para este fin, se introdujeron las rutas para convertir la UDP-glucosa en UDP-galactosa y UDP-rhamnosa, respectivamente. Como prueba de concepto, se seleccionó la flavonol quercetina bioactiva para galactosilación y rhamnosilación, produciendo hiperósido (quercetina 3-O-galactósido) y quercitrina (quercetina 3-O-rhamnosido), respectivamente. A continuación, la flavonol 3-O-galactosiltransferasa (F3GT) de Petunia híbrida y la flavonol 3-O-rhamnosiltransferasa de Arabidopsis thaliana (RhaGT) fueron sobreexpresadas en los mutantes de E. coli W de ingeniería metabólica. Las cepas creadas fueron capaces de producir 940 mg/L de hiperósido y 1176 mg/L de quercitrina a tasas específicas de producción de 68,7 mg/g de CDW/h y 47,8 mg/g de CDW/h, respectivamente, que son las más altas reportadas hasta la fecha. Curiosamente, ambos GT mostraron actividad in vivo hacia otros flavonoles dietéticos, por lo que por ejemplo, más de 400 mg/L de kaempferol 3-O-rhamnosido Todos los plasmidos utilizados fueron construidos utilizando el ensamblaje de Gibson [60] o CLIVA [61]. Todos los fragmentos de PCR fueron amplificados utilizando polimerasa Q5 de New England Biolabs (Ipswich, Massachusetts). Oligonucleótidos fueron comprados a IDT (Leuven, Bélgica). Los plasmidos y cepas bacterianas utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla 1. Una lista de imprimaciones para la creación de knockouts/knockins de genes y para la clonación de los plasmidos de expresión se da en el archivo adicional 2: Tabla S1. E. coli DH5α se utilizó para clonación y propagación de plasmidos, mientras que E. coli W se utilizó para la expresión de los plasmidos de producción y la creación de knockouts y knockins de genes El hiperósido, la quercitrina, la isoquercitrina, el kaempferol y la miricetina fueron comprados a Carbosynth (Berkshire, Reino Unido). Todas las demás sustancias químicas utilizadas fueron compradas a Sigma Aldrich (Alemania) a menos que se indique lo contrario. La expresión plásmidos para la prod uction del hiperósido y la quercitrina se construyeron como se describe en el archivo adicional 3: Figura S1A Figura S1D ). Las secuencias galE [Genbank: JW0742] y galE2 [Genbank: KJ543703] fueron amplificadas a partir del ADN genómico de E. coli y Bifidobacterium bifidum, respectivamente. El conjunto CLIVA resultó en el plásmido intermedio pBaSP/F3GT/UgpA (Figura S1A ), que posteriormente fue utilizado para la amplificación de la columna vertebral F3GT/UgpA. El ensamblaje Gibson de los insertos GalE o GalE2 con esta columna vertebral resultó en los plásmidos de galactosilación final pGalE/F3GT/UgpA y pGalE2/F3GT/UgpA, respectivamente (Figura S1B ). Del mismo modo, MUM4 y RhaGT fueron introducidos utilizando un ensamblaje Gibson de 3 piezas (Figura S1C ), resultando en el plásmido final rhamnosylation pMUM4/RhaGT/UgpA. Los mutantes de knockout E La estrategia para la integración cromosómica de BaSP bajo control del promotor constitutivo P22 flanqueado por L4 y L5 en los loci mela y glgC se describe y explica en el archivo adicional 1: Figura S2. Los transformadores se plasmaron en placas de agar medio de sacarosa mínima y se cultivaron durante la noche para su cribado. La cepa interna E. coli W ΔcscAR Δpgm Δagp ΔushA ΔlacZYA:::P22-lacY ΔgalETKM [45] se utilizó para la integración cromosómica de L4-P22-BaSP-L5 en el sitio melA, produciendo la cepa base sGLYC (Tabla 1). Esta cepa y el tipo silvestre E. coli W se transformaron con los plásmidos de producción descritos anteriormente, resultando en las cepas galactosilación (sGAL) y rhamnosilación (sRA) indicadas en el cuadro 1. La composición de LB y medio de sacarosa mínimo se describió previamente [45]. Las placas de agar medio mínimo con sacarosa (50 g/L) tenían la misma composición que el medio de sacarosa mínimo, pero contenían además 15 g/L de agarosa. La agarosa y las sales se autoclavearon por separado a 121 °C durante 21 min. La sacarosa fue filtrada esterilizada a través de un filtro de cornización de 0,22 μm (Fisher, Bélgica) y calentada durante 1 min en un horno de microondas a 800 W antes de mezclarla con la agarosa caliente y las soluciones de sal. Antes de verter las placas se añadió estérilmente 1 mL/L de solución mineral [45]. Se cultivaron precultivos mutantes Escherichia coli W en medio LB de 5 mL con los antibióticos (50 μg/mL de kanamicina o carbenicilina) necesarios para el mantenimiento y selección de los plásmidos. Los cultivos se cultivaron durante 16 h a 37 °C y 200 rpm y se utilizaron para la inoculación del 2 % de 100 mL de medio mínimo de sacarosa en matraces de agitación de 500 mL. Para la producción de hiperósidos y quercitrina, se añadió quercetina al medio mínimo a una concentración de 0,15 o 1,5 g/L. Las condiciones de crecimiento fueron las mismas que se habían descrito anteriormente [45]. Las muestras se tomaron a intervalos regulares del caldo y, tras la centrifugación, Para el análisis de quercetina y sus glucósidos, se recogieron 200 μL del cultivo y se extrajeron con acetato de etilo de 800 μL. La capa orgánica fue recolectada, evaporada en un concentrador de vacío SpeedVac TM (Thermo Fisher, USA) y disuelta en 200 μL de DMSO para la cuantificación de HPLC. Las condiciones de montaje y fermentación del biorreactor son las mismas que se han descrito anteriormente [45]. Los experimentos de producción se realizaron en medio mínimo de sacarosa sin amortiguador MOPS y con la adición de quercetina como aceptor. Las muestras de cultivo fueron analizadas principalmente por TLC en placas prerevestidas de gel de sílice 60 F 254 (Merck, Alemania). Todas las placas fueron ejecutadas en una cámara de TLC cerrada y desarrolladas utilizando técnicas y agentes de visualización estándar: fluorescencia UV (254 nm) o por tinción con 10 % (v/v) H 2 SO 4 y posterior carbonización. La fase móvil para la detección de los diversos flavonols y glucósidos correspondientes consistió en un acetato de etilo:ácido acético:ácido formínico:agua (100:11:11:27 v/v) mezcla [63]. Las intensidades puntuales del producto de otros glucósidos de flavonol fueron procesadas y cuantificadas utilizando ImageJ [64]. La cuantificación HPLC de sacarosa, fructosa y glucosa se realizó utilizando una columna Amida de puente X (35 μm, Waters, USA) como se describió anteriormente [45]. Quercetina, hiperósido, [41] utilizando un sistema Varian HPLC (Tecnologías Agilent, California). La espectrometría de masas para la determinación de los diversos glucósidos de flavonol se realizó con un Quattro LC de Micromasa (McKinley Scientific, EE.UU.). La detección se realizó en modo negativo ESI-224 MS con una tensión capilar de 2,53 kV, una tensión cono de 20 V, flujos de gas cono y desintoxicación de 93 y 420 L/h, y temperaturas de fuente y cono de 150 y 350 °C, respectivamente. Los glucósidos de Quercetina se extrajeron del caldo con un volumen igual de acetato de etilo después de lo cual la capa orgánica fue evaporada a sequedad. La banda que contiene hiperósido (R f 0.53) o quercitrina (R f 0.75) fue raspada, extraída con acetato de etilo y evaporada para producir un polvo amarillo brillante. Los productos fueron confirmados por NMR. Se notificaron espectros en otros lugares [47, 65].

¿Qué características tiene la glicosilación en los flavonoides?

Clara Cell 10 kDa Protein Alivia la cepa del virus de la hepatitis murina 3-Hepatitis fulminante inducida por la inhibición de la proteína fibrinógena 2 Expresiónhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6300492/SHA: f0c2cd2793d71f1ea11a810442a2c06d5013e899Autores: Yu, Haijing; Liu, Yang; Wang, Hongwu; Wan, Xiaoyang; Huang, Jiaquan; Yan, Weiming; Xi, Dong; Luo, Xiaoping; Shen, Guanxin; Ning, QinFecha: 2018-12-13DOI: 10.3389/fimmu.2018.02935Licencia: cc-by Las células Kupffer, la mayor población de células inmunes involucradas en las respuestas inmunes innatas, se consideran centrales para la FH. La proteína 2 de tipo fibrinógeno (Fgl2) es una proteína procoagulante que se induce sustancialmente en los macrófagos después de la infección viral, y el agotamiento de Fgl2 reprime la cepa 3 del virus de la hepatitis murina (MHV-3). La proteína Clara 10 kDa (CC10) es una proteína secreta con propiedades antiinflamatorias en la rinitis alérgica y el asma. Sin embargo, sus mecanismos de acción y funciones patogénicas en otras enfermedades siguen sin estar claros. En este estudio, nuestro objetivo fue determinar el papel de la CC10 en la FH y la regulación de la Fgl2 por la CC10. Métodos: Se estableció un modelo FH de ratón mediante inyección peritoneal de MHV-3. Se examinó la tasa de supervivencia, la función hepática, la histología hepática, la deposición de fibrina y la necrosis; se investigó el efecto regulador de la CC10 sobre la expresión de Fgl2 utilizando células TPH-1 y macrófagos peritoneales de ratón in vitro. Resultados: En el modelo FH del ratón inducido por MHV-3, la tasa de supervivencia aumentó de 0 a 12,5% en el grupo CC10 en comparación con la del grupo control exclusivo de la solución salina; mientras tanto, los niveles de ALT y AST en suero disminuyeron significativamente y se redujo el daño hepático; además, la expresión hepática Fgl2, TNF-α e IL-1β fue claramente desregulada junto con la deposición de fibrina, y la apoptosis hepatocítica se redujo después de la administración de proteína CC10. In vitro, se encontró que CC10 inhibe significativamente la expresión de Fgl2 en las células tratadas con IFN-γ TPH-1 y los macrófagos peritoneales del ratón infectados por MHV-3 por Western blot y PCR en tiempo real. Sin embargo, no hubo interacción directa entre CC10 y Fgl2 como se demostró por coinmunoprecipitación. Investigaciones de microarray sugieren que el factor de transcripción HMG-box 1 (HBP1) fue significativamente bajo en las células tratadas con CC10 y con IFN-γ-primed THP-1. El tratamiento con HBP1-siRN abrogó el efecto inhibidor de CC10 sobre la expresión de Fgl2 en las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs). Conclusión:CC10 protege contra la FH inducida por MHV-3 Estos efectos pueden ser mediados por el factor de transcripción HBP1. Texto: Hepatitis Fulminante (FH) es una enfermedad grave que amenaza la vida caracterizada por necrosis hepatocitica masiva, daño hepático severo y alta mortalidad. Los mecanismos subyacentes y la patogénesis de la FH no son claros. Sin embargo, la acumulación de evidencia sugiere que, independientemente de la patogénesis de la FH, las respuestas inflamatorias del huésped contribuyen a los trastornos microcirculatorios hepáticos y lesiones. En consecuencia, se ha demostrado que la activación celular inmune y las citocinas inflamatorias juegan un papel importante en la FH (1). En los últimos años, nuestro laboratorio ha llevado a cabo una extensa investigación sobre la patogénesis de la FH y encontró que las células inmunes desempeñan un papel clave en ella. Las células Kupffer, las células asesinas naturales (NK) (2, 3), los linfocitos T citotóxicos (LCT) y las células T doblemente negativas (DNT) (4) (5) (6) en el hígado y las citocinas producidas por estas células causan daño hepático. Protrombinasa Fgl2 pertenece a la superfamilia fibrinógena y es producida por macrófagos activados o células endoteliales, transformando la protrombina directamente en trombina, con el fin de iniciar rápidamente el proceso de coagulación. Esto promueve la conversión del fibrinógeno en fibrina, dando lugar a trombosis (7) (8) (9) (10) (11) (12). Nuestro estudio encontró que la Fgl2 se expresaba altamente en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y en tejido hepático de humanos o ratones con hepatitis viral grave, y estaba relacionada positivamente con La terapia génica dirigida al silenciamiento de Fgl2 mostró que la tasa de supervivencia de los ratones de hepatitis fulminante aumentó de 0 a 33,3% (15). Hasta el momento, el descubrimiento y la investigación relacionada con Fgl2 han proporcionado nuevas ideas sobre el mecanismo molecular de la necrosis hepatocitica en la HF. En vista del importante papel de Fgl2 en la hepatitis viral grave, las investigaciones sobre la regulación de Fgl2 serán beneficiosas en la búsqueda de nuevas estrategias para el tratamiento de la hepatitis grave. La proteína Clara 10 kDa (CC10), también considerada como uteroglobina, proteína secretora de células Clara, es uno de los miembros de la superfamilia de la secretoglobina. Expresada en células epiteliales mucosales de órganos (incluyendo pulmones y nariz) que se comunican con el mundo exterior (16). CC10 tiene efectos inmunomoduladores y anti En comparación con ratones de tipo salvaje, los ratones CC10-knockout mostraron inflamación excesiva de las vías respiratorias Abreviaturas: FH, hepatitis fulminante; MHV-3, cepa 3 del virus de la hepatitis murina; Fgl2, proteína 2 similar a la fibrinógeno; CC10, proteína de la célula Clara 10 KDa; ALF, insuficiencia hepática aguda; PFU, unidades formadoras de placa; PBS, solución salina fosfato-buffered; ALT, alanina aminotransferasa; AST, aspartato aminotransferasa; PCA, actividad procoagulante; HRP, peroxidasa de rábano; TUNEL, etiquetado final de la desoxinucleotidil transferasa dUTP. causado por reacción alérgica e infecciones bacterianas y virales (17). Los niveles reducidos de CC10 están asociados con enfermedades inflamatorias y alérgicas de las vías respiratorias, incluyendo sinusitis, asma y rinitis alérgica (18) (19) (20) (21). Estudios previos y artículos publicados muestran que la proteína CC10 no sólo puede inhibir las respuestas celulares Th17 al inhibir la expresión de moléculas relacionadas de células dendríticas y citocinas en ratones con rinitis alérgica, sino que también puede inhibir el quitosano-3 como la proteína 1 (22, 23). Además, CC10 inhibe la expresión de un importante regulador inmune, osteopontina (OPN), en modelos de rinitis alérgica (21). En este estudio, investigamos el papel de CC10 en la cepa 3 del virus de la hepatitis (MHV-3) FH inducida en ratones y exploramos si la proteína CC10 podría regular Fgl2 en el proceso de la enfermedad. Las hembras de ratones BALB/cJ (Shanghai Shilaike Animal Seed Center, Shanghai, China), de 6-8 semanas de edad, con un peso corporal de 18,0-20,0 g, se mantuvieron en el Hospital Tongji con alimentos y agua. Los ratones se dividieron en dos grupos: grupo CC10 (grupo experimental) y grupo salino fosfatado (PBS) (grupo de control). Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con las recomendaciones de las directrices de los Institutos Nacionales de Salud y el Comité de Experimentación Animal del hospital Tongji. Este estudio fue revisado y aprobado por el Comité de Experimentación Animal del hospital Tongji. La línea de células monocíticas humanas TPH-1 fue adquirida en el Instituto Celular de la Academia China de Ciencias (Shanghai, China). La línea celular de ovario de hámster chino (CHO) fue adquirida del banco celular típico de la comisión de preservación del cultivo, la Academia China de Ciencias (Shanghai, China). Las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) y las células CHO fueron cultivadas en el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM), y las células THP-1 se mantuvieron en el RPMI 1.640 que contenían 10% de suero fetal inactivado por calor (FBS, Gibco Life Technologies, EE.UU.), 100 U/ml penicilina y 100 mg/ml estreptomicina y cultivadas a 37 • C, 50 mL/L CO 2 y 95% de humedad. Los macrófagos exudativos peritoneales (PEM) se obtuvieron de ratones BALB/cJ. Las células fueron resuspedidas en RPMI 1.640 suplementadas con un 10% de FBS en 1-2 × 10 6 células/ml en una placa de 6 pozos e incubadas durante 4 h. Luego fueron lavadas con RPMI 1640 células medias y no adherentes desechadas. Las células adherentes fueron macrófagos y fueron incubadas durante 12 h. Los macrófagos exudativos peritoneales (PEM) se dividieron en dos grupos. Un grupo fue complementado con proteína CC10 (150 ng/ml) y en el otro grupo se añadió PBS. Después de 2 h de estimulación, se agregaron 1.000 unidades formadoras de placa (PCU) de MHV-3 a las células, que luego fueron cultivadas durante 4 h. Se recolectaron macrófagos exudativos peritoneales (PEM) y se lis La apoptosis celular fue detectada por el método terminal de desoxinucleotidil transferasa dUTP nick end labeling (TUNEL) con un kit de detección de apoptosis TUNEL (Roche, Suiza). Brevemente, 5 secciones de μm fueron desparafinadas, deshidratadas a través de una serie de alcoholes e incubadas con proteinasa K durante 30 minutos a 37 • C. Después de detener la reacción digestiva proteinasa K con PBS, las muestras fueron incubadas con un cóctel terminal de desoxinucleotidil transferasa (una mezcla de desoxinucleotidil transferasa terminal y dUTP a razón de 2:29, respectivamente), durante 2 h a 37 • C en una caja húmeda inmunohistoquímica. Después del lavado y bloqueo, cada sección fue complementada con reactivo (converter-POD) para cubrir los tejidos e incubada durante 30 minutos a 37 • C en una caja húmeda. Luego, las secciones de tejido hepático fueron lavadas con PBS, y coloreadas con diaminobencidina (DAB) posteriormente. Los hepatocitos con núcleo teñido de amarillo parduzco fueron considerados como células apoptóticas. La expresión de Fgl2 en células TPH-1 fue medida por citometría de flujo (BD FACS Canto II, EE.UU.). Brevemente, las células (2 × 10 5 por tubo) fueron incubadas con anticuerpo humano TruStrain FcX (solución Fc Receptor Blocking, BioLegend, EE.UU.) durante 10 minutos a temperatura ambiente y luego incubadas en la oscuridad con anticuerpo anti-Fgl2 del ratón (1:100, Abnova,) o suero de cabra normal (control de isotipo) a 4 • C durante 40 min. Las células fueron lavadas con PBS e incubadas en la oscuridad con anticuerpo anti-IgG de cabra conjugado con PE (1:50, BioLegend, EE.UU.) a 4 • C durante 30 min. Las células fueron luego lavadas con PBS y resucitadas en 300 μL PBS para estudio. La inmunohistoquímica de los tejidos hepáticos se realizó utilizando los kits SP-9001 SPlink Detection Kits (Biotin-Streptavidin HRP Detection Systems) (ZSGB-BIO, Beijing, China) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la tinción inmunohistoquímica, se detectó la expresión de Fgl2, fibrinógeno, Fas y TNF-receptor 1 en tejidos hepáticos de ratón con anticuerpo antimouse Fgl2 de conejo policlonal (1:100, Proteintech, EE.UU.), anticuerpo antimouse fibrinógeno de conejo policlonal (1:1.000, Abcam, EngLand), anticuerpo antimouse Fas de conejo policlonal (1:50, Abcam, EngLand), y anticuerpo antimouse TNF-receptor 1 de Después de la incubación con una fracción IgG de cabra marcada con rábano peroxidasa (HRP) a conejo IgG Fc, la proteína diana fue detectada usando un kit de DAB (ZSGB-BIO, Beijing, China). Las diapositivas fueron entonces contrapuestas con hematoxilina y visualizadas bajo un microscopio (Olympus, Tokio, Japón). El tejido hepático y las células fueron homogeneizados en el tampón de lisis RIPA con inhibidor de la proteasa de fenilmetano fluoruro de sulfonilo (PMSF). Los lisatos proteicos fueron separados por SDS-PAGE, y el Western Blotting fue realizado usando un ratón monoclonal antihumano/ratón Fgl2 (1:750, Abnova), un ratón monoclonal antihumano HBP1 (1:100, Santa Cruz, EE.UU.), y un conejo monoclonal antihumano/ratón β-actina (1:1,000, Cell Signaling Technology, EE.UU.). Los tejidos hepáticos fueron recolectados de ratones BALB/cJ infectados por MHV-3 a 72 h, y el ARN total fue extraído usando Reagent Trizol (Invitrogen, EE.UU.) y luego transcriptado en cDNA mediante ReverTra Ace qPCR RT kit (TOYOBO, Japón). PCR cuantitativo en tiempo real (qPCR) con SYBR Green PCR Master Mix en tiempo real (TOYOBO, Japón) se realizó utilizando un sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96 (Bio-Rad, EE.UU.) y los niveles de ARNm se normalizaron con referencia a los del gen de mantenimiento doméstico GAPDH. Las secuencias iniciales para la amplificación de qPCR fueron las siguientes: mTNF-α hacia adelante, 5 ′ -TTT GAG ATC CAT GCC GTT-3 ′ ; mTNF-α hacia atrás, 5 ′ -GCCA CCA CCA CCA CCA TCT TCT GT-3 ′ ; mil-1β hacia adelante, 5 ′ -TGT AAT GAA AGA CGC ACC-3 ′ ; mil-1β hacia atrás, 5 ′ -TCT TCT TTG GGT ATT GCT TG-3 ′. mFgl2 hacia adelante, 5 ′ -GCC AAA TGT GAG TCC CTG GAA-3 ′ ; mFgl2 hacia atrás, 5 ′ -TTC CAC CCA AGA GCA CGT TTA AG-3 ′ ; hFgl2 hacia adelante 5 ′ -ACA GTT CAG GCT GGT GGT-3 ′ ; hFgl2 hacia atrás, 5 ′ -GGC TTA AAG TGC TTG GGT-3 ′ ; HBP1 hacia adelante, 5 ′ -TGA AGC AGA AGC TGGG GAGT-3 ′ ; células HBP1 hacia atrás, THP-1 fueron tratadas con 100 ng/ml de forbol 12-miritato 13-acetato (PMA) (Sigma, EE.UU.) El grupo CC10 fue complementado con proteína CC10 (150 ng/ml). Después de 2 h de estimulación, se añadió IFN-γ (10 ng/ml) a estas células, que luego fueron cultivadas durante 12 h antes de ser recolectadas para estudios de borrado occidental y PCR en tiempo real. Las células de ovario de hámster chino (CHO) fueron cultivadas en platos de cultivo celular de 10 cm con DMEM complementado con 10% FBS hasta 80-90% confluencia. A continuación, 12 μg pcDNA3.1-hFgl2 (construido en nuestro laboratorio) fue mezclado con 12 μg pcDNA3.1-hCC10 en DMEM libre de suero. La mezcla fue luego combinada con Lipofectamine 2.000 (Invitrogen, EE.UU.) y mezclada suavemente. Después de la incubación a 27 • C durante 20 min, la solución fue añadida a las células CHO e incubada a 37 • C en 5% CO 2. Cuatro a seis horas después de la transfección, se eliminó el medio y se añadió un medio fresco con un 10% de FBS. A las 48 h después de la transfección, las células fueron recolectadas para el análisis de co-inmunoprecipitación para evaluar la interacción de CC10 con Fgl2. Las células HUVEC y TPH-1 expresan fgl2. Sin embargo, en los experimentos de transfección es difícil transfectar las células THP-1 con siRNA, por lo que utilizamos HUVEC en lugar de THP-1. Las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) fueron cultivadas en FIGURE 1 proteína CC10 aumentaron la tasa de (A) La tasa de supervivencia del grupo CC10 es mayor que el grupo control compuesto por ratones BALB/cJ infectados por MHV-3 tratados con solución salina. La proteína CC10 (2 μg) o solución salina se inyectaron en ratones por vena de cola. Los ratones BALB/cJ recibieron 100 UFP de MHV-3 intraperitonealmente 24 h más tarde para desarrollar hepatitis viral fulminante. Luego, la proteína CC10 (2 μg) o solución salina se inyectaron en ratones por vena de cola después de la infección por MHV-3 24 h más tarde. La tasa de supervivencia se observó durante 10 días (n = 24/grupo). Se muestran los datos representativos de tres experimentos independientes. La curva de supervivencia se analizó mediante la prueba Log-Rank. ***P < 0,001 en comparación con el grupo salino. (B) Se evaluó la histopatología de los tejidos hepáticos (manipulación de H&E; aumento original, ×400, n = 5/grupo) a 72 h de infección post-MHV-3 en los dos grupos de ratones BALB/cJ infectados por MHV-3. Se recogieron hígados de los tratados con salino (a) y CC10 (b) de los ratones BALB/cJ a 72 h después de infección por MHV-3. Las flechas apuntan a áreas de infiltración celular inflamatoria o regiones necróticas con inflamación. (C) Efecto de CC10 en los niveles séricos de ALT y AST (n = 6-8/grupo). Los valores representan el medio y el error estándar de tres experimentos independientes realizados en triplicado. **P < 0,01 en comparación con el grupo salino. 50 pmol HBP1-siRNA se mezcló con 125 μl libres de suero DMEM. Dos microlitros Lipofectamina 2.000 se mezclaron suavemente con DMEM libre de suero. Después de la incubación a 27 • C durante 5 min, la solución se añadió a HUVEC e incubada a 37 • C. Cuatro horas después de la transfección, se eliminó el medio y se añadió un medio fresco con 10% de FBS. A las 48 h después de la transfección, se recolectaron células para PCR en tiempo real y análisis de manchas occidentales para evaluar los efectos de HBP1 en Fgl2. A las 24 h después de la transfección, el grupo CC10 fue complementado con la proteína CC10 (150 ng/mL). Después de 4 h de estimulación, se añadió IFN-γ (10 ng/mL) a estas células. Estas células fueron cultivadas durante 24 h antes de ser recolectadas para estudios de PCR en tiempo real para evaluar los efectos de CC10 sobre Fgl2 por HBP1. El control negativo fue utilizado como control. Para detectar si había una interacción potencial entre la proteína CC10 y Fgl2, las células CHO fueron transfectadas con pcDNA3.1-hCC10 y pcDNA3.1-hFgl2 durante 48 h. Las células transfectadas con plásmido vacío pcDNA3.1 (mock) fueron utilizadas como controles negativos para la transfección del gen CC10. La inmunoprecipitación e inmunoblotación fueron realizadas utilizando Pierce Co-Immunoprecipitation Kit (Pierce, EE.UU.). Las proteínas celulares totales fueron extraídas como se describió anteriormente (25). Las proteínas fueron inmunoprecipitadas por anticuerpo Fgl2 antihumano Para los experimentos de coinmunoprecipitación, el Western bloting se realizó usando tanto anticuerpo anti-uteroglobina humana de rata/SCGB1A1 (1:750, R&D, USA) Frontiers in Immunology www.frontiersin.org y anticuerpo anti-humano Fgl2 de ratón (1:500, Abnova). El control isotipo de rata IgG1 fue utilizado como control negativo de anticuerpos primarios. El gen de la región de codificación CC10 humana, incluyendo una secuencia de 389 bp, fue amplificado a partir de tejido turbinado humano homogenizado por RT-PCR. En este estudio, las secuencias de los imprimadores PCR para CC10 fueron las siguientes: hCC10-forward, 5 ′ -CCC TCC ACC ATG AAA CTCG-3 ′ ; hCC10-reverse, 5 ′ -TGA GAT GCT TGT GGT TTA TTG AAG-3 ′. Los productos PCR fueron clonados en el vector de clonación peasy-T1 (TransGEN, Beijing, China) y luego subclonados en HindIII/XbaI sitio de pcDNA3.1 vector (Invitrogen, EE.UU.) para formar plasmidos de expresión eucariótica pcDNA3.1-hCC10. El análisis de microarray se utilizó para detectar cambios en los patrones de expresión génica de todo el genoma en células TPH-1 con o sin proteína CC Los cambios en más de 47,000 patrones de expresión génica humana fueron evaluados utilizando microarrays del gen Affymetrix (Genoma Humano U133 Plus 2.0) (CapitalBio Co.,Ltd., Beijing, China). Se utilizaron tres réplicas para el análisis de microarrays. Los datos obtenidos de los experimentos se expresan como promedio ± SEM. Se realizaron comparaciones de curvas de supervivencia con la prueba Log Rank. Se evaluaron múltiples análisis de grupos para los datos mediante análisis de varianza de un solo sentido. Se realizaron análisis de dos resultados de grupo utilizando la prueba t de Student para evaluar la significancia estadística de las diferencias. Valores de P < 0,05 indicaron significancia. Para establecer un modelo animal de ratón FH, MHV-3 fue inyectado intraperitonealmente a ratones BALB/cJ (24 ratones/grupo). Para seguir estudiando el papel de la CC10 en la FH, se administró la proteína CC10 del ratón recombinante (2 μg/ratón) o solución salina en la vena de la cola 24 h antes de la infección por MHV-3, la misma dosis de proteína CC10 o solución salina se administró 24 h más tarde, se observó la tasa de supervivencia de los grupos CC10 y salina durante 10 días, los resultados mostraron que los ratones de los dos grupos comenzaron a morir a las 48 h después de la inyección de MHV-3 y mostraron síntomas de horripilación, actividad lenta y reducción del consumo de alimentos; en el grupo CC10 24 ratones estaban vivos el día 3 después de la infección, 4 ratones vivos el día 4 y 3 de 24 (12,5%) ratones recuperados de hepatitis viral fulminante; al mismo tiempo, en el grupo tratado con solución salina, había 5 ratones vivos el día 3, 1 ratones vivos Es decir, los ratones del grupo salino murieron en 3 ó 4 días. Tres de los 24 (12,5%) ratones del grupo CC10 recuperados de hepatitis viral fulminante (Figura 1A). Para comprender mejor los mecanismos subyacentes a los efectos biológicos de la proteína CC10, se realizó la función hepática (niveles de ALT y AST en suero) y la histología hepática en ratones de VHM-3-infectados. Los tejidos hepáticos fueron recolectados 72 h después de la infección por VHM-3, y la histología hepática fue detectada por tinción H&E. Estos resultados mostraron que hubo infiltración celular inflamatoria sustancial y necrosis generalizada de hepatocitos en el tejido hepático de ratones del grupo salino (Figura 1Ba ). Hubo células inflamatorias raras o no infiltradas, y pocas o ninguna necrosis hepatocitica en los hígados de ratones en el Se observaron niveles séricos de ALT y AST en ratones 72 h después de la infección por MHV-3. Los resultados mostraron que los niveles séricos de ALT y AST en el grupo salino alcanzaron un pico 72 h después de la infección por MHV-3, pero no hubo un aumento significativo en el grupo CC10 en comparación con los niveles en el grupo control (P < 0,01, Figura 1C). Estos resultados sugieren que la proteína CC10 tiene un papel en la protección contra la lesión hepática inducida por MHV-3 en ratones. Para dilucidar aún más los mecanismos de reducción de la lesión hepática después de la inyección de proteína CC10, se investigó la expresión de citocinas TNF-α e IL-1β. Debido a que estas dos citocinas juegan un papel crucial en el daño hepático de la FH. Se caracterizan por un aumento de la apoptosis. Los niveles de TNF-α e IL-1β en los tejidos hepáticos se redujeron notablemente en el grupo CC10 (como se muestra en la Figura 2A). La apoptosis hepática (Figura 2B ) se redujo significativamente en el grupo CC10. Nosotros y los colaboradores tenemos un interés de larga data en estudiar el papel de fgl2 en la hepatitis viral. Fgl2 ha sido verificado para jugar un papel esencial en la progresión de la hepatitis viral fulminante como apreciamos de informes anteriores. Hemos proporcionado cifras de patología hepática y función hepática para ratones infectados por MHV-3 con un knockout genético fgl2 como se muestra en la Figura 1 suplementaria. Los datos fueron comparables con informes anteriores de nuestro centro y colaboradores. A partir de este estudio actual se demostró que la CC10 juega un papel protector en el daño hepático.Para estudiar las moléculas relacionadas de la CC10 en ratones MHV-3 inducidos por FH, se evaluó si había interconversación entre Fgl2 y CC10. Se encontró que la expresión de Fgl2 en el hígado de ratones se redujo 72 h después de la infección por MHV-3 y el tratamiento con proteína CC10 (Figuras 3A,B). Además, la deposición de fibrina, un indicador de lesión hepática asociado con la expresión Fgl2 en la FH, también se redujo en los hígados de ratones tratados con CC10 en comparación con la de control (Figura 3C ), lo que indica que el tratamiento con CC10 redujo la lesión hepática después de la infección viral al inhibir la expresión Fgl2. Se examinó el efecto del aumento de dosis de proteína CC10 (0, 50, 150 y 300 ng/ml) en la expresión Fgl2 inducida por IFN-γ en las células TPH-1. El tratamiento con CC10 mostró una disminución del 10,1% en las células TPH-1 en comparación con el control después de la estimulación con 10 ng/ml IFN-γ durante 12 h. La proteína CC10 inhibió la expresión Fgl2 entre dosis de 0 ng/ml y 300 ng/ml (Figura 4A). En particular, 150 ng/ml proteína CC10 tuvo el efecto inhibidor más fuerte sobre la expresión Fgl2 entre las dosis, y se eligió esta dosis para los siguientes experimentos. Se exploró el efecto de diferentes puntos de tiempo de estimulación con una concentración de 150 ng/ml proteína CC10. Después de la estimulación con proteína CC10 para 6, 12 y 24 h en comparación con el control del PBS, el efecto inhibidor más fuerte sobre la expresión de Fgl2 se observó a las 12 h; por lo tanto, se eligió este momento para los siguientes estudios (Figura 4B ). Un número creciente de estudios sugieren que los macrófagos son la fuente primaria de Fgl2. Para determinar que el CC10 tiene un efecto directo sobre los macrófagos, se trató a las células TPH-1 con CC10 recombinante y se evaluó la expresión de Fgl2. A diferencia de los controles, IFN-γ indujo un aumento significativo en la expresión de Fgl2. Este efecto se atenuó cuando las células fueron tratadas con proteína CC10 (Figuras 4C,D), revelando que el CC10 reduce directamente los niveles de Fgl2 en los macrófagos. Para explorar la posibilidad de que la proteína CC10 actúe directamente sobre los macrófagos, infectamos PEM murinos con MHV-3 en presencia de CC10 recombinante y determinamos la expresión Fgl2. En comparación con los niveles en los controles, los macrófagos infectados con MHV-3 mostraron un aumento significativo en la producción de Fgl2, y este efecto fue abolido mediante el uso de proteína CC10 (Figuras 5A,B), indicando que CC10 modula directamente la producción de Fgl2 en los macrófagos. Para determinar los genes que fueron regulados después de la estimulación por la proteína CC10, utilizamos el análisis de microarray del ADN para detectar genes de expresión diferencial. Los resultados mostraron que los genes más obviamente desregulados fueron UBE2W, HECTD1, MIR612, ATRX, SOX4, HBP1 y Fgl2 (Tabla Suplementaria 1). Y luego estos genes fueron probados por qPCR. Sin embargo, UBE2W, HECTD1, MIR612, ATRX y SOX4 no fueron expresados de manera diferencial por qPCR, mientras que HBP1 y fgl2 todavía eran genes desregulados. El análisis de microarray ADN identificó HBP1 como un gen desregulado involucrado en los procesos patológicos de la regulación de CC10. Recientemente, estudios muy limitados han explorado el papel de HBP1 en FH. Sin embargo, las funciones mecánicas de HBP1 en FH permanecen en gran medida inexploradas. Por lo tanto El análisis de qPCR confirmó que los niveles de ARNm de HBP1 fueron significativamente disminuidos en las células TPH-1 después de la estimulación de la proteína CC10 en comparación con el grupo de control de PBS (Figura 6A ). Derribamos HBP1 usando HBP1-siRNA. Luego, la transfección de HBP1-SiRNA en HUVECs fue detectada por qPCR y métodos de bloqueo occidental. Como era de esperar, el derribo de HBP1 llevó a una disminución significativa de la expresión de HBP1 (Figuras 6B,C). Además, el derribo de HBP1 de la expresión deteriorada de Fgl2 (Figura 6D ), sugiriendo que HBP1 fue capaz de activar Fgl2. HBP1-SiRNA se utilizó para trans Luego, se añadió IFN-γ para inducir la expresión de Fgl2 seguido de estimulación con proteína CC10 (150 ng/ml) después de 2 h. Finalmente, se exploró la expresión de Fgl2 por qPCR. Los resultados mostraron que el tratamiento con HBP1-SiRNA abrogó el efecto inhibidor de CC10 sobre la expresión Fgl2 en HUVECs (Figura 7). Es decir, CC10 podría suprimir la expresión Fgl2 en macrófagos. Tal efecto puede ser mediado por el factor de transcripción HBP1. Es bien sabido que la proteína CC10 puede suprimir la respuesta inmune. En modelos animales de enfermedades alérgicas del tracto respiratorio, la mayoría de las evidencias confirman esta inhibición (26). Su función en FH no ha sido investigada todavía. Para determinar el papel de la CC10 en la patogénesis de la FH, la proteína CC10 se inyectó en un modelo de FH del ratón establecido por la infección MHV-3. En raras ocasiones se produjo una lesión hepática inducida por la MHV-3 en ratones tratados con CC10 y las áreas de lesiones fueron mucho menos que en ratones de control tratados con salino. En resumen, estos resultados sugieren que la CC10 podría reducir el daño hepático patológico en este modelo de FH junto con tasas de mortalidad más bajas seguidas por la infección MHV-3. La hepatitis viral fulminante inducida por MHV-3 progresa rápidamente y los ratones infectados mueren en 3-5 días. Estudios anteriores sugieren que la fgl2 jugó un papel vital en este proceso con un aumento del 15-40% de supervivencia cuando se eliminó la fgl2 (12, 15, 27, 28). Se ha demostrado que múltiples factores o mediadores inflamatorios, incluyendo TNF-α e IFN-γ, IL-1β y C5aR, promueven la progresión de la FH con discrepancias significativas entre el daño hepático y la tasa de supervivencia (29) (30) (31) (32), lo que concuerda con nuestra observación de que la CC10 aliviaba sustancialmente la lesión hepática aunque la tasa de supervivencia mejoraba levemente. La tasa de supervivencia basada en horas puede ser más precisa para examinar el efecto de la CC10 sobre la FH. Se especula que la fgl2 puede mediar la letalidad en la FH inducida por MHV-3. Esto se debe a que la fgl2 induce la deposición de fibrinógeno, lo que conduce a la activación de la cascada de coagulación y la inducción de la actividad procoagulante (15). Para determinar si la necrosis tisular Los resultados sugieren que la expresión de Fgl2 se incrementó significativamente en ratones FH inducidos por MHV-3 y el tratamiento con CC10 redujo significativamente la producción de Fgl2 en el hígado y el suero infectados. Además, también se observó una disminución de la deposición fibrinógena en los hígados de ratones tratados con CC10. Por lo tanto, nuestros resultados de investigación aclaran fuertemente que la menor mortalidad de ratones tratados con CC10 después de la infección por MHV-3 se debe a los niveles más bajos de Fgl2 y a la disminución de la deposición fibrinógena. De hecho, se ha reportado que Fgl2 se expresa en macrófagos, y se cree que la expresión de Fgl2 es inducida por IFN-γ y TNF-α (22). Se han demostrado células TPH-1 cultivadas activadas por IFN-γ o IL Por lo tanto, en este estudio, exploramos esta línea celular para investigar la modulación de CC10 en Fgl2. Sorprendentemente, encontramos que CC10 inhibió directamente la expresión Fgl2 inducida por IFN-γ en las células TPH-1. Como sabemos, IFN-γ ha demostrado ser la principal citocina que conduce al desarrollo y progresión de FH. Además, se demostró que IFN-γ podría ejercer su propia función biológica proinflamatoria a través de la mejora de la expresión Fgl2. Por lo tanto, en nuestro estudio, CC10 podría contrarrestar el efecto de IFN-γ en el establecimiento de FH, lo que confirma su papel en FH. Estos resultados demostraron que CC10 regula la expresión de Fgl2 en macrófagos. En el estudio actual, utilizamos co-inmunoprecipitación para analizar la unión entre CC10 y Fgl2. En este estudio se investigaron posibles interacciones proteína-proteínas entre CC10 y Fgl2 in vitro. Las células de ovario de hámster chino (CHO) transfectadas con pcDNA3.1-hCC10 y pcDNA3.1-hFgl2. Las proteínas celulares fueron inmunoprecipitadas con anticuerpos anti-CC10 o anti-Fgl2 y se realizó inmunobloqueo con anticuerpos anti-Fgl2 y anti-CC10. Inmunoprecipitación de extractos proteicos del pcDNA 3,1-CC10 y del pcDNA 3,1-Fgl2 cotransfectados con anticuerpos anti-Fgl2 o anti-CC10 seguidos de blocado occidental con anticuerpos Fgl2 y CC10 indicó que CC10 no coinmunoprecipitado con Fgl2, demostrando que no hay relación directa entre CC10 y Fgl2 (datos no mostrados). Los resultados mostraron que CC10 no tiene interacción directa con Fgl2. De nuestro estudio anterior el gen de fgl2 contribuyó profundamente en la hepatitis fulminante inducida por MHV-3 y se expresa ampliamente en macrófagos y endotelio (12, 33). Nuestro microarray indicó una expresión de fgl2 regulada por CC10 y esto es confirmado por qPCR y Western bloting in vivo (macrófagos peritoneales) e in vitro (THP-1, línea celular macrófaga). Por lo tanto, es razonable centrarse en los macrófagos para mostrar el efecto de CC10 en la expresión fgl2 y finalmente la supervivencia de ratones. Estamos totalmente de acuerdo en que puede haber otras posibilidades de un efecto protector de CC10 para contribuir al proceso de la enfermedad. Esto vale la pena estudios adicionales. El receptor potencial de CC10 no ha sido revelado todavía. Nuestro estudio anterior ha demostrado que CC10 tiene efecto de las células dendríticas en la rinitis alérgica (34). En esta investigación, evaluamos el efecto de CC10 sobre las funciones de los macrófagos y descubrimos que Fgl2 fue sustancialmente regulado sobre el tratamiento CC El análisis de microarray del ADN es uno de los enfoques más poderosos para la identificación potencial de genes inesperados involucrados en procesos patógenos. Usando este enfoque, se encontró que el factor de transcripción HMGbox 1 (HBP1) es uno de los genes más desregulados después del tratamiento de las células THP-1. HBP1 es un represor transcripcional bien descrito que modula la expresión de genes involucrados en la progresión del ciclo celular. En un estudio reciente, se encontró que el HBP1 es un objetivo directo de miR-21 y confirmó que el HBP1 modula la función inhibitoria del miR-21-ASO en hepatoesteatosis y carcinogénesis simultáneamente (23). El HBP1 es un inhibidor endógeno de la vía de señalización Wnt en células normales y cancerosas. El papel supresor del tumor de HBP1 ha sido reportado en algunas neoplasias malignas, como el cáncer oral y el glioma (35). Sin embargo, una asociación entre HBP1 y Fgl2 no ha sido investigada todavía. El estudio actual demostró claramente que CC10 protege contra el MHV-3 inducido FH a través de la supresión de la expresión Fgl2. Tales efectos podrían ser mediados por HBP1. Sin embargo, el estado funcional de HBP1 en la vía CC10 requiere investigación adicional, y tales estudios están realizando en nuestro laboratorio. En conclusión, demostramos que CC10 podría limitar el daño inmunopatológico en ratones MHV-3 inducidos FH. Nuestros resultados sugieren que mejorar la expresión CC10 por un enfoque inmunoterapéutico podría ser un tratamiento eficaz para FH. HY realizó todos los experimentos descritos y escribió el manuscrito. YL ayudó con algunos experimentos XW revisó y editó el manuscrito. JH, WY, DX, XL, GS y QN proporcionaron ayuda experimental y diseño.

¿Qué es la proteína 2 similar al fibrinógeno (FgI2)?

Clara Cell 10 kDa Protein Alivia la cepa del virus de la hepatitis murina 3-Hepatitis fulminante inducida por la inhibición de la proteína fibrinógena 2 Expresiónhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6300492/SHA: f0c2cd2793d71f1ea11a810442a2c06d5013e899Autores: Yu, Haijing; Liu, Yang; Wang, Hongwu; Wan, Xiaoyang; Huang, Jiaquan; Yan, Weiming; Xi, Dong; Luo, Xiaoping; Shen, Guanxin; Ning, QinFecha: 2018-12-13DOI: 10.3389/fimmu.2018.02935Licencia: cc-by Las células Kupffer, la mayor población de células inmunes involucradas en las respuestas inmunes innatas, se consideran centrales para la FH. La proteína 2 de tipo fibrinógeno (Fgl2) es una proteína procoagulante que se induce sustancialmente en los macrófagos después de la infección viral, y el agotamiento de Fgl2 reprime la cepa 3 del virus de la hepatitis murina (MHV-3). La proteína Clara 10 kDa (CC10) es una proteína secreta con propiedades antiinflamatorias en la rinitis alérgica y el asma. Sin embargo, sus mecanismos de acción y funciones patogénicas en otras enfermedades siguen sin estar claros. En este estudio, nuestro objetivo fue determinar el papel de la CC10 en la FH y la regulación de la Fgl2 por la CC10. Métodos: Se estableció un modelo FH de ratón mediante inyección peritoneal de MHV-3. Se examinó la tasa de supervivencia, la función hepática, la histología hepática, la deposición de fibrina y la necrosis; se investigó el efecto regulador de la CC10 sobre la expresión de Fgl2 utilizando células TPH-1 y macrófagos peritoneales de ratón in vitro. Resultados: En el modelo FH del ratón inducido por MHV-3, la tasa de supervivencia aumentó de 0 a 12,5% en el grupo CC10 en comparación con la del grupo control exclusivo de la solución salina; mientras tanto, los niveles de ALT y AST en suero disminuyeron significativamente y se redujo el daño hepático; además, la expresión hepática Fgl2, TNF-α e IL-1β fue claramente desregulada junto con la deposición de fibrina, y la apoptosis hepatocítica se redujo después de la administración de proteína CC10. In vitro, se encontró que CC10 inhibe significativamente la expresión de Fgl2 en las células tratadas con IFN-γ TPH-1 y los macrófagos peritoneales del ratón infectados por MHV-3 por Western blot y PCR en tiempo real. Sin embargo, no hubo interacción directa entre CC10 y Fgl2 como se demostró por coinmunoprecipitación. Investigaciones de microarray sugieren que el factor de transcripción HMG-box 1 (HBP1) fue significativamente bajo en las células tratadas con CC10 y con IFN-γ-primed THP-1. El tratamiento con HBP1-siRN abrogó el efecto inhibidor de CC10 sobre la expresión de Fgl2 en las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs). Conclusión:CC10 protege contra la FH inducida por MHV-3 Estos efectos pueden ser mediados por el factor de transcripción HBP1. Texto: Hepatitis Fulminante (FH) es una enfermedad grave que amenaza la vida caracterizada por necrosis hepatocitica masiva, daño hepático severo y alta mortalidad. Los mecanismos subyacentes y la patogénesis de la FH no son claros. Sin embargo, la acumulación de evidencia sugiere que, independientemente de la patogénesis de la FH, las respuestas inflamatorias del huésped contribuyen a los trastornos microcirculatorios hepáticos y lesiones. En consecuencia, se ha demostrado que la activación celular inmune y las citocinas inflamatorias juegan un papel importante en la FH (1). En los últimos años, nuestro laboratorio ha llevado a cabo una extensa investigación sobre la patogénesis de la FH y encontró que las células inmunes desempeñan un papel clave en ella. Las células Kupffer, las células asesinas naturales (NK) (2, 3), los linfocitos T citotóxicos (LCT) y las células T doblemente negativas (DNT) (4) (5) (6) en el hígado y las citocinas producidas por estas células causan daño hepático. Protrombinasa Fgl2 pertenece a la superfamilia fibrinógena y es producida por macrófagos activados o células endoteliales, transformando la protrombina directamente en trombina, con el fin de iniciar rápidamente el proceso de coagulación. Esto promueve la conversión del fibrinógeno en fibrina, dando lugar a trombosis (7) (8) (9) (10) (11) (12). Nuestro estudio encontró que la Fgl2 se expresaba altamente en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y en tejido hepático de humanos o ratones con hepatitis viral grave, y estaba relacionada positivamente con La terapia génica dirigida al silenciamiento de Fgl2 mostró que la tasa de supervivencia de los ratones de hepatitis fulminante aumentó de 0 a 33,3% (15). Hasta el momento, el descubrimiento y la investigación relacionada con Fgl2 han proporcionado nuevas ideas sobre el mecanismo molecular de la necrosis hepatocitica en la HF. En vista del importante papel de Fgl2 en la hepatitis viral grave, las investigaciones sobre la regulación de Fgl2 serán beneficiosas en la búsqueda de nuevas estrategias para el tratamiento de la hepatitis grave. La proteína Clara 10 kDa (CC10), también considerada como uteroglobina, proteína secretora de células Clara, es uno de los miembros de la superfamilia de la secretoglobina. Expresada en células epiteliales mucosales de órganos (incluyendo pulmones y nariz) que se comunican con el mundo exterior (16). CC10 tiene efectos inmunomoduladores y anti En comparación con ratones de tipo salvaje, los ratones CC10-knockout mostraron inflamación excesiva de las vías respiratorias Abreviaturas: FH, hepatitis fulminante; MHV-3, cepa 3 del virus de la hepatitis murina; Fgl2, proteína 2 similar a la fibrinógeno; CC10, proteína de la célula Clara 10 KDa; ALF, insuficiencia hepática aguda; PFU, unidades formadoras de placa; PBS, solución salina fosfato-buffered; ALT, alanina aminotransferasa; AST, aspartato aminotransferasa; PCA, actividad procoagulante; HRP, peroxidasa de rábano; TUNEL, etiquetado final de la desoxinucleotidil transferasa dUTP. causado por reacción alérgica e infecciones bacterianas y virales (17). Los niveles reducidos de CC10 están asociados con enfermedades inflamatorias y alérgicas de las vías respiratorias, incluyendo sinusitis, asma y rinitis alérgica (18) (19) (20) (21). Estudios previos y artículos publicados muestran que la proteína CC10 no sólo puede inhibir las respuestas celulares Th17 al inhibir la expresión de moléculas relacionadas de células dendríticas y citocinas en ratones con rinitis alérgica, sino que también puede inhibir el quitosano-3 como la proteína 1 (22, 23). Además, CC10 inhibe la expresión de un importante regulador inmune, osteopontina (OPN), en modelos de rinitis alérgica (21). En este estudio, investigamos el papel de CC10 en la cepa 3 del virus de la hepatitis (MHV-3) FH inducida en ratones y exploramos si la proteína CC10 podría regular Fgl2 en el proceso de la enfermedad. Las hembras de ratones BALB/cJ (Shanghai Shilaike Animal Seed Center, Shanghai, China), de 6-8 semanas de edad, con un peso corporal de 18,0-20,0 g, se mantuvieron en el Hospital Tongji con alimentos y agua. Los ratones se dividieron en dos grupos: grupo CC10 (grupo experimental) y grupo salino fosfatado (PBS) (grupo de control). Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con las recomendaciones de las directrices de los Institutos Nacionales de Salud y el Comité de Experimentación Animal del hospital Tongji. Este estudio fue revisado y aprobado por el Comité de Experimentación Animal del hospital Tongji. La línea de células monocíticas humanas TPH-1 fue adquirida en el Instituto Celular de la Academia China de Ciencias (Shanghai, China). La línea celular de ovario de hámster chino (CHO) fue adquirida del banco celular típico de la comisión de preservación del cultivo, la Academia China de Ciencias (Shanghai, China). Las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) y las células CHO fueron cultivadas en el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM), y las células THP-1 se mantuvieron en el RPMI 1.640 que contenían 10% de suero fetal inactivado por calor (FBS, Gibco Life Technologies, EE.UU.), 100 U/ml penicilina y 100 mg/ml estreptomicina y cultivadas a 37 • C, 50 mL/L CO 2 y 95% de humedad. Los macrófagos exudativos peritoneales (PEM) se obtuvieron de ratones BALB/cJ. Las células fueron resuspedidas en RPMI 1.640 suplementadas con un 10% de FBS en 1-2 × 10 6 células/ml en una placa de 6 pozos e incubadas durante 4 h. Luego fueron lavadas con RPMI 1640 células medias y no adherentes desechadas. Las células adherentes fueron macrófagos y fueron incubadas durante 12 h. Los macrófagos exudativos peritoneales (PEM) se dividieron en dos grupos. Un grupo fue complementado con proteína CC10 (150 ng/ml) y en el otro grupo se añadió PBS. Después de 2 h de estimulación, se agregaron 1.000 unidades formadoras de placa (PCU) de MHV-3 a las células, que luego fueron cultivadas durante 4 h. Se recolectaron macrófagos exudativos peritoneales (PEM) y se lis La apoptosis celular fue detectada por el método terminal de desoxinucleotidil transferasa dUTP nick end labeling (TUNEL) con un kit de detección de apoptosis TUNEL (Roche, Suiza). Brevemente, 5 secciones de μm fueron desparafinadas, deshidratadas a través de una serie de alcoholes e incubadas con proteinasa K durante 30 minutos a 37 • C. Después de detener la reacción digestiva proteinasa K con PBS, las muestras fueron incubadas con un cóctel terminal de desoxinucleotidil transferasa (una mezcla de desoxinucleotidil transferasa terminal y dUTP a razón de 2:29, respectivamente), durante 2 h a 37 • C en una caja húmeda inmunohistoquímica. Después del lavado y bloqueo, cada sección fue complementada con reactivo (converter-POD) para cubrir los tejidos e incubada durante 30 minutos a 37 • C en una caja húmeda. Luego, las secciones de tejido hepático fueron lavadas con PBS, y coloreadas con diaminobencidina (DAB) posteriormente. Los hepatocitos con núcleo teñido de amarillo parduzco fueron considerados como células apoptóticas. La expresión de Fgl2 en células TPH-1 fue medida por citometría de flujo (BD FACS Canto II, EE.UU.). Brevemente, las células (2 × 10 5 por tubo) fueron incubadas con anticuerpo humano TruStrain FcX (solución Fc Receptor Blocking, BioLegend, EE.UU.) durante 10 minutos a temperatura ambiente y luego incubadas en la oscuridad con anticuerpo anti-Fgl2 del ratón (1:100, Abnova,) o suero de cabra normal (control de isotipo) a 4 • C durante 40 min. Las células fueron lavadas con PBS e incubadas en la oscuridad con anticuerpo anti-IgG de cabra conjugado con PE (1:50, BioLegend, EE.UU.) a 4 • C durante 30 min. Las células fueron luego lavadas con PBS y resucitadas en 300 μL PBS para estudio. La inmunohistoquímica de los tejidos hepáticos se realizó utilizando los kits SP-9001 SPlink Detection Kits (Biotin-Streptavidin HRP Detection Systems) (ZSGB-BIO, Beijing, China) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la tinción inmunohistoquímica, se detectó la expresión de Fgl2, fibrinógeno, Fas y TNF-receptor 1 en tejidos hepáticos de ratón con anticuerpo antimouse Fgl2 de conejo policlonal (1:100, Proteintech, EE.UU.), anticuerpo antimouse fibrinógeno de conejo policlonal (1:1.000, Abcam, EngLand), anticuerpo antimouse Fas de conejo policlonal (1:50, Abcam, EngLand), y anticuerpo antimouse TNF-receptor 1 de Después de la incubación con una fracción IgG de cabra marcada con rábano peroxidasa (HRP) a conejo IgG Fc, la proteína diana fue detectada usando un kit de DAB (ZSGB-BIO, Beijing, China). Las diapositivas fueron entonces contrapuestas con hematoxilina y visualizadas bajo un microscopio (Olympus, Tokio, Japón). El tejido hepático y las células fueron homogeneizados en el tampón de lisis RIPA con inhibidor de la proteasa de fenilmetano fluoruro de sulfonilo (PMSF). Los lisatos proteicos fueron separados por SDS-PAGE, y el Western Blotting fue realizado usando un ratón monoclonal antihumano/ratón Fgl2 (1:750, Abnova), un ratón monoclonal antihumano HBP1 (1:100, Santa Cruz, EE.UU.), y un conejo monoclonal antihumano/ratón β-actina (1:1,000, Cell Signaling Technology, EE.UU.). Los tejidos hepáticos fueron recolectados de ratones BALB/cJ infectados por MHV-3 a 72 h, y el ARN total fue extraído usando Reagent Trizol (Invitrogen, EE.UU.) y luego transcriptado en cDNA mediante ReverTra Ace qPCR RT kit (TOYOBO, Japón). PCR cuantitativo en tiempo real (qPCR) con SYBR Green PCR Master Mix en tiempo real (TOYOBO, Japón) se realizó utilizando un sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96 (Bio-Rad, EE.UU.) y los niveles de ARNm se normalizaron con referencia a los del gen de mantenimiento doméstico GAPDH. Las secuencias iniciales para la amplificación de qPCR fueron las siguientes: mTNF-α hacia adelante, 5 ′ -TTT GAG ATC CAT GCC GTT-3 ′ ; mTNF-α hacia atrás, 5 ′ -GCCA CCA CCA CCA CCA TCT TCT GT-3 ′ ; mil-1β hacia adelante, 5 ′ -TGT AAT GAA AGA CGC ACC-3 ′ ; mil-1β hacia atrás, 5 ′ -TCT TCT TTG GGT ATT GCT TG-3 ′. mFgl2 hacia adelante, 5 ′ -GCC AAA TGT GAG TCC CTG GAA-3 ′ ; mFgl2 hacia atrás, 5 ′ -TTC CAC CCA AGA GCA CGT TTA AG-3 ′ ; hFgl2 hacia adelante 5 ′ -ACA GTT CAG GCT GGT GGT-3 ′ ; hFgl2 hacia atrás, 5 ′ -GGC TTA AAG TGC TTG GGT-3 ′ ; HBP1 hacia adelante, 5 ′ -TGA AGC AGA AGC TGGG GAGT-3 ′ ; células HBP1 hacia atrás, THP-1 fueron tratadas con 100 ng/ml de forbol 12-miritato 13-acetato (PMA) (Sigma, EE.UU.) El grupo CC10 fue complementado con proteína CC10 (150 ng/ml). Después de 2 h de estimulación, se añadió IFN-γ (10 ng/ml) a estas células, que luego fueron cultivadas durante 12 h antes de ser recolectadas para estudios de borrado occidental y PCR en tiempo real. Las células de ovario de hámster chino (CHO) fueron cultivadas en platos de cultivo celular de 10 cm con DMEM complementado con 10% FBS hasta 80-90% confluencia. A continuación, 12 μg pcDNA3.1-hFgl2 (construido en nuestro laboratorio) fue mezclado con 12 μg pcDNA3.1-hCC10 en DMEM libre de suero. La mezcla fue luego combinada con Lipofectamine 2.000 (Invitrogen, EE.UU.) y mezclada suavemente. Después de la incubación a 27 • C durante 20 min, la solución fue añadida a las células CHO e incubada a 37 • C en 5% CO 2. Cuatro a seis horas después de la transfección, se eliminó el medio y se añadió un medio fresco que contenía 10% FBS. A las 48 h después de la transfección, las células fueron recolectadas para el análisis de co-inmunoprecipitación para evaluar la interacción de CC10 con Fgl2. Tanto las células HUVEC como las células TPH-1 expresan fgl2. Sin embargo, en los experimentos de transfección es difícil transfectar las células TPH-1 con siRNA, por lo que utilizamos HUVEC en lugar de THP-1. Las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) fueron cultivadas en FIGURE 1 proteína CC10 aumentaron la tasa (A) La tasa de supervivencia del grupo CC10 es mayor que el grupo control compuesto por ratones BALB/cJ infectados por MHV-3 tratados con solución salina. La proteína CC10 (2 μg) o solución salina se inyectaron en ratones por vena de cola. Los ratones BALB/cJ recibieron 100 UFP de MHV-3 intraperitonealmente 24 h más tarde para desarrollar hepatitis viral fulminante. Luego, la proteína CC10 (2 μg) o solución salina se inyectaron en ratones por vena de cola después de la infección por MHV-3 24 h más tarde. La tasa de supervivencia se observó durante 10 días (n = 24/grupo). Se muestran los datos representativos de tres experimentos independientes. La curva de supervivencia se analizó mediante la prueba Log-Rank. ***P < 0,001 en comparación con el grupo salino. (B) Se evaluó la histopatología de los tejidos hepáticos (manipulación de H&E; aumento original, ×400, n = 5/grupo) a 72 h de infección post-MHV-3 en los dos grupos de ratones BALB/cJ infectados por MHV-3. Se recogieron hígados de los tratados con salino (a) y CC10 (b) de los ratones BALB/cJ a 72 h después de infección por MHV-3. Las flechas apuntan a áreas de infiltración celular inflamatoria o regiones necróticas con inflamación. (C) Efecto de CC10 en los niveles séricos de ALT y AST (n = 6-8/grupo). Los valores representan el medio y el error estándar de tres experimentos independientes realizados en triplicado. **P < 0,01 en comparación con el grupo salino. 50 pmol HBP1-siRNA se mezcló con 125 μl libres de suero DMEM. Dos microlitros Lipofectamina 2.000 se mezclaron suavemente con DMEM libre de suero. Después de la incubación a 27 • C durante 5 min, la solución se añadió a HUVEC e incubada a 37 • C. Cuatro horas después de la transfección, se eliminó el medio y se añadió un medio fresco con 10% de FBS. A las 48 h después de la transfección, se recolectaron células para PCR en tiempo real y análisis de manchas occidentales para evaluar los efectos de HBP1 en Fgl2. A las 24 h después de la transfección, el grupo CC10 fue complementado con la proteína CC10 (150 ng/mL). Después de 4 h de estimulación, se añadió IFN-γ (10 ng/mL) a estas células. Estas células fueron cultivadas durante 24 h antes de ser recolectadas para estudios de PCR en tiempo real para evaluar los efectos de CC10 sobre Fgl2 por HBP1. El control negativo fue utilizado como control. Para detectar si había una interacción potencial entre la proteína CC10 y Fgl2, las células CHO fueron transfectadas con pcDNA3.1-hCC10 y pcDNA3.1-hFgl2 durante 48 h. Las células transfectadas con plásmido vacío pcDNA3.1 (mock) fueron utilizadas como controles negativos para la transfección del gen CC10. La inmunoprecipitación e inmunoblotación fueron realizadas utilizando Pierce Co-Immunoprecipitation Kit (Pierce, EE.UU.). Las proteínas celulares totales fueron extraídas como se describió anteriormente (25). Las proteínas fueron inmunoprecipitadas por anticuerpo Fgl2 antihumano Para los experimentos de coinmunoprecipitación, el Western bloting se realizó usando tanto anticuerpo anti-uteroglobina humana de rata/SCGB1A1 (1:750, R&D, USA) Frontiers in Immunology www.frontiersin.org y anticuerpo anti-humano Fgl2 de ratón (1:500, Abnova). El control isotipo de rata IgG1 fue utilizado como control negativo de anticuerpos primarios. El gen de la región de codificación CC10 humana, incluyendo una secuencia de 389 bp, fue amplificado a partir de tejido turbinado humano homogenizado por RT-PCR. En este estudio, las secuencias de los imprimadores PCR para CC10 fueron las siguientes: hCC10-forward, 5 ′ -CCC TCC ACC ATG AAA CTCG-3 ′ ; hCC10-reverse, 5 ′ -TGA GAT GCT TGT GGT TTA TTG AAG-3 ′. Los productos PCR fueron clonados en el vector de clonación peasy-T1 (TransGEN, Beijing, China) y luego subclonados en HindIII/XbaI sitio de pcDNA3.1 vector (Invitrogen, EE.UU.) para formar plasmidos de expresión eucariótica pcDNA3.1-hCC10. El análisis de microarray se utilizó para detectar cambios en los patrones de expresión génica de todo el genoma en células TPH-1 con o sin proteína CC Los cambios en más de 47,000 patrones de expresión génica humana fueron evaluados utilizando microarrays del gen Affymetrix (Genoma Humano U133 Plus 2.0) (CapitalBio Co.,Ltd., Beijing, China). Se utilizaron tres réplicas para el análisis de microarrays. Los datos obtenidos de los experimentos se expresan como promedio ± SEM. Se realizaron comparaciones de curvas de supervivencia con la prueba Log Rank. Se evaluaron múltiples análisis de grupos para los datos mediante análisis de varianza de un solo sentido. Se realizaron análisis de dos resultados de grupo utilizando la prueba t de Student para evaluar la significancia estadística de las diferencias. Valores de P < 0,05 indicaron significancia. Para establecer un modelo animal de ratón FH, MHV-3 fue inyectado intraperitonealmente a ratones BALB/cJ (24 ratones/grupo). Para seguir estudiando el papel de la CC10 en la FH, se administró la proteína CC10 del ratón recombinante (2 μg/ratón) o solución salina en la vena de la cola 24 h antes de la infección por MHV-3, la misma dosis de proteína CC10 o solución salina se administró 24 h más tarde, se observó la tasa de supervivencia de los grupos CC10 y salina durante 10 días, los resultados mostraron que los ratones de los dos grupos comenzaron a morir a las 48 h después de la inyección de MHV-3 y mostraron síntomas de horripilación, actividad lenta y reducción del consumo de alimentos; en el grupo CC10 24 ratones estaban vivos el día 3 después de la infección, 4 ratones vivos el día 4 y 3 de 24 (12,5%) ratones recuperados de hepatitis viral fulminante; al mismo tiempo, en el grupo tratado con solución salina, había 5 ratones vivos el día 3, 1 ratones vivos Es decir, los ratones del grupo salino murieron en 3 ó 4 días. Tres de los 24 (12,5%) ratones del grupo CC10 recuperados de hepatitis viral fulminante (Figura 1A). Para comprender mejor los mecanismos subyacentes a los efectos biológicos de la proteína CC10, se realizó la función hepática (niveles de ALT y AST en suero) y la histología hepática en ratones de VHM-3-infectados. Los tejidos hepáticos fueron recolectados 72 h después de la infección por VHM-3, y la histología hepática fue detectada por tinción H&E. Estos resultados mostraron que hubo infiltración celular inflamatoria sustancial y necrosis generalizada de hepatocitos en el tejido hepático de ratones del grupo salino (Figura 1Ba ). Hubo células inflamatorias raras o no infiltradas, y pocas o ninguna necrosis hepatocitica en los hígados de ratones en el Se observaron niveles séricos de ALT y AST en ratones 72 h después de la infección por MHV-3. Los resultados mostraron que los niveles séricos de ALT y AST en el grupo salino alcanzaron un pico 72 h después de la infección por MHV-3, pero no hubo un aumento significativo en el grupo CC10 en comparación con los niveles en el grupo control (P < 0,01, Figura 1C). Estos resultados sugieren que la proteína CC10 tiene un papel en la protección contra la lesión hepática inducida por MHV-3 en ratones. Para dilucidar aún más los mecanismos de reducción de la lesión hepática después de la inyección de proteína CC10, se investigó la expresión de citocinas TNF-α e IL-1β. Debido a que estas dos citocinas juegan un papel crucial en el daño hepático de la FH. Se caracterizan por un aumento de la apoptosis. Los niveles de TNF-α e IL-1β en los tejidos hepáticos se redujeron notablemente en el grupo CC10 (como se muestra en la Figura 2A). La apoptosis hepática (Figura 2B ) se redujo significativamente en el grupo CC10. Nosotros y los colaboradores tenemos un interés de larga data en estudiar el papel de fgl2 en la hepatitis viral. Fgl2 ha sido verificado para jugar un papel esencial en la progresión de la hepatitis viral fulminante como apreciamos de informes anteriores. Hemos proporcionado cifras de patología hepática y función hepática para ratones infectados por MHV-3 con un knockout genético de fgl2 como se muestra en la Figura 1 suplementaria. Los datos fueron comparables con informes anteriores de nuestro centro y colaboradores. A partir de este estudio actual se demostró que la CC10 juega un papel protector en el daño hepático.Para estudiar las moléculas relacionadas de la CC10 en ratones MHV-3 inducidos por FH, se evaluó si había interconversación entre Fgl2 y CC10. Se encontró que la expresión de Fgl2 en el hígado de ratones se redujo 72 h después de la infección por MHV-3 y el tratamiento con proteína CC10 (Figuras 3A,B). Además, la deposición de fibrina, un indicador de lesión hepática asociado con la expresión Fgl2 en la FH, también se redujo en los hígados de ratones tratados con CC10 en comparación con la de control (Figura 3C ). Se examinó el efecto del aumento de dosis de proteína CC10 (0, 50, 150 y 300 ng/ml) en la expresión Fgl2 inducida por IFN-γ en las células TPH-1. El tratamiento con CC10 mostró una disminución del 10,1% en las células TPH-1 en comparación con el control después de la estimulación con 10 ng/ml IFN-γ durante 12 h. La proteína CC10 inhibió la expresión Fgl2 entre dosis de 0 ng/ml y 300 ng/ml (Figura 4A). En particular, 150 ng/ml proteína CC10 tuvo el efecto inhibidor más fuerte sobre la expresión Fgl2 entre las dosis, y se eligió esta dosis para los siguientes experimentos. Se exploró el efecto de diferentes puntos de tiempo de estimulación con una concentración de 150 ng/ml proteína CC10. Después de la estimulación con proteína CC10 para 6, 12 y 24 h en comparación con el control del PBS, el efecto inhibidor más fuerte sobre la expresión de Fgl2 se observó a las 12 h; por lo tanto, se eligió este momento para los siguientes estudios (Figura 4B ). Un número creciente de estudios sugieren que los macrófagos son la fuente primaria de Fgl2. Para determinar que el CC10 tiene un efecto directo sobre los macrófagos, se trató a las células TPH-1 con CC10 recombinante y se evaluó la expresión de Fgl2. A diferencia de los controles, IFN-γ indujo un aumento significativo en la expresión de Fgl2. Este efecto se atenuó cuando las células fueron tratadas con proteína CC10 (Figuras 4C,D), revelando que el CC10 reduce directamente los niveles de Fgl2 en los macrófagos. Para explorar la posibilidad de que la proteína CC10 actúe directamente sobre los macrófagos, infectamos PEM murinos con MHV-3 en presencia de CC10 recombinante y determinamos la expresión Fgl2. En comparación con los niveles en los controles, los macrófagos infectados con MHV-3 mostraron un aumento significativo en la producción de Fgl2, y este efecto fue abolido mediante el uso de proteína CC10 (Figuras 5A,B), indicando que CC10 modula directamente la producción de Fgl2 en los macrófagos. Para determinar los genes que fueron regulados después de la estimulación por la proteína CC10, utilizamos el análisis de microarray del ADN para detectar genes de expresión diferencial. Los resultados mostraron que los genes más obviamente desregulados fueron UBE2W, HECTD1, MIR612, ATRX, SOX4, HBP1 y Fgl2 (Tabla Suplementaria 1). Y luego estos genes fueron probados por qPCR. Sin embargo, UBE2W, HECTD1, MIR612, ATRX y SOX4 no fueron expresados de manera diferencial por qPCR, mientras que HBP1 y fgl2 todavía eran genes desregulados. El análisis de microarray ADN identificó HBP1 como un gen desregulado involucrado en los procesos patológicos de la regulación de CC10. Recientemente, estudios muy limitados han explorado el papel de HBP1 en FH. Sin embargo, las funciones mecánicas de HBP1 en FH permanecen en gran medida inexploradas. Por lo tanto El análisis de qPCR confirmó que los niveles de ARNm de HBP1 fueron significativamente disminuidos en las células TPH-1 después de la estimulación de la proteína CC10 en comparación con el grupo de control de PBS (Figura 6A ). Derribamos HBP1 usando HBP1-siRNA. Luego, la transfección de HBP1-SiRNA en HUVECs fue detectada por qPCR y métodos de bloqueo occidental. Como era de esperar, el derribo de HBP1 llevó a una disminución significativa de la expresión de HBP1 (Figuras 6B,C). Además, el derribo de HBP1 de la expresión deteriorada de Fgl2 (Figura 6D ), sugiriendo que HBP1 fue capaz de activar Fgl2. HBP1-SiRNA se utilizó para trans Luego, se añadió IFN-γ para inducir la expresión de Fgl2 seguido de estimulación con proteína CC10 (150 ng/ml) después de 2 h. Finalmente, se exploró la expresión de Fgl2 por qPCR. Los resultados mostraron que el tratamiento con HBP1-SiRNA abrogó el efecto inhibidor de CC10 sobre la expresión Fgl2 en HUVECs (Figura 7). Es decir, CC10 podría suprimir la expresión Fgl2 en macrófagos. Tal efecto puede ser mediado por el factor de transcripción HBP1. Es bien sabido que la proteína CC10 puede suprimir la respuesta inmune. En modelos animales de enfermedades alérgicas del tracto respiratorio, la mayoría de las evidencias confirman esta inhibición (26). Su función en FH no ha sido investigada todavía. Para determinar el papel de la CC10 en la patogénesis de la FH, la proteína CC10 se inyectó en un modelo de FH del ratón establecido por la infección MHV-3. En raras ocasiones se produjo una lesión hepática inducida por la MHV-3 en ratones tratados con CC10 y las áreas de lesiones fueron mucho menos que en ratones de control tratados con salino. En resumen, estos resultados sugieren que la CC10 podría reducir el daño hepático patológico en este modelo de FH junto con tasas de mortalidad más bajas seguidas por la infección MHV-3. La hepatitis viral fulminante inducida por MHV-3 progresa rápidamente y los ratones infectados mueren en 3-5 días. Estudios anteriores sugieren que la fgl2 jugó un papel vital en este proceso con un aumento del 15-40% de supervivencia cuando se eliminó la fgl2 (12, 15, 27, 28). Se ha demostrado que múltiples factores o mediadores inflamatorios, incluyendo TNF-α e IFN-γ, IL-1β y C5aR, promueven la progresión de la FH con discrepancias significativas entre el daño hepático y la tasa de supervivencia (29) (30) (31) (32), lo que concuerda con nuestra observación de que la CC10 aliviaba sustancialmente la lesión hepática aunque la tasa de supervivencia mejoraba levemente. La tasa de supervivencia basada en horas puede ser más precisa para examinar el efecto de la CC10 sobre la FH. Se especula que la fgl2 puede mediar la letalidad en la FH inducida por MHV-3. Esto se debe a que la fgl2 induce la deposición de fibrinógeno, lo que conduce a la activación de la cascada de coagulación y la inducción de la actividad procoagulante (15). Para determinar si la necrosis tisular Los resultados sugieren que la expresión de Fgl2 se incrementó significativamente en ratones FH inducidos por MHV-3 y el tratamiento con CC10 redujo significativamente la producción de Fgl2 en el hígado y el suero infectados. Además, también se observó una disminución de la deposición fibrinógena en los hígados de ratones tratados con CC10. Por lo tanto, nuestros resultados de investigación aclaran fuertemente que la menor mortalidad de ratones tratados con CC10 después de la infección por MHV-3 se debe a los niveles más bajos de Fgl2 y a la disminución de la deposición fibrinógena. De hecho, se ha reportado que Fgl2 se expresa en macrófagos, y se cree que la expresión de Fgl2 es inducida por IFN-γ y TNF-α (22). Se han demostrado células TPH-1 cultivadas activadas por IFN-γ o IL Por lo tanto, en este estudio, exploramos esta línea celular para investigar la modulación de CC10 en Fgl2. Sorprendentemente, encontramos que CC10 inhibió directamente la expresión Fgl2 inducida por IFN-γ en las células TPH-1. Como sabemos, IFN-γ ha demostrado ser la principal citocina que conduce al desarrollo y progresión de FH. Además, se demostró que IFN-γ podría ejercer su propia función biológica proinflamatoria mediante la mejora de la expresión Fgl2. Por lo tanto, en nuestro estudio, CC10 podría contrarrestar el efecto de IFN-γ en el establecimiento de FH, lo que confirma su papel en FH. Estos resultados demostraron que CC10 regula la expresión de Fgl2 en macrófagos. En el estudio actual, utilizamos co-inmunoprecipitación para analizar la unión entre CC10 y Fgl2. En este estudio se investigaron posibles interacciones proteína-proteínas entre CC10 y Fgl2 in vitro. Las células de ovario de hámster chino (CHO) transfectadas con pcDNA3.1-hCC10 y pcDNA3.1-hFgl2. Las proteínas celulares fueron inmunoprecipitadas con anticuerpos anti-CC10 o anti-Fgl2 y se realizó inmunobloqueo con anticuerpos anti-Fgl2 y anti-CC10. Inmunoprecipitación de extractos proteicos del pcDNA 3,1-CC10 y del pcDNA 3,1-Fgl2 cotransfectados con anticuerpos anti-Fgl2 o anti-CC10 seguidos de blocado occidental con anticuerpos Fgl2 y CC10 indicó que CC10 no coinmunoprecipitado con Fgl2, demostrando que no hay relación directa entre CC10 y Fgl2 (datos no mostrados). Los resultados mostraron que CC10 no tiene interacción directa con Fgl2. De nuestro estudio anterior el gen de fgl2 contribuyó profundamente en la hepatitis fulminante inducida por MHV-3 y se expresa ampliamente en macrófagos y endotelio (12, 33). Nuestro microarray indicó una expresión de fgl2 regulada por CC10 y esto es confirmado por qPCR y Western bloting in vivo (macrófagos peritoneales) e in vitro (THP-1, línea celular macrófaga). Por lo tanto, es razonable centrarse en los macrófagos para mostrar el efecto de CC10 en la expresión fgl2 y finalmente la supervivencia de ratones. Estamos totalmente de acuerdo en que puede haber otras posibilidades de un efecto protector de CC10 para contribuir al proceso de la enfermedad. Esto vale la pena estudios adicionales. El receptor potencial de CC10 no ha sido revelado todavía. Nuestro estudio anterior ha demostrado que CC10 tiene efecto de las células dendríticas en la rinitis alérgica (34). En esta investigación, evaluamos el efecto de CC10 sobre las funciones de los macrófagos y descubrimos que Fgl2 fue sustancialmente regulado sobre el tratamiento CC El análisis de microarray del ADN es uno de los enfoques más poderosos para la identificación potencial de genes inesperados involucrados en procesos patógenos. Usando este enfoque, se encontró que el factor de transcripción HMGbox 1 (HBP1) es uno de los genes más desregulados después del tratamiento de las células THP-1. HBP1 es un represor transcripcional bien descrito que modula la expresión de genes involucrados en la progresión del ciclo celular. En un estudio reciente, se encontró que el HBP1 es un objetivo directo de miR-21 y confirmó que el HBP1 modula la función inhibitoria del miR-21-ASO en hepatoesteatosis y carcinogénesis simultáneamente (23). El HBP1 es un inhibidor endógeno de la vía de señalización Wnt en células normales y cancerosas. El papel supresor del tumor de HBP1 ha sido reportado en algunas neoplasias malignas, como el cáncer oral y el glioma (35). Sin embargo, una asociación entre HBP1 y Fgl2 no ha sido investigada todavía. El estudio actual demostró claramente que CC10 protege contra el MHV-3 inducido FH a través de la supresión de la expresión Fgl2. Tales efectos podrían ser mediados por HBP1. Sin embargo, el estado funcional de HBP1 en la vía CC10 requiere investigación adicional, y tales estudios están realizando en nuestro laboratorio. En conclusión, demostramos que CC10 podría limitar el daño inmunopatológico en ratones MHV-3 inducidos FH. Nuestros resultados sugieren que mejorar la expresión CC10 por un enfoque inmunoterapéutico podría ser un tratamiento eficaz para FH. HY realizó todos los experimentos descritos y escribió el manuscrito. YL ayudó con algunos experimentos XW revisó y editó el manuscrito. JH, WY, DX, XL, GS y QN proporcionaron ayuda experimental y diseño.

¿Cuál era el objetivo de este estudio?

Clara Cell 10 kDa Protein Alivia la cepa del virus de la hepatitis murina 3-Hepatitis fulminante inducida por la inhibición de la proteína fibrinógena 2 Expresiónhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6300492/SHA: f0c2cd2793d71f1ea11a810442a2c06d5013e899Autores: Yu, Haijing; Liu, Yang; Wang, Hongwu; Wan, Xiaoyang; Huang, Jiaquan; Yan, Weiming; Xi, Dong; Luo, Xiaoping; Shen, Guanxin; Ning, QinFecha: 2018-12-13DOI: 10.3389/fimmu.2018.02935Licencia: cc-by Las células Kupffer, la mayor población de células inmunes involucradas en las respuestas inmunes innatas, se consideran centrales para la FH. La proteína 2 de tipo fibrinógeno (Fgl2) es una proteína procoagulante que se induce sustancialmente en los macrófagos después de la infección viral, y el agotamiento de Fgl2 reprime la cepa 3 del virus de la hepatitis murina (MHV-3). La proteína Clara 10 kDa (CC10) es una proteína secreta con propiedades antiinflamatorias en la rinitis alérgica y el asma. Sin embargo, sus mecanismos de acción y funciones patogénicas en otras enfermedades siguen sin estar claros. En este estudio, nuestro objetivo fue determinar el papel de la CC10 en la FH y la regulación de la Fgl2 por la CC10. Métodos: Se estableció un modelo FH de ratón mediante inyección peritoneal de MHV-3. Se examinó la tasa de supervivencia, la función hepática, la histología hepática, la deposición de fibrina y la necrosis; se investigó el efecto regulador de la CC10 sobre la expresión de Fgl2 utilizando células TPH-1 y macrófagos peritoneales de ratón in vitro. Resultados: En el modelo FH del ratón inducido por MHV-3, la tasa de supervivencia aumentó de 0 a 12,5% en el grupo CC10 en comparación con la del grupo control exclusivo de la solución salina; mientras tanto, los niveles de ALT y AST en suero disminuyeron significativamente y se redujo el daño hepático; además, la expresión hepática Fgl2, TNF-α e IL-1β fue claramente desregulada junto con la deposición de fibrina, y la apoptosis hepatocítica se redujo después de la administración de proteína CC10. In vitro, se encontró que CC10 inhibe significativamente la expresión de Fgl2 en las células tratadas con IFN-γ TPH-1 y los macrófagos peritoneales del ratón infectados por MHV-3 por Western blot y PCR en tiempo real. Sin embargo, no hubo interacción directa entre CC10 y Fgl2 como se demostró por coinmunoprecipitación. Investigaciones de microarray sugieren que el factor de transcripción HMG-box 1 (HBP1) fue significativamente bajo en las células tratadas con CC10 y con IFN-γ-primed THP-1. El tratamiento con HBP1-siRN abrogó el efecto inhibidor de CC10 sobre la expresión de Fgl2 en las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs). Conclusión:CC10 protege contra la FH inducida por MHV-3 Estos efectos pueden ser mediados por el factor de transcripción HBP1. Texto: Hepatitis Fulminante (FH) es una enfermedad grave que amenaza la vida caracterizada por necrosis hepatocitica masiva, daño hepático severo y alta mortalidad. Los mecanismos subyacentes y la patogénesis de la FH no son claros. Sin embargo, la acumulación de evidencia sugiere que, independientemente de la patogénesis de la FH, las respuestas inflamatorias del huésped contribuyen a los trastornos microcirculatorios hepáticos y lesiones. En consecuencia, se ha demostrado que la activación celular inmune y las citocinas inflamatorias juegan un papel importante en la FH (1). En los últimos años, nuestro laboratorio ha llevado a cabo una extensa investigación sobre la patogénesis de la FH y encontró que las células inmunes desempeñan un papel clave en ella. Las células Kupffer, las células asesinas naturales (NK) (2, 3), los linfocitos T citotóxicos (LCT) y las células T doblemente negativas (DNT) (4) (5) (6) en el hígado y las citocinas producidas por estas células causan daño hepático. Protrombinasa Fgl2 pertenece a la superfamilia fibrinógena y es producida por macrófagos activados o células endoteliales, transformando la protrombina directamente en trombina, con el fin de iniciar rápidamente el proceso de coagulación. Esto promueve la conversión del fibrinógeno en fibrina, dando lugar a trombosis (7) (8) (9) (10) (11) (12). Nuestro estudio encontró que la Fgl2 se expresaba altamente en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y en tejido hepático de humanos o ratones con hepatitis viral grave, y estaba relacionada positivamente con La terapia génica dirigida al silenciamiento de Fgl2 mostró que la tasa de supervivencia de los ratones de hepatitis fulminante aumentó de 0 a 33,3% (15). Hasta el momento, el descubrimiento y la investigación relacionada con Fgl2 han proporcionado nuevas ideas sobre el mecanismo molecular de la necrosis hepatocitica en la HF. En vista del importante papel de Fgl2 en la hepatitis viral grave, las investigaciones sobre la regulación de Fgl2 serán beneficiosas en la búsqueda de nuevas estrategias para el tratamiento de la hepatitis grave. La proteína Clara 10 kDa (CC10), también considerada como uteroglobina, proteína secretora de células Clara, es uno de los miembros de la superfamilia de la secretoglobina. Expresada en células epiteliales mucosales de órganos (incluyendo pulmones y nariz) que se comunican con el mundo exterior (16). CC10 tiene efectos inmunomoduladores y anti En comparación con ratones de tipo salvaje, los ratones CC10-knockout mostraron inflamación excesiva de las vías respiratorias Abreviaturas: FH, hepatitis fulminante; MHV-3, cepa 3 del virus de la hepatitis murina; Fgl2, proteína 2 similar a la fibrinógeno; CC10, proteína de la célula Clara 10 KDa; ALF, insuficiencia hepática aguda; PFU, unidades formadoras de placa; PBS, solución salina fosfato-buffered; ALT, alanina aminotransferasa; AST, aspartato aminotransferasa; PCA, actividad procoagulante; HRP, peroxidasa de rábano; TUNEL, etiquetado final de la desoxinucleotidil transferasa dUTP. causado por reacción alérgica e infecciones bacterianas y virales (17). Los niveles reducidos de CC10 están asociados con enfermedades inflamatorias y alérgicas de las vías respiratorias, incluyendo sinusitis, asma y rinitis alérgica (18) (19) (20) (21). Estudios previos y artículos publicados muestran que la proteína CC10 no sólo puede inhibir las respuestas celulares Th17 al inhibir la expresión de moléculas relacionadas de células dendríticas y citocinas en ratones con rinitis alérgica, sino que también puede inhibir el quitosano-3 como la proteína 1 (22, 23). Además, CC10 inhibe la expresión de un importante regulador inmune, osteopontina (OPN), en modelos de rinitis alérgica (21). En este estudio, investigamos el papel de CC10 en la cepa 3 del virus de la hepatitis (MHV-3) FH inducida en ratones y exploramos si la proteína CC10 podría regular Fgl2 en el proceso de la enfermedad. Las hembras de ratones BALB/cJ (Shanghai Shilaike Animal Seed Center, Shanghai, China), de 6-8 semanas de edad, con un peso corporal de 18,0-20,0 g, se mantuvieron en el Hospital Tongji con alimentos y agua. Los ratones se dividieron en dos grupos: grupo CC10 (grupo experimental) y grupo salino fosfatado (PBS) (grupo de control). Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con las recomendaciones de las directrices de los Institutos Nacionales de Salud y el Comité de Experimentación Animal del hospital Tongji. Este estudio fue revisado y aprobado por el Comité de Experimentación Animal del hospital Tongji. La línea de células monocíticas humanas TPH-1 fue adquirida en el Instituto Celular de la Academia China de Ciencias (Shanghai, China). La línea celular de ovario de hámster chino (CHO) fue adquirida del banco celular típico de la comisión de preservación del cultivo, la Academia China de Ciencias (Shanghai, China). Las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) y las células CHO fueron cultivadas en el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM), y las células THP-1 se mantuvieron en el RPMI 1.640 que contenían 10% de suero fetal inactivado por calor (FBS, Gibco Life Technologies, EE.UU.), 100 U/ml penicilina y 100 mg/ml estreptomicina y cultivadas a 37 • C, 50 mL/L CO 2 y 95% de humedad. Los macrófagos exudativos peritoneales (PEM) se obtuvieron de ratones BALB/cJ. Las células fueron resuspedidas en RPMI 1.640 suplementadas con un 10% de FBS en 1-2 × 10 6 células/ml en una placa de 6 pozos e incubadas durante 4 h. Luego fueron lavadas con RPMI 1640 células medias y no adherentes desechadas. Las células adherentes fueron macrófagos y fueron incubadas durante 12 h. Los macrófagos exudativos peritoneales (PEM) se dividieron en dos grupos. Un grupo fue complementado con proteína CC10 (150 ng/ml) y en el otro grupo se añadió PBS. Después de 2 h de estimulación, se agregaron 1.000 unidades formadoras de placa (PCU) de MHV-3 a las células, que luego fueron cultivadas durante 4 h. Se recolectaron macrófagos exudativos peritoneales (PEM) y se lis La apoptosis celular fue detectada por el método terminal de desoxinucleotidil transferasa dUTP nick end labeling (TUNEL) con un kit de detección de apoptosis TUNEL (Roche, Suiza). Brevemente, 5 secciones de μm fueron desparafinadas, deshidratadas a través de una serie de alcoholes e incubadas con proteinasa K durante 30 minutos a 37 • C. Después de detener la reacción digestiva proteinasa K con PBS, las muestras fueron incubadas con un cóctel terminal de desoxinucleotidil transferasa (una mezcla de desoxinucleotidil transferasa terminal y dUTP a razón de 2:29, respectivamente), durante 2 h a 37 • C en una caja húmeda inmunohistoquímica. Después del lavado y bloqueo, cada sección fue complementada con reactivo (converter-POD) para cubrir los tejidos e incubada durante 30 minutos a 37 • C en una caja húmeda. Luego, las secciones de tejido hepático fueron lavadas con PBS, y coloreadas con diaminobencidina (DAB) posteriormente. Los hepatocitos con núcleo teñido de amarillo parduzco fueron considerados como células apoptóticas. La expresión de Fgl2 en células TPH-1 fue medida por citometría de flujo (BD FACS Canto II, EE.UU.). Brevemente, las células (2 × 10 5 por tubo) fueron incubadas con anticuerpo humano TruStrain FcX (solución Fc Receptor Blocking, BioLegend, EE.UU.) durante 10 minutos a temperatura ambiente y luego incubadas en la oscuridad con anticuerpo anti-Fgl2 del ratón (1:100, Abnova,) o suero de cabra normal (control de isotipo) a 4 • C durante 40 min. Las células fueron lavadas con PBS e incubadas en la oscuridad con anticuerpo anti-IgG de cabra conjugado con PE (1:50, BioLegend, EE.UU.) a 4 • C durante 30 min. Las células fueron luego lavadas con PBS y resucitadas en 300 μL PBS para estudio. La inmunohistoquímica de los tejidos hepáticos se realizó utilizando los kits SP-9001 SPlink Detection Kits (Biotin-Streptavidin HRP Detection Systems) (ZSGB-BIO, Beijing, China) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la tinción inmunohistoquímica, se detectó la expresión de Fgl2, fibrinógeno, Fas y TNF-receptor 1 en tejidos hepáticos de ratón con anticuerpo antimouse Fgl2 de conejo policlonal (1:100, Proteintech, EE.UU.), anticuerpo antimouse fibrinógeno de conejo policlonal (1:1.000, Abcam, EngLand), anticuerpo antimouse Fas de conejo policlonal (1:50, Abcam, EngLand), y anticuerpo antimouse TNF-receptor 1 de Después de la incubación con una fracción IgG de cabra marcada con rábano peroxidasa (HRP) a conejo IgG Fc, la proteína diana fue detectada usando un kit de DAB (ZSGB-BIO, Beijing, China). Las diapositivas fueron entonces contrapuestas con hematoxilina y visualizadas bajo un microscopio (Olympus, Tokio, Japón). El tejido hepático y las células fueron homogeneizados en el tampón de lisis RIPA con inhibidor de la proteasa de fenilmetano fluoruro de sulfonilo (PMSF). Los lisatos proteicos fueron separados por SDS-PAGE, y el Western Blotting fue realizado usando un ratón monoclonal antihumano/ratón Fgl2 (1:750, Abnova), un ratón monoclonal antihumano HBP1 (1:100, Santa Cruz, EE.UU.), y un conejo monoclonal antihumano/ratón β-actina (1:1,000, Cell Signaling Technology, EE.UU.). Los tejidos hepáticos fueron recolectados de ratones BALB/cJ infectados por MHV-3 a 72 h, y el ARN total fue extraído usando Reagent Trizol (Invitrogen, EE.UU.) y luego transcriptado en cDNA mediante ReverTra Ace qPCR RT kit (TOYOBO, Japón). PCR cuantitativo en tiempo real (qPCR) con SYBR Green PCR Master Mix en tiempo real (TOYOBO, Japón) se realizó utilizando un sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96 (Bio-Rad, EE.UU.) y los niveles de ARNm se normalizaron con referencia a los del gen de mantenimiento doméstico GAPDH. Las secuencias iniciales para la amplificación de qPCR fueron las siguientes: mTNF-α hacia adelante, 5 ′ -TTT GAG ATC CAT GCC GTT-3 ′ ; mTNF-α hacia atrás, 5 ′ -GCCA CCA CCA CCA CCA TCT TCT GT-3 ′ ; mil-1β hacia adelante, 5 ′ -TGT AAT GAA AGA CGC ACC-3 ′ ; mil-1β hacia atrás, 5 ′ -TCT TCT TTG GGT ATT GCT TG-3 ′. mFgl2 hacia adelante, 5 ′ -GCC AAA TGT GAG TCC CTG GAA-3 ′ ; mFgl2 hacia atrás, 5 ′ -TTC CAC CCA AGA GCA CGT TTA AG-3 ′ ; hFgl2 hacia adelante 5 ′ -ACA GTT CAG GCT GGT GGT-3 ′ ; hFgl2 hacia atrás, 5 ′ -GGC TTA AAG TGC TTG GGT-3 ′ ; HBP1 hacia adelante, 5 ′ -TGA AGC AGA AGC TGGG GAGT-3 ′ ; células HBP1 hacia atrás, THP-1 fueron tratadas con 100 ng/ml de forbol 12-miritato 13-acetato (PMA) (Sigma, EE.UU.) El grupo CC10 fue complementado con proteína CC10 (150 ng/ml). Después de 2 h de estimulación, se añadió IFN-γ (10 ng/ml) a estas células, que luego fueron cultivadas durante 12 h antes de ser recolectadas para estudios de borrado occidental y PCR en tiempo real. Las células de ovario de hámster chino (CHO) fueron cultivadas en platos de cultivo celular de 10 cm con DMEM complementado con 10% FBS hasta 80-90% confluencia. A continuación, 12 μg pcDNA3.1-hFgl2 (construido en nuestro laboratorio) fue mezclado con 12 μg pcDNA3.1-hCC10 en DMEM libre de suero. La mezcla fue luego combinada con Lipofectamine 2.000 (Invitrogen, EE.UU.) y mezclada suavemente. Después de la incubación a 27 • C durante 20 min, la solución fue añadida a las células CHO e incubada a 37 • C en 5% CO 2. Cuatro a seis horas después de la transfección, se eliminó el medio y se añadió un medio fresco con un 10% de FBS. A las 48 h después de la transfección, las células fueron recolectadas para el análisis de co-inmunoprecipitación para evaluar la interacción de CC10 con Fgl2. Las células HUVEC y TPH-1 expresan fgl2. Sin embargo, en los experimentos de transfección es difícil transfectar las células THP-1 con siRNA, por lo que utilizamos HUVEC en lugar de THP-1. Las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) fueron cultivadas en FIGURE 1 proteína CC10 aumentaron la tasa de (A) La tasa de supervivencia del grupo CC10 es mayor que el grupo control compuesto por ratones BALB/cJ infectados por MHV-3 tratados con solución salina. La proteína CC10 (2 μg) o solución salina se inyectaron en ratones por vena de cola. Los ratones BALB/cJ recibieron 100 UFP de MHV-3 intraperitonealmente 24 h más tarde para desarrollar hepatitis viral fulminante. Luego, la proteína CC10 (2 μg) o solución salina se inyectaron en ratones por vena de cola después de la infección por MHV-3 24 h más tarde. La tasa de supervivencia se observó durante 10 días (n = 24/grupo). Se muestran los datos representativos de tres experimentos independientes. La curva de supervivencia se analizó mediante la prueba Log-Rank. ***P < 0,001 en comparación con el grupo salino. (B) Se evaluó la histopatología de los tejidos hepáticos (manipulación de H&E; aumento original, ×400, n = 5/grupo) a 72 h de infección post-MHV-3 en los dos grupos de ratones BALB/cJ infectados por MHV-3. Se recogieron hígados de los tratados con salino (a) y CC10 (b) de los ratones BALB/cJ a 72 h después de infección por MHV-3. Las flechas apuntan a áreas de infiltración celular inflamatoria o regiones necróticas con inflamación. (C) Efecto de CC10 en los niveles séricos de ALT y AST (n = 6-8/grupo). Los valores representan el medio y el error estándar de tres experimentos independientes realizados en triplicado. **P < 0,01 en comparación con el grupo salino. 50 pmol HBP1-siRNA se mezcló con 125 μl libres de suero DMEM. Dos microlitros Lipofectamina 2.000 se mezclaron suavemente con DMEM libre de suero. Después de la incubación a 27 • C durante 5 min, la solución se añadió a HUVEC e incubada a 37 • C. Cuatro horas después de la transfección, se eliminó el medio y se añadió un medio fresco con 10% de FBS. A las 48 h después de la transfección, se recolectaron células para PCR en tiempo real y análisis de manchas occidentales para evaluar los efectos de HBP1 en Fgl2. A las 24 h después de la transfección, el grupo CC10 fue complementado con la proteína CC10 (150 ng/mL). Después de 4 h de estimulación, se añadió IFN-γ (10 ng/mL) a estas células. Estas células fueron cultivadas durante 24 h antes de ser recolectadas para estudios de PCR en tiempo real para evaluar los efectos de CC10 sobre Fgl2 por HBP1. El control negativo fue utilizado como control. Para detectar si había una interacción potencial entre la proteína CC10 y Fgl2, las células CHO fueron transfectadas con pcDNA3.1-hCC10 y pcDNA3.1-hFgl2 durante 48 h. Las células transfectadas con plásmido vacío pcDNA3.1 (mock) fueron utilizadas como controles negativos para la transfección del gen CC10. La inmunoprecipitación e inmunoblotación fueron realizadas utilizando Pierce Co-Immunoprecipitation Kit (Pierce, EE.UU.). Las proteínas celulares totales fueron extraídas como se describió anteriormente (25). Las proteínas fueron inmunoprecipitadas por anticuerpo Fgl2 antihumano Para los experimentos de coinmunoprecipitación, el Western bloting se realizó usando tanto anticuerpo anti-uteroglobina humana de rata/SCGB1A1 (1:750, R&D, USA) Frontiers in Immunology www.frontiersin.org y anticuerpo anti-humano Fgl2 de ratón (1:500, Abnova). El control isotipo de rata IgG1 fue utilizado como control negativo de anticuerpos primarios. El gen de la región de codificación CC10 humana, incluyendo una secuencia de 389 bp, fue amplificado a partir de tejido turbinado humano homogenizado por RT-PCR. En este estudio, las secuencias de los imprimadores PCR para CC10 fueron las siguientes: hCC10-forward, 5 ′ -CCC TCC ACC ATG AAA CTCG-3 ′ ; hCC10-reverse, 5 ′ -TGA GAT GCT TGT GGT TTA TTG AAG-3 ′. Los productos PCR fueron clonados en el vector de clonación peasy-T1 (TransGEN, Beijing, China) y luego subclonados en HindIII/XbaI sitio de pcDNA3.1 vector (Invitrogen, EE.UU.) para formar plasmidos de expresión eucariótica pcDNA3.1-hCC10. El análisis de microarray se utilizó para detectar cambios en los patrones de expresión génica de todo el genoma en células TPH-1 con o sin proteína CC Los cambios en más de 47,000 patrones de expresión génica humana fueron evaluados utilizando microarrays del gen Affymetrix (Genoma Humano U133 Plus 2.0) (CapitalBio Co.,Ltd., Beijing, China). Se utilizaron tres réplicas para el análisis de microarrays. Los datos obtenidos de los experimentos se expresan como promedio ± SEM. Se realizaron comparaciones de curvas de supervivencia con la prueba Log Rank. Se evaluaron múltiples análisis de grupos para los datos mediante análisis de varianza de un solo sentido. Se realizaron análisis de dos resultados de grupo utilizando la prueba t de Student para evaluar la significancia estadística de las diferencias. Valores de P < 0,05 indicaron significancia. Para establecer un modelo animal de ratón FH, MHV-3 fue inyectado intraperitonealmente a ratones BALB/cJ (24 ratones/grupo). Para seguir estudiando el papel de la CC10 en la FH, se administró la proteína CC10 del ratón recombinante (2 μg/ratón) o solución salina en la vena de la cola 24 h antes de la infección por MHV-3, la misma dosis de proteína CC10 o solución salina se administró 24 h más tarde, se observó la tasa de supervivencia de los grupos CC10 y salina durante 10 días, los resultados mostraron que los ratones de los dos grupos comenzaron a morir a las 48 h después de la inyección de MHV-3 y mostraron síntomas de horripilación, actividad lenta y reducción del consumo de alimentos; en el grupo CC10 24 ratones estaban vivos el día 3 después de la infección, 4 ratones vivos el día 4 y 3 de 24 (12,5%) ratones recuperados de hepatitis viral fulminante; al mismo tiempo, en el grupo tratado con solución salina, había 5 ratones vivos el día 3, 1 ratones vivos Es decir, los ratones del grupo salino murieron en 3 ó 4 días. Tres de los 24 (12,5%) ratones del grupo CC10 recuperados de hepatitis viral fulminante (Figura 1A). Para comprender mejor los mecanismos subyacentes a los efectos biológicos de la proteína CC10, se realizó la función hepática (niveles de ALT y AST en suero) y la histología hepática en ratones de VHM-3-infectados. Los tejidos hepáticos fueron recolectados 72 h después de la infección por VHM-3, y la histología hepática fue detectada por tinción H&E. Estos resultados mostraron que hubo infiltración celular inflamatoria sustancial y necrosis generalizada de hepatocitos en el tejido hepático de ratones del grupo salino (Figura 1Ba ). Hubo células inflamatorias raras o no infiltradas, y pocas o ninguna necrosis hepatocitica en los hígados de ratones en el Se observaron niveles séricos de ALT y AST en ratones 72 h después de la infección por MHV-3. Los resultados mostraron que los niveles séricos de ALT y AST en el grupo salino alcanzaron un pico 72 h después de la infección por MHV-3, pero no hubo un aumento significativo en el grupo CC10 en comparación con los niveles en el grupo control (P < 0,01, Figura 1C). Estos resultados sugieren que la proteína CC10 tiene un papel en la protección contra la lesión hepática inducida por MHV-3 en ratones. Para dilucidar aún más los mecanismos de reducción de la lesión hepática después de la inyección de proteína CC10, se investigó la expresión de citocinas TNF-α e IL-1β. Debido a que estas dos citocinas juegan un papel crucial en el daño hepático de la FH. Se caracterizan por un aumento de la apoptosis. Los niveles de TNF-α e IL-1β en los tejidos hepáticos se redujeron notablemente en el grupo CC10 (como se muestra en la Figura 2A). La apoptosis hepática (Figura 2B ) se redujo significativamente en el grupo CC10. Nosotros y los colaboradores tenemos un interés de larga data en estudiar el papel de fgl2 en la hepatitis viral. Fgl2 ha sido verificado para jugar un papel esencial en la progresión de la hepatitis viral fulminante como apreciamos de informes anteriores. Hemos proporcionado cifras de patología hepática y función hepática para ratones infectados por MHV-3 con un knockout genético fgl2 como se muestra en la Figura 1 suplementaria. Los datos fueron comparables con informes anteriores de nuestro centro y colaboradores. A partir de este estudio actual se demostró que la CC10 juega un papel protector en el daño hepático.Para estudiar las moléculas relacionadas de la CC10 en ratones MHV-3 inducidos por FH, se evaluó si había interconversación entre Fgl2 y CC10. Se encontró que la expresión de Fgl2 en el hígado de ratones se redujo 72 h después de la infección por MHV-3 y el tratamiento con proteína CC10 (Figuras 3A,B). Además, la deposición de fibrina, un indicador de lesión hepática asociado con la expresión Fgl2 en la FH, también se redujo en los hígados de ratones tratados con CC10 en comparación con la de control (Figura 3C ). Se examinó el efecto del aumento de dosis de proteína CC10 (0, 50, 150 y 300 ng/ml) en la expresión Fgl2 inducida por IFN-γ en las células TPH-1. El tratamiento con CC10 mostró una disminución del 10,1% en las células TPH-1 en comparación con el control después de la estimulación con 10 ng/ml IFN-γ durante 12 h. La proteína CC10 inhibió la expresión Fgl2 entre dosis de 0 ng/ml y 300 ng/ml (Figura 4A). En particular, 150 ng/ml proteína CC10 tuvo el efecto inhibidor más fuerte sobre la expresión Fgl2 entre las dosis, y se eligió esta dosis para los siguientes experimentos. Se exploró el efecto de diferentes puntos de tiempo de estimulación con una concentración de 150 ng/ml proteína CC10. Después de la estimulación con proteína CC10 para 6, 12 y 24 h en comparación con el control del PBS, el efecto inhibidor más fuerte sobre la expresión de Fgl2 se observó a las 12 h; por lo tanto, se eligió este momento para los siguientes estudios (Figura 4B ). Un número creciente de estudios sugieren que los macrófagos son la fuente primaria de Fgl2. Para determinar que el CC10 tiene un efecto directo sobre los macrófagos, se trató a las células TPH-1 con CC10 recombinante y se evaluó la expresión de Fgl2. A diferencia de los controles, IFN-γ indujo un aumento significativo en la expresión de Fgl2. Este efecto se atenuó cuando las células fueron tratadas con proteína CC10 (Figuras 4C,D), revelando que el CC10 reduce directamente los niveles de Fgl2 en los macrófagos. Para explorar la posibilidad de que la proteína CC10 actúe directamente sobre los macrófagos, infectamos PEM murinos con MHV-3 en presencia de CC10 recombinante y determinamos la expresión Fgl2. En comparación con los niveles en los controles, los macrófagos infectados con MHV-3 mostraron un aumento significativo en la producción de Fgl2, y este efecto fue abolido mediante el uso de proteína CC10 (Figuras 5A,B), indicando que CC10 modula directamente la producción de Fgl2 en los macrófagos. Para determinar los genes que fueron regulados después de la estimulación por la proteína CC10, utilizamos el análisis de microarray del ADN para detectar genes de expresión diferencial. Los resultados mostraron que los genes más obviamente desregulados fueron UBE2W, HECTD1, MIR612, ATRX, SOX4, HBP1 y Fgl2 (Tabla Suplementaria 1). Y luego estos genes fueron probados por qPCR. Sin embargo, UBE2W, HECTD1, MIR612, ATRX y SOX4 no fueron expresados de manera diferencial por qPCR, mientras que HBP1 y fgl2 todavía eran genes desregulados. El análisis de microarray ADN identificó HBP1 como un gen desregulado involucrado en los procesos patológicos de la regulación de CC10. Recientemente, estudios muy limitados han explorado el papel de HBP1 en FH. Sin embargo, las funciones mecánicas de HBP1 en FH permanecen en gran medida inexploradas. Por lo tanto El análisis de qPCR confirmó que los niveles de ARNm de HBP1 fueron significativamente disminuidos en las células TPH-1 después de la estimulación de la proteína CC10 en comparación con el grupo de control de PBS (Figura 6A ). Derribamos HBP1 usando HBP1-siRNA. Luego, la transfección de HBP1-SiRNA en HUVECs fue detectada por qPCR y métodos de bloqueo occidental. Como era de esperar, el derribo de HBP1 llevó a una disminución significativa de la expresión de HBP1 (Figuras 6B,C). Además, el derribo de HBP1 de la expresión deteriorada de Fgl2 (Figura 6D ), sugiriendo que HBP1 fue capaz de activar Fgl2. HBP1-SiRNA se utilizó para trans Luego, se añadió IFN-γ para inducir la expresión de Fgl2 seguido de estimulación con proteína CC10 (150 ng/ml) después de 2 h. Finalmente, se exploró la expresión de Fgl2 por qPCR. Los resultados mostraron que el tratamiento con HBP1-SiRNA abrogó el efecto inhibidor de CC10 sobre la expresión Fgl2 en HUVECs (Figura 7). Es decir, CC10 podría suprimir la expresión Fgl2 en macrófagos. Tal efecto puede ser mediado por el factor de transcripción HBP1. Es bien sabido que la proteína CC10 puede suprimir la respuesta inmune. En modelos animales de enfermedades alérgicas del tracto respiratorio, la mayoría de las evidencias confirman esta inhibición (26). Su función en FH no ha sido investigada todavía. Para determinar el papel de la CC10 en la patogénesis de la FH, la proteína CC10 se inyectó en un modelo de FH del ratón establecido por la infección MHV-3. En raras ocasiones se produjo una lesión hepática inducida por la MHV-3 en ratones tratados con CC10 y las áreas de lesiones fueron mucho menos que en ratones de control tratados con salino. En resumen, estos resultados sugieren que la CC10 podría reducir el daño hepático patológico en este modelo de FH junto con tasas de mortalidad más bajas seguidas por la infección MHV-3. La hepatitis viral fulminante inducida por MHV-3 progresa rápidamente y los ratones infectados mueren en 3-5 días. Estudios anteriores sugieren que la fgl2 jugó un papel vital en este proceso con un aumento del 15-40% de supervivencia cuando se eliminó la fgl2 (12, 15, 27, 28). Se ha demostrado que múltiples factores o mediadores inflamatorios, incluyendo TNF-α e IFN-γ, IL-1β y C5aR, promueven la progresión de la FH con discrepancias significativas entre el daño hepático y la tasa de supervivencia (29) (30) (31) (32), lo que concuerda con nuestra observación de que la CC10 aliviaba sustancialmente la lesión hepática aunque la tasa de supervivencia mejoraba levemente. La tasa de supervivencia basada en horas puede ser más precisa para examinar el efecto de la CC10 sobre la FH. Se especula que la fgl2 puede mediar la letalidad en la FH inducida por MHV-3. Esto se debe a que la fgl2 induce la deposición de fibrinógeno, lo que conduce a la activación de la cascada de coagulación y la inducción de la actividad procoagulante (15). Para determinar si la necrosis tisular Los resultados sugieren que la expresión de Fgl2 se incrementó significativamente en ratones FH inducidos por MHV-3 y el tratamiento con CC10 redujo significativamente la producción de Fgl2 en el hígado y el suero infectados. Además, también se observó una disminución de la deposición fibrinógena en los hígados de ratones tratados con CC10. Por lo tanto, nuestros resultados de investigación aclaran fuertemente que la menor mortalidad de ratones tratados con CC10 después de la infección por MHV-3 se debe a los niveles más bajos de Fgl2 y a la disminución de la deposición fibrinógena. De hecho, se ha reportado que Fgl2 se expresa en macrófagos, y se cree que la expresión de Fgl2 es inducida por IFN-γ y TNF-α (22). Se han demostrado células TPH-1 cultivadas activadas por IFN-γ o IL Por lo tanto, en este estudio, exploramos esta línea celular para investigar la modulación de CC10 en Fgl2. Sorprendentemente, encontramos que CC10 inhibió directamente la expresión Fgl2 inducida por IFN-γ en las células TPH-1. Como sabemos, IFN-γ ha demostrado ser la principal citocina que conduce al desarrollo y progresión de FH. Además, se demostró que IFN-γ podría ejercer su propia función biológica proinflamatoria mediante la mejora de la expresión Fgl2. Por lo tanto, en nuestro estudio, CC10 podría contrarrestar el efecto de IFN-γ en el establecimiento de FH, lo que confirma su papel en FH. Estos resultados demostraron que CC10 regula la expresión de Fgl2 en macrófagos. En el estudio actual, utilizamos co-inmunoprecipitación para analizar la unión entre CC10 y Fgl2. En este estudio se investigaron posibles interacciones proteína-proteínas entre CC10 y Fgl2 in vitro. Las células de ovario de hámster chino (CHO) transfectadas con pcDNA3.1-hCC10 y pcDNA3.1-hFgl2. Las proteínas celulares fueron inmunoprecipitadas con anticuerpos anti-CC10 o anti-Fgl2 y se realizó inmunobloqueo con anticuerpos anti-Fgl2 y anti-CC10. Inmunoprecipitación de extractos proteicos del pcDNA 3,1-CC10 y del pcDNA 3,1-Fgl2 cotransfectados con anticuerpos anti-Fgl2 o anti-CC10 seguidos de blocado occidental con anticuerpos Fgl2 y CC10 indicó que CC10 no coinmunoprecipitado con Fgl2, demostrando que no hay relación directa entre CC10 y Fgl2 (datos no mostrados). Los resultados mostraron que CC10 no tiene interacción directa con Fgl2. De nuestro estudio anterior el gen de fgl2 contribuyó profundamente en la hepatitis fulminante inducida por MHV-3 y se expresa ampliamente en macrófagos y endotelio (12, 33). Nuestro microarray indicó una expresión de fgl2 regulada por CC10 y esto es confirmado por qPCR y Western bloting in vivo (macrófagos peritoneales) e in vitro (THP-1, línea celular macrófaga). Por lo tanto, es razonable centrarse en los macrófagos para mostrar el efecto de CC10 en la expresión fgl2 y finalmente la supervivencia de ratones. Estamos totalmente de acuerdo en que puede haber otras posibilidades de un efecto protector de CC10 para contribuir al proceso de la enfermedad. Esto vale la pena estudios adicionales. El receptor potencial de CC10 no ha sido revelado todavía. Nuestro estudio anterior ha demostrado que CC10 tiene efecto de las células dendríticas en la rinitis alérgica (34). En esta investigación, evaluamos el efecto de CC10 sobre las funciones de los macrófagos y descubrimos que Fgl2 fue sustancialmente regulado sobre el tratamiento CC El análisis de microarray del ADN es uno de los enfoques más poderosos para la identificación potencial de genes inesperados involucrados en procesos patógenos. Usando este enfoque, se encontró que el factor de transcripción HMGbox 1 (HBP1) es uno de los genes más desregulados después del tratamiento de las células THP-1. HBP1 es un represor transcripcional bien descrito que modula la expresión de genes involucrados en la progresión del ciclo celular. En un estudio reciente, se encontró que el HBP1 es un objetivo directo de miR-21 y confirmó que el HBP1 modula la función inhibitoria del miR-21-ASO en hepatoesteatosis y carcinogénesis simultáneamente (23). El HBP1 es un inhibidor endógeno de la vía de señalización Wnt en células normales y cancerosas. El papel supresor del tumor de HBP1 ha sido reportado en algunas neoplasias malignas, como el cáncer oral y el glioma (35). Sin embargo, una asociación entre HBP1 y Fgl2 no ha sido investigada todavía. El estudio actual demostró claramente que CC10 protege contra el MHV-3 inducido FH a través de la supresión de la expresión Fgl2. Tales efectos podrían ser mediados por HBP1. Sin embargo, el estado funcional de HBP1 en la vía CC10 requiere investigación adicional, y tales estudios están realizando en nuestro laboratorio. En conclusión, demostramos que CC10 podría limitar el daño inmunopatológico en ratones MHV-3 inducidos FH. Nuestros resultados sugieren que mejorar la expresión CC10 por un enfoque inmunoterapéutico podría ser un tratamiento eficaz para FH. HY realizó todos los experimentos descritos y escribió el manuscrito. YL ayudó con algunos experimentos XW revisó y editó el manuscrito. JH, WY, DX, XL, GS y QN proporcionaron ayuda experimental y diseño.

¿Cuánto tiempo después de la infección por MHV-3 se tomaron muestras de hígado?

Evidencia para el modelo de convergencia: La emergencia de la gripe aviar altamente patógena (H5N1) en Viet Namhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4580613/SHA: ee5b43d20a640664510cb7a540caaae4a8e19933Autores: Saksena, Sumeet; Fox, Jefferson; Epprecht, Michael; Tran, Chinh C.; Nong, Duong H.; Spencer, James H.; Nguyen, Lam; Finucane, Melissa L.; Tran, Vien D.; Wilcox, Bruce A. Fecha: 2015-09-23DOI: 10.1371/journal.pone.0138138Licencia: cc-byAbstract: Sobre la base de una serie de revisiones que primero definieron y llamaron la atención sobre las enfermedades infecciosas emergentes (EID), se propuso el “modelo de convergencia” para explicar la causalidad multifactorial de la aparición de enfermedades. El modelo en general hipotetiza la aparición de enfermedades por la coincidencia de factores genéticos, físicos, ambientales, ecológicos y sociales. Desarrollamos y probamos un modelo de la aparición de gripe aviar altamente patógena (HPAI) H5N1 basado en supuestos factores de convergencia que están asociados principalmente con el cambio de uso de la tierra. Basándonos en estudios estadísticos geoespaciales previos que identificaron factores de riesgo naturales y humanos asociados con la urbanización, añadimos nuevos factores para probar si los mecanismos causales y los paisajes patógenos Nuestros hallazgos sugieren que la urbanización combina espacialmente factores de riesgo para producir determinados tipos de paisajes periurbanos con un riesgo de emergencia significativamente mayor de la IAPAP H5N1. El trabajo destaca que las áreas periurbanas de Viet Nam tienen mayores niveles de densidades de pollo, diversidades de tamaño de manadas de patos y gansos, y fracción de tierra bajo arroz o acuicultura que las zonas rurales y urbanas. También encontramos que la diversidad de uso de la tierra, una medida sustitutiva para la posible mezcla de poblaciones de acogida y otros factores que probablemente influyen en la transmisión viral, mejora significativamente la previsibilidad del modelo. Del mismo modo, paisajes donde se encontraron formas intensivas y extensas de superposición de la producción de aves de corral con mayor riesgo. Estos resultados apoyan la hipótesis de convergencia en general y demuestran el potencial de mejorar la prevención y el control de la EID mediante el análisis geoespacial de estos factores junto con los programas de vigilancia Texto: Dos décadas después del informe seminal del Instituto de Medicina [1] reconoció las enfermedades novedosas y reemergentes como una nueva categoría de amenazas microbianas, la naturaleza perpetua e inesperada de la aparición de enfermedades infecciosas sigue siendo un desafío a pesar de los avances significativos de la investigación clínica y biomédica [2]. La gripe aviar altamente patógena (HPAI) (subtipo H5N1) es la enfermedad pandémica de reciente aparición más importante desde el VIH/SIDA. Su erupción en el sudeste asiático en 2003-4 y posterior propagación mundial a más de 60 países se ajusta a la compleja definición de sistemas de "sorpresa" [3]. En este mismo año que la OIM había publicado su informe final sobre las amenazas microbianas que destacó la contención exitosa de H5N1 en Hong Kong en 1997 [4], brotes masivos ocurrieron en el sudeste asiático donde sigue siendo endémica, junto con el Delta del Nilo de Egipto. Desde 2003, HPAI H5N1 ha matado millones de aves de corral en países de Asia, Europa y África, y 402 humanos han muerto de ella en dieciséis países según datos de la OMS en enero de 2015. La amenaza de una pandemia que resulta en millones de casos humanos en todo el mundo sigue siendo una posibilidad [5]. Lederberg et al. [1] señalaron en primer lugar la multiplicidad de factores que impulsan la aparición de enfermedades, que más tarde se elaboraron y describieron en términos del'modelo de convergencia' [6]. El modelo propone que los eventos de emergencia se precipitan por la intensificación de los factores biológicos, ambientales, ecológicos y socioeconómicos. Joshua Lederberg, la mayor fuerza intelectual detrás de los estudios resumió diciendo "Las inestabilidades ecológicas surgen de las maneras en que alteramos el ambiente físico y biológico, los inquilinos microbianos y animales (incluidos los humanos) de estos ambientes, y nuestras interacciones (incluidas las intervenciones higiénicas y terapéuticas) con los parásitos" [6]. Combinando tales factores dispares y conceptos asociados de la biomedicina, la ecología y las ciencias sociales en un único marco sigue siendo difícil de alcanzar.Un enfoque sugerido ha sido emplear la teoría de sistemas socioecológicos que intenta capturar el comportamiento de los llamados'sistemas naturales-humanos acoplados', incluyendo la inevitable aparición inesperada de nuevas enfermedades, ellas mismas una de las "propiedades emergentes" de sistemas adaptativos complejos (CAS) [7, 8]. El modelo de convergencia puede adaptarse así incorporando la dinámica de las transformaciones urbanas, agrícolas y de ecosistemas naturales propuestas con este Estas interacciones multifacéticas asociadas, incluyendo retroalimentaciones que afectan a comunidades ecológicas, hospedadores y poblaciones de patógenos, son los impulsores inmediatos de la aparición de enfermedades. Los brotes iniciales de IAAP H5N1 en Vietnam representan una oportunidad ideal para adaptarse y probar un modelo de convergencia CAS. El riesgo de emergencia debe ser mayor en las áreas urbanas que se transforman más rápidamente, las zonas periurbanas donde las mezclas de usos urbanos-rural, modernos-tradicionales de la tierra y la cría de aves de corral coinciden más intensamente. Específicamente, hemos supuesto una asociación positiva entre la presencia de brotes de IAAP en aves de corral en el nivel comunal y: 1) áreas periurbanas, según lo definido por Saksena y otros [9], 2) diversidad de uso de la tierra, y 3) coubicación de sistemas intensivos y extensos de aves de corral. Utilizamos la presencia o ausencia en el nivel comuna Vietnam experimentó su primer brote de HPAI H5N1 a finales de 2003, desde entonces, ha habido cinco olas y brotes esporádicos registrados a lo largo de los años [10, 11]. Decidimos estudiar la primera ola (Ola 1) que terminó en febrero de 2004 y la segunda ola (Ola 2) que se produjo entre diciembre de 2004 y abril de 2005. Utilizamos datos del Censo Agrícola de Viet Nam 2006 para desarrollar una clasificación de la urbanicidad que utilizó datos recogidos en un solo punto en el tiempo (2006) pero a través del espacio (10.820 comunas) para inferir procesos de cambio (urbanización, diversificación del uso de la tierra e intensificación de las aves de corral) [9]. Las 58 provincias de Vietnam (sin contar las 5 provincias urbanas que están gobernadas centralmente) se dividen en distritos rurales, ciudades provinciales y ciudades. Una comuna de Viet Nam es, por tanto, la subdivisión administrativa de tercer nivel, compuesta por aldeas/hamlets. Con el fin de simplificar, en adelante utilizaremos el término "comuna" para referirse a la unidad administrativa más pequeña, ya sea una comuna, ciudad o barrio. Hemos incluido factores de riesgo documentados en trabajos anteriores. También hemos tratado de entender las diferencias, si las hay, en la dinámica de riesgo a diferentes escalas; comparando los riesgos a escala nacional con los de dos zonas agroecológicas subnacionales. Para ello hemos elegido estudiar los deltas del río Rojo y del río Mekong, puntos calientes bien conocidos de la enfermedad. Por lo tanto, hemos realizado dos conjuntos de análisis (ondas 1 y 2) para tres lugares (nación, Delta del río Rojo y Delta del Mekong) que producen un total de 6 análisis de lugares de onda. Los datos sobre brotes se obtuvieron de la base de datos pública del Departamento de Sanidad Dadas las dinámicas altamente complejas de las epidemias y en consonancia con las tendencias metodológicas recientes, utilizamos múltiples enfoques de modelado-paramétricos y no-paramétricos con enfoque en el análisis espacial. Utilizamos tanto modelos orientados al "lugar" que pueden tener en cuenta variaciones en factores como políticas y administración, como modelos orientados al "espacio" que reconocen la importancia de la proximidad física en el fenómeno natural [12]. Muy pocos estudios empíricos han intentado determinar si la urbanización está relacionada con brotes de EID o si la urbanización está asociada principalmente con otros factores relacionados con brotes de EID. Un problema inmediato que enfrentan los investigadores es definir lo que es rural, urbano y transitorio (es decir, periurbano). Algunos estudios han utilizado definiciones administrativas oficiales de áreas urbanas y rurales, pero este enfoque es limitado en su rompidez [13]. Otros estudios priorizaron la densidad de la población humana como un sustituto satisfactorio [11, [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20], pero este enfoque ignora el importante hecho de que la densidad no es un factor de riesgo si va acompañada de una infraestructura suficiente para manejar a la población. Spencer [21] examinó la urbanización como una característica no lineal, utilizando variables a nivel familiar como los servicios de agua y saneamiento. Encontró evidencia de que el aumento de la diversidad en las fuentes de abastecimiento de agua y la infraestructura de saneamiento estaban asociados con mayores incidencias de IAAP. Estos estudios utilizaron una definición limitada de urbanización que carecía de una caracterización bien definida de la periurbanización. Si bien estos estudios muestran diferencias en la naturaleza rural/urbana de las comunidades en el espacio y el tiempo, se han limitado a estudios observacionales de pequeña a mediana escala; y no han logrado distinguir entre los diferentes niveles de "ruralidad".Quizá el modelo más conocido de periurbanización es el concepto de McGee de desakota (Indonesiano para "pueblo-ciudad") [26]. McGee identificó seis características de las regiones desakota: 1) una gran población de pequeños cultivadores; 2) un aumento de las actividades no agrícolas; 3) una fluidez extrema y movilidad de la población; 4) una mezcla de usos de la tierra, agricultura, industrias artesanales, desarrollo suburbano; 5) una mayor participación de la fuerza de trabajo femenina; y 6) "zonas grises", donde el grupo de actividades informales e ilegales [26]. Saksena et al. [9] se basaron en los conceptos y datos desakota de McGee Este estudio identificó y mapeó las 10.820 comunas, la unidad administrativa más pequeña para la que se recopilan datos, como núcleo rural, periurbano, urbano o urbano. Este proyecto utilizó la clasificación Saksena para evaluar asociaciones entre clases de urbanismo, otros factores de riesgo y brotes de IAAP. Los investigadores han estimado que casi el 75% de las enfermedades zoonóticas están asociadas con cambios en la cubierta terrestre y el uso de la tierra (LCLUC) [27, 28]. LCLUC, como la periurbanización y la diversificación agrícola, suelen dar lugar a paisajes más diversos y fragmentados (número de cubiertas o usos de la tierra por unidad de tierra). La importancia del patrón paisajístico, incluyendo la diversidad y los procesos asociados, que equivalen al tamaño y distribución del hábitat de las especies de acogida, y por lo tanto la dinámica de transmisión de patógenos es axiomática, aunque los mecanismos específicos dependen La fragmentación del paisaje produce ecotonas, definidas como bordes abruptos o zonas de transición entre diferentes sistemas ecológicos, que se consideran que facilitan la aparición de enfermedades al aumentar la intensidad y frecuencia del contacto entre las especies de acogida [31] Además, la fragmentación del hábitat natural tiende a interrumpir y degradar los procesos naturales, incluidas las interacciones entre especies que regulan las densidades de especies oportunistas que pueden servir de huéspedes competentes [32], aunque no está claro si la reducción de la diversidad de especies aumenta necesariamente la transmisión de patógenos [33]. Rara vez se ha relacionado la investigación con la diversificación del uso de la tierra a los puntos finales de salud en los seres humanos o el ganado; este estudio intenta vincular la diversidad del uso de la tierra con los brotes de HPAI H5N1. Como se teorizó von Thünen en 1826 [34], gran parte de esta demanda se satisface en granjas cercanas a las ciudades [35], muchas de ellas en zonas en proceso de periurbanización [26]. Debido a la globalización del comercio de aves de corral, las granjas avícolas a gran escala que crían miles de aves se han expandido rápidamente en el sudeste asiático y compiten con los pequeños agricultores de patios traseros existentes [36]. Las operaciones de gran escala (15.000 a 100.000 aves) siguen siendo raras en Viet Nam (sólo 33 comunas tienen una instalación de este tipo). Por otro lado, las empresas nacionales y multinacionales suelen contratar agricultores para criar entre 2.000 y 15.000 aves. Estudios recientes han examinado el papel relativo de los sistemas extensos (de patio) y los sistemas intensivos [15, [17] [18] [19] 37]. En gran parte de Asia hay a menudo una Los expertos han sugerido que, desde la perspectiva de la bioseguridad, la colocalización de sistemas extensos e intensivos es un factor de riesgo potencial [38]. Los sistemas intensivos permiten la evolución del virus (por ejemplo, la baja gripe aviar patogénica a la IAAP) y la transformación, mientras que los sistemas extensos permiten la persistencia y la circulación del medio ambiente [39]. Estudios anteriores de poblaciones de pollos como factor de riesgo han distinguido entre sistemas de producción-pollos nativos, pollos de jardín; densidad de manadas; pollos comerciales, pollos de engorde y densidad de capas, etc. [15, [17] [18] [19] 37]. Sin embargo, en aislamiento, ninguno de estos métricas de aves de corral basadas en el número y/o la densidad mide adecuadamente el alcance de la colocalización de sistemas intensivos y extensos en cualquier lugar dado. Los sistemas intensivos y extenso Un índice de diversidad del número relativo de sistemas intensivos y extensos de cría de aves de corral puede estimar mejor el efecto de dicha coubicación; este estudio intenta vincular un índice de diversidad ganadera con la presencia o ausencia de brotes de IAAP H5N1 a nivel comunal. Este estudio investigó para las 10.820 comunas de Viet Nam un amplio conjunto de variables socioeconómicas, agrícolas, climáticas y ecológicas relevantes para la gestión de aves de corral y la transmisión y persistencia del virus IAAP. Muchas de estas variables se identificaron a partir de estudios anteriores de IAAP (revisados en Gilbert y Pfeiffer [40] ). Se incluyeron tres variables novedosas basadas en hipótesis generadas por este proyecto. Todas las variables fueron medidas o agregadas al nivel comunal. Las variables novedosas fueron:• Grado de urbanización: Utilizamos la clasificación de urbanismo desarrollada por Saksena et al. [9] para definir el carácter urbano de cada El marco de clasificación se basa en cuatro características: 1) porcentaje de hogares cuyos ingresos principales son la agricultura, la acuicultura y la silvicultura; 2) porcentaje de hogares con formas modernas de retretes; 3) porcentaje de tierras en la agricultura, la acuicultura y la silvicultura; y 4) índice normalizado de vegetación diferenciada (NDVI). La clasificación en tres sentidos permitió realizar pruebas para las respuestas no lineales y no monotónicas. • diversidad del uso del suelo: se midió la diversidad del uso del suelo utilizando el índice de diversidad Gini-Simpson [41]. El índice de diversidad Gini-Simpson se da por 1- Utilizamos las siguientes cinco clases de uso de la tierra: cultivos anuales, cultivos perennes, bosques, acuicultura y tierras edificadas (incluidos usos diversos) para los que se recogieron datos en el Censo Agrícola de 2006; la zona de la última clase se calculó como la diferencia entre la superficie total y la suma de las cuatro primeras clases; se enumeran las siguientes variables según su función en la introducción, transmisión y persistencia de enfermedades, aunque algunos de estos factores pueden tener múltiples funciones. • Transmisión relacionada con la población humana. Densidad de población humana [11, 14-16, 18, 19, 44, 45]. • Comercio y mercado de aves de corral. Se supuso que las ciudades eran lugares de comercio activos [10, 18, 37, 44, 46]. Así, la distancia a la ciudad más cercana se utilizó como indicador del comercio de aves de corral. Por lo tanto, la distancia a la carretera nacional más cercana y a la carretera provincial b) fue utilizada como indicador de infraestructura de transporte. • Introducción y amplificación de enfermedades. Las densidades de pollo se calcularon en base al área comunal [15, 19, 37, 49]. • Hosterías intermedias. Se calcularon densidades de patos y gansos utilizando el área comunal total [11, 19, 49]. Como estudios previos han mostrado un vínculo entre la recolección en campos de arroz por patos y brotes, también se calculó la densidad de patos utilizando sólo la zona bajo arroz. • Factores de riesgo agroecológicos y ambientales. Estudios previos han demostrado que el alcance del cultivo de arroz es un factor de riesgo, principalmente debido a su asociación con patos de libre alcance que actúan como carroñeros [10]. Utilizamos el porcentaje de tierras bajo cultivo de arroz como medida de extensión. La intensidad de cultivo de arroz es La extensión de la acuicultura es un factor de riesgo conocido [10], posiblemente debido a que las masas de agua ofrecen rutas de transmisión y persistencia del virus; el porcentaje de tierras acuícolas se utilizó como medida; la proximidad a las masas de agua aumenta el riesgo de brotes [47, [50] [51] [52], posiblemente aumentando la posibilidad de contacto entre aves acuáticas silvestres y aves de corral domésticas; se midió la distancia entre la comuna y la más cercana: a) lago y b) río; las variables climáticas -temperatura media anual y precipitación anual- se han asociado con cambios significativos en el riesgo [48, 53]. La elevación, que se asocia con tipos de cubierta terrestre y agricultura, ha demostrado ser un factor de riesgo significativo en Vietnam [10]. El Índice Topográfico Compuesto (ICT, también conocido como Índice Topográfico de Humedad) es una medida de la tendencia del agua a la piscina. Estudios realizados en Tailandia y en otros lugares [54] han demostrado que la extensión del agua superficial es un factor de riesgo fuerte, posiblemente debido al papel del agua en la transmisión a largo plazo y la persistencia del virus. En ausencia de datos fiables y baratos sobre la extensión del agua superficial, utilizamos el CTI como sustituto. El CTI se ha utilizado en los Modelos Ecológicos de Nicho (ENM) de HPAI H5N1 [55, 56]. Sin embargo, dada la naturaleza de los estudios de ENM, el efecto del CTI como factor de riesgo se ha desconocido hasta ahora. El CTI se ha utilizado como factor de riesgo en el estudio de otras enfermedades infecciosas y no infecciosas [57]. Algunos estudios han demostrado que en escalas locales, la pendiente del terreno (un componente de la ITC) se correlaciona significativamente con el dominio de las especies de reservorio [58]. La ITC es una función tanto de la pendiente como de la zona de aporte aguas arriba por unidad de ancho ortogonal a la dirección del flujo. La ITC se calcula de la siguiente manera: ITC = ln (A s / (tan (β)) donde; A s = Valor de Área calculado como ((acumulación de flujo + 1) Ã (área de píxeles en m 2) y β es la pendiente expresada en radianes [59). Aunque estudios previos han indicado que el Índice de Diferencia Normalizada de Vegetación (NDVI) es un factor de riesgo [10, 20, 55, 60, 61], no lo incluimos explícitamente en nuestros modelos, ya que el índice de Se obtuvieron datos a nivel comunal sobre brotes de IAAP H5N1 de la base de datos de acceso público del Departamento de Sanidad Animal [10]. Viet Nam experimentó sus primeras grandes oleadas epidémicas entre diciembre de 2003 y febrero de 2006 [10]. Decidimos estudiar la primera ola (ola 1) que terminó en febrero de 2004 y la segunda ola (ola 2) que se produjo entre diciembre de 2004 y abril de 2005. En la Ola 1, el 21% de las comunas y en la Ola 2, el 6% de las comunas experimentaron brotes. Utilizamos datos del Censo de Población de Viet Nam de 1999 para estimar la población humana por comuna. Nos basamos en datos de dos Censos Agrícolas de Viet Nam. Esta encuesta se realiza cada cinco años que abarcan todos los hogares rurales y los hogares periurbanos que poseen explotaciones. Así, se incluyen cerca de tres cuartas partes de todos los hogares del país. Los contenidos de la encuesta incluyen el número de hogares en las principales actividades de producción, población, mano de obra clasificada por sexo, edad, cualificación, empleo y fuente de ingresos; tierras agrícolas, forestales y acuícolas utilizadas por hogares clasificados por fuente, tipo, área de cultivo para cada tipo de cultivo; y equipo agrícola por finalidad; encuestas a nivel comunal incluyen información sobre infraestructura rural, a saber, electricidad, transporte, estaciones médicas, escuelas; fuente de agua dulce, comunicación, mercados, etc. Se recopilan datos económicos detallados para las grandes explotaciones agrícolas. Utilizamos el Censo de Agricultura de 2006 para la mayoría de las variables porque las tres primeras oleadas epidémicas ocurrieron entre los censos agrícolas de 2001 y 2006, pero fueron más cercanas a tiempo al censo de 2006 [10]. Sin embargo, para los datos sobre el número de aves de corral se utilizaron los datos del Censo de Agricultura de 2001 porque entre 1991 y 2003 la población avícola creció a una tasa Sólo a mediados de 2008 la población avícola regresó cerca de los niveles preepidémicos, por lo que consideramos que los datos de población avícola del censo de 2001 eran más representativos. Agregamos los datos de los hogares del censo al nivel comunal. Una clasificación de tres vías de la transición rural-urbana se basó en un estudio conexo [9]. Se obtuvieron datos de raster sobre la temperatura media anual y la precipitación de la base de datos World-Clim y se convirtieron en datos de nivel comunal. Las variables bioclimáticas se compilaron a partir de los valores mensuales de temperatura y precipitación e interpolaron a superficies a 90 metros de resolución espacial [62]. Esta base de datos pública proporciona datos sobre las condiciones climáticas medias del período 1950-2000. La elevación se generó a partir de los modelos de elevación digital (DEM) de SRTM 90 metros adquiridos del Consorcio de Información Espacial (CGIAR-CSI). Los datos del Índice Topográfico Compuesto (ITC) se generaron utilizando la Caja de Herramientas de Geomorfometría y Métrica Gradient para Arc-GIS 10.1. Antes del análisis de factores de riesgo, se limpiaron los datos identificando valores ilógicos para todas las variables y luego se les asignaba un valor faltante o se ajustaban los valores. Los valores ilógicos ocurrieron principalmente (menos del 1% de los casos) para variables relacionadas con el suelo, como el porcentaje de suelo comunal bajo un tipo particular de uso del suelo. Luego se probó cada variable para la normalidad utilizando el software BestFit (Palisade Corporation). Se encontró que la mayoría de las variables seguían una distribución logarít-normal y se utilizó una transformación logarítmica en ellas. Luego se examinaron las correlaciones bivariadas entre todos los factores de riesgo (o su transformación logarítmica, según el caso 0.5 (r es el coeficiente de correlación de Pearson). Cuando dos factores de riesgo estaban altamente correlacionados, se optó por incluir el que no había sido estudiado adecuadamente explícitamente en modelos de riesgo publicados previamente. En particular, se excluyó a) elevación (correlacionado con la densidad de población humana, densidad de pollo, densidad de pato, porcentaje de tierra bajo el arroz, temperatura anual e índice topográfico compuesto), b) densidad de población humana (correlacionado con la elevación e ITC), c) densidad de pollo (solo a nivel nacional, correlacionado con la ITC), d) densidad de pato y ganso (correlacionado con la elevación, densidad de pollo, porcentaje de tierra bajo el arroz, índice de diversidad de uso de la tierra e ITC), e) temperatura anual (correlacionado con la elevación e ITC) y f) intensidad de cultivo (correlacionado con el porcentaje de tierra bajo el arroz). Teniendo en cuenta la importancia de la autocorrelación espacial en tales epidemias, se utilizaron dos enfoques de modelado: 1) Modelo Lineal Generalizado de varios niveles (GLMM) y 2) Árboles de Regresión Impulsada (BRT) [63, 64] con un término autorregresivo [65]. GLMM es un enfoque orientado al 'lugar' que es adecuado para analizar el efecto de agrupaciones administrativas, mientras que BRT es un enfoque orientado al 'espacio' que explica los efectos de la proximidad física. Comenzamos por derivar un término autorregresivo promediando la presencia/ausencia entre un conjunto de vecinos definidos por el límite de autocorrelación, ponderado por la inversa de la distancia euclidiana [65]. El límite de la autocorrelación de la variable de respuesta se obtuvo a partir del rango del correlograma espacial (h) [66]. Para determinar qué variables predictivas incluir en los dos modelos, se realizó un modelo de regresión logística por separado para cada uno de ellos, pero se incluyó el término autorregresivo cada vez. Finalmente se incluyeron sólo aquellas variables cuyo coeficiente tenía un valor de significación p 0,2 (en al menos una combinación de lugar de onda) y se observó el signo del coeficiente. Esta elección del valor p para el cribado de factores de riesgo es común en estudios similares [15, 18, 45, 67]. Utilizamos un GLMM de dos niveles (comunes anidados bajo distritos) para tener en cuenta los efectos aleatorios para un área influenciada por sus vecinos, y por lo tanto, estudiamos el efecto de la autocorrelación espacial. Utilizamos errores estándar robustos para las pruebas de efectos fijos. Este método fue desarrollado recientemente y aplicado ampliamente para la predicción de la distribución en diversos campos de la ecología [63, 64]. Es ampliamente utilizado para el modelado de la distribución de especies donde sólo se conocen los sitios de ocurrencia de la especie [68]. El método ha sido aplicado en numerosos estudios para predecir la distribución de la enfermedad HPAI H5N1 [16, 51, [69] [70] [71]. BRT utiliza árboles de regresión y algoritmos de impulso para adaptarse a varios modelos y los combina para mejorar la predicción mediante la realización de bucle iterativo en todo el modelo [63, 64]. La ventaja de BRT es que aplica procesos estocásticos que incluyen componentes probabilísticos para mejorar el rendimiento predictivo. Utilizamos árboles de regresión para seleccionar variables predictivas relevantes e impulsar para mejorar la precisión en un solo árbol. El proceso secuencial permite que los árboles se ajusten iterativamente a Dos parámetros importantes especificados en el modelo BRT son la tasa de aprendizaje (lr) y la complejidad de los árboles (tc) para determinar el número de árboles para una predicción óptima [63, 64]. En nuestro modelo utilizamos 10 conjuntos de entrenamiento y puntos de prueba para la validación cruzada, una complejidad de los árboles de 5, una tasa de aprendizaje de 0,01 y una fracción de bolsa de 0,5. Otras ventajas de BRT incluyen su insensibilidad a la colinealidad y respuestas no lineales. Sin embargo, en aras de la coherencia con el método GLMM, optamos por eliminar predictores que estaban altamente correlacionados con otros predictores y hacer transformas de logs cuando era necesario. En los modelos GLMM utilizamos p 0,05 para identificar factores de riesgo significativos. Las prestaciones predictivas de los modelos fueron evaluadas por el área bajo la curva (AUC) de la curva característica de operación del receptor (ROC). El AUC es una medida del ajuste global del modelo que varía de 0,5 (evento de oportunidad) a 1,0 (ajuste perfecto) [72]. Una comparación del AUC con otras métricas de precisión concluyó que es la medida más robusta del rendimiento del modelo porque se mantuvo constante en una amplia gama de tasas de prevalencia [73]. Utilizamos los Criterios de Información Akaike corregidos (AICc) para comparar cada modelo GLMM con y sin su respectivo conjunto de predictores fijos. Utilizamos la versión 21 del SPSS (IBM Corp., Nueva York, 2012) para GLMM y R versión 3.1.0 (The R Foundation for Statistical Computing, 2014) para el BRT. Para el cálculo del correlograma espacial se utilizó el paquete spdep de R. Las catorce variables predictivas que modelamos (ver tablas) se encontraron significativamente asociadas con brotes de HPAI H5N1 (p 0.2) en al menos una combinación de lugar de onda basada en análisis univariado (pero incluyendo el término autorregresivo) (Tabla 1). Se encontró que la diversidad de uso del suelo, densidad de pollo, diversidad de tamaño de manadas de aves de corral y distancia a la carretera nacional tienen asociaciones significativas en cinco de las seis combinaciones de lugar de onda. la potencia de los modelos GLMM, medida por el AUC, es muy buena con valores AUC que van de 0,802 a 0,952 (Tablas 2-7 ). La potencia predictiva de los modelos nacionales fue mayor que la de los modelos delta. La potencia predictiva de los modelos BRT es buena, con AUCs que van de 0,737 Los modelos BRT también tuvieron una mejor potencia predictiva a nivel nacional que a nivel delta. Estos valores son más altos que los reportados para la Ola 1 (AUC = 0,69) y la Ola 2 (AUC = 0,77) por Gilbert et al. [11]. Tanto Gilbert et al. [11] y este estudio encontraron que a nivel nacional el rendimiento predictivo para la Ola 2 fue mayor que el de la Ola 1. La Ola 2 afectó principalmente al Delta del río Mekong. Estudios anteriores indicaron que la densidad del pato era un predictor importante [11] ; sin embargo, nuestros resultados indicaron que la diversidad del tamaño del rebaño de patos era un predictor más importante que la densidad del pato. Ambos modelos GLMM y BRT encontraron que la precipitación anual era un factor significativo. El modelo GLMM indicó una asociación negativa; similar a lo encontrado por estudios en China [51] y en el En general, el papel de la precipitación fue mucho más significativo en los deltas que en el conjunto del país. El riesgo relativo (RR) no ajustado de las zonas periurbanas en comparación con las zonas no periurbanas fue de 1,41 y 1,60 para las Olas 1 y 2, respectivamente. En términos de urbanidad, se encontró que la densidad de pollo, el porcentaje de tierra bajo arroz, el porcentaje de tierra bajo acuicultura, la diversidad del tamaño de las manadas de patos y gansos, y el Índice Topográfico Compuesto (CTI) era más alto en las zonas periurbanas (Fig 1a-1e). También se encontró que la diversidad de uso de la tierra era mayor en las zonas rurales, pero las zonas periurbanas tenían niveles de diversidad sólo marginalmente inferiores (Fig 1f). Sin embargo, la variable urbanística por sí sola no se asoció significativamente con la HPAI H5N1 en ningún lugar según el modelo GLMM, excepto en el nivel urbano del Delta del Río Rojo para la Ola 2 y en el Delta del Río Mekong para la Ola 1. El modelo BRT clasificó la urbanicidad como una de las variables menos influyentes. Se encontró que la diversidad de uso de la tierra se asoció significativamente con la HPAI H5N1 en ambas olas para Viet Nam según el modelo GLMM, pero en el nivel del delta la asociación fue significativa sólo para la Ola 2 en el Delta del Río Mekong. El modelo BRT indicó que la diversidad de uso de la tierra influyó altamente en la HPAI H5N1 a nivel nacional en la Ola 2. Tanto los modelos GLMM como BRT indicaron que la diversidad del tamaño de rebaño de pollo tenía una fuerte asociación con HPAI H5N1 para ambas ondas a nivel nacional, lo cual se encontró generalmente en los niveles delta con algunas excepciones.La diversidad del tamaño de rebaño de pato y ganso también se asoció significativamente con HPAI H5N1 en todos los lugares, pero las asociaciones fueron mucho más fuertes en la Ola 2 que en la Ola 1. El modelo GLMM indicó que el CTI tenía una asociación muy fuerte con HPAI H5N1 a nivel nacional en ambas ondas, aunque esto no era cierto en los dos deltas. El CTI es un índice de humedad en estado estable utilizado comúnmente para cuantificar el control topográfico en procesos hidrológicos. Los números de acumulación en áreas planas, como los deltas, son muy grandes; por lo tanto, el CTI no era una variable relevante en el modelo GLMM El modelo BRT sin embargo indicó que el CTI tuvo una influencia media a baja en todas las ondas y lugares. Encontramos efectos de agrupamiento espacial muy altos como lo indica el hecho de que en todas las ondas y lugares el modelo BRT encontró que el término de autocorrelación espacial tiene el rango más alto de influencia. Como se esperaba, la influencia relativa del término de autocorrelación a nivel nacional fue mayor (60-78%) que en los niveles delta (14-35%). En los modelos GLMM encontramos el Criterio de Información Akaike (AIC) usando todo el conjunto de 14 variables para ser mucho menor que los AICs de un modelo GLMM sin efectos fijos. Esto indicó que aunque los efectos de agrupamiento fueron significativos, nuestra teoría impulsó variables predictoras mejoró el rendimiento del modelo. Es posible la sub-reporte/detección en áreas rurales en comparación con áreas periurbanas. Creemos que la urbanicidad y la distancia más corta a los factores de riesgo de la ciudad más cercanos sirven como proxys ásperos para reportar/detectar eficiencia. Estudios anteriores han tendido a utilizar la densidad de población humana como un indicador para este propósito. En nuestro estudio encontramos una fuerte asociación entre la densidad de población humana y la urbanicidad. Pero reconocemos que una variable categórica como la urbanicidad puede proporcionar menos sensibilidad que una variable continua como la densidad de población humana en este contexto específico. Este estudio exploró la validez de un modelo general para la emergencia de enfermedades que combina el'modelo de convergencia' de la OIM [6] y el modelo de sistemas socioecológicos [7, 8], para investigar el caso específico de la IAP en Vietnam. Buscamos probar las hipótesis de que las medidas de urbanización, diversificación del uso Nuestros resultados apoyan generalmente la hipótesis de que las transformaciones del sistema socio-ecológico están asociadas a brotes de H5NI en aves de corral.Los resultados presentados aquí destacan tres hallazgos principales: 1) cuando se tienen en cuenta factores de riesgo relevantes, la urbanización no es generalmente un factor de riesgo independiente significativo; pero en paisajes periurbanos convergen factores de emergencia, incluyendo mayores niveles de densidades de pollo, diversidades de tamaño de manada de patos y gansos, y fracción de tierra bajo arroz o acuicultura; 2) paisajes de alta diversidad de uso de la tierra, variable no considerada previamente en estudios espaciales de HPAI H5N1, tienen un riesgo significativamente mayor para brotes de HPAI H5N1; al igual que 3) paisajes donde se coubican formas intensivas y extensas de producción avícola. [17] Las áreas periurbanas encontradas en Indonesia se asociaron significativamente con casos de IAPH H5N1, incluso basados en modelos multivariables. Sin embargo, nuestro estudio intentó asociar tanto la IAPH H5N1 con el grado de urbanidad y determinar las características de las áreas periurbanas que las ponen en riesgo. Cuando estas características (es decir, densidades de pollo, diversidades de tamaño de manada de patos y gansos, y la fracción de tierra bajo arroz o acuicultura) se incluyen en modelos multivariados, el papel de la variable de urbanización per se disminuye. Encontramos en los principales deltas del río en Viet Nam (Río Rojo y Mekong), la urbanización no tenía asociación significativa con la IAPH5N1. Esto puede deberse a que los deltas son más homogéneos, en términos de urbanización, que el país en su conjunto. Este es el primer estudio en examinar la diversidad del uso de la tierra como factor de riesgo para la IAAP H5N1. Medidos por el Índice de Diversidad Gini-Simpson de las cinco clases de uso de la tierra sobre las que se recogieron datos en el Censo Agrícola de Viet Nam de 2006, y la presencia o ausencia de brotes de IAAP a nivel comunal, nuestros resultados indican una fuerte asociación entre la diversidad del uso de la tierra y la IAAP H5N1 a nivel nacional y en el Delta del río Mekong. Esta métrica capta tanto la variedad de hábitats como la complejidad del patrón geoespacial probablemente asociado a la intensidad de transmisión. Nuestros resultados son similares a los observados por estudios de otras EID utilizando métricas de fragmentación (por ejemplo [75] [76] [77]. Este es uno de los pocos estudios, sin embargo, para vincular la fragmentación del paisaje a Los estudios anteriores se han centrado en factores de producción de aves de corral, como el tipo de especie, el tamaño de las manadas y el grado de comercialización (por ejemplo, [15, [17] [18] [19]. Este estudio amplía esos hallazgos al proporcionar pruebas de que cuando los sistemas intensivos y extensos de producción de pollo y/o pato y gansos coexisten en la misma comuna, la comuna experimenta un mayor riesgo de brote de enfermedad. Los estudios futuros deben examinar los mecanismos biológicos causales en este contexto. Sugerimos que los datos censales nacionales (en particular los censos agrícolas) compilados a nivel local proporcionan información valiosa que no está disponible a partir de datos de teleobservación (como las densidades de aves de corral) o requieren una gran cantidad de mano de obra para mapear a escala nacional a mayor escala (diversidad del uso de la tierra). Sin embargo, estudios futuros podrían examinar la correlación entre una métrica basada en censos y las métricas derivadas de la teleobservación utilizadas para medir la abundancia proporcional de cada tipo de cubierta terrestre dentro de un paisaje [78]. Vietnam está relativamente avanzado en la disponibilidad de datos censales nacionales digitales y agrícolas en un formato que puede vincularse a los límites administrativos. Mientras que otras naciones están empezando a desarrollar capacidades similares, a corto plazo la aplicación de este método a otros países puede ser limitada. En última instancia, tanto los datos censales como los datos de teleobservación pueden utilizarse independientemente para trazar el mapa de la transición urbana y la diversidad de uso de la tierra; sin embargo, estos instrumentos pueden proporcionar sus mayores conocimientos cuando se utilizan juntos. Otra contribución importante de este estudio fue el descubrimiento de la importancia de la CTI. Hasta ahora, la CTI sólo se había utilizado en estudios de modelización ecológica de nichos de HPAI H5N1; el papel Nuestro estudio, el primero en utilizar la CTI como factor de riesgo, encontró que tuvo una gran influencia positiva en el riesgo de la HPAI H5N1 a nivel nacional. Estudios anteriores han destacado el papel de la extensión de agua superficial en la persistencia y transmisión del virus de la HPAI H5N1. Estos estudios midieron la extensión de agua superficial como área cubierta por el agua, magnitud de inundaciones estacionales, distancia al cuerpo de agua más cercano, u otras variables que a menudo son difíciles de mapear utilizando datos de teleobservación, especialmente para estudios de área grande. CTI por otro lado tiene el potencial de servir como excelente sustituto que puede ser fácilmente medido en una base de datos SIG. Los modelos nacionales y regionales (delta) difirieron considerablemente, tanto en términos de rendimiento como de factores de riesgo significativos. Esto sugiere que la dinámica de riesgo a nivel comunal depende fuertemente del rango espacial de análisis, consistente con otro estudio en el Delta del Mekong [61]. Aunque el modelo de ese estudio incluyó inicialmente tres docenas de factores de riesgo comúnmente conocidos, los factores de riesgo significativos se limitaron a la densidad de manadas de aves de corral, proporción de hogares con electricidad, mediana NDVI reescalonada de mayo a octubre, densidad de búfalos y rendimiento de batata. Otro estudio en el Delta del Río Rojo [79] encontró que, además de las métricas típicas de densidad de aves de corral, sólo la presencia de comerciantes de aves de corral era significativa. Especulamos que para las regiones más pequeñas, especialmente para las zonas calientes conocidas, los factores de riesgo relevantes son los que reflejan las fuerzas motrices a corto plazo como el comercio de aves de corral, la presencia de mercados de aves vivas y mercados húmedos Para mejorar el rendimiento de los modelos en las regiones más pequeñas se necesitarían parámetros altamente refinados y matizados para el comercio de aves de corral, la infraestructura vial, las masas de agua, etc.-datos que normalmente no están disponibles a través de encuestas censales. Las diferencias entre los modelos nacionales y regionales sugieren que nuestros resultados pueden informar a los planificadores que toman decisiones en diferentes niveles jerárquicos de jurisdicción: nacional, regional y local. Nuestro estudio tiene el potencial de fundamentar el diseño de futuras investigaciones relacionadas con la epidemiología de otras EIDs en Viet Nam y en otros lugares. Por ejemplo, especulamos que en el sudeste asiático, la encefalitis japonesa, cuya transmisión está asociada con el cultivo de arroz y el riego por inundaciones [80], también puede mostrar una fuerte asociación con la periurbanización. Del mismo modo, el virus Hantaan, la causa de la fiebre hemorrágica coreana, está asociado con el ratón de campo Apodemus agrario y la cosecha de arroz en los campos donde están presentes los roedores [80]. Nuestro trabajo ha demostrado que el porcentaje de tierra bajo el arroz en las zonas periurbanas y rurales es similar. Por lo tanto, las enfermedades asociadas con la producción de arroz son propensas a pico en las zonas periurbanas debido a otros factores de riesgo como la diversidad de uso de la tierra, la CTI y la distancia a la infraestructura. Nuestros hallazgos de diversidad del tamaño de manadas de aves de corral también pueden ser relevantes para entender la dinámica de otras infecciones relacionadas con aves de corral como la enfermedad de Newcastle. Por último, estos resultados sugieren la validez de un modelo general de aparición de enfermedades zoonóticas que integra el modelo de convergencia de la OIM con los sistemas socioecológicos y el marco EID propuestos Los resultados del proyecto cuestionan si la dicotomía de uso de la tierra urbana/rural es útil cuando grandes áreas y partes de la población se encuentran atrapadas entre ambas. Los planificadores necesitan mejores herramientas para trazar el mapa de la transición rural-urbana, y para entender cómo la naturaleza específica de los entornos periurbanos crea un riesgo elevado para la salud que requiere la adaptación de las prácticas de planificación, uso de la tierra y desarrollo existentes.

¿Qué es el método de árbol de regresión potenciado?

Evidencia para el modelo de convergencia: La emergencia de la gripe aviar altamente patógena (H5N1) en Viet Namhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4580613/SHA: ee5b43d20a640664510cb7a540caaae4a8e19933Autores: Saksena, Sumeet; Fox, Jefferson; Epprecht, Michael; Tran, Chinh C.; Nong, Duong H.; Spencer, James H.; Nguyen, Lam; Finucane, Melissa L.; Tran, Vien D.; Wilcox, Bruce A. Fecha: 2015-09-23DOI: 10.1371/journal.pone.0138138Licencia: cc-byAbstract: Sobre la base de una serie de revisiones que primero definieron y llamaron la atención sobre las enfermedades infecciosas emergentes (EID), se propuso el “modelo de convergencia” para explicar la causalidad multifactorial de la aparición de enfermedades. El modelo en general hipotetiza la aparición de enfermedades por la coincidencia de factores genéticos, físicos, ambientales, ecológicos y sociales. Desarrollamos y probamos un modelo de la aparición de gripe aviar altamente patógena (HPAI) H5N1 basado en supuestos factores de convergencia que están asociados principalmente con el cambio de uso de la tierra. Basándonos en estudios estadísticos geoespaciales previos que identificaron factores de riesgo naturales y humanos asociados con la urbanización, añadimos nuevos factores para probar si los mecanismos causales y los paisajes patógenos Nuestros hallazgos sugieren que la urbanización combina espacialmente factores de riesgo para producir determinados tipos de paisajes periurbanos con un riesgo de emergencia significativamente mayor de la IAPAP H5N1. El trabajo destaca que las áreas periurbanas de Viet Nam tienen mayores niveles de densidades de pollo, diversidades de tamaño de manadas de patos y gansos, y fracción de tierra bajo arroz o acuicultura que las zonas rurales y urbanas. También encontramos que la diversidad de uso de la tierra, una medida sustitutiva para la posible mezcla de poblaciones de acogida y otros factores que probablemente influyen en la transmisión viral, mejora significativamente la previsibilidad del modelo. Del mismo modo, paisajes donde se encontraron formas intensivas y extensas de superposición de la producción de aves de corral con mayor riesgo. Estos resultados apoyan la hipótesis de convergencia en general y demuestran el potencial de mejorar la prevención y el control de la EID mediante el análisis geoespacial de estos factores junto con los programas de vigilancia Texto: Dos décadas después del informe seminal del Instituto de Medicina [1] reconoció las enfermedades novedosas y reemergentes como una nueva categoría de amenazas microbianas, la naturaleza perpetua e inesperada de la aparición de enfermedades infecciosas sigue siendo un desafío a pesar de los avances significativos de la investigación clínica y biomédica [2]. La gripe aviar altamente patógena (HPAI) (subtipo H5N1) es la enfermedad pandémica de reciente aparición más importante desde el VIH/SIDA. Su erupción en el sudeste asiático en 2003-4 y posterior propagación mundial a más de 60 países se ajusta a la compleja definición de sistemas de "sorpresa" [3]. En este mismo año que la OIM había publicado su informe final sobre las amenazas microbianas que destacó la contención exitosa de H5N1 en Hong Kong en 1997 [4], brotes masivos ocurrieron en el sudeste asiático donde sigue siendo endémica, junto con el Delta del Nilo de Egipto. Desde 2003, HPAI H5N1 ha matado millones de aves de corral en países de Asia, Europa y África, y 402 humanos han muerto de ella en dieciséis países según datos de la OMS en enero de 2015. La amenaza de una pandemia que resulta en millones de casos humanos en todo el mundo sigue siendo una posibilidad [5]. Lederberg et al. [1] señalaron en primer lugar la multiplicidad de factores que impulsan la aparición de enfermedades, que más tarde se elaboraron y describieron en términos del'modelo de convergencia' [6]. El modelo propone que los eventos de emergencia se precipitan por la intensificación de los factores biológicos, ambientales, ecológicos y socioeconómicos. Joshua Lederberg, la mayor fuerza intelectual detrás de los estudios resumió diciendo "Las inestabilidades ecológicas surgen de las maneras en que alteramos el ambiente físico y biológico, los inquilinos microbianos y animales (incluidos los humanos) de estos ambientes, y nuestras interacciones (incluidas las intervenciones higiénicas y terapéuticas) con los parásitos" [6]. Combinando tales factores dispares y conceptos asociados de la biomedicina, la ecología y las ciencias sociales en un único marco sigue siendo difícil de alcanzar.Un enfoque sugerido ha sido emplear la teoría de sistemas socioecológicos que intenta capturar el comportamiento de los llamados'sistemas naturales-humanos acoplados', incluyendo la inevitable aparición inesperada de nuevas enfermedades, ellas mismas una de las "propiedades emergentes" de sistemas adaptativos complejos (CAS) [7, 8]. El modelo de convergencia puede adaptarse así incorporando la dinámica de las transformaciones urbanas, agrícolas y de ecosistemas naturales propuestas con este Estas interacciones multifacéticas asociadas, incluyendo retroalimentaciones que afectan a comunidades ecológicas, hospedadores y poblaciones de patógenos, son los impulsores inmediatos de la aparición de enfermedades. Los brotes iniciales de IAAP H5N1 en Vietnam representan una oportunidad ideal para adaptarse y probar un modelo de convergencia CAS. El riesgo de emergencia debe ser mayor en las áreas urbanas que se transforman más rápidamente, las zonas periurbanas donde las mezclas de usos urbanos-rural, modernos-tradicionales de la tierra y la cría de aves de corral coinciden más intensamente. Específicamente, hemos supuesto una asociación positiva entre la presencia de brotes de IAAP en aves de corral en el nivel comunal y: 1) áreas periurbanas, según lo definido por Saksena y otros [9], 2) diversidad de uso de la tierra, y 3) coubicación de sistemas intensivos y extensos de aves de corral. Utilizamos la presencia o ausencia en el nivel comuna Vietnam experimentó su primer brote de HPAI H5N1 a finales de 2003, desde entonces, ha habido cinco olas y brotes esporádicos registrados a lo largo de los años [10, 11]. Decidimos estudiar la primera ola (Ola 1) que terminó en febrero de 2004 y la segunda ola (Ola 2) que se produjo entre diciembre de 2004 y abril de 2005. Utilizamos datos del Censo Agrícola de Viet Nam 2006 para desarrollar una clasificación de la urbanicidad que utilizó datos recogidos en un solo punto en el tiempo (2006) pero a través del espacio (10.820 comunas) para inferir procesos de cambio (urbanización, diversificación del uso de la tierra e intensificación de las aves de corral) [9]. Las 58 provincias de Vietnam (sin contar las 5 provincias urbanas que están gobernadas centralmente) se dividen en distritos rurales, ciudades provinciales y ciudades. Una comuna de Viet Nam es, por tanto, la subdivisión administrativa de tercer nivel, compuesta por aldeas/hamlets. Con el fin de simplificar, en adelante utilizaremos el término "comuna" para referirse a la unidad administrativa más pequeña, ya sea una comuna, ciudad o barrio. Hemos incluido factores de riesgo documentados en trabajos anteriores. También hemos tratado de entender las diferencias, si las hay, en la dinámica de riesgo a diferentes escalas; comparando los riesgos a escala nacional con los de dos zonas agroecológicas subnacionales. Para ello hemos elegido estudiar los deltas del río Rojo y del río Mekong, puntos calientes bien conocidos de la enfermedad. Por lo tanto, hemos realizado dos conjuntos de análisis (ondas 1 y 2) para tres lugares (nación, Delta del río Rojo y Delta del Mekong) que producen un total de 6 análisis de lugares de onda. Los datos sobre brotes se obtuvieron de la base de datos pública del Departamento de Sanidad Dadas las dinámicas altamente complejas de las epidemias y en consonancia con las tendencias metodológicas recientes, utilizamos múltiples enfoques de modelado-paramétricos y no-paramétricos con enfoque en el análisis espacial. Utilizamos tanto modelos orientados al "lugar" que pueden tener en cuenta variaciones en factores como políticas y administración, como modelos orientados al "espacio" que reconocen la importancia de la proximidad física en el fenómeno natural [12]. Muy pocos estudios empíricos han intentado determinar si la urbanización está relacionada con brotes de EID o si la urbanización está asociada principalmente con otros factores relacionados con brotes de EID. Un problema inmediato que enfrentan los investigadores es definir lo que es rural, urbano y transitorio (es decir, periurbano). Algunos estudios han utilizado definiciones administrativas oficiales de áreas urbanas y rurales, pero este enfoque es limitado en su rompidez [13]. Otros estudios priorizaron la densidad de la población humana como un sustituto satisfactorio [11, [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20], pero este enfoque ignora el importante hecho de que la densidad no es un factor de riesgo si va acompañada de una infraestructura suficiente para manejar a la población. Spencer [21] examinó la urbanización como una característica no lineal, utilizando variables a nivel familiar como los servicios de agua y saneamiento. Encontró evidencia de que el aumento de la diversidad en las fuentes de abastecimiento de agua y la infraestructura de saneamiento estaban asociados con mayores incidencias de IAAP. Estos estudios utilizaron una definición limitada de urbanización que carecía de una caracterización bien definida de la periurbanización. Si bien estos estudios muestran diferencias en la naturaleza rural/urbana de las comunidades en el espacio y el tiempo, se han limitado a estudios observacionales de pequeña a mediana escala; y no han logrado distinguir entre los diferentes niveles de "ruralidad".Quizá el modelo más conocido de periurbanización es el concepto de McGee de desakota (Indonesiano para "pueblo-ciudad") [26]. McGee identificó seis características de las regiones desakota: 1) una gran población de pequeños cultivadores; 2) un aumento de las actividades no agrícolas; 3) una fluidez extrema y movilidad de la población; 4) una mezcla de usos de la tierra, agricultura, industrias artesanales, desarrollo suburbano; 5) una mayor participación de la fuerza de trabajo femenina; y 6) "zonas grises", donde el grupo de actividades informales e ilegales [26]. Saksena et al. [9] se basaron en los conceptos y datos desakota de McGee Este estudio identificó y mapeó las 10.820 comunas, la unidad administrativa más pequeña para la que se recopilan datos, como núcleo rural, periurbano, urbano o urbano. Este proyecto utilizó la clasificación Saksena para evaluar asociaciones entre clases de urbanismo, otros factores de riesgo y brotes de IAAP. Los investigadores han estimado que casi el 75% de las enfermedades zoonóticas están asociadas con cambios en la cubierta terrestre y el uso de la tierra (LCLUC) [27, 28]. LCLUC, como la periurbanización y la diversificación agrícola, suelen dar lugar a paisajes más diversos y fragmentados (número de cubiertas o usos de la tierra por unidad de tierra). La importancia del patrón paisajístico, incluyendo la diversidad y los procesos asociados, que equivalen al tamaño y distribución del hábitat de las especies de acogida, y por lo tanto la dinámica de transmisión de patógenos es axiomática, aunque los mecanismos específicos dependen La fragmentación del paisaje produce ecotonas, definidas como bordes abruptos o zonas de transición entre diferentes sistemas ecológicos, que se consideran que facilitan la aparición de enfermedades al aumentar la intensidad y frecuencia del contacto entre las especies de acogida [31] Además, la fragmentación del hábitat natural tiende a interrumpir y degradar los procesos naturales, incluidas las interacciones entre especies que regulan las densidades de especies oportunistas que pueden servir de huéspedes competentes [32], aunque no está claro si la reducción de la diversidad de especies aumenta necesariamente la transmisión de patógenos [33]. Rara vez se ha relacionado la investigación con la diversificación del uso de la tierra a los puntos finales de salud en los seres humanos o el ganado; este estudio intenta vincular la diversidad del uso de la tierra con los brotes de HPAI H5N1. Como se teorizó von Thünen en 1826 [34], gran parte de esta demanda se satisface en granjas cercanas a las ciudades [35], muchas de ellas en zonas en proceso de periurbanización [26]. Debido a la globalización del comercio de aves de corral, las granjas avícolas a gran escala que crían miles de aves se han expandido rápidamente en el sudeste asiático y compiten con los pequeños agricultores de patios traseros existentes [36]. Las operaciones de gran escala (15.000 a 100.000 aves) siguen siendo raras en Viet Nam (sólo 33 comunas tienen una instalación de este tipo). Por otro lado, las empresas nacionales y multinacionales suelen contratar agricultores para criar entre 2.000 y 15.000 aves. Estudios recientes han examinado el papel relativo de los sistemas extensos (de patio) y los sistemas intensivos [15, [17] [18] [19] 37]. En gran parte de Asia hay a menudo una Los expertos han sugerido que, desde la perspectiva de la bioseguridad, la colocalización de sistemas extensos e intensivos es un factor de riesgo potencial [38]. Los sistemas intensivos permiten la evolución del virus (por ejemplo, la baja gripe aviar patogénica a la IAAP) y la transformación, mientras que los sistemas extensos permiten la persistencia y la circulación del medio ambiente [39]. Estudios anteriores de poblaciones de pollos como factor de riesgo han distinguido entre sistemas de producción-pollos nativos, pollos de jardín; densidad de manadas; pollos comerciales, pollos de engorde y densidad de capas, etc. [15, [17] [18] [19] 37]. Sin embargo, en aislamiento, ninguno de estos métricas de aves de corral basadas en el número y/o la densidad mide adecuadamente el alcance de la colocalización de sistemas intensivos y extensos en cualquier lugar dado. Los sistemas intensivos y extenso Un índice de diversidad del número relativo de sistemas intensivos y extensos de cría de aves de corral puede estimar mejor el efecto de dicha coubicación; este estudio intenta vincular un índice de diversidad ganadera con la presencia o ausencia de brotes de IAAP H5N1 a nivel comunal. Este estudio investigó para las 10.820 comunas de Viet Nam un amplio conjunto de variables socioeconómicas, agrícolas, climáticas y ecológicas relevantes para la gestión de aves de corral y la transmisión y persistencia del virus IAAP. Muchas de estas variables se identificaron a partir de estudios anteriores de IAAP (revisados en Gilbert y Pfeiffer [40] ). Se incluyeron tres variables novedosas basadas en hipótesis generadas por este proyecto. Todas las variables fueron medidas o agregadas al nivel comunal. Las variables novedosas fueron:• Grado de urbanización: Utilizamos la clasificación de urbanismo desarrollada por Saksena et al. [9] para definir el carácter urbano de cada El marco de clasificación se basa en cuatro características: 1) porcentaje de hogares cuyos ingresos principales son la agricultura, la acuicultura y la silvicultura; 2) porcentaje de hogares con formas modernas de retretes; 3) porcentaje de tierras en la agricultura, la acuicultura y la silvicultura; y 4) índice normalizado de vegetación diferenciada (NDVI). La clasificación en tres sentidos permitió realizar pruebas para las respuestas no lineales y no monotónicas. • diversidad del uso del suelo: se midió la diversidad del uso del suelo utilizando el índice de diversidad Gini-Simpson [41]. El índice de diversidad Gini-Simpson se da por 1- Utilizamos las siguientes cinco clases de uso de la tierra: cultivos anuales, cultivos perennes, bosques, acuicultura y tierras edificadas (incluidos usos diversos) para los que se recogieron datos en el Censo Agrícola de 2006; la zona de la última clase se calculó como la diferencia entre la superficie total y la suma de las cuatro primeras clases; se enumeran las siguientes variables según su función en la introducción, transmisión y persistencia de enfermedades, aunque algunos de estos factores pueden tener múltiples funciones. • Transmisión relacionada con la población humana. Densidad de población humana [11, 14-16, 18, 19, 44, 45]. • Comercio y mercado de aves de corral. Se supuso que las ciudades eran lugares de comercio activos [10, 18, 37, 44, 46]. Así, la distancia a la ciudad más cercana se utilizó como indicador del comercio de aves de corral. Por lo tanto, la distancia a la carretera nacional más cercana y a la carretera provincial b) fue utilizada como indicador de infraestructura de transporte. • Introducción y amplificación de enfermedades. Las densidades de pollo se calcularon en base al área comunal [15, 19, 37, 49]. • Hosterías intermedias. Se calcularon densidades de patos y gansos utilizando el área comunal total [11, 19, 49]. Como estudios previos han mostrado un vínculo entre la recolección en campos de arroz por patos y brotes, también se calculó la densidad de patos utilizando sólo la zona bajo arroz. • Factores de riesgo agroecológicos y ambientales. Estudios previos han demostrado que el alcance del cultivo de arroz es un factor de riesgo, principalmente debido a su asociación con patos de libre alcance que actúan como carroñeros [10]. Utilizamos el porcentaje de tierras bajo cultivo de arroz como medida de extensión. La intensidad de cultivo de arroz es La extensión de la acuicultura es un factor de riesgo conocido [10], posiblemente debido a que las masas de agua ofrecen rutas de transmisión y persistencia del virus; el porcentaje de tierras acuícolas se utilizó como medida; la proximidad a las masas de agua aumenta el riesgo de brotes [47, [50] [51] [52], posiblemente aumentando la posibilidad de contacto entre aves acuáticas silvestres y aves de corral domésticas; se midió la distancia entre la comuna y la más cercana: a) lago y b) río; las variables climáticas -temperatura media anual y precipitación anual- se han asociado con cambios significativos en el riesgo [48, 53]. La elevación, que se asocia con tipos de cubierta terrestre y agricultura, ha demostrado ser un factor de riesgo significativo en Vietnam [10]. El Índice Topográfico Compuesto (ICT, también conocido como Índice Topográfico de Humedad) es una medida de la tendencia del agua a la piscina. Estudios realizados en Tailandia y en otros lugares [54] han demostrado que la extensión del agua superficial es un factor de riesgo fuerte, posiblemente debido al papel del agua en la transmisión a largo plazo y la persistencia del virus. En ausencia de datos fiables y baratos sobre la extensión del agua superficial, utilizamos el CTI como sustituto. El CTI se ha utilizado en los Modelos Ecológicos de Nicho (ENM) de HPAI H5N1 [55, 56]. Sin embargo, dada la naturaleza de los estudios de ENM, el efecto del CTI como factor de riesgo se ha desconocido hasta ahora. El CTI se ha utilizado como factor de riesgo en el estudio de otras enfermedades infecciosas y no infecciosas [57]. Algunos estudios han demostrado que en escalas locales, la pendiente del terreno (un componente de la ITC) se correlaciona significativamente con el dominio de las especies de reservorio [58]. La ITC es una función tanto de la pendiente como de la zona de aporte aguas arriba por unidad de ancho ortogonal a la dirección del flujo. La ITC se calcula de la siguiente manera: ITC = ln (A s / (tan (β)) donde; A s = Valor de Área calculado como ((acumulación de flujo + 1) Ã (área de píxeles en m 2) y β es la pendiente expresada en radianes [59). Aunque estudios previos han indicado que el Índice de Diferencia Normalizada de Vegetación (NDVI) es un factor de riesgo [10, 20, 55, 60, 61], no lo incluimos explícitamente en nuestros modelos, ya que el índice de Se obtuvieron datos a nivel comunal sobre brotes de IAAP H5N1 de la base de datos de acceso público del Departamento de Sanidad Animal [10]. Viet Nam experimentó sus primeras grandes oleadas epidémicas entre diciembre de 2003 y febrero de 2006 [10]. Decidimos estudiar la primera ola (ola 1) que terminó en febrero de 2004 y la segunda ola (ola 2) que se produjo entre diciembre de 2004 y abril de 2005. En la Ola 1, el 21% de las comunas y en la Ola 2, el 6% de las comunas experimentaron brotes. Utilizamos datos del Censo de Población de Viet Nam de 1999 para estimar la población humana por comuna. Nos basamos en datos de dos Censos Agrícolas de Viet Nam. Esta encuesta se realiza cada cinco años que abarcan todos los hogares rurales y los hogares periurbanos que poseen explotaciones. Así, se incluyen cerca de tres cuartas partes de todos los hogares del país. Los contenidos de la encuesta incluyen el número de hogares en las principales actividades de producción, población, mano de obra clasificada por sexo, edad, cualificación, empleo y fuente de ingresos; tierras agrícolas, forestales y acuícolas utilizadas por hogares clasificados por fuente, tipo, área de cultivo para cada tipo de cultivo; y equipo agrícola por finalidad; encuestas a nivel comunal incluyen información sobre infraestructura rural, a saber, electricidad, transporte, estaciones médicas, escuelas; fuente de agua dulce, comunicación, mercados, etc. Se recopilan datos económicos detallados para las grandes explotaciones agrícolas. Utilizamos el Censo de Agricultura de 2006 para la mayoría de las variables porque las tres primeras oleadas epidémicas ocurrieron entre los censos agrícolas de 2001 y 2006, pero fueron más cercanas a tiempo al censo de 2006 [10]. Sin embargo, para los datos sobre el número de aves de corral se utilizaron los datos del Censo de Agricultura de 2001 porque entre 1991 y 2003 la población avícola creció a una tasa Sólo a mediados de 2008 la población avícola regresó cerca de los niveles preepidémicos, por lo que consideramos que los datos de población avícola del censo de 2001 eran más representativos. Agregamos los datos de los hogares del censo al nivel comunal. Una clasificación de tres vías de la transición rural-urbana se basó en un estudio conexo [9]. Se obtuvieron datos de raster sobre la temperatura media anual y la precipitación de la base de datos World-Clim y se convirtieron en datos de nivel comunal. Las variables bioclimáticas se compilaron a partir de los valores mensuales de temperatura y precipitación e interpolaron a superficies a 90 metros de resolución espacial [62]. Esta base de datos pública proporciona datos sobre las condiciones climáticas medias del período 1950-2000. La elevación se generó a partir de los modelos de elevación digital SRTM 90 metros (DEM) adquiridos del Consorcio de Información Espacial (CGIAR-CSI). Los datos del Índice Topográfico Compuesto (ITC) se generaron utilizando la Caja de Herramientas de Geomorfometría y Métrica Gradient para Arc-GIS 10.1. Antes del análisis de factores de riesgo, se limpiaron los datos identificando valores ilógicos para todas las variables y luego se les asignaba un valor faltante o se ajustaban los valores. Los valores ilógicos ocurrieron principalmente (menos del 1% de los casos) para variables relacionadas con el suelo, como el porcentaje de suelo comunal bajo un tipo particular de uso del suelo. Luego se probó cada variable para la normalidad utilizando el software BestFit (Palisade Corporation). Se encontró que la mayoría de las variables seguían una distribución logarít-normal y se utilizó una transformación logarítmica en ellas. Luego se examinaron las correlaciones bivariadas entre todos los factores de riesgo (o su transformación logarítmica, según el caso 0.5 (r es el coeficiente de correlación de Pearson). Cuando dos factores de riesgo estaban altamente correlacionados, se optó por incluir el que no había sido estudiado adecuadamente explícitamente en modelos de riesgo publicados previamente. En particular, se excluyó a) elevación (correlacionado con la densidad de población humana, densidad de pollo, densidad de pato, porcentaje de tierra bajo el arroz, temperatura anual e índice topográfico compuesto), b) densidad de población humana (correlacionado con la elevación e ITC), c) densidad de pollo (solo a nivel nacional, correlacionado con la ITC), d) densidad de pato y ganso (correlacionado con la elevación, densidad de pollo, porcentaje de tierra bajo el arroz, índice de diversidad de uso de la tierra e ITC), e) temperatura anual (correlacionado con la elevación e ITC) y f) intensidad de cultivo (correlacionado con el porcentaje de tierra bajo el arroz). Teniendo en cuenta la importancia de la autocorrelación espacial en tales epidemias, se utilizaron dos enfoques de modelado: 1) Modelo Lineal Generalizado de varios niveles (GLMM) y 2) Árboles de Regresión Impulsada (BRT) [63, 64] con un término autorregresivo [65]. GLMM es un enfoque orientado al "lugar" que es adecuado para analizar el efecto de agrupaciones administrativas, mientras que BRT es un enfoque orientado al "espacio" que explica los efectos de la proximidad física. Comenzamos por derivar un término autorregresivo promediando la presencia/ausencia entre un conjunto de vecinos definidos por el límite de autocorrelación, ponderado por el inverso de la distancia euclidiana [65]. El límite de la autocorrelación de la variable de respuesta se obtuvo del rango del correlograma espacial (h) [66]. Para determinar qué variables predictivas incluir en los dos modelos, se realizó un modelo de regresión logística por separado para cada uno de ellos, pero se incluyó el término autorregresivo cada vez. Finalmente se incluyeron sólo aquellas variables cuyo coeficiente tenía un valor de significación p 0,2 (en al menos una combinación de lugar de onda) y se notó el signo del coeficiente. Esta elección del valor p para el cribado de factores de riesgo es común en estudios similares [15, 18, 45, 67]. Utilizamos un GLMM de dos niveles (comunes anidados bajo distritos) para tener en cuenta los efectos aleatorios para un área influenciada por sus vecinos, y por lo tanto, estudiamos el efecto de la autocorrelación espacial. Utilizamos errores estándar robustos para las pruebas de efectos fijos. Este método fue desarrollado recientemente y aplicado ampliamente para la predicción de la distribución en diversos campos de la ecología [63, 64]. Es ampliamente utilizado para el modelado de la distribución de especies donde sólo se conocen los sitios de ocurrencia de la especie [68]. El método ha sido aplicado en numerosos estudios para predecir la distribución de la enfermedad HPAI H5N1 [16, 51, [69] [70] [71]. BRT utiliza árboles de regresión y algoritmos de impulso para adaptarse a varios modelos y los combina para mejorar la predicción mediante la realización de bucle iterativo en todo el modelo [63, 64]. La ventaja de BRT es que aplica procesos estocásticos que incluyen componentes probabilísticos para mejorar el rendimiento predictivo. Utilizamos árboles de regresión para seleccionar variables predictivas relevantes e impulsar para mejorar la precisión en un solo árbol. El proceso secuencial permite que los árboles se ajusten iterativamente a Dos parámetros importantes especificados en el modelo BRT son la tasa de aprendizaje (lr) y la complejidad de los árboles (tc) para determinar el número de árboles para una predicción óptima [63, 64]. En nuestro modelo utilizamos 10 conjuntos de entrenamiento y puntos de prueba para la validación cruzada, una complejidad de los árboles de 5, una tasa de aprendizaje de 0,01 y una fracción de bolsa de 0,5. Otras ventajas de BRT incluyen su insensibilidad a la colinealidad y respuestas no lineales. Sin embargo, en aras de la coherencia con el método GLMM, optamos por eliminar predictores que estaban altamente correlacionados con otros predictores y hacer transformas de logs cuando era necesario. En los modelos GLMM utilizamos p 0,05 para identificar factores de riesgo significativos. Las prestaciones predictivas de los modelos fueron evaluadas por el área bajo la curva (AUC) de la curva característica de operación del receptor (ROC). El AUC es una medida del ajuste global del modelo que varía de 0,5 (evento de oportunidad) a 1,0 (ajuste perfecto) [72]. Una comparación del AUC con otras métricas de precisión concluyó que es la medida más robusta del rendimiento del modelo porque se mantuvo constante en una amplia gama de tasas de prevalencia [73]. Utilizamos los Criterios de Información Akaike corregidos (AICc) para comparar cada modelo GLMM con y sin su respectivo conjunto de predictores fijos. Utilizamos la versión 21 del SPSS (IBM Corp., Nueva York, 2012) para GLMM y R versión 3.1.0 (The R Foundation for Statistical Computing, 2014) para el BRT. Para el cálculo del correlograma espacial se utilizó el paquete spdep de R. Las catorce variables predictivas que modelamos (ver tablas) se encontraron significativamente asociadas con brotes de HPAI H5N1 (p 0.2) en al menos una combinación de lugar de onda basada en análisis univariado (pero incluyendo el término autorregresivo) (Tabla 1). Se encontró que la diversidad de uso del suelo, densidad de pollo, diversidad de tamaño de manadas de aves de corral y distancia a la carretera nacional tienen asociaciones significativas en cinco de las seis combinaciones de lugar de onda. la potencia de los modelos GLMM, medida por el AUC, es muy buena con valores AUC que van de 0,802 a 0,952 (Tablas 2-7 ). La potencia predictiva de los modelos nacionales fue mayor que la de los modelos delta. La potencia predictiva de los modelos BRT es buena, con AUCs que van de 0,737 Los modelos BRT también tuvieron una mejor potencia predictiva a nivel nacional que a nivel delta. Estos valores son más altos que los reportados para la Ola 1 (AUC = 0,69) y la Ola 2 (AUC = 0,77) por Gilbert et al. [11]. Tanto Gilbert et al. [11] y este estudio encontraron que a nivel nacional el rendimiento predictivo para la Ola 2 fue mayor que el de la Ola 1. La Ola 2 afectó principalmente al Delta del río Mekong. Estudios anteriores indicaron que la densidad del pato era un predictor importante [11] ; sin embargo, nuestros resultados indicaron que la diversidad del tamaño del rebaño de patos era un predictor más importante que la densidad del pato. Ambos modelos GLMM y BRT encontraron que la precipitación anual era un factor significativo. El modelo GLMM indicó una asociación negativa; similar a lo encontrado por estudios en China [51] y en el En general, el papel de la precipitación fue mucho más significativo en los deltas que en el conjunto del país. El riesgo relativo (RR) no ajustado de las zonas periurbanas en comparación con las zonas no periurbanas fue de 1,41 y 1,60 para las Olas 1 y 2, respectivamente. En términos de urbanidad, se encontró que la densidad de pollo, el porcentaje de tierra bajo arroz, el porcentaje de tierra bajo acuicultura, la diversidad del tamaño de las manadas de patos y gansos, y el Índice Topográfico Compuesto (CTI) era más alto en las zonas periurbanas (Fig 1a-1e). También se encontró que la diversidad de uso de la tierra era mayor en las zonas rurales, pero las zonas periurbanas tenían niveles de diversidad sólo marginalmente inferiores (Fig 1f). Sin embargo, la variable urbanística por sí sola no se asoció significativamente con la HPAI H5N1 en ningún lugar según el modelo GLMM, excepto en el nivel urbano del Delta del Río Rojo para la Ola 2 y en el Delta del Río Mekong para la Ola 1. El modelo BRT clasificó la urbanicidad como una de las variables menos influyentes. Se encontró que la diversidad de uso de la tierra se asoció significativamente con la HPAI H5N1 en ambas olas para Viet Nam según el modelo GLMM, pero en el nivel del delta la asociación fue significativa sólo para la Ola 2 en el Delta del Río Mekong. El modelo BRT indicó que la diversidad de uso de la tierra influyó altamente en la HPAI H5N1 a nivel nacional en la Ola 2. Tanto los modelos GLMM como BRT indicaron que la diversidad del tamaño de rebaño de pollo tenía una fuerte asociación con HPAI H5N1 para ambas ondas a nivel nacional, lo cual se encontró generalmente en los niveles delta con algunas excepciones.La diversidad del tamaño de rebaño de pato y ganso también se asoció significativamente con HPAI H5N1 en todos los lugares, pero las asociaciones fueron mucho más fuertes en la Ola 2 que en la Ola 1. El modelo GLMM indicó que el CTI tenía una asociación muy fuerte con HPAI H5N1 a nivel nacional en ambas ondas, aunque esto no era cierto en los dos deltas. El CTI es un índice de humedad en estado estable utilizado comúnmente para cuantificar el control topográfico en procesos hidrológicos. Los números de acumulación en áreas planas, como los deltas, son muy grandes; por lo tanto, el CTI no era una variable relevante en el modelo GLMM El modelo BRT sin embargo indicó que el CTI tuvo una influencia media a baja en todas las ondas y lugares. Encontramos efectos de agrupamiento espacial muy altos como lo indica el hecho de que en todas las ondas y lugares el modelo BRT encontró que el término autocorrelación espacial tiene el rango más alto de influencia. Como se esperaba, la influencia relativa del término autocorrelación a nivel nacional fue mayor (60-78%) que en los niveles delta (14-35%). En los modelos GLMM encontramos que el Criterio de Información Akaike (AIC) usando todo el conjunto de 14 variables es mucho menor que los AICs de un modelo GLMM sin efectos fijos, lo que indica que aunque los efectos de agrupamiento fueron significativos, nuestra teoría impulsó variables predictoras mejoró el rendimiento del modelo. Una limitación del uso de métodos de vigilancia para la variable dependiente (brotes puercos) es que los datos pueden tener sesgos Es posible la sub-reporte/detección en áreas rurales en comparación con áreas periurbanas. Creemos que la urbanicidad y la distancia más corta a los factores de riesgo de la ciudad más cercanos sirven como proxys ásperos para reportar/detectar eficiencia. Estudios anteriores han tendido a utilizar la densidad de población humana como un indicador para este propósito. En nuestro estudio encontramos una fuerte asociación entre la densidad de población humana y la urbanicidad. Pero reconocemos que una variable categórica como la urbanicidad puede proporcionar menos sensibilidad que una variable continua como la densidad de población humana en este contexto específico. Este estudio exploró la validez de un modelo general para la emergencia de enfermedades que combina el'modelo de convergencia' de la OIM [6] y el modelo de sistemas socioecológicos [7, 8], para investigar el caso específico de la IAP en Vietnam. Buscamos probar las hipótesis de que las medidas de urbanización, diversificación del uso Nuestros resultados apoyan generalmente la hipótesis de que las transformaciones del sistema socio-ecológico están asociadas a brotes de H5NI en aves de corral.Los resultados presentados aquí destacan tres hallazgos principales: 1) cuando se tienen en cuenta factores de riesgo relevantes, la urbanización no es generalmente un factor de riesgo independiente significativo; pero en paisajes periurbanos convergen factores de emergencia, incluyendo mayores niveles de densidades de pollo, diversidades de tamaño de manada de patos y gansos, y fracción de tierra bajo arroz o acuicultura; 2) paisajes de alta diversidad de uso de la tierra, variable no considerada previamente en estudios espaciales de HPAI H5N1, tienen un riesgo significativamente mayor para brotes de HPAI H5N1; al igual que 3) paisajes donde se coubican formas intensivas y extensas de producción avícola. [17] Las áreas periurbanas encontradas en Indonesia se asociaron significativamente con casos de IAPH H5N1, incluso basados en modelos multivariables. Sin embargo, nuestro estudio intentó asociar tanto la IAPH H5N1 con el grado de urbanidad y determinar las características de las áreas periurbanas que las ponen en riesgo. Cuando estas características (es decir, densidades de pollo, diversidades de tamaño de manada de patos y gansos, y la fracción de tierra bajo arroz o acuicultura) se incluyen en modelos multivariados, el papel de la variable de urbanización per se disminuye. Encontramos en los principales deltas del río en Viet Nam (Río Rojo y Mekong), la urbanización no tenía asociación significativa con la IAPH5N1. Esto puede deberse a que los deltas son más homogéneos, en términos de urbanización, que el país en su conjunto. Este es el primer estudio en examinar la diversidad del uso de la tierra como factor de riesgo para la IAAP H5N1. Medidos por el Índice de Diversidad Gini-Simpson de las cinco clases de uso de la tierra sobre las que se recogieron datos en el Censo Agrícola de Viet Nam de 2006, y la presencia o ausencia de brotes de IAAP a nivel comunal, nuestros resultados indican una fuerte asociación entre la diversidad del uso de la tierra y la IAAP H5N1 a nivel nacional y en el Delta del río Mekong. Esta métrica capta tanto la variedad de hábitats como la complejidad del patrón geoespacial probablemente asociado a la intensidad de transmisión. Nuestros resultados son similares a los observados por estudios de otras EID utilizando métricas de fragmentación (por ejemplo [75] [76] [77]. Este es uno de los pocos estudios, sin embargo, para vincular la fragmentación del paisaje a Los estudios anteriores se han centrado en factores de producción de aves de corral, como el tipo de especie, el tamaño de las manadas y el grado de comercialización (por ejemplo, [15, [17] [18] [19]. Este estudio amplía esos hallazgos al proporcionar pruebas de que cuando los sistemas intensivos y extensos de producción de pollo y/o pato y gansos coexisten en la misma comuna, la comuna experimenta un mayor riesgo de brote de enfermedad. Los estudios futuros deben examinar los mecanismos biológicos causales en este contexto. Sugerimos que los datos censales nacionales (en particular los censos agrícolas) compilados a nivel local proporcionan información valiosa que no está disponible a partir de datos de teleobservación (como las densidades de aves de corral) o requieren una gran cantidad de mano de obra para mapear a escala nacional a mayor escala (diversidad del uso de la tierra). Sin embargo, estudios futuros podrían examinar la correlación entre una métrica basada en censos y las métricas derivadas de la teleobservación utilizadas para medir la abundancia proporcional de cada tipo de cubierta terrestre dentro de un paisaje [78]. Vietnam está relativamente avanzado en la disponibilidad de datos censales nacionales digitales y agrícolas en un formato que puede vincularse a los límites administrativos. Mientras que otras naciones están empezando a desarrollar capacidades similares, a corto plazo la aplicación de este método a otros países puede ser limitada. En última instancia, tanto los datos censales como los datos de teleobservación pueden utilizarse independientemente para trazar el mapa de la transición urbana y la diversidad de uso de la tierra; sin embargo, estos instrumentos pueden proporcionar sus mayores conocimientos cuando se utilizan juntos. Otra contribución importante de este estudio fue el descubrimiento de la importancia de la CTI. Hasta ahora, la CTI sólo se había utilizado en estudios de modelización ecológica de nichos de HPAI H5N1; el papel Nuestro estudio, el primero en utilizar la CTI como factor de riesgo, encontró que tuvo una gran influencia positiva en el riesgo de la HPAI H5N1 a nivel nacional. Estudios anteriores han destacado el papel de la extensión de agua superficial en la persistencia y transmisión del virus de la HPAI H5N1. Estos estudios midieron la extensión de agua superficial como área cubierta por el agua, magnitud de inundaciones estacionales, distancia al cuerpo de agua más cercano, u otras variables que a menudo son difíciles de mapear utilizando datos de teleobservación, especialmente para estudios de área grande. CTI por otro lado tiene el potencial de servir como excelente sustituto que puede ser fácilmente medido en una base de datos SIG. Los modelos nacionales y regionales (delta) difirieron considerablemente, tanto en términos de rendimiento como de factores de riesgo significativos. Esto sugiere que la dinámica de riesgo a nivel comunal depende fuertemente del rango espacial de análisis, consistente con otro estudio en el Delta del Mekong [61]. Aunque el modelo de ese estudio incluyó inicialmente tres docenas de factores de riesgo comúnmente conocidos, los factores de riesgo significativos se limitaron a la densidad de manadas de aves de corral, proporción de hogares con electricidad, mediana NDVI reescalonada de mayo a octubre, densidad de búfalos y rendimiento de batata. Otro estudio en el Delta del Río Rojo [79] encontró que, además de las métricas típicas de densidad de aves de corral, sólo la presencia de comerciantes de aves de corral era significativa. Especulamos que para las regiones más pequeñas, especialmente para las zonas calientes conocidas, los factores de riesgo relevantes son los que reflejan las fuerzas motrices a corto plazo como el comercio de aves de corral, la presencia de mercados de aves vivas y mercados húmedos Para mejorar el rendimiento de los modelos en las regiones más pequeñas se necesitarían parámetros altamente refinados y matizados para el comercio de aves de corral, la infraestructura vial, las masas de agua, etc.-datos que normalmente no están disponibles a través de encuestas censales. Las diferencias entre los modelos nacionales y regionales sugieren que nuestros resultados pueden informar a los planificadores que toman decisiones en diferentes niveles jerárquicos de jurisdicción: nacional, regional y local. Nuestro estudio tiene el potencial de fundamentar el diseño de futuras investigaciones relacionadas con la epidemiología de otras EIDs en Viet Nam y en otros lugares. Por ejemplo, especulamos que en el sudeste asiático, la encefalitis japonesa, cuya transmisión está asociada con el cultivo de arroz y el riego por inundaciones [80], también puede mostrar una fuerte asociación con la periurbanización. Del mismo modo, el virus Hantaan, la causa de la fiebre hemorrágica coreana, está asociado con el ratón de campo Apodemus agrario y la cosecha de arroz en los campos donde están presentes los roedores [80]. Nuestro trabajo ha demostrado que el porcentaje de tierra bajo el arroz en las zonas periurbanas y rurales es similar. Por lo tanto, las enfermedades asociadas con la producción de arroz son propensas a pico en las zonas periurbanas debido a otros factores de riesgo como la diversidad de uso de la tierra, la CTI y la distancia a la infraestructura. Nuestros hallazgos de diversidad del tamaño de manadas de aves de corral también pueden ser relevantes para entender la dinámica de otras infecciones relacionadas con aves de corral como la enfermedad de Newcastle. Por último, estos resultados sugieren la validez de un modelo general de aparición de enfermedades zoonóticas que integra el modelo de convergencia de la OIM con los sistemas socioecológicos y el marco EID propuestos Los resultados del proyecto cuestionan si la dicotomía de uso de la tierra urbana/rural es útil cuando grandes áreas y partes de la población se encuentran atrapadas entre ambas. Los planificadores necesitan mejores herramientas para trazar el mapa de la transición rural-urbana, y para entender cómo la naturaleza específica de los entornos periurbanos crea un riesgo elevado para la salud que requiere la adaptación de las prácticas de planificación, uso de la tierra y desarrollo existentes.

¿Cuál es la ventaja del método de árbol de regresión potenciado?

Factores asociados con los resultados de salud mental entre los trabajadores de atención de la salud expuestos a la enfermedad de Coronavirus 2019https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7090843/SHA: 0a08fddd9dcee1b1254a05b49113521bbc423ccdAutores: Lai, Jianbo; Ma, Simeng; Wang, Ying; Cai, Zhongxiang; Hu, Jianbo; Wei, Ning; Wu, Jiang; Du, Hui; Chen, Tingting; Li, Ruiting; Tan, Huawei; Kang, Lijun; Yao, Lihua; Huang, Manli; Wang, Huafen; Wang, Gaohua; Liu, Zhongchun; Hu, ShaohuaFecha: 2020-03-23DO OBJETIVO: Evaluar la magnitud de los resultados de salud mental y los factores asociados entre los trabajadores de la salud que tratan a pacientes expuestos a COVID-19 en China. DISEÑO, ESTABLECIMIENTOS Y PARTICIPANTES: Este estudio transversal, basado en encuestas y estratificado por regiones, recopiló datos demográficos y mediciones de salud mental de 1257 trabajadores de la salud en 34 hospitales desde el 29 de enero de 2020 hasta el 3 de febrero de 2020, en China. Los trabajadores de la salud en hospitales equipados con clínicas o salas de tratamiento de la fiebre para pacientes con COVID-19 fueron elegibles. RESULTADOS PRINCIPALES Y MEDIDAS: El grado de síntomas de depresión, ansiedad, insomnio y malestar fue evaluado por las versiones chinas del cuestionario de salud del paciente de 9 ítems, la escala de trastorno de ansiedad generalizada de 7 ítems, el Índice de Severidad de Insomnia de 7 Se realizó un análisis de regresión logística multivariable para identificar los factores asociados a los resultados de salud mental.RESULTADOS: Un total de 1257 de 1830 personas contactadas completaron la encuesta, con una tasa de participación del 68,7%; un total de 813 (64,7%) tenían entre 26 y 40 años, y 964 (76,7%) eran mujeres; de todas las participantes, 764 (60,8%) eran enfermeras, y 493 (39,2%) eran médicos; 760 (60,5%) trabajaban en hospitales de Wuhan, y 522 (41,5%) eran trabajadores de atención de la salud de primera línea; una proporción considerable de participantes reportaron síntomas de depresión (634 [50,4%]), ansiedad (560 [44,6%)), insomnio (427 [34,0%] y malestar (899 [71,5%]). Las enfermeras, las mujeres, los trabajadores de atención de la salud de primera línea, y los que trabajan en Wuhan, China, informaron grados más severos de todas las mediciones de los síntomas de salud mental que otros trabajadores de la salud (por ejemplo, mediana [IQR] Cuestionario de salud de los pacientes entre los médicos y las enfermeras: 4,0 [1,0-7,0] vs 5,0 [2,0-8,0]; P = 0,007; mediana [intervalo intercuartílico {IQR}] Resultados de la escala de ansiedad generalizada entre los hombres y las mujeres: 2,0 [0-6,0] vs 4,0 [1,0-7,0]; P <.001; mediana [IQR] Resultados de la escala de eventos–Puntuaciones revisadas entre los de Wuhan y los de Hubei fuera de Wuhan y los de fuera de Hubei: 21.0 [ El análisis de regresión logística multivariable mostró que los participantes de fuera de la provincia de Hubei se asociaron con menor riesgo de experimentar síntomas de malestar en comparación con los de Wuhan (odds ratio [OR], 0,62; IC 95%, 0,43-0,88; P = 0,008). Los trabajadores de atención de la salud en línea directa que participaron en el diagnóstico, tratamiento y atención directos de pacientes con COVID-19 se asociaron con mayor riesgo de síntomas de depresión (OR, 1,52; IC 95%, 1,11-2,09; P = 0,01), ansiedad (OR, 1,57; IC 95%, 1,22-2,02; P < 0,001), insomnio (OR, 2,97; IC 95%, 1,92-4,60; P < 0,001) y malestar (OR, 1,60; IC 95%, 1,25-2,04; P < 0,001). CONCLUSIONES Y RELEVANZA: En esta encuesta de trabajadores sanitarios en hospitales equipados con clínicas de fiebre o salas para pacientes con COVID-19 en Wuhan y otras regiones de China, los participantes reportaron haber experimentado carga psicológica, especialmente enfermeras, mujeres, aquellos en Wuhan, y trabajadores de atención de la salud de primera línea involucrados directamente en el diagnóstico, tratamiento y atención de pacientes con COVID-19. Texto: Abreviatura: PHQ-9, 9 ítem Cuestionario de Salud del Paciente; GAD-7, 7 ítems de Trastorno de Ansiedad Generalizada; ISI, 7 ítems Índice de Severidad de Insomnio; IES-R, 22 ítems Impacto de la Abreviación de Eventos: IES-R, 22 ítems Impacto de la Escala de Eventos-Revisado; IQR, rango intercuartil. Hiperousal, mediana (IQ

¿Qué proporción de trabajadores de la salud reportó síntomas de depresión?

Factores asociados con los resultados de salud mental entre los trabajadores de atención de la salud expuestos a la enfermedad de Coronavirus 2019https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7090843/SHA: 0a08fddd9dcee1b1254a05b49113521bbc423ccdAutores: Lai, Jianbo; Ma, Simeng; Wang, Ying; Cai, Zhongxiang; Hu, Jianbo; Wei, Ning; Wu, Jiang; Du, Hui; Chen, Tingting; Li, Ruiting; Tan, Huawei; Kang, Lijun; Yao, Lihua; Huang, Manli; Wang, Huafen; Wang, Gaohua; Liu, Zhongchun; Hu, ShaohuaFecha: 2020-03-23DO OBJETIVO: Evaluar la magnitud de los resultados de salud mental y los factores asociados entre los trabajadores de la salud que tratan a pacientes expuestos a COVID-19 en China. DISEÑO, ESTABLECIMIENTOS Y PARTICIPANTES: Este estudio transversal, basado en encuestas y estratificado por regiones, recopiló datos demográficos y mediciones de salud mental de 1257 trabajadores de la salud en 34 hospitales desde el 29 de enero de 2020 hasta el 3 de febrero de 2020, en China. Los trabajadores de la salud en hospitales equipados con clínicas o salas de tratamiento de la fiebre para pacientes con COVID-19 fueron elegibles. RESULTADOS PRINCIPALES Y MEDIDAS: El grado de síntomas de depresión, ansiedad, insomnio y malestar fue evaluado por las versiones chinas del cuestionario de salud del paciente de 9 ítems, la escala de trastorno de ansiedad generalizada de 7 ítems, el Índice de Severidad de Insomnia de 7 Se realizó un análisis de regresión logística multivariable para identificar los factores asociados a los resultados de salud mental.RESULTADOS: Un total de 1257 de 1830 personas contactadas completaron la encuesta, con una tasa de participación del 68,7%; un total de 813 (64,7%) tenían entre 26 y 40 años, y 964 (76,7%) eran mujeres; de todas las participantes, 764 (60,8%) eran enfermeras, y 493 (39,2%) eran médicos; 760 (60,5%) trabajaban en hospitales de Wuhan, y 522 (41,5%) eran trabajadores de atención de la salud de primera línea; una proporción considerable de participantes reportaron síntomas de depresión (634 [50,4%]), ansiedad (560 [44,6%)), insomnio (427 [34,0%] y malestar (899 [71,5%]). Las enfermeras, las mujeres, los trabajadores de atención de la salud de primera línea, y los que trabajan en Wuhan, China, informaron grados más severos de todas las mediciones de los síntomas de salud mental que otros trabajadores de la salud (por ejemplo, mediana [IQR] Cuestionario de salud de los pacientes entre los médicos y las enfermeras: 4,0 [1,0-7,0] vs 5,0 [2,0-8,0]; P = 0,007; mediana [intervalo intercuartílico {IQR}] Resultados de la escala de ansiedad generalizada entre los hombres y las mujeres: 2,0 [0-6,0] vs 4,0 [1,0-7,0]; P <.001; mediana [IQR] Resultados de la escala de eventos–Puntuaciones revisadas entre los de Wuhan y los de Hubei fuera de Wuhan y los de fuera de Hubei: 21.0 [ El análisis de regresión logística multivariable mostró que los participantes de fuera de la provincia de Hubei se asociaron con menor riesgo de experimentar síntomas de malestar en comparación con los de Wuhan (odds ratio [OR], 0,62; IC 95%, 0,43-0,88; P = 0,008). Los trabajadores de atención de la salud en línea directa que participaron en el diagnóstico, tratamiento y atención directos de pacientes con COVID-19 se asociaron con mayor riesgo de síntomas de depresión (OR, 1,52; IC 95%, 1,11-2,09; P = 0,01), ansiedad (OR, 1,57; IC 95%, 1,22-2,02; P < 0,001), insomnio (OR, 2,97; IC 95%, 1,92-4,60; P < 0,001) y malestar (OR, 1,60; IC 95%, 1,25-2,04; P < 0,001). CONCLUSIONES Y RELEVANZA: En esta encuesta de trabajadores sanitarios en hospitales equipados con clínicas de fiebre o salas para pacientes con COVID-19 en Wuhan y otras regiones de China, los participantes reportaron haber experimentado carga psicológica, especialmente enfermeras, mujeres, aquellos en Wuhan, y trabajadores de atención de la salud de primera línea involucrados directamente en el diagnóstico, tratamiento y atención de pacientes con COVID-19. Texto: Abreviatura: PHQ-9, 9 ítem Cuestionario de Salud del Paciente; GAD-7, 7 ítems de Trastorno de Ansiedad Generalizada; ISI, 7 ítems Índice de Severidad de Insomnio; IES-R, 22 ítems Impacto de la Abreviación de Eventos: IES-R, 22 ítems Impacto de la Escala de Eventos-Revisado; IQR, rango intercuartil. Hiperousal, mediana (IQ

¿Qué proporción de trabajadores de la salud reportó síntomas de ansiedad?

Factores asociados con los resultados de salud mental entre los trabajadores de atención de la salud expuestos a la enfermedad de Coronavirus 2019https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7090843/SHA: 0a08fddd9dcee1b1254a05b49113521bbc423ccdAutores: Lai, Jianbo; Ma, Simeng; Wang, Ying; Cai, Zhongxiang; Hu, Jianbo; Wei, Ning; Wu, Jiang; Du, Hui; Chen, Tingting; Li, Ruiting; Tan, Huawei; Kang, Lijun; Yao, Lihua; Huang, Manli; Wang, Huafen; Wang, Gaohua; Liu, Zhongchun; Hu, ShaohuaFecha: 2020-03-23DO OBJETIVO: Evaluar la magnitud de los resultados de salud mental y los factores asociados entre los trabajadores de la salud que tratan a pacientes expuestos a COVID-19 en China. DISEÑO, ESTABLECIMIENTOS Y PARTICIPANTES: Este estudio transversal, basado en encuestas y estratificado por regiones, recopiló datos demográficos y mediciones de salud mental de 1257 trabajadores de la salud en 34 hospitales desde el 29 de enero de 2020 hasta el 3 de febrero de 2020, en China. Los trabajadores de la salud en hospitales equipados con clínicas o salas de tratamiento de la fiebre para pacientes con COVID-19 fueron elegibles. RESULTADOS PRINCIPALES Y MEDIDAS: El grado de síntomas de depresión, ansiedad, insomnio y malestar fue evaluado por las versiones chinas del cuestionario de salud del paciente de 9 ítems, la escala de trastorno de ansiedad generalizada de 7 ítems, el Índice de Severidad de Insomnia de 7 Se realizó un análisis de regresión logística multivariable para identificar los factores asociados a los resultados de salud mental.RESULTADOS: Un total de 1257 de 1830 personas contactadas completaron la encuesta, con una tasa de participación del 68,7%; un total de 813 (64,7%) tenían entre 26 y 40 años, y 964 (76,7%) eran mujeres; de todas las participantes, 764 (60,8%) eran enfermeras, y 493 (39,2%) eran médicos; 760 (60,5%) trabajaban en hospitales de Wuhan, y 522 (41,5%) eran trabajadores de atención de la salud de primera línea; una proporción considerable de participantes reportaron síntomas de depresión (634 [50,4%]), ansiedad (560 [44,6%)), insomnio (427 [34,0%] y malestar (899 [71,5%]). Las enfermeras, las mujeres, los trabajadores de atención de la salud de primera línea, y los que trabajan en Wuhan, China, informaron grados más severos de todas las mediciones de los síntomas de salud mental que otros trabajadores de la salud (por ejemplo, mediana [IQR] Cuestionario de salud de los pacientes entre los médicos y las enfermeras: 4,0 [1,0-7,0] vs 5,0 [2,0-8,0]; P = 0,007; mediana [intervalo intercuartílico {IQR}] Resultados de la escala de ansiedad generalizada entre los hombres y las mujeres: 2,0 [0-6,0] vs 4,0 [1,0-7,0]; P <.001; mediana [IQR] Resultados de la escala de eventos–Puntuaciones revisadas entre los de Wuhan y los de Hubei fuera de Wuhan y los de fuera de Hubei: 21.0 [ El análisis de regresión logística multivariable mostró que los participantes de fuera de la provincia de Hubei se asociaron con menor riesgo de experimentar síntomas de malestar en comparación con los de Wuhan (odds ratio [OR], 0,62; IC 95%, 0,43-0,88; P = 0,008). Los trabajadores de atención de la salud en línea directa que participaron en el diagnóstico, tratamiento y atención directos de pacientes con COVID-19 se asociaron con mayor riesgo de síntomas de depresión (OR, 1,52; IC 95%, 1,11-2,09; P = 0,01), ansiedad (OR, 1,57; IC 95%, 1,22-2,02; P < 0,001), insomnio (OR, 2,97; IC 95%, 1,92-4,60; P < 0,001) y malestar (OR, 1,60; IC 95%, 1,25-2,04; P < 0,001). CONCLUSIONES Y RELEVANZA: En esta encuesta de trabajadores sanitarios en hospitales equipados con clínicas de fiebre o salas para pacientes con COVID-19 en Wuhan y otras regiones de China, los participantes reportaron haber experimentado carga psicológica, especialmente enfermeras, mujeres, aquellos en Wuhan, y trabajadores de atención de la salud de primera línea involucrados directamente en el diagnóstico, tratamiento y atención de pacientes con COVID-19. Texto: Abreviatura: PHQ-9, 9 ítem Cuestionario de Salud del Paciente; GAD-7, 7 ítems de Trastorno de Ansiedad Generalizada; ISI, 7 ítems Índice de Severidad de Insomnio; IES-R, 22 ítems Impacto de la Abreviación de Eventos: IES-R, 22 ítems Impacto de la Escala de Eventos-Revisado; IQR, rango intercuartil. Hiperousal, mediana (IQ

¿Qué proporción de trabajadores de la salud reportó síntomas de insomnio?

Factores asociados con los resultados de salud mental entre los trabajadores de atención de la salud expuestos a la enfermedad de Coronavirus 2019https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7090843/SHA: 0a08fddd9dcee1b1254a05b49113521bbc423ccdAutores: Lai, Jianbo; Ma, Simeng; Wang, Ying; Cai, Zhongxiang; Hu, Jianbo; Wei, Ning; Wu, Jiang; Du, Hui; Chen, Tingting; Li, Ruiting; Tan, Huawei; Kang, Lijun; Yao, Lihua; Huang, Manli; Wang, Huafen; Wang, Gaohua; Liu, Zhongchun; Hu, ShaohuaFecha: 2020-03-23DO OBJETIVO: Evaluar la magnitud de los resultados de salud mental y los factores asociados entre los trabajadores de la salud que tratan a pacientes expuestos a COVID-19 en China. DISEÑO, ESTABLECIMIENTOS Y PARTICIPANTES: Este estudio transversal, basado en encuestas y estratificado por regiones, recopiló datos demográficos y mediciones de salud mental de 1257 trabajadores de la salud en 34 hospitales desde el 29 de enero de 2020 hasta el 3 de febrero de 2020, en China. Los trabajadores de la salud en hospitales equipados con clínicas o salas de tratamiento de la fiebre para pacientes con COVID-19 fueron elegibles. RESULTADOS PRINCIPALES Y MEDIDAS: El grado de síntomas de depresión, ansiedad, insomnio y malestar fue evaluado por las versiones chinas del cuestionario de salud del paciente de 9 ítems, la escala de trastorno de ansiedad generalizada de 7 ítems, el Índice de Severidad de Insomnia de 7 Se realizó un análisis de regresión logística multivariable para identificar los factores asociados a los resultados de salud mental.RESULTADOS: Un total de 1257 de 1830 personas contactadas completaron la encuesta, con una tasa de participación del 68,7%; un total de 813 (64,7%) tenían entre 26 y 40 años, y 964 (76,7%) eran mujeres; de todas las participantes, 764 (60,8%) eran enfermeras, y 493 (39,2%) eran médicos; 760 (60,5%) trabajaban en hospitales de Wuhan, y 522 (41,5%) eran trabajadores de atención de la salud de primera línea; una proporción considerable de participantes reportaron síntomas de depresión (634 [50,4%]), ansiedad (560 [44,6%)), insomnio (427 [34,0%] y malestar (899 [71,5%]). Las enfermeras, las mujeres, los trabajadores de atención de la salud de primera línea, y los que trabajan en Wuhan, China, informaron grados más severos de todas las mediciones de los síntomas de salud mental que otros trabajadores de la salud (por ejemplo, mediana [IQR] Cuestionario de salud de los pacientes entre los médicos y las enfermeras: 4,0 [1,0-7,0] vs 5,0 [2,0-8,0]; P = 0,007; mediana [intervalo intercuartílico {IQR}] Resultados de la escala de ansiedad generalizada entre los hombres y las mujeres: 2,0 [0-6,0] vs 4,0 [1,0-7,0]; P <.001; mediana [IQR] Resultados de la escala de eventos–Puntuaciones revisadas entre los de Wuhan y los de Hubei fuera de Wuhan y los de fuera de Hubei: 21.0 [ El análisis de regresión logística multivariable mostró que los participantes de fuera de la provincia de Hubei se asociaron con menor riesgo de experimentar síntomas de malestar en comparación con los de Wuhan (odds ratio [OR], 0,62; IC 95%, 0,43-0,88; P = 0,008). Los trabajadores de atención de la salud en línea directa que participaron en el diagnóstico, tratamiento y atención directos de pacientes con COVID-19 se asociaron con mayor riesgo de síntomas de depresión (OR, 1,52; IC 95%, 1,11-2,09; P = 0,01), ansiedad (OR, 1,57; IC 95%, 1,22-2,02; P < 0,001), insomnio (OR, 2,97; IC 95%, 1,92-4,60; P < 0,001) y malestar (OR, 1,60; IC 95%, 1,25-2,04; P < 0,001). CONCLUSIONES Y RELEVANZA: En esta encuesta de trabajadores sanitarios en hospitales equipados con clínicas de fiebre o salas para pacientes con COVID-19 en Wuhan y otras regiones de China, los participantes reportaron haber experimentado carga psicológica, especialmente enfermeras, mujeres, aquellos en Wuhan, y trabajadores de atención de la salud de primera línea involucrados directamente en el diagnóstico, tratamiento y atención de pacientes con COVID-19. Texto: Abreviatura: PHQ-9, 9 ítem Cuestionario de Salud del Paciente; GAD-7, 7 ítems de Trastorno de Ansiedad Generalizada; ISI, 7 ítems Índice de Severidad de Insomnio; IES-R, 22 ítems Impacto de la Abreviación de Eventos: IES-R, 22 ítems Impacto de la Escala de Eventos-Revisado; IQR, rango intercuartil. Hiperousal, mediana (IQ

¿ Qué proporción reportó angustia?

Una mutación missense en Katnal1 subyace a anomalías conductuales, neurológicas y ciliareshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5761721/SHA: f4cebabd74b16e710fb41a737d8ef84b7d565d8dAutores: Banks, G; Lassi, G; Hoerder-Suabadissen, A; Tinarelli, F; Simon, M; Wilcox, A; Lau, P; Lawson, T N; Johnson, S; Rutman, A; Sweeting, M; Chesham, J E; Barnard, A; Horner, N; Westerberg, H; Smith, L B; Molnár, Z; Hastings, M H; Hirst, Aunque la separación de microtúbulos es fundamental para muchos procesos neurales dinámicos, poco se sabe sobre el papel del miembro de la familia Katanin p60 subunidad A-como 1, KATNAL1, en la función del sistema nervioso central (SNC). Estudios recientes que reportan que las microdeleciones que incorporan el locus KATNAL1 en humanos resultan en discapacidad intelectual y microcefalia sugieren que KATNAL1 puede jugar un papel prominente en el SNC; sin embargo, tales asociaciones carecen de los datos funcionales necesarios para resaltar los mecanismos potenciales que vinculan el gen con los síntomas de la enfermedad. Aquí identificamos y caracterizamos una línea de ratón que lleva una pérdida de función alelo en Katnal1. Demostramos que los mutantes expresan déficits de comportamiento incluyendo en ritmos circadianos, sueño, ansiedad y aprendizaje/memoria. Además, en el cerebro de ratones mutantes Katnal1 revelamos numerosas Además, se evidencian defectos en los cilios motiles de las células ependimales ventriculares de los mutantes, sugiriendo un papel para Katnal1 en el desarrollo de la función ciliar. Creemos que los datos que presentamos aquí son los primeros en asociar KATNAL1 con tales fenotipos, demostrando que la proteína juega papeles claves en una serie de procesos integrales al desarrollo de la función y el comportamiento neuronal. Texto: Las enzimas cortantes del microtúbulo son una familia de proteínas AAA-ATPasa que participan en procesos celulares fundamentales como la mitosis, la biogénesis ciliar y la motilidad del cono de crecimiento. 2 Además, las mutaciones en los genes de las enzimas cortantes de los microtúbulos SPG4, KATNB1 y KATNAL2 se asocian con la paraplejia espástica hereditaria, las malformaciones cerebrales y el autismo, respectivamente [3] [4] [5] [6] y las mutaciones en Fign causan una gama de fenotipos en ratones. 7 Actualmente la enzima cortante de los microtúbulos KATNAL1 está mal caracterizada y todavía no se entiende cómo funciona la enzima en el sistema nervioso. Evidencia reciente de la caracterización genética de pacientes humanos sugiere que la haploinsuficiencia de KATNAL1 está relacionada con una serie de síntomas, incluyendo discapacidad intelectual (ID) y dismorfologías craneofaciales. 8, 9 También es notable que una mutación KATNAL1 muy rara se ha asociado con esquizofrenia 10 (http://atgu.mgh.harvard.edu/~spurcell/genebook/gene book.cgi?user = guest&cmd = verb-gene&tbox = KATNAL1) y que el síndrome de Peters y el autismo se han asociado con la región cromosómica que contiene el locus KATNAL1. 11, 12 Aunque estos estudios de asociación sugieren fuertemente que KATNAL1 juega un papel fundamental en el sistema nervioso central (SNC), se requieren estudios adicionales utilizando modelos celulares o animales para entender cómo el gen puede ser causativo de enfermedad. Aquí presentamos el primer estudio que describe déficits neuronales y de comportamiento asociados con una pérdida de función allele de Katnal1 en el ratón. Esta línea de ratón mutante fue identificada de forma independiente en dos pantallas fenotipadoras paralelas, que demostraron que los ratones mutantes mostraban tanto esterilidad masculina como fenotipos circadianos. Investigaciones de comportamiento posteriores demostraron que esta mutación está asociada con ansiedad y déficits de memoria.Basándose en estos fenotipos de comportamiento, identificamos anomalías histopatológicas en el cerebro de los mutantes Katnal1 1H/1H, incluyendo capas celulares desordenadas en el hipocampo y corteza y ventrículos sustancialmente mayores. Investigaciones posteriores demostraron que los ratones Katnal1 1H/1H muestran migración neuronal y déficits de función ciliar que sugieren que KATNAL1 juega un papel esencial en estos procesos. Estos hallazgos son los primeros de nuestro conocimiento que muestran de manera concluyente que las mutaciones en Katnal1 conducen a trastornos de comportamiento y neuronales y proporcionan información sobre las asociaciones clínicas que han sido vinculadas al gen. Se realizó en cohortes de ratón parcialmente o completamente congénicas en el fondo C57BL/6 J. Se realizó el funcionamiento de rueda circadiana como se describió anteriormente. 14 Se realizó la evaluación del sueño mediante electroencefalografía y electromiografía La electroencefalografía y electromiografía como se describió anteriormente. 15 Alternancia espontánea conductual fenotipado. Se colocó a los ratones en un T-maze amurallado (cloruro de polivinilo negro, forrado con serrín; tronco = 88 × 13 cm; brazos = 32 × 13 cm) y se les permitió entrar en un brazo de meta de su elección. El ratón se confina en el brazo de meta durante 30 s, antes de que se les permitiera una segunda elección libre del brazo de meta. Se registró una alternancia si la segunda elección difería de la primera. Se realizó un ensayo por día durante 10 días Los ratones fueron colocados en una arena amurallada (cloruro de polivinilo gris; 45 × 45 cm) y se les permitió explorar durante 20 minutos. Los animales fueron monitorizados por el software de análisis XT de EthoVision (Noldus, Wageningen, Países Bajos). El seguimiento de vídeo en la jaula doméstica. La actividad en la jaula doméstica fue grabada por el seguimiento de vídeo como se describió anteriormente. 16 laberinto de agua Morris y vocalización ultrasónica. Estas pruebas se realizaron como se describió anteriormente. 17 histología cerebral e inmunofluorescencia Los cerebros fueron montados en OCT (VWR) y 12 μm secciones coronales tomadas. Las secciones fueron manchadas con hematoxilina y eosina, o inmunoetiquetadas siguiendo protocolos estándar. La evaluación de migración neuronal in vivo se realizó como se describió anteriormente 18 utilizando embriones en E13 o E15 (tres madres por grupo de La evaluación in vitro de la migración neuronal se realizó mediante un protocolo de migración de cámara Boyden descrito anteriormente. 19 Tomografía microcomputada La tomografía microcomputada se realizó mediante una Skyscan 1172 a 90 kV, 112 μA mediante un filtro de aluminio y cobre, un paso de rotación de 0,250 grados y un tamaño de píxel de 4,96 μm. La segmentación, el cálculo de volumen y el modelado 3D se realizaron mediante ITK-SNAP versión 3.0.0 (ref. 20) y 3DSlicer. 21 Tinción Golgi-Cox de neuronas La tinción neuronal Golgi-Cox se realizó mediante el kit FD Rapid GolgiStain (FD NeuroTechnologies, Columbia, MD, EE.UU.). Se diseccionaron los cerebros de los ratones P2 y se seccionó la mitad cerebral dorsal (250 μm) a través del suelo del ventrículo lateral y del tercer ventrículo utilizando un vibratomo. Se analizó la frecuencia y el patrón de latidos ciliares como se describió anteriormente. 22 Microscopía electrónica para escanear Microscopía electrónica El revestimiento ependimal del ventrículo lateral se fijó en 2,5% glutaraldehído, 2% paraformaldehído en tampón de fosfato de 0,1 M, incubado en tetróxido de ósmico al 2%, y deshidratado a través de soluciones de etanol. Las muestras se secaron en punto crítico utilizando un microscopio electrónico de barrido Emitech K850 (Quorum Technologies, East Sussex, UK), recubierto con platino utilizando un capa de sputter Quorom Q150R (Qu La microscopía electrónica de transmisión se realizó según lo descrito anteriormente. 22 Análisis estadístico Los datos fueron analizados utilizando la prueba T de estudiantes de dos colas o AVOVA utilizando SPSS (IBM) o GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, EE.UU.). El nivel de significancia para todos los análisis se estableció en Po 0.05. Todos los gráficos se presentan mostrando promedio ± s.m. Se pueden encontrar métodos adicionales y más detallados en información complementaria. Identificación y clonación de la mutación Katnal1 1H Para identificar mutaciones genéticas novedosas que afectan al comportamiento circadiano, realizamos una pantalla de rueda circadiana de pedigrees de ratones N-etil-N-nitrosourea mutagenizados. 13 En un pedigrí 17,65% de los animales mostró un corto período circadiano en constante oscuridad (o En las siguientes pantallas intercruzadas, el 15,5% de los animales fueron afectados (53 de los 342 animales examinados), lo que sugiere que el pedigrí lleva una mutación que causa un fenotipo circadiano recesivo que es un 60% penetrante. No encontramos sesgo de género en los animales afectados (proporción de los animales afectados: macho = 47,2%; hembra = 52,8%). Al mismo tiempo, se identificó un fenotipo de esterilidad masculina dentro del mismo pedigrí. 23 El análisis de la vinculación SNP a escala del genoma mapeó los fenotipos circadiano y esterilidad a la misma región en el cromosoma 5 y la secuenciación posterior identificó la mutación causal como una mutación de punto único T a G dentro del exón siete del gen Katnal1. Para más detalles sobre el mapeo e identificación de la mutación ver referencia 23. Este alelo mutante fue designado Katnal1 1H, y resulta en una sustitución de leucina a valina en el residuo 286 de la proteína. El análisis funcional in vitro demostró que la mutación es un alelo recesivo de pérdida de función. 23 Modelización 3D de la proteína sugiere que esta pérdida de función se debe a cambios hidrofóbicos en el dominio AAA de la enzima (Figura Suplementaria S1 ). Genotipado confirmó que la mutación fue homocigota en animales circadianos afectados y tipo salvaje o heterocigota en animales no afectados, confirmando que Katnal1 1H fue causa del fenotipo circadiano. Anomalías circadianas y del sueño en ratones Katnal1 1H/1H El fenotipo circadiano más extenso realizado en ratones Katnal1 homocigotos (Katnal1 1H/1H ) y en camadas de tipo salvaje (Katnal1 +/+ ) confirmó que los ratones Katnal1 1H/1H tuvieron un período circadiano de funcionamiento libre más corto (Figuras 1a-c) y además reveló que los animales Katnal1 1H/1H eran más activos en la fase de luz del ciclo luz/oscuro (Figura 1d ), mostraron una mayor anticipación de las transiciones de luz a oscuras y un mayor cambio en el inicio de actividad cuando fueron liberados de los ciclos luz/oscuro a la oscuridad constante (Figura 1e ). Los datos y detalles de la cohorte se dan en la Tabla Complementaria S Las grabaciones de bioluminiscencia realizadas con ratones reporteros de LUCIFERASE que llevaban la mutación Katnal1 1H revelaron que estos cambios circadianos no se debían a cambios en el reloj molecular central del núcleo suprachiasmático (el sitio del reloj circadiano maestro en el cerebro; Figura suplementaria S2 ). Las alteraciones circadianas a menudo se asocian con déficits en la homeostasis del sueño. Por lo tanto, para complementar nuestros estudios circadianos realizamos grabaciones electroencefalográficas inalámbricas durante un período basal de 24 h y después de un período de privación del sueño de 6 h. En la Tabla suplementaria S1 se da un resumen detallado del análisis electroencefalográfico. En comparación con los camarones salvajes, el poder delta no REM de los ratones Katnal1 1H/1H fue mayor en la fase oscura del sueño basal (ANOVA mixto, factores de interacción 'genotipo X time, F(1,88) = 8,91, P = 0,0175) (Figura 1f ) y en las fases claras y oscuras del sueño de recuperación (ANOVA mixto, factores de interacción 'genotipo X time', F(1,136) = 11,93, P = 0,0086; Figura 1g ). Todos los demás parámetros del sueño no se vieron afectados en los animales Katnal1 1H/1H. Los ratones Katnal1 1H/1H muestran un espectro de déficits de comportamiento Los pacientes humanos que llevan una deleción heterocigosa que incorpora el locus Katnal1 muestran una serie de déficits cognitivos, incluyendo ID y un retraso en la adquisición Por lo tanto, investigamos si estos déficits fueron modelados en ratones Katnal1 1H/1H sometiendo cohortes animales a una batería de pruebas de comportamiento. Los datos y detalles de cohortes se dan en la Tabla Complementaria S2. Tanto la memoria de trabajo como la memoria espacial fueron significativamente más pobres en ratones Katnal1 1H/1H, como lo evidencian las alteraciones espontáneas reducidas en un T-maze (Figura 2a ) y en el laberinto de agua Morris donde los mutantes tardan más tiempo en encontrar la plataforma en los ensayos de adquisición (Figura 2b En comparación con los animales de tipo salvaje, los animales Katnal1 1H/1H tienen un período más corto (c), son más activos en la fase de luz del ciclo de luz/oscuridad (d) y muestran un inicio más temprano de actividad en transiciones luz/oscuridad y En las grabaciones de EEG durante el sueño, los ratones Katnal1 1H/1H muestran un aumento de la potencia delta no REM en la fase oscura del ciclo de luz/oscuridad (f) y después de la privación del sueño (g). *P 0,05; **P 0,01; ***P 0,001. EEG, electroencefalografía; DD, oscuridad constante; LD, ciclo de luz/oscuridad. tipo = 164 ± 12 m, Katnal1 1H/1H = 243 ± 20 m, P = 0,02; distancia recorrida en la periferia del campo abierto: tipo salvaje = 4,3 ± 0,2 m, Katnal1 1H/1H = 6 ± 0,3 m, P = 0,004). Por el contrario, cuando se registró la actividad del ratón en la jaula doméstica, no se encontró diferencia entre los genotipos (distancia recorrida a lo largo de 24 h: tipo salvaje = 399 ± 77 m, Katnal1 1H/1H = 418 ± 41 m, P = 0,833) sugiriendo que las diferencias de actividad anteriores se debían al ambiente novedoso del campo abierto en lugar de la hiperactividad generalizada en animales Katnal1 1H/1H. Finalmente, en ciertas condiciones (como la separación materna) los ratones emiten vocalizaciones ultrasónicas (USVs). Para comprobar si los animales Katnal1 1H/1H vocalizaban de manera diferente a los tipos salvajes, separamos a los cachorros en los días postnatales 7-8 (la edad a la que los ratones muestran pico de emisión de USV 24 ) y registramos sus USVs. En estas pruebas, en comparación con los tipos salvajes, las crías de Katnal1 1H/1H produjeron menos (Figura 2g ) y más cortas (Figura 2h ) vocalizaciones, conteniendo menos frases (Figura 2i ). Anomalías morfológicas cerebrales brutas en ratones Katnal1 1H/1H Dado que observamos una serie de fenotipos de comportamiento en ratones Katnal1 1H/1H, realizamos análisis histológicos para determinar si las diferencias en la histología cerebral subyacen a estos comportamientos. Los datos y los detalles de la cohorte se dan en la Tabla Suplementaria S3. El análisis de las secciones cerebrales manchadas de hematoxilina y eosina reveló que, en comparación con los camadas de tipo salvaje, los animales de Katnal1 1H/1H tenían capas piramidales menos apretadas en el hipocampo (Fi Para confirmar estas diferencias en las capas corticales, se realizó inmunofluorescencia utilizando la (Figuras 3l y m). La cuantificación de la intensidad de fluorescencia demostró que en la corteza de Katnal1 1H/1H tanto la calbindina como el etiquetado CUX1 fueron más intensos más cerca de la superficie cortical, lo que es consistente con la reducción del tamaño de la capa 1 (análisis bidireccional de la varianza (ANOVA), factores de interacción 'geotipo X distancia de fluorescencia desde la superficie cortical', calbindina: F(75.988) = 16,8, P o 0,0005; CUX1: F(93.372 = 2,17, P = 0,001; Figuras 3h y k). Una cuantificación similar reveló que el etiquetado FOXP2 se extendió más a partir de la capa 6b (marcada por el CTGF) en la corteza de Katnal1 1H/1H, lo que es consistente con un aumento en el tamaño de la capa 6 (ANOVA de dos vías, factores de interacción 'genotipo X distancia de fluorescencia desde el etiquetado del CTGF:' F(93,372) = 1,32, P = 0,038; Figura 3n ). Finalmente, los modelos tridimensionales del sistema ventricular fueron construidos a partir de tomografías microcomputadas cerebrales (Figuras 3o y p). El análisis volumétrico reveló que los ratones Katnal1 1H/1H tenían ventrículos sustancialmente más grandes que los tipos salvajes (Figura 3q ). 18 Por lo tanto, se investigó si los ratones Katnal1 1H/1H mostraron migración neuronal anormal utilizando el etiquetado BrdU de embriones E13 y E15 y células etiquetadas cuantificadas en la corteza de crías P9 (descritas en la referencia 18). A ambas edades los animales Katnal1 1H/1H tenían un mayor número de neuronas etiquetadas en contenedores cercanos a la superficie cortical neuronas situadas más cerca de la superficie cortical que en el tipo salvaje. Para confirmar estos resultados se utilizó una cámara Boyden 19 y se realizó un análisis de migración neuronal in vitro en cultivos neuronales corticales primarios E13.5. Aquí se encontró que una mayor proporción de neuronas corticales Katnal1 1H/1H migró a la base del inserto de cultivo celular en comparación con controles de tipo salvaje (figura complementaria S3). Dado que tanto en el etiquetado BrdU como en las neuronas de ensayo de Boyden de los animales de Katnal1 1H/1H migraron más allá de los de los camarones de tipo salvaje, estos resultados sugieren que las neuronas corticales de Katnal1 1H/1H muestran defectos en la terminación de la migración neuronal cortical. Dada su función en la organización citoesquelética, también se planteó la hipótesis de que la morfología neuronal es modulada por Katnal1. El análisis de las neuronas manchadas con golgi de las capas 2-3 de la corteza (Figuras 4g e i) demostró que, en comparación con los camarones de tipo salvaje, las neuronas de Katnal1 1H/1H tenían el soma más grande (Figura 4k) y los axones más cortos y delgados (Figuras 4l y m) (los datos y Además, el análisis a mayor aumento (Figuras 4h y j), demostró que el número de espinas sinápticas en las neuronas de Katnal1 1H/1H se redujo significativamente en comparación con el tipo salvaje (Figura 4n ). Estudios recientes han demostrado que las mutaciones en algunas enzimas cortantes de microtúbulos pueden causar defectos en los cilios. 5 Dado que tales defectos ciliares podrían subyacer a los fenotipos descritos anteriormente, estudiamos los cilios motiles del revestimiento ependimal del ventrículo lateral en secciones de cerebros de ratón postnatales del día 2 de Katnal1 1H/1H (n = 4) y animales de tipo salvaje (n = 3). Se encontró que la frecuencia de latido ciliar (CBF) de los animales de Katnal1 1H/1H fue significativamente atenuada en comparación con el tipo salvaje (CBF: salvaje = 22,39 ± 0,94 Hz, Katnal1 1H/1H = 14,25 ± 0,92 Hz, P = 0,0001; Figura 5a, Películas suplementarias S1). Esta reducción en la FBC en animales de Katnal1 1H/1H también se asoció con un aumento de la proporción de cilia con un patrón de latido anormal (discinesia ciliar) (proporción de cilia discinética: salvaje = 17%, Katnal1 1H/1H = 75%) (Figura 5b y Películas suplementarias S1). La inspección visual de los cilios identificó una serie de anomalías ciliares tales como una punta ciliar hinchada (Supplementary Movie S3) o cilios extremadamente largos (Supplementary Movie S4) diseminados por todo el campo de los cilios en los ventrículos de Katnal1 1H/1H. Estas anomalías se observaron en aproximadamente el 25% de las rebanadas cerebrales de Katnal1 1H/1H. Los cilios anormales siempre mostraron un patrón de latido discinético y una frecuencia de latido inferior. Para investigar más a fondo la morfología ciliar realizamos microscopía electrónica de escaneo sobre el revestimiento ependimal de los ventrículos laterales de ambos Katnal1 1H/1H (n = 3) y animales de tipo salvaje (n = 3; Figuras 5c y d). Las mediciones de Cilia no mostraron diferencias significativas en la longitud media de los cilias entre los genotipos (longitud media de los cilias: tipo salvaje = 6,22 ± 0,86 μm, Katnal1 1H/1H = 6,54 ± 0,94 Hz, P = 0,303). Sin embargo, en las muestras de Katnal1 1H/1H se observó la presencia de cilias largas y cortas (Figuras 5e y f; definidas como dos desviaciones estándar más largas o más cortas que la longitud media de los cilias) que no estaban presentes en las muestras de tipo salvaje. Además, la inspección de los cilias de Katnal1 1H/1H identificó anomalías ciliares incluyendo cilias bifurcadas (Figura 5g), torceduras anormales en los cilias (Figura 5h ) e inflamaciones a lo La microscopía electrónica de transmisión de cilios ependimales encontró que la alteración vesicular aggre- Katnal1 afecta a las funciones del SNC Los bancos y las puertas estaban presentes dentro de las inflamaciones ciliares descritas anteriormente (Figura 5j ). Aunque estas anormalidades estaban presentes en una pequeña proporción (o1%) de los cilios de Katnal1 1H/1H, estaban notablemente ausentes de los cilios de tipo salvaje. Las enzimas cortantes de microtúbulos desempeñan diversos papeles en el sistema nervioso. 1, 2 Sin embargo, en la actualidad la enzima cortante de microtúbulos Katnal1 está mal definida en el contexto del desarrollo y la función del SNC. Aquí presentamos un análisis fenotípico detallado de Katnal1 1H y mostramos que la mutación está asociada con cambios en los ritmos circadianos, el sueño y el comportamiento. Además, se demuestra que los defectos en la histopatología cerebral, la migración neuronal y la morfología neuronal subyacen a estos fenotipos. Finalmente, también se demuestra que Katnal1 1H causa una gama de defectos en los cilios móviles de las células ependimales ventriculares. Los datos que presentamos aquí son los primeros en asociar KATNAL1 con tales disfunciones con importantes implicaciones para los estudios de asociación clínica. La mutación Katnal1 1H fue identificada inicialmente con un déficit circadiano incluyendo un corto período de libre ejecución y un inicio avanzado de actividad. Sin embargo, experimentos ex vivo posteriores usando rebanadas de SCN de animales que transportaban el PER2:El gen del reportero de LUC no demostró defectos en los ritmos celulares del SCN, sugiriendo que el reloj circadiano central no fue afectado por la mutación. 25 Aquí se ha sugerido que los cambios en el funcionamiento de las ruedas observados son el resultado de defectos en las vías de salida del reloj circadiano SCN. Del mismo modo, en los ratones 1H/1H de Katnal1 se hipótesis que los defectos que demostramos en la anatomía neuronal y la morfología neuronal pueden alterar las señales de salida del NCG. Alternativamente, dado que varios neuropéptidos como la oxitocina se secretan de manera circadiana de células ependimales que recubren el tercer ventrículo del cerebro, 26 morfología ventricular alterada y función ciliar en ratones 1H/1H de Katnal1 pueden alterar la circulación de factores secretados por las células ependimales ventriculares ciliadas y contribuir a la alteración de los ritmos de comportamiento observados. En la actualidad los fenotipos descritos se limitan a la disfunción motora en ratones que carecen del gen Spg4 27 y agitan y rodean la cabeza en el mutante Fign. 7, 28, 29 En contraste, aquí demostramos que la pérdida de la función de Katnal1 está asociada con una serie de fenotipos conductuales, incluyendo cambios en la actividad circadiana, mal aprendizaje y memoria, hiperactividad en un entorno novedoso (campo abierto) y déficits en los USVs. En particular, los fenotipos de aprendizaje y memoria, ansiedad y vocalización repiten los síntomas clínicos de ID, aumento de la ansiedad en situaciones novedosas y retrasos en la adquisición del lenguaje reportados en pacientes humanos que portan microdeleciones que incorporan haploinsuficiencia de KATNAL1. 8, 9 Aunque también vale la pena señalar que los ratones mutantes pasan más tiempo en el centro del campo abierto que los tipos salvajes (implicando que los animales Katnal1 1H/1H muestran menor ansiedad), sugerimos que este resultado está confundido por la hiperactividad en entornos novedosos fenotipo que también describimos en ratones mutantes. Esta observación está respaldada por el hecho de que los animales mutantes mostraron mayor actividad en todas las regiones del campo abierto en lugar de sólo la periferia ansiolítica. Aquí también destacamos defectos en ratones Katnal1 1H/1H tales como migración neuronal comprometida y morfología que pueden sustentar tales fenotipos. En Drosophila, se ha demostrado que el homólogo de Katnal1 (kat-60L1) juega un papel crítico en la morfología neuronal durante el desarrollo, 30 sin embargo los datos que presentamos aquí son los primeros en demostrar un fenotipo similar en mamíferos y además sugieren cómo las perturbaciones sutiles a la función KATNAL1 pueden contribuir a condiciones neuronales y conductuales específicas.Por ejemplo, defectos en la migración neuronal, espinas sinápticas y morfología neuronal como los que hemos demostrado aquí, se han sugerido para sustentar la ID en condiciones como la lissencefalia, el síndrome de Down 18 31 y el síndrome de Rett.32 Aunque no estamos sugiriendo que Katnal1 sea causa de estas condiciones, se deben apreciar similitudes en síntomas y fenotipos neuronales entre estas condiciones y los relacionados con la disfunción Katnal1. Además, se ha asociado una mutación rara en KATNAL1 con esquizofrenia 10 (http://atgu.mgh.harvard.edu/~spurcell/gene book/genebook.cgi?user = guest&cmd = verb-gene&tbox = KATNAL1) y se ha demostrado que KATNAL1 interactúa con el gen de esquizofrenia asociado DISC1. 33 En línea con estas observaciones, observamos que se han reportado aumentos en el volumen ventricular y reducciones en las espinas sinápticas en pacientes esquizofrénicos 34, 35 y nuestros datos demuestran los mismos fenotipos en ratones Katnal1 1H/1H. Así, el rango de fenotipos asociados con defectos en la función de Katnal1 sugiere fuertemente que el gen debe ser considerado en la patología de trastornos como el ID y la esquizofrenia. Si bien los pacientes humanos fueron todos heterocigotos para la eliminación de Katnal1, no encontramos fenotipo en ratones mutantes heterocigotos (datos no mostrados) sugiriendo que si bien la haploinsuficiencia es causativa para los fenotipos en humanos, los ratones requieren pérdida completa de la función KATNAL1 para mostrar efectos similares. Una discrepancia similar entre humanos y ratones también se ha observado para el gen candidato a discapacidad intelectual CTNNB1. 17 Si bien la pérdida heterocigota de mutaciones funcionales en CTNNB1 son causales de discapacidad intelectual en humanos, los golpes condicionales para CTNNB1 no tienen fenotipos conductuales o craneofaciales reportados. 36, 37 Estas diferencias demuestran que, si bien los modelos de discapacidad intelectual del ratón son de gran utilidad en nuestra comprensión de los mecanismos causales que subyacen a la condición, todavía existen diferencias genéticas y neurodesarrollistas entre especies que también deben tenerse en cuenta. También observamos que si bien la mutación Katnal1 1H muestra una pérdida de la función catalítica tanto en las células HEK293 como en las células Sertoli, 23 esta pérdida de función no se ha verificado en las células neuronales. Sin embargo, dado que nuestros datos demuestran que la mutación Katnal1 1H se encuentra en un dominio catalítico esencial y que mostramos fenotipos neuronales en ratones Katnal1 1H/1H, esperamos ver la misma pérdida de la función catalítica en neuronas. Los datos que presentamos aquí también demuestran defectos en cilia motil en ratones Katnal1 1H/1H. Las alteraciones ciliarias en humanos (ciliopatías) incluyen el síndrome de Bardet-Biedl y Joubert. 38 Aunque actualmente hay datos limitados sobre los fenotipos conductuales de los modelos de ciliopatías en ratones, observamos que la disfunción ciliar en ratones se ha relacionado con el aprendizaje y la memoria 39 y los fenotipos de vocalización, 40 de los cuales fueron alterados en los ratones Katnal1 1H/1H descritos aquí. También es notable que la migración neuronal y los fenotipos del ventrículo agrandado que describimos en ratones Katnal1 1H/1H recapitulan características asociadas con mutaciones génicas conocidas de la ciliopatía. [42] [43] [44] [44] Además, en los modelos de ratón del síndrome de Bardet-Byedl se han descrito defectos ciliares como la reducción de la CBF 45 y defectos estructurales como alargamiento anormal e hinchazón a lo largo de su longitud 41, que son similares a los que se describen en los ratones Katnal1 1H/1H. Existen fuertes evidencias de que los genes asociados a la ciliopatía desempeñan una serie de funciones en el desarrollo neuronal al afectar procesos como la proliferación progenitora o el mantenimiento del andamio de la glia radial. 43 Sin embargo, también está claro que los defectos en la organización de microtúbulos también afectan a la estructura sináptica. 2 En la actualidad es difícil desenredar las contribuciones relativas de los defectos en el corte de microtúbulos y las anomalías ciliares a los fenotipos generales que observamos en los ratones Katnal1 1H/1 Sin embargo, es notable que si bien los defectos en la estructura cilia puede contribuir a los fenotipos que describimos en los ratones Katnal1 1H/1H, son mucho menos prominentes en los ratones Katnal1 1H/1H que en otros modelos de ciliopatía de ratón, 41 sugiriendo que el componente ciliar de la disfunción KATNAL1 puede ser leve en comparación con otras ciliapatías. Del mismo modo, se ha sugerido que la hidrocefalia es un componente de algunos modelos de ratón de ciliopatía, 46 ratones Katnal1 1H/1H mostraron sólo un aumento en el tamaño de los ventrículos en lugar de una mayor incidencia de hidrocefalia, sugiriendo además que los defectos ciliares en estos animales son leves en comparación con otras ciliapatías. En resumen, los datos presentados aquí demuestran claramente que KATNAL1 juega un papel importante en una variedad de procesos neuronales incluyendo El efecto posterior de estos defectos conduce a su vez a una serie de cambios de comportamiento, incluyendo en el aprendizaje y la memoria, reacción a situaciones ansiogénicas y ritmos circadianos. Estos datos destacan cómo las perturbaciones en KATNAL1 pueden jugar un papel en la disfunción neuronal y demuestran que la enzima es un candidato novedoso en el estudio de trastornos de comportamiento y neurodesarrollo.Los autores declaran no conflicto de intereses.

¿Qué son las enzimas cortantes del microtúbulo?

Una mutación missense en Katnal1 subyace a anomalías conductuales, neurológicas y ciliareshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5761721/SHA: f4cebabd74b16e710fb41a737d8ef84b7d565d8dAutores: Banks, G; Lassi, G; Hoerder-Suabadissen, A; Tinarelli, F; Simon, M; Wilcox, A; Lau, P; Lawson, T N; Johnson, S; Rutman, A; Sweeting, M; Chesham, J E; Barnard, A; Horner, N; Westerberg, H; Smith, L B; Molnár, Z; Hastings, M H; Hirst, Aunque la separación de microtúbulos es fundamental para muchos procesos neurales dinámicos, poco se sabe sobre el papel del miembro de la familia Katanin p60 subunidad A-como 1, KATNAL1, en la función del sistema nervioso central (SNC). Estudios recientes que reportan que las microdeleciones que incorporan el locus KATNAL1 en humanos resultan en discapacidad intelectual y microcefalia sugieren que KATNAL1 puede jugar un papel prominente en el SNC; sin embargo, tales asociaciones carecen de los datos funcionales necesarios para resaltar los mecanismos potenciales que vinculan el gen con los síntomas de la enfermedad. Aquí identificamos y caracterizamos una línea de ratón que lleva una pérdida de función alelo en Katnal1. Demostramos que los mutantes expresan déficits de comportamiento incluyendo en ritmos circadianos, sueño, ansiedad y aprendizaje/memoria. Además, en el cerebro de ratones mutantes Katnal1 revelamos numerosas Además, se evidencian defectos en los cilios motiles de las células ependimales ventriculares de los mutantes, sugiriendo un papel para Katnal1 en el desarrollo de la función ciliar. Creemos que los datos que presentamos aquí son los primeros en asociar KATNAL1 con tales fenotipos, demostrando que la proteína juega papeles claves en una serie de procesos integrales al desarrollo de la función y el comportamiento neuronal. Texto: Las enzimas cortantes del microtúbulo son una familia de proteínas AAA-ATPasa que participan en procesos celulares fundamentales como la mitosis, la biogénesis ciliar y la motilidad del cono de crecimiento. 2 Además, las mutaciones en los genes de las enzimas cortantes de los microtúbulos SPG4, KATNB1 y KATNAL2 se asocian con la paraplejia espástica hereditaria, las malformaciones cerebrales y el autismo, respectivamente [3] [4] [5] [6] y las mutaciones en Fign causan una gama de fenotipos en ratones. 7 Actualmente la enzima cortante de los microtúbulos KATNAL1 está mal caracterizada y todavía no se entiende cómo funciona la enzima en el sistema nervioso. Evidencia reciente de la caracterización genética de pacientes humanos sugiere que la haploinsuficiencia de KATNAL1 está relacionada con una serie de síntomas, incluyendo discapacidad intelectual (ID) y dismorfologías craneofaciales. 8, 9 También es notable que una mutación KATNAL1 muy rara se ha asociado con esquizofrenia 10 (http://atgu.mgh.harvard.edu/~spurcell/genebook/gene book.cgi?user = guest&cmd = verb-gene&tbox = KATNAL1) y que el síndrome de Peters y el autismo se han asociado con la región cromosómica que contiene el locus KATNAL1. 11, 12 Aunque estos estudios de asociación sugieren fuertemente que KATNAL1 juega un papel fundamental en el sistema nervioso central (SNC), se requieren estudios adicionales utilizando modelos celulares o animales para entender cómo el gen puede ser causativo de enfermedad. Aquí presentamos el primer estudio que describe déficits neuronales y de comportamiento asociados con una pérdida de función allele de Katnal1 en el ratón. Esta línea de ratón mutante fue identificada de forma independiente en dos pantallas fenotipadoras paralelas, que demostraron que los ratones mutantes mostraban tanto esterilidad masculina como fenotipos circadianos. Investigaciones de comportamiento posteriores demostraron que esta mutación está asociada con ansiedad y déficits de memoria.Basándose en estos fenotipos de comportamiento, identificamos anomalías histopatológicas en el cerebro de los mutantes Katnal1 1H/1H, incluyendo capas celulares desordenadas en el hipocampo y corteza y ventrículos sustancialmente mayores. Investigaciones posteriores demostraron que los ratones Katnal1 1H/1H muestran migración neuronal y déficits de función ciliar que sugieren que KATNAL1 juega un papel esencial en estos procesos. Estos hallazgos son los primeros de nuestro conocimiento que muestran de manera concluyente que las mutaciones en Katnal1 conducen a trastornos de comportamiento y neuronales y proporcionan información sobre las asociaciones clínicas que han sido vinculadas al gen. Se realizó en cohortes de ratón parcialmente o completamente congénicas en el fondo C57BL/6 J. Se realizó el funcionamiento de rueda circadiana como se describió anteriormente. 14 Se realizó la evaluación del sueño mediante electroencefalografía y electromiografía La electroencefalografía y electromiografía como se describió anteriormente. 15 Alternancia espontánea conductual fenotipado. Se colocó a los ratones en un T-maze amurallado (cloruro de polivinilo negro, forrado con serrín; tronco = 88 × 13 cm; brazos = 32 × 13 cm) y se les permitió entrar en un brazo de meta de su elección. El ratón se confina en el brazo de meta durante 30 s, antes de que se les permitiera una segunda elección libre del brazo de meta. Se registró una alternancia si la segunda elección difería de la primera. Se realizó un ensayo por día durante 10 días Los ratones fueron colocados en una arena amurallada (cloruro de polivinilo gris; 45 × 45 cm) y se les permitió explorar durante 20 minutos. Los animales fueron monitorizados por el software de análisis XT de EthoVision (Noldus, Wageningen, Países Bajos). El seguimiento de vídeo en la jaula doméstica. La actividad en la jaula doméstica fue grabada por el seguimiento de vídeo como se describió anteriormente. 16 laberinto de agua Morris y vocalización ultrasónica. Estas pruebas se realizaron como se describió anteriormente. 17 histología cerebral e inmunofluorescencia Los cerebros fueron montados en OCT (VWR) y 12 μm secciones coronales tomadas. Las secciones fueron manchadas con hematoxilina y eosina, o inmunoetiquetadas siguiendo protocolos estándar. La evaluación de migración neuronal in vivo se realizó como se describió anteriormente 18 utilizando embriones en E13 o E15 (tres madres por grupo de La evaluación in vitro de la migración neuronal se realizó mediante un protocolo de migración de cámara Boyden descrito anteriormente. 19 Tomografía microcomputada La tomografía microcomputada se realizó mediante una Skyscan 1172 a 90 kV, 112 μA mediante un filtro de aluminio y cobre, un paso de rotación de 0,250 grados y un tamaño de píxel de 4,96 μm. La segmentación, el cálculo de volumen y el modelado 3D se realizaron mediante ITK-SNAP versión 3.0.0 (ref. 20) y 3DSlicer. 21 Tinción Golgi-Cox de neuronas La tinción neuronal Golgi-Cox se realizó mediante el kit FD Rapid GolgiStain (FD NeuroTechnologies, Columbia, MD, EE.UU.). Se diseccionaron los cerebros de los ratones P2 y se seccionó la mitad cerebral dorsal (250 μm) a través del suelo del ventrículo lateral y del tercer ventrículo utilizando un vibratomo. Se analizó la frecuencia y el patrón de latidos ciliares como se describió anteriormente. 22 Microscopía electrónica para escanear Microscopía electrónica El revestimiento ependimal del ventrículo lateral se fijó en 2,5% glutaraldehído, 2% paraformaldehído en tampón de fosfato de 0,1 M, incubado en tetróxido de ósmico al 2%, y deshidratado a través de soluciones de etanol. Las muestras se secaron en punto crítico utilizando un microscopio electrónico de barrido Emitech K850 (Quorum Technologies, East Sussex, UK), recubierto con platino utilizando un capa de sputter Quorom Q150R (Qu La microscopía electrónica de transmisión se realizó según lo descrito anteriormente. 22 Análisis estadístico Los datos fueron analizados utilizando la prueba T de estudiantes de dos colas o AVOVA utilizando SPSS (IBM) o GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, EE.UU.). El nivel de significancia para todos los análisis se estableció en Po 0.05. Todos los gráficos se presentan mostrando promedio ± s.m. Se pueden encontrar métodos adicionales y más detallados en información complementaria. Identificación y clonación de la mutación Katnal1 1H Para identificar mutaciones genéticas novedosas que afectan al comportamiento circadiano, realizamos una pantalla de rueda circadiana de pedigrees de ratones N-etil-N-nitrosourea mutagenizados. 13 En un pedigrí 17,65% de los animales mostró un corto período circadiano en constante oscuridad (o En las siguientes pantallas intercruzadas, el 15,5% de los animales fueron afectados (53 de los 342 animales examinados), lo que sugiere que el pedigrí lleva una mutación que causa un fenotipo circadiano recesivo que es un 60% penetrante. No encontramos sesgo de género en los animales afectados (proporción de los animales afectados: macho = 47,2%; hembra = 52,8%). Al mismo tiempo, se identificó un fenotipo de esterilidad masculina dentro del mismo pedigrí. 23 El análisis de la vinculación SNP a escala del genoma mapeó los fenotipos circadiano y esterilidad a la misma región en el cromosoma 5 y la secuenciación posterior identificó la mutación causal como una mutación de punto único T a G dentro del exón siete del gen Katnal1. Para más detalles sobre el mapeo e identificación de la mutación ver referencia 23. Este alelo mutante fue designado Katnal1 1H, y resulta en una sustitución de leucina a valina en el residuo 286 de la proteína. El análisis funcional in vitro demostró que la mutación es un alelo recesivo de pérdida de función. 23 Modelización 3D de la proteína sugiere que esta pérdida de función se debe a cambios hidrofóbicos en el dominio AAA de la enzima (Figura Suplementaria S1 ). Genotipado confirmó que la mutación fue homocigota en animales circadianos afectados y tipo salvaje o heterocigota en animales no afectados, confirmando que Katnal1 1H fue causa del fenotipo circadiano. Anomalías circadianas y del sueño en ratones Katnal1 1H/1H El fenotipo circadiano más extenso realizado en ratones Katnal1 homocigotos (Katnal1 1H/1H ) y en camadas de tipo salvaje (Katnal1 +/+ ) confirmó que los ratones Katnal1 1H/1H tuvieron un período circadiano de funcionamiento libre más corto (Figuras 1a-c) y además reveló que los animales Katnal1 1H/1H eran más activos en la fase de luz del ciclo luz/oscuro (Figura 1d ), mostraron una mayor anticipación de las transiciones de luz a oscuras y un mayor cambio en el inicio de actividad cuando fueron liberados de los ciclos luz/oscuro a la oscuridad constante (Figura 1e ). Los datos y detalles de la cohorte se dan en la Tabla Complementaria S Las grabaciones de bioluminiscencia realizadas con ratones reporteros de LUCIFERASE que llevaban la mutación Katnal1 1H revelaron que estos cambios circadianos no se debían a cambios en el reloj molecular central del núcleo suprachiasmático (el sitio del reloj circadiano maestro en el cerebro; Figura suplementaria S2 ). Las alteraciones circadianas a menudo se asocian con déficits en la homeostasis del sueño. Por lo tanto, para complementar nuestros estudios circadianos realizamos grabaciones electroencefalográficas inalámbricas durante un período basal de 24 h y después de un período de privación del sueño de 6 h. En la Tabla suplementaria S1 se da un resumen detallado del análisis electroencefalográfico. En comparación con los camarones salvajes, el poder delta no REM de los ratones Katnal1 1H/1H fue mayor en la fase oscura del sueño basal (ANOVA mixto, factores de interacción 'genotipo X time, F(1,88) = 8,91, P = 0,0175) (Figura 1f ) y en las fases claras y oscuras del sueño de recuperación (ANOVA mixto, factores de interacción 'genotipo X time', F(1,136) = 11,93, P = 0,0086; Figura 1g ). Todos los demás parámetros del sueño no se vieron afectados en los animales Katnal1 1H/1H. Los ratones Katnal1 1H/1H muestran un espectro de déficits de comportamiento Los pacientes humanos que llevan una deleción heterocigosa que incorpora el locus Katnal1 muestran una serie de déficits cognitivos, incluyendo ID y un retraso en la adquisición Por lo tanto, investigamos si estos déficits fueron modelados en ratones Katnal1 1H/1H sometiendo cohortes animales a una batería de pruebas de comportamiento. Los datos y detalles de cohortes se dan en la Tabla Complementaria S2. Tanto la memoria de trabajo como la memoria espacial fueron significativamente más pobres en ratones Katnal1 1H/1H, como lo evidencian las alteraciones espontáneas reducidas en un T-maze (Figura 2a ) y en el laberinto de agua Morris donde los mutantes tardan más tiempo en encontrar la plataforma en los ensayos de adquisición (Figura 2b En comparación con los animales de tipo salvaje, los animales Katnal1 1H/1H tienen un período más corto (c), son más activos en la fase de luz del ciclo de luz/oscuridad (d) y muestran un inicio más temprano de actividad en transiciones luz/oscuridad y En las grabaciones de EEG durante el sueño, los ratones Katnal1 1H/1H muestran un aumento de la potencia delta no REM en la fase oscura del ciclo de luz/oscuridad (f) y después de la privación del sueño (g). *P 0,05; **P 0,01; ***P 0,001. EEG, electroencefalografía; DD, oscuridad constante; LD, ciclo de luz/oscuridad. tipo = 164 ± 12 m, Katnal1 1H/1H = 243 ± 20 m, P = 0,02; distancia recorrida en la periferia del campo abierto: tipo salvaje = 4,3 ± 0,2 m, Katnal1 1H/1H = 6 ± 0,3 m, P = 0,004). Por el contrario, cuando se registró la actividad del ratón en la jaula doméstica, no se encontró diferencia entre los genotipos (distancia recorrida a lo largo de 24 h: tipo salvaje = 399 ± 77 m, Katnal1 1H/1H = 418 ± 41 m, P = 0,833) sugiriendo que las diferencias de actividad anteriores se debían al ambiente novedoso del campo abierto en lugar de la hiperactividad generalizada en animales Katnal1 1H/1H. Finalmente, en ciertas condiciones (como la separación materna) los ratones emiten vocalizaciones ultrasónicas (USVs). Para comprobar si los animales Katnal1 1H/1H vocalizaban de manera diferente a los tipos salvajes, separamos a los cachorros en los días postnatales 7-8 (la edad a la que los ratones muestran pico de emisión de USV 24 ) y registramos sus USVs. En estas pruebas, en comparación con los tipos salvajes, las crías de Katnal1 1H/1H produjeron menos (Figura 2g ) y más cortas (Figura 2h ) vocalizaciones, conteniendo menos frases (Figura 2i ). Anomalías morfológicas cerebrales brutas en ratones Katnal1 1H/1H Dado que observamos una serie de fenotipos de comportamiento en ratones Katnal1 1H/1H, realizamos análisis histológicos para determinar si las diferencias en la histología cerebral subyacen a estos comportamientos. Los datos y los detalles de la cohorte se dan en la Tabla Suplementaria S3. El análisis de las secciones cerebrales manchadas de hematoxilina y eosina reveló que, en comparación con los camadas de tipo salvaje, los animales de Katnal1 1H/1H tenían capas piramidales menos apretadas en el hipocampo (Fi Para confirmar estas diferencias en las capas corticales, se realizó inmunofluorescencia utilizando la (Figuras 3l y m). La cuantificación de la intensidad de fluorescencia demostró que en la corteza de Katnal1 1H/1H tanto la calbindina como el etiquetado CUX1 fueron más intensos más cerca de la superficie cortical, lo que es consistente con la reducción del tamaño de la capa 1 (análisis bidireccional de la varianza (ANOVA), factores de interacción 'geotipo X distancia de fluorescencia desde la superficie cortical', calbindina: F(75.988) = 16,8, P o 0,0005; CUX1: F(93.372 = 2,17, P = 0,001; Figuras 3h y k). Una cuantificación similar reveló que el etiquetado FOXP2 se extendió más a partir de la capa 6b (marcada por el CTGF) en la corteza de Katnal1 1H/1H, lo que es consistente con un aumento en el tamaño de la capa 6 (ANOVA de dos vías, factores de interacción 'genotipo X distancia de fluorescencia desde el etiquetado del CTGF:' F(93,372) = 1,32, P = 0,038; Figura 3n ). Finalmente, los modelos tridimensionales del sistema ventricular fueron construidos a partir de tomografías microcomputadas cerebrales (Figuras 3o y p). El análisis volumétrico reveló que los ratones Katnal1 1H/1H tenían ventrículos sustancialmente más grandes que los tipos salvajes (Figura 3q ). 18 Por lo tanto, se investigó si los ratones Katnal1 1H/1H mostraron migración neuronal anormal utilizando el etiquetado BrdU de embriones E13 y E15 y células etiquetadas cuantificadas en la corteza de crías P9 (descritas en la referencia 18). A ambas edades los animales Katnal1 1H/1H tenían un mayor número de neuronas etiquetadas en contenedores cercanos a la superficie cortical neuronas situadas más cerca de la superficie cortical que en el tipo salvaje. Para confirmar estos resultados se utilizó una cámara Boyden 19 y se realizó un análisis de migración neuronal in vitro en cultivos neuronales corticales primarios E13.5. Aquí se encontró que una mayor proporción de neuronas corticales Katnal1 1H/1H migró a la base del inserto de cultivo celular en comparación con controles de tipo salvaje (figura complementaria S3). Dado que tanto en el etiquetado BrdU como en las neuronas de ensayo de Boyden de los animales de Katnal1 1H/1H migraron más allá de los de los camarones de tipo salvaje, estos resultados sugieren que las neuronas corticales de Katnal1 1H/1H muestran defectos en la terminación de la migración neuronal cortical. Dada su función en la organización citoesquelética, también se planteó la hipótesis de que la morfología neuronal es modulada por Katnal1. El análisis de las neuronas manchadas con golgi de las capas 2-3 de la corteza (Figuras 4g e i) demostró que, en comparación con los camarones de tipo salvaje, las neuronas de Katnal1 1H/1H tenían el soma más grande (Figura 4k) y los axones más cortos y delgados (Figuras 4l y m) (los datos y Además, el análisis a mayor aumento (Figuras 4h y j), demostró que el número de espinas sinápticas en las neuronas de Katnal1 1H/1H se redujo significativamente en comparación con el tipo salvaje (Figura 4n ). Estudios recientes han demostrado que las mutaciones en algunas enzimas cortantes de microtúbulos pueden causar defectos en los cilios. 5 Dado que tales defectos ciliares podrían subyacer a los fenotipos descritos anteriormente, estudiamos los cilios motiles del revestimiento ependimal del ventrículo lateral en secciones de cerebros de ratón postnatales del día 2 de Katnal1 1H/1H (n = 4) y animales de tipo salvaje (n = 3). Se encontró que la frecuencia de latido ciliar (CBF) de los animales de Katnal1 1H/1H fue significativamente atenuada en comparación con el tipo salvaje (CBF: salvaje = 22,39 ± 0,94 Hz, Katnal1 1H/1H = 14,25 ± 0,92 Hz, P = 0,0001; Figura 5a, Películas suplementarias S1). Esta reducción en la FBC en animales de Katnal1 1H/1H también se asoció con un aumento de la proporción de cilia con un patrón de latido anormal (discinesia ciliar) (proporción de cilia discinética: salvaje = 17%, Katnal1 1H/1H = 75%) (Figura 5b y Películas suplementarias S1). La inspección visual de los cilios identificó una serie de anomalías ciliares tales como una punta ciliar hinchada (Supplementary Movie S3) o cilios extremadamente largos (Supplementary Movie S4) diseminados por todo el campo de los cilios en los ventrículos de Katnal1 1H/1H. Estas anomalías se observaron en aproximadamente el 25% de las rebanadas cerebrales de Katnal1 1H/1H. Los cilios anormales siempre mostraron un patrón de latido discinético y una frecuencia de latido inferior. Para investigar más a fondo la morfología ciliar realizamos microscopía electrónica de escaneo sobre el revestimiento ependimal de los ventrículos laterales de ambos Katnal1 1H/1H (n = 3) y animales de tipo salvaje (n = 3; Figuras 5c y d). Las mediciones de Cilia no mostraron diferencias significativas en la longitud media de los cilias entre los genotipos (longitud media de los cilias: tipo salvaje = 6,22 ± 0,86 μm, Katnal1 1H/1H = 6,54 ± 0,94 Hz, P = 0,303). Sin embargo, en las muestras de Katnal1 1H/1H se observó la presencia de cilias largas y cortas (Figuras 5e y f; definidas como dos desviaciones estándar más largas o más cortas que la longitud media de los cilias) que no estaban presentes en las muestras de tipo salvaje. Además, la inspección de los cilias de Katnal1 1H/1H identificó anomalías ciliares incluyendo cilias bifurcadas (Figura 5g), torceduras anormales en los cilias (Figura 5h ) e inflamaciones a lo La microscopía electrónica de transmisión de cilios ependimales encontró que la alteración vesicular aggre- Katnal1 afecta a las funciones del SNC Los bancos y las puertas estaban presentes dentro de las inflamaciones ciliares descritas anteriormente (Figura 5j ). Aunque estas anormalidades estaban presentes en una pequeña proporción (o1%) de los cilios de Katnal1 1H/1H, estaban notablemente ausentes de los cilios de tipo salvaje. Las enzimas cortantes de microtúbulos desempeñan diversos papeles en el sistema nervioso. 1, 2 Sin embargo, en la actualidad la enzima cortante de microtúbulos Katnal1 está mal definida en el contexto del desarrollo y la función del SNC. Aquí presentamos un análisis fenotípico detallado de Katnal1 1H y mostramos que la mutación está asociada con cambios en los ritmos circadianos, el sueño y el comportamiento. Además, se demuestra que los defectos en la histopatología cerebral, la migración neuronal y la morfología neuronal subyacen a estos fenotipos. Finalmente, también se demuestra que Katnal1 1H causa una gama de defectos en los cilios móviles de las células ependimales ventriculares. Los datos que presentamos aquí son los primeros en asociar KATNAL1 con tales disfunciones con importantes implicaciones para los estudios de asociación clínica. La mutación Katnal1 1H fue identificada inicialmente con un déficit circadiano incluyendo un corto período de libre ejecución y un inicio avanzado de actividad. Sin embargo, experimentos ex vivo posteriores usando rebanadas de SCN de animales que transportaban el PER2:El gen del reportero de LUC no demostró defectos en los ritmos celulares del SCN, sugiriendo que el reloj circadiano central no fue afectado por la mutación. 25 Aquí se ha sugerido que los cambios en el funcionamiento de las ruedas observados son el resultado de defectos en las vías de salida del reloj circadiano SCN. Del mismo modo, en los ratones 1H/1H de Katnal1 se hipótesis que los defectos que demostramos en la anatomía neuronal y la morfología neuronal pueden alterar las señales de salida del NCG. Alternativamente, dado que varios neuropéptidos como la oxitocina se secretan de manera circadiana de células ependimales que recubren el tercer ventrículo del cerebro, 26 morfología ventricular alterada y función ciliar en ratones 1H/1H de Katnal1 pueden alterar la circulación de factores secretados por las células ependimales ventriculares ciliadas y contribuir a la alteración de los ritmos de comportamiento observados. En la actualidad los fenotipos descritos se limitan a la disfunción motora en ratones que carecen del gen Spg4 27 y agitan y rodean la cabeza en el mutante Fign. 7, 28, 29 En contraste, aquí demostramos que la pérdida de la función de Katnal1 está asociada con una serie de fenotipos conductuales, incluyendo cambios en la actividad circadiana, mal aprendizaje y memoria, hiperactividad en un entorno novedoso (campo abierto) y déficits en los USVs. En particular, los fenotipos de aprendizaje y memoria, ansiedad y vocalización repiten los síntomas clínicos de ID, aumento de la ansiedad en situaciones novedosas y retrasos en la adquisición del lenguaje reportados en pacientes humanos que portan microdeleciones que incorporan haploinsuficiencia de KATNAL1. 8, 9 Aunque también vale la pena señalar que los ratones mutantes pasan más tiempo en el centro del campo abierto que los tipos salvajes (implicando que los animales Katnal1 1H/1H muestran menor ansiedad), sugerimos que este resultado está confundido por la hiperactividad en entornos novedosos fenotipo que también describimos en ratones mutantes. Esta observación está respaldada por el hecho de que los animales mutantes mostraron mayor actividad en todas las regiones del campo abierto en lugar de sólo la periferia ansiolítica. Aquí también destacamos defectos en ratones Katnal1 1H/1H tales como migración neuronal comprometida y morfología que pueden sustentar tales fenotipos. En Drosophila, se ha demostrado que el homólogo de Katnal1 (kat-60L1) juega un papel crítico en la morfología neuronal durante el desarrollo, 30 sin embargo los datos que presentamos aquí son los primeros en demostrar un fenotipo similar en mamíferos y además sugieren cómo las perturbaciones sutiles a la función KATNAL1 pueden contribuir a condiciones neuronales y conductuales específicas.Por ejemplo, defectos en la migración neuronal, espinas sinápticas y morfología neuronal como los que hemos demostrado aquí, se han sugerido para sustentar la ID en condiciones como la lissencefalia, el síndrome de Down 18 31 y el síndrome de Rett.32 Aunque no estamos sugiriendo que Katnal1 sea causa de estas condiciones, se deben apreciar similitudes en síntomas y fenotipos neuronales entre estas condiciones y los relacionados con la disfunción Katnal1. Además, se ha asociado una mutación rara en KATNAL1 con esquizofrenia 10 (http://atgu.mgh.harvard.edu/~spurcell/gene book/genebook.cgi?user = guest&cmd = verb-gene&tbox = KATNAL1) y se ha demostrado que KATNAL1 interactúa con el gen de esquizofrenia asociado DISC1. 33 En línea con estas observaciones, observamos que se han reportado aumentos en el volumen ventricular y reducciones en las espinas sinápticas en pacientes esquizofrénicos 34, 35 y nuestros datos demuestran los mismos fenotipos en ratones Katnal1 1H/1H. Así, el rango de fenotipos asociados con defectos en la función de Katnal1 sugiere fuertemente que el gen debe ser considerado en la patología de trastornos como el ID y la esquizofrenia. Si bien los pacientes humanos fueron todos heterocigotos para la eliminación de Katnal1, no encontramos fenotipo en ratones mutantes heterocigotos (datos no mostrados) sugiriendo que si bien la haploinsuficiencia es causativa para los fenotipos en humanos, los ratones requieren pérdida completa de la función KATNAL1 para mostrar efectos similares. Una discrepancia similar entre humanos y ratones también se ha observado para el gen candidato a discapacidad intelectual CTNNB1. 17 Si bien la pérdida heterocigota de mutaciones funcionales en CTNNB1 son causales de discapacidad intelectual en humanos, los golpes condicionales para CTNNB1 no tienen fenotipos conductuales o craneofaciales reportados. 36, 37 Estas diferencias demuestran que, si bien los modelos de discapacidad intelectual del ratón son de gran utilidad en nuestra comprensión de los mecanismos causales que subyacen a la condición, todavía existen diferencias genéticas y neurodesarrollistas entre especies que también deben tenerse en cuenta. También observamos que si bien la mutación Katnal1 1H muestra una pérdida de la función catalítica tanto en las células HEK293 como en las células Sertoli, 23 esta pérdida de función no se ha verificado en las células neuronales. Sin embargo, dado que nuestros datos demuestran que la mutación Katnal1 1H se encuentra en un dominio catalítico esencial y que mostramos fenotipos neuronales en ratones Katnal1 1H/1H, esperamos ver la misma pérdida de la función catalítica en neuronas. Los datos que presentamos aquí también demuestran defectos en cilia motil en ratones Katnal1 1H/1H. Las alteraciones ciliarias en humanos (ciliopatías) incluyen el síndrome de Bardet-Biedl y Joubert. 38 Aunque actualmente hay datos limitados sobre los fenotipos conductuales de los modelos de ciliopatías en ratones, observamos que la disfunción ciliar en ratones se ha relacionado con el aprendizaje y la memoria 39 y los fenotipos de vocalización, 40 de los cuales fueron alterados en los ratones Katnal1 1H/1H descritos aquí. También es notable que la migración neuronal y los fenotipos del ventrículo agrandado que describimos en ratones Katnal1 1H/1H recapitulan características asociadas con mutaciones génicas conocidas de la ciliopatía. [42] [43] [44] [44] Además, en los modelos de ratón del síndrome de Bardet-Byedl se han descrito defectos ciliares como la reducción de la CBF 45 y defectos estructurales como alargamiento anormal e hinchazón a lo largo de su longitud 41, que son similares a los que se describen en los ratones Katnal1 1H/1H. Existen fuertes evidencias de que los genes asociados a la ciliopatía desempeñan una serie de funciones en el desarrollo neuronal al afectar procesos como la proliferación progenitora o el mantenimiento del andamio de la glia radial. 43 Sin embargo, también está claro que los defectos en la organización de microtúbulos también afectan a la estructura sináptica. 2 En la actualidad es difícil desenredar las contribuciones relativas de los defectos en el corte de microtúbulos y las anomalías ciliares a los fenotipos generales que observamos en los ratones Katnal1 1H/1 Sin embargo, es notable que si bien los defectos en la estructura cilia puede contribuir a los fenotipos que describimos en los ratones Katnal1 1H/1H, son mucho menos prominentes en los ratones Katnal1 1H/1H que en otros modelos de ciliopatía de ratón, 41 sugiriendo que el componente ciliar de la disfunción KATNAL1 puede ser leve en comparación con otras ciliapatías. Del mismo modo, se ha sugerido que la hidrocefalia es un componente de algunos modelos de ratón de ciliopatía, 46 ratones Katnal1 1H/1H mostraron sólo un aumento en el tamaño de los ventrículos en lugar de una mayor incidencia de hidrocefalia, sugiriendo además que los defectos ciliares en estos animales son leves en comparación con otras ciliapatías. En resumen, los datos presentados aquí demuestran claramente que KATNAL1 juega un papel importante en una variedad de procesos neuronales incluyendo El efecto posterior de estos defectos conduce a su vez a una serie de cambios de comportamiento, incluyendo en el aprendizaje y la memoria, reacción a situaciones ansiogénicas y ritmos circadianos. Estos datos destacan cómo las perturbaciones en KATNAL1 pueden jugar un papel en la disfunción neuronal y demuestran que la enzima es un candidato novedoso en el estudio de trastornos de comportamiento y neurodesarrollo.Los autores declaran no conflicto de intereses.

¿Qué mutación genética se asocia con la paraplejia espástica hereditaria?

Una mutación missense en Katnal1 subyace a anomalías conductuales, neurológicas y ciliareshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5761721/SHA: f4cebabd74b16e710fb41a737d8ef84b7d565d8dAutores: Banks, G; Lassi, G; Hoerder-Suabadissen, A; Tinarelli, F; Simon, M; Wilcox, A; Lau, P; Lawson, T N; Johnson, S; Rutman, A; Sweeting, M; Chesham, J E; Barnard, A; Horner, N; Westerberg, H; Smith, L B; Molnár, Z; Hastings, M H; Hirst, Aunque la separación de microtúbulos es fundamental para muchos procesos neurales dinámicos, poco se sabe sobre el papel del miembro de la familia Katanin p60 subunidad A-como 1, KATNAL1, en la función del sistema nervioso central (SNC). Estudios recientes que reportan que las microdeleciones que incorporan el locus KATNAL1 en humanos resultan en discapacidad intelectual y microcefalia sugieren que KATNAL1 puede jugar un papel prominente en el SNC; sin embargo, tales asociaciones carecen de los datos funcionales necesarios para resaltar los mecanismos potenciales que vinculan el gen con los síntomas de la enfermedad. Aquí identificamos y caracterizamos una línea de ratón que lleva una pérdida de función alelo en Katnal1. Demostramos que los mutantes expresan déficits de comportamiento incluyendo en ritmos circadianos, sueño, ansiedad y aprendizaje/memoria. Además, en el cerebro de ratones mutantes Katnal1 revelamos numerosas Además, se evidencian defectos en los cilios motiles de las células ependimales ventriculares de los mutantes, sugiriendo un papel para Katnal1 en el desarrollo de la función ciliar. Creemos que los datos que presentamos aquí son los primeros en asociar KATNAL1 con tales fenotipos, demostrando que la proteína juega papeles claves en una serie de procesos integrales al desarrollo de la función y el comportamiento neuronal. Texto: Las enzimas cortantes del microtúbulo son una familia de proteínas AAA-ATPasa que participan en procesos celulares fundamentales como la mitosis, la biogénesis ciliar y la motilidad del cono de crecimiento. 2 Además, las mutaciones en los genes de las enzimas cortantes de los microtúbulos SPG4, KATNB1 y KATNAL2 se asocian con la paraplejia espástica hereditaria, las malformaciones cerebrales y el autismo, respectivamente [3] [4] [5] [6] y las mutaciones en Fign causan una gama de fenotipos en ratones. 7 Actualmente la enzima cortante de los microtúbulos KATNAL1 está mal caracterizada y todavía no se entiende cómo funciona la enzima en el sistema nervioso. Evidencia reciente de la caracterización genética de pacientes humanos sugiere que la haploinsuficiencia de KATNAL1 está relacionada con una serie de síntomas, incluyendo discapacidad intelectual (ID) y dismorfologías craneofaciales. 8, 9 También es notable que una mutación KATNAL1 muy rara se ha asociado con esquizofrenia 10 (http://atgu.mgh.harvard.edu/~spurcell/genebook/gene book.cgi?user = guest&cmd = verb-gene&tbox = KATNAL1) y que el síndrome de Peters y el autismo se han asociado con la región cromosómica que contiene el locus KATNAL1. 11, 12 Aunque estos estudios de asociación sugieren fuertemente que KATNAL1 juega un papel fundamental en el sistema nervioso central (SNC), se requieren estudios adicionales utilizando modelos celulares o animales para entender cómo el gen puede ser causativo de enfermedad. Aquí presentamos el primer estudio que describe déficits neuronales y de comportamiento asociados con una pérdida de función allele de Katnal1 en el ratón. Esta línea de ratón mutante fue identificada de forma independiente en dos pantallas fenotipadoras paralelas, que demostraron que los ratones mutantes mostraron tanto esterilidad masculina como fenotipos circadianos. Investigaciones de comportamiento posteriores demostraron que esta mutación está asociada con ansiedad y déficits de memoria.Basando estos fenotipos de comportamiento, identificamos anomalías histopatológicas en el cerebro de los mutantes Katnal1 1H/1H, incluyendo capas celulares desordenadas en el hipocampo y la corteza y ventrículos sustancialmente más grandes. Investigaciones posteriores demostraron que los ratones Katnal1 1H/1H muestran migración neuronal y déficits de función ciliar, lo que sugiere que KATNAL1 juega un papel esencial en estos procesos. Estos hallazgos son los primeros de nuestro conocimiento que muestran de manera concluyente que las mutaciones en Katnal1 conducen a trastornos de comportamiento y neuronales y proporcionan información sobre las asociaciones clínicas que han sido vinculadas al gen Se realizó en cohortes de ratón parcialmente o completamente congénicas en el fondo C57BL/6 J. Se realizó el funcionamiento de rueda circadiana como se describió anteriormente. 14 Se realizó la evaluación del sueño mediante electroencefalografía y electromiografía La electroencefalografía y electromiografía como se describió anteriormente. 15 Alternancia espontánea conductual fenotipado. Se colocó a los ratones en un T-maze amurallado (cloruro de polivinilo negro, forrado con serrín; tronco = 88 × 13 cm; brazos = 32 × 13 cm) y se les permitió entrar en un brazo de meta de su elección. El ratón se confina en el brazo de meta durante 30 s, antes de que se les permitiera una segunda elección libre del brazo de meta. Se registró una alternancia si la segunda elección difería de la primera. Se realizó un ensayo por día durante 10 días Los ratones fueron colocados en una arena amurallada (cloruro de polivinilo gris; 45 × 45 cm) y se les permitió explorar durante 20 minutos. Los animales fueron monitorizados por el software de análisis XT de EthoVision (Noldus, Wageningen, Países Bajos). El seguimiento de vídeo en la jaula doméstica. La actividad en la jaula doméstica fue grabada por el seguimiento de vídeo como se describió anteriormente. 16 laberinto de agua Morris y vocalización ultrasónica. Estas pruebas se realizaron como se describió anteriormente. 17 histología cerebral e inmunofluorescencia Los cerebros fueron montados en OCT (VWR) y 12 μm secciones coronales tomadas. Las secciones fueron manchadas con hematoxilina y eosina, o inmunoetiquetadas siguiendo protocolos estándar. La evaluación de migración neuronal in vivo se realizó como se describió anteriormente 18 utilizando embriones en E13 o E15 (tres madres por grupo de La evaluación in vitro de la migración neuronal se realizó mediante un protocolo de migración de cámara Boyden descrito anteriormente. 19 Tomografía microcomputada La tomografía microcomputada se realizó mediante una Skyscan 1172 a 90 kV, 112 μA mediante un filtro de aluminio y cobre, un paso de rotación de 0,250 grados y un tamaño de píxel de 4,96 μm. La segmentación, el cálculo de volumen y el modelado 3D se realizaron mediante ITK-SNAP versión 3.0.0 (ref. 20) y 3DSlicer. 21 Tinción Golgi-Cox de neuronas La tinción neuronal Golgi-Cox se realizó mediante el kit FD Rapid GolgiStain (FD NeuroTechnologies, Columbia, MD, EE.UU.). Se diseccionaron los cerebros de los ratones P2 y se seccionó la mitad cerebral dorsal (250 μm) a través del suelo del ventrículo lateral y del tercer ventrículo utilizando un vibratomo. Se analizó la frecuencia y el patrón de latidos ciliares como se describió anteriormente. 22 Microscopía electrónica para escanear Microscopía electrónica El revestimiento ependimal del ventrículo lateral se fijó en 2,5% glutaraldehído, 2% paraformaldehído en tampón de fosfato de 0,1 M, incubado en tetróxido de ósmico al 2%, y deshidratado a través de soluciones de etanol. Las muestras se secaron en punto crítico utilizando un microscopio electrónico de barrido Emitech K850 (Quorum Technologies, East Sussex, UK), recubierto con platino utilizando un capa de sputter Quorom Q150R (Qu La microscopía electrónica de transmisión se realizó según lo descrito anteriormente. 22 Análisis estadístico Los datos fueron analizados utilizando la prueba T de estudiantes de dos colas o AVOVA utilizando SPSS (IBM) o GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, EE.UU.). El nivel de significancia para todos los análisis se estableció en Po 0.05. Todos los gráficos se presentan mostrando promedio ± s.m. Se pueden encontrar métodos adicionales y más detallados en información complementaria. Identificación y clonación de la mutación Katnal1 1H Para identificar mutaciones genéticas novedosas que afectan al comportamiento circadiano, realizamos una pantalla de rueda circadiana de pedigrees de ratones N-etil-N-nitrosourea mutagenizados. 13 En un pedigrí 17,65% de los animales mostró un corto período circadiano en constante oscuridad (o En las siguientes pantallas intercruzadas, el 15,5% de los animales fueron afectados (53 de los 342 animales examinados), lo que sugiere que el pedigrí lleva una mutación que causa un fenotipo circadiano recesivo que es un 60% penetrante. No encontramos sesgo de género en los animales afectados (proporción de los animales afectados: macho = 47,2%; hembra = 52,8%). Al mismo tiempo, se identificó un fenotipo de esterilidad masculina dentro del mismo pedigrí. 23 El análisis de la vinculación SNP a escala del genoma mapeó los fenotipos circadiano y esterilidad a la misma región en el cromosoma 5 y la secuenciación posterior identificó la mutación causal como una mutación de punto único T a G dentro del exón siete del gen Katnal1. Para más detalles sobre el mapeo e identificación de la mutación ver referencia 23. Este alelo mutante fue designado Katnal1 1H, y resulta en una sustitución de leucina a valina en el residuo 286 de la proteína. El análisis funcional in vitro demostró que la mutación es un alelo recesivo de pérdida de función. 23 Modelización 3D de la proteína sugiere que esta pérdida de función se debe a cambios hidrofóbicos en el dominio AAA de la enzima (Figura Suplementaria S1 ). Genotipado confirmó que la mutación fue homocigota en animales circadianos afectados y tipo salvaje o heterocigota en animales no afectados, confirmando que Katnal1 1H fue causa del fenotipo circadiano. Anomalías circadianas y del sueño en ratones Katnal1 1H/1H El fenotipo circadiano más extenso realizado en ratones Katnal1 homocigotos (Katnal1 1H/1H ) y en camadas de tipo salvaje (Katnal1 +/+ ) confirmó que los ratones Katnal1 1H/1H tuvieron un período circadiano de funcionamiento libre más corto (Figuras 1a-c) y además reveló que los animales Katnal1 1H/1H eran más activos en la fase de luz del ciclo luz/oscuro (Figura 1d ), mostraron una mayor anticipación de las transiciones de luz a oscuras y un mayor cambio en el inicio de actividad cuando fueron liberados de los ciclos luz/oscuro a la oscuridad constante (Figura 1e ). Los datos y detalles de la cohorte se dan en la Tabla Complementaria S Las grabaciones de bioluminiscencia realizadas con ratones reporteros de LUCIFERASE que llevaban la mutación Katnal1 1H revelaron que estos cambios circadianos no se debían a cambios en el reloj molecular central del núcleo suprachiasmático (el sitio del reloj circadiano maestro en el cerebro; Figura suplementaria S2 ). Las alteraciones circadianas a menudo se asocian con déficits en la homeostasis del sueño. Por lo tanto, para complementar nuestros estudios circadianos realizamos grabaciones electroencefalográficas inalámbricas durante un período basal de 24 h y después de un período de privación del sueño de 6 h. En la Tabla suplementaria S1 se da un resumen detallado del análisis electroencefalográfico. En comparación con los camarones salvajes, el poder delta no REM de los ratones Katnal1 1H/1H fue mayor en la fase oscura del sueño basal (ANOVA mixto, factores de interacción 'genotipo X time, F(1,88) = 8,91, P = 0,0175) (Figura 1f ) y en las fases claras y oscuras del sueño de recuperación (ANOVA mixto, factores de interacción 'genotipo X time', F(1,136) = 11,93, P = 0,0086; Figura 1g ). Todos los demás parámetros del sueño no se vieron afectados en los animales Katnal1 1H/1H. Los ratones Katnal1 1H/1H muestran un espectro de déficits de comportamiento Los pacientes humanos que llevan una deleción heterocigosa que incorpora el locus Katnal1 muestran una serie de déficits cognitivos, incluyendo ID y un retraso en la adquisición Por lo tanto, investigamos si estos déficits fueron modelados en ratones Katnal1 1H/1H sometiendo cohortes animales a una batería de pruebas de comportamiento. Los datos y detalles de cohortes se dan en la Tabla Complementaria S2. Tanto la memoria de trabajo como la memoria espacial fueron significativamente más pobres en ratones Katnal1 1H/1H, como lo evidencian las alternaciones espontáneas reducidas en un T-maze (Figura 2a ) y en el laberinto de agua Morris donde los mutantes tardan más tiempo en encontrar la plataforma en los ensayos de adquisición (Figura 2b En comparación con los animales de tipo salvaje, los animales Katnal1 1H/1H tienen un período más corto (c), son más activos en la fase de luz del ciclo de luz/oscuridad (d) y muestran un inicio más temprano de actividad en transiciones luz/oscuridad y En las grabaciones de EEG durante el sueño, los ratones Katnal1 1H/1H muestran un aumento de la potencia delta no REM en la fase oscura del ciclo de luz/oscuridad (f) y después de la privación del sueño (g). *P 0,05; **P 0,01; ***P 0,001. EEG, electroencefalografía; DD, oscuridad constante; LD, ciclo de luz/oscuridad. tipo = 164 ± 12 m, Katnal1 1H/1H = 243 ± 20 m, P = 0,02; distancia recorrida en la periferia del campo abierto: tipo salvaje = 4,3 ± 0,2 m, Katnal1 1H/1H = 6 ± 0,3 m, P = 0,004). Por el contrario, cuando se registró la actividad del ratón en la jaula doméstica, no se encontró diferencia entre los genotipos (distancia recorrida a lo largo de 24 h: tipo salvaje = 399 ± 77 m, Katnal1 1H/1H = 418 ± 41 m, P = 0,833) sugiriendo que las diferencias de actividad anteriores se debían al ambiente novedoso del campo abierto en lugar de la hiperactividad generalizada en animales Katnal1 1H/1H. Finalmente, en ciertas condiciones (como la separación materna) los ratones emiten vocalizaciones ultrasónicas (USVs). Para comprobar si los animales Katnal1 1H/1H vocalizaban de manera diferente a los tipos salvajes, separamos a los cachorros en los días postnatales 7-8 (la edad a la que los ratones muestran pico de emisión de USV 24 ) y registramos sus USVs. En estas pruebas, en comparación con los tipos salvajes, las crías de Katnal1 1H/1H produjeron menos (Figura 2g ) y más cortas (Figura 2h ) vocalizaciones, conteniendo menos frases (Figura 2i ). Anomalías morfológicas cerebrales brutas en ratones Katnal1 1H/1H Dado que observamos una serie de fenotipos de comportamiento en ratones Katnal1 1H/1H, realizamos análisis histológicos para determinar si las diferencias en la histología cerebral subyacen a estos comportamientos. Los datos y los detalles de la cohorte se dan en la Tabla Suplementaria S3. El análisis de las secciones cerebrales manchadas de hematoxilina y eosina reveló que, en comparación con los camadas de tipo salvaje, los animales de Katnal1 1H/1H tenían capas piramidales menos apretadas en el hipocampo (Fi Para confirmar estas diferencias en las capas corticales, se realizó inmunofluorescencia utilizando la (Figuras 3l y m). La cuantificación de la intensidad de fluorescencia demostró que en la corteza de Katnal1 1H/1H tanto la calbindina como el etiquetado CUX1 fueron más intensos más cerca de la superficie cortical, lo que es consistente con la reducción del tamaño de la capa 1 (análisis bidireccional de la varianza (ANOVA), factores de interacción 'geotipo X distancia de fluorescencia desde la superficie cortical', calbindina: F(75.988) = 16,8, P o 0,0005; CUX1: F(93.372 = 2,17, P = 0,001; Figuras 3h y k). Una cuantificación similar reveló que el etiquetado FOXP2 se extendió más a partir de la capa 6b (marcada por el CTGF) en la corteza de Katnal1 1H/1H, lo que es consistente con un aumento en el tamaño de la capa 6 (ANOVA de dos vías, factores de interacción 'genotipo X distancia de fluorescencia desde el etiquetado del CTGF:' F(93,372) = 1,32, P = 0,038; Figura 3n ). Finalmente, los modelos tridimensionales del sistema ventricular fueron construidos a partir de tomografías microcomputadas cerebrales (Figuras 3o y p). El análisis volumétrico reveló que los ratones Katnal1 1H/1H tenían ventrículos sustancialmente más grandes que los tipos salvajes (Figura 3q ). 18 Por lo tanto, se investigó si los ratones Katnal1 1H/1H mostraron migración neuronal anormal utilizando el etiquetado BrdU de embriones E13 y E15 y células etiquetadas cuantificadas en la corteza de crías P9 (descritas en la referencia 18). A ambas edades los animales Katnal1 1H/1H tenían un mayor número de neuronas etiquetadas en contenedores cercanos a la superficie cortical neuronas situadas más cerca de la superficie cortical que en el tipo salvaje. Para confirmar estos resultados se utilizó una cámara Boyden 19 y se realizó un análisis de migración neuronal in vitro en cultivos neuronales corticales primarios E13.5. Aquí se encontró que una mayor proporción de neuronas corticales Katnal1 1H/1H migró a la base del inserto de cultivo celular en comparación con controles de tipo salvaje (figura complementaria S3). Dado que tanto en el etiquetado BrdU como en las neuronas de ensayo de Boyden de los animales de Katnal1 1H/1H migró más allá de los de los camarones de tipo salvaje, estos resultados sugieren que las neuronas corticales de Katnal1 1H/1H muestran defectos en la terminación de la migración neuronal cortical. Dada su función en la organización citoesquelética, también se planteó la hipótesis de que la morfología neuronal es modulada por Katnal1. El análisis de las neuronas manchadas con golgi de las capas 2-3 de la corteza (Figuras 4g e i) demostró que, en comparación con los camarones de tipo salvaje, las neuronas de Katnal1 1H/1H tenían el soma más grande (Figura 4k) y los axones más cortos y delgados (Figuras 4l y m) (los datos y Además, el análisis a mayor aumento (Figuras 4h y j), demostró que el número de espinas sinápticas en las neuronas de Katnal1 1H/1H se redujo significativamente en comparación con el tipo salvaje (Figura 4n ). Estudios recientes han demostrado que las mutaciones en algunas enzimas cortantes de microtúbulos pueden causar defectos en los cilios. 5 Dado que tales defectos ciliares podrían subyacer a los fenotipos descritos anteriormente, estudiamos los cilios motiles del revestimiento ependimal del ventrículo lateral en secciones de cerebros de ratón postnatales del día 2 de Katnal1 1H/1H (n = 4) y animales de tipo salvaje (n = 3). Se encontró que la frecuencia de latido ciliar (CBF) de los animales de Katnal1 1H/1H fue significativamente atenuada en comparación con el tipo salvaje (CBF: salvaje = 22,39 ± 0,94 Hz, Katnal1 1H/1H = 14,25 ± 0,92 Hz, P = 0,0001; Figura 5a, Películas suplementarias S1). Esta reducción en la FBC en animales de Katnal1 1H/1H también se asoció con un aumento de la proporción de cilia con un patrón de latido anormal (discinesia ciliar) (proporción de cilia discinética: salvaje = 17%, Katnal1 1H/1H = 75%) (Figura 5b y Películas suplementarias S1). La inspección visual de los cilios identificó una serie de anomalías ciliares tales como una punta ciliar hinchada (Supplementary Movie S3) o cilios extremadamente largos (Supplementary Movie S4) diseminados por todo el campo de los cilios en los ventrículos de Katnal1 1H/1H. Estas anomalías se observaron en aproximadamente el 25% de las rebanadas cerebrales de Katnal1 1H/1H. Los cilios anormales siempre mostraron un patrón de latido discinético y una frecuencia de latido inferior. Para investigar más a fondo la morfología ciliar realizamos microscopía electrónica de escaneo sobre el revestimiento ependimal de los ventrículos laterales de ambos Katnal1 1H/1H (n = 3) y animales de tipo salvaje (n = 3; Figuras 5c y d). Las mediciones de Cilia no mostraron diferencias significativas en la longitud media de los cilias entre los genotipos (longitud media de los cilias: tipo salvaje = 6,22 ± 0,86 μm, Katnal1 1H/1H = 6,54 ± 0,94 Hz, P = 0,303). Sin embargo, en las muestras de Katnal1 1H/1H se observó la presencia de cilias largas y cortas (Figuras 5e y f; definidas como dos desviaciones estándar más largas o más cortas que la longitud media de los cilias) que no estaban presentes en las muestras de tipo salvaje. Además, la inspección de los cilias de Katnal1 1H/1H identificó anomalías ciliares incluyendo cilias bifurcadas (Figura 5g), torceduras anormales en los cilias (Figura 5h ) e inflamaciones a lo La microscopía electrónica de transmisión de cilios ependimales encontró que la alteración vesicular aggre- Katnal1 afecta a las funciones del SNC Los bancos y las puertas estaban presentes dentro de las inflamaciones ciliares descritas anteriormente (Figura 5j ). Aunque estas anormalidades estaban presentes en una pequeña proporción (o1%) de los cilios de Katnal1 1H/1H, estaban notablemente ausentes de los cilios de tipo salvaje. Las enzimas cortantes de microtúbulos desempeñan diversos papeles en el sistema nervioso. 1, 2 Sin embargo, en la actualidad la enzima cortante de microtúbulos Katnal1 está mal definida en el contexto del desarrollo y la función del SNC. Aquí presentamos un análisis fenotípico detallado de Katnal1 1H y mostramos que la mutación está asociada con cambios en los ritmos circadianos, el sueño y el comportamiento. Además, se demuestra que los defectos en la histopatología cerebral, la migración neuronal y la morfología neuronal subyacen a estos fenotipos. Finalmente, también se demuestra que Katnal1 1H causa una gama de defectos en los cilios móviles de las células ependimales ventriculares. Los datos que presentamos aquí son los primeros en asociar KATNAL1 con tales disfunciones con importantes implicaciones para los estudios de asociación clínica. La mutación Katnal1 1H fue identificada inicialmente con un déficit circadiano incluyendo un corto período de libre ejecución y un inicio avanzado de actividad. Sin embargo, experimentos ex vivo posteriores usando rebanadas de SCN de animales que transportaban el PER2:El gen del reportero de LUC no demostró defectos en los ritmos celulares del SCN, sugiriendo que el reloj circadiano central no fue afectado por la mutación. 25 Aquí se ha sugerido que los cambios en el funcionamiento de las ruedas observados son el resultado de defectos en las vías de salida del reloj circadiano SCN. Del mismo modo, en los ratones 1H/1H de Katnal1 se hipótesis que los defectos que demostramos en la anatomía neuronal y la morfología neuronal pueden alterar las señales de salida del NCG. Alternativamente, dado que varios neuropéptidos como la oxitocina se secretan de manera circadiana de células ependimales que recubren el tercer ventrículo del cerebro, 26 morfología ventricular alterada y función ciliar en ratones 1H/1H de Katnal1 pueden alterar la circulación de factores secretados por las células ependimales ventriculares ciliadas y contribuir a la alteración de los ritmos de comportamiento observados. En la actualidad los fenotipos descritos se limitan a la disfunción motora en ratones que carecen del gen Spg4 27 y agitan y rodean la cabeza en el mutante Fign. 7, 28, 29 En contraste, aquí demostramos que la pérdida de la función de Katnal1 está asociada con una serie de fenotipos conductuales, incluyendo cambios en la actividad circadiana, mal aprendizaje y memoria, hiperactividad en un entorno novedoso (campo abierto) y déficits en los USVs. En particular, los fenotipos de aprendizaje y memoria, ansiedad y vocalización repiten los síntomas clínicos de ID, aumento de la ansiedad en situaciones novedosas y retrasos en la adquisición del lenguaje reportados en pacientes humanos que portan microdeleciones que incorporan haploinsuficiencia de KATNAL1. 8, 9 Aunque también vale la pena señalar que los ratones mutantes pasan más tiempo en el centro del campo abierto que los tipos salvajes (implicando que los animales Katnal1 1H/1H muestran menor ansiedad), sugerimos que este resultado está confundido por la hiperactividad en entornos novedosos fenotipo que también describimos en ratones mutantes. Esta observación está respaldada por el hecho de que los animales mutantes mostraron mayor actividad en todas las regiones del campo abierto en lugar de sólo la periferia ansiolítica. Aquí también destacamos defectos en ratones Katnal1 1H/1H tales como migración neuronal comprometida y morfología que pueden sustentar tales fenotipos. En Drosophila, se ha demostrado que el homólogo de Katnal1 (kat-60L1) juega un papel crítico en la morfología neuronal durante el desarrollo, 30 sin embargo los datos que presentamos aquí son los primeros en demostrar un fenotipo similar en mamíferos y además sugieren cómo las perturbaciones sutiles a la función KATNAL1 pueden contribuir a condiciones neuronales y conductuales específicas.Por ejemplo, defectos en la migración neuronal, espinas sinápticas y morfología neuronal como los que hemos demostrado aquí, se han sugerido para sustentar la ID en condiciones como la lissencefalia, el síndrome de Down 18 31 y el síndrome de Rett.32 Aunque no estamos sugiriendo que Katnal1 sea causa de estas condiciones, se deben apreciar similitudes en síntomas y fenotipos neuronales entre estas condiciones y los relacionados con la disfunción Katnal1. Además, se ha asociado una mutación rara en KATNAL1 con esquizofrenia 10 (http://atgu.mgh.harvard.edu/~spurcell/gene book/genebook.cgi?user = guest&cmd = verb-gene&tbox = KATNAL1) y se ha demostrado que KATNAL1 interactúa con el gen de esquizofrenia asociado DISC1. 33 En línea con estas observaciones, observamos que se han reportado aumentos en el volumen ventricular y reducciones en las espinas sinápticas en pacientes esquizofrénicos 34, 35 y nuestros datos demuestran los mismos fenotipos en ratones Katnal1 1H/1H. Así, el rango de fenotipos asociados con defectos en la función de Katnal1 sugiere fuertemente que el gen debe ser considerado en la patología de trastornos como el ID y la esquizofrenia. Si bien los pacientes humanos fueron todos heterocigotos para la eliminación de Katnal1, no encontramos fenotipo en ratones mutantes heterocigotos (datos no mostrados) sugiriendo que si bien la haploinsuficiencia es causativa para los fenotipos en humanos, los ratones requieren pérdida completa de la función KATNAL1 para mostrar efectos similares. Una discrepancia similar entre humanos y ratones también se ha observado para el gen candidato a discapacidad intelectual CTNNB1. 17 Si bien la pérdida heterocigota de mutaciones funcionales en CTNNB1 son causales de discapacidad intelectual en humanos, los golpes condicionales para CTNNB1 no tienen fenotipos conductuales o craneofaciales reportados. 36, 37 Estas diferencias demuestran que, si bien los modelos de discapacidad intelectual del ratón son de gran utilidad en nuestra comprensión de los mecanismos causales que subyacen a la condición, todavía existen diferencias genéticas y neurodesarrollistas entre especies que también deben tenerse en cuenta. También observamos que si bien la mutación Katnal1 1H muestra una pérdida de la función catalítica tanto en las células HEK293 como en las células Sertoli, 23 esta pérdida de función no se ha verificado en las células neuronales. Sin embargo, dado que nuestros datos demuestran que la mutación Katnal1 1H se encuentra en un dominio catalítico esencial y que mostramos fenotipos neuronales en ratones Katnal1 1H/1H, esperamos ver la misma pérdida de la función catalítica en neuronas. Los datos que presentamos aquí también demuestran defectos en cilia motil en ratones Katnal1 1H/1H. Las alteraciones ciliarias en humanos (ciliopatías) incluyen el síndrome de Bardet-Biedl y Joubert. 38 Aunque actualmente hay datos limitados sobre los fenotipos conductuales de los modelos de ciliopatías en ratones, observamos que la disfunción ciliar en ratones se ha relacionado con el aprendizaje y la memoria 39 y los fenotipos de vocalización, 40 de los cuales fueron alterados en los ratones Katnal1 1H/1H descritos aquí. También es notable que la migración neuronal y los fenotipos del ventrículo agrandado que describimos en ratones Katnal1 1H/1H recapitulan características asociadas con mutaciones génicas conocidas de la ciliopatía. [42] [43] [44] [44] Además, en los modelos de ratón del síndrome de Bardet-Byedl se han descrito defectos ciliares como la reducción de la CBF 45 y defectos estructurales como alargamiento anormal e hinchazón a lo largo de su longitud 41, que son similares a los que se describen en los ratones Katnal1 1H/1H. Existen fuertes evidencias de que los genes asociados a la ciliopatía desempeñan una serie de funciones en el desarrollo neuronal al afectar procesos como la proliferación progenitora o el mantenimiento del andamio de la glia radial. 43 Sin embargo, también está claro que los defectos en la organización de microtúbulos también afectan a la estructura sináptica. 2 En la actualidad es difícil desenredar las contribuciones relativas de los defectos en el corte de microtúbulos y las anomalías ciliares a los fenotipos generales que observamos en los ratones Katnal1 1H/1 Sin embargo, es notable que si bien los defectos en la estructura cilia puede contribuir a los fenotipos que describimos en los ratones Katnal1 1H/1H, son mucho menos prominentes en los ratones Katnal1 1H/1H que en otros modelos de ciliopatía de ratón, 41 sugiriendo que el componente ciliar de la disfunción KATNAL1 puede ser leve en comparación con otras ciliapatías. Del mismo modo, se ha sugerido que la hidrocefalia es un componente de algunos modelos de ratón de ciliopatía, 46 ratones Katnal1 1H/1H mostraron sólo un aumento en el tamaño de los ventrículos en lugar de una mayor incidencia de hidrocefalia, sugiriendo además que los defectos ciliares en estos animales son leves en comparación con otras ciliapatías. En resumen, los datos presentados aquí demuestran claramente que KATNAL1 juega un papel importante en una variedad de procesos neuronales incluyendo El efecto posterior de estos defectos conduce a su vez a una serie de cambios de comportamiento, incluyendo en el aprendizaje y la memoria, reacción a situaciones ansiogénicas y ritmos circadianos. Estos datos destacan cómo las perturbaciones en KATNAL1 pueden jugar un papel en la disfunción neuronal y demuestran que la enzima es un candidato novedoso en el estudio de trastornos de comportamiento y neurodesarrollo.Los autores declaran no conflicto de intereses.

¿Qué mutación genética se asocia con las malformaciones cerebrales?

Una mutación missense en Katnal1 subyace a anomalías conductuales, neurológicas y ciliareshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5761721/SHA: f4cebabd74b16e710fb41a737d8ef84b7d565d8dAutores: Banks, G; Lassi, G; Hoerder-Suabadissen, A; Tinarelli, F; Simon, M; Wilcox, A; Lau, P; Lawson, T N; Johnson, S; Rutman, A; Sweeting, M; Chesham, J E; Barnard, A; Horner, N; Westerberg, H; Smith, L B; Molnár, Z; Hastings, M H; Hirst, Aunque la separación de microtúbulos es fundamental para muchos procesos neurales dinámicos, poco se sabe sobre el papel del miembro de la familia Katanin p60 subunidad A-como 1, KATNAL1, en la función del sistema nervioso central (SNC). Estudios recientes que reportan que las microdeleciones que incorporan el locus KATNAL1 en humanos resultan en discapacidad intelectual y microcefalia sugieren que KATNAL1 puede jugar un papel prominente en el SNC; sin embargo, tales asociaciones carecen de los datos funcionales necesarios para resaltar los mecanismos potenciales que vinculan el gen con los síntomas de la enfermedad. Aquí identificamos y caracterizamos una línea de ratón que lleva una pérdida de función alelo en Katnal1. Demostramos que los mutantes expresan déficits de comportamiento incluyendo en ritmos circadianos, sueño, ansiedad y aprendizaje/memoria. Además, en el cerebro de ratones mutantes Katnal1 revelamos numerosas Además, se evidencian defectos en los cilios motiles de las células ependimales ventriculares de los mutantes, sugiriendo un papel para Katnal1 en el desarrollo de la función ciliar. Creemos que los datos que presentamos aquí son los primeros en asociar KATNAL1 con tales fenotipos, demostrando que la proteína juega papeles claves en una serie de procesos integrales al desarrollo de la función y el comportamiento neuronal. Texto: Las enzimas cortantes del microtúbulo son una familia de proteínas AAA-ATPasa que participan en procesos celulares fundamentales como la mitosis, la biogénesis ciliar y la motilidad del cono de crecimiento. 2 Además, las mutaciones en los genes de las enzimas cortantes de los microtúbulos SPG4, KATNB1 y KATNAL2 se asocian con la paraplejia espástica hereditaria, las malformaciones cerebrales y el autismo, respectivamente [3] [4] [5] [6] y las mutaciones en Fign causan una gama de fenotipos en ratones. 7 Actualmente la enzima cortante de los microtúbulos KATNAL1 está mal caracterizada y todavía no se entiende cómo funciona la enzima en el sistema nervioso. Evidencia reciente de la caracterización genética de pacientes humanos sugiere que la haploinsuficiencia de KATNAL1 está relacionada con una serie de síntomas, incluyendo discapacidad intelectual (ID) y dismorfologías craneofaciales. 8, 9 También es notable que una mutación KATNAL1 muy rara se ha asociado con esquizofrenia 10 (http://atgu.mgh.harvard.edu/~spurcell/genebook/gene book.cgi?user = guest&cmd = verb-gene&tbox = KATNAL1) y que el síndrome de Peters y el autismo se han asociado con la región cromosómica que contiene el locus KATNAL1. 11, 12 Aunque estos estudios de asociación sugieren fuertemente que KATNAL1 juega un papel fundamental en el sistema nervioso central (SNC), se requieren estudios adicionales utilizando modelos celulares o animales para entender cómo el gen puede ser causativo de enfermedad. Aquí presentamos el primer estudio que describe déficits neuronales y de comportamiento asociados con una pérdida de función allele de Katnal1 en el ratón. Esta línea de ratón mutante fue identificada de forma independiente en dos pantallas fenotipadoras paralelas, que demostraron que los ratones mutantes mostraban tanto esterilidad masculina como fenotipos circadianos. Investigaciones de comportamiento posteriores demostraron que esta mutación está asociada con ansiedad y déficits de memoria.Basándose en estos fenotipos de comportamiento, identificamos anomalías histopatológicas en el cerebro de los mutantes Katnal1 1H/1H, incluyendo capas celulares desordenadas en el hipocampo y corteza y ventrículos sustancialmente mayores. Investigaciones posteriores demostraron que los ratones Katnal1 1H/1H muestran migración neuronal y déficits de función ciliar que sugieren que KATNAL1 juega un papel esencial en estos procesos. Estos hallazgos son los primeros de nuestro conocimiento que muestran de manera concluyente que las mutaciones en Katnal1 conducen a trastornos de comportamiento y neuronales y proporcionan información sobre las asociaciones clínicas que han sido vinculadas al gen. Se realizó en cohortes de ratón parcialmente o completamente congénicas en el fondo C57BL/6 J. Se realizó el funcionamiento de rueda circadiana como se describió anteriormente. 14 Se realizó la evaluación del sueño mediante electroencefalografía y electromiografía La electroencefalografía y electromiografía como se describió anteriormente. 15 Alternancia espontánea conductual fenotipado. Se colocó a los ratones en un T-maze amurallado (cloruro de polivinilo negro, forrado con serrín; tronco = 88 × 13 cm; brazos = 32 × 13 cm) y se les permitió entrar en un brazo de meta de su elección. El ratón se confina en el brazo de meta durante 30 s, antes de que se les permitiera una segunda elección libre del brazo de meta. Se registró una alternancia si la segunda elección difería de la primera. Se realizó un ensayo por día durante 10 días Los ratones fueron colocados en una arena amurallada (cloruro de polivinilo gris; 45 × 45 cm) y se les permitió explorar durante 20 minutos. Los animales fueron monitorizados por el software de análisis XT de EthoVision (Noldus, Wageningen, Países Bajos). El seguimiento de vídeo en la jaula doméstica. La actividad en la jaula doméstica fue grabada por el seguimiento de vídeo como se describió anteriormente. 16 laberinto de agua Morris y vocalización ultrasónica. Estas pruebas se realizaron como se describió anteriormente. 17 histología cerebral e inmunofluorescencia Los cerebros fueron montados en OCT (VWR) y 12 μm secciones coronales tomadas. Las secciones fueron manchadas con hematoxilina y eosina, o inmunoetiquetadas siguiendo protocolos estándar. La evaluación de migración neuronal in vivo se realizó como se describió anteriormente 18 utilizando embriones en E13 o E15 (tres madres por grupo de La evaluación in vitro de la migración neuronal se realizó mediante un protocolo de migración de cámara Boyden descrito anteriormente. 19 Tomografía microcomputada La tomografía microcomputada se realizó mediante una Skyscan 1172 a 90 kV, 112 μA mediante un filtro de aluminio y cobre, un paso de rotación de 0,250 grados y un tamaño de píxel de 4,96 μm. La segmentación, el cálculo de volumen y el modelado 3D se realizaron mediante ITK-SNAP versión 3.0.0 (ref. 20) y 3DSlicer. 21 Tinción Golgi-Cox de neuronas La tinción neuronal Golgi-Cox se realizó mediante el kit FD Rapid GolgiStain (FD NeuroTechnologies, Columbia, MD, EE.UU.). Se diseccionaron los cerebros de los ratones P2 y se seccionó la mitad cerebral dorsal (250 μm) a través del suelo del ventrículo lateral y del tercer ventrículo utilizando un vibratomo. Se analizó la frecuencia y el patrón de latidos ciliares como se describió anteriormente. 22 Microscopía electrónica para escanear Microscopía electrónica El revestimiento ependimal del ventrículo lateral se fijó en 2,5% glutaraldehído, 2% paraformaldehído en tampón de fosfato de 0,1 M, incubado en tetróxido de ósmico al 2%, y deshidratado a través de soluciones de etanol. Las muestras se secaron en punto crítico utilizando un microscopio electrónico de barrido Emitech K850 (Quorum Technologies, East Sussex, UK), recubierto con platino utilizando un capa de sputter Quorom Q150R (Qu La microscopía electrónica de transmisión se realizó según lo descrito anteriormente. 22 Análisis estadístico Los datos fueron analizados utilizando la prueba T de estudiantes de dos colas o AVOVA utilizando SPSS (IBM) o GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, EE.UU.). El nivel de significancia para todos los análisis se estableció en Po 0.05. Todos los gráficos se presentan mostrando promedio ± s.m. Se pueden encontrar métodos adicionales y más detallados en información complementaria. Identificación y clonación de la mutación Katnal1 1H Para identificar mutaciones genéticas novedosas que afectan al comportamiento circadiano, realizamos una pantalla de rueda circadiana de pedigrees de ratones N-etil-N-nitrosourea mutagenizados. 13 En un pedigrí 17,65% de los animales mostró un corto período circadiano en constante oscuridad (o En las siguientes pantallas intercruzadas, el 15,5% de los animales fueron afectados (53 de los 342 animales examinados), lo que sugiere que el pedigrí lleva una mutación que causa un fenotipo circadiano recesivo que es un 60% penetrante. No encontramos sesgo de género en los animales afectados (proporción de los animales afectados: macho = 47,2%; hembra = 52,8%). Al mismo tiempo, se identificó un fenotipo de esterilidad masculina dentro del mismo pedigrí. 23 El análisis de la vinculación SNP a escala del genoma mapeó los fenotipos circadiano y esterilidad a la misma región en el cromosoma 5 y la secuenciación posterior identificó la mutación causal como una mutación de punto único T a G dentro del exón siete del gen Katnal1. Para más detalles sobre el mapeo e identificación de la mutación ver referencia 23. Este alelo mutante fue designado Katnal1 1H, y resulta en una sustitución de leucina a valina en el residuo 286 de la proteína. El análisis funcional in vitro demostró que la mutación es un alelo recesivo de pérdida de función. 23 Modelización 3D de la proteína sugiere que esta pérdida de función se debe a cambios hidrofóbicos en el dominio AAA de la enzima (Figura Suplementaria S1 ). Genotipado confirmó que la mutación fue homocigota en animales circadianos afectados y tipo salvaje o heterocigota en animales no afectados, confirmando que Katnal1 1H fue causa del fenotipo circadiano. Anomalías circadianas y del sueño en ratones Katnal1 1H/1H El fenotipo circadiano más extenso realizado en ratones Katnal1 homocigotos (Katnal1 1H/1H ) y en camadas de tipo salvaje (Katnal1 +/+ ) confirmó que los ratones Katnal1 1H/1H tuvieron un período circadiano de funcionamiento libre más corto (Figuras 1a-c) y además reveló que los animales Katnal1 1H/1H eran más activos en la fase de luz del ciclo luz/oscuro (Figura 1d ), mostraron una mayor anticipación de las transiciones de luz a oscuras y un mayor cambio en el inicio de actividad cuando fueron liberados de los ciclos luz/oscuro a la oscuridad constante (Figura 1e ). Los datos y detalles de la cohorte se dan en la Tabla Complementaria S Las grabaciones de bioluminiscencia realizadas con ratones reporteros de LUCIFERASE que llevaban la mutación Katnal1 1H revelaron que estos cambios circadianos no se debían a cambios en el reloj molecular central del núcleo suprachiasmático (el sitio del reloj circadiano maestro en el cerebro; Figura suplementaria S2 ). Las alteraciones circadianas a menudo se asocian con déficits en la homeostasis del sueño. Por lo tanto, para complementar nuestros estudios circadianos realizamos grabaciones electroencefalográficas inalámbricas durante un período basal de 24 h y después de un período de privación del sueño de 6 h. En la Tabla suplementaria S1 se da un resumen detallado del análisis electroencefalográfico. En comparación con los camarones salvajes, el poder delta no REM de los ratones Katnal1 1H/1H fue mayor en la fase oscura del sueño basal (ANOVA mixto, factores de interacción 'genotipo X time, F(1,88) = 8,91, P = 0,0175) (Figura 1f ) y en las fases claras y oscuras del sueño de recuperación (ANOVA mixto, factores de interacción 'genotipo X time', F(1,136) = 11,93, P = 0,0086; Figura 1g ). Todos los demás parámetros del sueño no se vieron afectados en los animales Katnal1 1H/1H. Los ratones Katnal1 1H/1H muestran un espectro de déficits de comportamiento Los pacientes humanos que llevan una deleción heterocigosa que incorpora el locus Katnal1 muestran una serie de déficits cognitivos, incluyendo ID y un retraso en la adquisición Por lo tanto, investigamos si estos déficits fueron modelados en ratones Katnal1 1H/1H sometiendo cohortes animales a una batería de pruebas de comportamiento. Los datos y detalles de cohortes se dan en la Tabla Complementaria S2. Tanto la memoria de trabajo como la memoria espacial fueron significativamente más pobres en ratones Katnal1 1H/1H, como lo evidencian las alteraciones espontáneas reducidas en un T-maze (Figura 2a ) y en el laberinto de agua Morris donde los mutantes tardan más tiempo en encontrar la plataforma en los ensayos de adquisición (Figura 2b En comparación con los animales de tipo salvaje, los animales Katnal1 1H/1H tienen un período más corto (c), son más activos en la fase de luz del ciclo de luz/oscuridad (d) y muestran un inicio más temprano de actividad en transiciones luz/oscuridad y En las grabaciones de EEG durante el sueño, los ratones Katnal1 1H/1H muestran un aumento de la potencia delta no REM en la fase oscura del ciclo de luz/oscuridad (f) y después de la privación del sueño (g). *P 0,05; **P 0,01; ***P 0,001. EEG, electroencefalografía; DD, oscuridad constante; LD, ciclo de luz/oscuridad. tipo = 164 ± 12 m, Katnal1 1H/1H = 243 ± 20 m, P = 0,02; distancia recorrida en la periferia del campo abierto: tipo salvaje = 4,3 ± 0,2 m, Katnal1 1H/1H = 6 ± 0,3 m, P = 0,004). Por el contrario, cuando se registró la actividad del ratón en la jaula doméstica, no se encontró diferencia entre los genotipos (distancia recorrida a lo largo de 24 h: tipo salvaje = 399 ± 77 m, Katnal1 1H/1H = 418 ± 41 m, P = 0,833) sugiriendo que las diferencias de actividad anteriores se debían al ambiente novedoso del campo abierto en lugar de la hiperactividad generalizada en animales Katnal1 1H/1H. Finalmente, en ciertas condiciones (como la separación materna) los ratones emiten vocalizaciones ultrasónicas (USVs). Para comprobar si los animales Katnal1 1H/1H vocalizaban de manera diferente a los tipos salvajes, separamos a los cachorros en los días postnatales 7-8 (la edad a la que los ratones muestran pico de emisión de USV 24 ) y registramos sus USVs. En estas pruebas, en comparación con los tipos salvajes, las crías de Katnal1 1H/1H produjeron menos (Figura 2g ) y más cortas (Figura 2h ) vocalizaciones, conteniendo menos frases (Figura 2i ). Anomalías morfológicas cerebrales brutas en ratones Katnal1 1H/1H Dado que observamos una serie de fenotipos de comportamiento en ratones Katnal1 1H/1H, realizamos análisis histológicos para determinar si las diferencias en la histología cerebral subyacen a estos comportamientos. Los datos y los detalles de la cohorte se dan en la Tabla Suplementaria S3. El análisis de las secciones cerebrales manchadas de hematoxilina y eosina reveló que, en comparación con los camadas de tipo salvaje, los animales de Katnal1 1H/1H tenían capas piramidales menos apretadas en el hipocampo (Fi Para confirmar estas diferencias en las capas corticales, se realizó inmunofluorescencia utilizando la (Figuras 3l y m). La cuantificación de la intensidad de fluorescencia demostró que en la corteza de Katnal1 1H/1H tanto la calbindina como el etiquetado CUX1 fueron más intensos más cerca de la superficie cortical, lo que es consistente con la reducción del tamaño de la capa 1 (análisis bidireccional de la varianza (ANOVA), factores de interacción 'geotipo X distancia de fluorescencia desde la superficie cortical', calbindina: F(75.988) = 16,8, P o 0,0005; CUX1: F(93.372 = 2,17, P = 0,001; Figuras 3h y k). Una cuantificación similar reveló que el etiquetado FOXP2 se extendió más a partir de la capa 6b (marcada por el CTGF) en la corteza de Katnal1 1H/1H, lo que es consistente con un aumento en el tamaño de la capa 6 (ANOVA de dos vías, factores de interacción 'genotipo X distancia de fluorescencia desde el etiquetado del CTGF:' F(93,372) = 1,32, P = 0,038; Figura 3n ). Finalmente, los modelos tridimensionales del sistema ventricular fueron construidos a partir de tomografías microcomputadas cerebrales (Figuras 3o y p). El análisis volumétrico reveló que los ratones Katnal1 1H/1H tenían ventrículos sustancialmente más grandes que los tipos salvajes (Figura 3q ). 18 Por lo tanto, se investigó si los ratones Katnal1 1H/1H mostraron migración neuronal anormal utilizando el etiquetado BrdU de embriones E13 y E15 y células etiquetadas cuantificadas en la corteza de crías P9 (descritas en la referencia 18). A ambas edades los animales Katnal1 1H/1H tenían un mayor número de neuronas etiquetadas en contenedores cercanos a la superficie cortical neuronas situadas más cerca de la superficie cortical que en el tipo salvaje. Para confirmar estos resultados se utilizó una cámara Boyden 19 y se realizó un análisis de migración neuronal in vitro en cultivos neuronales corticales primarios E13.5. Aquí se encontró que una mayor proporción de neuronas corticales Katnal1 1H/1H migró a la base del inserto de cultivo celular en comparación con controles de tipo salvaje (figura complementaria S3). Dado que tanto en el etiquetado BrdU como en las neuronas de ensayo de Boyden de los animales de Katnal1 1H/1H migraron más allá de los de los camarones de tipo salvaje, estos resultados sugieren que las neuronas corticales de Katnal1 1H/1H muestran defectos en la terminación de la migración neuronal cortical. Dada su función en la organización citoesquelética, también se planteó la hipótesis de que la morfología neuronal es modulada por Katnal1. El análisis de las neuronas manchadas con golgi de las capas 2-3 de la corteza (Figuras 4g e i) demostró que, en comparación con los camarones de tipo salvaje, las neuronas de Katnal1 1H/1H tenían el soma más grande (Figura 4k) y los axones más cortos y delgados (Figuras 4l y m) (los datos y Además, el análisis a mayor aumento (Figuras 4h y j), demostró que el número de espinas sinápticas en las neuronas de Katnal1 1H/1H se redujo significativamente en comparación con el tipo salvaje (Figura 4n ). Estudios recientes han demostrado que las mutaciones en algunas enzimas cortantes de microtúbulos pueden causar defectos en los cilios. 5 Dado que tales defectos ciliares podrían subyacer a los fenotipos descritos anteriormente, estudiamos los cilios motiles del revestimiento ependimal del ventrículo lateral en secciones de cerebros de ratón postnatales del día 2 de Katnal1 1H/1H (n = 4) y animales de tipo salvaje (n = 3). Se encontró que la frecuencia de latido ciliar (CBF) de los animales de Katnal1 1H/1H fue significativamente atenuada en comparación con el tipo salvaje (CBF: salvaje = 22,39 ± 0,94 Hz, Katnal1 1H/1H = 14,25 ± 0,92 Hz, P = 0,0001; Figura 5a, Películas suplementarias S1). Esta reducción en la FBC en animales de Katnal1 1H/1H también se asoció con un aumento de la proporción de cilia con un patrón de latido anormal (discinesia ciliar) (proporción de cilia discinética: salvaje = 17%, Katnal1 1H/1H = 75%) (Figura 5b y Películas suplementarias S1). La inspección visual de los cilios identificó una serie de anomalías ciliares tales como una punta ciliar hinchada (Supplementary Movie S3) o cilios extremadamente largos (Supplementary Movie S4) diseminados por todo el campo de los cilios en los ventrículos de Katnal1 1H/1H. Estas anomalías se observaron en aproximadamente el 25% de las rebanadas cerebrales de Katnal1 1H/1H. Los cilios anormales siempre mostraron un patrón de latido discinético y una frecuencia de latido inferior. Para investigar más a fondo la morfología ciliar realizamos microscopía electrónica de escaneo sobre el revestimiento ependimal de los ventrículos laterales de ambos Katnal1 1H/1H (n = 3) y animales de tipo salvaje (n = 3; Figuras 5c y d). Las mediciones de Cilia no mostraron diferencias significativas en la longitud media de los cilias entre los genotipos (longitud media de los cilias: tipo salvaje = 6,22 ± 0,86 μm, Katnal1 1H/1H = 6,54 ± 0,94 Hz, P = 0,303). Sin embargo, en las muestras de Katnal1 1H/1H se observó la presencia de cilias largas y cortas (Figuras 5e y f; definidas como dos desviaciones estándar más largas o más cortas que la longitud media de los cilias) que no estaban presentes en las muestras de tipo salvaje. Además, la inspección de los cilias de Katnal1 1H/1H identificó anomalías ciliares incluyendo cilias bifurcadas (Figura 5g), torceduras anormales en los cilias (Figura 5h ) e inflamaciones a lo La microscopía electrónica de transmisión de cilios ependimales encontró que la alteración vesicular aggre- Katnal1 afecta a las funciones del SNC Los bancos y las puertas estaban presentes dentro de las inflamaciones ciliares descritas anteriormente (Figura 5j ). Aunque estas anormalidades estaban presentes en una pequeña proporción (o1%) de los cilios de Katnal1 1H/1H, estaban notablemente ausentes de los cilios de tipo salvaje. Las enzimas cortantes de microtúbulos desempeñan diversos papeles en el sistema nervioso. 1, 2 Sin embargo, en la actualidad la enzima cortante de microtúbulos Katnal1 está mal definida en el contexto del desarrollo y la función del SNC. Aquí presentamos un análisis fenotípico detallado de Katnal1 1H y mostramos que la mutación está asociada con cambios en los ritmos circadianos, el sueño y el comportamiento. Además, se demuestra que los defectos en la histopatología cerebral, la migración neuronal y la morfología neuronal subyacen a estos fenotipos. Finalmente, también se demuestra que Katnal1 1H causa una gama de defectos en los cilios móviles de las células ependimales ventriculares. Los datos que presentamos aquí son los primeros en asociar KATNAL1 con tales disfunciones con importantes implicaciones para los estudios de asociación clínica. La mutación Katnal1 1H fue identificada inicialmente con un déficit circadiano incluyendo un corto período de libre ejecución y un inicio avanzado de actividad. Sin embargo, experimentos ex vivo posteriores usando rebanadas de SCN de animales que transportaban el PER2:El gen del reportero de LUC no demostró defectos en los ritmos celulares del SCN, sugiriendo que el reloj circadiano central no fue afectado por la mutación. 25 Aquí se ha sugerido que los cambios en el funcionamiento de las ruedas observados son el resultado de defectos en las vías de salida del reloj circadiano SCN. Del mismo modo, en los ratones 1H/1H de Katnal1 se hipótesis que los defectos que demostramos en la anatomía neuronal y la morfología neuronal pueden alterar las señales de salida del NCG. Alternativamente, dado que varios neuropéptidos como la oxitocina se secretan de manera circadiana de células ependimales que recubren el tercer ventrículo del cerebro, 26 morfología ventricular alterada y función ciliar en ratones 1H/1H de Katnal1 pueden alterar la circulación de factores secretados por las células ependimales ventriculares ciliadas y contribuir a la alteración de los ritmos de comportamiento observados. En la actualidad los fenotipos descritos se limitan a la disfunción motora en ratones que carecen del gen Spg4 27 y agitan y rodean la cabeza en el mutante Fign. 7, 28, 29 En contraste, aquí demostramos que la pérdida de la función de Katnal1 está asociada con una serie de fenotipos conductuales, incluyendo cambios en la actividad circadiana, mal aprendizaje y memoria, hiperactividad en un entorno novedoso (campo abierto) y déficits en los USVs. En particular, los fenotipos de aprendizaje y memoria, ansiedad y vocalización repiten los síntomas clínicos de ID, aumento de la ansiedad en situaciones novedosas y retrasos en la adquisición del lenguaje reportados en pacientes humanos que portan microdeleciones que incorporan haploinsuficiencia de KATNAL1. 8, 9 Aunque también vale la pena señalar que los ratones mutantes pasan más tiempo en el centro del campo abierto que los tipos salvajes (implicando que los animales Katnal1 1H/1H muestran menor ansiedad), sugerimos que este resultado está confundido por la hiperactividad en entornos novedosos fenotipo que también describimos en ratones mutantes. Esta observación está respaldada por el hecho de que los animales mutantes mostraron mayor actividad en todas las regiones del campo abierto en lugar de sólo la periferia ansiolítica. Aquí también destacamos defectos en ratones Katnal1 1H/1H tales como migración neuronal comprometida y morfología que pueden sustentar tales fenotipos. En Drosophila, se ha demostrado que el homólogo de Katnal1 (kat-60L1) juega un papel crítico en la morfología neuronal durante el desarrollo, 30 sin embargo los datos que presentamos aquí son los primeros en demostrar un fenotipo similar en mamíferos y además sugieren cómo las perturbaciones sutiles a la función KATNAL1 pueden contribuir a condiciones neuronales y conductuales específicas.Por ejemplo, defectos en la migración neuronal, espinas sinápticas y morfología neuronal como los que hemos demostrado aquí, se han sugerido para sustentar la ID en condiciones como la lissencefalia, el síndrome de Down 18 31 y el síndrome de Rett.32 Aunque no estamos sugiriendo que Katnal1 sea causa de estas condiciones, se deben apreciar similitudes en síntomas y fenotipos neuronales entre estas condiciones y los relacionados con la disfunción Katnal1. Además, se ha asociado una mutación rara en KATNAL1 con esquizofrenia 10 (http://atgu.mgh.harvard.edu/~spurcell/gene book/genebook.cgi?user = guest&cmd = verb-gene&tbox = KATNAL1) y se ha demostrado que KATNAL1 interactúa con el gen de esquizofrenia asociado DISC1. 33 En línea con estas observaciones, observamos que se han reportado aumentos en el volumen ventricular y reducciones en las espinas sinápticas en pacientes esquizofrénicos 34, 35 y nuestros datos demuestran los mismos fenotipos en ratones Katnal1 1H/1H. Así, el rango de fenotipos asociados con defectos en la función de Katnal1 sugiere fuertemente que el gen debe ser considerado en la patología de trastornos como el ID y la esquizofrenia. Si bien los pacientes humanos fueron todos heterocigotos para la eliminación de Katnal1, no encontramos fenotipo en ratones mutantes heterocigotos (datos no mostrados) sugiriendo que si bien la haploinsuficiencia es causativa para los fenotipos en humanos, los ratones requieren pérdida completa de la función KATNAL1 para mostrar efectos similares. Una discrepancia similar entre humanos y ratones también se ha observado para el gen candidato a discapacidad intelectual CTNNB1. 17 Si bien la pérdida heterocigota de mutaciones funcionales en CTNNB1 son causales de discapacidad intelectual en humanos, los golpes condicionales para CTNNB1 no tienen fenotipos conductuales o craneofaciales reportados. 36, 37 Estas diferencias demuestran que, si bien los modelos de discapacidad intelectual del ratón son de gran utilidad en nuestra comprensión de los mecanismos causales que subyacen a la condición, todavía existen diferencias genéticas y neurodesarrollistas entre especies que también deben tenerse en cuenta. También observamos que si bien la mutación Katnal1 1H muestra una pérdida de la función catalítica tanto en las células HEK293 como en las células Sertoli, 23 esta pérdida de función no se ha verificado en las células neuronales. Sin embargo, dado que nuestros datos demuestran que la mutación Katnal1 1H se encuentra en un dominio catalítico esencial y que mostramos fenotipos neuronales en ratones Katnal1 1H/1H, esperamos ver la misma pérdida de la función catalítica en neuronas. Los datos que presentamos aquí también demuestran defectos en cilia motil en ratones Katnal1 1H/1H. Las alteraciones ciliarias en humanos (ciliopatías) incluyen el síndrome de Bardet-Biedl y Joubert. 38 Aunque actualmente hay datos limitados sobre los fenotipos conductuales de los modelos de ciliopatías en ratones, observamos que la disfunción ciliar en ratones se ha relacionado con el aprendizaje y la memoria 39 y los fenotipos de vocalización, 40 de los cuales fueron alterados en los ratones Katnal1 1H/1H descritos aquí. También es notable que la migración neuronal y los fenotipos del ventrículo agrandado que describimos en ratones Katnal1 1H/1H recapitulan características asociadas con mutaciones génicas conocidas de la ciliopatía. [42] [43] [44] [44] Además, en los modelos de ratón del síndrome de Bardet-Byedl se han descrito defectos ciliares como la reducción de la CBF 45 y defectos estructurales como alargamiento anormal e hinchazón a lo largo de su longitud 41, que son similares a los que se describen en los ratones Katnal1 1H/1H. Existen fuertes evidencias de que los genes asociados a la ciliopatía desempeñan una serie de funciones en el desarrollo neuronal al afectar procesos como la proliferación progenitora o el mantenimiento del andamio de la glia radial. 43 Sin embargo, también está claro que los defectos en la organización de microtúbulos también afectan a la estructura sináptica. 2 En la actualidad es difícil desenredar las contribuciones relativas de los defectos en el corte de microtúbulos y las anomalías ciliares a los fenotipos generales que observamos en los ratones Katnal1 1H/1 Sin embargo, es notable que si bien los defectos en la estructura cilia puede contribuir a los fenotipos que describimos en los ratones Katnal1 1H/1H, son mucho menos prominentes en los ratones Katnal1 1H/1H que en otros modelos de ciliopatía de ratón, 41 sugiriendo que el componente ciliar de la disfunción KATNAL1 puede ser leve en comparación con otras ciliapatías. Del mismo modo, se ha sugerido que la hidrocefalia es un componente de algunos modelos de ratón de ciliopatía, 46 ratones Katnal1 1H/1H mostraron sólo un aumento en el tamaño de los ventrículos en lugar de una mayor incidencia de hidrocefalia, sugiriendo además que los defectos ciliares en estos animales son leves en comparación con otras ciliapatías. En resumen, los datos presentados aquí demuestran claramente que KATNAL1 juega un papel importante en una variedad de procesos neuronales incluyendo El efecto posterior de estos defectos conduce a su vez a una serie de cambios de comportamiento, incluyendo en el aprendizaje y la memoria, reacción a situaciones ansiogénicas y ritmos circadianos. Estos datos destacan cómo las perturbaciones en KATNAL1 pueden jugar un papel en la disfunción neuronal y demuestran que la enzima es un candidato novedoso en el estudio de trastornos de comportamiento y neurodesarrollo.Los autores declaran no conflicto de intereses.

¿Qué mutación genética se asocia con el autismo?

Una mutación missense en Katnal1 subyace a anomalías conductuales, neurológicas y ciliareshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5761721/SHA: f4cebabd74b16e710fb41a737d8ef84b7d565d8dAutores: Banks, G; Lassi, G; Hoerder-Suabadissen, A; Tinarelli, F; Simon, M; Wilcox, A; Lau, P; Lawson, T N; Johnson, S; Rutman, A; Sweeting, M; Chesham, J E; Barnard, A; Horner, N; Westerberg, H; Smith, L B; Molnár, Z; Hastings, M H; Hirst, Aunque la separación de microtúbulos es fundamental para muchos procesos neurales dinámicos, poco se sabe sobre el papel del miembro de la familia Katanin p60 subunidad A-como 1, KATNAL1, en la función del sistema nervioso central (SNC). Estudios recientes que reportan que las microdeleciones que incorporan el locus KATNAL1 en humanos resultan en discapacidad intelectual y microcefalia sugieren que KATNAL1 puede jugar un papel prominente en el SNC; sin embargo, tales asociaciones carecen de los datos funcionales necesarios para resaltar los mecanismos potenciales que vinculan el gen con los síntomas de la enfermedad. Aquí identificamos y caracterizamos una línea de ratón que lleva una pérdida de función alelo en Katnal1. Demostramos que los mutantes expresan déficits de comportamiento incluyendo en ritmos circadianos, sueño, ansiedad y aprendizaje/memoria. Además, en el cerebro de ratones mutantes Katnal1 revelamos numerosas Además, se evidencian defectos en los cilios motiles de las células ependimales ventriculares de los mutantes, sugiriendo un papel para Katnal1 en el desarrollo de la función ciliar. Creemos que los datos que presentamos aquí son los primeros en asociar KATNAL1 con tales fenotipos, demostrando que la proteína juega papeles claves en una serie de procesos integrales al desarrollo de la función y el comportamiento neuronal. Texto: Las enzimas cortantes del microtúbulo son una familia de proteínas AAA-ATPasa que participan en procesos celulares fundamentales como la mitosis, la biogénesis ciliar y la motilidad del cono de crecimiento. 2 Además, las mutaciones en los genes de las enzimas cortantes de los microtúbulos SPG4, KATNB1 y KATNAL2 se asocian con la paraplejia espástica hereditaria, las malformaciones cerebrales y el autismo, respectivamente [3] [4] [5] [6] y las mutaciones en Fign causan una gama de fenotipos en ratones. 7 Actualmente la enzima cortante de los microtúbulos KATNAL1 está mal caracterizada y todavía no se entiende cómo funciona la enzima en el sistema nervioso. Evidencia reciente de la caracterización genética de pacientes humanos sugiere que la haploinsuficiencia de KATNAL1 está relacionada con una serie de síntomas, incluyendo discapacidad intelectual (ID) y dismorfologías craneofaciales. 8, 9 También es notable que una mutación KATNAL1 muy rara se ha asociado con esquizofrenia 10 (http://atgu.mgh.harvard.edu/~spurcell/genebook/gene book.cgi?user = guest&cmd = verb-gene&tbox = KATNAL1) y que el síndrome de Peters y el autismo se han asociado con la región cromosómica que contiene el locus KATNAL1. 11, 12 Aunque estos estudios de asociación sugieren fuertemente que KATNAL1 juega un papel fundamental en el sistema nervioso central (SNC), se requieren estudios adicionales utilizando modelos celulares o animales para entender cómo el gen puede ser causativo de enfermedad. Aquí presentamos el primer estudio que describe déficits neuronales y de comportamiento asociados con una pérdida de función allele de Katnal1 en el ratón. Esta línea de ratón mutante fue identificada de forma independiente en dos pantallas fenotipadoras paralelas, que demostraron que los ratones mutantes mostraban tanto esterilidad masculina como fenotipos circadianos. Investigaciones de comportamiento posteriores demostraron que esta mutación está asociada con ansiedad y déficits de memoria.Basándose en estos fenotipos de comportamiento, identificamos anomalías histopatológicas en el cerebro de los mutantes Katnal1 1H/1H, incluyendo capas celulares desordenadas en el hipocampo y corteza y ventrículos sustancialmente mayores. Investigaciones posteriores demostraron que los ratones Katnal1 1H/1H muestran migración neuronal y déficits de función ciliar que sugieren que KATNAL1 juega un papel esencial en estos procesos. Estos hallazgos son los primeros de nuestro conocimiento que muestran de manera concluyente que las mutaciones en Katnal1 conducen a trastornos de comportamiento y neuronales y proporcionan información sobre las asociaciones clínicas que han sido vinculadas al gen. Se realizó en cohortes de ratón parcialmente o completamente congénicas en el fondo C57BL/6 J. Se realizó el funcionamiento de rueda circadiana como se describió anteriormente. 14 Se realizó la evaluación del sueño mediante electroencefalografía y electromiografía La electroencefalografía y electromiografía como se describió anteriormente. 15 Alternancia espontánea conductual fenotipado. Se colocó a los ratones en un T-maze amurallado (cloruro de polivinilo negro, forrado con serrín; tronco = 88 × 13 cm; brazos = 32 × 13 cm) y se les permitió entrar en un brazo de meta de su elección. El ratón se confina en el brazo de meta durante 30 s, antes de que se les permitiera una segunda elección libre del brazo de meta. Se registró una alternancia si la segunda elección difería de la primera. Se realizó un ensayo por día durante 10 días Los ratones fueron colocados en una arena amurallada (cloruro de polivinilo gris; 45 × 45 cm) y se les permitió explorar durante 20 minutos. Los animales fueron monitorizados por el software de análisis XT de EthoVision (Noldus, Wageningen, Países Bajos). El seguimiento de vídeo en la jaula doméstica. La actividad en la jaula doméstica fue grabada por el seguimiento de vídeo como se describió anteriormente. 16 laberinto de agua Morris y vocalización ultrasónica. Estas pruebas se realizaron como se describió anteriormente. 17 histología cerebral e inmunofluorescencia Los cerebros fueron montados en OCT (VWR) y 12 μm secciones coronales tomadas. Las secciones fueron manchadas con hematoxilina y eosina, o inmunoetiquetadas siguiendo protocolos estándar. La evaluación de migración neuronal in vivo se realizó como se describió anteriormente 18 utilizando embriones en E13 o E15 (tres madres por grupo de La evaluación in vitro de la migración neuronal se realizó mediante un protocolo de migración de cámara Boyden descrito anteriormente. 19 Tomografía microcomputada La tomografía microcomputada se realizó mediante una Skyscan 1172 a 90 kV, 112 μA mediante un filtro de aluminio y cobre, un paso de rotación de 0,250 grados y un tamaño de píxel de 4,96 μm. La segmentación, el cálculo de volumen y el modelado 3D se realizaron mediante ITK-SNAP versión 3.0.0 (ref. 20) y 3DSlicer. 21 Tinción Golgi-Cox de neuronas La tinción neuronal Golgi-Cox se realizó mediante el kit FD Rapid GolgiStain (FD NeuroTechnologies, Columbia, MD, EE.UU.). Se diseccionaron los cerebros de los ratones P2 y se seccionó la mitad cerebral dorsal (250 μm) a través del suelo del ventrículo lateral y del tercer ventrículo utilizando un vibratomo. Se analizó la frecuencia y el patrón de latidos ciliares como se describió anteriormente. 22 Microscopía electrónica para escanear Microscopía electrónica El revestimiento ependimal del ventrículo lateral se fijó en 2,5% glutaraldehído, 2% paraformaldehído en tampón de fosfato de 0,1 M, incubado en tetróxido de ósmico al 2%, y deshidratado a través de soluciones de etanol. Las muestras se secaron en punto crítico utilizando un microscopio electrónico de barrido Emitech K850 (Quorum Technologies, East Sussex, UK), recubierto con platino utilizando un capa de sputter Quorom Q150R (Qu La microscopía electrónica de transmisión se realizó según lo descrito anteriormente. 22 Análisis estadístico Los datos fueron analizados utilizando la prueba T de estudiantes de dos colas o AVOVA utilizando SPSS (IBM) o GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, EE.UU.). El nivel de significancia para todos los análisis se estableció en Po 0.05. Todos los gráficos se presentan mostrando promedio ± s.m. Se pueden encontrar métodos adicionales y más detallados en información complementaria. Identificación y clonación de la mutación Katnal1 1H Para identificar mutaciones genéticas novedosas que afectan al comportamiento circadiano, realizamos una pantalla de rueda circadiana de pedigrees de ratones N-etil-N-nitrosourea mutagenizados. 13 En un pedigrí 17,65% de los animales mostró un corto período circadiano en constante oscuridad (o En las siguientes pantallas intercruzadas, el 15,5% de los animales fueron afectados (53 de los 342 animales examinados), lo que sugiere que el pedigrí lleva una mutación que causa un fenotipo circadiano recesivo que es un 60% penetrante. No encontramos sesgo de género en los animales afectados (proporción de los animales afectados: macho = 47,2%; hembra = 52,8%). Al mismo tiempo, se identificó un fenotipo de esterilidad masculina dentro del mismo pedigrí. 23 El análisis de la vinculación SNP a escala del genoma mapeó los fenotipos circadiano y esterilidad a la misma región en el cromosoma 5 y la secuenciación posterior identificó la mutación causal como una mutación de punto único T a G dentro del exón siete del gen Katnal1. Para más detalles sobre el mapeo e identificación de la mutación ver referencia 23. Este alelo mutante fue designado Katnal1 1H, y resulta en una sustitución de leucina a valina en el residuo 286 de la proteína. El análisis funcional in vitro demostró que la mutación es un alelo recesivo de pérdida de función. 23 Modelización 3D de la proteína sugiere que esta pérdida de función se debe a cambios hidrofóbicos en el dominio AAA de la enzima (Figura Suplementaria S1 ). Genotipado confirmó que la mutación fue homocigota en animales circadianos afectados y tipo salvaje o heterocigota en animales no afectados, confirmando que Katnal1 1H fue causa del fenotipo circadiano. Anomalías circadianas y del sueño en ratones Katnal1 1H/1H El fenotipo circadiano más extenso realizado en ratones Katnal1 homocigotos (Katnal1 1H/1H ) y en camadas de tipo salvaje (Katnal1 +/+ ) confirmó que los ratones Katnal1 1H/1H tuvieron un período circadiano de funcionamiento libre más corto (Figuras 1a-c) y además reveló que los animales Katnal1 1H/1H eran más activos en la fase de luz del ciclo luz/oscuro (Figura 1d ), mostraron una mayor anticipación de las transiciones de luz a oscuras y un mayor cambio en el inicio de actividad cuando fueron liberados de los ciclos luz/oscuro a la oscuridad constante (Figura 1e ). Los datos y detalles de la cohorte se dan en la Tabla Complementaria S Las grabaciones de bioluminiscencia realizadas con ratones reporteros de LUCIFERASE que llevaban la mutación Katnal1 1H revelaron que estos cambios circadianos no se debían a cambios en el reloj molecular central del núcleo suprachiasmático (el sitio del reloj circadiano maestro en el cerebro; Figura suplementaria S2 ). Las alteraciones circadianas a menudo se asocian con déficits en la homeostasis del sueño. Por lo tanto, para complementar nuestros estudios circadianos realizamos grabaciones electroencefalográficas inalámbricas durante un período basal de 24 h y después de un período de privación del sueño de 6 h. En la Tabla suplementaria S1 se da un resumen detallado del análisis electroencefalográfico. En comparación con los camarones salvajes, el poder delta no REM de los ratones Katnal1 1H/1H fue mayor en la fase oscura del sueño basal (ANOVA mixto, factores de interacción 'genotipo X time, F(1,88) = 8,91, P = 0,0175) (Figura 1f ) y en las fases claras y oscuras del sueño de recuperación (ANOVA mixto, factores de interacción 'genotipo X time', F(1,136) = 11,93, P = 0,0086; Figura 1g ). Todos los demás parámetros del sueño no se vieron afectados en los animales Katnal1 1H/1H. Los ratones Katnal1 1H/1H muestran un espectro de déficits de comportamiento Los pacientes humanos que llevan una deleción heterocigosa que incorpora el locus Katnal1 muestran una serie de déficits cognitivos, incluyendo ID y un retraso en la adquisición Por lo tanto, investigamos si estos déficits fueron modelados en ratones Katnal1 1H/1H sometiendo cohortes animales a una batería de pruebas de comportamiento. Los datos y detalles de cohortes se dan en la Tabla Complementaria S2. Tanto la memoria de trabajo como la memoria espacial fueron significativamente más pobres en ratones Katnal1 1H/1H, como lo evidencian las alternaciones espontáneas reducidas en un T-maze (Figura 2a ) y en el laberinto de agua Morris donde los mutantes tardan más tiempo en encontrar la plataforma en los ensayos de adquisición (Figura 2b En comparación con los animales de tipo salvaje, los animales Katnal1 1H/1H tienen un período más corto (c), son más activos en la fase de luz del ciclo de luz/oscuridad (d) y muestran un inicio más temprano de actividad en transiciones luz/oscuridad y En las grabaciones de EEG durante el sueño, los ratones Katnal1 1H/1H muestran un aumento de la potencia delta no REM en la fase oscura del ciclo de luz/oscuridad (f) y después de la privación del sueño (g). *P 0,05; **P 0,01; ***P 0,001. EEG, electroencefalografía; DD, oscuridad constante; LD, ciclo de luz/oscuridad. tipo = 164 ± 12 m, Katnal1 1H/1H = 243 ± 20 m, P = 0,02; distancia recorrida en la periferia del campo abierto: tipo salvaje = 4,3 ± 0,2 m, Katnal1 1H/1H = 6 ± 0,3 m, P = 0,004). Por el contrario, cuando se registró la actividad del ratón en la jaula doméstica, no se encontró diferencia entre los genotipos (distancia recorrida a lo largo de 24 h: tipo salvaje = 399 ± 77 m, Katnal1 1H/1H = 418 ± 41 m, P = 0,833) sugiriendo que las diferencias de actividad anteriores se debían al ambiente novedoso del campo abierto en lugar de la hiperactividad generalizada en animales Katnal1 1H/1H. Finalmente, en ciertas condiciones (como la separación materna) los ratones emiten vocalizaciones ultrasónicas (USVs). Para comprobar si los animales Katnal1 1H/1H vocalizaban de manera diferente a los tipos salvajes, separamos a los cachorros en los días postnatales 7-8 (la edad a la que los ratones muestran pico de emisión de USV 24 ) y registramos sus USVs. En estas pruebas, en comparación con los tipos salvajes, las crías de Katnal1 1H/1H produjeron menos (Figura 2g ) y más cortas (Figura 2h ) vocalizaciones, conteniendo menos frases (Figura 2i ). Anomalías morfológicas cerebrales brutas en ratones Katnal1 1H/1H Dado que observamos una serie de fenotipos de comportamiento en ratones Katnal1 1H/1H, realizamos análisis histológicos para determinar si las diferencias en la histología cerebral subyacen a estos comportamientos. Los datos y los detalles de la cohorte se dan en la Tabla Suplementaria S3. El análisis de las secciones cerebrales manchadas de hematoxilina y eosina reveló que, en comparación con los camadas de tipo salvaje, los animales de Katnal1 1H/1H tenían capas piramidales menos apretadas en el hipocampo (Fi Para confirmar estas diferencias en las capas corticales, se realizó inmunofluorescencia utilizando la (Figuras 3l y m). La cuantificación de la intensidad de fluorescencia demostró que en la corteza de Katnal1 1H/1H tanto la calbindina como el etiquetado CUX1 fueron más intensos más cerca de la superficie cortical, lo que es consistente con la reducción del tamaño de la capa 1 (análisis bidireccional de la varianza (ANOVA), factores de interacción 'geotipo X distancia de fluorescencia desde la superficie cortical', calbindina: F(75.988) = 16,8, P o 0,0005; CUX1: F(93.372 = 2,17, P = 0,001; Figuras 3h y k). Una cuantificación similar reveló que el etiquetado FOXP2 se extendió más a partir de la capa 6b (marcada por el CTGF) en la corteza de Katnal1 1H/1H, lo que es consistente con un aumento en el tamaño de la capa 6 (ANOVA de dos vías, factores de interacción 'genotipo X distancia de fluorescencia desde el etiquetado del CTGF:' F(93,372) = 1,32, P = 0,038; Figura 3n ). Finalmente, los modelos tridimensionales del sistema ventricular fueron construidos a partir de tomografías microcomputadas cerebrales (Figuras 3o y p). El análisis volumétrico reveló que los ratones Katnal1 1H/1H tenían ventrículos sustancialmente más grandes que los tipos salvajes (Figura 3q ). 18 Por lo tanto, se investigó si los ratones Katnal1 1H/1H mostraron migración neuronal anormal utilizando el etiquetado BrdU de embriones E13 y E15 y células etiquetadas cuantificadas en la corteza de crías P9 (descritas en la referencia 18). A ambas edades los animales Katnal1 1H/1H tenían un mayor número de neuronas etiquetadas en contenedores cercanos a la superficie cortical neuronas situadas más cerca de la superficie cortical que en el tipo salvaje. Para confirmar estos resultados se utilizó una cámara Boyden 19 y se realizó un análisis de migración neuronal in vitro en cultivos neuronales corticales primarios E13.5. Aquí se encontró que una mayor proporción de neuronas corticales Katnal1 1H/1H migró a la base del inserto de cultivo celular en comparación con controles de tipo salvaje (figura complementaria S3). Dado que tanto en el etiquetado BrdU como en las neuronas de ensayo de Boyden de los animales de Katnal1 1H/1H migró más allá de los de los camarones de tipo salvaje, estos resultados sugieren que las neuronas corticales de Katnal1 1H/1H muestran defectos en la terminación de la migración neuronal cortical. Dada su función en la organización citoesquelética, también se planteó la hipótesis de que la morfología neuronal es modulada por Katnal1. El análisis de las neuronas manchadas con golgi de las capas 2-3 de la corteza (Figuras 4g e i) demostró que, en comparación con los camarones de tipo salvaje, las neuronas de Katnal1 1H/1H tenían el soma más grande (Figura 4k) y los axones más cortos y delgados (Figuras 4l y m) (los datos y Además, el análisis a mayor aumento (Figuras 4h y j), demostró que el número de espinas sinápticas en las neuronas de Katnal1 1H/1H se redujo significativamente en comparación con el tipo salvaje (Figura 4n ). Estudios recientes han demostrado que las mutaciones en algunas enzimas cortantes de microtúbulos pueden causar defectos en los cilios. 5 Dado que tales defectos ciliares podrían subyacer a los fenotipos descritos anteriormente, estudiamos los cilios motiles del revestimiento ependimal del ventrículo lateral en secciones de cerebros de ratón postnatales del día 2 de Katnal1 1H/1H (n = 4) y animales de tipo salvaje (n = 3). Se encontró que la frecuencia de latido ciliar (CBF) de los animales de Katnal1 1H/1H fue significativamente atenuada en comparación con el tipo salvaje (CBF: salvaje = 22,39 ± 0,94 Hz, Katnal1 1H/1H = 14,25 ± 0,92 Hz, P = 0,0001; Figura 5a, Películas suplementarias S1). Esta reducción en la FBC en animales de Katnal1 1H/1H también se asoció con un aumento de la proporción de cilia con un patrón de latido anormal (discinesia ciliar) (proporción de cilia discinética: salvaje = 17%, Katnal1 1H/1H = 75%) (Figura 5b y Películas suplementarias S1). La inspección visual de los cilios identificó una serie de anomalías ciliares tales como una punta ciliar hinchada (Supplementary Movie S3) o cilios extremadamente largos (Supplementary Movie S4) diseminados por todo el campo de los cilios en los ventrículos de Katnal1 1H/1H. Estas anomalías se observaron en aproximadamente el 25% de las rebanadas cerebrales de Katnal1 1H/1H. Los cilios anormales siempre mostraron un patrón de latido discinético y una frecuencia de latido inferior. Para investigar más a fondo la morfología ciliar realizamos microscopía electrónica de escaneo sobre el revestimiento ependimal de los ventrículos laterales de ambos Katnal1 1H/1H (n = 3) y animales de tipo salvaje (n = 3; Figuras 5c y d). Las mediciones de Cilia no mostraron diferencias significativas en la longitud media de los cilias entre los genotipos (longitud media de los cilias: tipo salvaje = 6,22 ± 0,86 μm, Katnal1 1H/1H = 6,54 ± 0,94 Hz, P = 0,303). Sin embargo, en las muestras de Katnal1 1H/1H se observó la presencia de cilias largas y cortas (Figuras 5e y f; definidas como dos desviaciones estándar más largas o más cortas que la longitud media de los cilias) que no estaban presentes en las muestras de tipo salvaje. Además, la inspección de los cilias de Katnal1 1H/1H identificó anomalías ciliares incluyendo cilias bifurcadas (Figura 5g), torceduras anormales en los cilias (Figura 5h ) e inflamaciones a lo La microscopía electrónica de transmisión de cilios ependimales encontró que la alteración vesicular aggre- Katnal1 afecta a las funciones del SNC Los bancos y las puertas estaban presentes dentro de las inflamaciones ciliares descritas anteriormente (Figura 5j ). Aunque estas anormalidades estaban presentes en una pequeña proporción (o1%) de los cilios de Katnal1 1H/1H, estaban notablemente ausentes de los cilios de tipo salvaje. Las enzimas cortantes de microtúbulos desempeñan diversos papeles en el sistema nervioso. 1, 2 Sin embargo, en la actualidad la enzima cortante de microtúbulos Katnal1 está mal definida en el contexto del desarrollo y la función del SNC. Aquí presentamos un análisis fenotípico detallado de Katnal1 1H y mostramos que la mutación está asociada con cambios en los ritmos circadianos, el sueño y el comportamiento. Además, se demuestra que los defectos en la histopatología cerebral, la migración neuronal y la morfología neuronal subyacen a estos fenotipos. Finalmente, también se demuestra que Katnal1 1H causa una gama de defectos en los cilios móviles de las células ependimales ventriculares. Los datos que presentamos aquí son los primeros en asociar KATNAL1 con tales disfunciones con importantes implicaciones para los estudios de asociación clínica. La mutación Katnal1 1H fue identificada inicialmente con un déficit circadiano incluyendo un corto período de libre ejecución y un inicio avanzado de actividad. Sin embargo, experimentos ex vivo posteriores usando rebanadas de SCN de animales que transportaban el PER2:El gen del reportero de LUC no demostró defectos en los ritmos celulares del SCN, sugiriendo que el reloj circadiano central no fue afectado por la mutación. 25 Aquí se ha sugerido que los cambios en el funcionamiento de las ruedas observados son el resultado de defectos en las vías de salida del reloj circadiano SCN. Del mismo modo, en los ratones 1H/1H de Katnal1 se hipótesis que los defectos que demostramos en la anatomía neuronal y la morfología neuronal pueden alterar las señales de salida del NCG. Alternativamente, dado que varios neuropéptidos como la oxitocina se secretan de manera circadiana de células ependimales que recubren el tercer ventrículo del cerebro, 26 morfología ventricular alterada y función ciliar en ratones 1H/1H de Katnal1 pueden alterar la circulación de factores secretados por las células ependimales ventriculares ciliadas y contribuir a la alteración de los ritmos de comportamiento observados. En la actualidad los fenotipos descritos se limitan a la disfunción motora en ratones que carecen del gen Spg4 27 y agitan y rodean la cabeza en el mutante Fign. 7, 28, 29 En contraste, aquí demostramos que la pérdida de la función de Katnal1 está asociada con una serie de fenotipos conductuales, incluyendo cambios en la actividad circadiana, mal aprendizaje y memoria, hiperactividad en un entorno novedoso (campo abierto) y déficits en los USVs. En particular, los fenotipos de aprendizaje y memoria, ansiedad y vocalización repiten los síntomas clínicos de ID, aumento de la ansiedad en situaciones novedosas y retrasos en la adquisición del lenguaje reportados en pacientes humanos que portan microdeleciones que incorporan haploinsuficiencia de KATNAL1. 8, 9 Aunque también vale la pena señalar que los ratones mutantes pasan más tiempo en el centro del campo abierto que los tipos salvajes (implicando que los animales Katnal1 1H/1H muestran menor ansiedad), sugerimos que este resultado está confundido por la hiperactividad en entornos novedosos fenotipo que también describimos en ratones mutantes. Esta observación está respaldada por el hecho de que los animales mutantes mostraron mayor actividad en todas las regiones del campo abierto en lugar de sólo la periferia ansiolítica. Aquí también destacamos defectos en ratones Katnal1 1H/1H tales como migración neuronal comprometida y morfología que pueden sustentar tales fenotipos. En Drosophila, se ha demostrado que el homólogo de Katnal1 (kat-60L1) juega un papel crítico en la morfología neuronal durante el desarrollo, 30 sin embargo los datos que presentamos aquí son los primeros en demostrar un fenotipo similar en mamíferos y además sugieren cómo las perturbaciones sutiles a la función KATNAL1 pueden contribuir a condiciones neuronales y conductuales específicas.Por ejemplo, defectos en la migración neuronal, espinas sinápticas y morfología neuronal como los que hemos demostrado aquí, se han sugerido para sustentar la ID en condiciones como la lissencefalia, el síndrome de Down 18 31 y el síndrome de Rett.32 Aunque no estamos sugiriendo que Katnal1 sea causa de estas condiciones, se deben apreciar similitudes en síntomas y fenotipos neuronales entre estas condiciones y los relacionados con la disfunción Katnal1. Además, se ha asociado una mutación rara en KATNAL1 con esquizofrenia 10 (http://atgu.mgh.harvard.edu/~spurcell/gene book/genebook.cgi?user = guest&cmd = verb-gene&tbox = KATNAL1) y se ha demostrado que KATNAL1 interactúa con el gen de esquizofrenia asociado DISC1. 33 En línea con estas observaciones, observamos que se han reportado aumentos en el volumen ventricular y reducciones en las espinas sinápticas en pacientes esquizofrénicos 34, 35 y nuestros datos demuestran los mismos fenotipos en ratones Katnal1 1H/1H. Así, el rango de fenotipos asociados con defectos en la función de Katnal1 sugiere fuertemente que el gen debe ser considerado en la patología de trastornos como el ID y la esquizofrenia. Si bien los pacientes humanos fueron todos heterocigotos para la eliminación de Katnal1, no encontramos fenotipo en ratones mutantes heterocigotos (datos no mostrados) sugiriendo que si bien la haploinsuficiencia es causativa para los fenotipos en humanos, los ratones requieren pérdida completa de la función KATNAL1 para mostrar efectos similares. Una discrepancia similar entre humanos y ratones también se ha observado para el gen candidato a discapacidad intelectual CTNNB1. 17 Si bien la pérdida heterocigota de mutaciones funcionales en CTNNB1 son causa de discapacidad intelectual en humanos, los golpes condicionales para CTNNB1 no tienen fenotipos conductuales o craneofaciales reportados. 36, 37 Estas diferencias demuestran que, si bien los modelos de discapacidad intelectual del ratón son de gran utilidad en nuestra comprensión de los mecanismos causales que subyacen a la condición, todavía existen diferencias genéticas y neurodesarrollistas entre especies que también deben tenerse en cuenta. También observamos que si bien la mutación Katnal1 1H muestra una pérdida de la función catalítica tanto en las células HEK293 como en las células Sertoli, 23 esta pérdida de función no se ha verificado en las células neuronales. Sin embargo, dado que nuestros datos demuestran que la mutación Katnal1 1H se encuentra en un dominio catalítico esencial y que mostramos fenotipos neuronales en ratones Katnal1 1H/1H, esperamos ver la misma pérdida de la función catalítica en neuronas. Los datos que presentamos aquí también demuestran defectos en cilia motil en ratones Katnal1 1H/1H. Las alteraciones ciliarias en humanos (ciliopatías) incluyen el síndrome de Bardet-Biedl y Joubert. 38 Aunque actualmente hay datos limitados sobre los fenotipos conductuales de los modelos de ciliopatías en ratones, observamos que la disfunción ciliar en ratones se ha relacionado con el aprendizaje y la memoria 39 y los fenotipos de vocalización, 40 de los cuales fueron alterados en los ratones Katnal1 1H/1H descritos aquí. También es notable que la migración neuronal y los fenotipos del ventrículo agrandado que describimos en ratones Katnal1 1H/1H recapitulan características asociadas con mutaciones génicas conocidas de la ciliopatía. [42] [43] [44] [44] Además, en los modelos de ratón del síndrome de Bardet-Byedl se han descrito defectos ciliares como la reducción de la CBF 45 y defectos estructurales como alargamiento anormal e hinchazón a lo largo de su longitud 41, que son similares a los que se describen en los ratones Katnal1 1H/1H. Existen fuertes evidencias de que los genes asociados a la ciliopatía desempeñan una serie de funciones en el desarrollo neuronal al afectar procesos como la proliferación progenitora o el mantenimiento del andamio de la glia radial. 43 Sin embargo, también está claro que los defectos en la organización de microtúbulos también afectan a la estructura sináptica. 2 En la actualidad es difícil desenredar las contribuciones relativas de los defectos en el corte de microtúbulos y las anomalías ciliares a los fenotipos generales que observamos en los ratones Katnal1 1H/1 Sin embargo, es notable que si bien los defectos en la estructura cilia puede contribuir a los fenotipos que describimos en los ratones Katnal1 1H/1H, son mucho menos prominentes en los ratones Katnal1 1H/1H que en otros modelos de ciliopatía de ratón, 41 sugiriendo que el componente ciliar de la disfunción KATNAL1 puede ser leve en comparación con otras ciliapatías. Del mismo modo, se ha sugerido que la hidrocefalia es un componente de algunos modelos de ratón de ciliopatía, 46 ratones Katnal1 1H/1H mostraron sólo un aumento del tamaño de los ventrículos en lugar de una mayor incidencia de hidrocefalia, sugiriendo además que los defectos ciliares en estos animales son leves en comparación con otras ciliapatías. El efecto posterior de estos defectos conduce a su vez a una serie de cambios de comportamiento, incluyendo en el aprendizaje y la memoria, reacción a situaciones ansiogénicas y ritmos circadianos. Estos datos destacan cómo las perturbaciones en KATNAL1 pueden jugar un papel en la disfunción neuronal y demuestran que la enzima es un candidato novedoso en el estudio de trastornos de comportamiento y neurodesarrollo.Los autores declaran no conflicto de intereses.

¿Qué órgano está más asociado con el gen KATNAL1?

El cribado de fármacos aprobados por la FDA para inhibidores de la infección por el virus de la encefalitis japonesahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5640845/SHA: 1bd2f6497996fc0fccd8dffd7f848446d3d36f964Autores: Wang, Shaobo; Liu, Yang; Guo, Jiao; Wang, Peilin; Zhang, Leike; Xiao, Gengfu; Wang, WeiFecha: 2017-10-13DOI: 10.1128/jvi.01055-17Licencia: cc-byResumen: virus de la encefalitis japonesa (JEV), un flavivirus transmitido por artrópodos, es una de las principales causas de la encefalitis viral aguda en No se dispone de ningún medicamento aprobado para el tratamiento específico de las infecciones por JEV, y las vacunas disponibles no son eficaces contra todos los aislados clínicos de JEV. En el estudio descrito aquí, se realizó una revisión de alto rendimiento de una biblioteca de medicamentos aprobada por la FDA para inhibidores del JEV. Se identificaron cinco fármacos afectados que inhibieron la infección por JEV con un índice selectivo de >10. También se validaron las actividades antivirales de estos cinco fármacos afectados contra otros flavivirus, incluido el virus Zika. El análisis de mutantes adaptativos reveló que la sustitución de Q130, ubicada en el dominio transmembrana 3 de la proteína NS4B no estructural, que se conserva relativamente en flavivirus, con la resistencia de JEV conferida a la manidipina R o K, un inhibidor del canal Ca(2+) activado por voltaje (VGCC), sin una pérdida aparente del perfil de crecimiento viral. Además, se indicó que manidipina protegía a ratones contra la letalidad inducida por JEV disminuyendo la carga viral en el cerebro, mientras que abrogaba los cambios histopatológicos asociados a la infección por JEV. Este estudio proporciona cinco candidatos a antiflavivirus e identifica el calcio citoplasmático como un nuevo objetivo antiviral para el tratamiento de la infección por JEV. Los hallazgos reportados aquí proporcionan posibilidades terapéuticas para combatir infecciones causadas por flavivirus. La reutilización de fármacos aprobados aceleraría el desarrollo de una estratagema terapéutica. En este estudio, examinamos una biblioteca de fármacos aprobados por la FDA e identificamos cinco fármacos afectados, especialmente inhibidores del calcio, que ejercen actividad antiflavivirus que bloquea la replicación viral. La eficacia in vivo y la toxicidad de manidipina fueron investigados con un modelo de ratón de infección por JEV, y el objetivo viral fue identificado generando un mutante adaptativo. Texto: Los lavivirus F están clasificados taxonómicamente en el género Flavivirus y la familia Flaviviridae. Estos virus comprenden más de 70 patógenos diferentes, como el virus japonés de la encefalitis (JEV), el virus Zika (ZIKV), el virus del dengue (DEV), el virus del Nilo Occidental (WNVW), y el virus de la fiebre amarilla (YFV). La mayoría de los flavivirus El desarrollo y uso de vacunas contra algunos flavivirus, como el JEV, el YFV y el virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (TBEV), han disminuido las tasas de morbilidad y mortalidad por infecciones causadas por estos virus (2) ; sin embargo, las enfermedades inducidas por flavivirus siguen siendo pandémicas, y hay pocas terapias disponibles además de los cuidados intensivos de apoyo. Los flavivirus tienen un genoma de ARN de aproximadamente 11 kb de cadena positiva que contiene un único marco de lectura abierto (ORF) flanqueado por regiones no traducidas (UTR) en ambos termini. El ORF codifica tres proteínas estructurales, incluyendo el capsid (C), membrana (premembrana [prM] y membrana [M]), y envoltorio (E) y siete proteínas no estructurales (NS1, NS2A, NS2 Estas siete proteínas no estructurales participan en la replicación viral, el ensamblaje del virión y el escape del virus de la vigilancia inmune. Hasta la fecha, no hay antivirales específicos con actividad contra los flavivirus. Para ello, realizamos una pantalla de una biblioteca de 1.018 medicamentos aprobados por la FDA. Dado que los flavivirus son similares en estructura y patogénesis, primero utilizamos el JEV como prototipo para examinar la biblioteca de medicamentos y posteriormente validamos las actividades antivirales con ZIKV, WNV y DENV tipo 2 (DEV-2). Los fármacos afectados identificados en este estudio ofrecen nuevas terapias potenciales para el tratamiento de la infección y enfermedad por flavivirus. Para seleccionar inhibidores se utilizaron partículas virales recombinantes (RVP) con el replicon notificado por luciferasa envuelto por las proteínas estructurales del JEV, con un enfoque en aquellos que inhiben la entrada y replicación del virus, mediante un ensayo de detección de alto rendimiento (HTS) (4, 5). Se determinó que el número de copias de RVP de ARN genómico era de 8,4 10 6 copias/ml utilizando una curva estándar generada con plásmidos que transportaban el clon infeccioso. Las condiciones de ensayo del HTS, incluyendo la densidad celular de siembra y la dosis de RVP, fueron optimizadas para ser 10.000 células por placa de 96 pocillos y 20 l (16 copias/célula) RVP para la dosis infecciosa, respectivamente. En las condiciones optimizadas, la relación señal-basal (S/B), el coeficiente de variación (CV) y el factor Z= fueron 38.374, 2,8% y 0.89, respectivamente, lo que demostró que el ensayo era robusto y adecuado para el cribado a gran escala de compuestos. Se seleccionó un esquema del ensayo HTS en la Fig. 1B. Después de tres rondas de cribado, cinco hits con un índice selectivo (SI; que es igual a la concentración citotóxica del 50% [CC 50 [ concentración inhibitoria del 50% [IC 50 ]]) de 10. Los valores CC 50 de los fármacos afectados exhibidos en la Fig. 1B fueron similares a los publicados anteriormente para diversos sistemas celulares pero determinados utilizando diferentes ensayos de toxicidad (6) (7) (8) (9) (10) (12) (13) (13). Tres de los fármacos afectados, manidipino, cilnidipino y hidrocloruro de benidipina, fueron antagonistas del canal Ca 2 (VGCC) activados por dihidropiridina, mientras que el pimecrolimus es un inhibidor de la secreción inflamatoria de citoquinas y el mesilato de nelfinavir es un bloqueador de proteasa VIH-1. Todos los cinco fármacos afectados mostraron una inhibición dosis-dependiente de la infección por JEV RVP (Fig. 1C). Para validar el efecto antiviral, los fármacos afectados fueron comprados de otras fuentes comerciales y probados. En la pantalla de reconfirmación, todos los fármacos afectados mostraron efectos antivirales y citotóxicos similares a los encontrados en la pantalla primaria. Validación de los fármacos afectados. Para verificar los resultados obtenidos por los ensayos del reportero de luciferasa, también investigamos Como se esperaba del ensayo HTS, los cinco fármacos inhibieron robustamente la producción de virus, con una reducción de aproximadamente 4 a 5 unidades log en la concentración más alta y una disminución de aproximadamente 1 log-unidad con 2,5 M los fármacos (Fig. 2B). También se detectó una fuerte disminución de los niveles de ARN JEV (Fig. 2C). Los niveles de ARN atenuados en los grupos de dosis altas, dosis media y dosis bajas fueron todos superiores al 40%. En particular, en el grupo tratado con manidipina, el efecto inhibitorio fue al menos del 80% en comparación con el control, que mostró una fuerte inhibición de la replicación viral. Coherente con la inhibición de la replicación y producción del virus, la expresión de la proteína estructural viral prM fue apenas detectable después del tratamiento con los fármacos en la concentración alta (Fig. 2D) 2 confirmó que los cinco fármacos afectados inhibieron in vitro la infección por JEV de forma dosis-dependiente. Los fármacos inhiben la infección por JEV durante la síntesis del ARN viral. Debido a que los RVP, que tienen un sobre natural similar al virus en el exterior y un replicon en el interior, permitieron la cuantificación de la entrada y replicación productiva del JEV, se realizó un experimento de tiempo de adición para investigar si los fármacos afectados bloquearon el paso de entrada o el paso de replicación. Como se muestra en la Fig. 3B, no se observó supresión de la actividad de luciferasa por cualquiera de los fármacos afectados cuando se utilizaron como tratamientos antes de la infección o durante la infección o como virúcida, sugiriendo que estos fármacos no inhiben la infección por JEV ya sea inactivando el virus directamente o bloqueando la entrada del JEV. Sin embargo, estos Para confirmar esta sugerencia, se investigaron los efectos inhibidores de estos fármacos en el JEV replicon. La concentración más alta de manidipino y mesilato de nelfinavir en las células de hámster bebé (BHK-21) se ajustó a 5 M y 10 M, respectivamente. Se demostró que los cinco fármacos inhiben la síntesis del ARN del JEV de manera dependiente de la dosis, mientras que ninguno de ellos inhibió la traducción inicial del ARN del réplico (5, 14) (Fig. 3C), confirmando que estos fármacos inhibieron la infección del JEV en la etapa de replicación. Los fármacos hit exhiben actividad antiflavivirus de amplio espectro. Para determinar si la actividad antiviral de los cinco fármacos afectados se extendió a otros flavivirus, exploramos su efecto antiviral contra ZIKV. Similar a los hallazgos para JEV, el título de ZIKV fue disminuido por unidades de registro múltiples cuando ZIKV fue tratado con una alta concentración de cada uno de los fármacos (Fig. 4A). Además, ZIKV mostró una mayor sensibilidad a los dos inhibidores de canales de calcio manidipina y cilnidipina que JEV, sin que se observe formación de placa a 10 M. De acuerdo con este resultado, se detectaron también disminuciones bruscas en el nivel de replicación del ARN de ZIKV y el nivel de expresión de proteína viral (Fig. 4A). Cabe destacar que el tratamiento con 5 M manidipina produjo una inhibición del 95% de la replicación viral, traducción y rendimientos virales. Tomados juntos, estos resultados indican que los fármacos afectados podrían efectivamente inhibir la infección por ZIKV. Dado que estos fármacos exhibieron sus efectos anti-JEV en la etapa de replicación viral, se probaron además los efectos contra WNV y DENV-2 mediante el uso de los replicadores WNV y DENV-2. Al igual que los resultados para JEV, se observó una reducción dosis-dependiente en el nivel de replicación de WNV con los tratamientos farmacológicos. El mismo fenotipo se observó para DENV-2 para todos los fármacos excepto mesilato de nelfinavir, que no mostró ningún efecto en las concentraciones probadas (fig. 4B y C). Juntos, estos resultados indican que los cinco fármacos afectados son excelentes candidatos para el tratamiento antiflavivirus de amplio espectro. Efecto antiviral de inhibidores del calcio. Ya que tres fármacos afectados, manidipina, cilnidipina e hidrocloruro de benidipina, eran inhibidores de DHP VGC Verapamil, un prototipo de inhibidor de fenilalquilamina (PAA) VGCC (15), mostró una inhibición dosis-dependiente del JEV tanto en el riñón de mono verde africano (Vero) como en las células de carcinoma hepatocelular humano (Huh-7) (Fig. 5), lo que fue consistente con los efectos inhibitorios de los inhibidores del DHP, sugiriendo que los canales de calcio juegan un papel importante en la infección por JEV. También se encontró que la ciclosporina y el borato de 2-aminobifenilo (2-APB), que inhiben el eflujo de Ca 2 del grupo mitocondrial y endoplasmático (ER), respectivamente (16) (17) (18) (19), bloquean eficazmente la infección por JEV. Del mismo modo, el tratamiento con el quelante celular Ca 2 1,2-bis-(o-aminofenoxi)-etano-N,N,N=,N=-tetraacético, ester tetraacetoximetilo (BAPTA-AM), también podría suprimir la infección por JEV. Tomado en conjunto, se concluyó que el Ca 2 intracelular es esencial para la infección por JEV y el calcio citoplasmático es un objetivo potente para el tratamiento con antiflavivirus. Selección y caracterización del JEV resistente a manidipina. Para identificar el objetivo viral del inhibidor del canal de calcio, se seleccionó un virus resistente a manidipino por transpiración serial del JEV en presencia de manidipina. Los virus del pasaje 20 (P20) mostraron resistencia robusta en comparación con el tipo salvaje (WT) (Fig. 6A ). Cuando el JEV de P20 fue tratado con 5 M o 10 M manidipina, el título viral fue aproximadamente 10 y 100 veces más alto que el del WT, respectivamente. Los clones individuales del virus fueron aislados, y dos aislados fueron seleccionados aleatoriamente y amplificados. Se observó una sustitución de aminoácidos en dos clones aislados, resultando en un cambio de glutamina (Q) a a arginina (R) en la posición de aminoácido 130 en el dominio transmembrana 3 (TMD3) de NS4B, es decir, la posición 2401 de la poliproteína traducida en el clon cDNA infeccioso JEV (Fig. 6B ). La alineación secuencial de NS4B indicó que el Q130 fue conservado en todos los flavivirus excepto YFV, que poseía una lisina en esa posición (Fig. 6B ). El Q130 conservado de NS4B puede explicar la sensibilidad de JEV, ZIKV, WNV y DENV-2 a manidipina, como se describe anteriormente (Fig. 4), mientras que el YFV mostró resistencia al fármaco (datos no mostrados). Para confirmar que la mutación Q130R confirió resistencia a manidipina e investigar el papel del Q130 en la función NS4B, produjimos clones de JEV con la mutación Q130R, Q130K, Q130E o Q130A introduciendo las mutaciones deseadas en el clon de ADNc infeccioso y rescatando los virus mutantes. Para investigar las propiedades biológicas de los virus mutantes, primero examinamos la cinética de crecimiento de los virus rescatados. Como se muestra en la Fig. 6C, todos los virus mutantes tuvieron una acumulación de viriones infecciosas y alcanzaron el título La infección de los virus mutantes Q130R y Q130K resultó en curvas de crecimiento similares a la curva de crecimiento para el WT (Fig. 6C), mientras que los mutantes Q130E y Q130A produjeron cantidades menores de virus entre 24 y 60 h. El análisis de la morfología de la placa reveló que las placas de los mutantes Q130R, Q130K y Q130E eran similares a las placas del WT, mientras que las placas del mutante Q130A eran menores que las del WT. A continuación se investigó la sensibilidad de los cuatro virus mutantes a manidipino. Como se muestra en la figura 6D, los virus mutantes Q130R y Q130K eran resistentes a manidipino. En una concentración de 10 M, la manidipina inhibió eficientemente la infección WT JEV y redujo los rendimientos virales en aproximadamente 4 unidades log, mientras que los virus mutantes Q130R y Q130K fueron resistentes a la manidipina y el título viral disminuyó menos de 2 unidades log.El virus mutante Q130A demostró resistencia moderada y un poco más alto Tomado juntos, se pudo concluir que Q130 no sólo es crítico para conferir sensibilidad a la manidipina sino que también es importante para la replicación del JEV. El reemplazo de glutamina por aminoácidos básicos confirió resistencia a la manidipina sin una aparente pérdida de crecimiento. Eficacia in vivo de la manidipina. Como manidipina mostró las actividades inhibidoras más fuertes en la replicación del JEV, así como la infección por ZIKV cuando sus actividades se compararon con las de los cinco fármacos afectados ( 2 y 4A), examinamos además el efecto protector de la manidipina frente a la letalidad inducida por el JEV en un modelo de ratón. Como era de prever, los ratones del grupo tratado con el JEV comenzaron a mostrar síntomas, incluyendo parálisis en las extremidades, restricción de movimiento, piloerección, rigidez corporal y temblor en todo el cuerpo, a partir del día 5 postinfección. En los 21 días posteriores a la infección, la mayoría de los ratones del grupo infectado por el JEV sucumbieron a la infección, con una tasa de mortalidad del 73% (4 de 15 animales sobrevivieron). El tratamiento con manidipina tras la infección por el JEV redujo la tasa de mortalidad al 20% (12 de 15 animales sobrevivieron) (Fig. 7A ). Los ratones tratados con manidipina solos o tratados con manidipina e infectados con JEV mostraron poco comportamiento anormal, similar a los Para relacionar aún más estos efectos protectores con la carga viral y los cambios histopatológicos en el cerebro del ratón, se determinó el título viral y se recogieron y analizaron las secciones cerebrales del ratón en el día 5 y el día 21 postinfección, ya que los ratones comenzaron a mostrar síntomas de infección por JEV desde el día 5 postinfección y la mayoría de los ratones sobrevivientes se habían recuperado en el día 21. Los resultados indicaron que, durante la progresión de la enfermedad, el tratamiento con manidipina redujo significativamente la carga viral en ratones infectados en comparación con la de ratones infectados que no recibían tratamiento, mientras que no se formaron placas ni en el grupo tratado con manidipino ni en el vehículo, y las cargas virales fueron indetectables en cada grupo el día 21 postinfección (fig. 7B). Como el JEV fue rápidamente eliminado de la sangre después de la inoculación y estuvo presente en el sistema linfático durante la fase preclínica, los efectos de la manidipina sobre la infección del suero y el bazo fueron evaluados en momentos anteriores para detectar si el fármaco redujo las cargas virales periféricas (20, 21). Como se muestra en la figura 7C, la manidipina tuvo poco efecto sobre la infección periférica del JEV, lo que indica que la manidipina protegió a los ratones contra la letalidad inducida por el JEV al disminuir la carga viral en el cerebro. Del mismo modo, se observó un daño aparente en el cerebro, incluyendo meningitis, manguitos perivasculares, degeneración vacuolar y nódulos gliales en el grupo infectado y tratado con JEV el día 5 de postinfección, mientras que el tratamiento con manidipina aliviaba notablemente estos Estos resultados indican que el alivio de los cambios histopatológicos fue acompañado por una reducción de la carga viral, así como una reducción en la tasa de mortalidad, confirmando aún más los efectos curativos de la manidipina sobre la encefalitis viral. Entre los cinco fármacos afectados, manidipina, cilnidipina e hidrocloruro de benidipina fueron inhibidores del VGCC. Ha sido bien documentado en la literatura que los inhibidores de Ca 2 sirven para inhibir la infección viral en la etapa de entrada (15, 22) o replicación (18) e incluso en la etapa de brote (23). Con este fin, primero revisamos los 21 inhibidores del calcio incluidos en la actual biblioteca de fármacos aprobados por la FDA y encontramos que, además de los cuatro inhibidores del DHP VGCC enumerados en la Fig. El 1B, otros dos inhibidores de calcio, es decir, dihidrocloruro de flunarizina y clorhidrato de lomerizina, también fueron identificados como candidatos primarios con niveles de inhibición de 90%. Del mismo modo, tres antagonistas de los canales de calcio, nisoldipino, felodipino y clorhidrato de nicardipina, mostraron niveles de inhibición de 75%, 72% y 66%, respectivamente, en la pantalla primaria. Juntos, 9 de los 21 inhibidores de calcio de la biblioteca, que representan casi la mitad de los inhibidores de calcio, mostraron niveles de inhibición de flavivirus superiores al 50%, lo que sugiere que el calcio, especialmente el canal de calcio, es un potencial objetivo antiviral. Para abordar este, se investigó otro tipo de inhibidor del VGCC, verapamilo, un fármaco aprobado por la FDA que aún no se incluye en la biblioteca de medicamentos utilizada en este Del mismo modo, un quelante Ca 2, BAPTA-AM, así como los inhibidores Ca 2 2-APB y ciclosporina, dirigidos a la ER y el canal mitocondrial Ca 2, respectivamente, fueron empleados para investigar la respuesta de la infección por JEV a la disminución de los niveles intracelulares de Ca 2. En línea con las actividades de los tres fármacos inhibidores DHP VGCC golpeados, los inhibidores adicionales Ca 2 ejercieron actividad anti-JEV, lo que indicó que Ca 2 es indispensable para la infección por JEV. Así, los inhibidores Ca 2 podrían ser utilizados como tratamientos eficaces para la infección por flavivirus. Como los fármacos afectados ejercieron actividad inhibitoria completa cuando fueron añadidos al tratamiento, creemos que Ca 2 es importante para la replicación del genoma del flavivirus. Además, la selección y el análisis genético de NS4B es parte del complejo de replicación viral y se supone que ancla la replicasa viral a la membrana ER (24). Mientras tanto, el dominio N-terminal 125aminoácido de DENV NS4B fue indicado como responsable de la inhibición de la respuesta inmune (25). En particular, varios compuestos estructuralmente distintos han sido identificados para inhibir la replicación de flavivirus al dirigir intensivamente la TMD de NS4B (26) (27) (28) (29) (30) (31) (32). Es así concebible que los inhibidores que se dirigen a la TMD de NS4B perturben su función, lo que conduce a la supresión de la replicación de ARN viral. En este estudio, la sustitución de Q130 de NS4B por un aminoácido básico confirió el efecto de resistencia sin suprimir la replicación del JEV, sugiriendo que la posición 130 podría tolerar un aminoácido básico y que el aminoácido básico podría estar involucrado en la interacción del NS4B con proteínas huésped en lugar de proteínas virales. Además, la eficacia y toxicidad de manidipina fueron monitoreadas in vivo, con manidipina demostrando una actividad antiviral efectiva con biocompatibilidad favorable. Sin embargo, la dosis utilizada en este estudio fue mayor que la dosis típicamente utilizada clínicamente, representando uno de los escenarios más comúnmente encontrados en la repurposición de fármacos (33, 34). Como manidipina fue aprobada para el tratamiento a largo plazo de la hipertensión (35, 36), el tratamiento de dosis de pulso con manidipina durante el período más corto requerido para el tratamiento de la infección viral podría ser relativamente Además, el uso de una combinación de manidipina con otros inhibidores de Ca 2 podría mejorar su eficacia terapéutica, reducir su toxicidad y reducir el riesgo de desarrollo de resistencia (37) (39). Además de los tres inhibidores de VGCC, dos fármacos afectados, pimecrolimus y mesilato de nelfinavir, mostraron actividades inhibitorias equivalentes en la replicación de JEV, ZIKV, WNV y DENV-2. Aunque no se ha reportado el uso de pimecrolimus para el tratamiento de enfermedades infecciosas, se demostró que tuvo un efecto robusto contra JEV con un SI de 32. La concentración plasmática máxima (C max ) de mesilato de nelfinavir alcanzado con una dosis adulta fue de 3 a 4 g/ml (40), lo que fue comparable al IC 50 reportado aquí. En particular, se confirmó que el mesilato de nelfinavir inhibe el virus del herpes simplex 1 (HSV-1) y la replicación de varios otros herpesvirus interfiriendo directa o indirectamente con los pasos posteriores de la formación del virus, como la maduración de la glucoproteína o la liberación de virus, además de funcionar en la proteasa del herpesvirus (41, 42). Se desconoce si el mesilato de nelfinavir inhibe el flavivirus por interferencia con la proteasa del virus o por otros efectos no deseados. La comprensión del mecanismo de los efectos antiflavivirus de estos fármacos podría descubrir nuevos objetivos de los medicamentos, proporcionando una visión más profunda de la patogénesis de los flavivirus. Las células BHK-21, SH-SY5Y (neurblastoma humano), Vero, y Huh-7 fueron cultivadas en el medio de águila modificado Dulbecco (HyClone, Logan, UT, USA) complementado con 10% de suero bovino fetal (Gibco, Grand Island, NY, USA). La cepa JEV AT31, el replicado WNV, y el replicado DENV-2 que expresa Renilla luciferasa (Rluc) fueron amablemente proporcionados por Bo Zhang, Wuhan Institute of Virology, Academia China de Ciencias (CAS), China. Las partículas virales recombinantes de JEV replicon (RVPs) fueron generadas como se describió previamente (4, 5). La cepa H/PF/2013 de ZIKV, amablemente proporcionada por el Archivo Europeo de Virus Goes Global, fue propagada y titulada en La densidad celular y la dosis de RVP fueron optimizadas para el ensayo de HTS. Las células de Vero en diferentes densidades (2.500 a 12.500 células por pozo) fueron infectadas con RVPs de 1,25 a 20 l (1 a 16 copias por pozo). La densidad celular apropiada así como la dosis de RVP fueron seleccionadas comparando la relación S/B, CV y valores de Z= en diferentes condiciones como se describió previamente (43). Se utilizaron metil--ciclodextrina y sulfóxido de dimetilo (DMSO) como controles positivos y negativos respectivamente. Ensayo de HTS de una biblioteca compuesta aprobada por la FDA. Se compró una biblioteca de 1.018 medicamentos aprobados por la FDA a Selleck Chemicals (Houston, TX, EE.UU.). Los compuestos fueron almacenados como soluciones de stock de 10 mM en DMSO a 4°C hasta su uso. La primera ronda del ensayo de H Los criterios utilizados para identificar los candidatos primarios no fueron citotoxicidad aparente y un nivel medio de inhibición de 90% en pozos duplicados. Los criterios de inhibición dosis-dependiente y viabilidad celular de 80% se aplicaron para la pantalla de reconfirmación. Además, se calculó el CC 50 de cada compuesto, y los compuestos que mostraban SI mayores de 10 fueron considerados hits en este estudio. Identificación de efectos antivirales de cinco fármacos golpeados. Los efectos antivirales de los fármacos fueron evaluados mediante transcripción cuantitativa inversa-PCR (qRT-PCR), ensayo de inmunofluorescencia (IFA), y ensayo de placa como se informó previamente (44) (45) (46) (47). El cronograma experimental se describe en la figura 2A. Para asegurar la efectividad de los fármacos afectados en la replicación de flavivirus, se incubaron células BHK-21 transfectadas con el JEV, WNV o DENV-2 con cada fármaco en las concentraciones indicadas anteriormente, y se determinaron las actividades de luciferasa 24 h, 48 h o 72 h más tarde, respectivamente. Experimentación de tiempo de adición. Para evaluar qué etapa del ciclo de vida del JEV fue inhibida por cada golpe, se realizó un experimento de tiempo de adición como se describió previamente (43). Las células Vero fueron infectadas con 20 l de VPR durante 1 h (0 a 1 h). Los compuestos de prueba fueron incubados con las células durante 1 h antes de la infección (1 a 0 h), durante la infección (0 a 1 h), y durante 23 h postinfección (1 a 24 h) (fig. 3A). Para excluir un posible efecto inactivador directo de los fármacos, los RVP fueron incubados con cada fármaco a 37°C durante 1 h, y las mezclas fueron diluidas 25 veces para infectar las células Vero. Veinticuatro horas después, las actividades de luciferasa se determinaron como se describe anteriormente (Fig. 3A). Virus resistente a manidipina. Virus resistente a manidipina fue generado por transpiración de JEV en células Vero en presencia de manidipina. Pasajes 1 a 10 usaron 5 M manidipina, y pasajes 11 a 20 usaron 10 M manidipina. Como control, el virus WT fue pasaje en presencia de 2 % DMSO en paralelo. El pasaje fue terminado en el pasaje 20, cuando no se detectó ninguna mejoría adicional en la resistencia. Dos aislados del virus resistente a manidipina fueron purificados en placa y amplificados en presencia El ARN viral fue extraído, amplificado y purificado para la secuenciación. Se utilizó un clon cDNA infeccioso de JEV, cepa AT31 (pMWJEAT), amablemente proporcionado por T. Wakita, Instituto Metropolitano de Neurociencia de Tokio, para recuperar los virus WT y mutantes, como se describió anteriormente (4). Los títulos de virus y sensibilidades manidipinas fueron determinados por el ensayo de placa en células Vero. La administración de manidipina a ratones infectados por JEV. Los ratones adultos BALB/c (edad, 4 semanas) fueron mantenidos en el Centro Animal de Laboratorio del Instituto de Virología Wuhan, CAS (Wuhan, China). Los ratones fueron divididos aleatoriamente en cuatro grupos (30 ratones por grupo): un JEV infectado y un vehículo (2% Tween 80 plus 5% DMSO en el grupo tratado con solución salina fosfatada [PBS]), un grupo tratado con manidipino, un grupo tratado con JEV infectado y manidipino, y un grupo tratado con vehículo. Para la infección, los ratones fueron infectados intraperitonealmente con 5 10 6 UFP de cepa JEV AT31. Para el tratamiento con manidipino y vehículo, los ratones fueron inyectados intraperitonealmente con 25 mg/kg de peso corporal manidipino o PBS con 2% Tween 80 y 5% DMSO, respectivamente. Los tratamientos fueron administrados dos veces al día durante los primeros 2 días y luego administrados consecutivamente una vez al día durante 21 días. Cinco ratones de cada grupo fueron sacrificados en los días 1, 3 y 5 Se recogieron muestras de sero, tejido del bazo y tejido cerebral para la determinación del título viral y la investigación histopatológica. Quince ratones fueron monitorizados diariamente por morbilidad y mortalidad. Los ratones que mostraron signos neurológicos de enfermedad fueron eutanasiados de acuerdo con el Reglamento para la Administración de Asuntos relativos a Animales Experimentales en China. Los protocolos fueron revisados y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso Animal de Laboratorio del Instituto de Virología Wuhan, CAS (Wuhan, China).

¿Cómo se transmite la encefalitis japonesa?

El cribado de fármacos aprobados por la FDA para inhibidores de la infección por el virus de la encefalitis japonesahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5640845/SHA: 1bd2f6497996fc0fccd8dffd7f848446d3d36f964Autores: Wang, Shaobo; Liu, Yang; Guo, Jiao; Wang, Peilin; Zhang, Leike; Xiao, Gengfu; Wang, WeiFecha: 2017-10-13DOI: 10.1128/jvi.01055-17Licencia: cc-byResumen: virus de la encefalitis japonesa (JEV), un flavivirus transmitido por artrópodos, es una de las principales causas de la encefalitis viral aguda en No se dispone de ningún medicamento aprobado para el tratamiento específico de las infecciones por JEV, y las vacunas disponibles no son eficaces contra todos los aislados clínicos de JEV. En el estudio descrito aquí, se realizó una revisión de alto rendimiento de una biblioteca de medicamentos aprobada por la FDA para inhibidores del JEV. Se identificaron cinco fármacos afectados que inhibieron la infección por JEV con un índice selectivo de >10. También se validaron las actividades antivirales de estos cinco fármacos afectados contra otros flavivirus, incluido el virus Zika. El análisis de mutantes adaptativos reveló que la sustitución de Q130, ubicada en el dominio transmembrana 3 de la proteína NS4B no estructural, que se conserva relativamente en flavivirus, con la resistencia de JEV conferida a la manidipina R o K, un inhibidor del canal Ca(2+) activado por voltaje (VGCC), sin una pérdida aparente del perfil de crecimiento viral. Además, se indicó que manidipina protegía a ratones contra la letalidad inducida por JEV disminuyendo la carga viral en el cerebro, mientras que abrogaba los cambios histopatológicos asociados a la infección por JEV. Este estudio proporciona cinco candidatos a antiflavivirus e identifica el calcio citoplasmático como un nuevo objetivo antiviral para el tratamiento de la infección por JEV. Los hallazgos reportados aquí proporcionan posibilidades terapéuticas para combatir infecciones causadas por flavivirus. La reutilización de fármacos aprobados aceleraría el desarrollo de una estratagema terapéutica. En este estudio, examinamos una biblioteca de fármacos aprobados por la FDA e identificamos cinco fármacos afectados, especialmente inhibidores del calcio, que ejercen actividad antiflavivirus que bloquea la replicación viral. La eficacia in vivo y la toxicidad de manidipina fueron investigados con un modelo de ratón de infección por JEV, y el objetivo viral fue identificado generando un mutante adaptativo. Texto: Los lavivirus F están clasificados taxonómicamente en el género Flavivirus y la familia Flaviviridae. Estos virus comprenden más de 70 patógenos diferentes, como el virus japonés de la encefalitis (JEV), el virus Zika (ZIKV), el virus del dengue (DEV), el virus del Nilo Occidental (WNVW), y el virus de la fiebre amarilla (YFV). La mayoría de los flavivirus El desarrollo y uso de vacunas contra algunos flavivirus, como el JEV, el YFV y el virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (TBEV), han disminuido las tasas de morbilidad y mortalidad por infecciones causadas por estos virus (2) ; sin embargo, las enfermedades inducidas por flavivirus siguen siendo pandemias, y hay pocas terapias disponibles además de los cuidados intensivos de apoyo. Los flavivirus tienen un genoma de ARN de aproximadamente 11 kb de cadena positiva que contiene un único marco de lectura abierto (ORF) flanqueado por regiones no traducidas (UTR) en ambos termini. El ORF codifica tres proteínas estructurales, incluyendo el capsid (C), membrana (premembrana [prM] y membrana [M]), y envoltorio (E) y siete proteínas no estructurales (NS1, NS2A, NS2B, Estas siete proteínas no estructurales participan en la replicación viral, el ensamblaje del virión y el escape del virus de la vigilancia inmune. Hasta la fecha, no hay antivirales específicos con actividad contra los flavivirus. Para ello, realizamos una pantalla de una biblioteca de 1.018 medicamentos aprobados por la FDA. Dado que los flavivirus son similares en estructura y patogénesis, primero utilizamos el JEV como prototipo para examinar la biblioteca de medicamentos y posteriormente validamos las actividades antivirales con ZIKV, WNV y DENV tipo 2 (DEV-2). Los fármacos afectados identificados en este estudio ofrecen nuevas terapias potenciales para el tratamiento de la infección y enfermedad por flavivirus. Para seleccionar inhibidores se utilizaron partículas virales recombinantes (RVP) con el replicon notificado por luciferasa envuelto por las proteínas estructurales del JEV, con un enfoque en aquellos que inhiben la entrada y replicación del virus, mediante un ensayo de detección de alto rendimiento (HTS) (4, 5). Se determinó que el número de copias de RVP de ARN genómico era de 8,4 10 6 copias/ml utilizando una curva estándar generada con plásmidos que transportaban el clon infeccioso. Las condiciones de ensayo del HTS, incluyendo la densidad celular de siembra y la dosis de RVP, fueron optimizadas para ser 10.000 células por placa de 96 pocillos y 20 l (16 copias/célula) RVP para la dosis infecciosa, respectivamente. En las condiciones optimizadas, la relación señal-basal (S/B), el coeficiente de variación (CV) y el factor Z= fueron 38.374, 2,8% y 0.89, respectivamente, lo que demostró que el ensayo era robusto y adecuado para el cribado a gran escala de compuestos. Se seleccionó un esquema del ensayo HTS en la Fig. 1B. Después de tres rondas de cribado, cinco hits con un índice selectivo (SI; que es igual a la concentración citotóxica del 50% [CC 50 [ concentración inhibitoria del 50% [IC 50 ]]) de 10. Los valores CC 50 de los fármacos afectados exhibidos en la Fig. 1B fueron similares a los publicados anteriormente para diversos sistemas celulares pero determinados utilizando diferentes ensayos de toxicidad (6) (7) (8) (9) (10) (12) (13) (13). Tres de los fármacos afectados, manidipino, cilnidipino y hidrocloruro de benidipina, fueron antagonistas del canal Ca 2 (VGCC) activados por dihidropiridina, mientras que el pimecrolimus es un inhibidor de la secreción inflamatoria de citoquinas y el mesilato de nelfinavir es un bloqueador de proteasa VIH-1. Todos los cinco fármacos afectados mostraron una inhibición dosis-dependiente de la infección por JEV RVP (Fig. 1C). Para validar el efecto antiviral, los fármacos afectados fueron comprados de otras fuentes comerciales y probados. En la pantalla de reconfirmación, todos los fármacos afectados mostraron efectos antivirales y citotóxicos similares a los encontrados en la pantalla primaria. Validación de los fármacos afectados. Para verificar los resultados obtenidos por los ensayos del reportero de luciferasa, también investigamos Como se esperaba del ensayo HTS, los cinco fármacos inhibieron robustamente la producción de virus, con una reducción de aproximadamente 4 a 5 unidades log en la concentración más alta y una disminución de aproximadamente 1 log-unidad con 2,5 M los fármacos (Fig. 2B). También se detectó una fuerte disminución de los niveles de ARN JEV (Fig. 2C). Los niveles de ARN atenuados en los grupos de dosis altas, dosis media y dosis bajas fueron todos superiores al 40%. En particular, en el grupo tratado con manidipina, el efecto inhibitorio fue al menos del 80% en comparación con el control, que mostró una fuerte inhibición de la replicación viral. Coherente con la inhibición de la replicación y producción del virus, la expresión de la proteína estructural viral prM fue apenas detectable después del tratamiento con los fármacos en la concentración alta (Fig. 2D) 2 confirmó que los cinco fármacos afectados inhibieron in vitro la infección por JEV de forma dosis-dependiente. Los fármacos inhiben la infección por JEV durante la síntesis del ARN viral. Debido a que los RVP, que tienen un sobre natural similar al virus en el exterior y un replicon en el interior, permitieron la cuantificación de la entrada y replicación productiva del JEV, se realizó un experimento de tiempo de adición para investigar si los fármacos afectados bloquearon el paso de entrada o el paso de replicación. Como se muestra en la Fig. 3B, no se observó supresión de la actividad de luciferasa por cualquiera de los fármacos afectados cuando se utilizaron como tratamientos antes de la infección o durante la infección o como virúcida, sugiriendo que estos fármacos no inhiben la infección por JEV ya sea inactivando el virus directamente o bloqueando la entrada del JEV. Sin embargo, estos Para confirmar esta sugerencia, se investigaron los efectos inhibidores de estos fármacos en el JEV replicon. La concentración más alta de manidipino y mesilato de nelfinavir en las células de hámster bebé (BHK-21) se ajustó a 5 M y 10 M, respectivamente. Se demostró que los cinco fármacos inhiben la síntesis del ARN del JEV de manera dependiente de la dosis, mientras que ninguno de ellos inhibió la traducción inicial del ARN del réplico (5, 14) (Fig. 3C), confirmando que estos fármacos inhibieron la infección del JEV en la etapa de replicación. Los fármacos hit exhiben actividad antiflavivirus de amplio espectro. Para determinar si la actividad antiviral de los cinco fármacos afectados se extendió a otros flavivirus, exploramos su efecto antiviral contra ZIKV. Similar a los hallazgos para JEV, el título de ZIKV fue disminuido por unidades de registro múltiples cuando ZIKV fue tratado con una alta concentración de cada uno de los fármacos (Fig. 4A). Además, ZIKV mostró una mayor sensibilidad a los dos inhibidores de canales de calcio manidipina y cilnidipina que JEV, sin que se observe formación de placa a 10 M. De acuerdo con este resultado, se detectaron también disminuciones bruscas en el nivel de replicación del ARN de ZIKV y el nivel de expresión de proteína viral (Fig. 4A). Cabe destacar que el tratamiento con 5 M manidipina produjo una inhibición del 95% de la replicación viral, traducción y rendimientos virales. Tomados juntos, estos resultados indican que los fármacos afectados podrían efectivamente inhibir la infección por ZIKV. Dado que estos fármacos exhibieron sus efectos anti-JEV en la etapa de replicación viral, se probaron además los efectos contra WNV y DENV-2 mediante el uso de los replicadores WNV y DENV-2. Al igual que los resultados para JEV, se observó una reducción dosis-dependiente en el nivel de replicación de WNV con los tratamientos farmacológicos. El mismo fenotipo se observó para DENV-2 para todos los fármacos excepto mesilato de nelfinavir, que no mostró ningún efecto en las concentraciones probadas (fig. 4B y C). Juntos, estos resultados indican que los cinco fármacos afectados son excelentes candidatos para el tratamiento antiflavivirus de amplio espectro. Efecto antiviral de inhibidores del calcio. Ya que tres fármacos afectados, manidipina, cilnidipina e hidrocloruro de benidipina, eran inhibidores de DHP VGC Verapamil, un prototipo de inhibidor de fenilalquilamina (PAA) VGCC (15), mostró una inhibición dosis-dependiente del JEV tanto en el riñón de mono verde africano (Vero) como en las células de carcinoma hepatocelular humano (Huh-7) (Fig. 5), lo que fue consistente con los efectos inhibitorios de los inhibidores del DHP, sugiriendo que los canales de calcio juegan un papel importante en la infección por JEV. También se encontró que la ciclosporina y el borato de 2-aminobifenilo (2-APB), que inhiben el eflujo de Ca 2 del grupo mitocondrial y endoplasmático (ER), respectivamente (16) (17) (18) (19), bloquean eficazmente la infección por JEV. Del mismo modo, el tratamiento con el quelante celular Ca 2 1,2-bis-(o-aminofenoxi)-etano-N,N,N=,N=-tetraacético, ester tetraacetoximetilo (BAPTA-AM), también podría suprimir la infección por JEV. Tomado en conjunto, se concluyó que el Ca 2 intracelular es esencial para la infección por JEV y el calcio citoplasmático es un objetivo potente para el tratamiento con antiflavivirus. Selección y caracterización del JEV resistente a manidipina. Para identificar el objetivo viral del inhibidor del canal de calcio, se seleccionó un virus resistente a manidipino por transpiración serial del JEV en presencia de manidipina. Los virus del pasaje 20 (P20) mostraron resistencia robusta en comparación con el tipo salvaje (WT) (Fig. 6A ). Cuando el JEV de P20 fue tratado con 5 M o 10 M manidipina, el título viral fue aproximadamente 10 y 100 veces más alto que el del WT, respectivamente. Los clones individuales del virus fueron aislados, y dos aislados fueron seleccionados aleatoriamente y amplificados. Se observó una sustitución de aminoácidos en dos clones aislados, resultando en un cambio de glutamina (Q) a a arginina (R) en la posición de aminoácido 130 en el dominio transmembrana 3 (TMD3) de NS4B, es decir, la posición 2401 de la poliproteína traducida en el clon cDNA infeccioso JEV (Fig. 6B ). La alineación secuencial de NS4B indicó que el Q130 fue conservado en todos los flavivirus excepto YFV, que poseía una lisina en esa posición (Fig. 6B ). El Q130 conservado de NS4B puede explicar la sensibilidad de JEV, ZIKV, WNV y DENV-2 a manidipina, como se describe anteriormente (Fig. 4), mientras que el YFV mostró resistencia al fármaco (datos no mostrados). Para confirmar que la mutación Q130R confirió resistencia a manidipina e investigar el papel del Q130 en la función NS4B, produjimos clones de JEV con la mutación Q130R, Q130K, Q130E o Q130A introduciendo las mutaciones deseadas en el clon de ADNc infeccioso y rescatando los virus mutantes. Para investigar las propiedades biológicas de los virus mutantes, primero examinamos la cinética de crecimiento de los virus rescatados. Como se muestra en la Fig. 6C, todos los virus mutantes tuvieron una acumulación de viriones infecciosas y alcanzaron el título La infección de los virus mutantes Q130R y Q130K resultó en curvas de crecimiento similares a la curva de crecimiento para el WT (Fig. 6C), mientras que los mutantes Q130E y Q130A produjeron cantidades menores de virus entre 24 y 60 h. El análisis de la morfología de la placa reveló que las placas de los mutantes Q130R, Q130K y Q130E eran similares a las placas del WT, mientras que las placas del mutante Q130A eran menores que las del WT. A continuación se investigó la sensibilidad de los cuatro virus mutantes a manidipino. Como se muestra en la figura 6D, los virus mutantes Q130R y Q130K eran resistentes a manidipino. En una concentración de 10 M, la manidipina inhibió eficientemente la infección WT JEV y redujo los rendimientos virales en aproximadamente 4 unidades log, mientras que los virus mutantes Q130R y Q130K fueron resistentes a la manidipina y el título viral disminuyó menos de 2 unidades log.El virus mutante Q130A demostró resistencia moderada y un poco más alto Tomado juntos, se pudo concluir que Q130 no sólo es crítico para conferir sensibilidad a la manidipina sino que también es importante para la replicación del JEV. El reemplazo de glutamina por aminoácidos básicos confirió resistencia a la manidipina sin una aparente pérdida de crecimiento. Eficacia in vivo de la manidipina. Como manidipina mostró las actividades inhibidoras más fuertes en la replicación del JEV, así como la infección por ZIKV cuando sus actividades se compararon con las de los cinco fármacos afectados ( 2 y 4A), examinamos además el efecto protector de la manidipina frente a la letalidad inducida por el JEV en un modelo de ratón. Como era de prever, los ratones del grupo tratado con el JEV comenzaron a mostrar síntomas, incluyendo parálisis en las extremidades, restricción de movimiento, piloerección, rigidez corporal y temblor en todo el cuerpo, a partir del día 5 postinfección. En los 21 días posteriores a la infección, la mayoría de los ratones del grupo infectado por el JEV sucumbieron a la infección, con una tasa de mortalidad del 73% (4 de 15 animales sobrevivieron). El tratamiento con manidipina tras la infección por el JEV redujo la tasa de mortalidad al 20% (12 de 15 animales sobrevivieron) (Fig. 7A ). Los ratones tratados con manidipina solos o tratados con manidipina e infectados con JEV mostraron poco comportamiento anormal, similar a los Para relacionar aún más estos efectos protectores con la carga viral y los cambios histopatológicos en el cerebro del ratón, se determinó el título viral y se recogieron y analizaron las secciones cerebrales del ratón en el día 5 y el día 21 postinfección, ya que los ratones comenzaron a mostrar síntomas de infección por JEV desde el día 5 postinfección y la mayoría de los ratones sobrevivientes se habían recuperado en el día 21. Los resultados indicaron que, durante la progresión de la enfermedad, el tratamiento con manidipina redujo significativamente la carga viral en ratones infectados en comparación con la de ratones infectados que no recibían tratamiento, mientras que no se formaron placas ni en el grupo tratado con manidipino ni en el vehículo, y las cargas virales fueron indetectables en cada grupo el día 21 postinfección (fig. 7B). Como el JEV fue rápidamente eliminado de la sangre después de la inoculación y estuvo presente en el sistema linfático durante la fase preclínica, los efectos de la manidipina sobre la infección del suero y el bazo fueron evaluados en momentos anteriores para detectar si el fármaco redujo las cargas virales periféricas (20, 21). Como se muestra en la figura 7C, la manidipina tuvo poco efecto sobre la infección periférica del JEV, lo que indica que la manidipina protegió a los ratones contra la letalidad inducida por el JEV al disminuir la carga viral en el cerebro. Del mismo modo, se observó un daño aparente en el cerebro, incluyendo meningitis, manguitos perivasculares, degeneración vacuolar y nódulos gliales en el grupo infectado y tratado con JEV el día 5 de postinfección, mientras que el tratamiento con manidipina aliviaba notablemente estos Estos resultados indican que el alivio de los cambios histopatológicos fue acompañado por una reducción de la carga viral, así como una reducción en la tasa de mortalidad, confirmando aún más los efectos curativos de la manidipina sobre la encefalitis viral. Entre los cinco fármacos afectados, manidipina, cilnidipina e hidrocloruro de benidipina fueron inhibidores del VGCC. Ha sido bien documentado en la literatura que los inhibidores de Ca 2 sirven para inhibir la infección viral en la etapa de entrada (15, 22) o replicación (18) e incluso en la etapa de brote (23). Con este fin, primero revisamos los 21 inhibidores del calcio incluidos en la actual biblioteca de fármacos aprobados por la FDA y encontramos que, además de los cuatro inhibidores del DHP VGCC enumerados en la Fig. El 1B, otros dos inhibidores de calcio, es decir, dihidrocloruro de flunarizina y clorhidrato de lomerizina, también fueron identificados como candidatos primarios con niveles de inhibición de 90%. Del mismo modo, tres antagonistas de los canales de calcio, nisoldipino, felodipino y clorhidrato de nicardipina, mostraron niveles de inhibición de 75%, 72% y 66%, respectivamente, en la pantalla primaria. Juntos, 9 de los 21 inhibidores de calcio de la biblioteca, que representan casi la mitad de los inhibidores de calcio, mostraron niveles de inhibición de flavivirus superiores al 50%, lo que sugiere que el calcio, especialmente el canal de calcio, es un potencial objetivo antiviral. Para abordar este, se investigó otro tipo de inhibidor del VGCC, verapamilo, un fármaco aprobado por la FDA que aún no se incluye en la biblioteca de medicamentos utilizada en este Del mismo modo, un quelante Ca 2, BAPTA-AM, así como los inhibidores Ca 2 2-APB y ciclosporina, dirigidos a la ER y el canal mitocondrial Ca 2, respectivamente, fueron empleados para investigar la respuesta de la infección por JEV a la disminución de los niveles intracelulares de Ca 2. En línea con las actividades de los tres fármacos inhibidores DHP VGCC golpeados, los inhibidores adicionales Ca 2 ejercieron actividad anti-JEV, lo que indicó que Ca 2 es indispensable para la infección por JEV. Así, los inhibidores Ca 2 podrían ser utilizados como tratamientos eficaces para la infección por flavivirus. Como los fármacos afectados ejercieron actividad inhibitoria completa cuando fueron añadidos al tratamiento, creemos que Ca 2 es importante para la replicación del genoma del flavivirus. Además, la selección y el análisis genético de NS4B es parte del complejo de replicación viral y se supone que ancla la replicasa viral a la membrana ER (24). Mientras tanto, el dominio N-terminal 125aminoácido de DENV NS4B fue indicado como responsable de la inhibición de la respuesta inmune (25). En particular, varios compuestos estructuralmente distintos han sido identificados para inhibir la replicación de flavivirus al dirigir intensivamente la TMD de NS4B (26) (27) (28) (29) (30) (31) (32). Es así concebible que los inhibidores que se dirigen a la TMD de NS4B perturben su función, lo que conduce a la supresión de la replicación de ARN viral. En este estudio, la sustitución de Q130 de NS4B por un aminoácido básico confirió el efecto de resistencia sin suprimir la replicación del JEV, sugiriendo que la posición 130 podría tolerar un aminoácido básico y que el aminoácido básico podría estar involucrado en la interacción del NS4B con proteínas huésped en lugar de proteínas virales. Además, la eficacia y toxicidad de manidipina fueron monitoreadas in vivo, con manidipina demostrando una actividad antiviral efectiva con biocompatibilidad favorable. Sin embargo, la dosis utilizada en este estudio fue mayor que la dosis típicamente utilizada clínicamente, representando uno de los escenarios más comúnmente encontrados en la repurposición de fármacos (33, 34). Como manidipina fue aprobada para el tratamiento a largo plazo de la hipertensión (35, 36), el tratamiento de dosis de pulso con manidipina durante el período más corto requerido para el tratamiento de la infección viral podría ser relativamente Además, el uso de una combinación de manidipina con otros inhibidores de Ca 2 podría mejorar su eficacia terapéutica, reducir su toxicidad y reducir el riesgo de desarrollo de resistencia (37) (39). Además de los tres inhibidores de VGCC, dos fármacos afectados, pimecrolimus y mesilato de nelfinavir, mostraron actividades inhibitorias equivalentes en la replicación de JEV, ZIKV, WNV y DENV-2. Aunque no se ha reportado el uso de pimecrolimus para el tratamiento de enfermedades infecciosas, se demostró que tuvo un efecto robusto contra JEV con un SI de 32. La concentración plasmática máxima (C max ) de mesilato de nelfinavir alcanzado con una dosis adulta fue de 3 a 4 g/ml (40), lo que fue comparable al IC 50 reportado aquí. En particular, se confirmó que el mesilato de nelfinavir inhibe el virus del herpes simplex 1 (HSV-1) y la replicación de varios otros herpesvirus interfiriendo directa o indirectamente con los pasos posteriores de la formación del virus, como la maduración de la glucoproteína o la liberación de virus, además de funcionar en la proteasa del herpesvirus (41, 42). Se desconoce si el mesilato de nelfinavir inhibe el flavivirus por interferencia con la proteasa del virus o por otros efectos no deseados. La comprensión del mecanismo de los efectos antiflavivirus de estos fármacos podría descubrir nuevos objetivos de los medicamentos, proporcionando una visión más profunda de la patogénesis de los flavivirus. Las células BHK-21, SH-SY5Y (neurblastoma humano), Vero, y Huh-7 fueron cultivadas en el medio de águila modificado Dulbecco (HyClone, Logan, UT, USA) complementado con 10% de suero bovino fetal (Gibco, Grand Island, NY, USA). La cepa JEV AT31, el replicado WNV, y el replicado DENV-2 que expresa Renilla luciferasa (Rluc) fueron amablemente proporcionados por Bo Zhang, Wuhan Institute of Virology, Academia China de Ciencias (CAS), China. Las partículas virales recombinantes de JEV replicon (RVPs) fueron generadas como se describió previamente (4, 5). La cepa H/PF/2013 de ZIKV, amablemente proporcionada por el Archivo Europeo de Virus Goes Global, fue propagada y titulada en La densidad celular y la dosis de RVP fueron optimizadas para el ensayo de HTS. Las células de Vero en diferentes densidades (2.500 a 12.500 células por pozo) fueron infectadas con RVPs de 1,25 a 20 l (1 a 16 copias por pozo). La densidad celular apropiada así como la dosis de RVP fueron seleccionadas comparando la relación S/B, CV y valores de Z= en diferentes condiciones como se describió previamente (43). Se utilizaron metil--ciclodextrina y sulfóxido de dimetilo (DMSO) como controles positivos y negativos respectivamente. Ensayo de HTS de una biblioteca compuesta aprobada por la FDA. Se compró una biblioteca de 1.018 medicamentos aprobados por la FDA a Selleck Chemicals (Houston, TX, EE.UU.). Los compuestos fueron almacenados como soluciones de stock de 10 mM en DMSO a 4°C hasta su uso. La primera ronda del ensayo de H Los criterios utilizados para identificar los candidatos primarios no fueron citotoxicidad aparente y un nivel medio de inhibición de 90% en pozos duplicados. Los criterios de inhibición dosis-dependiente y viabilidad celular de 80% se aplicaron para la pantalla de reconfirmación. Además, se calculó el CC 50 de cada compuesto, y los compuestos que mostraban SI mayores de 10 fueron considerados hits en este estudio. Identificación de efectos antivirales de cinco fármacos golpeados. Los efectos antivirales de los fármacos fueron evaluados mediante transcripción cuantitativa inversa-PCR (qRT-PCR), ensayo de inmunofluorescencia (IFA), y ensayo de placa como se informó previamente (44) (45) (46) (47). El cronograma experimental se describe en la figura 2A. Para asegurar la efectividad de los fármacos afectados en la replicación de flavivirus, se incubaron células BHK-21 transfectadas con el JEV, WNV o DENV-2 con cada fármaco en las concentraciones indicadas anteriormente, y se determinaron las actividades de luciferasa 24 h, 48 h o 72 h más tarde, respectivamente. Experimentación de tiempo de adición. Para evaluar qué etapa del ciclo de vida del JEV fue inhibida por cada golpe, se realizó un experimento de tiempo de adición como se describió previamente (43). Las células Vero fueron infectadas con 20 l de VPR durante 1 h (0 a 1 h). Los compuestos de prueba fueron incubados con las células durante 1 h antes de la infección (1 a 0 h), durante la infección (0 a 1 h), y durante 23 h postinfección (1 a 24 h) (fig. 3A). Para excluir un posible efecto inactivador directo de los fármacos, los RVP fueron incubados con cada fármaco a 37°C durante 1 h, y las mezclas fueron diluidas 25 veces para infectar las células Vero. Veinticuatro horas después, las actividades de luciferasa se determinaron como se describe anteriormente (Fig. 3A). Virus resistente a manidipina. Virus resistente a manidipina fue generado por transpiración de JEV en células Vero en presencia de manidipina. Pasajes 1 a 10 usaron 5 M manidipina, y pasajes 11 a 20 usaron 10 M manidipina. Como control, el virus WT fue pasaje en presencia de 2 % DMSO en paralelo. El pasaje fue terminado en el pasaje 20, cuando no se detectó ninguna mejoría adicional en la resistencia. Dos aislados del virus resistente a manidipina fueron purificados en placa y amplificados en presencia El ARN viral fue extraído, amplificado y purificado para la secuenciación. Se utilizó un clon cDNA infeccioso de JEV, cepa AT31 (pMWJEAT), amablemente proporcionado por T. Wakita, Instituto Metropolitano de Neurociencia de Tokio, para recuperar los virus WT y mutantes, como se describió anteriormente (4). Los títulos de virus y sensibilidades manidipinas fueron determinados por el ensayo de placa en células Vero. La administración de manidipina a ratones infectados por JEV. Los ratones adultos BALB/c (edad, 4 semanas) fueron mantenidos en el Centro Animal de Laboratorio del Instituto de Virología Wuhan, CAS (Wuhan, China). Los ratones fueron divididos aleatoriamente en cuatro grupos (30 ratones por grupo): un JEV infectado y un vehículo (2% Tween 80 plus 5% DMSO en el grupo tratado con solución salina fosfatada [PBS]), un grupo tratado con manidipino, un grupo tratado con JEV infectado y manidipino, y un grupo tratado con vehículo. Para la infección, los ratones fueron infectados intraperitonealmente con 5 10 6 UFP de cepa JEV AT31. Para el tratamiento con manidipino y vehículo, los ratones fueron inyectados intraperitonealmente con 25 mg/kg de peso corporal manidipino o PBS con 2% Tween 80 y 5% DMSO, respectivamente. Los tratamientos fueron administrados dos veces al día durante los primeros 2 días y luego administrados consecutivamente una vez al día durante 21 días. Cinco ratones de cada grupo fueron sacrificados en los días 1, 3 y 5 Se recogieron muestras de sero, tejido del bazo y tejido cerebral para la determinación del título viral y la investigación histopatológica. Quince ratones fueron monitorizados diariamente por morbilidad y mortalidad. Los ratones que mostraron signos neurológicos de enfermedad fueron eutanasiados de acuerdo con el Reglamento para la Administración de Asuntos relativos a Animales Experimentales en China. Los protocolos fueron revisados y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso Animal de Laboratorio del Instituto de Virología Wuhan, CAS (Wuhan, China).

¿Qué elemento es esencial para promover la infección por JEV?

El cribado de fármacos aprobados por la FDA para inhibidores de la infección por el virus de la encefalitis japonesahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5640845/SHA: 1bd2f6497996fc0fccd8dffd7f848446d3d36f964Autores: Wang, Shaobo; Liu, Yang; Guo, Jiao; Wang, Peilin; Zhang, Leike; Xiao, Gengfu; Wang, WeiFecha: 2017-10-13DOI: 10.1128/jvi.01055-17Licencia: cc-byResumen: virus de la encefalitis japonesa (JEV), un flavivirus transmitido por artrópodos, es una de las principales causas de la encefalitis viral aguda en No se dispone de ningún medicamento aprobado para el tratamiento específico de las infecciones por JEV, y las vacunas disponibles no son eficaces contra todos los aislados clínicos de JEV. En el estudio descrito aquí, se realizó una revisión de alto rendimiento de una biblioteca de medicamentos aprobada por la FDA para inhibidores del JEV. Se identificaron cinco fármacos afectados que inhibieron la infección por JEV con un índice selectivo de >10. También se validaron las actividades antivirales de estos cinco fármacos afectados contra otros flavivirus, incluido el virus Zika. El análisis de mutantes adaptativos reveló que la sustitución de Q130, ubicada en el dominio transmembrana 3 de la proteína NS4B no estructural, que se conserva relativamente en flavivirus, con la resistencia de JEV conferida a la manidipina R o K, un inhibidor del canal Ca(2+) activado por voltaje (VGCC), sin una pérdida aparente del perfil de crecimiento viral. Además, se indicó que manidipina protegía a ratones contra la letalidad inducida por JEV disminuyendo la carga viral en el cerebro, mientras que abrogaba los cambios histopatológicos asociados a la infección por JEV. Este estudio proporciona cinco candidatos a antiflavivirus e identifica el calcio citoplasmático como un nuevo objetivo antiviral para el tratamiento de la infección por JEV. Los hallazgos reportados aquí proporcionan posibilidades terapéuticas para combatir infecciones causadas por flavivirus. La reutilización de fármacos aprobados aceleraría el desarrollo de una estratagema terapéutica. En este estudio, examinamos una biblioteca de fármacos aprobados por la FDA e identificamos cinco fármacos afectados, especialmente inhibidores del calcio, que ejercen actividad antiflavivirus que bloquea la replicación viral. La eficacia in vivo y la toxicidad de manidipina fueron investigados con un modelo de ratón de infección por JEV, y el objetivo viral fue identificado generando un mutante adaptativo. Texto: Los lavivirus F están clasificados taxonómicamente en el género Flavivirus y la familia Flaviviridae. Estos virus comprenden más de 70 patógenos diferentes, como el virus japonés de la encefalitis (JEV), el virus Zika (ZIKV), el virus del dengue (DEV), el virus del Nilo Occidental (WNVW), y el virus de la fiebre amarilla (YFV). La mayoría de los flavivirus El desarrollo y uso de vacunas contra algunos flavivirus, como el JEV, el YFV y el virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (TBEV), han disminuido las tasas de morbilidad y mortalidad por infecciones causadas por estos virus (2) ; sin embargo, las enfermedades inducidas por flavivirus siguen siendo pandemias, y hay pocas terapias disponibles además de los cuidados intensivos de apoyo. Los flavivirus tienen un genoma de ARN de aproximadamente 11 kb de cadena positiva que contiene un único marco de lectura abierto (ORF) flanqueado por regiones no traducidas (UTR) en ambos termini. El ORF codifica tres proteínas estructurales, incluyendo el capsid (C), membrana (premembrana [prM] y membrana [M]), y envoltorio (E) y siete proteínas no estructurales (NS1, NS2A, NS2B, Estas siete proteínas no estructurales participan en la replicación viral, el ensamblaje del virión y el escape del virus de la vigilancia inmune. Hasta la fecha, no hay antivirales específicos con actividad contra los flavivirus. Para ello, realizamos una pantalla de una biblioteca de 1.018 medicamentos aprobados por la FDA. Dado que los flavivirus son similares en estructura y patogénesis, primero utilizamos el JEV como prototipo para examinar la biblioteca de medicamentos y posteriormente validamos las actividades antivirales con ZIKV, WNV y DENV tipo 2 (DEV-2). Los fármacos afectados identificados en este estudio ofrecen nuevas terapias potenciales para el tratamiento de la infección y enfermedad por flavivirus. Para seleccionar inhibidores se utilizaron partículas virales recombinantes (RVP) con el replicon notificado por luciferasa envuelto por las proteínas estructurales del JEV, con un enfoque en aquellos que inhiben la entrada y replicación del virus, mediante un ensayo de detección de alto rendimiento (HTS) (4, 5). Se determinó que el número de copias de RVP de ARN genómico era de 8,4 10 6 copias/ml utilizando una curva estándar generada con plásmidos que transportaban el clon infeccioso. Las condiciones de ensayo del HTS, incluyendo la densidad celular de siembra y la dosis de RVP, fueron optimizadas para ser 10.000 células por placa de 96 pocillos y 20 l (16 copias/célula) RVP para la dosis infecciosa, respectivamente. En las condiciones optimizadas, la relación señal-basal (S/B), el coeficiente de variación (CV) y el factor Z= fueron 38.374, 2,8% y 0.89, respectivamente, lo que demostró que el ensayo era robusto y adecuado para el cribado a gran escala de compuestos. Se seleccionó un esquema del ensayo HTS en la Fig. 1B. Después de tres rondas de cribado, cinco hits con un índice selectivo (SI; que es igual a la concentración citotóxica del 50% [CC 50 [ concentración inhibitoria del 50% [IC 50 ]]) de 10. Los valores CC 50 de los fármacos afectados exhibidos en la Fig. 1B fueron similares a los publicados anteriormente para diversos sistemas celulares pero determinados utilizando diferentes ensayos de toxicidad (6) (7) (8) (9) (10) (12) (13) (13). Tres de los fármacos afectados, manidipino, cilnidipino y hidrocloruro de benidipina, fueron antagonistas del canal Ca 2 (VGCC) activados por dihidropiridina, mientras que el pimecrolimus es un inhibidor de la secreción inflamatoria de citoquinas y el mesilato de nelfinavir es un bloqueador de proteasa VIH-1. Todos los cinco fármacos afectados mostraron una inhibición dosis-dependiente de la infección por JEV RVP (Fig. 1C). Para validar el efecto antiviral, los fármacos afectados fueron comprados de otras fuentes comerciales y probados. En la pantalla de reconfirmación, todos los fármacos afectados mostraron efectos antivirales y citotóxicos similares a los encontrados en la pantalla primaria. Validación de los fármacos afectados. Para verificar los resultados obtenidos por los ensayos del reportero de luciferasa, también investigamos Como se esperaba del ensayo HTS, los cinco fármacos inhibieron robustamente la producción de virus, con una reducción de aproximadamente 4 a 5 unidades log en la concentración más alta y una disminución de aproximadamente 1 log-unidad con 2,5 M los fármacos (Fig. 2B). También se detectó una fuerte disminución de los niveles de ARN JEV (Fig. 2C). Los niveles de ARN atenuados en los grupos de dosis altas, dosis media y dosis bajas fueron todos superiores al 40%. En particular, en el grupo tratado con manidipina, el efecto inhibitorio fue al menos del 80% en comparación con el control, que mostró una fuerte inhibición de la replicación viral. Coherente con la inhibición de la replicación y producción del virus, la expresión de la proteína estructural viral prM fue apenas detectable después del tratamiento con los fármacos en la concentración alta (Fig. 2D) 2 confirmó que los cinco fármacos afectados inhibieron in vitro la infección por JEV de forma dosis-dependiente. Los fármacos inhiben la infección por JEV durante la síntesis del ARN viral. Debido a que los RVP, que tienen un sobre natural similar al virus en el exterior y un replicon en el interior, permitieron la cuantificación de la entrada y replicación productiva del JEV, se realizó un experimento de tiempo de adición para investigar si los fármacos afectados bloquearon el paso de entrada o el paso de replicación. Como se muestra en la Fig. 3B, no se observó supresión de la actividad de luciferasa por cualquiera de los fármacos afectados cuando se utilizaron como tratamientos antes de la infección o durante la infección o como virúcida, sugiriendo que estos fármacos no inhiben la infección por JEV ya sea inactivando el virus directamente o bloqueando la entrada del JEV. Sin embargo, estos Para confirmar esta sugerencia, se investigaron los efectos inhibidores de estos fármacos en el JEV replicon. La concentración más alta de manidipino y mesilato de nelfinavir en las células de hámster bebé (BHK-21) se ajustó a 5 M y 10 M, respectivamente. Se demostró que los cinco fármacos inhiben la síntesis del ARN del JEV de manera dependiente de la dosis, mientras que ninguno de ellos inhibió la traducción inicial del ARN del réplico (5, 14) (Fig. 3C), confirmando que estos fármacos inhibieron la infección del JEV en la etapa de replicación. Los fármacos hit exhiben actividad antiflavivirus de amplio espectro. Para determinar si la actividad antiviral de los cinco fármacos afectados se extendió a otros flavivirus, exploramos su efecto antiviral contra ZIKV. Similar a los hallazgos para JEV, el título de ZIKV fue disminuido por unidades de registro múltiples cuando ZIKV fue tratado con una alta concentración de cada uno de los fármacos (Fig. 4A). Además, ZIKV mostró una mayor sensibilidad a los dos inhibidores de canales de calcio manidipina y cilnidipina que JEV, sin que se observe formación de placa a 10 M. De acuerdo con este resultado, se detectaron también disminuciones bruscas en el nivel de replicación del ARN de ZIKV y el nivel de expresión de proteína viral (Fig. 4A). Cabe destacar que el tratamiento con 5 M manidipina produjo una inhibición del 95% de la replicación viral, traducción y rendimientos virales. Tomados juntos, estos resultados indican que los fármacos afectados podrían efectivamente inhibir la infección por ZIKV. Dado que estos fármacos exhibieron sus efectos anti-JEV en la etapa de replicación viral, se probaron además los efectos contra WNV y DENV-2 mediante el uso de los replicadores WNV y DENV-2. Al igual que los resultados para JEV, se observó una reducción dosis-dependiente en el nivel de replicación de WNV con los tratamientos farmacológicos. El mismo fenotipo se observó para DENV-2 para todos los fármacos excepto mesilato de nelfinavir, que no mostró ningún efecto en las concentraciones probadas (fig. 4B y C). Juntos, estos resultados indican que los cinco fármacos afectados son excelentes candidatos para el tratamiento antiflavivirus de amplio espectro. Efecto antiviral de inhibidores del calcio. Ya que tres fármacos afectados, manidipina, cilnidipina e hidrocloruro de benidipina, eran inhibidores de DHP VGC Verapamil, un prototipo de inhibidor de fenilalquilamina (PAA) VGCC (15), mostró una inhibición dosis-dependiente del JEV tanto en el riñón de mono verde africano (Vero) como en las células de carcinoma hepatocelular humano (Huh-7) (Fig. 5), lo que fue consistente con los efectos inhibitorios de los inhibidores del DHP, sugiriendo que los canales de calcio juegan un papel importante en la infección por JEV. También se encontró que la ciclosporina y el borato de 2-aminobifenilo (2-APB), que inhiben el eflujo de Ca 2 del grupo mitocondrial y endoplasmático (ER), respectivamente (16) (17) (18) (19), bloquean eficazmente la infección por JEV. Del mismo modo, el tratamiento con el quelante celular Ca 2 1,2-bis-(o-aminofenoxi)-etano-N,N,N=,N=-tetraacético, ester tetraacetoximetilo (BAPTA-AM), también podría suprimir la infección por JEV. Tomado en conjunto, se concluyó que el Ca 2 intracelular es esencial para la infección por JEV y el calcio citoplasmático es un objetivo potente para el tratamiento con antiflavivirus. Selección y caracterización del JEV resistente a manidipina. Para identificar el objetivo viral del inhibidor del canal de calcio, se seleccionó un virus resistente a manidipino por transpiración serial del JEV en presencia de manidipina. Los virus del pasaje 20 (P20) mostraron resistencia robusta en comparación con el tipo salvaje (WT) (Fig. 6A ). Cuando el JEV de P20 fue tratado con 5 M o 10 M manidipina, el título viral fue aproximadamente 10 y 100 veces más alto que el del WT, respectivamente. Los clones individuales del virus fueron aislados, y dos aislados fueron seleccionados aleatoriamente y amplificados. Se observó una sustitución de aminoácidos en dos clones aislados, resultando en un cambio de glutamina (Q) a a arginina (R) en la posición de aminoácido 130 en el dominio transmembrana 3 (TMD3) de NS4B, es decir, la posición 2401 de la poliproteína traducida en el clon cDNA infeccioso JEV (Fig. 6B ). La alineación secuencial de NS4B indicó que el Q130 fue conservado en todos los flavivirus excepto YFV, que poseía una lisina en esa posición (Fig. 6B ). El Q130 conservado de NS4B puede explicar la sensibilidad de JEV, ZIKV, WNV y DENV-2 a manidipina, como se describe anteriormente (Fig. 4), mientras que el YFV mostró resistencia al fármaco (datos no mostrados). Para confirmar que la mutación Q130R confirió resistencia a manidipina e investigar el papel del Q130 en la función NS4B, produjimos clones de JEV con la mutación Q130R, Q130K, Q130E o Q130A introduciendo las mutaciones deseadas en el clon de ADNc infeccioso y rescatando los virus mutantes. Para investigar las propiedades biológicas de los virus mutantes, primero examinamos la cinética de crecimiento de los virus rescatados. Como se muestra en la Fig. 6C, todos los virus mutantes tuvieron una acumulación de viriones infecciosas y alcanzaron el título La infección de los virus mutantes Q130R y Q130K resultó en curvas de crecimiento similares a la curva de crecimiento para el WT (Fig. 6C), mientras que los mutantes Q130E y Q130A produjeron cantidades menores de virus entre 24 y 60 h. El análisis de la morfología de la placa reveló que las placas de los mutantes Q130R, Q130K y Q130E eran similares a las placas del WT, mientras que las placas del mutante Q130A eran menores que las del WT. A continuación se investigó la sensibilidad de los cuatro virus mutantes a manidipino. Como se muestra en la figura 6D, los virus mutantes Q130R y Q130K eran resistentes a manidipino. En una concentración de 10 M, la manidipina inhibió eficientemente la infección WT JEV y redujo los rendimientos virales en aproximadamente 4 unidades log, mientras que los virus mutantes Q130R y Q130K fueron resistentes a la manidipina y el título viral disminuyó menos de 2 unidades log.El virus mutante Q130A demostró resistencia moderada y un poco más alto Tomado juntos, se pudo concluir que Q130 no sólo es crítico para conferir sensibilidad a la manidipina sino que también es importante para la replicación del JEV. El reemplazo de glutamina por aminoácidos básicos confirió resistencia a la manidipina sin una aparente pérdida de crecimiento. Eficacia in vivo de la manidipina. Como manidipina mostró las actividades inhibidoras más fuertes en la replicación del JEV, así como la infección por ZIKV cuando sus actividades se compararon con las de los cinco fármacos afectados ( 2 y 4A), examinamos además el efecto protector de la manidipina frente a la letalidad inducida por el JEV en un modelo de ratón. Como era de prever, los ratones del grupo tratado con el JEV comenzaron a mostrar síntomas, incluyendo parálisis en las extremidades, restricción de movimiento, piloerección, rigidez corporal y temblor en todo el cuerpo, a partir del día 5 postinfección. En los 21 días posteriores a la infección, la mayoría de los ratones del grupo infectado por el JEV sucumbieron a la infección, con una tasa de mortalidad del 73% (4 de 15 animales sobrevivieron). El tratamiento con manidipina tras la infección por el JEV redujo la tasa de mortalidad al 20% (12 de 15 animales sobrevivieron) (Fig. 7A ). Los ratones tratados con manidipina solos o tratados con manidipina e infectados con JEV mostraron poco comportamiento anormal, similar a los Para relacionar aún más estos efectos protectores con la carga viral y los cambios histopatológicos en el cerebro del ratón, se determinó el título viral y se recogieron y analizaron las secciones cerebrales del ratón en el día 5 y el día 21 postinfección, ya que los ratones comenzaron a mostrar síntomas de infección por JEV desde el día 5 postinfección y la mayoría de los ratones sobrevivientes se habían recuperado en el día 21. Los resultados indicaron que, durante la progresión de la enfermedad, el tratamiento con manidipina redujo significativamente la carga viral en ratones infectados en comparación con la de ratones infectados que no recibían tratamiento, mientras que no se formaron placas ni en el grupo tratado con manidipino ni en el vehículo, y las cargas virales fueron indetectables en cada grupo el día 21 postinfección (fig. 7B). Como el JEV fue rápidamente eliminado de la sangre después de la inoculación y estuvo presente en el sistema linfático durante la fase preclínica, los efectos de la manidipina sobre la infección del suero y el bazo fueron evaluados en momentos anteriores para detectar si el fármaco redujo las cargas virales periféricas (20, 21). Como se muestra en la figura 7C, la manidipina tuvo poco efecto sobre la infección periférica del JEV, lo que indica que la manidipina protegió a los ratones contra la letalidad inducida por el JEV al disminuir la carga viral en el cerebro. Del mismo modo, se observó un daño aparente en el cerebro, incluyendo meningitis, manguitos perivasculares, degeneración vacuolar y nódulos gliales en el grupo infectado y tratado con JEV el día 5 de postinfección, mientras que el tratamiento con manidipina aliviaba notablemente estos Estos resultados indican que el alivio de los cambios histopatológicos fue acompañado por una reducción de la carga viral, así como una reducción en la tasa de mortalidad, confirmando aún más los efectos curativos de la manidipina sobre la encefalitis viral. Entre los cinco fármacos afectados, manidipina, cilnidipina e hidrocloruro de benidipina fueron inhibidores del VGCC. Ha sido bien documentado en la literatura que los inhibidores de Ca 2 sirven para inhibir la infección viral en la etapa de entrada (15, 22) o replicación (18) e incluso en la etapa de brote (23). Con este fin, primero revisamos los 21 inhibidores del calcio incluidos en la actual biblioteca de fármacos aprobados por la FDA y encontramos que, además de los cuatro inhibidores del DHP VGCC enumerados en la Fig. El 1B, otros dos inhibidores de calcio, es decir, dihidrocloruro de flunarizina y clorhidrato de lomerizina, también fueron identificados como candidatos primarios con niveles de inhibición de 90%. Del mismo modo, tres antagonistas de los canales de calcio, nisoldipino, felodipino y clorhidrato de nicardipina, mostraron niveles de inhibición de 75%, 72% y 66%, respectivamente, en la pantalla primaria. Juntos, 9 de los 21 inhibidores de calcio de la biblioteca, que representan casi la mitad de los inhibidores de calcio, mostraron niveles de inhibición de flavivirus superiores al 50%, lo que sugiere que el calcio, especialmente el canal de calcio, es un potencial objetivo antiviral. Para abordar este, se investigó otro tipo de inhibidor del VGCC, verapamilo, un fármaco aprobado por la FDA que aún no se incluye en la biblioteca de medicamentos utilizada en este Del mismo modo, un quelante Ca 2, BAPTA-AM, así como los inhibidores Ca 2 2-APB y ciclosporina, dirigidos a la ER y el canal mitocondrial Ca 2, respectivamente, fueron empleados para investigar la respuesta de la infección por JEV a la disminución de los niveles intracelulares de Ca 2. En línea con las actividades de los tres fármacos inhibidores DHP VGCC golpeados, los inhibidores adicionales Ca 2 ejercieron actividad anti-JEV, lo que indicó que Ca 2 es indispensable para la infección por JEV. Así, los inhibidores Ca 2 podrían ser utilizados como tratamientos eficaces para la infección por flavivirus. Como los fármacos afectados ejercieron actividad inhibitoria completa cuando fueron añadidos al tratamiento, creemos que Ca 2 es importante para la replicación del genoma del flavivirus. Además, la selección y el análisis genético de NS4B es parte del complejo de replicación viral y se supone que ancla la replicasa viral a la membrana ER (24). Mientras tanto, el dominio N-terminal 125aminoácido de DENV NS4B fue indicado como responsable de la inhibición de la respuesta inmune (25). En particular, varios compuestos estructuralmente distintos han sido identificados para inhibir la replicación de flavivirus al dirigir intensivamente la TMD de NS4B (26) (27) (28) (29) (30) (31) (32). Es así concebible que los inhibidores que se dirigen a la TMD de NS4B perturben su función, lo que conduce a la supresión de la replicación de ARN viral. En este estudio, la sustitución de Q130 de NS4B por un aminoácido básico confirió el efecto de resistencia sin suprimir la replicación del JEV, sugiriendo que la posición 130 podría tolerar un aminoácido básico y que el aminoácido básico podría estar involucrado en la interacción del NS4B con proteínas huésped en lugar de proteínas virales. Además, la eficacia y toxicidad de manidipina fueron monitoreadas in vivo, con manidipina demostrando una actividad antiviral efectiva con biocompatibilidad favorable. Sin embargo, la dosis utilizada en este estudio fue mayor que la dosis típicamente utilizada clínicamente, representando uno de los escenarios más comúnmente encontrados en la repurposición de fármacos (33, 34). Como manidipina fue aprobada para el tratamiento a largo plazo de la hipertensión (35, 36), el tratamiento de dosis de pulso con manidipina durante el período más corto requerido para el tratamiento de la infección viral podría ser relativamente Además, el uso de una combinación de manidipina con otros inhibidores de Ca 2 podría mejorar su eficacia terapéutica, reducir su toxicidad y reducir el riesgo de desarrollo de resistencia (37) (39). Además de los tres inhibidores de VGCC, dos fármacos afectados, pimecrolimus y mesilato de nelfinavir, mostraron actividades inhibitorias equivalentes en la replicación de JEV, ZIKV, WNV y DENV-2. Aunque no se ha reportado el uso de pimecrolimus para el tratamiento de enfermedades infecciosas, se demostró que tuvo un efecto robusto contra JEV con un SI de 32. La concentración plasmática máxima (C max ) de mesilato de nelfinavir alcanzado con una dosis adulta fue de 3 a 4 g/ml (40), lo que fue comparable al IC 50 reportado aquí. En particular, se confirmó que el mesilato de nelfinavir inhibe el virus del herpes simplex 1 (HSV-1) y la replicación de varios otros herpesvirus interfiriendo directa o indirectamente con los pasos posteriores de la formación del virus, como la maduración de la glucoproteína o la liberación de virus, además de funcionar en la proteasa del herpesvirus (41, 42). Se desconoce si el mesilato de nelfinavir inhibe el flavivirus por interferencia con la proteasa del virus o por otros efectos no deseados. La comprensión del mecanismo de los efectos antiflavivirus de estos fármacos podría descubrir nuevos objetivos de los medicamentos, proporcionando una visión más profunda de la patogénesis de los flavivirus. Las células BHK-21, SH-SY5Y (neurblastoma humano), Vero, y Huh-7 fueron cultivadas en el medio de águila modificado Dulbecco (HyClone, Logan, UT, USA) complementado con 10% de suero bovino fetal (Gibco, Grand Island, NY, USA). La cepa JEV AT31, el replicado WNV, y el replicado DENV-2 que expresa Renilla luciferasa (Rluc) fueron amablemente proporcionados por Bo Zhang, Wuhan Institute of Virology, Academia China de Ciencias (CAS), China. Las partículas virales recombinantes de JEV replicon (RVPs) fueron generadas como se describió previamente (4, 5). La cepa H/PF/2013 de ZIKV, amablemente proporcionada por el Archivo Europeo de Virus Goes Global, fue propagada y titulada en La densidad celular y la dosis de RVP fueron optimizadas para el ensayo de HTS. Las células de Vero en diferentes densidades (2.500 a 12.500 células por pozo) fueron infectadas con RVPs de 1,25 a 20 l (1 a 16 copias por pozo). La densidad celular apropiada así como la dosis de RVP fueron seleccionadas comparando la relación S/B, CV y valores de Z= en diferentes condiciones como se describió previamente (43). Se utilizaron metil--ciclodextrina y sulfóxido de dimetilo (DMSO) como controles positivos y negativos respectivamente. Ensayo de HTS de una biblioteca compuesta aprobada por la FDA. Se compró una biblioteca de 1.018 medicamentos aprobados por la FDA a Selleck Chemicals (Houston, TX, EE.UU.). Los compuestos fueron almacenados como soluciones de stock de 10 mM en DMSO a 4°C hasta su uso. La primera ronda del ensayo de H Los criterios utilizados para identificar los candidatos primarios no fueron citotoxicidad aparente y un nivel medio de inhibición de 90% en pozos duplicados. Los criterios de inhibición dosis-dependiente y viabilidad celular de 80% se aplicaron para la pantalla de reconfirmación. Además, se calculó el CC 50 de cada compuesto, y los compuestos que mostraban SI mayores de 10 fueron considerados hits en este estudio. Identificación de efectos antivirales de cinco fármacos golpeados. Los efectos antivirales de los fármacos fueron evaluados mediante transcripción cuantitativa inversa-PCR (qRT-PCR), ensayo de inmunofluorescencia (IFA), y ensayo de placa como se informó previamente (44) (45) (46) (47). El cronograma experimental se describe en la figura 2A. Para asegurar la efectividad de los fármacos afectados en la replicación de flavivirus, se incubaron células BHK-21 transfectadas con el JEV, WNV o DENV-2 con cada fármaco en las concentraciones indicadas anteriormente, y se determinaron las actividades de luciferasa 24 h, 48 h o 72 h más tarde, respectivamente. Experimentación de tiempo de adición. Para evaluar qué etapa del ciclo de vida del JEV fue inhibida por cada golpe, se realizó un experimento de tiempo de adición como se describió previamente (43). Las células Vero fueron infectadas con 20 l de VPR durante 1 h (0 a 1 h). Los compuestos de prueba fueron incubados con las células durante 1 h antes de la infección (1 a 0 h), durante la infección (0 a 1 h), y durante 23 h postinfección (1 a 24 h) (fig. 3A). Para excluir un posible efecto inactivador directo de los fármacos, los RVP fueron incubados con cada fármaco a 37°C durante 1 h, y las mezclas fueron diluidas 25 veces para infectar las células Vero. Veinticuatro horas después, las actividades de luciferasa se determinaron como se describe anteriormente (Fig. 3A). Virus resistente a manidipina. Virus resistente a manidipina fue generado por transpiración de JEV en células Vero en presencia de manidipina. Pasajes 1 a 10 usaron 5 M manidipina, y pasajes 11 a 20 usaron 10 M manidipina. Como control, el virus WT fue pasaje en presencia de 2 % DMSO en paralelo. El pasaje fue terminado en el pasaje 20, cuando no se detectó ninguna mejoría adicional en la resistencia. Dos aislados del virus resistente a manidipina fueron purificados en placa y amplificados en presencia El ARN viral fue extraído, amplificado y purificado para la secuenciación. Se utilizó un clon cDNA infeccioso de JEV, cepa AT31 (pMWJEAT), amablemente proporcionado por T. Wakita, Instituto Metropolitano de Neurociencia de Tokio, para recuperar los virus WT y mutantes, como se describió anteriormente (4). Los títulos de virus y sensibilidades manidipinas fueron determinados por el ensayo de placa en células Vero. La administración de manidipina a ratones infectados por JEV. Los ratones adultos BALB/c (edad, 4 semanas) fueron mantenidos en el Centro Animal de Laboratorio del Instituto de Virología Wuhan, CAS (Wuhan, China). Los ratones fueron divididos aleatoriamente en cuatro grupos (30 ratones por grupo): un JEV infectado y un vehículo (2% Tween 80 plus 5% DMSO en el grupo tratado con solución salina fosfatada [PBS]), un grupo tratado con manidipino, un grupo tratado con JEV infectado y manidipino, y un grupo tratado con vehículo. Para la infección, los ratones fueron infectados intraperitonealmente con 5 10 6 UFP de cepa JEV AT31. Para el tratamiento con manidipino y vehículo, los ratones fueron inyectados intraperitonealmente con 25 mg/kg de peso corporal manidipino o PBS con 2% Tween 80 y 5% DMSO, respectivamente. Los tratamientos fueron administrados dos veces al día durante los primeros 2 días y luego administrados consecutivamente una vez al día durante 21 días. Cinco ratones de cada grupo fueron sacrificados en los días 1, 3 y 5 Se recogieron muestras de sero, tejido del bazo y tejido cerebral para la determinación del título viral y la investigación histopatológica. Quince ratones fueron monitorizados diariamente por morbilidad y mortalidad. Los ratones que mostraron signos neurológicos de enfermedad fueron eutanasiados de acuerdo con el Reglamento para la Administración de Asuntos relativos a Animales Experimentales en China. Los protocolos fueron revisados y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso Animal de Laboratorio del Instituto de Virología Wuhan, CAS (Wuhan, China).

¿Dónde se encuentra el Q130 en la proteína NS4B?

El cribado de fármacos aprobados por la FDA para inhibidores de la infección por el virus de la encefalitis japonesahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5640845/SHA: 1bd2f6497996fc0fccd8dffd7f848446d3d36f964Autores: Wang, Shaobo; Liu, Yang; Guo, Jiao; Wang, Peilin; Zhang, Leike; Xiao, Gengfu; Wang, WeiFecha: 2017-10-13DOI: 10.1128/jvi.01055-17Licencia: cc-byResumen: virus de la encefalitis japonesa (JEV), un flavivirus transmitido por artrópodos, es una de las principales causas de la encefalitis viral aguda en No se dispone de ningún medicamento aprobado para el tratamiento específico de las infecciones por JEV, y las vacunas disponibles no son eficaces contra todos los aislados clínicos de JEV. En el estudio descrito aquí, se realizó una revisión de alto rendimiento de una biblioteca de medicamentos aprobada por la FDA para inhibidores del JEV. Se identificaron cinco fármacos afectados que inhibieron la infección por JEV con un índice selectivo de >10. También se validaron las actividades antivirales de estos cinco fármacos afectados contra otros flavivirus, incluido el virus Zika. El análisis de mutantes adaptativos reveló que la sustitución de Q130, ubicada en el dominio transmembrana 3 de la proteína NS4B no estructural, que se conserva relativamente en flavivirus, con la resistencia de JEV conferida a la manidipina R o K, un inhibidor del canal Ca(2+) activado por voltaje (VGCC), sin una pérdida aparente del perfil de crecimiento viral. Además, se indicó que manidipina protegía a ratones contra la letalidad inducida por JEV disminuyendo la carga viral en el cerebro, mientras que abrogaba los cambios histopatológicos asociados a la infección por JEV. Este estudio proporciona cinco candidatos a antiflavivirus e identifica el calcio citoplasmático como un nuevo objetivo antiviral para el tratamiento de la infección por JEV. Los hallazgos reportados aquí proporcionan posibilidades terapéuticas para combatir infecciones causadas por flavivirus. La reutilización de fármacos aprobados aceleraría el desarrollo de una estratagema terapéutica. En este estudio, examinamos una biblioteca de fármacos aprobados por la FDA e identificamos cinco fármacos afectados, especialmente inhibidores del calcio, que ejercen actividad antiflavivirus que bloquea la replicación viral. La eficacia in vivo y la toxicidad de manidipina fueron investigados con un modelo de ratón de infección por JEV, y el objetivo viral fue identificado generando un mutante adaptativo. Texto: Los lavivirus F están clasificados taxonómicamente en el género Flavivirus y la familia Flaviviridae. Estos virus comprenden más de 70 patógenos diferentes, como el virus japonés de la encefalitis (JEV), el virus Zika (ZIKV), el virus del dengue (DEV), el virus del Nilo Occidental (WNVW), y el virus de la fiebre amarilla (YFV). La mayoría de los flavivirus El desarrollo y uso de vacunas contra algunos flavivirus, como el JEV, el YFV y el virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (TBEV), han disminuido las tasas de morbilidad y mortalidad por infecciones causadas por estos virus (2) ; sin embargo, las enfermedades inducidas por flavivirus siguen siendo pandemias, y hay pocas terapias disponibles además de los cuidados intensivos de apoyo. Los flavivirus tienen un genoma de ARN de aproximadamente 11 kb de cadena positiva que contiene un único marco de lectura abierto (ORF) flanqueado por regiones no traducidas (UTR) en ambos termini. El ORF codifica tres proteínas estructurales, incluyendo el capsid (C), membrana (premembrana [prM] y membrana [M]), y envoltorio (E) y siete proteínas no estructurales (NS1, NS2A, NS2B, Estas siete proteínas no estructurales participan en la replicación viral, el ensamblaje del virión y el escape del virus de la vigilancia inmune. Hasta la fecha, no hay antivirales específicos con actividad contra los flavivirus. Para ello, realizamos una pantalla de una biblioteca de 1.018 medicamentos aprobados por la FDA. Dado que los flavivirus son similares en estructura y patogénesis, primero utilizamos el JEV como prototipo para examinar la biblioteca de medicamentos y posteriormente validamos las actividades antivirales con ZIKV, WNV y DENV tipo 2 (DEV-2). Los fármacos afectados identificados en este estudio ofrecen nuevas terapias potenciales para el tratamiento de la infección y enfermedad por flavivirus. Para seleccionar inhibidores se utilizaron partículas virales recombinantes (RVP) con el replicon notificado por luciferasa envuelto por las proteínas estructurales del JEV, con un enfoque en aquellos que inhiben la entrada y replicación del virus, mediante un ensayo de detección de alto rendimiento (HTS) (4, 5). Se determinó que el número de copias de RVP de ARN genómico era de 8,4 10 6 copias/ml utilizando una curva estándar generada con plásmidos que transportaban el clon infeccioso. Las condiciones de ensayo del HTS, incluyendo la densidad celular de siembra y la dosis de RVP, fueron optimizadas para ser 10.000 células por placa de 96 pocillos y 20 l (16 copias/célula) RVP para la dosis infecciosa, respectivamente. En las condiciones optimizadas, la relación señal-basal (S/B), el coeficiente de variación (CV) y el factor Z= fueron 38.374, 2,8% y 0.89, respectivamente, lo que demostró que el ensayo era robusto y adecuado para el cribado a gran escala de compuestos. Se seleccionó un esquema del ensayo HTS en la Fig. 1B. Después de tres rondas de cribado, cinco hits con un índice selectivo (SI; que es igual a la concentración citotóxica del 50% [CC 50 [ concentración inhibitoria del 50% [IC 50 ]]) de 10. Los valores CC 50 de los fármacos afectados exhibidos en la Fig. 1B fueron similares a los publicados anteriormente para diversos sistemas celulares pero determinados utilizando diferentes ensayos de toxicidad (6) (7) (8) (9) (10) (12) (13) (13). Tres de los fármacos afectados, manidipino, cilnidipino y hidrocloruro de benidipina, fueron antagonistas del canal Ca 2 (VGCC) activados por dihidropiridina, mientras que el pimecrolimus es un inhibidor de la secreción inflamatoria de citoquinas y el mesilato de nelfinavir es un bloqueador de proteasa VIH-1. Todos los cinco fármacos afectados mostraron una inhibición dosis-dependiente de la infección por JEV RVP (Fig. 1C). Para validar el efecto antiviral, los fármacos afectados fueron comprados de otras fuentes comerciales y probados. En la pantalla de reconfirmación, todos los fármacos afectados mostraron efectos antivirales y citotóxicos similares a los encontrados en la pantalla primaria. Validación de los fármacos afectados. Para verificar los resultados obtenidos por los ensayos del reportero de luciferasa, también investigamos Como se esperaba del ensayo HTS, los cinco fármacos inhibieron robustamente la producción de virus, con una reducción de aproximadamente 4 a 5 unidades log en la concentración más alta y una disminución de aproximadamente 1 log-unidad con 2,5 M los fármacos (Fig. 2B). También se detectó una fuerte disminución de los niveles de ARN JEV (Fig. 2C). Los niveles de ARN atenuados en los grupos de dosis altas, dosis media y dosis bajas fueron todos superiores al 40%. En particular, en el grupo tratado con manidipina, el efecto inhibitorio fue al menos del 80% en comparación con el control, que mostró una fuerte inhibición de la replicación viral. Coherente con la inhibición de la replicación y producción del virus, la expresión de la proteína estructural viral prM fue apenas detectable después del tratamiento con los fármacos en la concentración alta (Fig. 2D) 2 confirmó que los cinco fármacos afectados inhibieron in vitro la infección por JEV de forma dosis-dependiente. Los fármacos inhiben la infección por JEV durante la síntesis del ARN viral. Debido a que los RVP, que tienen un sobre natural similar al virus en el exterior y un replicon en el interior, permitieron la cuantificación de la entrada y replicación productiva del JEV, se realizó un experimento de tiempo de adición para investigar si los fármacos afectados bloquearon el paso de entrada o el paso de replicación. Como se muestra en la Fig. 3B, no se observó supresión de la actividad de luciferasa por cualquiera de los fármacos afectados cuando se utilizaron como tratamientos antes de la infección o durante la infección o como virúcida, sugiriendo que estos fármacos no inhiben la infección por JEV ya sea inactivando el virus directamente o bloqueando la entrada del JEV. Sin embargo, estos Para confirmar esta sugerencia, se investigaron los efectos inhibidores de estos fármacos en el JEV replicon. La concentración más alta de manidipino y mesilato de nelfinavir en las células de hámster bebé (BHK-21) se ajustó a 5 M y 10 M, respectivamente. Se demostró que los cinco fármacos inhiben la síntesis del ARN del JEV de manera dependiente de la dosis, mientras que ninguno de ellos inhibió la traducción inicial del ARN del réplico (5, 14) (Fig. 3C), confirmando que estos fármacos inhibieron la infección del JEV en la etapa de replicación. Los fármacos hit exhiben actividad antiflavivirus de amplio espectro. Para determinar si la actividad antiviral de los cinco fármacos afectados se extendió a otros flavivirus, exploramos su efecto antiviral contra ZIKV. Similar a los hallazgos para JEV, el título de ZIKV fue disminuido por unidades de registro múltiples cuando ZIKV fue tratado con una alta concentración de cada uno de los fármacos (Fig. 4A). Además, ZIKV mostró una mayor sensibilidad a los dos inhibidores de canales de calcio manidipina y cilnidipina que JEV, sin que se observe formación de placa a 10 M. De acuerdo con este resultado, se detectaron también disminuciones bruscas en el nivel de replicación del ARN de ZIKV y el nivel de expresión de proteína viral (Fig. 4A). Cabe destacar que el tratamiento con 5 M manidipina produjo una inhibición del 95% de la replicación viral, traducción y rendimientos virales. Tomados juntos, estos resultados indican que los fármacos afectados podrían efectivamente inhibir la infección por ZIKV. Dado que estos fármacos exhibieron sus efectos anti-JEV en la etapa de replicación viral, se probaron además los efectos contra WNV y DENV-2 mediante el uso de los replicadores WNV y DENV-2. Al igual que los resultados para JEV, se observó una reducción dosis-dependiente en el nivel de replicación de WNV con los tratamientos farmacológicos. El mismo fenotipo se observó para DENV-2 para todos los fármacos excepto mesilato de nelfinavir, que no mostró ningún efecto en las concentraciones probadas (fig. 4B y C). Juntos, estos resultados indican que los cinco fármacos afectados son excelentes candidatos para el tratamiento antiflavivirus de amplio espectro. Efecto antiviral de inhibidores del calcio. Ya que tres fármacos afectados, manidipina, cilnidipina e hidrocloruro de benidipina, eran inhibidores de DHP VGC Verapamil, un prototipo de inhibidor de fenilalquilamina (PAA) VGCC (15), mostró una inhibición dosis-dependiente del JEV tanto en el riñón de mono verde africano (Vero) como en las células de carcinoma hepatocelular humano (Huh-7) (Fig. 5), lo que fue consistente con los efectos inhibitorios de los inhibidores del DHP, sugiriendo que los canales de calcio juegan un papel importante en la infección por JEV. También se encontró que la ciclosporina y el borato de 2-aminobifenilo (2-APB), que inhiben el eflujo de Ca 2 del grupo mitocondrial y endoplasmático (ER), respectivamente (16) (17) (18) (19), bloquean eficazmente la infección por JEV. Del mismo modo, el tratamiento con el quelante celular Ca 2 1,2-bis-(o-aminofenoxi)-etano-N,N,N=,N=-tetraacético, ester tetraacetoximetilo (BAPTA-AM), también podría suprimir la infección por JEV. Tomado en conjunto, se concluyó que el Ca 2 intracelular es esencial para la infección por JEV y el calcio citoplasmático es un objetivo potente para el tratamiento con antiflavivirus. Selección y caracterización del JEV resistente a manidipina. Para identificar el objetivo viral del inhibidor del canal de calcio, se seleccionó un virus resistente a manidipino por transpiración serial del JEV en presencia de manidipina. Los virus del pasaje 20 (P20) mostraron resistencia robusta en comparación con el tipo salvaje (WT) (Fig. 6A ). Cuando el JEV de P20 fue tratado con 5 M o 10 M manidipina, el título viral fue aproximadamente 10 y 100 veces más alto que el del WT, respectivamente. Los clones individuales del virus fueron aislados, y dos aislados fueron seleccionados aleatoriamente y amplificados. Se observó una sustitución de aminoácidos en dos clones aislados, resultando en un cambio de glutamina (Q) a a arginina (R) en la posición de aminoácido 130 en el dominio transmembrana 3 (TMD3) de NS4B, es decir, la posición 2401 de la poliproteína traducida en el clon cDNA infeccioso JEV (Fig. 6B ). La alineación secuencial de NS4B indicó que el Q130 fue conservado en todos los flavivirus excepto YFV, que poseía una lisina en esa posición (Fig. 6B ). El Q130 conservado de NS4B puede explicar la sensibilidad de JEV, ZIKV, WNV y DENV-2 a manidipina, como se describe anteriormente (Fig. 4), mientras que el YFV mostró resistencia al fármaco (datos no mostrados). Para confirmar que la mutación Q130R confirió resistencia a manidipina e investigar el papel del Q130 en la función NS4B, produjimos clones de JEV con la mutación Q130R, Q130K, Q130E o Q130A introduciendo las mutaciones deseadas en el clon de ADNc infeccioso y rescatando los virus mutantes. Para investigar las propiedades biológicas de los virus mutantes, primero examinamos la cinética de crecimiento de los virus rescatados. Como se muestra en la Fig. 6C, todos los virus mutantes tuvieron una acumulación de viriones infecciosas y alcanzaron el título La infección de los virus mutantes Q130R y Q130K resultó en curvas de crecimiento similares a la curva de crecimiento para el WT (Fig. 6C), mientras que los mutantes Q130E y Q130A produjeron cantidades menores de virus entre 24 y 60 h. El análisis de la morfología de la placa reveló que las placas de los mutantes Q130R, Q130K y Q130E eran similares a las placas del WT, mientras que las placas del mutante Q130A eran menores que las del WT. A continuación se investigó la sensibilidad de los cuatro virus mutantes a manidipino. Como se muestra en la figura 6D, los virus mutantes Q130R y Q130K eran resistentes a manidipino. En una concentración de 10 M, la manidipina inhibió eficientemente la infección WT JEV y redujo los rendimientos virales en aproximadamente 4 unidades log, mientras que los virus mutantes Q130R y Q130K fueron resistentes a la manidipina y el título viral disminuyó menos de 2 unidades log.El virus mutante Q130A demostró resistencia moderada y un poco más alto Tomado juntos, se pudo concluir que Q130 no sólo es crítico para conferir sensibilidad a la manidipina sino que también es importante para la replicación del JEV. El reemplazo de glutamina por aminoácidos básicos confirió resistencia a la manidipina sin una aparente pérdida de crecimiento. Eficacia in vivo de la manidipina. Como manidipina mostró las actividades inhibidoras más fuertes en la replicación del JEV, así como la infección por ZIKV cuando sus actividades se compararon con las de los cinco fármacos afectados ( 2 y 4A), examinamos además el efecto protector de la manidipina frente a la letalidad inducida por el JEV en un modelo de ratón. Como era de prever, los ratones del grupo tratado con el JEV comenzaron a mostrar síntomas, incluyendo parálisis en las extremidades, restricción de movimiento, piloerección, rigidez corporal y temblor en todo el cuerpo, a partir del día 5 postinfección. En los 21 días posteriores a la infección, la mayoría de los ratones del grupo infectado por el JEV sucumbieron a la infección, con una tasa de mortalidad del 73% (4 de 15 animales sobrevivieron). El tratamiento con manidipina tras la infección por el JEV redujo la tasa de mortalidad al 20% (12 de 15 animales sobrevivieron) (Fig. 7A ). Los ratones tratados con manidipina solos o tratados con manidipina e infectados con JEV mostraron poco comportamiento anormal, similar a los Para relacionar aún más estos efectos protectores con la carga viral y los cambios histopatológicos en el cerebro del ratón, se determinó el título viral y se recogieron y analizaron las secciones cerebrales del ratón en el día 5 y el día 21 postinfección, ya que los ratones comenzaron a mostrar síntomas de infección por JEV desde el día 5 postinfección y la mayoría de los ratones sobrevivientes se habían recuperado en el día 21. Los resultados indicaron que, durante la progresión de la enfermedad, el tratamiento con manidipina redujo significativamente la carga viral en ratones infectados en comparación con la de ratones infectados que no recibían tratamiento, mientras que no se formaron placas ni en el grupo tratado con manidipino ni en el vehículo, y las cargas virales fueron indetectables en cada grupo el día 21 postinfección (fig. 7B). Como el JEV fue rápidamente eliminado de la sangre después de la inoculación y estuvo presente en el sistema linfático durante la fase preclínica, los efectos de la manidipina sobre la infección del suero y el bazo fueron evaluados en momentos anteriores para detectar si el fármaco redujo las cargas virales periféricas (20, 21). Como se muestra en la figura 7C, la manidipina tuvo poco efecto sobre la infección periférica del JEV, lo que indica que la manidipina protegió a los ratones contra la letalidad inducida por el JEV al disminuir la carga viral en el cerebro. Del mismo modo, se observó un daño aparente en el cerebro, incluyendo meningitis, manguitos perivasculares, degeneración vacuolar y nódulos gliales en el grupo infectado y tratado con JEV el día 5 de postinfección, mientras que el tratamiento con manidipina aliviaba notablemente estos Estos resultados indican que el alivio de los cambios histopatológicos fue acompañado por una reducción de la carga viral, así como una reducción en la tasa de mortalidad, confirmando aún más los efectos curativos de la manidipina sobre la encefalitis viral. Entre los cinco fármacos golpeados, manidipina, cilnidipina e hidrocloruro de benidipina fueron inhibidores del VGCC. Se ha documentado bien en la literatura que los inhibidores del Ca 2 sirven para inhibir la infección viral en la etapa de entrada (15, 22) o replicación (18) e incluso en la etapa de brote (23). Con este fin, primero revisamos los 21 inhibidores del calcio incluidos en la actual biblioteca de fármacos aprobados por la FDA y encontramos que, además de los cuatro inhibidores del DHP VGCC enumerados en la Fig. El 1B, otros dos inhibidores de calcio, es decir, dihidrocloruro de flunarizina y clorhidrato de lomerizina, también fueron identificados como candidatos primarios con niveles de inhibición de 90%. Del mismo modo, tres antagonistas de los canales de calcio, nisoldipino, felodipino y clorhidrato de nicardipina, mostraron niveles de inhibición de 75%, 72% y 66%, respectivamente, en la pantalla primaria. Juntos, 9 de los 21 inhibidores de calcio de la biblioteca, que representan casi la mitad de los inhibidores de calcio, mostraron niveles de inhibición de flavivirus superiores al 50%, lo que sugiere que el calcio, especialmente el canal de calcio, es un potencial objetivo antiviral. Para abordar este, se investigó otro tipo de inhibidor del VGCC, verapamilo, un fármaco aprobado por la FDA que aún no se incluye en la biblioteca de medicamentos utilizada en este Del mismo modo, un quelante Ca 2, BAPTA-AM, así como los inhibidores Ca 2 2-APB y ciclosporina, dirigidos a la ER y el canal mitocondrial Ca 2, respectivamente, fueron empleados para investigar la respuesta de la infección por JEV a la disminución de los niveles intracelulares de Ca 2. En línea con las actividades de los tres fármacos inhibidores DHP VGCC golpeados, los inhibidores adicionales Ca 2 ejercieron actividad anti-JEV, lo que indicó que Ca 2 es indispensable para la infección por JEV. Así, los inhibidores Ca 2 podrían ser utilizados como tratamientos eficaces para la infección por flavivirus. Como los fármacos afectados ejercieron actividad inhibitoria completa cuando fueron añadidos al tratamiento, creemos que Ca 2 es importante para la replicación del genoma del flavivirus. Además, la selección y el análisis genético de NS4B es parte del complejo de replicación viral y se supone que ancla la replicasa viral a la membrana ER (24). Mientras tanto, el dominio N-terminal 125aminoácido de DENV NS4B fue indicado como responsable de la inhibición de la respuesta inmune (25). En particular, varios compuestos estructuralmente distintos han sido identificados para inhibir la replicación de flavivirus al dirigir intensivamente la TMD de NS4B (26) (27) (28) (29) (30) (31) (32). Es así concebible que los inhibidores que se dirigen a la TMD de NS4B perturben su función, lo que conduce a la supresión de la replicación de ARN viral. En este estudio, la sustitución de Q130 de NS4B por un aminoácido básico confirió el efecto de resistencia sin suprimir la replicación del JEV, sugiriendo que la posición 130 podría tolerar un aminoácido básico y que el aminoácido básico podría estar involucrado en la interacción del NS4B con proteínas huésped en lugar de proteínas virales. Además, la eficacia y toxicidad de manidipina fueron monitoreadas in vivo, con manidipina demostrando una actividad antiviral efectiva con biocompatibilidad favorable. Sin embargo, la dosis utilizada en este estudio fue mayor que la dosis típicamente utilizada clínicamente, representando uno de los escenarios más comúnmente encontrados en la repurposición de fármacos (33, 34). Como manidipina fue aprobada para el tratamiento a largo plazo de la hipertensión (35, 36), el tratamiento de dosis de pulso con manidipina durante el período más corto requerido para el tratamiento de la infección viral podría ser relativamente Además, el uso de una combinación de manidipina con otros inhibidores de Ca 2 podría mejorar su eficacia terapéutica, reducir su toxicidad y reducir el riesgo de desarrollo de resistencia (37) (39). Además de los tres inhibidores de VGCC, dos fármacos afectados, pimecrolimus y mesilato de nelfinavir, mostraron actividades inhibitorias equivalentes en la replicación de JEV, ZIKV, WNV y DENV-2. Aunque no se ha reportado el uso de pimecrolimus para el tratamiento de enfermedades infecciosas, se demostró que tuvo un efecto robusto contra JEV con un SI de 32. La concentración plasmática máxima (C max ) de mesilato de nelfinavir alcanzado con una dosis adulta fue de 3 a 4 g/ml (40), lo que fue comparable al IC 50 reportado aquí. En particular, se confirmó que el mesilato de nelfinavir inhibe el virus del herpes simplex 1 (HSV-1) y la replicación de varios otros herpesvirus interfiriendo directa o indirectamente con los pasos posteriores de la formación del virus, como la maduración de la glucoproteína o la liberación de virus, además de funcionar en la proteasa del herpesvirus (41, 42). Se desconoce si el mesilato de nelfinavir inhibe el flavivirus por interferencia con la proteasa del virus o por otros efectos no deseados. La comprensión del mecanismo de los efectos antiflavivirus de estos fármacos podría descubrir nuevos objetivos de los medicamentos, proporcionando una visión más profunda de la patogénesis de los flavivirus. Las células BHK-21, SH-SY5Y (neurblastoma humano), Vero, y Huh-7 fueron cultivadas en el medio de águila modificado Dulbecco (HyClone, Logan, UT, USA) complementado con 10% de suero bovino fetal (Gibco, Grand Island, NY, USA). La cepa JEV AT31, el replicado WNV, y el replicado DENV-2 que expresa Renilla luciferasa (Rluc) fueron amablemente proporcionados por Bo Zhang, Wuhan Institute of Virology, Academia China de Ciencias (CAS), China. Las partículas virales recombinantes de JEV replicon (RVPs) fueron generadas como se describió previamente (4, 5). La cepa H/PF/2013 de ZIKV, amablemente proporcionada por el Archivo Europeo de Virus Goes Global, fue propagada y titulada en La densidad celular y la dosis de RVP fueron optimizadas para el ensayo de HTS. Las células de Vero en diferentes densidades (2.500 a 12.500 células por pozo) fueron infectadas con RVPs de 1,25 a 20 l (1 a 16 copias por pozo). La densidad celular apropiada así como la dosis de RVP fueron seleccionadas comparando la relación S/B, CV y valores de Z= en diferentes condiciones como se describió previamente (43). Se utilizaron metil--ciclodextrina y sulfóxido de dimetilo (DMSO) como controles positivos y negativos respectivamente. Ensayo de HTS de una biblioteca compuesta aprobada por la FDA. Se compró una biblioteca de 1.018 medicamentos aprobados por la FDA a Selleck Chemicals (Houston, TX, EE.UU.). Los compuestos fueron almacenados como soluciones de stock de 10 mM en DMSO a 4°C hasta su uso. La primera ronda del ensayo de H Los criterios utilizados para identificar los candidatos primarios no fueron citotoxicidad aparente y un nivel medio de inhibición de 90% en pozos duplicados. Los criterios de inhibición dosis-dependiente y viabilidad celular de 80% se aplicaron para la pantalla de reconfirmación. Además, se calculó el CC 50 de cada compuesto, y los compuestos que mostraban SI mayores de 10 fueron considerados hits en este estudio. Identificación de efectos antivirales de cinco fármacos golpeados. Los efectos antivirales de los fármacos fueron evaluados mediante transcripción cuantitativa inversa-PCR (qRT-PCR), ensayo de inmunofluorescencia (IFA), y ensayo de placa como se informó previamente (44) (45) (46) (47). El cronograma experimental se describe en la figura 2A. Para asegurar la efectividad de los fármacos afectados en la replicación de flavivirus, se incubaron células BHK-21 transfectadas con el JEV, WNV o DENV-2 con cada fármaco en las concentraciones indicadas anteriormente, y se determinaron las actividades de luciferasa 24 h, 48 h o 72 h más tarde, respectivamente. Experimentación de tiempo de adición. Para evaluar qué etapa del ciclo de vida del JEV fue inhibida por cada golpe, se realizó un experimento de tiempo de adición como se describió previamente (43). Las células Vero fueron infectadas con 20 l de VPR durante 1 h (0 a 1 h). Los compuestos de prueba fueron incubados con las células durante 1 h antes de la infección (1 a 0 h), durante la infección (0 a 1 h), y durante 23 h postinfección (1 a 24 h) (fig. 3A). Para excluir un posible efecto inactivador directo de los fármacos, los RVP fueron incubados con cada fármaco a 37°C durante 1 h, y las mezclas fueron diluidas 25 veces para infectar las células Vero. Veinticuatro horas después, las actividades de luciferasa se determinaron como se describe anteriormente (Fig. 3A). Virus resistente a manidipina. Virus resistente a manidipina fue generado por transpiración de JEV en células Vero en presencia de manidipina. Pasajes 1 a 10 usaron 5 M manidipina, y pasajes 11 a 20 usaron 10 M manidipina. Como control, el virus WT fue pasaje en presencia de 2 % DMSO en paralelo. El pasaje fue terminado en el pasaje 20, cuando no se detectó ninguna mejoría adicional en la resistencia. Dos aislados del virus resistente a manidipina fueron purificados en placa y amplificados en presencia El ARN viral fue extraído, amplificado y purificado para la secuenciación. Se utilizó un clon cDNA infeccioso de JEV, cepa AT31 (pMWJEAT), amablemente proporcionado por T. Wakita, Instituto Metropolitano de Neurociencia de Tokio, para recuperar los virus WT y mutantes, como se describió anteriormente (4). Los títulos de virus y sensibilidades manidipinas fueron determinados por el ensayo de placa en células Vero. La administración de manidipina a ratones infectados por JEV. Los ratones adultos BALB/c (edad, 4 semanas) fueron mantenidos en el Centro Animal de Laboratorio del Instituto de Virología Wuhan, CAS (Wuhan, China). Los ratones fueron divididos aleatoriamente en cuatro grupos (30 ratones por grupo): un JEV infectado y un vehículo (2% Tween 80 plus 5% DMSO en el grupo tratado con solución salina fosfatada [PBS]), un grupo tratado con manidipino, un grupo tratado con JEV infectado y manidipino, y un grupo tratado con vehículo. Para la infección, los ratones fueron infectados intraperitonealmente con 5 10 6 UFP de cepa JEV AT31. Para el tratamiento con manidipino y vehículo, los ratones fueron inyectados intraperitonealmente con 25 mg/kg de peso corporal manidipino o PBS con 2% Tween 80 y 5% DMSO, respectivamente. Los tratamientos fueron administrados dos veces al día durante los primeros 2 días y luego administrados consecutivamente una vez al día durante 21 días. Cinco ratones de cada grupo fueron sacrificados en los días 1, 3 y 5 Se recogieron muestras de sero, tejido del bazo y tejido cerebral para la determinación del título viral y la investigación histopatológica. Quince ratones fueron monitorizados diariamente por morbilidad y mortalidad. Los ratones que mostraron signos neurológicos de enfermedad fueron eutanasiados de acuerdo con el Reglamento para la Administración de Asuntos relativos a Animales Experimentales en China. Los protocolos fueron revisados y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso Animal de Laboratorio del Instituto de Virología Wuhan, CAS (Wuhan, China).

¿Cuántos patógenos diferentes son miembros de la familia Flaviviridae del virus?

El cribado de fármacos aprobados por la FDA para inhibidores de la infección por el virus de la encefalitis japonesahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5640845/SHA: 1bd2f6497996fc0fccd8dffd7f848446d3d36f964Autores: Wang, Shaobo; Liu, Yang; Guo, Jiao; Wang, Peilin; Zhang, Leike; Xiao, Gengfu; Wang, WeiFecha: 2017-10-13DOI: 10.1128/jvi.01055-17Licencia: cc-byResumen: virus de la encefalitis japonesa (JEV), un flavivirus transmitido por artrópodos, es una de las principales causas de la encefalitis viral aguda en No se dispone de ningún medicamento aprobado para el tratamiento específico de las infecciones por JEV, y las vacunas disponibles no son eficaces contra todos los aislados clínicos de JEV. En el estudio descrito aquí, se realizó una revisión de alto rendimiento de una biblioteca de medicamentos aprobada por la FDA para inhibidores del JEV. Se identificaron cinco fármacos afectados que inhibieron la infección por JEV con un índice selectivo de >10. También se validaron las actividades antivirales de estos cinco fármacos afectados contra otros flavivirus, incluido el virus Zika. El análisis de mutantes adaptativos reveló que la sustitución de Q130, ubicada en el dominio transmembrana 3 de la proteína NS4B no estructural, que se conserva relativamente en flavivirus, con la resistencia de JEV conferida a la manidipina R o K, un inhibidor del canal Ca(2+) activado por voltaje (VGCC), sin una pérdida aparente del perfil de crecimiento viral. Además, se indicó que manidipina protegía a ratones contra la letalidad inducida por JEV disminuyendo la carga viral en el cerebro, mientras que abrogaba los cambios histopatológicos asociados a la infección por JEV. Este estudio proporciona cinco candidatos a antiflavivirus e identifica el calcio citoplasmático como un nuevo objetivo antiviral para el tratamiento de la infección por JEV. Los hallazgos reportados aquí proporcionan posibilidades terapéuticas para combatir infecciones causadas por flavivirus. La reutilización de fármacos aprobados aceleraría el desarrollo de una estratagema terapéutica. En este estudio, examinamos una biblioteca de fármacos aprobados por la FDA e identificamos cinco fármacos afectados, especialmente inhibidores del calcio, que ejercen actividad antiflavivirus que bloquea la replicación viral. La eficacia in vivo y la toxicidad de manidipina fueron investigados con un modelo de ratón de infección por JEV, y el objetivo viral fue identificado generando un mutante adaptativo. Texto: Los lavivirus F están clasificados taxonómicamente en el género Flavivirus y la familia Flaviviridae. Estos virus comprenden más de 70 patógenos diferentes, como el virus japonés de la encefalitis (JEV), el virus Zika (ZIKV), el virus del dengue (DEV), el virus del Nilo Occidental (WNVW), y el virus de la fiebre amarilla (YFV). La mayoría de los flavivirus El desarrollo y uso de vacunas contra algunos flavivirus, como el JEV, el YFV y el virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (TBEV), han disminuido las tasas de morbilidad y mortalidad por infecciones causadas por estos virus (2) ; sin embargo, las enfermedades inducidas por flavivirus siguen siendo pandemias, y hay pocas terapias disponibles además de los cuidados intensivos de apoyo. Los flavivirus tienen un genoma de ARN de aproximadamente 11 kb de cadena positiva que contiene un único marco de lectura abierto (ORF) flanqueado por regiones no traducidas (UTR) en ambos termini. El ORF codifica tres proteínas estructurales, incluyendo el capsid (C), membrana (premembrana [prM] y membrana [M]), y envoltorio (E) y siete proteínas no estructurales (NS1, NS2A, NS2B, Estas siete proteínas no estructurales participan en la replicación viral, el ensamblaje del virión y el escape del virus de la vigilancia inmune. Hasta la fecha, no hay antivirales específicos con actividad contra los flavivirus. Para ello, realizamos una pantalla de una biblioteca de 1.018 medicamentos aprobados por la FDA. Dado que los flavivirus son similares en estructura y patogénesis, primero utilizamos el JEV como prototipo para examinar la biblioteca de medicamentos y posteriormente validamos las actividades antivirales con ZIKV, WNV y DENV tipo 2 (DEV-2). Los fármacos afectados identificados en este estudio ofrecen nuevas terapias potenciales para el tratamiento de la infección y enfermedad por flavivirus. Para seleccionar inhibidores se utilizaron partículas virales recombinantes (RVP) con el replicon notificado por luciferasa envuelto por las proteínas estructurales del JEV, con un enfoque en aquellos que inhiben la entrada y replicación del virus, mediante un ensayo de detección de alto rendimiento (HTS) (4, 5). Se determinó que el número de copias de RVP de ARN genómico era de 8,4 10 6 copias/ml utilizando una curva estándar generada con plásmidos que transportaban el clon infeccioso. Las condiciones de ensayo del HTS, incluyendo la densidad celular de siembra y la dosis de RVP, fueron optimizadas para ser 10.000 células por placa de 96 pocillos y 20 l (16 copias/célula) RVP para la dosis infecciosa, respectivamente. En las condiciones optimizadas, la relación señal-basal (S/B), el coeficiente de variación (CV) y el factor Z= fueron 38.374, 2,8% y 0.89, respectivamente, lo que demostró que el ensayo era robusto y adecuado para el cribado a gran escala de compuestos. Se seleccionó un esquema del ensayo HTS en la Fig. 1B. Después de tres rondas de cribado, cinco hits con un índice selectivo (SI; que es igual a la concentración citotóxica del 50% [CC 50 [ concentración inhibitoria del 50% [IC 50 ]]) de 10. Los valores CC 50 de los fármacos afectados exhibidos en la Fig. 1B fueron similares a los publicados anteriormente para diversos sistemas celulares pero determinados utilizando diferentes ensayos de toxicidad (6) (7) (8) (9) (10) (12) (13) (13). Tres de los fármacos afectados, manidipino, cilnidipino y hidrocloruro de benidipina, fueron antagonistas del canal Ca 2 (VGCC) activados por dihidropiridina, mientras que el pimecrolimus es un inhibidor de la secreción inflamatoria de citoquinas y el mesilato de nelfinavir es un bloqueador de proteasa VIH-1. Todos los cinco fármacos afectados mostraron una inhibición dosis-dependiente de la infección por JEV RVP (Fig. 1C). Para validar el efecto antiviral, los fármacos afectados fueron comprados de otras fuentes comerciales y probados. En la pantalla de reconfirmación, todos los fármacos afectados mostraron efectos antivirales y citotóxicos similares a los encontrados en la pantalla primaria. Validación de los fármacos afectados. Para verificar los resultados obtenidos por los ensayos del reportero de luciferasa, también investigamos Como se esperaba del ensayo HTS, los cinco fármacos inhibieron robustamente la producción de virus, con una reducción de aproximadamente 4 a 5 unidades log en la concentración más alta y una disminución de aproximadamente 1 log-unidad con 2,5 M los fármacos (Fig. 2B). También se detectó una fuerte disminución de los niveles de ARN JEV (Fig. 2C). Los niveles de ARN atenuados en los grupos de dosis altas, dosis media y dosis bajas fueron todos superiores al 40%. En particular, en el grupo tratado con manidipina, el efecto inhibitorio fue al menos del 80% en comparación con el control, que mostró una fuerte inhibición de la replicación viral. Coherente con la inhibición de la replicación y producción del virus, la expresión de la proteína estructural viral prM fue apenas detectable después del tratamiento con los fármacos en la concentración alta (Fig. 2D) 2 confirmó que los cinco fármacos afectados inhibieron in vitro la infección por JEV de forma dosis-dependiente. Los fármacos inhiben la infección por JEV durante la síntesis del ARN viral. Debido a que los RVP, que tienen un sobre natural similar al virus en el exterior y un replicon en el interior, permitieron la cuantificación de la entrada y replicación productiva del JEV, se realizó un experimento de tiempo de adición para investigar si los fármacos afectados bloquearon el paso de entrada o el paso de replicación. Como se muestra en la Fig. 3B, no se observó supresión de la actividad de luciferasa por cualquiera de los fármacos afectados cuando se utilizaron como tratamientos antes de la infección o durante la infección o como virúcida, sugiriendo que estos fármacos no inhiben la infección por JEV ya sea inactivando el virus directamente o bloqueando la entrada del JEV. Sin embargo, estos Para confirmar esta sugerencia, se investigaron los efectos inhibidores de estos fármacos en el JEV replicon. La concentración más alta de manidipino y mesilato de nelfinavir en las células de hámster bebé (BHK-21) se ajustó a 5 M y 10 M, respectivamente. Se demostró que los cinco fármacos inhiben la síntesis del ARN del JEV de manera dependiente de la dosis, mientras que ninguno de ellos inhibió la traducción inicial del ARN del réplico (5, 14) (Fig. 3C), confirmando que estos fármacos inhibieron la infección del JEV en la etapa de replicación. Los fármacos hit exhiben actividad antiflavivirus de amplio espectro. Para determinar si la actividad antiviral de los cinco fármacos afectados se extendió a otros flavivirus, exploramos su efecto antiviral contra ZIKV. Similar a los hallazgos para JEV, el título de ZIKV fue disminuido por unidades de registro múltiples cuando ZIKV fue tratado con una alta concentración de cada uno de los fármacos (Fig. 4A). Además, ZIKV mostró una mayor sensibilidad a los dos inhibidores de canales de calcio manidipina y cilnidipina que JEV, sin que se observe formación de placa a 10 M. De acuerdo con este resultado, se detectaron también disminuciones bruscas en el nivel de replicación del ARN de ZIKV y el nivel de expresión de proteína viral (Fig. 4A). Cabe destacar que el tratamiento con 5 M manidipina produjo una inhibición del 95% de la replicación viral, traducción y rendimientos virales. Tomados juntos, estos resultados indican que los fármacos afectados podrían efectivamente inhibir la infección por ZIKV. Dado que estos fármacos exhibieron sus efectos anti-JEV en la etapa de replicación viral, se probaron además los efectos contra WNV y DENV-2 mediante el uso de los replicadores WNV y DENV-2. Al igual que los resultados para JEV, se observó una reducción dosis-dependiente en el nivel de replicación de WNV con los tratamientos farmacológicos. El mismo fenotipo se observó para DENV-2 para todos los fármacos excepto mesilato de nelfinavir, que no mostró ningún efecto en las concentraciones probadas (fig. 4B y C). Juntos, estos resultados indican que los cinco fármacos afectados son excelentes candidatos para el tratamiento antiflavivirus de amplio espectro. Efecto antiviral de inhibidores del calcio. Ya que tres fármacos afectados, manidipina, cilnidipina e hidrocloruro de benidipina, eran inhibidores de DHP VGC Verapamil, un prototipo de inhibidor de fenilalquilamina (PAA) VGCC (15), mostró una inhibición dosis-dependiente del JEV tanto en el riñón de mono verde africano (Vero) como en las células de carcinoma hepatocelular humano (Huh-7) (Fig. 5), lo que fue consistente con los efectos inhibitorios de los inhibidores del DHP, sugiriendo que los canales de calcio juegan un papel importante en la infección por JEV. También se encontró que la ciclosporina y el borato de 2-aminobifenilo (2-APB), que inhiben el eflujo de Ca 2 del grupo mitocondrial y endoplasmático (ER), respectivamente (16) (17) (18) (19), bloquean eficazmente la infección por JEV. Del mismo modo, el tratamiento con el quelante celular Ca 2 1,2-bis-(o-aminofenoxi)-etano-N,N,N=,N=-tetraacético, ester tetraacetoximetilo (BAPTA-AM), también podría suprimir la infección por JEV. Tomado en conjunto, se concluyó que el Ca 2 intracelular es esencial para la infección por JEV y el calcio citoplasmático es un objetivo potente para el tratamiento con antiflavivirus. Selección y caracterización del JEV resistente a manidipina. Para identificar el objetivo viral del inhibidor del canal de calcio, se seleccionó un virus resistente a manidipino por transpiración serial del JEV en presencia de manidipina. Los virus del pasaje 20 (P20) mostraron resistencia robusta en comparación con el tipo salvaje (WT) (Fig. 6A ). Cuando el JEV de P20 fue tratado con 5 M o 10 M manidipina, el título viral fue aproximadamente 10 y 100 veces más alto que el del WT, respectivamente. Los clones individuales del virus fueron aislados, y dos aislados fueron seleccionados aleatoriamente y amplificados. Se observó una sustitución de aminoácidos en dos clones aislados, resultando en un cambio de glutamina (Q) a a arginina (R) en la posición de aminoácido 130 en el dominio transmembrana 3 (TMD3) de NS4B, es decir, la posición 2401 de la poliproteína traducida en el clon cDNA infeccioso JEV (Fig. 6B ). La alineación secuencial de NS4B indicó que el Q130 fue conservado en todos los flavivirus excepto YFV, que poseía una lisina en esa posición (Fig. 6B ). El Q130 conservado de NS4B puede explicar la sensibilidad de JEV, ZIKV, WNV y DENV-2 a manidipina, como se describe anteriormente (Fig. 4), mientras que el YFV mostró resistencia al fármaco (datos no mostrados). Para confirmar que la mutación Q130R confirió resistencia a manidipina e investigar el papel del Q130 en la función NS4B, produjimos clones de JEV con la mutación Q130R, Q130K, Q130E o Q130A introduciendo las mutaciones deseadas en el clon de ADNc infeccioso y rescatando los virus mutantes. Para investigar las propiedades biológicas de los virus mutantes, primero examinamos la cinética de crecimiento de los virus rescatados. Como se muestra en la Fig. 6C, todos los virus mutantes tuvieron una acumulación de viriones infecciosas y alcanzaron el título La infección de los virus mutantes Q130R y Q130K resultó en curvas de crecimiento similares a la curva de crecimiento para el WT (Fig. 6C), mientras que los mutantes Q130E y Q130A produjeron cantidades menores de virus entre 24 y 60 h. El análisis de la morfología de la placa reveló que las placas de los mutantes Q130R, Q130K y Q130E eran similares a las placas del WT, mientras que las placas del mutante Q130A eran menores que las del WT. A continuación se investigó la sensibilidad de los cuatro virus mutantes a manidipino. Como se muestra en la figura 6D, los virus mutantes Q130R y Q130K eran resistentes a manidipino. En una concentración de 10 M, la manidipina inhibió eficientemente la infección WT JEV y redujo los rendimientos virales en aproximadamente 4 unidades log, mientras que los virus mutantes Q130R y Q130K fueron resistentes a la manidipina y el título viral disminuyó menos de 2 unidades log.El virus mutante Q130A demostró resistencia moderada y un poco más alto Tomado juntos, se pudo concluir que Q130 no sólo es crítico para conferir sensibilidad a la manidipina sino que también es importante para la replicación del JEV. El reemplazo de glutamina por aminoácidos básicos confirió resistencia a la manidipina sin una aparente pérdida de crecimiento. Eficacia in vivo de la manidipina. Como manidipina mostró las actividades inhibidoras más fuertes en la replicación del JEV, así como la infección por ZIKV cuando sus actividades se compararon con las de los cinco fármacos afectados ( 2 y 4A), examinamos además el efecto protector de la manidipina frente a la letalidad inducida por el JEV en un modelo de ratón. Como era de prever, los ratones del grupo tratado con el JEV comenzaron a mostrar síntomas, incluyendo parálisis en las extremidades, restricción de movimiento, piloerección, rigidez corporal y temblor en todo el cuerpo, a partir del día 5 postinfección. En los 21 días posteriores a la infección, la mayoría de los ratones del grupo infectado por el JEV sucumbieron a la infección, con una tasa de mortalidad del 73% (4 de 15 animales sobrevivieron). El tratamiento con manidipina tras la infección por el JEV redujo la tasa de mortalidad al 20% (12 de 15 animales sobrevivieron) (Fig. 7A ). Los ratones tratados con manidipina solos o tratados con manidipina e infectados con JEV mostraron poco comportamiento anormal, similar a los Para relacionar aún más estos efectos protectores con la carga viral y los cambios histopatológicos en el cerebro del ratón, se determinó el título viral y se recogieron y analizaron las secciones cerebrales del ratón en el día 5 y el día 21 postinfección, ya que los ratones comenzaron a mostrar síntomas de infección por JEV desde el día 5 postinfección y la mayoría de los ratones sobrevivientes se habían recuperado en el día 21. Los resultados indicaron que, durante la progresión de la enfermedad, el tratamiento con manidipina redujo significativamente la carga viral en ratones infectados en comparación con la de ratones infectados que no recibían tratamiento, mientras que no se formaron placas ni en el grupo tratado con manidipino ni en el vehículo, y las cargas virales fueron indetectables en cada grupo el día 21 postinfección (fig. 7B). Como el JEV fue rápidamente eliminado de la sangre después de la inoculación y estuvo presente en el sistema linfático durante la fase preclínica, los efectos de la manidipina sobre la infección del suero y el bazo fueron evaluados en momentos anteriores para detectar si el fármaco redujo las cargas virales periféricas (20, 21). Como se muestra en la figura 7C, la manidipina tuvo poco efecto sobre la infección periférica del JEV, lo que indica que la manidipina protegió a los ratones contra la letalidad inducida por el JEV al disminuir la carga viral en el cerebro. Del mismo modo, se observó un daño aparente en el cerebro, incluyendo meningitis, manguitos perivasculares, degeneración vacuolar y nódulos gliales en el grupo infectado y tratado con JEV el día 5 de postinfección, mientras que el tratamiento con manidipina aliviaba notablemente estos Estos resultados indican que el alivio de los cambios histopatológicos fue acompañado por una reducción de la carga viral, así como una reducción en la tasa de mortalidad, confirmando aún más los efectos curativos de la manidipina sobre la encefalitis viral. Entre los cinco fármacos afectados, manidipina, cilnidipina e hidrocloruro de benidipina fueron inhibidores del VGCC. Ha sido bien documentado en la literatura que los inhibidores de Ca 2 sirven para inhibir la infección viral en la etapa de entrada (15, 22) o replicación (18) e incluso en la etapa de brote (23). Con este fin, primero revisamos los 21 inhibidores del calcio incluidos en la actual biblioteca de fármacos aprobados por la FDA y encontramos que, además de los cuatro inhibidores del DHP VGCC enumerados en la Fig. El 1B, otros dos inhibidores de calcio, es decir, dihidrocloruro de flunarizina y clorhidrato de lomerizina, también fueron identificados como candidatos primarios con niveles de inhibición de 90%. Del mismo modo, tres antagonistas de los canales de calcio, nisoldipino, felodipino y clorhidrato de nicardipina, mostraron niveles de inhibición de 75%, 72% y 66%, respectivamente, en la pantalla primaria. Juntos, 9 de los 21 inhibidores de calcio de la biblioteca, que representan casi la mitad de los inhibidores de calcio, mostraron niveles de inhibición de flavivirus superiores al 50%, lo que sugiere que el calcio, especialmente el canal de calcio, es un potencial objetivo antiviral. Para abordar este, se investigó otro tipo de inhibidor del VGCC, verapamilo, un fármaco aprobado por la FDA que aún no se incluye en la biblioteca de medicamentos utilizada en este Del mismo modo, un quelante Ca 2, BAPTA-AM, así como los inhibidores Ca 2 2-APB y ciclosporina, dirigidos a la ER y el canal mitocondrial Ca 2, respectivamente, fueron empleados para investigar la respuesta de la infección por JEV a la disminución de los niveles intracelulares de Ca 2. En línea con las actividades de los tres fármacos inhibidores DHP VGCC golpeados, los inhibidores adicionales Ca 2 ejercieron actividad anti-JEV, lo que indicó que Ca 2 es indispensable para la infección por JEV. Así, los inhibidores Ca 2 podrían ser utilizados como tratamientos eficaces para la infección por flavivirus. Como los fármacos afectados ejercieron actividad inhibitoria completa cuando fueron añadidos al tratamiento, creemos que Ca 2 es importante para la replicación del genoma del flavivirus. Además, la selección y el análisis genético de NS4B es parte del complejo de replicación viral y se supone que ancla la replicasa viral a la membrana ER (24). Mientras tanto, el dominio N-terminal 125aminoácido de DENV NS4B fue indicado como responsable de la inhibición de la respuesta inmune (25). En particular, varios compuestos estructuralmente distintos han sido identificados para inhibir la replicación de flavivirus al dirigir intensivamente la TMD de NS4B (26) (27) (28) (29) (30) (31) (32). Es así concebible que los inhibidores que se dirigen a la TMD de NS4B perturben su función, lo que conduce a la supresión de la replicación de ARN viral. En este estudio, la sustitución de Q130 de NS4B por un aminoácido básico confirió el efecto de resistencia sin suprimir la replicación del JEV, sugiriendo que la posición 130 podría tolerar un aminoácido básico y que el aminoácido básico podría estar involucrado en la interacción del NS4B con proteínas huésped en lugar de proteínas virales. Además, la eficacia y toxicidad de manidipina fueron monitoreadas in vivo, con manidipina demostrando una actividad antiviral efectiva con biocompatibilidad favorable. Sin embargo, la dosis utilizada en este estudio fue mayor que la dosis típicamente utilizada clínicamente, representando uno de los escenarios más comúnmente encontrados en la repurposición de fármacos (33, 34). Como manidipina fue aprobada para el tratamiento a largo plazo de la hipertensión (35, 36), el tratamiento de dosis de pulso con manidipina durante el período más corto requerido para el tratamiento de la infección viral podría ser relativamente Además, el uso de una combinación de manidipina con otros inhibidores de Ca 2 podría mejorar su eficacia terapéutica, reducir su toxicidad y reducir el riesgo de desarrollo de resistencia (37) (39). Además de los tres inhibidores de VGCC, dos fármacos afectados, pimecrolimus y mesilato de nelfinavir, mostraron actividades inhibitorias equivalentes en la replicación de JEV, ZIKV, WNV y DENV-2. Aunque no se ha reportado el uso de pimecrolimus para el tratamiento de enfermedades infecciosas, se demostró que tuvo un efecto robusto contra JEV con un SI de 32. La concentración plasmática máxima (C max ) de mesilato de nelfinavir alcanzado con una dosis adulta fue de 3 a 4 g/ml (40), lo que fue comparable al IC 50 reportado aquí. En particular, se confirmó que el mesilato de nelfinavir inhibe el virus del herpes simplex 1 (HSV-1) y la replicación de varios otros herpesvirus interfiriendo directa o indirectamente con los pasos posteriores de la formación del virus, como la maduración de la glucoproteína o la liberación de virus, además de funcionar en la proteasa del herpesvirus (41, 42). Se desconoce si el mesilato de nelfinavir inhibe el flavivirus por interferencia con la proteasa del virus o por otros efectos no deseados. La comprensión del mecanismo de los efectos antiflavivirus de estos fármacos podría descubrir nuevos objetivos de los medicamentos, proporcionando una visión más profunda de la patogénesis de los flavivirus. Las células BHK-21, SH-SY5Y (neurblastoma humano), Vero, y Huh-7 fueron cultivadas en el medio de águila modificado Dulbecco (HyClone, Logan, UT, USA) complementado con 10% de suero bovino fetal (Gibco, Grand Island, NY, USA). La cepa JEV AT31, el replicado WNV, y el replicado DENV-2 que expresa Renilla luciferasa (Rluc) fueron amablemente proporcionados por Bo Zhang, Wuhan Institute of Virology, Academia China de Ciencias (CAS), China. Las partículas virales recombinantes de JEV replicon (RVPs) fueron generadas como se describió previamente (4, 5). La cepa H/PF/2013 de ZIKV, amablemente proporcionada por el Archivo Europeo de Virus Goes Global, fue propagada y titulada en La densidad celular y la dosis de RVP fueron optimizadas para el ensayo de HTS. Las células de Vero en diferentes densidades (2.500 a 12.500 células por pozo) fueron infectadas con RVPs de 1,25 a 20 l (1 a 16 copias por pozo). La densidad celular apropiada así como la dosis de RVP fueron seleccionadas comparando la relación S/B, CV y valores de Z= en diferentes condiciones como se describió previamente (43). Se utilizaron metil--ciclodextrina y sulfóxido de dimetilo (DMSO) como controles positivos y negativos respectivamente. Ensayo de HTS de una biblioteca compuesta aprobada por la FDA. Se compró una biblioteca de 1.018 medicamentos aprobados por la FDA a Selleck Chemicals (Houston, TX, EE.UU.). Los compuestos fueron almacenados como soluciones de stock de 10 mM en DMSO a 4°C hasta su uso. La primera ronda del ensayo de H Los criterios utilizados para identificar los candidatos primarios no fueron citotoxicidad aparente y un nivel medio de inhibición de 90% en pozos duplicados. Los criterios de inhibición dosis-dependiente y viabilidad celular de 80% se aplicaron para la pantalla de reconfirmación. Además, se calculó el CC 50 de cada compuesto, y los compuestos que mostraban SI mayores de 10 fueron considerados hits en este estudio. Identificación de efectos antivirales de cinco fármacos golpeados. Los efectos antivirales de los fármacos fueron evaluados mediante transcripción cuantitativa inversa-PCR (qRT-PCR), ensayo de inmunofluorescencia (IFA), y ensayo de placa como se informó previamente (44) (45) (46) (47). El cronograma experimental se describe en la figura 2A. Para asegurar la efectividad de los fármacos afectados en la replicación de flavivirus, se incubaron células BHK-21 transfectadas con el JEV, WNV o DENV-2 con cada fármaco en las concentraciones indicadas anteriormente, y se determinaron las actividades de luciferasa 24 h, 48 h o 72 h más tarde, respectivamente. Experimentación de tiempo de adición. Para evaluar qué etapa del ciclo de vida del JEV fue inhibida por cada golpe, se realizó un experimento de tiempo de adición como se describió previamente (43). Las células Vero fueron infectadas con 20 l de VPR durante 1 h (0 a 1 h). Los compuestos de prueba fueron incubados con las células durante 1 h antes de la infección (1 a 0 h), durante la infección (0 a 1 h), y durante 23 h postinfección (1 a 24 h) (fig. 3A). Para excluir un posible efecto inactivador directo de los fármacos, los RVP fueron incubados con cada fármaco a 37°C durante 1 h, y las mezclas fueron diluidas 25 veces para infectar las células Vero. Veinticuatro horas después, las actividades de luciferasa se determinaron como se describe anteriormente (Fig. 3A). Virus resistente a manidipina. Virus resistente a manidipina fue generado por transpiración de JEV en células Vero en presencia de manidipina. Pasajes 1 a 10 usaron 5 M manidipina, y pasajes 11 a 20 usaron 10 M manidipina. Como control, el virus WT fue pasaje en presencia de 2 % DMSO en paralelo. El pasaje fue terminado en el pasaje 20, cuando no se detectó ninguna mejoría adicional en la resistencia. Dos aislados del virus resistente a manidipina fueron purificados en placa y amplificados en presencia El ARN viral fue extraído, amplificado y purificado para la secuenciación. Se utilizó un clon cDNA infeccioso de JEV, cepa AT31 (pMWJEAT), amablemente proporcionado por T. Wakita, Instituto Metropolitano de Neurociencia de Tokio, para recuperar los virus WT y mutantes, como se describió anteriormente (4). Los títulos de virus y sensibilidades manidipinas fueron determinados por el ensayo de placa en células Vero. La administración de manidipina a ratones infectados por JEV. Los ratones adultos BALB/c (edad, 4 semanas) fueron mantenidos en el Centro Animal de Laboratorio del Instituto de Virología Wuhan, CAS (Wuhan, China). Los ratones fueron divididos aleatoriamente en cuatro grupos (30 ratones por grupo): un JEV infectado y un vehículo (2% Tween 80 plus 5% DMSO en el grupo tratado con solución salina fosfatada [PBS]), un grupo tratado con manidipino, un grupo tratado con JEV infectado y manidipino, y un grupo tratado con vehículo. Para la infección, los ratones fueron infectados intraperitonealmente con 5 10 6 UFP de cepa JEV AT31. Para el tratamiento con manidipino y vehículo, los ratones fueron inyectados intraperitonealmente con 25 mg/kg de peso corporal manidipino o PBS con 2% Tween 80 y 5% DMSO, respectivamente. Los tratamientos fueron administrados dos veces al día durante los primeros 2 días y luego administrados consecutivamente una vez al día durante 21 días. Cinco ratones de cada grupo fueron sacrificados en los días 1, 3 y 5 Se recogieron muestras de sero, tejido del bazo y tejido cerebral para la determinación del título viral y la investigación histopatológica. Quince ratones fueron monitorizados diariamente por morbilidad y mortalidad. Los ratones que mostraron signos neurológicos de enfermedad fueron eutanasiados de acuerdo con el Reglamento para la Administración de Asuntos relativos a Animales Experimentales en China. Los protocolos fueron revisados y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso Animal de Laboratorio del Instituto de Virología Wuhan, CAS (Wuhan, China).

¿Cuántos marcos de lectura abiertos hay en el genoma del flavivirus?

El cribado de fármacos aprobados por la FDA para inhibidores de la infección por el virus de la encefalitis japonesahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5640845/SHA: 1bd2f6497996fc0fccd8dffd7f848446d3d36f964Autores: Wang, Shaobo; Liu, Yang; Guo, Jiao; Wang, Peilin; Zhang, Leike; Xiao, Gengfu; Wang, WeiFecha: 2017-10-13DOI: 10.1128/jvi.01055-17Licencia: cc-byResumen: virus de la encefalitis japonesa (JEV), un flavivirus transmitido por artrópodos, es una de las principales causas de la encefalitis viral aguda en No se dispone de ningún medicamento aprobado para el tratamiento específico de las infecciones por JEV, y las vacunas disponibles no son eficaces contra todos los aislados clínicos de JEV. En el estudio descrito aquí, se realizó una revisión de alto rendimiento de una biblioteca de medicamentos aprobada por la FDA para inhibidores del JEV. Se identificaron cinco fármacos afectados que inhibieron la infección por JEV con un índice selectivo de >10. También se validaron las actividades antivirales de estos cinco fármacos afectados contra otros flavivirus, incluido el virus Zika. El análisis de mutantes adaptativos reveló que la sustitución de Q130, ubicada en el dominio transmembrana 3 de la proteína NS4B no estructural, que se conserva relativamente en flavivirus, con la resistencia de JEV conferida a la manidipina R o K, un inhibidor del canal Ca(2+) activado por voltaje (VGCC), sin una pérdida aparente del perfil de crecimiento viral. Además, se indicó que manidipina protegía a ratones contra la letalidad inducida por JEV disminuyendo la carga viral en el cerebro, mientras que abrogaba los cambios histopatológicos asociados a la infección por JEV. Este estudio proporciona cinco candidatos a antiflavivirus e identifica el calcio citoplasmático como un nuevo objetivo antiviral para el tratamiento de la infección por JEV. Los hallazgos reportados aquí proporcionan posibilidades terapéuticas para combatir infecciones causadas por flavivirus. La reutilización de fármacos aprobados aceleraría el desarrollo de una estratagema terapéutica. En este estudio, examinamos una biblioteca de fármacos aprobados por la FDA e identificamos cinco fármacos afectados, especialmente inhibidores del calcio, que ejercen actividad antiflavivirus que bloquea la replicación viral. La eficacia in vivo y la toxicidad de manidipina fueron investigados con un modelo de ratón de infección por JEV, y el objetivo viral fue identificado generando un mutante adaptativo. Texto: Los lavivirus F están clasificados taxonómicamente en el género Flavivirus y la familia Flaviviridae. Estos virus comprenden más de 70 patógenos diferentes, como el virus japonés de la encefalitis (JEV), el virus Zika (ZIKV), el virus del dengue (DEV), el virus del Nilo Occidental (WNVW), y el virus de la fiebre amarilla (YFV). La mayoría de los flavivirus El desarrollo y uso de vacunas contra algunos flavivirus, como el JEV, el YFV y el virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (TBEV), han disminuido las tasas de morbilidad y mortalidad por infecciones causadas por estos virus (2) ; sin embargo, las enfermedades inducidas por flavivirus siguen siendo pandemias, y hay pocas terapias disponibles además de los cuidados intensivos de apoyo. Los flavivirus tienen un genoma de ARN de aproximadamente 11 kb de cadena positiva que contiene un único marco de lectura abierto (ORF) flanqueado por regiones no traducidas (UTR) en ambos termini. El ORF codifica tres proteínas estructurales, incluyendo el capsid (C), membrana (premembrana [prM] y membrana [M]), y envoltorio (E) y siete proteínas no estructurales (NS1, NS2A, NS2B, Estas siete proteínas no estructurales participan en la replicación viral, el ensamblaje del virión y el escape del virus de la vigilancia inmune. Hasta la fecha, no hay antivirales específicos con actividad contra los flavivirus. Para ello, realizamos una pantalla de una biblioteca de 1.018 medicamentos aprobados por la FDA. Dado que los flavivirus son similares en estructura y patogénesis, primero utilizamos el JEV como prototipo para examinar la biblioteca de medicamentos y posteriormente validamos las actividades antivirales con ZIKV, WNV y DENV tipo 2 (DEV-2). Los fármacos afectados identificados en este estudio ofrecen nuevas terapias potenciales para el tratamiento de la infección y enfermedad por flavivirus. Para seleccionar inhibidores se utilizaron partículas virales recombinantes (RVP) con el replicon notificado por luciferasa envuelto por las proteínas estructurales del JEV, con un enfoque en aquellos que inhiben la entrada y replicación del virus, mediante un ensayo de detección de alto rendimiento (HTS) (4, 5). Se determinó que el número de copias de RVP de ARN genómico era de 8,4 10 6 copias/ml utilizando una curva estándar generada con plásmidos que transportaban el clon infeccioso. Las condiciones de ensayo del HTS, incluyendo la densidad celular de siembra y la dosis de RVP, fueron optimizadas para ser 10.000 células por placa de 96 pocillos y 20 l (16 copias/célula) RVP para la dosis infecciosa, respectivamente. En las condiciones optimizadas, la relación señal-basal (S/B), el coeficiente de variación (CV) y el factor Z= fueron 38.374, 2,8% y 0.89, respectivamente, lo que demostró que el ensayo era robusto y adecuado para el cribado a gran escala de compuestos. Se seleccionó un esquema del ensayo HTS en la Fig. 1B. Después de tres rondas de cribado, cinco hits con un índice selectivo (SI; que es igual a la concentración citotóxica del 50% [CC 50 [ concentración inhibitoria del 50% [IC 50 ]]) de 10. Los valores CC 50 de los fármacos afectados exhibidos en la Fig. 1B fueron similares a los publicados anteriormente para diversos sistemas celulares pero determinados utilizando diferentes ensayos de toxicidad (6) (7) (8) (9) (10) (12) (13) (13). Tres de los fármacos afectados, manidipino, cilnidipino y hidrocloruro de benidipina, fueron antagonistas del canal Ca 2 (VGCC) activados por dihidropiridina, mientras que el pimecrolimus es un inhibidor de la secreción inflamatoria de citoquinas y el mesilato de nelfinavir es un bloqueador de proteasa VIH-1. Todos los cinco fármacos afectados mostraron una inhibición dosis-dependiente de la infección por JEV RVP (Fig. 1C). Para validar el efecto antiviral, los fármacos afectados fueron comprados de otras fuentes comerciales y probados. En la pantalla de reconfirmación, todos los fármacos afectados mostraron efectos antivirales y citotóxicos similares a los encontrados en la pantalla primaria. Validación de los fármacos afectados. Para verificar los resultados obtenidos por los ensayos del reportero de luciferasa, también investigamos Como se esperaba del ensayo HTS, los cinco fármacos inhibieron robustamente la producción de virus, con una reducción de aproximadamente 4 a 5 unidades log en la concentración más alta y una disminución de aproximadamente 1 log-unidad con 2,5 M los fármacos (Fig. 2B). También se detectó una fuerte disminución de los niveles de ARN JEV (Fig. 2C). Los niveles de ARN atenuados en los grupos de dosis altas, dosis media y dosis bajas fueron todos superiores al 40%. En particular, en el grupo tratado con manidipina, el efecto inhibitorio fue al menos del 80% en comparación con el control, que mostró una fuerte inhibición de la replicación viral. Coherente con la inhibición de la replicación y producción del virus, la expresión de la proteína estructural viral prM fue apenas detectable después del tratamiento con los fármacos en la concentración alta (Fig. 2D) 2 confirmó que los cinco fármacos afectados inhibieron in vitro la infección por JEV de forma dosis-dependiente. Los fármacos inhiben la infección por JEV durante la síntesis del ARN viral. Debido a que los RVP, que tienen un sobre natural similar al virus en el exterior y un replicon en el interior, permitieron la cuantificación de la entrada y replicación productiva del JEV, se realizó un experimento de tiempo de adición para investigar si los fármacos afectados bloquearon el paso de entrada o el paso de replicación. Como se muestra en la Fig. 3B, no se observó supresión de la actividad de luciferasa por cualquiera de los fármacos afectados cuando se utilizaron como tratamientos antes de la infección o durante la infección o como virúcida, sugiriendo que estos fármacos no inhiben la infección por JEV ya sea inactivando el virus directamente o bloqueando la entrada del JEV. Sin embargo, estos Para confirmar esta sugerencia, se investigaron los efectos inhibidores de estos fármacos en el JEV replicon. La concentración más alta de manidipino y mesilato de nelfinavir en las células de hámster bebé (BHK-21) se ajustó a 5 M y 10 M, respectivamente. Se demostró que los cinco fármacos inhiben la síntesis del ARN del JEV de manera dependiente de la dosis, mientras que ninguno de ellos inhibió la traducción inicial del ARN del réplico (5, 14) (Fig. 3C), confirmando que estos fármacos inhibieron la infección del JEV en la etapa de replicación. Los fármacos hit exhiben actividad antiflavivirus de amplio espectro. Para determinar si la actividad antiviral de los cinco fármacos afectados se extendió a otros flavivirus, exploramos su efecto antiviral contra ZIKV. Similar a los hallazgos para JEV, el título de ZIKV fue disminuido por unidades de registro múltiples cuando ZIKV fue tratado con una alta concentración de cada uno de los fármacos (Fig. 4A). Además, ZIKV mostró una mayor sensibilidad a los dos inhibidores de canales de calcio manidipina y cilnidipina que JEV, sin que se observe formación de placa a 10 M. De acuerdo con este resultado, se detectaron también disminuciones bruscas en el nivel de replicación del ARN de ZIKV y el nivel de expresión de proteína viral (Fig. 4A). Cabe destacar que el tratamiento con 5 M manidipina produjo una inhibición del 95% de la replicación viral, traducción y rendimientos virales. Tomados juntos, estos resultados indican que los fármacos afectados podrían efectivamente inhibir la infección por ZIKV. Dado que estos fármacos exhibieron sus efectos anti-JEV en la etapa de replicación viral, se probaron además los efectos contra WNV y DENV-2 mediante el uso de los replicadores WNV y DENV-2. Al igual que los resultados para JEV, se observó una reducción dosis-dependiente en el nivel de replicación de WNV con los tratamientos farmacológicos. El mismo fenotipo se observó para DENV-2 para todos los fármacos excepto mesilato de nelfinavir, que no mostró ningún efecto en las concentraciones probadas (fig. 4B y C). Juntos, estos resultados indican que los cinco fármacos afectados son excelentes candidatos para el tratamiento antiflavivirus de amplio espectro. Efecto antiviral de inhibidores del calcio. Ya que tres fármacos afectados, manidipina, cilnidipina e hidrocloruro de benidipina, eran inhibidores de DHP VGC Verapamil, un prototipo de inhibidor de fenilalquilamina (PAA) VGCC (15), mostró una inhibición dosis-dependiente del JEV tanto en el riñón de mono verde africano (Vero) como en las células de carcinoma hepatocelular humano (Huh-7) (Fig. 5), lo que fue consistente con los efectos inhibitorios de los inhibidores del DHP, sugiriendo que los canales de calcio juegan un papel importante en la infección por JEV. También se encontró que la ciclosporina y el borato de 2-aminobifenilo (2-APB), que inhiben el eflujo de Ca 2 del grupo mitocondrial y endoplasmático (ER), respectivamente (16) (17) (18) (19), bloquean eficazmente la infección por JEV. Del mismo modo, el tratamiento con el quelante celular Ca 2 1,2-bis-(o-aminofenoxi)-etano-N,N,N=,N=-tetraacético, ester tetraacetoximetilo (BAPTA-AM), también podría suprimir la infección por JEV. Tomado en conjunto, se concluyó que el Ca 2 intracelular es esencial para la infección por JEV y el calcio citoplasmático es un objetivo potente para el tratamiento con antiflavivirus. Selección y caracterización del JEV resistente a manidipina. Para identificar el objetivo viral del inhibidor del canal de calcio, se seleccionó un virus resistente a manidipino por transpiración serial del JEV en presencia de manidipina. Los virus del pasaje 20 (P20) mostraron resistencia robusta en comparación con el tipo salvaje (WT) (Fig. 6A ). Cuando el JEV de P20 fue tratado con 5 M o 10 M manidipina, el título viral fue aproximadamente 10 y 100 veces más alto que el del WT, respectivamente. Los clones individuales del virus fueron aislados, y dos aislados fueron seleccionados aleatoriamente y amplificados. Se observó una sustitución de aminoácidos en dos clones aislados, resultando en un cambio de glutamina (Q) a a arginina (R) en la posición de aminoácido 130 en el dominio transmembrana 3 (TMD3) de NS4B, es decir, la posición 2401 de la poliproteína traducida en el clon cDNA infeccioso JEV (Fig. 6B ). La alineación secuencial de NS4B indicó que el Q130 fue conservado en todos los flavivirus excepto YFV, que poseía una lisina en esa posición (Fig. 6B ). El Q130 conservado de NS4B puede explicar la sensibilidad de JEV, ZIKV, WNV y DENV-2 a manidipina, como se describe anteriormente (Fig. 4), mientras que el YFV mostró resistencia al fármaco (datos no mostrados). Para confirmar que la mutación Q130R confirió resistencia a manidipina e investigar el papel del Q130 en la función NS4B, produjimos clones de JEV con la mutación Q130R, Q130K, Q130E o Q130A introduciendo las mutaciones deseadas en el clon de ADNc infeccioso y rescatando los virus mutantes. Para investigar las propiedades biológicas de los virus mutantes, primero examinamos la cinética de crecimiento de los virus rescatados. Como se muestra en la Fig. 6C, todos los virus mutantes tuvieron una acumulación de viriones infecciosas y alcanzaron el título La infección de los virus mutantes Q130R y Q130K resultó en curvas de crecimiento similares a la curva de crecimiento para el WT (Fig. 6C), mientras que los mutantes Q130E y Q130A produjeron cantidades menores de virus entre 24 y 60 h. El análisis de la morfología de la placa reveló que las placas de los mutantes Q130R, Q130K y Q130E eran similares a las placas del WT, mientras que las placas del mutante Q130A eran menores que las del WT. A continuación se investigó la sensibilidad de los cuatro virus mutantes a manidipino. Como se muestra en la figura 6D, los virus mutantes Q130R y Q130K eran resistentes a manidipino. En una concentración de 10 M, la manidipina inhibió eficientemente la infección WT JEV y redujo los rendimientos virales en aproximadamente 4 unidades log, mientras que los virus mutantes Q130R y Q130K fueron resistentes a la manidipina y el título viral disminuyó menos de 2 unidades log.El virus mutante Q130A demostró resistencia moderada y un poco más alto Tomado juntos, se pudo concluir que Q130 no sólo es crítico para conferir sensibilidad a la manidipina sino que también es importante para la replicación del JEV. El reemplazo de glutamina por aminoácidos básicos confirió resistencia a la manidipina sin una aparente pérdida de crecimiento. Eficacia in vivo de la manidipina. Como manidipina mostró las actividades inhibidoras más fuertes en la replicación del JEV, así como la infección por ZIKV cuando sus actividades se compararon con las de los cinco fármacos afectados ( 2 y 4A), examinamos además el efecto protector de la manidipina frente a la letalidad inducida por el JEV en un modelo de ratón. Como era de prever, los ratones del grupo tratado con el JEV comenzaron a mostrar síntomas, incluyendo parálisis en las extremidades, restricción de movimiento, piloerección, rigidez corporal y temblor en todo el cuerpo, a partir del día 5 postinfección. En los 21 días posteriores a la infección, la mayoría de los ratones del grupo infectado por el JEV sucumbieron a la infección, con una tasa de mortalidad del 73% (4 de 15 animales sobrevivieron). El tratamiento con manidipina tras la infección por el JEV redujo la tasa de mortalidad al 20% (12 de 15 animales sobrevivieron) (Fig. 7A ). Los ratones tratados con manidipina solos o tratados con manidipina e infectados con JEV mostraron poco comportamiento anormal, similar a los Para relacionar aún más estos efectos protectores con la carga viral y los cambios histopatológicos en el cerebro del ratón, se determinó el título viral y se recogieron y analizaron las secciones cerebrales del ratón en el día 5 y el día 21 postinfección, ya que los ratones comenzaron a mostrar síntomas de infección por JEV desde el día 5 postinfección y la mayoría de los ratones sobrevivientes se habían recuperado en el día 21. Los resultados indicaron que, durante la progresión de la enfermedad, el tratamiento con manidipina redujo significativamente la carga viral en ratones infectados en comparación con la de ratones infectados que no recibían tratamiento, mientras que no se formaron placas ni en el grupo tratado con manidipino ni en el vehículo, y las cargas virales fueron indetectables en cada grupo el día 21 postinfección (fig. 7B). Como el JEV fue rápidamente eliminado de la sangre después de la inoculación y estuvo presente en el sistema linfático durante la fase preclínica, los efectos de la manidipina sobre la infección del suero y el bazo fueron evaluados en momentos anteriores para detectar si el fármaco redujo las cargas virales periféricas (20, 21). Como se muestra en la figura 7C, la manidipina tuvo poco efecto sobre la infección periférica del JEV, lo que indica que la manidipina protegió a los ratones contra la letalidad inducida por el JEV al disminuir la carga viral en el cerebro. Del mismo modo, se observó un daño aparente en el cerebro, incluyendo meningitis, manguitos perivasculares, degeneración vacuolar y nódulos gliales en el grupo infectado y tratado con JEV el día 5 de postinfección, mientras que el tratamiento con manidipina aliviaba notablemente estos Estos resultados indican que el alivio de los cambios histopatológicos fue acompañado por una reducción de la carga viral, así como una reducción en la tasa de mortalidad, confirmando aún más los efectos curativos de la manidipina sobre la encefalitis viral. Entre los cinco fármacos afectados, manidipina, cilnidipina e hidrocloruro de benidipina fueron inhibidores del VGCC. Ha sido bien documentado en la literatura que los inhibidores de Ca 2 sirven para inhibir la infección viral en la etapa de entrada (15, 22) o replicación (18) e incluso en la etapa de brote (23). Con este fin, primero revisamos los 21 inhibidores del calcio incluidos en la actual biblioteca de fármacos aprobados por la FDA y encontramos que, además de los cuatro inhibidores del DHP VGCC enumerados en la Fig. El 1B, otros dos inhibidores de calcio, es decir, dihidrocloruro de flunarizina y clorhidrato de lomerizina, también fueron identificados como candidatos primarios con niveles de inhibición de 90%. Del mismo modo, tres antagonistas de los canales de calcio, nisoldipino, felodipino y clorhidrato de nicardipina, mostraron niveles de inhibición de 75%, 72% y 66%, respectivamente, en la pantalla primaria. Juntos, 9 de los 21 inhibidores de calcio de la biblioteca, que representan casi la mitad de los inhibidores de calcio, mostraron niveles de inhibición de flavivirus superiores al 50%, lo que sugiere que el calcio, especialmente el canal de calcio, es un potencial objetivo antiviral. Para abordar este, se investigó otro tipo de inhibidor del VGCC, verapamilo, un fármaco aprobado por la FDA que aún no se incluye en la biblioteca de medicamentos utilizada en este Del mismo modo, un quelante Ca 2, BAPTA-AM, así como los inhibidores Ca 2 2-APB y ciclosporina, dirigidos a la ER y el canal mitocondrial Ca 2, respectivamente, fueron empleados para investigar la respuesta de la infección por JEV a la disminución de los niveles intracelulares de Ca 2. En línea con las actividades de los tres fármacos inhibidores DHP VGCC golpeados, los inhibidores adicionales Ca 2 ejercieron actividad anti-JEV, lo que indicó que Ca 2 es indispensable para la infección por JEV. Así, los inhibidores Ca 2 podrían ser utilizados como tratamientos eficaces para la infección por flavivirus. Como los fármacos afectados ejercieron actividad inhibitoria completa cuando fueron añadidos al tratamiento, creemos que Ca 2 es importante para la replicación del genoma del flavivirus. Además, la selección y el análisis genético de NS4B es parte del complejo de replicación viral y se supone que ancla la replicasa viral a la membrana ER (24). Mientras tanto, el dominio N-terminal 125aminoácido de DENV NS4B fue indicado como responsable de la inhibición de la respuesta inmune (25). En particular, varios compuestos estructuralmente distintos han sido identificados para inhibir la replicación de flavivirus al dirigir intensivamente la TMD de NS4B (26) (27) (28) (29) (30) (31) (32). Es así concebible que los inhibidores que se dirigen a la TMD de NS4B perturben su función, lo que conduce a la supresión de la replicación de ARN viral. En este estudio, la sustitución de Q130 de NS4B por un aminoácido básico confirió el efecto de resistencia sin suprimir la replicación del JEV, sugiriendo que la posición 130 podría tolerar un aminoácido básico y que el aminoácido básico podría estar involucrado en la interacción del NS4B con proteínas huésped en lugar de proteínas virales. Además, la eficacia y toxicidad de manidipina fueron monitoreadas in vivo, con manidipina demostrando una actividad antiviral efectiva con biocompatibilidad favorable. Sin embargo, la dosis utilizada en este estudio fue mayor que la dosis típicamente utilizada clínicamente, representando uno de los escenarios más comúnmente encontrados en la repurposición de fármacos (33, 34). Como manidipina fue aprobada para el tratamiento a largo plazo de la hipertensión (35, 36), el tratamiento de dosis de pulso con manidipina durante el período más corto requerido para el tratamiento de la infección viral podría ser relativamente Además, el uso de una combinación de manidipina con otros inhibidores de Ca 2 podría mejorar su eficacia terapéutica, reducir su toxicidad y reducir el riesgo de desarrollo de resistencia (37) (39). Además de los tres inhibidores de VGCC, dos fármacos afectados, pimecrolimus y mesilato de nelfinavir, mostraron actividades inhibitorias equivalentes en la replicación de JEV, ZIKV, WNV y DENV-2. Aunque no se ha reportado el uso de pimecrolimus para el tratamiento de enfermedades infecciosas, se demostró que tuvo un efecto robusto contra JEV con un SI de 32. La concentración plasmática máxima (C max ) de mesilato de nelfinavir alcanzado con una dosis adulta fue de 3 a 4 g/ml (40), lo que fue comparable al IC 50 reportado aquí. En particular, se confirmó que el mesilato de nelfinavir inhibe el virus del herpes simplex 1 (HSV-1) y la replicación de varios otros herpesvirus interfiriendo directa o indirectamente con los pasos posteriores de la formación del virus, como la maduración de la glucoproteína o la liberación de virus, además de funcionar en la proteasa del herpesvirus (41, 42). Se desconoce si el mesilato de nelfinavir inhibe el flavivirus por interferencia con la proteasa del virus o por otros efectos no deseados. La comprensión del mecanismo de los efectos antiflavivirus de estos fármacos podría descubrir nuevos objetivos de los medicamentos, proporcionando una visión más profunda de la patogénesis de los flavivirus. Las células BHK-21, SH-SY5Y (neurblastoma humano), Vero, y Huh-7 fueron cultivadas en el medio de águila modificado Dulbecco (HyClone, Logan, UT, USA) complementado con 10% de suero bovino fetal (Gibco, Grand Island, NY, USA). La cepa JEV AT31, el replicado WNV, y el replicado DENV-2 que expresa Renilla luciferasa (Rluc) fueron amablemente proporcionados por Bo Zhang, Wuhan Institute of Virology, Academia China de Ciencias (CAS), China. Las partículas virales recombinantes de JEV replicon (RVPs) fueron generadas como se describió previamente (4, 5). La cepa H/PF/2013 de ZIKV, amablemente proporcionada por el Archivo Europeo de Virus Goes Global, fue propagada y titulada en La densidad celular y la dosis de RVP fueron optimizadas para el ensayo de HTS. Las células de Vero en diferentes densidades (2.500 a 12.500 células por pozo) fueron infectadas con RVPs de 1,25 a 20 l (1 a 16 copias por pozo). La densidad celular apropiada así como la dosis de RVP fueron seleccionadas comparando la relación S/B, CV y valores de Z= en diferentes condiciones como se describió previamente (43). Se utilizaron metil--ciclodextrina y sulfóxido de dimetilo (DMSO) como controles positivos y negativos respectivamente. Ensayo de HTS de una biblioteca compuesta aprobada por la FDA. Se compró una biblioteca de 1.018 medicamentos aprobados por la FDA a Selleck Chemicals (Houston, TX, EE.UU.). Los compuestos fueron almacenados como soluciones de stock de 10 mM en DMSO a 4°C hasta su uso. La primera ronda del ensayo de H Los criterios utilizados para identificar los candidatos primarios no fueron citotoxicidad aparente y un nivel medio de inhibición de 90% en pozos duplicados. Los criterios de inhibición dosis-dependiente y viabilidad celular de 80% se aplicaron para la pantalla de reconfirmación. Además, se calculó el CC 50 de cada compuesto, y los compuestos que mostraban SI mayores de 10 fueron considerados hits en este estudio. Identificación de efectos antivirales de cinco fármacos golpeados. Los efectos antivirales de los fármacos fueron evaluados mediante transcripción cuantitativa inversa-PCR (qRT-PCR), ensayo de inmunofluorescencia (IFA), y ensayo de placa como se informó previamente (44) (45) (46) (47). El cronograma experimental se describe en la figura 2A. Para asegurar la efectividad de los fármacos afectados en la replicación de flavivirus, se incubaron células BHK-21 transfectadas con el JEV, WNV o DENV-2 con cada fármaco en las concentraciones indicadas anteriormente, y se determinaron las actividades de luciferasa 24 h, 48 h o 72 h más tarde, respectivamente. Experimentación de tiempo de adición. Para evaluar qué etapa del ciclo de vida del JEV fue inhibida por cada golpe, se realizó un experimento de tiempo de adición como se describió previamente (43). Las células Vero fueron infectadas con 20 l de VPR durante 1 h (0 a 1 h). Los compuestos de prueba fueron incubados con las células durante 1 h antes de la infección (1 a 0 h), durante la infección (0 a 1 h), y durante 23 h postinfección (1 a 24 h) (fig. 3A). Para excluir un posible efecto inactivador directo de los fármacos, los RVP fueron incubados con cada fármaco a 37°C durante 1 h, y las mezclas fueron diluidas 25 veces para infectar las células Vero. Veinticuatro horas después, las actividades de luciferasa se determinaron como se describe anteriormente (Fig. 3A). Virus resistente a manidipina. Virus resistente a manidipina fue generado por transpiración de JEV en células Vero en presencia de manidipina. Pasajes 1 a 10 usaron 5 M manidipina, y pasajes 11 a 20 usaron 10 M manidipina. Como control, el virus WT fue pasaje en presencia de 2 % DMSO en paralelo. El pasaje fue terminado en el pasaje 20, cuando no se detectó ninguna mejoría adicional en la resistencia. Dos aislados del virus resistente a manidipina fueron purificados en placa y amplificados en presencia El ARN viral fue extraído, amplificado y purificado para la secuenciación. Se utilizó un clon cDNA infeccioso de JEV, cepa AT31 (pMWJEAT), amablemente proporcionado por T. Wakita, Instituto Metropolitano de Neurociencia de Tokio, para recuperar los virus WT y mutantes, como se describió anteriormente (4). Los títulos de virus y sensibilidades manidipinas fueron determinados por el ensayo de placa en células Vero. La administración de manidipina a ratones infectados por JEV. Los ratones adultos BALB/c (edad, 4 semanas) fueron mantenidos en el Centro Animal de Laboratorio del Instituto de Virología Wuhan, CAS (Wuhan, China). Los ratones fueron divididos aleatoriamente en cuatro grupos (30 ratones por grupo): un JEV infectado y un vehículo (2% Tween 80 plus 5% DMSO en el grupo tratado con solución salina fosfatada [PBS]), un grupo tratado con manidipino, un grupo tratado con JEV infectado y manidipino, y un grupo tratado con vehículo. Para la infección, los ratones fueron infectados intraperitonealmente con 5 10 6 UFP de cepa JEV AT31. Para el tratamiento con manidipino y vehículo, los ratones fueron inyectados intraperitonealmente con 25 mg/kg de peso corporal manidipino o PBS con 2% Tween 80 y 5% DMSO, respectivamente. Los tratamientos fueron administrados dos veces al día durante los primeros 2 días y luego administrados consecutivamente una vez al día durante 21 días. Cinco ratones de cada grupo fueron sacrificados en los días 1, 3 y 5 Se recogieron muestras de sero, tejido del bazo y tejido cerebral para la determinación del título viral y la investigación histopatológica. Quince ratones fueron monitorizados diariamente por morbilidad y mortalidad. Los ratones que mostraron signos neurológicos de enfermedad fueron eutanasiados de acuerdo con el Reglamento para la Administración de Asuntos relativos a Animales Experimentales en China. Los protocolos fueron revisados y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso Animal de Laboratorio del Instituto de Virología Wuhan, CAS (Wuhan, China).

¿Cuál es la estructura de una partícula viral recombinante?

Rotavirus A en animales silvestres y domésticos de zonas con degradación ambiental en la Amazonía brasileñahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6298726/SHA: f3c309c596c20f48f493b77e714ce957d8777bcbAutores: de Barros, Bruno de Cássio Veloso; Chagas, Elaine Nunes; Bezerra, Luna Wanessa; Ribeiro, Laila Graziela; Duarte Júnior, Jose Wandilson Barboza; Pereira, Diego; da Penha Junior, Edvaldo Tavares; Silva, Julia Rezende; Bezerra, Delana Andreza Melo; Bandeira, Renato Silva; Pinheiro, Helder Henrique Costa; Guerra, Sylvia de Fátima dos Santos Los animales domésticos y principalmente silvestres como murciélagos, pequeños roedores y aves son animales altamente diversificados en relación a sus hábitats y nichos ecológicos y están ampliamente distribuidos geográficamente en ambientes de fragmentación forestal en algunas zonas de la Amazonía, siendo consideradas fuentes importantes de virus que afectan a los seres humanos y otros animales. Debido a las actividades antrópicas, estos animales cambiaron su hábitat natural y se adaptaron a entornos urbanizados, representando así riesgos para la salud humana y animal. Aunque el conocimiento de la diversidad global de virus entéricos es escaso, existen informes que demuestran la detección de rotavirus en animales domésticos y animales de sistemas productivos, como bovinos y cerdos. El presente estudio investigó la prevalencia del Rotavirus A en 648 muestras fecales de diferentes especies animales de la mesoregión noreste del estado de Pará, Brasil, que se caracteriza por ser un área urbanizada con fragmentos forestales. Los especímenes fecales fueron recolectados de octubre de 2014 a abril de 2016 y sometidos a una Reacción en Cadena de Polimerasa en Tiempo Real Cualitativa (RT-qPCR), utilizando el gen NSP3 como objetivo. Se observó que el 27,5% (178/648) de las muestras presentaron resultados positivos para la VRA, con 178 muestras distribuidas en aves (23,6%), caninos (21,35%), quiropteros (17,98%), bovinos (14,6%), caballos (8,43%), pequeños roedores (6,74%), cerdos (3,93%) y felinos (3,37%), demostrando la circulación de la VRA en animales domésticos y sugiriendo que tal proximidad podría causar transmisiones entre diferentes especies y la ocurrencia de reordenamientos en el genoma de la VRA ya descrito en la literatura, asociados a las trazas de degradación ambiental en las áreas estudiadas. Texto: Las enfermedades infecciosas emergentes y reemergentes están aumentando cada año en varios países, con un impacto tanto en las poblaciones humanas como en los animales domésticos y silvestres que viven en áreas con restos forestales considerables [1]. La mayoría de estas enfermedades son de origen viral, lo que sugiere la aparición y reaparición de virus que son desencadenados por actividades humanas que modifican el medio ambiente [2]. Las poblaciones de animales silvestres que habitan fragmentos forestales son grupos estratégicos para estudios de salud pública y transmisión de zoonosis, dado que actúan como indicadores en la asistencia e intervención en las poblaciones humanas, con el objetivo de prevenir brotes y epidemias [3]. La gastroenteritis aguda puede ser causada por infección en el tracto gastrointestinal, causada por diferentes agentes infecciosos o parásitos [4] [5] [6] [7]. Representan una de las principales causas de mortalidad en humanos y en animales jóvenes, contando con alrededor del 25% de mortalidad [8]. El rotavirus se distribuye ampliamente en los animales, que actúan como fuentes de cepas emergentes del rotavirus, con estos animales actuando en la transmisión entre especies y por medio del reasociamiento que conduce a la aparición de nuevas cepas que han sido reportadas en infecciones humanas [9] [10] [11] [12]. El rotavirus (RV) pertenece a la familia Reoviridae y comprende nueve especies conocidas como Rotavirus grupo A a I, con una propuesta reciente de la especie J [13, 14]. El rotavirus A (RVA) está muy extendido en todo el mundo y afecta predominantemente a seres humanos, bovinos y otras especies de mamíferos, así como a aves [15]. Tienen un genoma de ácido ribonucleico de doble cadena (dsRNA), dividido en 11 segmentos de codificación para proteínas estructurales (VP1-VP4, VP6 y VP7) y proteínas no estructurales (NSP1-NSP5/NSP6 Hay registros de una estrecha relación entre la fauna y flora amazónicas y las poblaciones humanas [18], y esta interacción es el efecto de las actividades de urbanización antropogénica que resultan en la deforestación de zonas forestales, causando la degradación de sitios previamente aislados como cuevas y pequeñas cuevas, un proceso continuo y progresivo de la naturaleza que ha llevado no sólo a cambios en los hábitats de la fauna y flora silvestres, sino también a una mayor relación con las poblaciones humanas en entornos rurales y urbanos, contribuyendo a la aparición y aparición de enfermedades diferentes de las que normalmente ocurren en regiones endémicas [19] [20] [22]. Aunque los resultados del VRA ya se han descrito globalmente [12, [23] [25] [26] [28] [30], en Brasil, la ocurrencia, diversidad y papel del rotavirus en estos animales todavía están poco estudiados, teniendo en cuenta el gran número de especies presentes [4, [31 En la Amazonía brasileña, especialmente en el estado de Pará, las mesoregiones metropolitanas de Belém y Nordeste son algunas de las zonas con mayor índice de cambios ambientales [35], que se concentran, junto con el hecho de que el conocimiento de la diversidad global del virus entérico en animales es escaso [36]. Por lo tanto, es importante monitorear la salud de los animales domésticos y silvestres en su hábitat natural, especialmente en áreas con alteraciones antrópicas que tienen una interfaz con comunidades rurales y empresas, para investigar la ocurrencia de VRA en esta población. Estas comunidades son ecológicamente complejas, ya que cuentan con múltiples hospedadores y patógenos sin fin que eventualmente pueden circular en centros urbanos contiguos, además de que también debe considerarse que todavía no existen estudios que demuestren la importancia de estos virus que infectan a esta población, ya que en el contexto de la vigilancia epidemiológica, estos animales se vuelven importantes, ya que pueden ser considerados como fuentes naturales, con la posibilidad de transmisión a los seres humanos [37] [38]. La reacción cualitativa en cadena de la polimerasa en tiempo real (qRT-PCR) utilizó el gen NSP3 y la sonda TaqMan de una región altamente conservada de la proteína no estructural del rotavirus 3 (NSP3), que se utilizó previamente en muestras de origen humano y con bajas cargas virales Los datos de precipitación se obtuvieron del Instituto Nacional Brasileño de Meteorología (Inmethttp://www.inmet.gov.br/) para los años de captura en el Acuerdo Expedito Ribeiro (2014) y Açailândia (2015) de las Plataformas de Recolección de Datos (PCD) de Belém, ubicado a 50 km de Santa Bárbara do Pará, y Tracuateua, ubicado a 50 km de Peixe-Boi y a 100 km de Viseu. Los límites municipales se obtuvieron en el sitio web del Instituto Brasileño de Geografía y Estadística (IBGE) (http://www.ibge.gov.br/) y los datos sobre deforestación y uso de la tierra se obtuvieron de los proyectos PRODES [43] y TerraClass [44]. PRODES cuenta con datos anuales en formato digital desde 2000 y TerraClass presenta datos semestrales desde 2004. La imagen satelital se generó utilizando el sensor Sentinel 2 de la Agencia Espacial Europea (ESA) (https://sentinel.esa.int/web/sentinel/user-guides/sentinel-2-msi) con licencia CC-BY de acceso abierto (http://open.esa.int/) de los años 2017 y 2018. Todos los datos obtenidos se almacenaron en una base de datos geográficos (BDG). El BDG fue importado/almacenado en un SIG para la edición de los elementos gráficos, el establecimiento de relaciones topológicas entre los elementos y sus atributos respectivos, el análisis espacial y la visualización del resultado a través de mapas temáticos. Para el presente estudio, se eligieron fragmentos forestales de tamaño, forma y fisiología similar, considerando una matriz periurbana abierta con uso de suelo similar. Los fragmentos seleccionados fueron distribuidos dentro de las mesoregiones estudiadas, y en cada fragmento seleccionado muestras fecales fueron recolectadas aleatoriamente de animales domésticos y salvajes [45]. Se obtuvieron clases de uso de suelo del mosaico de datos TerraClass de 2004 a 2016, ya que los sitios de estudio se encontraban en un área con alta presencia de nubes, lo que impidió la observación (el área no se observó).El procesamiento de datos, interpretación, visualización y análisis espacial se realizaron en el software ArcGIS (http://www.arcgis Para el análisis de los datos relacionados con la determinación de la riqueza, composición y abundancia de la fauna de los animales estudiados en el área de estudio, considerando los métodos de recolección adoptados y las especies disponibles en cada ciudad, cada muestra fue considerada como una muestra independiente. La riqueza de la fauna silvestre y animales domésticos fue determinada por el número total de especies incluyendo todos los métodos de recolección, y la similitud de las especies fue realizada por el análisis chi-cuadrado entre las muestras de los diferentes tratamientos con la ayuda del software EstimatS 8.0 [46]. Para el cálculo del Test T, se utilizó el software Statistica, y se calcularon los índices de animales infectados en los dos ambientes (fragmento forestal y peridomicil) para cada tratamiento muestreado por área de recolección, utilizando el software Past 1.92. Apuntando a comparar los valores de los índices de diversidad a través del test emparejado, así como el análisis descriptivo Los datos obtenidos para la ocurrencia de la VRA y los cuestionarios fueron insertados en una base de datos para un análisis descriptivo del perfil epidemiológico de la población animal en los tres ecosistemas forestales estudiados.En este análisis se realizaron tratamientos estadísticos descriptivos, utilizando tablas de tipo "columnas de surco" personalizadas, referidas a los datos, con el fin de caracterizar la muestra y cuantificar los resultados mediante valores de frecuencia absoluta utilizando la prueba chi-cuadrado y la prueba T.Population estudio, recolección de especímenes clínicos y metodología de laboratorio.Los animales voladores (aves silvestres y quiroptera) fueron capturados mediante redes de niebla que se abrieron al amanecer (4:00 a.m.) y cerraron por la mañana (9:00 a.m.) y fueron inspeccionados cada hora hasta el cierre, con un esfuerzo de muestreo de 15 días.Esta investigación fue aprobada por National All procedimientos con animales fueron realizados por veterinarios, siendo aves Los especímenes fecales fueron recolectados por estimulación de la ampolla rectal con el uso de un "Zaragatoa", envasados en viales criogénicos, identificados, almacenados en nitrógeno líquido, y posteriormente enviados al Laboratorio. Los animales salvajes (pequeños mamíferos no voladores) fueron atrapados en trampas de contención en vivo de la jaula Tomahawk (tamaño 45x16x16cm) y de aluminio tipo Sherman (tamaño 30x9x8cm). En cada parcela de muestra, se distribuyeron 61 trampas, 20 Shermans y 41 Tomahawks siendo cebos con una mezcla hecha con pasta de maní, sardinas, aceite de hígado de bacalao y harina de maíz, así como frutas como plátano, manzana y piña. Todas las trampas utilizadas fueron inspeccionadas diariamente por la mañana, los cebos fueron intercambiados cuando era necesario y más tarde después de la captura en bolsas de tela y Los animales silvestres fueron sedados con una combinación de ketamina 20mg/kg y xilazina 2mg/kg intramuscularmente y posteriormente, eutanasiados con sobredosis anestésica de lidocaína al 2% en el foramen magnum, de acuerdo con la recomendación del Consejo Nacional para el Control de la Experimentación Animal (CONCEA). De octubre de 2014 a abril de 2016, se recolectaron 1.282 muestras fecales de animales silvestres y domésticos, de las cuales 648 (50,5%) fueron seleccionadas aleatoriamente para investigación RVA y manejadas en Laboratorio de Bioseguridad de Nivel Tres (NB3). El genoma viral fue extraído mediante el protocolo TRIZOL LS REAGENT (INVITRO-GEN, USA/KIT QIAGEN), siguiendo las recomendaciones del fabricante, con menor adaptación según el protocolo descrito en los datos complementarios. [40] para la detección de RVA utilizando el segmento NSP3 de RVA como secuencia génica diana. El ensayo se llevó a cabo en una mezcla que contenía: RNAse-free H 2 O, TaqMan RT-PCR Mix (2x), TAqMan RT Enzyme Mix (40x), imprimaciones para el gen NSP3, Primer NSP3 Forward (20mM), Primer NSP3 Inverso (20mM), sonda NSP3 S (10nm), Plantilla (ARN) 3μL, con un volumen de reacción total de 17μL y ciclo de transcripción inversa de 50°C, 30 minutos, desnaturalización de 95°C, 10 minutos, recocido de 45 ciclos de 95°C, 15 segundos y extensión de 60°C, 1 minuto. Los análisis se consideraron positivos al presentar el umbral de ciclo (TC) 40. Para garantizar un resultado de prueba fiable, las mediciones del control de la contaminación se realizaron con el uso de control animal positivo (prototipo SA11) y un control negativo (agua de úlcera). Todas las muestras positivas de RVA fueron sometidas a reacción en cadena de la transcripción inversa-polimerasa (RT-PCR) de acuerdo con Mijatovic et al [41] para genotipar muestras de bajas cargas virales. La primera ronda fue realizada con imprimaciones de consenso N-VP4F1/N-VP4R1 y la Nested-PCR fue realizada con imprimaciones N-VP4F2/N-VP4R2 para amplificar el gen VP4. Los amplificadores fueron purificados y secuenciados para el gen VP4 usando los mismos imprimadores de Nested-PCR. Las secuencias fueron recolectadas de un secuenciador automático ABI Prism 3130xl ADN Los fragmentos de secuencia fueron ensamblados y editados utilizando la plataforma de software Geneious Bioinformática v.8.1.7. Posteriormente, los datos fueron comparados con otras secuencias de la base de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica GenBank utilizando la herramienta de alineación BLAST para dilucidar el genotipo RVA de las muestras. De octubre de 2014 a abril de 2016, un total de 648 muestras fecales de animales silvestres y domésticos pertenecientes a tres áreas de fragmentos forestales fueron probadas para el gen NSP3 por QPCR cualitativo, y 178 (27,5%) fueron positivas para RVA, distribuidas entre las especies: aves (23,6%), caninos (21,35%), murciélagos (17,98%), bovinos (14,6%), caballos (8,43%), pequeños roedores (6,74%), cerdos (3,93%) y felinos (3,37%). 47 Fue posible detectar cepas virales en todos los géneros de animales estudiados y en el período de recolección ninguno de los animales mostró signos de infección aguda y/o diarrea. Rotavirus A (RVA) detectados en el presente estudio de animales silvestres y domésticos pertenecientes a las tres áreas del fragmento forestal, según la Fig. 2. En relación a los bovinos evaluados, sólo en la ciudad de Viseu, estas especies fueron estudiadas porque fueron creadas extensamente. Además, la mayoría de los animales eran jóvenes con edades que variaban de 1 día a 8 años, antecedentes de vacunación deficiente, falta de asistencia técnica y criados en forma de subsistencia. Los animales no mostraron síntomas de diarrea, solo bajo rendimiento de peso y mal estado de manejo sanitario. En relación a la quiroptera, se distribuyeron 32 (17,98%) muestras positivas de RVA entre las especies de Carollia perspicillata, con 12 (37,5%) siendo todas adultas, 9 (28,12%) muestras de Desmodus rotundus (4 jóvenes y 5 adultos), 5 (15,6%) de Uroderma bilobata (15,62%), 3 (9,37%) de Artibeus lituratus y las especies Artibeus Planirostus, Diaemus iyoug y Glossophagina con 1 (3,12%) cada una. Estos animales procedían de áreas de fragmentos forestales ubicadas cerca de granjas de bovinos y equinos, además de habitar pequeñas granjas de pollos. La figura 3 muestra los resultados obtenidos para todas las especies de animales investigadas en el fragmento forestal así como en la zona del peridomicillus. Las variables antrópicas fueron analizadas para las tres ciudades estudiadas, así como el uso del suelo dentro del rango de los animales, obedeciendo el domicilio, el peridomicil y el fragmento forestal donde se capturaron las trampas de pequeños roedores, aves y diversas especies de animales (Fig 4 y Fig 5). Considerando los factores relacionados con las actividades antrópicas en las tres áreas estudiadas dentro de las tres ciudades del presente estudio, se observó que la ciudad de Santa Bárbara es la que tiene una mejor área de bosque preservado y la ciudad de Viseu una área más pequeña. Sin embargo, en la ciudad de Santa Bárbara se observó una mayor concentración de ocupaciones alrededor del área de fragmento forestal. Se observó en esta zona escogida de la ciudad, la presencia de diferentes familias viviendo en un asentamiento rural, sobreviviendo de la explotación de los recursos forestales y la creación de pequeños animales de subsistencia, como aves de corral y piscicultura, así como productos agrícolas familiares. La cría de animales en pastos nativos sólo se observó en las ciudades de Peixe Boi y Viseu. Se practicó una extensa ganadería con ganado vacuno, equinos para trabajo y pequeños animales (porcinos y cabras). En relación con la zona de pastos más conservada, la ciudad de Peixe Boi tuvo la mayor superficie, según los datos mostrados en la Figura 5, sin embargo, en la ciudad de Viseu se observó una mayor regeneración en los pastos durante el período del estudio, con significativa vegetación secundaria. Al comparar los climas de las tres áreas se observó que el clima predominante es megatermal y húmedo con temperatura media anual alrededor de Los meses de octubre, noviembre y diciembre son los más calurosos, con temperaturas entre 32°C y 34°C y máximos absolutos alrededor de 41°C. Las precipitaciones anuales son bastante altas, generalmente alrededor de 2.350 mm, pero fuertemente concentradas de enero a junio (80%). De septiembre a diciembre, por el contrario, las precipitaciones son raras, alrededor del 7%, con una corta estación seca, de déficit de agua moderado en esos meses. La humedad relativa del aire promedio oscila alrededor del 85%, como se muestra en la figura 6 [48]. La descripción de la precipitación acumulada en el año de captura de los especímenes fecales en comparación con las Normales Climatológicas (CLINO) para el período 1961-1990 de los PCD más cercanos a las localidades del Expedito Ribeiro / Santa Bárbara (Belém PCD), Vila Ananim / Peixe-Boi y Açaiteua / Viseu (Tracauateua PCD) muestran la frecuencia de lluvias en las regiones, lo que facilita la renovación de los pastos y la regeneración de los bosques impactados, siendo un indicador importante de la reducción de los daños causados por la deforestación en la región. El índice medio de deforestación en las tres áreas de estudio se calculó a partir de los datos obtenidos de los sistemas de información del INPE. Se observó que en los años de 2013 a 2014 no hubo cambios en estas regiones; en el período de 2014 a 2015 alrededor del 4,1% de la ciudad de Viseu fue cambiada y el 1,6% de la ciudad de Peixe Boi. En relación con el período de 2016, se observaron grandes cambios en Peixe Boi (79%) y en la ciudad de Viseu (70%), demostrando así que los cambios en el ecosistema natural pueden estar asociados con las frecuencias de VRA en las áreas estudiadas, según la Fig 7. Al evaluar a los animales infectados en relación a los animales no infectados tanto en el fragmento del bosque como en el peridomicilo, considerando como animales del bosque fragmentan a las aves, se obtuvieron la quiroptera y los pequeños roedores y como animales del peridomicilo los caninos, bovinos, cerdos, felinos y caballos, un porcentaje de 37,07% infectados por animales domésticos (86/232) y 22,12 % infectados por animales fragmentados del bosque (92/416). Aplicando el análisis estadístico seleccionado, se obtuvo un valor de Pearson x2 Chi-cuadrado: 16,7159, df = 1 y p < 0,001, lo que significa que la hipótesis fue corroborada, es decir, cuanto mayor sea la degradación del medio ambiente, más probable será la búsqueda de alimentos por animales silvestres en áreas adyacentes, o en el borde del bosque o incluso en la región peridomiciliaria. En este sentido, se debe considerar la posibilidad de contagio con otras especies de animales, incluso humanos, debido a la capacidad del rotavirus para ser transmitido por vía fecal/ oral o por contacto directo con el medio ambiente. Es importante señalar que los animales detectados en este estudio son fuentes importantes de cepas virales. Se seleccionaron, reextractaron y analizaron un total de 80 muestras de heces utilizando PCR para el gen VP4. Ocho cepas (10%) fueron positivas para el gen VP4, siendo 2 cepas despojadas del genotipo P [6] y 6 al tipo P[4], según el presente estudio, se detectó la presencia de VRA circulando en el 27,5% de los animales; 36% en animales domésticos y 64% en animales silvestres, proporcionando un conjunto de datos único con qRT-PCR detectando una baja carga viral de VRA en diferentes especies, lo que además se correlaciona con el índice de deforestación Estos datos son importantes debido a la falta de pruebas para el diagnóstico del VRA en animales, ya que los métodos actuales de detección del VRA no siempre se detectan en estas poblaciones [8]. Con el advenimiento de la RCP en tiempo real (QPCR), hubo un crecimiento exponencial, en comparación con los ensayos convencionales del RPR, ya que su precisión, sensibilidad y especificidad superiores son notables, y es Rotavirus A en animales silvestres y domésticos posible detectar el VRA en una variedad de especies animales utilizando el gen NSP3 [49]. La sensibilidad del RT-qPCR mejoró significativamente la tasa de detección del VRA en muestras clínicas de animales y en este contexto, el presente estudio propuso un interesante estudio métricas utilizando el virus que se propaga en animales silvestres que habitan fragmentos forestales para indicar intervenciones de población humana, con el objetivo de prevenir los brotes de virus apalancados en las características geográficas únicas de Brasil y su En la actualidad, no se han descrito datos en la literatura sobre la detección de RVA utilizando la técnica qPCR en tiempo real en una amplia variedad de especies animales silvestres. Sin embargo, un estudio de Soltan et al. [50] realizado con caballos y bovinos detectó RVA por RT-PCR, RT-PCR comercial y RT-qPCR en 36,7%, 51,4% y 56,9% respectivamente, de manera diferente al presente estudio que mostró mayor positividad para los quiropteros (17,98%), caninos (21,35%), aves (23,6%) y ganado (14,6%). La primera descripción de RVA en quiroptera se registró en heces de Eidolon helvum capturadas en Vihiga, Kenia [51]. Posteriormente, varias cepas de RVA fueron detectadas por diferentes técnicas moleculares que involucraban a quiroptera, en varios países, incluyendo Kenia (E. helvum), China (Rhinolophus hipposideros y Aselliscus stoliczkanus), Francia (Myotis mystacinus), Camerún (E. helvum) y Brasil [31, [51] [53] [53] [54]. El presente estudio muestra la ocurrencia de RVA en el 17,98% de las quiropteras, estando entre las especies Carollia perspicillata (37,5%), Desmodus rotundus (28,12%), Uroderma bilobata (15,6%), Artibeus lituratus (9,37%), Artibeus Planirostus (3,12%), Diaemus iyoug y Glossofagina (3 [56] informó que Desmodus rotundus es una de las tres especies hematófagas de la familia Phyllostomidae, encontrada en toda América del Sur, América Central y México. De las quiropteras positivas para RVA en el presente estudio, una prevalencia de 28,12% fue de Desmodus rotundus. Esta especie se alimenta de aves, puede alimentarse de mamíferos, en su mayoría de tamaño medio o grande, facilitando la diseminación de esporas virales entre la comunidad dentro del hábitat, como se observa en el presente estudio. Estos hallazgos muestran la importancia de los datos epidemiológicos sobre las especies estudiadas debido a la falta de estudios que involucren especies de quiroptera neotropical, y no es posible establecer parámetros comparativos para estos animales. Respecto a la circulación de RVA en caninos y aves, la prevalencia fue del 53% y 29%, respectivamente. Aunque en la región amazónica existen registros de RVA, RVD, RVF y RVG que infectan a las aves [57] [58] y RVD en aves migratorias [59], todos fueron detectados mediante ensayos RT-PCR de manera diferente al presente estudio que detectaron el RVA por RT-qPCR involucrando una variedad de especies animales. Por otro lado, la prevalencia en felinos (16%) y cerdos (22%) fue menor, probablemente porque hay pocos animales de estas especies en la región, así como pocas creaciones. El estudio detectó la presencia de RVA en diferentes especies de animales tanto en áreas cercanas al hogar como en áreas ubicadas en fragmentos de bosque, caracterizadas como restos forestales, ya que se encontraban en ciudades que sufrieron un alto impacto ambiental debido al extractivismo vegetal, la formación de pastos para la cría de ganado, la explotación de recursos naturales y reflejos directos sobre los hábitats de animales silvestres que pueden servir como fuentes víricas, facilitando así la dispersión de RVA entre comunidades de animales coexistentes. Cabe destacar que estos animales tienen mayor contacto con las poblaciones humanas de las áreas estudiadas ya que cohabitan con los humanos de la región, además de tener un alto flujo de movimiento entre los extractos forestales y ambientes elegidos para el presente estudio. Sin embargo, cabe destacar que sólo en las comunidades de Santa Bárbara y Viseu se recogieron especímenes fecales de humanos asintomáticos para diarrea y se probaron para RVA, pero todos La fragmentación del bosque genera muchas consecuencias sobre la biota amazónica, pudiendo alterar la diversidad y la composición de las comunidades animales en los fragmentos e incluso interferir en los procesos ecológicos, sin considerar que los fragmentos de bosque en la Amazonía están influenciados por el clima, lo que posiblemente facilita la dispersión de patógenos por el medio ambiente, ya que los animales silvestres detectados en el presente estudio son asintomáticos y tienen baja carga viral para la VRA. La ocurrencia de VRA en esta población de animales puede explicar la posibilidad de dispersión de cepas virales, ya que existe una proximidad a la población humana, además de las características biológicas de estas especies que pueden representar fuentes importantes de virus gastroenternos, junto con el hecho de que todos los animales fueron asintomáticos para la diarrea. Las aves silvestres tienen una capacidad de vuelo ilimitada, fueron capturadas en una región de interfaz entre el peridomicilo y los fragmentos forestales y se cree que esta región no ha sido influenciada por actividades antrópicas como las observadas en el área del presente estudio. Por otro lado, el método de cría de aves de corral y caninos cercanos a los hogares y al ecosistema forestal, tal como se crean en las comunidades estudiadas, probablemente facilita el contacto directo con posibles fuentes de contaminación, ya que en las zonas el uso de tanques sépticos es deficiente y a veces inexistente, lo que puede facilitar o incluso aumentar el riesgo de dispersión viral en todo el medio ambiente. Las altas tasas de aumento y el análisis del uso del suelo en las zonas investigadas pueden ser indicadores importantes de cómo interactúan estos animales, ya que con la deforestación, las poblaciones de animales silvestres buscan refugio en comunidades cercanas facilitando la dispersión de agentes infecciosos y la posible ocurrencia de A nuestro conocimiento, este es el primer estudio en el que se aplicó un ensayo PCR en tiempo real para la detección de RVA involucrando una amplia variedad de animales domésticos y salvajes, facilitando la utilidad práctica en estudios epidemiológicos y moleculares y ayudando en una perspectiva en la elaboración de control sanitario y monitoreo, evitando posibles brotes en las comunidades estudiadas. La detección de animales positivos fue útil para monitorear la infección del agente en la población animal y para proporcionar una señal de alerta temprana para predecir una epidemia inminente y un riesgo favorable para la población humana, dada la evidencia de la circulación de RVA en los diferentes fragmentos forestales. Además, el ensayo RT-qPCR puede ser una alternativa útil para el diagnóstico diferencial de RV en posibles infecciones mixtas que coexistan clínicamente indistinguibles como las causadas por otras cepas virales que causan gastroenteritis tales como: astrovirus, coronavirus, picobirnavirus, calicivirus, entre otros, como se observó en los estudios de Jing et al. [60] y Waruhiu et al. [61]. La diarrea asociada a infecciones por VRA en cerdos es una causa importante de aumento de la mortalidad y pérdidas económicas en Europa. Los genotipos más prevalentes aislados de heces de lechones diarreicos y no diarreicos belgas en 2012 [62] demuestran una amplia gama de combinaciones de genotipos G / P incluyendo; G3P [6], G4P [6], G5P [6], G4P [7], G5P [7], G9P [7], G9P [13] y G9P [23]. Por otro lado, en el presente estudio fue posible detectar sólo el genotipo P [6], ya que la mayoría de las muestras eran asintomáticas para la diarrea. El hallazgo muestra que diferentes genotipos P de cepas RVA interactúan con antígenos histológicos distintos del grupo sanguíneo (HBGA, ABOH, Lewis) y ácidos siálicos vía VP4 proporcionando una visión de la prevalencia regional y un aumento del potencial zoonótico de algunos El genotipo P [6] fue identificado en lechones en Brasil [64] y en Italia y Japón, parecido al genotipo P [6] humano [65, 66]. En la población de animales estudiados, la transmisión zoonótica puede ser frecuente, ya que los animales viven en contacto con humanos y en condiciones sanitarias precarias. En Brasil, este genotipo fue descrito en poblaciones animales y humanas en estudios de Luchs y otros [32] ; Honma y otros [67] ; Araújo y otros [68] ; Mascarenhas y otros [69] y Lorenzetti y otros [70] tales estudios corroboran la importancia de seguir monitoreando los genotipos para verificar si surgen cepas poco comunes o nuevas cepas y pueden infectar poblaciones animales o transmisiones interespecíficas.En cuanto al genotipo P [4], fue más detectado en nuestras muestras en murciélagos, perros, Este genotipo no es común en animales, siendo más detectados en muestras humanas y ambientales en diversas partes del mundo e incluyendo a nuestra región [71]. Es importante destacar que los indicadores de contaminación ambiental en Brasil son significativos y contribuyen a la posibilidad de transmisión humano-animal [71]. Estos datos requieren investigación adicional en trabajos posteriores para caracterizar mejor la transmisión interespecífica, ya que la ocurrencia de virus entéricos en diferentes matrices demuestra el impacto antropogénico de la población expuesta alrededor y señala el riesgo potencial de infección por la posible exposición de individuos susceptibles. Nuestros hallazgos pueden ser útiles para el seguimiento de la contaminación fecal en el ambiente utilizando animales como posibles fuentes, minimizando así el riesgo de infección por exposición a individuos susceptibles, en este caso diferentes especies animales o incluso poblaciones humanas. RVA fueron detectados en animales silvestres y domésticos utilizando un ensayo RT-qPCR que analizó muestras que tenían baja carga viral para RVA. Aunque las muestras son asintomáticas para la diarrea, es necesario llevar a cabo estrategias para el monitoreo y control de los animales en las áreas estudiadas en la población humana, así como en otras especies de animales, así como la implementación de medidas preventivas dirigidas a futuros brotes en comunidades animales de la población residente en estas áreas impactadas. Por lo tanto, el presente estudio no tiene precedentes en la región y en el país en relación con la investigación del VRA en animales silvestres. Cabe destacar que, aunque la calidad de las muestras analizadas se caracteriza por una baja carga viral detectable, la técnica presentó una buena respuesta analítica en la detección de los animales de origen para el VRA, facilitando la selección de las muestras para futuras pruebas de caracterización genética.

¿Cuántas especies conocidas de Rotavirus existen?