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Las variantes genéticas funcionales en DC-SIGNR están asociadas con la transmisión del VIH-1 de madre a hijohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2752805/Boily-Larouche, Geneviève; Iscache, Anne-Laure; Zijenah, Lynn S.; Humphrey, Jean H.; Mouland, Andrew J.; Ward, Brian J.; Roger, Michel2009-10-07DOI:10.1371/journal.pone.0007211Licencia:cc-byAbstract: ANTECEDENTES: La transmisión de madre a hijo (MTCT) es la principal causa de infección por VIH-1 en niños de todo el mundo. Dado que el receptor de lectina de tipo C, el receptor de lectina dendrítico específico para células ICAM no relacionado con la integración (DC-SIGNR, también conocido como CD209L o ganglio hepático/linfa-nodo específico para ICAM no integrador (L-SIGN)), puede interactuar con patógenos incluyendo el VIH-1 y se expresa en la interfaz materno-fetal, se hipotetiza que podría influir en la TCM del VIH-1. MÉTODOS Y INDICACIONES: Para investigar el papel potencial de DC-SIGNR en la TCM del VIH-1, realizamos un estudio de asociación genética de DC-SIGNR en una cohorte bien caracterizada de 197 madres infectadas por el VIH y sus bebés reclutados en Harare, Zimbabwe. Los lactantes que albergaban dos copias de los haplotipos DC-SIGNR H1 y/o H3 (H1-H1, H1-H3, H3-H3) tuvieron un aumento de 3,6 veces el riesgo de infección por VIH-1 en el útero (UI) (P = 0,013) y un aumento de 5,7 veces el riesgo de infección por VIH-1 en el intraparto (IP) (P = 0,025) después de ajustarse para varios factores maternos. Los haplotipos H1 y H3 implicados comparten dos polimorfismos de nucleótidos únicos (SNP) en la región promotora (p-198A) e intron 2 (int2-180A) que se asociaron con un aumento del riesgo de ambas UI (P = 0,045 y P = 0,003, respectivamente) e IP (P = 0,025, para la infección por VIH-1) La variante En los lactantes homocigotos H1 con mutaciones tanto p-198A como int2-180A, observamos una disminución de 4 veces en el nivel de transcripciones DC-SIGNR placentarias, afectando desproporcionadamente la expresión de isoformas ligadas a la membrana en comparación con las no portadoras infantiles (P = 0,011). CONCLUSIÓN: Estos resultados sugieren que DC-SIGNR juega un papel crucial en la TCM del VIH-1 y que la expresión DC-SIGNR placentaria alterada aumenta el riesgo de transmisión. Texto: Sin intervenciones específicas, la tasa de transmisión del VIH-1 de madre a hijo (TCMM) es de aproximadamente 15-45% [1]. ONUSIDA estima que solo el año pasado, más de 400.000 niños fueron infectados en todo el mundo, principalmente a través de la TCM y el 90% de ellos vivían en el África subsahariana. En los países más afectados, como Zimbabwe, el La TCM del VIH-1 puede ocurrir durante el embarazo (in utero, UI), el parto (intraparto, IP) o la lactancia materna (postparto, PP). La alta carga viral materna, el bajo recuento de células CD4, el parto vaginal, la baja edad gestacional se han identificado como factores independientes asociados con la TCM del VIH-1 [1]. Aunque los antirretrovirales pueden reducir la TCM al 2%, el acceso limitado a diagnósticos y medicamentos oportunos en muchos países en desarrollo limita el impacto potencial de esta estrategia. Una mejor comprensión de los mecanismos que actúan en la interfaz materno-fetal es crucial para el diseño de intervenciones alternativas a la terapia antirretroviral para la prevención de la transmisión. Las células dentríticas específicas de la ICAM no relacionadas con la integración (DC-SIGNR, también conocido como CD209L o ICAM no integrador (L-SIGN)) pueden interactuar con una plétora de patógenos incluyendo VIH-1 y se expresa en células endoteliales capilares placentarias [2]. DC-SIGNR se organiza en tres dominios distintos, una cola citoplásmica N-terminal, una región de repetición que contiene siete repeticiones de 23 aminoácidos y un dominio C-terminal implicado en la unión de patógenos. El empalme alternativo del gen DC-SIGNR conduce a la producción de un repertorio de isoformas altamente diversificadas que incluye isoformas asociadas a la membrana y solubles [3]. Se ha propuesto que la interacción entre DC-SIGNR y VIH-1 podría mejorar la transferencia viral a otros tipos de células sensibles [2] pero DC-SIGNR también puede internalizar y mediar la degradación dependiente de proteasomas de virus [4] que pueden afectar de manera diferente el resultado de la infección. Dada la presencia de DC-SIGNR en la interfaz materno-fetal y su interacción con el VIH-1, se hizo una hipótesis de que podría influir en la TCM del VIH-1. Para investigar el papel potencial de DC-SIGNR en la TCM del VIH-1, se llevó a cabo un estudio de asociación genética de DC-SIGNR en una cohorte bien caracterizada de madres infectadas por el VIH y sus bebés reclutados en Zimbabwe, y se identificaron variantes específicas de DC-SIGNR asociadas con el aumento de los riesgos de transmisión del VIH. Además, caracterizamos el impacto funcional de estas variantes genéticas en la expresión DC-SIGNR y demostramos que afectan tanto al nivel como al tipo de transcripciones DC-SIGNR producidas en la placenta. Las muestras consistieron en extractos de ADN almacenados obtenidos de 197 parejas madre-hijo co-inscritas inmediatamente después del parto en el ensayo de suplementación de vitamina A de ZVITAMBO (Harare, Zimbabwe) y seguidos a 6 semanas e intervalos de 3 meses hasta 24 meses. El proyecto ZVITAMBO fue un ensayo clínico aleatorizado controlado con placebo que incluyó a 14.110 parejas madre-hijo, entre noviembre de 1997 y enero de 2000, con el objetivo principal de investigar el impacto de la suplementación inmediata de vitamina A de postparto en la TCM del VIH-1. Las muestras utilizadas en el presente estudio fueron de parejas madre-hijo asignadas aleatoriamente al grupo placebo del proyecto ZVI La profilaxis antirretroviral para mujeres embarazadas VIH-1 positivas no estaba disponible en el sector público de Harare durante el reclutamiento de pacientes de ZVITAMBO. Las muestras fueron obtenidas consecutivamente de dos grupos: 97 parejas de madres VIH-1 positivas/hijos VIH-1 positivos y 100 parejas de madres VIH-1 positivas/niños VIH-negativos. El estado serológico de la madre fue determinado por ELISA y confirmado por Western Blot. Se consideró que los lactantes estaban infectados si eran seropositivos a los 18 meses o mayores y tenían dos o más resultados positivos de reacción en cadena de la polimerasa del VIH-1-DNA (PCR) a edades más tempranas. Se consideró que 100 niños no estaban infectados por ser ELISA negativos a los 18 meses o mayores y tuvieron dos resultados negativos de PCR de ADN de muestras recogidas a una edad más temprana. De los 97 niños infectados por el VIH-1, 57 fueron infectados IU, 11 fueron infectados IP y 17 fueron infectados PP según los análisis de PCR de muestras de sangre recolectadas al nacer, 6 semanas, 3 y 6 meses de edad y según las siguientes definiciones adaptadas de Bryson y colegas [5]. Brevemente, los bebés con ADN PCR positivo al nacer fueron infectados IU. Los bebés con PCR negativo resultado de la muestra obtenida al nacer pero que se hicieron positivos por 6 semanas de edad fueron infectados IP. Los lactantes con resultados negativos de PCR al nacer y 6 semanas de edad pero que posteriormente se convirtieron en DNA PCR positivo fueron considerados infectados durante el período PP. En el análisis de comparación de los 3 modos diferentes de TCM, 12 bebés infectados por el VIH-1 fueron excluidos porque los resultados de PCR no estaban disponibles a las 6 semanas de edad. Métodos completos de reclutamiento, recolección de características basales, procedimientos de laboratorio La variación de la secuencia de nucleótidos de todo el promotor, codificación y parte de las 39 regiones UTR del gen DC-SIGNR en la población del estudio se determinó previamente [7]. La reconstrucción del haplotipo se realizó utilizando el método estadístico Bayesiano implementado en FASE [8], versión 2.1.1, utilizando polimorfismo nucleótido único (SNP) con una frecuencia mínima de alelos (MAF) del 2%. Aplicamos el algoritmo cinco veces, utilizando diferentes semillas generadas aleatoriamente, y se obtuvieron resultados consistentes a lo largo de las carreras (Figura 1 ). Quince SNPs con etiqueta de haplotipo (htSNPs) fueron identificados por el software HaploBlockFinder [9] con un MAF $5%. Estos htSNPs fueron genotipados en los 197 infantes mediante el análisis de secuenciación PCR directo como hemos descrito El genotipo de región de repetición DC-SIGNR 4 fue determinado por amplificación PCR seguida de migración en geles de agarosa del 1,5% [10]. Se analizaron secuencias de ADN en la región promotora con la interfaz TESS (http//:www.cbil.upenn.edu/tess) para sitios de unión de factores de transcripción putativos utilizando la base de datos TRANSFAC. Se realizaron ensayos de reporteros Luciferase utilizando vector pGL2-Básico para investigar el efecto funcional de mutaciones en la actividad promotora DC-SIGNR. El ADN genómico de los sujetos homocigotos para las variantes promotoras y WT fue amplificado desde la posición nucleótida 2715 a 21 y clonado entre los sitios de clonación múltiple BglII y HindIII en el vector pGL2-Basico que alberga un gen luciferasa de luciferasa de reportero aguas abajo (Invitrogen Canada inc, Burlington, Canadá). Todos los clones recombinantes fueron verificados por secuenciación de ADN. El vector reportero de prueba de luciferasa de luciferasa de luciferasa de luciferasa de luciferasa de fuego fue co-transfectado a una proporción de 10:1 con el expresor constitutivo de Renilla luciferasa, phRL-CMV (Promega, Madison, WI, EE.UU.). Cultivamos células Las células se lisaron y se realizaron ensayos de luciferasa utilizando 20 mg de extracto proteico según el fabricante (Promega) a 44 h de post-transfección. La actividad luciferasa de Firefly se normalizó a la actividad de Renilla luciferasa. El vector CMV-Tat de 0 mg, 0,5 mg o 1 mg se transfectó con LTR-Luc como un control positivo en estos experimentos. Realizamos ensayos de lucierasa por triplicado en tres experimentos independientes. Los resultados se expresan como error estándar medio 6 (S.E.M.). Los tejidos placentarios de primer término se obtuvieron a partir de abortos tras la interrupción voluntaria del embarazo en CHUM Hôpital Saint-Luc (Montreal, Canadá). Se utilizaron tejidos de 3 H1 (asociados con TCM del VIH-1) y 3 H15 (tipo salvaje) haplotipos homocigotos para analizar posibles diferencias en la expresión isoforma. Los ARN placentarios totales fueron extraídos por MasterPure DNA y ARN Extraction Kit (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI, USA) según el fabricante. Fragmentos correspondientes a la región de codificación DC-SIGNR fueron transcritos (RT) invertidas y luego amplificados por PCR anidados con los siguientes imprimadores; RT imprimadores RR, primer PCR RF y RR y segundo PCR RcF y RcR según Liu y colegas [11]. 1 mg de ARN total fue transcrito con Expand RT (Roche Applied Science, Indianápolis, IN, EE.UU.) según el fabricante y fue amplificado con PCR de ADN Platinum Taq Polymerase (Invitrogen). Los principales productos de PCR de la segunda reacción PCR fueron extraídos en gel con el Qiagen Gel Extraction Kit (Qiagen Canada inc, Mississauga, ON, Canadá) y clonados utilizando el TOPO TA Cloning Kit para secuenciación (Invitrogen). Para cada placenta, 15 clones diferentes fueron seleccionados aleatoriamente y amplificados con imprimadores M13 y secuenciados con secuenciador automatizado ABI PRISM 3100 capilar (Applicated Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Las secuencias fueron analizadas y alineadas con secuencia de referencia GeneBank NM La expresión cuantitativa de las isoformas DC-SIGNR 1,5 mg de ARN placentario fue transcrita inversamente utilizando 2,5 mM de Oligo dT 20 y Expand RT en 20 ml de volumen según el fabricante (Roche Applied Science). 15 ng de cDNA total en un volumen final de 20 ml se utilizó para realizar PCR cuantitativa en tiempo real utilizando Universal Express SYBR GreenER qPCR Supermix (Invitrogen) en un Rotor Gene Realtime Rotary Analyser (Corbett Life Science, Sydney, Australia). Se utilizaron muestras de 2 sujetos en cada grupo porque la calidad ARN de otros no era adecuada para un análisis QRT-PCR. La amplificación de todas las isoformas DC-SIGNR se realizó utilizando un par de primos específico exon 5 (Tabla S1 ). Las isoformas ligadas a la membrana se amplificaron utilizando imprimaciones específicas para el exón 3, correspondientes al dominio transmembrana común de DC-SIGNR. Las primeras fueron dirigidas a la unión exon-exón y los extractos de ARN fueron tratados con Dnasa (Fermantas International inc, Burlington, ON, Canadá) para evitar la amplificación del ADN contaminante. Las curvas estándar (50-500 000 copias por reacción) fueron generadas mediante dilución en serie de un DC-SIGNR de larga duración o ADN de plasma GAPDH comercial (Invitrogen). Todas las reacciones de qPCR tuvieron eficiencias que oscilaban entre el 99% y el 100%, incluso en presencia de 20 ng de ácidos nucleicos no específicos, y por lo tanto se pudo comparar. El número de copias de muestras desconocidas se estimó colocando el número de ciclo de PCR medido (u Para corregir las diferencias en calidad de ARN y cantidad entre muestras, los niveles de expresión de las transcripciones fueron normalizados a las transcripciones genéticas GAPDH de referencia. Las secuencias de primos GAPDH fueron amablemente proporcionadas por A. Mes-Masson en el CHUM. Los resultados se presentan como número de copia génica objetivo por 10 5 copias de GAPDH. La relación de isoformas ligadas a membranas fue calculada como E3/E5. Las isoformas solubles fueron calculadas restando unión de membranas de isoformas totales. Realizamos ensayos de QPCR en triplicado en tres experimentos independientes. Los resultados se expresan como media6S.E.M. El análisis estadístico se realizó utilizando el GraphPad PRISM 5.0 para Windows (GraphPad Software inc, San Diego, CA, EE.UU.). Se compararon diferencias en las características basales y frecuencias genotípicas de haplotipos o htSNPs entre los grupos utilizando el análisis x 2 o la prueba exacta de Fisher, se utilizó el análisis de regresión logística para estimar las odds ratios (OR) para cada genotipo y factores de riesgo basales, se utilizó regresión logística múltiple para definir predictores independientes identificados como significativos en el análisis bruto, se calcularon las OR y el intervalo de confianza del 95% con el método exacto, se evaluaron comparaciones de variables continuas entre grupos con la t de Student no pareada cuando las variables se distribuían normalmente y con la U de Mann-Whitney cuando lo contrario, se consideraron significativas en P0,05. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todas las madres que participaron en el estudio y el ensayo de ZVITAMBO, y la investigación reportada en este trabajo fue aprobada por The We realizó un estudio de asociación de polimorfismo DC-SIGNR en 197 niños nacidos de madres infectadas con VIH-1 no tratadas reclutados en Harare, Zimbabwe. De ellos, 97 niños fueron infectados con VIH-1 y 100 niños permanecieron sin infección. De los 97 niños infectados con VIH-1, 57 fueron infectados con IU, 11 con IP infectada y 17 infectados con PP. No se determinó el momento de la infección para 12 niños infectados con VIH-1. Las características basales de las madres y lactantes se presentan en la Tabla 1. La edad materna y el recuento de células CD4, el sexo infantil, el modo de parto, la duración de la ruptura de membrana y la edad gestacional fueron similares entre todos los grupos. Sin embargo, la carga viral materna 29 000 copias/ml se asoció con un aumento del riesgo tanto en UI como en PP con odds ratios (OR) de 3,64 (IC 95% = 1,82-7,31, P = 0,0002) y 4,45 (IC 95% = 1,50-13,2, P = 0,0045) para la transmisión del VIH-1, respectivamente. En nuestras muestras de estudio (Tablas S2 y S3 ) se identificaron 15 SNPs marcados con haplotipos (htSNPs) correspondientes a los 15 haplotipos principales de DC-SIGNR (Figura 1 ). H1 (31%) y H3 (11%) fueron los haplotipos más frecuentes observados (Figura 1 ) siendo homocigosos para el haplotipo H1 se asociaron con un aumento del riesgo de ambas UI (OR: 4, Los bebés que albergaban dos combinaciones de copias de haplotipos H1 y/ o H3 (H1-H1, H1-H3 o H3-H3) tenían un mayor riesgo de IU (OR: 3,42, P = 0,007) e IP (OR: 5,71, P = 0,025) pero no de infección por VIH-1 (P = 0,098) en comparación con los no portadores infantiles (Tabla 2 ). Estas últimas asociaciones siguieron siendo significativas tras el ajuste de la carga viral materna para ambas UI (OR: 3,57, IC 95% = 1,30-9,82, P = 0,013) e IP (OR: 5,71, IC 95% = 1,40-23, P = 0,025) transmisión del VIH-1. Los haplotipos H1 y H3 comparten un grupo de mutaciones (p-198A, int2-391C, int2-180A, ex4 De estos, las variantes p-198A e int2-180A se asociaron significativamente con la TCM del VIH-1 (Tabla S2 ). En el análisis de regresión no ajustado, los lactantes homocigotos para las variantes p-198A e int2-180A presentaron un aumento del riesgo de UI (OR: 2,07 P = 0,045, OR: 3,78, P = 0,003, respectivamente) e IP (OR: 2,47, P = 0,17, O.R: 5,71, P = 0,025, respectivamente) infección por VIH-1 en comparación con los lactantes o no portadores de heterocigoto (Tabla 3). Cuando se realizó ajuste por factores maternos, sólo la asociación con la variante int2-180A siguió siendo significativa para la transmisión por IU (OR: 3,83, IC 95% = 1,42-10, 4, P = 0,008) e IP Así, los bebés homocigotos para la variante DC-SIGNR int2-180A contenida en los haplotipos H1 y H3 tuvieron 4 a 6 veces más probabilidades de ser infectados por el VIH-1 durante el embarazo o durante el parto, respectivamente. La empalme alternativa del gen DC-SIGNR en la placenta produce ambos repertorios isoformados unidos a membrana y solubles [3]. La proporción relativa de DC-SIGNR unido a membrana y soluble podría influir de manera plausible en la susceptibilidad a la infección VIH-1 [11]. Por lo tanto, hicimos una hipótesis de que las mutaciones DC-SIGNR asociadas con la TCM del VIH-1 tendrían un impacto tanto en el nivel de expresión DC-SIGNR y en el repertorio isoforma producido. Se clonó DC-SIGNR a partir de tejidos placentarios mediante RT-PCR a partir de 3 muestras H1 homocigotas que contenían tanto las variantes DC-SIGNR p-198AA e int2-180AA asociadas a la transmisión del VIH-1 y 3 muestras de tipo salvaje homocigoto (WT) (p-198CC, int2-180GG). Se seleccionaron quince clones por muestra al azar para su secuenciación. Como era de esperar, se encontró un amplio repertorio de transcripciones DC-SIGNR en todas las muestras con 9 a 16 isoformas diferentes por individuo. Se identificaron un total de 65 transcripciones distintas (Figura S1), de las cuales 3 eran transcripciones de duración completa. 64 de los clones secuenciados contenían un total de 69 sustituciones de aminoácidos con 3 nuevos C terminos y 2 codones de parada Sin embargo, la diversidad se atribuyó principalmente a la eliminación total del exón 2 o exón 3 o a variaciones en la longitud de la región del cuello (exón 4) del DC-SIGNR. La eliminación del exón 3 elimina el dominio transmembrana de la proteína y conduce a la expresión de isoformas solubles del DC-SIGNR [3]. Curiosamente, la abundancia de isoformas ligadas a la membrana en los tejidos placentarios de los homocigotos H1 parece ser menor que la observada en muestras de individuos de WT (Figura S1 ). La eliminación del exón 3 fue confirmada por la secuenciación e hipotetizamos que el salto de exón 3 podría deberse a la presencia de la mutación int2-180A observada en lactantes con el haplotipo H1. De hecho, esta mutación intron se encuentra 180 pb aguas abajo del exón 3 y potencialmente modifica los eventos de empalme (Figura 2A ). Confirmamos que la variación en las proporciones de transcripción observadas entre los dos grupos también se reflejó en el nivel de expresión del ARNm en la placenta. Para cuantificar las isoformas unidos a la membrana frente a las isoformas solubles en muestras placentarias de bebés homocigosos H1 y WT, amplificamos la secuencia del exón 5 (E5) presente en todas las isoformas DC-SIGNR (transcripciones totales). Luego amplificamos el exón 3 (E3) que se elimina en las formas solubles y luego calculamos la relación E3:E5. Se encontró que los tejidos placentarios de los lactantes homocigosos H1 expresan una proporción significativamente menor de DC-SIGNR unido a la membrana (18%) en comparación con los de los individuos WT (36%) (P = 0,004) (Figura 2B ) sugiriendo que el salto de exón 3 ocurre con mayor frecuencia en presencia de la variante DC-SIGNR int2-180A asociada con el TCM del VIH-1. La variante DC-SIGNR int2-180A siempre se transmite con la mutación promotora p-198A (Figura 1 ). En el análisis de regresión no ajustado, la variante p-198A se asoció significativamente con UI pero no con la transmisión IP y PP VIH-1 (Tabla 3). El análisis del sitio de unión del factor de transcripción computacional predice Tabla 1. Figura 3A ). La actividad luciferasa del constructo variante p-198A fue significativamente menor que la del constructo promotor de WT p-198C (p-198C/A ratio = 2, P = 0,006) (Figura 3B ) sugiriendo que DC-SIGNR p-198A afecta a la actividad promotora. Los otros mutantes promotores (p-577C y p-323A) observados en la población zimbabuense no afectaron a la transcripción DC-SIGNR en este ensayo (Figura S2). Para determinar el impacto neto de la mutación DC-SIGNR p-198A sobre la expresión DC-SIGNR en la placenta, cuantificamos el número absoluto de transcripciones DC-SIGNR totales y de unión de membrana en las muestras homocigoto H1 y placentales de tipo salvaje El número total de transcripciones DC-SIGNR se determinó en 6856213 (copias DC-SIGNR6S.E.M por 10 5 copias GAPDH) en las muestras placentarias de lactantes homocigóticos H1 y fue 4 veces menor en comparación con la encontrada en las placentas de individuos WT (27816638, P = 0.011) (Figura 3C ). Como se sugirió anteriormente, la mutación int2-180A podría inducir el salto de exón 3 dando lugar a una menor producción de DC-SIGNR unido a membrana. Aunque la disminución en el número total de transcripciones DC-SIGNR en muestras placentarias homocigóticas H1 que contenían tanto las variantes p-198AA como int2-180AA afectó la proporción de isoformas solubles y ligadas a la membrana, el efecto de estas mutaciones fue más pronunciado en las isoformas ligadas a la membrana con una disminución de 8 veces (H1 = 117636,2 vs WT = 9906220,6; P = 0,003) en comparación con una disminución de 3 veces en las isoformas solubles totales (H1 = 5686181,9 vs WT = 19256495,3; P = 0,03) (Figura 3C). Por lo tanto, las mutaciones DC-SIGNR p-198A e int2-180A asociadas con la TCM del VIH-1 disminuyeron significativamente el nivel Tabla 3. Asociaciones entre el promotor de DC-SIGNR infantil p-198 e intron 2 (int2)-180 variantes e intrauterina (UI), intraparto (IP) y postparto (PP) transmisión del VIH-1 de madre a hijo. Nuestros resultados genéticos, apoyados por el ensayo de expresión en placenta, sugieren la implicación de DC-SIGNR en el TCM del VIH-1. La homocigosidad para el haplotipo H1 se asoció con la transmisión de UI en el análisis de regresión no ajustada. Sin embargo, la asociación desapareció después del ajuste para los factores maternos presumiblemente debido al pequeño número de bebés homocigotos H1 analizados en cada grupo. H1 y H3 fueron los haplotipos más frecuentes observados en la población del estudio y comparten un grupo de mutaciones (Figura 1 ). La agrupación de haplotipos H1 y H3 aumentó el poder del estudio y permitió la identificación de mutaciones DC-SIGNR específicas asociadas con la TCM del VIH-1. De hecho, dos mutaciones compartidas por los haplotipos H1 y H3 se asociaron con la transmisión vertical del VIH-1. La int2-180A se asoció con un aumento de 4 veces en el riesgo de UI y 6 veces en el riesgo de IP después del ajuste por los factores maternos. Aunque la variante p-198A se asoció con la transmisión UI, la asociación desapareció después del ajuste por la carga viral materna. Sin embargo, se demostró que esta mutación reduce la actividad transcripcional DC-SIGNR in vitro y produce un menor nivel de transcripciones DC-SIGNR en tejidos placentarios en combinación con la variante int2-180A. Dado que int2-180A siempre se transmite con p-198A en los haplotipos combinados asociados a la ETMT H1/H3, mientras que p-198A se lleva a cabo en otros haplotipos no asociados (Figura 1), podemos especular que la mutación p-198A sola puede tener un efecto menor in vivo, mientras que en combinación con la variante int2-180A, ambos actúan para reducir el nivel de expresión DC-SIGNR placentaria que resulta en un aumento del riesgo de ETM de VIH-1. La mayoría de la transmisión de UI ocurre durante el último trimestre del embarazo (revisado en [12] ). Las muestras de placenta a término completo no estaban disponibles para el estudio actual y los ensayos de expresión se realizaron en tejidos placentales de primer plazo. Un estudio previo que analizó el repertorio de isoformas placentarias DC-SIGNR en muestras de placenta a término demostró una diversidad similar de transcripciones DC-SIGNR como en los tejidos placentarios de primer término estudiados en este estudio [3]. Sin embargo, dado que los niveles de expresión DC-SIGNR nunca se han comparado entre los diferentes términos del embarazo, no se sabe si la expresión DC-SIGNR varía durante el embarazo. Sin embargo, es razonable suponer que las diferencias interindividuales tanto en el repertorio isoformo de DC-SIGNR como en los niveles de transcripción observados entre los bebés homocigóticos H1 y WT se reflejarían a lo largo del embarazo. Hasta la fecha, la mayoría de los estudios se han centrado en el papel potencial de DC-SIGNR en la infección trans del VIH-1 in vitro [2, 10]. Sin embargo, los múltiples mecanismos involucrados en la infección trans y redundancia entre las funciones de la lectina de tipo C dificultan la determinación de la participación real de DC-SIGNR en este modo de infección in vivo [13, 14]. La fuerte correlación que observamos entre la transmisión vertical del VIH-1 y las variantes genéticas de DC-SIGNR que producen bajos niveles de DC-SIGNR en la placenta sugiere que mecanismos distintos de la infección trans mediada por DC-SIGNR podrían operar durante la transmisión vertical del VIH-1. Por ejemplo, DC-SIGNR también ha demostrado funcionar como receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor [15]. Chan y sus colegas demostraron recientemente que las células CHO transfectadas por DC-SIGNR disminuyen los títulos de SARS-CoV mediante una mayor captura y degradación del virus de manera dependiente del proteasoma [4]. Dado que las células endoteliales expresan MHC-I y II, los antígenos virales degradados podrían presentarse a las células inmunes para provocar una respuesta inmune adaptativa [16, 17]. El receptor de núcleo HIV-1 CCR5, pero no CD4, se coexpresa con DC-SIGNR en las células endoteliales placentarias y de barrera hematoencefálica (BBB) [18, 19]. La unión del VIH-1 gp120 al receptor CCR5 en las células endoteliales compromete la integridad del BBB y aumenta la adhesión y transmigración de los monocitos a través del BBB [20, 21]. Por lo tanto, es posible que una menor expresión de DC-SIGNR, en particular las isoformas ligadas a la membrana, en las células endoteliales capilares placentarias pueda favorecer la unión del VIH-1 al receptor CCR5, en lugar del receptor DC-SIGNR, facilitando la migración de las células maternas infectadas por el VIH-1 a través de la barrera placentaria que resulta en la transmisión UI del VIH-1. La variante int2-180A contenida en los haplotipos H1 y H3 se asoció con la transmisión IP, lo que sugiere que DC-SIGNR también afecta a la transmisión del VIH-1 durante el parto. El paso por el canal del parto podría exponer potencialmente a los bebés a través de una entrada en el portal de la mucosa (presumiblemente oftalmológica, cutánea o gastrointestinal), mientras que el insulto placentario durante el parto (físico o inflamatorio) puede mejorar el paso transplacental de las células maternas infectadas por el VIH-1 a la circulación fetal [22, 23]. Este proceso llamado microtransfusión se ha propuesto con respecto a los resultados obtenidos en una cohorte malauiana. Kweik y sus colegas encontraron una asociación significativa entre los niveles de ADN materno en la sangre del cordón umbilical y la transmisión IP del VIH-1, lo que sugiere que es probable que el paso de células maternas infectadas a través de la placenta ocurra durante el parto [22]. Así, de manera similar a lo sugerido anteriormente para la transmisión de la IU, el nivel relativamente inferior de DC-SIGNR en la placenta de los bebés homocigotos que albergan la variante int2-180A podría promover la unión del VIH-1 al receptor CCR5 en las células endoteliales que afectan la integridad de la barrera placentaria y facilitan el paso de las células maternas infectadas en la circulación fetal durante el parto. Además de DC-SIGNR, se sabe que otros receptores del VIH-1 influyen en la TCM del VIH-1 (revisado en [24] ). Se ha demostrado que las variantes genéticas de la CCR5 influyen en la transmisión vertical del VIH-1. Las variantes promotoras de la CCR5 que resultan en una mayor expresión del receptor se asocian con un mayor riesgo de TCM del VIH-1 entre los africanos subsaharianos [25, 26]. El polimorfismo de eliminación de 32 pb en la CCR5 se ha demostrado que protege de la transmisión vertical del VIH-1 [27], pero esta variante está prácticamente ausente entre las poblaciones africanas [28]. El elevado número de copias de CCL3L1, un potente ligando supresor del VIH-1 para la CCR5, está asociado con una mayor producción de quimioquinas y un menor riesgo de TCM del VIH-1 entre los lactantes sudafricanos [29, 30]. La lectina de unión a la manosa (MBL) es un receptor inmune innato sintetizado en el hígado y segregado en el torrente sanguíneo en respuesta a la señal de inflamación. MBL promueve la eliminación de patógenos por opsonización y fagocitosis, y la expresión reducida de MBL resultante de polimorfismo en regiones codificantes y no codificantes se ha asociado con un aumento del riesgo de TCM del VIH En este estudio, demostramos por primera vez, el impacto funcional potencial de las mutaciones DC-SIGNR en su expresión en la placenta y en la transmisión vertical del VIH-1. Creemos que la presencia de DC-SIGNR en la superficie celular endotelial placentaria puede proteger a los bebés de la infección por el VIH-1 capturando virus y promoviendo su degradación/presentación. Sin embargo, en la placenta que contiene bajos niveles de DC-SIGNR, el VIH-1 se une preferentemente al CCR5 en células endotelial, lo que resulta en una pérdida de integridad de la barrera placentaria y un mayor paso de las células maternas infectadas por el VIH-1 en la circulación fetal que conduce al TCM del VIH-1. Este mecanismo también puede aplicarse a otros patógenos transmitidos verticalmente conocidos por interactuar con DC-SIGNR como el VIH-2, hepatitis C y virus del dengue y Las asociaciones entre los genotipos de región repetida de DC-SIGNR infantil exon 4 y la transmisión del VIH-1 de madre a hijo.CI, Intervalo de confianza; N, número; NA; no aplicable; OR, odds ratio a P-value según lo determinado por la prueba Chi-cuadrado. b Comparación entre el genotipo y todos los demás. Se encontró en: doi:10.1371/journal.pone.0007211.s003 (0,05 MB DOC) Figura S1 DC-SIGNR transcripciones repertorio en placenta. Los principales productos RT-PCR a partir del extracto de ARN de 3 muestras homocigóticas H1 y 3 homocigóticas WT placenta fueron purificadas, clonadas y secuenciadas. Se analizaron las secuencias según la secuencia de referencia NCBI NM_014257. TC; cola citoplasmática, TM; dominio transmembrana; WT; tipo salvaje Se encontró en: doi:10.1371/journal.pone.0007211.s004 (0,11 MB DOC) Figura S2 Efecto de la variante promotora DC-SIGNR sobre la actividad transcripcional en el ensayo de reporter de luciferasa in vitro en células transfectadas HeLa. Expresión relativa de luciferasa de pGL2-Basico, vector parental sin promotor. Expresión Constructos de promotor DC-SIGNR, variante p-577C o variante p-323A se calcularon relativamente a este valor. Los datos se presentan en valores medios6S.E.M de tres experimentos independientes realizados por triplicado. Para comparar la expresión relativa de luciferasa de los receptores de variantes p-557C y p-323A contra el constructo de tipo salvaje (WT) se utilizó la prueba ANOVA de ida seguida de la prueba Dunnett para la comparación múltiple. El vector CMV-Tat de 0 mg, 0,5 mg o 1 mg se transfectó con LTR-Luc como control positivo en estos experimentos.

¿Cuál es el porcentaje de transmisión del VIH-1 de madre a hijo cuando no hay intervención?

El papel de la S-Palmitoylation en IFITM5 para la interacción con FKBP11 en células de Osteoblastohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3776769/Tsukamoto, Takashi; Li, Xianglan; Morita, Hiromi; Minowa, Takashi; Aizawa, Tomoyasu; Hanagata, Nobutaka; Demura, Makoto2013-09-18DOI:10.1371/journal.pone.0075831Licencia:cc-byAbstract: Recientemente, una de las proteínas familiares de la transmembrana inducida por interferón, IFITM3, se ha convertido en un objetivo importante para la actividad contra la infección por el virus de la gripe A (H1N1). En esta proteína, una modificación post-translacional por ácidos grasos covalentemente unidos a la cisteína, llamada S-palmitoilación, juega un papel crucial para la actividad antiviral. IFITM3 posee tres residuos de cisteína para la S-palmitoilación en el primer dominio de la transmembrana (TM1) y en el bucle citoplasmático (CP). Debido a que estas cisteínas están bien conservadas en las proteínas de la familia de mamíferos IFITM, la S-palmitoilación en estas cisteínas es significativa para sus funciones. IFITM5 es otra proteína de la familia IFITM e interactúa con la proteína de unión FK506 (FKBP11) para formar un complejo de mayor orden en células osteoblastales, que induce la expresión de genes inmunológicamente relevantes. En este estudio, investigamos el papel que desempeña la palmitoilación S de IFITM5 en su interacción con FKBP11 en las células, ya que esta interacción es un proceso clave para la expresión génica. Nuestras investigaciones con un reportero establecido, ácido 17-octadecinoico (17-ODYA), y un inhibidor para la palmitoilación S, ácido 2-bromopalmítico (2BP), revelaron que IFITM5 fue palmitoilado S además de IFITM3. Específicamente, encontramos que los residuos de cisteína en el dominio TM1 y en el bucle CP fueron palmitoilados S en IFITM5. Luego, revelamos por inmunoprecipitación y análisis de manchas occidentales que la interacción de IFITM5 con FKBP11 fue inhibida en presencia de 2BP. El mutante que carecía del sitio S-palmitoylation en el dominio TM1 perdió la interacción con FKBP11. Estos resultados indican que la S-palmitoylation en IFITM5 promueve la interacción con FKBP11. Finalmente, investigamos la formación de nódulos óseos en células osteoblastadas en presencia de 2BP, ya que IFITM5 fue identificado originalmente como factor de formación ósea. El experimento resultó en una aberración morfológica del nódulo óseo, lo que también indicó que la S-palmitoylation contribuye a la formación ósea. Texto: La familia de proteínas transmembranas inducidas por interferón (IFITM) (también conocida como la familia Fragilis en ratones) es parte de la familia de las dispaninas [1] y está compuesta por α-hélices de doble transmembrana conectados por un bucle citoplasmático (CP) y secuencias de polipéptidos amino- y carboxil-terminales (Figura 1-A) extracelulares (EC). Las proteínas IFITM se conservan evolutivamente en vertebrados [2]. Investigaciones genómicas recientes han revelado que hay 5 miembros IFITM en humanos (IFITM1, 2, 3, 5 y 10) y 7 miembros en ratones (IFITM1, 2, 3, 5, 6, 7, y 10). Estas proteínas desempeñan papeles en diversos procesos biológicos, como la maduración de células germinativas durante la gastrulación (IFITTM1-3) [3] [5] [5], la adhesión de células a células (IFITTM1) [6] [7] [8], la actividad antiviral (IFITTM1-3) [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17], y la formación ósea (IFITTM5] [18] [19] [20] [21] [22], aunque actualmente se desconocen las funciones detalladas de IFITM6, 7 y 10; en particular, IFITM3 ha sido objeto de estudios intensivos sobre su actividad contra la infección e internalización del virus de la gripe A (H1N1) [9] [10] [11] [12] [13] [14]. En 2010, el Dr. Yount y sus colaboradores informaron que la actividad antiviral de IFITM3 depende de la palmitoilación S en la proteína [10]. La palmitoilación S [23] es una modificación post-translacional de las proteínas por los ácidos grasos saturados C 16 (ácidos palmíticos) covalentemente unidos a ciertos residuos de cisteína a través de un enlace tioéster (Figura 1-B). La modificación es catalizada reversiblemente por las proteínas aciltransferasas y las tioesterasas acilproteínas, y confiere propiedades únicas a la proteína, tales como unión a la membrana y segmentación, inmunoreactividad, alineación de secuencias aminoácidos de IFITM5, IFITM1, IFITM2 e IFITM3 derivadas de ratones. Los residuos conservados se destacan en negro. Las tres cisteinas conservadas se resaltan en rojo y numeradas en base a la secuencia de IFITM5 (top) e IFITM3 (bottom). Los residuos únicos en IFITM5 se resaltan en gris. Los dominios transmembrana primero y segundo, las secuencias extracelulares y el bucle citoplásmico se indican por flechas y se denotan como TM1 y TM2, EC y el bucle CP, respectivamente. Los dominios TM fueron predichos por SOSUI. Los aspartatos en la región C-terminal en IFITM5 se muestran en azul. B) La ilustración esquemática de la proteína S-palmitoilación. El ácido C 16-palmítico se une a la cisteína a través de un enlace tioéster. La palmitoilación y la despalmitoilación son catalizadas por proteínas aciltransferasas y acilproteínas tioesterasas, respectivamente. En este estudio se resume la hidroxilamina, NH 2 OH, para reducir la vinculación tioestérmica. C) La identidad de la secuencia de aminoácidos (similaridad) entre IFITM5, IFITM1, IFITM2 e IFITM3. doi: 10.1371/journal.pone.0075831.g001 y la interacción proteína-proteína. Los autores revelaron que IFITM3 es S-palmitoilado en tres quisteinas proximales de membrana, Cys71 y Cys72 en el primer dominio transmembrana (TM1), y Cys105 en el bucle CP (Figura 1-A) [10]. Además, IFITM3 carece de la palmitoilación S no se agrupa en la membrana celular y disminuye significativamente la actividad antiviral. Además, las cisteinas en IFITM2, Cys70, Cys71 y Cys104 también son palmitoiladas de la misma manera, lo que afecta a la localización intracelular [24]. Un estudio resentido ha revelado que la murina IFITM1 tiene cuatro residuos de cisteína (Cys49, Cys50, Cys83 y Cys103) para la palmitoilación S, que es necesaria para la actividad antiviral y la estabilidad proteica [25]. Los otros miembros de la familia IFITM también poseen estas cisteínas (Figura 1-A), y por lo tanto el papel de la espalmitoilación en las cisteinas debe ser significativo para las funciones de las proteínas IFITM. Aquí, nos centramos en las proteínas de la familia IFITM5, que también se conoce como proteína similar a IFITM (BRIL) [18]. Entre las proteínas de la familia IFITM, IFITM5 es única. (i) Expresión de IFITM5: A diferencia de las otras proteínas de la familia IFITM, la expresión de IFITM5 no es inducida por interferones porque la región anterior al gen ifitm5 carece de los elementos reguladores del interferón [26]. Además, la expresión de IFITM5 se limita principalmente a las células osteoblastadas [18, 19, 27], mientras que las otras proteínas de IFITM se expresan ubicuamente (ii). Además, IFITM5 tiene un dominio rico en aspartato en la región C-terminal, que podría estar involucrado en la unión al calcio (Figura 1 -A) [26]. iii) Papel de IFITM5 en la formación ósea: La expresión de IFITM5 está asociada con la mineralización durante el proceso de formación ósea en células osteoblásticas [18] [19] [20] [20]. Estudios anteriores han confirmado la expresión de IFITM5 en tejidos óseos en ratones, ratas, humanos y tammar wallabies [2]. Los ratones ifitm5-gene knockout tienen huesos más pequeños [19]. Además, el derribo del gen ifitm5 por el ARN de la horquilla pequeña induce una disminución en la formación de nódulos óseos, mientras que la sobreexpresión del gen en células UMR106 ha demostrado iv) Papel del IFITM5 en la actividad inmunitaria: Estudios recientes han revelado que el IFITM5 interactúa con la proteína 11 de unión FK506 (FKBP11) para formar IFITM5-FKBP11-CD81-el complejo regulador negativo del receptor de la prostaglandina F2 (FPRP) [28]. Cuando se forma el complejo, se inducen las expresiones de 5 genes inducidos por interferón, incluyendo el antígeno 2 de células estromales de médula ósea (Bst2), la proteína 1 inducible del interferón (Irgm), la proteína inducida por interferón con tetratricopéptido repite 3 (Ifit3), b(2) microglobulina (B2m) y el gen antígeno de clase I del MHC. En consecuencia, estos resultados indican que el IFITM5 está involucrado no sólo en la formación ósea sino también en la actividad En este estudio se investigó la palmitoilación S de IFITM5 y su papel en la interacción con FKBP11 en células de osteoblasto de ratón. Las células transfectadas por un plásmido DNA que codificaba el ratón IFITM5 fueron cultivadas en presencia de un reportero químico establecido, ácido 17-octadecinoico (17-ODYA) [29, 30], o un inhibidor para la palmitoilación S, ácido 2-bromopalmítico (2BP) [31]. Los ensayos bioquímicos usando estos compuestos revelaron que el tipo salvaje IFITM5 es S-palmitoilado. Para identificar el sitio de Spalmitoilación en IFITM5, se prepararon mutantes substituidos por cisteína, IFITM5-C86A, -C52A/C53A, y -C52A/53A El ensayo de reportero químico sugirió que al menos dos de las tres cisteínas en IFITM5 son S-palmitoiladas. La interacción de IFITM5 con FKBP11 fue examinada por inmunoprecipitación, resultando en la pérdida de la interacción en presencia de 2BP. El mismo resultado se obtuvo en los dos mutantes, C52A/C53A y Cys-less. Estos resultados sugieren que la S-palmitoilación en Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 de IFITM5 es necesaria para la interacción con FKBP11. Por otro lado, Cys86 en el bucle CP de IFITM5 fue S-palmitoilada pero no involucrada en la interacción. Debido a que esta interacción es importante para la expresión génica inmunológicamente relevante, se indicó que el papel de la palmitoilación S es promover la interacción de IFITM5 con FKBP11 y regular la actividad inmunitaria en las células osteoblásticas. Se discutirá el posible mecanismo de interacción y el efecto de la palmitoilación S en la formación de nódulos óseos. Para la expresión celular mamífera, se construyeron vectores de plásmidos de tipo salvaje IFITM5 (IFITM5-WT) y FKBP11 fusionado con FLAG (FKBP11-FLAG) insertando los genes clonados en un vector de expresión neopBApo-CMV (Takara Bio, Shiga, Japón). Los detalles de las construcciones de ADN recombinante fueron los mismos descritos anteriormente [19]. Los genes de los mutantes IFITM5 (IFITM5-C86A, -C52A/53A, y -C52A/C53A/C86A (Cys-less)) se prepararon utilizando un kit QuikChange de mutagenesis dirigido por el sitio (Stratagene, La Jolla, CA). Los vectores plásmidos de los IFITM5-WT fusionados con FLAG, -C52A/53A y Cys-less se construyeron insertando los genes clonados en el vector de expresión neo de pBApo-CMV. Para la expresión celular de E. coli, el vector plásmido de IFITM5-WT se construyó insertando el gen clonado en un vector de expresión pET22b (Novagen, Madison, WI). El primer delantero 5'-GGAATTCATTCATATTACACTTCATATCCCGTG-3' y el primer reverso 5'-CCGCTCGAGTTATAGTCTCATCAAACTTG-3' fueron utilizados para amplificar el gen que codifica todo el IFITM5 del vector plásmido para la expresión celular mamífera descrita anteriormente. Las letras subrayadas denotan un NdeI y un sitio de escote XhoI, respectivamente. Los plásmidos de mutantes IFITM5 fueron preparados usando un kit de mutagenesis dirigido por el sitio QuikChange. El sentido y los imprimadores antisenso utilizados fueron 5'-GGCAGTATGCTCCAAAGCCAAGGCGTACCATCTGGGCTGC-3' y 5'-GCAGCCGAGATGGTGGTGCCTGCTGGTGGTGGGGAGCATACT GCC-3' para IFITM5-C86A; y 5'-GCACGATGTACCTGAATGCGCGGCGCTTGGTGCTG CGC-3' y 5'-GCGCCAGGAATGAGCGCGCCGCGACAGAGCATCG TGC-3' para IFITM5-C52A/C53A, respectivamente (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Las células MC3T3 similares a los osteoblastos fueron provistas por el RIKEN, Cell Bank (RCB 1126). Los procedimientos de cultivo celular, transfección y expresión proteica fueron los mismos reportados anteriormente. Cuando fue necesario, el ácido 2-bromopalmítico (2BP; Wako, Osaka, Japón) y el ácido 17-octadecinoico (17-ODYA; Sigma-Aldrich) fueron disueltos en el 99,5% de sulfóxido dimetilo (DMSO; Wako) y añadidos al medio de diferenciación a concentraciones de 100 μM y 50 μM en menos del 0,1% de DMSO, respectivamente [30, 31]. Las proteínas de tipo salvaje y mutante IFITM5 también fueron producidas utilizando un sistema de expresión recombinante E. coli. Las células E. coli BL21(DE3) transformadas por la expresión plásmido fueron cultivadas a 37°C en medio LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina. Después de cuatro horas de inducción por 1 mM isopropil β-Dtiogalactopiranoside (IPTG), las células fueron recolectadas por centrifugación (6.400 × g durante 10 min a 4°C). Las células fueron suspendidas en 50 mM tampón Tris-HCl (pH 8) y interrumpidas por una prensa francesa (Ohtake, Tokio, Japón) (100 MPa × 4 veces). La fracción de membrana bruta fue recolectada por ultracentrifugación (178.000 × g durante 90 min a 4°C). La fracción recolectada fue solubilizado con 1,5% n-dodecyl-β-Dmaltopiranoside (DDM) (Dojindo Lab, Kumamoto, Japón) en 50 mM Tris-HCl, pH 8, que contenía 0,3 M NaCl y 5 mM imidazol. Después de la ultracentrifugación, el sobrenadante fue incubado con resina de agarosa Ni 2+ -NTA (Qiagen, Hilden, Alemania). La resina fue aplicada a una columna de cromatografía y lavada con 50 mM imidazol que contenía 50 mM Tris-HCl (pH 8), 0,3 M NaCl y 0,1% DDM. El IFITM5 solubilizado con DDM fue recolectado por elución con el mismo tampón que contenía 0,3 M imidazol. Los medios de muestreo fueron reemplazados por la solución tampón apropiada por dos pasajes sobre una columna PD-10 (GE Healthcare UK, Ltd., Amersham Place, Inglaterra). Los detalles experimentales se describen en informes anteriores [19, 28]. Brevemente, se extrajeron proteínas totales de las células osteoblásticas que coexpresaron IFITM5 y FKBP11-FLAG utilizando un kit de extracción total de proteínas (BioChain Institute Inc., Newark, CA). Luego, el lisato celular fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG M2 (Sigma-Aldrich) a 4°C durante 2 h. Para recuperar FKBP11-FLAG, 500 ng/μL 3 × péptido FLAG (Sigma-Aldrich) disuelto en solución salina tris-buffered se añadió al gel recogido a 4°C durante 1 h. Las proteínas recuperadas y el lisato celular que contenía proteínas totales fueron analizados por SDS-PAGE (15% ePAGEL; ATTO, Tokio, Japón) y la mancha occidental El anticuerpo policlonal anti-IFITM5, preparado a partir de la secuencia péptida aminoterminal (TSYPREDPRAPSSRC), y el anticuerpo monoclonal anti-FLAG (Sigma-Aldrich) fueron utilizados como anticuerpos primarios. Los anticuerpos anti-rabbit IgG (H+L) de cabra conjugados con HRP (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) y anti-mouse IgG (H+L) (Sigma-Aldrich) fueron utilizados como anticuerpos secundarios para los anticuerpos primarios anti-IFITM5 y anti-FLAG, respectivamente. Las proteínas fueron detectadas por reacción quimioluminiscente (MercK-Millipore, Billerica, MA). El lisato celular extraído de las células osteoblásticas marcadas metabólicamente por 17-ODYA fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG M2 para obtener proteínas purificadas con FLAG IFITM5. Las proteínas marcadas con 17-ODYA fueron etiquetadas químicamente con azida-PEG 3 -5(6)-carboxitetrametilrhodamina (TAMRA-azida; Click Chemistry Tools, Scottsdale, AZ) con referencia a estudios previos [10, 29, 30, 32] y la guía del fabricante. Las proteínas separadas por SDS-PAGE fueron visualizadas utilizando un láser de 532-nm para excitación y la fluorescencia por TAMRA (565 nm) fue detectada mediante un filtro de largo camino de 575nm (Typhoon FLA 9000; GE Healthcare). Las células de osteoblasto subcultivo MC3T3 fueron sembradas a una densidad de 5.000 células/cm 2 en platos de 40 mm y cultivadas en medio de águila α-modificada (α-MEM; Sigma-Aldrich) conteniendo 10% (v/v) de suero fetal bovino (FBS; Nichirei Biosciences Inc., Tokio, Japón). Al día siguiente, esto fue reemplazado por medio de diferenciación, conteniendo 2 mM de glicerofosfato y 50 μg/ml de ascorbato sódico en concentraciones finales, para inducir la diferenciación osteoblasto. Cuando fue necesario, 100 μM 2BP en menos de 0,1% DMSO, o 0,1% DMSO solo se añadió al medio de diferenciación en concentraciones finales. Todos los cultivos fueron incubados a 37°C en una atmósfera humidificada que contenía 5% CO 2 durante Los nódulos mineralizados fueron manchados con Alizarin Red S (Sigma-Aldrich). Se utilizó el procedimiento estándar de tinción. Los nódulos mineralizados fueron revisados cada tres días. Para identificar la palmitoilación S en IFITM5, las células osteoblásticas que albergaban el ADN plásmido que codificaba IFITM5-WT fueron cultivadas en ausencia y presencia de 2BP, lo que inhibe la palmitoilación S (Figura 2-A) [31]. A continuación, se extrajo el lisato celular que contenía proteína total para su uso en los análisis de manchas SDS-PAGE y occidentales. A efectos de comparación, las células E. coli también fueron cultivadas en ausencia de 2BP y se extrajo el lisato celular. La Figura 2 -B muestra los resultados del ensayo de manchas occidentales para IFITM5-WT expresado en el osteo En las células de osteoblasto, IFITM5-WT exhibió una sola banda cerca del marcador de masa molecular de 17,4 kDa (ver carril 1) en ausencia de 2BP. Sin embargo, en presencia de 2BP (ver carril 4), la banda apareció en una posición más baja que en ausencia de 2BP (lane 1). Estos resultados sugieren que IFITM5-WT tiene formas de masa molecular alta y baja en ausencia y presencia de 2BP, respectivamente. La palmitoilación S es una reacción reversible, y por lo tanto es despalmitoilada por un reductor fuerte como la hidroxilamina [10]. Tras el tratamiento de hidroxilamina (ver carril 2), la banda apareció en la misma posición que en presencia de 2BP (lane 4). En las células prokaryote E. coli, la modificación post-translacional S-Palmitoylation en IFITM5 PLOS ONE www.plosone.org no se produce. Por lo tanto, la banda también se observó en la misma posición inferior (ver carril 3). En el caso de IFITM3, también se informó que la palmitoylation induce un cambio en la movilidad en la electroforesis, al igual que en nuestros resultados actuales [10]. Para la observación directa de la S-palmitoylation, se utilizó un reportero químico establecido, 17-ODYA (Figura 2-C). Las células osteoblastadas que albergan la codificación plasmídica IFITM5-WT fueron cultivadas en presencia de 17-ODYA para etiquetar la proteína metabólicamente. Después de la extracción y purificación del lisato celular, el IFITM5-WT etiquetado fue ligado con TAMRA-azida de acuerdo con el método de cicloadición de azidealkyne [3+2] catalizado Cu(I) [3+2] [10, 29, 30, 32 ]. Una imagen de fluorescencia en gel del IFITM5-WT marcado 17-ODYA-TAMRA (véase el carril 2 en la Figura 2 -D) mostró que IFITM5 estaba espalmitoilado en las células osteoblastadas. La etiqueta FLAG adjunta a IFITM5 no tiene influencia en la modificación y etiquetado químico (vías 1 y 5). Además, después del tratamiento con hidroxilamina (ver carril 6), la fluorescencia se debilitó debido a la disociación de 17-ODYA de IFITM5, que fue el mismo mecanismo que la disociación del ácido palmítico de IFITM5 por reducción como se describe anteriormente (lane 2 de la Figura 2-B). Por lo tanto, concluimos que el IFITM5 expresado en las células de osteoblasto nativas es S-palmitoilado. Además, las bandas correspondientes a las formas de masa molecular alta y baja mostradas en el análisis de manchas occidentales fueron asignadas tentativamente a las formas S-palmitoiladas y depalmitoiladas, respectivamente. Como se describe anteriormente en la Introducción, los residuos de cisteína son el sustrato para la palmitoilación S. IFITM5 posee tres cisteínas, Cys52 y Cys53 en el dominio TM1, y Cys86 en el bucle CP (Figura 1-A). Todas estas cisteínas están altamente conservadas entre las proteínas de la familia IFITM de mamíferos (Figura 3-A). Para identificar el sitio de modificación en IFITM5, preparamos mutantes substituidos por cisteína, IFITM5-C52A/C53A, -C86A, y -C52A/C53A/C86A (Cys-less). Las células osteoblastadas que albergaban cada plasmido fueron cultivadas en ausencia de 2BP, y luego se extrajo el lisato celular. La Figura 3-B muestra los resultados de la mancha occidental detectando la expresión de todos los mutantes en las células osteoblastadas. En los mutantes C52A/C53A y Cys-less (ver carriles 2 y 4), se detectó la forma de baja masa molecular. Este resultado indica que Cys52 o Cys53 están involucrados en la palmitoilación S. Además, como se muestra en la Figura 2 -D, se detectaron fluorescencia fuerte y débil en el mutante C52A/C53A en ausencia y presencia de hidroxilamina (lanes 3 y 7), respectivamente, pero no en el mutante Cys-less (lanes 4 y 8). Estos resultados sugieren que el resto de la cisteína en el mutante C52A/C53A, Cys86, es S-palmitoilado y el mutante Cyss-less perdió por completo la palmitoilación S porque todas las cisteinas fueron sustituidas. Por lo tanto, concluimos que Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados. Además, se encontró que la S-palmitoilación en el dominio TM1 tiene un efecto importante en la movilidad en el gel (panel inferior de la Figura 2 -D y Figura 3-B). Por lo tanto, en adelante nos referimos a las formas de masa molecular alta y baja como las formas TM1palmitoiladas y TM1-depalmitoiladas, respectivamente. Finalmente, reasignamos las bandas mostradas en el análisis de Western blot como sigue: IFITM5-WT está totalmente palmitoilado, el mutante C86A está parcialmente palmitoilado en Cys52 y/o Cys53, el mutante C52A/C53A está parcialmente palmitoilado en Cys86, y el mutante sin Cys está completamente depalmitoilado. Estudios previos han revelado que IFITM5 interactúa con FKBP11 [19]. FKBP11 pertenece a la familia de proteínas de unión FK506 y tiene un dominio transmembrana. La interacción entre IFITM5 y FKBP11 es importante para la actividad inmunitaria debido a que la formación del complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP induce la expresión de genes inducidos por interferón, a saber, el Bst2, Irgm, Ifit3, B2m y el gen antígeno clase I de MHC [28]. Para investigar el efecto de la palmitoilación S en la interacción de IFITM5 con FKBP11, se realizó un ensayo de inmunoprecipitación. Las células osteoblásticas cotransfectadas por los plásmidos que codifican IFITM5-WT y FKBP11-FLAG fueron cultivadas en ausencia y presencia de 2BP. Luego, el análisis celular extraído fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG. El gel fue lavado varias veces. Finalmente, las proteínas fueron eludidas competitivamente por la adición de péptido FLAG. Si IFITM5 interactuaba con FKBP11, se esperaba que IFITM5 Las cisteínas conservadas fueran resaltadas en naranja y numeradas. En el panel inferior, los números dados entre paréntesis corresponden al número residual para IFITM2. Para el cálculo de probabilidad, un total de 23 secuencias IFITM2, 23 IFITM3 y 17 IFITM5 derivadas de especies mamíferas en la base de datos Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomas (KEGG) fueron utilizadas. La alineación de secuencias se llevó a cabo utilizando CLUSTALW. Los logotipos de secuencia se generaron utilizando WEBLOGO 3. B) Botón occidental para los mutantes de tipo salvaje y substituidos por cisteína de IFITM5 expresados en células osteoblastadas La flecha superior indica que los mutantes C52 y/o C53 en el dominio TM1 son Spalmitoylated (lanes 1 y 3). El C52A/C53A (lane 2) y Cys-less (lane 4) son parcial y completamente depalmitoylated. El experimento se llevó a cabo 2 veces. doi: 10.1371/journal.pone.0075831.g003 se obtendría durante este paso y se detectaría por inmunobloqueo. Figura 4 -A muestra los resultados de la mancha occidental para la co-inmunoprecipitación de IFITM5-WT con FKBP-FLAG. La banda correspondiente a FKBP11 apareció en todos los carriles (panel superior). Las lanes 1 y 2 son controles para asegurar que IFITM5 y FKBP11 estén contenidas en el lisato celular Los controles también aseguraron que el IFITM5 fuera palmitoilado S en ausencia de 2BP (ver carril 1), mientras que el IFITM5 no fue palmitoilado S en presencia de 2BP (ver carril 2). Después de la inmunoprecipitación, una sola banda correspondiente al IFITM5 palmitoilado S apareció en ausencia de 2BP (ver carril 3), indicando la interacción del IFITM5 espalmitoilado con el FKBP11. Sin embargo, en presencia de 2BP, no apareció ninguna banda correspondiente al IFITM5 (ver carril 4), indicando que las dos moléculas no interactúan entre sí. Estos resultados sugieren que la palmitoilación S sobre el IFITM5 contribuye a la interacción con el FKBP11. A continuación, investigamos la relación entre la Spalmitoylation y la interacción con FKBP11 utilizando los mutantes IFITM5 descritos anteriormente. Las células osteoblastadas cotransfectadas por los plásmidos que codifican los mutantes IFITM5 (C52A/ C53A, C86A y Cys-less) y FKBP11-FLAG fueron cultivadas. El ensayo de inmunoprecipitación se llevó a cabo de la misma manera que se describió anteriormente. La Figura 4 -B muestra los resultados de la mancha occidental para la co-inmunoprecipitación de los mutantes de tipo salvaje y el IFITM5 con FKBP11. La Figura 4 -C muestra los resultados del experimento de control utilizando el lisato celular antes de la inmunoprecipitación. Como se describe en la sección anterior 3-3, la banda correspondiente a FKBP11 apareció en todos los carriles (paneles superiores) porque la inmunoprecipitación se realizó utilizando el gel de agarosa anti-FLAG. En el panel inferior de la Figura 4 -B, se observaron bandas individuales para el mutante IFITM5-WT y -C86A (lanes 1 y 3) pero no para los mutantes -C52A/C53A y Cys-less (lanes 2 y 4). Este resultado indica que el tipo salvaje y el mutante C86A interactúan con FKBP11, mientras que los otros dos mutantes no lo hacen. Curiosamente, esta tendencia refleja la tendencia de los perfiles de palmitoilación S, lo que significa que Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 de los mutantes IFITM5-WT y -C86A es S-palmitoilado, mientras que estos residuos no son S-palmitoilados en los mutantes C52A/C53A y Cysless (ver Figuras 2-D, 3-B y el panel inferior de la Figura 4-C). Debido a que la palmitoilación S contribuye a la interacción IFITM5-FKBP11, como se describe en la sección anterior 3-3 (también en la Figura 4-A), los resultados de la Figura 4-B sugieren que los mutantes que perdieron el sitio(s) de palmitoilación S, Cys52 y/o Cys53, no son capaces de interactuar con FKB En otras palabras, la palmitoilación S en estas cisteínas es necesaria para la interacción de IFITM5 con FKBP11. Como se ha descrito anteriormente en la Introducción, estudios previos han revelado que IFITM5 también contribuye a la formación ósea [18] [19] [20]. Por lo tanto, se investigó la influencia de Spalmitoilación en la formación de nódulos óseos en células osteoblastadas, en las que se expresa IFITM5 nativas. La Figura 5 muestra la formación de nódulos dependientes del tiempo en ausencia y la presencia de 2BP (Figuras 5-A y -B). La Figura 5 -C muestra los resultados del ensayo de control para verificar el efecto de DMSO, que se utilizó como disolvente para 2BP, en la formación de nódulos. El nódulo mineralizado fue manchado con Alizarin Red, que reacciona con calcio depositado. En la Figura 5 -D, el área del nódulo mineralizado fue trazada contra el tiempo experimental. En ausencia de 2BP (Figura 5-A, -C, y -D), la mineralización se inició 15 días después del inicio de la diferenciación celular (Día 0). Por otro lado, en presencia de 2BP (Figura 5-B y -D) se formó el nódulo el Día 12. El tiempo medio para la mineralización máxima en presencia de 2BP se estimó 7 días antes que en ausencia de 2BP (Figura 5-D). Además, se observaron diferencias en la forma de los nódulos mineralizados. La Figura 5 -E muestra una visión ampliada de cada nódulo en el Día 21. Los nódulos manchados se difundieron en presencia de 2BP (panel b), mientras que en ausencia de 2BP los nódulos formaron un gran cúmulo (panels a y c). Por lo tanto, nuestras observaciones en este estudio sugieren que la S-palmitoilación afecta la formación de nódulos óseos en las células osteoblásticas. En este estudio, se confirmó la S-palmitoilación sobre IFITM5 en las células osteoblásticas, que fue la misma que la reportada previamente para IFITM3 e IFITM2. Como se informó anteriormente, en IFITM3 e IFITM2, que comparten similitud de secuencia del 85% (Figura 1-C), dos cisteínas en el dominio TM1 (Cys71 y Cys72 para IFITM3, Cys70 y Cys71 para IFITM2) y una cisteína en el bucle CP (Cys105 para IFITM3, Cys104 para IFITM2) son todas S-palmitoiladas en células [10, 24]. Por otro lado, aunque IFITM5 comparte similitud de secuencia del 68% y 66% a IFITM3 e IFITM2, respectivamente, más de una cisteína en el dominio TM1 (Cys52 o Cys53) y una cisteína en el bucle CP (Cys86) son S-palmitoiladas. Teniendo en cuenta la alta conservación de tres cisteínas en las proteínas IFITM (Figuras 1-A y 3-A), todas las cisteínas en IFITM5 pueden estar involucradas en la palmitoilación S al igual que en el caso de IFITM3 e IFITM2 [10, 24]. Los roles de la palmitoilación S en IFITM3 se han estudiado intensamente, y la palmitoilación S ha demostrado ser crucial para el correcto posicionamiento en la membrana y la resistencia a la infección viral y la internalización [10] (los papeles se resumen en la Figura 6-A y se discuten en detalle más adelante). Un estudio reciente ha revelado que la palmitoilación S en IFITM2 también es importante para la agrupación de proteínas en la membrana [24]. Sin embargo, no conocemos el papel de la Spalmitoylation de IFITM5 para el agrupamiento en la membrana en la actualidad porque todavía no hemos logrado obtener un anticuerpo adecuado para la inmunohistoquímica, a pesar de que dedicamos mucho tiempo a la búsqueda y considerando un número considerable de anticuerpos. El Dr. Hanagata y sus colaboradores reportaron previamente que IFITM5 carecían del dominio TM1 y del bucle CP, que y IFITM5 (paneles inferiores), los anticuerpos anti-FLAG y anti-IFITM5 fueron utilizados como anticuerpos primarios, respectivamente. Las flechas indican la existencia de cada proteína y la S-palmitoylation en IFITM5. A) La mancha occidental para la coinmunoprecipitación del tipo salvaje IFITM5 con el FKBP11 (FKBP11-FLAG) fusionado con FLAG en las células osteoblásticas en ausencia y presencia de 2BP (denominadas "-" y "+", respectivamente). Las vías 1 y 2 son los resultados de los ensayos de control utilizados para verificar la existencia de IFITM5 y FKBP11 antes de la inmunoprecipitación, y las vías 3 y 4 muestran los resultados después de la inmunoprecipitación. El experimento se repitió 3 veces. B) La mancha occidental para la coinmunoprecipitación del tipo salvaje y los mutantes substituidos por cisteína de IFITM5 con FKBP11-FLAG en las células osteoblásticas. La banda correspondiente al péptido FLAG no se muestra debido a la menor masa molecular del péptido FLAG en relación con FKBP11-FLAG. C) El experimento de control de la Figura 4 -B utilizado para verificar que IFITM5 y FKBP11 estaban presentes en el lisato celular antes de la inmunoprecipitación. El experimento se repitió 2 veces. A) El mecanismo funcional de IFITM3 se resume en estudios anteriores. i) IFITM3 es S-palmitoilado en Cys71, Cys72 y Cys105, ii) que induce el agrupamiento y el posicionamiento correcto en la membrana, iii) resultando en la actividad antiviral contra el virus de la gripe. B) El mecanismo funcional de IFITM5 se resume combinando los resultados del presente y los estudios anteriores. (i) Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados (ii). La S-palmitoilación permite que IFITM5 interactúe con FKBP11 en las células osteoblásticas (iii). La disociación del CD9 del complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 es inducida por la formación del complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP y conduce a la expresión genética inmunológicamente relevante. IFITM5 también contribuye a la formación ósea, pero se desconoce cuáles son los estados descritos en i)-iii) son importantes para la formación ósea en la actualidad. Por otro lado, la IFITM5 interactúa con la proteína asociada, FKBP11, y la S-palmitoylation claramente hace una contribución significativa a la interacción. Por lo tanto, IFITM5 forma un hetero-oligomero en la membrana celular para su función fisiológica. contiene los sitios de modificación relevantes, perdió la capacidad de interactuar con FKBP11 [19]. En el presente estudio, determinamos que la S-palmitoylation en Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 es necesaria para la interacción. De estos resultados, especulamos que Cys52 y Cys53 se enfrentan a la superficie de interacción con FKBP11, y por lo tanto IFITM5 y FKBP11 interactúan entre sí a través del ácido palmítico unido a la cisteína (resumidos en la Figura 6 -B, discutidos más Nuestra investigación reveló que Cys86 está involucrado en la Spalmitoylation pero no contribuye a la interacción con FKBP11. Especulamos que otros residuos en el bucle CP ubicados cerca del dominio TM1 hacen alguna contribución a la interacción. Investigaciones previas también revelaron que IFITM5 expresado en las células fibroblasto heterologosas NIH3T3 exhibieron interacciones directas con CD81, la proteína 31 asociada al receptor de células B (BCAP31) y el hidroxiesteroide (17-beta) deshidrogenasa 7 (HSD17b7). Estas tres proteínas se unen al IFITM5 sin la S-palmitoylation (forma de masa molecular baja; ver Figura 3-b en ref [19]. y Figura 1-B en ref [28]. En las células fibroblastosas, la S-palmitoylation en IFI Estas interacciones no se observan en las células nativas del osteoblasto y, por lo tanto, son inespecíficas. Teniendo en cuenta estos hechos, se especula que la palmitoilación S sobre las células del IFITM5 promueve la interacción específica con FKBP11 en las células del osteoblasto. El papel que desempeña la palmitoilación S de las células del IFITM5 en la actividad inmune de las células del osteoblasto se discutirá combinando los resultados del presente y de los estudios anteriores. Debe ser necesaria una interacción específica entre IFITM5 y FKBP11 para formar el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP. CD81, también conocido como TAPA-1, es un miembro de la familia de proteínas de membrana de tetraspanina y un componente del núcleo de células B que media la señalización de células B para respuestas inmunes. Al formar este complejo, CD9, una proteína asociada con CD81, disociada del complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 y consecuentemente induce la expresión osteoblastada específica de los genes inducidos por interferón, Bst2, Irgm, Ifit3, B2m y el gen antígeno clase I de la MHC [28]. Si se perdiera la interacción específica mediada por Spalmitoylation de IFITM5 con FKBP11, no se formaría el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP y, por consiguiente, se inhibiría la expresión génica inducida por interferón, ya que el CD9 seguiría asociado con el complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9. En este sentido, especulamos que el IFITM5 está involucrado en la actividad del sistema inmunitario en las células osteoblastadas y la interacción del IFITM5 palmitoilado S con el FKBP11 regula la actividad inmune. Además, se sugirió que la S-palmitoilación en el IFITM5 contribuye a la formación de nódulos óseos, incluyendo la morfología y el tiempo de mineralización, en las células osteoblastadas (Figura 5). Es difícil concluir en la actualidad que la falta de la S-palmitoilación en el IFITM5 causa la difusión de los nódulos óseos (panel b de la Figura 5 -E); sin embargo, podemos decir que el IFITM5 probablemente no será S-palmitoilado en las células en presencia de 2BP. Mientras que el 2BP se utiliza comúnmente como inhibidor de la palmitoilación, también se dirige a muchas enzimas Por lo tanto, también es difícil interpretar los resultados de la incubación a largo plazo de las células osteoblásticas en presencia de 2BP. En cualquier caso, estas son observaciones interesantes y clave en términos de aclarar el papel desempeñado por la S-palmitoilación de IFITM5 en la formación ósea, y se requieren estudios adicionales. La Figura 6 describe un posible mecanismo de la interacción de IFITM5 con FKBP11 y el papel de IFITM5 en la función celular osteoblástica mediante una comparación con IFITM3. En el caso de IFITM3, como se muestra en la Figura 6 -A, se observan los siguientes. i) Las tres cisteinas son todas S-palmitoiladas (ii). La S-palmitoilación conduce a la agrupación y el posicionamiento correcto de moléculas IFITM3 en la membrana (iii). La espalmitoilación y la siguiente agrupación son cruciales para la resistencia al virus de la gripe. Cuando IFITM3 carece de la espalmitoilación, las moléculas de IFITM3 no se agrupan, lo que conduce a la disminución significativa de la actividad antiviral. Por otro lado, la Figura 6 -B muestra que las siguientes observaciones se hacen en el caso de IFITM5. i) Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados (ii). El S-palmitoilado IFITM5 es capaz de interactuar específicamente con FKBP11. Se supone que la interacción está mediada por el ácido palmítico unido a la cisteína frente a la superficie de interacción en FKBP11. Cys86 está involucrado en la palmitoilación S, pero no en la interacción de IFITM5 con FKBP11. En la actualidad, sin embargo, poco se sabe sobre el papel de la palmitoilación S de IFITM5 para la localización en la membrana. Cuando la palmitoilación S afecta la localización de IFITM5 como en el caso de IFITM3 [10], las moléculas S-palmitoiladas IFITM5 deben ser localizadas en la membrana o las moléculas depalmitoiladas deben ser deslocalizadas. La pérdida de la interacción entre IFITM5 y FKBP11 podría deberse a una relocalización de la depalmitoilada IFITM5 que impide su asociación con FKBP11 (iii). El Spalmitoilado IFITM5 interactúa con el complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 a través del FKBP11, que induce la disociación del CD9 del complejo y la expresión de 5 genes inmunológicamente relevantes. Finalmente, el IFITM5 forma el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP. Se desconoce en la actualidad cuál de los tres estados (i)~(iii) ilustrados en la Figura 6-B es importante para la mineralización ósea de las células osteoblásticas. La falta de la S-palmitoilación influye en la interacción con el FKBP11, que podría explicar la siguiente formación compleja y expresión génica. Además, la formación de nódulos óseos también se ve afectada. Se indica que la S-palmitoilación en IFITM5 juega un papel no sólo en la regulación de la actividad inmune sino también en la formación ósea. En conclusión, hemos revelado la S-palmitoilación en IFITM5 y su papel en la interacción con FKBP11. No sólo la actividad inmune sino también la mineralización ósea en las células osteoblásticas se ve afectada por la S-palmitoilación. En general, el papel funcional de la S-palmitoilación es diferente para cada proteína [36]. Para muchas proteínas, el ciclo de palmitoilación y despalmitoilación es constitutivo y regulado por enzimas. Basado en los resultados actuales, es difícil abordar (i) si la S-palmitoilación en IFITM5 es constitutiva o regulada, o (ii) cuando y donde IFITM5 es S-palmitoilada en las células osteoblásticas. Se necesitan más estudios y actualmente se están realizando.

¿Qué es IFITM?

El papel de la S-Palmitoylation en IFITM5 para la interacción con FKBP11 en células de Osteoblastohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3776769/Tsukamoto, Takashi; Li, Xianglan; Morita, Hiromi; Minowa, Takashi; Aizawa, Tomoyasu; Hanagata, Nobutaka; Demura, Makoto2013-09-18DOI:10.1371/journal.pone.0075831Licencia:cc-byAbstract: Recientemente, una de las proteínas familiares de la transmembrana inducida por interferón, IFITM3, se ha convertido en un objetivo importante para la actividad contra la infección por el virus de la gripe A (H1N1). En esta proteína, una modificación post-translacional por ácidos grasos covalentemente unidos a la cisteína, llamada S-palmitoilación, juega un papel crucial para la actividad antiviral. IFITM3 posee tres residuos de cisteína para la S-palmitoilación en el primer dominio de la transmembrana (TM1) y en el bucle citoplasmático (CP). Debido a que estas cisteínas están bien conservadas en las proteínas de la familia de mamíferos IFITM, la S-palmitoilación en estas cisteínas es significativa para sus funciones. IFITM5 es otra proteína de la familia IFITM e interactúa con la proteína de unión FK506 (FKBP11) para formar un complejo de mayor orden en células osteoblastales, que induce la expresión de genes inmunológicamente relevantes. En este estudio, investigamos el papel que desempeña la palmitoilación S de IFITM5 en su interacción con FKBP11 en las células, ya que esta interacción es un proceso clave para la expresión génica. Nuestras investigaciones con un reportero establecido, ácido 17-octadecinoico (17-ODYA), y un inhibidor para la palmitoilación S, ácido 2-bromopalmítico (2BP), revelaron que IFITM5 fue palmitoilado S además de IFITM3. Específicamente, encontramos que los residuos de cisteína en el dominio TM1 y en el bucle CP fueron palmitoilados S en IFITM5. Luego, revelamos por inmunoprecipitación y análisis de manchas occidentales que la interacción de IFITM5 con FKBP11 fue inhibida en presencia de 2BP. El mutante que carecía del sitio S-palmitoylation en el dominio TM1 perdió la interacción con FKBP11. Estos resultados indican que la S-palmitoylation en IFITM5 promueve la interacción con FKBP11. Finalmente, investigamos la formación de nódulos óseos en células osteoblastadas en presencia de 2BP, ya que IFITM5 fue identificado originalmente como factor de formación ósea. El experimento resultó en una aberración morfológica del nódulo óseo, lo que también indicó que la S-palmitoylation contribuye a la formación ósea. Texto: La familia de proteínas transmembranas inducidas por interferón (IFITM) (también conocida como la familia Fragilis en ratones) es parte de la familia de las dispaninas [1] y está compuesta por α-hélices de doble transmembrana conectados por un bucle citoplasmático (CP) y secuencias de polipéptidos amino- y carboxil-terminales (Figura 1-A) extracelulares (EC). Las proteínas IFITM se conservan evolutivamente en vertebrados [2]. Investigaciones genómicas recientes han revelado que hay 5 miembros IFITM en humanos (IFITM1, 2, 3, 5 y 10) y 7 miembros en ratones (IFITM1, 2, 3, 5, 6, 7, y 10). Estas proteínas desempeñan papeles en diversos procesos biológicos, como la maduración de células germinativas durante la gastrulación (IFITTM1-3) [3] [5] [5], la adhesión de células a células (IFITTM1) [6] [7] [8], la actividad antiviral (IFITTM1-3) [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17], y la formación ósea (IFITTM5] [18] [19] [20] [21] [22], aunque actualmente se desconocen las funciones detalladas de IFITM6, 7 y 10; en particular, IFITM3 ha sido objeto de estudios intensivos sobre su actividad contra la infección e internalización del virus de la gripe A (H1N1) [9] [10] [11] [12] [13] [14]. En 2010, el Dr. Yount y sus colaboradores informaron que la actividad antiviral de IFITM3 depende de la palmitoilación S en la proteína [10]. La palmitoilación S [23] es una modificación post-translacional de las proteínas por los ácidos grasos saturados C 16 (ácidos palmíticos) covalentemente unidos a ciertos residuos de cisteína a través de un enlace tioéster (Figura 1-B). La modificación es catalizada reversiblemente por las proteínas aciltransferasas y las tioesterasas acilproteínas, y confiere propiedades únicas a la proteína, tales como unión a la membrana y segmentación, inmunoreactividad, alineación de secuencias aminoácidos de IFITM5, IFITM1, IFITM2 e IFITM3 derivadas de ratones. Los residuos conservados se destacan en negro. Las tres cisteinas conservadas se resaltan en rojo y numeradas en base a la secuencia de IFITM5 (top) e IFITM3 (bottom). Los residuos únicos en IFITM5 se resaltan en gris. Los dominios transmembrana primero y segundo, las secuencias extracelulares y el bucle citoplásmico se indican por flechas y se denotan como TM1 y TM2, EC y el bucle CP, respectivamente. Los dominios TM fueron predichos por SOSUI. Los aspartatos en la región C-terminal en IFITM5 se muestran en azul. B) La ilustración esquemática de la proteína S-palmitoilación. El ácido C 16-palmítico se une a la cisteína a través de un enlace tioéster. La palmitoilación y la despalmitoilación son catalizadas por proteínas aciltransferasas y acilproteínas tioesterasas, respectivamente. En este estudio se resume la hidroxilamina, NH 2 OH, para reducir la vinculación tioestérmica. C) La identidad de la secuencia de aminoácidos (similaridad) entre IFITM5, IFITM1, IFITM2 e IFITM3. doi: 10.1371/journal.pone.0075831.g001 y la interacción proteína-proteína. Los autores revelaron que IFITM3 es S-palmitoilado en tres quisteinas proximales de membrana, Cys71 y Cys72 en el primer dominio transmembrana (TM1), y Cys105 en el bucle CP (Figura 1-A) [10]. Además, IFITM3 carece de la palmitoilación S no se agrupa en la membrana celular y disminuye significativamente la actividad antiviral. Además, las cisteinas en IFITM2, Cys70, Cys71 y Cys104 también son palmitoiladas de la misma manera, lo que afecta a la localización intracelular [24]. Un estudio resentido ha revelado que la murina IFITM1 tiene cuatro residuos de cisteína (Cys49, Cys50, Cys83 y Cys103) para la palmitoilación S, que es necesaria para la actividad antiviral y la estabilidad proteica [25]. Los otros miembros de la familia IFITM también poseen estas cisteínas (Figura 1-A), y por lo tanto el papel de la espalmitoilación en las cisteinas debe ser significativo para las funciones de las proteínas IFITM. Aquí, nos centramos en las proteínas de la familia IFITM5, que también se conoce como proteína similar a IFITM (BRIL) [18]. Entre las proteínas de la familia IFITM, IFITM5 es única. (i) Expresión de IFITM5: A diferencia de las otras proteínas de la familia IFITM, la expresión de IFITM5 no es inducida por interferones porque la región anterior al gen ifitm5 carece de los elementos reguladores del interferón [26]. Además, la expresión de IFITM5 se limita principalmente a las células osteoblastadas [18, 19, 27], mientras que las otras proteínas de IFITM se expresan ubicuamente (ii). Además, IFITM5 tiene un dominio rico en aspartato en la región C-terminal, que podría estar involucrado en la unión al calcio (Figura 1 -A) [26]. iii) Papel de IFITM5 en la formación ósea: La expresión de IFITM5 está asociada con la mineralización durante el proceso de formación ósea en células osteoblásticas [18] [19] [20] [20]. Estudios anteriores han confirmado la expresión de IFITM5 en tejidos óseos en ratones, ratas, humanos y tammar wallabies [2]. Los ratones ifitm5-gene knockout tienen huesos más pequeños [19]. Además, el derribo del gen ifitm5 por el ARN de la horquilla pequeña induce una disminución en la formación de nódulos óseos, mientras que la sobreexpresión del gen en células UMR106 ha demostrado iv) Papel del IFITM5 en la actividad inmunitaria: Estudios recientes han revelado que el IFITM5 interactúa con la proteína 11 de unión FK506 (FKBP11) para formar IFITM5-FKBP11-CD81-el complejo regulador negativo del receptor de la prostaglandina F2 (FPRP) [28]. Cuando se forma el complejo, se inducen las expresiones de 5 genes inducidos por interferón, incluyendo el antígeno 2 de células estromales de médula ósea (Bst2), la proteína 1 inducible del interferón (Irgm), la proteína inducida por interferón con tetratricopéptido repite 3 (Ifit3), b(2) microglobulina (B2m) y el gen antígeno de clase I del MHC. En consecuencia, estos resultados indican que el IFITM5 está involucrado no sólo en la formación ósea sino también en la actividad En este estudio se investigó la palmitoilación S de IFITM5 y su papel en la interacción con FKBP11 en células de osteoblasto de ratón. Las células transfectadas por un plásmido DNA que codificaba el ratón IFITM5 fueron cultivadas en presencia de un reportero químico establecido, ácido 17-octadecinoico (17-ODYA) [29, 30], o un inhibidor para la palmitoilación S, ácido 2-bromopalmítico (2BP) [31]. Los ensayos bioquímicos usando estos compuestos revelaron que el tipo salvaje IFITM5 es S-palmitoilado. Para identificar el sitio de Spalmitoilación en IFITM5, se prepararon mutantes substituidos por cisteína, IFITM5-C86A, -C52A/C53A, y -C52A/53A El ensayo de reportero químico sugirió que al menos dos de las tres cisteínas en IFITM5 son S-palmitoiladas. La interacción de IFITM5 con FKBP11 fue examinada por inmunoprecipitación, resultando en la pérdida de la interacción en presencia de 2BP. El mismo resultado se obtuvo en los dos mutantes, C52A/C53A y Cys-less. Estos resultados sugieren que la S-palmitoilación en Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 de IFITM5 es necesaria para la interacción con FKBP11. Por otro lado, Cys86 en el bucle CP de IFITM5 fue S-palmitoilada pero no involucrada en la interacción. Debido a que esta interacción es importante para la expresión génica inmunológicamente relevante, se indicó que el papel de la palmitoilación S es promover la interacción de IFITM5 con FKBP11 y regular la actividad inmunitaria en las células osteoblásticas. Se discutirá el posible mecanismo de interacción y el efecto de la palmitoilación S en la formación de nódulos óseos. Para la expresión celular mamífera, se construyeron vectores de plásmidos de tipo salvaje IFITM5 (IFITM5-WT) y FKBP11 fusionado con FLAG (FKBP11-FLAG) insertando los genes clonados en un vector de expresión neopBApo-CMV (Takara Bio, Shiga, Japón). Los detalles de las construcciones de ADN recombinante fueron los mismos descritos anteriormente [19]. Los genes de los mutantes IFITM5 (IFITM5-C86A, -C52A/53A, y -C52A/C53A/C86A (Cys-less)) se prepararon utilizando un kit QuikChange de mutagenesis dirigido por el sitio (Stratagene, La Jolla, CA). Los vectores plásmidos de los IFITM5-WT fusionados con FLAG, -C52A/53A y Cys-less se construyeron insertando los genes clonados en el vector de expresión neo de pBApo-CMV. Para la expresión celular de E. coli, el vector plásmido de IFITM5-WT se construyó insertando el gen clonado en un vector de expresión pET22b (Novagen, Madison, WI). El primer delantero 5'-GGAATTCATTCATATTACACTTCATATCCCGTG-3' y el primer reverso 5'-CCGCTCGAGTTATAGTCTCATCAAACTTG-3' fueron utilizados para amplificar el gen que codifica todo el IFITM5 del vector plásmido para la expresión celular mamífera descrita anteriormente. Las letras subrayadas denotan un NdeI y un sitio de escote XhoI, respectivamente. Los plásmidos de mutantes IFITM5 fueron preparados usando un kit de mutagenesis dirigido por el sitio QuikChange. El sentido y los imprimadores antisenso utilizados fueron 5'-GGCAGTATGCTCCAAAGCCAAGGCGTACCATCTGGGCTGC-3' y 5'-GCAGCCGAGATGGTGGTGCCTGCTGGTGGTGGGGAGCATACT GCC-3' para IFITM5-C86A; y 5'-GCACGATGTACCTGAATGCGCGGCGCTTGGTGCTG CGC-3' y 5'-GCGCCAGGAATGAGCGCGCCGCGACAGAGCATCG TGC-3' para IFITM5-C52A/C53A, respectivamente (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Las células MC3T3 similares a los osteoblastos fueron provistas por el RIKEN, Cell Bank (RCB 1126). Los procedimientos de cultivo celular, transfección y expresión proteica fueron los mismos reportados anteriormente. Cuando fue necesario, el ácido 2-bromopalmítico (2BP; Wako, Osaka, Japón) y el ácido 17-octadecinoico (17-ODYA; Sigma-Aldrich) fueron disueltos en el 99,5% de sulfóxido dimetilo (DMSO; Wako) y añadidos al medio de diferenciación a concentraciones de 100 μM y 50 μM en menos del 0,1% de DMSO, respectivamente [30, 31]. Las proteínas de tipo salvaje y mutante IFITM5 también fueron producidas utilizando un sistema de expresión recombinante E. coli. Las células E. coli BL21(DE3) transformadas por la expresión plásmido fueron cultivadas a 37°C en medio LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina. Después de cuatro horas de inducción por 1 mM isopropil β-Dtiogalactopiranoside (IPTG), las células fueron recolectadas por centrifugación (6.400 × g durante 10 min a 4°C). Las células fueron suspendidas en 50 mM tampón Tris-HCl (pH 8) y interrumpidas por una prensa francesa (Ohtake, Tokio, Japón) (100 MPa × 4 veces). La fracción de membrana bruta fue recolectada por ultracentrifugación (178.000 × g durante 90 min a 4°C). La fracción recolectada fue solubilizado con 1,5% n-dodecyl-β-Dmaltopiranoside (DDM) (Dojindo Lab, Kumamoto, Japón) en 50 mM Tris-HCl, pH 8, que contenía 0,3 M NaCl y 5 mM imidazol. Después de la ultracentrifugación, el sobrenadante fue incubado con resina de agarosa Ni 2+ -NTA (Qiagen, Hilden, Alemania). La resina fue aplicada a una columna de cromatografía y lavada con 50 mM imidazol que contenía 50 mM Tris-HCl (pH 8), 0,3 M NaCl y 0,1% DDM. El IFITM5 solubilizado con DDM fue recolectado por elución con el mismo tampón que contenía 0,3 M imidazol. Los medios de muestreo fueron reemplazados por la solución tampón apropiada por dos pasajes sobre una columna PD-10 (GE Healthcare UK, Ltd., Amersham Place, Inglaterra). Los detalles experimentales se describen en informes anteriores [19, 28]. Brevemente, se extrajeron proteínas totales de las células osteoblásticas que coexpresaron IFITM5 y FKBP11-FLAG utilizando un kit de extracción total de proteínas (BioChain Institute Inc., Newark, CA). Luego, el lisato celular fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG M2 (Sigma-Aldrich) a 4°C durante 2 h. Para recuperar FKBP11-FLAG, 500 ng/μL 3 × péptido FLAG (Sigma-Aldrich) disuelto en solución salina tris-buffered se añadió al gel recogido a 4°C durante 1 h. Las proteínas recuperadas y el lisato celular que contenía proteínas totales fueron analizados por SDS-PAGE (15% ePAGEL; ATTO, Tokio, Japón) y la mancha occidental El anticuerpo policlonal anti-IFITM5, preparado a partir de la secuencia péptida aminoterminal (TSYPREDPRAPSSRC), y el anticuerpo monoclonal anti-FLAG (Sigma-Aldrich) fueron utilizados como anticuerpos primarios. Los anticuerpos anti-rabbit IgG (H+L) de cabra conjugados con HRP (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) y anti-mouse IgG (H+L) (Sigma-Aldrich) fueron utilizados como anticuerpos secundarios para los anticuerpos primarios anti-IFITM5 y anti-FLAG, respectivamente. Las proteínas fueron detectadas por reacción quimioluminiscente (MercK-Millipore, Billerica, MA). El lisato celular extraído de las células osteoblásticas marcadas metabólicamente por 17-ODYA fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG M2 para obtener proteínas purificadas con FLAG IFITM5. Las proteínas marcadas con 17-ODYA fueron etiquetadas químicamente con azida-PEG 3 -5(6)-carboxitetrametilrhodamina (TAMRA-azida; Click Chemistry Tools, Scottsdale, AZ) con referencia a estudios previos [10, 29, 30, 32] y la guía del fabricante. Las proteínas separadas por SDS-PAGE fueron visualizadas utilizando un láser de 532-nm para excitación y la fluorescencia por TAMRA (565 nm) fue detectada mediante un filtro de largo camino de 575nm (Typhoon FLA 9000; GE Healthcare). Las células de osteoblasto subcultivo MC3T3 fueron sembradas a una densidad de 5.000 células/cm 2 en platos de 40 mm y cultivadas en medio de águila α-modificada (α-MEM; Sigma-Aldrich) conteniendo 10% (v/v) de suero fetal bovino (FBS; Nichirei Biosciences Inc., Tokio, Japón). Al día siguiente, esto fue reemplazado por medio de diferenciación, conteniendo 2 mM de glicerofosfato y 50 μg/ml de ascorbato sódico en concentraciones finales, para inducir la diferenciación osteoblasto. Cuando fue necesario, 100 μM 2BP en menos de 0,1% DMSO, o 0,1% DMSO solo se añadió al medio de diferenciación en concentraciones finales. Todos los cultivos fueron incubados a 37°C en una atmósfera humidificada que contenía 5% CO 2 durante Los nódulos mineralizados fueron manchados con Alizarin Red S (Sigma-Aldrich). Se utilizó el procedimiento estándar de tinción. Los nódulos mineralizados fueron revisados cada tres días. Para identificar la palmitoilación S en IFITM5, las células osteoblásticas que albergaban el ADN plásmido que codificaba IFITM5-WT fueron cultivadas en ausencia y presencia de 2BP, lo que inhibe la palmitoilación S (Figura 2-A) [31]. A continuación, se extrajo el lisato celular que contenía proteína total para su uso en los análisis de manchas SDS-PAGE y occidentales. A efectos de comparación, las células E. coli también fueron cultivadas en ausencia de 2BP y se extrajo el lisato celular. La Figura 2 -B muestra los resultados del ensayo de manchas occidentales para IFITM5-WT expresado en el osteo En las células de osteoblasto, IFITM5-WT exhibió una sola banda cerca del marcador de masa molecular de 17,4 kDa (ver carril 1) en ausencia de 2BP. Sin embargo, en presencia de 2BP (ver carril 4), la banda apareció en una posición más baja que en ausencia de 2BP (lane 1). Estos resultados sugieren que IFITM5-WT tiene formas de masa molecular alta y baja en ausencia y presencia de 2BP, respectivamente. La palmitoilación S es una reacción reversible, y por lo tanto es despalmitoilada por un reductor fuerte como la hidroxilamina [10]. Tras el tratamiento de hidroxilamina (ver carril 2), la banda apareció en la misma posición que en presencia de 2BP (lane 4). En las células prokaryote E. coli, la modificación post-translacional S-Palmitoylation en IFITM5 PLOS ONE www.plosone.org no se produce. Por lo tanto, la banda también se observó en la misma posición inferior (ver carril 3). En el caso de IFITM3, también se informó que la palmitoylation induce un cambio en la movilidad en la electroforesis, al igual que en nuestros resultados actuales [10]. Para la observación directa de la S-palmitoylation, se utilizó un reportero químico establecido, 17-ODYA (Figura 2-C). Las células osteoblastadas que albergan la codificación plasmídica IFITM5-WT fueron cultivadas en presencia de 17-ODYA para etiquetar la proteína metabólicamente. Después de la extracción y purificación del lisato celular, el IFITM5-WT etiquetado fue ligado con TAMRA-azida de acuerdo con el método de cicloadición de azidealkyne [3+2] catalizado Cu(I) [3+2] [10, 29, 30, 32 ]. Una imagen de fluorescencia en gel del IFITM5-WT marcado 17-ODYA-TAMRA (véase el carril 2 en la Figura 2 -D) mostró que IFITM5 estaba espalmitoilado en las células osteoblastadas. La etiqueta FLAG adjunta a IFITM5 no tiene influencia en la modificación y etiquetado químico (vías 1 y 5). Además, después del tratamiento con hidroxilamina (ver carril 6), la fluorescencia se debilitó debido a la disociación de 17-ODYA de IFITM5, que fue el mismo mecanismo que la disociación del ácido palmítico de IFITM5 por reducción como se describe anteriormente (lane 2 de la Figura 2-B). Por lo tanto, concluimos que el IFITM5 expresado en las células de osteoblasto nativas es S-palmitoilado. Además, las bandas correspondientes a las formas de masa molecular alta y baja mostradas en el análisis de manchas occidentales fueron asignadas tentativamente a las formas S-palmitoiladas y depalmitoiladas, respectivamente. Como se describe anteriormente en la Introducción, los residuos de cisteína son el sustrato para la palmitoilación S. IFITM5 posee tres cisteínas, Cys52 y Cys53 en el dominio TM1, y Cys86 en el bucle CP (Figura 1-A). Todas estas cisteínas están altamente conservadas entre las proteínas de la familia IFITM de mamíferos (Figura 3-A). Para identificar el sitio de modificación en IFITM5, preparamos mutantes substituidos por cisteína, IFITM5-C52A/C53A, -C86A, y -C52A/C53A/C86A (Cys-less). Las células osteoblastadas que albergaban cada plasmido fueron cultivadas en ausencia de 2BP, y luego se extrajo el lisato celular. La Figura 3-B muestra los resultados de la mancha occidental detectando la expresión de todos los mutantes en las células osteoblastadas. En los mutantes C52A/C53A y Cys-less (ver carriles 2 y 4), se detectó la forma de baja masa molecular. Este resultado indica que Cys52 o Cys53 están involucrados en la palmitoilación S. Además, como se muestra en la Figura 2 -D, se detectaron fluorescencia fuerte y débil en el mutante C52A/C53A en ausencia y presencia de hidroxilamina (lanes 3 y 7), respectivamente, pero no en el mutante Cys-less (lanes 4 y 8). Estos resultados sugieren que el resto de la cisteína en el mutante C52A/C53A, Cys86, es S-palmitoilado y el mutante Cyss-less perdió por completo la palmitoilación S porque todas las cisteinas fueron sustituidas. Por lo tanto, concluimos que Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados. Además, se encontró que la S-palmitoilación en el dominio TM1 tiene un efecto importante en la movilidad en el gel (panel inferior de la Figura 2 -D y Figura 3-B). Por lo tanto, en adelante nos referimos a las formas de masa molecular alta y baja como las formas TM1palmitoiladas y TM1-depalmitoiladas, respectivamente. Finalmente, reasignamos las bandas mostradas en el análisis de Western blot como sigue: IFITM5-WT está totalmente palmitoilado, el mutante C86A está parcialmente palmitoilado en Cys52 y/o Cys53, el mutante C52A/C53A está parcialmente palmitoilado en Cys86, y el mutante sin Cys está completamente depalmitoilado. Estudios previos han revelado que IFITM5 interactúa con FKBP11 [19]. FKBP11 pertenece a la familia de proteínas de unión FK506 y tiene un dominio transmembrana. La interacción entre IFITM5 y FKBP11 es importante para la actividad inmunitaria debido a que la formación del complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP induce la expresión de genes inducidos por interferón, a saber, el Bst2, Irgm, Ifit3, B2m y el gen antígeno clase I de MHC [28]. Para investigar el efecto de la palmitoilación S en la interacción de IFITM5 con FKBP11, se realizó un ensayo de inmunoprecipitación. Las células osteoblásticas cotransfectadas por los plásmidos que codifican IFITM5-WT y FKBP11-FLAG fueron cultivadas en ausencia y presencia de 2BP. Luego, el análisis celular extraído fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG. El gel fue lavado varias veces. Finalmente, las proteínas fueron eludidas competitivamente por la adición de péptido FLAG. Si IFITM5 interactuaba con FKBP11, se esperaba que IFITM5 Las cisteínas conservadas fueran resaltadas en naranja y numeradas. En el panel inferior, los números dados entre paréntesis corresponden al número residual para IFITM2. Para el cálculo de probabilidad, un total de 23 secuencias IFITM2, 23 IFITM3 y 17 IFITM5 derivadas de especies mamíferas en la base de datos Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomas (KEGG) fueron utilizadas. La alineación de secuencias se llevó a cabo utilizando CLUSTALW. Los logotipos de secuencia se generaron utilizando WEBLOGO 3. B) Botón occidental para los mutantes de tipo salvaje y substituidos por cisteína de IFITM5 expresados en células osteoblastadas La flecha superior indica que los mutantes C52 y/o C53 en el dominio TM1 son Spalmitoylated (lanes 1 y 3). El C52A/C53A (lane 2) y Cys-less (lane 4) son parcial y completamente depalmitoylated. El experimento se llevó a cabo 2 veces. doi: 10.1371/journal.pone.0075831.g003 se obtendría durante este paso y se detectaría por inmunobloqueo. Figura 4 -A muestra los resultados de la mancha occidental para la co-inmunoprecipitación de IFITM5-WT con FKBP-FLAG. La banda correspondiente a FKBP11 apareció en todos los carriles (panel superior). Las lanes 1 y 2 son controles para asegurar que IFITM5 y FKBP11 estén contenidas en el lisato celular Los controles también aseguraron que el IFITM5 fuera palmitoilado S en ausencia de 2BP (ver carril 1), mientras que el IFITM5 no fue palmitoilado S en presencia de 2BP (ver carril 2). Después de la inmunoprecipitación, una sola banda correspondiente al IFITM5 palmitoilado S apareció en ausencia de 2BP (ver carril 3), indicando la interacción del IFITM5 espalmitoilado con el FKBP11. Sin embargo, en presencia de 2BP, no apareció ninguna banda correspondiente al IFITM5 (ver carril 4), indicando que las dos moléculas no interactúan entre sí. Estos resultados sugieren que la palmitoilación S sobre el IFITM5 contribuye a la interacción con el FKBP11. A continuación, investigamos la relación entre la Spalmitoylation y la interacción con FKBP11 utilizando los mutantes IFITM5 descritos anteriormente. Las células osteoblastadas cotransfectadas por los plásmidos que codifican los mutantes IFITM5 (C52A/ C53A, C86A y Cys-less) y FKBP11-FLAG fueron cultivadas. El ensayo de inmunoprecipitación se llevó a cabo de la misma manera que se describió anteriormente. La Figura 4 -B muestra los resultados de la mancha occidental para la co-inmunoprecipitación de los mutantes de tipo salvaje y el IFITM5 con FKBP11. La Figura 4 -C muestra los resultados del experimento de control utilizando el lisato celular antes de la inmunoprecipitación. Como se describe en la sección anterior 3-3, la banda correspondiente a FKBP11 apareció en todos los carriles (paneles superiores) porque la inmunoprecipitación se realizó utilizando el gel de agarosa anti-FLAG. En el panel inferior de la Figura 4 -B, se observaron bandas individuales para el mutante IFITM5-WT y -C86A (lanes 1 y 3) pero no para los mutantes -C52A/C53A y Cys-less (lanes 2 y 4). Este resultado indica que el tipo salvaje y el mutante C86A interactúan con FKBP11, mientras que los otros dos mutantes no lo hacen. Curiosamente, esta tendencia refleja la tendencia de los perfiles de palmitoilación S, lo que significa que Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 de los mutantes IFITM5-WT y -C86A es S-palmitoilado, mientras que estos residuos no son S-palmitoilados en los mutantes C52A/C53A y Cysless (ver Figuras 2-D, 3-B y el panel inferior de la Figura 4-C). Debido a que la palmitoilación S contribuye a la interacción IFITM5-FKBP11, como se describe en la sección anterior 3-3 (también en la Figura 4-A), los resultados de la Figura 4-B sugieren que los mutantes que perdieron el sitio(s) de palmitoilación S, Cys52 y/o Cys53, no son capaces de interactuar con FKB En otras palabras, la palmitoilación S en estas cisteínas es necesaria para la interacción de IFITM5 con FKBP11. Como se ha descrito anteriormente en la Introducción, estudios previos han revelado que IFITM5 también contribuye a la formación ósea [18] [19] [20]. Por lo tanto, se investigó la influencia de Spalmitoilación en la formación de nódulos óseos en células osteoblastadas, en las que se expresa IFITM5 nativas. La Figura 5 muestra la formación de nódulos dependientes del tiempo en ausencia y la presencia de 2BP (Figuras 5-A y -B). La Figura 5 -C muestra los resultados del ensayo de control para verificar el efecto de DMSO, que se utilizó como disolvente para 2BP, en la formación de nódulos. El nódulo mineralizado fue manchado con Alizarin Red, que reacciona con calcio depositado. En la Figura 5 -D, el área del nódulo mineralizado fue trazada contra el tiempo experimental. En ausencia de 2BP (Figura 5-A, -C, y -D), la mineralización se inició 15 días después del inicio de la diferenciación celular (Día 0). Por otro lado, en presencia de 2BP (Figura 5-B y -D) se formó el nódulo el Día 12. El tiempo medio para la mineralización máxima en presencia de 2BP se estimó 7 días antes que en ausencia de 2BP (Figura 5-D). Además, se observaron diferencias en la forma de los nódulos mineralizados. La Figura 5 -E muestra una visión ampliada de cada nódulo en el Día 21. Los nódulos manchados se difundieron en presencia de 2BP (panel b), mientras que en ausencia de 2BP los nódulos formaron un gran cúmulo (panels a y c). Por lo tanto, nuestras observaciones en este estudio sugieren que la S-palmitoilación afecta la formación de nódulos óseos en las células osteoblásticas. En este estudio, se confirmó la S-palmitoilación sobre IFITM5 en las células osteoblásticas, que fue la misma que la reportada previamente para IFITM3 e IFITM2. Como se informó anteriormente, en IFITM3 e IFITM2, que comparten similitud de secuencia del 85% (Figura 1-C), dos cisteínas en el dominio TM1 (Cys71 y Cys72 para IFITM3, Cys70 y Cys71 para IFITM2) y una cisteína en el bucle CP (Cys105 para IFITM3, Cys104 para IFITM2) son todas S-palmitoiladas en células [10, 24]. Por otro lado, aunque IFITM5 comparte similitud de secuencia del 68% y 66% a IFITM3 e IFITM2, respectivamente, más de una cisteína en el dominio TM1 (Cys52 o Cys53) y una cisteína en el bucle CP (Cys86) son S-palmitoiladas. Teniendo en cuenta la alta conservación de tres cisteínas en las proteínas IFITM (Figuras 1-A y 3-A), todas las cisteínas en IFITM5 pueden estar involucradas en la palmitoilación S al igual que en el caso de IFITM3 e IFITM2 [10, 24]. Los roles de la palmitoilación S en IFITM3 se han estudiado intensamente, y la palmitoilación S ha demostrado ser crucial para el correcto posicionamiento en la membrana y la resistencia a la infección viral y la internalización [10] (los papeles se resumen en la Figura 6-A y se discuten en detalle más adelante). Un estudio reciente ha revelado que la palmitoilación S en IFITM2 también es importante para la agrupación de proteínas en la membrana [24]. Sin embargo, no conocemos el papel de la Spalmitoylation de IFITM5 para el agrupamiento en la membrana en la actualidad porque todavía no hemos logrado obtener un anticuerpo adecuado para la inmunohistoquímica, a pesar de que dedicamos mucho tiempo a la búsqueda y considerando un número considerable de anticuerpos. El Dr. Hanagata y sus colaboradores reportaron previamente que IFITM5 carecían del dominio TM1 y del bucle CP, que y IFITM5 (paneles inferiores), los anticuerpos anti-FLAG y anti-IFITM5 fueron utilizados como anticuerpos primarios, respectivamente. Las flechas indican la existencia de cada proteína y la S-palmitoylation en IFITM5. A) La mancha occidental para la coinmunoprecipitación del tipo salvaje IFITM5 con el FKBP11 (FKBP11-FLAG) fusionado con FLAG en las células osteoblásticas en ausencia y presencia de 2BP (denominadas "-" y "+", respectivamente). Las vías 1 y 2 son los resultados de los ensayos de control utilizados para verificar la existencia de IFITM5 y FKBP11 antes de la inmunoprecipitación, y las vías 3 y 4 muestran los resultados después de la inmunoprecipitación. El experimento se repitió 3 veces. B) La mancha occidental para la coinmunoprecipitación del tipo salvaje y los mutantes substituidos por cisteína de IFITM5 con FKBP11-FLAG en las células osteoblásticas. La banda correspondiente al péptido FLAG no se muestra debido a la menor masa molecular del péptido FLAG en relación con FKBP11-FLAG. C) El experimento de control de la Figura 4 -B utilizado para verificar que IFITM5 y FKBP11 estaban presentes en el lisato celular antes de la inmunoprecipitación. El experimento se repitió 2 veces. A) El mecanismo funcional de IFITM3 se resume en estudios anteriores. i) IFITM3 es S-palmitoilado en Cys71, Cys72 y Cys105, ii) que induce el agrupamiento y el posicionamiento correcto en la membrana, iii) resultando en la actividad antiviral contra el virus de la gripe. B) El mecanismo funcional de IFITM5 se resume combinando los resultados del presente y los estudios anteriores. (i) Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados (ii). La S-palmitoilación permite que IFITM5 interactúe con FKBP11 en las células osteoblásticas (iii). La disociación del CD9 del complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 es inducida por la formación del complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP y conduce a la expresión genética inmunológicamente relevante. IFITM5 también contribuye a la formación ósea, pero se desconoce cuáles son los estados descritos en i)-iii) son importantes para la formación ósea en la actualidad. Por otro lado, la IFITM5 interactúa con la proteína asociada, FKBP11, y la S-palmitoylation claramente hace una contribución significativa a la interacción. Por lo tanto, IFITM5 forma un hetero-oligomero en la membrana celular para su función fisiológica. contiene los sitios de modificación relevantes, perdió la capacidad de interactuar con FKBP11 [19]. En el presente estudio, determinamos que la S-palmitoylation en Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 es necesaria para la interacción. De estos resultados, especulamos que Cys52 y Cys53 se enfrentan a la superficie de interacción con FKBP11, y por lo tanto IFITM5 y FKBP11 interactúan entre sí a través del ácido palmítico unido a la cisteína (resumidos en la Figura 6 -B, discutidos más Nuestra investigación reveló que Cys86 está involucrado en la Spalmitoylation pero no contribuye a la interacción con FKBP11. Especulamos que otros residuos en el bucle CP ubicados cerca del dominio TM1 hacen alguna contribución a la interacción. Investigaciones previas también revelaron que IFITM5 expresado en las células fibroblasto heterologosas NIH3T3 exhibieron interacciones directas con CD81, la proteína 31 asociada al receptor de células B (BCAP31) y el hidroxiesteroide (17-beta) deshidrogenasa 7 (HSD17b7). Estas tres proteínas se unen al IFITM5 sin la S-palmitoylation (forma de masa molecular baja; ver Figura 3-b en ref [19]. y Figura 1-B en ref [28]. En las células fibroblastosas, la S-palmitoylation en IFI Estas interacciones no se observan en las células nativas del osteoblasto y, por lo tanto, son inespecíficas. Teniendo en cuenta estos hechos, se especula que la palmitoilación S sobre las células del IFITM5 promueve la interacción específica con FKBP11 en las células del osteoblasto. El papel que desempeña la palmitoilación S de las células del IFITM5 en la actividad inmune de las células del osteoblasto se discutirá combinando los resultados del presente y de los estudios anteriores. Debe ser necesaria una interacción específica entre IFITM5 y FKBP11 para formar el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP. CD81, también conocido como TAPA-1, es un miembro de la familia de proteínas de membrana de tetraspanina y un componente del núcleo de células B que media la señalización de células B para respuestas inmunes. Al formar este complejo, CD9, una proteína asociada con CD81, disociada del complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 y consecuentemente induce la expresión osteoblastada específica de los genes inducidos por interferón, Bst2, Irgm, Ifit3, B2m y el gen antígeno clase I de la MHC [28]. Si se perdiera la interacción específica mediada por Spalmitoylation de IFITM5 con FKBP11, no se formaría el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP y, por consiguiente, se inhibiría la expresión génica inducida por interferón, ya que el CD9 seguiría asociado con el complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9. En este sentido, especulamos que el IFITM5 está involucrado en la actividad del sistema inmunitario en las células osteoblastadas y la interacción del IFITM5 palmitoilado S con el FKBP11 regula la actividad inmune. Además, se sugirió que la S-palmitoilación en el IFITM5 contribuye a la formación de nódulos óseos, incluyendo la morfología y el tiempo de mineralización, en las células osteoblastadas (Figura 5). Es difícil concluir en la actualidad que la falta de la S-palmitoilación en el IFITM5 causa la difusión de los nódulos óseos (panel b de la Figura 5 -E); sin embargo, podemos decir que el IFITM5 probablemente no será S-palmitoilado en las células en presencia de 2BP. Mientras que el 2BP se utiliza comúnmente como inhibidor de la palmitoilación, también se dirige a muchas enzimas Por lo tanto, también es difícil interpretar los resultados de la incubación a largo plazo de las células osteoblásticas en presencia de 2BP. En cualquier caso, estas son observaciones interesantes y clave en términos de aclarar el papel desempeñado por la S-palmitoilación de IFITM5 en la formación ósea, y se requieren estudios adicionales. La Figura 6 describe un posible mecanismo de la interacción de IFITM5 con FKBP11 y el papel de IFITM5 en la función celular osteoblástica mediante una comparación con IFITM3. En el caso de IFITM3, como se muestra en la Figura 6 -A, se observan los siguientes. i) Las tres cisteinas son todas S-palmitoiladas (ii). La S-palmitoilación conduce a la agrupación y el posicionamiento correcto de moléculas IFITM3 en la membrana (iii). La espalmitoilación y la siguiente agrupación son cruciales para la resistencia al virus de la gripe. Cuando IFITM3 carece de la espalmitoilación, las moléculas de IFITM3 no se agrupan, lo que conduce a la disminución significativa de la actividad antiviral. Por otro lado, la Figura 6 -B muestra que las siguientes observaciones se hacen en el caso de IFITM5. i) Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados (ii). El S-palmitoilado IFITM5 es capaz de interactuar específicamente con FKBP11. Se supone que la interacción está mediada por el ácido palmítico unido a la cisteína frente a la superficie de interacción en FKBP11. Cys86 está involucrado en la palmitoilación S, pero no en la interacción de IFITM5 con FKBP11. En la actualidad, sin embargo, poco se sabe sobre el papel de la palmitoilación S de IFITM5 para la localización en la membrana. Cuando la palmitoilación S afecta la localización de IFITM5 como en el caso de IFITM3 [10], las moléculas S-palmitoiladas IFITM5 deben ser localizadas en la membrana o las moléculas depalmitoiladas deben ser deslocalizadas. La pérdida de la interacción entre IFITM5 y FKBP11 podría deberse a una relocalización de la depalmitoilada IFITM5 que impide su asociación con FKBP11 (iii). El Spalmitoilado IFITM5 interactúa con el complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 a través del FKBP11, que induce la disociación del CD9 del complejo y la expresión de 5 genes inmunológicamente relevantes. Finalmente, el IFITM5 forma el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP. Se desconoce en la actualidad cuál de los tres estados (i)~(iii) ilustrados en la Figura 6-B es importante para la mineralización ósea de las células osteoblásticas. La falta de la S-palmitoilación influye en la interacción con el FKBP11, que podría explicar la siguiente formación compleja y expresión génica. Además, la formación de nódulos óseos también se ve afectada. Se indica que la S-palmitoilación en IFITM5 juega un papel no sólo en la regulación de la actividad inmune sino también en la formación ósea. En conclusión, hemos revelado la S-palmitoilación en IFITM5 y su papel en la interacción con FKBP11. No sólo la actividad inmune sino también la mineralización ósea en las células osteoblásticas se ve afectada por la S-palmitoilación. En general, el papel funcional de la S-palmitoilación es diferente para cada proteína [36]. Para muchas proteínas, el ciclo de palmitoilación y despalmitoilación es constitutivo y regulado por enzimas. Basado en los resultados actuales, es difícil abordar (i) si la S-palmitoilación en IFITM5 es constitutiva o regulada, o (ii) cuando y donde IFITM5 es S-palmitoilada en las células osteoblásticas. Se necesitan más estudios y actualmente se están realizando.

¿Cuántos residuos de cisteína están contenidos en el primer dominio transmembrana de IFITM3?

El papel de la S-Palmitoylation en IFITM5 para la interacción con FKBP11 en células de Osteoblastohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3776769/Tsukamoto, Takashi; Li, Xianglan; Morita, Hiromi; Minowa, Takashi; Aizawa, Tomoyasu; Hanagata, Nobutaka; Demura, Makoto2013-09-18DOI:10.1371/journal.pone.0075831Licencia:cc-byAbstract: Recientemente, una de las proteínas familiares de la transmembrana inducida por interferón, IFITM3, se ha convertido en un objetivo importante para la actividad contra la infección por el virus de la gripe A (H1N1). En esta proteína, una modificación post-translacional por ácidos grasos covalentemente unidos a la cisteína, llamada S-palmitoilación, juega un papel crucial para la actividad antiviral. IFITM3 posee tres residuos de cisteína para la S-palmitoilación en el primer dominio de la transmembrana (TM1) y en el bucle citoplasmático (CP). Debido a que estas cisteínas están bien conservadas en las proteínas de la familia de mamíferos IFITM, la S-palmitoilación en estas cisteínas es significativa para sus funciones. IFITM5 es otra proteína de la familia IFITM e interactúa con la proteína de unión FK506 (FKBP11) para formar un complejo de mayor orden en células osteoblastales, que induce la expresión de genes inmunológicamente relevantes. En este estudio, investigamos el papel que desempeña la palmitoilación S de IFITM5 en su interacción con FKBP11 en las células, ya que esta interacción es un proceso clave para la expresión génica. Nuestras investigaciones con un reportero establecido, ácido 17-octadecinoico (17-ODYA), y un inhibidor para la palmitoilación S, ácido 2-bromopalmítico (2BP), revelaron que IFITM5 fue palmitoilado S además de IFITM3. Específicamente, encontramos que los residuos de cisteína en el dominio TM1 y en el bucle CP fueron palmitoilados S en IFITM5. Luego, revelamos por inmunoprecipitación y análisis de manchas occidentales que la interacción de IFITM5 con FKBP11 fue inhibida en presencia de 2BP. El mutante que carecía del sitio S-palmitoylation en el dominio TM1 perdió la interacción con FKBP11. Estos resultados indican que la S-palmitoylation en IFITM5 promueve la interacción con FKBP11. Finalmente, investigamos la formación de nódulos óseos en células osteoblastadas en presencia de 2BP, ya que IFITM5 fue identificado originalmente como factor de formación ósea. El experimento resultó en una aberración morfológica del nódulo óseo, lo que también indicó que la S-palmitoylation contribuye a la formación ósea. Texto: La familia de proteínas transmembranas inducidas por interferón (IFITM) (también conocida como la familia Fragilis en ratones) es parte de la familia de las dispaninas [1] y está compuesta por α-hélices de doble transmembrana conectados por un bucle citoplasmático (CP) y secuencias de polipéptidos amino- y carboxil-terminales (Figura 1-A) extracelulares (EC). Las proteínas IFITM se conservan evolutivamente en vertebrados [2]. Investigaciones genómicas recientes han revelado que hay 5 miembros IFITM en humanos (IFITM1, 2, 3, 5 y 10) y 7 miembros en ratones (IFITM1, 2, 3, 5, 6, 7, y 10). Estas proteínas desempeñan papeles en diversos procesos biológicos, como la maduración de células germinativas durante la gastrulación (IFITTM1-3) [3] [5] [5], la adhesión de células a células (IFITTM1) [6] [7] [8], la actividad antiviral (IFITTM1-3) [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17], y la formación ósea (IFITTM5] [18] [19] [20] [21] [22], aunque actualmente se desconocen las funciones detalladas de IFITM6, 7 y 10; en particular, IFITM3 ha sido objeto de estudios intensivos sobre su actividad contra la infección e internalización del virus de la gripe A (H1N1) [9] [10] [11] [12] [13] [14]. En 2010, el Dr. Yount y sus colaboradores informaron que la actividad antiviral de IFITM3 depende de la palmitoilación S en la proteína [10]. La palmitoilación S [23] es una modificación post-translacional de las proteínas por los ácidos grasos saturados C 16 (ácidos palmíticos) covalentemente unidos a ciertos residuos de cisteína a través de un enlace tioéster (Figura 1-B). La modificación es catalizada reversiblemente por las proteínas aciltransferasas y las tioesterasas acilproteínas, y confiere propiedades únicas a la proteína, tales como unión a la membrana y segmentación, inmunoreactividad, alineación de secuencias aminoácidos de IFITM5, IFITM1, IFITM2 e IFITM3 derivadas de ratones. Los residuos conservados se destacan en negro. Las tres cisteinas conservadas se resaltan en rojo y numeradas en base a la secuencia de IFITM5 (top) e IFITM3 (bottom). Los residuos únicos en IFITM5 se resaltan en gris. Los dominios transmembrana primero y segundo, las secuencias extracelulares y el bucle citoplásmico se indican por flechas y se denotan como TM1 y TM2, EC y el bucle CP, respectivamente. Los dominios TM fueron predichos por SOSUI. Los aspartatos en la región C-terminal en IFITM5 se muestran en azul. B) La ilustración esquemática de la proteína S-palmitoilación. El ácido C 16-palmítico se une a la cisteína a través de un enlace tioéster. La palmitoilación y la despalmitoilación son catalizadas por proteínas aciltransferasas y acilproteínas tioesterasas, respectivamente. En este estudio se resume la hidroxilamina, NH 2 OH, para reducir la vinculación tioestérmica. C) La identidad de la secuencia de aminoácidos (similaridad) entre IFITM5, IFITM1, IFITM2 e IFITM3. doi: 10.1371/journal.pone.0075831.g001 y la interacción proteína-proteína. Los autores revelaron que IFITM3 es S-palmitoilado en tres quisteinas proximales de membrana, Cys71 y Cys72 en el primer dominio transmembrana (TM1), y Cys105 en el bucle CP (Figura 1-A) [10]. Además, IFITM3 carece de la palmitoilación S no se agrupa en la membrana celular y disminuye significativamente la actividad antiviral. Además, las cisteinas en IFITM2, Cys70, Cys71 y Cys104 también son palmitoiladas de la misma manera, lo que afecta a la localización intracelular [24]. Un estudio resentido ha revelado que la murina IFITM1 tiene cuatro residuos de cisteína (Cys49, Cys50, Cys83 y Cys103) para la palmitoilación S, que es necesaria para la actividad antiviral y la estabilidad proteica [25]. Los otros miembros de la familia IFITM también poseen estas cisteínas (Figura 1-A), y por lo tanto el papel de la espalmitoilación en las cisteinas debe ser significativo para las funciones de las proteínas IFITM. Aquí, nos centramos en las proteínas de la familia IFITM5, que también se conoce como proteína similar a IFITM (BRIL) [18]. Entre las proteínas de la familia IFITM, IFITM5 es única. (i) Expresión de IFITM5: A diferencia de las otras proteínas de la familia IFITM, la expresión de IFITM5 no es inducida por interferones porque la región anterior al gen ifitm5 carece de los elementos reguladores del interferón [26]. Además, la expresión de IFITM5 se limita principalmente a las células osteoblastadas [18, 19, 27], mientras que las otras proteínas de IFITM se expresan ubicuamente (ii). Además, IFITM5 tiene un dominio rico en aspartato en la región C-terminal, que podría estar involucrado en la unión al calcio (Figura 1 -A) [26]. iii) Papel de IFITM5 en la formación ósea: La expresión de IFITM5 está asociada con la mineralización durante el proceso de formación ósea en células osteoblásticas [18] [19] [20] [20]. Estudios anteriores han confirmado la expresión de IFITM5 en tejidos óseos en ratones, ratas, humanos y tammar wallabies [2]. Los ratones ifitm5-gene knockout tienen huesos más pequeños [19]. Además, el derribo del gen ifitm5 por el ARN de la horquilla pequeña induce una disminución en la formación de nódulos óseos, mientras que la sobreexpresión del gen en células UMR106 ha demostrado iv) Papel del IFITM5 en la actividad inmunitaria: Estudios recientes han revelado que el IFITM5 interactúa con la proteína 11 de unión FK506 (FKBP11) para formar IFITM5-FKBP11-CD81-el complejo regulador negativo del receptor de la prostaglandina F2 (FPRP) [28]. Cuando se forma el complejo, se inducen las expresiones de 5 genes inducidos por interferón, incluyendo el antígeno 2 de células estromales de médula ósea (Bst2), la proteína 1 inducible del interferón (Irgm), la proteína inducida por interferón con tetratricopéptido repite 3 (Ifit3), b(2) microglobulina (B2m) y el gen antígeno de clase I del MHC. En consecuencia, estos resultados indican que el IFITM5 está involucrado no sólo en la formación ósea sino también en la actividad En este estudio se investigó la palmitoilación S de IFITM5 y su papel en la interacción con FKBP11 en células de osteoblasto de ratón. Las células transfectadas por un plásmido DNA que codificaba el ratón IFITM5 fueron cultivadas en presencia de un reportero químico establecido, ácido 17-octadecinoico (17-ODYA) [29, 30], o un inhibidor para la palmitoilación S, ácido 2-bromopalmítico (2BP) [31]. Los ensayos bioquímicos usando estos compuestos revelaron que el tipo salvaje IFITM5 es S-palmitoilado. Para identificar el sitio de Spalmitoilación en IFITM5, se prepararon mutantes substituidos por cisteína, IFITM5-C86A, -C52A/C53A, y -C52A/53A El ensayo de reportero químico sugirió que al menos dos de las tres cisteínas en IFITM5 son S-palmitoiladas. La interacción de IFITM5 con FKBP11 fue examinada por inmunoprecipitación, resultando en la pérdida de la interacción en presencia de 2BP. El mismo resultado se obtuvo en los dos mutantes, C52A/C53A y Cys-less. Estos resultados sugieren que la S-palmitoilación en Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 de IFITM5 es necesaria para la interacción con FKBP11. Por otro lado, Cys86 en el bucle CP de IFITM5 fue S-palmitoilada pero no involucrada en la interacción. Debido a que esta interacción es importante para la expresión génica inmunológicamente relevante, se indicó que el papel de la palmitoilación S es promover la interacción de IFITM5 con FKBP11 y regular la actividad inmunitaria en las células osteoblásticas. Se discutirá el posible mecanismo de interacción y el efecto de la palmitoilación S en la formación de nódulos óseos. Para la expresión celular mamífera, se construyeron vectores de plásmidos de tipo salvaje IFITM5 (IFITM5-WT) y FKBP11 fusionado con FLAG (FKBP11-FLAG) insertando los genes clonados en un vector de expresión neopBApo-CMV (Takara Bio, Shiga, Japón). Los detalles de las construcciones de ADN recombinante fueron los mismos descritos anteriormente [19]. Los genes de los mutantes IFITM5 (IFITM5-C86A, -C52A/53A, y -C52A/C53A/C86A (Cys-less)) se prepararon utilizando un kit QuikChange de mutagenesis dirigido por el sitio (Stratagene, La Jolla, CA). Los vectores plásmidos de los IFITM5-WT fusionados con FLAG, -C52A/53A y Cys-less se construyeron insertando los genes clonados en el vector de expresión neo de pBApo-CMV. Para la expresión celular de E. coli, el vector plásmido de IFITM5-WT se construyó insertando el gen clonado en un vector de expresión pET22b (Novagen, Madison, WI). El primer delantero 5'-GGAATTCATTCATATTACACTTCATATCCCGTG-3' y el primer reverso 5'-CCGCTCGAGTTATAGTCTCATCAAACTTG-3' fueron utilizados para amplificar el gen que codifica todo el IFITM5 del vector plásmido para la expresión celular mamífera descrita anteriormente. Las letras subrayadas denotan un NdeI y un sitio de escote XhoI, respectivamente. Los plásmidos de mutantes IFITM5 fueron preparados usando un kit de mutagenesis dirigido por el sitio QuikChange. El sentido y los imprimadores antisenso utilizados fueron 5'-GGCAGTATGCTCCAAAGCCAAGGCGTACCATCTGGGCTGC-3' y 5'-GCAGCCGAGATGGTGGTGCCTGCTGGTGGTGGGGAGCATACT GCC-3' para IFITM5-C86A; y 5'-GCACGATGTACCTGAATGCGCGGCGCTTGGTGCTG CGC-3' y 5'-GCGCCAGGAATGAGCGCGCCGCGACAGAGCATCG TGC-3' para IFITM5-C52A/C53A, respectivamente (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Las células MC3T3 similares a los osteoblastos fueron provistas por el RIKEN, Cell Bank (RCB 1126). Los procedimientos de cultivo celular, transfección y expresión proteica fueron los mismos reportados anteriormente. Cuando fue necesario, el ácido 2-bromopalmítico (2BP; Wako, Osaka, Japón) y el ácido 17-octadecinoico (17-ODYA; Sigma-Aldrich) fueron disueltos en el 99,5% de sulfóxido dimetilo (DMSO; Wako) y añadidos al medio de diferenciación a concentraciones de 100 μM y 50 μM en menos del 0,1% de DMSO, respectivamente [30, 31]. Las proteínas de tipo salvaje y mutante IFITM5 también fueron producidas utilizando un sistema de expresión recombinante E. coli. Las células E. coli BL21(DE3) transformadas por la expresión plásmido fueron cultivadas a 37°C en medio LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina. Después de cuatro horas de inducción por 1 mM isopropil β-Dtiogalactopiranoside (IPTG), las células fueron recolectadas por centrifugación (6.400 × g durante 10 min a 4°C). Las células fueron suspendidas en 50 mM tampón Tris-HCl (pH 8) y interrumpidas por una prensa francesa (Ohtake, Tokio, Japón) (100 MPa × 4 veces). La fracción de membrana bruta fue recolectada por ultracentrifugación (178.000 × g durante 90 min a 4°C). La fracción recolectada fue solubilizado con 1,5% n-dodecyl-β-Dmaltopiranoside (DDM) (Dojindo Lab, Kumamoto, Japón) en 50 mM Tris-HCl, pH 8, que contenía 0,3 M NaCl y 5 mM imidazol. Después de la ultracentrifugación, el sobrenadante fue incubado con resina de agarosa Ni 2+ -NTA (Qiagen, Hilden, Alemania). La resina fue aplicada a una columna de cromatografía y lavada con 50 mM imidazol que contenía 50 mM Tris-HCl (pH 8), 0,3 M NaCl y 0,1% DDM. El IFITM5 solubilizado con DDM fue recolectado por elución con el mismo tampón que contenía 0,3 M imidazol. Los medios de muestreo fueron reemplazados por la solución tampón apropiada por dos pasajes sobre una columna PD-10 (GE Healthcare UK, Ltd., Amersham Place, Inglaterra). Los detalles experimentales se describen en informes anteriores [19, 28]. Brevemente, se extrajeron proteínas totales de las células osteoblásticas que coexpresaron IFITM5 y FKBP11-FLAG utilizando un kit de extracción total de proteínas (BioChain Institute Inc., Newark, CA). Luego, el lisato celular fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG M2 (Sigma-Aldrich) a 4°C durante 2 h. Para recuperar FKBP11-FLAG, 500 ng/μL 3 × péptido FLAG (Sigma-Aldrich) disuelto en solución salina tris-buffered se añadió al gel recogido a 4°C durante 1 h. Las proteínas recuperadas y el lisato celular que contenía proteínas totales fueron analizados por SDS-PAGE (15% ePAGEL; ATTO, Tokio, Japón) y la mancha occidental El anticuerpo policlonal anti-IFITM5, preparado a partir de la secuencia péptida aminoterminal (TSYPREDPRAPSSRC), y el anticuerpo monoclonal anti-FLAG (Sigma-Aldrich) fueron utilizados como anticuerpos primarios. Los anticuerpos anti-rabbit IgG (H+L) de cabra conjugados con HRP (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) y anti-mouse IgG (H+L) (Sigma-Aldrich) fueron utilizados como anticuerpos secundarios para los anticuerpos primarios anti-IFITM5 y anti-FLAG, respectivamente. Las proteínas fueron detectadas por reacción quimioluminiscente (MercK-Millipore, Billerica, MA). El lisato celular extraído de las células osteoblásticas marcadas metabólicamente por 17-ODYA fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG M2 para obtener proteínas purificadas con FLAG IFITM5. Las proteínas marcadas con 17-ODYA fueron etiquetadas químicamente con azida-PEG 3 -5(6)-carboxitetrametilrhodamina (TAMRA-azida; Click Chemistry Tools, Scottsdale, AZ) con referencia a estudios previos [10, 29, 30, 32] y la guía del fabricante. Las proteínas separadas por SDS-PAGE fueron visualizadas utilizando un láser de 532-nm para excitación y la fluorescencia por TAMRA (565 nm) fue detectada mediante un filtro de largo camino de 575nm (Typhoon FLA 9000; GE Healthcare). Las células de osteoblasto subcultivo MC3T3 fueron sembradas a una densidad de 5.000 células/cm 2 en platos de 40 mm y cultivadas en medio de águila α-modificada (α-MEM; Sigma-Aldrich) conteniendo 10% (v/v) de suero fetal bovino (FBS; Nichirei Biosciences Inc., Tokio, Japón). Al día siguiente, esto fue reemplazado por medio de diferenciación, conteniendo 2 mM de glicerofosfato y 50 μg/ml de ascorbato sódico en concentraciones finales, para inducir la diferenciación osteoblasto. Cuando fue necesario, 100 μM 2BP en menos de 0,1% DMSO, o 0,1% DMSO solo se añadió al medio de diferenciación en concentraciones finales. Todos los cultivos fueron incubados a 37°C en una atmósfera humidificada que contenía 5% CO 2 durante Los nódulos mineralizados fueron manchados con Alizarin Red S (Sigma-Aldrich). Se utilizó el procedimiento estándar de tinción. Los nódulos mineralizados fueron revisados cada tres días. Para identificar la palmitoilación S en IFITM5, las células osteoblásticas que albergaban el ADN plásmido que codificaba IFITM5-WT fueron cultivadas en ausencia y presencia de 2BP, lo que inhibe la palmitoilación S (Figura 2-A) [31]. A continuación, se extrajo el lisato celular que contenía proteína total para su uso en los análisis de manchas SDS-PAGE y occidentales. A efectos de comparación, las células E. coli también fueron cultivadas en ausencia de 2BP y se extrajo el lisato celular. La Figura 2 -B muestra los resultados del ensayo de manchas occidentales para IFITM5-WT expresado en el osteo En las células de osteoblasto, IFITM5-WT exhibió una sola banda cerca del marcador de masa molecular de 17,4 kDa (ver carril 1) en ausencia de 2BP. Sin embargo, en presencia de 2BP (ver carril 4), la banda apareció en una posición más baja que en ausencia de 2BP (lane 1). Estos resultados sugieren que IFITM5-WT tiene formas de masa molecular alta y baja en ausencia y presencia de 2BP, respectivamente. La palmitoilación S es una reacción reversible, y por lo tanto es despalmitoilada por un reductor fuerte como la hidroxilamina [10]. Tras el tratamiento de hidroxilamina (ver carril 2), la banda apareció en la misma posición que en presencia de 2BP (lane 4). En las células prokaryote E. coli, la modificación post-translacional S-Palmitoylation en IFITM5 PLOS ONE www.plosone.org no se produce. Por lo tanto, la banda también se observó en la misma posición inferior (ver carril 3). En el caso de IFITM3, también se informó que la palmitoylation induce un cambio en la movilidad en la electroforesis, al igual que en nuestros resultados actuales [10]. Para la observación directa de la S-palmitoylation, se utilizó un reportero químico establecido, 17-ODYA (Figura 2-C). Las células osteoblastadas que albergan la codificación plasmídica IFITM5-WT fueron cultivadas en presencia de 17-ODYA para etiquetar la proteína metabólicamente. Después de la extracción y purificación del lisato celular, el IFITM5-WT etiquetado fue ligado con TAMRA-azida de acuerdo con el método de cicloadición de azidealkyne [3+2] catalizado Cu(I) [3+2] [10, 29, 30, 32 ]. Una imagen de fluorescencia en gel del IFITM5-WT marcado 17-ODYA-TAMRA (véase el carril 2 en la Figura 2 -D) mostró que IFITM5 estaba espalmitoilado en las células osteoblastadas. La etiqueta FLAG adjunta a IFITM5 no tiene influencia en la modificación y etiquetado químico (vías 1 y 5). Además, después del tratamiento con hidroxilamina (ver carril 6), la fluorescencia se debilitó debido a la disociación de 17-ODYA de IFITM5, que fue el mismo mecanismo que la disociación del ácido palmítico de IFITM5 por reducción como se describe anteriormente (lane 2 de la Figura 2-B). Por lo tanto, concluimos que el IFITM5 expresado en las células de osteoblasto nativas es S-palmitoilado. Además, las bandas correspondientes a las formas de masa molecular alta y baja mostradas en el análisis de manchas occidentales fueron asignadas tentativamente a las formas S-palmitoiladas y depalmitoiladas, respectivamente. Como se describe anteriormente en la Introducción, los residuos de cisteína son el sustrato para la palmitoilación S. IFITM5 posee tres cisteínas, Cys52 y Cys53 en el dominio TM1, y Cys86 en el bucle CP (Figura 1-A). Todas estas cisteínas están altamente conservadas entre las proteínas de la familia IFITM de mamíferos (Figura 3-A). Para identificar el sitio de modificación en IFITM5, preparamos mutantes substituidos por cisteína, IFITM5-C52A/C53A, -C86A, y -C52A/C53A/C86A (Cys-less). Las células osteoblastadas que albergaban cada plasmido fueron cultivadas en ausencia de 2BP, y luego se extrajo el lisato celular. La Figura 3-B muestra los resultados de la mancha occidental detectando la expresión de todos los mutantes en las células osteoblastadas. En los mutantes C52A/C53A y Cys-less (ver carriles 2 y 4), se detectó la forma de baja masa molecular. Este resultado indica que Cys52 o Cys53 están involucrados en la palmitoilación S. Además, como se muestra en la Figura 2 -D, se detectaron fluorescencia fuerte y débil en el mutante C52A/C53A en ausencia y presencia de hidroxilamina (lanes 3 y 7), respectivamente, pero no en el mutante Cys-less (lanes 4 y 8). Estos resultados sugieren que el resto de la cisteína en el mutante C52A/C53A, Cys86, es S-palmitoilado y el mutante Cyss-less perdió por completo la palmitoilación S porque todas las cisteinas fueron sustituidas. Por lo tanto, concluimos que Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados. Además, se encontró que la S-palmitoilación en el dominio TM1 tiene un efecto importante en la movilidad en el gel (panel inferior de la Figura 2 -D y Figura 3-B). Por lo tanto, en adelante nos referimos a las formas de masa molecular alta y baja como las formas TM1palmitoiladas y TM1-depalmitoiladas, respectivamente. Finalmente, reasignamos las bandas mostradas en el análisis de Western blot como sigue: IFITM5-WT está totalmente palmitoilado, el mutante C86A está parcialmente palmitoilado en Cys52 y/o Cys53, el mutante C52A/C53A está parcialmente palmitoilado en Cys86, y el mutante sin Cys está completamente depalmitoilado. Estudios previos han revelado que IFITM5 interactúa con FKBP11 [19]. FKBP11 pertenece a la familia de proteínas de unión FK506 y tiene un dominio transmembrana. La interacción entre IFITM5 y FKBP11 es importante para la actividad inmunitaria debido a que la formación del complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP induce la expresión de genes inducidos por interferón, a saber, el Bst2, Irgm, Ifit3, B2m y el gen antígeno clase I de MHC [28]. Para investigar el efecto de la palmitoilación S en la interacción de IFITM5 con FKBP11, se realizó un ensayo de inmunoprecipitación. Las células osteoblásticas cotransfectadas por los plásmidos que codifican IFITM5-WT y FKBP11-FLAG fueron cultivadas en ausencia y presencia de 2BP. Luego, el análisis celular extraído fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG. El gel fue lavado varias veces. Finalmente, las proteínas fueron eludidas competitivamente por la adición de péptido FLAG. Si IFITM5 interactuaba con FKBP11, se esperaba que IFITM5 Las cisteínas conservadas fueran resaltadas en naranja y numeradas. En el panel inferior, los números dados entre paréntesis corresponden al número residual para IFITM2. Para el cálculo de probabilidad, un total de 23 secuencias IFITM2, 23 IFITM3 y 17 IFITM5 derivadas de especies mamíferas en la base de datos Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomas (KEGG) fueron utilizadas. La alineación de secuencias se llevó a cabo utilizando CLUSTALW. Los logotipos de secuencia se generaron utilizando WEBLOGO 3. B) Botón occidental para los mutantes de tipo salvaje y substituidos por cisteína de IFITM5 expresados en células osteoblastadas La flecha superior indica que los mutantes C52 y/o C53 en el dominio TM1 son Spalmitoylated (lanes 1 y 3). El C52A/C53A (lane 2) y Cys-less (lane 4) son parcial y completamente depalmitoylated. El experimento se llevó a cabo 2 veces. doi: 10.1371/journal.pone.0075831.g003 se obtendría durante este paso y se detectaría por inmunobloqueo. Figura 4 -A muestra los resultados de la mancha occidental para la co-inmunoprecipitación de IFITM5-WT con FKBP-FLAG. La banda correspondiente a FKBP11 apareció en todos los carriles (panel superior). Las lanes 1 y 2 son controles para asegurar que IFITM5 y FKBP11 estén contenidas en el lisato celular Los controles también aseguraron que el IFITM5 fuera palmitoilado S en ausencia de 2BP (ver carril 1), mientras que el IFITM5 no fue palmitoilado S en presencia de 2BP (ver carril 2). Después de la inmunoprecipitación, una sola banda correspondiente al IFITM5 palmitoilado S apareció en ausencia de 2BP (ver carril 3), indicando la interacción del IFITM5 espalmitoilado con el FKBP11. Sin embargo, en presencia de 2BP, no apareció ninguna banda correspondiente al IFITM5 (ver carril 4), indicando que las dos moléculas no interactúan entre sí. Estos resultados sugieren que la palmitoilación S sobre el IFITM5 contribuye a la interacción con el FKBP11. A continuación, investigamos la relación entre la Spalmitoylation y la interacción con FKBP11 utilizando los mutantes IFITM5 descritos anteriormente. Las células osteoblastadas cotransfectadas por los plásmidos que codifican los mutantes IFITM5 (C52A/ C53A, C86A y Cys-less) y FKBP11-FLAG fueron cultivadas. El ensayo de inmunoprecipitación se llevó a cabo de la misma manera que se describió anteriormente. La Figura 4 -B muestra los resultados de la mancha occidental para la co-inmunoprecipitación de los mutantes de tipo salvaje y el IFITM5 con FKBP11. La Figura 4 -C muestra los resultados del experimento de control utilizando el lisato celular antes de la inmunoprecipitación. Como se describe en la sección anterior 3-3, la banda correspondiente a FKBP11 apareció en todos los carriles (paneles superiores) porque la inmunoprecipitación se realizó utilizando el gel de agarosa anti-FLAG. En el panel inferior de la Figura 4 -B, se observaron bandas individuales para el mutante IFITM5-WT y -C86A (lanes 1 y 3) pero no para los mutantes -C52A/C53A y Cys-less (lanes 2 y 4). Este resultado indica que el tipo salvaje y el mutante C86A interactúan con FKBP11, mientras que los otros dos mutantes no lo hacen. Curiosamente, esta tendencia refleja la tendencia de los perfiles de palmitoilación S, lo que significa que Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 de los mutantes IFITM5-WT y -C86A es S-palmitoilado, mientras que estos residuos no son S-palmitoilados en los mutantes C52A/C53A y Cysless (ver Figuras 2-D, 3-B y el panel inferior de la Figura 4-C). Debido a que la palmitoilación S contribuye a la interacción IFITM5-FKBP11, como se describe en la sección anterior 3-3 (también en la Figura 4-A), los resultados de la Figura 4-B sugieren que los mutantes que perdieron el sitio(s) de palmitoilación S, Cys52 y/o Cys53, no son capaces de interactuar con FKB En otras palabras, la palmitoilación S en estas cisteínas es necesaria para la interacción de IFITM5 con FKBP11. Como se ha descrito anteriormente en la Introducción, estudios previos han revelado que IFITM5 también contribuye a la formación ósea [18] [19] [20]. Por lo tanto, se investigó la influencia de Spalmitoilación en la formación de nódulos óseos en células osteoblastadas, en las que se expresa IFITM5 nativas. La Figura 5 muestra la formación de nódulos dependientes del tiempo en ausencia y la presencia de 2BP (Figuras 5-A y -B). La Figura 5 -C muestra los resultados del ensayo de control para verificar el efecto de DMSO, que se utilizó como disolvente para 2BP, en la formación de nódulos. El nódulo mineralizado fue manchado con Alizarin Red, que reacciona con calcio depositado. En la Figura 5 -D, el área del nódulo mineralizado fue trazada contra el tiempo experimental. En ausencia de 2BP (Figura 5-A, -C, y -D), la mineralización se inició 15 días después del inicio de la diferenciación celular (Día 0). Por otro lado, en presencia de 2BP (Figura 5-B y -D) se formó el nódulo el Día 12. El tiempo medio para la mineralización máxima en presencia de 2BP se estimó 7 días antes que en ausencia de 2BP (Figura 5-D). Además, se observaron diferencias en la forma de los nódulos mineralizados. La Figura 5 -E muestra una visión ampliada de cada nódulo en el Día 21. Los nódulos manchados se difundieron en presencia de 2BP (panel b), mientras que en ausencia de 2BP los nódulos formaron un gran cúmulo (panels a y c). Por lo tanto, nuestras observaciones en este estudio sugieren que la S-palmitoilación afecta la formación de nódulos óseos en las células osteoblásticas. En este estudio, se confirmó la S-palmitoilación sobre IFITM5 en las células osteoblásticas, que fue la misma que la reportada previamente para IFITM3 e IFITM2. Como se informó anteriormente, en IFITM3 e IFITM2, que comparten similitud de secuencia del 85% (Figura 1-C), dos cisteínas en el dominio TM1 (Cys71 y Cys72 para IFITM3, Cys70 y Cys71 para IFITM2) y una cisteína en el bucle CP (Cys105 para IFITM3, Cys104 para IFITM2) son todas S-palmitoiladas en células [10, 24]. Por otro lado, aunque IFITM5 comparte similitud de secuencia del 68% y 66% a IFITM3 e IFITM2, respectivamente, más de una cisteína en el dominio TM1 (Cys52 o Cys53) y una cisteína en el bucle CP (Cys86) son S-palmitoiladas. Teniendo en cuenta la alta conservación de tres cisteínas en las proteínas IFITM (Figuras 1-A y 3-A), todas las cisteínas en IFITM5 pueden estar involucradas en la palmitoilación S al igual que en el caso de IFITM3 e IFITM2 [10, 24]. Los roles de la palmitoilación S en IFITM3 se han estudiado intensamente, y la palmitoilación S ha demostrado ser crucial para el correcto posicionamiento en la membrana y la resistencia a la infección viral y la internalización [10] (los papeles se resumen en la Figura 6-A y se discuten en detalle más adelante). Un estudio reciente ha revelado que la palmitoilación S en IFITM2 también es importante para la agrupación de proteínas en la membrana [24]. Sin embargo, no conocemos el papel de la Spalmitoylation de IFITM5 para el agrupamiento en la membrana en la actualidad porque todavía no hemos logrado obtener un anticuerpo adecuado para la inmunohistoquímica, a pesar de que dedicamos mucho tiempo a la búsqueda y considerando un número considerable de anticuerpos. El Dr. Hanagata y sus colaboradores reportaron previamente que IFITM5 carecían del dominio TM1 y del bucle CP, que y IFITM5 (paneles inferiores), los anticuerpos anti-FLAG y anti-IFITM5 fueron utilizados como anticuerpos primarios, respectivamente. Las flechas indican la existencia de cada proteína y la S-palmitoylation en IFITM5. A) La mancha occidental para la coinmunoprecipitación del tipo salvaje IFITM5 con el FKBP11 (FKBP11-FLAG) fusionado con FLAG en las células osteoblásticas en ausencia y presencia de 2BP (denominadas "-" y "+", respectivamente). Las vías 1 y 2 son los resultados de los ensayos de control utilizados para verificar la existencia de IFITM5 y FKBP11 antes de la inmunoprecipitación, y las vías 3 y 4 muestran los resultados después de la inmunoprecipitación. El experimento se repitió 3 veces. B) La mancha occidental para la coinmunoprecipitación del tipo salvaje y los mutantes substituidos por cisteína de IFITM5 con FKBP11-FLAG en las células osteoblásticas. La banda correspondiente al péptido FLAG no se muestra debido a la menor masa molecular del péptido FLAG en relación con FKBP11-FLAG. C) El experimento de control de la Figura 4 -B utilizado para verificar que IFITM5 y FKBP11 estaban presentes en el lisato celular antes de la inmunoprecipitación. El experimento se repitió 2 veces. A) El mecanismo funcional de IFITM3 se resume en estudios anteriores. i) IFITM3 es S-palmitoilado en Cys71, Cys72 y Cys105, ii) que induce el agrupamiento y el posicionamiento correcto en la membrana, iii) resultando en la actividad antiviral contra el virus de la gripe. B) El mecanismo funcional de IFITM5 se resume combinando los resultados del presente y los estudios anteriores. (i) Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados (ii). La S-palmitoilación permite que IFITM5 interactúe con FKBP11 en las células osteoblásticas (iii). La disociación del CD9 del complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 es inducida por la formación del complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP y conduce a la expresión genética inmunológicamente relevante. IFITM5 también contribuye a la formación ósea, pero se desconoce cuáles son los estados descritos en i)-iii) son importantes para la formación ósea en la actualidad. Por otro lado, la IFITM5 interactúa con la proteína asociada, FKBP11, y la S-palmitoylation claramente hace una contribución significativa a la interacción. Por lo tanto, IFITM5 forma un hetero-oligomero en la membrana celular para su función fisiológica. contiene los sitios de modificación relevantes, perdió la capacidad de interactuar con FKBP11 [19]. En el presente estudio, determinamos que la S-palmitoylation en Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 es necesaria para la interacción. De estos resultados, especulamos que Cys52 y Cys53 se enfrentan a la superficie de interacción con FKBP11, y por lo tanto IFITM5 y FKBP11 interactúan entre sí a través del ácido palmítico unido a la cisteína (resumidos en la Figura 6 -B, discutidos más Nuestra investigación reveló que Cys86 está involucrado en la Spalmitoylation pero no contribuye a la interacción con FKBP11. Especulamos que otros residuos en el bucle CP ubicados cerca del dominio TM1 hacen alguna contribución a la interacción. Investigaciones previas también revelaron que IFITM5 expresado en las células fibroblasto heterologosas NIH3T3 exhibieron interacciones directas con CD81, la proteína 31 asociada al receptor de células B (BCAP31) y el hidroxiesteroide (17-beta) deshidrogenasa 7 (HSD17b7). Estas tres proteínas se unen al IFITM5 sin la S-palmitoylation (forma de masa molecular baja; ver Figura 3-b en ref [19]. y Figura 1-B en ref [28]. En las células fibroblastosas, la S-palmitoylation en IFI Estas interacciones no se observan en las células nativas del osteoblasto y, por lo tanto, son inespecíficas. Teniendo en cuenta estos hechos, se especula que la palmitoilación S sobre las células del IFITM5 promueve la interacción específica con FKBP11 en las células del osteoblasto. El papel que desempeña la palmitoilación S de las células del IFITM5 en la actividad inmune de las células del osteoblasto se discutirá combinando los resultados del presente y de los estudios anteriores. Debe ser necesaria una interacción específica entre IFITM5 y FKBP11 para formar el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP. CD81, también conocido como TAPA-1, es un miembro de la familia de proteínas de membrana de tetraspanina y un componente del núcleo de células B que media la señalización de células B para respuestas inmunes. Al formar este complejo, CD9, una proteína asociada con CD81, disociada del complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 y consecuentemente induce la expresión osteoblastada específica de los genes inducidos por interferón, Bst2, Irgm, Ifit3, B2m y el gen antígeno clase I de la MHC [28]. Si se perdiera la interacción específica mediada por Spalmitoylation de IFITM5 con FKBP11, no se formaría el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP y, por consiguiente, se inhibiría la expresión génica inducida por interferón, ya que el CD9 seguiría asociado con el complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9. En este sentido, especulamos que el IFITM5 está involucrado en la actividad del sistema inmunitario en las células osteoblastadas y la interacción del IFITM5 palmitoilado S con el FKBP11 regula la actividad inmune. Además, se sugirió que la S-palmitoilación en el IFITM5 contribuye a la formación de nódulos óseos, incluyendo la morfología y el tiempo de mineralización, en las células osteoblastadas (Figura 5). Es difícil concluir en la actualidad que la falta de la S-palmitoilación en el IFITM5 causa la difusión de los nódulos óseos (panel b de la Figura 5 -E); sin embargo, podemos decir que el IFITM5 probablemente no será S-palmitoilado en las células en presencia de 2BP. Mientras que el 2BP se utiliza comúnmente como inhibidor de la palmitoilación, también se dirige a muchas enzimas Por lo tanto, también es difícil interpretar los resultados de la incubación a largo plazo de las células osteoblásticas en presencia de 2BP. En cualquier caso, estas son observaciones interesantes y clave en términos de aclarar el papel desempeñado por la S-palmitoilación de IFITM5 en la formación ósea, y se requieren estudios adicionales. La Figura 6 describe un posible mecanismo de la interacción de IFITM5 con FKBP11 y el papel de IFITM5 en la función celular osteoblástica mediante una comparación con IFITM3. En el caso de IFITM3, como se muestra en la Figura 6 -A, se observan los siguientes. i) Las tres cisteinas son todas S-palmitoiladas (ii). La S-palmitoilación conduce a la agrupación y el posicionamiento correcto de moléculas IFITM3 en la membrana (iii). La espalmitoilación y la siguiente agrupación son cruciales para la resistencia al virus de la gripe. Cuando IFITM3 carece de la espalmitoilación, las moléculas de IFITM3 no se agrupan, lo que conduce a la disminución significativa de la actividad antiviral. Por otro lado, la Figura 6 -B muestra que las siguientes observaciones se hacen en el caso de IFITM5. i) Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados (ii). El S-palmitoilado IFITM5 es capaz de interactuar específicamente con FKBP11. Se supone que la interacción está mediada por el ácido palmítico unido a la cisteína frente a la superficie de interacción en FKBP11. Cys86 está involucrado en la palmitoilación S, pero no en la interacción de IFITM5 con FKBP11. En la actualidad, sin embargo, poco se sabe sobre el papel de la palmitoilación S de IFITM5 para la localización en la membrana. Cuando la palmitoilación S afecta la localización de IFITM5 como en el caso de IFITM3 [10], las moléculas S-palmitoiladas IFITM5 deben ser localizadas en la membrana o las moléculas depalmitoiladas deben ser deslocalizadas. La pérdida de la interacción entre IFITM5 y FKBP11 podría deberse a una relocalización de la depalmitoilada IFITM5 que impide su asociación con FKBP11 (iii). El Spalmitoilado IFITM5 interactúa con el complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 a través del FKBP11, que induce la disociación del CD9 del complejo y la expresión de 5 genes inmunológicamente relevantes. Finalmente, el IFITM5 forma el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP. Se desconoce en la actualidad cuál de los tres estados (i)~(iii) ilustrados en la Figura 6-B es importante para la mineralización ósea de las células osteoblásticas. La falta de la S-palmitoilación influye en la interacción con el FKBP11, que podría explicar la siguiente formación compleja y expresión génica. Además, la formación de nódulos óseos también se ve afectada. Se indica que la S-palmitoilación en IFITM5 juega un papel no sólo en la regulación de la actividad inmune sino también en la formación ósea. En conclusión, hemos revelado la S-palmitoilación en IFITM5 y su papel en la interacción con FKBP11. No sólo la actividad inmune sino también la mineralización ósea en las células osteoblásticas se ve afectada por la S-palmitoilación. En general, el papel funcional de la S-palmitoilación es diferente para cada proteína [36]. Para muchas proteínas, el ciclo de palmitoilación y despalmitoilación es constitutivo y regulado por enzimas. Basado en los resultados actuales, es difícil abordar (i) si la S-palmitoilación en IFITM5 es constitutiva o regulada, o (ii) cuando y donde IFITM5 es S-palmitoilada en las células osteoblásticas. Se necesitan más estudios y actualmente se están realizando.

¿Qué interacción es inhibida por la presencia de ácido 2-bromopalmítico (2BP)?

El papel de la S-Palmitoylation en IFITM5 para la interacción con FKBP11 en células de Osteoblastohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3776769/Tsukamoto, Takashi; Li, Xianglan; Morita, Hiromi; Minowa, Takashi; Aizawa, Tomoyasu; Hanagata, Nobutaka; Demura, Makoto2013-09-18DOI:10.1371/journal.pone.0075831Licencia:cc-byAbstract: Recientemente, una de las proteínas familiares de la transmembrana inducida por interferón, IFITM3, se ha convertido en un objetivo importante para la actividad contra la infección por el virus de la gripe A (H1N1). En esta proteína, una modificación post-translacional por ácidos grasos covalentemente unidos a la cisteína, llamada S-palmitoilación, juega un papel crucial para la actividad antiviral. IFITM3 posee tres residuos de cisteína para la S-palmitoilación en el primer dominio de la transmembrana (TM1) y en el bucle citoplasmático (CP). Debido a que estas cisteínas están bien conservadas en las proteínas de la familia de mamíferos IFITM, la S-palmitoilación en estas cisteínas es significativa para sus funciones. IFITM5 es otra proteína de la familia IFITM e interactúa con la proteína de unión FK506 (FKBP11) para formar un complejo de mayor orden en células osteoblastales, que induce la expresión de genes inmunológicamente relevantes. En este estudio, investigamos el papel que desempeña la palmitoilación S de IFITM5 en su interacción con FKBP11 en las células, ya que esta interacción es un proceso clave para la expresión génica. Nuestras investigaciones con un reportero establecido, ácido 17-octadecinoico (17-ODYA), y un inhibidor para la palmitoilación S, ácido 2-bromopalmítico (2BP), revelaron que IFITM5 fue palmitoilado S además de IFITM3. Específicamente, encontramos que los residuos de cisteína en el dominio TM1 y en el bucle CP fueron palmitoilados S en IFITM5. Luego, revelamos por inmunoprecipitación y análisis de manchas occidentales que la interacción de IFITM5 con FKBP11 fue inhibida en presencia de 2BP. El mutante que carecía del sitio S-palmitoylation en el dominio TM1 perdió la interacción con FKBP11. Estos resultados indican que la S-palmitoylation en IFITM5 promueve la interacción con FKBP11. Finalmente, investigamos la formación de nódulos óseos en células osteoblastadas en presencia de 2BP, ya que IFITM5 fue identificado originalmente como factor de formación ósea. El experimento resultó en una aberración morfológica del nódulo óseo, lo que también indicó que la S-palmitoylation contribuye a la formación ósea. Texto: La familia de proteínas transmembranas inducidas por interferón (IFITM) (también conocida como la familia Fragilis en ratones) es parte de la familia de las dispaninas [1] y está compuesta por α-hélices de doble transmembrana conectados por un bucle citoplasmático (CP) y secuencias de polipéptidos amino- y carboxil-terminales (Figura 1-A) extracelulares (EC). Las proteínas IFITM se conservan evolutivamente en vertebrados [2]. Investigaciones genómicas recientes han revelado que hay 5 miembros IFITM en humanos (IFITM1, 2, 3, 5 y 10) y 7 miembros en ratones (IFITM1, 2, 3, 5, 6, 7, y 10). Estas proteínas desempeñan papeles en diversos procesos biológicos, como la maduración de células germinativas durante la gastrulación (IFITTM1-3) [3] [5] [5], la adhesión de células a células (IFITTM1) [6] [7] [8], la actividad antiviral (IFITTM1-3) [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17], y la formación ósea (IFITTM5] [18] [19] [20] [21] [22], aunque actualmente se desconocen las funciones detalladas de IFITM6, 7 y 10; en particular, IFITM3 ha sido objeto de estudios intensivos sobre su actividad contra la infección e internalización del virus de la gripe A (H1N1) [9] [10] [11] [12] [13] [14]. En 2010, el Dr. Yount y sus colaboradores informaron que la actividad antiviral de IFITM3 depende de la palmitoilación S en la proteína [10]. La palmitoilación S [23] es una modificación post-translacional de las proteínas por los ácidos grasos saturados C 16 (ácidos palmíticos) covalentemente unidos a ciertos residuos de cisteína a través de un enlace tioéster (Figura 1-B). La modificación es catalizada reversiblemente por las proteínas aciltransferasas y las tioesterasas acilproteínas, y confiere propiedades únicas a la proteína, tales como unión a la membrana y segmentación, inmunoreactividad, alineación de secuencias aminoácidos de IFITM5, IFITM1, IFITM2 e IFITM3 derivadas de ratones. Los residuos conservados se destacan en negro. Las tres cisteinas conservadas se resaltan en rojo y numeradas en base a la secuencia de IFITM5 (top) e IFITM3 (bottom). Los residuos únicos en IFITM5 se resaltan en gris. Los dominios transmembrana primero y segundo, las secuencias extracelulares y el bucle citoplásmico se indican por flechas y se denotan como TM1 y TM2, EC y el bucle CP, respectivamente. Los dominios TM fueron predichos por SOSUI. Los aspartatos en la región C-terminal en IFITM5 se muestran en azul. B) La ilustración esquemática de la proteína S-palmitoilación. El ácido C 16-palmítico se une a la cisteína a través de un enlace tioéster. La palmitoilación y la despalmitoilación son catalizadas por proteínas aciltransferasas y acilproteínas tioesterasas, respectivamente. En este estudio se resume la hidroxilamina, NH 2 OH, para reducir la vinculación tioestérmica. C) La identidad de la secuencia de aminoácidos (similaridad) entre IFITM5, IFITM1, IFITM2 e IFITM3. doi: 10.1371/journal.pone.0075831.g001 y la interacción proteína-proteína. Los autores revelaron que IFITM3 es S-palmitoilado en tres quisteinas proximales de membrana, Cys71 y Cys72 en el primer dominio transmembrana (TM1), y Cys105 en el bucle CP (Figura 1-A) [10]. Además, IFITM3 carece de la palmitoilación S no se agrupa en la membrana celular y disminuye significativamente la actividad antiviral. Además, las cisteinas en IFITM2, Cys70, Cys71 y Cys104 también son palmitoiladas de la misma manera, lo que afecta a la localización intracelular [24]. Un estudio resentido ha revelado que la murina IFITM1 tiene cuatro residuos de cisteína (Cys49, Cys50, Cys83 y Cys103) para la palmitoilación S, que es necesaria para la actividad antiviral y la estabilidad proteica [25]. Los otros miembros de la familia IFITM también poseen estas cisteínas (Figura 1-A), y por lo tanto el papel de la espalmitoilación en las cisteinas debe ser significativo para las funciones de las proteínas IFITM. Aquí, nos centramos en las proteínas de la familia IFITM5, que también se conoce como proteína similar a IFITM (BRIL) [18]. Entre las proteínas de la familia IFITM, IFITM5 es única. (i) Expresión de IFITM5: A diferencia de las otras proteínas de la familia IFITM, la expresión de IFITM5 no es inducida por interferones porque la región anterior al gen ifitm5 carece de los elementos reguladores del interferón [26]. Además, la expresión de IFITM5 se limita principalmente a las células osteoblastadas [18, 19, 27], mientras que las otras proteínas de IFITM se expresan ubicuamente (ii). Además, IFITM5 tiene un dominio rico en aspartato en la región C-terminal, que podría estar involucrado en la unión al calcio (Figura 1 -A) [26]. iii) Papel de IFITM5 en la formación ósea: La expresión de IFITM5 está asociada con la mineralización durante el proceso de formación ósea en células osteoblásticas [18] [19] [20] [20]. Estudios anteriores han confirmado la expresión de IFITM5 en tejidos óseos en ratones, ratas, humanos y tammar wallabies [2]. Los ratones ifitm5-gene knockout tienen huesos más pequeños [19]. Además, el derribo del gen ifitm5 por el ARN de la horquilla pequeña induce una disminución en la formación de nódulos óseos, mientras que la sobreexpresión del gen en células UMR106 ha demostrado iv) Papel del IFITM5 en la actividad inmunitaria: Estudios recientes han revelado que el IFITM5 interactúa con la proteína 11 de unión FK506 (FKBP11) para formar IFITM5-FKBP11-CD81-el complejo regulador negativo del receptor de la prostaglandina F2 (FPRP) [28]. Cuando se forma el complejo, se inducen las expresiones de 5 genes inducidos por interferón, incluyendo el antígeno 2 de células estromales de médula ósea (Bst2), la proteína 1 inducible del interferón (Irgm), la proteína inducida por interferón con tetratricopéptido repite 3 (Ifit3), b(2) microglobulina (B2m) y el gen antígeno de clase I del MHC. En consecuencia, estos resultados indican que el IFITM5 está involucrado no sólo en la formación ósea sino también en la actividad En este estudio se investigó la palmitoilación S de IFITM5 y su papel en la interacción con FKBP11 en células de osteoblasto de ratón. Las células transfectadas por un plásmido DNA que codificaba el ratón IFITM5 fueron cultivadas en presencia de un reportero químico establecido, ácido 17-octadecinoico (17-ODYA) [29, 30], o un inhibidor para la palmitoilación S, ácido 2-bromopalmítico (2BP) [31]. Los ensayos bioquímicos usando estos compuestos revelaron que el tipo salvaje IFITM5 es S-palmitoilado. Para identificar el sitio de Spalmitoilación en IFITM5, se prepararon mutantes substituidos por cisteína, IFITM5-C86A, -C52A/C53A, y -C52A/53A El ensayo de reportero químico sugirió que al menos dos de las tres cisteínas en IFITM5 son S-palmitoiladas. La interacción de IFITM5 con FKBP11 fue examinada por inmunoprecipitación, resultando en la pérdida de la interacción en presencia de 2BP. El mismo resultado se obtuvo en los dos mutantes, C52A/C53A y Cys-less. Estos resultados sugieren que la S-palmitoilación en Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 de IFITM5 es necesaria para la interacción con FKBP11. Por otro lado, Cys86 en el bucle CP de IFITM5 fue S-palmitoilada pero no involucrada en la interacción. Debido a que esta interacción es importante para la expresión génica inmunológicamente relevante, se indicó que el papel de la palmitoilación S es promover la interacción de IFITM5 con FKBP11 y regular la actividad inmunitaria en las células osteoblásticas. Se discutirá el posible mecanismo de interacción y el efecto de la palmitoilación S en la formación de nódulos óseos. Para la expresión celular mamífera, se construyeron vectores de plásmidos de tipo salvaje IFITM5 (IFITM5-WT) y FKBP11 fusionado con FLAG (FKBP11-FLAG) insertando los genes clonados en un vector de expresión neopBApo-CMV (Takara Bio, Shiga, Japón). Los detalles de las construcciones de ADN recombinante fueron los mismos descritos anteriormente [19]. Los genes de los mutantes IFITM5 (IFITM5-C86A, -C52A/53A, y -C52A/C53A/C86A (Cys-less)) se prepararon utilizando un kit QuikChange de mutagenesis dirigido por el sitio (Stratagene, La Jolla, CA). Los vectores plásmidos de los IFITM5-WT fusionados con FLAG, -C52A/53A y Cys-less se construyeron insertando los genes clonados en el vector de expresión neo de pBApo-CMV. Para la expresión celular de E. coli, el vector plásmido de IFITM5-WT se construyó insertando el gen clonado en un vector de expresión pET22b (Novagen, Madison, WI). El primer delantero 5'-GGAATTCATTCATATTACACTTCATATCCCGTG-3' y el primer reverso 5'-CCGCTCGAGTTATAGTCTCATCAAACTTG-3' fueron utilizados para amplificar el gen que codifica todo el IFITM5 del vector plásmido para la expresión celular mamífera descrita anteriormente. Las letras subrayadas denotan un NdeI y un sitio de escote XhoI, respectivamente. Los plásmidos de mutantes IFITM5 fueron preparados usando un kit de mutagenesis dirigido por el sitio QuikChange. El sentido y los imprimadores antisenso utilizados fueron 5'-GGCAGTATGCTCCAAAGCCAAGGCGTACCATCTGGGCTGC-3' y 5'-GCAGCCGAGATGGTGGTGCCTGCTGGTGGTGGGGAGCATACT GCC-3' para IFITM5-C86A; y 5'-GCACGATGTACCTGAATGCGCGGCGCTTGGTGCTG CGC-3' y 5'-GCGCCAGGAATGAGCGCGCCGCGACAGAGCATCG TGC-3' para IFITM5-C52A/C53A, respectivamente (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Las células MC3T3 similares a los osteoblastos fueron provistas por el RIKEN, Cell Bank (RCB 1126). Los procedimientos de cultivo celular, transfección y expresión proteica fueron los mismos reportados anteriormente. Cuando fue necesario, el ácido 2-bromopalmítico (2BP; Wako, Osaka, Japón) y el ácido 17-octadecinoico (17-ODYA; Sigma-Aldrich) fueron disueltos en el 99,5% de sulfóxido dimetilo (DMSO; Wako) y añadidos al medio de diferenciación a concentraciones de 100 μM y 50 μM en menos del 0,1% de DMSO, respectivamente [30, 31]. Las proteínas de tipo salvaje y mutante IFITM5 también fueron producidas utilizando un sistema de expresión recombinante E. coli. Las células E. coli BL21(DE3) transformadas por la expresión plásmido fueron cultivadas a 37°C en medio LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina. Después de cuatro horas de inducción por 1 mM isopropil β-Dtiogalactopiranoside (IPTG), las células fueron recolectadas por centrifugación (6.400 × g durante 10 min a 4°C). Las células fueron suspendidas en 50 mM tampón Tris-HCl (pH 8) y interrumpidas por una prensa francesa (Ohtake, Tokio, Japón) (100 MPa × 4 veces). La fracción de membrana bruta fue recolectada por ultracentrifugación (178.000 × g durante 90 min a 4°C). La fracción recolectada fue solubilizado con 1,5% n-dodecyl-β-Dmaltopiranoside (DDM) (Dojindo Lab, Kumamoto, Japón) en 50 mM Tris-HCl, pH 8, que contenía 0,3 M NaCl y 5 mM imidazol. Después de la ultracentrifugación, el sobrenadante fue incubado con resina de agarosa Ni 2+ -NTA (Qiagen, Hilden, Alemania). La resina fue aplicada a una columna de cromatografía y lavada con 50 mM imidazol que contenía 50 mM Tris-HCl (pH 8), 0,3 M NaCl y 0,1% DDM. El IFITM5 solubilizado con DDM fue recolectado por elución con el mismo tampón que contenía 0,3 M imidazol. Los medios de muestreo fueron reemplazados por la solución tampón apropiada por dos pasajes sobre una columna PD-10 (GE Healthcare UK, Ltd., Amersham Place, Inglaterra). Los detalles experimentales se describen en informes anteriores [19, 28]. Brevemente, se extrajeron proteínas totales de las células osteoblásticas que coexpresaron IFITM5 y FKBP11-FLAG utilizando un kit de extracción total de proteínas (BioChain Institute Inc., Newark, CA). Luego, el lisato celular fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG M2 (Sigma-Aldrich) a 4°C durante 2 h. Para recuperar FKBP11-FLAG, 500 ng/μL 3 × péptido FLAG (Sigma-Aldrich) disuelto en solución salina tris-buffered se añadió al gel recogido a 4°C durante 1 h. Las proteínas recuperadas y el lisato celular que contenía proteínas totales fueron analizados por SDS-PAGE (15% ePAGEL; ATTO, Tokio, Japón) y la mancha occidental El anticuerpo policlonal anti-IFITM5, preparado a partir de la secuencia péptida aminoterminal (TSYPREDPRAPSSRC), y el anticuerpo monoclonal anti-FLAG (Sigma-Aldrich) fueron utilizados como anticuerpos primarios. Los anticuerpos anti-rabbit IgG (H+L) de cabra conjugados con HRP (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) y anti-mouse IgG (H+L) (Sigma-Aldrich) fueron utilizados como anticuerpos secundarios para los anticuerpos primarios anti-IFITM5 y anti-FLAG, respectivamente. Las proteínas fueron detectadas por reacción quimioluminiscente (MercK-Millipore, Billerica, MA). El lisato celular extraído de las células osteoblásticas marcadas metabólicamente por 17-ODYA fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG M2 para obtener proteínas purificadas con FLAG IFITM5. Las proteínas marcadas con 17-ODYA fueron etiquetadas químicamente con azida-PEG 3 -5(6)-carboxitetrametilrhodamina (TAMRA-azida; Click Chemistry Tools, Scottsdale, AZ) con referencia a estudios previos [10, 29, 30, 32] y la guía del fabricante. Las proteínas separadas por SDS-PAGE fueron visualizadas utilizando un láser de 532-nm para excitación y la fluorescencia por TAMRA (565 nm) fue detectada mediante un filtro de largo camino de 575nm (Typhoon FLA 9000; GE Healthcare). Las células de osteoblasto subcultivo MC3T3 fueron sembradas a una densidad de 5.000 células/cm 2 en platos de 40 mm y cultivadas en medio de águila α-modificada (α-MEM; Sigma-Aldrich) conteniendo 10% (v/v) de suero fetal bovino (FBS; Nichirei Biosciences Inc., Tokio, Japón). Al día siguiente, esto fue reemplazado por medio de diferenciación, conteniendo 2 mM de glicerofosfato y 50 μg/ml de ascorbato sódico en concentraciones finales, para inducir la diferenciación osteoblasto. Cuando fue necesario, 100 μM 2BP en menos de 0,1% DMSO, o 0,1% DMSO solo se añadió al medio de diferenciación en concentraciones finales. Todos los cultivos fueron incubados a 37°C en una atmósfera humidificada que contenía 5% CO 2 durante Los nódulos mineralizados fueron manchados con Alizarin Red S (Sigma-Aldrich). Se utilizó el procedimiento estándar de tinción. Los nódulos mineralizados fueron revisados cada tres días. Para identificar la palmitoilación S en IFITM5, las células osteoblásticas que albergaban el ADN plásmido que codificaba IFITM5-WT fueron cultivadas en ausencia y presencia de 2BP, lo que inhibe la palmitoilación S (Figura 2-A) [31]. A continuación, se extrajo el lisato celular que contenía proteína total para su uso en los análisis de manchas SDS-PAGE y occidentales. A efectos de comparación, las células E. coli también fueron cultivadas en ausencia de 2BP y se extrajo el lisato celular. La Figura 2 -B muestra los resultados del ensayo de manchas occidentales para IFITM5-WT expresado en el osteo En las células de osteoblasto, IFITM5-WT exhibió una sola banda cerca del marcador de masa molecular de 17,4 kDa (ver carril 1) en ausencia de 2BP. Sin embargo, en presencia de 2BP (ver carril 4), la banda apareció en una posición más baja que en ausencia de 2BP (lane 1). Estos resultados sugieren que IFITM5-WT tiene formas de masa molecular alta y baja en ausencia y presencia de 2BP, respectivamente. La palmitoilación S es una reacción reversible, y por lo tanto es despalmitoilada por un reductor fuerte como la hidroxilamina [10]. Tras el tratamiento de hidroxilamina (ver carril 2), la banda apareció en la misma posición que en presencia de 2BP (lane 4). En las células prokaryote E. coli, la modificación post-translacional S-Palmitoylation en IFITM5 PLOS ONE www.plosone.org no se produce. Por lo tanto, la banda también se observó en la misma posición inferior (ver carril 3). En el caso de IFITM3, también se informó que la palmitoylation induce un cambio en la movilidad en la electroforesis, al igual que en nuestros resultados actuales [10]. Para la observación directa de la S-palmitoylation, se utilizó un reportero químico establecido, 17-ODYA (Figura 2-C). Las células osteoblastadas que albergan la codificación plasmídica IFITM5-WT fueron cultivadas en presencia de 17-ODYA para etiquetar la proteína metabólicamente. Después de la extracción y purificación del lisato celular, el IFITM5-WT etiquetado fue ligado con TAMRA-azida de acuerdo con el método de cicloadición de azidealkyne [3+2] catalizado Cu(I) [3+2] [10, 29, 30, 32 ]. Una imagen de fluorescencia en gel del IFITM5-WT marcado 17-ODYA-TAMRA (véase el carril 2 en la Figura 2 -D) mostró que IFITM5 estaba espalmitoilado en las células osteoblastadas. La etiqueta FLAG adjunta a IFITM5 no tiene influencia en la modificación y etiquetado químico (vías 1 y 5). Además, después del tratamiento con hidroxilamina (ver carril 6), la fluorescencia se debilitó debido a la disociación de 17-ODYA de IFITM5, que fue el mismo mecanismo que la disociación del ácido palmítico de IFITM5 por reducción como se describe anteriormente (lane 2 de la Figura 2-B). Por lo tanto, concluimos que el IFITM5 expresado en las células de osteoblasto nativas es S-palmitoilado. Además, las bandas correspondientes a las formas de masa molecular alta y baja mostradas en el análisis de manchas occidentales fueron asignadas tentativamente a las formas S-palmitoiladas y depalmitoiladas, respectivamente. Como se describe anteriormente en la Introducción, los residuos de cisteína son el sustrato para la palmitoilación S. IFITM5 posee tres cisteínas, Cys52 y Cys53 en el dominio TM1, y Cys86 en el bucle CP (Figura 1-A). Todas estas cisteínas están altamente conservadas entre las proteínas de la familia IFITM de mamíferos (Figura 3-A). Para identificar el sitio de modificación en IFITM5, preparamos mutantes substituidos por cisteína, IFITM5-C52A/C53A, -C86A, y -C52A/C53A/C86A (Cys-less). Las células osteoblastadas que albergaban cada plasmido fueron cultivadas en ausencia de 2BP, y luego se extrajo el lisato celular. La Figura 3-B muestra los resultados de la mancha occidental detectando la expresión de todos los mutantes en las células osteoblastadas. En los mutantes C52A/C53A y Cys-less (ver carriles 2 y 4), se detectó la forma de baja masa molecular. Este resultado indica que Cys52 o Cys53 están involucrados en la palmitoilación S. Además, como se muestra en la Figura 2 -D, se detectaron fluorescencia fuerte y débil en el mutante C52A/C53A en ausencia y presencia de hidroxilamina (lanes 3 y 7), respectivamente, pero no en el mutante Cys-less (lanes 4 y 8). Estos resultados sugieren que el resto de la cisteína en el mutante C52A/C53A, Cys86, es S-palmitoilado y el mutante Cyss-less perdió por completo la palmitoilación S porque todas las cisteinas fueron sustituidas. Por lo tanto, concluimos que Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados. Además, se encontró que la S-palmitoilación en el dominio TM1 tiene un efecto importante en la movilidad en el gel (panel inferior de la Figura 2 -D y Figura 3-B). Por lo tanto, en adelante nos referimos a las formas de masa molecular alta y baja como las formas TM1palmitoiladas y TM1-depalmitoiladas, respectivamente. Finalmente, reasignamos las bandas mostradas en el análisis de Western blot como sigue: IFITM5-WT está totalmente palmitoilado, el mutante C86A está parcialmente palmitoilado en Cys52 y/o Cys53, el mutante C52A/C53A está parcialmente palmitoilado en Cys86, y el mutante sin Cys está completamente depalmitoilado. Estudios previos han revelado que IFITM5 interactúa con FKBP11 [19]. FKBP11 pertenece a la familia de proteínas de unión FK506 y tiene un dominio transmembrana. La interacción entre IFITM5 y FKBP11 es importante para la actividad inmunitaria debido a que la formación del complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP induce la expresión de genes inducidos por interferón, a saber, el Bst2, Irgm, Ifit3, B2m y el gen antígeno clase I de MHC [28]. Para investigar el efecto de la palmitoilación S en la interacción de IFITM5 con FKBP11, se realizó un ensayo de inmunoprecipitación. Las células osteoblásticas cotransfectadas por los plásmidos que codifican IFITM5-WT y FKBP11-FLAG fueron cultivadas en ausencia y presencia de 2BP. Luego, el análisis celular extraído fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG. El gel fue lavado varias veces. Finalmente, las proteínas fueron eludidas competitivamente por la adición de péptido FLAG. Si IFITM5 interactuaba con FKBP11, se esperaba que IFITM5 Las cisteínas conservadas fueran resaltadas en naranja y numeradas. En el panel inferior, los números dados entre paréntesis corresponden al número residual para IFITM2. Para el cálculo de probabilidad, un total de 23 secuencias IFITM2, 23 IFITM3 y 17 IFITM5 derivadas de especies mamíferas en la base de datos Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomas (KEGG) fueron utilizadas. La alineación de secuencias se llevó a cabo utilizando CLUSTALW. Los logotipos de secuencia se generaron utilizando WEBLOGO 3. B) Botón occidental para los mutantes de tipo salvaje y substituidos por cisteína de IFITM5 expresados en células osteoblastadas La flecha superior indica que los mutantes C52 y/o C53 en el dominio TM1 son Spalmitoylated (lanes 1 y 3). El C52A/C53A (lane 2) y Cys-less (lane 4) son parcial y completamente depalmitoylated. El experimento se llevó a cabo 2 veces. doi: 10.1371/journal.pone.0075831.g003 se obtendría durante este paso y se detectaría por inmunobloqueo. Figura 4 -A muestra los resultados de la mancha occidental para la co-inmunoprecipitación de IFITM5-WT con FKBP-FLAG. La banda correspondiente a FKBP11 apareció en todos los carriles (panel superior). Las lanes 1 y 2 son controles para asegurar que IFITM5 y FKBP11 estén contenidas en el lisato celular Los controles también aseguraron que el IFITM5 fuera palmitoilado S en ausencia de 2BP (ver carril 1), mientras que el IFITM5 no fue palmitoilado S en presencia de 2BP (ver carril 2). Después de la inmunoprecipitación, una sola banda correspondiente al IFITM5 palmitoilado S apareció en ausencia de 2BP (ver carril 3), indicando la interacción del IFITM5 espalmitoilado con el FKBP11. Sin embargo, en presencia de 2BP, no apareció ninguna banda correspondiente al IFITM5 (ver carril 4), indicando que las dos moléculas no interactúan entre sí. Estos resultados sugieren que la palmitoilación S sobre el IFITM5 contribuye a la interacción con el FKBP11. A continuación, investigamos la relación entre la Spalmitoylation y la interacción con FKBP11 utilizando los mutantes IFITM5 descritos anteriormente. Las células osteoblastadas cotransfectadas por los plásmidos que codifican los mutantes IFITM5 (C52A/ C53A, C86A y Cys-less) y FKBP11-FLAG fueron cultivadas. El ensayo de inmunoprecipitación se llevó a cabo de la misma manera que se describió anteriormente. La Figura 4 -B muestra los resultados de la mancha occidental para la co-inmunoprecipitación de los mutantes de tipo salvaje y el IFITM5 con FKBP11. La Figura 4 -C muestra los resultados del experimento de control utilizando el lisato celular antes de la inmunoprecipitación. Como se describe en la sección anterior 3-3, la banda correspondiente a FKBP11 apareció en todos los carriles (paneles superiores) porque la inmunoprecipitación se realizó utilizando el gel de agarosa anti-FLAG. En el panel inferior de la Figura 4 -B, se observaron bandas individuales para el mutante IFITM5-WT y -C86A (lanes 1 y 3) pero no para los mutantes -C52A/C53A y Cys-less (lanes 2 y 4). Este resultado indica que el tipo salvaje y el mutante C86A interactúan con FKBP11, mientras que los otros dos mutantes no lo hacen. Curiosamente, esta tendencia refleja la tendencia de los perfiles de palmitoilación S, lo que significa que Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 de los mutantes IFITM5-WT y -C86A es S-palmitoilado, mientras que estos residuos no son S-palmitoilados en los mutantes C52A/C53A y Cysless (ver Figuras 2-D, 3-B y el panel inferior de la Figura 4-C). Debido a que la palmitoilación S contribuye a la interacción IFITM5-FKBP11, como se describe en la sección anterior 3-3 (también en la Figura 4-A), los resultados de la Figura 4-B sugieren que los mutantes que perdieron el sitio(s) de palmitoilación S, Cys52 y/o Cys53, no son capaces de interactuar con FKB En otras palabras, la palmitoilación S en estas cisteínas es necesaria para la interacción de IFITM5 con FKBP11. Como se ha descrito anteriormente en la Introducción, estudios previos han revelado que IFITM5 también contribuye a la formación ósea [18] [19] [20]. Por lo tanto, se investigó la influencia de Spalmitoilación en la formación de nódulos óseos en células osteoblastadas, en las que se expresa IFITM5 nativas. La Figura 5 muestra la formación de nódulos dependientes del tiempo en ausencia y la presencia de 2BP (Figuras 5-A y -B). La Figura 5 -C muestra los resultados del ensayo de control para verificar el efecto de DMSO, que se utilizó como disolvente para 2BP, en la formación de nódulos. El nódulo mineralizado fue manchado con Alizarin Red, que reacciona con calcio depositado. En la Figura 5 -D, el área del nódulo mineralizado fue trazada contra el tiempo experimental. En ausencia de 2BP (Figura 5-A, -C, y -D), la mineralización se inició 15 días después del inicio de la diferenciación celular (Día 0). Por otro lado, en presencia de 2BP (Figura 5-B y -D) se formó el nódulo el Día 12. El tiempo medio para la mineralización máxima en presencia de 2BP se estimó 7 días antes que en ausencia de 2BP (Figura 5-D). Además, se observaron diferencias en la forma de los nódulos mineralizados. La Figura 5 -E muestra una visión ampliada de cada nódulo en el Día 21. Los nódulos manchados se difundieron en presencia de 2BP (panel b), mientras que en ausencia de 2BP los nódulos formaron un gran cúmulo (panels a y c). Por lo tanto, nuestras observaciones en este estudio sugieren que la S-palmitoilación afecta la formación de nódulos óseos en las células osteoblásticas. En este estudio, se confirmó la S-palmitoilación sobre IFITM5 en las células osteoblásticas, que fue la misma que la reportada previamente para IFITM3 e IFITM2. Como se informó anteriormente, en IFITM3 e IFITM2, que comparten similitud de secuencia del 85% (Figura 1-C), dos cisteínas en el dominio TM1 (Cys71 y Cys72 para IFITM3, Cys70 y Cys71 para IFITM2) y una cisteína en el bucle CP (Cys105 para IFITM3, Cys104 para IFITM2) son todas S-palmitoiladas en células [10, 24]. Por otro lado, aunque IFITM5 comparte similitud de secuencia del 68% y 66% a IFITM3 e IFITM2, respectivamente, más de una cisteína en el dominio TM1 (Cys52 o Cys53) y una cisteína en el bucle CP (Cys86) son S-palmitoiladas. Teniendo en cuenta la alta conservación de tres cisteínas en las proteínas IFITM (Figuras 1-A y 3-A), todas las cisteínas en IFITM5 pueden estar involucradas en la palmitoilación S al igual que en el caso de IFITM3 e IFITM2 [10, 24]. Los roles de la palmitoilación S en IFITM3 se han estudiado intensamente, y la palmitoilación S ha demostrado ser crucial para el correcto posicionamiento en la membrana y la resistencia a la infección viral y la internalización [10] (los papeles se resumen en la Figura 6-A y se discuten en detalle más adelante). Un estudio reciente ha revelado que la palmitoilación S en IFITM2 también es importante para la agrupación de proteínas en la membrana [24]. Sin embargo, no conocemos el papel de la Spalmitoylation de IFITM5 para el agrupamiento en la membrana en la actualidad porque todavía no hemos logrado obtener un anticuerpo adecuado para la inmunohistoquímica, a pesar de que dedicamos mucho tiempo a la búsqueda y considerando un número considerable de anticuerpos. El Dr. Hanagata y sus colaboradores reportaron previamente que IFITM5 carecían del dominio TM1 y del bucle CP, que y IFITM5 (paneles inferiores), los anticuerpos anti-FLAG y anti-IFITM5 fueron utilizados como anticuerpos primarios, respectivamente. Las flechas indican la existencia de cada proteína y la S-palmitoylation en IFITM5. A) La mancha occidental para la coinmunoprecipitación del tipo salvaje IFITM5 con el FKBP11 (FKBP11-FLAG) fusionado con FLAG en las células osteoblásticas en ausencia y presencia de 2BP (denominadas "-" y "+", respectivamente). Las vías 1 y 2 son los resultados de los ensayos de control utilizados para verificar la existencia de IFITM5 y FKBP11 antes de la inmunoprecipitación, y las vías 3 y 4 muestran los resultados después de la inmunoprecipitación. El experimento se repitió 3 veces. B) La mancha occidental para la coinmunoprecipitación del tipo salvaje y los mutantes substituidos por cisteína de IFITM5 con FKBP11-FLAG en las células osteoblásticas. La banda correspondiente al péptido FLAG no se muestra debido a la menor masa molecular del péptido FLAG en relación con FKBP11-FLAG. C) El experimento de control de la Figura 4 -B utilizado para verificar que IFITM5 y FKBP11 estaban presentes en el lisato celular antes de la inmunoprecipitación. El experimento se repitió 2 veces. A) El mecanismo funcional de IFITM3 se resume en estudios anteriores. i) IFITM3 es S-palmitoilado en Cys71, Cys72 y Cys105, ii) que induce el agrupamiento y el posicionamiento correcto en la membrana, iii) resultando en la actividad antiviral contra el virus de la gripe. B) El mecanismo funcional de IFITM5 se resume combinando los resultados del presente y los estudios anteriores. (i) Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados (ii). La S-palmitoilación permite que IFITM5 interactúe con FKBP11 en las células osteoblásticas (iii). La disociación del CD9 del complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 es inducida por la formación del complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP y conduce a la expresión genética inmunológicamente relevante. IFITM5 también contribuye a la formación ósea, pero se desconoce cuáles son los estados descritos en i)-iii) son importantes para la formación ósea en la actualidad. Por otro lado, la IFITM5 interactúa con la proteína asociada, FKBP11, y la S-palmitoylation claramente hace una contribución significativa a la interacción. Por lo tanto, IFITM5 forma un hetero-oligomero en la membrana celular para su función fisiológica. contiene los sitios de modificación relevantes, perdió la capacidad de interactuar con FKBP11 [19]. En el presente estudio, determinamos que la S-palmitoylation en Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 es necesaria para la interacción. De estos resultados, especulamos que Cys52 y Cys53 se enfrentan a la superficie de interacción con FKBP11, y por lo tanto IFITM5 y FKBP11 interactúan entre sí a través del ácido palmítico unido a la cisteína (resumidos en la Figura 6 -B, discutidos más Nuestra investigación reveló que Cys86 está involucrado en la Spalmitoylation pero no contribuye a la interacción con FKBP11. Especulamos que otros residuos en el bucle CP ubicados cerca del dominio TM1 hacen alguna contribución a la interacción. Investigaciones previas también revelaron que IFITM5 expresado en las células fibroblasto heterologosas NIH3T3 exhibieron interacciones directas con CD81, la proteína 31 asociada al receptor de células B (BCAP31) y el hidroxiesteroide (17-beta) deshidrogenasa 7 (HSD17b7). Estas tres proteínas se unen al IFITM5 sin la S-palmitoylation (forma de masa molecular baja; ver Figura 3-b en ref [19]. y Figura 1-B en ref [28]. En las células fibroblastosas, la S-palmitoylation en IFI Estas interacciones no se observan en las células nativas del osteoblasto y, por lo tanto, son inespecíficas. Teniendo en cuenta estos hechos, se especula que la palmitoilación S sobre las células del IFITM5 promueve la interacción específica con FKBP11 en las células del osteoblasto. El papel que desempeña la palmitoilación S de las células del IFITM5 en la actividad inmune de las células del osteoblasto se discutirá combinando los resultados del presente y de los estudios anteriores. Debe ser necesaria una interacción específica entre IFITM5 y FKBP11 para formar el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP. CD81, también conocido como TAPA-1, es un miembro de la familia de proteínas de membrana de tetraspanina y un componente del núcleo de células B que media la señalización de células B para respuestas inmunes. Al formar este complejo, CD9, una proteína asociada con CD81, disociada del complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 y consecuentemente induce la expresión osteoblastada específica de los genes inducidos por interferón, Bst2, Irgm, Ifit3, B2m y el gen antígeno clase I de la MHC [28]. Si se perdiera la interacción específica mediada por Spalmitoylation de IFITM5 con FKBP11, no se formaría el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP y, por consiguiente, se inhibiría la expresión génica inducida por interferón, ya que el CD9 seguiría asociado con el complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9. En este sentido, especulamos que el IFITM5 está involucrado en la actividad del sistema inmunitario en las células osteoblastadas y la interacción del IFITM5 palmitoilado S con el FKBP11 regula la actividad inmune. Además, se sugirió que la S-palmitoilación en el IFITM5 contribuye a la formación de nódulos óseos, incluyendo la morfología y el tiempo de mineralización, en las células osteoblastadas (Figura 5). Es difícil concluir en la actualidad que la falta de la S-palmitoilación en el IFITM5 causa la difusión de los nódulos óseos (panel b de la Figura 5 -E); sin embargo, podemos decir que el IFITM5 probablemente no será S-palmitoilado en las células en presencia de 2BP. Mientras que el 2BP se utiliza comúnmente como inhibidor de la palmitoilación, también se dirige a muchas enzimas Por lo tanto, también es difícil interpretar los resultados de la incubación a largo plazo de las células osteoblásticas en presencia de 2BP. En cualquier caso, estas son observaciones interesantes y clave en términos de aclarar el papel desempeñado por la S-palmitoilación de IFITM5 en la formación ósea, y se requieren estudios adicionales. La Figura 6 describe un posible mecanismo de la interacción de IFITM5 con FKBP11 y el papel de IFITM5 en la función celular osteoblástica mediante una comparación con IFITM3. En el caso de IFITM3, como se muestra en la Figura 6 -A, se observan los siguientes. i) Las tres cisteinas son todas S-palmitoiladas (ii). La S-palmitoilación conduce a la agrupación y el posicionamiento correcto de moléculas IFITM3 en la membrana (iii). La espalmitoilación y la siguiente agrupación son cruciales para la resistencia al virus de la gripe. Cuando IFITM3 carece de la espalmitoilación, las moléculas de IFITM3 no se agrupan, lo que conduce a la disminución significativa de la actividad antiviral. Por otro lado, la Figura 6 -B muestra que las siguientes observaciones se hacen en el caso de IFITM5. i) Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados (ii). El S-palmitoilado IFITM5 es capaz de interactuar específicamente con FKBP11. Se supone que la interacción está mediada por el ácido palmítico unido a la cisteína frente a la superficie de interacción en FKBP11. Cys86 está involucrado en la palmitoilación S, pero no en la interacción de IFITM5 con FKBP11. En la actualidad, sin embargo, poco se sabe sobre el papel de la palmitoilación S de IFITM5 para la localización en la membrana. Cuando la palmitoilación S afecta la localización de IFITM5 como en el caso de IFITM3 [10], las moléculas S-palmitoiladas IFITM5 deben ser localizadas en la membrana o las moléculas depalmitoiladas deben ser deslocalizadas. La pérdida de la interacción entre IFITM5 y FKBP11 podría deberse a una relocalización de la depalmitoilada IFITM5 que impide su asociación con FKBP11 (iii). El Spalmitoilado IFITM5 interactúa con el complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 a través del FKBP11, que induce la disociación del CD9 del complejo y la expresión de 5 genes inmunológicamente relevantes. Finalmente, el IFITM5 forma el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP. Se desconoce en la actualidad cuál de los tres estados (i)~(iii) ilustrados en la Figura 6-B es importante para la mineralización ósea de las células osteoblásticas. La falta de la S-palmitoilación influye en la interacción con el FKBP11, que podría explicar la siguiente formación compleja y expresión génica. Además, la formación de nódulos óseos también se ve afectada. Se indica que la S-palmitoilación en IFITM5 juega un papel no sólo en la regulación de la actividad inmune sino también en la formación ósea. En conclusión, hemos revelado la S-palmitoilación en IFITM5 y su papel en la interacción con FKBP11. No sólo la actividad inmune sino también la mineralización ósea en las células osteoblásticas se ve afectada por la S-palmitoilación. En general, el papel funcional de la S-palmitoilación es diferente para cada proteína [36]. Para muchas proteínas, el ciclo de palmitoilación y despalmitoilación es constitutivo y regulado por enzimas. Basado en los resultados actuales, es difícil abordar (i) si la S-palmitoilación en IFITM5 es constitutiva o regulada, o (ii) cuando y donde IFITM5 es S-palmitoilada en las células osteoblásticas. Se necesitan más estudios y actualmente se están realizando.

¿Qué es una función asociada con IFITM5?

El papel de la S-Palmitoylation en IFITM5 para la interacción con FKBP11 en células de Osteoblastohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3776769/Tsukamoto, Takashi; Li, Xianglan; Morita, Hiromi; Minowa, Takashi; Aizawa, Tomoyasu; Hanagata, Nobutaka; Demura, Makoto2013-09-18DOI:10.1371/journal.pone.0075831Licencia:cc-byAbstract: Recientemente, una de las proteínas familiares de la transmembrana inducida por interferón, IFITM3, se ha convertido en un objetivo importante para la actividad contra la infección por el virus de la gripe A (H1N1). En esta proteína, una modificación post-translacional por ácidos grasos covalentemente unidos a la cisteína, llamada S-palmitoilación, juega un papel crucial para la actividad antiviral. IFITM3 posee tres residuos de cisteína para la S-palmitoilación en el primer dominio de la transmembrana (TM1) y en el bucle citoplasmático (CP). Debido a que estas cisteínas están bien conservadas en las proteínas de la familia de mamíferos IFITM, la S-palmitoilación en estas cisteínas es significativa para sus funciones. IFITM5 es otra proteína de la familia IFITM e interactúa con la proteína de unión FK506 (FKBP11) para formar un complejo de mayor orden en células osteoblastales, que induce la expresión de genes inmunológicamente relevantes. En este estudio, investigamos el papel que desempeña la palmitoilación S de IFITM5 en su interacción con FKBP11 en las células, ya que esta interacción es un proceso clave para la expresión génica. Nuestras investigaciones con un reportero establecido, ácido 17-octadecinoico (17-ODYA), y un inhibidor para la palmitoilación S, ácido 2-bromopalmítico (2BP), revelaron que IFITM5 fue palmitoilado S además de IFITM3. Específicamente, encontramos que los residuos de cisteína en el dominio TM1 y en el bucle CP fueron palmitoilados S en IFITM5. Luego, revelamos por inmunoprecipitación y análisis de manchas occidentales que la interacción de IFITM5 con FKBP11 fue inhibida en presencia de 2BP. El mutante que carecía del sitio S-palmitoylation en el dominio TM1 perdió la interacción con FKBP11. Estos resultados indican que la S-palmitoylation en IFITM5 promueve la interacción con FKBP11. Finalmente, investigamos la formación de nódulos óseos en células osteoblastadas en presencia de 2BP, ya que IFITM5 fue identificado originalmente como factor de formación ósea. El experimento resultó en una aberración morfológica del nódulo óseo, lo que también indicó que la S-palmitoylation contribuye a la formación ósea. Texto: La familia de proteínas transmembranas inducidas por interferón (IFITM) (también conocida como la familia Fragilis en ratones) es parte de la familia de las dispaninas [1] y está compuesta por α-hélices de doble transmembrana conectados por un bucle citoplasmático (CP) y secuencias de polipéptidos amino- y carboxil-terminales (Figura 1-A) extracelulares (EC). Las proteínas IFITM se conservan evolutivamente en vertebrados [2]. Investigaciones genómicas recientes han revelado que hay 5 miembros IFITM en humanos (IFITM1, 2, 3, 5 y 10) y 7 miembros en ratones (IFITM1, 2, 3, 5, 6, 7, y 10). Estas proteínas desempeñan papeles en diversos procesos biológicos, como la maduración de células germinativas durante la gastrulación (IFITTM1-3) [3] [5] [5], la adhesión de células a células (IFITTM1) [6] [7] [8], la actividad antiviral (IFITTM1-3) [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17], y la formación ósea (IFITTM5] [18] [19] [20] [21] [22], aunque actualmente se desconocen las funciones detalladas de IFITM6, 7 y 10; en particular, IFITM3 ha sido objeto de estudios intensivos sobre su actividad contra la infección e internalización del virus de la gripe A (H1N1) [9] [10] [11] [12] [13] [14]. En 2010, el Dr. Yount y sus colaboradores informaron que la actividad antiviral de IFITM3 depende de la palmitoilación S en la proteína [10]. La palmitoilación S [23] es una modificación post-translacional de las proteínas por los ácidos grasos saturados C 16 (ácidos palmíticos) covalentemente unidos a ciertos residuos de cisteína a través de un enlace tioéster (Figura 1-B). La modificación es catalizada reversiblemente por las proteínas aciltransferasas y las tioesterasas acilproteínas, y confiere propiedades únicas a la proteína, tales como unión a la membrana y segmentación, inmunoreactividad, alineación de secuencias aminoácidos de IFITM5, IFITM1, IFITM2 e IFITM3 derivadas de ratones. Los residuos conservados se destacan en negro. Las tres cisteinas conservadas se resaltan en rojo y numeradas en base a la secuencia de IFITM5 (top) e IFITM3 (bottom). Los residuos únicos en IFITM5 se resaltan en gris. Los dominios transmembrana primero y segundo, las secuencias extracelulares y el bucle citoplásmico se indican por flechas y se denotan como TM1 y TM2, EC y el bucle CP, respectivamente. Los dominios TM fueron predichos por SOSUI. Los aspartatos en la región C-terminal en IFITM5 se muestran en azul. B) La ilustración esquemática de la proteína S-palmitoilación. El ácido C 16-palmítico se une a la cisteína a través de un enlace tioéster. La palmitoilación y la despalmitoilación son catalizadas por proteínas aciltransferasas y acilproteínas tioesterasas, respectivamente. En este estudio se resume la hidroxilamina, NH 2 OH, para reducir la vinculación tioestérmica. C) La identidad de la secuencia de aminoácidos (similaridad) entre IFITM5, IFITM1, IFITM2 e IFITM3. doi: 10.1371/journal.pone.0075831.g001 y la interacción proteína-proteína. Los autores revelaron que IFITM3 es S-palmitoilado en tres quisteinas proximales de membrana, Cys71 y Cys72 en el primer dominio transmembrana (TM1), y Cys105 en el bucle CP (Figura 1-A) [10]. Además, IFITM3 carece de la palmitoilación S no se agrupa en la membrana celular y disminuye significativamente la actividad antiviral. Además, las cisteinas en IFITM2, Cys70, Cys71 y Cys104 también son palmitoiladas de la misma manera, lo que afecta a la localización intracelular [24]. Un estudio resentido ha revelado que la murina IFITM1 tiene cuatro residuos de cisteína (Cys49, Cys50, Cys83 y Cys103) para la palmitoilación S, que es necesaria para la actividad antiviral y la estabilidad proteica [25]. Los otros miembros de la familia IFITM también poseen estas cisteínas (Figura 1-A), y por lo tanto el papel de la espalmitoilación en las cisteinas debe ser significativo para las funciones de las proteínas IFITM. Aquí, nos centramos en las proteínas de la familia IFITM5, que también se conoce como proteína similar a IFITM (BRIL) [18]. Entre las proteínas de la familia IFITM, IFITM5 es única. (i) Expresión de IFITM5: A diferencia de las otras proteínas de la familia IFITM, la expresión de IFITM5 no es inducida por interferones porque la región anterior al gen ifitm5 carece de los elementos reguladores del interferón [26]. Además, la expresión de IFITM5 se limita principalmente a las células osteoblastadas [18, 19, 27], mientras que las otras proteínas de IFITM se expresan ubicuamente (ii). Además, IFITM5 tiene un dominio rico en aspartato en la región C-terminal, que podría estar involucrado en la unión al calcio (Figura 1 -A) [26]. iii) Papel de IFITM5 en la formación ósea: La expresión de IFITM5 está asociada con la mineralización durante el proceso de formación ósea en células osteoblásticas [18] [19] [20] [20]. Estudios anteriores han confirmado la expresión de IFITM5 en tejidos óseos en ratones, ratas, humanos y tammar wallabies [2]. Los ratones ifitm5-gene knockout tienen huesos más pequeños [19]. Además, el derribo del gen ifitm5 por el ARN de la horquilla pequeña induce una disminución en la formación de nódulos óseos, mientras que la sobreexpresión del gen en células UMR106 ha demostrado iv) Papel del IFITM5 en la actividad inmunitaria: Estudios recientes han revelado que el IFITM5 interactúa con la proteína 11 de unión FK506 (FKBP11) para formar IFITM5-FKBP11-CD81-el complejo regulador negativo del receptor de la prostaglandina F2 (FPRP) [28]. Cuando se forma el complejo, se inducen las expresiones de 5 genes inducidos por interferón, incluyendo el antígeno 2 de células estromales de médula ósea (Bst2), la proteína 1 inducible del interferón (Irgm), la proteína inducida por interferón con tetratricopéptido repite 3 (Ifit3), b(2) microglobulina (B2m) y el gen antígeno de clase I del MHC. En consecuencia, estos resultados indican que el IFITM5 está involucrado no sólo en la formación ósea sino también en la actividad En este estudio se investigó la palmitoilación S de IFITM5 y su papel en la interacción con FKBP11 en células de osteoblasto de ratón. Las células transfectadas por un plásmido DNA que codificaba el ratón IFITM5 fueron cultivadas en presencia de un reportero químico establecido, ácido 17-octadecinoico (17-ODYA) [29, 30], o un inhibidor para la palmitoilación S, ácido 2-bromopalmítico (2BP) [31]. Los ensayos bioquímicos usando estos compuestos revelaron que el tipo salvaje IFITM5 es S-palmitoilado. Para identificar el sitio de Spalmitoilación en IFITM5, se prepararon mutantes substituidos por cisteína, IFITM5-C86A, -C52A/C53A, y -C52A/53A El ensayo de reportero químico sugirió que al menos dos de las tres cisteínas en IFITM5 son S-palmitoiladas. La interacción de IFITM5 con FKBP11 fue examinada por inmunoprecipitación, resultando en la pérdida de la interacción en presencia de 2BP. El mismo resultado se obtuvo en los dos mutantes, C52A/C53A y Cys-less. Estos resultados sugieren que la S-palmitoilación en Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 de IFITM5 es necesaria para la interacción con FKBP11. Por otro lado, Cys86 en el bucle CP de IFITM5 fue S-palmitoilada pero no involucrada en la interacción. Debido a que esta interacción es importante para la expresión génica inmunológicamente relevante, se indicó que el papel de la palmitoilación S es promover la interacción de IFITM5 con FKBP11 y regular la actividad inmunitaria en las células osteoblásticas. Se discutirá el posible mecanismo de interacción y el efecto de la palmitoilación S en la formación de nódulos óseos. Para la expresión celular mamífera, se construyeron vectores de plásmidos de tipo salvaje IFITM5 (IFITM5-WT) y FKBP11 fusionado con FLAG (FKBP11-FLAG) insertando los genes clonados en un vector de expresión neopBApo-CMV (Takara Bio, Shiga, Japón). Los detalles de las construcciones de ADN recombinante fueron los mismos descritos anteriormente [19]. Los genes de los mutantes IFITM5 (IFITM5-C86A, -C52A/53A, y -C52A/C53A/C86A (Cys-less)) se prepararon utilizando un kit QuikChange de mutagenesis dirigido por el sitio (Stratagene, La Jolla, CA). Los vectores plásmidos de los IFITM5-WT fusionados con FLAG, -C52A/53A y Cys-less se construyeron insertando los genes clonados en el vector de expresión neo de pBApo-CMV. Para la expresión celular de E. coli, el vector plásmido de IFITM5-WT se construyó insertando el gen clonado en un vector de expresión pET22b (Novagen, Madison, WI). El primer delantero 5'-GGAATTCATTCATATTACACTTCATATCCCGTG-3' y el primer reverso 5'-CCGCTCGAGTTATAGTCTCATCAAACTTG-3' fueron utilizados para amplificar el gen que codifica todo el IFITM5 del vector plásmido para la expresión celular mamífera descrita anteriormente. Las letras subrayadas denotan un NdeI y un sitio de escote XhoI, respectivamente. Los plásmidos de mutantes IFITM5 fueron preparados usando un kit de mutagenesis dirigido por el sitio QuikChange. El sentido y los imprimadores antisenso utilizados fueron 5'-GGCAGTATGCTCCAAAGCCAAGGCGTACCATCTGGGCTGC-3' y 5'-GCAGCCGAGATGGTGGTGCCTGCTGGTGGTGGGGAGCATACT GCC-3' para IFITM5-C86A; y 5'-GCACGATGTACCTGAATGCGCGGCGCTTGGTGCTG CGC-3' y 5'-GCGCCAGGAATGAGCGCGCCGCGACAGAGCATCG TGC-3' para IFITM5-C52A/C53A, respectivamente (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Las células MC3T3 similares a los osteoblastos fueron provistas por el RIKEN, Cell Bank (RCB 1126). Los procedimientos de cultivo celular, transfección y expresión proteica fueron los mismos reportados anteriormente. Cuando fue necesario, el ácido 2-bromopalmítico (2BP; Wako, Osaka, Japón) y el ácido 17-octadecinoico (17-ODYA; Sigma-Aldrich) fueron disueltos en el 99,5% de sulfóxido dimetilo (DMSO; Wako) y añadidos al medio de diferenciación a concentraciones de 100 μM y 50 μM en menos del 0,1% de DMSO, respectivamente [30, 31]. Las proteínas de tipo salvaje y mutante IFITM5 también fueron producidas utilizando un sistema de expresión recombinante E. coli. Las células E. coli BL21(DE3) transformadas por la expresión plásmido fueron cultivadas a 37°C en medio LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina. Después de cuatro horas de inducción por 1 mM isopropil β-Dtiogalactopiranoside (IPTG), las células fueron recolectadas por centrifugación (6.400 × g durante 10 min a 4°C). Las células fueron suspendidas en 50 mM tampón Tris-HCl (pH 8) y interrumpidas por una prensa francesa (Ohtake, Tokio, Japón) (100 MPa × 4 veces). La fracción de membrana bruta fue recolectada por ultracentrifugación (178.000 × g durante 90 min a 4°C). La fracción recolectada fue solubilizado con 1,5% n-dodecyl-β-Dmaltopiranoside (DDM) (Dojindo Lab, Kumamoto, Japón) en 50 mM Tris-HCl, pH 8, que contenía 0,3 M NaCl y 5 mM imidazol. Después de la ultracentrifugación, el sobrenadante fue incubado con resina de agarosa Ni 2+ -NTA (Qiagen, Hilden, Alemania). La resina fue aplicada a una columna de cromatografía y lavada con 50 mM imidazol que contenía 50 mM Tris-HCl (pH 8), 0,3 M NaCl y 0,1% DDM. El IFITM5 solubilizado con DDM fue recolectado por elución con el mismo tampón que contenía 0,3 M imidazol. Los medios de muestreo fueron reemplazados por la solución tampón apropiada por dos pasajes sobre una columna PD-10 (GE Healthcare UK, Ltd., Amersham Place, Inglaterra). Los detalles experimentales se describen en informes anteriores [19, 28]. Brevemente, se extrajeron proteínas totales de las células osteoblásticas que coexpresaron IFITM5 y FKBP11-FLAG utilizando un kit de extracción total de proteínas (BioChain Institute Inc., Newark, CA). Luego, el lisato celular fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG M2 (Sigma-Aldrich) a 4°C durante 2 h. Para recuperar FKBP11-FLAG, 500 ng/μL 3 × péptido FLAG (Sigma-Aldrich) disuelto en solución salina tris-buffered se añadió al gel recogido a 4°C durante 1 h. Las proteínas recuperadas y el lisato celular que contenía proteínas totales fueron analizados por SDS-PAGE (15% ePAGEL; ATTO, Tokio, Japón) y la mancha occidental El anticuerpo policlonal anti-IFITM5, preparado a partir de la secuencia péptida aminoterminal (TSYPREDPRAPSSRC), y el anticuerpo monoclonal anti-FLAG (Sigma-Aldrich) fueron utilizados como anticuerpos primarios. Los anticuerpos anti-rabbit IgG (H+L) de cabra conjugados con HRP (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) y anti-mouse IgG (H+L) (Sigma-Aldrich) fueron utilizados como anticuerpos secundarios para los anticuerpos primarios anti-IFITM5 y anti-FLAG, respectivamente. Las proteínas fueron detectadas por reacción quimioluminiscente (MercK-Millipore, Billerica, MA). El lisato celular extraído de las células osteoblásticas marcadas metabólicamente por 17-ODYA fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG M2 para obtener proteínas purificadas con FLAG IFITM5. Las proteínas marcadas con 17-ODYA fueron etiquetadas químicamente con azida-PEG 3 -5(6)-carboxitetrametilrhodamina (TAMRA-azida; Click Chemistry Tools, Scottsdale, AZ) con referencia a estudios previos [10, 29, 30, 32] y la guía del fabricante. Las proteínas separadas por SDS-PAGE fueron visualizadas utilizando un láser de 532-nm para excitación y la fluorescencia por TAMRA (565 nm) fue detectada mediante un filtro de largo camino de 575nm (Typhoon FLA 9000; GE Healthcare). Las células de osteoblasto subcultivo MC3T3 fueron sembradas a una densidad de 5.000 células/cm 2 en platos de 40 mm y cultivadas en medio de águila α-modificada (α-MEM; Sigma-Aldrich) conteniendo 10% (v/v) de suero fetal bovino (FBS; Nichirei Biosciences Inc., Tokio, Japón). Al día siguiente, esto fue reemplazado por medio de diferenciación, conteniendo 2 mM de glicerofosfato y 50 μg/ml de ascorbato sódico en concentraciones finales, para inducir la diferenciación osteoblasto. Cuando fue necesario, 100 μM 2BP en menos de 0,1% DMSO, o 0,1% DMSO solo se añadió al medio de diferenciación en concentraciones finales. Todos los cultivos fueron incubados a 37°C en una atmósfera humidificada que contenía 5% CO 2 durante Los nódulos mineralizados fueron manchados con Alizarin Red S (Sigma-Aldrich). Se utilizó el procedimiento estándar de tinción. Los nódulos mineralizados fueron revisados cada tres días. Para identificar la palmitoilación S en IFITM5, las células osteoblásticas que albergaban el ADN plásmido que codificaba IFITM5-WT fueron cultivadas en ausencia y presencia de 2BP, lo que inhibe la palmitoilación S (Figura 2-A) [31]. A continuación, se extrajo el lisato celular que contenía proteína total para su uso en los análisis de manchas SDS-PAGE y occidentales. A efectos de comparación, las células E. coli también fueron cultivadas en ausencia de 2BP y se extrajo el lisato celular. La Figura 2 -B muestra los resultados del ensayo de manchas occidentales para IFITM5-WT expresado en el osteo En las células de osteoblasto, IFITM5-WT exhibió una sola banda cerca del marcador de masa molecular de 17,4 kDa (ver carril 1) en ausencia de 2BP. Sin embargo, en presencia de 2BP (ver carril 4), la banda apareció en una posición más baja que en ausencia de 2BP (lane 1). Estos resultados sugieren que IFITM5-WT tiene formas de masa molecular alta y baja en ausencia y presencia de 2BP, respectivamente. La palmitoilación S es una reacción reversible, y por lo tanto es despalmitoilada por un reductor fuerte como la hidroxilamina [10]. Tras el tratamiento de hidroxilamina (ver carril 2), la banda apareció en la misma posición que en presencia de 2BP (lane 4). En las células prokaryote E. coli, la modificación post-translacional S-Palmitoylation en IFITM5 PLOS ONE www.plosone.org no se produce. Por lo tanto, la banda también se observó en la misma posición inferior (ver carril 3). En el caso de IFITM3, también se informó que la palmitoylation induce un cambio en la movilidad en la electroforesis, al igual que en nuestros resultados actuales [10]. Para la observación directa de la S-palmitoylation, se utilizó un reportero químico establecido, 17-ODYA (Figura 2-C). Las células osteoblastadas que albergan la codificación plasmídica IFITM5-WT fueron cultivadas en presencia de 17-ODYA para etiquetar la proteína metabólicamente. Después de la extracción y purificación del lisato celular, el IFITM5-WT etiquetado fue ligado con TAMRA-azida de acuerdo con el método de cicloadición de azidealkyne [3+2] catalizado Cu(I) [3+2] [10, 29, 30, 32 ]. Una imagen de fluorescencia en gel del IFITM5-WT marcado 17-ODYA-TAMRA (véase el carril 2 en la Figura 2 -D) mostró que IFITM5 estaba espalmitoilado en las células osteoblastadas. La etiqueta FLAG adjunta a IFITM5 no tiene influencia en la modificación y etiquetado químico (vías 1 y 5). Además, después del tratamiento con hidroxilamina (ver carril 6), la fluorescencia se debilitó debido a la disociación de 17-ODYA de IFITM5, que fue el mismo mecanismo que la disociación del ácido palmítico de IFITM5 por reducción como se describe anteriormente (lane 2 de la Figura 2-B). Por lo tanto, concluimos que el IFITM5 expresado en las células de osteoblasto nativas es S-palmitoilado. Además, las bandas correspondientes a las formas de masa molecular alta y baja mostradas en el análisis de manchas occidentales fueron asignadas tentativamente a las formas S-palmitoiladas y depalmitoiladas, respectivamente. Como se describe anteriormente en la Introducción, los residuos de cisteína son el sustrato para la palmitoilación S. IFITM5 posee tres cisteínas, Cys52 y Cys53 en el dominio TM1, y Cys86 en el bucle CP (Figura 1-A). Todas estas cisteínas están altamente conservadas entre las proteínas de la familia IFITM de mamíferos (Figura 3-A). Para identificar el sitio de modificación en IFITM5, preparamos mutantes substituidos por cisteína, IFITM5-C52A/C53A, -C86A, y -C52A/C53A/C86A (Cys-less). Las células osteoblastadas que albergaban cada plasmido fueron cultivadas en ausencia de 2BP, y luego se extrajo el lisato celular. La Figura 3-B muestra los resultados de la mancha occidental detectando la expresión de todos los mutantes en las células osteoblastadas. En los mutantes C52A/C53A y Cys-less (ver carriles 2 y 4), se detectó la forma de baja masa molecular. Este resultado indica que Cys52 o Cys53 están involucrados en la palmitoilación S. Además, como se muestra en la Figura 2 -D, se detectaron fluorescencia fuerte y débil en el mutante C52A/C53A en ausencia y presencia de hidroxilamina (lanes 3 y 7), respectivamente, pero no en el mutante Cys-less (lanes 4 y 8). Estos resultados sugieren que el resto de la cisteína en el mutante C52A/C53A, Cys86, es S-palmitoilado y el mutante Cyss-less perdió por completo la palmitoilación S porque todas las cisteinas fueron sustituidas. Por lo tanto, concluimos que Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados. Además, se encontró que la S-palmitoilación en el dominio TM1 tiene un efecto importante en la movilidad en el gel (panel inferior de la Figura 2 -D y Figura 3-B). Por lo tanto, en adelante nos referimos a las formas de masa molecular alta y baja como las formas TM1palmitoiladas y TM1-depalmitoiladas, respectivamente. Finalmente, reasignamos las bandas mostradas en el análisis de Western blot como sigue: IFITM5-WT está totalmente palmitoilado, el mutante C86A está parcialmente palmitoilado en Cys52 y/o Cys53, el mutante C52A/C53A está parcialmente palmitoilado en Cys86, y el mutante sin Cys está completamente depalmitoilado. Estudios previos han revelado que IFITM5 interactúa con FKBP11 [19]. FKBP11 pertenece a la familia de proteínas de unión FK506 y tiene un dominio transmembrana. La interacción entre IFITM5 y FKBP11 es importante para la actividad inmunitaria debido a que la formación del complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP induce la expresión de genes inducidos por interferón, a saber, el Bst2, Irgm, Ifit3, B2m y el gen antígeno clase I de MHC [28]. Para investigar el efecto de la palmitoilación S en la interacción de IFITM5 con FKBP11, se realizó un ensayo de inmunoprecipitación. Las células osteoblásticas cotransfectadas por los plásmidos que codifican IFITM5-WT y FKBP11-FLAG fueron cultivadas en ausencia y presencia de 2BP. Luego, el análisis celular extraído fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG. El gel fue lavado varias veces. Finalmente, las proteínas fueron eludidas competitivamente por la adición de péptido FLAG. Si IFITM5 interactuaba con FKBP11, se esperaba que IFITM5 Las cisteínas conservadas fueran resaltadas en naranja y numeradas. En el panel inferior, los números dados entre paréntesis corresponden al número residual para IFITM2. Para el cálculo de probabilidad, un total de 23 secuencias IFITM2, 23 IFITM3 y 17 IFITM5 derivadas de especies mamíferas en la base de datos Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomas (KEGG) fueron utilizadas. La alineación de secuencias se llevó a cabo utilizando CLUSTALW. Los logotipos de secuencia se generaron utilizando WEBLOGO 3. B) Botón occidental para los mutantes de tipo salvaje y substituidos por cisteína de IFITM5 expresados en células osteoblastadas La flecha superior indica que los mutantes C52 y/o C53 en el dominio TM1 son Spalmitoylated (lanes 1 y 3). El C52A/C53A (lane 2) y Cys-less (lane 4) son parcial y completamente depalmitoylated. El experimento se llevó a cabo 2 veces. doi: 10.1371/journal.pone.0075831.g003 se obtendría durante este paso y se detectaría por inmunobloqueo. Figura 4 -A muestra los resultados de la mancha occidental para la co-inmunoprecipitación de IFITM5-WT con FKBP-FLAG. La banda correspondiente a FKBP11 apareció en todos los carriles (panel superior). Las lanes 1 y 2 son controles para asegurar que IFITM5 y FKBP11 estén contenidas en el lisato celular Los controles también aseguraron que el IFITM5 fuera palmitoilado S en ausencia de 2BP (ver carril 1), mientras que el IFITM5 no fue palmitoilado S en presencia de 2BP (ver carril 2). Después de la inmunoprecipitación, una sola banda correspondiente al IFITM5 palmitoilado S apareció en ausencia de 2BP (ver carril 3), indicando la interacción del IFITM5 espalmitoilado con el FKBP11. Sin embargo, en presencia de 2BP, no apareció ninguna banda correspondiente al IFITM5 (ver carril 4), indicando que las dos moléculas no interactúan entre sí. Estos resultados sugieren que la palmitoilación S sobre el IFITM5 contribuye a la interacción con el FKBP11. A continuación, investigamos la relación entre la Spalmitoylation y la interacción con FKBP11 utilizando los mutantes IFITM5 descritos anteriormente. Las células osteoblastadas cotransfectadas por los plásmidos que codifican los mutantes IFITM5 (C52A/ C53A, C86A y Cys-less) y FKBP11-FLAG fueron cultivadas. El ensayo de inmunoprecipitación se llevó a cabo de la misma manera que se describió anteriormente. La Figura 4 -B muestra los resultados de la mancha occidental para la co-inmunoprecipitación de los mutantes de tipo salvaje y el IFITM5 con FKBP11. La Figura 4 -C muestra los resultados del experimento de control utilizando el lisato celular antes de la inmunoprecipitación. Como se describe en la sección anterior 3-3, la banda correspondiente a FKBP11 apareció en todos los carriles (paneles superiores) porque la inmunoprecipitación se realizó utilizando el gel de agarosa anti-FLAG. En el panel inferior de la Figura 4 -B, se observaron bandas individuales para el mutante IFITM5-WT y -C86A (lanes 1 y 3) pero no para los mutantes -C52A/C53A y Cys-less (lanes 2 y 4). Este resultado indica que el tipo salvaje y el mutante C86A interactúan con FKBP11, mientras que los otros dos mutantes no lo hacen. Curiosamente, esta tendencia refleja la tendencia de los perfiles de palmitoilación S, lo que significa que Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 de los mutantes IFITM5-WT y -C86A es S-palmitoilado, mientras que estos residuos no son S-palmitoilados en los mutantes C52A/C53A y Cysless (ver Figuras 2-D, 3-B y el panel inferior de la Figura 4-C). Debido a que la palmitoilación S contribuye a la interacción IFITM5-FKBP11, como se describe en la sección anterior 3-3 (también en la Figura 4-A), los resultados de la Figura 4-B sugieren que los mutantes que perdieron el sitio(s) de palmitoilación S, Cys52 y/o Cys53, no son capaces de interactuar con FKB En otras palabras, la palmitoilación S en estas cisteínas es necesaria para la interacción de IFITM5 con FKBP11. Como se ha descrito anteriormente en la Introducción, estudios previos han revelado que IFITM5 también contribuye a la formación ósea [18] [19] [20]. Por lo tanto, se investigó la influencia de Spalmitoilación en la formación de nódulos óseos en células osteoblastadas, en las que se expresa IFITM5 nativas. La Figura 5 muestra la formación de nódulos dependientes del tiempo en ausencia y la presencia de 2BP (Figuras 5-A y -B). La Figura 5 -C muestra los resultados del ensayo de control para verificar el efecto de DMSO, que se utilizó como disolvente para 2BP, en la formación de nódulos. El nódulo mineralizado fue manchado con Alizarin Red, que reacciona con calcio depositado. En la Figura 5 -D, el área del nódulo mineralizado fue trazada contra el tiempo experimental. En ausencia de 2BP (Figura 5-A, -C, y -D), la mineralización se inició 15 días después del inicio de la diferenciación celular (Día 0). Por otro lado, en presencia de 2BP (Figura 5-B y -D) se formó el nódulo el Día 12. El tiempo medio para la mineralización máxima en presencia de 2BP se estimó 7 días antes que en ausencia de 2BP (Figura 5-D). Además, se observaron diferencias en la forma de los nódulos mineralizados. La Figura 5 -E muestra una visión ampliada de cada nódulo en el Día 21. Los nódulos manchados se difundieron en presencia de 2BP (panel b), mientras que en ausencia de 2BP los nódulos formaron un gran cúmulo (panels a y c). Por lo tanto, nuestras observaciones en este estudio sugieren que la S-palmitoilación afecta la formación de nódulos óseos en las células osteoblásticas. En este estudio, se confirmó la S-palmitoilación sobre IFITM5 en las células osteoblásticas, que fue la misma que la reportada previamente para IFITM3 e IFITM2. Como se informó anteriormente, en IFITM3 e IFITM2, que comparten similitud de secuencia del 85% (Figura 1-C), dos cisteínas en el dominio TM1 (Cys71 y Cys72 para IFITM3, Cys70 y Cys71 para IFITM2) y una cisteína en el bucle CP (Cys105 para IFITM3, Cys104 para IFITM2) son todas S-palmitoiladas en células [10, 24]. Por otro lado, aunque IFITM5 comparte similitud de secuencia del 68% y 66% a IFITM3 e IFITM2, respectivamente, más de una cisteína en el dominio TM1 (Cys52 o Cys53) y una cisteína en el bucle CP (Cys86) son S-palmitoiladas. Teniendo en cuenta la alta conservación de tres cisteínas en las proteínas IFITM (Figuras 1-A y 3-A), todas las cisteínas en IFITM5 pueden estar involucradas en la palmitoilación S al igual que en el caso de IFITM3 e IFITM2 [10, 24]. Los roles de la palmitoilación S en IFITM3 se han estudiado intensamente, y la palmitoilación S ha demostrado ser crucial para el correcto posicionamiento en la membrana y la resistencia a la infección viral y la internalización [10] (los papeles se resumen en la Figura 6-A y se discuten en detalle más adelante). Un estudio reciente ha revelado que la palmitoilación S en IFITM2 también es importante para la agrupación de proteínas en la membrana [24]. Sin embargo, no conocemos el papel de la Spalmitoylation de IFITM5 para el agrupamiento en la membrana en la actualidad porque todavía no hemos logrado obtener un anticuerpo adecuado para la inmunohistoquímica, a pesar de que dedicamos mucho tiempo a la búsqueda y considerando un número considerable de anticuerpos. El Dr. Hanagata y sus colaboradores reportaron previamente que IFITM5 carecían del dominio TM1 y del bucle CP, que y IFITM5 (paneles inferiores), los anticuerpos anti-FLAG y anti-IFITM5 fueron utilizados como anticuerpos primarios, respectivamente. Las flechas indican la existencia de cada proteína y la S-palmitoylation en IFITM5. A) La mancha occidental para la coinmunoprecipitación del tipo salvaje IFITM5 con el FKBP11 (FKBP11-FLAG) fusionado con FLAG en las células osteoblásticas en ausencia y presencia de 2BP (denominadas "-" y "+", respectivamente). Las vías 1 y 2 son los resultados de los ensayos de control utilizados para verificar la existencia de IFITM5 y FKBP11 antes de la inmunoprecipitación, y las vías 3 y 4 muestran los resultados después de la inmunoprecipitación. El experimento se repitió 3 veces. B) La mancha occidental para la coinmunoprecipitación del tipo salvaje y los mutantes substituidos por cisteína de IFITM5 con FKBP11-FLAG en las células osteoblásticas. La banda correspondiente al péptido FLAG no se muestra debido a la menor masa molecular del péptido FLAG en relación con FKBP11-FLAG. C) El experimento de control de la Figura 4 -B utilizado para verificar que IFITM5 y FKBP11 estaban presentes en el lisato celular antes de la inmunoprecipitación. El experimento se repitió 2 veces. A) El mecanismo funcional de IFITM3 se resume en estudios anteriores. i) IFITM3 es S-palmitoilado en Cys71, Cys72 y Cys105, ii) que induce el agrupamiento y el posicionamiento correcto en la membrana, iii) resultando en la actividad antiviral contra el virus de la gripe. B) El mecanismo funcional de IFITM5 se resume combinando los resultados del presente y los estudios anteriores. (i) Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados (ii). La S-palmitoilación permite que IFITM5 interactúe con FKBP11 en las células osteoblásticas (iii). La disociación del CD9 del complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 es inducida por la formación del complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP y conduce a la expresión genética inmunológicamente relevante. IFITM5 también contribuye a la formación ósea, pero se desconoce cuáles son los estados descritos en i)-iii) son importantes para la formación ósea en la actualidad. Por otro lado, la IFITM5 interactúa con la proteína asociada, FKBP11, y la S-palmitoylation claramente hace una contribución significativa a la interacción. Por lo tanto, IFITM5 forma un hetero-oligomero en la membrana celular para su función fisiológica. contiene los sitios de modificación relevantes, perdió la capacidad de interactuar con FKBP11 [19]. En el presente estudio, determinamos que la S-palmitoylation en Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 es necesaria para la interacción. De estos resultados, especulamos que Cys52 y Cys53 se enfrentan a la superficie de interacción con FKBP11, y por lo tanto IFITM5 y FKBP11 interactúan entre sí a través del ácido palmítico unido a la cisteína (resumidos en la Figura 6 -B, discutidos más Nuestra investigación reveló que Cys86 está involucrado en la Spalmitoylation pero no contribuye a la interacción con FKBP11. Especulamos que otros residuos en el bucle CP ubicados cerca del dominio TM1 hacen alguna contribución a la interacción. Investigaciones previas también revelaron que IFITM5 expresado en las células fibroblasto heterologosas NIH3T3 exhibieron interacciones directas con CD81, la proteína 31 asociada al receptor de células B (BCAP31) y el hidroxiesteroide (17-beta) deshidrogenasa 7 (HSD17b7). Estas tres proteínas se unen al IFITM5 sin la S-palmitoylation (forma de masa molecular baja; ver Figura 3-b en ref [19]. y Figura 1-B en ref [28]. En las células fibroblastosas, la S-palmitoylation en IFI Estas interacciones no se observan en las células nativas del osteoblasto y, por lo tanto, son inespecíficas. Teniendo en cuenta estos hechos, se especula que la palmitoilación S sobre las células del IFITM5 promueve la interacción específica con FKBP11 en las células del osteoblasto. El papel que desempeña la palmitoilación S de las células del IFITM5 en la actividad inmune de las células del osteoblasto se discutirá combinando los resultados del presente y de los estudios anteriores. Debe ser necesaria una interacción específica entre IFITM5 y FKBP11 para formar el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP. CD81, también conocido como TAPA-1, es un miembro de la familia de proteínas de membrana de tetraspanina y un componente del núcleo de células B que media la señalización de células B para respuestas inmunes. Al formar este complejo, CD9, una proteína asociada con CD81, disociada del complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 y consecuentemente induce la expresión osteoblastada específica de los genes inducidos por interferón, Bst2, Irgm, Ifit3, B2m y el gen antígeno clase I de la MHC [28]. Si se perdiera la interacción específica mediada por Spalmitoylation de IFITM5 con FKBP11, no se formaría el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP y, por consiguiente, se inhibiría la expresión génica inducida por interferón, ya que el CD9 seguiría asociado con el complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9. En este sentido, especulamos que el IFITM5 está involucrado en la actividad del sistema inmunitario en las células osteoblastadas y la interacción del IFITM5 palmitoilado S con el FKBP11 regula la actividad inmune. Además, se sugirió que la S-palmitoilación en el IFITM5 contribuye a la formación de nódulos óseos, incluyendo la morfología y el tiempo de mineralización, en las células osteoblastadas (Figura 5). Es difícil concluir en la actualidad que la falta de la S-palmitoilación en el IFITM5 causa la difusión de los nódulos óseos (panel b de la Figura 5 -E); sin embargo, podemos decir que el IFITM5 probablemente no será S-palmitoilado en las células en presencia de 2BP. Mientras que el 2BP se utiliza comúnmente como inhibidor de la palmitoilación, también se dirige a muchas enzimas Por lo tanto, también es difícil interpretar los resultados de la incubación a largo plazo de las células osteoblásticas en presencia de 2BP. En cualquier caso, estas son observaciones interesantes y clave en términos de aclarar el papel desempeñado por la S-palmitoilación de IFITM5 en la formación ósea, y se requieren estudios adicionales. La Figura 6 describe un posible mecanismo de la interacción de IFITM5 con FKBP11 y el papel de IFITM5 en la función celular osteoblástica mediante una comparación con IFITM3. En el caso de IFITM3, como se muestra en la Figura 6 -A, se observan los siguientes. i) Las tres cisteinas son todas S-palmitoiladas (ii). La S-palmitoilación conduce a la agrupación y el posicionamiento correcto de moléculas IFITM3 en la membrana (iii). La espalmitoilación y la siguiente agrupación son cruciales para la resistencia al virus de la gripe. Cuando IFITM3 carece de la espalmitoilación, las moléculas de IFITM3 no se agrupan, lo que conduce a la disminución significativa de la actividad antiviral. Por otro lado, la Figura 6 -B muestra que las siguientes observaciones se hacen en el caso de IFITM5. i) Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados (ii). El S-palmitoilado IFITM5 es capaz de interactuar específicamente con FKBP11. Se supone que la interacción está mediada por el ácido palmítico unido a la cisteína frente a la superficie de interacción en FKBP11. Cys86 está involucrado en la palmitoilación S, pero no en la interacción de IFITM5 con FKBP11. En la actualidad, sin embargo, poco se sabe sobre el papel de la palmitoilación S de IFITM5 para la localización en la membrana. Cuando la palmitoilación S afecta la localización de IFITM5 como en el caso de IFITM3 [10], las moléculas S-palmitoiladas IFITM5 deben ser localizadas en la membrana o las moléculas depalmitoiladas deben ser deslocalizadas. La pérdida de la interacción entre IFITM5 y FKBP11 podría deberse a una relocalización de la depalmitoilada IFITM5 que impide su asociación con FKBP11 (iii). El Spalmitoilado IFITM5 interactúa con el complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 a través del FKBP11, que induce la disociación del CD9 del complejo y la expresión de 5 genes inmunológicamente relevantes. Finalmente, el IFITM5 forma el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP. Se desconoce en la actualidad cuál de los tres estados (i)~(iii) ilustrados en la Figura 6-B es importante para la mineralización ósea de las células osteoblásticas. La falta de la S-palmitoilación influye en la interacción con el FKBP11, que podría explicar la siguiente formación compleja y expresión génica. Además, la formación de nódulos óseos también se ve afectada. Se indica que la S-palmitoilación en IFITM5 juega un papel no sólo en la regulación de la actividad inmune sino también en la formación ósea. En conclusión, hemos revelado la S-palmitoilación en IFITM5 y su papel en la interacción con FKBP11. No sólo la actividad inmune sino también la mineralización ósea en las células osteoblásticas se ve afectada por la S-palmitoilación. En general, el papel funcional de la S-palmitoilación es diferente para cada proteína [36]. Para muchas proteínas, el ciclo de palmitoilación y despalmitoilación es constitutivo y regulado por enzimas. Basado en los resultados actuales, es difícil abordar (i) si la S-palmitoilación en IFITM5 es constitutiva o regulada, o (ii) cuando y donde IFITM5 es S-palmitoilada en las células osteoblásticas. Se necesitan más estudios y actualmente se están realizando.

¿Por qué los interferones no promueven la expresión de IFITM5?

El papel de la S-Palmitoylation en IFITM5 para la interacción con FKBP11 en células de Osteoblastohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3776769/Tsukamoto, Takashi; Li, Xianglan; Morita, Hiromi; Minowa, Takashi; Aizawa, Tomoyasu; Hanagata, Nobutaka; Demura, Makoto2013-09-18DOI:10.1371/journal.pone.0075831Licencia:cc-byAbstract: Recientemente, una de las proteínas familiares de la transmembrana inducida por interferón, IFITM3, se ha convertido en un objetivo importante para la actividad contra la infección por el virus de la gripe A (H1N1). En esta proteína, una modificación post-translacional por ácidos grasos covalentemente unidos a la cisteína, llamada S-palmitoilación, juega un papel crucial para la actividad antiviral. IFITM3 posee tres residuos de cisteína para la S-palmitoilación en el primer dominio de la transmembrana (TM1) y en el bucle citoplasmático (CP). Debido a que estas cisteínas están bien conservadas en las proteínas de la familia de mamíferos IFITM, la S-palmitoilación en estas cisteínas es significativa para sus funciones. IFITM5 es otra proteína de la familia IFITM e interactúa con la proteína de unión FK506 (FKBP11) para formar un complejo de mayor orden en células osteoblastales, que induce la expresión de genes inmunológicamente relevantes. En este estudio, investigamos el papel que desempeña la palmitoilación S de IFITM5 en su interacción con FKBP11 en las células, ya que esta interacción es un proceso clave para la expresión génica. Nuestras investigaciones con un reportero establecido, ácido 17-octadecinoico (17-ODYA), y un inhibidor para la palmitoilación S, ácido 2-bromopalmítico (2BP), revelaron que IFITM5 fue palmitoilado S además de IFITM3. Específicamente, encontramos que los residuos de cisteína en el dominio TM1 y en el bucle CP fueron palmitoilados S en IFITM5. Luego, revelamos por inmunoprecipitación y análisis de manchas occidentales que la interacción de IFITM5 con FKBP11 fue inhibida en presencia de 2BP. El mutante que carecía del sitio S-palmitoylation en el dominio TM1 perdió la interacción con FKBP11. Estos resultados indican que la S-palmitoylation en IFITM5 promueve la interacción con FKBP11. Finalmente, investigamos la formación de nódulos óseos en células osteoblastadas en presencia de 2BP, ya que IFITM5 fue identificado originalmente como factor de formación ósea. El experimento resultó en una aberración morfológica del nódulo óseo, lo que también indicó que la S-palmitoylation contribuye a la formación ósea. Texto: La familia de proteínas transmembranas inducidas por interferón (IFITM) (también conocida como la familia Fragilis en ratones) es parte de la familia de las dispaninas [1] y está compuesta por α-hélices de doble transmembrana conectados por un bucle citoplasmático (CP) y secuencias de polipéptidos amino- y carboxil-terminales (Figura 1-A) extracelulares (EC). Las proteínas IFITM se conservan evolutivamente en vertebrados [2]. Investigaciones genómicas recientes han revelado que hay 5 miembros IFITM en humanos (IFITM1, 2, 3, 5 y 10) y 7 miembros en ratones (IFITM1, 2, 3, 5, 6, 7, y 10). Estas proteínas desempeñan papeles en diversos procesos biológicos, como la maduración de células germinativas durante la gastrulación (IFITTM1-3) [3] [5] [5], la adhesión de células a células (IFITTM1) [6] [7] [8], la actividad antiviral (IFITTM1-3) [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17], y la formación ósea (IFITTM5] [18] [19] [20] [21] [22], aunque actualmente se desconocen las funciones detalladas de IFITM6, 7 y 10; en particular, IFITM3 ha sido objeto de estudios intensivos sobre su actividad contra la infección e internalización del virus de la gripe A (H1N1) [9] [10] [11] [12] [13] [14]. En 2010, el Dr. Yount y sus colaboradores informaron que la actividad antiviral de IFITM3 depende de la palmitoilación S en la proteína [10]. La palmitoilación S [23] es una modificación post-translacional de las proteínas por los ácidos grasos saturados C 16 (ácidos palmíticos) covalentemente unidos a ciertos residuos de cisteína a través de un enlace tioéster (Figura 1-B). La modificación es catalizada reversiblemente por las proteínas aciltransferasas y las tioesterasas acilproteínas, y confiere propiedades únicas a la proteína, tales como unión a la membrana y segmentación, inmunoreactividad, alineación de secuencias aminoácidos de IFITM5, IFITM1, IFITM2 e IFITM3 derivadas de ratones. Los residuos conservados se destacan en negro. Las tres cisteinas conservadas se resaltan en rojo y numeradas en base a la secuencia de IFITM5 (top) e IFITM3 (bottom). Los residuos únicos en IFITM5 se resaltan en gris. Los dominios transmembrana primero y segundo, las secuencias extracelulares y el bucle citoplásmico se indican por flechas y se denotan como TM1 y TM2, EC y el bucle CP, respectivamente. Los dominios TM fueron predichos por SOSUI. Los aspartatos en la región C-terminal en IFITM5 se muestran en azul. B) La ilustración esquemática de la proteína S-palmitoilación. El ácido C 16-palmítico se une a la cisteína a través de un enlace tioéster. La palmitoilación y la despalmitoilación son catalizadas por proteínas aciltransferasas y acilproteínas tioesterasas, respectivamente. En este estudio se resume la hidroxilamina, NH 2 OH, para reducir la vinculación tioestérmica. C) La identidad de la secuencia de aminoácidos (similaridad) entre IFITM5, IFITM1, IFITM2 e IFITM3. doi: 10.1371/journal.pone.0075831.g001 y la interacción proteína-proteína. Los autores revelaron que IFITM3 es S-palmitoilado en tres quisteinas proximales de membrana, Cys71 y Cys72 en el primer dominio transmembrana (TM1), y Cys105 en el bucle CP (Figura 1-A) [10]. Además, IFITM3 carece de la palmitoilación S no se agrupa en la membrana celular y disminuye significativamente la actividad antiviral. Además, las cisteinas en IFITM2, Cys70, Cys71 y Cys104 también son palmitoiladas de la misma manera, lo que afecta a la localización intracelular [24]. Un estudio resentido ha revelado que la murina IFITM1 tiene cuatro residuos de cisteína (Cys49, Cys50, Cys83 y Cys103) para la palmitoilación S, que es necesaria para la actividad antiviral y la estabilidad proteica [25]. Los otros miembros de la familia IFITM también poseen estas cisteínas (Figura 1-A), y por lo tanto el papel de la espalmitoilación en las cisteinas debe ser significativo para las funciones de las proteínas IFITM. Aquí, nos centramos en las proteínas de la familia IFITM5, que también se conoce como proteína similar a IFITM (BRIL) [18]. Entre las proteínas de la familia IFITM, IFITM5 es única. (i) Expresión de IFITM5: A diferencia de las otras proteínas de la familia IFITM, la expresión de IFITM5 no es inducida por interferones porque la región anterior al gen ifitm5 carece de los elementos reguladores del interferón [26]. Además, la expresión de IFITM5 se limita principalmente a las células osteoblastadas [18, 19, 27], mientras que las otras proteínas de IFITM se expresan ubicuamente (ii). Además, IFITM5 tiene un dominio rico en aspartato en la región C-terminal, que podría estar involucrado en la unión al calcio (Figura 1 -A) [26]. iii) Papel de IFITM5 en la formación ósea: La expresión de IFITM5 está asociada con la mineralización durante el proceso de formación ósea en células osteoblásticas [18] [19] [20] [20]. Estudios anteriores han confirmado la expresión de IFITM5 en tejidos óseos en ratones, ratas, humanos y tammar wallabies [2]. Los ratones ifitm5-gene knockout tienen huesos más pequeños [19]. Además, el derribo del gen ifitm5 por el ARN de la horquilla pequeña induce una disminución en la formación de nódulos óseos, mientras que la sobreexpresión del gen en células UMR106 ha demostrado iv) Papel del IFITM5 en la actividad inmunitaria: Estudios recientes han revelado que el IFITM5 interactúa con la proteína 11 de unión FK506 (FKBP11) para formar IFITM5-FKBP11-CD81-el complejo regulador negativo del receptor de la prostaglandina F2 (FPRP) [28]. Cuando se forma el complejo, se inducen las expresiones de 5 genes inducidos por interferón, incluyendo el antígeno 2 de células estromales de médula ósea (Bst2), la proteína 1 inducible del interferón (Irgm), la proteína inducida por interferón con tetratricopéptido repite 3 (Ifit3), b(2) microglobulina (B2m) y el gen antígeno de clase I del MHC. En consecuencia, estos resultados indican que el IFITM5 está involucrado no sólo en la formación ósea sino también en la actividad En este estudio se investigó la palmitoilación S de IFITM5 y su papel en la interacción con FKBP11 en células de osteoblasto de ratón. Las células transfectadas por un plásmido DNA que codificaba el ratón IFITM5 fueron cultivadas en presencia de un reportero químico establecido, ácido 17-octadecinoico (17-ODYA) [29, 30], o un inhibidor para la palmitoilación S, ácido 2-bromopalmítico (2BP) [31]. Los ensayos bioquímicos usando estos compuestos revelaron que el tipo salvaje IFITM5 es S-palmitoilado. Para identificar el sitio de Spalmitoilación en IFITM5, se prepararon mutantes substituidos por cisteína, IFITM5-C86A, -C52A/C53A, y -C52A/53A El ensayo de reportero químico sugirió que al menos dos de las tres cisteínas en IFITM5 son S-palmitoiladas. La interacción de IFITM5 con FKBP11 fue examinada por inmunoprecipitación, resultando en la pérdida de la interacción en presencia de 2BP. El mismo resultado se obtuvo en los dos mutantes, C52A/C53A y Cys-less. Estos resultados sugieren que la S-palmitoilación en Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 de IFITM5 es necesaria para la interacción con FKBP11. Por otro lado, Cys86 en el bucle CP de IFITM5 fue S-palmitoilada pero no involucrada en la interacción. Debido a que esta interacción es importante para la expresión génica inmunológicamente relevante, se indicó que el papel de la palmitoilación S es promover la interacción de IFITM5 con FKBP11 y regular la actividad inmunitaria en las células osteoblásticas. Se discutirá el posible mecanismo de interacción y el efecto de la palmitoilación S en la formación de nódulos óseos. Para la expresión celular mamífera, se construyeron vectores de plásmidos de tipo salvaje IFITM5 (IFITM5-WT) y FKBP11 fusionado con FLAG (FKBP11-FLAG) insertando los genes clonados en un vector de expresión neopBApo-CMV (Takara Bio, Shiga, Japón). Los detalles de las construcciones de ADN recombinante fueron los mismos descritos anteriormente [19]. Los genes de los mutantes IFITM5 (IFITM5-C86A, -C52A/53A, y -C52A/C53A/C86A (Cys-less)) se prepararon utilizando un kit QuikChange de mutagenesis dirigido por el sitio (Stratagene, La Jolla, CA). Los vectores plásmidos de los IFITM5-WT fusionados con FLAG, -C52A/53A y Cys-less se construyeron insertando los genes clonados en el vector de expresión neo de pBApo-CMV. Para la expresión celular de E. coli, el vector plásmido de IFITM5-WT se construyó insertando el gen clonado en un vector de expresión pET22b (Novagen, Madison, WI). El primer delantero 5'-GGAATTCATTCATATTACACTTCATATCCCGTG-3' y el primer reverso 5'-CCGCTCGAGTTATAGTCTCATCAAACTTG-3' fueron utilizados para amplificar el gen que codifica todo el IFITM5 del vector plásmido para la expresión celular mamífera descrita anteriormente. Las letras subrayadas denotan un NdeI y un sitio de escote XhoI, respectivamente. Los plásmidos de mutantes IFITM5 fueron preparados usando un kit de mutagenesis dirigido por el sitio QuikChange. El sentido y los imprimadores antisenso utilizados fueron 5'-GGCAGTATGCTCCAAAGCCAAGGCGTACCATCTGGGCTGC-3' y 5'-GCAGCCGAGATGGTGGTGCCTGCTGGTGGTGGGGAGCATACT GCC-3' para IFITM5-C86A; y 5'-GCACGATGTACCTGAATGCGCGGCGCTTGGTGCTG CGC-3' y 5'-GCGCCAGGAATGAGCGCGCCGCGACAGAGCATCG TGC-3' para IFITM5-C52A/C53A, respectivamente (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Las células MC3T3 similares a los osteoblastos fueron provistas por el RIKEN, Cell Bank (RCB 1126). Los procedimientos de cultivo celular, transfección y expresión proteica fueron los mismos reportados anteriormente. Cuando fue necesario, el ácido 2-bromopalmítico (2BP; Wako, Osaka, Japón) y el ácido 17-octadecinoico (17-ODYA; Sigma-Aldrich) fueron disueltos en el 99,5% de sulfóxido dimetilo (DMSO; Wako) y añadidos al medio de diferenciación a concentraciones de 100 μM y 50 μM en menos del 0,1% de DMSO, respectivamente [30, 31]. Las proteínas de tipo salvaje y mutante IFITM5 también fueron producidas utilizando un sistema de expresión recombinante E. coli. Las células E. coli BL21(DE3) transformadas por la expresión plásmido fueron cultivadas a 37°C en medio LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina. Después de cuatro horas de inducción por 1 mM isopropil β-Dtiogalactopiranoside (IPTG), las células fueron recolectadas por centrifugación (6.400 × g durante 10 min a 4°C). Las células fueron suspendidas en 50 mM tampón Tris-HCl (pH 8) y interrumpidas por una prensa francesa (Ohtake, Tokio, Japón) (100 MPa × 4 veces). La fracción de membrana bruta fue recolectada por ultracentrifugación (178.000 × g durante 90 min a 4°C). La fracción recolectada fue solubilizado con 1,5% n-dodecyl-β-Dmaltopiranoside (DDM) (Dojindo Lab, Kumamoto, Japón) en 50 mM Tris-HCl, pH 8, que contenía 0,3 M NaCl y 5 mM imidazol. Después de la ultracentrifugación, el sobrenadante fue incubado con resina de agarosa Ni 2+ -NTA (Qiagen, Hilden, Alemania). La resina fue aplicada a una columna de cromatografía y lavada con 50 mM imidazol que contenía 50 mM Tris-HCl (pH 8), 0,3 M NaCl y 0,1% DDM. El IFITM5 solubilizado con DDM fue recolectado por elución con el mismo tampón que contenía 0,3 M imidazol. Los medios de muestreo fueron reemplazados por la solución tampón apropiada por dos pasajes sobre una columna PD-10 (GE Healthcare UK, Ltd., Amersham Place, Inglaterra). Los detalles experimentales se describen en informes anteriores [19, 28]. Brevemente, se extrajeron proteínas totales de las células osteoblásticas que coexpresaron IFITM5 y FKBP11-FLAG utilizando un kit de extracción total de proteínas (BioChain Institute Inc., Newark, CA). Luego, el lisato celular fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG M2 (Sigma-Aldrich) a 4°C durante 2 h. Para recuperar FKBP11-FLAG, 500 ng/μL 3 × péptido FLAG (Sigma-Aldrich) disuelto en solución salina tris-buffered se añadió al gel recogido a 4°C durante 1 h. Las proteínas recuperadas y el lisato celular que contenía proteínas totales fueron analizados por SDS-PAGE (15% ePAGEL; ATTO, Tokio, Japón) y la mancha occidental El anticuerpo policlonal anti-IFITM5, preparado a partir de la secuencia péptida aminoterminal (TSYPREDPRAPSSRC), y el anticuerpo monoclonal anti-FLAG (Sigma-Aldrich) fueron utilizados como anticuerpos primarios. Los anticuerpos anti-rabbit IgG (H+L) de cabra conjugados con HRP (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) y anti-mouse IgG (H+L) (Sigma-Aldrich) fueron utilizados como anticuerpos secundarios para los anticuerpos primarios anti-IFITM5 y anti-FLAG, respectivamente. Las proteínas fueron detectadas por reacción quimioluminiscente (MercK-Millipore, Billerica, MA). El lisato celular extraído de las células osteoblásticas marcadas metabólicamente por 17-ODYA fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG M2 para obtener proteínas purificadas con FLAG IFITM5. Las proteínas marcadas con 17-ODYA fueron etiquetadas químicamente con azida-PEG 3 -5(6)-carboxitetrametilrhodamina (TAMRA-azida; Click Chemistry Tools, Scottsdale, AZ) con referencia a estudios previos [10, 29, 30, 32] y la guía del fabricante. Las proteínas separadas por SDS-PAGE fueron visualizadas utilizando un láser de 532-nm para excitación y la fluorescencia por TAMRA (565 nm) fue detectada mediante un filtro de largo camino de 575nm (Typhoon FLA 9000; GE Healthcare). Las células de osteoblasto subcultivo MC3T3 fueron sembradas a una densidad de 5.000 células/cm 2 en platos de 40 mm y cultivadas en medio de águila α-modificada (α-MEM; Sigma-Aldrich) conteniendo 10% (v/v) de suero fetal bovino (FBS; Nichirei Biosciences Inc., Tokio, Japón). Al día siguiente, esto fue reemplazado por medio de diferenciación, conteniendo 2 mM de glicerofosfato y 50 μg/ml de ascorbato sódico en concentraciones finales, para inducir la diferenciación osteoblasto. Cuando fue necesario, 100 μM 2BP en menos de 0,1% DMSO, o 0,1% DMSO solo se añadió al medio de diferenciación en concentraciones finales. Todos los cultivos fueron incubados a 37°C en una atmósfera humidificada que contenía 5% CO 2 durante Los nódulos mineralizados fueron manchados con Alizarin Red S (Sigma-Aldrich). Se utilizó el procedimiento estándar de tinción. Los nódulos mineralizados fueron revisados cada tres días. Para identificar la palmitoilación S en IFITM5, las células osteoblásticas que albergaban el ADN plásmido que codificaba IFITM5-WT fueron cultivadas en ausencia y presencia de 2BP, lo que inhibe la palmitoilación S (Figura 2-A) [31]. A continuación, se extrajo el lisato celular que contenía proteína total para su uso en los análisis de manchas SDS-PAGE y occidentales. A efectos de comparación, las células E. coli también fueron cultivadas en ausencia de 2BP y se extrajo el lisato celular. La Figura 2 -B muestra los resultados del ensayo de manchas occidentales para IFITM5-WT expresado en el osteo En las células de osteoblasto, IFITM5-WT exhibió una sola banda cerca del marcador de masa molecular de 17,4 kDa (ver carril 1) en ausencia de 2BP. Sin embargo, en presencia de 2BP (ver carril 4), la banda apareció en una posición más baja que en ausencia de 2BP (lane 1). Estos resultados sugieren que IFITM5-WT tiene formas de masa molecular alta y baja en ausencia y presencia de 2BP, respectivamente. La palmitoilación S es una reacción reversible, y por lo tanto es despalmitoilada por un reductor fuerte como la hidroxilamina [10]. Tras el tratamiento de hidroxilamina (ver carril 2), la banda apareció en la misma posición que en presencia de 2BP (lane 4). En las células prokaryote E. coli, la modificación post-translacional S-Palmitoylation en IFITM5 PLOS ONE www.plosone.org no se produce. Por lo tanto, la banda también se observó en la misma posición inferior (ver carril 3). En el caso de IFITM3, también se informó que la palmitoylation induce un cambio en la movilidad en la electroforesis, al igual que en nuestros resultados actuales [10]. Para la observación directa de la S-palmitoylation, se utilizó un reportero químico establecido, 17-ODYA (Figura 2-C). Las células osteoblastadas que albergan la codificación plasmídica IFITM5-WT fueron cultivadas en presencia de 17-ODYA para etiquetar la proteína metabólicamente. Después de la extracción y purificación del lisato celular, el IFITM5-WT etiquetado fue ligado con TAMRA-azida de acuerdo con el método de cicloadición de azidealkyne [3+2] catalizado Cu(I) [3+2] [10, 29, 30, 32 ]. Una imagen de fluorescencia en gel del IFITM5-WT marcado 17-ODYA-TAMRA (véase el carril 2 en la Figura 2 -D) mostró que IFITM5 estaba espalmitoilado en las células osteoblastadas. La etiqueta FLAG adjunta a IFITM5 no tiene influencia en la modificación y etiquetado químico (vías 1 y 5). Además, después del tratamiento con hidroxilamina (ver carril 6), la fluorescencia se debilitó debido a la disociación de 17-ODYA de IFITM5, que fue el mismo mecanismo que la disociación del ácido palmítico de IFITM5 por reducción como se describe anteriormente (lane 2 de la Figura 2-B). Por lo tanto, concluimos que el IFITM5 expresado en las células de osteoblasto nativas es S-palmitoilado. Además, las bandas correspondientes a las formas de masa molecular alta y baja mostradas en el análisis de manchas occidentales fueron asignadas tentativamente a las formas S-palmitoiladas y depalmitoiladas, respectivamente. Como se describe anteriormente en la Introducción, los residuos de cisteína son el sustrato para la palmitoilación S. IFITM5 posee tres cisteínas, Cys52 y Cys53 en el dominio TM1, y Cys86 en el bucle CP (Figura 1-A). Todas estas cisteínas están altamente conservadas entre las proteínas de la familia IFITM de mamíferos (Figura 3-A). Para identificar el sitio de modificación en IFITM5, preparamos mutantes substituidos por cisteína, IFITM5-C52A/C53A, -C86A, y -C52A/C53A/C86A (Cys-less). Las células osteoblastadas que albergaban cada plasmido fueron cultivadas en ausencia de 2BP, y luego se extrajo el lisato celular. La Figura 3-B muestra los resultados de la mancha occidental detectando la expresión de todos los mutantes en las células osteoblastadas. En los mutantes C52A/C53A y Cys-less (ver carriles 2 y 4), se detectó la forma de baja masa molecular. Este resultado indica que Cys52 o Cys53 están involucrados en la palmitoilación S. Además, como se muestra en la Figura 2 -D, se detectaron fluorescencia fuerte y débil en el mutante C52A/C53A en ausencia y presencia de hidroxilamina (lanes 3 y 7), respectivamente, pero no en el mutante Cys-less (lanes 4 y 8). Estos resultados sugieren que el resto de la cisteína en el mutante C52A/C53A, Cys86, es S-palmitoilado y el mutante Cyss-less perdió por completo la palmitoilación S porque todas las cisteinas fueron sustituidas. Por lo tanto, concluimos que Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados. Además, se encontró que la S-palmitoilación en el dominio TM1 tiene un efecto importante en la movilidad en el gel (panel inferior de la Figura 2 -D y Figura 3-B). Por lo tanto, en adelante nos referimos a las formas de masa molecular alta y baja como las formas TM1palmitoiladas y TM1-depalmitoiladas, respectivamente. Finalmente, reasignamos las bandas mostradas en el análisis de Western blot como sigue: IFITM5-WT está totalmente palmitoilado, el mutante C86A está parcialmente palmitoilado en Cys52 y/o Cys53, el mutante C52A/C53A está parcialmente palmitoilado en Cys86, y el mutante sin Cys está completamente depalmitoilado. Estudios previos han revelado que IFITM5 interactúa con FKBP11 [19]. FKBP11 pertenece a la familia de proteínas de unión FK506 y tiene un dominio transmembrana. La interacción entre IFITM5 y FKBP11 es importante para la actividad inmunitaria debido a que la formación del complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP induce la expresión de genes inducidos por interferón, a saber, el Bst2, Irgm, Ifit3, B2m y el gen antígeno clase I de MHC [28]. Para investigar el efecto de la palmitoilación S en la interacción de IFITM5 con FKBP11, se realizó un ensayo de inmunoprecipitación. Las células osteoblásticas cotransfectadas por los plásmidos que codifican IFITM5-WT y FKBP11-FLAG fueron cultivadas en ausencia y presencia de 2BP. Luego, el análisis celular extraído fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG. El gel fue lavado varias veces. Finalmente, las proteínas fueron eludidas competitivamente por la adición de péptido FLAG. Si IFITM5 interactuaba con FKBP11, se esperaba que IFITM5 Las cisteínas conservadas fueran resaltadas en naranja y numeradas. En el panel inferior, los números dados entre paréntesis corresponden al número residual para IFITM2. Para el cálculo de probabilidad, un total de 23 secuencias IFITM2, 23 IFITM3 y 17 IFITM5 derivadas de especies mamíferas en la base de datos Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomas (KEGG) fueron utilizadas. La alineación de secuencias se llevó a cabo utilizando CLUSTALW. Los logotipos de secuencia se generaron utilizando WEBLOGO 3. B) Botón occidental para los mutantes de tipo salvaje y substituidos por cisteína de IFITM5 expresados en células osteoblastadas La flecha superior indica que los mutantes C52 y/o C53 en el dominio TM1 son Spalmitoylated (lanes 1 y 3). El C52A/C53A (lane 2) y Cys-less (lane 4) son parcial y completamente depalmitoylated. El experimento se llevó a cabo 2 veces. doi: 10.1371/journal.pone.0075831.g003 se obtendría durante este paso y se detectaría por inmunobloqueo. Figura 4 -A muestra los resultados de la mancha occidental para la co-inmunoprecipitación de IFITM5-WT con FKBP-FLAG. La banda correspondiente a FKBP11 apareció en todos los carriles (panel superior). Las lanes 1 y 2 son controles para asegurar que IFITM5 y FKBP11 estén contenidas en el lisato celular Los controles también aseguraron que el IFITM5 fuera palmitoilado S en ausencia de 2BP (ver carril 1), mientras que el IFITM5 no fue palmitoilado S en presencia de 2BP (ver carril 2). Después de la inmunoprecipitación, una sola banda correspondiente al IFITM5 palmitoilado S apareció en ausencia de 2BP (ver carril 3), indicando la interacción del IFITM5 espalmitoilado con el FKBP11. Sin embargo, en presencia de 2BP, no apareció ninguna banda correspondiente al IFITM5 (ver carril 4), indicando que las dos moléculas no interactúan entre sí. Estos resultados sugieren que la palmitoilación S sobre el IFITM5 contribuye a la interacción con el FKBP11. A continuación, investigamos la relación entre la Spalmitoylation y la interacción con FKBP11 utilizando los mutantes IFITM5 descritos anteriormente. Las células osteoblastadas cotransfectadas por los plásmidos que codifican los mutantes IFITM5 (C52A/ C53A, C86A y Cys-less) y FKBP11-FLAG fueron cultivadas. El ensayo de inmunoprecipitación se llevó a cabo de la misma manera que se describió anteriormente. La Figura 4 -B muestra los resultados de la mancha occidental para la co-inmunoprecipitación de los mutantes de tipo salvaje y el IFITM5 con FKBP11. La Figura 4 -C muestra los resultados del experimento de control utilizando el lisato celular antes de la inmunoprecipitación. Como se describe en la sección anterior 3-3, la banda correspondiente a FKBP11 apareció en todos los carriles (paneles superiores) porque la inmunoprecipitación se realizó utilizando el gel de agarosa anti-FLAG. En el panel inferior de la Figura 4 -B, se observaron bandas individuales para el mutante IFITM5-WT y -C86A (lanes 1 y 3) pero no para los mutantes -C52A/C53A y Cys-less (lanes 2 y 4). Este resultado indica que el tipo salvaje y el mutante C86A interactúan con FKBP11, mientras que los otros dos mutantes no lo hacen. Curiosamente, esta tendencia refleja la tendencia de los perfiles de palmitoilación S, lo que significa que Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 de los mutantes IFITM5-WT y -C86A es S-palmitoilado, mientras que estos residuos no son S-palmitoilados en los mutantes C52A/C53A y Cysless (ver Figuras 2-D, 3-B y el panel inferior de la Figura 4-C). Debido a que la palmitoilación S contribuye a la interacción IFITM5-FKBP11, como se describe en la sección anterior 3-3 (también en la Figura 4-A), los resultados de la Figura 4-B sugieren que los mutantes que perdieron el sitio(s) de palmitoilación S, Cys52 y/o Cys53, no son capaces de interactuar con FKB En otras palabras, la palmitoilación S en estas cisteínas es necesaria para la interacción de IFITM5 con FKBP11. Como se ha descrito anteriormente en la Introducción, estudios previos han revelado que IFITM5 también contribuye a la formación ósea [18] [19] [20]. Por lo tanto, se investigó la influencia de Spalmitoilación en la formación de nódulos óseos en células osteoblastadas, en las que se expresa IFITM5 nativas. La Figura 5 muestra la formación de nódulos dependientes del tiempo en ausencia y la presencia de 2BP (Figuras 5-A y -B). La Figura 5 -C muestra los resultados del ensayo de control para verificar el efecto de DMSO, que se utilizó como disolvente para 2BP, en la formación de nódulos. El nódulo mineralizado fue manchado con Alizarin Red, que reacciona con calcio depositado. En la Figura 5 -D, el área del nódulo mineralizado fue trazada contra el tiempo experimental. En ausencia de 2BP (Figura 5-A, -C, y -D), la mineralización se inició 15 días después del inicio de la diferenciación celular (Día 0). Por otro lado, en presencia de 2BP (Figura 5-B y -D) se formó el nódulo el Día 12. El tiempo medio para la mineralización máxima en presencia de 2BP se estimó 7 días antes que en ausencia de 2BP (Figura 5-D). Además, se observaron diferencias en la forma de los nódulos mineralizados. La Figura 5 -E muestra una visión ampliada de cada nódulo en el Día 21. Los nódulos manchados se difundieron en presencia de 2BP (panel b), mientras que en ausencia de 2BP los nódulos formaron un gran cúmulo (panels a y c). Por lo tanto, nuestras observaciones en este estudio sugieren que la S-palmitoilación afecta la formación de nódulos óseos en las células osteoblásticas. En este estudio, se confirmó la S-palmitoilación sobre IFITM5 en las células osteoblásticas, que fue la misma que la reportada previamente para IFITM3 e IFITM2. Como se informó anteriormente, en IFITM3 e IFITM2, que comparten similitud de secuencia del 85% (Figura 1-C), dos cisteínas en el dominio TM1 (Cys71 y Cys72 para IFITM3, Cys70 y Cys71 para IFITM2) y una cisteína en el bucle CP (Cys105 para IFITM3, Cys104 para IFITM2) son todas S-palmitoiladas en células [10, 24]. Por otro lado, aunque IFITM5 comparte similitud de secuencia del 68% y 66% a IFITM3 e IFITM2, respectivamente, más de una cisteína en el dominio TM1 (Cys52 o Cys53) y una cisteína en el bucle CP (Cys86) son S-palmitoiladas. Teniendo en cuenta la alta conservación de tres cisteínas en las proteínas IFITM (Figuras 1-A y 3-A), todas las cisteínas en IFITM5 pueden estar involucradas en la palmitoilación S al igual que en el caso de IFITM3 e IFITM2 [10, 24]. Los roles de la palmitoilación S en IFITM3 se han estudiado intensamente, y la palmitoilación S ha demostrado ser crucial para el correcto posicionamiento en la membrana y la resistencia a la infección viral y la internalización [10] (los papeles se resumen en la Figura 6-A y se discuten en detalle más adelante). Un estudio reciente ha revelado que la palmitoilación S en IFITM2 también es importante para la agrupación de proteínas en la membrana [24]. Sin embargo, no conocemos el papel de la Spalmitoylation de IFITM5 para el agrupamiento en la membrana en la actualidad porque todavía no hemos logrado obtener un anticuerpo adecuado para la inmunohistoquímica, a pesar de que dedicamos mucho tiempo a la búsqueda y considerando un número considerable de anticuerpos. El Dr. Hanagata y sus colaboradores reportaron previamente que IFITM5 carecían del dominio TM1 y del bucle CP, que y IFITM5 (paneles inferiores), los anticuerpos anti-FLAG y anti-IFITM5 fueron utilizados como anticuerpos primarios, respectivamente. Las flechas indican la existencia de cada proteína y la S-palmitoylation en IFITM5. A) La mancha occidental para la coinmunoprecipitación del tipo salvaje IFITM5 con el FKBP11 (FKBP11-FLAG) fusionado con FLAG en las células osteoblásticas en ausencia y presencia de 2BP (denominadas "-" y "+", respectivamente). Las vías 1 y 2 son los resultados de los ensayos de control utilizados para verificar la existencia de IFITM5 y FKBP11 antes de la inmunoprecipitación, y las vías 3 y 4 muestran los resultados después de la inmunoprecipitación. El experimento se repitió 3 veces. B) La mancha occidental para la coinmunoprecipitación del tipo salvaje y los mutantes substituidos por cisteína de IFITM5 con FKBP11-FLAG en las células osteoblásticas. La banda correspondiente al péptido FLAG no se muestra debido a la menor masa molecular del péptido FLAG en relación con FKBP11-FLAG. C) El experimento de control de la Figura 4 -B utilizado para verificar que IFITM5 y FKBP11 estaban presentes en el lisato celular antes de la inmunoprecipitación. El experimento se repitió 2 veces. A) El mecanismo funcional de IFITM3 se resume en estudios anteriores. i) IFITM3 es S-palmitoilado en Cys71, Cys72 y Cys105, ii) que induce el agrupamiento y el posicionamiento correcto en la membrana, iii) resultando en la actividad antiviral contra el virus de la gripe. B) El mecanismo funcional de IFITM5 se resume combinando los resultados del presente y los estudios anteriores. (i) Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados (ii). La S-palmitoilación permite que IFITM5 interactúe con FKBP11 en las células osteoblásticas (iii). La disociación del CD9 del complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 es inducida por la formación del complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP y conduce a la expresión genética inmunológicamente relevante. IFITM5 también contribuye a la formación ósea, pero se desconoce cuáles son los estados descritos en i)-iii) son importantes para la formación ósea en la actualidad. Por otro lado, la IFITM5 interactúa con la proteína asociada, FKBP11, y la S-palmitoylation claramente hace una contribución significativa a la interacción. Por lo tanto, IFITM5 forma un hetero-oligomero en la membrana celular para su función fisiológica. contiene los sitios de modificación relevantes, perdió la capacidad de interactuar con FKBP11 [19]. En el presente estudio, determinamos que la S-palmitoylation en Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 es necesaria para la interacción. De estos resultados, especulamos que Cys52 y Cys53 se enfrentan a la superficie de interacción con FKBP11, y por lo tanto IFITM5 y FKBP11 interactúan entre sí a través del ácido palmítico unido a la cisteína (resumidos en la Figura 6 -B, discutidos más Nuestra investigación reveló que Cys86 está involucrado en la Spalmitoylation pero no contribuye a la interacción con FKBP11. Especulamos que otros residuos en el bucle CP ubicados cerca del dominio TM1 hacen alguna contribución a la interacción. Investigaciones previas también revelaron que IFITM5 expresado en las células fibroblasto heterologosas NIH3T3 exhibieron interacciones directas con CD81, la proteína 31 asociada al receptor de células B (BCAP31) y el hidroxiesteroide (17-beta) deshidrogenasa 7 (HSD17b7). Estas tres proteínas se unen al IFITM5 sin la S-palmitoylation (forma de masa molecular baja; ver Figura 3-b en ref [19]. y Figura 1-B en ref [28]. En las células fibroblastosas, la S-palmitoylation en IFI Estas interacciones no se observan en las células nativas del osteoblasto y, por lo tanto, son inespecíficas. Teniendo en cuenta estos hechos, se especula que la palmitoilación S sobre las células del IFITM5 promueve la interacción específica con FKBP11 en las células del osteoblasto. El papel que desempeña la palmitoilación S de las células del IFITM5 en la actividad inmune de las células del osteoblasto se discutirá combinando los resultados del presente y de los estudios anteriores. Debe ser necesaria una interacción específica entre IFITM5 y FKBP11 para formar el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP. CD81, también conocido como TAPA-1, es un miembro de la familia de proteínas de membrana de tetraspanina y un componente del núcleo de células B que media la señalización de células B para respuestas inmunes. Al formar este complejo, CD9, una proteína asociada con CD81, disociada del complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 y consecuentemente induce la expresión osteoblastada específica de los genes inducidos por interferón, Bst2, Irgm, Ifit3, B2m y el gen antígeno clase I de la MHC [28]. Si se perdiera la interacción específica mediada por Spalmitoylation de IFITM5 con FKBP11, no se formaría el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP y, por consiguiente, se inhibiría la expresión génica inducida por interferón, ya que el CD9 seguiría asociado con el complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9. En este sentido, especulamos que el IFITM5 está involucrado en la actividad del sistema inmunitario en las células osteoblastadas y la interacción del IFITM5 palmitoilado S con el FKBP11 regula la actividad inmune. Además, se sugirió que la S-palmitoilación en el IFITM5 contribuye a la formación de nódulos óseos, incluyendo la morfología y el tiempo de mineralización, en las células osteoblastadas (Figura 5). Es difícil concluir en la actualidad que la falta de la S-palmitoilación en el IFITM5 causa la difusión de los nódulos óseos (panel b de la Figura 5 -E); sin embargo, podemos decir que el IFITM5 probablemente no será S-palmitoilado en las células en presencia de 2BP. Mientras que el 2BP se utiliza comúnmente como inhibidor de la palmitoilación, también se dirige a muchas enzimas Por lo tanto, también es difícil interpretar los resultados de la incubación a largo plazo de las células osteoblásticas en presencia de 2BP. En cualquier caso, estas son observaciones interesantes y clave en términos de aclarar el papel desempeñado por la S-palmitoilación de IFITM5 en la formación ósea, y se requieren estudios adicionales. La Figura 6 describe un posible mecanismo de la interacción de IFITM5 con FKBP11 y el papel de IFITM5 en la función celular osteoblástica mediante una comparación con IFITM3. En el caso de IFITM3, como se muestra en la Figura 6 -A, se observan los siguientes. i) Las tres cisteinas son todas S-palmitoiladas (ii). La S-palmitoilación conduce a la agrupación y el posicionamiento correcto de moléculas IFITM3 en la membrana (iii). La espalmitoilación y la siguiente agrupación son cruciales para la resistencia al virus de la gripe. Cuando IFITM3 carece de la espalmitoilación, las moléculas de IFITM3 no se agrupan, lo que conduce a la disminución significativa de la actividad antiviral. Por otro lado, la Figura 6 -B muestra que las siguientes observaciones se hacen en el caso de IFITM5. i) Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados (ii). El S-palmitoilado IFITM5 es capaz de interactuar específicamente con FKBP11. Se supone que la interacción está mediada por el ácido palmítico unido a la cisteína frente a la superficie de interacción en FKBP11. Cys86 está involucrado en la palmitoilación S, pero no en la interacción de IFITM5 con FKBP11. En la actualidad, sin embargo, poco se sabe sobre el papel de la palmitoilación S de IFITM5 para la localización en la membrana. Cuando la palmitoilación S afecta la localización de IFITM5 como en el caso de IFITM3 [10], las moléculas S-palmitoiladas IFITM5 deben ser localizadas en la membrana o las moléculas depalmitoiladas deben ser deslocalizadas. La pérdida de la interacción entre IFITM5 y FKBP11 podría deberse a una relocalización de la depalmitoilada IFITM5 que impide su asociación con FKBP11 (iii). El Spalmitoilado IFITM5 interactúa con el complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 a través del FKBP11, que induce la disociación del CD9 del complejo y la expresión de 5 genes inmunológicamente relevantes. Finalmente, el IFITM5 forma el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP. Se desconoce en la actualidad cuál de los tres estados (i)~(iii) ilustrados en la Figura 6-B es importante para la mineralización ósea de las células osteoblásticas. La falta de la S-palmitoilación influye en la interacción con el FKBP11, que podría explicar la siguiente formación compleja y expresión génica. Además, la formación de nódulos óseos también se ve afectada. Se indica que la S-palmitoilación en IFITM5 juega un papel no sólo en la regulación de la actividad inmune sino también en la formación ósea. En conclusión, hemos revelado la S-palmitoilación en IFITM5 y su papel en la interacción con FKBP11. No sólo la actividad inmune sino también la mineralización ósea en las células osteoblásticas se ve afectada por la S-palmitoilación. En general, el papel funcional de la S-palmitoilación es diferente para cada proteína [36]. Para muchas proteínas, el ciclo de palmitoilación y despalmitoilación es constitutivo y regulado por enzimas. Basado en los resultados actuales, es difícil abordar (i) si la S-palmitoilación en IFITM5 es constitutiva o regulada, o (ii) cuando y donde IFITM5 es S-palmitoilada en las células osteoblásticas. Se necesitan más estudios y actualmente se están realizando.

¿Qué aminoácido podría estar involucrado en la unión al calcio en la región C-terminal de una proteína?

Primera secuencia completa del genoma de una cepa del coronavirus bovino francéshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5477389/SHA: eef0ecf5b8e7b179dadaef967e65f2ab68f021e1Autores: Kin, Nathalie; Guerard, Pauline; Diancourt, Laure; Caro, Valérie; Vabret, Astrid; Ar Gouilh, MeriadegFecha: 2017-05-25DOI: 10.1128/genomea.00319-17Licencia: cc-byAbstract: Secuenciamos la primera secuencia completa del genoma de Bovine (BCoV) de Francia. Esta BCoV fue secuenciada directamente a partir de una muestra fecal recolectada de un becerro en Normandía Texto: El coronavirus ovino B (BCoV) pertenece al orden Nidovirales, a la familia Coronaviridae, a la subfamilia Coronavirinae y al betacoronavirus (https://talk.ictvonline.org/ ICTV/propostions/2008.085-122V.v4.Coronaviridae.pdf). Su genoma es un ARN de una sola cadena, lineal y no segmentado de alrededor de 31 kb. BCoV es responsable de enfermedades respiratorias y entéricas en el ganado bovino, particularmente durante el invierno (1, 2). Hasta la fecha, las 19 secuencias completas del genoma BCoV disponibles en las bases de datos GenBank (consultadas el 17 de enero de 2017) originadas en Estados Unidos o Asia. Aquí informamos de la primera secuencia completa del genoma de un BCoV detectado en Francia. La cepa BCoV/FRA-EPI/CAEN/2014/13 se obtuvo de una muestra fecal recolectada de un ternero de 1 semana de edad en Normandía en 2014. La presencia de BCoV en la muestra fecal se evaluó utilizando una transcripción inversa interna-PCR (RT-PCR) dirigida al gen M (3). Se sintetizó una biblioteca de cDNA utilizando SuperScript III (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y hexameros. La secuenciación completa del genoma de los productos PCR superpuestos se llevó a cabo en ambas direcciones, utilizando imprimadores originales y la secuenciación dideoxida de Sanger. Se realizaron reacciones secuenciales como se describió previamente (3). Se montaron secuencias y se anotó utilizando el software Geneious (versión 5.1.6). Obtuvimos una secuencia contando 30.847 nucleótidos. Los genes orf1ab, HE, S, ns5, E, M y N del BCoV obtenido fueron sometidos a un análisis de Blastn. De acuerdo con estos análisis, el gen orf1ab (20kb nucleótidos, localizado en el lado 5= del genoma) está estrechamente relacionado con el coronavirus de camellos dromedario (DcCoV) HKU23-23-362F cepa de los Emiratos Árabes Unidos (adhesión no KF906251), con una identidad nucleótida de 99,19%. Por el contrario, los genes NS2, HE, S, ns5, y M están estrechamente relacionados con la cepa BCoV Bubalus/Italia/179/07-11 (adhesión no EU019216), con identidades nucleótidas de 99,88, 99,45%, 99,02%, 98,79% El gen E está estrechamente relacionado con la cepa china del coronavirus bovino BCV-AKS-01 (adhesión no. KU886219), con una identidad de nucleótidos del 100%. Finalmente, se encontró la puntuación más alta de Blastn para el gen N con el BCoV-ENT entérico americano (adhesión no. AF391541), asociado con una identidad de nucleótidos del 100%. La alineación de múltiples secuencias, incluyendo 20 BCoV y 10 clado Un betacoronavirus estrechamente relacionado con BCoV de América del Norte, dos DcCoV de los Emiratos Árabes Unidos, y dos cepas del coronavirus humano OC43 (HCoV-OC43) de Francia, se realizó utilizando el algoritmo muscular implementado en MEGA7 (4, 5). El análisis filogenético sobre el orf1ab confirma que BCoV/FRA-EPI/CAEN/2014/13 está estrechamente relacionado con el coronavirus de camellos dromedario (DcCoV) HKU23-23-362F. El gen orf1ab de estos dos virus agrupados por separado de los virus de BCoV y BCoV similares a los de América del Norte y Asia. Este hallazgo también confirma los resultados de nuestro análisis previo sobre genomas parciales en los que los genes nsp12, S y N de BCoVs americanos y asiáticos se agrupan en un grupo llamado tentativamente C 1. Las regiones de codificación nsp12 y N de BCoVs de Francia y DcCoVs de los Emiratos Árabes Unidos agrupados en C 2. El gen DcCoV S individualizado a partir de ambos genes HCoV-OC43 y BCoV Los posibles eventos de recombinación podrían estar en el origen de DcCoV. Número(s) de adhesión. La secuencia completa de secuencia del genoma del aislado BCoV/FRA-EPI/CAEN/2014/13 ha sido depositada en GenBank bajo el número de adhesión KX982264.

¿Cuál es el tamaño del coronavirus bovino?

Primera secuencia completa del genoma de una cepa del coronavirus bovino francéshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5477389/SHA: eef0ecf5b8e7b179dadaef967e65f2ab68f021e1Autores: Kin, Nathalie; Guerard, Pauline; Diancourt, Laure; Caro, Valérie; Vabret, Astrid; Ar Gouilh, MeriadegFecha: 2017-05-25DOI: 10.1128/genomea.00319-17Licencia: cc-byAbstract: Secuenciamos la primera secuencia completa del genoma de Bovine (BCoV) de Francia. Esta BCoV fue secuenciada directamente a partir de una muestra fecal recolectada de un becerro en Normandía Texto: El coronavirus ovino B (BCoV) pertenece al orden Nidovirales, a la familia Coronaviridae, a la subfamilia Coronavirinae y al betacoronavirus (https://talk.ictvonline.org/ ICTV/propostions/2008.085-122V.v4.Coronaviridae.pdf). Su genoma es un ARN de una sola cadena, lineal y no segmentado de alrededor de 31 kb. BCoV es responsable de enfermedades respiratorias y entéricas en el ganado bovino, particularmente durante el invierno (1, 2). Hasta la fecha, las 19 secuencias completas del genoma BCoV disponibles en las bases de datos GenBank (consultadas el 17 de enero de 2017) originadas en Estados Unidos o Asia. Aquí informamos de la primera secuencia completa del genoma de un BCoV detectado en Francia. La cepa BCoV/FRA-EPI/CAEN/2014/13 se obtuvo de una muestra fecal recolectada de un ternero de 1 semana de edad en Normandía en 2014. La presencia de BCoV en la muestra fecal se evaluó utilizando una transcripción inversa interna-PCR (RT-PCR) dirigida al gen M (3). Se sintetizó una biblioteca de cDNA utilizando SuperScript III (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y hexameros. La secuenciación completa del genoma de los productos PCR superpuestos se llevó a cabo en ambas direcciones, utilizando imprimadores originales y la secuenciación dideoxida de Sanger. Se realizaron reacciones secuenciales como se describió previamente (3). Se montaron secuencias y se anotó utilizando el software Geneious (versión 5.1.6). Obtuvimos una secuencia contando 30.847 nucleótidos. Los genes orf1ab, HE, S, ns5, E, M y N del BCoV obtenido fueron sometidos a un análisis de Blastn. De acuerdo con estos análisis, el gen orf1ab (20kb nucleótidos, localizado en el lado 5= del genoma) está estrechamente relacionado con el coronavirus de camellos dromedario (DcCoV) HKU23-23-362F cepa de los Emiratos Árabes Unidos (adhesión no KF906251), con una identidad nucleótida de 99,19%. Por el contrario, los genes NS2, HE, S, ns5, y M están estrechamente relacionados con la cepa BCoV Bubalus/Italia/179/07-11 (adhesión no EU019216), con identidades nucleótidas de 99,88, 99,45%, 99,02%, 98,79% El gen E está estrechamente relacionado con la cepa china del coronavirus bovino BCV-AKS-01 (adhesión no. KU886219), con una identidad de nucleótidos del 100%. Finalmente, se encontró la puntuación más alta de Blastn para el gen N con el BCoV-ENT entérico americano (adhesión no. AF391541), asociado con una identidad de nucleótidos del 100%. La alineación de múltiples secuencias, incluyendo 20 BCoV y 10 clado Un betacoronavirus estrechamente relacionado con BCoV de América del Norte, dos DcCoV de los Emiratos Árabes Unidos, y dos cepas del coronavirus humano OC43 (HCoV-OC43) de Francia, se realizó utilizando el algoritmo muscular implementado en MEGA7 (4, 5). El análisis filogenético sobre el orf1ab confirma que BCoV/FRA-EPI/CAEN/2014/13 está estrechamente relacionado con el coronavirus de camellos dromedario (DcCoV) HKU23-23-362F. El gen orf1ab de estos dos virus agrupados por separado de los virus de BCoV y BCoV similares a los de América del Norte y Asia. Este hallazgo también confirma los resultados de nuestro análisis previo sobre genomas parciales en los que los genes nsp12, S y N de BCoVs americanos y asiáticos se agrupan en un grupo llamado tentativamente C 1. Las regiones de codificación nsp12 y N de BCoVs de Francia y DcCoVs de los Emiratos Árabes Unidos agrupados en C 2. El gen DcCoV S individualizado a partir de ambos genes HCoV-OC43 y BCoV Los posibles eventos de recombinación podrían estar en el origen de DcCoV. Número(s) de adhesión. La secuencia completa de secuencia del genoma del aislado BCoV/FRA-EPI/CAEN/2014/13 ha sido depositada en GenBank bajo el número de adhesión KX982264.

¿Cuántos nucleótidos contiene el coronavirus bovino?

Primera secuencia completa del genoma de una cepa del coronavirus bovino francéshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5477389/SHA: eef0ecf5b8e7b179dadaef967e65f2ab68f021e1Autores: Kin, Nathalie; Guerard, Pauline; Diancourt, Laure; Caro, Valérie; Vabret, Astrid; Ar Gouilh, MeriadegFecha: 2017-05-25DOI: 10.1128/genomea.00319-17Licencia: cc-byAbstract: Secuenciamos la primera secuencia completa del genoma de Bovine (BCoV) de Francia. Esta BCoV fue secuenciada directamente a partir de una muestra fecal recolectada de un becerro en Normandía Texto: El coronavirus ovino B (BCoV) pertenece al orden Nidovirales, a la familia Coronaviridae, a la subfamilia Coronavirinae y al betacoronavirus (https://talk.ictvonline.org/ ICTV/propostions/2008.085-122V.v4.Coronaviridae.pdf). Su genoma es un ARN de una sola cadena, lineal y no segmentado de alrededor de 31 kb. BCoV es responsable de enfermedades respiratorias y entéricas en el ganado bovino, particularmente durante el invierno (1, 2). Hasta la fecha, las 19 secuencias completas del genoma BCoV disponibles en las bases de datos GenBank (consultadas el 17 de enero de 2017) originadas en Estados Unidos o Asia. Aquí informamos de la primera secuencia completa del genoma de un BCoV detectado en Francia. La cepa BCoV/FRA-EPI/CAEN/2014/13 se obtuvo de una muestra fecal recolectada de un ternero de 1 semana de edad en Normandía en 2014. La presencia de BCoV en la muestra fecal se evaluó utilizando una transcripción inversa interna-PCR (RT-PCR) dirigida al gen M (3). Se sintetizó una biblioteca de cDNA utilizando SuperScript III (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y hexameros. La secuenciación completa del genoma de los productos PCR superpuestos se llevó a cabo en ambas direcciones, utilizando imprimadores originales y la secuenciación dideoxida de Sanger. Se realizaron reacciones secuenciales como se describió previamente (3). Se montaron secuencias y se anotó utilizando el software Geneious (versión 5.1.6). Obtuvimos una secuencia contando 30.847 nucleótidos. Los genes orf1ab, HE, S, ns5, E, M y N del BCoV obtenido fueron sometidos a un análisis de Blastn. De acuerdo con estos análisis, el gen orf1ab (20kb nucleótidos, localizado en el lado 5= del genoma) está estrechamente relacionado con el coronavirus de camellos dromedario (DcCoV) HKU23-23-362F cepa de los Emiratos Árabes Unidos (adhesión no KF906251), con una identidad nucleótida de 99,19%. Por el contrario, los genes NS2, HE, S, ns5, y M están estrechamente relacionados con la cepa BCoV Bubalus/Italia/179/07-11 (adhesión no EU019216), con identidades nucleótidas de 99,88, 99,45%, 99,02%, 98,79% El gen E está estrechamente relacionado con la cepa china del coronavirus bovino BCV-AKS-01 (adhesión no. KU886219), con una identidad de nucleótidos del 100%. Finalmente, se encontró la puntuación más alta de Blastn para el gen N con el BCoV-ENT entérico americano (adhesión no. AF391541), asociado con una identidad de nucleótidos del 100%. La alineación de múltiples secuencias, incluyendo 20 BCoV y 10 clado Un betacoronavirus estrechamente relacionado con BCoV de América del Norte, dos DcCoV de los Emiratos Árabes Unidos, y dos cepas del coronavirus humano OC43 (HCoV-OC43) de Francia, se realizó utilizando el algoritmo muscular implementado en MEGA7 (4, 5). El análisis filogenético sobre el orf1ab confirma que BCoV/FRA-EPI/CAEN/2014/13 está estrechamente relacionado con el coronavirus de camellos dromedario (DcCoV) HKU23-23-362F. El gen orf1ab de estos dos virus agrupados por separado de los virus de BCoV y BCoV similares a los de América del Norte y Asia. Este hallazgo también confirma los resultados de nuestro análisis previo sobre genomas parciales en los que los genes nsp12, S y N de BCoVs americanos y asiáticos se agrupan en un grupo llamado tentativamente C 1. Las regiones de codificación nsp12 y N de BCoVs de Francia y DcCoVs de los Emiratos Árabes Unidos agrupados en C 2. El gen DcCoV S individualizado a partir de ambos genes HCoV-OC43 y BCoV Los posibles eventos de recombinación podrían estar en el origen de DcCoV. Número(s) de adhesión. La secuencia completa de secuencia del genoma del aislado BCoV/FRA-EPI/CAEN/2014/13 ha sido depositada en GenBank bajo el número de adhesión KX982264.

¿Cuál es el tamaño del gen orf1ab en el coronavirus bovino?

Características clínicas específicas de la infección por coronavirus humano entre adolescentes y adultos sanoshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5820427/SHA: edfe02a438fa9b667313da8f03614303fc2a4a14Autores: Bouvier, Monique; Chen, Wei-Ju; Arnold, John C.; Fairchok, Mary P.; Danaher, Patrick J.; Lalani, Tahaniyat; Malone, Leslie; Mor, Deepika; Ridoré, Michelande; Burgess, Timothy H.; Millar, Eugene V.Fecha: 2018-02-02DOI: 10.11111/irv.12538Licencia: cc-byAbstract: El coronavirus humano (HCoV) es una causa conocida En un estudio multisite, observacional y longitudinal de ILI entre adolescentes y adultos sanos, el 12% de los sujetos fueron PCR positivos para HCoV. La distribución de especies fue la siguiente: HCoV-OC43 (34%), HCoV-229E (28%), HCoV-NL63 (22%) y HCoV-HKU1 (16%). No observamos diferencias específicas de especies en las características clínicas de la infección por HCoV, con la excepción de HCoV-HKU1, para la cual la gravedad de los síntomas gastrointestinales tendió más alta en el cuarto día de la enfermedad. Texto: Las manifestaciones clínicas de la infección por coronavirus humano (HCoV) van desde una enfermedad leve y autolimitante del tracto respiratorio superior a un síndrome de distrés respiratorio agudo con una alta tasa de mortalidad. Las especies altamente virulentas de HCoV fueron responsables de brotes de síndrome respiratorio agudo grave (SARS) y síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS); las tasas de mortalidad de los casos oscilaron entre el 14% y el 45%. [1] [2] [3] Por el contrario, otras especies de HCoV (HCoV-HKU1, HCoV-OC43, HCoV-NL63 y HCoV-229E) son mucho más prevalentes, mucho menos graves, y causas comunes de enfermedad similar a la gripe (ILI). [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] Cinco estudios anteriores han descrito las características clínicas específicas de la infección por HCoV entre los adultos. 6, 7, [10] [11] [12] En dos de estos estudios, una proporción significativa de la población del estudio tenía condiciones médicas subyacentes. 6, 7 Describimos aquí, entre una cohorte de adolescentes sanos y adultos con enfermedad pseudogripal (ILI), la prevalencia específica de la especie y la gravedad de los síntomas asociados con la infección por HCoV. 13 Pacientes de 0 a 65 años de edad que presentaron atención < 72 horas después del inicio de los síntomas del ILI fueron reclutados para la participación en el estudio. ILI fue definido como una temperatura ≥100,4°F y dolor de garganta o uno de los siguientes síntomas respiratorios: tos, producción de esputo, falta de aliento o dolor torácico. Ambos pacientes internos y ambulatorios fueron elegibles para participar. Pacientes con condiciones médicas subyacentes (por ejemplo, diabetes, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asma grave), mujeres con un embarazo de alto riesgo o complicado, y pacientes con un trastorno psiquiátrico mal controlado fueron excluidos. A continuación, se instruyó a los participantes sobre el uso de un diario para registrar la presencia/severidad de los síntomas durante los 7 días siguientes a la aparición inicial de los síntomas. La gravedad de los síntomas se valoró en una escala ordinal de 0 (ninguna) a 3 (grave). Las puntuaciones de gravedad de los síntomas se cuantificaron utilizando las cinco medidas siguientes: i) puntuación individual de los síntomas para 20 síntomas, ii) puntuación de los síntomas respiratorios superiores, calculada como la suma de las puntuaciones de gravedad para dolor de oído, secreción nasal, dolor de garganta y estornudos, iii) puntuación de los síntomas respiratorios inferiores, calculada como la suma de las puntuaciones de gravedad para tos, dificultad para respirar, ronquera y molestias en el pecho, iv) puntuación de los síntomas gastrointestinales, calculada como la suma de las puntuaciones de gravedad para diarrea, vómitos, anorexia, náuseas y (Tabla 1) Los hallazgos de nuestro estudio, realizado durante un período de 5 años en cinco sitios geográficamente dispersos en los EE.UU., demuestran que el coronavirus humano (HCoV) es una importante causa de enfermedad similar a la gripe (ILI) varió entre el 4% y el 22%. [8] [9] [10] [11] 14 Además, encontramos que el HCoV-OC43to es la especie más común entre los adultos, como se ha informado en otros lugares. 8, 9, 11, 12, 14 HCoV-OC43 y HCoV-229E fueron las cepas más comunes en estaciones alternas, reflejando una variabilidad de temporada a temporada de la circulación de cepas de HCoV que se ha reportado en otros estudios plurianuales. 4 8 Los mecanismos por los cuales esta especie particular provoca estos síntomas no se conocen. Entre los puntos fuertes de este estudio de HCoV en adolescentes y adultos, de otra manera sanos, se encuentran su diseño multisitio y multianual, el uso de un panel diagnóstico multiplex, la recolección prospectiva de datos sintomáticos y el uso de una escala de severidad de síntomas similar a la empleada anteriormente. 15 Una limitación importante de este estudio fue nuestro reclutamiento selectivo de individuos que habían presentado a un centro de salud para el cuidado de un ILI. Por lo tanto, nuestros casos no son representativos de la infección por HCoV en la comunidad, donde los individuos con enfermedad leve y autolimitante debido a HCoV optan por no buscar atención médica para el manejo de su ILI. En resumen, hemos demostrado que el HCoV es una causa significativa de ILI entre adolescentes y adultos de otra forma saludables que se presentan para evaluación médica.

¿Cuál es una causa significativa de Influenze como enfermedad entre adolescentes sanos y adultos que se presentan para evaluación médica?

Características clínicas específicas de la infección por coronavirus humano entre adolescentes y adultos sanoshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5820427/SHA: edfe02a438fa9b667313da8f03614303fc2a4a14Autores: Bouvier, Monique; Chen, Wei-Ju; Arnold, John C.; Fairchok, Mary P.; Danaher, Patrick J.; Lalani, Tahaniyat; Malone, Leslie; Mor, Deepika; Ridoré, Michelande; Burgess, Timothy H.; Millar, Eugene V.Fecha: 2018-02-02DOI: 10.11111/irv.12538Licencia: cc-byAbstract: El coronavirus humano (HCoV) es una causa conocida En un estudio multisite, observacional y longitudinal de ILI entre adolescentes y adultos sanos, el 12% de los sujetos fueron PCR positivos para HCoV. La distribución de especies fue la siguiente: HCoV-OC43 (34%), HCoV-229E (28%), HCoV-NL63 (22%) y HCoV-HKU1 (16%). No observamos diferencias específicas de especies en las características clínicas de la infección por HCoV, con la excepción de HCoV-HKU1, para la cual la gravedad de los síntomas gastrointestinales tendió más alta en el cuarto día de la enfermedad. Texto: Las manifestaciones clínicas de la infección por coronavirus humano (HCoV) van desde una enfermedad leve y autolimitante del tracto respiratorio superior a un síndrome de distrés respiratorio agudo con una alta tasa de mortalidad. Las especies altamente virulentas de HCoV fueron responsables de brotes de síndrome respiratorio agudo grave (SARS) y síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS); las tasas de mortalidad de los casos oscilaron entre el 14% y el 45%. [1] [2] [3] Por el contrario, otras especies de HCoV (HCoV-HKU1, HCoV-OC43, HCoV-NL63 y HCoV-229E) son mucho más prevalentes, mucho menos graves, y causas comunes de enfermedad similar a la gripe (ILI). [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] Cinco estudios anteriores han descrito las características clínicas específicas de la infección por HCoV entre los adultos. 6, 7, [10] [11] [12] En dos de estos estudios, una proporción significativa de la población del estudio tenía condiciones médicas subyacentes. 6, 7 Describimos aquí, entre una cohorte de adolescentes sanos y adultos con enfermedad pseudogripal (ILI), la prevalencia específica de la especie y la gravedad de los síntomas asociados con la infección por HCoV. 13 Pacientes de 0 a 65 años de edad que presentaron atención < 72 horas después del inicio de los síntomas del ILI fueron reclutados para la participación en el estudio. ILI fue definido como una temperatura ≥100,4°F y dolor de garganta o uno de los siguientes síntomas respiratorios: tos, producción de esputo, falta de aliento o dolor torácico. Ambos pacientes internos y ambulatorios fueron elegibles para participar. Pacientes con condiciones médicas subyacentes (por ejemplo, diabetes, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asma grave), mujeres con un embarazo de alto riesgo o complicado, y pacientes con un trastorno psiquiátrico mal controlado fueron excluidos. A continuación, se instruyó a los participantes sobre el uso de un diario para registrar la presencia/severidad de los síntomas durante los 7 días siguientes a la aparición inicial de los síntomas. La gravedad de los síntomas se valoró en una escala ordinal de 0 (ninguna) a 3 (grave). Las puntuaciones de gravedad de los síntomas se cuantificaron utilizando las cinco medidas siguientes: i) puntuación individual de los síntomas para 20 síntomas, ii) puntuación de los síntomas respiratorios superiores, calculada como la suma de las puntuaciones de gravedad para dolor de oído, secreción nasal, dolor de garganta y estornudos, iii) puntuación de los síntomas respiratorios inferiores, calculada como la suma de las puntuaciones de gravedad para tos, dificultad para respirar, ronquera y molestias en el pecho, iv) puntuación de los síntomas gastrointestinales, calculada como la suma de las puntuaciones de gravedad para diarrea, vómitos, anorexia, náuseas y (Tabla 1) Los hallazgos de nuestro estudio, realizado durante un período de 5 años en cinco sitios geográficamente dispersos en los EE.UU., demuestran que el coronavirus humano (HCoV) es una importante causa de enfermedad similar a la gripe (ILI) varió entre el 4% y el 22%. [8] [9] [10] [11] 14 Además, encontramos que el HCoV-OC43to es la especie más común entre los adultos, como se ha informado en otros lugares. 8, 9, 11, 12, 14 HCoV-OC43 y HCoV-229E fueron las cepas más comunes en estaciones alternas, reflejando una variabilidad de temporada a temporada de la circulación de cepas de HCoV que se ha reportado en otros estudios plurianuales. 4 8 Los mecanismos por los cuales esta especie particular provoca estos síntomas no se conocen. Entre los puntos fuertes de este estudio de HCoV en adolescentes y adultos, de otra manera sanos, se encuentran su diseño multisitio y multianual, el uso de un panel diagnóstico multiplex, la recolección prospectiva de datos sintomáticos y el uso de una escala de severidad de síntomas similar a la empleada anteriormente. 15 Una limitación importante de este estudio fue nuestro reclutamiento selectivo de individuos que habían presentado a un centro de salud para el cuidado de un ILI. Por lo tanto, nuestros casos no son representativos de la infección por HCoV en la comunidad, donde los individuos con enfermedad leve y autolimitante debido a HCoV optan por no buscar atención médica para el manejo de su ILI. En resumen, hemos demostrado que el HCoV es una causa significativa de ILI entre adolescentes y adultos de otra forma saludables que se presentan para evaluación médica.

¿Cuál es la especie más común del Coronavirus Humano entre los adultos?

Características clínicas específicas de la infección por coronavirus humano entre adolescentes y adultos sanoshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5820427/SHA: edfe02a438fa9b667313da8f03614303fc2a4a14Autores: Bouvier, Monique; Chen, Wei-Ju; Arnold, John C.; Fairchok, Mary P.; Danaher, Patrick J.; Lalani, Tahaniyat; Malone, Leslie; Mor, Deepika; Ridoré, Michelande; Burgess, Timothy H.; Millar, Eugene V.Fecha: 2018-02-02DOI: 10.11111/irv.12538Licencia: cc-byAbstract: El coronavirus humano (HCoV) es una causa conocida En un estudio multisite, observacional y longitudinal de ILI entre adolescentes y adultos sanos, el 12% de los sujetos fueron PCR positivos para HCoV. La distribución de especies fue la siguiente: HCoV-OC43 (34%), HCoV-229E (28%), HCoV-NL63 (22%) y HCoV-HKU1 (16%). No observamos diferencias específicas de especies en las características clínicas de la infección por HCoV, con la excepción de HCoV-HKU1, para la cual la gravedad de los síntomas gastrointestinales tendió más alta en el cuarto día de la enfermedad. Texto: Las manifestaciones clínicas de la infección por coronavirus humano (HCoV) van desde una enfermedad leve y autolimitante del tracto respiratorio superior a un síndrome de distrés respiratorio agudo con una alta tasa de mortalidad. Las especies altamente virulentas de HCoV fueron responsables de brotes de síndrome respiratorio agudo grave (SARS) y síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS); las tasas de mortalidad de los casos oscilaron entre el 14% y el 45%. [1] [2] [3] Por el contrario, otras especies de HCoV (HCoV-HKU1, HCoV-OC43, HCoV-NL63 y HCoV-229E) son mucho más prevalentes, mucho menos graves, y causas comunes de enfermedad similar a la gripe (ILI). [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] Cinco estudios anteriores han descrito las características clínicas específicas de la infección por HCoV entre los adultos. 6, 7, [10] [11] [12] En dos de estos estudios, una proporción significativa de la población del estudio tenía condiciones médicas subyacentes. 6, 7 Describimos aquí, entre una cohorte de adolescentes sanos y adultos con enfermedad pseudogripal (ILI), la prevalencia específica de la especie y la gravedad de los síntomas asociados con la infección por HCoV. 13 Pacientes de 0 a 65 años de edad que presentaron atención < 72 horas después del inicio de los síntomas del ILI fueron reclutados para la participación en el estudio. ILI fue definido como una temperatura ≥100,4°F y dolor de garganta o uno de los siguientes síntomas respiratorios: tos, producción de esputo, falta de aliento o dolor torácico. Ambos pacientes internos y ambulatorios fueron elegibles para participar. Pacientes con condiciones médicas subyacentes (por ejemplo, diabetes, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asma grave), mujeres con un embarazo de alto riesgo o complicado, y pacientes con un trastorno psiquiátrico mal controlado fueron excluidos. A continuación, se instruyó a los participantes sobre el uso de un diario para registrar la presencia/severidad de los síntomas durante los 7 días siguientes a la aparición inicial de los síntomas. La gravedad de los síntomas se valoró en una escala ordinal de 0 (ninguna) a 3 (grave). Las puntuaciones de gravedad de los síntomas se cuantificaron utilizando las cinco medidas siguientes: i) puntuación individual de los síntomas para 20 síntomas, ii) puntuación de los síntomas respiratorios superiores, calculada como la suma de las puntuaciones de gravedad para dolor de oído, secreción nasal, dolor de garganta y estornudos, iii) puntuación de los síntomas respiratorios inferiores, calculada como la suma de las puntuaciones de gravedad para tos, dificultad para respirar, ronquera y molestias en el pecho, iv) puntuación de los síntomas gastrointestinales, calculada como la suma de las puntuaciones de gravedad para diarrea, vómitos, anorexia, náuseas y (Tabla 1) Los hallazgos de nuestro estudio, realizado durante un período de 5 años en cinco sitios geográficamente dispersos en los EE.UU., demuestran que el coronavirus humano (HCoV) es una importante causa de enfermedad similar a la gripe (ILI) varió entre el 4% y el 22%. [8] [9] [10] [11] 14 Además, encontramos que el HCoV-OC43to es la especie más común entre los adultos, como se ha informado en otros lugares. 8, 9, 11, 12, 14 HCoV-OC43 y HCoV-229E fueron las cepas más comunes en estaciones alternas, reflejando una variabilidad de temporada a temporada de la circulación de cepas de HCoV que se ha reportado en otros estudios plurianuales. 4 8 Los mecanismos por los cuales esta especie particular provoca estos síntomas no se conocen. Entre los puntos fuertes de este estudio de HCoV en adolescentes y adultos, de otra manera sanos, se encuentran su diseño multisitio y multianual, el uso de un panel diagnóstico multiplex, la recolección prospectiva de datos sintomáticos y el uso de una escala de severidad de síntomas similar a la empleada anteriormente. 15 Una limitación importante de este estudio fue nuestro reclutamiento selectivo de individuos que habían presentado a un centro de salud para el cuidado de un ILI. Por lo tanto, nuestros casos no son representativos de la infección por HCoV en la comunidad, donde los individuos con enfermedad leve y autolimitante debido a HCoV optan por no buscar atención médica para el manejo de su ILI. En resumen, hemos demostrado que el HCoV es una causa significativa de ILI entre adolescentes y adultos de otra forma saludables que se presentan para evaluación médica.

¿Qué Coronavirus humano mostró características clínicas específicas de su infección?

Características clínicas específicas de la infección por coronavirus humano entre adolescentes y adultos sanoshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5820427/SHA: edfe02a438fa9b667313da8f03614303fc2a4a14Autores: Bouvier, Monique; Chen, Wei-Ju; Arnold, John C.; Fairchok, Mary P.; Danaher, Patrick J.; Lalani, Tahaniyat; Malone, Leslie; Mor, Deepika; Ridoré, Michelande; Burgess, Timothy H.; Millar, Eugene V.Fecha: 2018-02-02DOI: 10.11111/irv.12538Licencia: cc-byAbstract: El coronavirus humano (HCoV) es una causa conocida En un estudio multisite, observacional y longitudinal de ILI entre adolescentes y adultos sanos, el 12% de los sujetos fueron PCR positivos para HCoV. La distribución de especies fue la siguiente: HCoV-OC43 (34%), HCoV-229E (28%), HCoV-NL63 (22%) y HCoV-HKU1 (16%). No observamos diferencias específicas de especies en las características clínicas de la infección por HCoV, con la excepción de HCoV-HKU1, para la cual la gravedad de los síntomas gastrointestinales tendió más alta en el cuarto día de la enfermedad. Texto: Las manifestaciones clínicas de la infección por coronavirus humano (HCoV) van desde una enfermedad leve y autolimitante del tracto respiratorio superior a un síndrome de distrés respiratorio agudo con una alta tasa de mortalidad. Las especies altamente virulentas de HCoV fueron responsables de brotes de síndrome respiratorio agudo grave (SARS) y síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS); las tasas de mortalidad de los casos oscilaron entre el 14% y el 45%. [1] [2] [3] Por el contrario, otras especies de HCoV (HCoV-HKU1, HCoV-OC43, HCoV-NL63 y HCoV-229E) son mucho más prevalentes, mucho menos graves, y causas comunes de enfermedad similar a la gripe (ILI). [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] Cinco estudios anteriores han descrito las características clínicas específicas de la infección por HCoV entre los adultos. 6, 7, [10] [11] [12] En dos de estos estudios, una proporción significativa de la población del estudio tenía condiciones médicas subyacentes. 6, 7 Describimos aquí, entre una cohorte de adolescentes sanos y adultos con enfermedad pseudogripal (ILI), la prevalencia específica de la especie y la gravedad de los síntomas asociados con la infección por HCoV. 13 Pacientes de 0 a 65 años de edad que presentaron atención < 72 horas después del inicio de los síntomas del ILI fueron reclutados para la participación en el estudio. ILI fue definido como una temperatura ≥100,4°F y dolor de garganta o uno de los siguientes síntomas respiratorios: tos, producción de esputo, falta de aliento o dolor torácico. Ambos pacientes internos y ambulatorios fueron elegibles para participar. Pacientes con condiciones médicas subyacentes (por ejemplo, diabetes, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asma grave), mujeres con un embarazo de alto riesgo o complicado, y pacientes con un trastorno psiquiátrico mal controlado fueron excluidos. A continuación, se instruyó a los participantes sobre el uso de un diario para registrar la presencia/severidad de los síntomas durante los 7 días siguientes a la aparición inicial de los síntomas. La gravedad de los síntomas se valoró en una escala ordinal de 0 (ninguna) a 3 (grave). Las puntuaciones de gravedad de los síntomas se cuantificaron utilizando las cinco medidas siguientes: i) puntuación individual de los síntomas para 20 síntomas, ii) puntuación de los síntomas respiratorios superiores, calculada como la suma de las puntuaciones de gravedad para dolor de oído, secreción nasal, dolor de garganta y estornudos, iii) puntuación de los síntomas respiratorios inferiores, calculada como la suma de las puntuaciones de gravedad para tos, dificultad para respirar, ronquera y molestias en el pecho, iv) puntuación de los síntomas gastrointestinales, calculada como la suma de las puntuaciones de gravedad para diarrea, vómitos, anorexia, náuseas y (Tabla 1) Los hallazgos de nuestro estudio, realizado durante un período de 5 años en cinco sitios geográficamente dispersos en los EE.UU., demuestran que el coronavirus humano (HCoV) es una importante causa de enfermedad similar a la gripe (ILI) varió entre el 4% y el 22%. [8] [9] [10] [11] 14 Además, encontramos que el HCoV-OC43to es la especie más común entre los adultos, como se ha informado en otros lugares. 8, 9, 11, 12, 14 HCoV-OC43 y HCoV-229E fueron las cepas más comunes en estaciones alternas, reflejando una variabilidad de temporada a temporada de la circulación de cepas de HCoV que se ha reportado en otros estudios plurianuales. 4 8 Los mecanismos por los cuales esta especie particular provoca estos síntomas no se conocen. Entre los puntos fuertes de este estudio de HCoV en adolescentes y adultos, de otra manera sanos, se encuentran su diseño multisitio y multianual, el uso de un panel diagnóstico multiplex, la recolección prospectiva de datos sintomáticos y el uso de una escala de severidad de síntomas similar a la empleada anteriormente. 15 Una limitación importante de este estudio fue nuestro reclutamiento selectivo de individuos que habían presentado a un centro de salud para el cuidado de un ILI. Por lo tanto, nuestros casos no son representativos de la infección por HCoV en la comunidad, donde los individuos con enfermedad leve y autolimitante debido a HCoV optan por no buscar atención médica para el manejo de su ILI. En resumen, hemos demostrado que el HCoV es una causa significativa de ILI entre adolescentes y adultos de otra forma saludables que se presentan para evaluación médica.

¿Cuáles fueron las cepas comunes de HCOV en el estudio de 5 años en EE.UU.?

Características clínicas específicas de la infección por coronavirus humano entre adolescentes y adultos sanoshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5820427/SHA: edfe02a438fa9b667313da8f03614303fc2a4a14Autores: Bouvier, Monique; Chen, Wei-Ju; Arnold, John C.; Fairchok, Mary P.; Danaher, Patrick J.; Lalani, Tahaniyat; Malone, Leslie; Mor, Deepika; Ridoré, Michelande; Burgess, Timothy H.; Millar, Eugene V.Fecha: 2018-02-02DOI: 10.11111/irv.12538Licencia: cc-byAbstract: El coronavirus humano (HCoV) es una causa conocida En un estudio multisite, observacional y longitudinal de ILI entre adolescentes y adultos sanos, el 12% de los sujetos fueron PCR positivos para HCoV. La distribución de especies fue la siguiente: HCoV-OC43 (34%), HCoV-229E (28%), HCoV-NL63 (22%) y HCoV-HKU1 (16%). No observamos diferencias específicas de especies en las características clínicas de la infección por HCoV, con la excepción de HCoV-HKU1, para la cual la gravedad de los síntomas gastrointestinales tendió más alta en el cuarto día de la enfermedad. Texto: Las manifestaciones clínicas de la infección por coronavirus humano (HCoV) van desde una enfermedad leve y autolimitante del tracto respiratorio superior a un síndrome de distrés respiratorio agudo con una alta tasa de mortalidad. Las especies altamente virulentas de HCoV fueron responsables de brotes de síndrome respiratorio agudo grave (SARS) y síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS); las tasas de mortalidad de los casos oscilaron entre el 14% y el 45%. [1] [2] [3] Por el contrario, otras especies de HCoV (HCoV-HKU1, HCoV-OC43, HCoV-NL63 y HCoV-229E) son mucho más prevalentes, mucho menos graves, y causas comunes de enfermedad similar a la gripe (ILI). [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] Cinco estudios anteriores han descrito las características clínicas específicas de la infección por HCoV entre los adultos. 6, 7, [10] [11] [12] En dos de estos estudios, una proporción significativa de la población del estudio tenía condiciones médicas subyacentes. 6, 7 Describimos aquí, entre una cohorte de adolescentes sanos y adultos con enfermedad pseudogripal (ILI), la prevalencia específica de la especie y la gravedad de los síntomas asociados con la infección por HCoV. 13 Pacientes de 0 a 65 años de edad que presentaron atención < 72 horas después del inicio de los síntomas del ILI fueron reclutados para la participación en el estudio. ILI fue definido como una temperatura ≥100,4°F y dolor de garganta o uno de los siguientes síntomas respiratorios: tos, producción de esputo, falta de aliento o dolor torácico. Ambos pacientes internos y ambulatorios fueron elegibles para participar. Pacientes con condiciones médicas subyacentes (por ejemplo, diabetes, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asma grave), mujeres con un embarazo de alto riesgo o complicado, y pacientes con un trastorno psiquiátrico mal controlado fueron excluidos. A continuación, se instruyó a los participantes sobre el uso de un diario para registrar la presencia/severidad de los síntomas durante los 7 días siguientes a la aparición inicial de los síntomas. La gravedad de los síntomas se valoró en una escala ordinal de 0 (ninguna) a 3 (grave). Las puntuaciones de gravedad de los síntomas se cuantificaron utilizando las cinco medidas siguientes: i) puntuación individual de los síntomas para 20 síntomas, ii) puntuación de los síntomas respiratorios superiores, calculada como la suma de las puntuaciones de gravedad para dolor de oído, secreción nasal, dolor de garganta y estornudos, iii) puntuación de los síntomas respiratorios inferiores, calculada como la suma de las puntuaciones de gravedad para tos, dificultad para respirar, ronquera y molestias en el pecho, iv) puntuación de los síntomas gastrointestinales, calculada como la suma de las puntuaciones de gravedad para diarrea, vómitos, anorexia, náuseas y (Tabla 1) Los hallazgos de nuestro estudio, realizado durante un período de 5 años en cinco sitios geográficamente dispersos en los EE.UU., demuestran que el coronavirus humano (HCoV) es una importante causa de enfermedad similar a la gripe (ILI) varió entre el 4% y el 22%. [8] [9] [10] [11] 14 Además, encontramos que el HCoV-OC43to es la especie más común entre los adultos, como se ha informado en otros lugares. 8, 9, 11, 12, 14 HCoV-OC43 y HCoV-229E fueron las cepas más comunes en estaciones alternas, reflejando una variabilidad de temporada a temporada de la circulación de cepas de HCoV que se ha reportado en otros estudios plurianuales. 4 8 Los mecanismos por los cuales esta especie particular provoca estos síntomas no se conocen. Entre los puntos fuertes de este estudio de HCoV en adolescentes y adultos, de otra manera sanos, se encuentran su diseño multisitio y multianual, el uso de un panel diagnóstico multiplex, la recolección prospectiva de datos sintomáticos y el uso de una escala de severidad de síntomas similar a la empleada anteriormente. 15 Una limitación importante de este estudio fue nuestro reclutamiento selectivo de individuos que habían presentado a un centro de salud para el cuidado de un ILI. Por lo tanto, nuestros casos no son representativos de la infección por HCoV en la comunidad, donde los individuos con enfermedad leve y autolimitante debido a HCoV optan por no buscar atención médica para el manejo de su ILI. En resumen, hemos demostrado que el HCoV es una causa significativa de ILI entre adolescentes y adultos de otra forma saludables que se presentan para evaluación médica.

¿Qué especies son más prevalentes pero menos severas?

Un paso más cerca de un sistema de infección experimental para el virus de la hepatitis B? --- la identificación del péptido cotransportador de taurocolato de sodio como receptor viralhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3562259/SHA: f4f36a8e9fee64d59ccf22b724c7dab345102658Autores: Chen, Pei-Jer; Wu, T-CFecha: 2013-01-11DOI: 10.1186/2045-3701-3-2Licencia: cc-byAbstract: Tras la clonación exitosa del receptor para el coronavirus del SARS hace unos años, el Dr. Wenhui Li y sus colegas volvieron a llamar la atención publicando un posible receptor para el virus de la hepatitis B en eLife. Revisaremos brevemente Texto: Entre los cinco virus hepatotrópicos de la hepatitis, sólo el virus de la hepatitis B (VHB) y su virus satélite de la hepatitis D (VHD) todavía esperan el desarrollo de un sistema de infección in vitro en el cultivo celular. Una línea celular de carcinoma hepatocelular (HCC), HepaRG, puede infectarse con una eficiencia modesta después de semanas de cultivo y diferenciación inducida [1]. Incluso los hepatocitos humanos primarios pierden rápidamente la capacidad de infección por el VHB después de un breve cultivo celular. La infección por el VHB exige factores tanto intracelulares como de superficie celular. Los requisitos intracelulares parecen menos estrictos, ya que después de la transfección del ADN del VHB en muchas líneas celulares del HCC o hígado de ratón, que no pueden infectarse naturalmente, el genoma viral se expresa y replica activamente. Así, el fracaso de la infección por el VHB se considera en gran parte debido a Las moléculas de la membrana celular necesarias para la infección por VHB pueden dividirse en dos clases: baja afinidad y alta afinidad. Entre otras, los sulfatos de heparano en las proteínas de la membrana median la interacción amplia, pero menos específica, de células víricas. Sin embargo, los socios de membrana de alta afinidad para el VHB siguen siendo elusivos (la carboxipeptidasa D encontrada para el virus de la hepatitis B del pato puede ser el único contendiente grave [2] ). La proteína de envoltura del VHB, a saber, los antígenos de superficie, desempeña un papel esencial en el proceso de infección. Ambos exámenes genéticos y funcionales identificaron un dominio en el Nterminus del VHB preS1 (aminoácidos 1-47) necesario para la infección. Se ha demostrado que este dominio funciona como mediador directo para el VHB mediante la unión de receptores (s) Más importante aún, el péptido miristoilado se muestra para bloquear efectivamente la infección del VHB en los hepatocitos humanos primarios y en el ratón hepatocytechimera humano en una concentración nanomolar [4]. De hecho, un ensayo clínico que prueba la eficacia de este péptido en la prevención de la infección del VHB ha estado en curso [5]. Claramente, este péptido preS1 puede ser una sonda útil para extraer los factores celulares que interactúan, incluyendo receptores virales específicos. Yan et al. han tomado un enfoque razonable para pescar posibles receptores del VHB [6]. Ellos diseñaron el primer 2-47 péptido aminoácido de PreS1 para aumentar su capacidad para ser interconectado con proteínas que interactúan con la membrana celular, sin afectar a su especificidad de unión. Las estrategias realmente bajaron muchas proteínas de membrana, pero en comparación con el control negativo (péptido homológico sin unión específica), identificaron una proteína celular, NTCP (péptido de cotransporte de taurocolato sódico) por LC/MS/MS. La misma proteína también fue retirada de los hepatocitos humanos. Los autores produjeron líneas celulares de HCC que expresaban fuertemente NTCP y posteriormente las infectaron con HBV o HDV. La tinción de inmunofluorescencia demostró claramente la expresión de proteínas de HBV y HDV en estas líneas celulares, lo que sugiere una infección viral exitosa. Además, documentaron un aumento de 2-4 veces del ARN viral y ADN después de la infección en la línea celular por PCR en tiempo real. También mostraron una mancha sureña que apoya la presencia de ADN circular covalentemente cerrado de HBV en la célula infectada, un marcador bien reconocido para la infección Finalmente, identificaron un tramo de 10 aminoácidos en el dominio de la transmembrana NTCP, como el motivo que interactúa directamente con el péptido PreS1. NTCP es una proteína transmembrana, usualmente localizada en la superficie lateral (canalicular) de los hepatocitos, que media el transporte de ácido biliar [7]. Geográficamente, es un buen candidato para un receptor de VHB. Además, los autores podrían convertir las líneas celulares previamente no permisibles a la infección por VHB a permitidas por sobreexpresión de PCN, apoyando de nuevo su posible papel en el proceso de infección por VHB. Esto puede ser un descubrimiento crítico y esperado hacia la comprensión de los receptores de VHB y el establecimiento de un sistema experimental de infección por VHB. Mirando hacia adelante, necesitamos entender cómo el PCN interactúa con ambas proteínas de envoltura de VHB y con otras proteínas celulares, especialmente a través El NTCP en sí mismo no es suficiente para permitir la infección por VHB, ya que la mayoría de las células de HepaRG fueron encontradas para expresar el NPCT pero no para ser infectadas [8]. El NTCP podría iniciar o mediar interacciones moleculares que pueden superar las restricciones de la superficie celular para la entrada viral. Tales factores celulares o virales cooperativos deben ser descubiertos y demostrados para mejorar la eficiencia de la infección viral, a un nivel comparable a uno natural (cientos o miles de amplificación viral). Por ejemplo, los autores pueden utilizar las líneas celulares que expresan el NTCP como los materiales iniciales para identificar sistémicamente otros factores (tal vez carboxipeptidasa D) y hacer que estas líneas celulares sean más productivas y permisivas a la infección por VHB. En un futuro próximo, se espera que los ensayos virológicos estándar para las infecciones por VHB, incluyendo manchas del norte u oeste, La comunidad de investigación del VHB ha buscado receptores del VHB durante décadas. Muchos candidatos han sido descubiertos y luego descartados. El estudio actual, sin embargo, aprovechó un péptido viral bien documentado requerido para la entrada del VHB en combinación con una plataforma proteómica de última generación. Como dice un proverbio chino, "un viaje de mil millas comienza desde un paso gradual". Así, la identificación del NTCP como receptor viral potencial del VHB puede servir como un paso inicial importante para este viaje, llevando al desarrollo de un sistema de infección del VHB para facilitar la investigación del VHB y el tratamiento de la hepatitis B.

¿Qué regula la amplia, pero menos específica, interacción virus-células en una infección por hepatitis B?

Un paso más cerca de un sistema de infección experimental para el virus de la hepatitis B? --- la identificación del péptido cotransportador de taurocolato de sodio como receptor viralhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3562259/SHA: f4f36a8e9fee64d59ccf22b724c7dab345102658Autores: Chen, Pei-Jer; Wu, T-CFecha: 2013-01-11DOI: 10.1186/2045-3701-3-2Licencia: cc-byAbstract: Tras la clonación exitosa del receptor para el coronavirus del SARS hace unos años, el Dr. Wenhui Li y sus colegas volvieron a llamar la atención publicando un posible receptor para el virus de la hepatitis B en eLife. Revisaremos brevemente Texto: Entre los cinco virus hepatotrópicos de la hepatitis, sólo el virus de la hepatitis B (VHB) y su virus satélite de la hepatitis D (VHD) todavía esperan el desarrollo de un sistema de infección in vitro en el cultivo celular. Una línea celular de carcinoma hepatocelular (HCC), HepaRG, puede infectarse con una eficiencia modesta después de semanas de cultivo y diferenciación inducida [1]. Incluso los hepatocitos humanos primarios pierden rápidamente la capacidad de infección por el VHB después de un breve cultivo celular. La infección por el VHB exige factores tanto intracelulares como de superficie celular. Los requisitos intracelulares parecen menos estrictos, ya que después de la transfección del ADN del VHB en muchas líneas celulares del HCC o hígado de ratón, que no pueden infectarse naturalmente, el genoma viral se expresa y replica activamente. Así, el fracaso de la infección por el VHB se considera en gran parte debido a Las moléculas de la membrana celular necesarias para la infección por VHB pueden dividirse en dos clases: baja afinidad y alta afinidad. Entre otras, los sulfatos de heparano en las proteínas de la membrana median la interacción amplia, pero menos específica, de células víricas. Sin embargo, los socios de membrana de alta afinidad para el VHB siguen siendo elusivos (la carboxipeptidasa D encontrada para el virus de la hepatitis B del pato puede ser el único contendiente grave [2] ). La proteína de envoltura del VHB, a saber, los antígenos de superficie, desempeña un papel esencial en el proceso de infección. Ambos exámenes genéticos y funcionales identificaron un dominio en el Nterminus del VHB preS1 (aminoácidos 1-47) necesario para la infección. Se ha demostrado que este dominio funciona como mediador directo para el VHB mediante la unión de receptores (s) Más importante aún, el péptido miristoilado se muestra para bloquear efectivamente la infección del VHB en los hepatocitos humanos primarios y en el ratón hepatocytechimera humano en una concentración nanomolar [4]. De hecho, un ensayo clínico que prueba la eficacia de este péptido en la prevención de la infección del VHB ha estado en curso [5]. Claramente, este péptido preS1 puede ser una sonda útil para extraer los factores celulares que interactúan, incluyendo receptores virales específicos. Yan et al. han tomado un enfoque razonable para pescar posibles receptores del VHB [6]. Ellos diseñaron el primer 2-47 péptido aminoácido de PreS1 para aumentar su capacidad para ser interconectado con proteínas que interactúan con la membrana celular, sin afectar a su especificidad de unión. Las estrategias realmente bajaron muchas proteínas de membrana, pero en comparación con el control negativo (péptido homológico sin unión específica), identificaron una proteína celular, NTCP (péptido de cotransporte de taurocolato sódico) por LC/MS/MS. La misma proteína también fue retirada de los hepatocitos humanos. Los autores produjeron líneas celulares de HCC que expresaban fuertemente NTCP y posteriormente las infectaron con HBV o HDV. La tinción de inmunofluorescencia demostró claramente la expresión de proteínas de HBV y HDV en estas líneas celulares, lo que sugiere una infección viral exitosa. Además, documentaron un aumento de 2-4 veces del ARN viral y ADN después de la infección en la línea celular por PCR en tiempo real. También mostraron una mancha sureña que apoya la presencia de ADN circular covalentemente cerrado de HBV en la célula infectada, un marcador bien reconocido para la infección Finalmente, identificaron un tramo de 10 aminoácidos en el dominio de la transmembrana NTCP, como el motivo que interactúa directamente con el péptido PreS1. NTCP es una proteína transmembrana, usualmente localizada en la superficie lateral (canalicular) de los hepatocitos, que media el transporte de ácido biliar [7]. Geográficamente, es un buen candidato para un receptor de VHB. Además, los autores podrían convertir las líneas celulares previamente no permisibles a la infección por VHB a permitidas por sobreexpresión de PCN, apoyando de nuevo su posible papel en el proceso de infección por VHB. Esto puede ser un descubrimiento crítico y esperado hacia la comprensión de los receptores de VHB y el establecimiento de un sistema experimental de infección por VHB. Mirando hacia adelante, necesitamos entender cómo el PCN interactúa con ambas proteínas de envoltura de VHB y con otras proteínas celulares, especialmente a través El NTCP en sí mismo no es suficiente para permitir la infección por VHB, ya que la mayoría de las células de HepaRG fueron encontradas para expresar el NPCT pero no para ser infectadas [8]. El NTCP podría iniciar o mediar interacciones moleculares que pueden superar las restricciones de la superficie celular para la entrada viral. Tales factores celulares o virales cooperativos deben ser descubiertos y demostrados para mejorar la eficiencia de la infección viral, a un nivel comparable a uno natural (cientos o miles de amplificación viral). Por ejemplo, los autores pueden utilizar las líneas celulares que expresan el NTCP como los materiales iniciales para identificar sistémicamente otros factores (tal vez carboxipeptidasa D) y hacer que estas líneas celulares sean más productivas y permisivas a la infección por VHB. En un futuro próximo, se espera que los ensayos virológicos estándar para las infecciones por VHB, incluyendo manchas del norte u oeste, La comunidad de investigación del VHB ha buscado receptores del VHB durante décadas. Muchos candidatos han sido descubiertos y luego descartados. El estudio actual, sin embargo, aprovechó un péptido viral bien documentado requerido para la entrada del VHB en combinación con una plataforma proteómica de última generación. Como dice un proverbio chino, "un viaje de mil millas comienza desde un paso gradual". Así, la identificación del NTCP como receptor viral potencial del VHB puede servir como un paso inicial importante para este viaje, llevando al desarrollo de un sistema de infección del VHB para facilitar la investigación del VHB y el tratamiento de la hepatitis B.

¿Dónde se encuentra NTCP en el cuerpo?

Un paso más cerca de un sistema de infección experimental para el virus de la hepatitis B? --- la identificación del péptido cotransportador de taurocolato de sodio como receptor viralhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3562259/SHA: f4f36a8e9fee64d59ccf22b724c7dab345102658Autores: Chen, Pei-Jer; Wu, T-CFecha: 2013-01-11DOI: 10.1186/2045-3701-3-2Licencia: cc-byAbstract: Tras la clonación exitosa del receptor para el coronavirus del SARS hace unos años, el Dr. Wenhui Li y sus colegas volvieron a llamar la atención publicando un posible receptor para el virus de la hepatitis B en eLife. Revisaremos brevemente Texto: Entre los cinco virus hepatotrópicos de la hepatitis, sólo el virus de la hepatitis B (VHB) y su virus satélite de la hepatitis D (VHD) todavía esperan el desarrollo de un sistema de infección in vitro en el cultivo celular. Una línea celular de carcinoma hepatocelular (HCC), HepaRG, puede infectarse con una eficiencia modesta después de semanas de cultivo y diferenciación inducida [1]. Incluso los hepatocitos humanos primarios pierden rápidamente la capacidad de infección por el VHB después de un breve cultivo celular. La infección por el VHB exige factores tanto intracelulares como de superficie celular. Los requisitos intracelulares parecen menos estrictos, ya que después de la transfección del ADN del VHB en muchas líneas celulares del HCC o hígado de ratón, que no pueden infectarse naturalmente, el genoma viral se expresa y replica activamente. Así, el fracaso de la infección por el VHB se considera en gran parte debido a Las moléculas de la membrana celular necesarias para la infección por VHB pueden dividirse en dos clases: baja afinidad y alta afinidad. Entre otras, los sulfatos de heparano en las proteínas de la membrana median la interacción amplia, pero menos específica, de células víricas. Sin embargo, los socios de membrana de alta afinidad para el VHB siguen siendo elusivos (la carboxipeptidasa D encontrada para el virus de la hepatitis B del pato puede ser el único contendiente grave [2] ). La proteína de envoltura del VHB, a saber, los antígenos de superficie, desempeña un papel esencial en el proceso de infección. Ambos exámenes genéticos y funcionales identificaron un dominio en el Nterminus del VHB preS1 (aminoácidos 1-47) necesario para la infección. Se ha demostrado que este dominio funciona como mediador directo para el VHB mediante la unión de receptores (s) Más importante aún, el péptido miristoilado se muestra para bloquear efectivamente la infección del VHB en los hepatocitos humanos primarios y en el ratón hepatocytechimera humano en una concentración nanomolar [4]. De hecho, un ensayo clínico que prueba la eficacia de este péptido en la prevención de la infección del VHB ha estado en curso [5]. Claramente, este péptido preS1 puede ser una sonda útil para extraer los factores celulares que interactúan, incluyendo receptores virales específicos. Yan et al. han tomado un enfoque razonable para pescar posibles receptores del VHB [6]. Ellos diseñaron el primer 2-47 péptido aminoácido de PreS1 para aumentar su capacidad para ser interconectado con proteínas que interactúan con la membrana celular, sin afectar a su especificidad de unión. Las estrategias realmente bajaron muchas proteínas de membrana, pero en comparación con el control negativo (péptido homológico sin unión específica), identificaron una proteína celular, NTCP (péptido de cotransporte de taurocolato sódico) por LC/MS/MS. La misma proteína también fue retirada de los hepatocitos humanos. Los autores produjeron líneas celulares de HCC que expresaban fuertemente NTCP y posteriormente las infectaron con HBV o HDV. La tinción de inmunofluorescencia demostró claramente la expresión de proteínas de HBV y HDV en estas líneas celulares, lo que sugiere una infección viral exitosa. Además, documentaron un aumento de 2-4 veces del ARN viral y ADN después de la infección en la línea celular por PCR en tiempo real. También mostraron una mancha sureña que apoya la presencia de ADN circular covalentemente cerrado de HBV en la célula infectada, un marcador bien reconocido para la infección Finalmente, identificaron un tramo de 10 aminoácidos en el dominio de la transmembrana NTCP, como el motivo que interactúa directamente con el péptido PreS1. NTCP es una proteína transmembrana, usualmente localizada en la superficie lateral (canalicular) de los hepatocitos, que media el transporte de ácido biliar [7]. Geográficamente, es un buen candidato para un receptor de VHB. Además, los autores podrían convertir las líneas celulares previamente no permisibles a la infección por VHB a permitidas por sobreexpresión de PCN, apoyando de nuevo su posible papel en el proceso de infección por VHB. Esto puede ser un descubrimiento crítico y esperado hacia la comprensión de los receptores de VHB y el establecimiento de un sistema experimental de infección por VHB. Mirando hacia adelante, necesitamos entender cómo el PCN interactúa con ambas proteínas de envoltura de VHB y con otras proteínas celulares, especialmente a través El NTCP en sí mismo no es suficiente para permitir la infección por VHB, ya que la mayoría de las células de HepaRG fueron encontradas para expresar el NPCT pero no para ser infectadas [8]. El NTCP podría iniciar o mediar interacciones moleculares que pueden superar las restricciones de la superficie celular para la entrada viral. Tales factores celulares o virales cooperativos deben ser descubiertos y demostrados para mejorar la eficiencia de la infección viral, a un nivel comparable a uno natural (cientos o miles de amplificación viral). Por ejemplo, los autores pueden utilizar las líneas celulares que expresan el NTCP como los materiales iniciales para identificar sistémicamente otros factores (tal vez carboxipeptidasa D) y hacer que estas líneas celulares sean más productivas y permisivas a la infección por VHB. En un futuro próximo, se espera que los ensayos virológicos estándar para las infecciones por VHB, incluyendo manchas del norte u oeste, La comunidad de investigación del VHB ha buscado receptores del VHB durante décadas. Muchos candidatos han sido descubiertos y luego descartados. El estudio actual, sin embargo, aprovechó un péptido viral bien documentado requerido para la entrada del VHB en combinación con una plataforma proteómica de última generación. Como dice un proverbio chino, "un viaje de mil millas comienza desde un paso gradual". Así, la identificación del NTCP como receptor viral potencial del VHB puede servir como un paso inicial importante para este viaje, llevando al desarrollo de un sistema de infección del VHB para facilitar la investigación del VHB y el tratamiento de la hepatitis B.

¿Es el NTCP suficiente para permitir la infección por VHB?

El desarrollo de una guía ELISA para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitishttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3305475/SHA: ef2b8f83d5a3ab8ae35e4b51fea6d3ed9eb49122Autores: Kang, Xiaoping; Li, Yuchang; Fan, Li; Lin, Fang; Wei, Jingjing; Zhu, Xiaolei; Hu, Yi; Li, Jing; Chang, Guohui; Zhu, Qingyu; Liu, Hong; Yang, YinhuiFecha: 2012-02-27DOI: 10.1186/1743-422x-9-56Licencia: cc-byAbstract: virus de la encefalitis japonesa(JEV), virus de El establecimiento de métodos precisos y fáciles para detectar estos virus es esencial para la prevención y el tratamiento de las enfermedades infecciosas asociadas. Actualmente, todavía no existen métodos de detección de antígenos múltiples disponibles clínicamente. En este estudio se desarrolló un sistema ELISA-array para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitis. Se prepararon siete anticuerpos monoclonales contra cinco virus asociados a la encefalitis y se utilizaron para el desarrollo del sistema ELISA-array. El ensayo ELISA-array se basa en un formato ELISA "sandwich" y consiste en anticuerpos virales impresos directamente en placas microtiterizadas de 96 pocillos, lo que permite la detección directa de 5 virus. El sistema ELISA-array desarrollado demostró tener una especificidad similar y una mayor sensibilidad en comparación con las ELISA convencionales. Este método fue validado por diferentes cultivos virales y tres huevos de pollo inoculados con suero de paciente infectado. Los resultados demostraron que el vector ELISA desarrollado es sensible y fácil de usar, lo que tendría potencial de uso clínico. Texto: virus de la encefalitis japonesa (JEV), virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (TBEV), virus de la encefalitis equina oriental (EEEV), virus sindbis (SV), y virus del dengue (DV) son arbovirus y causan síntomas de encefalitis, con una amplia gama de gravedad y tasas de mortalidad [1]. El establecimiento de un método preciso y fácil para la detección de estos virus es esencial para la prevención y el tratamiento de enfermedades infecciosas asociadas. Actualmente, ELISA e IFA son los métodos que están clínicamente disponibles para la detección de antígenos virales de encefalitis, pero sólo pudieron detectar un patógeno en un Hay una variedad de métodos diferentes disponibles para identificar antígenos múltiples en una muestra simultáneamente, tales como electroforesis gel bidimensional, chip de proteína, espectrometría de masas y tecnología de matriz de suspensión [4] [5] [6]. Sin embargo, la aplicación de estas técnicas en la detección de patógenos todavía se encuentra en una fase temprana, tal vez debido al uso complicado y alto costo. Arrays de anticuerpos para la cuantificación simultánea de antígenos múltiples se consideran los métodos más precisos [7] [8] [9] [10]. Liew [11] validó una ELISA múltiple para la detección de 9 antígenos; Anderson [12] utilizó el microarray ELISA para la detección multiplex de anticuerpos a antígenos tumorales en el cáncer de mama, y demostró que los análisis de matrices basados en ELISA tenían el rango dinámico más amplio y los requisitos de volumen de muestra más bajo en comparación con los otros ensayos. Sin embargo, la aplicación de matrices basadas en ELISA se limita actualmente En este estudio, se desarrolló una matriz con base ELISA para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitis, se prepararon siete anticuerpos monoclonales específicos contra cinco virus de la encefalitis y se utilizó para establecer un ensayo ELISA-array. El ensayo fue validado utilizando virus cultivados y huevos de pollo inoculados con suero paciente. Los resultados demostraron que este método combinaba la ventaja de ELISA y matriz proteica (multiplex y facilidad de uso) y tiene potencial para la identificación del virus de la encefalitis clínica. Los anticuerpos monoclonales se prepararon a partir de líneas celulares de hibridoma construidas por el Prof. Zhu et al. La purificación se realizó mediante cromatografía de inmunoafinidad en sepharose de afinidad proteica G [13]. Para este estudio se seleccionaron anticuerpos monoclonales específicos (4D5 frente a JEV, 2B5 frente a TVEV, 1F1 frente a SV, 2B8 frente a serotipo 2 DV, 4F9 frente a serotipo 4 DV, 4E11 frente a EEV y 2A10 frente a Flavivirus). Todos los anticuerpos se elevaron de acuerdo con los procedimientos estándar.Utilizando 4D5, 2B5, 1F1, 2B8, 4F9 y 4E11 como anticuerpos de captura, anticuerpos de detección (2A10, 1 F1 y 4E11) se acoplaron a ester de biotina-NHS (Pierce, Alemania) a 4°C durante 3 h según las instrucciones del fabricante.La biotina no incorporada fue eliminada por la columna de rotación Desalt (Pierce). Las reacciones inmunológicas fueron notificadas por Streptavidin-HRP (CWBIO, Beijing, China) y Super Signal ELISA Femto Sustrato Sensible Máximo. Se utilizó como control positivo el anticuerpo cabra-anti ratón purificado. JEV y DV fueron cultivadas en C6/36 células; SV, TBEV y EEEV fueron cultivadas en células BHK-21. El cultivo de TBEV y EEV fue realizado en instalaciones de nivel 3 de bioseguridad, sin embargo, JEV, DV y SV fueron realizadas en instalaciones de nivel 2 de bioseguridad. Los títulos virales fueron determinados por el método de la dosis infecciosa de cultivo tisular 50% (TCID 50 ). Todos los cultivos fueron inactivados por 0,025% β-propionolactona a 4°C durante la noche, luego 37°C Los anticuerpos fueron detectados utilizando una máquina BIODOT (BD6000;California, EE.UU.) en placas ELISA (30 nl/punto). Las placas fueron bloqueadas con 3 % BSA-PBS en 37°C durante 1 h, seguidas de lavado 3 veces con PBS que contenía 0,1% Tween-20 durante 2 minutos cada una. Luego, las placas fueron secas, selladas y almacenadas a 4°C antes de su uso [11]. Cuando se detectaron, se evaluaron diferentes tampones y concentraciones de anticuerpos monoclonales de captura para optimizar el ensayo ELISA-array. La optimización fue evaluada por morfología de punto e intensidad de señal. Los tampones de detección probados incluyeron 1 x fosfato tampón salino (PBS), PBS +20% glicerol, y 1 × PBS + 20% glicerol+0,004% Se comparó un rango de concentraciones de anticuerpos monoclonales (0,0125, 0,025, 0,05, 0,1 y 0,2 mg/ml). Tras un formato sándwich de doble anticuerpo, las placas impresas fueron incubadas secuencialmente con cultivos virales inactivados, anticuerpos de detección marcados con biotina, avidina y sustrato marcados con HPR, seguidos de una evaluación de la señal. La unión de antígenos se realizó en PBS (conteniendo 0,1% Tween-20 y 5% FCS) a 37°C durante 2 h, seguido de lavado 3 veces (1 × PBS con 0,1% Tween-20). La incubación de placas ELISA con cocteles anticuerpos de detección biotinilados fue realizada en PBS (conteniendo 0,1% Tween-20 y 5% FCS) a 37°C durante 2 h. Después del lavado, la unión específica de los anticuerpos de detección fue reportada por estreptavidina-HRP y teñida con Super Signal ELISA Femto Sustrato Máximo Sensible (Thermo científico, Rockford, EE.UU.) [11, 14, 15]. La visualización de la placa fue realizada en AE 1000 analizador de imagen CCD fresco (Beijing BGI GBI Biotech Company., LTD, China). La intensidad de la señal y el fondo de cada mancha fue leída y grabada con "Monster"software. Las señales positivas fueron definidas como un valor de señal > 400 y un valor de señal (muestra)/valor de señal Los anticuerpos idénticos utilizados en el formato ELISA-array también fueron probados en un formato ELISA convencional para determinar la diferencia en sensibilidad y especificidad de los dos métodos. Las ELISA convencionales se realizaron al mismo tiempo que los ensayos ELISA-array para asegurar condiciones de reacción similares. Las ELISA convencionales se realizaron en una forma idéntica a la ELISA-array, excepto que los anticuerpos fueron recubiertos con una concentración de 2 μg/ml en PBS (pH 7,4) y se utilizó el sustrato TMB en lugar de Super Signal ELISA Femto Sustrato Máximo Sensible [16, 17]. Se recolectaron tres muestras séricas de pacientes con síntomas del sistema nervioso e historias de picaduras de garrapatas. Las muestras séricas fueron tratadas con penicilina y estreptomicina, luego inoculadas en las cavidades alantóicas de huevos de pollo. 3 días después, el líquido fue recogido y dividido en dos porciones (una para inactivación y otra para extracción de ARN). El ARN y las muestras inactivadas fueron almacenadas a -70°C antes de su uso. El ARN se extrajo de los huevos de pollo inoculados utilizando un mini kit RNAasy (Qiagen Inc., Valencia, CA, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todos los procedimientos de extracción de ARN se realizaron en instalaciones de BSL-3. Los imprimadores y sondas se utilizaron como se describió anteriormente [18]. El RT-PCR en tiempo real se llevó a cabo con un Quti-teck q-RT-PCR Kit (Qiagen Inc.). La reacción consistió en 10 μL de 2 × tampón de reacción (0,2 μL enzima de transcripción inversa, y 250 nmol La PCR se realizó con un LightCycler 2.0 (Roche, Suiza) [19]. Optimización del ensayo ELISA-arrayEl diseño del array manchado se muestra en la Figura 1 y la eficacia de tres tampones de manchado diferentes en la calidad de los rayos ELISA impresos fueron investigados por observación morfológica puntual y comparación de intensidad de señal. La concentración de manchado de los anticuerpos de captura varió de 0,2 a 0,0125 mg/ml (cada uno se diluyó en serie 2 veces). La eficacia de la concentración de manchado de los anticuerpos de captura fue evaluada por detección del cultivo del virus, la concentración de manchado adecuada fue determinada por una combinación de reacción cruzada minimizada y mayor intensidad de señal. La Figura 1 ilustra el diseño del array y la Figura 2 muestra el resultado de los tres tampones de manchado y concentración de manchado de anticuerpos 2B5 por La observación de la morfología puntual (Figuras 2a, b y 2c) demostró que el tampón de detección que contiene PBS con 20% de glicerol produjo morfología puntual; los tampones que contienen PBS solo y PBS con 20% de glicerol +0,004% de Triton-X100 dieron buena morfología puntual (redondo y completo). Los tampones que contienen PBS con 20% de glicerol y PBS con 20% de glicerol+0,004% de Triton-X100 produjeron intensidades de señal más altas que el PBS solo. Así, PBS con 20% de glicerol +0,004% de Triton-X100 fue adoptado como el tampón de detección optimizado para experimentos posteriores. Simultáneamente, la evaluación de la concentración puntual sugirió que 0,05 mg/ml era óptima. A esta concentración, la intensidad de la señal fue mayor y la reacción cruzada no En consecuencia, la optimización de la concentración de detección de otros anticuerpos de captura (4D5, 1F1, 4E11 y 2B8) demostró que 0,05 mg/ml también eran adecuados (datos no mostrados). La disposición optimizada de la matriz ELISA se muestra en la Figura 3, que se aplicó en los siguientes experimentos. La detección exitosa de patógenos virales requiere una prueba con alta sensibilidad y especificidad. Para evaluar el rendimiento de las matrices de anticuerpos diseñadas, se examinó la especificidad y sensibilidad de los analitos individuales. Mediante la prueba de cultivos virales serialmente diluidos, incluyendo DV-2, DV-4, JEV, TBE, SV y EEEV, se comparó la sensibilidad de ELISAarray y la ELISA convencional idéntica ( Tabla 1 ). Se comparó y demostró el límite de detección de los dos métodos. La prueba de reactividad cruzada se realizó utilizando cultivos de BHK-21 y lisato de células de vero, virus de la fiebre amarilla (YFV) (5 × 10 5 TCID 50/ml, cultivos de virus del Nilo Occidental (WNV)(2 × 10 6 TCID 50/ml) y virus de la encefalitis equina occidental(1 × 10 7 TCID 50/ml). Los resultados demostraron que ni el vector ELISA ni el ELISA tradicional mostraron reactividad cruzada.En todas las pruebas se prepararon volúmenes iguales de TVEV, JEV, DV-2, DV-4, SV y EEEV para la detección de muestras únicas; dos o tres de los cultivos se mezclaron para la detección múltiplex. Se utilizó un cóctel de anticuerpo conjugado de biotina (2A10, 4E11 y 1F1). Los resultados demostraron que para todas las combinaciones virales, cada virus fue detectado específicamente, sin resultados falsos positivos o negativos (Figuras 4 y 5). Los huevos de pollo inoculados con suero humano infectado fueron utilizados para la validación del ensayo ELISA-array. Todas las muestras mostraron señales de alta reacción con anticuerpo de captura 2B5, que fue específico para TBEV (Figura 6b ). El ensayo ELISA-array sugirió que los tres pacientes estaban infectados con TBEV. Para verificar los resultados probados por ELISA-array, el ARN extraído de huevos de pollo se aplicó a un ensayo RT-PCR en tiempo real utilizando imprimadores y sondas dirigidas a TBEV. Los resultados también fueron positivos (Figura 6a). Los resultados de la detección de consenso confirmaron que el ensayo ELISAarray era confiable. Para ser ampliamente utilizado en el entorno clínico, el sistema de detección debe ser fácil de usar y puede ser realizado por personal no capacitado con poca experiencia de laboratorio y experimental. Además, cuando el volumen de las muestras clínicas es limitado y un número creciente de patógenos por muestra necesita ser probado, el sistema de detección debe ser de alto rendimiento para permitir la detección de múltiples patógenos simultáneamente [6, 20, 21]. Detección múltiple, fácil de usar y asequibilidad son requisitos para los métodos de detección en el entorno clínico. Por lo tanto, una revisión ELISA, que combina las ventajas de ELISA y matriz de proteínas, cumple los requisitos anteriores. Se ha reportado que una revisión ELISA se ha utilizado en el diagnóstico de cáncer y enfermedad autoalérgica [7, 12] ; sin embargo, ningún estudio ha reportado la detección de patógenos virales. En este estudio se desarrolló un método multiplex basado en ELISA en un sandwich de doble anticuerpo para la detección simultánea de cinco patógenos virales asociados a la encefalitis. La producción de un chip de anticuerpos confiable para la identificación de microorganismos requiere una cuidadosa detección de la captura de anticuerpos [14]. Se debe minimizar la reactividad cruzada y la afinidad del anticuerpo es tan importante como la especificidad. En primer lugar, se preparó y examinó 23 anticuerpos monoclonales contra ocho virus y se verificó la especificidad y afinidad con los virus objetivo mediante un ensayo de inmunofluorescencia. Luego, los anticuerpos fueron analizados por una matriz ELISA con un sandwich de doble anticuerpo formato ELISA. Se excluyeron los anticuerpos que produjeron reactividad cruzada y señales de baja positivo. Finalmente, se seleccionaron seis anticuerpos como anticuerpos de captura. Otro anticuerpo monoclonal, 2A10, que podría reaccionar específicamente con todos los virus del género Flavivirus, fue utilizado para detectar anticuerpos contra DV, JEV y TBEV. Para la detección de EEV y SV, aunque los anticuerpos de detección y captura fueron los mismos (1F1 y 4E11, respectivamente), los anticuerpos produjeron excelentes señales positivas. El epitope no fue definido; sin embargo, sospechamos que ambos anticuerpos se dirigen a la superficie de los viriones. A medida que un virio sale como, muchos con el mismo epítope aparecen, por lo tanto, no se produjo ninguna interferencia utilizando el mismo anticuerpo en el ensayo en forma de sándwich de doble anticuerpo. Actualmente, la disponibilidad de anticuerpos adecuados para un ensayo diagnóstico en formato de matriz es un problema importante. En el futuro, con un número creciente de anticuerpos adecuados, especialmente anticuerpos específicos contra Flavivirus, este ELISAarray podría ser capaz de probar más patógenos y ser de mayor uso potencial. Para hacer el ensayo más susceptible a la detección de múltiples virus, el protocolo de ensayo fue optimizado. Además del tampón de punción, la concentración de anticuerpos de captura y los diferentes métodos de inactivación del virus (calentamiento y β-propiolactona) también fueron comparados y evaluados. La inactivación del calor se realizó calentando los cultivos virales a 56°C durante 1 h, y la inactivación de β-propiolactona se realizó añadiendo β-propiolactona en los retenes mejor antigenicidad que el método de inactivación del calor. Así, se eligió el tratamiento de β-propiolactona como método de inactivación del virus. Un EL Se comparó el array ELISA con un ELISA convencional y se confirmó que la ventaja del array ELISA era evidente con especificidad comparable y mayor sensibilidad que ELISA. El tiempo requerido para el array ELISA es significativamente menor que para el array ELISA convencional (4 h frente a un mínimo de 6 h, respectivamente). Además, se requiere menos IgG para la impresión que para el recubrimiento de placas ELISA. Recubrimiento de un solo pozo en placa microtitular requiere 100 μl de una solución anticuerpo de 1 μg/ml, lo que equivale a 100 ng de IgG. Para el array ELISA, sólo se requiere 30 nl de una solución anticuerpo de 50 μg/ml para cada punto, lo que equivale a 1,5 ng de IgG. Con las características de facilidad de uso, sensibilidad, especificidad y precisión, el array ELISA sería ampliamente aceptado

¿Qué tipos de virus son el virus japonés de la encefalitis (JEV), el virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (TBEV), el virus de la encefalitis equina oriental (EEEV), el virus sindbis (SV) y el virus del dengue (DV)?

El desarrollo de una guía ELISA para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitishttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3305475/SHA: ef2b8f83d5a3ab8ae35e4b51fea6d3ed9eb49122Autores: Kang, Xiaoping; Li, Yuchang; Fan, Li; Lin, Fang; Wei, Jingjing; Zhu, Xiaolei; Hu, Yi; Li, Jing; Chang, Guohui; Zhu, Qingyu; Liu, Hong; Yang, YinhuiFecha: 2012-02-27DOI: 10.1186/1743-422x-9-56Licencia: cc-byAbstract: virus de la encefalitis japonesa(JEV), virus de El establecimiento de métodos precisos y fáciles para detectar estos virus es esencial para la prevención y el tratamiento de las enfermedades infecciosas asociadas. Actualmente, todavía no existen métodos de detección de antígenos múltiples disponibles clínicamente. En este estudio se desarrolló un sistema ELISA-array para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitis. Se prepararon siete anticuerpos monoclonales contra cinco virus asociados a la encefalitis y se utilizaron para el desarrollo del sistema ELISA-array. El ensayo ELISA-array se basa en un formato ELISA "sandwich" y consiste en anticuerpos virales impresos directamente en placas microtiterizadas de 96 pocillos, lo que permite la detección directa de 5 virus. El sistema ELISA-array desarrollado demostró tener una especificidad similar y una mayor sensibilidad en comparación con las ELISA convencionales. Este método fue validado por diferentes cultivos virales y tres huevos de pollo inoculados con suero de paciente infectado. Los resultados demostraron que el vector ELISA desarrollado es sensible y fácil de usar, lo que tendría potencial de uso clínico. Texto: virus de la encefalitis japonesa (JEV), virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (TBEV), virus de la encefalitis equina oriental (EEEV), virus sindbis (SV), y virus del dengue (DV) son arbovirus y causan síntomas de encefalitis, con una amplia gama de gravedad y tasas de mortalidad [1]. El establecimiento de un método preciso y fácil para la detección de estos virus es esencial para la prevención y el tratamiento de enfermedades infecciosas asociadas. Actualmente, ELISA e IFA son los métodos que están clínicamente disponibles para la detección de antígenos virales de encefalitis, pero sólo pudieron detectar un patógeno en un Hay una variedad de métodos diferentes disponibles para identificar antígenos múltiples en una muestra simultáneamente, tales como electroforesis gel bidimensional, chip de proteína, espectrometría de masas y tecnología de matriz de suspensión [4] [5] [6]. Sin embargo, la aplicación de estas técnicas en la detección de patógenos todavía se encuentra en una fase temprana, tal vez debido al uso complicado y alto costo. Arrays de anticuerpos para la cuantificación simultánea de antígenos múltiples se consideran los métodos más precisos [7] [8] [9] [10]. Liew [11] validó una ELISA múltiple para la detección de 9 antígenos; Anderson [12] utilizó el microarray ELISA para la detección multiplex de anticuerpos a antígenos tumorales en el cáncer de mama, y demostró que los análisis de matrices basados en ELISA tenían el rango dinámico más amplio y los requisitos de volumen de muestra más bajo en comparación con los otros ensayos. Sin embargo, la aplicación de matrices basadas en ELISA se limita actualmente En este estudio, se desarrolló una matriz con base ELISA para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitis, se prepararon siete anticuerpos monoclonales específicos contra cinco virus de la encefalitis y se utilizó para establecer un ensayo ELISA-array. El ensayo fue validado utilizando virus cultivados y huevos de pollo inoculados con suero paciente. Los resultados demostraron que este método combinaba la ventaja de ELISA y matriz proteica (multiplex y facilidad de uso) y tiene potencial para la identificación del virus de la encefalitis clínica. Los anticuerpos monoclonales se prepararon a partir de líneas celulares de hibridoma construidas por el Prof. Zhu et al. La purificación se realizó mediante cromatografía de inmunoafinidad en sepharose de afinidad proteica G [13]. Para este estudio se seleccionaron anticuerpos monoclonales específicos (4D5 frente a JEV, 2B5 frente a TVEV, 1F1 frente a SV, 2B8 frente a serotipo 2 DV, 4F9 frente a serotipo 4 DV, 4E11 frente a EEV y 2A10 frente a Flavivirus). Todos los anticuerpos se elevaron de acuerdo con los procedimientos estándar.Utilizando 4D5, 2B5, 1F1, 2B8, 4F9 y 4E11 como anticuerpos de captura, anticuerpos de detección (2A10, 1 F1 y 4E11) se acoplaron a ester de biotina-NHS (Pierce, Alemania) a 4°C durante 3 h según las instrucciones del fabricante.La biotina no incorporada fue eliminada por la columna de rotación Desalt (Pierce). Las reacciones inmunológicas fueron notificadas por Streptavidin-HRP (CWBIO, Beijing, China) y Super Signal ELISA Femto Sustrato Sensible Máximo. Se utilizó como control positivo el anticuerpo cabra-anti ratón purificado. JEV y DV fueron cultivadas en C6/36 células; SV, TBEV y EEEV fueron cultivadas en células BHK-21. El cultivo de TBEV y EEV fue realizado en instalaciones de nivel 3 de bioseguridad, sin embargo, JEV, DV y SV fueron realizadas en instalaciones de nivel 2 de bioseguridad. Los títulos virales fueron determinados por el método de la dosis infecciosa de cultivo tisular 50% (TCID 50 ). Todos los cultivos fueron inactivados por 0,025% β-propionolactona a 4°C durante la noche, luego 37°C Los anticuerpos fueron detectados utilizando una máquina BIODOT (BD6000;California, EE.UU.) en placas ELISA (30 nl/punto). Las placas fueron bloqueadas con 3 % BSA-PBS en 37°C durante 1 h, seguidas de lavado 3 veces con PBS que contenía 0,1% Tween-20 durante 2 minutos cada una. Luego, las placas fueron secas, selladas y almacenadas a 4°C antes de su uso [11]. Cuando se detectaron, se evaluaron diferentes tampones y concentraciones de anticuerpos monoclonales de captura para optimizar el ensayo ELISA-array. La optimización fue evaluada por morfología de punto e intensidad de señal. Los tampones de detección probados incluyeron 1 x fosfato tampón salino (PBS), PBS +20% glicerol, y 1 × PBS + 20% glicerol+0,004% Se comparó un rango de concentraciones de anticuerpos monoclonales (0,0125, 0,025, 0,05, 0,1 y 0,2 mg/ml). Tras un formato sándwich de doble anticuerpo, las placas impresas fueron incubadas secuencialmente con cultivos virales inactivados, anticuerpos de detección marcados con biotina, avidina y sustrato marcados con HPR, seguidos de una evaluación de la señal. La unión de antígenos se realizó en PBS (conteniendo 0,1% Tween-20 y 5% FCS) a 37°C durante 2 h, seguido de lavado 3 veces (1 × PBS con 0,1% Tween-20). La incubación de placas ELISA con cocteles anticuerpos de detección biotinilados fue realizada en PBS (conteniendo 0,1% Tween-20 y 5% FCS) a 37°C durante 2 h. Después del lavado, la unión específica de los anticuerpos de detección fue reportada por estreptavidina-HRP y teñida con Super Signal ELISA Femto Sustrato Máximo Sensible (Thermo científico, Rockford, EE.UU.) [11, 14, 15]. La visualización de la placa fue realizada en AE 1000 analizador de imagen CCD fresco (Beijing BGI GBI Biotech Company., LTD, China). La intensidad de la señal y el fondo de cada mancha fue leída y grabada con "Monster"software. Las señales positivas fueron definidas como un valor de señal > 400 y un valor de señal (muestra)/valor de señal Los anticuerpos idénticos utilizados en el formato ELISA-array también fueron probados en un formato ELISA convencional para determinar la diferencia en sensibilidad y especificidad de los dos métodos. Las ELISA convencionales se realizaron al mismo tiempo que los ensayos ELISA-array para asegurar condiciones de reacción similares. Las ELISA convencionales se realizaron en una forma idéntica a la ELISA-array, excepto que los anticuerpos fueron recubiertos con una concentración de 2 μg/ml en PBS (pH 7,4) y se utilizó el sustrato TMB en lugar de Super Signal ELISA Femto Sustrato Máximo Sensible [16, 17]. Se recolectaron tres muestras séricas de pacientes con síntomas del sistema nervioso e historias de picaduras de garrapatas. Las muestras séricas fueron tratadas con penicilina y estreptomicina, luego inoculadas en las cavidades alantóicas de huevos de pollo. 3 días después, el líquido fue recogido y dividido en dos porciones (una para inactivación y otra para extracción de ARN). El ARN y las muestras inactivadas fueron almacenadas a -70°C antes de su uso. El ARN se extrajo de los huevos de pollo inoculados utilizando un mini kit RNAasy (Qiagen Inc., Valencia, CA, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todos los procedimientos de extracción de ARN se realizaron en instalaciones de BSL-3. Los imprimadores y sondas se utilizaron como se describió anteriormente [18]. El RT-PCR en tiempo real se llevó a cabo con un Quti-teck q-RT-PCR Kit (Qiagen Inc.). La reacción consistió en 10 μL de 2 × tampón de reacción (0,2 μL enzima de transcripción inversa, y 250 nmol La PCR se realizó con un LightCycler 2.0 (Roche, Suiza) [19]. Optimización del ensayo ELISA-arrayEl diseño del array manchado se muestra en la Figura 1 y la eficacia de tres tampones de manchado diferentes en la calidad de los rayos ELISA impresos fueron investigados por observación morfológica puntual y comparación de intensidad de señal. La concentración de manchado de los anticuerpos de captura varió de 0,2 a 0,0125 mg/ml (cada uno se diluyó en serie 2 veces). La eficacia de la concentración de manchado de los anticuerpos de captura fue evaluada por detección del cultivo del virus, la concentración de manchado adecuada fue determinada por una combinación de reacción cruzada minimizada y mayor intensidad de señal. La Figura 1 ilustra el diseño del array y la Figura 2 muestra el resultado de los tres tampones de manchado y concentración de manchado de anticuerpos 2B5 por La observación de la morfología puntual (Figuras 2a, b y 2c) demostró que el tampón de detección que contiene PBS con 20% de glicerol produjo morfología puntual; los tampones que contienen PBS solo y PBS con 20% de glicerol +0,004% de Triton-X100 dieron buena morfología puntual (redondo y completo). Los tampones que contienen PBS con 20% de glicerol y PBS con 20% de glicerol+0,004% de Triton-X100 produjeron intensidades de señal más altas que el PBS solo. Así, PBS con 20% de glicerol +0,004% de Triton-X100 fue adoptado como el tampón de detección optimizado para experimentos posteriores. Simultáneamente, la evaluación de la concentración puntual sugirió que 0,05 mg/ml era óptima. A esta concentración, la intensidad de la señal fue mayor y la reacción cruzada no En consecuencia, la optimización de la concentración de detección de otros anticuerpos de captura (4D5, 1F1, 4E11 y 2B8) demostró que 0,05 mg/ml también eran adecuados (datos no mostrados). La disposición optimizada de la matriz ELISA se muestra en la Figura 3, que se aplicó en los siguientes experimentos. La detección exitosa de patógenos virales requiere una prueba con alta sensibilidad y especificidad. Para evaluar el rendimiento de las matrices de anticuerpos diseñadas, se examinó la especificidad y sensibilidad de los analitos individuales. Mediante la prueba de cultivos virales serialmente diluidos, incluyendo DV-2, DV-4, JEV, TBE, SV y EEEV, se comparó la sensibilidad de ELISAarray y la ELISA convencional idéntica ( Tabla 1 ). Se comparó y demostró el límite de detección de los dos métodos. La prueba de reactividad cruzada se realizó utilizando cultivos de BHK-21 y lisato de células de vero, virus de la fiebre amarilla (YFV) (5 × 10 5 TCID 50/ml, cultivos de virus del Nilo Occidental (WNV)(2 × 10 6 TCID 50/ml) y virus de la encefalitis equina occidental(1 × 10 7 TCID 50/ml). Los resultados demostraron que ni el vector ELISA ni el ELISA tradicional mostraron reactividad cruzada.En todas las pruebas se prepararon volúmenes iguales de TVEV, JEV, DV-2, DV-4, SV y EEEV para la detección de muestras únicas; dos o tres de los cultivos se mezclaron para la detección múltiplex. Se utilizó un cóctel de anticuerpo conjugado de biotina (2A10, 4E11 y 1F1). Los resultados demostraron que para todas las combinaciones virales, cada virus fue detectado específicamente, sin resultados falsos positivos o negativos (Figuras 4 y 5). Los huevos de pollo inoculados con suero humano infectado fueron utilizados para la validación del ensayo ELISA-array. Todas las muestras mostraron señales de alta reacción con anticuerpo de captura 2B5, que fue específico para TBEV (Figura 6b ). El ensayo ELISA-array sugirió que los tres pacientes estaban infectados con TBEV. Para verificar los resultados probados por ELISA-array, el ARN extraído de huevos de pollo se aplicó a un ensayo RT-PCR en tiempo real utilizando imprimadores y sondas dirigidas a TBEV. Los resultados también fueron positivos (Figura 6a). Los resultados de la detección de consenso confirmaron que el ensayo ELISAarray era confiable. Para ser ampliamente utilizado en el entorno clínico, el sistema de detección debe ser fácil de usar y puede ser realizado por personal no capacitado con poca experiencia de laboratorio y experimental. Además, cuando el volumen de las muestras clínicas es limitado y un número creciente de patógenos por muestra necesita ser probado, el sistema de detección debe ser de alto rendimiento para permitir la detección de múltiples patógenos simultáneamente [6, 20, 21]. Detección múltiple, fácil de usar y asequibilidad son requisitos para los métodos de detección en el entorno clínico. Por lo tanto, una revisión ELISA, que combina las ventajas de ELISA y matriz de proteínas, cumple los requisitos anteriores. Se ha reportado que una revisión ELISA se ha utilizado en el diagnóstico de cáncer y enfermedad autoalérgica [7, 12] ; sin embargo, ningún estudio ha reportado la detección de patógenos virales. En este estudio se desarrolló un método multiplex basado en ELISA en un sandwich de doble anticuerpo para la detección simultánea de cinco patógenos virales asociados a la encefalitis. La producción de un chip de anticuerpos confiable para la identificación de microorganismos requiere una cuidadosa detección de la captura de anticuerpos [14]. Se debe minimizar la reactividad cruzada y la afinidad del anticuerpo es tan importante como la especificidad. En primer lugar, se preparó y examinó 23 anticuerpos monoclonales contra ocho virus y se verificó la especificidad y afinidad con los virus objetivo mediante un ensayo de inmunofluorescencia. Luego, los anticuerpos fueron analizados por una matriz ELISA con un sandwich de doble anticuerpo formato ELISA. Se excluyeron los anticuerpos que produjeron reactividad cruzada y señales de baja positivo. Finalmente, se seleccionaron seis anticuerpos como anticuerpos de captura. Otro anticuerpo monoclonal, 2A10, que podría reaccionar específicamente con todos los virus del género Flavivirus, fue utilizado para detectar anticuerpos contra DV, JEV y TBEV. Para la detección de EEV y SV, aunque los anticuerpos de detección y captura fueron los mismos (1F1 y 4E11, respectivamente), los anticuerpos produjeron excelentes señales positivas. El epitope no fue definido; sin embargo, sospechamos que ambos anticuerpos se dirigen a la superficie de los viriones. A medida que un virio sale como, muchos con el mismo epítope aparecen, por lo tanto, no se produjo ninguna interferencia utilizando el mismo anticuerpo en el ensayo en forma de sándwich de doble anticuerpo. Actualmente, la disponibilidad de anticuerpos adecuados para un ensayo diagnóstico en formato de matriz es un problema importante. En el futuro, con un número creciente de anticuerpos adecuados, especialmente anticuerpos específicos contra Flavivirus, este ELISAarray podría ser capaz de probar más patógenos y ser de mayor uso potencial. Para hacer el ensayo más susceptible a la detección de múltiples virus, el protocolo de ensayo fue optimizado. Además del tampón de punción, la concentración de anticuerpos de captura y los diferentes métodos de inactivación del virus (calentamiento y β-propiolactona) también fueron comparados y evaluados. La inactivación del calor se realizó calentando los cultivos virales a 56°C durante 1 h, y la inactivación de β-propiolactona se realizó añadiendo β-propiolactona en los retenes mejor antigenicidad que el método de inactivación del calor. Así, se eligió el tratamiento de β-propiolactona como método de inactivación del virus. Un EL Se comparó el array ELISA con un ELISA convencional y se confirmó que la ventaja del array ELISA era evidente con especificidad comparable y mayor sensibilidad que ELISA. El tiempo requerido para el array ELISA es significativamente menor que para el array ELISA convencional (4 h frente a un mínimo de 6 h, respectivamente). Además, se requiere menos IgG para la impresión que para el recubrimiento de placas ELISA. Recubrimiento de un solo pozo en placa microtitular requiere 100 μl de una solución anticuerpo de 1 μg/ml, lo que equivale a 100 ng de IgG. Para el array ELISA, sólo se requiere 30 nl de una solución anticuerpo de 50 μg/ml para cada punto, lo que equivale a 1,5 ng de IgG. Con las características de facilidad de uso, sensibilidad, especificidad y precisión, el array ELISA sería ampliamente aceptado

¿Cuáles son los métodos disponibles clínicamente para detectar antígenos virales de la encefalitis?

El desarrollo de una guía ELISA para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitishttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3305475/SHA: ef2b8f83d5a3ab8ae35e4b51fea6d3ed9eb49122Autores: Kang, Xiaoping; Li, Yuchang; Fan, Li; Lin, Fang; Wei, Jingjing; Zhu, Xiaolei; Hu, Yi; Li, Jing; Chang, Guohui; Zhu, Qingyu; Liu, Hong; Yang, YinhuiFecha: 2012-02-27DOI: 10.1186/1743-422x-9-56Licencia: cc-byAbstract: virus de la encefalitis japonesa(JEV), virus de El establecimiento de métodos precisos y fáciles para detectar estos virus es esencial para la prevención y el tratamiento de las enfermedades infecciosas asociadas. Actualmente, todavía no existen métodos de detección de antígenos múltiples disponibles clínicamente. En este estudio se desarrolló un sistema ELISA-array para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitis. Se prepararon siete anticuerpos monoclonales contra cinco virus asociados a la encefalitis y se utilizaron para el desarrollo del sistema ELISA-array. El ensayo ELISA-array se basa en un formato ELISA "sandwich" y consiste en anticuerpos virales impresos directamente en placas microtiterizadas de 96 pocillos, lo que permite la detección directa de 5 virus. El sistema ELISA-array desarrollado demostró tener una especificidad similar y una mayor sensibilidad en comparación con las ELISA convencionales. Este método fue validado por diferentes cultivos virales y tres huevos de pollo inoculados con suero de paciente infectado. Los resultados demostraron que el vector ELISA desarrollado es sensible y fácil de usar, lo que tendría potencial de uso clínico. Texto: virus de la encefalitis japonesa (JEV), virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (TBEV), virus de la encefalitis equina oriental (EEEV), virus sindbis (SV), y virus del dengue (DV) son arbovirus y causan síntomas de encefalitis, con una amplia gama de gravedad y tasas de mortalidad [1]. El establecimiento de un método preciso y fácil para la detección de estos virus es esencial para la prevención y el tratamiento de enfermedades infecciosas asociadas. Actualmente, ELISA e IFA son los métodos que están clínicamente disponibles para la detección de antígenos virales de encefalitis, pero sólo pudieron detectar un patógeno en un Hay una variedad de métodos diferentes disponibles para identificar antígenos múltiples en una muestra simultáneamente, tales como electroforesis gel bidimensional, chip de proteína, espectrometría de masas y tecnología de matriz de suspensión [4] [5] [6]. Sin embargo, la aplicación de estas técnicas en la detección de patógenos todavía se encuentra en una fase temprana, tal vez debido al uso complicado y alto costo. Arrays de anticuerpos para la cuantificación simultánea de antígenos múltiples se consideran los métodos más precisos [7] [8] [9] [10]. Liew [11] validó una ELISA múltiple para la detección de 9 antígenos; Anderson [12] utilizó el microarray ELISA para la detección multiplex de anticuerpos a antígenos tumorales en el cáncer de mama, y demostró que los análisis de matrices basados en ELISA tenían el rango dinámico más amplio y los requisitos de volumen de muestra más bajo en comparación con los otros ensayos. Sin embargo, la aplicación de matrices basadas en ELISA se limita actualmente En este estudio, se desarrolló una matriz con base ELISA para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitis, se prepararon siete anticuerpos monoclonales específicos contra cinco virus de la encefalitis y se utilizó para establecer un ensayo ELISA-array. El ensayo fue validado utilizando virus cultivados y huevos de pollo inoculados con suero paciente. Los resultados demostraron que este método combinaba la ventaja de ELISA y matriz proteica (multiplex y facilidad de uso) y tiene potencial para la identificación del virus de la encefalitis clínica. Los anticuerpos monoclonales se prepararon a partir de líneas celulares de hibridoma construidas por el Prof. Zhu et al. La purificación se realizó mediante cromatografía de inmunoafinidad en sepharose de afinidad proteica G [13]. Para este estudio se seleccionaron anticuerpos monoclonales específicos (4D5 frente a JEV, 2B5 frente a TVEV, 1F1 frente a SV, 2B8 frente a serotipo 2 DV, 4F9 frente a serotipo 4 DV, 4E11 frente a EEV y 2A10 frente a Flavivirus). Todos los anticuerpos se elevaron de acuerdo con los procedimientos estándar.Utilizando 4D5, 2B5, 1F1, 2B8, 4F9 y 4E11 como anticuerpos de captura, anticuerpos de detección (2A10, 1 F1 y 4E11) se acoplaron a ester de biotina-NHS (Pierce, Alemania) a 4°C durante 3 h según las instrucciones del fabricante.La biotina no incorporada fue eliminada por la columna de rotación Desalt (Pierce). Las reacciones inmunológicas fueron notificadas por Streptavidin-HRP (CWBIO, Beijing, China) y Super Signal ELISA Femto Sustrato Sensible Máximo. Se utilizó como control positivo el anticuerpo cabra-anti ratón purificado. JEV y DV fueron cultivadas en C6/36 células; SV, TBEV y EEEV fueron cultivadas en células BHK-21. El cultivo de TBEV y EEV fue realizado en instalaciones de nivel 3 de bioseguridad, sin embargo, JEV, DV y SV fueron realizadas en instalaciones de nivel 2 de bioseguridad. Los títulos virales fueron determinados por el método de la dosis infecciosa de cultivo tisular 50% (TCID 50 ). Todos los cultivos fueron inactivados por 0,025% β-propionolactona a 4°C durante la noche, luego 37°C Los anticuerpos fueron detectados utilizando una máquina BIODOT (BD6000;California, EE.UU.) en placas ELISA (30 nl/punto). Las placas fueron bloqueadas con 3 % BSA-PBS en 37°C durante 1 h, seguidas de lavado 3 veces con PBS que contenía 0,1% Tween-20 durante 2 minutos cada una. Luego, las placas fueron secas, selladas y almacenadas a 4°C antes de su uso [11]. Cuando se detectaron, se evaluaron diferentes tampones y concentraciones de anticuerpos monoclonales de captura para optimizar el ensayo ELISA-array. La optimización fue evaluada por morfología de punto e intensidad de señal. Los tampones de detección probados incluyeron 1 x fosfato tampón salino (PBS), PBS +20% glicerol, y 1 × PBS + 20% glicerol+0,004% Se comparó un rango de concentraciones de anticuerpos monoclonales (0,0125, 0,025, 0,05, 0,1 y 0,2 mg/ml). Tras un formato sándwich de doble anticuerpo, las placas impresas fueron incubadas secuencialmente con cultivos virales inactivados, anticuerpos de detección marcados con biotina, avidina y sustrato marcados con HPR, seguidos de una evaluación de la señal. La unión de antígenos se realizó en PBS (conteniendo 0,1% Tween-20 y 5% FCS) a 37°C durante 2 h, seguido de lavado 3 veces (1 × PBS con 0,1% Tween-20). La incubación de placas ELISA con cocteles anticuerpos de detección biotinilados fue realizada en PBS (conteniendo 0,1% Tween-20 y 5% FCS) a 37°C durante 2 h. Después del lavado, la unión específica de los anticuerpos de detección fue reportada por estreptavidina-HRP y teñida con Super Signal ELISA Femto Sustrato Máximo Sensible (Thermo científico, Rockford, EE.UU.) [11, 14, 15]. La visualización de la placa fue realizada en AE 1000 analizador de imagen CCD fresco (Beijing BGI GBI Biotech Company., LTD, China). La intensidad de la señal y el fondo de cada mancha fue leída y grabada con "Monster"software. Las señales positivas fueron definidas como un valor de señal > 400 y un valor de señal (muestra)/valor de señal Los anticuerpos idénticos utilizados en el formato ELISA-array también fueron probados en un formato ELISA convencional para determinar la diferencia en sensibilidad y especificidad de los dos métodos. Las ELISA convencionales se realizaron al mismo tiempo que los ensayos ELISA-array para asegurar condiciones de reacción similares. Las ELISA convencionales se realizaron en una forma idéntica a la ELISA-array, excepto que los anticuerpos fueron recubiertos con una concentración de 2 μg/ml en PBS (pH 7,4) y se utilizó el sustrato TMB en lugar de Super Signal ELISA Femto Sustrato Máximo Sensible [16, 17]. Se recolectaron tres muestras séricas de pacientes con síntomas del sistema nervioso e historias de picaduras de garrapatas. Las muestras séricas fueron tratadas con penicilina y estreptomicina, luego inoculadas en las cavidades alantóicas de huevos de pollo. 3 días después, el líquido fue recogido y dividido en dos porciones (una para inactivación y otra para extracción de ARN). El ARN y las muestras inactivadas fueron almacenadas a -70°C antes de su uso. El ARN se extrajo de los huevos de pollo inoculados utilizando un mini kit RNAasy (Qiagen Inc., Valencia, CA, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todos los procedimientos de extracción de ARN se realizaron en instalaciones de BSL-3. Los imprimadores y sondas se utilizaron como se describió anteriormente [18]. El RT-PCR en tiempo real se llevó a cabo con un Quti-teck q-RT-PCR Kit (Qiagen Inc.). La reacción consistió en 10 μL de 2 × tampón de reacción (0,2 μL enzima de transcripción inversa, y 250 nmol La PCR se realizó con un LightCycler 2.0 (Roche, Suiza) [19]. Optimización del ensayo ELISA-arrayEl diseño del array manchado se muestra en la Figura 1 y la eficacia de tres tampones de manchado diferentes en la calidad de los rayos ELISA impresos fueron investigados por observación morfológica puntual y comparación de intensidad de señal. La concentración de manchado de los anticuerpos de captura varió de 0,2 a 0,0125 mg/ml (cada uno se diluyó en serie 2 veces). La eficacia de la concentración de manchado de los anticuerpos de captura fue evaluada por detección del cultivo del virus, la concentración de manchado adecuada fue determinada por una combinación de reacción cruzada minimizada y mayor intensidad de señal. La Figura 1 ilustra el diseño del array y la Figura 2 muestra el resultado de los tres tampones de manchado y concentración de manchado de anticuerpos 2B5 por La observación de la morfología puntual (Figuras 2a, b y 2c) demostró que el tampón de detección que contiene PBS con 20% de glicerol produjo morfología puntual; los tampones que contienen PBS solo y PBS con 20% de glicerol +0,004% de Triton-X100 dieron buena morfología puntual (redondo y completo). Los tampones que contienen PBS con 20% de glicerol y PBS con 20% de glicerol+0,004% de Triton-X100 produjeron intensidades de señal más altas que el PBS solo. Así, PBS con 20% de glicerol +0,004% de Triton-X100 fue adoptado como el tampón de detección optimizado para experimentos posteriores. Simultáneamente, la evaluación de la concentración puntual sugirió que 0,05 mg/ml era óptima. A esta concentración, la intensidad de la señal fue mayor y la reacción cruzada no En consecuencia, la optimización de la concentración de detección de otros anticuerpos de captura (4D5, 1F1, 4E11 y 2B8) demostró que 0,05 mg/ml también eran adecuados (datos no mostrados). La disposición optimizada de la matriz ELISA se muestra en la Figura 3, que se aplicó en los siguientes experimentos. La detección exitosa de patógenos virales requiere una prueba con alta sensibilidad y especificidad. Para evaluar el rendimiento de las matrices de anticuerpos diseñadas, se examinó la especificidad y sensibilidad de los analitos individuales. Mediante la prueba de cultivos virales serialmente diluidos, incluyendo DV-2, DV-4, JEV, TBE, SV y EEEV, se comparó la sensibilidad de ELISAarray y la ELISA convencional idéntica ( Tabla 1 ). Se comparó y demostró el límite de detección de los dos métodos. La prueba de reactividad cruzada se realizó utilizando cultivos de BHK-21 y lisato de células de vero, virus de la fiebre amarilla (YFV) (5 × 10 5 TCID 50/ml, cultivos de virus del Nilo Occidental (WNV)(2 × 10 6 TCID 50/ml) y virus de la encefalitis equina occidental(1 × 10 7 TCID 50/ml). Los resultados demostraron que ni el vector ELISA ni el ELISA tradicional mostraron reactividad cruzada.En todas las pruebas se prepararon volúmenes iguales de TVEV, JEV, DV-2, DV-4, SV y EEEV para la detección de muestras únicas; dos o tres de los cultivos se mezclaron para la detección múltiplex. Se utilizó un cóctel de anticuerpo conjugado de biotina (2A10, 4E11 y 1F1). Los resultados demostraron que para todas las combinaciones virales, cada virus fue detectado específicamente, sin resultados falsos positivos o negativos (Figuras 4 y 5). Los huevos de pollo inoculados con suero humano infectado fueron utilizados para la validación del ensayo ELISA-array. Todas las muestras mostraron señales de alta reacción con anticuerpo de captura 2B5, que fue específico para TBEV (Figura 6b ). El ensayo ELISA-array sugirió que los tres pacientes estaban infectados con TBEV. Para verificar los resultados probados por ELISA-array, el ARN extraído de huevos de pollo se aplicó a un ensayo RT-PCR en tiempo real utilizando imprimadores y sondas dirigidas a TBEV. Los resultados también fueron positivos (Figura 6a). Los resultados de la detección de consenso confirmaron que el ensayo ELISAarray era confiable. Para ser ampliamente utilizado en el entorno clínico, el sistema de detección debe ser fácil de usar y puede ser realizado por personal no capacitado con poca experiencia de laboratorio y experimental. Además, cuando el volumen de las muestras clínicas es limitado y un número creciente de patógenos por muestra necesita ser probado, el sistema de detección debe ser de alto rendimiento para permitir la detección de múltiples patógenos simultáneamente [6, 20, 21]. Detección múltiple, fácil de usar y asequibilidad son requisitos para los métodos de detección en el entorno clínico. Por lo tanto, una revisión ELISA, que combina las ventajas de ELISA y matriz de proteínas, cumple los requisitos anteriores. Se ha reportado que una revisión ELISA se ha utilizado en el diagnóstico de cáncer y enfermedad autoalérgica [7, 12] ; sin embargo, ningún estudio ha reportado la detección de patógenos virales. En este estudio se desarrolló un método multiplex basado en ELISA en un sandwich de doble anticuerpo para la detección simultánea de cinco patógenos virales asociados a la encefalitis. La producción de un chip de anticuerpos confiable para la identificación de microorganismos requiere una cuidadosa detección de la captura de anticuerpos [14]. Se debe minimizar la reactividad cruzada y la afinidad del anticuerpo es tan importante como la especificidad. En primer lugar, se preparó y examinó 23 anticuerpos monoclonales contra ocho virus y se verificó la especificidad y afinidad con los virus objetivo mediante un ensayo de inmunofluorescencia. Luego, los anticuerpos fueron analizados por una matriz ELISA con un sandwich de doble anticuerpo formato ELISA. Se excluyeron los anticuerpos que produjeron reactividad cruzada y señales de baja positivo. Finalmente, se seleccionaron seis anticuerpos como anticuerpos de captura. Otro anticuerpo monoclonal, 2A10, que podría reaccionar específicamente con todos los virus del género Flavivirus, fue utilizado para detectar anticuerpos contra DV, JEV y TBEV. Para la detección de EEV y SV, aunque los anticuerpos de detección y captura fueron los mismos (1F1 y 4E11, respectivamente), los anticuerpos produjeron excelentes señales positivas. El epitope no fue definido; sin embargo, sospechamos que ambos anticuerpos se dirigen a la superficie de los viriones. A medida que un virio sale como, muchos con el mismo epítope aparecen, por lo tanto, no se produjo ninguna interferencia utilizando el mismo anticuerpo en el ensayo en forma de sándwich de doble anticuerpo. Actualmente, la disponibilidad de anticuerpos adecuados para un ensayo diagnóstico en formato de matriz es un problema importante. En el futuro, con un número creciente de anticuerpos adecuados, especialmente anticuerpos específicos contra Flavivirus, este ELISAarray podría ser capaz de probar más patógenos y ser de mayor uso potencial. Para hacer el ensayo más susceptible a la detección de múltiples virus, el protocolo de ensayo fue optimizado. Además del tampón de punción, la concentración de anticuerpos de captura y los diferentes métodos de inactivación del virus (calentamiento y β-propiolactona) también fueron comparados y evaluados. La inactivación del calor se realizó calentando los cultivos virales a 56°C durante 1 h, y la inactivación de β-propiolactona se realizó añadiendo β-propiolactona en los retenes mejor antigenicidad que el método de inactivación del calor. Así, se eligió el tratamiento de β-propiolactona como método de inactivación del virus. Un EL Se comparó el array ELISA con un ELISA convencional y se confirmó que la ventaja del array ELISA era evidente con especificidad comparable y mayor sensibilidad que ELISA. El tiempo requerido para el array ELISA es significativamente menor que para el array ELISA convencional (4 h frente a un mínimo de 6 h, respectivamente). Además, se requiere menos IgG para la impresión que para el recubrimiento de placas ELISA. Recubrimiento de un solo pozo en placa microtitular requiere 100 μl de una solución anticuerpo de 1 μg/ml, lo que equivale a 100 ng de IgG. Para el array ELISA, sólo se requiere 30 nl de una solución anticuerpo de 50 μg/ml para cada punto, lo que equivale a 1,5 ng de IgG. Con las características de facilidad de uso, sensibilidad, especificidad y precisión, el array ELISA sería ampliamente aceptado

¿Cuántos antígenos podrían ser detectados por la prueba ELISA multiplex de Liew?

El desarrollo de una guía ELISA para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitishttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3305475/SHA: ef2b8f83d5a3ab8ae35e4b51fea6d3ed9eb49122Autores: Kang, Xiaoping; Li, Yuchang; Fan, Li; Lin, Fang; Wei, Jingjing; Zhu, Xiaolei; Hu, Yi; Li, Jing; Chang, Guohui; Zhu, Qingyu; Liu, Hong; Yang, YinhuiFecha: 2012-02-27DOI: 10.1186/1743-422x-9-56Licencia: cc-byAbstract: virus de la encefalitis japonesa(JEV), virus de El establecimiento de métodos precisos y fáciles para detectar estos virus es esencial para la prevención y el tratamiento de las enfermedades infecciosas asociadas. Actualmente, todavía no existen métodos de detección de antígenos múltiples disponibles clínicamente. En este estudio se desarrolló un sistema ELISA-array para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitis. Se prepararon siete anticuerpos monoclonales contra cinco virus asociados a la encefalitis y se utilizaron para el desarrollo del sistema ELISA-array. El ensayo ELISA-array se basa en un formato ELISA "sandwich" y consiste en anticuerpos virales impresos directamente en placas microtiterizadas de 96 pocillos, lo que permite la detección directa de 5 virus. El sistema ELISA-array desarrollado demostró tener una especificidad similar y una mayor sensibilidad en comparación con las ELISA convencionales. Este método fue validado por diferentes cultivos virales y tres huevos de pollo inoculados con suero de paciente infectado. Los resultados demostraron que el vector ELISA desarrollado es sensible y fácil de usar, lo que tendría potencial de uso clínico. Texto: virus de la encefalitis japonesa (JEV), virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (TBEV), virus de la encefalitis equina oriental (EEEV), virus sindbis (SV), y virus del dengue (DV) son arbovirus y causan síntomas de encefalitis, con una amplia gama de gravedad y tasas de mortalidad [1]. El establecimiento de un método preciso y fácil para la detección de estos virus es esencial para la prevención y el tratamiento de enfermedades infecciosas asociadas. Actualmente, ELISA e IFA son los métodos que están clínicamente disponibles para la detección de antígenos virales de encefalitis, pero sólo pudieron detectar un patógeno en un Hay una variedad de métodos diferentes disponibles para identificar antígenos múltiples en una muestra simultáneamente, tales como electroforesis gel bidimensional, chip de proteína, espectrometría de masas y tecnología de matriz de suspensión [4] [5] [6]. Sin embargo, la aplicación de estas técnicas en la detección de patógenos todavía se encuentra en una fase temprana, tal vez debido al uso complicado y alto costo. Arrays de anticuerpos para la cuantificación simultánea de antígenos múltiples se consideran los métodos más precisos [7] [8] [9] [10]. Liew [11] validó una ELISA múltiple para la detección de 9 antígenos; Anderson [12] utilizó el microarray ELISA para la detección multiplex de anticuerpos a antígenos tumorales en el cáncer de mama, y demostró que los análisis de matrices basados en ELISA tenían el rango dinámico más amplio y los requisitos de volumen de muestra más bajo en comparación con los otros ensayos. Sin embargo, la aplicación de matrices basadas en ELISA se limita actualmente En este estudio, se desarrolló una matriz con base ELISA para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitis, se prepararon siete anticuerpos monoclonales específicos contra cinco virus de la encefalitis y se utilizó para establecer un ensayo ELISA-array. El ensayo fue validado utilizando virus cultivados y huevos de pollo inoculados con suero paciente. Los resultados demostraron que este método combinaba la ventaja de ELISA y matriz proteica (multiplex y facilidad de uso) y tiene potencial para la identificación del virus de la encefalitis clínica. Los anticuerpos monoclonales se prepararon a partir de líneas celulares de hibridoma construidas por el Prof. Zhu et al. La purificación se realizó mediante cromatografía de inmunoafinidad en sepharose de afinidad proteica G [13]. Para este estudio se seleccionaron anticuerpos monoclonales específicos (4D5 frente a JEV, 2B5 frente a TVEV, 1F1 frente a SV, 2B8 frente a serotipo 2 DV, 4F9 frente a serotipo 4 DV, 4E11 frente a EEV y 2A10 frente a Flavivirus). Todos los anticuerpos se elevaron de acuerdo con los procedimientos estándar.Utilizando 4D5, 2B5, 1F1, 2B8, 4F9 y 4E11 como anticuerpos de captura, anticuerpos de detección (2A10, 1 F1 y 4E11) se acoplaron a ester de biotina-NHS (Pierce, Alemania) a 4°C durante 3 h según las instrucciones del fabricante.La biotina no incorporada fue eliminada por la columna de rotación Desalt (Pierce). Las reacciones inmunológicas fueron notificadas por Streptavidin-HRP (CWBIO, Beijing, China) y Super Signal ELISA Femto Sustrato Sensible Máximo. Se utilizó como control positivo el anticuerpo cabra-anti ratón purificado. JEV y DV fueron cultivadas en C6/36 células; SV, TBEV y EEEV fueron cultivadas en células BHK-21. El cultivo de TBEV y EEV fue realizado en instalaciones de nivel 3 de bioseguridad, sin embargo, JEV, DV y SV fueron realizadas en instalaciones de nivel 2 de bioseguridad. Los títulos virales fueron determinados por el método de la dosis infecciosa de cultivo tisular 50% (TCID 50 ). Todos los cultivos fueron inactivados por 0,025% β-propionolactona a 4°C durante la noche, luego 37°C Los anticuerpos fueron detectados utilizando una máquina BIODOT (BD6000;California, EE.UU.) en placas ELISA (30 nl/punto). Las placas fueron bloqueadas con 3 % BSA-PBS en 37°C durante 1 h, seguidas de lavado 3 veces con PBS que contenía 0,1% Tween-20 durante 2 minutos cada una. Luego, las placas fueron secas, selladas y almacenadas a 4°C antes de su uso [11]. Cuando se detectaron, se evaluaron diferentes tampones y concentraciones de anticuerpos monoclonales de captura para optimizar el ensayo ELISA-array. La optimización fue evaluada por morfología de punto e intensidad de señal. Los tampones de detección probados incluyeron 1 x fosfato tampón salino (PBS), PBS +20% glicerol, y 1 × PBS + 20% glicerol+0,004% Se comparó un rango de concentraciones de anticuerpos monoclonales (0,0125, 0,025, 0,05, 0,1 y 0,2 mg/ml). Tras un formato sándwich de doble anticuerpo, las placas impresas fueron incubadas secuencialmente con cultivos virales inactivados, anticuerpos de detección marcados con biotina, avidina y sustrato marcados con HPR, seguidos de una evaluación de la señal. La unión de antígenos se realizó en PBS (conteniendo 0,1% Tween-20 y 5% FCS) a 37°C durante 2 h, seguido de lavado 3 veces (1 × PBS con 0,1% Tween-20). La incubación de placas ELISA con cocteles anticuerpos de detección biotinilados fue realizada en PBS (conteniendo 0,1% Tween-20 y 5% FCS) a 37°C durante 2 h. Después del lavado, la unión específica de los anticuerpos de detección fue reportada por estreptavidina-HRP y teñida con Super Signal ELISA Femto Sustrato Máximo Sensible (Thermo científico, Rockford, EE.UU.) [11, 14, 15]. La visualización de la placa fue realizada en AE 1000 analizador de imagen CCD fresco (Beijing BGI GBI Biotech Company., LTD, China). La intensidad de la señal y el fondo de cada mancha fue leída y grabada con "Monster"software. Las señales positivas fueron definidas como un valor de señal > 400 y un valor de señal (muestra)/valor de señal Los anticuerpos idénticos utilizados en el formato ELISA-array también fueron probados en un formato ELISA convencional para determinar la diferencia en sensibilidad y especificidad de los dos métodos. Las ELISA convencionales se realizaron al mismo tiempo que los ensayos ELISA-array para asegurar condiciones de reacción similares. Las ELISA convencionales se realizaron en una forma idéntica a la ELISA-array, excepto que los anticuerpos fueron recubiertos con una concentración de 2 μg/ml en PBS (pH 7,4) y se utilizó el sustrato TMB en lugar de Super Signal ELISA Femto Sustrato Máximo Sensible [16, 17]. Se recolectaron tres muestras séricas de pacientes con síntomas del sistema nervioso e historias de picaduras de garrapatas. Las muestras séricas fueron tratadas con penicilina y estreptomicina, luego inoculadas en las cavidades alantóicas de huevos de pollo. 3 días después, el líquido fue recogido y dividido en dos porciones (una para inactivación y otra para extracción de ARN). El ARN y las muestras inactivadas fueron almacenadas a -70°C antes de su uso. El ARN se extrajo de los huevos de pollo inoculados utilizando un mini kit RNAasy (Qiagen Inc., Valencia, CA, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todos los procedimientos de extracción de ARN se realizaron en instalaciones de BSL-3. Los imprimadores y sondas se utilizaron como se describió anteriormente [18]. El RT-PCR en tiempo real se llevó a cabo con un Quti-teck q-RT-PCR Kit (Qiagen Inc.). La reacción consistió en 10 μL de 2 × tampón de reacción (0,2 μL enzima de transcripción inversa, y 250 nmol La PCR se realizó con un LightCycler 2.0 (Roche, Suiza) [19]. Optimización del ensayo ELISA-arrayEl diseño del array manchado se muestra en la Figura 1 y la eficacia de tres tampones de manchado diferentes en la calidad de los rayos ELISA impresos fueron investigados por observación morfológica puntual y comparación de intensidad de señal. La concentración de manchado de los anticuerpos de captura varió de 0,2 a 0,0125 mg/ml (cada uno se diluyó en serie 2 veces). La eficacia de la concentración de manchado de los anticuerpos de captura fue evaluada por detección del cultivo del virus, la concentración de manchado adecuada fue determinada por una combinación de reacción cruzada minimizada y mayor intensidad de señal. La Figura 1 ilustra el diseño del array y la Figura 2 muestra el resultado de los tres tampones de manchado y concentración de manchado de anticuerpos 2B5 por La observación de la morfología puntual (Figuras 2a, b y 2c) demostró que el tampón de detección que contiene PBS con 20% de glicerol produjo morfología puntual; los tampones que contienen PBS solo y PBS con 20% de glicerol +0,004% de Triton-X100 dieron buena morfología puntual (redondo y completo). Los tampones que contienen PBS con 20% de glicerol y PBS con 20% de glicerol+0,004% de Triton-X100 produjeron intensidades de señal más altas que el PBS solo. Así, PBS con 20% de glicerol +0,004% de Triton-X100 fue adoptado como el tampón de detección optimizado para experimentos posteriores. Simultáneamente, la evaluación de la concentración puntual sugirió que 0,05 mg/ml era óptima. A esta concentración, la intensidad de la señal fue mayor y la reacción cruzada no En consecuencia, la optimización de la concentración de detección de otros anticuerpos de captura (4D5, 1F1, 4E11 y 2B8) demostró que 0,05 mg/ml también eran adecuados (datos no mostrados). La disposición optimizada de la matriz ELISA se muestra en la Figura 3, que se aplicó en los siguientes experimentos. La detección exitosa de patógenos virales requiere una prueba con alta sensibilidad y especificidad. Para evaluar el rendimiento de las matrices de anticuerpos diseñadas, se examinó la especificidad y sensibilidad de los analitos individuales. Mediante la prueba de cultivos virales serialmente diluidos, incluyendo DV-2, DV-4, JEV, TBE, SV y EEEV, se comparó la sensibilidad de ELISAarray y la ELISA convencional idéntica ( Tabla 1 ). Se comparó y demostró el límite de detección de los dos métodos. La prueba de reactividad cruzada se realizó utilizando cultivos de BHK-21 y lisato de células de vero, virus de la fiebre amarilla (YFV) (5 × 10 5 TCID 50/ml, cultivos de virus del Nilo Occidental (WNV)(2 × 10 6 TCID 50/ml) y virus de la encefalitis equina occidental(1 × 10 7 TCID 50/ml). Los resultados demostraron que ni el vector ELISA ni el ELISA tradicional mostraron reactividad cruzada.En todas las pruebas se prepararon volúmenes iguales de TVEV, JEV, DV-2, DV-4, SV y EEEV para la detección de muestras únicas; dos o tres de los cultivos se mezclaron para la detección múltiplex. Se utilizó un cóctel de anticuerpo conjugado de biotina (2A10, 4E11 y 1F1). Los resultados demostraron que para todas las combinaciones virales, cada virus fue detectado específicamente, sin resultados falsos positivos o negativos (Figuras 4 y 5). Los huevos de pollo inoculados con suero humano infectado fueron utilizados para la validación del ensayo ELISA-array. Todas las muestras mostraron señales de alta reacción con anticuerpo de captura 2B5, que fue específico para TBEV (Figura 6b ). El ensayo ELISA-array sugirió que los tres pacientes estaban infectados con TBEV. Para verificar los resultados probados por ELISA-array, el ARN extraído de huevos de pollo se aplicó a un ensayo RT-PCR en tiempo real utilizando imprimadores y sondas dirigidas a TBEV. Los resultados también fueron positivos (Figura 6a). Los resultados de la detección de consenso confirmaron que el ensayo ELISAarray era confiable. Para ser ampliamente utilizado en el entorno clínico, el sistema de detección debe ser fácil de usar y puede ser realizado por personal no capacitado con poca experiencia de laboratorio y experimental. Además, cuando el volumen de las muestras clínicas es limitado y un número creciente de patógenos por muestra necesita ser probado, el sistema de detección debe ser de alto rendimiento para permitir la detección de múltiples patógenos simultáneamente [6, 20, 21]. Detección múltiple, fácil de usar y asequibilidad son requisitos para los métodos de detección en el entorno clínico. Por lo tanto, una revisión ELISA, que combina las ventajas de ELISA y matriz de proteínas, cumple los requisitos anteriores. Se ha reportado que una revisión ELISA se ha utilizado en el diagnóstico de cáncer y enfermedad autoalérgica [7, 12] ; sin embargo, ningún estudio ha reportado la detección de patógenos virales. En este estudio se desarrolló un método multiplex basado en ELISA en un sandwich de doble anticuerpo para la detección simultánea de cinco patógenos virales asociados a la encefalitis. La producción de un chip de anticuerpos confiable para la identificación de microorganismos requiere una cuidadosa detección de la captura de anticuerpos [14]. Se debe minimizar la reactividad cruzada y la afinidad del anticuerpo es tan importante como la especificidad. En primer lugar, se preparó y examinó 23 anticuerpos monoclonales contra ocho virus y se verificó la especificidad y afinidad con los virus objetivo mediante un ensayo de inmunofluorescencia. Luego, los anticuerpos fueron analizados por una matriz ELISA con un sandwich de doble anticuerpo formato ELISA. Se excluyeron los anticuerpos que produjeron reactividad cruzada y señales de baja positivo. Finalmente, se seleccionaron seis anticuerpos como anticuerpos de captura. Otro anticuerpo monoclonal, 2A10, que podría reaccionar específicamente con todos los virus del género Flavivirus, fue utilizado para detectar anticuerpos contra DV, JEV y TBEV. Para la detección de EEV y SV, aunque los anticuerpos de detección y captura fueron los mismos (1F1 y 4E11, respectivamente), los anticuerpos produjeron excelentes señales positivas. El epitope no fue definido; sin embargo, sospechamos que ambos anticuerpos se dirigen a la superficie de los viriones. A medida que un virio sale como, muchos con el mismo epítope aparecen, por lo tanto, no se produjo ninguna interferencia utilizando el mismo anticuerpo en el ensayo en forma de sándwich de doble anticuerpo. Actualmente, la disponibilidad de anticuerpos adecuados para un ensayo diagnóstico en formato de matriz es un problema importante. En el futuro, con un número creciente de anticuerpos adecuados, especialmente anticuerpos específicos contra Flavivirus, este ELISAarray podría ser capaz de probar más patógenos y ser de mayor uso potencial. Para hacer el ensayo más susceptible a la detección de múltiples virus, el protocolo de ensayo fue optimizado. Además del tampón de punción, la concentración de anticuerpos de captura y los diferentes métodos de inactivación del virus (calentamiento y β-propiolactona) también fueron comparados y evaluados. La inactivación del calor se realizó calentando los cultivos virales a 56°C durante 1 h, y la inactivación de β-propiolactona se realizó añadiendo β-propiolactona en los retenes mejor antigenicidad que el método de inactivación del calor. Así, se eligió el tratamiento de β-propiolactona como método de inactivación del virus. Un EL Se comparó el array ELISA con un ELISA convencional y se confirmó que la ventaja del array ELISA era evidente con especificidad comparable y mayor sensibilidad que ELISA. El tiempo requerido para el array ELISA es significativamente menor que para el array ELISA convencional (4 h frente a un mínimo de 6 h, respectivamente). Además, se requiere menos IgG para la impresión que para el recubrimiento de placas ELISA. Recubrimiento de un solo pozo en placa microtitular requiere 100 μl de una solución anticuerpo de 1 μg/ml, lo que equivale a 100 ng de IgG. Para el array ELISA, sólo se requiere 30 nl de una solución anticuerpo de 50 μg/ml para cada punto, lo que equivale a 1,5 ng de IgG. Con las características de facilidad de uso, sensibilidad, especificidad y precisión, el array ELISA sería ampliamente aceptado

¿Qué tipo de anticuerpos se utilizaron en el ensayo ELISA-array?

El desarrollo de una guía ELISA para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitishttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3305475/SHA: ef2b8f83d5a3ab8ae35e4b51fea6d3ed9eb49122Autores: Kang, Xiaoping; Li, Yuchang; Fan, Li; Lin, Fang; Wei, Jingjing; Zhu, Xiaolei; Hu, Yi; Li, Jing; Chang, Guohui; Zhu, Qingyu; Liu, Hong; Yang, YinhuiFecha: 2012-02-27DOI: 10.1186/1743-422x-9-56Licencia: cc-byAbstract: virus de la encefalitis japonesa(JEV), virus de El establecimiento de métodos precisos y fáciles para detectar estos virus es esencial para la prevención y el tratamiento de las enfermedades infecciosas asociadas. Actualmente, todavía no existen métodos de detección de antígenos múltiples disponibles clínicamente. En este estudio se desarrolló un sistema ELISA-array para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitis. Se prepararon siete anticuerpos monoclonales contra cinco virus asociados a la encefalitis y se utilizaron para el desarrollo del sistema ELISA-array. El ensayo ELISA-array se basa en un formato ELISA "sandwich" y consiste en anticuerpos virales impresos directamente en placas microtiterizadas de 96 pocillos, lo que permite la detección directa de 5 virus. El sistema ELISA-array desarrollado demostró tener una especificidad similar y una mayor sensibilidad en comparación con las ELISA convencionales. Este método fue validado por diferentes cultivos virales y tres huevos de pollo inoculados con suero de paciente infectado. Los resultados demostraron que el vector ELISA desarrollado es sensible y fácil de usar, lo que tendría potencial de uso clínico. Texto: virus de la encefalitis japonesa (JEV), virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (TBEV), virus de la encefalitis equina oriental (EEEV), virus sindbis (SV), y virus del dengue (DV) son arbovirus y causan síntomas de encefalitis, con una amplia gama de gravedad y tasas de mortalidad [1]. El establecimiento de un método preciso y fácil para la detección de estos virus es esencial para la prevención y el tratamiento de enfermedades infecciosas asociadas. Actualmente, ELISA e IFA son los métodos que están clínicamente disponibles para la detección de antígenos virales de encefalitis, pero sólo pudieron detectar un patógeno en un Hay una variedad de métodos diferentes disponibles para identificar antígenos múltiples en una muestra simultáneamente, tales como electroforesis gel bidimensional, chip de proteína, espectrometría de masas y tecnología de matriz de suspensión [4] [5] [6]. Sin embargo, la aplicación de estas técnicas en la detección de patógenos todavía se encuentra en una fase temprana, tal vez debido al uso complicado y alto costo. Arrays de anticuerpos para la cuantificación simultánea de antígenos múltiples se consideran los métodos más precisos [7] [8] [9] [10]. Liew [11] validó una ELISA múltiple para la detección de 9 antígenos; Anderson [12] utilizó el microarray ELISA para la detección multiplex de anticuerpos a antígenos tumorales en el cáncer de mama, y demostró que los análisis de matrices basados en ELISA tenían el rango dinámico más amplio y los requisitos de volumen de muestra más bajo en comparación con los otros ensayos. Sin embargo, la aplicación de matrices basadas en ELISA se limita actualmente En este estudio, se desarrolló una matriz con base ELISA para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitis, se prepararon siete anticuerpos monoclonales específicos contra cinco virus de la encefalitis y se utilizó para establecer un ensayo ELISA-array. El ensayo fue validado utilizando virus cultivados y huevos de pollo inoculados con suero paciente. Los resultados demostraron que este método combinaba la ventaja de ELISA y matriz proteica (multiplex y facilidad de uso) y tiene potencial para la identificación del virus de la encefalitis clínica. Los anticuerpos monoclonales se prepararon a partir de líneas celulares de hibridoma construidas por el Prof. Zhu et al. La purificación se realizó mediante cromatografía de inmunoafinidad en sepharose de afinidad proteica G [13]. Para este estudio se seleccionaron anticuerpos monoclonales específicos (4D5 frente a JEV, 2B5 frente a TVEV, 1F1 frente a SV, 2B8 frente a serotipo 2 DV, 4F9 frente a serotipo 4 DV, 4E11 frente a EEV y 2A10 frente a Flavivirus). Todos los anticuerpos se elevaron de acuerdo con los procedimientos estándar.Utilizando 4D5, 2B5, 1F1, 2B8, 4F9 y 4E11 como anticuerpos de captura, anticuerpos de detección (2A10, 1 F1 y 4E11) se acoplaron a ester de biotina-NHS (Pierce, Alemania) a 4°C durante 3 h según las instrucciones del fabricante.La biotina no incorporada fue eliminada por la columna de rotación Desalt (Pierce). Las reacciones inmunológicas fueron notificadas por Streptavidin-HRP (CWBIO, Beijing, China) y Super Signal ELISA Femto Sustrato Sensible Máximo. Se utilizó como control positivo el anticuerpo cabra-anti ratón purificado. JEV y DV fueron cultivadas en C6/36 células; SV, TBEV y EEEV fueron cultivadas en células BHK-21. El cultivo de TBEV y EEV fue realizado en instalaciones de nivel 3 de bioseguridad, sin embargo, JEV, DV y SV fueron realizadas en instalaciones de nivel 2 de bioseguridad. Los títulos virales fueron determinados por el método de la dosis infecciosa de cultivo tisular 50% (TCID 50 ). Todos los cultivos fueron inactivados por 0,025% β-propionolactona a 4°C durante la noche, luego 37°C Los anticuerpos fueron detectados utilizando una máquina BIODOT (BD6000;California, EE.UU.) en placas ELISA (30 nl/punto). Las placas fueron bloqueadas con 3 % BSA-PBS en 37°C durante 1 h, seguidas de lavado 3 veces con PBS que contenía 0,1% Tween-20 durante 2 minutos cada una. Luego, las placas fueron secas, selladas y almacenadas a 4°C antes de su uso [11]. Cuando se detectaron, se evaluaron diferentes tampones y concentraciones de anticuerpos monoclonales de captura para optimizar el ensayo ELISA-array. La optimización fue evaluada por morfología de punto e intensidad de señal. Los tampones de detección probados incluyeron 1 x fosfato tampón salino (PBS), PBS +20% glicerol, y 1 × PBS + 20% glicerol+0,004% Se comparó un rango de concentraciones de anticuerpos monoclonales (0,0125, 0,025, 0,05, 0,1 y 0,2 mg/ml). Tras un formato sándwich de doble anticuerpo, las placas impresas fueron incubadas secuencialmente con cultivos virales inactivados, anticuerpos de detección marcados con biotina, avidina y sustrato marcados con HPR, seguidos de una evaluación de la señal. La unión de antígenos se realizó en PBS (conteniendo 0,1% Tween-20 y 5% FCS) a 37°C durante 2 h, seguido de lavado 3 veces (1 × PBS con 0,1% Tween-20). La incubación de placas ELISA con cocteles anticuerpos de detección biotinilados fue realizada en PBS (conteniendo 0,1% Tween-20 y 5% FCS) a 37°C durante 2 h. Después del lavado, la unión específica de los anticuerpos de detección fue reportada por estreptavidina-HRP y teñida con Super Signal ELISA Femto Sustrato Máximo Sensible (Thermo científico, Rockford, EE.UU.) [11, 14, 15]. La visualización de la placa fue realizada en AE 1000 analizador de imagen CCD fresco (Beijing BGI GBI Biotech Company., LTD, China). La intensidad de la señal y el fondo de cada mancha fue leída y grabada con "Monster"software. Las señales positivas fueron definidas como un valor de señal > 400 y un valor de señal (muestra)/valor de señal Los anticuerpos idénticos utilizados en el formato ELISA-array también fueron probados en un formato ELISA convencional para determinar la diferencia en sensibilidad y especificidad de los dos métodos. Las ELISA convencionales se realizaron al mismo tiempo que los ensayos ELISA-array para asegurar condiciones de reacción similares. Las ELISA convencionales se realizaron en una forma idéntica a la ELISA-array, excepto que los anticuerpos fueron recubiertos con una concentración de 2 μg/ml en PBS (pH 7,4) y se utilizó el sustrato TMB en lugar de Super Signal ELISA Femto Sustrato Máximo Sensible [16, 17]. Se recolectaron tres muestras séricas de pacientes con síntomas del sistema nervioso e historias de picaduras de garrapatas. Las muestras séricas fueron tratadas con penicilina y estreptomicina, luego inoculadas en las cavidades alantóicas de huevos de pollo. 3 días después, el líquido fue recogido y dividido en dos porciones (una para inactivación y otra para extracción de ARN). El ARN y las muestras inactivadas fueron almacenadas a -70°C antes de su uso. El ARN se extrajo de los huevos de pollo inoculados utilizando un mini kit RNAasy (Qiagen Inc., Valencia, CA, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todos los procedimientos de extracción de ARN se realizaron en instalaciones de BSL-3. Los imprimadores y sondas se utilizaron como se describió anteriormente [18]. El RT-PCR en tiempo real se llevó a cabo con un Quti-teck q-RT-PCR Kit (Qiagen Inc.). La reacción consistió en 10 μL de 2 × tampón de reacción (0,2 μL enzima de transcripción inversa, y 250 nmol La PCR se realizó con un LightCycler 2.0 (Roche, Suiza) [19]. Optimización del ensayo ELISA-arrayEl diseño del array manchado se muestra en la Figura 1 y la eficacia de tres tampones de manchado diferentes en la calidad de los rayos ELISA impresos fueron investigados por observación morfológica puntual y comparación de intensidad de señal. La concentración de manchado de los anticuerpos de captura varió de 0,2 a 0,0125 mg/ml (cada uno se diluyó en serie 2 veces). La eficacia de la concentración de manchado de los anticuerpos de captura fue evaluada por detección del cultivo del virus, la concentración de manchado adecuada fue determinada por una combinación de reacción cruzada minimizada y mayor intensidad de señal. La Figura 1 ilustra el diseño del array y la Figura 2 muestra el resultado de los tres tampones de manchado y concentración de manchado de anticuerpos 2B5 por La observación de la morfología puntual (Figuras 2a, b y 2c) demostró que el tampón de detección que contiene PBS con 20% de glicerol produjo morfología puntual; los tampones que contienen PBS solo y PBS con 20% de glicerol +0,004% de Triton-X100 dieron buena morfología puntual (redondo y completo). Los tampones que contienen PBS con 20% de glicerol y PBS con 20% de glicerol+0,004% de Triton-X100 produjeron intensidades de señal más altas que el PBS solo. Así, PBS con 20% de glicerol +0,004% de Triton-X100 fue adoptado como el tampón de detección optimizado para experimentos posteriores. Simultáneamente, la evaluación de la concentración puntual sugirió que 0,05 mg/ml era óptima. A esta concentración, la intensidad de la señal fue mayor y la reacción cruzada no En consecuencia, la optimización de la concentración de detección de otros anticuerpos de captura (4D5, 1F1, 4E11 y 2B8) demostró que 0,05 mg/ml también eran adecuados (datos no mostrados). La disposición optimizada de la matriz ELISA se muestra en la Figura 3, que se aplicó en los siguientes experimentos. La detección exitosa de patógenos virales requiere una prueba con alta sensibilidad y especificidad. Para evaluar el rendimiento de las matrices de anticuerpos diseñadas, se examinó la especificidad y sensibilidad de los analitos individuales. Mediante la prueba de cultivos virales serialmente diluidos, incluyendo DV-2, DV-4, JEV, TBE, SV y EEEV, se comparó la sensibilidad de ELISAarray y la ELISA convencional idéntica ( Tabla 1 ). Se comparó y demostró el límite de detección de los dos métodos. La prueba de reactividad cruzada se realizó utilizando cultivos de BHK-21 y lisato de células de vero, virus de la fiebre amarilla (YFV) (5 × 10 5 TCID 50/ml, cultivos de virus del Nilo Occidental (WNV)(2 × 10 6 TCID 50/ml) y virus de la encefalitis equina occidental(1 × 10 7 TCID 50/ml). Los resultados demostraron que ni el vector ELISA ni el ELISA tradicional mostraron reactividad cruzada.En todas las pruebas se prepararon volúmenes iguales de TVEV, JEV, DV-2, DV-4, SV y EEEV para la detección de muestras únicas; dos o tres de los cultivos se mezclaron para la detección múltiplex. Se utilizó un cóctel de anticuerpo conjugado de biotina (2A10, 4E11 y 1F1). Los resultados demostraron que para todas las combinaciones virales, cada virus fue detectado específicamente, sin resultados falsos positivos o negativos (Figuras 4 y 5). Los huevos de pollo inoculados con suero humano infectado fueron utilizados para la validación del ensayo ELISA-array. Todas las muestras mostraron señales de alta reacción con anticuerpo de captura 2B5, que fue específico para TBEV (Figura 6b ). El ensayo ELISA-array sugirió que los tres pacientes estaban infectados con TBEV. Para verificar los resultados probados por ELISA-array, el ARN extraído de huevos de pollo se aplicó a un ensayo RT-PCR en tiempo real utilizando imprimadores y sondas dirigidas a TBEV. Los resultados también fueron positivos (Figura 6a). Los resultados de la detección de consenso confirmaron que el ensayo ELISAarray era confiable. Para ser ampliamente utilizado en el entorno clínico, el sistema de detección debe ser fácil de usar y puede ser realizado por personal no capacitado con poca experiencia de laboratorio y experimental. Además, cuando el volumen de las muestras clínicas es limitado y un número creciente de patógenos por muestra necesita ser probado, el sistema de detección debe ser de alto rendimiento para permitir la detección de múltiples patógenos simultáneamente [6, 20, 21]. Detección múltiple, fácil de usar y asequibilidad son requisitos para los métodos de detección en el entorno clínico. Por lo tanto, una revisión ELISA, que combina las ventajas de ELISA y matriz de proteínas, cumple los requisitos anteriores. Se ha reportado que una revisión ELISA se ha utilizado en el diagnóstico de cáncer y enfermedad autoalérgica [7, 12] ; sin embargo, ningún estudio ha reportado la detección de patógenos virales. En este estudio se desarrolló un método multiplex basado en ELISA en un sandwich de doble anticuerpo para la detección simultánea de cinco patógenos virales asociados a la encefalitis. La producción de un chip de anticuerpos confiable para la identificación de microorganismos requiere una cuidadosa detección de la captura de anticuerpos [14]. Se debe minimizar la reactividad cruzada y la afinidad del anticuerpo es tan importante como la especificidad. En primer lugar, se preparó y examinó 23 anticuerpos monoclonales contra ocho virus y se verificó la especificidad y afinidad con los virus objetivo mediante un ensayo de inmunofluorescencia. Luego, los anticuerpos fueron analizados por una matriz ELISA con un sandwich de doble anticuerpo formato ELISA. Se excluyeron los anticuerpos que produjeron reactividad cruzada y señales de baja positivo. Finalmente, se seleccionaron seis anticuerpos como anticuerpos de captura. Otro anticuerpo monoclonal, 2A10, que podría reaccionar específicamente con todos los virus del género Flavivirus, fue utilizado para detectar anticuerpos contra DV, JEV y TBEV. Para la detección de EEV y SV, aunque los anticuerpos de detección y captura fueron los mismos (1F1 y 4E11, respectivamente), los anticuerpos produjeron excelentes señales positivas. El epitope no fue definido; sin embargo, sospechamos que ambos anticuerpos se dirigen a la superficie de los viriones. A medida que un virio sale como, muchos con el mismo epítope aparecen, por lo tanto, no se produjo ninguna interferencia utilizando el mismo anticuerpo en el ensayo en forma de sándwich de doble anticuerpo. Actualmente, la disponibilidad de anticuerpos adecuados para un ensayo diagnóstico en formato de matriz es un problema importante. En el futuro, con un número creciente de anticuerpos adecuados, especialmente anticuerpos específicos contra Flavivirus, este ELISAarray podría ser capaz de probar más patógenos y ser de mayor uso potencial. Para hacer el ensayo más susceptible a la detección de múltiples virus, el protocolo de ensayo fue optimizado. Además del tampón de punción, la concentración de anticuerpos de captura y los diferentes métodos de inactivación del virus (calentamiento y β-propiolactona) también fueron comparados y evaluados. La inactivación del calor se realizó calentando los cultivos virales a 56°C durante 1 h, y la inactivación de β-propiolactona se realizó añadiendo β-propiolactona en los retenes mejor antigenicidad que el método de inactivación del calor. Así, se eligió el tratamiento de β-propiolactona como método de inactivación del virus. Un EL Se comparó el array ELISA con un ELISA convencional y se confirmó que la ventaja del array ELISA era evidente con especificidad comparable y mayor sensibilidad que ELISA. El tiempo requerido para el array ELISA es significativamente menor que para el array ELISA convencional (4 h frente a un mínimo de 6 h, respectivamente). Además, se requiere menos IgG para la impresión que para el recubrimiento de placas ELISA. Recubrimiento de un solo pozo en placa microtitular requiere 100 μl de una solución anticuerpo de 1 μg/ml, lo que equivale a 100 ng de IgG. Para el array ELISA, sólo se requiere 30 nl de una solución anticuerpo de 50 μg/ml para cada punto, lo que equivale a 1,5 ng de IgG. Con las características de facilidad de uso, sensibilidad, especificidad y precisión, el array ELISA sería ampliamente aceptado

¿Qué anticuerpos de captura se utilizaron en el estudio?

El desarrollo de una guía ELISA para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitishttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3305475/SHA: ef2b8f83d5a3ab8ae35e4b51fea6d3ed9eb49122Autores: Kang, Xiaoping; Li, Yuchang; Fan, Li; Lin, Fang; Wei, Jingjing; Zhu, Xiaolei; Hu, Yi; Li, Jing; Chang, Guohui; Zhu, Qingyu; Liu, Hong; Yang, YinhuiFecha: 2012-02-27DOI: 10.1186/1743-422x-9-56Licencia: cc-byAbstract: virus de la encefalitis japonesa(JEV), virus de El establecimiento de métodos precisos y fáciles para detectar estos virus es esencial para la prevención y el tratamiento de las enfermedades infecciosas asociadas. Actualmente, todavía no existen métodos de detección de antígenos múltiples disponibles clínicamente. En este estudio se desarrolló un sistema ELISA-array para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitis. Se prepararon siete anticuerpos monoclonales contra cinco virus asociados a la encefalitis y se utilizaron para el desarrollo del sistema ELISA-array. El ensayo ELISA-array se basa en un formato ELISA "sandwich" y consiste en anticuerpos virales impresos directamente en placas microtiterizadas de 96 pocillos, lo que permite la detección directa de 5 virus. El sistema ELISA-array desarrollado demostró tener una especificidad similar y una mayor sensibilidad en comparación con las ELISA convencionales. Este método fue validado por diferentes cultivos virales y tres huevos de pollo inoculados con suero de paciente infectado. Los resultados demostraron que el vector ELISA desarrollado es sensible y fácil de usar, lo que tendría potencial de uso clínico. Texto: virus de la encefalitis japonesa (JEV), virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (TBEV), virus de la encefalitis equina oriental (EEEV), virus sindbis (SV), y virus del dengue (DV) son arbovirus y causan síntomas de encefalitis, con una amplia gama de gravedad y tasas de mortalidad [1]. El establecimiento de un método preciso y fácil para la detección de estos virus es esencial para la prevención y el tratamiento de enfermedades infecciosas asociadas. Actualmente, ELISA e IFA son los métodos que están clínicamente disponibles para la detección de antígenos virales de encefalitis, pero sólo pudieron detectar un patógeno en un Hay una variedad de métodos diferentes disponibles para identificar antígenos múltiples en una muestra simultáneamente, tales como electroforesis gel bidimensional, chip de proteína, espectrometría de masas y tecnología de matriz de suspensión [4] [5] [6]. Sin embargo, la aplicación de estas técnicas en la detección de patógenos todavía se encuentra en una fase temprana, tal vez debido al uso complicado y alto costo. Arrays de anticuerpos para la cuantificación simultánea de antígenos múltiples se consideran los métodos más precisos [7] [8] [9] [10]. Liew [11] validó una ELISA múltiple para la detección de 9 antígenos; Anderson [12] utilizó el microarray ELISA para la detección multiplex de anticuerpos a antígenos tumorales en el cáncer de mama, y demostró que los análisis de matrices basados en ELISA tenían el rango dinámico más amplio y los requisitos de volumen de muestra más bajo en comparación con los otros ensayos. Sin embargo, la aplicación de matrices basadas en ELISA se limita actualmente En este estudio, se desarrolló una matriz con base ELISA para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitis, se prepararon siete anticuerpos monoclonales específicos contra cinco virus de la encefalitis y se utilizó para establecer un ensayo ELISA-array. El ensayo fue validado utilizando virus cultivados y huevos de pollo inoculados con suero paciente. Los resultados demostraron que este método combinaba la ventaja de ELISA y matriz proteica (multiplex y facilidad de uso) y tiene potencial para la identificación del virus de la encefalitis clínica. Los anticuerpos monoclonales se prepararon a partir de líneas celulares de hibridoma construidas por el Prof. Zhu et al. La purificación se realizó mediante cromatografía de inmunoafinidad en sepharose de afinidad proteica G [13]. Para este estudio se seleccionaron anticuerpos monoclonales específicos (4D5 frente a JEV, 2B5 frente a TVEV, 1F1 frente a SV, 2B8 frente a serotipo 2 DV, 4F9 frente a serotipo 4 DV, 4E11 frente a EEV y 2A10 frente a Flavivirus). Todos los anticuerpos se elevaron de acuerdo con los procedimientos estándar.Utilizando 4D5, 2B5, 1F1, 2B8, 4F9 y 4E11 como anticuerpos de captura, anticuerpos de detección (2A10, 1 F1 y 4E11) se acoplaron a ester de biotina-NHS (Pierce, Alemania) a 4°C durante 3 h según las instrucciones del fabricante.La biotina no incorporada fue eliminada por la columna de rotación Desalt (Pierce). Las reacciones inmunológicas fueron notificadas por Streptavidin-HRP (CWBIO, Beijing, China) y Super Signal ELISA Femto Sustrato Sensible Máximo. Se utilizó como control positivo el anticuerpo cabra-anti ratón purificado. JEV y DV fueron cultivadas en C6/36 células; SV, TBEV y EEEV fueron cultivadas en células BHK-21. El cultivo de TBEV y EEV fue realizado en instalaciones de nivel 3 de bioseguridad, sin embargo, JEV, DV y SV fueron realizadas en instalaciones de nivel 2 de bioseguridad. Los títulos virales fueron determinados por el método de la dosis infecciosa de cultivo tisular 50% (TCID 50 ). Todos los cultivos fueron inactivados por 0,025% β-propionolactona a 4°C durante la noche, luego 37°C Los anticuerpos fueron detectados utilizando una máquina BIODOT (BD6000;California, EE.UU.) en placas ELISA (30 nl/punto). Las placas fueron bloqueadas con 3 % BSA-PBS en 37°C durante 1 h, seguidas de lavado 3 veces con PBS que contenía 0,1% Tween-20 durante 2 minutos cada una. Luego, las placas fueron secas, selladas y almacenadas a 4°C antes de su uso [11]. Cuando se detectaron, se evaluaron diferentes tampones y concentraciones de anticuerpos monoclonales de captura para optimizar el ensayo ELISA-array. La optimización fue evaluada por morfología de punto e intensidad de señal. Los tampones de detección probados incluyeron 1 x fosfato tampón salino (PBS), PBS +20% glicerol, y 1 × PBS + 20% glicerol+0,004% Se comparó un rango de concentraciones de anticuerpos monoclonales (0,0125, 0,025, 0,05, 0,1 y 0,2 mg/ml). Tras un formato sándwich de doble anticuerpo, las placas impresas fueron incubadas secuencialmente con cultivos virales inactivados, anticuerpos de detección marcados con biotina, avidina y sustrato marcados con HPR, seguidos de una evaluación de la señal. La unión de antígenos se realizó en PBS (conteniendo 0,1% Tween-20 y 5% FCS) a 37°C durante 2 h, seguido de lavado 3 veces (1 × PBS con 0,1% Tween-20). La incubación de placas ELISA con cocteles anticuerpos de detección biotinilados fue realizada en PBS (conteniendo 0,1% Tween-20 y 5% FCS) a 37°C durante 2 h. Después del lavado, la unión específica de los anticuerpos de detección fue reportada por estreptavidina-HRP y teñida con Super Signal ELISA Femto Sustrato Máximo Sensible (Thermo científico, Rockford, EE.UU.) [11, 14, 15]. La visualización de la placa fue realizada en AE 1000 analizador de imagen CCD fresco (Beijing BGI GBI Biotech Company., LTD, China). La intensidad de la señal y el fondo de cada mancha fue leída y grabada con "Monster"software. Las señales positivas fueron definidas como un valor de señal > 400 y un valor de señal (muestra)/valor de señal Los anticuerpos idénticos utilizados en el formato ELISA-array también fueron probados en un formato ELISA convencional para determinar la diferencia en sensibilidad y especificidad de los dos métodos. Las ELISA convencionales se realizaron al mismo tiempo que los ensayos ELISA-array para asegurar condiciones de reacción similares. Las ELISA convencionales se realizaron en una forma idéntica a la ELISA-array, excepto que los anticuerpos fueron recubiertos con una concentración de 2 μg/ml en PBS (pH 7,4) y se utilizó el sustrato TMB en lugar de Super Signal ELISA Femto Sustrato Máximo Sensible [16, 17]. Se recolectaron tres muestras séricas de pacientes con síntomas del sistema nervioso e historias de picaduras de garrapatas. Las muestras séricas fueron tratadas con penicilina y estreptomicina, luego inoculadas en las cavidades alantóicas de huevos de pollo. 3 días después, el líquido fue recogido y dividido en dos porciones (una para inactivación y otra para extracción de ARN). El ARN y las muestras inactivadas fueron almacenadas a -70°C antes de su uso. El ARN se extrajo de los huevos de pollo inoculados utilizando un mini kit RNAasy (Qiagen Inc., Valencia, CA, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todos los procedimientos de extracción de ARN se realizaron en instalaciones de BSL-3. Los imprimadores y sondas se utilizaron como se describió anteriormente [18]. El RT-PCR en tiempo real se llevó a cabo con un Quti-teck q-RT-PCR Kit (Qiagen Inc.). La reacción consistió en 10 μL de 2 × tampón de reacción (0,2 μL enzima de transcripción inversa, y 250 nmol La PCR se realizó con un LightCycler 2.0 (Roche, Suiza) [19]. Optimización del ensayo ELISA-arrayEl diseño del array manchado se muestra en la Figura 1 y la eficacia de tres tampones de manchado diferentes en la calidad de los rayos ELISA impresos fueron investigados por observación morfológica puntual y comparación de intensidad de señal. La concentración de manchado de los anticuerpos de captura varió de 0,2 a 0,0125 mg/ml (cada uno se diluyó en serie 2 veces). La eficacia de la concentración de manchado de los anticuerpos de captura fue evaluada por detección del cultivo del virus, la concentración de manchado adecuada fue determinada por una combinación de reacción cruzada minimizada y mayor intensidad de señal. La Figura 1 ilustra el diseño del array y la Figura 2 muestra el resultado de los tres tampones de manchado y concentración de manchado de anticuerpos 2B5 por La observación de la morfología puntual (Figuras 2a, b y 2c) demostró que el tampón de detección que contiene PBS con 20% de glicerol produjo morfología puntual; los tampones que contienen PBS solo y PBS con 20% de glicerol +0,004% de Triton-X100 dieron buena morfología puntual (redondo y completo). Los tampones que contienen PBS con 20% de glicerol y PBS con 20% de glicerol+0,004% de Triton-X100 produjeron intensidades de señal más altas que el PBS solo. Así, PBS con 20% de glicerol +0,004% de Triton-X100 fue adoptado como el tampón de detección optimizado para experimentos posteriores. Simultáneamente, la evaluación de la concentración puntual sugirió que 0,05 mg/ml era óptima. A esta concentración, la intensidad de la señal fue mayor y la reacción cruzada no En consecuencia, la optimización de la concentración de detección de otros anticuerpos de captura (4D5, 1F1, 4E11 y 2B8) demostró que 0,05 mg/ml también eran adecuados (datos no mostrados). La disposición optimizada de la matriz ELISA se muestra en la Figura 3, que se aplicó en los siguientes experimentos. La detección exitosa de patógenos virales requiere una prueba con alta sensibilidad y especificidad. Para evaluar el rendimiento de las matrices de anticuerpos diseñadas, se examinó la especificidad y sensibilidad de los analitos individuales. Mediante la prueba de cultivos virales serialmente diluidos, incluyendo DV-2, DV-4, JEV, TBE, SV y EEEV, se comparó la sensibilidad de ELISAarray y la ELISA convencional idéntica ( Tabla 1 ). Se comparó y demostró el límite de detección de los dos métodos. La prueba de reactividad cruzada se realizó utilizando cultivos de BHK-21 y lisato de células de vero, virus de la fiebre amarilla (YFV) (5 × 10 5 TCID 50/ml, cultivos de virus del Nilo Occidental (WNV)(2 × 10 6 TCID 50/ml) y virus de la encefalitis equina occidental(1 × 10 7 TCID 50/ml). Los resultados demostraron que ni el vector ELISA ni el ELISA tradicional mostraron reactividad cruzada.En todas las pruebas se prepararon volúmenes iguales de TVEV, JEV, DV-2, DV-4, SV y EEEV para la detección de muestras únicas; dos o tres de los cultivos se mezclaron para la detección múltiplex. Se utilizó un cóctel de anticuerpo conjugado de biotina (2A10, 4E11 y 1F1). Los resultados demostraron que para todas las combinaciones virales, cada virus fue detectado específicamente, sin resultados falsos positivos o negativos (Figuras 4 y 5). Los huevos de pollo inoculados con suero humano infectado fueron utilizados para la validación del ensayo ELISA-array. Todas las muestras mostraron señales de alta reacción con anticuerpo de captura 2B5, que fue específico para TBEV (Figura 6b ). El ensayo ELISA-array sugirió que los tres pacientes estaban infectados con TBEV. Para verificar los resultados probados por ELISA-array, el ARN extraído de huevos de pollo se aplicó a un ensayo RT-PCR en tiempo real utilizando imprimadores y sondas dirigidas a TBEV. Los resultados también fueron positivos (Figura 6a). Los resultados de la detección de consenso confirmaron que el ensayo ELISAarray era confiable. Para ser ampliamente utilizado en el entorno clínico, el sistema de detección debe ser fácil de usar y puede ser realizado por personal no capacitado con poca experiencia de laboratorio y experimental. Además, cuando el volumen de las muestras clínicas es limitado y un número creciente de patógenos por muestra necesita ser probado, el sistema de detección debe ser de alto rendimiento para permitir la detección de múltiples patógenos simultáneamente [6, 20, 21]. Detección múltiple, fácil de usar y asequibilidad son requisitos para los métodos de detección en el entorno clínico. Por lo tanto, una revisión ELISA, que combina las ventajas de ELISA y matriz de proteínas, cumple los requisitos anteriores. Se ha reportado que una revisión ELISA se ha utilizado en el diagnóstico de cáncer y enfermedad autoalérgica [7, 12] ; sin embargo, ningún estudio ha reportado la detección de patógenos virales. En este estudio se desarrolló un método multiplex basado en ELISA en un sandwich de doble anticuerpo para la detección simultánea de cinco patógenos virales asociados a la encefalitis. La producción de un chip de anticuerpos confiable para la identificación de microorganismos requiere una cuidadosa detección de la captura de anticuerpos [14]. Se debe minimizar la reactividad cruzada y la afinidad del anticuerpo es tan importante como la especificidad. En primer lugar, se preparó y examinó 23 anticuerpos monoclonales contra ocho virus y se verificó la especificidad y afinidad con los virus objetivo mediante un ensayo de inmunofluorescencia. Luego, los anticuerpos fueron analizados por una matriz ELISA con un sandwich de doble anticuerpo formato ELISA. Se excluyeron los anticuerpos que produjeron reactividad cruzada y señales de baja positivo. Finalmente, se seleccionaron seis anticuerpos como anticuerpos de captura. Otro anticuerpo monoclonal, 2A10, que podría reaccionar específicamente con todos los virus del género Flavivirus, fue utilizado para detectar anticuerpos contra DV, JEV y TBEV. Para la detección de EEV y SV, aunque los anticuerpos de detección y captura fueron los mismos (1F1 y 4E11, respectivamente), los anticuerpos produjeron excelentes señales positivas. El epitope no fue definido; sin embargo, sospechamos que ambos anticuerpos se dirigen a la superficie de los viriones. A medida que un virio sale como, muchos con el mismo epítope aparecen, por lo tanto, no se produjo ninguna interferencia utilizando el mismo anticuerpo en el ensayo en forma de sándwich de doble anticuerpo. Actualmente, la disponibilidad de anticuerpos adecuados para un ensayo diagnóstico en formato de matriz es un problema importante. En el futuro, con un número creciente de anticuerpos adecuados, especialmente anticuerpos específicos contra Flavivirus, este ELISAarray podría ser capaz de probar más patógenos y ser de mayor uso potencial. Para hacer el ensayo más susceptible a la detección de múltiples virus, el protocolo de ensayo fue optimizado. Además del tampón de punción, la concentración de anticuerpos de captura y los diferentes métodos de inactivación del virus (calentamiento y β-propiolactona) también fueron comparados y evaluados. La inactivación del calor se realizó calentando los cultivos virales a 56°C durante 1 h, y la inactivación de β-propiolactona se realizó añadiendo β-propiolactona en los retenes mejor antigenicidad que el método de inactivación del calor. Así, se eligió el tratamiento de β-propiolactona como método de inactivación del virus. Un EL Se comparó el array ELISA con un ELISA convencional y se confirmó que la ventaja del array ELISA era evidente con especificidad comparable y mayor sensibilidad que ELISA. El tiempo requerido para el array ELISA es significativamente menor que para el array ELISA convencional (4 h frente a un mínimo de 6 h, respectivamente). Además, se requiere menos IgG para la impresión que para el recubrimiento de placas ELISA. Recubrimiento de un solo pozo en placa microtitular requiere 100 μl de una solución anticuerpo de 1 μg/ml, lo que equivale a 100 ng de IgG. Para el array ELISA, sólo se requiere 30 nl de una solución anticuerpo de 50 μg/ml para cada punto, lo que equivale a 1,5 ng de IgG. Con las características de facilidad de uso, sensibilidad, especificidad y precisión, el array ELISA sería ampliamente aceptado

¿Cuál fue el rango de concentración de los anticuerpos de captura?

El desarrollo de una guía ELISA para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitishttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3305475/SHA: ef2b8f83d5a3ab8ae35e4b51fea6d3ed9eb49122Autores: Kang, Xiaoping; Li, Yuchang; Fan, Li; Lin, Fang; Wei, Jingjing; Zhu, Xiaolei; Hu, Yi; Li, Jing; Chang, Guohui; Zhu, Qingyu; Liu, Hong; Yang, YinhuiFecha: 2012-02-27DOI: 10.1186/1743-422x-9-56Licencia: cc-byAbstract: virus de la encefalitis japonesa(JEV), virus de El establecimiento de métodos precisos y fáciles para detectar estos virus es esencial para la prevención y el tratamiento de las enfermedades infecciosas asociadas. Actualmente, todavía no existen métodos de detección de antígenos múltiples disponibles clínicamente. En este estudio se desarrolló un sistema ELISA-array para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitis. Se prepararon siete anticuerpos monoclonales contra cinco virus asociados a la encefalitis y se utilizaron para el desarrollo del sistema ELISA-array. El ensayo ELISA-array se basa en un formato ELISA "sandwich" y consiste en anticuerpos virales impresos directamente en placas microtiterizadas de 96 pocillos, lo que permite la detección directa de 5 virus. El sistema ELISA-array desarrollado demostró tener una especificidad similar y una mayor sensibilidad en comparación con las ELISA convencionales. Este método fue validado por diferentes cultivos virales y tres huevos de pollo inoculados con suero de paciente infectado. Los resultados demostraron que el vector ELISA desarrollado es sensible y fácil de usar, lo que tendría potencial de uso clínico. Texto: virus de la encefalitis japonesa (JEV), virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (TBEV), virus de la encefalitis equina oriental (EEEV), virus sindbis (SV), y virus del dengue (DV) son arbovirus y causan síntomas de encefalitis, con una amplia gama de gravedad y tasas de mortalidad [1]. El establecimiento de un método preciso y fácil para la detección de estos virus es esencial para la prevención y el tratamiento de enfermedades infecciosas asociadas. Actualmente, ELISA e IFA son los métodos que están clínicamente disponibles para la detección de antígenos virales de encefalitis, pero sólo pudieron detectar un patógeno en un Hay una variedad de métodos diferentes disponibles para identificar antígenos múltiples en una muestra simultáneamente, tales como electroforesis gel bidimensional, chip de proteína, espectrometría de masas y tecnología de matriz de suspensión [4] [5] [6]. Sin embargo, la aplicación de estas técnicas en la detección de patógenos todavía se encuentra en una fase temprana, tal vez debido al uso complicado y alto costo. Arrays de anticuerpos para la cuantificación simultánea de antígenos múltiples se consideran los métodos más precisos [7] [8] [9] [10]. Liew [11] validó una ELISA múltiple para la detección de 9 antígenos; Anderson [12] utilizó el microarray ELISA para la detección multiplex de anticuerpos a antígenos tumorales en el cáncer de mama, y demostró que los análisis de matrices basados en ELISA tenían el rango dinámico más amplio y los requisitos de volumen de muestra más bajo en comparación con los otros ensayos. Sin embargo, la aplicación de matrices basadas en ELISA se limita actualmente En este estudio, se desarrolló una matriz con base ELISA para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitis, se prepararon siete anticuerpos monoclonales específicos contra cinco virus de la encefalitis y se utilizó para establecer un ensayo ELISA-array. El ensayo fue validado utilizando virus cultivados y huevos de pollo inoculados con suero paciente. Los resultados demostraron que este método combinaba la ventaja de ELISA y matriz proteica (multiplex y facilidad de uso) y tiene potencial para la identificación del virus de la encefalitis clínica. Los anticuerpos monoclonales se prepararon a partir de líneas celulares de hibridoma construidas por el Prof. Zhu et al. La purificación se realizó mediante cromatografía de inmunoafinidad en sepharose de afinidad proteica G [13]. Para este estudio se seleccionaron anticuerpos monoclonales específicos (4D5 frente a JEV, 2B5 frente a TVEV, 1F1 frente a SV, 2B8 frente a serotipo 2 DV, 4F9 frente a serotipo 4 DV, 4E11 frente a EEV y 2A10 frente a Flavivirus). Todos los anticuerpos se elevaron de acuerdo con los procedimientos estándar.Utilizando 4D5, 2B5, 1F1, 2B8, 4F9 y 4E11 como anticuerpos de captura, anticuerpos de detección (2A10, 1 F1 y 4E11) se acoplaron a ester de biotina-NHS (Pierce, Alemania) a 4°C durante 3 h según las instrucciones del fabricante.La biotina no incorporada fue eliminada por la columna de rotación Desalt (Pierce). Las reacciones inmunológicas fueron notificadas por Streptavidin-HRP (CWBIO, Beijing, China) y Super Signal ELISA Femto Sustrato Sensible Máximo. Se utilizó como control positivo el anticuerpo cabra-anti ratón purificado. JEV y DV fueron cultivadas en C6/36 células; SV, TBEV y EEEV fueron cultivadas en células BHK-21. El cultivo de TBEV y EEV fue realizado en instalaciones de nivel 3 de bioseguridad, sin embargo, JEV, DV y SV fueron realizadas en instalaciones de nivel 2 de bioseguridad. Los títulos virales fueron determinados por el método de la dosis infecciosa de cultivo tisular 50% (TCID 50 ). Todos los cultivos fueron inactivados por 0,025% β-propionolactona a 4°C durante la noche, luego 37°C Los anticuerpos fueron detectados utilizando una máquina BIODOT (BD6000;California, EE.UU.) en placas ELISA (30 nl/punto). Las placas fueron bloqueadas con 3 % BSA-PBS en 37°C durante 1 h, seguidas de lavado 3 veces con PBS que contenía 0,1% Tween-20 durante 2 minutos cada una. Luego, las placas fueron secas, selladas y almacenadas a 4°C antes de su uso [11]. Cuando se detectaron, se evaluaron diferentes tampones y concentraciones de anticuerpos monoclonales de captura para optimizar el ensayo ELISA-array. La optimización fue evaluada por morfología de punto e intensidad de señal. Los tampones de detección probados incluyeron 1 x fosfato tampón salino (PBS), PBS +20% glicerol, y 1 × PBS + 20% glicerol+0,004% Se comparó un rango de concentraciones de anticuerpos monoclonales (0,0125, 0,025, 0,05, 0,1 y 0,2 mg/ml). Tras un formato sándwich de doble anticuerpo, las placas impresas fueron incubadas secuencialmente con cultivos virales inactivados, anticuerpos de detección marcados con biotina, avidina y sustrato marcados con HPR, seguidos de una evaluación de la señal. La unión de antígenos se realizó en PBS (conteniendo 0,1% Tween-20 y 5% FCS) a 37°C durante 2 h, seguido de lavado 3 veces (1 × PBS con 0,1% Tween-20). La incubación de placas ELISA con cocteles anticuerpos de detección biotinilados fue realizada en PBS (conteniendo 0,1% Tween-20 y 5% FCS) a 37°C durante 2 h. Después del lavado, la unión específica de los anticuerpos de detección fue reportada por estreptavidina-HRP y teñida con Super Signal ELISA Femto Sustrato Máximo Sensible (Thermo científico, Rockford, EE.UU.) [11, 14, 15]. La visualización de la placa fue realizada en AE 1000 analizador de imagen CCD fresco (Beijing BGI GBI Biotech Company., LTD, China). La intensidad de la señal y el fondo de cada mancha fue leída y grabada con "Monster"software. Las señales positivas fueron definidas como un valor de señal > 400 y un valor de señal (muestra)/valor de señal Los anticuerpos idénticos utilizados en el formato ELISA-array también fueron probados en un formato ELISA convencional para determinar la diferencia en sensibilidad y especificidad de los dos métodos. Las ELISA convencionales se realizaron al mismo tiempo que los ensayos ELISA-array para asegurar condiciones de reacción similares. Las ELISA convencionales se realizaron en una forma idéntica a la ELISA-array, excepto que los anticuerpos fueron recubiertos con una concentración de 2 μg/ml en PBS (pH 7,4) y se utilizó el sustrato TMB en lugar de Super Signal ELISA Femto Sustrato Máximo Sensible [16, 17]. Se recolectaron tres muestras séricas de pacientes con síntomas del sistema nervioso e historias de picaduras de garrapatas. Las muestras séricas fueron tratadas con penicilina y estreptomicina, luego inoculadas en las cavidades alantóicas de huevos de pollo. 3 días después, el líquido fue recogido y dividido en dos porciones (una para inactivación y otra para extracción de ARN). El ARN y las muestras inactivadas fueron almacenadas a -70°C antes de su uso. El ARN se extrajo de los huevos de pollo inoculados utilizando un mini kit RNAasy (Qiagen Inc., Valencia, CA, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todos los procedimientos de extracción de ARN se realizaron en instalaciones de BSL-3. Los imprimadores y sondas se utilizaron como se describió anteriormente [18]. El RT-PCR en tiempo real se llevó a cabo con un Quti-teck q-RT-PCR Kit (Qiagen Inc.). La reacción consistió en 10 μL de 2 × tampón de reacción (0,2 μL enzima de transcripción inversa, y 250 nmol La PCR se realizó con un LightCycler 2.0 (Roche, Suiza) [19]. Optimización del ensayo ELISA-arrayEl diseño del array manchado se muestra en la Figura 1 y la eficacia de tres tampones de manchado diferentes en la calidad de los rayos ELISA impresos fueron investigados por observación morfológica puntual y comparación de intensidad de señal. La concentración de manchado de los anticuerpos de captura varió de 0,2 a 0,0125 mg/ml (cada uno se diluyó en serie 2 veces). La eficacia de la concentración de manchado de los anticuerpos de captura fue evaluada por detección del cultivo del virus, la concentración de manchado adecuada fue determinada por una combinación de reacción cruzada minimizada y mayor intensidad de señal. La Figura 1 ilustra el diseño del array y la Figura 2 muestra el resultado de los tres tampones de manchado y concentración de manchado de anticuerpos 2B5 por La observación de la morfología puntual (Figuras 2a, b y 2c) demostró que el tampón de detección que contiene PBS con 20% de glicerol produjo morfología puntual; los tampones que contienen PBS solo y PBS con 20% de glicerol +0,004% de Triton-X100 dieron buena morfología puntual (redondo y completo). Los tampones que contienen PBS con 20% de glicerol y PBS con 20% de glicerol+0,004% de Triton-X100 produjeron intensidades de señal más altas que el PBS solo. Así, PBS con 20% de glicerol +0,004% de Triton-X100 fue adoptado como el tampón de detección optimizado para experimentos posteriores. Simultáneamente, la evaluación de la concentración puntual sugirió que 0,05 mg/ml era óptima. A esta concentración, la intensidad de la señal fue mayor y la reacción cruzada no En consecuencia, la optimización de la concentración de detección de otros anticuerpos de captura (4D5, 1F1, 4E11 y 2B8) demostró que 0,05 mg/ml también eran adecuados (datos no mostrados). La disposición optimizada de la matriz ELISA se muestra en la Figura 3, que se aplicó en los siguientes experimentos. La detección exitosa de patógenos virales requiere una prueba con alta sensibilidad y especificidad. Para evaluar el rendimiento de las matrices de anticuerpos diseñadas, se examinó la especificidad y sensibilidad de los analitos individuales. Mediante la prueba de cultivos virales serialmente diluidos, incluyendo DV-2, DV-4, JEV, TBE, SV y EEEV, se comparó la sensibilidad de ELISAarray y la ELISA convencional idéntica ( Tabla 1 ). Se comparó y demostró el límite de detección de los dos métodos. La prueba de reactividad cruzada se realizó utilizando cultivos de BHK-21 y lisato de células de vero, virus de la fiebre amarilla (YFV) (5 × 10 5 TCID 50/ml, cultivos de virus del Nilo Occidental (WNV)(2 × 10 6 TCID 50/ml) y virus de la encefalitis equina occidental(1 × 10 7 TCID 50/ml). Los resultados demostraron que ni el vector ELISA ni el ELISA tradicional mostraron reactividad cruzada.En todas las pruebas se prepararon volúmenes iguales de TVEV, JEV, DV-2, DV-4, SV y EEEV para la detección de muestras únicas; dos o tres de los cultivos se mezclaron para la detección múltiplex. Se utilizó un cóctel de anticuerpo conjugado de biotina (2A10, 4E11 y 1F1). Los resultados demostraron que para todas las combinaciones virales, cada virus fue detectado específicamente, sin resultados falsos positivos o negativos (Figuras 4 y 5). Los huevos de pollo inoculados con suero humano infectado fueron utilizados para la validación del ensayo ELISA-array. Todas las muestras mostraron señales de alta reacción con anticuerpo de captura 2B5, que fue específico para TBEV (Figura 6b ). El ensayo ELISA-array sugirió que los tres pacientes estaban infectados con TBEV. Para verificar los resultados probados por ELISA-array, el ARN extraído de huevos de pollo se aplicó a un ensayo RT-PCR en tiempo real utilizando imprimadores y sondas dirigidas a TBEV. Los resultados también fueron positivos (Figura 6a). Los resultados de la detección de consenso confirmaron que el ensayo ELISAarray era confiable. Para ser ampliamente utilizado en el entorno clínico, el sistema de detección debe ser fácil de usar y puede ser realizado por personal no capacitado con poca experiencia de laboratorio y experimental. Además, cuando el volumen de las muestras clínicas es limitado y un número creciente de patógenos por muestra necesita ser probado, el sistema de detección debe ser de alto rendimiento para permitir la detección de múltiples patógenos simultáneamente [6, 20, 21]. Detección múltiple, fácil de usar y asequibilidad son requisitos para los métodos de detección en el entorno clínico. Por lo tanto, una revisión ELISA, que combina las ventajas de ELISA y matriz de proteínas, cumple los requisitos anteriores. Se ha reportado que una revisión ELISA se ha utilizado en el diagnóstico de cáncer y enfermedad autoalérgica [7, 12] ; sin embargo, ningún estudio ha reportado la detección de patógenos virales. En este estudio se desarrolló un método multiplex basado en ELISA en un sandwich de doble anticuerpo para la detección simultánea de cinco patógenos virales asociados a la encefalitis. La producción de un chip de anticuerpos confiable para la identificación de microorganismos requiere una cuidadosa detección de la captura de anticuerpos [14]. Se debe minimizar la reactividad cruzada y la afinidad del anticuerpo es tan importante como la especificidad. En primer lugar, se preparó y examinó 23 anticuerpos monoclonales contra ocho virus y se verificó la especificidad y afinidad con los virus objetivo mediante un ensayo de inmunofluorescencia. Luego, los anticuerpos fueron analizados por una matriz ELISA con un sandwich de doble anticuerpo formato ELISA. Se excluyeron los anticuerpos que produjeron reactividad cruzada y señales de baja positivo. Finalmente, se seleccionaron seis anticuerpos como anticuerpos de captura. Otro anticuerpo monoclonal, 2A10, que podría reaccionar específicamente con todos los virus del género Flavivirus, fue utilizado para detectar anticuerpos contra DV, JEV y TBEV. Para la detección de EEV y SV, aunque los anticuerpos de detección y captura fueron los mismos (1F1 y 4E11, respectivamente), los anticuerpos produjeron excelentes señales positivas. El epitope no fue definido; sin embargo, sospechamos que ambos anticuerpos se dirigen a la superficie de los viriones. A medida que un virio sale como, muchos con el mismo epítope aparecen, por lo tanto, no se produjo ninguna interferencia utilizando el mismo anticuerpo en el ensayo en forma de sándwich de doble anticuerpo. Actualmente, la disponibilidad de anticuerpos adecuados para un ensayo diagnóstico en formato de matriz es un problema importante. En el futuro, con un número creciente de anticuerpos adecuados, especialmente anticuerpos específicos contra Flavivirus, este ELISAarray podría ser capaz de probar más patógenos y ser de mayor uso potencial. Para hacer el ensayo más susceptible a la detección de múltiples virus, el protocolo de ensayo fue optimizado. Además del tampón de punción, la concentración de anticuerpos de captura y los diferentes métodos de inactivación del virus (calentamiento y β-propiolactona) también fueron comparados y evaluados. La inactivación del calor se realizó calentando los cultivos virales a 56°C durante 1 h, y la inactivación de β-propiolactona se realizó añadiendo β-propiolactona en los retenes mejor antigenicidad que el método de inactivación del calor. Así, se eligió el tratamiento de β-propiolactona como método de inactivación del virus. Un EL Se comparó el array ELISA con un ELISA convencional y se confirmó que la ventaja del array ELISA era evidente con especificidad comparable y mayor sensibilidad que ELISA. El tiempo requerido para el array ELISA es significativamente menor que para el array ELISA convencional (4 h frente a un mínimo de 6 h, respectivamente). Además, se requiere menos IgG para la impresión que para el recubrimiento de placas ELISA. Recubrimiento de un solo pozo en placa microtitular requiere 100 μl de una solución anticuerpo de 1 μg/ml, lo que equivale a 100 ng de IgG. Para el array ELISA, sólo se requiere 30 nl de una solución anticuerpo de 50 μg/ml para cada punto, lo que equivale a 1,5 ng de IgG. Con las características de facilidad de uso, sensibilidad, especificidad y precisión, el array ELISA sería ampliamente aceptado

¿Cómo se determinó la concentración de manchado adecuada?

Cambios en la prevalencia de la tuberculosis pulmonar: evidencia de la encuesta de población de 2010 en una populosa provincia de Chinahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3890533/SHA: eef61bdfa49b8652fd660b5b8b7e74cf51922505Autores: Wei, Xiaolin; Zhang, Xiulei; Yin, Jia; Walley, John; Beanland, Rachel; Zou, Guanyang; Zhang, Hongmei; Li, Fang; Liu, Zhimin; Zee, Benny CY; Griffiths, Sian MDate: 2014-01-11DOI: 10.1186/1471-2334-14-21Licencia: cc-byAbstract: ANTEGRON: Este documento informa de los resultados de la El objetivo de este estudio fue estimar la prevalencia de TB en la provincia en 2010 en comparación con la encuesta de 2000; y comparar el rendimiento de casos de TB de diferentes abordajes de búsqueda de casos.MÉTODOS: Se realizó una encuesta transversal basada en la población mediante muestreo aleatorio multietapa. En la encuesta participaron 54.279 adultos con una tasa de respuesta del 96%. Los médicos entrevistaron y clasificaron a los participantes como presuntos casos de TB si presentaban tos persistente, rayos X torácicos anormales (CXRAY) o ambos. Se recogieron tres especímenes de esputo de todos los casos sospechosos y se enviaron para microscopía y cultivo. RESULTADOS: La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente fue de 34 por 100.000 en adultos en Shandong en 2010. En comparación con la encuesta de 2000, la prevalencia de TB disminuyó en un 80%. El 53% de los casos Más del 50% de los casos de tuberculosis se encontraban entre los más de 65 años. CONCLUSIONES: La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se redujo significativamente en comparación con el año 2000. La encuesta planteó desafíos para identificar casos de tuberculosis sin síntomas claros. Texto: China, con una prevalencia estimada de todos los casos de tuberculosis de 108 por 100.000 en 2010, tiene la segunda carga de tuberculosis más alta del mundo, representando el 13% de todos los casos en todo el mundo [1]. La Organización Mundial de la Salud (OMS) estimó que China había alcanzado los objetivos de éxito en el tratamiento del 85% para 1993 y la tasa de detección de casos del 70% para 2005 [2]. Las encuestas nacionales de prevalencia de tuberculosis se llevaron a cabo en China en 1979, China en 1990, China en 2000, y 2010 [4]. Los resultados de la encuesta proporcionan estimaciones más precisas de las tasas de prevalencia de tuberculosis que las estimaciones de la OMS y pueden utilizarse para evaluar la probabilidad de que China Se trata de una provincia relativamente desarrollada con un PIB per cápita 1,6 veces el promedio nacional en 2010 [5]. La tasa de prevalencia de la TB en Shandong fue menor que la tasa media de China en 2000 [3]. En las encuestas de 2000 y 2010 se tomaron muestras representativas de la población en Shandong utilizando métodos similares. El objetivo del estudio fue estimar la prevalencia de la TB en Shandong con base en la encuesta de 2010, y comparar los resultados de las dos encuestas transversales. La población objetivo de la encuesta de prevalencia de la TB fue la población de 15 años o más que había vivido en los grupos seleccionados durante más de 6 meses. Se realizó una encuesta transversal basada en la población, utilizando el método de muestreo aleatorio multietapa. La encuesta utilizó los mismos métodos de muestreo que la encuesta nacional de China en 2010, que fue similar a los métodos de muestreo utilizados en 2000 [6]. El diseño de las encuestas estuvo de acuerdo con las recomendaciones de Se calculó el tamaño de la muestra de 52500 adultos (de 15 años de edad), en 35 conglomerados, con base en la detección de un cambio del 20% en la tasa de prevalencia de casos positivos de citología de tuberculosis en comparación con la tasa de la encuesta de 2000 (95 por 100.000), con una probabilidad superior al 95% y el 95% de potencia, con una tasa de respuesta del 90% de los participantes [9]. Se utilizó un muestreo aleatorio estratificado en varias etapas para seleccionar los 35 conglomerados dentro de 17 prefecturas de la provincia de Shandong. El número de conglomerados se asignó al azar en proporción a la población provincial en los niveles de prefectura, condado/distrito y municipio. Se definió un conglomerado como una comunidad (un pueblo en la zona rural o una comunidad residente en una zona urbana) con una población de 1250 a 1750 adultos (es decir, los de 15 años o más). Si la comunidad contenía menos de Si la comunidad o comunidades combinadas que contenían más de 1750 adultos, seleccionamos aleatoriamente los hogares y luego incluimos a todos los adultos en el hogar para la encuesta hasta que el número total de adultos seleccionados llegó a 1750. Se excluyeron los cuarteles militares y las prisiones ubicadas en el grupo [7]. La encuesta fue realizada de marzo a junio de 2010 por equipos de encuesta integrados por médicos clínicos, médicos de salud pública, radiólogos, técnicos de laboratorio y enfermeras. Se utilizó los medios de comunicación locales para promover el conocimiento de la encuesta. Los trabajadores comunitarios realizaron un censo casa por casa para actualizar la base de datos de residentes, informar a los participantes de la encuesta y obtener el consentimiento informado. El estudio no incluyó a niños menores de 15 años. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes de 16 años o más. Mientras que de los de 15 años se obtuvieron consentimientos informados por escrito de sus padres o tutores. Todos los documentos fueron almacenados Se obtuvieron aprobaciones éticas para el estudio y los procedimientos de consentimiento de la Junta de Revisión Institucional (IRB) del Hospital Chest de Shandong (número de registro NIHIRB00006010), quienes aceptaron participar en la encuesta fueron invitados al dispensario de TB del condado, donde completaron una consulta con un médico de TB clínico capacitado sobre cualquier síntoma sugestivo de TB, como tos persistente (durante dos semanas o más), hemoptisis, pérdida de peso y fiebre; todos los participantes recibieron una radiografía de tórax (CXRAY) que luego fueron revisados por un panel de radiólogos; aquellos con síntomas o películas CXRAY sugestivas de TB fueron clasificados como presuntos casos de TB; todos los casos sospechosos fueron solicitados para producir tres muestras de esputo, una en el momento de la consulta, otra en la noche y la tercera en la madrugada del día siguiente. Los sospechosos identificados completaron un cuestionario adicional sobre su situación socioeconómica, su estado de tabaquismo y la presencia de síntomas relacionados con la tuberculosis en los seis meses anteriores (tos, fiebre, pérdida de peso, dolor torácico y hemoptisis).Se realizaron frotis de esputo en dispensarios locales de tuberculosis.Todas las muestras de esputo se cultivaron utilizando el medio Löwenstein-Jensen en el laboratorio provincial en un plazo de 24 horas utilizando el transporte en cadena fría.Las muestras se excluyeron de la tuberculosis cuando se identificaron bacilos no tuberculosos del cultivo.Todas las muestras de esputo se realizaron estrictamente de acuerdo con la medida de control de calidad externa del laboratorio nacional de tuberculosis, que es coherente con la directriz de la encuesta de prevalencia de la tuberculosis de la OMS [7].La clasificación de la tuberculosis se realizó de acuerdo con la directriz nacional china de tuberculosis [10]. Los pacientes con citología de esputo positiva fueron clasificados como casos positivos de esputo; los pacientes con citología de esputo positivo o de cultivo fueron clasificados como casos bacteriológicos confirmados como esputo bacteriológico; aquellos con cultivo negativo con CXRAY anormal sugestivo de TB y excluidos de otras enfermedades por médicos y radiólogos fueron clasificados como CXRAY sugestivo de casos bacteriológicos negativos; por limitaciones de recursos no se aplicó la recomendación de agentes antimicrobianos de amplio espectro para confirmar el diagnóstico de casos negativos de TB [11]. Los casos recién diagnosticados fueron diferenciados de casos previamente diagnosticados mediante controles durante las entrevistas y contra el sistema de registro de TB; el diagnóstico inicial fue realizado por un grupo de médicos y radiólogos locales; posteriormente, muestras y películas de CXRAY de todos los casos sospechosos y confirmados fueron reevaluados por un grupo de Las películas de CXRAY del 100% de las que fueron calificadas como anormales y las muestras aleatorias de 10% de las que fueron calificadas como normales fueron transferidas para lectura independiente. El equipo de laboratorio provincial examinó aleatoriamente una diapositiva de las tres muestras de casos positivos de esputo, las tres muestras de casos de TB sugerentes de CXRAY y seleccionó aleatoriamente el 10% de los casos no TB. Se calcularon estimaciones de prevalencia de los casos positivos de esputo, confirmados bacteriológicamente y todos los casos de TB. En todos los análisis se utilizaron ponderaciones de población para ajustar el efecto de diseño de muestreo multietapa estratificado [8]. Los resultados de la encuesta en 2010 y 2000 se estandarizaron con las estructuras de edad de la población del censo de China en 2010. La encuesta de prevalencia de TB de 2000 incluyó todos los grupos de edad [12]. El método recomendado por Se realizó el análisis de subgrupos en género, grupos de edad y residencia urbana/rural, se calculó la tasa de identificación de casos como el número de casos identificados por un método de cribado en todos los casos sospechosos encontrados por el método, se calcularon los rendimientos de la consulta sintomática y CXRAY como proporción del número total de casos confirmados bacteriológicamente, se seleccionaron 17 conglomerados urbanos y 18 conglomerados rurales, con una población total de 89.093, de los cuales 56.671 fueron elegibles para la encuesta (Figura 1 ), la tasa de respuesta osciló entre el 95% y el 97% en diferentes conglomerados. 54.279 participantes asistieron a la consulta clínica y fueron examinados por CXRAY, de los cuales el 47% eran varones; la edad promedio fue de 46 años con 14% de 65 años y se encontraron un total de 572 casos sospechosos de tuberculosis De estos, 264 (46%) fueron identificados en base a anomalías CXRAY, 228 (40%) se basaron en tos persistente, 80 (14%) se basaron en ambos, la encuesta diagnosticó 172 nuevos casos, incluyendo 19 nuevos casos confirmados bacteriológicamente (incluyendo 11 casos positivos de esputo y cultivo, y 8 casos negativos de esputo pero positivos de cultivo) y 153 casos bacteriológicos sugerentes CXRAY. La encuesta también identificó 11 casos existentes registrados en el programa nacional de TB. Además, la encuesta encontró cuatro casos con cultivo positivo de bacilos de no tuberculosis, y los excluyó de los pacientes de TB. Todos los participantes de la encuesta fueron examinados por primera vez por síntomas y CXRAY. Aquellos que tenían síntomas de tos o hemoptisis consistentes, o anomalías CXRAY fueron examinados por frotis y cultura. Las tasas de identificación de casos nuevos confirmados bacteriológicamente de los casos sospechosos fueron significativamente mayores con CXRAY como herramienta primaria (Figura 1, 3,8%, P = 0,012) y aumentaron tanto la pantalla de síntomas de tos persistente como la CXRAY (10%, P < 0,001) en comparación con la pantalla de síntomas solo (0,4%); se observó el mismo patrón de tasa de identificación de casos en los casos positivos de esputo (7,5%, 1,9% y 0% respectivamente); la proporción de casos confirmados bacteriológicamente no fue significativamente mayor entre los casos confirmados bacteriológicamente en comparación con otros sospechosos (P = 0,565); solo la consulta sintomática identificó 308 sospechosos, incluyendo 6 (1,9%) TB positiva de frotis de esputo y 9 (2,9%) TB confirmada bacteriológicamente; entre los 344 sospechosos con anomalías CXRA El rendimiento de los casos confirmados bacteriológicamente fue del 47,4% por consulta de cribado y del 94,7% por CXRAY. En la población de más de 65 años, la consulta de síntomas y la CXRAY identificaron 174 y 182 casos sospechosos respectivamente, lo que arrojó 5 (2,9%) y 9 (4,9%) de casos confirmados bacteriológicamente. Los rendimientos de los casos confirmados bacteriológicamente fueron del 55,6% por consulta de síntomas y del 100% por CXRAY entre los más de 65. De los 512 casos sospechosos que completaron el cuestionario adicional, el 42% eran agricultores y el 31% eran fumadores actuales (Tabla 1). De los diez casos confirmados bacteriológicamente que no presentaron tos persistente en la encuesta de prevalencia, uno tosió durante dos días, uno tuvo dolor torácico y los otros ocho no presentaron síntomas de TB en los últimos seis meses. La tasa bruta de prevalencia en Shandong en 2010 de casos positivos de esputo fue de 22,1 (IC 95%: 9,6-34,6), casos confirmados bacteriológicamente fue de 36,8 (IC 95%: 17,8-55,8), y todos los casos fueron de 337,1 (IC 95%: 254,1-420,0) por 100.000 en población adulta (Tabla 2 ). Las tasas ajustadas de prevalencia de toda la población en Shandong fueron de 17,8 (IC 95%: 8,3-17,5), 27,8 (IC 95%: 14,8-28.0) y 239,4 (IC 95%: 179,9-298,9) por 100.000 en 2010. Se observó una notable disminución de 82,0%, 80,2% y 31,4% en las tasas de prevalencia de esputo positivo, confirmado bacteriológicamente, y en todos los casos, respectivamente, en comparación con las tasas ajustadas en 2000 [12]. Se observaron grandes descensos en los hombres de 40 a 65 años y en las mujeres de más de 60 años (Figura 2). Las tasas de prevalencia ajustada en la población adulta fueron 21,4 (IC 95%: 10,0-32,8), 33,5 (IC 95%: 17,8-49,2) y 285,8 (IC 95%: 254,2-356,4) para los casos positivos de esputo, casos confirmados bacteriológicamente y todos los casos, respectivamente. Se observaron diferencias significativas en las tasas de prevalencia ajustada de tuberculosis entre hombres y mujeres de más de 65 años y de 15 a 64 años, en las zonas rurales y urbanas (Tabla 2, P < 0,001 Las proporciones entre hombres y mujeres fueron 5,5 en casos positivos de esputo y 2,8 en casos confirmados bacteriológicamente, mientras que las proporciones aumentaron a 6,0 y 4,1 respectivamente, entre los mayores de 65 años; la mayoría de los pacientes con TB, 54,5% en casos positivos de esputo y 47,3% en casos confirmados bacteriológicamente, fueron de 65 años o más; la proporción entre mayores de 65 años y 15 a 64 años fue de 8,4 en casos positivos de esputo y 5,9 en casos confirmados bacteriológicamente; la proporción entre zonas rurales y urbanas fue de 2,7 en casos positivos de esputo y 4,8 en casos confirmados bacteriológicamente; el hallazgo más llamativo fue que una gran proporción de pacientes con TB no presentó tos consistente; el hallazgo pasivo de casos es la práctica habitual en países en desarrollo donde se realiza la microscopía de esputo para identificar casos de Una gran proporción de los casos de tuberculosis pueden no ser detectados utilizando este método como 53% de los casos confirmados bacteriológicamente y 45% de los casos positivos de esputo en este estudio no tuvieron tos persistente pero fueron identificados a través de CXRAY anormal. Casi la mitad de los casos confirmados bacteriológicamente no reportaron síntomas en los últimos seis meses. Este hallazgo, aunque inicialmente sorprendente, es consistente con reportes de Vietnam (47% de los casos confirmados bacteriológicamente no presentaban tos persistente) [14], Myanmar (38%) y Etiopía (48%) [13]. CXRAY fue sensible en la detección de casos de tuberculosis, ya que los rendimientos de casos confirmados bacteriológicamente fueron mucho más altos por CXRAY en comparación con la detección de síntomas, como se informó en Vietnam [15] y algunos entornos de alta prevalencia del VIH [16, 17]. Nuestros hallazgos sugieren que la estrategia de búsqueda de casos utilizando CXRAY seguido de esputo o cultivo como las pruebas primarias y secundarias de cribado podría ser más efectiva, especialmente entre la población de más de 65 años, ya que los rendimientos fueron mayores en más de 65 años en comparación con la Tabla 2 Prevalencia de casos de TB positivo de esputo, casos de TB confirmados bacteriológicamente y todos los casos en Shandong, China, 2010 No hay población. Aunque usar CXRAY para examinar a todos no es factible, puede ser utilizado en exámenes físicos de ancianos de rutina. El paquete de salud pública de China ahora cubre CXRAY gratis para ancianos, así como exámenes corporales anuales de empleados proporcionó CXRAY gratuito. En esta encuesta, sólo un paciente positivo de esputo había sido detectado y tratado por el programa nacional, aunque se realizó una consulta clínica específica para identificar a cualquier paciente que haya sido diagnosticado y tratado Esto puede reflejar la diferencia entre el enfoque de búsqueda de casos activos en la encuesta y el enfoque de búsqueda de casquillo pasivo en la práctica; sin embargo, indicó que una gran proporción de casos de TB confirmados bacteriológicamente no son atendidos por el programa nacional de TB. Otro cambio notable es la fuerte disminución de la proporción de casos positivos de esputo, que representó el 30,5% de todos los casos en la encuesta de 2000, pero se redujo al 6,6% en la encuesta de 2010. La proporción de casos de esputo notificados de todos los casos de TB en Shandong también disminuyó del 80,9% en 2005 al 64,6% en 2010 [19]. La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se ha reducido en un 80% en la última década en Shandong, en comparación con una disminución nacional del 45% (de 216/ 100.000 en 2000 a 119/ 100.000 en 2010] [4]. La rápida disminución de la prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente en la última década puede atribuirse al fortalecimiento del sistema de salud pública de China tras el brote de síndrome respiratorio agudo grave en 2003 [2]. Otra razón puede deberse a la mejora de la notificación de casos de tuberculosis en el sistema de notificación de enfermedades transmisibles en línea, y a la mejora de la colaboración entre los hospitales públicos y los dispensarios de tuberculosis [20]. Otros factores como el desarrollo económico social también pueden haber desempeñado un papel importante en la reducción de la prevalencia de la tuberculosis, como se encontró en un estudio de las tendencias de las tasas de notificación de la tuberculosis en 134 países [21]. La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente en Shandong fue inferior a las estimaciones de la OMS para China en 2010 [1]. Una de las razones es que los resultados de las encuestas de prevalencia se basan en el hallazgo de casos activos, mientras que las estimaciones de la OMS se basan en las tasas de notificación de los casos pasivos. Se necesita una reevaluación de la prevalencia de tuberculosis reportada en China basada en la encuesta reciente. CXRAY sugiere que los casos bacteriológicos negativos pueden ser casos de tuberculosis bacteriológicamente negativos si tenían algún síntoma de tuberculosis, mientras que algunos pueden ser causados por un frotis o cultivo subóptimo. Como se informó en encuestas anteriores de China [3, 22], incluyendo estos casos como casos de tuberculosis pueden resultar en una sobreestimación de todos los casos pulmonares [23]. La encuesta reveló que más de la mitad de los pacientes con tuberculosis tenían 65 años o más en Shandong, mientras que los más de 65 años tenían más probabilidades de presentarse con CXRAY anormal y tos persistente. Tendencias similares se han Estas altas tasas pueden reflejar las tasas de tuberculosis más altas en el pasado y la disminución de la inmunidad en los más de 65 años.Cómo tratar a los ancianos con tuberculosis y otras complicaciones como la diabetes sigue siendo un desafío continuo en China y entornos similares.Los resultados de la encuesta pueden generalizarse a la población de Shandong de 94 millones de habitantes o entornos internacionales similares con ingresos medios y niveles medios de prevalencia de la tuberculosis.Los patrones de la epidemia de tuberculosis encontrados en Shandong, es decir, la proporción de pacientes con síntomas, proporción entre zonas urbanas y rurales, hombres y mujeres, fueron similares a los encontrados en la encuesta nacional [4].Sin embargo, las tasas de prevalencia no pueden extrapolarse a las provincias occidentales de China con una mayor prevalencia de tuberculosis.Por razones logísticas, la población elegible no incluyó a los adultos que permanecieron en los grupos muestreados menos de 6 meses, lo que fue la misma práctica en la encuesta de 2000.Sin embargo, los migrantes a La encuesta no recopiló indicadores socioeconómicos, estado de tabaquismo y estado de VIH de todos los participantes, por lo que no se dispone de comparaciones entre los casos de tuberculosis y todos los pacientes no tratados con TB. Sin embargo, la prevalencia del VIH en Shandong China es inferior al 0,01%, y no alteraría significativamente la tasa de prevalencia de la TB. Además, la encuesta no evaluó la TB infantil y la TB pulmonar extra. Las discusiones sobre el uso de CXRAY como herramienta de cribado fueron en el aspecto técnico, pero no en el lado de los costos, ya que no realizamos ningún análisis de la relación costo-eficacia ni la voluntad social de pagar por tal estrategia en entornos similares. Este estudio ha demostrado que la prevalencia de TB confirmada bacteriológicamente en Shandong ha disminuido sustancialmente en la última década. Es importante destacar que la mayoría de estos casos no se presentaron con tos persistente y la proporción de Se recomiendan estudios adicionales para evaluar la viabilidad de la adopción de CXRAY en los servicios de salud existentes para detectar casos de tuberculosis y la relación costo-eficacia de dicha intervención.Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

En 2010, ¿cuántos casos de tuberculosis se estimaron en China?

Cambios en la prevalencia de la tuberculosis pulmonar: evidencia de la encuesta de población de 2010 en una populosa provincia de Chinahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3890533/SHA: eef61bdfa49b8652fd660b5b8b7e74cf51922505Autores: Wei, Xiaolin; Zhang, Xiulei; Yin, Jia; Walley, John; Beanland, Rachel; Zou, Guanyang; Zhang, Hongmei; Li, Fang; Liu, Zhimin; Zee, Benny CY; Griffiths, Sian MDate: 2014-01-11DOI: 10.1186/1471-2334-14-21Licencia: cc-byAbstract: ANTEGRON: Este documento informa de los resultados de la El objetivo de este estudio fue estimar la prevalencia de TB en la provincia en 2010 en comparación con la encuesta de 2000; y comparar el rendimiento de casos de TB de diferentes abordajes de búsqueda de casos.MÉTODOS: Se realizó una encuesta transversal basada en la población mediante muestreo aleatorio multietapa. En la encuesta participaron 54.279 adultos con una tasa de respuesta del 96%. Los médicos entrevistaron y clasificaron a los participantes como presuntos casos de TB si presentaban tos persistente, rayos X torácicos anormales (CXRAY) o ambos. Se recogieron tres especímenes de esputo de todos los casos sospechosos y se enviaron para microscopía y cultivo. RESULTADOS: La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente fue de 34 por 100.000 en adultos en Shandong en 2010. En comparación con la encuesta de 2000, la prevalencia de TB disminuyó en un 80%. El 53% de los casos Más del 50% de los casos de tuberculosis se encontraban entre los más de 65 años. CONCLUSIONES: La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se redujo significativamente en comparación con el año 2000. La encuesta planteó desafíos para identificar casos de tuberculosis sin síntomas claros. Texto: China, con una prevalencia estimada de todos los casos de tuberculosis de 108 por 100.000 en 2010, tiene la segunda carga de tuberculosis más alta del mundo, representando el 13% de todos los casos en todo el mundo [1]. La Organización Mundial de la Salud (OMS) estimó que China había alcanzado los objetivos de éxito en el tratamiento del 85% para 1993 y la tasa de detección de casos del 70% para 2005 [2]. Las encuestas nacionales de prevalencia de tuberculosis se llevaron a cabo en China en 1979, China en 1990, China en 2000, y 2010 [4]. Los resultados de la encuesta proporcionan estimaciones más precisas de las tasas de prevalencia de tuberculosis que las estimaciones de la OMS y pueden utilizarse para evaluar la probabilidad de que China Se trata de una provincia relativamente desarrollada con un PIB per cápita 1,6 veces el promedio nacional en 2010 [5]. La tasa de prevalencia de la TB en Shandong fue menor que la tasa media de China en 2000 [3]. En las encuestas de 2000 y 2010 se tomaron muestras representativas de la población en Shandong utilizando métodos similares. El objetivo del estudio fue estimar la prevalencia de la TB en Shandong con base en la encuesta de 2010, y comparar los resultados de las dos encuestas transversales. La población objetivo de la encuesta de prevalencia de la TB fue la población de 15 años o más que había vivido en los grupos seleccionados durante más de 6 meses. Se realizó una encuesta transversal basada en la población, utilizando el método de muestreo aleatorio multietapa. La encuesta utilizó los mismos métodos de muestreo que la encuesta nacional de China en 2010, que fue similar a los métodos de muestreo utilizados en 2000 [6]. El diseño de las encuestas estuvo de acuerdo con las recomendaciones de Se calculó el tamaño de la muestra de 52500 adultos (de 15 años de edad), en 35 conglomerados, con base en la detección de un cambio del 20% en la tasa de prevalencia de casos positivos de citología de tuberculosis en comparación con la tasa de la encuesta de 2000 (95 por 100.000), con una probabilidad superior al 95% y el 95% de potencia, con una tasa de respuesta del 90% de los participantes [9]. Se utilizó un muestreo aleatorio estratificado en varias etapas para seleccionar los 35 conglomerados dentro de 17 prefecturas de la provincia de Shandong. El número de conglomerados se asignó al azar en proporción a la población provincial en los niveles de prefectura, condado/distrito y municipio. Se definió un conglomerado como una comunidad (un pueblo en la zona rural o una comunidad residente en una zona urbana) con una población de 1250 a 1750 adultos (es decir, los de 15 años o más). Si la comunidad contenía menos de Si la comunidad o comunidades combinadas que contenían más de 1750 adultos, seleccionamos aleatoriamente los hogares y luego incluimos a todos los adultos en el hogar para la encuesta hasta que el número total de adultos seleccionados llegó a 1750. Se excluyeron los cuarteles militares y las prisiones ubicadas en el grupo [7]. La encuesta fue realizada de marzo a junio de 2010 por equipos de encuesta integrados por médicos clínicos, médicos de salud pública, radiólogos, técnicos de laboratorio y enfermeras. Se utilizó los medios de comunicación locales para promover el conocimiento de la encuesta. Los trabajadores comunitarios realizaron un censo casa por casa para actualizar la base de datos de residentes, informar a los participantes de la encuesta y obtener el consentimiento informado. El estudio no incluyó a niños menores de 15 años. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes de 16 años o más. Mientras que de los de 15 años se obtuvieron consentimientos informados por escrito de sus padres o tutores. Todos los documentos fueron almacenados Se obtuvieron aprobaciones éticas para el estudio y los procedimientos de consentimiento de la Junta de Revisión Institucional (IRB) del Hospital Chest de Shandong (número de registro NIHIRB00006010), quienes aceptaron participar en la encuesta fueron invitados al dispensario de TB del condado, donde completaron una consulta con un médico de TB clínico capacitado sobre cualquier síntoma sugestivo de TB, como tos persistente (durante dos semanas o más), hemoptisis, pérdida de peso y fiebre; todos los participantes recibieron una radiografía de tórax (CXRAY) que luego fueron revisados por un panel de radiólogos; aquellos con síntomas o películas CXRAY sugestivas de TB fueron clasificados como presuntos casos de TB; todos los casos sospechosos fueron solicitados para producir tres muestras de esputo, una en el momento de la consulta, otra en la noche y la tercera en la madrugada del día siguiente. Los sospechosos identificados completaron un cuestionario adicional sobre su situación socioeconómica, su estado de tabaquismo y la presencia de síntomas relacionados con la tuberculosis en los seis meses anteriores (tos, fiebre, pérdida de peso, dolor torácico y hemoptisis).Se realizaron frotis de esputo en dispensarios locales de tuberculosis.Todas las muestras de esputo se cultivaron utilizando el medio Löwenstein-Jensen en el laboratorio provincial en un plazo de 24 horas utilizando el transporte en cadena fría.Las muestras se excluyeron de la tuberculosis cuando se identificaron bacilos no tuberculosos del cultivo.Todas las muestras de esputo se realizaron estrictamente de acuerdo con la medida de control de calidad externa del laboratorio nacional de tuberculosis, que es coherente con la directriz de la encuesta de prevalencia de la tuberculosis de la OMS [7].La clasificación de la tuberculosis se realizó de acuerdo con la directriz nacional china de tuberculosis [10]. Los pacientes con citología de esputo positiva fueron clasificados como casos positivos de esputo; los pacientes con citología de esputo positivo o de cultivo fueron clasificados como casos bacteriológicos confirmados como esputo bacteriológico; aquellos con cultivo negativo con CXRAY anormal sugestivo de TB y excluidos de otras enfermedades por médicos y radiólogos fueron clasificados como CXRAY sugestivo de casos bacteriológicos negativos; por limitaciones de recursos no se aplicó la recomendación de agentes antimicrobianos de amplio espectro para confirmar el diagnóstico de casos negativos de TB [11]. Los casos recién diagnosticados fueron diferenciados de casos previamente diagnosticados mediante controles durante las entrevistas y contra el sistema de registro de TB; el diagnóstico inicial fue realizado por un grupo de médicos y radiólogos locales; posteriormente, muestras y películas de CXRAY de todos los casos sospechosos y confirmados fueron reevaluados por un grupo de Las películas de CXRAY del 100% de las que fueron calificadas como anormales y las muestras aleatorias de 10% de las que fueron calificadas como normales fueron transferidas para lectura independiente. El equipo de laboratorio provincial examinó aleatoriamente una diapositiva de las tres muestras de casos positivos de esputo, las tres muestras de casos de TB sugerentes de CXRAY y seleccionó aleatoriamente el 10% de los casos no TB. Se calcularon estimaciones de prevalencia de los casos positivos de esputo, confirmados bacteriológicamente y todos los casos de TB. En todos los análisis se utilizaron ponderaciones de población para ajustar el efecto de diseño de muestreo multietapa estratificado [8]. Los resultados de la encuesta en 2010 y 2000 se estandarizaron con las estructuras de edad de la población del censo de China en 2010. La encuesta de prevalencia de TB de 2000 incluyó todos los grupos de edad [12]. El método recomendado por Se realizó el análisis de subgrupos en género, grupos de edad y residencia urbana/rural, se calculó la tasa de identificación de casos como el número de casos identificados por un método de cribado en todos los casos sospechosos encontrados por el método, se calcularon los rendimientos de la consulta sintomática y CXRAY como proporción del número total de casos confirmados bacteriológicamente, se seleccionaron 17 conglomerados urbanos y 18 conglomerados rurales, con una población total de 89.093, de los cuales 56.671 fueron elegibles para la encuesta (Figura 1 ), la tasa de respuesta osciló entre el 95% y el 97% en diferentes conglomerados. 54.279 participantes asistieron a la consulta clínica y fueron examinados por CXRAY, de los cuales el 47% eran varones; la edad promedio fue de 46 años con 14% de 65 años y se encontraron un total de 572 casos sospechosos de tuberculosis De estos, 264 (46%) fueron identificados en base a anomalías CXRAY, 228 (40%) se basaron en tos persistente, 80 (14%) se basaron en ambos, la encuesta diagnosticó 172 nuevos casos, incluyendo 19 nuevos casos confirmados bacteriológicamente (incluyendo 11 casos positivos de esputo y cultivo, y 8 casos negativos de esputo pero positivos de cultivo) y 153 casos bacteriológicos sugerentes CXRAY. La encuesta también identificó 11 casos existentes registrados en el programa nacional de TB. Además, la encuesta encontró cuatro casos con cultivo positivo de bacilos de no tuberculosis, y los excluyó de los pacientes de TB. Todos los participantes de la encuesta fueron examinados por primera vez por síntomas y CXRAY. Aquellos que tenían síntomas de tos o hemoptisis consistentes, o anomalías CXRAY fueron examinados por frotis y cultura. Las tasas de identificación de casos nuevos confirmados bacteriológicamente de los casos sospechosos fueron significativamente mayores con CXRAY como herramienta primaria (Figura 1, 3,8%, P = 0,012) y aumentaron tanto la pantalla de síntomas de tos persistente como la CXRAY (10%, P < 0,001) en comparación con la pantalla de síntomas solo (0,4%); se observó el mismo patrón de tasa de identificación de casos en los casos positivos de esputo (7,5%, 1,9% y 0% respectivamente); la proporción de casos confirmados bacteriológicamente no fue significativamente mayor entre los casos confirmados bacteriológicamente en comparación con otros sospechosos (P = 0,565); solo la consulta sintomática identificó 308 sospechosos, incluyendo 6 (1,9%) TB positiva de frotis de esputo y 9 (2,9%) TB confirmada bacteriológicamente; entre los 344 sospechosos con anomalías CXRA El rendimiento de los casos confirmados bacteriológicamente fue del 47,4% por consulta de cribado y del 94,7% por CXRAY. En la población de más de 65 años, la consulta de síntomas y la CXRAY identificaron 174 y 182 casos sospechosos respectivamente, lo que arrojó 5 (2,9%) y 9 (4,9%) de casos confirmados bacteriológicamente. Los rendimientos de los casos confirmados bacteriológicamente fueron del 55,6% por consulta de síntomas y del 100% por CXRAY entre los más de 65. De los 512 casos sospechosos que completaron el cuestionario adicional, el 42% eran agricultores y el 31% eran fumadores actuales (Tabla 1). De los diez casos confirmados bacteriológicamente que no presentaron tos persistente en la encuesta de prevalencia, uno tosió durante dos días, uno tuvo dolor torácico y los otros ocho no presentaron síntomas de TB en los últimos seis meses. La tasa bruta de prevalencia en Shandong en 2010 de casos positivos de esputo fue de 22,1 (IC 95%: 9,6-34,6), casos confirmados bacteriológicamente fue de 36,8 (IC 95%: 17,8-55,8), y todos los casos fueron de 337,1 (IC 95%: 254,1-420,0) por 100.000 en población adulta (Tabla 2 ). Las tasas ajustadas de prevalencia de toda la población en Shandong fueron de 17,8 (IC 95%: 8,3-17,5), 27,8 (IC 95%: 14,8-28.0) y 239,4 (IC 95%: 179,9-298,9) por 100.000 en 2010. Se observó una notable disminución de 82,0%, 80,2% y 31,4% en las tasas de prevalencia de esputo positivo, confirmado bacteriológicamente, y en todos los casos, respectivamente, en comparación con las tasas ajustadas en 2000 [12]. Se observaron grandes descensos en los hombres de 40 a 65 años y en las mujeres de más de 60 años (Figura 2). Las tasas de prevalencia ajustada en la población adulta fueron 21,4 (IC 95%: 10,0-32,8), 33,5 (IC 95%: 17,8-49,2) y 285,8 (IC 95%: 254,2-356,4) para los casos positivos de esputo, casos confirmados bacteriológicamente y todos los casos, respectivamente. Se observaron diferencias significativas en las tasas de prevalencia ajustada de tuberculosis entre hombres y mujeres de más de 65 años y de 15 a 64 años, en las zonas rurales y urbanas (Tabla 2, P < 0,001 Las proporciones entre hombres y mujeres fueron 5,5 en casos positivos de esputo y 2,8 en casos confirmados bacteriológicamente, mientras que las proporciones aumentaron a 6,0 y 4,1 respectivamente, entre los mayores de 65 años; la mayoría de los pacientes con TB, 54,5% en casos positivos de esputo y 47,3% en casos confirmados bacteriológicamente, fueron de 65 años o más; la proporción entre mayores de 65 años y 15 a 64 años fue de 8,4 en casos positivos de esputo y 5,9 en casos confirmados bacteriológicamente; la proporción entre zonas rurales y urbanas fue de 2,7 en casos positivos de esputo y 4,8 en casos confirmados bacteriológicamente; el hallazgo más llamativo fue que una gran proporción de pacientes con TB no presentó tos consistente; el hallazgo pasivo de casos es la práctica habitual en países en desarrollo donde se realiza la microscopía de esputo para identificar casos de Una gran proporción de los casos de tuberculosis pueden no ser detectados utilizando este método como 53% de los casos confirmados bacteriológicamente y 45% de los casos positivos de esputo en este estudio no tuvieron tos persistente pero fueron identificados a través de CXRAY anormal. Casi la mitad de los casos confirmados bacteriológicamente no reportaron síntomas en los últimos seis meses. Este hallazgo, aunque inicialmente sorprendente, es consistente con reportes de Vietnam (47% de los casos confirmados bacteriológicamente no presentaban tos persistente) [14], Myanmar (38%) y Etiopía (48%) [13]. CXRAY fue sensible en la detección de casos de tuberculosis, ya que los rendimientos de casos confirmados bacteriológicamente fueron mucho más altos por CXRAY en comparación con la detección de síntomas, como se informó en Vietnam [15] y algunos entornos de alta prevalencia del VIH [16, 17]. Nuestros hallazgos sugieren que la estrategia de búsqueda de casos utilizando CXRAY seguido de esputo o cultivo como las pruebas primarias y secundarias de cribado podría ser más efectiva, especialmente entre la población de más de 65 años, ya que los rendimientos fueron mayores en más de 65 años en comparación con la Tabla 2 Prevalencia de casos de TB positivo de esputo, casos de TB confirmados bacteriológicamente y todos los casos en Shandong, China, 2010 No hay población. Aunque usar CXRAY para examinar a todos no es factible, puede ser utilizado en exámenes físicos de ancianos de rutina. El paquete de salud pública de China ahora cubre CXRAY gratis para ancianos, así como exámenes corporales anuales de empleados proporcionó CXRAY gratuito. En esta encuesta, sólo un paciente positivo de esputo había sido detectado y tratado por el programa nacional, aunque se realizó una consulta clínica específica para identificar a cualquier paciente que haya sido diagnosticado y tratado Esto puede reflejar la diferencia entre el enfoque de búsqueda de casos activos en la encuesta y el enfoque de búsqueda de casquillo pasivo en la práctica; sin embargo, indicó que una gran proporción de casos de TB confirmados bacteriológicamente no son atendidos por el programa nacional de TB. Otro cambio notable es la fuerte disminución de la proporción de casos positivos de esputo, que representó el 30,5% de todos los casos en la encuesta de 2000, pero se redujo al 6,6% en la encuesta de 2010. La proporción de casos de esputo notificados de todos los casos de TB en Shandong también disminuyó del 80,9% en 2005 al 64,6% en 2010 [19]. La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se ha reducido en un 80% en la última década en Shandong, en comparación con una disminución nacional del 45% (de 216/ 100.000 en 2000 a 119/ 100.000 en 2010] [4]. La rápida disminución de la prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente en la última década puede atribuirse al fortalecimiento del sistema de salud pública de China tras el brote de síndrome respiratorio agudo grave en 2003 [2]. Otra razón puede deberse a la mejora de la notificación de casos de tuberculosis en el sistema de notificación de enfermedades transmisibles en línea, y a la mejora de la colaboración entre los hospitales públicos y los dispensarios de tuberculosis [20]. Otros factores como el desarrollo económico social también pueden haber desempeñado un papel importante en la reducción de la prevalencia de la tuberculosis, como se encontró en un estudio de las tendencias de las tasas de notificación de la tuberculosis en 134 países [21]. La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente en Shandong fue inferior a las estimaciones de la OMS para China en 2010 [1]. Una de las razones es que los resultados de las encuestas de prevalencia se basan en el hallazgo de casos activos, mientras que las estimaciones de la OMS se basan en las tasas de notificación de los casos pasivos. Se necesita una reevaluación de la prevalencia de tuberculosis reportada en China basada en la encuesta reciente. CXRAY sugiere que los casos bacteriológicos negativos pueden ser casos de tuberculosis bacteriológicamente negativos si tenían algún síntoma de tuberculosis, mientras que algunos pueden ser causados por un frotis o cultivo subóptimo. Como se informó en encuestas anteriores de China [3, 22], incluyendo estos casos como casos de tuberculosis pueden resultar en una sobreestimación de todos los casos pulmonares [23]. La encuesta reveló que más de la mitad de los pacientes con tuberculosis tenían 65 años o más en Shandong, mientras que los más de 65 años tenían más probabilidades de presentarse con CXRAY anormal y tos persistente. Tendencias similares se han Estas altas tasas pueden reflejar las tasas de tuberculosis más altas en el pasado y la disminución de la inmunidad en los más de 65 años.Cómo tratar a los ancianos con tuberculosis y otras complicaciones como la diabetes sigue siendo un desafío continuo en China y entornos similares.Los resultados de la encuesta pueden generalizarse a la población de Shandong de 94 millones de habitantes o entornos internacionales similares con ingresos medios y niveles medios de prevalencia de la tuberculosis.Los patrones de la epidemia de tuberculosis encontrados en Shandong, es decir, la proporción de pacientes con síntomas, proporción entre zonas urbanas y rurales, hombres y mujeres, fueron similares a los encontrados en la encuesta nacional [4].Sin embargo, las tasas de prevalencia no pueden extrapolarse a las provincias occidentales de China con una mayor prevalencia de tuberculosis.Por razones logísticas, la población elegible no incluyó a los adultos que permanecieron en los grupos muestreados menos de 6 meses, lo que fue la misma práctica en la encuesta de 2000.Sin embargo, los migrantes a La encuesta no recopiló indicadores socioeconómicos, estado de tabaquismo y estado de VIH de todos los participantes, por lo que no se dispone de comparaciones entre los casos de tuberculosis y todos los pacientes no tratados con TB. Sin embargo, la prevalencia del VIH en Shandong China es inferior al 0,01%, y no alteraría significativamente la tasa de prevalencia de la TB. Además, la encuesta no evaluó la TB infantil y la TB pulmonar extra. Las discusiones sobre el uso de CXRAY como herramienta de cribado fueron en el aspecto técnico, pero no en el lado de los costos, ya que no realizamos ningún análisis de la relación costo-eficacia ni la voluntad social de pagar por tal estrategia en entornos similares. Este estudio ha demostrado que la prevalencia de TB confirmada bacteriológicamente en Shandong ha disminuido sustancialmente en la última década. Es importante destacar que la mayoría de estos casos no se presentaron con tos persistente y la proporción de Se recomiendan estudios adicionales para evaluar la viabilidad de la adopción de CXRAY en los servicios de salud existentes para detectar casos de tuberculosis y la relación costo-eficacia de dicha intervención.Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

¿Cuál es la población de la provincia de Shandong?

Cambios en la prevalencia de la tuberculosis pulmonar: evidencia de la encuesta de población de 2010 en una populosa provincia de Chinahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3890533/SHA: eef61bdfa49b8652fd660b5b8b7e74cf51922505Autores: Wei, Xiaolin; Zhang, Xiulei; Yin, Jia; Walley, John; Beanland, Rachel; Zou, Guanyang; Zhang, Hongmei; Li, Fang; Liu, Zhimin; Zee, Benny CY; Griffiths, Sian MDate: 2014-01-11DOI: 10.1186/1471-2334-14-21Licencia: cc-byAbstract: ANTEGRON: Este documento informa de los resultados de la El objetivo de este estudio fue estimar la prevalencia de TB en la provincia en 2010 en comparación con la encuesta de 2000; y comparar el rendimiento de casos de TB de diferentes abordajes de búsqueda de casos.MÉTODOS: Se realizó una encuesta transversal basada en la población mediante muestreo aleatorio multietapa. En la encuesta participaron 54.279 adultos con una tasa de respuesta del 96%. Los médicos entrevistaron y clasificaron a los participantes como presuntos casos de TB si presentaban tos persistente, rayos X torácicos anormales (CXRAY) o ambos. Se recogieron tres especímenes de esputo de todos los casos sospechosos y se enviaron para microscopía y cultivo. RESULTADOS: La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente fue de 34 por 100.000 en adultos en Shandong en 2010. En comparación con la encuesta de 2000, la prevalencia de TB disminuyó en un 80%. El 53% de los casos Más del 50% de los casos de tuberculosis se encontraban entre los más de 65 años. CONCLUSIONES: La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se redujo significativamente en comparación con el año 2000. La encuesta planteó desafíos para identificar casos de tuberculosis sin síntomas claros. Texto: China, con una prevalencia estimada de todos los casos de tuberculosis de 108 por 100.000 en 2010, tiene la segunda carga de tuberculosis más alta del mundo, representando el 13% de todos los casos en todo el mundo [1]. La Organización Mundial de la Salud (OMS) estimó que China había alcanzado los objetivos de éxito en el tratamiento del 85% para 1993 y la tasa de detección de casos del 70% para 2005 [2]. Las encuestas nacionales de prevalencia de tuberculosis se llevaron a cabo en China en 1979, China en 1990, China en 2000, y 2010 [4]. Los resultados de la encuesta proporcionan estimaciones más precisas de las tasas de prevalencia de tuberculosis que las estimaciones de la OMS y pueden utilizarse para evaluar la probabilidad de que China Se trata de una provincia relativamente desarrollada con un PIB per cápita 1,6 veces el promedio nacional en 2010 [5]. La tasa de prevalencia de la TB en Shandong fue menor que la tasa media de China en 2000 [3]. En las encuestas de 2000 y 2010 se tomaron muestras representativas de la población en Shandong utilizando métodos similares. El objetivo del estudio fue estimar la prevalencia de la TB en Shandong con base en la encuesta de 2010, y comparar los resultados de las dos encuestas transversales. La población objetivo de la encuesta de prevalencia de la TB fue la población de 15 años o más que había vivido en los grupos seleccionados durante más de 6 meses. Se realizó una encuesta transversal basada en la población, utilizando el método de muestreo aleatorio multietapa. La encuesta utilizó los mismos métodos de muestreo que la encuesta nacional de China en 2010, que fue similar a los métodos de muestreo utilizados en 2000 [6]. El diseño de las encuestas estuvo de acuerdo con las recomendaciones de Se calculó el tamaño de la muestra de 52500 adultos (de 15 años de edad), en 35 conglomerados, con base en la detección de un cambio del 20% en la tasa de prevalencia de casos positivos de citología de tuberculosis en comparación con la tasa de la encuesta de 2000 (95 por 100.000), con una probabilidad superior al 95% y el 95% de potencia, con una tasa de respuesta del 90% de los participantes [9]. Se utilizó un muestreo aleatorio estratificado en varias etapas para seleccionar los 35 conglomerados dentro de 17 prefecturas de la provincia de Shandong. El número de conglomerados se asignó al azar en proporción a la población provincial en los niveles de prefectura, condado/distrito y municipio. Se definió un conglomerado como una comunidad (un pueblo en la zona rural o una comunidad residente en una zona urbana) con una población de 1250 a 1750 adultos (es decir, los de 15 años o más). Si la comunidad contenía menos de Si la comunidad o comunidades combinadas que contenían más de 1750 adultos, seleccionamos aleatoriamente los hogares y luego incluimos a todos los adultos en el hogar para la encuesta hasta que el número total de adultos seleccionados llegó a 1750. Se excluyeron los cuarteles militares y las prisiones ubicadas en el grupo [7]. La encuesta fue realizada de marzo a junio de 2010 por equipos de encuesta integrados por médicos clínicos, médicos de salud pública, radiólogos, técnicos de laboratorio y enfermeras. Se utilizó los medios de comunicación locales para promover el conocimiento de la encuesta. Los trabajadores comunitarios realizaron un censo casa por casa para actualizar la base de datos de residentes, informar a los participantes de la encuesta y obtener el consentimiento informado. El estudio no incluyó a niños menores de 15 años. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes de 16 años o más. Mientras que de los de 15 años se obtuvieron consentimientos informados por escrito de sus padres o tutores. Todos los documentos fueron almacenados Se obtuvieron aprobaciones éticas para el estudio y los procedimientos de consentimiento de la Junta de Revisión Institucional (IRB) del Hospital Chest de Shandong (número de registro NIHIRB00006010), quienes aceptaron participar en la encuesta fueron invitados al dispensario de TB del condado, donde completaron una consulta con un médico de TB clínico capacitado sobre cualquier síntoma sugestivo de TB, como tos persistente (durante dos semanas o más), hemoptisis, pérdida de peso y fiebre; todos los participantes recibieron una radiografía de tórax (CXRAY) que luego fueron revisados por un panel de radiólogos; aquellos con síntomas o películas CXRAY sugestivas de TB fueron clasificados como presuntos casos de TB; todos los casos sospechosos fueron solicitados para producir tres muestras de esputo, una en el momento de la consulta, otra en la noche y la tercera en la madrugada del día siguiente. Los sospechosos identificados completaron un cuestionario adicional sobre su situación socioeconómica, su estado de tabaquismo y la presencia de síntomas relacionados con la tuberculosis en los seis meses anteriores (tos, fiebre, pérdida de peso, dolor torácico y hemoptisis).Se realizaron frotis de esputo en dispensarios locales de tuberculosis.Todas las muestras de esputo se cultivaron utilizando el medio Löwenstein-Jensen en el laboratorio provincial en un plazo de 24 horas utilizando el transporte en cadena fría.Las muestras se excluyeron de la tuberculosis cuando se identificaron bacilos no tuberculosos del cultivo.Todas las muestras de esputo se realizaron estrictamente de acuerdo con la medida de control de calidad externa del laboratorio nacional de tuberculosis, que es coherente con la directriz de la encuesta de prevalencia de la tuberculosis de la OMS [7].La clasificación de la tuberculosis se realizó de acuerdo con la directriz nacional china de tuberculosis [10]. Los pacientes con citología de esputo positiva fueron clasificados como casos positivos de esputo; los pacientes con citología de esputo positivo o de cultivo fueron clasificados como casos bacteriológicos confirmados como esputo bacteriológico; aquellos con cultivo negativo con CXRAY anormal sugestivo de TB y excluidos de otras enfermedades por médicos y radiólogos fueron clasificados como CXRAY sugestivo de casos bacteriológicos negativos; por limitaciones de recursos no se aplicó la recomendación de agentes antimicrobianos de amplio espectro para confirmar el diagnóstico de casos negativos de TB [11]. Los casos recién diagnosticados fueron diferenciados de casos previamente diagnosticados mediante controles durante las entrevistas y contra el sistema de registro de TB; el diagnóstico inicial fue realizado por un grupo de médicos y radiólogos locales; posteriormente, muestras y películas de CXRAY de todos los casos sospechosos y confirmados fueron reevaluados por un grupo de Las películas de CXRAY del 100% de las que fueron calificadas como anormales y las muestras aleatorias de 10% de las que fueron calificadas como normales fueron transferidas para lectura independiente. El equipo de laboratorio provincial examinó aleatoriamente una diapositiva de las tres muestras de casos positivos de esputo, las tres muestras de casos de TB sugerentes de CXRAY y seleccionó aleatoriamente el 10% de los casos no TB. Se calcularon estimaciones de prevalencia de los casos positivos de esputo, confirmados bacteriológicamente y todos los casos de TB. En todos los análisis se utilizaron ponderaciones de población para ajustar el efecto de diseño de muestreo multietapa estratificado [8]. Los resultados de la encuesta en 2010 y 2000 se estandarizaron con las estructuras de edad de la población del censo de China en 2010. La encuesta de prevalencia de TB de 2000 incluyó todos los grupos de edad [12]. El método recomendado por Se realizó el análisis de subgrupos en género, grupos de edad y residencia urbana/rural, se calculó la tasa de identificación de casos como el número de casos identificados por un método de cribado en todos los casos sospechosos encontrados por el método, se calcularon los rendimientos de la consulta sintomática y CXRAY como proporción del número total de casos confirmados bacteriológicamente, se seleccionaron 17 conglomerados urbanos y 18 conglomerados rurales, con una población total de 89.093, de los cuales 56.671 fueron elegibles para la encuesta (Figura 1 ), la tasa de respuesta osciló entre el 95% y el 97% en diferentes conglomerados. 54.279 participantes asistieron a la consulta clínica y fueron examinados por CXRAY, de los cuales el 47% eran varones; la edad promedio fue de 46 años con 14% de 65 años y se encontraron un total de 572 casos sospechosos de tuberculosis De estos, 264 (46%) fueron identificados en base a anomalías CXRAY, 228 (40%) se basaron en tos persistente, 80 (14%) se basaron en ambos, la encuesta diagnosticó 172 nuevos casos, incluyendo 19 nuevos casos confirmados bacteriológicamente (incluyendo 11 casos positivos de esputo y cultivo, y 8 casos negativos de esputo pero positivos de cultivo) y 153 casos bacteriológicos sugerentes CXRAY. La encuesta también identificó 11 casos existentes registrados en el programa nacional de TB. Además, la encuesta encontró cuatro casos con cultivo positivo de bacilos de no tuberculosis, y los excluyó de los pacientes de TB. Todos los participantes de la encuesta fueron examinados por primera vez por síntomas y CXRAY. Aquellos que tenían síntomas de tos o hemoptisis consistentes, o anomalías CXRAY fueron examinados por frotis y cultura. Las tasas de identificación de casos nuevos confirmados bacteriológicamente de los casos sospechosos fueron significativamente mayores con CXRAY como herramienta primaria (Figura 1, 3,8%, P = 0,012) y aumentaron tanto la pantalla de síntomas de tos persistente como la CXRAY (10%, P < 0,001) en comparación con la pantalla de síntomas solo (0,4%); se observó el mismo patrón de tasa de identificación de casos en los casos positivos de esputo (7,5%, 1,9% y 0% respectivamente); la proporción de casos confirmados bacteriológicamente no fue significativamente mayor entre los casos confirmados bacteriológicamente en comparación con otros sospechosos (P = 0,565); solo la consulta sintomática identificó 308 sospechosos, incluyendo 6 (1,9%) TB positiva de frotis de esputo y 9 (2,9%) TB confirmada bacteriológicamente; entre los 344 sospechosos con anomalías CXRA El rendimiento de los casos confirmados bacteriológicamente fue del 47,4% por consulta de cribado y del 94,7% por CXRAY. En la población de más de 65 años, la consulta de síntomas y la CXRAY identificaron 174 y 182 casos sospechosos respectivamente, lo que arrojó 5 (2,9%) y 9 (4,9%) de casos confirmados bacteriológicamente. Los rendimientos de los casos confirmados bacteriológicamente fueron del 55,6% por consulta de síntomas y del 100% por CXRAY entre los más de 65. De los 512 casos sospechosos que completaron el cuestionario adicional, el 42% eran agricultores y el 31% eran fumadores actuales (Tabla 1). De los diez casos confirmados bacteriológicamente que no presentaron tos persistente en la encuesta de prevalencia, uno tosió durante dos días, uno tuvo dolor torácico y los otros ocho no presentaron síntomas de TB en los últimos seis meses. La tasa bruta de prevalencia en Shandong en 2010 de casos positivos de esputo fue de 22,1 (IC 95%: 9,6-34,6), casos confirmados bacteriológicamente fue de 36,8 (IC 95%: 17,8-55,8), y todos los casos fueron de 337,1 (IC 95%: 254,1-420,0) por 100.000 en población adulta (Tabla 2 ). Las tasas ajustadas de prevalencia de toda la población en Shandong fueron de 17,8 (IC 95%: 8,3-17,5), 27,8 (IC 95%: 14,8-28.0) y 239,4 (IC 95%: 179,9-298,9) por 100.000 en 2010. Se observó una notable disminución de 82,0%, 80,2% y 31,4% en las tasas de prevalencia de esputo positivo, confirmado bacteriológicamente, y en todos los casos, respectivamente, en comparación con las tasas ajustadas en 2000 [12]. Se observaron grandes descensos en los hombres de 40 a 65 años y en las mujeres de más de 60 años (Figura 2). Las tasas de prevalencia ajustada en la población adulta fueron 21,4 (IC 95%: 10,0-32,8), 33,5 (IC 95%: 17,8-49,2) y 285,8 (IC 95%: 254,2-356,4) para los casos positivos de esputo, casos confirmados bacteriológicamente y todos los casos, respectivamente. Se observaron diferencias significativas en las tasas de prevalencia ajustada de tuberculosis entre hombres y mujeres de más de 65 años y de 15 a 64 años, en las zonas rurales y urbanas (Tabla 2, P < 0,001 Las proporciones entre hombres y mujeres fueron 5,5 en casos positivos de esputo y 2,8 en casos confirmados bacteriológicamente, mientras que las proporciones aumentaron a 6,0 y 4,1 respectivamente, entre los mayores de 65 años; la mayoría de los pacientes con TB, 54,5% en casos positivos de esputo y 47,3% en casos confirmados bacteriológicamente, fueron de 65 años o más; la proporción entre mayores de 65 años y 15 a 64 años fue de 8,4 en casos positivos de esputo y 5,9 en casos confirmados bacteriológicamente; la proporción entre zonas rurales y urbanas fue de 2,7 en casos positivos de esputo y 4,8 en casos confirmados bacteriológicamente; el hallazgo más llamativo fue que una gran proporción de pacientes con TB no presentó tos consistente; el hallazgo pasivo de casos es la práctica habitual en países en desarrollo donde se realiza la microscopía de esputo para identificar casos de Una gran proporción de los casos de tuberculosis pueden no ser detectados utilizando este método como 53% de los casos confirmados bacteriológicamente y 45% de los casos positivos de esputo en este estudio no tuvieron tos persistente pero fueron identificados a través de CXRAY anormal. Casi la mitad de los casos confirmados bacteriológicamente no reportaron síntomas en los últimos seis meses. Este hallazgo, aunque inicialmente sorprendente, es consistente con reportes de Vietnam (47% de los casos confirmados bacteriológicamente no presentaban tos persistente) [14], Myanmar (38%) y Etiopía (48%) [13]. CXRAY fue sensible en la detección de casos de tuberculosis, ya que los rendimientos de casos confirmados bacteriológicamente fueron mucho más altos por CXRAY en comparación con la detección de síntomas, como se informó en Vietnam [15] y algunos entornos de alta prevalencia del VIH [16, 17]. Nuestros hallazgos sugieren que la estrategia de búsqueda de casos utilizando CXRAY seguido de esputo o cultivo como las pruebas primarias y secundarias de cribado podría ser más efectiva, especialmente entre la población de más de 65 años, ya que los rendimientos fueron mayores en más de 65 años en comparación con la Tabla 2 Prevalencia de casos de TB positivo de esputo, casos de TB confirmados bacteriológicamente y todos los casos en Shandong, China, 2010 No hay población. Aunque usar CXRAY para examinar a todos no es factible, puede ser utilizado en exámenes físicos de ancianos de rutina. El paquete de salud pública de China ahora cubre CXRAY gratis para ancianos, así como exámenes corporales anuales de empleados proporcionó CXRAY gratuito. En esta encuesta, sólo un paciente positivo de esputo había sido detectado y tratado por el programa nacional, aunque se realizó una consulta clínica específica para identificar a cualquier paciente que haya sido diagnosticado y tratado Esto puede reflejar la diferencia entre el enfoque de búsqueda de casos activos en la encuesta y el enfoque de búsqueda de casquillo pasivo en la práctica; sin embargo, indicó que una gran proporción de casos de TB confirmados bacteriológicamente no son atendidos por el programa nacional de TB. Otro cambio notable es la fuerte disminución de la proporción de casos positivos de esputo, que representó el 30,5% de todos los casos en la encuesta de 2000, pero se redujo al 6,6% en la encuesta de 2010. La proporción de casos de esputo notificados de todos los casos de TB en Shandong también disminuyó del 80,9% en 2005 al 64,6% en 2010 [19]. La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se ha reducido en un 80% en la última década en Shandong, en comparación con una disminución nacional del 45% (de 216/ 100.000 en 2000 a 119/ 100.000 en 2010] [4]. La rápida disminución de la prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente en la última década puede atribuirse al fortalecimiento del sistema de salud pública de China tras el brote de síndrome respiratorio agudo grave en 2003 [2]. Otra razón puede deberse a la mejora de la notificación de casos de tuberculosis en el sistema de notificación de enfermedades transmisibles en línea, y a la mejora de la colaboración entre los hospitales públicos y los dispensarios de tuberculosis [20]. Otros factores como el desarrollo económico social también pueden haber desempeñado un papel importante en la reducción de la prevalencia de la tuberculosis, como se encontró en un estudio de las tendencias de las tasas de notificación de la tuberculosis en 134 países [21]. La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente en Shandong fue inferior a las estimaciones de la OMS para China en 2010 [1]. Una de las razones es que los resultados de las encuestas de prevalencia se basan en el hallazgo de casos activos, mientras que las estimaciones de la OMS se basan en las tasas de notificación de los casos pasivos. Se necesita una reevaluación de la prevalencia de tuberculosis reportada en China basada en la encuesta reciente. CXRAY sugiere que los casos bacteriológicos negativos pueden ser casos de tuberculosis bacteriológicamente negativos si tenían algún síntoma de tuberculosis, mientras que algunos pueden ser causados por un frotis o cultivo subóptimo. Como se informó en encuestas anteriores de China [3, 22], incluyendo estos casos como casos de tuberculosis pueden resultar en una sobreestimación de todos los casos pulmonares [23]. La encuesta reveló que más de la mitad de los pacientes con tuberculosis tenían 65 años o más en Shandong, mientras que los más de 65 años tenían más probabilidades de presentarse con CXRAY anormal y tos persistente. Tendencias similares se han Estas altas tasas pueden reflejar las tasas de tuberculosis más altas en el pasado y la disminución de la inmunidad en los más de 65 años.Cómo tratar a los ancianos con tuberculosis y otras complicaciones como la diabetes sigue siendo un desafío continuo en China y entornos similares.Los resultados de la encuesta pueden generalizarse a la población de Shandong de 94 millones de habitantes o entornos internacionales similares con ingresos medios y niveles medios de prevalencia de la tuberculosis.Los patrones de la epidemia de tuberculosis encontrados en Shandong, es decir, la proporción de pacientes con síntomas, proporción entre zonas urbanas y rurales, hombres y mujeres, fueron similares a los encontrados en la encuesta nacional [4].Sin embargo, las tasas de prevalencia no pueden extrapolarse a las provincias occidentales de China con una mayor prevalencia de tuberculosis.Por razones logísticas, la población elegible no incluyó a los adultos que permanecieron en los grupos muestreados menos de 6 meses, lo que fue la misma práctica en la encuesta de 2000.Sin embargo, los migrantes a La encuesta no recopiló indicadores socioeconómicos, estado de tabaquismo y estado de VIH de todos los participantes, por lo que no se dispone de comparaciones entre los casos de tuberculosis y todos los pacientes no tratados con TB. Sin embargo, la prevalencia del VIH en Shandong China es inferior al 0,01%, y no alteraría significativamente la tasa de prevalencia de la TB. Además, la encuesta no evaluó la TB infantil y la TB pulmonar extra. Las discusiones sobre el uso de CXRAY como herramienta de cribado fueron en el aspecto técnico, pero no en el lado de los costos, ya que no realizamos ningún análisis de la relación costo-eficacia ni la voluntad social de pagar por tal estrategia en entornos similares. Este estudio ha demostrado que la prevalencia de TB confirmada bacteriológicamente en Shandong ha disminuido sustancialmente en la última década. Es importante destacar que la mayoría de estos casos no se presentaron con tos persistente y la proporción de Se recomiendan estudios adicionales para evaluar la viabilidad de la adopción de CXRAY en los servicios de salud existentes para detectar casos de tuberculosis y la relación costo-eficacia de dicha intervención.Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

¿Cuál era el rango de edad de las personas encuestadas?

Cambios en la prevalencia de la tuberculosis pulmonar: evidencia de la encuesta de población de 2010 en una populosa provincia de Chinahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3890533/SHA: eef61bdfa49b8652fd660b5b8b7e74cf51922505Autores: Wei, Xiaolin; Zhang, Xiulei; Yin, Jia; Walley, John; Beanland, Rachel; Zou, Guanyang; Zhang, Hongmei; Li, Fang; Liu, Zhimin; Zee, Benny CY; Griffiths, Sian MDate: 2014-01-11DOI: 10.1186/1471-2334-14-21Licencia: cc-byAbstract: ANTEGRON: Este documento informa de los resultados de la El objetivo de este estudio fue estimar la prevalencia de TB en la provincia en 2010 en comparación con la encuesta de 2000; y comparar el rendimiento de casos de TB de diferentes abordajes de búsqueda de casos.MÉTODOS: Se realizó una encuesta transversal basada en la población mediante muestreo aleatorio multietapa. En la encuesta participaron 54.279 adultos con una tasa de respuesta del 96%. Los médicos entrevistaron y clasificaron a los participantes como presuntos casos de TB si presentaban tos persistente, rayos X torácicos anormales (CXRAY) o ambos. Se recogieron tres especímenes de esputo de todos los casos sospechosos y se enviaron para microscopía y cultivo. RESULTADOS: La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente fue de 34 por 100.000 en adultos en Shandong en 2010. En comparación con la encuesta de 2000, la prevalencia de TB disminuyó en un 80%. El 53% de los casos Más del 50% de los casos de tuberculosis se encontraban entre los más de 65 años. CONCLUSIONES: La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se redujo significativamente en comparación con el año 2000. La encuesta planteó desafíos para identificar casos de tuberculosis sin síntomas claros. Texto: China, con una prevalencia estimada de todos los casos de tuberculosis de 108 por 100.000 en 2010, tiene la segunda carga de tuberculosis más alta del mundo, representando el 13% de todos los casos en todo el mundo [1]. La Organización Mundial de la Salud (OMS) estimó que China había alcanzado los objetivos de éxito en el tratamiento del 85% para 1993 y la tasa de detección de casos del 70% para 2005 [2]. Las encuestas nacionales de prevalencia de tuberculosis se llevaron a cabo en China en 1979, China en 1990, China en 2000, y 2010 [4]. Los resultados de la encuesta proporcionan estimaciones más precisas de las tasas de prevalencia de tuberculosis que las estimaciones de la OMS y pueden utilizarse para evaluar la probabilidad de que China Se trata de una provincia relativamente desarrollada con un PIB per cápita 1,6 veces el promedio nacional en 2010 [5]. La tasa de prevalencia de la TB en Shandong fue menor que la tasa media de China en 2000 [3]. En las encuestas de 2000 y 2010 se tomaron muestras representativas de la población en Shandong utilizando métodos similares. El objetivo del estudio fue estimar la prevalencia de la TB en Shandong con base en la encuesta de 2010, y comparar los resultados de las dos encuestas transversales. La población objetivo de la encuesta de prevalencia de la TB fue la población de 15 años o más que había vivido en los grupos seleccionados durante más de 6 meses. Se realizó una encuesta transversal basada en la población, utilizando el método de muestreo aleatorio multietapa. La encuesta utilizó los mismos métodos de muestreo que la encuesta nacional de China en 2010, que fue similar a los métodos de muestreo utilizados en 2000 [6]. El diseño de las encuestas estuvo de acuerdo con las recomendaciones de Se calculó el tamaño de la muestra de 52500 adultos (de 15 años de edad), en 35 conglomerados, con base en la detección de un cambio del 20% en la tasa de prevalencia de casos positivos de citología de tuberculosis en comparación con la tasa de la encuesta de 2000 (95 por 100.000), con una probabilidad superior al 95% y el 95% de potencia, con una tasa de respuesta del 90% de los participantes [9]. Se utilizó un muestreo aleatorio estratificado en varias etapas para seleccionar los 35 conglomerados dentro de 17 prefecturas de la provincia de Shandong. El número de conglomerados se asignó al azar en proporción a la población provincial en los niveles de prefectura, condado/distrito y municipio. Se definió un conglomerado como una comunidad (un pueblo en la zona rural o una comunidad residente en una zona urbana) con una población de 1250 a 1750 adultos (es decir, los de 15 años o más). Si la comunidad contenía menos de Si la comunidad o comunidades combinadas que contenían más de 1750 adultos, seleccionamos aleatoriamente los hogares y luego incluimos a todos los adultos en el hogar para la encuesta hasta que el número total de adultos seleccionados llegó a 1750. Se excluyeron los cuarteles militares y las prisiones ubicadas en el grupo [7]. La encuesta fue realizada de marzo a junio de 2010 por equipos de encuesta integrados por médicos clínicos, médicos de salud pública, radiólogos, técnicos de laboratorio y enfermeras. Se utilizó los medios de comunicación locales para promover el conocimiento de la encuesta. Los trabajadores comunitarios realizaron un censo casa por casa para actualizar la base de datos de residentes, informar a los participantes de la encuesta y obtener el consentimiento informado. El estudio no incluyó a niños menores de 15 años. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes de 16 años o más. Mientras que de los de 15 años se obtuvieron consentimientos informados por escrito de sus padres o tutores. Todos los documentos fueron almacenados Se obtuvieron aprobaciones éticas para el estudio y los procedimientos de consentimiento de la Junta de Revisión Institucional (IRB) del Hospital Chest de Shandong (número de registro NIHIRB00006010), quienes aceptaron participar en la encuesta fueron invitados al dispensario de TB del condado, donde completaron una consulta con un médico de TB clínico capacitado sobre cualquier síntoma sugestivo de TB, como tos persistente (durante dos semanas o más), hemoptisis, pérdida de peso y fiebre; todos los participantes recibieron una radiografía de tórax (CXRAY) que luego fueron revisados por un panel de radiólogos; aquellos con síntomas o películas CXRAY sugestivas de TB fueron clasificados como presuntos casos de TB; todos los casos sospechosos fueron solicitados para producir tres muestras de esputo, una en el momento de la consulta, otra en la noche y la tercera en la madrugada del día siguiente. Los sospechosos identificados completaron un cuestionario adicional sobre su situación socioeconómica, su estado de tabaquismo y la presencia de síntomas relacionados con la tuberculosis en los seis meses anteriores (tos, fiebre, pérdida de peso, dolor torácico y hemoptisis).Se realizaron frotis de esputo en dispensarios locales de tuberculosis.Todas las muestras de esputo se cultivaron utilizando el medio Löwenstein-Jensen en el laboratorio provincial en un plazo de 24 horas utilizando el transporte en cadena fría.Las muestras se excluyeron de la tuberculosis cuando se identificaron bacilos no tuberculosos del cultivo.Todas las muestras de esputo se realizaron estrictamente de acuerdo con la medida de control de calidad externa del laboratorio nacional de tuberculosis, que es coherente con la directriz de la encuesta de prevalencia de la tuberculosis de la OMS [7].La clasificación de la tuberculosis se realizó de acuerdo con la directriz nacional china de tuberculosis [10]. Los pacientes con citología de esputo positiva fueron clasificados como casos positivos de esputo; los pacientes con citología de esputo positivo o de cultivo fueron clasificados como casos bacteriológicos confirmados como esputo bacteriológico; aquellos con cultivo negativo con CXRAY anormal sugestivo de TB y excluidos de otras enfermedades por médicos y radiólogos fueron clasificados como CXRAY sugestivo de casos bacteriológicos negativos; por limitaciones de recursos no se aplicó la recomendación de agentes antimicrobianos de amplio espectro para confirmar el diagnóstico de casos negativos de TB [11]. Los casos recién diagnosticados fueron diferenciados de casos previamente diagnosticados mediante controles durante las entrevistas y contra el sistema de registro de TB; el diagnóstico inicial fue realizado por un grupo de médicos y radiólogos locales; posteriormente, muestras y películas de CXRAY de todos los casos sospechosos y confirmados fueron reevaluados por un grupo de Las películas de CXRAY del 100% de las que fueron calificadas como anormales y las muestras aleatorias de 10% de las que fueron calificadas como normales fueron transferidas para lectura independiente. El equipo de laboratorio provincial examinó aleatoriamente una diapositiva de las tres muestras de casos positivos de esputo, las tres muestras de casos de TB sugerentes de CXRAY y seleccionó aleatoriamente el 10% de los casos no TB. Se calcularon estimaciones de prevalencia de los casos positivos de esputo, confirmados bacteriológicamente y todos los casos de TB. En todos los análisis se utilizaron ponderaciones de población para ajustar el efecto de diseño de muestreo multietapa estratificado [8]. Los resultados de la encuesta en 2010 y 2000 se estandarizaron con las estructuras de edad de la población del censo de China en 2010. La encuesta de prevalencia de TB de 2000 incluyó todos los grupos de edad [12]. El método recomendado por Se realizó el análisis de subgrupos en género, grupos de edad y residencia urbana/rural, se calculó la tasa de identificación de casos como el número de casos identificados por un método de cribado en todos los casos sospechosos encontrados por el método, se calcularon los rendimientos de la consulta sintomática y CXRAY como proporción del número total de casos confirmados bacteriológicamente, se seleccionaron 17 conglomerados urbanos y 18 conglomerados rurales, con una población total de 89.093, de los cuales 56.671 fueron elegibles para la encuesta (Figura 1 ), la tasa de respuesta osciló entre el 95% y el 97% en diferentes conglomerados. 54.279 participantes asistieron a la consulta clínica y fueron examinados por CXRAY, de los cuales el 47% eran varones; la edad promedio fue de 46 años con 14% de 65 años y se encontraron un total de 572 casos sospechosos de tuberculosis De estos, 264 (46%) fueron identificados en base a anomalías CXRAY, 228 (40%) se basaron en tos persistente, 80 (14%) se basaron en ambos, la encuesta diagnosticó 172 nuevos casos, incluyendo 19 nuevos casos confirmados bacteriológicamente (incluyendo 11 casos positivos de esputo y cultivo, y 8 casos negativos de esputo pero positivos de cultivo) y 153 casos bacteriológicos sugerentes CXRAY. La encuesta también identificó 11 casos existentes registrados en el programa nacional de TB. Además, la encuesta encontró cuatro casos con cultivo positivo de bacilos de no tuberculosis, y los excluyó de los pacientes de TB. Todos los participantes de la encuesta fueron examinados por primera vez por síntomas y CXRAY. Aquellos que tenían síntomas de tos o hemoptisis consistentes, o anomalías CXRAY fueron examinados por frotis y cultura. Las tasas de identificación de casos nuevos confirmados bacteriológicamente de los casos sospechosos fueron significativamente mayores con CXRAY como herramienta primaria (Figura 1, 3,8%, P = 0,012) y aumentaron tanto la pantalla de síntomas de tos persistente como la CXRAY (10%, P < 0,001) en comparación con la pantalla de síntomas solo (0,4%); se observó el mismo patrón de tasa de identificación de casos en los casos positivos de esputo (7,5%, 1,9% y 0% respectivamente); la proporción de casos confirmados bacteriológicamente no fue significativamente mayor entre los casos confirmados bacteriológicamente en comparación con otros sospechosos (P = 0,565); solo la consulta sintomática identificó 308 sospechosos, incluyendo 6 (1,9%) TB positiva de frotis de esputo y 9 (2,9%) TB confirmada bacteriológicamente; entre los 344 sospechosos con anomalías CXRA El rendimiento de los casos confirmados bacteriológicamente fue del 47,4% por consulta de cribado y del 94,7% por CXRAY. En la población de más de 65 años, la consulta de síntomas y la CXRAY identificaron 174 y 182 casos sospechosos respectivamente, lo que arrojó 5 (2,9%) y 9 (4,9%) de casos confirmados bacteriológicamente. Los rendimientos de los casos confirmados bacteriológicamente fueron del 55,6% por consulta de síntomas y del 100% por CXRAY entre los más de 65. De los 512 casos sospechosos que completaron el cuestionario adicional, el 42% eran agricultores y el 31% eran fumadores actuales (Tabla 1). De los diez casos confirmados bacteriológicamente que no presentaron tos persistente en la encuesta de prevalencia, uno tosió durante dos días, uno tuvo dolor torácico y los otros ocho no presentaron síntomas de TB en los últimos seis meses. La tasa bruta de prevalencia en Shandong en 2010 de casos positivos de esputo fue de 22,1 (IC 95%: 9,6-34,6), casos confirmados bacteriológicamente fue de 36,8 (IC 95%: 17,8-55,8), y todos los casos fueron de 337,1 (IC 95%: 254,1-420,0) por 100.000 en población adulta (Tabla 2 ). Las tasas ajustadas de prevalencia de toda la población en Shandong fueron de 17,8 (IC 95%: 8,3-17,5), 27,8 (IC 95%: 14,8-28.0) y 239,4 (IC 95%: 179,9-298,9) por 100.000 en 2010. Se observó una notable disminución de 82,0%, 80,2% y 31,4% en las tasas de prevalencia de esputo positivo, confirmado bacteriológicamente, y en todos los casos, respectivamente, en comparación con las tasas ajustadas en 2000 [12]. Se observaron grandes descensos en los hombres de 40 a 65 años y en las mujeres de más de 60 años (Figura 2). Las tasas de prevalencia ajustada en la población adulta fueron 21,4 (IC 95%: 10,0-32,8), 33,5 (IC 95%: 17,8-49,2) y 285,8 (IC 95%: 254,2-356,4) para los casos positivos de esputo, casos confirmados bacteriológicamente y todos los casos, respectivamente. Se observaron diferencias significativas en las tasas de prevalencia ajustada de tuberculosis entre hombres y mujeres de más de 65 años y de 15 a 64 años, en las zonas rurales y urbanas (Tabla 2, P < 0,001 Las proporciones entre hombres y mujeres fueron 5,5 en casos positivos de esputo y 2,8 en casos confirmados bacteriológicamente, mientras que las proporciones aumentaron a 6,0 y 4,1 respectivamente, entre los mayores de 65 años; la mayoría de los pacientes con TB, 54,5% en casos positivos de esputo y 47,3% en casos confirmados bacteriológicamente, fueron de 65 años o más; la proporción entre mayores de 65 años y 15 a 64 años fue de 8,4 en casos positivos de esputo y 5,9 en casos confirmados bacteriológicamente; la proporción entre zonas rurales y urbanas fue de 2,7 en casos positivos de esputo y 4,8 en casos confirmados bacteriológicamente; el hallazgo más llamativo fue que una gran proporción de pacientes con TB no presentó tos consistente; el hallazgo pasivo de casos es la práctica habitual en países en desarrollo donde se realiza la microscopía de esputo para identificar casos de Una gran proporción de los casos de tuberculosis pueden no ser detectados utilizando este método como 53% de los casos confirmados bacteriológicamente y 45% de los casos positivos de esputo en este estudio no tuvieron tos persistente pero fueron identificados a través de CXRAY anormal. Casi la mitad de los casos confirmados bacteriológicamente no reportaron síntomas en los últimos seis meses. Este hallazgo, aunque inicialmente sorprendente, es consistente con reportes de Vietnam (47% de los casos confirmados bacteriológicamente no presentaban tos persistente) [14], Myanmar (38%) y Etiopía (48%) [13]. CXRAY fue sensible en la detección de casos de tuberculosis, ya que los rendimientos de casos confirmados bacteriológicamente fueron mucho más altos por CXRAY en comparación con la detección de síntomas, como se informó en Vietnam [15] y algunos entornos de alta prevalencia del VIH [16, 17]. Nuestros hallazgos sugieren que la estrategia de búsqueda de casos utilizando CXRAY seguido de esputo o cultivo como las pruebas primarias y secundarias de cribado podría ser más efectiva, especialmente entre la población de más de 65 años, ya que los rendimientos fueron mayores en más de 65 años en comparación con la Tabla 2 Prevalencia de casos de TB positivo de esputo, casos de TB confirmados bacteriológicamente y todos los casos en Shandong, China, 2010 No hay población. Aunque usar CXRAY para examinar a todos no es factible, puede ser utilizado en exámenes físicos de ancianos de rutina. El paquete de salud pública de China ahora cubre CXRAY gratis para ancianos, así como exámenes corporales anuales de empleados proporcionó CXRAY gratuito. En esta encuesta, sólo un paciente positivo de esputo había sido detectado y tratado por el programa nacional, aunque se realizó una consulta clínica específica para identificar a cualquier paciente que haya sido diagnosticado y tratado Esto puede reflejar la diferencia entre el enfoque de búsqueda de casos activos en la encuesta y el enfoque de búsqueda de casquillo pasivo en la práctica; sin embargo, indicó que una gran proporción de casos de TB confirmados bacteriológicamente no son atendidos por el programa nacional de TB. Otro cambio notable es la fuerte disminución de la proporción de casos positivos de esputo, que representó el 30,5% de todos los casos en la encuesta de 2000, pero se redujo al 6,6% en la encuesta de 2010. La proporción de casos de esputo notificados de todos los casos de TB en Shandong también disminuyó del 80,9% en 2005 al 64,6% en 2010 [19]. La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se ha reducido en un 80% en la última década en Shandong, en comparación con una disminución nacional del 45% (de 216/ 100.000 en 2000 a 119/ 100.000 en 2010] [4]. La rápida disminución de la prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente en la última década puede atribuirse al fortalecimiento del sistema de salud pública de China tras el brote de síndrome respiratorio agudo grave en 2003 [2]. Otra razón puede deberse a la mejora de la notificación de casos de tuberculosis en el sistema de notificación de enfermedades transmisibles en línea, y a la mejora de la colaboración entre los hospitales públicos y los dispensarios de tuberculosis [20]. Otros factores como el desarrollo económico social también pueden haber desempeñado un papel importante en la reducción de la prevalencia de la tuberculosis, como se encontró en un estudio de las tendencias de las tasas de notificación de la tuberculosis en 134 países [21]. La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente en Shandong fue inferior a las estimaciones de la OMS para China en 2010 [1]. Una de las razones es que los resultados de las encuestas de prevalencia se basan en el hallazgo de casos activos, mientras que las estimaciones de la OMS se basan en las tasas de notificación de los casos pasivos. Se necesita una reevaluación de la prevalencia de tuberculosis reportada en China basada en la encuesta reciente. CXRAY sugiere que los casos bacteriológicos negativos pueden ser casos de tuberculosis bacteriológicamente negativos si tenían algún síntoma de tuberculosis, mientras que algunos pueden ser causados por un frotis o cultivo subóptimo. Como se informó en encuestas anteriores de China [3, 22], incluyendo estos casos como casos de tuberculosis pueden resultar en una sobreestimación de todos los casos pulmonares [23]. La encuesta reveló que más de la mitad de los pacientes con tuberculosis tenían 65 años o más en Shandong, mientras que los más de 65 años tenían más probabilidades de presentarse con CXRAY anormal y tos persistente. Tendencias similares se han Estas altas tasas pueden reflejar las tasas de tuberculosis más altas en el pasado y la disminución de la inmunidad en los más de 65 años.Cómo tratar a los ancianos con tuberculosis y otras complicaciones como la diabetes sigue siendo un desafío continuo en China y entornos similares.Los resultados de la encuesta pueden generalizarse a la población de Shandong de 94 millones de habitantes o entornos internacionales similares con ingresos medios y niveles medios de prevalencia de la tuberculosis.Los patrones de la epidemia de tuberculosis encontrados en Shandong, es decir, la proporción de pacientes con síntomas, proporción entre zonas urbanas y rurales, hombres y mujeres, fueron similares a los encontrados en la encuesta nacional [4].Sin embargo, las tasas de prevalencia no pueden extrapolarse a las provincias occidentales de China con una mayor prevalencia de tuberculosis.Por razones logísticas, la población elegible no incluyó a los adultos que permanecieron en los grupos muestreados menos de 6 meses, lo que fue la misma práctica en la encuesta de 2000.Sin embargo, los migrantes a La encuesta no recopiló indicadores socioeconómicos, estado de tabaquismo y estado de VIH de todos los participantes, por lo que no se dispone de comparaciones entre los casos de tuberculosis y todos los pacientes no tratados con TB. Sin embargo, la prevalencia del VIH en Shandong China es inferior al 0,01%, y no alteraría significativamente la tasa de prevalencia de la TB. Además, la encuesta no evaluó la TB infantil y la TB pulmonar extra. Las discusiones sobre el uso de CXRAY como herramienta de cribado fueron en el aspecto técnico, pero no en el lado de los costos, ya que no realizamos ningún análisis de la relación costo-eficacia ni la voluntad social de pagar por tal estrategia en entornos similares. Este estudio ha demostrado que la prevalencia de TB confirmada bacteriológicamente en Shandong ha disminuido sustancialmente en la última década. Es importante destacar que la mayoría de estos casos no se presentaron con tos persistente y la proporción de Se recomiendan estudios adicionales para evaluar la viabilidad de la adopción de CXRAY en los servicios de salud existentes para detectar casos de tuberculosis y la relación costo-eficacia de dicha intervención.Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

¿Era el tamaño de la muestra?

Cambios en la prevalencia de la tuberculosis pulmonar: evidencia de la encuesta de población de 2010 en una populosa provincia de Chinahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3890533/SHA: eef61bdfa49b8652fd660b5b8b7e74cf51922505Autores: Wei, Xiaolin; Zhang, Xiulei; Yin, Jia; Walley, John; Beanland, Rachel; Zou, Guanyang; Zhang, Hongmei; Li, Fang; Liu, Zhimin; Zee, Benny CY; Griffiths, Sian MDate: 2014-01-11DOI: 10.1186/1471-2334-14-21Licencia: cc-byAbstract: ANTEGRON: Este documento informa de los resultados de la El objetivo de este estudio fue estimar la prevalencia de TB en la provincia en 2010 en comparación con la encuesta de 2000; y comparar el rendimiento de casos de TB de diferentes abordajes de búsqueda de casos.MÉTODOS: Se realizó una encuesta transversal basada en la población mediante muestreo aleatorio multietapa. En la encuesta participaron 54.279 adultos con una tasa de respuesta del 96%. Los médicos entrevistaron y clasificaron a los participantes como presuntos casos de TB si presentaban tos persistente, rayos X torácicos anormales (CXRAY) o ambos. Se recogieron tres especímenes de esputo de todos los casos sospechosos y se enviaron para microscopía y cultivo. RESULTADOS: La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente fue de 34 por 100.000 en adultos en Shandong en 2010. En comparación con la encuesta de 2000, la prevalencia de TB disminuyó en un 80%. El 53% de los casos Más del 50% de los casos de tuberculosis se encontraban entre los más de 65 años. CONCLUSIONES: La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se redujo significativamente en comparación con el año 2000. La encuesta planteó desafíos para identificar casos de tuberculosis sin síntomas claros. Texto: China, con una prevalencia estimada de todos los casos de tuberculosis de 108 por 100.000 en 2010, tiene la segunda carga de tuberculosis más alta del mundo, representando el 13% de todos los casos en todo el mundo [1]. La Organización Mundial de la Salud (OMS) estimó que China había alcanzado los objetivos de éxito en el tratamiento del 85% para 1993 y la tasa de detección de casos del 70% para 2005 [2]. Las encuestas nacionales de prevalencia de tuberculosis se llevaron a cabo en China en 1979, China en 1990, China en 2000, y 2010 [4]. Los resultados de la encuesta proporcionan estimaciones más precisas de las tasas de prevalencia de tuberculosis que las estimaciones de la OMS y pueden utilizarse para evaluar la probabilidad de que China Se trata de una provincia relativamente desarrollada con un PIB per cápita 1,6 veces el promedio nacional en 2010 [5]. La tasa de prevalencia de la TB en Shandong fue menor que la tasa media de China en 2000 [3]. En las encuestas de 2000 y 2010 se tomaron muestras representativas de la población en Shandong utilizando métodos similares. El objetivo del estudio fue estimar la prevalencia de la TB en Shandong con base en la encuesta de 2010, y comparar los resultados de las dos encuestas transversales. La población objetivo de la encuesta de prevalencia de la TB fue la población de 15 años o más que había vivido en los grupos seleccionados durante más de 6 meses. Se realizó una encuesta transversal basada en la población, utilizando el método de muestreo aleatorio multietapa. La encuesta utilizó los mismos métodos de muestreo que la encuesta nacional de China en 2010, que fue similar a los métodos de muestreo utilizados en 2000 [6]. El diseño de las encuestas estuvo de acuerdo con las recomendaciones de Se calculó el tamaño de la muestra de 52500 adultos (de 15 años de edad), en 35 conglomerados, con base en la detección de un cambio del 20% en la tasa de prevalencia de casos positivos de citología de tuberculosis en comparación con la tasa de la encuesta de 2000 (95 por 100.000), con una probabilidad superior al 95% y el 95% de potencia, con una tasa de respuesta del 90% de los participantes [9]. Se utilizó un muestreo aleatorio estratificado en varias etapas para seleccionar los 35 conglomerados dentro de 17 prefecturas de la provincia de Shandong. El número de conglomerados se asignó al azar en proporción a la población provincial en los niveles de prefectura, condado/distrito y municipio. Se definió un conglomerado como una comunidad (un pueblo en la zona rural o una comunidad residente en una zona urbana) con una población de 1250 a 1750 adultos (es decir, los de 15 años o más). Si la comunidad contenía menos de Si la comunidad o comunidades combinadas que contenían más de 1750 adultos, seleccionamos aleatoriamente los hogares y luego incluimos a todos los adultos en el hogar para la encuesta hasta que el número total de adultos seleccionados llegó a 1750. Se excluyeron los cuarteles militares y las prisiones ubicadas en el grupo [7]. La encuesta fue realizada de marzo a junio de 2010 por equipos de encuesta integrados por médicos clínicos, médicos de salud pública, radiólogos, técnicos de laboratorio y enfermeras. Se utilizó los medios de comunicación locales para promover el conocimiento de la encuesta. Los trabajadores comunitarios realizaron un censo casa por casa para actualizar la base de datos de residentes, informar a los participantes de la encuesta y obtener el consentimiento informado. El estudio no incluyó a niños menores de 15 años. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes de 16 años o más. Mientras que de los de 15 años se obtuvieron consentimientos informados por escrito de sus padres o tutores. Todos los documentos fueron almacenados Se obtuvieron aprobaciones éticas para el estudio y los procedimientos de consentimiento de la Junta de Revisión Institucional (IRB) del Hospital Chest de Shandong (número de registro NIHIRB00006010), quienes aceptaron participar en la encuesta fueron invitados al dispensario de TB del condado, donde completaron una consulta con un médico de TB clínico capacitado sobre cualquier síntoma sugestivo de TB, como tos persistente (durante dos semanas o más), hemoptisis, pérdida de peso y fiebre; todos los participantes recibieron una radiografía de tórax (CXRAY) que luego fueron revisados por un panel de radiólogos; aquellos con síntomas o películas CXRAY sugestivas de TB fueron clasificados como presuntos casos de TB; todos los casos sospechosos fueron solicitados para producir tres muestras de esputo, una en el momento de la consulta, otra en la noche y la tercera en la madrugada del día siguiente. Los sospechosos identificados completaron un cuestionario adicional sobre su situación socioeconómica, su estado de tabaquismo y la presencia de síntomas relacionados con la tuberculosis en los seis meses anteriores (tos, fiebre, pérdida de peso, dolor torácico y hemoptisis).Se realizaron frotis de esputo en dispensarios locales de tuberculosis.Todas las muestras de esputo se cultivaron utilizando el medio Löwenstein-Jensen en el laboratorio provincial en un plazo de 24 horas utilizando el transporte en cadena fría.Las muestras se excluyeron de la tuberculosis cuando se identificaron bacilos no tuberculosos del cultivo.Todas las muestras de esputo se realizaron estrictamente de acuerdo con la medida de control de calidad externa del laboratorio nacional de tuberculosis, que es coherente con la directriz de la encuesta de prevalencia de la tuberculosis de la OMS [7].La clasificación de la tuberculosis se realizó de acuerdo con la directriz nacional china de tuberculosis [10]. Los pacientes con citología de esputo positiva fueron clasificados como casos positivos de esputo; los pacientes con citología de esputo positivo o de cultivo fueron clasificados como casos bacteriológicos confirmados como esputo bacteriológico; aquellos con cultivo negativo con CXRAY anormal sugestivo de TB y excluidos de otras enfermedades por médicos y radiólogos fueron clasificados como CXRAY sugestivo de casos bacteriológicos negativos; por limitaciones de recursos no se aplicó la recomendación de agentes antimicrobianos de amplio espectro para confirmar el diagnóstico de casos negativos de TB [11]. Los casos recién diagnosticados fueron diferenciados de casos previamente diagnosticados mediante controles durante las entrevistas y contra el sistema de registro de TB; el diagnóstico inicial fue realizado por un grupo de médicos y radiólogos locales; posteriormente, muestras y películas de CXRAY de todos los casos sospechosos y confirmados fueron reevaluados por un grupo de Las películas de CXRAY del 100% de las que fueron calificadas como anormales y las muestras aleatorias de 10% de las que fueron calificadas como normales fueron transferidas para lectura independiente. El equipo de laboratorio provincial examinó aleatoriamente una diapositiva de las tres muestras de casos positivos de esputo, las tres muestras de casos de TB sugerentes de CXRAY y seleccionó aleatoriamente el 10% de los casos no TB. Se calcularon estimaciones de prevalencia de los casos positivos de esputo, confirmados bacteriológicamente y todos los casos de TB. En todos los análisis se utilizaron ponderaciones de población para ajustar el efecto de diseño de muestreo multietapa estratificado [8]. Los resultados de la encuesta en 2010 y 2000 se estandarizaron con las estructuras de edad de la población del censo de China en 2010. La encuesta de prevalencia de TB de 2000 incluyó todos los grupos de edad [12]. El método recomendado por Se realizó el análisis de subgrupos en género, grupos de edad y residencia urbana/rural, se calculó la tasa de identificación de casos como el número de casos identificados por un método de cribado en todos los casos sospechosos encontrados por el método, se calcularon los rendimientos de la consulta sintomática y CXRAY como proporción del número total de casos confirmados bacteriológicamente, se seleccionaron 17 conglomerados urbanos y 18 conglomerados rurales, con una población total de 89.093, de los cuales 56.671 fueron elegibles para la encuesta (Figura 1 ), la tasa de respuesta osciló entre el 95% y el 97% en diferentes conglomerados. 54.279 participantes asistieron a la consulta clínica y fueron examinados por CXRAY, de los cuales el 47% eran varones; la edad promedio fue de 46 años con 14% de 65 años y se encontraron un total de 572 casos sospechosos de tuberculosis De estos, 264 (46%) fueron identificados en base a anomalías CXRAY, 228 (40%) se basaron en tos persistente, 80 (14%) se basaron en ambos, la encuesta diagnosticó 172 nuevos casos, incluyendo 19 nuevos casos confirmados bacteriológicamente (incluyendo 11 casos positivos de esputo y cultivo, y 8 casos negativos de esputo pero positivos de cultivo) y 153 casos bacteriológicos sugerentes CXRAY. La encuesta también identificó 11 casos existentes registrados en el programa nacional de TB. Además, la encuesta encontró cuatro casos con cultivo positivo de bacilos de no tuberculosis, y los excluyó de los pacientes de TB. Todos los participantes de la encuesta fueron examinados por primera vez por síntomas y CXRAY. Aquellos que tenían síntomas de tos o hemoptisis consistentes, o anomalías CXRAY fueron examinados por frotis y cultura. Las tasas de identificación de casos nuevos confirmados bacteriológicamente de los casos sospechosos fueron significativamente mayores con CXRAY como herramienta primaria (Figura 1, 3,8%, P = 0,012) y aumentaron tanto la pantalla de síntomas de tos persistente como la CXRAY (10%, P < 0,001) en comparación con la pantalla de síntomas solo (0,4%); se observó el mismo patrón de tasa de identificación de casos en los casos positivos de esputo (7,5%, 1,9% y 0% respectivamente); la proporción de casos confirmados bacteriológicamente no fue significativamente mayor entre los casos confirmados bacteriológicamente en comparación con otros sospechosos (P = 0,565); solo la consulta sintomática identificó 308 sospechosos, incluyendo 6 (1,9%) TB positiva de frotis de esputo y 9 (2,9%) TB confirmada bacteriológicamente; entre los 344 sospechosos con anomalías CXRA El rendimiento de los casos confirmados bacteriológicamente fue del 47,4% por consulta de cribado y del 94,7% por CXRAY. En la población de más de 65 años, la consulta de síntomas y la CXRAY identificaron 174 y 182 casos sospechosos respectivamente, lo que arrojó 5 (2,9%) y 9 (4,9%) de casos confirmados bacteriológicamente. Los rendimientos de los casos confirmados bacteriológicamente fueron del 55,6% por consulta de síntomas y del 100% por CXRAY entre los más de 65. De los 512 casos sospechosos que completaron el cuestionario adicional, el 42% eran agricultores y el 31% eran fumadores actuales (Tabla 1). De los diez casos confirmados bacteriológicamente que no presentaron tos persistente en la encuesta de prevalencia, uno tosió durante dos días, uno tuvo dolor torácico y los otros ocho no presentaron síntomas de TB en los últimos seis meses. La tasa bruta de prevalencia en Shandong en 2010 de casos positivos de esputo fue de 22,1 (IC 95%: 9,6-34,6), casos confirmados bacteriológicamente fue de 36,8 (IC 95%: 17,8-55,8), y todos los casos fueron de 337,1 (IC 95%: 254,1-420,0) por 100.000 en población adulta (Tabla 2 ). Las tasas ajustadas de prevalencia de toda la población en Shandong fueron de 17,8 (IC 95%: 8,3-17,5), 27,8 (IC 95%: 14,8-28.0) y 239,4 (IC 95%: 179,9-298,9) por 100.000 en 2010. Se observó una notable disminución de 82,0%, 80,2% y 31,4% en las tasas de prevalencia de esputo positivo, confirmado bacteriológicamente, y en todos los casos, respectivamente, en comparación con las tasas ajustadas en 2000 [12]. Se observaron grandes descensos en los hombres de 40 a 65 años y en las mujeres de más de 60 años (Figura 2). Las tasas de prevalencia ajustada en la población adulta fueron 21,4 (IC 95%: 10,0-32,8), 33,5 (IC 95%: 17,8-49,2) y 285,8 (IC 95%: 254,2-356,4) para los casos positivos de esputo, casos confirmados bacteriológicamente y todos los casos, respectivamente. Se observaron diferencias significativas en las tasas de prevalencia ajustada de tuberculosis entre hombres y mujeres de más de 65 años y de 15 a 64 años, en las zonas rurales y urbanas (Tabla 2, P < 0,001 Las proporciones entre hombres y mujeres fueron 5,5 en casos positivos de esputo y 2,8 en casos confirmados bacteriológicamente, mientras que las proporciones aumentaron a 6,0 y 4,1 respectivamente, entre los mayores de 65 años; la mayoría de los pacientes con TB, 54,5% en casos positivos de esputo y 47,3% en casos confirmados bacteriológicamente, fueron de 65 años o más; la proporción entre mayores de 65 años y 15 a 64 años fue de 8,4 en casos positivos de esputo y 5,9 en casos confirmados bacteriológicamente; la proporción entre zonas rurales y urbanas fue de 2,7 en casos positivos de esputo y 4,8 en casos confirmados bacteriológicamente; el hallazgo más llamativo fue que una gran proporción de pacientes con TB no presentó tos consistente; el hallazgo pasivo de casos es la práctica habitual en países en desarrollo donde se realiza la microscopía de esputo para identificar casos de Una gran proporción de los casos de tuberculosis pueden no ser detectados utilizando este método como 53% de los casos confirmados bacteriológicamente y 45% de los casos positivos de esputo en este estudio no tuvieron tos persistente pero fueron identificados a través de CXRAY anormal. Casi la mitad de los casos confirmados bacteriológicamente no reportaron síntomas en los últimos seis meses. Este hallazgo, aunque inicialmente sorprendente, es consistente con reportes de Vietnam (47% de los casos confirmados bacteriológicamente no presentaban tos persistente) [14], Myanmar (38%) y Etiopía (48%) [13]. CXRAY fue sensible en la detección de casos de tuberculosis, ya que los rendimientos de casos confirmados bacteriológicamente fueron mucho más altos por CXRAY en comparación con la detección de síntomas, como se informó en Vietnam [15] y algunos entornos de alta prevalencia del VIH [16, 17]. Nuestros hallazgos sugieren que la estrategia de búsqueda de casos utilizando CXRAY seguido de esputo o cultivo como las pruebas primarias y secundarias de cribado podría ser más efectiva, especialmente entre la población de más de 65 años, ya que los rendimientos fueron mayores en más de 65 años en comparación con la Tabla 2 Prevalencia de casos de TB positivo de esputo, casos de TB confirmados bacteriológicamente y todos los casos en Shandong, China, 2010 No hay población. Aunque usar CXRAY para examinar a todos no es factible, puede ser utilizado en exámenes físicos de ancianos de rutina. El paquete de salud pública de China ahora cubre CXRAY gratis para ancianos, así como exámenes corporales anuales de empleados proporcionó CXRAY gratuito. En esta encuesta, sólo un paciente positivo de esputo había sido detectado y tratado por el programa nacional, aunque se realizó una consulta clínica específica para identificar a cualquier paciente que haya sido diagnosticado y tratado Esto puede reflejar la diferencia entre el enfoque de búsqueda de casos activos en la encuesta y el enfoque de búsqueda de casquillo pasivo en la práctica; sin embargo, indicó que una gran proporción de casos de TB confirmados bacteriológicamente no son atendidos por el programa nacional de TB. Otro cambio notable es la fuerte disminución de la proporción de casos positivos de esputo, que representó el 30,5% de todos los casos en la encuesta de 2000, pero se redujo al 6,6% en la encuesta de 2010. La proporción de casos de esputo notificados de todos los casos de TB en Shandong también disminuyó del 80,9% en 2005 al 64,6% en 2010 [19]. La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se ha reducido en un 80% en la última década en Shandong, en comparación con una disminución nacional del 45% (de 216/ 100.000 en 2000 a 119/ 100.000 en 2010] [4]. La rápida disminución de la prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente en la última década puede atribuirse al fortalecimiento del sistema de salud pública de China tras el brote de síndrome respiratorio agudo grave en 2003 [2]. Otra razón puede deberse a la mejora de la notificación de casos de tuberculosis en el sistema de notificación de enfermedades transmisibles en línea, y a la mejora de la colaboración entre los hospitales públicos y los dispensarios de tuberculosis [20]. Otros factores como el desarrollo económico social también pueden haber desempeñado un papel importante en la reducción de la prevalencia de la tuberculosis, como se encontró en un estudio de las tendencias de las tasas de notificación de la tuberculosis en 134 países [21]. La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente en Shandong fue inferior a las estimaciones de la OMS para China en 2010 [1]. Una de las razones es que los resultados de las encuestas de prevalencia se basan en el hallazgo de casos activos, mientras que las estimaciones de la OMS se basan en las tasas de notificación de los casos pasivos. Se necesita una reevaluación de la prevalencia de tuberculosis reportada en China basada en la encuesta reciente. CXRAY sugiere que los casos bacteriológicos negativos pueden ser casos de tuberculosis bacteriológicamente negativos si tenían algún síntoma de tuberculosis, mientras que algunos pueden ser causados por un frotis o cultivo subóptimo. Como se informó en encuestas anteriores de China [3, 22], incluyendo estos casos como casos de tuberculosis pueden resultar en una sobreestimación de todos los casos pulmonares [23]. La encuesta reveló que más de la mitad de los pacientes con tuberculosis tenían 65 años o más en Shandong, mientras que los más de 65 años tenían más probabilidades de presentarse con CXRAY anormal y tos persistente. Tendencias similares se han Estas altas tasas pueden reflejar las tasas de tuberculosis más altas en el pasado y la disminución de la inmunidad en los más de 65 años.Cómo tratar a los ancianos con tuberculosis y otras complicaciones como la diabetes sigue siendo un desafío continuo en China y entornos similares.Los resultados de la encuesta pueden generalizarse a la población de Shandong de 94 millones de habitantes o entornos internacionales similares con ingresos medios y niveles medios de prevalencia de la tuberculosis.Los patrones de la epidemia de tuberculosis encontrados en Shandong, es decir, la proporción de pacientes con síntomas, proporción entre zonas urbanas y rurales, hombres y mujeres, fueron similares a los encontrados en la encuesta nacional [4].Sin embargo, las tasas de prevalencia no pueden extrapolarse a las provincias occidentales de China con una mayor prevalencia de tuberculosis.Por razones logísticas, la población elegible no incluyó a los adultos que permanecieron en los grupos muestreados menos de 6 meses, lo que fue la misma práctica en la encuesta de 2000.Sin embargo, los migrantes a La encuesta no recopiló indicadores socioeconómicos, estado de tabaquismo y estado de VIH de todos los participantes, por lo que no se dispone de comparaciones entre los casos de tuberculosis y todos los pacientes no tratados con TB. Sin embargo, la prevalencia del VIH en Shandong China es inferior al 0,01%, y no alteraría significativamente la tasa de prevalencia de la TB. Además, la encuesta no evaluó la TB infantil y la TB pulmonar extra. Las discusiones sobre el uso de CXRAY como herramienta de cribado fueron en el aspecto técnico, pero no en el lado de los costos, ya que no realizamos ningún análisis de la relación costo-eficacia ni la voluntad social de pagar por tal estrategia en entornos similares. Este estudio ha demostrado que la prevalencia de TB confirmada bacteriológicamente en Shandong ha disminuido sustancialmente en la última década. Es importante destacar que la mayoría de estos casos no se presentaron con tos persistente y la proporción de Se recomiendan estudios adicionales para evaluar la viabilidad de la adopción de CXRAY en los servicios de salud existentes para detectar casos de tuberculosis y la relación costo-eficacia de dicha intervención.Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

¿Cuántas personas estaban en un grupo comunitario?

Cambios en la prevalencia de la tuberculosis pulmonar: evidencia de la encuesta de población de 2010 en una populosa provincia de Chinahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3890533/SHA: eef61bdfa49b8652fd660b5b8b7e74cf51922505Autores: Wei, Xiaolin; Zhang, Xiulei; Yin, Jia; Walley, John; Beanland, Rachel; Zou, Guanyang; Zhang, Hongmei; Li, Fang; Liu, Zhimin; Zee, Benny CY; Griffiths, Sian MDate: 2014-01-11DOI: 10.1186/1471-2334-14-21Licencia: cc-byAbstract: ANTEGRON: Este documento informa de los resultados de la El objetivo de este estudio fue estimar la prevalencia de TB en la provincia en 2010 en comparación con la encuesta de 2000; y comparar el rendimiento de casos de TB de diferentes abordajes de búsqueda de casos.MÉTODOS: Se realizó una encuesta transversal basada en la población mediante muestreo aleatorio multietapa. En la encuesta participaron 54.279 adultos con una tasa de respuesta del 96%. Los médicos entrevistaron y clasificaron a los participantes como presuntos casos de TB si presentaban tos persistente, rayos X torácicos anormales (CXRAY) o ambos. Se recogieron tres especímenes de esputo de todos los casos sospechosos y se enviaron para microscopía y cultivo. RESULTADOS: La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente fue de 34 por 100.000 en adultos en Shandong en 2010. En comparación con la encuesta de 2000, la prevalencia de TB disminuyó en un 80%. El 53% de los casos Más del 50% de los casos de tuberculosis se encontraban entre los más de 65 años. CONCLUSIONES: La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se redujo significativamente en comparación con el año 2000. La encuesta planteó desafíos para identificar casos de tuberculosis sin síntomas claros. Texto: China, con una prevalencia estimada de todos los casos de tuberculosis de 108 por 100.000 en 2010, tiene la segunda carga de tuberculosis más alta del mundo, representando el 13% de todos los casos en todo el mundo [1]. La Organización Mundial de la Salud (OMS) estimó que China había alcanzado los objetivos de éxito en el tratamiento del 85% para 1993 y la tasa de detección de casos del 70% para 2005 [2]. Las encuestas nacionales de prevalencia de tuberculosis se llevaron a cabo en China en 1979, China en 1990, China en 2000, y 2010 [4]. Los resultados de la encuesta proporcionan estimaciones más precisas de las tasas de prevalencia de tuberculosis que las estimaciones de la OMS y pueden utilizarse para evaluar la probabilidad de que China Se trata de una provincia relativamente desarrollada con un PIB per cápita 1,6 veces el promedio nacional en 2010 [5]. La tasa de prevalencia de la TB en Shandong fue menor que la tasa media de China en 2000 [3]. En las encuestas de 2000 y 2010 se tomaron muestras representativas de la población en Shandong utilizando métodos similares. El objetivo del estudio fue estimar la prevalencia de la TB en Shandong con base en la encuesta de 2010, y comparar los resultados de las dos encuestas transversales. La población objetivo de la encuesta de prevalencia de la TB fue la población de 15 años o más que había vivido en los grupos seleccionados durante más de 6 meses. Se realizó una encuesta transversal basada en la población, utilizando el método de muestreo aleatorio multietapa. La encuesta utilizó los mismos métodos de muestreo que la encuesta nacional de China en 2010, que fue similar a los métodos de muestreo utilizados en 2000 [6]. El diseño de las encuestas estuvo de acuerdo con las recomendaciones de Se calculó el tamaño de la muestra de 52500 adultos (de 15 años de edad), en 35 conglomerados, con base en la detección de un cambio del 20% en la tasa de prevalencia de casos positivos de citología de tuberculosis en comparación con la tasa de la encuesta de 2000 (95 por 100.000), con una probabilidad superior al 95% y el 95% de potencia, con una tasa de respuesta del 90% de los participantes [9]. Se utilizó un muestreo aleatorio estratificado en varias etapas para seleccionar los 35 conglomerados dentro de 17 prefecturas de la provincia de Shandong. El número de conglomerados se asignó al azar en proporción a la población provincial en los niveles de prefectura, condado/distrito y municipio. Se definió un conglomerado como una comunidad (un pueblo en la zona rural o una comunidad residente en una zona urbana) con una población de 1250 a 1750 adultos (es decir, los de 15 años o más). Si la comunidad contenía menos de Si la comunidad o comunidades combinadas que contenían más de 1750 adultos, seleccionamos aleatoriamente los hogares y luego incluimos a todos los adultos en el hogar para la encuesta hasta que el número total de adultos seleccionados llegó a 1750. Se excluyeron los cuarteles militares y las prisiones ubicadas en el grupo [7]. La encuesta fue realizada de marzo a junio de 2010 por equipos de encuesta integrados por médicos clínicos, médicos de salud pública, radiólogos, técnicos de laboratorio y enfermeras. Se utilizó los medios de comunicación locales para promover el conocimiento de la encuesta. Los trabajadores comunitarios realizaron un censo casa por casa para actualizar la base de datos de residentes, informar a los participantes de la encuesta y obtener el consentimiento informado. El estudio no incluyó a niños menores de 15 años. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes de 16 años o más. Mientras que de los de 15 años se obtuvieron consentimientos informados por escrito de sus padres o tutores. Todos los documentos fueron almacenados Se obtuvieron aprobaciones éticas para el estudio y los procedimientos de consentimiento de la Junta de Revisión Institucional (IRB) del Hospital Chest de Shandong (número de registro NIHIRB00006010), quienes aceptaron participar en la encuesta fueron invitados al dispensario de TB del condado, donde completaron una consulta con un médico de TB clínico capacitado sobre cualquier síntoma sugestivo de TB, como tos persistente (durante dos semanas o más), hemoptisis, pérdida de peso y fiebre; todos los participantes recibieron una radiografía de tórax (CXRAY) que luego fueron revisados por un panel de radiólogos; aquellos con síntomas o películas CXRAY sugestivas de TB fueron clasificados como presuntos casos de TB; todos los casos sospechosos fueron solicitados para producir tres muestras de esputo, una en el momento de la consulta, otra en la noche y la tercera en la madrugada del día siguiente. Los sospechosos identificados completaron un cuestionario adicional sobre su situación socioeconómica, su estado de tabaquismo y la presencia de síntomas relacionados con la tuberculosis en los seis meses anteriores (tos, fiebre, pérdida de peso, dolor torácico y hemoptisis).Se realizaron frotis de esputo en dispensarios locales de tuberculosis.Todas las muestras de esputo se cultivaron utilizando el medio Löwenstein-Jensen en el laboratorio provincial en un plazo de 24 horas utilizando el transporte en cadena fría.Las muestras se excluyeron de la tuberculosis cuando se identificaron bacilos no tuberculosos del cultivo.Todas las muestras de esputo se realizaron estrictamente de acuerdo con la medida de control de calidad externa del laboratorio nacional de tuberculosis, que es coherente con la directriz de la encuesta de prevalencia de la tuberculosis de la OMS [7].La clasificación de la tuberculosis se realizó de acuerdo con la directriz nacional china de tuberculosis [10]. Los pacientes con citología de esputo positiva fueron clasificados como casos positivos de esputo; los pacientes con citología de esputo positivo o de cultivo fueron clasificados como casos bacteriológicos confirmados como esputo bacteriológico; aquellos con cultivo negativo con CXRAY anormal sugestivo de TB y excluidos de otras enfermedades por médicos y radiólogos fueron clasificados como CXRAY sugestivo de casos bacteriológicos negativos; por limitaciones de recursos no se aplicó la recomendación de agentes antimicrobianos de amplio espectro para confirmar el diagnóstico de casos negativos de TB [11]. Los casos recién diagnosticados fueron diferenciados de casos previamente diagnosticados mediante controles durante las entrevistas y contra el sistema de registro de TB; el diagnóstico inicial fue realizado por un grupo de médicos y radiólogos locales; posteriormente, muestras y películas de CXRAY de todos los casos sospechosos y confirmados fueron reevaluados por un grupo de Las películas de CXRAY del 100% de las que fueron calificadas como anormales y las muestras aleatorias de 10% de las que fueron calificadas como normales fueron transferidas para lectura independiente. El equipo de laboratorio provincial examinó aleatoriamente una diapositiva de las tres muestras de casos positivos de esputo, las tres muestras de casos de TB sugerentes de CXRAY y seleccionó aleatoriamente el 10% de los casos no TB. Se calcularon estimaciones de prevalencia de los casos positivos de esputo, confirmados bacteriológicamente y todos los casos de TB. En todos los análisis se utilizaron ponderaciones de población para ajustar el efecto de diseño de muestreo multietapa estratificado [8]. Los resultados de la encuesta en 2010 y 2000 se estandarizaron con las estructuras de edad de la población del censo de China en 2010. La encuesta de prevalencia de TB de 2000 incluyó todos los grupos de edad [12]. El método recomendado por Se realizó el análisis de subgrupos en género, grupos de edad y residencia urbana/rural, se calculó la tasa de identificación de casos como el número de casos identificados por un método de cribado en todos los casos sospechosos encontrados por el método, se calcularon los rendimientos de la consulta sintomática y CXRAY como proporción del número total de casos confirmados bacteriológicamente, se seleccionaron 17 conglomerados urbanos y 18 conglomerados rurales, con una población total de 89.093, de los cuales 56.671 fueron elegibles para la encuesta (Figura 1 ), la tasa de respuesta osciló entre el 95% y el 97% en diferentes conglomerados. 54.279 participantes asistieron a la consulta clínica y fueron examinados por CXRAY, de los cuales el 47% eran varones; la edad promedio fue de 46 años con 14% de 65 años y se encontraron un total de 572 casos sospechosos de tuberculosis De estos, 264 (46%) fueron identificados en base a anomalías CXRAY, 228 (40%) se basaron en tos persistente, 80 (14%) se basaron en ambos, la encuesta diagnosticó 172 nuevos casos, incluyendo 19 nuevos casos confirmados bacteriológicamente (incluyendo 11 casos positivos de esputo y cultivo, y 8 casos negativos de esputo pero positivos de cultivo) y 153 casos bacteriológicos sugerentes CXRAY. La encuesta también identificó 11 casos existentes registrados en el programa nacional de TB. Además, la encuesta encontró cuatro casos con cultivo positivo de bacilos de no tuberculosis, y los excluyó de los pacientes de TB. Todos los participantes de la encuesta fueron examinados por primera vez por síntomas y CXRAY. Aquellos que tenían síntomas de tos o hemoptisis consistentes, o anomalías CXRAY fueron examinados por frotis y cultura. Las tasas de identificación de casos nuevos confirmados bacteriológicamente de los casos sospechosos fueron significativamente mayores con CXRAY como herramienta primaria (Figura 1, 3,8%, P = 0,012) y aumentaron tanto la pantalla de síntomas de tos persistente como la CXRAY (10%, P < 0,001) en comparación con la pantalla de síntomas solo (0,4%); se observó el mismo patrón de tasa de identificación de casos en los casos positivos de esputo (7,5%, 1,9% y 0% respectivamente); la proporción de casos confirmados bacteriológicamente no fue significativamente mayor entre los casos confirmados bacteriológicamente en comparación con otros sospechosos (P = 0,565); solo la consulta sintomática identificó 308 sospechosos, incluyendo 6 (1,9%) TB positiva de frotis de esputo y 9 (2,9%) TB confirmada bacteriológicamente; entre los 344 sospechosos con anomalías CXRA El rendimiento de los casos confirmados bacteriológicamente fue del 47,4% por consulta de cribado y del 94,7% por CXRAY. En la población de más de 65 años, la consulta de síntomas y la CXRAY identificaron 174 y 182 casos sospechosos respectivamente, lo que arrojó 5 (2,9%) y 9 (4,9%) de casos confirmados bacteriológicamente. Los rendimientos de los casos confirmados bacteriológicamente fueron del 55,6% por consulta de síntomas y del 100% por CXRAY entre los más de 65. De los 512 casos sospechosos que completaron el cuestionario adicional, el 42% eran agricultores y el 31% eran fumadores actuales (Tabla 1). De los diez casos confirmados bacteriológicamente que no presentaron tos persistente en la encuesta de prevalencia, uno tosió durante dos días, uno tuvo dolor torácico y los otros ocho no presentaron síntomas de TB en los últimos seis meses. La tasa bruta de prevalencia en Shandong en 2010 de casos positivos de esputo fue de 22,1 (IC 95%: 9,6-34,6), casos confirmados bacteriológicamente fue de 36,8 (IC 95%: 17,8-55,8), y todos los casos fueron de 337,1 (IC 95%: 254,1-420,0) por 100.000 en población adulta (Tabla 2 ). Las tasas ajustadas de prevalencia de toda la población en Shandong fueron de 17,8 (IC 95%: 8,3-17,5), 27,8 (IC 95%: 14,8-28.0) y 239,4 (IC 95%: 179,9-298,9) por 100.000 en 2010. Se observó una notable disminución de 82,0%, 80,2% y 31,4% en las tasas de prevalencia de esputo positivo, confirmado bacteriológicamente, y en todos los casos, respectivamente, en comparación con las tasas ajustadas en 2000 [12]. Se observaron grandes descensos en los hombres de 40 a 65 años y en las mujeres de más de 60 años (Figura 2). Las tasas de prevalencia ajustada en la población adulta fueron 21,4 (IC 95%: 10,0-32,8), 33,5 (IC 95%: 17,8-49,2) y 285,8 (IC 95%: 254,2-356,4) para los casos positivos de esputo, casos confirmados bacteriológicamente y todos los casos, respectivamente. Se observaron diferencias significativas en las tasas de prevalencia ajustada de tuberculosis entre hombres y mujeres de más de 65 años y de 15 a 64 años, en las zonas rurales y urbanas (Tabla 2, P < 0,001 Las proporciones entre hombres y mujeres fueron 5,5 en casos positivos de esputo y 2,8 en casos confirmados bacteriológicamente, mientras que las proporciones aumentaron a 6,0 y 4,1 respectivamente, entre los mayores de 65 años; la mayoría de los pacientes con TB, 54,5% en casos positivos de esputo y 47,3% en casos confirmados bacteriológicamente, fueron de 65 años o más; la proporción entre mayores de 65 años y 15 a 64 años fue de 8,4 en casos positivos de esputo y 5,9 en casos confirmados bacteriológicamente; la proporción entre zonas rurales y urbanas fue de 2,7 en casos positivos de esputo y 4,8 en casos confirmados bacteriológicamente; el hallazgo más llamativo fue que una gran proporción de pacientes con TB no presentó tos consistente; el hallazgo pasivo de casos es la práctica habitual en países en desarrollo donde se realiza la microscopía de esputo para identificar casos de Una gran proporción de los casos de tuberculosis pueden no ser detectados utilizando este método como 53% de los casos confirmados bacteriológicamente y 45% de los casos positivos de esputo en este estudio no tuvieron tos persistente pero fueron identificados a través de CXRAY anormal. Casi la mitad de los casos confirmados bacteriológicamente no reportaron síntomas en los últimos seis meses. Este hallazgo, aunque inicialmente sorprendente, es consistente con reportes de Vietnam (47% de los casos confirmados bacteriológicamente no presentaban tos persistente) [14], Myanmar (38%) y Etiopía (48%) [13]. CXRAY fue sensible en la detección de casos de tuberculosis, ya que los rendimientos de casos confirmados bacteriológicamente fueron mucho más altos por CXRAY en comparación con la detección de síntomas, como se informó en Vietnam [15] y algunos entornos de alta prevalencia del VIH [16, 17]. Nuestros hallazgos sugieren que la estrategia de búsqueda de casos utilizando CXRAY seguido de esputo o cultivo como las pruebas primarias y secundarias de cribado podría ser más efectiva, especialmente entre la población de más de 65 años, ya que los rendimientos fueron mayores en más de 65 años en comparación con la Tabla 2 Prevalencia de casos de TB positivo de esputo, casos de TB confirmados bacteriológicamente y todos los casos en Shandong, China, 2010 No hay población. Aunque usar CXRAY para examinar a todos no es factible, puede ser utilizado en exámenes físicos de ancianos de rutina. El paquete de salud pública de China ahora cubre CXRAY gratis para ancianos, así como exámenes corporales anuales de empleados proporcionó CXRAY gratuito. En esta encuesta, sólo un paciente positivo de esputo había sido detectado y tratado por el programa nacional, aunque se realizó una consulta clínica específica para identificar a cualquier paciente que haya sido diagnosticado y tratado Esto puede reflejar la diferencia entre el enfoque de búsqueda de casos activos en la encuesta y el enfoque de búsqueda de casquillo pasivo en la práctica; sin embargo, indicó que una gran proporción de casos de TB confirmados bacteriológicamente no son atendidos por el programa nacional de TB. Otro cambio notable es la fuerte disminución de la proporción de casos positivos de esputo, que representó el 30,5% de todos los casos en la encuesta de 2000, pero se redujo al 6,6% en la encuesta de 2010. La proporción de casos de esputo notificados de todos los casos de TB en Shandong también disminuyó del 80,9% en 2005 al 64,6% en 2010 [19]. La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se ha reducido en un 80% en la última década en Shandong, en comparación con una disminución nacional del 45% (de 216/ 100.000 en 2000 a 119/ 100.000 en 2010] [4]. La rápida disminución de la prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente en la última década puede atribuirse al fortalecimiento del sistema de salud pública de China tras el brote de síndrome respiratorio agudo grave en 2003 [2]. Otra razón puede deberse a la mejora de la notificación de casos de tuberculosis en el sistema de notificación de enfermedades transmisibles en línea, y a la mejora de la colaboración entre los hospitales públicos y los dispensarios de tuberculosis [20]. Otros factores como el desarrollo económico social también pueden haber desempeñado un papel importante en la reducción de la prevalencia de la tuberculosis, como se encontró en un estudio de las tendencias de las tasas de notificación de la tuberculosis en 134 países [21]. La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente en Shandong fue inferior a las estimaciones de la OMS para China en 2010 [1]. Una de las razones es que los resultados de las encuestas de prevalencia se basan en el hallazgo de casos activos, mientras que las estimaciones de la OMS se basan en las tasas de notificación de los casos pasivos. Se necesita una reevaluación de la prevalencia de tuberculosis reportada en China basada en la encuesta reciente. CXRAY sugiere que los casos bacteriológicos negativos pueden ser casos de tuberculosis bacteriológicamente negativos si tenían algún síntoma de tuberculosis, mientras que algunos pueden ser causados por un frotis o cultivo subóptimo. Como se informó en encuestas anteriores de China [3, 22], incluyendo estos casos como casos de tuberculosis pueden resultar en una sobreestimación de todos los casos pulmonares [23]. La encuesta reveló que más de la mitad de los pacientes con tuberculosis tenían 65 años o más en Shandong, mientras que los más de 65 años tenían más probabilidades de presentarse con CXRAY anormal y tos persistente. Tendencias similares se han Estas altas tasas pueden reflejar las tasas de tuberculosis más altas en el pasado y la disminución de la inmunidad en los más de 65 años.Cómo tratar a los ancianos con tuberculosis y otras complicaciones como la diabetes sigue siendo un desafío continuo en China y entornos similares.Los resultados de la encuesta pueden generalizarse a la población de Shandong de 94 millones de habitantes o entornos internacionales similares con ingresos medios y niveles medios de prevalencia de la tuberculosis.Los patrones de la epidemia de tuberculosis encontrados en Shandong, es decir, la proporción de pacientes con síntomas, proporción entre zonas urbanas y rurales, hombres y mujeres, fueron similares a los encontrados en la encuesta nacional [4].Sin embargo, las tasas de prevalencia no pueden extrapolarse a las provincias occidentales de China con una mayor prevalencia de tuberculosis.Por razones logísticas, la población elegible no incluyó a los adultos que permanecieron en los grupos muestreados menos de 6 meses, lo que fue la misma práctica en la encuesta de 2000.Sin embargo, los migrantes a La encuesta no recopiló indicadores socioeconómicos, estado de tabaquismo y estado de VIH de todos los participantes, por lo que no se dispone de comparaciones entre los casos de tuberculosis y todos los pacientes no tratados con TB. Sin embargo, la prevalencia del VIH en Shandong China es inferior al 0,01%, y no alteraría significativamente la tasa de prevalencia de la TB. Además, la encuesta no evaluó la TB infantil y la TB pulmonar extra. Las discusiones sobre el uso de CXRAY como herramienta de cribado fueron en el aspecto técnico, pero no en el lado de los costos, ya que no realizamos ningún análisis de la relación costo-eficacia ni la voluntad social de pagar por tal estrategia en entornos similares. Este estudio ha demostrado que la prevalencia de TB confirmada bacteriológicamente en Shandong ha disminuido sustancialmente en la última década. Es importante destacar que la mayoría de estos casos no se presentaron con tos persistente y la proporción de Se recomiendan estudios adicionales para evaluar la viabilidad de la adopción de CXRAY en los servicios de salud existentes para detectar casos de tuberculosis y la relación costo-eficacia de dicha intervención.Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

¿Quién dirigió el estudio?

Cambios en la prevalencia de la tuberculosis pulmonar: evidencia de la encuesta de población de 2010 en una populosa provincia de Chinahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3890533/SHA: eef61bdfa49b8652fd660b5b8b7e74cf51922505Autores: Wei, Xiaolin; Zhang, Xiulei; Yin, Jia; Walley, John; Beanland, Rachel; Zou, Guanyang; Zhang, Hongmei; Li, Fang; Liu, Zhimin; Zee, Benny CY; Griffiths, Sian MDate: 2014-01-11DOI: 10.1186/1471-2334-14-21Licencia: cc-byAbstract: ANTEGRON: Este documento informa de los resultados de la El objetivo de este estudio fue estimar la prevalencia de TB en la provincia en 2010 en comparación con la encuesta de 2000; y comparar el rendimiento de casos de TB de diferentes abordajes de búsqueda de casos.MÉTODOS: Se realizó una encuesta transversal basada en la población mediante muestreo aleatorio multietapa. En la encuesta participaron 54.279 adultos con una tasa de respuesta del 96%. Los médicos entrevistaron y clasificaron a los participantes como presuntos casos de TB si presentaban tos persistente, rayos X torácicos anormales (CXRAY) o ambos. Se recogieron tres especímenes de esputo de todos los casos sospechosos y se enviaron para microscopía y cultivo. RESULTADOS: La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente fue de 34 por 100.000 en adultos en Shandong en 2010. En comparación con la encuesta de 2000, la prevalencia de TB disminuyó en un 80%. El 53% de los casos Más del 50% de los casos de tuberculosis se encontraban entre los más de 65 años. CONCLUSIONES: La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se redujo significativamente en comparación con el año 2000. La encuesta planteó desafíos para identificar casos de tuberculosis sin síntomas claros. Texto: China, con una prevalencia estimada de todos los casos de tuberculosis de 108 por 100.000 en 2010, tiene la segunda carga de tuberculosis más alta del mundo, representando el 13% de todos los casos en todo el mundo [1]. La Organización Mundial de la Salud (OMS) estimó que China había alcanzado los objetivos de éxito en el tratamiento del 85% para 1993 y la tasa de detección de casos del 70% para 2005 [2]. Las encuestas nacionales de prevalencia de tuberculosis se llevaron a cabo en China en 1979, China en 1990, China en 2000, y 2010 [4]. Los resultados de la encuesta proporcionan estimaciones más precisas de las tasas de prevalencia de tuberculosis que las estimaciones de la OMS y pueden utilizarse para evaluar la probabilidad de que China Se trata de una provincia relativamente desarrollada con un PIB per cápita 1,6 veces el promedio nacional en 2010 [5]. La tasa de prevalencia de la TB en Shandong fue menor que la tasa media de China en 2000 [3]. En las encuestas de 2000 y 2010 se tomaron muestras representativas de la población en Shandong utilizando métodos similares. El objetivo del estudio fue estimar la prevalencia de la TB en Shandong con base en la encuesta de 2010, y comparar los resultados de las dos encuestas transversales. La población objetivo de la encuesta de prevalencia de la TB fue la población de 15 años o más que había vivido en los grupos seleccionados durante más de 6 meses. Se realizó una encuesta transversal basada en la población, utilizando el método de muestreo aleatorio multietapa. La encuesta utilizó los mismos métodos de muestreo que la encuesta nacional de China en 2010, que fue similar a los métodos de muestreo utilizados en 2000 [6]. El diseño de las encuestas estuvo de acuerdo con las recomendaciones de Se calculó el tamaño de la muestra de 52500 adultos (de 15 años de edad), en 35 conglomerados, con base en la detección de un cambio del 20% en la tasa de prevalencia de casos positivos de citología de tuberculosis en comparación con la tasa de la encuesta de 2000 (95 por 100.000), con una probabilidad superior al 95% y el 95% de potencia, con una tasa de respuesta del 90% de los participantes [9]. Se utilizó un muestreo aleatorio estratificado en varias etapas para seleccionar los 35 conglomerados dentro de 17 prefecturas de la provincia de Shandong. El número de conglomerados se asignó al azar en proporción a la población provincial en los niveles de prefectura, condado/distrito y municipio. Se definió un conglomerado como una comunidad (un pueblo en la zona rural o una comunidad residente en una zona urbana) con una población de 1250 a 1750 adultos (es decir, los de 15 años o más). Si la comunidad contenía menos de Si la comunidad o comunidades combinadas que contenían más de 1750 adultos, seleccionamos aleatoriamente los hogares y luego incluimos a todos los adultos en el hogar para la encuesta hasta que el número total de adultos seleccionados llegó a 1750. Se excluyeron los cuarteles militares y las prisiones ubicadas en el grupo [7]. La encuesta fue realizada de marzo a junio de 2010 por equipos de encuesta integrados por médicos clínicos, médicos de salud pública, radiólogos, técnicos de laboratorio y enfermeras. Se utilizó los medios de comunicación locales para promover el conocimiento de la encuesta. Los trabajadores comunitarios realizaron un censo casa por casa para actualizar la base de datos de residentes, informar a los participantes de la encuesta y obtener el consentimiento informado. El estudio no incluyó a niños menores de 15 años. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes de 16 años o más. Mientras que de los de 15 años se obtuvieron consentimientos informados por escrito de sus padres o tutores. Todos los documentos fueron almacenados Se obtuvieron aprobaciones éticas para el estudio y los procedimientos de consentimiento de la Junta de Revisión Institucional (IRB) del Hospital Chest de Shandong (número de registro NIHIRB00006010), quienes aceptaron participar en la encuesta fueron invitados al dispensario de TB del condado, donde completaron una consulta con un médico de TB clínico capacitado sobre cualquier síntoma sugestivo de TB, como tos persistente (durante dos semanas o más), hemoptisis, pérdida de peso y fiebre; todos los participantes recibieron una radiografía de tórax (CXRAY) que luego fueron revisados por un panel de radiólogos; aquellos con síntomas o películas CXRAY sugestivas de TB fueron clasificados como presuntos casos de TB; todos los casos sospechosos fueron solicitados para producir tres muestras de esputo, una en el momento de la consulta, otra en la noche y la tercera en la madrugada del día siguiente. Los sospechosos identificados completaron un cuestionario adicional sobre su situación socioeconómica, su estado de tabaquismo y la presencia de síntomas relacionados con la tuberculosis en los seis meses anteriores (tos, fiebre, pérdida de peso, dolor torácico y hemoptisis).Se realizaron frotis de esputo en dispensarios locales de tuberculosis.Todas las muestras de esputo se cultivaron utilizando el medio Löwenstein-Jensen en el laboratorio provincial en un plazo de 24 horas utilizando el transporte en cadena fría.Las muestras se excluyeron de la tuberculosis cuando se identificaron bacilos no tuberculosos del cultivo.Todas las muestras de esputo se realizaron estrictamente de acuerdo con la medida de control de calidad externa del laboratorio nacional de tuberculosis, que es coherente con la directriz de la encuesta de prevalencia de la tuberculosis de la OMS [7].La clasificación de la tuberculosis se realizó de acuerdo con la directriz nacional china de tuberculosis [10]. Los pacientes con citología de esputo positiva fueron clasificados como casos positivos de esputo; los pacientes con citología de esputo positivo o de cultivo fueron clasificados como casos bacteriológicos confirmados como esputo bacteriológico; aquellos con cultivo negativo con CXRAY anormal sugestivo de TB y excluidos de otras enfermedades por médicos y radiólogos fueron clasificados como CXRAY sugestivo de casos bacteriológicos negativos; por limitaciones de recursos no se aplicó la recomendación de agentes antimicrobianos de amplio espectro para confirmar el diagnóstico de casos negativos de TB [11]. Los casos recién diagnosticados fueron diferenciados de casos previamente diagnosticados mediante controles durante las entrevistas y contra el sistema de registro de TB; el diagnóstico inicial fue realizado por un grupo de médicos y radiólogos locales; posteriormente, muestras y películas de CXRAY de todos los casos sospechosos y confirmados fueron reevaluados por un grupo de Las películas de CXRAY del 100% de las que fueron calificadas como anormales y las muestras aleatorias de 10% de las que fueron calificadas como normales fueron transferidas para lectura independiente. El equipo de laboratorio provincial examinó aleatoriamente una diapositiva de las tres muestras de casos positivos de esputo, las tres muestras de casos de TB sugerentes de CXRAY y seleccionó aleatoriamente el 10% de los casos no TB. Se calcularon estimaciones de prevalencia de los casos positivos de esputo, confirmados bacteriológicamente y todos los casos de TB. En todos los análisis se utilizaron ponderaciones de población para ajustar el efecto de diseño de muestreo multietapa estratificado [8]. Los resultados de la encuesta en 2010 y 2000 se estandarizaron con las estructuras de edad de la población del censo de China en 2010. La encuesta de prevalencia de TB de 2000 incluyó todos los grupos de edad [12]. El método recomendado por Se realizó el análisis de subgrupos en género, grupos de edad y residencia urbana/rural, se calculó la tasa de identificación de casos como el número de casos identificados por un método de cribado en todos los casos sospechosos encontrados por el método, se calcularon los rendimientos de la consulta sintomática y CXRAY como proporción del número total de casos confirmados bacteriológicamente, se seleccionaron 17 conglomerados urbanos y 18 conglomerados rurales, con una población total de 89.093, de los cuales 56.671 fueron elegibles para la encuesta (Figura 1 ), la tasa de respuesta osciló entre el 95% y el 97% en diferentes conglomerados. 54.279 participantes asistieron a la consulta clínica y fueron examinados por CXRAY, de los cuales el 47% eran varones; la edad promedio fue de 46 años con 14% de 65 años y se encontraron un total de 572 casos sospechosos de tuberculosis De estos, 264 (46%) fueron identificados en base a anomalías CXRAY, 228 (40%) se basaron en tos persistente, 80 (14%) se basaron en ambos, la encuesta diagnosticó 172 nuevos casos, incluyendo 19 nuevos casos confirmados bacteriológicamente (incluyendo 11 casos positivos de esputo y cultivo, y 8 casos negativos de esputo pero positivos de cultivo) y 153 casos bacteriológicos sugerentes CXRAY. La encuesta también identificó 11 casos existentes registrados en el programa nacional de TB. Además, la encuesta encontró cuatro casos con cultivo positivo de bacilos de no tuberculosis, y los excluyó de los pacientes de TB. Todos los participantes de la encuesta fueron examinados por primera vez por síntomas y CXRAY. Aquellos que tenían síntomas de tos o hemoptisis consistentes, o anomalías CXRAY fueron examinados por frotis y cultura. Las tasas de identificación de casos nuevos confirmados bacteriológicamente de los casos sospechosos fueron significativamente mayores con CXRAY como herramienta primaria (Figura 1, 3,8%, P = 0,012) y aumentaron tanto la pantalla de síntomas de tos persistente como la CXRAY (10%, P < 0,001) en comparación con la pantalla de síntomas solo (0,4%); se observó el mismo patrón de tasa de identificación de casos en los casos positivos de esputo (7,5%, 1,9% y 0% respectivamente); la proporción de casos confirmados bacteriológicamente no fue significativamente mayor entre los casos confirmados bacteriológicamente en comparación con otros sospechosos (P = 0,565); solo la consulta sintomática identificó 308 sospechosos, incluyendo 6 (1,9%) TB positiva de frotis de esputo y 9 (2,9%) TB confirmada bacteriológicamente; entre los 344 sospechosos con anomalías CXRA El rendimiento de los casos confirmados bacteriológicamente fue del 47,4% por consulta de cribado y del 94,7% por CXRAY. En la población de más de 65 años, la consulta de síntomas y la CXRAY identificaron 174 y 182 casos sospechosos respectivamente, lo que arrojó 5 (2,9%) y 9 (4,9%) de casos confirmados bacteriológicamente. Los rendimientos de los casos confirmados bacteriológicamente fueron del 55,6% por consulta de síntomas y del 100% por CXRAY entre los más de 65. De los 512 casos sospechosos que completaron el cuestionario adicional, el 42% eran agricultores y el 31% eran fumadores actuales (Tabla 1). De los diez casos confirmados bacteriológicamente que no presentaron tos persistente en la encuesta de prevalencia, uno tosió durante dos días, uno tuvo dolor torácico y los otros ocho no presentaron síntomas de TB en los últimos seis meses. La tasa bruta de prevalencia en Shandong en 2010 de casos positivos de esputo fue de 22,1 (IC 95%: 9,6-34,6), casos confirmados bacteriológicamente fue de 36,8 (IC 95%: 17,8-55,8), y todos los casos fueron de 337,1 (IC 95%: 254,1-420,0) por 100.000 en población adulta (Tabla 2 ). Las tasas ajustadas de prevalencia de toda la población en Shandong fueron de 17,8 (IC 95%: 8,3-17,5), 27,8 (IC 95%: 14,8-28.0) y 239,4 (IC 95%: 179,9-298,9) por 100.000 en 2010. Se observó una notable disminución de 82,0%, 80,2% y 31,4% en las tasas de prevalencia de esputo positivo, confirmado bacteriológicamente, y en todos los casos, respectivamente, en comparación con las tasas ajustadas en 2000 [12]. Se observaron grandes descensos en los hombres de 40 a 65 años y en las mujeres de más de 60 años (Figura 2). Las tasas de prevalencia ajustada en la población adulta fueron 21,4 (IC 95%: 10,0-32,8), 33,5 (IC 95%: 17,8-49,2) y 285,8 (IC 95%: 254,2-356,4) para los casos positivos de esputo, casos confirmados bacteriológicamente y todos los casos, respectivamente. Se observaron diferencias significativas en las tasas de prevalencia ajustada de tuberculosis entre hombres y mujeres de más de 65 años y de 15 a 64 años, en las zonas rurales y urbanas (Tabla 2, P < 0,001 Las proporciones entre hombres y mujeres fueron 5,5 en casos positivos de esputo y 2,8 en casos confirmados bacteriológicamente, mientras que las proporciones aumentaron a 6,0 y 4,1 respectivamente, entre los mayores de 65 años; la mayoría de los pacientes con TB, 54,5% en casos positivos de esputo y 47,3% en casos confirmados bacteriológicamente, fueron de 65 años o más; la proporción entre mayores de 65 años y 15 a 64 años fue de 8,4 en casos positivos de esputo y 5,9 en casos confirmados bacteriológicamente; la proporción entre zonas rurales y urbanas fue de 2,7 en casos positivos de esputo y 4,8 en casos confirmados bacteriológicamente; el hallazgo más llamativo fue que una gran proporción de pacientes con TB no presentó tos consistente; el hallazgo pasivo de casos es la práctica habitual en países en desarrollo donde se realiza la microscopía de esputo para identificar casos de Una gran proporción de los casos de tuberculosis pueden no ser detectados utilizando este método como 53% de los casos confirmados bacteriológicamente y 45% de los casos positivos de esputo en este estudio no tuvieron tos persistente pero fueron identificados a través de CXRAY anormal. Casi la mitad de los casos confirmados bacteriológicamente no reportaron síntomas en los últimos seis meses. Este hallazgo, aunque inicialmente sorprendente, es consistente con reportes de Vietnam (47% de los casos confirmados bacteriológicamente no presentaban tos persistente) [14], Myanmar (38%) y Etiopía (48%) [13]. CXRAY fue sensible en la detección de casos de tuberculosis, ya que los rendimientos de casos confirmados bacteriológicamente fueron mucho más altos por CXRAY en comparación con la detección de síntomas, como se informó en Vietnam [15] y algunos entornos de alta prevalencia del VIH [16, 17]. Nuestros hallazgos sugieren que la estrategia de búsqueda de casos utilizando CXRAY seguido de esputo o cultivo como las pruebas primarias y secundarias de cribado podría ser más efectiva, especialmente entre la población de más de 65 años, ya que los rendimientos fueron mayores en más de 65 años en comparación con la Tabla 2 Prevalencia de casos de TB positivo de esputo, casos de TB confirmados bacteriológicamente y todos los casos en Shandong, China, 2010 No hay población. Aunque usar CXRAY para examinar a todos no es factible, puede ser utilizado en exámenes físicos de ancianos de rutina. El paquete de salud pública de China ahora cubre CXRAY gratis para ancianos, así como exámenes corporales anuales de empleados proporcionó CXRAY gratuito. En esta encuesta, sólo un paciente positivo de esputo había sido detectado y tratado por el programa nacional, aunque se realizó una consulta clínica específica para identificar a cualquier paciente que haya sido diagnosticado y tratado Esto puede reflejar la diferencia entre el enfoque de búsqueda de casos activos en la encuesta y el enfoque de búsqueda de casquillo pasivo en la práctica; sin embargo, indicó que una gran proporción de casos de TB confirmados bacteriológicamente no son atendidos por el programa nacional de TB. Otro cambio notable es la fuerte disminución de la proporción de casos positivos de esputo, que representó el 30,5% de todos los casos en la encuesta de 2000, pero se redujo al 6,6% en la encuesta de 2010. La proporción de casos de esputo notificados de todos los casos de TB en Shandong también disminuyó del 80,9% en 2005 al 64,6% en 2010 [19]. La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se ha reducido en un 80% en la última década en Shandong, en comparación con una disminución nacional del 45% (de 216/ 100.000 en 2000 a 119/ 100.000 en 2010] [4]. La rápida disminución de la prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente en la última década puede atribuirse al fortalecimiento del sistema de salud pública de China tras el brote de síndrome respiratorio agudo grave en 2003 [2]. Otra razón puede deberse a la mejora de la notificación de casos de tuberculosis en el sistema de notificación de enfermedades transmisibles en línea, y a la mejora de la colaboración entre los hospitales públicos y los dispensarios de tuberculosis [20]. Otros factores como el desarrollo económico social también pueden haber desempeñado un papel importante en la reducción de la prevalencia de la tuberculosis, como se encontró en un estudio de las tendencias de las tasas de notificación de la tuberculosis en 134 países [21]. La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente en Shandong fue inferior a las estimaciones de la OMS para China en 2010 [1]. Una de las razones es que los resultados de las encuestas de prevalencia se basan en el hallazgo de casos activos, mientras que las estimaciones de la OMS se basan en las tasas de notificación de los casos pasivos. Se necesita una reevaluación de la prevalencia de tuberculosis reportada en China basada en la encuesta reciente. CXRAY sugiere que los casos bacteriológicos negativos pueden ser casos de tuberculosis bacteriológicamente negativos si tenían algún síntoma de tuberculosis, mientras que algunos pueden ser causados por un frotis o cultivo subóptimo. Como se informó en encuestas anteriores de China [3, 22], incluyendo estos casos como casos de tuberculosis pueden resultar en una sobreestimación de todos los casos pulmonares [23]. La encuesta reveló que más de la mitad de los pacientes con tuberculosis tenían 65 años o más en Shandong, mientras que los más de 65 años tenían más probabilidades de presentarse con CXRAY anormal y tos persistente. Tendencias similares se han Estas altas tasas pueden reflejar las tasas de tuberculosis más altas en el pasado y la disminución de la inmunidad en los más de 65 años.Cómo tratar a los ancianos con tuberculosis y otras complicaciones como la diabetes sigue siendo un desafío continuo en China y entornos similares.Los resultados de la encuesta pueden generalizarse a la población de Shandong de 94 millones de habitantes o entornos internacionales similares con ingresos medios y niveles medios de prevalencia de la tuberculosis.Los patrones de la epidemia de tuberculosis encontrados en Shandong, es decir, la proporción de pacientes con síntomas, proporción entre zonas urbanas y rurales, hombres y mujeres, fueron similares a los encontrados en la encuesta nacional [4].Sin embargo, las tasas de prevalencia no pueden extrapolarse a las provincias occidentales de China con una mayor prevalencia de tuberculosis.Por razones logísticas, la población elegible no incluyó a los adultos que permanecieron en los grupos muestreados menos de 6 meses, lo que fue la misma práctica en la encuesta de 2000.Sin embargo, los migrantes a La encuesta no recopiló indicadores socioeconómicos, estado de tabaquismo y estado de VIH de todos los participantes, por lo que no se dispone de comparaciones entre los casos de tuberculosis y todos los pacientes no tratados con TB. Sin embargo, la prevalencia del VIH en Shandong China es inferior al 0,01%, y no alteraría significativamente la tasa de prevalencia de la TB. Además, la encuesta no evaluó la TB infantil y la TB pulmonar extra. Las discusiones sobre el uso de CXRAY como herramienta de cribado fueron en el aspecto técnico, pero no en el lado de los costos, ya que no realizamos ningún análisis de la relación costo-eficacia ni la voluntad social de pagar por tal estrategia en entornos similares. Este estudio ha demostrado que la prevalencia de TB confirmada bacteriológicamente en Shandong ha disminuido sustancialmente en la última década. Es importante destacar que la mayoría de estos casos no se presentaron con tos persistente y la proporción de Se recomiendan estudios adicionales para evaluar la viabilidad de la adopción de CXRAY en los servicios de salud existentes para detectar casos de tuberculosis y la relación costo-eficacia de dicha intervención.Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

¿Cuál fue la edad media de un participante del estudio?

Cambios en la prevalencia de la tuberculosis pulmonar: evidencia de la encuesta de población de 2010 en una populosa provincia de Chinahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3890533/SHA: eef61bdfa49b8652fd660b5b8b7e74cf51922505Autores: Wei, Xiaolin; Zhang, Xiulei; Yin, Jia; Walley, John; Beanland, Rachel; Zou, Guanyang; Zhang, Hongmei; Li, Fang; Liu, Zhimin; Zee, Benny CY; Griffiths, Sian MDate: 2014-01-11DOI: 10.1186/1471-2334-14-21Licencia: cc-byAbstract: ANTEGRON: Este documento informa de los resultados de la El objetivo de este estudio fue estimar la prevalencia de TB en la provincia en 2010 en comparación con la encuesta de 2000; y comparar el rendimiento de casos de TB de diferentes abordajes de búsqueda de casos.MÉTODOS: Se realizó una encuesta transversal basada en la población mediante muestreo aleatorio multietapa. En la encuesta participaron 54.279 adultos con una tasa de respuesta del 96%. Los médicos entrevistaron y clasificaron a los participantes como presuntos casos de TB si presentaban tos persistente, rayos X torácicos anormales (CXRAY) o ambos. Se recogieron tres especímenes de esputo de todos los casos sospechosos y se enviaron para microscopía y cultivo. RESULTADOS: La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente fue de 34 por 100.000 en adultos en Shandong en 2010. En comparación con la encuesta de 2000, la prevalencia de TB disminuyó en un 80%. El 53% de los casos Más del 50% de los casos de tuberculosis se encontraban entre los más de 65 años. CONCLUSIONES: La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se redujo significativamente en comparación con el año 2000. La encuesta planteó desafíos para identificar casos de tuberculosis sin síntomas claros. Texto: China, con una prevalencia estimada de todos los casos de tuberculosis de 108 por 100.000 en 2010, tiene la segunda carga de tuberculosis más alta del mundo, representando el 13% de todos los casos en todo el mundo [1]. La Organización Mundial de la Salud (OMS) estimó que China había alcanzado los objetivos de éxito en el tratamiento del 85% para 1993 y la tasa de detección de casos del 70% para 2005 [2]. Las encuestas nacionales de prevalencia de tuberculosis se llevaron a cabo en China en 1979, China en 1990, China en 2000, y 2010 [4]. Los resultados de la encuesta proporcionan estimaciones más precisas de las tasas de prevalencia de tuberculosis que las estimaciones de la OMS y pueden utilizarse para evaluar la probabilidad de que China Se trata de una provincia relativamente desarrollada con un PIB per cápita 1,6 veces el promedio nacional en 2010 [5]. La tasa de prevalencia de la TB en Shandong fue menor que la tasa media de China en 2000 [3]. En las encuestas de 2000 y 2010 se tomaron muestras representativas de la población en Shandong utilizando métodos similares. El objetivo del estudio fue estimar la prevalencia de la TB en Shandong con base en la encuesta de 2010, y comparar los resultados de las dos encuestas transversales. La población objetivo de la encuesta de prevalencia de la TB fue la población de 15 años o más que había vivido en los grupos seleccionados durante más de 6 meses. Se realizó una encuesta transversal basada en la población, utilizando el método de muestreo aleatorio multietapa. La encuesta utilizó los mismos métodos de muestreo que la encuesta nacional de China en 2010, que fue similar a los métodos de muestreo utilizados en 2000 [6]. El diseño de las encuestas estuvo de acuerdo con las recomendaciones de Se calculó el tamaño de la muestra de 52500 adultos (de 15 años de edad), en 35 conglomerados, con base en la detección de un cambio del 20% en la tasa de prevalencia de casos positivos de citología de tuberculosis en comparación con la tasa de la encuesta de 2000 (95 por 100.000), con una probabilidad superior al 95% y el 95% de potencia, con una tasa de respuesta del 90% de los participantes [9]. Se utilizó un muestreo aleatorio estratificado en varias etapas para seleccionar los 35 conglomerados dentro de 17 prefecturas de la provincia de Shandong. El número de conglomerados se asignó al azar en proporción a la población provincial en los niveles de prefectura, condado/distrito y municipio. Se definió un conglomerado como una comunidad (un pueblo en la zona rural o una comunidad residente en una zona urbana) con una población de 1250 a 1750 adultos (es decir, los de 15 años o más). Si la comunidad contenía menos de Si la comunidad o comunidades combinadas que contenían más de 1750 adultos, seleccionamos aleatoriamente los hogares y luego incluimos a todos los adultos en el hogar para la encuesta hasta que el número total de adultos seleccionados llegó a 1750. Se excluyeron los cuarteles militares y las prisiones ubicadas en el grupo [7]. La encuesta fue realizada de marzo a junio de 2010 por equipos de encuesta integrados por médicos clínicos, médicos de salud pública, radiólogos, técnicos de laboratorio y enfermeras. Se utilizó los medios de comunicación locales para promover el conocimiento de la encuesta. Los trabajadores comunitarios realizaron un censo casa por casa para actualizar la base de datos de residentes, informar a los participantes de la encuesta y obtener el consentimiento informado. El estudio no incluyó a niños menores de 15 años. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes de 16 años o más. Mientras que de los de 15 años se obtuvieron consentimientos informados por escrito de sus padres o tutores. Todos los documentos fueron almacenados Se obtuvieron aprobaciones éticas para el estudio y los procedimientos de consentimiento de la Junta de Revisión Institucional (IRB) del Hospital Chest de Shandong (número de registro NIHIRB00006010), quienes aceptaron participar en la encuesta fueron invitados al dispensario de TB del condado, donde completaron una consulta con un médico de TB clínico capacitado sobre cualquier síntoma sugestivo de TB, como tos persistente (durante dos semanas o más), hemoptisis, pérdida de peso y fiebre; todos los participantes recibieron una radiografía de tórax (CXRAY) que luego fueron revisados por un panel de radiólogos; aquellos con síntomas o películas CXRAY sugestivas de TB fueron clasificados como presuntos casos de TB; todos los casos sospechosos fueron solicitados para producir tres muestras de esputo, una en el momento de la consulta, otra en la noche y la tercera en la madrugada del día siguiente. Los sospechosos identificados completaron un cuestionario adicional sobre su situación socioeconómica, su estado de tabaquismo y la presencia de síntomas relacionados con la tuberculosis en los seis meses anteriores (tos, fiebre, pérdida de peso, dolor torácico y hemoptisis).Se realizaron frotis de esputo en dispensarios locales de tuberculosis.Todas las muestras de esputo se cultivaron utilizando el medio Löwenstein-Jensen en el laboratorio provincial en un plazo de 24 horas utilizando el transporte en cadena fría.Las muestras se excluyeron de la tuberculosis cuando se identificaron bacilos no tuberculosos del cultivo.Todas las muestras de esputo se realizaron estrictamente de acuerdo con la medida de control de calidad externa del laboratorio nacional de tuberculosis, que es coherente con la directriz de la encuesta de prevalencia de la tuberculosis de la OMS [7].La clasificación de la tuberculosis se realizó de acuerdo con la directriz nacional china de tuberculosis [10]. Los pacientes con citología de esputo positiva fueron clasificados como casos positivos de esputo; los pacientes con citología de esputo positivo o de cultivo fueron clasificados como casos bacteriológicos confirmados como esputo bacteriológico; aquellos con cultivo negativo con CXRAY anormal sugestivo de TB y excluidos de otras enfermedades por médicos y radiólogos fueron clasificados como CXRAY sugestivo de casos bacteriológicos negativos; por limitaciones de recursos no se aplicó la recomendación de agentes antimicrobianos de amplio espectro para confirmar el diagnóstico de casos negativos de TB [11]. Los casos recién diagnosticados fueron diferenciados de casos previamente diagnosticados mediante controles durante las entrevistas y contra el sistema de registro de TB; el diagnóstico inicial fue realizado por un grupo de médicos y radiólogos locales; posteriormente, muestras y películas de CXRAY de todos los casos sospechosos y confirmados fueron reevaluados por un grupo de Las películas de CXRAY del 100% de las que fueron calificadas como anormales y las muestras aleatorias de 10% de las que fueron calificadas como normales fueron transferidas para lectura independiente. El equipo de laboratorio provincial examinó aleatoriamente una diapositiva de las tres muestras de casos positivos de esputo, las tres muestras de casos de TB sugerentes de CXRAY y seleccionó aleatoriamente el 10% de los casos no TB. Se calcularon estimaciones de prevalencia de los casos positivos de esputo, confirmados bacteriológicamente y todos los casos de TB. En todos los análisis se utilizaron ponderaciones de población para ajustar el efecto de diseño de muestreo multietapa estratificado [8]. Los resultados de la encuesta en 2010 y 2000 se estandarizaron con las estructuras de edad de la población del censo de China en 2010. La encuesta de prevalencia de TB de 2000 incluyó todos los grupos de edad [12]. El método recomendado por Se realizó el análisis de subgrupos en género, grupos de edad y residencia urbana/rural, se calculó la tasa de identificación de casos como el número de casos identificados por un método de cribado en todos los casos sospechosos encontrados por el método, se calcularon los rendimientos de la consulta sintomática y CXRAY como proporción del número total de casos confirmados bacteriológicamente, se seleccionaron 17 conglomerados urbanos y 18 conglomerados rurales, con una población total de 89.093, de los cuales 56.671 fueron elegibles para la encuesta (Figura 1 ), la tasa de respuesta osciló entre el 95% y el 97% en diferentes conglomerados. 54.279 participantes asistieron a la consulta clínica y fueron examinados por CXRAY, de los cuales el 47% eran varones; la edad promedio fue de 46 años con 14% de 65 años y se encontraron un total de 572 casos sospechosos de tuberculosis De estos, 264 (46%) fueron identificados en base a anomalías CXRAY, 228 (40%) se basaron en tos persistente, 80 (14%) se basaron en ambos, la encuesta diagnosticó 172 nuevos casos, incluyendo 19 nuevos casos confirmados bacteriológicamente (incluyendo 11 casos positivos de esputo y cultivo, y 8 casos negativos de esputo pero positivos de cultivo) y 153 casos bacteriológicos sugerentes CXRAY. La encuesta también identificó 11 casos existentes registrados en el programa nacional de TB. Además, la encuesta encontró cuatro casos con cultivo positivo de bacilos de no tuberculosis, y los excluyó de los pacientes de TB. Todos los participantes de la encuesta fueron examinados por primera vez por síntomas y CXRAY. Aquellos que tenían síntomas de tos o hemoptisis consistentes, o anomalías CXRAY fueron examinados por frotis y cultura. Las tasas de identificación de casos nuevos confirmados bacteriológicamente de los casos sospechosos fueron significativamente mayores con CXRAY como herramienta primaria (Figura 1, 3,8%, P = 0,012) y aumentaron tanto la pantalla de síntomas de tos persistente como la CXRAY (10%, P < 0,001) en comparación con la pantalla de síntomas solo (0,4%); se observó el mismo patrón de tasa de identificación de casos en los casos positivos de esputo (7,5%, 1,9% y 0% respectivamente); la proporción de casos confirmados bacteriológicamente no fue significativamente mayor entre los casos confirmados bacteriológicamente en comparación con otros sospechosos (P = 0,565); solo la consulta sintomática identificó 308 sospechosos, incluyendo 6 (1,9%) TB positiva de frotis de esputo y 9 (2,9%) TB confirmada bacteriológicamente; entre los 344 sospechosos con anomalías CXRA El rendimiento de los casos confirmados bacteriológicamente fue del 47,4% por consulta de cribado y del 94,7% por CXRAY. En la población de más de 65 años, la consulta de síntomas y la CXRAY identificaron 174 y 182 casos sospechosos respectivamente, lo que arrojó 5 (2,9%) y 9 (4,9%) de casos confirmados bacteriológicamente. Los rendimientos de los casos confirmados bacteriológicamente fueron del 55,6% por consulta de síntomas y del 100% por CXRAY entre los más de 65. De los 512 casos sospechosos que completaron el cuestionario adicional, el 42% eran agricultores y el 31% eran fumadores actuales (Tabla 1). De los diez casos confirmados bacteriológicamente que no presentaron tos persistente en la encuesta de prevalencia, uno tosió durante dos días, uno tuvo dolor torácico y los otros ocho no presentaron síntomas de TB en los últimos seis meses. La tasa bruta de prevalencia en Shandong en 2010 de casos positivos de esputo fue de 22,1 (IC 95%: 9,6-34,6), casos confirmados bacteriológicamente fue de 36,8 (IC 95%: 17,8-55,8), y todos los casos fueron de 337,1 (IC 95%: 254,1-420,0) por 100.000 en población adulta (Tabla 2 ). Las tasas ajustadas de prevalencia de toda la población en Shandong fueron de 17,8 (IC 95%: 8,3-17,5), 27,8 (IC 95%: 14,8-28.0) y 239,4 (IC 95%: 179,9-298,9) por 100.000 en 2010. Se observó una notable disminución de 82,0%, 80,2% y 31,4% en las tasas de prevalencia de esputo positivo, confirmado bacteriológicamente, y en todos los casos, respectivamente, en comparación con las tasas ajustadas en 2000 [12]. Se observaron grandes descensos en los hombres de 40 a 65 años y en las mujeres de más de 60 años (Figura 2). Las tasas de prevalencia ajustada en la población adulta fueron 21,4 (IC 95%: 10,0-32,8), 33,5 (IC 95%: 17,8-49,2) y 285,8 (IC 95%: 254,2-356,4) para los casos positivos de esputo, casos confirmados bacteriológicamente y todos los casos, respectivamente. Se observaron diferencias significativas en las tasas de prevalencia ajustada de tuberculosis entre hombres y mujeres de más de 65 años y de 15 a 64 años, en las zonas rurales y urbanas (Tabla 2, P < 0,001 Las proporciones entre hombres y mujeres fueron 5,5 en casos positivos de esputo y 2,8 en casos confirmados bacteriológicamente, mientras que las proporciones aumentaron a 6,0 y 4,1 respectivamente, entre los mayores de 65 años; la mayoría de los pacientes con TB, 54,5% en casos positivos de esputo y 47,3% en casos confirmados bacteriológicamente, fueron de 65 años o más; la proporción entre mayores de 65 años y 15 a 64 años fue de 8,4 en casos positivos de esputo y 5,9 en casos confirmados bacteriológicamente; la proporción entre zonas rurales y urbanas fue de 2,7 en casos positivos de esputo y 4,8 en casos confirmados bacteriológicamente; el hallazgo más llamativo fue que una gran proporción de pacientes con TB no presentó tos consistente; el hallazgo pasivo de casos es la práctica habitual en países en desarrollo donde se realiza la microscopía de esputo para identificar casos de Una gran proporción de los casos de tuberculosis pueden no ser detectados utilizando este método como 53% de los casos confirmados bacteriológicamente y 45% de los casos positivos de esputo en este estudio no tuvieron tos persistente pero fueron identificados a través de CXRAY anormal. Casi la mitad de los casos confirmados bacteriológicamente no reportaron síntomas en los últimos seis meses. Este hallazgo, aunque inicialmente sorprendente, es consistente con reportes de Vietnam (47% de los casos confirmados bacteriológicamente no presentaban tos persistente) [14], Myanmar (38%) y Etiopía (48%) [13]. CXRAY fue sensible en la detección de casos de tuberculosis, ya que los rendimientos de casos confirmados bacteriológicamente fueron mucho más altos por CXRAY en comparación con la detección de síntomas, como se informó en Vietnam [15] y algunos entornos de alta prevalencia del VIH [16, 17]. Nuestros hallazgos sugieren que la estrategia de búsqueda de casos utilizando CXRAY seguido de esputo o cultivo como las pruebas primarias y secundarias de cribado podría ser más efectiva, especialmente entre la población de más de 65 años, ya que los rendimientos fueron mayores en más de 65 años en comparación con la Tabla 2 Prevalencia de casos de TB positivo de esputo, casos de TB confirmados bacteriológicamente y todos los casos en Shandong, China, 2010 No hay población. Aunque usar CXRAY para examinar a todos no es factible, puede ser utilizado en exámenes físicos de ancianos de rutina. El paquete de salud pública de China ahora cubre CXRAY gratis para ancianos, así como exámenes corporales anuales de empleados proporcionó CXRAY gratuito. En esta encuesta, sólo un paciente positivo de esputo había sido detectado y tratado por el programa nacional, aunque se realizó una consulta clínica específica para identificar a cualquier paciente que haya sido diagnosticado y tratado Esto puede reflejar la diferencia entre el enfoque de búsqueda de casos activos en la encuesta y el enfoque de búsqueda de casquillo pasivo en la práctica; sin embargo, indicó que una gran proporción de casos de TB confirmados bacteriológicamente no son atendidos por el programa nacional de TB. Otro cambio notable es la fuerte disminución de la proporción de casos positivos de esputo, que representó el 30,5% de todos los casos en la encuesta de 2000, pero se redujo al 6,6% en la encuesta de 2010. La proporción de casos de esputo notificados de todos los casos de TB en Shandong también disminuyó del 80,9% en 2005 al 64,6% en 2010 [19]. La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se ha reducido en un 80% en la última década en Shandong, en comparación con una disminución nacional del 45% (de 216/ 100.000 en 2000 a 119/ 100.000 en 2010] [4]. La rápida disminución de la prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente en la última década puede atribuirse al fortalecimiento del sistema de salud pública de China tras el brote de síndrome respiratorio agudo grave en 2003 [2]. Otra razón puede deberse a la mejora de la notificación de casos de tuberculosis en el sistema de notificación de enfermedades transmisibles en línea, y a la mejora de la colaboración entre los hospitales públicos y los dispensarios de tuberculosis [20]. Otros factores como el desarrollo económico social también pueden haber desempeñado un papel importante en la reducción de la prevalencia de la tuberculosis, como se encontró en un estudio de las tendencias de las tasas de notificación de la tuberculosis en 134 países [21]. La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente en Shandong fue inferior a las estimaciones de la OMS para China en 2010 [1]. Una de las razones es que los resultados de las encuestas de prevalencia se basan en el hallazgo de casos activos, mientras que las estimaciones de la OMS se basan en las tasas de notificación de los casos pasivos. Se necesita una reevaluación de la prevalencia de tuberculosis reportada en China basada en la encuesta reciente. CXRAY sugiere que los casos bacteriológicos negativos pueden ser casos de tuberculosis bacteriológicamente negativos si tenían algún síntoma de tuberculosis, mientras que algunos pueden ser causados por un frotis o cultivo subóptimo. Como se informó en encuestas anteriores de China [3, 22], incluyendo estos casos como casos de tuberculosis pueden resultar en una sobreestimación de todos los casos pulmonares [23]. La encuesta reveló que más de la mitad de los pacientes con tuberculosis tenían 65 años o más en Shandong, mientras que los más de 65 años tenían más probabilidades de presentarse con CXRAY anormal y tos persistente. Tendencias similares se han Estas altas tasas pueden reflejar las tasas de tuberculosis más altas en el pasado y la disminución de la inmunidad en los más de 65 años.Cómo tratar a los ancianos con tuberculosis y otras complicaciones como la diabetes sigue siendo un desafío continuo en China y entornos similares.Los resultados de la encuesta pueden generalizarse a la población de Shandong de 94 millones de habitantes o entornos internacionales similares con ingresos medios y niveles medios de prevalencia de la tuberculosis.Los patrones de la epidemia de tuberculosis encontrados en Shandong, es decir, la proporción de pacientes con síntomas, proporción entre zonas urbanas y rurales, hombres y mujeres, fueron similares a los encontrados en la encuesta nacional [4].Sin embargo, las tasas de prevalencia no pueden extrapolarse a las provincias occidentales de China con una mayor prevalencia de tuberculosis.Por razones logísticas, la población elegible no incluyó a los adultos que permanecieron en los grupos muestreados menos de 6 meses, lo que fue la misma práctica en la encuesta de 2000.Sin embargo, los migrantes a La encuesta no recopiló indicadores socioeconómicos, estado de tabaquismo y estado de VIH de todos los participantes, por lo que no se dispone de comparaciones entre los casos de tuberculosis y todos los pacientes no tratados con TB. Sin embargo, la prevalencia del VIH en Shandong China es inferior al 0,01%, y no alteraría significativamente la tasa de prevalencia de la TB. Además, la encuesta no evaluó la TB infantil y la TB pulmonar extra. Las discusiones sobre el uso de CXRAY como herramienta de cribado fueron en el aspecto técnico, pero no en el lado de los costos, ya que no realizamos ningún análisis de la relación costo-eficacia ni la voluntad social de pagar por tal estrategia en entornos similares. Este estudio ha demostrado que la prevalencia de TB confirmada bacteriológicamente en Shandong ha disminuido sustancialmente en la última década. Es importante destacar que la mayoría de estos casos no se presentaron con tos persistente y la proporción de Se recomiendan estudios adicionales para evaluar la viabilidad de la adopción de CXRAY en los servicios de salud existentes para detectar casos de tuberculosis y la relación costo-eficacia de dicha intervención.Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

¿Cuántos casos de pacientes con tuberculosis positiva al esputo no tuvieron tos persistente?

Cambios en la prevalencia de la tuberculosis pulmonar: evidencia de la encuesta de población de 2010 en una populosa provincia de Chinahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3890533/SHA: eef61bdfa49b8652fd660b5b8b7e74cf51922505Autores: Wei, Xiaolin; Zhang, Xiulei; Yin, Jia; Walley, John; Beanland, Rachel; Zou, Guanyang; Zhang, Hongmei; Li, Fang; Liu, Zhimin; Zee, Benny CY; Griffiths, Sian MDate: 2014-01-11DOI: 10.1186/1471-2334-14-21Licencia: cc-byAbstract: ANTEGRON: Este documento informa de los resultados de la El objetivo de este estudio fue estimar la prevalencia de TB en la provincia en 2010 en comparación con la encuesta de 2000; y comparar el rendimiento de casos de TB de diferentes abordajes de búsqueda de casos.MÉTODOS: Se realizó una encuesta transversal basada en la población mediante muestreo aleatorio multietapa. En la encuesta participaron 54.279 adultos con una tasa de respuesta del 96%. Los médicos entrevistaron y clasificaron a los participantes como presuntos casos de TB si presentaban tos persistente, rayos X torácicos anormales (CXRAY) o ambos. Se recogieron tres especímenes de esputo de todos los casos sospechosos y se enviaron para microscopía y cultivo. RESULTADOS: La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente fue de 34 por 100.000 en adultos en Shandong en 2010. En comparación con la encuesta de 2000, la prevalencia de TB disminuyó en un 80%. El 53% de los casos Más del 50% de los casos de tuberculosis se encontraban entre los más de 65 años. CONCLUSIONES: La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se redujo significativamente en comparación con el año 2000. La encuesta planteó desafíos para identificar casos de tuberculosis sin síntomas claros. Texto: China, con una prevalencia estimada de todos los casos de tuberculosis de 108 por 100.000 en 2010, tiene la segunda carga de tuberculosis más alta del mundo, representando el 13% de todos los casos en todo el mundo [1]. La Organización Mundial de la Salud (OMS) estimó que China había alcanzado los objetivos de éxito en el tratamiento del 85% para 1993 y la tasa de detección de casos del 70% para 2005 [2]. Las encuestas nacionales de prevalencia de tuberculosis se llevaron a cabo en China en 1979, China en 1990, China en 2000, y 2010 [4]. Los resultados de la encuesta proporcionan estimaciones más precisas de las tasas de prevalencia de tuberculosis que las estimaciones de la OMS y pueden utilizarse para evaluar la probabilidad de que China Se trata de una provincia relativamente desarrollada con un PIB per cápita 1,6 veces el promedio nacional en 2010 [5]. La tasa de prevalencia de la TB en Shandong fue menor que la tasa media de China en 2000 [3]. En las encuestas de 2000 y 2010 se tomaron muestras representativas de la población en Shandong utilizando métodos similares. El objetivo del estudio fue estimar la prevalencia de la TB en Shandong con base en la encuesta de 2010, y comparar los resultados de las dos encuestas transversales. La población objetivo de la encuesta de prevalencia de la TB fue la población de 15 años o más que había vivido en los grupos seleccionados durante más de 6 meses. Se realizó una encuesta transversal basada en la población, utilizando el método de muestreo aleatorio multietapa. La encuesta utilizó los mismos métodos de muestreo que la encuesta nacional de China en 2010, que fue similar a los métodos de muestreo utilizados en 2000 [6]. El diseño de las encuestas estuvo de acuerdo con las recomendaciones de Se calculó el tamaño de la muestra de 52500 adultos (de 15 años de edad), en 35 conglomerados, con base en la detección de un cambio del 20% en la tasa de prevalencia de casos positivos de citología de tuberculosis en comparación con la tasa de la encuesta de 2000 (95 por 100.000), con una probabilidad superior al 95% y el 95% de potencia, con una tasa de respuesta del 90% de los participantes [9]. Se utilizó un muestreo aleatorio estratificado en varias etapas para seleccionar los 35 conglomerados dentro de 17 prefecturas de la provincia de Shandong. El número de conglomerados se asignó al azar en proporción a la población provincial en los niveles de prefectura, condado/distrito y municipio. Se definió un conglomerado como una comunidad (un pueblo en la zona rural o una comunidad residente en una zona urbana) con una población de 1250 a 1750 adultos (es decir, los de 15 años o más). Si la comunidad contenía menos de Si la comunidad o comunidades combinadas que contenían más de 1750 adultos, seleccionamos aleatoriamente los hogares y luego incluimos a todos los adultos en el hogar para la encuesta hasta que el número total de adultos seleccionados llegó a 1750. Se excluyeron los cuarteles militares y las prisiones ubicadas en el grupo [7]. La encuesta fue realizada de marzo a junio de 2010 por equipos de encuesta integrados por médicos clínicos, médicos de salud pública, radiólogos, técnicos de laboratorio y enfermeras. Se utilizó los medios de comunicación locales para promover el conocimiento de la encuesta. Los trabajadores comunitarios realizaron un censo casa por casa para actualizar la base de datos de residentes, informar a los participantes de la encuesta y obtener el consentimiento informado. El estudio no incluyó a niños menores de 15 años. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes de 16 años o más. Mientras que de los de 15 años se obtuvieron consentimientos informados por escrito de sus padres o tutores. Todos los documentos fueron almacenados Se obtuvieron aprobaciones éticas para el estudio y los procedimientos de consentimiento de la Junta de Revisión Institucional (IRB) del Hospital Chest de Shandong (número de registro NIHIRB00006010), quienes aceptaron participar en la encuesta fueron invitados al dispensario de TB del condado, donde completaron una consulta con un médico de TB clínico capacitado sobre cualquier síntoma sugestivo de TB, como tos persistente (durante dos semanas o más), hemoptisis, pérdida de peso y fiebre; todos los participantes recibieron una radiografía de tórax (CXRAY) que luego fueron revisados por un panel de radiólogos; aquellos con síntomas o películas CXRAY sugestivas de TB fueron clasificados como presuntos casos de TB; todos los casos sospechosos fueron solicitados para producir tres muestras de esputo, una en el momento de la consulta, otra en la noche y la tercera en la madrugada del día siguiente. Los sospechosos identificados completaron un cuestionario adicional sobre su situación socioeconómica, su estado de tabaquismo y la presencia de síntomas relacionados con la tuberculosis en los seis meses anteriores (tos, fiebre, pérdida de peso, dolor torácico y hemoptisis).Se realizaron frotis de esputo en dispensarios locales de tuberculosis.Todas las muestras de esputo se cultivaron utilizando el medio Löwenstein-Jensen en el laboratorio provincial en un plazo de 24 horas utilizando el transporte en cadena fría.Las muestras se excluyeron de la tuberculosis cuando se identificaron bacilos no tuberculosos del cultivo.Todas las muestras de esputo se realizaron estrictamente de acuerdo con la medida de control de calidad externa del laboratorio nacional de tuberculosis, que es coherente con la directriz de la encuesta de prevalencia de la tuberculosis de la OMS [7].La clasificación de la tuberculosis se realizó de acuerdo con la directriz nacional china de tuberculosis [10]. Los pacientes con citología de esputo positiva fueron clasificados como casos positivos de esputo; los pacientes con citología de esputo positivo o de cultivo fueron clasificados como casos bacteriológicos confirmados como esputo bacteriológico; aquellos con cultivo negativo con CXRAY anormal sugestivo de TB y excluidos de otras enfermedades por médicos y radiólogos fueron clasificados como CXRAY sugestivo de casos bacteriológicos negativos; por limitaciones de recursos no se aplicó la recomendación de agentes antimicrobianos de amplio espectro para confirmar el diagnóstico de casos negativos de TB [11]. Los casos recién diagnosticados fueron diferenciados de casos previamente diagnosticados mediante controles durante las entrevistas y contra el sistema de registro de TB; el diagnóstico inicial fue realizado por un grupo de médicos y radiólogos locales; posteriormente, muestras y películas de CXRAY de todos los casos sospechosos y confirmados fueron reevaluados por un grupo de Las películas de CXRAY del 100% de las que fueron calificadas como anormales y las muestras aleatorias de 10% de las que fueron calificadas como normales fueron transferidas para lectura independiente. El equipo de laboratorio provincial examinó aleatoriamente una diapositiva de las tres muestras de casos positivos de esputo, las tres muestras de casos de TB sugerentes de CXRAY y seleccionó aleatoriamente el 10% de los casos no TB. Se calcularon estimaciones de prevalencia de los casos positivos de esputo, confirmados bacteriológicamente y todos los casos de TB. En todos los análisis se utilizaron ponderaciones de población para ajustar el efecto de diseño de muestreo multietapa estratificado [8]. Los resultados de la encuesta en 2010 y 2000 se estandarizaron con las estructuras de edad de la población del censo de China en 2010. La encuesta de prevalencia de TB de 2000 incluyó todos los grupos de edad [12]. El método recomendado por Se realizó el análisis de subgrupos en género, grupos de edad y residencia urbana/rural, se calculó la tasa de identificación de casos como el número de casos identificados por un método de cribado en todos los casos sospechosos encontrados por el método, se calcularon los rendimientos de la consulta sintomática y CXRAY como proporción del número total de casos confirmados bacteriológicamente, se seleccionaron 17 conglomerados urbanos y 18 conglomerados rurales, con una población total de 89.093, de los cuales 56.671 fueron elegibles para la encuesta (Figura 1 ), la tasa de respuesta osciló entre el 95% y el 97% en diferentes conglomerados. 54.279 participantes asistieron a la consulta clínica y fueron examinados por CXRAY, de los cuales el 47% eran varones; la edad promedio fue de 46 años con 14% de 65 años y se encontraron un total de 572 casos sospechosos de tuberculosis De estos, 264 (46%) fueron identificados en base a anomalías CXRAY, 228 (40%) se basaron en tos persistente, 80 (14%) se basaron en ambos, la encuesta diagnosticó 172 nuevos casos, incluyendo 19 nuevos casos confirmados bacteriológicamente (incluyendo 11 casos positivos de esputo y cultivo, y 8 casos negativos de esputo pero positivos de cultivo) y 153 casos bacteriológicos sugerentes CXRAY. La encuesta también identificó 11 casos existentes registrados en el programa nacional de TB. Además, la encuesta encontró cuatro casos con cultivo positivo de bacilos de no tuberculosis, y los excluyó de los pacientes de TB. Todos los participantes de la encuesta fueron examinados por primera vez por síntomas y CXRAY. Aquellos que tenían síntomas de tos o hemoptisis consistentes, o anomalías CXRAY fueron examinados por frotis y cultura. Las tasas de identificación de casos nuevos confirmados bacteriológicamente de los casos sospechosos fueron significativamente mayores con CXRAY como herramienta primaria (Figura 1, 3,8%, P = 0,012) y aumentaron tanto la pantalla de síntomas de tos persistente como la CXRAY (10%, P < 0,001) en comparación con la pantalla de síntomas solo (0,4%); se observó el mismo patrón de tasa de identificación de casos en los casos positivos de esputo (7,5%, 1,9% y 0% respectivamente); la proporción de casos confirmados bacteriológicamente no fue significativamente mayor entre los casos confirmados bacteriológicamente en comparación con otros sospechosos (P = 0,565); solo la consulta sintomática identificó 308 sospechosos, incluyendo 6 (1,9%) TB positiva de frotis de esputo y 9 (2,9%) TB confirmada bacteriológicamente; entre los 344 sospechosos con anomalías CXRA El rendimiento de los casos confirmados bacteriológicamente fue del 47,4% por consulta de cribado y del 94,7% por CXRAY. En la población de más de 65 años, la consulta de síntomas y la CXRAY identificaron 174 y 182 casos sospechosos respectivamente, lo que arrojó 5 (2,9%) y 9 (4,9%) de casos confirmados bacteriológicamente. Los rendimientos de los casos confirmados bacteriológicamente fueron del 55,6% por consulta de síntomas y del 100% por CXRAY entre los más de 65. De los 512 casos sospechosos que completaron el cuestionario adicional, el 42% eran agricultores y el 31% eran fumadores actuales (Tabla 1). De los diez casos confirmados bacteriológicamente que no presentaron tos persistente en la encuesta de prevalencia, uno tosió durante dos días, uno tuvo dolor torácico y los otros ocho no presentaron síntomas de TB en los últimos seis meses. La tasa bruta de prevalencia en Shandong en 2010 de casos positivos de esputo fue de 22,1 (IC 95%: 9,6-34,6), casos confirmados bacteriológicamente fue de 36,8 (IC 95%: 17,8-55,8), y todos los casos fueron de 337,1 (IC 95%: 254,1-420,0) por 100.000 en población adulta (Tabla 2 ). Las tasas ajustadas de prevalencia de toda la población en Shandong fueron de 17,8 (IC 95%: 8,3-17,5), 27,8 (IC 95%: 14,8-28.0) y 239,4 (IC 95%: 179,9-298,9) por 100.000 en 2010. Se observó una notable disminución de 82,0%, 80,2% y 31,4% en las tasas de prevalencia de esputo positivo, confirmado bacteriológicamente, y en todos los casos, respectivamente, en comparación con las tasas ajustadas en 2000 [12]. Se observaron grandes descensos en los hombres de 40 a 65 años y en las mujeres de más de 60 años (Figura 2). Las tasas de prevalencia ajustada en la población adulta fueron 21,4 (IC 95%: 10,0-32,8), 33,5 (IC 95%: 17,8-49,2) y 285,8 (IC 95%: 254,2-356,4) para los casos positivos de esputo, casos confirmados bacteriológicamente y todos los casos, respectivamente. Se observaron diferencias significativas en las tasas de prevalencia ajustada de tuberculosis entre hombres y mujeres de más de 65 años y de 15 a 64 años, en las zonas rurales y urbanas (Tabla 2, P < 0,001 Las proporciones entre hombres y mujeres fueron 5,5 en casos positivos de esputo y 2,8 en casos confirmados bacteriológicamente, mientras que las proporciones aumentaron a 6,0 y 4,1 respectivamente, entre los mayores de 65 años; la mayoría de los pacientes con TB, 54,5% en casos positivos de esputo y 47,3% en casos confirmados bacteriológicamente, fueron de 65 años o más; la proporción entre mayores de 65 años y 15 a 64 años fue de 8,4 en casos positivos de esputo y 5,9 en casos confirmados bacteriológicamente; la proporción entre zonas rurales y urbanas fue de 2,7 en casos positivos de esputo y 4,8 en casos confirmados bacteriológicamente; el hallazgo más llamativo fue que una gran proporción de pacientes con TB no presentó tos consistente; el hallazgo pasivo de casos es la práctica habitual en países en desarrollo donde se realiza la microscopía de esputo para identificar casos de Una gran proporción de los casos de tuberculosis pueden no ser detectados utilizando este método como 53% de los casos confirmados bacteriológicamente y 45% de los casos positivos de esputo en este estudio no tuvieron tos persistente pero fueron identificados a través de CXRAY anormal. Casi la mitad de los casos confirmados bacteriológicamente no reportaron síntomas en los últimos seis meses. Este hallazgo, aunque inicialmente sorprendente, es consistente con reportes de Vietnam (47% de los casos confirmados bacteriológicamente no presentaban tos persistente) [14], Myanmar (38%) y Etiopía (48%) [13]. CXRAY fue sensible en la detección de casos de tuberculosis, ya que los rendimientos de casos confirmados bacteriológicamente fueron mucho más altos por CXRAY en comparación con la detección de síntomas, como se informó en Vietnam [15] y algunos entornos de alta prevalencia del VIH [16, 17]. Nuestros hallazgos sugieren que la estrategia de búsqueda de casos utilizando CXRAY seguido de esputo o cultivo como las pruebas primarias y secundarias de cribado podría ser más efectiva, especialmente entre la población de más de 65 años, ya que los rendimientos fueron mayores en más de 65 años en comparación con la Tabla 2 Prevalencia de casos de TB positivo de esputo, casos de TB confirmados bacteriológicamente y todos los casos en Shandong, China, 2010 No hay población. Aunque usar CXRAY para examinar a todos no es factible, puede ser utilizado en exámenes físicos de ancianos de rutina. El paquete de salud pública de China ahora cubre CXRAY gratis para ancianos, así como exámenes corporales anuales de empleados proporcionó CXRAY gratuito. En esta encuesta, sólo un paciente positivo de esputo había sido detectado y tratado por el programa nacional, aunque se realizó una consulta clínica específica para identificar a cualquier paciente que haya sido diagnosticado y tratado Esto puede reflejar la diferencia entre el enfoque de búsqueda de casos activos en la encuesta y el enfoque de búsqueda de casquillo pasivo en la práctica; sin embargo, indicó que una gran proporción de casos de TB confirmados bacteriológicamente no son atendidos por el programa nacional de TB. Otro cambio notable es la fuerte disminución de la proporción de casos positivos de esputo, que representó el 30,5% de todos los casos en la encuesta de 2000, pero se redujo al 6,6% en la encuesta de 2010. La proporción de casos de esputo notificados de todos los casos de TB en Shandong también disminuyó del 80,9% en 2005 al 64,6% en 2010 [19]. La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se ha reducido en un 80% en la última década en Shandong, en comparación con una disminución nacional del 45% (de 216/ 100.000 en 2000 a 119/ 100.000 en 2010] [4]. La rápida disminución de la prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente en la última década puede atribuirse al fortalecimiento del sistema de salud pública de China tras el brote de síndrome respiratorio agudo grave en 2003 [2]. Otra razón puede deberse a la mejora de la notificación de casos de tuberculosis en el sistema de notificación de enfermedades transmisibles en línea, y a la mejora de la colaboración entre los hospitales públicos y los dispensarios de tuberculosis [20]. Otros factores como el desarrollo económico social también pueden haber desempeñado un papel importante en la reducción de la prevalencia de la tuberculosis, como se encontró en un estudio de las tendencias de las tasas de notificación de la tuberculosis en 134 países [21]. La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente en Shandong fue inferior a las estimaciones de la OMS para China en 2010 [1]. Una de las razones es que los resultados de las encuestas de prevalencia se basan en el hallazgo de casos activos, mientras que las estimaciones de la OMS se basan en las tasas de notificación de los casos pasivos. Se necesita una reevaluación de la prevalencia de tuberculosis reportada en China basada en la encuesta reciente. CXRAY sugiere que los casos bacteriológicos negativos pueden ser casos de tuberculosis bacteriológicamente negativos si tenían algún síntoma de tuberculosis, mientras que algunos pueden ser causados por un frotis o cultivo subóptimo. Como se informó en encuestas anteriores de China [3, 22], incluyendo estos casos como casos de tuberculosis pueden resultar en una sobreestimación de todos los casos pulmonares [23]. La encuesta reveló que más de la mitad de los pacientes con tuberculosis tenían 65 años o más en Shandong, mientras que los más de 65 años tenían más probabilidades de presentarse con CXRAY anormal y tos persistente. Tendencias similares se han Estas altas tasas pueden reflejar las tasas de tuberculosis más altas en el pasado y la disminución de la inmunidad en los más de 65 años.Cómo tratar a los ancianos con tuberculosis y otras complicaciones como la diabetes sigue siendo un desafío continuo en China y entornos similares.Los resultados de la encuesta pueden generalizarse a la población de Shandong de 94 millones de habitantes o entornos internacionales similares con ingresos medios y niveles medios de prevalencia de la tuberculosis.Los patrones de la epidemia de tuberculosis encontrados en Shandong, es decir, la proporción de pacientes con síntomas, proporción entre zonas urbanas y rurales, hombres y mujeres, fueron similares a los encontrados en la encuesta nacional [4].Sin embargo, las tasas de prevalencia no pueden extrapolarse a las provincias occidentales de China con una mayor prevalencia de tuberculosis.Por razones logísticas, la población elegible no incluyó a los adultos que permanecieron en los grupos muestreados menos de 6 meses, lo que fue la misma práctica en la encuesta de 2000.Sin embargo, los migrantes a La encuesta no recopiló indicadores socioeconómicos, estado de tabaquismo y estado de VIH de todos los participantes, por lo que no se dispone de comparaciones entre los casos de tuberculosis y todos los pacientes no tratados con TB. Sin embargo, la prevalencia del VIH en Shandong China es inferior al 0,01%, y no alteraría significativamente la tasa de prevalencia de la TB. Además, la encuesta no evaluó la TB infantil y la TB pulmonar extra. Las discusiones sobre el uso de CXRAY como herramienta de cribado fueron en el aspecto técnico, pero no en el lado de los costos, ya que no realizamos ningún análisis de la relación costo-eficacia ni la voluntad social de pagar por tal estrategia en entornos similares. Este estudio ha demostrado que la prevalencia de TB confirmada bacteriológicamente en Shandong ha disminuido sustancialmente en la última década. Es importante destacar que la mayoría de estos casos no se presentaron con tos persistente y la proporción de Se recomiendan estudios adicionales para evaluar la viabilidad de la adopción de CXRAY en los servicios de salud existentes para detectar casos de tuberculosis y la relación costo-eficacia de dicha intervención.Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

¿Cuántos pacientes de tuberculosis en Shandong tenían más de 65 años?

Diseño, síntesis, evaluación y termodinámica de un piridilimidazo substituido[1,5-a]Derivados de la piridina como inhibidores de la proteasa de la cisteínahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3734177/SHA: ee8483f8f2cc5fe38be4e5651eae3af9d0bb8220bAutores: Khan, Mohd Sajid; Baig, Mohd Hassan; Ahmad, Saheem; Siddiqui, Shapi Ahmad; Srivastava, Ashwini Kumar; Srinivasan, Kumar Venkatraman; Ansari, Irfan A. Fecha: 2013-08-05DOI: 10.1371/journal.pone.0069982Licencia: cc-byResumen: Las proteasas de cisteína de la familia de las papaínas son una de las nuevas estrategias en el desarrollo de quimioterapia para una serie de enfermedades. Los inhibidores de la proteasa de cisteína nuevos derivados de 1-piridilimidazo[1,5-a]piridina que representan la clase farmacológicamente importante de compuestos se reportan aquí por primera vez. Los derivados fueron inicialmente diseñados y analizados en silico mediante estudios moleculares de acoplamiento contra la papaína para explorar el posible modo de acción. La interacción molecular entre los compuestos y la proteasa de cisteína (papain) se encontró muy similar a las interacciones observadas con el respectivo inhibidor epóxido (E-64c) de la papaína. Posteriormente, los compuestos fueron sintetizados para validar su Cuando se caracterizan cinéticamente, estos compuestos muestran sus valores de K(i) y IC(50) en el rango de 13,75 a 99,30 μM y 13,40 a 96,50 μM, respectivamente. Los estudios termodinámicos sugieren su unión con la papaína impulsada hidrofóbica y entrópicamente. Estos inhibidores también inhiben el crecimiento de diferentes tipos clínicamente importantes de bacterias Gram positivas y Gram negativas con valores MIC(50) en el rango de 0,6–1,4 μg/ml. Basados en la regla de Lipinski de Cinco, también proponemos estos compuestos como potentes profármacos antibacterianos. El compuesto antibacteriano más activo fue 1-(2-piridil)-3-(2-hidroxifenil)imidazo[1,5-a]piridina (3a). Texto: Los inhibidores de la proteasa cisteína (IPC) han ganado considerable atención en las últimas dos décadas y muchas clases de compuestos están actualmente en ensayos clínicos humanos para una serie de enfermedades. El interés en las proteasasas de la familia de la papaína como objetivos quimioterapéuticos se deriva del reconocimiento de que son críticos para el ciclo de vida o patogenicidad de muchos microorganismos. Las proteasas de la cisteína de Streptococcus sp. (streptopain) [1], Staphylococcus sp. (staphopain) [2], Plasmodium falciparum (falcipain-1, -2, y -3) y Trypanosoma cruzi (cruzipain) [3] son algunos de los miembros más estudiados de la familia de la papaína que se ha informado que están relacionados con la gravedad de la infección y diversas condiciones patológicas causadas La activación de la vía kallikreina-kinina, que podría ser activada por más de dieciséis proteasas bacterianas, es un mecanismo que algunos patógenos explotan para asegurar que hay un suministro de nutrientes al lugar de la infección por el aumento de la permeabilidad vascular. Esto se ha demostrado que ocurre en infecciones con varias especies microbianas, incluyendo Pseudomonas, Serratia, Clostridium, Cándida, Bacteroides, Porphyromonas y Staphylococcus sp. [4]. Muchas bacterias secretan varias proteasas inespecíficas, por ejemplo Pseudomonas, Serratia, Streptococcus, Staphylococcus y Bacteroides sp. tienen potentes proteasases metalo-, cisteína y serina con amplia gama de actividades [5]. El papel crítico de las proteasas bacterianas en la virulencia se demostró con éxito al eliminar el gen proteasaencoding en P. gingivalis [6]. La superfamilia de proteínas de cistatina recientemente descrita comprende inhibidores de la proteasa eucariótica y procariótica [7]. Cistatinas humanas C, D y S, cistatinas de rata A y S, cistatina de pollo y oriza cistatina inhiben la replicación de ciertos virus y bacterias [8] aunque todavía no se ha demostrado directamente que estos efectos se deban a la capacidad inhibitoria de proteasa de las cistatinas [9]. El papel clave de las proteasasasas de cisteína en infecciones microbianas, junto con la relativa falta de redundancia en comparación con los sistemas mamíferos, ha hecho que las proteasas microbianas sean objetivos atractivos para el desarrollo de Los sistemas de anillo de imidazopiridina representan una importante clase de compuestos no sólo por su interés teórico, sino también desde el punto de vista farmacológico. Se ha demostrado que poseen una amplia gama de actividades farmacológicas útiles [12] incluyendo antigástrico, antisecretario, anestésico local, antiviral, antiansiedad, antibacteriano, antifúngico, antihelmíntico, antiprotozoario, anticonvulsivo, gastrointestinal, antiulcer (Zolmidina), ansiolítico (Alpidem), hipnótico (Zolpidem) e inmunomodulador [13]. La naturaleza y la posición de los substituentes sobre la moiedad piridinica influyen en estas actividades farmacológicas. Estas estructuras heterocíclicas de imidazopiridina forman parte del esqueleto de alcaloides naturales, agentes bloqueantes neuromusculares [14], inhibidores reversibles de las enzimas H +, K + -ATPasa con una potente actividad antisecretaria, y se sabe que son hipnóticos sedantes del sistema nervioso [15]. En este estudio, hemos propuesto cinética y termodinámicamente caracterizar 1 piridilimidazo[1,5-a] derivados de la piridina como un potente y novedoso inhibidor de la proteasa cisteína que también actúa como agentes antibacterianos. La estructura cristalina de la papaína se extrajo del Protein Data Bank (código PDB: 1PE6) [16]. Se eliminaron todas las moléculas de agua y heteroatomos y se añadieron átomos de hidrógeno a la proteína. Se aplicó el campo de fuerza CharMm [17] y la estructura fue sometida a minimización de energía para 1000 pasos utilizando el método de descenso más empinado. Las estructuras químicas de todos los compuestos sintetizados fueron generadas utilizando quimdraw y posteriormente convertidas en formato 3D utilizando CORINA. Se realizó una serie de experimentos de acoplamiento con todas las energías de unión diseñadas de 1 piridilimidazo[1,5-a] derivados de la piridina contra papaína utilizando AutoDock Tools 4.0 [18] para posibles actividades inhibidoras de la cisteína-proteasa. Los compuestos fueron seleccionados sobre la base de sus energías de unión y aquellos que reflejan una buena afinidad de unión fueron analizados en la plataforma silica. Como parámetro para el acoplamiento molecular, se utilizó el algoritmo genético Lamarckian, una combinación entre el algoritmo genético y el algoritmo local de búsqueda Pseudo-Solis y Wets. Se generó una caja de cuadrícula de 60660660 Å alrededor del sitio activo de papaína, asegurándose de que estos inhibidores pueden girar libremente dentro de la cuadrícula. El número de carreras de acoplamiento se fijó en 10. Cada acoplamiento se repitió cinco veces, teniendo al final un total de 50 carreras de acoplamiento, para comprobar la precisión de los resultados. Los complejos finalmente obtenidos fueron visualizados posteriormente usando PyMol [19]. El trabajo fue autenticado posteriormente en el laboratorio húmedo después de su análisis detallado en la plataforma de silico. Los derivados diseñados fueron filtrados por la ''Regla de cinco'' de Lipinski que establece los criterios para propiedades similares a las drogas. La semejanza de drogas es una propiedad que se utiliza más a menudo para caracterizar compuestos de plomo novedosos [20]. De acuerdo con esta regla, se espera mala absorción si MW.500, log P.5, donantes de enlace de En las propiedades de absorción, distribución, metabolismo y excreción de silico (ADME) de estos derivados también se predijeron utilizando las siguientes herramientas bioinformáticas en línea. N http://www.organical-chemistry.org. N http://mobyle.rpbs.univ-paris-diderot.fr/cgi-bin/portal. py? Form = admetox N https://secure.chemsilico.com/pages/submit.phpEl estudio anterior nos dio una idea sobre la existencia de posibles propiedades mutágenas y tumorígenas en compuestos sintetizados.El resultado obtenido nos ayudó a eliminar los compuestos sintetizados para su uso posterior como leads potentes. A partir de los resultados de los estudios de acoplamiento, se sintetizaron diez derivados de 1piridilimidazo[1,5-a]piridina según Siddiqui et al., 2006 [22] que se denominan así: 1- La capacidad de los derivados de 1-piridilimidazo[1,5-a]piridina para inhibir las proteasasas de cisteína se probó utilizando papaína como enzima modelo. La actividad proteolítica de las mezclas de reacción se determinó utilizando Bz-DL-Arg-pNA como sustrato cromogénico [23]. A las soluciones de papaína activa (concentración final: 0,05 mM) se añadieron soluciones concentradas de los diferentes derivados a concentraciones finales de 0,2 mM. Después de la incubación durante 30 min a 37uC, se añadió la solución de sustrato y después de una incubación posterior durante 20 min, la reacción se interrumpió mediante la adición de ácido triclórico (TCA) al 5% acidificado con 2,25% de HCl y la absorción de la mezcla de reacción se determinó a una longitud de onda de 410 nm por Microplate Manager 4.0 (laboratorios Bio-Rad). El mismo procedimiento se utilizó a 32uC y 42uC para estudios termodinámicos. Los parámetros cinéticos para la hidrólisis del sustrato se determinaron mediante la medición de la tasa inicial de actividad enzimática. La constante de inhibición K i fue determinada por el método Dixon [24] y también por la ecuación Lineweaver-Burk. El valor de K m se calculó a partir de la ecuación de doble recíproco mediante la incorporación de los Para el análisis cinético y las determinaciones constantes de velocidad, los ensayos se realizaron por triplicado, y el valor promedio fue considerado a lo largo de este trabajo. Se utilizó la dependencia de temperatura de las constantes de inhibición para determinar los parámetros termodinámicos. Los cambios en la entalpía (DH) se determinaron a partir de las parcelas de Van't Hoff mediante el uso de la ecuación, donde DH es entalpía cambio, R es constante de gas, DS es entropía cambio y T es la temperatura absoluta. El cambio entropía se obtuvo a partir de la ecuación.El ensayo se realizó a diferentes temperaturas (32uC, 37uC, 42uC) calculando varios K i de 1-piridilimidazo[1,5-a]piridina derivados con papaína como enzima modelo.El método de difusión en disco [25] se utilizó para la evaluación antibacteriana preliminar de los derivados El MIC 50 de estos derivados, que mostró inhibición en las pruebas preliminares, fue determinado además por la técnica de placa de microtitro utilizando el método de microdilución [26]. En resumen, las cepas bacterianas (S. aureus, P. vulgaris, Grupo D Streptococci, Bacillus sp., E. coli, P. aeruginosa y S. morganii)) fueron cultivadas y diluidas hasta 2610 5 unidades formadoras de colonias (CFU)/ml en tampón de fosfato sódico (SPB) que contenía 0,03% de caldo Luria-Bertani (LB). Los derivados sintetizados fueron disueltos en DMSO y su dilución en serie se realizó en 50 mL de medio LB en placa de microtitro de 96 pocillos para lograr las concentraciones requeridas (0,1-10 mg/ml) con inó El DMSO fue tomado como control negativo y Ceftriaxona y el clotrimazol fueron tomados como control positivo. Después de la incubación a 37uC durante la noche, los MIC fueron tomados como la concentración inhibidora más baja en la que se inhibió el crecimiento bacteriano. Se calculó el promedio de tres valores y fue el MIC para el material de prueba y cepa bacteriana. Para el método de recuento de placas de agar [27], 25 mL de alícuotas de bacterias a 1610 5 UFC/ml en SPB conteniendo 0,03% de caldo LB fueron incubados con 25 mL de compuestos diluidos durante 2 h a 37uC. Las mezclas de bacterias y compuestos se diluyeron en serie 10 veces con SPB y se plató en placas LB que fueron incubadas a 37uC de la noche a la mañana. Después de haber determinado los CMI, las cepas bacterianas de los pozos de la placa de microtitro sin crecimiento bacteriano visible fueron retiradas para subcultivo en serie de 2 ml en otra nueva placa de microtitro conteniendo 100 ml de caldo por pozo y posteriormente incubadas durante 24 h. La concentración más baja sin crecimiento visible fue definida como CMB [28], lo que indica la muerte del 99,5% del inóculo original. La absorción de cada pozo fue medida a una longitud de onda de 620 nm por Microplate Manager 4.0 (laboratorios Bio-Rad) y comparada con un vacío. Solvente (DMSO) fue utilizado como control negativo. Se realizaron tres réplicas para cada compuesto y el experimento se repitió dos veces. Las bacterias utilizan sus proteasas de cisteína para la patogeneidad como podría ser representado a partir de la estructura de homólogo Cif en Burkholderia pseudomallei (CHBP) que revela un pliegue tipo papaína y una tríada catalítica conservada Cys-His-Gln [29]. Se ha demostrado que los patógenos bacterianos tienen una actividad hidrolítica única como papaína para bloquear la progresión normal del ciclo celular huésped como el núcleo de una proteína de avirulencia (Avr) (AvrPphB) del patógeno vegetal Pseudomonas syringae, se asemeja a las proteasasasas de cisteína tipo papaína. La similitud de esta proteína AvrPphB con papaína incluye la tríada catalítica de Cys-98, His-212, y Asp-227 en el sitio Turk et al. han propuesto, sobre la base de estudios cinéticos y estructurales, que la papaína tiene siete subsitios en el sitio activo, pero sólo cinco subsitios son importantes que pueden unirse a un residuo de aminoácidos del sustrato [31]. Una variedad de intermedios se generan cuando la papaína reacciona con el sustrato o un inhibidor [2]. Al igual que las proteasasas de serina, las proteasasas de cisteína tienden a tener sitios activos relativamente poco profundos, expuestos a disolventes, que pueden acomodar segmentos cortos de sustrato/inhibidores de bucles proteicos (por ejemplo, a partir de inhibidores endógenos como las cistatinas) o hebras. Tipo de inhibición Ki (mM) IC 50 (mM) Compuesto no competitivo 13,7 13.4 unido a la proteasa con una combinación de enlaces de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas. Como parte de nuestra investigación en el desarrollo de nuevos y eficientes inhibidores de la proteasa cisteína, diez derivados de la piridilimidazo [1,5a] piridina sustituida (3a-j) fueron diseñados y analizados principalmente sobre la base de sus energías de acoplamiento contra la papaína para dilucidar su posible modo de acción. Se encontró que estos compuestos eran inhibidores específicos de la proteasa cisteína, papaína y no mostraron inhibición contra otros tipos de proteasasasasas como la serina, aspártica o metalloproteasas. Son específicos para el clan CA de la proteasa cisteína y no mostraron ninguna inhibición significativa contra otros clanes de proteasasasasas Estos nuevos compuestos fueron concebidos sobre la base del conocimiento de la capacidad de una proteína para alterar su conformación para acomodar un ligando de unión y nos permitió comparar directamente las posiciones relativas del residuo en el bolsillo de unión. El estudio de acoplamiento molecular proporcionó la visión estructural sobre la unión de estos compuestos (3a-j) (Figura 1) dentro del sitio activo de papaína que consiste principalmente en una tríada catalítica de Cys 25, Sus 159 y Asp 175 [32]. Además, el papel de otros residuos presentes en el sitio activo de papaína, jugando un papel importante en el alojamiento de compuestos también se han revelado. Inicialmente, el acoplamiento se realizó con todos los compuestos diseñados (3a-j) contra papaína, una conocida enzima de proteasa cisteína y en este contexto, observamos resultados muy interesantes donde nuestros inhibidores propuestos (3a-j) aprovechan los residuos aromáticos e hidrofílicos haciendo una variedad de Aunque los compuestos 3e-j dieron resultados significativos cuando se acoplaron con papaína pero durante la evaluación de las propiedades antibacterianas en experimentos de laboratorio húmedos, dieron resultados insignificantes (datos no mostrados).Por lo tanto, sólo cuatro compuestos fueron considerados para discusión y otros experimentos como estudios cinéticos y termodinámicos para caracterizar a estos compuestos como potentes pro-inhibidores (3a-d). Los hallazgos del estudio anterior han demostrado que las interacciones moleculares entre los compuestos 3a-d y papaína fueron muy similares a las interacciones observadas para E-64c, un derivado del inhibidor epóxido natural (E-64c) (Figura 1 ) de proteasasasas de cisteína [31, 32], con papaína; especialmente con respecto a la unión de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas de los ligandos con residuos conservados en el sitio de unión catalítica ( Varios residuos de papaína participaron en interacciones hidrofóbicas con compuestos 3a-d, incluyendo Gln19, Cys25, Gly66 y Asp158. Las propiedades de piridina de compuestos 3a-d interactúan con el sitio S2 de papaína, que incluye (Tyr61, Asn64, Gly65 y Tyr67) aminoácidos (Figura 2 A-D). Los residuos activos del sitio que se encontró que son un agente clave en la interacción de compuestos dentro del sitio activo (principalmente a través de interacciones hidrofóbicas) fueron Cys25, Tyr61, His159 y Trp177, mientras que Trp177, Gln19 fueron encontrados para mí haciendo enlaces de hidrógeno sólo con el compuesto 3a. Además de estos muchos otros residuos también se encontraron involucrados activamente (Tabla 1). Además, las energías de unión para el compuesto 3a, 3b, 3c y 3d con papaína se encontraron en 26.12, 25.76, 26.84 y 25.62 Kcal/mol respectivamente, que estuvieron en gran acuerdo con nuestros experimentos de laboratorio húmedo; se discutirán más adelante (Tabla 1). Esto confirmó la exactitud de nuestro protocolo de acoplamiento. Puesto que, la energía de unión es una medida directa de la fuerza de interacción y nuestros compuestos 3a-d mostraron una unión más fuerte dentro del sitio activo de papaína en comparación con el inhibidor E-64c (DG: 24.04 Kcal/mol), por lo tanto, los resultados sugieren que estos derivados de piridilimidazo[1,5-a]piridina (3ad) podrían ser inhibidores potentes de papaína como proteasasas de cisteína. La interacción en silico de compuestos 3a-d con papaína, observada como se ha comentado anteriormente, fue validada con laboratorio húmedo Tabla 5. La predicción de compuestos antibacterianos como fármacos (http://www.organical-chemistry.org). Tabla 2). Curiosamente, las energías de unión observadas en silico para los compuestos 3a-d contra papaína se encontraron en gran concordancia (error estándar 62 Kcal/mol) con el valor de energía libre de unión (DG) observado durante los estudios termodinámicos ( Tabla 1 y 2). Del mismo modo, el cambio entalpía (DH) de la unión fue negativo mientras que el cambio entropía (DS) de la unión fue positivo que indicó la naturaleza exotérmica y entropica de la unión. Este patrón de dependencia de la temperatura es característico de la interacción hidrofóbica [33]. Como se discutió anteriormente que todos los compuestos (3a-d) fueron encontrados para interactuar con los residuos activos del sitio de papaína a través de interacciones hidrofóbicas en la mayoría de los casos durante los estudios de silico, lo mismo fue observado por el análisis de las parcelas de Van't Hoff para todos los inhibidores propuestos a tres temperaturas diferentes (32uC, 37uC y 42uC) en experimentos de laboratorio húmedo (Figura 3). Esto demuestra la importancia de estos tipos de interacciones en el posicionamiento de compuestos dentro del sitio activo. Por lo tanto, la termodinámica así como en el estudio de silico revela que las interacciones hidrofóbicas favorecen la unión de estos inhibidores propuestos con papaína como proteasasasas de cisteína. En resumen, los resultados anteriores de estudios de acoplamiento molecular y análisis termodinámico de compuestos 3a-d con papaína mostraron que estos compuestos tienen el potencial de ser inhibidores de la proteasa cisteína novedosos y únicos. En el estudio actual, la actividad inhibidora de la proteasa cisteína de derivados sintetizados de 1 piridilimidazo substituido[1,5-a] piridina (3a-d)] también se realizó contra la papaína y se observaron constantes de inhibición (K i ) para la citada enzima 13,70, 23,20, 90,00 y 99,30 mM para los compuestos 3a, 3b, 3c y 3d respectivamente (Tabla 3). Además, los valores calculados de IC 50 fueron también de 13,40, 21,17, 94,50 y 96,50 mM para los compuestos 3a, 3b, 3c y 3d respectivamente (Tabla 3). Excepto el compuesto 3b, el resto de los compuestos mostraron inhibiciones reversibles no competitivas, pero todos los compuestos, independientemente de los tipos de unión, mostraron interacción hidrofóbica y entrópicamente impulsada. Estos derivados (3a-j) fueron finalmente evaluados para sus actividades antibacterianas contra siete microbios clínicamente importantes (S. aureus, P. vulgaris, Grupo D Streptococci, Bacillus sp., E. coli, P. aeruginosa y S. morganii). Aquí, estamos mostrando los datos de sólo cuatro compuestos (3a-d) debido a sus resultados significativos (Tabla 4). Todos los compuestos siguieron estrictamente el patrón de actividad antiproteasa hacia el crecimiento bacteriano excepto P. vulgaris y E. coli en una instancia cada uno (Tabla 4). Dado que los compuestos 3c y 3d no tienen mucha diferencia en sus valores IC50 (3c-94.5 mM y 3d-96.5 mM) contra la proteasa de cisteína, papaína y por lo tanto en la actividad antibacteriana en todos los casos excepto uno. Puede ser aleatorio debido a tan cerca en valores IC50. Compuestos 3c y 3d están teniendo mucha diferencia en sus valores IC50 (3b-21.17 mM y 3c-94.5 mM) y mostraron patrón exacto para su actividad antibacteriana para todos los microbios excepto E. coli en un caso. Aunque E. coli contiene seis proteasasas de cisteína principales pero ninguno pertenece al clan CA de papaína. Se argumenta que estos compuestos también inhibieron las proteas de cisteína de otros clanes pero con baja eficacia. Dado que los derivados de piridilimidazo[1,5-a]piridina son un andamio absolutamente nuevo hacia los agentes antibacterianos y, por lo tanto, no se dispone de ningún compuesto estándar del mismo andamio. Así, Clotrimazol (1-[(2-clorofenil)(difenil)metil]-1H-imidazol), un derivado imidazol y Ceftriaxona (antibio de cefalosporina de tercera generación con actividad de amplio espectro frente a bacterias Gram positivas y Gramnegativas) se han utilizado como control positivo, mientras que DMSO se ha utilizado como control negativo. Se ha demostrado que todas las especies bacterianas mencionadas anteriormente secretan ciertas proteasasas de cisteína que desempeñan un papel muy importante en la patogeneidad de diferentes enfermedades causadas por estos microorganismos. Se observó que la concentración inhibitoria mínima (CMI) de compuestos (3a-d) (Tabla 4) frente a todas las bacterias probadas, excepto E. coli y P. vulgaris, estaba en gran acuerdo con sus respectivos valores constantes de inhibición (Ki)/IC 50 frente a la papaína (Tabla 3), lo que indica claramente que estos compuestos tienen el potencial de inhibir la papaína como las proteasasas de cisteína de estos patógenos. El coeficiente de partición (logP) es una medida bien establecida de la lipofilia del compuesto. La distribución de los valores de logP calculados (cLogP) de la mayoría de los fármacos en el mercado está en el rango de cero a cinco. Todos los compuestos estudiados excepto 3d, mostraron un buen acuerdo con los criterios establecidos para la predicción de un compuesto como fármaco potencial (Tabla 5). Todos los compuestos no muestran ninguna amenaza contra la evaluación del riesgo de toxicidad excepto el compuesto 3d que mostró una amenaza como efecto tumorógeno debido a la presencia de grupo de isobutilo. Entre todos los compuestos probados, el compuesto 3a fue el más potente cuyo MIC fue el más bajo de todos los compuestos probados y mostró una puntuación máxima de fármaco y valores positivos para la semejanza con el fármaco. En resumen, los resultados del presente estudio han establecido que los derivados piridilimidazo[1,5-a] de 1 sustituto podrían ser candidatos a inhibidores nuevos y potentes de papaína como las proteasasas de cisteína, que juegan un papel deletérgico en la progresión de diferentes enfermedades causadas por diversos microorganismos. Por lo tanto, este grupo de compuestos podría ser objeto de investigación futura para hacer frente a los desafíos con microorganismos resistentes que son una amenaza importante a nivel mundial.

¿Qué enzimas se han comunicado que están relacionadas con la gravedad de la infección y diversas condiciones patológicas causadas por microorganismos?

Diseño, síntesis, evaluación y termodinámica de un piridilimidazo substituido[1,5-a]Derivados de la piridina como inhibidores de la proteasa de la cisteínahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3734177/SHA: ee8483f8f2cc5fe38be4e5651eae3af9d0bb8220bAutores: Khan, Mohd Sajid; Baig, Mohd Hassan; Ahmad, Saheem; Siddiqui, Shapi Ahmad; Srivastava, Ashwini Kumar; Srinivasan, Kumar Venkatraman; Ansari, Irfan A. Fecha: 2013-08-05DOI: 10.1371/journal.pone.0069982Licencia: cc-byResumen: Las proteasas de cisteína de la familia de las papaínas son una de las nuevas estrategias en el desarrollo de quimioterapia para una serie de enfermedades. Los inhibidores de la proteasa de cisteína nuevos derivados de 1-piridilimidazo[1,5-a]piridina que representan la clase farmacológicamente importante de compuestos se reportan aquí por primera vez. Los derivados fueron inicialmente diseñados y analizados en silico mediante estudios moleculares de acoplamiento contra la papaína para explorar el posible modo de acción. La interacción molecular entre los compuestos y la proteasa de cisteína (papain) se encontró muy similar a las interacciones observadas con el respectivo inhibidor epóxido (E-64c) de la papaína. Posteriormente, los compuestos fueron sintetizados para validar su Cuando se caracterizan cinéticamente, estos compuestos muestran sus valores de K(i) y IC(50) en el rango de 13,75 a 99,30 μM y 13,40 a 96,50 μM, respectivamente. Los estudios termodinámicos sugieren su unión con la papaína impulsada hidrofóbica y entrópicamente. Estos inhibidores también inhiben el crecimiento de diferentes tipos clínicamente importantes de bacterias Gram positivas y Gram negativas con valores MIC(50) en el rango de 0,6–1,4 μg/ml. Basados en la regla de Lipinski de Cinco, también proponemos estos compuestos como potentes profármacos antibacterianos. El compuesto antibacteriano más activo fue 1-(2-piridil)-3-(2-hidroxifenil)imidazo[1,5-a]piridina (3a). Texto: Los inhibidores de la proteasa cisteína (IPC) han ganado considerable atención en las últimas dos décadas y muchas clases de compuestos están actualmente en ensayos clínicos humanos para una serie de enfermedades. El interés en las proteasasas de la familia de la papaína como objetivos quimioterapéuticos se deriva del reconocimiento de que son críticos para el ciclo de vida o patogenicidad de muchos microorganismos. Las proteasas de la cisteína de Streptococcus sp. (streptopain) [1], Staphylococcus sp. (staphopain) [2], Plasmodium falciparum (falcipain-1, -2, y -3) y Trypanosoma cruzi (cruzipain) [3] son algunos de los miembros más estudiados de la familia de la papaína que se ha informado que están relacionados con la gravedad de la infección y diversas condiciones patológicas causadas La activación de la vía kallikreina-kinina, que podría ser activada por más de dieciséis proteasas bacterianas, es un mecanismo que algunos patógenos explotan para asegurar que hay un suministro de nutrientes al lugar de la infección por el aumento de la permeabilidad vascular. Esto se ha demostrado que ocurre en infecciones con varias especies microbianas, incluyendo Pseudomonas, Serratia, Clostridium, Cándida, Bacteroides, Porphyromonas y Staphylococcus sp. [4]. Muchas bacterias secretan varias proteasas inespecíficas, por ejemplo Pseudomonas, Serratia, Streptococcus, Staphylococcus y Bacteroides sp. tienen potentes proteasases metalo-, cisteína y serina con amplia gama de actividades [5]. El papel crítico de las proteasas bacterianas en la virulencia se demostró con éxito al eliminar el gen proteasaencoding en P. gingivalis [6]. La superfamilia de proteínas de cistatina recientemente descrita comprende inhibidores de la proteasa eucariótica y procariótica [7]. Cistatinas humanas C, D y S, cistatinas de rata A y S, cistatina de pollo y oriza cistatina inhiben la replicación de ciertos virus y bacterias [8] aunque todavía no se ha demostrado directamente que estos efectos se deban a la capacidad inhibitoria de proteasa de las cistatinas [9]. El papel clave de las proteasasasas de cisteína en infecciones microbianas, junto con la relativa falta de redundancia en comparación con los sistemas mamíferos, ha hecho que las proteasas microbianas sean objetivos atractivos para el desarrollo de Los sistemas de anillo de imidazopiridina representan una importante clase de compuestos no sólo por su interés teórico, sino también desde el punto de vista farmacológico. Se ha demostrado que poseen una amplia gama de actividades farmacológicas útiles [12] incluyendo antigástrico, antisecretario, anestésico local, antiviral, antiansiedad, antibacteriano, antifúngico, antihelmíntico, antiprotozoario, anticonvulsivo, gastrointestinal, antiulcer (Zolmidina), ansiolítico (Alpidem), hipnótico (Zolpidem) e inmunomodulador [13]. La naturaleza y la posición de los substituentes sobre la moiedad piridinica influyen en estas actividades farmacológicas. Estas estructuras heterocíclicas de imidazopiridina forman parte del esqueleto de alcaloides naturales, agentes bloqueantes neuromusculares [14], inhibidores reversibles de las enzimas H +, K + -ATPasa con una potente actividad antisecretaria, y se sabe que son hipnóticos sedantes del sistema nervioso [15]. En este estudio, hemos propuesto cinética y termodinámicamente caracterizar 1 piridilimidazo[1,5-a] derivados de la piridina como un potente y novedoso inhibidor de la proteasa cisteína que también actúa como agentes antibacterianos. La estructura cristalina de la papaína se extrajo del Protein Data Bank (código PDB: 1PE6) [16]. Se eliminaron todas las moléculas de agua y heteroatomos y se añadieron átomos de hidrógeno a la proteína. Se aplicó el campo de fuerza CharMm [17] y la estructura fue sometida a minimización de energía para 1000 pasos utilizando el método de descenso más empinado. Las estructuras químicas de todos los compuestos sintetizados fueron generadas utilizando quimdraw y posteriormente convertidas en formato 3D utilizando CORINA. Se realizó una serie de experimentos de acoplamiento con todas las energías de unión diseñadas de 1 piridilimidazo[1,5-a] derivados de la piridina contra papaína utilizando AutoDock Tools 4.0 [18] para posibles actividades inhibidoras de la cisteína-proteasa. Los compuestos fueron seleccionados sobre la base de sus energías de unión y aquellos que reflejan una buena afinidad de unión fueron analizados en la plataforma silica. Como parámetro para el acoplamiento molecular, se utilizó el algoritmo genético Lamarckian, una combinación entre el algoritmo genético y el algoritmo local de búsqueda Pseudo-Solis y Wets. Se generó una caja de cuadrícula de 60660660 Å alrededor del sitio activo de papaína, asegurándose de que estos inhibidores pueden girar libremente dentro de la cuadrícula. El número de carreras de acoplamiento se fijó en 10. Cada acoplamiento se repitió cinco veces, teniendo al final un total de 50 carreras de acoplamiento, para comprobar la precisión de los resultados. Los complejos finalmente obtenidos fueron visualizados posteriormente usando PyMol [19]. El trabajo fue autenticado posteriormente en el laboratorio húmedo después de su análisis detallado en la plataforma de silico. Los derivados diseñados fueron filtrados por la ''Regla de cinco'' de Lipinski que establece los criterios para propiedades similares a las drogas. La semejanza de drogas es una propiedad que se utiliza más a menudo para caracterizar compuestos de plomo novedosos [20]. De acuerdo con esta regla, se espera mala absorción si MW.500, log P.5, donantes de enlace de En las propiedades de absorción, distribución, metabolismo y excreción de silico (ADME) de estos derivados también se predijeron utilizando las siguientes herramientas bioinformáticas en línea. N http://www.organical-chemistry.org. N http://mobyle.rpbs.univ-paris-diderot.fr/cgi-bin/portal. py? Form = admetox N https://secure.chemsilico.com/pages/submit.phpEl estudio anterior nos dio una idea sobre la existencia de posibles propiedades mutágenas y tumorígenas en compuestos sintetizados.El resultado obtenido nos ayudó a eliminar los compuestos sintetizados para su uso posterior como leads potentes. A partir de los resultados de los estudios de acoplamiento, se sintetizaron diez derivados de 1piridilimidazo[1,5-a]piridina según Siddiqui et al., 2006 [22] que se denominan así: 1- La capacidad de los derivados de 1-piridilimidazo[1,5-a]piridina para inhibir las proteasasas de cisteína se probó utilizando papaína como enzima modelo. La actividad proteolítica de las mezclas de reacción se determinó utilizando Bz-DL-Arg-pNA como sustrato cromogénico [23]. A las soluciones de papaína activa (concentración final: 0,05 mM) se añadieron soluciones concentradas de los diferentes derivados a concentraciones finales de 0,2 mM. Después de la incubación durante 30 min a 37uC, se añadió la solución de sustrato y después de una incubación posterior durante 20 min, la reacción se interrumpió mediante la adición de ácido triclórico (TCA) al 5% acidificado con 2,25% de HCl y la absorción de la mezcla de reacción se determinó a una longitud de onda de 410 nm por Microplate Manager 4.0 (laboratorios Bio-Rad). El mismo procedimiento se utilizó a 32uC y 42uC para estudios termodinámicos. Los parámetros cinéticos para la hidrólisis del sustrato se determinaron mediante la medición de la tasa inicial de actividad enzimática. La constante de inhibición K i fue determinada por el método Dixon [24] y también por la ecuación Lineweaver-Burk. El valor de K m se calculó a partir de la ecuación de doble recíproco mediante la incorporación de los Para el análisis cinético y las determinaciones constantes de velocidad, los ensayos se realizaron por triplicado, y el valor promedio fue considerado a lo largo de este trabajo. Se utilizó la dependencia de temperatura de las constantes de inhibición para determinar los parámetros termodinámicos. Los cambios en la entalpía (DH) se determinaron a partir de las parcelas de Van't Hoff mediante el uso de la ecuación, donde DH es entalpía cambio, R es constante de gas, DS es entropía cambio y T es la temperatura absoluta. El cambio entropía se obtuvo a partir de la ecuación.El ensayo se realizó a diferentes temperaturas (32uC, 37uC, 42uC) calculando varios K i de 1-piridilimidazo[1,5-a]piridina derivados con papaína como enzima modelo.El método de difusión en disco [25] se utilizó para la evaluación antibacteriana preliminar de los derivados El MIC 50 de estos derivados, que mostró inhibición en las pruebas preliminares, fue determinado además por la técnica de placa de microtitro utilizando el método de microdilución [26]. En resumen, las cepas bacterianas (S. aureus, P. vulgaris, Grupo D Streptococci, Bacillus sp., E. coli, P. aeruginosa y S. morganii)) fueron cultivadas y diluidas hasta 2610 5 unidades formadoras de colonias (CFU)/ml en tampón de fosfato sódico (SPB) que contenía 0,03% de caldo Luria-Bertani (LB). Los derivados sintetizados fueron disueltos en DMSO y su dilución en serie se realizó en 50 mL de medio LB en placa de microtitro de 96 pocillos para lograr las concentraciones requeridas (0,1-10 mg/ml) con inó El DMSO fue tomado como control negativo y Ceftriaxona y el clotrimazol fueron tomados como control positivo. Después de la incubación a 37uC durante la noche, los MIC fueron tomados como la concentración inhibidora más baja en la que se inhibió el crecimiento bacteriano. Se calculó el promedio de tres valores y fue el MIC para el material de prueba y cepa bacteriana. Para el método de recuento de placas de agar [27], 25 mL de alícuotas de bacterias a 1610 5 UFC/ml en SPB conteniendo 0,03% de caldo LB fueron incubados con 25 mL de compuestos diluidos durante 2 h a 37uC. Las mezclas de bacterias y compuestos se diluyeron en serie 10 veces con SPB y se plató en placas LB que fueron incubadas a 37uC de la noche a la mañana. Después de haber determinado los CMI, las cepas bacterianas de los pozos de la placa de microtitro sin crecimiento bacteriano visible fueron retiradas para subcultivo en serie de 2 ml en otra nueva placa de microtitro conteniendo 100 ml de caldo por pozo y posteriormente incubadas durante 24 h. La concentración más baja sin crecimiento visible fue definida como CMB [28], lo que indica la muerte del 99,5% del inóculo original. La absorción de cada pozo fue medida a una longitud de onda de 620 nm por Microplate Manager 4.0 (laboratorios Bio-Rad) y comparada con un vacío. Solvente (DMSO) fue utilizado como control negativo. Se realizaron tres réplicas para cada compuesto y el experimento se repitió dos veces. Las bacterias utilizan sus proteasas de cisteína para la patogeneidad como podría ser representado a partir de la estructura de homólogo Cif en Burkholderia pseudomallei (CHBP) que revela un pliegue tipo papaína y una tríada catalítica conservada Cys-His-Gln [29]. Se ha demostrado que los patógenos bacterianos tienen una actividad hidrolítica única como papaína para bloquear la progresión normal del ciclo celular huésped como el núcleo de una proteína de avirulencia (Avr) (AvrPphB) del patógeno vegetal Pseudomonas syringae, se asemeja a las proteasasasas de cisteína tipo papaína. La similitud de esta proteína AvrPphB con papaína incluye la tríada catalítica de Cys-98, His-212, y Asp-227 en el sitio Turk et al. han propuesto, sobre la base de estudios cinéticos y estructurales, que la papaína tiene siete subsitios en el sitio activo, pero sólo cinco subsitios son importantes que pueden unirse a un residuo de aminoácidos del sustrato [31]. Una variedad de intermedios se generan cuando la papaína reacciona con el sustrato o un inhibidor [2]. Al igual que las proteasasas de serina, las proteasasas de cisteína tienden a tener sitios activos relativamente poco profundos, expuestos a disolventes, que pueden acomodar segmentos cortos de sustrato/inhibidores de bucles proteicos (por ejemplo, a partir de inhibidores endógenos como las cistatinas) o hebras. Tipo de inhibición Ki (mM) IC 50 (mM) Compuesto no competitivo 13,7 13.4 unido a la proteasa con una combinación de enlaces de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas. Como parte de nuestra investigación en el desarrollo de nuevos y eficientes inhibidores de la proteasa cisteína, diez derivados de la piridilimidazo [1,5a] piridina sustituida (3a-j) fueron diseñados y analizados principalmente sobre la base de sus energías de acoplamiento contra la papaína para dilucidar su posible modo de acción. Se encontró que estos compuestos eran inhibidores específicos de la proteasa cisteína, papaína y no mostraron inhibición contra otros tipos de proteasasasasas como la serina, aspártica o metalloproteasas. Son específicos para el clan CA de la proteasa cisteína y no mostraron ninguna inhibición significativa contra otros clanes de proteasasasasas Estos nuevos compuestos fueron concebidos sobre la base del conocimiento de la capacidad de una proteína para alterar su conformación para acomodar un ligando de unión y nos permitió comparar directamente las posiciones relativas del residuo en el bolsillo de unión. El estudio de acoplamiento molecular proporcionó la visión estructural sobre la unión de estos compuestos (3a-j) (Figura 1) dentro del sitio activo de papaína que consiste principalmente en una tríada catalítica de Cys 25, Sus 159 y Asp 175 [32]. Además, el papel de otros residuos presentes en el sitio activo de papaína, jugando un papel importante en el alojamiento de compuestos también se han revelado. Inicialmente, el acoplamiento se realizó con todos los compuestos diseñados (3a-j) contra papaína, una conocida enzima de proteasa cisteína y en este contexto, observamos resultados muy interesantes donde nuestros inhibidores propuestos (3a-j) aprovechan los residuos aromáticos e hidrofílicos haciendo una variedad de Aunque los compuestos 3e-j dieron resultados significativos cuando se acoplaron con papaína pero durante la evaluación de las propiedades antibacterianas en experimentos de laboratorio húmedos, dieron resultados insignificantes (datos no mostrados).Por lo tanto, sólo cuatro compuestos fueron considerados para discusión y otros experimentos como estudios cinéticos y termodinámicos para caracterizar a estos compuestos como potentes pro-inhibidores (3a-d). Los hallazgos del estudio anterior han demostrado que las interacciones moleculares entre los compuestos 3a-d y papaína fueron muy similares a las interacciones observadas para E-64c, un derivado del inhibidor epóxido natural (E-64c) (Figura 1 ) de proteasasasas de cisteína [31, 32], con papaína; especialmente con respecto a la unión de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas de los ligandos con residuos conservados en el sitio de unión catalítica ( Varios residuos de papaína participaron en interacciones hidrofóbicas con compuestos 3a-d, incluyendo Gln19, Cys25, Gly66 y Asp158. Las propiedades de piridina de compuestos 3a-d interactúan con el sitio S2 de papaína, que incluye (Tyr61, Asn64, Gly65 y Tyr67) aminoácidos (Figura 2 A-D). Los residuos activos del sitio que se encontró que son un agente clave en la interacción de compuestos dentro del sitio activo (principalmente a través de interacciones hidrofóbicas) fueron Cys25, Tyr61, His159 y Trp177, mientras que Trp177, Gln19 fueron encontrados para mí haciendo enlaces de hidrógeno sólo con el compuesto 3a. Además de estos muchos otros residuos también se encontraron involucrados activamente (Tabla 1). Además, las energías de unión para el compuesto 3a, 3b, 3c y 3d con papaína se encontraron en 26.12, 25.76, 26.84 y 25.62 Kcal/mol respectivamente, que estuvieron en gran acuerdo con nuestros experimentos de laboratorio húmedo; se discutirán más adelante (Tabla 1). Esto confirmó la exactitud de nuestro protocolo de acoplamiento. Puesto que, la energía de unión es una medida directa de la fuerza de interacción y nuestros compuestos 3a-d mostraron una unión más fuerte dentro del sitio activo de papaína en comparación con el inhibidor E-64c (DG: 24.04 Kcal/mol), por lo tanto, los resultados sugieren que estos derivados de piridilimidazo[1,5-a]piridina (3ad) podrían ser inhibidores potentes de papaína como proteasasas de cisteína. La interacción en silico de compuestos 3a-d con papaína, observada como se ha comentado anteriormente, fue validada con laboratorio húmedo Tabla 5. La predicción de compuestos antibacterianos como fármacos (http://www.organical-chemistry.org). Tabla 2). Curiosamente, las energías de unión observadas en silico para los compuestos 3a-d contra papaína se encontraron en gran concordancia (error estándar 62 Kcal/mol) con el valor de energía libre de unión (DG) observado durante los estudios termodinámicos ( Tabla 1 y 2). Del mismo modo, el cambio entalpía (DH) de la unión fue negativo mientras que el cambio entropía (DS) de la unión fue positivo que indicó la naturaleza exotérmica y entropica de la unión. Este patrón de dependencia de la temperatura es característico de la interacción hidrofóbica [33]. Como se discutió anteriormente que todos los compuestos (3a-d) fueron encontrados para interactuar con los residuos activos del sitio de papaína a través de interacciones hidrofóbicas en la mayoría de los casos durante los estudios de silico, lo mismo fue observado por el análisis de las parcelas de Van't Hoff para todos los inhibidores propuestos a tres temperaturas diferentes (32uC, 37uC y 42uC) en experimentos de laboratorio húmedo (Figura 3). Esto demuestra la importancia de estos tipos de interacciones en el posicionamiento de compuestos dentro del sitio activo. Por lo tanto, la termodinámica así como en el estudio de silico revela que las interacciones hidrofóbicas favorecen la unión de estos inhibidores propuestos con papaína como proteasasasas de cisteína. En resumen, los resultados anteriores de estudios de acoplamiento molecular y análisis termodinámico de compuestos 3a-d con papaína mostraron que estos compuestos tienen el potencial de ser inhibidores de la proteasa cisteína novedosos y únicos. En el estudio actual, la actividad inhibidora de la proteasa cisteína de derivados sintetizados de 1 piridilimidazo substituido[1,5-a] piridina (3a-d)] también se realizó contra la papaína y se observaron constantes de inhibición (K i ) para la citada enzima 13,70, 23,20, 90,00 y 99,30 mM para los compuestos 3a, 3b, 3c y 3d respectivamente (Tabla 3). Además, los valores calculados de IC 50 fueron también de 13,40, 21,17, 94,50 y 96,50 mM para los compuestos 3a, 3b, 3c y 3d respectivamente (Tabla 3). Excepto el compuesto 3b, el resto de los compuestos mostraron inhibiciones reversibles no competitivas, pero todos los compuestos, independientemente de los tipos de unión, mostraron interacción hidrofóbica y entrópicamente impulsada. Estos derivados (3a-j) fueron finalmente evaluados para sus actividades antibacterianas contra siete microbios clínicamente importantes (S. aureus, P. vulgaris, Grupo D Streptococci, Bacillus sp., E. coli, P. aeruginosa y S. morganii). Aquí, estamos mostrando los datos de sólo cuatro compuestos (3a-d) debido a sus resultados significativos (Tabla 4). Todos los compuestos siguieron estrictamente el patrón de actividad antiproteasa hacia el crecimiento bacteriano excepto P. vulgaris y E. coli en una instancia cada uno (Tabla 4). Dado que los compuestos 3c y 3d no tienen mucha diferencia en sus valores IC50 (3c-94.5 mM y 3d-96.5 mM) contra la proteasa de cisteína, papaína y por lo tanto en la actividad antibacteriana en todos los casos excepto uno. Puede ser aleatorio debido a tan cerca en valores IC50. Compuestos 3c y 3d están teniendo mucha diferencia en sus valores IC50 (3b-21.17 mM y 3c-94.5 mM) y mostraron patrón exacto para su actividad antibacteriana para todos los microbios excepto E. coli en un caso. Aunque E. coli contiene seis proteasasas de cisteína principales pero ninguno pertenece al clan CA de papaína. Se argumenta que estos compuestos también inhibieron las proteas de cisteína de otros clanes pero con baja eficacia. Dado que los derivados de piridilimidazo[1,5-a]piridina son un andamio absolutamente nuevo hacia los agentes antibacterianos y, por lo tanto, no se dispone de ningún compuesto estándar del mismo andamio. Así, Clotrimazol (1-[(2-clorofenil)(difenil)metil]-1H-imidazol), un derivado imidazol y Ceftriaxona (antibio de cefalosporina de tercera generación con actividad de amplio espectro frente a bacterias Gram positivas y Gramnegativas) se han utilizado como control positivo, mientras que DMSO se ha utilizado como control negativo. Se ha demostrado que todas las especies bacterianas mencionadas anteriormente secretan ciertas proteasasas de cisteína que desempeñan un papel muy importante en la patogeneidad de diferentes enfermedades causadas por estos microorganismos. Se observó que la concentración inhibitoria mínima (CMI) de compuestos (3a-d) (Tabla 4) frente a todas las bacterias probadas, excepto E. coli y P. vulgaris, estaba en gran acuerdo con sus respectivos valores constantes de inhibición (Ki)/IC 50 frente a la papaína (Tabla 3), lo que indica claramente que estos compuestos tienen el potencial de inhibir la papaína como las proteasasas de cisteína de estos patógenos. El coeficiente de partición (logP) es una medida bien establecida de la lipofilia del compuesto. La distribución de los valores de logP calculados (cLogP) de la mayoría de los fármacos en el mercado está en el rango de cero a cinco. Todos los compuestos estudiados excepto 3d, mostraron un buen acuerdo con los criterios establecidos para la predicción de un compuesto como fármaco potencial (Tabla 5). Todos los compuestos no muestran ninguna amenaza contra la evaluación del riesgo de toxicidad excepto el compuesto 3d que mostró una amenaza como efecto tumorógeno debido a la presencia de grupo de isobutilo. Entre todos los compuestos probados, el compuesto 3a fue el más potente cuyo MIC fue el más bajo de todos los compuestos probados y mostró una puntuación máxima de fármaco y valores positivos para la semejanza con el fármaco. En resumen, los resultados del presente estudio han establecido que los derivados piridilimidazo[1,5-a] de 1 sustituto podrían ser candidatos a inhibidores nuevos y potentes de papaína como las proteasasas de cisteína, que juegan un papel deletérgico en la progresión de diferentes enfermedades causadas por diversos microorganismos. Por lo tanto, este grupo de compuestos podría ser objeto de investigación futura para hacer frente a los desafíos con microorganismos resistentes que son una amenaza importante a nivel mundial.

¿ A qué temperatura se completó el ensayo?

Las plataformas terapéuticas de RNAi para las enfermedades pulmonareshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3816685/Fujita, Yu; Takeshita, Fumitaka; Kuwano, Kazuyoshi; Ochiya, Takahiro2013-02-06DOI:10.3390/ph6020223Licencia:cc-byAbstract: La interferencia del ARN (ARNi) se está convirtiendo rápidamente en un método importante para analizar las funciones genéticas en muchos eucariotas y promete el desarrollo de silenciamiento genético terapéutico. La inducción de RNAi se basa en los pequeños ARN silenciadores, que afectan a la degradación específica del ARN mensajero (ARNm). Los estudios de descubrimiento de fármacos y los tratamientos novedosos de los siRNAs están actualmente dirigidos a una amplia gama de enfermedades, incluyendo varias infecciones virales y cánceres. Las enfermedades pulmonares en general son blancos atractivos para las terapias de siRNAs debido a su letalidad y prevalencia. Además, el pulmón es accesible anatómicamente a los agentes terapéuticos a través de la vía intrapulmonar. Recientemente, la evidencia creciente indica que los miRNAs desempeñan un papel importante en las anomalías pulmonares, como la inflamación y la oncogénesis. Por lo tanto, los miRNAs están siendo dirigidos con fines terapéuticos. En esta revisión, presentamos estrategias para el parto de ARNi y discutimos el estado actual de la técnica RNAi basada en el arte para diversas enfermedades pulmonares. Texto: cirugía tradicional, Bivas-Benita et al. reportaron que no se produjo mortalidad como resultado del uso de Las aplicaciones endotraqueales están siendo utilizadas actualmente por muchos profesionales en el campo pulmonar [22, 34] ; esto es útil para estudiar la administración de fármacos pulmonares en ratones. Sin embargo, el enfoque es más complejo en humanos porque se utiliza una vía artificial para la entrega de medicamentos en los pulmones. Por lo tanto, el método se está utilizando en modelos animales para probar y evaluar su fiabilidad para posibles aplicaciones clínicas. Ruta intraqueal: bajo anestesia, la tráquea se expone quirúrgicamente, y se inserta un tubo o aguja a través de una incisión hecha entre los anillos traqueales. Complicaciones, tales como lesiones vasculares y fugas de aire, son posibles debido a la traqueotomía. b) Ruta endotraqueal: los siRNAs se rocian directamente desde la boca a los pulmones utilizando un aerolizador MicroSprayer ® (Penn-Century, Filadelfia, PA Es importante mantener una visión clara de la tráquea durante el procedimiento. El parto intranasal es otro método común de aplicación de fármacos pulmonares en estudios en animales. En muchos estudios, se ha demostrado éxito in vivo en la entrega de siRNAs a los pulmones intranasal [22, 35, 36 ]. Una configuración experimental de la entrega intranasal por pulverización o gotita es simple e indolora para el animal. Aunque el éxito en la entrega de siRNAs intranasal en roedores no puede ser completamente extrapolado al uso humano debido a las diferencias significativas en anatomía pulmonar [37], este enfoque tiene potencial para la aplicación clínica de siRNAs. Ensayos clínicos de fase II se han iniciado para el tratamiento de la infección por el virus sincitial respiratorio (RSV), haciendo uso de la aplicación intranasal de moléculas de siRNAs desnudas modificadas químicamente que se dirigen a los productos La entrada intranasal se ha utilizado durante mucho tiempo para administrar moléculas pequeñas, como proteínas, para el parto sistémico. Debido a que la mucosa nasal está altamente vascularizada, la entrega de un epitelio delgado de medicación a través de la superficie puede dar lugar a una rápida absorción del medicamento en la sangre. Por lo tanto, los siRNA administrados intranasalmente pueden depositarse en la nariz, y algunos de ellos pueden no poder llegar al tracto respiratorio inferior. De hecho, se ha informado que la aplicación intranasal de siRNAs no formulados dio lugar a una menor eficiencia de entrega y distribución pulmonar homogénea que la alcanzada con la aplicación intratraqueal [31]. El método intranasal es adecuado para algunas enfermedades pulmonares, como la infección respiratoria superior por VSR, y también tiene potencial para el parto sistémico en lugar de la entrega pulmonar de siRNAs. Por lo tanto, es importante considerar la vía de administración El uso de aerosoles para administrar medicamentos a los pulmones tiene un largo historial. La administración por inhalación es un método popular y no invasivo de administrar agentes a los pulmones. Hay varios dispositivos de inhalación disponibles para la entrega de medicamentos a los pulmones. Los inhaladores de dosis medidas (IDM) y los inhaladores de polvo seco (IDP) son los modos más comunes de administrar inhalación. Los inhaladores de dosis medidas son los inhaladores más utilizados para varias enfermedades pulmonares, como el asma, la bronquitis y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), y un espaciador es un dispositivo externo que se une a una IDM para permitir una mejor administración de medicamentos mediante una mayor coordinación de la activación y la inhalación. Para la mayoría de los IDM, el propelente es uno o más gases llamados clorofluorocarbonos (CFC). Aunque los CFC en los medicamentos son seguros para que los pacientes inhalen, son perjudiciales para el medio ambiente. Por lo tanto, el desarrollo ulterior de los siRNA inhalables puede no ser la mejor manera de avanzar. Los DPI son dispositivos que entregan medicamentos a los pulmones en forma de polvo seco. El uso de los DPI ya ha demostrado ser prometedor para la entrega in vivo de macromoléculas terapéuticas como la insulina [39] y la heparina de bajo peso molecular [40] ; por lo tanto, podría ser un mejor dispositivo para la entrega de siRNAs a los pulmones. Las ventajas de los DPI son una mayor estabilidad y esterilidad de las biomoléculas sobre aerosoles líquidos y la formación libre de propelentes. Aunque los medicamentos se envían comúnmente a los pulmones por inhalación, la mayoría de los estudios in vivo que utilizan siRNAs se han basado en la entrega intratraqueal También se necesita un portador adecuado para proteger los ácidos nucleicos de la degradación debido a la fuerza de corte y al aumento de la temperatura durante el proceso de secado. Se ha demostrado el uso del secado por pulverización como técnica para la ingeniería de formulaciones en polvo seco de nanopartículas de siRNA, que podrían permitir la entrega local de siRNA biológicamente activo directamente al tejido pulmonar [24, 25]. En el futuro, la técnica es deseable para estimar el estudio in vivo sobre terapia de siRNA para inhalación. A largo plazo, anticipamos que habrá dispositivos más sofisticados para el uso clínico y que los que se están desarrollando serán más adecuados. Hay dos barreras principales para la entrega eficiente de siRNA pulmonar a las células del pulmón. La primera es la anatomía compleja y ramificada de los pulmones y barreras biomecánicas, como la capa de muco que cubre las células de las vías respiratorias [41, 42 La vía aérea consiste en bronquiolos respiratorios, conductos alveolares y sacos alveolares. Todas estas estructuras contienen alvéolos, los diminutos sacos de aire en los que se produce el intercambio de gas. Generalmente se reconoce que el factor crítico para la entrega eficiente de siRNA depende de las propiedades de las partículas del fármaco ARNi en términos de tamaño, carga, forma, velocidad y densidad. Para la entrega eficiente de siRNA pulmonar, las partículas deben depositarse en el tracto respiratorio inferior. La deposición en la vía aérea se ve afectada por el tamaño de las partículas y la función pulmonar del paciente. Se encuentra que el tamaño de las partículas entre 1-5 μm es el más apropiado para la deposición en el tracto respiratorio inferior [23]. Además, la presencia de proteínas mucos y surfactantes, las acciones de aclaramiento mucociliar y la fagocitosis por Por lo tanto, los sistemas de parto generalmente requieren vectores de parto, y estos vectores necesitan ser diseñados con el fin de maximizar la deposición de siRNA en el área enferma del tracto respiratorio. Además, las barreras extracelulares al parto de siRNA también dependen de características fisiológicas del tracto respiratorio, que pueden cambiar con la enfermedad y características del paciente. En el estadio activo de la enfermedad pulmonar, las condiciones fisiológicas de las vías respiratorias podrían cambiar y tener un impacto significativo en la eficiencia del sistema de parto pulmonar. Durante la infección, inflamación y reacción alérgica, hay un aumento en la secreción de mucosidad junto con el aclaramiento mucociliar dañado [43]. Además, el asma y la EPOC son ambas condiciones inflamatorias crónicas del pulmón asociadas con "remodelación" estructural que no es apropiada para el mantenimiento de la función pulmonar normal [44]. Figura 2. Barreras extracelulares al parto de siRNA pulmonar. La característica anatómica del tracto respiratorio es su alto grado de ramificación. El moco alinea el epitelio respiratorio desde la cavidad nasal hasta los bronquios terminales. Las partículas depositadas en las células epiteliales ciliadas son rápidamente despejadas por las acciones de aclaramiento mucociliar. El muco y el aclaramiento mucociliar de las partículas atrapadas por mucosidad es un mecanismo de defensa pulmonar como barrera fisiológica. En las células alveolar, clara y alveolar tipo II se secretan en la superficie del epitelio alveolar, formando una capa delgada de surfactantes pulmonares. Los surfactantes actúan como barrera principal para el parto de siRNA porque reducen la eficiencia de la transfección. Además, los macrófagos ubicados en los alveolos absorbe Las partículas recogidas en los macrófagos se degradan posteriormente dentro de las células, los cuales presentan barreras importantes para el parto pulmonar dirigido; el segundo es el membrance de las células de las vías respiratorias y sus barreras intracelulares (Figura 3 ). Para el silenciamiento eficiente de los genes en los pulmones, los siRNAs deben ser entregados a su sitio de acción, ser estables, entrar en las células diana y estar presentes en el citoplasma a una concentración suficiente; una vez que los siRNAs alcanzan las células diana, deben ser transportados al citoplasma y llevados por Argonaute (Ago)2/complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), que degrada los mRNAs y, posteriormente, suprime la expresión génica secuencia-específica; para que ocurra una endocitosis eficiente, las partículas deben tener un tamaño inferior a 150 nm. Las propiedades fisicoquímicas de los siRNA también juegan un papel significativo en el cruce de la membrana biológica. A pesar de su pequeño tamaño, la carga negativa y la degradabilidad química de las moléculas de siRNA les impiden cruzar fácilmente las membranas biológicas. Por lo tanto, los enfoques eficientes de siRNA necesitan superar esta limitación facilitando la captación celular. Una de las principales funciones de un vector de entrega es facilitar la captación celular de siRNA [46]. La complejación electrostática de moléculas de siRNA con lípidos y polímeros catiónicos ayuda a enmascarar su carga negativa neta. El complejo portador de siRNA con carga positiva interactúa con proteoglicanos aniónicos en la membrana celular, forma una vesícula endocítica, y entra en las células por endocitosis [47]. Después de la internalización celular, el complejo portador de siRNA en vesículas endocíticas es transportado a lo largo de microtúbulos a lisosomas que son colocalizados con el centro organizador de microtúbulos. Para evitar la degradación lisosómica, los siRNAs deben escapar del endosoma al citoplasma, donde pueden asociarse con la maquinaria ARNi. El escape endosomal es una barrera importante para la entrega eficiente de siRNA [48, 49]. El endosomal atrapamiento y la degradación lisosómica del siRNA y los portadores contribuyen a la baja eficiencia de transfección y es una dificultad importante para los vectores de entrega. Un agente de entrega ideal debe proteger los siRNAs de la degradación enzimática, facilitar la absorción celular, y promover la fuga endosomal dentro de las células con toxicidad insignificante. Se han reportado múltiples enfoques para la entrega de siRNAs, que van desde la administración directa relativamente simple de siRNAs con forma salina hasta enfoques de nanopartículas basadas en lípidos y polímeros y enfoques de conjugación y complejación de siRNAs [50]. La carga negativa y la degradabilidad química de los siRNAs bajo condiciones fisiológicamente relevantes hacen que su entrega sea un desafío importante. En consecuencia, la entrega de siRNAs generalmente requiere un vector o portadores para su transfección en las células diana. En general, se están evaluando vectores virales y no virales para la entrega de siRNAs a las células pulmonares. Algunos vectores virales, como retrovirus y adenovirus, han sido demostrados para mediar el silenciamiento genético en un modelo pulmonar in vitro [51] e inducir RNAi en una gama de tejidos animales [52]. Demostró que el siRNA mediado por lentivirus fue utilizado específicamente para derribar la expresión de la proteína nuclear 1 (NUPR1) in vivo, lo que resultó en un crecimiento tumoral inhibido [53]. Sin embargo, el parto basado en virus tiene varias desventajas. La respuesta inmune a los virus no sólo impide la entrega de genes sino que también tiene el potencial de causar complicaciones graves [54]. Casos recientes bien documentados, como la muerte de Jesse Gelsinger debido a complicaciones relacionadas con un vector de distribución adenoviral, destacan este problema [55]. Además, algunos vectores virales pueden insertar su genoma en posiciones aleatorias en el cromosoma huésped, lo que finalmente restringe la función génica [56].. Barreras intracelulares para la entrega de siRNA pulmonar. Las barreras a la internalización celular dependen de las propiedades superficiales del siRNA y los portadores (por ejemplo Después de que los siRNAs sean llevados exitosamente a las células diana por medio de endocitosis, las principales barreras para entregar siRNAs a su sitio de acción son la atrapación endosomal y la degradación lisosómica de siRNAs y portadores. Para dirigir el silenciamiento del gen diana, los siRNAs necesitan escapar del endosoma hacia el citoplasma, donde se asocian con el complejo silenciador inducido por Ago2/ARN (RISC) para dirigir la división de mRNAs con sitios de unión complementarios. Como alternativa a los vectores virales, los vectores no virales, incluyendo vectores basados en lípidos y polímeros, generalmente se han utilizado para la entrega de siRNAs a los pulmones debido a su toxicidad reducida [57]. Los vectores de entrega basados en lípidos se utilizan con éxito para producir siRNA in vitro e in vivo [58]. Los lípidos catiónicos están compuestos de cabeza cargada positivamente, un enlace e hidrofóbico. En general, los complejos basados en lípidos son fáciles de formular y se logra una buena eficacia de transfección debido a la interacción con la membrana celular cargada negativa. Muchos agentes de transfección de siRNA comerciales son sistemas de administración basados en lípidos, algunos de los cuales también se emplean para el parto pulmonar-DharmFECT [30], Oligofectamina [59], Lipofectamina [60] y TransIT-TKO [35]. Del mismo modo, los polímeros catiónicos también se han evaluado para la entrega de siRNA a las células pulmonares. Por otro lado, los vectores basados en lípidos también pueden inducir toxicidad y activación inespecífica de las respuestas inflamatorias de citocina e interferón [62, 63]. Aunque los vectores basados en polímero provocan una respuesta inmune relativamente menos fuerte que los vectores basados en lípidos, la administración efectiva de siRNA a un área local en enfermedades pulmonares requiere más atención al desarrollo de vectores de entrega no tóxicos. Un punto importante para la inhibición de la expresión génica mediada por siRNA es si los efectos observados son específicos y no debidos a efectos fuera de la meta y no están libres de respuestas potenciales de interferón [64, 65]. Curiosamente, algunos estudios han demostrado que fue posible administrar "siRNA desnuda" a ratones y regular un objetivo endógeno o exógeno sin inducir una respuesta de interferón [66]. Los siRNAs desnudos son degradados por las endonucleasas séricas y generalmente son eliminados por filtración glomerular, resultando en una corta semivida plasmática de < 10 min. Por lo tanto, algunos estudios de la entrega sistémica de siRNAs desnudos no han logrado reducir la regulación del gen objetivo [67, 68]. En contraste, también ha habido algunos éxitos en la entrega local de siRNAs desnudos a los pulmones [15, 16, 20, 31]. Algunos de ellos reportaron que el uso de vectores de distribución no mostró diferencia significativa en la eficiencia silenciadora de genes en comparación con la de los siRNAs desnudos [16, 35]. De hecho, en un ensayo clínico, se ha utilizado la entrega de siRNAs desnudos para el tratamiento de RSV [17, 38]. Esta evidencia exitosa puede ser debido a que los siRNAs desnudos para aplicaciones clínicas son altamente modificados químicamente para prevenir la degradación inducida por nucleasa y presumiblemente minimizar los efectos estimuladores inmunes. Aunque no está claro cómo los siRNAs desnudos cruzan la membrana celular, obtienen acceso al citoplasma y permanecen intactos para realizar su acción biológica, tanto los ensayos en animales como en humanos se han llevado a cabo exitosamente, mostrando la eficacia de los siRNAs desnudos (ALN-RSV01) que fueron administrados intranasalmente. Esta explicación no ha sido confirmada, pero el daño fisiológico de las células epiteliales respiratorias causadas por infección viral puede haber influido posiblemente en el misterio. El cambio activo en la membrana de células epiteliales de la vía aérea causada por enfermedad infecciosa podría afectar la internalización celular. Sin embargo, la ventaja de los siRNA desnudos sobre los vectores de parto en el tratamiento de enfermedades pulmonares es controvertida [69, 70]. Se requieren más investigaciones in vivo sobre los siRNA desnudos y los vectores no virales. La enfermedad pulmonar es una de las principales causas de muerte, y la disminución de la calidad de vida es responsable del sufrimiento de muchos pacientes. Varias enfermedades pulmonares hacen la vida extremadamente difícil para los pacientes, y los casos graves de estas enfermedades pulmonares pueden resultar en la muerte. Las altas tasas de muerte asociadas con el cáncer de pulmón se deben en parte al hecho de que es lamentablemente difícil de curar. Sobre todo, la EPOC es la cuarta causa de muerte en la mayoría de los países industrializados y se prevé que se convierta en tercera para 2020 [71]. Por lo tanto, se necesita una acción decisiva para frenar el aumento de la salud y la carga económica que esto representa. Las enfermedades pulmonares crónicas La aprobación de corticosteroides inhalados fue pionera en una nueva generación de terapia en el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas, siendo la primera vez que se disponía de un producto antiinflamatorio para reducir la inflamación pulmonar característica en las vías respiratorias y la obstrucción asociada. Los corticosteroides siguen siendo una importante intervención terapéutica. Sin embargo, se utilizan con limitaciones en la EPOC y asma de moderada a grave. Asimismo, el tratamiento de diversas enfermedades pulmonares refractarias también depende de la terapia sistémica con corticosteroides. Muchos de estos pacientes también sufrieron diversos efectos secundarios del uso sistémico de corticosteroides, como aumento de peso e hiperglucemia no controlada. El tratamiento de la enfermedad pulmonar utilizando una orientación celular específica, así como técnicas RNAi, representan una estrategia novedosa y podrían proporcionar nuevas oportunidades en nanomedicina. Las aplicaciones pulmonares de siRNA in vivo son frecuentemente estudiadas y a menudo resultan en ensayos clínicos [57, 72]. Desde el descubrimiento de ARNi, el potencial terapéutico de los siRNAs ha sido rápidamente reconocido. En 2004, el primer ensayo clínico humano de terapia basada en ARNi se inició para el tratamiento de la degeneración macular relacionada con la edad con un siRNA dirigido al receptor de VEGF 1 entregado intravítreamente [73]. Se han realizado muchos estudios en los últimos años que involucran la entrega de siRNAs a los pulmones para el tratamiento de diversas enfermedades pulmonares. La entrega a los pulmones será más importante para mover la tecnología de siRNAs a la clínica. Se están evaluando varias terapias basadas en siRNAs en ensayos clínicos para el tratamiento de diferentes condiciones, incluyendo enfermedades pulmonares como asma e infección por VSR. La Tabla 1 es un resumen de ensayos clínicos de terapias basadas en siRNAs [74]. El siRNA muestra potencial para el tratamiento de varias infecciones virales pulmonares, y se ha reportado que los tratamientos basados en el siRNA también pueden ser utilizados en el tratamiento de la gripe [13], el virus de la parainfluenza [35], el síndrome respiratorio agudo severo (SARS) [14], y el VRS [35]. Sobre todo, el VRS es el objetivo terapéutico más prometedor de los siRNAs. El VRS es una causa común de infecciones respiratorias graves en lactantes y niños. También produce morbilidad y mortalidad significativas en poblaciones adultas inmunocomprometidas o ancianas [75]. No se dispone de una vacuna contra el VRS, y la única terapia antiviral aprobada para el VRS es indeseable para los pacientes pediátricos debido a su potencial teratogenicidad y eficacia limitada. El tratamiento basado en ARNi ha mostrado efectos prometedores en modelos murinos de infección por VRS [35]. El siRNA, ALN-RSV01, está dirigido contra el ARNm que codifica la proteína N del VRS que exhibe actividad anti-VRS específica in vitro e in vivo. Se entrega sin un vector de parto como aerosol nasal y se dirige al tracto respiratorio superior en lugar del área pulmonar inferior. ALN-RSV01 ha sido sometido a estudios completos de fase I intranasal e inhalación en adultos sanos y se ha encontrado que es generalmente bien tolerado [38]. Además, ALN-RSV01 ha sido evaluado en un ensayo aleatorizado, doble ciego, controlado con placebo en pacientes trasplantados de pulmón con infección del tracto respiratorio RSV [76]. La administración de ALN-RSV01 a pacientes de trasplante de pulmón infectados por VRS fue segura y bien tolerada y asociada con una Basándose en estos resultados, se ha iniciado un ensayo multinacional más amplio, aleatorizado y doble ciego de fase IIb de ALN-RSV01 en pacientes con trasplante de pulmón para confirmar y extender estos hallazgos. El cáncer es un objetivo principal de la terapia basada en ARNi, ya que los oncogenes, los genes supresores de tumores mutados y varios otros genes que contribuyen a la progresión del tumor son objetivos potencialmente importantes para el silenciamiento de genes por ARNi. El cáncer de pulmón es uno de los tumores más frecuentes en todo el mundo con respecto a las tasas de incidencia y mortalidad. Los pacientes con cáncer de pulmón se diagnostican comúnmente en un estadio avanzado de la enfermedad y tienen opciones terapéuticas limitadas. La principal ventaja de la terapia ARNi en el cáncer podría ser la focalización simultánea de genes múltiples pertenecientes a diferentes vías celulares que participan en la progresión del tumor. La inhibición simultánea de varios genes también minimizaría el riesgo de resistencia a fármacos que normalmente se encuentran con terapias basadas en pequeñas moléculas, que involucran siRNAs y miRNAs. Ya ha habido mejoras significativas en los siRNAs para el tratamiento primario o metastásico del cáncer de pulmón al dirigirse a oncogenes como Akt1 [9], tumor de Wilms 1 (WT1) [12], genes sobreexpresados como el receptor del factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1R) [77], NUPR1 [53] y EZH2 [78]. Algunos de estos estudios han demostrado con éxito la eficacia de la terapia basada en ARNi mediante la administración intrapulmonar de siRNAs Aunque se deben diseñar estrategias para minimizar los efectos inmunoestimuladores fuera de objetivo y no específicos, estos datos sugieren que el silenciamiento del gen diana con siRNAs es una estrategia atractiva para la prevención y el tratamiento del cáncer de pulmón primario y metastásico. Actualmente hay algunos ensayos clínicos en curso que estiman la seguridad y eficacia de los fármacos basados en siRNAs para el tratamiento del cáncer. Atu027, un siRNA-lipoplex dirigido contra la proteína cinasa N3 (PKN3), previno la metástasis pulmonar en un ensayo de fase I de varios modelos de cáncer [79]. PKN3 es un efector aguas abajo de la vía de señalización de la fosfoinositida 3-quinasa (PI3K), que regula diversas respuestas celulares, incluyendo desarrollo, crecimiento y supervivencia [81]. Recientemente, PKN3 también ha sido considerado como una diana terapéutica adecuada para modular la angiogénesis tumoral debido a que la pérdida de análisis de función con Atu027 en células endoteliales primarias cultivadas mostró un papel esencial de PKN3 para la formación y migración de tubos endoteliales [79]. Atu027 puede ser considerado como un potencial siRNA para prevenir metástasis pulmonares y podría ser adecuado para prevenir metástasis hematógenas combinadas con terapia convencional del cáncer. La enfermedad pulmonar inflamatoria, también llamada EPOC, incluye una amplia gama de dolencias pulmonares. Estas enfermedades relacionadas incluyen asma, fibrosis pulmonar y bronquitis crónica. Están influenciadas por una combinación de componentes ambientales, genéticos y epigenéticos [82]. La EPOC es una enfermedad inflamatoria crónica de las vías respiratorias. La EPOC se asocia principalmente al tabaquismo, y estudios recientes que investigan la fisiopatología del enfisema han demostrado que el humo del cigarrillo puede causar que las células entren en la senescencia celular. Fumar puede causar senescencia a las células debido al daño del ADN a través del aumento del recambio celular, lo que a su vez conduce al acortamiento acelerado del telómero [84]. Últimamente, muchos estudios han investigado el papel de la senescencia celular en el desarrollo y la progresión de la EPOC [85]. Aunque varias clases de medicamentos, incluyendo corticosteroides inhalados, se utilizan para el tratamiento de la EPOC, ninguno de estos medicamentos ha demostrado mejorar significativamente la función pulmonar a largo plazo durante la progresión de la enfermedad. Muchas personas están desarrollando EPOC, y la causa de esta afección es complicada y no se comprende a fondo.Un factor clave es la susceptibilidad genética.Algunos estudios han mostrado una gran contribución genética a la variabilidad de la función pulmonar y EPOC [86, 87].Los polimorfismos en genes múltiples se han reportado asociados con EPOC [87], tales como factor de transcripción [por ejemplo factor nuclear-kappa B (NFoB)] [88], matriz extracelular (por ejemplo, matriz metaloproteinasa-12 (MMP-12)) [89, 90], citocinas [por ejemplo factor de necrosis tumoral (TNF)-α] [91], quimioquinas [por ejemplo. la interleucina (IL)-8, el receptor IL-8 y el receptor de quimiocina (CCR)1 [92, 93], y la apoptosis (por ejemplo, caspasa-3 y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)) [94, 95]. Muchos de ellos se han identificado como posibles blancos de la intervención terapéutica utilizando inhibidores de moléculas o antagonistas. Aunque varios tratamientos nuevos que se dirigen al proceso inflamatorio se encuentran ahora en desarrollo clínico, como inhibidores del TNF-α e inhibidores del complejo I-kappaB cinasa 2 (IKK2) [96, 97], los ensayos clínicos con siRNA nunca se han realizado en la EPOC. El retraso en el desarrollo de fármacos para la EPOC podría deberse a la aparición relativamente reciente de investigaciones que abordan la base molecular de la EPOC. Además, se necesitan más investigaciones para entender los mecanismos moleculares esenciales sobre la patogénesis de la EPOC y desarrollar técnicas de monitoreo para apoyar el desarrollo de terapias ARNi. Actualmente, no hay tratamientos disponibles que reduzcan la progresión de la EPOC o supriman la inflamación en las vías aéreas pequeñas y el parénquima pulmonar. El enfoque basado en los ARNi para las moléculas clave también tiene implicaciones potenciales para el tratamiento de la EPOC. El asma es también una enfermedad inflamatoria crónica de las vías aéreas caracterizada por síntomas variables y recurrentes y obstrucción reversible del flujo de aire. La Organización Mundial de la Salud estima que actualmente están afectadas 300 millones de personas y que, para el año 2025, otros 100 millones serán afectados por la enfermedad [98]. Los corticosteroides inhalados son muy eficaces en asma leve porque mejoran los síntomas y disminuyen las exacerbaciones. Aunque los corticosteroides siguen siendo una importante intervención terapéutica para las enfermedades pulmonares inflamatorias, su uso no siempre es completamente efectivo y está asociado con efectos secundarios. Debido a estas limitaciones, está claro que hay una necesidad de nuevos tipos de medicamentos que pueden tratar y mejorar el pronóstico de asma moderada a grave. Se han identificado muchos genes diana que participan en la patogénesis del asma. Los objetivos más prometedores incluyen la codificación de genes para citoquinas (IL-4, IL5, IL-13), receptores de citoquinas y quimioquinas (IL-4 y CCR3), y tirosina quinasas [tirosina quinasa batida (Syk) y nuevas tirosina quinasa (Lyn) relacionadas con LCK/YES)], así como para factores de transcripción [transductores de señales y activadores de transcripción 1 (STAT1), STAT6, GATA3 y NF Actualmente, en un ensayo clínico para el asma, Excellair TM (ZaBeCor, Bala Cynwyd, PA, EE.UU.), se está utilizando un siRNA que se dirige a Syk. La cinasa está involucrada en la señalización de un receptor de células B y es un regulador clave de cascadas de señalización aguas abajo que en última instancia conducen a la activación de varios factores de transcripción proinflamatorios. Se ha reportado que los oligonucleótidos antisensibles administrados por aerosol fueron potentes para disminuir la expresión de Syk, liberación mediadora de macrófagos alveolares e inflamación pulmonar dependiente de Syk [102]. Además, se ha demostrado la inhibición de mediadores inflamatorios en un estudio utilizando siRNA dirigido a Syk en células epiteliales de vía aérea [103]. Algunos de los tratamientos actuales para el asma y otras condiciones inflamatorias, tales como inhibidores del TNF-α o inhibidores del leucotrieno, inhiben sólo uno de los mediadores de la inflamación. En contraste, el siRNA dirigido Syk busca inhibir un paso inicial de señalización de la inflamación y, por lo tanto, evitar la liberación de múltiples mediadores inflamatorios. En general, el progreso reciente de los siRNAs a los pulmones también ha mejorado la viabilidad terapéutica de los ARNi para enfermedades pulmonares inflamatorias. El progreso rápido pondrá los tratamientos basados en el siRNA en una vía rápida a la clínica. MiRNAs son pequeños ARNs no codificantes endógenos que regulan la expresión génica reprimiendo la traducción o promoviendo la degradación de su mRNA objetivo. MiRNAs regulan la expresión génica mediante la unión a la 3′ región no traducida (UTR) de En el genoma humano, se estima que las transcripciones de aproximadamente el 60% de todos los ARNm están dirigidas por los miRNAs [104]. De acuerdo con su función, los miRNAs desempeñan un papel importante en los procesos celulares como desarrollo, proliferación y apoptosis de patologías pulmonares [105]. Se ha demostrado que un número creciente de miRNAs están involucrados en diferentes enfermedades pulmonares. Esta evidencia hace de los miRNAs una tecnología prometedora para el desarrollo terapéutico actual y futuro. Discutimos el papel de algunos miRNAs en diversas enfermedades pulmonares, así como el posible futuro de estos descubrimientos en aplicaciones clínicas.La Tabla 2 muestra el resumen de los miRNAs en el desarrollo terapéutico.En este punto, una terapia basada en miRNAs ya ha entrado en un ensayo clínico de fase II.Existe evidencia de que la regulación ascendente o descendente de los miRNAs es Muchos estudios se han centrado en el papel de los miRNAs en las enfermedades pulmonares inflamatorias, como la EPOC [116, 117], la fibrosis pulmonar [118] [118] [119] [129] y el asma [122] [123] [123] [125] [125] (Tabla 3). [130] [117, 129] La patogénesis de la EPOC se atribuye no sólo a la inflamación crónica en las vías respiratorias sino también a la inflamación sistémica [131]. El tabaquismo es el principal factor de riesgo para el desarrollo de la EPOC. Se ha demostrado que el tabaquismo causa cambios biológicos en la expresión génica de los pulmones [132], y hay algunos informes sobre los miRNAs relacionados con el tabaquismo [117, 129, 130]. Sin embargo, hay pocos informes que se centran en los miRNAs relacionados con la patogénesis de esta enfermedad con componentes inflamatorios sistémico El estudio reciente sobre fibroblastos pulmonares de pacientes con EPOC presenta menos expresión de miR-146a después de la estimulación con citocinas proinflamatorias en comparación con sujetos no EPOC con historias de tabaquismo similares [127]. La regulación descendente de miR-146a resultó en una vida media prolongada de ciclooxigenasa-2 del ARNm, aumentando así la prostaglandina E2 en fibroblastos de sujetos con EPOC. Además, Ezzie et al. investigaron la diferencia de perfiles de miRNA expresados en los pulmones de fumadores con y sin EPOC. Concluyeron que miR-223 y miR-1274a fueron los miRNA más afectados en sujetos con EPOC [126]. Sin embargo, la EPOC es un trastorno complejo, multicomponente y heterogéneo con una serie de diferentes procesos patológicos y subgrupos con sus propias características Se necesita una mejor comprensión de la complejidad de la enfermedad y de la potencial relevancia clínica de los miRNA identificados. La fibrosis pulmonar puede ser causada por una irritación identificable a los pulmones, pero en muchos casos se desconoce la causa, y las posibilidades terapéuticas son limitadas. El tabaquismo es uno de los factores de riesgo más reconocidos para el desarrollo de fibrosis pulmonar. Este trastorno se acompaña principalmente de una mayor expresión del mediador fibrótico clave que transforma el factor de crecimiento β (TGF-β) y otras citoquinas producidas en la lesión de fibrosis activa [128]. Recientemente, se informó que los miRNAs pueden desempeñar un papel regulador importante en el cambio fibromático pulmonar en los pulmones. La regulación descendente de let-7d en fibrosis pulmonar idiopática (IPF) resultó en un aumento de la deposición de colágeno y engrosamiento septal alveolar [119] En un modelo diferente de ratón asmático, se observó un aumento en la expresión de miR-21 en los pulmones [123]. Este informe podría contribuir a la comprensión del mecanismo inflamatorio en la vía aérea a través de la inhibición de IL-12, favoreciendo la respuesta de linfocitos Th2. Un receptor 4 (TLR4) inducido por Th2 induce una alta expresión de miR-126, y el bloqueo selectivo de miR-126 suprimió el fenotipo asmático [124]. Además, la remodelación de la vía aérea es una característica del asma y tiene importantes implicaciones funcionales. Rodríguez et al. han demostrado que miR-155 está relacionada con el desarrollo de infiltración inflamatoria en el pulmón y la remodelación de la vía aérea [122]. Así, algunos estudios presentan una conexión funcional entre la expresión de miRNA y la patogénesis del asma y sugieren que dirigir miRNA en las vías respiratorias puede conducir a tratamientos antiinflamatorios para el asma alérgica. A pesar de la evidencia de modelos experimentales, el perfil de expresión de miRNAs en biopsias de vías respiratorias de pacientes con asma leve antes y después del tratamiento con corticosteroides inhalados y en voluntarios sanos no reveló diferencias en la expresión de miRNAs [135]. Se requieren investigaciones adicionales sobre el papel de los miRNAs relacionados con la patogénesis del asma. Aunque la evidencia básica de la biología de miRNAs sigue proporcionando nuevas ideas, las aplicaciones de la terapia basada en miRNAs para enfermedades pulmonares inflamatorias son menos avanzadas que las del cáncer de pulmón [136]. Una razón de esto podría ser que la heterogeneidad de la enfermedad es causada por los efectos de muchos contaminantes ambientales del aire, incluyendo humo y compuestos orgánicos volátiles. La presencia de varios factores de riesgo complica la comprensión de la patogénesis de enfermedades pulmonares inflamatorias. La comprensión del papel que desempeñan los miRNAs en la modulación de la expresión génica, que conduce a sostener la patogénesis de las enfermedades pulmonares, es importante para el desarrollo de nuevas terapias que se centran en la prevención de la progresión de la enfermedad y el alivio de los síntomas. Dadas las importantes funciones que desempeñan los miRNAs en múltiples vías de carcinogénesis pulmonar, se están dedicando cada vez más esfuerzos a la investigación y desarrollo de terapias basadas en miRNAs, incluyendo la restauración de las funciones de miRNAs supresoras de tumores o la inhibición de miRNAs oncogénicos. El desarrollo de terapias basadas en miRNAs para el cáncer de pulmón está creciendo prósperamente con la ayuda de nuevas tecnologías ARNi. En comparación con las terapias basadas en siRNAs, que ya están en ensayos clínicos, los miRNAs son menos tóxicos y tienen el potencial de Los problemas críticos para el desarrollo de esta terapia son la entrega efectiva a los sitios de destino, la potencia de la terapia y la eliminación de los efectos fuera de la diana [137]. Hay dos estrategias como las aplicaciones terapéuticas de los miRNAs para el cáncer de pulmón [138]. Una estrategia es la terapia de reemplazo de miRNAs, que implica la reintroducción de un miRNA supresor tumoral imitado para restaurar una pérdida de la función. MiRNAs imitan a los duplex de ARN sintéticos diseñados para imitar las funciones endógenas de los miRNAs con modificaciones químicas para la estabilidad y la absorción celular. El concepto de terapia de reemplazo de miRNAs es más ejemplificado por el miRNAs let-7. let-7 es un miRNAs tumor-supresor en cáncer de pulmón no microcítico que se correlaciona inversamente con la expresión La administración intranasal de let-7 imitado en modelos de ratón de cáncer de pulmón redujo significativamente el crecimiento del tumor, lo que sugiere que la terapia de reemplazo de miRNA es realmente prometedora [106, 140, 141]. Otro miRNA que muestra el valor del reemplazo de miRNA es proporcionado por miR-34a [107, 142]. La administración local y/o sistémica de una miR-34a sintética imitada llevó a la acumulación de miR-34a en el tejido tumoral e inhibición del crecimiento del tumor pulmonar. Últimamente, Ling et al. también mostraron que el supresor miR-22 mostró actividad anti-cáncer pulmonar mediante la regulación post-transcripción de ErbB3 [143]. Así, las miRNA terapéuticas imitadas tienen un potencial poderoso atacando genes múltiples relevantes para varias enfermedades. Sin embargo, es necesario prestar atención a la toxicidad potencial en los tejidos normales en condiciones en las que la administración terapéutica de miRNA imita conducirá a una acumulación de miRNAs exógenos en células normales [138]. Aunque las suposiciones están bien fundadas, todavía hay evidencia insuficiente de toxicidad causada por miRNA imitaciones. De hecho, varios estudios in vivo fallaron en revelar efectos secundarios causados por los miRNA imitaciones y sugirió que la entrega de miRNA imitaciones a tejidos normales fue bien tolerada [107, 141]. Será importante investigar los efectos miRNAs imitados en células normales y evaluar cuidadosamente la toxicidad antes de utilizarlos en la práctica clínica. La segunda estrategia se dirige a una ganancia de función y tiene como objetivo inhibir oncomiRs mediante el uso de anti-miRNAs. Las modificaciones químicas, como el grupo 2'-O-metilo y el ácido nucleico bloqueado (LNA), aumentarían la estabilidad del oligo contra las nucleasas [144]. Los oligonucleótidos antisensibles contenidos en estas modificaciones se denominan antagomirs o "LNA-antimiRs" [144, 145]. Son oligonucleótidos con secuencias complementarias al miRNA endógeno e inhiben la función específica del miRNA. Se ha demostrado que un LNA-antimiR contra miR-122 silencia efectivamente miR-122 en primates no humanos [145], y los hallazgos apoyan el potencial de estos compuestos como una nueva clase terapéutica. Además, también se ha reportado que los anti-miR-150 suministrados en el tumor pulmonar xenoinjertos en ratones llevaron a un crecimiento tumoral inhibido En relación con estudios sobre miRNA imitados, estudios con oligonucleótidos antisensibles han mostrado evidencia efectiva con oligonucleótidos desnudos, lo que ilustra el potencial de modificaciones químicas de oligonucleótidos para mejorar su estabilidad, resistencia a la RNASa y propiedades farmacológicas, por lo que la inhibición de la función miRNA por antimiR oligonucleótidos químicamente modificados se ha convertido en un enfoque importante y ampliamente utilizado. Datos recientes del primer estudio de fase II en pacientes con infección crónica por VHC tratados con el antimiR-122 modificado por LNA mostraron que este compuesto fue bien tolerado y proporcionó supresión viral continua. Un número creciente de estudios han examinado el potencial terapéutico de los miRNAs. Recientemente, ha surgido la evidencia de roles para miRNAs en la determinación de resistencia a fármacos [147]. En esta situación, la combinación de miRNA imita o antimiR con quimioterapia puede potenciar la eficacia del tratamiento del cáncer en el futuro. Además, los miRNA relacionados con las células madre cancerosas pueden ampliar significativamente el campo de la terapia basada en miRNA y sugerir que los miRNAs pueden ser herramientas potenciales para destruir las células cancerosas asociadas con la resistencia a la terapia, recurrencia y metástasis [108, 148]. Por lo tanto, el principal desafío es el suministro exitoso y las modificaciones químicas de los miRNAs terapéuticos al tejido objetivo sin dañar los tejidos normales. Los enfoques basados en ARNi proporcionan una modalidad terapéutica prometedora para el tratamiento de diversas enfermedades pulmonares. Uno de los mayores desafíos en la terapia basada en ARNi sigue siendo el método de entrega de los siRNAs terapéuticos y miRNAs a las células objetivo. Las aplicaciones de parto pulmonar son muy atractivas, ya que tienden a ser no invasivas, son localmente restringidas y pueden ser administradas por el paciente. Una intervención terapéutica realista, como la aerosolización, puede mejorar la administración de medicamentos en el lugar de acción y disminuir la exposición sistémica del paciente a la terapia, reduciendo así los efectos fuera de la diana. El avance de la entrega de siRNA pulmonar a la clínica ilustra que la terapia basada en ARNi ocupa un lugar central en el tratamiento futuro de las enfermedades pulmonares. Por otro lado, los miRNAs tienen la oportunidad de dirigir genes múltiples de una manera refinada, y la terapia basada en miRNA proporcionará un atractivo enfoque antitumoral y antiinflamatorio para diversas enfermedades pulmonares. En particular, la terapia antimiRNA por antimiR oligonucleótidos químicamente modificado se ha convertido en una terapia potencial para enfermedades pulmonares porque los oligonucleótidos El aumento de la evidencia ha indicado que los miRNA cumplen funciones causales en una variedad de enfermedades pulmonares y han impulsado investigaciones sobre su potencial como dianas terapéuticas. Para el desarrollo futuro se requieren una mayor comprensión de los mecanismos detallados de la terapia basada en ARNi y la investigación de métodos de parto más eficaces. Estos nuevos enfoques podrían abrir nuevas vías para diversas enfermedades pulmonares y mejorar el resultado clínico de los pacientes.

¿Por qué la mucosa nasal es útil en la entrega de pequeñas moléculas en el cuerpo?

Las plataformas terapéuticas de RNAi para las enfermedades pulmonareshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3816685/Fujita, Yu; Takeshita, Fumitaka; Kuwano, Kazuyoshi; Ochiya, Takahiro2013-02-06DOI:10.3390/ph6020223Licencia:cc-byAbstract: La interferencia del ARN (ARNi) se está convirtiendo rápidamente en un método importante para analizar las funciones genéticas en muchos eucariotas y promete el desarrollo de silenciamiento genético terapéutico. La inducción de RNAi se basa en los pequeños ARN silenciadores, que afectan a la degradación específica del ARN mensajero (ARNm). Los estudios de descubrimiento de fármacos y los tratamientos novedosos de los siRNAs están actualmente dirigidos a una amplia gama de enfermedades, incluyendo varias infecciones virales y cánceres. Las enfermedades pulmonares en general son blancos atractivos para las terapias de siRNAs debido a su letalidad y prevalencia. Además, el pulmón es accesible anatómicamente a los agentes terapéuticos a través de la vía intrapulmonar. Recientemente, la evidencia creciente indica que los miRNAs desempeñan un papel importante en las anomalías pulmonares, como la inflamación y la oncogénesis. Por lo tanto, los miRNAs están siendo dirigidos con fines terapéuticos. En esta revisión, presentamos estrategias para el parto de ARNi y discutimos el estado actual de la técnica RNAi basada en el arte para diversas enfermedades pulmonares. Texto: cirugía tradicional, Bivas-Benita et al. reportaron que no se produjo mortalidad como resultado del uso de Las aplicaciones endotraqueales están siendo utilizadas actualmente por muchos profesionales en el campo pulmonar [22, 34] ; esto es útil para estudiar la administración de fármacos pulmonares en ratones. Sin embargo, el enfoque es más complejo en humanos porque se utiliza una vía artificial para la entrega de medicamentos en los pulmones. Por lo tanto, el método se está utilizando en modelos animales para probar y evaluar su fiabilidad para posibles aplicaciones clínicas. Ruta intraqueal: bajo anestesia, la tráquea se expone quirúrgicamente, y se inserta un tubo o aguja a través de una incisión hecha entre los anillos traqueales. Complicaciones, tales como lesiones vasculares y fugas de aire, son posibles debido a la traqueotomía. b) Ruta endotraqueal: los siRNAs se rocian directamente desde la boca a los pulmones utilizando un aerolizador MicroSprayer ® (Penn-Century, Filadelfia, PA Es importante mantener una visión clara de la tráquea durante el procedimiento. El parto intranasal es otro método común de aplicación de fármacos pulmonares en estudios en animales. En muchos estudios, se ha demostrado éxito in vivo en la entrega de siRNAs a los pulmones intranasal [22, 35, 36 ]. Una configuración experimental de la entrega intranasal por pulverización o gotita es simple e indolora para el animal. Aunque el éxito en la entrega de siRNAs intranasal en roedores no puede ser completamente extrapolado al uso humano debido a las diferencias significativas en anatomía pulmonar [37], este enfoque tiene potencial para la aplicación clínica de siRNAs. Ensayos clínicos de fase II se han iniciado para el tratamiento de la infección por el virus sincitial respiratorio (RSV), haciendo uso de la aplicación intranasal de moléculas de siRNAs desnudas modificadas químicamente que se dirigen a los productos La entrada intranasal se ha utilizado durante mucho tiempo para administrar moléculas pequeñas, como proteínas, para el parto sistémico. Debido a que la mucosa nasal está altamente vascularizada, la entrega de un epitelio delgado de medicación a través de la superficie puede dar lugar a una rápida absorción del medicamento en la sangre. Por lo tanto, los siRNA administrados intranasalmente pueden depositarse en la nariz, y algunos de ellos pueden no poder llegar al tracto respiratorio inferior. De hecho, se ha informado que la aplicación intranasal de siRNAs no formulados dio lugar a una menor eficiencia de entrega y distribución pulmonar homogénea que la alcanzada con la aplicación intratraqueal [31]. El método intranasal es adecuado para algunas enfermedades pulmonares, como la infección respiratoria superior por VSR, y también tiene potencial para el parto sistémico en lugar de la entrega pulmonar de siRNAs. Por lo tanto, es importante considerar la vía de administración El uso de aerosoles para administrar medicamentos a los pulmones tiene un largo historial. La administración por inhalación es un método popular y no invasivo de administrar agentes a los pulmones. Hay varios dispositivos de inhalación disponibles para la entrega de medicamentos a los pulmones. Los inhaladores de dosis medidas (IDM) y los inhaladores de polvo seco (IDP) son los modos más comunes de administrar inhalación. Los inhaladores de dosis medidas son los inhaladores más utilizados para varias enfermedades pulmonares, como el asma, la bronquitis y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), y un espaciador es un dispositivo externo que se une a una IDM para permitir una mejor administración de medicamentos mediante una mayor coordinación de la activación y la inhalación. Para la mayoría de los IDM, el propelente es uno o más gases llamados clorofluorocarbonos (CFC). Aunque los CFC en los medicamentos son seguros para que los pacientes inhalen, son perjudiciales para el medio ambiente. Por lo tanto, el desarrollo ulterior de los siRNA inhalables puede no ser la mejor manera de avanzar. Los DPI son dispositivos que entregan medicamentos a los pulmones en forma de polvo seco. El uso de los DPI ya ha demostrado ser prometedor para la entrega in vivo de macromoléculas terapéuticas como la insulina [39] y la heparina de bajo peso molecular [40] ; por lo tanto, podría ser un mejor dispositivo para la entrega de siRNAs a los pulmones. Las ventajas de los DPI son una mayor estabilidad y esterilidad de las biomoléculas sobre aerosoles líquidos y la formación libre de propelentes. Aunque los medicamentos se envían comúnmente a los pulmones por inhalación, la mayoría de los estudios in vivo que utilizan siRNAs se han basado en la entrega intratraqueal También se necesita un portador adecuado para proteger los ácidos nucleicos de la degradación debido a la fuerza de corte y al aumento de la temperatura durante el proceso de secado. Se ha demostrado el uso del secado por pulverización como técnica para la ingeniería de formulaciones en polvo seco de nanopartículas de siRNA, que podrían permitir la entrega local de siRNA biológicamente activo directamente al tejido pulmonar [24, 25]. En el futuro, la técnica es deseable para estimar el estudio in vivo sobre terapia de siRNA para inhalación. A largo plazo, anticipamos que habrá dispositivos más sofisticados para el uso clínico y que los que se están desarrollando serán más adecuados. Hay dos barreras principales para la entrega eficiente de siRNA pulmonar a las células del pulmón. La primera es la anatomía compleja y ramificada de los pulmones y barreras biomecánicas, como la capa de muco que cubre las células de las vías respiratorias [41, 42 La vía aérea consiste en bronquiolos respiratorios, conductos alveolares y sacos alveolares. Todas estas estructuras contienen alvéolos, los diminutos sacos de aire en los que se produce el intercambio de gas. Generalmente se reconoce que el factor crítico para la entrega eficiente de siRNA depende de las propiedades de las partículas del fármaco ARNi en términos de tamaño, carga, forma, velocidad y densidad. Para la entrega eficiente de siRNA pulmonar, las partículas deben depositarse en el tracto respiratorio inferior. La deposición en la vía aérea se ve afectada por el tamaño de las partículas y la función pulmonar del paciente. Se encuentra que el tamaño de las partículas entre 1-5 μm es el más apropiado para la deposición en el tracto respiratorio inferior [23]. Además, la presencia de proteínas mucos y surfactantes, las acciones de aclaramiento mucociliar y la fagocitosis por Por lo tanto, los sistemas de parto generalmente requieren vectores de parto, y estos vectores necesitan ser diseñados con el fin de maximizar la deposición de siRNA en el área enferma del tracto respiratorio. Además, las barreras extracelulares al parto de siRNA también dependen de características fisiológicas del tracto respiratorio, que pueden cambiar con la enfermedad y características del paciente. En el estadio activo de la enfermedad pulmonar, las condiciones fisiológicas de las vías respiratorias podrían cambiar y tener un impacto significativo en la eficiencia del sistema de parto pulmonar. Durante la infección, inflamación y reacción alérgica, hay un aumento en la secreción de mucosidad junto con el aclaramiento mucociliar dañado [43]. Además, el asma y la EPOC son ambas condiciones inflamatorias crónicas del pulmón asociadas con "remodelación" estructural que no es apropiada para el mantenimiento de la función pulmonar normal [44]. Figura 2. Barreras extracelulares al parto de siRNA pulmonar. La característica anatómica del tracto respiratorio es su alto grado de ramificación. El moco alinea el epitelio respiratorio desde la cavidad nasal hasta los bronquios terminales. Las partículas depositadas en las células epiteliales ciliadas son rápidamente despejadas por las acciones de aclaramiento mucociliar. El muco y el aclaramiento mucociliar de las partículas atrapadas por mucosidad es un mecanismo de defensa pulmonar como barrera fisiológica. En las células alveolar, clara y alveolar tipo II se secretan en la superficie del epitelio alveolar, formando una capa delgada de surfactantes pulmonares. Los surfactantes actúan como barrera principal para el parto de siRNA porque reducen la eficiencia de la transfección. Además, los macrófagos ubicados en los alveolos absorbe Las partículas recogidas en los macrófagos se degradan posteriormente dentro de las células, los cuales presentan barreras importantes para el parto pulmonar dirigido; el segundo es el membrance de las células de las vías respiratorias y sus barreras intracelulares (Figura 3 ). Para el silenciamiento eficiente de los genes en los pulmones, los siRNAs deben ser entregados a su sitio de acción, ser estables, entrar en las células diana y estar presentes en el citoplasma a una concentración suficiente; una vez que los siRNAs alcanzan las células diana, deben ser transportados al citoplasma y llevados por Argonaute (Ago)2/complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), que degrada los mRNAs y, posteriormente, suprime la expresión génica secuencia-específica; para que ocurra una endocitosis eficiente, las partículas deben tener un tamaño inferior a 150 nm. Las propiedades fisicoquímicas de los siRNA también juegan un papel significativo en el cruce de la membrana biológica. A pesar de su pequeño tamaño, la carga negativa y la degradabilidad química de las moléculas de siRNA les impiden cruzar fácilmente las membranas biológicas. Por lo tanto, los enfoques eficientes de siRNA necesitan superar esta limitación facilitando la captación celular. Una de las principales funciones de un vector de entrega es facilitar la captación celular de siRNA [46]. La complejación electrostática de moléculas de siRNA con lípidos y polímeros catiónicos ayuda a enmascarar su carga negativa neta. El complejo portador de siRNA con carga positiva interactúa con proteoglicanos aniónicos en la membrana celular, forma una vesícula endocítica, y entra en las células por endocitosis [47]. Después de la internalización celular, el complejo portador de siRNA en vesículas endocíticas es transportado a lo largo de microtúbulos a lisosomas que son colocalizados con el centro organizador de microtúbulos. Para evitar la degradación lisosómica, los siRNAs deben escapar del endosoma al citoplasma, donde pueden asociarse con la maquinaria ARNi. El escape endosomal es una barrera importante para la entrega eficiente de siRNA [48, 49]. El endosomal atrapamiento y la degradación lisosómica del siRNA y los portadores contribuyen a la baja eficiencia de transfección y es una dificultad importante para los vectores de entrega. Un agente de entrega ideal debe proteger los siRNAs de la degradación enzimática, facilitar la absorción celular, y promover la fuga endosomal dentro de las células con toxicidad insignificante. Se han reportado múltiples enfoques para la entrega de siRNAs, que van desde la administración directa relativamente simple de siRNAs con forma salina hasta enfoques de nanopartículas basadas en lípidos y polímeros y enfoques de conjugación y complejación de siRNAs [50]. La carga negativa y la degradabilidad química de los siRNAs bajo condiciones fisiológicamente relevantes hacen que su entrega sea un desafío importante. En consecuencia, la entrega de siRNAs generalmente requiere un vector o portadores para su transfección en las células diana. En general, se están evaluando vectores virales y no virales para la entrega de siRNAs a las células pulmonares. Algunos vectores virales, como retrovirus y adenovirus, han sido demostrados para mediar el silenciamiento genético en un modelo pulmonar in vitro [51] e inducir RNAi en una gama de tejidos animales [52]. El siRNA mediado por lentivirus fue utilizado específicamente para derribar la expresión de la proteína nuclear 1 (NUPR1) in vivo, lo que resultó en un crecimiento tumoral inhibido [53]. Sin embargo, el parto basado en virus tiene varias desventajas. La respuesta inmune a los virus no sólo impide la entrega de genes sino que también tiene el potencial de causar complicaciones graves [54]. Casos recientes bien documentados, como la muerte de Jesse Gelsinger debido a complicaciones relacionadas con un vector de distribución adenoviral, destacan este problema [55]. Además, algunos vectores virales pueden insertar su genoma en posiciones aleatorias en el cromosoma huésped, lo que finalmente restringe la función génica [56].. Barreras intracelulares al suministro de siRNA pulmonar. Las barreras a la internalización celular dependen de las propiedades superficiales del siRNA y los portadores (por ejemplo, carga y tamaño). Después de que los siRNAs sean llevados exitosamente a las células diana por medio de endocitosis, las principales barreras para entregar siRNAs a su sitio de acción son la atrapación endosomal y la degradación lisosómica del siRNAs y los portadores. Para dirigir el silenciamiento del gen diana, los siRNAs necesitan escapar del endosoma hacia el citoplasma, donde se asocian con el complejo silenciador inducido por Ago2/ARN (RISC) para dirigir la división de mRNAs con sitios de unión complementarios. Como alternativa a los vectores virales, los vectores no virales, incluyendo vectores basados en lípidos y polímeros, generalmente se han utilizado para la entrega de siRNAs a los pulmones debido a su toxicidad reducida [57]. Los vectores de entrega basados en lípidos se utilizan con éxito para producir siRNA in vitro e in vivo [58]. Los lípidos catiónicos están compuestos de cabeza cargada positivamente, un enlace e hidrofóbico. En general, los complejos basados en lípidos son fáciles de formular y se logra una buena eficacia de transfección debido a la interacción con la membrana celular cargada negativa. Muchos agentes de transfección de siRNA comerciales son sistemas de administración basados en lípidos, algunos de los cuales también se emplean para el parto pulmonar-DharmFECT [30], Oligofectamina [59], Lipofectamina [60] y TransIT-TKO [35]. Del mismo modo, los polímeros catiónicos también se han evaluado para la entrega de siRNA a las células pulmonares. Por otro lado, los vectores basados en lípidos también pueden inducir toxicidad y activación inespecífica de las respuestas inflamatorias de citocina e interferón [62, 63]. Aunque los vectores basados en polímero provocan una respuesta inmune relativamente menos fuerte que los vectores basados en lípidos, la administración efectiva de siRNA a un área local en enfermedades pulmonares requiere más atención al desarrollo de vectores de entrega no tóxicos. Un punto importante para la inhibición de la expresión génica mediada por siRNA es si los efectos observados son específicos y no debidos a efectos fuera de la meta y no están libres de respuestas potenciales de interferón [64, 65]. Curiosamente, algunos estudios han demostrado que fue posible administrar "siRNA desnuda" a ratones y regular un objetivo endógeno o exógeno sin inducir una respuesta de interferón [66]. Los siRNAs desnudos son degradados por las endonucleasas séricas y generalmente son eliminados por filtración glomerular, resultando en una corta semivida plasmática de < 10 min. Por lo tanto, algunos estudios de la entrega sistémica de siRNAs desnudos no han logrado reducir la regulación del gen objetivo [67, 68]. En contraste, también ha habido algunos éxitos en la entrega local de siRNAs desnudos a los pulmones [15, 16, 20, 31]. Algunos de ellos reportaron que el uso de vectores de distribución no mostró diferencia significativa en la eficiencia silenciadora de genes en comparación con la de los siRNAs desnudos [16, 35]. De hecho, en un ensayo clínico, se ha utilizado la entrega de siRNAs desnudos para el tratamiento de RSV [17, 38]. Esta evidencia exitosa puede ser debido a que los siRNAs desnudos para aplicaciones clínicas son altamente modificados químicamente para prevenir la degradación inducida por nucleasa y presumiblemente minimizar los efectos estimuladores inmunes. Aunque no está claro cómo los siRNAs desnudos cruzan la membrana celular, obtienen acceso al citoplasma y permanecen intactos para realizar su acción biológica, tanto los ensayos en animales como en humanos se han llevado a cabo exitosamente, mostrando la eficacia de los siRNAs desnudos (ALN-RSV01) que fueron administrados intranasalmente. Esta explicación no ha sido confirmada, pero el daño fisiológico de las células epiteliales respiratorias causadas por infección viral puede posiblemente haber influido en el misterio. El cambio activo en la membrana celular epitelial de la vía aérea causada por enfermedad infecciosa podría afectar la internalización celular. Sin embargo, la ventaja de los siRNA desnudos sobre los vectores de parto en el tratamiento de enfermedades pulmonares es controvertida [69, 70]. Se requieren más investigaciones in vivo sobre los siRNA desnudos y los vectores no virales. La enfermedad pulmonar es una de las principales causas de muerte, y la disminución de la calidad de vida es responsable del sufrimiento de muchos pacientes. Varias enfermedades pulmonares hacen la vida extremadamente difícil para los pacientes, y los casos graves de estas enfermedades pulmonares pueden resultar en la muerte. Las altas tasas de muerte asociadas con el cáncer de pulmón se deben en parte al hecho de que es lamentablemente difícil de curar. Sobre todo, la EPOC es la cuarta causa de muerte en la mayoría de los países industrializados y se prevé que se convierta en tercera para 2020 [71]. Por lo tanto, se necesita una acción decisiva para frenar el aumento de la salud y la carga económica que esto representa. Las enfermedades pulmonares crónicas La aprobación de corticosteroides inhalados fue pionera en una nueva generación de terapia en el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas, siendo la primera vez que se disponía de un producto antiinflamatorio para reducir la inflamación pulmonar característica en las vías respiratorias y la obstrucción asociada. Los corticosteroides siguen siendo una importante intervención terapéutica. Sin embargo, se utilizan con limitaciones en la EPOC y asma de moderada a grave. Asimismo, el tratamiento de diversas enfermedades pulmonares refractarias también depende de la terapia sistémica con corticosteroides. Muchos de estos pacientes también sufrieron diversos efectos secundarios del uso sistémico de corticosteroides, como aumento de peso e hiperglucemia no controlada. El tratamiento de la enfermedad pulmonar utilizando una orientación celular específica, así como técnicas RNAi, representan una estrategia novedosa y podrían proporcionar nuevas oportunidades en nanomedicina. Las aplicaciones pulmonares de siRNA in vivo son frecuentemente estudiadas y a menudo resultan en ensayos clínicos [57, 72]. Desde el descubrimiento de ARNi, el potencial terapéutico de los siRNAs ha sido rápidamente reconocido. En 2004, el primer ensayo clínico humano de terapia basada en ARNi se inició para el tratamiento de la degeneración macular relacionada con la edad con un siRNA dirigido al receptor de VEGF 1 entregado intravítreamente [73]. Se han realizado muchos estudios en los últimos años que involucran la entrega de siRNAs a los pulmones para el tratamiento de diversas enfermedades pulmonares. La entrega a los pulmones será más importante para mover la tecnología de siRNAs a la clínica. Se están evaluando varias terapias basadas en siRNAs en ensayos clínicos para el tratamiento de diferentes condiciones, incluyendo enfermedades pulmonares como asma e infección por VSR. La Tabla 1 es un resumen de ensayos clínicos de terapias basadas en siRNAs [74]. El siRNA muestra potencial para el tratamiento de varias infecciones virales pulmonares, y se ha reportado que los tratamientos basados en el siRNA también pueden ser utilizados en el tratamiento de la gripe [13], el virus de la parainfluenza [35], el síndrome respiratorio agudo severo (SARS) [14], y el VRS [35]. Sobre todo, el VRS es el objetivo terapéutico más prometedor de los siRNAs. El VRS es una causa común de infecciones respiratorias graves en lactantes y niños. También produce morbilidad y mortalidad significativas en poblaciones adultas inmunocomprometidas o ancianas [75]. No se dispone de una vacuna contra el VRS, y la única terapia antiviral aprobada para el VRS es indeseable para los pacientes pediátricos debido a su potencial teratogenicidad y eficacia limitada. El tratamiento basado en ARNi ha mostrado efectos prometedores en modelos murinos de infección por VRS [35]. El siRNA, ALN-RSV01, está dirigido contra el ARNm que codifica la proteína N del VRS que exhibe actividad anti-VRS específica in vitro e in vivo. Se entrega sin un vector de parto como aerosol nasal y se dirige al tracto respiratorio superior en lugar del área pulmonar inferior. ALN-RSV01 ha sido sometido a estudios completos de fase I intranasal e inhalación en adultos sanos y se ha encontrado que es generalmente bien tolerado [38]. Además, ALN-RSV01 ha sido evaluado en un ensayo aleatorizado, doble ciego, controlado con placebo en pacientes trasplantados de pulmón con infección del tracto respiratorio RSV [76]. La administración de ALN-RSV01 a pacientes de trasplante de pulmón infectados por VRS fue segura y bien tolerada y asociada con una Basándose en estos resultados, se ha iniciado un ensayo multinacional más amplio, aleatorizado y doble ciego de fase IIb de ALN-RSV01 en pacientes con trasplante de pulmón para confirmar y extender estos hallazgos. El cáncer es un objetivo principal de la terapia basada en ARNi, ya que los oncogenes, los genes supresores de tumores mutados y varios otros genes que contribuyen a la progresión del tumor son objetivos potencialmente importantes para el silenciamiento de genes por ARNi. El cáncer de pulmón es uno de los tumores más frecuentes en todo el mundo con respecto a las tasas de incidencia y mortalidad. Los pacientes con cáncer de pulmón se diagnostican comúnmente en un estadio avanzado de la enfermedad y tienen opciones terapéuticas limitadas. La principal ventaja de la terapia ARNi en el cáncer podría ser la focalización simultánea de genes múltiples pertenecientes a diferentes vías celulares que participan en la progresión del tumor. La inhibición simultánea de varios genes también minimizaría el riesgo de resistencia a fármacos que normalmente se encuentran con terapias basadas en pequeñas moléculas, que involucran siRNAs y miRNAs. Ya ha habido mejoras significativas en los siRNAs para el tratamiento primario o metastásico del cáncer de pulmón al dirigirse a oncogenes como Akt1 [9], tumor de Wilms 1 (WT1) [12], genes sobreexpresados como el receptor del factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1R) [77], NUPR1 [53] y EZH2 [78]. Algunos de estos estudios han demostrado con éxito la eficacia de la terapia basada en ARNi mediante la administración intrapulmonar de siRNAs Aunque se deben diseñar estrategias para minimizar los efectos inmunoestimuladores fuera de objetivo y no específicos, estos datos sugieren que el silenciamiento del gen diana con siRNAs es una estrategia atractiva para la prevención y el tratamiento del cáncer de pulmón primario y metastásico. Actualmente hay algunos ensayos clínicos en curso que estiman la seguridad y eficacia de los fármacos basados en siRNAs para el tratamiento del cáncer. Atu027, un siRNA-lipoplex dirigido contra la proteína cinasa N3 (PKN3), previno la metástasis pulmonar en un ensayo de fase I de varios modelos de cáncer [79]. PKN3 es un efector aguas abajo de la vía de señalización de la fosfoinositida 3-quinasa (PI3K), que regula diversas respuestas celulares, incluyendo desarrollo, crecimiento y supervivencia [81]. Recientemente, PKN3 también ha sido considerado como una diana terapéutica adecuada para modular la angiogénesis tumoral debido a que la pérdida de análisis de función con Atu027 en células endoteliales primarias cultivadas mostró un papel esencial de PKN3 para la formación y migración de tubos endoteliales [79]. Atu027 puede ser considerado como un potencial siRNA para prevenir metástasis pulmonares y podría ser adecuado para prevenir metástasis hematógenas combinadas con terapia convencional del cáncer. La enfermedad pulmonar inflamatoria, también llamada EPOC, incluye una amplia gama de dolencias pulmonares. Estas enfermedades relacionadas incluyen asma, fibrosis pulmonar y bronquitis crónica. Están influenciadas por una combinación de componentes ambientales, genéticos y epigenéticos [82]. La EPOC es una enfermedad inflamatoria crónica de las vías respiratorias. La EPOC se asocia principalmente al tabaquismo, y estudios recientes que investigan la fisiopatología del enfisema han demostrado que el humo del cigarrillo puede causar que las células entren en la senescencia celular. Fumar puede causar senescencia a las células debido al daño del ADN a través del aumento del recambio celular, lo que a su vez conduce al acortamiento acelerado del telómero [84]. Últimamente, muchos estudios han investigado el papel de la senescencia celular en el desarrollo y la progresión de la EPOC [85]. Aunque varias clases de medicamentos, incluyendo corticosteroides inhalados, se utilizan para el tratamiento de la EPOC, ninguno de estos medicamentos ha demostrado mejorar significativamente la función pulmonar a largo plazo durante la progresión de la enfermedad. Muchas personas están desarrollando EPOC, y la causa de esta afección es complicada y no se comprende a fondo.Un factor clave es la susceptibilidad genética.Algunos estudios han mostrado una gran contribución genética a la variabilidad de la función pulmonar y EPOC [86, 87].Los polimorfismos en genes múltiples se han reportado asociados con EPOC [87], tales como factor de transcripción [por ejemplo factor nuclear-kappa B (NFoB)] [88], matriz extracelular (por ejemplo, matriz metaloproteinasa-12 (MMP-12)) [89, 90], citocinas [por ejemplo factor de necrosis tumoral (TNF)-α] [91], quimioquinas [por ejemplo. la interleucina (IL)-8, el receptor IL-8 y el receptor de quimiocina (CCR)1 [92, 93], y la apoptosis (por ejemplo, caspasa-3 y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)) [94, 95]. Muchos de ellos se han identificado como posibles blancos de la intervención terapéutica utilizando inhibidores de moléculas o antagonistas. Aunque varios tratamientos nuevos que se dirigen al proceso inflamatorio se encuentran ahora en desarrollo clínico, como inhibidores del TNF-α e inhibidores del complejo I-kappaB cinasa 2 (IKK2) [96, 97], los ensayos clínicos con siRNA nunca se han realizado en la EPOC. El retraso en el desarrollo de fármacos para la EPOC podría deberse a la aparición relativamente reciente de investigaciones que abordan la base molecular de la EPOC. Además, se necesitan más investigaciones para entender los mecanismos moleculares esenciales sobre la patogénesis de la EPOC y desarrollar técnicas de monitoreo para apoyar el desarrollo de terapias ARNi. Actualmente, no hay tratamientos disponibles que reduzcan la progresión de la EPOC o supriman la inflamación en las vías aéreas pequeñas y el parénquima pulmonar. El enfoque basado en los ARNi para las moléculas clave también tiene implicaciones potenciales para el tratamiento de la EPOC. El asma es también una enfermedad inflamatoria crónica de las vías aéreas caracterizada por síntomas variables y recurrentes y obstrucción reversible del flujo de aire. La Organización Mundial de la Salud estima que actualmente están afectadas 300 millones de personas y que, para el año 2025, otros 100 millones serán afectados por la enfermedad [98]. Los corticosteroides inhalados son muy eficaces en asma leve porque mejoran los síntomas y disminuyen las exacerbaciones. Aunque los corticosteroides siguen siendo una importante intervención terapéutica para las enfermedades pulmonares inflamatorias, su uso no siempre es completamente efectivo y está asociado con efectos secundarios. Debido a estas limitaciones, está claro que hay una necesidad de nuevos tipos de medicamentos que pueden tratar y mejorar el pronóstico de asma moderada a grave. Se han identificado muchos genes diana que participan en la patogénesis del asma. Los objetivos más prometedores incluyen la codificación de genes para citoquinas (IL-4, IL5, IL-13), receptores de citoquinas y quimioquinas (IL-4 y CCR3), y tirosina quinasas [tirosina quinasa batida (Syk) y nuevas tirosina quinasa (Lyn) relacionadas con LCK/YES)], así como para factores de transcripción [transductores de señales y activadores de transcripción 1 (STAT1), STAT6, GATA3 y NF Actualmente, en un ensayo clínico para el asma, Excellair TM (ZaBeCor, Bala Cynwyd, PA, EE.UU.), se está utilizando un siRNA que se dirige a Syk. La cinasa está involucrada en la señalización de un receptor de células B y es un regulador clave de cascadas de señalización aguas abajo que en última instancia conducen a la activación de varios factores de transcripción proinflamatorios. Se ha reportado que los oligonucleótidos antisensibles administrados por aerosol fueron potentes para disminuir la expresión de Syk, liberación mediadora de macrófagos alveolares e inflamación pulmonar dependiente de Syk [102]. Además, se ha demostrado la inhibición de mediadores inflamatorios en un estudio utilizando siRNA dirigido a Syk en células epiteliales de vía aérea [103]. Algunos de los tratamientos actuales para el asma y otras condiciones inflamatorias, tales como inhibidores del TNF-α o inhibidores del leucotrieno, inhiben sólo uno de los mediadores de la inflamación. En contraste, el siRNA dirigido Syk busca inhibir un paso inicial de señalización de la inflamación y, por lo tanto, evitar la liberación de múltiples mediadores inflamatorios. En general, el progreso reciente de los siRNAs a los pulmones también ha mejorado la viabilidad terapéutica de los ARNi para enfermedades pulmonares inflamatorias. El progreso rápido pondrá los tratamientos basados en el siRNA en una vía rápida a la clínica. MiRNAs son pequeños ARNs no codificantes endógenos que regulan la expresión génica reprimiendo la traducción o promoviendo la degradación de su mRNA objetivo. MiRNAs regulan la expresión génica mediante la unión a la 3′ región no traducida (UTR) de En el genoma humano, se estima que las transcripciones de aproximadamente el 60% de todos los ARNm están dirigidas por los miRNAs [104]. De acuerdo con su función, los miRNAs desempeñan un papel importante en los procesos celulares como desarrollo, proliferación y apoptosis de patologías pulmonares [105]. Se ha demostrado que un número creciente de miRNAs están involucrados en diferentes enfermedades pulmonares. Esta evidencia hace de los miRNAs una tecnología prometedora para el desarrollo terapéutico actual y futuro. Discutimos el papel de algunos miRNAs en diversas enfermedades pulmonares, así como el posible futuro de estos descubrimientos en aplicaciones clínicas.La Tabla 2 muestra el resumen de los miRNAs en el desarrollo terapéutico.En este punto, una terapia basada en miRNAs ya ha entrado en un ensayo clínico de fase II.Existe evidencia de que la regulación ascendente o descendente de los miRNAs es Muchos estudios se han centrado en el papel de los miRNAs en las enfermedades pulmonares inflamatorias, como la EPOC [116, 117], la fibrosis pulmonar [118] [118] [119] [129] y el asma [122] [123] [123] [125] [125] (Tabla 3). [130] [117, 129] La patogénesis de la EPOC se atribuye no sólo a la inflamación crónica en las vías respiratorias sino también a la inflamación sistémica [131]. El tabaquismo es el principal factor de riesgo para el desarrollo de la EPOC. Se ha demostrado que el tabaquismo causa cambios biológicos en la expresión génica de los pulmones [132], y hay algunos informes sobre los miRNAs relacionados con el tabaquismo [117, 129, 130]. Sin embargo, hay pocos informes que se centran en los miRNAs relacionados con la patogénesis de esta enfermedad con componentes inflamatorios sistémico El estudio reciente sobre fibroblastos pulmonares de pacientes con EPOC presenta menos expresión de miR-146a después de la estimulación con citocinas proinflamatorias en comparación con sujetos no EPOC con historias de tabaquismo similares [127]. La regulación descendente de miR-146a resultó en una vida media prolongada de ciclooxigenasa-2 del ARNm, aumentando así la prostaglandina E2 en fibroblastos de sujetos con EPOC. Además, Ezzie et al. investigaron la diferencia de perfiles de miRNA expresados en los pulmones de fumadores con y sin EPOC. Concluyeron que miR-223 y miR-1274a fueron los miRNA más afectados en sujetos con EPOC [126]. Sin embargo, la EPOC es un trastorno complejo, multicomponente y heterogéneo con una serie de diferentes procesos patológicos y subgrupos con sus propias características Se necesita una mejor comprensión de la complejidad de la enfermedad y de la potencial relevancia clínica de los miRNA identificados. La fibrosis pulmonar puede ser causada por una irritación identificable a los pulmones, pero en muchos casos se desconoce la causa, y las posibilidades terapéuticas son limitadas. El tabaquismo es uno de los factores de riesgo más reconocidos para el desarrollo de fibrosis pulmonar. Este trastorno se acompaña principalmente de una mayor expresión del mediador fibrótico clave que transforma el factor de crecimiento β (TGF-β) y otras citoquinas producidas en la lesión de fibrosis activa [128]. Recientemente, se informó que los miRNAs pueden desempeñar un papel regulador importante en el cambio fibromático pulmonar en los pulmones. La regulación descendente de let-7d en fibrosis pulmonar idiopática (IPF) resultó en un aumento de la deposición de colágeno y engrosamiento septal alveolar [119] En un modelo diferente de ratón asmático, se observó un aumento en la expresión de miR-21 en los pulmones [123]. Este informe podría contribuir a la comprensión del mecanismo inflamatorio en la vía aérea a través de la inhibición de IL-12, favoreciendo la respuesta de linfocitos Th2. Un receptor 4 (TLR4) inducido por Th2 induce una alta expresión de miR-126, y el bloqueo selectivo de miR-126 suprimió el fenotipo asmático [124]. Además, la remodelación de la vía aérea es una característica del asma y tiene importantes implicaciones funcionales. Rodríguez et al. han demostrado que miR-155 está relacionada con el desarrollo de infiltración inflamatoria en el pulmón y la remodelación de la vía aérea [122]. Así, algunos estudios presentan una conexión funcional entre la expresión de miRNA y la patogénesis del asma y sugieren que dirigir miRNA en las vías respiratorias puede conducir a tratamientos antiinflamatorios para el asma alérgica. A pesar de la evidencia de modelos experimentales, el perfil de expresión de miRNAs en biopsias de vías respiratorias de pacientes con asma leve antes y después del tratamiento con corticosteroides inhalados y en voluntarios sanos no reveló diferencias en la expresión de miRNAs [135]. Se requieren investigaciones adicionales sobre el papel de los miRNAs relacionados con la patogénesis del asma. Aunque la evidencia básica de la biología de miRNAs sigue proporcionando nuevas ideas, las aplicaciones de la terapia basada en miRNAs para enfermedades pulmonares inflamatorias son menos avanzadas que las del cáncer de pulmón [136]. Una razón de esto podría ser que la heterogeneidad de la enfermedad es causada por los efectos de muchos contaminantes ambientales del aire, incluyendo humo y compuestos orgánicos volátiles. La presencia de varios factores de riesgo complica la comprensión de la patogénesis de enfermedades pulmonares inflamatorias. La comprensión del papel que desempeñan los miRNAs en la modulación de la expresión génica, que conduce a sostener la patogénesis de las enfermedades pulmonares, es importante para el desarrollo de nuevas terapias que se centran en la prevención de la progresión de la enfermedad y el alivio de los síntomas. Dadas las importantes funciones que desempeñan los miRNAs en múltiples vías de carcinogénesis pulmonar, se están dedicando cada vez más esfuerzos a la investigación y desarrollo de terapias basadas en miRNAs, incluyendo la restauración de las funciones de miRNAs supresoras de tumores o la inhibición de miRNAs oncogénicos. El desarrollo de terapias basadas en miRNAs para el cáncer de pulmón está creciendo prósperamente con la ayuda de nuevas tecnologías ARNi. En comparación con las terapias basadas en siRNAs, que ya están en ensayos clínicos, los miRNAs son menos tóxicos y tienen el potencial de Los problemas críticos para el desarrollo de esta terapia son la entrega efectiva a los sitios de destino, la potencia de la terapia y la eliminación de los efectos fuera de la diana [137]. Hay dos estrategias como las aplicaciones terapéuticas de los miRNAs para el cáncer de pulmón [138]. Una estrategia es la terapia de reemplazo de miRNAs, que implica la reintroducción de un miRNA supresor tumoral imitado para restaurar una pérdida de la función. MiRNAs imitan a los duplex de ARN sintéticos diseñados para imitar las funciones endógenas de los miRNAs con modificaciones químicas para la estabilidad y la absorción celular. El concepto de terapia de reemplazo de miRNAs es más ejemplificado por el miRNAs let-7. let-7 es un miRNAs tumor-supresor en cáncer de pulmón no microcítico que se correlaciona inversamente con la expresión La administración intranasal de let-7 imitado en modelos de ratón de cáncer de pulmón redujo significativamente el crecimiento del tumor, lo que sugiere que la terapia de reemplazo de miRNA es realmente prometedora [106, 140, 141]. Otro miRNA que muestra el valor del reemplazo de miRNA es proporcionado por miR-34a [107, 142]. La administración local y/o sistémica de una miR-34a sintética imitada llevó a la acumulación de miR-34a en el tejido tumoral e inhibición del crecimiento del tumor pulmonar. Últimamente, Ling et al. también mostraron que el supresor miR-22 mostró actividad anti-cáncer pulmonar mediante la regulación post-transcripción de ErbB3 [143]. Así, las miRNA terapéuticas imitadas tienen un potencial poderoso atacando genes múltiples relevantes para varias enfermedades. Sin embargo, es necesario prestar atención a la toxicidad potencial en los tejidos normales en condiciones en las que la administración terapéutica de miRNA imita conducirá a una acumulación de miRNAs exógenos en células normales [138]. Aunque las suposiciones están bien fundadas, todavía hay evidencia insuficiente de toxicidad causada por miRNA imitaciones. De hecho, varios estudios in vivo fallaron en revelar efectos secundarios causados por los miRNA imitaciones y sugirió que la entrega de miRNA imitaciones a tejidos normales fue bien tolerada [107, 141]. Será importante investigar los efectos miRNAs imitados en células normales y evaluar cuidadosamente la toxicidad antes de utilizarlos en la práctica clínica. La segunda estrategia se dirige a una ganancia de función y tiene como objetivo inhibir oncomiRs mediante el uso de anti-miRNAs. Las modificaciones químicas, como el grupo 2'-O-metilo y el ácido nucleico bloqueado (LNA), aumentarían la estabilidad del oligo contra las nucleasas [144]. Los oligonucleótidos antisensibles contenidos en estas modificaciones se denominan antagomirs o "LNA-antimiRs" [144, 145]. Son oligonucleótidos con secuencias complementarias al miRNA endógeno e inhiben la función específica del miRNA. Se ha demostrado que un LNA-antimiR contra miR-122 silencia efectivamente miR-122 en primates no humanos [145], y los hallazgos apoyan el potencial de estos compuestos como una nueva clase terapéutica. Además, también se ha reportado que los anti-miR-150 suministrados en el tumor pulmonar xenoinjertos en ratones llevaron a un crecimiento tumoral inhibido En relación con estudios sobre miRNA imitados, estudios con oligonucleótidos antisensibles han mostrado evidencia efectiva con oligonucleótidos desnudos, lo que ilustra el potencial de modificaciones químicas de oligonucleótidos para mejorar su estabilidad, resistencia a la RNASa y propiedades farmacológicas, por lo que la inhibición de la función miRNA por antimiR oligonucleótidos químicamente modificados se ha convertido en un enfoque importante y ampliamente utilizado. Datos recientes del primer estudio de fase II en pacientes con infección crónica por VHC tratados con el antimiR-122 modificado por LNA mostraron que este compuesto fue bien tolerado y proporcionó supresión viral continua. Un número creciente de estudios han examinado el potencial terapéutico de los miRNAs. Recientemente, ha surgido la evidencia de roles para miRNAs en la determinación de resistencia a fármacos [147]. En esta situación, la combinación de miRNA imita o antimiR con quimioterapia puede potenciar la eficacia del tratamiento del cáncer en el futuro. Además, los miRNA relacionados con las células madre cancerosas pueden ampliar significativamente el campo de la terapia basada en miRNA y sugerir que los miRNAs pueden ser herramientas potenciales para destruir las células cancerosas asociadas con la resistencia a la terapia, recurrencia y metástasis [108, 148]. Por lo tanto, el principal desafío es el suministro exitoso y las modificaciones químicas de los miRNAs terapéuticos al tejido objetivo sin dañar los tejidos normales. Los enfoques basados en ARNi proporcionan una modalidad terapéutica prometedora para el tratamiento de diversas enfermedades pulmonares. Uno de los mayores desafíos en la terapia basada en ARNi sigue siendo el método de entrega de los siRNAs terapéuticos y miRNAs a las células objetivo. Las aplicaciones de parto pulmonar son muy atractivas, ya que tienden a ser no invasivas, son localmente restringidas y pueden ser administradas por el paciente. Una intervención terapéutica realista, como la aerosolización, puede mejorar la administración de medicamentos en el lugar de acción y disminuir la exposición sistémica del paciente a la terapia, reduciendo así los efectos fuera de la diana. El avance de la entrega de siRNA pulmonar a la clínica ilustra que la terapia basada en ARNi ocupa un lugar central en el tratamiento futuro de las enfermedades pulmonares. Por otro lado, los miRNAs tienen la oportunidad de dirigir genes múltiples de una manera refinada, y la terapia basada en miRNA proporcionará un atractivo enfoque antitumoral y antiinflamatorio para diversas enfermedades pulmonares. En particular, la terapia antimiRNA por antimiR oligonucleótidos químicamente modificado se ha convertido en una terapia potencial para enfermedades pulmonares porque los oligonucleótidos El aumento de la evidencia ha indicado que los miRNA cumplen funciones causales en una variedad de enfermedades pulmonares y han impulsado investigaciones sobre su potencial como dianas terapéuticas. Para el desarrollo futuro se requieren una mayor comprensión de los mecanismos detallados de la terapia basada en ARNi y la investigación de métodos de parto más eficaces. Estos nuevos enfoques podrían abrir nuevas vías para diversas enfermedades pulmonares y mejorar el resultado clínico de los pacientes.

¿Qué estructuras forman la vía aérea humana?

Las plataformas terapéuticas de RNAi para las enfermedades pulmonareshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3816685/Fujita, Yu; Takeshita, Fumitaka; Kuwano, Kazuyoshi; Ochiya, Takahiro2013-02-06DOI:10.3390/ph6020223Licencia:cc-byAbstract: La interferencia del ARN (ARNi) se está convirtiendo rápidamente en un método importante para analizar las funciones genéticas en muchos eucariotas y promete el desarrollo de silenciamiento genético terapéutico. La inducción de RNAi se basa en los pequeños ARN silenciadores, que afectan a la degradación específica del ARN mensajero (ARNm). Los estudios de descubrimiento de fármacos y los tratamientos novedosos de los siRNAs están actualmente dirigidos a una amplia gama de enfermedades, incluyendo varias infecciones virales y cánceres. Las enfermedades pulmonares en general son blancos atractivos para las terapias de siRNAs debido a su letalidad y prevalencia. Además, el pulmón es accesible anatómicamente a los agentes terapéuticos a través de la vía intrapulmonar. Recientemente, la evidencia creciente indica que los miRNAs desempeñan un papel importante en las anomalías pulmonares, como la inflamación y la oncogénesis. Por lo tanto, los miRNAs están siendo dirigidos con fines terapéuticos. En esta revisión, presentamos estrategias para el parto de ARNi y discutimos el estado actual de la técnica RNAi basada en el arte para diversas enfermedades pulmonares. Texto: cirugía tradicional, Bivas-Benita et al. reportaron que no se produjo mortalidad como resultado del uso de Las aplicaciones endotraqueales están siendo utilizadas actualmente por muchos profesionales en el campo pulmonar [22, 34] ; esto es útil para estudiar la administración de fármacos pulmonares en ratones. Sin embargo, el enfoque es más complejo en humanos porque se utiliza una vía artificial para la entrega de medicamentos en los pulmones. Por lo tanto, el método se está utilizando en modelos animales para probar y evaluar su fiabilidad para posibles aplicaciones clínicas. Ruta intraqueal: bajo anestesia, la tráquea se expone quirúrgicamente, y se inserta un tubo o aguja a través de una incisión hecha entre los anillos traqueales. Complicaciones, tales como lesiones vasculares y fugas de aire, son posibles debido a la traqueotomía. b) Ruta endotraqueal: los siRNAs se rocian directamente desde la boca a los pulmones utilizando un aerolizador MicroSprayer ® (Penn-Century, Filadelfia, PA Es importante mantener una visión clara de la tráquea durante el procedimiento. El parto intranasal es otro método común de aplicación de fármacos pulmonares en estudios en animales. En muchos estudios, se ha demostrado éxito in vivo en la entrega de siRNAs a los pulmones intranasal [22, 35, 36 ]. Una configuración experimental de la entrega intranasal por pulverización o gotita es simple e indolora para el animal. Aunque el éxito en la entrega de siRNAs intranasal en roedores no puede ser completamente extrapolado al uso humano debido a las diferencias significativas en anatomía pulmonar [37], este enfoque tiene potencial para la aplicación clínica de siRNAs. Ensayos clínicos de fase II se han iniciado para el tratamiento de la infección por el virus sincitial respiratorio (RSV), haciendo uso de la aplicación intranasal de moléculas de siRNAs desnudas modificadas químicamente que se dirigen a los productos La entrada intranasal se ha utilizado durante mucho tiempo para administrar moléculas pequeñas, como proteínas, para el parto sistémico. Debido a que la mucosa nasal está altamente vascularizada, la entrega de un epitelio delgado de medicación a través de la superficie puede dar lugar a una rápida absorción del medicamento en la sangre. Por lo tanto, los siRNA administrados intranasalmente pueden depositarse en la nariz, y algunos de ellos pueden no poder llegar al tracto respiratorio inferior. De hecho, se ha informado que la aplicación intranasal de siRNAs no formulados dio lugar a una menor eficiencia de entrega y distribución pulmonar homogénea que la alcanzada con la aplicación intratraqueal [31]. El método intranasal es adecuado para algunas enfermedades pulmonares, como la infección respiratoria superior por VSR, y también tiene potencial para el parto sistémico en lugar de la entrega pulmonar de siRNAs. Por lo tanto, es importante considerar la vía de administración El uso de aerosoles para administrar medicamentos a los pulmones tiene un largo historial. La administración por inhalación es un método popular y no invasivo de administrar agentes a los pulmones. Hay varios dispositivos de inhalación disponibles para la entrega de medicamentos a los pulmones. Los inhaladores de dosis medidas (IDM) y los inhaladores de polvo seco (IDP) son los modos más comunes de administrar inhalación. Los inhaladores de dosis medidas son los inhaladores más utilizados para varias enfermedades pulmonares, como el asma, la bronquitis y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), y un espaciador es un dispositivo externo que se une a una IDM para permitir una mejor administración de medicamentos mediante una mayor coordinación de la activación y la inhalación. Para la mayoría de los IDM, el propelente es uno o más gases llamados clorofluorocarbonos (CFC). Aunque los CFC en los medicamentos son seguros para que los pacientes inhalen, son perjudiciales para el medio ambiente. Por lo tanto, el desarrollo ulterior de los siRNA inhalables puede no ser la mejor manera de avanzar. Los DPI son dispositivos que entregan medicamentos a los pulmones en forma de polvo seco. El uso de los DPI ya ha demostrado ser prometedor para la entrega in vivo de macromoléculas terapéuticas como la insulina [39] y la heparina de bajo peso molecular [40] ; por lo tanto, podría ser un mejor dispositivo para la entrega de siRNAs a los pulmones. Las ventajas de los DPI son una mayor estabilidad y esterilidad de las biomoléculas sobre aerosoles líquidos y la formación libre de propelentes. Aunque los medicamentos se envían comúnmente a los pulmones por inhalación, la mayoría de los estudios in vivo que utilizan siRNAs se han basado en la entrega intratraqueal También se necesita un portador adecuado para proteger los ácidos nucleicos de la degradación debido a la fuerza de corte y al aumento de la temperatura durante el proceso de secado. Se ha demostrado el uso del secado por pulverización como técnica para la ingeniería de formulaciones en polvo seco de nanopartículas de siRNA, que podrían permitir la entrega local de siRNA biológicamente activo directamente al tejido pulmonar [24, 25]. En el futuro, la técnica es deseable para estimar el estudio in vivo sobre terapia de siRNA para inhalación. A largo plazo, anticipamos que habrá dispositivos más sofisticados para el uso clínico y que los que se están desarrollando serán más adecuados. Hay dos barreras principales para la entrega eficiente de siRNA pulmonar a las células del pulmón. La primera es la anatomía compleja y ramificada de los pulmones y barreras biomecánicas, como la capa de muco que cubre las células de las vías respiratorias [41, 42 La vía aérea consiste en bronquiolos respiratorios, conductos alveolares y sacos alveolares. Todas estas estructuras contienen alvéolos, los diminutos sacos de aire en los que se produce el intercambio de gas. Generalmente se reconoce que el factor crítico para la entrega eficiente de siRNA depende de las propiedades de las partículas del fármaco ARNi en términos de tamaño, carga, forma, velocidad y densidad. Para la entrega eficiente de siRNA pulmonar, las partículas deben depositarse en el tracto respiratorio inferior. La deposición en la vía aérea se ve afectada por el tamaño de las partículas y la función pulmonar del paciente. Se encuentra que el tamaño de las partículas entre 1-5 μm es el más apropiado para la deposición en el tracto respiratorio inferior [23]. Además, la presencia de proteínas mucos y surfactantes, las acciones de aclaramiento mucociliar y la fagocitosis por Por lo tanto, los sistemas de parto generalmente requieren vectores de parto, y estos vectores necesitan ser diseñados con el fin de maximizar la deposición de siRNA en el área enferma del tracto respiratorio. Además, las barreras extracelulares al parto de siRNA también dependen de características fisiológicas del tracto respiratorio, que pueden cambiar con la enfermedad y características del paciente. En el estadio activo de la enfermedad pulmonar, las condiciones fisiológicas de las vías respiratorias podrían cambiar y tener un impacto significativo en la eficiencia del sistema de parto pulmonar. Durante la infección, inflamación y reacción alérgica, hay un aumento en la secreción de mucosidad junto con el aclaramiento mucociliar dañado [43]. Además, el asma y la EPOC son ambas condiciones inflamatorias crónicas del pulmón asociadas con "remodelación" estructural que no es apropiada para el mantenimiento de la función pulmonar normal [44]. Figura 2. Barreras extracelulares al parto de siRNA pulmonar. La característica anatómica del tracto respiratorio es su alto grado de ramificación. El moco alinea el epitelio respiratorio desde la cavidad nasal hasta los bronquios terminales. Las partículas depositadas en las células epiteliales ciliadas son rápidamente despejadas por las acciones de aclaramiento mucociliar. El muco y el aclaramiento mucociliar de las partículas atrapadas por mucosidad es un mecanismo de defensa pulmonar como barrera fisiológica. En las células alveolar, clara y alveolar tipo II se secretan en la superficie del epitelio alveolar, formando una capa delgada de surfactantes pulmonares. Los surfactantes actúan como barrera principal para el parto de siRNA porque reducen la eficiencia de la transfección. Además, los macrófagos ubicados en los alveolos absorbe Las partículas recogidas en los macrófagos se degradan posteriormente dentro de las células, los cuales presentan barreras importantes para el parto pulmonar dirigido; el segundo es el membrance de las células de las vías respiratorias y sus barreras intracelulares (Figura 3 ). Para el silenciamiento eficiente de los genes en los pulmones, los siRNAs deben ser entregados a su sitio de acción, ser estables, entrar en las células diana y estar presentes en el citoplasma a una concentración suficiente; una vez que los siRNAs alcanzan las células diana, deben ser transportados al citoplasma y llevados por Argonaute (Ago)2/complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), que degrada los mRNAs y, posteriormente, suprime la expresión génica secuencia-específica; para que ocurra una endocitosis eficiente, las partículas deben tener un tamaño inferior a 150 nm. Las propiedades fisicoquímicas de los siRNA también juegan un papel significativo en el cruce de la membrana biológica. A pesar de su pequeño tamaño, la carga negativa y la degradabilidad química de las moléculas de siRNA les impiden cruzar fácilmente las membranas biológicas. Por lo tanto, los enfoques eficientes de siRNA necesitan superar esta limitación facilitando la captación celular. Una de las principales funciones de un vector de entrega es facilitar la captación celular de siRNA [46]. La complejación electrostática de moléculas de siRNA con lípidos y polímeros catiónicos ayuda a enmascarar su carga negativa neta. El complejo portador de siRNA con carga positiva interactúa con proteoglicanos aniónicos en la membrana celular, forma una vesícula endocítica, y entra en las células por endocitosis [47]. Después de la internalización celular, el complejo portador de siRNA en vesículas endocíticas es transportado a lo largo de microtúbulos a lisosomas que son colocalizados con el centro organizador de microtúbulos. Para evitar la degradación lisosómica, los siRNAs deben escapar del endosoma al citoplasma, donde pueden asociarse con la maquinaria ARNi. El escape endosomal es una barrera importante para la entrega eficiente de siRNA [48, 49]. El endosomal atrapamiento y la degradación lisosómica del siRNA y los portadores contribuyen a la baja eficiencia de transfección y es una dificultad importante para los vectores de entrega. Un agente de entrega ideal debe proteger los siRNAs de la degradación enzimática, facilitar la absorción celular, y promover la fuga endosomal dentro de las células con toxicidad insignificante. Se han reportado múltiples enfoques para la entrega de siRNAs, que van desde la administración directa relativamente simple de siRNAs con forma salina hasta enfoques de nanopartículas basadas en lípidos y polímeros y enfoques de conjugación y complejación de siRNAs [50]. La carga negativa y la degradabilidad química de los siRNAs bajo condiciones fisiológicamente relevantes hacen que su entrega sea un desafío importante. En consecuencia, la entrega de siRNAs generalmente requiere un vector o portadores para su transfección en las células diana. En general, se están evaluando vectores virales y no virales para la entrega de siRNAs a las células pulmonares. Algunos vectores virales, como retrovirus y adenovirus, han sido demostrados para mediar el silenciamiento genético en un modelo pulmonar in vitro [51] e inducir RNAi en una gama de tejidos animales [52]. Demostró que el siRNA mediado por lentivirus fue utilizado específicamente para derribar la expresión de la proteína nuclear 1 (NUPR1) in vivo, lo que resultó en un crecimiento tumoral inhibido [53]. Sin embargo, el parto basado en virus tiene varias desventajas. La respuesta inmune a los virus no sólo impide la entrega de genes sino que también tiene el potencial de causar complicaciones graves [54]. Casos recientes bien documentados, como la muerte de Jesse Gelsinger debido a complicaciones relacionadas con un vector de distribución adenoviral, destacan este problema [55]. Además, algunos vectores virales pueden insertar su genoma en posiciones aleatorias en el cromosoma huésped, lo que finalmente restringe la función génica [56].. Barreras intracelulares para la entrega de siRNA pulmonar. Las barreras a la internalización celular dependen de las propiedades superficiales del siRNA y los portadores (por ejemplo Después de que los siRNAs sean llevados exitosamente a las células diana por medio de endocitosis, las principales barreras para entregar siRNAs a su sitio de acción son la atrapación endosomal y la degradación lisosómica de siRNAs y portadores. Para dirigir el silenciamiento del gen diana, los siRNAs necesitan escapar del endosoma hacia el citoplasma, donde se asocian con el complejo silenciador inducido por Ago2/ARN (RISC) para dirigir la división de mRNAs con sitios de unión complementarios. Como alternativa a los vectores virales, los vectores no virales, incluyendo vectores basados en lípidos y polímeros, generalmente se han utilizado para la entrega de siRNAs a los pulmones debido a su toxicidad reducida [57]. Los vectores de entrega basados en lípidos se utilizan con éxito para producir siRNA in vitro e in vivo [58]. Los lípidos catiónicos están compuestos de cabeza cargada positivamente, un enlace e hidrofóbico. En general, los complejos basados en lípidos son fáciles de formular y se logra una buena eficacia de transfección debido a la interacción con la membrana celular cargada negativa. Muchos agentes de transfección de siRNA comerciales son sistemas de administración basados en lípidos, algunos de los cuales también se emplean para el parto pulmonar-DharmFECT [30], Oligofectamina [59], Lipofectamina [60] y TransIT-TKO [35]. Del mismo modo, los polímeros catiónicos también se han evaluado para la entrega de siRNA a las células pulmonares. Por otro lado, los vectores basados en lípidos también pueden inducir toxicidad y activación inespecífica de las respuestas inflamatorias de citocina e interferón [62, 63]. Aunque los vectores basados en polímero provocan una respuesta inmune relativamente menos fuerte que los vectores basados en lípidos, la administración efectiva de siRNA a un área local en enfermedades pulmonares requiere más atención al desarrollo de vectores de entrega no tóxicos. Un punto importante para la inhibición de la expresión génica mediada por siRNA es si los efectos observados son específicos y no debidos a efectos fuera de la meta y no están libres de respuestas potenciales de interferón [64, 65]. Curiosamente, algunos estudios han demostrado que fue posible administrar "siRNA desnuda" a ratones y regular un objetivo endógeno o exógeno sin inducir una respuesta de interferón [66]. Los siRNAs desnudos son degradados por las endonucleasas séricas y generalmente son eliminados por filtración glomerular, resultando en una corta semivida plasmática de < 10 min. Por lo tanto, algunos estudios de la entrega sistémica de siRNAs desnudos no han logrado reducir la regulación del gen objetivo [67, 68]. En contraste, también ha habido algunos éxitos en la entrega local de siRNAs desnudos a los pulmones [15, 16, 20, 31]. Algunos de ellos reportaron que el uso de vectores de distribución no mostró diferencia significativa en la eficiencia silenciadora de genes en comparación con la de los siRNAs desnudos [16, 35]. De hecho, en un ensayo clínico, se ha utilizado la entrega de siRNAs desnudos para el tratamiento de RSV [17, 38]. Esta evidencia exitosa puede ser debido a que los siRNAs desnudos para aplicaciones clínicas son altamente modificados químicamente para prevenir la degradación inducida por nucleasa y presumiblemente minimizar los efectos estimuladores inmunes. Aunque no está claro cómo los siRNAs desnudos cruzan la membrana celular, obtienen acceso al citoplasma y permanecen intactos para realizar su acción biológica, tanto los ensayos en animales como en humanos se han llevado a cabo exitosamente, mostrando la eficacia de los siRNAs desnudos (ALN-RSV01) que fueron administrados intranasalmente. Esta explicación no ha sido confirmada, pero el daño fisiológico de las células epiteliales respiratorias causadas por infección viral puede haber influido posiblemente en el misterio. El cambio activo en la membrana de células epiteliales de la vía aérea causada por enfermedad infecciosa podría afectar la internalización celular. Sin embargo, la ventaja de los siRNA desnudos sobre los vectores de parto en el tratamiento de enfermedades pulmonares es controvertida [69, 70]. Se requieren más investigaciones in vivo sobre los siRNA desnudos y los vectores no virales. La enfermedad pulmonar es una de las principales causas de muerte, y la disminución de la calidad de vida es responsable del sufrimiento de muchos pacientes. Varias enfermedades pulmonares hacen la vida extremadamente difícil para los pacientes, y los casos graves de estas enfermedades pulmonares pueden resultar en la muerte. Las altas tasas de muerte asociadas con el cáncer de pulmón se deben en parte al hecho de que es lamentablemente difícil de curar. Sobre todo, la EPOC es la cuarta causa de muerte en la mayoría de los países industrializados y se prevé que se convierta en tercera para 2020 [71]. Por lo tanto, se necesita una acción decisiva para frenar el aumento de la salud y la carga económica que esto representa. Las enfermedades pulmonares crónicas La aprobación de corticosteroides inhalados fue pionera en una nueva generación de terapia en el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas, siendo la primera vez que se disponía de un producto antiinflamatorio para reducir la inflamación pulmonar característica en las vías respiratorias y la obstrucción asociada. Los corticosteroides siguen siendo una importante intervención terapéutica. Sin embargo, se utilizan con limitaciones en la EPOC y asma de moderada a grave. Asimismo, el tratamiento de diversas enfermedades pulmonares refractarias también depende de la terapia sistémica con corticosteroides. Muchos de estos pacientes también sufrieron diversos efectos secundarios del uso sistémico de corticosteroides, como aumento de peso e hiperglucemia no controlada. El tratamiento de la enfermedad pulmonar utilizando una orientación celular específica, así como técnicas RNAi, representan una estrategia novedosa y podrían proporcionar nuevas oportunidades en nanomedicina. Las aplicaciones pulmonares de siRNA in vivo son frecuentemente estudiadas y a menudo resultan en ensayos clínicos [57, 72]. Desde el descubrimiento de ARNi, el potencial terapéutico de los siRNAs ha sido rápidamente reconocido. En 2004, el primer ensayo clínico humano de terapia basada en ARNi se inició para el tratamiento de la degeneración macular relacionada con la edad con un siRNA dirigido al receptor de VEGF 1 entregado intravítreamente [73]. Se han realizado muchos estudios en los últimos años que involucran la entrega de siRNAs a los pulmones para el tratamiento de diversas enfermedades pulmonares. La entrega a los pulmones será más importante para mover la tecnología de siRNAs a la clínica. Se están evaluando varias terapias basadas en siRNAs en ensayos clínicos para el tratamiento de diferentes condiciones, incluyendo enfermedades pulmonares como asma e infección por VSR. La Tabla 1 es un resumen de ensayos clínicos de terapias basadas en siRNAs [74]. El siRNA muestra potencial para el tratamiento de varias infecciones virales pulmonares, y se ha reportado que los tratamientos basados en el siRNA también pueden ser utilizados en el tratamiento de la gripe [13], el virus de la parainfluenza [35], el síndrome respiratorio agudo severo (SARS) [14], y el VRS [35]. Sobre todo, el VRS es el objetivo terapéutico más prometedor de los siRNAs. El VRS es una causa común de infecciones respiratorias graves en lactantes y niños. También produce morbilidad y mortalidad significativas en poblaciones adultas inmunocomprometidas o ancianas [75]. No se dispone de una vacuna contra el VRS, y la única terapia antiviral aprobada para el VRS es indeseable para los pacientes pediátricos debido a su potencial teratogenicidad y eficacia limitada. El tratamiento basado en ARNi ha mostrado efectos prometedores en modelos murinos de infección por VRS [35]. El siRNA, ALN-RSV01, está dirigido contra el ARNm que codifica la proteína N del VRS que exhibe actividad anti-VRS específica in vitro e in vivo. Se entrega sin un vector de parto como aerosol nasal y se dirige al tracto respiratorio superior en lugar del área pulmonar inferior. ALN-RSV01 ha sido sometido a estudios completos de fase I intranasal e inhalación en adultos sanos y se ha encontrado que es generalmente bien tolerado [38]. Además, ALN-RSV01 ha sido evaluado en un ensayo aleatorizado, doble ciego, controlado con placebo en pacientes trasplantados de pulmón con infección del tracto respiratorio RSV [76]. La administración de ALN-RSV01 a pacientes de trasplante de pulmón infectados por VRS fue segura y bien tolerada y asociada con una Basándose en estos resultados, se ha iniciado un ensayo multinacional más amplio, aleatorizado y doble ciego de fase IIb de ALN-RSV01 en pacientes con trasplante de pulmón para confirmar y extender estos hallazgos. El cáncer es un objetivo principal de la terapia basada en ARNi, ya que los oncogenes, los genes supresores de tumores mutados y varios otros genes que contribuyen a la progresión del tumor son objetivos potencialmente importantes para el silenciamiento de genes por ARNi. El cáncer de pulmón es uno de los tumores más frecuentes en todo el mundo con respecto a las tasas de incidencia y mortalidad. Los pacientes con cáncer de pulmón se diagnostican comúnmente en un estadio avanzado de la enfermedad y tienen opciones terapéuticas limitadas. La principal ventaja de la terapia ARNi en el cáncer podría ser la focalización simultánea de genes múltiples pertenecientes a diferentes vías celulares que participan en la progresión del tumor. La inhibición simultánea de varios genes también minimizaría el riesgo de resistencia a fármacos que normalmente se encuentran con terapias basadas en pequeñas moléculas, que involucran siRNAs y miRNAs. Ya ha habido mejoras significativas en los siRNAs para el tratamiento primario o metastásico del cáncer de pulmón al dirigirse a oncogenes como Akt1 [9], tumor de Wilms 1 (WT1) [12], genes sobreexpresados como el receptor del factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1R) [77], NUPR1 [53] y EZH2 [78]. Algunos de estos estudios han demostrado con éxito la eficacia de la terapia basada en ARNi mediante la administración intrapulmonar de siRNAs Aunque se deben diseñar estrategias para minimizar los efectos inmunoestimuladores fuera de objetivo y no específicos, estos datos sugieren que el silenciamiento del gen diana con siRNAs es una estrategia atractiva para la prevención y el tratamiento del cáncer de pulmón primario y metastásico. Actualmente hay algunos ensayos clínicos en curso que estiman la seguridad y eficacia de los fármacos basados en siRNAs para el tratamiento del cáncer. Atu027, un siRNA-lipoplex dirigido contra la proteína cinasa N3 (PKN3), previno la metástasis pulmonar en un ensayo de fase I de varios modelos de cáncer [79]. PKN3 es un efector aguas abajo de la vía de señalización de la fosfoinositida 3-quinasa (PI3K), que regula diversas respuestas celulares, incluyendo desarrollo, crecimiento y supervivencia [81]. Recientemente, PKN3 también ha sido considerado como una diana terapéutica adecuada para modular la angiogénesis tumoral debido a que la pérdida de análisis de función con Atu027 en células endoteliales primarias cultivadas mostró un papel esencial de PKN3 para la formación y migración de tubos endoteliales [79]. Atu027 puede ser considerado como un potencial siRNA para prevenir metástasis pulmonares y podría ser adecuado para prevenir metástasis hematógenas combinadas con terapia convencional del cáncer. La enfermedad pulmonar inflamatoria, también llamada EPOC, incluye una amplia gama de dolencias pulmonares. Estas enfermedades relacionadas incluyen asma, fibrosis pulmonar y bronquitis crónica. Están influenciadas por una combinación de componentes ambientales, genéticos y epigenéticos [82]. La EPOC es una enfermedad inflamatoria crónica de las vías respiratorias. La EPOC se asocia principalmente al tabaquismo, y estudios recientes que investigan la fisiopatología del enfisema han demostrado que el humo del cigarrillo puede causar que las células entren en la senescencia celular. Fumar puede causar senescencia a las células debido al daño del ADN a través del aumento del recambio celular, lo que a su vez conduce al acortamiento acelerado del telómero [84]. Últimamente, muchos estudios han investigado el papel de la senescencia celular en el desarrollo y la progresión de la EPOC [85]. Aunque varias clases de medicamentos, incluyendo corticosteroides inhalados, se utilizan para el tratamiento de la EPOC, ninguno de estos medicamentos ha demostrado mejorar significativamente la función pulmonar a largo plazo durante la progresión de la enfermedad. Muchas personas están desarrollando EPOC, y la causa de esta afección es complicada y no se comprende a fondo.Un factor clave es la susceptibilidad genética.Algunos estudios han mostrado una gran contribución genética a la variabilidad de la función pulmonar y EPOC [86, 87].Los polimorfismos en genes múltiples se han reportado asociados con EPOC [87], tales como factor de transcripción [por ejemplo factor nuclear-kappa B (NFoB)] [88], matriz extracelular (por ejemplo, matriz metaloproteinasa-12 (MMP-12)) [89, 90], citocinas [por ejemplo factor de necrosis tumoral (TNF)-α] [91], quimioquinas [por ejemplo. la interleucina (IL)-8, el receptor IL-8 y el receptor de quimiocina (CCR)1 [92, 93], y la apoptosis (por ejemplo, caspasa-3 y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)) [94, 95]. Muchos de ellos se han identificado como posibles blancos de la intervención terapéutica utilizando inhibidores de moléculas o antagonistas. Aunque varios tratamientos nuevos que se dirigen al proceso inflamatorio se encuentran ahora en desarrollo clínico, como inhibidores del TNF-α e inhibidores de la I-kappaB cinasa 2 (IKK2) [96, 97], los ensayos clínicos con siRNA nunca se han realizado en la EPOC. El retraso en el desarrollo de fármacos para la EPOC podría deberse a la aparición relativamente reciente de investigaciones que abordan la base molecular de la EPOC. Además, se necesitan más investigaciones para entender los mecanismos moleculares esenciales sobre la patogénesis de la EPOC y desarrollar técnicas de monitoreo para apoyar el desarrollo de terapias ARNi. Actualmente, no hay tratamientos disponibles que reduzcan la progresión de la EPOC o supriman la inflamación en las vías aéreas pequeñas y el parénquima pulmonar. El enfoque basado en los ARNi para las moléculas clave también tiene implicaciones potenciales para el tratamiento de la EPOC. El asma es también una enfermedad inflamatoria crónica de las vías aéreas caracterizada por síntomas variables y recurrentes y obstrucción reversible del flujo de aire. La Organización Mundial de la Salud estima que actualmente están afectadas 300 millones de personas y que, para el año 2025, otros 100 millones serán afectados por la enfermedad [98]. Los corticosteroides inhalados son muy eficaces en asma leve porque mejoran los síntomas y disminuyen las exacerbaciones. Aunque los corticosteroides siguen siendo una importante intervención terapéutica para las enfermedades pulmonares inflamatorias, su uso no siempre es completamente efectivo y está asociado con efectos secundarios. Debido a estas limitaciones, está claro que hay una necesidad de nuevos tipos de medicamentos que pueden tratar y mejorar el pronóstico de asma moderada a grave. Se han identificado muchos genes diana que participan en la patogénesis del asma. Los objetivos más prometedores incluyen la codificación de genes para citoquinas (IL-4, IL5, IL-13), receptores de citoquinas y quimioquinas (IL-4 y CCR3), y tirosina quinasas [tirosina quinasa batida (Syk) y nuevas tirosina quinasa (Lyn) relacionadas con LCK/YES)], así como para factores de transcripción [transductores de señales y activadores de transcripción 1 (STAT1), STAT6, GATA3 y NF Actualmente, en un ensayo clínico para el asma, Excellair TM (ZaBeCor, Bala Cynwyd, PA, EE.UU.), se está utilizando un siRNA que se dirige a Syk. La cinasa está involucrada en la señalización de un receptor de células B y es un regulador clave de cascadas de señalización aguas abajo que en última instancia conducen a la activación de varios factores de transcripción proinflamatorios. Se ha reportado que los oligonucleótidos antisensibles administrados por aerosol fueron potentes para disminuir la expresión de Syk, liberación mediadora de macrófagos alveolares e inflamación pulmonar dependiente de Syk [102]. Además, se ha demostrado la inhibición de mediadores inflamatorios en un estudio utilizando siRNA dirigido a Syk en células epiteliales de vía aérea [103]. Algunos de los tratamientos actuales para el asma y otras condiciones inflamatorias, tales como inhibidores del TNF-α o inhibidores del leucotrieno, inhiben sólo uno de los mediadores de la inflamación. En contraste, el siRNA dirigido Syk busca inhibir un paso inicial de señalización de la inflamación y, por lo tanto, evitar la liberación de múltiples mediadores inflamatorios. En general, el progreso reciente de los siRNAs a los pulmones también ha mejorado la viabilidad terapéutica de los ARNi para enfermedades pulmonares inflamatorias. El progreso rápido pondrá los tratamientos basados en el siRNA en una vía rápida a la clínica. MiRNAs son pequeños ARNs no codificantes endógenos que regulan la expresión génica reprimiendo la traducción o promoviendo la degradación de su mRNA objetivo. MiRNAs regulan la expresión génica mediante la unión a la 3′ región no traducida (UTR) de En el genoma humano, se estima que las transcripciones de aproximadamente el 60% de todos los ARNm están dirigidas por los miRNAs [104]. De acuerdo con su función, los miRNAs desempeñan un papel importante en los procesos celulares como desarrollo, proliferación y apoptosis de patologías pulmonares [105]. Se ha demostrado que un número creciente de miRNAs están involucrados en diferentes enfermedades pulmonares. Esta evidencia hace de los miRNAs una tecnología prometedora para el desarrollo terapéutico actual y futuro. Discutimos el papel de algunos miRNAs en diversas enfermedades pulmonares, así como el posible futuro de estos descubrimientos en aplicaciones clínicas.La Tabla 2 muestra el resumen de los miRNAs en el desarrollo terapéutico.En este punto, una terapia basada en miRNAs ya ha entrado en un ensayo clínico de fase II.Existe evidencia de que la regulación ascendente o descendente de los miRNAs es Muchos estudios se han centrado en el papel de los miRNAs en las enfermedades pulmonares inflamatorias, como la EPOC [116, 117], la fibrosis pulmonar [118] [118] [119] [129] y el asma [122] [123] [123] [125] [125] (Tabla 3). [130] [117, 129] La patogénesis de la EPOC se atribuye no sólo a la inflamación crónica en las vías respiratorias sino también a la inflamación sistémica [131]. El tabaquismo es el principal factor de riesgo para el desarrollo de la EPOC. Se ha demostrado que el tabaquismo causa cambios biológicos en la expresión génica de los pulmones [132], y hay algunos informes sobre los miRNAs relacionados con el tabaquismo [117, 129, 130]. Sin embargo, hay pocos informes que se centran en los miRNAs relacionados con la patogénesis de esta enfermedad con componentes inflamatorios sistémico El estudio reciente sobre fibroblastos pulmonares de pacientes con EPOC presenta menos expresión de miR-146a después de la estimulación con citocinas proinflamatorias en comparación con sujetos no EPOC con historias de tabaquismo similares [127]. La regulación descendente de miR-146a resultó en una vida media prolongada de ciclooxigenasa-2 del ARNm, aumentando así la prostaglandina E2 en fibroblastos de sujetos con EPOC. Además, Ezzie et al. investigaron la diferencia de perfiles de miRNA expresados en los pulmones de fumadores con y sin EPOC. Concluyeron que miR-223 y miR-1274a fueron los miRNA más afectados en sujetos con EPOC [126]. Sin embargo, la EPOC es un trastorno complejo, multicomponente y heterogéneo con una serie de diferentes procesos patológicos y subgrupos con sus propias características Se necesita una mejor comprensión de la complejidad de la enfermedad y de la potencial relevancia clínica de los miRNA identificados. La fibrosis pulmonar puede ser causada por una irritación identificable a los pulmones, pero en muchos casos se desconoce la causa, y las posibilidades terapéuticas son limitadas. El tabaquismo es uno de los factores de riesgo más reconocidos para el desarrollo de fibrosis pulmonar. Este trastorno se acompaña principalmente de una mayor expresión del mediador fibrótico clave que transforma el factor de crecimiento β (TGF-β) y otras citoquinas producidas en la lesión de fibrosis activa [128]. Recientemente, se informó que los miRNAs pueden desempeñar un papel regulador importante en el cambio fibromático pulmonar en los pulmones. La regulación descendente de let-7d en fibrosis pulmonar idiopática (IPF) resultó en un aumento de la deposición de colágeno y engrosamiento septal alveolar [119] En un modelo diferente de ratón asmático, se observó un aumento en la expresión de miR-21 en los pulmones [123]. Este informe podría contribuir a la comprensión del mecanismo inflamatorio en la vía aérea a través de la inhibición de IL-12, favoreciendo la respuesta de linfocitos Th2. Un receptor 4 (TLR4) inducido por Th2 induce una alta expresión de miR-126, y el bloqueo selectivo de miR-126 suprimió el fenotipo asmático [124]. Además, la remodelación de la vía aérea es una característica del asma y tiene importantes implicaciones funcionales. Rodríguez et al. han demostrado que miR-155 está relacionada con el desarrollo de infiltración inflamatoria en el pulmón y la remodelación de la vía aérea [122]. Así, algunos estudios presentan una conexión funcional entre la expresión de miRNA y la patogénesis del asma y sugieren que dirigir miRNA en las vías respiratorias puede conducir a tratamientos antiinflamatorios para el asma alérgica. A pesar de la evidencia de modelos experimentales, el perfil de expresión de miRNAs en biopsias de vías respiratorias de pacientes con asma leve antes y después del tratamiento con corticosteroides inhalados y en voluntarios sanos no reveló diferencias en la expresión de miRNAs [135]. Se requieren investigaciones adicionales sobre el papel de los miRNAs relacionados con la patogénesis del asma. Aunque la evidencia básica de la biología de miRNAs sigue proporcionando nuevas ideas, las aplicaciones de la terapia basada en miRNAs para enfermedades pulmonares inflamatorias son menos avanzadas que las del cáncer de pulmón [136]. Una razón de esto podría ser que la heterogeneidad de la enfermedad es causada por los efectos de muchos contaminantes ambientales del aire, incluyendo humo y compuestos orgánicos volátiles. La presencia de varios factores de riesgo complica la comprensión de la patogénesis de enfermedades pulmonares inflamatorias. La comprensión del papel que desempeñan los miRNAs en la modulación de la expresión génica, que conduce a sostener la patogénesis de las enfermedades pulmonares, es importante para el desarrollo de nuevas terapias que se centran en la prevención de la progresión de la enfermedad y el alivio de los síntomas. Dadas las importantes funciones que desempeñan los miRNAs en múltiples vías de carcinogénesis pulmonar, se están dedicando cada vez más esfuerzos a la investigación y desarrollo de terapias basadas en miRNAs, incluyendo la restauración de las funciones de miRNAs supresoras de tumores o la inhibición de miRNAs oncogénicos. El desarrollo de terapias basadas en miRNAs para el cáncer de pulmón está creciendo prósperamente con la ayuda de nuevas tecnologías ARNi. En comparación con las terapias basadas en siRNAs, que ya están en ensayos clínicos, los miRNAs son menos tóxicos y tienen el potencial de Los problemas críticos para el desarrollo de esta terapia son la entrega efectiva a los sitios de destino, la potencia de la terapia y la eliminación de los efectos fuera de la diana [137]. Hay dos estrategias como las aplicaciones terapéuticas de los miRNAs para el cáncer de pulmón [138]. Una estrategia es la terapia de reemplazo de miRNAs, que implica la reintroducción de un miRNA supresor tumoral imitado para restaurar una pérdida de la función. MiRNAs imitan a los duplex de ARN sintéticos diseñados para imitar las funciones endógenas de los miRNAs con modificaciones químicas para la estabilidad y la absorción celular. El concepto de terapia de reemplazo de miRNAs es más ejemplificado por el miRNAs let-7. let-7 es un miRNAs tumor-supresor en cáncer de pulmón no microcítico que se correlaciona inversamente con la expresión La administración intranasal de let-7 imitado en modelos de ratón de cáncer de pulmón redujo significativamente el crecimiento del tumor, lo que sugiere que la terapia de reemplazo de miRNA es realmente prometedora [106, 140, 141]. Otro miRNA que muestra el valor del reemplazo de miRNA es proporcionado por miR-34a [107, 142]. La administración local y/o sistémica de una miR-34a sintética imitada llevó a la acumulación de miR-34a en el tejido tumoral e inhibición del crecimiento del tumor pulmonar. Últimamente, Ling et al. también mostraron que el supresor miR-22 mostró actividad anti-cáncer pulmonar mediante la regulación post-transcripción de ErbB3 [143]. Así, las miRNA terapéuticas imitadas tienen un potencial poderoso atacando genes múltiples relevantes para varias enfermedades. Sin embargo, es necesario prestar atención a la toxicidad potencial en los tejidos normales en condiciones en las que la administración terapéutica de miRNA imita conducirá a una acumulación de miRNAs exógenos en células normales [138]. Aunque las suposiciones están bien fundadas, todavía hay evidencia insuficiente de toxicidad causada por miRNA imitaciones. De hecho, varios estudios in vivo fallaron en revelar efectos secundarios causados por los miRNA imitaciones y sugirió que la entrega de miRNA imitaciones a tejidos normales fue bien tolerada [107, 141]. Será importante investigar los efectos miRNAs imitados en células normales y evaluar cuidadosamente la toxicidad antes de utilizarlos en la práctica clínica. La segunda estrategia se dirige a una ganancia de función y tiene como objetivo inhibir oncomiRs mediante el uso de anti-miRNAs. Las modificaciones químicas, como el grupo 2'-O-metilo y el ácido nucleico bloqueado (LNA), aumentarían la estabilidad del oligo contra las nucleasas [144]. Los oligonucleótidos antisensibles contenidos en estas modificaciones se denominan antagomirs o "LNA-antimiRs" [144, 145]. Son oligonucleótidos con secuencias complementarias al miRNA endógeno e inhiben la función específica del miRNA. Se ha demostrado que un LNA-antimiR contra miR-122 silencia efectivamente miR-122 en primates no humanos [145], y los hallazgos apoyan el potencial de estos compuestos como una nueva clase terapéutica. Además, también se ha reportado que los anti-miR-150 suministrados en el tumor pulmonar xenoinjertos en ratones llevaron a un crecimiento tumoral inhibido En relación con estudios sobre miRNA imitados, estudios con oligonucleótidos antisensibles han mostrado evidencia efectiva con oligonucleótidos desnudos, lo que ilustra el potencial de modificaciones químicas de oligonucleótidos para mejorar su estabilidad, resistencia a la RNASa y propiedades farmacológicas, por lo que la inhibición de la función miRNA por antimiR oligonucleótidos químicamente modificados se ha convertido en un enfoque importante y ampliamente utilizado. Datos recientes del primer estudio de fase II en pacientes con infección crónica por VHC tratados con el antimiR-122 modificado por LNA mostraron que este compuesto fue bien tolerado y proporcionó supresión viral continua. Un número creciente de estudios han examinado el potencial terapéutico de los miRNAs. Recientemente, ha surgido la evidencia de roles para miRNAs en la determinación de resistencia a fármacos [147]. En esta situación, la combinación de miRNA imita o antimiR con quimioterapia puede potenciar la eficacia del tratamiento del cáncer en el futuro. Además, los miRNA relacionados con las células madre cancerosas pueden ampliar significativamente el campo de la terapia basada en miRNA y sugerir que los miRNAs pueden ser herramientas potenciales para destruir las células cancerosas asociadas con la resistencia a la terapia, recurrencia y metástasis [108, 148]. Por lo tanto, el principal desafío es el suministro exitoso y las modificaciones químicas de los miRNAs terapéuticos al tejido objetivo sin dañar los tejidos normales. Los enfoques basados en ARNi proporcionan una modalidad terapéutica prometedora para el tratamiento de diversas enfermedades pulmonares. Uno de los mayores desafíos en la terapia basada en ARNi sigue siendo el método de entrega de los siRNAs terapéuticos y miRNAs a las células objetivo. Las aplicaciones de parto pulmonar son muy atractivas, ya que tienden a ser no invasivas, son localmente restringidas y pueden ser administradas por el paciente. Una intervención terapéutica realista, como la aerosolización, puede mejorar la administración de fármacos en el lugar de acción y disminuir la exposición sistémica del paciente a la terapia, reduciendo así los efectos fuera de los objetivos. El avance de la entrega de siRNA pulmonar a la clínica ilustra que la terapia basada en ARNi ocupa un lugar central en el tratamiento futuro de las enfermedades pulmonares. Por otro lado, los miRNAs tienen la oportunidad de dirigir genes múltiples de una manera refinada, y la terapia basada en miRNA proporcionará un enfoque antitumoral y antiinflamatorio atractivo para diversas enfermedades pulmonares. En particular, la terapia antimiRNA por antimiR oligonucleótidos químicamente modificado se ha convertido en una terapia potencial para las enfermedades pulmonares porque los oligonucleótidos El aumento de la evidencia ha indicado que los miRNA cumplen funciones causales en una variedad de enfermedades pulmonares y han impulsado investigaciones sobre su potencial como dianas terapéuticas. Para el desarrollo futuro se requieren una mayor comprensión de los mecanismos detallados de la terapia basada en ARNi y la investigación de métodos de parto más eficaces. Estos nuevos enfoques podrían abrir nuevas vías para diversas enfermedades pulmonares y mejorar el resultado clínico de los pacientes.

¿Qué tamaño de partícula ha demostrado ser más eficaz en la entrega a la vía aérea inferior?

Secuencia completa del genoma de una cepa del virus de la bronquitis infecciosa nefropatía aislada en Chinahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3795213/SHA: f2df4fc3c60338755fd23da3d7e01c0455e20745Autores: Yang, Jing-tian; Ma, Bing-cunFecha: 2013-10DOI: 10.1128/genomea.0081-13Licencia: cc-byAbstract: El virus de la bronquitis infecciosa (IBV) causa enormes pérdidas económicas a la industria avícola. Texto: enfermedad tagiosa y aguda en pollos domésticos, pertenece al grupo III del género Coronavirus en la familia Coronaviridae (1). Es un virus de ARN (ssRNA) envuelto, no segmentado, de sentido positivo y de una sola cadena y tiene un genoma de aproximadamente 27,6 kb (2). Recientemente, muchos informes de análisis epidemiológicos han sugerido que las IBV nefropatógenas se han vuelto cada vez más frecuentes (3) (4) (5) (6) en China. En este trabajo, se analizó la secuencia completa del genoma de un aislado llamado SAIBK y se detectó la recombinación entre SAIBK y algunos IBVs previamente reportados. Se utilizó una rápida amplificación del kit de extremos de ADNc (RACE) (TaKaRa, Japón) para obtener los extremos 5= y 3= del genoma. Otras partes fueron amplificadas por 19 imprimaciones con solapamiento entre cada fragmento y fueron clonadas en el vector pMD19-T (TaKaRa, Japón). Todos los fragmentos fueron secuenciados tres veces por Sangon Biotech (Shanghai, China). Los fragmentos secuenciados fueron ensamblados usando el programa de software SeqMan (DNAStar, Inc.). Se realizó la alineación de secuencias y se construyó un árbol filogenético usando el programa de software MEGA5 (7). El análisis de recombinación fue realizado usando los programas de software RDP 4.14 (8) y SimPlot 3.5.1 (9). El genoma completo de la cepa SAIBK es 27.534 nucleótidos (nt) de longitud, incluyendo la cola poli(A). Tiene una organización clásica del genoma del IBV con 10 marcos de lectura abiertos (ORFs): La secuencia del genoma del SAIBK muestra la identidad más alta (94,3%) a la cepa china del IBV SC021202 (adhesión GenBank no. EU714029) y la identidad más baja (85,8%) a dos cepas chinas del IBV, BJ (adhesión GenBank no. AY319651) y DY07 (adhesión GenBank no. HM245923). Tiene identidades nucleótidas más bajas de 88,1%, 87,9% y 87,7% a las cepas de vacuna del IBV más utilizadas, H120, H52 y M41, respectivamente. El análisis filogenético de los resultados del genoma completo indicó que el SAIBK se agrupa en la misma rama que la cepa del IBV YN (adhesión Gen La subunidad S1 del genoma del IBV es el principal determinante del serotipo (10) (11) (12) (13) y el análisis S1 indicó que la cepa SAIBK tiene un serotipo similar a 4/91. Los métodos de detección de recombinación empleados revelaron que el SAIBK es un virus de la quimera, con la recombinación por la cepa SC021202 como padre principal y la cepa vacunal H120 como padre menor. La primera y la segunda regiones de recombinación se localizaron en las posiciones 7231 a 9126 y 13437 a 14473 en los genes 1a y 1b, respectivamente. Se detectaron otras dos regiones de recombinación en las posiciones 951 a 1067 y 5393 a 5605 de SAIBK, que fueron recombinadas con la cepa SC021202 como madre principal y la cepa vacunal H52 como madre menor. Los resultados de la detección de recombinación sugieren que SAIBK es posiblemente un virus de la quimera derivado de las cepas vacunales H120 y H52 de uso popular y la cepa de campo SC021202, y la cepa SC021202 fue aislada de pollos vacunados con H120 en la provincia de Sichuan en China en 2003 (14). Este resultado reveló que el campo IBV en la provincia de Sichuan ha sido sometido a recombinación genética y posiblemente está surgiendo como nuevas cepas mutantes, como SAIBK. Número de adhesión de secuencia de nucleotida. La secuencia completa del genoma del aislado SAIB

¿Cuánto tiempo dura el gen SAIBK?

Secuencia completa del genoma de una cepa del virus de la bronquitis infecciosa nefropatía aislada en Chinahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3795213/SHA: f2df4fc3c60338755fd23da3d7e01c0455e20745Autores: Yang, Jing-tian; Ma, Bing-cunFecha: 2013-10DOI: 10.1128/genomea.0081-13Licencia: cc-byAbstract: El virus de la bronquitis infecciosa (IBV) causa enormes pérdidas económicas a la industria avícola. Texto: enfermedad tagiosa y aguda en pollos domésticos, pertenece al grupo III del género Coronavirus en la familia Coronaviridae (1). Es un virus de ARN (ssRNA) envuelto, no segmentado, de sentido positivo y de una sola cadena y tiene un genoma de aproximadamente 27,6 kb (2). Recientemente, muchos informes de análisis epidemiológicos han sugerido que las IBV nefropatógenas se han vuelto cada vez más frecuentes (3) (4) (5) (6) en China. En este trabajo, se analizó la secuencia completa del genoma de un aislado llamado SAIBK y se detectó la recombinación entre SAIBK y algunos IBVs previamente reportados. Se utilizó una rápida amplificación del kit de extremos de ADNc (RACE) (TaKaRa, Japón) para obtener los extremos 5= y 3= del genoma. Otras partes fueron amplificadas por 19 imprimaciones con solapamiento entre cada fragmento y fueron clonadas en el vector pMD19-T (TaKaRa, Japón). Todos los fragmentos fueron secuenciados tres veces por Sangon Biotech (Shanghai, China). Los fragmentos secuenciados fueron ensamblados usando el programa de software SeqMan (DNAStar, Inc.). Se realizó la alineación de secuencias y se construyó un árbol filogenético usando el programa de software MEGA5 (7). El análisis de recombinación fue realizado usando los programas de software RDP 4.14 (8) y SimPlot 3.5.1 (9). El genoma completo de la cepa SAIBK es 27.534 nucleótidos (nt) de longitud, incluyendo la cola poli(A). Tiene una organización clásica del genoma del IBV con 10 marcos de lectura abiertos (ORFs): La secuencia del genoma del SAIBK muestra la identidad más alta (94,3%) a la cepa china del IBV SC021202 (adhesión GenBank no. EU714029) y la identidad más baja (85,8%) a dos cepas chinas del IBV, BJ (adhesión GenBank no. AY319651) y DY07 (adhesión GenBank no. HM245923). Tiene identidades nucleótidas más bajas de 88,1%, 87,9% y 87,7% a las cepas de vacuna del IBV más utilizadas, H120, H52 y M41, respectivamente. El análisis filogenético de los resultados del genoma completo indicó que el SAIBK se agrupa en la misma rama que la cepa del IBV YN (adhesión Gen La subunidad S1 del genoma del IBV es el principal determinante del serotipo (10) (11) (12) (13) y el análisis S1 indicó que la cepa SAIBK tiene un serotipo similar a 4/91. Los métodos de detección de recombinación empleados revelaron que el SAIBK es un virus de la quimera, con la recombinación por la cepa SC021202 como padre principal y la cepa vacunal H120 como padre menor. La primera y la segunda regiones de recombinación se localizaron en las posiciones 7231 a 9126 y 13437 a 14473 en los genes 1a y 1b, respectivamente. Se detectaron otras dos regiones de recombinación en las posiciones 951 a 1067 y 5393 a 5605 de SAIBK, que fueron recombinadas con la cepa SC021202 como madre principal y la cepa vacunal H52 como madre menor. Los resultados de la detección de recombinación sugieren que SAIBK es posiblemente un virus de la quimera derivado de las cepas vacunales H120 y H52 de uso popular y la cepa de campo SC021202, y la cepa SC021202 fue aislada de pollos vacunados con H120 en la provincia de Sichuan en China en 2003 (14). Este resultado reveló que el campo IBV en la provincia de Sichuan ha sido sometido a recombinación genética y posiblemente está surgiendo como nuevas cepas mutantes, como SAIBK. Número de adhesión de secuencia de nucleotida. La secuencia completa del genoma del aislado SAIB

¿Cuántos marcos de lectura abiertos hay en el gen SAIBK?

Preparación para la posible transmisión sostenida de la novela Coronavirus 2019Lecciones de epidemiologías anterioreshttps://jamanetwork.com/journals/jama/fullarticle/2761285Febrero 11, 2020David L. Swerdlow, MD1; Lyn Finelli, DrPH, MS2Author Afiliations Article InformationJAMA. 2020;323(12):1129-1130. doi:10.1001/jama.2020.19660COVID-19 Resource CenterIcono de artículos relacionados RelatedArtículosIcono de entrevista del autor EntrevistasAudio Entrevista (25:53)COVID-19 Actualización Desde ChinaTransmisibilidad y severidad son los 2 factores más críticos que determinan el efecto de una epidemia. Ni la pandemia del virus de la gripe pandémica A(H1N1) ([H1N1]pdm09) ni el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus (SARS-CoV) o la epidemia del síndrome respiratorio del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV) tuvieron la combinación de alta transmisibilidad y severidad. Las estrategias de control son impulsadas por esta combinación. R0, el número de reproducción básica, es una medida de transmisibilidad comúnmente utilizada y se define como el número de personas adicionales que un caso infecta durante el curso de su enfermedad. Un R0 de menos de 1 indica que la infección morirá “eventualmente”. Un R0 de mayor de 1 indica que la infección tiene el potencial de transmisión sostenida. Por ejemplo, influenza A(H1N1)pdm09, identificada por primera vez en el sur de California el 15 de abril de 2009, fue muy transmisible. Para el 5 de mayo de 2009, la gripe A(H1N1)pdm09 se había propagado a 41 Estados Unidos y 21 países.1 Aunque la gripe A(H1N1)pdm09 era muy transmisible, no era grave. Las estimaciones iniciales de la R0 de la gripe A(H1N1)pdm09 fueron 1,7.2 Aunque se estima que hubo 201 200 muertes respiratorias por gripe A(H1N1)pdm09 durante el primer año de la pandemia, el número de muertes por población fue 30 veces menor que el observado durante la pandemia de gripe de 1968, 1000 veces menor que la pandemia de 1918 e incluso menos que las epidemias estacionales típicas de gripe (estimadas por la Organización Mundial de la Salud [OMS] en 250 000 a 500 000 por año, aunque los métodos de estimación difieren).3 La gripe A(H1N1)pdm09 fue muy transmisible El SARS-CoV (2003) y el MERS-CoV (2012-corriente) causan enfermedades graves, pero a pesar de las estimaciones iniciales de R0 de más de 2,0 para el SARS-CoV (que indican una transmisión sostenida e incluso mundial), y algunos brotes grandes, tampoco fueron tan transmisibles como se sugirió inicialmente. El SARS-CoV causó 8098 casos notificados y 774 muertes (tasa de mortalidad por caso, 9,6%) en 37 países antes de que se controlara la epidemia. Se consideró que el control había sido posible porque una alta proporción de los casos eran graves, lo que facilitaba la identificación y el aislamiento rápidos de las personas infectadas. Además, el virus estaba presente en niveles más bajos en las secreciones de las vías aéreas superiores. No hubo transmisión secundaria en los Estados Unidos de los 8 casos importados, aunque en Toronto (Canadá) se cree que una sola importación ha provocado alrededor de 400 casos y 44 Las estimaciones posteriores de R0 fueron inferiores a 1, lo que indica que el SARS-CoV puede no haber sido capaz de transmitirse de forma sostenida, especialmente en el establecimiento de medidas de control4.Similarmente, el MERS-CoV parece tener alta severidad y poca transmisibilidad.Desde 2012, el MERS-CoV ha causado 2494 casos notificados y 858 muertes (tasa de mortalidad por caso, 34%) en 27 países.El MERS-CoV también ha causado algunos brotes rápidos, principalmente en hospitales de Arabia Saudita, Jordania y Corea del Sur, pero las estimaciones del MERS-CoV R0 son inferiores a 1, y hasta ahora se ha contenido5. En preparación para una pandemia de gripe, el Plan Pandemic Influenza del Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos incluyó una combinación de intervenciones no farmacéuticas (cierre de fronteras y escuelas, medidas de control de infecciones) y farmacéuticas (profilaxis antiviral, vacunas) destinadas a ser utilizadas en combinación para interrumpir o ralentizar la transmisión de la gripe. A pesar de la implementación de algunas de estas intervenciones, la gripe A(H1N1)pdm09 se extendió a 120 países en 3 meses. Con la aparición del MERS-CoV en el Medio Oriente, se elaboró un plan de preparación que incluyó un plan de vigilancia, pruebas de laboratorio y guía de rastreo de contactos. Se elaboraron directrices de control de infecciones para su uso en entornos de atención de la salud y se elaboró orientación para el viajero para el público6. No se identificaron casos secundarios en los Estados Unidos. Se consideró que el MERS-CoV era grave y las medidas de control se basaban en el reconocimiento de los casos sospechosos. Sin embargo, durante un brote hospitalario en Jeddah, Arabia Saudita, entre los pacientes hospitalizados sólo 5 de 53 (9%) casos asociados a la atención médica tenían presencia documentada en la misma habitación que un paciente con MERS5. A pesar de la alta tasa de mortalidad (una medida importante de gravedad), los casos de MERS pueden ser asintomáticos y leves (25% en un brote). Aunque no se sabe con qué frecuencia los pacientes asintomáticos o levemente sintomáticos transmiten MERS, iniciar medidas integrales como aislar a los pacientes sospechosos de haber estado expuestos al virus o haber estado expuestos a él y utilizar equipos de protección personal cuando se cuidan de ellos puede ser extremadamente difícil porque muchos pacientes tienen síntomas leves y no específicos. ¿Está el mundo listo para un virus Después de que se identificara un nuevo virus de la gripe (H7N9) en China en 2013, una serie de artículos de modelización describieron el efecto y el nivel de preparación para una pandemia grave de onda única en los Estados Unidos.7 En los escenarios que utilizaron tasas de ataque clínico (la proporción de personas que se enferman con una enfermedad o mueren de una enfermedad en una población inicialmente no infectada) del 20% al 30% (en comparación, la tasa de ataque clínico fue del 20% en el primer año de la pandemia de 2009 de H1N1), dependiendo de la gravedad se estima que habría entre 669 000 y 4,3 millones de hospitalizaciones y entre 54 000 y 538 000 muertes sin intervención alguna en los Estados Unidos. Los modelos sugerían que, sin una vacuna, los cierres escolares no serían probables para afectar a la pandemia, se necesitarían entre 35 000 y 60 000 ventiladores, se necesitarían hasta unos 7 300 millones de máscaras quirúrgicas o respiradores, y quizás lo más importante, si el desarrollo de la vacuna no comenzara antes de la introducción del virus, era poco probable que se pudiera evitar un número significativo de hospitalizaciones y muertes debido al tiempo que lleva desarrollar, probar, fabricar y distribuir una vacuna. Es imposible saber qué ocurrirá tan pronto en esta nueva epidemia de coronavirus 2019 (2019-nCoV). El alcance, la morbilidad y la mortalidad dependerán de la combinación de gravedad y transmisibilidad. Numerosos expertos han “casticado” cuántos casos han ocurrido y pronosticado cuántos casos probablemente ocurrirán. Un estudio reciente sugiere que la transmisión rápida de persona a persona puede ocurrir.8 Los modeladores de enfermedades han estimado que R0 es 2.2.9 La Universidad de Hong Kong estima que el brote podría infectar a más de 150 000 personas al día en China en su pico. ¿Es grave la infección por COV 2019-n? Hasta la fecha, aproximadamente el 14% de los casos de COV 2019-n han sido descritos como graves por la OMS, con una tasa de mortalidad por caso del 2,1%.10 Las estimaciones de gravedad son generalmente más altas al comienzo de una epidemia debido a la identificación de los casos más gravemente afectados y la disminución a medida que la epidemia progresa. Sin embargo, debido a que muchas personas infectadas aún no se han recuperado y pueden morir, la tasa de mortalidad por caso y gravedad podrían subestimarse. En la preparación para una posible transmisión sostenida de 2019-nCoV más allá de China, se deben considerar cuidadosamente las lecciones aplicables de experiencias previas con epidemias/pandemias de virus respiratorios para controlar y mitigar las posibles consecuencias. Se han desarrollado planes de preparación para la gripe que tienen como objetivo detener, frenar o limitar la propagación de una pandemia de gripe a los Estados Unidos. Estos planes abordan la limitación de la propagación doméstica y la mitigación de enfermedades, pero también el mantenimiento de la infraestructura y la reducción de los efectos adversos de la pandemia en la economía y la sociedad. Estos planes serían útiles para promulgar durante la epidemia de 2019-nCoV si los Estados Unidos experimentan una transmisión sostenida. Los países han tenido éxito en el pasado y todavía no hay nada que predecir que esta vez sea más probable. La prevención y el control eficaces no serán fáciles si hay transmisión sostenida y requerirán la plena atención de la salud pública, los gobiernos federal y local, el sector privado y Volver al principioInformación del artículoAutor para correspondencia: David L. Swerdlow, MD, Clinical Epidemiology Lead, Medical Development and Scientific/Clinical Affairs, Pfizer Vaccines, 500 Arcola Rd, Collegeville, PA 19426 (david.swerdlow@pfizer.com).Publicado en línea: 11 de febrero de 2020. doi:10.1001/jama.2020.1960Conflicto de intereses Divulgaciones: El Dr. Swerdlow informa que posee acciones y opciones de acciones en Pfizer Inc. El Dr. Swerdlow también informa que proporciona una consulta única consistente en una visión general de la epidemiología de SARS y MERS a GLG Consulting y recibe un honorario. Rol of the Funder/Sponsor: Pfizer Inc revisó el manuscrito y aprobó la decisión de enviar el manuscrito para su publicación. Referencias1. Swerdlow DL, Finelli L, Bridges CB. 2009 H1N1 pandemia de gripe: campo y investigaciones epidemiológicas en los Estados Unidos al comienzo de la primera pandemia del siglo XXI. Clin Infect Dis. 2011;52(suppl 1):S1-S3. doi:10.1093/cid/ciq005PubMedGoogle ScholarCrossref2. Balcan D, Hu H, Goncalves B, et al. Potencial de transmisión estacional y picos de actividad de la nueva gripe A(H1N1): un análisis de probabilidad de Monte Carlo basado en la movilidad humana. BMC Medicine. 2009;7(45). doi:10.1186/1741-7015-75-453. Dawood FS, Iuliano AD, Reed C, et al. Mortalidad global estimada asociada a los primeros 12 meses de la circulación del virus de la gripe pandémica A H1N1 de 2009: un estudio de modelización. Lancet Infect Dis. 2012;12(9):687-695. doi:10.1016/S1473-3099(12)70121-4PubMedGoogle ScholarCrossref4. Chowell G, Castillo-Chavez C, Fenimore PW, Kribs-Zaleta CM, Arriola L, Hyman JM. Parámetros modelo y control de brotes para SRAS. Emerg Infect Dis. 2004;10(7):1258-1263. doi:10.3201/eid1007.030647PubMedogle ScholarCrossref5. Killer Emerg Infect Dis. 2020;26(2):191-198. doi:10.3201/eid2602.190697PubMedGoogle ScholarCrossref6. Rasmussen SA, Watson AK, Swerdlow DL. Síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS). Microbiol Spectr. 2016;4(3). doi:10.1128/microbiolspec.EI10-0020/2016PubMedGoogle Scholar7. Swerdlow DL, Pillai SK, Meltzer MI, eds. CDC modelando esfuerzos en respuesta a una posible emergencia de salud pública: influenza A(H7N9) como ejemplo. Clin Infect Dis. 2015;60(suppl):S1-S63. https://academic.oup.com/cid/issue/60/suppl_1.Google Scholar8. Wang D, Hu B, Hu C, et al. Características clínicas de 138 pacientes hospitalizados con nueva neumonía infectada por coronavirus 2019 en Wuhan, China. JAMA. Publicado en línea el 7 de febrero de 2020. doi:10.1001/jama.2020.1585ArtículoPubMedGoogle Scholar9. Li Q, Guan X, Wu P, et al. Dinámica de transmisión temprana en Wuhan, China, de nueva neumonía infectada por coronavirus. N Engl J Med. Publicado en línea el 29 de enero de 2020. doi:10.1056/NEJMoa2001316PubMedGoogle Scholar10. Organización Mundial de la Salud. Novel coronavirus (2019-nCoV) informes de situación https://www.who.int/emergencies/ diseases/novel-coronavirus-2019/situation-reports/. Accessed February 4, 2020. Comment2 Comments for this articleEXPAND ALLFebruary 12, 2020Entender la R y el control de enfermedadesOz Mansoor Public Health Physician, WellingtonEl mensaje, que necesitamos prepararnos para una pandemia es vital. Pero el artículo no reporta algunas ideas clave. En primer lugar, el SRAS no fue controlado "porque una alta proporción de casos eran graves". Aunque eso ayudó, fue porque los casos no eran infecciosos antes de algunos días después de la aparición de los síntomas (generalmente en la segunda semana de enfermedad), lo que dio más tiempo para la identificación y el aislamiento de los casos. Y la mayoría de los casos no transmitieron infección a nadie, Desafortunadamente, el nuevo virus parece estar extendiéndose de las personas mucho antes en el curso de la enfermedad, e incluso con síntomas leves - que nunca fue documentado para el SARS. Sin embargo, no está claro que sea diferente o mejor en la propagación entre las personas, y tal vez con el mismo patrón de la mayoría de los casos no causando mayor propagación. En segundo lugar, el R0, el número de reproducción básica, se describe correctamente como el número medio de infecciones causa cada caso. Pero carece de dos ideas clave: 1) el 0 después de la R implica el estado nativo, que es una población totalmente susceptible y sin ninguna medida de control. R es el número efectivo y puede incluir el impacto de las medidas de control. Afirmar que fue la falta de transmisibilidad, en lugar de las medidas de control que terminaron con el SARS, no se basa en ninguna evidencia. E ignora los esfuerzos heroicos de los países afectados. La eliminación del SARS demostró el potencial de la acción colectiva coordinada globalmente, así como el daño causado por la ignorancia y los prejuicios.La mayoría parece haber olvidado ya las lecciones del SARS.CONFLICTO DE INTERÉS: Trabajado para la OMS/WPRO en respuesta al SARSREAD MÁSFebrero 24, 2020COVID 19: ¿una presencia global y no sólo un nuevo patógeno? Giuliano Ramadori, Profesor de Medicina Clínica Universitaria, Göttingen, AlemaniaEn la temporada de invierno llega el momento de las infecciones del tracto respiratorio superior e inferior caracterizadas por tos, disnea y eventualmente fiebre (enfermedad similar a la gripe).Algunos de los pacientes, especialmente las personas mayores que viven solas afectadas por la enfermedad, pueden necesitar hospitalización y eventualmente cuidados intensivos.En muchos de los casos se examina el líquido nasal y/o traqueal hospitalizado para detectar agentes virales o bacteria Sólo en menos del 50% de los casos se considera que el virus de la gripe es la causa de la enfermedad.En el resto de los casos el procedimiento de diagnóstico de coronavirus humanos no se realiza de forma rutinaria.Uno de los cuatro Coronavirus humanos diferentes (HuCoV: 229E,NL 63,0C43 y HKU1) se puede encontrar en hasta el 30% de los pacientes negativos para virus de la gripe (1). Científicos chinos en Wuhan, que tuvieron que hacer frente a un número creciente de enfermedades agudas de las vías respiratorias que se asemejan a neumonía viral, realizaron un análisis de secuenciación profunda a partir de muestras tomadas del tracto respiratorio inferior y encontraron un coronavirus "novela".La secuencia del genoma completo se hizo pública.Sin embargo, al mismo tiempo, Wuhan trajo a la atención las epidemias SARS y MERS.Las medidas adoptadas por las autoridades chinas y OMS son ahora bien conocidas. Recientemente se han identificado cerca de 150 nuevos casos en el norte de Italia y las autoridades sanitarias siguen buscando el caso 0 (la fuente). ¿Es posible que COVID-19 ya existiera en Italia -- y no sólo en Italia, sino posiblemente en todo el mundo -- y que la nueva secuencia de nucleótidos disponible permita ahora encontrar la causa de una enfermedad similar a la gripe sin definir previamente? REFERENCE1. Benezit F et al. INFECCIÓN, 13 de febrero de 2020, https://doi.org/101007/s15010-019-01388-1).CONFLICT OF INTEREST: Ninguno ReportedREAD MORESee More AboutGlobal Health Public Health Pulmonary Medicine Infectious Diseases InfluenzaDownload PDFCite ThisPermissionsCommentCME & MOC Coronavirus Resource CenterTrendingOpinion is learning have multimediaUS Emergency Legal Responses to Novel Coronavirus—Balancing Public Health and Civil LibertiesMarzo 24, 2020Opinion is learning has multimedia2019 Novel Coronavirus—Novel Coronavirus—Información importante para los médicosMarzo 17, 2020Investigación es un aprendizaje multimediaLas características legales de los pacientes con la infección Coronavirus (2019-nCoV) Hospitalizada en Beijing Todos los derechos reservados. Términos de uso Política de privacidad Declaración de accesibilidadSilverchair Logo

¿Qué virus de la gripe se identificó en China en 2013?

Preparación para la posible transmisión sostenida de la novela Coronavirus 2019Lecciones de epidemiologías anterioreshttps://jamanetwork.com/journals/jama/fullarticle/2761285Febrero 11, 2020David L. Swerdlow, MD1; Lyn Finelli, DrPH, MS2Author Afiliations Article InformationJAMA. 2020;323(12):1129-1130. doi:10.1001/jama.2020.19660COVID-19 Resource CenterIcono de artículos relacionados RelatedArtículosIcono de entrevista del autor EntrevistasAudio Entrevista (25:53)COVID-19 Actualización Desde ChinaTransmisibilidad y severidad son los 2 factores más críticos que determinan el efecto de una epidemia. Ni la pandemia del virus de la gripe pandémica A(H1N1) ([H1N1]pdm09) ni el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus (SARS-CoV) o la epidemia del síndrome respiratorio del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV) tuvieron la combinación de alta transmisibilidad y severidad. Las estrategias de control son impulsadas por esta combinación. R0, el número de reproducción básica, es una medida de transmisibilidad comúnmente utilizada y se define como el número de personas adicionales que un caso infecta durante el curso de su enfermedad. Un R0 de menos de 1 indica que la infección morirá “eventualmente”. Un R0 de mayor de 1 indica que la infección tiene el potencial de transmisión sostenida. Por ejemplo, influenza A(H1N1)pdm09, identificada por primera vez en el sur de California el 15 de abril de 2009, fue muy transmisible. Para el 5 de mayo de 2009, la gripe A(H1N1)pdm09 se había propagado a 41 Estados Unidos y 21 países.1 Aunque la gripe A(H1N1)pdm09 era muy transmisible, no era grave. Las estimaciones iniciales de la R0 de la gripe A(H1N1)pdm09 fueron 1,7.2 Aunque se estima que hubo 201 200 muertes respiratorias por gripe A(H1N1)pdm09 durante el primer año de la pandemia, el número de muertes por población fue 30 veces menor que el observado durante la pandemia de gripe de 1968, 1000 veces menor que la pandemia de 1918 e incluso menos que las epidemias estacionales típicas de gripe (estimadas por la Organización Mundial de la Salud [OMS] en 250 000 a 500 000 por año, aunque los métodos de estimación difieren).3 La gripe A(H1N1)pdm09 fue muy transmisible El SARS-CoV (2003) y el MERS-CoV (2012-corriente) causan enfermedades graves, pero a pesar de las estimaciones iniciales de R0 de más de 2,0 para el SARS-CoV (que indican una transmisión sostenida e incluso mundial), y algunos brotes grandes, tampoco fueron tan transmisibles como se sugirió inicialmente. El SARS-CoV causó 8098 casos notificados y 774 muertes (tasa de mortalidad por caso, 9,6%) en 37 países antes de que se controlara la epidemia. Se consideró que el control había sido posible porque una alta proporción de los casos eran graves, lo que facilitaba la identificación y el aislamiento rápidos de las personas infectadas. Además, el virus estaba presente en niveles más bajos en las secreciones de las vías aéreas superiores. No hubo transmisión secundaria en los Estados Unidos de los 8 casos importados, aunque en Toronto (Canadá) se cree que una sola importación ha provocado alrededor de 400 casos y 44 Las estimaciones posteriores de R0 fueron inferiores a 1, lo que indica que el SARS-CoV puede no haber sido capaz de transmitirse de forma sostenida, especialmente en el establecimiento de medidas de control4.Similarmente, el MERS-CoV parece tener alta severidad y poca transmisibilidad.Desde 2012, el MERS-CoV ha causado 2494 casos notificados y 858 muertes (tasa de mortalidad por caso, 34%) en 27 países.El MERS-CoV también ha causado algunos brotes rápidos, principalmente en hospitales de Arabia Saudita, Jordania y Corea del Sur, pero las estimaciones del MERS-CoV R0 son inferiores a 1, y hasta ahora se ha contenido5. En preparación para una pandemia de gripe, el Plan Pandemic Influenza del Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos incluyó una combinación de intervenciones no farmacéuticas (cierre de fronteras y escuelas, medidas de control de infecciones) y farmacéuticas (profilaxis antiviral, vacunas) destinadas a ser utilizadas en combinación para interrumpir o ralentizar la transmisión de la gripe. A pesar de la implementación de algunas de estas intervenciones, la gripe A(H1N1)pdm09 se extendió a 120 países en 3 meses. Con la aparición del MERS-CoV en el Medio Oriente, se elaboró un plan de preparación que incluyó un plan de vigilancia, pruebas de laboratorio y guía de rastreo de contactos. Se elaboraron directrices de control de infecciones para su uso en entornos de atención de la salud y se elaboró orientación para el viajero para el público6. No se identificaron casos secundarios en los Estados Unidos. Se consideró que el MERS-CoV era grave y las medidas de control se basaban en el reconocimiento de los casos sospechosos. Sin embargo, durante un brote hospitalario en Jeddah, Arabia Saudita, entre los pacientes hospitalizados sólo 5 de 53 (9%) casos asociados a la atención médica tenían presencia documentada en la misma habitación que un paciente con MERS5. A pesar de la alta tasa de mortalidad (una medida importante de gravedad), los casos de MERS pueden ser asintomáticos y leves (25% en un brote). Aunque no se sabe con qué frecuencia los pacientes asintomáticos o levemente sintomáticos transmiten MERS, iniciar medidas integrales como aislar a los pacientes sospechosos de haber estado expuestos al virus o haber estado expuestos a él y utilizar equipos de protección personal cuando se cuidan de ellos puede ser extremadamente difícil porque muchos pacientes tienen síntomas leves y no específicos. ¿Está el mundo listo para un virus Después de que se identificara un nuevo virus de la gripe (H7N9) en China en 2013, una serie de artículos de modelización describieron el efecto y el nivel de preparación para una pandemia grave de onda única en los Estados Unidos.7 En los escenarios que utilizaron tasas de ataque clínico (la proporción de personas que se enferman con una enfermedad o mueren de una enfermedad en una población inicialmente no infectada) del 20% al 30% (en comparación, la tasa de ataque clínico fue del 20% en el primer año de la pandemia de 2009 de H1N1), dependiendo de la gravedad se estima que habría entre 669 000 y 4,3 millones de hospitalizaciones y entre 54 000 y 538 000 muertes sin intervención alguna en los Estados Unidos. Los modelos sugerían que, sin una vacuna, los cierres escolares no serían probables para afectar a la pandemia, se necesitarían entre 35 000 y 60 000 ventiladores, se necesitarían hasta unos 7 300 millones de máscaras quirúrgicas o respiradores, y quizás lo más importante, si el desarrollo de la vacuna no comenzara antes de la introducción del virus, era poco probable que se pudiera evitar un número significativo de hospitalizaciones y muertes debido al tiempo que lleva desarrollar, probar, fabricar y distribuir una vacuna. Es imposible saber qué ocurrirá tan pronto en esta nueva epidemia de coronavirus 2019 (2019-nCoV). El alcance, la morbilidad y la mortalidad dependerán de la combinación de gravedad y transmisibilidad. Numerosos expertos han “casticado” cuántos casos han ocurrido y pronosticado cuántos casos probablemente ocurrirán. Un estudio reciente sugiere que la transmisión rápida de persona a persona puede ocurrir.8 Los modeladores de enfermedades han estimado que R0 es 2.2.9 La Universidad de Hong Kong estima que el brote podría infectar a más de 150 000 personas al día en China en su pico. ¿Es grave la infección por COV 2019-n? Hasta la fecha, aproximadamente el 14% de los casos de COV 2019-n han sido descritos como graves por la OMS, con una tasa de mortalidad por caso del 2,1%.10 Las estimaciones de gravedad son generalmente más altas al comienzo de una epidemia debido a la identificación de los casos más gravemente afectados y la disminución a medida que la epidemia progresa. Sin embargo, debido a que muchas personas infectadas aún no se han recuperado y pueden morir, la tasa de mortalidad por caso y gravedad podrían subestimarse. En la preparación para una posible transmisión sostenida de 2019-nCoV más allá de China, se deben considerar cuidadosamente las lecciones aplicables de experiencias previas con epidemias/pandemias de virus respiratorios para controlar y mitigar las posibles consecuencias. Se han desarrollado planes de preparación para la gripe que tienen como objetivo detener, frenar o limitar la propagación de una pandemia de gripe a los Estados Unidos. Estos planes abordan la limitación de la propagación doméstica y la mitigación de enfermedades, pero también el mantenimiento de la infraestructura y la reducción de los efectos adversos de la pandemia en la economía y la sociedad. Estos planes serían útiles para promulgar durante la epidemia de 2019-nCoV si los Estados Unidos experimentan una transmisión sostenida. Los países han tenido éxito en el pasado y todavía no hay nada que predecir que esta vez sea más probable. La prevención y el control eficaces no serán fáciles si hay transmisión sostenida y requerirán la plena atención de la salud pública, los gobiernos federal y local, el sector privado y Volver al principioInformación del artículoAutor para correspondencia: David L. Swerdlow, MD, Clinical Epidemiology Lead, Medical Development and Scientific/Clinical Affairs, Pfizer Vaccines, 500 Arcola Rd, Collegeville, PA 19426 (david.swerdlow@pfizer.com).Publicado en línea: 11 de febrero de 2020. doi:10.1001/jama.2020.1960Conflicto de intereses Divulgaciones: El Dr. Swerdlow informa que posee acciones y opciones de acciones en Pfizer Inc. El Dr. Swerdlow también informa que proporciona una consulta única consistente en una visión general de la epidemiología de SARS y MERS a GLG Consulting y recibe un honorario. Rol of the Funder/Sponsor: Pfizer Inc revisó el manuscrito y aprobó la decisión de enviar el manuscrito para su publicación. Referencias1. Swerdlow DL, Finelli L, Bridges CB. 2009 H1N1 pandemia de gripe: campo y investigaciones epidemiológicas en los Estados Unidos al comienzo de la primera pandemia del siglo XXI. Clin Infect Dis. 2011;52(suppl 1):S1-S3. doi:10.1093/cid/ciq005PubMedGoogle ScholarCrossref2. Balcan D, Hu H, Goncalves B, et al. Potencial de transmisión estacional y picos de actividad de la nueva gripe A(H1N1): un análisis de probabilidad de Monte Carlo basado en la movilidad humana. BMC Medicine. 2009;7(45). doi:10.1186/1741-7015-75-453. Dawood FS, Iuliano AD, Reed C, et al. Mortalidad global estimada asociada a los primeros 12 meses de la circulación del virus de la gripe pandémica A H1N1 de 2009: un estudio de modelización. Lancet Infect Dis. 2012;12(9):687-695. doi:10.1016/S1473-3099(12)70121-4PubMedGoogle ScholarCrossref4. Chowell G, Castillo-Chavez C, Fenimore PW, Kribs-Zaleta CM, Arriola L, Hyman JM. Parámetros modelo y control de brotes para SRAS. Emerg Infect Dis. 2004;10(7):1258-1263. doi:10.3201/eid1007.030647PubMedogle ScholarCrossref5. Killer Emerg Infect Dis. 2020;26(2):191-198. doi:10.3201/eid2602.190697PubMedGoogle ScholarCrossref6. Rasmussen SA, Watson AK, Swerdlow DL. Síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS). Microbiol Spectr. 2016;4(3). doi:10.1128/microbiolspec.EI10-0020/2016PubMedGoogle Scholar7. Swerdlow DL, Pillai SK, Meltzer MI, eds. CDC modelando esfuerzos en respuesta a una posible emergencia de salud pública: influenza A(H7N9) como ejemplo. Clin Infect Dis. 2015;60(suppl):S1-S63. https://academic.oup.com/cid/issue/60/suppl_1.Google Scholar8. Wang D, Hu B, Hu C, et al. Características clínicas de 138 pacientes hospitalizados con nueva neumonía infectada por coronavirus 2019 en Wuhan, China. JAMA. Publicado en línea el 7 de febrero de 2020. doi:10.1001/jama.2020.1585ArtículoPubMedGoogle Scholar9. Li Q, Guan X, Wu P, et al. Dinámica de transmisión temprana en Wuhan, China, de nueva neumonía infectada por coronavirus. N Engl J Med. Publicado en línea el 29 de enero de 2020. doi:10.1056/NEJMoa2001316PubMedGoogle Scholar10. Organización Mundial de la Salud. Novel coronavirus (2019-nCoV) informes de situación https://www.who.int/emergencies/ diseases/novel-coronavirus-2019/situation-reports/. Accessed February 4, 2020. Comment2 Comments for this articleEXPAND ALLFebruary 12, 2020Entender la R y el control de enfermedadesOz Mansoor Public Health Physician, WellingtonEl mensaje, que necesitamos prepararnos para una pandemia es vital. Pero el artículo no reporta algunas ideas clave. En primer lugar, el SRAS no fue controlado "porque una alta proporción de casos eran graves". Aunque eso ayudó, fue porque los casos no eran infecciosos antes de algunos días después de la aparición de los síntomas (generalmente en la segunda semana de enfermedad), lo que dio más tiempo para la identificación y el aislamiento de los casos. Y la mayoría de los casos no transmitieron infección a nadie, Desafortunadamente, el nuevo virus parece estar extendiéndose de las personas mucho antes en el curso de la enfermedad, e incluso con síntomas leves - que nunca fue documentado para el SARS. Sin embargo, no está claro que sea diferente o mejor en la propagación entre las personas, y tal vez con el mismo patrón de la mayoría de los casos no causando mayor propagación. En segundo lugar, el R0, el número de reproducción básica, se describe correctamente como el número medio de infecciones causa cada caso. Pero carece de dos ideas clave: 1) el 0 después de la R implica el estado nativo, que es una población totalmente susceptible y sin ninguna medida de control. R es el número efectivo y puede incluir el impacto de las medidas de control. Afirmar que fue la falta de transmisibilidad, en lugar de las medidas de control que terminaron con el SARS, no se basa en ninguna evidencia. E ignora los esfuerzos heroicos de los países afectados. La eliminación del SARS demostró el potencial de la acción colectiva coordinada globalmente, así como el daño causado por la ignorancia y los prejuicios.La mayoría parece haber olvidado ya las lecciones del SARS.CONFLICTO DE INTERÉS: Trabajado para la OMS/WPRO en respuesta al SARSREAD MÁSFebrero 24, 2020COVID 19: ¿una presencia global y no sólo un nuevo patógeno? Giuliano Ramadori, Profesor de Medicina Clínica Universitaria, Göttingen, AlemaniaEn la temporada de invierno llega el momento de las infecciones del tracto respiratorio superior e inferior caracterizadas por tos, disnea y eventualmente fiebre (enfermedad similar a la gripe).Algunos de los pacientes, especialmente las personas mayores que viven solas afectadas por la enfermedad, pueden necesitar hospitalización y eventualmente cuidados intensivos.En muchos de los casos se examina el líquido nasal y/o traqueal hospitalizado para detectar agentes virales o bacteria Sólo en menos del 50% de los casos se considera que el virus de la gripe es la causa de la enfermedad.En el resto de los casos el procedimiento de diagnóstico de coronavirus humanos no se realiza de forma rutinaria.Uno de los cuatro Coronavirus humanos diferentes (HuCoV: 229E,NL 63,0C43 y HKU1) se puede encontrar en hasta el 30% de los pacientes negativos para virus de la gripe (1). Científicos chinos en Wuhan, que tuvieron que hacer frente a un número creciente de enfermedades agudas de las vías respiratorias que se asemejan a neumonía viral, realizaron un análisis de secuenciación profunda a partir de muestras tomadas del tracto respiratorio inferior y encontraron un coronavirus "novela".La secuencia del genoma completo se hizo pública.Sin embargo, al mismo tiempo, Wuhan trajo a la atención las epidemias SARS y MERS.Las medidas adoptadas por las autoridades chinas y OMS son ahora bien conocidas. Recientemente se han identificado cerca de 150 nuevos casos en el norte de Italia y las autoridades sanitarias siguen buscando el caso 0 (la fuente). ¿Es posible que COVID-19 ya existiera en Italia -- y no sólo en Italia, sino posiblemente en todo el mundo -- y que la nueva secuencia de nucleótidos disponible permita ahora encontrar la causa de una enfermedad similar a la gripe sin definir previamente? REFERENCE1. Benezit F et al. INFECCIÓN, 13 de febrero de 2020, https://doi.org/101007/s15010-019-01388-1).CONFLICT OF INTEREST: Ninguno ReportedREAD MORESee More AboutGlobal Health Public Health Pulmonary Medicine Infectious Diseases InfluenzaDownload PDFCite ThisPermissionsCommentCME & MOC Coronavirus Resource CenterTrendingOpinion is learning have multimediaUS Emergency Legal Responses to Novel Coronavirus—Balancing Public Health and Civil LibertiesMarzo 24, 2020Opinion is learning has multimedia2019 Novel Coronavirus—Novel Coronavirus—Información importante para los médicosMarzo 17, 2020Investigación es un aprendizaje multimediaLas características legales de los pacientes con la infección Coronavirus (2019-nCoV) Hospitalizada en Beijing Todos los derechos reservados. Términos de uso Política de privacidad Declaración de accesibilidadSilverchair Logo

¿Cuál fue la tasa de ataque clínico en la pandemia H1N1 de 2009?

Preparación para la posible transmisión sostenida de la novela Coronavirus 2019Lecciones de epidemiologías anterioreshttps://jamanetwork.com/journals/jama/fullarticle/2761285Febrero 11, 2020David L. Swerdlow, MD1; Lyn Finelli, DrPH, MS2Author Afiliations Article InformationJAMA. 2020;323(12):1129-1130. doi:10.1001/jama.2020.19660COVID-19 Resource CenterIcono de artículos relacionados RelatedArtículosIcono de entrevista del autor EntrevistasAudio Entrevista (25:53)COVID-19 Actualización Desde ChinaTransmisibilidad y severidad son los 2 factores más críticos que determinan el efecto de una epidemia. Ni la pandemia del virus de la gripe pandémica A(H1N1) ([H1N1]pdm09) ni el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus (SARS-CoV) o la epidemia del síndrome respiratorio del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV) tuvieron la combinación de alta transmisibilidad y severidad. Las estrategias de control son impulsadas por esta combinación. R0, el número de reproducción básica, es una medida de transmisibilidad comúnmente utilizada y se define como el número de personas adicionales que un caso infecta durante el curso de su enfermedad. Un R0 de menos de 1 indica que la infección morirá “eventualmente”. Un R0 de mayor de 1 indica que la infección tiene el potencial de transmisión sostenida. Por ejemplo, influenza A(H1N1)pdm09, identificada por primera vez en el sur de California el 15 de abril de 2009, fue muy transmisible. Para el 5 de mayo de 2009, la gripe A(H1N1)pdm09 se había propagado a 41 Estados Unidos y 21 países.1 Aunque la gripe A(H1N1)pdm09 era muy transmisible, no era grave. Las estimaciones iniciales de la R0 de la gripe A(H1N1)pdm09 fueron 1,7.2 Aunque se estima que hubo 201 200 muertes respiratorias por gripe A(H1N1)pdm09 durante el primer año de la pandemia, el número de muertes por población fue 30 veces menor que el observado durante la pandemia de gripe de 1968, 1000 veces menor que la pandemia de 1918 e incluso menos que las epidemias estacionales típicas de gripe (estimadas por la Organización Mundial de la Salud [OMS] en 250 000 a 500 000 por año, aunque los métodos de estimación difieren).3 La gripe A(H1N1)pdm09 fue muy transmisible El SARS-CoV (2003) y el MERS-CoV (2012-corriente) causan enfermedades graves, pero a pesar de las estimaciones iniciales de R0 de más de 2,0 para el SARS-CoV (que indican una transmisión sostenida e incluso mundial), y algunos brotes grandes, tampoco fueron tan transmisibles como se sugirió inicialmente. El SARS-CoV causó 8098 casos notificados y 774 muertes (tasa de mortalidad por caso, 9,6%) en 37 países antes de que se controlara la epidemia. Se consideró que el control había sido posible porque una alta proporción de los casos eran graves, lo que facilitaba la identificación y el aislamiento rápidos de las personas infectadas. Además, el virus estaba presente en niveles más bajos en las secreciones de las vías aéreas superiores. No hubo transmisión secundaria en los Estados Unidos de los 8 casos importados, aunque en Toronto (Canadá) se cree que una sola importación ha provocado alrededor de 400 casos y 44 Las estimaciones posteriores de R0 fueron inferiores a 1, lo que indica que el SARS-CoV puede no haber sido capaz de transmitirse de forma sostenida, especialmente en el establecimiento de medidas de control4.Similarmente, el MERS-CoV parece tener alta severidad y poca transmisibilidad.Desde 2012, el MERS-CoV ha causado 2494 casos notificados y 858 muertes (tasa de mortalidad por caso, 34%) en 27 países.El MERS-CoV también ha causado algunos brotes rápidos, principalmente en hospitales de Arabia Saudita, Jordania y Corea del Sur, pero las estimaciones del MERS-CoV R0 son inferiores a 1, y hasta ahora se ha contenido5. En preparación para una pandemia de gripe, el Plan Pandemic Influenza del Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos incluyó una combinación de intervenciones no farmacéuticas (cierre de fronteras y escuelas, medidas de control de infecciones) y farmacéuticas (profilaxis antiviral, vacunas) destinadas a ser utilizadas en combinación para interrumpir o ralentizar la transmisión de la gripe. A pesar de la implementación de algunas de estas intervenciones, la gripe A(H1N1)pdm09 se extendió a 120 países en 3 meses. Con la aparición del MERS-CoV en el Medio Oriente, se elaboró un plan de preparación que incluyó un plan de vigilancia, pruebas de laboratorio y guía de rastreo de contactos. Se elaboraron directrices de control de infecciones para su uso en entornos de atención de la salud y se elaboró orientación para el viajero para el público6. No se identificaron casos secundarios en los Estados Unidos. Se consideró que el MERS-CoV era grave y las medidas de control se basaban en el reconocimiento de los casos sospechosos. Sin embargo, durante un brote hospitalario en Jeddah, Arabia Saudita, entre los pacientes hospitalizados sólo 5 de 53 (9%) casos asociados a la atención médica tenían presencia documentada en la misma habitación que un paciente con MERS5. A pesar de la alta tasa de mortalidad (una medida importante de gravedad), los casos de MERS pueden ser asintomáticos y leves (25% en un brote). Aunque no se sabe con qué frecuencia los pacientes asintomáticos o levemente sintomáticos transmiten MERS, iniciar medidas integrales como aislar a los pacientes sospechosos de haber estado expuestos al virus o haber estado expuestos a él y utilizar equipos de protección personal cuando se cuidan de ellos puede ser extremadamente difícil porque muchos pacientes tienen síntomas leves y no específicos. ¿Está el mundo listo para un virus Después de que se identificara un nuevo virus de la gripe (H7N9) en China en 2013, una serie de artículos de modelización describieron el efecto y el nivel de preparación para una pandemia grave de onda única en los Estados Unidos.7 En los escenarios que utilizaron tasas de ataque clínico (la proporción de personas que se enferman con una enfermedad o mueren de una enfermedad en una población inicialmente no infectada) del 20% al 30% (en comparación, la tasa de ataque clínico fue del 20% en el primer año de la pandemia de 2009 de H1N1), dependiendo de la gravedad se estima que habría entre 669 000 y 4,3 millones de hospitalizaciones y entre 54 000 y 538 000 muertes sin intervención alguna en los Estados Unidos. Los modelos sugerían que, sin una vacuna, los cierres escolares no serían probables para afectar a la pandemia, se necesitarían entre 35 000 y 60 000 ventiladores, se necesitarían hasta unos 7 300 millones de máscaras quirúrgicas o respiradores, y quizás lo más importante, si el desarrollo de la vacuna no comenzara antes de la introducción del virus, era poco probable que se pudiera evitar un número significativo de hospitalizaciones y muertes debido al tiempo que lleva desarrollar, probar, fabricar y distribuir una vacuna. Es imposible saber qué ocurrirá tan pronto en esta nueva epidemia de coronavirus 2019 (2019-nCoV). El alcance, la morbilidad y la mortalidad dependerán de la combinación de gravedad y transmisibilidad. Numerosos expertos han “casticado” cuántos casos han ocurrido y pronosticado cuántos casos probablemente ocurrirán. Un estudio reciente sugiere que la transmisión rápida de persona a persona puede ocurrir.8 Los modeladores de enfermedades han estimado que R0 es 2.2.9 La Universidad de Hong Kong estima que el brote podría infectar a más de 150 000 personas al día en China en su pico. ¿Es grave la infección por COV 2019-n? Hasta la fecha, aproximadamente el 14% de los casos de COV 2019-n han sido descritos como graves por la OMS, con una tasa de mortalidad por caso del 2,1%.10 Las estimaciones de gravedad son generalmente más altas al comienzo de una epidemia debido a la identificación de los casos más gravemente afectados y la disminución a medida que la epidemia progresa. Sin embargo, debido a que muchas personas infectadas aún no se han recuperado y pueden morir, la tasa de mortalidad por caso y gravedad podrían subestimarse. En la preparación para una posible transmisión sostenida de 2019-nCoV más allá de China, se deben considerar cuidadosamente las lecciones aplicables de experiencias previas con epidemias/pandemias de virus respiratorios para controlar y mitigar las posibles consecuencias. Se han desarrollado planes de preparación para la gripe que tienen como objetivo detener, frenar o limitar la propagación de una pandemia de gripe a los Estados Unidos. Estos planes abordan la limitación de la propagación doméstica y la mitigación de enfermedades, pero también el mantenimiento de la infraestructura y la reducción de los efectos adversos de la pandemia en la economía y la sociedad. Estos planes serían útiles para promulgar durante la epidemia de 2019-nCoV si los Estados Unidos experimentan una transmisión sostenida. Los países han tenido éxito en el pasado y todavía no hay nada que predecir que esta vez sea más probable. La prevención y el control eficaces no serán fáciles si hay transmisión sostenida y requerirán la plena atención de la salud pública, los gobiernos federal y local, el sector privado y Volver al principioInformación del artículoAutor para correspondencia: David L. Swerdlow, MD, Clinical Epidemiology Lead, Medical Development and Scientific/Clinical Affairs, Pfizer Vaccines, 500 Arcola Rd, Collegeville, PA 19426 (david.swerdlow@pfizer.com).Publicado en línea: 11 de febrero de 2020. doi:10.1001/jama.2020.1960Conflicto de intereses Divulgaciones: El Dr. Swerdlow informa que posee acciones y opciones de acciones en Pfizer Inc. El Dr. Swerdlow también informa que proporciona una consulta única consistente en una visión general de la epidemiología de SARS y MERS a GLG Consulting y recibe un honorario. Rol of the Funder/Sponsor: Pfizer Inc revisó el manuscrito y aprobó la decisión de enviar el manuscrito para su publicación. Referencias1. Swerdlow DL, Finelli L, Bridges CB. 2009 H1N1 pandemia de gripe: campo y investigaciones epidemiológicas en los Estados Unidos al comienzo de la primera pandemia del siglo XXI. Clin Infect Dis. 2011;52(suppl 1):S1-S3. doi:10.1093/cid/ciq005PubMedGoogle ScholarCrossref2. Balcan D, Hu H, Goncalves B, et al. Potencial de transmisión estacional y picos de actividad de la nueva gripe A(H1N1): un análisis de probabilidad de Monte Carlo basado en la movilidad humana. BMC Medicine. 2009;7(45). doi:10.1186/1741-7015-75-453. Dawood FS, Iuliano AD, Reed C, et al. Mortalidad global estimada asociada a los primeros 12 meses de la circulación del virus de la gripe pandémica A H1N1 de 2009: un estudio de modelización. Lancet Infect Dis. 2012;12(9):687-695. doi:10.1016/S1473-3099(12)70121-4PubMedGoogle ScholarCrossref4. Chowell G, Castillo-Chavez C, Fenimore PW, Kribs-Zaleta CM, Arriola L, Hyman JM. Parámetros modelo y control de brotes para SRAS. Emerg Infect Dis. 2004;10(7):1258-1263. doi:10.3201/eid1007.030647PubMedogle ScholarCrossref5. Killer Emerg Infect Dis. 2020;26(2):191-198. doi:10.3201/eid2602.190697PubMedGoogle ScholarCrossref6. Rasmussen SA, Watson AK, Swerdlow DL. Síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS). Microbiol Spectr. 2016;4(3). doi:10.1128/microbiolspec.EI10-0020/2016PubMedGoogle Scholar7. Swerdlow DL, Pillai SK, Meltzer MI, eds. CDC modelando esfuerzos en respuesta a una posible emergencia de salud pública: influenza A(H7N9) como ejemplo. Clin Infect Dis. 2015;60(suppl):S1-S63. https://academic.oup.com/cid/issue/60/suppl_1.Google Scholar8. Wang D, Hu B, Hu C, et al. Características clínicas de 138 pacientes hospitalizados con nueva neumonía infectada por coronavirus 2019 en Wuhan, China. JAMA. Publicado en línea el 7 de febrero de 2020. doi:10.1001/jama.2020.1585ArtículoPubMedGoogle Scholar9. Li Q, Guan X, Wu P, et al. Dinámica de transmisión temprana en Wuhan, China, de nueva neumonía infectada por coronavirus. N Engl J Med. Publicado en línea el 29 de enero de 2020. doi:10.1056/NEJMoa2001316PubMedGoogle Scholar10. Organización Mundial de la Salud. Novel coronavirus (2019-nCoV) informes de situación https://www.who.int/emergencies/ diseases/novel-coronavirus-2019/situation-reports/. Accessed February 4, 2020. Comment2 Comments for this articleEXPAND ALLFebruary 12, 2020Entender la R y el control de enfermedadesOz Mansoor Public Health Physician, WellingtonEl mensaje, que necesitamos prepararnos para una pandemia es vital. Pero el artículo no reporta algunas ideas clave. En primer lugar, el SRAS no fue controlado "porque una alta proporción de casos eran graves". Aunque eso ayudó, fue porque los casos no eran infecciosos antes de algunos días después de la aparición de los síntomas (generalmente en la segunda semana de enfermedad), lo que dio más tiempo para la identificación y el aislamiento de los casos. Y la mayoría de los casos no transmitieron infección a nadie, Desafortunadamente, el nuevo virus parece estar extendiéndose de las personas mucho antes en el curso de la enfermedad, e incluso con síntomas leves - que nunca fue documentado para el SARS. Sin embargo, no está claro que sea diferente o mejor en la propagación entre las personas, y tal vez con el mismo patrón de la mayoría de los casos no causando mayor propagación. En segundo lugar, el R0, el número de reproducción básica, se describe correctamente como el número medio de infecciones causa cada caso. Pero carece de dos ideas clave: 1) el 0 después de la R implica el estado nativo, que es una población totalmente susceptible y sin ninguna medida de control. R es el número efectivo y puede incluir el impacto de las medidas de control. Afirmar que fue la falta de transmisibilidad, en lugar de las medidas de control que terminaron con el SARS, no se basa en ninguna evidencia. E ignora los esfuerzos heroicos de los países afectados. La eliminación del SARS demostró el potencial de la acción colectiva coordinada globalmente, así como el daño causado por la ignorancia y los prejuicios.La mayoría parece haber olvidado ya las lecciones del SARS.CONFLICTO DE INTERÉS: Trabajado para la OMS/WPRO en respuesta al SARSREAD MÁSFebrero 24, 2020COVID 19: ¿una presencia global y no sólo un nuevo patógeno? Giuliano Ramadori, Profesor de Medicina Clínica Universitaria, Göttingen, AlemaniaEn la temporada de invierno llega el momento de las infecciones del tracto respiratorio superior e inferior caracterizadas por tos, disnea y eventualmente fiebre (enfermedad similar a la gripe).Algunos de los pacientes, especialmente las personas mayores que viven solas afectadas por la enfermedad, pueden necesitar hospitalización y eventualmente cuidados intensivos.En muchos de los casos se examina el líquido nasal y/o traqueal hospitalizado para detectar agentes virales o bacteria Sólo en menos del 50% de los casos se considera que el virus de la gripe es la causa de la enfermedad.En el resto de los casos el procedimiento de diagnóstico de coronavirus humanos no se realiza de forma rutinaria.Uno de los cuatro Coronavirus humanos diferentes (HuCoV: 229E,NL 63,0C43 y HKU1) se puede encontrar en hasta el 30% de los pacientes negativos para virus de la gripe (1). Científicos chinos en Wuhan, que tuvieron que hacer frente a un número creciente de enfermedades agudas de las vías respiratorias que se asemejan a neumonía viral, realizaron un análisis de secuenciación profunda a partir de muestras tomadas del tracto respiratorio inferior y encontraron un coronavirus "novela".La secuencia del genoma completo se hizo pública.Sin embargo, al mismo tiempo, Wuhan trajo a la atención las epidemias SARS y MERS.Las medidas adoptadas por las autoridades chinas y OMS son ahora bien conocidas. Recientemente se han identificado cerca de 150 nuevos casos en el norte de Italia y las autoridades sanitarias siguen buscando el caso 0 (la fuente). ¿Es posible que COVID-19 ya existiera en Italia -- y no sólo en Italia, sino posiblemente en todo el mundo -- y que la nueva secuencia de nucleótidos disponible permita ahora encontrar la causa de una enfermedad similar a la gripe sin definir previamente? REFERENCE1. Benezit F et al. INFECCIÓN, 13 de febrero de 2020, https://doi.org/101007/s15010-019-01388-1).CONFLICT OF INTEREST: Ninguno ReportedREAD MORESee More AboutGlobal Health Public Health Pulmonary Medicine Infectious Diseases InfluenzaDownload PDFCite ThisPermissionsCommentCME & MOC Coronavirus Resource CenterTrendingOpinion is learning have multimediaUS Emergency Legal Responses to Novel Coronavirus—Balancing Public Health and Civil LibertiesMarzo 24, 2020Opinion is learning has multimedia2019 Novel Coronavirus—Novel Coronavirus—Información importante para los médicosMarzo 17, 2020Investigación es un aprendizaje multimediaLas características legales de los pacientes con la infección Coronavirus (2019-nCoV) Hospitalizada en Beijing Todos los derechos reservados. Términos de uso Política de privacidad Declaración de accesibilidadSilverchair Logo

¿Cuál es el R0 estimado de COVID-19?

El muestreo de condensados respiratorios exhalados no es un nuevo método para la detección de virus respiratorioshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3059288/SHA: f3b46e7e8f58799207cc44515f859c1daf5e4dfcAutores: Houspie, Lieselot; De Coster, Sarah; Keyaerts, Els; Narongsack, Phouthalack; De Roy, Rikka; Talboom, Ive; Sisk, Maura; Maes, Piet; Verbeeck, Jannick; Van Ranst, MarcFecha: 2011-03-04DOI: 10.1186/1743-422x-8-98Licencia: cc-byAbstract: ANTEGRADO: El muestreo MÉTODOS: En nuestro estudio se reclutaron 102 voluntarios con infección de la vía aérea superior durante el invierno y principios de la primavera de 2008/2009 y la primera mitad del invierno de 2009/2010. Se obtuvieron con éxito 99 EBCs y se examinaron 14 virus respiratorios de circulación frecuente. Para investigar la eficiencia del aislamiento del virus del EBC, se tomó un hisopo nasal en paralelo de un subconjunto de voluntarios. El uso combinado del dispositivo ECoVent con el RTubeTM permitió registrar el volumen exhalado y la frecuencia respiratoria durante la recolección. De esta manera, se puede estimar teóricamente el número de partículas virales exhaladas por litro de aire o por minuto. RESULTADOS: El cribado viral resultó en la detección de 4 virus diferentes en EBC y/o hisopos nasales: Rhinovirus, Virus Sincitial Respiratorio Humano B, Influenza A e Influenza B. Rhinovirus fue detectado en 6 EBCs y 1 EBC fue Influenza B positivo. Se reporta una tasa de detección viral del 7% para los EBCs, que es mucho menor que la tasa de detección del 46,8% observada con hisopos nasales. CONCLUSIÓN: Aunque muy prometedora, la recolección de EBC utilizando el RPubeTM no es confiable para el diagnóstico de infecciones respiratorias. Texto: Las infecciones del tracto respiratorio humano representan las infecciones más frecuentemente encontradas en todo el mundo. En la mayoría de los casos, la etiología de estas infecciones sigue siendo indeterminada debido a la rápida convalecencia después de la infección. Las infecciones del tracto respiratorio en adultos sanos pueden ser causadas por una variedad de patógenos y la detección de estos agentes se basa actualmente en su aislamiento de hisopos nasales (NS), lavados broncoalveolares (BAL), aspirados nasofaríngeos y muestras de esputo. La adquisición de estos especímenes mediante técnicas semi-invasoras e invasivas es a menudo desagradable para el paciente. Por lo tanto, el análisis de condensado de aliento exhalado (EBC) se ha explorado recientemente como un método nuevo y no invasivo para monitorear la inflamación pulmonar y la enfermedad pulmonar como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), asma, fibrosis quística, cáncer de pulmón, etc. Los CEM consisten principalmente en vapor de agua, pero una pequeña fracción contiene gotitas respiratorias derivadas del líquido de revestimiento de las vías respiratorias [1, 2]. Esta observación ha generado un creciente interés en el uso de EBC como nuevo método de muestreo para el cribado de virus respiratorios que infectan las vías aéreas superiores. Al principio, los investigadores sospecharon que la turbulencia del aire inhalado era responsable de la aerosolización del líquido respiratorio. Sin embargo, el efecto del flujo turbulento de aire se limita a las vías aéreas superiores, ya que el flujo turbulento de aire se vuelve laminar a medida que llega a las vías aéreas bronquiales más pequeñas y los alvéolos. Recientemente, se ha descrito el modelo de explosión de la película de líquido bronquiol [3]. Este modelo sugiere que los aerosoles se producen durante la inhalación por el estallido de burbujas de líquido presentes en los bronquiolos. El objetivo de este estudio fue investigar si el método de recolección de EBC fue adecuado para la condensación eficiente de partículas de virus aerosolizados durante la respiración normal En este estudio, se recogieron 102 EBC de voluntarios sanos que mostraban síntomas respiratorios o gripales (definidos en la Tabla 1), utilizando un condensador disponible comercialmente (RTubeTM, Respiratory Research Inc., Charlottesville, Virginia, EE.UU.). Se instruyó al paciente a respirar por vía oral a volúmenes de mareas en una boquilla conectada a un condensador durante 10 minutos. No se utilizaron clips nasales durante la recolección y se evitó la contaminación salival por la presencia de una válvula de un solo sentido y la sección en forma de T de la boquilla. En una primera parte del estudio que se inició durante el invierno y la primavera de 2008/2009, se recogieron 70 muestras de EBC de pacientes que voluntariamente se presentaron a nuestro laboratorio. La mayoría de estos voluntarios fueron estudiantes que respondieron al folleto informativo, distribuido en los edificios universitarios de la Universidad Católica de Leuven. En el otoño y la primera mitad del invierno de 2009/2010, se recogieron 32 condensados de pacientes que se presentaron a su médico general. Debido a circunstancias prácticas, los condensados se recolectaron con el refrigerador refrigerado a -20°C. Para 13 de las 32 colecciones, el RUBETM fue conectado por un conector hecho a medida al ECoVent (Jaeger, Alemania). Este dispositivo registra parámetros ventilatorios como el volumen exhalado, la frecuencia respiratoria y el volumen de mareas. Además, se obtuvo un NS en paralelo con la colección de condensados de cada paciente. Todos los EBC se almacenaron inmediatamente a -20°C. Se refrigeraron los hisopos nasales (NS). Después de la extracción de ADN y ARN virales, se almacenaron muestras de EBC y toallitas nasales a -80°C. Se excluyeron del estudio tres especímenes por recolección incorrecta de condensados, se utilizó un breve cuestionario para documentar la fecha de nacimiento, la gravedad de las dolencias respiratorias y para registrar los días de enfermedad sintomática de todos los voluntarios, el cual fue aprobado por el Comité de Ética Médica del Hospital Universitario de Lovaina y se recibieron consentimientos informados de todos los participantes, se aislaron ADN y ARN virales con el kit de virus QIAamp MinElute (Qiagen, Westburg, Países Bajos) de acuerdo con el manual de instrucciones, se eludieron extractos de EBC en tampón de elución de 60 μl y extractos de NS en tampón de 110 μl. Los condensados respiratorios fueron analizados para detectar 11 virus del ARN respiratorio (CoV NL63, E229 y OC43, RV, HMPV, InfA&B y PIV1-4) [4] [5] [6] [7] utilizando un kit de RCR-RT de OneStep (Qiagen, Westburg, Países Bajos) en una reacción de 50 μl que contenía 10 μl de ARN extraído, 0,6 μM de imprimaciones hacia adelante e inversas (Tabla 2), 1,5 μl de Enzima de One Step, 10 μl 5 × Un tampón de RT-PCR de One Step y 400 μM de cada dNTP. Para el cribado de adenovirus, se realizó un PCR de ADN para el cual la mezcla de reacción de amplificación contenía 0,5 μM de imprimación delantera (AdFW) e imprimación inversa (AdRV), 0,4 mM dNTPs, 10 μl Buffer C y 1 U Taq polimerasa en un volumen final de 50 μl. Los imprimadores PCR utilizados se localizaron en regiones conservadas de los genomas de los patógenos respiratorios (Tabla 2 ). Las reacciones se realizaron en un Termociclista T3000 48 (Westburg, Leusden, Países Bajos) con un paso inicial de transcripción inversa para virus ARN a 50 °C durante 30 min, seguido de activación PCR a 95 °C durante 30 s, 45 ciclos de amplificación seguidos de un paso final de extensión durante 10 min a 72 °C. El programa de amplificación del ADN se inició con un paso de desnaturalización a 94 °C durante 3 minutos, seguido de 45 ciclos de 94 °C durante 30 s, 55 °C durante 30 s y un paso de extensión final a 72 °C durante 1 min. Los amplicones fueron sometidos a un gel de poliacrilamida del 6% y visualizados bajo luz UV por tinción con bromuro de etidium. Los productos PCR fueron purificados utilizando el Kit Invitado MSB Spin PCRapace y el ciclo secuenciado en dirección delantera e inversa utilizando el kit de secuenciación de ciclos de terminación de Big-Dye ABI PRISM (Aplicado Biosystems, Foster City, CA, USA). El análisis de secuencias se realizó con el Analizador Genético ABI3130 (Aplicado Biosystems, Foster City, CA, EE.UU En resumen, se preparó una mezcla múltiplex en un volumen final de 25 μl utilizando ARN extraído de 5 μl, 12,5 μl de Eurogentec One-Step Reverse Transcriptase qPCR Master Mix que contiene ROX como referencia pasiva, 0,125 μl Euroscript + RT & Rnasa inhibidor (Eurogentec, Seraing, Bélgica) 200 nM de HRSV-A y -B imprimadores delanteros e inversos específicos y 100 nM de HRSV-A y -B MGB. Los estándares de ARNc se construyeron utilizando el kit T7 de shortscript MEGA (Ambión, Austin, TX, EE.UU.) y cuantificado espectrométricamente. La carga viral de muestras positivas de RV fue cuantificada por qRT-PCR como se describe en el manuscrito publicado por Lu y compañeros [10]. El kit Eurogentec One-Step Reverse Transcriptase qPCR fue utilizado para la preparación de la mezcla maestra como se describe anteriormente. El primer HRSV-AF F 669-695 ctgtgatagarttcaacaaaagaaca [8, 9] HRSV-AF F 718-745 agttacaccttcattaactaaatcc [8, 9] HRSV-BN N 435-458 ggctccagaatatagggattc [8, 9] HRSV-BN N 480-508 tggttattacaagaagagcactacagagt [8, 9] MGB sondas y sondas, situadas en 5'UTR, se añadieron a una concentración final de 1 μM y 0,1 μM, respectivamente. Los estándares de ARNc se construyeron sobre la base del producto PCR de la muestra 1 utilizando el kit MegaScript (Ambion, Austin, TX, EE.UU.). La cuantificación se realizó con un espectrofotómetro a 260 nm y se convirtió al número de molécula [11]. Se realizaron diluciones en serie de diez veces, lo que permitió la detección en un rango de 8,6 × 10 6 a 8,6 × 10 2 copias de ARN. Los ensayos RT-PCR se realizaron en un Sistema de Detección de Secuencias ABI PRISM 7500 (Aplicado Biosistemas, Foster City, CA, EE.UU.). Se realizó un paso inicial de transcripción inversa a 48°C durante 30 minutos, seguido de un paso de desnaturalización a 95°C durante 10 minutos. Finalmente, se completó un paso de amplificación de 45 cicli a 95°C durante 15 segundos y 1 min a 60°C. (37,5%) hombres, con mediana de edad de 29 años (rango 9 -46 años). Faltaron edad y género para 2 participantes del segundo Sólo el 6% eran menores de 20 años y el 3% tenían más de 70 años; en total, 80 pacientes (78,4%) ya se encontraban enfermos durante 1 a 7 días en el día de la obtención de la muestra; siete voluntarios (6,8%) eran sintomáticos durante 8 a 14 días y 9 participantes (8,8%) ya estaban enfermos durante más de 14 días en el día de la recogida de la muestra; faltaban datos sobre la duración de los síntomas en 6 pacientes; casi todos los voluntarios experimentaron al menos 2 síntomas, excepto en dos pacientes (Tabla 1); cuarenta y siete (46,1%) voluntarios se quejaron de una constante secreción nasal o congestión nasal, 43 (42,2%) tuvieron frecuentes episodios de estornudos y 38 (37,3%) tuvieron dolor de garganta grave (Tabla 1). El cribado de los EBC para 14 virus respiratorios (Tabla 2), mostró 5 muestras positivas de RV (7,1%) (Tabla 3). En una segunda parte, se recolectaron 32 EBC de pacientes que se presentaron a su médico general; dos de estos EBC fueron positivos para uno de los 14 virus respiratorios investigados, 1 para RV y 1 para InfB. Para inspeccionar la tasa de detección de virus respiratorios en el condensado, se tomó un NS de este segundo grupo de voluntarios para la comparación. En 15 de los 32 NS (46,8%), uno o más patógenos virales fueron aislados. El cribado viral del NS resultó en la detección de RV, InfA (subtipo H1N1) y HRSV-B. La cuantificación de la carga viral HRSV-B demostrada para las muestras 72 y 101 títulos virales de 8,0 × 10 4 copias de ARN/ml y 6,8 × 10 7 copias de ARN/ml respectivamente. El ensayo RV RT-PCR no permitió la cuantificación de todas las muestras que dieron positivo para RV por PCR (Tabla 3). La presencia del mismo patógeno tanto en el EBC como en el NS fue confirmada para una sola muestra: muestra 71, que dio positivo para RV tanto en el EBC como en el NS. Para la muestra 81, se detectó RV en el NS y el análisis del EBC demostró una infección por InfB. Para las muestras de EBC que fueron recogidas en otoño e invierno de 2009/2010, las mediciones con el EcoVent en (Tabla 3, muestra 81) fueron positivas para InfB cuando se utilizó el RTube En teoría, la tasa de generación viral (número de copias de ARN viral exhaladas por minuto) se puede predecir mediante la cuantificación de la carga viral exhalada. Luego, se puede calcular una estimación de las copias de ARN por litro de aire exhalado o por minuto. La cuantificación del InfB exhalado nos permitiría predecir la tasa de generación de este virus. Debido a un volumen de muestra insuficiente, no pudimos determinar el número de copias de ARN en la muestra. La recolección de condensados de aliento exhalados es un método novedoso y no invasivo para obtener muestras del tracto respiratorio superior. La recolección de EBC es fácil de realizar y se puede llevar a cabo en un ambiente doméstico. Este método es mucho más agradable para el paciente cuando se compara con la recolección desagradable e invasiva de hisopos nasales, BAL, aspirados, etc. Este aspecto hace que el método sea muy atractivo para diagnósticos de laboratorio rutina La mayoría de los estudios que realizan análisis de aliento para la detección viral utilizan máscaras faciales modificadas, con una región central extraíble en electret o un filtro de teflón extraíble en el que las partículas exhaladas impactan [12] [13] [14]. Con el dispositivo de recolección de RTubeTM, las partículas aerosolizadas del líquido de revestimiento de las vías respiratorias se precipitan en un condensado cuando se enfría la respiración, lo que sirve como punto de partida inmediato para las pruebas moleculares. Hasta ahora, este es el estudio con el subconjunto más grande de voluntarios que investigó la EBC como muestra para la detección de virus respiratorios. Estudios anteriores reportaron la inclusión de un subconjunto limitado de participantes e investigaron la presencia de un número limitado de virus en las muestras de aliento. El estudio realizado por Fabian y colegas, incluyó 12 voluntarios [12]. Huynh y compañeros de trabajo reclutaron a 9 voluntarios En el estudio de Stelzer-Braid et al., se analizaron 50 EBCs [14] y St-George et al. reportaron la participación de 12 adultos [15]. Estos estudios se han centrado en la detección de InfA y -B, PIV1-3, HRSV y HMPV, mientras que hemos examinado las muestras para un panel de 14 virus respiratorios que circulan comúnmente. Basados en el análisis de 99 EBCs (3 EBCs fueron excluidos), nuestros resultados apoyan la exhalación de RV e InfB en el 7% de nuestras muestras. Dado que muchos de los voluntarios ya habían estado experimentando síntomas durante 1 a 7 días, inicialmente presumimos que ya se estaban recuperando de la infección y ya no estaban exhalando el virus. Sin embargo, en una segunda parte de nuestro estudio comenzamos a recolectar los CNE en paralelo con hisopos nasales de pacientes que se presentaban a su médico, 1 a 3 días después de la aparición de los síntomas; sólo se detectó 1 condensado del mismo patógeno tanto en el CNE como en el NS; la tasa de detección de patógenos virales respiratorios en el NS fue de 46,8%, muy superior a la tasa de detección del 7% en los CNE; por lo tanto, la baja detección de condensados positivos del virus no se puede atribuir al hecho de que los voluntarios ya no eran infecciosos; la tasa de detección discrepante entre muestras también puede explicarse por la diferente gravedad de la infección respiratoria, ya que las muestras de comparador eran de diferentes partes del tracto respiratorio; los pacientes que presentaron un NS positivo podrían haber sufrido una infección de vía aérea superior, mientras que los voluntarios positivos del CNE pueden haber Sin embargo, no se investigó el efecto de la inhalación nasal en la recolección de CNE, guiando partículas formadas en el tracto respiratorio superior a los compartimentos inferiores, en lugar de la inhalación oral, los pacientes con muestras positivas de CNE experimentaron síntomas durante un máximo de dos días en el momento de la recolección, sin embargo, esto no fue diferente en 7 pacientes con SNE positivo. Seis pacientes que proporcionaron SNE positivo experimentaron síntomas durante un período más largo en el momento de la recolección (Tabla 3 ). En el grupo de voluntarios que proporcionaron una muestra de CNE negativo o CNE y SNE negativo, la manifestación de síntomas fue reportada de 1 día a más de dos semanas. Cuando se compararon los síntomas reportados entre los pacientes positivos de CNE (7) y los pacientes positivos de SNE (15), el 27% y el 33% en el grupo positivo de SNE experimentaron escalofríos y dolor muscular En todos los grupos se reportaron fiebre, cefalea, ojos llorosos, nariz rellena, estornudos frecuentes, dolor de garganta y tos; no se diagnosticó a los voluntarios con otros patógenos antes de la participación en el estudio; ya que no probamos estas muestras para otros que no sean patógenos virales, no podemos excluir la posibilidad de que algunos de los NS negativos sean positivos para bacterias u otros patógenos causantes de enfermedades respiratorias; recientemente, un estudio reportó una tasa de detección del 5% para la gripe en el EBC [15] ; esto se encuentra en el mismo rango de la tasa de detección que reportamos para virus respiratorios en general; otros estudios con un número limitado de pacientes, describen una sensibilidad marcadamente mayor del 33 al 36% [12] [13] [14] pero el mayor porcentaje puede deberse al bajo número de sujetos participantes [12]. Las máscaras faciales consisten en electret que atrapan virus a base de fibras permanentemente cargadas [13]. Además, el filtro de Teflon tiene 2 μm poros que retienen todas las partículas más grandes. Posiblemente, la menor tasa de detección puede explicarse en parte por el hecho de que el RTubeTM está fabricado en polipropileno y no posee una característica de atracción y filtrado de virus como los materiales mencionados. El qRT-PCR desarrollado por Lu y colaboradores para la detección de RV, no permitió la evaluación de la carga viral presente en las muestras de EBC [10]. También para 4 NS, el título viral permaneció indeterminado, probablemente debido a la sensibilidad limitada del ensayo. Para el diagnóstico, podrían ser necesarios métodos más sensibles para detectar virus respiratorios presentes en EBC, ya que es impredecible cómo se diluyen las partículas virales en el espécimen. Recientemente, se han desarrollado ensayos de qRT-PCR anidados para permitir una detección más sensible de virus en aerosoles [16]. También se ha sugerido que los factores dependientes de la persona, como el número de partículas producidas, el volumen exhalado y la edad del paciente, desempeñan un papel importante para la exhalación de partículas virales. Los participantes que fueron reclutados en el estudio de Fabian y compañeros de trabajo tenían 12 años de edad y más [12]. Para los niños hospitalizados se reporta una tasa mucho más alta de muestras positivas del virus [14]. En nuestro estudio, la mayoría de los voluntarios tenían entre 20 y 30 años de edad. Sólo se incluyeron dos niños menores de 10 años y 3 ancianos (> 70 años de edad). Uno de los niños dio positivo para InfA en el NS, pero la infección no fue confirmada en el EBC. Para la gripe, se previó una tasa de generación exhalada de <3,2 a 20 copias de ARN de gripe por minuto, cuantificando los aerosoles del virus que impactaron en un filtro extraíble de Teflon de una máscara de recolección [12]. Utilizamos el RTubeTM en combinación con el ECoVent, que permitió el registro de parámetros de ventilación adicionales como frecuencia respiratoria y volumen exhalado. De esta manera, cuando se cuantifica el número de copias de ARN en el EBC, se puede estimar la cantidad de partículas virales que se exhalan por litro o por minuto. Lamentablemente, no pudimos predecir una tasa de generación de virus para InfB ya que la carga viral permaneció indeterminada. Aunque un método innovador, nuevo y prometedor, el EBC recogido por el RTubeTM no parece apropiado para el diagnóstico de infecciones respiratorias. Esta técnica también confirma la observación de que los virus son capaces de diseminarse a través de la respiración normal, particularmente RV. Además, se puede investigar más a fondo la recolección de glóbulos rojos de los pacientes durante las infecciones respiratorias para determinar los patrones de biomarcadores. En terneros infectados experimentalmente con VRS bovina, se observó un aumento en el leucotrieno B 4, lo que indica estrés oxidativo; este aumento también se asoció con el desarrollo de hiperrespuesta bronquial [17]. En humanos, se observó un nivel de H 2 O 2 transitoriamente elevado durante la infección por resfriado común; este marcador volvió a los valores basales cuando los voluntarios se recuperaron de la infección; H 2 O 2 también ha sido reconocido como un marcador interesante en asma, donde se asocia con inflamación crónica de las vías respiratorias inferiores [18]. En voluntarios infectados por InfA, se observó un aumento del CO durante la infección respiratoria Esta observación podría implicar que el CO es un indicador de inflamación de la vía aérea o representa uno de los mecanismos de defensa del huésped contra la infección viral [19]. Por lo tanto, una mejor identificación de la firma del biomarcador en condensados de individuos que experimentan una infección viral podría implicar hallazgos interesantes hacia la identificación de marcadores que reflejan la inflamación o protección antiviral, lo que puede contribuir a los perfiles de biomarcadores establecidos para enfermedades como asma y EPOC, para las cuales se sugiere que las infecciones virales desencadenan o exacerban síntomas [20].

¿Cuántos pacientes fui en este estudio?

El muestreo de condensados respiratorios exhalados no es un nuevo método para la detección de virus respiratorioshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3059288/SHA: f3b46e7e8f58799207cc44515f859c1daf5e4dfcAutores: Houspie, Lieselot; De Coster, Sarah; Keyaerts, Els; Narongsack, Phouthalack; De Roy, Rikka; Talboom, Ive; Sisk, Maura; Maes, Piet; Verbeeck, Jannick; Van Ranst, MarcFecha: 2011-03-04DOI: 10.1186/1743-422x-8-98Licencia: cc-byAbstract: ANTEGRADO: El muestreo MÉTODOS: En nuestro estudio se reclutaron 102 voluntarios con infección de la vía aérea superior durante el invierno y principios de la primavera de 2008/2009 y la primera mitad del invierno de 2009/2010. Se obtuvieron con éxito 99 EBCs y se examinaron 14 virus respiratorios de circulación frecuente. Para investigar la eficiencia del aislamiento del virus del EBC, se tomó un hisopo nasal en paralelo de un subconjunto de voluntarios. El uso combinado del dispositivo ECoVent con el RTubeTM permitió registrar el volumen exhalado y la frecuencia respiratoria durante la recolección. De esta manera, se puede estimar teóricamente el número de partículas virales exhaladas por litro de aire o por minuto. RESULTADOS: El cribado viral resultó en la detección de 4 virus diferentes en EBC y/o hisopos nasales: Rhinovirus, Virus Sincitial Respiratorio Humano B, Influenza A e Influenza B. Rhinovirus fue detectado en 6 EBCs y 1 EBC fue Influenza B positivo. Se reporta una tasa de detección viral del 7% para los EBCs, que es mucho menor que la tasa de detección del 46,8% observada con hisopos nasales. CONCLUSIÓN: Aunque muy prometedora, la recolección de EBC utilizando el RPubeTM no es confiable para el diagnóstico de infecciones respiratorias. Texto: Las infecciones del tracto respiratorio humano representan las infecciones más frecuentemente encontradas en todo el mundo. En la mayoría de los casos, la etiología de estas infecciones sigue siendo indeterminada debido a la rápida convalecencia después de la infección. Las infecciones del tracto respiratorio en adultos sanos pueden ser causadas por una variedad de patógenos y la detección de estos agentes se basa actualmente en su aislamiento de hisopos nasales (NS), lavados broncoalveolares (BAL), aspirados nasofaríngeos y muestras de esputo. La adquisición de estos especímenes mediante técnicas semi-invasoras e invasivas es a menudo desagradable para el paciente. Por lo tanto, el análisis de condensado de aliento exhalado (EBC) se ha explorado recientemente como un método nuevo y no invasivo para monitorear la inflamación pulmonar y la enfermedad pulmonar como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), asma, fibrosis quística, cáncer de pulmón, etc. Los CEM consisten principalmente en vapor de agua, pero una pequeña fracción contiene gotitas respiratorias derivadas del líquido de revestimiento de las vías respiratorias [1, 2]. Esta observación ha generado un creciente interés en el uso de EBC como nuevo método de muestreo para el cribado de virus respiratorios que infectan las vías aéreas superiores. Al principio, los investigadores sospecharon que la turbulencia del aire inhalado era responsable de la aerosolización del líquido respiratorio. Sin embargo, el efecto del flujo turbulento de aire se limita a las vías aéreas superiores, ya que el flujo turbulento de aire se vuelve laminar a medida que llega a las vías aéreas bronquiales más pequeñas y los alvéolos. Recientemente, se ha descrito el modelo de explosión de la película de líquido bronquiol [3]. Este modelo sugiere que los aerosoles se producen durante la inhalación por el estallido de burbujas de líquido presentes en los bronquiolos. El objetivo de este estudio fue investigar si el método de recolección de EBC fue adecuado para la condensación eficiente de partículas de virus aerosolizados durante la respiración normal En este estudio, se recogieron 102 EBC de voluntarios sanos que mostraban síntomas respiratorios o gripales (definidos en la Tabla 1), utilizando un condensador disponible comercialmente (RTubeTM, Respiratory Research Inc., Charlottesville, Virginia, EE.UU.). Se instruyó al paciente a respirar por vía oral a volúmenes de mareas en una boquilla conectada a un condensador durante 10 minutos. No se utilizaron clips nasales durante la recolección y se evitó la contaminación salival por la presencia de una válvula de un solo sentido y la sección en forma de T de la boquilla. En una primera parte del estudio que se inició durante el invierno y la primavera de 2008/2009, se recogieron 70 muestras de EBC de pacientes que voluntariamente se presentaron a nuestro laboratorio. La mayoría de estos voluntarios fueron estudiantes que respondieron al folleto informativo, distribuido en los edificios universitarios de la Universidad Católica de Leuven. En el otoño y la primera mitad del invierno de 2009/2010, se recogieron 32 condensados de pacientes que se presentaron a su médico general. Debido a circunstancias prácticas, los condensados se recolectaron con el refrigerador refrigerado a -20°C. Para 13 de las 32 colecciones, el RUBETM fue conectado por un conector hecho a medida al ECoVent (Jaeger, Alemania). Este dispositivo registra parámetros ventilatorios como el volumen exhalado, la frecuencia respiratoria y el volumen de mareas. Además, se obtuvo un NS en paralelo con la colección de condensados de cada paciente. Todos los EBC se almacenaron inmediatamente a -20°C. Se refrigeraron los hisopos nasales (NS). Después de la extracción de ADN y ARN virales, se almacenaron muestras de EBC y toallitas nasales a -80°C. Se excluyeron del estudio tres especímenes por recolección incorrecta de condensados, se utilizó un breve cuestionario para documentar la fecha de nacimiento, la gravedad de las dolencias respiratorias y para registrar los días de enfermedad sintomática de todos los voluntarios, el cual fue aprobado por el Comité de Ética Médica del Hospital Universitario de Lovaina y se recibieron consentimientos informados de todos los participantes, se aislaron ADN y ARN virales con el kit de virus QIAamp MinElute (Qiagen, Westburg, Países Bajos) de acuerdo con el manual de instrucciones, se eludieron extractos de EBC en tampón de elución de 60 μl y extractos de NS en tampón de 110 μl. Los condensados respiratorios fueron analizados para detectar 11 virus del ARN respiratorio (CoV NL63, E229 y OC43, RV, HMPV, InfA&B y PIV1-4) [4] [5] [6] [7] utilizando un kit de RCR-RT de OneStep (Qiagen, Westburg, Países Bajos) en una reacción de 50 μl que contenía 10 μl de ARN extraído, 0,6 μM de imprimaciones hacia adelante e inversas (Tabla 2), 1,5 μl de Enzima de One Step, 10 μl 5 × Un tampón de RT-PCR de One Step y 400 μM de cada dNTP. Para el cribado de adenovirus, se realizó un PCR de ADN para el cual la mezcla de reacción de amplificación contenía 0,5 μM de imprimación delantera (AdFW) e imprimación inversa (AdRV), 0,4 mM dNTPs, 10 μl Buffer C y 1 U Taq polimerasa en un volumen final de 50 μl. Los imprimadores PCR utilizados se localizaron en regiones conservadas de los genomas de los patógenos respiratorios (Tabla 2 ). Las reacciones se realizaron en un Termociclista T3000 48 (Westburg, Leusden, Países Bajos) con un paso inicial de transcripción inversa para virus ARN a 50 °C durante 30 min, seguido de activación PCR a 95 °C durante 30 s, 45 ciclos de amplificación seguidos de un paso final de extensión durante 10 min a 72 °C. El programa de amplificación del ADN se inició con un paso de desnaturalización a 94 °C durante 3 minutos, seguido de 45 ciclos de 94 °C durante 30 s, 55 °C durante 30 s y un paso de extensión final a 72 °C durante 1 min. Los amplicones fueron sometidos a un gel de poliacrilamida del 6% y visualizados bajo luz UV por tinción con bromuro de etidium. Los productos PCR fueron purificados utilizando el Kit Invitado MSB Spin PCRapace y el ciclo secuenciado en dirección delantera e inversa utilizando el kit de secuenciación de ciclos de terminación de Big-Dye ABI PRISM (Aplicado Biosystems, Foster City, CA, USA). El análisis de secuencias se realizó con el Analizador Genético ABI3130 (Aplicado Biosystems, Foster City, CA, EE.UU En resumen, se preparó una mezcla múltiplex en un volumen final de 25 μl utilizando ARN extraído de 5 μl, 12,5 μl de Eurogentec One-Step Reverse Transcriptase qPCR Master Mix que contiene ROX como referencia pasiva, 0,125 μl Euroscript + RT & Rnasa inhibidor (Eurogentec, Seraing, Bélgica) 200 nM de HRSV-A y -B imprimadores delanteros e inversos específicos y 100 nM de HRSV-A y -B MGB. Los estándares de ARNc se construyeron utilizando el kit T7 de shortscript MEGA (Ambión, Austin, TX, EE.UU.) y cuantificado espectrométricamente. La carga viral de muestras positivas de RV fue cuantificada por qRT-PCR como se describe en el manuscrito publicado por Lu y compañeros [10]. El kit Eurogentec One-Step Reverse Transcriptase qPCR fue utilizado para la preparación de la mezcla maestra como se describe anteriormente. El primer HRSV-AF F 669-695 ctgtgatagarttcaacaaaagaaca [8, 9] HRSV-AF F 718-745 agttacaccttcattaactaaatcc [8, 9] HRSV-BN N 435-458 ggctccagaatatagggattc [8, 9] HRSV-BN N 480-508 tggttattacaagaagagcactacagagt [8, 9] MGB sondas y sondas, situadas en 5'UTR, se añadieron a una concentración final de 1 μM y 0,1 μM, respectivamente. Los estándares de ARNc se construyeron sobre la base del producto PCR de la muestra 1 utilizando el kit MegaScript (Ambion, Austin, TX, EE.UU.). La cuantificación se realizó con un espectrofotómetro a 260 nm y se convirtió al número de molécula [11]. Se realizaron diluciones en serie de diez veces, lo que permitió la detección en un rango de 8,6 × 10 6 a 8,6 × 10 2 copias de ARN. Los ensayos RT-PCR se realizaron en un Sistema de Detección de Secuencias ABI PRISM 7500 (Aplicado Biosistemas, Foster City, CA, EE.UU.). Se realizó un paso inicial de transcripción inversa a 48°C durante 30 minutos, seguido de un paso de desnaturalización a 95°C durante 10 minutos. Finalmente, se completó un paso de amplificación de 45 cicli a 95°C durante 15 segundos y 1 min a 60°C. (37,5%) hombres, con mediana de edad de 29 años (rango 9 -46 años). Faltaron edad y género para 2 participantes del segundo Sólo el 6% eran menores de 20 años y el 3% tenían más de 70 años; en total, 80 pacientes (78,4%) ya se encontraban enfermos durante 1 a 7 días en el día de la obtención de la muestra; siete voluntarios (6,8%) eran sintomáticos durante 8 a 14 días y 9 participantes (8,8%) ya estaban enfermos durante más de 14 días en el día de la recogida de la muestra; faltaban datos sobre la duración de los síntomas en 6 pacientes; casi todos los voluntarios experimentaron al menos 2 síntomas, excepto en dos pacientes (Tabla 1); cuarenta y siete (46,1%) voluntarios se quejaron de una constante secreción nasal o congestión nasal, 43 (42,2%) tuvieron frecuentes episodios de estornudos y 38 (37,3%) tuvieron dolor de garganta grave (Tabla 1). El cribado de los EBC para 14 virus respiratorios (Tabla 2), mostró 5 muestras positivas de RV (7,1%) (Tabla 3). En una segunda parte, se recolectaron 32 EBC de pacientes que se presentaron a su médico general; dos de estos EBC fueron positivos para uno de los 14 virus respiratorios investigados, 1 para RV y 1 para InfB. Para inspeccionar la tasa de detección de virus respiratorios en el condensado, se tomó un NS de este segundo grupo de voluntarios para la comparación. En 15 de los 32 NS (46,8%), uno o más patógenos virales fueron aislados. El cribado viral del NS resultó en la detección de RV, InfA (subtipo H1N1) y HRSV-B. La cuantificación de la carga viral HRSV-B demostrada para las muestras 72 y 101 títulos virales de 8,0 × 10 4 copias de ARN/ml y 6,8 × 10 7 copias de ARN/ml respectivamente. El ensayo RV RT-PCR no permitió la cuantificación de todas las muestras que dieron positivo para RV por PCR (Tabla 3). La presencia del mismo patógeno tanto en el EBC como en el NS fue confirmada para una sola muestra: muestra 71, que dio positivo para RV tanto en el EBC como en el NS. Para la muestra 81, se detectó RV en el NS y el análisis del EBC demostró una infección por InfB. Para las muestras de EBC que fueron recogidas en otoño e invierno de 2009/2010, las mediciones con el EcoVent en (Tabla 3, muestra 81) fueron positivas para InfB cuando se utilizó el RTube En teoría, la tasa de generación viral (número de copias de ARN viral exhaladas por minuto) se puede predecir mediante la cuantificación de la carga viral exhalada. Luego, se puede calcular una estimación de las copias de ARN por litro de aire exhalado o por minuto. La cuantificación del InfB exhalado nos permitiría predecir la tasa de generación de este virus. Debido a un volumen de muestra insuficiente, no pudimos determinar el número de copias de ARN en la muestra. La recolección de condensados de aliento exhalados es un método novedoso y no invasivo para obtener muestras del tracto respiratorio superior. La recolección de EBC es fácil de realizar y se puede llevar a cabo en un ambiente doméstico. Este método es mucho más agradable para el paciente cuando se compara con la recolección desagradable e invasiva de hisopos nasales, BAL, aspirados, etc. Este aspecto hace que el método sea muy atractivo para diagnósticos de laboratorio rutina La mayoría de los estudios que realizan análisis de aliento para la detección viral utilizan máscaras faciales modificadas, con una región central extraíble en electret o un filtro de teflón extraíble en el que las partículas exhaladas impactan [12] [13] [14]. Con el dispositivo de recolección de RTubeTM, las partículas aerosolizadas del líquido de revestimiento de las vías respiratorias se precipitan en un condensado cuando se enfría la respiración, lo que sirve como punto de partida inmediato para las pruebas moleculares. Hasta ahora, este es el estudio con el subconjunto más grande de voluntarios que investigó la EBC como muestra para la detección de virus respiratorios. Estudios anteriores reportaron la inclusión de un subconjunto limitado de participantes e investigaron la presencia de un número limitado de virus en las muestras de aliento. El estudio realizado por Fabian y colegas, incluyó 12 voluntarios [12]. Huynh y compañeros de trabajo reclutaron a 9 voluntarios En el estudio de Stelzer-Braid et al., se analizaron 50 EBCs [14] y St-George et al. reportaron la participación de 12 adultos [15]. Estos estudios se han centrado en la detección de InfA y -B, PIV1-3, HRSV y HMPV, mientras que hemos examinado las muestras para un panel de 14 virus respiratorios que circulan comúnmente. Basados en el análisis de 99 EBCs (3 EBCs fueron excluidos), nuestros resultados apoyan la exhalación de RV e InfB en el 7% de nuestras muestras. Dado que muchos de los voluntarios ya habían estado experimentando síntomas durante 1 a 7 días, inicialmente presumimos que ya se estaban recuperando de la infección y ya no estaban exhalando el virus. Sin embargo, en una segunda parte de nuestro estudio comenzamos a recolectar los CNE en paralelo con hisopos nasales de pacientes que se presentaban a su médico, 1 a 3 días después de la aparición de los síntomas; sólo se detectó 1 condensado del mismo patógeno tanto en el CNE como en el NS; la tasa de detección de patógenos virales respiratorios en el NS fue de 46,8%, muy superior a la tasa de detección del 7% en los CNE; por lo tanto, la baja detección de condensados positivos del virus no se puede atribuir al hecho de que los voluntarios ya no eran infecciosos; la tasa de detección discrepante entre muestras también puede explicarse por la diferente gravedad de la infección respiratoria, ya que las muestras de comparador eran de diferentes partes del tracto respiratorio; los pacientes que presentaron un NS positivo podrían haber sufrido una infección de vía aérea superior, mientras que los voluntarios positivos del CNE pueden haber Sin embargo, no se investigó el efecto de la inhalación nasal en la recolección de CNE, guiando partículas formadas en el tracto respiratorio superior a los compartimentos inferiores, en lugar de la inhalación oral, los pacientes con muestras positivas de CNE experimentaron síntomas durante un máximo de dos días en el momento de la recolección, sin embargo, esto no fue diferente en 7 pacientes con SNE positivo. Seis pacientes que proporcionaron SNE positivo experimentaron síntomas durante un período más largo en el momento de la recolección (Tabla 3 ). En el grupo de voluntarios que proporcionaron una muestra de CNE negativo o CNE y SNE negativo, la manifestación de síntomas fue reportada de 1 día a más de dos semanas. Cuando se compararon los síntomas reportados entre los pacientes positivos de CNE (7) y los pacientes positivos de SNE (15), el 27% y el 33% en el grupo positivo de SNE experimentaron escalofríos y dolor muscular En todos los grupos se reportaron fiebre, cefalea, ojos llorosos, nariz rellena, estornudos frecuentes, dolor de garganta y tos; no se diagnosticó a los voluntarios con otros patógenos antes de la participación en el estudio; ya que no probamos estas muestras para otros que no sean patógenos virales, no podemos excluir la posibilidad de que algunos de los NS negativos sean positivos para bacterias u otros patógenos causantes de enfermedades respiratorias; recientemente, un estudio reportó una tasa de detección del 5% para la gripe en el EBC [15] ; esto se encuentra en el mismo rango de la tasa de detección que reportamos para virus respiratorios en general; otros estudios con un número limitado de pacientes, describen una sensibilidad marcadamente mayor del 33 al 36% [12] [13] [14] pero el mayor porcentaje puede deberse al bajo número de sujetos participantes [12]. Las máscaras faciales consisten en electret que atrapan virus a base de fibras permanentemente cargadas [13]. Además, el filtro de Teflon tiene 2 μm poros que retienen todas las partículas más grandes. Posiblemente, la menor tasa de detección puede explicarse en parte por el hecho de que el RTubeTM está fabricado en polipropileno y no posee una característica de atracción y filtrado de virus como los materiales mencionados. El qRT-PCR desarrollado por Lu y colaboradores para la detección de RV, no permitió la evaluación de la carga viral presente en las muestras de EBC [10]. También para 4 NS, el título viral permaneció indeterminado, probablemente debido a la sensibilidad limitada del ensayo. Para el diagnóstico, podrían ser necesarios métodos más sensibles para detectar virus respiratorios presentes en EBC, ya que es impredecible cómo se diluyen las partículas virales en el espécimen. Recientemente, se han desarrollado ensayos de qRT-PCR anidados para permitir una detección más sensible de virus en aerosoles [16]. También se ha sugerido que los factores dependientes de la persona, como el número de partículas producidas, el volumen exhalado y la edad del paciente, desempeñan un papel importante para la exhalación de partículas virales. Los participantes que fueron reclutados en el estudio de Fabian y compañeros de trabajo tenían 12 años de edad y más [12]. Para los niños hospitalizados se reporta una tasa mucho más alta de muestras positivas del virus [14]. En nuestro estudio, la mayoría de los voluntarios tenían entre 20 y 30 años de edad. Sólo se incluyeron dos niños menores de 10 años y 3 ancianos (> 70 años de edad). Uno de los niños dio positivo para InfA en el NS, pero la infección no fue confirmada en el EBC. Para la gripe, se previó una tasa de generación exhalada de <3,2 a 20 copias de ARN de gripe por minuto, cuantificando los aerosoles del virus que impactaron en un filtro extraíble de Teflon de una máscara de recolección [12]. Utilizamos el RTubeTM en combinación con el ECoVent, que permitió el registro de parámetros de ventilación adicionales como frecuencia respiratoria y volumen exhalado. De esta manera, cuando se cuantifica el número de copias de ARN en el EBC, se puede estimar la cantidad de partículas virales que se exhalan por litro o por minuto. Lamentablemente, no pudimos predecir una tasa de generación de virus para InfB ya que la carga viral permaneció indeterminada. Aunque un método innovador, nuevo y prometedor, el EBC recogido por el RTubeTM no parece apropiado para el diagnóstico de infecciones respiratorias. Esta técnica también confirma la observación de que los virus son capaces de diseminarse a través de la respiración normal, particularmente RV. Además, se puede investigar más a fondo la recolección de glóbulos rojos de los pacientes durante las infecciones respiratorias para determinar los patrones de biomarcadores. En terneros infectados experimentalmente con VRS bovina, se observó un aumento en el leucotrieno B 4, lo que indica estrés oxidativo; este aumento también se asoció con el desarrollo de hiperrespuesta bronquial [17]. En humanos, se observó un nivel de H 2 O 2 transitoriamente elevado durante la infección por resfriado común; este marcador volvió a los valores basales cuando los voluntarios se recuperaron de la infección; H 2 O 2 también ha sido reconocido como un marcador interesante en asma, donde se asocia con inflamación crónica de las vías respiratorias inferiores [18]. En voluntarios infectados por InfA, se observó un aumento del CO durante la infección respiratoria Esta observación podría implicar que el CO es un indicador de inflamación de la vía aérea o representa uno de los mecanismos de defensa del huésped contra la infección viral [19]. Por lo tanto, una mejor identificación de la firma del biomarcador en condensados de individuos que experimentan una infección viral podría implicar hallazgos interesantes hacia la identificación de marcadores que reflejan la inflamación o protección antiviral, lo que puede contribuir a los perfiles de biomarcadores establecidos para enfermedades como asma y EPOC, para las cuales se sugiere que las infecciones virales desencadenan o exacerban síntomas [20].

¿Cuánto tiempo inhaló el paciente en el RTube?

Neumonía adquirida por la comunidad en niños: un espectro cambiante de enfermedadeshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5608782/SHA: eecb946b106a94f26a79a964f0160e8e16f79f42Autores: le Roux, David M.; Zar, Heather J. Fecha: 2017-09-21DOI: 10.1007/s00247-017-3827-8Licencia: cc-byAbstract: La neumonía sigue siendo la principal causa de muerte en niños fuera del período neonatal, a pesar de los avances en la prevención y el manejo. Las nuevas vacunas conjugadas contra Haemophilus influenzae tipo b y Streptococcus pneumoniae han contribuido a la disminución de los casos de neumonía radiológica, clínica y complicada y han reducido la hospitalización y la mortalidad; la importancia de las coinfecciones con múltiples patógenos y el predominio de enfermedades virales están surgiendo; se necesita un mejor acceso a estrategias preventivas y de manejo eficaces en los países de ingresos bajos y medios, mientras que se necesitan nuevas estrategias para abordar la carga residual de la enfermedad una vez que se han implementado. Texto: La neumonía ha sido la principal causa de muerte en niños menores de 5 años durante décadas; aunque ha habido una disminución sustancial de la mortalidad global infantil y de la mortalidad específica por neumonía, la neumonía sigue siendo la principal causa de muerte en niños fuera del período neonatal, causando aproximadamente 900.000 de los 6,3 millones de muertes infantiles estimadas en 2013 [1]. Se han producido avances sustanciales en la comprensión de los factores de riesgo y etiología de la neumonía, en el desarrollo de definiciones de casos estandarizadas y en la prevención con la producción de mejores vacunas y en el tratamiento, lo que ha dado lugar a cambios en la epidemiología, la etiología y la mortalidad por neumonía infantil; sin embargo, en muchas áreas el acceso a estas intervenciones sigue siendo subóptimo, con grandes desigualdades entre países y regiones. En este trabajo se analiza el impacto de los recientes avances preventivos y de manejo en la epidemiología, etiología, presentación radiológica y resultados en niños. La carga global de neumonía infantil se ha reducido sustancialmente en la última década, a pesar de un aumento de la población infantil mundial de 605 millones en 2000 a 664 millones en 2015 [2]. Datos recientes sugieren que ha habido una disminución del 25% en la incidencia de neumonía, de 0,29 episodios por año infantil en países de Esto está corroborado por una disminución del 58% en los años de vida ajustados a la discapacidad asociada a neumonía entre 1990 y 2013, de 186 millones a 78 millones, según se estima en el estudio Global Burden of Disease [1]. Las muertes por neumonía disminuyeron de 1,8 millones en 2000 a 900.000 en 2013 [1]. Estos datos no reflejan el pleno impacto del uso cada vez más generalizado de la vacuna conjugada antineumocócica en países de ingresos bajos y medianos, ya que es probable que la incidencia de neumonía y el número de muertes disminuyan aún más como resultado de esta intervención generalizada [4]. A pesar de este progreso, sigue habiendo una carga desproporcionada de enfermedad en países de ingresos bajos y medianos, donde se producen más del 90% de los casos de neumonía y muertes. La incidencia en países de ingresos altos se estima en 0,015 episodios por año infantil, en comparación con 0,22 episodios por año infantil en países de ingresos bajos En promedio, 1 de cada 66 niños de países de ingresos altos se ve afectado por neumonía al año, en comparación con 1 de cada 5 niños de países de ingresos bajos y medianos. Incluso en los países de ingresos bajos y medianos existen desigualdades y desafíos regionales con acceso a los servicios de atención de la salud: hasta el 81% de las muertes por neumonía grave ocurren fuera de un hospital [5]. Además de una mayor incidencia de neumonía, se estima que la tasa de mortalidad de los casos es casi 10 veces mayor en los países de ingresos bajos y medianos en comparación con los países de ingresos altos [3, 5]. La neumonía infantil también puede conducir a una morbilidad significativa y a enfermedades crónicas. La neumonía de la vida temprana puede perjudicar la salud pulmonar a largo plazo disminuyendo la función pulmonar [6]. La neumonía grave o recurrente puede tener un efecto peor en la función pulmonar; cada vez más evidencia sugiere que la enfermedad pulmonar obstructiva crónica podría estar relacionada con la neumonía infantil [7, Un metaanálisis del riesgo de resultados a largo plazo después de la neumonía infantil categorizó las secuelas respiratorias crónicas en grupos mayores (enfermedad pulmonar restrictiva, enfermedad pulmonar obstructiva, bronquiectasia) y menores (bronquitis crónica, asma, función pulmonar anormal) [9]. El riesgo de desarrollar al menos una de las secuelas principales se estimó en un 6% después de un evento de neumonía ambulatoria y en un 14% después de un episodio de neumonía hospitalizada. Debido a que las enfermedades respiratorias afectan a casi 1.000 millones de personas en todo el mundo y son una causa importante de mortalidad y morbilidad [10], la neumonía infantil podría contribuir a una morbilidad sustancial a lo largo de la vida. Los cambios radiológicos de tórax se han considerado el estándar de oro para definir un evento de neumonía [11] porque los hallazgos clínicos pueden ser subjetivos y las definiciones clínicas de neumonía pueden ser inespecíficas. En 2005, para ayudar a definir los resultados de los estudios de la vacuna antineumocócica, la descripción de la radiografía torácica estandarizada de la Organización Mundial de la Salud (OMS) definió un grupo de niños que se consideraban más propensos a tener neumonía neumocócica [12]. El término "consolidación de punto final" se describió como una opacidad densa o esponjosa que ocupa una porción o todo un lóbulo o todo el pulmón. "Otros infiltrados" incluyeron densidades lineales y irregulares, engrosamiento peribronquial, infiltrados menores parcheados que no son de magnitud suficiente para constituir una consolidación de punto final primaria, y pequeñas áreas de atelectasia que en los niños pueden ser difíciles de distinguir de la consolidación. "Neumonía de punto final primario" incluyó consolidación de punto final o un derrame pleural asociado con un El uso generalizado de la vacunación conjugada neumocócica y la vacunación conjugada Haemophilus influenzae tipo B ha disminuido la incidencia de neumonía radiológica. En una revisión de cuatro ensayos controlados aleatorizados y dos estudios de casos y controles de la vacunación conjugada Haemophilus influenzae tipo B en comunidades de alta carga, la vacunación se asoció con una disminución del 18% de la neumonía radiológica [13]. La introducción de la vacunación conjugada neumocócica se asoció con una disminución del 26% de la neumonía radiológica en California entre 1995 y 1998 [14]. En los ensayos de eficacia vacunal en países de ingresos bajos y medianos, la vacunación conjugada neumocócica redujo la neumonía radiológica en un 37% en Gambia [15], un 25% en Sudáfrica [16] y un 26% en Filipinas [17]. La definición de caso radiológico de la OMS no tenía por objeto distinguir la etiología bacteriana de la viral, sino definir un subconjunto de casos de neumonía en los que la infección neumocócica se consideraba más probable y proporcionar un conjunto de definiciones estandarizadas a través de las cuales los investigadores podrían lograr un amplio acuerdo en la notificación de radiografías torácicas. Sin embargo, a pesar de la amplia utilización en el campo, existe preocupación por la repetibilidad de los observadores. Ha habido un buen consenso en la descripción de la consolidación lobar pero un desacuerdo significativo en la descripción de infiltrados parcheados y perihilares [18, 19]. Además, muchos niños con enfermedad pulmonar clínicamente grave no tienen neumonía primaria de punto final: en un estudio previo a la vacunación conjugada con neumocócica, sólo el 34% de los niños hospitalizados con neumonía tenían neumonía primaria de punto final [20]. Se ha introducido una definición revisada de caso de "pneumonia bacteriana presumida", que incluye los casos de neumonía con consolidación alveolar definida por la OMS, así como aquellos con otros infiltrados radiográficos en el tórax anormales y una proteína C reactiva sérica de al menos 40 mg/L [21, 22]. Se ha demostrado que esta definición tiene mayor sensibilidad que la definición radiológica original de la OMS de neumonía primaria de punto final para detectar la carga de neumonía prevenida por la vacunación conjugada neumocócica [23]. Utilizando la definición revisada, la vacuna conjugada antineumocócica 10-valente (vacuna conjugada antineumocócica-10), tuvo una eficacia vacunal del 22% en la prevención de la presunta neumonía bacteriana en niños pequeños de América del Sur [22], y la vacunación conjugada antineumocócica-13 tuvo una eficacia vacunal del 39% en la prevención de la presunta neumonía bacteriana en niños mayores de 16 semanas que no estaban infectados con el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) en Sudáfrica [21]. Por lo tanto, hay evidencia convincente de que la vacunación conjugada antineumocócica disminuye la incidencia de neumonía radiológica; sin embargo, no hay evidencia que sugiera que la vacunación conjugada antineumocócica modifique la aparición radiológica de neumonía neumocócica. Se observó un aumento de la incidencia de empiema en niños en algunos países de altos ingresos tras la introducción de la vacuna conjugada neumocócica-7, lo que se atribuyó a los serotipos neumocócicos no incluidos en la vacunación conjugada neumocócica-7, especialmente 3 y 19A [24]. En los Estados Unidos, los datos de una base de datos hospitalaria nacional indican que la incidencia de empiema aumentó 1,9 veces entre 1996 y 2008 [25]. En Australia, la tasa de incidencia aumentó 1,4 veces al comparar el período de vacunación conjugada preneumocócica-7 (1998-2004) con el período de vacunación conjugada postneumocócica-7 (2005 a 2010] [26]. En Escocia, la incidencia de empiema en niños aumentó de 6,5 por millón entre 1981 y 1998, a 66 por millón en 2005 [ Los datos de los Estados Unidos sugieren que el empiema disminuyó en un 50% en niños menores de 5 años [28] ; de manera similar, los datos del Reino Unido y Escocia mostraron una reducción sustancial en el empiema pediátrico tras la introducción de la vacuna conjugada antineumocócica-13 [29, 30]. Varias directrices nacionales de países de altos ingresos, así como las recomendaciones de la OMS para los países de bajos y medianos ingresos, recomiendan que la radiografía torácica no se realice rutinariamente en niños con neumonía ambulatoria [31] [33]. Las indicaciones para la radiografía torácica incluyen hospitalización, hipoxemia grave o dificultad respiratoria, tratamiento antibiótico inicial fallido o sospecha de otras enfermedades (tuberculosis, cuerpo extranjero inhalado) o complicaciones. Además del efecto sobre la neumonía radiológica, la vacunación conjugada antineumocócica reduce el riesgo de hospitalización por neumonía viral, probablemente reduciendo las coinfecciones bacterianas virales que resultan en enfermedad grave y hospitalización [35]. Un análisis de estudios ecológicos y observacionales de incidencia de neumonía en diferentes grupos de edad poco después de la introducción de la vacunación conjugada antineumocócica-7 en Canadá, Italia, Australia, Polonia y los Estados Unidos mostró una disminución en las hospitalizaciones por neumonía de causa general que oscilaban entre el 15% y el 65% [36]. En los Estados Unidos después de la vacunación conjugada antineumocócica-13 sustituyó la vacunación conjugada antineumocócica-7, hubo una disminución adicional del 17% en las hospitalizaciones por neumonía entre los niños elegibles para la vacunación, y una disminución adicional del 12% entre los adultos no vacunados [28]. Una revisión sistemática de los estudios de etiología antes de la disponibilidad de nuevas vacunas conjugadas confirmó que S. pneumoniae y H. influenzae tipo B fueron las causas bacterianas más importantes de la neumonía, con Staphylococcus aureus y Klebsiella pneumoniae asociadas a algunos casos graves. El virus sincitial respiratorio fue la principal causa viral, identificada en 15-40% de los casos de neumonía, seguido de influenza A y B, parainfluenza, metapneumovirus humano y adenovirus [37]. Los metaanálisis más recientes de datos de etiología sugieren un perfil patógeno cambiante, con un creciente reconocimiento de que la neumonía clínica es causada por la interacción secuencial o concurrente de más de un organismo. La enfermedad grave en particular es causada por múltiples patógenos. En estudios recientes de casos de control, se detectó al menos un virus en el 87% de los casos de neumonía clínica en Sudáfrica [39], mientras que los virus se detectaron en el 81% de los casos de neumonía radiológica en Suecia [40]. En un amplio estudio multicéntrico en Estados Unidos, se detectaron patógenos virales en el 73% de los niños hospitalizados con neumonía radiológica, mientras que las bacterias se detectaron en sólo el 15% de los casos [41]. Un metaanálisis de 23 estudios de casos de control de etiología viral en neumonía confirmada radiológicamente en niños, completados hasta 2014, reportó buenas pruebas de atribución causal para el virus sincitial respiratorio, la gripe, el metapneumovirus y el virus parainfluenza [42]. Sin embargo, no hubo evidencia consistente de que muchos otros virus comúnmente descritos, como el rinovirus, el adenovirus, el boca Otra atribución de la etiología bacteriana es difícil porque a menudo no es posible distinguir la colonización de las bacterias patógenas cuando están aisladas de especímenes nasales [43]. Otra etiología es la tos ferina. En la última década también ha habido un resurgimiento en los casos de tos ferina, especialmente en los países de altos ingresos [44]. Debido a que la inmunidad a la tos ferina después de la vacunación con pertussis acelular es menos duradera que la inmunidad después de la infección de tipo salvaje o la vacunación con células enteras, muchas mujeres en edad fértil tienen niveles de anticuerpos contra la tos ferina menguante, por lo que sus bebés pueden nacer con niveles bajos de inmunoglobulina G antipertussis transplacental, lo que las hace susceptibles a la infección por tos ferina antes de completar la serie de vacunación primaria [45]. En 2014, se notificaron más de 40.000 casos de tos ferina a los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades en los Estados Unidos; en algunos estados, las tasas de incidencia basadas en la población son más altas que en cualquier otro momento en los últimos 70 años [44]. En cambio, la mayoría de los países de ingresos bajos y medianos utilizan vacunas contra la tos ferina de células enteras y el número de casos de tos ferina en esos países se mantuvo estable o disminuyó hasta 2015 [46]. Sin embargo, las pruebas recientes procedentes de Sudáfrica (donde se utiliza la vacuna acelular) muestran una incidencia apreciable de tos ferina entre los lactantes que presentan neumonía aguda: el 2% de los casos de neumonía clínica entre los lactantes incluidos en una cohorte de parto fueron causados por tos ferina [39], y el 3,7% de los lactantes y niños pequeños que se presentan a un hospital académico terciario tenían pruebas de infección por tos ferina [47] Del mismo modo, la tuberculosis infantil es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en muchos países de ingresos bajos y medianos, y la tuberculosis de Mycobacterium ha sido reconocida cada vez más como un patógeno en la neumonía aguda en niños que viven en entornos de alta prevalencia de la tuberculosis. Los estudios postmortem de niños que mueren de enfermedades respiratorias agudas han reportado comúnmente M. tuberculosis [48, 49]. Una revisión sistemática reciente de la tuberculosis como comorbilidad de la neumonía infantil reportó enfermedad confirmada por el cultivo en aproximadamente el 8% de los casos [50]. Debido a que la tuberculosis intratorácica es sólo una enfermedad confirmada por el cultivo en una minoría de casos, la carga real podría ser aún mayor; la tuberculosis podría ser un factor importante para la incidencia de neumonía infantil y la mortalidad en las zonas de alta prevalencia. Debido a la efectividad de la vacunación conjugada neumocócica y la vacuna conjugada Haemophilus influenzae tipo B para la prevención de la neumonía radiológica y clínica, la vacunación incompleta o inadecuada debe considerarse un factor de riesgo importante para la neumonía infantil. Otros factores de riesgo incluyen el bajo peso al nacer, que se asocia con 3,2 veces mayores probabilidades de neumonía grave en los países de ingresos bajos y medianos y 1,8 veces mayores probabilidades en los países de ingresos altos [51]. Del mismo modo, la falta de lactancia materna exclusiva durante los primeros 4 meses de vida aumenta las probabilidades de neumonía grave en 2,7 veces en los países de ingresos bajos y medianos y 1,3 veces en los países de ingresos altos. La contaminación del aire en el interior por el uso de combustibles sólidos o de biomasa aumenta las probabilidades de neumonía en 1,6 veces; la falta de vacunación contra el sarampión al final del primer año de edad aumenta las probabilidades de neumonía en 1,8 veces [51]. Se estima que la prevalencia de estos factores críticos de riesgo en los países de ingresos bajos y medianos disminuyó en un 25% entre 2000 y 2010, contribuyendo a reducir la incidencia de neumonía y la mortalidad en los países de ingresos bajos y medianos, incluso en los países donde no se dispone de vacunas conjugadas [3]. El factor de riesgo único más fuerte para la neumonía es la infección por el VIH, que es especialmente frecuente en los niños del África subsahariana. Los niños infectados por el VIH tienen 6 veces más probabilidades de desarrollar neumonía grave o de muerte que los niños no infectados por el VIH [52]. Desde la prevención efectiva de la transmisión del VIH de madre a hijo, hay una población creciente de niños expuestos al VIH que no están infectados; su exceso de riesgo de neumonía, en comparación con los niños no expuestos al VIH, se ha descrito como de 1,3 a 3,4 veces mayor [53] [54] [56] [57]. La vacunación antineumocócica conjugada y la vacunación conjugada Haemophilus influenzae tipo B han sido instrumentos eficaces para reducir la incidencia, la gravedad y la mortalidad de la neumonía [58, 59]. Sin embargo, la cobertura equitativa y el acceso a las vacunas siguen siendo sub-óptimos. A finales de 2015, se había introducido la vacunación conjugada Haemophilus influenzae tipo B en 73 países, con una cobertura global estimada en 68%. Sin embargo, las desigualdades siguen siendo evidentes entre las regiones: en las Américas la cobertura se estima en 90%, mientras que en el Para 2015, se había introducido la vacunación conjugada antineumocócica en 54 países, con cobertura global de 35% para tres dosis de vacunación conjugada antineumocócica para la población infantil [60]. Para hacer frente a este problema, se puso en marcha la iniciativa del Plan Mundial de Acceso a Vacunas de la OMS para hacer más equitativa la disponibilidad de vacunas que salvan vidas. Además de garantizar la financiación de las vacunas, los objetivos del programa incluyen el fomento de la voluntad política en los países de bajos y medianos ingresos para comprometerse con la inmunización como prioridad, la comercialización social de las personas y las comunidades, el fortalecimiento de los sistemas de salud y la promoción de las innovaciones locales pertinentes en materia de investigación y desarrollo [61]. La vacunación contra la gripe durante el embarazo es segura, proporciona una protección materna razonable contra la gripe y también protege a los lactantes durante un período limitado de la infección por gripe confirmada (eficacia de la vacuna 63% en Bangladesh [63] y 50,4% en Sudáfrica [64] ). Sin embargo, a medida que los niveles de anticuerpos disminuyen bruscamente después del nacimiento, la protección de los lactantes no persiste mucho más allá de las 8 semanas [65]. Recientemente se ha demostrado que la vacunación contra el virus sincitial respiratorio en el embarazo es segura e inmunogénica, y se está llevando a cabo un ensayo clínico de fase 3 de eficacia para prevenir la enfermedad por el virus sincitial respiratorio en los lactantes [66]. El Plan de Acción Mundial Integrado de la OMS para la diarrea y la neumonía destaca muchas oportunidades para proteger, prevenir y tratar a los niños [68]. Las tasas de lactancia materna pueden mejorarse mediante programas que combinen intervenciones educativas y de asesoramiento en hogares, comunidades y centros de salud, y mediante la promoción de hospitales amigos de los bebés [69]. La mejora de la ventilación en el hogar, la utilización de combustibles más limpios para cocinar y la reducción de la exposición al humo de los cigarrillos son intervenciones esenciales para reducir la incidencia y la gravedad de la neumonía [70, 71]. La prevención del VIH pediátrico es posible mediante intervenciones para prevenir la transmisión de madre a hijo [72]. Las pruebas del VIH en la primera infancia y el inicio temprano de la terapia antirretroviral y la profilaxis del cotrimoxazol pueden reducir sustancialmente la incidencia de neumonía adquirida en la comunidad entre los niños infectados por el VIH [73]. Si estas intervenciones rentables se incrementaran, se estima que el 67% de las muertes por neumonía en países de ingresos bajos y medianos podrían prevenirse para 2025 [58]. El manejo de casos de neumonía es una estrategia por la cual la gravedad de la enfermedad se clasifica como grave o no grave. Todos los niños reciben antibióticos orales tempranos y apropiados y los casos graves se remiten a antibióticos parenteral. Cuando se implementan en áreas de alta carga antes de la disponibilidad de vacunas conjugadas, el manejo de casos como parte del Manejo Integrado de Enfermedades Infantiles se asocia con una disminución del 27% en la mortalidad infantil global, y una disminución del 42% en la mortalidad específica por neumonía [74]. Sin embargo, el predominio de las causas virales de neumonía y la baja mortalidad por casos han provocado preocupación por el uso excesivo de antibióticos. En dos estudios, realizados en Dinamarca y en la India, los resultados de los tratamientos con antibióticos y placebo fueron equivalentes [76, 77]. En el tercer estudio, en Pakistán, hubo una tasa de fracaso no significativa del 24% frente al 20% en el grupo placebo, que se consideró no equivalente al grupo antibiótico [75]. Además, debido a que la neumonía no grave y la bronquiolitis clasificadas por la OMS podrían considerarse dentro de un espectro de enfermedades respiratorias más bajas, muchos niños con neumonía clínica podrían tener bronquiolitis viral, para la que los antibióticos no son beneficiosos [79]. Esto se ha reflejado en las directrices nacionales británicas [33] y españolas [31] sobre neumonía, que no recomiendan el tratamiento antibiótico rutinario para niños menores de 2 años con evidencia de vacunación conjugada neumocócica que presentan neumonía no grave. Las directrices nacionales de los Estados Unidos recomiendan la retención de antibióticos en niños de hasta 5 años de edad que presenten neumonía no grave [32]. Sin embargo, dada la alta mortalidad por neumonía en los países de ingresos bajos y medianos, la falta de fácil acceso a la atención médica y la alta prevalencia de factores de riesgo para enfermedades graves, las directrices revisadas de la Organización Mundial de la Salud sobre la neumonía siguen recomendando el tratamiento antibiótico para todos los niños que cumplen las definiciones de casos de neumonía de la OMS [80]. El uso de oxígeno suplementario es vital, pero no está universalmente disponible en los países de ingresos bajos y medianos; se estima que el uso de sistemas de oxígeno suplementario podría reducir la mortalidad de los niños con neumonía hipoxica en un 20% [81]. Sin embargo, hasta el 81% de las muertes por neumonía en 2010 ocurrieron fuera de los centros de salud [5], por lo que hay grandes desafíos con el acceso a los servicios de salud y el comportamiento de las poblaciones vulnerables en busca de la salud. Identificar y cambiar las barreras para acceder a la atención de la salud es un área importante con el potencial de afectar la supervivencia y la salud de los niños más vulnerables [82]. Se ha avanzado mucho en la disminución de las muertes causadas por neumonía infantil. La mejora del estado socioeconómico y las vacunas, principalmente las vacunas conjugadas (contra Haemophilus influenzae y neumocococcus), han conducido a reducciones sustanciales en la incidencia y gravedad de la neumonía infantil. Estrategias más fuertes para prevenir y controlar el VIH han reducido las muertes por neumonía asociada al VIH. Sin embargo, a pesar de los cambios sustanciales en la incidencia, la etiología y la radiología a nivel mundial, persisten desigualdades en

¿Cuánto es la reducción de las muertes por neumonía infantil?

Neumonía adquirida por la comunidad en niños: un espectro cambiante de enfermedadeshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5608782/SHA: eecb946b106a94f26a79a964f0160e8e16f79f42Autores: le Roux, David M.; Zar, Heather J. Fecha: 2017-09-21DOI: 10.1007/s00247-017-3827-8Licencia: cc-byAbstract: La neumonía sigue siendo la principal causa de muerte en niños fuera del período neonatal, a pesar de los avances en la prevención y el manejo. Las nuevas vacunas conjugadas contra Haemophilus influenzae tipo b y Streptococcus pneumoniae han contribuido a la disminución de los casos de neumonía radiológica, clínica y complicada y han reducido la hospitalización y la mortalidad; la importancia de las coinfecciones con múltiples patógenos y el predominio de enfermedades virales están surgiendo; se necesita un mejor acceso a estrategias preventivas y de manejo eficaces en los países de ingresos bajos y medios, mientras que se necesitan nuevas estrategias para abordar la carga residual de la enfermedad una vez que se han implementado. Texto: La neumonía ha sido la principal causa de muerte en niños menores de 5 años durante décadas; aunque ha habido una disminución sustancial de la mortalidad global infantil y de la mortalidad específica por neumonía, la neumonía sigue siendo la principal causa de muerte en niños fuera del período neonatal, causando aproximadamente 900.000 de los 6,3 millones de muertes infantiles estimadas en 2013 [1]. Se han producido avances sustanciales en la comprensión de los factores de riesgo y etiología de la neumonía, en el desarrollo de definiciones de casos estandarizadas y en la prevención con la producción de mejores vacunas y en el tratamiento, lo que ha dado lugar a cambios en la epidemiología, la etiología y la mortalidad por neumonía infantil; sin embargo, en muchas áreas el acceso a estas intervenciones sigue siendo subóptimo, con grandes desigualdades entre países y regiones. En este trabajo se analiza el impacto de los recientes avances preventivos y de manejo en la epidemiología, etiología, presentación radiológica y resultados en niños. La carga global de neumonía infantil se ha reducido sustancialmente en la última década, a pesar de un aumento de la población infantil mundial de 605 millones en 2000 a 664 millones en 2015 [2]. Datos recientes sugieren que ha habido una disminución del 25% en la incidencia de neumonía, de 0,29 episodios por año infantil en países de Esto está corroborado por una disminución del 58% en los años de vida ajustados a la discapacidad asociada a neumonía entre 1990 y 2013, de 186 millones a 78 millones, según se estima en el estudio Global Burden of Disease [1]. Las muertes por neumonía disminuyeron de 1,8 millones en 2000 a 900.000 en 2013 [1]. Estos datos no reflejan el pleno impacto del uso cada vez más generalizado de la vacuna conjugada antineumocócica en países de ingresos bajos y medianos, ya que es probable que la incidencia de neumonía y el número de muertes disminuyan aún más como resultado de esta intervención generalizada [4]. A pesar de este progreso, sigue habiendo una carga desproporcionada de enfermedad en países de ingresos bajos y medianos, donde se producen más del 90% de los casos de neumonía y muertes. La incidencia en países de ingresos altos se estima en 0,015 episodios por año infantil, en comparación con 0,22 episodios por año infantil en países de ingresos bajos En promedio, 1 de cada 66 niños de países de ingresos altos se ve afectado por neumonía al año, en comparación con 1 de cada 5 niños de países de ingresos bajos y medianos. Incluso en los países de ingresos bajos y medianos existen desigualdades y desafíos regionales con acceso a los servicios de atención de la salud: hasta el 81% de las muertes por neumonía grave ocurren fuera de un hospital [5]. Además de una mayor incidencia de neumonía, se estima que la tasa de mortalidad de los casos es casi 10 veces mayor en los países de ingresos bajos y medianos en comparación con los países de ingresos altos [3, 5]. La neumonía infantil también puede conducir a una morbilidad significativa y a enfermedades crónicas. La neumonía de la vida temprana puede perjudicar la salud pulmonar a largo plazo disminuyendo la función pulmonar [6]. La neumonía grave o recurrente puede tener un efecto peor en la función pulmonar; cada vez más evidencia sugiere que la enfermedad pulmonar obstructiva crónica podría estar relacionada con la neumonía infantil [7, Un metaanálisis del riesgo de resultados a largo plazo después de la neumonía infantil categorizó las secuelas respiratorias crónicas en grupos mayores (enfermedad pulmonar restrictiva, enfermedad pulmonar obstructiva, bronquiectasia) y menores (bronquitis crónica, asma, función pulmonar anormal) [9]. El riesgo de desarrollar al menos una de las secuelas principales se estimó en un 6% después de un evento de neumonía ambulatoria y en un 14% después de un episodio de neumonía hospitalizada. Debido a que las enfermedades respiratorias afectan a casi 1.000 millones de personas en todo el mundo y son una causa importante de mortalidad y morbilidad [10], la neumonía infantil podría contribuir a una morbilidad sustancial a lo largo de la vida. Los cambios radiológicos de tórax se han considerado el estándar de oro para definir un evento de neumonía [11] porque los hallazgos clínicos pueden ser subjetivos y las definiciones clínicas de neumonía pueden ser inespecíficas. En 2005, para ayudar a definir los resultados de los estudios de la vacuna antineumocócica, la descripción de la radiografía torácica estandarizada de la Organización Mundial de la Salud (OMS) definió un grupo de niños que se consideraban más propensos a tener neumonía neumocócica [12]. El término "consolidación de punto final" se describió como una opacidad densa o esponjosa que ocupa una porción o todo un lóbulo o todo el pulmón. "Otros infiltrados" incluyeron densidades lineales y irregulares, engrosamiento peribronquial, infiltrados menores parcheados que no son de magnitud suficiente para constituir una consolidación de punto final primaria, y pequeñas áreas de atelectasia que en los niños pueden ser difíciles de distinguir de la consolidación. "Neumonía de punto final primario" incluyó consolidación de punto final o un derrame pleural asociado con un El uso generalizado de la vacunación conjugada neumocócica y la vacunación conjugada Haemophilus influenzae tipo B ha disminuido la incidencia de neumonía radiológica. En una revisión de cuatro ensayos controlados aleatorizados y dos estudios de casos y controles de la vacunación conjugada Haemophilus influenzae tipo B en comunidades de alta carga, la vacunación se asoció con una disminución del 18% de la neumonía radiológica [13]. La introducción de la vacunación conjugada neumocócica se asoció con una disminución del 26% de la neumonía radiológica en California entre 1995 y 1998 [14]. En los ensayos de eficacia vacunal en países de ingresos bajos y medianos, la vacunación conjugada neumocócica redujo la neumonía radiológica en un 37% en Gambia [15], un 25% en Sudáfrica [16] y un 26% en Filipinas [17]. La definición de caso radiológico de la OMS no tenía por objeto distinguir la etiología bacteriana de la viral, sino definir un subconjunto de casos de neumonía en los que la infección neumocócica se consideraba más probable y proporcionar un conjunto de definiciones estandarizadas a través de las cuales los investigadores podrían lograr un amplio acuerdo en la notificación de radiografías torácicas. Sin embargo, a pesar de la amplia utilización en el campo, existe preocupación por la repetibilidad de los observadores. Ha habido un buen consenso en la descripción de la consolidación lobar pero un desacuerdo significativo en la descripción de infiltrados parcheados y perihilares [18, 19]. Además, muchos niños con enfermedad pulmonar clínicamente grave no tienen neumonía primaria de punto final: en un estudio previo a la vacunación conjugada con neumocócica, sólo el 34% de los niños hospitalizados con neumonía tenían neumonía primaria de punto final [20]. Se ha introducido una definición revisada de caso de "pneumonia bacteriana presumida", que incluye los casos de neumonía con consolidación alveolar definida por la OMS, así como aquellos con otros infiltrados radiográficos en el tórax anormales y una proteína C reactiva sérica de al menos 40 mg/L [21, 22]. Se ha demostrado que esta definición tiene mayor sensibilidad que la definición radiológica original de la OMS de neumonía primaria de punto final para detectar la carga de neumonía prevenida por la vacunación conjugada neumocócica [23]. Utilizando la definición revisada, la vacuna conjugada antineumocócica 10-valente (vacuna conjugada antineumocócica-10), tuvo una eficacia vacunal del 22% en la prevención de la presunta neumonía bacteriana en niños pequeños de América del Sur [22], y la vacunación conjugada antineumocócica-13 tuvo una eficacia vacunal del 39% en la prevención de la presunta neumonía bacteriana en niños mayores de 16 semanas que no estaban infectados con el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) en Sudáfrica [21]. Por lo tanto, hay evidencia convincente de que la vacunación conjugada antineumocócica disminuye la incidencia de neumonía radiológica; sin embargo, no hay evidencia que sugiera que la vacunación conjugada antineumocócica modifique la aparición radiológica de neumonía neumocócica. Se observó un aumento de la incidencia de empiema en niños en algunos países de altos ingresos tras la introducción de la vacuna conjugada neumocócica-7, lo que se atribuyó a los serotipos neumocócicos no incluidos en la vacunación conjugada neumocócica-7, especialmente 3 y 19A [24]. En los Estados Unidos, los datos de una base de datos hospitalaria nacional indican que la incidencia de empiema aumentó 1,9 veces entre 1996 y 2008 [25]. En Australia, la tasa de incidencia aumentó 1,4 veces al comparar el período de vacunación conjugada preneumocócica-7 (1998-2004) con el período de vacunación conjugada postneumocócica-7 (2005 a 2010] [26]. En Escocia, la incidencia de empiema en niños aumentó de 6,5 por millón entre 1981 y 1998, a 66 por millón en 2005 [ Los datos de los Estados Unidos sugieren que el empiema disminuyó en un 50% en niños menores de 5 años [28] ; de manera similar, los datos del Reino Unido y Escocia mostraron una reducción sustancial en el empiema pediátrico tras la introducción de la vacuna conjugada antineumocócica-13 [29, 30]. Varias directrices nacionales de países de altos ingresos, así como las recomendaciones de la OMS para los países de bajos y medianos ingresos, recomiendan que la radiografía torácica no se realice rutinariamente en niños con neumonía ambulatoria [31] [33]. Las indicaciones para la radiografía torácica incluyen hospitalización, hipoxemia grave o dificultad respiratoria, tratamiento antibiótico inicial fallido o sospecha de otras enfermedades (tuberculosis, cuerpo extranjero inhalado) o complicaciones. Además del efecto sobre la neumonía radiológica, la vacunación conjugada antineumocócica reduce el riesgo de hospitalización por neumonía viral, probablemente reduciendo las coinfecciones bacterianas virales que resultan en enfermedad grave y hospitalización [35]. Un análisis de estudios ecológicos y observacionales de incidencia de neumonía en diferentes grupos de edad poco después de la introducción de la vacunación conjugada antineumocócica-7 en Canadá, Italia, Australia, Polonia y los Estados Unidos mostró una disminución en las hospitalizaciones por neumonía de causa general que oscilaban entre el 15% y el 65% [36]. En los Estados Unidos después de la vacunación conjugada antineumocócica-13 sustituyó la vacunación conjugada antineumocócica-7, hubo una disminución adicional del 17% en las hospitalizaciones por neumonía entre los niños elegibles para la vacunación, y una disminución adicional del 12% entre los adultos no vacunados [28]. Una revisión sistemática de los estudios de etiología antes de la disponibilidad de nuevas vacunas conjugadas confirmó que S. pneumoniae y H. influenzae tipo B fueron las causas bacterianas más importantes de la neumonía, con Staphylococcus aureus y Klebsiella pneumoniae asociadas a algunos casos graves. El virus sincitial respiratorio fue la principal causa viral, identificada en 15-40% de los casos de neumonía, seguido de influenza A y B, parainfluenza, metapneumovirus humano y adenovirus [37]. Los metaanálisis más recientes de datos de etiología sugieren un perfil patógeno cambiante, con un creciente reconocimiento de que la neumonía clínica es causada por la interacción secuencial o concurrente de más de un organismo. La enfermedad grave en particular es causada por múltiples patógenos. En estudios recientes de casos de control, se detectó al menos un virus en el 87% de los casos de neumonía clínica en Sudáfrica [39], mientras que los virus se detectaron en el 81% de los casos de neumonía radiológica en Suecia [40]. En un amplio estudio multicéntrico en Estados Unidos, se detectaron patógenos virales en el 73% de los niños hospitalizados con neumonía radiológica, mientras que las bacterias se detectaron en sólo el 15% de los casos [41]. Un metaanálisis de 23 estudios de casos de control de etiología viral en neumonía confirmada radiológicamente en niños, completados hasta 2014, reportó buenas pruebas de atribución causal para el virus sincitial respiratorio, la gripe, el metapneumovirus y el virus parainfluenza [42]. Sin embargo, no hubo evidencia consistente de que muchos otros virus comúnmente descritos, como el rinovirus, el adenovirus, el boca Otra atribución de la etiología bacteriana es difícil porque a menudo no es posible distinguir la colonización de las bacterias patógenas cuando están aisladas de especímenes nasales [43]. Otra etiología es la tos ferina. En la última década también ha habido un resurgimiento en los casos de tos ferina, especialmente en los países de altos ingresos [44]. Debido a que la inmunidad a la tos ferina después de la vacunación con pertussis acelular es menos duradera que la inmunidad después de la infección de tipo salvaje o la vacunación con células enteras, muchas mujeres en edad fértil tienen niveles de anticuerpos contra la tos ferina menguante, por lo que sus bebés pueden nacer con niveles bajos de inmunoglobulina G antipertussis transplacental, lo que las hace susceptibles a la infección por tos ferina antes de completar la serie de vacunación primaria [45]. En 2014, se notificaron más de 40.000 casos de tos ferina a los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades en los Estados Unidos; en algunos estados, las tasas de incidencia basadas en la población son más altas que en cualquier otro momento en los últimos 70 años [44]. En cambio, la mayoría de los países de ingresos bajos y medianos utilizan vacunas contra la tos ferina de células enteras y el número de casos de tos ferina en esos países se mantuvo estable o disminuyó hasta 2015 [46]. Sin embargo, las pruebas recientes procedentes de Sudáfrica (donde se utiliza la vacuna acelular) muestran una incidencia apreciable de tos ferina entre los lactantes que presentan neumonía aguda: el 2% de los casos de neumonía clínica entre los lactantes incluidos en una cohorte de parto fueron causados por tos ferina [39], y el 3,7% de los lactantes y niños pequeños que se presentan a un hospital académico terciario tenían pruebas de infección por tos ferina [47] Del mismo modo, la tuberculosis infantil es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en muchos países de ingresos bajos y medianos, y la tuberculosis de Mycobacterium ha sido reconocida cada vez más como un patógeno en la neumonía aguda en niños que viven en entornos de alta prevalencia de la tuberculosis. Los estudios postmortem de niños que mueren de enfermedades respiratorias agudas han reportado comúnmente M. tuberculosis [48, 49]. Una revisión sistemática reciente de la tuberculosis como comorbilidad de la neumonía infantil reportó enfermedad confirmada por el cultivo en aproximadamente el 8% de los casos [50]. Debido a que la tuberculosis intratorácica es sólo una enfermedad confirmada por el cultivo en una minoría de casos, la carga real podría ser aún mayor; la tuberculosis podría ser un factor importante para la incidencia de neumonía infantil y la mortalidad en las zonas de alta prevalencia. Debido a la efectividad de la vacunación conjugada neumocócica y la vacuna conjugada Haemophilus influenzae tipo B para la prevención de la neumonía radiológica y clínica, la vacunación incompleta o inadecuada debe considerarse un factor de riesgo importante para la neumonía infantil. Otros factores de riesgo incluyen el bajo peso al nacer, que se asocia con 3,2 veces mayores probabilidades de neumonía grave en los países de ingresos bajos y medianos y 1,8 veces mayores probabilidades en los países de ingresos altos [51]. Del mismo modo, la falta de lactancia materna exclusiva durante los primeros 4 meses de vida aumenta las probabilidades de neumonía grave en 2,7 veces en los países de ingresos bajos y medianos y 1,3 veces en los países de ingresos altos. La contaminación del aire en el interior por el uso de combustibles sólidos o de biomasa aumenta las probabilidades de neumonía en 1,6 veces; la falta de vacunación contra el sarampión al final del primer año de edad aumenta las probabilidades de neumonía en 1,8 veces [51]. Se estima que la prevalencia de estos factores críticos de riesgo en los países de ingresos bajos y medianos disminuyó en un 25% entre 2000 y 2010, contribuyendo a reducir la incidencia de neumonía y la mortalidad en los países de ingresos bajos y medianos, incluso en los países donde no se dispone de vacunas conjugadas [3]. El factor de riesgo único más fuerte para la neumonía es la infección por el VIH, que es especialmente frecuente en los niños del África subsahariana. Los niños infectados por el VIH tienen 6 veces más probabilidades de desarrollar neumonía grave o de muerte que los niños no infectados por el VIH [52]. Desde la prevención efectiva de la transmisión del VIH de madre a hijo, hay una población creciente de niños expuestos al VIH que no están infectados; su exceso de riesgo de neumonía, en comparación con los niños no expuestos al VIH, se ha descrito como de 1,3 a 3,4 veces mayor [53] [54] [56] [57]. La vacunación antineumocócica conjugada y la vacunación conjugada Haemophilus influenzae tipo B han sido instrumentos eficaces para reducir la incidencia, la gravedad y la mortalidad de la neumonía [58, 59]. Sin embargo, la cobertura equitativa y el acceso a las vacunas siguen siendo sub-óptimos. A finales de 2015, se había introducido la vacunación conjugada Haemophilus influenzae tipo B en 73 países, con una cobertura global estimada en 68%. Sin embargo, las desigualdades siguen siendo evidentes entre las regiones: en las Américas la cobertura se estima en 90%, mientras que en el Para 2015, se había introducido la vacunación conjugada antineumocócica en 54 países, con cobertura global de 35% para tres dosis de vacunación conjugada antineumocócica para la población infantil [60]. Para hacer frente a este problema, se puso en marcha la iniciativa del Plan Mundial de Acceso a Vacunas de la OMS para hacer más equitativa la disponibilidad de vacunas que salvan vidas. Además de garantizar la financiación de las vacunas, los objetivos del programa incluyen el fomento de la voluntad política en los países de bajos y medianos ingresos para comprometerse con la inmunización como prioridad, la comercialización social de las personas y las comunidades, el fortalecimiento de los sistemas de salud y la promoción de las innovaciones locales pertinentes en materia de investigación y desarrollo [61]. La vacunación contra la gripe durante el embarazo es segura, proporciona una protección materna razonable contra la gripe y también protege a los lactantes durante un período limitado de la infección por gripe confirmada (eficacia de la vacuna 63% en Bangladesh [63] y 50,4% en Sudáfrica [64] ). Sin embargo, a medida que los niveles de anticuerpos disminuyen bruscamente después del nacimiento, la protección de los lactantes no persiste mucho más allá de las 8 semanas [65]. Recientemente se ha demostrado que la vacunación contra el virus sincitial respiratorio en el embarazo es segura e inmunogénica, y se está llevando a cabo un ensayo clínico de fase 3 de eficacia para prevenir la enfermedad por el virus sincitial respiratorio en los lactantes [66]. El Plan de Acción Mundial Integrado de la OMS para la diarrea y la neumonía destaca muchas oportunidades para proteger, prevenir y tratar a los niños [68]. Las tasas de lactancia materna pueden mejorarse mediante programas que combinen intervenciones educativas y de asesoramiento en hogares, comunidades y centros de salud, y mediante la promoción de hospitales amigos de los bebés [69]. La mejora de la ventilación en el hogar, la utilización de combustibles más limpios para cocinar y la reducción de la exposición al humo de los cigarrillos son intervenciones esenciales para reducir la incidencia y la gravedad de la neumonía [70, 71]. La prevención del VIH pediátrico es posible mediante intervenciones para prevenir la transmisión de madre a hijo [72]. Las pruebas del VIH en la primera infancia y el inicio temprano de la terapia antirretroviral y la profilaxis del cotrimoxazol pueden reducir sustancialmente la incidencia de neumonía adquirida en la comunidad entre los niños infectados por el VIH [73]. Si estas intervenciones rentables se incrementaran, se estima que el 67% de las muertes por neumonía en países de ingresos bajos y medianos podrían prevenirse para 2025 [58]. El manejo de casos de neumonía es una estrategia por la cual la gravedad de la enfermedad se clasifica como grave o no grave. Todos los niños reciben antibióticos orales tempranos y apropiados y los casos graves se remiten a antibióticos parenteral. Cuando se implementan en áreas de alta carga antes de la disponibilidad de vacunas conjugadas, el manejo de casos como parte del Manejo Integrado de Enfermedades Infantiles se asocia con una disminución del 27% en la mortalidad infantil global, y una disminución del 42% en la mortalidad específica por neumonía [74]. Sin embargo, el predominio de las causas virales de neumonía y la baja mortalidad por casos han provocado preocupación por el uso excesivo de antibióticos. En dos estudios, realizados en Dinamarca y en la India, los resultados de los tratamientos con antibióticos y placebo fueron equivalentes [76, 77]. En el tercer estudio, en Pakistán, hubo una tasa de fracaso no significativa del 24% frente al 20% en el grupo placebo, que se consideró no equivalente al grupo antibiótico [75]. Además, debido a que la neumonía no grave y la bronquiolitis clasificadas por la OMS podrían considerarse dentro de un espectro de enfermedades respiratorias más bajas, muchos niños con neumonía clínica podrían tener bronquiolitis viral, para la que los antibióticos no son beneficiosos [79]. Esto se ha reflejado en las directrices nacionales británicas [33] y españolas [31] sobre neumonía, que no recomiendan el tratamiento antibiótico rutinario para niños menores de 2 años con evidencia de vacunación conjugada neumocócica que presentan neumonía no grave. Las directrices nacionales de los Estados Unidos recomiendan la retención de antibióticos en niños de hasta 5 años de edad que presenten neumonía no grave [32]. Sin embargo, dada la alta mortalidad por neumonía en los países de ingresos bajos y medianos, la falta de fácil acceso a la atención médica y la alta prevalencia de factores de riesgo para enfermedades graves, las directrices revisadas de la Organización Mundial de la Salud sobre la neumonía siguen recomendando el tratamiento antibiótico para todos los niños que cumplen las definiciones de casos de neumonía de la OMS [80]. El uso de oxígeno suplementario es vital, pero no está universalmente disponible en los países de ingresos bajos y medianos; se estima que el uso de sistemas de oxígeno suplementario podría reducir la mortalidad de los niños con neumonía hipoxica en un 20% [81]. Sin embargo, hasta el 81% de las muertes por neumonía en 2010 ocurrieron fuera de los centros de salud [5], por lo que hay grandes desafíos con el acceso a los servicios de salud y el comportamiento de las poblaciones vulnerables en busca de la salud. Identificar y cambiar las barreras para acceder a la atención de la salud es un área importante con el potencial de afectar la supervivencia y la salud de los niños más vulnerables [82]. Se ha avanzado mucho en la disminución de las muertes causadas por neumonía infantil. La mejora del estado socioeconómico y las vacunas, principalmente las vacunas conjugadas (contra Haemophilus influenzae y neumocococcus), han conducido a reducciones sustanciales en la incidencia y gravedad de la neumonía infantil. Estrategias más fuertes para prevenir y controlar el VIH han reducido las muertes por neumonía asociada al VIH. Sin embargo, a pesar de los cambios sustanciales en la incidencia, la etiología y la radiología a nivel mundial, persisten desigualdades en

¿Qué porcentaje de muertes por neumonía infantil ocurren fuera del hospital en países de ingresos bajos y medianos?

Neumonía adquirida por la comunidad en niños: un espectro cambiante de enfermedadeshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5608782/SHA: eecb946b106a94f26a79a964f0160e8e16f79f42Autores: le Roux, David M.; Zar, Heather J. Fecha: 2017-09-21DOI: 10.1007/s00247-017-3827-8Licencia: cc-byAbstract: La neumonía sigue siendo la principal causa de muerte en niños fuera del período neonatal, a pesar de los avances en la prevención y el manejo. Las nuevas vacunas conjugadas contra Haemophilus influenzae tipo b y Streptococcus pneumoniae han contribuido a la disminución de los casos de neumonía radiológica, clínica y complicada y han reducido la hospitalización y la mortalidad; la importancia de las coinfecciones con múltiples patógenos y el predominio de enfermedades virales están surgiendo; se necesita un mejor acceso a estrategias preventivas y de manejo eficaces en los países de ingresos bajos y medios, mientras que se necesitan nuevas estrategias para abordar la carga residual de la enfermedad una vez que se han implementado. Texto: La neumonía ha sido la principal causa de muerte en niños menores de 5 años durante décadas; aunque ha habido una disminución sustancial de la mortalidad global infantil y de la mortalidad específica por neumonía, la neumonía sigue siendo la principal causa de muerte en niños fuera del período neonatal, causando aproximadamente 900.000 de los 6,3 millones de muertes infantiles estimadas en 2013 [1]. Se han producido avances sustanciales en la comprensión de los factores de riesgo y etiología de la neumonía, en el desarrollo de definiciones de casos estandarizadas y en la prevención con la producción de mejores vacunas y en el tratamiento, lo que ha dado lugar a cambios en la epidemiología, la etiología y la mortalidad por neumonía infantil; sin embargo, en muchas áreas el acceso a estas intervenciones sigue siendo subóptimo, con grandes desigualdades entre países y regiones. En este trabajo se analiza el impacto de los recientes avances preventivos y de manejo en la epidemiología, etiología, presentación radiológica y resultados en niños. La carga global de neumonía infantil se ha reducido sustancialmente en la última década, a pesar de un aumento de la población infantil mundial de 605 millones en 2000 a 664 millones en 2015 [2]. Datos recientes sugieren que ha habido una disminución del 25% en la incidencia de neumonía, de 0,29 episodios por año infantil en países de Esto está corroborado por una disminución del 58% en los años de vida ajustados a la discapacidad asociada a neumonía entre 1990 y 2013, de 186 millones a 78 millones, según se estima en el estudio Global Burden of Disease [1]. Las muertes por neumonía disminuyeron de 1,8 millones en 2000 a 900.000 en 2013 [1]. Estos datos no reflejan el pleno impacto del uso cada vez más generalizado de la vacuna conjugada antineumocócica en países de ingresos bajos y medianos, ya que es probable que la incidencia de neumonía y el número de muertes disminuyan aún más como resultado de esta intervención generalizada [4]. A pesar de este progreso, sigue habiendo una carga desproporcionada de enfermedad en países de ingresos bajos y medianos, donde se producen más del 90% de los casos de neumonía y muertes. La incidencia en países de ingresos altos se estima en 0,015 episodios por año infantil, en comparación con 0,22 episodios por año infantil en países de ingresos bajos En promedio, 1 de cada 66 niños de países de ingresos altos se ve afectado por neumonía al año, en comparación con 1 de cada 5 niños de países de ingresos bajos y medianos. Incluso en los países de ingresos bajos y medianos existen desigualdades y desafíos regionales con acceso a los servicios de atención de la salud: hasta el 81% de las muertes por neumonía grave ocurren fuera de un hospital [5]. Además de una mayor incidencia de neumonía, se estima que la tasa de mortalidad de los casos es casi 10 veces mayor en los países de ingresos bajos y medianos en comparación con los países de ingresos altos [3, 5]. La neumonía infantil también puede conducir a una morbilidad significativa y a enfermedades crónicas. La neumonía de la vida temprana puede perjudicar la salud pulmonar a largo plazo disminuyendo la función pulmonar [6]. La neumonía grave o recurrente puede tener un efecto peor en la función pulmonar; cada vez más evidencia sugiere que la enfermedad pulmonar obstructiva crónica podría estar relacionada con la neumonía infantil [7, Un metaanálisis del riesgo de resultados a largo plazo después de la neumonía infantil categorizó las secuelas respiratorias crónicas en grupos mayores (enfermedad pulmonar restrictiva, enfermedad pulmonar obstructiva, bronquiectasia) y menores (bronquitis crónica, asma, función pulmonar anormal) [9]. El riesgo de desarrollar al menos una de las secuelas principales se estimó en un 6% después de un evento de neumonía ambulatoria y en un 14% después de un episodio de neumonía hospitalizada. Debido a que las enfermedades respiratorias afectan a casi 1.000 millones de personas en todo el mundo y son una causa importante de mortalidad y morbilidad [10], la neumonía infantil podría contribuir a una morbilidad sustancial a lo largo de la vida. Los cambios radiológicos de tórax se han considerado el estándar de oro para definir un evento de neumonía [11] porque los hallazgos clínicos pueden ser subjetivos y las definiciones clínicas de neumonía pueden ser inespecíficas. En 2005, para ayudar a definir los resultados de los estudios de la vacuna antineumocócica, la descripción de la radiografía torácica estandarizada de la Organización Mundial de la Salud (OMS) definió un grupo de niños que se consideraban más propensos a tener neumonía neumocócica [12]. El término "consolidación de punto final" se describió como una opacidad densa o esponjosa que ocupa una porción o todo un lóbulo o todo el pulmón. "Otros infiltrados" incluyeron densidades lineales y irregulares, engrosamiento peribronquial, infiltrados menores parcheados que no son de magnitud suficiente para constituir una consolidación de punto final primaria, y pequeñas áreas de atelectasia que en los niños pueden ser difíciles de distinguir de la consolidación. "Neumonía de punto final primario" incluyó consolidación de punto final o un derrame pleural asociado con un El uso generalizado de la vacunación conjugada neumocócica y la vacunación conjugada Haemophilus influenzae tipo B ha disminuido la incidencia de neumonía radiológica. En una revisión de cuatro ensayos controlados aleatorizados y dos estudios de casos y controles de la vacunación conjugada Haemophilus influenzae tipo B en comunidades de alta carga, la vacunación se asoció con una disminución del 18% de la neumonía radiológica [13]. La introducción de la vacunación conjugada neumocócica se asoció con una disminución del 26% de la neumonía radiológica en California entre 1995 y 1998 [14]. En los ensayos de eficacia vacunal en países de ingresos bajos y medianos, la vacunación conjugada neumocócica redujo la neumonía radiológica en un 37% en Gambia [15], un 25% en Sudáfrica [16] y un 26% en Filipinas [17]. La definición de caso radiológico de la OMS no tenía por objeto distinguir la etiología bacteriana de la viral, sino definir un subconjunto de casos de neumonía en los que la infección neumocócica se consideraba más probable y proporcionar un conjunto de definiciones estandarizadas a través de las cuales los investigadores podrían lograr un amplio acuerdo en la notificación de radiografías torácicas. Sin embargo, a pesar de la amplia utilización en el campo, existe preocupación por la repetibilidad de los observadores. Ha habido un buen consenso en la descripción de la consolidación lobar pero un desacuerdo significativo en la descripción de infiltrados parcheados y perihilares [18, 19]. Además, muchos niños con enfermedad pulmonar clínicamente grave no tienen neumonía primaria de punto final: en un estudio previo a la vacunación conjugada con neumocócica, sólo el 34% de los niños hospitalizados con neumonía tenían neumonía primaria de punto final [20]. Se ha introducido una definición revisada de caso de "pneumonia bacteriana presumida", que incluye los casos de neumonía con consolidación alveolar definida por la OMS, así como aquellos con otros infiltrados radiográficos en el tórax anormales y una proteína C reactiva sérica de al menos 40 mg/L [21, 22]. Se ha demostrado que esta definición tiene mayor sensibilidad que la definición radiológica original de la OMS de neumonía primaria de punto final para detectar la carga de neumonía prevenida por la vacunación conjugada neumocócica [23]. Utilizando la definición revisada, la vacuna conjugada antineumocócica 10-valente (vacuna conjugada antineumocócica-10), tuvo una eficacia vacunal del 22% en la prevención de la presunta neumonía bacteriana en niños pequeños de América del Sur [22], y la vacunación conjugada antineumocócica-13 tuvo una eficacia vacunal del 39% en la prevención de la presunta neumonía bacteriana en niños mayores de 16 semanas que no estaban infectados con el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) en Sudáfrica [21]. Por lo tanto, hay evidencia convincente de que la vacunación conjugada antineumocócica disminuye la incidencia de neumonía radiológica; sin embargo, no hay evidencia que sugiera que la vacunación conjugada antineumocócica modifique la aparición radiológica de neumonía neumocócica. Se observó un aumento de la incidencia de empiema en niños en algunos países de altos ingresos tras la introducción de la vacuna conjugada neumocócica-7, lo que se atribuyó a los serotipos neumocócicos no incluidos en la vacunación conjugada neumocócica-7, especialmente 3 y 19A [24]. En los Estados Unidos, los datos de una base de datos hospitalaria nacional indican que la incidencia de empiema aumentó 1,9 veces entre 1996 y 2008 [25]. En Australia, la tasa de incidencia aumentó 1,4 veces al comparar el período de vacunación conjugada preneumocócica-7 (1998-2004) con el período de vacunación conjugada postneumocócica-7 (2005 a 2010] [26]. En Escocia, la incidencia de empiema en niños aumentó de 6,5 por millón entre 1981 y 1998, a 66 por millón en 2005 [ Los datos de los Estados Unidos sugieren que el empiema disminuyó en un 50% en niños menores de 5 años [28] ; de manera similar, los datos del Reino Unido y Escocia mostraron una reducción sustancial en el empiema pediátrico tras la introducción de la vacuna conjugada antineumocócica-13 [29, 30]. Varias directrices nacionales de países de altos ingresos, así como las recomendaciones de la OMS para los países de bajos y medianos ingresos, recomiendan que la radiografía torácica no se realice rutinariamente en niños con neumonía ambulatoria [31] [33]. Las indicaciones para la radiografía torácica incluyen hospitalización, hipoxemia grave o dificultad respiratoria, tratamiento antibiótico inicial fallido o sospecha de otras enfermedades (tuberculosis, cuerpo extranjero inhalado) o complicaciones. Además del efecto sobre la neumonía radiológica, la vacunación conjugada antineumocócica reduce el riesgo de hospitalización por neumonía viral, probablemente reduciendo las coinfecciones bacterianas virales que resultan en enfermedad grave y hospitalización [35]. Un análisis de estudios ecológicos y observacionales de incidencia de neumonía en diferentes grupos de edad poco después de la introducción de la vacunación conjugada antineumocócica-7 en Canadá, Italia, Australia, Polonia y los Estados Unidos mostró una disminución en las hospitalizaciones por neumonía de causa general que oscilaban entre el 15% y el 65% [36]. En los Estados Unidos después de la vacunación conjugada antineumocócica-13 sustituyó la vacunación conjugada antineumocócica-7, hubo una disminución adicional del 17% en las hospitalizaciones por neumonía entre los niños elegibles para la vacunación, y una disminución adicional del 12% entre los adultos no vacunados [28]. Una revisión sistemática de los estudios de etiología antes de la disponibilidad de nuevas vacunas conjugadas confirmó que S. pneumoniae y H. influenzae tipo B fueron las causas bacterianas más importantes de la neumonía, con Staphylococcus aureus y Klebsiella pneumoniae asociadas a algunos casos graves. El virus sincitial respiratorio fue la principal causa viral, identificada en 15-40% de los casos de neumonía, seguido de influenza A y B, parainfluenza, metapneumovirus humano y adenovirus [37]. Los metaanálisis más recientes de datos de etiología sugieren un perfil patógeno cambiante, con un creciente reconocimiento de que la neumonía clínica es causada por la interacción secuencial o concurrente de más de un organismo. La enfermedad grave en particular es causada por múltiples patógenos. En estudios recientes de casos de control, se detectó al menos un virus en el 87% de los casos de neumonía clínica en Sudáfrica [39], mientras que los virus se detectaron en el 81% de los casos de neumonía radiológica en Suecia [40]. En un amplio estudio multicéntrico en Estados Unidos, se detectaron patógenos virales en el 73% de los niños hospitalizados con neumonía radiológica, mientras que las bacterias se detectaron en sólo el 15% de los casos [41]. Un metaanálisis de 23 estudios de casos de control de etiología viral en neumonía confirmada radiológicamente en niños, completados hasta 2014, reportó buenas pruebas de atribución causal para el virus sincitial respiratorio, la gripe, el metapneumovirus y el virus parainfluenza [42]. Sin embargo, no hubo evidencia consistente de que muchos otros virus comúnmente descritos, como el rinovirus, el adenovirus, el boca Otra atribución de la etiología bacteriana es difícil porque a menudo no es posible distinguir la colonización de las bacterias patógenas cuando están aisladas de especímenes nasales [43]. Otra etiología es la tos ferina. En la última década también ha habido un resurgimiento en los casos de tos ferina, especialmente en los países de altos ingresos [44]. Debido a que la inmunidad a la tos ferina después de la vacunación con pertussis acelular es menos duradera que la inmunidad después de la infección de tipo salvaje o la vacunación con células enteras, muchas mujeres en edad fértil tienen niveles de anticuerpos contra la tos ferina menguante, por lo que sus bebés pueden nacer con niveles bajos de inmunoglobulina G antipertussis transplacental, lo que las hace susceptibles a la infección por tos ferina antes de completar la serie de vacunación primaria [45]. En 2014, se notificaron más de 40.000 casos de tos ferina a los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades en los Estados Unidos; en algunos estados, las tasas de incidencia basadas en la población son más altas que en cualquier otro momento en los últimos 70 años [44]. En cambio, la mayoría de los países de ingresos bajos y medianos utilizan vacunas contra la tos ferina de células enteras y el número de casos de tos ferina en esos países se mantuvo estable o disminuyó hasta 2015 [46]. Sin embargo, las pruebas recientes procedentes de Sudáfrica (donde se utiliza la vacuna acelular) muestran una incidencia apreciable de tos ferina entre los lactantes que presentan neumonía aguda: el 2% de los casos de neumonía clínica entre los lactantes incluidos en una cohorte de parto fueron causados por tos ferina [39], y el 3,7% de los lactantes y niños pequeños que se presentan a un hospital académico terciario tenían pruebas de infección por tos ferina [47] Del mismo modo, la tuberculosis infantil es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en muchos países de ingresos bajos y medianos, y la tuberculosis de Mycobacterium ha sido reconocida cada vez más como un patógeno en la neumonía aguda en niños que viven en entornos de alta prevalencia de la tuberculosis. Los estudios postmortem de niños que mueren de enfermedades respiratorias agudas han reportado comúnmente M. tuberculosis [48, 49]. Una revisión sistemática reciente de la tuberculosis como comorbilidad de la neumonía infantil reportó enfermedad confirmada por el cultivo en aproximadamente el 8% de los casos [50]. Debido a que la tuberculosis intratorácica es sólo una enfermedad confirmada por el cultivo en una minoría de casos, la carga real podría ser aún mayor; la tuberculosis podría ser un factor importante para la incidencia de neumonía infantil y la mortalidad en las zonas de alta prevalencia. Debido a la efectividad de la vacunación conjugada neumocócica y la vacuna conjugada Haemophilus influenzae tipo B para la prevención de la neumonía radiológica y clínica, la vacunación incompleta o inadecuada debe considerarse un factor de riesgo importante para la neumonía infantil. Otros factores de riesgo incluyen el bajo peso al nacer, que se asocia con 3,2 veces mayores probabilidades de neumonía grave en los países de ingresos bajos y medianos y 1,8 veces mayores probabilidades en los países de ingresos altos [51]. Del mismo modo, la falta de lactancia materna exclusiva durante los primeros 4 meses de vida aumenta las probabilidades de neumonía grave en 2,7 veces en los países de ingresos bajos y medianos y 1,3 veces en los países de ingresos altos. La contaminación del aire en el interior por el uso de combustibles sólidos o de biomasa aumenta las probabilidades de neumonía en 1,6 veces; la falta de vacunación contra el sarampión al final del primer año de edad aumenta las probabilidades de neumonía en 1,8 veces [51]. Se estima que la prevalencia de estos factores críticos de riesgo en los países de ingresos bajos y medianos disminuyó en un 25% entre 2000 y 2010, contribuyendo a reducir la incidencia de neumonía y la mortalidad en los países de ingresos bajos y medianos, incluso en los países donde no se dispone de vacunas conjugadas [3]. El factor de riesgo único más fuerte para la neumonía es la infección por el VIH, que es especialmente frecuente en los niños del África subsahariana. Los niños infectados por el VIH tienen 6 veces más probabilidades de desarrollar neumonía grave o de muerte que los niños no infectados por el VIH [52]. Desde la prevención efectiva de la transmisión del VIH de madre a hijo, hay una población creciente de niños expuestos al VIH que no están infectados; su exceso de riesgo de neumonía, en comparación con los niños no expuestos al VIH, se ha descrito como de 1,3 a 3,4 veces mayor [53] [54] [56] [57]. La vacunación antineumocócica conjugada y la vacunación conjugada Haemophilus influenzae tipo B han sido instrumentos eficaces para reducir la incidencia, la gravedad y la mortalidad de la neumonía [58, 59]. Sin embargo, la cobertura equitativa y el acceso a las vacunas siguen siendo sub-óptimos. A finales de 2015, se había introducido la vacunación conjugada Haemophilus influenzae tipo B en 73 países, con una cobertura global estimada en 68%. Sin embargo, las desigualdades siguen siendo evidentes entre las regiones: en las Américas la cobertura se estima en 90%, mientras que en el Para 2015, se había introducido la vacunación conjugada antineumocócica en 54 países, con cobertura global de 35% para tres dosis de vacunación conjugada antineumocócica para la población infantil [60]. Para hacer frente a este problema, se puso en marcha la iniciativa del Plan Mundial de Acceso a Vacunas de la OMS para hacer más equitativa la disponibilidad de vacunas que salvan vidas. Además de garantizar la financiación de las vacunas, los objetivos del programa incluyen el fomento de la voluntad política en los países de bajos y medianos ingresos para comprometerse con la inmunización como prioridad, la comercialización social de las personas y las comunidades, el fortalecimiento de los sistemas de salud y la promoción de las innovaciones locales pertinentes en materia de investigación y desarrollo [61]. La vacunación contra la gripe durante el embarazo es segura, proporciona una protección materna razonable contra la gripe y también protege a los lactantes durante un período limitado de la infección por gripe confirmada (eficacia de la vacuna 63% en Bangladesh [63] y 50,4% en Sudáfrica [64] ). Sin embargo, a medida que los niveles de anticuerpos disminuyen bruscamente después del nacimiento, la protección de los lactantes no persiste mucho más allá de las 8 semanas [65]. Recientemente se ha demostrado que la vacunación contra el virus sincitial respiratorio en el embarazo es segura e inmunogénica, y se está llevando a cabo un ensayo clínico de fase 3 de eficacia para prevenir la enfermedad por el virus sincitial respiratorio en los lactantes [66]. El Plan de Acción Mundial Integrado de la OMS para la diarrea y la neumonía destaca muchas oportunidades para proteger, prevenir y tratar a los niños [68]. Las tasas de lactancia materna pueden mejorarse mediante programas que combinen intervenciones educativas y de asesoramiento en hogares, comunidades y centros de salud, y mediante la promoción de hospitales amigos de los bebés [69]. La mejora de la ventilación en el hogar, la utilización de combustibles más limpios para cocinar y la reducción de la exposición al humo de los cigarrillos son intervenciones esenciales para reducir la incidencia y la gravedad de la neumonía [70, 71]. La prevención del VIH pediátrico es posible mediante intervenciones para prevenir la transmisión de madre a hijo [72]. Las pruebas del VIH en la primera infancia y el inicio temprano de la terapia antirretroviral y la profilaxis del cotrimoxazol pueden reducir sustancialmente la incidencia de neumonía adquirida en la comunidad entre los niños infectados por el VIH [73]. Si estas intervenciones rentables se incrementaran, se estima que el 67% de las muertes por neumonía en países de ingresos bajos y medianos podrían prevenirse para 2025 [58]. El manejo de casos de neumonía es una estrategia por la cual la gravedad de la enfermedad se clasifica como grave o no grave. Todos los niños reciben antibióticos orales tempranos y apropiados y los casos graves se remiten a antibióticos parenteral. Cuando se implementan en áreas de alta carga antes de la disponibilidad de vacunas conjugadas, el manejo de casos como parte del Manejo Integrado de Enfermedades Infantiles se asocia con una disminución del 27% en la mortalidad infantil global, y una disminución del 42% en la mortalidad específica por neumonía [74]. Sin embargo, el predominio de las causas virales de neumonía y la baja mortalidad por casos han provocado preocupación por el uso excesivo de antibióticos. En dos estudios, realizados en Dinamarca y en la India, los resultados de los tratamientos con antibióticos y placebo fueron equivalentes [76, 77]. En el tercer estudio, en Pakistán, hubo una tasa de fracaso no significativa del 24% frente al 20% en el grupo placebo, que se consideró no equivalente al grupo antibiótico [75]. Además, debido a que la neumonía no grave y la bronquiolitis clasificadas por la OMS podrían considerarse dentro de un espectro de enfermedades respiratorias más bajas, muchos niños con neumonía clínica podrían tener bronquiolitis viral, para la que los antibióticos no son beneficiosos [79]. Esto se ha reflejado en las directrices nacionales británicas [33] y españolas [31] sobre neumonía, que no recomiendan el tratamiento antibiótico rutinario para niños menores de 2 años con evidencia de vacunación conjugada neumocócica que presentan neumonía no grave. Las directrices nacionales de los Estados Unidos recomiendan la retención de antibióticos en niños de hasta 5 años de edad que presenten neumonía no grave [32]. Sin embargo, dada la alta mortalidad por neumonía en los países de ingresos bajos y medianos, la falta de fácil acceso a la atención médica y la alta prevalencia de factores de riesgo para enfermedades graves, las directrices revisadas de la Organización Mundial de la Salud sobre la neumonía siguen recomendando el tratamiento antibiótico para todos los niños que cumplen las definiciones de casos de neumonía de la OMS [80]. El uso de oxígeno suplementario es vital, pero no está universalmente disponible en los países de ingresos bajos y medianos; se estima que el uso de sistemas de oxígeno suplementario podría reducir la mortalidad de los niños con neumonía hipoxica en un 20% [81]. Sin embargo, hasta el 81% de las muertes por neumonía en 2010 ocurrieron fuera de los centros de salud [5], por lo que hay grandes desafíos con el acceso a los servicios de salud y el comportamiento de las poblaciones vulnerables en busca de la salud. Identificar y cambiar las barreras para acceder a la atención de la salud es un área importante con el potencial de afectar la supervivencia y la salud de los niños más vulnerables [82]. Se ha avanzado mucho en la disminución de las muertes causadas por neumonía infantil. La mejora del estado socioeconómico y las vacunas, principalmente las vacunas conjugadas (contra Haemophilus influenzae y neumocococcus), han conducido a reducciones sustanciales en la incidencia y gravedad de la neumonía infantil. Estrategias más fuertes para prevenir y controlar el VIH han reducido las muertes por neumonía asociada al VIH. Sin embargo, a pesar de los cambios sustanciales en la incidencia, la etiología y la radiología a nivel mundial, persisten desigualdades en

¿Cuál es el aumento del riesgo de enfermedad respiratoria después de tener neumonía infantil?

Neumonía adquirida por la comunidad en niños: un espectro cambiante de enfermedadeshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5608782/SHA: eecb946b106a94f26a79a964f0160e8e16f79f42Autores: le Roux, David M.; Zar, Heather J. Fecha: 2017-09-21DOI: 10.1007/s00247-017-3827-8Licencia: cc-byAbstract: La neumonía sigue siendo la principal causa de muerte en niños fuera del período neonatal, a pesar de los avances en la prevención y el manejo. Las nuevas vacunas conjugadas contra Haemophilus influenzae tipo b y Streptococcus pneumoniae han contribuido a la disminución de los casos de neumonía radiológica, clínica y complicada y han reducido la hospitalización y la mortalidad; la importancia de las coinfecciones con múltiples patógenos y el predominio de enfermedades virales están surgiendo; se necesita un mejor acceso a estrategias preventivas y de manejo eficaces en los países de ingresos bajos y medios, mientras que se necesitan nuevas estrategias para abordar la carga residual de la enfermedad una vez que se han implementado. Texto: La neumonía ha sido la principal causa de muerte en niños menores de 5 años durante décadas; aunque ha habido una disminución sustancial de la mortalidad global infantil y de la mortalidad específica por neumonía, la neumonía sigue siendo la principal causa de muerte en niños fuera del período neonatal, causando aproximadamente 900.000 de los 6,3 millones de muertes infantiles estimadas en 2013 [1]. Se han producido avances sustanciales en la comprensión de los factores de riesgo y etiología de la neumonía, en el desarrollo de definiciones de casos estandarizadas y en la prevención con la producción de mejores vacunas y en el tratamiento, lo que ha dado lugar a cambios en la epidemiología, la etiología y la mortalidad por neumonía infantil; sin embargo, en muchas áreas el acceso a estas intervenciones sigue siendo subóptimo, con grandes desigualdades entre países y regiones. En este trabajo se analiza el impacto de los recientes avances preventivos y de manejo en la epidemiología, etiología, presentación radiológica y resultados en niños. La carga global de neumonía infantil se ha reducido sustancialmente en la última década, a pesar de un aumento de la población infantil mundial de 605 millones en 2000 a 664 millones en 2015 [2]. Datos recientes sugieren que ha habido una disminución del 25% en la incidencia de neumonía, de 0,29 episodios por año infantil en países de Esto está corroborado por una disminución del 58% en los años de vida ajustados a la discapacidad asociada a neumonía entre 1990 y 2013, de 186 millones a 78 millones, según se estima en el estudio Global Burden of Disease [1]. Las muertes por neumonía disminuyeron de 1,8 millones en 2000 a 900.000 en 2013 [1]. Estos datos no reflejan el pleno impacto del uso cada vez más generalizado de la vacuna conjugada antineumocócica en países de ingresos bajos y medianos, ya que es probable que la incidencia de neumonía y el número de muertes disminuyan aún más como resultado de esta intervención generalizada [4]. A pesar de este progreso, sigue habiendo una carga desproporcionada de enfermedad en países de ingresos bajos y medianos, donde se producen más del 90% de los casos de neumonía y muertes. La incidencia en países de ingresos altos se estima en 0,015 episodios por año infantil, en comparación con 0,22 episodios por año infantil en países de ingresos bajos En promedio, 1 de cada 66 niños de países de ingresos altos se ve afectado por neumonía al año, en comparación con 1 de cada 5 niños de países de ingresos bajos y medianos. Incluso en los países de ingresos bajos y medianos existen desigualdades y desafíos regionales con acceso a los servicios de atención de la salud: hasta el 81% de las muertes por neumonía grave ocurren fuera de un hospital [5]. Además de una mayor incidencia de neumonía, se estima que la tasa de mortalidad de los casos es casi 10 veces mayor en los países de ingresos bajos y medianos en comparación con los países de ingresos altos [3, 5]. La neumonía infantil también puede conducir a una morbilidad significativa y a enfermedades crónicas. La neumonía de la vida temprana puede perjudicar la salud pulmonar a largo plazo disminuyendo la función pulmonar [6]. La neumonía grave o recurrente puede tener un efecto peor en la función pulmonar; cada vez más evidencia sugiere que la enfermedad pulmonar obstructiva crónica podría estar relacionada con la neumonía infantil [7, Un metaanálisis del riesgo de resultados a largo plazo después de la neumonía infantil categorizó las secuelas respiratorias crónicas en grupos mayores (enfermedad pulmonar restrictiva, enfermedad pulmonar obstructiva, bronquiectasia) y menores (bronquitis crónica, asma, función pulmonar anormal) [9]. El riesgo de desarrollar al menos una de las secuelas principales se estimó en un 6% después de un evento de neumonía ambulatoria y en un 14% después de un episodio de neumonía hospitalizada. Debido a que las enfermedades respiratorias afectan a casi 1.000 millones de personas en todo el mundo y son una causa importante de mortalidad y morbilidad [10], la neumonía infantil podría contribuir a una morbilidad sustancial a lo largo de la vida. Los cambios radiológicos de tórax se han considerado el estándar de oro para definir un evento de neumonía [11] porque los hallazgos clínicos pueden ser subjetivos y las definiciones clínicas de neumonía pueden ser inespecíficas. En 2005, para ayudar a definir los resultados de los estudios de la vacuna antineumocócica, la descripción de la radiografía torácica estandarizada de la Organización Mundial de la Salud (OMS) definió un grupo de niños que se consideraban más propensos a tener neumonía neumocócica [12]. El término "consolidación de punto final" se describió como una opacidad densa o esponjosa que ocupa una porción o todo un lóbulo o todo el pulmón. "Otros infiltrados" incluyeron densidades lineales y irregulares, engrosamiento peribronquial, infiltrados menores parcheados que no son de magnitud suficiente para constituir una consolidación de punto final primaria, y pequeñas áreas de atelectasia que en los niños pueden ser difíciles de distinguir de la consolidación. "Neumonía de punto final primario" incluyó consolidación de punto final o un derrame pleural asociado con un El uso generalizado de la vacunación conjugada neumocócica y la vacunación conjugada Haemophilus influenzae tipo B ha disminuido la incidencia de neumonía radiológica. En una revisión de cuatro ensayos controlados aleatorizados y dos estudios de casos y controles de la vacunación conjugada Haemophilus influenzae tipo B en comunidades de alta carga, la vacunación se asoció con una disminución del 18% de la neumonía radiológica [13]. La introducción de la vacunación conjugada neumocócica se asoció con una disminución del 26% de la neumonía radiológica en California entre 1995 y 1998 [14]. En los ensayos de eficacia vacunal en países de ingresos bajos y medianos, la vacunación conjugada neumocócica redujo la neumonía radiológica en un 37% en Gambia [15], un 25% en Sudáfrica [16] y un 26% en Filipinas [17]. La definición de caso radiológico de la OMS no tenía por objeto distinguir la etiología bacteriana de la viral, sino definir un subconjunto de casos de neumonía en los que la infección neumocócica se consideraba más probable y proporcionar un conjunto de definiciones estandarizadas a través de las cuales los investigadores podrían lograr un amplio acuerdo en la notificación de radiografías torácicas. Sin embargo, a pesar de la amplia utilización en el campo, existe preocupación por la repetibilidad de los observadores. Ha habido un buen consenso en la descripción de la consolidación lobar pero un desacuerdo significativo en la descripción de infiltrados parcheados y perihilares [18, 19]. Además, muchos niños con enfermedad pulmonar clínicamente grave no tienen neumonía primaria de punto final: en un estudio previo a la vacunación conjugada con neumocócica, sólo el 34% de los niños hospitalizados con neumonía tenían neumonía primaria de punto final [20]. Se ha introducido una definición revisada de caso de "pneumonia bacteriana presumida", que incluye los casos de neumonía con consolidación alveolar definida por la OMS, así como aquellos con otros infiltrados radiográficos en el tórax anormales y una proteína C reactiva sérica de al menos 40 mg/L [21, 22]. Se ha demostrado que esta definición tiene mayor sensibilidad que la definición radiológica original de la OMS de neumonía primaria de punto final para detectar la carga de neumonía prevenida por la vacunación conjugada neumocócica [23]. Utilizando la definición revisada, la vacuna conjugada antineumocócica 10-valente (vacuna conjugada antineumocócica-10), tuvo una eficacia vacunal del 22% en la prevención de la presunta neumonía bacteriana en niños pequeños de América del Sur [22], y la vacunación conjugada antineumocócica-13 tuvo una eficacia vacunal del 39% en la prevención de la presunta neumonía bacteriana en niños mayores de 16 semanas que no estaban infectados con el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) en Sudáfrica [21]. Por lo tanto, hay evidencia convincente de que la vacunación conjugada antineumocócica disminuye la incidencia de neumonía radiológica; sin embargo, no hay evidencia que sugiera que la vacunación conjugada antineumocócica modifique la aparición radiológica de neumonía neumocócica. Se observó un aumento de la incidencia de empiema en niños en algunos países de altos ingresos tras la introducción de la vacuna conjugada neumocócica-7, lo que se atribuyó a los serotipos neumocócicos no incluidos en la vacunación conjugada neumocócica-7, especialmente 3 y 19A [24]. En los Estados Unidos, los datos de una base de datos hospitalaria nacional indican que la incidencia de empiema aumentó 1,9 veces entre 1996 y 2008 [25]. En Australia, la tasa de incidencia aumentó 1,4 veces al comparar el período de vacunación conjugada preneumocócica-7 (1998-2004) con el período de vacunación conjugada postneumocócica-7 (2005 a 2010] [26]. En Escocia, la incidencia de empiema en niños aumentó de 6,5 por millón entre 1981 y 1998, a 66 por millón en 2005 [ Los datos de los Estados Unidos sugieren que el empiema disminuyó en un 50% en niños menores de 5 años [28] ; de manera similar, los datos del Reino Unido y Escocia mostraron una reducción sustancial en el empiema pediátrico tras la introducción de la vacuna conjugada antineumocócica-13 [29, 30]. Varias directrices nacionales de países de altos ingresos, así como las recomendaciones de la OMS para los países de bajos y medianos ingresos, recomiendan que la radiografía torácica no se realice rutinariamente en niños con neumonía ambulatoria [31] [33]. Las indicaciones para la radiografía torácica incluyen hospitalización, hipoxemia grave o dificultad respiratoria, tratamiento antibiótico inicial fallido o sospecha de otras enfermedades (tuberculosis, cuerpo extranjero inhalado) o complicaciones. Además del efecto sobre la neumonía radiológica, la vacunación conjugada antineumocócica reduce el riesgo de hospitalización por neumonía viral, probablemente reduciendo las coinfecciones bacterianas virales que resultan en enfermedad grave y hospitalización [35]. Un análisis de estudios ecológicos y observacionales de incidencia de neumonía en diferentes grupos de edad poco después de la introducción de la vacunación conjugada antineumocócica-7 en Canadá, Italia, Australia, Polonia y los Estados Unidos mostró una disminución en las hospitalizaciones por neumonía de causa general que oscilaban entre el 15% y el 65% [36]. En los Estados Unidos después de la vacunación conjugada antineumocócica-13 sustituyó la vacunación conjugada antineumocócica-7, hubo una disminución adicional del 17% en las hospitalizaciones por neumonía entre los niños elegibles para la vacunación, y una disminución adicional del 12% entre los adultos no vacunados [28]. Una revisión sistemática de los estudios de etiología antes de la disponibilidad de nuevas vacunas conjugadas confirmó que S. pneumoniae y H. influenzae tipo B fueron las causas bacterianas más importantes de la neumonía, con Staphylococcus aureus y Klebsiella pneumoniae asociadas a algunos casos graves. El virus sincitial respiratorio fue la principal causa viral, identificada en 15-40% de los casos de neumonía, seguido de influenza A y B, parainfluenza, metapneumovirus humano y adenovirus [37]. Los metaanálisis más recientes de datos de etiología sugieren un perfil patógeno cambiante, con un creciente reconocimiento de que la neumonía clínica es causada por la interacción secuencial o concurrente de más de un organismo. La enfermedad grave en particular es causada por múltiples patógenos. En estudios recientes de casos de control, se detectó al menos un virus en el 87% de los casos de neumonía clínica en Sudáfrica [39], mientras que los virus se detectaron en el 81% de los casos de neumonía radiológica en Suecia [40]. En un amplio estudio multicéntrico en Estados Unidos, se detectaron patógenos virales en el 73% de los niños hospitalizados con neumonía radiológica, mientras que las bacterias se detectaron en sólo el 15% de los casos [41]. Un metaanálisis de 23 estudios de casos de control de etiología viral en neumonía confirmada radiológicamente en niños, completados hasta 2014, reportó buenas pruebas de atribución causal para el virus sincitial respiratorio, la gripe, el metapneumovirus y el virus parainfluenza [42]. Sin embargo, no hubo evidencia consistente de que muchos otros virus comúnmente descritos, como el rinovirus, el adenovirus, el boca Otra atribución de la etiología bacteriana es difícil porque a menudo no es posible distinguir la colonización de las bacterias patógenas cuando están aisladas de especímenes nasales [43]. Otra etiología es la tos ferina. En la última década también ha habido un resurgimiento en los casos de tos ferina, especialmente en los países de altos ingresos [44]. Debido a que la inmunidad a la tos ferina después de la vacunación con pertussis acelular es menos duradera que la inmunidad después de la infección de tipo salvaje o la vacunación con células enteras, muchas mujeres en edad fértil tienen niveles de anticuerpos contra la tos ferina menguante, por lo que sus bebés pueden nacer con niveles bajos de inmunoglobulina G antipertussis transplacental, lo que las hace susceptibles a la infección por tos ferina antes de completar la serie de vacunación primaria [45]. En 2014, se notificaron más de 40.000 casos de tos ferina a los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades en los Estados Unidos; en algunos estados, las tasas de incidencia basadas en la población son más altas que en cualquier otro momento en los últimos 70 años [44]. En cambio, la mayoría de los países de ingresos bajos y medianos utilizan vacunas contra la tos ferina de células enteras y el número de casos de tos ferina en esos países se mantuvo estable o disminuyó hasta 2015 [46]. Sin embargo, las pruebas recientes procedentes de Sudáfrica (donde se utiliza la vacuna acelular) muestran una incidencia apreciable de tos ferina entre los lactantes que presentan neumonía aguda: el 2% de los casos de neumonía clínica entre los lactantes incluidos en una cohorte de parto fueron causados por tos ferina [39], y el 3,7% de los lactantes y niños pequeños que se presentan a un hospital académico terciario tenían pruebas de infección por tos ferina [47] Del mismo modo, la tuberculosis infantil es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en muchos países de ingresos bajos y medianos, y la tuberculosis de Mycobacterium ha sido reconocida cada vez más como un patógeno en la neumonía aguda en niños que viven en entornos de alta prevalencia de la tuberculosis. Los estudios postmortem de niños que mueren de enfermedades respiratorias agudas han reportado comúnmente M. tuberculosis [48, 49]. Una revisión sistemática reciente de la tuberculosis como comorbilidad de la neumonía infantil reportó enfermedad confirmada por el cultivo en aproximadamente el 8% de los casos [50]. Debido a que la tuberculosis intratorácica es sólo una enfermedad confirmada por el cultivo en una minoría de casos, la carga real podría ser aún mayor; la tuberculosis podría ser un factor importante para la incidencia de neumonía infantil y la mortalidad en las zonas de alta prevalencia. Debido a la efectividad de la vacunación conjugada neumocócica y la vacuna conjugada Haemophilus influenzae tipo B para la prevención de la neumonía radiológica y clínica, la vacunación incompleta o inadecuada debe considerarse un factor de riesgo importante para la neumonía infantil. Otros factores de riesgo incluyen el bajo peso al nacer, que se asocia con 3,2 veces mayores probabilidades de neumonía grave en los países de ingresos bajos y medianos y 1,8 veces mayores probabilidades en los países de ingresos altos [51]. Del mismo modo, la falta de lactancia materna exclusiva durante los primeros 4 meses de vida aumenta las probabilidades de neumonía grave en 2,7 veces en los países de ingresos bajos y medianos y 1,3 veces en los países de ingresos altos. La contaminación del aire en el interior por el uso de combustibles sólidos o de biomasa aumenta las probabilidades de neumonía en 1,6 veces; la falta de vacunación contra el sarampión al final del primer año de edad aumenta las probabilidades de neumonía en 1,8 veces [51]. Se estima que la prevalencia de estos factores críticos de riesgo en los países de ingresos bajos y medianos disminuyó en un 25% entre 2000 y 2010, contribuyendo a reducir la incidencia de neumonía y la mortalidad en los países de ingresos bajos y medianos, incluso en los países donde no se dispone de vacunas conjugadas [3]. El factor de riesgo único más fuerte para la neumonía es la infección por el VIH, que es especialmente frecuente en los niños del África subsahariana. Los niños infectados por el VIH tienen 6 veces más probabilidades de desarrollar neumonía grave o de muerte que los niños no infectados por el VIH [52]. Desde la prevención efectiva de la transmisión del VIH de madre a hijo, hay una población creciente de niños expuestos al VIH que no están infectados; su exceso de riesgo de neumonía, en comparación con los niños no expuestos al VIH, se ha descrito como de 1,3 a 3,4 veces mayor [53] [54] [56] [57]. La vacunación antineumocócica conjugada y la vacunación conjugada Haemophilus influenzae tipo B han sido instrumentos eficaces para reducir la incidencia, la gravedad y la mortalidad de la neumonía [58, 59]. Sin embargo, la cobertura equitativa y el acceso a las vacunas siguen siendo sub-óptimos. A finales de 2015, se había introducido la vacunación conjugada Haemophilus influenzae tipo B en 73 países, con una cobertura global estimada en 68%. Sin embargo, las desigualdades siguen siendo evidentes entre las regiones: en las Américas la cobertura se estima en 90%, mientras que en el Para 2015, se había introducido la vacunación conjugada antineumocócica en 54 países, con cobertura global de 35% para tres dosis de vacunación conjugada antineumocócica para la población infantil [60]. Para hacer frente a este problema, se puso en marcha la iniciativa del Plan Mundial de Acceso a Vacunas de la OMS para hacer más equitativa la disponibilidad de vacunas que salvan vidas. Además de garantizar la financiación de las vacunas, los objetivos del programa incluyen el fomento de la voluntad política en los países de bajos y medianos ingresos para comprometerse con la inmunización como prioridad, la comercialización social de las personas y las comunidades, el fortalecimiento de los sistemas de salud y la promoción de las innovaciones locales pertinentes en materia de investigación y desarrollo [61]. La vacunación contra la gripe durante el embarazo es segura, proporciona una protección materna razonable contra la gripe y también protege a los lactantes durante un período limitado de la infección por gripe confirmada (eficacia de la vacuna 63% en Bangladesh [63] y 50,4% en Sudáfrica [64] ). Sin embargo, a medida que los niveles de anticuerpos disminuyen bruscamente después del nacimiento, la protección de los lactantes no persiste mucho más allá de las 8 semanas [65]. Recientemente se ha demostrado que la vacunación contra el virus sincitial respiratorio en el embarazo es segura e inmunogénica, y se está llevando a cabo un ensayo clínico de fase 3 de eficacia para prevenir la enfermedad por el virus sincitial respiratorio en los lactantes [66]. El Plan de Acción Mundial Integrado de la OMS para la diarrea y la neumonía destaca muchas oportunidades para proteger, prevenir y tratar a los niños [68]. Las tasas de lactancia materna pueden mejorarse mediante programas que combinen intervenciones educativas y de asesoramiento en hogares, comunidades y centros de salud, y mediante la promoción de hospitales amigos de los bebés [69]. La mejora de la ventilación en el hogar, la utilización de combustibles más limpios para cocinar y la reducción de la exposición al humo de los cigarrillos son intervenciones esenciales para reducir la incidencia y la gravedad de la neumonía [70, 71]. La prevención del VIH pediátrico es posible mediante intervenciones para prevenir la transmisión de madre a hijo [72]. Las pruebas del VIH en la primera infancia y el inicio temprano de la terapia antirretroviral y la profilaxis del cotrimoxazol pueden reducir sustancialmente la incidencia de neumonía adquirida en la comunidad entre los niños infectados por el VIH [73]. Si estas intervenciones rentables se incrementaran, se estima que el 67% de las muertes por neumonía en países de ingresos bajos y medianos podrían prevenirse para 2025 [58]. El manejo de casos de neumonía es una estrategia por la cual la gravedad de la enfermedad se clasifica como grave o no grave. Todos los niños reciben antibióticos orales tempranos y apropiados y los casos graves se remiten a antibióticos parenteral. Cuando se implementan en áreas de alta carga antes de la disponibilidad de vacunas conjugadas, el manejo de casos como parte del Manejo Integrado de Enfermedades Infantiles se asocia con una disminución del 27% en la mortalidad infantil global, y una disminución del 42% en la mortalidad específica por neumonía [74]. Sin embargo, el predominio de las causas virales de neumonía y la baja mortalidad por casos han provocado preocupación por el uso excesivo de antibióticos. En dos estudios, realizados en Dinamarca y en la India, los resultados de los tratamientos con antibióticos y placebo fueron equivalentes [76, 77]. En el tercer estudio, en Pakistán, hubo una tasa de fracaso no significativa del 24% frente al 20% en el grupo placebo, que se consideró no equivalente al grupo antibiótico [75]. Además, debido a que la neumonía no grave y la bronquiolitis clasificadas por la OMS podrían considerarse dentro de un espectro de enfermedades respiratorias más bajas, muchos niños con neumonía clínica podrían tener bronquiolitis viral, para la que los antibióticos no son beneficiosos [79]. Esto se ha reflejado en las directrices nacionales británicas [33] y españolas [31] sobre neumonía, que no recomiendan el tratamiento antibiótico rutinario para niños menores de 2 años con evidencia de vacunación conjugada neumocócica que presentan neumonía no grave. Las directrices nacionales de los Estados Unidos recomiendan la retención de antibióticos en niños de hasta 5 años de edad que presenten neumonía no grave [32]. Sin embargo, dada la alta mortalidad por neumonía en los países de ingresos bajos y medianos, la falta de fácil acceso a la atención médica y la alta prevalencia de factores de riesgo para enfermedades graves, las directrices revisadas de la Organización Mundial de la Salud sobre la neumonía siguen recomendando el tratamiento antibiótico para todos los niños que cumplen las definiciones de casos de neumonía de la OMS [80]. El uso de oxígeno suplementario es vital, pero no está universalmente disponible en los países de ingresos bajos y medianos; se estima que el uso de sistemas de oxígeno suplementario podría reducir la mortalidad de los niños con neumonía hipoxica en un 20% [81]. Sin embargo, hasta el 81% de las muertes por neumonía en 2010 ocurrieron fuera de los centros de salud [5], por lo que hay grandes desafíos con el acceso a los servicios de salud y el comportamiento de las poblaciones vulnerables en busca de la salud. Identificar y cambiar las barreras para acceder a la atención de la salud es un área importante con el potencial de afectar la supervivencia y la salud de los niños más vulnerables [82]. Se ha avanzado mucho en la disminución de las muertes causadas por neumonía infantil. La mejora del estado socioeconómico y las vacunas, principalmente las vacunas conjugadas (contra Haemophilus influenzae y neumocococcus), han conducido a reducciones sustanciales en la incidencia y gravedad de la neumonía infantil. Estrategias más fuertes para prevenir y controlar el VIH han reducido las muertes por neumonía asociada al VIH. Sin embargo, a pesar de los cambios sustanciales en la incidencia, la etiología y la radiología a nivel mundial, persisten desigualdades en

¿Qué es responsable de la reducción de la neumonía radiológica?

Neumonía adquirida por la comunidad en niños: un espectro cambiante de enfermedadeshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5608782/SHA: eecb946b106a94f26a79a964f0160e8e16f79f42Autores: le Roux, David M.; Zar, Heather J. Fecha: 2017-09-21DOI: 10.1007/s00247-017-3827-8Licencia: cc-byAbstract: La neumonía sigue siendo la principal causa de muerte en niños fuera del período neonatal, a pesar de los avances en la prevención y el manejo. Las nuevas vacunas conjugadas contra Haemophilus influenzae tipo b y Streptococcus pneumoniae han contribuido a la disminución de los casos de neumonía radiológica, clínica y complicada y han reducido la hospitalización y la mortalidad; la importancia de las coinfecciones con múltiples patógenos y el predominio de enfermedades virales están surgiendo; se necesita un mejor acceso a estrategias preventivas y de manejo eficaces en los países de ingresos bajos y medios, mientras que se necesitan nuevas estrategias para abordar la carga residual de la enfermedad una vez que se han implementado. Texto: La neumonía ha sido la principal causa de muerte en niños menores de 5 años durante décadas; aunque ha habido una disminución sustancial de la mortalidad global infantil y de la mortalidad específica por neumonía, la neumonía sigue siendo la principal causa de muerte en niños fuera del período neonatal, causando aproximadamente 900.000 de los 6,3 millones de muertes infantiles estimadas en 2013 [1]. Se han producido avances sustanciales en la comprensión de los factores de riesgo y etiología de la neumonía, en el desarrollo de definiciones de casos estandarizadas y en la prevención con la producción de mejores vacunas y en el tratamiento, lo que ha dado lugar a cambios en la epidemiología, la etiología y la mortalidad por neumonía infantil; sin embargo, en muchas áreas el acceso a estas intervenciones sigue siendo subóptimo, con grandes desigualdades entre países y regiones. En este trabajo se analiza el impacto de los recientes avances preventivos y de manejo en la epidemiología, etiología, presentación radiológica y resultados en niños. La carga global de neumonía infantil se ha reducido sustancialmente en la última década, a pesar de un aumento de la población infantil mundial de 605 millones en 2000 a 664 millones en 2015 [2]. Datos recientes sugieren que ha habido una disminución del 25% en la incidencia de neumonía, de 0,29 episodios por año infantil en países de Esto está corroborado por una disminución del 58% en los años de vida ajustados a la discapacidad asociada a neumonía entre 1990 y 2013, de 186 millones a 78 millones, según se estima en el estudio Global Burden of Disease [1]. Las muertes por neumonía disminuyeron de 1,8 millones en 2000 a 900.000 en 2013 [1]. Estos datos no reflejan el pleno impacto del uso cada vez más generalizado de la vacuna conjugada antineumocócica en países de ingresos bajos y medianos, ya que es probable que la incidencia de neumonía y el número de muertes disminuyan aún más como resultado de esta intervención generalizada [4]. A pesar de este progreso, sigue habiendo una carga desproporcionada de enfermedad en países de ingresos bajos y medianos, donde se producen más del 90% de los casos de neumonía y muertes. La incidencia en países de ingresos altos se estima en 0,015 episodios por año infantil, en comparación con 0,22 episodios por año infantil en países de ingresos bajos En promedio, 1 de cada 66 niños de países de ingresos altos se ve afectado por neumonía al año, en comparación con 1 de cada 5 niños de países de ingresos bajos y medianos. Incluso en los países de ingresos bajos y medianos existen desigualdades y desafíos regionales con acceso a los servicios de atención de la salud: hasta el 81% de las muertes por neumonía grave ocurren fuera de un hospital [5]. Además de una mayor incidencia de neumonía, se estima que la tasa de mortalidad de los casos es casi 10 veces mayor en los países de ingresos bajos y medianos en comparación con los países de ingresos altos [3, 5]. La neumonía infantil también puede conducir a una morbilidad significativa y a enfermedades crónicas. La neumonía de la vida temprana puede perjudicar la salud pulmonar a largo plazo disminuyendo la función pulmonar [6]. La neumonía grave o recurrente puede tener un efecto peor en la función pulmonar; cada vez más evidencia sugiere que la enfermedad pulmonar obstructiva crónica podría estar relacionada con la neumonía infantil [7, Un metaanálisis del riesgo de resultados a largo plazo después de la neumonía infantil categorizó las secuelas respiratorias crónicas en grupos mayores (enfermedad pulmonar restrictiva, enfermedad pulmonar obstructiva, bronquiectasia) y menores (bronquitis crónica, asma, función pulmonar anormal) [9]. El riesgo de desarrollar al menos una de las secuelas principales se estimó en un 6% después de un evento de neumonía ambulatoria y en un 14% después de un episodio de neumonía hospitalizada. Debido a que las enfermedades respiratorias afectan a casi 1.000 millones de personas en todo el mundo y son una causa importante de mortalidad y morbilidad [10], la neumonía infantil podría contribuir a una morbilidad sustancial a lo largo de la vida. Los cambios radiológicos de tórax se han considerado el estándar de oro para definir un evento de neumonía [11] porque los hallazgos clínicos pueden ser subjetivos y las definiciones clínicas de neumonía pueden ser inespecíficas. En 2005, para ayudar a definir los resultados de los estudios de la vacuna antineumocócica, la descripción de la radiografía torácica estandarizada de la Organización Mundial de la Salud (OMS) definió un grupo de niños que se consideraban más propensos a tener neumonía neumocócica [12]. El término "consolidación de punto final" se describió como una opacidad densa o esponjosa que ocupa una porción o todo un lóbulo o todo el pulmón. "Otros infiltrados" incluyeron densidades lineales y irregulares, engrosamiento peribronquial, infiltrados menores parcheados que no son de magnitud suficiente para constituir una consolidación de punto final primaria, y pequeñas áreas de atelectasia que en los niños pueden ser difíciles de distinguir de la consolidación. "Neumonía de punto final primario" incluyó consolidación de punto final o un derrame pleural asociado con un El uso generalizado de la vacunación conjugada neumocócica y la vacunación conjugada Haemophilus influenzae tipo B ha disminuido la incidencia de neumonía radiológica. En una revisión de cuatro ensayos controlados aleatorizados y dos estudios de casos y controles de la vacunación conjugada Haemophilus influenzae tipo B en comunidades de alta carga, la vacunación se asoció con una disminución del 18% de la neumonía radiológica [13]. La introducción de la vacunación conjugada neumocócica se asoció con una disminución del 26% de la neumonía radiológica en California entre 1995 y 1998 [14]. En los ensayos de eficacia vacunal en países de ingresos bajos y medianos, la vacunación conjugada neumocócica redujo la neumonía radiológica en un 37% en Gambia [15], un 25% en Sudáfrica [16] y un 26% en Filipinas [17]. La definición de caso radiológico de la OMS no tenía por objeto distinguir la etiología bacteriana de la viral, sino definir un subconjunto de casos de neumonía en los que la infección neumocócica se consideraba más probable y proporcionar un conjunto de definiciones estandarizadas a través de las cuales los investigadores podrían lograr un amplio acuerdo en la notificación de radiografías torácicas. Sin embargo, a pesar de la amplia utilización en el campo, existe preocupación por la repetibilidad de los observadores. Ha habido un buen consenso en la descripción de la consolidación lobar pero un desacuerdo significativo en la descripción de infiltrados parcheados y perihilares [18, 19]. Además, muchos niños con enfermedad pulmonar clínicamente grave no tienen neumonía primaria de punto final: en un estudio previo a la vacunación conjugada con neumocócica, sólo el 34% de los niños hospitalizados con neumonía tenían neumonía primaria de punto final [20]. Se ha introducido una definición revisada de caso de "pneumonia bacteriana presumida", que incluye los casos de neumonía con consolidación alveolar definida por la OMS, así como aquellos con otros infiltrados radiográficos en el tórax anormales y una proteína C reactiva sérica de al menos 40 mg/L [21, 22]. Se ha demostrado que esta definición tiene mayor sensibilidad que la definición radiológica original de la OMS de neumonía primaria de punto final para detectar la carga de neumonía prevenida por la vacunación conjugada neumocócica [23]. Utilizando la definición revisada, la vacuna conjugada antineumocócica 10-valente (vacuna conjugada antineumocócica-10), tuvo una eficacia vacunal del 22% en la prevención de la presunta neumonía bacteriana en niños pequeños de América del Sur [22], y la vacunación conjugada antineumocócica-13 tuvo una eficacia vacunal del 39% en la prevención de la presunta neumonía bacteriana en niños mayores de 16 semanas que no estaban infectados con el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) en Sudáfrica [21]. Por lo tanto, hay evidencia convincente de que la vacunación conjugada antineumocócica disminuye la incidencia de neumonía radiológica; sin embargo, no hay evidencia que sugiera que la vacunación conjugada antineumocócica modifique la aparición radiológica de neumonía neumocócica. Se observó un aumento de la incidencia de empiema en niños en algunos países de altos ingresos tras la introducción de la vacuna conjugada neumocócica-7, lo que se atribuyó a los serotipos neumocócicos no incluidos en la vacunación conjugada neumocócica-7, especialmente 3 y 19A [24]. En los Estados Unidos, los datos de una base de datos hospitalaria nacional indican que la incidencia de empiema aumentó 1,9 veces entre 1996 y 2008 [25]. En Australia, la tasa de incidencia aumentó 1,4 veces al comparar el período de vacunación conjugada preneumocócica-7 (1998-2004) con el período de vacunación conjugada postneumocócica-7 (2005 a 2010] [26]. En Escocia, la incidencia de empiema en niños aumentó de 6,5 por millón entre 1981 y 1998, a 66 por millón en 2005 [ Los datos de los Estados Unidos sugieren que el empiema disminuyó en un 50% en niños menores de 5 años [28] ; de manera similar, los datos del Reino Unido y Escocia mostraron una reducción sustancial en el empiema pediátrico tras la introducción de la vacuna conjugada antineumocócica-13 [29, 30]. Varias directrices nacionales de países de altos ingresos, así como las recomendaciones de la OMS para los países de bajos y medianos ingresos, recomiendan que la radiografía torácica no se realice rutinariamente en niños con neumonía ambulatoria [31] [33]. Las indicaciones para la radiografía torácica incluyen hospitalización, hipoxemia grave o dificultad respiratoria, tratamiento antibiótico inicial fallido o sospecha de otras enfermedades (tuberculosis, cuerpo extranjero inhalado) o complicaciones. Además del efecto sobre la neumonía radiológica, la vacunación conjugada antineumocócica reduce el riesgo de hospitalización por neumonía viral, probablemente reduciendo las coinfecciones bacterianas virales que resultan en enfermedad grave y hospitalización [35]. Un análisis de estudios ecológicos y observacionales de incidencia de neumonía en diferentes grupos de edad poco después de la introducción de la vacunación conjugada antineumocócica-7 en Canadá, Italia, Australia, Polonia y los Estados Unidos mostró una disminución en las hospitalizaciones por neumonía de causa general que oscilaban entre el 15% y el 65% [36]. En los Estados Unidos después de la vacunación conjugada antineumocócica-13 sustituyó la vacunación conjugada antineumocócica-7, hubo una disminución adicional del 17% en las hospitalizaciones por neumonía entre los niños elegibles para la vacunación, y una disminución adicional del 12% entre los adultos no vacunados [28]. Una revisión sistemática de los estudios de etiología antes de la disponibilidad de nuevas vacunas conjugadas confirmó que S. pneumoniae y H. influenzae tipo B fueron las causas bacterianas más importantes de la neumonía, con Staphylococcus aureus y Klebsiella pneumoniae asociadas a algunos casos graves. El virus sincitial respiratorio fue la principal causa viral, identificada en 15-40% de los casos de neumonía, seguido de influenza A y B, parainfluenza, metapneumovirus humano y adenovirus [37]. Los metaanálisis más recientes de datos de etiología sugieren un perfil patógeno cambiante, con un creciente reconocimiento de que la neumonía clínica es causada por la interacción secuencial o concurrente de más de un organismo. La enfermedad grave en particular es causada por múltiples patógenos. En estudios recientes de casos de control, se detectó al menos un virus en el 87% de los casos de neumonía clínica en Sudáfrica [39], mientras que los virus se detectaron en el 81% de los casos de neumonía radiológica en Suecia [40]. En un amplio estudio multicéntrico en Estados Unidos, se detectaron patógenos virales en el 73% de los niños hospitalizados con neumonía radiológica, mientras que las bacterias se detectaron en sólo el 15% de los casos [41]. Un metaanálisis de 23 estudios de casos de control de etiología viral en neumonía confirmada radiológicamente en niños, completados hasta 2014, reportó buenas pruebas de atribución causal para el virus sincitial respiratorio, la gripe, el metapneumovirus y el virus parainfluenza [42]. Sin embargo, no hubo evidencia consistente de que muchos otros virus comúnmente descritos, como el rinovirus, el adenovirus, el boca Otra atribución de la etiología bacteriana es difícil porque a menudo no es posible distinguir la colonización de las bacterias patógenas cuando están aisladas de especímenes nasales [43]. Otra etiología es la tos ferina. En la última década también ha habido un resurgimiento en los casos de tos ferina, especialmente en los países de altos ingresos [44]. Debido a que la inmunidad a la tos ferina después de la vacunación con pertussis acelular es menos duradera que la inmunidad después de la infección de tipo salvaje o la vacunación con células enteras, muchas mujeres en edad fértil tienen niveles de anticuerpos contra la tos ferina menguante, por lo que sus bebés pueden nacer con niveles bajos de inmunoglobulina G antipertussis transplacental, lo que las hace susceptibles a la infección por tos ferina antes de completar la serie de vacunación primaria [45]. En 2014, se notificaron más de 40.000 casos de tos ferina a los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades en los Estados Unidos; en algunos estados, las tasas de incidencia basadas en la población son más altas que en cualquier otro momento en los últimos 70 años [44]. En cambio, la mayoría de los países de ingresos bajos y medianos utilizan vacunas contra la tos ferina de células enteras y el número de casos de tos ferina en esos países se mantuvo estable o disminuyó hasta 2015 [46]. Sin embargo, las pruebas recientes procedentes de Sudáfrica (donde se utiliza la vacuna acelular) muestran una incidencia apreciable de tos ferina entre los lactantes que presentan neumonía aguda: el 2% de los casos de neumonía clínica entre los lactantes incluidos en una cohorte de parto fueron causados por tos ferina [39], y el 3,7% de los lactantes y niños pequeños que se presentan a un hospital académico terciario tenían pruebas de infección por tos ferina [47] Del mismo modo, la tuberculosis infantil es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en muchos países de ingresos bajos y medianos, y la tuberculosis de Mycobacterium ha sido reconocida cada vez más como un patógeno en la neumonía aguda en niños que viven en entornos de alta prevalencia de la tuberculosis. Los estudios postmortem de niños que mueren de enfermedades respiratorias agudas han reportado comúnmente M. tuberculosis [48, 49]. Una revisión sistemática reciente de la tuberculosis como comorbilidad de la neumonía infantil reportó enfermedad confirmada por el cultivo en aproximadamente el 8% de los casos [50]. Debido a que la tuberculosis intratorácica es sólo una enfermedad confirmada por el cultivo en una minoría de casos, la carga real podría ser aún mayor; la tuberculosis podría ser un factor importante para la incidencia de neumonía infantil y la mortalidad en las zonas de alta prevalencia. Debido a la efectividad de la vacunación conjugada neumocócica y la vacuna conjugada Haemophilus influenzae tipo B para la prevención de la neumonía radiológica y clínica, la vacunación incompleta o inadecuada debe considerarse un factor de riesgo importante para la neumonía infantil. Otros factores de riesgo incluyen el bajo peso al nacer, que se asocia con 3,2 veces mayores probabilidades de neumonía grave en los países de ingresos bajos y medianos y 1,8 veces mayores probabilidades en los países de ingresos altos [51]. Del mismo modo, la falta de lactancia materna exclusiva durante los primeros 4 meses de vida aumenta las probabilidades de neumonía grave en 2,7 veces en los países de ingresos bajos y medianos y 1,3 veces en los países de ingresos altos. La contaminación del aire en el interior por el uso de combustibles sólidos o de biomasa aumenta las probabilidades de neumonía en 1,6 veces; la falta de vacunación contra el sarampión al final del primer año de edad aumenta las probabilidades de neumonía en 1,8 veces [51]. Se estima que la prevalencia de estos factores críticos de riesgo en los países de ingresos bajos y medianos disminuyó en un 25% entre 2000 y 2010, contribuyendo a reducir la incidencia de neumonía y la mortalidad en los países de ingresos bajos y medianos, incluso en los países donde no se dispone de vacunas conjugadas [3]. El factor de riesgo único más fuerte para la neumonía es la infección por el VIH, que es especialmente frecuente en los niños del África subsahariana. Los niños infectados por el VIH tienen 6 veces más probabilidades de desarrollar neumonía grave o de muerte que los niños no infectados por el VIH [52]. Desde la prevención efectiva de la transmisión del VIH de madre a hijo, hay una población creciente de niños expuestos al VIH que no están infectados; su exceso de riesgo de neumonía, en comparación con los niños no expuestos al VIH, se ha descrito como de 1,3 a 3,4 veces mayor [53] [54] [56] [57]. La vacunación antineumocócica conjugada y la vacunación conjugada Haemophilus influenzae tipo B han sido instrumentos eficaces para reducir la incidencia, la gravedad y la mortalidad de la neumonía [58, 59]. Sin embargo, la cobertura equitativa y el acceso a las vacunas siguen siendo sub-óptimos. A finales de 2015, se había introducido la vacunación conjugada Haemophilus influenzae tipo B en 73 países, con una cobertura global estimada en 68%. Sin embargo, las desigualdades siguen siendo evidentes entre las regiones: en las Américas la cobertura se estima en 90%, mientras que en el Para 2015, se había introducido la vacunación conjugada antineumocócica en 54 países, con cobertura global de 35% para tres dosis de vacunación conjugada antineumocócica para la población infantil [60]. Para hacer frente a este problema, se puso en marcha la iniciativa del Plan Mundial de Acceso a Vacunas de la OMS para hacer más equitativa la disponibilidad de vacunas que salvan vidas. Además de garantizar la financiación de las vacunas, los objetivos del programa incluyen el fomento de la voluntad política en los países de bajos y medianos ingresos para comprometerse con la inmunización como prioridad, la comercialización social de las personas y las comunidades, el fortalecimiento de los sistemas de salud y la promoción de las innovaciones locales pertinentes en materia de investigación y desarrollo [61]. La vacunación contra la gripe durante el embarazo es segura, proporciona una protección materna razonable contra la gripe y también protege a los lactantes durante un período limitado de la infección por gripe confirmada (eficacia de la vacuna 63% en Bangladesh [63] y 50,4% en Sudáfrica [64] ). Sin embargo, a medida que los niveles de anticuerpos disminuyen bruscamente después del nacimiento, la protección de los lactantes no persiste mucho más allá de las 8 semanas [65]. Recientemente se ha demostrado que la vacunación contra el virus sincitial respiratorio en el embarazo es segura e inmunogénica, y se está llevando a cabo un ensayo clínico de fase 3 de eficacia para prevenir la enfermedad por el virus sincitial respiratorio en los lactantes [66]. El Plan de Acción Mundial Integrado de la OMS para la diarrea y la neumonía destaca muchas oportunidades para proteger, prevenir y tratar a los niños [68]. Las tasas de lactancia materna pueden mejorarse mediante programas que combinen intervenciones educativas y de asesoramiento en hogares, comunidades y centros de salud, y mediante la promoción de hospitales amigos de los bebés [69]. La mejora de la ventilación en el hogar, la utilización de combustibles más limpios para cocinar y la reducción de la exposición al humo de los cigarrillos son intervenciones esenciales para reducir la incidencia y la gravedad de la neumonía [70, 71]. La prevención del VIH pediátrico es posible mediante intervenciones para prevenir la transmisión de madre a hijo [72]. Las pruebas del VIH en la primera infancia y el inicio temprano de la terapia antirretroviral y la profilaxis del cotrimoxazol pueden reducir sustancialmente la incidencia de neumonía adquirida en la comunidad entre los niños infectados por el VIH [73]. Si estas intervenciones rentables se incrementaran, se estima que el 67% de las muertes por neumonía en países de ingresos bajos y medianos podrían prevenirse para 2025 [58]. El manejo de casos de neumonía es una estrategia por la cual la gravedad de la enfermedad se clasifica como grave o no grave. Todos los niños reciben antibióticos orales tempranos y apropiados y los casos graves se remiten a antibióticos parenteral. Cuando se implementan en áreas de alta carga antes de la disponibilidad de vacunas conjugadas, el manejo de casos como parte del Manejo Integrado de Enfermedades Infantiles se asocia con una disminución del 27% en la mortalidad infantil global, y una disminución del 42% en la mortalidad específica por neumonía [74]. Sin embargo, el predominio de las causas virales de neumonía y la baja mortalidad por casos han provocado preocupación por el uso excesivo de antibióticos. En dos estudios, realizados en Dinamarca y en la India, los resultados de los tratamientos con antibióticos y placebo fueron equivalentes [76, 77]. En el tercer estudio, en Pakistán, hubo una tasa de fracaso no significativa del 24% frente al 20% en el grupo placebo, que se consideró no equivalente al grupo antibiótico [75]. Además, debido a que la neumonía no grave y la bronquiolitis clasificadas por la OMS podrían considerarse dentro de un espectro de enfermedades respiratorias más bajas, muchos niños con neumonía clínica podrían tener bronquiolitis viral, para la que los antibióticos no son beneficiosos [79]. Esto se ha reflejado en las directrices nacionales británicas [33] y españolas [31] sobre neumonía, que no recomiendan el tratamiento antibiótico rutinario para niños menores de 2 años con evidencia de vacunación conjugada neumocócica que presentan neumonía no grave. Las directrices nacionales de los Estados Unidos recomiendan la retención de antibióticos en niños de hasta 5 años de edad que presenten neumonía no grave [32]. Sin embargo, dada la alta mortalidad por neumonía en los países de ingresos bajos y medianos, la falta de fácil acceso a la atención médica y la alta prevalencia de factores de riesgo para enfermedades graves, las directrices revisadas de la Organización Mundial de la Salud sobre la neumonía siguen recomendando el tratamiento antibiótico para todos los niños que cumplen las definiciones de casos de neumonía de la OMS [80]. El uso de oxígeno suplementario es vital, pero no está universalmente disponible en los países de ingresos bajos y medianos; se estima que el uso de sistemas de oxígeno suplementario podría reducir la mortalidad de los niños con neumonía hipoxica en un 20% [81]. Sin embargo, hasta el 81% de las muertes por neumonía en 2010 ocurrieron fuera de los centros de salud [5], por lo que hay grandes desafíos con el acceso a los servicios de salud y el comportamiento de las poblaciones vulnerables en busca de la salud. Identificar y cambiar las barreras para acceder a la atención de la salud es un área importante con el potencial de afectar la supervivencia y la salud de los niños más vulnerables [82]. Se ha avanzado mucho en la disminución de las muertes causadas por neumonía infantil. La mejora del estado socioeconómico y las vacunas, principalmente las vacunas conjugadas (contra Haemophilus influenzae y neumocococcus), han conducido a reducciones sustanciales en la incidencia y gravedad de la neumonía infantil. Estrategias más fuertes para prevenir y controlar el VIH han reducido las muertes por neumonía asociada al VIH. Sin embargo, a pesar de los cambios sustanciales en la incidencia, la etiología y la radiología a nivel mundial, persisten desigualdades en

¿Cuál es la reducción de la neumonía bacteriana bajo la definición revisada de la OMS de neumonía bacteriana?

Neumonía adquirida por la comunidad en niños: un espectro cambiante de enfermedadeshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5608782/SHA: eecb946b106a94f26a79a964f0160e8e16f79f42Autores: le Roux, David M.; Zar, Heather J. Fecha: 2017-09-21DOI: 10.1007/s00247-017-3827-8Licencia: cc-byAbstract: La neumonía sigue siendo la principal causa de muerte en niños fuera del período neonatal, a pesar de los avances en la prevención y el manejo. Las nuevas vacunas conjugadas contra Haemophilus influenzae tipo b y Streptococcus pneumoniae han contribuido a la disminución de los casos de neumonía radiológica, clínica y complicada y han reducido la hospitalización y la mortalidad; la importancia de las coinfecciones con múltiples patógenos y el predominio de enfermedades virales están surgiendo; se necesita un mejor acceso a estrategias preventivas y de manejo eficaces en los países de ingresos bajos y medios, mientras que se necesitan nuevas estrategias para abordar la carga residual de la enfermedad una vez que se han implementado. Texto: La neumonía ha sido la principal causa de muerte en niños menores de 5 años durante décadas; aunque ha habido una disminución sustancial de la mortalidad global infantil y de la mortalidad específica por neumonía, la neumonía sigue siendo la principal causa de muerte en niños fuera del período neonatal, causando aproximadamente 900.000 de los 6,3 millones de muertes infantiles estimadas en 2013 [1]. Se han producido avances sustanciales en la comprensión de los factores de riesgo y etiología de la neumonía, en el desarrollo de definiciones de casos estandarizadas y en la prevención con la producción de mejores vacunas y en el tratamiento, lo que ha dado lugar a cambios en la epidemiología, la etiología y la mortalidad por neumonía infantil; sin embargo, en muchas áreas el acceso a estas intervenciones sigue siendo subóptimo, con grandes desigualdades entre países y regiones. En este trabajo se analiza el impacto de los recientes avances preventivos y de manejo en la epidemiología, etiología, presentación radiológica y resultados en niños. La carga global de neumonía infantil se ha reducido sustancialmente en la última década, a pesar de un aumento de la población infantil mundial de 605 millones en 2000 a 664 millones en 2015 [2]. Datos recientes sugieren que ha habido una disminución del 25% en la incidencia de neumonía, de 0,29 episodios por año infantil en países de Esto está corroborado por una disminución del 58% en los años de vida ajustados a la discapacidad asociada a neumonía entre 1990 y 2013, de 186 millones a 78 millones, según se estima en el estudio Global Burden of Disease [1]. Las muertes por neumonía disminuyeron de 1,8 millones en 2000 a 900.000 en 2013 [1]. Estos datos no reflejan el pleno impacto del uso cada vez más generalizado de la vacuna conjugada antineumocócica en países de ingresos bajos y medianos, ya que es probable que la incidencia de neumonía y el número de muertes disminuyan aún más como resultado de esta intervención generalizada [4]. A pesar de este progreso, sigue habiendo una carga desproporcionada de enfermedad en países de ingresos bajos y medianos, donde se producen más del 90% de los casos de neumonía y muertes. La incidencia en países de ingresos altos se estima en 0,015 episodios por año infantil, en comparación con 0,22 episodios por año infantil en países de ingresos bajos En promedio, 1 de cada 66 niños de países de ingresos altos se ve afectado por neumonía al año, en comparación con 1 de cada 5 niños de países de ingresos bajos y medianos. Incluso en los países de ingresos bajos y medianos existen desigualdades y desafíos regionales con acceso a los servicios de atención de la salud: hasta el 81% de las muertes por neumonía grave ocurren fuera de un hospital [5]. Además de una mayor incidencia de neumonía, se estima que la tasa de mortalidad de los casos es casi 10 veces mayor en los países de ingresos bajos y medianos en comparación con los países de ingresos altos [3, 5]. La neumonía infantil también puede conducir a una morbilidad significativa y a enfermedades crónicas. La neumonía de la vida temprana puede perjudicar la salud pulmonar a largo plazo disminuyendo la función pulmonar [6]. La neumonía grave o recurrente puede tener un efecto peor en la función pulmonar; cada vez más evidencia sugiere que la enfermedad pulmonar obstructiva crónica podría estar relacionada con la neumonía infantil [7, Un metaanálisis del riesgo de resultados a largo plazo después de la neumonía infantil categorizó las secuelas respiratorias crónicas en grupos mayores (enfermedad pulmonar restrictiva, enfermedad pulmonar obstructiva, bronquiectasia) y menores (bronquitis crónica, asma, función pulmonar anormal) [9]. El riesgo de desarrollar al menos una de las secuelas principales se estimó en un 6% después de un evento de neumonía ambulatoria y en un 14% después de un episodio de neumonía hospitalizada. Debido a que las enfermedades respiratorias afectan a casi 1.000 millones de personas en todo el mundo y son una causa importante de mortalidad y morbilidad [10], la neumonía infantil podría contribuir a una morbilidad sustancial a lo largo de la vida. Los cambios radiológicos de tórax se han considerado el estándar de oro para definir un evento de neumonía [11] porque los hallazgos clínicos pueden ser subjetivos y las definiciones clínicas de neumonía pueden ser inespecíficas. En 2005, para ayudar a definir los resultados de los estudios de la vacuna antineumocócica, la descripción de la radiografía torácica estandarizada de la Organización Mundial de la Salud (OMS) definió un grupo de niños que se consideraban más propensos a tener neumonía neumocócica [12]. El término "consolidación de punto final" se describió como una opacidad densa o esponjosa que ocupa una porción o todo un lóbulo o todo el pulmón. "Otros infiltrados" incluyeron densidades lineales y irregulares, engrosamiento peribronquial, infiltrados menores parcheados que no son de magnitud suficiente para constituir una consolidación de punto final primaria, y pequeñas áreas de atelectasia que en los niños pueden ser difíciles de distinguir de la consolidación. "Neumonía de punto final primario" incluyó consolidación de punto final o un derrame pleural asociado con un El uso generalizado de la vacunación conjugada neumocócica y la vacunación conjugada Haemophilus influenzae tipo B ha disminuido la incidencia de neumonía radiológica. En una revisión de cuatro ensayos controlados aleatorizados y dos estudios de casos y controles de la vacunación conjugada Haemophilus influenzae tipo B en comunidades de alta carga, la vacunación se asoció con una disminución del 18% de la neumonía radiológica [13]. La introducción de la vacunación conjugada neumocócica se asoció con una disminución del 26% de la neumonía radiológica en California entre 1995 y 1998 [14]. En los ensayos de eficacia vacunal en países de ingresos bajos y medianos, la vacunación conjugada neumocócica redujo la neumonía radiológica en un 37% en Gambia [15], un 25% en Sudáfrica [16] y un 26% en Filipinas [17]. La definición de caso radiológico de la OMS no tenía por objeto distinguir la etiología bacteriana de la viral, sino definir un subconjunto de casos de neumonía en los que la infección neumocócica se consideraba más probable y proporcionar un conjunto de definiciones estandarizadas a través de las cuales los investigadores podrían lograr un amplio acuerdo en la notificación de radiografías torácicas. Sin embargo, a pesar de la amplia utilización en el campo, existe preocupación por la repetibilidad de los observadores. Ha habido un buen consenso en la descripción de la consolidación lobar pero un desacuerdo significativo en la descripción de infiltrados parcheados y perihilares [18, 19]. Además, muchos niños con enfermedad pulmonar clínicamente grave no tienen neumonía primaria de punto final: en un estudio previo a la vacunación conjugada con neumocócica, sólo el 34% de los niños hospitalizados con neumonía tenían neumonía primaria de punto final [20]. Se ha introducido una definición revisada de caso de "pneumonia bacteriana presumida", que incluye los casos de neumonía con consolidación alveolar definida por la OMS, así como aquellos con otros infiltrados radiográficos en el tórax anormales y una proteína C reactiva sérica de al menos 40 mg/L [21, 22]. Se ha demostrado que esta definición tiene mayor sensibilidad que la definición radiológica original de la OMS de neumonía primaria de punto final para detectar la carga de neumonía prevenida por la vacunación conjugada neumocócica [23]. Utilizando la definición revisada, la vacuna conjugada antineumocócica 10-valente (vacuna conjugada antineumocócica-10), tuvo una eficacia vacunal del 22% en la prevención de la presunta neumonía bacteriana en niños pequeños de América del Sur [22], y la vacunación conjugada antineumocócica-13 tuvo una eficacia vacunal del 39% en la prevención de la presunta neumonía bacteriana en niños mayores de 16 semanas que no estaban infectados con el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) en Sudáfrica [21]. Por lo tanto, hay evidencia convincente de que la vacunación conjugada antineumocócica disminuye la incidencia de neumonía radiológica; sin embargo, no hay evidencia que sugiera que la vacunación conjugada antineumocócica modifique la aparición radiológica de neumonía neumocócica. Se observó un aumento de la incidencia de empiema en niños en algunos países de altos ingresos tras la introducción de la vacuna conjugada neumocócica-7, lo que se atribuyó a los serotipos neumocócicos no incluidos en la vacunación conjugada neumocócica-7, especialmente 3 y 19A [24]. En los Estados Unidos, los datos de una base de datos hospitalaria nacional indican que la incidencia de empiema aumentó 1,9 veces entre 1996 y 2008 [25]. En Australia, la tasa de incidencia aumentó 1,4 veces al comparar el período de vacunación conjugada preneumocócica-7 (1998-2004) con el período de vacunación conjugada postneumocócica-7 (2005 a 2010] [26]. En Escocia, la incidencia de empiema en niños aumentó de 6,5 por millón entre 1981 y 1998, a 66 por millón en 2005 [ Los datos de los Estados Unidos sugieren que el empiema disminuyó en un 50% en niños menores de 5 años [28] ; de manera similar, los datos del Reino Unido y Escocia mostraron una reducción sustancial en el empiema pediátrico tras la introducción de la vacuna conjugada antineumocócica-13 [29, 30]. Varias directrices nacionales de países de altos ingresos, así como las recomendaciones de la OMS para los países de bajos y medianos ingresos, recomiendan que la radiografía torácica no se realice rutinariamente en niños con neumonía ambulatoria [31] [33]. Las indicaciones para la radiografía torácica incluyen hospitalización, hipoxemia grave o dificultad respiratoria, tratamiento antibiótico inicial fallido o sospecha de otras enfermedades (tuberculosis, cuerpo extranjero inhalado) o complicaciones. Además del efecto sobre la neumonía radiológica, la vacunación conjugada antineumocócica reduce el riesgo de hospitalización por neumonía viral, probablemente reduciendo las coinfecciones bacterianas virales que resultan en enfermedad grave y hospitalización [35]. Un análisis de estudios ecológicos y observacionales de incidencia de neumonía en diferentes grupos de edad poco después de la introducción de la vacunación conjugada antineumocócica-7 en Canadá, Italia, Australia, Polonia y los Estados Unidos mostró una disminución en las hospitalizaciones por neumonía de causa general que oscilaban entre el 15% y el 65% [36]. En los Estados Unidos después de la vacunación conjugada antineumocócica-13 sustituyó la vacunación conjugada antineumocócica-7, hubo una disminución adicional del 17% en las hospitalizaciones por neumonía entre los niños elegibles para la vacunación, y una disminución adicional del 12% entre los adultos no vacunados [28]. Una revisión sistemática de los estudios de etiología antes de la disponibilidad de nuevas vacunas conjugadas confirmó que S. pneumoniae y H. influenzae tipo B fueron las causas bacterianas más importantes de la neumonía, con Staphylococcus aureus y Klebsiella pneumoniae asociadas a algunos casos graves. El virus sincitial respiratorio fue la principal causa viral, identificada en 15-40% de los casos de neumonía, seguido de influenza A y B, parainfluenza, metapneumovirus humano y adenovirus [37]. Los metaanálisis más recientes de datos de etiología sugieren un perfil patógeno cambiante, con un creciente reconocimiento de que la neumonía clínica es causada por la interacción secuencial o concurrente de más de un organismo. La enfermedad grave en particular es causada por múltiples patógenos. En estudios recientes de casos de control, se detectó al menos un virus en el 87% de los casos de neumonía clínica en Sudáfrica [39], mientras que los virus se detectaron en el 81% de los casos de neumonía radiológica en Suecia [40]. En un amplio estudio multicéntrico en Estados Unidos, se detectaron patógenos virales en el 73% de los niños hospitalizados con neumonía radiológica, mientras que las bacterias se detectaron en sólo el 15% de los casos [41]. Un metaanálisis de 23 estudios de casos de control de etiología viral en neumonía confirmada radiológicamente en niños, completados hasta 2014, reportó buenas pruebas de atribución causal para el virus sincitial respiratorio, la gripe, el metapneumovirus y el virus parainfluenza [42]. Sin embargo, no hubo evidencia consistente de que muchos otros virus comúnmente descritos, como el rinovirus, el adenovirus, el boca Otra atribución de la etiología bacteriana es difícil porque a menudo no es posible distinguir la colonización de las bacterias patógenas cuando están aisladas de especímenes nasales [43]. Otra etiología es la tos ferina. En la última década también ha habido un resurgimiento en los casos de tos ferina, especialmente en los países de altos ingresos [44]. Debido a que la inmunidad a la tos ferina después de la vacunación con pertussis acelular es menos duradera que la inmunidad después de la infección de tipo salvaje o la vacunación con células enteras, muchas mujeres en edad fértil tienen niveles de anticuerpos contra la tos ferina menguante, por lo que sus bebés pueden nacer con niveles bajos de inmunoglobulina G antipertussis transplacental, lo que las hace susceptibles a la infección por tos ferina antes de completar la serie de vacunación primaria [45]. En 2014, se notificaron más de 40.000 casos de tos ferina a los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades en los Estados Unidos; en algunos estados, las tasas de incidencia basadas en la población son más altas que en cualquier otro momento en los últimos 70 años [44]. En cambio, la mayoría de los países de ingresos bajos y medianos utilizan vacunas contra la tos ferina de células enteras y el número de casos de tos ferina en esos países se mantuvo estable o disminuyó hasta 2015 [46]. Sin embargo, las pruebas recientes procedentes de Sudáfrica (donde se utiliza la vacuna acelular) muestran una incidencia apreciable de tos ferina entre los lactantes que presentan neumonía aguda: el 2% de los casos de neumonía clínica entre los lactantes incluidos en una cohorte de parto fueron causados por tos ferina [39], y el 3,7% de los lactantes y niños pequeños que se presentan a un hospital académico terciario tenían pruebas de infección por tos ferina [47] Del mismo modo, la tuberculosis infantil es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en muchos países de ingresos bajos y medianos, y la tuberculosis de Mycobacterium ha sido reconocida cada vez más como un patógeno en la neumonía aguda en niños que viven en entornos de alta prevalencia de la tuberculosis. Los estudios postmortem de niños que mueren de enfermedades respiratorias agudas han reportado comúnmente M. tuberculosis [48, 49]. Una revisión sistemática reciente de la tuberculosis como comorbilidad de la neumonía infantil reportó enfermedad confirmada por el cultivo en aproximadamente el 8% de los casos [50]. Debido a que la tuberculosis intratorácica es sólo una enfermedad confirmada por el cultivo en una minoría de casos, la carga real podría ser aún mayor; la tuberculosis podría ser un factor importante para la incidencia de neumonía infantil y la mortalidad en las zonas de alta prevalencia. Debido a la efectividad de la vacunación conjugada neumocócica y la vacuna conjugada Haemophilus influenzae tipo B para la prevención de la neumonía radiológica y clínica, la vacunación incompleta o inadecuada debe considerarse un factor de riesgo importante para la neumonía infantil. Otros factores de riesgo incluyen el bajo peso al nacer, que se asocia con 3,2 veces mayores probabilidades de neumonía grave en los países de ingresos bajos y medianos y 1,8 veces mayores probabilidades en los países de ingresos altos [51]. Del mismo modo, la falta de lactancia materna exclusiva durante los primeros 4 meses de vida aumenta las probabilidades de neumonía grave en 2,7 veces en los países de ingresos bajos y medianos y 1,3 veces en los países de ingresos altos. La contaminación del aire en el interior por el uso de combustibles sólidos o de biomasa aumenta las probabilidades de neumonía en 1,6 veces; la falta de vacunación contra el sarampión al final del primer año de edad aumenta las probabilidades de neumonía en 1,8 veces [51]. Se estima que la prevalencia de estos factores críticos de riesgo en los países de ingresos bajos y medianos disminuyó en un 25% entre 2000 y 2010, contribuyendo a reducir la incidencia de neumonía y la mortalidad en los países de ingresos bajos y medianos, incluso en los países donde no se dispone de vacunas conjugadas [3]. El factor de riesgo único más fuerte para la neumonía es la infección por el VIH, que es especialmente frecuente en los niños del África subsahariana. Los niños infectados por el VIH tienen 6 veces más probabilidades de desarrollar neumonía grave o de muerte que los niños no infectados por el VIH [52]. Desde la prevención efectiva de la transmisión del VIH de madre a hijo, hay una población creciente de niños expuestos al VIH que no están infectados; su exceso de riesgo de neumonía, en comparación con los niños no expuestos al VIH, se ha descrito como de 1,3 a 3,4 veces mayor [53] [54] [56] [57]. La vacunación antineumocócica conjugada y la vacunación conjugada Haemophilus influenzae tipo B han sido instrumentos eficaces para reducir la incidencia, la gravedad y la mortalidad de la neumonía [58, 59]. Sin embargo, la cobertura equitativa y el acceso a las vacunas siguen siendo sub-óptimos. A finales de 2015, se había introducido la vacunación conjugada Haemophilus influenzae tipo B en 73 países, con una cobertura global estimada en 68%. Sin embargo, las desigualdades siguen siendo evidentes entre las regiones: en las Américas la cobertura se estima en 90%, mientras que en el Para 2015, se había introducido la vacunación conjugada antineumocócica en 54 países, con cobertura global de 35% para tres dosis de vacunación conjugada antineumocócica para la población infantil [60]. Para hacer frente a este problema, se puso en marcha la iniciativa del Plan Mundial de Acceso a Vacunas de la OMS para hacer más equitativa la disponibilidad de vacunas que salvan vidas. Además de garantizar la financiación de las vacunas, los objetivos del programa incluyen el fomento de la voluntad política en los países de bajos y medianos ingresos para comprometerse con la inmunización como prioridad, la comercialización social de las personas y las comunidades, el fortalecimiento de los sistemas de salud y la promoción de las innovaciones locales pertinentes en materia de investigación y desarrollo [61]. La vacunación contra la gripe durante el embarazo es segura, proporciona una protección materna razonable contra la gripe y también protege a los lactantes durante un período limitado de la infección por gripe confirmada (eficacia de la vacuna 63% en Bangladesh [63] y 50,4% en Sudáfrica [64] ). Sin embargo, a medida que los niveles de anticuerpos disminuyen bruscamente después del nacimiento, la protección de los lactantes no persiste mucho más allá de las 8 semanas [65]. Recientemente se ha demostrado que la vacunación contra el virus sincitial respiratorio en el embarazo es segura e inmunogénica, y se está llevando a cabo un ensayo clínico de fase 3 de eficacia para prevenir la enfermedad por el virus sincitial respiratorio en los lactantes [66]. El Plan de Acción Mundial Integrado de la OMS para la diarrea y la neumonía destaca muchas oportunidades para proteger, prevenir y tratar a los niños [68]. Las tasas de lactancia materna pueden mejorarse mediante programas que combinen intervenciones educativas y de asesoramiento en hogares, comunidades y centros de salud, y mediante la promoción de hospitales amigos de los bebés [69]. La mejora de la ventilación en el hogar, la utilización de combustibles más limpios para cocinar y la reducción de la exposición al humo de los cigarrillos son intervenciones esenciales para reducir la incidencia y la gravedad de la neumonía [70, 71]. La prevención del VIH pediátrico es posible mediante intervenciones para prevenir la transmisión de madre a hijo [72]. Las pruebas del VIH en la primera infancia y el inicio temprano de la terapia antirretroviral y la profilaxis del cotrimoxazol pueden reducir sustancialmente la incidencia de neumonía adquirida en la comunidad entre los niños infectados por el VIH [73]. Si estas intervenciones rentables se incrementaran, se estima que el 67% de las muertes por neumonía en países de ingresos bajos y medianos podrían prevenirse para 2025 [58]. El manejo de casos de neumonía es una estrategia por la cual la gravedad de la enfermedad se clasifica como grave o no grave. Todos los niños reciben antibióticos orales tempranos y apropiados y los casos graves se remiten a antibióticos parenteral. Cuando se implementan en áreas de alta carga antes de la disponibilidad de vacunas conjugadas, el manejo de casos como parte del Manejo Integrado de Enfermedades Infantiles se asocia con una disminución del 27% en la mortalidad infantil global, y una disminución del 42% en la mortalidad específica por neumonía [74]. Sin embargo, el predominio de las causas virales de neumonía y la baja mortalidad por casos han provocado preocupación por el uso excesivo de antibióticos. En dos estudios, realizados en Dinamarca y en la India, los resultados de los tratamientos con antibióticos y placebo fueron equivalentes [76, 77]. En el tercer estudio, en Pakistán, hubo una tasa de fracaso no significativa del 24% frente al 20% en el grupo placebo, que se consideró no equivalente al grupo antibiótico [75]. Además, debido a que la neumonía no grave y la bronquiolitis clasificadas por la OMS podrían considerarse dentro de un espectro de enfermedades respiratorias más bajas, muchos niños con neumonía clínica podrían tener bronquiolitis viral, para la que los antibióticos no son beneficiosos [79]. Esto se ha reflejado en las directrices nacionales británicas [33] y españolas [31] sobre neumonía, que no recomiendan el tratamiento antibiótico rutinario para niños menores de 2 años con evidencia de vacunación conjugada neumocócica que presentan neumonía no grave. Las directrices nacionales de los Estados Unidos recomiendan la retención de antibióticos en niños de hasta 5 años de edad que presenten neumonía no grave [32]. Sin embargo, dada la alta mortalidad por neumonía en los países de ingresos bajos y medianos, la falta de fácil acceso a la atención médica y la alta prevalencia de factores de riesgo para enfermedades graves, las directrices revisadas de la Organización Mundial de la Salud sobre la neumonía siguen recomendando el tratamiento antibiótico para todos los niños que cumplen las definiciones de casos de neumonía de la OMS [80]. El uso de oxígeno suplementario es vital, pero no está universalmente disponible en los países de ingresos bajos y medianos; se estima que el uso de sistemas de oxígeno suplementario podría reducir la mortalidad de los niños con neumonía hipoxica en un 20% [81]. Sin embargo, hasta el 81% de las muertes por neumonía en 2010 ocurrieron fuera de los centros de salud [5], por lo que hay grandes desafíos con el acceso a los servicios de salud y el comportamiento de las poblaciones vulnerables en busca de la salud. Identificar y cambiar las barreras para acceder a la atención de la salud es un área importante con el potencial de afectar la supervivencia y la salud de los niños más vulnerables [82]. Se ha avanzado mucho en la disminución de las muertes causadas por neumonía infantil. La mejora del estado socioeconómico y las vacunas, principalmente las vacunas conjugadas (contra Haemophilus influenzae y neumocococcus), han conducido a reducciones sustanciales en la incidencia y gravedad de la neumonía infantil. Estrategias más fuertes para prevenir y controlar el VIH han reducido las muertes por neumonía asociada al VIH. Sin embargo, a pesar de los cambios sustanciales en la incidencia, la etiología y la radiología a nivel mundial, persisten desigualdades en

¿Es segura la vacunación contra la gripe durante el embarazo? ¿Cuánto tiempo protege al niño?

La actividad inmunomoduladora y los efectos protectores del polisacárido del extracto de hoja de adenoforo del Eupatorium sobre la infección por gripe altamente patógena H5N1https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3789439/SHA: efba2008a6ccf1ad2614aebd79a6a741ea6538b9Autores: Jin, Yi; Zhang, Yuewei; Wan, Chunyan; Wang, Hongjun; Hou, Lingyu; Chang, Jianyu; Fan, Kai; Xie, XiangmingFecha: 2013-09-18DOI: 10.1155/2013/194976Licencia: cc-byAbstract: El desarrollo de nuevos agentes antivirales de amplio espectro contra la infección por H5N En este estudio, se evaluaron las actividades inmunomoduladoras y el efecto protector del polisacárido de Eupatorium adenophorum (EAP) frente al subtipo altamente patógeno del virus de la gripe H5N1. El tratamiento con EAP aumentó significativamente la producción de IL-6, TNF-α e IFN-γ tanto in vivo como in vitro, medida por qPCR y ELISA. En un modelo de infección por ratón, la administración intranasal del EAP a una dosis de 25 mg/kg de peso corporal antes del desafío viral H5N1 inhibió eficientemente la replicación viral, la disminución de las lesiones pulmonares y el aumento de la tasa de supervivencia. Nuestra investigación sugiere una estrategia alternativa para el desarrollo de nuevos agentes antiinfluenza y beneficios de los productos de E. adenophorum. Texto: El virus de la gripe subtipo H5N1 altamente patógeno puede transmitirse directamente de las aves de corral al ser humano y causar infecciones respiratorias agudas. El virus de la gripe pandémica H5N1 representaba una amenaza mundial para la salud pública debido a la rápida propagación y alta patogenicidad [1, 2]. Los síntomas en animales o seres humanos infectados con H5N1 incluyen fiebre, encefalitis, neumonía y síndrome respiratorio agudo grave (SARS) [3, 4]. La Organización Mundial de la Salud informó 622 casos humanos de infección por el virus de la gripe H5N1, incluidas 371 muertes (tasa de mortalidad > 50%), de 2003 a 2013 (http://www.who.int/ influenza/human animal interface/H5N1 Actualmente, la medida preventiva más eficaz contra el virus de la gripe es la vacunación. Varios medicamentos antiinfluenza han sido ampliamente utilizados, incluyendo zanamivir (Relenza) y oseltamivir (Tamiflu). Desafortunadamente, sus beneficios han sido significativamente restringidos por la resistencia a los medicamentos y la mutación antigénica frecuente [5, 6]. Por lo tanto, el desarrollo de nuevos agentes antiinfluenza contra el subtipo H5N1 es muy importante. La planta invasiva Eupatorium adenophorum, nativa de Centroamérica, tiene una gran capacidad de adaptación a diferentes ambientes en todo el mundo. Esta planta invadió por primera vez la provincia de Yunnan en el sur (China) en la década de 1940 desde Birmania y Vietnam, y rápidamente se extendió por todo el suroeste de China a lo largo de la década de 1950 [7, 8]. En los últimos 50 años, E. adenophorum ha afectado gravemente el medio ambiente ecológico en las zonas subtropicales medias de China, incluidas las provincias de Yunnan, Guizhou, Sichuan y Guangxi, invadiendo tierras de cultivo, pastizales y bosques [7]. El control manual, químico o biológico de E. adenophorum ha obstaculizado su desarrollo y utilización integrales para beneficio económico. Muchos componentes bioactivos aislados de E. adenophorum han mostrado actividad antimicrobiana e inmunomodulando 2 propiedades de Medicina Complementaria y Alternativa Basadas en Evidencia [9]. En un estudio reciente, se evaluaron las propiedades antiinflamatorias del extracto de hoja etanólica [10]. Sin embargo, ha habido pocos informes sobre la bioactividad del polisacárido de E. adenophorum (EAP). Se han reportado las propiedades inmunomodula Varios polisacáridos de Cordyceps militaris, Portulaca oleracea, Gracilaria lemaneiformis, Gyrodinium impudium y Panax ginseng han sido descritos como agentes antiinfluenza eficaces frente a cepas H1N1 y H3N2 [12] [13] [14] [15]. En informes recientes, los adyuvantes a base de polisacáridos mejoraron la inmunogenicidad y la eficacia protectora de las vacunas H5N1 en modelos de infección animal [16, 17]. Sin embargo, a nuestro conocimiento no ha habido ningún informe sobre el tratamiento con EAP contra la gripe H5N1 altamente patógena. En el presente estudio, investigamos el efecto potencial de la EAP contra la infección por influenza H5N1 en un modelo de ratón. Nuestros resultados sugieren que los efectos anti-H5N1 de la EAP ofrecen una estrategia alternativa para el desarrollo de agentes antiinfluenza y la utilización de productos de E. adenophorum. Virus. El virus de la gripe H5N1 (A/cacaca de barra/ Qinghai/1/2010) utilizado en este estudio fue aislado del lago Qinghai en mayo de 2010. Este aislamiento es altamente patógeno en aves de corral, ratones y células de riñón canino Madin-Darby (MDCK). El virus se propagó en células MDCK a 37°C durante 48 h, y el sobrenadante viral fue cosechado, alícitado y almacenado en −80°C. Los títulos virales fueron determinados por el ensayo de placa descrito anteriormente [18]. De 8 a 10 semanas de edad, se obtuvieron ratones BALB/c hembra de Vital River Laboratories (Beijing, China), y las parejas reproductoras originales se compraron de Charles River (Beijing, China). Los ratones fueron criados en jaulas ventiladas independientes (IVC) y recibieron alimentos y agua libres de patógenos. Los tratamientos animales se regían por el Reglamento de Animales Experimentales de la Autoridad de Beijing, y fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Agricultura de China. La línea celular monocítica Raw 264,7, línea celular adenocarcinoma pulmonar humano epitelial A549, y líneas celulares de riñón canino Madin-Darby (MDCK) fueron proporcionadas por el Centro de Recursos Celulares de Peking Union Medical College. Las células fueron cultivadas y mantenidas de acuerdo con las recomendaciones del proveedor. Yunnan provincia, China. 100 g de materiales secos fueron pulverizados en un mezclador y luego filtrados con 40 mallas. El polvo de hoja fue extraído mediante tratamiento ultrasónico con 1000 mL de agua destilada durante 45 min. El sobrenadante fue recolectado y el precipitado resuspendido en 1000 mL de agua destilada y nuevamente extraído por tratamiento ultrasónico durante 30 min. El sobrenadante resultante fue combinado con el obtenido del primer tratamiento ultrasónico. La fracción acuosa final fue evaporada a sequedad en un evaporador rotatorio. El residuo obtenido fue disuelto en agua destilada y se mantuvo congelado a 4°C.El extracto fue centrifugado a 3000 g/min durante 25 min. y se concentró bajo 80°C durante 8 h para preparar polisacárido. El sobrenadante se desproteinizó con el método Sevag y se dializó contra el agua durante 48 h. El líquido final se mezcló con un volumen de 95% de etanol (v/v) y se centrifugó a 3000 g/min durante 10 min. Los precipitados se lavaron sucesivamente con etanol absoluto, éter y se secaron bajo vacío a 40 °C para obtener el polisacárido bruto (yield = 1,2%). El contenido del EAP se determinó mediante el método fenol-H 2 SO 4 [19]. Vitro. 2.5 mL A549 y 264,7 células Raw (4 × 10 5 / mL) por pozo se plató en placas de 6 pocillos y se cultivó a 37 °C por debajo del 5% de CO 2 durante 24 h. Se eliminó el medio de cultivo de 2,5 mL y se añadieron a cada pozo diferentes concentraciones de Los controles fueron tratados con solución salina fosfatada (PBS), se recolectaron células 36 h después del tratamiento para la extracción de ARN y reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa (QPCR). Ensayo. Se administraron ratones EAP a una dosis de 5, 10, 25 ó 50 mg/kg de peso corporal, intranasalmente una vez al día durante 5 días antes del desafío. Se administró PBS a ratones de control utilizando la misma pauta. Las existencias de virus de la gripe se diluyeron en PBS. Se anestesiaron ratones con Zotile (Virbac, Francia) intramuscularmente a 15 mg/kg (peso corporal) y luego infectaron intranasalmente con 120 unidades plaqueformantes (PCU) del virus de la gripe H5N1 en 50 L. El tejido pulmonar de cinco ratones por grupo se recogió el día 0 antes del desafío para qPCR y Se recolectó tejido pulmonar de otros cinco ratones en el día 3 postinfección para el ensayo de placa y qPCR. Se observaron diez ratones por grupo para la supervivencia durante 14 días y se registraron pesos corporales. 2.6. Ensayo de placa. Células MDCK fueron cultivadas en DMEM (Hyclone Laboratories, Logan, UT, USA) que contenían 10% FBS (Hyclone Laboratories), 100 U/ml penicilina, y 100 g/ml estreptomicina (Invitrogen, San Diego, CA, USA). El sobrenadante de tejido pulmonar se diluyó 10 veces y se añadió a una monocapa celular cubierta por agar semisólido que contenía 0,5 g/ml de tripsina TPCK (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Las placas fueron incubadas a 37o C El ARN total de 1 × 10 6 células o 10 mg de tejido pulmonar fue preparado por Trizol (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN tratado con DNaseI (0,2 g) fue transcrito inversamente al ADNc mediante imprimaciones aleatorias. La expresión del gen de la hemaglutinina (HA) del virus de la gripe H5N1 fue detectada por qPCR utilizando el kit Power SYBR Green PCR Master Mix (Applicated Biosystems, Foster City, CA, USA). Se utilizaron los siguientes imprimadores AGG CAC CA-3 5 -CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3 h IL-6 5 -CCT TCG GTC CAG TTG CCT TCT-3 5 -CCA GTG CCT CTT TGC TGC TGC TTT C-3 h IFN: imprimador delantero, 5 -CGC AGT ATT CAG AAG AAG CAAGAC-3 ; e imprimador inverso, 5 -TCC ATA AGG ATA GAC CTA CCA-3. La reacción se realizó en un ciclor térmico ABI 7500 con un paso inicial de desnaturalización a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s, 56 ° C durante 30 s y 72 ° C durante 40 s. El número de copia del gen HA fue calculado por el software 7500 v2.0 (Aplicado Biosistemas) utilizando un plásmido de concentración conocida con HA como estándar. Se realizó qPCR relativo para otros ocho genes: hactina, h IL-6, h IFN- y hTNF- para células A549; mactina, mTLR-2, mTLR-4, mDectin-1, mMR, mIL-6, mIFN- y mTNF- para células Raw264. La reacción se realizó con 95°C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 95°C durante 15 segundos, recocido a 52°C durante 30 s, y extensión a 72°C durante 40 s. El cambio de pliegues en la expresión génica se normalizó en controles (ratones naive) por 2 CT utilizando -actina como norma interna [20]. 2.8. ELISA. Los niveles de IL-6, TNF- e IFN en pulmón se probaron con kits ELISA (Boster, Wuhan, China) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Un gramo de tejido pulmonar de cada ratón fue molido en 1 mL PBS y centrifugado durante 20 min a 5000 rpm. Los sobrenadantes fueron recolectados y diluidos 10 veces para ELISA. 2.10. Análisis Estadístico. El análisis estadístico se realizó utilizando ANOVAs de una vía con SPSS 12.0 (SPSS Taiwan Corp., Taiwán) y se consideró significativo < 0,05. Muchos polisacáridos botánicos presentan un efecto inmunomodulador [11]. Para determinar las propiedades inmunomoduladoras del EAP, se investigó el efecto potencial de los polisacáridos sobre las células A549 y Raw264,7. Las células fueron tratadas con diversas concentraciones de EAP (50, 100, 200 g/ml) durante 36 h. Los niveles de ARNm de IL-6, TNF- e IFN fueron detectados por qPCR. La Figura 1 muestra las actividades inmunomoduladoras del EAP in vitro. Varias concentraciones de EAP desencadenaron una fuerte secreción de IL-6, TNF- e IFN de forma dosis dependiente tanto en las células A549 (Figuras 1(a)-1(c)) y Raw264,7 células (Figuras 1(d) -1(f))) en comparación con el grupo de tratamiento con PBS. Para comprobar si el EAP podía proteger a los ratones infectados con H5N1, los ratones fueron tratados con EAP a una dosis de 5, 10, 25 o 50 mg/kg de peso corporal intranasal una vez al día durante 5 días antes del desafío viral con 120 UFP. Diez ratones por grupo fueron monitorizados durante 14 días para la tasa de supervivencia. Como se muestra en la Figura 2(a), todos los ratones que recibieron PBS murieron en el día 11. Los ratones administrados con 25 mg/kg de EAP tuvieron una tasa de supervivencia del 50% en el día 14, que fue El tratamiento con EAP de 10 mg/kg y 50 mg/kg también pareció tener una ventaja de supervivencia, pero no estadísticamente significativa, lo que sugiere que el efecto protector de la EAP contra la infección por H5N1 requiere una dosis moderada. El tratamiento con EAP también alivió la pérdida de peso en ratones infectados (Figura 2(b) ). Para determinar la carga viral en el pulmón de los ratones infectados, se realizaron ensayos de placa y qPCR. Los títulos virales pulmonares en el grupo EAP (25 mg/kg) fueron significativamente más bajos que los títulos en los ratones que recibieron PBS en el día 3 postinfección (Figuras 2(c) y 2(d) ). Estos datos indican claramente que la administración intranasal de EAP controla la replicación viral H5N1 y mejora las tasas de supervivencia en un modelo de ratón. El efecto protector de EAP contra el virus Para detectar la expresión IL-6, TNF- e IFN, los pulmones de cinco ratones por grupo fueron recolectados en el día 0 antes de la infección y probados por qPCR y ELISA. Los niveles de ARNm en el grupo EAP (25 mg/kg) fueron significativamente más altos que los del grupo control PBS (ratones naive) (Figuras 3(a)-3(c) ). Los niveles de citoquinas solubles en el día 0 fueron medidos por ELISA, y los resultados fueron consistentes con los resultados de qPCR, aunque la producción de IFN en el grupo EAP no fue significativamente mayor que la del grupo PBS (= 0,0599) (Figuras 3(g)-3(i) ). Estos resultados sugieren que la EAP aumenta la producción IL-6, TNF- e IFN. La expresión IL-6, TNF- e IF En contraste, los niveles de TNF-mRNA tras el tratamiento con EAP (25 mg/kg) fueron significativamente más bajos que los del grupo PBS (Figura 3(e) ), mientras que la expresión IL-6 e IFN fue sólo ligeramente menor (no significativa) (Figuras 3(d) y 3(f) ). Estos resultados pueden ser explicados por una mayor carga viral, y la respuesta inflamatoria más severa en ratones tratados con PBS. La inflamación excesiva puede causar lesiones pulmonares graves durante la infección por influenza H5N1. Para evaluar los cambios histopatológicos en los pulmones de ratones infectados, se examinaron tejidos de cada grupo en el día 3 postinfección. Los pulmones de ratones tratados con PBS mostraron una respuesta inflamatoria severa, caracterizada por edema intersticial, infiltración celular inflamatoria alrededor de pequeños vasos sanguíneos, lumen alveolar inundado con líquido edema mezclado con células epiteliales alveolares exfoliadas, y un engrosamiento de las paredes alveolares (Figuras 4(c) y 4(d) ). Los pulmones de ratones tratados con EAP (25 mg/kg) mostraron lesiones más leves que los que recibieron PBS, caracterizadas por signos de bronconeumonía con edema intersticial, e infiltración celular inflamatoria alrededor de pequeños vasos sanguíneos (Figuras 4(a) y 4(b) ). Se correlacionaron cargas virales y producción de citocinas inflamatorias en el pulmón; sugiriendo que el tratamiento con EAP reduce lesiones pulmonares en ratones infectados con H5N Los polisacáridos derivados de muchas plantas mejoran la secreción de citoquinas y quimioquinas, tales como TNF-, IL-6, IL-8 e IL-12 [11]. Este efecto inmunomodulador está mediado principalmente por el reconocimiento de polisacáridos polímeros por varios receptores de reconocimiento de patrones (PRRs). Para determinar qué receptor contribuye directamente al reconocimiento inmune innato de EAP, el receptor de Toll-como 2 (TLR2), TLR4, Dectin-1 y receptor de manosa (MR) fueron examinados por qPCR tanto in vivo como in vitro. Los ratones fueron tratados con EAP a una dosis de 25 mg/kg de peso corporal intranasal una vez al día durante 5 días, con ratones de control recibiendo PBS. El ARN total pulmonar fue preparado para qPCR. La expresión de Dectin-1 y MR en ratones tratados con EAP fue significativamente elevada en comparación con los controles, mientras que la expresión de TLR2 y TLR4 fue ligeramente mayor, pero no estadísticamente significativa (Figura 5(a) ). El ensayo in vitro mostró tendencias similares. Como se muestra en la Figura 5(b), las células Raw264,7 fueron tratadas con 200 g/ml EPA durante 36 h antes de qPCR. Los niveles de Dectin-1 y MR fueron significativamente más altos, mientras que la expresión de TLR2 y TLR4 no cambió. Estos datos sugieren que el reconocimiento del EAP ocurrió principalmente a través de la vía Dectin-1 y MR. En este estudio, evaluamos las actividades inmunomoduladoras y el efecto protector del EAP frente a la infección por gripe H5N1 en un modelo de ratón. La administración intranasal de EAP antes del desafío viral H5N1 mejoró las tasas de supervivencia de ratones infectados con la correspondiente reducción de la carga viral pulmonar. El efecto anti-H5N1 fue muy probable debido al reconocimiento inmune innato de EAP y a la secreción de mediadores inmunes innatos (IL-6, TNFand IFN-) antes de la infección. Además, el efecto del EAP sobre la expresión PRR (incluyendo TLR2, TLR4, Dectin-1 y MR) fue determinado tanto in vivo como in vitro. Estos resultados sugieren que el reconocimiento inmune innato de EAP fue dependiente de la activación de las vías Dectin-1 y MR. Nuestros datos demuestran la viabilidad de usar EAP como un nuevo agente inmunomodulador contra la infección por influenza. La aparición de nuevas cepas farmacorresistentes derivadas de la deriva antigénica limita los beneficios terapéuticos de la vacunación y los agentes antivirales en el control de la gripe [6, 21, 22]. Por lo tanto, se necesita urgentemente el desarrollo de nuevas estrategias antiinfluenza de amplio espectro. La mayoría de los polisacáridos botánicos son candidatos ideales para nuevos agentes inmunomoduladores debido a sus propiedades no tóxicas y a menos efectos secundarios en comparación con los polisacáridos de origen bacteriano. Varios polisacáridos aislados de plantas y hongos exhiben beneficios antivirales eficaces contra el virus A de la gripe (incluidos los subtipos H1N1 y H3N2) [12] [13] [14] [15]. El uso de polisacáridos como agente inmunomodulador en estudios anti-H5N1 es poco frecuente. El tratamiento con EAP aumentó la producción de IL-6, TNF- e IFN y proporciona una ventaja de supervivencia en ratones infectados con H5N1. La tasa de supervivencia tras el pretratamiento con EAP (25 mg/kg de peso corporal) fue significativamente mayor que en ratones que recibían PBS (50% a 0%). En informes anteriores, se detectaron altos niveles de citoquinas y quimioquinas proinflamatorias (incluyendo TNF-, IL-6 e IFN-) durante la infección con H5N1 [23, 24]. Esta "tormenta de citoquinas" conduce a los síntomas respiratorios severos y a la lesión inmune del huésped. Así, las tormentas de citoquinas inducidas por H5N1 se hipotesan para ser la principal causa de mortalidad, y el uso de agentes antiinflamatorios puede, por lo tanto, proporcionar un efecto terapéutico [25, 26]. Curiosamente, 8 ratones de medicina complementaria y alternativa basados en pruebas deficientes en TNF-, TNF-receptor, IL-6, MIP-1, e IL-1R o tratados con esteroides, de tipo salvaje no tuvieron una ventaja de supervivencia en comparación con ratones de tipo salvaje después de la infección por gripe H5N1 [27, 28]. Curiosamente, el tratamiento profiláctico del agonista TLR3 PolyICLC, que aumenta fuertemente la producción de citoquinas, proporciona protección contra las infecciones por H1N1 y H5N1 [29, 30]. Estos estudios contradictorios se pueden explicar en que la respuesta inflamatoria ayuda a eliminar el virus, mientras agrava el daño patológico del huésped. Producción elevada de citocinas, como IL-6, TNF- e IFNare muy importante para el aclaramiento viral en la etapa temprana de la infección mediante la activación Una vez que la infección viral ha desencadenado una tormenta de citoquinas debido a la alta carga viral, la respuesta inflamatoria causa lesiones patológicas graves o incluso la muerte. En este caso, recibir un inmunomodulador por sí solo no puede ayudar a los animales a sobrevivir [25], lo que probablemente explica por qué el tratamiento inmunomodulador previo a la infección viral resulta en una mejor tasa de supervivencia [26, 30]. En nuestro estudio, el tratamiento de EAP poco después de la infección o postinfección 24 h no proporcionó una ventaja de supervivencia (datos no mostrados). Las propiedades antiinfluenza de IL-6, TNF- e IFN han sido discutidas en muchos estudios, a pesar de su participación en tormentas citoquinas desencadenadas por la infección por gripe. IL-6 juega un papel importante en la protección contra el virus influenza A, ya que es necesario para el aclaramiento viral y esencial para El tratamiento con IFN en las primeras etapas de la infección por gripe mejora la tasa de supervivencia en los modelos de ratón [33]. Además, los altos niveles de secreción de IFN estimulados por polisacáridos de ginseng proporcionan un efecto antiinfluenza in vivo [12]. En este informe, la administración intranasal de EAP antes del desafío H5N1 eleva la expresión de IL-6, TNF- e IFN en comparación con ratones que reciben PBS. Los altos niveles de estos mediadores contribuyen al aclaramiento viral y a la respuesta antiviral. Los títulos virales pulmonares después del tratamiento con EAP fueron más bajos en el día 3 postinfección. En contraste, los niveles de IL-6 e IFN-mRN fueron ligeramente más bajos, mientras que la producción de TNF fue significativamente menor que la del grupo PBS. En cuanto a la inflamación excesiva inducida por el virus H5N Por lo tanto, el momento del tratamiento con EAP como agente profiláctico es muy importante. Se cree que las actividades inmunomoduladoras de los polisacáridos botánicos son mediadas por varios PRR [11]. En este estudio, examinamos los niveles de ARNm de TLR2, TLR4, Dectin-1 y MR después del tratamiento con EAP. Se encontró que el EAP aumenta significativamente las expresiones de Dectin-1 y MR mRNm tanto in vivo como in vitro. Nuestra hipótesis es que el reconocimiento inmune innato del EAP se impulsa principalmente a través de una vía dependiente de Dectin-1 y MR. La unión a estos receptores, el EAP puede activar vías de señalización intracelulares complejas y aumentar la producción de citocinas, conduciendo a una respuesta antiviral. Así, la protección contra H5N1 por el tratamiento con EAP es menos probable que cause resistencia En conclusión, nuestro estudio demuestra que el extracto de hoja de EAP es un agente profiláctico e inmunomejorante contra la infección por el virus de la gripe H5N1. El tratamiento con EAP inhibe eficazmente la replicación viral de H5N1 y mejora la supervivencia animal. Este enfoque ofrece una estrategia alternativa para el desarrollo de agentes inmunomoduladores antiinfluenza y beneficia la utilización de productos de E. adenophorum.

¿Cuáles son los síntomas de la infección por H5N1 en humanos?

La actividad inmunomoduladora y los efectos protectores del polisacárido del extracto de hoja de adenoforo del Eupatorium sobre la infección por gripe altamente patógena H5N1https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3789439/SHA: efba2008a6ccf1ad2614aebd79a6a741ea6538b9Autores: Jin, Yi; Zhang, Yuewei; Wan, Chunyan; Wang, Hongjun; Hou, Lingyu; Chang, Jianyu; Fan, Kai; Xie, XiangmingFecha: 2013-09-18DOI: 10.1155/2013/194976Licencia: cc-byAbstract: El desarrollo de nuevos agentes antivirales de amplio espectro contra la infección por H5N En este estudio, se evaluaron las actividades inmunomoduladoras y el efecto protector del polisacárido de Eupatorium adenophorum (EAP) frente al subtipo altamente patógeno del virus de la gripe H5N1. El tratamiento con EAP aumentó significativamente la producción de IL-6, TNF-α e IFN-γ tanto in vivo como in vitro, medida por qPCR y ELISA. En un modelo de infección por ratón, la administración intranasal del EAP a una dosis de 25 mg/kg de peso corporal antes del desafío viral H5N1 inhibió eficientemente la replicación viral, la disminución de las lesiones pulmonares y el aumento de la tasa de supervivencia. Nuestra investigación sugiere una estrategia alternativa para el desarrollo de nuevos agentes antiinfluenza y beneficios de los productos de E. adenophorum. Texto: El virus de la gripe subtipo H5N1 altamente patógeno puede transmitirse directamente de las aves de corral al ser humano y causar infecciones respiratorias agudas. El virus de la gripe pandémica H5N1 representaba una amenaza mundial para la salud pública debido a la rápida propagación y alta patogenicidad [1, 2]. Los síntomas en animales o seres humanos infectados con H5N1 incluyen fiebre, encefalitis, neumonía y síndrome respiratorio agudo grave (SARS) [3, 4]. La Organización Mundial de la Salud informó 622 casos humanos de infección por el virus de la gripe H5N1, incluidas 371 muertes (tasa de mortalidad > 50%), de 2003 a 2013 (http://www.who.int/ influenza/human animal interface/H5N1 Actualmente, la medida preventiva más eficaz contra el virus de la gripe es la vacunación. Varios medicamentos antiinfluenza han sido ampliamente utilizados, incluyendo zanamivir (Relenza) y oseltamivir (Tamiflu). Desafortunadamente, sus beneficios han sido significativamente restringidos por la resistencia a los medicamentos y la mutación antigénica frecuente [5, 6]. Por lo tanto, el desarrollo de nuevos agentes antiinfluenza contra el subtipo H5N1 es muy importante. La planta invasiva Eupatorium adenophorum, nativa de Centroamérica, tiene una gran capacidad de adaptación a diferentes ambientes en todo el mundo. Esta planta invadió por primera vez la provincia de Yunnan en el sur (China) en la década de 1940 desde Birmania y Vietnam, y rápidamente se extendió por todo el suroeste de China a lo largo de la década de 1950 [7, 8]. En los últimos 50 años, E. adenophorum ha afectado gravemente el medio ambiente ecológico en las zonas subtropicales medias de China, incluidas las provincias de Yunnan, Guizhou, Sichuan y Guangxi, invadiendo tierras de cultivo, pastizales y bosques [7]. El control manual, químico o biológico de E. adenophorum ha obstaculizado su desarrollo y utilización integrales para beneficio económico. Muchos componentes bioactivos aislados de E. adenophorum han mostrado actividad antimicrobiana e inmunomodulando 2 propiedades de Medicina Complementaria y Alternativa Basadas en Evidencia [9]. En un estudio reciente, se evaluaron las propiedades antiinflamatorias del extracto de hoja etanólica [10]. Sin embargo, ha habido pocos informes sobre la bioactividad del polisacárido de E. adenophorum (EAP). Se han reportado las propiedades inmunomodula Varios polisacáridos de Cordyceps militaris, Portulaca oleracea, Gracilaria lemaneiformis, Gyrodinium impudium y Panax ginseng han sido descritos como agentes antiinfluenza eficaces frente a cepas H1N1 y H3N2 [12] [13] [14] [15]. En informes recientes, los adyuvantes a base de polisacáridos mejoraron la inmunogenicidad y la eficacia protectora de las vacunas H5N1 en modelos de infección animal [16, 17]. Sin embargo, a nuestro conocimiento no ha habido ningún informe sobre el tratamiento con EAP contra la gripe H5N1 altamente patógena. En el presente estudio, investigamos el efecto potencial de la EAP contra la infección por influenza H5N1 en un modelo de ratón. Nuestros resultados sugieren que los efectos anti-H5N1 de la EAP ofrecen una estrategia alternativa para el desarrollo de agentes antiinfluenza y la utilización de productos de E. adenophorum. Virus. El virus de la gripe H5N1 (A/cacaca de barra/ Qinghai/1/2010) utilizado en este estudio fue aislado del lago Qinghai en mayo de 2010. Este aislamiento es altamente patógeno en aves de corral, ratones y células de riñón canino Madin-Darby (MDCK). El virus se propagó en células MDCK a 37°C durante 48 h, y el sobrenadante viral fue cosechado, alícitado y almacenado en −80°C. Los títulos virales fueron determinados por el ensayo de placa descrito anteriormente [18]. De 8 a 10 semanas de edad, se obtuvieron ratones BALB/c hembra de Vital River Laboratories (Beijing, China), y las parejas reproductoras originales se compraron de Charles River (Beijing, China). Los ratones fueron criados en jaulas ventiladas independientes (IVC) y recibieron alimentos y agua libres de patógenos. Los tratamientos animales se regían por el Reglamento de Animales Experimentales de la Autoridad de Beijing, y fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Agricultura de China. La línea celular monocítica Raw 264,7, línea celular adenocarcinoma pulmonar humano epitelial A549, y líneas celulares de riñón canino Madin-Darby (MDCK) fueron proporcionadas por el Centro de Recursos Celulares de Peking Union Medical College. Las células fueron cultivadas y mantenidas de acuerdo con las recomendaciones del proveedor. Yunnan provincia, China. 100 g de materiales secos fueron pulverizados en un mezclador y luego filtrados con 40 mallas. El polvo de hoja fue extraído mediante tratamiento ultrasónico con 1000 mL de agua destilada durante 45 min. El sobrenadante fue recolectado y el precipitado resuspendido en 1000 mL de agua destilada y nuevamente extraído por tratamiento ultrasónico durante 30 min. El sobrenadante resultante fue combinado con el obtenido del primer tratamiento ultrasónico. La fracción acuosa final fue evaporada a sequedad en un evaporador rotatorio. El residuo obtenido fue disuelto en agua destilada y se mantuvo congelado a 4°C.El extracto fue centrifugado a 3000 g/min durante 25 min. y se concentró bajo 80°C durante 8 h para preparar polisacárido. El sobrenadante se desproteinizó con el método Sevag y se dializó contra el agua durante 48 h. El líquido final se mezcló con un volumen de 95% de etanol (v/v) y se centrifugó a 3000 g/min durante 10 min. Los precipitados se lavaron sucesivamente con etanol absoluto, éter y se secaron bajo vacío a 40 °C para obtener el polisacárido bruto (yield = 1,2%). El contenido del EAP se determinó mediante el método fenol-H 2 SO 4 [19]. Vitro. 2.5 mL A549 y 264,7 células Raw (4 × 10 5 / mL) por pozo se plató en placas de 6 pocillos y se cultivó a 37 °C por debajo del 5% de CO 2 durante 24 h. Se eliminó el medio de cultivo de 2,5 mL y se añadieron a cada pozo diferentes concentraciones de Los controles fueron tratados con solución salina fosfatada (PBS), se recolectaron células 36 h después del tratamiento para la extracción de ARN y reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa (QPCR). Ensayo. Se administraron ratones EAP a una dosis de 5, 10, 25 ó 50 mg/kg de peso corporal, intranasalmente una vez al día durante 5 días antes del desafío. Se administró PBS a ratones de control utilizando la misma pauta. Las existencias de virus de la gripe se diluyeron en PBS. Se anestesiaron ratones con Zotile (Virbac, Francia) intramuscularmente a 15 mg/kg (peso corporal) y luego infectaron intranasalmente con 120 unidades plaqueformantes (PCU) del virus de la gripe H5N1 en 50 L. El tejido pulmonar de cinco ratones por grupo se recogió el día 0 antes del desafío para qPCR y Se recolectó tejido pulmonar de otros cinco ratones en el día 3 postinfección para el ensayo de placa y qPCR. Se observaron diez ratones por grupo para la supervivencia durante 14 días y se registraron pesos corporales. 2.6. Ensayo de placa. Células MDCK fueron cultivadas en DMEM (Hyclone Laboratories, Logan, UT, USA) que contenían 10% FBS (Hyclone Laboratories), 100 U/ml penicilina, y 100 g/ml estreptomicina (Invitrogen, San Diego, CA, USA). El sobrenadante de tejido pulmonar se diluyó 10 veces y se añadió a una monocapa celular cubierta por agar semisólido que contenía 0,5 g/ml de tripsina TPCK (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Las placas fueron incubadas a 37o C El ARN total de 1 × 10 6 células o 10 mg de tejido pulmonar fue preparado por Trizol (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN tratado con DNaseI (0,2 g) fue transcrito inversamente al ADNc mediante imprimaciones aleatorias. La expresión del gen de la hemaglutinina (HA) del virus de la gripe H5N1 fue detectada por qPCR utilizando el kit Power SYBR Green PCR Master Mix (Applicated Biosystems, Foster City, CA, USA). Se utilizaron los siguientes imprimadores AGG CAC CA-3 5 -CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3 h IL-6 5 -CCT TCG GTC CAG TTG CCT TCT-3 5 -CCA GTG CCT CTT TGC TGC TGC TTT C-3 h IFN: imprimador delantero, 5 -CGC AGT ATT CAG AAG AAG CAAGAC-3 ; e imprimador inverso, 5 -TCC ATA AGG ATA GAC CTA CCA-3. La reacción se realizó en un ciclor térmico ABI 7500 con un paso inicial de desnaturalización a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s, 56 ° C durante 30 s y 72 ° C durante 40 s. El número de copia del gen HA fue calculado por el software 7500 v2.0 (Aplicado Biosistemas) utilizando un plásmido de concentración conocida con HA como estándar. Se realizó qPCR relativo para otros ocho genes: hactina, h IL-6, h IFN- y hTNF- para células A549; mactina, mTLR-2, mTLR-4, mDectin-1, mMR, mIL-6, mIFN- y mTNF- para células Raw264. La reacción se realizó con 95°C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 95°C durante 15 segundos, recocido a 52°C durante 30 s, y extensión a 72°C durante 40 s. El cambio de pliegues en la expresión génica se normalizó en controles (ratones naive) por 2 CT utilizando -actina como norma interna [20]. 2.8. ELISA. Los niveles de IL-6, TNF- e IFN en pulmón se probaron con kits ELISA (Boster, Wuhan, China) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Un gramo de tejido pulmonar de cada ratón fue molido en 1 mL PBS y centrifugado durante 20 min a 5000 rpm. Los sobrenadantes fueron recolectados y diluidos 10 veces para ELISA. 2.10. Análisis Estadístico. El análisis estadístico se realizó utilizando ANOVAs de una vía con SPSS 12.0 (SPSS Taiwan Corp., Taiwán) y se consideró significativo < 0,05. Muchos polisacáridos botánicos presentan un efecto inmunomodulador [11]. Para determinar las propiedades inmunomoduladoras del EAP, se investigó el efecto potencial de los polisacáridos sobre las células A549 y Raw264,7. Las células fueron tratadas con diversas concentraciones de EAP (50, 100, 200 g/ml) durante 36 h. Los niveles de ARNm de IL-6, TNF- e IFN fueron detectados por qPCR. La Figura 1 muestra las actividades inmunomoduladoras del EAP in vitro. Varias concentraciones de EAP desencadenaron una fuerte secreción de IL-6, TNF- e IFN de forma dosis dependiente tanto en las células A549 (Figuras 1(a)-1(c)) y Raw264,7 células (Figuras 1(d) -1(f))) en comparación con el grupo de tratamiento con PBS. Para comprobar si el EAP podía proteger a los ratones infectados con H5N1, los ratones fueron tratados con EAP a una dosis de 5, 10, 25 o 50 mg/kg de peso corporal intranasal una vez al día durante 5 días antes del desafío viral con 120 UFP. Diez ratones por grupo fueron monitorizados durante 14 días para la tasa de supervivencia. Como se muestra en la Figura 2(a), todos los ratones que recibieron PBS murieron en el día 11. Los ratones administrados con 25 mg/kg de EAP tuvieron una tasa de supervivencia del 50% en el día 14, que fue El tratamiento con EAP de 10 mg/kg y 50 mg/kg también pareció tener una ventaja de supervivencia, pero no estadísticamente significativa, lo que sugiere que el efecto protector de la EAP contra la infección por H5N1 requiere una dosis moderada. El tratamiento con EAP también alivió la pérdida de peso en ratones infectados (Figura 2(b) ). Para determinar la carga viral en el pulmón de los ratones infectados, se realizaron ensayos de placa y qPCR. Los títulos virales pulmonares en el grupo EAP (25 mg/kg) fueron significativamente más bajos que los títulos en los ratones que recibieron PBS en el día 3 postinfección (Figuras 2(c) y 2(d) ). Estos datos indican claramente que la administración intranasal de EAP controla la replicación viral H5N1 y mejora las tasas de supervivencia en un modelo de ratón. El efecto protector de EAP contra el virus Para detectar la expresión IL-6, TNF- e IFN, los pulmones de cinco ratones por grupo fueron recolectados en el día 0 antes de la infección y probados por qPCR y ELISA. Los niveles de ARNm en el grupo EAP (25 mg/kg) fueron significativamente más altos que los del grupo control PBS (ratones naive) (Figuras 3(a)-3(c) ). Los niveles de citoquinas solubles en el día 0 fueron medidos por ELISA, y los resultados fueron consistentes con los resultados de qPCR, aunque la producción de IFN en el grupo EAP no fue significativamente mayor que la del grupo PBS (= 0,0599) (Figuras 3(g)-3(i) ). Estos resultados sugieren que la EAP aumenta la producción IL-6, TNF- e IFN. La expresión IL-6, TNF- e IF En contraste, los niveles de TNF-mRNA tras el tratamiento con EAP (25 mg/kg) fueron significativamente más bajos que los del grupo PBS (Figura 3(e) ), mientras que la expresión IL-6 e IFN fue sólo ligeramente menor (no significativa) (Figuras 3(d) y 3(f) ). Estos resultados pueden ser explicados por una mayor carga viral, y la respuesta inflamatoria más severa en ratones tratados con PBS. La inflamación excesiva puede causar lesiones pulmonares graves durante la infección por influenza H5N1. Para evaluar los cambios histopatológicos en los pulmones de ratones infectados, se examinaron tejidos de cada grupo en el día 3 postinfección. Los pulmones de ratones tratados con PBS mostraron una respuesta inflamatoria severa, caracterizada por edema intersticial, infiltración celular inflamatoria alrededor de pequeños vasos sanguíneos, lumen alveolar inundado con líquido edema mezclado con células epiteliales alveolares exfoliadas, y un engrosamiento de las paredes alveolares (Figuras 4(c) y 4(d) ). Los pulmones de ratones tratados con EAP (25 mg/kg) mostraron lesiones más leves que los que recibieron PBS, caracterizadas por signos de bronconeumonía con edema intersticial, e infiltración celular inflamatoria alrededor de pequeños vasos sanguíneos (Figuras 4(a) y 4(b) ). Se correlacionaron cargas virales y producción de citocinas inflamatorias en el pulmón; sugiriendo que el tratamiento con EAP reduce lesiones pulmonares en ratones infectados con H5N Los polisacáridos derivados de muchas plantas mejoran la secreción de citoquinas y quimioquinas, tales como TNF-, IL-6, IL-8 e IL-12 [11]. Este efecto inmunomodulador está mediado principalmente por el reconocimiento de polisacáridos polímeros por varios receptores de reconocimiento de patrones (PRRs). Para determinar qué receptor contribuye directamente al reconocimiento inmune innato de EAP, el receptor de Toll-como 2 (TLR2), TLR4, Dectin-1 y receptor de manosa (MR) fueron examinados por qPCR tanto in vivo como in vitro. Los ratones fueron tratados con EAP a una dosis de 25 mg/kg de peso corporal intranasal una vez al día durante 5 días, con ratones de control recibiendo PBS. El ARN total pulmonar fue preparado para qPCR. La expresión de Dectin-1 y MR en ratones tratados con EAP fue significativamente elevada en comparación con los controles, mientras que la expresión de TLR2 y TLR4 fue ligeramente mayor, pero no estadísticamente significativa (Figura 5(a) ). El ensayo in vitro mostró tendencias similares. Como se muestra en la Figura 5(b), las células Raw264,7 fueron tratadas con 200 g/ml EPA durante 36 h antes de qPCR. Los niveles de Dectin-1 y MR fueron significativamente más altos, mientras que la expresión de TLR2 y TLR4 no cambió. Estos datos sugieren que el reconocimiento del EAP ocurrió principalmente a través de la vía Dectin-1 y MR. En este estudio, evaluamos las actividades inmunomoduladoras y el efecto protector del EAP frente a la infección por gripe H5N1 en un modelo de ratón. La administración intranasal de EAP antes del desafío viral H5N1 mejoró las tasas de supervivencia de ratones infectados con la correspondiente reducción de la carga viral pulmonar. El efecto anti-H5N1 fue muy probable debido al reconocimiento inmune innato de EAP y a la secreción de mediadores inmunes innatos (IL-6, TNFand IFN-) antes de la infección. Además, el efecto del EAP sobre la expresión PRR (incluyendo TLR2, TLR4, Dectin-1 y MR) fue determinado tanto in vivo como in vitro. Estos resultados sugieren que el reconocimiento inmune innato de EAP fue dependiente de la activación de las vías Dectin-1 y MR. Nuestros datos demuestran la viabilidad de usar EAP como un nuevo agente inmunomodulador contra la infección por influenza. La aparición de nuevas cepas farmacorresistentes derivadas de la deriva antigénica limita los beneficios terapéuticos de la vacunación y los agentes antivirales en el control de la gripe [6, 21, 22]. Por lo tanto, se necesita urgentemente el desarrollo de nuevas estrategias antiinfluenza de amplio espectro. La mayoría de los polisacáridos botánicos son candidatos ideales para nuevos agentes inmunomoduladores debido a sus propiedades no tóxicas y a menos efectos secundarios en comparación con los polisacáridos de origen bacteriano. Varios polisacáridos aislados de plantas y hongos exhiben beneficios antivirales eficaces contra el virus A de la gripe (incluidos los subtipos H1N1 y H3N2) [12] [13] [14] [15]. El uso de polisacáridos como agente inmunomodulador en estudios anti-H5N1 es poco frecuente. El tratamiento con EAP aumentó la producción de IL-6, TNF- e IFN y proporciona una ventaja de supervivencia en ratones infectados con H5N1. La tasa de supervivencia tras el pretratamiento con EAP (25 mg/kg de peso corporal) fue significativamente mayor que en ratones que recibían PBS (50% a 0%). En informes anteriores, se detectaron altos niveles de citoquinas y quimioquinas proinflamatorias (incluyendo TNF-, IL-6 e IFN-) durante la infección con H5N1 [23, 24]. Esta "tormenta de citoquinas" conduce a los síntomas respiratorios severos y a la lesión inmune del huésped. Así, las tormentas de citoquinas inducidas por H5N1 se hipotesan para ser la principal causa de mortalidad, y el uso de agentes antiinflamatorios puede, por lo tanto, proporcionar un efecto terapéutico [25, 26]. Curiosamente, 8 ratones de medicina complementaria y alternativa basados en pruebas deficientes en TNF-, TNF-receptor, IL-6, MIP-1, e IL-1R o tratados con esteroides, de tipo salvaje no tuvieron una ventaja de supervivencia en comparación con ratones de tipo salvaje después de la infección por gripe H5N1 [27, 28]. Curiosamente, el tratamiento profiláctico del agonista TLR3 PolyICLC, que aumenta fuertemente la producción de citoquinas, proporciona protección contra las infecciones por H1N1 y H5N1 [29, 30]. Estos estudios contradictorios se pueden explicar en que la respuesta inflamatoria ayuda a eliminar el virus, mientras agrava el daño patológico del huésped. Producción elevada de citocinas, como IL-6, TNF- e IFNare muy importante para el aclaramiento viral en la etapa temprana de la infección mediante la activación Una vez que la infección viral ha desencadenado una tormenta de citoquinas debido a la alta carga viral, la respuesta inflamatoria causa lesiones patológicas graves o incluso la muerte. En este caso, recibir un inmunomodulador por sí solo no puede ayudar a los animales a sobrevivir [25], lo que probablemente explica por qué el tratamiento inmunomodulador previo a la infección viral resulta en una mejor tasa de supervivencia [26, 30]. En nuestro estudio, el tratamiento de EAP poco después de la infección o postinfección 24 h no proporcionó una ventaja de supervivencia (datos no mostrados). Las propiedades antiinfluenza de IL-6, TNF- e IFN han sido discutidas en muchos estudios, a pesar de su participación en tormentas citoquinas desencadenadas por la infección por gripe. IL-6 juega un papel importante en la protección contra el virus influenza A, ya que es necesario para el aclaramiento viral y esencial para El tratamiento con IFN en las primeras etapas de la infección por gripe mejora la tasa de supervivencia en los modelos de ratón [33]. Además, los altos niveles de secreción de IFN estimulados por polisacáridos de ginseng proporcionan un efecto antiinfluenza in vivo [12]. En este informe, la administración intranasal de EAP antes del desafío H5N1 eleva la expresión de IL-6, TNF- e IFN en comparación con ratones que reciben PBS. Los altos niveles de estos mediadores contribuyen al aclaramiento viral y a la respuesta antiviral. Los títulos virales pulmonares después del tratamiento con EAP fueron más bajos en el día 3 postinfección. En contraste, los niveles de IL-6 e IFN-mRN fueron ligeramente más bajos, mientras que la producción de TNF fue significativamente menor que la del grupo PBS. En cuanto a la inflamación excesiva inducida por el virus H5N Por lo tanto, el momento del tratamiento con EAP como agente profiláctico es muy importante. Se cree que las actividades inmunomoduladoras de los polisacáridos botánicos son mediadas por varios PRR [11]. En este estudio, examinamos los niveles de ARNm de TLR2, TLR4, Dectin-1 y MR después del tratamiento con EAP. Se encontró que el EAP aumenta significativamente las expresiones de Dectin-1 y MR mRNm tanto in vivo como in vitro. Nuestra hipótesis es que el reconocimiento inmune innato del EAP se impulsa principalmente a través de una vía dependiente de Dectin-1 y MR. La unión a estos receptores, el EAP puede activar vías de señalización intracelulares complejas y aumentar la producción de citocinas, conduciendo a una respuesta antiviral. Así, la protección contra H5N1 por el tratamiento con EAP es menos probable que cause resistencia En conclusión, nuestro estudio demuestra que el extracto de hoja de EAP es un agente profiláctico e inmunomejorante contra la infección por el virus de la gripe H5N1. El tratamiento con EAP inhibe eficazmente la replicación viral de H5N1 y mejora la supervivencia animal. Este enfoque ofrece una estrategia alternativa para el desarrollo de agentes inmunomoduladores antiinfluenza y beneficia la utilización de productos de E. adenophorum.

Nombre algunos medicamentos utilizados para tratar la gripe.

La actividad inmunomoduladora y los efectos protectores del polisacárido del extracto de hoja de adenoforo del Eupatorium sobre la infección por gripe altamente patógena H5N1https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3789439/SHA: efba2008a6ccf1ad2614aebd79a6a741ea6538b9Autores: Jin, Yi; Zhang, Yuewei; Wan, Chunyan; Wang, Hongjun; Hou, Lingyu; Chang, Jianyu; Fan, Kai; Xie, XiangmingFecha: 2013-09-18DOI: 10.1155/2013/194976Licencia: cc-byAbstract: El desarrollo de nuevos agentes antivirales de amplio espectro contra la infección por H5N En este estudio, se evaluaron las actividades inmunomoduladoras y el efecto protector del polisacárido de Eupatorium adenophorum (EAP) frente al subtipo altamente patógeno del virus de la gripe H5N1. El tratamiento con EAP aumentó significativamente la producción de IL-6, TNF-α e IFN-γ tanto in vivo como in vitro, medida por qPCR y ELISA. En un modelo de infección por ratón, la administración intranasal del EAP a una dosis de 25 mg/kg de peso corporal antes del desafío viral H5N1 inhibió eficientemente la replicación viral, la disminución de las lesiones pulmonares y el aumento de la tasa de supervivencia. Nuestra investigación sugiere una estrategia alternativa para el desarrollo de nuevos agentes antiinfluenza y beneficios de los productos de E. adenophorum. Texto: El virus de la gripe subtipo H5N1 altamente patógeno puede transmitirse directamente de las aves de corral al ser humano y causar infecciones respiratorias agudas. El virus de la gripe pandémica H5N1 representaba una amenaza mundial para la salud pública debido a la rápida propagación y alta patogenicidad [1, 2]. Los síntomas en animales o seres humanos infectados con H5N1 incluyen fiebre, encefalitis, neumonía y síndrome respiratorio agudo grave (SARS) [3, 4]. La Organización Mundial de la Salud informó 622 casos humanos de infección por el virus de la gripe H5N1, incluidas 371 muertes (tasa de mortalidad > 50%), de 2003 a 2013 (http://www.who.int/ influenza/human animal interface/H5N1 Actualmente, la medida preventiva más eficaz contra el virus de la gripe es la vacunación. Varios medicamentos antiinfluenza han sido ampliamente utilizados, incluyendo zanamivir (Relenza) y oseltamivir (Tamiflu). Desafortunadamente, sus beneficios han sido significativamente restringidos por la resistencia a los medicamentos y la mutación antigénica frecuente [5, 6]. Por lo tanto, el desarrollo de nuevos agentes antiinfluenza contra el subtipo H5N1 es muy importante. La planta invasiva Eupatorium adenophorum, nativa de Centroamérica, tiene una gran capacidad de adaptación a diferentes ambientes en todo el mundo. Esta planta invadió por primera vez la provincia de Yunnan en el sur (China) en la década de 1940 desde Birmania y Vietnam, y rápidamente se extendió por todo el suroeste de China a lo largo de la década de 1950 [7, 8]. En los últimos 50 años, E. adenophorum ha afectado gravemente el medio ambiente ecológico en las zonas subtropicales medias de China, incluidas las provincias de Yunnan, Guizhou, Sichuan y Guangxi, invadiendo tierras de cultivo, pastizales y bosques [7]. El control manual, químico o biológico de E. adenophorum ha obstaculizado su desarrollo y utilización integrales para beneficio económico. Muchos componentes bioactivos aislados de E. adenophorum han mostrado actividad antimicrobiana e inmunomodulando 2 propiedades de Medicina Complementaria y Alternativa Basadas en Evidencia [9]. En un estudio reciente, se evaluaron las propiedades antiinflamatorias del extracto de hoja etanólica [10]. Sin embargo, ha habido pocos informes sobre la bioactividad del polisacárido de E. adenophorum (EAP). Se han reportado las propiedades inmunomodula Varios polisacáridos de Cordyceps militaris, Portulaca oleracea, Gracilaria lemaneiformis, Gyrodinium impudium y Panax ginseng han sido descritos como agentes antiinfluenza eficaces frente a cepas H1N1 y H3N2 [12] [13] [14] [15]. En informes recientes, los adyuvantes a base de polisacáridos mejoraron la inmunogenicidad y la eficacia protectora de las vacunas H5N1 en modelos de infección animal [16, 17]. Sin embargo, a nuestro conocimiento no ha habido ningún informe sobre el tratamiento con EAP contra la gripe H5N1 altamente patógena. En el presente estudio, investigamos el efecto potencial de la EAP contra la infección por influenza H5N1 en un modelo de ratón. Nuestros resultados sugieren que los efectos anti-H5N1 de la EAP ofrecen una estrategia alternativa para el desarrollo de agentes antiinfluenza y la utilización de productos de E. adenophorum. Virus. El virus de la gripe H5N1 (A/cacaca de barra/ Qinghai/1/2010) utilizado en este estudio fue aislado del lago Qinghai en mayo de 2010. Este aislamiento es altamente patógeno en aves de corral, ratones y células de riñón canino Madin-Darby (MDCK). El virus se propagó en células MDCK a 37°C durante 48 h, y el sobrenadante viral fue cosechado, alícitado y almacenado en −80°C. Los títulos virales fueron determinados por el ensayo de placa descrito anteriormente [18]. De 8 a 10 semanas de edad, se obtuvieron ratones BALB/c hembra de Vital River Laboratories (Beijing, China), y las parejas reproductoras originales se compraron de Charles River (Beijing, China). Los ratones fueron criados en jaulas ventiladas independientes (IVC) y recibieron alimentos y agua libres de patógenos. Los tratamientos animales se regían por el Reglamento de Animales Experimentales de la Autoridad de Beijing, y fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Agricultura de China. La línea celular monocítica Raw 264,7, línea celular adenocarcinoma pulmonar humano epitelial A549, y líneas celulares de riñón canino Madin-Darby (MDCK) fueron proporcionadas por el Centro de Recursos Celulares de Peking Union Medical College. Las células fueron cultivadas y mantenidas de acuerdo con las recomendaciones del proveedor. Yunnan provincia, China. 100 g de materiales secos fueron pulverizados en un mezclador y luego filtrados con 40 mallas. El polvo de hoja fue extraído mediante tratamiento ultrasónico con 1000 mL de agua destilada durante 45 min. El sobrenadante fue recolectado y el precipitado resuspendido en 1000 mL de agua destilada y nuevamente extraído por tratamiento ultrasónico durante 30 min. El sobrenadante resultante fue combinado con el obtenido del primer tratamiento ultrasónico. La fracción acuosa final fue evaporada a sequedad en un evaporador rotatorio. El residuo obtenido fue disuelto en agua destilada y se mantuvo congelado a 4°C.El extracto fue centrifugado a 3000 g/min durante 25 min. y se concentró bajo 80°C durante 8 h para preparar polisacárido. El sobrenadante se desproteinizó con el método Sevag y se dializó contra el agua durante 48 h. El líquido final se mezcló con un volumen de 95% de etanol (v/v) y se centrifugó a 3000 g/min durante 10 min. Los precipitados se lavaron sucesivamente con etanol absoluto, éter y se secaron bajo vacío a 40 °C para obtener el polisacárido bruto (yield = 1,2%). El contenido del EAP se determinó mediante el método fenol-H 2 SO 4 [19]. Vitro. 2.5 mL A549 y 264,7 células Raw (4 × 10 5 / mL) por pozo se plató en placas de 6 pocillos y se cultivó a 37 °C por debajo del 5% de CO 2 durante 24 h. Se eliminó el medio de cultivo de 2,5 mL y se añadieron a cada pozo diferentes concentraciones de Los controles fueron tratados con solución salina fosfatada (PBS), se recolectaron células 36 h después del tratamiento para la extracción de ARN y reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa (QPCR). Ensayo. Se administraron ratones EAP a una dosis de 5, 10, 25 ó 50 mg/kg de peso corporal, intranasalmente una vez al día durante 5 días antes del desafío. Se administró PBS a ratones de control utilizando la misma pauta. Las existencias de virus de la gripe se diluyeron en PBS. Se anestesiaron ratones con Zotile (Virbac, Francia) intramuscularmente a 15 mg/kg (peso corporal) y luego infectaron intranasalmente con 120 unidades plaqueformantes (PCU) del virus de la gripe H5N1 en 50 L. El tejido pulmonar de cinco ratones por grupo se recogió el día 0 antes del desafío para qPCR y Se recolectó tejido pulmonar de otros cinco ratones en el día 3 postinfección para el ensayo de placa y qPCR. Se observaron diez ratones por grupo para la supervivencia durante 14 días y se registraron pesos corporales. 2.6. Ensayo de placa. Células MDCK fueron cultivadas en DMEM (Hyclone Laboratories, Logan, UT, USA) que contenían 10% FBS (Hyclone Laboratories), 100 U/ml penicilina, y 100 g/ml estreptomicina (Invitrogen, San Diego, CA, USA). El sobrenadante de tejido pulmonar se diluyó 10 veces y se añadió a una monocapa celular cubierta por agar semisólido que contenía 0,5 g/ml de tripsina TPCK (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Las placas fueron incubadas a 37o C El ARN total de 1 × 10 6 células o 10 mg de tejido pulmonar fue preparado por Trizol (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN tratado con DNaseI (0,2 g) fue transcrito inversamente al ADNc mediante imprimaciones aleatorias. La expresión del gen de la hemaglutinina (HA) del virus de la gripe H5N1 fue detectada por qPCR utilizando el kit Power SYBR Green PCR Master Mix (Applicated Biosystems, Foster City, CA, USA). Se utilizaron los siguientes imprimadores AGG CAC CA-3 5 -CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3 h IL-6 5 -CCT TCG GTC CAG TTG CCT TCT-3 5 -CCA GTG CCT CTT TGC TGC TGC TTT C-3 h IFN: imprimador delantero, 5 -CGC AGT ATT CAG AAG AAG CAAGAC-3 ; e imprimador inverso, 5 -TCC ATA AGG ATA GAC CTA CCA-3. La reacción se realizó en un ciclor térmico ABI 7500 con un paso inicial de desnaturalización a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s, 56 ° C durante 30 s y 72 ° C durante 40 s. El número de copia del gen HA fue calculado por el software 7500 v2.0 (Aplicado Biosistemas) utilizando un plásmido de concentración conocida con HA como estándar. Se realizó qPCR relativo para otros ocho genes: hactina, h IL-6, h IFN- y hTNF- para células A549; mactina, mTLR-2, mTLR-4, mDectin-1, mMR, mIL-6, mIFN- y mTNF- para células Raw264. La reacción se realizó con 95°C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 95°C durante 15 segundos, recocido a 52°C durante 30 s, y extensión a 72°C durante 40 s. El cambio de pliegues en la expresión génica se normalizó en controles (ratones naive) por 2 CT utilizando -actina como norma interna [20]. 2.8. ELISA. Los niveles de IL-6, TNF- e IFN en pulmón se probaron con kits ELISA (Boster, Wuhan, China) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Un gramo de tejido pulmonar de cada ratón fue molido en 1 mL PBS y centrifugado durante 20 min a 5000 rpm. Los sobrenadantes fueron recolectados y diluidos 10 veces para ELISA. 2.10. Análisis Estadístico. El análisis estadístico se realizó utilizando ANOVAs de una vía con SPSS 12.0 (SPSS Taiwan Corp., Taiwán) y se consideró significativo < 0,05. Muchos polisacáridos botánicos presentan un efecto inmunomodulador [11]. Para determinar las propiedades inmunomoduladoras del EAP, se investigó el efecto potencial de los polisacáridos sobre las células A549 y Raw264,7. Las células fueron tratadas con diversas concentraciones de EAP (50, 100, 200 g/ml) durante 36 h. Los niveles de ARNm de IL-6, TNF- e IFN fueron detectados por qPCR. La Figura 1 muestra las actividades inmunomoduladoras del EAP in vitro. Varias concentraciones de EAP desencadenaron una fuerte secreción de IL-6, TNF- e IFN de forma dosis dependiente tanto en las células A549 (Figuras 1(a)-1(c)) y Raw264,7 células (Figuras 1(d) -1(f))) en comparación con el grupo de tratamiento con PBS. Para comprobar si el EAP podía proteger a los ratones infectados con H5N1, los ratones fueron tratados con EAP a una dosis de 5, 10, 25 o 50 mg/kg de peso corporal intranasal una vez al día durante 5 días antes del desafío viral con 120 UFP. Diez ratones por grupo fueron monitorizados durante 14 días para la tasa de supervivencia. Como se muestra en la Figura 2(a), todos los ratones que recibieron PBS murieron en el día 11. Los ratones administrados con 25 mg/kg de EAP tuvieron una tasa de supervivencia del 50% en el día 14, que fue El tratamiento con EAP de 10 mg/kg y 50 mg/kg también pareció tener una ventaja de supervivencia, pero no estadísticamente significativa, lo que sugiere que el efecto protector de la EAP contra la infección por H5N1 requiere una dosis moderada. El tratamiento con EAP también alivió la pérdida de peso en ratones infectados (Figura 2(b) ). Para determinar la carga viral en el pulmón de los ratones infectados, se realizaron ensayos de placa y qPCR. Los títulos virales pulmonares en el grupo EAP (25 mg/kg) fueron significativamente más bajos que los títulos en los ratones que recibieron PBS en el día 3 postinfección (Figuras 2(c) y 2(d) ). Estos datos indican claramente que la administración intranasal de EAP controla la replicación viral H5N1 y mejora las tasas de supervivencia en un modelo de ratón. El efecto protector de EAP contra el virus Para detectar la expresión IL-6, TNF- e IFN, los pulmones de cinco ratones por grupo fueron recolectados en el día 0 antes de la infección y probados por qPCR y ELISA. Los niveles de ARNm en el grupo EAP (25 mg/kg) fueron significativamente más altos que los del grupo control PBS (ratones naive) (Figuras 3(a)-3(c) ). Los niveles de citoquinas solubles en el día 0 fueron medidos por ELISA, y los resultados fueron consistentes con los resultados de qPCR, aunque la producción de IFN en el grupo EAP no fue significativamente mayor que la del grupo PBS (= 0,0599) (Figuras 3(g)-3(i) ). Estos resultados sugieren que la EAP aumenta la producción IL-6, TNF- e IFN. La expresión IL-6, TNF- e IF En contraste, los niveles de TNF-mRNA tras el tratamiento con EAP (25 mg/kg) fueron significativamente más bajos que los del grupo PBS (Figura 3(e) ), mientras que la expresión IL-6 e IFN fue sólo ligeramente menor (no significativa) (Figuras 3(d) y 3(f) ). Estos resultados pueden ser explicados por una mayor carga viral, y la respuesta inflamatoria más severa en ratones tratados con PBS. La inflamación excesiva puede causar lesiones pulmonares graves durante la infección por influenza H5N1. Para evaluar los cambios histopatológicos en los pulmones de ratones infectados, se examinaron tejidos de cada grupo en el día 3 postinfección. Los pulmones de ratones tratados con PBS mostraron una respuesta inflamatoria severa, caracterizada por edema intersticial, infiltración celular inflamatoria alrededor de pequeños vasos sanguíneos, lumen alveolar inundado con líquido edema mezclado con células epiteliales alveolares exfoliadas, y un engrosamiento de las paredes alveolares (Figuras 4(c) y 4(d) ). Los pulmones de ratones tratados con EAP (25 mg/kg) mostraron lesiones más leves que los que recibieron PBS, caracterizadas por signos de bronconeumonía con edema intersticial, e infiltración celular inflamatoria alrededor de pequeños vasos sanguíneos (Figuras 4(a) y 4(b) ). Se correlacionaron cargas virales y producción de citocinas inflamatorias en el pulmón; sugiriendo que el tratamiento con EAP reduce lesiones pulmonares en ratones infectados con H5N Los polisacáridos derivados de muchas plantas mejoran la secreción de citoquinas y quimioquinas, tales como TNF-, IL-6, IL-8 e IL-12 [11]. Este efecto inmunomodulador está mediado principalmente por el reconocimiento de polisacáridos polímeros por varios receptores de reconocimiento de patrones (PRRs). Para determinar qué receptor contribuye directamente al reconocimiento inmune innato de EAP, el receptor de Toll-como 2 (TLR2), TLR4, Dectin-1 y receptor de manosa (MR) fueron examinados por qPCR tanto in vivo como in vitro. Los ratones fueron tratados con EAP a una dosis de 25 mg/kg de peso corporal intranasal una vez al día durante 5 días, con ratones de control recibiendo PBS. El ARN total pulmonar fue preparado para qPCR. La expresión de Dectin-1 y MR en ratones tratados con EAP fue significativamente elevada en comparación con los controles, mientras que la expresión de TLR2 y TLR4 fue ligeramente mayor, pero no estadísticamente significativa (Figura 5(a) ). El ensayo in vitro mostró tendencias similares. Como se muestra en la Figura 5(b), las células Raw264,7 fueron tratadas con 200 g/ml EPA durante 36 h antes de qPCR. Los niveles de Dectin-1 y MR fueron significativamente más altos, mientras que la expresión de TLR2 y TLR4 no cambió. Estos datos sugieren que el reconocimiento del EAP ocurrió principalmente a través de la vía Dectin-1 y MR. En este estudio, evaluamos las actividades inmunomoduladoras y el efecto protector del EAP frente a la infección por gripe H5N1 en un modelo de ratón. La administración intranasal de EAP antes del desafío viral H5N1 mejoró las tasas de supervivencia de ratones infectados con la correspondiente reducción de la carga viral pulmonar. El efecto anti-H5N1 fue muy probable debido al reconocimiento inmune innato de EAP y a la secreción de mediadores inmunes innatos (IL-6, TNFand IFN-) antes de la infección. Además, el efecto del EAP sobre la expresión PRR (incluyendo TLR2, TLR4, Dectin-1 y MR) fue determinado tanto in vivo como in vitro. Estos resultados sugieren que el reconocimiento inmune innato de EAP fue dependiente de la activación de las vías Dectin-1 y MR. Nuestros datos demuestran la viabilidad de usar EAP como un nuevo agente inmunomodulador contra la infección por influenza. La aparición de nuevas cepas farmacorresistentes derivadas de la deriva antigénica limita los beneficios terapéuticos de la vacunación y los agentes antivirales en el control de la gripe [6, 21, 22]. Por lo tanto, se necesita urgentemente el desarrollo de nuevas estrategias antiinfluenza de amplio espectro. La mayoría de los polisacáridos botánicos son candidatos ideales para nuevos agentes inmunomoduladores debido a sus propiedades no tóxicas y a menos efectos secundarios en comparación con los polisacáridos de origen bacteriano. Varios polisacáridos aislados de plantas y hongos exhiben beneficios antivirales eficaces contra el virus A de la gripe (incluidos los subtipos H1N1 y H3N2) [12] [13] [14] [15]. El uso de polisacáridos como agente inmunomodulador en estudios anti-H5N1 es poco frecuente. El tratamiento con EAP aumentó la producción de IL-6, TNF- e IFN y proporciona una ventaja de supervivencia en ratones infectados con H5N1. La tasa de supervivencia tras el pretratamiento con EAP (25 mg/kg de peso corporal) fue significativamente mayor que en ratones que recibían PBS (50% a 0%). En informes anteriores, se detectaron altos niveles de citoquinas y quimioquinas proinflamatorias (incluyendo TNF-, IL-6 e IFN-) durante la infección con H5N1 [23, 24]. Esta "tormenta de citoquinas" conduce a los síntomas respiratorios severos y a la lesión inmune del huésped. Así, las tormentas de citoquinas inducidas por H5N1 se hipotesan para ser la principal causa de mortalidad, y el uso de agentes antiinflamatorios puede, por lo tanto, proporcionar un efecto terapéutico [25, 26]. Curiosamente, 8 ratones de medicina complementaria y alternativa basados en pruebas deficientes en TNF-, TNF-receptor, IL-6, MIP-1, e IL-1R o tratados con esteroides, de tipo salvaje no tuvieron una ventaja de supervivencia en comparación con ratones de tipo salvaje después de la infección por gripe H5N1 [27, 28]. Curiosamente, el tratamiento profiláctico del agonista TLR3 PolyICLC, que aumenta fuertemente la producción de citoquinas, proporciona protección contra las infecciones por H1N1 y H5N1 [29, 30]. Estos estudios contradictorios se pueden explicar en que la respuesta inflamatoria ayuda a eliminar el virus, mientras agrava el daño patológico del huésped. Producción elevada de citocinas, como IL-6, TNF- e IFNare muy importante para el aclaramiento viral en la etapa temprana de la infección mediante la activación Una vez que la infección viral ha desencadenado una tormenta de citoquinas debido a la alta carga viral, la respuesta inflamatoria causa lesiones patológicas graves o incluso la muerte. En este caso, recibir un inmunomodulador por sí solo no puede ayudar a los animales a sobrevivir [25], lo que probablemente explica por qué el tratamiento inmunomodulador previo a la infección viral resulta en una mejor tasa de supervivencia [26, 30]. En nuestro estudio, el tratamiento de EAP poco después de la infección o postinfección 24 h no proporcionó una ventaja de supervivencia (datos no mostrados). Las propiedades antiinfluenza de IL-6, TNF- e IFN han sido discutidas en muchos estudios, a pesar de su participación en tormentas citoquinas desencadenadas por la infección por gripe. IL-6 juega un papel importante en la protección contra el virus influenza A, ya que es necesario para el aclaramiento viral y esencial para El tratamiento con IFN en las primeras etapas de la infección por gripe mejora la tasa de supervivencia en los modelos de ratón [33]. Además, los altos niveles de secreción de IFN estimulados por polisacáridos de ginseng proporcionan un efecto antiinfluenza in vivo [12]. En este informe, la administración intranasal de EAP antes del desafío H5N1 eleva la expresión de IL-6, TNF- e IFN en comparación con ratones que reciben PBS. Los altos niveles de estos mediadores contribuyen al aclaramiento viral y a la respuesta antiviral. Los títulos virales pulmonares después del tratamiento con EAP fueron más bajos en el día 3 postinfección. En contraste, los niveles de IL-6 e IFN-mRN fueron ligeramente más bajos, mientras que la producción de TNF fue significativamente menor que la del grupo PBS. En cuanto a la inflamación excesiva inducida por el virus H5N Por lo tanto, el momento del tratamiento con EAP como agente profiláctico es muy importante. Se cree que las actividades inmunomoduladoras de los polisacáridos botánicos son mediadas por varios PRR [11]. En este estudio, examinamos los niveles de ARNm de TLR2, TLR4, Dectin-1 y MR después del tratamiento con EAP. Se encontró que el EAP aumenta significativamente las expresiones de Dectin-1 y MR mRNm tanto in vivo como in vitro. Nuestra hipótesis es que el reconocimiento inmune innato del EAP se impulsa principalmente a través de una vía dependiente de Dectin-1 y MR. La unión a estos receptores, el EAP puede activar vías de señalización intracelulares complejas y aumentar la producción de citocinas, conduciendo a una respuesta antiviral. Así, la protección contra H5N1 por el tratamiento con EAP es menos probable que cause resistencia En conclusión, nuestro estudio demuestra que el extracto de hoja de EAP es un agente profiláctico e inmunomejorante contra la infección por el virus de la gripe H5N1. El tratamiento con EAP inhibe eficazmente la replicación viral de H5N1 y mejora la supervivencia animal. Este enfoque ofrece una estrategia alternativa para el desarrollo de agentes inmunomoduladores antiinfluenza y beneficia la utilización de productos de E. adenophorum.

En este estudio, ¿cómo afectó el tratamiento de la EAP después de la infección a la supervivencia?

Se extiende del fregadero al paciente: Estudio in situ utilizando proteínas fluorescentes verdes (GFP)-expresión Escherichia coli A Modelo de dispersión bacteriana de depósitos de fregaderos de lavado a manohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5377511/SHA: 615071c8c959f24857b1bad521cc432b59719bfbAutores: Kotay, Shireen; Chai, Weidong; Guilford, William; Barry, Katie; Mathers, Amy J. Fecha: 2017-03-31DOI: 10.1128/aem.03327-16Licencia: cc-byResumen: Ha habido un número creciente de informes que implican Gammaproteobacteria como a menudo llevar genes de resistencia a los medicamentos de trampas de fregadero colonizados a pacientes hospitalizados vulnerables. Sin embargo, el mecanismo de transmisión de las aguas residuales de la trampa P del fregadero a los pacientes sigue siendo poco entendido. En este informe se informa el uso de una galería de laboratorio de lavabo designado para modelar la dispersión de proteína fluorescente verde (GFP) que expresa Escherichia coli de aguas residuales del fregadero al entorno circundante. No se encontró dispersión de GFP-expresando E. coli directamente desde la trampa P a la cuenca del fregadero o encimera circundante con flujo de agua coincidente desde un grifo. Sin embargo, cuando se permitió que las células E. coli que expresaban GFP maduraran en la trampa P en condiciones similares a las de un ambiente hospitalario, una biopelícula putativa con E. coli que expresaba GFP se extendía hacia arriba durante 7 días para llegar al colador, lo que resultó posteriormente en dispersión de gotitas a las áreas circundantes (<30 in.) durante la operación del grifo. También demostramos que la colonización de la trampa P podría ocurrir mediante una transmisión retrógrada a lo largo de un tubo común. Postulamos que los organismos se movilizan hasta el colador de la trampa P, resultando en dispersión de gotitas en lugar de dispersión directamente desde la trampa P. Este trabajo ayuda a definir más a fondo el modo de transmisión de bacterias desde un reservorio de P-trap a un paciente hospitalizado vulnerable. IMPORTANCIA Muchos informes recientes demuestran que las tuberías de drenaje se colonizan con bacterias Sin embargo, el mecanismo de dispersión de bacterias del fregadero a los pacientes no ha sido completamente aclarado. Mediante el establecimiento de una galería de fregaderos única, este trabajo encontró que un modo escalonado de transmisión que implica el crecimiento de biofilm desde el tubo inferior al colador del fregadero y posterior salpicadura al recipiente y área circundante se produce en lugar de salpicar directamente desde el agua en el tubo inferior. También hemos demostrado que la transmisión bacteriana puede ocurrir a través de conexiones en la plomería de aguas residuales a los sumideros vecinos. Este trabajo ayuda a definir más claramente el mecanismo y el riesgo de transmisión de una fuente de aguas residuales a pacientes hospitalizados en un mundo con bacterias cada vez más resistentes a los antibióticos que pueden prosperar en entornos de aguas residuales y causar infecciones en pacientes vulnerables. Recientemente ha habido un aumento alarmante de brotes relacionados con los sumideros en todo el mundo, con muchos informes que establecen un vínculo observacional (6) (7) (8) (9) (10) (12) (13). Un fregadero a menudo funciona como un conducto abierto a las aguas residuales en un área de atención al paciente que a menudo se encuentra en la misma habitación que el paciente. Los establecimientos de atención de la salud a menudo invierten en intervenciones desesperadas para hacer frente a brotes nosocomiales. El método preferido para abordar la mayor parte de la transmisión relacionada con el medio ambiente es utilizar una limpieza mejorada utilizando agentes químicos y físicos (14, 15). Desafortunadamente, los enfoques rutinarios son ineficientes en la eliminación completa de las Gammaproteobacterias resistentes a los medicamentos en una zona microbiológicamente activa inaccesible como una trampa del fregadero (6, 16) (18) (19) (20). El ambiente húmedo, húmedo y relativamente protegido en una trampa del fregadero favorece la Estas comunidades estarán expuestas a líquidos y desechos que se desechan en un fregadero y pueden incluir antimicrobianos, bebidas desechadas, jabón, bacterias presumiblemente patógenas de las manos de los trabajadores de la salud, y otros artículos. En resumen, las trampas de los sumideros podrían servir como caldo de cultivo para bacterias oportunistas y altamente resistentes a los antimicrobianos que no se pueden limpiar o eliminar fácilmente (23) (24) (25) (26) (28). Hay muchos informes de una asociación genética entre patógenos encontrados en las trampas de los sumideros y los encontrados en pacientes (29, 30). Sin embargo, sorprendentemente se ha hecho poco trabajo para entender la dinámica de transmisión a microescala. Anteriormente se demostró mediante la suspensión de partículas fluorescentes (Glo Germ; Glo Germ Co., Moab, UT) que el material inyectado en la trampa P se dispersa alrededor En última instancia, muchos detalles siguen sin ser abordados en torno a la propagación de Enterobacteriaceae en los sistemas de aguas residuales de las trampas de los sumideros: (i) pueden crecer organismos retrógrados desde el agua de las trampas P hasta el colador de los sumideros, (ii) pueden propagarse organismos de un fregadero a otro a lo largo de las superficies internas de tuberías con sistemas de drenaje compartidos, y (iii) qué porción de una tubería de drenaje colonizada resulta en dispersión en el recipiente del fregadero durante un evento de lavado a mano? En los primeros 14 días después de la instalación de la P-trap con proteína fluorescente verde establecida (GFP) que expresa Escherichia coli y sólo el agua corriendo desde el grifo, GFPexpresando E. coli no fue detectado en el tubo de escape más allá de 1.5 pulg. por encima del nivel de líquido en la P-trap. GFP-expresando E. coli, sin embargo, se encontró que era viable en la P-trap sin ningún nutriente añadido. A continuación, se instituyó un régimen de nutrientes para entender la influencia de los nutrientes en la movilidad y el crecimiento ascendente. La adición de caldo de soja triptic (TSB) promovió el crecimiento de GFP-expresando E. coli tan pronto como el día 1, con el crecimiento observado en el tubo de escape 2 pulg. sobre la superficie líquida en la P-trap (Tabla 1). por encima del líquido de la trampa P) se encontró colonizado con E. coli que expresa GFP. Esto se traduce en una tasa media de crecimiento de 1 pulg./día a lo largo de la longitud del tubo de escape con la adición de nutrientes y sin funcionamiento de grifo. E. coli que expresa GFP no se detectó en el agua del grifo. Transmisión de la bacteria de la gota a la gota. En estos experimentos, un fregadero flanqueador (sumidero 5) fue el único P-trap inoculado con E. coli que expresa GFP y por lo tanto fue la única fuente para la transmisión a los sumideros conectados. Comenzando con una concentración de inóculo más baja (10 3 CFU/ml) en el fregadero 5, el día 7, E. coli que expresa GFP fue detectado en el fregadero 2 y el fregadero 3 P-traps (Fig. 1a). Con concentraciones de inóculo de 10 6 UFC/ml y 10 10 UFC/ml en el fregadero 5, todas las trampas P del fregadero en la galería del fregadero, con la excepción del fregadero 1, fueron colonizadas con E. coli que expresaba GFP después de 7 días (Fig. 1b y c). Agua de grifo y aireadores probados negativos para E. coli que expresaba GFP. Independientemente de la concentración de inóculo inicial, el día 7 se registró el nivel más alto de colonización en el fregadero 3 P-trap. Después del día 7, cuando el régimen de nutrientes (descrito anteriormente) fue seguido durante 7 días adicionales en cada uno de los sumideros en la galería del fregadero con una concentración de inóculo de 10 10 UFC/ml, E. coli que expresa GFP fue detectado en los coladores de los sumideros 2 y 3 el día 14. Este hallazgo validó el crecimiento ascendente y la tasa de crecimiento en el tubo de escape cuando se añadieron nutrientes. En ocasiones se observaron colonias no fluorescentes en las muestras de agua de la trampa P recogidas de los sumideros, que posteriormente fueron identificadas como Pseudomonas sp. o Stenotrophomonas maltophilia, y colonias fluorescentes fueron confirmadas como E. coli. Dispersión de microesferas de los sumideros. En el primer experimento de dispersión, cuando las microesferas fluorescentes fueron inoculadas en la cola de drenaje offset sólo 4 pulg. debajo del colador, no se detectaron microesferas en las láminas de poliéster colocadas en el espacio del contador. Sin embargo, cuando el recipiente del fregadero fue recubierto con las microesferas, las láminas de poliéster superpuestas en el espacio del contador capturaron las microesferas dispersas causadas por la operación del Se observaron niveles relativamente más altos de dispersión a lo largo de los ejes mayor y menor del recipiente del fregadero elíptico (zonas 2, 5, 6, 9, 11, y 12). Las esquinas anteriores del espacio del contador del fregadero (zonas 4 y 7), que estaban más distantes del impacto del agua en el recipiente del fregadero, recibieron la menor dispersión. Dispersión de E. coli que expresa GFP de los sumideros. Inicialmente la trampa P sola fue inoculada con E. coli que expresa GFP y cuidadosamente instalada, manteniendo el tubo de escape y el colador libre de E. coli que expresa GFP antes de operar los grifos. No se observó UFC fluorescente en las placas colocadas en el mostrador o conectadas a la superficie del recipiente después de la operación del grifo. Curiosamente, cuando había una visible reserva de agua sobre el colador como resultado de un mayor caudal de agua del grifo que la tasa de drenaje de la trampa P, se detectó dispersión en las placas conectadas a la superficie del recipiente. El patrón de dispersión registrado cuando el recipiente del fregadero fue recubierto con E. coli expresivo de GFP fue comparable al patrón registrado cuando el recipiente del fregadero fue recubierto con microesferas fluorescentes (Fig. 2). La dispersión fue significativamente más alta a lo largo de los ejes (zonas 6, 9, 11 y 12) y más baja en las esquinas del espacio del contador del fregadero (zonas 4, 7 y 10). En contraste, la dispersión de E. coli que expresaba GFP causada por la operación del grifo fue mucho más extensa cuando se permitió que el colador fuera colonizado con GFPexpresante E. coli antes del experimento de dispersión. Además del espacio del contador del fregadero, se midió la dispersión al recipiente del fregadero, grifo, manijas del grifo, escudos de salpicaduras, y la superficie extendida del contador. La dispersión de E. coli que expresa GFP fue más alta en las placas unidas al recipiente del fregadero (Fig. 3b). Además, la dispersión fue mayor a lo largo del " y "" denotan la ausencia y presencia de E. coli que expresa GFP, respectivamente. Eje menor del recipiente del fregadero (Fig. 3b, zonas B3, B4 y B10) que a lo largo del eje principal del recipiente del fregadero, asociado con una distancia más corta desde el punto de ataque del agua del grifo hasta el recipiente a lo largo de este eje. El siguiente conteo más alto de UFC de la dispersión se registró en el área del contador cerca de los grifos (Fig. 3a, zonas 12 y 11). También se observó un patrón similar de mayor dispersión cerca de los grifos y menor dispersión en las esquinas del espacio de contador (Fig. 3a, zonas 4, 7 y 10) utilizando microesferas. También se registró dispersión en otras zonas del espacio de contador, en los escudos de salpicadura de Plexiglas, grifos, asas de grifo y superficie extendida (Fig. 3c). No hubo GFP-expresando E. coli CFU registrada en placas colocadas más allá de 30 pulg. del colador, demarcando el rango de dispersión bajo estas condiciones experimentales. La Tabla 2 da un resumen de las cargas de distribución total registradas utilizando microesferas fluorescentes y E. coli de GFP-expresando en cada experimento. Las cargas de dispersión en el contador del fregadero fueron comparables cuando el recipiente del fregadero fue recubierto con microesferas o E. coli de expresión GFP antes de la operación Aunque la carga de dispersión en el contador del fregadero fue menor cuando el colador del fregadero fue colonizado, es interesante notar que el recipiente del fregadero recibió la mayor dispersión. Para imitar la dispersión en un entorno hospitalario, primero investigamos si GFPexpresando E. coli establecería colonización consistente en una trampa del fregadero como muchas otras Gammaproteobacterias implicadas en brotes nosocomiales han hecho (6, 28). Muchos informes recientes demuestran que las trampas P se colonizan con Gammaproteobacterias altamente consecuentes, lo que luego resulta en transmisión nosocomial (29, 31, 32). El agua retenida en una trampa P del fregadero está presente para proporcionar una barrera de agua para evitar el desgastamiento del olor de las cloacas, pero puede proporcionar condiciones favorables para que microorganismos patógenos y oportunistas resistentes a antibióticos sobrevivan y desarrollen biopelículas resilientes (3, 33). Sin embargo, el mecanismo de dispersión de la bacteria en la P-trap a los pacientes o el área de atención médica circundante no había sido completamente dilucidado. Comenzamos con la hipótesis de que la bacteria se origina en la P-trap a través de la creación de gotitas cuando el agua del grifo golpea el agua de la P-trap, contaminando así el recipiente del fregadero y el área circundante. El hallazgo de esta teoría había sido reportado previamente usando partículas Glo Germ (6). Sin embargo, en el presente estudio con cuidadosa atención para evitar la contaminación por cola y cola, la dispersión directamente de la P-trap del fregadero con microesferas o E. coli que expresa GFP no pudo ser reproducida como se informó previamente (6). Más bien este trabajo demuestra un modo diferente y más escalonado de transmisión desde un depósito de P-trap al fregadero y entorno circundante. GFP-expresión de E. coli en la P-trap solamente se mantuvo durante 14 días, pero no creció o movilizó hasta el tubo de escape al colador con la exposición del agua sólo intermitente. Sin embargo, cuando los nutrientes fueron agregados posteriormente al sistema, los organismos crecieron rápidamente hasta el tubo de escape al colador a aproximadamente una pulgada por día. En un entorno real, la motilidad de las bacterias dentro del tubo de escape se limita a eventos de humectación relativamente esporádicos y breves en los que la natación es una oportunidad para colonizar nuevas superficies. Se supone que una vez establecido, el biofilm promueve el crecimiento ascendente de GFP-expresión de E. coli en el tubo de escape a un ritmo acelerado. El régimen de nutrientes que promovió la colonización en nuestro modelo refleja nuestras y otras observaciones de artículos comúnmente eliminados en los sumideros del hospital (fluidos intravenosos, suplementos de alimentación y bebidas sobra La transmisión de bacterias entre los sumideros a través de una tubería común fue un hallazgo clave en este estudio, ya que esto pone de relieve el concepto de que la fontanería local puede ser un sistema más continuo con microbiología compartida que un único fregadero aislado. La galería de fregaderos utilizada en este estudio proporcionó una ventaja in situ única para investigar la transmisión de bacterias entre el fregadero y el fregadero a través de desagües comunes. Los dos posibles mecanismos para los coladores de trampas P que se colonizan son la siembra de organismos desde arriba y la propagación retrógrada de organismos a lo largo de tuberías comunes en una infraestructura de aguas residuales hospitalarias. Aquí demostramos que es posible que E. coli, que expresa el GFP, contamine las trampas P adyacentes con un tiempo justo y agua dada una elevación estándar de la tubería del código de los EE.UU. de 0,25 pies/pie. La transmisión del fregadero al fregadero o retrógrada pueda El fregadero 3 fue el más bajo de la pendiente de la línea de drenaje (ver Fig. 4) con posiblemente la mayor oportunidad de reflujo y humectación retrógrada. El fregadero 1, por otro lado, estaba más alejado de la fuente (sink 5), y su P-trampa tenía la mayor inclinación en la línea de drenaje que conectaba los sumideros, lo que tal vez podría contribuir a las razones por las que no se había detectado colonización E. coli que expresara GFP después de 7 días. Ha habido más investigación sobre la dinámica microbiológica de partículas víricas infecciosas como las del síndrome respiratorio agudo severo (SARS) y los virus del Ébola a través de sistemas de fontanería local (34) (35) (36). Sin embargo, la microbiología, sostenibilidad y dinámica podrían ser muy diferentes, aunque los problemas de reflujo e inoculación podrían tener algunos paralelos al comparar virus con bacterias. Como Enterobacteriaceae puede multiplicarse o permanecer viable durante largos períodos de tiempo en biofilms que recubren el interior de las trampas P y las tuberías conectadas, puede no ser sostenible dirigir cualquier intervención limitada a un único fregadero aislado como fuente de un patógeno en particular. Los datos de diferentes experimentos de dispersión sugieren que aunque las trampas P pueden actuar como fuente o depósito de patógenos, la presencia física del organismo en el recipiente del fregadero o la colonización del colador es necesaria para que ocurra la dispersión. La colonización de coladores o desagües reportados en estudios anteriores (7, 10, 13, 24, 37) fue quizás el resultado del crecimiento ascendente de biofilm desde la trampa P al colador o la introducción a través de fluidos contaminados. Una vez que el colador fue colonizado, el agua del grifo resultó en la dispersión de E. coli que expresa GFP en el recipiente y en las superficies circundantes de hasta 30 pulg. El rango de dispersión (6). Mayor dispersión cerca del grifo puede atribuirse a los diseños específicos del recipiente del fregadero y grifo en este estudio, que determinan el ángulo de contacto del impacto del agua. Esto es un hallazgo importante ya que muchos fregaderos en los hospitales son similares en diseño, con asas del grifo que representan una superficie de alto toque para los usuarios del fregadero (38). También se puede concluir de los experimentos de dispersión que las dispersaciones secundarias y sucesivas probablemente aumentarían el grado y el alcance de dispersión. Hay varias limitaciones a este trabajo. Primero el uso de tazones del fregadero similares en estos sumideros sólo examina el patrón de dispersión de este diseño particular del fregadero. Del mismo modo, la transmisión del fregadero al fregadero puede no ser aplicable a todos los sistemas de plomería de aguas residuales, ya que los accesorios de la tubería están muy cerca, a diferencia de la mayoría de los diseños en entornos de salud. Sin embargo, especulamos que la transmisión podría ocurrir en sistemas más grandes a mayor escala de tiempo, especialmente si también se incluyen nutrientes pesados y cargas de contaminación. GFP-expresando E. coli es un sustituto de laboratorio, y los biofilms putativos establecidos en el corto período de tiempo de nuestros experimentos son poco probables para ser tan complejos o estables como biofilms desarrollados en un sistema de aguas residuales hospitalario durante muchos años. Sin embargo, para abordar el dominio monomicrobiano del GFP-expresando E. coli añadido al sistema, mantuvimos el sistema abierto, y otros organismos ambientales fueron capaces de cocolonizar en un intento de imitar el sistema hospitalario. Otra limitación fue la necesidad No estamos claros cuán extendida está la práctica de eliminar líquidos intravenosos o bebidas sobrantes que contienen dextrosa en los lavabos de lavado de manos; sin embargo, hemos observado esta práctica, y anecdóticamente parece ser relativamente común en los Estados Unidos. Tampoco caracterizamos completamente los tamaños de gotitas, ni demostramos muestreo de aire para entender si la dispersión es sólo gotita o si también hay aerosoles que contienen E. coli que expresan GFP. Esto requeriría pruebas adicionales y está previsto como trabajo futuro. En resumen, este trabajo por primera vez modela mejor los mecanismos de propagación de patógenos multirresistentes derivados del drenaje del fregadero e infectando a los pacientes. La dispersión de la gota de la trampa P no ocurre directamente. Más bien es un proceso multietapa: la dispersión se origina en el colador y/o el cuenco después del crecimiento del biofilm desde el depósito microbiano de la P-trap. También demostramos la transmisión del fregadero al fregadero a través de una tubería sanitaria común. Este trabajo podría tener implicaciones para la seguridad del paciente, el control de infecciones y las intervenciones, así como el diseño de futuros sistemas de fontanería hospitalaria para eliminar este modo de transmisión a pacientes hospitalizados vulnerables. Diseño de galería de fregaderos. Se creó una galería dedicada al fregadero para simular los lavabos de lavado de manos del hospital. La galería estaba compuesta por cinco módulos de fregaderos montados uno al lado del otro (Fig. 4). Las cinco estaciones de fregaderos de lavado de manos eran idénticas en diseños y dimensiones de cuencos y se modelaron a partir del tipo de fregadero de lavado de manos más común de la unidad de cuidados intensivos en Se instalaron particiones de chapa de plexiglás de 24 pulgadas de altura entre los lavabos para evitar salpicaduras y contaminación cruzada. Cada módulo de fregadero fue construido con fregadero/encimeras integrados Corian sin desbordamiento y equipado con un grifo de cuello de botella de 2 agujas de 8 pulgadas (Elkay, Oak Brook, IL). La línea de desagüe (Dearborn Brass-Oatey, Cleveland, OH). Todos los accesorios estaban hechos de latón con cromado. Cada una de las trampas P del fregadero estaba conectada a una tubería de hierro fundido común de 3 pulgadas que se inclinaba en una junta en T que conducía a la línea sanitaria del edificio situada detrás del fregadero 3 (Fig. 4). Inoculación, crecimiento y establecimiento de E. coli de expresión GFP en las trampas P del fregadero. Para la cepa E. coli que expresa GFP (ATCC 25922GFP), el gen de la proteína fluorescente verde (GFP) está contenido en un plásmido que también contiene un gen de resistencia a la ampicilina. Una colonia aislada de E. coli que expresa GFP cultivada a partir de un stock de 80°C fue inoculada en caldo de soja triptíca de 5 ml (TSB) (Becton, Dickinson y Company, Sparks, MD) que contenía 100 g/ml de ampicilina (mediante ATCC 2855). La concentración y método del inóculo variaban para cada experimento. Para el establecimiento de E. coli que expresa GFP en las trampas P del fregadero, las nuevas trampas P autoclave fueron rellenadas con 100 ml de TSB 0.1 e inoculadas con 10 3 CFU Después de la inoculación, ambos extremos de las P-traps fueron cubiertos con Parafilm perforado (Bemis, Inc., Oshkosh, WI) y permitidos incubar a temperatura ambiente (22 2°C) durante 14 días para facilitar el crecimiento bacteriano adherente. El medio en la P-trap fue decantado y reemplazado por fresco 0.1 TSB cada 48 h. Una alícuota de medio decantado y una muestra de hisopo de la superficie interna de la P-trap fueron plateados en agar de soja triptic (Becton, Dickinson y Company, Sparks, MD) placas que contenían 100 g/ml de ampicilina (TSA) para monitorear el crecimiento de E. coli de la GFP-expresante en las P-traps. Las placas TSA fueron incubadas durante la noche a 37 Todos los cultivos preparatorios de E. coli que expresa GFP tuvieron lugar en una sala separada de la galería del fregadero para evitar la contaminación no intencional. Instalación de P-trampas colonizadas con E. coli que expresa GFP. Después de la incubación de 14 días, P-trampas se fijaron en la plomería de los lavabos (Fig. 5a). El resto de la línea de drenaje fue autoclave (tramposo, tubo de escape y brazos de trampa) antes de la instalación o superficie desinfectada (tazón de fregadero, encimera y grifos) con Caviwipes-1 (Meterx Research, Romulus, MI), manteniendo al menos 1 minuto de tiempo de contacto. Después de la instalación de la P-trampa, se siguió un régimen diario en el que 25 ml de TSB seguido de 25 ml de solución NaCl del 0,9% (salina 5b) para imitar la exposición potencial de nutrientes en el hospital. Muestreo y enumeración de E. coli que expresa GFP. Para monitorear el crecimiento de E. coli que expresa GFP en la fontanería, se perforaron puertos de muestreo a lo largo de la cola (entre la P-trampa y el colador) y el brazo de la trampa (entre la P-trampa y la línea común). Estos agujeros fueron provistos de tapones de silicona tamaño 00 (Cole-Parmer, Vernon Hills, IL) (Fig. 5a). Se insertaron hisopos estériles de algodón (Covidien, Mansfield, MA) en solución salina a través de estos puertos de muestreo, y se recolectaron muestras girando el hisopo en un movimiento circular en la superficie interna (20 cm 2 ) de los tubos de cola. Las muestras de hisopos fueron vórtices de pulso en 3 ml de solución salina, y las diluciones en serie fueron chapadas en TSA. El colador, el aireador de grifo y la superficie del recipiente fueron muestreados con hisopos presacinados y procesados como se describió anteriormente. Transmisión de bacterias de fregadero a fregadero. Para investigar la transmisión de bacterias de fregadero a fregadero, un fregadero distal (sumidero 5) (Fig. 4) fue equipado con una P-trampa inoculada con E. coli que expresa GFP. Se investigaron los efectos de diferentes concentraciones de inóculo de E. coli-10 3, 10 6, y 10 10 UFC/ml (colonizado durante 14 días). La identificación del nivel de especies de colonias fluorescentes y no fluorescentes identificadas a partir de cultivos mixtos de tuberías se realizó utilizando un espectrómetro de masas asistido por láser de desorción (MALDI-TOF) de desorción por matriz (MALDI-TOF) (Vitek-MS; bioMérieux, Durham, NC). Las vías de aguas residuales de los sumideros 1 a 4 fueron autoclaves (espectro, tubo de escape, trampas P y armas trampa) antes de la instalación o desinfectadas en superficie (tazón, encimera y grifos) con Caviwipes-1 (Meterx Research, Romulus, MI). Los grifos de cada uno de los cinco sumideros se activaron simultáneamente durante 1 min, suministrando agua a un caudal de 8 litros/min, una vez cada 24 h durante 7 días. No se añadió alimentación adicional a ninguno de En los días 0 y 7, las trampas P en cada uno de los cinco lavabos no se fijaron, y se recolectaron y procesaron muestras de hisopos de la trampa P como se describió anteriormente. La dispersión medida utilizando microesferas fluorescentes. Microesferas de carboxilato de fluoresbrita YO (Polysciences, Inc.) que tenían un diámetro de 1 m y una excitación máxima y emisión de 529 nm y 546 nm, respectivamente, se utilizaron como trazador en los experimentos preliminares para entender la dispersión de gotitas de los sumideros de lavado manual. Para comprobar si las microesferas podían dispersarse desde debajo del colador del fregadero, se inyectó una suspensión de 1 ml de microesferas (10 10 partículas) a través de un colador conectado a un tubo de drenaje de 4,5 pulgadas offset utilizado típicamente para los sumideros accesibles en silla La distancia vertical entre el colador y la suspensión de microesfera inyectada en el tubo de escape fue de 4 pulg. El espacio de contador alrededor del recipiente del fregadero fue completamente limpiado con toallitas de alcohol (Covidien Webcol 6818; Kendall), y las hojas de poliéster precortadas a formas apropiadas fueron colocadas en el mostrador para cubrir todo el contador del fregadero y etiquetadas de acuerdo con la posición (Fig. 6a). El grifo fue encendido durante 5 minutos a un caudal de agua de 1,8 a 3,0 litros/min. Las hojas de poliéster fueron cosechadas y analizadas inmediatamente usando un sistema ChemiDoc MP (Bio-Rad Laboratories, Inc.) con un tiempo de exposición de 5 s. Microesferas fluorescentes fueron enumeradas a partir de los micrografos digitales utilizando el Software de Laboratorio de Imagen (Bio-Rad Laboratories Para comprobar si las microesferas podían dispersarse de la superficie del recipiente del fregadero, el recipiente del fregadero se recubrió uniformemente con una suspensión de microesfera de 20 ml (10 10 partículas/ml) utilizando un hisopo desechable (Sage Products, Inc., Cary, IL), y el experimento de dispersión se repitió siguiendo el protocolo descrito anteriormente. Para comprobar que no había fluorescencia de fondo no específica en el fregadero y/o el agua del grifo, se realizó un control utilizando el mismo protocolo pero sin las microesferas fluorescentes antes de cada experimento. Para comprobar si los organismos vivos en la trampa P podían ser dispersados por agua corriente, se añadió E. coli en solución salina de 10 CFU/ml y se instaló en la línea de desagüe preautoclave (tramposo, tubo de escape y brazos trampa). Del mismo modo, para comprobar si los organismos vivos podían ser dispersados de las piezas de cola de los sumideros accesibles en silla de ruedas, se añadió una suspensión de E. coli de 10 CFU/ml con una jeringa a través del colador en el tubo de escape de 4.5 pies (Fig. 5c ). Al igual que en el experimento de dispersión de microsfera, la distancia vertical entre la suspensión del colador y la E. coli de GFP inyectada en el tubo de escape fue de 4 pulgadas. A continuación probamos si los organismos vivos de la superficie del recipiente del fregadero podían ser dispersados por agua corriente. La superficie del recipiente del fregadero estaba cubierta uniformemente con una suspensión de aproximadamente 20 ml de E. coli, que expresaba 10 UFC/ml GFP. Finalmente, para imitar todas estas condiciones, se instaló una trampa P colonizada con E. coli que expresaba GFP (durante 14 días), y se siguió un régimen de nutrientes (Fig. 5b) durante 14 días para promover intencionadamente la colonización de E. coli que expresa GFP en el tubo de escape y colador adjunto. El día 15 se realizó el experimento de dispersión. Antes de cada uno de los experimentos de dispersión de E. coli que expresa GFP, el espacio del contador fue completamente desinfectado con Caviwipes-1. A continuación, se colocaron placas TSA en el mostrador del fregadero que rodeaba el recipiente y una plataforma de extensión (Fi Se colocaron placas adicionales en el recipiente del fregadero, grifos, tabiques de plexiglás y asas de grifo con cinta adhesiva. Las placas de TSA se colocaron a 3 m de distancia del fregadero como controles negativos. El grifo se encendió durante 5 minutos con un caudal de agua de 1,8 a 3,0 litros/min. Los lides de las placas de TSA se quitaron sólo durante el funcionamiento del grifo. Las muestras de Swab de los aireadores del grifo antes y después del funcionamiento se recolectaron y se plasmaron en TSA. Antes de cada experimento de dispersión, también se recogió agua de 50 ml del grifo, y se plastó alícuotas para evaluar la presencia de E. coli que expresa GFP en el agua de origen y asegurar que no se hubiera producido contaminación cruzada de E. coli que expresa GFP. También se realizó un experimento de dispersión de control utilizando el mismo protocolo La dispersión por área definida (UFC por centímetro cuadrado) se dedujo dividiendo los recuentos de UFC en la placa TSA por la superficie de la placa TSA.

¿Qué tipo de bacterias están implicadas en llevar genes de resistencia a fármacos?

Se extiende del fregadero al paciente: Estudio in situ utilizando proteínas fluorescentes verdes (GFP)-expresión Escherichia coli A Modelo de dispersión bacteriana de depósitos de fregaderos de lavado a manohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5377511/SHA: 615071c8c959f24857b1bad521cc432b59719bfbAutores: Kotay, Shireen; Chai, Weidong; Guilford, William; Barry, Katie; Mathers, Amy J. Fecha: 2017-03-31DOI: 10.1128/aem.03327-16Licencia: cc-byResumen: Ha habido un número creciente de informes que implican Gammaproteobacteria como a menudo llevar genes de resistencia a los medicamentos de trampas de fregadero colonizados a pacientes hospitalizados vulnerables. Sin embargo, el mecanismo de transmisión de las aguas residuales de la trampa P del fregadero a los pacientes sigue siendo poco entendido. En este informe se informa el uso de una galería de laboratorio de lavabo designado para modelar la dispersión de proteína fluorescente verde (GFP) que expresa Escherichia coli de aguas residuales del fregadero al entorno circundante. No se encontró dispersión de GFP-expresando E. coli directamente desde la trampa P a la cuenca del fregadero o encimera circundante con flujo de agua coincidente desde un grifo. Sin embargo, cuando se permitió que las células E. coli que expresaban GFP maduraran en la trampa P en condiciones similares a las de un ambiente hospitalario, una biopelícula putativa con E. coli que expresaba GFP se extendía hacia arriba durante 7 días para llegar al colador, lo que resultó posteriormente en dispersión de gotitas a las áreas circundantes (<30 in.) durante la operación del grifo. También demostramos que la colonización de la trampa P podría ocurrir mediante una transmisión retrógrada a lo largo de un tubo común. Postulamos que los organismos se movilizan hasta el colador de la trampa P, resultando en dispersión de gotitas en lugar de dispersión directamente desde la trampa P. Este trabajo ayuda a definir más a fondo el modo de transmisión de bacterias desde un reservorio de P-trap a un paciente hospitalizado vulnerable. IMPORTANCIA Muchos informes recientes demuestran que las tuberías de drenaje se colonizan con bacterias Sin embargo, el mecanismo de dispersión de bacterias del fregadero a los pacientes no ha sido completamente aclarado. Mediante el establecimiento de una galería de fregaderos única, este trabajo encontró que un modo escalonado de transmisión que implica el crecimiento de biofilm desde el tubo inferior al colador del fregadero y posterior salpicadura al recipiente y área circundante se produce en lugar de salpicar directamente desde el agua en el tubo inferior. También hemos demostrado que la transmisión bacteriana puede ocurrir a través de conexiones en la plomería de aguas residuales a los sumideros vecinos. Este trabajo ayuda a definir más claramente el mecanismo y el riesgo de transmisión de una fuente de aguas residuales a pacientes hospitalizados en un mundo con bacterias cada vez más resistentes a los antibióticos que pueden prosperar en entornos de aguas residuales y causar infecciones en pacientes vulnerables. Recientemente ha habido un aumento alarmante de brotes relacionados con los sumideros en todo el mundo, con muchos informes que establecen un vínculo observacional (6) (7) (8) (9) (10) (12) (13). Un fregadero a menudo funciona como un conducto abierto a las aguas residuales en un área de atención al paciente que a menudo se encuentra en la misma habitación que el paciente. Los establecimientos de atención de la salud a menudo invierten en intervenciones desesperadas para hacer frente a brotes nosocomiales. El método preferido para abordar la mayor parte de la transmisión relacionada con el medio ambiente es utilizar una limpieza mejorada utilizando agentes químicos y físicos (14, 15). Desafortunadamente, los enfoques rutinarios son ineficientes en la eliminación completa de las Gammaproteobacterias resistentes a los medicamentos en una zona microbiológicamente activa inaccesible como una trampa del fregadero (6, 16) (18) (19) (20). El ambiente húmedo, húmedo y relativamente protegido en una trampa del fregadero favorece la Estas comunidades estarán expuestas a líquidos y desechos que se desechan en un fregadero y pueden incluir antimicrobianos, bebidas desechadas, jabón, bacterias presumiblemente patógenas de las manos de los trabajadores de la salud, y otros artículos. En resumen, las trampas de los sumideros podrían servir como caldo de cultivo para bacterias oportunistas y altamente resistentes a los antimicrobianos que no se pueden limpiar o eliminar fácilmente (23) (24) (25) (26) (28). Hay muchos informes de una asociación genética entre patógenos encontrados en las trampas de los sumideros y los encontrados en pacientes (29, 30). Sin embargo, sorprendentemente se ha hecho poco trabajo para entender la dinámica de transmisión a microescala. Anteriormente se demostró mediante la suspensión de partículas fluorescentes (Glo Germ; Glo Germ Co., Moab, UT) que el material inyectado en la trampa P se dispersa alrededor En última instancia, muchos detalles siguen sin ser abordados en torno a la propagación de Enterobacteriaceae en los sistemas de aguas residuales de las trampas de los sumideros: (i) pueden crecer organismos retrógrados desde el agua de las trampas P hasta el colador de los sumideros, (ii) pueden propagarse organismos de un fregadero a otro a lo largo de las superficies internas de tuberías con sistemas de drenaje compartidos, y (iii) qué porción de una tubería de drenaje colonizada resulta en dispersión en el recipiente del fregadero durante un evento de lavado a mano? En los primeros 14 días después de la instalación de la P-trap con proteína fluorescente verde establecida (GFP) que expresa Escherichia coli y sólo el agua corriendo desde el grifo, GFPexpresando E. coli no fue detectado en el tubo de escape más allá de 1.5 pulg. por encima del nivel de líquido en la P-trap. GFP-expresando E. coli, sin embargo, se encontró que era viable en la P-trap sin ningún nutriente añadido. A continuación, se instituyó un régimen de nutrientes para entender la influencia de los nutrientes en la movilidad y el crecimiento ascendente. La adición de caldo de soja triptic (TSB) promovió el crecimiento de GFP-expresando E. coli tan pronto como el día 1, con el crecimiento observado en el tubo de escape 2 pulg. sobre la superficie líquida en la P-trap (Tabla 1). por encima del líquido de la trampa P) se encontró colonizado con E. coli que expresa GFP. Esto se traduce en una tasa media de crecimiento de 1 pulg./día a lo largo de la longitud del tubo de escape con la adición de nutrientes y sin funcionamiento de grifo. E. coli que expresa GFP no se detectó en el agua del grifo. Transmisión de la bacteria de la gota a la gota. En estos experimentos, un fregadero flanqueador (sumidero 5) fue el único P-trap inoculado con E. coli que expresa GFP y por lo tanto fue la única fuente para la transmisión a los sumideros conectados. Comenzando con una concentración de inóculo más baja (10 3 CFU/ml) en el fregadero 5, el día 7, E. coli que expresa GFP fue detectado en el fregadero 2 y el fregadero 3 P-traps (Fig. 1a). Con concentraciones de inóculo de 10 6 UFC/ml y 10 10 UFC/ml en el fregadero 5, todas las trampas P del fregadero en la galería del fregadero, con la excepción del fregadero 1, fueron colonizadas con E. coli que expresaba GFP después de 7 días (Fig. 1b y c). Agua de grifo y aireadores probados negativos para E. coli que expresaba GFP. Independientemente de la concentración de inóculo inicial, el día 7 se registró el nivel más alto de colonización en el fregadero 3 P-trap. Después del día 7, cuando el régimen de nutrientes (descrito anteriormente) fue seguido durante 7 días adicionales en cada uno de los sumideros en la galería del fregadero con una concentración de inóculo de 10 10 UFC/ml, E. coli que expresa GFP fue detectado en los coladores de los sumideros 2 y 3 el día 14. Este hallazgo validó el crecimiento ascendente y la tasa de crecimiento en el tubo de escape cuando se añadieron nutrientes. En ocasiones se observaron colonias no fluorescentes en las muestras de agua de la trampa P recogidas de los sumideros, que posteriormente fueron identificadas como Pseudomonas sp. o Stenotrophomonas maltophilia, y colonias fluorescentes fueron confirmadas como E. coli. Dispersión de microesferas de los sumideros. En el primer experimento de dispersión, cuando las microesferas fluorescentes fueron inoculadas en la cola de drenaje offset sólo 4 pulg. debajo del colador, no se detectaron microesferas en las láminas de poliéster colocadas en el espacio del contador. Sin embargo, cuando el recipiente del fregadero fue recubierto con las microesferas, las láminas de poliéster superpuestas en el espacio del contador capturaron las microesferas dispersas causadas por la operación del Se observaron niveles relativamente más altos de dispersión a lo largo de los ejes mayor y menor del recipiente del fregadero elíptico (zonas 2, 5, 6, 9, 11, y 12). Las esquinas anteriores del espacio del contador del fregadero (zonas 4 y 7), que estaban más distantes del impacto del agua en el recipiente del fregadero, recibieron la menor dispersión. Dispersión de E. coli que expresa GFP de los sumideros. Inicialmente la trampa P sola fue inoculada con E. coli que expresa GFP y cuidadosamente instalada, manteniendo el tubo de escape y el colador libre de E. coli que expresa GFP antes de operar los grifos. No se observó UFC fluorescente en las placas colocadas en el mostrador o conectadas a la superficie del recipiente después de la operación del grifo. Curiosamente, cuando había una visible reserva de agua sobre el colador como resultado de un mayor caudal de agua del grifo que la tasa de drenaje de la trampa P, se detectó dispersión en las placas conectadas a la superficie del recipiente. El patrón de dispersión registrado cuando el recipiente del fregadero fue recubierto con E. coli expresivo de GFP fue comparable al patrón registrado cuando el recipiente del fregadero fue recubierto con microesferas fluorescentes (Fig. 2). La dispersión fue significativamente más alta a lo largo de los ejes (zonas 6, 9, 11 y 12) y más baja en las esquinas del espacio del contador del fregadero (zonas 4, 7 y 10). En contraste, la dispersión de E. coli que expresaba GFP causada por la operación del grifo fue mucho más extensa cuando se permitió que el colador fuera colonizado con GFPexpresante E. coli antes del experimento de dispersión. Además del espacio del contador del fregadero, se midió la dispersión al recipiente del fregadero, grifo, manijas del grifo, escudos de salpicaduras, y la superficie extendida del contador. La dispersión de E. coli que expresa GFP fue más alta en las placas unidas al recipiente del fregadero (Fig. 3b). Además, la dispersión fue mayor a lo largo del " y "" denotan la ausencia y presencia de E. coli que expresa GFP, respectivamente. Eje menor del recipiente del fregadero (Fig. 3b, zonas B3, B4 y B10) que a lo largo del eje principal del recipiente del fregadero, asociado con una distancia más corta desde el punto de ataque del agua del grifo hasta el recipiente a lo largo de este eje. El siguiente conteo más alto de UFC de la dispersión se registró en el área del contador cerca de los grifos (Fig. 3a, zonas 12 y 11). También se observó un patrón similar de mayor dispersión cerca de los grifos y menor dispersión en las esquinas del espacio de contador (Fig. 3a, zonas 4, 7 y 10) utilizando microesferas. También se registró dispersión en otras zonas del espacio de contador, en los escudos de salpicadura de Plexiglas, grifos, asas de grifo y superficie extendida (Fig. 3c). No hubo GFP-expresando E. coli CFU registrada en placas colocadas más allá de 30 pulg. del colador, demarcando el rango de dispersión bajo estas condiciones experimentales. La Tabla 2 da un resumen de las cargas de distribución total registradas utilizando microesferas fluorescentes y E. coli de GFP-expresando en cada experimento. Las cargas de dispersión en el contador del fregadero fueron comparables cuando el recipiente del fregadero fue recubierto con microesferas o E. coli de expresión GFP antes de la operación Aunque la carga de dispersión en el contador del fregadero fue menor cuando el colador del fregadero fue colonizado, es interesante notar que el recipiente del fregadero recibió la mayor dispersión. Para imitar la dispersión en un entorno hospitalario, primero investigamos si GFPexpresando E. coli establecería colonización consistente en una trampa del fregadero como muchas otras Gammaproteobacterias implicadas en brotes nosocomiales han hecho (6, 28). Muchos informes recientes demuestran que las trampas P se colonizan con Gammaproteobacterias altamente consecuentes, lo que luego resulta en transmisión nosocomial (29, 31, 32). El agua retenida en una trampa P del fregadero está presente para proporcionar una barrera de agua para evitar el desgastamiento del olor de las cloacas, pero puede proporcionar condiciones favorables para que microorganismos patógenos y oportunistas resistentes a antibióticos sobrevivan y desarrollen biopelículas resilientes (3, 33). Sin embargo, el mecanismo de dispersión de la bacteria en la P-trap a los pacientes o el área de atención médica circundante no había sido completamente dilucidado. Comenzamos con la hipótesis de que la bacteria se origina en la P-trap a través de la creación de gotitas cuando el agua del grifo golpea el agua de la P-trap, contaminando así el recipiente del fregadero y el área circundante. El hallazgo de esta teoría había sido reportado previamente usando partículas Glo Germ (6). Sin embargo, en el presente estudio con cuidadosa atención para evitar la contaminación por cola y cola, la dispersión directamente de la P-trap del fregadero con microesferas o E. coli que expresa GFP no pudo ser reproducida como se informó previamente (6). Más bien este trabajo demuestra un modo diferente y más escalonado de transmisión desde un depósito de P-trap al fregadero y entorno circundante. GFP-expresión de E. coli en la P-trap solamente se mantuvo durante 14 días, pero no creció o movilizó hasta el tubo de escape al colador con la exposición del agua sólo intermitente. Sin embargo, cuando los nutrientes fueron agregados posteriormente al sistema, los organismos crecieron rápidamente hasta el tubo de escape al colador a aproximadamente una pulgada por día. En un entorno real, la motilidad de las bacterias dentro del tubo de escape se limita a eventos de humectación relativamente esporádicos y breves en los que la natación es una oportunidad para colonizar nuevas superficies. Se supone que una vez establecido, el biofilm promueve el crecimiento ascendente de GFP-expresión de E. coli en el tubo de escape a un ritmo acelerado. El régimen de nutrientes que promovió la colonización en nuestro modelo refleja nuestras y otras observaciones de artículos comúnmente eliminados en los sumideros del hospital (fluidos intravenosos, suplementos de alimentación y bebidas sobra La transmisión de bacterias entre los sumideros a través de una tubería común fue un hallazgo clave en este estudio, ya que esto pone de relieve el concepto de que la fontanería local puede ser un sistema más continuo con microbiología compartida que un único fregadero aislado. La galería de fregaderos utilizada en este estudio proporcionó una ventaja in situ única para investigar la transmisión de bacterias entre el fregadero y el fregadero a través de desagües comunes. Los dos posibles mecanismos para los coladores de trampas P que se colonizan son la siembra de organismos desde arriba y la propagación retrógrada de organismos a lo largo de tuberías comunes en una infraestructura de aguas residuales hospitalarias. Aquí demostramos que es posible que E. coli, que expresa el GFP, contamine las trampas P adyacentes con un tiempo justo y agua dada una elevación estándar de la tubería del código de los EE.UU. de 0,25 pies/pie. La transmisión del fregadero al fregadero o retrógrada pueda El fregadero 3 fue el más bajo de la pendiente de la línea de drenaje (ver Fig. 4) con posiblemente la mayor oportunidad de reflujo y humectación retrógrada. El fregadero 1, por otro lado, estaba más alejado de la fuente (sink 5), y su P-trampa tenía la mayor inclinación en la línea de drenaje que conectaba los sumideros, lo que tal vez podría contribuir a las razones por las que no se había detectado colonización E. coli que expresara GFP después de 7 días. Ha habido más investigación sobre la dinámica microbiológica de partículas víricas infecciosas como las del síndrome respiratorio agudo severo (SARS) y los virus del Ébola a través de sistemas de fontanería local (34) (35) (36). Sin embargo, la microbiología, sostenibilidad y dinámica podrían ser muy diferentes, aunque los problemas de reflujo e inoculación podrían tener algunos paralelos al comparar virus con bacterias. Como Enterobacteriaceae puede multiplicarse o permanecer viable durante largos períodos de tiempo en biofilms que recubren el interior de las trampas P y las tuberías conectadas, puede no ser sostenible dirigir cualquier intervención limitada a un único fregadero aislado como fuente de un patógeno en particular. Los datos de diferentes experimentos de dispersión sugieren que aunque las trampas P pueden actuar como fuente o depósito de patógenos, la presencia física del organismo en el recipiente del fregadero o la colonización del colador es necesaria para que ocurra la dispersión. La colonización de coladores o desagües reportados en estudios anteriores (7, 10, 13, 24, 37) fue quizás el resultado del crecimiento ascendente de biofilm desde la trampa P al colador o la introducción a través de fluidos contaminados. Una vez que el colador fue colonizado, el agua del grifo resultó en la dispersión de E. coli que expresa GFP en el recipiente y en las superficies circundantes de hasta 30 pulg. El rango de dispersión (6). Mayor dispersión cerca del grifo puede atribuirse a los diseños específicos del recipiente del fregadero y grifo en este estudio, que determinan el ángulo de contacto del impacto del agua. Esto es un hallazgo importante ya que muchos fregaderos en los hospitales son similares en diseño, con asas del grifo que representan una superficie de alto toque para los usuarios del fregadero (38). También se puede concluir de los experimentos de dispersión que las dispersaciones secundarias y sucesivas probablemente aumentarían el grado y el alcance de dispersión. Hay varias limitaciones a este trabajo. Primero el uso de tazones del fregadero similares en estos sumideros sólo examina el patrón de dispersión de este diseño particular del fregadero. Del mismo modo, la transmisión del fregadero al fregadero puede no ser aplicable a todos los sistemas de plomería de aguas residuales, ya que los accesorios de la tubería están muy cerca, a diferencia de la mayoría de los diseños en entornos de salud. Sin embargo, especulamos que la transmisión podría ocurrir en sistemas más grandes a mayor escala de tiempo, especialmente si también se incluyen nutrientes pesados y cargas de contaminación. GFP-expresando E. coli es un sustituto de laboratorio, y los biofilms putativos establecidos en el corto período de tiempo de nuestros experimentos son poco probables para ser tan complejos o estables como biofilms desarrollados en un sistema de aguas residuales hospitalario durante muchos años. Sin embargo, para abordar el dominio monomicrobiano del GFP-expresando E. coli añadido al sistema, mantuvimos el sistema abierto, y otros organismos ambientales fueron capaces de cocolonizar en un intento de imitar el sistema hospitalario. Otra limitación fue la necesidad No estamos claros cuán extendida está la práctica de eliminar líquidos intravenosos o bebidas sobrantes que contienen dextrosa en los lavabos de lavado de manos; sin embargo, hemos observado esta práctica, y anecdóticamente parece ser relativamente común en los Estados Unidos. Tampoco caracterizamos completamente los tamaños de gotitas, ni demostramos muestreo de aire para entender si la dispersión es sólo gotita o si también hay aerosoles que contienen E. coli que expresan GFP. Esto requeriría pruebas adicionales y está previsto como trabajo futuro. En resumen, este trabajo por primera vez modela mejor los mecanismos de propagación de patógenos multirresistentes derivados del drenaje del fregadero e infectando a los pacientes. La dispersión de la gota de la trampa P no ocurre directamente. Más bien es un proceso multietapa: la dispersión se origina en el colador y/o el cuenco después del crecimiento del biofilm desde el depósito microbiano de la P-trap. También demostramos la transmisión del fregadero al fregadero a través de una tubería sanitaria común. Este trabajo podría tener implicaciones para la seguridad del paciente, el control de infecciones y las intervenciones, así como el diseño de futuros sistemas de fontanería hospitalaria para eliminar este modo de transmisión a pacientes hospitalizados vulnerables. Diseño de galería de fregaderos. Se creó una galería dedicada al fregadero para simular los lavabos de lavado de manos del hospital. La galería estaba compuesta por cinco módulos de fregaderos montados uno al lado del otro (Fig. 4). Las cinco estaciones de fregaderos de lavado de manos eran idénticas en diseños y dimensiones de cuencos y se modelaron a partir del tipo de fregadero de lavado de manos más común de la unidad de cuidados intensivos en Se instalaron particiones de chapa de plexiglás de 24 pulgadas de altura entre los lavabos para evitar salpicaduras y contaminación cruzada. Cada módulo de fregadero fue construido con fregadero/encimeras integrados Corian sin desbordamiento y equipado con un grifo de cuello de botella de 2 agujas de 8 pulgadas (Elkay, Oak Brook, IL). La línea de desagüe (Dearborn Brass-Oatey, Cleveland, OH). Todos los accesorios estaban hechos de latón con cromado. Cada una de las trampas P del fregadero estaba conectada a una tubería de hierro fundido común de 3 pulgadas que se inclinaba en una junta en T que conducía a la línea sanitaria del edificio situada detrás del fregadero 3 (Fig. 4). Inoculación, crecimiento y establecimiento de E. coli de expresión GFP en las trampas P del fregadero. Para la cepa E. coli que expresa GFP (ATCC 25922GFP), el gen de la proteína fluorescente verde (GFP) está contenido en un plásmido que también contiene un gen de resistencia a la ampicilina. Una colonia aislada de E. coli que expresa GFP cultivada a partir de un stock de 80°C fue inoculada en caldo de soja triptíca de 5 ml (TSB) (Becton, Dickinson y Company, Sparks, MD) que contenía 100 g/ml de ampicilina (mediante ATCC 2855). La concentración y método del inóculo variaban para cada experimento. Para el establecimiento de E. coli que expresa GFP en las trampas P del fregadero, las nuevas trampas P autoclave fueron rellenadas con 100 ml de TSB 0.1 e inoculadas con 10 3 CFU Después de la inoculación, ambos extremos de las P-traps fueron cubiertos con Parafilm perforado (Bemis, Inc., Oshkosh, WI) y permitidos incubar a temperatura ambiente (22 2°C) durante 14 días para facilitar el crecimiento bacteriano adherente. El medio en la P-trap fue decantado y reemplazado por fresco 0.1 TSB cada 48 h. Una alícuota de medio decantado y una muestra de hisopo de la superficie interna de la P-trap fueron plateados en agar de soja triptic (Becton, Dickinson y Company, Sparks, MD) placas que contenían 100 g/ml de ampicilina (TSA) para monitorear el crecimiento de E. coli de la GFP-expresante en las P-traps. Las placas TSA fueron incubadas durante la noche a 37 Todos los cultivos preparatorios de E. coli que expresa GFP tuvieron lugar en una sala separada de la galería del fregadero para evitar la contaminación no intencional. Instalación de P-trampas colonizadas con E. coli que expresa GFP. Después de la incubación de 14 días, P-trampas se fijaron en la plomería de los lavabos (Fig. 5a). El resto de la línea de drenaje fue autoclave (tramposo, tubo de escape y brazos de trampa) antes de la instalación o superficie desinfectada (tazón de fregadero, encimera y grifos) con Caviwipes-1 (Meterx Research, Romulus, MI), manteniendo al menos 1 minuto de tiempo de contacto. Después de la instalación de la P-trampa, se siguió un régimen diario en el que 25 ml de TSB seguido de 25 ml de solución NaCl del 0,9% (salina 5b) para imitar la exposición potencial de nutrientes en el hospital. Muestreo y enumeración de E. coli que expresa GFP. Para monitorear el crecimiento de E. coli que expresa GFP en la fontanería, se perforaron puertos de muestreo a lo largo de la cola (entre la P-trampa y el colador) y el brazo de la trampa (entre la P-trampa y la línea común). Estos agujeros fueron provistos de tapones de silicona tamaño 00 (Cole-Parmer, Vernon Hills, IL) (Fig. 5a). Se insertaron hisopos estériles de algodón (Covidien, Mansfield, MA) en solución salina a través de estos puertos de muestreo, y se recolectaron muestras girando el hisopo en un movimiento circular en la superficie interna (20 cm 2 ) de los tubos de cola. Las muestras de hisopos fueron vórtices de pulso en 3 ml de solución salina, y las diluciones en serie fueron chapadas en TSA. El colador, el aireador de grifo y la superficie del recipiente fueron muestreados con hisopos presacinados y procesados como se describió anteriormente. Transmisión de bacterias de fregadero a fregadero. Para investigar la transmisión de bacterias de fregadero a fregadero, un fregadero distal (sumidero 5) (Fig. 4) fue equipado con una P-trampa inoculada con E. coli que expresa GFP. Se investigaron los efectos de diferentes concentraciones de inóculo de E. coli-10 3, 10 6, y 10 10 UFC/ml (colonizado durante 14 días). La identificación del nivel de especies de colonias fluorescentes y no fluorescentes identificadas a partir de cultivos de tuberías mixtas se realizó utilizando un espectrómetro de masas asistido por láser de desorción (MALDI-TOF) de desorción por matriz (MALDI-TOF) (Vitek-MS; bioMérieux, Durham, NC). Las vías de aguas residuales de los sumideros 1 a 4 fueron autoclaves (espectro, tubo de escape, trampas P y armas trampa) antes de la instalación o desinfectadas en superficie (tazón de fregadero, encimera y grifos) con Caviwipes-1 (Meterx Research, Romulus, MI). Los grifos de cada uno de los cinco sumideros se activaron simultáneamente durante 1 min, suministrando agua a un caudal de 8 litros/min, una vez cada 24 h durante 7 días. No se añadió alimentación adicional a En los días 0 y 7, las trampas P en cada uno de los cinco lavabos no se fijaron, y se recolectaron y procesaron muestras de hisopos de la trampa P como se describió anteriormente. La dispersión medida utilizando microesferas fluorescentes. Microesferas de carboxilato de fluoresbrita YO (Polysciences, Inc.) que tenían un diámetro de 1 m y una excitación máxima y emisión de 529 nm y 546 nm, respectivamente, se utilizaron como trazador en los experimentos preliminares para entender la dispersión de gotitas de los sumideros de lavado manual. Para comprobar si las microesferas podían dispersarse desde debajo del colador del fregadero, se inyectó una suspensión de 1 ml de microesferas (10 10 partículas) a través de un colador conectado a un tubo de drenaje de 4,5 pulgadas offset utilizado típicamente para los sumideros accesibles en silla La distancia vertical entre el colador y la suspensión de microesfera inyectada en el tubo de escape fue de 4 pulg. El espacio de contador alrededor del recipiente del fregadero fue completamente limpiado con toallitas de alcohol (Covidien Webcol 6818; Kendall), y las hojas de poliéster precortadas a formas apropiadas fueron colocadas en el mostrador para cubrir todo el contador del fregadero y etiquetadas de acuerdo con la posición (Fig. 6a). El grifo fue encendido durante 5 minutos a un caudal de agua de 1,8 a 3,0 litros/min. Las hojas de poliéster fueron cosechadas y analizadas inmediatamente usando un sistema ChemiDoc MP (Bio-Rad Laboratories, Inc.) con un tiempo de exposición de 5 s. Microesferas fluorescentes fueron enumeradas a partir de los micrografos digitales utilizando el Software de Laboratorio de Imagen (Bio-Rad Laboratories Para comprobar si las microesferas podían dispersarse de la superficie del recipiente del fregadero, el recipiente del fregadero se recubrió uniformemente con una suspensión de microesfera de 20 ml (10 10 partículas/ml) utilizando un hisopo desechable (Sage Products, Inc., Cary, IL), y el experimento de dispersión se repitió siguiendo el protocolo descrito anteriormente. Para comprobar que no había fluorescencia de fondo no específica en el fregadero y/o el agua del grifo, se realizó un control utilizando el mismo protocolo pero sin las microesferas fluorescentes antes de cada experimento. Para comprobar si los organismos vivos en la trampa P podían ser dispersados por agua corriente, se añadió E. coli en solución salina de 10 CFU/ml y se instaló en la línea de desagüe preautoclave (tramposo, tubo de escape y brazos trampa). Del mismo modo, para comprobar si los organismos vivos podían ser dispersados de las piezas de cola de los sumideros accesibles en silla de ruedas, se añadió una suspensión de E. coli de 10 CFU/ml con una jeringa a través del colador en el tubo de escape de 4.5 pies (Fig. 5c ). Al igual que en el experimento de dispersión de microsfera, la distancia vertical entre la suspensión del colador y la E. coli de GFP inyectada en el tubo de escape fue de 4 pulgadas. A continuación probamos si los organismos vivos de la superficie del recipiente del fregadero podían ser dispersados por agua corriente. La superficie del recipiente del fregadero estaba cubierta uniformemente con una suspensión de aproximadamente 20 ml de E. coli, que expresaba 10 UFC/ml GFP. Finalmente, para imitar todas estas condiciones, se instaló una trampa P colonizada con E. coli que expresaba GFP (durante 14 días), y se siguió un régimen de nutrientes (Fig. 5b) durante 14 días para promover intencionadamente la colonización de E. coli que expresa GFP en el tubo de escape y colador adjunto. El día 15 se realizó el experimento de dispersión. Antes de cada uno de los experimentos de dispersión de E. coli que expresa GFP, el espacio del contador fue completamente desinfectado con Caviwipes-1. A continuación, se colocaron placas TSA en el mostrador del fregadero que rodeaba el recipiente y una plataforma de extensión (Fi Se colocaron placas adicionales en el recipiente del fregadero, grifos, tabiques de plexiglás y asas de grifo con cinta adhesiva. Las placas de TSA se colocaron a 3 m de distancia del fregadero como controles negativos. El grifo se encendió durante 5 minutos con un caudal de agua de 1,8 a 3,0 litros/min. Los lides de las placas de TSA se quitaron sólo durante el funcionamiento del grifo. Las muestras de Swab de los aireadores del grifo antes y después del funcionamiento se recolectaron y se plasmaron en TSA. Antes de cada experimento de dispersión, también se recogió agua de 50 ml del grifo, y se plastó alícuotas para evaluar la presencia de E. coli que expresa GFP en el agua de origen y asegurar que no se hubiera producido contaminación cruzada de E. coli que expresa GFP. También se realizó un experimento de dispersión de control utilizando el mismo protocolo La dispersión por área definida (UFC por centímetro cuadrado) se dedujo dividiendo los recuentos de UFC en la placa TSA por la superficie de la placa TSA.

¿Cuál puede ser la causa probable de la propagación de patógenos en el hospital?

Técnicas para estudiar respuestas específicas de células B de antígenoshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6667631/SHA: ee632fa425607e8ff91fc3730bc0782d43ce9c0cAutores: Boonyaratanakornkit, Jim; Taylor, Justin J. Fecha: 2019-07-24DOI: 10.3389/fimmu.2019.01694Licencia: cc-byAbstract: Los anticuerpos contra antígenos extraños son un componente crítico de la respuesta inmune general y pueden facilitar el aclaramiento de patógenos durante una infección primaria y también proteger contra infecciones posteriores. Desde la delineación experimental de un linaje distinto de células B en 1965, se han desarrollado varios métodos para entender las respuestas específicas de las células B en el contexto de las enfermedades autoinmunes, las inmunodeficiencias primarias, la infección y la vacunación. En esta revisión, se resumen las técnicas establecidas y se discuten las tecnologías nuevas y emergentes para probar la respuesta de las células B in vitro e in vivo aprovechando la especificidad de los anticuerpos B asociados y segregados al receptor de células B (BCR), que incluyen ELISPOT, citometría de flujo, citometría de masa y microscopía de fluorescencia para identificar y/o aislar células B específicas de antígenos primarios. También se presenta nuestro enfoque para identificar células B específicas de antígenos raras utilizando enriquecimiento magnético seguido de citometría de flujo. Una vez que estas células están aisladas, los ensayos de proliferación in vitro y experimentos de transferencia adoptiva en ratones se pueden utilizar para caracterizar Los modelos transgénicos de ratones de células B dirigidos a antígenos modelo y de señalización de células B también han avanzado significativamente en nuestra comprensión de las respuestas de células B específicas de antígenos in vivo. Texto: En su conferencia Nobel en 1908, Paul Ehrlich comparó la interacción anticuerpo-antígeno a un bloqueo y clave. Razonaba que las antitoxinas (anticuerpos) contenidas en una solución en el suero de animales inmunizados deben ser idénticas a un receptor celular "para una llave realmente bien hecha no abrirá cerraduras diferentes al mismo tiempo" (1). Tomó casi cinco décadas antes de que se usara la microscopía de inmunofluorescencia para confirmar el origen celular de anticuerpos (2). Grandes pasos en el campo de células B y anticuerpos seguidos en la década de 1970 con el desarrollo de la tecnología del hibridoma para producir anticuerpos monoclonales y el descubrimiento de que el reordenamiento somático La posterior explosión de los anticuerpos monoclonales disponibles llevó a los reactivos diagnósticos, terapéuticos y de investigación revolucionarios a distinguir diferentes tipos de células inmunes (5). Juntos, estos descubrimientos nos han permitido investigar la inmunidad humoral a nivel de la célula B específica del antígeno. Métodos para investigar la respuesta específica de células B del antígeno han avanzado en nuestra comprensión de cómo aprovechar la notable amplitud del repertorio de células B y la exquisita especificidad de la célula B individual en el desarrollo de (1) candidatos vacunales que provocan anticuerpos protectores; (2) anticuerpos que previenen la enfermedad cuando se administra profilácticamente; y (3) anticuerpos que pueden administrarse como terapia después del inicio de la enfermedad. Muchas de las vacunas disponibles actualmente se desarrollaron empíricamente ya sea inactivando, atenuando o administrando una subunidad del patógeno. Sin embargo, el desarrollo de la vacuna contra patógenos que son tradicionalmente difíciles de vacunar contra puede depender de una investigación más profunda de la respuesta Para el VIH-1, el descubrimiento de anticuerpos ampliamente neutralizantes (bnAbs) que protegen contra la infección a través de diversos aislados virales ha intensificado los esfuerzos para entender la vía de desarrollo de las células B raras que producen estos anticuerpos (6) (7) (8) (9). Perspectivas sobre la ontogenia de estas células B raras podrían permitir el diseño de un régimen de vacunas graduales que estimula el precursor de la línea germinal para expandirse y madurar para producir bnAbs circulantes que podrían proteger contra la adquisición del VIH (10, 11). Para el VSR, versiones estabilizadas de la proteína de fusión (F) en la conformación de prefusión han llevado a la comprensión de la respuesta de la célula B a la infección y ha generado candidatos a vacunas potencialmente más seguros y eficaces (12, 13). La gripe también realiza la fusión a través de la región madre de la proteína hemaglutinina, y la identificación de las células B que se dirigen a este sitio relativamente conservado ha estimulado la investigación sobre el desarrollo de una vacuna universal contra la gripe (14) (15) (16). Al igual que el VRS, el VIH y la gripe, las proteínas de fusión del VET y el VMC existen en una conformación prefusional, y la estabilización en sus estados prefusionales podría acelerar en gran medida el desarrollo de vacunas contra estos patógenos (17-19). Células B de memoria raras que producen anticuerpos específicos para la maquinaria de fusión del VET han sido aisladas; estas pueden neutralizar tanto la infección por células B como la epitelial (20). También está surgiendo un nuevo paradigma en el desarrollo de vacunas contra la malaria con el descubrimiento de células IgM+ e IgD+ de memoria B dirigidas a la proteína superficial de merozo Además, los anticuerpos neutralizantes altamente potentes dirigidos a un sitio nuevo y conservado en la proteína Circumsporozoita se han aislado de las células B (22). Juntos, estos ejemplos demuestran la importancia de estudiar las respuestas humorales específicas de antígenos a enfermedades infecciosas. Las soluciones a las estructuras cristalinas de las proteínas superficiales para una variedad de patógenos, la estabilización conformacional de estos antígenos, y la aplicación de los métodos resumidos en esta revisión, para sondear respuestas de células B específicas de antígenos, han creado nuevas oportunidades para el diseño sistemático y racional de vacunas para el VIH, el VSR, el VSE, la malaria y muchos otros patógenos. El estudio de las respuestas de células B no sólo ha informado el diseño de vacunas, sino que también ha avanzado en nuestra comprensión de las enfermedades autoinmunes mediadas por anticuerpos, como la artritis reumatoide y el lupus eritematoso sistémico (23, 24 Aunque estas células son potencialmente patógenas, la eliminación de células B con alta afinidad al autoantígeno a través de la apoptosis, la anergia de células B con baja afinidad al autoantígeno y la ausencia de células T ayudan a combinarse para proteger contra la enfermedad autoinmune en ratones (26). El estudio de células B específicas de autoantígenos y un análisis detallado de subconjuntos de células B con potencial patógeno en humanos podrían conducir a una mejor comprensión de cómo prevenir y tratar enfermedades autoinmunes. Aunque el término célula B específica de antígenos se utiliza a lo largo de esta mini revisión para denotar el análisis de células B basado en la unión entre el receptor de células B (BCR) y un antígeno específico utilizado como cebo, es importante tener en cuenta que las BCR dentro del repertorio de células B policlonales exhiben un espectro de polireactividad. En un extremo del espectro La frecuencia de polireactividad en el repertorio normal de células B humanas adultas se ha estimado en el 4% de las células B naïve, el 23% de las células B IgG+ de memoria y el 26% de los plasmablastos IgA+ e IgG+ intestinales (27-29). En el otro extremo del espectro, un BCR mono reactivo se activa sólo cuando se encuentra con un antígeno cognato único. Aunque hay excepciones, la acumulación de hipermutaciones somáticas dentro de las regiones variables del BCR durante el proceso de maduración de afinidad se piensa generalmente que conduce a un aumento de afinidad y especificidad para el antígeno cognato (30, 31). Varias técnicas generales se utilizan comúnmente para identificar células B específicas de antígenos (Tabla 1 ). La técnica de inmunospot vinculado a la enzima B (ELISPOT) se basa en el principio de capturar el anticuerpo secreto en las proximidades de cada En la célula B ELISPOT, las células B secretadoras de anticuerpos (ASC) presentes en una muestra o diferenciadas in vitro se añaden a las placas recubiertas con el antígeno de interés. Los anticuerpos específicos de antígenos se unen muy cerca de la ubicación de las células B individuales que producen esos anticuerpos. Los anticuerpos secundarios enzimáticos o fluorescentes etiquetados se utilizan para visualizar puntos de secreción de anticuerpos y unión a antígenos unidos a placas en la ubicación de las ASCs. Cada punto corresponde a un anticuerpo producido a partir de una célula B específica de antígenos y por lo tanto la técnica es extremadamente sensible. Los anticuerpos secundarios conjugados a cuentas de color combinatoria también se pueden utilizar para detectar los anticuerpos segregados de células B individuales con la ventaja de multiplexar el ensayo (32). Una limitación del ensayo es su requisito para la secreción de anticuerpos por células B, limitando así el ensayo a sólo un subconjunto de células B Las células B de memoria pueden ser estimuladas in vitro para diferenciarse en ASCs antes de añadirse a la placa recubierta de antígenos (34). Además, las células B específicas de antígenos identificadas por ELISPOT generalmente no están disponibles para el análisis posterior. Limitar la dilución es otra técnica que se ha utilizado para aislar células B específicas de antígenos. En este enfoque, las células primarias se pueden diluir en serie hasta que las células B individuales se separan en placas de micropozo (36). Las células B pueden entonces ser cultivadas y expandidas ex vivo o inmortalizadas utilizando EBV de tal manera que cada pozo contiene un anticuerpo monoclonal (3, 37, 38). Las células B específicas de antígenos pueden ser seleccionadas mediante el cribado de los sobrenadantes de cultivo para detectar anticuerpos monoclonales que se unen a un antígeno de interés. Aunque los anticuerpos pueden ser secuenciados Esta técnica puede ser potencialmente prolongada y laboriosa, pero el uso de microfluídicas y robóticas ha mejorado en gran medida el rendimiento para seleccionar células B específicas de antígenos (39). Los avances en tecnología de secuenciación de una sola generación han permitido un perfil de transcripción de alto rendimiento y secuenciación de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina emparejadas (40). En este enfoque, la especificidad del antígeno se puede probar después de clonar anticuerpos monoclonales y producirlos utilizando los datos de secuenciación. Este método puede ser útil para identificar células B específicas de antígenos que han sufrido expansión clonal después de la vacunación o infección aguda (41). La citometría de flujo es el método más común utilizado para el análisis y aislamiento de células monocelulares (39). El análisis basado en citometría de flujo de células B específicas de antígenos depende del etiquetado del antígeno con una etiqueta fluorescente para permitir la detección. Los fluorocromos se pueden unir covalentemente a través de conjugación química al antígeno, expresado como una proteína de fusión recombinante, o bien se unen no covalentemente mediante biotinilación del antígeno. Después de la biotinilación, se añade estreptavidina conjugada con fluorocromo para generar un tetramero etiquetado del antígeno. La biotinilación del antígeno en una relación ≤1 biotina a 1 antígeno es importante, ya que cada estreptavidina tiene el potencial de unirse a cuatro biotinas. Si la relación entre biotina y antígeno es >1:1, entonces el clumping y la precipitación del antígeno fuera de solución puede ocurrir tan pronto como se añade estreptavidina. Alternativamente, la biotinilación dirigida en el sitio se puede lograr añadiendo una etiqueta AviTag o BioEase al antígeno recombinante antes de la expresión (77, 78) Cuando se utiliza biotinilación específica del sitio, los investigadores deben tener en cuenta que la etiqueta puede ocluir un epítopo del reconocimiento por las células B que puede ser problemático para los antígenos de la vacuna. Además, para las proteínas que oligomerizan, se pueden incorporar múltiples etiquetas, posiblemente dando lugar a la agregación. Otra consideración importante es el potencial de confusión por las células B en el repertorio que se unen a los fluorocromos, estreptavidina, o cualquier enlace en lugar del antígeno de interés. La unión entre fluorocromos, enlaces o estreptavidina y BCRs de humanos y ratones nunca expuestos a estos antígenos son generalmente de baja afinidad, y estos BCRs se expresan generalmente por células B naïve y potencialmente polireactivas (62, 79, 80). El etiquetado dual, en el que el mismo antígeno está etiquetado por separado con dos fluorocromos diferentes, se puede utilizar para identificar las células B de doble positivo y eliminar la confusión por las células B que unen el fluorocromo (12, 42). Sin embargo, incluso cuando los tetrameros se utilizan para el etiquetado dual, las células B específicas de estreptavidina contaminarán la población de doble positivo. Para eliminar completamente la confusión del fluorocromo, la estreptavidina y los enlaces, se puede utilizar un tetramero "decoy" para identificar estas células B contaminantes (21, 26). En este enfoque, el mismo fluorocromo utilizado para identificar las células B específicas de antígeno se conjuga a un fluorocromo diferente tal que el espectro de emisión se altera por transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) (26). En particular, es fundamental utilizar la misma fuente de estreptavidina conjugada de fluorocromo en el tetramero y reactivo de señuelo, porque los métodos de conjugación, estreptavidina recombinante y fluorocromos proteínicos como la R-ficoeritrina varían lo suficiente de compañía en compañía para alterar algunos de los epítopos disponibles para que las células B se unen. Una debilidad del enfoque citométrico de flujo es la dependencia de antígenos que se pueden conjugar fácilmente a un fluorocromo o biotinilado. Además de las proteínas recombinantes y los péptidos sintetizados, se han utilizado polisacáridos, lípidos, haptenes, partículas similares a los virus y pseudo virus para identificar células específicas de antígenos por citometría de flujo (33, [43] [44] [45] [47] [47] [47] [49] [50] [50] [52] [53] [53] [55] [56] [57] [57] [58] [58] [59]. Además, se han identificado células B específicas de epitopos mediante la detección de bacteriofagos o bibliotecas de péptidos de microarrayo con anticuerpos policlonales dirigidos al antígeno nativo para seleccionar epitopos conformacionales que pueden fusionarse con proteínas fluorescentes para su uso en citometría de flujo (47, 60]. Con avances tecnológicos que aumentan el número de parámetros simultáneamente medibles, las células B específicas Además, el ensayo de captura de inmunoglobulina es una adaptación basada en citometría de flujo del ensayo ELISPOT en el que se utiliza un anticuerpo anti-CD45 con estreptavidina que transporta cuatro anticuerpos anti-IgG biotinilados para unir simultáneamente los plasmablastos y capturar anticuerpos secretados seguidos de antígenos fluorescentes para detectar plasmablastos específicos (61). La intensidad media de fluorescencia medida por citometría de flujo y normalizada al nivel de expresión BCR también proporciona una medida de la cantidad relativa de antígenos que se unen a una célula B y puede utilizarse como sustituto áspero para la afinidad de unión (79, 81, 82). La preincubación de células B con concentraciones crecientes de un antígeno monomérico antes de etiquetarse con antígeno tetramérico también puede utilizarse para cuantificar la afinidad de unión. Las células que expresan una alta afinidad BCR se unen al antígeno monomérico en concentraciones bajas, mientras que las BCR de baja afinidad requerirán concentraciones más altas de antígeno monomérico para competir e inhibir la unión tetramérica (26). Las células individuales también pueden ser aisladas mediante la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para el análisis posterior, incluyendo la secuenciación y clonación de BCR, la medición de afinidad BCR, la proliferación in vitro y el perfil transcripcional. Recientemente se han desarrollado métodos para mejorar aún más la sensibilidad para detectar células B específicas de antígenos raras. Las nanopartículas magnéticas conjugadas con anticuerpos dirigidos al fluorocromo sobre el antígeno de interés, permiten el enriquecimiento de células B específicas de antígenos antes de la citometría de flujo (20, 26, 80, 83). Este enfoque es particularmente útil para detectar células B naïve raras específicas de antígenos, células La estrategia de enriquecimiento magnético permite el análisis de significativamente más células en un período de tiempo más corto concentrando las células de interés antes de la citometría de flujo (Figura 1). En particular, como con cualquier método que busca identificar una población de células a una frecuencia muy baja, el fondo y el ruido inherente al sistema de detección se magnifican con respecto a la señal de interés, especialmente cuando esa señal es débil. Por lo tanto, para detectar la población de interés específica de antígenos, las siguientes consideraciones son críticas: (1) Utilizar señuelos para excluir las células B de especificidades no deseadas;(2) diseño cuidadoso de paneles de citometría de flujo para evitar el derrame de emisiones en el canal para el antígeno de interés; y (3) elegir los fluorocromos más brillantes, como la R-ficoerythrin o la aloficocianina. Los métodos in vivo para sondear las respuestas de células B específicas de antígenos en presencia de otras células presentadoras de antígenos y ayudantes de células T, han aumentado nuestra comprensión mecánica de la respuesta inmune humoral durante la vacunación, infección y autoinmunidad. Las células B transferidas por adopción pueden distinguirse de los linfocitos receptores aprovechando cepas de ratón con variaciones alélicas en CD45 o ratones sin células B. Las células B transferidas por adopción pueden provenir de ratones de tipo salvaje o de ratones que expresan BCR transgénicos (Tabla 2), y las células B específicas de antígenos pueden analizarse utilizando las técnicas descritas anteriormente. La microscopía es otra técnica general que se ha utilizado para identificar células específicas de antígenos in vivo y ofrece la ventaja de la visualización directa. En la primera aplicación reportada de esta técnica para demostrar el origen celular de los anticuerpos en 1955, se utilizaron anticuerpos conjugados con fluoresceína contra la ovoalbúmina y la inmunoglobulina humana para tincionar secciones de tejido del bazo de conejos hiperinmunes (2). Desde entonces, otros grupos han etiquetado fluorescentemente antígenos para localizar células B específicas de antígenos mediante microscopía (62, 65). Los avances en la disección de captura láser microscopía, ya utilizada en el campo celular T, también proporcionan una oportunidad para aislar células B específicas de antígenos individuales para el análisis posterior, incluyendo la secuenciación y clonación del BCR o el perfil transcripcional (66). Sin embargo, la tinción de antígenos de BCR in situ puede ser un desafío dependiendo de la unión de antígenos de patógenos a otros receptores celulares o una alteración de la especificidad de BCR durante la fijación La microscopía bifotónica o multifotónica tiene la capacidad de resolver imágenes a mayor profundidad y con menor fotoblanqueo que la microscopía confocal (67, 68). Como resultado, esta tecnología ha permitido la obtención de imágenes en tiempo real en tejidos linfoides vivos e intactos de ratones, permitiendo la observación directa in vivo de interacciones inmunitarias. Los movimientos dinámicos e interacciones de células B específicas de antígenos pueden ser estudiados in vivo combinando una transferencia adoptiva de células B individuales (aisladas limitando la dilución o FACS) con microscopía bifotónica (63, 69, 70). Los modelos de ratón humanizados son herramientas poderosas para traducir experimentos en ratones a aplicaciones en humanos. Los ratones transgénicos con completa humanización de los loci de inmunoglobulina de ratón proporcionan una oportunidad para recapitular la amplitud del repertorio de células B humanas y sirven como una herramienta valiosa para el descubrimiento de anticuerpos terapéuticos (71). Sin embargo, una advertencia es que las frecuencias de alelos que se encuentran en los repertorios de células B de estos modelos de ratón no necesariamente recapitulan los encontrados en humanos (72). La citometría de masa tiene el potencial de proporcionar más análisis de alta dimensión de células B específicas de antígenos. En este método, las etiquetas de iones de metal pesado en lugar de fluorocromos se utilizan para etiquetar las células. Como los datos se recogen como espectrometría de masa de tiempo-desluz, hasta 42 parámetros únicos pueden medirse simultáneamente a partir de una sola muestra sin derrame significativo entre canales o la necesidad de compensación. La citometría de masa con tetrameros metálicos pesados se puede construir utilizando es La citometría de masas con tetrameros péptidos MHC metálicos ha sido utilizada con éxito para identificar y caracterizar células T específicas de antígenos, pero hasta ahora no se ha aplicado a células B específicas de antígenos (73, 74). Una limitación de este enfoque es que las células no están disponibles para el análisis posterior, ya que son vaporizadas por una antorcha de plasma para atomizar las etiquetas de los iones. Sin embargo, al detectar simultáneamente muchos más marcadores de superficie y citocinas intracelulares, factores de transcripción y detectar más moléculas de señalización de células individuales de lo que antes era posible con etiquetas fluorescentes tradicionales, la aplicación de citometría de masa con algoritmos de reducción de dimensión podría ayudar a diseccionar la complejidad del compartimento de células B, proporcionar una visión de mayor resolución del desarrollo de células B, y revelar nuevos subconjuntos de células B específicas de antígenos involucradas en la mediación de enfermedades autoinmunes En el horizonte, las tecnologías de secuenciación de ARN de células únicas (ARN-seq) tienen el potencial de revolucionar el estudio de células inmunes específicas de antígenos (75, 76). La capacidad de generar una biblioteca de tetrameros con códigos de barras únicos podría permitir el examen simultáneo de perfiles de expresión génica de un gran número de células con diferentes especificidades de antígenos en un solo experimento. Combinar tetrameros codificados con anticuerpos con oligonucleótidos y ARN-seq para medir simultáneamente la proteína y expresión génica de células específicas de antígenos podría aumentar aún más la cantidad de información multiómica imparcial sobre células específicas de antígenos individuales en estados normales y de enfermedad y ayudar al diseño racional de vacunas y terapéuticas (105) (106) (107). El análisis en curso de respuestas específicas de células B de antígenos ha llevado al desarrollo de nuevos reactivos diagnóstico Los métodos para estudiar las respuestas específicas de las células B de antígenos se están aplicando cada vez más para hacer frente a enfermedades como el VIH, el VRS y las enfermedades autoinmunes, en las que la respuesta inmune no protege o aclara la enfermedad, o donde mejora la enfermedad o es responsable de la enfermedad misma. Existen en el horizonte oportunidades considerables para aplicar estos métodos a una miríada de enfermedades en las que las células B desempeñan un papel activo. JB y JT revisaron la literatura, generaron cifras y tablas, y escribieron el manuscrito.

¿Cuál es el papel de los anticuerpos durante la infección?

Técnicas para estudiar respuestas específicas de células B de antígenoshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6667631/SHA: ee632fa425607e8ff91fc3730bc0782d43ce9c0cAutores: Boonyaratanakornkit, Jim; Taylor, Justin J. Fecha: 2019-07-24DOI: 10.3389/fimmu.2019.01694Licencia: cc-byAbstract: Los anticuerpos contra antígenos extraños son un componente crítico de la respuesta inmune general y pueden facilitar el aclaramiento de patógenos durante una infección primaria y también proteger contra infecciones posteriores. Desde la delineación experimental de un linaje distinto de células B en 1965, se han desarrollado varios métodos para entender las respuestas específicas de las células B en el contexto de enfermedades autoinmunes, inmunodeficiencias primarias, infección y vacunación. En esta revisión, se resumen las técnicas establecidas y se discuten las nuevas y emergentes tecnologías para probar la respuesta de células B in vitro e in vivo aprovechando la especificidad de los anticuerpos B asociados y segregados al receptor de células B (BCR), que incluyen ELISPOT, citometría de flujo, citometría de masa y microscopía de fluorescencia para identificar y/o aislar células B específicas de antígenos primarios. También se presenta nuestro enfoque para identificar células B específicas de antígenos raras utilizando enriquecimiento magnético seguido por citometría de flujo. Una vez que estas células están aisladas, los ensayos de proliferación in vitro y experimentos de transferencia adoptiva en ratones se pueden utilizar para caracterizar aún más la activación, Los modelos transgénicos de ratones de células B dirigidos a antígenos modelo y de señalización de células B también han avanzado significativamente en nuestra comprensión de las respuestas de células B específicas de antígenos in vivo. Texto: En su conferencia Nobel en 1908, Paul Ehrlich comparó la interacción anticuerpo-antígeno a un bloqueo y clave. Razonaba que las antitoxinas (anticuerpos) contenidas en una solución en el suero de animales inmunizados deben ser idénticas a un receptor celular "para una llave realmente bien hecha no abrirá cerraduras diferentes al mismo tiempo" (1). Tomó casi cinco décadas antes de que se usara la microscopía de inmunofluorescencia para confirmar el origen celular de anticuerpos (2). Grandes pasos en el campo de células B y anticuerpos seguidos en la década de 1970 con el desarrollo de la tecnología del hibridoma para producir anticuerpos monoclonales y el descubrimiento de que el reordenamiento somático La posterior explosión de los anticuerpos monoclonales disponibles llevó a los reactivos diagnósticos, terapéuticos y de investigación revolucionarios a distinguir diferentes tipos de células inmunes (5). Juntos, estos descubrimientos nos han permitido investigar la inmunidad humoral a nivel de la célula B específica del antígeno. Métodos para investigar la respuesta específica de células B del antígeno han avanzado en nuestra comprensión de cómo aprovechar la notable amplitud del repertorio de células B y la exquisita especificidad de la célula B individual en el desarrollo de (1) candidatos vacunales que provocan anticuerpos protectores; (2) anticuerpos que previenen la enfermedad cuando se administra profilácticamente; y (3) anticuerpos que pueden administrarse como terapia después del inicio de la enfermedad. Muchas de las vacunas disponibles actualmente se desarrollaron empíricamente ya sea inactivando, atenuando o administrando una subunidad del patógeno. Sin embargo, el desarrollo de la vacuna contra patógenos que son tradicionalmente difíciles de vacunar contra puede depender de una investigación más profunda de la respuesta Para el VIH-1, el descubrimiento de anticuerpos ampliamente neutralizantes (bnAbs) que protegen contra la infección a través de diversos aislados virales ha intensificado los esfuerzos para entender la vía de desarrollo de las células B raras que producen estos anticuerpos (6) (7) (8) (9). Perspectivas sobre la ontogenia de estas células B raras podrían permitir el diseño de un régimen de vacunas graduales que estimula el precursor de la línea germinal para expandirse y madurar para producir bnAbs circulantes que podrían proteger contra la adquisición del VIH (10, 11). Para el VSR, versiones estabilizadas de la proteína de fusión (F) en la conformación de prefusión han llevado a la comprensión de la respuesta de la célula B a la infección y ha generado candidatos a vacunas potencialmente más seguros y eficaces (12, 13). La gripe también realiza la fusión a través de la región madre de la proteína hemaglutinina, y la identificación de las células B que se dirigen a este sitio relativamente conservado ha estimulado la investigación sobre el desarrollo de una vacuna universal contra la gripe (14) (15) (16). Al igual que el VRS, el VIH y la gripe, las proteínas de fusión del VET y el VMC existen en una conformación prefusional, y la estabilización en sus estados prefusionales podría acelerar en gran medida el desarrollo de vacunas contra estos patógenos (17-19). Células B de memoria raras que producen anticuerpos específicos para la maquinaria de fusión del VET han sido aisladas; estas pueden neutralizar tanto la infección por células B como la epitelial (20). También está surgiendo un nuevo paradigma en el desarrollo de vacunas contra la malaria con el descubrimiento de células IgM+ e IgD+ de memoria B dirigidas a la proteína superficial de merozo Además, los anticuerpos neutralizantes altamente potentes dirigidos a un sitio nuevo y conservado en la proteína Circumsporozoita se han aislado de las células B (22). Juntos, estos ejemplos demuestran la importancia de estudiar las respuestas humorales específicas de antígenos a enfermedades infecciosas. Las soluciones a las estructuras cristalinas de las proteínas superficiales para una variedad de patógenos, la estabilización conformacional de estos antígenos, y la aplicación de los métodos resumidos en esta revisión, para sondear respuestas de células B específicas de antígenos, han creado nuevas oportunidades para el diseño sistemático y racional de vacunas para el VIH, el VSR, el VSE, la malaria y muchos otros patógenos. El estudio de las respuestas de células B no sólo ha informado el diseño de vacunas, sino que también ha avanzado en nuestra comprensión de las enfermedades autoinmunes mediadas por anticuerpos, como la artritis reumatoide y el lupus eritematoso sistémico (23, 24 Aunque estas células son potencialmente patógenas, la eliminación de células B con alta afinidad al autoantígeno a través de la apoptosis, la anergia de células B con baja afinidad al autoantígeno y la ausencia de células T ayudan a combinarse para proteger contra la enfermedad autoinmune en ratones (26). El estudio de células B específicas de autoantígenos y un análisis detallado de subconjuntos de células B con potencial patógeno en humanos podrían conducir a una mejor comprensión de cómo prevenir y tratar enfermedades autoinmunes. Aunque el término célula B específica de antígenos se utiliza a lo largo de esta mini revisión para denotar el análisis de células B basado en la unión entre el receptor de células B (BCR) y un antígeno específico utilizado como cebo, es importante tener en cuenta que las BCR dentro del repertorio de células B policlonales exhiben un espectro de polireactividad. En un extremo del espectro La frecuencia de polireactividad en el repertorio normal de células B humanas adultas se ha estimado en el 4% de las células B naïve, el 23% de las células B IgG+ de memoria y el 26% de los plasmablastos IgA+ e IgG+ intestinales (27-29). En el otro extremo del espectro, un BCR mono reactivo se activa sólo cuando se encuentra con un antígeno cognato único. Aunque hay excepciones, la acumulación de hipermutaciones somáticas dentro de las regiones variables del BCR durante el proceso de maduración de afinidad se piensa generalmente que conduce a un aumento de afinidad y especificidad para el antígeno cognato (30, 31). Varias técnicas generales se utilizan comúnmente para identificar células B específicas de antígenos (Tabla 1 ). La técnica de inmunospot vinculado a la enzima B (ELISPOT) se basa en el principio de capturar el anticuerpo secreto en las proximidades de cada En la célula B ELISPOT, las células B secretadoras de anticuerpos (ASC) presentes en una muestra o diferenciadas in vitro se añaden a las placas recubiertas con el antígeno de interés. Los anticuerpos específicos de antígenos se unen muy cerca de la ubicación de las células B individuales que producen esos anticuerpos. Los anticuerpos secundarios enzimáticos o fluorescentes etiquetados se utilizan para visualizar puntos de secreción de anticuerpos y unión a antígenos unidos a placas en la ubicación de las ASCs. Cada punto corresponde a un anticuerpo producido a partir de una célula B específica de antígenos y por lo tanto la técnica es extremadamente sensible. Los anticuerpos secundarios conjugados a cuentas de color combinatoria también se pueden utilizar para detectar los anticuerpos segregados de células B individuales con la ventaja de multiplexar el ensayo (32). Una limitación del ensayo es su requisito para la secreción de anticuerpos por células B, limitando así el ensayo a sólo un subconjunto de células B Las células B de memoria pueden ser estimuladas in vitro para diferenciarse en ASCs antes de añadirse a la placa recubierta de antígenos (34). Además, las células B específicas de antígenos identificadas por ELISPOT generalmente no están disponibles para el análisis posterior. Limitar la dilución es otra técnica que se ha utilizado para aislar células B específicas de antígenos. En este enfoque, las células primarias se pueden diluir en serie hasta que las células B individuales se separan en placas de micropozo (36). Las células B pueden entonces ser cultivadas y expandidas ex vivo o inmortalizadas utilizando EBV de tal manera que cada pozo contiene un anticuerpo monoclonal (3, 37, 38). Las células B específicas de antígenos pueden ser seleccionadas mediante el cribado de los sobrenadantes de cultivo para detectar anticuerpos monoclonales que se unen a un antígeno de interés. Aunque los anticuerpos pueden ser secuenciados Esta técnica puede ser potencialmente prolongada y laboriosa, pero el uso de microfluídicas y robóticas ha mejorado en gran medida el rendimiento para seleccionar células B específicas de antígenos (39). Los avances en tecnología de secuenciación de una sola generación han permitido un perfil de transcripción de alto rendimiento y secuenciación de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina emparejadas (40). En este enfoque, la especificidad del antígeno se puede probar después de clonar anticuerpos monoclonales y producirlos utilizando los datos de secuenciación. Este método puede ser útil para identificar células B específicas de antígenos que han sufrido expansión clonal después de la vacunación o infección aguda (41). La citometría de flujo es el método más común utilizado para el análisis y aislamiento de células monocelulares (39). El análisis basado en citometría de flujo de células B específicas de antígenos depende del etiquetado del antígeno con una etiqueta fluorescente para permitir la detección. Los fluorocromos se pueden unir covalentemente a través de conjugación química al antígeno, expresado como una proteína de fusión recombinante, o bien se unen no covalentemente mediante biotinilación del antígeno. Después de la biotinilación, se añade estreptavidina conjugada con fluorocromo para generar un tetramero etiquetado del antígeno. La biotinilación del antígeno en una relación ≤1 biotina a 1 antígeno es importante, ya que cada estreptavidina tiene el potencial de unirse a cuatro biotinas. Si la relación entre biotina y antígeno es >1:1, entonces el clumping y la precipitación del antígeno fuera de solución puede ocurrir tan pronto como se añade estreptavidina. Alternativamente, la biotinilación dirigida en el sitio se puede lograr añadiendo una etiqueta AviTag o BioEase al antígeno recombinante antes de la expresión (77, 78) Cuando se utiliza biotinilación específica del sitio, los investigadores deben tener en cuenta que la etiqueta puede ocluir un epítopo del reconocimiento por las células B que puede ser problemático para los antígenos de la vacuna. Además, para las proteínas que oligomerizan, se pueden incorporar múltiples etiquetas, posiblemente dando lugar a la agregación. Otra consideración importante es el potencial de confusión por las células B en el repertorio que se unen a los fluorocromos, estreptavidina, o cualquier enlace en lugar del antígeno de interés. La unión entre fluorocromos, enlaces o estreptavidina y BCRs de humanos y ratones nunca expuestos a estos antígenos son generalmente de baja afinidad, y estos BCRs se expresan generalmente por células B naïve y potencialmente polireactivas (62, 79, 80). El etiquetado dual, en el que el mismo antígeno está etiquetado por separado con dos fluorocromos diferentes, se puede utilizar para identificar las células B de doble positivo y eliminar la confusión por las células B que unen el fluorocromo (12, 42). Sin embargo, incluso cuando los tetrameros se utilizan para el etiquetado dual, las células B específicas de estreptavidina contaminarán la población de doble positivo. Para eliminar completamente la confusión del fluorocromo, la estreptavidina y los enlaces, se puede utilizar un tetramero "decoy" para identificar estas células B contaminantes (21, 26). En este enfoque, el mismo fluorocromo utilizado para identificar las células B específicas de antígeno se conjuga a un fluorocromo diferente tal que el espectro de emisión se altera por transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) (26). En particular, es fundamental utilizar la misma fuente de estreptavidina conjugada de fluorocromo en el tetramero y reactivo de señuelo, porque los métodos de conjugación, estreptavidina recombinante y fluorocromos proteínicos como la R-ficoeritrina varían lo suficiente de compañía en compañía para alterar algunos de los epítopos disponibles para que las células B se unen. Una debilidad del enfoque citométrico de flujo es la dependencia de antígenos que se pueden conjugar fácilmente a un fluorocromo o biotinilado. Además de las proteínas recombinantes y los péptidos sintetizados, se han utilizado polisacáridos, lípidos, haptenes, partículas similares a los virus y pseudo virus para identificar células específicas de antígenos por citometría de flujo (33, [43] [44] [45] [47] [47] [47] [49] [50] [50] [52] [53] [53] [55] [56] [57] [57] [58] [58] [59]. Además, se han identificado células B específicas de epitopos mediante la detección de bacteriofagos o bibliotecas de péptidos de microarrayo con anticuerpos policlonales dirigidos al antígeno nativo para seleccionar epitopos conformacionales que pueden fusionarse con proteínas fluorescentes para su uso en citometría de flujo (47, 60]. Con avances tecnológicos que aumentan el número de parámetros simultáneamente medibles, las células B específicas Además, el ensayo de captura de inmunoglobulina es una adaptación basada en citometría de flujo del ensayo ELISPOT en el que se utiliza un anticuerpo anti-CD45 con estreptavidina que transporta cuatro anticuerpos anti-IgG biotinilados para unir simultáneamente los plasmablastos y capturar anticuerpos secretados seguidos de antígenos fluorescentes para detectar plasmablastos específicos (61). La intensidad media de fluorescencia medida por citometría de flujo y normalizada al nivel de expresión BCR también proporciona una medida de la cantidad relativa de antígenos que se unen a una célula B y puede utilizarse como sustituto áspero para la afinidad de unión (79, 81, 82). La preincubación de células B con concentraciones crecientes de un antígeno monomérico antes de etiquetarse con antígeno tetramérico también puede utilizarse para cuantificar la afinidad de unión. Las células que expresan una alta afinidad BCR se unen al antígeno monomérico en concentraciones bajas, mientras que las BCR de baja afinidad requerirán concentraciones más altas de antígeno monomérico para competir e inhibir la unión tetramérica (26). Las células individuales también pueden ser aisladas mediante la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para el análisis posterior, incluyendo la secuenciación y clonación de BCR, la medición de afinidad BCR, la proliferación in vitro y el perfil transcripcional. Recientemente se han desarrollado métodos para mejorar aún más la sensibilidad para detectar células B específicas de antígenos raras. Las nanopartículas magnéticas conjugadas con anticuerpos dirigidos al fluorocromo sobre el antígeno de interés, permiten el enriquecimiento de células B específicas de antígenos antes de la citometría de flujo (20, 26, 80, 83). Este enfoque es particularmente útil para detectar células B naïve raras específicas de antígenos, células La estrategia de enriquecimiento magnético permite el análisis de significativamente más células en un período de tiempo más corto concentrando las células de interés antes de la citometría de flujo (Figura 1). En particular, como con cualquier método que busca identificar una población de células a una frecuencia muy baja, el fondo y el ruido inherente al sistema de detección se magnifican con respecto a la señal de interés, especialmente cuando esa señal es débil. Por lo tanto, para detectar la población de interés específica de antígenos, las siguientes consideraciones son críticas: (1) Utilizar señuelos para excluir las células B de especificidades no deseadas;(2) diseño cuidadoso de paneles de citometría de flujo para evitar el derrame de emisiones en el canal para el antígeno de interés; y (3) elegir los fluorocromos más brillantes, como la R-ficoerythrin o la aloficocianina. Los métodos in vivo para sondear las respuestas de células B específicas de antígenos en presencia de otras células presentadoras de antígenos y ayudantes de células T, han aumentado nuestra comprensión mecánica de la respuesta inmune humoral durante la vacunación, infección y autoinmunidad. Las células B transferidas por adopción pueden distinguirse de los linfocitos receptores aprovechando cepas de ratón con variaciones alélicas en CD45 o ratones sin células B. Las células B transferidas por adopción pueden provenir de ratones de tipo salvaje o de ratones que expresan BCR transgénicos (Tabla 2), y las células B específicas de antígenos pueden analizarse utilizando las técnicas descritas anteriormente. La microscopía es otra técnica general que se ha utilizado para identificar células específicas de antígenos in vivo y ofrece la ventaja de la visualización directa. En la primera aplicación reportada de esta técnica para demostrar el origen celular de los anticuerpos en 1955, se utilizaron anticuerpos conjugados con fluoresceína contra la ovoalbúmina y la inmunoglobulina humana para tincionar secciones de tejido del bazo de conejos hiperinmunes (2). Desde entonces, otros grupos han etiquetado fluorescentemente antígenos para localizar células B específicas de antígenos mediante microscopía (62, 65). Los avances en la disección de captura láser microscopía, ya utilizada en el campo celular T, también proporcionan una oportunidad para aislar células B específicas de antígenos individuales para el análisis posterior, incluyendo la secuenciación y clonación del BCR o el perfil transcripcional (66). Sin embargo, la tinción de antígenos de BCR in situ puede ser un desafío dependiendo de la unión de antígenos de patógenos a otros receptores celulares o una alteración de la especificidad de BCR durante la fijación La microscopía bifotónica o multifotónica tiene la capacidad de resolver imágenes a mayor profundidad y con menor fotoblanqueo que la microscopía confocal (67, 68). Como resultado, esta tecnología ha permitido la obtención de imágenes en tiempo real en tejidos linfoides vivos e intactos de ratones, permitiendo la observación directa in vivo de interacciones inmunitarias. Los movimientos dinámicos e interacciones de células B específicas de antígenos pueden ser estudiados in vivo combinando una transferencia adoptiva de células B individuales (aisladas limitando la dilución o FACS) con microscopía bifotónica (63, 69, 70). Los modelos de ratón humanizados son herramientas poderosas para traducir experimentos en ratones a aplicaciones en humanos. Los ratones transgénicos con completa humanización de los loci de inmunoglobulina de ratón proporcionan una oportunidad para recapitular la amplitud del repertorio de células B humanas y sirven como una herramienta valiosa para el descubrimiento de anticuerpos terapéuticos (71). Sin embargo, una advertencia es que las frecuencias de alelos que se encuentran en los repertorios de células B de estos modelos de ratón no necesariamente recapitulan los encontrados en humanos (72). La citometría de masa tiene el potencial de proporcionar más análisis de alta dimensión de células B específicas de antígenos. En este método, las etiquetas de iones de metal pesado en lugar de fluorocromos se utilizan para etiquetar las células. Como los datos se recogen como espectrometría de masa de tiempo-desluz, hasta 42 parámetros únicos pueden medirse simultáneamente a partir de una sola muestra sin derrame significativo entre canales o la necesidad de compensación. La citometría de masa con tetrameros metálicos pesados se puede construir utilizando es La citometría de masas con tetrameros péptidos MHC metálicos ha sido utilizada con éxito para identificar y caracterizar células T específicas de antígenos, pero hasta ahora no se ha aplicado a células B específicas de antígenos (73, 74). Una limitación de este enfoque es que las células no están disponibles para el análisis posterior, ya que son vaporizadas por una antorcha de plasma para atomizar las etiquetas de los iones. Sin embargo, al detectar simultáneamente muchos más marcadores de superficie y citocinas intracelulares, factores de transcripción y detectar más moléculas de señalización de células individuales de lo que antes era posible con etiquetas fluorescentes tradicionales, la aplicación de citometría de masa con algoritmos de reducción de dimensión podría ayudar a diseccionar la complejidad del compartimento de células B, proporcionar una visión de mayor resolución del desarrollo de células B, y revelar nuevos subconjuntos de células B específicas de antígenos involucradas en la mediación de enfermedades autoinmunes En el horizonte, las tecnologías de secuenciación de ARN de células únicas (ARN-seq) tienen el potencial de revolucionar el estudio de células inmunes específicas de antígenos (75, 76). La capacidad de generar una biblioteca de tetrameros con códigos de barras únicos podría permitir el examen simultáneo de perfiles de expresión génica de un gran número de células con diferentes especificidades de antígenos en un solo experimento. Combinar tetrameros codificados con anticuerpos con oligonucleótidos y ARN-seq para medir simultáneamente la proteína y expresión génica de células específicas de antígenos podría aumentar aún más la cantidad de información multiómica imparcial sobre células específicas de antígenos individuales en estados normales y de enfermedad y ayudar al diseño racional de vacunas y terapéuticas (105) (106) (107). El análisis en curso de respuestas específicas de células B de antígenos ha llevado al desarrollo de nuevos reactivos diagnóstico Los métodos para estudiar las respuestas específicas de las células B de antígenos se están aplicando cada vez más para hacer frente a enfermedades como el VIH, el VRS y las enfermedades autoinmunes, en las que la respuesta inmune no protege o aclara la enfermedad, o donde mejora la enfermedad o es responsable de la enfermedad misma. Existen en el horizonte oportunidades considerables para aplicar estos métodos a una miríada de enfermedades en las que las células B desempeñan un papel activo. JB y JT revisaron la literatura, generaron cifras y tablas, y escribieron el manuscrito.

¿Qué invención tecnológica produjo anticuerpos que son clones de una célula madre única?

Variaciones demográficas de la infección por MERS-CoV entre casos sospechosos y confirmados: Análisis epidemiológico de los datos de laboratorio del laboratorio regional de Riadhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7049846/SHA: edee452881f826fb72c58ee68a982789b12aa99dAutores: Altamimi, Asmaa; Abu-Saris, Raghib; El-Metwally, Ashraf; Alaifan, Taghreed; Alamri, ArefFecha: 2020-02-19DOI: 10.1155/2020/9629747Licencia: cc-byAbstract: Introducción. El síndrome respiratorio del Oriente Medio coronavirus fue reconocido por primera vez en septiembre de 2012 en Arabia Saudita. Las presentaciones clínicas de MERS y SARI no-MERS son a menudo similares. Por lo tanto, la identificación de casos sospechosos que pueden tener mayores probabilidades de ser diagnosticados como casos de MERS-CoV es esencial. Sin embargo, el verdadero reto es señalar a estos pacientes a través de algunos marcadores demográficos. La naturaleza de estos marcadores no ha sido previamente investigada en Arabia Saudita, y por lo tanto, este estudio tiene como objetivo identificarlos. MÉTODOS: Fue un estudio basado en el sistema de vigilancia, para el cual se analizaron datos de un total de 23.646 pacientes sospechosos en las regiones de Riad y Al Qassim desde enero de 2017 hasta diciembre de 2017 para estimar la prevalencia de MERS-CoV entre los casos sospechosos y determinar posibles factores de riesgo demográfico relacionados con la confirmación del diagnóstico. RESULTADOS: De 23.646 casos sospechosos, 119 (0,5%) fueron confirmados por resultados de laboratorio. Estos casos confirmado Alrededor del 42,2% de los casos confirmados tenían entre 41 y 60 años de edad y alrededor del 47% de los casos confirmados fueron analizados en verano. El estudio identificó tres predictores significativos e independientes para la confirmación de la enfermedad: una edad entre 41 y 60 años, sexo masculino y admisión en temporada estival. CONCLUSIÓN: El estudio proporciona evidencia de que la epidemia de MERS-CoV en las regiones del sujeto tiene características específicas que podrían ayudar a los planes futuros para la prevención y el manejo de tal enfermedad contagiosa. Los estudios futuros deben tener como objetivo confirmar tales hallazgos en otras regiones de Arabia Saudita y explorar factores de riesgo potenciales prevenibles. Texto: Una enfermedad viral respiratoria causada por el Síndrome Respiratorio de Oriente Medio CoronaVirus (MERS-CoV) se aisó por primera vez en 2012, en un hombre de 60 años que murió en Yeddah, KSA debido a neumonía aguda grave e insuficiencia orgánica múltiple Desde entonces, 27 países han reportado la presencia de este virus, incluyendo los 12 países de la región del Mediterráneo Oriental. Se han producido varios brotes en varios países incluyendo Arabia Saudita, Emiratos Árabes Unidos y la República de Corea [2]. Tasa de mortalidad reciente (CFR) del 21% [5, 6]. Existen pruebas muy limitadas para explorar la epidemiología de este virus entre la población pediátrica [7]. La literatura muestra que el MERS-CoV infecta a los hombres más que a las mujeres [8, 9]. La tasa de mortalidad de los hombres (52%) es más alta que la de las mujeres (23%) [10]. Los hombres con antecedentes de enfermedades graves son altamente susceptibles a esta infección. Además, la edad media de infección en adultos es de 60 años [10]. El modo de transmisión aún no se ha entendido completamente [2] ; sin embargo, las fuentes de transmisión humanas a humanas [11] y zoonóticas [12] han sido documentadas en muchos estudios. Los camellos dromedarios son la principal fuente animal de transmisión del MERS-CoV a los seres humanos. La transmisión interhumana del virus no se produjo fácilmente, pero se observa principalmente en las familias de los pacientes y en los entornos de salud [2]. Las imágenes clínicas de esta infección variaron de síntomas respiratorios asintomáticos a leves a dificultad respiratoria grave y muerte [2]. La enfermedad grave a menudo puede causar catástrofes respiratorias que necesitan ventilación mecánica y apoyo en UCI en diferentes entornos de salud [4]. Los estudios han sugerido un período de incubación de 16 días con una media de 5-6 días [12, 13], mientras que el tiempo medio hasta la muerte es de 11-13 días (rango 5-27 días) entre pacientes La prueba estándar de oro para la detección de este virus es la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa en tiempo real (rRT-PCR) [14]. En la actualidad, no existe ninguna vacuna para prevenir las infecciones de MERS-CoV. Los CDC indicaron que se deben tomar medidas preventivas para cualquier tipo de enfermedad respiratoria [4]. Estas acciones incluyen lavarse las manos con agua y jabón durante unos 20 segundos o usar desinfectantes de manos con alcohol si no hay agua. Hay que cubrir la nariz y la boca durante los casos de estornudos y tos con un tejido y evitar tocar la boca, la nariz o los ojos con las manos correctamente lavadas. También se debe evitar el contacto personal íntimo, por ejemplo, besar y compartir tazas o utensilios de comer [15]. Muchos estudios se han realizado en los últimos años en Arabia Saudita para combatir esta enfermedad mortal. Un estudio multicéntrico grande mostró que es casi imposible diferenciar entre pacientes de MERS-CoV y no-MERS-CoV sólo sobre la base de la presentación clínica [16]. Otro estudio de cohorte, que fue basado en el hospital (17 casos vs. 82 controles), encontró que había diferencias estadísticamente significativas en términos de género, clínica y presentación radiográfica [17]. Del mismo modo, otros dos estudios de control de casos de un solo centro reportaron que los síntomas de la infección por MERS-CoV no eran específicos [18, 19]. Los médicos y los profesionales de la salud pública necesitan identificar casos sospechosos que tienen mayores probabilidades de diagnóstico como casos confirmados antes de las pruebas de laboratorio (que generalmente La identificación de un caso confirmado es necesaria para implementar estrategias preventivas de lucha contra la propagación de la enfermedad a familiares y trabajadores sanitarios hospitalarios [20]. Los casos sintomáticos leves, que resultan en una PCR positiva, pueden ser aislados en el hogar. Los casos graves a moderados deben ser ingresados y aislados en un hospital hasta que mejoren y luego ser dados de alta para aislamiento en el hogar durante un período prolongado. Ambos casos leves y graves se vuelven a probar después de 7 días, y la prueba se repite posteriormente después de cada 3 días hasta que se obtenga un resultado negativo [20]. Identificar los casos sospechosos que pueden tener mayores probabilidades de ser diagnosticados como un caso confirmado e implementar procedimientos estrictos sobre ellos podría ofrecer la mejor solución. e desafío es señalar a estos pacientes por algunos marcadores demográficos, ya que la presentación clínica de los pacientes infectados por MERS-CoV no eran específicos. La naturaleza de estos marcadores no ha sido investigada en Arabia Saudita, por lo que este estudio tiene como objetivo identificarlos. Se realizó un estudio transversal en el laboratorio regional y banco de sangre, ubicado en el Hospital Shumaisi de Riad, KSA. El laboratorio ha recibido el Programa de Acreditación de Bancos Centrales de Sangre y Laboratorios de Referencia de la Junta Central Saudita de Acreditación de Institución Sanitaria (CBAHI) 2018 [21]. Técnica. Los datos fueron recolectados durante el período de enero de 2017 a diciembre de 2017. Todos los pacientes de las regiones de Riad y Al-Qassim que hicieron la prueba de muestras en el laboratorio regional de Riad durante el período de estudio fueron considerados como casos sospechosos. El estudio tuvo dos objetivos: descriptivo y analítico. Para el objetivo descriptivo, estimamos la prevalencia de MERS-CoV. Para el objetivo analítico, se desarrolló un modelo de regresión logística binaria. En este modelo Los datos se cotejaron con una base de datos computarizada de laboratorio, se recolectaron datos adicionales sobre características demográficas (edad y sexo), nacionalidad subyacente y estado de salud. Se recolectaron datos de 25.400 casos, de los cuales 23.646 casos sospechosos de MERS-CoV fueron incluidos en el análisis final. Los datos fueron limpiados, ingresados, almacenados y administrados con una base de datos Excel y IBM SPSS Versión 25. e análisis estadísticos consistieron en recuentos y porcentajes descriptivos. Para aquellos ítems en escala continua, se utilizaron estadísticas no paramétricas (medianos, rangos intercuartiles, mínimo y máximo) para describir la distribución. Se utilizó un análisis de regresión logística para identificar predictores de confirmación de infección dentro de los grupos de casos sospechosos. En primer lugar, se realizaron análisis univariados para estimar la contribución no ajustada y determinar los factores de riesgo significativos. Para determinar los factores significativos, se consideró un valor de p por debajo de 0,05 y un intervalo de confianza del 95%. Se definió un caso confirmado como un caso sospechoso con confirmación de laboratorio de infección por MERS-CoV [20]. En este estudio se incluyeron un total de 23.646 casos sospechosos de MERS-CoV, de los cuales el 52,3% eran varones (n 12376) y el 47,7% eran mujeres (n 11270). 23 e Las probabilidades ajustadas de MERS-CoV se mantuvieron significativas entre los diferentes grupos de edad; las probabilidades de pacientes de entre 20 y 40 años aumentaron tres veces (A.OR: 3,11, IC 95%: 1,104-8,76, valor P 0,032), mientras que en el grupo de edad de 41 a 60 años aumentó aún más hasta alcanzar un riesgo seis veces mayor es el estudio transversal sobre el análisis epidemiológico de los datos de laboratorio basados en la infección por MERS-CoV se realizó en Riad durante un período de un año (2017). En los resultados se incluyeron un total de 23.646 casos sospechosos. Del total de casos sospechosos, 119 casos habían sido confirmados a través de resultados de laboratorio. Todos los casos confirmados se reportan al MOH a través de HESN (redes de vigilancia electrónica de la salud) y a la Organización Mundial de la Salud (OMS) a través del Reglamento Sanitario Internacional (IHR Se encontró que la infección por MERS-CoV fue encontrada significativamente en personas entre 41 y 60 años de edad y fue reportada con mayor frecuencia durante la temporada de verano. Se encontró que las probabilidades de infección entre los hombres fueron dos veces mayores que las de las mujeres con casos sospechosos. Durante el período de estudio, es decir, el año 2017, sólo se reportaron 119 casos confirmados, lo que significa que el número de casos de infección por MERS-CoV ha disminuido en las regiones de Riad y Al-Qassim en comparación con el de los últimos tres años. De 2015 a 2016, hubo una disminución del 25,4%, mientras que de 2016 a 2017 disminuyó un 48,7%, lo que se traduce en una disminución del 50% entre los dos períodos. También se complementan los hallazgos reportados por Da'ar y Ahmed en su artículo [23]. También se observó predominio de la infección en varones en otro estudio pwefed en KSA (2015), que reportó que el porcentaje de casos confirmados entre hombres era del 66%, frente al 34% entre mujeres [24]. Cabe mencionar que Arabia Saudita define las categorías de edad de manera diferente a la OMS (niños: 0-14, adultos: de lo contrario) [20]. Sin embargo, a diferencia de la clasificación utilizada en Arabia Saudita, hemos seguido la clasificación de la OMS de edad para diferenciar entre niños/adolescentes (0 a 19 años) y adultos (20 años o mayores) como se indica en los informes de la OMS para la población estandarizada por edad y en enfermedades infecciosas [25]. es la categorización también fue seguida por Aly y sus colaboradores en su reciente trabajo publicado en 2017 [14]. Los adultos se subcategorizaron en tres grupos según la distribución por edad de la población del estudio utilizando los dos puntos de corte siguientes (edad de 41 años y edad de 60 años) [14]. Estos datos coincidieron con un estudio de vigilancia previo, que indicó que la mayoría de los casos confirmados de MERS-CoV se notificaron entre personas de 40 años y más [24]. En 2016, sólo 9 de 552 casos (1,6%) de infección por MERS-CoV se encontraron entre pacientes pediátricos. Además, el estudio realizado en King Fahad Medical City en Riad (KFMC) entre enero de 2012 y diciembre de 2013 no reportó ningún caso de MERS-CoV entre niños [26]. e estudio realizado en los países del Golfo durante cuatro años por Mahmoud Aly et al. entre 2012 y 2016 sugiere que la prevalencia y distribución de MERS-CoV fue el mayor riesgo en ancianos de 60 Similar a nuestros resultados, este estudio también reportó el mayor número de casos confirmados durante la temporada de verano [14]. Entre los casos confirmados, sólo el 25,2% eran trabajadores de la salud, mientras que alrededor del 75% no eran trabajadores de la salud. está de acuerdo con el estudio realizado por Ahmad para estimar la tasa de supervivencia en el MERS-CoV globalmente antes del 26 de enero de 2017; el 86,9% no eran trabajadores de la salud en comparación con el 13,1% de los casos confirmados de trabajadores de la salud [27]. Del mismo modo, otros estudios también reportaron una menor prevalencia en los trabajadores de la salud [28] [30]. Nuestros datos reportaron una mayor prevalencia de infección entre los nacionales sauditas en comparación con los no sauditas. En nuestro estudio, detectamos una baja prevalencia (0,5%). e bajo valor predictivo positivo de nuestros resultados de laboratorio no está relacionado con la baja sensibilidad y especificidad del ensayo de laboratorio. e se reportó que la sensibilidad analítica estimada y especificidad del kit Real Star de Altona fue 100% sin reactividad cruzada con otros patógenos respiratorios [31]. Además, este bajo valor predictivo en los resultados del laboratorio está relacionado con la alta carga de casos falsos positivos referidos al laboratorio. De hecho, esta investigación es sólo el punto de partida para arrojar luz sobre más factores que podrían ayudar a poner criterios más descriptivos para reducir la carga de recursos financieros y humanos. A nuestro leal saber, nadie ha desarrollado una regresión logística que se centre en factores de riesgo demográfico como sexo, edad y estaciones anteriores a nuestro estudio. Sin embargo, vale la pena mencionar que Ahmed et al. Desarrolló un modelo de predicción de riesgo que abarca factores de riesgo como dolor torácico, leucopenia y elevación de la aspartato aminotransferasa (AST) [21]. Sin embargo, se necesitan más investigaciones para confirmar nuestros hallazgos. Una de las principales fortalezas de nuestro estudio es que se trata de un estudio regional integral que incluyó todos los casos sospechosos de MERS-CoV en las regiones de Riad y Al-Qassim. En segundo lugar, se espera que la validez externa de nuestro estudio también sea alta, ya que abarca las dos regiones completamente, lo que significa que se incluyeron los registros de todos los casos sospechosos en estas dos regiones principales de Arabia Saudita. Además de esto, las políticas de garantía de calidad se implementan en HESN para mantener el más alto nivel de validez y fiabilidad del proceso de recolección de datos. Las variables disponibles para casos sospechosos se limitaron a la demografía, lo que limitó el alcance de nuestra investigación, pero proporcionaron información valiosa para formar una base para futuros estudios de un alcance más amplio. Variables como las infecciones primarias/secundarias son datos vitales, pero debido a la limitación de los datos disponibles, no pudimos determinar sus efectos. Según nuestro conocimiento, este es uno de los pocos estudios que han investigado específicamente los factores de riesgo de MERS-CoV en las áreas de Riad y Al-Qassim (dos regiones principales de KSA). Dado que todos los casos sospechosos y confirmados fueron incluidos en este estudio, suponemos que nuestros resultados son generalizables para ambas regiones con confianza. Cabe señalar que el grupo comparativo de este estudio es diferente al de los anteriores, ya que comparamos aquellos con MERS-CoV confirmados con aquellos con sospecha de MERS-CoV que han pasado todas las etapas de la detección en el hospital, mientras que otros estudios fueron hospitalarios pero no de laboratorio con el objetivo de identificar factores que ayudan a sospechar en lugar de confirmar casos. puede ser la razón por la que hemos encontrado algunos factores demográficos significativos a diferencia de otros informes. En conclusión, esta investigación se trata de predictores para la confirmación del diagnóstico sólo entre los casos sospechosos, lo que significa que los factores que encontramos pueden ayudar a identificar casos sospechosos que pueden tener una mayor probabilidad de pruebas positivas. es ayudar a los profesionales de la atención primaria a desarrollar una mejor herramienta de detección para los casos sospechosos, ya que actualmente sólo una pequeña minoría de casos sospechosos son confirmados positivos a través de los resultados de laboratorio, lo que resulta en una gran cantidad de recursos que e Tres factores que identificamos son importantes porque, por ejemplo, una mujer de 18 años de edad que presente en invierno tendrá menos probabilidades de ser diagnosticada que un hombre de 45 años de edad, que presente en verano, o, para dar otro ejemplo, un hombre de 60 años que presente signos de MERS-CoV con un resultado negativo en el laboratorio, puede necesitar ser sometido a un nuevo análisis. Nuestro estudio abarcó dos regiones principales de Arabia Saudita y proporciona pruebas de que la epidemia de MERS-CoV en estas dos regiones tiene características específicas que podrían ayudar a los planes futuros para la prevención y el tratamiento de estas enfermedades contagiosas. Nuestros resultados mostraron que sólo una minoría de los casos sospechosos son diagnosticados realmente con la enfermedad, lo que significa que los procedimientos que se están implementando parecen ser muy sensibles pero no muy específicos. e la mayoría de los casos confirmados eran hombres, de 41 a 60 años de edad, y presentados a los centros de salud en el Los futuros estudios deben tener como objetivo confirmar estos hallazgos en otras regiones de Arabia Saudita, explorar posibles factores de riesgo prevenibles y profundizar en los factores subyacentes que hacen que los hombres de 41 a 60 años sean más susceptibles que otros. Los datos de laboratorio utilizados para apoyar los hallazgos de este estudio fueron proporcionados por el Laboratorio Regional de Riad bajo licencia y no están disponibles libremente. Sin embargo, el acceso a los datos será considerado por el autor correspondiente a petición. Los autores declaran que no tienen intereses competidores.

¿Cuál es la tasa de mortalidad por MERS Coronavirus?

Variaciones demográficas de la infección por MERS-CoV entre casos sospechosos y confirmados: Análisis epidemiológico de los datos de laboratorio del laboratorio regional de Riadhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7049846/SHA: edee452881f826fb72c58ee68a982789b12aa99dAutores: Altamimi, Asmaa; Abu-Saris, Raghib; El-Metwally, Ashraf; Alaifan, Taghreed; Alamri, ArefFecha: 2020-02-19DOI: 10.1155/2020/9629747Licencia: cc-byAbstract: Introducción. El síndrome respiratorio del Oriente Medio coronavirus fue reconocido por primera vez en septiembre de 2012 en Arabia Saudita. Las presentaciones clínicas de MERS y SARI no-MERS son a menudo similares. Por lo tanto, la identificación de casos sospechosos que pueden tener mayores probabilidades de ser diagnosticados como casos de MERS-CoV es esencial. Sin embargo, el verdadero reto es señalar a estos pacientes a través de algunos marcadores demográficos. La naturaleza de estos marcadores no ha sido previamente investigada en Arabia Saudita, y por lo tanto, este estudio tiene como objetivo identificarlos. MÉTODOS: Fue un estudio basado en el sistema de vigilancia, para el cual se analizaron datos de un total de 23.646 pacientes sospechosos en las regiones de Riad y Al Qassim desde enero de 2017 hasta diciembre de 2017 para estimar la prevalencia de MERS-CoV entre los casos sospechosos y determinar posibles factores de riesgo demográfico relacionados con la confirmación del diagnóstico. RESULTADOS: De 23.646 casos sospechosos, 119 (0,5%) fueron confirmados por resultados de laboratorio. Estos casos confirmado Alrededor del 42,2% de los casos confirmados tenían entre 41 y 60 años de edad y alrededor del 47% de los casos confirmados fueron analizados en verano. El estudio identificó tres predictores significativos e independientes para la confirmación de la enfermedad: una edad entre 41 y 60 años, sexo masculino y admisión en temporada estival. CONCLUSIÓN: El estudio proporciona evidencia de que la epidemia de MERS-CoV en las regiones del sujeto tiene características específicas que podrían ayudar a los planes futuros para la prevención y el manejo de tal enfermedad contagiosa. Los estudios futuros deben tener como objetivo confirmar tales hallazgos en otras regiones de Arabia Saudita y explorar factores de riesgo potenciales prevenibles. Texto: Una enfermedad viral respiratoria causada por el Síndrome Respiratorio de Oriente Medio CoronaVirus (MERS-CoV) se aisó por primera vez en 2012, en un hombre de 60 años que murió en Yeddah, KSA debido a neumonía aguda grave e insuficiencia orgánica múltiple Desde entonces, 27 países han reportado la presencia de este virus, incluyendo los 12 países de la región del Mediterráneo Oriental. Se han producido varios brotes en varios países incluyendo Arabia Saudita, Emiratos Árabes Unidos y la República de Corea [2]. Tasa de mortalidad reciente (CFR) del 21% [5, 6]. Existen pruebas muy limitadas para explorar la epidemiología de este virus entre la población pediátrica [7]. La literatura muestra que el MERS-CoV infecta a los hombres más que a las mujeres [8, 9]. La tasa de mortalidad de los hombres (52%) es más alta que la de las mujeres (23%) [10]. Los hombres con antecedentes de enfermedades graves son altamente susceptibles a esta infección. Además, la edad media de infección en adultos es de 60 años [10]. El modo de transmisión aún no se ha entendido completamente [2] ; sin embargo, las fuentes de transmisión humanas a humanas [11] y zoonóticas [12] han sido documentadas en muchos estudios. Los camellos dromedarios son la principal fuente animal de transmisión del MERS-CoV a los seres humanos. La transmisión interhumana del virus no se produjo fácilmente, pero se observa principalmente en las familias de los pacientes y en los entornos de salud [2]. Las imágenes clínicas de esta infección variaron de síntomas respiratorios asintomáticos a leves a dificultad respiratoria grave y muerte [2]. La enfermedad grave a menudo puede causar catástrofes respiratorias que necesitan ventilación mecánica y apoyo en UCI en diferentes entornos de salud [4]. Los estudios han sugerido un período de incubación de 16 días con una media de 5-6 días [12, 13], mientras que el tiempo medio hasta la muerte es de 11-13 días (rango 5-27 días) entre pacientes La prueba estándar de oro para la detección de este virus es la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa en tiempo real (rRT-PCR) [14]. En la actualidad, no existe ninguna vacuna para prevenir las infecciones de MERS-CoV. Los CDC indicaron que se deben tomar medidas preventivas para cualquier tipo de enfermedad respiratoria [4]. Estas acciones incluyen lavarse las manos con agua y jabón durante unos 20 segundos o usar desinfectantes de manos con alcohol si no hay agua. Hay que cubrir la nariz y la boca durante los casos de estornudos y tos con un tejido y evitar tocar la boca, la nariz o los ojos con las manos correctamente lavadas. También se debe evitar el contacto personal íntimo, por ejemplo, besar y compartir tazas o utensilios de comer [15]. Muchos estudios se han realizado en los últimos años en Arabia Saudita para combatir esta enfermedad mortal. Un estudio multicéntrico grande mostró que es casi imposible diferenciar entre pacientes de MERS-CoV y no-MERS-CoV sólo sobre la base de la presentación clínica [16]. Otro estudio de cohorte, que fue basado en el hospital (17 casos vs. 82 controles), encontró que había diferencias estadísticamente significativas en términos de género, clínica y presentación radiográfica [17]. Del mismo modo, otros dos estudios de control de casos de un solo centro reportaron que los síntomas de la infección por MERS-CoV no eran específicos [18, 19]. Los médicos y los profesionales de la salud pública necesitan identificar casos sospechosos que tienen mayores probabilidades de diagnóstico como casos confirmados antes de las pruebas de laboratorio (que generalmente La identificación de un caso confirmado es necesaria para implementar estrategias preventivas de lucha contra la propagación de la enfermedad a familiares y trabajadores sanitarios hospitalarios [20]. Los casos sintomáticos leves, que resultan en una PCR positiva, pueden ser aislados en el hogar. Los casos graves a moderados deben ser ingresados y aislados en un hospital hasta que mejoren y luego ser dados de alta para aislamiento en el hogar durante un período prolongado. Ambos casos leves y graves se vuelven a probar después de 7 días, y la prueba se repite posteriormente después de cada 3 días hasta que se obtenga un resultado negativo [20]. Identificar los casos sospechosos que pueden tener mayores probabilidades de ser diagnosticados como un caso confirmado e implementar procedimientos estrictos sobre ellos podría ofrecer la mejor solución. e desafío es señalar a estos pacientes por algunos marcadores demográficos, ya que la presentación clínica de los pacientes infectados por MERS-CoV no eran específicos. La naturaleza de estos marcadores no ha sido investigada en Arabia Saudita, por lo que este estudio tiene como objetivo identificarlos. Se realizó un estudio transversal en el laboratorio regional y banco de sangre, ubicado en el Hospital Shumaisi de Riad, KSA. El laboratorio ha recibido el Programa de Acreditación de Bancos Centrales de Sangre y Laboratorios de Referencia de la Junta Central Saudita de Acreditación de Institución Sanitaria (CBAHI) 2018 [21]. Técnica. Los datos fueron recolectados durante el período de enero de 2017 a diciembre de 2017. Todos los pacientes de las regiones de Riad y Al-Qassim que hicieron la prueba de muestras en el laboratorio regional de Riad durante el período de estudio fueron considerados como casos sospechosos. El estudio tuvo dos objetivos: descriptivo y analítico. Para el objetivo descriptivo, estimamos la prevalencia de MERS-CoV. Para el objetivo analítico, se desarrolló un modelo de regresión logística binaria. En este modelo Los datos se cotejaron con una base de datos computarizada de laboratorio, se recolectaron datos adicionales sobre características demográficas (edad y sexo), nacionalidad subyacente y estado de salud. Se recolectaron datos de 25.400 casos, de los cuales 23.646 casos sospechosos de MERS-CoV fueron incluidos en el análisis final. Los datos fueron limpiados, ingresados, almacenados y administrados con una base de datos Excel y IBM SPSS Versión 25. e análisis estadísticos consistieron en recuentos y porcentajes descriptivos. Para aquellos ítems en escala continua, se utilizaron estadísticas no paramétricas (medianos, rangos intercuartiles, mínimo y máximo) para describir la distribución. Se utilizó un análisis de regresión logística para identificar predictores de confirmación de infección dentro de los grupos de casos sospechosos. En primer lugar, se realizaron análisis univariados para estimar la contribución no ajustada y determinar los factores de riesgo significativos. Para determinar los factores significativos, se consideró un valor de p por debajo de 0,05 y un intervalo de confianza del 95%. Se definió un caso confirmado como un caso sospechoso con confirmación de laboratorio de infección por MERS-CoV [20]. En este estudio se incluyeron un total de 23.646 casos sospechosos de MERS-CoV, de los cuales el 52,3% eran varones (n 12376) y el 47,7% eran mujeres (n 11270). 23 e Las probabilidades ajustadas de MERS-CoV se mantuvieron significativas entre los diferentes grupos de edad; las probabilidades de pacientes de entre 20 y 40 años aumentaron tres veces (A.OR: 3,11, IC 95%: 1,104-8,76, valor P 0,032), mientras que en el grupo de edad de 41 a 60 años aumentó aún más hasta alcanzar un riesgo seis veces mayor es el estudio transversal sobre el análisis epidemiológico de los datos de laboratorio basados en la infección por MERS-CoV se realizó en Riad durante un período de un año (2017). En los resultados se incluyeron un total de 23.646 casos sospechosos. Del total de casos sospechosos, 119 casos habían sido confirmados a través de resultados de laboratorio. Todos los casos confirmados se reportan al MOH a través de HESN (redes de vigilancia electrónica de la salud) y a la Organización Mundial de la Salud (OMS) a través del Reglamento Sanitario Internacional (IHR Se encontró que la infección por MERS-CoV fue encontrada significativamente en personas entre 41 y 60 años de edad y fue reportada con mayor frecuencia durante la temporada de verano. Se encontró que las probabilidades de infección entre los hombres fueron dos veces mayores que las de las mujeres con casos sospechosos. Durante el período de estudio, es decir, el año 2017, sólo se reportaron 119 casos confirmados, lo que significa que el número de casos de infección por MERS-CoV ha disminuido en las regiones de Riad y Al-Qassim en comparación con el de los últimos tres años. De 2015 a 2016, hubo una disminución del 25,4%, mientras que de 2016 a 2017 disminuyó un 48,7%, lo que se traduce en una disminución del 50% entre los dos períodos. También se complementan los hallazgos reportados por Da'ar y Ahmed en su artículo [23]. También se observó predominio de la infección en varones en otro estudio pwefed en KSA (2015), que reportó que el porcentaje de casos confirmados entre hombres era del 66%, frente al 34% entre mujeres [24]. Cabe mencionar que Arabia Saudita define las categorías de edad de manera diferente a la OMS (niños: 0-14, adultos: de lo contrario) [20]. Sin embargo, a diferencia de la clasificación utilizada en Arabia Saudita, hemos seguido la clasificación de la OMS de edad para diferenciar entre niños/adolescentes (0 a 19 años) y adultos (20 años o mayores) como se indica en los informes de la OMS para la población estandarizada por edad y en enfermedades infecciosas [25]. es la categorización también fue seguida por Aly y sus colaboradores en su reciente trabajo publicado en 2017 [14]. Los adultos se subcategorizaron en tres grupos según la distribución por edad de la población del estudio utilizando los dos puntos de corte siguientes (edad de 41 años y edad de 60 años) [14]. Estos datos coincidieron con un estudio de vigilancia previo, que indicó que la mayoría de los casos confirmados de MERS-CoV se notificaron entre personas de 40 años y más [24]. En 2016, sólo 9 de 552 casos (1,6%) de infección por MERS-CoV se encontraron entre pacientes pediátricos. Además, el estudio realizado en King Fahad Medical City en Riad (KFMC) entre enero de 2012 y diciembre de 2013 no reportó ningún caso de MERS-CoV entre niños [26]. e estudio realizado en los países del Golfo durante cuatro años por Mahmoud Aly et al. entre 2012 y 2016 sugiere que la prevalencia y distribución de MERS-CoV fue el mayor riesgo en ancianos de 60 Similar a nuestros resultados, este estudio también reportó el mayor número de casos confirmados durante la temporada de verano [14]. Entre los casos confirmados, sólo el 25,2% eran trabajadores de la salud, mientras que alrededor del 75% no eran trabajadores de la salud. está de acuerdo con el estudio realizado por Ahmad para estimar la tasa de supervivencia en el MERS-CoV globalmente antes del 26 de enero de 2017; el 86,9% no eran trabajadores de la salud en comparación con el 13,1% de los casos confirmados de trabajadores de la salud [27]. Del mismo modo, otros estudios también reportaron una menor prevalencia en los trabajadores de la salud [28] [30]. Nuestros datos reportaron una mayor prevalencia de infección entre los nacionales sauditas en comparación con los no sauditas. En nuestro estudio, detectamos una baja prevalencia (0,5%). e bajo valor predictivo positivo de nuestros resultados de laboratorio no está relacionado con la baja sensibilidad y especificidad del ensayo de laboratorio. e se reportó que la sensibilidad analítica estimada y especificidad del kit Real Star de Altona fue 100% sin reactividad cruzada con otros patógenos respiratorios [31]. Además, este bajo valor predictivo en los resultados del laboratorio está relacionado con la alta carga de casos falsos positivos referidos al laboratorio. De hecho, esta investigación es sólo el punto de partida para arrojar luz sobre más factores que podrían ayudar a poner criterios más descriptivos para reducir la carga de recursos financieros y humanos. A nuestro leal saber, nadie ha desarrollado una regresión logística que se centre en factores de riesgo demográfico como sexo, edad y estaciones anteriores a nuestro estudio. Sin embargo, vale la pena mencionar que Ahmed et al. Desarrolló un modelo de predicción de riesgo que abarca factores de riesgo como dolor torácico, leucopenia y elevación de la aspartato aminotransferasa (AST) [21]. Sin embargo, se necesitan más investigaciones para confirmar nuestros hallazgos. Una de las principales fortalezas de nuestro estudio es que se trata de un estudio regional integral que incluyó todos los casos sospechosos de MERS-CoV en las regiones de Riad y Al-Qassim. En segundo lugar, se espera que la validez externa de nuestro estudio también sea alta, ya que abarca las dos regiones completamente, lo que significa que se incluyeron los registros de todos los casos sospechosos en estas dos regiones principales de Arabia Saudita. Además de esto, las políticas de garantía de calidad se implementan en HESN para mantener el más alto nivel de validez y fiabilidad del proceso de recolección de datos. Las variables disponibles para casos sospechosos se limitaron a la demografía, lo que limitó el alcance de nuestra investigación, pero proporcionaron información valiosa para formar una base para futuros estudios de un alcance más amplio. Variables como las infecciones primarias/secundarias son datos vitales, pero debido a la limitación de los datos disponibles, no pudimos determinar sus efectos. Según nuestro conocimiento, este es uno de los pocos estudios que han investigado específicamente los factores de riesgo de MERS-CoV en las áreas de Riad y Al-Qassim (dos regiones principales de KSA). Dado que todos los casos sospechosos y confirmados fueron incluidos en este estudio, suponemos que nuestros resultados son generalizables para ambas regiones con confianza. Cabe señalar que el grupo comparativo de este estudio es diferente al de los anteriores, ya que comparamos aquellos con MERS-CoV confirmados con aquellos con sospecha de MERS-CoV que han pasado todas las etapas de la detección en el hospital, mientras que otros estudios fueron hospitalarios pero no de laboratorio con el objetivo de identificar factores que ayudan a sospechar en lugar de confirmar casos. puede ser la razón por la que hemos encontrado algunos factores demográficos significativos a diferencia de otros informes. En conclusión, esta investigación se trata de predictores para la confirmación del diagnóstico sólo entre los casos sospechosos, lo que significa que los factores que encontramos pueden ayudar a identificar casos sospechosos que pueden tener una mayor probabilidad de pruebas positivas. es ayudar a los profesionales de la atención primaria a desarrollar una mejor herramienta de detección para los casos sospechosos, ya que actualmente sólo una pequeña minoría de casos sospechosos son confirmados positivos a través de los resultados de laboratorio, lo que resulta en una gran cantidad de recursos que e Tres factores que identificamos son importantes porque, por ejemplo, una mujer de 18 años de edad que presente en invierno tendrá menos probabilidades de ser diagnosticada que un hombre de 45 años de edad, que presente en verano, o, para dar otro ejemplo, un hombre de 60 años que presente signos de MERS-CoV con un resultado negativo en el laboratorio, puede necesitar ser sometido a un nuevo análisis. Nuestro estudio abarcó dos regiones principales de Arabia Saudita y proporciona pruebas de que la epidemia de MERS-CoV en estas dos regiones tiene características específicas que podrían ayudar a los planes futuros para la prevención y el tratamiento de estas enfermedades contagiosas. Nuestros resultados mostraron que sólo una minoría de los casos sospechosos son diagnosticados realmente con la enfermedad, lo que significa que los procedimientos que se están implementando parecen ser muy sensibles pero no muy específicos. e la mayoría de los casos confirmados eran hombres, de 41 a 60 años de edad, y presentados a los centros de salud en el Los futuros estudios deben tener como objetivo confirmar estos hallazgos en otras regiones de Arabia Saudita, explorar posibles factores de riesgo prevenibles y profundizar en los factores subyacentes que hacen que los hombres de 41 a 60 años sean más susceptibles que otros. Los datos de laboratorio utilizados para apoyar los hallazgos de este estudio fueron proporcionados por el Laboratorio Regional de Riad bajo licencia y no están disponibles libremente. Sin embargo, el acceso a los datos será considerado por el autor correspondiente a petición. Los autores declaran que no tienen intereses competidores.

¿Cuál es el período de incubación para MERS-COV?

Los inhibidores de síntesis de gemcitabina y nucleos(t)ide son fármacos antivirales de amplio espectro que activan la inmunidad innatahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5923505/SHA: f1e1e2511e051195c8327a56d5c311a2dd4ab6b3Autores: Shin, Hye Jin; Kim, Chonsaeng; Cho, SungchanFecha: 2018-04-20DOI: 10.3390/v10040211Licencia: cc-byAbstract: Los análogos de nucleósidos se han identificado con frecuencia como agentes antivirales. En los últimos años, la gemcitabina, un análogo de citidina en uso clínico para el tratamiento de muchos tumores sólidos, también ha demostrado tener actividad antivir Los análogos de los nucleósidos generalmente interfieren con las vías de síntesis de los nucleos(t)ides celulares, resultando en el agotamiento o desequilibrio de los grupos de (d)NTP. Intriguyentemente, algunos informes recientes han demostrado que algunos análogos de los nucleósidos, incluyendo la gemcitabina, activaron la inmunidad innata, induciendo la expresión de genes estimulados por interferón, a través de la inhibición de la síntesis de nucleos(t)ide. Queda por determinar la relación precisa entre estos dos procesos independientes. Sin embargo, resumimos el conocimiento actual de la inmunidad innata relacionada con la inhibición de la síntesis de nucleos(t)ides y lo proponemos como un mecanismo antiviral emergente de análogos de los nucleósidos. Texto: Los análogos de los nucleósidos se han utilizado históricamente para la quimioterapia anticancerosa porque inhiben Más recientemente, los análogos de nucleósidos han ampliado sus aplicaciones terapéuticas y se están utilizando para desarrollar fármacos antivirales contra una amplia gama de virus graves y potencialmente mortales. Algunos fármacos análogos de nucleósidos dirigidos a polimerasas virales específicas (aciclovir para el herpesvirus, zidovudina para el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y sofosbuvir para el virus de la hepatitis C (VHC)) han tenido éxito en ensayos clínicos [2] [3] [4] [5] y actualmente se utilizan para el tratamiento de pacientes infectados por virus. Otra clase de fármacos análogos de nucleósidos como la ribavirina, que actúa más ampliamente en varios virus, se ha utilizado en conjunción con IFN-α [6]. Es importante destacar que estudios extensos sobre la acción antiviral de la ribavirina han establecido el marco molecular subyacente de análogos de nucleósidos. El mecanismo principal para explicar el efecto antiviral de Los análogos nucleótidos son transportados a las células y fosforilados por la acción consecutiva de las quinasas virales o celulares, generando finalmente trifosfatos de nucleótidos. Los análogos nucleótidos maduros, que son similares a los nucleótidos fisiológicos, pueden incorporarse directamente al genoma viral en crecimiento durante la polimerización, resultando en la terminación de la reacción en cadena o la acumulación de mutaciones (Figura 1 ). Alternativamente, los análogos nucleótidos pueden unirse a la región de unión de nucleótidos en las polimerasas virales y bloquear la entrada de nucleótidos naturales entrantes. El otro mecanismo se basa en la modulación de la síntesis de nucleos(t)ides celulares. Se han acumulado informes de que los análogos nucleótidos actúan como agentes antivirales interfiriendo con vías de síntesis Apuntando a las enzimas metabólicas, los análogos de nucleósidos bloquean el flujo natural de síntesis de nucleos(t)ide y, en consecuencia, causan el agotamiento o desequilibrio de los grupos de (d)NTP. Como la replicación viral depende en gran medida de la disponibilidad de nucleótidos de huésped, una condición nucleótida-defectiva disminuye la eficiencia de la replicación viral. Un mecanismo propuesto más recientemente se ha basado en las observaciones de que algunos análogos de nucleósidos activan la inmunidad innata, especialmente en la regulación de genes estimulados por interferón (ISGs). Es importante destacar que este fenómeno suele mediarse por la inhibición de la síntesis de nucleótidos, lo que sugiere una posible interacción entre la biosíntesis de nucleótidos y la inmunidad innata. En la presente revisión, nos centramos más en la gemcitabina como un análogo nucleósido, que es clínicamente relevante y cuya actividad antiviral de amplio espectro ha sido reportada recientemente por muchos grupos, incluyendo nuestro grupo. Lo más importante, resumimos inhibidores de las vías de biosíntesis purina/pirimidina que inducen la inmunidad innata y proponen posibles mecanismos de acción para estos inhibidores. pueden incorporarse directamente al genoma viral en crecimiento durante la polimerización, resultando en la terminación de la reacción en cadena o la acumulación de mutaciones (Figura 1 ). Alternativamente, los análogos nucleótidos pueden unirse a la región de unión nucleótida sobre polimerasas virales y bloquear la entrada de nucleótidos naturales entrantes. El otro mecanismo se basa en la modulación de la síntesis de nucleosida celular. Se han acumulado informes de que los análogos de los nucleósidos actúan como agentes antivirales interfiriendo con las vías de síntesis de los nucleos(t)ides del huésped [7] [8] [9] [10]. Al dirigirse a las enzimas metabólicas, los análogos de los nucleósidos bloquean el flujo natural de la síntesis de los nucleos(t)ides y, en consecuencia, causan el agotamiento o desequilibrio de los grupos de (d)NTP. Como la replicación viral depende en gran medida de la disponibilidad de nucleótidos del huésped, una condición nucleótida-defectiva disminuye la eficiencia de la replicación viral. Un mecanismo más recientemente propuesto se ha basado en las observaciones de que algunos análogos de los nucleósidos activan la inmunidad innata, especialmente la regulación ascendente de los genes estimulados por interferones (ISGs). Sin embargo, el mecanismo preciso de esta conversación cruzada aún no ha sido aclarado. Ahora hay un número creciente de análogos nucleósidos con actividad antiviral hacia una amplia gama de virus. Han sido bien resumidos en un informe anterior [1]. En la presente revisión, nos centramos más en la gemcitabina como análogo nucleósido, que es clínicamente relevante y cuya actividad antiviral de amplio espectro ha sido reportada recientemente por muchos grupos incluyendo nuestro grupo. Más importante aún, resumimos inhibidores de las vías de biosíntesis purina/pirimidina que inducen la inmunidad innata y proponen posibles mecanismos de acción para estos inhibidores. Figura 1. El mecanismo del efecto antiviral de los análogos nucleos(t)ide. Inmunidad innata relacionada con la inhibición de la síntesis de nucleos(t)ide, un mecanismo antiviral emergente de análogos nucleósidos, fue La gemcitabina es un análogo de la citidina que se ha utilizado clínicamente para el tratamiento de varios cánceres [11, 12]. Sin embargo, en los últimos años, la actividad antiviral de la gemcitabina también se ha notificado contra una amplia gama de virus del ARN, incluyendo el síndrome respiratorio de Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV), el síndrome respiratorio agudo grave coronavirus (SARS-CoV), el virus del Zika (ZIKV), el VHC, el poliovirus (PV), el virus de la gripe A (IAV), el VIH y los enterovirus (EV) [13] [14] [15] [16] [17] [18]. Las actividades antivirales de la gemcitabina contra los virus antes mencionados se resumen en la Tabla 1. Para seleccionar eficientemente el fármaco antiviral adecuado Figura 1. El mecanismo del efecto antiviral de los análogos de nucleos(t)ides. La inmunidad innata relacionada con la inhibición de la síntesis de nucleos(t)ides, un mecanismo antiviral emergente de análogos de nucleósidos, fue resaltado por las cajas amarillas. Gemcitabina es un análogo de la citidina que se ha utilizado clínicamente para el tratamiento de varios cánceres [11, 12]. Sin embargo, en los últimos años, la actividad antiviral de la gemcitabina también se ha notificado contra una amplia gama de virus del ARN, incluyendo el síndrome respiratorio del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV), el síndrome respiratorio agudo grave coronavirus (SARS-CoV), el virus del Zika (ZIKV), el VHC, el poliovirus (PV), el virus de la gripe A (IAV), el VIH y los enterovirus (EV) [13] [14] [15] [16] [17] [18]. Las actividades antivirales de la gemcitabina contra los virus mencionados se resumen en la Tabla 1. El MERS-CoV y el SARS-CoV pertenecen a la familia de Coronaviridae y son agentes causantes de enfermedades respiratorias virales graves en los seres humanos. Se examinaron 290 fármacos aprobados por la FDA en células de Vero E6 infectadas por virus e identificaron a la gemcitabina como uno de los fármacos con actividad antiviral contra MERS-CoV y SRAS-CoV (EC 50 de 1,2 μM y 4,9 μM, respectivamente) [13]. Más recientemente, se demostró que la gemcitabina suprimía eficazmente la infección y replicación de ZIKV en células de epitelio de pigmento retiniano humano (RPE), especialmente a concentraciones no citotóxicas (EC 50 de 0,01 μM vs. CC 50 de > 10 μM) [14]. ZIKV, miembro de la familia Flaviviridae, puede infectar a mujeres embarazadas y causar anomalías congénitas como la microcefalia en lactantes, que ha atraído una creciente atención pública, así como una amplia investigación y desarrollo en tratamientos posibles También se encontraron actividades antivirales efectivas de gemcitabina para la replicación del VHC en células Huh-7 y la infección del VIH en células U373-MAGI-CXCR4 CEM, con EC 50 s estimado de 12 nM y 16,3 nM, respectivamente [17, 19], que fueron concentraciones menores que las utilizadas en la terapia contra el cáncer [20]. En el caso del VIH, la combinación de gemcitabina con decitabina, otro análogo nucleósido en uso clínico para la terapia contra el cáncer, redujo sinérgicamente la infectividad del VIH al aumentar la frecuencia de mutación viral [21]. En un estudio de seguimiento, Clouser et al. reportaron además el efecto antiviral de la gemcitabina contra retrovirus relacionado con el VIH, el virus de la leucemia murina (MuLV), in vitro (EC 50 de 1,6 Denisova y otros (EC 50 de 0,068 μM) [16] También probaron si la gemcitabina tenía un efecto antiviral en varios otros virus de diferentes familias y encontraron su fuerte efecto inhibidor sobre el virus Sindbis y el virus herpes simplex-1 (HSV-1) (>2 log reduction in virus titer) pero efectos relativamente débiles sobre el virus forestal Semliki y el ecovirus humano 6, y efectos mínimos sobre el virus Bunyamwera, el virus sarampión (MeV) y el virus vaccinia [16]. El efecto antiviral de la gemcitabina sobre los EVs, realizado inicialmente sobre el Coxsackievirus B3 (CVB3), se encontró en el cribado de medicamentos aprobados por la FDA en células de Vero replicantes de CVB3 por nuestro grupo (EC 50 de 0,4 μM) [18]. Su actividad antiviral de amplio espectro sobre los EVs se identificó además al observar un efecto inhibidor similar sobre el enterovirus 71 (EV71) y los rinovirus humanos (HRVs) (EC 50 s de 1 y 1-5 μM, respectivamente). En el caso de la VFC, el efecto antiviral de la gemcitabina se confirmó además en un modelo de ratón infectado por virus [22]. En este estudio, la administración intranasal de gemcitabina redujo significativamente la carga viral pulmonar y la inflamación al disminuir las citocinas proinflamatorias, incluyendo TNF-α e IL-1β, y el número de linfocitos infiltrantes pulmonares. Más recientemente, Zhang et al. también identificaron a la gemcitabina como el mejor inhibidor anti-PV de una pantalla de fármacos aprobados por la FDA en las células HeLa replicantes de PV (EC 50 de 0,3 μM) [15]. Como se mencionó anteriormente, la acumulación de evidencia ha demostrado definitivamente que la gemcitabina es un inhibidor eficaz de amplio espectro de virus ARN y tiene un potencial terapéutico para el tratamiento de diversas enfermedades asociadas al virus. Además, es posible que la gemcitabina sea eficaz para otros virus ARN no probados. Consecuentemente con esta posibilidad, se ha reportado que la infección de HSV-1, que es un virus de ADN representativo clasificado en la familia Herpesviridae, fue fuertemente afectada por la gemcitabina [16]. La mayoría de los virus mencionados tienen, en el mejor de los casos, fármacos profilácticos o terapéuticos limitados como posibles tratamientos. Esto es especialmente cierto para los virus emergentes o resurgidos que involucran enfermedades graves, como el MERS-CoV, el SARS-CoV y el ZIKV, que son grandes amenazas para la salud pública y que necesitan urgentemente un tratamiento eficaz durante sus etapas tempranas de infección. En este sentido, la repurposición de gemcitabina para el tratamiento de pacientes infectados con estos virus mortales es un enfoque realista. Es importante destacar que ZIKV fue el más afectado por la gemcitabina, con un EC 50 nanomolar bajo, que Incluso para otros virus con un EC 50 relativamente alto, existe una opción para tratar pacientes con una combinación de gemcitabina con otros agentes antivirales. De esta manera, se puede lograr un tratamiento antiviral eficaz mediante la acción sinérgica de dos antivirales con dosis mucho más bajas para cada fármaco, lo que minimiza los efectos secundarios deletéreos cuando se utiliza clínicamente. Como ejemplo, el efecto antiviral sinérgico de gemcitabina en combinación con ribavirina, un fármaco antiviral que actualmente se utiliza contra unos pocos virus ARN, se notificó contra EVs como CVB3 y EV71 [18]. Como se mencionó anteriormente, la combinación de gemcitabina con decitabina suprimió sinérgicamente la infectividad del VIH tanto in vitro como in vivo [17, 21]. Sin embargo, el uso real de gemcitabina en pacientes infectados por virus requiere estudios previos in A pesar de que la mayoría de los datos antivirales provienen de estudios in vitro, dos estudios recientes han reportado los efectos antivirales de la gemcitabina en modelos murinos [17, 22]. Un análisis más extenso de la gemcitabina en modelos animales en un futuro próximo acelerará sus aplicaciones terapéuticas en ensayos clínicos. La mayoría de los estudios sobre la actividad antiviral de la gemcitabina carecen de evidencia experimental del modo de acción. Sin embargo, nuestro grupo ha reportado recientemente que la gemcitabina tuvo un efecto anti-EV al enfocar la vía de rescate de la biosíntesis de pirimidina [23]. Además, la gemcitabina indujo fuertemente la expresión de varios ISGs incluyendo CXCL10, IRF7, IRF9, IFIT1 y DDX58, que fueron los principales agentes en la inmunidad innata que defendió al huésped contra la infección Estos resultados fueron consistentes con un informe anterior según el cual la gemcitabina estimuló la producción de IFN-β e IFN-γ en células RPE infectadas por el VAI [16]. Es importante destacar que la activación de los ISG estaba bien relacionada con la inhibición de la biosíntesis de pirimidina, lo que sugiere un vínculo entre la biosíntesis de pirimidina y la inmunidad innata. Fenómenos similares en términos de activación del ISG se han notificado previamente con unos pocos compuestos de varios inhibidores de la biosíntesis de purina o pirimidina que tenían actividad antiviral, como se resume en el cuadro 2 [6, 10, [23] [25] [26] [28] [30] [32] [33] [35] [36] [38] [39] [40] [41] [42]. Con respecto a los inhibidores de la biosíntesis purina, la ribavirina y el ácido micofenolico (MPA) son inhibidores de la inosina-5-monofosfato (IMP) deshidrogenasa (IMPDH), que es una enzima clave de la vía de la biosíntesis purina. Estos inhibidores se han utilizado con éxito como agentes antivirales clínicos o inmunosupresores durante décadas. Ambos tienen actividades antivirales contra virus como el VHC, el virus de la hepatitis E (VHE), el MERS-CoV, el virus del dengue, la fiebre amarilla, el virus de la hepatitis B, el virus del Nilo Occidental (WNV), el virus de Chikungunya (CHIKV) y el IAV [24] [26] [27] [29] [30], principalmente a través de la inhibición de la biosín Para la actividad antiviral de ribavirina frente al VHC, la ribavirina indujo específicamente la expresión de ARNm IRF7, IRF9 e ISG15, que se sabe que son importantes para las respuestas inmunitarias anti-VHC [6]. La activación ISG se produjo a través de un mecanismo indefinido que fue diferente de la clásica señalización de IFN, vía de detección intracelular dsRNA, vías de receptor tipo peaje y de factor B nuclear. Lo más importante, la activación ISG inducida por ribavirina y la actividad antiviral fueron suprimidas utilizando guanosina suplementada, un análogo natural de ribavirina, sugiriendo la activación ISG mediada por inhibición de IMPDH como una vía de inmunidad innata alternativa. Al igual que la ribavirina, el MPA indujo notablemente la expresión de varios ISG, incluyendo IRF1, IRF9, ISG15, IFI6, IRF7, CXCL10, IFIT2 e IFITM3 mRNA en células Huh-7 ingenuas o infectadas por el VHE, y la inducción de ISG fue al menos parcialmente abrogada por el uso de guanosina suplementada [10]. Mecanicamente, la inducción de ISG por MPA fue independiente del sistema clásico JAK/STAT, similar a la observada con ribavirina [30]. Resultados similares se obtuvieron con varios inhibidores IMPDH1 o IMPDH2, con diversas afinidades, que fueron diseñados a medida y sintetizados [10]. Como se muestra en la Tabla 2, la mayoría de los inhibidores de la biosíntesis de pirimidina se dirigen a la dihidroorato deshidrogenasa (DHODH), una enzima esencial en la síntesis de la pirimidina de novo. Lucas-Hourani et al. identificaron a DD264 como un componente de respuesta sensible al interferón (ISRE) estimulado por la detección de alto rendimiento, y otros análisis sugirieron que era un inhibidor de la DHODH con una fuerte actividad antiviral contra varios virus, incluyendo MeV, CHIKV y WNV [37]. El DD264 realzó la expresión de varios ISG, que fueron suprimidos casi completamente por la adición de uridina suplementada, lo que indica la activación del ISG mediada por inhibición del DHODH. Además, la actividad antiviral y la activación del DD264 por el ISG requerían el factor de transcripción del interferón 1 (IRF1), un regulador maestro de la expresión génica antiviral [37], que era consistente con la observación de que la actividad anti-VHC del MPA fue mediada parcialmente por el IRF1 [30]. En este estudio, se mostraron resultados similares con el brequinar, otro inhibidor DHODH bien conocido. FA-613 es también un compuesto antiviral, que inhibe la vía de la biosíntesis de la pirimidina, probablemente a través de la focalización del DHODH e induce la expresión de los ISG como IFNB1, CXCL10, ISG15 y CCL5 [38]. Sin embargo, queda por determinar si la activación del ISG está mediada por la inhibición de la biosíntesis de la pirimidina El mecanismo de activación del ISG inducido por el inhibidor de la síntesis de nucleótidos todavía no está claro. Sin embargo, se ha acumulado evidencia que demuestra que la activación del ISG inducido por el inhibidor de la síntesis de nucleótidos es independiente de la señal IFN mediada por JAK/STAT clásica [6, 10, 23]. Primero, Wang et al. mostraron claramente que la activación del ISG y la actividad anti-HEV inducida por MPA o brequinar no fue mediada por JAK [10]. Segundo, la inducción del IRF7 por ribavirina no se vio afectada por la caída de STAT1, mientras que la de IFN-α se vio fuertemente afectada bajo las mismas condiciones [6]. Tercero, nuestro estudio reciente con gemcitabina confirmó además la activación del ISG independiente de la señal IFN mediante estudios paralelos que comparaban los efectos de gemcitabina e IFN-α En nuestro estudio, la fosforilación de STAT1 en Tyr701, que se desencadenó dramáticamente por IFN-α, no se produjo cuando se trató con gemcitabina [23]. Además, la regulación ascendente de DDX58 mRNAs inducida por gemcitabina no se vio afectada por el derribo de IRF9, lo que fue contrario al resultado de que la regulación ascendente inducida por IFN-α de DDX58 mRNAs fue suprimida significativamente bajo las mismas condiciones. De acuerdo con las observaciones anteriores, ha habido algunos informes de que los ISGs fueron inducidos en ausencia de activación JAK1 o STAT1 [43, 44]. A pesar de los datos limitados, especulamos el escenario de activación ISG que es independiente de la señal IPN mediada por JAK/STAT. Los inhibidores de la biosíntesis de purina o pirimidina podrían interferir con la vía metabólica a través de la focalización de algunas enzimas clave como IMPDH y DHODH, llevando al agotamiento o desequilibrio del grupo (d)NTP. La inactivación de las propias enzimas metabólicas o, en consecuencia, de los nucleos(t)ides alterados podría desencadenar una señal, que finalmente se entrega a ciertos elementos cis-actuantes en el promotor de un subconjunto de ISGs, posiblemente a través del relé de cinasas y factores de transcripción. Basándose en los informes mencionados anteriormente, esta señal es menos probable que dependa de STAT1/2-IRF9 (factor genético estimulado por IFN 3; ISGF3), al menos para la gemcitabina, que es el mayor complejo transcripcional de la vía JAK/STAT inducida por IFN. También debe considerarse que A pesar del consenso en la activación del ISG, cada inhibidor de la biosíntesis de la purina/pirimidina parece inducir distintos grupos de ISG, al menos con diferentes patrones [10]. La selección de una enzima en la que las vías (síntesis de la purina o de la pirimidina) o los pasos (pronto/tarde y de novo/salvaje) producen diferentes niveles de intermedios y nucleos(t)ides dará como resultado diversos resultados de las activaciones del ISG. Podría haber más de una vía de señalización involucrada. La actividad antiviral sinérgica de la gemcitabina y la ribavirina observada en nuestro estudio podría explicarse por la posible existencia de dos vías de señalización separadas que median cada inhibición de la síntesis de nucleótidos hacia la activación de la ISG. Los análisis sistemáticos de las quinasas de señalización, los IRF y los STATs utilizando el derribo de siRNA y/o la inhibición farmacológica y los análisis metabólicos de los intermediarios y nucleos(t)ides correspondientes deberían aclarar los mecanismos moleculares subyacentes de la activación de la ISG por inhibidores de la biosíntesis de purina/pirimidina. En este sentido, los análogos nucleósidos que se dirigen directamente a la polimerasa ARN viral dependiente de ARN y presentan una alta barrera al desarrollo de virus resistentes se han considerado ventajosos. Además, el reciente descubrimiento de un nuevo modo antiviral de análogos nucleósidos que actúan a través de la inmunidad innata fortalece la base molecular para su aplicación terapéutica como fármacos antivirales de amplio espectro. Los análogos nucleósidos probablemente inducen diferentes subconjuntos de ISGs, al menos con un patrón diferente, que conducen a varias combinaciones de ISGs y resultados antivirales resultantes. Además, según Schoggins et al., diferentes virus se ven afectados por subconjuntos distintos de ISGs y algunos ISGs como IRF1, MB21D1, HPSE, DDX58, MDA e IFITM3 actúan ampliamente sobre varios virus [45]. Por lo tanto, se requieren análisis más sistemáticos sobre los subconjuntos de GSI inducidos por análogos de nucleósidos antivirales para la identificación de mejores fármacos antivirales que puedan utilizarse de forma amplia o específica. Dados los efectos secundarios clínicos del tratamiento con IFN, los análogos de nucleótidos que difieren de IFN en la activación de subconjuntos de GSI deben considerarse como alternativas. Sin embargo, los análogos de nucleósidos que interfieran con la vía de síntesis de nucleótidos del huésped sugieren posibles efectos secundarios en sus aplicaciones clínicas. Se requiere una evaluación cuidadosa de la seguridad clínica y su aplicación para la medida urgente de pacientes infectados con virus mortales merecería ser considerada principalmente.

¿Qué análogo nucleósido es el foco del estudio actual?

Obesidad y riesgo de infecciones de las vías respiratorias: resultados de un estudio de cohortes basado en infección-diariohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5819164/SHA: ee0c318d282c0089cca94f0b2ea4d90db2ab9f8aAutores: Maccioni, Livia; Weber, Susanne; Elgizouli, Magdeldin; Stoehlker, Anne-Sophie; Geist, Ilona; Peter, Hans-Hartmut; Vach, Werner; Nieters, AlexandraFecha: 2018-02-20DOI: 10.1186/s12889-018172-8Licencia: cc-byAbstract: ANTEGRENTE: Las infecciones de las vías respiratorias (IT El objetivo del estudio fue comprobar si la obesidad (IMC ≥ 30 kg/m(2)) es uno de los factores de riesgo subyacentes a las ITR frecuentes en la población adulta alemana.MÉTODOS: Reclutamos a 1455 individuos entre 18 y 70 años de una encuesta transversal sobre infecciones de las vías respiratorias en Alemania y los invitamos a auto-reportar en diarios incidentes ITR experimentados durante tres temporadas consecutivas de invierno/primavera. Los ITR reportados en estos 18 meses y las medidas de resumen que agregaban ITR individuales fueron los resultados de interés. RESULTADOS: En comparación con individuos con peso normal, los individuos obesos reportaron una frecuencia consistentemente mayor de ITR superiores e inferiores y cayeron predominantemente en el grupo superior 10% de un diario sumando 10 síntomas de ITR diferentes a lo largo del tiempo. La obesidad se asoció tanto con ITR inferiores ((ajustados)OR = 2,02, IC95% = 1,36–3,00) como con ITR superiores ((ajustados)OR = 1,55, IC95% = 1,22–1,96). El ajuste por variables demográficas y de estilo de vida sólo afectó marginalmente a las OR. Los análisis estratificados sugieren una asociación más fuerte para las mujeres y modificaciones de los efectos por actividad deportiva y hábitos dietéticos. CONCLUSIONES: Confirmamos la asociación de la obesidad con la carga de infección y presentamos evidencia para la interacción putativa con la actividad deportiva y los patrones dietéticos. MATERIAL SUPLEMENTO ELECTRÓNICO: La versión en línea de este artículo (10.1186/s12889-018-5172-8) contiene material suplementario, que está disponible para los usuarios autorizados. Texto: Las infecciones respiratorias frecuentes y graves (ITS) constituyen un Los ITR se dividen en ITR superiores (URTI) incluyendo resfriado común, faringitis, otitis, sinusitis, laringotraqueitis, epiglotitis e ITR inferiores (IRL) incluyendo bronquitis, neumonía y bronquiolitis [3]. Se cree que la exposición individual a agentes infecciosos y factores de acogida como el tabaquismo [4, 5] y el estado de vitamina D [6, 7] contribuye a las diferencias observadas en el riesgo de ITR. Además, el papel del sobrepeso (índice de masa corporal (IMC) = 25,0-29,9 kg/m 2 ) y, en particular, la obesidad (IMC ≥ 30 kg/m 2 ) en la predisposición a ITR se discute cada vez más [8] [10] [11] [12] [13]. Este creciente interés está impulsado por el aumento del número de individuos con sobrepeso y obesos en todo el mundo [14] y el conocimiento emergente de desequilibrios inmunológicos notables en relación con la obesidad [15]. La mayoría de los estudios dirigidos a adultos exploraron la asociación de la obesidad con ITR específicas y sus resultados. Así, la obesidad se asoció con rinitis no alérgica [8] y enfermedad similar a la gripe [9]. Además, dos estudios basados en la población que investigaron el papel de la obesidad como factor de riesgo para la neumonía adquirida en la comunidad (CAP) en la población general resultaron en hallazgos controvertidos [10, 11]. Dos estudios recientes basados en la población danesa reportaron un exceso de un amplio espectro de ITR incluyendo neumonía entre las personas obesas [12, 13]. El objetivo general de nuestro estudio dirigido a la población adulta en Baden del Sur, Alemania, es identificar factores de riesgo para la susceptibilidad Aquí presentamos datos sobre el papel de la obesidad como factor que contribuye a una alta carga de ITR en la sociedad alemana y exploramos la modificación de los efectos por género, actividad deportiva y patrones nutricionales. Los participantes del estudio (n = 1455) fueron reclutados a partir del estudio transversal de susceptibilidad de infección de las vías respiratorias (AWIS) consultando la carga de ITR en una población adulta en South-Baden, Alemania [16]. El protocolo del estudio fue aprobado por funcionarios comunitarios y el Comité de Ética de la Universidad de Friburgo (Ref. No. 258/11_120365). Basado en el historial de ITR, los individuos con puntuación de riesgo Putativo bajo, medio y alto de ITR futuros fueron invitados a la subcohorte real. Se pidió a los participantes del estudio que rellenaran un cuestionario adicional (cuestionario de base) sobre factores de estilo de vida y comorbilidades y completaran los diarios mensuales que registraban la ocurrencia mensual y la duración (< 2 semanas, > 2 semanas) de las ITR, a saber, sinusitis, rinitis, otitis media, faringitis/laringitis, amigdalitis, enfermedad pseudogripal, bronquitis, neumonía, pleuresia y otras ITR agudas, desde principios de noviembre hasta finales de abril de tres temporadas: 2012/13, 2013/14 y 2014/15. Además, se preguntó sobre la ingesta de antibióticos, visitas médicas, hospitalización de las ITR y el impacto de los síntomas de las ITR en sus actividades diarias. Para describir la asociación entre obesidad e ITR, se consideraron diferentes indicadores de resultados: resultados a nivel de cada mes ["cualquier ITR", "cualquier ITRUR" (sinusitis, rinitis, otitis media, faringitis/laringitis y amigdalitis), "cualquier ITRL" (bronquitis, neumonía y pleuresia), "≥3 ITR", "cualquier infección de larga duración" (> 2 semanas)]; en el nivel de cada estación invernal ("≥4 meses con infecciones", "≥3 infecciones de larga duración"); y en el nivel individual (es decir, se definen una vez por individuo y abarcan el período de estudio general). Las diez categorías específicas de síntomas de ITR se consideraron con los indicadores binarios de "infección reportada" o "ninguna infección reportada" para cada mes. Al contar los episodios para el indicador de resultado "≥3 infecciones de larga duración", diferentes síntomas de infección fueron contados como episodios separados, incluso si se superponían en el tiempo. Sin embargo, dentro de una categoría de síntomas al menos un mes sin esta infección específica se requirió para llamarlo un nuevo episodio. También se calculó una puntuación mensual de ITR diario, promediando las diez categorías de síntomas de ITR con la codificación "0" para "sin infección reportada", "1" para "infección reportada con duración < 2 semanas" y "2" para "infección reportada presente con duración > 2 semanas". Los valores faltantes para los ítems de infección individuales fueron tratados como cero. Si se reportó un síntoma de ITR individual, pero falta información sobre la duración, se contabilizó como "infección reportada con duración < 2 semanas". Si faltaban todos los ítems, no se calculó la puntuación de diario. El puntaje diario de ITR a nivel mensual se amplió a una puntuación a nivel estacional con un promedio de seis meses (noviembre-abril) de cada temporada, y a una puntuación global a nivel individual con un promedio de todos los meses disponibles. El 10% superior respectivo de estos puntajes diarios dentro de cada mes, temporada y en general sirvió como indicadores de resultados adicionales. Otras variables consideradas en el estudio fueron edad, sexo, peso auto-reportado y altura para el cálculo del IMC (el IMC fue clasificado como < 30 (no-obeso), 25 ≤ IMC < 30 (sobrepeso) y ≥ 30 (obeso)), nivel educativo, contacto con niños, comorbilidades, órganos inmunológicos removidos, estado de tabaquismo, actividad deportiva y patrones de ingesta dietética. Los detalles de estas variables se describen en el archivo adicional 1 y la información complementaria sobre patrones de ingesta dietética se presenta en el Estadísticas descriptivas: Las prevalencias mensuales de los síntomas individuales de ITR se calcularon tomando el promedio de todos los sujetos disponibles cada mes y promediando en los 18 meses cubiertos; las prevalencias en el nivel estacional se calcularon en consecuencia con un promedio de las tres estaciones cubiertas; los intervalos de confianza correspondientes (IC) y valores p se basan en un modelo lineal generalizado con vínculo de identidad y varianza de tipo binomio junto con estimaciones de varianza robusta; la frecuencia de infecciones de larga duración entre todos los meses con infecciones se analizó en consecuencia; sin embargo, debido al número limitado de casos de amigdalitis y otitis media, se determinó la frecuencia mensual de infecciones de larga duración agrupando los datos de todas las estaciones y de neumonía agrupando todos los meses indicados; en el nivel mensual, las OR se calcularon utilizando un modelo de regresión logística con una interceptación aleatoria aplicada a los datos individuales para cada Debido a su pequeña prevalencia, la pleuresía no fue considerada como un único resultado en estos análisis; los resultados a nivel estacional fueron analizados en consecuencia con los datos individuales para cada estación de invierno y teniendo en cuenta las tres estaciones como un covariable categórico; los resultados a nivel individual fueron analizados utilizando un modelo de regresión logística; los resultados son OR y IC 95%; las OR ajustadas se basan en incluir los grupos de edad y la educación como covariables categóricos simultáneos; además, para estudiar la estabilidad de la asociación obesidad-IRT con respecto a potenciales confundadores, las OR fueron ajustadas por variables respectivas; los sujetos con datos covariables incompletos fueron excluidos de los análisis multivariables; la modificación de efecto por una variable binaria fue evaluada mediante el ajuste de un modelo global con las interacciones correspondientes parametrizadas para que pudiéramos leer directamente fuera de los dos subgrupos específicos de Se exploró la modificación de los efectos por actividad deportiva y patrones de nutrición entre los que representan el tercio inferior y superior de las puntuaciones respectivas; la población del estudio fue de 1455 individuos (931 mujeres y 524 hombres) con una edad media de 51,08 años; con base en el IMC calculado a partir del peso y la altura auto-reportados, el 2,1% de la población fue de bajo peso (IMC < 18,5 kg/m 2 ), el 54% tenía un peso normal (18,5 kg/m 2 ≤ IMC < 25 kg/m 2 ), el 31,1% tenía sobrepeso y el 12,8% se consideró obeso (Tabla 1 ); en las mujeres, la distribución fue del 2,8%, el 60,21%, el 25,0% y el 12,1% y en los hombres 0,76%, el 43,1%, el 41,8% y el 14,3%, respectivamente; los participantes del estudio fueron principalmente de En la Tabla 1 y el expediente adicional 4 se reporta información adicional sobre la población del estudio y los diarios completados.Las tasas de ausencia de ítems individuales en los diarios retornados fueron limitadas y oscilaron entre el 1,2% para rinitis y faringitis/laringitis al 2,6% para otras infecciones respiratorias agudas.Los participantes del estudio reportaron rinitis con mayor frecuencia (26,6%), seguida de enfermedad similar a la gripe (11,4%) y faringitis/laringitis (10,5%), mientras que la pleurisía (0,10%) fue raramente experimentada. Cualquier URTI (31,5%) fue más frecuente que cualquier LRTI (7,9%). Aparte de la bronquitis, neumonía y pleurisía de los LRTI, que más hombres que mujeres informaron, todas las otras ITR fueron más frecuentes entre las mujeres (Tabla 2 ). Las infecciones respiratorias con una fracción alta de larga duración fueron casi exclusivamente ITRL, a saber, neumonía (59%), seguidas de bronquitis (48,2%). Los hombres estaban sobrerrepresentados entre aquellos con ITRs de larga duración (Tabla 2). En comparación con los individuos con peso normal, las personas obesas y con sobrepeso sistemáticamente tuvieron una mayor prevalencia (Tabla 3) para los ITRs individuales, URTIs, ITRL, así como los otros parámetros de desenlace que observamos con otras infecciones agudas y neumonía como excepciones. Para la neumonía, sólo los sujetos obesos tenían una mayor prevalencia. El grupo con sobrepeso típicamente estaba cayendo entre los grupos con peso normal y obesidad (Tabla 3). La asociación más fuerte se observó para la neumonía y la bronquitis, por lo que cualquier ITRL fue más fuertemente asociada con obesidad que cualquier ITRRs de larga duración, ITRs frecuentes y Los ajustes por edad y educación sólo modificaron marginalmente estas estimaciones. Entre los sujetos con una infección, las infecciones de larga duración se asociaron nuevamente con obesidad, alcanzando significación para cualquier ITR, rinitis, faringitis/laringitis, enfermedad pseudogripal y bronquitis (Tabla 3). Para una mejor comprensión de la robustez de la relación entre la carga de ITR y obesidad, se exploró el efecto de ajuste para confundadores putativos (Fichero adicional 6). Las variables demográficas y de estilo de vida estudiadas (edad, género, nivel educativo, estado de tabaquismo, contacto con niños, asma, actividad deportiva, patrones dietéticos y extracción previa de órganos inmunes) sólo afectaron marginalmente a las OR. Sin embargo, el ajuste para asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) o una puntuación resumida que abarcaba todas las comorbilidades cuestionadas debilitaron considerablemente El ajuste de los niveles de vitamina D entre aquellos para los que se disponía de suero (n = 508), tuvo sólo un ligero efecto en la magnitud de la asociación entre obesidad y los resultados de ITR. La asociación entre obesidad y los resultados de ITR fue más prominente para las mujeres que para los hombres y alcanzó significación estadística sólo para los primeros (tabla 4 ); para la mayoría de los resultados esta interacción no fue significativa, con la puntuación del diario de nivel individual como excepción. Al considerar la actividad deportiva, para la mayoría de los resultados la asociación con obesidad se limitó a los físicamente más activos y no se observó para los que reportaban poca actividad deportiva (tabla 5). Para todos los resultados la asociación fue menos pronunciada en el último grupo (comparar las proporciones de OR en la tabla 5), diferencia que alcanzó significación para todos los resultados excepto los de baja prevalencia. Típicamente la prevalencia de un resultado sólo aumentó en el pequeño grupo de Del mismo modo, la prevalencia de los resultados se incrementó entre las personas con obesidad y un patrón nutricional más favorable, pero comparable entre los demás grupos (Tabla 6 ). La interacción alcanza significación para la mayoría de los resultados. Las ITR constituyen un factor de morbilidad importante considerando los altos costos de la atención de la salud, el tiempo perdido por el trabajo y la calidad de vida deteriorada entre los afectados recurrentemente [1, 2, 17]. La obesidad pertenece a uno de los factores de riesgo del huésped para las ITR y posiblemente tiene un papel emergente debido al aumento dramático de la prevalencia de obesidad en todo el mundo. En el presente estudio, informamos sobre la asociación de la obesidad con las ITR individuales, así como con un puntaje diario que resume diferentes síntomas de ITR incidente durante un período de 18 meses. Nuestra investigación podría demostrar una asociación entre obesidad e ITR confirmando hallazgos previos sobre enfermedades similares a la gripe [9], bronquitis [18 También se observó una asociación entre obesidad y rinitis, sinusitis y faringitis/laringitis. También se informó de un riesgo elevado de sinusitis entre las mujeres obesas en una cohorte de mujeres danesas basada en la población [13]. Ninguno de los dos estudios basados en la población danesa [12, 13] utilizó OR de prevalencia mensual, pero los coeficientes de riesgo (HRs), ya que podían identificar eventos a diario. La HR de 1,6 [12] para la asociación con ITR y la HR de 1,48 [13] para la asociación con URTIs son, sin embargo, de magnitud similar a las estimaciones de riesgo que observamos. Mecanicamente, la adiposidad excesiva podría pesar la defensa del huésped ya que varios ratones así como estudios humanos han sugerido [19, 20]. Las asociaciones observadas aquí fueron más prominentes para las ITRL en comparación con las URTIs, pero evidentes para ambas, y más pronunciadas al considerar ITRs de larga duración o frecuentes en comparación con los síntomas individuales. Con base en los datos del diario de la infección, se generó una puntuación del diario de ITR que resume los diez síntomas y permite un promedio por mes, por temporada entera o durante todo el período de tres años. Teniendo en cuenta el percentil superior de la distribución de tales puntuaciones como resultado, las asociaciones fueron típicamente más fuertes que cuando se consideraron síntomas únicos, y las interacciones fueron más pronunciadas. Además, los resultados de la puntuación estacional fueron muy similares o incluso más fuertes que los de la puntuación de tres años, argumentando la adecuación para consultar eventos infecciosos de seis meses en futuros estudios para identificar el subgrupo propenso a la infección de la población. Los hábitos de estilo de vida parecen contribuir al Entre ellos, el tabaquismo ha sido reportado como un importante factor de riesgo ambiental para las ITR recurrentes y graves [4, 5]. El contacto frecuente con niños pequeños [21, 22], la deficiencia de vitamina D [23, 24], y la falta de actividad física [25, 26] constituyen otras exposiciones asociadas con riesgos elevados de ITR. Además, los niveles más altos de educación se asociaron con un menor riesgo de CAP [27]. Basándonos en los hallazgos anteriores investigamos su papel como posibles confundadores. La asociación entre obesidad e ITR se mantuvo casi sin cambios después del ajuste por edad, sexo, estado educativo, contacto con niños, estado de tabaquismo, actividad deportiva y puntaje nutricional, sugiriendo que la asociación no está marcadamente confundida por los efectos de estos factores tanto en el IMC como en el riesgo de infecciones. Esto apoya argumentos de que las asociaciones observadas entre obesidad y carga de ITR se deben a diferencias fisiológicas en la respuesta inmune entre individuos obesos y no obesos en lugar de diferencias de estilo de vida. Además, algunas enfermedades crónicas, principalmente asma y EPOC, se asocian a un mayor riesgo de ITR y obesidad [28] [30] [31] [32]. Considerando estas asociaciones investigamos el efecto del asma, EPOC y una comorbilidad scoresummarizando las otras condiciones crónicas en la relación entre obesidad y ITR individuales y la puntuación del diario de ITR. Ajustando para estas condiciones individualmente y aún más de manera combinada resultó en una considerable atenuación de la asociación entre obesidad y los resultados de ITR considerados. Por lo tanto, parte de la asociación entre infecciones y obesidad podría ser explicable por asociaciones de comorbilidades con ambos. Vemos una diferencia de género en las asociaciones observadas En una cohorte danesa de donantes de sangre [12], también se restringió a las mujeres un riesgo significativamente mayor de ITR combinadas. Varias líneas de investigación apoyan esta noción: Szabova et al. e Ilavska et al. reportaron efectos de la obesidad en el sistema inmunitario dependientes del género [33, 34]. El efecto del IMC en una variedad de parámetros inmunes incluyendo aquellos con relevancia para la defensa inmune fue mucho más evidente en mujeres que en hombres [34]. Las células NK (CD3-/CD16+/CD56+), representan células de primera línea para el aclaramiento de células infectadas por virus. Los niveles reducidos de estas células reportados para mujeres obesas, pero no para hombres respectivos, podrían ser la base del efecto de género observado en nuestro estudio. También investigamos una posible modificación del efecto por actividad deportiva y nutrición. Curiosamente, una asociación entre obesidad e ITR fue Por lo tanto, sólo el grupo de personas obesas que participaron en actividades deportivas más intensivas reportaron ITR con más frecuencia, mientras que las personas obesas con baja actividad deportiva y no obesas con baja o alta actividad deportiva mostraron prevalencias comparativas más bajas para la mayoría de los resultados. Hipotetizamos que el estrés oxidativo inducido por la actividad aeróbica vigorosa, así como la actividad deportiva anaerobia, se exacerba en personas con obesidad, pero no en individuos con peso normal. Evidencia que apoya esto se ha publicado previamente [35]. Un estado de estrés oxidativo desequilibrado puede tener consecuencias negativas en el montaje de una respuesta inmune adecuada a los patógenos respiratorios. Especies de oxígeno reactivas excesivas (ROS) se demostró que dificultaban las respuestas de las células T a la infección viral [36] y la acumulación de ROS se detectó en células T con deficiencia de autofagia que las hacían incapaces Aquí indagamos los hábitos dietéticos de los participantes y los clasificamos como adherentes a un patrón dietético más favorable o desfavorable según Winkler et al. [38]. Conscientes de las limitaciones de una evaluación única de una dieta habitual, encontramos una relación más pronunciada entre la obesidad y las infecciones entre personas obesas que reportaron una dieta aparentemente más saludable. Así, de nuevo sólo el grupo de individuos obesos que presumiblemente consumen una dieta más saludable mostró un mayor riesgo de ITR. Se plantea la pregunta de si la mala comunicación de los hábitos dietéticos entre estos individuos con y sin ITR puede explicar el rompecabezas. Se puede imaginar que los individuos obesos pueden tener una mayor percepción de síntomas relacionados con ITR que experimentan la contradicción entre vivir un estilo de vida saludable y ser afectados por exceso de peso e infecciones frecuentes. Por otro lado, los resultados discretos de la población no obesa con respecto a un patrón de dieta favorable y desfavorable podrían Alternativamente, entre el grupo de personas con obesidad puede existir un subgrupo genéticamente definido predisponiendo a ambos, el exceso de peso corporal y propensión a infecciones. Como fortalezas de nuestro estudio contamos 1) su tamaño muestral, permitiendo el análisis de la modificación de los efectos, 2) su diseño prospectivo involucrando 18 meses de diarios de infección para la exploración de la relación entre IMC y posterior frecuencia y severidad de ITR, 3) la información integral sobre estilo de vida y comorbilidades que permiten estudiar la interacción de tales factores sobre su efecto en infecciones, y 4) la amplia gama de indicadores de resultados considerados. La uniformidad de los resultados con respecto a estos resultados también sugiere que en el campo de la morbilidad por infección de las vías respiratorias, los estudios pueden ser comparables a pesar de que a menudo se concentran en diferentes resultados de ITR. En línea con la mayoría de los estudios epidemiológicos en este área de investigación, nuestro estudio sufre de algunas limitaciones, incluyendo la dependencia Sin embargo, encontramos -por ejemplo- un buen acuerdo entre el IMC derivado de los datos de peso y altura auto-reportados y el IMC calculado a partir de los valores medidos disponibles para un subcohorte (n = 508). Además, la clasificación diferencial errónea que sesgaría sustancialmente la relación entre obesidad e ITR es bastante inesperada en este contexto.La selección desproporcionada de mujeres en el estudio puede afectar negativamente a la generalización de algunos de nuestros resultados.

¿Qué condiciones se consideran infecciones de las vías respiratorias superiores?

Obesidad y riesgo de infecciones de las vías respiratorias: resultados de un estudio de cohortes basado en infección-diariohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5819164/SHA: ee0c318d282c0089cca94f0b2ea4d90db2ab9f8aAutores: Maccioni, Livia; Weber, Susanne; Elgizouli, Magdeldin; Stoehlker, Anne-Sophie; Geist, Ilona; Peter, Hans-Hartmut; Vach, Werner; Nieters, AlexandraFecha: 2018-02-20DOI: 10.1186/s12889-018172-8Licencia: cc-byAbstract: ANTEGRENTE: Las infecciones de las vías respiratorias (IT El objetivo del estudio fue comprobar si la obesidad (IMC ≥ 30 kg/m(2)) es uno de los factores de riesgo subyacentes a las ITR frecuentes en la población adulta alemana.MÉTODOS: Reclutamos a 1455 individuos entre 18 y 70 años de una encuesta transversal sobre infecciones de las vías respiratorias en Alemania y los invitamos a auto-reportar en diarios incidentes ITR experimentados durante tres temporadas consecutivas de invierno/primavera. Los ITR reportados en estos 18 meses y las medidas de resumen que agregaban ITR individuales fueron los resultados de interés. RESULTADOS: En comparación con individuos con peso normal, los individuos obesos reportaron una frecuencia consistentemente mayor de ITR superiores e inferiores y cayeron predominantemente en el grupo superior 10% de un diario sumando 10 síntomas de ITR diferentes a lo largo del tiempo. La obesidad se asoció tanto con ITR inferiores ((ajustados)OR = 2,02, IC95% = 1,36–3,00) como con ITR superiores ((ajustados)OR = 1,55, IC95% = 1,22–1,96). El ajuste por variables demográficas y de estilo de vida sólo afectó marginalmente a las OR. Los análisis estratificados sugieren una asociación más fuerte para las mujeres y modificaciones de los efectos por actividad deportiva y hábitos dietéticos. CONCLUSIONES: Confirmamos la asociación de la obesidad con la carga de infección y presentamos evidencia para la interacción putativa con la actividad deportiva y los patrones dietéticos. MATERIAL SUPLEMENTO ELECTRÓNICO: La versión en línea de este artículo (10.1186/s12889-018-5172-8) contiene material suplementario, que está disponible para los usuarios autorizados. Texto: Las infecciones respiratorias frecuentes y graves (ITS) constituyen un Los ITR se dividen en ITR superiores (URTI) incluyendo resfriado común, faringitis, otitis, sinusitis, laringotraqueitis, epiglotitis e ITR inferiores (IRL) incluyendo bronquitis, neumonía y bronquiolitis [3]. Se cree que la exposición individual a agentes infecciosos y factores de acogida como el tabaquismo [4, 5] y el estado de vitamina D [6, 7] contribuye a las diferencias observadas en el riesgo de ITR. Además, el papel del sobrepeso (índice de masa corporal (IMC) = 25,0-29,9 kg/m 2 ) y, en particular, la obesidad (IMC ≥ 30 kg/m 2 ) en la predisposición a ITR se discute cada vez más [8] [10] [11] [12] [13]. Este creciente interés está impulsado por el aumento del número de individuos con sobrepeso y obesos en todo el mundo [14] y el conocimiento emergente de desequilibrios inmunológicos notables en relación con la obesidad [15]. La mayoría de los estudios dirigidos a adultos exploraron la asociación de la obesidad con ITR específicas y sus resultados. Así, la obesidad se asoció con rinitis no alérgica [8] y enfermedad similar a la gripe [9]. Además, dos estudios basados en la población que investigaron el papel de la obesidad como factor de riesgo para la neumonía adquirida en la comunidad (CAP) en la población general resultaron en hallazgos controvertidos [10, 11]. Dos estudios recientes basados en la población danesa reportaron un exceso de un amplio espectro de ITR incluyendo neumonía entre las personas obesas [12, 13]. El objetivo general de nuestro estudio dirigido a la población adulta en Baden del Sur, Alemania, es identificar factores de riesgo para la susceptibilidad Aquí presentamos datos sobre el papel de la obesidad como factor que contribuye a una alta carga de ITR en la sociedad alemana y exploramos la modificación de los efectos por género, actividad deportiva y patrones nutricionales. Los participantes del estudio (n = 1455) fueron reclutados a partir del estudio transversal de susceptibilidad de infección de las vías respiratorias (AWIS) consultando la carga de ITR en una población adulta en South-Baden, Alemania [16]. El protocolo del estudio fue aprobado por funcionarios comunitarios y el Comité de Ética de la Universidad de Friburgo (Ref. No. 258/11_120365). Basado en el historial de ITR, los individuos con puntuación de riesgo Putativo bajo, medio y alto de ITR futuros fueron invitados a la subcohorte real. Se pidió a los participantes del estudio que rellenaran un cuestionario adicional (cuestionario de base) sobre factores de estilo de vida y comorbilidades y completaran los diarios mensuales que registraban la ocurrencia mensual y la duración (< 2 semanas, > 2 semanas) de las ITR, a saber, sinusitis, rinitis, otitis media, faringitis/laringitis, amigdalitis, enfermedad pseudogripal, bronquitis, neumonía, pleuresia y otras ITR agudas, desde principios de noviembre hasta finales de abril de tres temporadas: 2012/13, 2013/14 y 2014/15. Además, se preguntó sobre la ingesta de antibióticos, visitas médicas, hospitalización de las ITR y el impacto de los síntomas de las ITR en sus actividades diarias. Para describir la asociación entre obesidad e ITR, se consideraron diferentes indicadores de resultados: resultados a nivel de cada mes ["cualquier ITR", "cualquier ITRUR" (sinusitis, rinitis, otitis media, faringitis/laringitis y amigdalitis), "cualquier ITRL" (bronquitis, neumonía y pleuresia), "≥3 ITR", "cualquier infección de larga duración" (> 2 semanas)]; en el nivel de cada estación invernal ("≥4 meses con infecciones", "≥3 infecciones de larga duración"); y en el nivel individual (es decir, se definen una vez por individuo y abarcan el período de estudio general). Las diez categorías específicas de síntomas de ITR se consideraron con los indicadores binarios de "infección reportada" o "ninguna infección reportada" para cada mes. Al contar los episodios para el indicador de resultado "≥3 infecciones de larga duración", diferentes síntomas de infección fueron contados como episodios separados, incluso si se superponían en el tiempo. Sin embargo, dentro de una categoría de síntomas al menos un mes sin esta infección específica se requirió para llamarlo un nuevo episodio. También se calculó una puntuación mensual de ITR diario, promediando las diez categorías de síntomas de ITR con la codificación "0" para "sin infección reportada", "1" para "infección reportada con duración < 2 semanas" y "2" para "infección reportada presente con duración > 2 semanas". Los valores faltantes para los ítems de infección individuales fueron tratados como cero. Si se reportó un síntoma de ITR individual, pero falta información sobre la duración, se contabilizó como "infección reportada con duración < 2 semanas". Si faltaban todos los ítems, no se calculó la puntuación de diario. El puntaje diario de ITR a nivel mensual se amplió a una puntuación a nivel estacional con un promedio de seis meses (noviembre-abril) de cada temporada, y a una puntuación global a nivel individual con un promedio de todos los meses disponibles. El 10% superior respectivo de estos puntajes diarios dentro de cada mes, temporada y en general sirvió como indicadores de resultados adicionales. Otras variables consideradas en el estudio fueron edad, sexo, peso auto-reportado y altura para el cálculo del IMC (el IMC fue clasificado como < 30 (no-obeso), 25 ≤ IMC < 30 (sobrepeso) y ≥ 30 (obeso)), nivel educativo, contacto con niños, comorbilidades, órganos inmunológicos removidos, estado de tabaquismo, actividad deportiva y patrones de ingesta dietética. Los detalles de estas variables se describen en el archivo adicional 1 y la información complementaria sobre patrones de ingesta dietética se presenta en el Estadísticas descriptivas: Las prevalencias mensuales de los síntomas individuales de ITR se calcularon tomando el promedio de todos los sujetos disponibles cada mes y promediando en los 18 meses cubiertos; las prevalencias en el nivel estacional se calcularon en consecuencia con un promedio de las tres estaciones cubiertas; los intervalos de confianza correspondientes (IC) y valores p se basan en un modelo lineal generalizado con vínculo de identidad y varianza de tipo binomio junto con estimaciones de varianza robusta; la frecuencia de infecciones de larga duración entre todos los meses con infecciones se analizó en consecuencia; sin embargo, debido al número limitado de casos de amigdalitis y otitis media, se determinó la frecuencia mensual de infecciones de larga duración agrupando los datos de todas las estaciones y de neumonía agrupando todos los meses indicados; en el nivel mensual, las OR se calcularon utilizando un modelo de regresión logística con una interceptación aleatoria aplicada a los datos individuales para cada Debido a su pequeña prevalencia, la pleuresía no fue considerada como un único resultado en estos análisis; los resultados a nivel estacional fueron analizados en consecuencia con los datos individuales para cada estación de invierno y teniendo en cuenta las tres estaciones como un covariable categórico; los resultados a nivel individual fueron analizados utilizando un modelo de regresión logística; los resultados son OR y IC 95%; las OR ajustadas se basan en incluir los grupos de edad y la educación como covariables categóricos simultáneos; además, para estudiar la estabilidad de la asociación obesidad-IRT con respecto a potenciales confundadores, las OR fueron ajustadas por variables respectivas; los sujetos con datos covariables incompletos fueron excluidos de los análisis multivariables; la modificación de efecto por una variable binaria fue evaluada mediante el ajuste de un modelo global con las interacciones correspondientes parametrizadas para que pudiéramos leer directamente fuera de los dos subgrupos específicos de Se exploró la modificación de los efectos por actividad deportiva y patrones de nutrición entre los que representan el tercio inferior y superior de las puntuaciones respectivas; la población del estudio fue de 1455 individuos (931 mujeres y 524 hombres) con una edad media de 51,08 años; con base en el IMC calculado a partir del peso y la altura auto-reportados, el 2,1% de la población fue de bajo peso (IMC < 18,5 kg/m 2 ), el 54% tenía un peso normal (18,5 kg/m 2 ≤ IMC < 25 kg/m 2 ), el 31,1% tenía sobrepeso y el 12,8% se consideró obeso (Tabla 1 ); en las mujeres, la distribución fue del 2,8%, el 60,21%, el 25,0% y el 12,1% y en los hombres 0,76%, el 43,1%, el 41,8% y el 14,3%, respectivamente; los participantes del estudio fueron principalmente de En la Tabla 1 y el expediente adicional 4 se reporta información adicional sobre la población del estudio y los diarios completados.Las tasas de ausencia de ítems individuales en los diarios retornados fueron limitadas y oscilaron entre el 1,2% para rinitis y faringitis/laringitis al 2,6% para otras infecciones respiratorias agudas.Los participantes del estudio reportaron rinitis con mayor frecuencia (26,6%), seguida de enfermedad similar a la gripe (11,4%) y faringitis/laringitis (10,5%), mientras que la pleurisía (0,10%) fue raramente experimentada. Cualquier URTI (31,5%) fue más frecuente que cualquier LRTI (7,9%). Aparte de la bronquitis, neumonía y pleurisía de los LRTI, que más hombres que mujeres informaron, todas las otras ITR fueron más frecuentes entre las mujeres (Tabla 2 ). Las infecciones respiratorias con una fracción alta de larga duración fueron casi exclusivamente ITRL, a saber, neumonía (59%), seguidas de bronquitis (48,2%). Los hombres estaban sobrerrepresentados entre aquellos con ITRs de larga duración (Tabla 2). En comparación con los individuos con peso normal, las personas obesas y con sobrepeso sistemáticamente tuvieron una mayor prevalencia (Tabla 3) para los ITRs individuales, URTIs, ITRL, así como los otros parámetros de desenlace que observamos con otras infecciones agudas y neumonía como excepciones. Para la neumonía, sólo los sujetos obesos tenían una mayor prevalencia. El grupo con sobrepeso típicamente estaba cayendo entre los grupos con peso normal y obesidad (Tabla 3). La asociación más fuerte se observó para la neumonía y la bronquitis, por lo que cualquier ITRL fue más fuertemente asociada con obesidad que cualquier ITRRs de larga duración, ITRs frecuentes y Los ajustes por edad y educación sólo modificaron marginalmente estas estimaciones. Entre los sujetos con una infección, las infecciones de larga duración se asociaron nuevamente con obesidad, alcanzando significación para cualquier ITR, rinitis, faringitis/laringitis, enfermedad pseudogripal y bronquitis (Tabla 3). Para una mejor comprensión de la robustez de la relación entre la carga de ITR y obesidad, se exploró el efecto de ajuste para confundadores putativos (Fichero adicional 6). Las variables demográficas y de estilo de vida estudiadas (edad, género, nivel educativo, estado de tabaquismo, contacto con niños, asma, actividad deportiva, patrones dietéticos y extracción previa de órganos inmunes) sólo afectaron marginalmente a las OR. Sin embargo, el ajuste para asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) o una puntuación resumida que abarcaba todas las comorbilidades cuestionadas debilitaron considerablemente El ajuste de los niveles de vitamina D entre aquellos para los que se disponía de suero (n = 508), tuvo sólo un ligero efecto en la magnitud de la asociación entre obesidad y los resultados de ITR. La asociación entre obesidad y los resultados de ITR fue más prominente para las mujeres que para los hombres y alcanzó significación estadística sólo para los primeros (tabla 4 ); para la mayoría de los resultados esta interacción no fue significativa, con la puntuación del diario de nivel individual como excepción. Al considerar la actividad deportiva, para la mayoría de los resultados la asociación con obesidad se limitó a los físicamente más activos y no se observó para los que reportaban poca actividad deportiva (tabla 5). Para todos los resultados la asociación fue menos pronunciada en el último grupo (comparar las proporciones de OR en la tabla 5), diferencia que alcanzó significación para todos los resultados excepto los de baja prevalencia. Típicamente la prevalencia de un resultado sólo aumentó en el pequeño grupo de Del mismo modo, la prevalencia de los resultados se incrementó entre las personas con obesidad y un patrón nutricional más favorable, pero comparable entre los demás grupos (Tabla 6 ). La interacción alcanza significación para la mayoría de los resultados. Las ITR constituyen un factor de morbilidad importante considerando los altos costos de la atención de la salud, el tiempo perdido por el trabajo y la calidad de vida deteriorada entre los afectados recurrentemente [1, 2, 17]. La obesidad pertenece a uno de los factores de riesgo del huésped para las ITR y posiblemente tiene un papel emergente debido al aumento dramático de la prevalencia de obesidad en todo el mundo. En el presente estudio, informamos sobre la asociación de la obesidad con las ITR individuales, así como con un puntaje diario que resume diferentes síntomas de ITR incidente durante un período de 18 meses. Nuestra investigación podría demostrar una asociación entre obesidad e ITR confirmando hallazgos previos sobre enfermedades similares a la gripe [9], bronquitis [18 También se observó una asociación entre obesidad y rinitis, sinusitis y faringitis/laringitis. También se informó de un riesgo elevado de sinusitis entre las mujeres obesas en una cohorte de mujeres danesas basada en la población [13]. Ninguno de los dos estudios basados en la población danesa [12, 13] utilizó OR de prevalencia mensual, pero los coeficientes de riesgo (HRs), ya que podían identificar eventos a diario. La HR de 1,6 [12] para la asociación con ITR y la HR de 1,48 [13] para la asociación con URTIs son, sin embargo, de magnitud similar a las estimaciones de riesgo que observamos. Mecanicamente, la adiposidad excesiva podría pesar la defensa del huésped ya que varios ratones así como estudios humanos han sugerido [19, 20]. Las asociaciones observadas aquí fueron más prominentes para las ITRL en comparación con las URTIs, pero evidentes para ambas, y más pronunciadas al considerar ITRs de larga duración o frecuentes en comparación con los síntomas individuales. Con base en los datos del diario de la infección, se generó una puntuación del diario de ITR que resume los diez síntomas y permite un promedio por mes, por temporada entera o durante todo el período de tres años. Teniendo en cuenta el percentil superior de la distribución de tales puntuaciones como resultado, las asociaciones fueron típicamente más fuertes que cuando se consideraron síntomas únicos, y las interacciones fueron más pronunciadas. Además, los resultados de la puntuación estacional fueron muy similares o incluso más fuertes que los de la puntuación de tres años, argumentando la adecuación para consultar eventos infecciosos de seis meses en futuros estudios para identificar el subgrupo propenso a la infección de la población. Los hábitos de estilo de vida parecen contribuir al Entre ellos, el tabaquismo ha sido reportado como un importante factor de riesgo ambiental para las ITR recurrentes y graves [4, 5]. El contacto frecuente con niños pequeños [21, 22], la deficiencia de vitamina D [23, 24], y la falta de actividad física [25, 26] constituyen otras exposiciones asociadas con riesgos elevados de ITR. Además, los niveles más altos de educación se asociaron con un menor riesgo de CAP [27]. Basándonos en los hallazgos anteriores investigamos su papel como posibles confundadores. La asociación entre obesidad e ITR se mantuvo casi sin cambios después del ajuste por edad, sexo, estado educativo, contacto con niños, estado de tabaquismo, actividad deportiva y puntaje nutricional, sugiriendo que la asociación no está marcadamente confundida por los efectos de estos factores tanto en el IMC como en el riesgo de infecciones. Esto apoya argumentos de que las asociaciones observadas entre obesidad y carga de ITR se deben a diferencias fisiológicas en la respuesta inmune entre individuos obesos y no obesos en lugar de diferencias de estilo de vida. Además, algunas enfermedades crónicas, principalmente asma y EPOC, se asocian a un mayor riesgo de ITR y obesidad [28] [30] [31] [32]. Considerando estas asociaciones investigamos el efecto del asma, EPOC y una comorbilidad scoresummarizando las otras condiciones crónicas en la relación entre obesidad y ITR individuales y la puntuación del diario de ITR. Ajustando para estas condiciones individualmente y aún más de manera combinada resultó en una considerable atenuación de la asociación entre obesidad y los resultados de ITR considerados. Por lo tanto, parte de la asociación entre infecciones y obesidad podría ser explicable por asociaciones de comorbilidades con ambos. Vemos una diferencia de género en las asociaciones observadas En una cohorte danesa de donantes de sangre [12], también se restringió a las mujeres un riesgo significativamente mayor de ITR combinadas. Varias líneas de investigación apoyan esta noción: Szabova et al. e Ilavska et al. reportaron efectos de la obesidad en el sistema inmunitario dependientes del género [33, 34]. El efecto del IMC en una variedad de parámetros inmunes incluyendo aquellos con relevancia para la defensa inmune fue mucho más evidente en mujeres que en hombres [34]. Las células NK (CD3-/CD16+/CD56+), representan células de primera línea para el aclaramiento de células infectadas por virus. Los niveles reducidos de estas células reportados para mujeres obesas, pero no para hombres respectivos, podrían ser la base del efecto de género observado en nuestro estudio. También investigamos una posible modificación del efecto por actividad deportiva y nutrición. Curiosamente, una asociación entre obesidad e ITR fue Por lo tanto, sólo el grupo de personas obesas que participaron en actividades deportivas más intensivas reportaron ITR con más frecuencia, mientras que las personas obesas con baja actividad deportiva y no obesas con baja o alta actividad deportiva mostraron prevalencias comparativas más bajas para la mayoría de los resultados. Hipotetizamos que el estrés oxidativo inducido por la actividad aeróbica vigorosa, así como la actividad deportiva anaerobia, se exacerba en personas con obesidad, pero no en individuos con peso normal. Evidencia que apoya esto se ha publicado previamente [35]. Un estado de estrés oxidativo desequilibrado puede tener consecuencias negativas en el montaje de una respuesta inmune adecuada a los patógenos respiratorios. Especies de oxígeno reactivas excesivas (ROS) se demostró que dificultaban las respuestas de las células T a la infección viral [36] y la acumulación de ROS se detectó en células T con deficiencia de autofagia que las hacían incapaces Aquí indagamos los hábitos dietéticos de los participantes y los clasificamos como adherentes a un patrón dietético más favorable o desfavorable según Winkler et al. [38]. Conscientes de las limitaciones de una evaluación única de una dieta habitual, encontramos una relación más pronunciada entre la obesidad y las infecciones entre personas obesas que reportaron una dieta aparentemente más saludable. Así, de nuevo sólo el grupo de individuos obesos que presumiblemente consumen una dieta más saludable mostró un mayor riesgo de ITR. Se plantea la pregunta de si la mala comunicación de los hábitos dietéticos entre estos individuos con y sin ITR puede explicar el rompecabezas. Se puede imaginar que los individuos obesos pueden tener una mayor percepción de síntomas relacionados con ITR que experimentan la contradicción entre vivir un estilo de vida saludable y ser afectados por exceso de peso e infecciones frecuentes. Por otro lado, los resultados discretos de la población no obesa con respecto a un patrón de dieta favorable y desfavorable podrían Alternativamente, entre el grupo de personas con obesidad puede existir un subgrupo genéticamente definido predisponiendo a ambos, el exceso de peso corporal y propensión a infecciones. Como fortalezas de nuestro estudio contamos 1) su tamaño muestral, permitiendo el análisis de la modificación de los efectos, 2) su diseño prospectivo involucrando 18 meses de diarios de infección para la exploración de la relación entre IMC y posterior frecuencia y severidad de ITR, 3) la información integral sobre estilo de vida y comorbilidades que permiten estudiar la interacción de tales factores sobre su efecto en infecciones, y 4) la amplia gama de indicadores de resultados considerados. La uniformidad de los resultados con respecto a estos resultados también sugiere que en el campo de la morbilidad por infección de las vías respiratorias, los estudios pueden ser comparables a pesar de que a menudo se concentran en diferentes resultados de ITR. En línea con la mayoría de los estudios epidemiológicos en este área de investigación, nuestro estudio sufre de algunas limitaciones, incluyendo la dependencia Sin embargo, encontramos -por ejemplo- un buen acuerdo entre el IMC derivado de los datos de peso y altura auto-reportados y el IMC calculado a partir de los valores medidos disponibles para un subcohorte (n = 508). Además, la clasificación diferencial errónea que sesgaría sustancialmente la relación entre obesidad e ITR es bastante inesperada en este contexto.La selección desproporcionada de mujeres en el estudio puede afectar negativamente a la generalización de algunos de nuestros resultados.

¿Qué condiciones se consideran infecciones del tracto respiratorio inferior?

Obesidad y riesgo de infecciones de las vías respiratorias: resultados de un estudio de cohortes basado en infección-diariohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5819164/SHA: ee0c318d282c0089cca94f0b2ea4d90db2ab9f8aAutores: Maccioni, Livia; Weber, Susanne; Elgizouli, Magdeldin; Stoehlker, Anne-Sophie; Geist, Ilona; Peter, Hans-Hartmut; Vach, Werner; Nieters, AlexandraFecha: 2018-02-20DOI: 10.1186/s12889-018172-8Licencia: cc-byAbstract: ANTEGRENTE: Las infecciones de las vías respiratorias (IT El objetivo del estudio fue comprobar si la obesidad (IMC ≥ 30 kg/m(2)) es uno de los factores de riesgo subyacentes a las ITR frecuentes en la población adulta alemana.MÉTODOS: Reclutamos a 1455 individuos entre 18 y 70 años de una encuesta transversal sobre infecciones de las vías respiratorias en Alemania y los invitamos a auto-reportar en diarios incidentes ITR experimentados durante tres temporadas consecutivas de invierno/primavera. Los ITR reportados en estos 18 meses y las medidas de resumen que agregaban ITR individuales fueron los resultados de interés. RESULTADOS: En comparación con individuos con peso normal, los individuos obesos reportaron una frecuencia consistentemente mayor de ITR superiores e inferiores y cayeron predominantemente en el grupo superior 10% de un diario sumando 10 síntomas de ITR diferentes a lo largo del tiempo. La obesidad se asoció tanto con ITR inferiores ((ajustados)OR = 2,02, IC95% = 1,36–3,00) como con ITR superiores ((ajustados)OR = 1,55, IC95% = 1,22–1,96). El ajuste por variables demográficas y de estilo de vida sólo afectó marginalmente a las OR. Los análisis estratificados sugieren una asociación más fuerte para las mujeres y modificaciones de los efectos por actividad deportiva y hábitos dietéticos. CONCLUSIONES: Confirmamos la asociación de la obesidad con la carga de infección y presentamos evidencia para la interacción putativa con la actividad deportiva y los patrones dietéticos. MATERIAL SUPLEMENTO ELECTRÓNICO: La versión en línea de este artículo (10.1186/s12889-018-5172-8) contiene material suplementario, que está disponible para los usuarios autorizados. Texto: Las infecciones respiratorias frecuentes y graves (ITS) constituyen un Los ITR se dividen en ITR superiores (URTI) incluyendo resfriado común, faringitis, otitis, sinusitis, laringotraqueitis, epiglotitis e ITR inferiores (IRL) incluyendo bronquitis, neumonía y bronquiolitis [3]. Se cree que la exposición individual a agentes infecciosos y factores de acogida como el tabaquismo [4, 5] y el estado de vitamina D [6, 7] contribuye a las diferencias observadas en el riesgo de ITR. Además, el papel del sobrepeso (índice de masa corporal (IMC) = 25,0-29,9 kg/m 2 ) y, en particular, la obesidad (IMC ≥ 30 kg/m 2 ) en la predisposición a ITR se discute cada vez más [8] [10] [11] [12] [13]. Este creciente interés está impulsado por el aumento del número de individuos con sobrepeso y obesos en todo el mundo [14] y el conocimiento emergente de desequilibrios inmunológicos notables en relación con la obesidad [15]. La mayoría de los estudios dirigidos a adultos exploraron la asociación de la obesidad con ITR específicas y sus resultados. Así, la obesidad se asoció con rinitis no alérgica [8] y enfermedad similar a la gripe [9]. Además, dos estudios basados en la población que investigaron el papel de la obesidad como factor de riesgo para la neumonía adquirida en la comunidad (CAP) en la población general resultaron en hallazgos controvertidos [10, 11]. Dos estudios recientes basados en la población danesa reportaron un exceso de un amplio espectro de ITR incluyendo neumonía entre las personas obesas [12, 13]. El objetivo general de nuestro estudio dirigido a la población adulta en Baden del Sur, Alemania, es identificar factores de riesgo para la susceptibilidad Aquí presentamos datos sobre el papel de la obesidad como factor que contribuye a una alta carga de ITR en la sociedad alemana y exploramos la modificación de los efectos por género, actividad deportiva y patrones nutricionales. Los participantes del estudio (n = 1455) fueron reclutados a partir del estudio transversal de susceptibilidad de infección de las vías respiratorias (AWIS) consultando la carga de ITR en una población adulta en South-Baden, Alemania [16]. El protocolo del estudio fue aprobado por funcionarios comunitarios y el Comité de Ética de la Universidad de Friburgo (Ref. No. 258/11_120365). Basado en el historial de ITR, los individuos con puntuación de riesgo Putativo bajo, medio y alto de ITR futuros fueron invitados a la subcohorte real. Se pidió a los participantes del estudio que rellenaran un cuestionario adicional (cuestionario de base) sobre factores de estilo de vida y comorbilidades y completaran los diarios mensuales que registraban la ocurrencia mensual y la duración (< 2 semanas, > 2 semanas) de las ITR, a saber, sinusitis, rinitis, otitis media, faringitis/laringitis, amigdalitis, enfermedad pseudogripal, bronquitis, neumonía, pleuresia y otras ITR agudas, desde principios de noviembre hasta finales de abril de tres temporadas: 2012/13, 2013/14 y 2014/15. Además, se preguntó sobre la ingesta de antibióticos, visitas médicas, hospitalización de las ITR y el impacto de los síntomas de las ITR en sus actividades diarias. Para describir la asociación entre obesidad e ITR, se consideraron diferentes indicadores de resultados: resultados a nivel de cada mes ["cualquier ITR", "cualquier ITRUR" (sinusitis, rinitis, otitis media, faringitis/laringitis y amigdalitis), "cualquier ITRL" (bronquitis, neumonía y pleuresia), "≥3 ITR", "cualquier infección de larga duración" (> 2 semanas)]; en el nivel de cada estación invernal ("≥4 meses con infecciones", "≥3 infecciones de larga duración"); y en el nivel individual (es decir, se definen una vez por individuo y abarcan el período de estudio general). Las diez categorías específicas de síntomas de ITR se consideraron con los indicadores binarios de "infección reportada" o "ninguna infección reportada" para cada mes. Al contar los episodios para el indicador de resultado "≥3 infecciones de larga duración", diferentes síntomas de infección fueron contados como episodios separados, incluso si se superponían en el tiempo. Sin embargo, dentro de una categoría de síntomas al menos un mes sin esta infección específica se requirió para llamarlo un nuevo episodio. También se calculó una puntuación mensual de ITR diario, promediando las diez categorías de síntomas de ITR con la codificación "0" para "sin infección reportada", "1" para "infección reportada con duración < 2 semanas" y "2" para "infección reportada presente con duración > 2 semanas". Los valores faltantes para los ítems de infección individuales fueron tratados como cero. Si se reportó un síntoma de ITR individual, pero falta información sobre la duración, se contabilizó como "infección reportada con duración < 2 semanas". Si faltaban todos los ítems, no se calculó la puntuación de diario. El puntaje diario de ITR a nivel mensual se amplió a una puntuación a nivel estacional con un promedio de seis meses (noviembre-abril) de cada temporada, y a una puntuación global a nivel individual con un promedio de todos los meses disponibles. El 10% superior respectivo de estos puntajes diarios dentro de cada mes, temporada y en general sirvió como indicadores de resultados adicionales. Otras variables consideradas en el estudio fueron edad, sexo, peso auto-reportado y altura para el cálculo del IMC (el IMC fue clasificado como < 30 (no-obeso), 25 ≤ IMC < 30 (sobrepeso) y ≥ 30 (obeso)), nivel educativo, contacto con niños, comorbilidades, órganos inmunológicos removidos, estado de tabaquismo, actividad deportiva y patrones de ingesta dietética. Los detalles de estas variables se describen en el archivo adicional 1 y la información complementaria sobre patrones de ingesta dietética se presenta en el Estadísticas descriptivas: Las prevalencias mensuales de los síntomas individuales de ITR se calcularon tomando el promedio de todos los sujetos disponibles cada mes y promediando en los 18 meses cubiertos; las prevalencias en el nivel estacional se calcularon en consecuencia con un promedio de las tres estaciones cubiertas; los intervalos de confianza correspondientes (IC) y valores p se basan en un modelo lineal generalizado con vínculo de identidad y varianza de tipo binomio junto con estimaciones de varianza robusta; la frecuencia de infecciones de larga duración entre todos los meses con infecciones se analizó en consecuencia; sin embargo, debido al número limitado de casos de amigdalitis y otitis media, se determinó la frecuencia mensual de infecciones de larga duración agrupando los datos de todas las estaciones y de neumonía agrupando todos los meses indicados; en el nivel mensual, las OR se calcularon utilizando un modelo de regresión logística con una interceptación aleatoria aplicada a los datos individuales para cada Debido a su pequeña prevalencia, la pleuresía no fue considerada como un único resultado en estos análisis; los resultados a nivel estacional fueron analizados en consecuencia con los datos individuales para cada estación de invierno y teniendo en cuenta las tres estaciones como un covariable categórico; los resultados a nivel individual fueron analizados utilizando un modelo de regresión logística; los resultados son OR y IC 95%; las OR ajustadas se basan en incluir los grupos de edad y la educación como covariables categóricos simultáneos; además, para estudiar la estabilidad de la asociación obesidad-IRT con respecto a potenciales confundadores, las OR fueron ajustadas por variables respectivas; los sujetos con datos covariables incompletos fueron excluidos de los análisis multivariables; la modificación de efecto por una variable binaria fue evaluada mediante el ajuste de un modelo global con las interacciones correspondientes parametrizadas para que pudiéramos leer directamente fuera de los dos subgrupos específicos de Se exploró la modificación de los efectos por actividad deportiva y patrones de nutrición entre los que representan el tercio inferior y superior de las puntuaciones respectivas; la población del estudio fue de 1455 individuos (931 mujeres y 524 hombres) con una edad media de 51,08 años; con base en el IMC calculado a partir del peso y la altura auto-reportados, el 2,1% de la población fue de bajo peso (IMC < 18,5 kg/m 2 ), el 54% tenía un peso normal (18,5 kg/m 2 ≤ IMC < 25 kg/m 2 ), el 31,1% tenía sobrepeso y el 12,8% se consideró obeso (Tabla 1 ); en las mujeres, la distribución fue del 2,8%, el 60,21%, el 25,0% y el 12,1% y en los hombres 0,76%, el 43,1%, el 41,8% y el 14,3%, respectivamente; los participantes del estudio fueron principalmente de En la Tabla 1 y el expediente adicional 4 se reporta información adicional sobre la población del estudio y los diarios completados.Las tasas de ausencia de ítems individuales en los diarios retornados fueron limitadas y oscilaron entre el 1,2% para rinitis y faringitis/laringitis al 2,6% para otras infecciones respiratorias agudas.Los participantes del estudio reportaron rinitis con mayor frecuencia (26,6%), seguida de enfermedad similar a la gripe (11,4%) y faringitis/laringitis (10,5%), mientras que la pleurisía (0,10%) fue raramente experimentada. Cualquier URTI (31,5%) fue más frecuente que cualquier LRTI (7,9%). Aparte de la bronquitis, neumonía y pleurisía de los LRTI, que más hombres que mujeres informaron, todas las otras ITR fueron más frecuentes entre las mujeres (Tabla 2 ). Las infecciones respiratorias con una fracción alta de larga duración fueron casi exclusivamente ITRL, a saber, neumonía (59%), seguidas de bronquitis (48,2%). Los hombres estaban sobrerrepresentados entre aquellos con ITRs de larga duración (Tabla 2). En comparación con los individuos con peso normal, las personas obesas y con sobrepeso sistemáticamente tuvieron una mayor prevalencia (Tabla 3) para los ITRs individuales, URTIs, ITRL, así como los otros parámetros de desenlace que observamos con otras infecciones agudas y neumonía como excepciones. Para la neumonía, sólo los sujetos obesos tenían una mayor prevalencia. El grupo con sobrepeso típicamente estaba cayendo entre los grupos con peso normal y obesidad (Tabla 3). La asociación más fuerte se observó para la neumonía y la bronquitis, por lo que cualquier ITRL fue más fuertemente asociada con obesidad que cualquier ITRRs de larga duración, ITRs frecuentes y Los ajustes por edad y educación sólo modificaron marginalmente estas estimaciones. Entre los sujetos con una infección, las infecciones de larga duración se asociaron nuevamente con obesidad, alcanzando significación para cualquier ITR, rinitis, faringitis/laringitis, enfermedad pseudogripal y bronquitis (Tabla 3). Para una mejor comprensión de la robustez de la relación entre la carga de ITR y obesidad, se exploró el efecto de ajuste para confundadores putativos (Fichero adicional 6). Las variables demográficas y de estilo de vida estudiadas (edad, género, nivel educativo, estado de tabaquismo, contacto con niños, asma, actividad deportiva, patrones dietéticos y extracción previa de órganos inmunes) sólo afectaron marginalmente a las OR. Sin embargo, el ajuste para asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) o una puntuación resumida que abarcaba todas las comorbilidades cuestionadas debilitaron considerablemente El ajuste de los niveles de vitamina D entre aquellos para los que se disponía de suero (n = 508), tuvo sólo un ligero efecto en la magnitud de la asociación entre obesidad y los resultados de ITR. La asociación entre obesidad y los resultados de ITR fue más prominente para las mujeres que para los hombres y alcanzó significación estadística sólo para los primeros (tabla 4 ); para la mayoría de los resultados esta interacción no fue significativa, con la puntuación del diario de nivel individual como excepción. Al considerar la actividad deportiva, para la mayoría de los resultados la asociación con obesidad se limitó a los físicamente más activos y no se observó para los que reportaban poca actividad deportiva (tabla 5). Para todos los resultados la asociación fue menos pronunciada en el último grupo (comparar las proporciones de OR en la tabla 5), diferencia que alcanzó significación para todos los resultados excepto los de baja prevalencia. Típicamente la prevalencia de un resultado sólo aumentó en el pequeño grupo de Del mismo modo, la prevalencia de los resultados se incrementó entre las personas con obesidad y un patrón nutricional más favorable, pero comparable entre los demás grupos (Tabla 6 ). La interacción alcanza significación para la mayoría de los resultados. Las ITR constituyen un factor de morbilidad importante considerando los altos costos de la atención de la salud, el tiempo perdido por el trabajo y la calidad de vida deteriorada entre los afectados recurrentemente [1, 2, 17]. La obesidad pertenece a uno de los factores de riesgo del huésped para las ITR y posiblemente tiene un papel emergente debido al aumento dramático de la prevalencia de obesidad en todo el mundo. En el presente estudio, informamos sobre la asociación de la obesidad con las ITR individuales, así como con un puntaje diario que resume diferentes síntomas de ITR incidente durante un período de 18 meses. Nuestra investigación podría demostrar una asociación entre obesidad e ITR confirmando hallazgos previos sobre enfermedades similares a la gripe [9], bronquitis [18 También se observó una asociación entre obesidad y rinitis, sinusitis y faringitis/laringitis. También se informó de un riesgo elevado de sinusitis entre las mujeres obesas en una cohorte de mujeres danesas basada en la población [13]. Ninguno de los dos estudios basados en la población danesa [12, 13] utilizó OR de prevalencia mensual, pero los coeficientes de riesgo (HRs), ya que podían identificar eventos a diario. La HR de 1,6 [12] para la asociación con ITR y la HR de 1,48 [13] para la asociación con URTIs son, sin embargo, de magnitud similar a las estimaciones de riesgo que observamos. Mecanicamente, la adiposidad excesiva podría pesar la defensa del huésped ya que varios ratones así como estudios humanos han sugerido [19, 20]. Las asociaciones observadas aquí fueron más prominentes para las ITRL en comparación con las URTIs, pero evidentes para ambas, y más pronunciadas al considerar ITRs de larga duración o frecuentes en comparación con los síntomas individuales. Con base en los datos del diario de la infección, se generó una puntuación del diario de ITR que resume los diez síntomas y permite un promedio por mes, por temporada entera o durante todo el período de tres años. Teniendo en cuenta el percentil superior de la distribución de tales puntuaciones como resultado, las asociaciones fueron típicamente más fuertes que cuando se consideraron síntomas únicos, y las interacciones fueron más pronunciadas. Además, los resultados de la puntuación estacional fueron muy similares o incluso más fuertes que los de la puntuación de tres años, argumentando la adecuación para consultar eventos infecciosos de seis meses en futuros estudios para identificar el subgrupo propenso a la infección de la población. Los hábitos de estilo de vida parecen contribuir al Entre ellos, el tabaquismo ha sido reportado como un importante factor de riesgo ambiental para las ITR recurrentes y graves [4, 5]. El contacto frecuente con niños pequeños [21, 22], la deficiencia de vitamina D [23, 24], y la falta de actividad física [25, 26] constituyen otras exposiciones asociadas con riesgos elevados de ITR. Además, los niveles más altos de educación se asociaron con un menor riesgo de CAP [27]. Basándonos en los hallazgos anteriores investigamos su papel como posibles confundadores. La asociación entre obesidad e ITR se mantuvo casi sin cambios después del ajuste por edad, sexo, estado educativo, contacto con niños, estado de tabaquismo, actividad deportiva y puntaje nutricional, sugiriendo que la asociación no está marcadamente confundida por los efectos de estos factores tanto en el IMC como en el riesgo de infecciones. Esto apoya argumentos de que las asociaciones observadas entre obesidad y carga de ITR se deben a diferencias fisiológicas en la respuesta inmune entre individuos obesos y no obesos en lugar de diferencias de estilo de vida. Además, algunas enfermedades crónicas, principalmente asma y EPOC, se asocian a un mayor riesgo de ITR y obesidad [28] [30] [31] [32]. Considerando estas asociaciones investigamos el efecto del asma, EPOC y una comorbilidad scoresummarizando las otras condiciones crónicas en la relación entre obesidad y ITR individuales y la puntuación del diario de ITR. Ajustando para estas condiciones individualmente y aún más de manera combinada resultó en una considerable atenuación de la asociación entre obesidad y los resultados de ITR considerados. Por lo tanto, parte de la asociación entre infecciones y obesidad podría ser explicable por asociaciones de comorbilidades con ambos. Vemos una diferencia de género en las asociaciones observadas En una cohorte danesa de donantes de sangre [12], también se restringió a las mujeres un riesgo significativamente mayor de ITR combinadas. Varias líneas de investigación apoyan esta noción: Szabova et al. e Ilavska et al. reportaron efectos de la obesidad en el sistema inmunitario dependientes del género [33, 34]. El efecto del IMC en una variedad de parámetros inmunes incluyendo aquellos con relevancia para la defensa inmune fue mucho más evidente en mujeres que en hombres [34]. Las células NK (CD3-/CD16+/CD56+), representan células de primera línea para el aclaramiento de células infectadas por virus. Los niveles reducidos de estas células reportados para mujeres obesas, pero no para hombres respectivos, podrían ser la base del efecto de género observado en nuestro estudio. También investigamos una posible modificación del efecto por actividad deportiva y nutrición. Curiosamente, una asociación entre obesidad e ITR fue Por lo tanto, sólo el grupo de personas obesas que participaron en actividades deportivas más intensivas reportaron ITR con más frecuencia, mientras que las personas obesas con baja actividad deportiva y no obesas con baja o alta actividad deportiva mostraron prevalencias comparativas más bajas para la mayoría de los resultados. Hipotetizamos que el estrés oxidativo inducido por la actividad aeróbica vigorosa, así como la actividad deportiva anaerobia, se exacerba en personas con obesidad, pero no en individuos con peso normal. Evidencia que apoya esto se ha publicado previamente [35]. Un estado de estrés oxidativo desequilibrado puede tener consecuencias negativas en el montaje de una respuesta inmune adecuada a los patógenos respiratorios. Especies de oxígeno reactivas excesivas (ROS) se demostró que dificultaban las respuestas de las células T a la infección viral [36] y la acumulación de ROS se detectó en células T con deficiencia de autofagia que las hacían incapaces Aquí indagamos los hábitos dietéticos de los participantes y los clasificamos como adherentes a un patrón dietético más favorable o desfavorable según Winkler et al. [38]. Conscientes de las limitaciones de una evaluación única de una dieta habitual, encontramos una relación más pronunciada entre la obesidad y las infecciones entre personas obesas que reportaron una dieta aparentemente más saludable. Así, de nuevo sólo el grupo de individuos obesos que presumiblemente consumen una dieta más saludable mostró un mayor riesgo de ITR. Se plantea la pregunta de si la mala comunicación de los hábitos dietéticos entre estos individuos con y sin ITR puede explicar el rompecabezas. Se puede imaginar que los individuos obesos pueden tener una mayor percepción de síntomas relacionados con ITR que experimentan la contradicción entre vivir un estilo de vida saludable y ser afectados por exceso de peso e infecciones frecuentes. Por otro lado, los resultados discretos de la población no obesa con respecto a un patrón de dieta favorable y desfavorable podrían Alternativamente, entre el grupo de personas con obesidad puede existir un subgrupo genéticamente definido predisponiendo a ambos, el exceso de peso corporal y propensión a infecciones. Como fortalezas de nuestro estudio contamos 1) su tamaño muestral, permitiendo el análisis de la modificación de los efectos, 2) su diseño prospectivo involucrando 18 meses de diarios de infección para la exploración de la relación entre IMC y posterior frecuencia y severidad de ITR, 3) la información integral sobre estilo de vida y comorbilidades que permiten estudiar la interacción de tales factores sobre su efecto en infecciones, y 4) la amplia gama de indicadores de resultados considerados. La uniformidad de los resultados con respecto a estos resultados también sugiere que en el campo de la morbilidad por infección de las vías respiratorias, los estudios pueden ser comparables a pesar de que a menudo se concentran en diferentes resultados de ITR. En línea con la mayoría de los estudios epidemiológicos en este área de investigación, nuestro estudio sufre de algunas limitaciones, incluyendo la dependencia Sin embargo, encontramos -por ejemplo- un buen acuerdo entre el IMC derivado de los datos de peso y altura auto-reportados y el IMC calculado a partir de los valores medidos disponibles para un subcohorte (n = 508). Además, la clasificación diferencial errónea que sesgaría sustancialmente la relación entre obesidad e ITR es bastante inesperada en este contexto.La selección desproporcionada de mujeres en el estudio puede afectar negativamente a la generalización de algunos de nuestros resultados.

¿Qué moléculas han demostrado dificultar las respuestas de las células T a las infecciones virales?

Un Campeón Global de la Salud—¿El Siguiente de la OMS? https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4924837/SHA: f2f90880556600d4160e36db5cb6ea000916390a3Autores: nanFecha: 2016-06-28DOI: 10.1371/journal.pmed.1002059Licencia: cc-byAbstract: En el editorial de este mes, los Editores de Medicina de PLOS proponen cualidades ideales para el próximo Director General de la Organización Mundial de la Salud, para quien el proceso de selección está en curso. Texto: respuesta al brote de Ébola [1]. La reforma de la OMS para prepararla para dirigir respuestas a futuras emergencias de salud es un área de debate activo. Chan se retirará de la OMS el 30 El proceso de elección del próximo líder de la OMS ha comenzado, prometiendo ser prolongado y riguroso como corresponde a la importancia del papel. Sin embargo, teniendo en cuenta los muchos interesados influyentes en el proceso de nombramiento del sucesor de Chan, la transparencia del proceso de selección puede ser un área poco probable que atraiga aplausos. Aunque demasiado pronto para especular sobre la identidad del próximo Director General de la OMS, vale la pena reflexionar sobre las cualidades que un líder entrante debe aportar a la OMS y cómo esa persona podría necesitar concebir cambios en la estructura y el comportamiento de la organización contra un panorama de amenazas importantes y cambiantes para la salud de la población mundial en rápido crecimiento. En lugar de elegir a un nuevo Director General, Lorenz Von Seidlein, de la Universidad Mahidol, Tailandia, sostuvo que "los problemas... ahora están tan arraigados que reemplazar a la OMS por organizaciones nuevas y más apropiadas es la solución lógica... a una fracción del costo actual, libre de obligaciones y derechos engorrosos y arcaicos y [con] la capacidad de responder a nuevos problemas". Este punto de vista es indicativo de la fuerza de la sensación que las deficiencias de la OMS han llegado a suscitar en algunos de los comprometidos con la causa de mejorar la salud de las personas en los países de ingresos bajos y medianos. Pero esta percepción reconoce que un organismo mundial responsable siempre será necesario para promover, establecer normas y evaluar el progreso hacia una mejor salud para las personas en todos los países. El próximo Director General tendrá que prestar atención a los críticos de la organización y diseñar un proceso de racionalización y reestructuración para producir una nueva OMS que sea demostrablemente eficaz para dirigir las respuestas a las amenazas a la salud, y eficiente al hacerlo. Como comentó Gostin a PLOS Medicine, "la OMS necesita urgentemente una agenda de reforma audaz para solucionar problemas de larga data reconocidos por cada grupo independiente que ha evaluado la Organización". Las maquinaciones políticas y el enemigo dentro de la burocracia, son propensos a impedir la reforma.Por ejemplo, algunas oficinas regionales y de países de la OMS son vistas por algunos como irrenunciables, pero la agencia del futuro tendrá que estar conectada y responder a los recursos y necesidades de todos los países constituyentes.Como Gostin también señaló, "[la OMS] no ha incluido a la sociedad civil en su gobernanza, a diferencia de... nuevas organizaciones". El nuevo recluta será recibido por un grupo completo, y es probable que las limitaciones impuestas por los actuales mecanismos de financiación de la OMS sean prominentes. Una proporción sustancial del presupuesto existente de la OMS está destinado a proyectos específicos, dejando a la organización con poca flexibilidad financiera para responder a demandas imprevistas. Sin embargo, es probable que cualquier mecanismo de financiación mejorado siga y dependa de la reforma de la organización. Según Kruk, "la OMS es a la vez esencial y desanimada... la elección del Director General debería ser un momento para que los países miembros y otros financiadores reflexionen sobre si quieren una agencia de implementación para su agenda de salud favorita, o una institución independiente con la inteligencia, la agilidad y la capacidad operacional para hacer frente a los próximos desafíos de la salud mundial". Más de uno de los expertos a los que contactamos hizo hincapié en la naturaleza fluida de las amenazas a la salud humana a las que la OMS debe dar forma a la respuesta mundial. La OMS debe ser capaz de dirigir las respuestas en algunas esferas de la salud mundial, pero, en otras áreas, trabajar junto con organizaciones más ágiles y centradas será pragmático. Continúan los brotes de enfermedades infecciosas a gran escala, y las enfermedades no transmisibles, como el cáncer, la demencia y las enfermedades mentales, están aumentando la prevalencia y la creciente demanda de tratamiento y atención. Los recursos y el ingenio de los investigadores y los médicos tendrán que aprovecharse, y las intervenciones se adaptarán a nuevos entornos, con mucho mayor dinamismo. Los problemas seculares del envejecimiento de la población, los conflictos, el cambio climático, la migración y otros producirán problemas de salud que sólo una organización con un alcance mundial, responsable para todos, puede esperar satisfacer. Esperamos con interés dar la bienvenida a un nuevo líder de la OMS con la energía y la visión de rehacer la organización para satisfacer las necesidades de salud de los pueblos y las sociedades del mundo para el siglo XXI.

¿Por qué podría ser necesaria una organización como la OMS?

Un ensayo de reducción de la neutralización de anticuerpos neutralizantes del virus de la hepatitis Chttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1852297/SHA: ee8dca216514deeed4c9415bc2ad8a78d3d9670Autores: Fournier, Carole; Duverlie, Gilles; François, Catherine; Schnuriger, Aurelie; Dedeeurwaerder, Sarah; Brochot, Etienne; Capron, Dominique; Wychowski, Czeslaw; Thibault, Vincent; Castelain, SandrineFecha: 2007-03-30DOI: 10.1186/1743-422x-4-35Licencia: cc-byAbstract: ANTEGRANO/AIM: El papel de la Sin embargo, existe un creciente interés en la caracterización de anticuerpos neutralizantes en el suero de pacientes infectados por el VHC. Los ensayos de reducción de focos han sido ampliamente utilizados para evaluar respuestas de anticuerpos neutralizantes frente a una gama de virus no citopáticos. Basados en el reciente desarrollo de un sistema de cultivo celular del VHC utilizando la cepa JFH-1 de genotipo 2, se desarrolló un ensayo de reducción de focos para anticuerpos neutralizantes contra el VHC. MÉTODOS: El ensayo de reducción de focos se basó en un ensayo estándar de microneutralización en el que se cuentan focos inmunosos en placas de cultivo tisular. Los títulos neutralizantes de anticuerpos anti-VHC de muestras de inmunoglobulinas séricas purificadas de setenta y siete individuos se determinaron utilizando un ensayo de neutralización de enfoque del 50%. Los anticuerpos IgG fueron purificados por primera vez de cada suero para evitar el efecto facilitador del HDL en la entrada del VHC. RESULTADOS: El corte del ensayo utilizando muestras ELISA y ARN VHC negativo fue de 1,25 log, correspondiente a una dilución de 1:18. El ensayo fue comparado con un ELISA comercial del VHC y mostró valores de especificidad y sensibilidad del 100% y 96,5%, respectivamente, y buena reproducibilidad (con coeficientes de variación intra-ensayo e inter-ensayo de 6,7% y 12,6%, respectivamente). El ensayo no mostró ninguna reactividad cruzada con muestras anti-VIH, anti-HBs o anticuerpos heterofílicos positivos. Los títulos de anticuerpos neutralizantes fueron 2,13 log (1:134) para muestras homólogas de pacientes infectados por el genotipo 2 del VHC que albergaban el mismo genotipo que JFH-1 y 1,93 log (1:85) para muestras heterólogas de pacientes infectados por genotipos distintos del tipo 2. Estos resultados confirman la presencia de anticuerpos ampliamente neutralizantes ya reportados utilizando el sistema de pseudopartículas del VHC. CONCLUSIÓN: Este estudio presenta un ensayo sencillo, específico y reproducible basado en cultivos celulares para la determinación de anticuerpos neutralizantes del VHC en sueros humanos. El ensayo debe ser una herramienta importante para medir la relación entre la respuesta de anticuerpos neutralizantes y la cinética de la carga viral en pacientes infectados aguda o crónicamente y para investigar la posible erradicación o prevención de la infección por VHC mediante anticuerpos neutralizantes. Texto: El virus de la hepatitis C (VHC, miembro de la familia Flaviviridae) es un virus del ARN envuelto y de cadena positiva que se replica preferentemente en los hepatocitos. Al menos 170 millones de personas en todo el mundo están infectadas persistentemente con el virus de la hepatitis C. La infección crónica por el VHC se asocia con un riesgo significativo de progresión a cirrosis y carcinoma hepatocelular [1]. La terapia antiviral con el alfa-interferón pegilado y ribavirina (el mejor régimen terapéutico actual) sólo tiene éxito en aproximadamente el 50% de todos los pacientes tratados. Se necesita un mejor conocimiento de los factores virales y de los huéspedes que determinan el aclaramiento o la persistencia del VHC durante la etapa aguda de la infección para mejorar la terapia antiviral y desarrollar vacunas eficientes. En la actualidad, el chimpancé es el único modelo animal confiable en el que se pueden evaluar los eventos iniciales de infección post-VHC y la eficacia de los candidatos a la vacuna [2]. Se ha demostrado que la inmunidad de células T específicas del VHC es importante para el control de la infección por el VHC [3, 4]. Varios estudios han indicado un papel para la inmunidad humoral en la etapa aguda de la infección por el VHC, pero este aspecto sigue estando mal caracterizado. Se cree que las glicoproteínas E1 y E2 son las proteínas de unión viral y, por lo tanto, los principales objetivos de anticuerpos neutralizadores del VHC; por lo tanto, la identificación de epitopos protectores conservados en diferentes cepas del VHC es un reto importante en el diseño de la vacuna. Se han descrito varios anticuerpos capaces de bloquear la unión de E2 a células o receptores celulares [5] [6] [7] [8]. Se ha demostrado que la entrada celular involucra varias moléculas superficiales (en particular, el CD81 de tetraspanina y el receptor SR-BI [11, 12] ), aunque se necesitan más estudios para entender mejor cómo se produce la entrada viral y cómo se puede neutralizar. La detección de anticuerpos neutralizantes en sangre humana había sido problemática hasta que se dispusiera de un sistema de cultivo celular eficiente y fiable para el VHC. Por lo tanto, el desarrollo de un ensayo de neutralización in vitro para el VHC podría ser extremadamente valioso para caracterizar la respuesta inmune humoral al VHC y para evaluar el potencial de inmunización pasiva y activa contra la hepatitis C. Estudios recientes que utilizan un sistema de neutralización in vitro (basado en pseudopartículas retrovirales infecciosas (HCVpp) que contienen glucoproteínas de envoltura del VHC) han confirmado que el sera del paciente infectado por VHC puede neutralizar la infección [13, 14] Sin embargo, también se ha demostrado que la actividad neutralizante de anticuerpos de pacientes infectados por el VHC es atenuada por un factor presente en el suero humano, identificado como la fracción de lipoproteínas de alta densidad (HDL) [11, 13, 15]. La facilitación de la entrada del VHCpp por HDL es un evento post-vinculante [16], sug-gestivo que los HDL favorecen la internalización de los viriones y por lo tanto el escape de estos últimos de anticuerpos neutralizantes. Recientemente, se ha desarrollado un modelo de cultivo celular del VHC (HCVcc) [17] [18] [19], permitiendo la producción de partículas virales que pueden propagarse eficientemente en el cultivo celular. Los ensayos de reducción de focos han sido ampliamente utilizados para evaluar las respuestas de anticuerpos neutralizantes a virus que pueden formar focos en células infectadas. Siguiendo el reciente desarrollo del modelo VHCcc, el principio del ensayo de reducción de focos se ha aplicado a la detección de anticuerpos neutralizantes del VHC. La cepa viral JFH-1 VHC 2a fue cultivada en una línea celular de hepatoma humano Huh-7. Después de tres días de infección y permeabilización celular, la detección de los focos del VHC se llevó a cabo utilizando un anticuerpo primario sérico del paciente VHC positivo inactivado y una peroxidasa acoplada, un anticuerpo IgG humano específico del Fc. La reacción se reveló con el sustrato de la peroxidasa DAB. Los focos virales fueron, por lo tanto, teñidos de color marrón, lo que los hace fáciles de contar (ver Figura 1a ). Por lo tanto, los HDLs fueron capaces de facilitar la entrada de VHCpp y VHCcc a través de un mecanismo que dependía de la expresión del receptor BI (SR-BI) y su función selectiva de absorción de lípidos [11, 15, 16, 20]. En vista del papel del HDL en la entrada del VHC, las inmunoglobulinas fueron purificadas de cada muestra sérica antes de determinar el título de anticuerpos neutralizantes (ver Fig. 1b ). La especificidad del ensayo de neutralización del VHC fue evaluada mediante la prueba de 20 muestras anti-VHC-ELISA-negativas, incluyendo cinco positivas para anticuerpos de superficie del virus de la hepatitis B (anti-HBs) y cinco positivas para anticuerpos heterofílicos. Todas las muestras probadas negativas con dos ensayos comerciales de detección de anticuerpos anti-VHC (Axsym ® VHC Version 3.0, Abbott, Wiesbaden, Alemania; Vitros ® Anti-HCV Reagent Pack, Ortho-Clinical Diagnostic, High Wycombe, Reino Unido) y VHC-ARN negativo con un ensayo cualitativo y comercial (Cobas Amplicor VHC Test Version 2.0, Roche Diagnostics, Meylan, Francia). Estas muestras anti-VHC negativas se compararon con 11 muestras de pacientes infectados crónicamente con el genotipo 2 del VHC. Los títulos de neutralización de muestras séricas anti-VHC negativos se muestran en la figura 2., con un valor medio de 1.083 ± 0.083 (correspondiente a una dilución de 1:12). El ensayo mostró valores de especificidad y sensibilidad del 100% y del 96,5%, respectivamente.El ensayo no mostró ninguna reactividad cruzada con muestras positivas de anticuerpos anti-VIH, anti-HB o anti-heterofilos (datos no mostrados).A la inversa, las muestras positivas de genotipo 2 del VHC mostraron reacciones fuertes, con un valor medio de 2,128 ± 0,365 (correspondiente a una dilución de 1:134) (p < 0,001).La variabilidad inter-ensayo se determinó probando una muestra de genotipo 2 del VHC en 10 experimentos consecutivos (n = 10), mientras que la variabilidad intra-ensayo fue evaluada probando la misma muestra 10 veces (n = 10) en el mismo experimento, mientras se ejecutaba la serie de dilución.Los coeficientes intra-ensayo e inter-ensayo de variación (CV) de los títulos de neutralización de log Se evaluaron 57 muestras de anticuerpos VHC positivos utilizando el ensayo de neutralización de la reducción del enfoque del VHC; los genotipos se distribuyeron de la siguiente manera: para los tipos 1a, 1b, 2, 3, 4 y 5, se estudiaron 11, 11, 11, 11, 12, 10 y 2 muestras, respectivamente; los valores medios de los diferentes genotipos se muestran en la figura 3 y en la tabla 1 ; los títulos medios de neutralización de log para los genotipos 1a, 2 y 3 son muy similares (2,046 ± 0,671 para el genotipo 1a, 2,128 ± 0,365 para el genotipo 2 y 2,148 ± 0,478 para el genotipo 3); los valores medios son menores para el genotipo 1b (1,747 ± 0,462) y el genotipo 4 (1,786 ± 0,236); se observaron títulos he Hubo muy pocas muestras de genotipo 5 para compararlas con los otros genotipos, pero los resultados correspondientes indican que el ensayo de neutralización es adecuado para este genotipo. Los dos títulos de neutralización de logs en todas las muestras de ELISA y ARN positivos del VHC en función del genotipo del VHC se muestran en la Fig. 3b. Más del 60% de los títulos de anticuerpos neutralizantes cayeron en el rango de 1,7 a 2,69 títulos de log, correspondientes a diluciones de 1:50 y 1:500, respectivamente. En general, el 3,5% de las muestras mostraron un título mayor que el log 3.0 (1:1000) y, al contrario, el 3,5% mostraron un título por debajo del valor de corte, es decir, log 1,25 (1:10). Así, de 57 pacientes infectados por VHC, sólo dos no probaron positivo para neutralizar anticuerpos en este ensayo (los El papel de los anticuerpos neutralizantes durante la infección viral aguda y crónica sigue siendo una cuestión importante y ha generado resultados controvertidos. Inicialmente, se demostró que la presencia de anticuerpos neutralizantes controlaba la carga del VHC y contribuía a la erradicación viral en pacientes capaces de eliminar la infección [13]. En otros estudios, la aparición de anticuerpos neutralizantes se retrasó y se restringió a anticuerpos IgG1 en pacientes que desarrollan una infección crónica [2, 21]. El modelo de chimpancé ha sido crítico para el estudio de la transmisión del VHC y las respuestas inmunitarias del huésped; sin embargo, no se detectaron anticuerpos neutralizantes en algunos animales que resolvieron su infección -sugiriendo un papel mínimo en el aclaramiento viral, como también se observó en estudios humanos [14, 15]. Los chimpancés infectados experimentalmente y los humanos infectados naturalmente pueden ser reinfectados con cepas del VHC homólogas y heterólogas, lo que sugiere que la inmunidad humoral que se desarrolla después de la resolución espontánea de la hepatitis C aguda no esteriliza [22] [23] [24]. Durante la infección crónica en los seres humanos, la presencia y/o producción de anticuerpos neutralizantes no bastan para curar la infección, sino que podría regular la propagación del virus. Así, se puede postular que durante la infección crónica, los mutantes virales pueden escapar continuamente de la renovación de la producción de anticuerpos neutralizantes. Seudopartículas retrovirales se han utilizado para desarrollar una herramienta muy interesante para medir anticuerpos neutralizantes in vitro [14]. El ensayo ha demostrado la presencia de anticuerpos neutralizantes del VHC en sueros humanos con títulos relativamente altos (> 1:320) y una actividad Sin embargo, este modelo no representa genuinos viriones del VHC; en particular, se cree que el brote de partículas retrovirales es muy diferente y puede implicar una variedad de vías celulares. La caracterización de partículas pseudotipo retrovirales infecciosas que contienen glucoproteínas del VHC ha demostrado ser muy heterogénea, por lo que es posible que estas pseudopartículas no sean tan relevantes como las viriones nativas del VHC [25]. El reciente desarrollo de un modelo de cultivo celular para el VHC permite la producción de viriones nativas del VHC que pueden propagarse eficientemente en el cultivo celular [17] [18] [19]. Este sistema de cultivo celular nos ha permitido desarrollar un ensayo de neutralización para evaluar el nivel y la proporción de anticuerpos neutralizantes del VHC en pacientes con VHC crónicamente infectados. Analizamos una serie de parámetros (como la practicabilidad, la reproducibilidad y la especificidad) y probamos el efecto de una gama de variables (tamaño del inóculo viral, tiempo de incubación, métodos de fijación y permeabilidad, reactivos de bloqueo y revelación) sobre estos parámetros (datos no mostrados). En general, el ensayo de neutralización descrito en este estudio se realiza de manera similar a los ensayos de neutralización estandarizados para muchos otros virus [26] [27]. El ensayo se basa en la capacidad de la cepa viral específica genotipo 2 de JFH para replicarse y multiplicarse en una línea celular hepatoma humana Huh-7 en un modelo de cultivo celular, permitiendo la detección rápida de focos virales después de 72 horas de infección. Además, no se detectaron focos secundarios en este momento. La fijación con paraformaldehído y la permeabilización con Triton X-100 fueron elegidas para preservar la antigenicidad y evitar que la monocapa celular se desprendiera durante los lavados. El desarrollo con sustrato de peróxido de DAB facilitó el recuento de focos virales de color específico. El tamaño del inóculo viral es un parámetro importante; debe ser lo suficientemente bajo como para permitir una buena sensibilidad al ensayo pero lo suficientemente alto como para producir un número estadísticamente significativo de focos, es decir, permitir la reducción del número de focos (y por lo tanto el efecto de la neutralización). Así, se utilizaron 100 FUs como inóculo en este ensayo de neutralización. Para probar diferentes muestras humanas, tuvimos que tener en cuenta la capacidad de HDL para facilitar la entrada del VHCcc a través de un mecanismo que depende de la expresión del receptor de escavenger BI [11, 15 Dado el papel del HDL en la entrada del VHC, las inmunoglobulinas fueron purificadas de cada muestra sérica antes de determinar el título de anticuerpos neutralizantes; esto libera el ensayo del riesgo de actividad de neutralización inespecífica del suero a través de los efectos del HDL, el sistema de complemento y/o la proteína amiloide A sérica (SAA) [29]. El ensayo de neutralización del VHC mostró buena reproducibilidad, tanto para ensayos duplicados como para pruebas independientes. Como era de esperar, el coeficiente de variación intra-ensayo (CV) fue menor que el CV interensayo. La prueba también mostró una buena especificidad, ya que no hubo interacción con anticuerpos anti-VIH, anti-VHB o heterofílicos. Se encontraron títulos muy bajos con muestras ELISA del VHC y ARN negativos, y el corte del ensayo se determinó como el título medio para muestras negativas más dos desviaciones estándar (1,25 log, correspondiente a una dilución de 1:18). Dado que sólo la cepa JFH-1 del genotipo 2a del VHC estaba disponible para el ensayo, se evaluó el título de neutralización de sera de pacientes infectados crónicamente con otros genotipos del VHC, es decir, 1, 2, 3, 4 y 5. La mayoría de estos sera fueron detectados como positivos por el ensayo de neutralización, excepto para dos sera de pacientes infectados por el VHC genotipo 1; estas dos muestras presentaron una alta proporción de anticuerpos específicos según el estudio ELISA, pero sólo muy baja inhibición por neutralización (muy por debajo del corte, de hecho). Concluimos que o las muestras carecían de anticuerpos neutralizantes o que cualquiera de los anticuerpos presentes no se La sensibilidad fue del 100%, no sólo para el genotipo 2 (el genotipo de la cepa utilizada para el ensayo) sino también para otros genotipos del VHC (excepto el genotipo 1). También se midieron anticuerpos del VHC genotipo 5 pero hubo muy pocas muestras para pruebas precisas. Además, el sera positivo (96,5%) tenía títulos comparables y significativamente altos (1,99 ± 0,63), cualquiera que sea el genotipo. Este hallazgo sugiere que la mayoría de los anticuerpos neutralizantes son reactivas cruzadas. Otra posibilidad es que la mayoría de los pacientes habían sido previamente infectados por una cepa del genotipo 2; sin embargo, esto es improbable porque en Francia circulan pocas cepas del genotipo 2 [30]. Como se esperaba para una prueba de neutralización, el ensayo presentado en el presente estudio parecía ser muy específico (independientemente del genotipo) y utilizable Por lo tanto, estamos seguros de que a medida que otros genotipos del VHCcc estén disponibles, estos ensayos reemplazarán el ensayo de pseudopartículas en un futuro próximo, ya que probablemente sean más relevantes. Nuestro ensayo es algo lento y podría simplificarse utilizando una dilución para contar los focos; sin embargo, este tipo de "corte corto" haría difícil extrapolar a la dilución neutralizando el 50% del inóculo. Otro enfoque consistiría en utilizar VHC recombinante capaz de expresar genes reporteros (como la luciferasa) con el fin de utilizar una sola dilución y obtener un resultado cuantitativo [31]. Sin embargo, se necesitan estudios de neutralización adicionales utilizando otros genotipos para completar nuestras observaciones y para el ensayo de neutralización basado en cultivos celulares simples, específicos y reproducibles para la determinación de anticuerpos neutralizantes anti-VHC en sueros humanos. Esta prueba debe ser una herramienta importante para medir la relación entre la respuesta neutralizante y la cinética de la carga viral en pacientes infectados aguda y crónicamente. Las células hepatoma humanas Huh-7 [32] fueron cultivadas en el medio esencial mínimo de Dulbecco (Invitrogen) suplementado con 10% de suero fetal bovino. Todos los cultivos celulares se mantuvieron en 5% CO 2 a 37°C. El plásmido pJFH-1 que contiene el ADNc de largo alcance del aislado JFH-1 (que pertenece al subtipo 2a (adhesión del GenBank no. AB047639)), fue un regalo del Dr. Wakita (Departamento de Microbiología, Instituto Metropolitano de Tokio para Neurociencia, Tokio, Japón) y ha sido descrito previamente [17]. Para generar ARN VHC genómico, el plásmido pJFH-1 fue linealizado al final de 3' del VHC cDNA y utilizado como plantilla para la transcripción in vitro, como se describió anteriormente [33]. Las existencias virales se obtuvieron mediante la recolección de sobrenadantes del cultivo celular y congelándolos a -80°C. La titulación del virus se realizó en células Huh-7 con placas de microtitulado de 6 pocillos (Corning, NY) 72 horas después de la incubación, mediante inmunotenedumbre de las células con anticuerpos de un suero de paciente con VHC positivo que previamente había sido inactivado a 56°C (ver sección sobre el ensayo de neutralización del virus). El título viral se determinó por triplicado a partir del número medio de focos y se expresó como unidades de conformación focalización/mL (FFU/mL). Se probaron La recolección de los sueros fue aprobada por el Comité de Ética local y se obtuvo el consentimiento informado de los donantes. Cincuenta y siete de estas muestras fueron obtenidas de pacientes con VHC infectados crónicamente. La presencia de anticuerpos contra el VHC fue determinada y confirmada mediante dos ensayos de EIA del VHC de tercera generación (Axsym ® VHC Version 3.0, Abbott, Wiesbaden, Alemania y Vitros ® Reactivo Anti-VHC Pack, Ortho-Clinical Diagnostic, High Wycombe, Reino Unido). El ARN del VHC se determinó con un ensayo comercial cualitativo (Cobas Amplicior VHC Test Version 2.0, Roche Diagnostics, Meylan, Francia) y el genotipado del VHC se realizó mediante secuenciación directa, como se describe en otras partes [34]. Los genotipos se distribuyeron de la siguiente manera Se utilizó un conjunto de 20 muestras séricas anti-VHC negativas para evaluar la especificidad del ensayo, incluyendo cinco muestras séricas con anticuerpo positivo de la superficie del virus de la hepatitis B (anti-HBs) y cinco sueros de pacientes infectados por el virus de Epstein-Barr que habían dado positivo para anticuerpos heterófilos. Todas las muestras séricas se habían almacenado a -80°C en el momento de la recogida y no habían sido descongeladas hasta el momento del ensayo. La fracción de inmunoglobulinas serum G (IgG) fue purificada utilizando proteína G-Sefarosa (GE Healthcare, Orsay, Francia El ensayo de neutralización de la reducción del foco del VHC se realizó en placas microtitulares de 96 pocillos. Se establecieron diluciones seriales de IgG purificada (10 μg) de 1:10 a 1:1.280. 25 μL de cada muestra se mezclaron con 25 μL de virus (100 UFU) en placas de microtitular de 96well e incubaron durante 1 hora a 37°C, 5% CO 2. Se añadió un volumen de 100 μL de suspensión celular Huh-7 (10.000 células/pozo) en medio de cultivo y se incubaron durante 5 horas a 37°C, 5% CO2. Después de 5 horas, se extirparon los sobrenadantes y se añadieron 100 μL de medio de cultivo a las monocapas. Después de 72 horas, las células se fijaron con paraformaldehído y permeabilizaron con 0,5% Tritón X-100. El anticuerpo primario (un suero de paciente con VHC positivo inactivado a 56°C) se diluyó a 1:500 antes de su uso y luego se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente Un anticuerpo IgG antihumano específico de Fc acoplado a peroxidasa (Sigma, Saint Quentin Fallavier, Francia) diluido a 1:200 fue dispensado en la monocapa celular e incubado durante 30 minutos a temperatura ambiente. La reacción se desarrolló con sustrato de la peroxidasa DAB (Sigma, Saint Quentin Fallavier, Francia) y se detuvo después de 10 minutos de incubación con agua destilada. Se determinó el número de focos del VHC en cada dilución. Se incluyeron controles en cada ensayo (virus no neutralizado, IgG purificado de cada paciente en una dilución 1:10). La dilución que neutralizaba el 50% del virus se calculó mediante análisis de regresión curvilínea utilizando el software XLSTAT 2006 (Addinsoft SARL, París, Francia) [35]. Cada título fue determinado como valor logarítmico de la dilución de anticuerpos recíprocos que redujo el número de focos virales en un 50%; se expresaron como valores logarítmicos y se calcularon medias ± desviación estándar; se utilizó la prueba t del estudiante para comparar datos entre grupos; se consideraron significativos los valores de p por debajo de 0,05.

¿Cuántas personas tienen el virus persistente de la hepatitis C?

Un ensayo de reducción de la neutralización de anticuerpos neutralizantes del virus de la hepatitis Chttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1852297/SHA: ee8dca216514deeed4c9415bc2ad8a78d3d9670Autores: Fournier, Carole; Duverlie, Gilles; François, Catherine; Schnuriger, Aurelie; Dedeeurwaerder, Sarah; Brochot, Etienne; Capron, Dominique; Wychowski, Czeslaw; Thibault, Vincent; Castelain, SandrineFecha: 2007-03-30DOI: 10.1186/1743-422x-4-35Licencia: cc-byAbstract: ANTEGRANO/AIM: El papel de la Sin embargo, existe un creciente interés en la caracterización de anticuerpos neutralizantes en el suero de pacientes infectados por el VHC. Los ensayos de reducción de focos han sido ampliamente utilizados para evaluar respuestas de anticuerpos neutralizantes frente a una gama de virus no citopáticos. Basados en el reciente desarrollo de un sistema de cultivo celular del VHC utilizando la cepa JFH-1 de genotipo 2, se desarrolló un ensayo de reducción de focos para anticuerpos neutralizantes contra el VHC. MÉTODOS: El ensayo de reducción de focos se basó en un ensayo estándar de microneutralización en el que se cuentan focos inmunosos en placas de cultivo tisular. Los títulos neutralizantes de anticuerpos anti-VHC de muestras de inmunoglobulinas séricas purificadas de setenta y siete individuos se determinaron utilizando un ensayo de neutralización de enfoque del 50%. Los anticuerpos IgG fueron purificados por primera vez de cada suero para evitar el efecto facilitador del HDL en la entrada del VHC. RESULTADOS: El corte del ensayo utilizando muestras ELISA y ARN VHC negativo fue de 1,25 log, correspondiente a una dilución de 1:18. El ensayo fue comparado con un ELISA comercial del VHC y mostró valores de especificidad y sensibilidad del 100% y 96,5%, respectivamente, y buena reproducibilidad (con coeficientes de variación intra-ensayo e inter-ensayo de 6,7% y 12,6%, respectivamente). El ensayo no mostró ninguna reactividad cruzada con muestras anti-VIH, anti-HBs o anticuerpos heterofílicos positivos. Los títulos de anticuerpos neutralizantes fueron 2,13 log (1:134) para muestras homólogas de pacientes infectados por el genotipo 2 del VHC que albergaban el mismo genotipo que JFH-1 y 1,93 log (1:85) para muestras heterólogas de pacientes infectados por genotipos distintos del tipo 2. Estos resultados confirman la presencia de anticuerpos ampliamente neutralizantes ya reportados utilizando el sistema de pseudopartículas del VHC. CONCLUSIÓN: Este estudio presenta un ensayo sencillo, específico y reproducible basado en cultivos celulares para la determinación de anticuerpos neutralizantes del VHC en sueros humanos. El ensayo debe ser una herramienta importante para medir la relación entre la respuesta de anticuerpos neutralizantes y la cinética de la carga viral en pacientes infectados aguda o crónicamente y para investigar la posible erradicación o prevención de la infección por VHC mediante anticuerpos neutralizantes. Texto: El virus de la hepatitis C (VHC, miembro de la familia Flaviviridae) es un virus del ARN envuelto y de cadena positiva que se replica preferentemente en los hepatocitos. Al menos 170 millones de personas en todo el mundo están infectadas persistentemente con el virus de la hepatitis C. La infección crónica por el VHC se asocia con un riesgo significativo de progresión a cirrosis y carcinoma hepatocelular [1]. La terapia antiviral con el alfa-interferón pegilado y ribavirina (el mejor régimen terapéutico actual) sólo tiene éxito en aproximadamente el 50% de todos los pacientes tratados. Se necesita un mejor conocimiento de los factores virales y de los huéspedes que determinan el aclaramiento o la persistencia del VHC durante la etapa aguda de la infección para mejorar la terapia antiviral y desarrollar vacunas eficientes. En la actualidad, el chimpancé es el único modelo animal confiable en el que se pueden evaluar los eventos iniciales de infección post-VHC y la eficacia de los candidatos a la vacuna [2]. Se ha demostrado que la inmunidad de células T específicas del VHC es importante para el control de la infección por el VHC [3, 4]. Varios estudios han indicado un papel para la inmunidad humoral en la etapa aguda de la infección por el VHC, pero este aspecto sigue estando mal caracterizado. Se cree que las glicoproteínas E1 y E2 son las proteínas de unión viral y, por lo tanto, los principales objetivos de anticuerpos neutralizadores del VHC; por lo tanto, la identificación de epitopos protectores conservados en diferentes cepas del VHC es un reto importante en el diseño de la vacuna. Se han descrito varios anticuerpos capaces de bloquear la unión de E2 a células o receptores celulares [5] [6] [7] [8]. Se ha demostrado que la entrada celular involucra varias moléculas superficiales (en particular, el CD81 de tetraspanina y el receptor SR-BI [11, 12] ), aunque se necesitan más estudios para entender mejor cómo se produce la entrada viral y cómo se puede neutralizar. La detección de anticuerpos neutralizantes en sangre humana había sido problemática hasta que se dispusiera de un sistema de cultivo celular eficiente y fiable para el VHC. Por lo tanto, el desarrollo de un ensayo de neutralización in vitro para el VHC podría ser extremadamente valioso para caracterizar la respuesta inmune humoral al VHC y para evaluar el potencial de inmunización pasiva y activa contra la hepatitis C. Estudios recientes que utilizan un sistema de neutralización in vitro (basado en pseudopartículas retrovirales infecciosas (HCVpp) que contienen glucoproteínas de envoltura del VHC) han confirmado que el sera del paciente infectado por VHC puede neutralizar la infección [13, 14] Sin embargo, también se ha demostrado que la actividad neutralizante de anticuerpos de pacientes infectados por el VHC es atenuada por un factor presente en el suero humano, identificado como la fracción de lipoproteínas de alta densidad (HDL) [11, 13, 15]. La facilitación de la entrada del VHCpp por HDL es un evento post-vinculante [16], sug-gestivo que los HDL favorecen la internalización de los viriones y por lo tanto el escape de estos últimos de anticuerpos neutralizantes. Recientemente, se ha desarrollado un modelo de cultivo celular del VHC (HCVcc) [17] [18] [19], permitiendo la producción de partículas virales que pueden propagarse eficientemente en el cultivo celular. Los ensayos de reducción de focos han sido ampliamente utilizados para evaluar las respuestas de anticuerpos neutralizantes a virus que pueden formar focos en células infectadas. Siguiendo el reciente desarrollo del modelo VHCcc, el principio del ensayo de reducción de focos se ha aplicado a la detección de anticuerpos neutralizantes del VHC. La cepa viral JFH-1 VHC 2a fue cultivada en una línea celular de hepatoma humano Huh-7. Después de tres días de infección y permeabilización celular, la detección de los focos del VHC se llevó a cabo utilizando un anticuerpo primario sérico del paciente VHC positivo inactivado y una peroxidasa acoplada, un anticuerpo IgG humano específico del Fc. La reacción se reveló con el sustrato de la peroxidasa DAB. Los focos virales fueron, por lo tanto, teñidos de color marrón, lo que los hace fáciles de contar (ver Figura 1a ). Por lo tanto, los HDLs fueron capaces de facilitar la entrada de VHCpp y VHCcc a través de un mecanismo que dependía de la expresión del receptor BI (SR-BI) y su función selectiva de absorción de lípidos [11, 15, 16, 20]. En vista del papel del HDL en la entrada del VHC, las inmunoglobulinas fueron purificadas de cada muestra sérica antes de determinar el título de anticuerpos neutralizantes (ver Fig. 1b ). La especificidad del ensayo de neutralización del VHC fue evaluada mediante la prueba de 20 muestras anti-VHC-ELISA-negativas, incluyendo cinco positivas para anticuerpos de superficie del virus de la hepatitis B (anti-HBs) y cinco positivas para anticuerpos heterofílicos. Todas las muestras probadas negativas con dos ensayos comerciales de detección de anticuerpos anti-VHC (Axsym ® VHC Version 3.0, Abbott, Wiesbaden, Alemania; Vitros ® Anti-HCV Reagent Pack, Ortho-Clinical Diagnostic, High Wycombe, Reino Unido) y VHC-ARN negativo con un ensayo cualitativo y comercial (Cobas Amplicor VHC Test Version 2.0, Roche Diagnostics, Meylan, Francia). Estas muestras anti-VHC negativas se compararon con 11 muestras de pacientes infectados crónicamente con el genotipo 2 del VHC. Los títulos de neutralización de muestras séricas anti-VHC negativos se muestran en la figura 2., con un valor medio de 1.083 ± 0.083 (correspondiente a una dilución de 1:12). El ensayo mostró valores de especificidad y sensibilidad del 100% y del 96,5%, respectivamente.El ensayo no mostró ninguna reactividad cruzada con muestras positivas de anticuerpos anti-VIH, anti-HB o anti-heterofilos (datos no mostrados).A la inversa, las muestras positivas de genotipo 2 del VHC mostraron reacciones fuertes, con un valor medio de 2,128 ± 0,365 (correspondiente a una dilución de 1:134) (p < 0,001).La variabilidad inter-ensayo se determinó probando una muestra de genotipo 2 del VHC en 10 experimentos consecutivos (n = 10), mientras que la variabilidad intra-ensayo fue evaluada probando la misma muestra 10 veces (n = 10) en el mismo experimento, mientras se ejecutaba la serie de dilución.Los coeficientes intra-ensayo e inter-ensayo de variación (CV) de los títulos de neutralización de log Se evaluaron 57 muestras de anticuerpos VHC positivos utilizando el ensayo de neutralización de la reducción del enfoque del VHC; los genotipos se distribuyeron de la siguiente manera: para los tipos 1a, 1b, 2, 3, 4 y 5, se estudiaron 11, 11, 11, 11, 12, 10 y 2 muestras, respectivamente; los valores medios de los diferentes genotipos se muestran en la figura 3 y en la tabla 1 ; los títulos medios de neutralización de log para los genotipos 1a, 2 y 3 son muy similares (2,046 ± 0,671 para el genotipo 1a, 2,128 ± 0,365 para el genotipo 2 y 2,148 ± 0,478 para el genotipo 3); los valores medios son menores para el genotipo 1b (1,747 ± 0,462) y el genotipo 4 (1,786 ± 0,236); se observaron títulos he Hubo muy pocas muestras de genotipo 5 para compararlas con los otros genotipos, pero los resultados correspondientes indican que el ensayo de neutralización es adecuado para este genotipo. Los dos títulos de neutralización de logs en todas las muestras de ELISA y ARN positivos del VHC en función del genotipo del VHC se muestran en la Fig. 3b. Más del 60% de los títulos de anticuerpos neutralizantes cayeron en el rango de 1,7 a 2,69 títulos de log, correspondientes a diluciones de 1:50 y 1:500, respectivamente. En general, el 3,5% de las muestras mostraron un título mayor que el log 3.0 (1:1000) y, al contrario, el 3,5% mostraron un título por debajo del valor de corte, es decir, log 1,25 (1:10). Así, de 57 pacientes infectados por VHC, sólo dos no probaron positivo para neutralizar anticuerpos en este ensayo (los El papel de los anticuerpos neutralizantes durante la infección viral aguda y crónica sigue siendo una cuestión importante y ha generado resultados controvertidos. Inicialmente, se demostró que la presencia de anticuerpos neutralizantes controlaba la carga del VHC y contribuía a la erradicación viral en pacientes capaces de eliminar la infección [13]. En otros estudios, la aparición de anticuerpos neutralizantes se retrasó y se restringió a anticuerpos IgG1 en pacientes que desarrollan una infección crónica [2, 21]. El modelo de chimpancé ha sido crítico para el estudio de la transmisión del VHC y las respuestas inmunitarias del huésped; sin embargo, no se detectaron anticuerpos neutralizantes en algunos animales que resolvieron su infección -sugiriendo un papel mínimo en el aclaramiento viral, como también se observó en estudios humanos [14, 15]. Los chimpancés infectados experimentalmente y los humanos infectados naturalmente pueden ser reinfectados con cepas del VHC homólogas y heterólogas, lo que sugiere que la inmunidad humoral que se desarrolla después de la resolución espontánea de la hepatitis C aguda no esteriliza [22] [23] [24]. Durante la infección crónica en los seres humanos, la presencia y/o producción de anticuerpos neutralizantes no bastan para curar la infección, sino que podría regular la propagación del virus. Así, se puede postular que durante la infección crónica, los mutantes virales pueden escapar continuamente de la renovación de la producción de anticuerpos neutralizantes. Seudopartículas retrovirales se han utilizado para desarrollar una herramienta muy interesante para medir anticuerpos neutralizantes in vitro [14]. El ensayo ha demostrado la presencia de anticuerpos neutralizantes del VHC en sueros humanos con títulos relativamente altos (> 1:320) y una actividad Sin embargo, este modelo no representa genuinos viriones del VHC; en particular, se cree que el brote de partículas retrovirales es muy diferente y puede implicar una variedad de vías celulares. La caracterización de partículas pseudotipo retrovirales infecciosas que contienen glucoproteínas del VHC ha demostrado ser muy heterogénea, por lo que es posible que estas pseudopartículas no sean tan relevantes como las viriones nativas del VHC [25]. El reciente desarrollo de un modelo de cultivo celular para el VHC permite la producción de viriones nativas del VHC que pueden propagarse eficientemente en el cultivo celular [17] [18] [19]. Este sistema de cultivo celular nos ha permitido desarrollar un ensayo de neutralización para evaluar el nivel y la proporción de anticuerpos neutralizantes del VHC en pacientes con VHC crónicamente infectados. Analizamos una serie de parámetros (como la practicabilidad, la reproducibilidad y la especificidad) y probamos el efecto de una gama de variables (tamaño del inóculo viral, tiempo de incubación, métodos de fijación y permeabilidad, reactivos de bloqueo y revelación) sobre estos parámetros (datos no mostrados). En general, el ensayo de neutralización descrito en este estudio se realiza de manera similar a los ensayos de neutralización estandarizados para muchos otros virus [26] [27]. El ensayo se basa en la capacidad de la cepa viral específica genotipo 2 de JFH para replicarse y multiplicarse en una línea celular hepatoma humana Huh-7 en un modelo de cultivo celular, permitiendo la detección rápida de focos virales después de 72 horas de infección. Además, no se detectaron focos secundarios en este momento. La fijación con paraformaldehído y la permeabilización con Triton X-100 fueron elegidas para preservar la antigenicidad y evitar que la monocapa celular se desprendiera durante los lavados. El desarrollo con sustrato de peróxido de DAB facilitó el recuento de focos virales de color específico. El tamaño del inóculo viral es un parámetro importante; debe ser lo suficientemente bajo como para permitir una buena sensibilidad al ensayo pero lo suficientemente alto como para producir un número estadísticamente significativo de focos, es decir, permitir la reducción del número de focos (y por lo tanto el efecto de la neutralización). Así, se utilizaron 100 FUs como inóculo en este ensayo de neutralización. Para probar diferentes muestras humanas, tuvimos que tener en cuenta la capacidad de HDL para facilitar la entrada del VHCcc a través de un mecanismo que depende de la expresión del receptor de escavenger BI [11, 15 Dado el papel del HDL en la entrada del VHC, las inmunoglobulinas fueron purificadas de cada muestra sérica antes de determinar el título de anticuerpos neutralizantes; esto libera el ensayo del riesgo de actividad de neutralización inespecífica del suero a través de los efectos del HDL, el sistema de complemento y/o la proteína amiloide A sérica (SAA) [29]. El ensayo de neutralización del VHC mostró buena reproducibilidad, tanto para ensayos duplicados como para pruebas independientes. Como era de esperar, el coeficiente de variación intra-ensayo (CV) fue menor que el CV interensayo. La prueba también mostró una buena especificidad, ya que no hubo interacción con anticuerpos anti-VIH, anti-VHB o heterofílicos. Se encontraron títulos muy bajos con muestras ELISA del VHC y ARN negativos, y el corte del ensayo se determinó como el título medio para muestras negativas más dos desviaciones estándar (1,25 log, correspondiente a una dilución de 1:18). Dado que sólo la cepa JFH-1 del genotipo 2a del VHC estaba disponible para el ensayo, se evaluó el título de neutralización de sera de pacientes infectados crónicamente con otros genotipos del VHC, es decir, 1, 2, 3, 4 y 5. La mayoría de estos sera fueron detectados como positivos por el ensayo de neutralización, excepto para dos sera de pacientes infectados por el VHC genotipo 1; estas dos muestras presentaron una alta proporción de anticuerpos específicos según el estudio ELISA, pero sólo muy baja inhibición por neutralización (muy por debajo del corte, de hecho). Concluimos que o las muestras carecían de anticuerpos neutralizantes o que cualquiera de los anticuerpos presentes no se La sensibilidad fue del 100%, no sólo para el genotipo 2 (el genotipo de la cepa utilizada para el ensayo) sino también para otros genotipos del VHC (excepto el genotipo 1). También se midieron anticuerpos del VHC genotipo 5 pero hubo muy pocas muestras para pruebas precisas. Además, el sera positivo (96,5%) tenía títulos comparables y significativamente altos (1,99 ± 0,63), cualquiera que sea el genotipo. Este hallazgo sugiere que la mayoría de los anticuerpos neutralizantes son reactivas cruzadas. Otra posibilidad es que la mayoría de los pacientes habían sido previamente infectados por una cepa del genotipo 2; sin embargo, esto es improbable porque en Francia circulan pocas cepas del genotipo 2 [30]. Como se esperaba para una prueba de neutralización, el ensayo presentado en el presente estudio parecía ser muy específico (independientemente del genotipo) y utilizable Por lo tanto, estamos seguros de que a medida que otros genotipos del VHCcc estén disponibles, estos ensayos reemplazarán el ensayo de pseudopartículas en un futuro próximo, ya que probablemente sean más relevantes. Nuestro ensayo es algo lento y podría simplificarse utilizando una dilución para contar los focos; sin embargo, este tipo de "corte corto" haría difícil extrapolar a la dilución neutralizando el 50% del inóculo. Otro enfoque consistiría en utilizar VHC recombinante capaz de expresar genes reporteros (como la luciferasa) con el fin de utilizar una sola dilución y obtener un resultado cuantitativo [31]. Sin embargo, se necesitan estudios de neutralización adicionales utilizando otros genotipos para completar nuestras observaciones y para el ensayo de neutralización basado en cultivos celulares simples, específicos y reproducibles para la determinación de anticuerpos neutralizantes anti-VHC en sueros humanos. Esta prueba debe ser una herramienta importante para medir la relación entre la respuesta neutralizante y la cinética de la carga viral en pacientes infectados aguda y crónicamente. Las células hepatoma humanas Huh-7 [32] fueron cultivadas en el medio esencial mínimo de Dulbecco (Invitrogen) suplementado con 10% de suero fetal bovino. Todos los cultivos celulares se mantuvieron en 5% CO 2 a 37°C. El plásmido pJFH-1 que contiene el ADNc de largo alcance del aislado JFH-1 (que pertenece al subtipo 2a (adhesión del GenBank no. AB047639)), fue un regalo del Dr. Wakita (Departamento de Microbiología, Instituto Metropolitano de Tokio para Neurociencia, Tokio, Japón) y ha sido descrito previamente [17]. Para generar ARN VHC genómico, el plásmido pJFH-1 fue linealizado al final de 3' del VHC cDNA y utilizado como plantilla para la transcripción in vitro, como se describió anteriormente [33]. Las existencias virales se obtuvieron mediante la recolección de sobrenadantes del cultivo celular y congelándolos a -80°C. La titulación del virus se realizó en células Huh-7 con placas de microtitulado de 6 pocillos (Corning, NY) 72 horas después de la incubación, mediante inmunotenedumbre de las células con anticuerpos de un suero de paciente con VHC positivo que previamente había sido inactivado a 56°C (ver sección sobre el ensayo de neutralización del virus). El título viral se determinó por triplicado a partir del número medio de focos y se expresó como unidades de conformación focalización/mL (FFU/mL). Se probaron La recolección de los sueros fue aprobada por el Comité de Ética local y se obtuvo el consentimiento informado de los donantes. Cincuenta y siete de estas muestras fueron obtenidas de pacientes con VHC infectados crónicamente. La presencia de anticuerpos contra el VHC fue determinada y confirmada mediante dos ensayos de EIA del VHC de tercera generación (Axsym ® VHC Version 3.0, Abbott, Wiesbaden, Alemania y Vitros ® Reactivo Anti-VHC Pack, Ortho-Clinical Diagnostic, High Wycombe, Reino Unido). El ARN del VHC se determinó con un ensayo comercial cualitativo (Cobas Amplicior VHC Test Version 2.0, Roche Diagnostics, Meylan, Francia) y el genotipado del VHC se realizó mediante secuenciación directa, como se describe en otras partes [34]. Los genotipos se distribuyeron de la siguiente manera Se utilizó un conjunto de 20 muestras séricas anti-VHC negativas para evaluar la especificidad del ensayo, incluyendo cinco muestras séricas con anticuerpo positivo de la superficie del virus de la hepatitis B (anti-HBs) y cinco sueros de pacientes infectados por el virus de Epstein-Barr que habían dado positivo para anticuerpos heterófilos. Todas las muestras séricas se habían almacenado a -80°C en el momento de la recogida y no habían sido descongeladas hasta el momento del ensayo. La fracción de inmunoglobulinas serum G (IgG) fue purificada utilizando proteína G-Sefarosa (GE Healthcare, Orsay, Francia El ensayo de neutralización de la reducción del foco del VHC se realizó en placas microtitulares de 96 pocillos. Se establecieron diluciones seriales de IgG purificada (10 μg) de 1:10 a 1:1.280. 25 μL de cada muestra se mezclaron con 25 μL de virus (100 UFU) en placas de microtitular de 96well e incubaron durante 1 hora a 37°C, 5% CO 2. Se añadió un volumen de 100 μL de suspensión celular Huh-7 (10.000 células/pozo) en medio de cultivo y se incubaron durante 5 horas a 37°C, 5% CO2. Después de 5 horas, se extirparon los sobrenadantes y se añadieron 100 μL de medio de cultivo a las monocapas. Después de 72 horas, las células se fijaron con paraformaldehído y permeabilizaron con 0,5% Tritón X-100. El anticuerpo primario (un suero de paciente con VHC positivo inactivado a 56°C) se diluyó a 1:500 antes de su uso y luego se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente Un anticuerpo IgG antihumano específico de Fc acoplado a peroxidasa (Sigma, Saint Quentin Fallavier, Francia) diluido a 1:200 fue dispensado en la monocapa celular e incubado durante 30 minutos a temperatura ambiente. La reacción se desarrolló con sustrato de la peroxidasa DAB (Sigma, Saint Quentin Fallavier, Francia) y se detuvo después de 10 minutos de incubación con agua destilada. Se determinó el número de focos del VHC en cada dilución. Se incluyeron controles en cada ensayo (virus no neutralizado, IgG purificado de cada paciente en una dilución 1:10). La dilución que neutralizaba el 50% del virus se calculó mediante análisis de regresión curvilínea utilizando el software XLSTAT 2006 (Addinsoft SARL, París, Francia) [35]. Cada título fue determinado como valor logarítmico de la dilución de anticuerpos recíprocos que redujo el número de focos virales en un 50%; se expresaron como valores logarítmicos y se calcularon medias ± desviación estándar; se utilizó la prueba t del estudiante para comparar datos entre grupos; se consideraron significativos los valores de p por debajo de 0,05.

¿Cuál es el riesgo a largo plazo de infección crónica por hepatitis C?

Un ensayo de reducción de la neutralización de anticuerpos neutralizantes del virus de la hepatitis Chttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1852297/SHA: ee8dca216514deeed4c9415bc2ad8a78d3d9670Autores: Fournier, Carole; Duverlie, Gilles; François, Catherine; Schnuriger, Aurelie; Dedeeurwaerder, Sarah; Brochot, Etienne; Capron, Dominique; Wychowski, Czeslaw; Thibault, Vincent; Castelain, SandrineFecha: 2007-03-30DOI: 10.1186/1743-422x-4-35Licencia: cc-byAbstract: ANTEGRANO/AIM: El papel de la Sin embargo, existe un creciente interés en la caracterización de anticuerpos neutralizantes en el suero de pacientes infectados por el VHC. Los ensayos de reducción de focos han sido ampliamente utilizados para evaluar respuestas de anticuerpos neutralizantes frente a una gama de virus no citopáticos. Basados en el reciente desarrollo de un sistema de cultivo celular del VHC utilizando la cepa JFH-1 de genotipo 2, se desarrolló un ensayo de reducción de focos para anticuerpos neutralizantes contra el VHC. MÉTODOS: El ensayo de reducción de focos se basó en un ensayo estándar de microneutralización en el que se cuentan focos inmunosos en placas de cultivo tisular. Los títulos neutralizantes de anticuerpos anti-VHC de muestras de inmunoglobulinas séricas purificadas de setenta y siete individuos se determinaron utilizando un ensayo de neutralización de enfoque del 50%. Los anticuerpos IgG fueron purificados por primera vez de cada suero para evitar el efecto facilitador del HDL en la entrada del VHC. RESULTADOS: El corte del ensayo utilizando muestras ELISA y ARN VHC negativo fue de 1,25 log, correspondiente a una dilución de 1:18. El ensayo fue comparado con un ELISA comercial del VHC y mostró valores de especificidad y sensibilidad del 100% y 96,5%, respectivamente, y buena reproducibilidad (con coeficientes de variación intra-ensayo e inter-ensayo de 6,7% y 12,6%, respectivamente). El ensayo no mostró ninguna reactividad cruzada con muestras anti-VIH, anti-HBs o anticuerpos heterofílicos positivos. Los títulos de anticuerpos neutralizantes fueron 2,13 log (1:134) para muestras homólogas de pacientes infectados por el genotipo 2 del VHC que albergaban el mismo genotipo que JFH-1 y 1,93 log (1:85) para muestras heterólogas de pacientes infectados por genotipos distintos del tipo 2. Estos resultados confirman la presencia de anticuerpos ampliamente neutralizantes ya reportados utilizando el sistema de pseudopartículas del VHC. CONCLUSIÓN: Este estudio presenta un ensayo sencillo, específico y reproducible basado en cultivos celulares para la determinación de anticuerpos neutralizantes del VHC en sueros humanos. El ensayo debe ser una herramienta importante para medir la relación entre la respuesta de anticuerpos neutralizantes y la cinética de la carga viral en pacientes infectados aguda o crónicamente y para investigar la posible erradicación o prevención de la infección por VHC mediante anticuerpos neutralizantes. Texto: El virus de la hepatitis C (VHC, miembro de la familia Flaviviridae) es un virus del ARN envuelto y de cadena positiva que se replica preferentemente en los hepatocitos. Al menos 170 millones de personas en todo el mundo están infectadas persistentemente con el virus de la hepatitis C. La infección crónica por el VHC se asocia con un riesgo significativo de progresión a cirrosis y carcinoma hepatocelular [1]. La terapia antiviral con el alfa-interferón pegilado y ribavirina (el mejor régimen terapéutico actual) sólo tiene éxito en aproximadamente el 50% de todos los pacientes tratados. Se necesita un mejor conocimiento de los factores virales y de los huéspedes que determinan el aclaramiento o la persistencia del VHC durante la etapa aguda de la infección para mejorar la terapia antiviral y desarrollar vacunas eficientes. En la actualidad, el chimpancé es el único modelo animal confiable en el que se pueden evaluar los eventos iniciales de infección post-VHC y la eficacia de los candidatos a la vacuna [2]. Se ha demostrado que la inmunidad de células T específicas del VHC es importante para el control de la infección por el VHC [3, 4]. Varios estudios han indicado un papel para la inmunidad humoral en la etapa aguda de la infección por el VHC, pero este aspecto sigue estando mal caracterizado. Se cree que las glicoproteínas E1 y E2 son las proteínas de unión viral y, por lo tanto, los principales objetivos de anticuerpos neutralizadores del VHC; por lo tanto, la identificación de epitopos protectores conservados en diferentes cepas del VHC es un reto importante en el diseño de la vacuna. Se han descrito varios anticuerpos capaces de bloquear la unión de E2 a células o receptores celulares [5] [6] [7] [8]. Se ha demostrado que la entrada celular involucra varias moléculas superficiales (en particular, el CD81 de tetraspanina y el receptor SR-BI [11, 12] ), aunque se necesitan más estudios para entender mejor cómo se produce la entrada viral y cómo se puede neutralizar. La detección de anticuerpos neutralizantes en sangre humana había sido problemática hasta que se dispusiera de un sistema de cultivo celular eficiente y fiable para el VHC. Por lo tanto, el desarrollo de un ensayo de neutralización in vitro para el VHC podría ser extremadamente valioso para caracterizar la respuesta inmune humoral al VHC y para evaluar el potencial de inmunización pasiva y activa contra la hepatitis C. Estudios recientes que utilizan un sistema de neutralización in vitro (basado en pseudopartículas retrovirales infecciosas (HCVpp) que contienen glucoproteínas de envoltura del VHC) han confirmado que el sera del paciente infectado por VHC puede neutralizar la infección [13, 14] Sin embargo, también se ha demostrado que la actividad neutralizante de anticuerpos de pacientes infectados por el VHC es atenuada por un factor presente en el suero humano, identificado como la fracción de lipoproteínas de alta densidad (HDL) [11, 13, 15]. La facilitación de la entrada del VHCpp por HDL es un evento post-vinculante [16], sug-gestivo que los HDL favorecen la internalización de los viriones y por lo tanto el escape de estos últimos de anticuerpos neutralizantes. Recientemente, se ha desarrollado un modelo de cultivo celular del VHC (HCVcc) [17] [18] [19], permitiendo la producción de partículas virales que pueden propagarse eficientemente en el cultivo celular. Los ensayos de reducción de focos han sido ampliamente utilizados para evaluar las respuestas de anticuerpos neutralizantes a virus que pueden formar focos en células infectadas. Siguiendo el reciente desarrollo del modelo VHCcc, el principio del ensayo de reducción de focos se ha aplicado a la detección de anticuerpos neutralizantes del VHC. La cepa viral JFH-1 VHC 2a fue cultivada en una línea celular de hepatoma humano Huh-7. Después de tres días de infección y permeabilización celular, la detección de los focos del VHC se llevó a cabo utilizando un anticuerpo primario sérico del paciente VHC positivo inactivado y una peroxidasa acoplada, un anticuerpo IgG humano específico del Fc. La reacción se reveló con el sustrato de la peroxidasa DAB. Los focos virales fueron, por lo tanto, teñidos de color marrón, lo que los hace fáciles de contar (ver Figura 1a ). Por lo tanto, los HDLs fueron capaces de facilitar la entrada de VHCpp y VHCcc a través de un mecanismo que dependía de la expresión del receptor BI (SR-BI) y su función selectiva de absorción de lípidos [11, 15, 16, 20]. En vista del papel del HDL en la entrada del VHC, las inmunoglobulinas fueron purificadas de cada muestra sérica antes de determinar el título de anticuerpos neutralizantes (ver Fig. 1b ). La especificidad del ensayo de neutralización del VHC fue evaluada mediante la prueba de 20 muestras anti-VHC-ELISA-negativas, incluyendo cinco positivas para anticuerpos de superficie del virus de la hepatitis B (anti-HBs) y cinco positivas para anticuerpos heterofílicos. Todas las muestras probadas negativas con dos ensayos comerciales de detección de anticuerpos anti-VHC (Axsym ® VHC Version 3.0, Abbott, Wiesbaden, Alemania; Vitros ® Anti-HCV Reagent Pack, Ortho-Clinical Diagnostic, High Wycombe, Reino Unido) y VHC-ARN negativo con un ensayo cualitativo y comercial (Cobas Amplicor VHC Test Version 2.0, Roche Diagnostics, Meylan, Francia). Estas muestras anti-VHC negativas se compararon con 11 muestras de pacientes infectados crónicamente con el genotipo 2 del VHC. Los títulos de neutralización de muestras séricas anti-VHC negativos se muestran en la figura 2., con un valor medio de 1.083 ± 0.083 (correspondiente a una dilución de 1:12). El ensayo mostró valores de especificidad y sensibilidad del 100% y del 96,5%, respectivamente.El ensayo no mostró ninguna reactividad cruzada con muestras positivas de anticuerpos anti-VIH, anti-HB o anti-heterofilos (datos no mostrados).A la inversa, las muestras positivas de genotipo 2 del VHC mostraron reacciones fuertes, con un valor medio de 2,128 ± 0,365 (correspondiente a una dilución de 1:134) (p < 0,001).La variabilidad inter-ensayo se determinó probando una muestra de genotipo 2 del VHC en 10 experimentos consecutivos (n = 10), mientras que la variabilidad intra-ensayo fue evaluada probando la misma muestra 10 veces (n = 10) en el mismo experimento, mientras se ejecutaba la serie de dilución.Los coeficientes intra-ensayo e inter-ensayo de variación (CV) de los títulos de neutralización de log Se evaluaron 57 muestras de anticuerpos VHC positivos utilizando el ensayo de neutralización de la reducción del enfoque del VHC; los genotipos se distribuyeron de la siguiente manera: para los tipos 1a, 1b, 2, 3, 4 y 5, se estudiaron 11, 11, 11, 11, 12, 10 y 2 muestras, respectivamente; los valores medios de los diferentes genotipos se muestran en la figura 3 y en la tabla 1 ; los títulos medios de neutralización de log para los genotipos 1a, 2 y 3 son muy similares (2,046 ± 0,671 para el genotipo 1a, 2,128 ± 0,365 para el genotipo 2 y 2,148 ± 0,478 para el genotipo 3); los valores medios son menores para el genotipo 1b (1,747 ± 0,462) y el genotipo 4 (1,786 ± 0,236); se observaron títulos he Hubo muy pocas muestras de genotipo 5 para compararlas con los otros genotipos, pero los resultados correspondientes indican que el ensayo de neutralización es adecuado para este genotipo. Los dos títulos de neutralización de logs en todas las muestras de ELISA y ARN positivos del VHC en función del genotipo del VHC se muestran en la Fig. 3b. Más del 60% de los títulos de anticuerpos neutralizantes cayeron en el rango de 1,7 a 2,69 títulos de log, correspondientes a diluciones de 1:50 y 1:500, respectivamente. En general, el 3,5% de las muestras mostraron un título mayor que el log 3.0 (1:1000) y, al contrario, el 3,5% mostraron un título por debajo del valor de corte, es decir, log 1,25 (1:10). Así, de 57 pacientes infectados por VHC, sólo dos no probaron positivo para neutralizar anticuerpos en este ensayo (los El papel de los anticuerpos neutralizantes durante la infección viral aguda y crónica sigue siendo una cuestión importante y ha generado resultados controvertidos. Inicialmente, se demostró que la presencia de anticuerpos neutralizantes controlaba la carga del VHC y contribuía a la erradicación viral en pacientes capaces de eliminar la infección [13]. En otros estudios, la aparición de anticuerpos neutralizantes se retrasó y se restringió a anticuerpos IgG1 en pacientes que desarrollan una infección crónica [2, 21]. El modelo de chimpancé ha sido crítico para el estudio de la transmisión del VHC y las respuestas inmunitarias del huésped; sin embargo, no se detectaron anticuerpos neutralizantes en algunos animales que resolvieron su infección -sugiriendo un papel mínimo en el aclaramiento viral, como también se observó en estudios humanos [14, 15]. Los chimpancés infectados experimentalmente y los humanos infectados naturalmente pueden ser reinfectados con cepas del VHC homólogas y heterólogas, lo que sugiere que la inmunidad humoral que se desarrolla después de la resolución espontánea de la hepatitis C aguda no esteriliza [22] [23] [24]. Durante la infección crónica en los seres humanos, la presencia y/o producción de anticuerpos neutralizantes no bastan para curar la infección, sino que podría regular la propagación del virus. Así, se puede postular que durante la infección crónica, los mutantes virales pueden escapar continuamente de la renovación de la producción de anticuerpos neutralizantes. Seudopartículas retrovirales se han utilizado para desarrollar una herramienta muy interesante para medir anticuerpos neutralizantes in vitro [14]. El ensayo ha demostrado la presencia de anticuerpos neutralizantes del VHC en sueros humanos con títulos relativamente altos (> 1:320) y una actividad Sin embargo, este modelo no representa genuinos viriones del VHC; en particular, se cree que el brote de partículas retrovirales es muy diferente y puede implicar una variedad de vías celulares. La caracterización de partículas pseudotipo retrovirales infecciosas que contienen glucoproteínas del VHC ha demostrado ser muy heterogénea, por lo que es posible que estas pseudopartículas no sean tan relevantes como las viriones nativas del VHC [25]. El reciente desarrollo de un modelo de cultivo celular para el VHC permite la producción de viriones nativas del VHC que pueden propagarse eficientemente en el cultivo celular [17] [18] [19]. Este sistema de cultivo celular nos ha permitido desarrollar un ensayo de neutralización para evaluar el nivel y la proporción de anticuerpos neutralizantes del VHC en pacientes con VHC crónicamente infectados. Analizamos una serie de parámetros (como la practicabilidad, la reproducibilidad y la especificidad) y probamos el efecto de una gama de variables (tamaño del inóculo viral, tiempo de incubación, métodos de fijación y permeabilidad, reactivos de bloqueo y revelación) sobre estos parámetros (datos no mostrados). En general, el ensayo de neutralización descrito en este estudio se realiza de manera similar a los ensayos de neutralización estandarizados para muchos otros virus [26] [27]. El ensayo se basa en la capacidad de la cepa viral específica genotipo 2 de JFH para replicarse y multiplicarse en una línea celular hepatoma humana Huh-7 en un modelo de cultivo celular, permitiendo la detección rápida de focos virales después de 72 horas de infección. Además, no se detectaron focos secundarios en este momento. La fijación con paraformaldehído y la permeabilización con Triton X-100 fueron elegidas para preservar la antigenicidad y evitar que la monocapa celular se desprendiera durante los lavados. El desarrollo con sustrato de peróxido de DAB facilitó el recuento de focos virales de color específico. El tamaño del inóculo viral es un parámetro importante; debe ser lo suficientemente bajo como para permitir una buena sensibilidad al ensayo pero lo suficientemente alto como para producir un número estadísticamente significativo de focos, es decir, permitir la reducción del número de focos (y por lo tanto el efecto de la neutralización). Así, se utilizaron 100 FUs como inóculo en este ensayo de neutralización. Para probar diferentes muestras humanas, tuvimos que tener en cuenta la capacidad de HDL para facilitar la entrada del VHCcc a través de un mecanismo que depende de la expresión del receptor de escavenger BI [11, 15 Dado el papel del HDL en la entrada del VHC, las inmunoglobulinas fueron purificadas de cada muestra sérica antes de determinar el título de anticuerpos neutralizantes; esto libera el ensayo del riesgo de actividad de neutralización inespecífica del suero a través de los efectos del HDL, el sistema de complemento y/o la proteína amiloide A sérica (SAA) [29]. El ensayo de neutralización del VHC mostró buena reproducibilidad, tanto para ensayos duplicados como para pruebas independientes. Como era de esperar, el coeficiente de variación intra-ensayo (CV) fue menor que el CV interensayo. La prueba también mostró una buena especificidad, ya que no hubo interacción con anticuerpos anti-VIH, anti-VHB o heterofílicos. Se encontraron títulos muy bajos con muestras ELISA del VHC y ARN negativos, y el corte del ensayo se determinó como el título medio para muestras negativas más dos desviaciones estándar (1,25 log, correspondiente a una dilución de 1:18). Dado que sólo la cepa JFH-1 del genotipo 2a del VHC estaba disponible para el ensayo, se evaluó el título de neutralización de sera de pacientes infectados crónicamente con otros genotipos del VHC, es decir, 1, 2, 3, 4 y 5. La mayoría de estos sera fueron detectados como positivos por el ensayo de neutralización, excepto para dos sera de pacientes infectados por el VHC genotipo 1; estas dos muestras presentaron una alta proporción de anticuerpos específicos según el estudio ELISA, pero sólo muy baja inhibición por neutralización (muy por debajo del corte, de hecho). Concluimos que o las muestras carecían de anticuerpos neutralizantes o que cualquiera de los anticuerpos presentes no se La sensibilidad fue del 100%, no sólo para el genotipo 2 (el genotipo de la cepa utilizada para el ensayo) sino también para otros genotipos del VHC (excepto el genotipo 1). También se midieron anticuerpos del VHC genotipo 5 pero hubo muy pocas muestras para pruebas precisas. Además, el sera positivo (96,5%) tenía títulos comparables y significativamente altos (1,99 ± 0,63), cualquiera que sea el genotipo. Este hallazgo sugiere que la mayoría de los anticuerpos neutralizantes son reactivas cruzadas. Otra posibilidad es que la mayoría de los pacientes habían sido previamente infectados por una cepa del genotipo 2; sin embargo, esto es improbable porque en Francia circulan pocas cepas del genotipo 2 [30]. Como se esperaba para una prueba de neutralización, el ensayo presentado en el presente estudio parecía ser muy específico (independientemente del genotipo) y utilizable Por lo tanto, estamos seguros de que a medida que otros genotipos del VHCcc estén disponibles, estos ensayos reemplazarán el ensayo de pseudopartículas en un futuro próximo, ya que probablemente sean más relevantes. Nuestro ensayo es algo lento y podría simplificarse utilizando una dilución para contar los focos; sin embargo, este tipo de "corte corto" haría difícil extrapolar a la dilución neutralizando el 50% del inóculo. Otro enfoque consistiría en utilizar VHC recombinante capaz de expresar genes reporteros (como la luciferasa) con el fin de utilizar una sola dilución y obtener un resultado cuantitativo [31]. Sin embargo, se necesitan estudios de neutralización adicionales utilizando otros genotipos para completar nuestras observaciones y para el ensayo de neutralización basado en cultivos celulares simples, específicos y reproducibles para la determinación de anticuerpos neutralizantes anti-VHC en sueros humanos. Esta prueba debe ser una herramienta importante para medir la relación entre la respuesta neutralizante y la cinética de la carga viral en pacientes infectados aguda y crónicamente. Las células hepatoma humanas Huh-7 [32] fueron cultivadas en el medio esencial mínimo de Dulbecco (Invitrogen) suplementado con 10% de suero fetal bovino. Todos los cultivos celulares se mantuvieron en 5% CO 2 a 37°C. El plásmido pJFH-1 que contiene el ADNc de largo alcance del aislado JFH-1 (que pertenece al subtipo 2a (adhesión del GenBank no. AB047639)), fue un regalo del Dr. Wakita (Departamento de Microbiología, Instituto Metropolitano de Tokio para Neurociencia, Tokio, Japón) y ha sido descrito previamente [17]. Para generar ARN VHC genómico, el plásmido pJFH-1 fue linealizado al final de 3' del VHC cDNA y utilizado como plantilla para la transcripción in vitro, como se describió anteriormente [33]. Las existencias virales se obtuvieron mediante la recolección de sobrenadantes del cultivo celular y congelándolos a -80°C. La titulación del virus se realizó en células Huh-7 con placas de microtitulado de 6 pocillos (Corning, NY) 72 horas después de la incubación, mediante inmunotenedumbre de las células con anticuerpos de un suero de paciente con VHC positivo que previamente había sido inactivado a 56°C (ver sección sobre el ensayo de neutralización del virus). El título viral se determinó por triplicado a partir del número medio de focos y se expresó como unidades de conformación focalización/mL (FFU/mL). Se probaron La recolección de los sueros fue aprobada por el Comité de Ética local y se obtuvo el consentimiento informado de los donantes. Cincuenta y siete de estas muestras fueron obtenidas de pacientes con VHC infectados crónicamente. La presencia de anticuerpos contra el VHC fue determinada y confirmada mediante dos ensayos de EIA del VHC de tercera generación (Axsym ® VHC Version 3.0, Abbott, Wiesbaden, Alemania y Vitros ® Reactivo Anti-VHC Pack, Ortho-Clinical Diagnostic, High Wycombe, Reino Unido). El ARN del VHC se determinó con un ensayo comercial cualitativo (Cobas Amplicior VHC Test Version 2.0, Roche Diagnostics, Meylan, Francia) y el genotipado del VHC se realizó mediante secuenciación directa, como se describe en otras partes [34]. Los genotipos se distribuyeron de la siguiente manera Se utilizó un conjunto de 20 muestras séricas anti-VHC negativas para evaluar la especificidad del ensayo, incluyendo cinco muestras séricas con anticuerpo positivo de la superficie del virus de la hepatitis B (anti-HBs) y cinco sueros de pacientes infectados por el virus de Epstein-Barr que habían dado positivo para anticuerpos heterófilos. Todas las muestras séricas se habían almacenado a -80°C en el momento de la recogida y no habían sido descongeladas hasta el momento del ensayo. La fracción de inmunoglobulinas serum G (IgG) fue purificada utilizando proteína G-Sefarosa (GE Healthcare, Orsay, Francia El ensayo de neutralización de la reducción del foco del VHC se realizó en placas microtitulares de 96 pocillos. Se establecieron diluciones seriales de IgG purificada (10 μg) de 1:10 a 1:1.280. 25 μL de cada muestra se mezclaron con 25 μL de virus (100 UFU) en placas de microtitular de 96well e incubaron durante 1 hora a 37°C, 5% CO 2. Se añadió un volumen de 100 μL de suspensión celular Huh-7 (10.000 células/pozo) en medio de cultivo y se incubaron durante 5 horas a 37°C, 5% CO2. Después de 5 horas, se extirparon los sobrenadantes y se añadieron 100 μL de medio de cultivo a las monocapas. Después de 72 horas, las células se fijaron con paraformaldehído y permeabilizaron con 0,5% Tritón X-100. El anticuerpo primario (un suero de paciente con VHC positivo inactivado a 56°C) se diluyó a 1:500 antes de su uso y luego se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente Un anticuerpo IgG antihumano específico de Fc acoplado a peroxidasa (Sigma, Saint Quentin Fallavier, Francia) diluido a 1:200 fue dispensado en la monocapa celular e incubado durante 30 minutos a temperatura ambiente. La reacción se desarrolló con sustrato de la peroxidasa DAB (Sigma, Saint Quentin Fallavier, Francia) y se detuvo después de 10 minutos de incubación con agua destilada. Se determinó el número de focos del VHC en cada dilución. Se incluyeron controles en cada ensayo (virus no neutralizado, IgG purificado de cada paciente en una dilución 1:10). La dilución que neutralizaba el 50% del virus se calculó mediante análisis de regresión curvilínea utilizando el software XLSTAT 2006 (Addinsoft SARL, París, Francia) [35]. Cada título fue determinado como valor logarítmico de la dilución de anticuerpos recíprocos que redujo el número de focos virales en un 50%; se expresaron como valores logarítmicos y se calcularon medias ± desviación estándar; se utilizó la prueba t del estudiante para comparar datos entre grupos; se consideraron significativos los valores de p por debajo de 0,05.

¿Qué tratamientos antivirales se utilizan para la infección por hepatitis C?

Relación entre hepcidina y oxidante/antioxidante en terneros con sospecha de septicemia neonatalhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5146304/SHA: efcd7d171bb51acf2ef0a631901900497957a3beAutores: Erkilic, E. E.; Erdogan, H. M.; Ogun, M.; Kirmizigul, A. H.; Gokce, E.; Kuru, M.; Kukurt, A. Fecha: 2016-11-14DOI: 10.14202/vetworld.2016.1238-1241Licencia: cc-byAbstract: AIM: Este estudio se ha realizado con el propósito de determinar la hepcidina sérica, el estado antioxidante total (TAS), el estado oxidante total (TOS), y los niveles de Fe en terneros con sospecha de septicemia neonatal antes y después del tratamiento y la importancia clínica de la hepcidina en terneros con sospecha de septicemia neonatal. MATERIALES Y MÉTODOS: El material del estudio consistió en 15 terneros de diferentes edades y sexos llevados al Centro de Capacitación, Investigación y Aplicación de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de Kafkas con sospecha de septicemia neonatal. 8,5 ml de sangre se extrajo de la vena yugular de cada animal en tubos coagulantes antes y después del tratamiento para análisis Se midieron los niveles séricos de hepcidina, TAS, TOS y Fe. RESULTADOS: Si bien los niveles de hepcidina pretratamiento fueron 58,42±3,46 ng/ml, los niveles postratamiento fueron 46,87±2,98 ng/ml (p<0,05). Los niveles de Fe pretratamiento fueron 60,13±7,27 μg/dl, mientras que los niveles posttratamiento fueron 83,1±8,09 μg/dl (p<0,05). Los cambios en los niveles de TAS y TOS también se encontraron estadísticamente significativos. CONCLUSIÓN: A la luz del hecho de que la hepcidina desempeña una función en la regulación de Fe, así como el hecho de que Fe es una fuente nutricional significativa para muchos microorganismos, se concluyó que la hepcidina puede desempeñar un papel significativo en la inmunidad nutricional y la patogénesis de las enfermedades. Texto: La septicemia del ternero neonatal causa alta morbilidad y mortalidad y es una de las principales y más significativas dificultades en la cría de ganado bovino. La septicemia del ternero es la principal causa de muerte en el período neonatal [1]. Su etiología implica bacterias (comúnmente Escherichia coli), virus (rota y coronavirus), parásitos y otros factores. A medida que la enfermedad progresa rápidamente y es letal, el diagnóstico y el tratamiento deben iniciarse lo más rápidamente posible [2]. La hepcidina es una hormona péptida antimicrobiana de bajo peso molecular y fue descubierta por primera vez en orina humana [3]. Es producida por el hígado como respuesta de primera línea a las reacciones inflamatorias y a las concentraciones elevadas de Fe [4, 5]. La hepcidina desempeña un papel fundamental en la regulación del metabolismo del Fe [6], que es parte de las funciones celulares Por otro lado, al participar en reacciones redox que conducen a la producción de especies reactivas de oxígeno (ROSs), Fe también causa estrés oxidativo. Por lo tanto, Fe ha sido considerado como un elemento potencialmente tóxico para las células [7]. Fe también juega un papel importante en la patogénesis de infecciones bacterianas ya que las bacterias utilizan Fe para la supervivencia, el crecimiento y la proliferación; por lo tanto, es de suma importancia controlar el metabolismo de Fe [6]. Es bien sabido que la abundancia de Fe suprime el sistema de defensa que conduce al huésped vulnerable a infecciones. Existe una relación significativa entre Hepcidina, Fe metabolismo, inflamación y el sistema inmunológico. El hecho de que la hepcidina juega un papel activo en la regulación de la liberación de Fe de macrófagos y en el control de la absorción excesiva de Fe del duodeno está bien documentado [6]. La hepcidina es parte del mecanismo En condiciones inflamatorias, la hipoferremia es un importante mecanismo protector de primera línea en respuesta a infecciones [9]. Fe también participa en reacciones redox, causando la producción de ROS, y por lo tanto conduce a estrés oxidativo [7]. Los radicales libres juegan un papel significativo en la patogénesis de muchas enfermedades [10]. Los recién nacidos están sujetos a estrés oxidativo durante el nacimiento. También se reporta que en enfermedades del ganado, especialmente enteritis y neumonía, la capacidad antioxidante es eficaz [11]. Este estudio fue diseñado para determinar la importancia clínica de la hepcidina en terneros con sospecha de septicemia neonatal mediante la evaluación de hepcidina sérica, estado antioxidante total (TAS), estado oxidante total (TOS) y niveles de Fe en terneros sospechosos de septicemia neonatal antes y después del tratamiento. Este estudio se realizó después de obtener la aprobación del Comité de Ética Local de los Experimentos con Animales de la Universidad Mehmet Akif Ersoy (MAKU-HADYEK-Submission: 2014/77), compuesto por 15 terneros con sospecha de septicemia neonatal de entre 1 y 10 días de edad ingresados en el Hospital de Enseñanza de Medicina Veterinaria. Se diagnosticó septicemia sospechosa basada en exámenes clínicos (diarrea, debilidad o ausencia de reflejo de succión, el ternero en posición supina sobre el suelo o incapaz de permanecer en pie, deshidratación severa, temperatura rectal anormal [hipotermia], hiperemia mucosa y esclerótica completa) y hematológicos (aumento del recuento de glóbulos blancos [BC]); se sospechó que los animales tenían septicemia [12, 13]. Los animales recibieron tratamiento estándar (antibióticos, Para la determinación de la hepcidina sérica, TAS, TOS, Fe y parámetros hematológicos se tomaron muestras de sangre antes y después del tratamiento en todos los casos. 8,5 ml de sangre se tomaron de la vena yugular de cada animal en tubos coagulantes para el análisis bioquímico, y 3 ml de sangre se tomaron en tubos ETDA para el análisis hematológico. Se centrifugaron muestras a 3000 rpm durante 10 min, y el suero fue recolectado y mantenido a −20 °C hasta el análisis. Hepcidina sérica (Mybiosource ® ), TAS (Rel Assay Diagnostics ® ) y TOS (Rel Assay Diagnostics ® ) se determinaron utilizando kits ELISA comerciales, y el valor Fe se midió espectrofotométricamente. El análisis hematológico (BCM, linfocitos [LYM], glóbulos rojos [RBC], volumen corpuscular medio (VCM) y hematocrito [HCT]) se realizó en el contador de sangre (VG-MS4e ®, Melet Schloesıng, Francia). Los resultados se evaluaron utilizando la prueba t en el programa estadístico SPSS ® (SPSS 20, EE.UU.) para determinar las diferencias entre los valores antes y después del tratamiento. Los terneros con septicemia sospechada mostraron signos clínicos de pérdida de apetito, fatiga, indiferencia hacia el entorno, disminución/ausencia de reflejos de succión, extremidades frías, incapacidad de estar de pie, diarrea, hundimiento ocular en sus cuencas e hiperemia en la conjuntiva. El promedio de temperatura corporal, frecuencia cardíaca y frecuencia respiratoria de los animales fue de 37,18±0,13°C, 104±4,33/min y 28,86±0,75/min pre-tratamiento; y 38,54±0,10°C, 107,53±2,20/min y 26,40±0,36/min post-tratamiento, respectivamente; los cambios en los niveles de hepcidina, TAS, TOS y Fe en terneros con sospecha de septicemia antes y después del tratamiento se dan en la Tabla 1. Después del tratamiento, los niveles séricos de hepcidina y TOS fueron significativamente más bajos que antes del tratamiento en terneros; por el contrario, los niveles séricos de TAS y Fe fueron significativamente más altos que antes del tratamiento (Tabla 1 ). El tratamiento de terneros dio lugar a cambios significativos en los parámetros hematológicos que se examinaron excepto en el caso de El objetivo de este estudio fue determinar la importancia clínica o el uso de la hepcidina comparando los valores de los niveles séricos de hepcidina, TAS, TOS y Fe en terneros con sospecha de septicemia neonatal antes y después del tratamiento. Los médicos confían en los exámenes clínicos y de laboratorio de los pacientes para formar un diagnóstico de trabajo, por lo que los parámetros hematológicos y bioquímicos séricos se suelen utilizar para este propósito [14]. Los parámetros hematológicos (WBC, HCT, LYM y MCV) evaluados en este estudio fueron comparables con los reportados por otros en terneros neonatales con diarrea y sospecha de septicemia [15] [16] [17]. El tratamiento se corrigió significativamente a valores normales los parámetros hematológicos que se examinaron con excepción de la RBC. El recuento de leucocitos pretratamiento fue alto debido a la La hepcidina está controlada por la presencia de inflamación en el cuerpo, el almacenamiento de Fe y la actividad eritropoyética en la médula ósea y desempeña un papel primordial en la homeostasis de Fe [4]. El aumento de los niveles plasmáticos y tisulares de Fe estimula la síntesis de hepcidina y reduce la liberación de Fe y la absorción entérica de Fe de macrófagos y hepatocitos [18]. El aumento de las concentraciones de hepcidina durante la inflamación e infección reduce los niveles séricos de Fe al disminuir la liberación de Fe de macrófagos y hepatocitos, y por lo tanto la Fe necesaria para microorganismos y células tumorales está restringida [19]. Los niveles séricos de hepcidina en terneros con sospecha de septicemia fueron significativamente elevados antes del tratamiento en comparación con después del tratamiento; también los niveles fe fueron inferiores antes del Esta situación podría estar relacionada con la interacción entre hepcidina y Fe y también da crédito al papel de la hepcidina en la hemostasia de Fe durante la inflamación e infección. Como en nuestro estudio, los niveles de Fe son bien conocidos por disminuir en terneros diarreicos en comparación con terneros sanos [20, 21]. Aunque no existe ningún estudio que reporte la concentración de hepcidina en terneros enfermos, los estudios en sujetos humanos muestran que los niveles de hepcidina en sangre del cordón umbilical podrían ser un indicador importante para diagnosticar el inicio temprano de la sepsis neonatal. Los niveles de hepcidina en sangre del cordón umbilical de lactantes con sepsis variaban entre 118,1 y 8400 ng/mL y eran significativamente más altos que los de lactantes sanos [22]. Estos hallazgos junto con nuestros resultados añaden credibilidad a la idea de que la interacción hepcidina-Fe puede jugar un papel en la patogénesis de la septicemia. La producción de especies libres de oxígeno causa alteraciones en las proteínas, los lípidos y el ADN durante el estrés oxidativo y conduce al desarrollo de lesiones en los órganos [24]. El hierro libre tiene características tóxicas ya que cataliza la producción de ROS [25] y por lo tanto causa estrés oxidativo [26]. El papel de Fe en el desarrollo de estrés oxidativo puede mostrar una vez más la importancia de la hepcidina, como importante regulador de la Fe, con respecto al aumento de la capacidad antioxidante mediante la inhibición de la utilización de Fe por el organismo así como las células huésped. El sistema antioxidante y oxidativo están en un estado constante de equilibrio en el organismo. Cualquier evento que rompa este equilibrio en favor de las moléculas de Las células huésped inician el sistema antioxidante en caso de exposición a estrés oxidativo [27]. Kabu et al. [16] notificaron valores TOS y TAS en terneros neonatales con diarrea como 13,47±0,81 μmol H 2 O 2 /L y 0,51±0,02 mmol Trolox equivalente/L, respectivamente, y el tratamiento de estos terneros causó cambios en estos valores de 11,21±0,26 μmol H 2 O 2 /L y 0,55±0,02 mmol Troloxequivalente/L, respectivamente. Los estudios también informaron que los parámetros utilizados para el estrés oxidativo (malondialdehído) fueron más altos [29] y los parámetros antioxidantes (superóxido dismutasa [21], TAS) fueron más bajos en terneros diarreicos [29]. La disminución de los niveles de TAS y el aumento de los niveles de TOS demostraron que el estrés oxidativo era evidente en los terneros enfermos en nuestro estudio. El aumento de los niveles de TOS y hepcidina antes del tratamiento se considera asociado a la inflamación. Después del tratamiento, el aumento de los niveles de TAS y la disminución de los niveles de hepcidina apoyan esta opinión. La hepcidina puede desempeñar un papel importante en la inmunidad no específica y es una molécula clave que juega un papel en la patogénesis de las enfermedades al mejorar el desarrollo del sistema antioxidante. Sin embargo, se necesitan estudios más detallados sobre el papel de la hepcidina en la patogénesis de la septicemia. Este trabajo se llevó a cabo en colaboración con todos los autores. EEE, HME y AHK: Diseñó los procedimientos experimentales. EEE, EG y MK: Realizaron el trabajo de investigación. EE

¿Dónde se descubrió por primera vez la hepcidina?

Relación entre hepcidina y oxidante/antioxidante en terneros con sospecha de septicemia neonatalhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5146304/SHA: efcd7d171bb51acf2ef0a631901900497957a3beAutores: Erkilic, E. E.; Erdogan, H. M.; Ogun, M.; Kirmizigul, A. H.; Gokce, E.; Kuru, M.; Kukurt, A. Fecha: 2016-11-14DOI: 10.14202/vetworld.2016.1238-1241Licencia: cc-byAbstract: AIM: Este estudio se ha realizado con el propósito de determinar la hepcidina sérica, el estado antioxidante total (TAS), el estado oxidante total (TOS), y los niveles de Fe en terneros con sospecha de septicemia neonatal antes y después del tratamiento y la importancia clínica de la hepcidina en terneros con sospecha de septicemia neonatal. MATERIALES Y MÉTODOS: El material del estudio consistió en 15 terneros de diferentes edades y sexos llevados al Centro de Capacitación, Investigación y Aplicación de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de Kafkas con sospecha de septicemia neonatal. 8,5 ml de sangre se extrajo de la vena yugular de cada animal en tubos coagulantes antes y después del tratamiento para análisis Se midieron los niveles séricos de hepcidina, TAS, TOS y Fe. RESULTADOS: Si bien los niveles de hepcidina pretratamiento fueron 58,42±3,46 ng/ml, los niveles postratamiento fueron 46,87±2,98 ng/ml (p<0,05). Los niveles de Fe pretratamiento fueron 60,13±7,27 μg/dl, mientras que los niveles posttratamiento fueron 83,1±8,09 μg/dl (p<0,05). Los cambios en los niveles de TAS y TOS también se encontraron estadísticamente significativos. CONCLUSIÓN: A la luz del hecho de que la hepcidina desempeña una función en la regulación de Fe, así como el hecho de que Fe es una fuente nutricional significativa para muchos microorganismos, se concluyó que la hepcidina puede desempeñar un papel significativo en la inmunidad nutricional y la patogénesis de las enfermedades. Texto: La septicemia del ternero neonatal causa alta morbilidad y mortalidad y es una de las principales y más significativas dificultades en la cría de ganado bovino. La septicemia del ternero es la principal causa de muerte en el período neonatal [1]. Su etiología implica bacterias (comúnmente Escherichia coli), virus (rota y coronavirus), parásitos y otros factores. A medida que la enfermedad progresa rápidamente y es letal, el diagnóstico y el tratamiento deben iniciarse lo más rápidamente posible [2]. La hepcidina es una hormona péptida antimicrobiana de bajo peso molecular y fue descubierta por primera vez en orina humana [3]. Es producida por el hígado como respuesta de primera línea a las reacciones inflamatorias y a las concentraciones elevadas de Fe [4, 5]. La hepcidina desempeña un papel fundamental en la regulación del metabolismo del Fe [6], que es parte de las funciones celulares Por otro lado, al participar en reacciones redox que conducen a la producción de especies reactivas de oxígeno (ROSs), Fe también causa estrés oxidativo. Por lo tanto, Fe ha sido considerado como un elemento potencialmente tóxico para las células [7]. Fe también juega un papel importante en la patogénesis de infecciones bacterianas ya que las bacterias utilizan Fe para la supervivencia, el crecimiento y la proliferación; por lo tanto, es de suma importancia controlar el metabolismo de Fe [6]. Es bien sabido que la abundancia de Fe suprime el sistema de defensa que conduce al huésped vulnerable a infecciones. Existe una relación significativa entre Hepcidina, Fe metabolismo, inflamación y el sistema inmunológico. El hecho de que la hepcidina juega un papel activo en la regulación de la liberación de Fe de macrófagos y en el control de la absorción excesiva de Fe del duodeno está bien documentado [6]. La hepcidina es parte del mecanismo En condiciones inflamatorias, la hipoferremia es un importante mecanismo protector de primera línea en respuesta a infecciones [9]. Fe también participa en reacciones redox, causando la producción de ROS, y por lo tanto conduce a estrés oxidativo [7]. Los radicales libres juegan un papel significativo en la patogénesis de muchas enfermedades [10]. Los recién nacidos están sujetos a estrés oxidativo durante el nacimiento. También se reporta que en enfermedades del ganado, especialmente enteritis y neumonía, la capacidad antioxidante es eficaz [11]. Este estudio fue diseñado para determinar la importancia clínica de la hepcidina en terneros con sospecha de septicemia neonatal mediante la evaluación de hepcidina sérica, estado antioxidante total (TAS), estado oxidante total (TOS) y niveles de Fe en terneros sospechosos de septicemia neonatal antes y después del tratamiento. Este estudio se realizó después de obtener la aprobación del Comité de Ética Local de los Experimentos con Animales de la Universidad Mehmet Akif Ersoy (MAKU-HADYEK-Submission: 2014/77), compuesto por 15 terneros con sospecha de septicemia neonatal de entre 1 y 10 días de edad ingresados en el Hospital de Enseñanza de Medicina Veterinaria. Se diagnosticó septicemia sospechosa basada en exámenes clínicos (diarrea, debilidad o ausencia de reflejo de succión, el ternero en posición supina sobre el suelo o incapaz de permanecer en pie, deshidratación severa, temperatura rectal anormal [hipotermia], hiperemia mucosa y esclerótica completa) y hematológicos (aumento del recuento de glóbulos blancos [BC]); se sospechó que los animales tenían septicemia [12, 13]. Los animales recibieron tratamiento estándar (antibióticos, Para la determinación de la hepcidina sérica, TAS, TOS, Fe y parámetros hematológicos se tomaron muestras de sangre antes y después del tratamiento en todos los casos. 8,5 ml de sangre se tomaron de la vena yugular de cada animal en tubos coagulantes para el análisis bioquímico, y 3 ml de sangre se tomaron en tubos ETDA para el análisis hematológico. Se centrifugaron muestras a 3000 rpm durante 10 min, y el suero fue recolectado y mantenido a −20 °C hasta el análisis. Hepcidina sérica (Mybiosource ® ), TAS (Rel Assay Diagnostics ® ) y TOS (Rel Assay Diagnostics ® ) se determinaron utilizando kits ELISA comerciales, y el valor Fe se midió espectrofotométricamente. El análisis hematológico (BCM, linfocitos [LYM], glóbulos rojos [RBC], volumen corpuscular medio (VCM) y hematocrito [HCT]) se realizó en el contador de sangre (VG-MS4e ®, Melet Schloesıng, Francia). Los resultados se evaluaron utilizando la prueba t en el programa estadístico SPSS ® (SPSS 20, EE.UU.) para determinar las diferencias entre los valores antes y después del tratamiento. Los terneros con septicemia sospechada mostraron signos clínicos de pérdida de apetito, fatiga, indiferencia hacia el entorno, disminución/ausencia de reflejos de succión, extremidades frías, incapacidad de estar de pie, diarrea, hundimiento ocular en sus cuencas e hiperemia en la conjuntiva. El promedio de temperatura corporal, frecuencia cardíaca y frecuencia respiratoria de los animales fue de 37,18±0,13°C, 104±4,33/min y 28,86±0,75/min pre-tratamiento; y 38,54±0,10°C, 107,53±2,20/min y 26,40±0,36/min post-tratamiento, respectivamente; los cambios en los niveles de hepcidina, TAS, TOS y Fe en terneros con sospecha de septicemia antes y después del tratamiento se dan en la Tabla 1. Después del tratamiento, los niveles séricos de hepcidina y TOS fueron significativamente más bajos que antes del tratamiento en terneros; por el contrario, los niveles séricos de TAS y Fe fueron significativamente más altos que antes del tratamiento (Tabla 1 ). El tratamiento de terneros dio lugar a cambios significativos en los parámetros hematológicos que se examinaron excepto en el caso de El objetivo de este estudio fue determinar la importancia clínica o el uso de la hepcidina comparando los valores de los niveles séricos de hepcidina, TAS, TOS y Fe en terneros con sospecha de septicemia neonatal antes y después del tratamiento. Los médicos confían en los exámenes clínicos y de laboratorio de los pacientes para formar un diagnóstico de trabajo, por lo que los parámetros hematológicos y bioquímicos séricos se suelen utilizar para este propósito [14]. Los parámetros hematológicos (WBC, HCT, LYM y MCV) evaluados en este estudio fueron comparables con los reportados por otros en terneros neonatales con diarrea y sospecha de septicemia [15] [16] [17]. El tratamiento se corrigió significativamente a valores normales los parámetros hematológicos que se examinaron con excepción de la RBC. El recuento de leucocitos pretratamiento fue alto debido a la La hepcidina está controlada por la presencia de inflamación en el cuerpo, el almacenamiento de Fe y la actividad eritropoyética en la médula ósea y desempeña un papel primordial en la homeostasis de Fe [4]. El aumento de los niveles plasmáticos y tisulares de Fe estimula la síntesis de hepcidina y reduce la liberación de Fe y la absorción entérica de Fe de macrófagos y hepatocitos [18]. El aumento de las concentraciones de hepcidina durante la inflamación e infección reduce los niveles séricos de Fe al disminuir la liberación de Fe de macrófagos y hepatocitos, y por lo tanto la Fe necesaria para microorganismos y células tumorales está restringida [19]. Los niveles séricos de hepcidina en terneros con sospecha de septicemia fueron significativamente elevados antes del tratamiento en comparación con después del tratamiento; también los niveles fe fueron inferiores antes del Esta situación podría estar relacionada con la interacción entre hepcidina y Fe y también da crédito al papel de la hepcidina en la hemostasia de Fe durante la inflamación e infección. Como en nuestro estudio, los niveles de Fe son bien conocidos por disminuir en terneros diarreicos en comparación con terneros sanos [20, 21]. Aunque no existe ningún estudio que reporte la concentración de hepcidina en terneros enfermos, los estudios en sujetos humanos muestran que los niveles de hepcidina en sangre del cordón umbilical podrían ser un indicador importante para diagnosticar el inicio temprano de la sepsis neonatal. Los niveles de hepcidina en sangre del cordón umbilical de lactantes con sepsis variaban entre 118,1 y 8400 ng/mL y eran significativamente más altos que los de lactantes sanos [22]. Estos hallazgos junto con nuestros resultados añaden credibilidad a la idea de que la interacción hepcidina-Fe puede jugar un papel en la patogénesis de la septicemia. La producción de especies libres de oxígeno causa alteraciones en las proteínas, los lípidos y el ADN durante el estrés oxidativo y conduce al desarrollo de lesiones en los órganos [24]. El hierro libre tiene características tóxicas ya que cataliza la producción de ROS [25] y por lo tanto causa estrés oxidativo [26]. El papel de Fe en el desarrollo de estrés oxidativo puede mostrar una vez más la importancia de la hepcidina, como importante regulador de la Fe, con respecto al aumento de la capacidad antioxidante mediante la inhibición de la utilización de Fe por el organismo así como las células huésped. El sistema antioxidante y oxidativo están en un estado constante de equilibrio en el organismo. Cualquier evento que rompa este equilibrio en favor de las moléculas de Las células huésped inician el sistema antioxidante en caso de exposición a estrés oxidativo [27]. Kabu et al. [16] notificaron valores TOS y TAS en terneros neonatales con diarrea como 13,47±0,81 μmol H 2 O 2 /L y 0,51±0,02 mmol Trolox equivalente/L, respectivamente, y el tratamiento de estos terneros causó cambios en estos valores de 11,21±0,26 μmol H 2 O 2 /L y 0,55±0,02 mmol Troloxequivalente/L, respectivamente. Los estudios también informaron que los parámetros utilizados para el estrés oxidativo (malondialdehído) fueron más altos [29] y los parámetros antioxidantes (superóxido dismutasa [21], TAS) fueron más bajos en terneros diarreicos [29]. La disminución de los niveles de TAS y el aumento de los niveles de TOS demostraron que el estrés oxidativo era evidente en los terneros enfermos en nuestro estudio. El aumento de los niveles de TOS y hepcidina antes del tratamiento se considera asociado a la inflamación. Después del tratamiento, el aumento de los niveles de TAS y la disminución de los niveles de hepcidina apoyan esta opinión. La hepcidina puede desempeñar un papel importante en la inmunidad no específica y es una molécula clave que juega un papel en la patogénesis de las enfermedades al mejorar el desarrollo del sistema antioxidante. Sin embargo, se necesitan estudios más detallados sobre el papel de la hepcidina en la patogénesis de la septicemia. Este trabajo se llevó a cabo en colaboración con todos los autores. EEE, HME y AHK: Diseñó los procedimientos experimentales. EEE, EG y MK: Realizaron el trabajo de investigación. EE

¿Qué órgano produce hepcidina?

Relación entre hepcidina y oxidante/antioxidante en terneros con sospecha de septicemia neonatalhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5146304/SHA: efcd7d171bb51acf2ef0a631901900497957a3beAutores: Erkilic, E. E.; Erdogan, H. M.; Ogun, M.; Kirmizigul, A. H.; Gokce, E.; Kuru, M.; Kukurt, A. Fecha: 2016-11-14DOI: 10.14202/vetworld.2016.1238-1241Licencia: cc-byAbstract: AIM: Este estudio se ha realizado con el propósito de determinar la hepcidina sérica, el estado antioxidante total (TAS), el estado oxidante total (TOS), y los niveles de Fe en terneros con sospecha de septicemia neonatal antes y después del tratamiento y la importancia clínica de la hepcidina en terneros con sospecha de septicemia neonatal. MATERIALES Y MÉTODOS: El material del estudio consistió en 15 terneros de diferentes edades y sexos llevados al Centro de Capacitación, Investigación y Aplicación de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de Kafkas con sospecha de septicemia neonatal. 8,5 ml de sangre se extrajo de la vena yugular de cada animal en tubos coagulantes antes y después del tratamiento para análisis Se midieron los niveles séricos de hepcidina, TAS, TOS y Fe. RESULTADOS: Si bien los niveles de hepcidina pretratamiento fueron 58,42±3,46 ng/ml, los niveles postratamiento fueron 46,87±2,98 ng/ml (p<0,05). Los niveles de Fe pretratamiento fueron 60,13±7,27 μg/dl, mientras que los niveles posttratamiento fueron 83,1±8,09 μg/dl (p<0,05). Los cambios en los niveles de TAS y TOS también se encontraron estadísticamente significativos. CONCLUSIÓN: A la luz del hecho de que la hepcidina desempeña una función en la regulación de Fe, así como el hecho de que Fe es una fuente nutricional significativa para muchos microorganismos, se concluyó que la hepcidina puede desempeñar un papel significativo en la inmunidad nutricional y la patogénesis de las enfermedades. Texto: La septicemia del ternero neonatal causa alta morbilidad y mortalidad y es una de las principales y más significativas dificultades en la cría de ganado bovino. La septicemia del ternero es la principal causa de muerte en el período neonatal [1]. Su etiología implica bacterias (comúnmente Escherichia coli), virus (rota y coronavirus), parásitos y otros factores. A medida que la enfermedad progresa rápidamente y es letal, el diagnóstico y el tratamiento deben iniciarse lo más rápidamente posible [2]. La hepcidina es una hormona péptida antimicrobiana de bajo peso molecular y fue descubierta por primera vez en orina humana [3]. Es producida por el hígado como respuesta de primera línea a las reacciones inflamatorias y a las concentraciones elevadas de Fe [4, 5]. La hepcidina desempeña un papel fundamental en la regulación del metabolismo del Fe [6], que es parte de las funciones celulares Por otro lado, al participar en reacciones redox que conducen a la producción de especies reactivas de oxígeno (ROSs), Fe también causa estrés oxidativo. Por lo tanto, Fe ha sido considerado como un elemento potencialmente tóxico para las células [7]. Fe también juega un papel importante en la patogénesis de infecciones bacterianas ya que las bacterias utilizan Fe para la supervivencia, el crecimiento y la proliferación; por lo tanto, es de suma importancia controlar el metabolismo de Fe [6]. Es bien sabido que la abundancia de Fe suprime el sistema de defensa que conduce al huésped vulnerable a infecciones. Existe una relación significativa entre Hepcidina, Fe metabolismo, inflamación y el sistema inmunológico. El hecho de que la hepcidina juega un papel activo en la regulación de la liberación de Fe de macrófagos y en el control de la absorción excesiva de Fe del duodeno está bien documentado [6]. La hepcidina es parte del mecanismo En condiciones inflamatorias, la hipoferremia es un importante mecanismo protector de primera línea en respuesta a infecciones [9]. Fe también participa en reacciones redox, causando la producción de ROS, y por lo tanto conduce a estrés oxidativo [7]. Los radicales libres juegan un papel significativo en la patogénesis de muchas enfermedades [10]. Los recién nacidos están sujetos a estrés oxidativo durante el nacimiento. También se reporta que en enfermedades del ganado, especialmente enteritis y neumonía, la capacidad antioxidante es eficaz [11]. Este estudio fue diseñado para determinar la importancia clínica de la hepcidina en terneros con sospecha de septicemia neonatal mediante la evaluación de hepcidina sérica, estado antioxidante total (TAS), estado oxidante total (TOS) y niveles de Fe en terneros sospechosos de septicemia neonatal antes y después del tratamiento. Este estudio se realizó después de obtener la aprobación del Comité de Ética Local de los Experimentos con Animales de la Universidad Mehmet Akif Ersoy (MAKU-HADYEK-Submission: 2014/77), compuesto por 15 terneros con sospecha de septicemia neonatal de entre 1 y 10 días de edad ingresados en el Hospital de Enseñanza de Medicina Veterinaria. Se diagnosticó septicemia sospechosa basada en exámenes clínicos (diarrea, debilidad o ausencia de reflejo de succión, el ternero en posición supina sobre el suelo o incapaz de permanecer en pie, deshidratación severa, temperatura rectal anormal [hipotermia], hiperemia mucosa y esclerótica completa) y hematológicos (aumento del recuento de glóbulos blancos [BC]); se sospechó que los animales tenían septicemia [12, 13]. Los animales recibieron tratamiento estándar (antibióticos, Para la determinación de la hepcidina sérica, TAS, TOS, Fe y parámetros hematológicos se tomaron muestras de sangre antes y después del tratamiento en todos los casos. 8,5 ml de sangre se tomaron de la vena yugular de cada animal en tubos coagulantes para el análisis bioquímico, y 3 ml de sangre se tomaron en tubos ETDA para el análisis hematológico. Se centrifugaron muestras a 3000 rpm durante 10 min, y el suero fue recolectado y mantenido a −20 °C hasta el análisis. Hepcidina sérica (Mybiosource ® ), TAS (Rel Assay Diagnostics ® ) y TOS (Rel Assay Diagnostics ® ) se determinaron utilizando kits ELISA comerciales, y el valor Fe se midió espectrofotométricamente. El análisis hematológico (BCM, linfocitos [LYM], glóbulos rojos [RBC], volumen corpuscular medio (VCM) y hematocrito [HCT]) se realizó en el contador de sangre (VG-MS4e ®, Melet Schloesıng, Francia). Los resultados se evaluaron utilizando la prueba t en el programa estadístico SPSS ® (SPSS 20, EE.UU.) para determinar las diferencias entre los valores antes y después del tratamiento. Los terneros con septicemia sospechada mostraron signos clínicos de pérdida de apetito, fatiga, indiferencia hacia el entorno, disminución/ausencia de reflejos de succión, extremidades frías, incapacidad de estar de pie, diarrea, hundimiento ocular en sus cuencas e hiperemia en la conjuntiva. El promedio de temperatura corporal, frecuencia cardíaca y frecuencia respiratoria de los animales fue de 37,18±0,13°C, 104±4,33/min y 28,86±0,75/min pre-tratamiento; y 38,54±0,10°C, 107,53±2,20/min y 26,40±0,36/min post-tratamiento, respectivamente; los cambios en los niveles de hepcidina, TAS, TOS y Fe en terneros con sospecha de septicemia antes y después del tratamiento se dan en la Tabla 1. Después del tratamiento, los niveles séricos de hepcidina y TOS fueron significativamente más bajos que antes del tratamiento en terneros; por el contrario, los niveles séricos de TAS y Fe fueron significativamente más altos que antes del tratamiento (Tabla 1 ). El tratamiento de terneros dio lugar a cambios significativos en los parámetros hematológicos que se examinaron excepto en el caso de El objetivo de este estudio fue determinar la importancia clínica o el uso de la hepcidina comparando los valores de los niveles séricos de hepcidina, TAS, TOS y Fe en terneros con sospecha de septicemia neonatal antes y después del tratamiento. Los médicos confían en los exámenes clínicos y de laboratorio de los pacientes para formar un diagnóstico de trabajo, por lo que los parámetros hematológicos y bioquímicos séricos se suelen utilizar para este propósito [14]. Los parámetros hematológicos (WBC, HCT, LYM y MCV) evaluados en este estudio fueron comparables con los reportados por otros en terneros neonatales con diarrea y sospecha de septicemia [15] [16] [17]. El tratamiento se corrigió significativamente a valores normales los parámetros hematológicos que se examinaron con excepción de la RBC. El recuento de leucocitos pretratamiento fue alto debido a la La hepcidina está controlada por la presencia de inflamación en el cuerpo, el almacenamiento de Fe y la actividad eritropoyética en la médula ósea y desempeña un papel primordial en la homeostasis de Fe [4]. El aumento de los niveles plasmáticos y tisulares de Fe estimula la síntesis de hepcidina y reduce la liberación de Fe y la absorción entérica de Fe de macrófagos y hepatocitos [18]. El aumento de las concentraciones de hepcidina durante la inflamación e infección reduce los niveles séricos de Fe al disminuir la liberación de Fe de macrófagos y hepatocitos, y por lo tanto la Fe necesaria para microorganismos y células tumorales está restringida [19]. Los niveles séricos de hepcidina en terneros con sospecha de septicemia fueron significativamente elevados antes del tratamiento en comparación con después del tratamiento; también los niveles fe fueron inferiores antes del Esta situación podría estar relacionada con la interacción entre hepcidina y Fe y también da crédito al papel de la hepcidina en la hemostasia de Fe durante la inflamación e infección. Como en nuestro estudio, los niveles de Fe son bien conocidos por disminuir en terneros diarreicos en comparación con terneros sanos [20, 21]. Aunque no existe ningún estudio que reporte la concentración de hepcidina en terneros enfermos, los estudios en sujetos humanos muestran que los niveles de hepcidina en sangre del cordón umbilical podrían ser un indicador importante para diagnosticar el inicio temprano de la sepsis neonatal. Los niveles de hepcidina en sangre del cordón umbilical de lactantes con sepsis variaban entre 118,1 y 8400 ng/mL y eran significativamente más altos que los de lactantes sanos [22]. Estos hallazgos junto con nuestros resultados añaden credibilidad a la idea de que la interacción hepcidina-Fe puede jugar un papel en la patogénesis de la septicemia. La producción de especies libres de oxígeno causa alteraciones en las proteínas, los lípidos y el ADN durante el estrés oxidativo y conduce al desarrollo de lesiones en los órganos [24]. El hierro libre tiene características tóxicas ya que cataliza la producción de ROS [25] y por lo tanto causa estrés oxidativo [26]. El papel de Fe en el desarrollo de estrés oxidativo puede mostrar una vez más la importancia de la hepcidina, como importante regulador de la Fe, con respecto al aumento de la capacidad antioxidante mediante la inhibición de la utilización de Fe por el organismo así como las células huésped. El sistema antioxidante y oxidativo están en un estado constante de equilibrio en el organismo. Cualquier evento que rompa este equilibrio en favor de las moléculas de Las células huésped inician el sistema antioxidante en caso de exposición a estrés oxidativo [27]. Kabu et al. [16] notificaron valores TOS y TAS en terneros neonatales con diarrea como 13,47±0,81 μmol H 2 O 2 /L y 0,51±0,02 mmol Trolox equivalente/L, respectivamente, y el tratamiento de estos terneros causó cambios en estos valores de 11,21±0,26 μmol H 2 O 2 /L y 0,55±0,02 mmol Troloxequivalente/L, respectivamente. Los estudios también informaron que los parámetros utilizados para el estrés oxidativo (malondialdehído) fueron más altos [29] y los parámetros antioxidantes (superóxido dismutasa [21], TAS) fueron más bajos en terneros diarreicos [29]. La disminución de los niveles de TAS y el aumento de los niveles de TOS demostraron que el estrés oxidativo era evidente en los terneros enfermos en nuestro estudio. El aumento de los niveles de TOS y hepcidina antes del tratamiento se considera asociado a la inflamación. Después del tratamiento, el aumento de los niveles de TAS y la disminución de los niveles de hepcidina apoyan esta opinión. La hepcidina puede desempeñar un papel importante en la inmunidad no específica y es una molécula clave que juega un papel en la patogénesis de las enfermedades al mejorar el desarrollo del sistema antioxidante. Sin embargo, se necesitan estudios más detallados sobre el papel de la hepcidina en la patogénesis de la septicemia. Este trabajo se llevó a cabo en colaboración con todos los autores. EEE, HME y AHK: Diseñó los procedimientos experimentales. EEE, EG y MK: Realizaron el trabajo de investigación. EE

¿Qué elemento desempeña la hepcidina en la regulación durante el metabolismo?

Relación entre hepcidina y oxidante/antioxidante en terneros con sospecha de septicemia neonatalhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5146304/SHA: efcd7d171bb51acf2ef0a631901900497957a3beAutores: Erkilic, E. E.; Erdogan, H. M.; Ogun, M.; Kirmizigul, A. H.; Gokce, E.; Kuru, M.; Kukurt, A. Fecha: 2016-11-14DOI: 10.14202/vetworld.2016.1238-1241Licencia: cc-byAbstract: AIM: Este estudio se ha realizado con el propósito de determinar la hepcidina sérica, el estado antioxidante total (TAS), el estado oxidante total (TOS), y los niveles de Fe en terneros con sospecha de septicemia neonatal antes y después del tratamiento y la importancia clínica de la hepcidina en terneros con sospecha de septicemia neonatal. MATERIALES Y MÉTODOS: El material del estudio consistió en 15 terneros de diferentes edades y sexos llevados al Centro de Capacitación, Investigación y Aplicación de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de Kafkas con sospecha de septicemia neonatal. 8,5 ml de sangre se extrajo de la vena yugular de cada animal en tubos coagulantes antes y después del tratamiento para análisis Se midieron los niveles séricos de hepcidina, TAS, TOS y Fe. RESULTADOS: Si bien los niveles de hepcidina pretratamiento fueron 58,42±3,46 ng/ml, los niveles postratamiento fueron 46,87±2,98 ng/ml (p<0,05). Los niveles de Fe pretratamiento fueron 60,13±7,27 μg/dl, mientras que los niveles posttratamiento fueron 83,1±8,09 μg/dl (p<0,05). Los cambios en los niveles de TAS y TOS también se encontraron estadísticamente significativos. CONCLUSIÓN: A la luz del hecho de que la hepcidina desempeña una función en la regulación de Fe, así como el hecho de que Fe es una fuente nutricional significativa para muchos microorganismos, se concluyó que la hepcidina puede desempeñar un papel significativo en la inmunidad nutricional y la patogénesis de las enfermedades. Texto: La septicemia del ternero neonatal causa alta morbilidad y mortalidad y es una de las principales y más significativas dificultades en la cría de ganado bovino. La septicemia del ternero es la principal causa de muerte en el período neonatal [1]. Su etiología implica bacterias (comúnmente Escherichia coli), virus (rota y coronavirus), parásitos y otros factores. A medida que la enfermedad progresa rápidamente y es letal, el diagnóstico y el tratamiento deben iniciarse lo más rápidamente posible [2]. La hepcidina es una hormona péptida antimicrobiana de bajo peso molecular y fue descubierta por primera vez en orina humana [3]. Es producida por el hígado como respuesta de primera línea a las reacciones inflamatorias y a las concentraciones elevadas de Fe [4, 5]. La hepcidina desempeña un papel fundamental en la regulación del metabolismo del Fe [6], que es parte de las funciones celulares Por otro lado, al participar en reacciones redox que conducen a la producción de especies reactivas de oxígeno (ROSs), Fe también causa estrés oxidativo. Por lo tanto, Fe ha sido considerado como un elemento potencialmente tóxico para las células [7]. Fe también juega un papel importante en la patogénesis de infecciones bacterianas ya que las bacterias utilizan Fe para la supervivencia, el crecimiento y la proliferación; por lo tanto, es de suma importancia controlar el metabolismo de Fe [6]. Es bien sabido que la abundancia de Fe suprime el sistema de defensa que conduce al huésped vulnerable a infecciones. Existe una relación significativa entre Hepcidina, Fe metabolismo, inflamación y el sistema inmunológico. El hecho de que la hepcidina juega un papel activo en la regulación de la liberación de Fe de macrófagos y en el control de la absorción excesiva de Fe del duodeno está bien documentado [6]. La hepcidina es parte del mecanismo En condiciones inflamatorias, la hipoferremia es un importante mecanismo protector de primera línea en respuesta a infecciones [9]. Fe también participa en reacciones redox, causando la producción de ROS, y por lo tanto conduce a estrés oxidativo [7]. Los radicales libres juegan un papel significativo en la patogénesis de muchas enfermedades [10]. Los recién nacidos están sujetos a estrés oxidativo durante el nacimiento. También se reporta que en enfermedades del ganado, especialmente enteritis y neumonía, la capacidad antioxidante es eficaz [11]. Este estudio fue diseñado para determinar la importancia clínica de la hepcidina en terneros con sospecha de septicemia neonatal mediante la evaluación de hepcidina sérica, estado antioxidante total (TAS), estado oxidante total (TOS) y niveles de Fe en terneros sospechosos de septicemia neonatal antes y después del tratamiento. Este estudio se realizó después de obtener la aprobación del Comité de Ética Local de los Experimentos con Animales de la Universidad Mehmet Akif Ersoy (MAKU-HADYEK-Submission: 2014/77), compuesto por 15 terneros con sospecha de septicemia neonatal de entre 1 y 10 días de edad ingresados en el Hospital de Enseñanza de Medicina Veterinaria. Se diagnosticó septicemia sospechosa basada en exámenes clínicos (diarrea, debilidad o ausencia de reflejo de succión, el ternero en posición supina sobre el suelo o incapaz de permanecer en pie, deshidratación severa, temperatura rectal anormal [hipotermia], hiperemia mucosa y esclerótica completa) y hematológicos (aumento del recuento de glóbulos blancos [BC]); se sospechó que los animales tenían septicemia [12, 13]. Los animales recibieron tratamiento estándar (antibióticos, Para la determinación de la hepcidina sérica, TAS, TOS, Fe y parámetros hematológicos se tomaron muestras de sangre antes y después del tratamiento en todos los casos. 8,5 ml de sangre se tomaron de la vena yugular de cada animal en tubos coagulantes para el análisis bioquímico, y 3 ml de sangre se tomaron en tubos ETDA para el análisis hematológico. Se centrifugaron muestras a 3000 rpm durante 10 min, y el suero fue recolectado y mantenido a −20 °C hasta el análisis. Hepcidina sérica (Mybiosource ® ), TAS (Rel Assay Diagnostics ® ) y TOS (Rel Assay Diagnostics ® ) se determinaron utilizando kits ELISA comerciales, y el valor Fe se midió espectrofotométricamente. El análisis hematológico (BCM, linfocitos [LYM], glóbulos rojos [RBC], volumen corpuscular medio (VCM) y hematocrito [HCT]) se realizó en el contador de sangre (VG-MS4e ®, Melet Schloesıng, Francia). Los resultados se evaluaron utilizando la prueba t en el programa estadístico SPSS ® (SPSS 20, EE.UU.) para determinar las diferencias entre los valores antes y después del tratamiento. Los terneros con septicemia sospechada mostraron signos clínicos de pérdida de apetito, fatiga, indiferencia hacia el entorno, disminución/ausencia de reflejos de succión, extremidades frías, incapacidad de estar de pie, diarrea, hundimiento ocular en sus cuencas e hiperemia en la conjuntiva. El promedio de temperatura corporal, frecuencia cardíaca y frecuencia respiratoria de los animales fue de 37,18±0,13°C, 104±4,33/min y 28,86±0,75/min pre-tratamiento; y 38,54±0,10°C, 107,53±2,20/min y 26,40±0,36/min post-tratamiento, respectivamente; los cambios en los niveles de hepcidina, TAS, TOS y Fe en terneros con sospecha de septicemia antes y después del tratamiento se dan en la Tabla 1. Después del tratamiento, los niveles séricos de hepcidina y TOS fueron significativamente más bajos que antes del tratamiento en terneros; por el contrario, los niveles séricos de TAS y Fe fueron significativamente más altos que antes del tratamiento (Tabla 1 ). El tratamiento de terneros dio lugar a cambios significativos en los parámetros hematológicos que se examinaron excepto en el caso de El objetivo de este estudio fue determinar la importancia clínica o el uso de la hepcidina comparando los valores de los niveles séricos de hepcidina, TAS, TOS y Fe en terneros con sospecha de septicemia neonatal antes y después del tratamiento. Los médicos confían en los exámenes clínicos y de laboratorio de los pacientes para formar un diagnóstico de trabajo, por lo que los parámetros hematológicos y bioquímicos séricos se suelen utilizar para este propósito [14]. Los parámetros hematológicos (WBC, HCT, LYM y MCV) evaluados en este estudio fueron comparables con los reportados por otros en terneros neonatales con diarrea y sospecha de septicemia [15] [16] [17]. El tratamiento se corrigió significativamente a valores normales los parámetros hematológicos que se examinaron con excepción de la RBC. El recuento de leucocitos pretratamiento fue alto debido a la La hepcidina está controlada por la presencia de inflamación en el cuerpo, el almacenamiento de Fe y la actividad eritropoyética en la médula ósea y desempeña un papel primordial en la homeostasis de Fe [4]. El aumento de los niveles plasmáticos y tisulares de Fe estimula la síntesis de hepcidina y reduce la liberación de Fe y la absorción entérica de Fe de macrófagos y hepatocitos [18]. El aumento de las concentraciones de hepcidina durante la inflamación e infección reduce los niveles séricos de Fe al disminuir la liberación de Fe de macrófagos y hepatocitos, y por lo tanto la Fe necesaria para microorganismos y células tumorales está restringida [19]. Los niveles séricos de hepcidina en terneros con sospecha de septicemia fueron significativamente elevados antes del tratamiento en comparación con después del tratamiento; también los niveles fe fueron inferiores antes del Esta situación podría estar relacionada con la interacción entre hepcidina y Fe y también da crédito al papel de la hepcidina en la hemostasia de Fe durante la inflamación e infección. Como en nuestro estudio, los niveles de Fe son bien conocidos por disminuir en terneros diarreicos en comparación con terneros sanos [20, 21]. Aunque no existe ningún estudio que reporte la concentración de hepcidina en terneros enfermos, los estudios en sujetos humanos muestran que los niveles de hepcidina en sangre del cordón umbilical podrían ser un indicador importante para diagnosticar el inicio temprano de la sepsis neonatal. Los niveles de hepcidina en sangre del cordón umbilical de lactantes con sepsis variaban entre 118,1 y 8400 ng/mL y eran significativamente más altos que los de lactantes sanos [22]. Estos hallazgos junto con nuestros resultados añaden credibilidad a la idea de que la interacción hepcidina-Fe puede jugar un papel en la patogénesis de la septicemia. La producción de especies libres de oxígeno causa alteraciones en las proteínas, los lípidos y el ADN durante el estrés oxidativo y conduce al desarrollo de lesiones en los órganos [24]. El hierro libre tiene características tóxicas ya que cataliza la producción de ROS [25] y por lo tanto causa estrés oxidativo [26]. El papel de Fe en el desarrollo de estrés oxidativo puede mostrar una vez más la importancia de la hepcidina, como importante regulador de la Fe, con respecto al aumento de la capacidad antioxidante mediante la inhibición de la utilización de Fe por el organismo así como las células huésped. El sistema antioxidante y oxidativo están en un estado constante de equilibrio en el organismo. Cualquier evento que rompa este equilibrio en favor de las moléculas de Las células huésped inician el sistema antioxidante en caso de exposición a estrés oxidativo [27]. Kabu et al. [16] notificaron valores TOS y TAS en terneros neonatales con diarrea como 13,47±0,81 μmol H 2 O 2 /L y 0,51±0,02 mmol Trolox equivalente/L, respectivamente, y el tratamiento de estos terneros causó cambios en estos valores de 11,21±0,26 μmol H 2 O 2 /L y 0,55±0,02 mmol Troloxequivalente/L, respectivamente. Los estudios también informaron que los parámetros utilizados para el estrés oxidativo (malondialdehído) fueron más altos [29] y los parámetros antioxidantes (superóxido dismutasa [21], TAS) fueron más bajos en terneros diarreicos [29]. La disminución de los niveles de TAS y el aumento de los niveles de TOS demostraron que el estrés oxidativo era evidente en los terneros enfermos en nuestro estudio. El aumento de los niveles de TOS y hepcidina antes del tratamiento se considera asociado a la inflamación. Después del tratamiento, el aumento de los niveles de TAS y la disminución de los niveles de hepcidina apoyan esta opinión. La hepcidina puede desempeñar un papel importante en la inmunidad no específica y es una molécula clave que juega un papel en la patogénesis de las enfermedades al mejorar el desarrollo del sistema antioxidante. Sin embargo, se necesitan estudios más detallados sobre el papel de la hepcidina en la patogénesis de la septicemia. Este trabajo se llevó a cabo en colaboración con todos los autores. EEE, HME y AHK: Diseñó los procedimientos experimentales. EEE, EG y MK: Realizaron el trabajo de investigación. EE

¿La hepcidina es tóxica?

Relación entre hepcidina y oxidante/antioxidante en terneros con sospecha de septicemia neonatalhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5146304/SHA: efcd7d171bb51acf2ef0a631901900497957a3beAutores: Erkilic, E. E.; Erdogan, H. M.; Ogun, M.; Kirmizigul, A. H.; Gokce, E.; Kuru, M.; Kukurt, A. Fecha: 2016-11-14DOI: 10.14202/vetworld.2016.1238-1241Licencia: cc-byAbstract: AIM: Este estudio se ha realizado con el propósito de determinar la hepcidina sérica, el estado antioxidante total (TAS), el estado oxidante total (TOS), y los niveles de Fe en terneros con sospecha de septicemia neonatal antes y después del tratamiento y la importancia clínica de la hepcidina en terneros con sospecha de septicemia neonatal. MATERIALES Y MÉTODOS: El material del estudio consistió en 15 terneros de diferentes edades y sexos llevados al Centro de Capacitación, Investigación y Aplicación de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de Kafkas con sospecha de septicemia neonatal. 8,5 ml de sangre se extrajo de la vena yugular de cada animal en tubos coagulantes antes y después del tratamiento para análisis Se midieron los niveles séricos de hepcidina, TAS, TOS y Fe. RESULTADOS: Si bien los niveles de hepcidina pretratamiento fueron 58,42±3,46 ng/ml, los niveles postratamiento fueron 46,87±2,98 ng/ml (p<0,05). Los niveles de Fe pretratamiento fueron 60,13±7,27 μg/dl, mientras que los niveles posttratamiento fueron 83,1±8,09 μg/dl (p<0,05). Los cambios en los niveles de TAS y TOS también se encontraron estadísticamente significativos. CONCLUSIÓN: A la luz del hecho de que la hepcidina desempeña una función en la regulación de Fe, así como el hecho de que Fe es una fuente nutricional significativa para muchos microorganismos, se concluyó que la hepcidina puede desempeñar un papel significativo en la inmunidad nutricional y la patogénesis de las enfermedades. Texto: La septicemia del ternero neonatal causa alta morbilidad y mortalidad y es una de las principales y más significativas dificultades en la cría de ganado bovino. La septicemia del ternero es la principal causa de muerte en el período neonatal [1]. Su etiología implica bacterias (comúnmente Escherichia coli), virus (rota y coronavirus), parásitos y otros factores. A medida que la enfermedad progresa rápidamente y es letal, el diagnóstico y el tratamiento deben iniciarse lo más rápidamente posible [2]. La hepcidina es una hormona péptida antimicrobiana de bajo peso molecular y fue descubierta por primera vez en orina humana [3]. Es producida por el hígado como respuesta de primera línea a las reacciones inflamatorias y a las concentraciones elevadas de Fe [4, 5]. La hepcidina desempeña un papel fundamental en la regulación del metabolismo del Fe [6], que es parte de las funciones celulares Por otro lado, al participar en reacciones redox que conducen a la producción de especies reactivas de oxígeno (ROSs), Fe también causa estrés oxidativo. Por lo tanto, Fe ha sido considerado como un elemento potencialmente tóxico para las células [7]. Fe también juega un papel importante en la patogénesis de infecciones bacterianas ya que las bacterias utilizan Fe para la supervivencia, el crecimiento y la proliferación; por lo tanto, es de suma importancia controlar el metabolismo de Fe [6]. Es bien sabido que la abundancia de Fe suprime el sistema de defensa que conduce al huésped vulnerable a infecciones. Existe una relación significativa entre Hepcidina, Fe metabolismo, inflamación y el sistema inmunológico. El hecho de que la hepcidina juega un papel activo en la regulación de la liberación de Fe de macrófagos y en el control de la absorción excesiva de Fe del duodeno está bien documentado [6]. La hepcidina es parte del mecanismo En condiciones inflamatorias, la hipoferremia es un importante mecanismo protector de primera línea en respuesta a infecciones [9]. Fe también participa en reacciones redox, causando la producción de ROS, y por lo tanto conduce a estrés oxidativo [7]. Los radicales libres juegan un papel significativo en la patogénesis de muchas enfermedades [10]. Los recién nacidos están sujetos a estrés oxidativo durante el nacimiento. También se reporta que en enfermedades del ganado, especialmente enteritis y neumonía, la capacidad antioxidante es eficaz [11]. Este estudio fue diseñado para determinar la importancia clínica de la hepcidina en terneros con sospecha de septicemia neonatal mediante la evaluación de hepcidina sérica, estado antioxidante total (TAS), estado oxidante total (TOS) y niveles de Fe en terneros sospechosos de septicemia neonatal antes y después del tratamiento. Este estudio se realizó después de obtener la aprobación del Comité de Ética Local de los Experimentos con Animales de la Universidad Mehmet Akif Ersoy (MAKU-HADYEK-Submission: 2014/77), compuesto por 15 terneros con sospecha de septicemia neonatal de entre 1 y 10 días de edad ingresados en el Hospital de Enseñanza de Medicina Veterinaria. Se diagnosticó septicemia sospechosa basada en exámenes clínicos (diarrea, debilidad o ausencia de reflejo de succión, el ternero en posición supina sobre el suelo o incapaz de permanecer en pie, deshidratación severa, temperatura rectal anormal [hipotermia], hiperemia mucosa y esclerótica completa) y hematológicos (aumento del recuento de glóbulos blancos [BC]); se sospechó que los animales tenían septicemia [12, 13]. Los animales recibieron tratamiento estándar (antibióticos, Para la determinación de la hepcidina sérica, TAS, TOS, Fe y parámetros hematológicos se tomaron muestras de sangre antes y después del tratamiento en todos los casos. 8,5 ml de sangre se tomaron de la vena yugular de cada animal en tubos coagulantes para el análisis bioquímico, y 3 ml de sangre se tomaron en tubos ETDA para el análisis hematológico. Se centrifugaron muestras a 3000 rpm durante 10 min, y el suero fue recolectado y mantenido a −20 °C hasta el análisis. Hepcidina sérica (Mybiosource ® ), TAS (Rel Assay Diagnostics ® ) y TOS (Rel Assay Diagnostics ® ) se determinaron utilizando kits ELISA comerciales, y el valor Fe se midió espectrofotométricamente. El análisis hematológico (BCM, linfocitos [LYM], glóbulos rojos [RBC], volumen corpuscular medio (VCM) y hematocrito [HCT]) se realizó en el contador de sangre (VG-MS4e ®, Melet Schloesıng, Francia). Los resultados se evaluaron utilizando la prueba t en el programa estadístico SPSS ® (SPSS 20, EE.UU.) para determinar las diferencias entre los valores antes y después del tratamiento. Los terneros con septicemia sospechada mostraron signos clínicos de pérdida de apetito, fatiga, indiferencia hacia el entorno, disminución/ausencia de reflejos de succión, extremidades frías, incapacidad de estar de pie, diarrea, hundimiento ocular en sus cuencas e hiperemia en la conjuntiva. El promedio de temperatura corporal, frecuencia cardíaca y frecuencia respiratoria de los animales fue de 37,18±0,13°C, 104±4,33/min y 28,86±0,75/min pre-tratamiento; y 38,54±0,10°C, 107,53±2,20/min y 26,40±0,36/min post-tratamiento, respectivamente; los cambios en los niveles de hepcidina, TAS, TOS y Fe en terneros con sospecha de septicemia antes y después del tratamiento se dan en la Tabla 1. Después del tratamiento, los niveles séricos de hepcidina y TOS fueron significativamente más bajos que antes del tratamiento en terneros; por el contrario, los niveles séricos de TAS y Fe fueron significativamente más altos que antes del tratamiento (Tabla 1 ). El tratamiento de terneros dio lugar a cambios significativos en los parámetros hematológicos que se examinaron excepto en el caso de El objetivo de este estudio fue determinar la importancia clínica o el uso de la hepcidina comparando los valores de los niveles séricos de hepcidina, TAS, TOS y Fe en terneros con sospecha de septicemia neonatal antes y después del tratamiento. Los médicos confían en los exámenes clínicos y de laboratorio de los pacientes para formar un diagnóstico de trabajo, por lo que los parámetros hematológicos y bioquímicos séricos se suelen utilizar para este propósito [14]. Los parámetros hematológicos (WBC, HCT, LYM y MCV) evaluados en este estudio fueron comparables con los reportados por otros en terneros neonatales con diarrea y sospecha de septicemia [15] [16] [17]. El tratamiento se corrigió significativamente a valores normales los parámetros hematológicos que se examinaron con excepción de la RBC. El recuento de leucocitos pretratamiento fue alto debido a la La hepcidina está controlada por la presencia de inflamación en el cuerpo, el almacenamiento de Fe y la actividad eritropoyética en la médula ósea y desempeña un papel primordial en la homeostasis de Fe [4]. El aumento de los niveles plasmáticos y tisulares de Fe estimula la síntesis de hepcidina y reduce la liberación de Fe y la absorción entérica de Fe de macrófagos y hepatocitos [18]. El aumento de las concentraciones de hepcidina durante la inflamación e infección reduce los niveles séricos de Fe al disminuir la liberación de Fe de macrófagos y hepatocitos, y por lo tanto la Fe necesaria para microorganismos y células tumorales está restringida [19]. Los niveles séricos de hepcidina en terneros con sospecha de septicemia fueron significativamente elevados antes del tratamiento en comparación con después del tratamiento; también los niveles fe fueron inferiores antes del Esta situación podría estar relacionada con la interacción entre hepcidina y Fe y también da crédito al papel de la hepcidina en la hemostasia de Fe durante la inflamación e infección. Como en nuestro estudio, los niveles de Fe son bien conocidos por disminuir en terneros diarreicos en comparación con terneros sanos [20, 21]. Aunque no existe ningún estudio que reporte la concentración de hepcidina en terneros enfermos, los estudios en sujetos humanos muestran que los niveles de hepcidina en sangre del cordón umbilical podrían ser un indicador importante para diagnosticar el inicio temprano de la sepsis neonatal. Los niveles de hepcidina en sangre del cordón umbilical de lactantes con sepsis variaban entre 118,1 y 8400 ng/mL y eran significativamente más altos que los de lactantes sanos [22]. Estos hallazgos junto con nuestros resultados añaden credibilidad a la idea de que la interacción hepcidina-Fe puede jugar un papel en la patogénesis de la septicemia. La producción de especies libres de oxígeno causa alteraciones en las proteínas, los lípidos y el ADN durante el estrés oxidativo y conduce al desarrollo de lesiones en los órganos [24]. El hierro libre tiene características tóxicas ya que cataliza la producción de ROS [25] y por lo tanto causa estrés oxidativo [26]. El papel de Fe en el desarrollo de estrés oxidativo puede mostrar una vez más la importancia de la hepcidina, como importante regulador de la Fe, con respecto al aumento de la capacidad antioxidante mediante la inhibición de la utilización de Fe por el organismo así como las células huésped. El sistema antioxidante y oxidativo están en un estado constante de equilibrio en el organismo. Cualquier evento que rompa este equilibrio en favor de las moléculas de Las células huésped inician el sistema antioxidante en caso de exposición a estrés oxidativo [27]. Kabu et al. [16] notificaron valores TOS y TAS en terneros neonatales con diarrea como 13,47±0,81 μmol H 2 O 2 /L y 0,51±0,02 mmol Trolox equivalente/L, respectivamente, y el tratamiento de estos terneros causó cambios en estos valores de 11,21±0,26 μmol H 2 O 2 /L y 0,55±0,02 mmol Troloxequivalente/L, respectivamente. Los estudios también informaron que los parámetros utilizados para el estrés oxidativo (malondialdehído) fueron más altos [29] y los parámetros antioxidantes (superóxido dismutasa [21], TAS) fueron más bajos en terneros diarreicos [29]. La disminución de los niveles de TAS y el aumento de los niveles de TOS demostraron que el estrés oxidativo era evidente en los terneros enfermos en nuestro estudio. El aumento de los niveles de TOS y hepcidina antes del tratamiento se considera asociado a la inflamación. Después del tratamiento, el aumento de los niveles de TAS y la disminución de los niveles de hepcidina apoyan esta opinión. La hepcidina puede desempeñar un papel importante en la inmunidad no específica y es una molécula clave que juega un papel en la patogénesis de las enfermedades al mejorar el desarrollo del sistema antioxidante. Sin embargo, se necesitan estudios más detallados sobre el papel de la hepcidina en la patogénesis de la septicemia. Este trabajo se llevó a cabo en colaboración con todos los autores. EEE, HME y AHK: Diseñó los procedimientos experimentales. EEE, EG y MK: Realizaron el trabajo de investigación. EE

¿Por qué es el hierro crítico para las bacterias?

Relación entre hepcidina y oxidante/antioxidante en terneros con sospecha de septicemia neonatalhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5146304/SHA: efcd7d171bb51acf2ef0a631901900497957a3beAutores: Erkilic, E. E.; Erdogan, H. M.; Ogun, M.; Kirmizigul, A. H.; Gokce, E.; Kuru, M.; Kukurt, A. Fecha: 2016-11-14DOI: 10.14202/vetworld.2016.1238-1241Licencia: cc-byAbstract: AIM: Este estudio se ha realizado con el propósito de determinar la hepcidina sérica, el estado antioxidante total (TAS), el estado oxidante total (TOS), y los niveles de Fe en terneros con sospecha de septicemia neonatal antes y después del tratamiento y la importancia clínica de la hepcidina en terneros con sospecha de septicemia neonatal. MATERIALES Y MÉTODOS: El material del estudio consistió en 15 terneros de diferentes edades y sexos llevados al Centro de Capacitación, Investigación y Aplicación de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de Kafkas con sospecha de septicemia neonatal. 8,5 ml de sangre se extrajo de la vena yugular de cada animal en tubos coagulantes antes y después del tratamiento para análisis Se midieron los niveles séricos de hepcidina, TAS, TOS y Fe. RESULTADOS: Si bien los niveles de hepcidina pretratamiento fueron 58,42±3,46 ng/ml, los niveles postratamiento fueron 46,87±2,98 ng/ml (p<0,05). Los niveles de Fe pretratamiento fueron 60,13±7,27 μg/dl, mientras que los niveles posttratamiento fueron 83,1±8,09 μg/dl (p<0,05). Los cambios en los niveles de TAS y TOS también se encontraron estadísticamente significativos. CONCLUSIÓN: A la luz del hecho de que la hepcidina desempeña una función en la regulación de Fe, así como el hecho de que Fe es una fuente nutricional significativa para muchos microorganismos, se concluyó que la hepcidina puede desempeñar un papel significativo en la inmunidad nutricional y la patogénesis de las enfermedades. Texto: La septicemia del ternero neonatal causa alta morbilidad y mortalidad y es una de las principales y más significativas dificultades en la cría de ganado bovino. La septicemia del ternero es la principal causa de muerte en el período neonatal [1]. Su etiología implica bacterias (comúnmente Escherichia coli), virus (rota y coronavirus), parásitos y otros factores. A medida que la enfermedad progresa rápidamente y es letal, el diagnóstico y el tratamiento deben iniciarse lo más rápidamente posible [2]. La hepcidina es una hormona péptida antimicrobiana de bajo peso molecular y fue descubierta por primera vez en orina humana [3]. Es producida por el hígado como respuesta de primera línea a las reacciones inflamatorias y a las concentraciones elevadas de Fe [4, 5]. La hepcidina desempeña un papel fundamental en la regulación del metabolismo del Fe [6], que es parte de las funciones celulares Por otro lado, al participar en reacciones redox que conducen a la producción de especies reactivas de oxígeno (ROSs), Fe también causa estrés oxidativo. Por lo tanto, Fe ha sido considerado como un elemento potencialmente tóxico para las células [7]. Fe también juega un papel importante en la patogénesis de infecciones bacterianas ya que las bacterias utilizan Fe para la supervivencia, el crecimiento y la proliferación; por lo tanto, es de suma importancia controlar el metabolismo de Fe [6]. Es bien sabido que la abundancia de Fe suprime el sistema de defensa que conduce al huésped vulnerable a infecciones. Existe una relación significativa entre Hepcidina, Fe metabolismo, inflamación y el sistema inmunológico. El hecho de que la hepcidina juega un papel activo en la regulación de la liberación de Fe de macrófagos y en el control de la absorción excesiva de Fe del duodeno está bien documentado [6]. La hepcidina es parte del mecanismo En condiciones inflamatorias, la hipoferremia es un importante mecanismo protector de primera línea en respuesta a infecciones [9]. Fe también participa en reacciones redox, causando la producción de ROS, y por lo tanto conduce a estrés oxidativo [7]. Los radicales libres juegan un papel significativo en la patogénesis de muchas enfermedades [10]. Los recién nacidos están sujetos a estrés oxidativo durante el nacimiento. También se reporta que en enfermedades del ganado, especialmente enteritis y neumonía, la capacidad antioxidante es eficaz [11]. Este estudio fue diseñado para determinar la importancia clínica de la hepcidina en terneros con sospecha de septicemia neonatal mediante la evaluación de hepcidina sérica, estado antioxidante total (TAS), estado oxidante total (TOS) y niveles de Fe en terneros sospechosos de septicemia neonatal antes y después del tratamiento. Este estudio se realizó después de obtener la aprobación del Comité de Ética Local de los Experimentos con Animales de la Universidad Mehmet Akif Ersoy (MAKU-HADYEK-Submission: 2014/77), compuesto por 15 terneros con sospecha de septicemia neonatal de entre 1 y 10 días de edad ingresados en el Hospital de Enseñanza de Medicina Veterinaria. Se diagnosticó septicemia sospechosa basada en exámenes clínicos (diarrea, debilidad o ausencia de reflejo de succión, el ternero en posición supina sobre el suelo o incapaz de permanecer en pie, deshidratación severa, temperatura rectal anormal [hipotermia], hiperemia mucosa y esclerótica completa) y hematológicos (aumento del recuento de glóbulos blancos [BC]); se sospechó que los animales tenían septicemia [12, 13]. Los animales recibieron tratamiento estándar (antibióticos, Para la determinación de la hepcidina sérica, TAS, TOS, Fe y parámetros hematológicos se tomaron muestras de sangre antes y después del tratamiento en todos los casos. 8,5 ml de sangre se tomaron de la vena yugular de cada animal en tubos coagulantes para el análisis bioquímico, y 3 ml de sangre se tomaron en tubos ETDA para el análisis hematológico. Se centrifugaron muestras a 3000 rpm durante 10 min, y el suero fue recolectado y mantenido a −20 °C hasta el análisis. Hepcidina sérica (Mybiosource ® ), TAS (Rel Assay Diagnostics ® ) y TOS (Rel Assay Diagnostics ® ) se determinaron utilizando kits ELISA comerciales, y el valor Fe se midió espectrofotométricamente. El análisis hematológico (BCM, linfocitos [LYM], glóbulos rojos [RBC], volumen corpuscular medio (VCM) y hematocrito [HCT]) se realizó en el contador de sangre (VG-MS4e ®, Melet Schloesıng, Francia). Los resultados se evaluaron utilizando la prueba t en el programa estadístico SPSS ® (SPSS 20, EE.UU.) para determinar las diferencias entre los valores antes y después del tratamiento. Los terneros con septicemia sospechada mostraron signos clínicos de pérdida de apetito, fatiga, indiferencia hacia el entorno, disminución/ausencia de reflejos de succión, extremidades frías, incapacidad de estar de pie, diarrea, hundimiento ocular en sus cuencas e hiperemia en la conjuntiva. El promedio de temperatura corporal, frecuencia cardíaca y frecuencia respiratoria de los animales fue de 37,18±0,13°C, 104±4,33/min y 28,86±0,75/min pre-tratamiento; y 38,54±0,10°C, 107,53±2,20/min y 26,40±0,36/min post-tratamiento, respectivamente; los cambios en los niveles de hepcidina, TAS, TOS y Fe en terneros con sospecha de septicemia antes y después del tratamiento se dan en la Tabla 1. Después del tratamiento, los niveles séricos de hepcidina y TOS fueron significativamente más bajos que antes del tratamiento en terneros; por el contrario, los niveles séricos de TAS y Fe fueron significativamente más altos que antes del tratamiento (Tabla 1 ). El tratamiento de terneros dio lugar a cambios significativos en los parámetros hematológicos que se examinaron excepto en el caso de El objetivo de este estudio fue determinar la importancia clínica o el uso de la hepcidina comparando los valores de los niveles séricos de hepcidina, TAS, TOS y Fe en terneros con sospecha de septicemia neonatal antes y después del tratamiento. Los médicos confían en los exámenes clínicos y de laboratorio de los pacientes para formar un diagnóstico de trabajo, por lo que los parámetros hematológicos y bioquímicos séricos se suelen utilizar para este propósito [14]. Los parámetros hematológicos (WBC, HCT, LYM y MCV) evaluados en este estudio fueron comparables con los reportados por otros en terneros neonatales con diarrea y sospecha de septicemia [15] [16] [17]. El tratamiento se corrigió significativamente a valores normales los parámetros hematológicos que se examinaron con excepción de la RBC. El recuento de leucocitos pretratamiento fue alto debido a la La hepcidina está controlada por la presencia de inflamación en el cuerpo, el almacenamiento de Fe y la actividad eritropoyética en la médula ósea y desempeña un papel primordial en la homeostasis de Fe [4]. El aumento de los niveles plasmáticos y tisulares de Fe estimula la síntesis de hepcidina y reduce la liberación de Fe y la absorción entérica de Fe de macrófagos y hepatocitos [18]. El aumento de las concentraciones de hepcidina durante la inflamación e infección reduce los niveles séricos de Fe al disminuir la liberación de Fe de macrófagos y hepatocitos, y por lo tanto la Fe necesaria para microorganismos y células tumorales está restringida [19]. Los niveles séricos de hepcidina en terneros con sospecha de septicemia fueron significativamente elevados antes del tratamiento en comparación con después del tratamiento; también los niveles fe fueron inferiores antes del Esta situación podría estar relacionada con la interacción entre hepcidina y Fe y también da crédito al papel de la hepcidina en la hemostasia de Fe durante la inflamación e infección. Como en nuestro estudio, los niveles de Fe son bien conocidos por disminuir en terneros diarreicos en comparación con terneros sanos [20, 21]. Aunque no existe ningún estudio que reporte la concentración de hepcidina en terneros enfermos, los estudios en sujetos humanos muestran que los niveles de hepcidina en sangre del cordón umbilical podrían ser un indicador importante para diagnosticar el inicio temprano de la sepsis neonatal. Los niveles de hepcidina en sangre del cordón umbilical de lactantes con sepsis variaban entre 118,1 y 8400 ng/mL y eran significativamente más altos que los de lactantes sanos [22]. Estos hallazgos junto con nuestros resultados añaden credibilidad a la idea de que la interacción hepcidina-Fe puede jugar un papel en la patogénesis de la septicemia. La producción de especies libres de oxígeno causa alteraciones en las proteínas, los lípidos y el ADN durante el estrés oxidativo y conduce al desarrollo de lesiones en los órganos [24]. El hierro libre tiene características tóxicas ya que cataliza la producción de ROS [25] y por lo tanto causa estrés oxidativo [26]. El papel de Fe en el desarrollo de estrés oxidativo puede mostrar una vez más la importancia de la hepcidina, como importante regulador de la Fe, con respecto al aumento de la capacidad antioxidante mediante la inhibición de la utilización de Fe por el organismo así como las células huésped. El sistema antioxidante y oxidativo están en un estado constante de equilibrio en el organismo. Cualquier evento que rompa este equilibrio en favor de las moléculas de Las células huésped inician el sistema antioxidante en caso de exposición a estrés oxidativo [27]. Kabu et al. [16] notificaron valores TOS y TAS en terneros neonatales con diarrea como 13,47±0,81 μmol H 2 O 2 /L y 0,51±0,02 mmol Trolox equivalente/L, respectivamente, y el tratamiento de estos terneros causó cambios en estos valores de 11,21±0,26 μmol H 2 O 2 /L y 0,55±0,02 mmol Troloxequivalente/L, respectivamente. Los estudios también informaron que los parámetros utilizados para el estrés oxidativo (malondialdehído) fueron más altos [29] y los parámetros antioxidantes (superóxido dismutasa [21], TAS) fueron más bajos en terneros diarreicos [29]. La disminución de los niveles de TAS y el aumento de los niveles de TOS demostraron que el estrés oxidativo era evidente en los terneros enfermos en nuestro estudio. El aumento de los niveles de TOS y hepcidina antes del tratamiento se considera asociado a la inflamación. Después del tratamiento, el aumento de los niveles de TAS y la disminución de los niveles de hepcidina apoyan esta opinión. La hepcidina puede desempeñar un papel importante en la inmunidad no específica y es una molécula clave que juega un papel en la patogénesis de las enfermedades al mejorar el desarrollo del sistema antioxidante. Sin embargo, se necesitan estudios más detallados sobre el papel de la hepcidina en la patogénesis de la septicemia. Este trabajo se llevó a cabo en colaboración con todos los autores. EEE, HME y AHK: Diseñó los procedimientos experimentales. EEE, EG y MK: Realizaron el trabajo de investigación. EE

¿Cómo actúa la hepcidina en el duodeno?

Relación entre hepcidina y oxidante/antioxidante en terneros con sospecha de septicemia neonatalhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5146304/SHA: efcd7d171bb51acf2ef0a631901900497957a3beAutores: Erkilic, E. E.; Erdogan, H. M.; Ogun, M.; Kirmizigul, A. H.; Gokce, E.; Kuru, M.; Kukurt, A. Fecha: 2016-11-14DOI: 10.14202/vetworld.2016.1238-1241Licencia: cc-byAbstract: AIM: Este estudio se ha realizado con el propósito de determinar la hepcidina sérica, el estado antioxidante total (TAS), el estado oxidante total (TOS), y los niveles de Fe en terneros con sospecha de septicemia neonatal antes y después del tratamiento y la importancia clínica de la hepcidina en terneros con sospecha de septicemia neonatal. MATERIALES Y MÉTODOS: El material del estudio consistió en 15 terneros de diferentes edades y sexos llevados al Centro de Capacitación, Investigación y Aplicación de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de Kafkas con sospecha de septicemia neonatal. 8,5 ml de sangre se extrajo de la vena yugular de cada animal en tubos coagulantes antes y después del tratamiento para análisis Se midieron los niveles séricos de hepcidina, TAS, TOS y Fe. RESULTADOS: Si bien los niveles de hepcidina pretratamiento fueron 58,42±3,46 ng/ml, los niveles postratamiento fueron 46,87±2,98 ng/ml (p<0,05). Los niveles de Fe pretratamiento fueron 60,13±7,27 μg/dl, mientras que los niveles posttratamiento fueron 83,1±8,09 μg/dl (p<0,05). Los cambios en los niveles de TAS y TOS también se encontraron estadísticamente significativos. CONCLUSIÓN: A la luz del hecho de que la hepcidina desempeña una función en la regulación de Fe, así como el hecho de que Fe es una fuente nutricional significativa para muchos microorganismos, se concluyó que la hepcidina puede desempeñar un papel significativo en la inmunidad nutricional y la patogénesis de las enfermedades. Texto: La septicemia del ternero neonatal causa alta morbilidad y mortalidad y es una de las principales y más significativas dificultades en la cría de ganado bovino. La septicemia del ternero es la principal causa de muerte en el período neonatal [1]. Su etiología implica bacterias (comúnmente Escherichia coli), virus (rota y coronavirus), parásitos y otros factores. A medida que la enfermedad progresa rápidamente y es letal, el diagnóstico y el tratamiento deben iniciarse lo más rápidamente posible [2]. La hepcidina es una hormona péptida antimicrobiana de bajo peso molecular y fue descubierta por primera vez en orina humana [3]. Es producida por el hígado como respuesta de primera línea a las reacciones inflamatorias y a las concentraciones elevadas de Fe [4, 5]. La hepcidina desempeña un papel fundamental en la regulación del metabolismo del Fe [6], que es parte de las funciones celulares Por otro lado, al participar en reacciones redox que conducen a la producción de especies reactivas de oxígeno (ROSs), Fe también causa estrés oxidativo. Por lo tanto, Fe ha sido considerado como un elemento potencialmente tóxico para las células [7]. Fe también juega un papel importante en la patogénesis de infecciones bacterianas ya que las bacterias utilizan Fe para la supervivencia, el crecimiento y la proliferación; por lo tanto, es de suma importancia controlar el metabolismo de Fe [6]. Es bien sabido que la abundancia de Fe suprime el sistema de defensa que conduce al huésped vulnerable a infecciones. Existe una relación significativa entre Hepcidina, Fe metabolismo, inflamación y el sistema inmunológico. El hecho de que la hepcidina juega un papel activo en la regulación de la liberación de Fe de macrófagos y en el control de la absorción excesiva de Fe del duodeno está bien documentado [6]. La hepcidina es parte del mecanismo En condiciones inflamatorias, la hipoferremia es un importante mecanismo protector de primera línea en respuesta a infecciones [9]. Fe también participa en reacciones redox, causando la producción de ROS, y por lo tanto conduce a estrés oxidativo [7]. Los radicales libres juegan un papel significativo en la patogénesis de muchas enfermedades [10]. Los recién nacidos están sujetos a estrés oxidativo durante el nacimiento. También se reporta que en enfermedades del ganado, especialmente enteritis y neumonía, la capacidad antioxidante es eficaz [11]. Este estudio fue diseñado para determinar la importancia clínica de la hepcidina en terneros con sospecha de septicemia neonatal mediante la evaluación de hepcidina sérica, estado antioxidante total (TAS), estado oxidante total (TOS) y niveles de Fe en terneros sospechosos de septicemia neonatal antes y después del tratamiento. Este estudio se realizó después de obtener la aprobación del Comité de Ética Local de los Experimentos con Animales de la Universidad Mehmet Akif Ersoy (MAKU-HADYEK-Submission: 2014/77), compuesto por 15 terneros con sospecha de septicemia neonatal de entre 1 y 10 días de edad ingresados en el Hospital de Enseñanza de Medicina Veterinaria. Se diagnosticó septicemia sospechosa basada en exámenes clínicos (diarrea, debilidad o ausencia de reflejo de succión, el ternero en posición supina sobre el suelo o incapaz de permanecer en pie, deshidratación severa, temperatura rectal anormal [hipotermia], hiperemia mucosa y esclerótica completa) y hematológicos (aumento del recuento de glóbulos blancos [BC]); se sospechó que los animales tenían septicemia [12, 13]. Los animales recibieron tratamiento estándar (antibióticos, Para la determinación de la hepcidina sérica, TAS, TOS, Fe y parámetros hematológicos se tomaron muestras de sangre antes y después del tratamiento en todos los casos. 8,5 ml de sangre se tomaron de la vena yugular de cada animal en tubos coagulantes para el análisis bioquímico, y 3 ml de sangre se tomaron en tubos ETDA para el análisis hematológico. Se centrifugaron muestras a 3000 rpm durante 10 min, y el suero fue recolectado y mantenido a −20 °C hasta el análisis. Hepcidina sérica (Mybiosource ® ), TAS (Rel Assay Diagnostics ® ) y TOS (Rel Assay Diagnostics ® ) se determinaron utilizando kits ELISA comerciales, y el valor Fe se midió espectrofotométricamente. El análisis hematológico (BCM, linfocitos [LYM], glóbulos rojos [RBC], volumen corpuscular medio (VCM) y hematocrito [HCT]) se realizó en el contador de sangre (VG-MS4e ®, Melet Schloesıng, Francia). Los resultados se evaluaron utilizando la prueba t en el programa estadístico SPSS ® (SPSS 20, EE.UU.) para determinar las diferencias entre los valores antes y después del tratamiento. Los terneros con septicemia sospechada mostraron signos clínicos de pérdida de apetito, fatiga, indiferencia hacia el entorno, disminución/ausencia de reflejos de succión, extremidades frías, incapacidad de estar de pie, diarrea, hundimiento ocular en sus cuencas e hiperemia en la conjuntiva. El promedio de temperatura corporal, frecuencia cardíaca y frecuencia respiratoria de los animales fue de 37,18±0,13°C, 104±4,33/min y 28,86±0,75/min pre-tratamiento; y 38,54±0,10°C, 107,53±2,20/min y 26,40±0,36/min post-tratamiento, respectivamente; los cambios en los niveles de hepcidina, TAS, TOS y Fe en terneros con sospecha de septicemia antes y después del tratamiento se dan en la Tabla 1. Después del tratamiento, los niveles séricos de hepcidina y TOS fueron significativamente más bajos que antes del tratamiento en terneros; por el contrario, los niveles séricos de TAS y Fe fueron significativamente más altos que antes del tratamiento (Tabla 1 ). El tratamiento de terneros dio lugar a cambios significativos en los parámetros hematológicos que se examinaron excepto en el caso de El objetivo de este estudio fue determinar la importancia clínica o el uso de la hepcidina comparando los valores de los niveles séricos de hepcidina, TAS, TOS y Fe en terneros con sospecha de septicemia neonatal antes y después del tratamiento. Los médicos confían en los exámenes clínicos y de laboratorio de los pacientes para formar un diagnóstico de trabajo, por lo que los parámetros hematológicos y bioquímicos séricos se suelen utilizar para este propósito [14]. Los parámetros hematológicos (WBC, HCT, LYM y MCV) evaluados en este estudio fueron comparables con los reportados por otros en terneros neonatales con diarrea y sospecha de septicemia [15] [16] [17]. El tratamiento se corrigió significativamente a valores normales los parámetros hematológicos que se examinaron con excepción de la RBC. El recuento de leucocitos pretratamiento fue alto debido a la La hepcidina está controlada por la presencia de inflamación en el cuerpo, el almacenamiento de Fe y la actividad eritropoyética en la médula ósea y desempeña un papel primordial en la homeostasis de Fe [4]. El aumento de los niveles plasmáticos y tisulares de Fe estimula la síntesis de hepcidina y reduce la liberación de Fe y la absorción entérica de Fe de macrófagos y hepatocitos [18]. El aumento de las concentraciones de hepcidina durante la inflamación e infección reduce los niveles séricos de Fe al disminuir la liberación de Fe de macrófagos y hepatocitos, y por lo tanto la Fe necesaria para microorganismos y células tumorales está restringida [19]. Los niveles séricos de hepcidina en terneros con sospecha de septicemia fueron significativamente elevados antes del tratamiento en comparación con después del tratamiento; también los niveles fe fueron inferiores antes del Esta situación podría estar relacionada con la interacción entre hepcidina y Fe y también da crédito al papel de la hepcidina en la hemostasia de Fe durante la inflamación e infección. Como en nuestro estudio, los niveles de Fe son bien conocidos por disminuir en terneros diarreicos en comparación con terneros sanos [20, 21]. Aunque no existe ningún estudio que reporte la concentración de hepcidina en terneros enfermos, los estudios en sujetos humanos muestran que los niveles de hepcidina en sangre del cordón umbilical podrían ser un indicador importante para diagnosticar el inicio temprano de la sepsis neonatal. Los niveles de hepcidina en sangre del cordón umbilical de lactantes con sepsis variaban entre 118,1 y 8400 ng/mL y eran significativamente más altos que los de lactantes sanos [22]. Estos hallazgos junto con nuestros resultados añaden credibilidad a la idea de que la interacción hepcidina-Fe puede jugar un papel en la patogénesis de la septicemia. La producción de especies libres de oxígeno causa alteraciones en las proteínas, los lípidos y el ADN durante el estrés oxidativo y conduce al desarrollo de lesiones en los órganos [24]. El hierro libre tiene características tóxicas ya que cataliza la producción de ROS [25] y por lo tanto causa estrés oxidativo [26]. El papel de Fe en el desarrollo de estrés oxidativo puede mostrar una vez más la importancia de la hepcidina, como importante regulador de la Fe, con respecto al aumento de la capacidad antioxidante mediante la inhibición de la utilización de Fe por el organismo así como las células huésped. El sistema antioxidante y oxidativo están en un estado constante de equilibrio en el organismo. Cualquier evento que rompa este equilibrio en favor de las moléculas de Las células huésped inician el sistema antioxidante en caso de exposición a estrés oxidativo [27]. Kabu et al. [16] notificaron valores TOS y TAS en terneros neonatales con diarrea como 13,47±0,81 μmol H 2 O 2 /L y 0,51±0,02 mmol Trolox equivalente/L, respectivamente, y el tratamiento de estos terneros causó cambios en estos valores de 11,21±0,26 μmol H 2 O 2 /L y 0,55±0,02 mmol Troloxequivalente/L, respectivamente. Los estudios también informaron que los parámetros utilizados para el estrés oxidativo (malondialdehído) fueron más altos [29] y los parámetros antioxidantes (superóxido dismutasa [21], TAS) fueron más bajos en terneros diarreicos [29]. La disminución de los niveles de TAS y el aumento de los niveles de TOS demostraron que el estrés oxidativo era evidente en los terneros enfermos en nuestro estudio. El aumento de los niveles de TOS y hepcidina antes del tratamiento se considera asociado a la inflamación. Después del tratamiento, el aumento de los niveles de TAS y la disminución de los niveles de hepcidina apoyan esta opinión. La hepcidina puede desempeñar un papel importante en la inmunidad no específica y es una molécula clave que juega un papel en la patogénesis de las enfermedades al mejorar el desarrollo del sistema antioxidante. Sin embargo, se necesitan estudios más detallados sobre el papel de la hepcidina en la patogénesis de la septicemia. Este trabajo se llevó a cabo en colaboración con todos los autores. EEE, HME y AHK: Diseñó los procedimientos experimentales. EEE, EG y MK: Realizaron el trabajo de investigación. EE

¿Cómo afecta la hepcidina a los macrófagos?

Relación entre hepcidina y oxidante/antioxidante en terneros con sospecha de septicemia neonatalhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5146304/SHA: efcd7d171bb51acf2ef0a631901900497957a3beAutores: Erkilic, E. E.; Erdogan, H. M.; Ogun, M.; Kirmizigul, A. H.; Gokce, E.; Kuru, M.; Kukurt, A. Fecha: 2016-11-14DOI: 10.14202/vetworld.2016.1238-1241Licencia: cc-byAbstract: AIM: Este estudio se ha realizado con el propósito de determinar la hepcidina sérica, el estado antioxidante total (TAS), el estado oxidante total (TOS), y los niveles de Fe en terneros con sospecha de septicemia neonatal antes y después del tratamiento y la importancia clínica de la hepcidina en terneros con sospecha de septicemia neonatal. MATERIALES Y MÉTODOS: El material del estudio consistió en 15 terneros de diferentes edades y sexos llevados al Centro de Capacitación, Investigación y Aplicación de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de Kafkas con sospecha de septicemia neonatal. 8,5 ml de sangre se extrajo de la vena yugular de cada animal en tubos coagulantes antes y después del tratamiento para análisis Se midieron los niveles séricos de hepcidina, TAS, TOS y Fe. RESULTADOS: Si bien los niveles de hepcidina pretratamiento fueron 58,42±3,46 ng/ml, los niveles postratamiento fueron 46,87±2,98 ng/ml (p<0,05). Los niveles de Fe pretratamiento fueron 60,13±7,27 μg/dl, mientras que los niveles posttratamiento fueron 83,1±8,09 μg/dl (p<0,05). Los cambios en los niveles de TAS y TOS también se encontraron estadísticamente significativos. CONCLUSIÓN: A la luz del hecho de que la hepcidina desempeña una función en la regulación de Fe, así como el hecho de que Fe es una fuente nutricional significativa para muchos microorganismos, se concluyó que la hepcidina puede desempeñar un papel significativo en la inmunidad nutricional y la patogénesis de las enfermedades. Texto: La septicemia del ternero neonatal causa alta morbilidad y mortalidad y es una de las principales y más significativas dificultades en la cría de ganado bovino. La septicemia del ternero es la principal causa de muerte en el período neonatal [1]. Su etiología implica bacterias (comúnmente Escherichia coli), virus (rota y coronavirus), parásitos y otros factores. A medida que la enfermedad progresa rápidamente y es letal, el diagnóstico y el tratamiento deben iniciarse lo más rápidamente posible [2]. La hepcidina es una hormona péptida antimicrobiana de bajo peso molecular y fue descubierta por primera vez en orina humana [3]. Es producida por el hígado como respuesta de primera línea a las reacciones inflamatorias y a las concentraciones elevadas de Fe [4, 5]. La hepcidina desempeña un papel fundamental en la regulación del metabolismo del Fe [6], que es parte de las funciones celulares Por otro lado, al participar en reacciones redox que conducen a la producción de especies reactivas de oxígeno (ROSs), Fe también causa estrés oxidativo. Por lo tanto, Fe ha sido considerado como un elemento potencialmente tóxico para las células [7]. Fe también juega un papel importante en la patogénesis de infecciones bacterianas ya que las bacterias utilizan Fe para la supervivencia, el crecimiento y la proliferación; por lo tanto, es de suma importancia controlar el metabolismo de Fe [6]. Es bien sabido que la abundancia de Fe suprime el sistema de defensa que conduce al huésped vulnerable a infecciones. Existe una relación significativa entre Hepcidina, Fe metabolismo, inflamación y el sistema inmunológico. El hecho de que la hepcidina juega un papel activo en la regulación de la liberación de Fe de macrófagos y en el control de la absorción excesiva de Fe del duodeno está bien documentado [6]. La hepcidina es parte del mecanismo En condiciones inflamatorias, la hipoferremia es un importante mecanismo protector de primera línea en respuesta a infecciones [9]. Fe también participa en reacciones redox, causando la producción de ROS, y por lo tanto conduce a estrés oxidativo [7]. Los radicales libres juegan un papel significativo en la patogénesis de muchas enfermedades [10]. Los recién nacidos están sujetos a estrés oxidativo durante el nacimiento. También se reporta que en enfermedades del ganado, especialmente enteritis y neumonía, la capacidad antioxidante es eficaz [11]. Este estudio fue diseñado para determinar la importancia clínica de la hepcidina en terneros con sospecha de septicemia neonatal mediante la evaluación de hepcidina sérica, estado antioxidante total (TAS), estado oxidante total (TOS) y niveles de Fe en terneros sospechosos de septicemia neonatal antes y después del tratamiento. Este estudio se realizó después de obtener la aprobación del Comité de Ética Local de los Experimentos con Animales de la Universidad Mehmet Akif Ersoy (MAKU-HADYEK-Submission: 2014/77), compuesto por 15 terneros con sospecha de septicemia neonatal de entre 1 y 10 días de edad ingresados en el Hospital de Enseñanza de Medicina Veterinaria. Se diagnosticó septicemia sospechosa basada en exámenes clínicos (diarrea, debilidad o ausencia de reflejo de succión, el ternero en posición supina sobre el suelo o incapaz de permanecer en pie, deshidratación severa, temperatura rectal anormal [hipotermia], hiperemia mucosa y esclerótica completa) y hematológicos (aumento del recuento de glóbulos blancos [BC]); se sospechó que los animales tenían septicemia [12, 13]. Los animales recibieron tratamiento estándar (antibióticos, Para la determinación de la hepcidina sérica, TAS, TOS, Fe y parámetros hematológicos se tomaron muestras de sangre antes y después del tratamiento en todos los casos. 8,5 ml de sangre se tomaron de la vena yugular de cada animal en tubos coagulantes para el análisis bioquímico, y 3 ml de sangre se tomaron en tubos ETDA para el análisis hematológico. Se centrifugaron muestras a 3000 rpm durante 10 min, y el suero fue recolectado y mantenido a −20 °C hasta el análisis. Hepcidina sérica (Mybiosource ® ), TAS (Rel Assay Diagnostics ® ) y TOS (Rel Assay Diagnostics ® ) se determinaron utilizando kits ELISA comerciales, y el valor Fe se midió espectrofotométricamente. El análisis hematológico (BCM, linfocitos [LYM], glóbulos rojos [RBC], volumen corpuscular medio (VCM) y hematocrito [HCT]) se realizó en el contador de sangre (VG-MS4e ®, Melet Schloesıng, Francia). Los resultados se evaluaron utilizando la prueba t en el programa estadístico SPSS ® (SPSS 20, EE.UU.) para determinar las diferencias entre los valores antes y después del tratamiento. Los terneros con septicemia sospechada mostraron signos clínicos de pérdida de apetito, fatiga, indiferencia hacia el entorno, disminución/ausencia de reflejos de succión, extremidades frías, incapacidad de estar de pie, diarrea, hundimiento ocular en sus cuencas e hiperemia en la conjuntiva. El promedio de temperatura corporal, frecuencia cardíaca y frecuencia respiratoria de los animales fue de 37,18±0,13°C, 104±4,33/min y 28,86±0,75/min pre-tratamiento; y 38,54±0,10°C, 107,53±2,20/min y 26,40±0,36/min post-tratamiento, respectivamente; los cambios en los niveles de hepcidina, TAS, TOS y Fe en terneros con sospecha de septicemia antes y después del tratamiento se dan en la Tabla 1. Después del tratamiento, los niveles séricos de hepcidina y TOS fueron significativamente más bajos que antes del tratamiento en terneros; por el contrario, los niveles séricos de TAS y Fe fueron significativamente más altos que antes del tratamiento (Tabla 1 ). El tratamiento de terneros dio lugar a cambios significativos en los parámetros hematológicos que se examinaron excepto en el caso de El objetivo de este estudio fue determinar la importancia clínica o el uso de la hepcidina comparando los valores de los niveles séricos de hepcidina, TAS, TOS y Fe en terneros con sospecha de septicemia neonatal antes y después del tratamiento. Los médicos confían en los exámenes clínicos y de laboratorio de los pacientes para formar un diagnóstico de trabajo, por lo que los parámetros hematológicos y bioquímicos séricos se suelen utilizar para este propósito [14]. Los parámetros hematológicos (WBC, HCT, LYM y MCV) evaluados en este estudio fueron comparables con los reportados por otros en terneros neonatales con diarrea y sospecha de septicemia [15] [16] [17]. El tratamiento se corrigió significativamente a valores normales los parámetros hematológicos que se examinaron con excepción de la RBC. El recuento de leucocitos pretratamiento fue alto debido a la La hepcidina está controlada por la presencia de inflamación en el cuerpo, el almacenamiento de Fe y la actividad eritropoyética en la médula ósea y desempeña un papel primordial en la homeostasis de Fe [4]. El aumento de los niveles plasmáticos y tisulares de Fe estimula la síntesis de hepcidina y reduce la liberación de Fe y la absorción entérica de Fe de macrófagos y hepatocitos [18]. El aumento de las concentraciones de hepcidina durante la inflamación e infección reduce los niveles séricos de Fe al disminuir la liberación de Fe de macrófagos y hepatocitos, y por lo tanto la Fe necesaria para microorganismos y células tumorales está restringida [19]. Los niveles séricos de hepcidina en terneros con sospecha de septicemia fueron significativamente elevados antes del tratamiento en comparación con después del tratamiento; también los niveles fe fueron inferiores antes del Esta situación podría estar relacionada con la interacción entre hepcidina y Fe y también da crédito al papel de la hepcidina en la hemostasia de Fe durante la inflamación e infección. Como en nuestro estudio, los niveles de Fe son bien conocidos por disminuir en terneros diarreicos en comparación con terneros sanos [20, 21]. Aunque no existe ningún estudio que reporte la concentración de hepcidina en terneros enfermos, los estudios en sujetos humanos muestran que los niveles de hepcidina en sangre del cordón umbilical podrían ser un indicador importante para diagnosticar el inicio temprano de la sepsis neonatal. Los niveles de hepcidina en sangre del cordón umbilical de lactantes con sepsis variaban entre 118,1 y 8400 ng/mL y eran significativamente más altos que los de lactantes sanos [22]. Estos hallazgos junto con nuestros resultados añaden credibilidad a la idea de que la interacción hepcidina-Fe puede jugar un papel en la patogénesis de la septicemia. La producción de especies libres de oxígeno causa alteraciones en las proteínas, los lípidos y el ADN durante el estrés oxidativo y conduce al desarrollo de lesiones en los órganos [24]. El hierro libre tiene características tóxicas ya que cataliza la producción de ROS [25] y por lo tanto causa estrés oxidativo [26]. El papel de Fe en el desarrollo de estrés oxidativo puede mostrar una vez más la importancia de la hepcidina, como importante regulador de la Fe, con respecto al aumento de la capacidad antioxidante mediante la inhibición de la utilización de Fe por el organismo así como las células huésped. El sistema antioxidante y oxidativo están en un estado constante de equilibrio en el organismo. Cualquier evento que rompa este equilibrio en favor de las moléculas de Las células huésped inician el sistema antioxidante en caso de exposición a estrés oxidativo [27]. Kabu et al. [16] notificaron valores TOS y TAS en terneros neonatales con diarrea como 13,47±0,81 μmol H 2 O 2 /L y 0,51±0,02 mmol Trolox equivalente/L, respectivamente, y el tratamiento de estos terneros causó cambios en estos valores de 11,21±0,26 μmol H 2 O 2 /L y 0,55±0,02 mmol Troloxequivalente/L, respectivamente. Los estudios también informaron que los parámetros utilizados para el estrés oxidativo (malondialdehído) fueron más altos [29] y los parámetros antioxidantes (superóxido dismutasa [21], TAS) fueron más bajos en terneros diarreicos [29]. La disminución de los niveles de TAS y el aumento de los niveles de TOS demostraron que el estrés oxidativo era evidente en los terneros enfermos en nuestro estudio. El aumento de los niveles de TOS y hepcidina antes del tratamiento se considera asociado a la inflamación. Después del tratamiento, el aumento de los niveles de TAS y la disminución de los niveles de hepcidina apoyan esta opinión. La hepcidina puede desempeñar un papel importante en la inmunidad no específica y es una molécula clave que juega un papel en la patogénesis de las enfermedades al mejorar el desarrollo del sistema antioxidante. Sin embargo, se necesitan estudios más detallados sobre el papel de la hepcidina en la patogénesis de la septicemia. Este trabajo se llevó a cabo en colaboración con todos los autores. EEE, HME y AHK: Diseñó los procedimientos experimentales. EEE, EG y MK: Realizaron el trabajo de investigación. EE

¿Qué lleva al estrés oxidativo en el cuerpo?

Relación entre hepcidina y oxidante/antioxidante en terneros con sospecha de septicemia neonatalhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5146304/SHA: efcd7d171bb51acf2ef0a631901900497957a3beAutores: Erkilic, E. E.; Erdogan, H. M.; Ogun, M.; Kirmizigul, A. H.; Gokce, E.; Kuru, M.; Kukurt, A. Fecha: 2016-11-14DOI: 10.14202/vetworld.2016.1238-1241Licencia: cc-byAbstract: AIM: Este estudio se ha realizado con el propósito de determinar la hepcidina sérica, el estado antioxidante total (TAS), el estado oxidante total (TOS), y los niveles de Fe en terneros con sospecha de septicemia neonatal antes y después del tratamiento y la importancia clínica de la hepcidina en terneros con sospecha de septicemia neonatal. MATERIALES Y MÉTODOS: El material del estudio consistió en 15 terneros de diferentes edades y sexos llevados al Centro de Capacitación, Investigación y Aplicación de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de Kafkas con sospecha de septicemia neonatal. 8,5 ml de sangre se extrajo de la vena yugular de cada animal en tubos coagulantes antes y después del tratamiento para análisis Se midieron los niveles séricos de hepcidina, TAS, TOS y Fe. RESULTADOS: Si bien los niveles de hepcidina pretratamiento fueron 58,42±3,46 ng/ml, los niveles postratamiento fueron 46,87±2,98 ng/ml (p<0,05). Los niveles de Fe pretratamiento fueron 60,13±7,27 μg/dl, mientras que los niveles posttratamiento fueron 83,1±8,09 μg/dl (p<0,05). Los cambios en los niveles de TAS y TOS también se encontraron estadísticamente significativos. CONCLUSIÓN: A la luz del hecho de que la hepcidina desempeña una función en la regulación de Fe, así como el hecho de que Fe es una fuente nutricional significativa para muchos microorganismos, se concluyó que la hepcidina puede desempeñar un papel significativo en la inmunidad nutricional y la patogénesis de las enfermedades. Texto: La septicemia del ternero neonatal causa alta morbilidad y mortalidad y es una de las principales y más significativas dificultades en la cría de ganado bovino. La septicemia del ternero es la principal causa de muerte en el período neonatal [1]. Su etiología implica bacterias (comúnmente Escherichia coli), virus (rota y coronavirus), parásitos y otros factores. A medida que la enfermedad progresa rápidamente y es letal, el diagnóstico y el tratamiento deben iniciarse lo más rápidamente posible [2]. La hepcidina es una hormona péptida antimicrobiana de bajo peso molecular y fue descubierta por primera vez en orina humana [3]. Es producida por el hígado como respuesta de primera línea a las reacciones inflamatorias y a las concentraciones elevadas de Fe [4, 5]. La hepcidina desempeña un papel fundamental en la regulación del metabolismo del Fe [6], que es parte de las funciones celulares Por otro lado, al participar en reacciones redox que conducen a la producción de especies reactivas de oxígeno (ROSs), Fe también causa estrés oxidativo. Por lo tanto, Fe ha sido considerado como un elemento potencialmente tóxico para las células [7]. Fe también juega un papel importante en la patogénesis de infecciones bacterianas ya que las bacterias utilizan Fe para la supervivencia, el crecimiento y la proliferación; por lo tanto, es de suma importancia controlar el metabolismo de Fe [6]. Es bien sabido que la abundancia de Fe suprime el sistema de defensa que conduce al huésped vulnerable a infecciones. Existe una relación significativa entre Hepcidina, Fe metabolismo, inflamación y el sistema inmunológico. El hecho de que la hepcidina juega un papel activo en la regulación de la liberación de Fe de macrófagos y en el control de la absorción excesiva de Fe del duodeno está bien documentado [6]. La hepcidina es parte del mecanismo En condiciones inflamatorias, la hipoferremia es un importante mecanismo protector de primera línea en respuesta a infecciones [9]. Fe también participa en reacciones redox, causando la producción de ROS, y por lo tanto conduce a estrés oxidativo [7]. Los radicales libres juegan un papel significativo en la patogénesis de muchas enfermedades [10]. Los recién nacidos están sujetos a estrés oxidativo durante el nacimiento. También se reporta que en enfermedades del ganado, especialmente enteritis y neumonía, la capacidad antioxidante es eficaz [11]. Este estudio fue diseñado para determinar la importancia clínica de la hepcidina en terneros con sospecha de septicemia neonatal mediante la evaluación de hepcidina sérica, estado antioxidante total (TAS), estado oxidante total (TOS) y niveles de Fe en terneros sospechosos de septicemia neonatal antes y después del tratamiento. Este estudio se realizó después de obtener la aprobación del Comité de Ética Local de los Experimentos con Animales de la Universidad Mehmet Akif Ersoy (MAKU-HADYEK-Submission: 2014/77), compuesto por 15 terneros con sospecha de septicemia neonatal de entre 1 y 10 días de edad ingresados en el Hospital de Enseñanza de Medicina Veterinaria. Se diagnosticó septicemia sospechosa basada en exámenes clínicos (diarrea, debilidad o ausencia de reflejo de succión, el ternero en posición supina sobre el suelo o incapaz de permanecer en pie, deshidratación severa, temperatura rectal anormal [hipotermia], hiperemia mucosa y esclerótica completa) y hematológicos (aumento del recuento de glóbulos blancos [BC]); se sospechó que los animales tenían septicemia [12, 13]. Los animales recibieron tratamiento estándar (antibióticos, Para la determinación de la hepcidina sérica, TAS, TOS, Fe y parámetros hematológicos se tomaron muestras de sangre antes y después del tratamiento en todos los casos. 8,5 ml de sangre se tomaron de la vena yugular de cada animal en tubos coagulantes para el análisis bioquímico, y 3 ml de sangre se tomaron en tubos ETDA para el análisis hematológico. Se centrifugaron muestras a 3000 rpm durante 10 min, y el suero fue recolectado y mantenido a −20 °C hasta el análisis. Hepcidina sérica (Mybiosource ® ), TAS (Rel Assay Diagnostics ® ) y TOS (Rel Assay Diagnostics ® ) se determinaron utilizando kits ELISA comerciales, y el valor Fe se midió espectrofotométricamente. El análisis hematológico (BCM, linfocitos [LYM], glóbulos rojos [RBC], volumen corpuscular medio (VCM) y hematocrito [HCT]) se realizó en el contador de sangre (VG-MS4e ®, Melet Schloesıng, Francia). Los resultados se evaluaron utilizando la prueba t en el programa estadístico SPSS ® (SPSS 20, EE.UU.) para determinar las diferencias entre los valores antes y después del tratamiento. Los terneros con septicemia sospechada mostraron signos clínicos de pérdida de apetito, fatiga, indiferencia hacia el entorno, disminución/ausencia de reflejos de succión, extremidades frías, incapacidad de estar de pie, diarrea, hundimiento ocular en sus cuencas e hiperemia en la conjuntiva. El promedio de temperatura corporal, frecuencia cardíaca y frecuencia respiratoria de los animales fue de 37,18±0,13°C, 104±4,33/min y 28,86±0,75/min pre-tratamiento; y 38,54±0,10°C, 107,53±2,20/min y 26,40±0,36/min post-tratamiento, respectivamente; los cambios en los niveles de hepcidina, TAS, TOS y Fe en terneros con sospecha de septicemia antes y después del tratamiento se dan en la Tabla 1. Después del tratamiento, los niveles séricos de hepcidina y TOS fueron significativamente más bajos que antes del tratamiento en terneros; por el contrario, los niveles séricos de TAS y Fe fueron significativamente más altos que antes del tratamiento (Tabla 1 ). El tratamiento de terneros dio lugar a cambios significativos en los parámetros hematológicos que se examinaron excepto en el caso de El objetivo de este estudio fue determinar la importancia clínica o el uso de la hepcidina comparando los valores de los niveles séricos de hepcidina, TAS, TOS y Fe en terneros con sospecha de septicemia neonatal antes y después del tratamiento. Los médicos confían en los exámenes clínicos y de laboratorio de los pacientes para formar un diagnóstico de trabajo, por lo que los parámetros hematológicos y bioquímicos séricos se suelen utilizar para este propósito [14]. Los parámetros hematológicos (WBC, HCT, LYM y MCV) evaluados en este estudio fueron comparables con los reportados por otros en terneros neonatales con diarrea y sospecha de septicemia [15] [16] [17]. El tratamiento se corrigió significativamente a valores normales los parámetros hematológicos que se examinaron con excepción de la RBC. El recuento de leucocitos pretratamiento fue alto debido a la La hepcidina está controlada por la presencia de inflamación en el cuerpo, el almacenamiento de Fe y la actividad eritropoyética en la médula ósea y desempeña un papel primordial en la homeostasis de Fe [4]. El aumento de los niveles plasmáticos y tisulares de Fe estimula la síntesis de hepcidina y reduce la liberación de Fe y la absorción entérica de Fe de macrófagos y hepatocitos [18]. El aumento de las concentraciones de hepcidina durante la inflamación e infección reduce los niveles séricos de Fe al disminuir la liberación de Fe de macrófagos y hepatocitos, y por lo tanto la Fe necesaria para microorganismos y células tumorales está restringida [19]. Los niveles séricos de hepcidina en terneros con sospecha de septicemia fueron significativamente elevados antes del tratamiento en comparación con después del tratamiento; también los niveles fe fueron inferiores antes del Esta situación podría estar relacionada con la interacción entre hepcidina y Fe y también da crédito al papel de la hepcidina en la hemostasia de Fe durante la inflamación e infección. Como en nuestro estudio, los niveles de Fe son bien conocidos por disminuir en terneros diarreicos en comparación con terneros sanos [20, 21]. Aunque no existe ningún estudio que reporte la concentración de hepcidina en terneros enfermos, los estudios en sujetos humanos muestran que los niveles de hepcidina en sangre del cordón umbilical podrían ser un indicador importante para diagnosticar el inicio temprano de la sepsis neonatal. Los niveles de hepcidina en sangre del cordón umbilical de lactantes con sepsis variaban entre 118,1 y 8400 ng/mL y eran significativamente más altos que los de lactantes sanos [22]. Estos hallazgos junto con nuestros resultados añaden credibilidad a la idea de que la interacción hepcidina-Fe puede jugar un papel en la patogénesis de la septicemia. La producción de especies libres de oxígeno causa alteraciones en las proteínas, los lípidos y el ADN durante el estrés oxidativo y conduce al desarrollo de lesiones en los órganos [24]. El hierro libre tiene características tóxicas ya que cataliza la producción de ROS [25] y por lo tanto causa estrés oxidativo [26]. El papel de Fe en el desarrollo de estrés oxidativo puede mostrar una vez más la importancia de la hepcidina, como importante regulador de la Fe, con respecto al aumento de la capacidad antioxidante mediante la inhibición de la utilización de Fe por el organismo así como las células huésped. El sistema antioxidante y oxidativo están en un estado constante de equilibrio en el organismo. Cualquier evento que rompa este equilibrio en favor de las moléculas de Las células huésped inician el sistema antioxidante en caso de exposición a estrés oxidativo [27]. Kabu et al. [16] notificaron valores TOS y TAS en terneros neonatales con diarrea como 13,47±0,81 μmol H 2 O 2 /L y 0,51±0,02 mmol Trolox equivalente/L, respectivamente, y el tratamiento de estos terneros causó cambios en estos valores de 11,21±0,26 μmol H 2 O 2 /L y 0,55±0,02 mmol Troloxequivalente/L, respectivamente. Los estudios también informaron que los parámetros utilizados para el estrés oxidativo (malondialdehído) fueron más altos [29] y los parámetros antioxidantes (superóxido dismutasa [21], TAS) fueron más bajos en terneros diarreicos [29]. La disminución de los niveles de TAS y el aumento de los niveles de TOS demostraron que el estrés oxidativo era evidente en los terneros enfermos en nuestro estudio. El aumento de los niveles de TOS y hepcidina antes del tratamiento se considera asociado a la inflamación. Después del tratamiento, el aumento de los niveles de TAS y la disminución de los niveles de hepcidina apoyan esta opinión. La hepcidina puede desempeñar un papel importante en la inmunidad no específica y es una molécula clave que juega un papel en la patogénesis de las enfermedades al mejorar el desarrollo del sistema antioxidante. Sin embargo, se necesitan estudios más detallados sobre el papel de la hepcidina en la patogénesis de la septicemia. Este trabajo se llevó a cabo en colaboración con todos los autores. EEE, HME y AHK: Diseñó los procedimientos experimentales. EEE, EG y MK: Realizaron el trabajo de investigación. EE

¿Qué parámetro se utiliza para medir los niveles antioxidantes?

Nueva Isoxazolidina-Conjugados de quinazolinonas-Sintesis, Antiviral y Actividad Citostáticahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6273226/SHA: eefddcf51f8426ecaa9e3ace144dadb34a74cf5Autores: Piotrowska, Dorota G.; Andrei, Graciela; Schols, Dominique; Snoeck, Robert; Grabkowska-Drużyc, MagdalenaFecha: 2016-07-22DOI: 10.3390/moléculas21070959Licencia: cc-byAbstract: Una nueva serie de 3-dietoxifosforil)isoxazolidinas sustituidas en C5 con varias quinazolinonas han sido Las isoxazolidinas trans-11f/cis-11f (90:10), trans-11h y trans-11i/cis-11i (97:3) mostraron una actividad débil (EC(50) = 6,84, 15,29 y 9,44 μM) hacia VZV ( cepa TK(+)), que era sólo un orden de magnitud inferior al de aciclovir utilizado como fármaco de referencia. Los fosfonatos trans-11b/cis-11b (90:10), trans-11c, trans-11e/cis-11e (90:10) y trans-11g aparecieron ligeramente activos hacia citomegalovirus (EC(50) = 27–45 μM). Los compuestos que contienen sustitutos bencilos en N3 en el esqueleto de quinazolinona mostraron una ligera actividad antiproliferativa hacia las células inmortalizadas probadas con IC(50) en el rango de 21-102 μM. Texto: Los heterociclos que contienen nitrógeno forman el núcleo de los productos naturales (por ejemplo, alcaloides) y también están presentes en muchos farmacoforos, así como en numerosos medicamentos comercializados. Entre ellos, las quinazolinas y las quinazolinonas han llamado la atención especialmente debido al amplio espectro de actividades biológicas de sus derivados, incluidos los sedantes [1] [2] [3], los anticancerosos [4] [6] [7], los antivirales [8] [9] [10] [11] [12], los antibacterianos [13] [14] [15], los antifúngicos [15, 16], los antiinflamatorios [15, [17] [18] [19] y las actividades antifibróticas [20, 21] Se han publicado varias revisiones centradas en las estrategias sintéticas y las actividades biológicas de estos compuestos [22] [23] [25] [26] [27] [28]. Se ha demostrado el impacto significativo de diversos grupos funcionales instalados en marcos de quinazolina/quinazolinona sobre propiedades farmacológicas. En las últimas décadas se han obtenido varios compuestos que contienen el marco de la quinazolina-4-ona, que exhibieron propiedades anticancerosas prometedoras, así como antivirales (Figura 1 ). Además, algunas quinazolina-4(3H)-onas sustituidas biológicamente activas fueron aisladas de varias especies de hongos y bacterias. Por ejemplo, se reconoció el 2-(4-hidroxibencil)quinazolina-4(3H)-ona (1) en un hongo entomopatógeno Isaria farinosa y sus fuertes propiedades inhibitorias en la replicación del virus del mosaico del tabaco (TMV) [30], mientras que su análogo 2-(4-hidroxibenzoilo) presente en hongos del género Penicillium apareció sólo ligeramente activo hacia TMV [30]. Además, el compuesto 1 mostró citotoxicidad significativa hacia varias líneas celulares del cáncer [31, 32]. . Muy recientemente se ha obtenido el análogo 4 sintético que contiene piridina y sus 3 derivados sustituidos 5 y 6 y se ha revelado su ligera actividad contra el virus de la gripe A [34]. Por otro lado, se han encontrado varias quinazolinas 2,3-distituidas-4(3H)-onas, incluidos los compuestos 7-10, que poseen actividad antitumoral [35]. Se ha descubierto una ligera actividad contra el virus de la gripe A [34]. Por otro lado, se han encontrado varias quinazolinas 2,3-disustituidas-4(3H)-onas, incluidos los compuestos 7-10, que poseen actividad antitumoral [35]. En la continuación de nuestros estudios sobre la actividad antiviral y citostática de análogos isoxazolidina de análogos C-nucleósidos, diseñamos una nueva serie de compuestos de la fórmula general 11 que contienen una fracción sustituida de quinazolinona como una falsa nucleobase en C5 en el anillo isoxazolidina y la función dietoxifosforil acoplada en C3. Nuestra estrategia sintética a los compuestos trans-11/cis-11 se basa en la cicloaddición 1,3-dipolar de N-metil-C-(dietoxifosforil)nitrono 12 [36] con 2-vinil-3H-quinazolina-4-ones 13 sustituida en N3 (Scheme 1). Esquema 1. Retrosíntesis de (isoxazolidinil) fosfonatos trans-11/cis-11. Las 2-vinil-3H-quinazolina-4-ones 13 modificadas en N3 con grupos bencilos sustituidos se sintetizaron a partir de la 2-aminobenzamida disponible comercialmente (14) mediante acilación con cloruro de 3-cloropropionilo seguido de ciclización y deshidrohalogenación para preparar 2-vinil-3Hquinazolina-4-ona (13a) como intermediario clave [37] y una reacción posterior con bromuros de bencilo sustituidos 13b-i [38] (Scheme 2). Además, también se obtuvieron compuestos 13j (R = Me) y 13k (R = Et) con la intención de determinar la influencia del sustituente de bencilo en la actividad biológica de las isoxazolidinas diseñadas trans-11/cis-11. En los espectros de 1 H-NMR de los compuestos 13a-k se observaron señales características para los protones de vinilo en los 6,94-5,59 ppm (tres dobles de dobles). Continuando con nuestros estudios sobre la actividad antiviral y citostática de los análogos de isoxazolidina de los análogos de C-nucleósidos, diseñamos una nueva serie de compuestos de la fórmula general 11 que contienen una fracción de quinazolinona sustituida como una falsa nucleobase en C5 en el anillo de isoxazolidina y la función dietoxifosforil acoplada en C3. Nuestra estrategia sintética a los compuestos trans-11/cis-11 se basa en la cicloaddición de 1,3-dipolar de N-metil-C-(dietoxifosforil)nitrono 12 [36] con 2-vinil-3H-quinazolin-4-ones 13 sustituidos en N Por otro lado, se ha encontrado que varias quinazolinas 2,3-disustituidas-4(3H)-ones, incluyendo compuestos 7-10, poseen actividad antitumoral [35]. Continuando con nuestros estudios sobre la actividad antiviral y citostática de análogos isoxazolidina de análogos C-nucleósidos, diseñamos una nueva serie de compuestos de la fórmula general 11 que contienen una fracción de quinazolinona sustituida como una nucleobasa falsa en C5 en el anillo isoxazolidina y la función dietoxifosforil unida a C3. Nuestra estrategia sintética para los compuestos trans-11/cis-11 se basa en la cicloadición 1,3-dipolar de N-metil-C-(dietoxifosforil)nitrono 12 [36] con 2-vinil-3H-quinazolina-4-ones 13 sustituidas en N3 (Scheme 1). Esquema 1. La retrosíntesis de los fosfonatos (isoxazolidinil) trans-11/cis-11. 2-vinil-3H-quinazolina-4-ones 13 modificadas en N3 con grupos de bencilo sustituidos se sintetizaron a partir de 2-aminobencimida disponible comercialmente (14) mediante acilación con cloruro de 3-cloropropionilo seguido de ciclación y deshidrohalogenación para preparar 2-vinil-3Hquinazolina-4-ona (13a) como un intermediario clave [37] y una reacción posterior con Además, los compuestos 13j (R = Me) y 13k (R = Et) también se obtuvieron con la intención de determinar la influencia del substituto bencilo en la actividad biológica de las isoxazolidinas diseñadas trans-11/cis-11. En los 6,94-5,59 ppm (tres dobles de dobles) se observaron en los espectros 1 H-NMR de los compuestos 13a-k señales características de los protones de vinilo. Las 2-vinil-3H-quinazolina-4-ones 13 modificadas en N3 con grupos bencilos sustituidos se sintetizaron a partir de la 2-aminobenzamida disponible comercialmente (14) mediante acilación con cloruro de 3-cloropropionilo seguido de ciclización y deshidrohalogenación para preparar 2-vinil-3H-quinazolina-4-ona (13a) como intermediario clave [37] y una reacción posterior con bromuro de bencilo sustituido 13b-i [38] (Scheme 2). Además, también se obtuvieron compuestos 13j (R = Me) y 13k (R = Et) con la intención de determinar la influencia del sustituente de bencilo en la actividad biológica de las isoxazolidinas diseñadas trans-11/cis-11. En los espectros de 1 H-NMR de compuestos 13a-k se observaron señales características para los protones de vinilo en los 6,94-5,59 ppm (tres dobles de dobles). La cicloadición 1,3-dipolar de un nitrono 12 con 2-vinilquinazolinonas 13a-k llevó a la formación de mezclas diastereoisoméricas de 5-sustituidas (3-dietoxifosforil)isoxazolidinas trans-11 y cis-11 con buenas (80%-88%) diastereoselectividades (Scheme 3, Tabla 1 ). Las proporciones de cis/transdiastereoisómeros se calcularon a partir de 31 espectros P-NMR de mezclas de reacción bruta y se confirmaron mediante el análisis de 1 H-NMR datos espectrales. Sin embargo, los intentos de aislar diastereoisómeros puros fueron fructíferos para trans-11a Las configuraciones relativas de isoxazolidinas trans-11a y cis-11a se establecieron a partir de nuestros estudios previos sobre estereoquímica de cicloaddición de N-metil-C-(dietoxifosforil)nitrono (12) con varios arilos de vinilo [39, 40] ya que se observaron Patters espectrales similares de 1 H-NMR para las respectivas series de trans y cis-isoxazolidinas. Ya que para el compuesto trans-11a todas las constantes de acoplamiento necesarias se extrajeron con éxito de los espectros 1 H y 13 C-NMR, se realizó un análisis detallado de la conformación basado en estos datos {J(H3-H4α) = 9,3 Hz [41], J(H3-H4β) 3 Hz, J(H4α-P) = 9,9 Hz La cicloadición 1,3-dipolar de un nitrono 12 con 2-vinilquinazolinonas 13a-k llevó a la formación de mezclas diastereoisoméricas de 5-sustituidas (3-dietoxifosforil)isoxazolidinas trans-11 y cis-11 con buenas diastereoselectividades (80%-88%) (Scheme 3, Tabla 1 ). Las proporciones de cis/diastereoisómeros trans fueron calculadas a partir de 31 espectros P-NMR de mezclas de reacción cruda y confirmadas por el análisis de 1 H-NMR datos espectrales. Sin embargo, los intentos de aislar los diastereoisómeros puros fueron fructíferos para trans-11a (R = H), trans-11c (R = 2-NO 2 -C 6 H 4 -CH 2 ), trans-11g (R = 3-F-C 6 H 4 -CH 2 ), trans-11h (R = 4-F-C 6 H 4 -CH 2 ) y trans-11j (R = Me) solamente. Tabla 1 ). Las proporciones de los diastereoisómeros cis/trans se calcularon a partir de 31 espectros P-NMR de mezclas de reacción bruta y confirmados por el análisis de 1 H-NMR datos espectrales. Sin embargo, los intentos de aislar diastereoisómeros puros fueron fructíferos para trans-11a (R = H), trans-11c (R = 2-NO2-C6H4-CH2), trans-11g (R = 3-F-C6H4-CH2), trans-11h (R = 4-F-C6H4-CH2) y trans-11j (R = Me) solamente. Las configuraciones relativas de isoxazolidinas trans-11a y cis-11a se establecieron a partir de nuestros estudios previos sobre estereoquímica de cicloaddición de N-metil-C-(dietoxifosforil)nitrono (12) con varios arilos de vinilo [39, 40] ya que se observaron Patters espectrales H-NMR similares para las series respectivas de isoxazolidinas trans-y cis. Dado que para el compuesto trans-11a todas las constantes de acoplamiento necesarias se extrajeron con éxito de los espectros 1 H-y 13 C-NMR, se realizó un análisis detallado de la conformación basado en estos datos {J(H3-H4α) = 9,3 Hz [41], J(H3-H4β) = 8, 3 Hz, J(H4α-P) = 9,9 Hz Scheme 3. Síntesis de las isoxazolidinas cis-11a-k y trans-11a-k. Las configuraciones relativas de isoxazolidinas trans-11a y cis-11a se establecieron a partir de nuestros estudios previos sobre estereoquímica de cicloaddición de N-metil-C-(dietoxifosforil)nitrono (12) con varios arilos de vinilo [39, 40] ya que se observaron Patters espectrales similares de 1 H-NMR para las respectivas series de cis-isoxazolidinas transand. Puesto que para el compuesto trans-11a todas las constantes de acoplamiento necesarias se extrajeron con éxito de los espectros 1 H y 13 C-NMR, se realizó un análisis detallado de la conformación basado en estos datos {J (H3-H4α) = 9,3 Hz [41], J (H3-H4β) = 8. 3 Hz, J (H4α-P) = 9,9 Hz [42, 43], J (H4β-P) = 16,9 Hz, J (H4α-H5) = 6,2 Hz, J (H4β-H5) = 8, 3 Hz, J (CCCP) = 8,5 Hz [44, 45] } y reveló que el anillo isoxazolidina en trans-11a adopta una conformación de 3 E en la que el grupo dietoxifosforil reside en la posición ecuatorial del anillo isoxazolidina, mientras que un sustituente de quinazolinona se encuentra pseudoecuatorialmente (Figura 2 ). Por otro lado, la configuración cis del isómero menor se estableció a partir de los correspondientes acoplamientos [J (H3-H4α) = 9,0 Hz, J (H3-H4β) = 6,5 Hz, J (H4α-P) = 11,2 Hz, J (H4β-P) = 20,0 Hz, J (H4α-H5) = 9,1 Hz, J (H4β-H5) = 3,9 Hz, J (CCCP) = 7, 3 Hz] indicando la conformación 2 E del anillo isoxazolidina (Figura 2 ). Los argumentos adicionales para apoyar nuestras asignaciones se derivan del blindaje de los protones CH 3 CH 2 OP observados para el isómero cis ( 0.1 ppm) cuando se comparan con el trans-11a. Además, se encontró que en un espectro de 1 H-NMR tomado en la mezcla 83:17 de cisand trans-11a, el protón H-N en el anillo de quinazolinona de cis-11a fue significativamente desbrilado ( = 0,7 ppm) en comparación con el isómero trans, muy probablemente, como resultado de la formación de enlace de hidrógeno con la amida de oxígeno fosforil, un fenómeno espacialmente alcanzable en el isómero cis solamente. Desde la introducción de varios sustituentes en N3 de la fracción de quinazolinona no tiene influencia en el resultado estereoquímico de la cicloaddición, por lo tanto, la configuración de todas las isoxazolidinas principales se asignaron como trans, por lo tanto menores como cis. Figura 2 ). Los argumentos adicionales para apoyar nuestras asignaciones siguen del blindaje de los protones CH3 0.1 ppm) en comparación con el trans-11a. Además, se encontró que en un espectro de 1 H-NMR tomado en la mezcla 83:17 de cis-y trans-11a, el protón H-N en el anillo de quinazolinona de cis-11a fue significativamente deshilachado ( = 0,7 ppm) en comparación con el isómero trans, muy probablemente, como resultado de la formación de enlace de hidrógeno con la amida de oxígeno fosforil, un fenómeno espacialmente alcanzable en el isómero cis solamente. Desde la introducción de varios sustituentes en N3 de la fracción de quinazolinona no tiene ninguna influencia en el resultado estereoquímico de la cicloaddición, por lo tanto, la configuración de todas las principales isoxazolidinas 11 fueron asignadas como trans, por lo tanto menores como cis. Ganciclovir, cidofovir, aciclovir, brivudin, zalcitabina, zanamivir, alovudina, amantadina, rimantadina, ribavirina, sulfato de dextrano (peso molecular 10.000, DS-10000), ácido micofenólico, aglutinina híbrida Hippeastrum (HHA) y Urtica dioica aglutinina (UDA) se utilizaron como compuestos de referencia. La actividad antiviral se expresó como el EC50: la concentración compuesta necesaria para reducir la formación de placa viral (VZV) en un 50% o para reducir la citopatogenicidad inducida por el virus en un 50% (otros virus). Varias isoxazolidinas trans-11/cis-11 fueron capaces de inhibir débilmente la replicación de cepas TK + y TK − VZV con valores de EC50 en el rango de 6,84-100 μM (Tabla 2). Entre ellas, se utilizaron como compuestos de referencia los fosfonatos Ganciclovir, cidofovir, aciclovir, brivudin, zalcitabina, zanamivir, alovudina, amantadina, rimantadina, ribavirina, sulfato de dextrina (peso molecular 10.000, DS-10000), ácido micofenolico, aglutinina híbrida Hippeastrum (HHA) y Urtica dioica agglutinin (UDA). La actividad antiviral se expresó como CE 50 : la concentración compuesta necesaria para reducir la formación de placas virales (VZV) en un 50% o para reducir la citopatogenicidad inducida por el virus en un 50% (otros virus). Varias isoxazolidinas trans-11/cis-11 fueron capaces de inhibir débilmente la replicación de cepas TK+ y TKV ZV con valores CE 50 en el rango de 6,84-100 μM (Tabla 2). Entre ellos, los fosfonatos trans-11f/cis-11f (90:10) (R = 2-F-C 6 H 4 -CH 2 ) (EC 50 = 6,84 μM), trans-11h (R = 4-F-C 6 H 4 -CH 2 ) (EC 50 = 15,29 μM), trans-11i/cis-11i (97:3) (R = 2,4-diF-C 6 H 3 -CH 2 ) (EC 50 = 9,44 μM) fueron los más activos hacia la cepa TK + VZV Oka, sin mostrar actividad hacia la cepa TK ́VZV. La actividad de estas isoxazolidinas trans-11/cis-11 contra la cepa TK + VZV Oka fue de 8 a 22 veces inferior a la del fármaco de referencia aciclovir. Por otro lado, los valores CE 50 para la cepa TK ́VZV 07-1 (que es una cepa resistente a aciclovir) de los fosfonatos trans-11e/cis-11e (90:10) (R = 4-NO 2 -C 6 H 4 -CH 2 ) (EC 50 = 42,87 μM) y trans-11k/cis-11k (97:3) (R = Et) (EC 50 = 41,57 μM) fueron comparables a los de aciclovir (EC 50 = 39,69 μM). Estos derivados mostraron EC 50's similares para las cepas TK + y TK ́VZV y, por lo tanto, su potencia frente a TK + VZV fue aproximadamente 50 veces inferior en comparación con aciclovir. Además, los compuestos trans-11b/cis-11b (90:10) (R = C 6 H 5 -CH 2 ), trans-11c (R = 2-NO 2 -C 6 H 4 -CH 2 ), trans-11e/cis-11e (90:10) (R = 4-NO 2 -C 6 H 4 -CH 2 ) y trans-11g (R = 3-F-C 6 H 4 -CH 2 ) mostraron alguna actividad frente al citomegalovirus humano (EC 50 = 27-45 μM), aunque eran menos activos que ganciclovir y cidofovir utilizados como compuestos de referencia (Tabla 3). Ninguno de los derivados fosfonatos aquí descritos mostró actividad frente a los otros virus de ADN y ARN probados. La concentración inhibitoria citostática del 50% (IC 50 ) que causa una disminución del 50% en la proliferación celular se determinó contra la leucemia murina L1210, el linfocito humano CEM, el carcinoma de cuello uterino humano HeLa y las células endoteliales microvaculares dérmicas humanas inmortalizadas (HMEC-1). Las isoxazolidinas trans-11a (R = H) y trans-11j (R = Me) no inhibieron la proliferación celular en la concentración más alta probada (es decir, 250 μM), mientras que las trans-11k/cis-11k (97:3) (R = Et) aparecieron ligeramente citostáticas hacia las líneas celulares probadas (IC 50 = 85-101 μM). Por otro lado (tabla 4, entradas b a i), compuestos con substitutos bencilos en N3 en la fracción de quinazolinona mostraron valores inferiores de IC 50 (IC 50 = 21-102 μM) indicando que la instalación de grupos bencilos funcionalizados era rentable para las propiedades inhibitorias. Tabla 4. Efecto inhibidor de los compuestos probados contra la proliferación de leucemia murina (L1210), linfocitos T humanos (CEM), carcinoma de cuello uterino humano (HeLa) y células endoteliales microvasculares dérmicas humanas inmortalizadas (HMEC-1). A la solución de 2-vinilo-3H-quinazolina-4-ona (13a, 1,00 mmol) en acetonitrilo (15 ml) de carbonato de potasio (3,00 mmol). Después de 15 minutos se añadió el respectivo bromuro de bencilo (1,10 mmol) y se agitó la mezcla de reacción bajo reflujo durante 4 h. Se eliminó un disolvente y se extrajo el residuo con agua (3,10 ml). Se secó una capa orgánica (MgSO 4 ), se concentró y el producto crudo se purificó en una columna de gel de sílice con cloruro de metileno: mezcla de hexano (7,3 v/v) seguida de cristalización (éter cloroformo-petróleo) para dar quinazolinonas puras 13b-e y 13g-i 133,57, 128,60, 128,28, 128,25, 127,67, 126,60, 123,81, 123,61, 115,59, 68.32 (s, N-CH 2 ). Anal. Calcd C 17 A la solución de 2-vinil-3H-quinazolina-4-ona (13a, 1,00 mmol) en acetonitrilo (15 mL) se añadió carbonato de potasio (3,00 mmol). Después de 15 min. se añadió yodometano (2.00 mmol) o yodoetano (1,10 mmol) y se agitó la mezcla de reacción a 60 °C durante 5 h. Se eliminó el disolvente y se extrajo un residuo con agua (3 °10 mL). Se se secó la capa orgánica (MgSO 4 ), se concentró y el producto crudo se purificó en una columna de gel de sílice con cloruro de metileno:mezcla de hexano (7:3, v/v) seguida de cristalización (cloroformo : éter de petróleo) para dar quinazolinonas puras 13j [35] o 13k. 3-metil = 122 C-124 C (referencia [35] m.p. = 123 C-125 C). Una solución del nitrono 12 (1,0 mmol) y la respectiva quinazolinona de vinilo (1,0 mmol) en tolueno (2 ml) se movió a 70 °C hasta la desaparición (TLC) del nitrono inicial. Todos los volátiles fueron eliminados en vacuo y los productos crudos fueron sometidos a cromatografía en columnas de gel de sílice con un cloroformo/metanol (100:1, 50:1, 20:1, v/v) mezclas como eluentes. Trans-(2-metil-5-(4-oxo-3,4-dihidroquinazolina-2-il)isoxazolidin-3-il)fosfonato (trans-11a). Aceite amarillento; IR (película, cm ́1) / max: 3085, 2980, 2929, 2782, 1687, 1610, 1469, 1331, 1132, 1098, 1052, 13 Transfonato de dietilo (2-metil-5-(3-(nitrobencil)-4-oxo-3,4-dihidroquinazolina-2-il)isoxazolidin-3-il) (trans-11d). Los datos que figuran a continuación corresponden a una mezcla de 92:8 de trans-11d y cis-11d. Aceite amarillento; IR (película, cm ́1) / max: 3070, 2982, 2930, 2910, 1620, 1574, 1531, 1497, 1415, 1298, 1103, 1025, 774

¿Compuestos de qué marco han mostrado propiedades prometedoras anticancerosas y antivirales?

Epidemiología de la infección por HBoV1 y relación con las condiciones meteorológicas en pacientes pediátricos hospitalizados con enfermedad respiratoria aguda: un estudio de 7 años en una región subtropicalhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6048719/SHA: f2f78c95ab378a31bd35dc1de84e0ec75eb7ce1bAutores: Liu, Wen-Kuan; Liu, Qian; Chen, De-Hui; Tan, Wei-Ping; Cai, Yong; Qiu, Shu-Yan; Xu, Duo; Li, Chi; Li, Xiao; Lin, Zheng-Shi; Zhou, RongFecha: 2018-07-16DOI: 10.1186/s1287-018-3Licencia: Para investigar la distribución de HBoV1 y determinar el efecto de las condiciones meteorológicas, los pacientes pediátricos hospitalizados fueron estudiados en una región subtropical de China. MÉTODOS: Muestras de 11.399 pacientes pediátricos hospitalizados (≤14 años), con ARI fueron probados para HBoV1 y otros patógenos respiratorios comunes utilizando PCR en tiempo real, entre julio de 2009 y junio de 2016. Además, se recolectaron datos meteorológicos locales. RESULTADOS: De los 11.399 pacientes evaluados, 5606 (49,2%) fueron positivos para al menos un patógeno respiratorio. Doscientos cuarenta y ocho de 11.399 (2,2%) fueron positivos para la infección por HBoV1. La coinfección fue común en pacientes HBoV1 positivos (45,2%, 112/248). Se encontró una diferencia significativa en la prevalencia de HBoV1 en pacientes de diferentes grupos de edad (p < 0,001), y la prevalencia máxima se encontró en pacientes de 7 a 12 meses (4,7%, 56/1203). Se encontraron dos picos de prevalencia de HBoV1 en verano (entre junio y septiembre) e invierno (entre noviembre y diciembre). La prevalencia de HBoV1 se relacionó significativamente positivamente con la temperatura media y se correlacionó negativamente con la humedad relativa media, y la temperatura media en el mes anterior tuvo mejor poder explicativo que la temperatura mensual actual. CONCLUSIONES: Este estudio proporciona una mejor comprensión de las características de la infección por HBoV1 en niños en regiones subtropicales. Los datos de este estudio proporcionan información útil para el futuro control y prevención de infecciones por HBoV1. Texto: Bocavirus humano 1 (HBoV1), que pertenece a la familia Parvoviridae, fue identificado en primer El HBoV1 ha sido confirmado como un patógeno respiratorio importante y se encuentra en infecciones respiratorias en niños y adultos en todo el mundo. La prevalencia de la detección de ácido nucleico del HBoV1 varía entre 1,5 y 33% en pacientes con enfermedad respiratoria aguda (ARI), según diferentes estudios [3] [5] [6] [7]. Los resultados de las pruebas serológicas y de ácido nucleico son generalmente consistentes [8] [9] [10] [11], mostrando que la infección por HBoV1 es muy común. El HBoV1 puede causar enfermedad respiratoria superior (URI) y enfermedad respiratoria inferior (LRI) [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18]. La infección por HBoV1 puede conducir al desarrollo de tos, rinitis, fiebre y otros síntomas clínicos comunes [15, 19]. El diagnóstico clínico es principalmente neumonía, bronquitis, neumotórax, enfisema mediastínico y otitis media y otras complicaciones [18] [19] [20] [21] [22]. En algunos casos, los pacientes presentan síntomas de lesión respiratoria grave, que pueden ser mortales [21, 23]. HBoV1 se puede detectar en muestras fecales [24], muestras de sangre [25, 26], orina [27, 28], líquido cefalorraquídeo [29] [30] [31], agua de río [32] y aguas residuales [33, 34], lo que indica que el HBoV1 puede asociarse con una variedad de enfermedades. Estudios in vitro actuales que modelan cultivos de células epiteliales de la vía aérea tisular muestran que la infección por HBoV1 puede conducir a la interrupción de la barrera de unión estrecha, pérdida de cilia e hipertrofia de células epiteliales [35] [36], similar a los cambios tisulares de lesión pulmonar in vivo. Actualmente no hay vacuna ni tratamiento específico para este virus; la prevención y el tratamiento de enfermedades relacionadas con HBoV1 todavía requieren investigación adicional. La prevalencia de virus respiratorios está asociada con muchos factores, incluyendo el clima local, que pueden afectar la supervivencia y propagación de los virus [38]. Estudiar la epidemiología del HBoV1 y su relación con las condiciones meteorológicas mejorará el diagnóstico, el tratamiento, el control y la prevención de este virus. En este estudio, investigamos la epidemiología de la infección por HBoV1 en niños (≤14 años) hospitalizados con Además, recopilamos datos climáticos para determinar si existía una relación entre la prevalencia del HBoV1 y las condiciones meteorológicas. Este estudio se sumará a los datos epidemiológicos existentes sobre el HBoV1 y su relación con las condiciones climáticas en las regiones subtropicales y desempeñará un papel positivo en el control y la prevención del HBoV1. Los sitios de estudio fueron tres hospitales terciarios en Guangzhou, al sur de China (longitud: E112°57′ a E114 03′; latitud N22°26′ a N23°56′). Los criterios de inclusión fueron pacientes pediátricos (≤14 años) que presentaron al menos dos de los siguientes síntomas: tos, molestias faríngeas, obstrucción nasal, rinitis, disnea o que fueron diagnosticados con neumonía por radiografía de tórax durante la semana anterior. La radiografía de tórax se realizó de acuerdo con la situación clínica del paciente. Entre julio de 2009 y junio de 2016 se recogieron muestras de hisopos de garganta de los pacientes inscritos para la detección sistemática de virus respiratorios, Mycoplasma pneumoniae (MP) y Chlamydophila pneumoniae (CP), las cuales fueron refrigeradas a 2-8°C en medio de transporte viral, transportadas en hielo y analizadas inmediatamente o almacenadas a − 80°C antes del análisis, como se describió anteriormente [15, 39]. Los datos meteorológicos para Guangzhou, fueron recolectados de julio de 2009 a junio de 2016 de la Administración Meteorológica de China, incluyendo la temperatura media mensual (°C), humedad relativa media (%), precipitación (mm), velocidad media del viento (m/s), presión media del aire (hPa), presión media del vapor (hPa), duración del sol (h). El PCR en tiempo real para la detección de HBoV1 y de patógenos respiratorios comunes ADN y ARN se extrajeron de las muestras respiratorias utilizando el kit QIAamp DNA Mini y el kit QIAamp Viral ARN Mini (Qiagen, Shanghai, China), respectivamente, de acuerdo con los protocolos del fabricante. Taqman PCR en tiempo real para HBoV1 fue diseñado en base a la región conservada del gen NP1, como se describió anteriormente [15]. Se detectaron simultáneamente cuatro tipos de parainfluenza (PIV1-4), adenovirus (ADV), enterovirus (EV), metapneumovirus humano (HMPV), cuatro cepas de coronavirus humano (HCoV-229E, OC43, NL63 y HKU1), rinovirus humano (HRV), MP y CP, como se había informado anteriormente [40]. Los datos se analizaron utilizando la prueba Chi-cuadrado y la prueba exacta de Fisher en SPSS 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.). La correlación con los datos climáticos se analizó mediante análisis de regresión lineal múltiple. Todas las pruebas fueron de dos colas y un valor p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo. Entre julio de 2009 y junio de 2016 se inscribieron en el estudio 11 mil 399 pacientes pediátricos (≤14 años) hospitalizados con IRA. La relación hombre-mujer fue de 1,82:1 (7361:4038) y la mediana de edad fue de 1,75 años (rango intercuartil 0,75-3,83). En general, el 86,5 % (9857/1139) de los pacientes eran menores de 5 años. Todos los 11.399 pacientes fueron probados para los 18 patógenos mencionados, y 5606 (49,2%) fueron positivos para uno o más de esos patógenos (Tabla 1) y tuvieron una mediana de edad de 1,50 años (rango intercuartil 0,67-3,00). Los coeficientes hombre-mujer fueron 1,94: 1 (3698:1908) en pacientes patógenos positivos y 1,72:1 (3663:2130) en pacientes patógenos negativos (p = 0,002). Doscientos cuarenta y ocho de los 11.399 pacientes (2,2%) dieron positivo en la infección por HBoV1. De los pacientes positivos por HBoV1, 112 (45,2%) fueron coinfectados con otros patógenos, con mayor frecuencia con VRS (11,7%, 29/248) (Tabla 1). La mediana de edad fue de 1 año (rango intercuartílico 0,75-1,83). La relación hombre-mujer fue de 2,54:1 (178:70) en los pacientes positivos por HBoV1 y 1,81:1 (7183:3968) en los pacientes negativos por HBoV1 (p = 0,019). Para aclarar la distribución de edad de HBoV1, los pacientes se dividieron en siete grupos de edad; 0-3 meses, 4-6 meses, 7-12 meses, 1-2 años, 3-5 años, 6-10 años y 11-14 años. Hubo una diferencia significativa en la prevalencia de HBoV1 en pacientes de diferentes grupos de edad (p < 0,001) y la prevalencia máxima se encontró en pacientes de 7 a 12 meses (4,7%, 56/1203) (Fig. 1). En este estudio, se monitorizó la prevalencia de HBoV1 en pacientes (≤14 años) hospitalizados con ARI desde julio Se recogieron datos meteorológicos para Guangzhou, incluyendo temperatura media mensual, humedad relativa media, precipitación, velocidad media del viento, presión media del aire, presión media del vapor y duración del sol durante un período de 7 años, para explorar la correlación entre las condiciones meteorológicas y la prevalencia de HBoV1. Guangzhou, que se encuentra en el sur de China (longitud 112°57′ a 114°3′, latitud 22°26′ a 23°56′), tiene un clima monzón subtropical marítimo. Entre julio de 2009 y junio de 2016, la temperatura media fue de 21,8 ± 5,8 °C (media ± desviación estándar), la humedad fue de 77,2 ± 7,3%, la duración del sol fue de 132,7 ± 59,5 h, la velocidad del viento fue de 2,2 ± 0,6 m/s, la precipitación fue de 175,2 ± 165,9 mm, la presión del aire fue de 1005,6 ± 6,0 hPa y la presión del vapor fue de 21,3 h ± 7,4 hPa. Para el análisis de regresión lineal múltiple de prevalencia de HBoV1 y correlación de condiciones meteorológicas, se excluyeron variables independientes de presión media del aire (R 2 ajustado = 0,793, p < 0,001) y presión media del vapor (R 2 ajustado = 0,929, p < 0,001), que se asociaron linealmente con temperatura media y precipitación (R 2 ajustado = 0,278, p < 0,001), fuertemente correlacionadas con humedad relativa media; las variables independientes para el análisis final de regresión lineal múltiple incluyeron temperatura media, humedad relativa media, velocidad media del viento y horas de sol; por lo tanto, el efecto de la temperatura tuvo un retraso en la temperatura media del mes anterior (temperatura media 1 mes antes) también se incluyó como variable independiente en el análisis (Tabla 2). Ambos modelos de regresión se establecieron (p < 0,001) y los valores ajustados de R 2 fueron 0,373 y 0,231 en la temperatura media del La prevalencia de HBoV1 estuvo correlacionada positivamente con la temperatura (coeficiente = 0,259 en el modelo de temperatura actual (p = 0,002), coeficiente = 0,328 en la temperatura media en el modelo del mes anterior (p < 0,001)). Por el contrario, la prevalencia de HBoV1 estuvo correlacionada negativamente con la humedad relativa (coeficiente = − 0,126 en el modelo de temperatura actual (p = 0,024), coeficiente = − 0,083 en el modelo de retardo de temperatura (p = 0,039) (Tabla 2). La IRA es una de las enfermedades humanas más comunes, principalmente causadas por diferentes virus respiratorios [41, 42]. En general, la prevalencia de virus varía debido a factores como el análisis de regresión lineal múltiple se realizó utilizando la prevalencia mensual de HBoV1 como variable dependiente, temperatura media mensual (o temperatura media en el mes anterior), humedad relativa media, velocidad media del viento y duración del sol, ya que las variables independientes Los datos capturados en negrita son ubicación geográfica altamente significativa, condiciones climáticas, población y actividad social [38]. Se ha descrito con más detalle la epidemiología del HBoV1 en regiones templadas y se ha observado una alta incidencia de infección en niños menores de 2 años en invierno y primavera [15, 16, 39, 44]. Para describir la epidemiología del HBoV1 en Guangzhou, se recogieron toallitas de garganta de 11.399 niños (≤14 años), hospitalizadas con ARI y monitoreadas HBoV1 y otros patógenos respiratorios comunes durante un período En el presente estudio, el 86,5% (9857/1139) de los pacientes eran menores de 5 años, con una mediana de edad de 1,75 años, lo que indica que los lactantes y los niños pequeños tenían mayor riesgo de IRA, de acuerdo con informes anteriores [45, 46]. En general, el 49,2% (5606/1139) de los pacientes dieron positivo en uno o más patógenos respiratorios, el 2,2% (248/1139) de los pacientes fueron sometidos a pruebas con infección por HBoV1 (tabla 1). Se detectó una mayor prevalencia de HBoV1 en los pacientes varones en comparación con las mujeres (p = 0,019), en consonancia con informes anteriores [15, 16, 39, 44]. La coinfección con HBoV1 y otros patógenos es común [14, 15]. En nuestro estudio, el 45,2% (112/248) de los pacientes positivos Esto puede ser causado en parte por epidemias coincidentes de HBoV1 y otros patógenos. En nuestro estudio, la distribución estacional de HBoV1 y la distribución total positiva de patógenos fueron consistentes, confirmando esta inferencia (Fig. 2). La investigación actual muestra que la infección por HBoV1 puede llevar al colapso de la primera línea de defensa del epitelio de las vías respiratorias [35] [36], lo que puede conducir a una mayor susceptibilidad a otros patógenos, explicando la alta tasa de coinfección. Si la coinfección conduce a una enfermedad más grave es actualmente desconocida y se necesita más investigación para determinar esto. Las características de la infección por HBoV1 son probablemente un buen modelo para estudiar los efectos de las coinfección. En este estudio, hubo una diferencia significativa en la prevalencia de HBoV1 en pacientes de diferentes edades (p < 0,001). La mayoría de las infecciones por HBoV1 ocurrieron en pacientes menores de 2 años y la frecuencia máxima de infección por HBoV1 ocurrió en pacientes de 7-12 meses (fig. 1), de acuerdo con informes serológicos y epidemiológicos previos sobre el virus [8-11, 15, 16, 39, 44]. Esto podría deberse a que el sistema inmunitario infantil todavía está en desarrollo y los anticuerpos maternos desaparecen gradualmente en este grupo de edad.La distribución del HBoV1 en pacientes de diferentes edades proporcionará una referencia importante para futuras vacunas y nuevas investigaciones y desarrollo de fármacos, además de proporcionar datos importantes para la prevención y el control de enfermedades.Muchos factores afectan la epidemiología de patógenos, como la ubicación geográfica y el clima local. Guangzhou, una ciudad central y principal centro de transporte en el sur de China, se encuentra en una región subtropical. Guangzhou es caliente y tiene altas precipitaciones anuales, 3). En este estudio se observaron dos picos de HBoV1 (Fig. 2). Los picos de gran prevalencia de la infección por HBoV1 ocurrieron entre junio y septiembre de cada año, que son los meses de verano en Guangzhou, con temperaturas medias superiores a 25°C (Fig. 3). Los picos pequeños de infección por HBoV1 ocurrieron en invierno, entre noviembre y diciembre de cada año. Esta distribución estacional es similar a la prevalencia en regiones subtropicales reportadas anteriormente [47], pero diferente a las epidemias de HBoV1 en regiones templadas, que ocurren principalmente en invierno y primavera [15, 16, 39, 44], así como en regiones tropicales, como India, donde no se ha encontrado ninguna estación epidémica obvia [48]. Para analizar la correlación entre la prevalencia de HBoV1 y las condiciones meteorológicas, se realizó un análisis de regresión lineal múltiple, con prevalencia mensual de HBoV1 como variable dependiente y temperatura media (o temperatura media en el mes anterior), humedad relativa media, velocidad media del viento y duración del sol como variables independientes (tabla 2). Ambos modelos de regresión se establecieron (p < 0,001) y el valor ajustado de R 2 (0,373) del modelo de temperatura dorp 1 mes fue mayor que el valor ajustado de R 2 (0,231) del modelo actual de temperatura mensual, indicando que el modelo de temperatura dorp 1 mes tenía mejor potencia explicativa que el modelo actual de temperatura mensual. Ambos modelos mostraron que la prevalencia de HBoV1 se correlacionaba significativamente con la temperatura y humedad relativa (tabla 2 ). En detalle, la prevalencia de HBoV1 estuvo correlacionada positivamente con la temperatura, lo que concuerda con informes anteriores [ Por el contrario, la prevalencia del HBoV1 se correlacionó negativamente con la humedad relativa, lo que fue diferente de un informe anterior en Suzhou [47], que puede estar relacionado con la alta humedad de Guangzhou (la humedad relativa mensual media fue 77,2 ± 7,3%) (Fig. 3). Es común que la prevalencia de patógenos fluctúe con el tiempo debido a factores de variedad. En este estudio, la prevalencia del HBoV1 fue relativamente baja en 2013 a 2014. Podría estar parcialmente relacionada con la humedad relativa relativamente mayor durante este período (Fig. 3). Las condiciones climáticas pueden afectar la supervivencia y propagación de virus respiratorios, sin embargo no se encontró ninguna relación lineal significativa entre la infección por HBoV1 y la velocidad del viento o la duración del sol en este estudio (p > 0.05) (Tabla 2). En primer lugar, porque nuestro estudio se centró principalmente en la circulación de HBoV1 en pacientes hospitalizados con IAR, HBoV1 en pacientes ambulatorios y población asintomática no fueron incluidos. En segundo lugar, muchos factores pueden afectar epidemias de virus, el análisis de datos meteorológicos por sí solo puede no servir como una interpretación concluyente final. En tercer lugar, el estudio sólo se llevó a cabo en tres hospitales y puede no ser representativo de la población en general. Nuestro estudio ha proporcionado una mejor comprensión de la epidemiología de HBoV1 en regiones subtropicales, específicamente correlaciones con datos climáticos; estos datos serán útiles para el control y prevención futuros de infecciones de HBoV1.

¿Cuántas muestras se obtuvieron?

Epidemiología de la infección por HBoV1 y relación con las condiciones meteorológicas en pacientes pediátricos hospitalizados con enfermedad respiratoria aguda: un estudio de 7 años en una región subtropicalhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6048719/SHA: f2f78c95ab378a31bd35dc1de84e0ec75eb7ce1bAutores: Liu, Wen-Kuan; Liu, Qian; Chen, De-Hui; Tan, Wei-Ping; Cai, Yong; Qiu, Shu-Yan; Xu, Duo; Li, Chi; Li, Xiao; Lin, Zheng-Shi; Zhou, RongFecha: 2018-07-16DOI: 10.1186/s1287-018-3Licencia: Para investigar la distribución de HBoV1 y determinar el efecto de las condiciones meteorológicas, los pacientes pediátricos hospitalizados fueron estudiados en una región subtropical de China. MÉTODOS: Muestras de 11.399 pacientes pediátricos hospitalizados (≤14 años), con ARI fueron probados para HBoV1 y otros patógenos respiratorios comunes utilizando PCR en tiempo real, entre julio de 2009 y junio de 2016. Además, se recolectaron datos meteorológicos locales. RESULTADOS: De los 11.399 pacientes evaluados, 5606 (49,2%) fueron positivos para al menos un patógeno respiratorio. Doscientos cuarenta y ocho de 11.399 (2,2%) fueron positivos para la infección por HBoV1. La coinfección fue común en pacientes HBoV1 positivos (45,2%, 112/248). Se encontró una diferencia significativa en la prevalencia de HBoV1 en pacientes de diferentes grupos de edad (p < 0,001), y la prevalencia máxima se encontró en pacientes de 7 a 12 meses (4,7%, 56/1203). Se encontraron dos picos de prevalencia de HBoV1 en verano (entre junio y septiembre) e invierno (entre noviembre y diciembre). La prevalencia de HBoV1 se relacionó significativamente positivamente con la temperatura media y se correlacionó negativamente con la humedad relativa media, y la temperatura media en el mes anterior tuvo mejor poder explicativo que la temperatura mensual actual. CONCLUSIONES: Este estudio proporciona una mejor comprensión de las características de la infección por HBoV1 en niños en regiones subtropicales. Los datos de este estudio proporcionan información útil para el futuro control y prevención de infecciones por HBoV1. Texto: Bocavirus humano 1 (HBoV1), que pertenece a la familia Parvoviridae, fue identificado en primer El HBoV1 ha sido confirmado como un patógeno respiratorio importante y se encuentra en infecciones respiratorias en niños y adultos en todo el mundo. La prevalencia de la detección de ácido nucleico del HBoV1 varía entre 1,5 y 33% en pacientes con enfermedad respiratoria aguda (ARI), según diferentes estudios [3] [5] [6] [7]. Los resultados de las pruebas serológicas y de ácido nucleico son generalmente consistentes [8] [9] [10] [11], mostrando que la infección por HBoV1 es muy común. El HBoV1 puede causar enfermedad respiratoria superior (URI) y enfermedad respiratoria inferior (LRI) [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18]. La infección por HBoV1 puede conducir al desarrollo de tos, rinitis, fiebre y otros síntomas clínicos comunes [15, 19]. El diagnóstico clínico es principalmente neumonía, bronquitis, neumotórax, enfisema mediastínico y otitis media y otras complicaciones [18] [19] [20] [21] [22]. En algunos casos, los pacientes presentan síntomas de lesión respiratoria grave, que pueden ser mortales [21, 23]. HBoV1 se puede detectar en muestras fecales [24], muestras de sangre [25, 26], orina [27, 28], líquido cefalorraquídeo [29] [30] [31], agua de río [32] y aguas residuales [33, 34], lo que indica que el HBoV1 puede asociarse con una variedad de enfermedades. Estudios in vitro actuales que modelan cultivos de células epiteliales de la vía aérea tisular muestran que la infección por HBoV1 puede conducir a la interrupción de la barrera de unión estrecha, pérdida de cilia e hipertrofia de células epiteliales [35] [36], similar a los cambios tisulares de lesión pulmonar in vivo. Actualmente no hay vacuna ni tratamiento específico para este virus; la prevención y el tratamiento de enfermedades relacionadas con HBoV1 todavía requieren investigación adicional. La prevalencia de virus respiratorios está asociada con muchos factores, incluyendo el clima local, que pueden afectar la supervivencia y propagación de los virus [38]. Estudiar la epidemiología del HBoV1 y su relación con las condiciones meteorológicas mejorará el diagnóstico, el tratamiento, el control y la prevención de este virus. En este estudio, investigamos la epidemiología de la infección por HBoV1 en niños (≤14 años) hospitalizados con Además, recopilamos datos climáticos para determinar si existía una relación entre la prevalencia del HBoV1 y las condiciones meteorológicas. Este estudio se sumará a los datos epidemiológicos existentes sobre el HBoV1 y su relación con las condiciones climáticas en las regiones subtropicales y desempeñará un papel positivo en el control y la prevención del HBoV1. Los sitios de estudio fueron tres hospitales terciarios en Guangzhou, al sur de China (longitud: E112°57′ a E114 03′; latitud N22°26′ a N23°56′). Los criterios de inclusión fueron pacientes pediátricos (≤14 años) que presentaron al menos dos de los siguientes síntomas: tos, molestias faríngeas, obstrucción nasal, rinitis, disnea o que fueron diagnosticados con neumonía por radiografía de tórax durante la semana anterior. La radiografía de tórax se realizó de acuerdo con la situación clínica del paciente. Entre julio de 2009 y junio de 2016 se recogieron muestras de hisopos de garganta de los pacientes inscritos para la detección sistemática de virus respiratorios, Mycoplasma pneumoniae (MP) y Chlamydophila pneumoniae (CP), las cuales fueron refrigeradas a 2-8°C en medio de transporte viral, transportadas en hielo y analizadas inmediatamente o almacenadas a − 80°C antes del análisis, como se describió anteriormente [15, 39]. Los datos meteorológicos para Guangzhou, fueron recolectados de julio de 2009 a junio de 2016 de la Administración Meteorológica de China, incluyendo la temperatura media mensual (°C), humedad relativa media (%), precipitación (mm), velocidad media del viento (m/s), presión media del aire (hPa), presión media del vapor (hPa), duración del sol (h). El PCR en tiempo real para la detección de HBoV1 y de patógenos respiratorios comunes ADN y ARN se extrajeron de las muestras respiratorias utilizando el kit QIAamp DNA Mini y el kit QIAamp Viral ARN Mini (Qiagen, Shanghai, China), respectivamente, de acuerdo con los protocolos del fabricante. Taqman PCR en tiempo real para HBoV1 fue diseñado en base a la región conservada del gen NP1, como se describió anteriormente [15]. Se detectaron simultáneamente cuatro tipos de parainfluenza (PIV1-4), adenovirus (ADV), enterovirus (EV), metapneumovirus humano (HMPV), cuatro cepas de coronavirus humano (HCoV-229E, OC43, NL63 y HKU1), rinovirus humano (HRV), MP y CP, como se había informado anteriormente [40]. Los datos se analizaron utilizando la prueba Chi-cuadrado y la prueba exacta de Fisher en SPSS 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.). La correlación con los datos climáticos se analizó mediante análisis de regresión lineal múltiple. Todas las pruebas fueron de dos colas y un valor p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo. Entre julio de 2009 y junio de 2016 se inscribieron en el estudio 11 mil 399 pacientes pediátricos (≤14 años) hospitalizados con IRA. La relación hombre-mujer fue de 1,82:1 (7361:4038) y la mediana de edad fue de 1,75 años (rango intercuartil 0,75-3,83). En general, el 86,5 % (9857/1139) de los pacientes eran menores de 5 años. Todos los 11.399 pacientes fueron probados para los 18 patógenos mencionados, y 5606 (49,2%) fueron positivos para uno o más de esos patógenos (Tabla 1) y tuvieron una mediana de edad de 1,50 años (rango intercuartil 0,67-3,00). Los coeficientes hombre-mujer fueron 1,94: 1 (3698:1908) en pacientes patógenos positivos y 1,72:1 (3663:2130) en pacientes patógenos negativos (p = 0,002). Doscientos cuarenta y ocho de los 11.399 pacientes (2,2%) dieron positivo en la infección por HBoV1. De los pacientes positivos por HBoV1, 112 (45,2%) fueron coinfectados con otros patógenos, con mayor frecuencia con VRS (11,7%, 29/248) (Tabla 1). La mediana de edad fue de 1 año (rango intercuartílico 0,75-1,83). La relación hombre-mujer fue de 2,54:1 (178:70) en los pacientes positivos por HBoV1 y 1,81:1 (7183:3968) en los pacientes negativos por HBoV1 (p = 0,019). Para aclarar la distribución de edad de HBoV1, los pacientes se dividieron en siete grupos de edad; 0-3 meses, 4-6 meses, 7-12 meses, 1-2 años, 3-5 años, 6-10 años y 11-14 años. Hubo una diferencia significativa en la prevalencia de HBoV1 en pacientes de diferentes grupos de edad (p < 0,001) y la prevalencia máxima se encontró en pacientes de 7 a 12 meses (4,7%, 56/1203) (Fig. 1). En este estudio, se monitorizó la prevalencia de HBoV1 en pacientes (≤14 años) hospitalizados con ARI desde julio Se recogieron datos meteorológicos para Guangzhou, incluyendo temperatura media mensual, humedad relativa media, precipitación, velocidad media del viento, presión media del aire, presión media del vapor y duración del sol durante un período de 7 años, para explorar la correlación entre las condiciones meteorológicas y la prevalencia de HBoV1. Guangzhou, que se encuentra en el sur de China (longitud 112°57′ a 114°3′, latitud 22°26′ a 23°56′), tiene un clima monzón subtropical marítimo. Entre julio de 2009 y junio de 2016, la temperatura media fue de 21,8 ± 5,8 °C (media ± desviación estándar), la humedad fue de 77,2 ± 7,3%, la duración del sol fue de 132,7 ± 59,5 h, la velocidad del viento fue de 2,2 ± 0,6 m/s, la precipitación fue de 175,2 ± 165,9 mm, la presión del aire fue de 1005,6 ± 6,0 hPa y la presión del vapor fue de 21,3 h ± 7,4 hPa. Para el análisis de regresión lineal múltiple de prevalencia de HBoV1 y correlación de condiciones meteorológicas, se excluyeron variables independientes de presión media del aire (R 2 ajustado = 0,793, p < 0,001) y presión media del vapor (R 2 ajustado = 0,929, p < 0,001), que se asociaron linealmente con temperatura media y precipitación (R 2 ajustado = 0,278, p < 0,001), fuertemente correlacionadas con humedad relativa media; las variables independientes para el análisis final de regresión lineal múltiple incluyeron temperatura media, humedad relativa media, velocidad media del viento y horas de sol; por lo tanto, el efecto de la temperatura tuvo un retraso en la temperatura media del mes anterior (temperatura media 1 mes antes) también se incluyó como variable independiente en el análisis (Tabla 2). Ambos modelos de regresión se establecieron (p < 0,001) y los valores ajustados de R 2 fueron 0,373 y 0,231 en la temperatura media del La prevalencia de HBoV1 estuvo correlacionada positivamente con la temperatura (coeficiente = 0,259 en el modelo de temperatura actual (p = 0,002), coeficiente = 0,328 en la temperatura media en el modelo del mes anterior (p < 0,001)). Por el contrario, la prevalencia de HBoV1 estuvo correlacionada negativamente con la humedad relativa (coeficiente = − 0,126 en el modelo de temperatura actual (p = 0,024), coeficiente = − 0,083 en el modelo de retardo de temperatura (p = 0,039) (Tabla 2). La IRA es una de las enfermedades humanas más comunes, principalmente causadas por diferentes virus respiratorios [41, 42]. En general, la prevalencia de virus varía debido a factores como el análisis de regresión lineal múltiple se realizó utilizando la prevalencia mensual de HBoV1 como variable dependiente, temperatura media mensual (o temperatura media en el mes anterior), humedad relativa media, velocidad media del viento y duración del sol, ya que las variables independientes Los datos capturados en negrita son ubicación geográfica altamente significativa, condiciones climáticas, población y actividad social [38]. Se ha descrito con más detalle la epidemiología del HBoV1 en regiones templadas y se ha observado una alta incidencia de infección en niños menores de 2 años en invierno y primavera [15, 16, 39, 44]. Para describir la epidemiología del HBoV1 en Guangzhou, se recogieron toallitas de garganta de 11.399 niños (≤14 años), hospitalizadas con ARI y monitoreadas HBoV1 y otros patógenos respiratorios comunes durante un período En el presente estudio, el 86,5% (9857/1139) de los pacientes eran menores de 5 años, con una mediana de edad de 1,75 años, lo que indica que los lactantes y los niños pequeños tenían mayor riesgo de IRA, de acuerdo con informes anteriores [45, 46]. En general, el 49,2% (5606/1139) de los pacientes dieron positivo en uno o más patógenos respiratorios, el 2,2% (248/1139) de los pacientes fueron sometidos a pruebas con infección por HBoV1 (tabla 1). Se detectó una mayor prevalencia de HBoV1 en los pacientes varones en comparación con las mujeres (p = 0,019), en consonancia con informes anteriores [15, 16, 39, 44]. La coinfección con HBoV1 y otros patógenos es común [14, 15]. En nuestro estudio, el 45,2% (112/248) de los pacientes positivos Esto puede ser causado en parte por epidemias coincidentes de HBoV1 y otros patógenos. En nuestro estudio, la distribución estacional de HBoV1 y la distribución total positiva de patógenos fueron consistentes, confirmando esta inferencia (Fig. 2). La investigación actual muestra que la infección por HBoV1 puede llevar al colapso de la primera línea de defensa del epitelio de las vías respiratorias [35] [36], lo que puede conducir a una mayor susceptibilidad a otros patógenos, explicando la alta tasa de coinfección. Si la coinfección conduce a una enfermedad más grave es actualmente desconocida y se necesita más investigación para determinar esto. Las características de la infección por HBoV1 son probablemente un buen modelo para estudiar los efectos de las coinfección. En este estudio, hubo una diferencia significativa en la prevalencia de HBoV1 en pacientes de diferentes edades (p < 0,001). La mayoría de las infecciones por HBoV1 ocurrieron en pacientes menores de 2 años y la frecuencia máxima de infección por HBoV1 ocurrió en pacientes de 7-12 meses (fig. 1), de acuerdo con informes serológicos y epidemiológicos previos sobre el virus [8-11, 15, 16, 39, 44]. Esto podría deberse a que el sistema inmunitario infantil todavía está en desarrollo y los anticuerpos maternos desaparecen gradualmente en este grupo de edad.La distribución del HBoV1 en pacientes de diferentes edades proporcionará una referencia importante para futuras vacunas y nuevas investigaciones y desarrollo de fármacos, además de proporcionar datos importantes para la prevención y el control de enfermedades.Muchos factores afectan la epidemiología de patógenos, como la ubicación geográfica y el clima local. Guangzhou, una ciudad central y principal centro de transporte en el sur de China, se encuentra en una región subtropical. Guangzhou es caliente y tiene altas precipitaciones anuales, 3). En este estudio se observaron dos picos de HBoV1 (Fig. 2). Los picos de gran prevalencia de la infección por HBoV1 ocurrieron entre junio y septiembre de cada año, que son los meses de verano en Guangzhou, con temperaturas medias superiores a 25°C (Fig. 3). Los picos pequeños de infección por HBoV1 ocurrieron en invierno, entre noviembre y diciembre de cada año. Esta distribución estacional es similar a la prevalencia en regiones subtropicales reportadas anteriormente [47], pero diferente a las epidemias de HBoV1 en regiones templadas, que ocurren principalmente en invierno y primavera [15, 16, 39, 44], así como en regiones tropicales, como India, donde no se ha encontrado ninguna estación epidémica obvia [48]. Para analizar la correlación entre la prevalencia de HBoV1 y las condiciones meteorológicas, se realizó un análisis de regresión lineal múltiple, con prevalencia mensual de HBoV1 como variable dependiente y temperatura media (o temperatura media en el mes anterior), humedad relativa media, velocidad media del viento y duración del sol como variables independientes (tabla 2). Ambos modelos de regresión se establecieron (p < 0,001) y el valor ajustado de R 2 (0,373) del modelo de temperatura dorp 1 mes fue mayor que el valor ajustado de R 2 (0,231) del modelo actual de temperatura mensual, indicando que el modelo de temperatura dorp 1 mes tenía mejor potencia explicativa que el modelo actual de temperatura mensual. Ambos modelos mostraron que la prevalencia de HBoV1 se correlacionaba significativamente con la temperatura y humedad relativa (tabla 2 ). En detalle, la prevalencia de HBoV1 estuvo correlacionada positivamente con la temperatura, lo que concuerda con informes anteriores [ Por el contrario, la prevalencia del HBoV1 se correlacionó negativamente con la humedad relativa, lo que fue diferente de un informe anterior en Suzhou [47], que puede estar relacionado con la alta humedad de Guangzhou (la humedad relativa mensual media fue 77,2 ± 7,3%) (Fig. 3). Es común que la prevalencia de patógenos fluctúe con el tiempo debido a factores de variedad. En este estudio, la prevalencia del HBoV1 fue relativamente baja en 2013 a 2014. Podría estar parcialmente relacionada con la humedad relativa relativamente mayor durante este período (Fig. 3). Las condiciones climáticas pueden afectar la supervivencia y propagación de virus respiratorios, sin embargo no se encontró ninguna relación lineal significativa entre la infección por HBoV1 y la velocidad del viento o la duración del sol en este estudio (p > 0.05) (Tabla 2). En primer lugar, porque nuestro estudio se centró principalmente en la circulación de HBoV1 en pacientes hospitalizados con IAR, HBoV1 en pacientes ambulatorios y población asintomática no fueron incluidos. En segundo lugar, muchos factores pueden afectar epidemias de virus, el análisis de datos meteorológicos por sí solo puede no servir como una interpretación concluyente final. En tercer lugar, el estudio sólo se llevó a cabo en tres hospitales y puede no ser representativo de la población en general. Nuestro estudio ha proporcionado una mejor comprensión de la epidemiología de HBoV1 en regiones subtropicales, específicamente correlaciones con datos climáticos; estos datos serán útiles para el control y prevención futuros de infecciones de HBoV1.

¿Qué porcentaje de pacientes fue positivo para al menos un patógeno respiratorio?

Epidemiología de la infección por HBoV1 y relación con las condiciones meteorológicas en pacientes pediátricos hospitalizados con enfermedad respiratoria aguda: un estudio de 7 años en una región subtropicalhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6048719/SHA: f2f78c95ab378a31bd35dc1de84e0ec75eb7ce1bAutores: Liu, Wen-Kuan; Liu, Qian; Chen, De-Hui; Tan, Wei-Ping; Cai, Yong; Qiu, Shu-Yan; Xu, Duo; Li, Chi; Li, Xiao; Lin, Zheng-Shi; Zhou, RongFecha: 2018-07-16DOI: 10.1186/s1287-018-3Licencia: Para investigar la distribución de HBoV1 y determinar el efecto de las condiciones meteorológicas, los pacientes pediátricos hospitalizados fueron estudiados en una región subtropical de China. MÉTODOS: Muestras de 11.399 pacientes pediátricos hospitalizados (≤14 años), con ARI fueron probados para HBoV1 y otros patógenos respiratorios comunes utilizando PCR en tiempo real, entre julio de 2009 y junio de 2016. Además, se recolectaron datos meteorológicos locales. RESULTADOS: De los 11.399 pacientes evaluados, 5606 (49,2%) fueron positivos para al menos un patógeno respiratorio. Doscientos cuarenta y ocho de 11.399 (2,2%) fueron positivos para la infección por HBoV1. La coinfección fue común en pacientes HBoV1 positivos (45,2%, 112/248). Se encontró una diferencia significativa en la prevalencia de HBoV1 en pacientes de diferentes grupos de edad (p < 0,001), y la prevalencia máxima se encontró en pacientes de 7 a 12 meses (4,7%, 56/1203). Se encontraron dos picos de prevalencia de HBoV1 en verano (entre junio y septiembre) e invierno (entre noviembre y diciembre). La prevalencia de HBoV1 se relacionó significativamente positivamente con la temperatura media y se correlacionó negativamente con la humedad relativa media, y la temperatura media en el mes anterior tuvo mejor poder explicativo que la temperatura mensual actual. CONCLUSIONES: Este estudio proporciona una mejor comprensión de las características de la infección por HBoV1 en niños en regiones subtropicales. Los datos de este estudio proporcionan información útil para el futuro control y prevención de infecciones por HBoV1. Texto: Bocavirus humano 1 (HBoV1), que pertenece a la familia Parvoviridae, fue identificado en primer El HBoV1 ha sido confirmado como un patógeno respiratorio importante y se encuentra en infecciones respiratorias en niños y adultos en todo el mundo. La prevalencia de la detección de ácido nucleico del HBoV1 varía entre 1,5 y 33% en pacientes con enfermedad respiratoria aguda (ARI), según diferentes estudios [3] [5] [6] [7]. Los resultados de las pruebas serológicas y de ácido nucleico son generalmente consistentes [8] [9] [10] [11], mostrando que la infección por HBoV1 es muy común. El HBoV1 puede causar enfermedad respiratoria superior (URI) y enfermedad respiratoria inferior (LRI) [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18]. La infección por HBoV1 puede conducir al desarrollo de tos, rinitis, fiebre y otros síntomas clínicos comunes [15, 19]. El diagnóstico clínico es principalmente neumonía, bronquitis, neumotórax, enfisema mediastínico y otitis media y otras complicaciones [18] [19] [20] [21] [22]. En algunos casos, los pacientes presentan síntomas de lesión respiratoria grave, que pueden ser mortales [21, 23]. HBoV1 se puede detectar en muestras fecales [24], muestras de sangre [25, 26], orina [27, 28], líquido cefalorraquídeo [29] [30] [31], agua de río [32] y aguas residuales [33, 34], lo que indica que el HBoV1 puede asociarse con una variedad de enfermedades. Estudios in vitro actuales que modelan cultivos de células epiteliales de la vía aérea tisular muestran que la infección por HBoV1 puede conducir a la interrupción de la barrera de unión estrecha, pérdida de cilia e hipertrofia de células epiteliales [35] [36], similar a los cambios tisulares de lesión pulmonar in vivo. Actualmente no hay vacuna ni tratamiento específico para este virus; la prevención y el tratamiento de enfermedades relacionadas con HBoV1 todavía requieren investigación adicional. La prevalencia de virus respiratorios está asociada con muchos factores, incluyendo el clima local, que pueden afectar la supervivencia y propagación de los virus [38]. Estudiar la epidemiología del HBoV1 y su relación con las condiciones meteorológicas mejorará el diagnóstico, el tratamiento, el control y la prevención de este virus. En este estudio, investigamos la epidemiología de la infección por HBoV1 en niños (≤14 años) hospitalizados con Además, recopilamos datos climáticos para determinar si existía una relación entre la prevalencia del HBoV1 y las condiciones meteorológicas. Este estudio se sumará a los datos epidemiológicos existentes sobre el HBoV1 y su relación con las condiciones climáticas en las regiones subtropicales y desempeñará un papel positivo en el control y la prevención del HBoV1. Los sitios de estudio fueron tres hospitales terciarios en Guangzhou, al sur de China (longitud: E112°57′ a E114 03′; latitud N22°26′ a N23°56′). Los criterios de inclusión fueron pacientes pediátricos (≤14 años) que presentaron al menos dos de los siguientes síntomas: tos, molestias faríngeas, obstrucción nasal, rinitis, disnea o que fueron diagnosticados con neumonía por radiografía de tórax durante la semana anterior. La radiografía de tórax se realizó de acuerdo con la situación clínica del paciente. Entre julio de 2009 y junio de 2016 se recogieron muestras de hisopos de garganta de los pacientes inscritos para la detección sistemática de virus respiratorios, Mycoplasma pneumoniae (MP) y Chlamydophila pneumoniae (CP), las cuales fueron refrigeradas a 2-8°C en medio de transporte viral, transportadas en hielo y analizadas inmediatamente o almacenadas a − 80°C antes del análisis, como se describió anteriormente [15, 39]. Los datos meteorológicos para Guangzhou, fueron recolectados de julio de 2009 a junio de 2016 de la Administración Meteorológica de China, incluyendo la temperatura media mensual (°C), humedad relativa media (%), precipitación (mm), velocidad media del viento (m/s), presión media del aire (hPa), presión media del vapor (hPa), duración del sol (h). El PCR en tiempo real para la detección de HBoV1 y de patógenos respiratorios comunes ADN y ARN se extrajeron de las muestras respiratorias utilizando el kit QIAamp DNA Mini y el kit QIAamp Viral ARN Mini (Qiagen, Shanghai, China), respectivamente, de acuerdo con los protocolos del fabricante. Taqman PCR en tiempo real para HBoV1 fue diseñado en base a la región conservada del gen NP1, como se describió anteriormente [15]. Se detectaron simultáneamente cuatro tipos de parainfluenza (PIV1-4), adenovirus (ADV), enterovirus (EV), metapneumovirus humano (HMPV), cuatro cepas de coronavirus humano (HCoV-229E, OC43, NL63 y HKU1), rinovirus humano (HRV), MP y CP, como se había informado anteriormente [40]. Los datos se analizaron utilizando la prueba Chi-cuadrado y la prueba exacta de Fisher en SPSS 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.). La correlación con los datos climáticos se analizó mediante análisis de regresión lineal múltiple. Todas las pruebas fueron de dos colas y un valor p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo. Entre julio de 2009 y junio de 2016 se inscribieron en el estudio 11 mil 399 pacientes pediátricos (≤14 años) hospitalizados con IRA. La relación hombre-mujer fue de 1,82:1 (7361:4038) y la mediana de edad fue de 1,75 años (rango intercuartil 0,75-3,83). En general, el 86,5 % (9857/1139) de los pacientes eran menores de 5 años. Todos los 11.399 pacientes fueron probados para los 18 patógenos mencionados, y 5606 (49,2%) fueron positivos para uno o más de esos patógenos (Tabla 1) y tuvieron una mediana de edad de 1,50 años (rango intercuartil 0,67-3,00). Los coeficientes hombre-mujer fueron 1,94: 1 (3698:1908) en pacientes patógenos positivos y 1,72:1 (3663:2130) en pacientes patógenos negativos (p = 0,002). Doscientos cuarenta y ocho de los 11.399 pacientes (2,2%) dieron positivo en la infección por HBoV1. De los pacientes positivos por HBoV1, 112 (45,2%) fueron coinfectados con otros patógenos, con mayor frecuencia con VRS (11,7%, 29/248) (Tabla 1). La mediana de edad fue de 1 año (rango intercuartílico 0,75-1,83). La relación hombre-mujer fue de 2,54:1 (178:70) en los pacientes positivos por HBoV1 y 1,81:1 (7183:3968) en los pacientes negativos por HBoV1 (p = 0,019). Para aclarar la distribución de edad de HBoV1, los pacientes se dividieron en siete grupos de edad; 0-3 meses, 4-6 meses, 7-12 meses, 1-2 años, 3-5 años, 6-10 años y 11-14 años. Hubo una diferencia significativa en la prevalencia de HBoV1 en pacientes de diferentes grupos de edad (p < 0,001) y la prevalencia máxima se encontró en pacientes de 7 a 12 meses (4,7%, 56/1203) (Fig. 1). En este estudio, se monitorizó la prevalencia de HBoV1 en pacientes (≤14 años) hospitalizados con ARI desde julio Se recogieron datos meteorológicos para Guangzhou, incluyendo temperatura media mensual, humedad relativa media, precipitación, velocidad media del viento, presión media del aire, presión media del vapor y duración del sol durante un período de 7 años, para explorar la correlación entre las condiciones meteorológicas y la prevalencia de HBoV1. Guangzhou, que se encuentra en el sur de China (longitud 112°57′ a 114°3′, latitud 22°26′ a 23°56′), tiene un clima monzón subtropical marítimo. Entre julio de 2009 y junio de 2016, la temperatura media fue de 21,8 ± 5,8 °C (media ± desviación estándar), la humedad fue de 77,2 ± 7,3%, la duración del sol fue de 132,7 ± 59,5 h, la velocidad del viento fue de 2,2 ± 0,6 m/s, la precipitación fue de 175,2 ± 165,9 mm, la presión del aire fue de 1005,6 ± 6,0 hPa y la presión del vapor fue de 21,3 h ± 7,4 hPa. Para el análisis de regresión lineal múltiple de prevalencia de HBoV1 y correlación de condiciones meteorológicas, se excluyeron variables independientes de presión media del aire (R 2 ajustado = 0,793, p < 0,001) y presión media del vapor (R 2 ajustado = 0,929, p < 0,001), que se asociaron linealmente con temperatura media y precipitación (R 2 ajustado = 0,278, p < 0,001), fuertemente correlacionadas con humedad relativa media; las variables independientes para el análisis final de regresión lineal múltiple incluyeron temperatura media, humedad relativa media, velocidad media del viento y horas de sol; por lo tanto, el efecto de la temperatura tuvo un retraso en la temperatura media del mes anterior (temperatura media 1 mes antes) también se incluyó como variable independiente en el análisis (Tabla 2). Ambos modelos de regresión se establecieron (p < 0,001) y los valores ajustados de R 2 fueron 0,373 y 0,231 en la temperatura media del La prevalencia de HBoV1 estuvo correlacionada positivamente con la temperatura (coeficiente = 0,259 en el modelo de temperatura actual (p = 0,002), coeficiente = 0,328 en la temperatura media en el modelo del mes anterior (p < 0,001)). Por el contrario, la prevalencia de HBoV1 estuvo correlacionada negativamente con la humedad relativa (coeficiente = − 0,126 en el modelo de temperatura actual (p = 0,024), coeficiente = − 0,083 en el modelo de retardo de temperatura (p = 0,039) (Tabla 2). La IRA es una de las enfermedades humanas más comunes, principalmente causadas por diferentes virus respiratorios [41, 42]. En general, la prevalencia de virus varía debido a factores como el análisis de regresión lineal múltiple se realizó utilizando la prevalencia mensual de HBoV1 como variable dependiente, temperatura media mensual (o temperatura media en el mes anterior), humedad relativa media, velocidad media del viento y duración del sol, ya que las variables independientes Los datos capturados en negrita son ubicación geográfica altamente significativa, condiciones climáticas, población y actividad social [38]. Se ha descrito con más detalle la epidemiología del HBoV1 en regiones templadas y se ha observado una alta incidencia de infección en niños menores de 2 años en invierno y primavera [15, 16, 39, 44]. Para describir la epidemiología del HBoV1 en Guangzhou, se recogieron toallitas de garganta de 11.399 niños (≤14 años), hospitalizadas con ARI y monitoreadas HBoV1 y otros patógenos respiratorios comunes durante un período En el presente estudio, el 86,5% (9857/1139) de los pacientes eran menores de 5 años, con una mediana de edad de 1,75 años, lo que indica que los lactantes y los niños pequeños tenían mayor riesgo de IRA, de acuerdo con informes anteriores [45, 46]. En general, el 49,2% (5606/1139) de los pacientes dieron positivo en uno o más patógenos respiratorios, el 2,2% (248/1139) de los pacientes fueron sometidos a pruebas con infección por HBoV1 (tabla 1). Se detectó una mayor prevalencia de HBoV1 en los pacientes varones en comparación con las mujeres (p = 0,019), en consonancia con informes anteriores [15, 16, 39, 44]. La coinfección con HBoV1 y otros patógenos es común [14, 15]. En nuestro estudio, el 45,2% (112/248) de los pacientes positivos Esto puede ser causado en parte por epidemias coincidentes de HBoV1 y otros patógenos. En nuestro estudio, la distribución estacional de HBoV1 y la distribución total positiva de patógenos fueron consistentes, confirmando esta inferencia (Fig. 2). La investigación actual muestra que la infección por HBoV1 puede llevar al colapso de la primera línea de defensa del epitelio de las vías respiratorias [35] [36], lo que puede conducir a una mayor susceptibilidad a otros patógenos, explicando la alta tasa de coinfección. Si la coinfección conduce a una enfermedad más grave es actualmente desconocida y se necesita más investigación para determinar esto. Las características de la infección por HBoV1 son probablemente un buen modelo para estudiar los efectos de las coinfección. En este estudio, hubo una diferencia significativa en la prevalencia de HBoV1 en pacientes de diferentes edades (p < 0,001). La mayoría de las infecciones por HBoV1 ocurrieron en pacientes menores de 2 años y la frecuencia máxima de infección por HBoV1 ocurrió en pacientes de 7-12 meses (fig. 1), de acuerdo con informes serológicos y epidemiológicos previos sobre el virus [8-11, 15, 16, 39, 44]. Esto podría deberse a que el sistema inmunitario infantil todavía está en desarrollo y los anticuerpos maternos desaparecen gradualmente en este grupo de edad.La distribución del HBoV1 en pacientes de diferentes edades proporcionará una referencia importante para futuras vacunas y nuevas investigaciones y desarrollo de fármacos, además de proporcionar datos importantes para la prevención y el control de enfermedades.Muchos factores afectan la epidemiología de patógenos, como la ubicación geográfica y el clima local. Guangzhou, una ciudad central y principal centro de transporte en el sur de China, se encuentra en una región subtropical. Guangzhou es caliente y tiene altas precipitaciones anuales, 3). En este estudio se observaron dos picos de HBoV1 (Fig. 2). Los picos de gran prevalencia de la infección por HBoV1 ocurrieron entre junio y septiembre de cada año, que son los meses de verano en Guangzhou, con temperaturas medias superiores a 25°C (Fig. 3). Los picos pequeños de infección por HBoV1 ocurrieron en invierno, entre noviembre y diciembre de cada año. Esta distribución estacional es similar a la prevalencia en regiones subtropicales reportadas anteriormente [47], pero diferente a las epidemias de HBoV1 en regiones templadas, que ocurren principalmente en invierno y primavera [15, 16, 39, 44], así como en regiones tropicales, como India, donde no se ha encontrado ninguna estación epidémica obvia [48]. Para analizar la correlación entre la prevalencia de HBoV1 y las condiciones meteorológicas, se realizó un análisis de regresión lineal múltiple, con prevalencia mensual de HBoV1 como variable dependiente y temperatura media (o temperatura media en el mes anterior), humedad relativa media, velocidad media del viento y duración del sol como variables independientes (tabla 2). Ambos modelos de regresión se establecieron (p < 0,001) y el valor ajustado de R 2 (0,373) del modelo de temperatura dorp 1 mes fue mayor que el valor ajustado de R 2 (0,231) del modelo actual de temperatura mensual, indicando que el modelo de temperatura dorp 1 mes tenía mejor potencia explicativa que el modelo actual de temperatura mensual. Ambos modelos mostraron que la prevalencia de HBoV1 se correlacionaba significativamente con la temperatura y humedad relativa (tabla 2 ). En detalle, la prevalencia de HBoV1 estuvo correlacionada positivamente con la temperatura, lo que concuerda con informes anteriores [ Por el contrario, la prevalencia del HBoV1 se correlacionó negativamente con la humedad relativa, lo que fue diferente de un informe anterior en Suzhou [47], que puede estar relacionado con la alta humedad de Guangzhou (la humedad relativa mensual media fue 77,2 ± 7,3%) (Fig. 3). Es común que la prevalencia de patógenos fluctúe con el tiempo debido a factores de variedad. En este estudio, la prevalencia del HBoV1 fue relativamente baja en 2013 a 2014. Podría estar parcialmente relacionada con la humedad relativa relativamente mayor durante este período (Fig. 3). Las condiciones climáticas pueden afectar la supervivencia y propagación de virus respiratorios, sin embargo no se encontró ninguna relación lineal significativa entre la infección por HBoV1 y la velocidad del viento o la duración del sol en este estudio (p > 0.05) (Tabla 2). En primer lugar, porque nuestro estudio se centró principalmente en la circulación de HBoV1 en pacientes hospitalizados con IAR, HBoV1 en pacientes ambulatorios y población asintomática no fueron incluidos. En segundo lugar, muchos factores pueden afectar epidemias de virus, el análisis de datos meteorológicos por sí solo puede no servir como una interpretación concluyente final. En tercer lugar, el estudio sólo se llevó a cabo en tres hospitales y puede no ser representativo de la población en general. Nuestro estudio ha proporcionado una mejor comprensión de la epidemiología de HBoV1 en regiones subtropicales, específicamente correlaciones con datos climáticos; estos datos serán útiles para el control y prevención futuros de infecciones de HBoV1.

¿Qué porcentaje de pacientes dio positivo para HBoV1?

Epidemiología de la infección por HBoV1 y relación con las condiciones meteorológicas en pacientes pediátricos hospitalizados con enfermedad respiratoria aguda: un estudio de 7 años en una región subtropicalhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6048719/SHA: f2f78c95ab378a31bd35dc1de84e0ec75eb7ce1bAutores: Liu, Wen-Kuan; Liu, Qian; Chen, De-Hui; Tan, Wei-Ping; Cai, Yong; Qiu, Shu-Yan; Xu, Duo; Li, Chi; Li, Xiao; Lin, Zheng-Shi; Zhou, RongFecha: 2018-07-16DOI: 10.1186/s1287-018-3Licencia: Para investigar la distribución de HBoV1 y determinar el efecto de las condiciones meteorológicas, los pacientes pediátricos hospitalizados fueron estudiados en una región subtropical de China. MÉTODOS: Muestras de 11.399 pacientes pediátricos hospitalizados (≤14 años), con ARI fueron probados para HBoV1 y otros patógenos respiratorios comunes utilizando PCR en tiempo real, entre julio de 2009 y junio de 2016. Además, se recolectaron datos meteorológicos locales. RESULTADOS: De los 11.399 pacientes evaluados, 5606 (49,2%) fueron positivos para al menos un patógeno respiratorio. Doscientos cuarenta y ocho de 11.399 (2,2%) fueron positivos para la infección por HBoV1. La coinfección fue común en pacientes HBoV1 positivos (45,2%, 112/248). Se encontró una diferencia significativa en la prevalencia de HBoV1 en pacientes de diferentes grupos de edad (p < 0,001), y la prevalencia máxima se encontró en pacientes de 7 a 12 meses (4,7%, 56/1203). Se encontraron dos picos de prevalencia de HBoV1 en verano (entre junio y septiembre) e invierno (entre noviembre y diciembre). La prevalencia de HBoV1 se relacionó significativamente positivamente con la temperatura media y se correlacionó negativamente con la humedad relativa media, y la temperatura media en el mes anterior tuvo mejor poder explicativo que la temperatura mensual actual. CONCLUSIONES: Este estudio proporciona una mejor comprensión de las características de la infección por HBoV1 en niños en regiones subtropicales. Los datos de este estudio proporcionan información útil para el futuro control y prevención de infecciones por HBoV1. Texto: Bocavirus humano 1 (HBoV1), que pertenece a la familia Parvoviridae, fue identificado en primer El HBoV1 ha sido confirmado como un patógeno respiratorio importante y se encuentra en infecciones respiratorias en niños y adultos en todo el mundo. La prevalencia de la detección de ácido nucleico del HBoV1 varía entre 1,5 y 33% en pacientes con enfermedad respiratoria aguda (ARI), según diferentes estudios [3] [5] [6] [7]. Los resultados de las pruebas serológicas y de ácido nucleico son generalmente consistentes [8] [9] [10] [11], mostrando que la infección por HBoV1 es muy común. El HBoV1 puede causar enfermedad respiratoria superior (URI) y enfermedad respiratoria inferior (LRI) [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18]. La infección por HBoV1 puede conducir al desarrollo de tos, rinitis, fiebre y otros síntomas clínicos comunes [15, 19]. El diagnóstico clínico es principalmente neumonía, bronquitis, neumotórax, enfisema mediastínico y otitis media y otras complicaciones [18] [19] [20] [21] [22]. En algunos casos, los pacientes presentan síntomas de lesión respiratoria grave, que pueden ser mortales [21, 23]. HBoV1 se puede detectar en muestras fecales [24], muestras de sangre [25, 26], orina [27, 28], líquido cefalorraquídeo [29] [30] [31], agua de río [32] y aguas residuales [33, 34], lo que indica que el HBoV1 puede asociarse con una variedad de enfermedades. Estudios in vitro actuales que modelan cultivos de células epiteliales de la vía aérea tisular muestran que la infección por HBoV1 puede conducir a la interrupción de la barrera de unión estrecha, pérdida de cilia e hipertrofia de células epiteliales [35] [36], similar a los cambios tisulares de lesión pulmonar in vivo. Actualmente no hay vacuna ni tratamiento específico para este virus; la prevención y el tratamiento de enfermedades relacionadas con HBoV1 todavía requieren investigación adicional. La prevalencia de virus respiratorios está asociada con muchos factores, incluyendo el clima local, que pueden afectar la supervivencia y propagación de los virus [38]. Estudiar la epidemiología del HBoV1 y su relación con las condiciones meteorológicas mejorará el diagnóstico, el tratamiento, el control y la prevención de este virus. En este estudio, investigamos la epidemiología de la infección por HBoV1 en niños (≤14 años) hospitalizados con Además, recopilamos datos climáticos para determinar si existía una relación entre la prevalencia del HBoV1 y las condiciones meteorológicas. Este estudio se sumará a los datos epidemiológicos existentes sobre el HBoV1 y su relación con las condiciones climáticas en las regiones subtropicales y desempeñará un papel positivo en el control y la prevención del HBoV1. Los sitios de estudio fueron tres hospitales terciarios en Guangzhou, al sur de China (longitud: E112°57′ a E114 03′; latitud N22°26′ a N23°56′). Los criterios de inclusión fueron pacientes pediátricos (≤14 años) que presentaron al menos dos de los siguientes síntomas: tos, molestias faríngeas, obstrucción nasal, rinitis, disnea o que fueron diagnosticados con neumonía por radiografía de tórax durante la semana anterior. La radiografía de tórax se realizó de acuerdo con la situación clínica del paciente. Entre julio de 2009 y junio de 2016 se recogieron muestras de hisopos de garganta de los pacientes inscritos para la detección sistemática de virus respiratorios, Mycoplasma pneumoniae (MP) y Chlamydophila pneumoniae (CP), las cuales fueron refrigeradas a 2-8°C en medio de transporte viral, transportadas en hielo y analizadas inmediatamente o almacenadas a − 80°C antes del análisis, como se describió anteriormente [15, 39]. Los datos meteorológicos para Guangzhou, fueron recolectados de julio de 2009 a junio de 2016 de la Administración Meteorológica de China, incluyendo la temperatura media mensual (°C), humedad relativa media (%), precipitación (mm), velocidad media del viento (m/s), presión media del aire (hPa), presión media del vapor (hPa), duración del sol (h). El PCR en tiempo real para la detección de HBoV1 y de patógenos respiratorios comunes ADN y ARN se extrajeron de las muestras respiratorias utilizando el kit QIAamp DNA Mini y el kit QIAamp Viral ARN Mini (Qiagen, Shanghai, China), respectivamente, de acuerdo con los protocolos del fabricante. Taqman PCR en tiempo real para HBoV1 fue diseñado en base a la región conservada del gen NP1, como se describió anteriormente [15]. Se detectaron simultáneamente cuatro tipos de parainfluenza (PIV1-4), adenovirus (ADV), enterovirus (EV), metapneumovirus humano (HMPV), cuatro cepas de coronavirus humano (HCoV-229E, OC43, NL63 y HKU1), rinovirus humano (HRV), MP y CP, como se había informado anteriormente [40]. Los datos se analizaron utilizando la prueba Chi-cuadrado y la prueba exacta de Fisher en SPSS 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.). La correlación con los datos climáticos se analizó mediante análisis de regresión lineal múltiple. Todas las pruebas fueron de dos colas y un valor p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo. Entre julio de 2009 y junio de 2016 se inscribieron en el estudio 11 mil 399 pacientes pediátricos (≤14 años) hospitalizados con IRA. La relación hombre-mujer fue de 1,82:1 (7361:4038) y la mediana de edad fue de 1,75 años (rango intercuartil 0,75-3,83). En general, el 86,5 % (9857/1139) de los pacientes eran menores de 5 años. Todos los 11.399 pacientes fueron probados para los 18 patógenos mencionados, y 5606 (49,2%) fueron positivos para uno o más de esos patógenos (Tabla 1) y tuvieron una mediana de edad de 1,50 años (rango intercuartil 0,67-3,00). Los coeficientes hombre-mujer fueron 1,94: 1 (3698:1908) en pacientes patógenos positivos y 1,72:1 (3663:2130) en pacientes patógenos negativos (p = 0,002). Doscientos cuarenta y ocho de los 11.399 pacientes (2,2%) dieron positivo en la infección por HBoV1. De los pacientes positivos por HBoV1, 112 (45,2%) fueron coinfectados con otros patógenos, con mayor frecuencia con VRS (11,7%, 29/248) (Tabla 1). La mediana de edad fue de 1 año (rango intercuartílico 0,75-1,83). La relación hombre-mujer fue de 2,54:1 (178:70) en los pacientes positivos por HBoV1 y 1,81:1 (7183:3968) en los pacientes negativos por HBoV1 (p = 0,019). Para aclarar la distribución de edad de HBoV1, los pacientes se dividieron en siete grupos de edad; 0-3 meses, 4-6 meses, 7-12 meses, 1-2 años, 3-5 años, 6-10 años y 11-14 años. Hubo una diferencia significativa en la prevalencia de HBoV1 en pacientes de diferentes grupos de edad (p < 0,001) y la prevalencia máxima se encontró en pacientes de 7 a 12 meses (4,7%, 56/1203) (Fig. 1). En este estudio, se monitorizó la prevalencia de HBoV1 en pacientes (≤14 años) hospitalizados con ARI desde julio Se recogieron datos meteorológicos para Guangzhou, incluyendo temperatura media mensual, humedad relativa media, precipitación, velocidad media del viento, presión media del aire, presión media del vapor y duración del sol durante un período de 7 años, para explorar la correlación entre las condiciones meteorológicas y la prevalencia de HBoV1. Guangzhou, que se encuentra en el sur de China (longitud 112°57′ a 114°3′, latitud 22°26′ a 23°56′), tiene un clima monzón subtropical marítimo. Entre julio de 2009 y junio de 2016, la temperatura media fue de 21,8 ± 5,8 °C (media ± desviación estándar), la humedad fue de 77,2 ± 7,3%, la duración del sol fue de 132,7 ± 59,5 h, la velocidad del viento fue de 2,2 ± 0,6 m/s, la precipitación fue de 175,2 ± 165,9 mm, la presión del aire fue de 1005,6 ± 6,0 hPa y la presión del vapor fue de 21,3 h ± 7,4 hPa. Para el análisis de regresión lineal múltiple de prevalencia de HBoV1 y correlación de condiciones meteorológicas, se excluyeron variables independientes de presión media del aire (R 2 ajustado = 0,793, p < 0,001) y presión media del vapor (R 2 ajustado = 0,929, p < 0,001), que se asociaron linealmente con temperatura media y precipitación (R 2 ajustado = 0,278, p < 0,001), fuertemente correlacionadas con humedad relativa media; las variables independientes para el análisis final de regresión lineal múltiple incluyeron temperatura media, humedad relativa media, velocidad media del viento y horas de sol; por lo tanto, el efecto de la temperatura tuvo un retraso en la temperatura media del mes anterior (temperatura media 1 mes antes) también se incluyó como variable independiente en el análisis (Tabla 2). Ambos modelos de regresión se establecieron (p < 0,001) y los valores ajustados de R 2 fueron 0,373 y 0,231 en la temperatura media del La prevalencia de HBoV1 estuvo correlacionada positivamente con la temperatura (coeficiente = 0,259 en el modelo de temperatura actual (p = 0,002), coeficiente = 0,328 en la temperatura media en el modelo del mes anterior (p < 0,001)). Por el contrario, la prevalencia de HBoV1 estuvo correlacionada negativamente con la humedad relativa (coeficiente = − 0,126 en el modelo de temperatura actual (p = 0,024), coeficiente = − 0,083 en el modelo de retardo de temperatura (p = 0,039) (Tabla 2). La IRA es una de las enfermedades humanas más comunes, principalmente causadas por diferentes virus respiratorios [41, 42]. En general, la prevalencia de virus varía debido a factores como el análisis de regresión lineal múltiple se realizó utilizando la prevalencia mensual de HBoV1 como variable dependiente, temperatura media mensual (o temperatura media en el mes anterior), humedad relativa media, velocidad media del viento y duración del sol, ya que las variables independientes Los datos capturados en negrita son ubicación geográfica altamente significativa, condiciones climáticas, población y actividad social [38]. Se ha descrito con más detalle la epidemiología del HBoV1 en regiones templadas y se ha observado una alta incidencia de infección en niños menores de 2 años en invierno y primavera [15, 16, 39, 44]. Para describir la epidemiología del HBoV1 en Guangzhou, se recogieron toallitas de garganta de 11.399 niños (≤14 años), hospitalizadas con ARI y monitoreadas HBoV1 y otros patógenos respiratorios comunes durante un período En el presente estudio, el 86,5% (9857/1139) de los pacientes eran menores de 5 años, con una mediana de edad de 1,75 años, lo que indica que los lactantes y los niños pequeños tenían mayor riesgo de IRA, de acuerdo con informes anteriores [45, 46]. En general, el 49,2% (5606/1139) de los pacientes dieron positivo en uno o más patógenos respiratorios, el 2,2% (248/1139) de los pacientes fueron sometidos a pruebas con infección por HBoV1 (tabla 1). Se detectó una mayor prevalencia de HBoV1 en los pacientes varones en comparación con las mujeres (p = 0,019), en consonancia con informes anteriores [15, 16, 39, 44]. La coinfección con HBoV1 y otros patógenos es común [14, 15]. En nuestro estudio, el 45,2% (112/248) de los pacientes positivos Esto puede ser causado en parte por epidemias coincidentes de HBoV1 y otros patógenos. En nuestro estudio, la distribución estacional de HBoV1 y la distribución total positiva de patógenos fueron consistentes, confirmando esta inferencia (Fig. 2). La investigación actual muestra que la infección por HBoV1 puede llevar al colapso de la primera línea de defensa del epitelio de las vías respiratorias [35] [36], lo que puede conducir a una mayor susceptibilidad a otros patógenos, explicando la alta tasa de coinfección. Si la coinfección conduce a una enfermedad más grave es actualmente desconocida y se necesita más investigación para determinar esto. Las características de la infección por HBoV1 son probablemente un buen modelo para estudiar los efectos de las coinfección. En este estudio, hubo una diferencia significativa en la prevalencia de HBoV1 en pacientes de diferentes edades (p < 0,001). La mayoría de las infecciones por HBoV1 ocurrieron en pacientes menores de 2 años y la frecuencia máxima de infección por HBoV1 ocurrió en pacientes de 7-12 meses (fig. 1), de acuerdo con informes serológicos y epidemiológicos previos sobre el virus [8-11, 15, 16, 39, 44]. Esto podría deberse a que el sistema inmunitario infantil todavía está en desarrollo y los anticuerpos maternos desaparecen gradualmente en este grupo de edad.La distribución del HBoV1 en pacientes de diferentes edades proporcionará una referencia importante para futuras vacunas y nuevas investigaciones y desarrollo de fármacos, además de proporcionar datos importantes para la prevención y el control de enfermedades.Muchos factores afectan la epidemiología de patógenos, como la ubicación geográfica y el clima local. Guangzhou, una ciudad central y principal centro de transporte en el sur de China, se encuentra en una región subtropical. Guangzhou es caliente y tiene altas precipitaciones anuales, 3). En este estudio se observaron dos picos de HBoV1 (Fig. 2). Los picos de gran prevalencia de la infección por HBoV1 ocurrieron entre junio y septiembre de cada año, que son los meses de verano en Guangzhou, con temperaturas medias superiores a 25°C (Fig. 3). Los picos pequeños de infección por HBoV1 ocurrieron en invierno, entre noviembre y diciembre de cada año. Esta distribución estacional es similar a la prevalencia en regiones subtropicales reportadas anteriormente [47], pero diferente a las epidemias de HBoV1 en regiones templadas, que ocurren principalmente en invierno y primavera [15, 16, 39, 44], así como en regiones tropicales, como India, donde no se ha encontrado ninguna estación epidémica obvia [48]. Para analizar la correlación entre la prevalencia de HBoV1 y las condiciones meteorológicas, se realizó un análisis de regresión lineal múltiple, con prevalencia mensual de HBoV1 como variable dependiente y temperatura media (o temperatura media en el mes anterior), humedad relativa media, velocidad media del viento y duración del sol como variables independientes (tabla 2). Ambos modelos de regresión se establecieron (p < 0,001) y el valor ajustado de R 2 (0,373) del modelo de temperatura dorp 1 mes fue mayor que el valor ajustado de R 2 (0,231) del modelo actual de temperatura mensual, indicando que el modelo de temperatura dorp 1 mes tenía mejor potencia explicativa que el modelo actual de temperatura mensual. Ambos modelos mostraron que la prevalencia de HBoV1 se correlacionaba significativamente con la temperatura y humedad relativa (tabla 2 ). En detalle, la prevalencia de HBoV1 estuvo correlacionada positivamente con la temperatura, lo que concuerda con informes anteriores [ Por el contrario, la prevalencia del HBoV1 se correlacionó negativamente con la humedad relativa, lo que fue diferente de un informe anterior en Suzhou [47], que puede estar relacionado con la alta humedad de Guangzhou (la humedad relativa mensual media fue 77,2 ± 7,3%) (Fig. 3). Es común que la prevalencia de patógenos fluctúe con el tiempo debido a factores de variedad. En este estudio, la prevalencia del HBoV1 fue relativamente baja en 2013 a 2014. Podría estar parcialmente relacionada con la humedad relativa relativamente mayor durante este período (Fig. 3). Las condiciones climáticas pueden afectar la supervivencia y propagación de virus respiratorios, sin embargo no se encontró ninguna relación lineal significativa entre la infección por HBoV1 y la velocidad del viento o la duración del sol en este estudio (p > 0.05) (Tabla 2). En primer lugar, porque nuestro estudio se centró principalmente en la circulación de HBoV1 en pacientes hospitalizados con IAR, HBoV1 en pacientes ambulatorios y población asintomática no fueron incluidos. En segundo lugar, muchos factores pueden afectar epidemias de virus, el análisis de datos meteorológicos por sí solo puede no servir como una interpretación concluyente final. En tercer lugar, el estudio sólo se llevó a cabo en tres hospitales y puede no ser representativo de la población en general. Nuestro estudio ha proporcionado una mejor comprensión de la epidemiología de HBoV1 en regiones subtropicales, específicamente correlaciones con datos climáticos; estos datos serán útiles para el control y prevención futuros de infecciones de HBoV1.

¿Cuáles son los síntomas de la infección por HBoV1?

Epidemiología de la infección por HBoV1 y relación con las condiciones meteorológicas en pacientes pediátricos hospitalizados con enfermedad respiratoria aguda: un estudio de 7 años en una región subtropicalhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6048719/SHA: f2f78c95ab378a31bd35dc1de84e0ec75eb7ce1bAutores: Liu, Wen-Kuan; Liu, Qian; Chen, De-Hui; Tan, Wei-Ping; Cai, Yong; Qiu, Shu-Yan; Xu, Duo; Li, Chi; Li, Xiao; Lin, Zheng-Shi; Zhou, RongFecha: 2018-07-16DOI: 10.1186/s1287-018-3Licencia: Para investigar la distribución de HBoV1 y determinar el efecto de las condiciones meteorológicas, los pacientes pediátricos hospitalizados fueron estudiados en una región subtropical de China. MÉTODOS: Muestras de 11.399 pacientes pediátricos hospitalizados (≤14 años), con ARI fueron probados para HBoV1 y otros patógenos respiratorios comunes utilizando PCR en tiempo real, entre julio de 2009 y junio de 2016. Además, se recolectaron datos meteorológicos locales. RESULTADOS: De los 11.399 pacientes evaluados, 5606 (49,2%) fueron positivos para al menos un patógeno respiratorio. Doscientos cuarenta y ocho de 11.399 (2,2%) fueron positivos para la infección por HBoV1. La coinfección fue común en pacientes HBoV1 positivos (45,2%, 112/248). Se encontró una diferencia significativa en la prevalencia de HBoV1 en pacientes de diferentes grupos de edad (p < 0,001), y la prevalencia máxima se encontró en pacientes de 7 a 12 meses (4,7%, 56/1203). Se encontraron dos picos de prevalencia de HBoV1 en verano (entre junio y septiembre) e invierno (entre noviembre y diciembre). La prevalencia de HBoV1 se relacionó significativamente positivamente con la temperatura media y se correlacionó negativamente con la humedad relativa media, y la temperatura media en el mes anterior tuvo mejor poder explicativo que la temperatura mensual actual. CONCLUSIONES: Este estudio proporciona una mejor comprensión de las características de la infección por HBoV1 en niños en regiones subtropicales. Los datos de este estudio proporcionan información útil para el futuro control y prevención de infecciones por HBoV1. Texto: Bocavirus humano 1 (HBoV1), que pertenece a la familia Parvoviridae, fue identificado en primer El HBoV1 ha sido confirmado como un patógeno respiratorio importante y se encuentra en infecciones respiratorias en niños y adultos en todo el mundo. La prevalencia de la detección de ácido nucleico del HBoV1 varía entre 1,5 y 33% en pacientes con enfermedad respiratoria aguda (ARI), según diferentes estudios [3] [5] [6] [7]. Los resultados de las pruebas serológicas y de ácido nucleico son generalmente consistentes [8] [9] [10] [11], mostrando que la infección por HBoV1 es muy común. El HBoV1 puede causar enfermedad respiratoria superior (URI) y enfermedad respiratoria inferior (LRI) [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18]. La infección por HBoV1 puede conducir al desarrollo de tos, rinitis, fiebre y otros síntomas clínicos comunes [15, 19]. El diagnóstico clínico es principalmente neumonía, bronquitis, neumotórax, enfisema mediastínico y otitis media y otras complicaciones [18] [19] [20] [21] [22]. En algunos casos, los pacientes presentan síntomas de lesión respiratoria grave, que pueden ser mortales [21, 23]. HBoV1 se puede detectar en muestras fecales [24], muestras de sangre [25, 26], orina [27, 28], líquido cefalorraquídeo [29] [30] [31], agua de río [32] y aguas residuales [33, 34], lo que indica que el HBoV1 puede asociarse con una variedad de enfermedades. Estudios in vitro actuales que modelan cultivos de células epiteliales de la vía aérea tisular muestran que la infección por HBoV1 puede conducir a la interrupción de la barrera de unión estrecha, pérdida de cilia e hipertrofia de células epiteliales [35] [36], similar a los cambios tisulares de lesión pulmonar in vivo. Actualmente no hay vacuna ni tratamiento específico para este virus; la prevención y el tratamiento de enfermedades relacionadas con HBoV1 todavía requieren investigación adicional. La prevalencia de virus respiratorios está asociada con muchos factores, incluyendo el clima local, que pueden afectar la supervivencia y propagación de los virus [38]. Estudiar la epidemiología del HBoV1 y su relación con las condiciones meteorológicas mejorará el diagnóstico, el tratamiento, el control y la prevención de este virus. En este estudio, investigamos la epidemiología de la infección por HBoV1 en niños (≤14 años) hospitalizados con Además, recopilamos datos climáticos para determinar si existía una relación entre la prevalencia del HBoV1 y las condiciones meteorológicas. Este estudio se sumará a los datos epidemiológicos existentes sobre el HBoV1 y su relación con las condiciones climáticas en las regiones subtropicales y desempeñará un papel positivo en el control y la prevención del HBoV1. Los sitios de estudio fueron tres hospitales terciarios en Guangzhou, al sur de China (longitud: E112°57′ a E114 03′; latitud N22°26′ a N23°56′). Los criterios de inclusión fueron pacientes pediátricos (≤14 años) que presentaron al menos dos de los siguientes síntomas: tos, molestias faríngeas, obstrucción nasal, rinitis, disnea o que fueron diagnosticados con neumonía por radiografía de tórax durante la semana anterior. La radiografía de tórax se realizó de acuerdo con la situación clínica del paciente. Entre julio de 2009 y junio de 2016 se recogieron muestras de hisopos de garganta de los pacientes inscritos para la detección sistemática de virus respiratorios, Mycoplasma pneumoniae (MP) y Chlamydophila pneumoniae (CP), las cuales fueron refrigeradas a 2-8°C en medio de transporte viral, transportadas en hielo y analizadas inmediatamente o almacenadas a − 80°C antes del análisis, como se describió anteriormente [15, 39]. Los datos meteorológicos para Guangzhou, fueron recolectados de julio de 2009 a junio de 2016 de la Administración Meteorológica de China, incluyendo la temperatura media mensual (°C), humedad relativa media (%), precipitación (mm), velocidad media del viento (m/s), presión media del aire (hPa), presión media del vapor (hPa), duración del sol (h). El PCR en tiempo real para la detección de HBoV1 y de patógenos respiratorios comunes ADN y ARN se extrajeron de las muestras respiratorias utilizando el kit QIAamp DNA Mini y el kit QIAamp Viral ARN Mini (Qiagen, Shanghai, China), respectivamente, de acuerdo con los protocolos del fabricante. Taqman PCR en tiempo real para HBoV1 fue diseñado en base a la región conservada del gen NP1, como se describió anteriormente [15]. Se detectaron simultáneamente cuatro tipos de parainfluenza (PIV1-4), adenovirus (ADV), enterovirus (EV), metapneumovirus humano (HMPV), cuatro cepas de coronavirus humano (HCoV-229E, OC43, NL63 y HKU1), rinovirus humano (HRV), MP y CP, como se había informado anteriormente [40]. Los datos se analizaron utilizando la prueba Chi-cuadrado y la prueba exacta de Fisher en SPSS 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.). La correlación con los datos climáticos se analizó mediante análisis de regresión lineal múltiple. Todas las pruebas fueron de dos colas y un valor p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo. Entre julio de 2009 y junio de 2016 se inscribieron en el estudio 11 mil 399 pacientes pediátricos (≤14 años) hospitalizados con IRA. La relación hombre-mujer fue de 1,82:1 (7361:4038) y la mediana de edad fue de 1,75 años (rango intercuartil 0,75-3,83). En general, el 86,5 % (9857/1139) de los pacientes eran menores de 5 años. Todos los 11.399 pacientes fueron probados para los 18 patógenos mencionados, y 5606 (49,2%) fueron positivos para uno o más de esos patógenos (Tabla 1) y tuvieron una mediana de edad de 1,50 años (rango intercuartil 0,67-3,00). Los coeficientes hombre-mujer fueron 1,94: 1 (3698:1908) en pacientes patógenos positivos y 1,72:1 (3663:2130) en pacientes patógenos negativos (p = 0,002). Doscientos cuarenta y ocho de los 11.399 pacientes (2,2%) dieron positivo en la infección por HBoV1. De los pacientes HBoV1 positivos, 112 (45,2%) fueron coinfectados con otros patógenos, con mayor frecuencia con VRS (11,7%, 29/248) (Tabla 1). La mediana de edad fue de 1 año (rango intercuartílico 0,75-1,83). La relación hombre-mujer fue de 2,54:1 (178:70) en los pacientes HBoV1 positivos y 1,81:1 (7183:3968) en los pacientes HBoV1-negativos (p = 0,019). Para aclarar la distribución de edad de HBoV1, los pacientes se dividieron en siete grupos de edad; 0-3 meses, 4-6 meses, 7-12 meses, 1-2 años, 3-5 años, 6-10 años y 11-14 años. Hubo una diferencia significativa en la prevalencia de HBoV1 en pacientes de diferentes grupos de edad (p < 0,001) y la prevalencia máxima se encontró en pacientes de 7 a 12 meses (4,7%, 56/1203) (Fig. 1). En este estudio, se monitorizó la prevalencia de HBoV1 en pacientes (≤14 años) hospitalizados con ARI desde julio Se recogieron datos meteorológicos para Guangzhou, incluyendo temperatura media mensual, humedad relativa media, precipitación, velocidad media del viento, presión media del aire, presión media del vapor y duración del sol durante un período de 7 años, para explorar la correlación entre las condiciones meteorológicas y la prevalencia de HBoV1. Guangzhou, que se encuentra en el sur de China (longitud 112°57′ a 114°3′, latitud 22°26′ a 23°56′), tiene un clima monzón subtropical marítimo. Entre julio de 2009 y junio de 2016, la temperatura media fue de 21,8 ± 5,8 °C (media ± desviación estándar), la humedad fue de 77,2 ± 7,3%, la duración del sol fue de 132,7 ± 59,5 h, la velocidad del viento fue de 2,2 ± 0,6 m/s, la precipitación fue de 175,2 ± 165,9 mm, la presión del aire fue de 1005,6 ± 6,0 hPa y la presión del vapor fue de 21,3 h ± 7,4 hPa. Para el análisis de regresión lineal múltiple de prevalencia de HBoV1 y correlación de condiciones meteorológicas, se excluyeron variables independientes de presión media del aire (R 2 ajustado = 0,793, p < 0,001) y presión media del vapor (R 2 ajustado = 0,929, p < 0,001), que se asociaron linealmente con temperatura media y precipitación (R 2 ajustado = 0,278, p < 0,001), fuertemente correlacionadas con humedad relativa media; las variables independientes para el análisis final de regresión lineal múltiple incluyeron temperatura media, humedad relativa media, velocidad media del viento y horas de sol; por lo tanto, el efecto de la temperatura tuvo un retraso en la temperatura media del mes anterior (temperatura media 1 mes antes) también se incluyó como variable independiente en el análisis (Tabla 2). Ambos modelos de regresión se establecieron (p < 0,001) y los valores ajustados de R 2 fueron 0,373 y 0,231 en la temperatura media del La prevalencia de HBoV1 estuvo correlacionada positivamente con la temperatura (coeficiente = 0,259 en el modelo de temperatura actual (p = 0,002), coeficiente = 0,328 en la temperatura media en el modelo del mes anterior (p < 0,001)). Por el contrario, la prevalencia de HBoV1 estuvo correlacionada negativamente con la humedad relativa (coeficiente = − 0,126 en el modelo de temperatura actual (p = 0,024), coeficiente = − 0,083 en el modelo de retardo de temperatura (p = 0,039) (Tabla 2). La IRA es una de las enfermedades humanas más comunes, principalmente causadas por diferentes virus respiratorios [41, 42]. En general, la prevalencia de virus varía debido a factores como el análisis de regresión lineal múltiple se realizó utilizando la prevalencia mensual de HBoV1 como variable dependiente, temperatura media mensual (o temperatura media en el mes anterior), humedad relativa media, velocidad media del viento y duración del sol, ya que las variables independientes Los datos capturados en negrita son ubicación geográfica altamente significativa, condiciones climáticas, población y actividad social [38]. Se ha descrito con más detalle la epidemiología del HBoV1 en regiones templadas y se ha observado una alta incidencia de infección en niños menores de 2 años en invierno y primavera [15, 16, 39, 44]. Para describir la epidemiología del HBoV1 en Guangzhou, se recogieron toallitas de garganta de 11.399 niños (≤14 años), hospitalizados con ARI y monitorizados con HBoV1 y otros patógenos respiratorios comunes durante un En el presente estudio, el 86,5% (9857/1139) de los pacientes eran menores de 5 años, con una mediana de edad de 1,75 años, lo que indica que los lactantes y los niños pequeños tenían mayor riesgo de IRA, de acuerdo con informes anteriores [45, 46]. En general, el 49,2% (5606/1139) de los pacientes dieron positivo en uno o más patógenos respiratorios, el 2,2% (248/1139) de los pacientes fueron sometidos a pruebas con infección por HBoV1 (tabla 1). Se detectó una mayor prevalencia de HBoV1 en los pacientes varones en comparación con las mujeres (p = 0,019), en consonancia con informes anteriores [15, 16, 39, 44]. La coinfección con HBoV1 y otros patógenos es común [14, 15]. En nuestro estudio, el 45,2% (112/248) de los pacientes positivos Esto puede ser causado en parte por epidemias coincidentes de HBoV1 y otros patógenos. En nuestro estudio, la distribución estacional de HBoV1 y la distribución total positiva de patógenos fueron consistentes, confirmando esta inferencia (Fig. 2). La investigación actual muestra que la infección por HBoV1 puede llevar al colapso de la primera línea de defensa del epitelio de las vías respiratorias [35] [36], lo que puede conducir a una mayor susceptibilidad a otros patógenos, explicando la alta tasa de coinfección. Si la coinfección conduce a una enfermedad más grave es actualmente desconocida y se necesita más investigación para determinar esto. Las características de la infección por HBoV1 son probablemente un buen modelo para estudiar los efectos de las coinfección. En este estudio, hubo una diferencia significativa en la prevalencia de HBoV1 en pacientes de diferentes edades (p < 0,001). La mayoría de las infecciones por HBoV1 ocurrieron en pacientes menores de 2 años y la frecuencia máxima de infección por HBoV1 ocurrió en pacientes de 7-12 meses (fig. 1), de acuerdo con informes serológicos y epidemiológicos previos sobre el virus [8-11, 15, 16, 39, 44]. Esto podría deberse a que el sistema inmunitario infantil todavía está en desarrollo y los anticuerpos maternos desaparecen gradualmente en este grupo de edad.La distribución del HBoV1 en pacientes de diferentes edades proporcionará una referencia importante para futuras vacunas y nuevas investigaciones y desarrollo de fármacos, además de proporcionar datos importantes para la prevención y el control de enfermedades.Muchos factores afectan la epidemiología de patógenos, como la ubicación geográfica y el clima local. Guangzhou, una ciudad central y principal centro de transporte en el sur de China, se encuentra en una región subtropical. Guangzhou es caliente y tiene altas precipitaciones anuales, 3). En este estudio se observaron dos picos de HBoV1 (Fig. 2). Los picos de gran prevalencia de la infección por HBoV1 ocurrieron entre junio y septiembre de cada año, que son los meses de verano en Guangzhou, con temperaturas medias superiores a 25°C (Fig. 3). Los picos pequeños de infección por HBoV1 ocurrieron en invierno, entre noviembre y diciembre de cada año. Esta distribución estacional es similar a la prevalencia en regiones subtropicales reportadas anteriormente [47], pero diferente a las epidemias de HBoV1 en regiones templadas, que ocurren principalmente en invierno y primavera [15, 16, 39, 44], así como en regiones tropicales, como India, donde no se ha encontrado ninguna estación epidémica obvia [48]. Para analizar la correlación entre la prevalencia de HBoV1 y las condiciones meteorológicas, se realizó un análisis de regresión lineal múltiple, con prevalencia mensual de HBoV1 como variable dependiente y temperatura media (o temperatura media en el mes anterior), humedad relativa media, velocidad media del viento y duración del sol como variables independientes (tabla 2). Ambos modelos de regresión se establecieron (p < 0,001) y el valor ajustado de R 2 (0,373) del modelo de temperatura dorp 1 mes fue mayor que el valor ajustado de R 2 (0,231) del modelo actual de temperatura mensual, indicando que el modelo de temperatura dorp 1 mes tenía mejor potencia explicativa que el modelo actual de temperatura mensual. Ambos modelos mostraron que la prevalencia de HBoV1 se correlacionaba significativamente con la temperatura y humedad relativa (tabla 2 ). En detalle, la prevalencia de HBoV1 estuvo correlacionada positivamente con la temperatura, lo que concuerda con informes anteriores [ Por el contrario, la prevalencia del HBoV1 se correlacionó negativamente con la humedad relativa, lo que fue diferente de un informe anterior en Suzhou [47], que puede estar relacionado con la alta humedad de Guangzhou (la humedad relativa mensual media fue 77,2 ± 7,3%) (Fig. 3). Es común que la prevalencia de patógenos fluctúe con el tiempo debido a factores de variedad. En este estudio, la prevalencia del HBoV1 fue relativamente baja en 2013 a 2014. Podría estar parcialmente relacionada con la humedad relativa relativamente mayor durante este período (Fig. 3). Las condiciones climáticas pueden afectar la supervivencia y propagación de virus respiratorios, sin embargo no se encontró ninguna relación lineal significativa entre la infección por HBoV1 y la velocidad del viento o la duración del sol en este estudio (p > 0.05) (Tabla 2). En primer lugar, porque nuestro estudio se centró principalmente en la circulación de HBoV1 en pacientes hospitalizados con IAR, HBoV1 en pacientes ambulatorios y población asintomática no fueron incluidos. En segundo lugar, muchos factores pueden afectar epidemias de virus, el análisis de datos meteorológicos por sí solo puede no servir como una interpretación concluyente final. En tercer lugar, el estudio sólo se llevó a cabo en tres hospitales y puede no ser representativo de la población en general. Nuestro estudio ha proporcionado una mejor comprensión de la epidemiología de HBoV1 en regiones subtropicales, específicamente correlaciones con datos climáticos; estos datos serán útiles para el control y prevención futuros de infecciones de HBoV1.

¿Cuál fue la proporción entre hombres y mujeres para este estudio?

Secuenciación del genoma completo y análisis filogenético de cepas humanas de metapneumovirus de Kenia y Zambiahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6941262/SHA: f5ae3f66face323615df39d838e056ab5fcc98dfAutores: Kamau, Everlyn; Oketch, John W.; de Laurent, Zaydah R.; Phan, My V. T.; Agoti, Charles N.; Nokes, D. James; Cotten, MatthewFecha: 2020-01-02DOI: 10.1186/s12864-019-6400-zLicencia: cc-byAbstract: ANTEGRANO: El metapneumovirus humano (HMPV) es una causa La secuenciación del genoma completo permite una mejor identificación de eventos de transmisión y brotes, lo que no siempre es posible con secuencias subgenómicas.RESULTADOS: Informamos de un método de secuenciación de próxima generación basado en 2 reacciones amplificadas para determinar las secuencias completas del genoma de cinco cepas HMPV, que representan tres subgrupos (A2, B1 y B2), directamente a partir de muestras clínicas. Además de reportar cinco genomas nuevos HMPV de África, examinamos la diversidad genética y los patrones de secuencia de genomas HMPV públicamente disponibles. Encontramos que la identidad general de la secuencia de nucleótidos fue del 71,3 y 80% para los grupos HMPV A y B, respectivamente, la diversidad entre los grupos HMPV fue mayor a nivel de aminoácidos para los genes de proteína de superficie SH y G, y múltiples subgrupos cocirculados en varios países. El análisis filogenético de todo el genoma mostró congruencia con los conjuntos de secuencias genéticas individuales excepto con los genes F y M2. CONCLUSIÓN: Esta es la primera caracterización genómica de genomas del VPHM de pacientes africanos. Texto: El metapneumovirus humano (VPHM) es un virus de ARN de una sola cadena en la familia Paramyxoviridae y está estrechamente relacionado con el virus sincitial respiratorio humano (VSR) [1]. El VPHM causa enfermedades respiratorias similares a la VSR, que van desde infecciones respiratorias superiores leves a bronquiolitis y neumonía [2]. Las infecciones por VPHM son estacionales y la coinfección con otros patógenos respiratorios es común [1]. El genoma del HMPV es de aproximadamente 13 kb y comprende ocho marcos de lectura abiertos (ORF) que codifican la nucleoproteína (N), la fosfoproteína (P), la proteína de matriz (M), la glucoproteína de fusión (F), la proteína potenciadora de la transcripción (M2), la proteína hidrofóbica pequeña (SH), la glicoproteína de unión (G) y la proteína polimerasa grande (L) [3]. Las secuencias de las glicoproteínas de membrana F y G se utilizan para definir dos grandes genotipos o grupos, A y B, que además se clasifican en cuatro subgrupos (A1, A2, B1 y B2). El HMPV A2, el subgrupo más frecuentemente observado, se divide además en dos sublineaciones propuestas (A2a y A2b) [3]. Se informa que el HMPV tiene una importante contribución a las infecciones respiratorias Por ejemplo, la hospitalización asociada al VPHM se estimó en 6,5 por cada 1.000 años en lactantes de Soweto, Sudáfrica [4] ; en 4% en niños hospitalizados con IAR grave durante un período de 2 años en Camerún [5] ; y en la zona rural occidental de Kenia, la incidencia de VPHM asociada a IHM en las consultas ambulatorias fue estimada en 0,43 por cada 100 años/persona [6]. En Kilifi, Kenia costera, entre enero de 2007 y diciembre de 2011, los niños menores de 6 meses de edad representaron el 44% de los casos positivos del VPHM, mientras que el 74% eran niños menores de 1 año y el 1,3% (2/160) eran niños > 36 meses [7]. En los campamentos de refugiados de Dadaab y Kakuma en Kenia, se detectó VPHM en un 5,7% de hospitalizaciones, y la tasa de hospitalización bruta positiva por virus (por En Malí, la contribución del VPHM a la neumonía tuvo una fracción de población atribuible del 9% (95% IC: 7-11%) [9] ; mientras que en Marruecos [10], el 8,9% de los niños < 5 años admitidos con neumonía grave fueron infectados con VPHM. La prevalencia e incidencia del VPHM en otros lugares a nivel mundial, se indica en el expediente adicional 4: Tabla S1. Cabe destacar que las variaciones en las tasas de incidencia podrían atribuirse a la población en estudio, la estacionalidad e incluso los métodos de detección. Sin embargo, la epidemiología genómica del VPHM en África es insuficiente y no se documenta la comparación de similitudes genéticas y diferencias entre cepas africanas y mundiales. Las secuencias del genoma proporcionan recursos valiosos para caracterizar la evolución viral y la epidemiología de la enfermedad, y para identificar eventos de transmisión y brotes, lo que no siempre es posible con fragmentos subge El aumento del número de sitios de variantes filogenéticamente informativas obtenidos a partir de genomas completos puede permitir una mejor vinculación de los casos y ayudar a las intervenciones de salud pública en tiempo real durante epidemias [14, 15]. Los enfoques PCR para la secuenciación del genoma completo dirigida, en contraste con la amplificación aleatoria, pueden amplificar preferentemente el virus objetivo sobre los ácidos nucleicos del huésped o del medio ambiente [16, 17] potencialmente centrando la secuenciación en el virus de interés. Hasta la fecha, el conjunto de datos más grande de genomas enteros HMPV (n = 61) secuenciados de cualquier país tropical procede de tres ciudades peruanas, Lima, Piura e Iquitos [18]. org/, accessed April 30, 2019). Esto ha llevado a una comprensión limitada de la diversidad genética y genómica del HMPV en el continente. Este trabajo describe todo un enfoque de secuenciación del genoma (WGS) para el HMPV a partir de un pequeño número de muestras clínicas positivas del HMPV recogidas en Kilifi County Hospital en Kilifi, Kenia y University Teaching Hospital en Lusaka, Zambia. Los genomas fueron generados por secuenciación superpuesta PCR amplicons que abarcan todo el genoma. Estas son las primeras secuencias completas del genoma reportadas de cepas de HMPV de circulación local obtenidas directamente de muestras clínicas en África. También combinamos los nuevos genomas con secuencias disponibles públicamente para examinar patrones en diversidad genética global del HMPV. La secuenciación del genoma completo fue exitosa para las 5 muestras clínicas que se intentaron obtener de cada muestra, y la longitud de los 5 nuevos genomas del H En la Tabla 1 se muestran los parámetros de secuenciación y ensamblaje de datos, incluyendo la profundidad de la cobertura. La anotación secuencial de los genomas de larga duración utilizando Geneious R8.1.5 (https://www.geneous.com) identificó las ocho regiones genómicas esperadas de codificación ORF y no codificantes. La identidad general de nucleótidos (es decir, sitios idénticos promediando en todos los pares de secuencias y excluyendo posiciones que contienen huecos) entre las 143 secuencias del genoma analizadas (5 genomas nuevos más 138 de ViPR) fue 58,2%. La identidad de secuencia de nucleótidos fue 71,3% dentro de HMVV-A y 80% dentro de HMVV-B. Los genomas intrasubgrupo, A1, A2, B1 y B2 compartieron 92,1% (10 secuencias), 76,8% (secuencias 88), 91% (24 secuencia Para los 143 genomas del HMPV, comprobamos la conservación de la secuencia en las regiones de control transcripcional, en los terminis de cada gen, así como la longitud de las secuencias intergénicas entre los límites del gen. La longitud de la región intergénica del F-M2 fue diferente entre los virus del grupo A y B, es decir, 13 nt y 2 nt, respectivamente. Las regiones intergénicas del SH-G y G-L fueron las más largas, hasta 125 nt y hasta 190 nt, respectivamente. Los nucleótidos de consenso (9 a 19 longitudes) en las regiones de inicio y final putativo flanqueando el ORF de los genes virales se muestran en la Fig. 1. Las regiones de inicio y final del gen de N y P se conservaron (> 90% de identidad de pareja media) en ambos grupos del HMPV, y los genes El codón de inicio ATG putativo se encontraba consistentemente en las posiciones 14-16 aguas arriba de un motivo de inicio del gen (consenso: GG/AGAC/TAAA/GTnnnnATG), excepto para el M2-2 interno. Se observó un codón de inicio ATG adicional aguas arriba del motivo de inicio del gen en el gen SH para las cepas B1 y B2. En cinco de los ocho genes anotados (N, P, F, M2 y G (sólo cepas B1 y B2)), las regiones intergénicas fueron cortas y los ORFs para estos 5 genes terminaron dentro de los motivos de fin del gen propuestos. Combinamos las cinco secuencias del genoma de Kenia y Zambia con las secuencias globales disponibles, alineando genes individuales y calculando el porcentaje de nucleótido (nt) y la identidad del aminoácido (aa) (Tabla 2). Las secuencias codificantes de los genes N, M, F, M2-1, M2-2 y L se conservaron en los niveles de nucleótidos y aminoácidos, compartiendo > 85% entre el subgrupo identidad de nucleótidos y 90% identidad de proteínas (Tabla 3 ). El gen de nucleoproteínas fue el más conservado entre todos los subgrupos en los niveles de nt y aa. Los genes de SH y G glicoproteínas fueron más divergentes entre los subgrupos de HMPV en el nivel de nucleótidos con identidad de 76 y 63%, respectivamente. La longitud de la proteína de SH fue variable entre las cepas de grupo A y B debido a una sustitución de nucleótidos (CAA La diversidad de las secuencias de aminoácidos para las glicoproteínas G y SH se muestra en la figura 2 y en el archivo adicional 2: Figura S2, respectivamente. La diversidad de las secuencias completas de nucleótidos de los genes SH y G se representa en los árboles filogenéticos en la figura 3. Se evaluó la clasificación filogenética y la relación entre los 5 nuevos genomas obtenidos en este estudio y los genomas publicados previamente (Fig. 3). El genoma completo figura S3. Hubo congruencia filogenética con los conjuntos de secuencias genéticas individuales como con el conjunto completo de datos del genoma, excepto para los genes F y M2 (Fig. 3: Figura S3 ). Las cepas virales variantes o derivadas pueden disminuir la sensibilidad de la detección resultando en una disminución de la cuantificación de la carga viral y subestimación de la incidencia de la enfermedad [19]. Comprobamos los nuevos genomas del HMPV para detectar las diferencias entre los nucleótidos en las regiones genómicas objetivo de nuestros primeros y sondas diagnósticas del rRT-PCR (archivo adicional 7: Tabla S4) utilizados para la detección del HMPV. Se identificaron hasta ocho desajustes entre el primer y la sonda (Fig. 4): un desajuste en la región del primer hacia adelante en el grupo del HMPV A (ensayo del rRT-PCR basado en genes F, Fig. 4a); un desajuste en cada una de las regiones diana hacia delante y la sonda en el grupo B (ensayo del rRT-PCR basado en genes F, Fig. 4b); y 5 desajustes diferentes con el ensayo del rRT-PCR basado en genes N-Gene ( El HMPV causa enfermedades respiratorias que se presentan como infección leve del tracto respiratorio superior o bronquiolitis grave potencialmente mortal y neumonía principalmente en niños, a veces adultos, así como en individuos inmunocomprometidos [2]. Sin embargo, los datos de la secuencia del genoma del HMPV de África son escasos y la información sobre la diversidad del genoma es limitada. En el presente estudio, se determinaron las secuencias del genoma completo de cinco cepas del HMPV de Kenia y Zambia y se compararon con los genomas publicados anteriormente de todo el mundo. El análisis comparativo de secuencias indicó una posición bastante conservada de las regiones de inicio y fin de los genes, así como de los codones de inicio y fin de la traducción. La variación de las secuencias del genstart y final puede tener un impacto significativo en la eficiencia de la iniciación de la transcripción para que exista una presión más selectiva que impida cambios en estas regiones [20], El codón de inicio ATG adicional encontrado aguas arriba del motivo de inicio del gen del gen SH fue consistente con un informe anterior [21], aunque su papel en la expresión génica aún no se ha identificado. Estos genes de secuencia observada en N, M, F, M2-1, M2-2 y L no son inusuales y sugieren limitaciones funcionales y estructurales sobre la diversidad, pero menos esperadas del gen F debido a su estado como antígeno de neutralización y protección, similar a su RSV'relativo' cercano [22]. También se ha sugerido que la baja diversidad en el gen F podría hacer una contribución sustancial a la neutralización cruzada y la protección cruzada entre los subgrupos HMPV [21]. La frecuencia relativamente alta de diversidad de aminoácidos en la G (y en menor medida la SH) podría atribuirse a la presión selectiva para el cambio de aminoácidos proveniente de la inmunidad del huésped; y la capacidad de la proteína para tolerar sustituciones, que podría deberse a su naturaleza extendida y desenvuelta propuesta [22]. La incongruencia filogenética observada entre el árbol del genoma completo y los árboles del gen F y G, es la reportada anteriormente para el HMPV [23], y podría atribuirse a tasas diferenciales de evolución, presión de selección o eventos de recombinación anteriores [24]. La prevalencia de VPHM en población pediátrica hospitalizada en el condado de Kilifi en la costa de Kenia ha sido reportada [7, 25]. Sin embargo, es notable que en los últimos años se ha detectado VPHM con baja prevalencia en Kilifi (observaciones no publicadas de vigilancia Aún no se ha establecido si esta baja prevalencia se debe a la reducción de la transmisión del virus o a la disminución de la sensibilidad de nuestro ensayo de diagnóstico molecular del HMPV debido a los desajustes progresivos entre el primer y la sonda. Presentamos las primeras secuencias del genoma completo de las cepas de HMPV circulantes del África subsahariana. Una limitación de nuestro método de secuenciación, como es común con los protocolos de secuenciación del amplificador [26, 27], no hubo cobertura en las regiones líderes de 3′ y 5′ de remolque no capturadas por estos imprimadores. Nuestros resultados demuestran la aplicación de la secuenciación amplicon para generar genomas de HMPV de longitud completa directamente a partir de muestras clínicas. La diversidad observada de los genes individuales es comparable a la descrita anteriormente [20] [22]. Este método y datos proporcionan una referencia útil para el diseño de diagnósticos moleculares locales y para Se recogieron muestras de hisopos nasofaríngeos y orofaríngeos (NP-OP) de niños (1-59 meses) hospitalizados con neumonía, cuatro de los cuales fueron incluidos en el estudio PERCH [18] en 2012. La quinta muestra fue recogida de un niño inscrito en el estudio rutinario de vigilancia de la neumonía en el Hospital del Condado de Kilifi, Kenia, en 2015. Las muestras fueron analizadas para el VPHM mediante ensayos multiplex semicuantitativos de transcripción inversa en tiempo real PCR (rRT-PCR). Los primeros y sondas rRT-PCR utilizados, condiciones de ciclismo y ensayos establecidos se han descrito en otras partes [28, 29]. Los genes codificantes de fusión (F) y glicoproteína (G) de las muestras positivas de HMPV fueron amplificados en un ensayo RT-PCR de un solo paso (boti de OneStep RT- Las secuencias parciales de nucleótidos G o F fueron analizadas por árboles filogenéticos de máxima probabilidad (ML) utilizando IQ-TREE [30], junto con cepas de referencia de subgrupos de HMPV (números de adhesión AF371337.2, FJ168779, AY297749, AY530095, JN184401 y AY297748). Cinco muestras de HMPV positivas de los sitios de estudio de Kenia y Zambia, pertenecientes a los A2a (n = 1), A2b (n = 2), B1 (n = 1) y B2 (n = 1), basadas en sus secuencias de genes G y F, fueron seleccionadas para secuenciación del genoma completo. Los datos sobre la información de evaluación clínica y de edad recolectada en el momento de la recolección de la muestra, para las cinco muestras seleccionadas, se muestran El protocolo de secuenciación consistió en cuatro pasos: (i) diseño de imprimación, (ii) preparación de mezclas de imprimación, (iii) cDNA y PCR (iv) secuenciación de Ilumina y análisis de datos. Todas las secuencias del genoma completo del metapneumovirus humano (HMPV) fueron recuperadas de GenBank (enero de 2018) utilizando la consulta (txid162145 (Organismo) Y 12000 (SLEN): 14000 (SLEN) NO patente). Se excluyeron entradas de secuencia con huecos mayores de 6 nt para generar un conjunto de 178 genomas. Todas las secuencias posibles de 23 nt fueron generadas a partir del conjunto de datos del genoma y recortadas a una temperatura de fusión (Tm) calculada final de 47,9-49.5°C. Se descartaron secuencias con homología a secuencias de ARNr, con contenido de GC fuera de < 0,3 o > 0,75 o con un único contenido fraccional de nucleótidos de > 0,6. El set de imprimación se hizo entonces no redundante produciendo 60.746 imprimaciones potenciales. Todos los imprimaciones potenciales fueron cartografiadas con los genomas completos de 178 HMPV y se determinó el número de coincidencias perfectas (puntuación de frecuencia) como una medida de conservación de la secuencia de imprimación. Para seleccionar los imprimaciones, las secuencias del genoma del HMPV se dividieron en amplificadores con 222 nt de superposición que abarcaban el genoma del virus. Se identificaron los imprimaciones potenciales que se mapearon dentro de los terminales 5′ y 3′ 222 nt de cada amplificador y se seleccionó la secuencia con la puntuación De esta manera, se seleccionaron 24 imprimaciones para cada uno de los genomas representativos del genotipo HMPV (número de adhesión de GenBank HMPV A1: AF371337, HMPV A2: FJ168779; HMPV B1: AY525843, y HMPV B2: FJ168778). Debido a la conservación entre los genotipos, hubo redundancia de imprimación que fue eliminada. El conjunto final de 65 secuencias de imprimación, sus longitudes, Tm calculado, contenido de GC fraccionado y posición de mapeo en el genoma HMPV se presentan en el archivo adicional 5: Tabla S2. Los imprimaciones se probaron computacionalmente con cada uno de los 4 subgrupos de HMPV. En el archivo adicional 1 se presenta una representación gráfica de los sitios objetivo de imprimación: Figura Para evitar la generación de pequeños productos a partir de imprimaciones adyacentes hacia adelante e inversas, se asignaron amplicones para alternar la Tabla 3 ). Se indican valores de soporte de Bootstrap (evaluados por 1000 réplicas) a lo largo de las ramas. Se indican subgrupos genéticos A1, A2a, A2b, B1 y B2. La alineación de múltiples secuencias se realizó utilizando MAFFT y la filogenia ML inferida utilizando el modelo de sustitución de nucleótidos GTR + Cada transcripción inversa utiliza mezclas de primer hacia adelante (PMF) hechas con 3,0 μl de cada imprimación inversa (100 pmol/μl) más agua a 200 μl para generar una concentración de primer hacia adelante de 24 pmol/μl. Dos microlitros de la MPF se utilizan entonces en una reacción de transcripción inversa de 20 μl (2,4 pmol/μl concentración final en reacción o 2,4 μM/primer). Para amplificación de PCR, cada reacción de primer hacia adelante de PCR utilizaba un mix de primer PCR (PPM) separado que contenía 1,5 μl de cada primer hacia adelante de 100 pmol/μl y 1,5 μl de cada imprimación inversa (5,3-5,5 pmol/μl en el PPM). Se utilizó 2 μl PPM por reacción de PCR de 25 μl = 0,5 Los ácidos nucleicos virales se extrajeron de las muestras originales utilizando el kit QIAamp Viral ARN Mini (QIAGEN). El ARN (5 μl) se transcribe de forma inversa en cDNA mediante SuperScript III (200 U, Invitrogen), tampón RT (1X concentración final, Invitrogen) y 2 μl de FPM en reacciones de 20 μl. Se amplificó un alícuota de cDNA (5 μl) en 35 ciclos utilizando el kit Phusion Highfidelity PCR (New England Biolabs) y 2 μl de PPM en una reacción de 25 μl. La mezcla PCR fue incubada a 98 °C durante 30 s, seguida de 35 ciclos de 98 °C durante 10 s, 43 °C durante 30 s y 72 ° Los productos de PCR esperados para cada amplicón fueron aproximadamente 1500 pb. Los productos de PCR de las dos reacciones para cada muestra fueron agrupados para la preparación de la biblioteca Illumina. Fig. 4 Mismatches entre los imprimadores de diagnóstico rRT-PCR y las sondas y sus sitios de unión esperados en los cinco genomas de Kenia y Zambia. 'Fwd imprimar' = Imprimador Adelante y 'Rev imprimador' = Imprimador Inverso. Dos ensayos de rRT-PCR fueron usados para la detección de HMPV. Las barras de color en la figura indican diferencias de nucleótidos (mismatches) entre: a) tres genomas HMPV-A y imprimaciones y sondas específicas HMPV-A dirigidas al gen de fusión; b) dos genomas HMPV-B y imprimaciones y sondas específicas HMPV-B también dirigidas al gen de fusión; y c) los cinco genomas reportados aquí y los imprimaciones y sondas específicas dirigidas al gen de nucleoproteína. Las secuencias de los imprimadores y sondas rRT-PCR verificados con los genomas africanos HMPV se enumeran en el archivo adicional 7: Tabla S4 Secuenciación de iluminaciones y análisis de datos Las bibliotecas se prepararon utilizando el kit de Nextera XT (Ilumina) y secuenciación de pares (2 × 300 pares base) con el kit MiSeq Reagent V3 La mezcla enzimática de Nextera se utilizó para fragmentar simultáneamente el ADN de entrada y etiquetar con adaptadores universales en una única reacción del tubo, seguida de la reacción PCR de 12 ciclos para la indexación dual. Las cuentas AMPure XP de Agencourt (Beckman Coulter) se utilizaron para todos los pasos de purificación y las bibliotecas se cuantificaron y verificaron la calidad utilizando el Qubit (Thermo Fisher) y Bioanalyzer (Agilent). El recorte del adaptador, el filtrado de calidad, la normalización de la secuenciación de kmer lee, el ensamblaje de novo, el cálculo de la cobertura media del genoma fue como se describió anteriormente [31]. Se recuperó un conjunto de datos de las secuencias del genoma del HMPV de ViPR para inferir la relación entre los virus del HMPV de Kenya y Zambia y las poblaciones virales muestreadas a nivel mundial. La alineación de secuencias se realizó utilizando MAFFT v.7.221 [32] utilizando los parámetros 'localpair -maxiterate 1000'. IQ-TREE se utilizó para inferir árboles de máxima probabilidad (ML) del genoma completo y genes individuales bajo el modelo de sustitución de tiempo reversible general (GTR) con heterogeneidad de frecuencia distribuida gamma entre el sitio. Un resumen de la metodología descrita aquí se muestra en la Fig. 5.

¿Qué tan grande es el genoma del HMPV?

Secuenciación del genoma completo y análisis filogenético de cepas humanas de metapneumovirus de Kenia y Zambiahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6941262/SHA: f5ae3f66face323615df39d838e056ab5fcc98dfAutores: Kamau, Everlyn; Oketch, John W.; de Laurent, Zaydah R.; Phan, My V. T.; Agoti, Charles N.; Nokes, D. James; Cotten, MatthewFecha: 2020-01-02DOI: 10.1186/s12864-019-6400-zLicencia: cc-byAbstract: ANTEGRANO: El metapneumovirus humano (HMPV) es una causa La secuenciación del genoma completo permite una mejor identificación de eventos de transmisión y brotes, lo que no siempre es posible con secuencias subgenómicas.RESULTADOS: Informamos de un método de secuenciación de próxima generación basado en 2 reacciones amplificadas para determinar las secuencias completas del genoma de cinco cepas HMPV, que representan tres subgrupos (A2, B1 y B2), directamente a partir de muestras clínicas. Además de reportar cinco genomas nuevos HMPV de África, examinamos la diversidad genética y los patrones de secuencia de genomas HMPV públicamente disponibles. Encontramos que la identidad general de la secuencia de nucleótidos fue del 71,3 y 80% para los grupos HMPV A y B, respectivamente, la diversidad entre los grupos HMPV fue mayor a nivel de aminoácidos para los genes de proteína de superficie SH y G, y múltiples subgrupos cocirculados en varios países. El análisis filogenético de todo el genoma mostró congruencia con los conjuntos de secuencias genéticas individuales excepto con los genes F y M2. CONCLUSIÓN: Esta es la primera caracterización genómica de genomas del VPHM de pacientes africanos. Texto: El metapneumovirus humano (VPHM) es un virus de ARN de una sola cadena en la familia Paramyxoviridae y está estrechamente relacionado con el virus sincitial respiratorio humano (VSR) [1]. El VPHM causa enfermedades respiratorias similares a la VSR, que van desde infecciones respiratorias superiores leves a bronquiolitis y neumonía [2]. Las infecciones por VPHM son estacionales y la coinfección con otros patógenos respiratorios es común [1]. El genoma del HMPV es de aproximadamente 13 kb y comprende ocho marcos de lectura abiertos (ORF) que codifican la nucleoproteína (N), la fosfoproteína (P), la proteína de matriz (M), la glucoproteína de fusión (F), la proteína potenciadora de la transcripción (M2), la proteína hidrofóbica pequeña (SH), la glicoproteína de unión (G) y la proteína polimerasa grande (L) [3]. Las secuencias de las glicoproteínas de membrana F y G se utilizan para definir dos grandes genotipos o grupos, A y B, que además se clasifican en cuatro subgrupos (A1, A2, B1 y B2). El HMPV A2, el subgrupo más frecuentemente observado, se divide además en dos sublineaciones propuestas (A2a y A2b) [3]. Se informa que el HMPV tiene una importante contribución a las infecciones respiratorias Por ejemplo, la hospitalización asociada al VPHM se estimó en 6,5 por cada 1.000 años en lactantes de Soweto, Sudáfrica [4] ; en 4% en niños hospitalizados con IAR grave durante un período de 2 años en Camerún [5] ; y en la zona rural occidental de Kenia, la incidencia de VPHM asociada a IHM en las consultas ambulatorias fue estimada en 0,43 por cada 100 años/persona [6]. En Kilifi, Kenia costera, entre enero de 2007 y diciembre de 2011, los niños menores de 6 meses de edad representaron el 44% de los casos positivos del VPHM, mientras que el 74% eran niños menores de 1 año y el 1,3% (2/160) eran niños > 36 meses [7]. En los campamentos de refugiados de Dadaab y Kakuma en Kenia, se detectó VPHM en un 5,7% de hospitalizaciones, y la tasa de hospitalización bruta positiva por virus (por En Malí, la contribución del VPHM a la neumonía tuvo una fracción de población atribuible del 9% (95% IC: 7-11%) [9] ; mientras que en Marruecos [10], el 8,9% de los niños < 5 años admitidos con neumonía grave fueron infectados con VPHM. La prevalencia e incidencia del VPHM en otros lugares a nivel mundial, se indica en el expediente adicional 4: Tabla S1. Cabe destacar que las variaciones en las tasas de incidencia podrían atribuirse a la población en estudio, la estacionalidad e incluso los métodos de detección. Sin embargo, la epidemiología genómica del VPHM en África es insuficiente y no se documenta la comparación de similitudes genéticas y diferencias entre cepas africanas y mundiales. Las secuencias del genoma proporcionan recursos valiosos para caracterizar la evolución viral y la epidemiología de la enfermedad, y para identificar eventos de transmisión y brotes, lo que no siempre es posible con fragmentos subge El aumento del número de sitios de variantes filogenéticamente informativas obtenidos a partir de genomas completos puede permitir una mejor vinculación de los casos y ayudar a las intervenciones de salud pública en tiempo real durante epidemias [14, 15]. Los enfoques PCR para la secuenciación del genoma completo dirigida, en contraste con la amplificación aleatoria, pueden amplificar preferentemente el virus objetivo sobre los ácidos nucleicos del huésped o del medio ambiente [16, 17] potencialmente centrando la secuenciación en el virus de interés. Hasta la fecha, el conjunto de datos más grande de genomas enteros HMPV (n = 61) secuenciados de cualquier país tropical procede de tres ciudades peruanas, Lima, Piura e Iquitos [18]. org/, accessed April 30, 2019). Esto ha llevado a una comprensión limitada de la diversidad genética y genómica del HMPV en el continente. Este trabajo describe todo un enfoque de secuenciación del genoma (WGS) para el HMPV a partir de un pequeño número de muestras clínicas positivas del HMPV recogidas en Kilifi County Hospital en Kilifi, Kenia y University Teaching Hospital en Lusaka, Zambia. Los genomas fueron generados por secuenciación superpuesta PCR amplicons que abarcan todo el genoma. Estas son las primeras secuencias completas del genoma reportadas de cepas de HMPV de circulación local obtenidas directamente de muestras clínicas en África. También combinamos los nuevos genomas con secuencias disponibles públicamente para examinar patrones en diversidad genética global del HMPV. La secuenciación del genoma completo fue exitosa para las 5 muestras clínicas que se intentaron obtener de cada muestra, y la longitud de los 5 nuevos genomas del H En la Tabla 1 se muestran los parámetros de secuenciación y ensamblaje de datos, incluyendo la profundidad de la cobertura. La anotación secuencial de los genomas de larga duración utilizando Geneious R8.1.5 (https://www.geneous.com) identificó las ocho regiones genómicas esperadas de codificación ORF y no codificantes. La identidad general de nucleótidos (es decir, sitios idénticos promediando en todos los pares de secuencias y excluyendo posiciones que contienen huecos) entre las 143 secuencias del genoma analizadas (5 genomas nuevos más 138 de ViPR) fue 58,2%. La identidad de secuencia de nucleótidos fue 71,3% dentro de HMVV-A y 80% dentro de HMVV-B. Los genomas intrasubgrupo, A1, A2, B1 y B2 compartieron 92,1% (10 secuencias), 76,8% (secuencias 88), 91% (24 secuencia Para los 143 genomas del HMPV, comprobamos la conservación de la secuencia en las regiones de control transcripcional, en los terminis de cada gen, así como la longitud de las secuencias intergénicas entre los límites del gen. La longitud de la región intergénica del F-M2 fue diferente entre los virus del grupo A y B, es decir, 13 nt y 2 nt, respectivamente. Las regiones intergénicas del SH-G y G-L fueron las más largas, hasta 125 nt y hasta 190 nt, respectivamente. Los nucleótidos de consenso (9 a 19 longitudes) en las regiones de inicio y final putativo flanqueando el ORF de los genes virales se muestran en la Fig. 1. Las regiones de inicio y final del gen de N y P se conservaron (> 90% de identidad de pareja media) en ambos grupos del HMPV, y los genes El codón de inicio ATG putativo se encontraba consistentemente en las posiciones 14-16 aguas arriba de un motivo de inicio del gen (consenso: GG/AGAC/TAAA/GTnnnnATG), excepto para el M2-2 interno. Se observó un codón de inicio ATG adicional aguas arriba del motivo de inicio del gen en el gen SH para las cepas B1 y B2. En cinco de los ocho genes anotados (N, P, F, M2 y G (sólo cepas B1 y B2)), las regiones intergénicas fueron cortas y los ORFs para estos 5 genes terminaron dentro de los motivos de fin del gen propuestos. Combinamos las cinco secuencias del genoma de Kenia y Zambia con las secuencias globales disponibles, alineando genes individuales y calculando el porcentaje de nucleótido (nt) y la identidad del aminoácido (aa) (Tabla 2). Las secuencias codificantes de los genes N, M, F, M2-1, M2-2 y L se conservaron en los niveles de nucleótidos y aminoácidos, compartiendo > 85% entre el subgrupo identidad de nucleótidos y 90% identidad de proteínas (Tabla 3 ). El gen de nucleoproteínas fue el más conservado entre todos los subgrupos en los niveles de nt y aa. Los genes de SH y G glicoproteínas fueron más divergentes entre los subgrupos de HMPV en el nivel de nucleótidos con identidad de 76 y 63%, respectivamente. La longitud de la proteína de SH fue variable entre las cepas de grupo A y B debido a una sustitución de nucleótidos (CAA La diversidad de las secuencias de aminoácidos para las glicoproteínas G y SH se muestra en la figura 2 y en el archivo adicional 2: Figura S2, respectivamente. La diversidad de las secuencias completas de nucleótidos de los genes SH y G se representa en los árboles filogenéticos en la figura 3. Se evaluó la clasificación filogenética y la relación entre los 5 nuevos genomas obtenidos en este estudio y los genomas publicados previamente (Fig. 3). El genoma completo figura S3. Hubo congruencia filogenética con los conjuntos de secuencias genéticas individuales como con el conjunto completo de datos del genoma, excepto para los genes F y M2 (Fig. 3: Figura S3 ). Las cepas virales variantes o derivadas pueden disminuir la sensibilidad de la detección resultando en una disminución de la cuantificación de la carga viral y subestimación de la incidencia de la enfermedad [19]. Comprobamos los nuevos genomas del HMPV para detectar las diferencias entre los nucleótidos en las regiones genómicas objetivo de nuestros primeros y sondas diagnósticas del rRT-PCR (archivo adicional 7: Tabla S4) utilizados para la detección del HMPV. Se identificaron hasta ocho desajustes entre el primer y la sonda (Fig. 4): un desajuste en la región del primer hacia adelante en el grupo del HMPV A (ensayo del rRT-PCR basado en genes F, Fig. 4a); un desajuste en cada una de las regiones diana hacia delante y la sonda en el grupo B (ensayo del rRT-PCR basado en genes F, Fig. 4b); y 5 desajustes diferentes con el ensayo del rRT-PCR basado en genes N-Gene ( El HMPV causa enfermedades respiratorias que se presentan como infección leve del tracto respiratorio superior o bronquiolitis grave potencialmente mortal y neumonía principalmente en niños, a veces adultos, así como en individuos inmunocomprometidos [2]. Sin embargo, los datos de la secuencia del genoma del HMPV de África son escasos y la información sobre la diversidad del genoma es limitada. En el presente estudio, se determinaron las secuencias del genoma completo de cinco cepas del HMPV de Kenia y Zambia y se compararon con los genomas publicados anteriormente de todo el mundo. El análisis comparativo de secuencias indicó una posición bastante conservada de las regiones de inicio y fin de los genes, así como de los codones de inicio y fin de la traducción. La variación de las secuencias del genstart y final puede tener un impacto significativo en la eficiencia de la iniciación de la transcripción para que exista una presión más selectiva que impida cambios en estas regiones [20], El codón de inicio ATG adicional encontrado aguas arriba del motivo de inicio del gen del gen SH fue consistente con un informe anterior [21], aunque su papel en la expresión génica aún no se ha identificado. Estos genes de secuencia observada en N, M, F, M2-1, M2-2 y L no son inusuales y sugieren limitaciones funcionales y estructurales sobre la diversidad, pero menos esperadas del gen F debido a su estado como antígeno de neutralización y protección, similar a su RSV'relativo' cercano [22]. También se ha sugerido que la baja diversidad en el gen F podría hacer una contribución sustancial a la neutralización cruzada y la protección cruzada entre los subgrupos HMPV [21]. La frecuencia relativamente alta de diversidad de aminoácidos en la G (y en menor medida la SH) podría atribuirse a la presión selectiva para el cambio de aminoácidos proveniente de la inmunidad del huésped; y la capacidad de la proteína para tolerar sustituciones, que podría deberse a su naturaleza extendida y desenvuelta propuesta [22]. La incongruencia filogenética observada entre el árbol del genoma completo y los árboles del gen F y G, es la reportada anteriormente para el HMPV [23], y podría atribuirse a tasas diferenciales de evolución, presión de selección o eventos de recombinación anteriores [24]. La prevalencia de VPHM en población pediátrica hospitalizada en el condado de Kilifi en la costa de Kenia ha sido reportada [7, 25]. Sin embargo, es notable que en los últimos años se ha detectado VPHM con baja prevalencia en Kilifi (observaciones no publicadas de vigilancia Aún no se ha establecido si esta baja prevalencia se debe a la reducción de la transmisión del virus o a la disminución de la sensibilidad de nuestro ensayo de diagnóstico molecular del HMPV debido a los desajustes progresivos entre el primer y la sonda. Presentamos las primeras secuencias del genoma completo de las cepas de HMPV circulantes del África subsahariana. Una limitación de nuestro método de secuenciación, como es común con los protocolos de secuenciación del amplificador [26, 27], no hubo cobertura en las regiones líderes de 3′ y 5′ de remolque no capturadas por estos imprimadores. Nuestros resultados demuestran la aplicación de la secuenciación amplicon para generar genomas de HMPV de longitud completa directamente a partir de muestras clínicas. La diversidad observada de los genes individuales es comparable a la descrita anteriormente [20] [22]. Este método y datos proporcionan una referencia útil para el diseño de diagnósticos moleculares locales y para Se recogieron muestras de hisopos nasofaríngeos y orofaríngeos (NP-OP) de niños (1-59 meses) hospitalizados con neumonía, cuatro de los cuales fueron incluidos en el estudio PERCH [18] en 2012. La quinta muestra fue recogida de un niño inscrito en el estudio rutinario de vigilancia de la neumonía en el Hospital del Condado de Kilifi, Kenia, en 2015. Las muestras fueron analizadas para el VPHM mediante ensayos multiplex semicuantitativos de transcripción inversa en tiempo real PCR (rRT-PCR). Los primeros y sondas rRT-PCR utilizados, condiciones de ciclismo y ensayos establecidos se han descrito en otras partes [28, 29]. Los genes codificantes de fusión (F) y glicoproteína (G) de las muestras positivas de HMPV fueron amplificados en un ensayo RT-PCR de un solo paso (boti de OneStep RT- Las secuencias parciales de nucleótidos G o F fueron analizadas por árboles filogenéticos de máxima probabilidad (ML) utilizando IQ-TREE [30], junto con cepas de referencia de subgrupos de HMPV (números de adhesión AF371337.2, FJ168779, AY297749, AY530095, JN184401 y AY297748). Cinco muestras de HMPV positivas de los sitios de estudio de Kenia y Zambia, pertenecientes a los A2a (n = 1), A2b (n = 2), B1 (n = 1) y B2 (n = 1), basadas en sus secuencias de genes G y F, fueron seleccionadas para secuenciación del genoma completo. Los datos sobre la información de evaluación clínica y de edad recolectada en el momento de la recolección de la muestra, para las cinco muestras seleccionadas, se muestran El protocolo de secuenciación consistió en cuatro pasos: (i) diseño de imprimación, (ii) preparación de mezclas de imprimación, (iii) cDNA y PCR (iv) secuenciación de Ilumina y análisis de datos. Todas las secuencias del genoma completo del metapneumovirus humano (HMPV) fueron recuperadas de GenBank (enero de 2018) utilizando la consulta (txid162145 (Organismo) Y 12000 (SLEN): 14000 (SLEN) NO patente). Se excluyeron entradas de secuencia con huecos mayores de 6 nt para generar un conjunto de 178 genomas. Todas las secuencias posibles de 23 nt fueron generadas a partir del conjunto de datos del genoma y recortadas a una temperatura de fusión (Tm) calculada final de 47,9-49.5°C. Se descartaron secuencias con homología a secuencias de ARNr, con contenido de GC fuera de < 0,3 o > 0,75 o con un único contenido fraccional de nucleótidos de > 0,6. El set de imprimación se hizo entonces no redundante produciendo 60.746 imprimaciones potenciales. Todos los imprimaciones potenciales fueron cartografiadas con los genomas completos de 178 HMPV y se determinó el número de coincidencias perfectas (puntuación de frecuencia) como una medida de conservación de la secuencia de imprimación. Para seleccionar los imprimaciones, las secuencias del genoma del HMPV se dividieron en amplificadores con 222 nt de superposición que abarcaban el genoma del virus. Se identificaron los imprimaciones potenciales que se mapearon dentro de los terminales 5′ y 3′ 222 nt de cada amplificador y se seleccionó la secuencia con la puntuación De esta manera, se seleccionaron 24 imprimaciones para cada uno de los genomas representativos del genotipo HMPV (número de adhesión de GenBank HMPV A1: AF371337, HMPV A2: FJ168779; HMPV B1: AY525843, y HMPV B2: FJ168778). Debido a la conservación entre los genotipos, hubo redundancia de imprimación que fue eliminada. El conjunto final de 65 secuencias de imprimación, sus longitudes, Tm calculado, contenido de GC fraccionado y posición de mapeo en el genoma HMPV se presentan en el archivo adicional 5: Tabla S2. Los imprimaciones se probaron computacionalmente con cada uno de los 4 subgrupos de HMPV. En el archivo adicional 1 se presenta una representación gráfica de los sitios objetivo de imprimación: Figura Para evitar la generación de pequeños productos a partir de imprimaciones adyacentes hacia adelante e inversas, se asignaron amplicones para alternar la Tabla 3 ). Se indican valores de soporte de Bootstrap (evaluados por 1000 réplicas) a lo largo de las ramas. Se indican subgrupos genéticos A1, A2a, A2b, B1 y B2. La alineación de múltiples secuencias se realizó utilizando MAFFT y la filogenia ML inferida utilizando el modelo de sustitución de nucleótidos GTR + Cada transcripción inversa utiliza mezclas de primer hacia adelante (PMF) hechas con 3,0 μl de cada imprimación inversa (100 pmol/μl) más agua a 200 μl para generar una concentración de primer hacia adelante de 24 pmol/μl. Dos microlitros de la MPF se utilizan entonces en una reacción de transcripción inversa de 20 μl (2,4 pmol/μl concentración final en reacción o 2,4 μM/primer). Para amplificación de PCR, cada reacción de primer hacia adelante de PCR utilizaba un mix de primer PCR (PPM) separado que contenía 1,5 μl de cada primer hacia adelante de 100 pmol/μl y 1,5 μl de cada imprimación inversa (5,3-5,5 pmol/μl en el PPM). Se utilizó 2 μl PPM por reacción de PCR de 25 μl = 0,5 Los ácidos nucleicos virales se extrajeron de las muestras originales utilizando el kit QIAamp Viral ARN Mini (QIAGEN). El ARN (5 μl) se transcribe de forma inversa en cDNA mediante SuperScript III (200 U, Invitrogen), tampón RT (1X concentración final, Invitrogen) y 2 μl de FPM en reacciones de 20 μl. Se amplificó un alícuota de cDNA (5 μl) en 35 ciclos utilizando el kit Phusion Highfidelity PCR (New England Biolabs) y 2 μl de PPM en una reacción de 25 μl. La mezcla PCR fue incubada a 98 °C durante 30 s, seguida de 35 ciclos de 98 °C durante 10 s, 43 °C durante 30 s y 72 ° Los productos de PCR esperados para cada amplicón fueron aproximadamente 1500 pb. Los productos de PCR de las dos reacciones para cada muestra fueron agrupados para la preparación de la biblioteca Illumina. Fig. 4 Mismatches entre los imprimadores de diagnóstico rRT-PCR y las sondas y sus sitios de unión esperados en los cinco genomas de Kenia y Zambia. 'Fwd imprimar' = Imprimador Adelante y 'Rev imprimador' = Imprimador Inverso. Dos ensayos de rRT-PCR fueron usados para la detección de HMPV. Las barras de color en la figura indican diferencias de nucleótidos (mismatches) entre: a) tres genomas HMPV-A y imprimaciones y sondas específicas HMPV-A dirigidas al gen de fusión; b) dos genomas HMPV-B y imprimaciones y sondas específicas HMPV-B también dirigidas al gen de fusión; y c) los cinco genomas reportados aquí y los imprimaciones y sondas específicas dirigidas al gen de nucleoproteína. Las secuencias de los imprimadores y sondas rRT-PCR verificados con los genomas africanos HMPV se enumeran en el archivo adicional 7: Tabla S4 Secuenciación de iluminaciones y análisis de datos Las bibliotecas se prepararon utilizando el kit de Nextera XT (Ilumina) y secuenciación de pares (2 × 300 pares base) con el kit MiSeq Reagent V3 La mezcla enzimática de Nextera se utilizó para fragmentar simultáneamente el ADN de entrada y etiquetar con adaptadores universales en una única reacción del tubo, seguida de la reacción PCR de 12 ciclos para la indexación dual. Las cuentas AMPure XP de Agencourt (Beckman Coulter) se utilizaron para todos los pasos de purificación y las bibliotecas se cuantificaron y verificaron la calidad utilizando el Qubit (Thermo Fisher) y Bioanalyzer (Agilent). El recorte del adaptador, el filtrado de calidad, la normalización de la secuenciación de kmer lee, el ensamblaje de novo, el cálculo de la cobertura media del genoma fue como se describió anteriormente [31]. Se recuperó un conjunto de datos de las secuencias del genoma del HMPV de ViPR para inferir la relación entre los virus del HMPV de Kenya y Zambia y las poblaciones virales muestreadas a nivel mundial. La alineación de secuencias se realizó utilizando MAFFT v.7.221 [32] utilizando los parámetros 'localpair -maxiterate 1000'. IQ-TREE se utilizó para inferir árboles de máxima probabilidad (ML) del genoma completo y genes individuales bajo el modelo de sustitución de tiempo reversible general (GTR) con heterogeneidad de frecuencia distribuida gamma entre el sitio. Un resumen de la metodología descrita aquí se muestra en la Fig. 5.

¿Cuántos marcos de lectura abiertos hay en el genoma del HMPV?

Secuenciación del genoma completo y análisis filogenético de cepas humanas de metapneumovirus de Kenia y Zambiahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6941262/SHA: f5ae3f66face323615df39d838e056ab5fcc98dfAutores: Kamau, Everlyn; Oketch, John W.; de Laurent, Zaydah R.; Phan, My V. T.; Agoti, Charles N.; Nokes, D. James; Cotten, MatthewFecha: 2020-01-02DOI: 10.1186/s12864-019-6400-zLicencia: cc-byAbstract: ANTEGRANO: El metapneumovirus humano (HMPV) es una causa La secuenciación del genoma completo permite una mejor identificación de eventos de transmisión y brotes, lo que no siempre es posible con secuencias subgenómicas.RESULTADOS: Informamos de un método de secuenciación de próxima generación basado en 2 reacciones amplificadas para determinar las secuencias completas del genoma de cinco cepas HMPV, que representan tres subgrupos (A2, B1 y B2), directamente a partir de muestras clínicas. Además de reportar cinco genomas nuevos HMPV de África, examinamos la diversidad genética y los patrones de secuencia de genomas HMPV públicamente disponibles. Encontramos que la identidad general de la secuencia de nucleótidos fue del 71,3 y 80% para los grupos HMPV A y B, respectivamente, la diversidad entre los grupos HMPV fue mayor a nivel de aminoácidos para los genes de proteína de superficie SH y G, y múltiples subgrupos cocirculados en varios países. El análisis filogenético de todo el genoma mostró congruencia con los conjuntos de secuencias genéticas individuales excepto con los genes F y M2. CONCLUSIÓN: Esta es la primera caracterización genómica de genomas del VPHM de pacientes africanos. Texto: El metapneumovirus humano (VPHM) es un virus de ARN de una sola cadena en la familia Paramyxoviridae y está estrechamente relacionado con el virus sincitial respiratorio humano (VSR) [1]. El VPHM causa enfermedades respiratorias similares a la VSR, que van desde infecciones respiratorias superiores leves a bronquiolitis y neumonía [2]. Las infecciones por VPHM son estacionales y la coinfección con otros patógenos respiratorios es común [1]. El genoma del HMPV es de aproximadamente 13 kb y comprende ocho marcos de lectura abiertos (ORF) que codifican la nucleoproteína (N), la fosfoproteína (P), la proteína de matriz (M), la glucoproteína de fusión (F), la proteína potenciadora de la transcripción (M2), la proteína hidrofóbica pequeña (SH), la glicoproteína de unión (G) y la proteína polimerasa grande (L) [3]. Las secuencias de las glicoproteínas de membrana F y G se utilizan para definir dos grandes genotipos o grupos, A y B, que además se clasifican en cuatro subgrupos (A1, A2, B1 y B2). El HMPV A2, el subgrupo más frecuentemente observado, se divide además en dos sublineaciones propuestas (A2a y A2b) [3]. Se informa que el HMPV tiene una importante contribución a las infecciones respiratorias Por ejemplo, la hospitalización asociada al VPHM se estimó en 6,5 por cada 1.000 años en lactantes de Soweto, Sudáfrica [4] ; en 4% en niños hospitalizados con IAR grave durante un período de 2 años en Camerún [5] ; y en la zona rural occidental de Kenia, la incidencia de VPHM asociada a IHM en las consultas ambulatorias fue estimada en 0,43 por cada 100 años/persona [6]. En Kilifi, Kenia costera, entre enero de 2007 y diciembre de 2011, los niños menores de 6 meses de edad representaron el 44% de los casos positivos del VPHM, mientras que el 74% eran niños menores de 1 año y el 1,3% (2/160) eran niños > 36 meses [7]. En los campamentos de refugiados de Dadaab y Kakuma en Kenia, se detectó VPHM en un 5,7% de hospitalizaciones, y la tasa de hospitalización bruta positiva por virus (por En Malí, la contribución del VPHM a la neumonía tuvo una fracción de población atribuible del 9% (95% IC: 7-11%) [9] ; mientras que en Marruecos [10], el 8,9% de los niños < 5 años admitidos con neumonía grave fueron infectados con VPHM. La prevalencia e incidencia del VPHM en otros lugares a nivel mundial, se indica en el expediente adicional 4: Tabla S1. Cabe destacar que las variaciones en las tasas de incidencia podrían atribuirse a la población en estudio, la estacionalidad e incluso los métodos de detección. Sin embargo, la epidemiología genómica del VPHM en África es insuficiente y no se documenta la comparación de similitudes genéticas y diferencias entre cepas africanas y mundiales. Las secuencias del genoma proporcionan recursos valiosos para caracterizar la evolución viral y la epidemiología de la enfermedad, y para identificar eventos de transmisión y brotes, lo que no siempre es posible con fragmentos subge El aumento del número de sitios de variantes filogenéticamente informativas obtenidos a partir de genomas completos puede permitir una mejor vinculación de los casos y ayudar a las intervenciones de salud pública en tiempo real durante epidemias [14, 15]. Los enfoques PCR para la secuenciación del genoma completo dirigida, en contraste con la amplificación aleatoria, pueden amplificar preferentemente el virus objetivo sobre los ácidos nucleicos del huésped o del medio ambiente [16, 17] potencialmente centrando la secuenciación en el virus de interés. Hasta la fecha, el conjunto de datos más grande de genomas enteros HMPV (n = 61) secuenciados de cualquier país tropical procede de tres ciudades peruanas, Lima, Piura e Iquitos [18]. org/, accessed April 30, 2019). Esto ha llevado a una comprensión limitada de la diversidad genética y genómica del HMPV en el continente. Este trabajo describe todo un enfoque de secuenciación del genoma (WGS) para el HMPV a partir de un pequeño número de muestras clínicas positivas del HMPV recogidas en Kilifi County Hospital en Kilifi, Kenia y University Teaching Hospital en Lusaka, Zambia. Los genomas fueron generados por secuenciación superpuesta PCR amplicons que abarcan todo el genoma. Estas son las primeras secuencias completas del genoma reportadas de cepas de HMPV de circulación local obtenidas directamente de muestras clínicas en África. También combinamos los nuevos genomas con secuencias disponibles públicamente para examinar patrones en diversidad genética global del HMPV. La secuenciación del genoma completo fue exitosa para las 5 muestras clínicas que se intentaron obtener de cada muestra, y la longitud de los 5 nuevos genomas del H En la Tabla 1 se muestran los parámetros de secuenciación y ensamblaje de datos, incluyendo la profundidad de la cobertura. La anotación secuencial de los genomas de larga duración utilizando Geneious R8.1.5 (https://www.geneous.com) identificó las ocho regiones genómicas esperadas de codificación ORF y no codificantes. La identidad general de nucleótidos (es decir, sitios idénticos promediando en todos los pares de secuencias y excluyendo posiciones que contienen huecos) entre las 143 secuencias del genoma analizadas (5 genomas nuevos más 138 de ViPR) fue 58,2%. La identidad de secuencia de nucleótidos fue 71,3% dentro de HMVV-A y 80% dentro de HMVV-B. Los genomas intrasubgrupo, A1, A2, B1 y B2 compartieron 92,1% (10 secuencias), 76,8% (secuencias 88), 91% (24 secuencia Para los 143 genomas del HMPV, comprobamos la conservación de la secuencia en las regiones de control transcripcional, en los terminis de cada gen, así como la longitud de las secuencias intergénicas entre los límites del gen. La longitud de la región intergénica del F-M2 fue diferente entre los virus del grupo A y B, es decir, 13 nt y 2 nt, respectivamente. Las regiones intergénicas del SH-G y G-L fueron las más largas, hasta 125 nt y hasta 190 nt, respectivamente. Los nucleótidos de consenso (9 a 19 longitudes) en las regiones de inicio y final putativo flanqueando el ORF de los genes virales se muestran en la Fig. 1. Las regiones de inicio y final del gen de N y P se conservaron (> 90% de identidad de pareja media) en ambos grupos del HMPV, y los genes El codón de inicio ATG putativo se encontraba consistentemente en las posiciones 14-16 aguas arriba de un motivo de inicio del gen (consenso: GG/AGAC/TAAA/GTnnnnATG), excepto para el M2-2 interno. Se observó un codón de inicio ATG adicional aguas arriba del motivo de inicio del gen en el gen SH para las cepas B1 y B2. En cinco de los ocho genes anotados (N, P, F, M2 y G (sólo cepas B1 y B2)), las regiones intergénicas fueron cortas y los ORFs para estos 5 genes terminaron dentro de los motivos de fin del gen propuestos. Combinamos las cinco secuencias del genoma de Kenia y Zambia con las secuencias globales disponibles, alineando genes individuales y calculando el porcentaje de nucleótido (nt) y la identidad del aminoácido (aa) (Tabla 2). Las secuencias codificantes de los genes N, M, F, M2-1, M2-2 y L se conservaron en los niveles de nucleótidos y aminoácidos, compartiendo > 85% entre el subgrupo identidad de nucleótidos y 90% identidad de proteínas (Tabla 3 ). El gen de nucleoproteínas fue el más conservado entre todos los subgrupos en los niveles de nt y aa. Los genes de SH y G glicoproteínas fueron más divergentes entre los subgrupos de HMPV en el nivel de nucleótidos con identidad de 76 y 63%, respectivamente. La longitud de la proteína de SH fue variable entre las cepas de grupo A y B debido a una sustitución de nucleótidos (CAA La diversidad de las secuencias de aminoácidos para las glicoproteínas G y SH se muestra en la figura 2 y en el archivo adicional 2: Figura S2, respectivamente. La diversidad de las secuencias completas de nucleótidos de los genes SH y G se representa en los árboles filogenéticos en la figura 3. Se evaluó la clasificación filogenética y la relación entre los 5 nuevos genomas obtenidos en este estudio y los genomas publicados previamente (Fig. 3). El genoma completo figura S3. Hubo congruencia filogenética con los conjuntos de secuencias genéticas individuales como con el conjunto completo de datos del genoma, excepto para los genes F y M2 (Fig. 3: Figura S3 ). Las cepas virales variantes o derivadas pueden disminuir la sensibilidad de la detección resultando en una disminución de la cuantificación de la carga viral y subestimación de la incidencia de la enfermedad [19]. Comprobamos los nuevos genomas del HMPV para detectar las diferencias entre los nucleótidos en las regiones genómicas objetivo de nuestros primeros y sondas diagnósticas del rRT-PCR (archivo adicional 7: Tabla S4) utilizados para la detección del HMPV. Se identificaron hasta ocho desajustes entre el primer y la sonda (Fig. 4): un desajuste en la región del primer hacia adelante en el grupo del HMPV A (ensayo del rRT-PCR basado en genes F, Fig. 4a); un desajuste en cada una de las regiones diana hacia delante y la sonda en el grupo B (ensayo del rRT-PCR basado en genes F, Fig. 4b); y 5 desajustes diferentes con el ensayo del rRT-PCR basado en genes N-Gene ( El HMPV causa enfermedades respiratorias que se presentan como infección leve del tracto respiratorio superior o bronquiolitis grave potencialmente mortal y neumonía principalmente en niños, a veces adultos, así como en individuos inmunocomprometidos [2]. Sin embargo, los datos de la secuencia del genoma del HMPV de África son escasos y la información sobre la diversidad del genoma es limitada. En el presente estudio, se determinaron las secuencias del genoma completo de cinco cepas del HMPV de Kenia y Zambia y se compararon con los genomas publicados anteriormente de todo el mundo. El análisis comparativo de secuencias indicó una posición bastante conservada de las regiones de inicio y fin de los genes, así como de los codones de inicio y fin de la traducción. La variación de las secuencias del genstart y final puede tener un impacto significativo en la eficiencia de la iniciación de la transcripción para que exista una presión más selectiva que impida cambios en estas regiones [20], El codón de inicio ATG adicional encontrado aguas arriba del motivo de inicio del gen del gen SH fue consistente con un informe anterior [21], aunque su papel en la expresión génica aún no se ha identificado. Estos genes de secuencia observada en N, M, F, M2-1, M2-2 y L no son inusuales y sugieren limitaciones funcionales y estructurales sobre la diversidad, pero menos esperadas del gen F debido a su estado como antígeno de neutralización y protección, similar a su RSV'relativo' cercano [22]. También se ha sugerido que la baja diversidad en el gen F podría hacer una contribución sustancial a la neutralización cruzada y la protección cruzada entre los subgrupos HMPV [21]. La frecuencia relativamente alta de diversidad de aminoácidos en la G (y en menor medida la SH) podría atribuirse a la presión selectiva para el cambio de aminoácidos proveniente de la inmunidad del huésped; y la capacidad de la proteína para tolerar sustituciones, que podría deberse a su naturaleza extendida y desenvuelta propuesta [22]. La incongruencia filogenética observada entre el árbol del genoma completo y los árboles del gen F y G, es la reportada anteriormente para el HMPV [23], y podría atribuirse a tasas diferenciales de evolución, presión de selección o eventos de recombinación anteriores [24]. La prevalencia de VPHM en población pediátrica hospitalizada en el condado de Kilifi en la costa de Kenia ha sido reportada [7, 25]. Sin embargo, es notable que en los últimos años se ha detectado VPHM con baja prevalencia en Kilifi (observaciones no publicadas de vigilancia Aún no se ha establecido si esta baja prevalencia se debe a la reducción de la transmisión del virus o a la disminución de la sensibilidad de nuestro ensayo de diagnóstico molecular del HMPV debido a los desajustes progresivos entre el primer y la sonda. Presentamos las primeras secuencias del genoma completo de las cepas de HMPV circulantes del África subsahariana. Una limitación de nuestro método de secuenciación, como es común con los protocolos de secuenciación del amplificador [26, 27], no hubo cobertura en las regiones líderes de 3′ y 5′ de remolque no capturadas por estos imprimadores. Nuestros resultados demuestran la aplicación de la secuenciación amplicon para generar genomas de HMPV de longitud completa directamente a partir de muestras clínicas. La diversidad observada de los genes individuales es comparable a la descrita anteriormente [20] [22]. Este método y datos proporcionan una referencia útil para el diseño de diagnósticos moleculares locales y para Se recogieron muestras de hisopos nasofaríngeos y orofaríngeos (NP-OP) de niños (1-59 meses) hospitalizados con neumonía, cuatro de los cuales fueron incluidos en el estudio PERCH [18] en 2012. La quinta muestra fue recogida de un niño inscrito en el estudio rutinario de vigilancia de la neumonía en el Hospital del Condado de Kilifi, Kenia, en 2015. Las muestras fueron analizadas para el VPHM mediante ensayos multiplex semicuantitativos de transcripción inversa en tiempo real PCR (rRT-PCR). Los primeros y sondas rRT-PCR utilizados, condiciones de ciclismo y ensayos establecidos se han descrito en otras partes [28, 29]. Los genes codificantes de fusión (F) y glicoproteína (G) de las muestras positivas de HMPV fueron amplificados en un ensayo RT-PCR de un solo paso (boti de OneStep RT- Las secuencias parciales de nucleótidos G o F fueron analizadas por árboles filogenéticos de máxima probabilidad (ML) utilizando IQ-TREE [30], junto con cepas de referencia de subgrupos de HMPV (números de adhesión AF371337.2, FJ168779, AY297749, AY530095, JN184401 y AY297748). Cinco muestras de HMPV positivas de los sitios de estudio de Kenia y Zambia, pertenecientes a los A2a (n = 1), A2b (n = 2), B1 (n = 1) y B2 (n = 1), basadas en sus secuencias de genes G y F, fueron seleccionadas para secuenciación del genoma completo. Los datos sobre la información de evaluación clínica y de edad recolectada en el momento de la recolección de la muestra, para las cinco muestras seleccionadas, se muestran El protocolo de secuenciación consistió en cuatro pasos: (i) diseño de imprimación, (ii) preparación de mezclas de imprimación, (iii) cDNA y PCR (iv) secuenciación de Ilumina y análisis de datos. Todas las secuencias del genoma completo del metapneumovirus humano (HMPV) fueron recuperadas de GenBank (enero de 2018) utilizando la consulta (txid162145 (Organismo) Y 12000 (SLEN): 14000 (SLEN) NO patente). Se excluyeron entradas de secuencia con huecos mayores de 6 nt para generar un conjunto de 178 genomas. Todas las secuencias posibles de 23 nt fueron generadas a partir del conjunto de datos del genoma y recortadas a una temperatura de fusión (Tm) calculada final de 47,9-49.5°C. Se descartaron secuencias con homología a secuencias de ARNr, con contenido de GC fuera de < 0,3 o > 0,75 o con un único contenido fraccional de nucleótidos de > 0,6. El set de imprimación se hizo entonces no redundante produciendo 60.746 imprimaciones potenciales. Todos los imprimaciones potenciales fueron cartografiadas con los genomas completos de 178 HMPV y se determinó el número de coincidencias perfectas (puntuación de frecuencia) como una medida de conservación de la secuencia de imprimación. Para seleccionar los imprimaciones, las secuencias del genoma del HMPV se dividieron en amplificadores con 222 nt de superposición que abarcaban el genoma del virus. Se identificaron los imprimaciones potenciales que se mapearon dentro de los terminales 5′ y 3′ 222 nt de cada amplificador y se seleccionó la secuencia con la puntuación De esta manera, se seleccionaron 24 imprimaciones para cada uno de los genomas representativos del genotipo HMPV (número de adhesión de GenBank HMPV A1: AF371337, HMPV A2: FJ168779; HMPV B1: AY525843, y HMPV B2: FJ168778). Debido a la conservación entre los genotipos, hubo redundancia de imprimación que fue eliminada. El conjunto final de 65 secuencias de imprimación, sus longitudes, Tm calculado, contenido de GC fraccionado y posición de mapeo en el genoma HMPV se presentan en el archivo adicional 5: Tabla S2. Los imprimaciones se probaron computacionalmente con cada uno de los 4 subgrupos de HMPV. En el archivo adicional 1 se presenta una representación gráfica de los sitios objetivo de imprimación: Figura Para evitar la generación de pequeños productos a partir de imprimaciones adyacentes hacia adelante e inversas, se asignaron amplicones para alternar la Tabla 3 ). Se indican valores de soporte de Bootstrap (evaluados por 1000 réplicas) a lo largo de las ramas. Se indican subgrupos genéticos A1, A2a, A2b, B1 y B2. La alineación de múltiples secuencias se realizó utilizando MAFFT y la filogenia ML inferida utilizando el modelo de sustitución de nucleótidos GTR + Cada transcripción inversa utiliza mezclas de primer hacia adelante (PMF) hechas con 3,0 μl de cada imprimación inversa (100 pmol/μl) más agua a 200 μl para generar una concentración de primer hacia adelante de 24 pmol/μl. Dos microlitros de la MPF se utilizan entonces en una reacción de transcripción inversa de 20 μl (2,4 pmol/μl concentración final en reacción o 2,4 μM/primer). Para amplificación de PCR, cada reacción de primer hacia adelante de PCR utilizaba un mix de primer PCR (PPM) separado que contenía 1,5 μl de cada primer hacia adelante de 100 pmol/μl y 1,5 μl de cada imprimación inversa (5,3-5,5 pmol/μl en el PPM). Se utilizó 2 μl PPM por reacción de PCR de 25 μl = 0,5 Los ácidos nucleicos virales se extrajeron de las muestras originales utilizando el kit QIAamp Viral ARN Mini (QIAGEN). El ARN (5 μl) se transcribe de forma inversa en cDNA mediante SuperScript III (200 U, Invitrogen), tampón RT (1X concentración final, Invitrogen) y 2 μl de FPM en reacciones de 20 μl. Se amplificó un alícuota de cDNA (5 μl) en 35 ciclos utilizando el kit Phusion Highfidelity PCR (New England Biolabs) y 2 μl de PPM en una reacción de 25 μl. La mezcla PCR fue incubada a 98 °C durante 30 s, seguida de 35 ciclos de 98 °C durante 10 s, 43 °C durante 30 s y 72 ° Los productos de PCR esperados para cada amplicón fueron aproximadamente 1500 pb. Los productos de PCR de las dos reacciones para cada muestra fueron agrupados para la preparación de la biblioteca Illumina. Fig. 4 Mismatches entre los imprimadores de diagnóstico rRT-PCR y las sondas y sus sitios de unión esperados en los cinco genomas de Kenia y Zambia. 'Fwd imprimar' = Imprimador Adelante y 'Rev imprimador' = Imprimador Inverso. Dos ensayos de rRT-PCR fueron usados para la detección de HMPV. Las barras de color en la figura indican diferencias de nucleótidos (mismatches) entre: a) tres genomas HMPV-A y imprimaciones y sondas específicas HMPV-A dirigidas al gen de fusión; b) dos genomas HMPV-B y imprimaciones y sondas específicas HMPV-B también dirigidas al gen de fusión; y c) los cinco genomas reportados aquí y los imprimaciones y sondas específicas dirigidas al gen de nucleoproteína. Las secuencias de los imprimadores y sondas rRT-PCR verificados con los genomas africanos HMPV se enumeran en el archivo adicional 7: Tabla S4 Secuenciación de iluminaciones y análisis de datos Las bibliotecas se prepararon utilizando el kit de Nextera XT (Ilumina) y secuenciación de pares (2 × 300 pares base) con el kit MiSeq Reagent V3 La mezcla enzimática de Nextera se utilizó para fragmentar simultáneamente el ADN de entrada y etiquetar con adaptadores universales en una única reacción del tubo, seguida de la reacción PCR de 12 ciclos para la indexación dual. Las cuentas AMPure XP de Agencourt (Beckman Coulter) se utilizaron para todos los pasos de purificación y las bibliotecas se cuantificaron y verificaron la calidad utilizando el Qubit (Thermo Fisher) y Bioanalyzer (Agilent). El recorte del adaptador, el filtrado de calidad, la normalización de la secuenciación de kmer lee, el ensamblaje de novo, el cálculo de la cobertura media del genoma fue como se describió anteriormente [31]. Se recuperó un conjunto de datos de las secuencias del genoma del HMPV de ViPR para inferir la relación entre los virus del HMPV de Kenya y Zambia y las poblaciones virales muestreadas a nivel mundial. La alineación de secuencias se realizó utilizando MAFFT v.7.221 [32] utilizando los parámetros 'localpair -maxiterate 1000'. IQ-TREE se utilizó para inferir árboles de máxima probabilidad (ML) del genoma completo y genes individuales bajo el modelo de sustitución de tiempo reversible general (GTR) con heterogeneidad de frecuencia distribuida gamma entre el sitio. Un resumen de la metodología descrita aquí se muestra en la Fig. 5.

¿Cuáles son los dos genotipos principales de HMPV?

Secuenciación del genoma completo y análisis filogenético de cepas humanas de metapneumovirus de Kenia y Zambiahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6941262/SHA: f5ae3f66face323615df39d838e056ab5fcc98dfAutores: Kamau, Everlyn; Oketch, John W.; de Laurent, Zaydah R.; Phan, My V. T.; Agoti, Charles N.; Nokes, D. James; Cotten, MatthewFecha: 2020-01-02DOI: 10.1186/s12864-019-6400-zLicencia: cc-byAbstract: ANTEGRANO: El metapneumovirus humano (HMPV) es una causa La secuenciación del genoma completo permite una mejor identificación de eventos de transmisión y brotes, lo que no siempre es posible con secuencias subgenómicas.RESULTADOS: Informamos de un método de secuenciación de próxima generación basado en 2 reacciones amplificadas para determinar las secuencias completas del genoma de cinco cepas HMPV, que representan tres subgrupos (A2, B1 y B2), directamente a partir de muestras clínicas. Además de reportar cinco genomas nuevos HMPV de África, examinamos la diversidad genética y los patrones de secuencia de genomas HMPV públicamente disponibles. Encontramos que la identidad general de la secuencia de nucleótidos fue del 71,3 y 80% para los grupos HMPV A y B, respectivamente, la diversidad entre los grupos HMPV fue mayor a nivel de aminoácidos para los genes de proteína de superficie SH y G, y múltiples subgrupos cocirculados en varios países. El análisis filogenético de todo el genoma mostró congruencia con los conjuntos de secuencias genéticas individuales excepto con los genes F y M2. CONCLUSIÓN: Esta es la primera caracterización genómica de genomas del VPHM de pacientes africanos. Texto: El metapneumovirus humano (VPHM) es un virus de ARN de una sola cadena en la familia Paramyxoviridae y está estrechamente relacionado con el virus sincitial respiratorio humano (VSR) [1]. El VPHM causa enfermedades respiratorias similares a la VSR, que van desde infecciones respiratorias superiores leves a bronquiolitis y neumonía [2]. Las infecciones por VPHM son estacionales y la coinfección con otros patógenos respiratorios es común [1]. El genoma del HMPV es de aproximadamente 13 kb y comprende ocho marcos de lectura abiertos (ORF) que codifican la nucleoproteína (N), la fosfoproteína (P), la proteína de matriz (M), la glucoproteína de fusión (F), la proteína potenciadora de la transcripción (M2), la proteína hidrofóbica pequeña (SH), la glicoproteína de unión (G) y la proteína polimerasa grande (L) [3]. Las secuencias de las glicoproteínas de membrana F y G se utilizan para definir dos grandes genotipos o grupos, A y B, que además se clasifican en cuatro subgrupos (A1, A2, B1 y B2). El HMPV A2, el subgrupo más frecuentemente observado, se divide además en dos sublineaciones propuestas (A2a y A2b) [3]. Se informa que el HMPV tiene una importante contribución a las infecciones respiratorias Por ejemplo, la hospitalización asociada al VPHM se estimó en 6,5 por cada 1.000 años en lactantes de Soweto, Sudáfrica [4] ; en 4% en niños hospitalizados con IAR grave durante un período de 2 años en Camerún [5] ; y en la zona rural occidental de Kenia, la incidencia de VPHM asociada a IHM en las consultas ambulatorias fue estimada en 0,43 por cada 100 años/persona [6]. En Kilifi, Kenia costera, entre enero de 2007 y diciembre de 2011, los niños menores de 6 meses de edad representaron el 44% de los casos positivos del VPHM, mientras que el 74% eran niños menores de 1 año y el 1,3% (2/160) eran niños > 36 meses [7]. En los campamentos de refugiados de Dadaab y Kakuma en Kenia, se detectó VPHM en un 5,7% de hospitalizaciones, y la tasa de hospitalización bruta positiva por virus (por En Malí, la contribución del VPHM a la neumonía tuvo una fracción de población atribuible del 9% (95% IC: 7-11%) [9] ; mientras que en Marruecos [10], el 8,9% de los niños < 5 años admitidos con neumonía grave fueron infectados con VPHM. La prevalencia e incidencia del VPHM en otros lugares a nivel mundial, se indica en el expediente adicional 4: Tabla S1. Cabe destacar que las variaciones en las tasas de incidencia podrían atribuirse a la población en estudio, la estacionalidad e incluso los métodos de detección. Sin embargo, la epidemiología genómica del VPHM en África es insuficiente y no se documenta la comparación de similitudes genéticas y diferencias entre cepas africanas y mundiales. Las secuencias del genoma proporcionan recursos valiosos para caracterizar la evolución viral y la epidemiología de la enfermedad, y para identificar eventos de transmisión y brotes, lo que no siempre es posible con fragmentos subge El aumento del número de sitios de variantes filogenéticamente informativas obtenidos a partir de genomas completos puede permitir una mejor vinculación de los casos y ayudar a las intervenciones de salud pública en tiempo real durante epidemias [14, 15]. Los enfoques PCR para la secuenciación del genoma completo dirigida, en contraste con la amplificación aleatoria, pueden amplificar preferentemente el virus objetivo sobre los ácidos nucleicos del huésped o del medio ambiente [16, 17] potencialmente centrando la secuenciación en el virus de interés. Hasta la fecha, el conjunto de datos más grande de genomas enteros HMPV (n = 61) secuenciados de cualquier país tropical procede de tres ciudades peruanas, Lima, Piura e Iquitos [18]. org/, accessed April 30, 2019). Esto ha llevado a una comprensión limitada de la diversidad genética y genómica del HMPV en el continente. Este trabajo describe todo un enfoque de secuenciación del genoma (WGS) para el HMPV a partir de un pequeño número de muestras clínicas positivas del HMPV recogidas en Kilifi County Hospital en Kilifi, Kenia y University Teaching Hospital en Lusaka, Zambia. Los genomas fueron generados por secuenciación superpuesta PCR amplicons que abarcan todo el genoma. Estas son las primeras secuencias completas del genoma reportadas de cepas de HMPV de circulación local obtenidas directamente de muestras clínicas en África. También combinamos los nuevos genomas con secuencias disponibles públicamente para examinar patrones en diversidad genética global del HMPV. La secuenciación del genoma completo fue exitosa para las 5 muestras clínicas que se intentaron obtener de cada muestra, y la longitud de los 5 nuevos genomas del H En la Tabla 1 se muestran los parámetros de secuenciación y ensamblaje de datos, incluyendo la profundidad de la cobertura. La anotación secuencial de los genomas de larga duración utilizando Geneious R8.1.5 (https://www.geneous.com) identificó las ocho regiones genómicas esperadas de codificación ORF y no codificantes. La identidad general de nucleótidos (es decir, sitios idénticos promediando en todos los pares de secuencias y excluyendo posiciones que contienen huecos) entre las 143 secuencias del genoma analizadas (5 genomas nuevos más 138 de ViPR) fue 58,2%. La identidad de secuencia de nucleótidos fue 71,3% dentro de HMVV-A y 80% dentro de HMVV-B. Los genomas intrasubgrupo, A1, A2, B1 y B2 compartieron 92,1% (10 secuencias), 76,8% (secuencias 88), 91% (24 secuencia Para los 143 genomas del HMPV, comprobamos la conservación de la secuencia en las regiones de control transcripcional, en los terminis de cada gen, así como la longitud de las secuencias intergénicas entre los límites del gen. La longitud de la región intergénica del F-M2 fue diferente entre los virus del grupo A y B, es decir, 13 nt y 2 nt, respectivamente. Las regiones intergénicas del SH-G y G-L fueron las más largas, hasta 125 nt y hasta 190 nt, respectivamente. Los nucleótidos de consenso (9 a 19 longitudes) en las regiones de inicio y final putativo flanqueando el ORF de los genes virales se muestran en la Fig. 1. Las regiones de inicio y final del gen de N y P se conservaron (> 90% de identidad de pareja media) en ambos grupos del HMPV, y los genes El codón de inicio ATG putativo se encontraba consistentemente en las posiciones 14-16 aguas arriba de un motivo de inicio del gen (consenso: GG/AGAC/TAAA/GTnnnnATG), excepto para el M2-2 interno. Se observó un codón de inicio ATG adicional aguas arriba del motivo de inicio del gen en el gen SH para las cepas B1 y B2. En cinco de los ocho genes anotados (N, P, F, M2 y G (sólo cepas B1 y B2)), las regiones intergénicas fueron cortas y los ORFs para estos 5 genes terminaron dentro de los motivos de fin del gen propuestos. Combinamos las cinco secuencias del genoma de Kenia y Zambia con las secuencias globales disponibles, alineando genes individuales y calculando el porcentaje de nucleótido (nt) y la identidad del aminoácido (aa) (Tabla 2). Las secuencias codificantes de los genes N, M, F, M2-1, M2-2 y L se conservaron en los niveles de nucleótidos y aminoácidos, compartiendo > 85% entre el subgrupo identidad de nucleótidos y 90% identidad de proteínas (Tabla 3 ). El gen de nucleoproteínas fue el más conservado entre todos los subgrupos en los niveles de nt y aa. Los genes de SH y G glicoproteínas fueron más divergentes entre los subgrupos de HMPV en el nivel de nucleótidos con identidad de 76 y 63%, respectivamente. La longitud de la proteína de SH fue variable entre las cepas de grupo A y B debido a una sustitución de nucleótidos (CAA La diversidad de las secuencias de aminoácidos para las glicoproteínas G y SH se muestra en la figura 2 y en el archivo adicional 2: Figura S2, respectivamente. La diversidad de las secuencias completas de nucleótidos de los genes SH y G se representa en los árboles filogenéticos en la figura 3. Se evaluó la clasificación filogenética y la relación entre los 5 nuevos genomas obtenidos en este estudio y los genomas publicados previamente (Fig. 3). El genoma completo figura S3. Hubo congruencia filogenética con los conjuntos de secuencias genéticas individuales como con el conjunto completo de datos del genoma, excepto para los genes F y M2 (Fig. 3: Figura S3 ). Las cepas virales variantes o derivadas pueden disminuir la sensibilidad de la detección resultando en una disminución de la cuantificación de la carga viral y subestimación de la incidencia de la enfermedad [19]. Comprobamos los nuevos genomas del HMPV para detectar las diferencias entre los nucleótidos en las regiones genómicas objetivo de nuestros primeros y sondas diagnósticas del rRT-PCR (archivo adicional 7: Tabla S4) utilizados para la detección del HMPV. Se identificaron hasta ocho desajustes entre el primer y la sonda (Fig. 4): un desajuste en la región del primer hacia adelante en el grupo del HMPV A (ensayo del rRT-PCR basado en genes F, Fig. 4a); un desajuste en cada una de las regiones diana hacia delante y la sonda en el grupo B (ensayo del rRT-PCR basado en genes F, Fig. 4b); y 5 desajustes diferentes con el ensayo del rRT-PCR basado en genes N-Gene ( El HMPV causa enfermedades respiratorias que se presentan como infección leve del tracto respiratorio superior o bronquiolitis grave potencialmente mortal y neumonía principalmente en niños, a veces adultos, así como en individuos inmunocomprometidos [2]. Sin embargo, los datos de la secuencia del genoma del HMPV de África son escasos y la información sobre la diversidad del genoma es limitada. En el presente estudio, se determinaron las secuencias del genoma completo de cinco cepas del HMPV de Kenia y Zambia y se compararon con los genomas publicados anteriormente de todo el mundo. El análisis comparativo de secuencias indicó una posición bastante conservada de las regiones de inicio y fin de los genes, así como de los codones de inicio y fin de la traducción. La variación de las secuencias del genstart y final puede tener un impacto significativo en la eficiencia de la iniciación de la transcripción para que exista una presión más selectiva que impida cambios en estas regiones [20], El codón de inicio ATG adicional encontrado aguas arriba del motivo de inicio del gen del gen SH fue consistente con un informe anterior [21], aunque su papel en la expresión génica aún no se ha identificado. Estos genes de secuencia observada en N, M, F, M2-1, M2-2 y L no son inusuales y sugieren limitaciones funcionales y estructurales sobre la diversidad, pero menos esperadas del gen F debido a su estado como antígeno de neutralización y protección, similar a su RSV'relativo' cercano [22]. También se ha sugerido que la baja diversidad en el gen F podría hacer una contribución sustancial a la neutralización cruzada y la protección cruzada entre los subgrupos HMPV [21]. La frecuencia relativamente alta de diversidad de aminoácidos en la G (y en menor medida la SH) podría atribuirse a la presión selectiva para el cambio de aminoácidos proveniente de la inmunidad del huésped; y la capacidad de la proteína para tolerar sustituciones, que podría deberse a su naturaleza extendida y desenvuelta propuesta [22]. La incongruencia filogenética observada entre el árbol del genoma completo y los árboles del gen F y G, es la reportada anteriormente para el HMPV [23], y podría atribuirse a tasas diferenciales de evolución, presión de selección o eventos de recombinación anteriores [24]. La prevalencia de VPHM en población pediátrica hospitalizada en el condado de Kilifi en la costa de Kenia ha sido reportada [7, 25]. Sin embargo, es notable que en los últimos años se ha detectado VPHM con baja prevalencia en Kilifi (observaciones no publicadas de vigilancia Aún no se ha establecido si esta baja prevalencia se debe a la reducción de la transmisión del virus o a la disminución de la sensibilidad de nuestro ensayo de diagnóstico molecular del HMPV debido a los desajustes progresivos entre el primer y la sonda. Presentamos las primeras secuencias del genoma completo de las cepas de HMPV circulantes del África subsahariana. Una limitación de nuestro método de secuenciación, como es común con los protocolos de secuenciación del amplificador [26, 27], no hubo cobertura en las regiones líderes de 3′ y 5′ de remolque no capturadas por estos imprimadores. Nuestros resultados demuestran la aplicación de la secuenciación amplicon para generar genomas de HMPV de longitud completa directamente a partir de muestras clínicas. La diversidad observada de los genes individuales es comparable a la descrita anteriormente [20] [22]. Este método y datos proporcionan una referencia útil para el diseño de diagnósticos moleculares locales y para Se recogieron muestras de hisopos nasofaríngeos y orofaríngeos (NP-OP) de niños (1-59 meses) hospitalizados con neumonía, cuatro de los cuales fueron incluidos en el estudio PERCH [18] en 2012. La quinta muestra fue recogida de un niño inscrito en el estudio rutinario de vigilancia de la neumonía en el Hospital del Condado de Kilifi, Kenia, en 2015. Las muestras fueron analizadas para el VPHM mediante ensayos multiplex semicuantitativos de transcripción inversa en tiempo real PCR (rRT-PCR). Los primeros y sondas rRT-PCR utilizados, condiciones de ciclismo y ensayos establecidos se han descrito en otras partes [28, 29]. Los genes codificantes de fusión (F) y glicoproteína (G) de las muestras positivas de HMPV fueron amplificados en un ensayo RT-PCR de un solo paso (boti de OneStep RT- Las secuencias parciales de nucleótidos G o F fueron analizadas por árboles filogenéticos de máxima probabilidad (ML) utilizando IQ-TREE [30], junto con cepas de referencia de subgrupos de HMPV (números de adhesión AF371337.2, FJ168779, AY297749, AY530095, JN184401 y AY297748). Cinco muestras de HMPV positivas de los sitios de estudio de Kenia y Zambia, pertenecientes a los A2a (n = 1), A2b (n = 2), B1 (n = 1) y B2 (n = 1), basadas en sus secuencias de genes G y F, fueron seleccionadas para secuenciación del genoma completo. Los datos sobre la información de evaluación clínica y de edad recolectada en el momento de la recolección de la muestra, para las cinco muestras seleccionadas, se muestran El protocolo de secuenciación consistió en cuatro pasos: (i) diseño de imprimación, (ii) preparación de mezclas de imprimación, (iii) cDNA y PCR (iv) secuenciación de Ilumina y análisis de datos. Todas las secuencias del genoma completo del metapneumovirus humano (HMPV) fueron recuperadas de GenBank (enero de 2018) utilizando la consulta (txid162145 (Organismo) Y 12000 (SLEN): 14000 (SLEN) NO patente). Se excluyeron entradas de secuencia con huecos mayores de 6 nt para generar un conjunto de 178 genomas. Todas las secuencias posibles de 23 nt fueron generadas a partir del conjunto de datos del genoma y recortadas a una temperatura de fusión (Tm) calculada final de 47,9-49.5°C. Se descartaron secuencias con homología a secuencias de ARNr, con contenido de GC fuera de < 0,3 o > 0,75 o con un único contenido fraccional de nucleótidos de > 0,6. El set de imprimación se hizo entonces no redundante produciendo 60.746 imprimaciones potenciales. Todos los imprimaciones potenciales fueron cartografiadas con los genomas completos de 178 HMPV y se determinó el número de coincidencias perfectas (puntuación de frecuencia) como una medida de conservación de la secuencia de imprimación. Para seleccionar los imprimaciones, las secuencias del genoma del HMPV se dividieron en amplificadores con 222 nt de superposición que abarcaban el genoma del virus. Se identificaron los imprimaciones potenciales que se mapearon dentro de los terminales 5′ y 3′ 222 nt de cada amplificador y se seleccionó la secuencia con la puntuación De esta manera, se seleccionaron 24 imprimaciones para cada uno de los genomas representativos del genotipo HMPV (número de adhesión de GenBank HMPV A1: AF371337, HMPV A2: FJ168779; HMPV B1: AY525843, y HMPV B2: FJ168778). Debido a la conservación entre los genotipos, hubo redundancia de imprimación que fue eliminada. El conjunto final de 65 secuencias de imprimación, sus longitudes, Tm calculado, contenido de GC fraccionado y posición de mapeo en el genoma HMPV se presentan en el archivo adicional 5: Tabla S2. Los imprimaciones se probaron computacionalmente con cada uno de los 4 subgrupos de HMPV. En el archivo adicional 1 se presenta una representación gráfica de los sitios objetivo de imprimación: Figura Para evitar la generación de pequeños productos a partir de imprimaciones adyacentes hacia adelante e inversas, se asignaron amplicones para alternar la Tabla 3 ). Se indican valores de soporte de Bootstrap (evaluados por 1000 réplicas) a lo largo de las ramas. Se indican subgrupos genéticos A1, A2a, A2b, B1 y B2. La alineación de múltiples secuencias se realizó utilizando MAFFT y la filogenia ML inferida utilizando el modelo de sustitución de nucleótidos GTR + Cada transcripción inversa utiliza mezclas de primer hacia adelante (PMF) hechas con 3,0 μl de cada imprimación inversa (100 pmol/μl) más agua a 200 μl para generar una concentración de primer hacia adelante de 24 pmol/μl. Dos microlitros de la MPF se utilizan entonces en una reacción de transcripción inversa de 20 μl (2,4 pmol/μl concentración final en reacción o 2,4 μM/primer). Para amplificación de PCR, cada reacción de primer hacia adelante de PCR utilizaba un mix de primer PCR (PPM) separado que contenía 1,5 μl de cada primer hacia adelante de 100 pmol/μl y 1,5 μl de cada imprimación inversa (5,3-5,5 pmol/μl en el PPM). Se utilizó 2 μl PPM por reacción de PCR de 25 μl = 0,5 Los ácidos nucleicos virales se extrajeron de las muestras originales utilizando el kit QIAamp Viral ARN Mini (QIAGEN). El ARN (5 μl) se transcribe de forma inversa en cDNA mediante SuperScript III (200 U, Invitrogen), tampón RT (1X concentración final, Invitrogen) y 2 μl de FPM en reacciones de 20 μl. Se amplificó un alícuota de cDNA (5 μl) en 35 ciclos utilizando el kit Phusion Highfidelity PCR (New England Biolabs) y 2 μl de PPM en una reacción de 25 μl. La mezcla PCR fue incubada a 98 °C durante 30 s, seguida de 35 ciclos de 98 °C durante 10 s, 43 °C durante 30 s y 72 ° Los productos de PCR esperados para cada amplicón fueron aproximadamente 1500 pb. Los productos de PCR de las dos reacciones para cada muestra fueron agrupados para la preparación de la biblioteca Illumina. Fig. 4 Mismatches entre los imprimadores de diagnóstico rRT-PCR y las sondas y sus sitios de unión esperados en los cinco genomas de Kenia y Zambia. 'Fwd imprimar' = Imprimador Adelante y 'Rev imprimador' = Imprimador Inverso. Dos ensayos de rRT-PCR fueron usados para la detección de HMPV. Las barras de color en la figura indican diferencias de nucleótidos (mismatches) entre: a) tres genomas HMPV-A y imprimaciones y sondas específicas HMPV-A dirigidas al gen de fusión; b) dos genomas HMPV-B y imprimaciones y sondas específicas HMPV-B también dirigidas al gen de fusión; y c) los cinco genomas reportados aquí y los imprimaciones y sondas específicas dirigidas al gen de nucleoproteína. Las secuencias de los imprimadores y sondas rRT-PCR verificados con los genomas africanos HMPV se enumeran en el archivo adicional 7: Tabla S4 Secuenciación de iluminaciones y análisis de datos Las bibliotecas se prepararon utilizando el kit de Nextera XT (Ilumina) y secuenciación de pares (2 × 300 pares base) con el kit MiSeq Reagent V3 La mezcla enzimática de Nextera se utilizó para fragmentar simultáneamente el ADN de entrada y etiquetar con adaptadores universales en una única reacción del tubo, seguida de la reacción PCR de 12 ciclos para la indexación dual. Las cuentas AMPure XP de Agencourt (Beckman Coulter) se utilizaron para todos los pasos de purificación y las bibliotecas se cuantificaron y verificaron la calidad utilizando el Qubit (Thermo Fisher) y Bioanalyzer (Agilent). El recorte del adaptador, el filtrado de calidad, la normalización de la secuenciación de kmer lee, el ensamblaje de novo, el cálculo de la cobertura media del genoma fue como se describió anteriormente [31]. Se recuperó un conjunto de datos de las secuencias del genoma del HMPV de ViPR para inferir la relación entre los virus del HMPV de Kenya y Zambia y las poblaciones virales muestreadas a nivel mundial. La alineación de secuencias se realizó utilizando MAFFT v.7.221 [32] utilizando los parámetros 'localpair -maxiterate 1000'. IQ-TREE se utilizó para inferir árboles de máxima probabilidad (ML) del genoma completo y genes individuales bajo el modelo de sustitución de tiempo reversible general (GTR) con heterogeneidad de frecuencia distribuida gamma entre el sitio. Un resumen de la metodología descrita aquí se muestra en la Fig. 5.

¿Cuál es el subgrupo más común de HMPV?

Infecciones del tracto respiratorio viral en pacientes adultos que asisten a los departamentos de pacientes ambulatorios y de emergencia, Taiwán, 2012–2013: Estudio de espectrometría de masas de la PCR/Electrosprayhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4635751/SHA: ef6361c7bffb9e92f397d7004bfb3a9c804d7c6aAutores: Shih, Hsin-I; Wang, Hsuan-Chen; Su, Ih-Jen; Hsu, Hsiang-Chin; Wang, Jen-Ren; Sun, Hsiao Fang Sunny; Chou, Chien-Hsuan; Ko, Wen-Chien; Hsieh, Ming-I; Wu, Chi-JungFecha Además, la capacidad de la PCR/electrospray ionization mass spectrometry (PCR/ESI-MS) para detectar enterovirus y rinovirus en muestras respiratorias no ha sido bien evaluada. Tratamos de utilizar PCR/ESI-MS para investigar exhaustivamente la epidemiología viral de los ITR adultos, incluyendo pruebas de rinovirus y enterovirus. Los hisopos nasofaríngeos o de garganta de 267 adultos con ITR agudas (212 ITR superiores y 55 ITR inferiores) que visitaron una clínica local o los departamentos ambulatorios o de emergencia de un centro médico en Taiwán entre octubre de 2012 y junio de 2013 fueron probados en busca de virus respiratorios por aislamiento del virus y PCR/ESI-MS. Los virus respiratorios fueron encontrados en el 23,6%, 47,2% y 47,9% de los 267 casos por aislamiento del virus, PCR/ESI-MS y ambos métodos, respectivamente.Cuando se utilizaron ambos métodos, el virus influenza A (24,3%) y rinovirus (9,4%) fueron los virus identificados con mayor frecuencia, mientras que los coronavirus humanos, metapneumovirus humano (hMPV), enterovirus, adenovirus, virus respiratorios sincitiales y virus de la parainfluenza fueron identificados en pequeñas proporciones de casos (<5% de casos para cada tipo de virus).La coinfección se observó en el 4,1% de los casos.En el grupo control, sólo 1 (2,4%) muestra positiva para virus respiratorio por PCR/ESI-MS. Los pacientes sometidos a tratamiento con esteroides, con malignidad activa o con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) tenían riesgo de infección por rinovirus, hMPV o parainfluenza, respectivamente. En general, los pacientes inmunocomprometidos, los pacientes con EPOC y los pacientes sometidos a diálisis tenían riesgo de infección por virus respiratorios no influenza. Los rinovirus (12,7%), el virus influenza A (10,9%) y los virus parainfluenza (7,3%) fueron los virus más comunes implicados en los 55 casos de ITR inferiores. Los factores de infección por parainfluenza, vejez e inmunosupresión se asociaron de forma independiente con ITR inferiores. En conclusión, PCR/ESI-MS mejoraron el rendimiento diagnóstico de las ITR virales. Las infecciones por virus respiratorios no influenza se asociaron con pacientes con comorbilidades y con ITR inferiores. Se justifican estudios adicionales que delineen la necesidad clínica de incluir virus respiratorios no-influenza en el trabajo diagnóstico en estas poblaciones. Texto: Las infecciones de las vías respiratorias virales (IRT) en humanos ocurren durante todo el año y representan una causa importante de las visitas clínicas en todo el mundo. En el pasado, las causas virales de las ITR eran en gran parte desconocidas, principalmente debido a la insensibilidad de los métodos basados en cultivos para la detección de virus o al espectro estrecho de detección viral mediante pruebas de ácido nucleico plex único (NATs). Recientemente, el desarrollo de NATs respiratorios múltiples ha permitido la detección simultánea, rápida y sensible de múltiples virus, lo que facilita estudios exhaustivos sobre la epidemiología de las ITR virales. Actualmente, la epidemiología viral de las ITRs se ha estudiado más ampliamente entre las poblaciones pediátricas que con poblaciones adultas en todo el De manera similar, la mayoría de los estudios que describen la etiología viral de las enfermedades respiratorias en Taiwán, un país subtropical en Asia Oriental, se limitaron a poblaciones pediátricas. [2] [3] [4] Así, los estudios entre pacientes adultos carecen de estudios, particularmente en relación con infecciones por virus fastidiosos o recién identificados, como el metapneumovirus humano (hMPV) y el coronavirus humano (hCoV). La superposición de presentaciones clínicas compartidas por diferentes virus respiratorios dificulta el diagnóstico diferencial basado únicamente en los parámetros clínicos. 5 Además, los agentes antivirales eficaces están actualmente restringidos a las infecciones por virus de la gripe. Por lo tanto, una mejor comprensión de la epidemiología de las ITR virales adultas ayudaría al futuro diseño de estrategias diagnósticas, control de infecciones y manejo de pacientes. [6] [7] [8] [9] A pesar del potencial diagnóstico, la capacidad de PCR/ESI-MS para detectar enterovirus humano y rinovirus en muestras respiratorias de pacientes con ITR no ha sido bien evaluada.Los estudios anteriores de PCR/ESI-MS en pacientes con ITR no incluyeron estos 2 virus en los paneles diagnósticos. [6] [7] [8] En este caso, ampliamos estos estudios previos utilizando PCR/ESI-MS para la detección de virus respiratorios. Tratamos de investigar exhaustivamente la epidemiología de ITR virales adultos utilizando PCR/ESI-MS y comparar el desempeño diagnóstico entre PCR/ESI-MS y métodos de cultivo convencionales para identificar virus respiratorios múltiples, clínicamente relevantes, incluyendo enterovirus e rinovirus. Para realizar un estudio epidemiológico integral que incluyó a pacientes con y sin comorbilidad, se inscribió a adultos (de al menos 18 años de edad) con ITR aguda en los 7 días de inicio que fueron tratados en una clínica externa local del hospital YC o en los departamentos ambulatorios o de emergencia del Hospital Universitario Nacional Cheng-Kung (NCKUH), un centro médico afiliado a la universidad en el sur de Taiwán, entre octubre de 2012 y junio de 2013. La ITR aguda se definió como la aparición simultánea de al menos 1 síntoma o signo respiratorio (Tose nueva o empeoramiento, producción de esputo, dolor de garganta, congestión nasal, rinorrea, disnea, sibilancias o tonsias inyectadas) y al menos 1 de los siguientes síntomas: fiebre, escalofríos y tos. Para los pacientes que experimentaron más de un episodio de ITR, el episodio más reciente fue contado como separado sólo si el paciente se recuperó completamente del episodio anterior y hubo un intervalo mínimo de 3 semanas entre el inicio de los 2 episodios. Datos clínicos, de laboratorio y radiológicos y el historial de contacto de cada paciente fueron recuperados. Comorbilidades fueron evaluadas en todos los pacientes con base en el índice de comorbilidad de Charlson (ICC). 10 El uso de esteroides se definió como la recepción de tratamiento con corticosteroides (10 mg de prednisolona o una dosis diaria equivalente) durante más de 2 semanas. Se diagnosticó un estado inmunocomprometido si los pacientes cumplían una de las siguientes condiciones: tratamiento con corticosteroides, órgano sólido o receptor de células madre hematopoyéticas, o quimioterapia para una neoplasia subyacente durante los últimos 6 meses. 11 para la detección e identificación de virus tanto por aislamiento del virus como por PCR/ESI-MS. Las muestras clínicas fueron almacenadas en 48C y transportadas a los sitios del estudio dentro de las 24 horas siguientes a la recolección. Se incluyeron hisopos de garganta de 42 casos sin infecciones respiratorias durante el mes anterior a la inscripción como muestras de control para el análisis PCR/ESI-MS, incluyendo 15 pacientes con infecciones exclusivamente bacterianas (casos documentados de bacteremia o infección del tracto urinario) que fueron ingresados en NCKUH y 27 individuos sin infecciones activas. Estos sujetos sin infecciones activas incluyeron 10 pacientes con enfermedades crónicas estables seguidos en las clínicas NCKUH y 17 individuos sanos cuya información médica fue recolectada mediante un cuestionario clínico.El estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional (B-ER-101-31) del hospital del estudio, y todos los pacientes dieron consentimiento informado. Los especímenes respiratorios fueron inoculados en cultivos tisulares apropiados (Renino canino Madin-Darby, MRC-5, A549, y rabdomiosarcoma) para aislar el virus de la gripe humana, el virus de la parainfluenza, el género Enterovirus, el citomegalovirus (CMV), el adenovirus, el virus sincitial respiratorio (RSV), los virus del herpes simplex 1 y 2 (HSV-1 y -2), y el virus de la varicela zoster (VZV). El aislamiento e identificación de virus se realizaron utilizando un método descrito anteriormente 11 y los enterovirus fueron identificados mediante un ensayo de inmunofluorescencia utilizando una mezcla de Chemicon Pan EV que reacciona de forma cruzada con el rinovirus (Diágnóstico de la luz, Chemicon [Millipore], MA). 11, 12 Detección e identificación de virus por PCR/ESI-MS Los ácidos nucleicos totales se extrajeron de 700 mL de muestras de hisopo utilizando un autoextractor de ácido nucleico (MagNA Pure Compact Instrument, Mannheim, Alemania), y el eluato se almacenó en À808C hasta el análisis. Durante los análisis, los ácidos nucleicos extraídos se agregaron tanto a una placa de ensayo del virus respiratorio PLEX-ID como a una placa de ensayo de PLEX-ID Broad Viral I (PLEX-ID, Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois). El ensayo del virus respiratorio PLEX-ID detecta el adenovirus humano, hCoV, hMPV, influenza A y B, parainfluenza tipos 1 a 3 y RSV, 6 mientras que el ensayo PLEX-ID Broad Viral I detecta el adenovirus humano, enterovirus, rinovirus, poliomavirus BK y JC, parvovirus B19, HSV-1 y -2, VZV, virus Epstein-Barr (EBV), CMV y herpesvirus humano (HHV)-8. 13, 14 En este estudio, los virus respiratorios se refieren al adenovirus, hCoV, hMPV, influenza, parainfluenza, RSV, enterovirus y rinovirus. La amplificación del ácido nucleico y los análisis de los productos PCR se realizaron utilizando la plataforma PCR/ESI-MS (PLEX-ID, Abbott Laboratories) siguiendo las instrucciones del fabricante, con el tiempo de retorno de la muestra hasta el resultado en un plazo de 6 a 8 horas. 8, 13 Los análisis PCR/ESI-MS incluyeron desalación automatizada de PCR, adquisición de señales ESI-MS, análisis espectral y notificación de datos. La identificación del organismo se basó en la masa total y las composiciones básicas de los amplicones PCR en comparación con las de la base de datos de firma molecular establecida por el fabricante PLEX-ID. 6, 8, 13, 14 Muestras en las que los resultados PCR/ESI-MS no estaban de acuerdo con los resultados de cultivo a nivel de especie fueron reexaminados por un segundo método molecular. Para los enterovirus, el rinovirus se distinguió del enterovirus mediante un análisis convencional de secuenciación PCR con los imprimadores descritos previamente (Rhinovirus s1 y as) y una búsqueda BLAST. 15 Todos los análisis se realizaron con el Package Statistical for the Social Sciences versión 17.0 (SPSS Inc, Chicago, IL). Las variables continuas se expresaron como valores medios desviaciones estándar de la EA y se compararon con el análisis de la prueba de varianza. Las variables categóricas se compararon con el test exacto de Fisher o x 2; todas las variables biológicamente plausibles con un valor P 0,10 en el análisis univariado se consideraron para su inclusión en el modelo de regresión logística para el análisis multivariado. Durante el período de estudio de 9 meses, se registraron 267 episodios de ITR aguda de 263 pacientes, incluyendo 96 episodios en una clínica local y 171 episodios en NCKUH (19 ambulatorios y 152 en los departamentos de urgencias); por conveniencia, cada episodio fue contado como un caso; en total, 123 (46,1%) casos fueron varones, y 152 (56,9%), 60 (22,5%) y 55 (20,6%) pacientes fueron 18 a 39, 40 a 59 y!60 años de edad, respectivamente. Doscientos y doce (79,4%) pacientes presentaron ITR superior (URTIs), y 55 (20,6%) casos presentados con ITRL. En comparación con los pacientes que asistieron a la clínica local, los pacientes que asistieron al centro de atención médica eran mayores y tenían más comorbilidades ( Tabla 1 ). Los datos demográficos detallados de los 267 casos de ITR y 42 casos de control se presentan en la Tabla 1. Las 267 muestras respiratorias de cada caso de ITR fueron examinadas por virus tanto por aislamiento del virus como por PCR/ESI-MS, y los resultados se presentan en la Tabla 2. Para el aislamiento del virus, se detectaron virus respiratorios en 63 (23,6%) casos, incluyendo influenza A (48 casos, 18,0%), enterovirus (13, 4,9%) y virus de parainfluenza (2, 0,7%) y no se detectaron coinfección. El aislamiento del virus identificó infecciones adicionales de parainfluenza tipo 3 e enterovirus que no fueron encontradas por PCR/ESI-MS en 2 muestras. Por PCR/ESI-MS, se detectaron virus respiratorios en 126 casos (47,2%). La influenza A (65 casos, 24,3%) fue el virus identificado con mayor frecuencia, de los cuales 36 (13,5%) fueron subtipos como virus pandémico H1N1/09, 28 (10,5%) como virus estacional H3N2 y 1 caso como gripe A que coincide tanto con la pandemia H1N1 como con la estacional H3N2. El enterovirus Genus (34, 12,7%) fue el segundo virus detectado con mayor frecuencia, incluyendo rinovirus (25, 9,4%), enterovirus (8, 3,0%) y 1 caso de cultivo negativo para rinovirus y enterovirus. hCoV (13, 4,9%), hMPV (10, 3,7%), adenovirus (6, 2,2%), RSV (6, 2,2%) y parainfluenza (4, 1,5%) fueron detectados en pequeñas proporciones de casos. Se observó la detección simultánea de más de un virus respiratorio en 11 (4,1%) pacientes, y el rinovirus (5 casos) fue más probable que fuera codificado con otro virus respiratorio (Tabla 2). Cabe destacar que 4 virus cultivados identificados como enterovirus debido a la reactividad con la mezcla de Chemicon Pan EV fueron caracterizados como rinovirus por PCR/ESI-MS. Un análisis posterior de las secuencias de PCR de los 4 especímenes clínicos confirmó la existencia de rinovirus pero no enterovirus. PCR/ESI-MS identificó virus respiratorios adicionales en 65 muestras de cultivo negativo, principalmente rinovirus (21 muestras), y un segundo virus respiratorio en 3 muestras de influenza A positiva para cultivo. En general, las tasas positivas de detección de cualquier virus respiratorio por cultivo, PCR/ESI-MS, y ambos métodos fueron 23,6%, 47,2% y 47,9% (128/267), respectivamente. De los 61 especímenes positivos por ambos métodos, PCR/ESI-MS y métodos de cultivo alcanzaron niveles de concordancia del 100% en el nivel de especie para influenza y parainfluenza y del 100% en el nivel de género para el género Enterovirus. En el grupo de control, sólo 1 (2,4%) individuo sano testó positivo para un virus respiratorio (rhinovirus) por PCR/ESI-MS.Con respecto a los herpesvirus, PCR/ESI-MS identificó EBV, HSV-1, CMV y VZV en 128 (47,9%), 25 (9,4%), 7 (2,6%) y 2 (0,7%) muestras de casos de ITR, con tasas de detección similares observadas en el grupo de control.No hubo detección de poliomavirus, parvovirus B19, HSV-2, o virus HHV-8 en muestras de casos con ITR o el grupo de control. Se analizaron los casos positivos para cualquier virus respiratorio, ya sea por cultivo o por PCR/ESI-MS. Las tasas de detección positivas disminuyeron con la edad: 55,3%, 41,7% y 34,5% en los grupos de 18-39, 40-59 y!60 años, respectivamente (P 1⁄4 0,02) (Figura 1A). Se observó una tasa de positividad más alta en pacientes con URTIs que en pacientes con LRTIs (50,5% frente a 38,2%, P 1⁄4 0,10) (Tabla 3 y Figura 1B ). Hubo distribución similar de virus respiratorios en casos del centro clínico y médico local (Tabla 2), y entre pacientes de los 3 grupos de edad (Figura 1A ). De 128 casos con virus respiratorios identificables, la infección por el virus no-influenza fue más frecuente en pacientes con ITRL que en pacientes con ITRL (81,0% [17/21] vs. 48,6% [52/107], P 1⁄4 0,007). Rhinovirus (12,7%), influenza A (10,9%) y parainfluenza (7,3%) fueron los 3 virus respiratorios principales involucrados en 55 casos de ITRL, y la parainfluenza se observó con más frecuencia en el grupo ITRL que en el grupo IRTL (Tabla 3 y Figura 1B ). No hubo variación estacional en ningún virus respiratorio individual durante el período de 9 meses. De 128 pacientes con virus respiratorios identificables, el análisis univariado reveló que los pacientes con 1 de las siguientes afecciones tenían más probabilidades de presentar infecciones por virus respiratorios no influenza: estado inmunocomprometido, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) e insuficiencia renal crónica en diálisis (OR 5,4, IC 95% 1,2-25,5, P 1⁄4 0,02). El análisis multivariado demostró que el uso de esteroides era un factor de riesgo independiente para la infección por rinovirus (OR 15,3; IC 95% 1,5-154,7; P 1⁄4 0,02), la neoplasia maligna activa fue un factor de riesgo independiente para la infección por hMPV (OR 29,3; IC 95% 2,4-358, P 1⁄4 0,008), y la EPOC fue un factor de riesgo independiente para la infección por parainfluenza (OR 229,2; IC 95% 10,5-5020.8.Mientras se comparaban los grupos URTI y LRTI, los factores que se encontraron asociados con LRTI por análisis univariado incluyeron la vejez (60 años), un índice de comorbilidad alto, insuficiencia cardíaca congestiva, EPOC, neoplasia, estado inmunocomprometido y detección de parainfluenza o VEB, mientras que la detección de influenza A se aso De los 117 episodios de infecciones por virus respiratorios, la artralgia se observó con más frecuencia en infecciones por influenza A que en infecciones por no gripe (66,1% [39/59] vs. 46,6% [27/58], P 1⁄4 0,033); para estos 2 tipos de infecciones, los otros síntomas examinados, incluyendo dolor de garganta, rinorrea, tos, esputo purulento, sibilancias, disnea y dolor de cabeza, fueron detectados a frecuencias similares. De 55 casos de IRT, la coinfección con patógenos bacterianos por cultivo de esputo o cultivo de sangre se encontró en 3 (8,8%) de 34 pacientes que dieron positivo para virus respiratorios y en 2 (9,5%) de 21 pacientes que dieron negativo para virus respiratorios. Cuatro de los 6 casos de influenza A LRTI habían recibido oseltamivir. Dos pacientes fallecieron de neumonía y el empeoramiento de una neoplasia subyacente; uno de estos pacientes resultó positivo para HMPV, y el otro resultó negativo para virus respiratorios. Cuatro Nuestro estudio de la epidemiología viral de las ITR agudas adultas utilizando tecnología PCR/ESI-MS tiene 3 ventajas principales. Primero, ampliamos los estudios previos utilizando PCR/ESI-MS para la detección de virus respiratorios. El ensayo PLEX-ID Broad Viral I, que se dirige a enterovirus, rinovirus, herpesvirus, JC y BK poliomavirus, y parvovirus B19, y las pruebas del Virus Respiratorio PLEX-ID fueron adoptadas para la detección de múltiples virus respiratorios clínicamente relevantes. En segundo lugar, se incluyeron 2 grupos de control (pacientes con infecciones exclusivamente bacterianas e individuos sin infecciones activas) para eliminar artefactos falsos positivos de NATs y estimar la prevalencia de portadores asintomáticos detectables de virus respiratorios. En tercer lugar, este estudio incluyó a pacientes inmunocompetentes e inmunocomprometidos que visitaban una clínica local o un centro médico y que se presentaron con un URTI o LRTI, lo que refleja la verdadera epidemiología viral de los ITR adultos. Al complementar el método de cultivo convencional con PCR/ESI-MS, se logró un aumento de 2 veces en la tasa de detección de virus respiratorios, de 23,6% por cultivo solo a 47,9% por una combinación de ambos métodos. Se observó ganancia diagnóstica tanto para virus culturalbles, especialmente rinovirus, como para virus fastidiosos. Aunque no se comparó una NAT alternativa debido a limitaciones de volumen de muestra, se ha reportado que PCR/ ESI-MS tiene una alta sensibilidad (92,9-100%) y especificidad (99-100%) para la detección de virus respiratorios variables en relación con métodos inmunológicos y basados en PCR como ensayos estándar de oro, con la excepción de parainfluenza (sensibilidad 63,4%). 6 Coincidentemente, encontramos que la parainfluenza tipo 3 fue 1 de sólo 2 virus que no fueron detectados por PCR/ESI-MS. Las causas potenciales que contribuyeron a la menor tasa de detección de parainfluenza permanecen por explorar. La tasa de detección positiva (47,2%) para virus respiratorios por PCR/ESI-MS en el presente estudio fue similar a la de programas paralelos de vigilancia de adultos utilizando NATs (43,2-57%). 5,16-18 pero notablemente superior a un estudio anterior utilizando el sistema de biosensores Ibis T5000 (prototipo de PCR-ESI/ MS) utilizando el kit de vigilancia del virus respiratorio II (35,9%), probablemente porque el kit no fue diseñado para la detección de enterovirus y rinovirus. 8 El enterovirus y rinovirus, ambos miembros del género Enterovirus, contribuyeron al 13,1% de los casos de ITR en nuestro estudio y el 9.8-17,8% de los casos de adultos en otros estudios. 5, 16, 17 Considerando su prevalencia, el enterovirus y el rinovirus deben ser incluidos en los paneles de diagnóstico de virus respiratorios si se indica la detección viral integral. La tasa de codetección (4,1%) estaba dentro del rango de 2,0-7,2% que se ha reportado en otras partes. 5, 16, 17 y el rinovirus fue el virus más frecuentemente involucrado en las coinfección, 18 La influenza A y el rinovirus fueron los 2 virus respiratorios detectados con mayor frecuencia, mientras que hCoV, hMPV, enterovirus, adenovirus, VRS y parainfluenza fueron detectados en pequeñas proporciones de casos, lo cual es similar a la epidemiología viral de los IRT adultos observada por otros grupos de estudio. 5, 16, 17 Las distribuciones similares de virus entre los casos de una clínica local y un centro médico y entre los pacientes de los 3 grupos de edad sugieren que los individuos de todos los grupos de edad son susceptibles a múltiples virus respiratorios que circulan simultáneamente en la comunidad. Se observó una menor tasa de detección positiva en la población anciana, probablemente porque los pacientes adultos mayores arrojan títulos más bajos de virus. 19 Sin embargo, los roles de EBV, HSV-1 y CMV en los ITR adultos permanecen incompletos 20.Además, la asociación univariada entre EBV y LTTIs observada en este estudio puede haber sido causada por el factor de confusión de la edad, particularmente dado que la edad avanzada fue identificada como un factor independiente para la detección de EBV (datos no mostrados). La falta de detección del poliomavirus BK y JC o parvovirus B19 implica que estos virus juegan un papel menor en los ITR adultos y que las células orofaríngeas no están involucradas en la persistencia del poliomavirus BK y JC. 21 Además, la baja tasa de detección positiva de virus respiratorios en el grupo control sugiere una baja posibilidad de artefactos falsos positivos en PCR/ESI-MS o una menor tasa de colonización asintomática de virus respiratorios. Además de la ventaja de la detección sensible, PCR/ ESI-MS posee la capacidad de identificación simultánea de subtipos de virus respiratorios. 22 En este estudio, los virus influenza A fueron subtipos de gripe pandémica H1N1 influenza A y estacional H3N2 influenza. En Europa, ambos virus cocircularon en la comunidad en la temporada de gripe 2012-2013. 23 En el género enterovirus, el rinovirus ácido-lábil se puede diferenciar del enterovirus mediante una prueba de labilidad ácida. 24 mientras que PCR/ESI-MS puede diferenciar rápidamente las 2 especies en una sola prueba, como se demostró en nuestro estudio. Los 13 hCoV fueron subtipos como hCoV-OC43, -229E, y -HKU1, que fue validado además por ensayos convencionales de secuencia de PCR (datos no mostrados). El nuevo HCoV-NL63 identificado no fue detectado durante el periodo de estudio, y se reportó una baja tasa de detección (<1%) en China. 16 Nuestra comprensión de los roles de los virus respiratorios no-influenza en pacientes con comorbilidades o ITRL se ha fortalecido en nuestro estudio. Los pacientes que estaban bajo tratamiento con esteroides, tenían un malignidad activa, o padecían EPOC estaban en riesgo de infecciones por rinovirus, hMPV, o parainfluenza, respectivamente. En general, los pacientes inmunocomprometidos, los pacientes con EPOC y los pacientes sometidos a diálisis estaban en riesgo de infección por virus respiratorios no-influenza. Entre los ITRL, el rinovirus y la parainfluenza fueron clasificados como los patógenos más comunes en primer y tercer lugar, respectivamente, y la parainfluenza fue un factor independiente asociado a los ITRL, un hallazgo consistente con reportes previos de que ambos virus son causas significativas de ITRL. 18, [25] [26] [27] Por otro lado, a pesar de un papel creciente de los virus respiratorios no-influenza, los agentes antivirales y las vacunas actualmente disponibles se dirigen principalmente a la infección por gripe. Aunque la ITR viral es una enfermedad autolimitada, como se observa en la mayoría de nuestros pacientes con ITRL que se recuperaron de la enfermedad sin la ayuda de agentes antivirales, un diagnóstico etiológico definido puede ayudar a reducir el uso injustificado de agentes antiinfluenza o antimicrobianos y/o hospitalizaciones innecesarias, y proporcionar información útil para Sin embargo, observamos que la diferenciación clínica de la infección por influenza de otras infecciones por virus respiratorios es difícil debido a la superposición de síntomas, como se ha descrito anteriormente. 5 En conjunto, la asociación de la infección por el virus de la no gripe con pacientes con comorbilidades o ITSL aquí reportados sugiere que un panel viral respiratorio completo sería apropiado en el diagnóstico de ITR en estas poblaciones. Los costos adicionales incurridos por el uso de un panel completo de evaluaciones basadas en PCR/ESI-MS u otras pruebas moleculares probablemente serían compensados por las reducciones concomitantes en terapia antimicrobiana innecesaria y/o hospitalización. 18 Nuestro estudio tiene algunas limitaciones. Primero, los virus respiratorios parainfluenza de tipo 4 y 3 recién identificados, bocavirus humano, poliomavirus humano KI y poliomavirus WU no fueron incluidos en los paneles. [28] [30] [31] y sus funciones en I En segundo lugar, aunque se han identificado ciertos factores de riesgo para infecciones virales específicas, como las infecciones por hMPV o parainfluenza, estas asociaciones deben ser reexaminadas en estudios clínicos a gran escala adicionales, y debe explorarse el impacto clínico y los mecanismos subyacentes de estas asociaciones. Asimismo, pueden ser necesarios más casos de control para estimar mejor la prevalencia de portadores asintomáticos de virus respiratorios. En tercer lugar, sólo se cubrieron 3 temporadas y no se pudo demostrar la estacionalidad de las infecciones respiratorias virales. En conclusión, en comparación con el aislamiento del virus, PCR/ESI-MS produjo un mayor rendimiento diagnóstico para las ITR virales, con una baja posibilidad de artefactos falsos positivos. La infección por virus respiratorios no-influenza se relacionó significativamente con pacientes con comorbilidades y con ITRL. Se justifican estudios adicionales para delinear la necesidad clínica y los beneficios económicos de incluir

¿Cuál era el propósito de este estudio?

Infecciones del tracto respiratorio viral en pacientes adultos que asisten a los departamentos de pacientes ambulatorios y de emergencia, Taiwán, 2012–2013: Estudio de espectrometría de masas de la PCR/Electrosprayhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4635751/SHA: ef6361c7bffb9e92f397d7004bfb3a9c804d7c6aAutores: Shih, Hsin-I; Wang, Hsuan-Chen; Su, Ih-Jen; Hsu, Hsiang-Chin; Wang, Jen-Ren; Sun, Hsiao Fang Sunny; Chou, Chien-Hsuan; Ko, Wen-Chien; Hsieh, Ming-I; Wu, Chi-JungFecha Además, la capacidad de la PCR/electrospray ionization mass spectrometry (PCR/ESI-MS) para detectar enterovirus y rinovirus en muestras respiratorias no ha sido bien evaluada. Tratamos de utilizar PCR/ESI-MS para investigar exhaustivamente la epidemiología viral de los ITR adultos, incluyendo pruebas de rinovirus y enterovirus. Los hisopos nasofaríngeos o de garganta de 267 adultos con ITR agudas (212 ITR superiores y 55 ITR inferiores) que visitaron una clínica local o los departamentos ambulatorios o de emergencia de un centro médico en Taiwán entre octubre de 2012 y junio de 2013 fueron probados en busca de virus respiratorios por aislamiento del virus y PCR/ESI-MS. Los virus respiratorios fueron encontrados en el 23,6%, 47,2% y 47,9% de los 267 casos por aislamiento del virus, PCR/ESI-MS y ambos métodos, respectivamente.Cuando se utilizaron ambos métodos, el virus influenza A (24,3%) y rinovirus (9,4%) fueron los virus identificados con mayor frecuencia, mientras que los coronavirus humanos, metapneumovirus humano (hMPV), enterovirus, adenovirus, virus respiratorios sincitiales y virus de la parainfluenza fueron identificados en pequeñas proporciones de casos (<5% de casos para cada tipo de virus).La coinfección se observó en el 4,1% de los casos.En el grupo control, sólo 1 (2,4%) muestra positiva para virus respiratorio por PCR/ESI-MS. Los pacientes sometidos a tratamiento con esteroides, con malignidad activa o con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) tenían riesgo de infección por rinovirus, hMPV o parainfluenza, respectivamente. En general, los pacientes inmunocomprometidos, los pacientes con EPOC y los pacientes sometidos a diálisis tenían riesgo de infección por virus respiratorios no influenza. Los rinovirus (12,7%), el virus influenza A (10,9%) y los virus parainfluenza (7,3%) fueron los virus más comunes implicados en los 55 casos de ITR inferiores. Los factores de infección por parainfluenza, vejez e inmunosupresión se asociaron de forma independiente con ITR inferiores. En conclusión, PCR/ESI-MS mejoraron el rendimiento diagnóstico de las ITR virales. Las infecciones por virus respiratorios no influenza se asociaron con pacientes con comorbilidades y con ITR inferiores. Se justifican estudios adicionales que delineen la necesidad clínica de incluir virus respiratorios no-influenza en el trabajo diagnóstico en estas poblaciones. Texto: Las infecciones de las vías respiratorias virales (IRT) en humanos ocurren durante todo el año y representan una causa importante de las visitas clínicas en todo el mundo. En el pasado, las causas virales de las ITR eran en gran parte desconocidas, principalmente debido a la insensibilidad de los métodos basados en cultivos para la detección de virus o al espectro estrecho de detección viral mediante pruebas de ácido nucleico plex único (NATs). Recientemente, el desarrollo de NATs respiratorios múltiples ha permitido la detección simultánea, rápida y sensible de múltiples virus, lo que facilita estudios exhaustivos sobre la epidemiología de las ITR virales. Actualmente, la epidemiología viral de las ITRs se ha estudiado más ampliamente entre las poblaciones pediátricas que con poblaciones adultas en todo el De manera similar, la mayoría de los estudios que describen la etiología viral de las enfermedades respiratorias en Taiwán, un país subtropical en Asia Oriental, se limitaron a poblaciones pediátricas. [2] [3] [4] Así, los estudios entre pacientes adultos carecen de estudios, particularmente en relación con infecciones por virus fastidiosos o recién identificados, como el metapneumovirus humano (hMPV) y el coronavirus humano (hCoV). La superposición de presentaciones clínicas compartidas por diferentes virus respiratorios dificulta el diagnóstico diferencial basado únicamente en los parámetros clínicos. 5 Además, los agentes antivirales eficaces están actualmente restringidos a las infecciones por virus de la gripe. Por lo tanto, una mejor comprensión de la epidemiología de las ITR virales adultas ayudaría al futuro diseño de estrategias diagnósticas, control de infecciones y manejo de pacientes. [6] [7] [8] [9] A pesar del potencial diagnóstico, la capacidad de PCR/ESI-MS para detectar enterovirus humano y rinovirus en muestras respiratorias de pacientes con ITR no ha sido bien evaluada.Los estudios anteriores de PCR/ESI-MS en pacientes con ITR no incluyeron estos 2 virus en los paneles diagnósticos. [6] [7] [8] En este caso, ampliamos estos estudios previos utilizando PCR/ESI-MS para la detección de virus respiratorios. Tratamos de investigar exhaustivamente la epidemiología de ITR virales adultos utilizando PCR/ESI-MS y comparar el desempeño diagnóstico entre PCR/ESI-MS y métodos de cultivo convencionales para identificar virus respiratorios múltiples, clínicamente relevantes, incluyendo enterovirus e rinovirus. Para realizar un estudio epidemiológico integral que incluyó a pacientes con y sin comorbilidad, se inscribió a adultos (de al menos 18 años de edad) con ITR aguda en los 7 días de inicio que fueron tratados en una clínica externa local del hospital YC o en los departamentos ambulatorios o de emergencia del Hospital Universitario Nacional Cheng-Kung (NCKUH), un centro médico afiliado a la universidad en el sur de Taiwán, entre octubre de 2012 y junio de 2013. La ITR aguda se definió como la aparición simultánea de al menos 1 síntoma o signo respiratorio (Tose nueva o empeoramiento, producción de esputo, dolor de garganta, congestión nasal, rinorrea, disnea, sibilancias o tonsias inyectadas) y al menos 1 de los siguientes síntomas: fiebre, escalofríos y tos. Para los pacientes que experimentaron más de un episodio de ITR, el episodio más reciente fue contado como separado sólo si el paciente se recuperó completamente del episodio anterior y hubo un intervalo mínimo de 3 semanas entre el inicio de los 2 episodios. Datos clínicos, de laboratorio y radiológicos y el historial de contacto de cada paciente fueron recuperados. Comorbilidades fueron evaluadas en todos los pacientes con base en el índice de comorbilidad de Charlson (ICC). 10 El uso de esteroides se definió como la recepción de tratamiento con corticosteroides (10 mg de prednisolona o una dosis diaria equivalente) durante más de 2 semanas. Se diagnosticó un estado inmunocomprometido si los pacientes cumplían una de las siguientes condiciones: tratamiento con corticosteroides, órgano sólido o receptor de células madre hematopoyéticas, o quimioterapia para una neoplasia subyacente durante los últimos 6 meses. 11 para la detección e identificación de virus tanto por aislamiento del virus como por PCR/ESI-MS. Las muestras clínicas fueron almacenadas en 48C y transportadas a los sitios del estudio dentro de las 24 horas siguientes a la recolección. Se incluyeron hisopos de garganta de 42 casos sin infecciones respiratorias durante el mes anterior a la inscripción como muestras de control para el análisis PCR/ESI-MS, incluyendo 15 pacientes con infecciones exclusivamente bacterianas (casos documentados de bacteremia o infección del tracto urinario) que fueron ingresados en NCKUH y 27 individuos sin infecciones activas. Estos sujetos sin infecciones activas incluyeron 10 pacientes con enfermedades crónicas estables seguidos en las clínicas NCKUH y 17 individuos sanos cuya información médica fue recolectada mediante un cuestionario clínico.El estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional (B-ER-101-31) del hospital del estudio, y todos los pacientes dieron consentimiento informado. Los especímenes respiratorios fueron inoculados en cultivos tisulares apropiados (Renino canino Madin-Darby, MRC-5, A549, y rabdomiosarcoma) para aislar el virus de la gripe humana, el virus de la parainfluenza, el género Enterovirus, el citomegalovirus (CMV), el adenovirus, el virus sincitial respiratorio (RSV), los virus del herpes simplex 1 y 2 (HSV-1 y -2), y el virus de la varicela zoster (VZV). El aislamiento e identificación de virus se realizaron utilizando un método descrito anteriormente 11 y los enterovirus fueron identificados mediante un ensayo de inmunofluorescencia utilizando una mezcla de Chemicon Pan EV que reacciona de forma cruzada con el rinovirus (Diágnóstico de la luz, Chemicon [Millipore], MA). 11, 12 Detección e identificación de virus por PCR/ESI-MS Los ácidos nucleicos totales se extrajeron de 700 mL de muestras de hisopo utilizando un autoextractor de ácido nucleico (MagNA Pure Compact Instrument, Mannheim, Alemania), y el eluato se almacenó en À808C hasta el análisis. Durante los análisis, los ácidos nucleicos extraídos se agregaron tanto a una placa de ensayo del virus respiratorio PLEX-ID como a una placa de ensayo de PLEX-ID Broad Viral I (PLEX-ID, Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois). El ensayo del virus respiratorio PLEX-ID detecta el adenovirus humano, hCoV, hMPV, influenza A y B, parainfluenza tipos 1 a 3 y RSV, 6 mientras que el ensayo PLEX-ID Broad Viral I detecta el adenovirus humano, enterovirus, rinovirus, poliomavirus BK y JC, parvovirus B19, HSV-1 y -2, VZV, virus Epstein-Barr (EBV), CMV y herpesvirus humano (HHV)-8. 13, 14 En este estudio, los virus respiratorios se refieren al adenovirus, hCoV, hMPV, influenza, parainfluenza, RSV, enterovirus y rinovirus. La amplificación del ácido nucleico y los análisis de los productos PCR se realizaron utilizando la plataforma PCR/ESI-MS (PLEX-ID, Abbott Laboratories) siguiendo las instrucciones del fabricante, con el tiempo de retorno de la muestra hasta el resultado en un plazo de 6 a 8 horas. 8, 13 Los análisis PCR/ESI-MS incluyeron desalación automatizada de PCR, adquisición de señales ESI-MS, análisis espectral y notificación de datos. La identificación del organismo se basó en la masa total y las composiciones básicas de los amplicones PCR en comparación con las de la base de datos de firma molecular establecida por el fabricante PLEX-ID. 6, 8, 13, 14 Muestras en las que los resultados PCR/ESI-MS no estaban de acuerdo con los resultados de cultivo a nivel de especie fueron reexaminados por un segundo método molecular. Para los enterovirus, el rinovirus se distinguió del enterovirus mediante un análisis convencional de secuenciación PCR con los imprimadores descritos previamente (Rhinovirus s1 y as) y una búsqueda BLAST. 15 Todos los análisis se realizaron con el Package Statistical for the Social Sciences versión 17.0 (SPSS Inc, Chicago, IL). Las variables continuas se expresaron como valores medios desviaciones estándar de la EA y se compararon con el análisis de la prueba de varianza. Las variables categóricas se compararon con el test exacto de Fisher o x 2; todas las variables biológicamente plausibles con un valor P 0,10 en el análisis univariado se consideraron para su inclusión en el modelo de regresión logística para el análisis multivariado. Durante el período de estudio de 9 meses, se registraron 267 episodios de ITR aguda de 263 pacientes, incluyendo 96 episodios en una clínica local y 171 episodios en NCKUH (19 ambulatorios y 152 en los departamentos de urgencias); por conveniencia, cada episodio fue contado como un caso; en total, 123 (46,1%) casos fueron varones, y 152 (56,9%), 60 (22,5%) y 55 (20,6%) pacientes fueron 18 a 39, 40 a 59 y!60 años de edad, respectivamente. Doscientos y doce (79,4%) pacientes presentaron ITR superior (URTIs), y 55 (20,6%) casos presentados con ITRL. En comparación con los pacientes que asistieron a la clínica local, los pacientes que asistieron al centro de atención médica eran mayores y tenían más comorbilidades ( Tabla 1 ). Los datos demográficos detallados de los 267 casos de ITR y 42 casos de control se presentan en la Tabla 1. Las 267 muestras respiratorias de cada caso de ITR fueron examinadas por virus tanto por aislamiento del virus como por PCR/ESI-MS, y los resultados se presentan en la Tabla 2. Para el aislamiento del virus, se detectaron virus respiratorios en 63 (23,6%) casos, incluyendo influenza A (48 casos, 18,0%), enterovirus (13, 4,9%) y virus de parainfluenza (2, 0,7%) y no se detectaron coinfección. El aislamiento del virus identificó infecciones adicionales de parainfluenza tipo 3 e enterovirus que no fueron encontradas por PCR/ESI-MS en 2 muestras. Por PCR/ESI-MS, se detectaron virus respiratorios en 126 casos (47,2%). La influenza A (65 casos, 24,3%) fue el virus identificado con mayor frecuencia, de los cuales 36 (13,5%) fueron subtipos como virus pandémico H1N1/09, 28 (10,5%) como virus estacional H3N2 y 1 caso como gripe A que coincide tanto con la pandemia H1N1 como con la estacional H3N2. El enterovirus Genus (34, 12,7%) fue el segundo virus detectado con mayor frecuencia, incluyendo rinovirus (25, 9,4%), enterovirus (8, 3,0%) y 1 caso de cultivo negativo para rinovirus y enterovirus. hCoV (13, 4,9%), hMPV (10, 3,7%), adenovirus (6, 2,2%), RSV (6, 2,2%) y parainfluenza (4, 1,5%) fueron detectados en pequeñas proporciones de casos. Se observó la detección simultánea de más de un virus respiratorio en 11 (4,1%) pacientes, y el rinovirus (5 casos) fue más probable que fuera codificado con otro virus respiratorio (Tabla 2). Cabe destacar que 4 virus cultivados identificados como enterovirus debido a la reactividad con la mezcla de Chemicon Pan EV fueron caracterizados como rinovirus por PCR/ESI-MS. Un análisis posterior de las secuencias de PCR de los 4 especímenes clínicos confirmó la existencia de rinovirus pero no enterovirus. PCR/ESI-MS identificó virus respiratorios adicionales en 65 muestras de cultivo negativo, principalmente rinovirus (21 muestras), y un segundo virus respiratorio en 3 muestras de influenza A positiva para cultivo. En general, las tasas positivas de detección de cualquier virus respiratorio por cultivo, PCR/ESI-MS, y ambos métodos fueron 23,6%, 47,2% y 47,9% (128/267), respectivamente. De los 61 especímenes positivos por ambos métodos, PCR/ESI-MS y métodos de cultivo alcanzaron niveles de concordancia del 100% en el nivel de especie para influenza y parainfluenza y del 100% en el nivel de género para el género Enterovirus. En el grupo de control, sólo 1 (2,4%) individuo sano testó positivo para un virus respiratorio (rhinovirus) por PCR/ESI-MS.Con respecto a los herpesvirus, PCR/ESI-MS identificó EBV, HSV-1, CMV y VZV en 128 (47,9%), 25 (9,4%), 7 (2,6%) y 2 (0,7%) muestras de casos de ITR, con tasas de detección similares observadas en el grupo de control.No hubo detección de poliomavirus, parvovirus B19, HSV-2, o virus HHV-8 en muestras de casos con ITR o el grupo de control. Se analizaron los casos positivos para cualquier virus respiratorio, ya sea por cultivo o por PCR/ESI-MS. Las tasas de detección positivas disminuyeron con la edad: 55,3%, 41,7% y 34,5% en los grupos de 18-39, 40-59 y!60 años, respectivamente (P 1⁄4 0,02) (Figura 1A). Se observó una tasa de positividad más alta en pacientes con URTIs que en pacientes con LRTIs (50,5% frente a 38,2%, P 1⁄4 0,10) (Tabla 3 y Figura 1B ). Hubo distribución similar de virus respiratorios en casos del centro clínico y médico local (Tabla 2), y entre pacientes de los 3 grupos de edad (Figura 1A ). De 128 casos con virus respiratorios identificables, la infección por el virus no-influenza fue más frecuente en pacientes con ITRL que en pacientes con ITRL (81,0% [17/21] vs. 48,6% [52/107], P 1⁄4 0,007). Rhinovirus (12,7%), influenza A (10,9%) y parainfluenza (7,3%) fueron los 3 virus respiratorios principales involucrados en 55 casos de ITRL, y la parainfluenza se observó con más frecuencia en el grupo ITRL que en el grupo IRTL (Tabla 3 y Figura 1B ). No hubo variación estacional en ningún virus respiratorio individual durante el período de 9 meses. De 128 pacientes con virus respiratorios identificables, el análisis univariado reveló que los pacientes con 1 de las siguientes afecciones tenían más probabilidades de presentar infecciones por virus respiratorios no influenza: estado inmunocomprometido, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) e insuficiencia renal crónica en diálisis (OR 5,4, IC 95% 1,2-25,5, P 1⁄4 0,02). El análisis multivariado demostró que el uso de esteroides era un factor de riesgo independiente para la infección por rinovirus (OR 15,3; IC 95% 1,5-154,7; P 1⁄4 0,02), la neoplasia maligna activa fue un factor de riesgo independiente para la infección por hMPV (OR 29,3; IC 95% 2,4-358, P 1⁄4 0,008), y la EPOC fue un factor de riesgo independiente para la infección por parainfluenza (OR 229,2; IC 95% 10,5-5020.8.Mientras se comparaban los grupos URTI y LRTI, los factores que se encontraron asociados con LRTI por análisis univariado incluyeron la vejez (60 años), un índice de comorbilidad alto, insuficiencia cardíaca congestiva, EPOC, neoplasia, estado inmunocomprometido y detección de parainfluenza o VEB, mientras que la detección de influenza A se aso De los 117 episodios de infecciones por virus respiratorios, la artralgia se observó con más frecuencia en infecciones por influenza A que en infecciones por no gripe (66,1% [39/59] vs. 46,6% [27/58], P 1⁄4 0,033); para estos 2 tipos de infecciones, los otros síntomas examinados, incluyendo dolor de garganta, rinorrea, tos, esputo purulento, sibilancias, disnea y dolor de cabeza, fueron detectados a frecuencias similares. De 55 casos de IRT, la coinfección con patógenos bacterianos por cultivo de esputo o cultivo de sangre se encontró en 3 (8,8%) de 34 pacientes que dieron positivo para virus respiratorios y en 2 (9,5%) de 21 pacientes que dieron negativo para virus respiratorios. Cuatro de los 6 casos de influenza A LRTI habían recibido oseltamivir. Dos pacientes fallecieron de neumonía y el empeoramiento de una neoplasia subyacente; uno de estos pacientes resultó positivo para HMPV, y el otro resultó negativo para virus respiratorios. Cuatro Nuestro estudio de la epidemiología viral de las ITR agudas adultas utilizando tecnología PCR/ESI-MS tiene 3 ventajas principales. Primero, ampliamos los estudios previos utilizando PCR/ESI-MS para la detección de virus respiratorios. El ensayo PLEX-ID Broad Viral I, que se dirige a enterovirus, rinovirus, herpesvirus, JC y BK poliomavirus, y parvovirus B19, y las pruebas del Virus Respiratorio PLEX-ID fueron adoptadas para la detección de múltiples virus respiratorios clínicamente relevantes. En segundo lugar, se incluyeron 2 grupos de control (pacientes con infecciones exclusivamente bacterianas e individuos sin infecciones activas) para eliminar artefactos falsos positivos de NATs y estimar la prevalencia de portadores asintomáticos detectables de virus respiratorios. En tercer lugar, este estudio incluyó a pacientes inmunocompetentes e inmunocomprometidos que visitaban una clínica local o un centro médico y que se presentaron con un URTI o LRTI, lo que refleja la verdadera epidemiología viral de los ITR adultos. Al complementar el método de cultivo convencional con PCR/ESI-MS, se logró un aumento de 2 veces en la tasa de detección de virus respiratorios, de 23,6% por cultivo solo a 47,9% por una combinación de ambos métodos. Se observó ganancia diagnóstica tanto para virus culturalbles, especialmente rinovirus, como para virus fastidiosos. Aunque no se comparó una NAT alternativa debido a limitaciones de volumen de muestra, se ha reportado que PCR/ ESI-MS tiene una alta sensibilidad (92,9-100%) y especificidad (99-100%) para la detección de virus respiratorios variables en relación con métodos inmunológicos y basados en PCR como ensayos estándar de oro, con la excepción de parainfluenza (sensibilidad 63,4%). 6 Coincidentemente, encontramos que la parainfluenza tipo 3 fue 1 de sólo 2 virus que no fueron detectados por PCR/ESI-MS. Las causas potenciales que contribuyeron a la menor tasa de detección de parainfluenza permanecen por explorar. La tasa de detección positiva (47,2%) para virus respiratorios por PCR/ESI-MS en el presente estudio fue similar a la de programas paralelos de vigilancia de adultos utilizando NATs (43,2-57%). 5,16-18 pero notablemente superior a un estudio anterior utilizando el sistema de biosensores Ibis T5000 (prototipo de PCR-ESI/ MS) utilizando el kit de vigilancia del virus respiratorio II (35,9%), probablemente porque el kit no fue diseñado para la detección de enterovirus y rinovirus. 8 El enterovirus y rinovirus, ambos miembros del género Enterovirus, contribuyeron al 13,1% de los casos de ITR en nuestro estudio y el 9.8-17,8% de los casos de adultos en otros estudios. 5, 16, 17 Considerando su prevalencia, el enterovirus y el rinovirus deben ser incluidos en los paneles de diagnóstico de virus respiratorios si se indica la detección viral integral. La tasa de codetección (4,1%) estaba dentro del rango de 2,0-7,2% que se ha reportado en otras partes. 5, 16, 17 y el rinovirus fue el virus más frecuentemente involucrado en las coinfección, 18 La influenza A y el rinovirus fueron los 2 virus respiratorios detectados con mayor frecuencia, mientras que hCoV, hMPV, enterovirus, adenovirus, VRS y parainfluenza fueron detectados en pequeñas proporciones de casos, lo cual es similar a la epidemiología viral de los IRT adultos observada por otros grupos de estudio. 5, 16, 17 Las distribuciones similares de virus entre los casos de una clínica local y un centro médico y entre los pacientes de los 3 grupos de edad sugieren que los individuos de todos los grupos de edad son susceptibles a múltiples virus respiratorios que circulan simultáneamente en la comunidad. Se observó una menor tasa de detección positiva en la población anciana, probablemente porque los pacientes adultos mayores arrojan títulos más bajos de virus. 19 Sin embargo, los roles de EBV, HSV-1 y CMV en los ITR adultos permanecen incompletos 20.Además, la asociación univariada entre EBV y LTTIs observada en este estudio puede haber sido causada por el factor de confusión de la edad, particularmente dado que la edad avanzada fue identificada como un factor independiente para la detección de EBV (datos no mostrados). La falta de detección del poliomavirus BK y JC o parvovirus B19 implica que estos virus juegan un papel menor en los ITR adultos y que las células orofaríngeas no están involucradas en la persistencia del poliomavirus BK y JC. 21 Además, la baja tasa de detección positiva de virus respiratorios en el grupo control sugiere una baja posibilidad de artefactos falsos positivos en PCR/ESI-MS o una menor tasa de colonización asintomática de virus respiratorios. Además de la ventaja de la detección sensible, PCR/ ESI-MS posee la capacidad de identificación simultánea de subtipos de virus respiratorios. 22 En este estudio, los virus influenza A fueron subtipos de gripe pandémica H1N1 influenza A y estacional H3N2 influenza. En Europa, ambos virus cocircularon en la comunidad en la temporada de gripe 2012-2013. 23 En el género enterovirus, el rinovirus ácido-lábil se puede diferenciar del enterovirus mediante una prueba de labilidad ácida. 24 mientras que PCR/ESI-MS puede diferenciar rápidamente las 2 especies en una sola prueba, como se demostró en nuestro estudio. Los 13 hCoV fueron subtipos como hCoV-OC43, -229E, y -HKU1, que fue validado además por ensayos convencionales de secuencia de PCR (datos no mostrados). El nuevo HCoV-NL63 identificado no fue detectado durante el periodo de estudio, y se reportó una baja tasa de detección (<1%) en China. 16 Nuestra comprensión de los roles de los virus respiratorios no-influenza en pacientes con comorbilidades o ITRL se ha fortalecido en nuestro estudio. Los pacientes que estaban bajo tratamiento con esteroides, tenían un malignidad activa, o padecían EPOC estaban en riesgo de infecciones por rinovirus, hMPV, o parainfluenza, respectivamente. En general, los pacientes inmunocomprometidos, los pacientes con EPOC y los pacientes sometidos a diálisis estaban en riesgo de infección por virus respiratorios no-influenza. Entre los ITRL, el rinovirus y la parainfluenza fueron clasificados como los patógenos más comunes en primer y tercer lugar, respectivamente, y la parainfluenza fue un factor independiente asociado a los ITRL, un hallazgo consistente con reportes previos de que ambos virus son causas significativas de ITRL. 18, [25] [26] [27] Por otro lado, a pesar de un papel creciente de los virus respiratorios no-influenza, los agentes antivirales y las vacunas actualmente disponibles se dirigen principalmente a la infección por gripe. Aunque la ITR viral es una enfermedad autolimitada, como se observa en la mayoría de nuestros pacientes con ITRL que se recuperaron de la enfermedad sin la ayuda de agentes antivirales, un diagnóstico etiológico definido puede ayudar a reducir el uso injustificado de agentes antiinfluenza o antimicrobianos y/o hospitalizaciones innecesarias, y proporcionar información útil para Sin embargo, observamos que la diferenciación clínica de la infección por influenza de otras infecciones por virus respiratorios es difícil debido a la superposición de síntomas, como se ha descrito anteriormente. 5 En conjunto, la asociación de la infección por el virus de la no gripe con pacientes con comorbilidades o ITSL aquí reportados sugiere que un panel viral respiratorio completo sería apropiado en el diagnóstico de ITR en estas poblaciones. Los costos adicionales incurridos por el uso de un panel completo de evaluaciones basadas en PCR/ESI-MS u otras pruebas moleculares probablemente serían compensados por las reducciones concomitantes en terapia antimicrobiana innecesaria y/o hospitalización. 18 Nuestro estudio tiene algunas limitaciones. Primero, los virus respiratorios parainfluenza de tipo 4 y 3 recién identificados, bocavirus humano, poliomavirus humano KI y poliomavirus WU no fueron incluidos en los paneles. [28] [30] [31] y sus funciones en I En segundo lugar, aunque se han identificado ciertos factores de riesgo para infecciones virales específicas, como las infecciones por hMPV o parainfluenza, estas asociaciones deben ser reexaminadas en estudios clínicos a gran escala adicionales, y debe explorarse el impacto clínico y los mecanismos subyacentes de estas asociaciones. Asimismo, pueden ser necesarios más casos de control para estimar mejor la prevalencia de portadores asintomáticos de virus respiratorios. En tercer lugar, sólo se cubrieron 3 temporadas y no se pudo demostrar la estacionalidad de las infecciones respiratorias virales. En conclusión, en comparación con el aislamiento del virus, PCR/ESI-MS produjo un mayor rendimiento diagnóstico para las ITR virales, con una baja posibilidad de artefactos falsos positivos. La infección por virus respiratorios no-influenza se relacionó significativamente con pacientes con comorbilidades y con ITRL. Se justifican estudios adicionales para delinear la necesidad clínica y los beneficios económicos de incluir

¿Cuántas muestras de control se utilizaron en este estudio?

Infecciones del tracto respiratorio viral en pacientes adultos que asisten a los departamentos de pacientes ambulatorios y de emergencia, Taiwán, 2012–2013: Estudio de espectrometría de masas de la PCR/Electrosprayhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4635751/SHA: ef6361c7bffb9e92f397d7004bfb3a9c804d7c6aAutores: Shih, Hsin-I; Wang, Hsuan-Chen; Su, Ih-Jen; Hsu, Hsiang-Chin; Wang, Jen-Ren; Sun, Hsiao Fang Sunny; Chou, Chien-Hsuan; Ko, Wen-Chien; Hsieh, Ming-I; Wu, Chi-JungFecha Además, la capacidad de la PCR/electrospray ionization mass spectrometry (PCR/ESI-MS) para detectar enterovirus y rinovirus en muestras respiratorias no ha sido bien evaluada. Tratamos de utilizar PCR/ESI-MS para investigar exhaustivamente la epidemiología viral de los ITR adultos, incluyendo pruebas de rinovirus y enterovirus. Los hisopos nasofaríngeos o de garganta de 267 adultos con ITR agudas (212 ITR superiores y 55 ITR inferiores) que visitaron una clínica local o los departamentos ambulatorios o de emergencia de un centro médico en Taiwán entre octubre de 2012 y junio de 2013 fueron probados en busca de virus respiratorios por aislamiento del virus y PCR/ESI-MS. Los virus respiratorios fueron encontrados en el 23,6%, 47,2% y 47,9% de los 267 casos por aislamiento del virus, PCR/ESI-MS y ambos métodos, respectivamente.Cuando se utilizaron ambos métodos, el virus influenza A (24,3%) y rinovirus (9,4%) fueron los virus identificados con mayor frecuencia, mientras que los coronavirus humanos, metapneumovirus humano (hMPV), enterovirus, adenovirus, virus respiratorios sincitiales y virus de la parainfluenza fueron identificados en pequeñas proporciones de casos (<5% de casos para cada tipo de virus).La coinfección se observó en el 4,1% de los casos.En el grupo control, sólo 1 (2,4%) muestra positiva para virus respiratorio por PCR/ESI-MS. Los pacientes sometidos a tratamiento con esteroides, con malignidad activa o con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) tenían riesgo de infección por rinovirus, hMPV o parainfluenza, respectivamente. En general, los pacientes inmunocomprometidos, los pacientes con EPOC y los pacientes sometidos a diálisis tenían riesgo de infección por virus respiratorios no influenza. Los rinovirus (12,7%), el virus influenza A (10,9%) y los virus parainfluenza (7,3%) fueron los virus más comunes implicados en los 55 casos de ITR inferiores. Los factores de infección por parainfluenza, vejez e inmunosupresión se asociaron de forma independiente con ITR inferiores. En conclusión, PCR/ESI-MS mejoraron el rendimiento diagnóstico de las ITR virales. Las infecciones por virus respiratorios no influenza se asociaron con pacientes con comorbilidades y con ITR inferiores. Se justifican estudios adicionales que delineen la necesidad clínica de incluir virus respiratorios no-influenza en el trabajo diagnóstico en estas poblaciones. Texto: Las infecciones de las vías respiratorias virales (IRT) en humanos ocurren durante todo el año y representan una causa importante de las visitas clínicas en todo el mundo. En el pasado, las causas virales de las ITR eran en gran parte desconocidas, principalmente debido a la insensibilidad de los métodos basados en cultivos para la detección de virus o al espectro estrecho de detección viral mediante pruebas de ácido nucleico plex único (NATs). Recientemente, el desarrollo de NATs respiratorios múltiples ha permitido la detección simultánea, rápida y sensible de múltiples virus, lo que facilita estudios exhaustivos sobre la epidemiología de las ITR virales. Actualmente, la epidemiología viral de las ITRs se ha estudiado más ampliamente entre las poblaciones pediátricas que con poblaciones adultas en todo el De manera similar, la mayoría de los estudios que describen la etiología viral de las enfermedades respiratorias en Taiwán, un país subtropical en Asia Oriental, se limitaron a poblaciones pediátricas. [2] [3] [4] Así, los estudios entre pacientes adultos carecen de estudios, particularmente en relación con infecciones por virus fastidiosos o recién identificados, como el metapneumovirus humano (hMPV) y el coronavirus humano (hCoV). La superposición de presentaciones clínicas compartidas por diferentes virus respiratorios dificulta el diagnóstico diferencial basado únicamente en los parámetros clínicos. 5 Además, los agentes antivirales eficaces están actualmente restringidos a las infecciones por virus de la gripe. Por lo tanto, una mejor comprensión de la epidemiología de las ITR virales adultas ayudaría al futuro diseño de estrategias diagnósticas, control de infecciones y manejo de pacientes. [6] [7] [8] [9] A pesar del potencial diagnóstico, la capacidad de PCR/ESI-MS para detectar enterovirus humano y rinovirus en muestras respiratorias de pacientes con ITR no ha sido bien evaluada.Los estudios anteriores de PCR/ESI-MS en pacientes con ITR no incluyeron estos 2 virus en los paneles diagnósticos. [6] [7] [8] En este caso, ampliamos estos estudios previos utilizando PCR/ESI-MS para la detección de virus respiratorios. Tratamos de investigar exhaustivamente la epidemiología de ITR virales adultos utilizando PCR/ESI-MS y comparar el desempeño diagnóstico entre PCR/ESI-MS y métodos de cultivo convencionales para identificar virus respiratorios múltiples, clínicamente relevantes, incluyendo enterovirus e rinovirus. Para realizar un estudio epidemiológico integral que incluyó a pacientes con y sin comorbilidad, se inscribió a adultos (de al menos 18 años de edad) con ITR agudas en los 7 días de inicio que fueron tratados en una clínica externa local del hospital de YC o en los departamentos de ambulatorios o urgencias del Hospital Universitario Nacional Cheng-Kung (NCKUH), un centro médico afiliado a la universidad en el sur de Taiwán, entre octubre de 2012 y junio de 2013. La ITR aguda se definió como la aparición simultánea de al menos 1 síntoma o signo respiratorio (tose nueva o empeoramiento, producción de esputo, dolor de garganta, congestión nasal, rinorrea, disnea, sibilancias o tonsias inyectadas) y al menos 1 de los siguientes síntomas: fiebre, escalofríos y tos. Para los pacientes que experimentaron más de un episodio de ITR, el episodio más reciente fue contado como separado sólo si el paciente se recuperó completamente del episodio anterior y hubo un intervalo mínimo de 3 semanas entre el inicio de los 2 episodios. Datos clínicos, de laboratorio y radiológicos y el historial de contacto de cada paciente fueron recuperados. Comorbilidades fueron evaluadas en todos los pacientes con base en el índice de comorbilidad de Charlson (ICC). 10 El uso de esteroides se definió como la recepción de tratamiento con corticosteroides (10 mg de prednisolona o una dosis diaria equivalente) durante más de 2 semanas. Se diagnosticó un estado inmunocomprometido si los pacientes cumplían una de las siguientes condiciones: tratamiento con corticosteroides, órgano sólido o receptor de células madre hematopoyéticas, o quimioterapia para una neoplasia subyacente durante los últimos 6 meses. 11 para la detección e identificación de virus tanto por aislamiento del virus como por PCR/ESI-MS. Las muestras clínicas fueron almacenadas en 48C y transportadas a los sitios del estudio dentro de las 24 horas siguientes a la recolección. Se incluyeron hisopos de garganta de 42 casos sin infecciones respiratorias durante el mes anterior a la inscripción como muestras de control para el análisis PCR/ESI-MS, incluyendo 15 pacientes con infecciones exclusivamente bacterianas (casos documentados de bacteremia o infección del tracto urinario) que fueron ingresados en NCKUH y 27 individuos sin infecciones activas. Estos sujetos sin infecciones activas incluyeron 10 pacientes con enfermedades crónicas estables seguidos en las clínicas NCKUH y 17 individuos sanos cuya información médica fue recolectada mediante un cuestionario clínico.El estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional (B-ER-101-31) del hospital del estudio, y todos los pacientes dieron consentimiento informado. Los especímenes respiratorios fueron inoculados en cultivos tisulares apropiados (Renino canino Madin-Darby, MRC-5, A549, y rabdomiosarcoma) para aislar el virus de la gripe humana, el virus de la parainfluenza, el género Enterovirus, el citomegalovirus (CMV), el adenovirus, el virus sincitial respiratorio (RSV), los virus del herpes simplex 1 y 2 (HSV-1 y -2), y el virus de la varicela zoster (VZV). El aislamiento e identificación de virus se realizaron utilizando un método descrito anteriormente 11 y los enterovirus fueron identificados mediante un ensayo de inmunofluorescencia utilizando una mezcla de Chemicon Pan EV que reacciona de forma cruzada con el rinovirus (Diágnóstico de la luz, Chemicon [Millipore], MA). 11, 12 Detección e identificación de virus por PCR/ESI-MS Los ácidos nucleicos totales se extrajeron de 700 mL de muestras de hisopo utilizando un autoextractor de ácido nucleico (MagNA Pure Compact Instrument, Mannheim, Alemania), y el eluato se almacenó en À808C hasta el análisis. Durante los análisis, los ácidos nucleicos extraídos se agregaron tanto a una placa de ensayo del virus respiratorio PLEX-ID como a una placa de ensayo de PLEX-ID Broad Viral I (PLEX-ID, Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois). El ensayo del virus respiratorio PLEX-ID detecta el adenovirus humano, hCoV, hMPV, influenza A y B, parainfluenza tipos 1 a 3 y RSV, 6 mientras que el ensayo PLEX-ID Broad Viral I detecta el adenovirus humano, enterovirus, rinovirus, poliomavirus BK y JC, parvovirus B19, HSV-1 y -2, VZV, virus Epstein-Barr (EBV), CMV y herpesvirus humano (HHV)-8. 13, 14 En este estudio, los virus respiratorios se refieren al adenovirus, hCoV, hMPV, influenza, parainfluenza, RSV, enterovirus y rinovirus. La amplificación del ácido nucleico y los análisis de los productos PCR se realizaron utilizando la plataforma PCR/ESI-MS (PLEX-ID, Abbott Laboratories) siguiendo las instrucciones del fabricante, con el tiempo de retorno de la muestra hasta el resultado en un plazo de 6 a 8 horas. 8, 13 Los análisis PCR/ESI-MS incluyeron desalación automatizada de PCR, adquisición de señales ESI-MS, análisis espectral y notificación de datos. La identificación del organismo se basó en la masa total y las composiciones básicas de los amplicones PCR en comparación con las de la base de datos de firma molecular establecida por el fabricante PLEX-ID. 6, 8, 13, 14 Muestras en las que los resultados PCR/ESI-MS no estaban de acuerdo con los resultados de cultivo a nivel de especie fueron reexaminados por un segundo método molecular. Para los enterovirus, el rinovirus se distinguió del enterovirus mediante un análisis convencional de secuenciación PCR con los imprimadores descritos previamente (Rhinovirus s1 y as) y una búsqueda BLAST. 15 Todos los análisis se realizaron con el Package Statistical for the Social Sciences versión 17.0 (SPSS Inc, Chicago, IL). Las variables continuas se expresaron como valores medios desviaciones estándar de la EA y se compararon con el análisis de la prueba de varianza. Las variables categóricas se compararon con el test exacto de Fisher o x 2; todas las variables biológicamente plausibles con un valor P 0,10 en el análisis univariado se consideraron para su inclusión en el modelo de regresión logística para el análisis multivariado. Durante el período de estudio de 9 meses, se registraron 267 episodios de ITR aguda de 263 pacientes, incluyendo 96 episodios en una clínica local y 171 episodios en NCKUH (19 ambulatorios y 152 en los departamentos de urgencias); por conveniencia, cada episodio fue contado como un caso; en total, 123 (46,1%) casos fueron varones, y 152 (56,9%), 60 (22,5%) y 55 (20,6%) pacientes fueron 18 a 39, 40 a 59 y!60 años de edad, respectivamente. Doscientos y doce (79,4%) pacientes presentaron ITR superior (URTIs), y 55 (20,6%) casos presentados con ITRL. En comparación con los pacientes que asistieron a la clínica local, los pacientes que asistieron al centro de atención médica eran mayores y tenían más comorbilidades ( Tabla 1 ). Los datos demográficos detallados de los 267 casos de ITR y 42 casos de control se presentan en la Tabla 1. Las 267 muestras respiratorias de cada caso de ITR fueron examinadas por virus tanto por aislamiento del virus como por PCR/ESI-MS, y los resultados se presentan en la Tabla 2. Para el aislamiento del virus, se detectaron virus respiratorios en 63 (23,6%) casos, incluyendo influenza A (48 casos, 18,0%), enterovirus (13, 4,9%) y virus de parainfluenza (2, 0,7%) y no se detectaron coinfección. El aislamiento del virus identificó infecciones adicionales de parainfluenza tipo 3 e enterovirus que no fueron encontradas por PCR/ESI-MS en 2 muestras. Por PCR/ESI-MS, se detectaron virus respiratorios en 126 casos (47,2%). La influenza A (65 casos, 24,3%) fue el virus identificado con mayor frecuencia, de los cuales 36 (13,5%) fueron subtipos como virus pandémico H1N1/09, 28 (10,5%) como virus estacional H3N2 y 1 caso como gripe A que coincide tanto con la pandemia H1N1 como con la estacional H3N2. El enterovirus Genus (34, 12,7%) fue el segundo virus detectado con mayor frecuencia, incluyendo rinovirus (25, 9,4%), enterovirus (8, 3,0%) y 1 caso de cultivo negativo para rinovirus y enterovirus. hCoV (13, 4,9%), hMPV (10, 3,7%), adenovirus (6, 2,2%), RSV (6, 2,2%) y parainfluenza (4, 1,5%) fueron detectados en pequeñas proporciones de casos. Se observó la detección simultánea de más de un virus respiratorio en 11 (4,1%) pacientes, y el rinovirus (5 casos) fue más probable que fuera codificado con otro virus respiratorio (Tabla 2). Cabe destacar que 4 virus cultivados identificados como enterovirus debido a la reactividad con la mezcla de Chemicon Pan EV fueron caracterizados como rinovirus por PCR/ESI-MS. Un análisis posterior de las secuencias de PCR de los 4 especímenes clínicos confirmó la existencia de rinovirus pero no enterovirus. PCR/ESI-MS identificó virus respiratorios adicionales en 65 muestras de cultivo negativo, principalmente rinovirus (21 muestras), y un segundo virus respiratorio en 3 muestras de influenza A positiva para cultivo. En general, las tasas positivas de detección de cualquier virus respiratorio por cultivo, PCR/ESI-MS, y ambos métodos fueron 23,6%, 47,2% y 47,9% (128/267), respectivamente. De los 61 especímenes positivos por ambos métodos, PCR/ESI-MS y métodos de cultivo alcanzaron niveles de concordancia del 100% en el nivel de especie para influenza y parainfluenza y del 100% en el nivel de género para el género Enterovirus. En el grupo de control, sólo 1 (2,4%) individuo sano testó positivo para un virus respiratorio (rhinovirus) por PCR/ESI-MS.Con respecto a los herpesvirus, PCR/ESI-MS identificó EBV, HSV-1, CMV y VZV en 128 (47,9%), 25 (9,4%), 7 (2,6%) y 2 (0,7%) muestras de casos de ITR, con tasas de detección similares observadas en el grupo de control.No hubo detección de poliomavirus, parvovirus B19, HSV-2, o virus HHV-8 en muestras de casos con ITR o el grupo de control. Se analizaron los casos positivos para cualquier virus respiratorio, ya sea por cultivo o por PCR/ESI-MS. Las tasas de detección positivas disminuyeron con la edad: 55,3%, 41,7% y 34,5% en los grupos de 18-39, 40-59 y!60 años, respectivamente (P 1⁄4 0,02) (Figura 1A). Se observó una tasa de positividad más alta en pacientes con URTIs que en pacientes con LRTIs (50,5% frente a 38,2%, P 1⁄4 0,10) (Tabla 3 y Figura 1B ). Hubo distribución similar de virus respiratorios en casos del centro clínico y médico local (Tabla 2), y entre pacientes de los 3 grupos de edad (Figura 1A ). De 128 casos con virus respiratorios identificables, la infección por el virus no-influenza fue más frecuente en pacientes con ITRL que en pacientes con ITRL (81,0% [17/21] vs. 48,6% [52/107], P 1⁄4 0,007). Rhinovirus (12,7%), influenza A (10,9%) y parainfluenza (7,3%) fueron los 3 virus respiratorios principales involucrados en 55 casos de ITRL, y la parainfluenza se observó con más frecuencia en el grupo ITRL que en el grupo IRTL (Tabla 3 y Figura 1B ). No hubo variación estacional en ningún virus respiratorio individual durante el período de 9 meses. De 128 pacientes con virus respiratorios identificables, el análisis univariado reveló que los pacientes con 1 de las siguientes afecciones tenían más probabilidades de presentar infecciones por virus respiratorios no influenza: estado inmunocomprometido, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) e insuficiencia renal crónica en diálisis (OR 5,4, IC 95% 1,2-25,5, P 1⁄4 0,02). El análisis multivariado demostró que el uso de esteroides era un factor de riesgo independiente para la infección por rinovirus (OR 15,3; IC 95% 1,5-154,7; P 1⁄4 0,02), la neoplasia maligna activa fue un factor de riesgo independiente para la infección por hMPV (OR 29,3; IC 95% 2,4-358, P 1⁄4 0,008), y la EPOC fue un factor de riesgo independiente para la infección por parainfluenza (OR 229,2; IC 95% 10,5-5020.8.Mientras se comparaban los grupos URTI y LRTI, los factores que se encontraron asociados con LRTI por análisis univariado incluyeron la vejez (60 años), un índice de comorbilidad alto, insuficiencia cardíaca congestiva, EPOC, malignidad, estado inmunocomprometido y detección de parainfluenza o VEB, mientras que la detección de influenza A se a De los 117 episodios de infecciones por virus respiratorios, la artralgia se observó con más frecuencia en infecciones por influenza A que en infecciones por no gripe (66,1% [39/59] vs. 46,6% [27/58], P 1⁄4 0,033); para estos 2 tipos de infecciones, los otros síntomas examinados, incluyendo dolor de garganta, rinorrea, tos, esputo purulento, sibilancia, disnea y dolor de cabeza, fueron detectados a frecuencias similares. De 55 casos de IRT, la coinfección con patógenos bacterianos por cultivo de esputo o cultivo de sangre se encontró en 3 (8,8%) de 34 pacientes que dieron positivo para virus respiratorios y en 2 (9,5%) de 21 pacientes que dieron negativo para virus respiratorios. Cuatro de los 6 casos de influenza A LRTI habían recibido oseltamivir. Dos pacientes fallecieron de neumonía y el empeoramiento de una neoplasia subyacente; uno de estos pacientes resultó positivo para HMPV, y el otro resultó negativo para virus respiratorios. Cuatro Nuestro estudio de la epidemiología viral de las ITR agudas adultas utilizando tecnología PCR/ESI-MS tiene 3 ventajas principales. Primero, ampliamos los estudios previos utilizando PCR/ESI-MS para la detección de virus respiratorios. El ensayo PLEX-ID Broad Viral I, que se dirige a enterovirus, rinovirus, herpesvirus, JC y BK poliomavirus, y parvovirus B19, y las pruebas del Virus Respiratorio PLEX-ID fueron adoptadas para la detección de múltiples virus respiratorios clínicamente relevantes. En segundo lugar, se incluyeron 2 grupos de control (pacientes con infecciones exclusivamente bacterianas e individuos sin infecciones activas) para eliminar artefactos falsos positivos de NATs y estimar la prevalencia de portadores asintomáticos detectables de virus respiratorios. En tercer lugar, este estudio incluyó a pacientes inmunocompetentes e inmunocomprometidos que visitaban una clínica local o un centro médico y que se presentaron con un URTI o LRTI, lo que refleja la verdadera epidemiología viral de los ITR adultos. Al complementar el método de cultivo convencional con PCR/ESI-MS, se logró un aumento de 2 veces en la tasa de detección de virus respiratorios, de 23,6% por cultivo solo a 47,9% por una combinación de ambos métodos. Se observó ganancia diagnóstica tanto para virus culturalbles, especialmente rinovirus, como para virus fastidiosos. Aunque no se comparó una NAT alternativa debido a limitaciones de volumen de muestra, se ha reportado que PCR/ ESI-MS tiene una alta sensibilidad (92,9-100%) y especificidad (99-100%) para la detección de virus respiratorios variables en relación con métodos inmunológicos y basados en PCR como ensayos estándar de oro, con la excepción de parainfluenza (sensibilidad 63,4%). 6 Coincidentemente, encontramos que la parainfluenza tipo 3 fue 1 de sólo 2 virus que no fueron detectados por PCR/ESI-MS. Las causas potenciales que contribuyeron a la menor tasa de detección de parainfluenza permanecen por explorar. La tasa de detección positiva (47,2%) para virus respiratorios por PCR/ESI-MS en el presente estudio fue similar a la de programas paralelos de vigilancia de adultos utilizando NATs (43,2-57%). 5,16-18 pero notablemente superior a un estudio anterior utilizando el sistema de biosensores Ibis T5000 (prototipo de PCR-ESI/ MS) utilizando el kit de vigilancia del virus respiratorio II (35,9%), probablemente porque el kit no fue diseñado para la detección de enterovirus y rinovirus. 8 El enterovirus y rinovirus, ambos miembros del género Enterovirus, contribuyeron al 13,1% de los casos de ITR en nuestro estudio y el 9.8-17,8% de los casos de adultos en otros estudios. 5, 16, 17 Considerando su prevalencia, el enterovirus y el rinovirus deben ser incluidos en los paneles de diagnóstico de virus respiratorios si se indica la detección viral integral. La tasa de codetección (4,1%) estaba dentro del rango de 2,0-7,2% que se ha reportado en otras partes. 5, 16, 17 y el rinovirus fue el virus más frecuentemente involucrado en las coinfección, 18 La influenza A y el rinovirus fueron los 2 virus respiratorios detectados con mayor frecuencia, mientras que hCoV, hMPV, enterovirus, adenovirus, VRS y parainfluenza fueron detectados en pequeñas proporciones de casos, lo cual es similar a la epidemiología viral de los IRT adultos observada por otros grupos de estudio. 5, 16, 17 Las distribuciones similares de virus entre los casos de una clínica local y un centro médico y entre los pacientes de los 3 grupos de edad sugieren que los individuos de todos los grupos de edad son susceptibles a múltiples virus respiratorios que circulan simultáneamente en la comunidad. Se observó una menor tasa de detección positiva en la población anciana, probablemente porque los pacientes adultos mayores arrojan títulos más bajos de virus. 19 Sin embargo, los roles de EBV, HSV-1 y CMV en los ITR adultos permanecen incompletos 20.Además, la asociación univariada entre EBV y LTTIs observada en este estudio puede haber sido causada por el factor de confusión de la edad, particularmente dado que la edad avanzada fue identificada como un factor independiente para la detección de EBV (datos no mostrados). La falta de detección del poliomavirus BK y JC o parvovirus B19 implica que estos virus juegan un papel menor en los ITR adultos y que las células orofaríngeas no están involucradas en la persistencia del poliomavirus BK y JC. 21 Además, la baja tasa de detección positiva de virus respiratorios en el grupo control sugiere una baja posibilidad de artefactos falsos positivos en PCR/ESI-MS o una menor tasa de colonización asintomática de virus respiratorios. Además de la ventaja de la detección sensible, PCR/ ESI-MS posee la capacidad de identificación simultánea de subtipos de virus respiratorios. 22 En este estudio, los virus influenza A fueron subtipos de gripe pandémica H1N1 influenza A y estacional H3N2 influenza. En Europa, ambos virus cocircularon en la comunidad en la temporada de gripe 2012-2013. 23 En el género enterovirus, el rinovirus ácido-lábil se puede diferenciar del enterovirus mediante una prueba de labilidad ácida. 24 mientras que PCR/ESI-MS puede diferenciar rápidamente las 2 especies en una sola prueba, como se demostró en nuestro estudio. Los 13 hCoV fueron subtipos como hCoV-OC43, -229E, y -HKU1, que fue validado además por ensayos convencionales de secuencia de PCR (datos no mostrados). El nuevo HCoV-NL63 identificado no fue detectado durante el periodo de estudio, y se reportó una baja tasa de detección (<1%) en China. 16 Nuestra comprensión de los roles de los virus respiratorios no-influenza en pacientes con comorbilidades o ITRL se ha fortalecido en nuestro estudio. Los pacientes que estaban bajo tratamiento con esteroides, tenían un malignidad activa, o padecían EPOC estaban en riesgo de infecciones por rinovirus, hMPV, o parainfluenza, respectivamente. En general, los pacientes inmunocomprometidos, los pacientes con EPOC y los pacientes sometidos a diálisis estaban en riesgo de infección por virus respiratorios no-influenza. Entre los ITRL, el rinovirus y la parainfluenza fueron clasificados como los patógenos más comunes en primer y tercer lugar, respectivamente, y la parainfluenza fue un factor independiente asociado a los ITRL, un hallazgo consistente con reportes previos de que ambos virus son causas significativas de ITRL. 18, [25] [26] [27] Por otro lado, a pesar de un papel creciente de los virus respiratorios no-influenza, los agentes antivirales y las vacunas actualmente disponibles se dirigen principalmente a la infección por gripe. Aunque la ITR viral es una enfermedad autolimitada, como se observa en la mayoría de nuestros pacientes con ITRL que se recuperaron de la enfermedad sin la ayuda de agentes antivirales, un diagnóstico etiológico definido puede ayudar a reducir el uso injustificado de agentes antiinfluenza o antimicrobianos y/o hospitalizaciones innecesarias, y proporcionar información útil para Sin embargo, observamos que la diferenciación clínica de la infección por influenza de otras infecciones por virus respiratorios es difícil debido a la superposición de síntomas, como se ha descrito anteriormente. 5 En conjunto, la asociación de la infección por el virus de la no gripe con pacientes con comorbilidades o ITSL aquí reportados sugiere que un panel viral respiratorio completo sería apropiado en el diagnóstico de ITR en estas poblaciones. Los costos adicionales incurridos por el uso de un panel completo de evaluaciones basadas en PCR/ESI-MS u otras pruebas moleculares probablemente serían compensados por las reducciones concomitantes en terapia antimicrobiana innecesaria y/o hospitalización. 18 Nuestro estudio tiene algunas limitaciones. Primero, los virus respiratorios parainfluenza de tipo 4 y 3 recién identificados, bocavirus humano, poliomavirus humano KI y poliomavirus WU no fueron incluidos en los paneles. [28] [30] [31] y sus funciones en I En segundo lugar, aunque se han identificado ciertos factores de riesgo para infecciones virales específicas, como las infecciones por hMPV o parainfluenza, estas asociaciones deben ser reexaminadas en estudios clínicos a gran escala adicionales, y debe explorarse el impacto clínico y los mecanismos subyacentes de estas asociaciones. Asimismo, pueden ser necesarios más casos de control para estimar mejor la prevalencia de portadores asintomáticos de virus respiratorios. En tercer lugar, sólo se cubrieron 3 temporadas y no se pudo demostrar la estacionalidad de las infecciones respiratorias virales. En conclusión, en comparación con el aislamiento del virus, PCR/ESI-MS produjo un mayor rendimiento diagnóstico para las ITR virales, con una baja posibilidad de artefactos falsos positivos. La infección por virus respiratorios no-influenza se relacionó significativamente con pacientes con comorbilidades y con ITRL. Se justifican estudios adicionales para delinear la necesidad clínica y los beneficios económicos de incluir

¿Cuál fue la prevalencia de la coinfección?

Infecciones del tracto respiratorio viral en pacientes adultos que asisten a los departamentos de pacientes ambulatorios y de emergencia, Taiwán, 2012–2013: Estudio de espectrometría de masas de la PCR/Electrosprayhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4635751/SHA: ef6361c7bffb9e92f397d7004bfb3a9c804d7c6aAutores: Shih, Hsin-I; Wang, Hsuan-Chen; Su, Ih-Jen; Hsu, Hsiang-Chin; Wang, Jen-Ren; Sun, Hsiao Fang Sunny; Chou, Chien-Hsuan; Ko, Wen-Chien; Hsieh, Ming-I; Wu, Chi-JungFecha Además, la capacidad de la PCR/electrospray ionization mass spectrometry (PCR/ESI-MS) para detectar enterovirus y rinovirus en muestras respiratorias no ha sido bien evaluada. Tratamos de utilizar PCR/ESI-MS para investigar exhaustivamente la epidemiología viral de los ITR adultos, incluyendo pruebas de rinovirus y enterovirus. Los hisopos nasofaríngeos o de garganta de 267 adultos con ITR agudas (212 ITR superiores y 55 ITR inferiores) que visitaron una clínica local o los departamentos ambulatorios o de emergencia de un centro médico en Taiwán entre octubre de 2012 y junio de 2013 fueron probados en busca de virus respiratorios por aislamiento del virus y PCR/ESI-MS. Los virus respiratorios fueron encontrados en el 23,6%, 47,2% y 47,9% de los 267 casos por aislamiento del virus, PCR/ESI-MS y ambos métodos, respectivamente.Cuando se utilizaron ambos métodos, el virus influenza A (24,3%) y rinovirus (9,4%) fueron los virus identificados con mayor frecuencia, mientras que los coronavirus humanos, metapneumovirus humano (hMPV), enterovirus, adenovirus, virus respiratorios sincitiales y virus de la parainfluenza fueron identificados en pequeñas proporciones de casos (<5% de casos para cada tipo de virus).La coinfección se observó en el 4,1% de los casos.En el grupo control, sólo 1 (2,4%) muestra positiva para virus respiratorio por PCR/ESI-MS. Los pacientes sometidos a tratamiento con esteroides, con malignidad activa o con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) tenían riesgo de infección por rinovirus, hMPV o parainfluenza, respectivamente. En general, los pacientes inmunocomprometidos, los pacientes con EPOC y los pacientes sometidos a diálisis tenían riesgo de infección por virus respiratorios no influenza. Los rinovirus (12,7%), el virus influenza A (10,9%) y los virus parainfluenza (7,3%) fueron los virus más comunes implicados en los 55 casos de ITR inferiores. Los factores de infección por parainfluenza, vejez e inmunosupresión se asociaron de forma independiente con ITR inferiores. En conclusión, PCR/ESI-MS mejoraron el rendimiento diagnóstico de las ITR virales. Las infecciones por virus respiratorios no influenza se asociaron con pacientes con comorbilidades y con ITR inferiores. Se justifican estudios adicionales que delineen la necesidad clínica de incluir virus respiratorios no-influenza en el trabajo diagnóstico en estas poblaciones. Texto: Las infecciones de las vías respiratorias virales (IRT) en humanos ocurren durante todo el año y representan una causa importante de las visitas clínicas en todo el mundo. En el pasado, las causas virales de las ITR eran en gran parte desconocidas, principalmente debido a la insensibilidad de los métodos basados en cultivos para la detección de virus o al espectro estrecho de detección viral mediante pruebas de ácido nucleico plex único (NATs). Recientemente, el desarrollo de NATs respiratorios múltiples ha permitido la detección simultánea, rápida y sensible de múltiples virus, lo que facilita estudios exhaustivos sobre la epidemiología de las ITR virales. Actualmente, la epidemiología viral de las ITRs se ha estudiado más ampliamente entre las poblaciones pediátricas que con poblaciones adultas en todo el De manera similar, la mayoría de los estudios que describen la etiología viral de las enfermedades respiratorias en Taiwán, un país subtropical en Asia Oriental, se limitaron a poblaciones pediátricas. [2] [3] [4] Así, los estudios entre pacientes adultos carecen de estudios, particularmente en relación con infecciones por virus fastidiosos o recién identificados, como el metapneumovirus humano (hMPV) y el coronavirus humano (hCoV). La superposición de presentaciones clínicas compartidas por diferentes virus respiratorios dificulta el diagnóstico diferencial basado únicamente en los parámetros clínicos. 5 Además, los agentes antivirales eficaces están actualmente restringidos a las infecciones por virus de la gripe. Por lo tanto, una mejor comprensión de la epidemiología de las ITR virales adultas ayudaría al futuro diseño de estrategias diagnósticas, control de infecciones y manejo de pacientes. [6] [7] [8] [9] A pesar del potencial diagnóstico, la capacidad de PCR/ESI-MS para detectar enterovirus humano y rinovirus en muestras respiratorias de pacientes con ITR no ha sido bien evaluada.Los estudios anteriores de PCR/ESI-MS en pacientes con ITR no incluyeron estos 2 virus en los paneles diagnósticos. [6] [7] [8] En este caso, ampliamos estos estudios previos utilizando PCR/ESI-MS para la detección de virus respiratorios. Tratamos de investigar exhaustivamente la epidemiología de ITR virales adultos utilizando PCR/ESI-MS y comparar el desempeño diagnóstico entre PCR/ESI-MS y métodos de cultivo convencionales para identificar virus respiratorios múltiples, clínicamente relevantes, incluyendo enterovirus e rinovirus. Para realizar un estudio epidemiológico integral que incluyó a pacientes con y sin comorbilidad, se inscribió a adultos (de al menos 18 años de edad) con ITR aguda en los 7 días de inicio que fueron tratados en una clínica externa local del hospital YC o en los departamentos ambulatorios o de emergencia del Hospital Universitario Nacional Cheng-Kung (NCKUH), un centro médico afiliado a la universidad en el sur de Taiwán, entre octubre de 2012 y junio de 2013. La ITR aguda se definió como la aparición simultánea de al menos 1 síntoma o signo respiratorio (Tose nueva o empeoramiento, producción de esputo, dolor de garganta, congestión nasal, rinorrea, disnea, sibilancias o tonsias inyectadas) y al menos 1 de los siguientes síntomas: fiebre, escalofríos y tos. Para los pacientes que experimentaron más de un episodio de ITR, el episodio más reciente fue contado como separado sólo si el paciente se recuperó completamente del episodio anterior y hubo un intervalo mínimo de 3 semanas entre el inicio de los 2 episodios. Datos clínicos, de laboratorio y radiológicos y el historial de contacto de cada paciente fueron recuperados. Comorbilidades fueron evaluadas en todos los pacientes con base en el índice de comorbilidad de Charlson (ICC). 10 El uso de esteroides se definió como la recepción de tratamiento con corticosteroides (10 mg de prednisolona o una dosis diaria equivalente) durante más de 2 semanas. Se diagnosticó un estado inmunocomprometido si los pacientes cumplían una de las siguientes condiciones: tratamiento con corticosteroides, órgano sólido o receptor de células madre hematopoyéticas, o quimioterapia para una neoplasia subyacente durante los últimos 6 meses. 11 para la detección e identificación de virus tanto por aislamiento del virus como por PCR/ESI-MS. Las muestras clínicas fueron almacenadas en 48C y transportadas a los sitios del estudio dentro de las 24 horas siguientes a la recolección. Se incluyeron hisopos de garganta de 42 casos sin infecciones respiratorias durante el mes anterior a la inscripción como muestras de control para el análisis PCR/ESI-MS, incluyendo 15 pacientes con infecciones exclusivamente bacterianas (casos documentados de bacteremia o infección del tracto urinario) que fueron ingresados en NCKUH y 27 individuos sin infecciones activas. Estos sujetos sin infecciones activas incluyeron 10 pacientes con enfermedades crónicas estables seguidos en las clínicas NCKUH y 17 individuos sanos cuya información médica fue recolectada mediante un cuestionario clínico.El estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional (B-ER-101-31) del hospital del estudio, y todos los pacientes dieron consentimiento informado. Los especímenes respiratorios fueron inoculados en cultivos tisulares apropiados (Renino canino Madin-Darby, MRC-5, A549, y rabdomiosarcoma) para aislar el virus de la gripe humana, el virus de la parainfluenza, el género Enterovirus, el citomegalovirus (CMV), el adenovirus, el virus sincitial respiratorio (RSV), los virus del herpes simplex 1 y 2 (HSV-1 y -2), y el virus de la varicela zoster (VZV). El aislamiento e identificación de virus se realizaron utilizando un método descrito anteriormente 11 y los enterovirus fueron identificados mediante un ensayo de inmunofluorescencia utilizando una mezcla de Chemicon Pan EV que reacciona de forma cruzada con el rinovirus (Diágnóstico de la luz, Chemicon [Millipore], MA). 11, 12 Detección e identificación de virus por PCR/ESI-MS Los ácidos nucleicos totales se extrajeron de 700 mL de muestras de hisopo utilizando un autoextractor de ácido nucleico (MagNA Pure Compact Instrument, Mannheim, Alemania), y el eluato se almacenó en À808C hasta el análisis. Durante los análisis, los ácidos nucleicos extraídos se agregaron tanto a una placa de ensayo del virus respiratorio PLEX-ID como a una placa de ensayo de PLEX-ID Broad Viral I (PLEX-ID, Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois). El ensayo del virus respiratorio PLEX-ID detecta el adenovirus humano, hCoV, hMPV, influenza A y B, parainfluenza tipos 1 a 3 y RSV, 6 mientras que el ensayo PLEX-ID Broad Viral I detecta el adenovirus humano, enterovirus, rinovirus, poliomavirus BK y JC, parvovirus B19, HSV-1 y -2, VZV, virus Epstein-Barr (EBV), CMV y herpesvirus humano (HHV)-8. 13, 14 En este estudio, los virus respiratorios se refieren al adenovirus, hCoV, hMPV, influenza, parainfluenza, RSV, enterovirus y rinovirus. La amplificación del ácido nucleico y los análisis de los productos PCR se realizaron utilizando la plataforma PCR/ESI-MS (PLEX-ID, Abbott Laboratories) siguiendo las instrucciones del fabricante, con el tiempo de retorno de la muestra hasta el resultado en un plazo de 6 a 8 horas. 8, 13 Los análisis PCR/ESI-MS incluyeron desalación automatizada de PCR, adquisición de señales ESI-MS, análisis espectral y notificación de datos. La identificación del organismo se basó en la masa total y las composiciones básicas de los amplicones PCR en comparación con las de la base de datos de firma molecular establecida por el fabricante PLEX-ID. 6, 8, 13, 14 Muestras en las que los resultados PCR/ESI-MS no estaban de acuerdo con los resultados de cultivo a nivel de especie fueron reexaminados por un segundo método molecular. Para los enterovirus, el rinovirus se distinguió del enterovirus mediante un análisis convencional de secuenciación PCR con los imprimadores descritos previamente (Rhinovirus s1 y as) y una búsqueda BLAST. 15 Todos los análisis se realizaron con el Package Statistical for the Social Sciences versión 17.0 (SPSS Inc, Chicago, IL). Las variables continuas se expresaron como valores medios desviaciones estándar de la EA y se compararon con el análisis de la prueba de varianza. Las variables categóricas se compararon con el test exacto de Fisher o x 2; todas las variables biológicamente plausibles con un valor P 0,10 en el análisis univariado se consideraron para su inclusión en el modelo de regresión logística para el análisis multivariado. Durante el período de estudio de 9 meses, se registraron 267 episodios de ITR aguda de 263 pacientes, incluyendo 96 episodios en una clínica local y 171 episodios en NCKUH (19 ambulatorios y 152 en los departamentos de urgencias); por conveniencia, cada episodio fue contado como un caso; en total, 123 (46,1%) casos fueron varones, y 152 (56,9%), 60 (22,5%) y 55 (20,6%) pacientes fueron 18 a 39, 40 a 59 y!60 años de edad, respectivamente. Doscientos y doce (79,4%) pacientes presentaron ITR superior (URTIs), y 55 (20,6%) casos presentados con ITRL. En comparación con los pacientes que asistieron a la clínica local, los pacientes que asistieron al centro de atención médica eran mayores y tenían más comorbilidades ( Tabla 1 ). Los datos demográficos detallados de los 267 casos de ITR y 42 casos de control se presentan en la Tabla 1. Las 267 muestras respiratorias de cada caso de ITR fueron examinadas por virus tanto por aislamiento del virus como por PCR/ESI-MS, y los resultados se presentan en la Tabla 2. Para el aislamiento del virus, se detectaron virus respiratorios en 63 (23,6%) casos, incluyendo influenza A (48 casos, 18,0%), enterovirus (13, 4,9%) y virus de parainfluenza (2, 0,7%) y no se detectaron coinfección. El aislamiento del virus identificó infecciones adicionales de parainfluenza tipo 3 e enterovirus que no fueron encontradas por PCR/ESI-MS en 2 muestras. Por PCR/ESI-MS, se detectaron virus respiratorios en 126 casos (47,2%). La influenza A (65 casos, 24,3%) fue el virus identificado con mayor frecuencia, de los cuales 36 (13,5%) fueron subtipos como virus pandémico H1N1/09, 28 (10,5%) como virus estacional H3N2 y 1 caso como gripe A que coincide tanto con la pandemia H1N1 como con la estacional H3N2. El enterovirus Genus (34, 12,7%) fue el segundo virus detectado con mayor frecuencia, incluyendo rinovirus (25, 9,4%), enterovirus (8, 3,0%) y 1 caso de cultivo negativo para rinovirus y enterovirus. hCoV (13, 4,9%), hMPV (10, 3,7%), adenovirus (6, 2,2%), RSV (6, 2,2%) y parainfluenza (4, 1,5%) fueron detectados en pequeñas proporciones de casos. Se observó la detección simultánea de más de un virus respiratorio en 11 (4,1%) pacientes, y el rinovirus (5 casos) fue más probable que fuera codificado con otro virus respiratorio (Tabla 2). Cabe destacar que 4 virus cultivados identificados como enterovirus debido a la reactividad con la mezcla de Chemicon Pan EV fueron caracterizados como rinovirus por PCR/ESI-MS. Un análisis posterior de las secuencias de PCR de los 4 especímenes clínicos confirmó la existencia de rinovirus pero no enterovirus. PCR/ESI-MS identificó virus respiratorios adicionales en 65 muestras de cultivo negativo, principalmente rinovirus (21 muestras), y un segundo virus respiratorio en 3 muestras de influenza A positiva para cultivo. En general, las tasas positivas de detección de cualquier virus respiratorio por cultivo, PCR/ESI-MS, y ambos métodos fueron 23,6%, 47,2% y 47,9% (128/267), respectivamente. De los 61 especímenes positivos por ambos métodos, PCR/ESI-MS y métodos de cultivo alcanzaron niveles de concordancia del 100% en el nivel de especie para influenza y parainfluenza y del 100% en el nivel de género para el género Enterovirus. En el grupo de control, sólo 1 (2,4%) individuo sano testó positivo para un virus respiratorio (rhinovirus) por PCR/ESI-MS.Con respecto a los herpesvirus, PCR/ESI-MS identificó EBV, HSV-1, CMV y VZV en 128 (47,9%), 25 (9,4%), 7 (2,6%) y 2 (0,7%) muestras de casos de ITR, con tasas de detección similares observadas en el grupo de control.No hubo detección de poliomavirus, parvovirus B19, HSV-2, o virus HHV-8 en muestras de casos con ITR o el grupo de control. Se analizaron los casos positivos para cualquier virus respiratorio, ya sea por cultivo o por PCR/ESI-MS. Las tasas de detección positivas disminuyeron con la edad: 55,3%, 41,7% y 34,5% en los grupos de 18-39, 40-59 y!60 años, respectivamente (P 1⁄4 0,02) (Figura 1A). Se observó una tasa de positividad más alta en pacientes con URTIs que en pacientes con LRTIs (50,5% frente a 38,2%, P 1⁄4 0,10) (Tabla 3 y Figura 1B ). Hubo distribución similar de virus respiratorios en casos del centro clínico y médico local (Tabla 2), y entre pacientes de los 3 grupos de edad (Figura 1A ). De 128 casos con virus respiratorios identificables, la infección por el virus no-influenza fue más frecuente en pacientes con ITRL que en pacientes con ITRL (81,0% [17/21] vs. 48,6% [52/107], P 1⁄4 0,007). Rhinovirus (12,7%), influenza A (10,9%) y parainfluenza (7,3%) fueron los 3 virus respiratorios principales involucrados en 55 casos de ITRL, y la parainfluenza se observó con más frecuencia en el grupo ITRL que en el grupo IRTL (Tabla 3 y Figura 1B ). No hubo variación estacional en ningún virus respiratorio individual durante el período de 9 meses. De 128 pacientes con virus respiratorios identificables, el análisis univariado reveló que los pacientes con 1 de las siguientes afecciones tenían más probabilidades de presentar infecciones por virus respiratorios no influenza: estado inmunocomprometido, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) e insuficiencia renal crónica en diálisis (OR 5,4, IC 95% 1,2-25,5, P 1⁄4 0,02). El análisis multivariado demostró que el uso de esteroides era un factor de riesgo independiente para la infección por rinovirus (OR 15,3; IC 95% 1,5-154,7; P 1⁄4 0,02), la neoplasia maligna activa fue un factor de riesgo independiente para la infección por hMPV (OR 29,3; IC 95% 2,4-358, P 1⁄4 0,008), y la EPOC fue un factor de riesgo independiente para la infección por parainfluenza (OR 229,2; IC 95% 10,5-5020.8.Mientras se comparaban los grupos URTI y LRTI, los factores que se encontraron asociados con LRTI por análisis univariado incluyeron la vejez (60 años), un índice de comorbilidad alto, insuficiencia cardíaca congestiva, EPOC, neoplasia, estado inmunocomprometido y detección de parainfluenza o VEB, mientras que la detección de influenza A se aso De los 117 episodios de infecciones por virus respiratorios, la artralgia se observó con más frecuencia en infecciones por influenza A que en infecciones por no gripe (66,1% [39/59] vs. 46,6% [27/58], P 1⁄4 0,033); para estos 2 tipos de infecciones, los otros síntomas examinados, incluyendo dolor de garganta, rinorrea, tos, esputo purulento, sibilancias, disnea y dolor de cabeza, fueron detectados a frecuencias similares. De 55 casos de IRT, la coinfección con patógenos bacterianos por cultivo de esputo o cultivo de sangre se encontró en 3 (8,8%) de 34 pacientes que dieron positivo para virus respiratorios y en 2 (9,5%) de 21 pacientes que dieron negativo para virus respiratorios. Cuatro de los 6 casos de influenza A LRTI habían recibido oseltamivir. Dos pacientes fallecieron de neumonía y el empeoramiento de una neoplasia subyacente; uno de estos pacientes resultó positivo para HMPV, y el otro resultó negativo para virus respiratorios. Cuatro Nuestro estudio de la epidemiología viral de las ITR agudas adultas utilizando tecnología PCR/ESI-MS tiene 3 ventajas principales. Primero, ampliamos los estudios previos utilizando PCR/ESI-MS para la detección de virus respiratorios. El ensayo PLEX-ID Broad Viral I, que se dirige a enterovirus, rinovirus, herpesvirus, JC y BK poliomavirus, y parvovirus B19, y las pruebas del Virus Respiratorio PLEX-ID fueron adoptadas para la detección de múltiples virus respiratorios clínicamente relevantes. En segundo lugar, se incluyeron 2 grupos de control (pacientes con infecciones exclusivamente bacterianas e individuos sin infecciones activas) para eliminar artefactos falsos positivos de NATs y estimar la prevalencia de portadores asintomáticos detectables de virus respiratorios. En tercer lugar, este estudio incluyó a pacientes inmunocompetentes e inmunocomprometidos que visitaban una clínica local o un centro médico y que se presentaron con un URTI o LRTI, lo que refleja la verdadera epidemiología viral de los ITR adultos. Al complementar el método de cultivo convencional con PCR/ESI-MS, se logró un aumento de 2 veces en la tasa de detección de virus respiratorios, de 23,6% por cultivo solo a 47,9% por una combinación de ambos métodos. Se observó ganancia diagnóstica tanto para virus culturalbles, especialmente rinovirus, como para virus fastidiosos. Aunque no se comparó una NAT alternativa debido a limitaciones de volumen de muestra, se ha reportado que PCR/ ESI-MS tiene una alta sensibilidad (92,9-100%) y especificidad (99-100%) para la detección de virus respiratorios variables en relación con métodos inmunológicos y basados en PCR como ensayos estándar de oro, con la excepción de parainfluenza (sensibilidad 63,4%). 6 Coincidentemente, encontramos que la parainfluenza tipo 3 fue 1 de sólo 2 virus que no fueron detectados por PCR/ESI-MS. Las causas potenciales que contribuyeron a la menor tasa de detección de parainfluenza permanecen por explorar. La tasa de detección positiva (47,2%) para virus respiratorios por PCR/ESI-MS en el presente estudio fue similar a la de programas paralelos de vigilancia de adultos utilizando NATs (43,2-57%). 5,16-18 pero notablemente superior a un estudio anterior utilizando el sistema de biosensores Ibis T5000 (prototipo de PCR-ESI/ MS) utilizando el kit de vigilancia del virus respiratorio II (35,9%), probablemente porque el kit no fue diseñado para la detección de enterovirus y rinovirus. 8 El enterovirus y rinovirus, ambos miembros del género Enterovirus, contribuyeron al 13,1% de los casos de ITR en nuestro estudio y el 9.8-17,8% de los casos de adultos en otros estudios. 5, 16, 17 Considerando su prevalencia, el enterovirus y el rinovirus deben ser incluidos en los paneles de diagnóstico de virus respiratorios si se indica la detección viral integral. La tasa de codetección (4,1%) estaba dentro del rango de 2,0-7,2% que se ha reportado en otras partes. 5, 16, 17 y el rinovirus fue el virus más frecuentemente involucrado en las coinfección, 18 La influenza A y el rinovirus fueron los 2 virus respiratorios detectados con mayor frecuencia, mientras que hCoV, hMPV, enterovirus, adenovirus, VRS y parainfluenza fueron detectados en pequeñas proporciones de casos, lo cual es similar a la epidemiología viral de los IRT adultos observada por otros grupos de estudio. 5, 16, 17 Las distribuciones similares de virus entre los casos de una clínica local y un centro médico y entre los pacientes de los 3 grupos de edad sugieren que los individuos de todos los grupos de edad son susceptibles a múltiples virus respiratorios que circulan simultáneamente en la comunidad. Se observó una menor tasa de detección positiva en la población anciana, probablemente porque los pacientes adultos mayores arrojan títulos más bajos de virus. 19 Sin embargo, los roles de EBV, HSV-1 y CMV en los ITR adultos permanecen incompletos 20.Además, la asociación univariada entre EBV y LTTIs observada en este estudio puede haber sido causada por el factor de confusión de la edad, particularmente dado que la edad avanzada fue identificada como un factor independiente para la detección de EBV (datos no mostrados). La falta de detección del poliomavirus BK y JC o parvovirus B19 implica que estos virus juegan un papel menor en los ITR adultos y que las células orofaríngeas no están involucradas en la persistencia del poliomavirus BK y JC. 21 Además, la baja tasa de detección positiva de virus respiratorios en el grupo control sugiere una baja posibilidad de artefactos falsos positivos en PCR/ESI-MS o una menor tasa de colonización asintomática de virus respiratorios. Además de la ventaja de la detección sensible, PCR/ ESI-MS posee la capacidad de identificación simultánea de subtipos de virus respiratorios. 22 En este estudio, los virus influenza A fueron subtipos de gripe pandémica H1N1 influenza A y estacional H3N2 influenza. En Europa, ambos virus cocircularon en la comunidad en la temporada de gripe 2012-2013. 23 En el género enterovirus, el rinovirus ácido-lábil se puede diferenciar del enterovirus mediante una prueba de labilidad ácida. 24 mientras que PCR/ESI-MS puede diferenciar rápidamente las 2 especies en una sola prueba, como se demostró en nuestro estudio. Los 13 hCoV fueron subtipos como hCoV-OC43, -229E, y -HKU1, que fue validado además por ensayos convencionales de secuencia de PCR (datos no mostrados). El nuevo HCoV-NL63 identificado no fue detectado durante el periodo de estudio, y se reportó una baja tasa de detección (<1%) en China. 16 Nuestra comprensión de los roles de los virus respiratorios no-influenza en pacientes con comorbilidades o ITRL se ha fortalecido en nuestro estudio. Los pacientes que estaban bajo tratamiento con esteroides, tenían un malignidad activa, o padecían EPOC estaban en riesgo de infecciones por rinovirus, hMPV, o parainfluenza, respectivamente. En general, los pacientes inmunocomprometidos, los pacientes con EPOC y los pacientes sometidos a diálisis estaban en riesgo de infección por virus respiratorios no-influenza. Entre los ITRL, el rinovirus y la parainfluenza fueron clasificados como los patógenos más comunes en primer y tercer lugar, respectivamente, y la parainfluenza fue un factor independiente asociado a los ITRL, un hallazgo consistente con reportes previos de que ambos virus son causas significativas de ITRL. 18, [25] [26] [27] Por otro lado, a pesar de un papel creciente de los virus respiratorios no-influenza, los agentes antivirales y las vacunas actualmente disponibles se dirigen principalmente a la infección por gripe. Aunque la ITR viral es una enfermedad autolimitada, como se observa en la mayoría de nuestros pacientes con ITRL que se recuperaron de la enfermedad sin la ayuda de agentes antivirales, un diagnóstico etiológico definido puede ayudar a reducir el uso injustificado de agentes antiinfluenza o antimicrobianos y/o hospitalizaciones innecesarias, y proporcionar información útil para Sin embargo, observamos que la diferenciación clínica de la infección por influenza de otras infecciones por virus respiratorios es difícil debido a la superposición de síntomas, como se ha descrito anteriormente. 5 En conjunto, la asociación de la infección por el virus de la no gripe con pacientes con comorbilidades o ITSL aquí reportados sugiere que un panel viral respiratorio completo sería apropiado en el diagnóstico de ITR en estas poblaciones. Los costos adicionales incurridos por el uso de un panel completo de evaluaciones basadas en PCR/ESI-MS u otras pruebas moleculares probablemente serían compensados por las reducciones concomitantes en terapia antimicrobiana innecesaria y/o hospitalización. 18 Nuestro estudio tiene algunas limitaciones. Primero, los virus respiratorios parainfluenza de tipo 4 y 3 recién identificados, bocavirus humano, poliomavirus humano KI y poliomavirus WU no fueron incluidos en los paneles. [28] [30] [31] y sus funciones en I En segundo lugar, aunque se han identificado ciertos factores de riesgo para infecciones virales específicas, como las infecciones por hMPV o parainfluenza, estas asociaciones deben ser reexaminadas en estudios clínicos a gran escala adicionales, y debe explorarse el impacto clínico y los mecanismos subyacentes de estas asociaciones. Asimismo, pueden ser necesarios más casos de control para estimar mejor la prevalencia de portadores asintomáticos de virus respiratorios. En tercer lugar, sólo se cubrieron 3 temporadas y no se pudo demostrar la estacionalidad de las infecciones respiratorias virales. En conclusión, en comparación con el aislamiento del virus, PCR/ESI-MS produjo un mayor rendimiento diagnóstico para las ITR virales, con una baja posibilidad de artefactos falsos positivos. La infección por virus respiratorios no-influenza se relacionó significativamente con pacientes con comorbilidades y con ITRL. Se justifican estudios adicionales para delinear la necesidad clínica y los beneficios económicos de incluir

¿Cuál fue la duración del estudio?

Infecciones del tracto respiratorio viral en pacientes adultos que asisten a los departamentos de pacientes ambulatorios y de emergencia, Taiwán, 2012–2013: Estudio de espectrometría de masas de la PCR/Electrosprayhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4635751/SHA: ef6361c7bffb9e92f397d7004bfb3a9c804d7c6aAutores: Shih, Hsin-I; Wang, Hsuan-Chen; Su, Ih-Jen; Hsu, Hsiang-Chin; Wang, Jen-Ren; Sun, Hsiao Fang Sunny; Chou, Chien-Hsuan; Ko, Wen-Chien; Hsieh, Ming-I; Wu, Chi-JungFecha Además, la capacidad de la PCR/electrospray ionization mass spectrometry (PCR/ESI-MS) para detectar enterovirus y rinovirus en muestras respiratorias no ha sido bien evaluada. Tratamos de utilizar PCR/ESI-MS para investigar exhaustivamente la epidemiología viral de los ITR adultos, incluyendo pruebas de rinovirus y enterovirus. Los hisopos nasofaríngeos o de garganta de 267 adultos con ITR agudas (212 ITR superiores y 55 ITR inferiores) que visitaron una clínica local o los departamentos ambulatorios o de emergencia de un centro médico en Taiwán entre octubre de 2012 y junio de 2013 fueron probados en busca de virus respiratorios por aislamiento del virus y PCR/ESI-MS. Los virus respiratorios fueron encontrados en el 23,6%, 47,2% y 47,9% de los 267 casos por aislamiento del virus, PCR/ESI-MS y ambos métodos, respectivamente.Cuando se utilizaron ambos métodos, el virus influenza A (24,3%) y rinovirus (9,4%) fueron los virus identificados con mayor frecuencia, mientras que los coronavirus humanos, metapneumovirus humano (hMPV), enterovirus, adenovirus, virus respiratorios sincitiales y virus de la parainfluenza fueron identificados en pequeñas proporciones de casos (<5% de casos para cada tipo de virus).La coinfección se observó en el 4,1% de los casos.En el grupo control, sólo 1 (2,4%) muestra positiva para virus respiratorio por PCR/ESI-MS. Los pacientes sometidos a tratamiento con esteroides, con malignidad activa o con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) tenían riesgo de infección por rinovirus, hMPV o parainfluenza, respectivamente. En general, los pacientes inmunocomprometidos, los pacientes con EPOC y los pacientes sometidos a diálisis tenían riesgo de infección por virus respiratorios no influenza. Los rinovirus (12,7%), el virus influenza A (10,9%) y los virus parainfluenza (7,3%) fueron los virus más comunes implicados en los 55 casos de ITR inferiores. Los factores de infección por parainfluenza, vejez e inmunosupresión se asociaron de forma independiente con ITR inferiores. En conclusión, PCR/ESI-MS mejoraron el rendimiento diagnóstico de las ITR virales. Las infecciones por virus respiratorios no influenza se asociaron con pacientes con comorbilidades y con ITR inferiores. Se justifican estudios adicionales que delineen la necesidad clínica de incluir virus respiratorios no-influenza en el trabajo diagnóstico en estas poblaciones. Texto: Las infecciones de las vías respiratorias virales (IRT) en humanos ocurren durante todo el año y representan una causa importante de las visitas clínicas en todo el mundo. En el pasado, las causas virales de las ITR eran en gran parte desconocidas, principalmente debido a la insensibilidad de los métodos basados en cultivos para la detección de virus o al espectro estrecho de detección viral mediante pruebas de ácido nucleico plex único (NATs). Recientemente, el desarrollo de NATs respiratorios múltiples ha permitido la detección simultánea, rápida y sensible de múltiples virus, lo que facilita estudios exhaustivos sobre la epidemiología de las ITR virales. Actualmente, la epidemiología viral de las ITRs se ha estudiado más ampliamente entre las poblaciones pediátricas que con poblaciones adultas en todo el De manera similar, la mayoría de los estudios que describen la etiología viral de las enfermedades respiratorias en Taiwán, un país subtropical en Asia Oriental, se limitaron a poblaciones pediátricas. [2] [3] [4] Así, los estudios entre pacientes adultos carecen de estudios, particularmente en relación con infecciones por virus fastidiosos o recién identificados, como el metapneumovirus humano (hMPV) y el coronavirus humano (hCoV). La superposición de presentaciones clínicas compartidas por diferentes virus respiratorios dificulta el diagnóstico diferencial basado únicamente en los parámetros clínicos. 5 Además, los agentes antivirales eficaces están actualmente restringidos a las infecciones por virus de la gripe. Por lo tanto, una mejor comprensión de la epidemiología de las ITR virales adultas ayudaría al futuro diseño de estrategias diagnósticas, control de infecciones y manejo de pacientes. [6] [7] [8] [9] A pesar del potencial diagnóstico, la capacidad de PCR/ESI-MS para detectar enterovirus humano y rinovirus en muestras respiratorias de pacientes con ITR no ha sido bien evaluada.Los estudios anteriores de PCR/ESI-MS en pacientes con ITR no incluyeron estos 2 virus en los paneles diagnósticos. [6] [7] [8] En este caso, ampliamos estos estudios previos utilizando PCR/ESI-MS para la detección de virus respiratorios. Tratamos de investigar exhaustivamente la epidemiología de ITR virales adultos utilizando PCR/ESI-MS y comparar el desempeño diagnóstico entre PCR/ESI-MS y métodos de cultivo convencionales para identificar virus respiratorios múltiples, clínicamente relevantes, incluyendo enterovirus e rinovirus. Para realizar un estudio epidemiológico integral que incluyó a pacientes con y sin comorbilidad, se inscribió a adultos (de al menos 18 años de edad) con ITR aguda en los 7 días de inicio que fueron tratados en una clínica externa local del hospital YC o en los departamentos ambulatorios o de emergencia del Hospital Universitario Nacional Cheng-Kung (NCKUH), un centro médico afiliado a la universidad en el sur de Taiwán, entre octubre de 2012 y junio de 2013. La ITR aguda se definió como la aparición simultánea de al menos 1 síntoma o signo respiratorio (Tose nueva o empeoramiento, producción de esputo, dolor de garganta, congestión nasal, rinorrea, disnea, sibilancias o tonsias inyectadas) y al menos 1 de los siguientes síntomas: fiebre, escalofríos y tos. Para los pacientes que experimentaron más de un episodio de ITR, el episodio más reciente fue contado como separado sólo si el paciente se recuperó completamente del episodio anterior y hubo un intervalo mínimo de 3 semanas entre el inicio de los 2 episodios. Datos clínicos, de laboratorio y radiológicos y el historial de contacto de cada paciente fueron recuperados. Comorbilidades fueron evaluadas en todos los pacientes con base en el índice de comorbilidad de Charlson (ICC). 10 El uso de esteroides se definió como la recepción de tratamiento con corticosteroides (10 mg de prednisolona o una dosis diaria equivalente) durante más de 2 semanas. Se diagnosticó un estado inmunocomprometido si los pacientes cumplían una de las siguientes condiciones: tratamiento con corticosteroides, órgano sólido o receptor de células madre hematopoyéticas, o quimioterapia para una neoplasia subyacente durante los últimos 6 meses. 11 para la detección e identificación de virus tanto por aislamiento del virus como por PCR/ESI-MS. Las muestras clínicas fueron almacenadas en 48C y transportadas a los sitios del estudio dentro de las 24 horas siguientes a la recolección. Se incluyeron hisopos de garganta de 42 casos sin infecciones respiratorias durante el mes anterior a la inscripción como muestras de control para el análisis PCR/ESI-MS, incluyendo 15 pacientes con infecciones exclusivamente bacterianas (casos documentados de bacteremia o infección del tracto urinario) que fueron ingresados en NCKUH y 27 individuos sin infecciones activas. Estos sujetos sin infecciones activas incluyeron 10 pacientes con enfermedades crónicas estables seguidos en las clínicas NCKUH y 17 individuos sanos cuya información médica fue recolectada mediante un cuestionario clínico.El estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional (B-ER-101-31) del hospital del estudio, y todos los pacientes dieron consentimiento informado. Los especímenes respiratorios fueron inoculados en cultivos tisulares apropiados (Renino canino Madin-Darby, MRC-5, A549, y rabdomiosarcoma) para aislar el virus de la gripe humana, el virus de la parainfluenza, el género Enterovirus, el citomegalovirus (CMV), el adenovirus, el virus sincitial respiratorio (RSV), los virus del herpes simplex 1 y 2 (HSV-1 y -2), y el virus de la varicela zoster (VZV). El aislamiento e identificación de virus se realizaron utilizando un método descrito anteriormente 11 y los enterovirus fueron identificados mediante un ensayo de inmunofluorescencia utilizando una mezcla de Chemicon Pan EV que reacciona de forma cruzada con el rinovirus (Diágnóstico de la luz, Chemicon [Millipore], MA). 11, 12 Detección e identificación de virus por PCR/ESI-MS Los ácidos nucleicos totales se extrajeron de 700 mL de muestras de hisopo utilizando un autoextractor de ácido nucleico (MagNA Pure Compact Instrument, Mannheim, Alemania), y el eluato se almacenó en À808C hasta el análisis. Durante los análisis, los ácidos nucleicos extraídos se agregaron tanto a una placa de ensayo del virus respiratorio PLEX-ID como a una placa de ensayo de PLEX-ID Broad Viral I (PLEX-ID, Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois). El ensayo del virus respiratorio PLEX-ID detecta el adenovirus humano, hCoV, hMPV, influenza A y B, parainfluenza tipos 1 a 3 y RSV, 6 mientras que el ensayo PLEX-ID Broad Viral I detecta el adenovirus humano, enterovirus, rinovirus, poliomavirus BK y JC, parvovirus B19, HSV-1 y -2, VZV, virus Epstein-Barr (EBV), CMV y herpesvirus humano (HHV)-8. 13, 14 En este estudio, los virus respiratorios se refieren al adenovirus, hCoV, hMPV, influenza, parainfluenza, RSV, enterovirus y rinovirus. La amplificación del ácido nucleico y los análisis de los productos PCR se realizaron utilizando la plataforma PCR/ESI-MS (PLEX-ID, Abbott Laboratories) siguiendo las instrucciones del fabricante, con el tiempo de retorno de la muestra hasta el resultado en un plazo de 6 a 8 horas. 8, 13 Los análisis PCR/ESI-MS incluyeron desalación automatizada de PCR, adquisición de señales ESI-MS, análisis espectral y notificación de datos. La identificación del organismo se basó en la masa total y las composiciones básicas de los amplicones PCR en comparación con las de la base de datos de firma molecular establecida por el fabricante PLEX-ID. 6, 8, 13, 14 Muestras en las que los resultados PCR/ESI-MS no estaban de acuerdo con los resultados de cultivo a nivel de especie fueron reexaminados por un segundo método molecular. Para los enterovirus, el rinovirus se distinguió del enterovirus mediante un análisis convencional de secuenciación PCR con los imprimadores descritos previamente (Rhinovirus s1 y as) y una búsqueda BLAST. 15 Todos los análisis se realizaron con el Package Statistical for the Social Sciences versión 17.0 (SPSS Inc, Chicago, IL). Las variables continuas se expresaron como valores medios desviaciones estándar de la EA y se compararon con el análisis de la prueba de varianza. Las variables categóricas se compararon con el test exacto de Fisher o x 2; todas las variables biológicamente plausibles con un valor P 0,10 en el análisis univariado se consideraron para su inclusión en el modelo de regresión logística para el análisis multivariado. Durante el período de estudio de 9 meses, se registraron 267 episodios de ITR aguda de 263 pacientes, incluyendo 96 episodios en una clínica local y 171 episodios en NCKUH (19 ambulatorios y 152 en los departamentos de urgencias); por conveniencia, cada episodio fue contado como un caso; en total, 123 (46,1%) casos fueron varones, y 152 (56,9%), 60 (22,5%) y 55 (20,6%) pacientes fueron 18 a 39, 40 a 59 y!60 años de edad, respectivamente. Doscientos y doce (79,4%) pacientes presentaron ITR superior (URTIs), y 55 (20,6%) casos presentados con ITRL. En comparación con los pacientes que asistieron a la clínica local, los pacientes que asistieron al centro de atención médica eran mayores y tenían más comorbilidades ( Tabla 1 ). Los datos demográficos detallados de los 267 casos de ITR y 42 casos de control se presentan en la Tabla 1. Las 267 muestras respiratorias de cada caso de ITR fueron examinadas por virus tanto por aislamiento del virus como por PCR/ESI-MS, y los resultados se presentan en la Tabla 2. Para el aislamiento del virus, se detectaron virus respiratorios en 63 (23,6%) casos, incluyendo influenza A (48 casos, 18,0%), enterovirus (13, 4,9%) y virus de parainfluenza (2, 0,7%) y no se detectaron coinfección. El aislamiento del virus identificó infecciones adicionales de parainfluenza tipo 3 e enterovirus que no fueron encontradas por PCR/ESI-MS en 2 muestras. Por PCR/ESI-MS, se detectaron virus respiratorios en 126 casos (47,2%). La influenza A (65 casos, 24,3%) fue el virus identificado con mayor frecuencia, de los cuales 36 (13,5%) fueron subtipos como virus pandémico H1N1/09, 28 (10,5%) como virus estacional H3N2 y 1 caso como gripe A que coincide tanto con la pandemia H1N1 como con la estacional H3N2. El enterovirus Genus (34, 12,7%) fue el segundo virus detectado con mayor frecuencia, incluyendo rinovirus (25, 9,4%), enterovirus (8, 3,0%) y 1 caso de cultivo negativo para rinovirus y enterovirus. hCoV (13, 4,9%), hMPV (10, 3,7%), adenovirus (6, 2,2%), RSV (6, 2,2%) y parainfluenza (4, 1,5%) fueron detectados en pequeñas proporciones de casos. Se observó la detección simultánea de más de un virus respiratorio en 11 (4,1%) pacientes, y el rinovirus (5 casos) fue más probable que fuera codificado con otro virus respiratorio (Tabla 2). Cabe destacar que 4 virus cultivados identificados como enterovirus debido a la reactividad con la mezcla de Chemicon Pan EV fueron caracterizados como rinovirus por PCR/ESI-MS. Un análisis posterior de las secuencias de PCR de los 4 especímenes clínicos confirmó la existencia de rinovirus pero no enterovirus. PCR/ESI-MS identificó virus respiratorios adicionales en 65 muestras de cultivo negativo, principalmente rinovirus (21 muestras), y un segundo virus respiratorio en 3 muestras de influenza A positiva para cultivo. En general, las tasas positivas de detección de cualquier virus respiratorio por cultivo, PCR/ESI-MS, y ambos métodos fueron 23,6%, 47,2% y 47,9% (128/267), respectivamente. De los 61 especímenes positivos por ambos métodos, PCR/ESI-MS y métodos de cultivo alcanzaron niveles de concordancia del 100% en el nivel de especie para influenza y parainfluenza y del 100% en el nivel de género para el género Enterovirus. En el grupo de control, sólo 1 (2,4%) individuo sano testó positivo para un virus respiratorio (rhinovirus) por PCR/ESI-MS.Con respecto a los herpesvirus, PCR/ESI-MS identificó EBV, HSV-1, CMV y VZV en 128 (47,9%), 25 (9,4%), 7 (2,6%) y 2 (0,7%) muestras de casos de ITR, con tasas de detección similares observadas en el grupo de control.No hubo detección de poliomavirus, parvovirus B19, HSV-2, o virus HHV-8 en muestras de casos con ITR o el grupo de control. Se analizaron los casos positivos para cualquier virus respiratorio, ya sea por cultivo o por PCR/ESI-MS. Las tasas de detección positivas disminuyeron con la edad: 55,3%, 41,7% y 34,5% en los grupos de 18-39, 40-59 y!60 años, respectivamente (P 1⁄4 0,02) (Figura 1A). Se observó una tasa de positividad más alta en pacientes con URTIs que en pacientes con LRTIs (50,5% frente a 38,2%, P 1⁄4 0,10) (Tabla 3 y Figura 1B ). Hubo distribución similar de virus respiratorios en casos del centro clínico y médico local (Tabla 2), y entre pacientes de los 3 grupos de edad (Figura 1A ). De 128 casos con virus respiratorios identificables, la infección por el virus no-influenza fue más frecuente en pacientes con ITRL que en pacientes con ITRL (81,0% [17/21] vs. 48,6% [52/107], P 1⁄4 0,007). Rhinovirus (12,7%), influenza A (10,9%) y parainfluenza (7,3%) fueron los 3 virus respiratorios principales involucrados en 55 casos de ITRL, y la parainfluenza se observó con más frecuencia en el grupo ITRL que en el grupo IRTL (Tabla 3 y Figura 1B ). No hubo variación estacional en ningún virus respiratorio individual durante el período de 9 meses. De 128 pacientes con virus respiratorios identificables, el análisis univariado reveló que los pacientes con 1 de las siguientes afecciones tenían más probabilidades de presentar infecciones por virus respiratorios no influenza: estado inmunocomprometido, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) e insuficiencia renal crónica en diálisis (OR 5,4, IC 95% 1,2-25,5, P 1⁄4 0,02). El análisis multivariado demostró que el uso de esteroides era un factor de riesgo independiente para la infección por rinovirus (OR 15,3; IC 95% 1,5-154,7; P 1⁄4 0,02), la neoplasia maligna activa fue un factor de riesgo independiente para la infección por hMPV (OR 29,3; IC 95% 2,4-358, P 1⁄4 0,008), y la EPOC fue un factor de riesgo independiente para la infección por parainfluenza (OR 229,2; IC 95% 10,5-5020.8.Mientras se comparaban los grupos URTI y LRTI, los factores que se encontraron asociados con LRTI por análisis univariado incluyeron la vejez (60 años), un índice de comorbilidad alto, insuficiencia cardíaca congestiva, EPOC, neoplasia, estado inmunocomprometido y detección de parainfluenza o VEB, mientras que la detección de influenza A se aso De los 117 episodios de infecciones por virus respiratorios, la artralgia se observó con más frecuencia en infecciones por influenza A que en infecciones por no gripe (66,1% [39/59] vs. 46,6% [27/58], P 1⁄4 0,033); para estos 2 tipos de infecciones, los otros síntomas examinados, incluyendo dolor de garganta, rinorrea, tos, esputo purulento, sibilancias, disnea y dolor de cabeza, fueron detectados a frecuencias similares. De 55 casos de IRT, la coinfección con patógenos bacterianos por cultivo de esputo o cultivo de sangre se encontró en 3 (8,8%) de 34 pacientes que dieron positivo para virus respiratorios y en 2 (9,5%) de 21 pacientes que dieron negativo para virus respiratorios. Cuatro de los 6 casos de influenza A LRTI habían recibido oseltamivir. Dos pacientes fallecieron de neumonía y el empeoramiento de una neoplasia subyacente; uno de estos pacientes resultó positivo para HMPV, y el otro resultó negativo para virus respiratorios. Cuatro Nuestro estudio de la epidemiología viral de las ITR agudas adultas utilizando tecnología PCR/ESI-MS tiene 3 ventajas principales. Primero, ampliamos los estudios previos utilizando PCR/ESI-MS para la detección de virus respiratorios. El ensayo PLEX-ID Broad Viral I, que se dirige a enterovirus, rinovirus, herpesvirus, JC y BK poliomavirus, y parvovirus B19, y las pruebas del Virus Respiratorio PLEX-ID fueron adoptadas para la detección de múltiples virus respiratorios clínicamente relevantes. En segundo lugar, se incluyeron 2 grupos de control (pacientes con infecciones exclusivamente bacterianas e individuos sin infecciones activas) para eliminar artefactos falsos positivos de NATs y estimar la prevalencia de portadores asintomáticos detectables de virus respiratorios. En tercer lugar, este estudio incluyó a pacientes inmunocompetentes e inmunocomprometidos que visitaban una clínica local o un centro médico y que se presentaron con un URTI o LRTI, lo que refleja la verdadera epidemiología viral de los ITR adultos. Al complementar el método de cultivo convencional con PCR/ESI-MS, se logró un aumento de 2 veces en la tasa de detección de virus respiratorios, de 23,6% por cultivo solo a 47,9% por una combinación de ambos métodos. Se observó ganancia diagnóstica tanto para virus culturalbles, especialmente rinovirus, como para virus fastidiosos. Aunque no se comparó una NAT alternativa debido a limitaciones de volumen de muestra, se ha reportado que PCR/ ESI-MS tiene una alta sensibilidad (92,9-100%) y especificidad (99-100%) para la detección de virus respiratorios variables en relación con métodos inmunológicos y basados en PCR como ensayos estándar de oro, con la excepción de parainfluenza (sensibilidad 63,4%). 6 Coincidentemente, encontramos que la parainfluenza tipo 3 fue 1 de sólo 2 virus que no fueron detectados por PCR/ESI-MS. Las causas potenciales que contribuyeron a la menor tasa de detección de parainfluenza permanecen por explorar. La tasa de detección positiva (47,2%) para virus respiratorios por PCR/ESI-MS en el presente estudio fue similar a la de programas paralelos de vigilancia de adultos utilizando NATs (43,2-57%). 5,16-18 pero notablemente superior a un estudio anterior utilizando el sistema de biosensores Ibis T5000 (prototipo de PCR-ESI/ MS) utilizando el kit de vigilancia del virus respiratorio II (35,9%), probablemente porque el kit no fue diseñado para la detección de enterovirus y rinovirus. 8 El enterovirus y rinovirus, ambos miembros del género Enterovirus, contribuyeron al 13,1% de los casos de ITR en nuestro estudio y el 9.8-17,8% de los casos de adultos en otros estudios. 5, 16, 17 Considerando su prevalencia, el enterovirus y el rinovirus deben ser incluidos en los paneles de diagnóstico de virus respiratorios si se indica la detección viral integral. La tasa de codetección (4,1%) estaba dentro del rango de 2,0-7,2% que se ha reportado en otras partes. 5, 16, 17 y el rinovirus fue el virus más frecuentemente involucrado en las coinfección, 18 La influenza A y el rinovirus fueron los 2 virus respiratorios detectados con mayor frecuencia, mientras que hCoV, hMPV, enterovirus, adenovirus, VRS y parainfluenza fueron detectados en pequeñas proporciones de casos, lo cual es similar a la epidemiología viral de los IRT adultos observada por otros grupos de estudio. 5, 16, 17 Las distribuciones similares de virus entre los casos de una clínica local y un centro médico y entre los pacientes de los 3 grupos de edad sugieren que los individuos de todos los grupos de edad son susceptibles a múltiples virus respiratorios que circulan simultáneamente en la comunidad. Se observó una menor tasa de detección positiva en la población anciana, probablemente porque los pacientes adultos mayores arrojan títulos más bajos de virus. 19 Sin embargo, los roles de EBV, HSV-1 y CMV en los ITR adultos permanecen incompletos 20.Además, la asociación univariada entre EBV y LTTIs observada en este estudio puede haber sido causada por el factor de confusión de la edad, particularmente dado que la edad avanzada fue identificada como un factor independiente para la detección de EBV (datos no mostrados). La falta de detección del poliomavirus BK y JC o parvovirus B19 implica que estos virus juegan un papel menor en los ITR adultos y que las células orofaríngeas no están involucradas en la persistencia del poliomavirus BK y JC. 21 Además, la baja tasa de detección positiva de virus respiratorios en el grupo control sugiere una baja posibilidad de artefactos falsos positivos en PCR/ESI-MS o una menor tasa de colonización asintomática de virus respiratorios. Además de la ventaja de la detección sensible, PCR/ ESI-MS posee la capacidad de identificación simultánea de subtipos de virus respiratorios. 22 En este estudio, los virus influenza A fueron subtipos de gripe pandémica H1N1 influenza A y estacional H3N2 influenza. En Europa, ambos virus cocircularon en la comunidad en la temporada de gripe 2012-2013. 23 En el género enterovirus, el rinovirus ácido-lábil se puede diferenciar del enterovirus mediante una prueba de labilidad ácida. 24 mientras que PCR/ESI-MS puede diferenciar rápidamente las 2 especies en una sola prueba, como se demostró en nuestro estudio. Los 13 hCoV fueron subtipos como hCoV-OC43, -229E, y -HKU1, que fue validado además por ensayos convencionales de secuencia de PCR (datos no mostrados). El nuevo HCoV-NL63 identificado no fue detectado durante el periodo de estudio, y se reportó una baja tasa de detección (<1%) en China. 16 Nuestra comprensión de los roles de los virus respiratorios no-influenza en pacientes con comorbilidades o ITRL se ha fortalecido en nuestro estudio. Los pacientes que estaban bajo tratamiento con esteroides, tenían un malignidad activa, o padecían EPOC estaban en riesgo de infecciones por rinovirus, hMPV, o parainfluenza, respectivamente. En general, los pacientes inmunocomprometidos, los pacientes con EPOC y los pacientes sometidos a diálisis estaban en riesgo de infección por virus respiratorios no-influenza. Entre los ITRL, el rinovirus y la parainfluenza fueron clasificados como los patógenos más comunes en primer y tercer lugar, respectivamente, y la parainfluenza fue un factor independiente asociado a los ITRL, un hallazgo consistente con reportes previos de que ambos virus son causas significativas de ITRL. 18, [25] [26] [27] Por otro lado, a pesar de un papel creciente de los virus respiratorios no-influenza, los agentes antivirales y las vacunas actualmente disponibles se dirigen principalmente a la infección por gripe. Aunque la ITR viral es una enfermedad autolimitada, como se observa en la mayoría de nuestros pacientes con ITRL que se recuperaron de la enfermedad sin la ayuda de agentes antivirales, un diagnóstico etiológico definido puede ayudar a reducir el uso injustificado de agentes antiinfluenza o antimicrobianos y/o hospitalizaciones innecesarias, y proporcionar información útil para Sin embargo, observamos que la diferenciación clínica de la infección por influenza de otras infecciones por virus respiratorios es difícil debido a la superposición de síntomas, como se ha descrito anteriormente. 5 En conjunto, la asociación de la infección por el virus de la no gripe con pacientes con comorbilidades o ITSL aquí reportados sugiere que un panel viral respiratorio completo sería apropiado en el diagnóstico de ITR en estas poblaciones. Los costos adicionales incurridos por el uso de un panel completo de evaluaciones basadas en PCR/ESI-MS u otras pruebas moleculares probablemente serían compensados por las reducciones concomitantes en terapia antimicrobiana innecesaria y/o hospitalización. 18 Nuestro estudio tiene algunas limitaciones. Primero, los virus respiratorios parainfluenza de tipo 4 y 3 recién identificados, bocavirus humano, poliomavirus humano KI y poliomavirus WU no fueron incluidos en los paneles. [28] [30] [31] y sus funciones en I En segundo lugar, aunque se han identificado ciertos factores de riesgo para infecciones virales específicas, como las infecciones por hMPV o parainfluenza, estas asociaciones deben ser reexaminadas en estudios clínicos a gran escala adicionales, y debe explorarse el impacto clínico y los mecanismos subyacentes de estas asociaciones. Asimismo, pueden ser necesarios más casos de control para estimar mejor la prevalencia de portadores asintomáticos de virus respiratorios. En tercer lugar, sólo se cubrieron 3 temporadas y no se pudo demostrar la estacionalidad de las infecciones respiratorias virales. En conclusión, en comparación con el aislamiento del virus, PCR/ESI-MS produjo un mayor rendimiento diagnóstico para las ITR virales, con una baja posibilidad de artefactos falsos positivos. La infección por virus respiratorios no-influenza se relacionó significativamente con pacientes con comorbilidades y con ITRL. Se justifican estudios adicionales para delinear la necesidad clínica y los beneficios económicos de incluir

¿Cuántos pacientes tenían ITR agudas?

Infecciones del tracto respiratorio viral en pacientes adultos que asisten a los departamentos de pacientes ambulatorios y de emergencia, Taiwán, 2012–2013: Estudio de espectrometría de masas de la PCR/Electrosprayhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4635751/SHA: ef6361c7bffb9e92f397d7004bfb3a9c804d7c6aAutores: Shih, Hsin-I; Wang, Hsuan-Chen; Su, Ih-Jen; Hsu, Hsiang-Chin; Wang, Jen-Ren; Sun, Hsiao Fang Sunny; Chou, Chien-Hsuan; Ko, Wen-Chien; Hsieh, Ming-I; Wu, Chi-JungFecha Además, la capacidad de la PCR/electrospray ionization mass spectrometry (PCR/ESI-MS) para detectar enterovirus y rinovirus en muestras respiratorias no ha sido bien evaluada. Tratamos de utilizar PCR/ESI-MS para investigar exhaustivamente la epidemiología viral de los ITR adultos, incluyendo pruebas de rinovirus y enterovirus. Los hisopos nasofaríngeos o de garganta de 267 adultos con ITR agudas (212 ITR superiores y 55 ITR inferiores) que visitaron una clínica local o los departamentos ambulatorios o de emergencia de un centro médico en Taiwán entre octubre de 2012 y junio de 2013 fueron probados en busca de virus respiratorios por aislamiento del virus y PCR/ESI-MS. Los virus respiratorios fueron encontrados en el 23,6%, 47,2% y 47,9% de los 267 casos por aislamiento del virus, PCR/ESI-MS y ambos métodos, respectivamente.Cuando se utilizaron ambos métodos, el virus influenza A (24,3%) y rinovirus (9,4%) fueron los virus identificados con mayor frecuencia, mientras que los coronavirus humanos, metapneumovirus humano (hMPV), enterovirus, adenovirus, virus respiratorios sincitiales y virus de la parainfluenza fueron identificados en pequeñas proporciones de casos (<5% de casos para cada tipo de virus).La coinfección se observó en el 4,1% de los casos.En el grupo control, sólo 1 (2,4%) muestra positiva para virus respiratorio por PCR/ESI-MS. Los pacientes sometidos a tratamiento con esteroides, con malignidad activa o con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) tenían riesgo de infección por rinovirus, hMPV o parainfluenza, respectivamente. En general, los pacientes inmunocomprometidos, los pacientes con EPOC y los pacientes sometidos a diálisis tenían riesgo de infección por virus respiratorios no influenza. Los rinovirus (12,7%), el virus influenza A (10,9%) y los virus parainfluenza (7,3%) fueron los virus más comunes implicados en los 55 casos de ITR inferiores. Los factores de infección por parainfluenza, vejez e inmunosupresión se asociaron de forma independiente con ITR inferiores. En conclusión, PCR/ESI-MS mejoraron el rendimiento diagnóstico de las ITR virales. Las infecciones por virus respiratorios no influenza se asociaron con pacientes con comorbilidades y con ITR inferiores. Se justifican estudios adicionales que delineen la necesidad clínica de incluir virus respiratorios no-influenza en el trabajo diagnóstico en estas poblaciones. Texto: Las infecciones de las vías respiratorias virales (IRT) en humanos ocurren durante todo el año y representan una causa importante de las visitas clínicas en todo el mundo. En el pasado, las causas virales de las ITR eran en gran parte desconocidas, principalmente debido a la insensibilidad de los métodos basados en cultivos para la detección de virus o al espectro estrecho de detección viral mediante pruebas de ácido nucleico plex único (NATs). Recientemente, el desarrollo de NATs respiratorios múltiples ha permitido la detección simultánea, rápida y sensible de múltiples virus, lo que facilita estudios exhaustivos sobre la epidemiología de las ITR virales. Actualmente, la epidemiología viral de las ITRs se ha estudiado más ampliamente entre las poblaciones pediátricas que con poblaciones adultas en todo el De manera similar, la mayoría de los estudios que describen la etiología viral de las enfermedades respiratorias en Taiwán, un país subtropical en Asia Oriental, se limitaron a poblaciones pediátricas. [2] [3] [4] Así, los estudios entre pacientes adultos carecen de estudios, particularmente en relación con infecciones por virus fastidiosos o recién identificados, como el metapneumovirus humano (hMPV) y el coronavirus humano (hCoV). La superposición de presentaciones clínicas compartidas por diferentes virus respiratorios dificulta el diagnóstico diferencial basado únicamente en los parámetros clínicos. 5 Además, los agentes antivirales eficaces están actualmente restringidos a las infecciones por virus de la gripe. Por lo tanto, una mejor comprensión de la epidemiología de las ITR virales adultas ayudaría al futuro diseño de estrategias diagnósticas, control de infecciones y manejo de pacientes. [6] [7] [8] [9] A pesar del potencial diagnóstico, la capacidad de PCR/ESI-MS para detectar enterovirus humano y rinovirus en muestras respiratorias de pacientes con ITR no ha sido bien evaluada.Los estudios anteriores de PCR/ESI-MS en pacientes con ITR no incluyeron estos 2 virus en los paneles diagnósticos. [6] [7] [8] En este caso, ampliamos estos estudios previos utilizando PCR/ESI-MS para la detección de virus respiratorios. Tratamos de investigar exhaustivamente la epidemiología de ITR virales adultos utilizando PCR/ESI-MS y comparar el desempeño diagnóstico entre PCR/ESI-MS y métodos de cultivo convencionales para identificar virus respiratorios múltiples, clínicamente relevantes, incluyendo enterovirus e rinovirus. Para realizar un estudio epidemiológico integral que incluyó a pacientes con y sin comorbilidad, se inscribió a adultos (de al menos 18 años de edad) con ITR aguda en los 7 días de inicio que fueron tratados en una clínica externa local del hospital YC o en los departamentos ambulatorios o de emergencia del Hospital Universitario Nacional Cheng-Kung (NCKUH), un centro médico afiliado a la universidad en el sur de Taiwán, entre octubre de 2012 y junio de 2013. La ITR aguda se definió como la aparición simultánea de al menos 1 síntoma o signo respiratorio (Tose nueva o empeoramiento, producción de esputo, dolor de garganta, congestión nasal, rinorrea, disnea, sibilancias o tonsias inyectadas) y al menos 1 de los siguientes síntomas: fiebre, escalofríos y tos. Para los pacientes que experimentaron más de un episodio de ITR, el episodio más reciente fue contado como separado sólo si el paciente se recuperó completamente del episodio anterior y hubo un intervalo mínimo de 3 semanas entre el inicio de los 2 episodios. Datos clínicos, de laboratorio y radiológicos y el historial de contacto de cada paciente fueron recuperados. Comorbilidades fueron evaluadas en todos los pacientes con base en el índice de comorbilidad de Charlson (ICC). 10 El uso de esteroides se definió como la recepción de tratamiento con corticosteroides (10 mg de prednisolona o una dosis diaria equivalente) durante más de 2 semanas. Se diagnosticó un estado inmunocomprometido si los pacientes cumplían una de las siguientes condiciones: tratamiento con corticosteroides, órgano sólido o receptor de células madre hematopoyéticas, o quimioterapia para una neoplasia subyacente durante los últimos 6 meses. 11 para la detección e identificación de virus tanto por aislamiento del virus como por PCR/ESI-MS. Las muestras clínicas fueron almacenadas en 48C y transportadas a los sitios del estudio dentro de las 24 horas siguientes a la recolección. Se incluyeron hisopos de garganta de 42 casos sin infecciones respiratorias durante el mes anterior a la inscripción como muestras de control para el análisis PCR/ESI-MS, incluyendo 15 pacientes con infecciones exclusivamente bacterianas (casos documentados de bacteremia o infección del tracto urinario) que fueron ingresados en NCKUH y 27 individuos sin infecciones activas. Estos sujetos sin infecciones activas incluyeron 10 pacientes con enfermedades crónicas estables seguidos en las clínicas NCKUH y 17 individuos sanos cuya información médica fue recolectada mediante un cuestionario clínico.El estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional (B-ER-101-31) del hospital del estudio, y todos los pacientes dieron consentimiento informado. Los especímenes respiratorios fueron inoculados en cultivos tisulares apropiados (Renino canino Madin-Darby, MRC-5, A549, y rabdomiosarcoma) para aislar el virus de la gripe humana, el virus de la parainfluenza, el género Enterovirus, el citomegalovirus (CMV), el adenovirus, el virus sincitial respiratorio (RSV), los virus del herpes simplex 1 y 2 (HSV-1 y -2), y el virus de la varicela zoster (VZV). El aislamiento e identificación de virus se realizaron utilizando un método descrito anteriormente 11 y los enterovirus fueron identificados mediante un ensayo de inmunofluorescencia utilizando una mezcla de Chemicon Pan EV que reacciona de forma cruzada con el rinovirus (Diágnóstico de la luz, Chemicon [Millipore], MA). 11, 12 Detección e identificación de virus por PCR/ESI-MS Los ácidos nucleicos totales se extrajeron de 700 mL de muestras de hisopo utilizando un autoextractor de ácido nucleico (MagNA Pure Compact Instrument, Mannheim, Alemania), y el eluato se almacenó en À808C hasta el análisis. Durante los análisis, los ácidos nucleicos extraídos se agregaron tanto a una placa de ensayo del virus respiratorio PLEX-ID como a una placa de ensayo de PLEX-ID Broad Viral I (PLEX-ID, Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois). El ensayo del virus respiratorio PLEX-ID detecta el adenovirus humano, hCoV, hMPV, influenza A y B, parainfluenza tipos 1 a 3 y RSV, 6 mientras que el ensayo PLEX-ID Broad Viral I detecta el adenovirus humano, enterovirus, rinovirus, poliomavirus BK y JC, parvovirus B19, HSV-1 y -2, VZV, virus Epstein-Barr (EBV), CMV y herpesvirus humano (HHV)-8. 13, 14 En este estudio, los virus respiratorios se refieren al adenovirus, hCoV, hMPV, influenza, parainfluenza, RSV, enterovirus y rinovirus. La amplificación del ácido nucleico y los análisis de los productos PCR se realizaron utilizando la plataforma PCR/ESI-MS (PLEX-ID, Abbott Laboratories) siguiendo las instrucciones del fabricante, con el tiempo de retorno de la muestra hasta el resultado en un plazo de 6 a 8 horas. 8, 13 Los análisis PCR/ESI-MS incluyeron desalación automatizada de PCR, adquisición de señales ESI-MS, análisis espectral y notificación de datos. La identificación del organismo se basó en la masa total y las composiciones básicas de los amplicones PCR en comparación con las de la base de datos de firma molecular establecida por el fabricante PLEX-ID. 6, 8, 13, 14 Muestras en las que los resultados PCR/ESI-MS no estaban de acuerdo con los resultados de cultivo a nivel de especie fueron reexaminados por un segundo método molecular. Para los enterovirus, el rinovirus se distinguió del enterovirus mediante un análisis convencional de secuenciación PCR con los imprimadores descritos previamente (Rhinovirus s1 y as) y una búsqueda BLAST. 15 Todos los análisis se realizaron con el Package Statistical for the Social Sciences versión 17.0 (SPSS Inc, Chicago, IL). Las variables continuas se expresaron como valores medios desviaciones estándar de la EA y se compararon con el análisis de la prueba de varianza. Las variables categóricas se compararon con el test exacto de Fisher o x 2; todas las variables biológicamente plausibles con un valor P 0,10 en el análisis univariado se consideraron para su inclusión en el modelo de regresión logística para el análisis multivariado. Durante el período de estudio de 9 meses, se registraron 267 episodios de ITR aguda de 263 pacientes, incluyendo 96 episodios en una clínica local y 171 episodios en NCKUH (19 ambulatorios y 152 en los departamentos de urgencias); por conveniencia, cada episodio fue contado como un caso; en total, 123 (46,1%) casos fueron varones, y 152 (56,9%), 60 (22,5%) y 55 (20,6%) pacientes fueron 18 a 39, 40 a 59 y!60 años de edad, respectivamente. Doscientos y doce (79,4%) pacientes presentaron ITR superior (URTIs), y 55 (20,6%) casos presentados con ITRL. En comparación con los pacientes que asistieron a la clínica local, los pacientes que asistieron al centro de atención médica eran mayores y tenían más comorbilidades ( Tabla 1 ). Los datos demográficos detallados de los 267 casos de ITR y 42 casos de control se presentan en la Tabla 1. Las 267 muestras respiratorias de cada caso de ITR fueron examinadas por virus tanto por aislamiento del virus como por PCR/ESI-MS, y los resultados se presentan en la Tabla 2. Para el aislamiento del virus, se detectaron virus respiratorios en 63 (23,6%) casos, incluyendo influenza A (48 casos, 18,0%), enterovirus (13, 4,9%) y virus de parainfluenza (2, 0,7%) y no se detectaron coinfección. El aislamiento del virus identificó infecciones adicionales de parainfluenza tipo 3 e enterovirus que no fueron encontradas por PCR/ESI-MS en 2 muestras. Por PCR/ESI-MS, se detectaron virus respiratorios en 126 casos (47,2%). La gripe A (65 casos, 24,3%) fue el virus identificado con mayor frecuencia, de los cuales 36 (13,5%) fueron subtipos como virus pandémico H1N1/09, 28 (10,5%) como virus estacional H3N2 y 1 caso como gripe A que coincide tanto con la pandemia H1N1 como con la estacional H3N2. El enterovirus Genus (34, 12,7%) fue el segundo virus detectado con mayor frecuencia, incluyendo rinovirus (25, 9,4%), enterovirus (8, 3,0%) y 1 caso de cultivo negativo para rinovirus y enterovirus. hCoV (13, 4, 9%), hMPV (10, 3,7%), adenovirus (6, 2,2%), RSV (6, 2,2%) y parainfluenza (4, 1,5%) fueron detectados en pequeñas proporciones de casos. Se observó la detección simultánea de más de un virus respiratorio en 11 (4,1%) pacientes, y el rinovirus (5 casos) fue más probable que fuera codificado con otro virus respiratorio (Tabla 2). Cabe destacar que 4 virus cultivados identificados como enterovirus debido a la reactividad con la mezcla de Chemicon Pan EV fueron caracterizados como rinovirus por PCR/ESI-MS. Un análisis posterior de las secuencias de PCR de los 4 especímenes clínicos confirmó la existencia de rinovirus pero no enterovirus. PCR/ESI-MS identificó virus respiratorios adicionales en 65 muestras de cultivo negativo, principalmente rinovirus (21 muestras), y un segundo virus respiratorio en 3 muestras de influenza A positiva para cultivo. En general, las tasas positivas de detección de cualquier virus respiratorio por cultivo, PCR/ESI-MS, y ambos métodos fueron 23,6%, 47,2% y 47,9% (128/267), respectivamente. De los 61 especímenes positivos por ambos métodos, PCR/ESI-MS y métodos de cultivo alcanzaron niveles de concordancia del 100% en el nivel de especie para influenza y parainfluenza y del 100% en el nivel de género para el género Enterovirus. En el grupo de control, sólo 1 (2,4%) individuo sano testó positivo para un virus respiratorio (rhinovirus) por PCR/ESI-MS.Con respecto a los herpesvirus, PCR/ESI-MS identificó EBV, HSV-1, CMV y VZV en 128 (47,9%), 25 (9,4%), 7 (2,6%) y 2 (0,7%) muestras de casos de ITR, con tasas de detección similares observadas en el grupo de control.No hubo detección de poliomavirus, parvovirus B19, HSV-2, o virus HHV-8 en muestras de casos con ITR o el grupo de control. Se analizaron los casos positivos para cualquier virus respiratorio, ya sea por cultivo o por PCR/ESI-MS. Las tasas de detección positivas disminuyeron con la edad: 55,3%, 41,7% y 34,5% en los grupos de 18-39, 40-59 y!60 años, respectivamente (P 1⁄4 0,02) (Figura 1A). Se observó una tasa de positividad más alta en pacientes con URTIs que en pacientes con LRTIs (50,5% frente a 38,2%, P 1⁄4 0,10) (Tabla 3 y Figura 1B ). Hubo distribución similar de virus respiratorios en casos del centro clínico y médico local (Tabla 2), y entre pacientes de los 3 grupos de edad (Figura 1A ). De 128 casos con virus respiratorios identificables, la infección por el virus no-influenza fue más frecuente en pacientes con ITRL que en pacientes con ITRL (81,0% [17/21] vs. 48,6% [52/107], P 1⁄4 0,007). Rhinovirus (12,7%), influenza A (10,9%) y parainfluenza (7,3%) fueron los 3 virus respiratorios principales involucrados en 55 casos de ITRL, y la parainfluenza se observó con más frecuencia en el grupo ITRL que en el grupo IRTL (Tabla 3 y Figura 1B ). No hubo variación estacional en ningún virus respiratorio individual durante el período de 9 meses. De 128 pacientes con virus respiratorios identificables, el análisis univariado reveló que los pacientes con 1 de las siguientes afecciones tenían más probabilidades de presentar infecciones por virus respiratorios no influenza: estado inmunocomprometido, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) e insuficiencia renal crónica en diálisis (OR 5,4, IC 95% 1,2-25,5, P 1⁄4 0,02). El análisis multivariado demostró que el uso de esteroides era un factor de riesgo independiente para la infección por rinovirus (OR 15,3; IC 95% 1,5-154,7; P 1⁄4 0,02), la neoplasia maligna activa fue un factor de riesgo independiente para la infección por hMPV (OR 29,3; IC 95% 2,4-358, P 1⁄4 0,008), y la EPOC fue un factor de riesgo independiente para la infección por parainfluenza (OR 229,2; IC 95% 10,5-5020.8.Mientras se comparaban los grupos URTI y LRTI, los factores que se encontraron asociados con LRTI por análisis univariado incluyeron la vejez (60 años), un índice de comorbilidad alto, insuficiencia cardíaca congestiva, EPOC, neoplasia, estado inmunocomprometido y detección de parainfluenza o VEB, mientras que la detección de influenza A se aso De los 117 episodios de infecciones por virus respiratorios, la artralgia se observó con más frecuencia en infecciones por influenza A que en infecciones por no gripe (66,1% [39/59] vs. 46,6% [27/58], P 1⁄4 0,033); para estos 2 tipos de infecciones, los otros síntomas examinados, incluyendo dolor de garganta, rinorrea, tos, esputo purulento, sibilancia, disnea y dolor de cabeza, fueron detectados a frecuencias similares. De 55 casos de IRT, la coinfección con patógenos bacterianos por cultivo de esputo o hemocultivo se encontró en 3 (8,8%) de 34 pacientes que dieron positivo para virus respiratorios y en 2 (9,5%) de 21 pacientes que dieron negativo para virus respiratorios. Cuatro de los 6 casos de influenza A LRTI habían recibido oseltamivir. Dos pacientes fallecieron de neumonía y el empeoramiento de una neoplasia subyacente; uno de estos pacientes resultó positivo para HMPV, y el otro resultó negativo para virus respiratorios. Cuatro Nuestro estudio de la epidemiología viral de las ITR agudas adultas utilizando tecnología PCR/ESI-MS tiene 3 ventajas principales. Primero, ampliamos los estudios previos utilizando PCR/ESI-MS para la detección de virus respiratorios. El ensayo PLEX-ID Broad Viral I, que se dirige a enterovirus, rinovirus, herpesvirus, JC y BK poliomavirus, y parvovirus B19, y las pruebas del Virus Respiratorio PLEX-ID fueron adoptadas para la detección de múltiples virus respiratorios clínicamente relevantes. En segundo lugar, se incluyeron 2 grupos de control (pacientes con infecciones exclusivamente bacterianas e individuos sin infecciones activas) para eliminar artefactos falsos positivos de NATs y estimar la prevalencia de portadores asintomáticos detectables de virus respiratorios. En tercer lugar, este estudio incluyó a pacientes inmunocompetentes e inmunocomprometidos que visitaban una clínica local o un centro médico y que se presentaron con un URTI o LRTI, lo que refleja la verdadera epidemiología viral de los ITR adultos. Al complementar el método de cultivo convencional con PCR/ESI-MS, se logró un aumento de 2 veces en la tasa de detección de virus respiratorios, de 23,6% por cultivo solo a 47,9% por una combinación de ambos métodos. Se observó ganancia diagnóstica tanto para virus culturalbles, especialmente rinovirus, como para virus fastidiosos. Aunque no se comparó una NAT alternativa debido a limitaciones de volumen de muestra, se ha reportado que PCR/ ESI-MS tiene una alta sensibilidad (92,9-100%) y especificidad (99-100%) para la detección de virus respiratorios variables en relación con métodos inmunológicos y basados en PCR como ensayos estándar de oro, con la excepción de parainfluenza (sensibilidad 63,4%). 6 Coincidentemente, encontramos que la parainfluenza tipo 3 fue 1 de sólo 2 virus que no fueron detectados por PCR/ESI-MS. Las causas potenciales que contribuyeron a la menor tasa de detección de parainfluenza permanecen por explorar. La tasa de detección positiva (47,2%) para virus respiratorios por PCR/ESI-MS en el presente estudio fue similar a la de programas paralelos de vigilancia de adultos utilizando NATs (43,2-57%). 5,16-18 pero notablemente superior a un estudio anterior utilizando el sistema de biosensores Ibis T5000 (prototipo de PCR-ESI/ MS) utilizando el kit de vigilancia del virus respiratorio II (35,9%), probablemente porque el kit no fue diseñado para la detección de enterovirus y rinovirus. 8 El enterovirus y rinovirus, ambos miembros del género Enterovirus, contribuyeron al 13,1% de los casos de ITR en nuestro estudio y el 9.8-17,8% de los casos de adultos en otros estudios. 5, 16, 17 Considerando su prevalencia, el enterovirus y el rinovirus deben ser incluidos en los paneles de diagnóstico de virus respiratorios si se indica la detección viral integral. La tasa de codetección (4,1%) estaba dentro del rango de 2,0-7,2% que se ha reportado en otras partes. 5, 16, 17 y el rinovirus fue el virus más frecuentemente involucrado en las coinfección, 18 La influenza A y el rinovirus fueron los 2 virus respiratorios detectados con mayor frecuencia, mientras que hCoV, hMPV, enterovirus, adenovirus, VRS y parainfluenza fueron detectados en pequeñas proporciones de casos, lo cual es similar a la epidemiología viral de los IRT adultos observada por otros grupos de estudio. 5, 16, 17 Las distribuciones similares de virus entre los casos de una clínica local y un centro médico y entre los pacientes de los 3 grupos de edad sugieren que los individuos de todos los grupos de edad son susceptibles a múltiples virus respiratorios que circulan simultáneamente en la comunidad. Se observó una menor tasa de detección positiva en la población anciana, probablemente porque los pacientes adultos mayores arrojan títulos más bajos de virus. 19 Sin embargo, los roles de EBV, HSV-1 y CMV en los ITR adultos permanecen incompletos 20.Además, la asociación univariada entre EBV y LTTIs observada en este estudio puede haber sido causada por el factor de confusión de la edad, particularmente dado que la edad avanzada fue identificada como un factor independiente para la detección de EBV (datos no mostrados). La falta de detección del poliomavirus BK y JC o parvovirus B19 implica que estos virus juegan un papel menor en los ITR adultos y que las células orofaríngeas no están involucradas en la persistencia del poliomavirus BK y JC. 21 Además, la baja tasa de detección positiva de virus respiratorios en el grupo control sugiere una baja posibilidad de artefactos falsos positivos en PCR/ESI-MS o una menor tasa de colonización asintomática de virus respiratorios. Además de la ventaja de la detección sensible, PCR/ ESI-MS posee la capacidad de identificación simultánea de subtipos de virus respiratorios. 22 En este estudio, los virus influenza A fueron subtipos de gripe pandémica H1N1 influenza A y estacional H3N2 influenza. En Europa, ambos virus cocircularon en la comunidad en la temporada de gripe 2012-2013. 23 En el género enterovirus, el rinovirus ácido-lábil se puede diferenciar del enterovirus mediante una prueba de labilidad ácida. 24 mientras que PCR/ESI-MS puede diferenciar rápidamente las 2 especies en una sola prueba, como se demostró en nuestro estudio. Los 13 hCoV fueron subtipos como hCoV-OC43, -229E, y -HKU1, que fue validado además por ensayos convencionales de secuencia de PCR (datos no mostrados). El nuevo HCoV-NL63 identificado no fue detectado durante el periodo de estudio, y se reportó una baja tasa de detección (<1%) en China. 16 Nuestra comprensión de los roles de los virus respiratorios no-influenza en pacientes con comorbilidades o ITRL se ha fortalecido en nuestro estudio. Los pacientes que estaban bajo tratamiento con esteroides, tenían un malignidad activa, o padecían EPOC estaban en riesgo de infecciones por rinovirus, hMPV, o parainfluenza, respectivamente. En general, los pacientes inmunocomprometidos, los pacientes con EPOC y los pacientes sometidos a diálisis estaban en riesgo de infección por virus respiratorios no-influenza. Entre los ITRL, el rinovirus y la parainfluenza fueron clasificados como los patógenos más comunes en primer y tercer lugar, respectivamente, y la parainfluenza fue un factor independiente asociado a los ITRL, un hallazgo consistente con reportes previos de que ambos virus son causas significativas de ITRL. 18, [25] [26] [27] Por otro lado, a pesar de un papel creciente de los virus respiratorios no-influenza, los agentes antivirales y las vacunas actualmente disponibles se dirigen principalmente a la infección por gripe. Aunque la ITR viral es una enfermedad autolimitada, como se observa en la mayoría de nuestros pacientes con ITRL que se recuperaron de la enfermedad sin la ayuda de agentes antivirales, un diagnóstico etiológico definido puede ayudar a reducir el uso injustificado de agentes antiinfluenza o antimicrobianos y/o hospitalizaciones innecesarias, y proporcionar información útil para Sin embargo, observamos que la diferenciación clínica de la infección por influenza de otras infecciones por virus respiratorios es difícil debido a la superposición de síntomas, como se ha descrito anteriormente. 5 En conjunto, la asociación de la infección por el virus de la no gripe con pacientes con comorbilidades o ITSL aquí reportados sugiere que un panel viral respiratorio completo sería apropiado en el diagnóstico de ITR en estas poblaciones. Los costos adicionales incurridos por el uso de un panel completo de evaluaciones basadas en PCR/ESI-MS u otras pruebas moleculares probablemente serían compensados por las reducciones concomitantes en terapia antimicrobiana innecesaria y/o hospitalización. 18 Nuestro estudio tiene algunas limitaciones. Primero, los virus respiratorios parainfluenza de tipo 4 y 3 recién identificados, bocavirus humano, poliomavirus humano KI y poliomavirus WU no fueron incluidos en los paneles. [28] [30] [31] y sus funciones en I En segundo lugar, aunque se han identificado ciertos factores de riesgo para infecciones virales específicas, como las infecciones por hMPV o parainfluenza, estas asociaciones deben ser reexaminadas en estudios clínicos a gran escala adicionales, y debe explorarse el impacto clínico y los mecanismos subyacentes de estas asociaciones. Asimismo, pueden ser necesarios más casos de control para estimar mejor la prevalencia de portadores asintomáticos de virus respiratorios. En tercer lugar, sólo se cubrieron 3 temporadas y no se pudo demostrar la estacionalidad de las infecciones respiratorias virales. En conclusión, en comparación con el aislamiento del virus, PCR/ESI-MS produjo un mayor rendimiento diagnóstico para las ITR virales, con una baja posibilidad de artefactos falsos positivos. La infección por virus respiratorios no-influenza se relacionó significativamente con pacientes con comorbilidades y con ITRL. Se justifican estudios adicionales para delinear la necesidad clínica y los beneficios económicos de incluir

¿Cuál fue la coinfección más frecuente?

Una oveja súper extendida infecta a cientos de personas con fiebre Q en un mercado de agricultores en Alemaniahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1618839/SHA: ee1b5a9618dcc4080ed100486cedd0969e80fa4dAutores: Porten, Klaudia; Rissland, Jürgen; Tigges, Almira; Broll, Susanne; Hopp, Wilfried; Lunemann, Mechthild; van Treeck, Ulrich; Kimmig, Peter; Brockmann, Stefan O; Wagner-Wiening, Christiane; Hellenbrand, Wiebke; Buchholz, UdoFecha: 2006-10-06DOI: 10.1186/1471-2334-6-147Licencia: cc- MÉTODOS: En las entrevistas exploratorias los pacientes mencionaron haber visitado un mercado de agricultores donde una oveja había labrado. Las pruebas serológicas confirmaron el diagnóstico de fiebre Q. Se pidió a los departamentos de salud locales de Alemania que identificaran a los pacientes con fiebre Q que habían visitado el mercado de agricultores. Para investigar los factores de riesgo de infección se realizó un estudio de control de casos (los casos fueron pacientes con fiebre Q, los controles fueron seleccionados al azar ciudadanos soest) y un estudio de cohorte entre los vendedores en el mercado. Las ovejas exhibieron en el mercado, el rebaño del que se originó, así como ovejas de rebaños mantenidos en las proximidades de Soest se probaron para Coxiella burnetii (C. burnetii). RESULTADOS: Un total de 299 casos de fiebre Q reportados se vincularon a este brote. El período medio de incubación fue de 21 días, con un El estudio de control de casos identificó como factores de riesgo significativos la proximidad y parada de al menos unos pocos segundos en el corral de ovejas. Los vendedores dentro de aproximadamente 6 metros del corral de ovejas tuvieron mayor riesgo de enfermedad en comparación con los ubicados más lejos. El viento no jugó un papel significativo. La tasa de ataque clínico de adultos y niños se estimó en 20% y 3%, respectivamente, 25% de los casos fueron hospitalizados. La oveja que había labrado así como el 25% de su rebaño testó positivo para anticuerpos C. burnetii. CONCLUSIÓN: Debido a su tamaño y origen puntual este brote permitió la evaluación de parámetros epidemiológicos fundamentales, pero rara vez estudiados. Como consecuencia de este brote, se recomendó que las ovejas embarazadas no se exhibieran en público durante el trimestre 3(o) y para probar animales en zoológicos de mascotas regularmente para C. burnetii. Texto: La fiebre Q es una zoonosis mundial causada por Coxiella burnetii (C. burnetii), una bacteria intracelular pequeña, gramnegativa. C. burnetii muestra una variación antigénica con una fase infecciosa I y menos infecciosa II. El reservorio primario desde el que se produce la infección humana consiste en ovinos, caprinos y bovinos. Aunque las infecciones por C. burnetii en animales son generalmente asintomáticas, pueden causar abortos en ovejas y cabras [1]. Las altas concentraciones de C. burnetii pueden encontrarse en productos de nacimiento de mamíferos infectados [2]. Los humanos con frecuencia adquieren infección por inhalación de aerosoles contaminados a partir de fluidos parturinos, placenta o lana [1]. Debido a que la dosis infecciosa es muy baja [3] y C. burnetii es capaz de sobrevivir en un estado similar a esporas durante meses La infección por C. burnetii en humanos es asintomática en aproximadamente el 50% de los casos. Aproximadamente el 5% de los casos son hospitalizados, y los casos mortales son raros [1]. La presentación clínica de la fiebre Q aguda es variable y puede parecerse a muchas otras enfermedades infecciosas [2]. Sin embargo, la manifestación clínica más frecuente de la fiebre Q aguda es una enfermedad febril autolimitada asociada con dolor de cabeza severo. La neumonía atípica y la hepatitis son las principales manifestaciones clínicas de la enfermedad más grave. La fiebre Q aguda puede complicarse por meningoencefalitis o miocarditis. Rara vez una forma crónica de fiebre Q se desarrolla meses después de la enfermedad aguda, más comúnmente en forma de endocarditis [1]. Los niños desarrollan la enfermedad clínica con menos frecuencia [7, 8]. Debido a su presentación no específica, la fiebre Q sólo puede sospecharse por motivos clínicos y requiere confirmación serológica Si bien se considera que el método de referencia es el ensayo indirecto de inmunofluorescencia (IFA), la fijación del complemento (CF), ELISA y la microaglutinación (MA) también pueden utilizarse [9]. Las infecciones agudas se diagnostican con anticuerpos IgG y/o IgM antifase II elevados, mientras que los anticuerpos IgG antifase I son característicos de las infecciones crónicas [1]. En Alemania, la fiebre Q aguda es una enfermedad notificable. Entre 1991 y 2000 el número anual de casos varió de 46 a 273 casos al año [10]. En 2001 y 2002, se notificaron 293 y 191 casos, respectivamente [11, 12]. El 26 de mayo de 2003 el departamento de salud de Soest fue informado por un hospital local de un número inusualmente grande de pacientes con neumonía atípica. Dado que la etiología no estaba clara, se consideraron patógenos como el coronavirus SARS y se implementaron estrictas medidas de control de infecciones hasta el diagnóstico de fiebre Q. Se formó un equipo de investigación de brotes que incluyó a profesionales de salud pública del departamento de salud local, el departamento de salud veterinaria local, el departamento de salud estatal, el Laboratorio Nacional de Consultoría (NCL) para Coxiellae y el Instituto Robert Koch (RKI), el Instituto Federal de Salud Pública. Debido al tamaño y la aparición de la fuente puntual del brote, el objetivo de la investigación fue identificar factores etiológicos relevantes para la prevención y control de la fiebre Q, así como evaluar parámetros epidemiológicos que rara vez pueden ser estudiados de otra manera. Se solicitó a los médicos asistentes que analizaran el suero de pacientes con neumonía atípica de Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae, Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, Influenza A y B, Parainfluenza 1-3, Adenovirus y Enterovirus. Se probaron muestras de sangre para detectar el virus de la gripe, Adenovirus y SARS-Coronavirus. La confirmación de laboratorio de una infección aguda por fiebre Q se definió como la presencia de anticuerpos IgM contra antígenos de fase II C. burnetii (ELISA o IFA), un aumento de 4 veces en el título de anticuerpos IgG antifase II (ELISA o IFA) o en el título de anticuerpos antifase II por CF entre sueros agudos y convalecientes. Se confirmó una infección crónica cuando se Debido a que los pacientes con cardiopatías valvulares y las mujeres embarazadas tienen un alto riesgo de desarrollar infección crónica [13, 14], alertamos a los internistas y ginecólogos a través de la revista de la Asociación Médica Alemana y les pedimos que enviaran muestras de suero a la NCL si identificaban a pacientes de estos grupos de riesgo que habían estado en el mercado de agricultores durante el brote.El objetivo del primer estudio de caso de control fue determinar si existía un vínculo entre el mercado de los agricultores y el brote e identificar otros posibles factores de riesgo. Realizamos entrevistas telefónicas mediante un cuestionario estandarizado que preguntó acerca de la asistencia al mercado de agricultores, habiendo estado a 1 km de distancia de una de las 6 manadas de ovejas en la zona, picaduras de garrapatas y consumo de leche no pasteurizada, queso de oveja o de cabra. A los efectos de la CCS1 definimos un caso (caso CCS1) como un adulto residente en la ciudad de Soest notificado al sistema de vigilancia legal con fiebre Q, con inicio de síntomas entre el 4 de mayo y el 3 de junio de 2003. El criterio de exclusión fue un negativo IgM-titer contra antígenos de fase II. Se reclutaron dos controles por caso de habitantes de Soest por marcación aleatoria de dígitos. Calculamos la fracción atribuible de casos expuestos al mercado de agricultores el 4 de mayo (AFE) como (OR-1)/OR y la fracción atribuible para todos los casos debido a esta exposición como:El mercado de agricultores se mantuvo en una ciudad balneario cerca de Soest con muchos visitantes de otras zonas del estado e incluso de todo el país. Para determinar el tamaño del brote, pedimos a los departamentos de salud pública locales de Alemania que determinaran un posible vínculo con el mercado de agricultores en Soest para todos los Un caso en este contexto ("caso notificado") fue definido como cualquier persona con un diagnóstico clínico compatible con la fiebre Q con o sin confirmación de laboratorio y antecedentes de exposición al mercado de agricultores.Los departamentos de salud locales también informaron si un caso notificado fue hospitalizado.Para obtener una segunda estimación independiente de la proporción de hospitalizaciones entre pacientes sintomáticos más allá de la reportada a través del sistema de vigilancia legal se calculó la proporción de pacientes hospitalizados entre las personas que cumplen la definición de caso clínico (como se utiliza en el estudio de vendedores (s.b.)) identificado mediante muestreo aleatorio de la población Soest (dentro de CCS2 (s.b.)) así como en dos cohortes (estudio de vendedores y los 9 amigos marineros (véase más adelante).El objetivo de CCS2 fue identificar los factores de riesgo asociados con la asistencia del mercado de agricultores en el segundo día. Utilizamos la misma definición de caso que en el CCS1, pero incluimos solamente a las personas que habían visitado el mercado de agricultores el 4 de mayo, el segundo día del mercado. Seleccionamos los controles de nuevo al azar del registro telefónico de Soest e incluimos sólo a aquellas personas que habían visitado el mercado de agricultores el 4 de mayo y no habían estado enfermas de fiebre después. Los controles potenciales que se enfermaron fueron excluidos para su análisis en el CCS2, pero todavía estaban completamente entrevistados. Esto permitió calcular la tasa de ataque entre los visitantes al mercado (ver abajo "Estimación de la tasa de ataque global") y dio una estimación de la proporción de casos clínicamente enfermos que fueron hospitalizados (s.a.). En el estudio de los vendedores investigamos si la distancia del vendedor se encuentra desde la pluma de ovejas o la dispersión de C. burnetii por viento eran factores de riesgo relevantes para adquirir fiebre Q. Obtuvimos una lista de todos El 4 de mayo de 2003 se realizó una entrevista telefónica mediante cuestionarios estandarizados, se definió un caso como una persona con inicio de fiebre entre el 4 de mayo y el 3 de junio de 2003 y al menos tres de los siguientes síntomas: dolor de cabeza, tos, disnea, dolor articular, dolor muscular, pérdida de peso de más de 2 kg, fatiga, náuseas o vómitos; la distancia relativa de las gradas a la pluma de oveja se estimó por contar las gradas entre la pluma de oveja y el stand en cuestión; cada gradas se consideró una unidad de soporte (aproximadamente 3 metros); las gradas más grandes se contaron como 2 unidades; la dirección del viento en relación con la pluma de oveja se definió dividiendo la rosa de viento (360°) en 4 partes iguales de 90°; la dirección predominante del viento durante el mercado fue Sur-Sureste (Figura 1 ). Para el análisis dividimos la zona del mercado en 4 secciones En la sección 1, el viento soplaba hacia el corral de ovejas (más menos 45°). La sección 4 estaba en el lado opuesto, es decir, donde el viento soplaba desde el corral de ovejas hacia las gradas, y las secciones 2 y 3 estaban al este y al oeste con respecto a la dirección del viento, respectivamente. La ubicación de las gradas en referencia al corral de ovejas se definió así de dos maneras: como la distancia absoluta al corral de ovejas (en unidades de stand o metros) y en referencia a la dirección del viento. Identificamos una pequeña cohorte de 9 amigos marineros que visitaron el mercado de los agricultores el 4 de mayo de 2003. Todos ellos se probaron serológicamente independientemente de los síntomas. Por lo tanto, pudimos calcular la proporción de personas confirmadas por el laboratorio que cumplían la definición de caso clínico (como se define en el estudio de cohorte sobre vendedores). La tasa global de ataque entre adultos se estimó sobre la base de las siguientes fuentes:(1) Las entrevistas realizadas para el reclutamiento de controles para la CCS2 permitieron la proporción de adultos que adquirieron fiebre Q sintomática entre los que visitaron el mercado de agricultores en el segundo día;Fracción AFE atribuible Número de casos expuestos Todos los casos = *(2) Las entrevistas de casos y controles en la CCS2 dieron información sobre acompañantes adultos y cuántos de estos se convirtieron posteriormente en "peligrosidad";(3) Resultados de la pequeña cohorte de 9 amigos marineros (s.a.);(4) Resultados del estudio de cohorte sobre vendedores.Los departamentos de salud locales que identificaron casos de brote de fiebre Q (s.a. "determinación del tamaño del brote y epidemiología descriptiva") entrevistaron a pacientes sobre el número de personas que los habían acompañado al mercado de agricultores y si alguno de Sin embargo, como no hubo diferenciación entre adultos y niños, se realizaron cálculos para estimar la tasa de ataque entre adultos tanto con como sin esta fuente. Para contar los casos en (1), (3) y (4) se utilizó la definición de caso clínico tal como se definió en el estudio de cohorte sobre vendedores. Para el cálculo de la tasa de ataque entre niños obtenido en CCS2 fue la misma para todos los visitantes. El número de niños que visitaron el mercado se pudo estimar a partir del número total de visitantes estimado por los organizadores. Luego se estimó el número de niños sintomáticos (numerador). Para esto se asumió que la proporción de niños con fiebre Q que fueron vistos por médicos y por lo tanto fueron notificados fue la misma que la de adultos. Se calculó como:Así el número verdadero de niños con fiebre Q fue estimado por el número de niños reportados dividido por la proporción estimada reportada. A continuación, la tasa de ataque entre los niños pudo ser estimada de la siguiente manera:Debido a que este cálculo se basó en varios supuestos (número de visitantes, proporción de visitantes adultos y tasa de ataque clínico entre los adultos) se realizó un análisis de sensibilidad donde los valores de estas variables variaron.El sero fue recogido de todas las ovejas y vacas mostradas en el mercado de los agricultores, así como de todas las ovejas de los respectivos rebaños domésticos (70 animales).Las muestras de 25 ovejas de otros cinco rebaños en el área de Soest también fueron probadas para C. burnetii.Las pruebas fueron realizadas por ELISA con una mezcla de antígenos de fase I y fase II.Se realizó un análisis estadístico con Epi Info, versión 6.04 (CDC, Atlanta, EE.UU.).Se compararon variables dicotómicas en los estudios de control de casos y cohorte utilizando la prueba Chi-Square y variables La investigación del brote se llevó a cabo en el marco de la Ley de Reforma de la Ley de Enfermedades Transmisibles de Alemania. Se observaron normas obligatorias. Los pacientes del hospital local de Soest informaron de que el 3 y 4 de mayo de 2003 se había producido un mercado de agricultores en una ciudad balneario cercana a la ciudad de Soest. Se encontraba en un parque a lo largo del paseo principal, a una distancia de aproximadamente 500 metros. El mercado atrajo principalmente a tres grupos de personas: lugareños, habitantes de la gran región de Soest, pacientes del spa sanatoria y sus familiares o amigos visitantes. Los entrevistados iniciales mencionaron también que habían pasado tiempo en el corral de ovejas observando corderos recién nacidos que habían nacido en las primeras horas de la mañana del 4 de mayo de 2003. En total, 171 (65%) de 263 muestras séricas sometidas a la NCL fueron positivas para anticuerpos antifase II IgM por ELISA. Resultados de hisopos de garganta y suero fueron negativos para otros agentes infecciosos. (Figura 2 ) Si se supone que el inicio de los síntomas en los casos fue normalmente distribuido con una media de 21 días, el 95% de los casos (desviaciones estándar medias +/-2) tuvieron su inicio entre los días 10 y 31. Los dos casos notificados con inicio temprano el 6 y 8 de mayo, respectivamente, fueron confirmados en laboratorio y las entrevistas adicionales no revelaron ningún factor de riesgo adicional; de los 298 casos con sexo conocido, 158 (53%) eran varones y 140 (47%) eran mujeres. De los casos notificados, 189 (63%) procedían del condado de Soest, 104 (35%) correspondían al número notificado de adultos notificantes número de casos de ataques entre adultos. * Tasa de ataque entre niños estimada en número verdadero de niños = e en con fiebre Q. Se estimaba que el número de niños en el mercado de otros condados del mismo estado federal (Northrin Westfalia) y 6 (2%) procedían de otros cinco estados federales de Alemania (Figura 3 ). Sólo ocho (3%) casos eran menores de 18 años, la media y la mediana de edad era de 54 y 56 años, respectivamente (Figura 4 ). 75 (25%) de los 297 casos notificados fueron hospitalizados, ninguno murió. El cálculo de la proporción de casos hospitalizados a través de otras fuentes de información reveló que 4 de 19 (21%; IC 95% = 6-46%; (1/5 (CCS2), 2/11 (estudio de vendedores) y 1/3 (amigos de Sailor)) fueron hospitalizados; se notificó confirmación de laboratorio en 167 (56%) casos de brotes; 66 (22%) fueron confirmados por un aumento en el título de anticuerpos antifase II (CF), 89 (30%) tenían anticuerpos IgM contra antígenos de fase II, 11 (4%) fueron positivos en ambas pruebas y uno fue confirmado por cultivo; no se dispuso de información sobre si los 132 (44%) casos sin confirmación de laboratorio fueron probados en laboratorio; 18 pacientes con cardiopatías valvulares y 11 mujeres embarazadas fueron examinados; ninguno de ellos tuvo signos clínicos de fiebre Q. Dos (11%) de 18 pacientes cardiológicos y cuatro (36%) de 11 mujeres embarazadas tuvieron una infección aguda El seguimiento serológico de las madres detectó infección crónica en la misma mujer (caso 3) 12 semanas después del parto; el seguimiento de un año de dos recién nacidos (de los casos 1 y 3) no identificó infecciones agudas ni crónicas por fiebre Q; el 4 de mayo reclutamos 20 casos y 36 controles que visitaron el mercado de agricultores para el segundo estudio de control de casos; no difirieron significativamente en edad y sexo (OR para sexo masculino = 1,7; IC95% = 0,5-5,3; p = 0,26; valor de p para edad = 0,23). Diecisiete (85%) de 20 casos indicaron que habían visto a la vaca (que también estaba en exhibición en el mercado junto a la oveja) en comparación con 7 (32%) de localización geográfica de los casos de brote de fiebre Q notificados al sistema de vigilancia legal Figura 3 Localización geográfica de los casos de brote de fiebre Q notificados al sistema de vigilancia legal. o directamente en la puerta de la pluma de ovino en comparación con 8 (32%) de 25 controles (OR = 5,0; IC95% = 1,2-22,3; p = 0,03). Tocar a la oveja también fue significativamente más frecuente entre los casos (5/20 (25%) casos de CCS2 frente a 0/22 (0%) controles; O indefinido; IC95% inferior = 1,1; p = 0,02). 17 (85%) de 20 casos de CCS2, pero sólo 6 (25%) de 24 controles se detuvieron durante al menos unos pocos segundos en o en la pluma de ovinos, la referencia para esta variable fue "pasar por la pluma sin detenerse" (OR = 17,0; IC95% = 3,0-112,5; p < 0,01). Entre los casos de CCS2, la proximidad o el tiempo de permanencia con o cerca de la oveja no se asoció con un período de incubación más corto. Pudimos contactar y entrevistar a 75 (86%) de 87 vendedores, y recibimos información de segunda mano sobre 7 más (tasa de respuesta general: 94%). Cuarenta y cinco (56%) eran hombres y 35 (44%) eran mujeres. 13 (16%) cumplían la definición de caso clínico. De los 11 vendedores que trabajaron en dos unidades de stand del corral de ovejas, 6 (55%) se convirtieron en casos comparados con sólo 7 (10%) de 70 personas que trabajaron en un stand a mayor distancia (riesgo relativo (RR) = 5,5 (IC 95% = 2,3-13,2; p = 0,002); Figura 1 ). De estos 7 vendedores, 4 habían pasado tiempo dentro de los 5 metros de la pluma el 4 de mayo, uno había estado cerca de la pluma, pero a una distancia de más de 5 metros, y no se disponía de información sobre esta variable para los restantes 2. En la sección del mercado frente al viento procedente de la pluma (sección 4, Figura 1 ), 4 (9%) de 44 proveedores se convirtieron en casos, en comparación con 2 (13%) de 15 personas que trabajaron en la sección 1 (p = 0,6). Entre 22 personas que trabajaron en stands perpendiculares a la dirección del viento, En todos los escenarios la AR entre los adultos fue significativamente mayor que entre los niños (Figura 5). En total, 5 corderos y 5 ovejas fueron exhibidas en el mercado, una de ellas estaba embarazada y dio a luz a dos corderos gemelos a las 6:30 a.m. del 4 de mayo de 2003. De éstos, 3 ovejas incluyendo la que había probado positivo para C. burnetii. Los animales procedían de un rebaño de 67 ovejas, de las cuales 66 habían dado a luz entre febrero y junio. La mayoría de los nacimientos (57 (86%)) habían ocurrido en febrero y marzo, generalmente dentro de un establo o en un prado situado fuera de la ciudad. Seis ovejas abortaron, tuvieron mortinatos o corderos anormalmente débiles. Entre todas las ovejas, 17/67 (25%) habían probado positivo para C. burnetii. El porcentaje de ovejas que dieron positivo en los otros 5 rebaños de ovejas de la región osciló entre el 8% y el 24% (8%; 12%; 12%; 16%; 24%). Hemos descrito uno de los mayores brotes de fiebre Q en Alemania que, debido a su naturaleza puntual, brindó la oportunidad de evaluar muchas características epidemiológicas de la enfermedad que rara vez se pueden estudiar de otro modo. En 1954, más de 500 casos de fiebre Q estaban, similares a este brote, relacionados con el aborto de una vaca infectada en un mercado de agricultores [15]. Más recientemente, un gran brote ocurrió en Jena (Turingia) en 2005 con 322 casos notificados [16] asociados con la exposición a un rebaño de ovejas mantenido en un prado cerca de la zona de alojamiento en la que ocurrieron los casos. El primer estudio de control sirvió para confirmar la hipótesis de una asociación entre el brote y el mercado de los agricultores. El hecho de que sólo la asistencia en el segundo día, pero no el primero, estuviera fuertemente asociada a la enfermedad apuntaba hacia el papel de la oveja que había dado a luz Las personas que acompañaban a los casos notificados (fuente 5) eran una mezcla de adultos y niños y por lo tanto se enumeran por separado. en la madrugada del 4 de mayo de 2005. Esta asociación fuerte y la fracción muy alta atribuible entre todos los casos sugerían una fuente puntual y justificaban definir los casos notificados a través del sistema de notificación como casos de brote si eran clínicamente compatibles con la fiebre Q y daban un historial de haber visitado el mercado de los agricultores. La naturaleza de la fuente puntual del brote permitió calcular el período de incubación de casos que promediaba 21 días y oscilaba entre 2 y 48 días con un intervalo intercuartílico de 16 a 24 días. Esto es compatible con la literatura [1]. Una entrevista adicional con los dos casos con inicio temprano (2 y 4 días después de asistir al mercado el 4 de mayo, Tasas de ataque entre adultos y niños en un escenario más probable y 8 escenarios más Figura 5 Tasas de ataque entre adultos y niños en un escenario más probable y 8 escenarios más probables. Escenario más probable: 3000 visitantes, 83% visitantes adultos y 20% tasa de ataque clínico entre adultos. Escenarios 1-8 variaron en los supuestos de "número de visitantes", "proporción de visitantes adultos" y "tasa de ataque entre adultos" (ver Tabla 3 ). Se muestran tasas de ataque y intervalos de confianza del 95% respectivamente) no pudieron identificar ninguna otra fuente de infección. Recientemente se observó un corto período de incubación en otro brote de fiebre Q en el que la dosis infecciosa fue probablemente muy alta [17]. El segundo estudio de control de caso entre las personas que visitaron el mercado el 4 de mayo Este hallazgo fue confirmado por el estudio de cohorte sobre vendedores que mostró que aquellos que trabajaron en un puesto cercano a (dentro de 6 metros) el corral de ovejas tenían un riesgo significativamente mayor de adquirir fiebre Q. El estudio no mostró un papel significativo de la ubicación del stand en referencia a la dirección del viento, aunque debemos tener en cuenta que el viento no era probable que no siempre y exactamente como lo informó la estación meteorológica. Sin embargo, si el viento había sido importante en todos los casos más podría haber ocurrido entre los proveedores situados a mayor distancia de las ovejas. Según los datos del sistema de vigilancia legal, la proporción de casos clínicos hospitalizados fue 25%, similar a la proporción de 21% encontrada en personas agrupadas de los otros estudios realizados. Varias publicaciones reportan proporciones inferiores a las encontradas en esta investigación: 4% (8/ 191) [7], 5% [1] y 10% (4/39) [5], y hubo al menos un estudio con una proporción mucho mayor (63% (10/16)) [18]. Es improbable que los hospitales notificaran casos con fiebre Q con más frecuencia que los médicos privados porque la proporción hospitalizada entre pacientes con fiebre Q identificados a través de llamadas telefónicas aleatorias en la población soest o en las dos cohortes fue similar a la de los casos notificados. Por lo tanto, notificar sesgos es una explicación poco probable para la proporción relativamente alta de casos hospitalizados. La estimación del 23% basada en la muestra aleatoria de personas que visitan el mercado en el segundo día parecería más inmune a la tendencia a recordar, incluso si no se puede descartar completamente. La estimación basada en la información sobre las personas que acompañan los casos puede estar sujeta a una sobreestimación porque estos individuos presumiblemente tenían una mayor probabilidad de estar cerca del corral de ovejas, similar a los casos. Por otro lado, la estimación del estudio de cohortes sobre los vendedores podría ser una subestimación, ya que los vendedores obviamente tenían un propósito diferente para estar en el mercado y podrían haber estado menos interesados en echar un vistazo a las ovejas. Sin embargo, todas las estimaciones eran independientes entre sí y teniendo en cuenta los diversos posibles sesgos, eran notablemente similares. En comparación, en un brote diferente en Alemania, en el que los habitantes de una aldea estaban expuestos a un gran rebaño de ovejas (n = 1000-2000) [5, 7] la tasa de ataque En un brote similar en Suiza, varios pueblos fueron expuestos a aproximadamente 900 ovejas [19]. En el pueblo más gravemente afectado, la tasa de ataque clínico fue del 16% (estimado a partir de los datos proporcionados) [19]. Es notable que en el brote descrito aquí, el potencial infeccioso de una oveja embarazada -sobre el cordero- era comparable al de rebaños enteros, aunque en diferentes entornos. Nuestra estimación de la proporción de casos confirmados serológicamente que se convirtieron en sintomáticos (50% (3/6)) se basa en una muestra muy pequeña, pero coherente con la literatura internacional. En el brote suizo mencionado anteriormente, el 46% de los pacientes serológicamente positivos desarrollaron enfermedad clínica [7]. Sólo aproximadamente la mitad de todos los casos sintomáticos se notificaron al sistema de vigilancia legal. Los pacientes que no buscaron atención médica debido a enfermedades leves, así como el subdiagnóstico o la falta de Nuestra tasa estimada de ataque del 3% entre los niños se basa en una serie de supuestos sucesivos y, por lo tanto, debe interpretarse con precaución. Sin embargo, el análisis de sensibilidad confirmó que los adultos tenían una tasa de ataque significativamente elevada en comparación con los niños. Si bien se ha sugerido que los niños tienen menor riesgo que los adultos de desarrollar enfermedades sintomáticas [7, 8], se han publicado pocos datos sobre las tasas de ataque de los niños en comparación con los adultos. La seroprevalencia estimada de C. burnetii en las manadas de ovejas en la zona varió del 8% al 24%. La seroprevalencia del 25% en la manada de los animales expuestos junto con una reacción positiva en cadena de polimerasa en un parto posterior en junio de 2003 sugirió una infección reciente de la manada [20]. La mediana de seroprevalencia en una serie de estudios relevantes realizados en el contexto de brotes humanos [7, 20, 21], fue del 40% en comparación con el 1% en rebaños de ovejas no vinculados a brotes humanos [20]. Este brote muestra las dramáticas consecuencias de poner a un gran número de individuos susceptibles en estrecho contacto con una sola oveja infectada que (en tal entorno) puede convertirse en un super-difundidor sobre la cría de cordero. Siempre hay un componente cultural en la interacción entre personas y animales, y estos pueden contribuir a brotes o cambios en los patrones de incidencia. Durante las últimas décadas se han producido la urbanización de las zonas rurales y cambios en la cría de animales [20], con intentos más recientes de poner en contacto a una población urbana "deprivada" con animales de granja. Si bien no todas las eventualidades pueden preverse, es importante sensibilizar a los propietarios de animales de compañía y de ganado, así como reforzar las recomendaciones cuando sea necesario. Este brote condujo a la modificación y ampliación de las recomendaciones existentes [25] que ahora prohíben la exhibición de ovejas en el último tercio de su embarazo y requieren pruebas periódicas de animales para C. burnetii en zoológicos de mascotas, donde existe un estrecho contacto entre humanos y animales. Debido al tamaño y la naturaleza de la fuente de este brote permitió una nueva evaluación de los parámetros epidemiológicos fundamentales, pero raramente estudiados de la fiebre Q. También sirvió para revisar las recomendaciones de salud pública para tener en cuenta los cambios en el tipo y la frecuencia de contacto de los seres humanos susceptibles con animales potencialmente infecciosos. Abreviaturas AFE = fracción atribuible de los casos expuestos Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

¿Cuál fue la seropresencia mediana de C. burnetti en rebaños de ovejas no vinculados a brotes humanos?

Una oveja súper extendida infecta a cientos de personas con fiebre Q en un mercado de agricultores en Alemaniahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1618839/SHA: ee1b5a9618dcc4080ed100486cedd0969e80fa4dAutores: Porten, Klaudia; Rissland, Jürgen; Tigges, Almira; Broll, Susanne; Hopp, Wilfried; Lunemann, Mechthild; van Treeck, Ulrich; Kimmig, Peter; Brockmann, Stefan O; Wagner-Wiening, Christiane; Hellenbrand, Wiebke; Buchholz, UdoFecha: 2006-10-06DOI: 10.1186/1471-2334-6-147Licencia: cc- MÉTODOS: En las entrevistas exploratorias los pacientes mencionaron haber visitado un mercado de agricultores donde una oveja había labrado. Las pruebas serológicas confirmaron el diagnóstico de fiebre Q. Se pidió a los departamentos de salud locales de Alemania que identificaran a los pacientes con fiebre Q que habían visitado el mercado de agricultores. Para investigar los factores de riesgo de infección se realizó un estudio de control de casos (los casos fueron pacientes con fiebre Q, los controles fueron seleccionados al azar ciudadanos soest) y un estudio de cohorte entre los vendedores en el mercado. Las ovejas exhibieron en el mercado, el rebaño del que se originó, así como ovejas de rebaños mantenidos en las proximidades de Soest se probaron para Coxiella burnetii (C. burnetii). RESULTADOS: Un total de 299 casos de fiebre Q reportados se vincularon a este brote. El período medio de incubación fue de 21 días, con un El estudio de control de casos identificó como factores de riesgo significativos la proximidad y parada de al menos unos pocos segundos en el corral de ovejas. Los vendedores dentro de aproximadamente 6 metros del corral de ovejas tuvieron mayor riesgo de enfermedad en comparación con los ubicados más lejos. El viento no jugó un papel significativo. La tasa de ataque clínico de adultos y niños se estimó en 20% y 3%, respectivamente, 25% de los casos fueron hospitalizados. La oveja que había labrado así como el 25% de su rebaño testó positivo para anticuerpos C. burnetii. CONCLUSIÓN: Debido a su tamaño y origen puntual este brote permitió la evaluación de parámetros epidemiológicos fundamentales, pero rara vez estudiados. Como consecuencia de este brote, se recomendó que las ovejas embarazadas no se exhibieran en público durante el trimestre 3(o) y para probar animales en zoológicos de mascotas regularmente para C. burnetii. Texto: La fiebre Q es una zoonosis mundial causada por Coxiella burnetii (C. burnetii), una bacteria intracelular pequeña, gramnegativa. C. burnetii muestra una variación antigénica con una fase infecciosa I y menos infecciosa II. El reservorio primario desde el que se produce la infección humana consiste en ovinos, caprinos y bovinos. Aunque las infecciones por C. burnetii en animales son generalmente asintomáticas, pueden causar abortos en ovejas y cabras [1]. Las altas concentraciones de C. burnetii pueden encontrarse en productos de nacimiento de mamíferos infectados [2]. Los humanos con frecuencia adquieren infección por inhalación de aerosoles contaminados a partir de fluidos parturinos, placenta o lana [1]. Debido a que la dosis infecciosa es muy baja [3] y C. burnetii es capaz de sobrevivir en un estado similar a esporas durante meses La infección por C. burnetii en humanos es asintomática en aproximadamente el 50% de los casos. Aproximadamente el 5% de los casos son hospitalizados, y los casos mortales son raros [1]. La presentación clínica de la fiebre Q aguda es variable y puede parecerse a muchas otras enfermedades infecciosas [2]. Sin embargo, la manifestación clínica más frecuente de la fiebre Q aguda es una enfermedad febril autolimitada asociada con dolor de cabeza severo. La neumonía atípica y la hepatitis son las principales manifestaciones clínicas de la enfermedad más grave. La fiebre Q aguda puede complicarse por meningoencefalitis o miocarditis. Rara vez una forma crónica de fiebre Q se desarrolla meses después de la enfermedad aguda, más comúnmente en forma de endocarditis [1]. Los niños desarrollan la enfermedad clínica con menos frecuencia [7, 8]. Debido a su presentación no específica, la fiebre Q sólo puede sospecharse por motivos clínicos y requiere confirmación serológica Si bien se considera que el método de referencia es el ensayo indirecto de inmunofluorescencia (IFA), la fijación del complemento (CF), ELISA y la microaglutinación (MA) también pueden utilizarse [9]. Las infecciones agudas se diagnostican con anticuerpos IgG y/o IgM antifase II elevados, mientras que los anticuerpos IgG antifase I son característicos de las infecciones crónicas [1]. En Alemania, la fiebre Q aguda es una enfermedad notificable. Entre 1991 y 2000 el número anual de casos varió de 46 a 273 casos al año [10]. En 2001 y 2002, se notificaron 293 y 191 casos, respectivamente [11, 12]. El 26 de mayo de 2003 el departamento de salud de Soest fue informado por un hospital local de un número inusualmente grande de pacientes con neumonía atípica. Dado que la etiología no estaba clara, se consideraron patógenos como el coronavirus SARS y se implementaron estrictas medidas de control de infecciones hasta el diagnóstico de fiebre Q. Se formó un equipo de investigación de brotes que incluyó a profesionales de salud pública del departamento de salud local, el departamento de salud veterinaria local, el departamento de salud estatal, el Laboratorio Nacional de Consultoría (NCL) para Coxiellae y el Instituto Robert Koch (RKI), el Instituto Federal de Salud Pública. Debido al tamaño y la aparición de la fuente puntual del brote, el objetivo de la investigación fue identificar factores etiológicos relevantes para la prevención y control de la fiebre Q, así como evaluar parámetros epidemiológicos que rara vez pueden ser estudiados de otra manera. Se solicitó a los médicos asistentes que analizaran el suero de pacientes con neumonía atípica de Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae, Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, Influenza A y B, Parainfluenza 1-3, Adenovirus y Enterovirus. Se probaron muestras de sangre para detectar el virus de la gripe, Adenovirus y SARS-Coronavirus. La confirmación de laboratorio de una infección aguda por fiebre Q se definió como la presencia de anticuerpos IgM contra antígenos de fase II C. burnetii (ELISA o IFA), un aumento de 4 veces en el título de anticuerpos IgG antifase II (ELISA o IFA) o en el título de anticuerpos antifase II por CF entre sueros agudos y convalecientes. Se confirmó una infección crónica cuando se Debido a que los pacientes con cardiopatías valvulares y las mujeres embarazadas tienen un alto riesgo de desarrollar infección crónica [13, 14], alertamos a los internistas y ginecólogos a través de la revista de la Asociación Médica Alemana y les pedimos que enviaran muestras de suero a la NCL si identificaban a pacientes de estos grupos de riesgo que habían estado en el mercado de agricultores durante el brote.El objetivo del primer estudio de caso de control fue determinar si existía un vínculo entre el mercado de los agricultores y el brote e identificar otros posibles factores de riesgo. Realizamos entrevistas telefónicas mediante un cuestionario estandarizado que preguntó acerca de la asistencia al mercado de agricultores, habiendo estado a 1 km de distancia de una de las 6 manadas de ovejas en la zona, picaduras de garrapatas y consumo de leche no pasteurizada, queso de oveja o de cabra. A los efectos de la CCS1 definimos un caso (caso CCS1) como un adulto residente en la ciudad de Soest notificado al sistema de vigilancia legal con fiebre Q, con inicio de síntomas entre el 4 de mayo y el 3 de junio de 2003. El criterio de exclusión fue un negativo IgM-titer contra antígenos de fase II. Se reclutaron dos controles por caso de habitantes de Soest por marcación aleatoria de dígitos. Calculamos la fracción atribuible de casos expuestos al mercado de agricultores el 4 de mayo (AFE) como (OR-1)/OR y la fracción atribuible para todos los casos debido a esta exposición como:El mercado de agricultores se mantuvo en una ciudad balneario cerca de Soest con muchos visitantes de otras zonas del estado e incluso de todo el país. Para determinar el tamaño del brote, pedimos a los departamentos de salud pública locales de Alemania que determinaran un posible vínculo con el mercado de agricultores en Soest para todos los Un caso en este contexto ("caso notificado") fue definido como cualquier persona con un diagnóstico clínico compatible con la fiebre Q con o sin confirmación de laboratorio y antecedentes de exposición al mercado de agricultores.Los departamentos de salud locales también informaron si un caso notificado fue hospitalizado.Para obtener una segunda estimación independiente de la proporción de hospitalizaciones entre pacientes sintomáticos más allá de la reportada a través del sistema de vigilancia legal se calculó la proporción de pacientes hospitalizados entre las personas que cumplen la definición de caso clínico (como se utiliza en el estudio de vendedores (s.b.)) identificado mediante muestreo aleatorio de la población Soest (dentro de CCS2 (s.b.)) así como en dos cohortes (estudio de vendedores y los 9 amigos marineros (véase más adelante).El objetivo de CCS2 fue identificar los factores de riesgo asociados con la asistencia del mercado de agricultores en el segundo día. Utilizamos la misma definición de caso que en el CCS1, pero incluimos solamente a las personas que habían visitado el mercado de agricultores el 4 de mayo, el segundo día del mercado. Seleccionamos los controles de nuevo al azar del registro telefónico de Soest e incluimos sólo a aquellas personas que habían visitado el mercado de agricultores el 4 de mayo y no habían estado enfermas de fiebre después. Los controles potenciales que se enfermaron fueron excluidos para su análisis en el CCS2, pero todavía estaban completamente entrevistados. Esto permitió calcular la tasa de ataque entre los visitantes al mercado (ver abajo "Estimación de la tasa de ataque global") y dio una estimación de la proporción de casos clínicamente enfermos que fueron hospitalizados (s.a.). En el estudio de los vendedores investigamos si la distancia del vendedor se encuentra desde la pluma de ovejas o la dispersión de C. burnetii por viento eran factores de riesgo relevantes para adquirir fiebre Q. Obtuvimos una lista de todos El 4 de mayo de 2003 se realizó una entrevista telefónica mediante cuestionarios estandarizados, se definió un caso como una persona con inicio de fiebre entre el 4 de mayo y el 3 de junio de 2003 y al menos tres de los siguientes síntomas: dolor de cabeza, tos, disnea, dolor articular, dolor muscular, pérdida de peso de más de 2 kg, fatiga, náuseas o vómitos; la distancia relativa de las gradas a la pluma de oveja se estimó por contar las gradas entre la pluma de oveja y el stand en cuestión; cada gradas se consideró una unidad de soporte (aproximadamente 3 metros); las gradas más grandes se contaron como 2 unidades; la dirección del viento en relación con la pluma de oveja se definió dividiendo la rosa de viento (360°) en 4 partes iguales de 90°; la dirección predominante del viento durante el mercado fue Sur-Sureste (Figura 1 ). Para el análisis dividimos la zona del mercado en 4 secciones En la sección 1, el viento soplaba hacia el corral de ovejas (más menos 45°). La sección 4 estaba en el lado opuesto, es decir, donde el viento soplaba desde el corral de ovejas hacia las gradas, y las secciones 2 y 3 estaban al este y al oeste con respecto a la dirección del viento, respectivamente. La ubicación de las gradas en referencia al corral de ovejas se definió así de dos maneras: como la distancia absoluta al corral de ovejas (en unidades de stand o metros) y en referencia a la dirección del viento. Identificamos una pequeña cohorte de 9 amigos marineros que visitaron el mercado de los agricultores el 4 de mayo de 2003. Todos ellos se probaron serológicamente independientemente de los síntomas. Por lo tanto, pudimos calcular la proporción de personas confirmadas por el laboratorio que cumplían la definición de caso clínico (como se define en el estudio de cohorte sobre vendedores). La tasa global de ataque entre adultos se estimó sobre la base de las siguientes fuentes:(1) Las entrevistas realizadas para el reclutamiento de controles para la CCS2 permitieron la proporción de adultos que adquirieron fiebre Q sintomática entre los que visitaron el mercado de agricultores en el segundo día;Fracción AFE atribuible Número de casos expuestos Todos los casos = *(2) Las entrevistas de casos y controles en la CCS2 dieron información sobre acompañantes adultos y cuántos de estos se convirtieron posteriormente en "peligrosidad";(3) Resultados de la pequeña cohorte de 9 amigos marineros (s.a.);(4) Resultados del estudio de cohorte sobre vendedores.Los departamentos de salud locales que identificaron casos de brote de fiebre Q (s.a. "determinación del tamaño del brote y epidemiología descriptiva") entrevistaron a pacientes sobre el número de personas que los habían acompañado al mercado de agricultores y si alguno de Sin embargo, como no hubo diferenciación entre adultos y niños, se realizaron cálculos para estimar la tasa de ataque entre adultos tanto con como sin esta fuente. Para contar los casos en (1), (3) y (4) se utilizó la definición de caso clínico tal como se definió en el estudio de cohorte sobre vendedores. Para el cálculo de la tasa de ataque entre niños obtenido en CCS2 fue la misma para todos los visitantes. El número de niños que visitaron el mercado se pudo estimar a partir del número total de visitantes estimado por los organizadores. Luego se estimó el número de niños sintomáticos (numerador). Para esto se asumió que la proporción de niños con fiebre Q que fueron vistos por médicos y por lo tanto fueron notificados fue la misma que la de adultos. Se calculó como:Así el número verdadero de niños con fiebre Q fue estimado por el número de niños reportados dividido por la proporción estimada reportada. A continuación, la tasa de ataque entre los niños pudo ser estimada de la siguiente manera:Debido a que este cálculo se basó en varios supuestos (número de visitantes, proporción de visitantes adultos y tasa de ataque clínico entre los adultos) se realizó un análisis de sensibilidad donde los valores de estas variables variaron.El sero fue recogido de todas las ovejas y vacas mostradas en el mercado de los agricultores, así como de todas las ovejas de los respectivos rebaños domésticos (70 animales).Las muestras de 25 ovejas de otros cinco rebaños en el área de Soest también fueron probadas para C. burnetii.Las pruebas fueron realizadas por ELISA con una mezcla de antígenos de fase I y fase II.Se realizó un análisis estadístico con Epi Info, versión 6.04 (CDC, Atlanta, EE.UU.).Se compararon variables dicotómicas en los estudios de control de casos y cohorte utilizando la prueba Chi-Square y variables La investigación del brote se llevó a cabo en el marco de la Ley de Reforma de la Ley de Enfermedades Transmisibles de Alemania. Se observaron normas obligatorias. Los pacientes del hospital local de Soest informaron de que el 3 y 4 de mayo de 2003 se había producido un mercado de agricultores en una ciudad balneario cercana a la ciudad de Soest. Se encontraba en un parque a lo largo del paseo principal, a una distancia de aproximadamente 500 metros. El mercado atrajo principalmente a tres grupos de personas: lugareños, habitantes de la gran región de Soest, pacientes del spa sanatoria y sus familiares o amigos visitantes. Los entrevistados iniciales mencionaron también que habían pasado tiempo en el corral de ovejas observando corderos recién nacidos que habían nacido en las primeras horas de la mañana del 4 de mayo de 2003. En total, 171 (65%) de 263 muestras séricas sometidas a la NCL fueron positivas para anticuerpos antifase II IgM por ELISA. Resultados de hisopos de garganta y suero fueron negativos para otros agentes infecciosos. (Figura 2 ) Si se supone que el inicio de los síntomas en los casos fue normalmente distribuido con una media de 21 días, el 95% de los casos (desviaciones estándar medias +/-2) tuvieron su inicio entre los días 10 y 31. Los dos casos notificados con inicio temprano el 6 y 8 de mayo, respectivamente, fueron confirmados en laboratorio y las entrevistas adicionales no revelaron ningún factor de riesgo adicional; de los 298 casos con sexo conocido, 158 (53%) eran varones y 140 (47%) eran mujeres. De los casos notificados, 189 (63%) procedían del condado de Soest, 104 (35%) correspondían al número notificado de adultos notificantes número de casos de ataques entre adultos. * Tasa de ataque entre niños estimada en número verdadero de niños = e en con fiebre Q. Se estimaba que el número de niños en el mercado de otros condados del mismo estado federal (Northrin Westfalia) y 6 (2%) procedían de otros cinco estados federales de Alemania (Figura 3 ). Sólo ocho (3%) casos eran menores de 18 años, la media y la mediana de edad era de 54 y 56 años, respectivamente (Figura 4 ). 75 (25%) de los 297 casos notificados fueron hospitalizados, ninguno murió. El cálculo de la proporción de casos hospitalizados a través de otras fuentes de información reveló que 4 de 19 (21%; IC 95% = 6-46%; (1/5 (CCS2), 2/11 (estudio de vendedores) y 1/3 (amigos de Sailor)) fueron hospitalizados; se notificó confirmación de laboratorio en 167 (56%) casos de brotes; 66 (22%) fueron confirmados por un aumento en el título de anticuerpos antifase II (CF), 89 (30%) tenían anticuerpos IgM contra antígenos de fase II, 11 (4%) fueron positivos en ambas pruebas y uno fue confirmado por cultivo; no se dispuso de información sobre si los 132 (44%) casos sin confirmación de laboratorio fueron probados en laboratorio; 18 pacientes con cardiopatías valvulares y 11 mujeres embarazadas fueron examinados; ninguno de ellos tuvo signos clínicos de fiebre Q. Dos (11%) de 18 pacientes cardiológicos y cuatro (36%) de 11 mujeres embarazadas tuvieron una infección aguda El seguimiento serológico de las madres detectó infección crónica en la misma mujer (caso 3) 12 semanas después del parto; el seguimiento de un año de dos recién nacidos (de los casos 1 y 3) no identificó infecciones agudas ni crónicas por fiebre Q; el 4 de mayo reclutamos 20 casos y 36 controles que visitaron el mercado de agricultores para el segundo estudio de control de casos; no difirieron significativamente en edad y sexo (OR para sexo masculino = 1,7; IC95% = 0,5-5,3; p = 0,26; valor de p para edad = 0,23). Diecisiete (85%) de 20 casos indicaron que habían visto a la vaca (que también estaba en exhibición en el mercado junto a la oveja) en comparación con 7 (32%) de localización geográfica de los casos de brote de fiebre Q notificados al sistema de vigilancia legal Figura 3 Localización geográfica de los casos de brote de fiebre Q notificados al sistema de vigilancia legal. o directamente en la puerta de la pluma de ovino en comparación con 8 (32%) de 25 controles (OR = 5,0; IC95% = 1,2-22,3; p = 0,03). Tocar a la oveja también fue significativamente más frecuente entre los casos (5/20 (25%) casos de CCS2 frente a 0/22 (0%) controles; O indefinido; IC95% inferior = 1,1; p = 0,02). 17 (85%) de 20 casos de CCS2, pero sólo 6 (25%) de 24 controles se detuvieron durante al menos unos pocos segundos en o en la pluma de ovinos, la referencia para esta variable fue "pasar por la pluma sin detenerse" (OR = 17,0; IC95% = 3,0-112,5; p < 0,01). Entre los casos de CCS2, la proximidad o el tiempo de permanencia con o cerca de la oveja no se asoció con un período de incubación más corto. Pudimos contactar y entrevistar a 75 (86%) de 87 vendedores, y recibimos información de segunda mano sobre 7 más (tasa de respuesta general: 94%). Cuarenta y cinco (56%) eran hombres y 35 (44%) eran mujeres. 13 (16%) cumplían la definición de caso clínico. De los 11 vendedores que trabajaron en dos unidades de stand del corral de ovejas, 6 (55%) se convirtieron en casos comparados con sólo 7 (10%) de 70 personas que trabajaron en un stand a mayor distancia (riesgo relativo (RR) = 5,5 (IC 95% = 2,3-13,2; p = 0,002); Figura 1 ). De estos 7 vendedores, 4 habían pasado tiempo dentro de los 5 metros de la pluma el 4 de mayo, uno había estado cerca de la pluma, pero a una distancia de más de 5 metros, y no se disponía de información sobre esta variable para los restantes 2. En la sección del mercado frente al viento procedente de la pluma (sección 4, Figura 1 ), 4 (9%) de 44 proveedores se convirtieron en casos, en comparación con 2 (13%) de 15 personas que trabajaron en la sección 1 (p = 0,6). Entre 22 personas que trabajaron en stands perpendiculares a la dirección del viento, En todos los escenarios la AR entre los adultos fue significativamente mayor que entre los niños (Figura 5). En total, 5 corderos y 5 ovejas fueron exhibidas en el mercado, una de ellas estaba embarazada y dio a luz a dos corderos gemelos a las 6:30 a.m. del 4 de mayo de 2003. De éstos, 3 ovejas incluyendo la que había probado positivo para C. burnetii. Los animales procedían de un rebaño de 67 ovejas, de las cuales 66 habían dado a luz entre febrero y junio. La mayoría de los nacimientos (57 (86%)) habían ocurrido en febrero y marzo, generalmente dentro de un establo o en un prado situado fuera de la ciudad. Seis ovejas abortaron, tuvieron mortinatos o corderos anormalmente débiles. Entre todas las ovejas, 17/67 (25%) habían probado positivo para C. burnetii. El porcentaje de ovejas que dieron positivo en los otros 5 rebaños de ovejas de la región osciló entre el 8% y el 24% (8%; 12%; 12%; 16%; 24%). Hemos descrito uno de los mayores brotes de fiebre Q en Alemania que, debido a su naturaleza puntual, brindó la oportunidad de evaluar muchas características epidemiológicas de la enfermedad que rara vez se pueden estudiar de otro modo. En 1954, más de 500 casos de fiebre Q estaban, similares a este brote, relacionados con el aborto de una vaca infectada en un mercado de agricultores [15]. Más recientemente, un gran brote ocurrió en Jena (Turingia) en 2005 con 322 casos notificados [16] asociados con la exposición a un rebaño de ovejas mantenido en un prado cerca de la zona de alojamiento en la que ocurrieron los casos. El primer estudio de control sirvió para confirmar la hipótesis de una asociación entre el brote y el mercado de los agricultores. El hecho de que sólo la asistencia en el segundo día, pero no el primero, estuviera fuertemente asociada a la enfermedad apuntaba hacia el papel de la oveja que había dado a luz Las personas que acompañaban a los casos notificados (fuente 5) eran una mezcla de adultos y niños y por lo tanto se enumeran por separado. en la madrugada del 4 de mayo de 2005. Esta asociación fuerte y la fracción muy alta atribuible entre todos los casos sugerían una fuente puntual y justificaban definir los casos notificados a través del sistema de notificación como casos de brote si eran clínicamente compatibles con la fiebre Q y daban un historial de haber visitado el mercado de los agricultores. La naturaleza de la fuente puntual del brote permitió calcular el período de incubación de casos que promediaba 21 días y oscilaba entre 2 y 48 días con un intervalo intercuartílico de 16 a 24 días. Esto es compatible con la literatura [1]. Una entrevista adicional con los dos casos con inicio temprano (2 y 4 días después de asistir al mercado el 4 de mayo, Tasas de ataque entre adultos y niños en un escenario más probable y 8 escenarios más Figura 5 Tasas de ataque entre adultos y niños en un escenario más probable y 8 escenarios más probables. Escenario más probable: 3000 visitantes, 83% visitantes adultos y 20% tasa de ataque clínico entre adultos. Escenarios 1-8 variaron en los supuestos de "número de visitantes", "proporción de visitantes adultos" y "tasa de ataque entre adultos" (ver Tabla 3 ). Se muestran tasas de ataque y intervalos de confianza del 95% respectivamente) no pudieron identificar ninguna otra fuente de infección. Recientemente se observó un corto período de incubación en otro brote de fiebre Q en el que la dosis infecciosa fue probablemente muy alta [17]. El segundo estudio de control de caso entre las personas que visitaron el mercado el 4 de mayo Este hallazgo fue confirmado por el estudio de cohorte sobre vendedores que mostró que aquellos que trabajaron en un puesto cercano a (dentro de 6 metros) el corral de ovejas tenían un riesgo significativamente mayor de adquirir fiebre Q. El estudio no mostró un papel significativo de la ubicación del stand en referencia a la dirección del viento, aunque debemos tener en cuenta que el viento no era probable que no siempre y exactamente como lo informó la estación meteorológica. Sin embargo, si el viento había sido importante en todos los casos más podría haber ocurrido entre los proveedores situados a mayor distancia de las ovejas. Según los datos del sistema de vigilancia legal, la proporción de casos clínicos hospitalizados fue 25%, similar a la proporción de 21% encontrada en personas agrupadas de los otros estudios realizados. Varias publicaciones reportan proporciones inferiores a las encontradas en esta investigación: 4% (8/ 191) [7], 5% [1] y 10% (4/39) [5], y hubo al menos un estudio con una proporción mucho mayor (63% (10/16)) [18]. Es improbable que los hospitales notificaran casos con fiebre Q con más frecuencia que los médicos privados porque la proporción hospitalizada entre pacientes con fiebre Q identificados a través de llamadas telefónicas aleatorias en la población soest o en las dos cohortes fue similar a la de los casos notificados. Por lo tanto, notificar sesgos es una explicación poco probable para la proporción relativamente alta de casos hospitalizados. La estimación del 23% basada en la muestra aleatoria de personas que visitan el mercado en el segundo día parecería más inmune a la tendencia a recordar, incluso si no se puede descartar completamente. La estimación basada en la información sobre las personas que acompañan los casos puede estar sujeta a una sobreestimación porque estos individuos presumiblemente tenían una mayor probabilidad de estar cerca del corral de ovejas, similar a los casos. Por otro lado, la estimación del estudio de cohortes sobre los vendedores podría ser una subestimación, ya que los vendedores obviamente tenían un propósito diferente para estar en el mercado y podrían haber estado menos interesados en echar un vistazo a las ovejas. Sin embargo, todas las estimaciones eran independientes entre sí y teniendo en cuenta los diversos posibles sesgos, eran notablemente similares. En comparación, en un brote diferente en Alemania, en el que los habitantes de una aldea estaban expuestos a un gran rebaño de ovejas (n = 1000-2000) [5, 7] la tasa de ataque En un brote similar en Suiza, varios pueblos fueron expuestos a aproximadamente 900 ovejas [19]. En el pueblo más gravemente afectado, la tasa de ataque clínico fue del 16% (estimado a partir de los datos proporcionados) [19]. Es notable que en el brote descrito aquí, el potencial infeccioso de una oveja embarazada -sobre el cordero- era comparable al de rebaños enteros, aunque en diferentes entornos. Nuestra estimación de la proporción de casos confirmados serológicamente que se convirtieron en sintomáticos (50% (3/6)) se basa en una muestra muy pequeña, pero coherente con la literatura internacional. En el brote suizo mencionado anteriormente, el 46% de los pacientes serológicamente positivos desarrollaron enfermedad clínica [7]. Sólo aproximadamente la mitad de todos los casos sintomáticos se notificaron al sistema de vigilancia legal. Los pacientes que no buscaron atención médica debido a enfermedades leves, así como el subdiagnóstico o la falta de Nuestra tasa estimada de ataque del 3% entre los niños se basa en una serie de supuestos sucesivos y, por lo tanto, debe interpretarse con precaución. Sin embargo, el análisis de sensibilidad confirmó que los adultos tenían una tasa de ataque significativamente elevada en comparación con los niños. Si bien se ha sugerido que los niños tienen menor riesgo que los adultos de desarrollar enfermedades sintomáticas [7, 8], se han publicado pocos datos sobre las tasas de ataque de los niños en comparación con los adultos. La seroprevalencia estimada de C. burnetii en las manadas de ovejas en la zona varió del 8% al 24%. La seroprevalencia del 25% en la manada de los animales expuestos junto con una reacción positiva en cadena de polimerasa en un parto posterior en junio de 2003 sugirió una infección reciente de la manada [20]. La mediana de seroprevalencia en una serie de estudios relevantes realizados en el contexto de brotes humanos [7, 20, 21], fue del 40% en comparación con el 1% en rebaños de ovejas no vinculados a brotes humanos [20]. Este brote muestra las dramáticas consecuencias de poner a un gran número de individuos susceptibles en estrecho contacto con una sola oveja infectada que (en tal entorno) puede convertirse en un super-difundidor sobre la cría de cordero. Siempre hay un componente cultural en la interacción entre personas y animales, y estos pueden contribuir a brotes o cambios en los patrones de incidencia. Durante las últimas décadas se han producido la urbanización de las zonas rurales y cambios en la cría de animales [20], con intentos más recientes de poner en contacto a una población urbana "deprivada" con animales de granja. Si bien no todas las eventualidades pueden preverse, es importante sensibilizar a los propietarios de animales de compañía y de ganado, así como reforzar las recomendaciones cuando sea necesario. Este brote condujo a la modificación y ampliación de las recomendaciones existentes [25] que ahora prohíben la exhibición de ovejas en el último tercio de su embarazo y requieren pruebas periódicas de animales para C. burnetii en zoológicos de mascotas, donde existe un estrecho contacto entre humanos y animales. Debido al tamaño y la naturaleza de la fuente de este brote permitió una nueva evaluación de los parámetros epidemiológicos fundamentales, pero raramente estudiados de la fiebre Q. También sirvió para revisar las recomendaciones de salud pública para tener en cuenta los cambios en el tipo y la frecuencia de contacto de los seres humanos susceptibles con animales potencialmente infecciosos. Abreviaturas AFE = fracción atribuible de los casos expuestos Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

¿Cuál fue el rango intercuartil del período de incubación?

Una oveja súper extendida infecta a cientos de personas con fiebre Q en un mercado de agricultores en Alemaniahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1618839/SHA: ee1b5a9618dcc4080ed100486cedd0969e80fa4dAutores: Porten, Klaudia; Rissland, Jürgen; Tigges, Almira; Broll, Susanne; Hopp, Wilfried; Lunemann, Mechthild; van Treeck, Ulrich; Kimmig, Peter; Brockmann, Stefan O; Wagner-Wiening, Christiane; Hellenbrand, Wiebke; Buchholz, UdoFecha: 2006-10-06DOI: 10.1186/1471-2334-6-147Licencia: cc- MÉTODOS: En las entrevistas exploratorias los pacientes mencionaron haber visitado un mercado de agricultores donde una oveja había labrado. Las pruebas serológicas confirmaron el diagnóstico de fiebre Q. Se pidió a los departamentos de salud locales de Alemania que identificaran a los pacientes con fiebre Q que habían visitado el mercado de agricultores. Para investigar los factores de riesgo de infección se realizó un estudio de control de casos (los casos fueron pacientes con fiebre Q, los controles fueron seleccionados al azar ciudadanos soest) y un estudio de cohorte entre los vendedores en el mercado. Las ovejas exhibieron en el mercado, el rebaño del que se originó, así como ovejas de rebaños mantenidos en las proximidades de Soest se probaron para Coxiella burnetii (C. burnetii). RESULTADOS: Un total de 299 casos de fiebre Q reportados se vincularon a este brote. El período medio de incubación fue de 21 días, con un El estudio de control de casos identificó como factores de riesgo significativos la proximidad y parada de al menos unos pocos segundos en el corral de ovejas. Los vendedores dentro de aproximadamente 6 metros del corral de ovejas tuvieron mayor riesgo de enfermedad en comparación con los ubicados más lejos. El viento no jugó un papel significativo. La tasa de ataque clínico de adultos y niños se estimó en 20% y 3%, respectivamente, 25% de los casos fueron hospitalizados. La oveja que había labrado así como el 25% de su rebaño testó positivo para anticuerpos C. burnetii. CONCLUSIÓN: Debido a su tamaño y origen puntual este brote permitió la evaluación de parámetros epidemiológicos fundamentales, pero rara vez estudiados. Como consecuencia de este brote, se recomendó que las ovejas embarazadas no se exhibieran en público durante el trimestre 3(o) y para probar animales en zoológicos de mascotas regularmente para C. burnetii. Texto: La fiebre Q es una zoonosis mundial causada por Coxiella burnetii (C. burnetii), una bacteria intracelular pequeña, gramnegativa. C. burnetii muestra una variación antigénica con una fase infecciosa I y menos infecciosa II. El reservorio primario desde el que se produce la infección humana consiste en ovinos, caprinos y bovinos. Aunque las infecciones por C. burnetii en animales son generalmente asintomáticas, pueden causar abortos en ovejas y cabras [1]. Las altas concentraciones de C. burnetii pueden encontrarse en productos de nacimiento de mamíferos infectados [2]. Los humanos con frecuencia adquieren infección por inhalación de aerosoles contaminados a partir de fluidos parturinos, placenta o lana [1]. Debido a que la dosis infecciosa es muy baja [3] y C. burnetii es capaz de sobrevivir en un estado similar a esporas durante meses La infección por C. burnetii en humanos es asintomática en aproximadamente el 50% de los casos. Aproximadamente el 5% de los casos son hospitalizados, y los casos mortales son raros [1]. La presentación clínica de la fiebre Q aguda es variable y puede parecerse a muchas otras enfermedades infecciosas [2]. Sin embargo, la manifestación clínica más frecuente de la fiebre Q aguda es una enfermedad febril autolimitada asociada con dolor de cabeza severo. La neumonía atípica y la hepatitis son las principales manifestaciones clínicas de la enfermedad más grave. La fiebre Q aguda puede complicarse por meningoencefalitis o miocarditis. Rara vez una forma crónica de fiebre Q se desarrolla meses después de la enfermedad aguda, más comúnmente en forma de endocarditis [1]. Los niños desarrollan la enfermedad clínica con menos frecuencia [7, 8]. Debido a su presentación no específica, la fiebre Q sólo puede sospecharse por motivos clínicos y requiere confirmación serológica Si bien se considera que el método de referencia es el ensayo indirecto de inmunofluorescencia (IFA), la fijación del complemento (CF), ELISA y la microaglutinación (MA) también pueden utilizarse [9]. Las infecciones agudas se diagnostican con anticuerpos IgG y/o IgM antifase II elevados, mientras que los anticuerpos IgG antifase I son característicos de las infecciones crónicas [1]. En Alemania, la fiebre Q aguda es una enfermedad notificable. Entre 1991 y 2000 el número anual de casos varió de 46 a 273 casos al año [10]. En 2001 y 2002, se notificaron 293 y 191 casos, respectivamente [11, 12]. El 26 de mayo de 2003 el departamento de salud de Soest fue informado por un hospital local de un número inusualmente grande de pacientes con neumonía atípica. Dado que la etiología no estaba clara, se consideraron patógenos como el coronavirus SARS y se implementaron estrictas medidas de control de infecciones hasta el diagnóstico de fiebre Q. Se formó un equipo de investigación de brotes que incluyó a profesionales de salud pública del departamento de salud local, el departamento de salud veterinaria local, el departamento de salud estatal, el Laboratorio Nacional de Consultoría (NCL) para Coxiellae y el Instituto Robert Koch (RKI), el Instituto Federal de Salud Pública. Debido al tamaño y la aparición de la fuente puntual del brote, el objetivo de la investigación fue identificar factores etiológicos relevantes para la prevención y control de la fiebre Q, así como evaluar parámetros epidemiológicos que rara vez pueden ser estudiados de otra manera. Se solicitó a los médicos asistentes que analizaran el suero de pacientes con neumonía atípica de Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae, Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, Influenza A y B, Parainfluenza 1-3, Adenovirus y Enterovirus. Se probaron muestras de sangre para detectar el virus de la gripe, Adenovirus y SARS-Coronavirus. La confirmación de laboratorio de una infección aguda por fiebre Q se definió como la presencia de anticuerpos IgM contra antígenos de fase II C. burnetii (ELISA o IFA), un aumento de 4 veces en el título de anticuerpos IgG antifase II (ELISA o IFA) o en el título de anticuerpos antifase II por CF entre sueros agudos y convalecientes. Se confirmó una infección crónica cuando se Debido a que los pacientes con cardiopatías valvulares y las mujeres embarazadas tienen un alto riesgo de desarrollar infección crónica [13, 14], alertamos a los internistas y ginecólogos a través de la revista de la Asociación Médica Alemana y les pedimos que enviaran muestras de suero a la NCL si identificaban a pacientes de estos grupos de riesgo que habían estado en el mercado de agricultores durante el brote.El objetivo del primer estudio de caso de control fue determinar si existía un vínculo entre el mercado de los agricultores y el brote e identificar otros posibles factores de riesgo. Realizamos entrevistas telefónicas mediante un cuestionario estandarizado que preguntó acerca de la asistencia al mercado de agricultores, habiendo estado a 1 km de distancia de una de las 6 manadas de ovejas en la zona, picaduras de garrapatas y consumo de leche no pasteurizada, queso de oveja o de cabra. A los efectos de la CCS1 definimos un caso (caso CCS1) como un adulto residente en la ciudad de Soest notificado al sistema de vigilancia legal con fiebre Q, con inicio de síntomas entre el 4 de mayo y el 3 de junio de 2003. El criterio de exclusión fue un negativo IgM-titer contra antígenos de fase II. Se reclutaron dos controles por caso de habitantes de Soest por marcación aleatoria de dígitos. Calculamos la fracción atribuible de casos expuestos al mercado de agricultores el 4 de mayo (AFE) como (OR-1)/OR y la fracción atribuible para todos los casos debido a esta exposición como:El mercado de agricultores se mantuvo en una ciudad balneario cerca de Soest con muchos visitantes de otras zonas del estado e incluso de todo el país. Para determinar el tamaño del brote, pedimos a los departamentos de salud pública locales de Alemania que determinaran un posible vínculo con el mercado de agricultores en Soest para todos los Un caso en este contexto ("caso notificado") fue definido como cualquier persona con un diagnóstico clínico compatible con la fiebre Q con o sin confirmación de laboratorio y antecedentes de exposición al mercado de agricultores.Los departamentos de salud locales también informaron si un caso notificado fue hospitalizado.Para obtener una segunda estimación independiente de la proporción de hospitalizaciones entre pacientes sintomáticos más allá de la reportada a través del sistema de vigilancia legal se calculó la proporción de pacientes hospitalizados entre las personas que cumplen la definición de caso clínico (como se utiliza en el estudio de vendedores (s.b.)) identificado mediante muestreo aleatorio de la población Soest (dentro de CCS2 (s.b.)) así como en dos cohortes (estudio de vendedores y los 9 amigos marineros (véase más adelante).El objetivo de CCS2 fue identificar los factores de riesgo asociados con la asistencia del mercado de agricultores en el segundo día. Utilizamos la misma definición de caso que en el CCS1, pero incluimos solamente a las personas que habían visitado el mercado de agricultores el 4 de mayo, el segundo día del mercado. Seleccionamos los controles de nuevo al azar del registro telefónico de Soest e incluimos sólo a aquellas personas que habían visitado el mercado de agricultores el 4 de mayo y no habían estado enfermas de fiebre después. Los controles potenciales que se enfermaron fueron excluidos para su análisis en el CCS2, pero todavía estaban completamente entrevistados. Esto permitió calcular la tasa de ataque entre los visitantes al mercado (ver abajo "Estimación de la tasa de ataque global") y dio una estimación de la proporción de casos clínicamente enfermos que fueron hospitalizados (s.a.). En el estudio de los vendedores investigamos si la distancia del vendedor se encuentra desde la pluma de ovejas o la dispersión de C. burnetii por viento eran factores de riesgo relevantes para adquirir fiebre Q. Obtuvimos una lista de todos El 4 de mayo de 2003 se realizó una entrevista telefónica mediante cuestionarios estandarizados, se definió un caso como una persona con inicio de fiebre entre el 4 de mayo y el 3 de junio de 2003 y al menos tres de los siguientes síntomas: dolor de cabeza, tos, disnea, dolor articular, dolor muscular, pérdida de peso de más de 2 kg, fatiga, náuseas o vómitos; la distancia relativa de las gradas a la pluma de oveja se estimó por contar las gradas entre la pluma de oveja y el stand en cuestión; cada gradas se consideró una unidad de soporte (aproximadamente 3 metros); las gradas más grandes se contaron como 2 unidades; la dirección del viento en relación con la pluma de oveja se definió dividiendo la rosa de viento (360°) en 4 partes iguales de 90°; la dirección predominante del viento durante el mercado fue Sur-Sureste (Figura 1 ). Para el análisis dividimos la zona del mercado en 4 secciones En la sección 1, el viento soplaba hacia el corral de ovejas (más menos 45°). La sección 4 estaba en el lado opuesto, es decir, donde el viento soplaba desde el corral de ovejas hacia las gradas, y las secciones 2 y 3 estaban al este y al oeste con respecto a la dirección del viento, respectivamente. La ubicación de las gradas en referencia al corral de ovejas se definió así de dos maneras: como la distancia absoluta al corral de ovejas (en unidades de stand o metros) y en referencia a la dirección del viento. Identificamos una pequeña cohorte de 9 amigos marineros que visitaron el mercado de los agricultores el 4 de mayo de 2003. Todos ellos se probaron serológicamente independientemente de los síntomas. Por lo tanto, pudimos calcular la proporción de personas confirmadas por el laboratorio que cumplían la definición de caso clínico (como se define en el estudio de cohorte sobre vendedores). La tasa global de ataque entre adultos se estimó sobre la base de las siguientes fuentes:(1) Las entrevistas realizadas para el reclutamiento de controles para la CCS2 permitieron la proporción de adultos que adquirieron fiebre Q sintomática entre los que visitaron el mercado de agricultores en el segundo día;Fracción AFE atribuible Número de casos expuestos Todos los casos = *(2) Las entrevistas de casos y controles en la CCS2 dieron información sobre acompañantes adultos y cuántos de estos se convirtieron posteriormente en "peligrosidad";(3) Resultados de la pequeña cohorte de 9 amigos marineros (s.a.);(4) Resultados del estudio de cohorte sobre vendedores.Los departamentos de salud locales que identificaron casos de brote de fiebre Q (s.a. "determinación del tamaño del brote y epidemiología descriptiva") entrevistaron a pacientes sobre el número de personas que los habían acompañado al mercado de agricultores y si alguno de Sin embargo, como no hubo diferenciación entre adultos y niños, se realizaron cálculos para estimar la tasa de ataque entre adultos tanto con como sin esta fuente. Para contar los casos en (1), (3) y (4) se utilizó la definición de caso clínico tal como se definió en el estudio de cohorte sobre vendedores. Para el cálculo de la tasa de ataque entre niños obtenido en CCS2 fue la misma para todos los visitantes. El número de niños que visitaron el mercado se pudo estimar a partir del número total de visitantes estimado por los organizadores. Luego se estimó el número de niños sintomáticos (numerador). Para esto se asumió que la proporción de niños con fiebre Q que fueron vistos por médicos y por lo tanto fueron notificados fue la misma que la de adultos. Se calculó como:Así el número verdadero de niños con fiebre Q fue estimado por el número de niños reportados dividido por la proporción estimada reportada. A continuación, la tasa de ataque entre los niños pudo ser estimada de la siguiente manera:Debido a que este cálculo se basó en varios supuestos (número de visitantes, proporción de visitantes adultos y tasa de ataque clínico entre los adultos) se realizó un análisis de sensibilidad donde los valores de estas variables variaron.El sero fue recogido de todas las ovejas y vacas mostradas en el mercado de los agricultores, así como de todas las ovejas de los respectivos rebaños domésticos (70 animales).Las muestras de 25 ovejas de otros cinco rebaños en el área de Soest también fueron probadas para C. burnetii.Las pruebas fueron realizadas por ELISA con una mezcla de antígenos de fase I y fase II.Se realizó un análisis estadístico con Epi Info, versión 6.04 (CDC, Atlanta, EE.UU.).Se compararon variables dicotómicas en los estudios de control de casos y cohorte utilizando la prueba Chi-Square y variables La investigación del brote se llevó a cabo en el marco de la Ley de Reforma de la Ley de Enfermedades Transmisibles de Alemania. Se observaron normas obligatorias. Los pacientes del hospital local de Soest informaron de que el 3 y 4 de mayo de 2003 se había producido un mercado de agricultores en una ciudad balneario cercana a la ciudad de Soest. Se encontraba en un parque a lo largo del paseo principal, a una distancia de aproximadamente 500 metros. El mercado atrajo principalmente a tres grupos de personas: lugareños, habitantes de la gran región de Soest, pacientes del spa sanatoria y sus familiares o amigos visitantes. Los entrevistados iniciales mencionaron también que habían pasado tiempo en el corral de ovejas observando corderos recién nacidos que habían nacido en las primeras horas de la mañana del 4 de mayo de 2003. En total, 171 (65%) de 263 muestras séricas sometidas a la NCL fueron positivas para anticuerpos antifase II IgM por ELISA. Resultados de hisopos de garganta y suero fueron negativos para otros agentes infecciosos. (Figura 2 ) Si se supone que el inicio de los síntomas en los casos fue normalmente distribuido con una media de 21 días, el 95% de los casos (desviaciones estándar medias +/-2) tuvieron su inicio entre los días 10 y 31. Los dos casos notificados con inicio temprano el 6 y 8 de mayo, respectivamente, fueron confirmados en laboratorio y las entrevistas adicionales no revelaron ningún factor de riesgo adicional; de los 298 casos con sexo conocido, 158 (53%) eran varones y 140 (47%) eran mujeres. De los casos notificados, 189 (63%) procedían del condado de Soest, 104 (35%) correspondían al número notificado de adultos notificantes número de casos de ataques entre adultos. * Tasa de ataque entre niños estimada en número verdadero de niños = e en con fiebre Q. Se estimaba que el número de niños en el mercado de otros condados del mismo estado federal (Northrin Westfalia) y 6 (2%) procedían de otros cinco estados federales de Alemania (Figura 3 ). Sólo ocho (3%) casos eran menores de 18 años, la media y la mediana de edad era de 54 y 56 años, respectivamente (Figura 4 ). 75 (25%) de los 297 casos notificados fueron hospitalizados, ninguno murió. El cálculo de la proporción de casos hospitalizados a través de otras fuentes de información reveló que 4 de 19 (21%; IC 95% = 6-46%; (1/5 (CCS2), 2/11 (estudio de vendedores) y 1/3 (amigos de Sailor)) fueron hospitalizados; se notificó confirmación de laboratorio en 167 (56%) casos de brotes; 66 (22%) fueron confirmados por un aumento en el título de anticuerpos antifase II (CF), 89 (30%) tenían anticuerpos IgM contra antígenos de fase II, 11 (4%) fueron positivos en ambas pruebas y uno fue confirmado por cultivo; no se dispuso de información sobre si los 132 (44%) casos sin confirmación de laboratorio fueron probados en laboratorio; 18 pacientes con cardiopatías valvulares y 11 mujeres embarazadas fueron examinados; ninguno de ellos tuvo signos clínicos de fiebre Q. Dos (11%) de 18 pacientes cardiológicos y cuatro (36%) de 11 mujeres embarazadas tuvieron una infección aguda El seguimiento serológico de las madres detectó infección crónica en la misma mujer (caso 3) 12 semanas después del parto; el seguimiento de un año de dos recién nacidos (de los casos 1 y 3) no identificó infecciones agudas ni crónicas por fiebre Q; el 4 de mayo reclutamos 20 casos y 36 controles que visitaron el mercado de agricultores para el segundo estudio de control de casos; no difirieron significativamente en edad y sexo (OR para sexo masculino = 1,7; IC95% = 0,5-5,3; p = 0,26; valor de p para edad = 0,23). Diecisiete (85%) de 20 casos indicaron que habían visto a la vaca (que también estaba en exhibición en el mercado junto a la oveja) en comparación con 7 (32%) de localización geográfica de los casos de brote de fiebre Q notificados al sistema de vigilancia legal Figura 3 Localización geográfica de los casos de brote de fiebre Q notificados al sistema de vigilancia legal. o directamente en la puerta de la pluma de ovino en comparación con 8 (32%) de 25 controles (OR = 5,0; IC95% = 1,2-22,3; p = 0,03). Tocar a la oveja también fue significativamente más frecuente entre los casos (5/20 (25%) casos de CCS2 frente a 0/22 (0%) controles; O indefinido; IC95% inferior = 1,1; p = 0,02). 17 (85%) de 20 casos de CCS2, pero sólo 6 (25%) de 24 controles se detuvieron durante al menos unos pocos segundos en o en la pluma de ovinos, la referencia para esta variable fue "pasar por la pluma sin detenerse" (OR = 17,0; IC95% = 3,0-112,5; p < 0,01). Entre los casos de CCS2, la proximidad o el tiempo de permanencia con o cerca de la oveja no se asoció con un período de incubación más corto. Pudimos contactar y entrevistar a 75 (86%) de 87 vendedores, y recibimos información de segunda mano sobre 7 más (tasa de respuesta general: 94%). Cuarenta y cinco (56%) eran hombres y 35 (44%) eran mujeres. 13 (16%) cumplían la definición de caso clínico. De los 11 vendedores que trabajaron en dos unidades de stand del corral de ovejas, 6 (55%) se convirtieron en casos comparados con sólo 7 (10%) de 70 personas que trabajaron en un stand a mayor distancia (riesgo relativo (RR) = 5,5 (IC 95% = 2,3-13,2; p = 0,002); Figura 1 ). De estos 7 vendedores, 4 habían pasado tiempo dentro de los 5 metros de la pluma el 4 de mayo, uno había estado cerca de la pluma, pero a una distancia de más de 5 metros, y no se disponía de información sobre esta variable para los restantes 2. En la sección del mercado frente al viento procedente de la pluma (sección 4, Figura 1 ), 4 (9%) de 44 proveedores se convirtieron en casos, en comparación con 2 (13%) de 15 personas que trabajaron en la sección 1 (p = 0,6). Entre 22 personas que trabajaron en stands perpendiculares a la dirección del viento, En todos los escenarios la AR entre los adultos fue significativamente mayor que entre los niños (Figura 5). En total, 5 corderos y 5 ovejas fueron exhibidas en el mercado, una de ellas estaba embarazada y dio a luz a dos corderos gemelos a las 6:30 a.m. del 4 de mayo de 2003. De éstos, 3 ovejas incluyendo la que había probado positivo para C. burnetii. Los animales procedían de un rebaño de 67 ovejas, de las cuales 66 habían dado a luz entre febrero y junio. La mayoría de los nacimientos (57 (86%)) habían ocurrido en febrero y marzo, generalmente dentro de un establo o en un prado situado fuera de la ciudad. Seis ovejas abortaron, tuvieron mortinatos o corderos anormalmente débiles. Entre todas las ovejas, 17/67 (25%) habían probado positivo para C. burnetii. El porcentaje de ovejas que dieron positivo en los otros 5 rebaños de ovejas de la región osciló entre el 8% y el 24% (8%; 12%; 12%; 16%; 24%). Hemos descrito uno de los mayores brotes de fiebre Q en Alemania que, debido a su naturaleza puntual, brindó la oportunidad de evaluar muchas características epidemiológicas de la enfermedad que rara vez se pueden estudiar de otro modo. En 1954, más de 500 casos de fiebre Q estaban, similares a este brote, relacionados con el aborto de una vaca infectada en un mercado de agricultores [15]. Más recientemente, un gran brote ocurrió en Jena (Turingia) en 2005 con 322 casos notificados [16] asociados con la exposición a un rebaño de ovejas mantenido en un prado cerca de la zona de alojamiento en la que ocurrieron los casos. El primer estudio de control sirvió para confirmar la hipótesis de una asociación entre el brote y el mercado de los agricultores. El hecho de que sólo la asistencia en el segundo día, pero no el primero, estuviera fuertemente asociada a la enfermedad apuntaba hacia el papel de la oveja que había dado a luz Las personas que acompañaban a los casos notificados (fuente 5) eran una mezcla de adultos y niños y por lo tanto se enumeran por separado. en la madrugada del 4 de mayo de 2005. Esta asociación fuerte y la fracción muy alta atribuible entre todos los casos sugerían una fuente puntual y justificaban definir los casos notificados a través del sistema de notificación como casos de brote si eran clínicamente compatibles con la fiebre Q y daban un historial de haber visitado el mercado de los agricultores. La naturaleza de la fuente puntual del brote permitió calcular el período de incubación de casos que promediaba 21 días y oscilaba entre 2 y 48 días con un intervalo intercuartílico de 16 a 24 días. Esto es compatible con la literatura [1]. Una entrevista adicional con los dos casos con inicio temprano (2 y 4 días después de asistir al mercado el 4 de mayo, Tasas de ataque entre adultos y niños en un escenario más probable y 8 escenarios más Figura 5 Tasas de ataque entre adultos y niños en un escenario más probable y 8 escenarios más probables. Escenario más probable: 3000 visitantes, 83% visitantes adultos y 20% tasa de ataque clínico entre adultos. Escenarios 1-8 variaron en los supuestos de "número de visitantes", "proporción de visitantes adultos" y "tasa de ataque entre adultos" (ver Tabla 3 ). Se muestran tasas de ataque y intervalos de confianza del 95% respectivamente) no pudieron identificar ninguna otra fuente de infección. Recientemente se observó un corto período de incubación en otro brote de fiebre Q en el que la dosis infecciosa fue probablemente muy alta [17]. El segundo estudio de control de caso entre las personas que visitaron el mercado el 4 de mayo Este hallazgo fue confirmado por el estudio de cohorte sobre vendedores que mostró que aquellos que trabajaron en un puesto cercano a (dentro de 6 metros) el corral de ovejas tenían un riesgo significativamente mayor de adquirir fiebre Q. El estudio no mostró un papel significativo de la ubicación del stand en referencia a la dirección del viento, aunque debemos tener en cuenta que el viento no era probable que no siempre y exactamente como lo informó la estación meteorológica. Sin embargo, si el viento había sido importante en todos los casos más podría haber ocurrido entre los proveedores situados a mayor distancia de las ovejas. Según los datos del sistema de vigilancia legal, la proporción de casos clínicos hospitalizados fue 25%, similar a la proporción de 21% encontrada en personas agrupadas de los otros estudios realizados. Varias publicaciones reportan proporciones inferiores a las encontradas en esta investigación: 4% (8/ 191) [7], 5% [1] y 10% (4/39) [5], y hubo al menos un estudio con una proporción mucho mayor (63% (10/16)) [18]. Es improbable que los hospitales notificaran casos con fiebre Q con más frecuencia que los médicos privados porque la proporción hospitalizada entre pacientes con fiebre Q identificados a través de llamadas telefónicas aleatorias en la población soest o en las dos cohortes fue similar a la de los casos notificados. Por lo tanto, notificar sesgos es una explicación poco probable para la proporción relativamente alta de casos hospitalizados. La estimación del 23% basada en la muestra aleatoria de personas que visitan el mercado en el segundo día parecería más inmune a la tendencia a recordar, incluso si no se puede descartar completamente. La estimación basada en la información sobre las personas que acompañan los casos puede estar sujeta a una sobreestimación porque estos individuos presumiblemente tenían una mayor probabilidad de estar cerca del corral de ovejas, similar a los casos. Por otro lado, la estimación del estudio de cohortes sobre los vendedores podría ser una subestimación, ya que los vendedores obviamente tenían un propósito diferente para estar en el mercado y podrían haber estado menos interesados en echar un vistazo a las ovejas. Sin embargo, todas las estimaciones eran independientes entre sí y teniendo en cuenta los diversos posibles sesgos, eran notablemente similares. En comparación, en un brote diferente en Alemania, en el que los habitantes de una aldea estaban expuestos a un gran rebaño de ovejas (n = 1000-2000) [5, 7] la tasa de ataque En un brote similar en Suiza, varios pueblos fueron expuestos a aproximadamente 900 ovejas [19]. En el pueblo más gravemente afectado, la tasa de ataque clínico fue del 16% (estimado a partir de los datos proporcionados) [19]. Es notable que en el brote descrito aquí, el potencial infeccioso de una oveja embarazada -sobre el cordero- era comparable al de rebaños enteros, aunque en diferentes entornos. Nuestra estimación de la proporción de casos confirmados serológicamente que se convirtieron en sintomáticos (50% (3/6)) se basa en una muestra muy pequeña, pero coherente con la literatura internacional. En el brote suizo mencionado anteriormente, el 46% de los pacientes serológicamente positivos desarrollaron enfermedad clínica [7]. Sólo aproximadamente la mitad de todos los casos sintomáticos se notificaron al sistema de vigilancia legal. Los pacientes que no buscaron atención médica debido a enfermedades leves, así como el subdiagnóstico o la falta de Nuestra tasa estimada de ataque del 3% entre los niños se basa en una serie de supuestos sucesivos y, por lo tanto, debe interpretarse con precaución. Sin embargo, el análisis de sensibilidad confirmó que los adultos tenían una tasa de ataque significativamente elevada en comparación con los niños. Si bien se ha sugerido que los niños tienen menor riesgo que los adultos de desarrollar enfermedades sintomáticas [7, 8], se han publicado pocos datos sobre las tasas de ataque de los niños en comparación con los adultos. La seroprevalencia estimada de C. burnetii en las manadas de ovejas en la zona varió del 8% al 24%. La seroprevalencia del 25% en la manada de los animales expuestos junto con una reacción positiva en cadena de polimerasa en un parto posterior en junio de 2003 sugirió una infección reciente de la manada [20]. La mediana de seroprevalencia en una serie de estudios relevantes realizados en el contexto de brotes humanos [7, 20, 21], fue del 40% en comparación con el 1% en rebaños de ovejas no vinculados a brotes humanos [20]. Este brote muestra las dramáticas consecuencias de poner a un gran número de individuos susceptibles en estrecho contacto con una sola oveja infectada que (en tal entorno) puede convertirse en un super-difundidor sobre la cría de cordero. Siempre hay un componente cultural en la interacción entre personas y animales, y estos pueden contribuir a brotes o cambios en los patrones de incidencia. Durante las últimas décadas se han producido la urbanización de las zonas rurales y cambios en la cría de animales [20], con intentos más recientes de poner en contacto a una población urbana "deprivada" con animales de granja. Si bien no todas las eventualidades pueden preverse, es importante sensibilizar a los propietarios de animales de compañía y de ganado, así como reforzar las recomendaciones cuando sea necesario. Este brote condujo a la modificación y ampliación de las recomendaciones existentes [25] que ahora prohíben la exhibición de ovejas en el último tercio de su embarazo y requieren pruebas periódicas de animales para C. burnetii en zoológicos de mascotas, donde existe un estrecho contacto entre humanos y animales. Debido al tamaño y la naturaleza de la fuente de este brote permitió una nueva evaluación de los parámetros epidemiológicos fundamentales, pero raramente estudiados de la fiebre Q. También sirvió para revisar las recomendaciones de salud pública para tener en cuenta los cambios en el tipo y la frecuencia de contacto de los seres humanos susceptibles con animales potencialmente infecciosos. Abreviaturas AFE = fracción atribuible de los casos expuestos Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

¿Cuántos controles se utilizaron en el segundo estudio de caso?

Una oveja súper extendida infecta a cientos de personas con fiebre Q en un mercado de agricultores en Alemaniahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1618839/SHA: ee1b5a9618dcc4080ed100486cedd0969e80fa4dAutores: Porten, Klaudia; Rissland, Jürgen; Tigges, Almira; Broll, Susanne; Hopp, Wilfried; Lunemann, Mechthild; van Treeck, Ulrich; Kimmig, Peter; Brockmann, Stefan O; Wagner-Wiening, Christiane; Hellenbrand, Wiebke; Buchholz, UdoFecha: 2006-10-06DOI: 10.1186/1471-2334-6-147Licencia: cc- MÉTODOS: En las entrevistas exploratorias los pacientes mencionaron haber visitado un mercado de agricultores donde una oveja había labrado. Las pruebas serológicas confirmaron el diagnóstico de fiebre Q. Se pidió a los departamentos de salud locales de Alemania que identificaran a los pacientes con fiebre Q que habían visitado el mercado de agricultores. Para investigar los factores de riesgo de infección se realizó un estudio de control de casos (los casos fueron pacientes con fiebre Q, los controles fueron seleccionados al azar ciudadanos soest) y un estudio de cohorte entre los vendedores en el mercado. Las ovejas exhibieron en el mercado, el rebaño del que se originó, así como ovejas de rebaños mantenidos en las proximidades de Soest se probaron para Coxiella burnetii (C. burnetii). RESULTADOS: Un total de 299 casos de fiebre Q reportados se vincularon a este brote. El período medio de incubación fue de 21 días, con un El estudio de control de casos identificó como factores de riesgo significativos la proximidad y parada de al menos unos pocos segundos en el corral de ovejas. Los vendedores dentro de aproximadamente 6 metros del corral de ovejas tuvieron mayor riesgo de enfermedad en comparación con los ubicados más lejos. El viento no jugó un papel significativo. La tasa de ataque clínico de adultos y niños se estimó en 20% y 3%, respectivamente, 25% de los casos fueron hospitalizados. La oveja que había labrado así como el 25% de su rebaño testó positivo para anticuerpos C. burnetii. CONCLUSIÓN: Debido a su tamaño y origen puntual este brote permitió la evaluación de parámetros epidemiológicos fundamentales, pero rara vez estudiados. Como consecuencia de este brote, se recomendó que las ovejas embarazadas no se exhibieran en público durante el trimestre 3(o) y para probar animales en zoológicos de mascotas regularmente para C. burnetii. Texto: La fiebre Q es una zoonosis mundial causada por Coxiella burnetii (C. burnetii), una bacteria intracelular pequeña, gramnegativa. C. burnetii muestra una variación antigénica con una fase infecciosa I y menos infecciosa II. El reservorio primario desde el que se produce la infección humana consiste en ovinos, caprinos y bovinos. Aunque las infecciones por C. burnetii en animales son generalmente asintomáticas, pueden causar abortos en ovejas y cabras [1]. Las altas concentraciones de C. burnetii pueden encontrarse en productos de nacimiento de mamíferos infectados [2]. Los humanos con frecuencia adquieren infección por inhalación de aerosoles contaminados a partir de fluidos parturinos, placenta o lana [1]. Debido a que la dosis infecciosa es muy baja [3] y C. burnetii es capaz de sobrevivir en un estado similar a esporas durante meses La infección por C. burnetii en humanos es asintomática en aproximadamente el 50% de los casos. Aproximadamente el 5% de los casos son hospitalizados, y los casos mortales son raros [1]. La presentación clínica de la fiebre Q aguda es variable y puede parecerse a muchas otras enfermedades infecciosas [2]. Sin embargo, la manifestación clínica más frecuente de la fiebre Q aguda es una enfermedad febril autolimitada asociada con dolor de cabeza severo. La neumonía atípica y la hepatitis son las principales manifestaciones clínicas de la enfermedad más grave. La fiebre Q aguda puede complicarse por meningoencefalitis o miocarditis. Rara vez una forma crónica de fiebre Q se desarrolla meses después de la enfermedad aguda, más comúnmente en forma de endocarditis [1]. Los niños desarrollan la enfermedad clínica con menos frecuencia [7, 8]. Debido a su presentación no específica, la fiebre Q sólo puede sospecharse por motivos clínicos y requiere confirmación serológica Si bien se considera que el método de referencia es el ensayo indirecto de inmunofluorescencia (IFA), la fijación del complemento (CF), ELISA y la microaglutinación (MA) también pueden utilizarse [9]. Las infecciones agudas se diagnostican con anticuerpos IgG y/o IgM antifase II elevados, mientras que los anticuerpos IgG antifase I son característicos de las infecciones crónicas [1]. En Alemania, la fiebre Q aguda es una enfermedad notificable. Entre 1991 y 2000 el número anual de casos varió de 46 a 273 casos al año [10]. En 2001 y 2002, se notificaron 293 y 191 casos, respectivamente [11, 12]. El 26 de mayo de 2003 el departamento de salud de Soest fue informado por un hospital local de un número inusualmente grande de pacientes con neumonía atípica. Dado que la etiología no estaba clara, se consideraron patógenos como el coronavirus SARS y se implementaron estrictas medidas de control de infecciones hasta el diagnóstico de fiebre Q. Se formó un equipo de investigación de brotes que incluyó a profesionales de salud pública del departamento de salud local, el departamento de salud veterinaria local, el departamento de salud estatal, el Laboratorio Nacional de Consultoría (NCL) para Coxiellae y el Instituto Robert Koch (RKI), el Instituto Federal de Salud Pública. Debido al tamaño y la aparición de la fuente puntual del brote, el objetivo de la investigación fue identificar factores etiológicos relevantes para la prevención y control de la fiebre Q, así como evaluar parámetros epidemiológicos que rara vez pueden ser estudiados de otra manera. Se solicitó a los médicos asistentes que analizaran el suero de pacientes con neumonía atípica de Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae, Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, Influenza A y B, Parainfluenza 1-3, Adenovirus y Enterovirus. Se probaron muestras de sangre para detectar el virus de la gripe, Adenovirus y SARS-Coronavirus. La confirmación de laboratorio de una infección aguda por fiebre Q se definió como la presencia de anticuerpos IgM contra antígenos de fase II C. burnetii (ELISA o IFA), un aumento de 4 veces en el título de anticuerpos IgG antifase II (ELISA o IFA) o en el título de anticuerpos antifase II por CF entre sueros agudos y convalecientes. Se confirmó una infección crónica cuando se Debido a que los pacientes con cardiopatías valvulares y las mujeres embarazadas tienen un alto riesgo de desarrollar infección crónica [13, 14], alertamos a los internistas y ginecólogos a través de la revista de la Asociación Médica Alemana y les pedimos que enviaran muestras de suero a la NCL si identificaban a pacientes de estos grupos de riesgo que habían estado en el mercado de agricultores durante el brote.El objetivo del primer estudio de caso de control fue determinar si existía un vínculo entre el mercado de los agricultores y el brote e identificar otros posibles factores de riesgo. Realizamos entrevistas telefónicas mediante un cuestionario estandarizado que preguntó acerca de la asistencia al mercado de agricultores, habiendo estado a 1 km de distancia de una de las 6 manadas de ovejas en la zona, picaduras de garrapatas y consumo de leche no pasteurizada, queso de oveja o de cabra. A los efectos de la CCS1 definimos un caso (caso CCS1) como un adulto residente en la ciudad de Soest notificado al sistema de vigilancia legal con fiebre Q, con inicio de síntomas entre el 4 de mayo y el 3 de junio de 2003. El criterio de exclusión fue un negativo IgM-titer contra antígenos de fase II. Se reclutaron dos controles por caso de habitantes de Soest por marcación aleatoria de dígitos. Calculamos la fracción atribuible de casos expuestos al mercado de agricultores el 4 de mayo (AFE) como (OR-1)/OR y la fracción atribuible para todos los casos debido a esta exposición como:El mercado de agricultores se mantuvo en una ciudad balneario cerca de Soest con muchos visitantes de otras zonas del estado e incluso de todo el país. Para determinar el tamaño del brote, pedimos a los departamentos de salud pública locales de Alemania que determinaran un posible vínculo con el mercado de agricultores en Soest para todos los Un caso en este contexto ("caso notificado") fue definido como cualquier persona con un diagnóstico clínico compatible con la fiebre Q con o sin confirmación de laboratorio y antecedentes de exposición al mercado de agricultores.Los departamentos de salud locales también informaron si un caso notificado fue hospitalizado.Para obtener una segunda estimación independiente de la proporción de hospitalizaciones entre pacientes sintomáticos más allá de la reportada a través del sistema de vigilancia legal se calculó la proporción de pacientes hospitalizados entre las personas que cumplen la definición de caso clínico (como se utiliza en el estudio de vendedores (s.b.)) identificado mediante muestreo aleatorio de la población Soest (dentro de CCS2 (s.b.)) así como en dos cohortes (estudio de vendedores y los 9 amigos marineros (véase más adelante).El objetivo de CCS2 fue identificar los factores de riesgo asociados con la asistencia del mercado de agricultores en el segundo día. Utilizamos la misma definición de caso que en el CCS1, pero incluimos solamente a las personas que habían visitado el mercado de agricultores el 4 de mayo, el segundo día del mercado. Seleccionamos los controles de nuevo al azar del registro telefónico de Soest e incluimos sólo a aquellas personas que habían visitado el mercado de agricultores el 4 de mayo y no habían estado enfermas de fiebre después. Los controles potenciales que se enfermaron fueron excluidos para su análisis en el CCS2, pero todavía estaban completamente entrevistados. Esto permitió calcular la tasa de ataque entre los visitantes al mercado (ver abajo "Estimación de la tasa de ataque global") y dio una estimación de la proporción de casos clínicamente enfermos que fueron hospitalizados (s.a.). En el estudio de los vendedores investigamos si la distancia del vendedor se encuentra desde la pluma de ovejas o la dispersión de C. burnetii por viento eran factores de riesgo relevantes para adquirir fiebre Q. Obtuvimos una lista de todos El 4 de mayo de 2003 se realizó una entrevista telefónica mediante cuestionarios estandarizados, se definió un caso como una persona con inicio de fiebre entre el 4 de mayo y el 3 de junio de 2003 y al menos tres de los siguientes síntomas: dolor de cabeza, tos, disnea, dolor articular, dolor muscular, pérdida de peso de más de 2 kg, fatiga, náuseas o vómitos; la distancia relativa de las gradas a la pluma de oveja se estimó por contar las gradas entre la pluma de oveja y el stand en cuestión; cada gradas se consideró una unidad de soporte (aproximadamente 3 metros); las gradas más grandes se contaron como 2 unidades; la dirección del viento en relación con la pluma de oveja se definió dividiendo la rosa de viento (360°) en 4 partes iguales de 90°; la dirección predominante del viento durante el mercado fue Sur-Sureste (Figura 1 ). Para el análisis dividimos la zona del mercado en 4 secciones En la sección 1, el viento soplaba hacia el corral de ovejas (más menos 45°). La sección 4 estaba en el lado opuesto, es decir, donde el viento soplaba desde el corral de ovejas hacia las gradas, y las secciones 2 y 3 estaban al este y al oeste con respecto a la dirección del viento, respectivamente. La ubicación de las gradas en referencia al corral de ovejas se definió así de dos maneras: como la distancia absoluta al corral de ovejas (en unidades de stand o metros) y en referencia a la dirección del viento. Identificamos una pequeña cohorte de 9 amigos marineros que visitaron el mercado de los agricultores el 4 de mayo de 2003. Todos ellos se probaron serológicamente independientemente de los síntomas. Por lo tanto, pudimos calcular la proporción de personas confirmadas por el laboratorio que cumplían la definición de caso clínico (como se define en el estudio de cohorte sobre vendedores). La tasa global de ataque entre adultos se estimó sobre la base de las siguientes fuentes:(1) Las entrevistas realizadas para el reclutamiento de controles para la CCS2 permitieron la proporción de adultos que adquirieron fiebre Q sintomática entre los que visitaron el mercado de agricultores en el segundo día;Fracción AFE atribuible Número de casos expuestos Todos los casos = *(2) Las entrevistas de casos y controles en la CCS2 dieron información sobre acompañantes adultos y cuántos de estos se convirtieron posteriormente en "peligrosidad";(3) Resultados de la pequeña cohorte de 9 amigos marineros (s.a.);(4) Resultados del estudio de cohorte sobre vendedores.Los departamentos de salud locales que identificaron casos de brote de fiebre Q (s.a. "determinación del tamaño del brote y epidemiología descriptiva") entrevistaron a pacientes sobre el número de personas que los habían acompañado al mercado de agricultores y si alguno de Sin embargo, como no hubo diferenciación entre adultos y niños, se realizaron cálculos para estimar la tasa de ataque entre adultos tanto con como sin esta fuente. Para contar los casos en (1), (3) y (4) se utilizó la definición de caso clínico tal como se definió en el estudio de cohorte sobre vendedores. Para el cálculo de la tasa de ataque entre niños obtenido en CCS2 fue la misma para todos los visitantes. El número de niños que visitaron el mercado se pudo estimar a partir del número total de visitantes estimado por los organizadores. Luego se estimó el número de niños sintomáticos (numerador). Para esto se asumió que la proporción de niños con fiebre Q que fueron vistos por médicos y por lo tanto fueron notificados fue la misma que la de adultos. Se calculó como:Así el número verdadero de niños con fiebre Q fue estimado por el número de niños reportados dividido por la proporción estimada reportada. A continuación, la tasa de ataque entre los niños pudo ser estimada de la siguiente manera:Debido a que este cálculo se basó en varios supuestos (número de visitantes, proporción de visitantes adultos y tasa de ataque clínico entre los adultos) se realizó un análisis de sensibilidad donde los valores de estas variables variaron.El sero fue recogido de todas las ovejas y vacas mostradas en el mercado de los agricultores, así como de todas las ovejas de los respectivos rebaños domésticos (70 animales).Las muestras de 25 ovejas de otros cinco rebaños en el área de Soest también fueron probadas para C. burnetii.Las pruebas fueron realizadas por ELISA con una mezcla de antígenos de fase I y fase II.Se realizó un análisis estadístico con Epi Info, versión 6.04 (CDC, Atlanta, EE.UU.).Se compararon variables dicotómicas en los estudios de control de casos y cohorte utilizando la prueba Chi-Square y variables La investigación del brote se llevó a cabo en el marco de la Ley de Reforma de la Ley de Enfermedades Transmisibles de Alemania. Se observaron normas obligatorias. Los pacientes del hospital local de Soest informaron de que el 3 y 4 de mayo de 2003 se había producido un mercado de agricultores en una ciudad balneario cercana a la ciudad de Soest. Se encontraba en un parque a lo largo del paseo principal, a una distancia de aproximadamente 500 metros. El mercado atrajo principalmente a tres grupos de personas: lugareños, habitantes de la gran región de Soest, pacientes del spa sanatoria y sus familiares o amigos visitantes. Los entrevistados iniciales mencionaron también que habían pasado tiempo en el corral de ovejas observando corderos recién nacidos que habían nacido en las primeras horas de la mañana del 4 de mayo de 2003. En total, 171 (65%) de 263 muestras séricas sometidas a la NCL fueron positivas para anticuerpos antifase II IgM por ELISA. Resultados de hisopos de garganta y suero fueron negativos para otros agentes infecciosos. (Figura 2 ) Si se supone que el inicio de los síntomas en los casos fue normalmente distribuido con una media de 21 días, el 95% de los casos (desviaciones estándar medias +/-2) tuvieron su inicio entre los días 10 y 31. Los dos casos notificados con inicio temprano el 6 y 8 de mayo, respectivamente, fueron confirmados en laboratorio y las entrevistas adicionales no revelaron ningún factor de riesgo adicional; de los 298 casos con sexo conocido, 158 (53%) eran varones y 140 (47%) eran mujeres. De los casos notificados, 189 (63%) procedían del condado de Soest, 104 (35%) correspondían al número notificado de adultos notificantes número de casos de ataques entre adultos. * Tasa de ataque entre niños estimada en número verdadero de niños = e en con fiebre Q. Se estimaba que el número de niños en el mercado de otros condados del mismo estado federal (Northrin Westfalia) y 6 (2%) procedían de otros cinco estados federales de Alemania (Figura 3 ). Sólo ocho (3%) casos eran menores de 18 años, la media y la mediana de edad era de 54 y 56 años, respectivamente (Figura 4 ). 75 (25%) de los 297 casos notificados fueron hospitalizados, ninguno murió. El cálculo de la proporción de casos hospitalizados a través de otras fuentes de información reveló que 4 de 19 (21%; IC 95% = 6-46%; (1/5 (CCS2), 2/11 (estudio de vendedores) y 1/3 (amigos de Sailor)) fueron hospitalizados; se notificó confirmación de laboratorio en 167 (56%) casos de brotes; 66 (22%) fueron confirmados por un aumento en el título de anticuerpos antifase II (CF), 89 (30%) tenían anticuerpos IgM contra antígenos de fase II, 11 (4%) fueron positivos en ambas pruebas y uno fue confirmado por cultivo; no se dispuso de información sobre si los 132 (44%) casos sin confirmación de laboratorio fueron probados en laboratorio; 18 pacientes con cardiopatías valvulares y 11 mujeres embarazadas fueron examinados; ninguno de ellos tuvo signos clínicos de fiebre Q. Dos (11%) de 18 pacientes cardiológicos y cuatro (36%) de 11 mujeres embarazadas tuvieron una infección aguda El seguimiento serológico de las madres detectó infección crónica en la misma mujer (caso 3) 12 semanas después del parto; el seguimiento de un año de dos recién nacidos (de los casos 1 y 3) no identificó infecciones agudas ni crónicas por fiebre Q; el 4 de mayo reclutamos 20 casos y 36 controles que visitaron el mercado de agricultores para el segundo estudio de control de casos; no difirieron significativamente en edad y sexo (OR para sexo masculino = 1,7; IC95% = 0,5-5,3; p = 0,26; valor de p para edad = 0,23). Diecisiete (85%) de 20 casos indicaron que habían visto a la vaca (que también estaba en exhibición en el mercado junto a la oveja) en comparación con 7 (32%) de localización geográfica de los casos de brote de fiebre Q notificados al sistema de vigilancia legal Figura 3 Localización geográfica de los casos de brote de fiebre Q notificados al sistema de vigilancia legal. o directamente en la puerta de la pluma de ovino en comparación con 8 (32%) de 25 controles (OR = 5,0; IC95% = 1,2-22,3; p = 0,03). Tocar a la oveja también fue significativamente más frecuente entre los casos (5/20 (25%) casos de CCS2 frente a 0/22 (0%) controles; O indefinido; IC95% inferior = 1,1; p = 0,02). 17 (85%) de 20 casos de CCS2, pero sólo 6 (25%) de 24 controles se detuvieron durante al menos unos pocos segundos en o en la pluma de ovinos, la referencia para esta variable fue "pasar por la pluma sin detenerse" (OR = 17,0; IC95% = 3,0-112,5; p < 0,01). Entre los casos de CCS2, la proximidad o el tiempo de permanencia con o cerca de la oveja no se asoció con un período de incubación más corto. Pudimos contactar y entrevistar a 75 (86%) de 87 vendedores, y recibimos información de segunda mano sobre 7 más (tasa de respuesta general: 94%). Cuarenta y cinco (56%) eran hombres y 35 (44%) eran mujeres. 13 (16%) cumplían la definición de caso clínico. De los 11 vendedores que trabajaron en dos unidades de stand del corral de ovejas, 6 (55%) se convirtieron en casos comparados con sólo 7 (10%) de 70 personas que trabajaron en un stand a mayor distancia (riesgo relativo (RR) = 5,5 (IC 95% = 2,3-13,2; p = 0,002); Figura 1 ). De estos 7 vendedores, 4 habían pasado tiempo dentro de los 5 metros de la pluma el 4 de mayo, uno había estado cerca de la pluma, pero a una distancia de más de 5 metros, y no se disponía de información sobre esta variable para los restantes 2. En la sección del mercado frente al viento procedente de la pluma (sección 4, Figura 1 ), 4 (9%) de 44 proveedores se convirtieron en casos, en comparación con 2 (13%) de 15 personas que trabajaron en la sección 1 (p = 0,6). Entre 22 personas que trabajaron en stands perpendiculares a la dirección del viento, En todos los escenarios la AR entre los adultos fue significativamente mayor que entre los niños (Figura 5). En total, 5 corderos y 5 ovejas fueron exhibidas en el mercado, una de ellas estaba embarazada y dio a luz a dos corderos gemelos a las 6:30 a.m. del 4 de mayo de 2003. De éstos, 3 ovejas incluyendo la que había probado positivo para C. burnetii. Los animales procedían de un rebaño de 67 ovejas, de las cuales 66 habían dado a luz entre febrero y junio. La mayoría de los nacimientos (57 (86%)) habían ocurrido en febrero y marzo, generalmente dentro de un establo o en un prado situado fuera de la ciudad. Seis ovejas abortaron, tuvieron mortinatos o corderos anormalmente débiles. Entre todas las ovejas, 17/67 (25%) habían probado positivo para C. burnetii. El porcentaje de ovejas que dieron positivo en los otros 5 rebaños de ovejas de la región osciló entre el 8% y el 24% (8%; 12%; 12%; 16%; 24%). Hemos descrito uno de los mayores brotes de fiebre Q en Alemania que, debido a su naturaleza puntual, brindó la oportunidad de evaluar muchas características epidemiológicas de la enfermedad que rara vez se pueden estudiar de otro modo. En 1954, más de 500 casos de fiebre Q estaban, similares a este brote, relacionados con el aborto de una vaca infectada en un mercado de agricultores [15]. Más recientemente, un gran brote ocurrió en Jena (Turingia) en 2005 con 322 casos notificados [16] asociados con la exposición a un rebaño de ovejas mantenido en un prado cerca de la zona de alojamiento en la que ocurrieron los casos. El primer estudio de control sirvió para confirmar la hipótesis de una asociación entre el brote y el mercado de los agricultores. El hecho de que sólo la asistencia en el segundo día, pero no el primero, estuviera fuertemente asociada a la enfermedad apuntaba hacia el papel de la oveja que había dado a luz Las personas que acompañaban a los casos notificados (fuente 5) eran una mezcla de adultos y niños y por lo tanto se enumeran por separado. en la madrugada del 4 de mayo de 2005. Esta asociación fuerte y la fracción muy alta atribuible entre todos los casos sugerían una fuente puntual y justificaban definir los casos notificados a través del sistema de notificación como casos de brote si eran clínicamente compatibles con la fiebre Q y daban un historial de haber visitado el mercado de los agricultores. La naturaleza de la fuente puntual del brote permitió calcular el período de incubación de casos que promediaba 21 días y oscilaba entre 2 y 48 días con un intervalo intercuartílico de 16 a 24 días. Esto es compatible con la literatura [1]. Una entrevista adicional con los dos casos con inicio temprano (2 y 4 días después de asistir al mercado el 4 de mayo, Tasas de ataque entre adultos y niños en un escenario más probable y 8 escenarios más Figura 5 Tasas de ataque entre adultos y niños en un escenario más probable y 8 escenarios más probables. Escenario más probable: 3000 visitantes, 83% visitantes adultos y 20% tasa de ataque clínico entre adultos. Escenarios 1-8 variaron en los supuestos de "número de visitantes", "proporción de visitantes adultos" y "tasa de ataque entre adultos" (ver Tabla 3 ). Se muestran tasas de ataque y intervalos de confianza del 95% respectivamente) no pudieron identificar ninguna otra fuente de infección. Recientemente se observó un corto período de incubación en otro brote de fiebre Q en el que la dosis infecciosa fue probablemente muy alta [17]. El segundo estudio de control de caso entre las personas que visitaron el mercado el 4 de mayo Este hallazgo fue confirmado por el estudio de cohorte sobre vendedores que mostró que aquellos que trabajaron en un puesto cercano a (dentro de 6 metros) el corral de ovejas tenían un riesgo significativamente mayor de adquirir fiebre Q. El estudio no mostró un papel significativo de la ubicación del stand en referencia a la dirección del viento, aunque debemos tener en cuenta que el viento no era probable que no siempre y exactamente como lo informó la estación meteorológica. Sin embargo, si el viento había sido importante en todos los casos más podría haber ocurrido entre los proveedores situados a mayor distancia de las ovejas. Según los datos del sistema de vigilancia legal, la proporción de casos clínicos hospitalizados fue 25%, similar a la proporción de 21% encontrada en personas agrupadas de los otros estudios realizados. Varias publicaciones reportan proporciones inferiores a las encontradas en esta investigación: 4% (8/ 191) [7], 5% [1] y 10% (4/39) [5], y hubo al menos un estudio con una proporción mucho mayor (63% (10/16)) [18]. Es improbable que los hospitales notificaran casos con fiebre Q con más frecuencia que los médicos privados porque la proporción hospitalizada entre pacientes con fiebre Q identificados a través de llamadas telefónicas aleatorias en la población soest o en las dos cohortes fue similar a la de los casos notificados. Por lo tanto, notificar sesgos es una explicación poco probable para la proporción relativamente alta de casos hospitalizados. La estimación del 23% basada en la muestra aleatoria de personas que visitan el mercado en el segundo día parecería más inmune a la tendencia a recordar, incluso si no se puede descartar completamente. La estimación basada en la información sobre las personas que acompañan los casos puede estar sujeta a una sobreestimación porque estos individuos presumiblemente tenían una mayor probabilidad de estar cerca del corral de ovejas, similar a los casos. Por otro lado, la estimación del estudio de cohortes sobre los vendedores podría ser una subestimación, ya que los vendedores obviamente tenían un propósito diferente para estar en el mercado y podrían haber estado menos interesados en echar un vistazo a las ovejas. Sin embargo, todas las estimaciones eran independientes entre sí y teniendo en cuenta los diversos posibles sesgos, eran notablemente similares. En comparación, en un brote diferente en Alemania, en el que los habitantes de una aldea estaban expuestos a un gran rebaño de ovejas (n = 1000-2000) [5, 7] la tasa de ataque En un brote similar en Suiza, varios pueblos fueron expuestos a aproximadamente 900 ovejas [19]. En el pueblo más gravemente afectado, la tasa de ataque clínico fue del 16% (estimado a partir de los datos proporcionados) [19]. Es notable que en el brote descrito aquí, el potencial infeccioso de una oveja embarazada -sobre el cordero- era comparable al de rebaños enteros, aunque en diferentes entornos. Nuestra estimación de la proporción de casos confirmados serológicamente que se convirtieron en sintomáticos (50% (3/6)) se basa en una muestra muy pequeña, pero coherente con la literatura internacional. En el brote suizo mencionado anteriormente, el 46% de los pacientes serológicamente positivos desarrollaron enfermedad clínica [7]. Sólo aproximadamente la mitad de todos los casos sintomáticos se notificaron al sistema de vigilancia legal. Los pacientes que no buscaron atención médica debido a enfermedades leves, así como el subdiagnóstico o la falta de Nuestra tasa estimada de ataque del 3% entre los niños se basa en una serie de supuestos sucesivos y, por lo tanto, debe interpretarse con precaución. Sin embargo, el análisis de sensibilidad confirmó que los adultos tenían una tasa de ataque significativamente elevada en comparación con los niños. Si bien se ha sugerido que los niños tienen menor riesgo que los adultos de desarrollar enfermedades sintomáticas [7, 8], se han publicado pocos datos sobre las tasas de ataque de los niños en comparación con los adultos. La seroprevalencia estimada de C. burnetii en las manadas de ovejas en la zona varió del 8% al 24%. La seroprevalencia del 25% en la manada de los animales expuestos junto con una reacción positiva en cadena de polimerasa en un parto posterior en junio de 2003 sugirió una infección reciente de la manada [20]. La mediana de seroprevalencia en una serie de estudios relevantes realizados en el contexto de brotes humanos [7, 20, 21], fue del 40% en comparación con el 1% en rebaños de ovejas no vinculados a brotes humanos [20]. Este brote muestra las dramáticas consecuencias de poner a un gran número de individuos susceptibles en estrecho contacto con una sola oveja infectada que (en tal entorno) puede convertirse en un super-difundidor sobre la cría de cordero. Siempre hay un componente cultural en la interacción entre personas y animales, y estos pueden contribuir a brotes o cambios en los patrones de incidencia. Durante las últimas décadas se han producido la urbanización de las zonas rurales y cambios en la cría de animales [20], con intentos más recientes de poner en contacto a una población urbana "deprivada" con animales de granja. Si bien no todas las eventualidades pueden preverse, es importante sensibilizar a los propietarios de animales de compañía y de ganado, así como reforzar las recomendaciones cuando sea necesario. Este brote condujo a la modificación y ampliación de las recomendaciones existentes [25] que ahora prohíben la exhibición de ovejas en el último tercio de su embarazo y requieren pruebas periódicas de animales para C. burnetii en zoológicos de mascotas, donde existe un estrecho contacto entre humanos y animales. Debido al tamaño y la naturaleza de la fuente de este brote permitió una nueva evaluación de los parámetros epidemiológicos fundamentales, pero raramente estudiados de la fiebre Q. También sirvió para revisar las recomendaciones de salud pública para tener en cuenta los cambios en el tipo y la frecuencia de contacto de los seres humanos susceptibles con animales potencialmente infecciosos. Abreviaturas AFE = fracción atribuible de los casos expuestos Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

¿Qué causa la fiebre Q?

Una oveja súper extendida infecta a cientos de personas con fiebre Q en un mercado de agricultores en Alemaniahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1618839/SHA: ee1b5a9618dcc4080ed100486cedd0969e80fa4dAutores: Porten, Klaudia; Rissland, Jürgen; Tigges, Almira; Broll, Susanne; Hopp, Wilfried; Lunemann, Mechthild; van Treeck, Ulrich; Kimmig, Peter; Brockmann, Stefan O; Wagner-Wiening, Christiane; Hellenbrand, Wiebke; Buchholz, UdoFecha: 2006-10-06DOI: 10.1186/1471-2334-6-147Licencia: cc- MÉTODOS: En las entrevistas exploratorias los pacientes mencionaron haber visitado un mercado de agricultores donde una oveja había labrado. Las pruebas serológicas confirmaron el diagnóstico de fiebre Q. Se pidió a los departamentos de salud locales de Alemania que identificaran a los pacientes con fiebre Q que habían visitado el mercado de agricultores. Para investigar los factores de riesgo de infección se realizó un estudio de control de casos (los casos fueron pacientes con fiebre Q, los controles fueron seleccionados al azar ciudadanos soest) y un estudio de cohorte entre los vendedores en el mercado. Las ovejas exhibieron en el mercado, el rebaño del que se originó, así como ovejas de rebaños mantenidos en las proximidades de Soest se probaron para Coxiella burnetii (C. burnetii). RESULTADOS: Un total de 299 casos de fiebre Q reportados se vincularon a este brote. El período medio de incubación fue de 21 días, con un El estudio de control de casos identificó como factores de riesgo significativos la proximidad y parada de al menos unos pocos segundos en el corral de ovejas. Los vendedores dentro de aproximadamente 6 metros del corral de ovejas tuvieron mayor riesgo de enfermedad en comparación con los ubicados más lejos. El viento no jugó un papel significativo. La tasa de ataque clínico de adultos y niños se estimó en 20% y 3%, respectivamente, 25% de los casos fueron hospitalizados. La oveja que había labrado así como el 25% de su rebaño testó positivo para anticuerpos C. burnetii. CONCLUSIÓN: Debido a su tamaño y origen puntual este brote permitió la evaluación de parámetros epidemiológicos fundamentales, pero rara vez estudiados. Como consecuencia de este brote, se recomendó que las ovejas embarazadas no se exhibieran en público durante el trimestre 3(o) y para probar animales en zoológicos de mascotas regularmente para C. burnetii. Texto: La fiebre Q es una zoonosis mundial causada por Coxiella burnetii (C. burnetii), una bacteria intracelular pequeña, gramnegativa. C. burnetii muestra una variación antigénica con una fase infecciosa I y menos infecciosa II. El reservorio primario desde el que se produce la infección humana consiste en ovinos, caprinos y bovinos. Aunque las infecciones por C. burnetii en animales son generalmente asintomáticas, pueden causar abortos en ovejas y cabras [1]. Las altas concentraciones de C. burnetii pueden encontrarse en productos de nacimiento de mamíferos infectados [2]. Los humanos con frecuencia adquieren infección por inhalación de aerosoles contaminados a partir de fluidos parturinos, placenta o lana [1]. Debido a que la dosis infecciosa es muy baja [3] y C. burnetii es capaz de sobrevivir en un estado similar a esporas durante meses La infección por C. burnetii en humanos es asintomática en aproximadamente el 50% de los casos. Aproximadamente el 5% de los casos son hospitalizados, y los casos mortales son raros [1]. La presentación clínica de la fiebre Q aguda es variable y puede parecerse a muchas otras enfermedades infecciosas [2]. Sin embargo, la manifestación clínica más frecuente de la fiebre Q aguda es una enfermedad febril autolimitada asociada con dolor de cabeza severo. La neumonía atípica y la hepatitis son las principales manifestaciones clínicas de la enfermedad más grave. La fiebre Q aguda puede complicarse por meningoencefalitis o miocarditis. Rara vez una forma crónica de fiebre Q se desarrolla meses después de la enfermedad aguda, más comúnmente en forma de endocarditis [1]. Los niños desarrollan la enfermedad clínica con menos frecuencia [7, 8]. Debido a su presentación no específica, la fiebre Q sólo puede sospecharse por motivos clínicos y requiere confirmación serológica Si bien se considera que el método de referencia es el ensayo indirecto de inmunofluorescencia (IFA), la fijación del complemento (CF), ELISA y la microaglutinación (MA) también pueden utilizarse [9]. Las infecciones agudas se diagnostican con anticuerpos IgG y/o IgM antifase II elevados, mientras que los anticuerpos IgG antifase I son característicos de las infecciones crónicas [1]. En Alemania, la fiebre Q aguda es una enfermedad notificable. Entre 1991 y 2000 el número anual de casos varió de 46 a 273 casos al año [10]. En 2001 y 2002, se notificaron 293 y 191 casos, respectivamente [11, 12]. El 26 de mayo de 2003 el departamento de salud de Soest fue informado por un hospital local de un número inusualmente grande de pacientes con neumonía atípica. Dado que la etiología no estaba clara, se consideraron patógenos como el coronavirus SARS y se implementaron estrictas medidas de control de infecciones hasta el diagnóstico de fiebre Q. Se formó un equipo de investigación de brotes que incluyó a profesionales de salud pública del departamento de salud local, el departamento de salud veterinaria local, el departamento de salud estatal, el Laboratorio Nacional de Consultoría (NCL) para Coxiellae y el Instituto Robert Koch (RKI), el Instituto Federal de Salud Pública. Debido al tamaño y la aparición de la fuente puntual del brote, el objetivo de la investigación fue identificar factores etiológicos relevantes para la prevención y control de la fiebre Q, así como evaluar parámetros epidemiológicos que rara vez pueden ser estudiados de otra manera. Se solicitó a los médicos asistentes que analizaran el suero de pacientes con neumonía atípica de Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae, Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, Influenza A y B, Parainfluenza 1-3, Adenovirus y Enterovirus. Se probaron muestras de sangre para detectar el virus de la gripe, Adenovirus y SARS-Coronavirus. La confirmación de laboratorio de una infección aguda por fiebre Q se definió como la presencia de anticuerpos IgM contra antígenos de fase II C. burnetii (ELISA o IFA), un aumento de 4 veces en el título de anticuerpos IgG antifase II (ELISA o IFA) o en el título de anticuerpos antifase II por CF entre sueros agudos y convalecientes. Se confirmó una infección crónica cuando se Debido a que los pacientes con cardiopatías valvulares y las mujeres embarazadas tienen un alto riesgo de desarrollar infección crónica [13, 14], alertamos a los internistas y ginecólogos a través de la revista de la Asociación Médica Alemana y les pedimos que enviaran muestras de suero a la NCL si identificaban a pacientes de estos grupos de riesgo que habían estado en el mercado de agricultores durante el brote.El objetivo del primer estudio de caso de control fue determinar si existía un vínculo entre el mercado de los agricultores y el brote e identificar otros posibles factores de riesgo. Realizamos entrevistas telefónicas mediante un cuestionario estandarizado que preguntó acerca de la asistencia al mercado de agricultores, habiendo estado a 1 km de distancia de una de las 6 manadas de ovejas en la zona, picaduras de garrapatas y consumo de leche no pasteurizada, queso de oveja o de cabra. A los efectos de la CCS1 definimos un caso (caso CCS1) como un adulto residente en la ciudad de Soest notificado al sistema de vigilancia legal con fiebre Q, con inicio de síntomas entre el 4 de mayo y el 3 de junio de 2003. El criterio de exclusión fue un negativo IgM-titer contra antígenos de fase II. Se reclutaron dos controles por caso de habitantes de Soest por marcación aleatoria de dígitos. Calculamos la fracción atribuible de casos expuestos al mercado de agricultores el 4 de mayo (AFE) como (OR-1)/OR y la fracción atribuible para todos los casos debido a esta exposición como:El mercado de agricultores se mantuvo en una ciudad balneario cerca de Soest con muchos visitantes de otras zonas del estado e incluso de todo el país. Para determinar el tamaño del brote, pedimos a los departamentos de salud pública locales de Alemania que determinaran un posible vínculo con el mercado de agricultores en Soest para todos los Un caso en este contexto ("caso notificado") fue definido como cualquier persona con un diagnóstico clínico compatible con la fiebre Q con o sin confirmación de laboratorio y antecedentes de exposición al mercado de agricultores.Los departamentos de salud locales también informaron si un caso notificado fue hospitalizado.Para obtener una segunda estimación independiente de la proporción de hospitalizaciones entre pacientes sintomáticos más allá de la reportada a través del sistema de vigilancia legal se calculó la proporción de pacientes hospitalizados entre las personas que cumplen la definición de caso clínico (como se utiliza en el estudio de vendedores (s.b.)) identificado mediante muestreo aleatorio de la población Soest (dentro de CCS2 (s.b.)) así como en dos cohortes (estudio de vendedores y los 9 amigos marineros (véase más adelante).El objetivo de CCS2 fue identificar los factores de riesgo asociados con la asistencia del mercado de agricultores en el segundo día. Utilizamos la misma definición de caso que en el CCS1, pero incluimos solamente a las personas que habían visitado el mercado de agricultores el 4 de mayo, el segundo día del mercado. Seleccionamos los controles de nuevo al azar del registro telefónico de Soest e incluimos sólo a aquellas personas que habían visitado el mercado de agricultores el 4 de mayo y no habían estado enfermas de fiebre después. Los controles potenciales que se enfermaron fueron excluidos para su análisis en el CCS2, pero todavía estaban completamente entrevistados. Esto permitió calcular la tasa de ataque entre los visitantes al mercado (ver abajo "Estimación de la tasa de ataque global") y dio una estimación de la proporción de casos clínicamente enfermos que fueron hospitalizados (s.a.). En el estudio de los vendedores investigamos si la distancia del vendedor se encuentra desde la pluma de ovejas o la dispersión de C. burnetii por viento eran factores de riesgo relevantes para adquirir fiebre Q. Obtuvimos una lista de todos El 4 de mayo de 2003 se realizó una entrevista telefónica mediante cuestionarios estandarizados, se definió un caso como una persona con inicio de fiebre entre el 4 de mayo y el 3 de junio de 2003 y al menos tres de los siguientes síntomas: dolor de cabeza, tos, disnea, dolor articular, dolor muscular, pérdida de peso de más de 2 kg, fatiga, náuseas o vómitos; la distancia relativa de las gradas a la pluma de oveja se estimó por contar las gradas entre la pluma de oveja y el stand en cuestión; cada gradas se consideró una unidad de soporte (aproximadamente 3 metros); las gradas más grandes se contaron como 2 unidades; la dirección del viento en relación con la pluma de oveja se definió dividiendo la rosa de viento (360°) en 4 partes iguales de 90°; la dirección predominante del viento durante el mercado fue Sur-Sureste (Figura 1 ). Para el análisis dividimos la zona del mercado en 4 secciones En la sección 1, el viento soplaba hacia el corral de ovejas (más menos 45°). La sección 4 estaba en el lado opuesto, es decir, donde el viento soplaba desde el corral de ovejas hacia las gradas, y las secciones 2 y 3 estaban al este y al oeste con respecto a la dirección del viento, respectivamente. La ubicación de las gradas en referencia al corral de ovejas se definió así de dos maneras: como la distancia absoluta al corral de ovejas (en unidades de stand o metros) y en referencia a la dirección del viento. Identificamos una pequeña cohorte de 9 amigos marineros que visitaron el mercado de los agricultores el 4 de mayo de 2003. Todos ellos se probaron serológicamente independientemente de los síntomas. Por lo tanto, pudimos calcular la proporción de personas confirmadas por el laboratorio que cumplían la definición de caso clínico (como se define en el estudio de cohorte sobre vendedores). La tasa global de ataque entre adultos se estimó sobre la base de las siguientes fuentes:(1) Las entrevistas realizadas para el reclutamiento de controles para la CCS2 permitieron la proporción de adultos que adquirieron fiebre Q sintomática entre los que visitaron el mercado de agricultores en el segundo día;Fracción AFE atribuible Número de casos expuestos Todos los casos = *(2) Las entrevistas de casos y controles en la CCS2 dieron información sobre acompañantes adultos y cuántos de estos se convirtieron posteriormente en "peligrosidad";(3) Resultados de la pequeña cohorte de 9 amigos marineros (s.a.);(4) Resultados del estudio de cohorte sobre vendedores.Los departamentos de salud locales que identificaron casos de brote de fiebre Q (s.a. "determinación del tamaño del brote y epidemiología descriptiva") entrevistaron a pacientes sobre el número de personas que los habían acompañado al mercado de agricultores y si alguno de Sin embargo, como no hubo diferenciación entre adultos y niños, se realizaron cálculos para estimar la tasa de ataque entre adultos tanto con como sin esta fuente. Para contar los casos en (1), (3) y (4) se utilizó la definición de caso clínico tal como se definió en el estudio de cohorte sobre vendedores. Para el cálculo de la tasa de ataque entre niños obtenido en CCS2 fue la misma para todos los visitantes. El número de niños que visitaron el mercado se pudo estimar a partir del número total de visitantes estimado por los organizadores. Luego se estimó el número de niños sintomáticos (numerador). Para esto se asumió que la proporción de niños con fiebre Q que fueron vistos por médicos y por lo tanto fueron notificados fue la misma que la de adultos. Se calculó como:Así el número verdadero de niños con fiebre Q fue estimado por el número de niños reportados dividido por la proporción estimada reportada. A continuación, la tasa de ataque entre los niños pudo ser estimada de la siguiente manera:Debido a que este cálculo se basó en varios supuestos (número de visitantes, proporción de visitantes adultos y tasa de ataque clínico entre los adultos) se realizó un análisis de sensibilidad donde los valores de estas variables variaron.El sero fue recogido de todas las ovejas y vacas mostradas en el mercado de los agricultores, así como de todas las ovejas de los respectivos rebaños domésticos (70 animales).Las muestras de 25 ovejas de otros cinco rebaños en el área de Soest también fueron probadas para C. burnetii.Las pruebas fueron realizadas por ELISA con una mezcla de antígenos de fase I y fase II.Se realizó un análisis estadístico con Epi Info, versión 6.04 (CDC, Atlanta, EE.UU.).Se compararon variables dicotómicas en los estudios de control de casos y cohorte utilizando la prueba Chi-Square y variables La investigación del brote se llevó a cabo en el marco de la Ley de Reforma de la Ley de Enfermedades Transmisibles de Alemania. Se observaron normas obligatorias. Los pacientes del hospital local de Soest informaron de que el 3 y 4 de mayo de 2003 se había producido un mercado de agricultores en una ciudad balneario cercana a la ciudad de Soest. Se encontraba en un parque a lo largo del paseo principal, a una distancia de aproximadamente 500 metros. El mercado atrajo principalmente a tres grupos de personas: lugareños, habitantes de la gran región de Soest, pacientes del spa sanatoria y sus familiares o amigos visitantes. Los entrevistados iniciales mencionaron también que habían pasado tiempo en el corral de ovejas observando corderos recién nacidos que habían nacido en las primeras horas de la mañana del 4 de mayo de 2003. En total, 171 (65%) de 263 muestras séricas sometidas a la NCL fueron positivas para anticuerpos antifase II IgM por ELISA. Resultados de hisopos de garganta y suero fueron negativos para otros agentes infecciosos. (Figura 2 ) Si se supone que el inicio de los síntomas en los casos fue normalmente distribuido con una media de 21 días, el 95% de los casos (desviaciones estándar medias +/-2) tuvieron su inicio entre los días 10 y 31. Los dos casos notificados con inicio temprano el 6 y 8 de mayo, respectivamente, fueron confirmados en laboratorio y las entrevistas adicionales no revelaron ningún factor de riesgo adicional; de los 298 casos con sexo conocido, 158 (53%) eran varones y 140 (47%) eran mujeres. De los casos notificados, 189 (63%) procedían del condado de Soest, 104 (35%) correspondían al número notificado de adultos notificantes número de casos de ataques entre adultos. * Tasa de ataque entre niños estimada en número verdadero de niños = e en con fiebre Q. Se estimaba que el número de niños en el mercado de otros condados del mismo estado federal (Northrin Westfalia) y 6 (2%) procedían de otros cinco estados federales de Alemania (Figura 3 ). Sólo ocho (3%) casos eran menores de 18 años, la media y la mediana de edad era de 54 y 56 años, respectivamente (Figura 4 ). 75 (25%) de los 297 casos notificados fueron hospitalizados, ninguno murió. El cálculo de la proporción de casos hospitalizados a través de otras fuentes de información reveló que 4 de 19 (21%; IC 95% = 6-46%; (1/5 (CCS2), 2/11 (estudio de vendedores) y 1/3 (amigos de Sailor)) fueron hospitalizados; se notificó confirmación de laboratorio en 167 (56%) casos de brotes; 66 (22%) fueron confirmados por un aumento en el título de anticuerpos antifase II (CF), 89 (30%) tenían anticuerpos IgM contra antígenos de fase II, 11 (4%) fueron positivos en ambas pruebas y uno fue confirmado por cultivo; no se dispuso de información sobre si los 132 (44%) casos sin confirmación de laboratorio fueron probados en laboratorio; 18 pacientes con cardiopatías valvulares y 11 mujeres embarazadas fueron examinados; ninguno de ellos tuvo signos clínicos de fiebre Q. Dos (11%) de 18 pacientes cardiológicos y cuatro (36%) de 11 mujeres embarazadas tuvieron una infección aguda El seguimiento serológico de las madres detectó infección crónica en la misma mujer (caso 3) 12 semanas después del parto; el seguimiento de un año de dos recién nacidos (de los casos 1 y 3) no identificó infecciones agudas ni crónicas por fiebre Q; el 4 de mayo reclutamos 20 casos y 36 controles que visitaron el mercado de agricultores para el segundo estudio de control de casos; no difirieron significativamente en edad y sexo (OR para sexo masculino = 1,7; IC95% = 0,5-5,3; p = 0,26; valor de p para edad = 0,23). Diecisiete (85%) de 20 casos indicaron que habían visto a la vaca (que también estaba en exhibición en el mercado junto a la oveja) en comparación con 7 (32%) de localización geográfica de los casos de brote de fiebre Q notificados al sistema de vigilancia legal Figura 3 Localización geográfica de los casos de brote de fiebre Q notificados al sistema de vigilancia legal. o directamente en la puerta de la pluma de ovino en comparación con 8 (32%) de 25 controles (OR = 5,0; IC95% = 1,2-22,3; p = 0,03). Tocar a la oveja también fue significativamente más frecuente entre los casos (5/20 (25%) casos de CCS2 frente a 0/22 (0%) controles; O indefinido; IC95% inferior = 1,1; p = 0,02). 17 (85%) de 20 casos de CCS2, pero sólo 6 (25%) de 24 controles se detuvieron durante al menos unos pocos segundos en o en la pluma de ovinos, la referencia para esta variable fue "pasar por la pluma sin detenerse" (OR = 17,0; IC95% = 3,0-112,5; p < 0,01). Entre los casos de CCS2, la proximidad o el tiempo de permanencia con o cerca de la oveja no se asoció con un período de incubación más corto. Pudimos contactar y entrevistar a 75 (86%) de 87 vendedores, y recibimos información de segunda mano sobre 7 más (tasa de respuesta general: 94%). Cuarenta y cinco (56%) eran hombres y 35 (44%) eran mujeres. 13 (16%) cumplían la definición de caso clínico. De los 11 vendedores que trabajaron en dos unidades de stand del corral de ovejas, 6 (55%) se convirtieron en casos comparados con sólo 7 (10%) de 70 personas que trabajaron en un stand a mayor distancia (riesgo relativo (RR) = 5,5 (IC 95% = 2,3-13,2; p = 0,002); Figura 1 ). De estos 7 vendedores, 4 habían pasado tiempo dentro de los 5 metros de la pluma el 4 de mayo, uno había estado cerca de la pluma, pero a una distancia de más de 5 metros, y no se disponía de información sobre esta variable para los restantes 2. En la sección del mercado frente al viento procedente de la pluma (sección 4, Figura 1 ), 4 (9%) de 44 proveedores se convirtieron en casos, en comparación con 2 (13%) de 15 personas que trabajaron en la sección 1 (p = 0,6). Entre 22 personas que trabajaron en stands perpendiculares a la dirección del viento, En todos los escenarios la AR entre los adultos fue significativamente mayor que entre los niños (Figura 5). En total, 5 corderos y 5 ovejas fueron exhibidas en el mercado, una de ellas estaba embarazada y dio a luz a dos corderos gemelos a las 6:30 a.m. del 4 de mayo de 2003. De éstos, 3 ovejas incluyendo la que había probado positivo para C. burnetii. Los animales procedían de un rebaño de 67 ovejas, de las cuales 66 habían dado a luz entre febrero y junio. La mayoría de los nacimientos (57 (86%)) habían ocurrido en febrero y marzo, generalmente dentro de un establo o en un prado situado fuera de la ciudad. Seis ovejas abortaron, tuvieron mortinatos o corderos anormalmente débiles. Entre todas las ovejas, 17/67 (25%) habían probado positivo para C. burnetii. El porcentaje de ovejas que dieron positivo en los otros 5 rebaños de ovejas de la región osciló entre el 8% y el 24% (8%; 12%; 12%; 16%; 24%). Hemos descrito uno de los mayores brotes de fiebre Q en Alemania que, debido a su naturaleza puntual, brindó la oportunidad de evaluar muchas características epidemiológicas de la enfermedad que rara vez se pueden estudiar de otro modo. En 1954, más de 500 casos de fiebre Q estaban, similares a este brote, relacionados con el aborto de una vaca infectada en un mercado de agricultores [15]. Más recientemente, un gran brote ocurrió en Jena (Turingia) en 2005 con 322 casos notificados [16] asociados con la exposición a un rebaño de ovejas mantenido en un prado cerca de la zona de alojamiento en la que ocurrieron los casos. El primer estudio de control sirvió para confirmar la hipótesis de una asociación entre el brote y el mercado de los agricultores. El hecho de que sólo la asistencia en el segundo día, pero no el primero, estuviera fuertemente asociada a la enfermedad apuntaba hacia el papel de la oveja que había dado a luz Las personas que acompañaban a los casos notificados (fuente 5) eran una mezcla de adultos y niños y por lo tanto se enumeran por separado. en la madrugada del 4 de mayo de 2005. Esta asociación fuerte y la fracción muy alta atribuible entre todos los casos sugerían una fuente puntual y justificaban definir los casos notificados a través del sistema de notificación como casos de brote si eran clínicamente compatibles con la fiebre Q y daban un historial de haber visitado el mercado de los agricultores. La naturaleza de la fuente puntual del brote permitió calcular el período de incubación de casos que promediaba 21 días y oscilaba entre 2 y 48 días con un intervalo intercuartílico de 16 a 24 días. Esto es compatible con la literatura [1]. Una entrevista adicional con los dos casos con inicio temprano (2 y 4 días después de asistir al mercado el 4 de mayo, Tasas de ataque entre adultos y niños en un escenario más probable y 8 escenarios más Figura 5 Tasas de ataque entre adultos y niños en un escenario más probable y 8 escenarios más probables. Escenario más probable: 3000 visitantes, 83% visitantes adultos y 20% tasa de ataque clínico entre adultos. Escenarios 1-8 variaron en los supuestos de "número de visitantes", "proporción de visitantes adultos" y "tasa de ataque entre adultos" (ver Tabla 3 ). Se muestran tasas de ataque y intervalos de confianza del 95% respectivamente) no pudieron identificar ninguna otra fuente de infección. Recientemente se observó un corto período de incubación en otro brote de fiebre Q en el que la dosis infecciosa fue probablemente muy alta [17]. El segundo estudio de control de caso entre las personas que visitaron el mercado el 4 de mayo Este hallazgo fue confirmado por el estudio de cohorte sobre vendedores que mostró que aquellos que trabajaron en un puesto cercano a (dentro de 6 metros) el corral de ovejas tenían un riesgo significativamente mayor de adquirir fiebre Q. El estudio no mostró un papel significativo de la ubicación del stand en referencia a la dirección del viento, aunque debemos tener en cuenta que el viento no era probable que no siempre y exactamente como lo informó la estación meteorológica. Sin embargo, si el viento había sido importante en todos los casos más podría haber ocurrido entre los proveedores situados a mayor distancia de las ovejas. Según los datos del sistema de vigilancia legal, la proporción de casos clínicos hospitalizados fue 25%, similar a la proporción de 21% encontrada en personas agrupadas de los otros estudios realizados. Varias publicaciones reportan proporciones inferiores a las encontradas en esta investigación: 4% (8/ 191) [7], 5% [1] y 10% (4/39) [5], y hubo al menos un estudio con una proporción mucho mayor (63% (10/16)) [18]. Es improbable que los hospitales notificaran casos con fiebre Q con más frecuencia que los médicos privados porque la proporción hospitalizada entre pacientes con fiebre Q identificados a través de llamadas telefónicas aleatorias en la población soest o en las dos cohortes fue similar a la de los casos notificados. Por lo tanto, notificar sesgos es una explicación poco probable para la proporción relativamente alta de casos hospitalizados. La estimación del 23% basada en la muestra aleatoria de personas que visitan el mercado en el segundo día parecería más inmune a la tendencia a recordar, incluso si no se puede descartar completamente. La estimación basada en la información sobre las personas que acompañan los casos puede estar sujeta a una sobreestimación porque estos individuos presumiblemente tenían una mayor probabilidad de estar cerca del corral de ovejas, similar a los casos. Por otro lado, la estimación del estudio de cohortes sobre los vendedores podría ser una subestimación, ya que los vendedores obviamente tenían un propósito diferente para estar en el mercado y podrían haber estado menos interesados en echar un vistazo a las ovejas. Sin embargo, todas las estimaciones eran independientes entre sí y teniendo en cuenta los diversos posibles sesgos, eran notablemente similares. En comparación, en un brote diferente en Alemania, en el que los habitantes de una aldea estaban expuestos a un gran rebaño de ovejas (n = 1000-2000) [5, 7] la tasa de ataque En un brote similar en Suiza, varios pueblos fueron expuestos a aproximadamente 900 ovejas [19]. En el pueblo más gravemente afectado, la tasa de ataque clínico fue del 16% (estimado a partir de los datos proporcionados) [19]. Es notable que en el brote descrito aquí, el potencial infeccioso de una oveja embarazada -sobre el cordero- era comparable al de rebaños enteros, aunque en diferentes entornos. Nuestra estimación de la proporción de casos confirmados serológicamente que se convirtieron en sintomáticos (50% (3/6)) se basa en una muestra muy pequeña, pero coherente con la literatura internacional. En el brote suizo mencionado anteriormente, el 46% de los pacientes serológicamente positivos desarrollaron enfermedad clínica [7]. Sólo aproximadamente la mitad de todos los casos sintomáticos se notificaron al sistema de vigilancia legal. Los pacientes que no buscaron atención médica debido a enfermedades leves, así como el subdiagnóstico o la falta de Nuestra tasa estimada de ataque del 3% entre los niños se basa en una serie de supuestos sucesivos y, por lo tanto, debe interpretarse con precaución. Sin embargo, el análisis de sensibilidad confirmó que los adultos tenían una tasa de ataque significativamente elevada en comparación con los niños. Si bien se ha sugerido que los niños tienen menor riesgo que los adultos de desarrollar enfermedades sintomáticas [7, 8], se han publicado pocos datos sobre las tasas de ataque de los niños en comparación con los adultos. La seroprevalencia estimada de C. burnetii en las manadas de ovejas en la zona varió del 8% al 24%. La seroprevalencia del 25% en la manada de los animales expuestos junto con una reacción positiva en cadena de polimerasa en un parto posterior en junio de 2003 sugirió una infección reciente de la manada [20]. La mediana de seroprevalencia en una serie de estudios relevantes realizados en el contexto de brotes humanos [7, 20, 21], fue del 40% en comparación con el 1% en rebaños de ovejas no vinculados a brotes humanos [20]. Este brote muestra las dramáticas consecuencias de poner a un gran número de individuos susceptibles en estrecho contacto con una sola oveja infectada que (en tal entorno) puede convertirse en un super-difundidor sobre la cría de cordero. Siempre hay un componente cultural en la interacción entre personas y animales, y estos pueden contribuir a brotes o cambios en los patrones de incidencia. Durante las últimas décadas se han producido la urbanización de las zonas rurales y cambios en la cría de animales [20], con intentos más recientes de poner en contacto a una población urbana "deprivada" con animales de granja. Si bien no todas las eventualidades pueden preverse, es importante sensibilizar a los propietarios de animales de compañía y de ganado, así como reforzar las recomendaciones cuando sea necesario. Este brote condujo a la modificación y ampliación de las recomendaciones existentes [25] que ahora prohíben la exhibición de ovejas en el último tercio de su embarazo y requieren pruebas periódicas de animales para C. burnetii en zoológicos de mascotas, donde existe un estrecho contacto entre humanos y animales. Debido al tamaño y la naturaleza de la fuente de este brote permitió una nueva evaluación de los parámetros epidemiológicos fundamentales, pero raramente estudiados de la fiebre Q. También sirvió para revisar las recomendaciones de salud pública para tener en cuenta los cambios en el tipo y la frecuencia de contacto de los seres humanos susceptibles con animales potencialmente infecciosos. Abreviaturas AFE = fracción atribuible de los casos expuestos Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

¿Cuál es el depósito primario de Coxiella burnetii?

Predicción de interacciones lncRNA-proteína utilizando puntuaciones HeteSim basadas en redes heterogéneashttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5473862/SHA: f4f9ea9e0aeb74d3601ee316b84292638c59cc53Autores: Xiao, Yun; Zhang, Jingpu; Deng, LeiFecha: 2017-06-16DOI: 10.1038/s41598-017-03986-1Licencia: cc-byAbstract: Estudios masivos han indicado que los ARNs largos no codificantes (lncRNAs) son críticos para la regulación de procesos biológicos celulares mediante la unión con proteínas relacionadas con el ARN. Sin embargo, sólo se han reportado algunas asociaciones de proteína lncRNA apoyadas experimentalmente. Los métodos basados en la red existentes se centran típicamente en las características intrínsecas del lncRNA y la proteína, pero ignoran la información implícita en las topologías de las redes biológicas asociadas con lncRNAs. Considerando las limitaciones en métodos anteriores, proponemos PLPIHS, un método computacional efectivo para predecir las interacciones lncRNAs-proteína utilizando las puntuaciones HeteSim. PLPIHS utiliza la medida HeteSim para calcular la puntuación de la relación para cada par de proteínas lncRNAs en la red heterogénea, que consiste en red de similitud lncRNAs-lncRNAs, red de asociación lncRNAs-proteína y red de interacción proteína-proteína. Se construye un clasificador SVM para predecir las interacciones lncRNAs-proteína con las puntuaciones HeteSim. Los resultados muestran que PLPIHS funciona significativamente mejor que También comparamos los resultados de las redes con diferentes densidades de conectividad y encontramos que PLPIHS funciona bien en todas las redes. Además, utilizamos el método propuesto para identificar las proteínas relacionadas con el lncRNA MALAT1. Las proteínas altamente clasificadas son verificadas por los estudios biológicos y demuestran la efectividad de nuestro método. Texto: el enfoque más utilizado es la culpa por asociación (GBA) 19, que proporciona el principio central de arriba abajo para analizar las redes genéticas en términos funcionales o evaluar su calidad en la codificación de la información funcional. Nuevos métodos surgidos, incluyendo el método Katz 20, Combinando dATa A través de especies utilizando técnicas de aprendizaje positivas sin etiqueta (CATAPULT) 19, Caminada aleatoria con reinicio (RWR) 21, y LncRNA-protein Interacción predicción basada en el modelo de red heterogénea (LPIHN) 22, han extendido la asociación de interacciones de proteínas sólo directas a conexiones más distantes de varias maneras. La medida KATZ 20 es una suma ponderada del número de rutas en la red que mide la similitud de dos nodos. CATAPULT 19 es un método de aprendizaje de máquina supervisado que utiliza una máquina vectorial de soporte parcial donde las características se derivan de caminatas en una red heterogénea de rastro genético. RWR 21 es un método para priorizar genes candidatos mediante el uso de una medida de distancia de red global, análisis de caminatas aleatorias, para definir similitudes en las redes de interacción proteína-proteína y añade peso a la suposición de que enfermedades fenotípicamente similares están asociadas con alteraciones de subredes dentro del interactoma proteico más grande que se extienden más allá de las propias proteínas de la enfermedad. LPIHN 22 es un método basado en la red mediante la implementación de una caminata aleatoria en una red heterogénea. PRINCE es un método global basado en la formulación de limitaciones en la función de priorización que se relacionan con su suavidad sobre la red y el uso de información previa. Sin embargo, muchos métodos basados en redes existentes simplemente ven los objetos en redes heterogéneas como el mismo tipo y no consideran los sutiles significados semánticos de diferentes rutas. En este artículo, adoptamos un método llamado HeteSim, que es una medida basada en rutas para calcular la relevancia entre los objetos en redes heterogéneas 25. La idea básica es que objetos similares son más propensos a estar relacionados con otros objetos. Teniendo en cuenta la relación de los objetos heterogéneos es la ruta restringida, HeteSim da una medida uniforme y simétrica para las rutas arbitrarias para evaluar la relación de pares de objetos heterogéneos (mismo o diferentes tipos) con una sola puntuación. Debido a la ruta de relevancia no sólo captura la información de la semántica sino que también limita la ruta de caminata, la puntuación es también una medida de similitud basada en rutas. Un ejemplo de puntuación HeteSim se ilustra El conteo de caminatas entre A y C es mayor que B y C, lo que podría indicar que A está más cerca de C que B. Pero la conectividad entre B y C es más intensa que A y C a la vista de la puntuación de HeteSim, ya que la mayoría de los bordes a partir de B están conectados con C, cuando A sólo tiene una pequeña parte de los bordes conectados con C. Aquí, proponemos un método llamado PLPIHS (Fig. 2) para predecir interacciones de lncRNA-Proteína usando las puntuaciones de HeteSim. Primero construimos una red heterogénea que consiste en una red de similitud lncRNA-lncRNA, una red de asociación de proteína lncRNA y una red de interacción proteína-proteína. Luego, utilizamos la medida HeteSim para calcular la puntuación de cada par de proteína lncRNA en la red. Comparamos nuestro PLPIHS con PRINCE, RWR y LPIHN y encontramos que PLPIHS supera a los otros métodos en muchas medidas de rendimiento. Medidas de validación. LOOCV(Validación cruzada de una sola salida) 26 se implementa en las asociaciones de proteínas lncR-NA verificadas para evaluar el rendimiento de LPIHN 22. Dejamos un conocido par de proteínas lncRNA a su vez como muestra de prueba y todos los otros pares conocidos de proteínas lncRNA se consideran muestras de entrenamiento. Con el fin de mejorar la precisión de PLPIHS, eliminamos todos los lncRNAs y proteínas conectados mientras que en cada ronda de validación. Receiver Operating Characteristic(ROC) curva 27 se utiliza para evaluar el rendimiento de predicción, que traza tasa de verdadero positivo (TPR, sensibilidad o recordar) versus tasa de falso positivo (FPR Al variar los cortes de rango de la predicción exitosa, podemos obtener la correspondiente TPR y FPR. De esta manera, se dibuja la curva ROC y se calcula el área bajo la curva (AUC) también. Para un umbral de rango, sensibilidad (SEN) 28 y especificidad (SPE) 29 Estas mediciones también se utilizan para evaluar la capacidad de PLPIHS durante el procedimiento de preprocesamiento. Afección de las características de preprocesamiento de la red. En este artículo, sólo tenemos dos tipos de objetos, lncRNA y proteína. Así, las rutas de un lncRNA a una proteína en nuestra red heterogénea con menos de seis longitudes se enumeran en la Tabla 1. Con el fin de seleccionar las rutas más eficientes, comparamos las actuaciones de estos 14 caminos bajo diferentes combinaciones (Fig. 3). Podemos ver que todos los caminos alcanzan un estatus favorable excepto la ruta 12′. La trayectoria 114′ obtiene el mejor rendimiento en todas las medidas, lo que significa que la trayectoria con longitud superior a tres contiene significados más significativos. El factor constante β se utiliza para controlar la influencia de rutas más largas. Cuanto más larga es la longitud de la trayectoria, menor es el factor inhibidor. La longitud de la trayectoria es igual a 3 coincidencias con la constante β, longitud de la trayectoria es igual a 4 coincidencias con la constante β*β y longitud de la trayectoria es igual a 5 coincidencias con la constante β*β*β. La tabla 2 muestra que β tiene un pequeño impacto en los resultados finales y β = 0,2, 0.4 y 0.7 logró la mejor puntuación AUC y los otros no están muy atrasados todavía. Para verificar aún más la dependencia de nuestro método, comparamos las tres redes de densidad de conectividad diferente bajo diferentes valores de corte 0.3, 0.5 y 0.9 (ver asociaciones lnc La puntuación AUC de la red 0.5 es más alta que la de otras, mientras que la red 0.9 supera a otras en ACC, SEN, MCC y F1-Score. Esto sugiere que PLPIHS funciona bien a través de redes con diferentes densidades. Tabla 1. Las rutas de un lncRNA a una proteína en nuestra red heterogénea con una longitud inferior a seis. El método RWR, sólo hay una probabilidad de reinicio r y sus efectos son muy leves, lo que se demuestra por experimentos. El parámetro r se establece como 0,5 en esta comparación. Para calcular el rendimiento de los diferentes métodos, utilizamos un procedimiento de validación cruzada omitiendo una sola salida. Extraemos 2000 asociaciones de proteínas lncRNA de la red 0,9 como muestras positivas, el mismo número de muestras negativas se seleccionan al azar de la red 0.3 también, evitando el error causado por el conjunto de datos de desequilibrio. El conjunto de oro que contiene 185 interacciones lncRNA-proteína descargada de la base de datos NPinter también se ha incluido en pares positivos. En la priorización de proteínas lncRNA, cada interacción lncRNA-proteína se utiliza como el conjunto de pruebas a su vez y las asociaciones restantes se utilizan como datos de entrenamiento. El experimento completo se repetirá 4000 veces para probar cada pares lncRNA-proteína en el conjunto de datos. La curva ROC se dibuja basado en la tasa real positiva (TPR) y tasa falsa positiva (FPR) en diferentes umbrales. La puntuación AUC se utiliza para medir el rendimiento. AUC = 1 demuestra el rendimiento perfecto y AUC = 0.5 demuestra el rendimiento aleatorio.La curva ROC de PLPIHS, LPIHS, PRINCE y RWR se trazan en la Fig. 5. Los resultados muestran que la puntuación AUC de PLPIHS en la red 0.3 es 96,8%, superior a la de PRINCE, LPIHN y RWR, alcanzando un valor AUC de 81,3%, 88,4% y 79,2%, respectivamente. Del mismo modo, PLPIHS supera a otros métodos en la red 0,5 y también a la red 0,9. Evaluación de rendimiento por prueba independiente. Para mayor validación, también seleccionamos al azar 2000 asociaciones de proteínas de lncRNA del resto de muestras positivas en la red 0,9 y el mismo número de interacciones negativas se extraen de las muestras negativas restantes de la red 0,3 para generar el conjunto de datos de prueba independiente. Dado que los métodos basados en la red existentes no son adecuados para la prueba independiente, sólo evaluamos el rendimiento para el PLPIHS propuesto. Los resultados de la prueba independiente se muestran en la figura 6, una puntuación AUC de 0,879 se obtiene mediante PLPIHS Mediante la aplicación del método propuesto PLPIHS, se predicen proteínas nuevas relacionadas con el lncRNA candidatas utilizando LOOCV. Aplicamos PLPIHS sobre las asociaciones conocidas de proteínas de 2000 lncRNA, que incluye 1511 lncRNA y 344 proteínas para inferir interacciones nuevas de proteínas de lncRNA. Como resultado, un área bajo la curva ROC de 0.9669, 0.9705 y 0.9703 (Fig. 5) se logra utilizando las tres redes de densidad de conectividad diferente, que demuestran que nuestro método propuesto es eficaz en la recuperación de proteínas relacionadas con lncRNA conocidas. Para ilustrar aún más la aplicación de nuestro enfoque, se examina un estudio de caso de lncRNA MALAT1 (ID de ensamble: ENSG00000251562). MALAT1 es un ARN largo no codificante que se sobreexpresa en muchos MALAT1 ha sido identificado en múltiples tipos de procesos fisiológicos, tales como empalme alternativo, organización nuclear, modulación epigenética de la expresión génica. Una gran cantidad de evidencia indica que MALAT1 también se relaciona estrechamente con varios procesos patológicos, incluyendo complicaciones de la diabetes, cánceres y así sucesivamente 32, 33. MALAT1 está asociado con 68 proteínas en NPInter 3.0 34. Construimos las redes de interacción de lncRNA MALAT1 utilizando los resultados de predicción de estos cuatro métodos (Fig. 7). De las 68 interacciones conocidas de lncRNA-proteína, PLPIHS predice erróneamente 6 interacciones, mientras que 13 asociaciones son predichas erróneamente por el método PRINCE y RWR y 15 pares de lncRNA-proteína son falsamente predicho por el método LPIHN. Controlamos manualmente las 10 proteínas principales en la lista clasificada bajo la red 0.5 (Tabla 3).Tres de las 10 proteínas principales predichas tienen interacciones con MALAT1, y la mayoría de ellas tenían rangos altos en las listas de proteínas predichas. Por ejemplo, en la investigación del cáncer colorrectal (CRC), MALAT1 podría unirse a SFPQ, liberando así PTBP2 del complejo SFPQ/PTBP2 y la interacción entre MALAT1 y SFPQ podría ser un nuevo objetivo terapéutico para CRC 35. MALAT1 interactúa con proteínas SR (SRSF1, SRSF2, SRSF3 y SRSF5) y regula los niveles celulares de las formas fosforiladas de proteínas SR 36. Y también es como objetivo de TARDBP para jugar el rendimiento biológico y se encontró que TDP-43 unido a largos ncRNAs de manera altamente secuencia-específica en el tejido de los sujetos con o sin FTLD-TDP, el MALAT1 ncRNA recluta factores de empalme a espectros nucleares y afecta la fosforilación de proteínas de factores de empalme ricos en serina/arginina 37, 38. Todos estos resultados indican que nuestro método propuesto es eficaz y confiable en la identificación de proteínas nuevas relacionadas con lncRNA. Los LncRNAs están involucrados en una amplia gama de funciones biológicas a través de diversos mecanismos moleculares a menudo incluyendo la interacción con uno o más socios proteicos 12, 13. Sólo un pequeño número de interacciones lncRNA-proteína han sido bien caracterizados. Los métodos computacionales pueden ser útiles para sugerir interacciones potenciales para En este estudio, utilizamos la medida HeteSim para calcular la relevancia entre el lncRNA y la proteína en una red heterogénea. Se ha verificado la importancia de inferir interacciones novedosas de lncRNA-proteína considerando los sutiles significados semánticos de diferentes rutas en la red heterogénea 39. Primero construimos una red heterogénea que consiste en una red de similitud lncRNA-lncRNA, una red de asociación lncRNA-proteína y una red de interacción proteína-proteína. Luego, utilizamos la medida HeteSim para calcular una puntuación para cada pareja lncRNA-proteína en cada ruta. Finalmente, se utiliza un clasificador SVM para combinar los puntajes de diferentes rutas y hacer predicciones. Comparamos el PLPIHS propuesto con PRINCE, RWR y LPIHN y encontramos que el PLPIHS obtiene una puntuación AUC de 0,9679 en la red 0,3, que es significativamente mayor que el PRINCE, RWR y LPIHN (0,813, 0,884 y 0,7918, respectivamente). También comparamos el desempeño de estos cuatro métodos en redes de densidad de conectividad diferente. Como resultado, PLPIHS supera al otro método en todas las redes. Además, al analizar las proteínas predichas interactuadas con lncRNA MALAT1, PLPIHS predice con éxito 63 de 68 asociaciones, mientras que PRINCE, RWR y LPIHN recuperan interacciones mucho más bajas de 57, 57 y 53, respectivamente. Los resultados destacan las ventajas de nuestro método propuesto en la predicción de posibles interacciones lncRNA-proteína. Métodos de asociación lncRNA-Proteína. Todos los genes lncRNA humanos y genes codificadores de proteínas se descargan de la versión 24 9 de GENCODE. Se extraen 15941 genes lncRNA y 20284 genes codificadores de proteínas. Para obtener asociaciones de genes codificadores de proteínas y lncRNA del genoma, combinamos tres fuentes de datos:• datos de coexpresión de COXPRESdb 40. Se recogieron tres conjuntos de datos de coexpresión preprocesados (Hsa.c4-1, Hsa2.c2-0 y Hsa3.c1-0) incluyendo los coeficientes de correlación de pares precalculados de Pearson para humanos de COXPRESdb. Las correlaciones se calculan de la siguiente manera: donde C(l, p) es la correlación global entre el gen l (lncRNA) y el gen codificante de proteínas p, C d (l, p) es la puntuación de correlación entre l y p en dataset d, D es el número de pares de genes (l y p) con puntuaciones de correlación positivas. Se eliminan los pares de genes con puntuaciones de correlación negativas. • Los datos de coexpresión de ArrayExpress 41 y GEO 42. Obtuvimos los datos de coexpresión del trabajo de Jiang et al. 43. Los datos en bruto de ARN-Seq de 19 tejidos normales humanos se obtienen de ArrayExpress (E-MTAB-513) y GEO (GSE30554). TopHat y Cufflinks con los parámetros por defecto se utilizan para calcular los valores de expresión. Los coeficientes • Datos de interacción proteína-lncRNA. Descargamos datos de interacción proteína-lncRNA conocidos de interacciones proteína-proteína. Obtenemos los datos de interacción proteína-proteína (PPI) de la base de datos STRING V10.0 45, que contiene interacciones proteicas ponderadas derivadas de métodos de predicción computacional, experimentos de alto rendimiento y extracción de texto. Los puntajes de confianza se calculan combinando las probabilidades de los diferentes canales de evidencia, corrigiendo la probabilidad de observar aleatoriamente una interacción. La medida HeteSim. La medida HeteSim es una medida de relevancia uniforme y simétrica. Se puede utilizar para calcular la relación de objetos con los mismos o diferentes tipos en un marco uniforme, y también es una medida limitada para estimar la relación de pares de objetos basada en la ruta de búsqueda que conecta dos objetos a través de una secuencia de tipos de nodos 39. Además, el score de HeteSim tiene algunas buenas propiedades (es decir, automáximo y simétrico), que han logrado un rendimiento positivo en muchos estudios 25. En este estudio, utilizamos scores de HeteSim para medir las similitudes entre lncRNAs y proteínas. Definición 1 La matriz de probabilidad de transición 39 L y P son dos tipos de objeto en la red heterogénea, (I LP ) n*m es una matriz adyacente entre L y P, luego la matriz normalizada de I LP a lo largo del vector de fila se define comoLP LP k m LP 1 Definición 2 Matriz de probabilidad alcanzable 39 En una red heterogénea, la matriz de probabilidad alcanzable R para ruta = + • PP P ( ) n 1 2 1 de longitud n, donde P i pertenece a cualquier objeto en la red heterogénea, puede expresarse como P P P P n n 1 2 2 3 1 Basado en las definiciones anteriores, los pasos para calcular los puntajes de HeteSim entre dos tipos de objetos (lncRNA y proteína) pueden presentarse de la siguiente manera:• Dividir el camino en dos partes. Cuando la longitud n de la ruta es par, podemos dividirla en = P P ( ) De lo contrario, si n es impar, la ruta no se puede dividir en dos rutas de longitud igual. Para hacer frente a tal problema, necesitamos dividir la ruta dos veces, respectivamente. Entonces, podemos obtener una puntuación HeteSim para cada valor medio, la puntuación final será el promedio de las dos puntuaciones. • Lograr la matriz de probabilidad de transición y matriz de probabilidad alcanzable bajo la trayectoria L y R . • Calcular la puntuación HeteSim: donde − R 1 es la ruta reversa de R . Un ejemplo de calcular la puntuación HeteSim se indica en la Fig. 8. Podemos ver que hay tres tipos de objetos L, T y P en la red. Los pasos simplificados de calcular la puntuación de HeteSim entre l3 y p2 bajo la trayectoria = (LTP) son los siguientes:• Dividir la trayectoria en dos componentes = LT ( )• Dada la matriz adyacente I LT y I TP a continuación, lo que significa las interacciones entre lncRNAs y proteínas, podemos obtener la matriz de probabilidad de transición T LT y T TP normalizando la matriz a lo largo del vector de fila. El método PLPIHS. Entre una red heterogénea, diferentes caminos pueden expresar significados semánticos diferentes. Por ejemplo, un lncRNAs y una proteína se conectan a través de la ruta 'lncRNAs-lncRNAs-proteína' o 'lncRNAs-proteína' ruta que representa significados totalmente diferentes. Esta última muestra que si una proteína asociada con un lncRNA, entonces otra proteína interactuada con la proteína será probablemente asociada con el lncRNA. Por lo tanto, la información potencial oculta en cada camino es extraordinariamente esencial para ser tenido en cuenta durante la predicción. El marco PLPIHS se ilustra en la Fig. 2. Primero, construimos una red heterogénea que consiste en una red de similitud lncRNA-lncRNA, una red de asociación lncRNA-proteína y una red de interacción proteína-proteína. Tres tipos de redes escasas se obtienen de la red heterogénea bajo diferentes valores de corte 0.3, 0.5 y 0.9 (ver asociaciones lncRNA-Proteína). El corte más grande es, la red es más escasa. Un total de 15941 genes lncRNA y 20284 genes codificantes de proteína se extraen como se presenta en la Sección 2.3. La construcción de las redes heterogéneas más pequeñas bajo diferentes valores de corte se muestran en la Tabla 4, donde 'lnc2lnc' denota la red lncRNA-lncRNA, 'lnc2code' denota la red lncRNA y 'code2code' denota la red proteico-lncRNA. Tabla 1. Utilizamos el id para indicar la combinación de ruta, es decir, 12′ representa la ruta 'LLP' y la ruta 'LPP'. A continuación, calculamos la puntuación heteSim para cada par proteína-lncRNA bajo cada ruta. Los resultados de diferentes rutas se utilizan como características diferentes. Y combinamos un factor β constante para inhibir la influencia de rutas más largas.Cuanto más larga sea la longitud del camino, más pequeño es el factor inhibidor. Finalmente, un clasificador SVM se construye con estas puntuaciones para predecir las asociaciones potenciales de lncRNA-proteína. En la cuenta de la medida HeteSim se basa en el marco de relevancia basado en la trayectoria 39, que puede efectivamente desenterrar la semántica sutil de cada ruta.

¿Qué tipo de datos se incluyen en la base de datos STRING?