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Rotavirus A en animales silvestres y domésticos de zonas con degradación ambiental en la Amazonía brasileñahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6298726/SHA: f3c309c596c20f48f493b77e714ce957d8777bcbAutores: de Barros, Bruno de Cássio Veloso; Chagas, Elaine Nunes; Bezerra, Luna Wanessa; Ribeiro, Laila Graziela; Duarte Júnior, Jose Wandilson Barboza; Pereira, Diego; da Penha Junior, Edvaldo Tavares; Silva, Julia Rezende; Bezerra, Delana Andreza Melo; Bandeira, Renato Silva; Pinheiro, Helder Henrique Costa; Guerra, Sylvia de Fátima dos Santos Los animales domésticos y principalmente silvestres como murciélagos, pequeños roedores y aves son animales altamente diversificados en relación a sus hábitats y nichos ecológicos y están ampliamente distribuidos geográficamente en ambientes de fragmentación forestal en algunas zonas de la Amazonía, siendo consideradas fuentes importantes de virus que afectan a los seres humanos y otros animales. Debido a las actividades antrópicas, estos animales cambiaron su hábitat natural y se adaptaron a entornos urbanizados, representando así riesgos para la salud humana y animal. Aunque el conocimiento de la diversidad global de virus entéricos es escaso, existen informes que demuestran la detección de rotavirus en animales domésticos y animales de sistemas productivos, como bovinos y cerdos. El presente estudio investigó la prevalencia del Rotavirus A en 648 muestras fecales de diferentes especies animales de la mesoregión noreste del estado de Pará, Brasil, que se caracteriza por ser un área urbanizada con fragmentos forestales. Los especímenes fecales fueron recolectados de octubre de 2014 a abril de 2016 y sometidos a una Reacción en Cadena de Polimerasa en Tiempo Real Cualitativa (RT-qPCR), utilizando el gen NSP3 como objetivo. Se observó que el 27,5% (178/648) de las muestras presentaron resultados positivos para la VRA, con 178 muestras distribuidas en aves (23,6%), caninos (21,35%), quiropteros (17,98%), bovinos (14,6%), caballos (8,43%), pequeños roedores (6,74%), cerdos (3,93%) y felinos (3,37%), demostrando la circulación de la VRA en animales domésticos y sugiriendo que tal proximidad podría causar transmisiones entre diferentes especies y la ocurrencia de reordenamientos en el genoma de la VRA ya descrito en la literatura, asociados a las trazas de degradación ambiental en las áreas estudiadas. Texto: Las enfermedades infecciosas emergentes y reemergentes están aumentando cada año en varios países, con un impacto tanto en las poblaciones humanas como en los animales domésticos y silvestres que viven en áreas con restos forestales considerables [1]. La mayoría de estas enfermedades son de origen viral, lo que sugiere la aparición y reaparición de virus que son desencadenados por actividades humanas que modifican el medio ambiente [2]. Las poblaciones de animales silvestres que habitan fragmentos forestales son grupos estratégicos para estudios de salud pública y transmisión de zoonosis, dado que actúan como indicadores en la asistencia e intervención en las poblaciones humanas, con el objetivo de prevenir brotes y epidemias [3]. La gastroenteritis aguda puede ser causada por infección en el tracto gastrointestinal, causada por diferentes agentes infecciosos o parásitos [4] [5] [6] [7]. Representan una de las principales causas de mortalidad en humanos y en animales jóvenes, contando con alrededor del 25% de mortalidad [8]. El rotavirus se distribuye ampliamente en los animales, que actúan como fuentes de cepas emergentes del rotavirus, con estos animales actuando en la transmisión entre especies y por medio del reasociamiento que conduce a la aparición de nuevas cepas que han sido reportadas en infecciones humanas [9] [10] [11] [12]. El rotavirus (RV) pertenece a la familia Reoviridae y comprende nueve especies conocidas como Rotavirus grupo A a I, con una propuesta reciente de la especie J [13, 14]. El rotavirus A (RVA) está muy extendido en todo el mundo y afecta predominantemente a seres humanos, bovinos y otras especies de mamíferos, así como a aves [15]. Tienen un genoma de ácido ribonucleico de doble cadena (dsRNA), dividido en 11 segmentos de codificación para proteínas estructurales (VP1-VP4, VP6 y VP7) y proteínas no estructurales (NSP1-NSP5/NSP6 Hay registros de una estrecha relación entre la fauna y flora amazónicas y las poblaciones humanas [18], y esta interacción es el efecto de las actividades de urbanización antropogénica que resultan en la deforestación de zonas forestales, causando la degradación de sitios previamente aislados como cuevas y pequeñas cuevas, un proceso continuo y progresivo de la naturaleza que ha llevado no sólo a cambios en los hábitats de la fauna y flora silvestres, sino también a una mayor relación con las poblaciones humanas en entornos rurales y urbanos, contribuyendo a la aparición y aparición de enfermedades diferentes de las que normalmente ocurren en regiones endémicas [19] [20] [22]. Aunque los resultados del VRA ya se han descrito globalmente [12, [23] [25] [26] [28] [30], en Brasil, la ocurrencia, diversidad y papel del rotavirus en estos animales todavía están poco estudiados, teniendo en cuenta el gran número de especies presentes [4, [31 En la Amazonía brasileña, especialmente en el estado de Pará, las mesoregiones metropolitanas de Belém y Nordeste son algunas de las zonas con mayor índice de cambios ambientales [35], que se concentran, junto con el hecho de que el conocimiento de la diversidad global del virus entérico en animales es escaso [36]. Por lo tanto, es importante monitorear la salud de los animales domésticos y silvestres en su hábitat natural, especialmente en áreas con alteraciones antrópicas que tienen una interfaz con comunidades rurales y empresas, para investigar la ocurrencia de VRA en esta población. Estas comunidades son ecológicamente complejas, ya que cuentan con múltiples hospedadores y patógenos sin fin que eventualmente pueden circular en centros urbanos contiguos, además de que también debe considerarse que todavía no existen estudios que demuestren la importancia de estos virus que infectan a esta población, ya que en el contexto de la vigilancia epidemiológica, estos animales se vuelven importantes, ya que pueden ser considerados como fuentes naturales, con la posibilidad de transmisión a los seres humanos [37] [38]. La reacción cualitativa en cadena de la polimerasa en tiempo real (qRT-PCR) utilizó el gen NSP3 y la sonda TaqMan de una región altamente conservada de la proteína no estructural del rotavirus 3 (NSP3), que se utilizó previamente en muestras de origen humano y con bajas cargas virales Los datos de precipitación se obtuvieron del Instituto Nacional Brasileño de Meteorología (Inmethttp://www.inmet.gov.br/) para los años de captura en el Acuerdo Expedito Ribeiro (2014) y Açailândia (2015) de las Plataformas de Recolección de Datos (PCD) de Belém, ubicado a 50 km de Santa Bárbara do Pará, y Tracuateua, ubicado a 50 km de Peixe-Boi y a 100 km de Viseu. Los límites municipales se obtuvieron en el sitio web del Instituto Brasileño de Geografía y Estadística (IBGE) (http://www.ibge.gov.br/) y los datos sobre deforestación y uso de la tierra se obtuvieron de los proyectos PRODES [43] y TerraClass [44]. PRODES cuenta con datos anuales en formato digital desde 2000 y TerraClass presenta datos semestrales desde 2004. La imagen satelital se generó utilizando el sensor Sentinel 2 de la Agencia Espacial Europea (ESA) (https://sentinel.esa.int/web/sentinel/user-guides/sentinel-2-msi) con licencia CC-BY de acceso abierto (http://open.esa.int/) de los años 2017 y 2018. Todos los datos obtenidos se almacenaron en una base de datos geográficos (BDG). El BDG fue importado/almacenado en un SIG para la edición de los elementos gráficos, el establecimiento de relaciones topológicas entre los elementos y sus atributos respectivos, el análisis espacial y la visualización del resultado a través de mapas temáticos. Para el presente estudio, se eligieron fragmentos forestales de tamaño, forma y fisiología similar, considerando una matriz periurbana abierta con uso de suelo similar. Los fragmentos seleccionados fueron distribuidos dentro de las mesoregiones estudiadas, y en cada fragmento seleccionado muestras fecales fueron recolectadas aleatoriamente de animales domésticos y salvajes [45]. Se obtuvieron clases de uso de suelo del mosaico de datos TerraClass de 2004 a 2016, ya que los sitios de estudio se encontraban en un área con alta presencia de nubes, lo que impidió la observación (el área no se observó).El procesamiento de datos, interpretación, visualización y análisis espacial se realizaron en el software ArcGIS (http://www.arcgis Para el análisis de los datos relacionados con la determinación de la riqueza, composición y abundancia de la fauna de los animales estudiados en el área de estudio, considerando los métodos de recolección adoptados y las especies disponibles en cada ciudad, cada muestra fue considerada como una muestra independiente. La riqueza de la fauna silvestre y animales domésticos fue determinada por el número total de especies incluyendo todos los métodos de recolección, y la similitud de las especies fue realizada por el análisis chi-cuadrado entre las muestras de los diferentes tratamientos con la ayuda del software EstimatS 8.0 [46]. Para el cálculo del Test T, se utilizó el software Statistica, y se calcularon los índices de animales infectados en los dos ambientes (fragmento forestal y peridomicil) para cada tratamiento muestreado por área de recolección, utilizando el software Past 1.92. Apuntando a comparar los valores de los índices de diversidad a través del test emparejado, así como el análisis descriptivo Los datos obtenidos para la ocurrencia de la VRA y los cuestionarios fueron insertados en una base de datos para un análisis descriptivo del perfil epidemiológico de la población animal en los tres ecosistemas forestales estudiados.En este análisis se realizaron tratamientos estadísticos descriptivos, utilizando tablas de tipo "columnas de surco" personalizadas, referidas a los datos, con el fin de caracterizar la muestra y cuantificar los resultados mediante valores de frecuencia absoluta utilizando la prueba chi-cuadrado y la prueba T.Population estudio, recolección de especímenes clínicos y metodología de laboratorio.Los animales voladores (aves silvestres y quiroptera) fueron capturados mediante redes de niebla que se abrieron al amanecer (4:00 a.m.) y cerraron por la mañana (9:00 a.m.) y fueron inspeccionados cada hora hasta el cierre, con un esfuerzo de muestreo de 15 días.Esta investigación fue aprobada por National All procedimientos con animales fueron realizados por veterinarios, siendo aves Los especímenes fecales fueron recolectados por estimulación de la ampolla rectal con el uso de un "Zaragatoa", envasados en viales criogénicos, identificados, almacenados en nitrógeno líquido, y posteriormente enviados al Laboratorio. Los animales salvajes (pequeños mamíferos no voladores) fueron atrapados en trampas de contención en vivo de la jaula Tomahawk (tamaño 45x16x16cm) y de aluminio tipo Sherman (tamaño 30x9x8cm). En cada parcela de muestra, se distribuyeron 61 trampas, 20 Shermans y 41 Tomahawks siendo cebos con una mezcla hecha con pasta de maní, sardinas, aceite de hígado de bacalao y harina de maíz, así como frutas como plátano, manzana y piña. Todas las trampas utilizadas fueron inspeccionadas diariamente por la mañana, los cebos fueron intercambiados cuando era necesario y más tarde después de la captura en bolsas de tela y Los animales silvestres fueron sedados con una combinación de ketamina 20mg/kg y xilazina 2mg/kg intramuscularmente y posteriormente, eutanasiados con sobredosis anestésica de lidocaína al 2% en el foramen magnum, de acuerdo con la recomendación del Consejo Nacional para el Control de la Experimentación Animal (CONCEA). De octubre de 2014 a abril de 2016, se recolectaron 1.282 muestras fecales de animales silvestres y domésticos, de las cuales 648 (50,5%) fueron seleccionadas aleatoriamente para investigación RVA y manejadas en Laboratorio de Bioseguridad de Nivel Tres (NB3). El genoma viral fue extraído mediante el protocolo TRIZOL LS REAGENT (INVITRO-GEN, USA/KIT QIAGEN), siguiendo las recomendaciones del fabricante, con menor adaptación según el protocolo descrito en los datos complementarios. [40] para la detección de RVA utilizando el segmento NSP3 de RVA como secuencia génica diana. El ensayo se llevó a cabo en una mezcla que contenía: RNAse-free H 2 O, TaqMan RT-PCR Mix (2x), TAqMan RT Enzyme Mix (40x), imprimaciones para el gen NSP3, Primer NSP3 Forward (20mM), Primer NSP3 Inverso (20mM), sonda NSP3 S (10nm), Plantilla (ARN) 3μL, con un volumen de reacción total de 17μL y ciclo de transcripción inversa de 50°C, 30 minutos, desnaturalización de 95°C, 10 minutos, recocido de 45 ciclos de 95°C, 15 segundos y extensión de 60°C, 1 minuto. Los análisis se consideraron positivos al presentar el umbral de ciclo (TC) 40. Para garantizar un resultado de prueba fiable, las mediciones del control de la contaminación se realizaron con el uso de control animal positivo (prototipo SA11) y un control negativo (agua de úlcera). Todas las muestras positivas de RVA fueron sometidas a reacción en cadena de la transcripción inversa-polimerasa (RT-PCR) de acuerdo con Mijatovic et al [41] para genotipar muestras de bajas cargas virales. La primera ronda fue realizada con imprimaciones de consenso N-VP4F1/N-VP4R1 y la Nested-PCR fue realizada con imprimaciones N-VP4F2/N-VP4R2 para amplificar el gen VP4. Los amplificadores fueron purificados y secuenciados para el gen VP4 usando los mismos imprimadores de Nested-PCR. Las secuencias fueron recolectadas de un secuenciador automático ABI Prism 3130xl ADN Los fragmentos de secuencia fueron ensamblados y editados utilizando la plataforma de software Geneious Bioinformática v.8.1.7. Posteriormente, los datos fueron comparados con otras secuencias de la base de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica GenBank utilizando la herramienta de alineación BLAST para dilucidar el genotipo RVA de las muestras. De octubre de 2014 a abril de 2016, un total de 648 muestras fecales de animales silvestres y domésticos pertenecientes a tres áreas de fragmentos forestales fueron probadas para el gen NSP3 por QPCR cualitativo, y 178 (27,5%) fueron positivas para RVA, distribuidas entre las especies: aves (23,6%), caninos (21,35%), murciélagos (17,98%), bovinos (14,6%), caballos (8,43%), pequeños roedores (6,74%), cerdos (3,93%) y felinos (3,37%). 47 Fue posible detectar cepas virales en todos los géneros de animales estudiados y en el período de recolección ninguno de los animales mostró signos de infección aguda y/o diarrea. Rotavirus A (RVA) detectados en el presente estudio de animales silvestres y domésticos pertenecientes a las tres áreas del fragmento forestal, según la Fig. 2. En relación a los bovinos evaluados, sólo en la ciudad de Viseu, estas especies fueron estudiadas porque fueron creadas extensamente. Además, la mayoría de los animales eran jóvenes con edades que variaban de 1 día a 8 años, antecedentes de vacunación deficiente, falta de asistencia técnica y criados en forma de subsistencia. Los animales no mostraron síntomas de diarrea, solo bajo rendimiento de peso y mal estado de manejo sanitario. En relación a la quiroptera, se distribuyeron 32 (17,98%) muestras positivas de RVA entre las especies de Carollia perspicillata, con 12 (37,5%) siendo todas adultas, 9 (28,12%) muestras de Desmodus rotundus (4 jóvenes y 5 adultos), 5 (15,6%) de Uroderma bilobata (15,62%), 3 (9,37%) de Artibeus lituratus y las especies Artibeus Planirostus, Diaemus iyoug y Glossophagina con 1 (3,12%) cada una. Estos animales procedían de áreas de fragmentos forestales ubicadas cerca de granjas de bovinos y equinos, además de habitar pequeñas granjas de pollos. La figura 3 muestra los resultados obtenidos para todas las especies de animales investigadas en el fragmento forestal así como en la zona del peridomicillus. Las variables antrópicas fueron analizadas para las tres ciudades estudiadas, así como el uso del suelo dentro del rango de los animales, obedeciendo el domicilio, el peridomicil y el fragmento forestal donde se capturaron las trampas de pequeños roedores, aves y diversas especies de animales (Fig 4 y Fig 5). Considerando los factores relacionados con las actividades antrópicas en las tres áreas estudiadas dentro de las tres ciudades del presente estudio, se observó que la ciudad de Santa Bárbara es la que tiene una mejor área de bosque preservado y la ciudad de Viseu una área más pequeña. Sin embargo, en la ciudad de Santa Bárbara se observó una mayor concentración de ocupaciones alrededor del área de fragmento forestal. Se observó en esta zona escogida de la ciudad, la presencia de diferentes familias viviendo en un asentamiento rural, sobreviviendo de la explotación de los recursos forestales y la creación de pequeños animales de subsistencia, como aves de corral y piscicultura, así como productos agrícolas familiares. La cría de animales en pastos nativos sólo se observó en las ciudades de Peixe Boi y Viseu. Se practicó una extensa ganadería con ganado vacuno, equinos para trabajo y pequeños animales (porcinos y cabras). En relación con la zona de pastos más conservada, la ciudad de Peixe Boi tuvo la mayor superficie, según los datos mostrados en la Figura 5, sin embargo, en la ciudad de Viseu se observó una mayor regeneración en los pastos durante el período del estudio, con significativa vegetación secundaria. Al comparar los climas de las tres áreas se observó que el clima predominante es megatermal y húmedo con temperatura media anual alrededor de Los meses de octubre, noviembre y diciembre son los más calurosos, con temperaturas entre 32°C y 34°C y máximos absolutos alrededor de 41°C. Las precipitaciones anuales son bastante altas, generalmente alrededor de 2.350 mm, pero fuertemente concentradas de enero a junio (80%). De septiembre a diciembre, por el contrario, las precipitaciones son raras, alrededor del 7%, con una corta estación seca, de déficit de agua moderado en esos meses. La humedad relativa del aire promedio oscila alrededor del 85%, como se muestra en la figura 6 [48]. La descripción de la precipitación acumulada en el año de captura de los especímenes fecales en comparación con las Normales Climatológicas (CLINO) para el período 1961-1990 de los PCD más cercanos a las localidades del Expedito Ribeiro / Santa Bárbara (Belém PCD), Vila Ananim / Peixe-Boi y Açaiteua / Viseu (Tracauateua PCD) muestran la frecuencia de lluvias en las regiones, lo que facilita la renovación de los pastos y la regeneración de los bosques impactados, siendo un indicador importante de la reducción de los daños causados por la deforestación en la región. El índice medio de deforestación en las tres áreas de estudio se calculó a partir de los datos obtenidos de los sistemas de información del INPE. Se observó que en los años de 2013 a 2014 no hubo cambios en estas regiones; en el período de 2014 a 2015 alrededor del 4,1% de la ciudad de Viseu fue cambiada y el 1,6% de la ciudad de Peixe Boi. En relación con el período de 2016, se observaron grandes cambios en Peixe Boi (79%) y en la ciudad de Viseu (70%), demostrando así que los cambios en el ecosistema natural pueden estar asociados con las frecuencias de VRA en las áreas estudiadas, según la Fig 7. Al evaluar a los animales infectados en relación a los animales no infectados tanto en el fragmento del bosque como en el peridomicilo, considerando como animales del bosque fragmentan a las aves, se obtuvieron la quiroptera y los pequeños roedores y como animales del peridomicilo los caninos, bovinos, cerdos, felinos y caballos, un porcentaje de 37,07% infectados por animales domésticos (86/232) y 22,12 % infectados por animales fragmentados del bosque (92/416). Aplicando el análisis estadístico seleccionado, se obtuvo un valor de Pearson x2 Chi-cuadrado: 16,7159, df = 1 y p < 0,001, lo que significa que la hipótesis fue corroborada, es decir, cuanto mayor sea la degradación del medio ambiente, más probable será la búsqueda de alimentos por animales silvestres en áreas adyacentes, o en el borde del bosque o incluso en la región peridomiciliaria. En este sentido, se debe considerar la posibilidad de contagio con otras especies de animales, incluso humanos, debido a la capacidad del rotavirus para ser transmitido por vía fecal/ oral o por contacto directo con el medio ambiente. Es importante señalar que los animales detectados en este estudio son fuentes importantes de cepas virales. Se seleccionaron, reextractaron y analizaron un total de 80 muestras de heces utilizando PCR para el gen VP4. Ocho cepas (10%) fueron positivas para el gen VP4, siendo 2 cepas despojadas del genotipo P [6] y 6 al tipo P[4], según el presente estudio, se detectó la presencia de VRA circulando en el 27,5% de los animales; 36% en animales domésticos y 64% en animales silvestres, proporcionando un conjunto de datos único con qRT-PCR detectando una baja carga viral de VRA en diferentes especies, lo que además se correlaciona con el índice de deforestación Estos datos son importantes debido a la falta de pruebas para el diagnóstico del VRA en animales, ya que los métodos actuales de detección del VRA no siempre se detectan en estas poblaciones [8]. Con el advenimiento de la RCP en tiempo real (QPCR), hubo un crecimiento exponencial, en comparación con los ensayos convencionales del RPR, ya que su precisión, sensibilidad y especificidad superiores son notables, y es Rotavirus A en animales silvestres y domésticos posible detectar el VRA en una variedad de especies animales utilizando el gen NSP3 [49]. La sensibilidad del RT-qPCR mejoró significativamente la tasa de detección del VRA en muestras clínicas de animales y en este contexto, el presente estudio propuso un interesante estudio métricas utilizando el virus que se propaga en animales silvestres que habitan fragmentos forestales para indicar intervenciones de población humana, con el objetivo de prevenir los brotes de virus apalancados en las características geográficas únicas de Brasil y su En la actualidad, no se han descrito datos en la literatura sobre la detección de RVA utilizando la técnica qPCR en tiempo real en una amplia variedad de especies animales silvestres. Sin embargo, un estudio de Soltan et al. [50] realizado con caballos y bovinos detectó RVA por RT-PCR, RT-PCR comercial y RT-qPCR en 36,7%, 51,4% y 56,9% respectivamente, de manera diferente al presente estudio que mostró mayor positividad para los quiropteros (17,98%), caninos (21,35%), aves (23,6%) y ganado (14,6%). La primera descripción de RVA en quiroptera se registró en heces de Eidolon helvum capturadas en Vihiga, Kenia [51]. Posteriormente, varias cepas de RVA fueron detectadas por diferentes técnicas moleculares que involucraban a quiroptera, en varios países, incluyendo Kenia (E. helvum), China (Rhinolophus hipposideros y Aselliscus stoliczkanus), Francia (Myotis mystacinus), Camerún (E. helvum) y Brasil [31, [51] [53] [53] [54]. El presente estudio muestra la ocurrencia de RVA en el 17,98% de las quiropteras, estando entre las especies Carollia perspicillata (37,5%), Desmodus rotundus (28,12%), Uroderma bilobata (15,6%), Artibeus lituratus (9,37%), Artibeus Planirostus (3,12%), Diaemus iyoug y Glossofagina (3 [56] informó que Desmodus rotundus es una de las tres especies hematófagas de la familia Phyllostomidae, encontrada en toda América del Sur, América Central y México. De las quiropteras positivas para RVA en el presente estudio, una prevalencia de 28,12% fue de Desmodus rotundus. Esta especie se alimenta de aves, puede alimentarse de mamíferos, en su mayoría de tamaño medio o grande, facilitando la diseminación de esporas virales entre la comunidad dentro del hábitat, como se observa en el presente estudio. Estos hallazgos muestran la importancia de los datos epidemiológicos sobre las especies estudiadas debido a la falta de estudios que involucren especies de quiroptera neotropical, y no es posible establecer parámetros comparativos para estos animales. Respecto a la circulación de RVA en caninos y aves, la prevalencia fue del 53% y 29%, respectivamente. Aunque en la región amazónica existen registros de RVA, RVD, RVF y RVG que infectan a las aves [57] [58] y RVD en aves migratorias [59], todos fueron detectados mediante ensayos RT-PCR de manera diferente al presente estudio que detectaron el RVA por RT-qPCR involucrando una variedad de especies animales. Por otro lado, la prevalencia en felinos (16%) y cerdos (22%) fue menor, probablemente porque hay pocos animales de estas especies en la región, así como pocas creaciones. El estudio detectó la presencia de RVA en diferentes especies de animales tanto en áreas cercanas al hogar como en áreas ubicadas en fragmentos de bosque, caracterizadas como restos forestales, ya que se encontraban en ciudades que sufrieron un alto impacto ambiental debido al extractivismo vegetal, la formación de pastos para la cría de ganado, la explotación de recursos naturales y reflejos directos sobre los hábitats de animales silvestres que pueden servir como fuentes víricas, facilitando así la dispersión de RVA entre comunidades de animales coexistentes. Cabe destacar que estos animales tienen mayor contacto con las poblaciones humanas de las áreas estudiadas ya que cohabitan con los humanos de la región, además de tener un alto flujo de movimiento entre los extractos forestales y ambientes elegidos para el presente estudio. Sin embargo, cabe destacar que sólo en las comunidades de Santa Bárbara y Viseu se recogieron especímenes fecales de humanos asintomáticos para diarrea y se probaron para RVA, pero todos La fragmentación del bosque genera muchas consecuencias sobre la biota amazónica, pudiendo alterar la diversidad y la composición de las comunidades animales en los fragmentos e incluso interferir en los procesos ecológicos, sin considerar que los fragmentos de bosque en la Amazonía están influenciados por el clima, lo que posiblemente facilita la dispersión de patógenos por el medio ambiente, ya que los animales silvestres detectados en el presente estudio son asintomáticos y tienen baja carga viral para la VRA. La ocurrencia de VRA en esta población de animales puede explicar la posibilidad de dispersión de cepas virales, ya que existe una proximidad a la población humana, además de las características biológicas de estas especies que pueden representar fuentes importantes de virus gastroenternos, junto con el hecho de que todos los animales fueron asintomáticos para la diarrea. Las aves silvestres tienen una capacidad de vuelo ilimitada, fueron capturadas en una región de interfaz entre el peridomicilo y los fragmentos forestales y se cree que esta región no ha sido influenciada por actividades antrópicas como las observadas en el área del presente estudio. Por otro lado, el método de cría de aves de corral y caninos cercanos a los hogares y al ecosistema forestal, tal como se crean en las comunidades estudiadas, probablemente facilita el contacto directo con posibles fuentes de contaminación, ya que en las zonas el uso de tanques sépticos es deficiente y a veces inexistente, lo que puede facilitar o incluso aumentar el riesgo de dispersión viral en todo el medio ambiente. Las altas tasas de aumento y el análisis del uso del suelo en las zonas investigadas pueden ser indicadores importantes de cómo interactúan estos animales, ya que con la deforestación, las poblaciones de animales silvestres buscan refugio en comunidades cercanas facilitando la dispersión de agentes infecciosos y la posible ocurrencia de A nuestro conocimiento, este es el primer estudio en el que se aplicó un ensayo PCR en tiempo real para la detección de RVA involucrando una amplia variedad de animales domésticos y salvajes, facilitando la utilidad práctica en estudios epidemiológicos y moleculares y ayudando en una perspectiva en la elaboración de control sanitario y monitoreo, evitando posibles brotes en las comunidades estudiadas. La detección de animales positivos fue útil para monitorear la infección del agente en la población animal y para proporcionar una señal de alerta temprana para predecir una epidemia inminente y un riesgo favorable para la población humana, dada la evidencia de la circulación de RVA en los diferentes fragmentos forestales. Además, el ensayo RT-qPCR puede ser una alternativa útil para el diagnóstico diferencial de RV en posibles infecciones mixtas que coexistan clínicamente indistinguibles como las causadas por otras cepas virales que causan gastroenteritis tales como: astrovirus, coronavirus, picobirnavirus, calicivirus, entre otros, como se observó en los estudios de Jing et al. [60] y Waruhiu et al. [61]. La diarrea asociada a infecciones por VRA en cerdos es una causa importante de aumento de la mortalidad y pérdidas económicas en Europa. Los genotipos más prevalentes aislados de heces de lechones diarreicos y no diarreicos belgas en 2012 [62] demuestran una amplia gama de combinaciones de genotipos G / P incluyendo; G3P [6], G4P [6], G5P [6], G4P [7], G5P [7], G9P [7], G9P [13] y G9P [23]. Por otro lado, en el presente estudio fue posible detectar sólo el genotipo P [6], ya que la mayoría de las muestras eran asintomáticas para la diarrea. El hallazgo muestra que diferentes genotipos P de cepas RVA interactúan con antígenos histológicos distintos del grupo sanguíneo (HBGA, ABOH, Lewis) y ácidos siálicos vía VP4 proporcionando una visión de la prevalencia regional y un aumento del potencial zoonótico de algunos El genotipo P [6] fue identificado en lechones en Brasil [64] y en Italia y Japón, parecido al genotipo P [6] humano [65, 66]. En la población de animales estudiados, la transmisión zoonótica puede ser frecuente, ya que los animales viven en contacto con humanos y en condiciones sanitarias precarias. En Brasil, este genotipo fue descrito en poblaciones animales y humanas en estudios de Luchs y otros [32] ; Honma y otros [67] ; Araújo y otros [68] ; Mascarenhas y otros [69] y Lorenzetti y otros [70] tales estudios corroboran la importancia de seguir monitoreando los genotipos para verificar si surgen cepas poco comunes o nuevas cepas y pueden infectar poblaciones animales o transmisiones interespecíficas.En cuanto al genotipo P [4], fue más detectado en nuestras muestras en murciélagos, perros, Este genotipo no es común en animales, siendo más detectados en muestras humanas y ambientales en diversas partes del mundo e incluyendo a nuestra región [71]. Es importante destacar que los indicadores de contaminación ambiental en Brasil son significativos y contribuyen a la posibilidad de transmisión humano-animal [71]. Estos datos requieren investigación adicional en trabajos posteriores para caracterizar mejor la transmisión interespecífica, ya que la ocurrencia de virus entéricos en diferentes matrices demuestra el impacto antropogénico de la población expuesta alrededor y señala el riesgo potencial de infección por la posible exposición de individuos susceptibles. Nuestros hallazgos pueden ser útiles para el seguimiento de la contaminación fecal en el ambiente utilizando animales como posibles fuentes, minimizando así el riesgo de infección por exposición a individuos susceptibles, en este caso diferentes especies animales o incluso poblaciones humanas. RVA fueron detectados en animales silvestres y domésticos utilizando un ensayo RT-qPCR que analizó muestras que tenían baja carga viral para RVA. Aunque las muestras son asintomáticas para la diarrea, es necesario llevar a cabo estrategias para el monitoreo y control de los animales en las áreas estudiadas en la población humana, así como en otras especies de animales, así como la implementación de medidas preventivas dirigidas a futuros brotes en comunidades animales de la población residente en estas áreas impactadas. Por lo tanto, el presente estudio no tiene precedentes en la región y en el país en relación con la investigación del VRA en animales silvestres. Cabe destacar que, aunque la calidad de las muestras analizadas se caracteriza por una baja carga viral detectable, la técnica presentó una buena respuesta analítica en la detección de los animales de origen para el VRA, facilitando la selección de las muestras para futuras pruebas de caracterización genética.

¿El rotavirus es simple o de doble cadena?

Rotavirus A en animales silvestres y domésticos de zonas con degradación ambiental en la Amazonía brasileñahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6298726/SHA: f3c309c596c20f48f493b77e714ce957d8777bcbAutores: de Barros, Bruno de Cássio Veloso; Chagas, Elaine Nunes; Bezerra, Luna Wanessa; Ribeiro, Laila Graziela; Duarte Júnior, Jose Wandilson Barboza; Pereira, Diego; da Penha Junior, Edvaldo Tavares; Silva, Julia Rezende; Bezerra, Delana Andreza Melo; Bandeira, Renato Silva; Pinheiro, Helder Henrique Costa; Guerra, Sylvia de Fátima dos Santos Los animales domésticos y principalmente silvestres como murciélagos, pequeños roedores y aves son animales altamente diversificados en relación a sus hábitats y nichos ecológicos y están ampliamente distribuidos geográficamente en ambientes de fragmentación forestal en algunas zonas de la Amazonía, siendo consideradas fuentes importantes de virus que afectan a los seres humanos y otros animales. Debido a las actividades antrópicas, estos animales cambiaron su hábitat natural y se adaptaron a entornos urbanizados, representando así riesgos para la salud humana y animal. Aunque el conocimiento de la diversidad global de virus entéricos es escaso, existen informes que demuestran la detección de rotavirus en animales domésticos y animales de sistemas productivos, como bovinos y cerdos. El presente estudio investigó la prevalencia del Rotavirus A en 648 muestras fecales de diferentes especies animales de la mesoregión noreste del estado de Pará, Brasil, que se caracteriza por ser un área urbanizada con fragmentos forestales. Los especímenes fecales fueron recolectados de octubre de 2014 a abril de 2016 y sometidos a una Reacción en Cadena de Polimerasa en Tiempo Real Cualitativa (RT-qPCR), utilizando el gen NSP3 como objetivo. Se observó que el 27,5% (178/648) de las muestras presentaron resultados positivos para la VRA, con 178 muestras distribuidas en aves (23,6%), caninos (21,35%), quiropteros (17,98%), bovinos (14,6%), caballos (8,43%), pequeños roedores (6,74%), cerdos (3,93%) y felinos (3,37%), demostrando la circulación de la VRA en animales domésticos y sugiriendo que tal proximidad podría causar transmisiones entre diferentes especies y la ocurrencia de reordenamientos en el genoma de la VRA ya descrito en la literatura, asociados a las trazas de degradación ambiental en las áreas estudiadas. Texto: Las enfermedades infecciosas emergentes y reemergentes están aumentando cada año en varios países, con un impacto tanto en las poblaciones humanas como en los animales domésticos y silvestres que viven en áreas con restos forestales considerables [1]. La mayoría de estas enfermedades son de origen viral, lo que sugiere la aparición y reaparición de virus que son desencadenados por actividades humanas que modifican el medio ambiente [2]. Las poblaciones de animales silvestres que habitan fragmentos forestales son grupos estratégicos para estudios de salud pública y transmisión de zoonosis, dado que actúan como indicadores en la asistencia e intervención en las poblaciones humanas, con el objetivo de prevenir brotes y epidemias [3]. La gastroenteritis aguda puede ser causada por infección en el tracto gastrointestinal, causada por diferentes agentes infecciosos o parásitos [4] [5] [6] [7]. Representan una de las principales causas de mortalidad en humanos y en animales jóvenes, contando con alrededor del 25% de mortalidad [8]. El rotavirus se distribuye ampliamente en los animales, que actúan como fuentes de cepas emergentes del rotavirus, con estos animales actuando en la transmisión entre especies y por medio del reasociamiento que conduce a la aparición de nuevas cepas que han sido reportadas en infecciones humanas [9] [10] [11] [12]. El rotavirus (RV) pertenece a la familia Reoviridae y comprende nueve especies conocidas como Rotavirus grupo A a I, con una propuesta reciente de la especie J [13, 14]. El rotavirus A (RVA) está muy extendido en todo el mundo y afecta predominantemente a seres humanos, bovinos y otras especies de mamíferos, así como a aves [15]. Tienen un genoma de ácido ribonucleico de doble cadena (dsRNA), dividido en 11 segmentos de codificación para proteínas estructurales (VP1-VP4, VP6 y VP7) y proteínas no estructurales (NSP1-NSP5/NSP6 Hay registros de una estrecha relación entre la fauna y flora amazónicas y las poblaciones humanas [18], y esta interacción es el efecto de las actividades de urbanización antropogénica que resultan en la deforestación de zonas forestales, causando la degradación de sitios previamente aislados como cuevas y pequeñas cuevas, un proceso continuo y progresivo de la naturaleza que ha llevado no sólo a cambios en los hábitats de la fauna y flora silvestres, sino también a una mayor relación con las poblaciones humanas en entornos rurales y urbanos, contribuyendo a la aparición y aparición de enfermedades diferentes de las que normalmente ocurren en regiones endémicas [19] [20] [22]. Aunque los resultados del VRA ya se han descrito globalmente [12, [23] [25] [26] [28] [30], en Brasil, la ocurrencia, diversidad y papel del rotavirus en estos animales todavía están poco estudiados, teniendo en cuenta el gran número de especies presentes [4, [31 En la Amazonía brasileña, especialmente en el estado de Pará, las mesoregiones metropolitanas de Belém y Nordeste son algunas de las zonas con mayor índice de cambios ambientales [35], que se concentran, junto con el hecho de que el conocimiento de la diversidad global del virus entérico en animales es escaso [36]. Por lo tanto, es importante monitorear la salud de los animales domésticos y silvestres en su hábitat natural, especialmente en áreas con alteraciones antrópicas que tienen una interfaz con comunidades rurales y empresas, para investigar la ocurrencia de VRA en esta población. Estas comunidades son ecológicamente complejas, ya que cuentan con múltiples hospedadores y patógenos sin fin que eventualmente pueden circular en centros urbanos contiguos, además de que también debe considerarse que todavía no existen estudios que demuestren la importancia de estos virus que infectan a esta población, ya que en el contexto de la vigilancia epidemiológica, estos animales se vuelven importantes, ya que pueden ser considerados como fuentes naturales, con la posibilidad de transmisión a los seres humanos [37] [38]. La reacción cualitativa en cadena de la polimerasa en tiempo real (qRT-PCR) utilizó el gen NSP3 y la sonda TaqMan de una región altamente conservada de la proteína no estructural del rotavirus 3 (NSP3), que se utilizó previamente en muestras de origen humano y con bajas cargas virales Los datos de precipitación se obtuvieron del Instituto Nacional Brasileño de Meteorología (Inmethttp://www.inmet.gov.br/) para los años de captura en el Acuerdo Expedito Ribeiro (2014) y Açailândia (2015) de las Plataformas de Recolección de Datos (PCD) de Belém, ubicado a 50 km de Santa Bárbara do Pará, y Tracuateua, ubicado a 50 km de Peixe-Boi y a 100 km de Viseu. Los límites municipales se obtuvieron en el sitio web del Instituto Brasileño de Geografía y Estadística (IBGE) (http://www.ibge.gov.br/) y los datos sobre deforestación y uso de la tierra se obtuvieron de los proyectos PRODES [43] y TerraClass [44]. PRODES cuenta con datos anuales en formato digital desde 2000 y TerraClass presenta datos semestrales desde 2004. La imagen satelital se generó utilizando el sensor Sentinel 2 de la Agencia Espacial Europea (ESA) (https://sentinel.esa.int/web/sentinel/user-guides/sentinel-2-msi) con licencia CC-BY de acceso abierto (http://open.esa.int/) de los años 2017 y 2018. Todos los datos obtenidos se almacenaron en una base de datos geográficos (BDG). El BDG fue importado/almacenado en un SIG para la edición de los elementos gráficos, el establecimiento de relaciones topológicas entre los elementos y sus atributos respectivos, el análisis espacial y la visualización del resultado a través de mapas temáticos. Para el presente estudio, se eligieron fragmentos forestales de tamaño, forma y fisiología similar, considerando una matriz periurbana abierta con uso de suelo similar. Los fragmentos seleccionados fueron distribuidos dentro de las mesoregiones estudiadas, y en cada fragmento seleccionado muestras fecales fueron recolectadas aleatoriamente de animales domésticos y salvajes [45]. Se obtuvieron clases de uso de suelo del mosaico de datos TerraClass de 2004 a 2016, ya que los sitios de estudio se encontraban en un área con alta presencia de nubes, lo que impidió la observación (el área no se observó).El procesamiento de datos, interpretación, visualización y análisis espacial se realizaron en el software ArcGIS (http://www.arcgis Para el análisis de los datos relacionados con la determinación de la riqueza, composición y abundancia de la fauna de los animales estudiados en el área de estudio, considerando los métodos de recolección adoptados y las especies disponibles en cada ciudad, cada muestra fue considerada como una muestra independiente. La riqueza de la fauna silvestre y animales domésticos fue determinada por el número total de especies incluyendo todos los métodos de recolección, y la similitud de las especies fue realizada por el análisis chi-cuadrado entre las muestras de los diferentes tratamientos con la ayuda del software EstimatS 8.0 [46]. Para el cálculo del Test T, se utilizó el software Statistica, y se calcularon los índices de animales infectados en los dos ambientes (fragmento forestal y peridomicil) para cada tratamiento muestreado por área de recolección, utilizando el software Past 1.92. Apuntando a comparar los valores de los índices de diversidad a través del test emparejado, así como el análisis descriptivo Los datos obtenidos para la ocurrencia de la VRA y los cuestionarios fueron insertados en una base de datos para un análisis descriptivo del perfil epidemiológico de la población animal en los tres ecosistemas forestales estudiados.En este análisis se realizaron tratamientos estadísticos descriptivos, utilizando tablas de tipo "columnas de surco" personalizadas, referidas a los datos, con el fin de caracterizar la muestra y cuantificar los resultados mediante valores de frecuencia absoluta utilizando la prueba chi-cuadrado y la prueba T.Population estudio, recolección de especímenes clínicos y metodología de laboratorio.Los animales voladores (aves silvestres y quiroptera) fueron capturados mediante redes de niebla que se abrieron al amanecer (4:00 a.m.) y cerraron por la mañana (9:00 a.m.) y fueron inspeccionados cada hora hasta el cierre, con un esfuerzo de muestreo de 15 días.Esta investigación fue aprobada por National All procedimientos con animales fueron realizados por veterinarios, siendo aves Los especímenes fecales fueron recolectados por estimulación de la ampolla rectal con el uso de un "Zaragatoa", envasados en viales criogénicos, identificados, almacenados en nitrógeno líquido, y posteriormente enviados al Laboratorio. Los animales salvajes (pequeños mamíferos no voladores) fueron atrapados en trampas de contención en vivo de la jaula Tomahawk (tamaño 45x16x16cm) y de aluminio tipo Sherman (tamaño 30x9x8cm). En cada parcela de muestra, se distribuyeron 61 trampas, 20 Shermans y 41 Tomahawks siendo cebos con una mezcla hecha con pasta de maní, sardinas, aceite de hígado de bacalao y harina de maíz, así como frutas como plátano, manzana y piña. Todas las trampas utilizadas fueron inspeccionadas diariamente por la mañana, los cebos fueron intercambiados cuando era necesario y más tarde después de la captura en bolsas de tela y Los animales silvestres fueron sedados con una combinación de ketamina 20mg/kg y xilazina 2mg/kg intramuscularmente y posteriormente, eutanasiados con sobredosis anestésica de lidocaína al 2% en el foramen magnum, de acuerdo con la recomendación del Consejo Nacional para el Control de la Experimentación Animal (CONCEA). De octubre de 2014 a abril de 2016, se recolectaron 1.282 muestras fecales de animales silvestres y domésticos, de las cuales 648 (50,5%) fueron seleccionadas aleatoriamente para investigación RVA y manejadas en Laboratorio de Bioseguridad de Nivel Tres (NB3). El genoma viral fue extraído mediante el protocolo TRIZOL LS REAGENT (INVITRO-GEN, USA/KIT QIAGEN), siguiendo las recomendaciones del fabricante, con menor adaptación según el protocolo descrito en los datos complementarios. [40] para la detección de RVA utilizando el segmento NSP3 de RVA como secuencia génica diana. El ensayo se llevó a cabo en una mezcla que contenía: RNAse-free H 2 O, TaqMan RT-PCR Mix (2x), TAqMan RT Enzyme Mix (40x), imprimaciones para el gen NSP3, Primer NSP3 Forward (20mM), Primer NSP3 Inverso (20mM), sonda NSP3 S (10nm), Plantilla (ARN) 3μL, con un volumen de reacción total de 17μL y ciclo de transcripción inversa de 50°C, 30 minutos, desnaturalización de 95°C, 10 minutos, recocido de 45 ciclos de 95°C, 15 segundos y extensión de 60°C, 1 minuto. Los análisis se consideraron positivos al presentar el umbral de ciclo (TC) 40. Para garantizar un resultado de prueba fiable, las mediciones del control de la contaminación se realizaron con el uso de control animal positivo (prototipo SA11) y un control negativo (agua de úlcera). Todas las muestras positivas de RVA fueron sometidas a reacción en cadena de la transcripción inversa-polimerasa (RT-PCR) de acuerdo con Mijatovic et al [41] para genotipar muestras de bajas cargas virales. La primera ronda fue realizada con imprimaciones de consenso N-VP4F1/N-VP4R1 y la Nested-PCR fue realizada con imprimaciones N-VP4F2/N-VP4R2 para amplificar el gen VP4. Los amplificadores fueron purificados y secuenciados para el gen VP4 usando los mismos imprimadores de Nested-PCR. Las secuencias fueron recolectadas de un secuenciador automático ABI Prism 3130xl ADN Los fragmentos de secuencia fueron ensamblados y editados utilizando la plataforma de software Geneious Bioinformática v.8.1.7. Posteriormente, los datos fueron comparados con otras secuencias de la base de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica GenBank utilizando la herramienta de alineación BLAST para dilucidar el genotipo RVA de las muestras. De octubre de 2014 a abril de 2016, un total de 648 muestras fecales de animales silvestres y domésticos pertenecientes a tres áreas de fragmentos forestales fueron probadas para el gen NSP3 por QPCR cualitativo, y 178 (27,5%) fueron positivas para RVA, distribuidas entre las especies: aves (23,6%), caninos (21,35%), murciélagos (17,98%), bovinos (14,6%), caballos (8,43%), pequeños roedores (6,74%), cerdos (3,93%) y felinos (3,37%). 47 Fue posible detectar cepas virales en todos los géneros de animales estudiados y en el período de recolección ninguno de los animales mostró signos de infección aguda y/o diarrea. Rotavirus A (RVA) detectados en el presente estudio de animales silvestres y domésticos pertenecientes a las tres áreas del fragmento forestal, según la Fig. 2. En relación a los bovinos evaluados, sólo en la ciudad de Viseu, estas especies fueron estudiadas porque fueron creadas extensamente. Además, la mayoría de los animales eran jóvenes con edades que variaban de 1 día a 8 años, antecedentes de vacunación deficiente, falta de asistencia técnica y criados en forma de subsistencia. Los animales no mostraron síntomas de diarrea, solo bajo rendimiento de peso y mal estado de manejo sanitario. En relación a la quiroptera, se distribuyeron 32 (17,98%) muestras positivas de RVA entre las especies de Carollia perspicillata, con 12 (37,5%) siendo todas adultas, 9 (28,12%) muestras de Desmodus rotundus (4 jóvenes y 5 adultos), 5 (15,6%) de Uroderma bilobata (15,62%), 3 (9,37%) de Artibeus lituratus y las especies Artibeus Planirostus, Diaemus iyoug y Glossophagina con 1 (3,12%) cada una. Estos animales procedían de áreas de fragmentos forestales ubicadas cerca de granjas de bovinos y equinos, además de habitar pequeñas granjas de pollos. La figura 3 muestra los resultados obtenidos para todas las especies de animales investigadas en el fragmento forestal así como en la zona del peridomicillus. Las variables antrópicas fueron analizadas para las tres ciudades estudiadas, así como el uso del suelo dentro del rango de los animales, obedeciendo el domicilio, el peridomicil y el fragmento forestal donde se capturaron las trampas de pequeños roedores, aves y diversas especies de animales (Fig 4 y Fig 5). Considerando los factores relacionados con las actividades antrópicas en las tres áreas estudiadas dentro de las tres ciudades del presente estudio, se observó que la ciudad de Santa Bárbara es la que tiene una mejor área de bosque preservado y la ciudad de Viseu una área más pequeña. Sin embargo, en la ciudad de Santa Bárbara se observó una mayor concentración de ocupaciones alrededor del área de fragmento forestal. Se observó en esta zona escogida de la ciudad, la presencia de diferentes familias viviendo en un asentamiento rural, sobreviviendo de la explotación de los recursos forestales y la creación de pequeños animales de subsistencia, como aves de corral y piscicultura, así como productos agrícolas familiares. La cría de animales en pastos nativos sólo se observó en las ciudades de Peixe Boi y Viseu. Se practicó una extensa ganadería con ganado vacuno, equinos para trabajo y pequeños animales (porcinos y cabras). En relación con la zona de pastos más conservada, la ciudad de Peixe Boi tuvo la mayor superficie, según los datos mostrados en la Figura 5, sin embargo, en la ciudad de Viseu se observó una mayor regeneración en los pastos durante el período del estudio, con significativa vegetación secundaria. Al comparar los climas de las tres áreas se observó que el clima predominante es megatermal y húmedo con temperatura media anual alrededor de Los meses de octubre, noviembre y diciembre son los más calurosos, con temperaturas entre 32°C y 34°C y máximos absolutos alrededor de 41°C. Las precipitaciones anuales son bastante altas, generalmente alrededor de 2.350 mm, pero fuertemente concentradas de enero a junio (80%). De septiembre a diciembre, por el contrario, las precipitaciones son raras, alrededor del 7%, con una corta estación seca, de déficit de agua moderado en esos meses. La humedad relativa del aire promedio oscila alrededor del 85%, como se muestra en la figura 6 [48]. La descripción de la precipitación acumulada en el año de captura de los especímenes fecales en comparación con las Normales Climatológicas (CLINO) para el período 1961-1990 de los PCD más cercanos a las localidades del Expedito Ribeiro / Santa Bárbara (Belém PCD), Vila Ananim / Peixe-Boi y Açaiteua / Viseu (Tracauateua PCD) muestran la frecuencia de lluvias en las regiones, lo que facilita la renovación de los pastos y la regeneración de los bosques impactados, siendo un indicador importante de la reducción de los daños causados por la deforestación en la región. El índice medio de deforestación en las tres áreas de estudio se calculó a partir de los datos obtenidos de los sistemas de información del INPE. Se observó que en los años de 2013 a 2014 no hubo cambios en estas regiones; en el período de 2014 a 2015 alrededor del 4,1% de la ciudad de Viseu fue cambiada y el 1,6% de la ciudad de Peixe Boi. En relación con el período de 2016, se observaron grandes cambios en Peixe Boi (79%) y en la ciudad de Viseu (70%), demostrando así que los cambios en el ecosistema natural pueden estar asociados con las frecuencias de VRA en las áreas estudiadas, según la Fig 7. Al evaluar a los animales infectados en relación a los animales no infectados tanto en el fragmento del bosque como en el peridomicilo, considerando como animales del bosque fragmentan a las aves, se obtuvieron la quiroptera y los pequeños roedores y como animales del peridomicilo los caninos, bovinos, cerdos, felinos y caballos, un porcentaje de 37,07% infectados por animales domésticos (86/232) y 22,12 % infectados por animales fragmentados del bosque (92/416). Aplicando el análisis estadístico seleccionado, se obtuvo un valor de Pearson x2 Chi-cuadrado: 16,7159, df = 1 y p < 0,001, lo que significa que la hipótesis fue corroborada, es decir, cuanto mayor sea la degradación del medio ambiente, más probable será la búsqueda de alimentos por animales silvestres en áreas adyacentes, o en el borde del bosque o incluso en la región peridomiciliaria. En este sentido, se debe considerar la posibilidad de contagio con otras especies de animales, incluso humanos, debido a la capacidad del rotavirus para ser transmitido por vía fecal/ oral o por contacto directo con el medio ambiente. Es importante señalar que los animales detectados en este estudio son fuentes importantes de cepas virales. Se seleccionaron, reextractaron y analizaron un total de 80 muestras de heces utilizando PCR para el gen VP4. Ocho cepas (10%) fueron positivas para el gen VP4, siendo 2 cepas despojadas del genotipo P [6] y 6 al tipo P[4], según el presente estudio, se detectó la presencia de VRA circulando en el 27,5% de los animales; 36% en animales domésticos y 64% en animales silvestres, proporcionando un conjunto de datos único con qRT-PCR detectando una baja carga viral de VRA en diferentes especies, lo que además se correlaciona con el índice de deforestación Estos datos son importantes debido a la falta de pruebas para el diagnóstico del VRA en animales, ya que los métodos actuales de detección del VRA no siempre se detectan en estas poblaciones [8]. Con el advenimiento de la RCP en tiempo real (QPCR), hubo un crecimiento exponencial, en comparación con los ensayos convencionales del RPR, ya que su precisión, sensibilidad y especificidad superiores son notables, y es Rotavirus A en animales silvestres y domésticos posible detectar el VRA en una variedad de especies animales utilizando el gen NSP3 [49]. La sensibilidad del RT-qPCR mejoró significativamente la tasa de detección del VRA en muestras clínicas de animales y en este contexto, el presente estudio propuso un interesante estudio métricas utilizando el virus que se propaga en animales silvestres que habitan fragmentos forestales para indicar intervenciones de población humana, con el objetivo de prevenir los brotes de virus apalancados en las características geográficas únicas de Brasil y su En la actualidad, no se han descrito datos en la literatura sobre la detección de RVA utilizando la técnica qPCR en tiempo real en una amplia variedad de especies animales silvestres. Sin embargo, un estudio de Soltan et al. [50] realizado con caballos y bovinos detectó RVA por RT-PCR, RT-PCR comercial y RT-qPCR en 36,7%, 51,4% y 56,9% respectivamente, de manera diferente al presente estudio que mostró mayor positividad para los quiropteros (17,98%), caninos (21,35%), aves (23,6%) y ganado (14,6%). La primera descripción de RVA en quiroptera se registró en heces de Eidolon helvum capturadas en Vihiga, Kenia [51]. Posteriormente, varias cepas de RVA fueron detectadas por diferentes técnicas moleculares que involucraban a quiroptera, en varios países, incluyendo Kenia (E. helvum), China (Rhinolophus hipposideros y Aselliscus stoliczkanus), Francia (Myotis mystacinus), Camerún (E. helvum) y Brasil [31, [51] [53] [53] [54]. El presente estudio muestra la ocurrencia de RVA en el 17,98% de las quiropteras, estando entre las especies Carollia perspicillata (37,5%), Desmodus rotundus (28,12%), Uroderma bilobata (15,6%), Artibeus lituratus (9,37%), Artibeus Planirostus (3,12%), Diaemus iyoug y Glossofagina (3 [56] informó que Desmodus rotundus es una de las tres especies hematófagas de la familia Phyllostomidae, encontrada en toda América del Sur, América Central y México. De las quiropteras positivas para RVA en el presente estudio, una prevalencia de 28,12% fue de Desmodus rotundus. Esta especie se alimenta de aves, puede alimentarse de mamíferos, en su mayoría de tamaño medio o grande, facilitando la diseminación de esporas virales entre la comunidad dentro del hábitat, como se observa en el presente estudio. Estos hallazgos muestran la importancia de los datos epidemiológicos sobre las especies estudiadas debido a la falta de estudios que involucren especies de quiroptera neotropical, y no es posible establecer parámetros comparativos para estos animales. Respecto a la circulación de RVA en caninos y aves, la prevalencia fue del 53% y 29%, respectivamente. Aunque en la región amazónica existen registros de RVA, RVD, RVF y RVG que infectan a las aves [57] [58] y RVD en aves migratorias [59], todos fueron detectados mediante ensayos RT-PCR de manera diferente al presente estudio que detectaron el RVA por RT-qPCR involucrando una variedad de especies animales. Por otro lado, la prevalencia en felinos (16%) y cerdos (22%) fue menor, probablemente porque hay pocos animales de estas especies en la región, así como pocas creaciones. El estudio detectó la presencia de RVA en diferentes especies de animales tanto en áreas cercanas al hogar como en áreas ubicadas en fragmentos de bosque, caracterizadas como restos forestales, ya que se encontraban en ciudades que sufrieron un alto impacto ambiental debido al extractivismo vegetal, la formación de pastos para la cría de ganado, la explotación de recursos naturales y reflejos directos sobre los hábitats de animales silvestres que pueden servir como fuentes víricas, facilitando así la dispersión de RVA entre comunidades de animales coexistentes. Cabe destacar que estos animales tienen mayor contacto con las poblaciones humanas de las áreas estudiadas ya que cohabitan con los humanos de la región, además de tener un alto flujo de movimiento entre los extractos forestales y ambientes elegidos para el presente estudio. Sin embargo, cabe destacar que sólo en las comunidades de Santa Bárbara y Viseu se recogieron especímenes fecales de humanos asintomáticos para diarrea y se probaron para RVA, pero todos La fragmentación del bosque genera muchas consecuencias sobre la biota amazónica, pudiendo alterar la diversidad y la composición de las comunidades animales en los fragmentos e incluso interferir en los procesos ecológicos, sin considerar que los fragmentos de bosque en la Amazonía están influenciados por el clima, lo que posiblemente facilita la dispersión de patógenos por el medio ambiente, ya que los animales silvestres detectados en el presente estudio son asintomáticos y tienen baja carga viral para la VRA. La ocurrencia de VRA en esta población de animales puede explicar la posibilidad de dispersión de cepas virales, ya que existe una proximidad a la población humana, además de las características biológicas de estas especies que pueden representar fuentes importantes de virus gastroenternos, junto con el hecho de que todos los animales fueron asintomáticos para la diarrea. Las aves silvestres tienen una capacidad de vuelo ilimitada, fueron capturadas en una región de interfaz entre el peridomicilo y los fragmentos forestales y se cree que esta región no ha sido influenciada por actividades antrópicas como las observadas en el área del presente estudio. Por otro lado, el método de cría de aves de corral y caninos cercanos a los hogares y al ecosistema forestal, tal como se crean en las comunidades estudiadas, probablemente facilita el contacto directo con posibles fuentes de contaminación, ya que en las zonas el uso de tanques sépticos es deficiente y a veces inexistente, lo que puede facilitar o incluso aumentar el riesgo de dispersión viral en todo el medio ambiente. Las altas tasas de aumento y el análisis del uso del suelo en las zonas investigadas pueden ser indicadores importantes de cómo interactúan estos animales, ya que con la deforestación, las poblaciones de animales silvestres buscan refugio en comunidades cercanas facilitando la dispersión de agentes infecciosos y la posible ocurrencia de A nuestro conocimiento, este es el primer estudio en el que se aplicó un ensayo de PCR en tiempo real para la detección de RVA involucrando una amplia variedad de animales domésticos y salvajes, facilitando la utilidad práctica en estudios epidemiológicos y moleculares y ayudando en una perspectiva en la elaboración de control sanitario y monitoreo, evitando posibles brotes en las comunidades estudiadas. La detección de animales positivos fue útil para monitorear la infección del agente en la población animal y para proporcionar una señal de alerta temprana para predecir una epidemia inminente y un riesgo favorable para la población humana, dada la evidencia de la circulación de RVA en los diferentes fragmentos forestales. Además, el ensayo RT-qPCR puede ser una alternativa útil para el diagnóstico diferencial de RV en posibles infecciones mixtas que coexistan clínicamente indistinguibles como las causadas por otras cepas virales que causan gastroenteritis tales como: astrovirus, coronavirus, picobirnavirus, calicivirus, entre otros, como se observó en los estudios de Jing et al. [60] y Waruhiu et al. [61]. La diarrea asociada a infecciones por VRA en cerdos es una causa importante de aumento de la mortalidad y pérdidas económicas en Europa. Los genotipos más prevalentes aislados de heces de lechones diarreicos y no diarreicos belgas en 2012 [62] demuestran una amplia gama de combinaciones de genotipos G / P incluyendo; G3P [6], G4P [6], G5P [6], G4P [7], G5P [7], G9P [7], G9P [13] y G9P [23]. Por otro lado, en el presente estudio fue posible detectar sólo el genotipo P [6], ya que la mayoría de las muestras eran asintomáticas para la diarrea. El hallazgo muestra que diferentes genotipos P de cepas RVA interactúan con antígenos histológicos distintos del grupo sanguíneo (HBGA, ABOH, Lewis) y ácidos siálicos vía VP4 proporcionando una visión de la prevalencia regional y un aumento del potencial zoonótico de algunos El genotipo P [6] fue identificado en lechones en Brasil [64] y en Italia y Japón, parecido al genotipo P [6] humano [65, 66]. En la población de animales estudiados, la transmisión zoonótica puede ser frecuente, ya que los animales viven en contacto con humanos y en condiciones sanitarias precarias. En Brasil, este genotipo fue descrito en poblaciones animales y humanas en estudios de Luchs y otros [32] ; Honma y otros [67] ; Araújo y otros [68] ; Mascarenhas y otros [69] y Lorenzetti y otros [70] tales estudios corroboran la importancia de seguir monitoreando los genotipos para verificar si surgen cepas poco comunes o nuevas cepas y pueden infectar poblaciones animales o transmisiones interespecíficas.En cuanto al genotipo P [4], fue más detectado en nuestras muestras en murciélagos, perros, Este genotipo no es común en animales, siendo más detectados en muestras humanas y ambientales en diversas partes del mundo e incluyendo a nuestra región [71]. Es importante destacar que los indicadores de contaminación ambiental en Brasil son significativos y contribuyen a la posibilidad de transmisión humano-animal [71]. Estos datos requieren investigación adicional en trabajos posteriores para caracterizar mejor la transmisión interespecífica, ya que la ocurrencia de virus entéricos en diferentes matrices demuestra el impacto antropogénico de la población expuesta alrededor y señala el riesgo potencial de infección por la posible exposición de individuos susceptibles. Nuestros hallazgos pueden ser útiles para el seguimiento de la contaminación fecal en el ambiente utilizando animales como posibles fuentes, minimizando así el riesgo de infección por exposición a individuos susceptibles, en este caso diferentes especies animales o incluso poblaciones humanas. RVA fueron detectados en animales silvestres y domésticos utilizando un ensayo RT-qPCR que analizó muestras que tenían baja carga viral para RVA. Aunque las muestras son asintomáticas para la diarrea, es necesario llevar a cabo estrategias para el monitoreo y control de los animales en las áreas estudiadas en la población humana, así como en otras especies de animales, así como la implementación de medidas preventivas dirigidas a futuros brotes en comunidades animales de la población residente en estas áreas impactadas. Por lo tanto, el presente estudio no tiene precedentes en la región y en el país en relación con la investigación del VRA en animales silvestres. Cabe destacar que, aunque la calidad de las muestras analizadas se caracteriza por una baja carga viral detectable, la técnica presentó una buena respuesta analítica en la detección de los animales de origen para el VRA, facilitando la selección de las muestras para futuras pruebas de caracterización genética.

¿Qué proteínas estructurales están codificadas por Rotavirus?

Rotavirus A en animales silvestres y domésticos de zonas con degradación ambiental en la Amazonía brasileñahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6298726/SHA: f3c309c596c20f48f493b77e714ce957d8777bcbAutores: de Barros, Bruno de Cássio Veloso; Chagas, Elaine Nunes; Bezerra, Luna Wanessa; Ribeiro, Laila Graziela; Duarte Júnior, Jose Wandilson Barboza; Pereira, Diego; da Penha Junior, Edvaldo Tavares; Silva, Julia Rezende; Bezerra, Delana Andreza Melo; Bandeira, Renato Silva; Pinheiro, Helder Henrique Costa; Guerra, Sylvia de Fátima dos Santos Los animales domésticos y principalmente silvestres como murciélagos, pequeños roedores y aves son animales altamente diversificados en relación a sus hábitats y nichos ecológicos y están ampliamente distribuidos geográficamente en ambientes de fragmentación forestal en algunas zonas de la Amazonía, siendo consideradas fuentes importantes de virus que afectan a los seres humanos y otros animales. Debido a las actividades antrópicas, estos animales cambiaron su hábitat natural y se adaptaron a entornos urbanizados, representando así riesgos para la salud humana y animal. Aunque el conocimiento de la diversidad global de virus entéricos es escaso, existen informes que demuestran la detección de rotavirus en animales domésticos y animales de sistemas productivos, como bovinos y cerdos. El presente estudio investigó la prevalencia del Rotavirus A en 648 muestras fecales de diferentes especies animales de la mesoregión noreste del estado de Pará, Brasil, que se caracteriza por ser un área urbanizada con fragmentos forestales. Los especímenes fecales fueron recolectados de octubre de 2014 a abril de 2016 y sometidos a una Reacción en Cadena de Polimerasa en Tiempo Real Cualitativa (RT-qPCR), utilizando el gen NSP3 como objetivo. Se observó que el 27,5% (178/648) de las muestras presentaron resultados positivos para la VRA, con 178 muestras distribuidas en aves (23,6%), caninos (21,35%), quiropteros (17,98%), bovinos (14,6%), caballos (8,43%), pequeños roedores (6,74%), cerdos (3,93%) y felinos (3,37%), demostrando la circulación de la VRA en animales domésticos y sugiriendo que tal proximidad podría causar transmisiones entre diferentes especies y la ocurrencia de reordenamientos en el genoma de la VRA ya descrito en la literatura, asociados a las trazas de degradación ambiental en las áreas estudiadas. Texto: Las enfermedades infecciosas emergentes y reemergentes están aumentando cada año en varios países, con un impacto tanto en las poblaciones humanas como en los animales domésticos y silvestres que viven en áreas con restos forestales considerables [1]. La mayoría de estas enfermedades son de origen viral, lo que sugiere la aparición y reaparición de virus que son desencadenados por actividades humanas que modifican el medio ambiente [2]. Las poblaciones de animales silvestres que habitan fragmentos forestales son grupos estratégicos para estudios de salud pública y transmisión de zoonosis, dado que actúan como indicadores en la asistencia e intervención en las poblaciones humanas, con el objetivo de prevenir brotes y epidemias [3]. La gastroenteritis aguda puede ser causada por infección en el tracto gastrointestinal, causada por diferentes agentes infecciosos o parásitos [4] [5] [6] [7]. Representan una de las principales causas de mortalidad en humanos y en animales jóvenes, contando con alrededor del 25% de mortalidad [8]. El rotavirus se distribuye ampliamente en los animales, que actúan como fuentes de cepas emergentes del rotavirus, con estos animales actuando en la transmisión entre especies y por medio del reasociamiento que conduce a la aparición de nuevas cepas que han sido reportadas en infecciones humanas [9] [10] [11] [12]. El rotavirus (RV) pertenece a la familia Reoviridae y comprende nueve especies conocidas como Rotavirus grupo A a I, con una propuesta reciente de la especie J [13, 14]. El rotavirus A (RVA) está muy extendido en todo el mundo y afecta predominantemente a seres humanos, bovinos y otras especies de mamíferos, así como a aves [15]. Tienen un genoma de ácido ribonucleico de doble cadena (dsRNA), dividido en 11 segmentos de codificación para proteínas estructurales (VP1-VP4, VP6 y VP7) y proteínas no estructurales (NSP1-NSP5/NSP6 Hay registros de una estrecha relación entre la fauna y flora amazónicas y las poblaciones humanas [18], y esta interacción es el efecto de las actividades de urbanización antropogénica que resultan en la deforestación de zonas forestales, causando la degradación de sitios previamente aislados como cuevas y pequeñas cuevas, un proceso continuo y progresivo de la naturaleza que ha llevado no sólo a cambios en los hábitats de la fauna y flora silvestres, sino también a una mayor relación con las poblaciones humanas en entornos rurales y urbanos, contribuyendo a la aparición y aparición de enfermedades diferentes de las que normalmente ocurren en regiones endémicas [19] [20] [22]. Aunque los resultados del VRA ya se han descrito globalmente [12, [23] [25] [26] [28] [30], en Brasil, la ocurrencia, diversidad y papel del rotavirus en estos animales todavía están poco estudiados, teniendo en cuenta el gran número de especies presentes [4, [31 En la Amazonía brasileña, especialmente en el estado de Pará, las mesoregiones metropolitanas de Belém y Nordeste son algunas de las zonas con mayor índice de cambios ambientales [35], que se concentran, junto con el hecho de que el conocimiento de la diversidad global del virus entérico en animales es escaso [36]. Por lo tanto, es importante monitorear la salud de los animales domésticos y silvestres en su hábitat natural, especialmente en áreas con alteraciones antrópicas que tienen una interfaz con comunidades rurales y empresas, para investigar la ocurrencia de VRA en esta población. Estas comunidades son ecológicamente complejas, ya que cuentan con múltiples hospedadores y patógenos sin fin que eventualmente pueden circular en centros urbanos contiguos, además de que también debe considerarse que todavía no existen estudios que demuestren la importancia de estos virus que infectan a esta población, ya que en el contexto de la vigilancia epidemiológica, estos animales se vuelven importantes, ya que pueden ser considerados como fuentes naturales, con la posibilidad de transmisión a los seres humanos [37] [38]. La reacción cualitativa en cadena de la polimerasa en tiempo real (qRT-PCR) utilizó el gen NSP3 y la sonda TaqMan de una región altamente conservada de la proteína no estructural del rotavirus 3 (NSP3), que se utilizó previamente en muestras de origen humano y con bajas cargas virales Los datos de precipitación se obtuvieron del Instituto Nacional Brasileño de Meteorología (Inmethttp://www.inmet.gov.br/) para los años de captura en el Acuerdo Expedito Ribeiro (2014) y Açailândia (2015) de las Plataformas de Recolección de Datos (PCD) de Belém, ubicado a 50 km de Santa Bárbara do Pará, y Tracuateua, ubicado a 50 km de Peixe-Boi y a 100 km de Viseu. Los límites municipales se obtuvieron en el sitio web del Instituto Brasileño de Geografía y Estadística (IBGE) (http://www.ibge.gov.br/) y los datos sobre deforestación y uso de la tierra se obtuvieron de los proyectos PRODES [43] y TerraClass [44]. PRODES cuenta con datos anuales en formato digital desde 2000 y TerraClass presenta datos semestrales desde 2004. La imagen satelital se generó utilizando el sensor Sentinel 2 de la Agencia Espacial Europea (ESA) (https://sentinel.esa.int/web/sentinel/user-guides/sentinel-2-msi) con licencia CC-BY de acceso abierto (http://open.esa.int/) de los años 2017 y 2018. Todos los datos obtenidos se almacenaron en una base de datos geográficos (BDG). El BDG fue importado/almacenado en un SIG para la edición de los elementos gráficos, el establecimiento de relaciones topológicas entre los elementos y sus atributos respectivos, el análisis espacial y la visualización del resultado a través de mapas temáticos. Para el presente estudio, se eligieron fragmentos forestales de tamaño, forma y fisiología similar, considerando una matriz periurbana abierta con uso de suelo similar. Los fragmentos seleccionados fueron distribuidos dentro de las mesoregiones estudiadas, y en cada fragmento seleccionado muestras fecales fueron recolectadas aleatoriamente de animales domésticos y salvajes [45]. Se obtuvieron clases de uso de suelo del mosaico de datos TerraClass de 2004 a 2016, ya que los sitios de estudio se encontraban en un área con alta presencia de nubes, lo que impidió la observación (el área no se observó).El procesamiento de datos, interpretación, visualización y análisis espacial se realizaron en el software ArcGIS (http://www.arcgis Para el análisis de los datos relacionados con la determinación de la riqueza, composición y abundancia de la fauna de los animales estudiados en el área de estudio, considerando los métodos de recolección adoptados y las especies disponibles en cada ciudad, cada muestra fue considerada como una muestra independiente. La riqueza de la fauna silvestre y animales domésticos fue determinada por el número total de especies incluyendo todos los métodos de recolección, y la similitud de las especies fue realizada por el análisis chi-cuadrado entre las muestras de los diferentes tratamientos con la ayuda del software EstimatS 8.0 [46]. Para el cálculo del Test T, se utilizó el software Statistica, y se calcularon los índices de animales infectados en los dos ambientes (fragmento forestal y peridomicil) para cada tratamiento muestreado por área de recolección, utilizando el software Past 1.92. Apuntando a comparar los valores de los índices de diversidad a través del test emparejado, así como el análisis descriptivo Los datos obtenidos para la ocurrencia de la VRA y los cuestionarios fueron insertados en una base de datos para un análisis descriptivo del perfil epidemiológico de la población animal en los tres ecosistemas forestales estudiados.En este análisis se realizaron tratamientos estadísticos descriptivos, utilizando tablas de tipo "columnas de surco" personalizadas, referidas a los datos, con el fin de caracterizar la muestra y cuantificar los resultados mediante valores de frecuencia absoluta utilizando la prueba chi-cuadrado y la prueba T.Population estudio, recolección de especímenes clínicos y metodología de laboratorio.Los animales voladores (aves silvestres y quiroptera) fueron capturados mediante redes de niebla que se abrieron al amanecer (4:00 a.m.) y cerraron por la mañana (9:00 a.m.) y fueron inspeccionados cada hora hasta el cierre, con un esfuerzo de muestreo de 15 días.Esta investigación fue aprobada por National All procedimientos con animales fueron realizados por veterinarios, siendo aves Los especímenes fecales fueron recolectados por estimulación de la ampolla rectal con el uso de un "Zaragatoa", envasados en viales criogénicos, identificados, almacenados en nitrógeno líquido, y posteriormente enviados al Laboratorio. Los animales salvajes (pequeños mamíferos no voladores) fueron atrapados en trampas de contención en vivo de la jaula Tomahawk (tamaño 45x16x16cm) y de aluminio tipo Sherman (tamaño 30x9x8cm). En cada parcela de muestra, se distribuyeron 61 trampas, 20 Shermans y 41 Tomahawks siendo cebos con una mezcla hecha con pasta de maní, sardinas, aceite de hígado de bacalao y harina de maíz, así como frutas como plátano, manzana y piña. Todas las trampas utilizadas fueron inspeccionadas diariamente por la mañana, los cebos fueron intercambiados cuando era necesario y más tarde después de la captura en bolsas de tela y Los animales silvestres fueron sedados con una combinación de ketamina 20mg/kg y xilazina 2mg/kg intramuscularmente y posteriormente, eutanasiados con sobredosis anestésica de lidocaína al 2% en el foramen magnum, de acuerdo con la recomendación del Consejo Nacional para el Control de la Experimentación Animal (CONCEA). De octubre de 2014 a abril de 2016, se recolectaron 1.282 muestras fecales de animales silvestres y domésticos, de las cuales 648 (50,5%) fueron seleccionadas aleatoriamente para investigación RVA y manejadas en Laboratorio de Bioseguridad de Nivel Tres (NB3). El genoma viral fue extraído mediante el protocolo TRIZOL LS REAGENT (INVITRO-GEN, USA/KIT QIAGEN), siguiendo las recomendaciones del fabricante, con menor adaptación según el protocolo descrito en los datos complementarios. [40] para la detección de RVA utilizando el segmento NSP3 de RVA como secuencia génica diana. El ensayo se llevó a cabo en una mezcla que contenía: RNAse-free H 2 O, TaqMan RT-PCR Mix (2x), TAqMan RT Enzyme Mix (40x), imprimaciones para el gen NSP3, Primer NSP3 Forward (20mM), Primer NSP3 Inverso (20mM), sonda NSP3 S (10nm), Plantilla (ARN) 3μL, con un volumen de reacción total de 17μL y ciclo de transcripción inversa de 50°C, 30 minutos, desnaturalización de 95°C, 10 minutos, recocido de 45 ciclos de 95°C, 15 segundos y extensión de 60°C, 1 minuto. Los análisis se consideraron positivos al presentar el umbral de ciclo (TC) 40. Para garantizar un resultado de prueba fiable, las mediciones del control de la contaminación se realizaron con el uso de control animal positivo (prototipo SA11) y un control negativo (agua de úlcera). Todas las muestras positivas de RVA fueron sometidas a reacción en cadena de la transcripción inversa-polimerasa (RT-PCR) de acuerdo con Mijatovic et al [41] para genotipar muestras de bajas cargas virales. La primera ronda fue realizada con imprimaciones de consenso N-VP4F1/N-VP4R1 y la Nested-PCR fue realizada con imprimaciones N-VP4F2/N-VP4R2 para amplificar el gen VP4. Los amplificadores fueron purificados y secuenciados para el gen VP4 usando los mismos imprimadores de Nested-PCR. Las secuencias fueron recolectadas de un secuenciador automático ABI Prism 3130xl ADN Los fragmentos de secuencia fueron ensamblados y editados utilizando la plataforma de software Geneious Bioinformática v.8.1.7. Posteriormente, los datos fueron comparados con otras secuencias de la base de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica GenBank utilizando la herramienta de alineación BLAST para dilucidar el genotipo RVA de las muestras. De octubre de 2014 a abril de 2016, un total de 648 muestras fecales de animales silvestres y domésticos pertenecientes a tres áreas de fragmentos forestales fueron probadas para el gen NSP3 por QPCR cualitativo, y 178 (27,5%) fueron positivas para RVA, distribuidas entre las especies: aves (23,6%), caninos (21,35%), murciélagos (17,98%), bovinos (14,6%), caballos (8,43%), pequeños roedores (6,74%), cerdos (3,93%) y felinos (3,37%). 47 Fue posible detectar cepas virales en todos los géneros de animales estudiados y en el período de recolección ninguno de los animales mostró signos de infección aguda y/o diarrea. Rotavirus A (RVA) detectados en el presente estudio de animales silvestres y domésticos pertenecientes a las tres áreas del fragmento forestal, según la Fig. 2. En relación a los bovinos evaluados, sólo en la ciudad de Viseu, estas especies fueron estudiadas porque fueron creadas extensamente. Además, la mayoría de los animales eran jóvenes con edades que variaban de 1 día a 8 años, antecedentes de vacunación deficiente, falta de asistencia técnica y criados en forma de subsistencia. Los animales no mostraron síntomas de diarrea, solo bajo rendimiento de peso y mal estado de manejo sanitario. En relación a la quiroptera, se distribuyeron 32 (17,98%) muestras positivas de RVA entre las especies de Carollia perspicillata, con 12 (37,5%) siendo todas adultas, 9 (28,12%) muestras de Desmodus rotundus (4 jóvenes y 5 adultos), 5 (15,6%) de Uroderma bilobata (15,62%), 3 (9,37%) de Artibeus lituratus y las especies Artibeus Planirostus, Diaemus iyoug y Glossophagina con 1 (3,12%) cada una. Estos animales procedían de áreas de fragmentos forestales ubicadas cerca de granjas de bovinos y equinos, además de habitar pequeñas granjas de pollos. La figura 3 muestra los resultados obtenidos para todas las especies de animales investigadas en el fragmento forestal así como en la zona del peridomicillus. Las variables antrópicas fueron analizadas para las tres ciudades estudiadas, así como el uso del suelo dentro del rango de los animales, obedeciendo el domicilio, el peridomicil y el fragmento forestal donde se capturaron las trampas de pequeños roedores, aves y diversas especies de animales (Fig 4 y Fig 5). Considerando los factores relacionados con las actividades antrópicas en las tres áreas estudiadas dentro de las tres ciudades del presente estudio, se observó que la ciudad de Santa Bárbara es la que tiene una mejor área de bosque preservado y la ciudad de Viseu una área más pequeña. Sin embargo, en la ciudad de Santa Bárbara se observó una mayor concentración de ocupaciones alrededor del área de fragmento forestal. Se observó en esta zona escogida de la ciudad, la presencia de diferentes familias viviendo en un asentamiento rural, sobreviviendo de la explotación de los recursos forestales y la creación de pequeños animales de subsistencia, como aves de corral y piscicultura, así como productos agrícolas familiares. La cría de animales en pastos nativos sólo se observó en las ciudades de Peixe Boi y Viseu. Se practicó una extensa ganadería con ganado vacuno, equinos para trabajo y pequeños animales (porcinos y cabras). En relación con la zona de pastos más conservada, la ciudad de Peixe Boi tuvo la mayor superficie, según los datos mostrados en la Figura 5, sin embargo, en la ciudad de Viseu se observó una mayor regeneración en los pastos durante el período del estudio, con significativa vegetación secundaria. Al comparar los climas de las tres áreas se observó que el clima predominante es megatermal y húmedo con temperatura media anual alrededor de Los meses de octubre, noviembre y diciembre son los más calurosos, con temperaturas entre 32°C y 34°C y máximos absolutos alrededor de 41°C. Las precipitaciones anuales son bastante altas, generalmente alrededor de 2.350 mm, pero fuertemente concentradas de enero a junio (80%). De septiembre a diciembre, por el contrario, las precipitaciones son raras, alrededor del 7%, con una corta estación seca, de déficit de agua moderado en esos meses. La humedad relativa del aire promedio oscila alrededor del 85%, como se muestra en la figura 6 [48]. La descripción de la precipitación acumulada en el año de captura de los especímenes fecales en comparación con las Normales Climatológicas (CLINO) para el período 1961-1990 de los PCD más cercanos a las localidades del Expedito Ribeiro / Santa Bárbara (Belém PCD), Vila Ananim / Peixe-Boi y Açaiteua / Viseu (Tracauateua PCD) muestran la frecuencia de lluvias en las regiones, lo que facilita la renovación de los pastos y la regeneración de los bosques impactados, siendo un indicador importante de la reducción de los daños causados por la deforestación en la región. El índice medio de deforestación en las tres áreas de estudio se calculó a partir de los datos obtenidos de los sistemas de información del INPE. Se observó que en los años de 2013 a 2014 no hubo cambios en estas regiones; en el período de 2014 a 2015 alrededor del 4,1% de la ciudad de Viseu fue cambiada y el 1,6% de la ciudad de Peixe Boi. En relación con el período de 2016, se observaron grandes cambios en Peixe Boi (79%) y en la ciudad de Viseu (70%), demostrando así que los cambios en el ecosistema natural pueden estar asociados con las frecuencias de VRA en las áreas estudiadas, según la Fig 7. Al evaluar a los animales infectados en relación a los animales no infectados tanto en el fragmento del bosque como en el peridomicilo, considerando como animales del bosque fragmentan a las aves, se obtuvieron la quiroptera y los pequeños roedores y como animales del peridomicilo los caninos, bovinos, cerdos, felinos y caballos, un porcentaje de 37,07% infectados por animales domésticos (86/232) y 22,12 % infectados por animales fragmentados del bosque (92/416). Aplicando el análisis estadístico seleccionado, se obtuvo un valor de Pearson x2 Chi-cuadrado: 16,7159, df = 1 y p < 0,001, lo que significa que la hipótesis fue corroborada, es decir, cuanto mayor sea la degradación del medio ambiente, más probable será la búsqueda de alimentos por animales silvestres en áreas adyacentes, o en el borde del bosque o incluso en la región peridomiciliaria. En este sentido, se debe considerar la posibilidad de contagio con otras especies de animales, incluso humanos, debido a la capacidad del rotavirus para ser transmitido por vía fecal/ oral o por contacto directo con el medio ambiente. Es importante señalar que los animales detectados en este estudio son fuentes importantes de cepas virales. Se seleccionaron, reextractaron y analizaron un total de 80 muestras de heces utilizando PCR para el gen VP4. Ocho cepas (10%) fueron positivas para el gen VP4, siendo 2 cepas despojadas del genotipo P [6] y 6 al tipo P[4], según el presente estudio, se detectó la presencia de VRA circulando en el 27,5% de los animales; 36% en animales domésticos y 64% en animales silvestres, proporcionando un conjunto de datos único con qRT-PCR detectando una baja carga viral de VRA en diferentes especies, lo que además se correlaciona con el índice de deforestación Estos datos son importantes debido a la falta de pruebas para el diagnóstico del VRA en animales, ya que los métodos actuales de detección del VRA no siempre se detectan en estas poblaciones [8]. Con el advenimiento de la RCP en tiempo real (QPCR), hubo un crecimiento exponencial, en comparación con los ensayos convencionales del RPR, ya que su precisión, sensibilidad y especificidad superiores son notables, y es Rotavirus A en animales silvestres y domésticos posible detectar el VRA en una variedad de especies animales utilizando el gen NSP3 [49]. La sensibilidad del RT-qPCR mejoró significativamente la tasa de detección del VRA en muestras clínicas de animales y en este contexto, el presente estudio propuso un interesante estudio métricas utilizando el virus que se propaga en animales silvestres que habitan fragmentos forestales para indicar intervenciones de población humana, con el objetivo de prevenir los brotes de virus apalancados en las características geográficas únicas de Brasil y su En la actualidad, no se han descrito datos en la literatura sobre la detección de RVA utilizando la técnica qPCR en tiempo real en una amplia variedad de especies animales silvestres. Sin embargo, un estudio de Soltan et al. [50] realizado con caballos y bovinos detectó RVA por RT-PCR, RT-PCR comercial y RT-qPCR en 36,7%, 51,4% y 56,9% respectivamente, de manera diferente al presente estudio que mostró mayor positividad para los quiropteros (17,98%), caninos (21,35%), aves (23,6%) y ganado (14,6%). La primera descripción de RVA en quiroptera se registró en heces de Eidolon helvum capturadas en Vihiga, Kenia [51]. Posteriormente, varias cepas de RVA fueron detectadas por diferentes técnicas moleculares que involucraban a quiroptera, en varios países, incluyendo Kenia (E. helvum), China (Rhinolophus hipposideros y Aselliscus stoliczkanus), Francia (Myotis mystacinus), Camerún (E. helvum) y Brasil [31, [51] [53] [53] [54]. El presente estudio muestra la ocurrencia de RVA en el 17,98% de las quiropteras, estando entre las especies Carollia perspicillata (37,5%), Desmodus rotundus (28,12%), Uroderma bilobata (15,6%), Artibeus lituratus (9,37%), Artibeus Planirostus (3,12%), Diaemus iyoug y Glossofagina (3 [56] informó que Desmodus rotundus es una de las tres especies hematófagas de la familia Phyllostomidae, encontrada en toda América del Sur, América Central y México. De las quiropteras positivas para RVA en el presente estudio, una prevalencia de 28,12% fue de Desmodus rotundus. Esta especie se alimenta de aves, puede alimentarse de mamíferos, en su mayoría de tamaño medio o grande, facilitando la diseminación de esporas virales entre la comunidad dentro del hábitat, como se observa en el presente estudio. Estos hallazgos muestran la importancia de los datos epidemiológicos sobre las especies estudiadas debido a la falta de estudios que involucren especies de quiroptera neotropical, y no es posible establecer parámetros comparativos para estos animales. Respecto a la circulación de RVA en caninos y aves, la prevalencia fue del 53% y 29%, respectivamente. Aunque en la región amazónica existen registros de RVA, RVD, RVF y RVG que infectan a las aves [57] [58] y RVD en aves migratorias [59], todos fueron detectados mediante ensayos RT-PCR de manera diferente al presente estudio que detectaron el RVA por RT-qPCR involucrando una variedad de especies animales. Por otro lado, la prevalencia en felinos (16%) y cerdos (22%) fue menor, probablemente porque hay pocos animales de estas especies en la región, así como pocas creaciones. El estudio detectó la presencia de RVA en diferentes especies de animales tanto en áreas cercanas al hogar como en áreas ubicadas en fragmentos de bosque, caracterizadas como restos forestales, ya que se encontraban en ciudades que sufrieron un alto impacto ambiental debido al extractivismo vegetal, la formación de pastos para la cría de ganado, la explotación de recursos naturales y reflejos directos sobre los hábitats de animales silvestres que pueden servir como fuentes víricas, facilitando así la dispersión de RVA entre comunidades de animales coexistentes. Cabe destacar que estos animales tienen mayor contacto con las poblaciones humanas de las áreas estudiadas ya que cohabitan con los humanos de la región, además de tener un alto flujo de movimiento entre los extractos forestales y ambientes elegidos para el presente estudio. Sin embargo, cabe destacar que sólo en las comunidades de Santa Bárbara y Viseu se recogieron especímenes fecales de humanos asintomáticos para diarrea y se probaron para RVA, pero todos La fragmentación del bosque genera muchas consecuencias sobre la biota amazónica, pudiendo alterar la diversidad y la composición de las comunidades animales en los fragmentos e incluso interferir en los procesos ecológicos, sin considerar que los fragmentos de bosque en la Amazonía están influenciados por el clima, lo que posiblemente facilita la dispersión de patógenos por el medio ambiente, ya que los animales silvestres detectados en el presente estudio son asintomáticos y tienen baja carga viral para la VRA. La ocurrencia de VRA en esta población de animales puede explicar la posibilidad de dispersión de cepas virales, ya que existe una proximidad a la población humana, además de las características biológicas de estas especies que pueden representar fuentes importantes de virus gastroenternos, junto con el hecho de que todos los animales fueron asintomáticos para la diarrea. Las aves silvestres tienen una capacidad de vuelo ilimitada, fueron capturadas en una región de interfaz entre el peridomicilo y los fragmentos forestales y se cree que esta región no ha sido influenciada por actividades antrópicas como las observadas en el área del presente estudio. Por otro lado, el método de cría de aves de corral y caninos cercanos a los hogares y al ecosistema forestal, tal como se crean en las comunidades estudiadas, probablemente facilita el contacto directo con posibles fuentes de contaminación, ya que en las zonas el uso de tanques sépticos es deficiente y a veces inexistente, lo que puede facilitar o incluso aumentar el riesgo de dispersión viral en todo el medio ambiente. Las altas tasas de aumento y el análisis del uso del suelo en las zonas investigadas pueden ser indicadores importantes de cómo interactúan estos animales, ya que con la deforestación, las poblaciones de animales silvestres buscan refugio en comunidades cercanas facilitando la dispersión de agentes infecciosos y la posible ocurrencia de A nuestro conocimiento, este es el primer estudio en el que se aplicó un ensayo PCR en tiempo real para la detección de RVA involucrando una amplia variedad de animales domésticos y salvajes, facilitando la utilidad práctica en estudios epidemiológicos y moleculares y ayudando en una perspectiva en la elaboración de control sanitario y monitoreo, evitando posibles brotes en las comunidades estudiadas. La detección de animales positivos fue útil para monitorear la infección del agente en la población animal y para proporcionar una señal de alerta temprana para predecir una epidemia inminente y un riesgo favorable para la población humana, dada la evidencia de la circulación de RVA en los diferentes fragmentos forestales. Además, el ensayo RT-qPCR puede ser una alternativa útil para el diagnóstico diferencial de RV en posibles infecciones mixtas que coexistan clínicamente indistinguibles como las causadas por otras cepas virales que causan gastroenteritis tales como: astrovirus, coronavirus, picobirnavirus, calicivirus, entre otros, como se observó en los estudios de Jing et al. [60] y Waruhiu et al. [61]. La diarrea asociada a infecciones por VRA en cerdos es una causa importante de aumento de la mortalidad y pérdidas económicas en Europa. Los genotipos más prevalentes aislados de heces de lechones diarreicos y no diarreicos belgas en 2012 [62] demuestran una amplia gama de combinaciones de genotipos G / P incluyendo; G3P [6], G4P [6], G5P [6], G4P [7], G5P [7], G9P [7], G9P [13] y G9P [23]. Por otro lado, en el presente estudio fue posible detectar sólo el genotipo P [6], ya que la mayoría de las muestras eran asintomáticas para la diarrea. El hallazgo muestra que diferentes genotipos P de cepas RVA interactúan con antígenos histológicos distintos del grupo sanguíneo (HBGA, ABOH, Lewis) y ácidos siálicos vía VP4 proporcionando una visión de la prevalencia regional y un aumento del potencial zoonótico de algunos El genotipo P [6] fue identificado en lechones en Brasil [64] y en Italia y Japón, parecido al genotipo P [6] humano [65, 66]. En la población de animales estudiados, la transmisión zoonótica puede ser frecuente, ya que los animales viven en contacto con humanos y en condiciones sanitarias precarias. En Brasil, este genotipo fue descrito en poblaciones animales y humanas en estudios de Luchs y otros [32] ; Honma y otros [67] ; Araújo y otros [68] ; Mascarenhas y otros [69] y Lorenzetti y otros [70] tales estudios corroboran la importancia de seguir monitoreando los genotipos para verificar si surgen cepas poco comunes o nuevas cepas y pueden infectar poblaciones animales o transmisiones interespecíficas.En cuanto al genotipo P [4], fue más detectado en nuestras muestras en murciélagos, perros, Este genotipo no es común en animales, siendo más detectados en muestras humanas y ambientales en diversas partes del mundo e incluyendo a nuestra región [71]. Es importante destacar que los indicadores de contaminación ambiental en Brasil son significativos y contribuyen a la posibilidad de transmisión humano-animal [71]. Estos datos requieren investigación adicional en trabajos posteriores para caracterizar mejor la transmisión interespecífica, ya que la ocurrencia de virus entéricos en diferentes matrices demuestra el impacto antropogénico de la población expuesta alrededor y señala el riesgo potencial de infección por la posible exposición de individuos susceptibles. Nuestros hallazgos pueden ser útiles para el seguimiento de la contaminación fecal en el ambiente utilizando animales como posibles fuentes, minimizando así el riesgo de infección por exposición a individuos susceptibles, en este caso diferentes especies animales o incluso poblaciones humanas. RVA fueron detectados en animales silvestres y domésticos utilizando un ensayo RT-qPCR que analizó muestras que tenían baja carga viral para RVA. Aunque las muestras son asintomáticas para la diarrea, es necesario llevar a cabo estrategias para el monitoreo y control de los animales en las áreas estudiadas en la población humana, así como en otras especies de animales, así como la implementación de medidas preventivas dirigidas a futuros brotes en comunidades animales de la población residente en estas áreas impactadas. Por lo tanto, el presente estudio no tiene precedentes en la región y en el país en relación con la investigación del VRA en animales silvestres. Cabe destacar que, aunque la calidad de las muestras analizadas se caracteriza por una baja carga viral detectable, la técnica presentó una buena respuesta analítica en la detección de los animales de origen para el VRA, facilitando la selección de las muestras para futuras pruebas de caracterización genética.

¿Qué proteínas no estructurales son codificadas por Rotavirus?

Rotavirus A en animales silvestres y domésticos de zonas con degradación ambiental en la Amazonía brasileñahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6298726/SHA: f3c309c596c20f48f493b77e714ce957d8777bcbAutores: de Barros, Bruno de Cássio Veloso; Chagas, Elaine Nunes; Bezerra, Luna Wanessa; Ribeiro, Laila Graziela; Duarte Júnior, Jose Wandilson Barboza; Pereira, Diego; da Penha Junior, Edvaldo Tavares; Silva, Julia Rezende; Bezerra, Delana Andreza Melo; Bandeira, Renato Silva; Pinheiro, Helder Henrique Costa; Guerra, Sylvia de Fátima dos Santos Los animales domésticos y principalmente silvestres como murciélagos, pequeños roedores y aves son animales altamente diversificados en relación a sus hábitats y nichos ecológicos y están ampliamente distribuidos geográficamente en ambientes de fragmentación forestal en algunas zonas de la Amazonía, siendo consideradas fuentes importantes de virus que afectan a los seres humanos y otros animales. Debido a las actividades antrópicas, estos animales cambiaron su hábitat natural y se adaptaron a entornos urbanizados, representando así riesgos para la salud humana y animal. Aunque el conocimiento de la diversidad global de virus entéricos es escaso, existen informes que demuestran la detección de rotavirus en animales domésticos y animales de sistemas productivos, como bovinos y cerdos. El presente estudio investigó la prevalencia del Rotavirus A en 648 muestras fecales de diferentes especies animales de la mesoregión noreste del estado de Pará, Brasil, que se caracteriza por ser un área urbanizada con fragmentos forestales. Los especímenes fecales fueron recolectados de octubre de 2014 a abril de 2016 y sometidos a una Reacción en Cadena de Polimerasa en Tiempo Real Cualitativa (RT-qPCR), utilizando el gen NSP3 como objetivo. Se observó que el 27,5% (178/648) de las muestras presentaron resultados positivos para la VRA, con 178 muestras distribuidas en aves (23,6%), caninos (21,35%), quiropteros (17,98%), bovinos (14,6%), caballos (8,43%), pequeños roedores (6,74%), cerdos (3,93%) y felinos (3,37%), demostrando la circulación de la VRA en animales domésticos y sugiriendo que tal proximidad podría causar transmisiones entre diferentes especies y la ocurrencia de reordenamientos en el genoma de la VRA ya descrito en la literatura, asociados a las trazas de degradación ambiental en las áreas estudiadas. Texto: Las enfermedades infecciosas emergentes y reemergentes están aumentando cada año en varios países, con un impacto tanto en las poblaciones humanas como en los animales domésticos y silvestres que viven en áreas con restos forestales considerables [1]. La mayoría de estas enfermedades son de origen viral, lo que sugiere la aparición y reaparición de virus que son desencadenados por actividades humanas que modifican el medio ambiente [2]. Las poblaciones de animales silvestres que habitan fragmentos forestales son grupos estratégicos para estudios de salud pública y transmisión de zoonosis, dado que actúan como indicadores en la asistencia e intervención en las poblaciones humanas, con el objetivo de prevenir brotes y epidemias [3]. La gastroenteritis aguda puede ser causada por infección en el tracto gastrointestinal, causada por diferentes agentes infecciosos o parásitos [4] [5] [6] [7]. Representan una de las principales causas de mortalidad en humanos y en animales jóvenes, contando con alrededor del 25% de mortalidad [8]. El rotavirus se distribuye ampliamente en los animales, que actúan como fuentes de cepas emergentes del rotavirus, con estos animales actuando en la transmisión entre especies y por medio del reasociamiento que conduce a la aparición de nuevas cepas que han sido reportadas en infecciones humanas [9] [10] [11] [12]. El rotavirus (RV) pertenece a la familia Reoviridae y comprende nueve especies conocidas como Rotavirus grupo A a I, con una propuesta reciente de la especie J [13, 14]. El rotavirus A (RVA) está muy extendido en todo el mundo y afecta predominantemente a seres humanos, bovinos y otras especies de mamíferos, así como a aves [15]. Tienen un genoma de ácido ribonucleico de doble cadena (dsRNA), dividido en 11 segmentos de codificación para proteínas estructurales (VP1-VP4, VP6 y VP7) y proteínas no estructurales (NSP1-NSP5/NSP6 Hay registros de una estrecha relación entre la fauna y flora amazónicas y las poblaciones humanas [18], y esta interacción es el efecto de las actividades de urbanización antropogénica que resultan en la deforestación de zonas forestales, causando la degradación de sitios previamente aislados como cuevas y pequeñas cuevas, un proceso continuo y progresivo de la naturaleza que ha llevado no sólo a cambios en los hábitats de la fauna y flora silvestres, sino también a una mayor relación con las poblaciones humanas en entornos rurales y urbanos, contribuyendo a la aparición y aparición de enfermedades diferentes de las que normalmente ocurren en regiones endémicas [19] [20] [22]. Aunque los resultados del VRA ya se han descrito globalmente [12, [23] [25] [26] [28] [30], en Brasil, la ocurrencia, diversidad y papel del rotavirus en estos animales todavía están poco estudiados, teniendo en cuenta el gran número de especies presentes [4, [31 En la Amazonía brasileña, especialmente en el estado de Pará, las mesoregiones metropolitanas de Belém y Nordeste son algunas de las zonas con mayor índice de cambios ambientales [35], que se concentran, junto con el hecho de que el conocimiento de la diversidad global del virus entérico en animales es escaso [36]. Por lo tanto, es importante monitorear la salud de los animales domésticos y silvestres en su hábitat natural, especialmente en áreas con alteraciones antrópicas que tienen una interfaz con comunidades rurales y empresas, para investigar la ocurrencia de VRA en esta población. Estas comunidades son ecológicamente complejas, ya que cuentan con múltiples hospedadores y patógenos sin fin que eventualmente pueden circular en centros urbanos contiguos, además de que también debe considerarse que todavía no existen estudios que demuestren la importancia de estos virus que infectan a esta población, ya que en el contexto de la vigilancia epidemiológica, estos animales se vuelven importantes, ya que pueden ser considerados como fuentes naturales, con la posibilidad de transmisión a los seres humanos [37] [38]. La reacción cualitativa en cadena de la polimerasa en tiempo real (qRT-PCR) utilizó el gen NSP3 y la sonda TaqMan de una región altamente conservada de la proteína no estructural del rotavirus 3 (NSP3), que se utilizó previamente en muestras de origen humano y con bajas cargas virales Los datos de precipitación se obtuvieron del Instituto Nacional Brasileño de Meteorología (Inmethttp://www.inmet.gov.br/) para los años de captura en el Acuerdo Expedito Ribeiro (2014) y Açailândia (2015) de las Plataformas de Recolección de Datos (PCD) de Belém, ubicado a 50 km de Santa Bárbara do Pará, y Tracuateua, ubicado a 50 km de Peixe-Boi y a 100 km de Viseu. Los límites municipales se obtuvieron en el sitio web del Instituto Brasileño de Geografía y Estadística (IBGE) (http://www.ibge.gov.br/) y los datos sobre deforestación y uso de la tierra se obtuvieron de los proyectos PRODES [43] y TerraClass [44]. PRODES cuenta con datos anuales en formato digital desde 2000 y TerraClass presenta datos semestrales desde 2004. La imagen satelital se generó utilizando el sensor Sentinel 2 de la Agencia Espacial Europea (ESA) (https://sentinel.esa.int/web/sentinel/user-guides/sentinel-2-msi) con licencia CC-BY de acceso abierto (http://open.esa.int/) de los años 2017 y 2018. Todos los datos obtenidos se almacenaron en una base de datos geográficos (BDG). El BDG fue importado/almacenado en un SIG para la edición de los elementos gráficos, el establecimiento de relaciones topológicas entre los elementos y sus atributos respectivos, el análisis espacial y la visualización del resultado a través de mapas temáticos. Para el presente estudio, se eligieron fragmentos forestales de tamaño, forma y fisiología similar, considerando una matriz periurbana abierta con uso de suelo similar. Los fragmentos seleccionados fueron distribuidos dentro de las mesoregiones estudiadas, y en cada fragmento seleccionado muestras fecales fueron recolectadas aleatoriamente de animales domésticos y salvajes [45]. Se obtuvieron clases de uso de suelo del mosaico de datos TerraClass de 2004 a 2016, ya que los sitios de estudio se encontraban en un área con alta presencia de nubes, lo que impidió la observación (el área no se observó).El procesamiento de datos, interpretación, visualización y análisis espacial se realizaron en el software ArcGIS (http://www.arcgis Para el análisis de los datos relacionados con la determinación de la riqueza, composición y abundancia de la fauna de los animales estudiados en el área de estudio, considerando los métodos de recolección adoptados y las especies disponibles en cada ciudad, cada muestra fue considerada como una muestra independiente. La riqueza de la fauna silvestre y animales domésticos fue determinada por el número total de especies incluyendo todos los métodos de recolección, y la similitud de las especies fue realizada por el análisis chi-cuadrado entre las muestras de los diferentes tratamientos con la ayuda del software EstimatS 8.0 [46]. Para el cálculo del Test T, se utilizó el software Statistica, y se calcularon los índices de animales infectados en los dos ambientes (fragmento forestal y peridomicil) para cada tratamiento muestreado por área de recolección, utilizando el software Past 1.92. Apuntando a comparar los valores de los índices de diversidad a través del test emparejado, así como el análisis descriptivo Los datos obtenidos para la ocurrencia de la VRA y los cuestionarios fueron insertados en una base de datos para un análisis descriptivo del perfil epidemiológico de la población animal en los tres ecosistemas forestales estudiados.En este análisis se realizaron tratamientos estadísticos descriptivos, utilizando tablas de tipo "columnas de surco" personalizadas, referidas a los datos, con el fin de caracterizar la muestra y cuantificar los resultados mediante valores de frecuencia absoluta utilizando la prueba chi-cuadrado y la prueba T.Population estudio, recolección de especímenes clínicos y metodología de laboratorio.Los animales voladores (aves silvestres y quiroptera) fueron capturados mediante redes de niebla que se abrieron al amanecer (4:00 a.m.) y cerraron por la mañana (9:00 a.m.) y fueron inspeccionados cada hora hasta el cierre, con un esfuerzo de muestreo de 15 días.Esta investigación fue aprobada por National All procedimientos con animales fueron realizados por veterinarios, siendo aves Los especímenes fecales fueron recolectados por estimulación de la ampolla rectal con el uso de un "Zaragatoa", envasados en viales criogénicos, identificados, almacenados en nitrógeno líquido, y posteriormente enviados al Laboratorio. Los animales salvajes (pequeños mamíferos no voladores) fueron atrapados en trampas de contención en vivo de la jaula Tomahawk (tamaño 45x16x16cm) y de aluminio tipo Sherman (tamaño 30x9x8cm). En cada parcela de muestra, se distribuyeron 61 trampas, 20 Shermans y 41 Tomahawks siendo cebos con una mezcla hecha con pasta de maní, sardinas, aceite de hígado de bacalao y harina de maíz, así como frutas como plátano, manzana y piña. Todas las trampas utilizadas fueron inspeccionadas diariamente por la mañana, los cebos fueron intercambiados cuando era necesario y más tarde después de la captura en bolsas de tela y Los animales silvestres fueron sedados con una combinación de ketamina 20mg/kg y xilazina 2mg/kg intramuscularmente y posteriormente, eutanasiados con sobredosis anestésica de lidocaína al 2% en el foramen magnum, de acuerdo con la recomendación del Consejo Nacional para el Control de la Experimentación Animal (CONCEA). De octubre de 2014 a abril de 2016, se recolectaron 1.282 muestras fecales de animales silvestres y domésticos, de las cuales 648 (50,5%) fueron seleccionadas aleatoriamente para investigación RVA y manejadas en Laboratorio de Bioseguridad de Nivel Tres (NB3). El genoma viral fue extraído mediante el protocolo TRIZOL LS REAGENT (INVITRO-GEN, USA/KIT QIAGEN), siguiendo las recomendaciones del fabricante, con menor adaptación según el protocolo descrito en los datos complementarios. [40] para la detección de RVA utilizando el segmento NSP3 de RVA como secuencia génica diana. El ensayo se llevó a cabo en una mezcla que contenía: RNAse-free H 2 O, TaqMan RT-PCR Mix (2x), TAqMan RT Enzyme Mix (40x), imprimaciones para el gen NSP3, Primer NSP3 Forward (20mM), Primer NSP3 Inverso (20mM), sonda NSP3 S (10nm), Plantilla (ARN) 3μL, con un volumen de reacción total de 17μL y ciclo de transcripción inversa de 50°C, 30 minutos, desnaturalización de 95°C, 10 minutos, recocido de 45 ciclos de 95°C, 15 segundos y extensión de 60°C, 1 minuto. Los análisis se consideraron positivos al presentar el umbral de ciclo (TC) 40. Para garantizar un resultado de prueba fiable, las mediciones del control de la contaminación se realizaron con el uso de control animal positivo (prototipo SA11) y un control negativo (agua de úlcera). Todas las muestras positivas de RVA fueron sometidas a reacción en cadena de la transcripción inversa-polimerasa (RT-PCR) de acuerdo con Mijatovic et al [41] para genotipar muestras de bajas cargas virales. La primera ronda fue realizada con imprimaciones de consenso N-VP4F1/N-VP4R1 y la Nested-PCR fue realizada con imprimaciones N-VP4F2/N-VP4R2 para amplificar el gen VP4. Los amplificadores fueron purificados y secuenciados para el gen VP4 usando los mismos imprimadores de Nested-PCR. Las secuencias fueron recolectadas de un secuenciador automático ABI Prism 3130xl ADN Los fragmentos de secuencia fueron ensamblados y editados utilizando la plataforma de software Geneious Bioinformática v.8.1.7. Posteriormente, los datos fueron comparados con otras secuencias de la base de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica GenBank utilizando la herramienta de alineación BLAST para dilucidar el genotipo RVA de las muestras. De octubre de 2014 a abril de 2016, un total de 648 muestras fecales de animales silvestres y domésticos pertenecientes a tres áreas de fragmentos forestales fueron probadas para el gen NSP3 por QPCR cualitativo, y 178 (27,5%) fueron positivas para RVA, distribuidas entre las especies: aves (23,6%), caninos (21,35%), murciélagos (17,98%), bovinos (14,6%), caballos (8,43%), pequeños roedores (6,74%), cerdos (3,93%) y felinos (3,37%). 47 Fue posible detectar cepas virales en todos los géneros de animales estudiados y en el período de recolección ninguno de los animales mostró signos de infección aguda y/o diarrea. Rotavirus A (RVA) detectados en el presente estudio de animales silvestres y domésticos pertenecientes a las tres áreas del fragmento forestal, según la Fig. 2. En relación a los bovinos evaluados, sólo en la ciudad de Viseu, estas especies fueron estudiadas porque fueron creadas extensamente. Además, la mayoría de los animales eran jóvenes con edades que variaban de 1 día a 8 años, antecedentes de vacunación deficiente, falta de asistencia técnica y criados en forma de subsistencia. Los animales no mostraron síntomas de diarrea, solo bajo rendimiento de peso y mal estado de manejo sanitario. En relación a la quiroptera, se distribuyeron 32 (17,98%) muestras positivas de RVA entre las especies de Carollia perspicillata, con 12 (37,5%) siendo todas adultas, 9 (28,12%) muestras de Desmodus rotundus (4 jóvenes y 5 adultos), 5 (15,6%) de Uroderma bilobata (15,62%), 3 (9,37%) de Artibeus lituratus y las especies Artibeus Planirostus, Diaemus iyoug y Glossophagina con 1 (3,12%) cada una. Estos animales procedían de áreas de fragmentos forestales ubicadas cerca de granjas de bovinos y equinos, además de habitar pequeñas granjas de pollos. La figura 3 muestra los resultados obtenidos para todas las especies de animales investigadas en el fragmento forestal así como en la zona del peridomicillus. Las variables antrópicas fueron analizadas para las tres ciudades estudiadas, así como el uso del suelo dentro del rango de los animales, obedeciendo el domicilio, el peridomicil y el fragmento forestal donde se capturaron las trampas de pequeños roedores, aves y diversas especies de animales (Fig 4 y Fig 5). Considerando los factores relacionados con las actividades antrópicas en las tres áreas estudiadas dentro de las tres ciudades del presente estudio, se observó que la ciudad de Santa Bárbara es la que tiene una mejor área de bosque preservado y la ciudad de Viseu una área más pequeña. Sin embargo, en la ciudad de Santa Bárbara se observó una mayor concentración de ocupaciones alrededor del área de fragmento forestal. Se observó en esta zona escogida de la ciudad, la presencia de diferentes familias viviendo en un asentamiento rural, sobreviviendo de la explotación de los recursos forestales y la creación de pequeños animales de subsistencia, como aves de corral y piscicultura, así como productos agrícolas familiares. La cría de animales en pastos nativos sólo se observó en las ciudades de Peixe Boi y Viseu. Se practicó una extensa ganadería con ganado vacuno, equinos para trabajo y pequeños animales (porcinos y cabras). En relación con la zona de pastos más conservada, la ciudad de Peixe Boi tuvo la mayor superficie, según los datos mostrados en la Figura 5, sin embargo, en la ciudad de Viseu se observó una mayor regeneración en los pastos durante el período del estudio, con significativa vegetación secundaria. Al comparar los climas de las tres áreas se observó que el clima predominante es megatermal y húmedo con temperatura media anual alrededor de Los meses de octubre, noviembre y diciembre son los más calurosos, con temperaturas entre 32°C y 34°C y máximos absolutos alrededor de 41°C. Las precipitaciones anuales son bastante altas, generalmente alrededor de 2.350 mm, pero fuertemente concentradas de enero a junio (80%). De septiembre a diciembre, por el contrario, las precipitaciones son raras, alrededor del 7%, con una corta estación seca, de déficit de agua moderado en esos meses. La humedad relativa del aire promedio oscila alrededor del 85%, como se muestra en la figura 6 [48]. La descripción de la precipitación acumulada en el año de captura de los especímenes fecales en comparación con las Normales Climatológicas (CLINO) para el período 1961-1990 de los PCD más cercanos a las localidades del Expedito Ribeiro / Santa Bárbara (Belém PCD), Vila Ananim / Peixe-Boi y Açaiteua / Viseu (Tracauateua PCD) muestran la frecuencia de lluvias en las regiones, lo que facilita la renovación de los pastos y la regeneración de los bosques impactados, siendo un indicador importante de la reducción de los daños causados por la deforestación en la región. El índice medio de deforestación en las tres áreas de estudio se calculó a partir de los datos obtenidos de los sistemas de información del INPE. Se observó que en los años de 2013 a 2014 no hubo cambios en estas regiones; en el período de 2014 a 2015 alrededor del 4,1% de la ciudad de Viseu fue cambiada y el 1,6% de la ciudad de Peixe Boi. En relación con el período de 2016, se observaron grandes cambios en Peixe Boi (79%) y en la ciudad de Viseu (70%), demostrando así que los cambios en el ecosistema natural pueden estar asociados con las frecuencias de VRA en las áreas estudiadas, según la Fig 7. Al evaluar a los animales infectados en relación a los animales no infectados tanto en el fragmento del bosque como en el peridomicilo, considerando como animales del bosque fragmentan a las aves, se obtuvieron la quiroptera y los pequeños roedores y como animales del peridomicilo los caninos, bovinos, cerdos, felinos y caballos, un porcentaje de 37,07% infectados por animales domésticos (86/232) y 22,12 % infectados por animales fragmentados del bosque (92/416). Aplicando el análisis estadístico seleccionado, se obtuvo un valor de Pearson x2 Chi-cuadrado: 16,7159, df = 1 y p < 0,001, lo que significa que la hipótesis fue corroborada, es decir, cuanto mayor sea la degradación del medio ambiente, más probable será la búsqueda de alimentos por animales silvestres en áreas adyacentes, o en el borde del bosque o incluso en la región peridomiciliaria. En este sentido, se debe considerar la posibilidad de contagio con otras especies de animales, incluso humanos, debido a la capacidad del rotavirus para ser transmitido por vía fecal/ oral o por contacto directo con el medio ambiente. Es importante señalar que los animales detectados en este estudio son fuentes importantes de cepas virales. Se seleccionaron, reextractaron y analizaron un total de 80 muestras de heces utilizando PCR para el gen VP4. Ocho cepas (10%) fueron positivas para el gen VP4, siendo 2 cepas despojadas del genotipo P [6] y 6 al tipo P[4], según el presente estudio, se detectó la presencia de VRA circulando en el 27,5% de los animales; 36% en animales domésticos y 64% en animales silvestres, proporcionando un conjunto de datos único con qRT-PCR detectando una baja carga viral de VRA en diferentes especies, lo que además se correlaciona con el índice de deforestación Estos datos son importantes debido a la falta de pruebas para el diagnóstico del VRA en animales, ya que los métodos actuales de detección del VRA no siempre se detectan en estas poblaciones [8]. Con el advenimiento de la RCP en tiempo real (QPCR), hubo un crecimiento exponencial, en comparación con los ensayos convencionales del RPR, ya que su precisión, sensibilidad y especificidad superiores son notables, y es Rotavirus A en animales silvestres y domésticos posible detectar el VRA en una variedad de especies animales utilizando el gen NSP3 [49]. La sensibilidad del RT-qPCR mejoró significativamente la tasa de detección del VRA en muestras clínicas de animales y en este contexto, el presente estudio propuso un interesante estudio métricas utilizando el virus que se propaga en animales silvestres que habitan fragmentos forestales para indicar intervenciones de población humana, con el objetivo de prevenir los brotes de virus apalancados en las características geográficas únicas de Brasil y su En la actualidad, no se han descrito datos en la literatura sobre la detección de RVA utilizando la técnica qPCR en tiempo real en una amplia variedad de especies animales silvestres. Sin embargo, un estudio de Soltan et al. [50] realizado con caballos y bovinos detectó RVA por RT-PCR, RT-PCR comercial y RT-qPCR en 36,7%, 51,4% y 56,9% respectivamente, de manera diferente al presente estudio que mostró mayor positividad para los quiropteros (17,98%), caninos (21,35%), aves (23,6%) y ganado (14,6%). La primera descripción de RVA en quiroptera se registró en heces de Eidolon helvum capturadas en Vihiga, Kenia [51]. Posteriormente, varias cepas de RVA fueron detectadas por diferentes técnicas moleculares que involucraban a quiroptera, en varios países, incluyendo Kenia (E. helvum), China (Rhinolophus hipposideros y Aselliscus stoliczkanus), Francia (Myotis mystacinus), Camerún (E. helvum) y Brasil [31, [51] [53] [53] [54]. El presente estudio muestra la ocurrencia de RVA en el 17,98% de las quiropteras, estando entre las especies Carollia perspicillata (37,5%), Desmodus rotundus (28,12%), Uroderma bilobata (15,6%), Artibeus lituratus (9,37%), Artibeus Planirostus (3,12%), Diaemus iyoug y Glossofagina (3 [56] informó que Desmodus rotundus es una de las tres especies hematófagas de la familia Phyllostomidae, encontrada en toda América del Sur, América Central y México. De las quiropteras positivas para RVA en el presente estudio, una prevalencia de 28,12% fue de Desmodus rotundus. Esta especie se alimenta de aves, puede alimentarse de mamíferos, en su mayoría de tamaño medio o grande, facilitando la diseminación de esporas virales entre la comunidad dentro del hábitat, como se observa en el presente estudio. Estos hallazgos muestran la importancia de los datos epidemiológicos sobre las especies estudiadas debido a la falta de estudios que involucren especies de quiroptera neotropical, y no es posible establecer parámetros comparativos para estos animales. Respecto a la circulación de RVA en caninos y aves, la prevalencia fue del 53% y 29%, respectivamente. Aunque en la región amazónica existen registros de RVA, RVD, RVF y RVG que infectan a las aves [57] [58] y RVD en aves migratorias [59], todos fueron detectados mediante ensayos RT-PCR de manera diferente al presente estudio que detectaron el RVA por RT-qPCR involucrando una variedad de especies animales. Por otro lado, la prevalencia en felinos (16%) y cerdos (22%) fue menor, probablemente porque hay pocos animales de estas especies en la región, así como pocas creaciones. El estudio detectó la presencia de RVA en diferentes especies de animales tanto en áreas cercanas al hogar como en áreas ubicadas en fragmentos de bosque, caracterizadas como restos forestales, ya que se encontraban en ciudades que sufrieron un alto impacto ambiental debido al extractivismo vegetal, la formación de pastos para la cría de ganado, la explotación de recursos naturales y reflejos directos sobre los hábitats de animales silvestres que pueden servir como fuentes víricas, facilitando así la dispersión de RVA entre comunidades de animales coexistentes. Cabe destacar que estos animales tienen mayor contacto con las poblaciones humanas de las áreas estudiadas ya que cohabitan con los humanos de la región, además de tener un alto flujo de movimiento entre los extractos forestales y ambientes elegidos para el presente estudio. Sin embargo, cabe destacar que sólo en las comunidades de Santa Bárbara y Viseu se recogieron especímenes fecales de humanos asintomáticos para diarrea y se probaron para RVA, pero todos La fragmentación del bosque genera muchas consecuencias sobre la biota amazónica, pudiendo alterar la diversidad y la composición de las comunidades animales en los fragmentos e incluso interferir en los procesos ecológicos, sin considerar que los fragmentos de bosque en la Amazonía están influenciados por el clima, lo que posiblemente facilita la dispersión de patógenos por el medio ambiente, ya que los animales silvestres detectados en el presente estudio son asintomáticos y tienen baja carga viral para la VRA. La ocurrencia de VRA en esta población de animales puede explicar la posibilidad de dispersión de cepas virales, ya que existe una proximidad a la población humana, además de las características biológicas de estas especies que pueden representar fuentes importantes de virus gastroenternos, junto con el hecho de que todos los animales fueron asintomáticos para la diarrea. Las aves silvestres tienen una capacidad de vuelo ilimitada, fueron capturadas en una región de interfaz entre el peridomicilo y los fragmentos forestales y se cree que esta región no ha sido influenciada por actividades antrópicas como las observadas en el área del presente estudio. Por otro lado, el método de cría de aves de corral y caninos cercanos a los hogares y al ecosistema forestal, tal como se crean en las comunidades estudiadas, probablemente facilita el contacto directo con posibles fuentes de contaminación, ya que en las zonas el uso de tanques sépticos es deficiente y a veces inexistente, lo que puede facilitar o incluso aumentar el riesgo de dispersión viral en todo el medio ambiente. Las altas tasas de aumento y el análisis del uso del suelo en las zonas investigadas pueden ser indicadores importantes de cómo interactúan estos animales, ya que con la deforestación, las poblaciones de animales silvestres buscan refugio en comunidades cercanas facilitando la dispersión de agentes infecciosos y la posible ocurrencia de A nuestro conocimiento, este es el primer estudio en el que se aplicó un ensayo de PCR en tiempo real para la detección de RVA involucrando una amplia variedad de animales domésticos y salvajes, facilitando la utilidad práctica en estudios epidemiológicos y moleculares y ayudando en una perspectiva en la elaboración de control sanitario y monitoreo, previniendo posibles brotes en las comunidades estudiadas. La detección de animales positivos fue útil para monitorear la infección del agente en la población animal y proporcionar una señal de alerta temprana para predecir una epidemia inminente y un riesgo favorable para la población humana, dada la evidencia de la circulación de RVA en los diferentes fragmentos forestales. Además, el ensayo RT-qPCR puede ser una alternativa útil para el diagnóstico diferencial de RV en posibles infecciones mixtas que coexistan clínicamente indistinguibles como las causadas por otras cepas virales que causan gastroenteritis tales como: astrovirus, coronavirus, picobirnavirus, calicivirus, entre otros, como se observó en los estudios de Jing et al. [60] y Waruhiu et al. [61]. La diarrea asociada a infecciones por VRA en cerdos es una causa importante de aumento de la mortalidad y pérdidas económicas en Europa. Los genotipos más prevalentes aislados de heces de lechones diarreicos y no diarreicos belgas en 2012 [62] demuestran una amplia gama de combinaciones de genotipos G / P incluyendo; G3P [6], G4P [6], G5P [6], G4P [7], G5P [7], G9P [7], G9P [13] y G9P [23]. Por otro lado, en el presente estudio fue posible detectar sólo el genotipo P [6], ya que la mayoría de las muestras eran asintomáticas para la diarrea. El hallazgo muestra que diferentes genotipos P de cepas RVA interactúan con antígenos histológicos distintos del grupo sanguíneo (HBGA, ABOH, Lewis) y ácidos siálicos vía VP4 proporcionando una visión de la prevalencia regional y un aumento del potencial zoonótico de algunos El genotipo P [6] fue identificado en lechones en Brasil [64] y en Italia y Japón, parecido al genotipo P [6] humano [65, 66]. En la población de animales estudiados, la transmisión zoonótica puede ser frecuente, ya que los animales viven en contacto con humanos y en condiciones sanitarias precarias. En Brasil, este genotipo fue descrito en poblaciones animales y humanas en estudios de Luchs y otros [32] ; Honma y otros [67] ; Araújo y otros [68] ; Mascarenhas y otros [69] y Lorenzetti y otros [70] tales estudios corroboran la importancia de seguir monitoreando los genotipos para verificar si surgen cepas poco comunes o nuevas cepas y pueden infectar poblaciones animales o transmisiones interespecíficas.En cuanto al genotipo P [4], fue más detectado en nuestras muestras en murciélagos, perros, Este genotipo no es común en animales, siendo más detectados en muestras humanas y ambientales en diversas partes del mundo e incluyendo a nuestra región [71]. Es importante destacar que los indicadores de contaminación ambiental en Brasil son significativos y contribuyen a la posibilidad de transmisión humano-animal [71]. Estos datos requieren investigación adicional en trabajos posteriores para caracterizar mejor la transmisión interespecífica, ya que la ocurrencia de virus entéricos en diferentes matrices demuestra el impacto antropogénico de la población expuesta alrededor y señala el riesgo potencial de infección por la posible exposición de individuos susceptibles. Nuestros hallazgos pueden ser útiles para el seguimiento de la contaminación fecal en el ambiente utilizando animales como posibles fuentes, minimizando así el riesgo de infección por exposición a individuos susceptibles, en este caso diferentes especies animales o incluso poblaciones humanas. RVA fueron detectados en animales silvestres y domésticos utilizando un ensayo RT-qPCR que analizó muestras que tenían baja carga viral para RVA. Aunque las muestras son asintomáticas para la diarrea, es necesario llevar a cabo estrategias para el monitoreo y control de los animales en las áreas estudiadas en la población humana, así como en otras especies de animales, así como la implementación de medidas preventivas dirigidas a futuros brotes en comunidades animales de la población residente en estas áreas impactadas. Por lo tanto, el presente estudio no tiene precedentes en la región y en el país en relación con la investigación del VRA en animales silvestres. Cabe destacar que, aunque la calidad de las muestras analizadas se caracteriza por una baja carga viral detectable, la técnica presentó una buena respuesta analítica en la detección de los animales de origen para el VRA, facilitando la selección de las muestras para futuras pruebas de caracterización genética.

¿Qué es qRT-PCR?

Método de optimización para pronosticar casos confirmados de COVID-19 en Chinahttps://doi.org/10.3390/jcm9030674SHA: 1d7f8850c5244fdc9b387038e7eeae9bbbbde6d2Autores: Al-Qaness, Mohammed A. A.; Ewees, Ahmed A.; Fan, Hong; Abd El Aziz, MohamedFecha: 2020DOI: 10.3390/jcm9030674Licencia: cc-byAbstract: En diciembre de 2019, un nuevo coronavirus, llamado COVID-19, fue descubierto en Wuhan, China, y se ha extendido a diferentes ciudades de China, así como a otros 24 países. El número de casos confirmados está aumentando diariamente y llegó a 34.598 el 8 de febrero de 2020. En el presente estudio, presentamos un nuevo modelo de pronóstico para estimar y pronosticar el número de casos confirmados de COVID-19 en los próximos diez días, basado en los casos previamente confirmados registrados en China. El modelo propuesto es un sistema de inferencia neuro-fuzzy adaptable mejorado (ANFIS) utilizando un algoritmo de polinización de flores mejorado (FPA) utilizando el algoritmo de enjambre de salp (SSA). En general, SSA se emplea para mejorar el FPA para evitar sus inconvenientes (es decir, quedar atrapado en la optima local). La idea principal del modelo propuesto, llamado FPASSA-ANFIS, es mejorar el rendimiento del ANFIS mediante la determinación de los parámetros del ANFIS utilizando FPASSA. El modelo FPASSA-ANFIS se evalúa utilizando los datos oficiales de la Organización Mundial de la Salud (OMS) del brote del COVID-19 para predecir los casos Más aún, el modelo FPASSA-ANFIS se compara con varios modelos existentes, y mostró un mejor rendimiento en términos de Error del porcentaje absoluto medio (MAPE), Error relativo cuadrado medio de la raíz (RMSRE), Error relativo cuadrado medio de la raíz (RMSRE), coeficiente de determinación ( R 2) y tiempo de computación. Además, probamos el modelo propuesto utilizando dos conjuntos de datos diferentes de casos confirmados de gripe semanal en dos países, a saber, EE.UU. y China. Los resultados también mostraron buenos resultados. Texto: Una gran familia de virus, llamados coronavirus, son patógenos severos para los seres humanos, que infectan enfermedades respiratorias, hepáticas, gastrointestinales y neurológicas. Se distribuyen entre humanos, aves, ganado, ratones, murciélagos y otros animales salvajes [1] [2] [3]. Los brotes de dos coronavirus anteriores, SARS-CoV y MERS-CoV en 2003 y 2012, respectivamente, han aprobado la transmisión de animales a animales y humanos a humanos [4]. En diciembre de 2019, la Organización Mundial de la Salud (OMS) recibió notificaciones de China para muchos casos de enfermedades respiratorias que estaban relacionadas con algunas personas que habían visitado un mercado de mariscos en Wuhan [5]. Actualmente, la ciudad de Wuhan sufre de la propagación de un nuevo coronavirus, llamado COVID-19 (anteriormente, se llamaba 2019-nCoV). En [6], los autores concluyeron que COVID-19 probablemente se originó en murciélagos, porque es más similar a dos cepas de coronavirus derivadas de murciélagos. Sin embargo, la fuente del COVID-19 no está confirmada todavía, y sus comunidades, Hong Kong y Toronto, fueron 1,2 y 1.32, respectivamente. Ong et al. [20] propuso un modelo de monitoreo y pronóstico para la gripe A (H1N1-2009). Además, Nah et al. [21] propusieron un modelo basado en la probabilidad para predecir la propagación del MERS. El Sistema de Inferencia Neuro Fuzzy Adaptativo (ANFIS) [22] se aplica ampliamente en la predicción de series temporales y problemas de pronóstico, y mostró un buen rendimiento en muchas aplicaciones existentes. Ofrece flexibilidad para determinar la no linealidad en los datos de las series temporales, así como para combinar las propiedades de las redes neuronales artificiales (ANN) y los sistemas lógicos borrosos. Se ha aplicado en diversas aplicaciones de pronóstico, por ejemplo, en [23], se propuso un modelo de pronóstico de precios de existencias utilizando ANFIS y descomposición del modo empírico. Chen et al. [24] propusieron un modelo de pronóstico de series temporales TAIEX basado en un híbrido de ANFIS y promedio ponderado ordenado ( En [25], se presentó otro método de pronóstico de series temporales para los precios de la electricidad basado en ANFIS. Svalina y otros [26] propusieron un modelo de pronóstico basado en ANFIS para índices de precios cercanos para un mercado de valores durante cinco días. Ekici y Aksoy [27] presentaron un modelo de pronóstico del consumo de energía en edificios basado en ANFIS. Más aún, ANFIS también se aplica para predecir cargas eléctricas [28]. Kumar y otros [29] propusieron un modelo basado en ANFIS para pronosticar productos de retorno. Ho y Tsai [30] aplicaron ANFIS para pronosticar el rendimiento del desarrollo del producto. Sin embargo, estimar los parámetros de ANFIS es un reto que debe mejorarse. Por lo tanto, en estudios anteriores se han aplicado algunos métodos de inteligencia enjambres individuales (SI) a los parámetros de ANFIS para mejorar Los métodos SI incluyen la optimización del enjambre de partículas (PSO) [31, 32], la optimización del aspersor social [33], el algoritmo sine-cosine (SCA) [34], y el optimizador multiverso (MVO) [35]. Por ejemplo, en [34] se aplicó el algoritmo SCA para mejorar el modelo ANFIS para pronosticar el consumo de petróleo en tres países, a saber, Canadá, Alemania y Japón. En el mismo contexto, en [35], el algoritmo MVO se utilizó para mejorar el modelo ANFIS para pronosticar el consumo de petróleo en dos países. Además, en [36] se utilizó el PSO con ANFIS para predecir el rendimiento del biocarburante. Sin embargo, los algoritmos SI individuales pueden almacenarse en optima local. Por lo tanto, una solución es aplicar algoritmos SI híbridos para evitar este problema. En [37], se presentó un híbrido de dos algoritmos SI, a saber, GA y SSA, para mejorar el modelo ANFIS. Se aplicó el nuevo modelo propuesto llamado GA-SSA-ANFIS para predecir los precios del crudo para los datos de las series temporales a largo plazo. Sin embargo, los métodos mencionados anteriormente sufren algunas limitaciones que pueden afectar el rendimiento de la producción de pronósticos, como la lenta convergencia y la capacidad de equilibrar entre las fases de exploración y explotación pueden influir en la calidad de la producción final. Esto nos motivó a proponer un método de pronóstico alternativo dependiente del concepto de hibridación. Este concepto evita las limitaciones de las técnicas tradicionales de SI combinando las fortalezas de diferentes técnicas, y produce nuevas técnicas de SI que son mejores que las tradicionales. En el estudio actual, proponemos un modelo ANFIS mejorado basado en un algoritmo de polinización de flores modificado (FPA) utilizando el algoritmo de enjambre El FPA es un algoritmo de optimización propuesto por Yang [38], que se inspiró en el proceso de polinización de flujo de las plantas de floración. El FPA fue empleado en varias aplicaciones de optimización, por ejemplo para estimar el parámetro solar PV [39, 40], resolviendo rompecabezas sudoku [42], selección de características [42], diseño de antena [43], y otras aplicaciones [44] [45] [46] [47]. Además, SSA es también un algoritmo de optimización propuesto por Mirjali et al. [48] inspirado en el comportamiento de las cadenas de salp. En los últimos años, el SSA fue utilizado para resolver diferentes problemas de optimización, como la selección de características [49, 50], clasificación de datos [51], segmentación de imágenes [52], y otros [53, 54]. El método propuesto llamado FPASSA es un híbrido de FPA y SSA, en el que se aplica el SSA como método de búsqueda local para FPA. La propuesta de FPASSA comienza por recibir el conjunto de datos históricos COVID-19. Luego se genera un conjunto de soluciones donde cada una de ellas representa el valor para los parámetros del modelo ANFIS. Entonces la calidad de cada solución se calcula utilizando el valor de aptitud, y la solución que tiene el mejor valor de aptitud se elige para representar la mejor solución. Luego se calcula la probabilidad de cada solución. Luego se actualiza la solución actual, ya sea utilizando la estrategia global o local en FPA. Sin embargo, en el caso de la estrategia local, los operadores de SSA o FPA se utilizarán según la probabilidad del valor de aptitud para cada solución. El proceso de actualización de las soluciones se repite hasta llegar a la condición de parada, y se utilizan las mejores configuraciones Los principales puntos de contribución del presente estudio son los siguientes:1. Proponemos un modelo de pronóstico eficiente para predecir los casos confirmados del COVID-19 en China para los próximos diez días basados en casos confirmados previamente. Se propone un modelo ANFIS mejorado utilizando un algoritmo FPA modificado, utilizando SSA. Comparamos el modelo propuesto con el ANFIS original y los modelos ANFIS modificados existentes, como PSO, GA, ABC y FPA. El resto de este estudio se organiza de la siguiente manera. Los preliminares de ANFIS, FPA y SSA se describen en la Sección 2. La Sección 3 presenta la propuesta FPASSA, y la Sección 4 presenta la configuración experimental y los resultados. Concluimos este estudio en la Sección 5. Los principios del ANFIS se dan en esta sección. El modelo ANFIS vincula la lógica difusa y las redes neuronales [22]. Genera un mapeo entre la entrada y la salida mediante la aplicación de reglas IF-THEN (también se llama modelo de inferencia Takagi-Sugeno). La Figura 1 ilustra el modelo ANFIS donde, y y x definen las entradas a la Capa 1 mientras que, O 1i es su salida de nodo i que se calcula de la siguiente manera:donde μ denota las funciones generalizadas de membresía gaussiana. A i y B i definen los valores de membresía de μ. α i y La salida de la Capa 2 (también se conoce como la fuerza de disparo de una regla) se calcula de la siguiente manera:Mientras tanto, la salida de la Capa 3 (también se conoce como la fuerza de disparo normalizada) se calcula de la siguiente manera:La salida de la Capa 4 (también se conoce como un nodo adaptativo) se calcula de la siguiente manera:donde r i, q i y p i definen los parámetros consiguientes del nodo i. La Capa 5 contiene sólo un nodo; su salida se calcula como:El algoritmo de polinización de flores es un método de optimización propuesto por Yang [38]. Simula la transferencia de polen de flores por polinizadores en la naturaleza.Este algoritmo utiliza los dos tipos de polinización (es decir, auto-polación y polinización cruzada).En la auto-polación, la polinización ocurre sin polinizadores, mientras que en la polin En más detalle, la polinización se puede representar como una polinización local, mientras que la polinización cruzada se puede llamar polinización global. La polinización global o polinización cruzada se puede formar matemáticamente de la siguiente manera:donde x t i define el polen i en iteración t. L denota la fuerza de la polinización o el tamaño del escalón. F * es la posición objetivo o la mejor solución.En algunos casos, los insectos pueden volar con diferentes pasos de distancia durante un espacio largo; por lo tanto, la distribución de la mosca Levy se aplica para simular este movimiento.donde x t i y x k i representan polenes de diferentes flores en la misma planta. en el rango [0,1] El proceso de polinización se puede hacer usando polinización cruzada o autopolinización. Por lo tanto, la variable aleatoria p, en el rango [0,1], se utiliza para determinar este proceso. SSA es una técnica de optimización introducida por [48]. Simula el comportamiento de las Salps en la naturaleza. Este comportamiento se llama cadena salp. El modelo matemático de SSA comienza por férula su población en un grupo de líderes y grupos de seguidores. El líder es la salp frontal, mientras que, los seguidores son las otras salps. El espacio de búsqueda se determina en n-dimensiones con n variables. Ecuación (10) trabaja para actualizar las posiciones de las salps. donde x 1 j denota la posición del líder en j-th dimension. F j es la posición objetivo. ub j y lb j representan los límites máximo y min, respectivamente c 2 y c 3 denotan números aleatorios en [0, 1]. c 1 es un parámetro importante; se equilibra entre las fases de exploración y explotación. Se calcula de la siguiente manera:donde el número de bucle actual es t y el número de bucle máximo es t max. Entonces, la posición de los seguidores se actualiza de la siguiente manera:donde x i j define la posición i-ésima del seguidor en la dimensión j-th. i > 1. Esta sección explica el método propuesto de FPASSA-ANFIS. Es un método de series temporales para predecir los casos confirmados del COVID-19, como se indica en la Figura 2. El FPASSA-ANFIS utiliza el FPA mejorado para entrenar el modelo ANFIS optimizando sus parámetros. El FPASSA-ANFIS contiene cinco capas como el modelo clásico de ANFIS. La capa 1 contiene las variables de entrada ( En la fase de aprendizaje, se utiliza el FPASSA para seleccionar los mejores pesos entre la Capa 4 y la Capa 5. El FPASSA-ANFIS comienza por formatear los datos de entrada en forma de serie temporal. En nuestro caso, se consideró la función de autocorrelación (ACF). ACF es uno de los métodos aplicados para encontrar patrones en los datos; presenta información sobre la correlación entre puntos separados por varios lapsos de tiempo. Por lo tanto, en este artículo se consideran las variables con ACF mayores de 0,2, es decir, 5-lags. Además, los datos de entrenamiento contienen el 75% de los conjuntos de datos, mientras que los datos de prueba contienen el 25% de ellos. El número de clusters se define por el método fuzzy c-mean (FCM) para construir el modelo ANFIS. Los parámetros del modelo ANFIS son preparados por el algoritmo FPASSA. En la fase de entrenamiento, el error de cálculo (como en la Ecuación (13)) entre los datos reales y los datos predichos se utiliza para evaluar la calidad de los parámetros. donde T es los datos reales, y P es los datos predichos. N s es la longitud de la muestra. Los valores más pequeños de la función objetiva indican el parámetro bueno de ANFIS. Por otro lado, se aplica la fase de actualización de las posiciones de los seguidores en el algoritmo SSA para mejorar la fase de polinización global en el algoritmo FPA. En esta mejora, hay una variable aleatoria (r) utilizada para cambiar entre ambas fases. Si se utiliza r > 0,5, entonces se utilizan los operadores del SSA; de lo contrario, se utilizan los operadores del FPA. En general, el FPASS comienza por construir la población (X); después, se calcula la función objetiva para cada solución. La solución con Esta secuencia se repite hasta cumplir con la condición de parada, que en este artículo es el número máximo de iteraciones. Luego se pasa la mejor solución para entrenar los parámetros del modelo ANFIS. Después de terminar la fase de entrenamiento, la fase de prueba se inicia con la mejor solución para calcular la salida final. El rendimiento del método propuesto se evalúa comparando los datos reales con los datos predichos utilizando las medidas de rendimiento. Finalmente, el FPASS produce un valor anticipado para casos confirmados de COVID-19 en China en el día siguiente. Los pasos de la FPASSA propuesta se presentan en Algoritmo 1. Entrada: Conjunto histórico de datos COVID-19, tamaño de la población N, número total de iteraciones t max. Divide los datos en conjuntos de entrenamiento y pruebas. Utilizando el método de c-media fuzzy para determinar el número de funciones de membresía. Construyendo la red ANFIS. Devolver la mejor solución que representa la mejor configuración para ANFIS. Aplicar el conjunto de pruebas al mejor modelo ANFIS. Previsionar el COVID-19 para los próximos diez días. Esta sección presenta la descripción del conjunto de datos usados, las medidas de rendimiento, la configuración de parámetros para todos los métodos, los resultados del experimento y las discusiones. El conjunto de datos principales de este estudio es el conjunto de datos COVID-19. Se recogió del sitio web de la OMS (https: //www.who.int/emergencias/enfermedad/novel-coronavirus-2019/situación-reports/). Contiene los casos confirmados diariamente en China del 21 de enero de 2020 al 18 de febrero de 2020, como se muestra en la Tabla 1. Utilizamos el 75% del conjunto de datos para entrenar el modelo mientras que el resto se utiliza para probarlo. Además, evaluamos el rendimiento del El primero se llama DS1; fue recolectado de los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC) (https://www.cdc.gov/flu/weekly/). Comienza a partir de la semana número 40 en 2015 y continúa hasta la semana número 6 en 2020. Mientras que el segundo se llama DS2. Se recogió del sitio web de la OMS (https://www.who.int/influenza). Contiene los datos de casos confirmados de gripe semanal en China desde la semana número 1 en 2016 hasta la semana número 8 en 2020. La calidad del método propuesto se evalúa utilizando un conjunto de métricas de rendimiento como sigue:• Error cuadrado medio raíz (RMSE): donde Yp y Y son los valores predichos y originales, respectivamente. • Error absoluto medio (MAE):• Error porcentual medio (MAPE):• Error relativo cuadrado medio raíz (RMSRE): s representa el tamaño • Coeficiente de Determinación (R 2): donde Y representa la media de Y. El valor más bajo de RMSE, MAE, MAPE y RMSRE se refiere al mejor método. El valor más alto de R 2 indica una mejor correlación para el método. Este artículo tiene como objetivo evaluar la capacidad de la FPASSA para predecir el COVID-19 comparando su desempeño con otros métodos, a saber, el ANFIS y los modelos entrenados de ANFIS utilizando PSO, GA, ABC, AFPA y FPASSA. El ajuste de parámetros para estos modelos se enumera en la Tabla 2. Los parámetros comunes, como el tamaño de la población, se establecen en 25 y 100 iteraciones. Además, cada algoritmo se realiza para 30 carreras independientes a comparaciones justas. Los parámetros seleccionados son elegidos porque produjeron un buen comportamiento en experimentos anteriores, tales como [34, 35, 55, 56] Parámetros AjusteMax. épocas = 100, Objetivo de error = 0, Paso inicial = 0,01, Disminución de la tasa = 0,9, Tasa de aumento = 1. En esta sección se discute el desempeño de la propuesta de FSASA para predecir el DS1 y DS2. Se puede concluir a partir de la Tabla 3 que el rendimiento de FSASA superó a los métodos comparados en todas las medidas, mientras que el FPA se clasifica en segundo lugar. Los resultados de DS2 indican que el FPASS se clasifica en primer lugar en términos de RMSE, MAPE, R 2 y el tiempo de CPU. Mientras que, el PSO se clasifica en segundo lugar, seguido por el FPA, GA, entonces ABC. Estos resultados denotan que el método propuesto puede optimizar los parámetros del modelo ANFIS de manera efectiva y producir buenos resultados en términos de las medidas de desempeño. Resultados de comparación entre Se puede concluir que el FCASSA supera a otros modelos, por ejemplo, analizando los resultados de RMSE, MAE, MAPE, RMSRE y tiempo(s) de CPU, se puede observar que el FCASSA alcanza el menor valor entre los algoritmos de comparación, y esto indica la alta calidad del FCASSA. Mientras tanto, el FPA asigna el segundo rango, lo que proporciona mejores resultados que el resto de los métodos. Además, el valor de R 2 se refiere a la alta correlación entre la predicción obtenida por el método propuesto de FPASSA y el COVID-19 original, que tiene casi 0,97. Esto también se puede notar a partir de la Figura 3, que representa la formación de los algoritmos utilizando los datos históricos del COVID-19 así como sus valores de pronóstico para diez días. En el cuadro 5 se muestra el valor de previsión de los casos confirmados del COVID-19 en China de 19/2/2020 a 28/2/2020. De estos resultados, se puede observar que el brote alcanzará su nivel más alto el día 28/2/2020. El porcentaje medio del aumento durante el período previsto es del 10%, el porcentaje más alto es del 12% el 28/2/2020, y el porcentaje más bajo es del 8,7% el 19/2/2020. De los resultados anteriores, se puede concluir que el FPASS-ANFIS propuesto tiene una alta capacidad para pronosticar el conjunto de datos del COVID-19. Estos resultados evitan las limitaciones del ANFIS tradicional debido a la combinación con el método modificado del FAP. Además, los operadores del SSA se combinan con la estrategia local del AFP para mejorar su capacidad de explotación. Este artículo propone una versión modificada para el algoritmo de polinización de flores (FPA) utilizando el algoritmo de enjambre de salp (SSA). Esta versión modificada, llamada FPASSA, se aplica para mejorar el rendimiento del ANFIS a través de la determinación del valor óptimo para sus parámetros. El modelo desarrollado de FPASSA-ANFIS se aplica como una técnica de pronóstico para un coronavirus nuevo, llamado COVID-19, que fue descubierto en Wuhan, China a finales del año pasado y enero del año actual. El modelo propuesto de FPASSA-ANFIS tiene una alta capacidad para predecir el número de casos confirmados en diez días. Además, FPASSA-ANFIS supera a otros modelos de pronóstico en términos de RMSE, MAE, MAPE, RMSRE y R 2. Además, para evaluar el método propuesto se utilizaron dos conjuntos de datos de casos confirmados semanalmente de gripe en EE.UU. y China, y los resultados de la evaluación mostraron su buen desempeño.De acuerdo con los prometedores resultados obtenidos por la propuesta FPASSA-ANFIS, se puede aplicar en diferentes aplicaciones de pronóstico.

¿Dónde se descubrió el coronavirus?

Método de optimización para pronosticar casos confirmados de COVID-19 en Chinahttps://doi.org/10.3390/jcm9030674SHA: 1d7f8850c5244fdc9b387038e7eeae9bbbbde6d2Autores: Al-Qaness, Mohammed A. A.; Ewees, Ahmed A.; Fan, Hong; Abd El Aziz, MohamedFecha: 2020DOI: 10.3390/jcm9030674Licencia: cc-byAbstract: En diciembre de 2019, un nuevo coronavirus, llamado COVID-19, fue descubierto en Wuhan, China, y se ha extendido a diferentes ciudades de China, así como a otros 24 países. El número de casos confirmados está aumentando diariamente y llegó a 34.598 el 8 de febrero de 2020. En el presente estudio, presentamos un nuevo modelo de pronóstico para estimar y pronosticar el número de casos confirmados de COVID-19 en los próximos diez días, basado en los casos previamente confirmados registrados en China. El modelo propuesto es un sistema de inferencia neuro-fuzzy adaptable mejorado (ANFIS) utilizando un algoritmo de polinización de flores mejorado (FPA) utilizando el algoritmo de enjambre de salp (SSA). En general, SSA se emplea para mejorar el FPA para evitar sus inconvenientes (es decir, quedar atrapado en la optima local). La idea principal del modelo propuesto, llamado FPASSA-ANFIS, es mejorar el rendimiento del ANFIS mediante la determinación de los parámetros del ANFIS utilizando FPASSA. El modelo FPASSA-ANFIS se evalúa utilizando los datos oficiales de la Organización Mundial de la Salud (OMS) del brote del COVID-19 para predecir los casos Más aún, el modelo FPASSA-ANFIS se compara con varios modelos existentes, y mostró un mejor rendimiento en términos de Error del porcentaje absoluto medio (MAPE), Error relativo cuadrado medio de la raíz (RMSRE), Error relativo cuadrado medio de la raíz (RMSRE), coeficiente de determinación ( R 2) y tiempo de computación. Además, probamos el modelo propuesto utilizando dos conjuntos de datos diferentes de casos confirmados de gripe semanal en dos países, a saber, EE.UU. y China. Los resultados también mostraron buenos resultados. Texto: Una gran familia de virus, llamados coronavirus, son patógenos severos para los seres humanos, que infectan enfermedades respiratorias, hepáticas, gastrointestinales y neurológicas. Se distribuyen entre humanos, aves, ganado, ratones, murciélagos y otros animales salvajes [1] [2] [3]. Los brotes de dos coronavirus anteriores, SARS-CoV y MERS-CoV en 2003 y 2012, respectivamente, han aprobado la transmisión de animales a animales y humanos a humanos [4]. En diciembre de 2019, la Organización Mundial de la Salud (OMS) recibió notificaciones de China para muchos casos de enfermedades respiratorias que estaban relacionadas con algunas personas que habían visitado un mercado de mariscos en Wuhan [5]. Actualmente, la ciudad de Wuhan sufre de la propagación de un nuevo coronavirus, llamado COVID-19 (anteriormente, se llamaba 2019-nCoV). En [6], los autores concluyeron que COVID-19 probablemente se originó en murciélagos, porque es más similar a dos cepas de coronavirus derivadas de murciélagos. Sin embargo, la fuente del COVID-19 no está confirmada todavía, y sus comunidades, Hong Kong y Toronto, fueron 1,2 y 1.32, respectivamente. Ong et al. [20] propuso un modelo de monitoreo y pronóstico para la gripe A (H1N1-2009). Además, Nah et al. [21] propusieron un modelo basado en la probabilidad para predecir la propagación del MERS. El Sistema de Inferencia Neuro Fuzzy Adaptativo (ANFIS) [22] se aplica ampliamente en la predicción de series temporales y problemas de pronóstico, y mostró un buen rendimiento en muchas aplicaciones existentes. Ofrece flexibilidad para determinar la no linealidad en los datos de las series temporales, así como para combinar las propiedades de las redes neuronales artificiales (ANN) y los sistemas lógicos borrosos. Se ha aplicado en diversas aplicaciones de pronóstico, por ejemplo, en [23], se propuso un modelo de pronóstico de precios de existencias utilizando ANFIS y descomposición del modo empírico. Chen et al. [24] propusieron un modelo de pronóstico de series temporales TAIEX basado en un híbrido de ANFIS y promedio ponderado ordenado ( En [25], se presentó otro método de pronóstico de series temporales para los precios de la electricidad basado en ANFIS. Svalina y otros [26] propusieron un modelo de pronóstico basado en ANFIS para índices de precios cercanos para un mercado de valores durante cinco días. Ekici y Aksoy [27] presentaron un modelo de pronóstico del consumo de energía en edificios basado en ANFIS. Más aún, ANFIS también se aplica para predecir cargas eléctricas [28]. Kumar y otros [29] propusieron un modelo basado en ANFIS para pronosticar productos de retorno. Ho y Tsai [30] aplicaron ANFIS para pronosticar el rendimiento del desarrollo del producto. Sin embargo, estimar los parámetros de ANFIS es un reto que debe mejorarse. Por lo tanto, en estudios anteriores se han aplicado algunos métodos de inteligencia enjambres individuales (SI) a los parámetros de ANFIS para mejorar Los métodos SI incluyen la optimización del enjambre de partículas (PSO) [31, 32], la optimización del aspersor social [33], el algoritmo sine-cosine (SCA) [34], y el optimizador multiverso (MVO) [35]. Por ejemplo, en [34] se aplicó el algoritmo SCA para mejorar el modelo ANFIS para pronosticar el consumo de petróleo en tres países, a saber, Canadá, Alemania y Japón. En el mismo contexto, en [35], el algoritmo MVO se utilizó para mejorar el modelo ANFIS para pronosticar el consumo de petróleo en dos países. Además, en [36] se utilizó el PSO con ANFIS para predecir el rendimiento del biocarburante. Sin embargo, los algoritmos SI individuales pueden almacenarse en optima local. Por lo tanto, una solución es aplicar algoritmos SI híbridos para evitar este problema. En [37], se presentó un híbrido de dos algoritmos SI, a saber, GA y SSA, para mejorar el modelo ANFIS. Se aplicó el nuevo modelo propuesto llamado GA-SSA-ANFIS para predecir los precios del crudo para los datos de las series temporales a largo plazo. Sin embargo, los métodos mencionados anteriormente sufren algunas limitaciones que pueden afectar el rendimiento de la producción de pronósticos, como la lenta convergencia y la capacidad de equilibrar entre las fases de exploración y explotación pueden influir en la calidad de la producción final. Esto nos motivó a proponer un método de pronóstico alternativo dependiente del concepto de hibridación. Este concepto evita las limitaciones de las técnicas tradicionales de SI combinando las fortalezas de diferentes técnicas, y produce nuevas técnicas de SI que son mejores que las tradicionales. En el estudio actual, proponemos un modelo ANFIS mejorado basado en un algoritmo de polinización de flores modificado (FPA) utilizando el algoritmo de enjambre El FPA es un algoritmo de optimización propuesto por Yang [38], que se inspiró en el proceso de polinización de flujo de las plantas de floración. El FPA fue empleado en varias aplicaciones de optimización, por ejemplo para estimar el parámetro solar PV [39, 40], resolviendo rompecabezas sudoku [42], selección de características [42], diseño de antena [43], y otras aplicaciones [44] [45] [46] [47]. Además, SSA es también un algoritmo de optimización propuesto por Mirjali et al. [48] inspirado en el comportamiento de las cadenas de salp. En los últimos años, el SSA fue utilizado para resolver diferentes problemas de optimización, como la selección de características [49, 50], clasificación de datos [51], segmentación de imágenes [52], y otros [53, 54]. El método propuesto llamado FPASSA es un híbrido de FPA y SSA, en el que se aplica el SSA como método de búsqueda local para FPA. La propuesta de FPASSA comienza por recibir el conjunto de datos históricos COVID-19. Luego se genera un conjunto de soluciones donde cada una de ellas representa el valor para los parámetros del modelo ANFIS. Entonces la calidad de cada solución se calcula utilizando el valor de aptitud, y la solución que tiene el mejor valor de aptitud se elige para representar la mejor solución. Luego se calcula la probabilidad de cada solución. Luego se actualiza la solución actual, ya sea utilizando la estrategia global o local en FPA. Sin embargo, en el caso de la estrategia local, los operadores de SSA o FPA se utilizarán según la probabilidad del valor de aptitud para cada solución. El proceso de actualización de las soluciones se repite hasta llegar a la condición de parada, y se utilizan las mejores configuraciones Los principales puntos de contribución del presente estudio son los siguientes:1. Proponemos un modelo de pronóstico eficiente para predecir los casos confirmados del COVID-19 en China para los próximos diez días basados en casos confirmados previamente. Se propone un modelo ANFIS mejorado utilizando un algoritmo FPA modificado, utilizando SSA. Comparamos el modelo propuesto con el ANFIS original y los modelos ANFIS modificados existentes, como PSO, GA, ABC y FPA. El resto de este estudio se organiza de la siguiente manera. Los preliminares de ANFIS, FPA y SSA se describen en la Sección 2. La Sección 3 presenta la propuesta FPASSA, y la Sección 4 presenta la configuración experimental y los resultados. Concluimos este estudio en la Sección 5. Los principios del ANFIS se dan en esta sección. El modelo ANFIS vincula la lógica difusa y las redes neuronales [22]. Genera un mapeo entre la entrada y la salida mediante la aplicación de reglas IF-THEN (también se llama modelo de inferencia Takagi-Sugeno). La Figura 1 ilustra el modelo ANFIS donde, y y x definen las entradas a la Capa 1 mientras que, O 1i es su salida de nodo i que se calcula de la siguiente manera:donde μ denota las funciones generalizadas de membresía gaussiana. A i y B i definen los valores de membresía de μ. α i y La salida de la Capa 2 (también se conoce como la fuerza de disparo de una regla) se calcula de la siguiente manera:Mientras tanto, la salida de la Capa 3 (también se conoce como la fuerza de disparo normalizada) se calcula de la siguiente manera:La salida de la Capa 4 (también se conoce como un nodo adaptativo) se calcula de la siguiente manera:donde r i, q i y p i definen los parámetros consiguientes del nodo i. La Capa 5 contiene sólo un nodo; su salida se calcula como:El algoritmo de polinización de flores es un método de optimización propuesto por Yang [38]. Simula la transferencia de polen de flores por polinizadores en la naturaleza.Este algoritmo utiliza los dos tipos de polinización (es decir, auto-polación y polinización cruzada).En la auto-polación, la polinización ocurre sin polinizadores, mientras que en la polin En más detalle, la polinización se puede representar como una polinización local, mientras que la polinización cruzada se puede llamar polinización global. La polinización global o polinización cruzada se puede formar matemáticamente de la siguiente manera:donde x t i define el polen i en iteración t. L denota la fuerza de la polinización o el tamaño del escalón. F * es la posición objetivo o la mejor solución.En algunos casos, los insectos pueden volar con diferentes pasos de distancia durante un espacio largo; por lo tanto, la distribución de la mosca Levy se aplica para simular este movimiento.donde x t i y x k i representan polenes de diferentes flores en la misma planta. en el rango [0,1] El proceso de polinización se puede hacer usando polinización cruzada o autopolinización. Por lo tanto, la variable aleatoria p, en el rango [0,1], se utiliza para determinar este proceso. SSA es una técnica de optimización introducida por [48]. Simula el comportamiento de las Salps en la naturaleza. Este comportamiento se llama cadena salp. El modelo matemático de SSA comienza por férula su población en un grupo de líderes y grupos de seguidores. El líder es la salp frontal, mientras que, los seguidores son las otras salps. El espacio de búsqueda se determina en n-dimensiones con n variables. Ecuación (10) trabaja para actualizar las posiciones de las salps. donde x 1 j denota la posición del líder en j-th dimension. F j es la posición objetivo. ub j y lb j representan los límites máximo y min, respectivamente c 2 y c 3 denotan números aleatorios en [0, 1]. c 1 es un parámetro importante; se equilibra entre las fases de exploración y explotación. Se calcula de la siguiente manera:donde el número de bucle actual es t y el número de bucle máximo es t max. Entonces, la posición de los seguidores se actualiza de la siguiente manera:donde x i j define la posición i-ésima del seguidor en la dimensión j-th. i > 1. Esta sección explica el método propuesto de FPASSA-ANFIS. Es un método de series temporales para predecir los casos confirmados del COVID-19, como se indica en la Figura 2. El FPASSA-ANFIS utiliza el FPA mejorado para entrenar el modelo ANFIS optimizando sus parámetros. El FPASSA-ANFIS contiene cinco capas como el modelo clásico de ANFIS. La capa 1 contiene las variables de entrada ( En la fase de aprendizaje, se utiliza el FPASSA para seleccionar los mejores pesos entre la Capa 4 y la Capa 5. El FPASSA-ANFIS comienza por formatear los datos de entrada en forma de serie temporal. En nuestro caso, se consideró la función de autocorrelación (ACF). ACF es uno de los métodos aplicados para encontrar patrones en los datos; presenta información sobre la correlación entre puntos separados por varios lapsos de tiempo. Por lo tanto, en este artículo se consideran las variables con ACF mayores de 0,2, es decir, 5-lags. Además, los datos de entrenamiento contienen el 75% de los conjuntos de datos, mientras que los datos de prueba contienen el 25% de ellos. El número de clusters se define por el método fuzzy c-mean (FCM) para construir el modelo ANFIS. Los parámetros del modelo ANFIS son preparados por el algoritmo FPASSA. En la fase de entrenamiento, el error de cálculo (como en la Ecuación (13)) entre los datos reales y los datos predichos se utiliza para evaluar la calidad de los parámetros. donde T es los datos reales, y P es los datos predichos. N s es la longitud de la muestra. Los valores más pequeños de la función objetiva indican el parámetro bueno de ANFIS. Por otro lado, se aplica la fase de actualización de las posiciones de los seguidores en el algoritmo SSA para mejorar la fase de polinización global en el algoritmo FPA. En esta mejora, hay una variable aleatoria (r) utilizada para cambiar entre ambas fases. Si se utiliza r > 0,5, entonces se utilizan los operadores del SSA; de lo contrario, se utilizan los operadores del FPA. En general, el FPASS comienza por construir la población (X); después, se calcula la función objetiva para cada solución. La solución con Esta secuencia se repite hasta cumplir con la condición de parada, que en este artículo es el número máximo de iteraciones. Luego se pasa la mejor solución para entrenar los parámetros del modelo ANFIS. Después de terminar la fase de entrenamiento, la fase de prueba se inicia con la mejor solución para calcular la salida final. El rendimiento del método propuesto se evalúa comparando los datos reales con los datos predichos utilizando las medidas de rendimiento. Finalmente, el FPASS produce un valor anticipado para casos confirmados de COVID-19 en China en el día siguiente. Los pasos de la FPASSA propuesta se presentan en Algoritmo 1. Entrada: Conjunto histórico de datos COVID-19, tamaño de la población N, número total de iteraciones t max. Divide los datos en conjuntos de entrenamiento y pruebas. Utilizando el método de c-media fuzzy para determinar el número de funciones de membresía. Construyendo la red ANFIS. Devolver la mejor solución que representa la mejor configuración para ANFIS. Aplicar el conjunto de pruebas al mejor modelo ANFIS. Previsionar el COVID-19 para los próximos diez días. Esta sección presenta la descripción del conjunto de datos usados, las medidas de rendimiento, la configuración de parámetros para todos los métodos, los resultados del experimento y las discusiones. El conjunto de datos principales de este estudio es el conjunto de datos COVID-19. Se recogió del sitio web de la OMS (https: //www.who.int/emergencias/enfermedad/novel-coronavirus-2019/situación-reports/). Contiene los casos confirmados diariamente en China del 21 de enero de 2020 al 18 de febrero de 2020, como se muestra en la Tabla 1. Utilizamos el 75% del conjunto de datos para entrenar el modelo mientras que el resto se utiliza para probarlo. Además, evaluamos el rendimiento del El primero se llama DS1; fue recolectado de los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC) (https://www.cdc.gov/flu/weekly/). Comienza a partir de la semana número 40 en 2015 y continúa hasta la semana número 6 en 2020. Mientras que el segundo se llama DS2. Se recogió del sitio web de la OMS (https://www.who.int/influenza). Contiene los datos de casos confirmados de gripe semanal en China desde la semana número 1 en 2016 hasta la semana número 8 en 2020. La calidad del método propuesto se evalúa utilizando un conjunto de métricas de rendimiento como sigue:• Error cuadrado medio raíz (RMSE): donde Yp y Y son los valores predichos y originales, respectivamente. • Error absoluto medio (MAE):• Error porcentual medio (MAPE):• Error relativo cuadrado medio raíz (RMSRE): s representa el tamaño • Coeficiente de Determinación (R 2): donde Y representa la media de Y. El valor más bajo de RMSE, MAE, MAPE y RMSRE se refiere al mejor método. El valor más alto de R 2 indica una mejor correlación para el método. Este artículo tiene como objetivo evaluar la capacidad de la FPASSA para predecir el COVID-19 comparando su desempeño con otros métodos, a saber, el ANFIS y los modelos entrenados de ANFIS utilizando PSO, GA, ABC, AFPA y FPASSA. El ajuste de parámetros para estos modelos se enumera en la Tabla 2. Los parámetros comunes, como el tamaño de la población, se establecen en 25 y 100 iteraciones. Además, cada algoritmo se realiza para 30 carreras independientes a comparaciones justas. Los parámetros seleccionados son elegidos porque produjeron un buen comportamiento en experimentos anteriores, tales como [34, 35, 55, 56] Parámetros AjusteMax. épocas = 100, Objetivo de error = 0, Paso inicial = 0,01, Disminución de la tasa = 0,9, Tasa de aumento = 1. En esta sección se discute el desempeño de la propuesta de FSASA para predecir el DS1 y DS2. Se puede concluir a partir de la Tabla 3 que el rendimiento de FSASA superó a los métodos comparados en todas las medidas, mientras que el FPA se clasifica en segundo lugar. Los resultados de DS2 indican que el FPASS se clasifica en primer lugar en términos de RMSE, MAPE, R 2 y el tiempo de CPU. Mientras que, el PSO se clasifica en segundo lugar, seguido por el FPA, GA, entonces ABC. Estos resultados denotan que el método propuesto puede optimizar los parámetros del modelo ANFIS de manera efectiva y producir buenos resultados en términos de las medidas de desempeño. Resultados de comparación entre Se puede concluir que el FCASSA supera a otros modelos, por ejemplo, analizando los resultados de RMSE, MAE, MAPE, RMSRE y tiempo(s) de CPU, se puede observar que el FCASSA alcanza el menor valor entre los algoritmos de comparación, y esto indica la alta calidad del FCASSA. Mientras tanto, el FPA asigna el segundo rango, lo que proporciona mejores resultados que el resto de los métodos. Además, el valor de R 2 se refiere a la alta correlación entre la predicción obtenida por el método propuesto de FPASSA y el COVID-19 original, que tiene casi 0,97. Esto también se puede notar a partir de la Figura 3, que representa la formación de los algoritmos utilizando los datos históricos del COVID-19 así como sus valores de pronóstico para diez días. En el cuadro 5 se muestra el valor de previsión de los casos confirmados del COVID-19 en China de 19/2/2020 a 28/2/2020. De estos resultados, se puede observar que el brote alcanzará su nivel más alto el día 28/2/2020. El porcentaje medio del aumento durante el período previsto es del 10%, el porcentaje más alto es del 12% el 28/2/2020, y el porcentaje más bajo es del 8,7% el 19/2/2020. De los resultados anteriores, se puede concluir que el FPASS-ANFIS propuesto tiene una alta capacidad para pronosticar el conjunto de datos del COVID-19. Estos resultados evitan las limitaciones del ANFIS tradicional debido a la combinación con el método modificado del FAP. Además, los operadores del SSA se combinan con la estrategia local del AFP para mejorar su capacidad de explotación. Este artículo propone una versión modificada para el algoritmo de polinización de flores (FPA) utilizando el algoritmo de enjambre de salp (SSA). Esta versión modificada, llamada FPASSA, se aplica para mejorar el rendimiento del ANFIS a través de la determinación del valor óptimo para sus parámetros. El modelo desarrollado de FPASSA-ANFIS se aplica como una técnica de pronóstico para un coronavirus nuevo, llamado COVID-19, que fue descubierto en Wuhan, China a finales del año pasado y enero del año actual. El modelo propuesto de FPASSA-ANFIS tiene una alta capacidad para predecir el número de casos confirmados en diez días. Además, FPASSA-ANFIS supera a otros modelos de pronóstico en términos de RMSE, MAE, MAPE, RMSRE y R 2. Además, para evaluar el método propuesto se utilizaron dos conjuntos de datos de casos confirmados semanalmente de gripe en EE.UU. y China, y los resultados de la evaluación mostraron su buen desempeño.De acuerdo con los prometedores resultados obtenidos por la propuesta FPASSA-ANFIS, se puede aplicar en diferentes aplicaciones de pronóstico.

¿Cuál es el número de casos confirmados alcanzado el 8 de febrero de 2020?

Método de optimización para pronosticar casos confirmados de COVID-19 en Chinahttps://doi.org/10.3390/jcm9030674SHA: 1d7f8850c5244fdc9b387038e7eeae9bbbbde6d2Autores: Al-Qaness, Mohammed A. A.; Ewees, Ahmed A.; Fan, Hong; Abd El Aziz, MohamedFecha: 2020DOI: 10.3390/jcm9030674Licencia: cc-byAbstract: En diciembre de 2019, un nuevo coronavirus, llamado COVID-19, fue descubierto en Wuhan, China, y se ha extendido a diferentes ciudades de China, así como a otros 24 países. El número de casos confirmados está aumentando diariamente y llegó a 34.598 el 8 de febrero de 2020. En el presente estudio, presentamos un nuevo modelo de pronóstico para estimar y pronosticar el número de casos confirmados de COVID-19 en los próximos diez días, basado en los casos previamente confirmados registrados en China. El modelo propuesto es un sistema de inferencia neuro-fuzzy adaptable mejorado (ANFIS) utilizando un algoritmo de polinización de flores mejorado (FPA) utilizando el algoritmo de enjambre de salp (SSA). En general, SSA se emplea para mejorar el FPA para evitar sus inconvenientes (es decir, quedar atrapado en la optima local). La idea principal del modelo propuesto, llamado FPASSA-ANFIS, es mejorar el rendimiento del ANFIS mediante la determinación de los parámetros del ANFIS utilizando FPASSA. El modelo FPASSA-ANFIS se evalúa utilizando los datos oficiales de la Organización Mundial de la Salud (OMS) del brote del COVID-19 para predecir los casos Más aún, el modelo FPASSA-ANFIS se compara con varios modelos existentes, y mostró un mejor rendimiento en términos de Error del porcentaje absoluto medio (MAPE), Error relativo cuadrado medio de la raíz (RMSRE), Error relativo cuadrado medio de la raíz (RMSRE), coeficiente de determinación ( R 2) y tiempo de computación. Además, probamos el modelo propuesto utilizando dos conjuntos de datos diferentes de casos confirmados de gripe semanal en dos países, a saber, EE.UU. y China. Los resultados también mostraron buenos resultados. Texto: Una gran familia de virus, llamados coronavirus, son patógenos severos para los seres humanos, que infectan enfermedades respiratorias, hepáticas, gastrointestinales y neurológicas. Se distribuyen entre humanos, aves, ganado, ratones, murciélagos y otros animales salvajes [1] [2] [3]. Los brotes de dos coronavirus anteriores, SARS-CoV y MERS-CoV en 2003 y 2012, respectivamente, han aprobado la transmisión de animales a animales y humanos a humanos [4]. En diciembre de 2019, la Organización Mundial de la Salud (OMS) recibió notificaciones de China para muchos casos de enfermedades respiratorias que estaban relacionadas con algunas personas que habían visitado un mercado de mariscos en Wuhan [5]. Actualmente, la ciudad de Wuhan sufre de la propagación de un nuevo coronavirus, llamado COVID-19 (anteriormente, se llamaba 2019-nCoV). En [6], los autores concluyeron que COVID-19 probablemente se originó en murciélagos, porque es más similar a dos cepas de coronavirus derivadas de murciélagos. Sin embargo, la fuente del COVID-19 no está confirmada todavía, y sus comunidades, Hong Kong y Toronto, fueron 1,2 y 1.32, respectivamente. Ong et al. [20] propuso un modelo de monitoreo y pronóstico para la gripe A (H1N1-2009). Además, Nah et al. [21] propusieron un modelo basado en la probabilidad para predecir la propagación del MERS. El Sistema de Inferencia Neuro Fuzzy Adaptativo (ANFIS) [22] se aplica ampliamente en la predicción de series temporales y problemas de pronóstico, y mostró un buen rendimiento en muchas aplicaciones existentes. Ofrece flexibilidad para determinar la no linealidad en los datos de las series temporales, así como para combinar las propiedades de las redes neuronales artificiales (ANN) y los sistemas lógicos borrosos. Se ha aplicado en diversas aplicaciones de pronóstico, por ejemplo, en [23], se propuso un modelo de pronóstico de precios de existencias utilizando ANFIS y descomposición del modo empírico. Chen et al. [24] propusieron un modelo de pronóstico de series temporales TAIEX basado en un híbrido de ANFIS y promedio ponderado ordenado ( En [25], se presentó otro método de pronóstico de series temporales para los precios de la electricidad basado en ANFIS. Svalina y otros [26] propusieron un modelo de pronóstico basado en ANFIS para índices de precios cercanos para un mercado de valores durante cinco días. Ekici y Aksoy [27] presentaron un modelo de pronóstico del consumo de energía en edificios basado en ANFIS. Más aún, ANFIS también se aplica para predecir cargas eléctricas [28]. Kumar y otros [29] propusieron un modelo basado en ANFIS para pronosticar productos de retorno. Ho y Tsai [30] aplicaron ANFIS para pronosticar el rendimiento del desarrollo del producto. Sin embargo, estimar los parámetros de ANFIS es un reto que debe mejorarse. Por lo tanto, en estudios anteriores se han aplicado algunos métodos de inteligencia enjambres individuales (SI) a los parámetros de ANFIS para mejorar Los métodos SI incluyen la optimización del enjambre de partículas (PSO) [31, 32], la optimización del aspersor social [33], el algoritmo sine-cosine (SCA) [34], y el optimizador multiverso (MVO) [35]. Por ejemplo, en [34] se aplicó el algoritmo SCA para mejorar el modelo ANFIS para pronosticar el consumo de petróleo en tres países, a saber, Canadá, Alemania y Japón. En el mismo contexto, en [35], el algoritmo MVO se utilizó para mejorar el modelo ANFIS para pronosticar el consumo de petróleo en dos países. Además, en [36] se utilizó el PSO con ANFIS para predecir el rendimiento del biocarburante. Sin embargo, los algoritmos SI individuales pueden almacenarse en optima local. Por lo tanto, una solución es aplicar algoritmos SI híbridos para evitar este problema. En [37], se presentó un híbrido de dos algoritmos SI, a saber, GA y SSA, para mejorar el modelo ANFIS. Se aplicó el nuevo modelo propuesto llamado GA-SSA-ANFIS para predecir los precios del crudo para los datos de las series temporales a largo plazo. Sin embargo, los métodos mencionados anteriormente sufren algunas limitaciones que pueden afectar el rendimiento de la producción de pronósticos, como la lenta convergencia y la capacidad de equilibrar entre las fases de exploración y explotación pueden influir en la calidad de la producción final. Esto nos motivó a proponer un método de pronóstico alternativo dependiente del concepto de hibridación. Este concepto evita las limitaciones de las técnicas tradicionales de SI combinando las fortalezas de diferentes técnicas, y produce nuevas técnicas de SI que son mejores que las tradicionales. En el estudio actual, proponemos un modelo ANFIS mejorado basado en un algoritmo de polinización de flores modificado (FPA) utilizando el algoritmo de enjambre El FPA es un algoritmo de optimización propuesto por Yang [38], que se inspiró en el proceso de polinización de flujo de las plantas de floración. El FPA fue empleado en varias aplicaciones de optimización, por ejemplo para estimar el parámetro solar PV [39, 40], resolviendo rompecabezas sudoku [42], selección de características [42], diseño de antena [43], y otras aplicaciones [44] [45] [46] [47]. Además, SSA es también un algoritmo de optimización propuesto por Mirjali et al. [48] inspirado en el comportamiento de las cadenas de salp. En los últimos años, el SSA fue utilizado para resolver diferentes problemas de optimización, como la selección de características [49, 50], clasificación de datos [51], segmentación de imágenes [52], y otros [53, 54]. El método propuesto llamado FPASSA es un híbrido de FPA y SSA, en el que se aplica el SSA como método de búsqueda local para FPA. La propuesta de FPASSA comienza por recibir el conjunto de datos históricos COVID-19. Luego se genera un conjunto de soluciones donde cada una de ellas representa el valor para los parámetros del modelo ANFIS. Entonces la calidad de cada solución se calcula utilizando el valor de aptitud, y la solución que tiene el mejor valor de aptitud se elige para representar la mejor solución. Luego se calcula la probabilidad de cada solución. Luego se actualiza la solución actual, ya sea utilizando la estrategia global o local en FPA. Sin embargo, en el caso de la estrategia local, los operadores de SSA o FPA se utilizarán según la probabilidad del valor de aptitud para cada solución. El proceso de actualización de las soluciones se repite hasta llegar a la condición de parada, y se utilizan las mejores configuraciones Los principales puntos de contribución del presente estudio son los siguientes:1. Proponemos un modelo de pronóstico eficiente para predecir los casos confirmados del COVID-19 en China para los próximos diez días basados en casos confirmados previamente. Se propone un modelo ANFIS mejorado utilizando un algoritmo FPA modificado, utilizando SSA. Comparamos el modelo propuesto con el ANFIS original y los modelos ANFIS modificados existentes, como PSO, GA, ABC y FPA. El resto de este estudio se organiza de la siguiente manera. Los preliminares de ANFIS, FPA y SSA se describen en la Sección 2. La Sección 3 presenta la propuesta FPASSA, y la Sección 4 presenta la configuración experimental y los resultados. Concluimos este estudio en la Sección 5. Los principios del ANFIS se dan en esta sección. El modelo ANFIS vincula la lógica difusa y las redes neuronales [22]. Genera un mapeo entre la entrada y la salida mediante la aplicación de reglas IF-THEN (también se llama modelo de inferencia Takagi-Sugeno). La Figura 1 ilustra el modelo ANFIS donde, y y x definen las entradas a la Capa 1 mientras que, O 1i es su salida de nodo i que se calcula de la siguiente manera:donde μ denota las funciones generalizadas de membresía gaussiana. A i y B i definen los valores de membresía de μ. α i y La salida de la Capa 2 (también se conoce como la fuerza de disparo de una regla) se calcula de la siguiente manera:Mientras tanto, la salida de la Capa 3 (también se conoce como la fuerza de disparo normalizada) se calcula de la siguiente manera:La salida de la Capa 4 (también se conoce como un nodo adaptativo) se calcula de la siguiente manera:donde r i, q i y p i definen los parámetros consiguientes del nodo i. La Capa 5 contiene sólo un nodo; su salida se calcula como:El algoritmo de polinización de flores es un método de optimización propuesto por Yang [38]. Simula la transferencia de polen de flores por polinizadores en la naturaleza.Este algoritmo utiliza los dos tipos de polinización (es decir, auto-polación y polinización cruzada).En la auto-polación, la polinización ocurre sin polinizadores, mientras que en la polin En más detalle, la polinización se puede representar como una polinización local, mientras que la polinización cruzada se puede llamar polinización global. La polinización global o polinización cruzada se puede formar matemáticamente de la siguiente manera:donde x t i define el polen i en iteración t. L denota la fuerza de la polinización o el tamaño del escalón. F * es la posición objetivo o la mejor solución.En algunos casos, los insectos pueden volar con diferentes pasos de distancia durante un espacio largo; por lo tanto, la distribución de la mosca Levy se aplica para simular este movimiento.donde x t i y x k i representan polenes de diferentes flores en la misma planta. en el rango [0,1] El proceso de polinización se puede hacer usando polinización cruzada o autopolinización. Por lo tanto, la variable aleatoria p, en el rango [0,1], se utiliza para determinar este proceso. SSA es una técnica de optimización introducida por [48]. Simula el comportamiento de las Salps en la naturaleza. Este comportamiento se llama cadena salp. El modelo matemático de SSA comienza por férula su población en un grupo de líderes y grupos de seguidores. El líder es la salp frontal, mientras que, los seguidores son las otras salps. El espacio de búsqueda se determina en n-dimensiones con n variables. Ecuación (10) trabaja para actualizar las posiciones de las salps. donde x 1 j denota la posición del líder en j-th dimension. F j es la posición objetivo. ub j y lb j representan los límites máximo y min, respectivamente c 2 y c 3 denotan números aleatorios en [0, 1]. c 1 es un parámetro importante; se equilibra entre las fases de exploración y explotación. Se calcula de la siguiente manera:donde el número de bucle actual es t y el número de bucle máximo es t max. Entonces, la posición de los seguidores se actualiza de la siguiente manera:donde x i j define la posición i-ésima del seguidor en la dimensión j-th. i > 1. Esta sección explica el método propuesto de FPASSA-ANFIS. Es un método de series temporales para predecir los casos confirmados del COVID-19, como se indica en la Figura 2. El FPASSA-ANFIS utiliza el FPA mejorado para entrenar el modelo ANFIS optimizando sus parámetros. El FPASSA-ANFIS contiene cinco capas como el modelo clásico de ANFIS. La capa 1 contiene las variables de entrada ( En la fase de aprendizaje, se utiliza el FPASSA para seleccionar los mejores pesos entre la Capa 4 y la Capa 5. El FPASSA-ANFIS comienza por formatear los datos de entrada en forma de serie temporal. En nuestro caso, se consideró la función de autocorrelación (ACF). ACF es uno de los métodos aplicados para encontrar patrones en los datos; presenta información sobre la correlación entre puntos separados por varios lapsos de tiempo. Por lo tanto, en este artículo se consideran las variables con ACF mayores de 0,2, es decir, 5-lags. Además, los datos de entrenamiento contienen el 75% de los conjuntos de datos, mientras que los datos de prueba contienen el 25% de ellos. El número de clusters se define por el método fuzzy c-mean (FCM) para construir el modelo ANFIS. Los parámetros del modelo ANFIS son preparados por el algoritmo FPASSA. En la fase de entrenamiento, el error de cálculo (como en la Ecuación (13)) entre los datos reales y los datos predichos se utiliza para evaluar la calidad de los parámetros. donde T es los datos reales, y P es los datos predichos. N s es la longitud de la muestra. Los valores más pequeños de la función objetiva indican el parámetro bueno de ANFIS. Por otro lado, se aplica la fase de actualización de las posiciones de los seguidores en el algoritmo SSA para mejorar la fase de polinización global en el algoritmo FPA. En esta mejora, hay una variable aleatoria (r) utilizada para cambiar entre ambas fases. Si se utiliza r > 0,5, entonces se utilizan los operadores del SSA; de lo contrario, se utilizan los operadores del FPA. En general, el FPASS comienza por construir la población (X); después, se calcula la función objetiva para cada solución. La solución con Esta secuencia se repite hasta cumplir con la condición de parada, que en este artículo es el número máximo de iteraciones. Luego se pasa la mejor solución para entrenar los parámetros del modelo ANFIS. Después de terminar la fase de entrenamiento, la fase de prueba se inicia con la mejor solución para calcular la salida final. El rendimiento del método propuesto se evalúa comparando los datos reales con los datos predichos utilizando las medidas de rendimiento. Finalmente, el FPASS produce un valor anticipado para casos confirmados de COVID-19 en China en el día siguiente. Los pasos de la FPASSA propuesta se presentan en Algoritmo 1. Entrada: Conjunto histórico de datos COVID-19, tamaño de la población N, número total de iteraciones t max. Divide los datos en conjuntos de entrenamiento y pruebas. Utilizando el método de c-media fuzzy para determinar el número de funciones de membresía. Construyendo la red ANFIS. Devolver la mejor solución que representa la mejor configuración para ANFIS. Aplicar el conjunto de pruebas al mejor modelo ANFIS. Previsionar el COVID-19 para los próximos diez días. Esta sección presenta la descripción del conjunto de datos usados, las medidas de rendimiento, la configuración de parámetros para todos los métodos, los resultados del experimento y las discusiones. El conjunto de datos principales de este estudio es el conjunto de datos COVID-19. Se recogió del sitio web de la OMS (https: //www.who.int/emergencias/enfermedad/novel-coronavirus-2019/situación-reports/). Contiene los casos confirmados diariamente en China del 21 de enero de 2020 al 18 de febrero de 2020, como se muestra en la Tabla 1. Utilizamos el 75% del conjunto de datos para entrenar el modelo mientras que el resto se utiliza para probarlo. Además, evaluamos el rendimiento del El primero se llama DS1; fue recolectado de los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC) (https://www.cdc.gov/flu/weekly/). Comienza a partir de la semana número 40 en 2015 y continúa hasta la semana número 6 en 2020. Mientras que el segundo se llama DS2. Se recogió del sitio web de la OMS (https://www.who.int/influenza). Contiene los datos de casos confirmados de gripe semanal en China desde la semana número 1 en 2016 hasta la semana número 8 en 2020. La calidad del método propuesto se evalúa utilizando un conjunto de métricas de rendimiento como sigue:• Error cuadrado medio raíz (RMSE): donde Yp y Y son los valores predichos y originales, respectivamente. • Error absoluto medio (MAE):• Error porcentual medio (MAPE):• Error relativo cuadrado medio raíz (RMSRE): s representa el tamaño • Coeficiente de Determinación (R 2): donde Y representa la media de Y. El valor más bajo de RMSE, MAE, MAPE y RMSRE se refiere al mejor método. El valor más alto de R 2 indica una mejor correlación para el método. Este artículo tiene como objetivo evaluar la capacidad de la FPASSA para predecir el COVID-19 comparando su desempeño con otros métodos, a saber, el ANFIS y los modelos entrenados de ANFIS utilizando PSO, GA, ABC, AFPA y FPASSA. El ajuste de parámetros para estos modelos se enumera en la Tabla 2. Los parámetros comunes, como el tamaño de la población, se establecen en 25 y 100 iteraciones. Además, cada algoritmo se realiza para 30 carreras independientes a comparaciones justas. Los parámetros seleccionados son elegidos porque produjeron un buen comportamiento en experimentos anteriores, tales como [34, 35, 55, 56] Parámetros AjusteMax. épocas = 100, Objetivo de error = 0, Paso inicial = 0,01, Disminución de la tasa = 0,9, Tasa de aumento = 1. En esta sección se discute el desempeño de la propuesta de FSASA para predecir el DS1 y DS2. Se puede concluir a partir de la Tabla 3 que el rendimiento de FSASA superó a los métodos comparados en todas las medidas, mientras que el FPA se clasifica en segundo lugar. Los resultados de DS2 indican que el FPASS se clasifica en primer lugar en términos de RMSE, MAPE, R 2 y el tiempo de CPU. Mientras que, el PSO se clasifica en segundo lugar, seguido por el FPA, GA, entonces ABC. Estos resultados denotan que el método propuesto puede optimizar los parámetros del modelo ANFIS de manera efectiva y producir buenos resultados en términos de las medidas de desempeño. Resultados de comparación entre Se puede concluir que el FCASSA supera a otros modelos, por ejemplo, analizando los resultados de RMSE, MAE, MAPE, RMSRE y tiempo(s) de CPU, se puede observar que el FCASSA alcanza el menor valor entre los algoritmos de comparación, y esto indica la alta calidad del FCASSA. Mientras tanto, el FPA asigna el segundo rango, lo que proporciona mejores resultados que el resto de los métodos. Además, el valor de R 2 se refiere a la alta correlación entre la predicción obtenida por el método propuesto de FPASSA y el COVID-19 original, que tiene casi 0,97. Esto también se puede notar a partir de la Figura 3, que representa la formación de los algoritmos utilizando los datos históricos del COVID-19 así como sus valores de pronóstico para diez días. En el cuadro 5 se muestra el valor de previsión de los casos confirmados del COVID-19 en China de 19/2/2020 a 28/2/2020. De estos resultados, se puede observar que el brote alcanzará su nivel más alto el día 28/2/2020. El porcentaje medio del aumento durante el período previsto es del 10%, el porcentaje más alto es del 12% el 28/2/2020, y el porcentaje más bajo es del 8,7% el 19/2/2020. De los resultados anteriores, se puede concluir que el FPASS-ANFIS propuesto tiene una alta capacidad para pronosticar el conjunto de datos del COVID-19. Estos resultados evitan las limitaciones del ANFIS tradicional debido a la combinación con el método modificado del FAP. Además, los operadores del SSA se combinan con la estrategia local del AFP para mejorar su capacidad de explotación. Este artículo propone una versión modificada para el algoritmo de polinización de flores (FPA) utilizando el algoritmo de enjambre de salp (SSA). Esta versión modificada, llamada FPASSA, se aplica para mejorar el rendimiento del ANFIS a través de la determinación del valor óptimo para sus parámetros. El modelo desarrollado de FPASSA-ANFIS se aplica como una técnica de pronóstico para un coronavirus nuevo, llamado COVID-19, que fue descubierto en Wuhan, China a finales del año pasado y enero del año actual. El modelo propuesto de FPASSA-ANFIS tiene una alta capacidad para predecir el número de casos confirmados en diez días. Además, FPASSA-ANFIS supera a otros modelos de pronóstico en términos de RMSE, MAE, MAPE, RMSRE y R 2. Además, para evaluar el método propuesto se utilizaron dos conjuntos de datos de casos confirmados semanalmente de gripe en EE.UU. y China, y los resultados de la evaluación mostraron su buen desempeño.De acuerdo con los prometedores resultados obtenidos por la propuesta FPASSA-ANFIS, se puede aplicar en diferentes aplicaciones de pronóstico.

¿Cómo se llama el modelo propuesto?

Método de optimización para pronosticar casos confirmados de COVID-19 en Chinahttps://doi.org/10.3390/jcm9030674SHA: 1d7f8850c5244fdc9b387038e7eeae9bbbbde6d2Autores: Al-Qaness, Mohammed A. A.; Ewees, Ahmed A.; Fan, Hong; Abd El Aziz, MohamedFecha: 2020DOI: 10.3390/jcm9030674Licencia: cc-byAbstract: En diciembre de 2019, un nuevo coronavirus, llamado COVID-19, fue descubierto en Wuhan, China, y se ha extendido a diferentes ciudades de China, así como a otros 24 países. El número de casos confirmados está aumentando diariamente y llegó a 34.598 el 8 de febrero de 2020. En el presente estudio, presentamos un nuevo modelo de pronóstico para estimar y pronosticar el número de casos confirmados de COVID-19 en los próximos diez días, basado en los casos previamente confirmados registrados en China. El modelo propuesto es un sistema de inferencia neuro-fuzzy adaptable mejorado (ANFIS) utilizando un algoritmo de polinización de flores mejorado (FPA) utilizando el algoritmo de enjambre de salp (SSA). En general, SSA se emplea para mejorar el FPA para evitar sus inconvenientes (es decir, quedar atrapado en la optima local). La idea principal del modelo propuesto, llamado FPASSA-ANFIS, es mejorar el rendimiento del ANFIS mediante la determinación de los parámetros del ANFIS utilizando FPASSA. El modelo FPASSA-ANFIS se evalúa utilizando los datos oficiales de la Organización Mundial de la Salud (OMS) del brote del COVID-19 para predecir los casos Más aún, el modelo FPASSA-ANFIS se compara con varios modelos existentes, y mostró un mejor rendimiento en términos de Error del porcentaje absoluto medio (MAPE), Error relativo cuadrado medio de la raíz (RMSRE), Error relativo cuadrado medio de la raíz (RMSRE), coeficiente de determinación ( R 2) y tiempo de computación. Además, probamos el modelo propuesto utilizando dos conjuntos de datos diferentes de casos confirmados de gripe semanal en dos países, a saber, EE.UU. y China. Los resultados también mostraron buenos resultados. Texto: Una gran familia de virus, llamados coronavirus, son patógenos severos para los seres humanos, que infectan enfermedades respiratorias, hepáticas, gastrointestinales y neurológicas. Se distribuyen entre humanos, aves, ganado, ratones, murciélagos y otros animales salvajes [1] [2] [3]. Los brotes de dos coronavirus anteriores, SARS-CoV y MERS-CoV en 2003 y 2012, respectivamente, han aprobado la transmisión de animales a animales y humanos a humanos [4]. En diciembre de 2019, la Organización Mundial de la Salud (OMS) recibió notificaciones de China para muchos casos de enfermedades respiratorias que estaban relacionadas con algunas personas que habían visitado un mercado de mariscos en Wuhan [5]. Actualmente, la ciudad de Wuhan sufre de la propagación de un nuevo coronavirus, llamado COVID-19 (anteriormente, se llamaba 2019-nCoV). En [6], los autores concluyeron que COVID-19 probablemente se originó en murciélagos, porque es más similar a dos cepas de coronavirus derivadas de murciélagos. Sin embargo, la fuente del COVID-19 no está confirmada todavía, y sus comunidades, Hong Kong y Toronto, fueron 1,2 y 1.32, respectivamente. Ong et al. [20] propuso un modelo de monitoreo y pronóstico para la gripe A (H1N1-2009). Además, Nah et al. [21] propusieron un modelo basado en la probabilidad para predecir la propagación del MERS. El Sistema de Inferencia Neuro Fuzzy Adaptativo (ANFIS) [22] se aplica ampliamente en la predicción de series temporales y problemas de pronóstico, y mostró un buen rendimiento en muchas aplicaciones existentes. Ofrece flexibilidad para determinar la no linealidad en los datos de las series temporales, así como para combinar las propiedades de las redes neuronales artificiales (ANN) y los sistemas lógicos borrosos. Se ha aplicado en diversas aplicaciones de pronóstico, por ejemplo, en [23], se propuso un modelo de pronóstico de precios de existencias utilizando ANFIS y descomposición del modo empírico. Chen et al. [24] propusieron un modelo de pronóstico de series temporales TAIEX basado en un híbrido de ANFIS y promedio ponderado ordenado ( En [25], se presentó otro método de pronóstico de series temporales para los precios de la electricidad basado en ANFIS. Svalina y otros [26] propusieron un modelo de pronóstico basado en ANFIS para índices de precios cercanos para un mercado de valores durante cinco días. Ekici y Aksoy [27] presentaron un modelo de pronóstico del consumo de energía en edificios basado en ANFIS. Más aún, ANFIS también se aplica para predecir cargas eléctricas [28]. Kumar y otros [29] propusieron un modelo basado en ANFIS para pronosticar productos de retorno. Ho y Tsai [30] aplicaron ANFIS para pronosticar el rendimiento del desarrollo del producto. Sin embargo, estimar los parámetros de ANFIS es un reto que debe mejorarse. Por lo tanto, en estudios anteriores se han aplicado algunos métodos de inteligencia enjambres individuales (SI) a los parámetros de ANFIS para mejorar Los métodos SI incluyen la optimización del enjambre de partículas (PSO) [31, 32], la optimización del aspersor social [33], el algoritmo sine-cosine (SCA) [34], y el optimizador multiverso (MVO) [35]. Por ejemplo, en [34] se aplicó el algoritmo SCA para mejorar el modelo ANFIS para pronosticar el consumo de petróleo en tres países, a saber, Canadá, Alemania y Japón. En el mismo contexto, en [35], el algoritmo MVO se utilizó para mejorar el modelo ANFIS para pronosticar el consumo de petróleo en dos países. Además, en [36] se utilizó el PSO con ANFIS para predecir el rendimiento del biocarburante. Sin embargo, los algoritmos SI individuales pueden almacenarse en optima local. Por lo tanto, una solución es aplicar algoritmos SI híbridos para evitar este problema. En [37], se presentó un híbrido de dos algoritmos SI, a saber, GA y SSA, para mejorar el modelo ANFIS. Se aplicó el nuevo modelo propuesto llamado GA-SSA-ANFIS para predecir los precios del crudo para los datos de las series temporales a largo plazo. Sin embargo, los métodos mencionados anteriormente sufren algunas limitaciones que pueden afectar el rendimiento de la producción de pronósticos, como la lenta convergencia y la capacidad de equilibrar entre las fases de exploración y explotación pueden influir en la calidad de la producción final. Esto nos motivó a proponer un método de pronóstico alternativo dependiente del concepto de hibridación. Este concepto evita las limitaciones de las técnicas tradicionales de SI combinando las fortalezas de diferentes técnicas, y produce nuevas técnicas de SI que son mejores que las tradicionales. En el estudio actual, proponemos un modelo ANFIS mejorado basado en un algoritmo de polinización de flores modificado (FPA) utilizando el algoritmo de enjambre El FPA es un algoritmo de optimización propuesto por Yang [38], que se inspiró en el proceso de polinización de flujo de las plantas de floración. El FPA fue empleado en varias aplicaciones de optimización, por ejemplo para estimar el parámetro solar PV [39, 40], resolviendo rompecabezas sudoku [42], selección de características [42], diseño de antena [43], y otras aplicaciones [44] [45] [46] [47]. Además, SSA es también un algoritmo de optimización propuesto por Mirjali et al. [48] inspirado en el comportamiento de las cadenas de salp. En los últimos años, el SSA fue utilizado para resolver diferentes problemas de optimización, como la selección de características [49, 50], clasificación de datos [51], segmentación de imágenes [52], y otros [53, 54]. El método propuesto llamado FPASSA es un híbrido de FPA y SSA, en el que se aplica el SSA como método de búsqueda local para FPA. La propuesta de FPASSA comienza por recibir el conjunto de datos históricos COVID-19. Luego se genera un conjunto de soluciones donde cada una de ellas representa el valor para los parámetros del modelo ANFIS. Entonces la calidad de cada solución se calcula utilizando el valor de aptitud, y la solución que tiene el mejor valor de aptitud se elige para representar la mejor solución. Luego se calcula la probabilidad de cada solución. Luego se actualiza la solución actual, ya sea utilizando la estrategia global o local en FPA. Sin embargo, en el caso de la estrategia local, los operadores de SSA o FPA se utilizarán según la probabilidad del valor de aptitud para cada solución. El proceso de actualización de las soluciones se repite hasta llegar a la condición de parada, y se utilizan las mejores configuraciones Los principales puntos de contribución del presente estudio son los siguientes:1. Proponemos un modelo de pronóstico eficiente para predecir los casos confirmados del COVID-19 en China para los próximos diez días basados en casos confirmados previamente. Se propone un modelo ANFIS mejorado utilizando un algoritmo FPA modificado, utilizando SSA. Comparamos el modelo propuesto con el ANFIS original y los modelos ANFIS modificados existentes, como PSO, GA, ABC y FPA. El resto de este estudio se organiza de la siguiente manera. Los preliminares de ANFIS, FPA y SSA se describen en la Sección 2. La Sección 3 presenta la propuesta FPASSA, y la Sección 4 presenta la configuración experimental y los resultados. Concluimos este estudio en la Sección 5. Los principios del ANFIS se dan en esta sección. El modelo ANFIS vincula la lógica difusa y las redes neuronales [22]. Genera un mapeo entre la entrada y la salida mediante la aplicación de reglas IF-THEN (también se llama modelo de inferencia Takagi-Sugeno). La Figura 1 ilustra el modelo ANFIS donde, y y x definen las entradas a la Capa 1 mientras que, O 1i es su salida de nodo i que se calcula de la siguiente manera:donde μ denota las funciones generalizadas de membresía gaussiana. A i y B i definen los valores de membresía de μ. α i y La salida de la Capa 2 (también se conoce como la fuerza de disparo de una regla) se calcula de la siguiente manera:Mientras tanto, la salida de la Capa 3 (también se conoce como la fuerza de disparo normalizada) se calcula de la siguiente manera:La salida de la Capa 4 (también se conoce como un nodo adaptativo) se calcula de la siguiente manera:donde r i, q i y p i definen los parámetros consiguientes del nodo i. La Capa 5 contiene sólo un nodo; su salida se calcula como:El algoritmo de polinización de flores es un método de optimización propuesto por Yang [38]. Simula la transferencia de polen de flores por polinizadores en la naturaleza.Este algoritmo utiliza los dos tipos de polinización (es decir, auto-polación y polinización cruzada).En la auto-polación, la polinización ocurre sin polinizadores, mientras que en la polin En más detalle, la polinización se puede representar como una polinización local, mientras que la polinización cruzada se puede llamar polinización global. La polinización global o polinización cruzada se puede formar matemáticamente de la siguiente manera:donde x t i define el polen i en iteración t. L denota la fuerza de la polinización o el tamaño del escalón. F * es la posición objetivo o la mejor solución.En algunos casos, los insectos pueden volar con diferentes pasos de distancia durante un espacio largo; por lo tanto, la distribución de la mosca Levy se aplica para simular este movimiento.donde x t i y x k i representan polenes de diferentes flores en la misma planta. en el rango [0,1] El proceso de polinización se puede hacer usando polinización cruzada o autopolinización. Por lo tanto, la variable aleatoria p, en el rango [0,1], se utiliza para determinar este proceso. SSA es una técnica de optimización introducida por [48]. Simula el comportamiento de las Salps en la naturaleza. Este comportamiento se llama cadena salp. El modelo matemático de SSA comienza por férula su población en un grupo de líderes y grupos de seguidores. El líder es la salp frontal, mientras que, los seguidores son las otras salps. El espacio de búsqueda se determina en n-dimensiones con n variables. Ecuación (10) trabaja para actualizar las posiciones de las salps. donde x 1 j denota la posición del líder en j-th dimension. F j es la posición objetivo. ub j y lb j representan los límites máximo y min, respectivamente c 2 y c 3 denotan números aleatorios en [0, 1]. c 1 es un parámetro importante; se equilibra entre las fases de exploración y explotación. Se calcula de la siguiente manera:donde el número de bucle actual es t y el número de bucle máximo es t max. Entonces, la posición de los seguidores se actualiza de la siguiente manera:donde x i j define la posición i-ésima del seguidor en la dimensión j-th. i > 1. Esta sección explica el método propuesto de FPASSA-ANFIS. Es un método de series temporales para predecir los casos confirmados del COVID-19, como se indica en la Figura 2. El FPASSA-ANFIS utiliza el FPA mejorado para entrenar el modelo ANFIS optimizando sus parámetros. El FPASSA-ANFIS contiene cinco capas como el modelo clásico de ANFIS. La capa 1 contiene las variables de entrada ( En la fase de aprendizaje, se utiliza el FPASSA para seleccionar los mejores pesos entre la Capa 4 y la Capa 5. El FPASSA-ANFIS comienza por formatear los datos de entrada en forma de serie temporal. En nuestro caso, se consideró la función de autocorrelación (ACF). ACF es uno de los métodos aplicados para encontrar patrones en los datos; presenta información sobre la correlación entre puntos separados por varios lapsos de tiempo. Por lo tanto, en este artículo se consideran las variables con ACF mayores de 0,2, es decir, 5-lags. Además, los datos de entrenamiento contienen el 75% de los conjuntos de datos, mientras que los datos de prueba contienen el 25% de ellos. El número de clusters se define por el método fuzzy c-mean (FCM) para construir el modelo ANFIS. Los parámetros del modelo ANFIS son preparados por el algoritmo FPASSA. En la fase de entrenamiento, el error de cálculo (como en la Ecuación (13)) entre los datos reales y los datos predichos se utiliza para evaluar la calidad de los parámetros. donde T es los datos reales, y P es los datos predichos. N s es la longitud de la muestra. Los valores más pequeños de la función objetiva indican el parámetro bueno de ANFIS. Por otro lado, se aplica la fase de actualización de las posiciones de los seguidores en el algoritmo SSA para mejorar la fase de polinización global en el algoritmo FPA. En esta mejora, hay una variable aleatoria (r) utilizada para cambiar entre ambas fases. Si se utiliza r > 0,5, entonces se utilizan los operadores del SSA; de lo contrario, se utilizan los operadores del FPA. En general, el FPASS comienza por construir la población (X); después, se calcula la función objetiva para cada solución. La solución con Esta secuencia se repite hasta cumplir con la condición de parada, que en este artículo es el número máximo de iteraciones. Luego se pasa la mejor solución para entrenar los parámetros del modelo ANFIS. Después de terminar la fase de entrenamiento, la fase de prueba se inicia con la mejor solución para calcular la salida final. El rendimiento del método propuesto se evalúa comparando los datos reales con los datos predichos utilizando las medidas de rendimiento. Finalmente, el FPASS produce un valor anticipado para casos confirmados de COVID-19 en China en el día siguiente. Los pasos de la FPASSA propuesta se presentan en Algoritmo 1. Entrada: Conjunto histórico de datos COVID-19, tamaño de la población N, número total de iteraciones t max. Divide los datos en conjuntos de entrenamiento y pruebas. Utilizando el método de c-media fuzzy para determinar el número de funciones de membresía. Construyendo la red ANFIS. Devolver la mejor solución que representa la mejor configuración para ANFIS. Aplicar el conjunto de pruebas al mejor modelo ANFIS. Previsionar el COVID-19 para los próximos diez días. Esta sección presenta la descripción del conjunto de datos usados, las medidas de rendimiento, la configuración de parámetros para todos los métodos, los resultados del experimento y las discusiones. El conjunto de datos principales de este estudio es el conjunto de datos COVID-19. Se recogió del sitio web de la OMS (https: //www.who.int/emergencias/enfermedad/novel-coronavirus-2019/situación-reports/). Contiene los casos confirmados diariamente en China del 21 de enero de 2020 al 18 de febrero de 2020, como se muestra en la Tabla 1. Utilizamos el 75% del conjunto de datos para entrenar el modelo mientras que el resto se utiliza para probarlo. Además, evaluamos el rendimiento del El primero se llama DS1; fue recolectado de los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC) (https://www.cdc.gov/flu/weekly/). Comienza a partir de la semana número 40 en 2015 y continúa hasta la semana número 6 en 2020. Mientras que el segundo se llama DS2. Se recogió del sitio web de la OMS (https://www.who.int/influenza). Contiene los datos de casos confirmados de gripe semanal en China desde la semana número 1 en 2016 hasta la semana número 8 en 2020. La calidad del método propuesto se evalúa utilizando un conjunto de métricas de rendimiento como sigue:• Error cuadrado medio raíz (RMSE): donde Yp y Y son los valores predichos y originales, respectivamente. • Error absoluto medio (MAE):• Error porcentual medio (MAPE):• Error relativo cuadrado medio raíz (RMSRE): s representa el tamaño • Coeficiente de Determinación (R 2): donde Y representa la media de Y. El valor más bajo de RMSE, MAE, MAPE y RMSRE se refiere al mejor método. El valor más alto de R 2 indica una mejor correlación para el método. Este artículo tiene como objetivo evaluar la capacidad de la FPASSA para predecir el COVID-19 comparando su desempeño con otros métodos, a saber, el ANFIS y los modelos entrenados de ANFIS utilizando PSO, GA, ABC, AFPA y FPASSA. El ajuste de parámetros para estos modelos se enumera en la Tabla 2. Los parámetros comunes, como el tamaño de la población, se establecen en 25 y 100 iteraciones. Además, cada algoritmo se realiza para 30 carreras independientes a comparaciones justas. Los parámetros seleccionados son elegidos porque produjeron un buen comportamiento en experimentos anteriores, tales como [34, 35, 55, 56] Parámetros AjusteMax. épocas = 100, Objetivo de error = 0, Paso inicial = 0,01, Disminución de la tasa = 0,9, Tasa de aumento = 1. En esta sección se discute el desempeño de la propuesta de FSASA para predecir el DS1 y DS2. Se puede concluir a partir de la Tabla 3 que el rendimiento de FSASA superó a los métodos comparados en todas las medidas, mientras que el FPA se clasifica en segundo lugar. Los resultados de DS2 indican que el FPASS se clasifica en primer lugar en términos de RMSE, MAPE, R 2 y el tiempo de CPU. Mientras que, el PSO se clasifica en segundo lugar, seguido por el FPA, GA, entonces ABC. Estos resultados denotan que el método propuesto puede optimizar los parámetros del modelo ANFIS de manera efectiva y producir buenos resultados en términos de las medidas de desempeño. Resultados de comparación entre Se puede concluir que el FCASSA supera a otros modelos, por ejemplo, analizando los resultados de RMSE, MAE, MAPE, RMSRE y tiempo(s) de CPU, se puede observar que el FCASSA alcanza el menor valor entre los algoritmos de comparación, y esto indica la alta calidad del FCASSA. Mientras tanto, el FPA asigna el segundo rango, lo que proporciona mejores resultados que el resto de los métodos. Además, el valor de R 2 se refiere a la alta correlación entre la predicción obtenida por el método propuesto de FPASSA y el COVID-19 original, que tiene casi 0,97. Esto también se puede notar a partir de la Figura 3, que representa la formación de los algoritmos utilizando los datos históricos del COVID-19 así como sus valores de pronóstico para diez días. En el cuadro 5 se muestra el valor de previsión de los casos confirmados del COVID-19 en China de 19/2/2020 a 28/2/2020. De estos resultados, se puede observar que el brote alcanzará su nivel más alto el día 28/2/2020. El porcentaje medio del aumento durante el período previsto es del 10%, el porcentaje más alto es del 12% el 28/2/2020, y el porcentaje más bajo es del 8,7% el 19/2/2020. De los resultados anteriores, se puede concluir que el FPASS-ANFIS propuesto tiene una alta capacidad para pronosticar el conjunto de datos del COVID-19. Estos resultados evitan las limitaciones del ANFIS tradicional debido a la combinación con el método modificado del FAP. Además, los operadores del SSA se combinan con la estrategia local del AFP para mejorar su capacidad de explotación. Este artículo propone una versión modificada para el algoritmo de polinización de flores (FPA) utilizando el algoritmo de enjambre de salp (SSA). Esta versión modificada, llamada FPASSA, se aplica para mejorar el rendimiento del ANFIS a través de la determinación del valor óptimo para sus parámetros. El modelo desarrollado de FPASSA-ANFIS se aplica como una técnica de pronóstico para un coronavirus nuevo, llamado COVID-19, que fue descubierto en Wuhan, China a finales del año pasado y enero del año actual. El modelo propuesto de FPASSA-ANFIS tiene una alta capacidad para predecir el número de casos confirmados en diez días. Además, FPASSA-ANFIS supera a otros modelos de pronóstico en términos de RMSE, MAE, MAPE, RMSRE y R 2. Además, para evaluar el método propuesto se utilizaron dos conjuntos de datos de casos confirmados semanalmente de gripe en EE.UU. y China, y los resultados de la evaluación mostraron su buen desempeño.De acuerdo con los prometedores resultados obtenidos por la propuesta FPASSA-ANFIS, se puede aplicar en diferentes aplicaciones de pronóstico.

¿Entre los cuales se distribuyen los coronavirus?

Método de optimización para pronosticar casos confirmados de COVID-19 en Chinahttps://doi.org/10.3390/jcm9030674SHA: 1d7f8850c5244fdc9b387038e7eeae9bbbbde6d2Autores: Al-Qaness, Mohammed A. A.; Ewees, Ahmed A.; Fan, Hong; Abd El Aziz, MohamedFecha: 2020DOI: 10.3390/jcm9030674Licencia: cc-byAbstract: En diciembre de 2019, un nuevo coronavirus, llamado COVID-19, fue descubierto en Wuhan, China, y se ha extendido a diferentes ciudades de China, así como a otros 24 países. El número de casos confirmados está aumentando diariamente y llegó a 34.598 el 8 de febrero de 2020. En el presente estudio, presentamos un nuevo modelo de pronóstico para estimar y pronosticar el número de casos confirmados de COVID-19 en los próximos diez días, basado en los casos previamente confirmados registrados en China. El modelo propuesto es un sistema de inferencia neuro-fuzzy adaptable mejorado (ANFIS) utilizando un algoritmo de polinización de flores mejorado (FPA) utilizando el algoritmo de enjambre de salp (SSA). En general, SSA se emplea para mejorar el FPA para evitar sus inconvenientes (es decir, quedar atrapado en la optima local). La idea principal del modelo propuesto, llamado FPASSA-ANFIS, es mejorar el rendimiento del ANFIS mediante la determinación de los parámetros del ANFIS utilizando FPASSA. El modelo FPASSA-ANFIS se evalúa utilizando los datos oficiales de la Organización Mundial de la Salud (OMS) del brote del COVID-19 para predecir los casos Más aún, el modelo FPASSA-ANFIS se compara con varios modelos existentes, y mostró un mejor rendimiento en términos de Error del porcentaje absoluto medio (MAPE), Error relativo cuadrado medio de la raíz (RMSRE), Error relativo cuadrado medio de la raíz (RMSRE), coeficiente de determinación ( R 2) y tiempo de computación. Además, probamos el modelo propuesto utilizando dos conjuntos de datos diferentes de casos confirmados de gripe semanal en dos países, a saber, EE.UU. y China. Los resultados también mostraron buenos resultados. Texto: Una gran familia de virus, llamados coronavirus, son patógenos severos para los seres humanos, que infectan enfermedades respiratorias, hepáticas, gastrointestinales y neurológicas. Se distribuyen entre humanos, aves, ganado, ratones, murciélagos y otros animales salvajes [1] [2] [3]. Los brotes de dos coronavirus anteriores, SARS-CoV y MERS-CoV en 2003 y 2012, respectivamente, han aprobado la transmisión de animales a animales y humanos a humanos [4]. En diciembre de 2019, la Organización Mundial de la Salud (OMS) recibió notificaciones de China para muchos casos de enfermedades respiratorias que estaban relacionadas con algunas personas que habían visitado un mercado de mariscos en Wuhan [5]. Actualmente, la ciudad de Wuhan sufre de la propagación de un nuevo coronavirus, llamado COVID-19 (anteriormente, se llamaba 2019-nCoV). En [6], los autores concluyeron que COVID-19 probablemente se originó en murciélagos, porque es más similar a dos cepas de coronavirus derivadas de murciélagos. Sin embargo, la fuente del COVID-19 no está confirmada todavía, y sus comunidades, Hong Kong y Toronto, fueron 1,2 y 1.32, respectivamente. Ong et al. [20] propuso un modelo de monitoreo y pronóstico para la gripe A (H1N1-2009). Además, Nah et al. [21] propusieron un modelo basado en la probabilidad para predecir la propagación del MERS. El Sistema de Inferencia Neuro Fuzzy Adaptativo (ANFIS) [22] se aplica ampliamente en la predicción de series temporales y problemas de pronóstico, y mostró un buen rendimiento en muchas aplicaciones existentes. Ofrece flexibilidad para determinar la no linealidad en los datos de las series temporales, así como para combinar las propiedades de las redes neuronales artificiales (ANN) y los sistemas lógicos borrosos. Se ha aplicado en diversas aplicaciones de pronóstico, por ejemplo, en [23], se propuso un modelo de pronóstico de precios de existencias utilizando ANFIS y descomposición del modo empírico. Chen et al. [24] propusieron un modelo de pronóstico de series temporales TAIEX basado en un híbrido de ANFIS y promedio ponderado ordenado ( En [25], se presentó otro método de pronóstico de series temporales para los precios de la electricidad basado en ANFIS. Svalina y otros [26] propusieron un modelo de pronóstico basado en ANFIS para índices de precios cercanos para un mercado de valores durante cinco días. Ekici y Aksoy [27] presentaron un modelo de pronóstico del consumo de energía en edificios basado en ANFIS. Más aún, ANFIS también se aplica para predecir cargas eléctricas [28]. Kumar y otros [29] propusieron un modelo basado en ANFIS para pronosticar productos de retorno. Ho y Tsai [30] aplicaron ANFIS para pronosticar el rendimiento del desarrollo del producto. Sin embargo, estimar los parámetros de ANFIS es un reto que debe mejorarse. Por lo tanto, en estudios anteriores se han aplicado algunos métodos de inteligencia enjambres individuales (SI) a los parámetros de ANFIS para mejorar Los métodos SI incluyen la optimización del enjambre de partículas (PSO) [31, 32], la optimización del aspersor social [33], el algoritmo sine-cosine (SCA) [34], y el optimizador multiverso (MVO) [35]. Por ejemplo, en [34] se aplicó el algoritmo SCA para mejorar el modelo ANFIS para pronosticar el consumo de petróleo en tres países, a saber, Canadá, Alemania y Japón. En el mismo contexto, en [35], el algoritmo MVO se utilizó para mejorar el modelo ANFIS para pronosticar el consumo de petróleo en dos países. Además, en [36] se utilizó el PSO con ANFIS para predecir el rendimiento del biocarburante. Sin embargo, los algoritmos SI individuales pueden almacenarse en optima local. Por lo tanto, una solución es aplicar algoritmos SI híbridos para evitar este problema. En [37], se presentó un híbrido de dos algoritmos SI, a saber, GA y SSA, para mejorar el modelo ANFIS. Se aplicó el nuevo modelo propuesto llamado GA-SSA-ANFIS para predecir los precios del crudo para los datos de las series temporales a largo plazo. Sin embargo, los métodos mencionados anteriormente sufren algunas limitaciones que pueden afectar el rendimiento de la producción de pronósticos, como la lenta convergencia y la capacidad de equilibrar entre las fases de exploración y explotación pueden influir en la calidad de la producción final. Esto nos motivó a proponer un método de pronóstico alternativo dependiente del concepto de hibridación. Este concepto evita las limitaciones de las técnicas tradicionales de SI combinando las fortalezas de diferentes técnicas, y produce nuevas técnicas de SI que son mejores que las tradicionales. En el estudio actual, proponemos un modelo ANFIS mejorado basado en un algoritmo de polinización de flores modificado (FPA) utilizando el algoritmo de enjambre El FPA es un algoritmo de optimización propuesto por Yang [38], que se inspiró en el proceso de polinización de flujo de las plantas de floración. El FPA fue empleado en varias aplicaciones de optimización, por ejemplo para estimar el parámetro solar PV [39, 40], resolviendo rompecabezas sudoku [42], selección de características [42], diseño de antena [43], y otras aplicaciones [44] [45] [46] [47]. Además, SSA es también un algoritmo de optimización propuesto por Mirjali et al. [48] inspirado en el comportamiento de las cadenas de salp. En los últimos años, el SSA fue utilizado para resolver diferentes problemas de optimización, como la selección de características [49, 50], clasificación de datos [51], segmentación de imágenes [52], y otros [53, 54]. El método propuesto llamado FPASSA es un híbrido de FPA y SSA, en el que se aplica el SSA como método de búsqueda local para FPA. La propuesta de FPASSA comienza por recibir el conjunto de datos históricos COVID-19. Luego se genera un conjunto de soluciones donde cada una de ellas representa el valor para los parámetros del modelo ANFIS. Entonces la calidad de cada solución se calcula utilizando el valor de aptitud, y la solución que tiene el mejor valor de aptitud se elige para representar la mejor solución. Luego se calcula la probabilidad de cada solución. Luego se actualiza la solución actual, ya sea utilizando la estrategia global o local en FPA. Sin embargo, en el caso de la estrategia local, los operadores de SSA o FPA se utilizarán según la probabilidad del valor de aptitud para cada solución. El proceso de actualización de las soluciones se repite hasta llegar a la condición de parada, y se utilizan las mejores configuraciones Los principales puntos de contribución del presente estudio son los siguientes:1. Proponemos un modelo de pronóstico eficiente para predecir los casos confirmados del COVID-19 en China para los próximos diez días basados en casos confirmados previamente. Se propone un modelo ANFIS mejorado utilizando un algoritmo FPA modificado, utilizando SSA. Comparamos el modelo propuesto con el ANFIS original y los modelos ANFIS modificados existentes, como PSO, GA, ABC y FPA. El resto de este estudio se organiza de la siguiente manera. Los preliminares de ANFIS, FPA y SSA se describen en la Sección 2. La Sección 3 presenta la propuesta FPASSA, y la Sección 4 presenta la configuración experimental y los resultados. Concluimos este estudio en la Sección 5. Los principios del ANFIS se dan en esta sección. El modelo ANFIS vincula la lógica difusa y las redes neuronales [22]. Genera un mapeo entre la entrada y la salida mediante la aplicación de reglas IF-THEN (también se llama modelo de inferencia Takagi-Sugeno). La Figura 1 ilustra el modelo ANFIS donde, y y x definen las entradas a la Capa 1 mientras que, O 1i es su salida de nodo i que se calcula de la siguiente manera:donde μ denota las funciones generalizadas de membresía gaussiana. A i y B i definen los valores de membresía de μ. α i y La salida de la Capa 2 (también se conoce como la fuerza de disparo de una regla) se calcula de la siguiente manera:Mientras tanto, la salida de la Capa 3 (también se conoce como la fuerza de disparo normalizada) se calcula de la siguiente manera:La salida de la Capa 4 (también se conoce como un nodo adaptativo) se calcula de la siguiente manera:donde r i, q i y p i definen los parámetros consiguientes del nodo i. La Capa 5 contiene sólo un nodo; su salida se calcula como:El algoritmo de polinización de flores es un método de optimización propuesto por Yang [38]. Simula la transferencia de polen de flores por polinizadores en la naturaleza.Este algoritmo utiliza los dos tipos de polinización (es decir, auto-polación y polinización cruzada).En la auto-polación, la polinización ocurre sin polinizadores, mientras que en la polin En más detalle, la polinización se puede representar como una polinización local, mientras que la polinización cruzada se puede llamar polinización global. La polinización global o polinización cruzada se puede formar matemáticamente de la siguiente manera:donde x t i define el polen i en iteración t. L denota la fuerza de la polinización o el tamaño del escalón. F * es la posición objetivo o la mejor solución.En algunos casos, los insectos pueden volar con diferentes pasos de distancia durante un espacio largo; por lo tanto, la distribución de la mosca Levy se aplica para simular este movimiento.donde x t i y x k i representan polenes de diferentes flores en la misma planta. en el rango [0,1] El proceso de polinización se puede hacer usando polinización cruzada o autopolinización. Por lo tanto, la variable aleatoria p, en el rango [0,1], se utiliza para determinar este proceso. SSA es una técnica de optimización introducida por [48]. Simula el comportamiento de las Salps en la naturaleza. Este comportamiento se llama cadena salp. El modelo matemático de SSA comienza por férula su población en un grupo de líderes y grupos de seguidores. El líder es la salp frontal, mientras que, los seguidores son las otras salps. El espacio de búsqueda se determina en n-dimensiones con n variables. Ecuación (10) trabaja para actualizar las posiciones de las salps. donde x 1 j denota la posición del líder en j-th dimension. F j es la posición objetivo. ub j y lb j representan los límites máximo y min, respectivamente c 2 y c 3 denotan números aleatorios en [0, 1]. c 1 es un parámetro importante; se equilibra entre las fases de exploración y explotación. Se calcula de la siguiente manera:donde el número de bucle actual es t y el número de bucle máximo es t max. Entonces, la posición de los seguidores se actualiza de la siguiente manera:donde x i j define la posición i-ésima del seguidor en la dimensión j-th. i > 1. Esta sección explica el método propuesto de FPASSA-ANFIS. Es un método de series temporales para predecir los casos confirmados del COVID-19, como se indica en la Figura 2. El FPASSA-ANFIS utiliza el FPA mejorado para entrenar el modelo ANFIS optimizando sus parámetros. El FPASSA-ANFIS contiene cinco capas como el modelo clásico de ANFIS. La capa 1 contiene las variables de entrada ( En la fase de aprendizaje, se utiliza el FPASSA para seleccionar los mejores pesos entre la Capa 4 y la Capa 5. El FPASSA-ANFIS comienza por formatear los datos de entrada en forma de serie temporal. En nuestro caso, se consideró la función de autocorrelación (ACF). ACF es uno de los métodos aplicados para encontrar patrones en los datos; presenta información sobre la correlación entre puntos separados por varios lapsos de tiempo. Por lo tanto, en este artículo se consideran las variables con ACF mayores de 0,2, es decir, 5-lags. Además, los datos de entrenamiento contienen el 75% de los conjuntos de datos, mientras que los datos de prueba contienen el 25% de ellos. El número de clusters se define por el método fuzzy c-mean (FCM) para construir el modelo ANFIS. Los parámetros del modelo ANFIS son preparados por el algoritmo FPASSA. En la fase de entrenamiento, el error de cálculo (como en la Ecuación (13)) entre los datos reales y los datos predichos se utiliza para evaluar la calidad de los parámetros. donde T es los datos reales, y P es los datos predichos. N s es la longitud de la muestra. Los valores más pequeños de la función objetiva indican el parámetro bueno de ANFIS. Por otro lado, se aplica la fase de actualización de las posiciones de los seguidores en el algoritmo SSA para mejorar la fase de polinización global en el algoritmo FPA. En esta mejora, hay una variable aleatoria (r) utilizada para cambiar entre ambas fases. Si se utiliza r > 0,5, entonces se utilizan los operadores del SSA; de lo contrario, se utilizan los operadores del FPA. En general, el FPASS comienza por construir la población (X); después, se calcula la función objetiva para cada solución. La solución con Esta secuencia se repite hasta cumplir con la condición de parada, que en este artículo es el número máximo de iteraciones. Luego se pasa la mejor solución para entrenar los parámetros del modelo ANFIS. Después de terminar la fase de entrenamiento, la fase de prueba se inicia con la mejor solución para calcular la salida final. El rendimiento del método propuesto se evalúa comparando los datos reales con los datos predichos utilizando las medidas de rendimiento. Finalmente, el FPASS produce un valor anticipado para casos confirmados de COVID-19 en China en el día siguiente. Los pasos de la FPASSA propuesta se presentan en Algoritmo 1. Entrada: Conjunto histórico de datos COVID-19, tamaño de la población N, número total de iteraciones t max. Divide los datos en conjuntos de entrenamiento y pruebas. Utilizando el método de c-media fuzzy para determinar el número de funciones de membresía. Construyendo la red ANFIS. Devolver la mejor solución que representa la mejor configuración para ANFIS. Aplicar el conjunto de pruebas al mejor modelo ANFIS. Previsionar el COVID-19 para los próximos diez días. Esta sección presenta la descripción del conjunto de datos usados, las medidas de rendimiento, la configuración de parámetros para todos los métodos, los resultados del experimento y las discusiones. El conjunto de datos principales de este estudio es el conjunto de datos COVID-19. Se recogió del sitio web de la OMS (https: //www.who.int/emergencias/enfermedad/novel-coronavirus-2019/situación-reports/). Contiene los casos confirmados diariamente en China del 21 de enero de 2020 al 18 de febrero de 2020, como se muestra en la Tabla 1. Utilizamos el 75% del conjunto de datos para entrenar el modelo mientras que el resto se utiliza para probarlo. Además, evaluamos el rendimiento del El primero se llama DS1; fue recolectado de los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC) (https://www.cdc.gov/flu/weekly/). Comienza a partir de la semana número 40 en 2015 y continúa hasta la semana número 6 en 2020. Mientras que el segundo se llama DS2. Se recogió del sitio web de la OMS (https://www.who.int/influenza). Contiene los datos de casos confirmados de gripe semanal en China desde la semana número 1 en 2016 hasta la semana número 8 en 2020. La calidad del método propuesto se evalúa utilizando un conjunto de métricas de rendimiento como sigue:• Error cuadrado medio raíz (RMSE): donde Yp y Y son los valores predichos y originales, respectivamente. • Error absoluto medio (MAE):• Error porcentual medio (MAPE):• Error relativo cuadrado medio raíz (RMSRE): s representa el tamaño • Coeficiente de Determinación (R 2): donde Y representa la media de Y. El valor más bajo de RMSE, MAE, MAPE y RMSRE se refiere al mejor método. El valor más alto de R 2 indica una mejor correlación para el método. Este artículo tiene como objetivo evaluar la capacidad de la FPASSA para predecir el COVID-19 comparando su desempeño con otros métodos, a saber, el ANFIS y los modelos entrenados de ANFIS utilizando PSO, GA, ABC, AFPA y FPASSA. El ajuste de parámetros para estos modelos se enumera en la Tabla 2. Los parámetros comunes, como el tamaño de la población, se establecen en 25 y 100 iteraciones. Además, cada algoritmo se realiza para 30 carreras independientes a comparaciones justas. Los parámetros seleccionados son elegidos porque produjeron un buen comportamiento en experimentos anteriores, tales como [34, 35, 55, 56] Parámetros AjusteMax. épocas = 100, Objetivo de error = 0, Paso inicial = 0,01, Disminución de la tasa = 0,9, Tasa de aumento = 1. En esta sección se discute el desempeño de la propuesta de FSASA para predecir el DS1 y DS2. Se puede concluir a partir de la Tabla 3 que el rendimiento de FSASA superó a los métodos comparados en todas las medidas, mientras que el FPA se clasifica en segundo lugar. Los resultados de DS2 indican que el FPASS se clasifica en primer lugar en términos de RMSE, MAPE, R 2 y el tiempo de CPU. Mientras que, el PSO se clasifica en segundo lugar, seguido por el FPA, GA, entonces ABC. Estos resultados denotan que el método propuesto puede optimizar los parámetros del modelo ANFIS de manera efectiva y producir buenos resultados en términos de las medidas de desempeño. Resultados de comparación entre Se puede concluir que el FCASSA supera a otros modelos, por ejemplo, analizando los resultados de RMSE, MAE, MAPE, RMSRE y tiempo(s) de CPU, se puede observar que el FCASSA alcanza el menor valor entre los algoritmos de comparación, y esto indica la alta calidad del FCASSA. Mientras tanto, el FPA asigna el segundo rango, lo que proporciona mejores resultados que el resto de los métodos. Además, el valor de R 2 se refiere a la alta correlación entre la predicción obtenida por el método propuesto de FPASSA y el COVID-19 original, que tiene casi 0,97. Esto también se puede notar a partir de la Figura 3, que representa la formación de los algoritmos utilizando los datos históricos del COVID-19 así como sus valores de pronóstico para diez días. En el cuadro 5 se muestra el valor de previsión de los casos confirmados del COVID-19 en China de 19/2/2020 a 28/2/2020. De estos resultados, se puede observar que el brote alcanzará su nivel más alto el día 28/2/2020. El porcentaje medio del aumento durante el período previsto es del 10%, el porcentaje más alto es del 12% el 28/2/2020, y el porcentaje más bajo es del 8,7% el 19/2/2020. De los resultados anteriores, se puede concluir que el FPASS-ANFIS propuesto tiene una alta capacidad para pronosticar el conjunto de datos del COVID-19. Estos resultados evitan las limitaciones del ANFIS tradicional debido a la combinación con el método modificado del FAP. Además, los operadores del SSA se combinan con la estrategia local del AFP para mejorar su capacidad de explotación. Este artículo propone una versión modificada para el algoritmo de polinización de flores (FPA) utilizando el algoritmo de enjambre de salp (SSA). Esta versión modificada, llamada FPASSA, se aplica para mejorar el rendimiento del ANFIS a través de la determinación del valor óptimo para sus parámetros. El modelo desarrollado de FPASSA-ANFIS se aplica como una técnica de pronóstico para un coronavirus nuevo, llamado COVID-19, que fue descubierto en Wuhan, China a finales del año pasado y enero del año actual. El modelo propuesto de FPASSA-ANFIS tiene una alta capacidad para predecir el número de casos confirmados en diez días. Además, FPASSA-ANFIS supera a otros modelos de pronóstico en términos de RMSE, MAE, MAPE, RMSRE y R 2. Además, para evaluar el método propuesto se utilizaron dos conjuntos de datos de casos confirmados semanalmente de gripe en EE.UU. y China, y los resultados de la evaluación mostraron su buen desempeño.De acuerdo con los prometedores resultados obtenidos por la propuesta FPASSA-ANFIS, se puede aplicar en diferentes aplicaciones de pronóstico.

¿En qué se aplica ampliamente el Sistema de Inferencia Neuro Fuzzy Adaptativa (ANFIS) [22]?

Método de optimización para pronosticar casos confirmados de COVID-19 en Chinahttps://doi.org/10.3390/jcm9030674SHA: 1d7f8850c5244fdc9b387038e7eeae9bbbbde6d2Autores: Al-Qaness, Mohammed A. A.; Ewees, Ahmed A.; Fan, Hong; Abd El Aziz, MohamedFecha: 2020DOI: 10.3390/jcm9030674Licencia: cc-byAbstract: En diciembre de 2019, un nuevo coronavirus, llamado COVID-19, fue descubierto en Wuhan, China, y se ha extendido a diferentes ciudades de China, así como a otros 24 países. El número de casos confirmados está aumentando diariamente y llegó a 34.598 el 8 de febrero de 2020. En el presente estudio, presentamos un nuevo modelo de pronóstico para estimar y pronosticar el número de casos confirmados de COVID-19 en los próximos diez días, basado en los casos previamente confirmados registrados en China. El modelo propuesto es un sistema de inferencia neuro-fuzzy adaptable mejorado (ANFIS) utilizando un algoritmo de polinización de flores mejorado (FPA) utilizando el algoritmo de enjambre de salp (SSA). En general, SSA se emplea para mejorar el FPA para evitar sus inconvenientes (es decir, quedar atrapado en la optima local). La idea principal del modelo propuesto, llamado FPASSA-ANFIS, es mejorar el rendimiento del ANFIS mediante la determinación de los parámetros del ANFIS utilizando FPASSA. El modelo FPASSA-ANFIS se evalúa utilizando los datos oficiales de la Organización Mundial de la Salud (OMS) del brote del COVID-19 para predecir los casos Más aún, el modelo FPASSA-ANFIS se compara con varios modelos existentes, y mostró un mejor rendimiento en términos de Error del porcentaje absoluto medio (MAPE), Error relativo cuadrado medio de la raíz (RMSRE), Error relativo cuadrado medio de la raíz (RMSRE), coeficiente de determinación ( R 2) y tiempo de computación. Además, probamos el modelo propuesto utilizando dos conjuntos de datos diferentes de casos confirmados de gripe semanal en dos países, a saber, EE.UU. y China. Los resultados también mostraron buenos resultados. Texto: Una gran familia de virus, llamados coronavirus, son patógenos severos para los seres humanos, que infectan enfermedades respiratorias, hepáticas, gastrointestinales y neurológicas. Se distribuyen entre humanos, aves, ganado, ratones, murciélagos y otros animales salvajes [1] [2] [3]. Los brotes de dos coronavirus anteriores, SARS-CoV y MERS-CoV en 2003 y 2012, respectivamente, han aprobado la transmisión de animales a animales y humanos a humanos [4]. En diciembre de 2019, la Organización Mundial de la Salud (OMS) recibió notificaciones de China para muchos casos de enfermedades respiratorias que estaban relacionadas con algunas personas que habían visitado un mercado de mariscos en Wuhan [5]. Actualmente, la ciudad de Wuhan sufre de la propagación de un nuevo coronavirus, llamado COVID-19 (anteriormente, se llamaba 2019-nCoV). En [6], los autores concluyeron que COVID-19 probablemente se originó en murciélagos, porque es más similar a dos cepas de coronavirus derivadas de murciélagos. Sin embargo, la fuente del COVID-19 no está confirmada todavía, y sus comunidades, Hong Kong y Toronto, fueron 1,2 y 1.32, respectivamente. Ong et al. [20] propuso un modelo de monitoreo y pronóstico para la gripe A (H1N1-2009). Además, Nah et al. [21] propusieron un modelo basado en la probabilidad para predecir la propagación del MERS. El Sistema de Inferencia Neuro Fuzzy Adaptativo (ANFIS) [22] se aplica ampliamente en la predicción de series temporales y problemas de pronóstico, y mostró un buen rendimiento en muchas aplicaciones existentes. Ofrece flexibilidad para determinar la no linealidad en los datos de las series temporales, así como para combinar las propiedades de las redes neuronales artificiales (ANN) y los sistemas lógicos borrosos. Se ha aplicado en diversas aplicaciones de pronóstico, por ejemplo, en [23], se propuso un modelo de pronóstico de precios de existencias utilizando ANFIS y descomposición del modo empírico. Chen et al. [24] propusieron un modelo de pronóstico de series temporales TAIEX basado en un híbrido de ANFIS y promedio ponderado ordenado ( En [25], se presentó otro método de pronóstico de series temporales para los precios de la electricidad basado en ANFIS. Svalina y otros [26] propusieron un modelo de pronóstico basado en ANFIS para índices de precios cercanos para un mercado de valores durante cinco días. Ekici y Aksoy [27] presentaron un modelo de pronóstico del consumo de energía en edificios basado en ANFIS. Más aún, ANFIS también se aplica para predecir cargas eléctricas [28]. Kumar y otros [29] propusieron un modelo basado en ANFIS para pronosticar productos de retorno. Ho y Tsai [30] aplicaron ANFIS para pronosticar el rendimiento del desarrollo del producto. Sin embargo, estimar los parámetros de ANFIS es un reto que debe mejorarse. Por lo tanto, en estudios anteriores se han aplicado algunos métodos de inteligencia enjambres individuales (SI) a los parámetros de ANFIS para mejorar Los métodos SI incluyen la optimización del enjambre de partículas (PSO) [31, 32], la optimización del aspersor social [33], el algoritmo sine-cosine (SCA) [34], y el optimizador multiverso (MVO) [35]. Por ejemplo, en [34] se aplicó el algoritmo SCA para mejorar el modelo ANFIS para pronosticar el consumo de petróleo en tres países, a saber, Canadá, Alemania y Japón. En el mismo contexto, en [35], el algoritmo MVO se utilizó para mejorar el modelo ANFIS para pronosticar el consumo de petróleo en dos países. Además, en [36] se utilizó el PSO con ANFIS para predecir el rendimiento del biocarburante. Sin embargo, los algoritmos SI individuales pueden almacenarse en optima local. Por lo tanto, una solución es aplicar algoritmos SI híbridos para evitar este problema. En [37], se presentó un híbrido de dos algoritmos SI, a saber, GA y SSA, para mejorar el modelo ANFIS. Se aplicó el nuevo modelo propuesto llamado GA-SSA-ANFIS para predecir los precios del crudo para los datos de las series temporales a largo plazo. Sin embargo, los métodos mencionados anteriormente sufren algunas limitaciones que pueden afectar el rendimiento de la producción de pronósticos, como la lenta convergencia y la capacidad de equilibrar entre las fases de exploración y explotación pueden influir en la calidad de la producción final. Esto nos motivó a proponer un método de pronóstico alternativo dependiente del concepto de hibridación. Este concepto evita las limitaciones de las técnicas tradicionales de SI combinando las fortalezas de diferentes técnicas, y produce nuevas técnicas de SI que son mejores que las tradicionales. En el estudio actual, proponemos un modelo ANFIS mejorado basado en un algoritmo de polinización de flores modificado (FPA) utilizando el algoritmo de enjambre El FPA es un algoritmo de optimización propuesto por Yang [38], que se inspiró en el proceso de polinización de flujo de las plantas de floración. El FPA fue empleado en varias aplicaciones de optimización, por ejemplo para estimar el parámetro solar PV [39, 40], resolviendo rompecabezas sudoku [42], selección de características [42], diseño de antena [43], y otras aplicaciones [44] [45] [46] [47]. Además, SSA es también un algoritmo de optimización propuesto por Mirjali et al. [48] inspirado en el comportamiento de las cadenas de salp. En los últimos años, el SSA fue utilizado para resolver diferentes problemas de optimización, como la selección de características [49, 50], clasificación de datos [51], segmentación de imágenes [52], y otros [53, 54]. El método propuesto llamado FPASSA es un híbrido de FPA y SSA, en el que se aplica el SSA como método de búsqueda local para FPA. La propuesta de FPASSA comienza por recibir el conjunto de datos históricos COVID-19. Luego se genera un conjunto de soluciones donde cada una de ellas representa el valor para los parámetros del modelo ANFIS. Entonces la calidad de cada solución se calcula utilizando el valor de aptitud, y la solución que tiene el mejor valor de aptitud se elige para representar la mejor solución. Luego se calcula la probabilidad de cada solución. Luego se actualiza la solución actual, ya sea utilizando la estrategia global o local en FPA. Sin embargo, en el caso de la estrategia local, los operadores de SSA o FPA se utilizarán según la probabilidad del valor de aptitud para cada solución. El proceso de actualización de las soluciones se repite hasta llegar a la condición de parada, y se utilizan las mejores configuraciones Los principales puntos de contribución del presente estudio son los siguientes:1. Proponemos un modelo de pronóstico eficiente para predecir los casos confirmados del COVID-19 en China para los próximos diez días basados en casos confirmados previamente. Se propone un modelo ANFIS mejorado utilizando un algoritmo FPA modificado, utilizando SSA. Comparamos el modelo propuesto con el ANFIS original y los modelos ANFIS modificados existentes, como PSO, GA, ABC y FPA. El resto de este estudio se organiza de la siguiente manera. Los preliminares de ANFIS, FPA y SSA se describen en la Sección 2. La Sección 3 presenta la propuesta FPASSA, y la Sección 4 presenta la configuración experimental y los resultados. Concluimos este estudio en la Sección 5. Los principios del ANFIS se dan en esta sección. El modelo ANFIS vincula la lógica difusa y las redes neuronales [22]. Genera un mapeo entre la entrada y la salida mediante la aplicación de reglas IF-THEN (también se llama modelo de inferencia Takagi-Sugeno). La Figura 1 ilustra el modelo ANFIS donde, y y x definen las entradas a la Capa 1 mientras que, O 1i es su salida de nodo i que se calcula de la siguiente manera:donde μ denota las funciones generalizadas de membresía gaussiana. A i y B i definen los valores de membresía de μ. α i y La salida de la Capa 2 (también se conoce como la fuerza de disparo de una regla) se calcula de la siguiente manera:Mientras tanto, la salida de la Capa 3 (también se conoce como la fuerza de disparo normalizada) se calcula de la siguiente manera:La salida de la Capa 4 (también se conoce como un nodo adaptativo) se calcula de la siguiente manera:donde r i, q i y p i definen los parámetros consiguientes del nodo i. La Capa 5 contiene sólo un nodo; su salida se calcula como:El algoritmo de polinización de flores es un método de optimización propuesto por Yang [38]. Simula la transferencia de polen de flores por polinizadores en la naturaleza.Este algoritmo utiliza los dos tipos de polinización (es decir, auto-polación y polinización cruzada).En la auto-polación, la polinización ocurre sin polinizadores, mientras que en la polin En más detalle, la polinización se puede representar como una polinización local, mientras que la polinización cruzada se puede llamar polinización global. La polinización global o polinización cruzada se puede formar matemáticamente de la siguiente manera:donde x t i define el polen i en iteración t. L denota la fuerza de la polinización o el tamaño del escalón. F * es la posición objetivo o la mejor solución.En algunos casos, los insectos pueden volar con diferentes pasos de distancia durante un espacio largo; por lo tanto, la distribución de la mosca Levy se aplica para simular este movimiento.donde x t i y x k i representan polenes de diferentes flores en la misma planta. en el rango [0,1] El proceso de polinización se puede hacer usando polinización cruzada o autopolinización. Por lo tanto, la variable aleatoria p, en el rango [0,1], se utiliza para determinar este proceso. SSA es una técnica de optimización introducida por [48]. Simula el comportamiento de las Salps en la naturaleza. Este comportamiento se llama cadena salp. El modelo matemático de SSA comienza por férula su población en un grupo de líderes y grupos de seguidores. El líder es la salp frontal, mientras que, los seguidores son las otras salps. El espacio de búsqueda se determina en n-dimensiones con n variables. Ecuación (10) trabaja para actualizar las posiciones de las salps. donde x 1 j denota la posición del líder en j-th dimension. F j es la posición objetivo. ub j y lb j representan los límites máximo y min, respectivamente c 2 y c 3 denotan números aleatorios en [0, 1]. c 1 es un parámetro importante; se equilibra entre las fases de exploración y explotación. Se calcula de la siguiente manera:donde el número de bucle actual es t y el número de bucle máximo es t max. Entonces, la posición de los seguidores se actualiza de la siguiente manera:donde x i j define la posición i-ésima del seguidor en la dimensión j-th. i > 1. Esta sección explica el método propuesto de FPASSA-ANFIS. Es un método de series temporales para predecir los casos confirmados del COVID-19, como se indica en la Figura 2. El FPASSA-ANFIS utiliza el FPA mejorado para entrenar el modelo ANFIS optimizando sus parámetros. El FPASSA-ANFIS contiene cinco capas como el modelo clásico de ANFIS. La capa 1 contiene las variables de entrada ( En la fase de aprendizaje, se utiliza el FPASSA para seleccionar los mejores pesos entre la Capa 4 y la Capa 5. El FPASSA-ANFIS comienza por formatear los datos de entrada en forma de serie temporal. En nuestro caso, se consideró la función de autocorrelación (ACF). ACF es uno de los métodos aplicados para encontrar patrones en los datos; presenta información sobre la correlación entre puntos separados por varios lapsos de tiempo. Por lo tanto, en este artículo se consideran las variables con ACF mayores de 0,2, es decir, 5-lags. Además, los datos de entrenamiento contienen el 75% de los conjuntos de datos, mientras que los datos de prueba contienen el 25% de ellos. El número de clusters se define por el método fuzzy c-mean (FCM) para construir el modelo ANFIS. Los parámetros del modelo ANFIS son preparados por el algoritmo FPASSA. En la fase de entrenamiento, el error de cálculo (como en la Ecuación (13)) entre los datos reales y los datos predichos se utiliza para evaluar la calidad de los parámetros. donde T es los datos reales, y P es los datos predichos. N s es la longitud de la muestra. Los valores más pequeños de la función objetiva indican el parámetro bueno de ANFIS. Por otro lado, se aplica la fase de actualización de las posiciones de los seguidores en el algoritmo SSA para mejorar la fase de polinización global en el algoritmo FPA. En esta mejora, hay una variable aleatoria (r) utilizada para cambiar entre ambas fases. Si se utiliza r > 0,5, entonces se utilizan los operadores del SSA; de lo contrario, se utilizan los operadores del FPA. En general, el FPASS comienza por construir la población (X); después, se calcula la función objetiva para cada solución. La solución con Esta secuencia se repite hasta cumplir con la condición de parada, que en este artículo es el número máximo de iteraciones. Luego se pasa la mejor solución para entrenar los parámetros del modelo ANFIS. Después de terminar la fase de entrenamiento, la fase de prueba se inicia con la mejor solución para calcular la salida final. El rendimiento del método propuesto se evalúa comparando los datos reales con los datos predichos utilizando las medidas de rendimiento. Finalmente, el FPASS produce un valor anticipado para casos confirmados de COVID-19 en China en el día siguiente. Los pasos de la FPASSA propuesta se presentan en Algoritmo 1. Entrada: Conjunto histórico de datos COVID-19, tamaño de la población N, número total de iteraciones t max. Divide los datos en conjuntos de entrenamiento y pruebas. Utilizando el método de c-media fuzzy para determinar el número de funciones de membresía. Construyendo la red ANFIS. Devolver la mejor solución que representa la mejor configuración para ANFIS. Aplicar el conjunto de pruebas al mejor modelo ANFIS. Previsionar el COVID-19 para los próximos diez días. Esta sección presenta la descripción del conjunto de datos usados, las medidas de rendimiento, la configuración de parámetros para todos los métodos, los resultados del experimento y las discusiones. El conjunto de datos principales de este estudio es el conjunto de datos COVID-19. Se recogió del sitio web de la OMS (https: //www.who.int/emergencias/enfermedad/novel-coronavirus-2019/situación-reports/). Contiene los casos confirmados diariamente en China del 21 de enero de 2020 al 18 de febrero de 2020, como se muestra en la Tabla 1. Utilizamos el 75% del conjunto de datos para entrenar el modelo mientras que el resto se utiliza para probarlo. Además, evaluamos el rendimiento del El primero se llama DS1; fue recolectado de los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC) (https://www.cdc.gov/flu/weekly/). Comienza a partir de la semana número 40 en 2015 y continúa hasta la semana número 6 en 2020. Mientras que el segundo se llama DS2. Se recogió del sitio web de la OMS (https://www.who.int/influenza). Contiene los datos de casos confirmados de gripe semanal en China desde la semana número 1 en 2016 hasta la semana número 8 en 2020. La calidad del método propuesto se evalúa utilizando un conjunto de métricas de rendimiento como sigue:• Error cuadrado medio raíz (RMSE): donde Yp y Y son los valores predichos y originales, respectivamente. • Error absoluto medio (MAE):• Error porcentual medio (MAPE):• Error relativo cuadrado medio raíz (RMSRE): s representa el tamaño • Coeficiente de Determinación (R 2): donde Y representa la media de Y. El valor más bajo de RMSE, MAE, MAPE y RMSRE se refiere al mejor método. El valor más alto de R 2 indica una mejor correlación para el método. Este artículo tiene como objetivo evaluar la capacidad de la FPASSA para predecir el COVID-19 comparando su desempeño con otros métodos, a saber, el ANFIS y los modelos entrenados de ANFIS utilizando PSO, GA, ABC, AFPA y FPASSA. El ajuste de parámetros para estos modelos se enumera en la Tabla 2. Los parámetros comunes, como el tamaño de la población, se establecen en 25 y 100 iteraciones. Además, cada algoritmo se realiza para 30 carreras independientes a comparaciones justas. Los parámetros seleccionados son elegidos porque produjeron un buen comportamiento en experimentos anteriores, tales como [34, 35, 55, 56] Parámetros AjusteMax. épocas = 100, Objetivo de error = 0, Paso inicial = 0,01, Disminución de la tasa = 0,9, Tasa de aumento = 1. En esta sección se discute el desempeño de la propuesta de FSASA para predecir el DS1 y DS2. Se puede concluir a partir de la Tabla 3 que el rendimiento de FSASA superó a los métodos comparados en todas las medidas, mientras que el FPA se clasifica en segundo lugar. Los resultados de DS2 indican que el FPASS se clasifica en primer lugar en términos de RMSE, MAPE, R 2 y el tiempo de CPU. Mientras que, el PSO se clasifica en segundo lugar, seguido por el FPA, GA, entonces ABC. Estos resultados denotan que el método propuesto puede optimizar los parámetros del modelo ANFIS de manera efectiva y producir buenos resultados en términos de las medidas de desempeño. Resultados de comparación entre Se puede concluir que el FCASSA supera a otros modelos, por ejemplo, analizando los resultados de RMSE, MAE, MAPE, RMSRE y tiempo(s) de CPU, se puede observar que el FCASSA alcanza el menor valor entre los algoritmos de comparación, y esto indica la alta calidad del FCASSA. Mientras tanto, el FPA asigna el segundo rango, lo que proporciona mejores resultados que el resto de los métodos. Además, el valor de R 2 se refiere a la alta correlación entre la predicción obtenida por el método propuesto de FPASSA y el COVID-19 original, que tiene casi 0,97. Esto también se puede notar a partir de la Figura 3, que representa la formación de los algoritmos utilizando los datos históricos del COVID-19 así como sus valores de pronóstico para diez días. En el cuadro 5 se muestra el valor de previsión de los casos confirmados del COVID-19 en China de 19/2/2020 a 28/2/2020. De estos resultados, se puede observar que el brote alcanzará su nivel más alto el día 28/2/2020. El porcentaje medio del aumento durante el período previsto es del 10%, el porcentaje más alto es del 12% el 28/2/2020, y el porcentaje más bajo es del 8,7% el 19/2/2020. De los resultados anteriores, se puede concluir que el FPASS-ANFIS propuesto tiene una alta capacidad para pronosticar el conjunto de datos del COVID-19. Estos resultados evitan las limitaciones del ANFIS tradicional debido a la combinación con el método modificado del FAP. Además, los operadores del SSA se combinan con la estrategia local del AFP para mejorar su capacidad de explotación. Este artículo propone una versión modificada para el algoritmo de polinización de flores (FPA) utilizando el algoritmo de enjambre de salp (SSA). Esta versión modificada, llamada FPASSA, se aplica para mejorar el rendimiento del ANFIS a través de la determinación del valor óptimo para sus parámetros. El modelo desarrollado de FPASSA-ANFIS se aplica como una técnica de pronóstico para un coronavirus nuevo, llamado COVID-19, que fue descubierto en Wuhan, China a finales del año pasado y enero del año actual. El modelo propuesto de FPASSA-ANFIS tiene una alta capacidad para predecir el número de casos confirmados en diez días. Además, FPASSA-ANFIS supera a otros modelos de pronóstico en términos de RMSE, MAE, MAPE, RMSRE y R 2. Además, para evaluar el método propuesto se utilizaron dos conjuntos de datos de casos confirmados semanalmente de gripe en EE.UU. y China, y los resultados de la evaluación mostraron su buen desempeño.De acuerdo con los prometedores resultados obtenidos por la propuesta FPASSA-ANFIS, se puede aplicar en diferentes aplicaciones de pronóstico.

¿Qué es PSO?

Método de optimización para pronosticar casos confirmados de COVID-19 en Chinahttps://doi.org/10.3390/jcm9030674SHA: 1d7f8850c5244fdc9b387038e7eeae9bbbbde6d2Autores: Al-Qaness, Mohammed A. A.; Ewees, Ahmed A.; Fan, Hong; Abd El Aziz, MohamedFecha: 2020DOI: 10.3390/jcm9030674Licencia: cc-byAbstract: En diciembre de 2019, un nuevo coronavirus, llamado COVID-19, fue descubierto en Wuhan, China, y se ha extendido a diferentes ciudades de China, así como a otros 24 países. El número de casos confirmados está aumentando diariamente y llegó a 34.598 el 8 de febrero de 2020. En el presente estudio, presentamos un nuevo modelo de pronóstico para estimar y pronosticar el número de casos confirmados de COVID-19 en los próximos diez días, basado en los casos previamente confirmados registrados en China. El modelo propuesto es un sistema de inferencia neuro-fuzzy adaptable mejorado (ANFIS) utilizando un algoritmo de polinización de flores mejorado (FPA) utilizando el algoritmo de enjambre de salp (SSA). En general, SSA se emplea para mejorar el FPA para evitar sus inconvenientes (es decir, quedar atrapado en la optima local). La idea principal del modelo propuesto, llamado FPASSA-ANFIS, es mejorar el rendimiento del ANFIS mediante la determinación de los parámetros del ANFIS utilizando FPASSA. El modelo FPASSA-ANFIS se evalúa utilizando los datos oficiales de la Organización Mundial de la Salud (OMS) del brote del COVID-19 para predecir los casos Más aún, el modelo FPASSA-ANFIS se compara con varios modelos existentes, y mostró un mejor rendimiento en términos de Error del porcentaje absoluto medio (MAPE), Error relativo cuadrado medio de la raíz (RMSRE), Error relativo cuadrado medio de la raíz (RMSRE), coeficiente de determinación ( R 2) y tiempo de computación. Además, probamos el modelo propuesto utilizando dos conjuntos de datos diferentes de casos confirmados de gripe semanal en dos países, a saber, EE.UU. y China. Los resultados también mostraron buenos resultados. Texto: Una gran familia de virus, llamados coronavirus, son patógenos severos para los seres humanos, que infectan enfermedades respiratorias, hepáticas, gastrointestinales y neurológicas. Se distribuyen entre humanos, aves, ganado, ratones, murciélagos y otros animales salvajes [1] [2] [3]. Los brotes de dos coronavirus anteriores, SARS-CoV y MERS-CoV en 2003 y 2012, respectivamente, han aprobado la transmisión de animales a animales y humanos a humanos [4]. En diciembre de 2019, la Organización Mundial de la Salud (OMS) recibió notificaciones de China para muchos casos de enfermedades respiratorias que estaban relacionadas con algunas personas que habían visitado un mercado de mariscos en Wuhan [5]. Actualmente, la ciudad de Wuhan sufre de la propagación de un nuevo coronavirus, llamado COVID-19 (anteriormente, se llamaba 2019-nCoV). En [6], los autores concluyeron que COVID-19 probablemente se originó en murciélagos, porque es más similar a dos cepas de coronavirus derivadas de murciélagos. Sin embargo, la fuente del COVID-19 no está confirmada todavía, y sus comunidades, Hong Kong y Toronto, fueron 1,2 y 1.32, respectivamente. Ong et al. [20] propuso un modelo de monitoreo y pronóstico para la gripe A (H1N1-2009). Además, Nah et al. [21] propusieron un modelo basado en la probabilidad para predecir la propagación del MERS. El Sistema de Inferencia Neuro Fuzzy Adaptativo (ANFIS) [22] se aplica ampliamente en la predicción de series temporales y problemas de pronóstico, y mostró un buen rendimiento en muchas aplicaciones existentes. Ofrece flexibilidad para determinar la no linealidad en los datos de las series temporales, así como para combinar las propiedades de las redes neuronales artificiales (ANN) y los sistemas lógicos borrosos. Se ha aplicado en diversas aplicaciones de pronóstico, por ejemplo, en [23], se propuso un modelo de pronóstico de precios de existencias utilizando ANFIS y descomposición del modo empírico. Chen et al. [24] propusieron un modelo de pronóstico de series temporales TAIEX basado en un híbrido de ANFIS y promedio ponderado ordenado ( En [25], se presentó otro método de pronóstico de series temporales para los precios de la electricidad basado en ANFIS. Svalina y otros [26] propusieron un modelo de pronóstico basado en ANFIS para índices de precios cercanos para un mercado de valores durante cinco días. Ekici y Aksoy [27] presentaron un modelo de pronóstico del consumo de energía en edificios basado en ANFIS. Más aún, ANFIS también se aplica para predecir cargas eléctricas [28]. Kumar y otros [29] propusieron un modelo basado en ANFIS para pronosticar productos de retorno. Ho y Tsai [30] aplicaron ANFIS para pronosticar el rendimiento del desarrollo del producto. Sin embargo, estimar los parámetros de ANFIS es un reto que debe mejorarse. Por lo tanto, en estudios anteriores se han aplicado algunos métodos de inteligencia enjambres individuales (SI) a los parámetros de ANFIS para mejorar Los métodos SI incluyen la optimización del enjambre de partículas (PSO) [31, 32], la optimización del aspersor social [33], el algoritmo sine-cosine (SCA) [34], y el optimizador multiverso (MVO) [35]. Por ejemplo, en [34] se aplicó el algoritmo SCA para mejorar el modelo ANFIS para pronosticar el consumo de petróleo en tres países, a saber, Canadá, Alemania y Japón. En el mismo contexto, en [35], el algoritmo MVO se utilizó para mejorar el modelo ANFIS para pronosticar el consumo de petróleo en dos países. Además, en [36] se utilizó el PSO con ANFIS para predecir el rendimiento del biocarburante. Sin embargo, los algoritmos SI individuales pueden almacenarse en optima local. Por lo tanto, una solución es aplicar algoritmos SI híbridos para evitar este problema. En [37], se presentó un híbrido de dos algoritmos SI, a saber, GA y SSA, para mejorar el modelo ANFIS. Se aplicó el nuevo modelo propuesto llamado GA-SSA-ANFIS para predecir los precios del crudo para los datos de las series temporales a largo plazo. Sin embargo, los métodos mencionados anteriormente sufren algunas limitaciones que pueden afectar el rendimiento de la producción de pronósticos, como la lenta convergencia y la capacidad de equilibrar entre las fases de exploración y explotación pueden influir en la calidad de la producción final. Esto nos motivó a proponer un método de pronóstico alternativo dependiente del concepto de hibridación. Este concepto evita las limitaciones de las técnicas tradicionales de SI combinando las fortalezas de diferentes técnicas, y produce nuevas técnicas de SI que son mejores que las tradicionales. En el estudio actual, proponemos un modelo ANFIS mejorado basado en un algoritmo de polinización de flores modificado (FPA) utilizando el algoritmo de enjambre El FPA es un algoritmo de optimización propuesto por Yang [38], que se inspiró en el proceso de polinización de flujo de las plantas de floración. El FPA fue empleado en varias aplicaciones de optimización, por ejemplo para estimar el parámetro solar PV [39, 40], resolviendo rompecabezas sudoku [42], selección de características [42], diseño de antena [43], y otras aplicaciones [44] [45] [46] [47]. Además, SSA es también un algoritmo de optimización propuesto por Mirjali et al. [48] inspirado en el comportamiento de las cadenas de salp. En los últimos años, el SSA fue utilizado para resolver diferentes problemas de optimización, como la selección de características [49, 50], clasificación de datos [51], segmentación de imágenes [52], y otros [53, 54]. El método propuesto llamado FPASSA es un híbrido de FPA y SSA, en el que se aplica el SSA como método de búsqueda local para FPA. La propuesta de FPASSA comienza por recibir el conjunto de datos históricos COVID-19. Luego se genera un conjunto de soluciones donde cada una de ellas representa el valor para los parámetros del modelo ANFIS. Entonces la calidad de cada solución se calcula utilizando el valor de aptitud, y la solución que tiene el mejor valor de aptitud se elige para representar la mejor solución. Luego se calcula la probabilidad de cada solución. Luego se actualiza la solución actual, ya sea utilizando la estrategia global o local en FPA. Sin embargo, en el caso de la estrategia local, los operadores de SSA o FPA se utilizarán según la probabilidad del valor de aptitud para cada solución. El proceso de actualización de las soluciones se repite hasta llegar a la condición de parada, y se utilizan las mejores configuraciones Los principales puntos de contribución del presente estudio son los siguientes:1. Proponemos un modelo de pronóstico eficiente para predecir los casos confirmados del COVID-19 en China para los próximos diez días basados en casos confirmados previamente. Se propone un modelo ANFIS mejorado utilizando un algoritmo FPA modificado, utilizando SSA. Comparamos el modelo propuesto con el ANFIS original y los modelos ANFIS modificados existentes, como PSO, GA, ABC y FPA. El resto de este estudio se organiza de la siguiente manera. Los preliminares de ANFIS, FPA y SSA se describen en la Sección 2. La Sección 3 presenta la propuesta FPASSA, y la Sección 4 presenta la configuración experimental y los resultados. Concluimos este estudio en la Sección 5. Los principios del ANFIS se dan en esta sección. El modelo ANFIS vincula la lógica difusa y las redes neuronales [22]. Genera un mapeo entre la entrada y la salida mediante la aplicación de reglas IF-THEN (también se llama modelo de inferencia Takagi-Sugeno). La Figura 1 ilustra el modelo ANFIS donde, y y x definen las entradas a la Capa 1 mientras que, O 1i es su salida de nodo i que se calcula de la siguiente manera:donde μ denota las funciones generalizadas de membresía gaussiana. A i y B i definen los valores de membresía de μ. α i y La salida de la Capa 2 (también se conoce como la fuerza de disparo de una regla) se calcula de la siguiente manera:Mientras tanto, la salida de la Capa 3 (también se conoce como la fuerza de disparo normalizada) se calcula de la siguiente manera:La salida de la Capa 4 (también se conoce como un nodo adaptativo) se calcula de la siguiente manera:donde r i, q i y p i definen los parámetros consiguientes del nodo i. La Capa 5 contiene sólo un nodo; su salida se calcula como:El algoritmo de polinización de flores es un método de optimización propuesto por Yang [38]. Simula la transferencia de polen de flores por polinizadores en la naturaleza.Este algoritmo utiliza los dos tipos de polinización (es decir, auto-polación y polinización cruzada).En la auto-polación, la polinización ocurre sin polinizadores, mientras que en la polin En más detalle, la polinización se puede representar como una polinización local, mientras que la polinización cruzada se puede llamar polinización global. La polinización global o polinización cruzada se puede formar matemáticamente de la siguiente manera:donde x t i define el polen i en iteración t. L denota la fuerza de la polinización o el tamaño del escalón. F * es la posición objetivo o la mejor solución.En algunos casos, los insectos pueden volar con diferentes pasos de distancia durante un espacio largo; por lo tanto, la distribución de la mosca Levy se aplica para simular este movimiento.donde x t i y x k i representan polenes de diferentes flores en la misma planta. en el rango [0,1] El proceso de polinización se puede hacer usando polinización cruzada o autopolinización. Por lo tanto, la variable aleatoria p, en el rango [0,1], se utiliza para determinar este proceso. SSA es una técnica de optimización introducida por [48]. Simula el comportamiento de las Salps en la naturaleza. Este comportamiento se llama cadena salp. El modelo matemático de SSA comienza por férula su población en un grupo de líderes y grupos de seguidores. El líder es la salp frontal, mientras que, los seguidores son las otras salps. El espacio de búsqueda se determina en n-dimensiones con n variables. Ecuación (10) trabaja para actualizar las posiciones de las salps. donde x 1 j denota la posición del líder en j-th dimension. F j es la posición objetivo. ub j y lb j representan los límites máximo y min, respectivamente c 2 y c 3 denotan números aleatorios en [0, 1]. c 1 es un parámetro importante; se equilibra entre las fases de exploración y explotación. Se calcula de la siguiente manera:donde el número de bucle actual es t y el número de bucle máximo es t max. Entonces, la posición de los seguidores se actualiza de la siguiente manera:donde x i j define la posición i-ésima del seguidor en la dimensión j-th. i > 1. Esta sección explica el método propuesto de FPASSA-ANFIS. Es un método de series temporales para predecir los casos confirmados del COVID-19, como se indica en la Figura 2. El FPASSA-ANFIS utiliza el FPA mejorado para entrenar el modelo ANFIS optimizando sus parámetros. El FPASSA-ANFIS contiene cinco capas como el modelo clásico de ANFIS. La capa 1 contiene las variables de entrada ( En la fase de aprendizaje, se utiliza el FPASSA para seleccionar los mejores pesos entre la Capa 4 y la Capa 5. El FPASSA-ANFIS comienza por formatear los datos de entrada en forma de serie temporal. En nuestro caso, se consideró la función de autocorrelación (ACF). ACF es uno de los métodos aplicados para encontrar patrones en los datos; presenta información sobre la correlación entre puntos separados por varios lapsos de tiempo. Por lo tanto, en este artículo se consideran las variables con ACF mayores de 0,2, es decir, 5-lags. Además, los datos de entrenamiento contienen el 75% de los conjuntos de datos, mientras que los datos de prueba contienen el 25% de ellos. El número de clusters se define por el método fuzzy c-mean (FCM) para construir el modelo ANFIS. Los parámetros del modelo ANFIS son preparados por el algoritmo FPASSA. En la fase de entrenamiento, el error de cálculo (como en la Ecuación (13)) entre los datos reales y los datos predichos se utiliza para evaluar la calidad de los parámetros. donde T es los datos reales, y P es los datos predichos. N s es la longitud de la muestra. Los valores más pequeños de la función objetiva indican el parámetro bueno de ANFIS. Por otro lado, se aplica la fase de actualización de las posiciones de los seguidores en el algoritmo SSA para mejorar la fase de polinización global en el algoritmo FPA. En esta mejora, hay una variable aleatoria (r) utilizada para cambiar entre ambas fases. Si se utiliza r > 0,5, entonces se utilizan los operadores del SSA; de lo contrario, se utilizan los operadores del FPA. En general, el FPASS comienza por construir la población (X); después, se calcula la función objetiva para cada solución. La solución con Esta secuencia se repite hasta cumplir con la condición de parada, que en este artículo es el número máximo de iteraciones. Luego se pasa la mejor solución para entrenar los parámetros del modelo ANFIS. Después de terminar la fase de entrenamiento, la fase de prueba se inicia con la mejor solución para calcular la salida final. El rendimiento del método propuesto se evalúa comparando los datos reales con los datos predichos utilizando las medidas de rendimiento. Finalmente, el FPASS produce un valor anticipado para casos confirmados de COVID-19 en China en el día siguiente. Los pasos de la FPASSA propuesta se presentan en Algoritmo 1. Entrada: Conjunto histórico de datos COVID-19, tamaño de la población N, número total de iteraciones t max. Divide los datos en conjuntos de entrenamiento y pruebas. Utilizando el método de c-media fuzzy para determinar el número de funciones de membresía. Construyendo la red ANFIS. Devolver la mejor solución que representa la mejor configuración para ANFIS. Aplicar el conjunto de pruebas al mejor modelo ANFIS. Previsionar el COVID-19 para los próximos diez días. Esta sección presenta la descripción del conjunto de datos usados, las medidas de rendimiento, la configuración de parámetros para todos los métodos, los resultados del experimento y las discusiones. El conjunto de datos principales de este estudio es el conjunto de datos COVID-19. Se recogió del sitio web de la OMS (https: //www.who.int/emergencias/enfermedad/novel-coronavirus-2019/situación-reports/). Contiene los casos confirmados diariamente en China del 21 de enero de 2020 al 18 de febrero de 2020, como se muestra en la Tabla 1. Utilizamos el 75% del conjunto de datos para entrenar el modelo mientras que el resto se utiliza para probarlo. Además, evaluamos el rendimiento del El primero se llama DS1; fue recolectado de los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC) (https://www.cdc.gov/flu/weekly/). Comienza a partir de la semana número 40 en 2015 y continúa hasta la semana número 6 en 2020. Mientras que el segundo se llama DS2. Se recogió del sitio web de la OMS (https://www.who.int/influenza). Contiene los datos de casos confirmados de gripe semanal en China desde la semana número 1 en 2016 hasta la semana número 8 en 2020. La calidad del método propuesto se evalúa utilizando un conjunto de métricas de rendimiento como sigue:• Error cuadrado medio raíz (RMSE): donde Yp y Y son los valores predichos y originales, respectivamente. • Error absoluto medio (MAE):• Error porcentual medio (MAPE):• Error relativo cuadrado medio raíz (RMSRE): s representa el tamaño • Coeficiente de Determinación (R 2): donde Y representa la media de Y. El valor más bajo de RMSE, MAE, MAPE y RMSRE se refiere al mejor método. El valor más alto de R 2 indica una mejor correlación para el método. Este artículo tiene como objetivo evaluar la capacidad de la FPASSA para predecir el COVID-19 comparando su desempeño con otros métodos, a saber, el ANFIS y los modelos entrenados de ANFIS utilizando PSO, GA, ABC, AFPA y FPASSA. El ajuste de parámetros para estos modelos se enumera en la Tabla 2. Los parámetros comunes, como el tamaño de la población, se establecen en 25 y 100 iteraciones. Además, cada algoritmo se realiza para 30 carreras independientes a comparaciones justas. Los parámetros seleccionados son elegidos porque produjeron un buen comportamiento en experimentos anteriores, tales como [34, 35, 55, 56] Parámetros AjusteMax. épocas = 100, Objetivo de error = 0, Paso inicial = 0,01, Disminución de la tasa = 0,9, Tasa de aumento = 1. En esta sección se discute el desempeño de la propuesta de FSASA para predecir el DS1 y DS2. Se puede concluir a partir de la Tabla 3 que el rendimiento de FSASA superó a los métodos comparados en todas las medidas, mientras que el FPA se clasifica en segundo lugar. Los resultados de DS2 indican que el FPASS se clasifica en primer lugar en términos de RMSE, MAPE, R 2 y el tiempo de CPU. Mientras que, el PSO se clasifica en segundo lugar, seguido por el FPA, GA, entonces ABC. Estos resultados denotan que el método propuesto puede optimizar los parámetros del modelo ANFIS de manera efectiva y producir buenos resultados en términos de las medidas de desempeño. Resultados de comparación entre Se puede concluir que el FCASSA supera a otros modelos, por ejemplo, analizando los resultados de RMSE, MAE, MAPE, RMSRE y tiempo(s) de CPU, se puede observar que el FCASSA alcanza el menor valor entre los algoritmos de comparación, y esto indica la alta calidad del FCASSA. Mientras tanto, el FPA asigna el segundo rango, lo que proporciona mejores resultados que el resto de los métodos. Además, el valor de R 2 se refiere a la alta correlación entre la predicción obtenida por el método propuesto de FPASSA y el COVID-19 original, que tiene casi 0,97. Esto también se puede notar a partir de la Figura 3, que representa la formación de los algoritmos utilizando los datos históricos del COVID-19 así como sus valores de pronóstico para diez días. En el cuadro 5 se muestra el valor de previsión de los casos confirmados del COVID-19 en China de 19/2/2020 a 28/2/2020. De estos resultados, se puede observar que el brote alcanzará su nivel más alto el día 28/2/2020. El porcentaje medio del aumento durante el período previsto es del 10%, el porcentaje más alto es del 12% el 28/2/2020, y el porcentaje más bajo es del 8,7% el 19/2/2020. De los resultados anteriores, se puede concluir que el FPASS-ANFIS propuesto tiene una alta capacidad para pronosticar el conjunto de datos del COVID-19. Estos resultados evitan las limitaciones del ANFIS tradicional debido a la combinación con el método modificado del FAP. Además, los operadores del SSA se combinan con la estrategia local del AFP para mejorar su capacidad de explotación. Este artículo propone una versión modificada para el algoritmo de polinización de flores (FPA) utilizando el algoritmo de enjambre de salp (SSA). Esta versión modificada, llamada FPASSA, se aplica para mejorar el rendimiento del ANFIS a través de la determinación del valor óptimo para sus parámetros. El modelo desarrollado de FPASSA-ANFIS se aplica como una técnica de pronóstico para un coronavirus nuevo, llamado COVID-19, que fue descubierto en Wuhan, China a finales del año pasado y enero del año actual. El modelo propuesto de FPASSA-ANFIS tiene una alta capacidad para predecir el número de casos confirmados en diez días. Además, FPASSA-ANFIS supera a otros modelos de pronóstico en términos de RMSE, MAE, MAPE, RMSRE y R 2. Además, para evaluar el método propuesto se utilizaron dos conjuntos de datos de casos confirmados semanalmente de gripe en EE.UU. y China, y los resultados de la evaluación mostraron su buen desempeño.De acuerdo con los prometedores resultados obtenidos por la propuesta FPASSA-ANFIS, se puede aplicar en diferentes aplicaciones de pronóstico.

¿Qué es OWA?

Método de optimización para pronosticar casos confirmados de COVID-19 en Chinahttps://doi.org/10.3390/jcm9030674SHA: 1d7f8850c5244fdc9b387038e7eeae9bbbbde6d2Autores: Al-Qaness, Mohammed A. A.; Ewees, Ahmed A.; Fan, Hong; Abd El Aziz, MohamedFecha: 2020DOI: 10.3390/jcm9030674Licencia: cc-byAbstract: En diciembre de 2019, un nuevo coronavirus, llamado COVID-19, fue descubierto en Wuhan, China, y se ha extendido a diferentes ciudades de China, así como a otros 24 países. El número de casos confirmados está aumentando diariamente y llegó a 34.598 el 8 de febrero de 2020. En el presente estudio, presentamos un nuevo modelo de pronóstico para estimar y pronosticar el número de casos confirmados de COVID-19 en los próximos diez días, basado en los casos previamente confirmados registrados en China. El modelo propuesto es un sistema de inferencia neuro-fuzzy adaptable mejorado (ANFIS) utilizando un algoritmo de polinización de flores mejorado (FPA) utilizando el algoritmo de enjambre de salp (SSA). En general, SSA se emplea para mejorar el FPA para evitar sus inconvenientes (es decir, quedar atrapado en la optima local). La idea principal del modelo propuesto, llamado FPASSA-ANFIS, es mejorar el rendimiento del ANFIS mediante la determinación de los parámetros del ANFIS utilizando FPASSA. El modelo FPASSA-ANFIS se evalúa utilizando los datos oficiales de la Organización Mundial de la Salud (OMS) del brote del COVID-19 para predecir los casos Más aún, el modelo FPASSA-ANFIS se compara con varios modelos existentes, y mostró un mejor rendimiento en términos de Error del porcentaje absoluto medio (MAPE), Error relativo cuadrado medio de la raíz (RMSRE), Error relativo cuadrado medio de la raíz (RMSRE), coeficiente de determinación ( R 2) y tiempo de computación. Además, probamos el modelo propuesto utilizando dos conjuntos de datos diferentes de casos confirmados de gripe semanal en dos países, a saber, EE.UU. y China. Los resultados también mostraron buenos resultados. Texto: Una gran familia de virus, llamados coronavirus, son patógenos severos para los seres humanos, que infectan enfermedades respiratorias, hepáticas, gastrointestinales y neurológicas. Se distribuyen entre humanos, aves, ganado, ratones, murciélagos y otros animales salvajes [1] [2] [3]. Los brotes de dos coronavirus anteriores, SARS-CoV y MERS-CoV en 2003 y 2012, respectivamente, han aprobado la transmisión de animales a animales y humanos a humanos [4]. En diciembre de 2019, la Organización Mundial de la Salud (OMS) recibió notificaciones de China para muchos casos de enfermedades respiratorias que estaban relacionadas con algunas personas que habían visitado un mercado de mariscos en Wuhan [5]. Actualmente, la ciudad de Wuhan sufre de la propagación de un nuevo coronavirus, llamado COVID-19 (anteriormente, se llamaba 2019-nCoV). En [6], los autores concluyeron que COVID-19 probablemente se originó en murciélagos, porque es más similar a dos cepas de coronavirus derivadas de murciélagos. Sin embargo, la fuente del COVID-19 no está confirmada todavía, y sus comunidades, Hong Kong y Toronto, fueron 1,2 y 1.32, respectivamente. Ong et al. [20] propuso un modelo de monitoreo y pronóstico para la gripe A (H1N1-2009). Además, Nah et al. [21] propusieron un modelo basado en la probabilidad para predecir la propagación del MERS. El Sistema de Inferencia Neuro Fuzzy Adaptativo (ANFIS) [22] se aplica ampliamente en la predicción de series temporales y problemas de pronóstico, y mostró un buen rendimiento en muchas aplicaciones existentes. Ofrece flexibilidad para determinar la no linealidad en los datos de las series temporales, así como para combinar las propiedades de las redes neuronales artificiales (ANN) y los sistemas lógicos borrosos. Se ha aplicado en diversas aplicaciones de pronóstico, por ejemplo, en [23], se propuso un modelo de pronóstico de precios de existencias utilizando ANFIS y descomposición del modo empírico. Chen et al. [24] propusieron un modelo de pronóstico de series temporales TAIEX basado en un híbrido de ANFIS y promedio ponderado ordenado ( En [25], se presentó otro método de pronóstico de series temporales para los precios de la electricidad basado en ANFIS. Svalina y otros [26] propusieron un modelo de pronóstico basado en ANFIS para índices de precios cercanos para un mercado de valores durante cinco días. Ekici y Aksoy [27] presentaron un modelo de pronóstico del consumo de energía en edificios basado en ANFIS. Más aún, ANFIS también se aplica para predecir cargas eléctricas [28]. Kumar y otros [29] propusieron un modelo basado en ANFIS para pronosticar productos de retorno. Ho y Tsai [30] aplicaron ANFIS para pronosticar el rendimiento del desarrollo del producto. Sin embargo, estimar los parámetros de ANFIS es un reto que debe mejorarse. Por lo tanto, en estudios anteriores se han aplicado algunos métodos de inteligencia enjambres individuales (SI) a los parámetros de ANFIS para mejorar Los métodos SI incluyen la optimización del enjambre de partículas (PSO) [31, 32], la optimización del aspersor social [33], el algoritmo sine-cosine (SCA) [34], y el optimizador multiverso (MVO) [35]. Por ejemplo, en [34] se aplicó el algoritmo SCA para mejorar el modelo ANFIS para pronosticar el consumo de petróleo en tres países, a saber, Canadá, Alemania y Japón. En el mismo contexto, en [35], el algoritmo MVO se utilizó para mejorar el modelo ANFIS para pronosticar el consumo de petróleo en dos países. Además, en [36] se utilizó el PSO con ANFIS para predecir el rendimiento del biocarburante. Sin embargo, los algoritmos SI individuales pueden almacenarse en optima local. Por lo tanto, una solución es aplicar algoritmos SI híbridos para evitar este problema. En [37], se presentó un híbrido de dos algoritmos SI, a saber, GA y SSA, para mejorar el modelo ANFIS. Se aplicó el nuevo modelo propuesto llamado GA-SSA-ANFIS para predecir los precios del crudo para los datos de las series temporales a largo plazo. Sin embargo, los métodos mencionados anteriormente sufren algunas limitaciones que pueden afectar el rendimiento de la producción de pronósticos, como la lenta convergencia y la capacidad de equilibrar entre las fases de exploración y explotación pueden influir en la calidad de la producción final. Esto nos motivó a proponer un método de pronóstico alternativo dependiente del concepto de hibridación. Este concepto evita las limitaciones de las técnicas tradicionales de SI combinando las fortalezas de diferentes técnicas, y produce nuevas técnicas de SI que son mejores que las tradicionales. En el estudio actual, proponemos un modelo ANFIS mejorado basado en un algoritmo de polinización de flores modificado (FPA) utilizando el algoritmo de enjambre El FPA es un algoritmo de optimización propuesto por Yang [38], que se inspiró en el proceso de polinización de flujo de las plantas de floración. El FPA fue empleado en varias aplicaciones de optimización, por ejemplo para estimar el parámetro solar PV [39, 40], resolviendo rompecabezas sudoku [42], selección de características [42], diseño de antena [43], y otras aplicaciones [44] [45] [46] [47]. Además, SSA es también un algoritmo de optimización propuesto por Mirjali et al. [48] inspirado en el comportamiento de las cadenas de salp. En los últimos años, el SSA fue utilizado para resolver diferentes problemas de optimización, como la selección de características [49, 50], clasificación de datos [51], segmentación de imágenes [52], y otros [53, 54]. El método propuesto llamado FPASSA es un híbrido de FPA y SSA, en el que se aplica el SSA como método de búsqueda local para FPA. La propuesta de FPASSA comienza por recibir el conjunto de datos históricos COVID-19. Luego se genera un conjunto de soluciones donde cada una de ellas representa el valor para los parámetros del modelo ANFIS. Entonces la calidad de cada solución se calcula utilizando el valor de aptitud, y la solución que tiene el mejor valor de aptitud se elige para representar la mejor solución. Luego se calcula la probabilidad de cada solución. Luego se actualiza la solución actual, ya sea utilizando la estrategia global o local en FPA. Sin embargo, en el caso de la estrategia local, los operadores de SSA o FPA se utilizarán según la probabilidad del valor de aptitud para cada solución. El proceso de actualización de las soluciones se repite hasta llegar a la condición de parada, y se utilizan las mejores configuraciones Los principales puntos de contribución del presente estudio son los siguientes:1. Proponemos un modelo de pronóstico eficiente para predecir los casos confirmados del COVID-19 en China para los próximos diez días basados en casos confirmados previamente. Se propone un modelo ANFIS mejorado utilizando un algoritmo FPA modificado, utilizando SSA. Comparamos el modelo propuesto con el ANFIS original y los modelos ANFIS modificados existentes, como PSO, GA, ABC y FPA. El resto de este estudio se organiza de la siguiente manera. Los preliminares de ANFIS, FPA y SSA se describen en la Sección 2. La Sección 3 presenta la propuesta FPASSA, y la Sección 4 presenta la configuración experimental y los resultados. Concluimos este estudio en la Sección 5. Los principios del ANFIS se dan en esta sección. El modelo ANFIS vincula la lógica difusa y las redes neuronales [22]. Genera un mapeo entre la entrada y la salida mediante la aplicación de reglas IF-THEN (también se llama modelo de inferencia Takagi-Sugeno). La Figura 1 ilustra el modelo ANFIS donde, y y x definen las entradas a la Capa 1 mientras que, O 1i es su salida de nodo i que se calcula de la siguiente manera:donde μ denota las funciones generalizadas de membresía gaussiana. A i y B i definen los valores de membresía de μ. α i y La salida de la Capa 2 (también se conoce como la fuerza de disparo de una regla) se calcula de la siguiente manera:Mientras tanto, la salida de la Capa 3 (también se conoce como la fuerza de disparo normalizada) se calcula de la siguiente manera:La salida de la Capa 4 (también se conoce como un nodo adaptativo) se calcula de la siguiente manera:donde r i, q i y p i definen los parámetros consiguientes del nodo i. La Capa 5 contiene sólo un nodo; su salida se calcula como:El algoritmo de polinización de flores es un método de optimización propuesto por Yang [38]. Simula la transferencia de polen de flores por polinizadores en la naturaleza.Este algoritmo utiliza los dos tipos de polinización (es decir, auto-polación y polinización cruzada).En la auto-polación, la polinización ocurre sin polinizadores, mientras que en la polin En más detalle, la polinización se puede representar como una polinización local, mientras que la polinización cruzada se puede llamar polinización global. La polinización global o polinización cruzada se puede formar matemáticamente de la siguiente manera:donde x t i define el polen i en iteración t. L denota la fuerza de la polinización o el tamaño del escalón. F * es la posición objetivo o la mejor solución.En algunos casos, los insectos pueden volar con diferentes pasos de distancia durante un espacio largo; por lo tanto, la distribución de la mosca Levy se aplica para simular este movimiento.donde x t i y x k i representan polenes de diferentes flores en la misma planta. en el rango [0,1] El proceso de polinización se puede hacer usando polinización cruzada o autopolinización. Por lo tanto, la variable aleatoria p, en el rango [0,1], se utiliza para determinar este proceso. SSA es una técnica de optimización introducida por [48]. Simula el comportamiento de las Salps en la naturaleza. Este comportamiento se llama cadena salp. El modelo matemático de SSA comienza por férula su población en un grupo de líderes y grupos de seguidores. El líder es la salp frontal, mientras que, los seguidores son las otras salps. El espacio de búsqueda se determina en n-dimensiones con n variables. Ecuación (10) trabaja para actualizar las posiciones de las salps. donde x 1 j denota la posición del líder en j-th dimension. F j es la posición objetivo. ub j y lb j representan los límites máximo y min, respectivamente c 2 y c 3 denotan números aleatorios en [0, 1]. c 1 es un parámetro importante; se equilibra entre las fases de exploración y explotación. Se calcula de la siguiente manera:donde el número de bucle actual es t y el número de bucle máximo es t max. Entonces, la posición de los seguidores se actualiza de la siguiente manera:donde x i j define la posición i-ésima del seguidor en la dimensión j-th. i > 1. Esta sección explica el método propuesto de FPASSA-ANFIS. Es un método de series temporales para predecir los casos confirmados del COVID-19, como se indica en la Figura 2. El FPASSA-ANFIS utiliza el FPA mejorado para entrenar el modelo ANFIS optimizando sus parámetros. El FPASSA-ANFIS contiene cinco capas como el modelo clásico de ANFIS. La capa 1 contiene las variables de entrada ( En la fase de aprendizaje, se utiliza el FPASSA para seleccionar los mejores pesos entre la Capa 4 y la Capa 5. El FPASSA-ANFIS comienza por formatear los datos de entrada en forma de serie temporal. En nuestro caso, se consideró la función de autocorrelación (ACF). ACF es uno de los métodos aplicados para encontrar patrones en los datos; presenta información sobre la correlación entre puntos separados por varios lapsos de tiempo. Por lo tanto, en este artículo se consideran las variables con ACF mayores de 0,2, es decir, 5-lags. Además, los datos de entrenamiento contienen el 75% de los conjuntos de datos, mientras que los datos de prueba contienen el 25% de ellos. El número de clusters se define por el método fuzzy c-mean (FCM) para construir el modelo ANFIS. Los parámetros del modelo ANFIS son preparados por el algoritmo FPASSA. En la fase de entrenamiento, el error de cálculo (como en la Ecuación (13)) entre los datos reales y los datos predichos se utiliza para evaluar la calidad de los parámetros. donde T es los datos reales, y P es los datos predichos. N s es la longitud de la muestra. Los valores más pequeños de la función objetiva indican el parámetro bueno de ANFIS. Por otro lado, se aplica la fase de actualización de las posiciones de los seguidores en el algoritmo SSA para mejorar la fase de polinización global en el algoritmo FPA. En esta mejora, hay una variable aleatoria (r) utilizada para cambiar entre ambas fases. Si se utiliza r > 0,5, entonces se utilizan los operadores del SSA; de lo contrario, se utilizan los operadores del FPA. En general, el FPASS comienza por construir la población (X); después, se calcula la función objetiva para cada solución. La solución con Esta secuencia se repite hasta cumplir con la condición de parada, que en este artículo es el número máximo de iteraciones. Luego se pasa la mejor solución para entrenar los parámetros del modelo ANFIS. Después de terminar la fase de entrenamiento, la fase de prueba se inicia con la mejor solución para calcular la salida final. El rendimiento del método propuesto se evalúa comparando los datos reales con los datos predichos utilizando las medidas de rendimiento. Finalmente, el FPASS produce un valor anticipado para casos confirmados de COVID-19 en China en el día siguiente. Los pasos de la FPASSA propuesta se presentan en Algoritmo 1. Entrada: Conjunto histórico de datos COVID-19, tamaño de la población N, número total de iteraciones t max. Divide los datos en conjuntos de entrenamiento y pruebas. Utilizando el método de c-media fuzzy para determinar el número de funciones de membresía. Construyendo la red ANFIS. Devolver la mejor solución que representa la mejor configuración para ANFIS. Aplicar el conjunto de pruebas al mejor modelo ANFIS. Previsionar el COVID-19 para los próximos diez días. Esta sección presenta la descripción del conjunto de datos usados, las medidas de rendimiento, la configuración de parámetros para todos los métodos, los resultados del experimento y las discusiones. El conjunto de datos principales de este estudio es el conjunto de datos COVID-19. Se recogió del sitio web de la OMS (https: //www.who.int/emergencias/enfermedad/novel-coronavirus-2019/situación-reports/). Contiene los casos confirmados diariamente en China del 21 de enero de 2020 al 18 de febrero de 2020, como se muestra en la Tabla 1. Utilizamos el 75% del conjunto de datos para entrenar el modelo mientras que el resto se utiliza para probarlo. Además, evaluamos el rendimiento del El primero se llama DS1; fue recolectado de los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC) (https://www.cdc.gov/flu/weekly/). Comienza a partir de la semana número 40 en 2015 y continúa hasta la semana número 6 en 2020. Mientras que el segundo se llama DS2. Se recogió del sitio web de la OMS (https://www.who.int/influenza). Contiene los datos de casos confirmados de gripe semanal en China desde la semana número 1 en 2016 hasta la semana número 8 en 2020. La calidad del método propuesto se evalúa utilizando un conjunto de métricas de rendimiento como sigue:• Error cuadrado medio raíz (RMSE): donde Yp y Y son los valores predichos y originales, respectivamente. • Error absoluto medio (MAE):• Error porcentual medio (MAPE):• Error relativo cuadrado medio raíz (RMSRE): s representa el tamaño • Coeficiente de Determinación (R 2): donde Y representa la media de Y. El valor más bajo de RMSE, MAE, MAPE y RMSRE se refiere al mejor método. El valor más alto de R 2 indica una mejor correlación para el método. Este artículo tiene como objetivo evaluar la capacidad de la FPASSA para predecir el COVID-19 comparando su desempeño con otros métodos, a saber, el ANFIS y los modelos entrenados de ANFIS utilizando PSO, GA, ABC, AFPA y FPASSA. El ajuste de parámetros para estos modelos se enumera en la Tabla 2. Los parámetros comunes, como el tamaño de la población, se establecen en 25 y 100 iteraciones. Además, cada algoritmo se realiza para 30 carreras independientes a comparaciones justas. Los parámetros seleccionados son elegidos porque produjeron un buen comportamiento en experimentos anteriores, tales como [34, 35, 55, 56] Parámetros AjusteMax. épocas = 100, Objetivo de error = 0, Paso inicial = 0,01, Disminución de la tasa = 0,9, Tasa de aumento = 1. En esta sección se discute el desempeño de la propuesta de FSASA para predecir el DS1 y DS2. Se puede concluir a partir de la Tabla 3 que el rendimiento de FSASA superó a los métodos comparados en todas las medidas, mientras que el FPA se clasifica en segundo lugar. Los resultados de DS2 indican que el FPASS se clasifica en primer lugar en términos de RMSE, MAPE, R 2 y el tiempo de CPU. Mientras que, el PSO se clasifica en segundo lugar, seguido por el FPA, GA, entonces ABC. Estos resultados denotan que el método propuesto puede optimizar los parámetros del modelo ANFIS de manera efectiva y producir buenos resultados en términos de las medidas de desempeño. Resultados de comparación entre Se puede concluir que el FCASSA supera a otros modelos, por ejemplo, analizando los resultados de RMSE, MAE, MAPE, RMSRE y tiempo(s) de CPU, se puede observar que el FCASSA alcanza el menor valor entre los algoritmos de comparación, y esto indica la alta calidad del FCASSA. Mientras tanto, el FPA asigna el segundo rango, lo que proporciona mejores resultados que el resto de los métodos. Además, el valor de R 2 se refiere a la alta correlación entre la predicción obtenida por el método propuesto de FPASSA y el COVID-19 original, que tiene casi 0,97. Esto también se puede notar a partir de la Figura 3, que representa la formación de los algoritmos utilizando los datos históricos del COVID-19 así como sus valores de pronóstico para diez días. En el cuadro 5 se muestra el valor de previsión de los casos confirmados del COVID-19 en China de 19/2/2020 a 28/2/2020. De estos resultados, se puede observar que el brote alcanzará su nivel más alto el día 28/2/2020. El porcentaje medio del aumento durante el período previsto es del 10%, el porcentaje más alto es del 12% el 28/2/2020, y el porcentaje más bajo es del 8,7% el 19/2/2020. De los resultados anteriores, se puede concluir que el FPASS-ANFIS propuesto tiene una alta capacidad para pronosticar el conjunto de datos del COVID-19. Estos resultados evitan las limitaciones del ANFIS tradicional debido a la combinación con el método modificado del FAP. Además, los operadores del SSA se combinan con la estrategia local del AFP para mejorar su capacidad de explotación. Este artículo propone una versión modificada para el algoritmo de polinización de flores (FPA) utilizando el algoritmo de enjambre de salp (SSA). Esta versión modificada, llamada FPASSA, se aplica para mejorar el rendimiento del ANFIS a través de la determinación del valor óptimo para sus parámetros. El modelo desarrollado de FPASSA-ANFIS se aplica como una técnica de pronóstico para un coronavirus nuevo, llamado COVID-19, que fue descubierto en Wuhan, China a finales del año pasado y enero del año actual. El modelo propuesto de FPASSA-ANFIS tiene una alta capacidad para predecir el número de casos confirmados en diez días. Además, FPASSA-ANFIS supera a otros modelos de pronóstico en términos de RMSE, MAE, MAPE, RMSRE y R 2. Además, para evaluar el método propuesto se utilizaron dos conjuntos de datos de casos confirmados semanalmente de gripe en EE.UU. y China, y los resultados de la evaluación mostraron su buen desempeño.De acuerdo con los prometedores resultados obtenidos por la propuesta FPASSA-ANFIS, se puede aplicar en diferentes aplicaciones de pronóstico.

¿Cuál es el método propuesto FPASSA?

La bomba de protones principal que acidifica los compartimentos intracelulares de las células eucariotas aumenta la adhesión de las células tumorales a las células endoteliales mediante la acumulación de colágeno extracelularhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6133348/SHA: f1b81916fac1ca3d50dde774df2e1bb26bf0fb39Autores: Luong, Betty; Schwenk, Rebecca; Bräutigam, Jacqueline; Müller, Rolf; Menche, Dirk; Bischoff, Iris; Fürst, RobertFecha: 2018-09-11DOI: 10.1371/journal.pone.0203053Licencia: cc-byAbstract: La H(+ Debido a que la inhibición de la v-ATPasa dio lugar a efectos antitumorales y antimetastáticos en diferentes modelos tumorales, esta enzima ha surgido como una estrategia prometedora contra el cáncer. Aquí, utilizamos el bien establecido archazolid inhibidor de la v-ATPasa, un producto natural aislado por primera vez del mixobacterio Archangium gephyra, para estudiar las consecuencias de la inhibición de la v-ATPasa en las células endoteliales (ECs), en particular en la interacción entre las CEs y las células cancerosas, que ha sido descuidado hasta ahora. Las células endoteliales humanas tratadas con archazolid mostraron una mayor adhesión de las células tumorales, mientras que la migración transendotelial de las células tumorales se redujo. El proceso de adhesión fue independiente de las moléculas de adhesión CE ICAM-1, VCAM-1, E-selectina y N En cambio, la adhesión fue mediada por las integraciones β1 expresadas en las células tumorales, ya que el bloqueo de la subunidad integrina β1 invirtió este proceso. Las células tumorales se adhirieron preferentemente al colágeno de ligando β1-integrante y archazolid, lo que llevó a un aumento de la cantidad de colágeno en la superficie de las CE. La acumulación de colágeno fue acompañada por una fuerte disminución de la expresión y actividad de la catepsina de proteasa B. La sobreexpresión de la catepsina B en las CE evitó la capacidad de archazolid para aumentar la adhesión de células tumorales a las CE. Nuestro estudio demuestra que la inhibición de la v-ATPasa por archazolid induce un fenotipo pro-adhesivo en células endoteliales que promueve su interacción con células cancerosas, mientras que la transmigración de células tumor Texto: La enzima tipo vacuolar H + -ATPasa (v-ATPasa) es la mayor bomba de protones responsable de la acidificación de los compartimentos intracelulares en células eucariotas [1]. La enzima consiste en dos complejos multisubunidades, el subcomplejo transmembrana V 1 soluble que se requiere para el transporte de protones a través de membranas [1, 2]. En la mayoría de los tipos de células las v-ATPasas se expresan únicamente en el sistema de endomembrana para regular y mantener el pH ácido de los compartimentos intracelulares como lisosomas, endosomas, el aparato Golgi, gránulos secretores y vesículas recubiertas [3]. La función de las v-ATPasas es esencial para procesos celulares como el tráfico vesicular, la endocitosis mediada por receptores y la degradación y En los tipos de células especializadas incluyendo osteoclastos y células epiteliales renales, las v-ATPasas también se pueden expresar en la membrana plasmática, donde bombean protones en el espacio extracelular [2] [3] [4]. En las células cancerosas las v-ATPasas se expresan en la membrana plasmática para eliminar la citosólica tóxica H +. Lo más importante, las v-ATPasas contribuyen al microambiente tumoral ácido, lo que conduce a la activación de proteasasas, facilitando así la migración, invasión y angiogénesis de las células tumorales [5] [7]. Dado que la inhibición de la v-ATPasa ha demostrado reducir la invasividad de las células cancerosas y la formación de metástasis [8, 9], esta enzima ha surgido como un fármaco prometedor en los últimos años. Archazolid A y B son inhibidores altamente potentes y específicos de las v-ATPasas [10]. Se aislaron por primera vez del mixobacterium Archangium gephyra [11]. Estos compuestos inhiben la v-ATPasa a bajas concentraciones nanomolares [10, 12] mediante la unión a la subunidad c del complejo V o. Como su actividad biológica es comparable a los inhibidores de la v-ATPasa bafilomicina y concanamicina [10, 11], los archazolids son compuestos naturales de alto interés que se pueden utilizar tanto como herramienta para estudiar las consecuencias de la inhibición de la v-ATPasa como como como plomo para el desarrollo de fármacos. Los arcazolids pueden ser producidos por fermentación [11] o por síntesis total [13, 14]. En el campo de la investigación del cáncer se reportan varios estudios sobre efectos farmacológicos interesantes del archazolid: Redujo la migración de diferentes células tumorales invasivas in vitro y de células cancerosas metástasis in vivo en Además, las vías activadas de archazolid de respuesta al estrés celular y apoptosis en células tumorales altamente invasivas [16]. En los macrófagos clásicamente activados, el archazolid indujo selectivamente la generación de factor de necrosis tumoral α (TNFα), que puede promover indirectamente la supresión tumoral [17]. Hasta ahora, el papel de las v-ATPasas en las células endoteliales sólo se ha investigado raramente. El endotelio juega un papel crucial en la patogénesis y progresión del cáncer: La cascada metastásica incluye la angiogénesis local en el sitio del tumor primario y la adhesión de células tumorales en el sitio de metástasis [18]. La angiogénesis, el desarrollo de nuevos vasos sanguíneos fuera de los existentes, depende de la proliferación, migración y diferenciación de células endoteliales [19 Las células cancerosas circulantes pueden adherirse al endotelio en sitios distantes. Esta interacción adhesiva está mediada por receptores y ligandos correspondientes expresados en células tumorales y endoteliales [18, 21]. Se ha informado que las V-ATPasas regulan el pH intracelular y la migración celular en células endoteliales microvasculares [22, 23]. Un estudio reciente mostró que la inhibición de la v-ATPasa por la concanamicina previno la proliferación, la reducción de la migración y el deterioro de la señalización relacionada con la angiogénesis en células endoteliales [24]. Hasta el momento, no hay investigaciones sobre el papel de las v-ATPasas endoteliales para el proceso de adhesión de células tumorales al endotelio. Así, nos interesaron las consecuencias de la inhibición de la v-ATPasa endoteliales por Varias moléculas de adhesión celular en el endotelio, como la molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1), la proteína de adhesión celular vascular (VCAM-1), la e-selectina o la N-cadherina [21], así como las integrinas expresadas en las células cancerosas, han sido reportadas para mediar la adhesión celular de las células cancerosas a las células endoteliales [25] [26]. Así, nos enfocamos en estas moléculas de adhesión celular e integrinas. Por primera vez, nuestro estudio reveló un vínculo entre la función de las v-ATPasas y las propiedades de adhesión y transmigración de las células endoteliales. CellTiter-Blue Cell Viability Assay (Promega, Mannheim, Alemania) se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante para determinar la viabilidad celular de las células después del tratamiento con archa Este ensayo se basa en la capacidad de las células metabólicamente activas para reducir la resazurina, lo que da lugar a resorufina fluorescente. El reactivo CellTiter-Blue se añadió a las células 4 h antes del final del tratamiento. La fluorescencia se midió con un lector de microplacas Infinite F200 (Tecan, Männedorf, Suiza) a 560 nm (excitación) y 590 nm (emisión). El ensayo de citotoxicidad no radioactiva CytoTox 96 (Promega) se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante para determinar la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) después del tratamiento con archazolid. El tampón de lisis se añadió a las células no tratadas 45 min antes del final del tratamiento para inducir la liberación de esta enzima. La LDH es una enzima citosólica que La LDH liberada cataliza la conversión enzimática de lactato a piruvato, que proporciona NADH para la conversión de violeta iodonitrotetrazolio en un producto de color rojo formazán en presencia de diaforasa. La absorbancia se midió con un lector de microplacas Varioskan Flash (Thermo Fisher Scientific) a 490 nm. LysoTracker Red DND-99 (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific) es un tinte para medir los valores de pH en células viables. Los HUVEC fueron cultivados para confluir en μ-deslizantes con recubrimiento de colágeno G (80826, ibidi, Martinsried, Alemania) antes de ser tratados con archazolid durante 24 h. 1 μg/ ml Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich, Munich, Alemania) fue utilizado para visualizar los núcleos y 50 nM LysoTracker Red DND-99 fue utilizado para visualizar los compartimentos ácidos que corresponden a los lisosomas. Ambos tintes fueron incubados durante 10 minutos a 37°C antes de la adquisición de imágenes individuales por un microscopio de fluorescencia Leica DMI6000 B (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania). Las células fueron incubadas con concentraciones indicadas de archazolid durante 24 h. Las células MDA-MB-231 o PC-3 no tratadas fueron etiquetadas con CellTracker Green CMFDA Dye (5 μM en DMEM libre de suero, 37 μC) durante 30 minutos antes de que se añadieran 100.000 células por pozo a los HUVEC y se les permitió adherirse durante varios puntos de tiempo a 37 μC. Las células tumorales no compatibles fueron lavadas tres veces con PBS que contenían Ca 2+ y Mg 2+. La adhesión de células tumorales se determinó mediante mediciones de fluorescencia con un lector de microplacas Infinite F200 pro (Tecan) a 485 nm (excitación) y 535 nm (emisión). Para bloquear la subunidad de integrina β1 en células MDA-MB-231 o PC-3, CellTracker se incubaron células MDA-MB-231 o PC-3 con un anticuerpo antiintegrante β1 (P5D2, ab24693, Abcam, Cambridge, Reino Unido) a una concentración de 1 μg de anticuerpo por millón de células en 1 ml de DMEM. Antes de añadir a las células HUVEC tratadas con archazolid, MDA-MB-231 o PC-3 se lavaron una vez con DMEM. Para bloquear la subunidad de integrina β1 en las células HUVEC, las células se incubaron con el anticuerpo antiintegrante β1 (0,1 μg/pozo en ECGM). Las HUVEC se lavaron una vez con ECGM antes de añadir células MDA-MB-231 o PC Para la adhesión de células MDA-MB-231 o PC-3 a los componentes de la matriz extracelular (ECM) las placas de 24 pocillos fueron recubiertas con colágeno G (10 μg/ml en PBS), fibronectina plasmática humana (10 μg/ml PBS) o laminin-411 (10 μg/ml en PBS de Dulbecco [DPBS] que contenía Ca 2+ y Mg 2+ ) a 4oC durante la noche. La adhesión de células MDA-MB-231 y PC-3 a estos tres componentes ECM más prominentes se llevó a cabo como se describe anteriormente (10 min de adhesión a 37oC). Los HUVECs fueron cultivados sobre una membrana filtrante porosa (Inserto Transwell, membrana de policarbonato, 8 μm poros; Corning, Nueva York, EE.UU.) durante 48 h y Las células MDA-MB-231 no tratadas fueron etiquetadas con CellTracker Green CMFDA Dye (como se describe en el ensayo de adhesión celular de sección) y resucitadas en el medio 199 (PAN-Biotech) que contenía 0,1% BSA. Los HUVECs fueron lavados dos veces con medio 199 que contenía 0,1% BSA antes de que las células MDA-MB-231 pudieran transmigrar a través de la monocapa endotelial durante 24 h. Medio 199 que contenía 0,1% BSA fue utilizado como control negativo y medio 199 que contenía 20% FCS fue utilizado como quimioatractante para la transmigración en el compartimento inferior. Las células no migradas que permanecían en el compartimento superior fueron cuidadosamente removidas mediante un hisopo de algodón. Las células transmigradas se lisaron en el ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) tampón y la transmigración se cuantificó midiendo la señal de fluorescencia a 485 nm (excitación) y 535 nm (emisión). Los HUVEC fueron cultivados para confluir en placas de 6 pozos antes de ser tratados con archazolid durante 12 h. Las células fueron inducidas a aumentar la expresión génica de las moléculas de adhesión celular por TNFα. El ARN fue aislado usando el kit RNeasy de Qiagen (Hilden, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La digestión de la Dnasa en la columna se realizó para eliminar el ADN genómico. El ARN fue transcrito al cDNA por Superscript II (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific). Los experimentos con qPCR se realizaron utilizando un Sistema StepOnePlus (Aplicated Biosystems, Thermo Fisher Scientific) y los datos fueron analizados por StepOne y Ste-pOnePlus Software v2.3. Power SYBR Green PCR Master Mix (Life Technologies) y se utilizó el método comparativo de cuantificación C T (2 -+CT ). Los HUVEC fueron cultivados para confluir en placas de 12 pocillos antes de ser tratados con archazolid durante 24 h. Las células fueron tratadas con TNFα durante 24 h para inducir la expresión de moléculas de adhesión celular. Posteriormente, las células fueron separadas con HyClone HyQTase (GE Healthcare, Freiburg, Alemania). En el caso de ICAM-1, las células separadas se fijaron con un 4% de formaldehído (Polysciences, Hirschberg an der Bergstraße, Alemania) en PBS durante 10 min y se lavaron una vez con PBS antes de incubar con el anticuerpo anti-humano CD54 (ratón, ICAM-1) marcado con fluoresceína isotiocianato (FITC) (MCA1615F, Biozol, Eching, Alemania) a temperatura ambiente durante 45 min. Para todas las demás proteínas, las células no se fijaron y lavaron una vez con PBS antes de incubar con los anticuerpos anti-humanos CD106 (ratón, VCAM-1), anti-humanos CD62E (ratón, E-selectina) y anti-humanos CD325 (ratón, N-cadherina) de Becton Dickinson en hielo durante 45 min. Estos anticuerpos se diluyeron en PBS que contenían un 0.2% de BSA. La expresión superficial de moléculas de adhesión celular se midió mediante citometría de flujo (FACSVerse, Becton Dickinson, Heidelberg, Alemania). Para manchar la superficie de colágeno en los HUVEC, las células se incubaron con un anticuerpo de colágeno antihumano (rabbit, 1:40, ab36064, Abcam) en hielo durante 30 min. El procedimiento de tinción se realizó en hielo para asegurar que las proteínas superficiales o anticuerpos no se endocitosan. Las células se lavaron una vez con PBS que contenían Ca 2+ y Mg 2+ antes de que se fijaran con Roti-Histofix (Carl Roth). Alexa Fluor 488-conjugado anti-rabbits (cabra, 1:400, A11008, Life Technologies) se utilizó como anticuerpo secundario y Hoechst 33342 (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) se utilizó para visualizar núcleos. Las células se lavaron con PBS helados y se lisaron con tampón RIPA complementado con inhibidores de la proteasa (completa Mini EDTA-libre; Roche, Mannheim, Alemania), ortovanadato de sodio, fluoruro de sodio, fenilmetilsulfonil fluoruro, β-glicerofosfato, pirofosfato de sodio y H 2 O 2. La determinación de proteínas se realizó utilizando el Kit de Ensayo de Proteínas Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific). Cantidades iguales de proteínas (10-20 μg) fueron separadas por electroforesis de gel dodecil sulfatepoliacrilamida de sodio (SDS-PAGE; Laboratorios Bio-Rad, Munich, Alemania). Las membranas fueron bloqueadas con 5% de leche atornillada en polvo (Carl Roth) en TBS que contenía 0,1% Tween 20 (Sigma-Aldrich). Se utilizaron los siguientes anticuerpos: anticuerpo anti-catepsina B (IM27L, Merck) (1:500), anticuerpo anti-β-actina-peroxidasa de ratón (A3854, Sigma-Aldrich) (1:10.000) y anticuerpo vinculado a la peroxidasa de rábano de caballo IgG (HRP) (7076, Cell Signaling, Frankfurt, Alemania) (1:5.000). ImageJ versión 1.49m se utilizó para el análisis densitométrico. El ensayo de actividad de la catepsina B se realizó como se describe en la publicación de Kubisch et al. [28]. Las células se lavaron con PBS y se lisaron con el reactivo de extracción de proteínas de mamíferos M-PER no desnaturalizante (78501, Thermo Fisher Scientific) suplementado con inhibidores de la proteasa (completa Mini EDTA-libre, Roche), ortovanadato de sodio, fluoruro de sodio, fluoruro de fenilmetilsulfonilo. El sustrato de catepsina B fluorogénica Z-Arg-Arg-7-amido-4-metilcoumarina clorhidrato (C5429, Sigma-Aldrich) se añadió a 30 μg de lisato celular diluido en tampón de ensayo complementado con 2 mM de L-cisteína (C7880, Sigma-Aldrich) e incubado durante 30 min a 40°C. La fluorescencia se midió a 348 nm (excitación) y 440 nm (emisión) con un lector de microplacas (Varioskan Flash, Thermo Fisher Scientific). La intensidad de la señal de fluorescencia correspondió a la actividad de la enzima catepsina B. Para la sustracción de fondo el inhibidor de la catepsina B CA-074Me (Enzo Life Sciences, Lörrach, Alemania) se añadió a una reacción adicional. El kit de nucleofectores HUVEC (Lonza, Colonia, Alemania) se utilizó para transfectar a los HUVEC. La transfección se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante utilizando 2,5 μg de plásmido ADN para 500.000 células (Nucleofector 2b Device, Lonza). 48 h después de la transfección las células fueron tratadas para experimentos posteriores. El plásmido addgene #11249 hCathepsin B fue amablemente proporcionado por Hyeryun Choe [29]. hCathepsin B fue digerido con PmeI y XbaI y el fragmento de ADN lineal no correspondiente al gen CTSB humano fue religado para generar el plásmido vacío pcDNA3.1 (-) delta MCS que se utilizó para controlar las transfecciones. La columna vertebral original de hCathepsin B es el pcDNA3.1 (-) de Thermo Fisher Scientific. El vector de control pcDNA3.1 (-) delta MCS utilizado para nuestras transfecciones fue clonado sobre la base de hCathepsin B y por lo tanto carece casi de toda la parte del sitio de clonación múltiple del pcDNA3.1 (-). Los análisis estadísticos se realizaron Para la evaluación de un mínimo de tres experimentos independientes se utilizó el ANOVA de ida seguido de la prueba post-hoc de Tukey o t-test sin emparejar. El número de experimentos realizados de forma independiente (n) se indica en las correspondientes leyendas de la figura. p 0.05 se consideró estadísticamente significativo. Los datos se expresan como media ± error estándar de la media (SEM). Dado que el inhibidor de la v-ATPasa archazolid nunca ha sido utilizado para estudios en células endoteliales, primero realizamos ensayos de citotoxicidad. Tratamos a los HUVEC confluentes con un archazolid de hasta 1 nM durante 24 y 48 h y observamos que este tratamiento no tiene influencia en la actividad metabólica ni en la liberación de LDH después de 24 h (Fig 1A y 1B, paneles izquierdos). La actividad metabólica y la liberación de LDH sólo se vieron levemente afectadas por la mayor concentración de archazolid después de 48 h (Fig 1A y 1B, paneles derecho). En consecuencia, los siguientes experimentos se llevaron a cabo después de 24 h (o menos) de tratamiento con archazolid con el fin de excluir cualquier efecto citotóxico de archazolid dentro de nuestros entornos experimentales. El análisis microscópico reveló que también la integridad de la monocapa endotelial no se vio afectada por el archazolid, pero las células mostraron una morfología ligeramente diferente (Fig 2A): las células tratadas con archazolid se hincharon en comparación con las células de control, lo que no fue inesperado, ya que la vacuolación del retículo endoplasmático (ER) se ha descrito para otros tipos de células y es típica para inhibidores de la v- Este efecto fue evidente tanto en las células subconfluentes como en las confluentes (Fig 2A). La inhibición de la v-ATPasa impide la acidificación de los lisosomas [1, 31]. Utilizando el tinte permeable a las células LysoTracker Red DND-99, es posible etiquetar los lisosomas ácidos en las células vivas. Así, este tinte puede servir como indicador de inhibición de la v-ATPasa. Para demostrar que el archazolid también es funcionalmente activo como inhibidor de la v-ATPasa en los HUVECs, las células fueron tratadas con archazolid de 1 nM antes de ser incubadas con LysoTracker Red DND-99 y Hoechst 33342. Como se muestra en la figura 2B, la tinción vesicular roja correspondiente a los lisosomas acidificados en las células En resumen, el tratamiento con archazolid durante 24 h no fue citotóxico para los HUVEC quiescentes, pero inhibió la funcionalidad de la v-ATPasa. Analizamos la adhesión de células MDA-MB-231 a los HUVEC. Se trató a los HUVEC confluentes con un archazolid de hasta 1 nM durante 24 h. Las células MDA-MB-231 no tratadas fueron etiquetadas con el color verde CMFDA de Cell-Tracker. Curiosamente, la inhibición de la v-ATPasa aumentó fuertemente la unión de la línea de células de carcinoma de mama metastásico MDA-MB-231 a los HUVEC después de 10 y 120 min de adhesión (Fig 3A y 3B). También investigamos la influencia de los archazolid en la migración transendotelial de células MDA-MB-231. Las células HUVEC sembradas en una cámara de Boyden fueron tratadas con 1 nM de archazolid durante 24 h. CellTracker Células MDA-MB-231 de marca verde (no tratadas con archazolid) fueron autorizadas a transmigrar a través de la monocapa endotelial durante 24 h. Como se muestra en la figura 3C, archazolid disminuyó significativamente la migración transendotelial de las células MDA-MB-231. La influencia de los archazolid en la adhesión de las células tumorales no sólo se estudió en las células HUVEC, que representan células macrovasculares endotelial, sino también en células microvasculares HMEC-1. Además, además de la línea de células de cáncer de mama MDA-MB-231, también se utilizaron células de cáncer de próstata PC-3 como segunda línea de células de cáncer El tratamiento con Archazolid de las células endoteliales aumentó la unión de las células MDA-MB-231 a la monocapa HMEC-1 después de 120 min de adhesión (fig. 4A) y aumentó la unión de las células PC-3 a la monocapa HUVEC después de 30 y 60 min de adhesión (fig. 4B). Cabe destacar que la adhesión de las células Jurkat no metastáticas, una línea celular de leucemia de células T aguda, no se vio afectada tras el tratamiento de las células HUVEC con archazolid (S1A Fig.). Tomadas juntas, el tratamiento con archazolid aumentó las propiedades adhesivas de las células endoteliales micro y macrovasculares para las células tumorales metastásicas, pero no para las no metastáticas. La adhesión de las células tumorales al endotelio es en principio similar a la de los leucocitos, pero difiere ligeramente en las moléculas que median el proceso de adhesión. Se encontró que los ligandos para las moléculas de adhesión de células endoteliales ICAM-1, VCAM-1, E-selectina y N-cadherina se expresan en las células tumorales y para mediar la interacción de células endoteliales-tumorales [21]. La inhibición de la v-ATPasa puede afectar la expresión de moléculas de adhesión de células endoteliales en los niveles de ARNm o proteína. Para determinar la expresión de ARNm de ICAM-1, VCAM-1, E-selectina y Ncadherina, los HUVECs fueron tratados con archazolid durante 12 h. TNFα es conocido por aumentar la regulación de la expresión de La PCR cuantitativa en tiempo real mostró que la inhibición de la V-ATPasa en los HUVECs no alteró los niveles de ARNm de ICAM-1, VCAM-1, E-selectina y N-cadherina (Fig 5A). La expresión proteica de estas moléculas de adhesión en la superficie de las células endoteliales fue analizada por citometría de flujo. Archazolid (1 nM, 24 h) no afectó a la expresión celular de ICAM-1, VCAM-1, E-selectina y N-cadherina (Fig 5B). Además de ICAM-1, VCAM-1, E-selectina y N-cadherina, también las integrinas son capaces de mediar el proceso de adhesión celular [33] [35]. Dado que ninguna de las moléculas de adhesión celular expresadas en los HUVEC se regulaba mediante el tratamiento con archazolid, se consideró que las integrinas eran socios potenciales de interacción. En esta familia de proteínas se ha informado que las integraciones β1 median la adhesión de células tumorales a células endoteliales quiescentes [25]. Con el fin de dilucidar el papel de las integraciones β1-para la adhesión de células tumorales inducidas por archazolid, la subunidad de integrina β1- fue bloqueada ya sea en células MDA-MB-231, células PC-3 o en HUVEC. (Obra de notar, como en todos los experimentos a lo largo de este estudio, sólo las células endoteliales fueron tratadas con archazolid.) Después de bloquear las integraciones β1 en las células MDA-MB-231 o PC-3, la adhesión a las células tumorales inducida por archazolid se redujo casi al nivel de control (Fig 6A y 6B, paneles izquierdos), mientras que el bloqueo de las integraciones β1 en los HUVEC no tuvo un efecto significativo en el aumento de la adhesión a las células tumorales por inhibición de la V-ATPasa (Fig 6A y 6B, paneles derecho). Dependiendo de su subunidad α, las integraciones β1 tienen una variedad de ligandos incluyendo componentes de matriz extracelular (ECM) como colágeno, fibronectina y lamina [35]. Por lo tanto, hipotetizamos que el tratamiento archazolid de células endoteliales podría conducir a una regulación ascendente de estos componentes. Las células MDA-MB-231 y Este ensayo de adhesión celular reveló que las células MDA-MB-231 así como las células PC-3 favorecen la interacción con el colágeno del componente ECM, ya que la adhesión al colágeno es mucho más alta que en el control plástico no recubierto (Fig 7A). Las células MDA-MB-231 y PC-3 también se adhirieron al plástico recubierto con fibronectina, pero en un grado mucho menor en comparación con el recubrimiento de colágeno. Por lo tanto, nos centramos en la interacción entre estas dos líneas celulares tumorales y colágeno. Bloqueo de la subunidad integrina β1 en las células MDA-MB-231 y PC-3 claramente abolió la interacción con colágeno (Fig 7B), indicando que la unión de estas células tumorales al colágeno está mediada por β1-integrantes. Dado que el colágeno es el principal componente del ECM MDA-MB-231 y las células PC-3 interactúan con, el siguiente paso fue probar si la inhibición de la V-ATPasa influye en la cantidad de colágeno expresada por los HUVEC como matriz extracelular. Para detectar colágeno en la superficie endotelial, los archazolidos tratados con HUVEC fueron etiquetados con un anticuerpo contra el colágeno tipo I-IV en el hielo para prevenir la endocitosis y para asegurar que el anticuerpo no se une al colágeno intracelular. Curiosamente, los archazolidos aumentaron la cantidad de colágeno superficial en los HUVEC en aproximadamente un 50% (Fig 7C). Las manchas de control se realizaron utilizando un anticuerpo contra la subunidad citosólica p65 del factor de transcripción nuclear factor B (NFoB) para mostrar que las proteínas intracelulares no fueron detectadas por este método Se informó que la inhibición de la v-ATPasa por archazolid perjudica la actividad de la catepsina B [28, 36], una enzima lisosómica que degrada los componentes de la matriz extracelular incluyendo colágeno [37] [38] [39] [40] [41]. Como el colágeno es degradado por la catepsina B y la activación de la catepsina B depende de la actividad de la v-ATPasa [28, [36] [37] [38] 42], se sugirió que una acumulación de colágeno en la superficie de las células endoteliales podría ser consecuencia de una funcionalidad alterada de la catepsina B. Por lo tanto, se realizó un ensayo de actividad enzimática basado en la proteólisis de un sustrato de la fluorogénica catepsina B. En los HUVECs tratados con archazolidos y HMEC-1, la actividad de la catepsina B fue inducida tanto por el ARNm (1 ng/ml TNF) como por la expresión de la superficie celular (10 ng/ml TNF) de ICAM-1, VCAM-1, E-selectina y Ncadherin. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0203053.g005 La inhibición de la vATPasa endotelial aumenta la adhesión de células tumorales a las células endoteliales fuertemente disminuida en aproximadamente un 50% en comparación con las células de control a una concentración archazolida de 1 nM (Fig 8A). En línea con este resultado, el análisis de manchas occidentales mostró que el archazolido (1 nM) reduce la expresión proteica de la forma madura Para comprobar si la adhesión a las células tumorales inducida por archazolidos es consecuencia de la disminución de la cantidad de catepsina B, los HUVEC fueron transfectados con un plásmido de codificación para la catepsina B humana o con el vector vacío como control. Después de 48 h, las células transfectadas fueron tratadas con 1 nM de archazolido. El nivel de catepsina B después de la transfección y el tratamiento fue evaluado por el análisis de Western blot (Fig 9A). La sobreexpresión de la catepsina B disminuyó fuertemente tanto la adhesión basal como la inducida por archazolidos de las células MDA-MB-231 (Fig 9B). Así, se realizaron investigaciones intensivas relacionadas con las v-ATPasas en células cancerosas, mientras que son pocos los estudios que investigan las v-ATPasas en células endoteliales que indican un papel en la migración, proliferación y posiblemente angiogénesis [22] [23]. En el presente estudio se utilizó el producto natural mixobacterial archazolid para investigar las consecuencias de la inhibición de la v-ATPasa en el endotelio en las interacciones entre células tumor-endoteliales. Por primera vez, pudimos mostrar un vínculo entre la v-ATPasa y las propiedades de adhesión y transmigración del endotelio. La inhibición de la v-ATPasa en células endoteliales por archazolid aumentó significativamente la adhesión de células cancerosas metastásicas y disminuyó la migración transendotelial de células cancerosas que se atribuyó a niveles aumentados de colágeno Cabe destacar que la adhesión de la línea celular Jurkat no metastática a las células endoteliales tratadas con archazolid permaneció inalterada. La adhesión inducida por archazolid de las células tumorales fue independiente de las moléculas de adhesión de células endoteliales ICAM-1, VCAM-1, E-selectina y N-cadherina, ya que su expresión no fue regulada por el compuesto. Sin embargo, encontramos que la adhesión de células tumorales inducida por archazolid fue mediada por β1-integrantes expresadas en cáncer de mama MDA-MB-231 y células de cáncer de próstata PC-3 como bloqueo de la subunidad integrina β1 en estas células tumorales revirtieron el efecto proadhesivo de archazolid. En experimentos de adhesión en plástico recubierto con componentes de matriz extracelular, podríamos demostrar que las células MDA-MB-231 y PC-3 favorecieron claramente la interacción con el colágeno, mientras que la adhesión de las células Jurkat no metastáticas era en gran medida independiente de las proteínas de matriz extracelular (S1B Fig). Las diferentes propiedades de adhesión de las células cancerosas metastásicas y las células Jurkat podrían ser el resultado del patrón de expresión de integración de cada línea celular. Las células MDA-MB-231 y PC-3 expresan α2β1- y α3β1-integrantes, que representan receptores de colágeno [43, 44], mientras que las células Jurkat expresan α4β1-integrantes pero carecen de α2β1-, α3β1-integrantes [44]. Las α4β1integrantes son receptores para VCAM-1 y fibronectina [35] y se ha demostrado que las células Jurkat interactúan con las células endoteliales humanas que expresan VCAM-1 después del tratamiento con citoquinas o células transfectadas con VCAM-1 [45]. Nuestros resultados están en línea con estudios anteriores que muestran que las células α2β1- y α3β1-integrantes que expresan MDA-MB-231 y PC-3 fueron capaces de unirse rápidamente al colágeno en la matriz ósea cortical. En contraste, las células Jurkat no fueron capaces de adherirse [44] y podrían interactuar preferentemente con moléculas de adhesión celular en lugar de con proteínas ECM. Las α2β1- y α3β1-integrantes pueden actuar además como receptores de lamina [46] y al menos α3β1integrantes reconocen fibronectina [46, 47] Aunque expresan receptores de fibronectina y laminina, las células MDA-MB-231 y PC-3 se adhirieron a la fibronectina en una medida mucho menor y no se adhirieron a laminina, probablemente debido a una menor afinidad a estos componentes de la matriz extracelular. Importantemente, la inhibición de la V-ATPasa por archazolid aumentó los niveles superficiales del colágeno del componente de la matriz extracelular, lo que podría explicar que el aumento de las células MDA-MB-231 y PC-3 en las HUVEC tratadas con archazolid es independiente de las moléculas de adhesión celular endotelial. Al realizar un ensayo de proteólisis de células vivas, Cavallo-Medved et al. demostraron degradación del ECM, en particular de gelatina y colágeno IV, en asociación con la catepsina B activa en las caveolas de células endotelial durante la Además, estudios recientes reportaron que la inhibición de la v-ATPasa perjudica la actividad de la catepsina B en las células cancerosas [28, 36]. Por lo tanto, sugerimos que la acumulación de colágeno en la superficie endotelial podría ser consecuencia de la actividad o expresión de la catepsina B alterada en las células endoteliales. De hecho, confirmamos el deterioro de la actividad de la catepsina B por archazolid ya que los niveles de expresión de la forma activa madura de esta enzima fueron fuertemente reducidos. La catepsina B se sintetiza como preprocatepsina B en ribosomas unidos a la membrana. Tras el transporte al aparato Golgi, la preprocatepsina B es glicosilada con oligosacáridos que contienen mannosa. La focalización de la procatepsina B a los lisosomas es dependiente del receptor mannoso-6-fosfato y su disociación del receptor, así como su procesamiento proteolítico hacia la catepsina B madura requiere la acidificación del compartimento [48]. En las células cancerosas la inhibición de la v-ATPasa por archazolid altera el tráfico mediado por el receptor mannoso-6-fosfato desde la red trans-Golgi a los compartimentos prelisosomales resultando en una disminución de proteasasas activa como la catepsina B [28]. Asumimos que la disminución inducida por la archazolida en la actividad y expresión de la catepsina B se basó en el mismo mecanismo. Curiosamente, la sobreexpresión de la catepsina B atenuó la adhesión de las células de cáncer de mama inducida por archazolido a las células endoteliales, indicando que la adhesión se correlaciona negativamente con la expresión de la catepsina B. Como la catepsina B también puede degradar otros componentes de la matriz extracelular como la fibronectina y lamina [38, 49], la inhibición de la v-ATPasa podría conducir a una acumulación de estas proteínas y un aumento de la adhesión de células que expresan receptores de fibronectina o lamina. Sin embargo, no nos centramos en estos componentes ECM ya que no eran relevantes para la adhesión de las células MDA-MB-231 y PC-3. Estas células se adhirieron predominantemente al colágeno, mientras que la adhesión de las células Jurkat es principalmente independiente de las proteínas ECM colágeno, fibro En las células de cáncer hepático, el archazolid reduce la señalización de Ras/Raf/MEK/ERK alterando la composición de la membrana y la fluidez [51]. Asumimos que el archazolid afecta a las células endoteliales de manera similar, lo que conduce a la inhibición de la señalización de Ras y, por lo tanto, a la reducción de la migración transendotelial de las células MDA-MB-231. Tomado en conjunto, nuestro estudio muestra que el archazolid reduce la actividad y la expresión de la catepsina B en las células endoteliales. Como resultado, la cantidad de colágeno en la superficie de las células endoteliales fue significativamente regulada, lo que finalmente resultó en un aumento de la adhesión de las líneas de células de cáncer metastásicas β1-integrantes MDA-MB-231 y PC Este estudio muestra que la v-ATPasa desempeña un papel importante en la regulación de la adhesión de las células que expresan receptores para los componentes de la matriz extracelular. Archazolid representa una herramienta prometedora para dilucidar el papel de la v-ATPasa en las células endoteliales. Además, por primera vez vinculamos la función de la v-ATPasa a la adhesión y transmigración de las células tumorales a las células endoteliales, así como a la remodelación de la matriz extracelular en la superficie de las células endoteliales. El hecho de que la adhesión de las células tumorales metastásicas a las células endoteliales se incrementa mientras que su migración transendotelial se reduce tras la inhibición de la v-ATPasa endotelial por archazolid apoya aún más la visión de arcazolid como un potencial compuesto antimetastático.

¿Cuántos complejos hay dentro de la V-ATPasa?

La bomba de protones principal que acidifica los compartimentos intracelulares de las células eucariotas aumenta la adhesión de las células tumorales a las células endoteliales mediante la acumulación de colágeno extracelularhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6133348/SHA: f1b81916fac1ca3d50dde774df2e1bb26bf0fb39Autores: Luong, Betty; Schwenk, Rebecca; Bräutigam, Jacqueline; Müller, Rolf; Menche, Dirk; Bischoff, Iris; Fürst, RobertFecha: 2018-09-11DOI: 10.1371/journal.pone.0203053Licencia: cc-byAbstract: La H(+ Debido a que la inhibición de la v-ATPasa dio lugar a efectos antitumorales y antimetastáticos en diferentes modelos tumorales, esta enzima ha surgido como una estrategia prometedora contra el cáncer. Aquí, utilizamos el bien establecido archazolid inhibidor de la v-ATPasa, un producto natural aislado por primera vez del mixobacterio Archangium gephyra, para estudiar las consecuencias de la inhibición de la v-ATPasa en las células endoteliales (ECs), en particular en la interacción entre las CEs y las células cancerosas, que ha sido descuidado hasta ahora. Las células endoteliales humanas tratadas con archazolid mostraron una mayor adhesión de las células tumorales, mientras que la migración transendotelial de las células tumorales se redujo. El proceso de adhesión fue independiente de las moléculas de adhesión CE ICAM-1, VCAM-1, E-selectina y N En cambio, la adhesión fue mediada por las integraciones β1 expresadas en las células tumorales, ya que el bloqueo de la subunidad integrina β1 invirtió este proceso. Las células tumorales se adhirieron preferentemente al colágeno de ligando β1-integrante y archazolid, lo que llevó a un aumento de la cantidad de colágeno en la superficie de las CE. La acumulación de colágeno fue acompañada por una fuerte disminución de la expresión y actividad de la catepsina de proteasa B. La sobreexpresión de la catepsina B en las CE evitó la capacidad de archazolid para aumentar la adhesión de células tumorales a las CE. Nuestro estudio demuestra que la inhibición de la v-ATPasa por archazolid induce un fenotipo pro-adhesivo en células endoteliales que promueve su interacción con células cancerosas, mientras que la transmigración de células tumor Texto: La enzima tipo vacuolar H + -ATPasa (v-ATPasa) es la mayor bomba de protones responsable de la acidificación de los compartimentos intracelulares en células eucariotas [1]. La enzima consiste en dos complejos multisubunidades, el subcomplejo transmembrana V 1 soluble que se requiere para el transporte de protones a través de membranas [1, 2]. En la mayoría de los tipos de células las v-ATPasas se expresan únicamente en el sistema de endomembrana para regular y mantener el pH ácido de los compartimentos intracelulares como lisosomas, endosomas, el aparato Golgi, gránulos secretores y vesículas recubiertas [3]. La función de las v-ATPasas es esencial para procesos celulares como el tráfico vesicular, la endocitosis mediada por receptores y la degradación y En los tipos de células especializadas incluyendo osteoclastos y células epiteliales renales, las v-ATPasas también se pueden expresar en la membrana plasmática, donde bombean protones en el espacio extracelular [2] [3] [4]. En las células cancerosas las v-ATPasas se expresan en la membrana plasmática para eliminar la citosólica tóxica H +. Lo más importante, las v-ATPasas contribuyen al microambiente tumoral ácido, lo que conduce a la activación de proteasasas, facilitando así la migración, invasión y angiogénesis de las células tumorales [5] [7]. Dado que la inhibición de la v-ATPasa ha demostrado reducir la invasividad de las células cancerosas y la formación de metástasis [8, 9], esta enzima ha surgido como un fármaco prometedor en los últimos años. Archazolid A y B son inhibidores altamente potentes y específicos de las v-ATPasas [10]. Se aislaron por primera vez del mixobacterium Archangium gephyra [11]. Estos compuestos inhiben la v-ATPasa a bajas concentraciones nanomolares [10, 12] mediante la unión a la subunidad c del complejo V o. Como su actividad biológica es comparable a los inhibidores de la v-ATPasa bafilomicina y concanamicina [10, 11], los archazolids son compuestos naturales de alto interés que se pueden utilizar tanto como herramienta para estudiar las consecuencias de la inhibición de la v-ATPasa como como como plomo para el desarrollo de fármacos. Los arcazolids pueden ser producidos por fermentación [11] o por síntesis total [13, 14]. En el campo de la investigación del cáncer se reportan varios estudios sobre efectos farmacológicos interesantes del archazolid: Redujo la migración de diferentes células tumorales invasivas in vitro y de células cancerosas metástasis in vivo en Además, las vías activadas de archazolid de respuesta al estrés celular y apoptosis en células tumorales altamente invasivas [16]. En los macrófagos clásicamente activados, el archazolid indujo selectivamente la generación de factor de necrosis tumoral α (TNFα), que puede promover indirectamente la supresión tumoral [17]. Hasta ahora, el papel de las v-ATPasas en las células endoteliales sólo se ha investigado raramente. El endotelio juega un papel crucial en la patogénesis y progresión del cáncer: La cascada metastásica incluye la angiogénesis local en el sitio del tumor primario y la adhesión de células tumorales en el sitio de metástasis [18]. La angiogénesis, el desarrollo de nuevos vasos sanguíneos fuera de los existentes, depende de la proliferación, migración y diferenciación de células endoteliales [19 Las células cancerosas circulantes pueden adherirse al endotelio en sitios distantes. Esta interacción adhesiva está mediada por receptores y ligandos correspondientes expresados en células tumorales y endoteliales [18, 21]. Se ha informado que las V-ATPasas regulan el pH intracelular y la migración celular en células endoteliales microvasculares [22, 23]. Un estudio reciente mostró que la inhibición de la v-ATPasa por la concanamicina previno la proliferación, la reducción de la migración y el deterioro de la señalización relacionada con la angiogénesis en células endoteliales [24]. Hasta el momento, no hay investigaciones sobre el papel de las v-ATPasas endoteliales para el proceso de adhesión de células tumorales al endotelio. Así, nos interesaron las consecuencias de la inhibición de la v-ATPasa endoteliales por Varias moléculas de adhesión celular en el endotelio, como la molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1), la proteína de adhesión celular vascular (VCAM-1), la e-selectina o la N-cadherina [21], así como las integrinas expresadas en las células cancerosas, han sido reportadas para mediar la adhesión celular de las células cancerosas a las células endoteliales [25] [26]. Así, nos enfocamos en estas moléculas de adhesión celular e integrinas. Por primera vez, nuestro estudio reveló un vínculo entre la función de las v-ATPasas y las propiedades de adhesión y transmigración de las células endoteliales. CellTiter-Blue Cell Viability Assay (Promega, Mannheim, Alemania) se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante para determinar la viabilidad celular de las células después del tratamiento con archa Este ensayo se basa en la capacidad de las células metabólicamente activas para reducir la resazurina, lo que da lugar a resorufina fluorescente. El reactivo CellTiter-Blue se añadió a las células 4 h antes del final del tratamiento. La fluorescencia se midió con un lector de microplacas Infinite F200 (Tecan, Männedorf, Suiza) a 560 nm (excitación) y 590 nm (emisión). El ensayo de citotoxicidad no radioactiva CytoTox 96 (Promega) se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante para determinar la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) después del tratamiento con archazolid. El tampón de lisis se añadió a las células no tratadas 45 min antes del final del tratamiento para inducir la liberación de esta enzima. La LDH es una enzima citosólica que La LDH liberada cataliza la conversión enzimática de lactato a piruvato, que proporciona NADH para la conversión de violeta iodonitrotetrazolio en un producto de color rojo formazán en presencia de diaforasa. La absorbancia se midió con un lector de microplacas Varioskan Flash (Thermo Fisher Scientific) a 490 nm. LysoTracker Red DND-99 (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific) es un tinte para medir los valores de pH en células viables. Los HUVEC fueron cultivados para confluir en μ-deslizantes con recubrimiento de colágeno G (80826, ibidi, Martinsried, Alemania) antes de ser tratados con archazolid durante 24 h. 1 μg/ ml Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich, Munich, Alemania) fue utilizado para visualizar los núcleos y 50 nM LysoTracker Red DND-99 fue utilizado para visualizar los compartimentos ácidos que corresponden a los lisosomas. Ambos tintes fueron incubados durante 10 minutos a 37°C antes de la adquisición de imágenes individuales por un microscopio de fluorescencia Leica DMI6000 B (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania). Las células fueron incubadas con concentraciones indicadas de archazolid durante 24 h. Las células MDA-MB-231 o PC-3 no tratadas fueron etiquetadas con CellTracker Green CMFDA Dye (5 μM en DMEM libre de suero, 37 μC) durante 30 minutos antes de que se añadieran 100.000 células por pozo a los HUVEC y se les permitió adherirse durante varios puntos de tiempo a 37 μC. Las células tumorales no compatibles fueron lavadas tres veces con PBS que contenían Ca 2+ y Mg 2+. La adhesión de células tumorales se determinó mediante mediciones de fluorescencia con un lector de microplacas Infinite F200 pro (Tecan) a 485 nm (excitación) y 535 nm (emisión). Para bloquear la subunidad de integrina β1 en células MDA-MB-231 o PC-3, CellTracker se incubaron células MDA-MB-231 o PC-3 con un anticuerpo antiintegrante β1 (P5D2, ab24693, Abcam, Cambridge, Reino Unido) a una concentración de 1 μg de anticuerpo por millón de células en 1 ml de DMEM. Antes de añadir a las células HUVEC tratadas con archazolid, MDA-MB-231 o PC-3 se lavaron una vez con DMEM. Para bloquear la subunidad de integrina β1 en las células HUVEC, las células se incubaron con el anticuerpo antiintegrante β1 (0,1 μg/pozo en ECGM). Las HUVEC se lavaron una vez con ECGM antes de añadir células MDA-MB-231 o PC Para la adhesión de células MDA-MB-231 o PC-3 a los componentes de la matriz extracelular (ECM) las placas de 24 pocillos fueron recubiertas con colágeno G (10 μg/ml en PBS), fibronectina plasmática humana (10 μg/ml PBS) o laminin-411 (10 μg/ml en PBS de Dulbecco [DPBS] que contenía Ca 2+ y Mg 2+ ) a 4oC durante la noche. La adhesión de células MDA-MB-231 y PC-3 a estos tres componentes ECM más prominentes se llevó a cabo como se describe anteriormente (10 min de adhesión a 37oC). Los HUVECs fueron cultivados sobre una membrana filtrante porosa (Inserto Transwell, membrana de policarbonato, 8 μm poros; Corning, Nueva York, EE.UU.) durante 48 h y Las células MDA-MB-231 no tratadas fueron etiquetadas con CellTracker Green CMFDA Dye (como se describe en el ensayo de adhesión celular de sección) y resucitadas en el medio 199 (PAN-Biotech) que contenía 0,1% BSA. Los HUVECs fueron lavados dos veces con medio 199 que contenía 0,1% BSA antes de que las células MDA-MB-231 pudieran transmigrar a través de la monocapa endotelial durante 24 h. Medio 199 que contenía 0,1% BSA fue utilizado como control negativo y medio 199 que contenía 20% FCS fue utilizado como quimioatractante para la transmigración en el compartimento inferior. Las células no migradas que permanecían en el compartimento superior fueron cuidadosamente removidas mediante un hisopo de algodón. Las células transmigradas se lisaron en el ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) tampón y la transmigración se cuantificó midiendo la señal de fluorescencia a 485 nm (excitación) y 535 nm (emisión). Los HUVEC fueron cultivados para confluir en placas de 6 pozos antes de ser tratados con archazolid durante 12 h. Las células fueron inducidas a aumentar la expresión génica de las moléculas de adhesión celular por TNFα. El ARN fue aislado usando el kit RNeasy de Qiagen (Hilden, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La digestión de la Dnasa en la columna se realizó para eliminar el ADN genómico. El ARN fue transcrito al cDNA por Superscript II (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific). Los experimentos con qPCR se realizaron utilizando un Sistema StepOnePlus (Aplicated Biosystems, Thermo Fisher Scientific) y los datos fueron analizados por StepOne y Ste-pOnePlus Software v2.3. Power SYBR Green PCR Master Mix (Life Technologies) y se utilizó el método comparativo de cuantificación C T (2 -+CT ). Los HUVEC fueron cultivados para confluir en placas de 12 pocillos antes de ser tratados con archazolid durante 24 h. Las células fueron tratadas con TNFα durante 24 h para inducir la expresión de moléculas de adhesión celular. Posteriormente, las células fueron separadas con HyClone HyQTase (GE Healthcare, Freiburg, Alemania). En el caso de ICAM-1, las células separadas se fijaron con un 4% de formaldehído (Polysciences, Hirschberg an der Bergstraße, Alemania) en PBS durante 10 min y se lavaron una vez con PBS antes de incubar con el anticuerpo anti-humano CD54 (ratón, ICAM-1) marcado con fluoresceína isotiocianato (FITC) (MCA1615F, Biozol, Eching, Alemania) a temperatura ambiente durante 45 min. Para todas las demás proteínas, las células no se fijaron y lavaron una vez con PBS antes de incubar con los anticuerpos anti-humanos CD106 (ratón, VCAM-1), anti-humanos CD62E (ratón, E-selectina) y anti-humanos CD325 (ratón, N-cadherina) de Becton Dickinson en hielo durante 45 min. Estos anticuerpos se diluyeron en PBS que contenían un 0.2% de BSA. La expresión superficial de moléculas de adhesión celular se midió mediante citometría de flujo (FACSVerse, Becton Dickinson, Heidelberg, Alemania). Para manchar la superficie de colágeno en los HUVEC, las células se incubaron con un anticuerpo de colágeno antihumano (rabbit, 1:40, ab36064, Abcam) en hielo durante 30 min. El procedimiento de tinción se realizó en hielo para asegurar que las proteínas superficiales o anticuerpos no se endocitosan. Las células se lavaron una vez con PBS que contenían Ca 2+ y Mg 2+ antes de que se fijaran con Roti-Histofix (Carl Roth). Alexa Fluor 488-conjugado anti-rabbits (cabra, 1:400, A11008, Life Technologies) se utilizó como anticuerpo secundario y Hoechst 33342 (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) se utilizó para visualizar núcleos. Las células se lavaron con PBS helados y se lisaron con tampón RIPA complementado con inhibidores de la proteasa (completa Mini EDTA-libre; Roche, Mannheim, Alemania), ortovanadato de sodio, fluoruro de sodio, fenilmetilsulfonil fluoruro, β-glicerofosfato, pirofosfato de sodio y H 2 O 2. La determinación de proteínas se realizó utilizando el Kit de Ensayo de Proteínas Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific). Cantidades iguales de proteínas (10-20 μg) fueron separadas por electroforesis de gel dodecil sulfatepoliacrilamida de sodio (SDS-PAGE; Laboratorios Bio-Rad, Munich, Alemania). Las membranas fueron bloqueadas con 5% de leche atornillada en polvo (Carl Roth) en TBS que contenía 0,1% Tween 20 (Sigma-Aldrich). Se utilizaron los siguientes anticuerpos: anticuerpo anti-catepsina B de ratón (IM27L, Merck) (1:500), anticuerpo anti-β-actina-peroxidasa de ratón (A3854, Sigma-Aldrich) (1:10.000) y anticuerpo vinculado a la peroxidasa de rábano de caballo IgG (HRP) (7076, Cell Signaling, Frankfurt, Alemania) (1:5.000). ImageJ versión 1.49m se utilizó para el análisis densitométrico. El ensayo de actividad de la catepsina B se realizó como se describe en la publicación de Kubisch et al. [28]. Las células se lavaron con PBS y se lisaron con el reactivo de extracción de proteínas de mamíferos M-PER no desnaturalizante (78501, Thermo Fisher Scientific) suplementado con inhibidores de la proteasa (completa Mini EDTA-libre, Roche), ortovanadato de sodio, fluoruro de sodio, fluoruro de fenilmetilsulfonilo. El sustrato de catepsina B fluorogénica Z-Arg-Arg-7-amido-4-metilcoumarina clorhidrato (C5429, Sigma-Aldrich) se añadió a 30 μg de lisato celular diluido en tampón de ensayo complementado con 2 mM de L-cisteína (C7880, Sigma-Aldrich) e incubado durante 30 min a 40°C. La fluorescencia se midió a 348 nm (excitación) y 440 nm (emisión) con un lector de microplacas (Varioskan Flash, Thermo Fisher Scientific). La intensidad de la señal de fluorescencia correspondió a la actividad de la enzima catepsina B. Para la sustracción de fondo el inhibidor de la catepsina B CA-074Me (Enzo Life Sciences, Lörrach, Alemania) se añadió a una reacción adicional. El kit de nucleofectores HUVEC (Lonza, Colonia, Alemania) se utilizó para transfectar a los HUVEC. La transfección se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante utilizando 2,5 μg de plásmido ADN para 500.000 células (Nucleofector 2b Device, Lonza). 48 h después de la transfección las células fueron tratadas para experimentos posteriores. El plásmido addgene #11249 hCathepsin B fue amablemente proporcionado por Hyeryun Choe [29]. hCathepsin B fue digerido con PmeI y XbaI y el fragmento de ADN lineal no correspondiente al gen CTSB humano fue religado para generar el plásmido vacío pcDNA3.1 (-) delta MCS que se utilizó para controlar las transfecciones. La columna vertebral original de hCathepsin B es el pcDNA3.1 (-) de Thermo Fisher Scientific. El vector de control pcDNA3.1 (-) delta MCS utilizado para nuestras transfecciones fue clonado sobre la base de hCathepsin B y por lo tanto carece casi de toda la parte del sitio de clonación múltiple del pcDNA3.1 (-). Los análisis estadísticos se realizaron Para la evaluación de un mínimo de tres experimentos independientes se utilizó el ANOVA de ida seguido de la prueba post-hoc de Tukey o t-test sin emparejar. El número de experimentos realizados de forma independiente (n) se indica en las leyendas de la figura correspondientes. p 0.05 se consideró estadísticamente significativo. Los datos se expresan como media ± error estándar de la media (SEM). Dado que el inhibidor de la v-ATPasa archazolid nunca ha sido utilizado para estudios en células endoteliales, primero se realizaron ensayos de citotoxicidad. Tratamos a los HUVEC confluentes con un archazolid de hasta 1 nM durante 24 y 48 h y observamos que este tratamiento no tiene influencia en la actividad metabólica ni en la liberación de LDH después de 24 h (Fig 1A y 1B, paneles izquierdos). La actividad metabólica y la liberación de LDH sólo se vieron levemente afectadas por la mayor concentración de archazolid después de 48 h (Fig 1A y 1B, paneles derecho). En consecuencia, los siguientes experimentos se llevaron a cabo después de 24 h (o menos) de tratamiento con archazolid con el fin de excluir cualquier efecto citotóxico de archazolid dentro de nuestros entornos experimentales. El análisis microscópico reveló que también la integridad de la monocapa endotelial no se vio afectada por el archazolid, pero las células mostraron una morfología ligeramente diferente (Fig 2A): las células tratadas con archazolid se hincharon en comparación con las células de control, lo que no fue inesperado, ya que la vacuolación del retículo endoplasmático (ER) se ha descrito para otros tipos de células y es típica para inhibidores de la v- Este efecto fue evidente tanto en las células subconfluentes como en las confluentes (Fig 2A). La inhibición de la v-ATPasa impide la acidificación de los lisosomas [1, 31]. Utilizando el tinte permeable a las células LysoTracker Red DND-99, es posible etiquetar los lisosomas ácidos en las células vivas. Así, este tinte puede servir como indicador de inhibición de la v-ATPasa. Para demostrar que el archazolid también es funcionalmente activo como inhibidor de la v-ATPasa en los HUVECs, las células fueron tratadas con archazolid de 1 nM antes de ser incubadas con LysoTracker Red DND-99 y Hoechst 33342. Como se muestra en la figura 2B, la tinción vesicular roja correspondiente a los lisosomas acidificados en las células En resumen, el tratamiento con archazolid durante 24 h no fue citotóxico para los HUVEC quiescentes, pero inhibió la funcionalidad de la V-ATPasa. Analizamos la adhesión de células MDA-MB-231 a los HUVEC. Se trató a los HUVEC confluentes con un archazolid de hasta 1 nM durante 24 h. Las células MDA-MB-231 no tratadas fueron etiquetadas con un color verde CMFDA de Tracker celular. Curiosamente, la inhibición de la V-ATPasa aumentó fuertemente la unión de la línea de células de carcinoma de mama metastásico MDA-MB-231 a los HUVEC después de 10 y 120 min de adhesión (Fig 3A y 3B). También investigamos la influencia de los archazolid en la migración transendotelial de células MDA-MB-231. Las células HUVEC sembradas en una cámara de Boyden fueron tratadas con 1 nM de archazolid durante 24 h. CellTracker Células MDA-MB-231 de marca verde (no tratadas con archazolid) fueron autorizadas a transmigrar a través de la monocapa endotelial durante 24 h. Como se muestra en la figura 3C, archazolid disminuyó significativamente la migración transendotelial de las células MDA-MB-231. La influencia de los archazolid en la adhesión de las células tumorales no sólo se estudió en las células HUVEC, que representan células macrovasculares endotelial, sino también en células microvasculares HMEC-1. Además, además de la línea de células de cáncer de mama MDA-MB-231, también se utilizaron células de cáncer de próstata PC-3 como segunda línea de células de cáncer El tratamiento con Archazolid de las células endoteliales aumentó la unión de las células MDA-MB-231 a la monocapa HMEC-1 después de 120 min de adhesión (fig. 4A) y aumentó la unión de las células PC-3 a la monocapa HUVEC después de 30 y 60 min de adhesión (fig. 4B). Cabe destacar que la adhesión de las células Jurkat no metastáticas, una línea celular de leucemia de células T aguda, no se vio afectada tras el tratamiento de las células HUVEC con archazolid (S1A Fig.). Tomadas juntas, el tratamiento con archazolid aumentó las propiedades adhesivas de las células endoteliales micro y macrovasculares para las células tumorales metastásicas, pero no para las no metastáticas. La adhesión de las células tumorales al endotelio es en principio similar a la de los leucocitos, pero difiere ligeramente en las moléculas que median el proceso de adhesión. Se encontró que los ligandos para las moléculas de adhesión de células endoteliales ICAM-1, VCAM-1, E-selectina y N-cadherina se expresan en las células tumorales y para mediar la interacción de células endoteliales-tumorales [21]. La inhibición de la v-ATPasa puede afectar la expresión de moléculas de adhesión de células endoteliales en los niveles de ARNm o proteína. Para determinar la expresión de ARNm de ICAM-1, VCAM-1, E-selectina y Ncadherina, los HUVECs fueron tratados con archazolid durante 12 h. TNFα es conocido por aumentar la regulación de la expresión de La PCR cuantitativa en tiempo real mostró que la inhibición de la V-ATPasa en los HUVECs no alteró los niveles de ARNm de ICAM-1, VCAM-1, E-selectina y N-cadherina (Fig 5A). La expresión proteica de estas moléculas de adhesión en la superficie de las células endoteliales fue analizada por citometría de flujo. Archazolid (1 nM, 24 h) no afectó a la expresión celular de ICAM-1, VCAM-1, E-selectina y N-cadherina (Fig 5B). Además de ICAM-1, VCAM-1, E-selectina y N-cadherina, también las integrinas son capaces de mediar el proceso de adhesión celular [33] [35]. Dado que ninguna de las moléculas de adhesión celular expresadas en los HUVEC se regulaba mediante el tratamiento con archazolid, se consideró que las integrinas eran socios potenciales de interacción. En esta familia de proteínas se ha informado que las integraciones β1 median la adhesión de células tumorales a células endoteliales quiescentes [25]. Con el fin de dilucidar el papel de las integraciones β1-para la adhesión de células tumorales inducidas por archazolid, la subunidad de integrina β1- fue bloqueada ya sea en células MDA-MB-231, células PC-3 o en HUVEC. (Obra de notar, como en todos los experimentos a lo largo de este estudio, sólo las células endoteliales fueron tratadas con archazolid.) Después de bloquear las integraciones β1 en las células MDA-MB-231 o PC-3, la adhesión a las células tumorales inducida por archazolid se redujo casi al nivel de control (Fig 6A y 6B, paneles izquierdos), mientras que el bloqueo de las integraciones β1 en los HUVEC no tuvo un efecto significativo en el aumento de la adhesión a las células tumorales por inhibición de la V-ATPasa (Fig 6A y 6B, paneles derecho). Dependiendo de su subunidad α, las integraciones β1 tienen una variedad de ligandos incluyendo componentes de matriz extracelular (ECM) como colágeno, fibronectina y lamina [35]. Por lo tanto, hipotetizamos que el tratamiento archazolid de células endoteliales podría conducir a una regulación ascendente de estos componentes. Las células MDA-MB-231 y Este ensayo de adhesión celular reveló que las células MDA-MB-231 así como las células PC-3 favorecen la interacción con el colágeno del componente ECM, ya que la adhesión al colágeno es mucho más alta que en el control plástico no recubierto (Fig 7A). Las células MDA-MB-231 y PC-3 también se adhirieron al plástico recubierto con fibronectina, pero en un grado mucho menor en comparación con el recubrimiento de colágeno. Por lo tanto, nos centramos en la interacción entre estas dos líneas celulares tumorales y colágeno. Bloqueo de la subunidad integrina β1 en las células MDA-MB-231 y PC-3 claramente abolió la interacción con colágeno (Fig 7B), indicando que la unión de estas células tumorales al colágeno está mediada por β1-integrantes. Dado que el colágeno es el principal componente del ECM MDA-MB-231 y las células PC-3 interactúan con, el siguiente paso fue probar si la inhibición de la V-ATPasa influye en la cantidad de colágeno expresada por los HUVEC como matriz extracelular. Para detectar colágeno en la superficie endotelial, los archazolidos tratados con HUVEC fueron etiquetados con un anticuerpo contra el colágeno tipo I-IV en el hielo para prevenir la endocitosis y para asegurar que el anticuerpo no se une al colágeno intracelular. Curiosamente, los archazolidos aumentaron la cantidad de colágeno superficial en los HUVEC en aproximadamente un 50% (Fig 7C). Se informó que la inhibición de la v-ATPasa por archazolid perjudica la actividad de la catepsina B [28, 36], una enzima lisosómica que degrada los componentes de la matriz extracelular incluyendo colágeno [37] [38] [39] [40] [41]. Como el colágeno es degradado por la catepsina B y la activación de la catepsina B depende de la actividad de la v-ATPasa [28, [36] [37] [38] 42], se sugirió que una acumulación de colágeno en la superficie de las células endoteliales podría ser consecuencia de una funcionalidad alterada de la catepsina B. Por lo tanto, se realizó un ensayo de actividad enzimática basado en la proteólisis de un sustrato de la fluorogénica catepsina B. En los HUVECs tratados con archazolidos y HMEC-1, la actividad de la catepsina B fue inducida tanto por el ARNm (1 ng/ml TNF) como por la expresión de la superficie celular (10 ng/ml TNF) de ICAM-1, VCAM-1, E-selectina y Ncadherin. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0203053.g005 La inhibición de la vATPasa endotelial aumenta la adhesión de células tumorales a las células endoteliales fuertemente disminuida en aproximadamente un 50% en comparación con las células de control a una concentración archazolida de 1 nM (Fig 8A). En línea con este resultado, el análisis de manchas occidentales mostró que el archazolido (1 nM) reduce la expresión proteica de la forma madura Para comprobar si la adhesión a las células tumorales inducida por archazolidos es consecuencia de la disminución de la cantidad de catepsina B, los HUVEC fueron transfectados con un plásmido de codificación para la catepsina B humana o con el vector vacío como control. Después de 48 h, las células transfectadas fueron tratadas con 1 nM de archazolido. El nivel de catepsina B después de la transfección y el tratamiento fue evaluado por el análisis de Western blot (Fig 9A). La sobreexpresión de la catepsina B disminuyó fuertemente tanto la adhesión basal como la inducida por archazolidos de las células MDA-MB-231 (Fig 9B). Así, se realizaron investigaciones intensivas relacionadas con las v-ATPasas en células cancerosas, mientras que son pocos los estudios que investigan las v-ATPasas en células endoteliales que indican un papel en la migración, proliferación y posiblemente angiogénesis [22] [23]. En el presente estudio se utilizó el producto natural mixobacterial archazolid para investigar las consecuencias de la inhibición de la v-ATPasa en el endotelio en las interacciones entre células tumor-endoteliales. Por primera vez, pudimos mostrar un vínculo entre la v-ATPasa y las propiedades de adhesión y transmigración del endotelio. La inhibición de la v-ATPasa en células endoteliales por archazolid aumentó significativamente la adhesión de células cancerosas metastásicas y disminuyó la migración transendotelial de células cancerosas que se atribuyó a niveles aumentados de colágeno Cabe destacar que la adhesión de la línea celular Jurkat no metastática a las células endoteliales tratadas con archazolid permaneció inalterada. La adhesión inducida por archazolid de las células tumorales fue independiente de las moléculas de adhesión de células endoteliales ICAM-1, VCAM-1, E-selectina y N-cadherina, ya que su expresión no fue regulada por el compuesto. Sin embargo, encontramos que la adhesión de células tumorales inducida por archazolid fue mediada por β1-integrantes expresadas en cáncer de mama MDA-MB-231 y células de cáncer de próstata PC-3 como bloqueo de la subunidad integrina β1 en estas células tumorales revirtieron el efecto proadhesivo de archazolid. En experimentos de adhesión en plástico recubierto con componentes de matriz extracelular, podríamos demostrar que las células MDA-MB-231 y PC-3 favorecieron claramente la interacción con el colágeno, mientras que la adhesión de las células Jurkat no metastáticas era en gran medida independiente de las proteínas de matriz extracelular (S1B Fig). Las diferentes propiedades de adhesión de las células cancerosas metastásicas y las células Jurkat podrían ser el resultado del patrón de expresión de integración de cada línea celular. Las células MDA-MB-231 y PC-3 expresan α2β1- y α3β1-integrantes, que representan receptores de colágeno [43, 44], mientras que las células Jurkat expresan α4β1-integrantes pero carecen de α2β1-, α3β1-integrantes [44]. Las α4β1integrantes son receptores para VCAM-1 y fibronectina [35] y se ha demostrado que las células Jurkat interactúan con las células endoteliales humanas que expresan VCAM-1 después del tratamiento con citoquinas o células transfectadas con VCAM-1 [45]. Nuestros resultados están en línea con estudios anteriores que muestran que las células α2β1- y α3β1-integrantes que expresan MDA-MB-231 y PC-3 fueron capaces de unirse rápidamente al colágeno en la matriz ósea cortical. En contraste, las células Jurkat no fueron capaces de adherirse [44] y podrían interactuar preferentemente con moléculas de adhesión celular en lugar de con proteínas ECM. Las α2β1- y α3β1-integrantes pueden actuar además como receptores de lamina [46] y al menos α3β1integrantes reconocen fibronectina [46, 47] Aunque expresan receptores de fibronectina y laminina, las células MDA-MB-231 y PC-3 se adhirieron a la fibronectina en una medida mucho menor y no se adhirieron a laminina, probablemente debido a una menor afinidad a estos componentes de la matriz extracelular. Importantemente, la inhibición de la V-ATPasa por archazolid aumentó los niveles superficiales del colágeno del componente de la matriz extracelular, lo que podría explicar que el aumento de las células MDA-MB-231 y PC-3 en las HUVEC tratadas con archazolid es independiente de las moléculas de adhesión celular endotelial. Al realizar un ensayo de proteólisis de células vivas, Cavallo-Medved et al. demostraron degradación del ECM, en particular de gelatina y colágeno IV, en asociación con la catepsina B activa en las caveolas de células endotelial durante la Además, estudios recientes reportaron que la inhibición de la v-ATPasa perjudica la actividad de la catepsina B en las células cancerosas [28, 36]. Por lo tanto, sugerimos que la acumulación de colágeno en la superficie endotelial podría ser consecuencia de la actividad o expresión de la catepsina B alterada en las células endoteliales. De hecho, confirmamos el deterioro de la actividad de la catepsina B por archazolid ya que los niveles de expresión de la forma activa madura de esta enzima fueron fuertemente reducidos. La catepsina B se sintetiza como preprocatepsina B en ribosomas unidos a la membrana. Tras el transporte al aparato Golgi, la preprocatepsina B es glicosilada con oligosacáridos que contienen mannosa. La focalización de la procatepsina B a los lisosomas es dependiente del receptor mannoso-6-fosfato y su disociación del receptor, así como su procesamiento proteolítico hacia la catepsina B madura requiere la acidificación del compartimento [48]. En las células cancerosas la inhibición de la v-ATPasa por archazolid altera el tráfico mediado por el receptor mannoso-6-fosfato desde la red trans-Golgi a los compartimentos prelisosomales resultando en una disminución de proteasasas activa como la catepsina B [28]. Asumimos que la disminución inducida por la archazolida en la actividad y expresión de la catepsina B se basó en el mismo mecanismo. Curiosamente, la sobreexpresión de la catepsina B atenuó la adhesión de las células de cáncer de mama inducida por archazolido a las células endoteliales, indicando que la adhesión se correlaciona negativamente con la expresión de la catepsina B. Como la catepsina B también puede degradar otros componentes de la matriz extracelular como la fibronectina y lamina [38, 49], la inhibición de la v-ATPasa podría conducir a una acumulación de estas proteínas y un aumento de la adhesión de células que expresan receptores de fibronectina o lamina. Sin embargo, no nos centramos en estos componentes ECM ya que no eran relevantes para la adhesión de las células MDA-MB-231 y PC-3. Estas células se adhirieron predominantemente al colágeno, mientras que la adhesión de las células Jurkat es principalmente independiente de las proteínas ECM colágeno, fibro En las células de cáncer hepático, el archazolid reduce la señalización de Ras/Raf/MEK/ERK alterando la composición de la membrana y la fluidez [51]. Asumimos que el archazolid afecta a las células endoteliales de manera similar, lo que conduce a la inhibición de la señalización de Ras y, por lo tanto, a la reducción de la migración transendotelial de las células MDA-MB-231. Tomado en conjunto, nuestro estudio muestra que el archazolid reduce la actividad y la expresión de la catepsina B en las células endoteliales. Como resultado, la cantidad de colágeno en la superficie de las células endoteliales fue significativamente regulada, lo que finalmente resultó en un aumento de la adhesión de las líneas de células de cáncer metastásicas β1-integrantes MDA-MB-231 y PC Este estudio muestra que la v-ATPasa desempeña un papel importante en la regulación de la adhesión de las células que expresan receptores para los componentes de la matriz extracelular. Archazolid representa una herramienta prometedora para dilucidar el papel de la v-ATPasa en las células endoteliales. Además, por primera vez vinculamos la función de la v-ATPasa a la adhesión y transmigración de las células tumorales a las células endoteliales, así como a la remodelación de la matriz extracelular en la superficie de las células endoteliales. El hecho de que la adhesión de las células tumorales metastásicas a las células endoteliales se incrementa mientras que su migración transendotelial se reduce tras la inhibición de la v-ATPasa endotelial por archazolid apoya aún más la visión de arcazolid como un potencial compuesto antimetastático.

¿Cuál es el papel de la v-ATPasa en la membrana plasmática de los osteoclastos y las células epiteliales renales?

La bomba de protones principal que acidifica los compartimentos intracelulares de las células eucariotas aumenta la adhesión de las células tumorales a las células endoteliales mediante la acumulación de colágeno extracelularhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6133348/SHA: f1b81916fac1ca3d50dde774df2e1bb26bf0fb39Autores: Luong, Betty; Schwenk, Rebecca; Bräutigam, Jacqueline; Müller, Rolf; Menche, Dirk; Bischoff, Iris; Fürst, RobertFecha: 2018-09-11DOI: 10.1371/journal.pone.0203053Licencia: cc-byAbstract: La H(+ Debido a que la inhibición de la v-ATPasa dio lugar a efectos antitumorales y antimetastáticos en diferentes modelos tumorales, esta enzima ha surgido como una estrategia prometedora contra el cáncer. Aquí, utilizamos el bien establecido archazolid inhibidor de la v-ATPasa, un producto natural aislado por primera vez del mixobacterio Archangium gephyra, para estudiar las consecuencias de la inhibición de la v-ATPasa en las células endoteliales (ECs), en particular en la interacción entre las CEs y las células cancerosas, que ha sido descuidado hasta ahora. Las células endoteliales humanas tratadas con archazolid mostraron una mayor adhesión de las células tumorales, mientras que la migración transendotelial de las células tumorales se redujo. El proceso de adhesión fue independiente de las moléculas de adhesión CE ICAM-1, VCAM-1, E-selectina y N En cambio, la adhesión fue mediada por las integraciones β1 expresadas en las células tumorales, ya que el bloqueo de la subunidad integrina β1 invirtió este proceso. Las células tumorales se adhirieron preferentemente al colágeno de ligando β1-integrante y archazolid, lo que llevó a un aumento de la cantidad de colágeno en la superficie de las CE. La acumulación de colágeno fue acompañada por una fuerte disminución de la expresión y actividad de la catepsina de proteasa B. La sobreexpresión de la catepsina B en las CE evitó la capacidad de archazolid para aumentar la adhesión de células tumorales a las CE. Nuestro estudio demuestra que la inhibición de la v-ATPasa por archazolid induce un fenotipo pro-adhesivo en células endoteliales que promueve su interacción con células cancerosas, mientras que la transmigración de células tumor Texto: La enzima tipo vacuolar H + -ATPasa (v-ATPasa) es la mayor bomba de protones responsable de la acidificación de los compartimentos intracelulares en células eucariotas [1]. La enzima consiste en dos complejos multisubunidades, el subcomplejo transmembrana V 1 soluble que se requiere para el transporte de protones a través de membranas [1, 2]. En la mayoría de los tipos de células las v-ATPasas se expresan únicamente en el sistema de endomembrana para regular y mantener el pH ácido de los compartimentos intracelulares como lisosomas, endosomas, el aparato Golgi, gránulos secretores y vesículas recubiertas [3]. La función de las v-ATPasas es esencial para procesos celulares como el tráfico vesicular, la endocitosis mediada por receptores y la degradación y En los tipos de células especializadas incluyendo osteoclastos y células epiteliales renales, las v-ATPasas también se pueden expresar en la membrana plasmática, donde bombean protones en el espacio extracelular [2] [3] [4]. En las células cancerosas las v-ATPasas se expresan en la membrana plasmática para eliminar la citosólica tóxica H +. Lo más importante, las v-ATPasas contribuyen al microambiente tumoral ácido, lo que conduce a la activación de proteasasas, facilitando así la migración, invasión y angiogénesis de las células tumorales [5] [7]. Dado que la inhibición de la v-ATPasa ha demostrado reducir la invasividad de las células cancerosas y la formación de metástasis [8, 9], esta enzima ha surgido como un fármaco prometedor en los últimos años. Archazolid A y B son inhibidores altamente potentes y específicos de las v-ATPasas [10]. Se aislaron por primera vez del mixobacterium Archangium gephyra [11]. Estos compuestos inhiben la v-ATPasa a bajas concentraciones nanomolares [10, 12] mediante la unión a la subunidad c del complejo V o. Como su actividad biológica es comparable a los inhibidores de la v-ATPasa bafilomicina y concanamicina [10, 11], los archazolids son compuestos naturales de alto interés que se pueden utilizar tanto como herramienta para estudiar las consecuencias de la inhibición de la v-ATPasa como como como plomo para el desarrollo de fármacos. Los arcazolids pueden ser producidos por fermentación [11] o por síntesis total [13, 14]. En el campo de la investigación del cáncer se reportan varios estudios sobre efectos farmacológicos interesantes del archazolid: Redujo la migración de diferentes células tumorales invasivas in vitro y de células cancerosas metástasis in vivo en Además, las vías activadas de archazolid de respuesta al estrés celular y apoptosis en células tumorales altamente invasivas [16]. En los macrófagos clásicamente activados, el archazolid indujo selectivamente la generación de factor de necrosis tumoral α (TNFα), que puede promover indirectamente la supresión tumoral [17]. Hasta ahora, el papel de las v-ATPasas en las células endoteliales sólo se ha investigado raramente. El endotelio juega un papel crucial en la patogénesis y progresión del cáncer: La cascada metastásica incluye la angiogénesis local en el sitio del tumor primario y la adhesión de células tumorales en el sitio de metástasis [18]. La angiogénesis, el desarrollo de nuevos vasos sanguíneos fuera de los existentes, depende de la proliferación, migración y diferenciación de células endoteliales [19 Las células cancerosas circulantes pueden adherirse al endotelio en sitios distantes. Esta interacción adhesiva está mediada por receptores y ligandos correspondientes expresados en células tumorales y endoteliales [18, 21]. Se ha informado que las V-ATPasas regulan el pH intracelular y la migración celular en células endoteliales microvasculares [22, 23]. Un estudio reciente mostró que la inhibición de la v-ATPasa por la concanamicina previno la proliferación, la reducción de la migración y el deterioro de la señalización relacionada con la angiogénesis en células endoteliales [24]. Hasta el momento, no hay investigaciones sobre el papel de las v-ATPasas endoteliales para el proceso de adhesión de células tumorales al endotelio. Así, nos interesaron las consecuencias de la inhibición de la v-ATPasa endoteliales por Varias moléculas de adhesión celular en el endotelio, como la molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1), la proteína de adhesión celular vascular (VCAM-1), la e-selectina o la N-cadherina [21], así como las integrinas expresadas en las células cancerosas, han sido reportadas para mediar la adhesión celular de las células cancerosas a las células endoteliales [25] [26]. Así, nos enfocamos en estas moléculas de adhesión celular e integrinas. Por primera vez, nuestro estudio reveló un vínculo entre la función de las v-ATPasas y las propiedades de adhesión y transmigración de las células endoteliales. CellTiter-Blue Cell Viability Assay (Promega, Mannheim, Alemania) se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante para determinar la viabilidad celular de las células después del tratamiento con archa Este ensayo se basa en la capacidad de las células metabólicamente activas para reducir la resazurina, lo que da lugar a resorufina fluorescente. El reactivo CellTiter-Blue se añadió a las células 4 h antes del final del tratamiento. La fluorescencia se midió con un lector de microplacas Infinite F200 (Tecan, Männedorf, Suiza) a 560 nm (excitación) y 590 nm (emisión). El ensayo de citotoxicidad no radioactiva CytoTox 96 (Promega) se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante para determinar la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) después del tratamiento con archazolid. El tampón de lisis se añadió a las células no tratadas 45 min antes del final del tratamiento para inducir la liberación de esta enzima. La LDH es una enzima citosólica que La LDH liberada cataliza la conversión enzimática de lactato a piruvato, que proporciona NADH para la conversión de violeta iodonitrotetrazolio en un producto de color rojo formazán en presencia de diaforasa. La absorbancia se midió con un lector de microplacas Varioskan Flash (Thermo Fisher Scientific) a 490 nm. LysoTracker Red DND-99 (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific) es un tinte para medir los valores de pH en células viables. Los HUVEC fueron cultivados para confluir en μ-deslizantes con recubrimiento de colágeno G (80826, ibidi, Martinsried, Alemania) antes de ser tratados con archazolid durante 24 h. 1 μg/ ml Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich, Munich, Alemania) fue utilizado para visualizar los núcleos y 50 nM LysoTracker Red DND-99 fue utilizado para visualizar los compartimentos ácidos que corresponden a los lisosomas. Ambos tintes fueron incubados durante 10 minutos a 37°C antes de la adquisición de imágenes individuales por un microscopio de fluorescencia Leica DMI6000 B (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania). Las células fueron incubadas con concentraciones indicadas de archazolid durante 24 h. Las células MDA-MB-231 o PC-3 no tratadas fueron etiquetadas con CellTracker Green CMFDA Dye (5 μM en DMEM libre de suero, 37 μC) durante 30 minutos antes de que se añadieran 100.000 células por pozo a los HUVEC y se les permitió adherirse durante varios puntos de tiempo a 37 μC. Las células tumorales no compatibles fueron lavadas tres veces con PBS que contenían Ca 2+ y Mg 2+. La adhesión de células tumorales se determinó mediante mediciones de fluorescencia con un lector de microplacas Infinite F200 pro (Tecan) a 485 nm (excitación) y 535 nm (emisión). Para bloquear la subunidad de integrina β1 en células MDA-MB-231 o PC-3, CellTracker se incubaron células MDA-MB-231 o PC-3 con un anticuerpo antiintegrante β1 (P5D2, ab24693, Abcam, Cambridge, Reino Unido) a una concentración de 1 μg de anticuerpo por millón de células en 1 ml de DMEM. Antes de añadir a las células HUVEC tratadas con archazolid, MDA-MB-231 o PC-3 se lavaron una vez con DMEM. Para bloquear la subunidad de integrina β1 en las células HUVEC, las células se incubaron con el anticuerpo antiintegrante β1 (0,1 μg/pozo en ECGM). Las HUVEC se lavaron una vez con ECGM antes de añadir células MDA-MB-231 o PC Para la adhesión de células MDA-MB-231 o PC-3 a los componentes de la matriz extracelular (ECM) las placas de 24 pocillos fueron recubiertas con colágeno G (10 μg/ml en PBS), fibronectina plasmática humana (10 μg/ml PBS) o laminin-411 (10 μg/ml en PBS de Dulbecco [DPBS] que contenía Ca 2+ y Mg 2+ ) a 4oC durante la noche. La adhesión de células MDA-MB-231 y PC-3 a estos tres componentes ECM más prominentes se llevó a cabo como se describe anteriormente (10 min de adhesión a 37oC). Los HUVECs fueron cultivados sobre una membrana filtrante porosa (Inserto Transwell, membrana de policarbonato, 8 μm poros; Corning, Nueva York, EE.UU.) durante 48 h y Las células MDA-MB-231 no tratadas fueron etiquetadas con CellTracker Green CMFDA Dye (como se describe en el ensayo de adhesión celular de sección) y resucitadas en el medio 199 (PAN-Biotech) que contenía 0,1% BSA. Los HUVECs fueron lavados dos veces con medio 199 que contenía 0,1% BSA antes de que las células MDA-MB-231 pudieran transmigrar a través de la monocapa endotelial durante 24 h. Medio 199 que contenía 0,1% BSA fue utilizado como control negativo y medio 199 que contenía 20% FCS fue utilizado como quimioatractante para la transmigración en el compartimento inferior. Las células no migradas que permanecían en el compartimento superior fueron cuidadosamente removidas mediante un hisopo de algodón. Las células transmigradas se lisaron en el ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) tampón y la transmigración se cuantificó midiendo la señal de fluorescencia a 485 nm (excitación) y 535 nm (emisión). Los HUVEC fueron cultivados para confluir en placas de 6 pozos antes de ser tratados con archazolid durante 12 h. Las células fueron inducidas a aumentar la expresión génica de las moléculas de adhesión celular por TNFα. El ARN fue aislado usando el kit RNeasy de Qiagen (Hilden, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La digestión de la Dnasa en la columna se realizó para eliminar el ADN genómico. El ARN fue transcrito al cDNA por Superscript II (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific). Los experimentos con qPCR se realizaron utilizando un Sistema StepOnePlus (Aplicated Biosystems, Thermo Fisher Scientific) y los datos fueron analizados por StepOne y Ste-pOnePlus Software v2.3. Power SYBR Green PCR Master Mix (Life Technologies) y se utilizó el método comparativo de cuantificación C T (2 -+CT ). Los HUVEC fueron cultivados para confluir en placas de 12 pocillos antes de ser tratados con archazolid durante 24 h. Las células fueron tratadas con TNFα durante 24 h para inducir la expresión de moléculas de adhesión celular. Posteriormente, las células fueron separadas con HyClone HyQTase (GE Healthcare, Freiburg, Alemania). En el caso de ICAM-1, las células separadas se fijaron con un 4% de formaldehído (Polysciences, Hirschberg an der Bergstraße, Alemania) en PBS durante 10 min y se lavaron una vez con PBS antes de incubar con el anticuerpo anti-humano CD54 (ratón, ICAM-1) marcado con fluoresceína isotiocianato (FITC) (MCA1615F, Biozol, Eching, Alemania) a temperatura ambiente durante 45 min. Para todas las demás proteínas, las células no se fijaron y lavaron una vez con PBS antes de incubar con los anticuerpos anti-humanos CD106 (ratón, VCAM-1), anti-humanos CD62E (ratón, E-selectina) y anti-humanos CD325 (ratón, N-cadherina) de Becton Dickinson en hielo durante 45 min. Estos anticuerpos se diluyeron en PBS que contenían un 0.2% de BSA. La expresión superficial de moléculas de adhesión celular se midió mediante citometría de flujo (FACSVerse, Becton Dickinson, Heidelberg, Alemania). Para manchar la superficie de colágeno en los HUVEC, las células se incubaron con un anticuerpo de colágeno antihumano (rabbit, 1:40, ab36064, Abcam) en hielo durante 30 min. El procedimiento de tinción se realizó en hielo para asegurar que las proteínas superficiales o anticuerpos no se endocitosan. Las células se lavaron una vez con PBS que contenían Ca 2+ y Mg 2+ antes de que se fijaran con Roti-Histofix (Carl Roth). Alexa Fluor 488-conjugado anti-rabbits (cabra, 1:400, A11008, Life Technologies) se utilizó como anticuerpo secundario y Hoechst 33342 (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) se utilizó para visualizar núcleos. Las células se lavaron con PBS helados y se lisaron con tampón RIPA complementado con inhibidores de la proteasa (completa Mini EDTA-libre; Roche, Mannheim, Alemania), ortovanadato de sodio, fluoruro de sodio, fenilmetilsulfonil fluoruro, β-glicerofosfato, pirofosfato de sodio y H 2 O 2. La determinación de proteínas se realizó utilizando el Kit de Ensayo de Proteínas Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific). Cantidades iguales de proteínas (10-20 μg) fueron separadas por electroforesis de gel dodecil sulfatepoliacrilamida de sodio (SDS-PAGE; Laboratorios Bio-Rad, Munich, Alemania). Las membranas fueron bloqueadas con 5% de leche atornillada en polvo (Carl Roth) en TBS que contenía 0,1% Tween 20 (Sigma-Aldrich). Se utilizaron los siguientes anticuerpos: anticuerpo anti-catepsina B (IM27L, Merck) (1:500), anticuerpo anti-β-actina-peroxidasa de ratón (A3854, Sigma-Aldrich) (1:10.000) y anticuerpo vinculado a la peroxidasa de rábano de caballo IgG (HRP) (7076, Cell Signaling, Frankfurt, Alemania) (1:5.000). ImageJ versión 1.49m se utilizó para el análisis densitométrico. El ensayo de actividad de la catepsina B se realizó como se describe en la publicación de Kubisch et al. [28]. Las células se lavaron con PBS y se lisaron con el reactivo de extracción de proteínas de mamíferos M-PER no desnaturalizante (78501, Thermo Fisher Scientific) suplementado con inhibidores de la proteasa (completa Mini EDTA-libre, Roche), ortovanadato de sodio, fluoruro de sodio, fluoruro de fenilmetilsulfonilo. El sustrato de catepsina B fluorogénica Z-Arg-Arg-7-amido-4-metilcoumarina clorhidrato (C5429, Sigma-Aldrich) se añadió a 30 μg de lisato celular diluido en tampón de ensayo complementado con 2 mM de L-cisteína (C7880, Sigma-Aldrich) e incubado durante 30 min a 40°C. La fluorescencia se midió a 348 nm (excitación) y 440 nm (emisión) con un lector de microplacas (Varioskan Flash, Thermo Fisher Scientific). La intensidad de la señal de fluorescencia correspondió a la actividad de la enzima catepsina B. Para la sustracción de fondo el inhibidor de la catepsina B CA-074Me (Enzo Life Sciences, Lörrach, Alemania) se añadió a una reacción adicional. El kit de nucleofectores HUVEC (Lonza, Colonia, Alemania) se utilizó para transfectar a los HUVEC. La transfección se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante utilizando 2,5 μg de plásmido ADN para 500.000 células (Nucleofector 2b Device, Lonza). 48 h después de la transfección las células fueron tratadas para experimentos posteriores. El plásmido addgene #11249 hCathepsin B fue amablemente proporcionado por Hyeryun Choe [29]. hCathepsin B fue digerido con PmeI y XbaI y el fragmento de ADN lineal no correspondiente al gen CTSB humano fue religado para generar el plásmido vacío pcDNA3.1 (-) delta MCS que se utilizó para controlar las transfecciones. La columna vertebral original de hCathepsin B es el pcDNA3.1 (-) de Thermo Fisher Scientific. El vector de control pcDNA3.1 (-) delta MCS utilizado para nuestras transfecciones fue clonado sobre la base de hCathepsin B y por lo tanto carece casi de toda la parte del sitio de clonación múltiple del pcDNA3.1 (-). Los análisis estadísticos se realizaron Para la evaluación de un mínimo de tres experimentos independientes se utilizó el ANOVA de ida seguido de la prueba post-hoc de Tukey o t-test sin emparejar. El número de experimentos realizados de forma independiente (n) se indica en las correspondientes leyendas de la figura. p 0.05 se consideró estadísticamente significativo. Los datos se expresan como media ± error estándar de la media (SEM). Dado que el inhibidor de la v-ATPasa archazolid nunca ha sido utilizado para estudios en células endoteliales, primero realizamos ensayos de citotoxicidad. Tratamos a los HUVEC confluentes con un archazolid de hasta 1 nM durante 24 y 48 h y observamos que este tratamiento no tiene influencia en la actividad metabólica ni en la liberación de LDH después de 24 h (Fig 1A y 1B, paneles izquierdos). La actividad metabólica y la liberación de LDH sólo se vieron levemente afectadas por la mayor concentración de archazolid después de 48 h (Fig 1A y 1B, paneles derecho). En consecuencia, los siguientes experimentos se llevaron a cabo después de 24 h (o menos) de tratamiento con archazolid con el fin de excluir cualquier efecto citotóxico de archazolid dentro de nuestros entornos experimentales. El análisis microscópico reveló que también la integridad de la monocapa endotelial no se vio afectada por el archazolid, pero las células mostraron una morfología ligeramente diferente (Fig 2A): las células tratadas con archazolid se hincharon en comparación con las células de control, lo que no fue inesperado, ya que la vacuolación del retículo endoplasmático (ER) se ha descrito para otros tipos de células y es típica para inhibidores de la v- Este efecto fue evidente tanto en las células subconfluentes como en las confluentes (Fig 2A). La inhibición de la v-ATPasa impide la acidificación de los lisosomas [1, 31]. Utilizando el tinte permeable a las células LysoTracker Red DND-99, es posible etiquetar los lisosomas ácidos en las células vivas. Así, este tinte puede servir como indicador de inhibición de la v-ATPasa. Para demostrar que el archazolid también es funcionalmente activo como inhibidor de la v-ATPasa en los HUVECs, las células fueron tratadas con archazolid de 1 nM antes de ser incubadas con LysoTracker Red DND-99 y Hoechst 33342. Como se muestra en la figura 2B, la tinción vesicular roja correspondiente a los lisosomas acidificados en las células En resumen, el tratamiento con archazolid durante 24 h no fue citotóxico para los HUVEC quiescentes, pero inhibió la funcionalidad de la v-ATPasa. Analizamos la adhesión de células MDA-MB-231 a los HUVEC. Se trató a los HUVEC confluentes con un archazolid de hasta 1 nM durante 24 h. Las células MDA-MB-231 no tratadas fueron etiquetadas con el color verde CMFDA de Cell-Tracker. Curiosamente, la inhibición de la v-ATPasa aumentó fuertemente la unión de la línea de células de carcinoma de mama metastásico MDA-MB-231 a los HUVEC después de 10 y 120 min de adhesión (Fig 3A y 3B). También investigamos la influencia de los archazolid en la migración transendotelial de células MDA-MB-231. Las células HUVEC sembradas en una cámara de Boyden fueron tratadas con 1 nM de archazolid durante 24 h. CellTracker Células MDA-MB-231 de marca verde (no tratadas con archazolid) fueron autorizadas a transmigrar a través de la monocapa endotelial durante 24 h. Como se muestra en la figura 3C, archazolid disminuyó significativamente la migración transendotelial de las células MDA-MB-231. La influencia de los archazolid en la adhesión de las células tumorales no sólo se estudió en las células HUVEC, que representan células macrovasculares endotelial, sino también en células microvasculares HMEC-1. Además, además de la línea de células de cáncer de mama MDA-MB-231, también se utilizaron células de cáncer de próstata PC-3 como segunda línea de células de cáncer El tratamiento con Archazolid de las células endoteliales aumentó la unión de las células MDA-MB-231 a la monocapa HMEC-1 después de 120 min de adhesión (fig. 4A) y aumentó la unión de las células PC-3 a la monocapa HUVEC después de 30 y 60 min de adhesión (fig. 4B). Cabe destacar que la adhesión de las células Jurkat no metastáticas, una línea celular de leucemia de células T aguda, no se vio afectada tras el tratamiento de las células HUVEC con archazolid (S1A Fig.). Tomadas juntas, el tratamiento con archazolid aumentó las propiedades adhesivas de las células endoteliales micro y macrovasculares para las células tumorales metastásicas, pero no para las no metastáticas. La adhesión de las células tumorales al endotelio es en principio similar a la de los leucocitos, pero difiere ligeramente en las moléculas que median el proceso de adhesión. Se encontró que los ligandos para las moléculas de adhesión de células endoteliales ICAM-1, VCAM-1, E-selectina y N-cadherina se expresan en las células tumorales y para mediar la interacción de células endoteliales-tumorales [21]. La inhibición de la v-ATPasa puede afectar la expresión de moléculas de adhesión de células endoteliales en los niveles de ARNm o proteína. Para determinar la expresión de ARNm de ICAM-1, VCAM-1, E-selectina y Ncadherina, los HUVECs fueron tratados con archazolid durante 12 h. TNFα es conocido por aumentar la regulación de la expresión de La PCR cuantitativa en tiempo real mostró que la inhibición de la V-ATPasa en los HUVECs no alteró los niveles de ARNm de ICAM-1, VCAM-1, E-selectina y N-cadherina (Fig 5A). La expresión proteica de estas moléculas de adhesión en la superficie de las células endoteliales fue analizada por citometría de flujo. Archazolid (1 nM, 24 h) no afectó a la expresión celular de ICAM-1, VCAM-1, E-selectina y N-cadherina (Fig 5B). Además de ICAM-1, VCAM-1, E-selectina y N-cadherina, también las integrinas son capaces de mediar el proceso de adhesión celular [33] [35]. Dado que ninguna de las moléculas de adhesión celular expresadas en los HUVEC se regulaba mediante el tratamiento con archazolid, se consideró que las integrinas eran socios potenciales de interacción. En esta familia de proteínas se ha informado que las integraciones β1 median la adhesión de células tumorales a células endoteliales quiescentes [25]. Con el fin de dilucidar el papel de las integraciones β1-para la adhesión de células tumorales inducidas por archazolid, la subunidad de integrina β1- fue bloqueada ya sea en células MDA-MB-231, células PC-3 o en HUVEC. (Obra de notar, como en todos los experimentos a lo largo de este estudio, sólo las células endoteliales fueron tratadas con archazolid.) Después de bloquear las integraciones β1 en las células MDA-MB-231 o PC-3, la adhesión a las células tumorales inducida por archazolid se redujo casi al nivel de control (Fig 6A y 6B, paneles izquierdos), mientras que el bloqueo de las integraciones β1 en los HUVEC no tuvo un efecto significativo en el aumento de la adhesión a las células tumorales por inhibición de la V-ATPasa (Fig 6A y 6B, paneles derecho). Dependiendo de su subunidad α, las integraciones β1 tienen una variedad de ligandos incluyendo componentes de matriz extracelular (ECM) como colágeno, fibronectina y lamina [35]. Por lo tanto, hipotetizamos que el tratamiento archazolid de células endoteliales podría conducir a una regulación ascendente de estos componentes. Las células MDA-MB-231 y Este ensayo de adhesión celular reveló que las células MDA-MB-231 así como las células PC-3 favorecen la interacción con el colágeno del componente ECM, ya que la adhesión al colágeno es mucho más alta que en el control plástico no recubierto (Fig 7A). Las células MDA-MB-231 y PC-3 también se adhirieron al plástico recubierto con fibronectina, pero en un grado mucho menor en comparación con el recubrimiento de colágeno. Por lo tanto, nos centramos en la interacción entre estas dos líneas celulares tumorales y colágeno. Bloqueo de la subunidad integrina β1 en las células MDA-MB-231 y PC-3 claramente abolió la interacción con colágeno (Fig 7B), indicando que la unión de estas células tumorales al colágeno está mediada por β1-integrantes. Dado que el colágeno es el principal componente del ECM MDA-MB-231 y las células PC-3 interactúan con, el siguiente paso fue probar si la inhibición de la V-ATPasa influye en la cantidad de colágeno expresada por los HUVEC como matriz extracelular. Para detectar colágeno en la superficie endotelial, los archazolidos tratados con HUVEC fueron etiquetados con un anticuerpo contra el colágeno tipo I-IV en el hielo para prevenir la endocitosis y para asegurar que el anticuerpo no se une al colágeno intracelular. Curiosamente, los archazolidos aumentaron la cantidad de colágeno superficial en los HUVEC en aproximadamente un 50% (Fig 7C). Se informó que la inhibición de la v-ATPasa por archazolid perjudica la actividad de la catepsina B [28, 36], una enzima lisosómica que degrada los componentes de la matriz extracelular incluyendo colágeno [37] [38] [39] [40] [41]. Como el colágeno es degradado por la catepsina B y la activación de la catepsina B depende de la actividad de la v-ATPasa [28, [36] [37] [38] 42], se sugirió que una acumulación de colágeno en la superficie de las células endoteliales podría ser consecuencia de una funcionalidad alterada de la catepsina B. Por lo tanto, se realizó un ensayo de actividad enzimática basado en la proteólisis de un sustrato de la fluorogénica catepsina B. En los HUVECs tratados con archazolidos y HMEC-1, la actividad de la catepsina B fue inducida tanto por el ARNm (1 ng/ml TNF) como por la expresión de la superficie celular (10 ng/ml TNF) de ICAM-1, VCAM-1, E-selectina y Ncadherin. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0203053.g005 La inhibición de la vATPasa endotelial aumenta la adhesión de células tumorales a las células endoteliales fuertemente disminuida en aproximadamente un 50% en comparación con las células de control a una concentración archazolida de 1 nM (Fig 8A). En línea con este resultado, el análisis de manchas occidentales mostró que el archazolido (1 nM) reduce la expresión proteica de la forma madura Para comprobar si la adhesión a las células tumorales inducida por archazolidos es consecuencia de la disminución de la cantidad de catepsina B, los HUVEC fueron transfectados con un plásmido de codificación para la catepsina B humana o con el vector vacío como control. Después de 48 h, las células transfectadas fueron tratadas con 1 nM de archazolido. El nivel de catepsina B después de la transfección y el tratamiento fue evaluado por el análisis de Western blot (Fig 9A). La sobreexpresión de la catepsina B disminuyó fuertemente tanto la adhesión basal como la inducida por archazolidos de las células MDA-MB-231 (Fig 9B). Así, se realizaron investigaciones intensivas relacionadas con las v-ATPasas en células cancerosas, mientras que son pocos los estudios que investigan las v-ATPasas en células endoteliales que indican un papel en la migración, proliferación y posiblemente angiogénesis [22] [23]. En el presente estudio se utilizó el producto natural mixobacterial archazolid para investigar las consecuencias de la inhibición de la v-ATPasa en el endotelio en las interacciones entre células tumor-endoteliales. Por primera vez, pudimos mostrar un vínculo entre la v-ATPasa y las propiedades de adhesión y transmigración del endotelio. La inhibición de la v-ATPasa en células endoteliales por archazolid aumentó significativamente la adhesión de células cancerosas metastásicas y disminuyó la migración transendotelial de células cancerosas que se atribuyó a niveles aumentados de colágeno Cabe destacar que la adhesión de la línea celular Jurkat no metastática a las células endoteliales tratadas con archazolid permaneció inalterada. La adhesión inducida por archazolid de las células tumorales fue independiente de las moléculas de adhesión de células endoteliales ICAM-1, VCAM-1, E-selectina y N-cadherina, ya que su expresión no fue regulada por el compuesto. Sin embargo, encontramos que la adhesión de células tumorales inducida por archazolid fue mediada por β1-integrantes expresadas en cáncer de mama MDA-MB-231 y células de cáncer de próstata PC-3 como bloqueo de la subunidad integrina β1 en estas células tumorales revirtieron el efecto proadhesivo de archazolid. En experimentos de adhesión en plástico recubierto con componentes de matriz extracelular, podríamos demostrar que las células MDA-MB-231 y PC-3 favorecieron claramente la interacción con el colágeno, mientras que la adhesión de las células Jurkat no metastáticas era en gran medida independiente de las proteínas de matriz extracelular (S1B Fig). Las diferentes propiedades de adhesión de las células cancerosas metastásicas y las células Jurkat podrían ser el resultado del patrón de expresión de integración de cada línea celular. Las células MDA-MB-231 y PC-3 expresan α2β1- y α3β1-integrantes, que representan receptores de colágeno [43, 44], mientras que las células Jurkat expresan α4β1-integrantes pero carecen de α2β1-, α3β1-integrantes [44]. Las α4β1integrantes son receptores para VCAM-1 y fibronectina [35] y se ha demostrado que las células Jurkat interactúan con las células endoteliales humanas que expresan VCAM-1 después del tratamiento con citoquinas o células transfectadas con VCAM-1 [45]. Nuestros resultados están en línea con estudios anteriores que muestran que las células α2β1- y α3β1-integrantes que expresan MDA-MB-231 y PC-3 fueron capaces de unirse rápidamente al colágeno en la matriz ósea cortical. En contraste, las células Jurkat no fueron capaces de adherirse [44] y podrían interactuar preferentemente con moléculas de adhesión celular en lugar de con proteínas ECM. Las α2β1- y α3β1-integrantes pueden actuar además como receptores de lamina [46] y al menos α3β1integrantes reconocen fibronectina [46, 47] Aunque expresan receptores de fibronectina y laminina, las células MDA-MB-231 y PC-3 se adhirieron a la fibronectina en una medida mucho menor y no se adhirieron a laminina, probablemente debido a una menor afinidad a estos componentes de la matriz extracelular. Importantemente, la inhibición de la V-ATPasa por archazolid aumentó los niveles superficiales del colágeno del componente de la matriz extracelular, lo que podría explicar que el aumento de las células MDA-MB-231 y PC-3 en las HUVEC tratadas con archazolid es independiente de las moléculas de adhesión celular endotelial. Al realizar un ensayo de proteólisis de células vivas, Cavallo-Medved et al. demostraron degradación del ECM, en particular de gelatina y colágeno IV, en asociación con la catepsina B activa en las caveolas de células endotelial durante la Además, estudios recientes reportaron que la inhibición de la v-ATPasa perjudica la actividad de la catepsina B en las células cancerosas [28, 36]. Por lo tanto, sugerimos que la acumulación de colágeno en la superficie endotelial podría ser consecuencia de la actividad o expresión de la catepsina B alterada en las células endoteliales. De hecho, confirmamos el deterioro de la actividad de la catepsina B por archazolid ya que los niveles de expresión de la forma activa madura de esta enzima fueron fuertemente reducidos. La catepsina B se sintetiza como preprocatepsina B en ribosomas unidos a la membrana. Tras el transporte al aparato Golgi, la preprocatepsina B es glicosilada con oligosacáridos que contienen mannosa. La focalización de la procatepsina B a los lisosomas es dependiente del receptor mannoso-6-fosfato y su disociación del receptor, así como su procesamiento proteolítico hacia la catepsina B madura requiere la acidificación del compartimento [48]. En las células cancerosas la inhibición de la v-ATPasa por archazolid altera el tráfico mediado por el receptor mannoso-6-fosfato desde la red trans-Golgi a los compartimentos prelisosomales resultando en una disminución de proteasasas activa como la catepsina B [28]. Asumimos que la disminución inducida por la archazolida en la actividad y expresión de la catepsina B se basó en el mismo mecanismo. Curiosamente, la sobreexpresión de la catepsina B atenuó la adhesión de las células de cáncer de mama inducida por archazolido a las células endoteliales, indicando que la adhesión se correlaciona negativamente con la expresión de la catepsina B. Como la catepsina B también puede degradar otros componentes de la matriz extracelular como la fibronectina y lamina [38, 49], la inhibición de la v-ATPasa podría conducir a una acumulación de estas proteínas y un aumento de la adhesión de células que expresan receptores de fibronectina o lamina. Sin embargo, no nos centramos en estos componentes ECM ya que no eran relevantes para la adhesión de las células MDA-MB-231 y PC-3. Estas células se adhirieron predominantemente al colágeno, mientras que la adhesión de las células Jurkat es principalmente independiente de las proteínas ECM colágeno, fibro En las células de cáncer hepático, el archazolid reduce la señalización de Ras/Raf/MEK/ERK alterando la composición de la membrana y la fluidez [51]. Asumimos que el archazolid afecta a las células endoteliales de manera similar, lo que conduce a la inhibición de la señalización de Ras y, por lo tanto, a la reducción de la migración transendotelial de las células MDA-MB-231. Tomado en conjunto, nuestro estudio muestra que el archazolid reduce la actividad y la expresión de la catepsina B en las células endoteliales. Como resultado, la cantidad de colágeno en la superficie de las células endoteliales fue significativamente regulada, lo que finalmente resultó en un aumento de la adhesión de las líneas de células de cáncer metastásicas β1-integrantes MDA-MB-231 y PC Este estudio muestra que la v-ATPasa desempeña un papel importante en la regulación de la adhesión de las células que expresan receptores para los componentes de la matriz extracelular. Archazolid representa una herramienta prometedora para dilucidar el papel de la v-ATPasa en las células endoteliales. Además, por primera vez vinculamos la función de la v-ATPasa a la adhesión y transmigración de las células tumorales a las células endoteliales, así como a la remodelación de la matriz extracelular en la superficie de las células endoteliales. El hecho de que la adhesión de las células tumorales metastásicas a las células endoteliales se incrementa mientras que su migración transendotelial se reduce tras la inhibición de la v-ATPasa endotelial por archazolid apoya aún más la visión de arcazolid como un potencial compuesto antimetastático.

¿De qué depende la angiogénesis?

La gastroenteritis y los brotes de infecciones respiratorias en los hogares de ancianos franceses de 2007 a 2018: Morbilidad y letalidad por cualquier causa según las características individuales de los residenteshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6759171/SHA: f1d456ea268266ff3c21317c4190e4fb49b5e4fAutores: Gaspard, Philippe; Mosnier, Anne; Simon, Loic; Ali-Brandmeyer, Olivia; Rabaud, Christian; Larocca, Sabrina; Heck, Béatrice; Aho-Glélé, Serge; Pothier, Pierre; Ambert-Balay, KatiaFecha: 2019-09-24DOI: 10.1371/journal.pone.0222321Licencia El objetivo de este estudio fue describir brotes de GE y ITR con infección y tasas de letalidad por cualquier causa de acuerdo a las características individuales de los residentes en hogares de ancianos. MÉTODOS: Se realizó vigilancia clínica y virológica (2007-2018). Las estratificaciones virales para el análisis fueron: brotes con norovirus positivo o identificaciones de influenza (respectivamente noV+ o flu+), episodios sin identificación o pruebas de noV o gripe (respectivamente noV- o flu-). Asociaciones entre variables individuales (sexo, edad, duración de la estancia (LOS), estado de autonomía) e infecciones y tasas de letalidad se probaron con métodos univariados y Mantel-Haenszel (MH). RESULTADOS: 61 brotes de GE y 76 brotes de ITR (total 137 brotes) se registraron involucrando respectivamente 4309 y 5862 residentes. En el análisis univariado, las tasas de infección más altas y la edad se asociaron en los contextos NoV+, NoV- y Flu+, y las tasas de infección más bajas se asociaron con estancias más prolongadas (NoV+ y NoV-). En el análisis estratificado de la HM (virus, sexo (mujer/hombre) ajustado para LOS (<4 o ≥4 años), las probabilidades de infección permanecieron significativas entre los residentes de edad avanzada (≥86 años): NoV+/hombre (proporción de Odds (OR(MH)): 1,64, intervalo de confianza del 95% (IC): 1,16–2,30) y Flu+/mujer y macho (Respectivamente OR(MH): 1,50, IC: 1,27–1,79 y 1,73, IC: 1,28–2,33). En el análisis univariado, el estado de menor autonomía (NoV+ En el análisis ajustado de la HM, la OR(edad) significativa ajustada para la autonomía fue: Flu+/ ≥86 años en comparación con <86 años, 1,97 (1,19-3,25) y OR(autonomía) ajustada para la edad para el grupo más autónomo (en comparación con el grupo menos autónomo) fue: Flu+, 0,41 (0,24–0,69); Flu-, 0,42 (0,20, 0,90). CONCLUSIÓN: Los residentes de los hogares de ancianos son cada vez más ancianos y dependientes. Los riesgos específicos de infección y letalidad según estos dos factores indican que las medidas de vigilancia y control de la infección son esenciales y de alta prioridad. Texto: Introducción Los brotes de gastroenteritis (GE) e infección del tracto respiratorio (ITR) representan una carga significativa de enfermedad en los hogares de enfermería. Los virus causan la mayoría de estos brotes, y los noro Estudios anteriores han sugerido que las infecciones respiratorias virales y los brotes de norovirus son una causa común de hospitalización o muerte, particularmente entre los ancianos [3] [4] [5]. El impacto de los brotes se ha descrito en términos de frecuencia y epidemiología, pero poco se sabe sobre las tasas de infección y letalidad por todas las causas en los brotes de hogares de enfermería de GE y RTI en relación con las características individuales de los residentes [6]. Los residentes de estas instituciones son cada vez más ancianos y dependientes, y el impacto de esta tendencia en la carga estacional del brote requiere una investigación en profundidad. Los resultados de estudios centrados en este tema podrían producir información valiosa para los hogares de enfermería, permitiéndoles adaptar sus estrategias de control de infecciones, en particular para mejorar la evaluación del riesgo de infección. Nuestro objetivo fue describir la infección por GE y ITR y las tasas de letalidad por cualquier causa de acuerdo a las características individuales de los residentes en hogares de ancianos (sexo, edad, duración de la estancia, estado de autonomía), e identificar patrones específicos de susceptibilidad relacionados con estos tipos de brotes virales en estas instalaciones.El presente estudio exploró brotes en 14 sitios (28 unidades con actividades geriátricas en hogares de ancianos para un total de 1121 camas) cuidando a personas dependientes en el sur de Alsacia (una zona en el noreste de Francia).Los datos fueron recolectados entre septiembre de 2007 y agosto de 2018 [7, 8].Cada sitio fue geográficamente independiente y autónomo para la gestión social y asistencial.Las unidades estaban ubicadas dentro de los sitios más grandes y fueron definidas como un lugar con un equipo dedicado en un lugar.Durante los brotes en un sitio, sólo se incluyeron los residentes en las unidades con casos confirmados La vigilancia se realizó en cada unidad de forma independiente, y los miembros del personal tuvieron que informar a un médico o enfermero de cargo cuando se observaron dos o más casos potenciales relacionados de neumonía o GE en un plazo de cuatro días y cuando se observaron tres o más casos para otras ITR. Las unidades también tuvieron que informar al equipo de higiene cuando se superaron estos valores umbral. Para la gripe, el primer caso sospechoso dio lugar a una alerta local y se contactó al equipo de higiene. Un profesional del equipo de higiene recogió la información y evaluó los signos clínicos, la información virológica y el contexto epidemiológico con el médico de la unidad afectada. El clúster detectado sólo se puso bajo vigilancia si el equipo de higiene consideró que existía un fenómeno potencial de brote. La duración de 4 días fue en relación con el protocolo nacional con alerta a las autoridades cuando 5 casos ocurrieron en un plazo de 4 días [9, 10]. A nivel local y además de los conglomerados reportados a las autoridades, los conglomerados con al menos 3 casos dentro de un período de siete días en una unidad pudieron ser registrados si fueron reportados al equipo de higiene. Debido a que varios brotes podrían ocurrir potencialmente en la misma unidad durante el período de vigilancia, un residente pudo ser incluido repetidamente en diferentes conglomerados. Como resultado, los patrones observados reflejaron las características de una población institucional con exposiciones longitudinales y plurianuales. La información personal e información clínica fue recolectada por un profesional del equipo de higiene directamente de los registros de salud de los residentes. La información personal fue recolectada para todos los presentes el primer día del brote. La información recolectada incluyó: mes y año de nacimiento, sexo, fecha de llegada al hogar de enfermería y estado de autonomía. El estatus de autonomía de los residentes en hogares de ancianos franceses se evalúa utilizando la escala AGGIR (Grupos de Gerontología Autonómica Iso-Recursos), que es el instrumento legal para evaluar la dependencia en los ancianos y cuyo propósito principal es la asignación de medios y recursos [11]. Con la escala AGGIR, la autonomía se clasifica en 6 grupos de Iso-Recursos (GIR): GIR 1 (personas montadas en cama o en sillones, funciones mentales seriamente alteradas y que requieren presencia continua), GIR 2 (personas montadas en cama o en sillones, funciones mentales no totalmente alteradas y que requieren asistencia en la mayoría de las actividades de la vida diaria, o funciones mentales alteradas con capacidad preservada para desplazarse), GIR 3 (autonomía mental conservada con autonomía motora parcialmente preservada y asistencia varias veces al día para la autonomía física), GIR 4 (desplazamiento por el hogar y a veces asistencia para lavar, vestir, actividades físicas o comer), GIR 5 (solo asistencia ocasional para el lavado, preparación de comidas y tareas domésticas), GIR 6 (autonomía para tareas esenciales de la vida diaria). El GE se definió como el inicio súbito de vómitos y/o diarrea durante un periodo de 24 h: (i) diarrea 3 episodios, (ii) y/o vómitos 3 episodios, (iii) diarrea o vómitos <3 episodios con dos o más otros síntomas (diarrea, vómitos, dolor de estómago, calambres abdominales, náuseas, fiebre, moco en heces) [1]. La presentación de ITR en adultos mayores puede ser atípica, como para otras enfermedades agudas en este grupo de edad [12]. Utilizamos las definiciones recomendadas para la vigilancia de ITR en unidades geriátricas, divididas en 3 subcategorías: (i) síndromes de resfriado común o faringitis (al menos dos de los siguientes criterios: secreción nasal o estornudo, nariz congestionada (i. Congestión), dolor de garganta o ronquera o dificultad para tragar, tos seca, glándulas hinchadas o sensibles en el cuello (linfadenopatía cervical), ii) enfermedad similar a la gripe (deben cumplirse los siguientes criterios: fiebre y al menos otros tres síntomas (muertes, dolor de cabeza o dolor de ojo nuevo, mialgia o dolor de cuerpo, malestar o pérdida del apetito, dolor de garganta, tos seca nueva o aumentada) y iii) infección del tracto respiratorio inferior (deben cumplirse al menos dos de los siguientes criterios: al menos dos signos o síntomas respiratorios (tose nueva o aumentada, nueva o aumentada producción de esputo, saturación de O 2 < 94% o reducida > 3% desde la línea basal, examen pulmonar anormal (nuevo o modificado), dolor de pecho pleurítico, frecuencia respiratoria 25 respiraciones/min Y uno o más signos/síntomas constitucionales (fiebre, La infección correspondiente a una de estas tres subcategorías se incluyó en este estudio y se clasificó como ITR. Para ambos tipos de infección, el profesional del equipo de higiene obtuvo información clínica de los registros de salud del paciente, y se consultó a los miembros del equipo de salud si era necesario para completar cualquier información faltante. Al final del episodio (dentro de los siete días siguientes al último caso identificado), se determinó la inclusión del caso como expuesto y no infectado (ENI) o expuesto e infectado (EI) con un médico residente. Para estudiar la letalidad, se evaluó la presencia de cada residente infectado una vez al menos 56 días después del último caso de cada brote. Cada residente fue objeto de seguimiento retrospectivo durante el octavo intervalo de 7 días (I n, n = 1 a 8, total 56 días, entre la fecha de inicio de los síntomas y el quincuagésimo sexto día del período estudiado) con tres posibilidades diferentes: presente (vivo y oficialmente residente en la institución), perdido en el seguimiento (vivo en la fecha de salida pero que ya no reside en la institución (regreso a casa, traslado a otra institución)) o muerte (muerte registrada en el registro de salud). Las fechas de muerte y pérdida en el seguimiento fueron registradas. Las pruebas del virus no fueron sistemáticas y fueron decididas por los médicos de cada institución en presencia de signos clínicos. Para GE, se enviaron muestras de heces al Centro Nacional de Referencia para Virus de Gastroenteritis en Dijon para pruebas de laboratorio, como se describió anteriormente [8]. Las pruebas de diagnóstico rápido de inmunoensayo utilizadas para la detección de la gripe fueron: Clearview1 Exact Influenza A y B (Inverness Medical, Colonia, Alemania) de 2007 a 2014 e InfluenzaTop1 (Alldiag, Estrasburgo, Francia) de 2014 a 2018. Dada la baja sensibilidad de las pruebas rápidas de gripe, ya no se utilizaban una vez que se habían aplicado las medidas de control y el brote de gripe estaba bajo control. También se enviaron ocasionalmente muestras a laboratorios hospitalarios o al Centro Nacional de Referencia para Virus de la Influenza para detectar virus con RT-PCR en tiempo real [17]. La mayoría de las pruebas se centraron en el norovirus (NoV) y el virus de la gripe, pero ocasionalmente otras fueron realizadas por el Centro Nacional de Referencia para Virus de la Influenza (rhinovirus, virus sincitial respiratorio, metapneumovirus humano, parainfluenza 1, 2, 3 y 4, y coronavirus) y el Centro Nacional de Referencia para Virus Entéricos (rotavirus, astrovirus y adenovirus), ya que las pruebas para los virus fueron variables (de una institución/médico a otra, no utilizadas en algunos brotes, tipos de virus buscados) y teniendo en cuenta la baja sensibilidad de las pruebas de gripe rápida, estas dos fuentes de datos se utilizaron para definir el contexto epidemiológico de los brotes confirmados, por lo que los casos individuales se incluyeron consistentemente en todos los episodios de acuerdo con los signos clínicos y la evaluación médica; cuando las pruebas de virus fueron negativas, los signos clínicos El contexto epidemiológico de cada brote fue definido en función de si el virus había sido identificado o no. Una o más muestras positivas llevaron a la calificación de un contexto de noV (NoV+) o gripe (Flu+). Los otros episodios fueron calificados como brotes de gripe o noV sin identificación o pruebas específicas (NoV- y Flu-). Los contextos de gripe y noV no eliminaron otros patógenos entéricos o respiratorios potenciales. Sexo, edad, duración de la estancia (LOS, en años) y estado de autonomía fueron descritos para todos los residentes expuestos. La vacunación contra la gripe y la administración de oseltamivir fueron calculadas para brotes confirmados de gripe. Las variables dicotómicas o categóricas se expresaron como porcentajes. En el análisis univariado, las categorías fueron específicas para obtener una descripción precisa de la edad y variables de LOS. Los intervalos de clase fueron 5 años para la edad y un año para Los residentes clasificados como GIR 4 a 6 (a veces ocasionales y sin asistencia) fueron agrupados por ser pocos; para el análisis multinivel con tablas de 2x2 se utilizó un valor medio para definir las categorías de edad de dos niveles; para los ELS fue necesario evaluar las estancias más largas para identificar el efecto de mayor exposición en un hogar de enfermería; por lo tanto, se optó por un corte de cuatro años para crear las dos categorías; para la autonomía, se agruparon las dos categorías más dependientes (GIR 2) y se compararon con las categorías más autónomas (GIR 3); los contextos epidemiológicos de brote se utilizaron con las cuatro categorías: NoV+, Flu+, NoV-y influenza-; ocasionalmente se identificaron otros virus GE o RTI, pero el número de resultados fue demasiado limitado para desarrollar análisis separados; sin embargo, todos los resultados están disponibles en las tablas sobre las investigaciones del virus junto con las identificaciones Para las diferentes categorías, se calculó la tasa de infección (EI/residentes expuestos (ER), en porcentaje, según sexo, grupo de edad, EL y estado de autonomía. Para investigar la letalidad por todas las causas y definir el período apropiado para el seguimiento de 56 días (D 1 a 56 ), se calculó la tasa de letalidad por todas las causas por intervalo de 7 días (LR n /I n, n = 1 a 8): (número de muertes durante el intervalo I n /(EI vivo el primer día de n o estudiado intervalo menos perdido para el seguimiento EI durante el intervalo I n ) 100). Viendo que los cúmulos sucesivos podrían ocurrir dentro del mismo lugar, influyendo potencialmente en toda la letalidad por causa, se calculó el intervalo serial en días (SI d ). El SI d fue el período entre el inicio de los síntomas del último caso en el brote inicial (N) y el Las investigaciones se realizaron cuando la SI d fue menor o igual a la longitud de la D 1 a 56 anterior y se evaluaron los siguientes parámetros para estas situaciones específicas: número de episodios, residentes infectados en ambos brotes y muerte entre los individuos identificados. Finalmente, de acuerdo con la tasa de mortalidad y el impacto de brotes sucesivos, se definió el número de intervalos de 7 días (N.I. ) a tener en cuenta, y se analizó la tasa de letalidad por todas las causas durante estos periodos (I. 1 a N..I. o D. 1 a 7 N ). Las tasas de letalidad por todas las causas se calcularon con la siguiente fórmula: (número de muertes de D. 1 a 7 N/(número de IE a D.1 menos perdidas para seguimiento entre IE durante el período D. 1 a 7 N ) 100). La estimación de la tasa de rotación por intervalo de 7 días entre los residentes infectados se calculó sobre la base de los LOS (mediana en años) con la siguiente fórmula: (proporción de residentes dados de alta: 50,0% en el caso de la mediana)/[(mediana LOS 365)/7)]. La tasa media de residentes dados de alta por período de 7 días se calculó: [(número de desaparecidos para el seguimiento durante el período D 1 a 7 N /número de residentes expuestos e infectados en el intervalo D 1 )/N 7 días] 100. Como algunos residentes fueron incluidos en varios brotes durante la vigilancia, las observaciones no fueron completamente independientes; como resultado se utilizaron pruebas no paramétricas. En el análisis univariado, se utilizaron pruebas exactas de Chi-cuadrado o Fisher (número esperado de frecuencias menores a 5) para comparar las tasas de infección y letalidad de acuerdo a los parámetros estudiados y se calculó la relación de odds por estimación mediana-no sesgada; se utilizó la prueba de Kruskal-Wallis para comparar los valores medios; se calcularon intervalos de confianza para las medianas con métodos bootstrap; se realizaron análisis ajustados covariables con dos tablas (2x2). El impacto respectivo de cada factor individual se probó con pruebas Chi-cuadrado de Mantel-Haenszel; se probó la igualdad de los coeficientes de odds estrato con la prueba Woolf de homogeneidad; finalmente, para cada contexto del virus, se generaron múltiples tablas (2x2) y se probaron con variables de confusión, modificadores de efecto o covariables Se transmite un archivo en la Información de Apoyo con todos los códigos R y los paquetes utilizados (Códigos S1 R). Las diferencias se consideraron significativas en p.05. La Autoridad Francesa de Protección de Datos aprobó la recolección y análisis de datos (DE-2013-074) y el comité local de ética (Espace Local de Réflexion Ethique, Centre Hospitalier de Rouffach) aprobaron el protocolo del estudio (ERLE-32). De acuerdo con la ley francesa de investigación biomédica y experimentación humana, no se requirió el consentimiento escrito individual de los pacientes o sus familiares para la recolección de datos. Cada año, el médico local del estudio coordinador del estudio con los médicos que trabajan en el hogar de enfermería. Al inicio del período de vigilancia, la información relativa a la participación en el estudio se mostró en el área familiar, incluyendo un documento sobre su derecho de acceso y rectificación de datos personales. Después de la recolección, los datos se hicieron anónimos. No En total, 7643 de los residentes expuestos eran mujeres y 2528 eran hombres. La mediana de edad era de 86,7 años (rango intercuartílico: 81,1-91,0 años). Investigaciones virales (respectivamente 389 muestras de ITR y 143 de GE con todos los resultados detallados en las tablas S1-S4) confirmaron un número considerable de brotes de ITR relacionados con norovirus (34/61) y brotes de ITR relacionados con la gripe (46/76). En el caso de los brotes de GE, 2524 residentes se encontraban en un contexto noV+ frente a 1785 en un contexto noV, y en el de los brotes de ITR, 3479 residentes se encontraban en un contexto flu+ frente a 2383 en un contexto gripal. Para la vigilancia de GE en el contexto de noV+, hubo 1093 residentes de IE frente a 1431 residentes de ENI, mientras que en el contexto de noV-contexto, hubo 583 residentes de IE frente a 1202 residentes de ENI. Por lo tanto, la tasa de infección fue mayor en el contexto de noV+ (43,3%) que en el contexto de noV-contexto (32,7%, (odds ratio (OR): 0,63, intervalo de confianza del 95% (IC): 0,56-0,72), p < 0,001). Para la vigilancia de RTI, las tasas de infección fueron similares con y sin gripe confirmada: 31,5% (N = 1095 residentes de IE /3479 residentes expuestos) frente a 30,5% (N = 728 residentes de IE/ 2383 residentes expuestos, OR: 0,96, IC: 0,85-1,07, p = 0,47). Además, la tasa de infección en el contexto noV + fue superior a los otros tres contextos: noV-(OR: 0,63, IC: 0,56-0,72), flu+ (OR: 0,60, IC: 0,54-0,67) y flu-(OR: 0,58, IC: 0,51-0,65). En el análisis univariado, ciertas características individuales se asociaron con variaciones significativas en la tasa de infección (Tabla S5); la tasa de infección aumentó con la edad (excepto en el Flucontext) y disminuyó con los EE. El análisis ajustado covariable reveló una modificación específica del efecto significativo según el sexo (NoV+) y los EE.UU. (Tabla S6). En los análisis estratificados según el virus y el sexo, la edad ajustada para los EE.UU. siguió siendo significativa para los brotes de gripe+ y noV+ (machos). En el contexto noV-con Finalmente, cuando se incluyó la autonomía y se ajustó para la edad (virus, sexo, estratificación de LOS), los residentes menos autónomos (mujer/LOS<4 años/edad<86/GIR 1-2) se vieron más afectados por brotes de gripe+ con modificación de efecto específico en función de la edad (Tabla S7). El estudio de las tasas de letalidad en residentes infectados durante los 56 días posteriores al inicio indicó que hubo variaciones significativas para ITR pero no hubo cambios para GE (Tabla 2 ). Las diferencias significativas aparecieron después de 28 días en el contexto de brotes de gripe+ y otros brotes de ITR. El análisis de los cúmulos sucesivos o simultáneos en las mismas instituciones se realizó cuando el período entre el inicio de los síntomas del último caso en el brote N y el inicio de los síntomas del primer caso en el brote N+1 fue de 56 días (Tabla S8). Se identificaron 44 de los 137 brotes El porcentaje de residentes expuestos e infectados implicados en la estratificación de más de un virus fue del 11,09% ((194 2)/3499). Además, dos residentes fallecidos fueron incluidos en los análisis de noV-Na y letalidad de la gripe porque la muerte ocurrió en 56 días para ambas infecciones. El análisis de estratificación de virus de los 44 brotes mostró la ausencia de conglomerados sucesivos para la misma categoría. El mismo análisis para los cuatro primeros intervalos de 7 días (Días 1 a 28) mostró los valores respectivos: 26 brotes (18,98%), 117 residentes ((6,69% ((117 2)/3499)), un residente muerto. Finalmente, de acuerdo con el mayor impacto de letalidad durante los primeros cuatro intervalos de 7 días y para limitar el impacto de los cúmulos sucesivos en el mismo sitio, todas las tasas de letalidad causal fueron estudiadas según parámetros individuales para los intervalos de 4 7 días con el número respectivo de De acuerdo con el tipo de vigilancia (GE o ITR), las tasas de letalidad difirieron significativamente: 1,6% versus 3,4% (respectivamente NoV+ y NoV-contextos, OR: 2,24, IC: 1,16-4,39, p = 0,02) y 8,3% versus 5,6% (respectivamente Flu+ y Flu-, OR: 0,67, IC: 0,45-0,97, p = 0,04). En el análisis univariado (Tabla S9), el estado de baja autonomía en los contextos de NoV+, Flu+ y Flu En el análisis ajustado, no se identificaron diferencias estadísticas significativas en los brotes de GE; para los episodios de ITR, el análisis ajustado mostró que la autonomía tuvo un impacto significativo cuando se ajustó por sexo, edad o LOS (Flu+ y Flu-NA) y que la edad tuvo un impacto significativo cuando se ajustó por sexo, autonomía o LOS (Flu+) (S10 Tabla). En la Tabla 3 se probaron los efectos específicos de edad o autonomía. O edad significativa ajustada por autonomía fueron: Flu+/edad 86 años (en comparación con el grupo <86), 1,97 (1,19-3,25). O autonomía ajustada por edad fueron para GIR 3-6 (en comparación con GIR 1-2): Flu+, 0,41 (0,24-0,69); Flu-, 0,42 (0,20,0,90). Finalmente, a pesar del bajo número de residentes y defunciones por categoría, y en consecuencia la limitada solidez de los resultados, la autonomía ajustada para edad con estratificación según virus, sexo y ELS mostró que los efectos fueron mayores entre subgrupos de residentes menos autónomos (mujeres o hombres/LOS<4 años/GIR 1-2) en brotes de gripe+, y también hubo mayor mortalidad en el pequeño subgrupo de hombres autónomos con LOS 4 años (mayor mortalidad) (Tabla S11). En el contexto de la gripe+, se disponía de datos sobre el estado de vacunación y las prescripciones de oseltamivir, pero no se utilizaron en este estudio. En el presente estudio, los datos de vigilancia obtenidos durante brotes de GE y ITR en hogares de enfermería se utilizaron para construir análisis estratificados e identificar infecciones específicas y tasas de letalidad por todas las causas de acuerdo con las características individuales de los residentes. Las tasas de infección observadas aquí fueron similares a las observadas en estudios previos de brotes de noV e gripe (odds de estar infectados durante un brote de gripe+ fueron alrededor de 40% menos que durante un brote de noV+).Las tasas de infección reportadas fueron cercanas al 30,0% en brotes de gripe y 40,0% en brotes de noV [18] [19] [20].La edad avanzada pareció aumentar la probabilidad de infección por GE e influenza, con tasas crecientes entre residentes de edad avanzada.La edad es un factor bien conocido para la gravedad de influenza y norovirus en ancianos y en hogares de ancianos [21, 22].Para el NoV, las estimaciones de incidencia más altas (estratos de edad de 5 años) se encontraron en la categoría de 85 años (aproximadamente 800 hombres y 1.400 mujeres por cada 100.000 habitantes).En nuestro estudio, el análisis univariado (NoV+) mostró que Además, un análisis ajustado de los brotes de GE puso de relieve diferentes efectos entre subgrupos de residentes según el sexo y los EE.UU. De hecho, la exposición múltiple y/o repetida a los virus de GE durante la institucionalización puede conducir a la susceptibilidad o posible aumento de la inmunidad en algunos residentes [23]. Para la variable sexo, dos factores podrían explicar el efecto: un posible sesgo de selección con hombres que reportan infecciones leves menos que las mujeres (particularmente en el subgrupo < 86 años) o que la susceptibilidad masculina fue diferente (edad, LOS, inmunidad, etc.). Un estudio alemán de 2013 también reportó un mayor impacto en las mujeres [21]. Además, cuando el análisis de edad se estratificó por sexo y los EE.UU. no se observaron efectos epidémicos en los hogares de enfermería impacto significativo en las mujeres; las únicas diferencias significativas fueron menos infecciones en los hombres Para los brotes de ITR, las variables sexo y EL no tuvieron un efecto significativo; en los residentes mayores de 86 años, las probabilidades de infección en el contexto de la gripe+ fueron 1,5 veces mayores para las mujeres y 1,7 para los hombres; en el análisis univariado, contrariamente a los otros contextos de virus donde las odds ratios fueron raramente superiores a 2, los residentes mayores de 95 años tuvieron mayores probabilidades de infección de 2,8 en comparación con la categoría de 70 años, y para el grupo de 100 años las probabilidades fueron aproximadamente 3,8; en el contexto de la gripe+, la autonomía ajustada para edad (virus, sexo y estratificación de LOS) reveló un posible aumento en las tasas de infección entre los residentes menos autónomos; un estudio previo encontró que cuando los residentes mayores estaban expuestos al virus A(H3N2), hubo mayores tasas de infección y reinfección, y efectos más significativos en la institución que con otros tipos/subtipo En la comunidad, la relación de enfermedad relativa (RIR) en el [22, 24]. La incidencia de la infección por influenza y los riesgos asociados fueron bien descritos por grupo de edad, pero no se estudió el impacto específico según la edad. Los resultados de este trabajo destacaron la distribución específica por edad de las enfermedades por influenza entre los residentes en hogares de ancianos y el impacto más significativo entre los residentes de edad avanzada. Esta susceptibilidad específica podría ser un factor crítico en la exposición institucional y diseminación de la gripe y podría explicar en parte el alto impacto de infección en la población institucional de ancianos.En este trabajo, el estatus de autonomía no fue el principal factor asociado a la infección (sin impacto significativo en GE y en contextos de gripe).Sin embargo, en los brotes de gripe+, un alto nivel de dependencia se asoció con un mayor riesgo de enfermarse. Esta observación implica que el personal podría desempeñar un papel en la propagación de la infección (los residentes altamente dependientes y menos móviles son menos propensos a contaminarse a sí mismos) o que los residentes más activos pueden ser menos frágiles y/o tener una mayor implicación en las medidas de control de la infección recomendadas. Finalmente, es de esperar que la mejora del cumplimiento de las medidas de higiene personal tanto para el personal de enfermería como para los residentes tenga un efecto beneficioso en las tasas de infección. Estudios anteriores identificaron tasas de infección no V más altas en individuos altamente dependientes, pero los resultados no fueron ajustados para la edad y los EE.UU. para tener en cuenta la correlación potencial con el estado de autonomía [20]. La letalidad es difícil de evaluar en los hogares de enfermería porque la muerte es frecuente. Nuestros episodios de GE y ITR ocurrieron durante las estaciones de invierno, y existen posibles interacciones entre brotes y aumento de la mortalidad en esta época del No es sorprendente que se haya observado una mayor tasa de letalidad por todas las causas en los contextos de la gripe, como se informó en estudios previos [25] [27]. La edad y la autonomía tuvieron efectos similares en los diferentes contextos, pero en el GE y en menor grado en los brotes de gripe, el número relativamente pequeño de muertes podría haber limitado el poder de las pruebas estadísticas. En los hogares de ancianos, los residentes son generalmente dados de alta por muerte. El número de residentes que perdieron el seguimiento fue bajo (0,14% en los primeros 28 días), por lo que la tasa de rotación del intervalo de 7 días calculada sobre la base de la mediana de los EE.UU. proporciona una buena indicación de la tasa media de letalidad del caso. La tasa de letalidad de los brotes noV+ fue similar a la tasa estimada de rotación del intervalo de 7 días (1,6%), lo que indica que este contexto tuvo un Ambas características individuales fueron significativas en los brotes de gripe+, y la autonomía ajustada para la edad fue significativa en los episodios de la gripe.La influencia de la edad sobre la mortalidad en un contexto de gripe ya ha sido descrita: se registró una tasa de mortalidad muy alta (831/100.000 habitantes) en personas de 90 años y mayores en comparación con las de 65 a 69 años (23/100.000 habitantes) [28].En nuestro análisis univariado, se observó el mayor riesgo en el grupo 90 cuyo riesgo de muerte fue al menos 2,6 más alto que el grupo <70.Cuando ajustado para la autonomía, el impacto de la edad no fue significativo en los residentes más autónomos en el contexto de la gripe+ y no en absoluto en el Flucontext.El análisis opuesto (autonomía ajustada para la edad) mostró mayor impacto global en el grupo menos autónomo (Flu-) o sólo en el grupo de edad 86 ( Los puntajes de fragilidad clínica no fueron utilizados en este estudio, pero en un estudio previo de pacientes con enfermedad crítica, se asociaron con mayor mortalidad, independientemente de la edad [29], lo que sugiere que, además de la edad, la autonomía puede ser un indicador valioso para la evaluación del impacto del brote en la vigilancia del brote; otros estudios han sugerido que la edad y ciertas comorbilidades son factores de riesgo independientes para la tasa de mortalidad por gripe o que la mortalidad aumenta según el número de factores de riesgo [28, 30]. Las comorbilidades y enfermedades subyacentes de diversas severidades podrían reflejar la fragilidad general y consecuentemente el riesgo de muerte. En los hogares de enfermería, la información sobre autonomía y edad es más fácil de recopilar e interpretar que los datos sobre comorbilidades; estos diversos enfoques deben ser evaluados y comparados en el objetivo de optimizar la evaluación del riesgo entre los residentes en hogares de enfermería; el presente Consecuentemente, algunos episodios en los niveles sin identificación disponible también pueden haber sido asociados con influenza o norovirus, y múltiples contaminaciones podrían haber sido subestimadas o no tenidas en cuenta. Además, se registraron prescripciones de vacunación y oseltamivir pero no incluidas porque no se determinó el genotipo de influenza y la identificación fue limitada. En segundo lugar, las muertes de residentes no infectados no fueron registradas en este protocolo aunque estos datos habrían proporcionado información valiosa sobre el contexto epidemiológico mundial. En conclusión, se observaron patrones específicos de susceptibilidad entre los residentes expuestos. En esta cohorte de hogares de enfermería, las tasas de infección variaron según el virus, sexo, duración de la estancia y edad, y hubo grandes diferencias en la letalidad según el virus, edad y autonomía. Por último, a medida que el nivel medio de edad y dependencia de los residentes siga aumentando, aumentando posteriormente el riesgo de infección y muerte, el personal de atención de la salud tendrá que estar cada vez más atento durante los brotes estacionales y se deben aplicar intervenciones específicas.

¿Cuál fue la tasa de infección reportada para la gripe?

Respuesta de atención crítica a un brote hospitalario de la infección por nCoV 2019 en Shenzhen, Chinahttps://doi.org/10.1186/s13054-020-2786-xSHA: 6a93283b4999ae5bc6aaf29f14e701dc8f25138eaAutores: Liu, Yong; Li, Jinxiu; Feng, YongwenFecha: 2020DOI: 10.1186/s13054-020-2786-xLicencia: cc-byAbstract: nanTexto: El principal desafío puede incluir (1) la identificación temprana del brote, (2) la rápida expansión de los pacientes, (3) el alto riesgo de transmisión nosocomial, (4) la imprevisibilidad del tamaño afectado, y (5) la falta de recursos de respaldo. La fiesta del Festival de Primavera ha agravado en gran medida la escasez de recursos humanos y el fuerte flujo de tráfico debido a las vacaciones de trabajadores sanos y trabajadores de las fábricas, lo que ha aumentado aún más el riesgo de transmisión. El punto clave es discriminar el brote de enfermedades infecciosas de los casos de agrupamiento regular de enfermedades similares a la gripe en la etapa temprana. Hay una compensación entre falsa alarma que causa pánico en la población y retraso en la identificación que conduce a la crisis social. La identificación temprana de la infección por nCoV 2019 presenta un gran desafío para los médicos de primera línea. Sus síntomas clínicos se superponen en gran medida con los de enfermedades respiratorias agudas comunes, incluyendo fiebre (98%), tos (76%) y diarrea (3%), a menudo más grave en adultos mayores con comorbilidades crónicas preexistentes [1]. Por lo general, las anomalías de laboratorio incluyen linfocitopenia e hipoxemia [1]. Además, los casos asintomáticos y la falta de kits de diagnóstico dan lugar a un diagnóstico tardío o incluso perdido inevitable y hace que muchos otros pacientes, visitantes y trabajadores de la salud estén expuestos a la infección por COV 2019-n. La respuesta crítica al brote de coronavirus debe ocurrir no sólo en el nivel del hospital, sino también en el nivel de la ciudad que está dominada por el gobierno. En la etapa temprana, el tamaño de la población de los pacientes no está más allá de la capacidad del hospital local de enfermedades infecciosas (IDH). El hospital general es responsable de la triage de fiebre, la identificación de los casos sospechosos, y el traslado a la IDH local. Este plan es obligatorio para cada hospital. La ciudad de Shenzhen ha establecido un plan epidémica de enfermedad infecciosa preexistente (IDEP), que ha facilitado el manejo y la contención del brote local de la COV 2019-n. En caso de que la carga del paciente supere la capacidad hospitalaria del IDH, los nuevos IDH deben considerarse ya sea construyendo un nuevo IDH temporal o reconstruyendo un hospital existente. Wuhan, el epicentro del brote, está compitiendo contra tiempo para construir dos hospitales especializados para pacientes nCoV, a saber, el hospital Huoshenshan y Leishenshan, mientras que se ha emprendido una estrategia diferente en la ciudad de Shenzhen reconstruyendo un hospital existente para convertirse en un IDH con capacidad para 800 camas. Los pacientes 2019-nCoV deben ser admitidos en salas de presión negativas de una sola cama en unidades aisladas con cuidados intensivos y vigilancia [2]. La ingeniería clínica debe tener planes para reconstruir habitaciones estándar [2]. Además, el hospital general puede considerar procedimientos como la suspensión de cirugías electivas, la cancelación de clínicas ambulatorias y procedimientos de diagnóstico ambulatorios, el traslado de pacientes a otras instituciones y la restricción de los visitantes del hospital [2]. Más importante aún, debido a que la capacidad de los hospitales para responder al brote depende en gran medida de sus camas de UTI disponibles, es necesario determinar el plan para aumentar la capacidad de las camas de UTI. El cuidado de los pacientes con VCI 2019-nCoV representa un riesgo de exposición sustancial para el personal de la UTI debido a las siguientes razones: altamente contagioso con vía de transmisión múltiple, alta dosis de exposición, largas horas diarias de contacto y permanencia en la UTI. El número reproductivo básico se estimó en 2,2 (IC 95%, 1,4 a 3,9) [3], o tan alto como entre 3,6 y 4,0 [4]. La mayor carga viral y los procedimientos generadores de aerosoles, como la ventilación no invasiva, aumentan el riesgo de exposición y transmisión [2, 7, 8]. Además, la eliminación de virus puede prolongarse y durar > 3 semanas de acuerdo con alguna literatura y nuestros datos no publicados [2]. Los proveedores sanitarios y los que están en contacto con pacientes infectados deben utilizar las precauciones de contacto, gotita y aerotransportadas con el respirador N95. Se han implementado y auditado estrictas prácticas de prevención y control de infecciones en nuestras unidades siguiendo el plan de prevención y control de infecciones publicado por el Comité Nacional de Salud de China (CNHC). Además, se ha establecido una clínica de la fiebre bien equipada como estación de triaje con personal capacitado que conoce las definiciones de casos 2019-nCoV. Para la sospecha de infección 2019-nCoV, varios puntos clave son los procedimientos cruciales: registro de una historia detallada, normalización de la neumonía, obtención de muestras El riesgo de exposición a 2019-nCoV puede causar un estrés psicosocial significativo a los trabajadores sanitarios [2]. La muerte de un médico de la ENT jubilado por una infección de 2019-nCoV ha aumentado los temores en enero de 2020. También se ha invitado a los psicoterapeutas a unirse a equipos médicos para evaluar y tratar el estrés potencial y la depresión por la seguridad de los trabajadores sanitarios. La gestión crítica de 2019-nCoV fue en gran medida de apoyo, incluyendo intubación, posicionamiento propenso temprano, bloqueo neuromuscular y oxigenación de membrana extracorpórea (ECMO) de acuerdo con las recomendaciones actualizadas por la CNHC. Se alentaron los corticosteroides sistemáticos de baja dosis, lopinavir/ritonavir, y la inhalación atomizada de interferón. Estos manejos críticos han funcionado bien hasta el momento, ya que nuestros pacientes de la nCoV 2019 tuvieron

¿Por qué la identificación temprana de los pacientes COVID-19 puede ser difícil?

Respuesta de atención crítica a un brote hospitalario de la infección por nCoV 2019 en Shenzhen, Chinahttps://doi.org/10.1186/s13054-020-2786-xSHA: 6a93283b4999ae5bc6aaf29f14e701dc8f25138eaAutores: Liu, Yong; Li, Jinxiu; Feng, YongwenFecha: 2020DOI: 10.1186/s13054-020-2786-xLicencia: cc-byAbstract: nanTexto: El principal desafío puede incluir (1) la identificación temprana del brote, (2) la rápida expansión de los pacientes, (3) el alto riesgo de transmisión nosocomial, (4) la imprevisibilidad del tamaño afectado, y (5) la falta de recursos de respaldo. La fiesta del Festival de Primavera ha agravado en gran medida la escasez de recursos humanos y el fuerte flujo de tráfico debido a las vacaciones de trabajadores sanos y trabajadores de las fábricas, lo que ha aumentado aún más el riesgo de transmisión. El punto clave es discriminar el brote de enfermedades infecciosas de los casos de agrupamiento regular de enfermedades similares a la gripe en la etapa temprana. Hay una compensación entre falsa alarma que causa pánico en la población y retraso en la identificación que conduce a la crisis social. La identificación temprana de la infección por nCoV 2019 presenta un gran desafío para los médicos de primera línea. Sus síntomas clínicos se superponen en gran medida con los de enfermedades respiratorias agudas comunes, incluyendo fiebre (98%), tos (76%) y diarrea (3%), a menudo más grave en adultos mayores con comorbilidades crónicas preexistentes [1]. Por lo general, las anomalías de laboratorio incluyen linfocitopenia e hipoxemia [1]. Además, los casos asintomáticos y la falta de kits de diagnóstico dan lugar a un diagnóstico tardío o incluso perdido inevitable y hace que muchos otros pacientes, visitantes y trabajadores de la salud estén expuestos a la infección por COV 2019-n. La respuesta crítica al brote de coronavirus debe ocurrir no sólo en el nivel del hospital, sino también en el nivel de la ciudad que está dominada por el gobierno. En la etapa temprana, el tamaño de la población de los pacientes no está más allá de la capacidad del hospital local de enfermedades infecciosas (IDH). El hospital general es responsable de la triage de fiebre, la identificación de los casos sospechosos, y el traslado a la IDH local. Este plan es obligatorio para cada hospital. La ciudad de Shenzhen ha establecido un plan epidémica de enfermedad infecciosa preexistente (IDEP), que ha facilitado el manejo y la contención del brote local de la COV 2019-n. En caso de que la carga del paciente supere la capacidad hospitalaria del IDH, los nuevos IDH deben considerarse ya sea construyendo un nuevo IDH temporal o reconstruyendo un hospital existente. Wuhan, el epicentro del brote, está compitiendo contra tiempo para construir dos hospitales especializados para pacientes nCoV, a saber, el hospital Huoshenshan y Leishenshan, mientras que se ha emprendido una estrategia diferente en la ciudad de Shenzhen reconstruyendo un hospital existente para convertirse en un IDH con capacidad para 800 camas. Los pacientes 2019-nCoV deben ser admitidos en salas de presión negativas de una sola cama en unidades aisladas con cuidados intensivos y vigilancia [2]. La ingeniería clínica debe tener planes para reconstruir habitaciones estándar [2]. Además, el hospital general puede considerar procedimientos como la suspensión de cirugías electivas, la cancelación de clínicas ambulatorias y procedimientos de diagnóstico ambulatorios, el traslado de pacientes a otras instituciones y la restricción de los visitantes del hospital [2]. Más importante aún, debido a que la capacidad de los hospitales para responder al brote depende en gran medida de sus camas de UTI disponibles, es necesario determinar el plan para aumentar la capacidad de las camas de UTI. El cuidado de los pacientes con VCI 2019-nCoV representa un riesgo de exposición sustancial para el personal de la UTI debido a las siguientes razones: altamente contagioso con vía de transmisión múltiple, alta dosis de exposición, largas horas diarias de contacto y permanencia en la UTI. El número reproductivo básico se estimó en 2,2 (IC 95%, 1,4 a 3,9) [3], o tan alto como entre 3,6 y 4,0 [4]. La mayor carga viral y los procedimientos generadores de aerosoles, como la ventilación no invasiva, aumentan el riesgo de exposición y transmisión [2, 7, 8]. Además, la eliminación de virus puede prolongarse y durar > 3 semanas de acuerdo con alguna literatura y nuestros datos no publicados [2]. Los proveedores sanitarios y los que están en contacto con pacientes infectados deben utilizar las precauciones de contacto, gotita y aerotransportadas con el respirador N95. Se han implementado y auditado estrictas prácticas de prevención y control de infecciones en nuestras unidades siguiendo el plan de prevención y control de infecciones publicado por el Comité Nacional de Salud de China (CNHC). Además, se ha establecido una clínica de la fiebre bien equipada como estación de triaje con personal capacitado que conoce las definiciones de casos 2019-nCoV. Para la sospecha de infección 2019-nCoV, varios puntos clave son los procedimientos cruciales: registro de una historia detallada, normalización de la neumonía, obtención de muestras El riesgo de exposición a 2019-nCoV puede causar un estrés psicosocial significativo a los trabajadores sanitarios [2]. La muerte de un médico de la ENT jubilado por una infección de 2019-nCoV ha aumentado los temores en enero de 2020. También se ha invitado a los psicoterapeutas a unirse a equipos médicos para evaluar y tratar el estrés potencial y la depresión por la seguridad de los trabajadores sanitarios. La gestión crítica de 2019-nCoV fue en gran medida de apoyo, incluyendo intubación, posicionamiento propenso temprano, bloqueo neuromuscular y oxigenación de membrana extracorpórea (ECMO) de acuerdo con las recomendaciones actualizadas por la CNHC. Se alentaron los corticosteroides sistemáticos de baja dosis, lopinavir/ritonavir, y la inhalación atomizada de interferón. Estos manejos críticos han funcionado bien hasta el momento, ya que nuestros pacientes de la nCoV 2019 tuvieron

¿Por qué el riesgo de exposición a COVID-19 es muy alto para el personal de la UCI y qué precauciones deben tomarse?

El virus de la estomatitis vesicular con la glicoproteína del virus de la rabia dirige el transporte transsináptico retrógrado entre las neuronas in vivohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3566411/SHA: ee48061797d29eeef5a9e606841bf8ab04b1d75bAutores: Beier, Kevin T.; Saunders, Arpiar B.; Oldenburg, Ian A.; Sabatini, Bernardo L.; Cepko, Constance L.Fecha: 2013-02-07DOI: 10.3389/fncir.2013.00011Licencia: cc-byAbstract: Definir las conexiones entre neuronas es crítico para nuestra comprensión de la estructura y función del sistema nervioso. Los virus recombinantes diseñados para transmitir a través de las sinapsis proporcionan un enfoque poderoso para la disección de los circuitos neuronales in vivo. Recientemente demostramos que el virus de la estomatitis vesicular recombinante (VSV) puede estar dotado de una capacidad de rastreo transsináptico anterograda o retrógrada, proporcionando al virus diferentes glicoproteínas. Aquí ampliamos la caracterización de la transmisión y expresión génica del VSV recombinante (rVSV) con la glucoproteína del virus de la rabia (RABV-G), y proporcionamos ejemplos de su actividad relativa a la forma de trazador transsináptico anterograda de rVSV. rVSV con RABV-G se encontró para impulsar la fuerte expresión de los transgenes y para propagarse rápidamente de la neurona a la neurona de una manera sólo retrógrada. Dependiendo de cómo se entregara el RABV-G, VSV sirvió como un rastreador polisináptico o monosináptico, o pudo definir proyecciones a través de la captación axonal y el transporte retrógrado. En animales coinfectados con rVV en su forma anterógrada, rVSV con RABV-G podría ser utilizado para comenzar a caracterizar las similitudes y diferencias en las conexiones a diferentes áreas. rVSV con RABV-G proporciona una herramienta de rastreo flexible, rápida y versátil que complementa el trazador transsináptico basado en VSV previamente descrito. Texto: Mapear la conectividad neuronal en el sistema nervioso central (CNS) de organismos incluso simples es una tarea difícil. Los virus recombinantes diseñados para rastrear conexiones sinápticas y expresar transgenes prometen permitir un mapeo de mayor rendimiento de conexiones entre neuronas que otros métodos, por ejemplo, la reconstrucción en serie a partir de micrografías electrónicas (Bock et al., 2011; Briggman et al., 2011). Los virus Pseudorabies (PRV) y Rabies (RABV) han sido los virus de rastreo de circuitos mejor caracterizados y más utilizados hasta la fecha (Ugolini et al., 1989; Kelly y Strick, 2000). RABV fue recientemente modificado por Wickersham y colegas de tal manera que puede viajar a través de una sola sinapsis, permitiendo una definición directa de conexiones monosinápticas (Wickersham et al., 2007b). Esta estrategia permitió la primera identificación inequívoca de células retrógradamente conectadas desde una célula inicialmente infectada Además, la célula de arranque podría definirse a través de la expresión de un receptor viral específico que limitaba la infección inicial. Recientemente, creamos un virus monosináptico anterogrado que complementa los marcadores virales retrógrados previamente disponibles (Beier et al., 2011). El virus de la estomatitis vesicular (VSV), un virus relacionado con el VRAB, con su propio gen de la glucoproteína (G) (VSV-G), o con un G del virus no relacionado de la coriomeningitis linfocítica (LCMV-G), se disemina en la dirección anterograda a través de las sinapsis. VSV puede ser utilizado como un rastreador polisináptico que se propaga a través de muchas sinapsis, debido al hecho de que la forma normal, replicacióncompetente del virus no causa enfermedades graves en los seres humanos (Brandly y Hanson, 1957; Johnson et al., 1966; Brody et al., 1967). Si el virus es un rastreador monosináptico o polisináptico está determinado por el método de entrega del gen G (Figura 1A). Ventajas de VSV son que es bien caracterizado, es relativamente simple en comparación con PRV, y crece rápidamente a alto título en células de cultivo de tejidos. También se está desarrollando como un vector de la vacuna, a menudo utilizando un G de otro virus como el inmunogeno, así como se está desarrollando como un agente citocida que se dirigirá a las células tumorales en los seres humanos (Balachandran y Barber, 2000; Stojdl et al., 2000 Stojdl et al., 2003. Estudios anteriores de los patrones anatómicos de transmisión, así como registros fisiológicos, han demostrado que la transmisión de VSV y RABV entre neuronas es vía sinapsis (Kelly y Strick, 2000; Wickersham et al., 2007b; Beier et al., 2011). Además, se ha demostrado que RABV, así como lentivirus con RABV-G en su envoltorio, viajan retrógradamente desde un lugar de inyección (Mazarakis et al., 2001; Wicker Hipotemamos que proporcionar un VSV recombinante (rVSV) con el RABV-G crearía un rastreador polisináptico retrógrado sin las preocupaciones de bioseguridad inherentes a RABV. Nuestra caracterización inicial de rVVV con RABV-G mostró que de hecho FIGURE 1 Estrategias de rastreo sináptico utilizando VSV. (A) Esquema que ilustra las estrategias para la transmisión retrógrada o antierograda de la codificación de rVSV transsináptica polisináptica. La célula inicialmente infectada está indicada por un asterisco. VSV codificación de una glucoproteína (G) dentro de su genoma puede propagarse polisinápticamente. La dirección de la propagación depende de la identidad de la glucoproteína. Las neuronas infectadas se muestran en verde. En algunos casos, la célula de arranque inicialmente infectada puede definirse por la expresión de un receptor aviar, TVA (marcado con una proteína fluorescente roja). Las neuronas que expresan TVA pueden entonces ser infectadas específicamente por rVSV G con la glicoproteína EnvA/RABV-G (A/RG) (Wickersham et al., 2007b) en la superficie del virion [rVSV G(A/RG)]. Estas células de arranque son entonces amarillas, debido a GFP viral y mCherry de la expresión TVA-mCherry. Para el rastreo monosináptico, la proteína G se expresa en la célula de expresión TVA, y por lo tanto complementa rVSV G para permitir la transmisión en una dirección específica. (B) Diagramas genómicos de vectores rVSV. Todos los VSV contienen cuatro proteínas esenciales: N, P, M y L. Algunos virus codifican un gen G en su genoma, lo que les permite diseminar polisinápticamente. Los vectores rVSV típicamente codifican un transgen en la primera posición, mientras que otros llevan un transgen adicional en la posición G. (C) Caracterización morfológica de neuronas infectadas por rVSV en varios lugares dentro del cerebro del ratón. (i,ii) neuronas de Caudate-putamen (CP) a 4 dpi de una inyección de CP con virus rVSV(VSV-G) codificando i) CFP o ii) Korange. (iii) Las neuronas etiquetadas de la región CA1 del hipocampo se muestran a 5 dpi después de la inyección en el hipocampo de rVSV(VSV-G) codificando Venus. (iv,v) Las neuronas piramidales corticales se muestran después de la inyección en la CP de rVSV(RABV-G) expresando iv) GFP a 24 hpi, o v) mCherry a 48 hpi. Inserto en iv) es una alta magnificación de la neurona en el panel iv), destacando el etiquetado de las espinas dendríticas. (vi) Múltiples virus se pueden inyectar en el mismo animal. Aquí, los virus rVSV G(VSV-G) individuales codificando CFP, GFP, Venus, Korange, y mCherry se utilizaron para infectar la corteza. Barras de escala = 50 μm. www.fronterizosin.org Febrero 2013 Volumen 7 Artículo 11 2 se podría tomar como un trazador retrógrado (Beier et al., 2011) Para determinar si podía transmitir entre las neuronas después de su replicación en neuronas, y para analizar más a fondo los patrones de transmisión tanto de las formas monosinápticas como polisinápticas de rVSV con RAVV-G, hicimos inyecciones en varios puntos del SNC y periféricos. Además, realizamos coinfecciones de rVVV con RAV-G y la forma anterógrada de rVSV para aprovechar las diferencias en la direccionalidad de la transmisión de estos dos virus en circuitos cartográficos. Esquemáticas de virus creados y utilizados a lo largo de este estudio se muestran en la Figura 1. Creamos plásmidos vectoriales de rVSV con diferentes transgénicos en las posiciones genómicas primera o quinta (Figura 1B). Después de rescatar cada virus, probamos la capacidad de cada uno de ellos de expresar transgénicos en diferentes regiones cerebrales Todos los vectores rVSV impulsaron la expresión robusta del fluoroforo 1 o 2 días después de la infección (hpi) (Figura 1C ) (van den Pol et al., 2009). De hecho, por 12 hpi, el etiquetado fue lo suficientemente brillante como para imagenar detalles morfológicos finos, tales como espinas dendríticas (Figura 1C, iv). Para caracterizar las propiedades fisiológicas de las células infectadas con rVSV, probamos una codificación rVSV competente GFP, con RABV-G en el genoma en lugar de VSV-G [en adelante designado rVSV(RABV-G)]. van den Pol et al. Sin embargo, por 2 dpi, las propiedades electrofisiológicas eran tan anormales en las células piramidales corticales infectadas que no se podían realizar mediciones fisiológicas. La velocidad y la fuerza de la expresión de transgenes codificados por VSV depende de la posición genómica del gen (van den Pol et al., 2009; Beier et al., 2011). Los genes en la primera posición se expresan más alto, con una disminución en el nivel de expresión en posiciones más 3 dentro de la fila viral plus. Cuando GFP fue insertado en la primera posición de VSV, la fluorescencia de GFP fue detectable por primera vez en aproximadamente 1 hpi en células cultivadas (van den Pol et al., 2009). Con el fin de cuantificar la expresión relativa de una proteína fluorescente en la primera posición genómica en neuronas, las rodajas de hipocampo de rata fueron infectadas con una replicación incompetente rVSV que expresa mCherry (rVSV G, Figuras 1A, B). Se trata de un virus G que tuvo el RABV-G suministrado en trans durante la preparación del stock del virus [referido como rVSV G(RABV-G)]. La intensidad media de fluorescencia de las células infectadas se midió cada hora a lo largo de 18 h. Por 4 hpi a 37 • C, la fluorescencia roja era claramente visible, y alcanzó niveles máximos de aproximadamente 14 hpi (N = 3, Figura 3 ). Resultados similares se obtuvieron con un virus codificando GFP en la primera posición genómica en lugar de mCherry (es decir, Figura 1B ) (N = 3). Anteriormente se demostró que el rVVSV(RABV-G) podía ser tomado retrógradamente por neuronas (Beier et al., 2011), pero estos experimentos no distinguían entre la absorción axonal directa de la transmisión inocula Para distinguir entre estos dos mecanismos y ampliar los análisis anteriores, se realizaron más experimentos en el sistema visual mamífero (Figuras 4A-G). Como el área visual de la corteza 1 (V1) no recibe proyecciones directas de las células ganglionares de la retina (RGCs), sino que recibe una entrada secundaria de los CGRs a través del núcleo genogénico lateral (GNL), la infección de los CGRs por inyección de V1 demostraría la transmisión retrógrada de células que soportaban al menos una ronda de replicación viral. Tras una inyección V1 con rVSV(RABV-G), los CGRs positivos de GFP fueron observados en la retina por 3 dpi (N = 3; Figura 4G ). Importantemente, el etiquetado viral en el cerebro se restringió a áreas de proyección primaria y secundaria, incluso a 7 dpi. Entre ellos se encontraban el LGN (Figura 4D ) y el hipotálamo (Figura 4E ), dos áreas conocidas por proyectar directamente a V1 (Kandel, 2000). Se observó etiquetado selectivo en otras áreas, como áreas corticales que rodean a V1 (Figura 4C), que proyectan directamente a V1, y también en el estrato central superior de colliculus (SC), que proyectan al LGN (Figura 4F ). También se observó etiquetado en el núcleo basalis, que proyecta a la corteza, así como muchos componentes del circuito de ganglios basales, que proporcionan entrada al tálamo [como el caudato-putamen (CP), el globus pallidus (GP), y el núcleo subtalámico (STn)]. En consonancia con la falta de transmisión viral generalizada, los animales no mostraron signos de enfermedad a 7 dpi. Estos datos muestran que rVSV(RABV-G) puede propagarse en una dirección retrógrada desde el lugar de inyección, pero no abordan si el virus puede propagarse exclusivamente en la dirección retrógrada. La especificidad transsináptica direccional sólo se puede abordar definitivamente mediante un circuito unidireccional. Por lo tanto, nos dirigimos a la corteza motora primaria (M1) a la conexión CP, en la que las neuronas se proyectan desde la corteza a la CP, pero no en la otra dirección (Figura 4H ) (Beier et al., 2011). Las inyecciones de rVSV(RABV-G) en M1 no deben etiquetar las neuronas en la CP si el virus sólo puede etiquetar las células a través de sinapsis en la dirección retrógrada De hecho, en 2 dpi, se etiquetaron áreas que proyectaban directamente al lugar de inyección, incluyendo la corteza contralateral (Figura 4I ). Sólo se observaron axones de células corticales en la CP, sin cuerpos celulares marcados con GFP presentes en la CP (Figura 4J), consistentes con la falta de diseminación transsináptica anterograda. Por 3 dpi, se observó un pequeño número de neuronas medianas espinosas (MSN) en la CP, probablemente a través de diseminación secundaria de neuronas talámicas o GP inicialmente infectadas (datos no mostrados). Una ventaja particular de los trazadores virales retrógrados es la capacidad de etiquetar neuronas del SNC proyectando a sitios periféricos. Esto ha sido una poderosa aplicación tanto de RABV y PRV (Ugolini et al., 1989; Standish et al., 1994). Para comprobar si el rVSV (RABV-G) también podría realizar esta función, examinamos la inervación de la superficie de la dura por neuronas del ganglio trigémino, un circuito neuronal que se cree que está involucrado en migrañas (Penfield y McNaughton, 1940; Mayberg et al., 1984). Estas neuronas tienen axones, pero no dendritas canónicas, y envían proyecciones a la médula espinal y tronco cerebral. Por lo tanto, la única manera en que las neuronas trigéminas podrían ser etiquetadas desde la aplicación viral a la dura es mediante la absorción retrógrada del virus. Aplicamos el rVSV(RABV-G) a la dura mater intacta y analizamos la dura, el ganglio trigémino y el CNS para la etiquetación (Figura 4K ). En el momento más temprano examinado, 3 dpi, observamos axones viajando a lo largo de la dura, pero poca otra evidencia de infección (Figura 4L). No se observaron cuerpos de células neuronales etiquetados en la dura, consistentes con la falta de neuronas en esta superficie. En contraste, encontramos cuerpos celulares etiquetados en el ganglio trigémino (Figura 4M ). No se observó infección en el SNC, incluso a 4 dpi, consistente con la falta de entradas del cerebro en el ganglio trigémino (N = 4 animales). Para caracterizar más patrones y cinética de transmisión viral y especificidad direccional de la propagación transsináptica, se hicieron inyecciones de rVSV(RABV-G) en la CP (Figura 5A ). Para determinar qué células fueron etiquetadas por absorción directa de virus en el inóculo, se inyectó un conjunto separado de animales en la CP con la replicación incompetente rVSV G(RABV-G) (N = 3 animales, analizados 3 dpi). Se observaron células etiquetadas por rVSV G(RABV-G) en la CP, GP, substantia nigra (SN), tálamo y capas 3 y 5 de la corteza, consistentes con infección en el terminal de axón y etiquetado retrógrado de cuerpos celulares de neuronas conocidas por proyectar directamente a la CP (Figura 5C ) (Albin et al., 1995). Las áreas etiquetadas por inyección de CP se indican en la Figura 5B. Los patrones de propagación para la replicación-competente rVSV(RABV-G) se caracterizaron a lo largo de 1-5 dpi (Figuras 5D-H). Durante este intervalo, progresivamente más células en regiones infectadas fueron etiquetadas por rVSV(RABV-G), incluyendo dentro de la CP, núcleo basalis, corteza y GP (listado en la Figura 5B ). Además, más células corticales fueron etiquetadas en grupos cercanos a neuronas piramidales corticales, tanto ipsilaterales como contralaterales al lado inyectado, incluyendo células neurogliaformas (datos no mostrados). Estos datos contrastan con los observados después de la infección por un virus de rastreo transsináptico anterogrado, como rVSV con su propio gen G, rVSV(VSV-G) (Figura 5B) A 3 dpi después de la inyección de rVSV(VSV-G) en la CP, la corteza cerebral no fue etiquetada, pero las regiones que recibieron proyecciones de la CP, como el STn, GP y SN, fueron etiquetadas (Beier et al., 2011). Para investigar otras áreas de evidencia de diseminación transsináptica retrógrada de células a células, se examinó el núcleo basalis después de la infección de la CP con rVSV (RABV-G). El núcleo basalis fue etiquetado por 2 dpi (Figuras 5E-H), consistente con al menos un salto transsináptico único, ya que esta área no se proyecta directamente a la CP. El virus parecía viajar transsinápticamente a la velocidad de aproximadamente 1 sinapsis por día, como evidencia la falta de células neurogliaformas etiquetadas en la corteza, y la falta de neuronas en el núcleo basalis a 1 dpi, y la etiqueta que aparece en estos tipos/áreas celulares a 2 dpi, como se observó previamente (Beier et al., 2011). La etiqueta se mantuvo bien restringida a los circuitos corticostriatales esperados a 5 dpi, sugiriendo que la propagación viral se vuelve menos eficiente después de cruzar una o dos conexiones, consistentes con inyecciones en V1 (Figura 4). Mientras que las células gliales se pueden infectar y se observaron cerca del lugar de inyección (van den Pol et al., 2002; Chauhan et al., 2010), las células gliales infectadas fuera del lugar de inyección generalmente no se observaron. Una ventaja de tener formas tanto anterogradas como retrógradas del mismo virus es que pueden utilizarse en paralelo, o en tándem, para rastrear circuitos desde y hacia un único o múltiple lugar de inyección, con cada virus con cinética similar de propagación y expresión génica. De hecho, si diferentes fluoroforos se utilizan en diferentes virus, por ejemplo, rVSV(VSV-G) y rVSV(RABV-G), entonces los virus pueden ser co-inyectados en el mismo lugar y su transmisión puede ser rastreada de forma independiente (Figura 6A ). Esto es más sencillo si no hay células en el lugar de inyección que estén infectadas inicialmente por ambos virus. Las células coinfectadas pueden ser fácilmente detectadas, ya que expresarían ambas proteínas fluorescentes poco después de la inyección. Para determinar si dos virus permitirían el rastreo transsináptico simultáneo anterogrado y retrógrado desde un único lugar de inyección, se inyectaban individualmente un rVSV(VSV-G) que expresaba Venus y un rVSV(RABV-G) que expresaba mCherry (figuras 6B-D) o co-inyección (figuras 6E-G) en la corteza motora, y se examinaban los cerebros 3 dpi. El patrón de etiquetado de los cerebros co-inyectados era equivalente a los patrones observados cuando cada virus se inyectaba individualmente: se observó que rVSV(VSV-G) infectaba neuronas en la corteza, CP y núcleos posteriores, mientras que el rVSV(RABV-G) no se observó que infectaba neuronas en la CP, sino más bien en el tálamo y La tasa de coinfección inicial depende de La presencia o ausencia de etiquetado está indicada por (+) y (−), respectivamente. La extensión del etiquetado está indicada por el número de (+). Algunos animales fueron infectados con virus G para determinar qué áreas fueron marcadas por la absorción directa de los viriones, en lugar de por la replicación y transmisión. Estos fueron sacrificados a 3 dpi. (C) Sección parasaggital de un cerebro infectado con VSV[delta de Grecia]G(RABV-G). El lugar de inyección está marcado por una flecha roja. Varias áreas que se proyectan directamente a la CP fueron etiquetadas debido a la absorción directa de los viriones, incluyendo la corteza, el tálamo y GP (cabezas de flecha), 3 dpi. la dosis de la ínócula inicial. Al inyectar 3 × 10 3 unidades de conformación de foco (ffu) rVSV(VSV-G) y 3 × 10 4 ffu rVSV(RABV-G), no se observó coinfección en el lugar de inyección. Así, la coinfección de la misma región cerebral, sin coinfección de las mismas células, no altera el comportamiento de propagación de rVSV(VSV-G) ni de rVSV(RABV-G). Un ejemplo de cómo este sistema de rastreo transsináptico retrógrado y anterogrado puede utilizarse es determinar si tres Fronteras en los Circuitos Neuales www.fronterizosin.org Febrero 2013 Volumen 7 Artículo 11 8 regiones distintas están conectadas y la direccionalidad de cualquier conexión. Por ejemplo, el virus transsináptico anterogrado puede inyectarse en una región, el retrógrado en otra, y una tercera región puede entonces ser examinada para evidencia de etiquetado por uno o ambos virus (por ejemplo, Figura 6H ). Para probar esta posibilidad, se inyectó rVSV(VSV-G) en la corteza motora, se inyectó rVSV(RABV-G) en la substantia nigra pars reticulara (SNr), y se sacrificaron animales a 3 dpi. Observamos que las células estaban marcadas individualmente, ya sea con Venus [rVSV(VSV-G)] o con mCherry [rVSV(RABV-G)], y se encontraban en gran parte en diferentes regiones del CP (Figuras 6I,J) (N = 3). Estos resultados sugieren que las conexiones anterogradas de las células infectadas con rVSV(VSV-G) en el M1 fueron con CP MSNs que no proyectaban a la región del SNr inyectado con rVSV(RABV-G) (N = 3 animales). Además del rastreo polisináptico, VSV puede ser modificado a circuitos traza monosinapticamente (Beier et al., 2011). Con RABV, esto se logró in vivo por primera vez infectando con un virus asociado adeno (AAV) que expresa TVA, un receptor para un retrovirus aviar, y RABV-G (Wall et al., 2010). Esto fue seguido 3 semanas más tarde por una infección con un VRABG con una glucoproteína quimérica EnvA/RABV-G en la superficie del virión (Wickersham et al., 2007b), que permitió la infección específicamente de las células que expresan TVA. Se utilizó una estrategia similar para probar la capacidad de rVSV de rastrear monosinápticamente neuronas retrógradas conectadas in vivo. Se utilizaron para esta prueba las entradas a las neuronas de expresión de la colina acetiltransferasa (ChAT) en el estriato. Estas neuronas reciben principalmente la entrada de la corteza y el tálamo (Thomas et al., 2000; Bloomfield et al., 2007) (Figura 7A). Para marcar esta población, cruzamos ratones ChAT-Cre a ratones Ai9, que expresan tdTomato en células con antecedentes de expresión Cre (Madisen et al., 2010). Los ratones de seis semanas de edad de esta cruz fueron inyectados en la CP con dos vectores AAV: uno que expresa una proteína de fusión Cre-condicional ("floxed") TVA-mCherry, y otro que expresa una floxed RABV-G. Dos semanas más tarde, los ratones fueron inyectados en las mismas coordenadas con rVSVG con la glucoproteína quimérica EnvA/RABV-G en la superficie del virion [rVSV G(A/RG)] (Beier et al., 2011). Las células infectadas con éxito con estos dos vectores AAV podrían albergar infección por un rVSV y deberían ser capaces de producir vi Estas células de arranque también deberían expresar tdTomato y GFP. Si se produjeran rVSV, y si se transmitiera a través de la sinapsis retrógradamente, las neuronas corticales y talámicas deberían ser etiquetadas por GFP. Los ratones inyectados con estos virus AAV y rVSV fueron sacrificados 5 días después de la infección por rVSV, y los cerebros analizados para la fluorescencia. Como se esperaba para las células de arranque, algunas neuronas en la CP expresaron tdTomato y GFP (Figura 7B). Fuera de la CP, se observaron pequeños números de neuronas GFP+ que no eran mCherry+ en la corteza (Figuras 7C,D) y thalamus (Figura 7E), consistentes con la propagación retrógrada. Los animales de control que no expresan Cre, o no se inyectan con la codificación AAV RABV-G, no etiquetan las células en la corteza o el tálamo (N = 3 para ambos controles y condición experimental). Aquí, informamos sobre el uso de rVSV como un rastreador transsináptico retrógrado para el circuito CNS. VSV se puede modificar para codificar la proteína RABV-G en el genoma viral, permitiendo que el virus se reproduzca y transmita a través de múltiples células sinápticamente conectadas, es decir, como un trazador polisináptico. Alternativamente, si el virus tiene el gen G eliminado de su genoma y RABV-G se proporciona en trans, se comporta como un trazador monosináptico (Beier et al., 2011). Aunque se sabe desde hace muchos años que el VRAB viaja retrógradamente entre las neuronas (Astic et al., 1993; Ugolini, 1995; Kelly y Strick, 2003), y el seudotipado de lentivirus con RABV-G es suficiente para el transporte axonal (Mazarakis et al., 2001), la especificidad de transmisión retrógrada entre neuronas no había demostrado claramente ser una propiedad de la proteína G en sí, ya que podría haber sido debido a otras proteínas virales además de, o en lugar de, la proteína G viral. Dado que el VSV nativo no tiene estas propiedades transsinápticas retrógradas (van den Pol et al., 2002; Beier et al., 2011), y la única alteración al genoma del VSV fue la sustitución del gen VSV G por el gen G de RABV, está claro que la glicoproteína RABV es responsable de la dirección retrógrada de la transmisión viral a través de las sinapsis, al menos en el caso del rVVV. El inicio temprano de la expresión génica del VSV en relación con el RABV (una hora frente a varias horas) lo hace beneficioso en paradigmas experimentales en los que el experimento debe realizarse dentro de una ventana estrecha del tiempo, como cortes de tejido y explantes. Además, más de un transgene puede codificarse en el genoma viral sin necesidad de un elemento 2A o IRES. El uso de la primera posición del genoma aumenta el nivel de expresión del transgéne insertado en esa ubicación, ya que VSV (y RABV) expresan genes en un gradiente transcripcional; por lo tanto, el primer gen es el más transcrito (Knipe, 2007). Esto conduce a predicciones racionales de los niveles de expresión para que uno pueda elegir la posición de inserción de un transgéne, o transgénes, de acuerdo con este gradiente y el nivel deseado de expresión. El tamaño del capsid viral aparentemente no es rígido, permitiendo la inclusión de genomas que son sustancialmente más grandes que el genoma nativo, a diferencia de la capacidad rígida para algunos otros vectores virales, como AAV Yan et al., 2000). El hecho de que el VSV pueda ser hecho para diseminar anterogradamente (Beier et al., 2011) o retrógradamente a través de sinapsis con el cambio de un único gen ofrece varias ventajas sobre los trazadores virales que hasta ahora no han mostrado tal flexibilidad en la direccionalidad del rastreo. Además de la aplicación obvia de rastrear conexiones anterogradas, se pueden hacer combinaciones para explotar las diferentes formas del virus. Un ejemplo que emplea la infección simultánea con una forma anterograda y retrógrada de VSV se demuestra en la Figura 6. Este experimento fue diseñado para abordar si las proyecciones anterogradas de la corteza a la CP etiquetarían las mismas regiones cerebrales que fueron etiquetadas por un virus retrógrado inyectado en la SN. Aunque un bloque de superinfección por el virus puede impedir la infección de la misma célula con múltiples VSVr, las células adyacentes podrían seguir siendo etiquetadas por diferentes virus (Whitaker-Dowling et al., 1983). Los resultados observados podrían deberse a un etiquetado preferencial por el virus transsináptico anterógrado de las vías indirectas MSNs en este experimento, que luego se sinapizan en el GP, reflejando así un sesgo viral. Alternativamente, podría indicar que las neuronas corticales en la región inyectada en gran medida no etiquetan las NSM que proyectan al área de la SN inyectada con el virus retrógrado. Otra posibilidad es que se utilizó demasiado poco virus para observar el co-etiquetado de una región dada. Sin embargo, dada la densidad de infección (es decir, Figuras 6I,J), esta última posibilidad parece poco probable. Además, la propagación del rVSV polisináptico (RABV-G) parece atenuarse con el aumento del número de sinapsis cruzadas, lo que permite un análisis de la propagación viral más restringida. Esto es bastante fortuito, como si la propagación continuara, llevaría a una infección generalizada y letalidad. Además, la reconstrucción de la conectividad sería más difícil. Esta eficiencia reducida parece sostener también la forma monosináptica de VSV complementada con RABV-G, ya que la eficiencia de la transmisión parecía inferior al experimento comparable con RABV (Watabe-Uchida et al., 2012). Esto es probablemente debido a la atenuación viral cuando VSV-G es reemplazado por RABV-G.Nos sentimos atraídos por el uso del VSV como rastreador viral debido a su largo historial como agente de laboratorio seguro, replicante y competente. Los trabajadores de laboratorio que utilizan VSV no han contraído ninguna enfermedad, y las infecciones por VSV naturales entre las poblaciones humanas de América Central y el suroeste de Estados Unidos (Rodríguez, 2002) se producen sin patología evidente (Johnson et al., 1966; Brody et al., 1967). VSV fue así un candidato atractivo para su uso como rastreador polisináptico para estudios del SNC, lo que requiere una capacidad de replicación a través de múltiples ciclos de transmisión. Tanto las formas de replicación como las formas incompetentes de VVV están en uso bajo contención de Bioseguridad Nivel 2. Es probable que las diferencias de patogenicidad entre VSV y VRAB se deban a la capacidad del VRAB para evadir el sistema inmunitario innato, en particular el interferón (Hangartner et al., 2006; Junt et al., 2007; Lyles and Rupprecht, 2007; Rieder and Conzelmann, 2009; Iannacone et al., 2010). La infección por VSV provoca eficazmente una respuesta al interferón, y no ha evolucionado un método de escape de esta respuesta, a diferencia de RABV (Brzózka et al., 2006). De hecho, el VSV se está persiguiendo como vacuna contra otros virus, entre ellos el VRAB (Lichty et al., 2004; Publicover et al., 2004; Kapadia et al., 2005; Schwartz et al., 2007; Iyer et al., 2009; Geisbert El VSV no se disemina típicamente más allá del sitio inicialmente infectado en la periferia (Kramer et al., 1983; Vogel y Fertsch, 1987). Esto probablemente es la causa de los síntomas menores o ausentes en humanos y animales infectados en la naturaleza. Los vectores VSV polisinápticos son así predichos para ser mucho más seguros que los vectores RABV polisinápticos. Hemos probado esta predicción inyectando una serie de ratones en las almohadillas y músculos de las piernas traseras con rVSV(RABV-G), con el resultado de que ningún animal inyectado mostró ninguna evidencia de morbilidad o mortalidad (Beier, Goz et al., en preparación). Aunque más seguro para los trabajadores de laboratorio que RABV, el principal inconveniente al uso del VSV es su toxicidad celular rápida (van den Pol et al., 2009; Beier et al., La toxicidad se debe a la supresión de la transcripción celular y a un bloqueo en la exportación de ARN celulares del núcleo al citoplasma (Black and Lyles, 1992; Her et al., 1997; Ahmed and Lyles, 1998; Petersen et al., 2000; von Kobbe et al., 2000), así como a la inhibición de la traducción de mRNA celulares (Francoeur et al., 1987; Jayakar et al., 2000; Kopecky et al., Frontiers in Neural Circuits www.fronterizosin.org Febrero 2013 Volumen 7 Artículo 11 10 2001). El VSV es mucho más rápido para promulgar su programa de expresión genética que el RABV, de modo que las células sufren los efectos tóxicos más rápidamente que después de la infección por RABV. Un aspecto de VSV que puede ser explotado en el futuro para mejorar la velocidad de toxicidad es el uso de mutantes y variantes de VSV. Uno de estos mutantes es el M51R, que nos permitió realizar análisis fisiológicos de células pre y post-sinápticas (Beier et al., 2011). Estamos en el proceso de examinar las propiedades de transmisión de este mutante in vivo, así como los efectos de otras mutaciones o variantes virales en la prolongación de la salud de las neuronas después de la infección. vectores rVSV se pueden utilizar para estudiar la conectividad de circuitos neuronales. Además de combinaciones de formas de replicación-competentes de VSV, las formas de replicación-incompetentes, monosinápticas del virus se pueden combinar fácilmente, sin la necesidad de cambiar virus (Beier et al., 2011). Esto permite una forma directa de estudiar tanto las proyecciones hacia una población celular genéticamente definida como hacia fuera. Esto se puede hacer con el mismo genoma viral, siendo el único cambio necesario la glucoproteína, para la selección de la dirección de transmisión. Esta flexibilidad del VSV lo convierte en un poderoso vector multi-aplicación para el estudio de la conectividad en el SNC. Todos los clones del rVSV fueron clonados de la columna vertebral del rVSV G (Chandran et al., 2005). mCherry, Kusabira naranja, Venus y CFP fueron clonados en la primera posición (GFP) usando sitios XhoI y MscI, y VSV-G (un regalo de Richard Mulligan, Harvard Medical School, Boston, MA) y RABV-G (un regalo de Ed Callaway, Salk Institute, San Diego, CA) fueron clonados en la quinta posición (G) utilizando los sitios de restricción MluI y NotI. Los genes para proteínas fluorescentes fueron obtenidos de Clontech. Los virus fueron rescatados como se describió anteriormente (Whelan et al., 1995). A 95% de confluencia, ocho placas de células BSR de 10 cm fueron infectadas en un MOI de 0,01. Los sobrenadantes virales fueron recolectados a intervalos de 24h y ultracentrífugos a 21.000 RPM usando un rotor SW28 y resuspendido Para la titulación, las reservas virales concentradas se aplicaron en una serie de dilución a células BSR 100% confluentes y las placas se examinaron a 12 hpi. Las existencias virales se almacenaron a −80 • C. En el caso de los virus G, las células 293T fueron transfectadas con IEP (Ehrhardt et al., 2006) a un 70% de confluencia en platos de 10 cm con 5 μg de pCAG-RABV-G. Veinticuatro horas después de la infección, las células fueron infectadas a un MOI de 0,01 con rVSVG que expresaba GFP o mCherry. Los sobrenadantes virales se recogieron durante los siguientes 4 días a intervalos de 24 h. Los preparados virales están ahora disponibles en el núcleo viral de Salk GT3 (http://vectorcore.salk.edu/). Todos los Los plásmidos AAV-FLEx-RABV-G y AAV-FLEx-TVA-mCherry se originaron en el laboratorio de Naoshige Uchida (Watabe-Uchida et al., 2012), y las existencias de virus fueron regalos generosos de Brad Lowell, Harvard Medical School. Los ratones ChAT-Cre (B6;129S6-Chat tm1(cre)Lowl /J) y Ai9 (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor<tm9(CAG-tdTomato)Hze>/J) se obtuvieron del laboratorio Jackson (Madisen et al., 2010). Los ratones CD-1 de ocho semanas de edad se inyectaron utilizando microdispensadores capilares tirados (Drummond Scientific, Cat. No: 5-000-2005), utilizando coordenadas del Ratón Cerebro en coordenadas estereotáxicas (Franklin y Paxinos, 1997). Las coordenadas de inyección (en mm) utilizadas fueron: Para el análisis multicolor (Figuras 1C,D) se inyectó 3 × 10 9 ffu/mL rVSV en varias regiones. Para las inyecciones de CP, 100 nL de rVSV(RABV-G) o rVSV(VSV-G) a 3 × 10 7 ffu/mL se inyectó a una velocidad de 100 nL/min. Para los virus incompetentes de replicación, se inyectó 100 nL de 1 × 10 7 ffu/mL rVSV G(RABV-G) o rVSV G (VSV-G). En la corteza motora, se inyectaron 100 nL de 1 × 10 7 ffu/mL rVSV(RABV-G) y ratones cosecharon 2 dpi. Para las inyecciones de V1, se inyectaron 100 nL de 3 × 10 10 ffu/mL rVSV(RABV-G) y se examinó a los ratones 3 o 7 dpi. Para las infecciones de la dura mater, se aplicó 1 μL de 3 × 10 10 ffu/mL rVSV(RABV-G) a la superficie de la dura. Se permitió la absorción del virus, y la superficie fue cubierta posteriormente con cera ósea, y la herida suturada. Para la coinyección de virus en el mismo animal, 100 nL de una combinación de 3 × 10 7 ffu/mL rVSV(VSV-G) y 3 × 10 8 ffu/mL rVSV(RABV-G) fueron coinyectados en la corteza motora, y los cerebros examinaron 3 dpi. Para la inyección de virus en diferentes regiones, 100 nL de 3 × 10 7 ffu/mL rVSV(VSV-G) se inyectaron en M1, y 100 nL de 3 × 10 8 ffu/mL rVSV(RABV-G) en el SNr, y los cerebros examinaron 3 dpi. Se utilizó un título inferior de rVSV(VSV-G), ya que rVSV(RABV-G) está atenuado. Todo el trabajo del ratón se realizó en condiciones de contención de bioseguridad nivel 2 y fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucionales del Área Médica de Longwood. Las grabaciones fueron hechas de neuronas piramidales corticales en rebanadas tomadas de ratones del día 12-18 postnatales, inoculadas en el CP 12-18 h previo con rVSV(RABV-G). Las rebanadas coronales (300 μm de espesor) fueron cortadas en solución externa helada conteniendo (en mM): 110 colina, 25 NaHCO 3, 1,25 NaH 2 PO 4, 2,5 KCl, 7 MgCl 2, 0,5 CaCl 2, 25 glucosa, 11,6 Na-ascorbato, y 3,1 Na-piruvato, burbujado con 95% O 2 y 5% CO 2. A continuación, se transfirieron las rebanadas al líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) que contenía (en mM): 127 NaCl, 25 NaHCO 3, 1,25 NaH 2 PO 4, 2,5 KCl, 1 MgCl 2, 2 CaCl 2, y 25 glucosa, burbujas con 95% O 2 y 5% CO 2. Después de un período de incubación Fronteras en Circuitos Neurales www.frontiersin.org Febrero 2013 Volumen 7 Artículo 11 11 de 30-40 min a 34 • C, las rebanadas se almacenaron a temperatura ambiente. Todos los experimentos se llevaron a cabo a temperatura ambiente (25 • C). En todos los experimentos se detectaron picrotoxina de 50 μM, 10 μM 2,3-dioxo-6-nitro-1, 2, 3, 4 -tetrahidrobenzo [f]quinoxalina -7-sulfonamida (NBQX), y 10 μM 3-(R)-2-carboxipiperazin-4-il)-propil-1-ácido fosfónico (CPP) en el ACSF para bloquear la transmisión mediada por receptores GABAA/C, AMPA y NMDA, respectivamente. Todas las sustancias químicas fueron de Sigma o Tocris. Se obtuvieron registros de células enteras de neuronas piramidales corticales de capa profunda infectadas y no infectadas identificadas con la fluorescencia video-IR/DIC y GFP mediante iluminación de epifluorescencia. Con las capas profundas de la corteza, se utilizó la microscopía de escaneo láser de 2 fotones (2PLSM) para confirmar los tipos celulares basados en la morfología. Las neuronas piramidales de capa profunda tenían cuerpos celulares grandes, forma piramidal clásica y espinas dendríticas. Los electrodos de vidrio (2-4 M) se llenaron con solución interna que contenía (en mM): 135 KMeSO 4, 5 KCl, 5 HEPES, 4 MgATP, 0.3 NaGTP, 10 Na 2 HPO 4, 1 EGTA, y 0.01 Alexa Fluor-594 (para imagen de morfología neuronal) ajustado al pH 7.4 con KOH. Las grabaciones de corriente y voltaje se realizaron a temperatura ambiente utilizando un amplificador AxoPatch 200B o un Multiclamp 700B. Los datos se filtraron a 5 kHz y se digital Los datos de imagen y fisiología fueron adquiridos y analizados según lo descrito previamente (Carter y Sabatini, 2004). El potencial de membrana de reposo fue determinado por el promedio de tres barridos de 5-s sin corriente inyectada. Las propiedades pasivas de la célula, membrana (RM) y resistencia en serie (Rs) y capacitancia (Cm), fueron medidas mientras que las células de sujeción a −65 mV y aplicando pasos de tensión de −55 a −75 mV. La relación de corriente con fuego fue determinada en la abrazadera actual con 1-s períodos de corriente inyectada de 100 a 500 pA. El curso temporal de los experimentos de expresión génica viral se llevó a cabo en cultivos de rebanadas de hipocampo organotípicas preparados a partir de ratas postnatales 5-7 Sprague-Dawley como se describió anteriormente (Stoppini et al.,

¿En qué dirección se propaga el virus de la estomatitis vesicular a través del sistema nervioso?

El virus de la estomatitis vesicular con la glicoproteína del virus de la rabia dirige el transporte transsináptico retrógrado entre las neuronas in vivohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3566411/SHA: ee48061797d29eeef5a9e606841bf8ab04b1d75bAutores: Beier, Kevin T.; Saunders, Arpiar B.; Oldenburg, Ian A.; Sabatini, Bernardo L.; Cepko, Constance L.Fecha: 2013-02-07DOI: 10.3389/fncir.2013.00011Licencia: cc-byAbstract: Definir las conexiones entre neuronas es crítico para nuestra comprensión de la estructura y función del sistema nervioso. Los virus recombinantes diseñados para transmitir a través de las sinapsis proporcionan un enfoque poderoso para la disección de los circuitos neuronales in vivo. Recientemente demostramos que el virus de la estomatitis vesicular recombinante (VSV) puede estar dotado de una capacidad de rastreo transsináptico anterograda o retrógrada, proporcionando al virus diferentes glicoproteínas. Aquí ampliamos la caracterización de la transmisión y expresión génica del VSV recombinante (rVSV) con la glucoproteína del virus de la rabia (RABV-G), y proporcionamos ejemplos de su actividad relativa a la forma de trazador transsináptico anterograda de rVSV. rVSV con RABV-G se encontró para impulsar la fuerte expresión de los transgenes y para propagarse rápidamente de la neurona a la neurona de una manera sólo retrógrada. Dependiendo de cómo se entregara el RABV-G, VSV sirvió como un rastreador polisináptico o monosináptico, o pudo definir proyecciones a través de la captación axonal y el transporte retrógrado. En animales coinfectados con rVV en su forma anterógrada, rVSV con RABV-G podría ser utilizado para comenzar a caracterizar las similitudes y diferencias en las conexiones a diferentes áreas. rVSV con RABV-G proporciona una herramienta de rastreo flexible, rápida y versátil que complementa el trazador transsináptico basado en VSV previamente descrito. Texto: Mapear la conectividad neuronal en el sistema nervioso central (CNS) de organismos incluso simples es una tarea difícil. Los virus recombinantes diseñados para rastrear conexiones sinápticas y expresar transgenes prometen permitir un mapeo de mayor rendimiento de conexiones entre neuronas que otros métodos, por ejemplo, la reconstrucción en serie a partir de micrografías electrónicas (Bock et al., 2011; Briggman et al., 2011). Los virus Pseudorabies (PRV) y Rabies (RABV) han sido los virus de rastreo de circuitos mejor caracterizados y más utilizados hasta la fecha (Ugolini et al., 1989; Kelly y Strick, 2000). RABV fue recientemente modificado por Wickersham y colegas de tal manera que puede viajar a través de una sola sinapsis, permitiendo una definición directa de conexiones monosinápticas (Wickersham et al., 2007b). Esta estrategia permitió la primera identificación inequívoca de células retrógradamente conectadas desde una célula inicialmente infectada Además, la célula de arranque podría definirse a través de la expresión de un receptor viral específico que limitaba la infección inicial. Recientemente, creamos un virus monosináptico anterogrado que complementa los marcadores virales retrógrados previamente disponibles (Beier et al., 2011). El virus de la estomatitis vesicular (VSV), un virus relacionado con el VRAB, con su propio gen de la glucoproteína (G) (VSV-G), o con un G del virus no relacionado de la coriomeningitis linfocítica (LCMV-G), se disemina en la dirección anterograda a través de las sinapsis. VSV puede ser utilizado como un rastreador polisináptico que se propaga a través de muchas sinapsis, debido al hecho de que la forma normal, replicacióncompetente del virus no causa enfermedades graves en los seres humanos (Brandly y Hanson, 1957; Johnson et al., 1966; Brody et al., 1967). Si el virus es un rastreador monosináptico o polisináptico está determinado por el método de entrega del gen G (Figura 1A). Ventajas de VSV son que es bien caracterizado, es relativamente simple en comparación con PRV, y crece rápidamente a alto título en células de cultivo de tejidos. También se está desarrollando como un vector de la vacuna, a menudo utilizando un G de otro virus como el inmunogeno, así como se está desarrollando como un agente citocida que se dirigirá a las células tumorales en los seres humanos (Balachandran y Barber, 2000; Stojdl et al., 2000 Stojdl et al., 2003. Estudios anteriores de los patrones anatómicos de transmisión, así como registros fisiológicos, han demostrado que la transmisión de VSV y RABV entre neuronas es vía sinapsis (Kelly y Strick, 2000; Wickersham et al., 2007b; Beier et al., 2011). Además, se ha demostrado que RABV, así como lentivirus con RABV-G en su envoltorio, viajan retrógradamente desde un lugar de inyección (Mazarakis et al., 2001; Wicker Hipotemamos que proporcionar un VSV recombinante (rVSV) con el RABV-G crearía un rastreador polisináptico retrógrado sin las preocupaciones de bioseguridad inherentes a RABV. Nuestra caracterización inicial de rVVV con RABV-G mostró que de hecho FIGURE 1 Estrategias de rastreo sináptico utilizando VSV. (A) Esquema que ilustra las estrategias para la transmisión retrógrada o antierograda de la codificación de rVSV transsináptica polisináptica. La célula inicialmente infectada está indicada por un asterisco. VSV codificación de una glucoproteína (G) dentro de su genoma puede propagarse polisinápticamente. La dirección de la propagación depende de la identidad de la glucoproteína. Las neuronas infectadas se muestran en verde. En algunos casos, la célula de arranque inicialmente infectada puede definirse por la expresión de un receptor aviar, TVA (marcado con una proteína fluorescente roja). Las neuronas que expresan TVA pueden entonces ser infectadas específicamente por rVSV G con la glicoproteína EnvA/RABV-G (A/RG) (Wickersham et al., 2007b) en la superficie del virion [rVSV G(A/RG)]. Estas células de arranque son entonces amarillas, debido a GFP viral y mCherry de la expresión TVA-mCherry. Para el rastreo monosináptico, la proteína G se expresa en la célula de expresión TVA, y por lo tanto complementa rVSV G para permitir la transmisión en una dirección específica. (B) Diagramas genómicos de vectores rVSV. Todos los VSV contienen cuatro proteínas esenciales: N, P, M y L. Algunos virus codifican un gen G en su genoma, lo que les permite diseminar polisinápticamente. Los vectores rVSV típicamente codifican un transgen en la primera posición, mientras que otros llevan un transgen adicional en la posición G. (C) Caracterización morfológica de neuronas infectadas por rVSV en varios lugares dentro del cerebro del ratón. (i,ii) neuronas de Caudate-putamen (CP) a 4 dpi de una inyección de CP con virus rVSV(VSV-G) codificando i) CFP o ii) Korange. (iii) Las neuronas etiquetadas de la región CA1 del hipocampo se muestran a 5 dpi después de la inyección en el hipocampo de rVSV(VSV-G) codificando Venus. (iv,v) Las neuronas piramidales corticales se muestran después de la inyección en la CP de rVSV(RABV-G) expresando iv) GFP a 24 hpi, o v) mCherry a 48 hpi. Inserto en iv) es una alta magnificación de la neurona en el panel iv), destacando el etiquetado de las espinas dendríticas. (vi) Múltiples virus se pueden inyectar en el mismo animal. Aquí, los virus rVSV G(VSV-G) individuales codificando CFP, GFP, Venus, Korange, y mCherry se utilizaron para infectar la corteza. Barras de escala = 50 μm. www.fronterizosin.org Febrero 2013 Volumen 7 Artículo 11 2 se podría tomar como un trazador retrógrado (Beier et al., 2011) Para determinar si podía transmitir entre las neuronas después de su replicación en neuronas, y para analizar más a fondo los patrones de transmisión tanto de las formas monosinápticas como polisinápticas de rVSV con RAVV-G, hicimos inyecciones en varios puntos del SNC y periféricos. Además, realizamos coinfecciones de rVVV con RAV-G y la forma anterógrada de rVSV para aprovechar las diferencias en la direccionalidad de la transmisión de estos dos virus en circuitos cartográficos. Esquemáticas de virus creados y utilizados a lo largo de este estudio se muestran en la Figura 1. Creamos plásmidos vectoriales de rVSV con diferentes transgénicos en las posiciones genómicas primera o quinta (Figura 1B). Después de rescatar cada virus, probamos la capacidad de cada uno de ellos de expresar transgénicos en diferentes regiones cerebrales Todos los vectores rVSV impulsaron la expresión robusta del fluoroforo 1 o 2 días después de la infección (hpi) (Figura 1C ) (van den Pol et al., 2009). De hecho, por 12 hpi, el etiquetado fue lo suficientemente brillante como para imagenar detalles morfológicos finos, tales como espinas dendríticas (Figura 1C, iv). Para caracterizar las propiedades fisiológicas de las células infectadas con rVSV, probamos una codificación rVSV competente GFP, con RABV-G en el genoma en lugar de VSV-G [en adelante designado rVSV(RABV-G)]. van den Pol et al. Sin embargo, por 2 dpi, las propiedades electrofisiológicas eran tan anormales en las células piramidales corticales infectadas que no se podían realizar mediciones fisiológicas. La velocidad y la fuerza de la expresión de transgenes codificados por VSV depende de la posición genómica del gen (van den Pol et al., 2009; Beier et al., 2011). Los genes en la primera posición se expresan más alto, con una disminución en el nivel de expresión en posiciones más 3 dentro de la fila viral plus. Cuando GFP fue insertado en la primera posición de VSV, la fluorescencia de GFP fue detectable por primera vez en aproximadamente 1 hpi en células cultivadas (van den Pol et al., 2009). Con el fin de cuantificar la expresión relativa de una proteína fluorescente en la primera posición genómica en neuronas, las rodajas de hipocampo de rata fueron infectadas con una replicación incompetente rVSV que expresa mCherry (rVSV G, Figuras 1A, B). Se trata de un virus G que tuvo el RABV-G suministrado en trans durante la preparación del stock del virus [referido como rVSV G(RABV-G)]. La intensidad media de fluorescencia de las células infectadas se midió cada hora a lo largo de 18 h. Por 4 hpi a 37 • C, la fluorescencia roja era claramente visible, y alcanzó niveles máximos de aproximadamente 14 hpi (N = 3, Figura 3 ). Resultados similares se obtuvieron con un virus codificando GFP en la primera posición genómica en lugar de mCherry (es decir, Figura 1B ) (N = 3). Anteriormente se demostró que el rVVSV(RABV-G) podía ser tomado retrógradamente por neuronas (Beier et al., 2011), pero estos experimentos no distinguían entre la absorción axonal directa de la transmisión inocula Para distinguir entre estos dos mecanismos y ampliar los análisis anteriores, se realizaron más experimentos en el sistema visual mamífero (Figuras 4A-G). Como el área visual de la corteza 1 (V1) no recibe proyecciones directas de las células ganglionares de la retina (RGCs), sino que recibe una entrada secundaria de los CGRs a través del núcleo genogénico lateral (GNL), la infección de los CGRs por inyección de V1 demostraría la transmisión retrógrada de células que soportaban al menos una ronda de replicación viral. Tras una inyección V1 con rVSV(RABV-G), los CGRs positivos de GFP fueron observados en la retina por 3 dpi (N = 3; Figura 4G ). Importantemente, el etiquetado viral en el cerebro se restringió a áreas de proyección primaria y secundaria, incluso a 7 dpi. Entre ellos se encontraban el LGN (Figura 4D ) y el hipotálamo (Figura 4E ), dos áreas conocidas por proyectar directamente a V1 (Kandel, 2000). Se observó etiquetado selectivo en otras áreas, como áreas corticales que rodean a V1 (Figura 4C), que proyectan directamente a V1, y también en el estrato central superior de colliculus (SC), que proyectan al LGN (Figura 4F ). También se observó etiquetado en el núcleo basalis, que proyecta a la corteza, así como muchos componentes del circuito de ganglios basales, que proporcionan entrada al tálamo [como el caudato-putamen (CP), el globus pallidus (GP), y el núcleo subtalámico (STn)]. En consonancia con la falta de transmisión viral generalizada, los animales no mostraron signos de enfermedad a 7 dpi. Estos datos muestran que rVSV(RABV-G) puede propagarse en una dirección retrógrada desde el lugar de inyección, pero no abordan si el virus puede propagarse exclusivamente en la dirección retrógrada. La especificidad transsináptica direccional sólo se puede abordar definitivamente mediante un circuito unidireccional. Por lo tanto, nos dirigimos a la corteza motora primaria (M1) a la conexión CP, en la que las neuronas se proyectan desde la corteza a la CP, pero no en la otra dirección (Figura 4H ) (Beier et al., 2011). Las inyecciones de rVSV(RABV-G) en M1 no deben etiquetar las neuronas en la CP si el virus sólo puede etiquetar las células a través de sinapsis en la dirección retrógrada De hecho, en 2 dpi, se etiquetaron áreas que proyectaban directamente al lugar de inyección, incluyendo la corteza contralateral (Figura 4I ). Sólo se observaron axones de células corticales en la CP, sin cuerpos celulares marcados con GFP presentes en la CP (Figura 4J), consistentes con la falta de diseminación transsináptica anterograda. Por 3 dpi, se observó un pequeño número de neuronas medianas espinosas (MSN) en la CP, probablemente a través de diseminación secundaria de neuronas talámicas o GP inicialmente infectadas (datos no mostrados). Una ventaja particular de los trazadores virales retrógrados es la capacidad de etiquetar neuronas del SNC proyectando a sitios periféricos. Esto ha sido una poderosa aplicación tanto de RABV y PRV (Ugolini et al., 1989; Standish et al., 1994). Para comprobar si el rVSV (RABV-G) también podría realizar esta función, examinamos la inervación de la superficie de la dura por neuronas del ganglio trigémino, un circuito neuronal que se cree que está involucrado en migrañas (Penfield y McNaughton, 1940; Mayberg et al., 1984). Estas neuronas tienen axones, pero no dendritas canónicas, y envían proyecciones a la médula espinal y tronco cerebral. Por lo tanto, la única manera en que las neuronas trigéminas podrían ser etiquetadas desde la aplicación viral a la dura es mediante la absorción retrógrada del virus. Aplicamos el rVSV(RABV-G) a la dura mater intacta y analizamos la dura, el ganglio trigémino y el CNS para la etiquetación (Figura 4K ). En el momento más temprano examinado, 3 dpi, observamos axones viajando a lo largo de la dura, pero poca otra evidencia de infección (Figura 4L). No se observaron cuerpos de células neuronales etiquetados en la dura, consistentes con la falta de neuronas en esta superficie. En contraste, encontramos cuerpos celulares etiquetados en el ganglio trigémino (Figura 4M ). No se observó infección en el SNC, incluso a 4 dpi, consistente con la falta de entradas del cerebro en el ganglio trigémino (N = 4 animales). Para caracterizar más patrones y cinética de transmisión viral y especificidad direccional de la propagación transsináptica, se hicieron inyecciones de rVSV(RABV-G) en la CP (Figura 5A ). Para determinar qué células fueron etiquetadas por absorción directa de virus en el inóculo, se inyectó un conjunto separado de animales en la CP con la replicación incompetente rVSV G(RABV-G) (N = 3 animales, analizados 3 dpi). Se observaron células etiquetadas por rVSV G(RABV-G) en la CP, GP, substantia nigra (SN), tálamo y capas 3 y 5 de la corteza, consistentes con infección en el terminal de axón y etiquetado retrógrado de cuerpos celulares de neuronas conocidas por proyectar directamente a la CP (Figura 5C ) (Albin et al., 1995). Las áreas etiquetadas por inyección de CP se indican en la Figura 5B. Los patrones de propagación para la replicación-competente rVSV(RABV-G) se caracterizaron a lo largo de 1-5 dpi (Figuras 5D-H). Durante este intervalo, progresivamente más células en regiones infectadas fueron etiquetadas por rVSV(RABV-G), incluyendo dentro de la CP, núcleo basalis, corteza y GP (listado en la Figura 5B ). Además, más células corticales fueron etiquetadas en grupos cercanos a neuronas piramidales corticales, tanto ipsilaterales como contralaterales al lado inyectado, incluyendo células neurogliaformas (datos no mostrados). Estos datos contrastan con los observados después de la infección por un virus de rastreo transsináptico anterogrado, como rVSV con su propio gen G, rVSV(VSV-G) (Figura 5B) A 3 dpi después de la inyección de rVSV(VSV-G) en la CP, la corteza cerebral no fue etiquetada, pero las regiones que recibieron proyecciones de la CP, como el STn, GP y SN, fueron etiquetadas (Beier et al., 2011). Para investigar otras áreas de evidencia de diseminación transsináptica retrógrada de células a células, se examinó el núcleo basalis después de la infección de la CP con rVSV (RABV-G). El núcleo basalis fue etiquetado por 2 dpi (Figuras 5E-H), consistente con al menos un salto transsináptico único, ya que esta área no se proyecta directamente a la CP. El virus parecía viajar transsinápticamente a la velocidad de aproximadamente 1 sinapsis por día, como evidencia la falta de células neurogliaformas etiquetadas en la corteza, y la falta de neuronas en el núcleo basalis a 1 dpi, y la etiqueta que aparece en estos tipos/áreas celulares a 2 dpi, como se observó previamente (Beier et al., 2011). La etiqueta se mantuvo bien restringida a los circuitos corticostriatales esperados a 5 dpi, sugiriendo que la propagación viral se vuelve menos eficiente después de cruzar una o dos conexiones, consistentes con inyecciones en V1 (Figura 4). Mientras que las células gliales se pueden infectar y se observaron cerca del lugar de inyección (van den Pol et al., 2002; Chauhan et al., 2010), las células gliales infectadas fuera del lugar de inyección generalmente no se observaron. Una ventaja de tener formas tanto anterogradas como retrógradas del mismo virus es que pueden utilizarse en paralelo, o en tándem, para rastrear circuitos desde y hacia un único o múltiple lugar de inyección, con cada virus con cinética similar de propagación y expresión génica. De hecho, si diferentes fluoroforos se utilizan en diferentes virus, por ejemplo, rVSV(VSV-G) y rVSV(RABV-G), entonces los virus pueden ser co-inyectados en el mismo lugar y su transmisión puede ser rastreada de forma independiente (Figura 6A ). Esto es más sencillo si no hay células en el lugar de inyección que estén infectadas inicialmente por ambos virus. Las células coinfectadas pueden ser fácilmente detectadas, ya que expresarían ambas proteínas fluorescentes poco después de la inyección. Para determinar si dos virus permitirían el rastreo transsináptico simultáneo anterogrado y retrógrado desde un único lugar de inyección, se inyectaban individualmente un rVSV(VSV-G) que expresaba Venus y un rVSV(RABV-G) que expresaba mCherry (figuras 6B-D) o co-inyección (figuras 6E-G) en la corteza motora, y se examinaban los cerebros 3 dpi. El patrón de etiquetado de los cerebros co-inyectados era equivalente a los patrones observados cuando cada virus se inyectaba individualmente: se observó que rVSV(VSV-G) infectaba neuronas en la corteza, CP y núcleos posteriores, mientras que el rVSV(RABV-G) no se observó que infectaba neuronas en la CP, sino más bien en el tálamo y La tasa de coinfección inicial depende de La presencia o ausencia de etiquetado está indicada por (+) y (−), respectivamente. La extensión del etiquetado está indicada por el número de (+). Algunos animales fueron infectados con virus G para determinar qué áreas fueron marcadas por la absorción directa de los viriones, en lugar de por la replicación y transmisión. Estos fueron sacrificados a 3 dpi. (C) Sección parasaggital de un cerebro infectado con VSV[delta de Grecia]G(RABV-G). El lugar de inyección está marcado por una flecha roja. Varias áreas que se proyectan directamente a la CP fueron etiquetadas debido a la absorción directa de los viriones, incluyendo la corteza, el tálamo y GP (cabezas de flecha), 3 dpi. la dosis de la ínócula inicial. Al inyectar 3 × 10 3 unidades de conformación de foco (ffu) rVSV(VSV-G) y 3 × 10 4 ffu rVSV(RABV-G), no se observó coinfección en el lugar de inyección. Así, la coinfección de la misma región cerebral, sin coinfección de las mismas células, no altera el comportamiento de propagación de rVSV(VSV-G) ni de rVSV(RABV-G). Un ejemplo de cómo este sistema de rastreo transsináptico retrógrado y anterogrado puede utilizarse es determinar si tres Fronteras en los Circuitos Neuales www.fronterizosin.org Febrero 2013 Volumen 7 Artículo 11 8 regiones distintas están conectadas y la direccionalidad de cualquier conexión. Por ejemplo, el virus transsináptico anterogrado puede inyectarse en una región, el retrógrado en otra, y una tercera región puede entonces ser examinada para evidencia de etiquetado por uno o ambos virus (por ejemplo, Figura 6H ). Para probar esta posibilidad, se inyectó rVSV(VSV-G) en la corteza motora, se inyectó rVSV(RABV-G) en la substantia nigra pars reticulara (SNr), y se sacrificaron animales a 3 dpi. Observamos que las células estaban marcadas individualmente, ya sea con Venus [rVSV(VSV-G)] o con mCherry [rVSV(RABV-G)], y se encontraban en gran parte en diferentes regiones del CP (Figuras 6I,J) (N = 3). Estos resultados sugieren que las conexiones anterogradas de las células infectadas con rVSV(VSV-G) en el M1 fueron con CP MSNs que no proyectaban a la región del SNr inyectado con rVSV(RABV-G) (N = 3 animales). Además del rastreo polisináptico, VSV puede ser modificado a circuitos traza monosinapticamente (Beier et al., 2011). Con RABV, esto se logró in vivo por primera vez infectando con un virus asociado adeno (AAV) que expresa TVA, un receptor para un retrovirus aviar, y RABV-G (Wall et al., 2010). Esto fue seguido 3 semanas más tarde por una infección con un VRABG con una glucoproteína quimérica EnvA/RABV-G en la superficie del virión (Wickersham et al., 2007b), que permitió la infección específicamente de las células que expresan TVA. Se utilizó una estrategia similar para probar la capacidad de rVSV de rastrear monosinápticamente neuronas retrógradas conectadas in vivo. Se utilizaron para esta prueba las entradas a las neuronas de expresión de la colina acetiltransferasa (ChAT) en el estriato. Estas neuronas reciben principalmente la entrada de la corteza y el tálamo (Thomas et al., 2000; Bloomfield et al., 2007) (Figura 7A). Para marcar esta población, cruzamos ratones ChAT-Cre a ratones Ai9, que expresan tdTomato en células con antecedentes de expresión Cre (Madisen et al., 2010). Los ratones de seis semanas de edad de esta cruz fueron inyectados en la CP con dos vectores AAV: uno que expresa una proteína de fusión Cre-condicional ("floxed") TVA-mCherry, y otro que expresa una floxed RABV-G. Dos semanas más tarde, los ratones fueron inyectados en las mismas coordenadas con rVSVG con la glucoproteína quimérica EnvA/RABV-G en la superficie del virion [rVSV G(A/RG)] (Beier et al., 2011). Las células infectadas con éxito con estos dos vectores AAV podrían albergar infección por un rVSV y deberían ser capaces de producir vi Estas células de arranque también deberían expresar tdTomato y GFP. Si se produjeran rVSV, y si se transmitiera a través de la sinapsis retrógradamente, las neuronas corticales y talámicas deberían ser etiquetadas por GFP. Los ratones inyectados con estos virus AAV y rVSV fueron sacrificados 5 días después de la infección por rVSV, y los cerebros analizados para la fluorescencia. Como se esperaba para las células de arranque, algunas neuronas en la CP expresaron tdTomato y GFP (Figura 7B). Fuera de la CP, se observaron pequeños números de neuronas GFP+ que no eran mCherry+ en la corteza (Figuras 7C,D) y thalamus (Figura 7E), consistentes con la propagación retrógrada. Los animales de control que no expresan Cre, o no se inyectan con la codificación AAV RABV-G, no etiquetan las células en la corteza o el tálamo (N = 3 para ambos controles y condición experimental). Aquí, informamos sobre el uso de rVSV como un rastreador transsináptico retrógrado para el circuito CNS. VSV se puede modificar para codificar la proteína RABV-G en el genoma viral, permitiendo que el virus se reproduzca y transmita a través de múltiples células sinápticamente conectadas, es decir, como un trazador polisináptico. Alternativamente, si el virus tiene el gen G eliminado de su genoma y RABV-G se proporciona en trans, se comporta como un trazador monosináptico (Beier et al., 2011). Aunque se sabe desde hace muchos años que el VRAB viaja retrógradamente entre las neuronas (Astic et al., 1993; Ugolini, 1995; Kelly y Strick, 2003), y el seudotipado de lentivirus con RABV-G es suficiente para el transporte axonal (Mazarakis et al., 2001), la especificidad de transmisión retrógrada entre neuronas no había demostrado claramente ser una propiedad de la proteína G en sí, ya que podría haber sido debido a otras proteínas virales además de, o en lugar de, la proteína G viral. Dado que el VSV nativo no tiene estas propiedades transsinápticas retrógradas (van den Pol et al., 2002; Beier et al., 2011), y la única alteración al genoma del VSV fue la sustitución del gen VSV G por el gen G de RABV, está claro que la glicoproteína RABV es responsable de la dirección retrógrada de la transmisión viral a través de las sinapsis, al menos en el caso del rVVV. El inicio temprano de la expresión génica del VSV en relación con el RABV (una hora frente a varias horas) lo hace beneficioso en paradigmas experimentales en los que el experimento debe realizarse dentro de una ventana estrecha del tiempo, como cortes de tejido y explantes. Además, más de un transgene puede codificarse en el genoma viral sin necesidad de un elemento 2A o IRES. El uso de la primera posición del genoma aumenta el nivel de expresión del transgéne insertado en esa ubicación, ya que VSV (y RABV) expresan genes en un gradiente transcripcional; por lo tanto, el primer gen es el más transcrito (Knipe, 2007). Esto conduce a predicciones racionales de los niveles de expresión para que uno pueda elegir la posición de inserción de un transgéne, o transgénes, de acuerdo con este gradiente y el nivel deseado de expresión. El tamaño del capsid viral aparentemente no es rígido, permitiendo la inclusión de genomas que son sustancialmente más grandes que el genoma nativo, a diferencia de la capacidad rígida para algunos otros vectores virales, como AAV Yan et al., 2000). El hecho de que el VSV pueda ser hecho para diseminar anterogradamente (Beier et al., 2011) o retrógradamente a través de sinapsis con el cambio de un único gen ofrece varias ventajas sobre los trazadores virales que hasta ahora no han mostrado tal flexibilidad en la direccionalidad del rastreo. Además de la aplicación obvia de rastrear conexiones anterogradas, se pueden hacer combinaciones para explotar las diferentes formas del virus. Un ejemplo que emplea la infección simultánea con una forma anterograda y retrógrada de VSV se demuestra en la Figura 6. Este experimento fue diseñado para abordar si las proyecciones anterogradas de la corteza a la CP etiquetarían las mismas regiones cerebrales que fueron etiquetadas por un virus retrógrado inyectado en la SN. Aunque un bloque de superinfección por el virus puede impedir la infección de la misma célula con múltiples VSVr, las células adyacentes podrían seguir siendo etiquetadas por diferentes virus (Whitaker-Dowling et al., 1983). Los resultados observados podrían deberse a un etiquetado preferencial por el virus transsináptico anterógrado de las vías indirectas MSNs en este experimento, que luego se sinapizan en el GP, reflejando así un sesgo viral. Alternativamente, podría indicar que las neuronas corticales en la región inyectada en gran medida no etiquetan las NSM que proyectan al área de la SN inyectada con el virus retrógrado. Otra posibilidad es que se utilizó demasiado poco virus para observar el co-etiquetado de una región dada. Sin embargo, dada la densidad de infección (es decir, Figuras 6I,J), esta última posibilidad parece poco probable. Además, la propagación del rVSV polisináptico (RABV-G) parece atenuarse con el aumento del número de sinapsis cruzadas, lo que permite un análisis de la propagación viral más restringida. Esto es bastante fortuito, como si la propagación continuara, llevaría a una infección generalizada y letalidad. Además, la reconstrucción de la conectividad sería más difícil. Esta eficiencia reducida parece sostener también la forma monosináptica de VSV complementada con RABV-G, ya que la eficiencia de la transmisión parecía inferior al experimento comparable con RABV (Watabe-Uchida et al., 2012). Esto es probablemente debido a la atenuación viral cuando VSV-G es reemplazado por RABV-G.Nos sentimos atraídos por el uso del VSV como rastreador viral debido a su largo historial como agente de laboratorio seguro, replicante y competente. Los trabajadores de laboratorio que utilizan VSV no han contraído ninguna enfermedad, y las infecciones por VSV naturales entre las poblaciones humanas de América Central y el suroeste de Estados Unidos (Rodríguez, 2002) se producen sin patología evidente (Johnson et al., 1966; Brody et al., 1967). VSV fue así un candidato atractivo para su uso como rastreador polisináptico para estudios del SNC, lo que requiere una capacidad de replicación a través de múltiples ciclos de transmisión. Tanto las formas de replicación como las formas incompetentes de VVV están en uso bajo contención de Bioseguridad Nivel 2. Es probable que las diferencias de patogenicidad entre VSV y VRAB se deban a la capacidad del VRAB para evadir el sistema inmunitario innato, en particular el interferón (Hangartner et al., 2006; Junt et al., 2007; Lyles and Rupprecht, 2007; Rieder and Conzelmann, 2009; Iannacone et al., 2010). La infección por VSV provoca eficazmente una respuesta al interferón, y no ha evolucionado un método de escape de esta respuesta, a diferencia de RABV (Brzózka et al., 2006). De hecho, el VSV se está persiguiendo como vacuna contra otros virus, entre ellos el VRAB (Lichty et al., 2004; Publicover et al., 2004; Kapadia et al., 2005; Schwartz et al., 2007; Iyer et al., 2009; Geisbert El VSV no se disemina típicamente más allá del sitio inicialmente infectado en la periferia (Kramer et al., 1983; Vogel y Fertsch, 1987). Esto probablemente es la causa de los síntomas menores o ausentes en humanos y animales infectados en la naturaleza. Los vectores VSV polisinápticos son así predichos para ser mucho más seguros que los vectores RABV polisinápticos. Hemos probado esta predicción inyectando una serie de ratones en las almohadillas y músculos de las piernas traseras con rVSV(RABV-G), con el resultado de que ningún animal inyectado mostró ninguna evidencia de morbilidad o mortalidad (Beier, Goz et al., en preparación). Aunque más seguro para los trabajadores de laboratorio que RABV, el principal inconveniente al uso del VSV es su toxicidad celular rápida (van den Pol et al., 2009; Beier et al., La toxicidad se debe a la supresión de la transcripción celular y a un bloqueo en la exportación de ARN celulares del núcleo al citoplasma (Black and Lyles, 1992; Her et al., 1997; Ahmed and Lyles, 1998; Petersen et al., 2000; von Kobbe et al., 2000), así como a la inhibición de la traducción de mRNA celulares (Francoeur et al., 1987; Jayakar et al., 2000; Kopecky et al., Frontiers in Neural Circuits www.fronterizosin.org Febrero 2013 Volumen 7 Artículo 11 10 2001). El VSV es mucho más rápido para promulgar su programa de expresión genética que el RABV, de modo que las células sufren los efectos tóxicos más rápidamente que después de la infección por RABV. Un aspecto de VSV que puede ser explotado en el futuro para mejorar la velocidad de toxicidad es el uso de mutantes y variantes de VSV. Uno de estos mutantes es el M51R, que nos permitió realizar análisis fisiológicos de células pre y post-sinápticas (Beier et al., 2011). Estamos en el proceso de examinar las propiedades de transmisión de este mutante in vivo, así como los efectos de otras mutaciones o variantes virales en la prolongación de la salud de las neuronas después de la infección. vectores rVSV se pueden utilizar para estudiar la conectividad de circuitos neuronales. Además de combinaciones de formas de replicación-competentes de VSV, las formas de replicación-incompetentes, monosinápticas del virus se pueden combinar fácilmente, sin la necesidad de cambiar virus (Beier et al., 2011). Esto permite una forma directa de estudiar tanto las proyecciones hacia una población celular genéticamente definida como hacia fuera. Esto se puede hacer con el mismo genoma viral, siendo el único cambio necesario la glucoproteína, para la selección de la dirección de transmisión. Esta flexibilidad del VSV lo convierte en un poderoso vector multi-aplicación para el estudio de la conectividad en el SNC. Todos los clones del rVSV fueron clonados de la columna vertebral del rVSV G (Chandran et al., 2005). mCherry, Kusabira naranja, Venus y CFP fueron clonados en la primera posición (GFP) usando sitios XhoI y MscI, y VSV-G (un regalo de Richard Mulligan, Harvard Medical School, Boston, MA) y RABV-G (un regalo de Ed Callaway, Salk Institute, San Diego, CA) fueron clonados en la quinta posición (G) utilizando los sitios de restricción MluI y NotI. Los genes para proteínas fluorescentes fueron obtenidos de Clontech. Los virus fueron rescatados como se describió anteriormente (Whelan et al., 1995). A 95% de confluencia, ocho placas de células BSR de 10 cm fueron infectadas en un MOI de 0,01. Los sobrenadantes virales fueron recolectados a intervalos de 24h y ultracentrífugos a 21.000 RPM usando un rotor SW28 y resuspendido Para la titulación, las reservas virales concentradas se aplicaron en una serie de dilución a células BSR 100% confluentes y las placas se examinaron a 12 hpi. Las existencias virales se almacenaron a −80 • C. En el caso de los virus G, las células 293T fueron transfectadas con IEP (Ehrhardt et al., 2006) a un 70% de confluencia en platos de 10 cm con 5 μg de pCAG-RABV-G. Veinticuatro horas después de la infección, las células fueron infectadas a un MOI de 0,01 con rVSVG que expresaba GFP o mCherry. Los sobrenadantes virales se recogieron durante los siguientes 4 días a intervalos de 24 h. Los preparados virales están ahora disponibles en el núcleo viral de Salk GT3 (http://vectorcore.salk.edu/). Todos los Los plásmidos AAV-FLEx-RABV-G y AAV-FLEx-TVA-mCherry se originaron en el laboratorio de Naoshige Uchida (Watabe-Uchida et al., 2012), y las existencias de virus fueron regalos generosos de Brad Lowell, Harvard Medical School. Los ratones ChAT-Cre (B6;129S6-Chat tm1(cre)Lowl /J) y Ai9 (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor<tm9(CAG-tdTomato)Hze>/J) se obtuvieron del laboratorio Jackson (Madisen et al., 2010). Los ratones CD-1 de ocho semanas de edad se inyectaron utilizando microdispensadores capilares tirados (Drummond Scientific, Cat. No: 5-000-2005), utilizando coordenadas del Ratón Cerebro en coordenadas estereotáxicas (Franklin y Paxinos, 1997). Las coordenadas de inyección (en mm) utilizadas fueron: Para el análisis multicolor (Figuras 1C,D) se inyectó 3 × 10 9 ffu/mL rVSV en varias regiones. Para las inyecciones de CP, 100 nL de rVSV(RABV-G) o rVSV(VSV-G) a 3 × 10 7 ffu/mL se inyectó a una velocidad de 100 nL/min. Para los virus incompetentes de replicación, se inyectó 100 nL de 1 × 10 7 ffu/mL rVSV G(RABV-G) o rVSV G (VSV-G). En la corteza motora, se inyectaron 100 nL de 1 × 10 7 ffu/mL rVSV(RABV-G) y ratones cosecharon 2 dpi. Para las inyecciones de V1, se inyectaron 100 nL de 3 × 10 10 ffu/mL rVSV(RABV-G) y se examinó a los ratones 3 o 7 dpi. Para las infecciones de la dura mater, se aplicó 1 μL de 3 × 10 10 ffu/mL rVSV(RABV-G) a la superficie de la dura. Se permitió la absorción del virus, y la superficie fue cubierta posteriormente con cera ósea, y la herida suturada. Para la coinyección de virus en el mismo animal, 100 nL de una combinación de 3 × 10 7 ffu/mL rVSV(VSV-G) y 3 × 10 8 ffu/mL rVSV(RABV-G) fueron coinyectados en la corteza motora, y los cerebros examinaron 3 dpi. Para la inyección de virus en diferentes regiones, 100 nL de 3 × 10 7 ffu/mL rVSV(VSV-G) se inyectaron en M1, y 100 nL de 3 × 10 8 ffu/mL rVSV(RABV-G) en el SNr, y los cerebros examinaron 3 dpi. Se utilizó un título inferior de rVSV(VSV-G), ya que rVSV(RABV-G) está atenuado. Todo el trabajo del ratón se realizó en condiciones de contención de bioseguridad nivel 2 y fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucionales del Área Médica de Longwood. Las grabaciones fueron hechas de neuronas piramidales corticales en rebanadas tomadas de ratones del día 12-18 postnatales, inoculadas en el CP 12-18 h previo con rVSV(RABV-G). Las rebanadas coronales (300 μm de espesor) fueron cortadas en solución externa helada conteniendo (en mM): 110 colina, 25 NaHCO 3, 1,25 NaH 2 PO 4, 2,5 KCl, 7 MgCl 2, 0,5 CaCl 2, 25 glucosa, 11,6 Na-ascorbato, y 3,1 Na-piruvato, burbujado con 95% O 2 y 5% CO 2. A continuación, se transfirieron las rebanadas al líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) que contenía (en mM): 127 NaCl, 25 NaHCO 3, 1,25 NaH 2 PO 4, 2,5 KCl, 1 MgCl 2, 2 CaCl 2, y 25 glucosa, burbujas con 95% O 2 y 5% CO 2. Después de un período de incubación Fronteras en Circuitos Neurales www.frontiersin.org Febrero 2013 Volumen 7 Artículo 11 11 de 30-40 min a 34 • C, las rebanadas se almacenaron a temperatura ambiente. Todos los experimentos se llevaron a cabo a temperatura ambiente (25 • C). En todos los experimentos se detectaron picrotoxina de 50 μM, 10 μM 2,3-dioxo-6-nitro-1, 2, 3, 4 -tetrahidrobenzo [f]quinoxalina -7-sulfonamida (NBQX), y 10 μM 3-(R)-2-carboxipiperazin-4-il)-propil-1-ácido fosfónico (CPP) en el ACSF para bloquear la transmisión mediada por receptores GABAA/C, AMPA y NMDA, respectivamente. Todas las sustancias químicas fueron de Sigma o Tocris. Se obtuvieron registros de células enteras de neuronas piramidales corticales de capa profunda infectadas y no infectadas identificadas con la fluorescencia video-IR/DIC y GFP mediante iluminación de epifluorescencia. Con las capas profundas de la corteza, se utilizó la microscopía de escaneo láser de 2 fotones (2PLSM) para confirmar los tipos celulares basados en la morfología. Las neuronas piramidales de capa profunda tenían cuerpos celulares grandes, forma piramidal clásica y espinas dendríticas. Los electrodos de vidrio (2-4 M) se llenaron con solución interna que contenía (en mM): 135 KMeSO 4, 5 KCl, 5 HEPES, 4 MgATP, 0.3 NaGTP, 10 Na 2 HPO 4, 1 EGTA, y 0.01 Alexa Fluor-594 (para imagen de morfología neuronal) ajustado al pH 7.4 con KOH. Las grabaciones de corriente y voltaje se realizaron a temperatura ambiente utilizando un amplificador AxoPatch 200B o un Multiclamp 700B. Los datos se filtraron a 5 kHz y se digital Los datos de imagen y fisiología fueron adquiridos y analizados según lo descrito previamente (Carter y Sabatini, 2004). El potencial de membrana de reposo fue determinado por el promedio de tres barridos de 5-s sin corriente inyectada. Las propiedades pasivas de la célula, membrana (RM) y resistencia en serie (Rs) y capacitancia (Cm), fueron medidas mientras que las células de sujeción a −65 mV y aplicando pasos de tensión de −55 a −75 mV. La relación de corriente con fuego fue determinada en la abrazadera actual con 1-s períodos de corriente inyectada de 100 a 500 pA. El curso temporal de los experimentos de expresión génica viral se llevó a cabo en cultivos de rebanadas de hipocampo organotípicas preparados a partir de ratas postnatales 5-7 Sprague-Dawley como se describió anteriormente (Stoppini et al.,

¿Qué tipos de virus se pueden utilizar para estudiar la conectividad de los circuitos neuronales?

La aplicación intranasal de Zanamivir y Carragenan es sinérgicamente activa contra el virus de la gripe A en el modelo murinohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4459876/SHA: f0b1fa4036434b57c8307d43c39a4193f7e8053aAutores: Morokutti-Kurz, Martina; König-Schuster, Marielle; Koller, Christiane; Graf, Christine; Graf, Philipp; Kirchoff, Norman; Reutwer, Benjamin; Seifert, Jan-Marcus; Unger, Hermann; Grassauer, Andreas; Prieschl-Grassauer, Eva; Nakowitsch, SabineFecha: 2015-06-08DOI Como las infecciones causadas por el virus de la gripe suelen ir acompañadas de infecciones por otros virus respiratorios, la combinación de un compuesto anti-influenza específico con el polímero antiviral ampliamente activo tiene un enorme potencial para el tratamiento de infecciones respiratorias. Así, la combinación del fármaco anti-influenza específico Zanamivir junto con carragenano en una formulación adecuada para la aplicación intranasal se evaluó in-vitro e in-vivo. Además, se demuestra en un modelo de gripe letal con un virus H7N7 de baja patogenicidad (HA estrechamente relacionado con el virus de la gripe aviar A(H7N9)) y un virus de la gripe H1N1(09)pdm en ratones C57BL/6 que el uso combinado de ambos compuestos aumenta significativamente la supervivencia de los animales infectados en comparación con las monoterapias o placebo. Cabe destacar que este beneficio se mantiene incluso cuando el tratamiento comienza hasta 72 horas después de la infección. CONCLUSIÓN: Por lo tanto, se debe probar un aerosol nasal que contenga carragenan y Zanamivir para prevenir y tratar la gripe no complicada en ensayos clínicos. Texto: La aparición periódica de nuevas variantes de gripe plantea una amenaza pandémica mundial. Desde la aparición del nuevo virus A(H7N9), más de 400 casos humanos fueron reportados a la OMS con una tasa de mortalidad de más del La mayoría de los pacientes con infecciones por el virus A(H7N9) tuvieron contacto con aves de corral o visitaron mercados de animales vivos. Sin embargo, algunos casos esporádicos parecían ser resultado de transmisiones humanas a seres humanos [1, 2]. A diferencia de los virus pandémicos que entran fulminantemente en la población humana y causan altas tasas de mortalidad, los virus estacionales de la gripe generalmente causan infecciones no complicadas y transitorias en humanos, con replicación viral localizada en el tracto respiratorio superior [3, 4]. Sin embargo, en su forma plenamente desarrollada la gripe es una enfermedad respiratoria aguda que resulta en hospitalizaciones y muertes principalmente entre grupos de alto riesgo. En todo el mundo, las epidemias anuales resultan en cerca de tres a cinco millones de casos de enfermedad grave, y entre 250.000 y 500.000 muertes [5]. Por esta razón, la OMS [6] y los CDC [7] recomiendan el tratamiento antiviral Según el método de detección (qRT-PCR o inmunofluorescencia) se han encontrado diferentes proporciones de coinfecciones. El análisis por qRT-PCR reveló que el 54,5-83,3% de los pacientes positivos de influenza A o B tenían al menos una infección viral respiratoria concomitante [9] [10] [11] [12]. La frecuencia de detección con inmunofluorescencia fue aún mayor (90-100%) [13, 14]. Los patógenos virales potenciales concomitantes de infecciones por virus de gripe incluyen rinovirus humano (RVH), virus respiratorio sincitial, adenovirus, coronavirus humano, metapneumovirus humano y virus de parainfluenza [14, 15]. Como resultado de las múltiples infecciones, una monoterapia antiinfluenza específica trata la infección por virus de gripe solamente, pero no la infección con el patógeno viral concomitante. Esto también se refleja en el hecho de que los inhibidores de la neuraminidasa (NI) son altamente eficaces en modelos animales que investigan las monoinfecciones por gripe [16, 17] pero muestran menor eficacia frente a los síntomas de gripe en ensayos clínicos en adultos con infecciones naturales [18]. Por lo tanto, existe una alta necesidad médica de una terapia antiviral de acción amplia en combinación con una terapia anti-influenza específica para el tratamiento de pacientes con síntomas del tracto respiratorio superior. Idealmente, las sustancias presentes en la combinación se complementan entre sí por diferentes modos de acción, lo que conduce a un tratamiento que proporciona una protección completa contra una amplia gama de virus respiratorios diferentes, así como diferentes cepas de gripe con una baja probabilidad de inducir mutaciones de escape. Carragenan es un polímero sulfatado de alto peso molecular derivado de algas rojas (Rhodophyceae) que se ha utilizado ampliamente en la industria alimentaria, cosmética y farmacéutica y que es generalmente reconocido como seguro por la FDA (GRAS) (revisado en [19] ). Se utilizan comercialmente tres formas principales de carragenanos: kappa, iota y lambda. Se diferencian entre sí en el grado de sulfación, solubilidad y propiedades gelificantes [20]. El mecanismo antiviral del carragenano se basa en la interferencia con el apego viral; como consecuencia, se inhibe la entrada viral [21, 22]. Su actividad antiviral depende del tipo de polímero, así como del virus y de las células hospedantes [23] [25] [26] [27] [28] [30] [32] y Se publicó que iota-carragenan es un potente inhibidor de la replicación de hRV [36] y influenza A [37] y demostró la eficacia antiviral de iota-carragenan frente a virus resfriados comunes por aplicación intranasal en varios ensayos clínicos aleatorizados, doble ciego, grupo paralelo, controlados con placebo [38] [39] [40]. El análisis combinado de dos estudios realizados en 153 niños y 203 adultos reveló que los pacientes infectados con cualquier virus respiratorio, que fueron tratados intranasalmente con iota-carragenan, mostraron una recuperación más rápida de 1,9 días de los síntomas de resfriados comunes que los pacientes tratados con placebo en la población con intención de tratar [41, 42]. La actividad antiinfluenza se mostró por el análisis de subgrupo de 49 pacientes infectados con gripe que se beneficiaron de una recuperación de síntomas más rápida de 3,3 días. El uso del aerosol nasal carragenano se asoció con una reducción significativa de la carga viral de la gripe en los fluidos nasales y un aumento significativo en el número de pacientes libres de virus en el período de tratamiento de 7 días. De acuerdo con Prieschl-Grassauer son cofundadores de Marinomed Biotechnologie GmbH. Marinomed Biotechnologie GmbH tuvo un papel en el diseño del estudio, la recopilación de datos y el análisis, la decisión de publicar, la preparación del manuscrito y está financiando la carga de procesamiento del manuscrito. con la literatura [9] [10] [11] [12] [13] [14] observamos que la mayoría de los pacientes infectados por el virus de la gripe sufrían de una infección viral respiratoria concomitante (66%) determinada por PCR en tiempo real. Carragenan que contiene aerosoles nasales ya se comercializan para el tratamiento de infecciones virales respiratorias bajo diferentes marcas en 18 países. En la actualidad, los únicos medicamentos eficaces disponibles para el tratamiento y la prevención de la gripe después de la exposición son los NI (Oseltamivir y Zanamivir en todo el mundo; Peramivir en Japón y Corea del Sur). Desde el uso a gran escala de bloqueadores M2 para la profilaxis y el tratamiento en humanos [43] y la cría [44], los virus de la gripe que circulan actualmente carecen ya de sensibilidad a este grupo de fármacos [45]. Ya hemos demostrado un efecto terapéutico aditivo de una terapia combinada con iota-carragenano aplicado intranasalmente y oseltamivir administrado por vía oral en ratones infectados con H1N1 A/PR/ 8/34 y un tratamiento comienza 48 horas después de la infección (hpi) [37]. En contraste con Oseltamivir, que necesita ser activado por conversión metabólica, Zanamivir se aplica directamente como fármaco activo y también puede ser administrado intranasal [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52]. GlaxoSmithKline investigó el potencial de una administración intranasal de Zanamivir. En siete ensayos clínicos de desafío 66 voluntarios fueron infectados con gripe B/Yamagata/16/88 y 213 con gripe A/Texas/36/91 (H1N1). 156 de estos participantes recibieron Zanamivir intranasal a diferentes dosis (niveles diarios de dosis de 6,4 mg a 96 mg) para profilaxis o terapia [46, 47, 53, 54]. Estos ensayos de desafío mostraron que el tratamiento que comenzó antes y hasta 36 horas después de la inoculación viral se asoció con la prevención de la gripe confirmada en laboratorio y la enfermedad febril, así como con una reducción de los títulos virales, la duración de la eliminación y los síntomas.En total, se publicaron datos de seguridad de 1.092 pacientes después de la aplicación intranasal de Zanamivir y no se encontraron pruebas de que Zanamivir indujera acontecimientos adversos o aumento de las frecuencias de intolerancia nasal local en comparación con los grupos placebo [46, 49, 52]. En conjunto, la combinación de un aerosol nasal carragenano que proporciona una amplia actividad antiviral contra las infecciones respiratorias superiores -incluyendo la gripe- con Zanamivir, un fármaco específico contra la gripe, satisface la necesidad médica existente para tratar múltiples infecciones virales.En el presente trabajo se investiga el efecto terapéutico de una combinación de carragen La identidad, pureza (>95%) de los subtipos carragenanos y el peso molecular (>100.000) fueron confirmados por el análisis NMR descrito en otra parte [55] y la presencia de lambda-carragenano estaba por debajo del límite de detección del 3%. Los polvos de polímeros secos se disuelven en aqua bidest (Fresenius Kabi, Austria) a una concentración final de 2,4 mg/ml de iota y 0,8 mg/ml de kappa-carragenano. Esta solución madre 2x fue filtrada estérilmente a través de un filtro de 0,22 μm (PAA, Suiza) y almacenada a temperatura ambiente hasta su uso. Para las pruebas posteriores, la solución madre se diluyó a una mezcla que contenía 1,2 mg/ml de iota-carragenano y 0,4 mg/ml de kappa-carragenano (en adelante, "carragenano"). Zanamivir fue comprado como polvo (Haosun Pharma, China) y la identidad y pureza fue confirmada por el análisis NMR. Zanamivir fue disuelto en soluciones de carragenano o placebo, seguido por filtración estéril a través de un filtro de 0,22 μm (Sarstedt, Alemania). Para los estudios in vivo todas las soluciones que contenían Zanamivir fueron recién preparadas. Las células de riñón canino Madin-Darby (MDCK) fueron obtenidas de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) y cultivadas en una incubadora de 37°C (Sanyo, Japón; CO Las células MDCK fueron cultivadas en el mínimo esencial de Dulbecco (DMEM) medio de glucosa alta (PAA, Austria) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS; PAA, Austria; calor inactivado). El virus de la gripe A/Hansa Hamburg/01/09 (H1N1(09)pdm) fue proporcionado amablemente por el Departamento de Virología de Peter Staeheli, Universidad de Friburgo, Alemania, y descrito previamente en [56] ; A/Teal/Alemania/Wv632/05 (H5N1) publicado anteriormente en [57] (números de adhesión CY061882-9) y A/Turquía/Alemania/R11/01 (H7N7) (taxonomía ID 278191, número de adhesión AEZ68716) fueron suministrados por cortesía de Martin Beer, Instituto de Virología Diagnóstica, Friedrich-Loeffler-Institute, Riems, Alemania; A/Aichi/2/68 (H3N2) fue comprado a la ATCC. Todos los virus de la gripe se propagaron en células MDCK a 37°C y 5% de CO2 en medio de la gripe [medio libre de suero Opti-Pro (Gibco, Austria) complementado con 4 mM de L-glutamina (PAA, Austria), 1% de mezcla antibiótico-antimicótica (PAA, Austria) y 5 μg/ml de tripsina (Sigma Aldrich, Austria)]. Para determinar la concentración inhibitoria del 50% (IC 50 ) y el efecto combinado de carragenano y Zanamivir, se desarrolló un ensayo de placa semilíquida. En 96 placas de cultivo de tejidos de pozo 1.7x10 4 células/pozo de MDCK fueron sembradas e infectadas a confluencia del 90% (24-28 horas más tarde). Se prepararon diluciones seriales de carragenano y Zanamivir en medio Para la infección, los virus fueron diluidos a un MOI de 0,003 (H1N1(09)pdm y H3N2 Aichi), 0,015 (H5N1) o 0,004 (H7N7), respectivamente, en medio de ensayo e incubados a temperatura ambiente (RT) durante 10 minutos con las diluciones en serie de carragenan y/o Zanamivir, respectivamente. Para la evaluación del efecto combinado de carragenan y Zanamivir, los virus fueron diluidos en medio de ensayo que contenía concentraciones constantes de carragenan o Zanamivir. La otra sustancia se diluyó en serie y se utilizó para la incubación del virus. Las células fueron infectadas en 6 repeticiones/dilución compuesta, respectivamente, e incubadas en RT durante 45 minutos antes de la extracción del inóculo. Las células fueron incubadas además con la concentración respectiva de las sustancias investigadas presentes en el revestimiento [medio de la gripe con 2,25% de carboximetilcelulosa (CMC, Fluka, Austria)] durante 30-42 horas a 37°C. Las placas en evolución fueron evaluadas después de la fijación de células de metanol/acetona por tinción inmune con anticuerpos dirigidos contra la nucleoproteína A de la gripe (AbD Serotec, Alemania) (para H1N1(09)pdm, H5N1 y H7N7) o la hemaglutinina (AbD Serotec, Alemania) (para H3N2). El análisis se realizó con un anticuerpo de detección etiquetado HRP (Thermo Scientific, Alemania) utilizando TMB (Biolegend, Alemania) como sustrato y un lector de microplacas a 450 nm. La reducción de la señal detectada representa una reducción en el número y tamaño de las placas e indica la supresión de la replicación viral durante la infección y el cultivo. Después de que las células inmunotensivas fueron teñidas con solución violeta cristalina de 0,005% para evaluar el estado de la capa celular y la toxicidad de los compuestos. IC 50 valores y desviaciones estándar se calcularon para un modelo de respuesta a dosis sigmoidal utilizando XLfit Excel add-in versión 5.3.1.3. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de la "Convención Europea para la Protección de Animales Vertebrados Utilizados para Experimentales y otros Propósitos Científicos" y la ley austríaca para experimentos con animales.Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el comité de ética institucional de la Universidad Veterinaria de Viena y realizados bajo el Ministerio Federal de Ciencia e Investigación Austriano. Se compraron ratones C57BL/6 a Janvier Labs, Francia, y se mantuvieron bajo condiciones estándar de laboratorio en las instalaciones animales de la Universidad Veterinaria de Viena. Para la eutanasia y la asfixia anestésica a través del CO 2 se hizo todo lo posible para minimizar el sufrimiento. Para los experimentos de infección, ratones hembra de 3-5 semanas de edad fueron inoculados por vía intranasal con solución de 50 μl de virus influenza (25 μl/nostril) que contenía 2,27x10 3 ó 1,65x10 3 unidades formadoras de placa de H1N1(09)pdm o H7N7, respectivamente. Posteriormente, el tratamiento comenzó 24, 48 ó 72 hpi, según lo indicado para los diferentes experimentos. El tratamiento se realizó por vía intranasal con solución terapéutica de 50 μl o placebo dos veces al día durante 5 días. Como tratamiento, ya sea carragenano (que contiene 1,2 mg/ml de iota-carragenano y 0,4 mg/ml de kappa-carragenano para proporcionar una dosis diaria de 12 mg/kg de peso corporal (BW)), Zanamivir (que contiene 130 μg/ml o 390 μg/ml de Zanamivir, para proporcionar una dosis diaria de 1 o 3 mg/kg de peso corporal, respectivamente) o una combinación de carragenano y Zanamivir se utilizaron. Carragenan y Zanamivir se utilizan a concentraciones no tóxicas como se muestra en [58] y [59]. Los ratones fueron monitorizados dos veces al día durante 15 días para la supervivencia y la pérdida de peso. La mortalidad también incluye ratones sacrificados por consideraciones éticas cuando habían perdido más del 25% de su peso corporal inicial. Confirmamos la infección viral en estos Como los mecanismos subyacentes a la actividad antiviral de los NI y los carragenanos son fundamentalmente distintos, es probable que presenten diferentes actividades hacia las cepas individuales del virus de la gripe. Como resultado, en combinación podrían complementarse entre sí para proporcionar protección contra un espectro más amplio de cepas del virus de la gripe que los compuestos individuales. Para probar esta hipótesis, investigamos la sensibilidad de varias cepas del virus de la gripe a Zanamivir y carragenano en un ensayo de reducción de placa adaptado con superposición semilíquida en células MDCK [60, 61]. Utilizando este método, determinamos el IC 50 de Zanamivir y carragenano contra los virus de la gripe A de origen humano y animal, a saber, H1N1(09)pdm (A/Hansa Hamburg/01/09), H3N2 (A/Aichi/2/68), H5N1 (A/Teal/Alemania/Wv632/05) y LP H7N7 (A/Turquía/Alemania/R11/01) (Tabla 1). Ambas sustancias no eran tóxicas en la concentración más alta probada (400 μM Zanamivir y 533 μg/ml carragenan), ni su combinación. Además, el CMC en la superposición no mostró ningún efecto inhibidor del virus (datos no mostrados). Se logró la inhibición de la replicación viral de todas las cepas de gripe probadas con ambas sustancias. Los valores de IC 50 de Zanamivir oscilaron entre 0,18 μM para H5N1 y 22,97 μM para H7N7 y el de carragenano de 0,39 μg/ml a 118,48 μg/ml para H1N1(09)pdm y H7N7, respectivamente (ver Tabla 1 ). Estos resultados demuestran que el carragenano y el Zanamivir se dirigen a cepas individuales de gripe en diferentes grados para que puedan complementarse mutuamente para proporcionar una mayor actividad anti-influenza. El tipo de interacción compuesta se caracterizó por el empleo de isobologramas (Fig 1). Como se describe en [62], los isobologramas comparan gráficamente las dosis de dos compuestos necesarios para alcanzar la inhibición del 50% con las dosis previstas calculadas sobre la base de un modelo de aditividad farmacológica. Se espera una linealidad curvada de ~1 para una interacción compuesta aditiva mientras que una progresión curvada <1 aboga por una interacción sinérgica y >1 para una interacción compuesta antagónica. Se seleccionaron dos cepas de virus para esos experimentos, siendo una la más sensible al carragenano (H1N1(09)pdm) y otra la menos sensible (H7N7). En ambos casos los isobologramas muestran una interacción sinérgica del carragenano y el Zanamivir (Fig 1). Así, se demostró que Zanamivir y el carragenano se dirigen a virus individuales de gripe con diferentes eficiencias, probablemente debido a sus diferentes estrategias antivirales. Como resultado, la combinación proporciona una actividad sinérgica con mayor protección contra un espectro más amplio de cepas de virus de gripe que los compuestos individuales. En el modelo de influenza animal, los ratones C57Bl/6 son desafiados con una dosis letal del virus respectivo y tratados con diferentes regímenes en comparación con un control del vehículo (placebo). La infección y el tratamiento (dos veces al día durante 5 días) se realizan intranasalmente sin anestesia. Investigamos si la combinación de Zanamivir y carragenano es más eficaz para reducir la mortalidad que las monoterapias correspondientes. Primero, determinamos la dosis mínima efectiva de un monoterapia de Zanamivir que mejoró significativamente el tiempo de supervivencia de los ratones infectados por H1N1 y H7N7. Para la infección letal por H7N7 la dosis mínima efectiva de Zanamivir como monoterapia varió entre 1 y 3 mg/kg de peso corporal/día (datos no mostrados). A continuación, comparamos la actividad antiviral de carragenan (12 mg/kg BW/ día) y Zanamivir (1 y 3 mg/kg BW/día) con la combinación respectiva frente al tratamiento con placebo. En la figura 2A se muestran las tasas de supervivencia de ratones con tratamiento inicial de 24 hpi. Todos los ratones tratados con placebo murieron entre los días 7 y 9 y también en todos los grupos de monoterapia se observó una letalidad del 100% hasta el día 15. En cambio, las terapias combinadas dieron lugar a una supervivencia del 50% y el 90%, dependiendo de la concentración de Zanamivir. El análisis estadístico mostró que la monoterapia de Zanamivir 1 mg/kg BW/día no mostró un beneficio significativo (p = 0,1810), mientras que la monoterapia con 3 mg/kg BW/día aumentó significativamente la tasa de supervivencia en comparación con los ratones tratados con placebo ( Del mismo modo, las terapias combinadas resultaron en un notable aumento de la supervivencia (p = 0,0421 para 1 mg y p <0,0001 para 3 mg/kg de peso corporal/día) en comparación con la monoterapia con carragenina. No se observó diferencia estadísticamente significativa entre la combinación que contiene 3 mg/kg de peso corporal/día de Zanamivir y la que contiene 1 mg/kg de peso corporal/día (p = 0,0525). Sin embargo, se observó una tendencia a un aumento de la tasa de supervivencia con la concentración de Zanamivir más alta. Por lo tanto, para una investigación ulterior se evaluó la terapia combinada que contiene 3 mg/kg de peso corporal/día de Zanamivir en ratones infectados letalmente por H7N7. A continuación, se encontró el potencial terapéutico de la combinación con un inicio tardío de la terapia 48 o 72 hpi frente al tratamiento con placebo. En contraste, la terapia de combinación que comenzó con 48 hpi proporcionó una tasa de supervivencia mejorada estadísticamente significativa en comparación con ratones tratados con placebo (p = 0,0010). En resumen, la combinación de dos monoterapias efectivas y establecidas dio lugar a una supervivencia significativamente mejorada en ratones infectados con H7N7. Además, la terapia de combinación fue altamente eficiente en comparación con el tratamiento con placebo incluso después de un inicio de tratamiento de hasta 48 hpi. La terapia intranasal con carragenano y Zanamivir que comenzó con 72 hpi protege significativamente a ratones infectados con influenza H1N1(09)pdm A continuación, se evaluó la dosis mínima efectiva de Zanamivir utilizada como monoterapia en un modelo letal de ratón H1N1(09)pdm, siguiendo el mismo esquema descrito en los experimentos con H7N7. La dosis efectiva más baja de Zanamivir después de iniciar el tratamiento con 24 hpi fue de 1 mg/kg de peso corporal/ día y su combinación con carragenan fue altamente eficaz (no se muestran los datos).En el siguiente experimento se investigó el potencial terapéutico de la combinación con un tratamiento con inicio de 48 o 72 hpi en comparación con el tratamiento con placebo respectivo.Como se muestra en la figura 3, las tasas de supervivencia de los ratones tratados con el tratamiento combinado aumentaron significativamente en comparación con el grupo placebo (p<0,0001).No hubo diferencia en la supervivencia entre los dos puntos de inicio del tratamiento, 48 o 72 hpi, lo que dio lugar a que se investigara el efecto antiviral de una combinación de carragenan con el NI Zanamivir en los estudios de cultivo celular y en los modelos de infección por gripe en ratones. Anteriormente hemos demostrado que una terapia combinada de iota-carragenano con el NI Oseltamivir llevó a una supervivencia significativamente mejorada en ratones infectados con H1N1 PR/8/34 en comparación con las respectivas monoterapias [37]. Sin embargo, Oseltamivir es un profármaco administrado por vía oral, que tiene que ser convertido en su forma activa mediante el procesamiento metabólico. Por lo tanto, no fue posible un mayor desarrollo de una combinación de aerosol nasal con Oseltamivir. En cambio Zanamivir-un NI que se aplica como fármaco activo-fue elegido para el desarrollo de una combinación compuesta. Durante el proceso de evaluación se encontró que la eficiencia de unión de diferentes subtipos carragenanos en diferentes cepas de gripe varía. El uso combinado de iota- y kappa-carragenano para el tratamiento de los ratones infectados por la gripe letal C57Bl/6 reveló un efecto terapéutico mejor que el uso de iota-carragenano solo (S1 Fig). Así, para proporcionar un espectro más amplio de actividad contra diferentes cepas del virus de la gripe, se utilizó una mezcla de iota- y kappa-carragenano (designado como carragenano) para una evaluación adicional. Para la investigación del efecto de una combinación compuesta de carragenano y Zanamivir, examinamos su eficiencia de inhibición, individual y en combinación, contra los virus de la gripe en un ensayo adaptado de reducción de placa con superposición de semilíquido en células MDCK. La combinación mostró una inhibición sinérgica de la replicación del virus en ensayos in vitro con todos los virus de la gripe probados (Fig 1). Esto indica que la interacción física del polímero con el virus no perturba la inhibición de la neuraminidasa por Zanamivir, lo que fue confirmado en pruebas in vitro que examinan una posible influencia del polímero en la actividad inhibidora de la neuraminidasa de Zanamivir (datos no mostrados). Por lo tanto, el efecto sinérgico observado se basa en la combinación de dos mecanismos subyacentes distintos. Como resultado, en la combinación propuesta ambos mecanismos se complementarían entre sí para proporcionar una protección más eficiente contra un espectro más amplio de cepas del virus de la gripe que los compuestos individuales. El efecto sinérgico también se mostró en modelos de ratones letales (Fig 2 y Fig 3). La patogenicidad de los virus de la gripe en ratones varía y depende de la cepa y su adaptación al huésped. Dependiendo de la dosis y cepa del virus, los virus de la gripe pueden inducir infecciones letales en ciertas cepas En nuestro modelo, los ratones C57Bl/6 son desafiados intranasalmente con una dosis letal del virus respectivo y tratados con diferentes regímenes en comparación con un control del vehículo (placebo). En este modelo, la replicación temprana del virus tiene lugar en el tracto respiratorio superior. A partir de ahí, el virus se disemina al pulmón y causa neumonía letal. El efecto del tratamiento sobre la mortalidad se evalúa en comparación con los ratones de control tratados con placebo. De todas las cepas de gripe in vitro probadas, el H1N1(09)pdm y el LP H7N7 son particularmente interesantes por dos razones. Primero, son patógenos altamente relevantes, como placebo o con las monoterapias consistentes en carrageenan (12 mg/kg BW/día) o Zanamivir (1 y 3 mg/kg BW/día) o una combinación de estos. El tratamiento comenzó 24 hpi (B) Los ratones (n = 20 por grupo) fueron infectados letalmente por vía intranasal sin anestesia en el día 0 y tratados intranasalmente dos veces al día con placebo o una combinación de carragenan con Zanamivir (3 mg/kg de peso corporal/día). El tratamiento comenzó con 48 hpi o 72 hpi y continuó durante 5 días. En el eje y la supervivencia de ratones [%] y en el eje x se da el tiempo posterior a la infección [días]. Los ratones control tratados con Placebo mostraron una supervivencia del 100% en ambos experimentos (datos no mostrados).Los análisis estadísticos se realizaron mediante pruebas de rango logarítmico y se muestran debajo de los gráficos. Los valores de p<0,05 se consideraron estadísticamente significativos; no significancia (n.s.) se obtuvieron con valores p >0,05. El H1N1(09)pdm está asociado con más de 18.400 muertes en la temporada 2009/2010, mientras que el LP H7N7 lleva un HA estrechamente relacionado con el virus de la gripe aviar H7N9 que ha causado más de 175 muertes hasta octubre de 2014 [64]. En segundo lugar, son de especial interés para el enfoque de combinación carragenano/Zanamivir. Han demostrado ser diferentes en susceptibilidad in vitro a carragenano, Zanamivir (Tabla 1 ) y la combinación de los mismos (Fig 1). Si bien H1N1(09)pdm era altamente sensible a la inhibición por ambas sustancias solo, el H7N7 requería concentraciones mucho más altas de carrageneno y Zanamivir, respectivamente, para lograr eficiencias de inhibición similares. Se establecieron modelos de ratón letales con ambos virus que resultaron en 6,8 y 8,5 días medios de supervivencia para LP H7N7 y H1N1(09)pdm, respectivamente. Estos resultados están en buena consonancia con modelos similares de gripe letal ya publicados [65] [66] [67]. En nuestros modelos se encontró que la dosis efectiva más baja para Zanamivir en un inicio de tratamiento 24 hpi fue entre 1 a 3 mg/kg BW/día para ambos virus. Este rango de concentración es relativamente alto en comparación con otros estudios publicados. Sin embargo, estos estudios se realizaron bajo anestesia con diferentes virus y una terapia profiláctica comienza [65, 66]. El hecho de que se necesite una dosis más alta de NI para un tratamiento efectivo cuando se inicia la terapia 24 hpi ya se conoce para Oseltamivir [68]. Sin embargo, también se publicaron datos con concentraciones efectivas mucho más altas (10 mg/kg BW/día [69] ) y con concentraciones similares de Zanamivir (2,5 mg/kg BW/día [67] ). Encontramos que la combinación de carragenano con 3 mg/kg BW/día Zanamivir utilizado para el tratamiento de ratones infectados con H7N7 resultó en una supervivencia significativamente mejorada de ratones en comparación con las dos monoterapias (fig 2). La supervivencia significativamente mejorada en comparación con el grupo tratado con placebo también se encontró después de un inicio de tratamiento tardío 48 hpi. Además, en el modelo H1N1(09)pdm la combinación de carragenano con 1 mg/kg BW/día Zanamivir mostró una supervivencia estadísticamente significativa en comparación con el tratamiento con placebo incluso después de un inicio de tratamiento 72 hpi. Este es un hallazgo notable ya que Como el régimen de tratamiento intranasal es incapaz de tratar eficazmente las infecciones virales pulmonares, el objetivo principal de este producto es la profilaxis y el tratamiento de la gripe no complicada. Dado que la mayoría de las infecciones por gripe causan enfermedades no complicadas y prácticamente todos los casos de gripe comienzan con una infección de la cavidad nasal o del tracto respiratorio superior, el potencial terapéutico es enorme. Sin embargo, se requieren estudios clínicos para dilucidar y demostrar el potencial de la terapia combinada propuesta. La combinación de estrategias antivirales ha dado lugar a logros impresionantes en la lucha contra otras enfermedades virales como el VIH. En particular, el problema de la resistencia antiviral podría abordarse con esta estrategia. En la última década se han planteado preocupaciones sobre la creciente aparición de virus de la gripe resistente a Oseltamivir. La aparición aumentada de virus portadores de la mutación H275Y en la neuraminidasa de virus H1N1(09)pdm que confiere resistencia a Oseltamivir dejó Zanamivir como única opción de tratamiento para pacientes sintomáticos infectados con una cepa de gripe resistente a Oseltamivir [70]. A diferencia de Oseltamivir, la resistencia a Zanamivir es menos frecuente. Hasta la fecha, la gripe resistente a Zanamivir se ha detectado sólo una vez, en un paciente inmunocomprometido [71, 72]. Sin embargo, se deben aprender lecciones de intervenciones previas contra la gripe que dieron lugar a la aparición de resistencia contra fármacos actualmente aprobados [73]. Por lo tanto, es comprensible que el aumento del uso de Zanamivir también pueda conducir a la aparición rápida de resistencias [74]. Para superar esta amenaza, una combinación de antivira Comprobamos la posibilidad de generar virus mutantes de escape de doble compuesto al pasar virus en presencia de concentraciones crecientes de combinaciones de compuestos. Después de 10 pasajes en células MDCK no se pudo encontrar resistencia a la combinación de compuestos para cualquier virus de gripe probado (datos no mostrados). Sin embargo, este hallazgo no garantiza que la aparición de mutantes de escape de Zanamivir pueda detenerse completamente. En resumen, demostramos que los mecanismos anti-influenza de ambos compuestos individuales se complementan entre sí. La combinación proporciona una mejor protección sinérgica contra un espectro más amplio de virus de gripe que los compuestos individuales. Un aerosol nasal que contiene carragenano junto con Zanamivir proporciona un tratamiento fácil de aplicar de infecciones del tracto respiratorio superior en pacientes sospechosos de estar infectados por gripe. Los pacientes se beneficiarían del tratamiento rápido y eficiente de la gripe no complicada en el tracto respiratorio superior. Debido al aclaramiento más rápido del virus de la gripe en el tracto respiratorio superior y al mecanismo antiviral independiente de carragenan y Zanamivir, se reducirá la probabilidad de desarrollar mutaciones de escape contra Zanamivir. Ambos compuestos individuales son capaces de reducir la gravedad y/o la duración de la enfermedad de la gripe y se espera que una combinación funcione de manera similar. Además, debido a la amplia eficacia antiviral de carragenan, los pacientes recibirán en paralelo un tratamiento de infecciones virales concomitantes. Por lo tanto, los pacientes se beneficiarán de una menor probabilidad de desarrollar complicaciones. Teniendo en cuenta las complicaciones conocidas que acompañan una enfermedad del virus de la gripe, esta terapia combinada satisface una necesidad médica urgente. Un segundo ámbito de esta combinación es la protección contra virus pandémicos recién emergentes durante el tiempo hasta la identificación del virus seguido por la fabricación y distribución de vacunas [43]. Incluso si, debido a las nuevas técnicas genéticas inversas, se necesita menos tiempo para la producción de vacunas, todavía toma meses antes de que grandes cantidades de vacunas estén disponibles [75]. Durante este tiempo la población humana debe estar protegida para desacelerar la propagación viral. En este momento las únicas oportunidades disponibles para la protección personal son las medidas de higiene y el uso de Tamiflu (nombre comercial de Oseltamivir). Se necesitan desesperadamente nuevas opciones de protección y tratamiento para la gripe. Basado en nuestros resultados alentadores en ratones, sugerimos probar un aerosol nasal que contenga carragenan en combinación con el inhibidor de la neuraminidasa Zanamivir en ensayos clínicos para la prevención o el tratamiento de infecciones de gripe no complicadas. Los ratones (n = 20 por grupo) fueron infectados letalmente por vía intranasal sin anestesia en el día 0 y, por lo tanto, fueron tratados intranasalmente dos veces al día con placebo o con iota-carragenano o con una mezcla de iota-y kappa-carragenano. El tratamiento comenzó 24 hpi y continuó durante 5 días. En el eje Y la supervivencia de ratones [%] y en el eje X se da el tiempo post infección [días]. Los ratones de control tratados con Placebo, no infectados, mostraron una supervivencia del 100% (datos no mostrados). Los análisis estadísticos se realizaron utilizando la prueba de rango logarítmico y se muestran debajo de los gráficos. Los valores de p<0,05 se consideraron estadísticamente significativos; no significancia (n.s.) se obtuvieron con valores p >0,05. (TIFF)

¿Cuál es la ventana óptima para iniciar el tratamiento con caragenan y Zanamivir?

La aplicación intranasal de Zanamivir y Carragenan es sinérgicamente activa contra el virus de la gripe A en el modelo murinohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4459876/SHA: f0b1fa4036434b57c8307d43c39a4193f7e8053aAutores: Morokutti-Kurz, Martina; König-Schuster, Marielle; Koller, Christiane; Graf, Christine; Graf, Philipp; Kirchoff, Norman; Reutwer, Benjamin; Seifert, Jan-Marcus; Unger, Hermann; Grassauer, Andreas; Prieschl-Grassauer, Eva; Nakowitsch, SabineFecha: 2015-06-08DOI Como las infecciones causadas por el virus de la gripe suelen ir acompañadas de infecciones por otros virus respiratorios, la combinación de un compuesto anti-influenza específico con el polímero antiviral ampliamente activo tiene un enorme potencial para el tratamiento de infecciones respiratorias. Así, la combinación del fármaco anti-influenza específico Zanamivir junto con carragenano en una formulación adecuada para la aplicación intranasal se evaluó in-vitro e in-vivo. Además, se demuestra en un modelo de gripe letal con un virus H7N7 de baja patogenicidad (HA estrechamente relacionado con el virus de la gripe aviar A(H7N9)) y un virus de la gripe H1N1(09)pdm en ratones C57BL/6 que el uso combinado de ambos compuestos aumenta significativamente la supervivencia de los animales infectados en comparación con las monoterapias o placebo. Cabe destacar que este beneficio se mantiene incluso cuando el tratamiento comienza hasta 72 horas después de la infección. CONCLUSIÓN: Por lo tanto, se debe probar un aerosol nasal que contenga carragenan y Zanamivir para prevenir y tratar la gripe no complicada en ensayos clínicos. Texto: La aparición periódica de nuevas variantes de gripe plantea una amenaza pandémica mundial. Desde la aparición del nuevo virus A(H7N9), más de 400 casos humanos fueron reportados a la OMS con una tasa de mortalidad de más del La mayoría de los pacientes con infecciones por el virus A(H7N9) tuvieron contacto con aves de corral o visitaron mercados de animales vivos. Sin embargo, algunos casos esporádicos parecían ser resultado de transmisiones humanas a seres humanos [1, 2]. A diferencia de los virus pandémicos que entran fulminantemente en la población humana y causan altas tasas de mortalidad, los virus estacionales de la gripe generalmente causan infecciones no complicadas y transitorias en humanos, con replicación viral localizada en el tracto respiratorio superior [3, 4]. Sin embargo, en su forma plenamente desarrollada la gripe es una enfermedad respiratoria aguda que resulta en hospitalizaciones y muertes principalmente entre grupos de alto riesgo. En todo el mundo, las epidemias anuales resultan en cerca de tres a cinco millones de casos de enfermedad grave, y entre 250.000 y 500.000 muertes [5]. Por esta razón, la OMS [6] y los CDC [7] recomiendan el tratamiento antiviral Según el método de detección (qRT-PCR o inmunofluorescencia) se han encontrado diferentes proporciones de coinfecciones. El análisis por qRT-PCR reveló que el 54,5-83,3% de los pacientes positivos de influenza A o B tenían al menos una infección viral respiratoria concomitante [9] [10] [11] [12]. La frecuencia de detección con inmunofluorescencia fue aún mayor (90-100%) [13, 14]. Los patógenos virales potenciales concomitantes de infecciones por virus de gripe incluyen rinovirus humano (RVH), virus respiratorio sincitial, adenovirus, coronavirus humano, metapneumovirus humano y virus de parainfluenza [14, 15]. Como resultado de las múltiples infecciones, una monoterapia antiinfluenza específica trata la infección por virus de gripe solamente, pero no la infección con el patógeno viral concomitante. Esto también se refleja en el hecho de que los inhibidores de la neuraminidasa (NI) son altamente eficaces en modelos animales que investigan las monoinfecciones por gripe [16, 17] pero muestran menor eficacia frente a los síntomas de gripe en ensayos clínicos en adultos con infecciones naturales [18]. Por lo tanto, existe una alta necesidad médica de una terapia antiviral de acción amplia en combinación con una terapia anti-influenza específica para el tratamiento de pacientes con síntomas del tracto respiratorio superior. Idealmente, las sustancias presentes en la combinación se complementan entre sí por diferentes modos de acción, lo que conduce a un tratamiento que proporciona una protección completa contra una amplia gama de virus respiratorios diferentes, así como diferentes cepas de gripe con una baja probabilidad de inducir mutaciones de escape. Carragenan es un polímero sulfatado de alto peso molecular derivado de algas rojas (Rhodophyceae) que se ha utilizado ampliamente en la industria alimentaria, cosmética y farmacéutica y que es generalmente reconocido como seguro por la FDA (GRAS) (revisado en [19] ). Se utilizan comercialmente tres formas principales de carragenanos: kappa, iota y lambda. Se diferencian entre sí en el grado de sulfación, solubilidad y propiedades gelificantes [20]. El mecanismo antiviral del carragenano se basa en la interferencia con el apego viral; como consecuencia, se inhibe la entrada viral [21, 22]. Su actividad antiviral depende del tipo de polímero, así como del virus y de las células hospedantes [23] [25] [26] [27] [28] [30] [32] y Se publicó que iota-carragenan es un potente inhibidor de la replicación de hRV [36] y influenza A [37] y demostró la eficacia antiviral de iota-carragenan frente a virus resfriados comunes por aplicación intranasal en varios ensayos clínicos aleatorizados, doble ciego, grupo paralelo, controlados con placebo [38] [39] [40]. El análisis combinado de dos estudios realizados en 153 niños y 203 adultos reveló que los pacientes infectados con cualquier virus respiratorio, que fueron tratados intranasalmente con iota-carragenan, mostraron una recuperación más rápida de 1,9 días de los síntomas de resfriados comunes que los pacientes tratados con placebo en la población con intención de tratar [41, 42]. La actividad antiinfluenza se mostró por el análisis de subgrupo de 49 pacientes infectados con gripe que se beneficiaron de una recuperación de síntomas más rápida de 3,3 días. El uso del aerosol nasal carragenano se asoció con una reducción significativa de la carga viral de la gripe en los fluidos nasales y un aumento significativo en el número de pacientes libres de virus en el período de tratamiento de 7 días. De acuerdo con Prieschl-Grassauer son cofundadores de Marinomed Biotechnologie GmbH. Marinomed Biotechnologie GmbH tuvo un papel en el diseño del estudio, la recopilación de datos y el análisis, la decisión de publicar, la preparación del manuscrito y está financiando la carga de procesamiento del manuscrito. con la literatura [9] [10] [11] [12] [13] [14] observamos que la mayoría de los pacientes infectados por el virus de la gripe sufrían de una infección viral respiratoria concomitante (66%) determinada por PCR en tiempo real. Carragenan que contiene aerosoles nasales ya se comercializan para el tratamiento de infecciones virales respiratorias bajo diferentes marcas en 18 países. En la actualidad, los únicos medicamentos eficaces disponibles para el tratamiento y la prevención de la gripe después de la exposición son los NI (Oseltamivir y Zanamivir en todo el mundo; Peramivir en Japón y Corea del Sur). Desde el uso a gran escala de bloqueadores M2 para la profilaxis y el tratamiento en humanos [43] y la cría [44], los virus de la gripe que circulan actualmente carecen ya de sensibilidad a este grupo de fármacos [45]. Ya hemos demostrado un efecto terapéutico aditivo de una terapia combinada con iota-carragenano aplicado intranasalmente y oseltamivir administrado por vía oral en ratones infectados con H1N1 A/PR/ 8/34 y un tratamiento comienza 48 horas después de la infección (hpi) [37]. En contraste con Oseltamivir, que necesita ser activado por conversión metabólica, Zanamivir se aplica directamente como fármaco activo y también puede ser administrado intranasal [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52]. GlaxoSmithKline investigó el potencial de una administración intranasal de Zanamivir. En siete ensayos clínicos de desafío 66 voluntarios fueron infectados con gripe B/Yamagata/16/88 y 213 con gripe A/Texas/36/91 (H1N1). 156 de estos participantes recibieron Zanamivir intranasal a diferentes dosis (niveles diarios de dosis de 6,4 mg a 96 mg) para profilaxis o terapia [46, 47, 53, 54]. Estos ensayos de desafío mostraron que el tratamiento que comenzó antes y hasta 36 horas después de la inoculación viral se asoció con la prevención de la gripe confirmada en laboratorio y la enfermedad febril, así como con una reducción de los títulos virales, la duración de la eliminación y los síntomas.En total, se publicaron datos de seguridad de 1.092 pacientes después de la aplicación intranasal de Zanamivir y no se encontraron pruebas de que Zanamivir indujera acontecimientos adversos o aumento de las frecuencias de intolerancia nasal local en comparación con los grupos placebo [46, 49, 52]. En conjunto, la combinación de un aerosol nasal carragenano que proporciona una amplia actividad antiviral contra las infecciones respiratorias superiores -incluyendo la gripe- con Zanamivir, un fármaco específico contra la gripe, satisface la necesidad médica existente para tratar múltiples infecciones virales.En el presente trabajo se investiga el efecto terapéutico de una combinación de carragen La identidad, pureza (>95%) de los subtipos carragenanos y el peso molecular (>100.000) fueron confirmados por el análisis NMR descrito en otra parte [55] y la presencia de lambda-carragenano estaba por debajo del límite de detección del 3%. Los polvos de polímeros secos se disuelven en aqua bidest (Fresenius Kabi, Austria) a una concentración final de 2,4 mg/ml de iota y 0,8 mg/ml de kappa-carragenano. Esta solución madre 2x fue filtrada estérilmente a través de un filtro de 0,22 μm (PAA, Suiza) y almacenada a temperatura ambiente hasta su uso. Para las pruebas posteriores, la solución madre se diluyó a una mezcla que contenía 1,2 mg/ml de iota-carragenano y 0,4 mg/ml de kappa-carragenano (en adelante, "carragenano"). Zanamivir fue comprado como polvo (Haosun Pharma, China) y la identidad y pureza fue confirmada por el análisis NMR. Zanamivir fue disuelto en soluciones de carragenano o placebo, seguido por filtración estéril a través de un filtro de 0,22 μm (Sarstedt, Alemania). Para los estudios in vivo todas las soluciones que contenían Zanamivir fueron recién preparadas. Las células de riñón canino Madin-Darby (MDCK) fueron obtenidas de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) y cultivadas en una incubadora de 37°C (Sanyo, Japón; CO Las células MDCK fueron cultivadas en el mínimo esencial de Dulbecco (DMEM) medio de glucosa alta (PAA, Austria) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS; PAA, Austria; calor inactivado). El virus de la gripe A/Hansa Hamburg/01/09 (H1N1(09)pdm) fue proporcionado amablemente por el Departamento de Virología de Peter Staeheli, Universidad de Friburgo, Alemania, y descrito previamente en [56] ; A/Teal/Alemania/Wv632/05 (H5N1) publicado anteriormente en [57] (números de adhesión CY061882-9) y A/Turquía/Alemania/R11/01 (H7N7) (taxonomía ID 278191, número de adhesión AEZ68716) fueron suministrados por cortesía de Martin Beer, Instituto de Virología Diagnóstica, Friedrich-Loeffler-Institute, Riems, Alemania; A/Aichi/2/68 (H3N2) fue comprado a la ATCC. Todos los virus de la gripe se propagaron en células MDCK a 37°C y 5% de CO2 en medio de la gripe [medio libre de suero Opti-Pro (Gibco, Austria) complementado con 4 mM de L-glutamina (PAA, Austria), 1% de mezcla antibiótico-antimicótica (PAA, Austria) y 5 μg/ml de tripsina (Sigma Aldrich, Austria)]. Para determinar la concentración inhibitoria del 50% (IC 50 ) y el efecto combinado de carragenano y Zanamivir, se desarrolló un ensayo de placa semilíquida. En 96 placas de cultivo de tejidos de pozo 1.7x10 4 células/pozo de MDCK fueron sembradas e infectadas a confluencia del 90% (24-28 horas más tarde). Se prepararon diluciones seriales de carragenano y Zanamivir en medio Para la infección, los virus fueron diluidos a un MOI de 0,003 (H1N1(09)pdm y H3N2 Aichi), 0,015 (H5N1) o 0,004 (H7N7), respectivamente, en medio de ensayo e incubados a temperatura ambiente (RT) durante 10 minutos con las diluciones en serie de carragenan y/o Zanamivir, respectivamente. Para la evaluación del efecto combinado de carragenan y Zanamivir, los virus fueron diluidos en medio de ensayo que contenía concentraciones constantes de carragenan o Zanamivir. La otra sustancia se diluyó en serie y se utilizó para la incubación del virus. Las células fueron infectadas en 6 repeticiones/dilución compuesta, respectivamente, e incubadas en RT durante 45 minutos antes de la extracción del inóculo. Las células fueron incubadas además con la concentración respectiva de las sustancias investigadas presentes en el revestimiento [medio de la gripe con 2,25% de carboximetilcelulosa (CMC, Fluka, Austria)] durante 30-42 horas a 37°C. Las placas en evolución fueron evaluadas después de la fijación de células de metanol/acetona por tinción inmune con anticuerpos dirigidos contra la nucleoproteína A de la gripe (AbD Serotec, Alemania) (para H1N1(09)pdm, H5N1 y H7N7) o la hemaglutinina (AbD Serotec, Alemania) (para H3N2). El análisis se realizó con un anticuerpo de detección etiquetado HRP (Thermo Scientific, Alemania) utilizando TMB (Biolegend, Alemania) como sustrato y un lector de microplacas a 450 nm. La reducción de la señal detectada representa una reducción en el número y tamaño de las placas e indica la supresión de la replicación viral durante la infección y el cultivo. Después de que las células inmunotensivas fueron teñidas con solución violeta cristalina de 0,005% para evaluar el estado de la capa celular y la toxicidad de los compuestos. IC 50 valores y desviaciones estándar se calcularon para un modelo de respuesta a dosis sigmoidal utilizando XLfit Excel add-in versión 5.3.1.3. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de la "Convención Europea para la Protección de Animales Vertebrados Utilizados para Experimentales y otros Propósitos Científicos" y la ley austríaca para experimentos con animales.Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el comité de ética institucional de la Universidad Veterinaria de Viena y realizados bajo el Ministerio Federal de Ciencia e Investigación Austriano. Se compraron ratones C57BL/6 a Janvier Labs, Francia, y se mantuvieron bajo condiciones estándar de laboratorio en las instalaciones animales de la Universidad Veterinaria de Viena. Para la eutanasia y la asfixia anestésica a través del CO 2 se hizo todo lo posible para minimizar el sufrimiento. Para los experimentos de infección, ratones hembra de 3-5 semanas de edad fueron inoculados por vía intranasal con solución de 50 μl de virus influenza (25 μl/nostril) que contenía 2,27x10 3 ó 1,65x10 3 unidades formadoras de placa de H1N1(09)pdm o H7N7, respectivamente. Posteriormente, el tratamiento comenzó 24, 48 ó 72 hpi, según lo indicado para los diferentes experimentos. El tratamiento se realizó por vía intranasal con solución terapéutica de 50 μl o placebo dos veces al día durante 5 días. Como tratamiento, ya sea carragenano (que contiene 1,2 mg/ml de iota-carragenano y 0,4 mg/ml de kappa-carragenano para proporcionar una dosis diaria de 12 mg/kg de peso corporal (BW)), Zanamivir (que contiene 130 μg/ml o 390 μg/ml de Zanamivir, para proporcionar una dosis diaria de 1 o 3 mg/kg de peso corporal, respectivamente) o una combinación de carragenano y Zanamivir se utilizaron. Carragenan y Zanamivir se utilizan a concentraciones no tóxicas como se muestra en [58] y [59]. Los ratones fueron monitorizados dos veces al día durante 15 días para la supervivencia y la pérdida de peso. La mortalidad también incluye ratones sacrificados por consideraciones éticas cuando habían perdido más del 25% de su peso corporal inicial. Confirmamos la infección viral en estos Como los mecanismos subyacentes a la actividad antiviral de los NI y los carragenanos son fundamentalmente distintos, es probable que presenten diferentes actividades hacia las cepas individuales del virus de la gripe. Como resultado, en combinación podrían complementarse entre sí para proporcionar protección contra un espectro más amplio de cepas del virus de la gripe que los compuestos individuales. Para probar esta hipótesis, investigamos la sensibilidad de varias cepas del virus de la gripe a Zanamivir y carragenano en un ensayo de reducción de placa adaptado con superposición semilíquida en células MDCK [60, 61]. Utilizando este método, determinamos el IC 50 de Zanamivir y carragenano contra los virus de la gripe A de origen humano y animal, a saber, H1N1(09)pdm (A/Hansa Hamburg/01/09), H3N2 (A/Aichi/2/68), H5N1 (A/Teal/Alemania/Wv632/05) y LP H7N7 (A/Turquía/Alemania/R11/01) (Tabla 1). Ambas sustancias no eran tóxicas en la concentración más alta probada (400 μM Zanamivir y 533 μg/ml carragenan), ni su combinación. Además, el CMC en la superposición no mostró ningún efecto inhibidor del virus (datos no mostrados). Se logró la inhibición de la replicación viral de todas las cepas de gripe probadas con ambas sustancias. Los valores de IC 50 de Zanamivir oscilaron entre 0,18 μM para H5N1 y 22,97 μM para H7N7 y el de carragenano de 0,39 μg/ml a 118,48 μg/ml para H1N1(09)pdm y H7N7, respectivamente (ver Tabla 1 ). Estos resultados demuestran que el carragenano y el Zanamivir se dirigen a cepas individuales de gripe en diferentes grados para que puedan complementarse mutuamente para proporcionar una mayor actividad anti-influenza. El tipo de interacción compuesta se caracterizó por el empleo de isobologramas (Fig 1). Como se describe en [62], los isobologramas comparan gráficamente las dosis de dos compuestos necesarios para alcanzar la inhibición del 50% con las dosis previstas calculadas sobre la base de un modelo de aditividad farmacológica. Se espera una linealidad curvada de ~1 para una interacción compuesta aditiva mientras que una progresión curvada <1 aboga por una interacción sinérgica y >1 para una interacción compuesta antagónica. Se seleccionaron dos cepas de virus para esos experimentos, siendo una la más sensible al carragenano (H1N1(09)pdm) y otra la menos sensible (H7N7). En ambos casos los isobologramas muestran una interacción sinérgica del carragenano y el Zanamivir (Fig 1). Así, se demostró que Zanamivir y el carragenano se dirigen a virus individuales de gripe con diferentes eficiencias, probablemente debido a sus diferentes estrategias antivirales. Como resultado, la combinación proporciona una actividad sinérgica con mayor protección contra un espectro más amplio de cepas de virus de gripe que los compuestos individuales. En el modelo de influenza animal, los ratones C57Bl/6 son desafiados con una dosis letal del virus respectivo y tratados con diferentes regímenes en comparación con un control del vehículo (placebo). La infección y el tratamiento (dos veces al día durante 5 días) se realizan intranasalmente sin anestesia. Investigamos si la combinación de Zanamivir y carragenano es más eficaz para reducir la mortalidad que las monoterapias correspondientes. Primero, determinamos la dosis mínima efectiva de un monoterapia de Zanamivir que mejoró significativamente el tiempo de supervivencia de los ratones infectados por H1N1 y H7N7. Para la infección letal por H7N7 la dosis mínima efectiva de Zanamivir como monoterapia varió entre 1 y 3 mg/kg de peso corporal/día (datos no mostrados). A continuación, comparamos la actividad antiviral de carragenan (12 mg/kg BW/ día) y Zanamivir (1 y 3 mg/kg BW/día) con la combinación respectiva frente al tratamiento con placebo. En la figura 2A se muestran las tasas de supervivencia de ratones con tratamiento inicial de 24 hpi. Todos los ratones tratados con placebo murieron entre los días 7 y 9 y también en todos los grupos de monoterapia se observó una letalidad del 100% hasta el día 15. En cambio, las terapias combinadas dieron lugar a una supervivencia del 50% y el 90%, dependiendo de la concentración de Zanamivir. El análisis estadístico mostró que la monoterapia de Zanamivir 1 mg/kg BW/día no mostró un beneficio significativo (p = 0,1810), mientras que la monoterapia con 3 mg/kg BW/día aumentó significativamente la tasa de supervivencia en comparación con los ratones tratados con placebo ( Del mismo modo, las terapias combinadas resultaron en un notable aumento de la supervivencia (p = 0,0421 para 1 mg y p <0,0001 para 3 mg/kg de peso corporal/día) en comparación con la monoterapia con carragenina. No se observó diferencia estadísticamente significativa entre la combinación que contiene 3 mg/kg de peso corporal/día de Zanamivir y la que contiene 1 mg/kg de peso corporal/día (p = 0,0525). Sin embargo, se observó una tendencia a un aumento de la tasa de supervivencia con la concentración de Zanamivir más alta. Por lo tanto, para una investigación ulterior se evaluó la terapia combinada que contiene 3 mg/kg de peso corporal/día de Zanamivir en ratones infectados letalmente por H7N7. A continuación, se encontró el potencial terapéutico de la combinación con un inicio tardío de la terapia 48 o 72 hpi frente al tratamiento con placebo. En contraste, la terapia de combinación que comenzó con 48 hpi proporcionó una tasa de supervivencia mejorada estadísticamente significativa en comparación con ratones tratados con placebo (p = 0,0010). En resumen, la combinación de dos monoterapias efectivas y establecidas dio lugar a una supervivencia significativamente mejorada en ratones infectados con H7N7. Además, la terapia de combinación fue altamente eficiente en comparación con el tratamiento con placebo incluso después de un inicio de tratamiento de hasta 48 hpi. La terapia intranasal con carragenano y Zanamivir que comenzó con 72 hpi protege significativamente a ratones infectados con influenza H1N1(09)pdm A continuación, se evaluó la dosis mínima efectiva de Zanamivir utilizada como monoterapia en un modelo letal de ratón H1N1(09)pdm, siguiendo el mismo esquema descrito en los experimentos con H7N7. La dosis efectiva más baja de Zanamivir después de iniciar el tratamiento con 24 hpi fue de 1 mg/kg de peso corporal/ día y su combinación con carragenan fue altamente eficaz (no se muestran los datos).En el siguiente experimento se investigó el potencial terapéutico de la combinación con un tratamiento con inicio de 48 o 72 hpi en comparación con el tratamiento con placebo respectivo.Como se muestra en la figura 3, las tasas de supervivencia de los ratones tratados con el tratamiento combinado aumentaron significativamente en comparación con el grupo placebo (p<0,0001).No hubo diferencia en la supervivencia entre los dos puntos de inicio del tratamiento, 48 o 72 hpi, lo que dio lugar a que se investigara el efecto antiviral de una combinación de carragenan con el NI Zanamivir en los estudios de cultivo celular y en los modelos de infección por gripe en ratones. Anteriormente hemos demostrado que una terapia combinada de iota-carragenano con el NI Oseltamivir llevó a una supervivencia significativamente mejorada en ratones infectados con H1N1 PR/8/34 en comparación con las respectivas monoterapias [37]. Sin embargo, Oseltamivir es un profármaco administrado por vía oral, que tiene que ser convertido en su forma activa mediante el procesamiento metabólico. Por lo tanto, no fue posible un mayor desarrollo de una combinación de aerosol nasal con Oseltamivir. En cambio Zanamivir-un NI que se aplica como fármaco activo-fue elegido para el desarrollo de una combinación compuesta. Durante el proceso de evaluación se encontró que la eficiencia de unión de diferentes subtipos carragenanos en diferentes cepas de gripe varía. El uso combinado de iota- y kappa-carragenano para el tratamiento de los ratones infectados por la gripe letal C57Bl/6 reveló un efecto terapéutico mejor que el uso de iota-carragenano solo (S1 Fig). Así, para proporcionar un espectro más amplio de actividad contra diferentes cepas del virus de la gripe, se utilizó una mezcla de iota- y kappa-carragenano (designado como carragenano) para una evaluación adicional. Para la investigación del efecto de una combinación compuesta de carragenano y Zanamivir, examinamos su eficiencia de inhibición, individual y en combinación, contra los virus de la gripe en un ensayo adaptado de reducción de placa con superposición de semilíquido en células MDCK. La combinación mostró una inhibición sinérgica de la replicación del virus en ensayos in vitro con todos los virus de la gripe probados (Fig 1). Esto indica que la interacción física del polímero con el virus no perturba la inhibición de la neuraminidasa por Zanamivir, lo que fue confirmado en pruebas in vitro que examinan una posible influencia del polímero en la actividad inhibidora de la neuraminidasa de Zanamivir (datos no mostrados). Por lo tanto, el efecto sinérgico observado se basa en la combinación de dos mecanismos subyacentes distintos. Como resultado, en la combinación propuesta ambos mecanismos se complementarían entre sí para proporcionar una protección más eficiente contra un espectro más amplio de cepas del virus de la gripe que los compuestos individuales. El efecto sinérgico también se mostró en modelos de ratones letales (Fig 2 y Fig 3). La patogenicidad de los virus de la gripe en ratones varía y depende de la cepa y su adaptación al huésped. Dependiendo de la dosis y cepa del virus, los virus de la gripe pueden inducir infecciones letales en ciertas cepas En nuestro modelo, los ratones C57Bl/6 son desafiados intranasalmente con una dosis letal del virus respectivo y tratados con diferentes regímenes en comparación con un control del vehículo (placebo). En este modelo, la replicación temprana del virus tiene lugar en el tracto respiratorio superior. A partir de ahí, el virus se disemina al pulmón y causa neumonía letal. El efecto del tratamiento sobre la mortalidad se evalúa en comparación con los ratones de control tratados con placebo. De todas las cepas de gripe in vitro probadas, el H1N1(09)pdm y el LP H7N7 son particularmente interesantes por dos razones. Primero, son patógenos altamente relevantes, como placebo o con las monoterapias consistentes en carrageenan (12 mg/kg BW/día) o Zanamivir (1 y 3 mg/kg BW/día) o una combinación de estos. El tratamiento comenzó 24 hpi (B) Los ratones (n = 20 por grupo) fueron infectados letalmente por vía intranasal sin anestesia en el día 0 y tratados intranasalmente dos veces al día con placebo o una combinación de carragenan con Zanamivir (3 mg/kg de peso corporal/día). El tratamiento comenzó con 48 hpi o 72 hpi y continuó durante 5 días. En el eje y la supervivencia de ratones [%] y en el eje x se da el tiempo posterior a la infección [días]. Los ratones control tratados con Placebo mostraron una supervivencia del 100% en ambos experimentos (datos no mostrados).Los análisis estadísticos se realizaron mediante pruebas de rango logarítmico y se muestran debajo de los gráficos. Los valores de p<0,05 se consideraron estadísticamente significativos; no significancia (n.s.) se obtuvieron con valores p >0,05. El H1N1(09)pdm está asociado con más de 18.400 muertes en la temporada 2009/2010, mientras que el LP H7N7 lleva un HA estrechamente relacionado con el virus de la gripe aviar H7N9 que ha causado más de 175 muertes hasta octubre de 2014 [64]. En segundo lugar, son de especial interés para el enfoque de combinación carragenano/Zanamivir. Han demostrado ser diferentes en susceptibilidad in vitro a carragenano, Zanamivir (Tabla 1 ) y la combinación de los mismos (Fig 1). Si bien H1N1(09)pdm era altamente sensible a la inhibición por ambas sustancias solo, el H7N7 requería concentraciones mucho más altas de carrageneno y Zanamivir, respectivamente, para lograr eficiencias de inhibición similares. Se establecieron modelos de ratón letales con ambos virus que resultaron en 6,8 y 8,5 días medios de supervivencia para LP H7N7 y H1N1(09)pdm, respectivamente. Estos resultados están en buena consonancia con modelos similares de gripe letal ya publicados [65] [66] [67]. En nuestros modelos se encontró que la dosis efectiva más baja para Zanamivir en un inicio de tratamiento 24 hpi fue entre 1 a 3 mg/kg BW/día para ambos virus. Este rango de concentración es relativamente alto en comparación con otros estudios publicados. Sin embargo, estos estudios se realizaron bajo anestesia con diferentes virus y una terapia profiláctica comienza [65, 66]. El hecho de que se necesite una dosis más alta de NI para un tratamiento efectivo cuando se inicia la terapia 24 hpi ya se conoce para Oseltamivir [68]. Sin embargo, también se publicaron datos con concentraciones efectivas mucho más altas (10 mg/kg BW/día [69] ) y con concentraciones similares de Zanamivir (2,5 mg/kg BW/día [67] ). Encontramos que la combinación de carragenano con 3 mg/kg BW/día Zanamivir utilizado para el tratamiento de ratones infectados con H7N7 resultó en una supervivencia significativamente mejorada de ratones en comparación con las dos monoterapias (fig 2). La supervivencia significativamente mejorada en comparación con el grupo tratado con placebo también se encontró después de un inicio de tratamiento tardío 48 hpi. Además, en el modelo H1N1(09)pdm la combinación de carragenano con 1 mg/kg BW/día Zanamivir mostró una supervivencia estadísticamente significativa en comparación con el tratamiento con placebo incluso después de un inicio de tratamiento 72 hpi. Este es un hallazgo notable ya que Como el régimen de tratamiento intranasal es incapaz de tratar eficazmente las infecciones virales pulmonares, el objetivo principal de este producto es la profilaxis y el tratamiento de la gripe no complicada. Dado que la mayoría de las infecciones por gripe causan enfermedades no complicadas y prácticamente todos los casos de gripe comienzan con una infección de la cavidad nasal o del tracto respiratorio superior, el potencial terapéutico es enorme. Sin embargo, se requieren estudios clínicos para dilucidar y demostrar el potencial de la terapia combinada propuesta. La combinación de estrategias antivirales ha dado lugar a logros impresionantes en la lucha contra otras enfermedades virales como el VIH. En particular, el problema de la resistencia antiviral podría abordarse con esta estrategia. En la última década se han planteado preocupaciones sobre la creciente aparición de virus de la gripe resistente a Oseltamivir. La aparición aumentada de virus portadores de la mutación H275Y en la neuraminidasa de virus H1N1(09)pdm que confiere resistencia a Oseltamivir dejó Zanamivir como única opción de tratamiento para pacientes sintomáticos infectados con una cepa de gripe resistente a Oseltamivir [70]. A diferencia de Oseltamivir, la resistencia a Zanamivir es menos frecuente. Hasta la fecha, la gripe resistente a Zanamivir se ha detectado sólo una vez, en un paciente inmunocomprometido [71, 72]. Sin embargo, se deben aprender lecciones de intervenciones previas contra la gripe que dieron lugar a la aparición de resistencia contra fármacos actualmente aprobados [73]. Por lo tanto, es comprensible que el aumento del uso de Zanamivir también pueda conducir a la aparición rápida de resistencias [74]. Para superar esta amenaza, una combinación de antivira Comprobamos la posibilidad de generar virus mutantes de escape de doble compuesto al pasar virus en presencia de concentraciones crecientes de combinaciones de compuestos. Después de 10 pasajes en células MDCK no se pudo encontrar resistencia a la combinación de compuestos para cualquier virus de gripe probado (datos no mostrados). Sin embargo, este hallazgo no garantiza que la aparición de mutantes de escape de Zanamivir pueda detenerse completamente. En resumen, demostramos que los mecanismos anti-influenza de ambos compuestos individuales se complementan entre sí. La combinación proporciona una mejor protección sinérgica contra un espectro más amplio de virus de gripe que los compuestos individuales. Un aerosol nasal que contiene carragenano junto con Zanamivir proporciona un tratamiento fácil de aplicar de infecciones del tracto respiratorio superior en pacientes sospechosos de estar infectados por gripe. Los pacientes se beneficiarían del tratamiento rápido y eficiente de la gripe no complicada en el tracto respiratorio superior. Debido al aclaramiento más rápido del virus de la gripe en el tracto respiratorio superior y al mecanismo antiviral independiente de carragenan y Zanamivir, se reducirá la probabilidad de desarrollar mutaciones de escape contra Zanamivir. Ambos compuestos individuales son capaces de reducir la gravedad y/o la duración de la enfermedad de la gripe y se espera que una combinación funcione de manera similar. Además, debido a la amplia eficacia antiviral de carragenan, los pacientes recibirán en paralelo un tratamiento de infecciones virales concomitantes. Por lo tanto, los pacientes se beneficiarán de una menor probabilidad de desarrollar complicaciones. Teniendo en cuenta las complicaciones conocidas que acompañan una enfermedad del virus de la gripe, esta terapia combinada satisface una necesidad médica urgente. Un segundo ámbito de esta combinación es la protección contra virus pandémicos recién emergentes durante el tiempo hasta la identificación del virus seguido por la fabricación y distribución de vacunas [43]. Incluso si, debido a las nuevas técnicas genéticas inversas, se necesita menos tiempo para la producción de vacunas, todavía toma meses antes de que grandes cantidades de vacunas estén disponibles [75]. Durante este tiempo la población humana debe estar protegida para desacelerar la propagación viral. En este momento las únicas oportunidades disponibles para la protección personal son las medidas de higiene y el uso de Tamiflu (nombre comercial de Oseltamivir). Se necesitan desesperadamente nuevas opciones de protección y tratamiento para la gripe. Basado en nuestros resultados alentadores en ratones, sugerimos probar un aerosol nasal que contenga carragenan en combinación con el inhibidor de la neuraminidasa Zanamivir en ensayos clínicos para la prevención o el tratamiento de infecciones de gripe no complicadas. Los ratones (n = 20 por grupo) fueron infectados letalmente por vía intranasal sin anestesia en el día 0 y, por lo tanto, fueron tratados intranasalmente dos veces al día con placebo o con iota-carragenano o con una mezcla de iota-y kappa-carragenano. El tratamiento comenzó 24 hpi y continuó durante 5 días. En el eje Y la supervivencia de ratones [%] y en el eje X se da el tiempo post infección [días]. Los ratones de control tratados con Placebo, no infectados, mostraron una supervivencia del 100% (datos no mostrados). Los análisis estadísticos se realizaron utilizando la prueba de rango logarítmico y se muestran debajo de los gráficos. Los valores de p<0,05 se consideraron estadísticamente significativos; no significancia (n.s.) se obtuvieron con valores p >0,05. (TIFF)

¿Cuántos casos humanos había de gripe un subtipo de virus h7n9?

Etiología de enfermedades similares a la gripe de los profesionales de la red centinela en la isla de Reunión, 2011-2012https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5031398/SHA: f5ff89ebfdd0375d0334c112c6c1c7e163fa69a0cAutores: Brottet, Elise; Jaffar-Bandjee, Marie-Christine; Li-Pat-Yuen, Ghislaine; Filleul, LaurentFecha: 2016-09-21DOI: 10.1371/journal.pone.0163377Licencia: cc-byAbstract: In Réunion Island, a pesar de una vigilancia de gripe establecida desde 1996 por la red de médicos generales centinelas, poco se conoce sobre la e Se estableció un estudio retrospectivo con hisopos nasales recolectados por GP centinelas de pacientes con ILI en 2011 y 2012. Se seleccionaron y analizaron al azar 250 hisopos mediante reacción en cadena multiplex transcriptasa inversa polimerasa (RT-PCR), incluyendo investigación de 18 virus y 4 bacterias. Se detectaron virus respiratorios en 169/222 (76,1%) muestras, principalmente rinovirus (23,4%), virus influenza A (21,2%), virus influenza B (12,6%), coronavirus (4,9%) y metapneumovirus humano (3,6%). Nueve hisopos (5,3% de los hisopos positivos) revelaron coinfecciones con dos virus identificados, entre los cuales seis se referían a coinfecciones con virus influenza. Observamos importantes diferencias estacionales, con circulación de Metapneumovirus humano, RSV A y B y coronavirus sólo durante el verano; mientras que En conclusión, este estudio destaca una circulación sustancial de múltiples patógenos respiratorios en Isla Reunión a lo largo del año. Muestra que ILI no sólo son atribuibles a la gripe y subraya la necesidad de vigilancia biológica. Como el uso de multiplex RT-PCR demostró su eficacia, ahora se utiliza de forma rutinaria en la vigilancia de ILI. Texto: La enfermedad similar a la gripe (ILI) o infecciones respiratorias agudas pueden ser causadas por varios tipos de virus respiratorios o bacterias en humanos [1]. Virus de gripe, virus respiratorios sincitiales (RSV) y virus parainfluenza se identifican como virus principales responsables principalmente de ILI y neumonía en varios estudios [2]. Sin embargo, los profesionales no pueden diagnosticar la infección sin una confirmación biológica de la prueba. Desafortunadamente, estas causas de infecciones se identifican en menos del 50% [3]. La isla de Reunión, un territorio francés de ultramar con 850.000 habitantes, se encuentra en el hemisferio sur entre Madagascar y Mauricio en el Océano Índico (Latitud: 21°05.2920 S Longitud: 55°36.4380 E.). La isla se beneficia de un sistema sanitario similar al de Francia continental y la vigilancia epidemiológica ha sido desarrollada por la oficina regional del Instituto Francés de Vigilancia de la Salud Pública (CIRE OI), basado en el sistema de vigilancia de Francia continental [4]. La actividad de la gripe aumenta generalmente durante el invierno austral, correspondiente al verano en Europa [5]. Desde 2011, la campaña de vacunación contra la gripe en la isla de Reunión comienza en abril y la vacuna utilizada corresponde a las recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud para el hemisferio sur. Desde 1996, la vigilancia clínica y biológica de la gripe se basa en una red de médicos centinelas [6]. Los hisopos nasales son recolectados al azar durante todo el año y son probados por RT-PCR para virus de la gripe. Entre estas muestras de vigilancia, 40 a 50% son testados positivos para virus influenza A, A(H1N1)pdm09 o virus B por el laboratorio virológico del Hospital Universitario Centro de Reunión. Así, las muestras ILI testadas negativas para influenza son de etiología desconocida. Varias herramientas biológicas permiten identificar patógenos respiratorios a partir de hisopos nasales. En los últimos años, se ha desarrollado la reacción en cadena multiplex transcriptasa inversa polimerasa (RT-PCR) para identificar varios virus simultáneamente [7] [8] [9] [10]. Por lo tanto, utilizamos este nuevo método para establecer un estudio retrospectivo utilizando hisopos recolectados por los GP centineles de 2011 a 2012. El principal objetivo de nuestro estudio fue caracterizar patógenos respiratorios responsables de consultas Los objetivos secundarios fueron resaltar las tendencias estacionales en la circulación de patógenos respiratorios y describir la ocurrencia de coinfecciones, especialmente durante la temporada de gripe. Se definió como un inicio súbito de fiebre de más de 38 grados Celsius y tos, asociada o no con otros síntomas como dificultad respiratoria, dolor de cabeza, etc. Cada semana, se animó a todos los médicos de cabecera de la red centinela a recoger un hisopo nasal de los dos primeros pacientes que presentaron ILI desde menos de tres días. Después de ser probados para virus de gripe, los 994 hisopos recogidos en 2011 y 2012 se congelaron a -80°C en el laboratorio del centro hospitalario universitario (CHU). Con base en el presupuesto, se seleccionó aleatoriamente una muestra estratificada por temporada de 250 hisopos para describir virus circulantes incluyendo la temporada de gripe. Se realizó muestreo aleatorio con Excel 1 utilizando la base de datos de El cuadro de muestreo contenía el número de identificación del hisopo asignado por Cire OI, número de identificación de laboratorio, sexo, edad, fecha de inicio de los síntomas, fecha de recogida del hisopo y resultado de la influenza RT-PCR. Utilizamos Respifinder 1 Smart 22 kits un RT-PCR multiplex (PathoFinder, Maastricht, Países Bajos) que puede detectar 22 patógenos respiratorios. Este ensayo se basa en la tecnología de amplificación de la sonda dependiente de la ligadura múltiple (MLPA). Los pasos de transcripción inversa y preamplificación se realizaron en el Mastercycler epgradiente 1 (Eppendorf) y los pasos de hibridación, ligadura y detección en el sistema LightCycler 1 480 (Roche Applied Science). Este método fue elegido por su alta especificidad, en comparación con otros mismos métodos (78% frente a 33%) De este modo, permite destacar la posible presencia de dieciocho virus respiratorios y cuatro bacterias en una sola reacción mediante el análisis de la curva de fusión: Influenza A not (H1N1 Se realizaron análisis estadísticos con Stata 1 y Excel 1. Se definieron dos estaciones para identificar posibles tendencias estacionales en la circulación de los virus: temporada de invierno durante las semanas 23 a 39 entre junio y septiembre y temporada de verano durante el resto del año. Datos y hisopos resultan de un sistema de vigilancia que recibió aprobaciones reglamentarias, incluida la aprobación de la CNIL (Comisión Nacional de Tecnología de la Información y Libertades Civiles No 1592205) en julio de 2012. Todos los pacientes han recibido información oral y han dado su consentimiento para la recolección de hisopos y datos. Los datos fueron recolectados con fines de vigilancia y son totalmente anónimos. De acuerdo con la sensibilidad del ensayo dos muestras podrían ser resultados discordantes entre Influenza PCR inicialmente realizado y Multiplex PCR. Así fueron eliminadas del análisis: una es positiva para Influenza en un soloplex y negativa para todos los patógenos probados en multiplex y otra es positiva para Influenza en un soloplex y positiva para PIV2 en multiplex. En total, se consideraron 222 análisis. Además, 53 muestras fueron negativas para todos los patógenos respiratorios analizados (23,9%) y 169 muestras tenían al menos un patógeno detectado (76,1%), finalmente se identificó un total de 178 patógenos. Durante el período de estudio, una minoría de las semanas (21, es decir, 20%) no incluyó ninguna muestra, principalmente fuera de la estación de la gripe. La relación entre el sexo y el paciente fue 0,63 (86 hombres y 136 mujeres) y la edad media fue 28,4 años [min 0; El 10% tenían menos de 5 años, el 24% 5-15 años, el 63% 15-65 años y sólo el 3% eran mayores de 65 años. Los patógenos respiratorios identificados con mayor frecuencia en los hisopos ILI fueron rinovirus (23,4%), influenza A no H1N1 (21,2%) y gripe B (12,6%). Entre los 22 patógenos respiratorios probados por el multiplex, sólo tres no se encontraron en ninguna muestra analizada: Parainfluenza3, Legionella pneumophila y Bordetella pertussis. En cuanto a las coinfecciones, nueve hisopos revelaron la presencia de dos virus, entre los cuales6 involucraban virus de gripe (tabla 2). Los análisis mostraron que algunos virus son posiblemente estacionales y circulaban durante un período específico del año. Para este último, es específico del período estudiado desde que el virus influenza A(H1N1)pdm09 reapareció en la Isla Reunión en octubre de 2012 y ya no circulaba desde finales de 2010. Por el contrario, se identificaron parainfluenza 1,2 y 4 virus sólo en invierno. Para otros patógenos, no se observó ningún período específico de detección. Se realizó una descripción semanal de muestras para estudiar la distribución de patógenos respiratorios en 2011 y 2012 (Fig 1). Los resultados de los análisis biológicos se compararon con los datos de las consultas ILI declaradas por los GP centinelas en 2011 y 2012. Se observó en 2011, después de una primera ola en junio principalmente debido al virus influenza A no H1N1, una segunda ola de consultas ILI con identificación principalmente de virus de parainfluenza y no virus de gripe. En 2012, la segunda ola epidémica al final del invierno austral coincidió con En cuanto a los hisopos negativos (Fig 2), no se observó estacionalidad durante el periodo de estudio con una proporción similar sea cual sea la temporada. Este estudio retrospectivo basado en una red de GP centinelas mostró que no sólo los virus de la gripe son responsables de las consultas ILI. De hecho, se observó una importante circulación de múltiples patógenos a lo largo del año, con 12 tipos diferentes de patógenos identificados en 2011 y 2012. Los patógenos virales respiratorios estuvieron presentes en 76,1% de las muestras, lo que es ampliamente superior a los resultados de la vigilancia anual de la gripe [12]. Después de los virus de la gripe, Rhinovirus y Coronavirus fueron los virus respiratorios más comunes en Isla Reunión. Aunque no se tomaron muestras cada semana, la muestra fue representativa de la actividad ILI y consistente con la temporada de gripe. Sin embargo, según el bajo número de muestras, es difícil concluir acerca de la esta Este estudio también destacó varias coinfecciones, mostrando que concomitantemente la etiología múltiple de la ILI. La cocirculación ya se observó en Isla Reunión durante la pandemia de A(H1N1) pdm09, además del virus influenza, con la identificación de otros virus respiratorios como Rhinovirus o Coronavirus [14]. En Francia continental, durante esta pandemia, se encontró la circulación de virus respiratorios mayores, como Rhinovirus, Parainfluenza, Coronavirus, Metaneumovirus Humano, como en nuestra publicación [15] [16]. En nuestro estudio, sólo el 5,3% de los hisopos positivos fueron coinfecciones, mientras que en dos estudios en Madagascar las coinfecciones representaron 27,3% y 29,4% [17] [18]. A pesar de la distancia de 9.300 km entre la Reunión y Francia, la isla está directamente conectada a Europa con cuatro vuelos diarios a Francia. Estos intercambios pueden afectar a la circulación de patógenos respiratorios en el hemisferio sur y norte, por lo que los resultados de este estudio pueden ser de interés tanto para los países del Océano Índico como para Europa. Entre los 148 hisopos inicialmente negativos para la gripe, ya que no fueron previamente probados para otros virus, el estudio encontró una etiología para 95 hisopos. En total, sólo 53 hisopos, que representan el 24% de la muestra, permanecieron sin etiología con resultados negativos multiplex PCR a lo largo del año. Múltiples hipótesis pueden explicar este resultado: una mala calidad de los hisopos, impidiendo identificar un patógeno, causas no infecciosas u otros patógenos no incluidos en el multiplex PCR. Sin embargo, no pudimos probar los hisopos negativos para ARNse P, un marcador de células humanas, que podría proporcionar un mínimo de seguridad de que el hisopo contenía células humanas. En cuanto a las dos muestras divergentes para la identificación de influenza entre el multiplex y el PCR de un soloplex, las descartamos para el análisis; una fue positiva en Influenza con un soloplex y positiva en PIV con multiplex. Podría ser un resultado falso positivo de un soloplex. De hecho, como el ensayo multiplex de PCR tiene una buena sensibilidad y se considera un estándar dorado, decidimos mantener siete resultados negativos para Influenza en un soloplex y positivo en Influenza en multiplex [7] [8] [9] [10]. No hay ningún caso de pertussis de Bordetella que cause tos ferina y Legionella pneumophila que cause la enfermedad de Legionaires fue identificada en este estudio. Sin embargo, estas enfermedades son raras en Isla Reunión, alrededor de tres casos de enfermedad de Legionaires se declaran cada año. Un límite del estudio es que no se Fue imposible comparar los síntomas clínicos según cada patógeno y saber si existen diferentes patógenos que causen, por ejemplo, rinitis, laringitis o bronquitis (enfermedades incluidas en el ILI). Un estudio prospectivo específico que incluya datos clínicos podría proporcionar elementos útiles en la semiótica de las enfermedades. En conclusión, este estudio destacó una importante circulación de múltiples patógenos en Isla Reunión durante todo el año. Muestra que el ILI no es específico de la gripe y por lo tanto es esencial tener resultados biológicos para establecer el diagnóstico diferencial y así explicar la etiología de los síntomas. Para una mejor comprensión de los patógenos respiratorios que circulan en Isla Reunión, la información de este estudio también puede ser útil para los profesionales que ven a muchos pacientes en consulta con el ILI. Como el uso de multiplex RT-PCR demostró su eficacia en la vigilancia de la ILI y permitió resaltar la circulación de otros virus y causas bacterianas de infecciones respiratorias, ahora se utiliza de forma rutinaria en la vigilancia de la ILI. Además, sería interesante repetir este estudio cada 3 o 5 años añadiendo datos clínicos para monitorear la evolución de los patógenos respiratorios en la Isla Reunión a lo largo del tiempo.

¿Cuántos hisopos fueron seleccionados y analizados al azar?

Etiología de enfermedades similares a la gripe de los profesionales de la red centinela en la isla de Reunión, 2011-2012https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5031398/SHA: f5ff89ebfdd0375d0334c112c6c1c7e163fa69a0cAutores: Brottet, Elise; Jaffar-Bandjee, Marie-Christine; Li-Pat-Yuen, Ghislaine; Filleul, LaurentFecha: 2016-09-21DOI: 10.1371/journal.pone.0163377Licencia: cc-byAbstract: In Réunion Island, a pesar de una vigilancia de gripe establecida desde 1996 por la red de médicos generales centinelas, poco se conoce sobre la e Se estableció un estudio retrospectivo con hisopos nasales recolectados por GP centinelas de pacientes con ILI en 2011 y 2012. Se seleccionaron y analizaron al azar 250 hisopos mediante reacción en cadena multiplex transcriptasa inversa polimerasa (RT-PCR), incluyendo investigación de 18 virus y 4 bacterias. Se detectaron virus respiratorios en 169/222 (76,1%) muestras, principalmente rinovirus (23,4%), virus influenza A (21,2%), virus influenza B (12,6%), coronavirus (4,9%) y metapneumovirus humano (3,6%). Nueve hisopos (5,3% de los hisopos positivos) revelaron coinfecciones con dos virus identificados, entre los cuales seis se referían a coinfecciones con virus influenza. Observamos importantes diferencias estacionales, con circulación de Metapneumovirus humano, RSV A y B y coronavirus sólo durante el verano; mientras que En conclusión, este estudio destaca una circulación sustancial de múltiples patógenos respiratorios en Isla Reunión a lo largo del año. Muestra que ILI no sólo son atribuibles a la gripe y subraya la necesidad de vigilancia biológica. Como el uso de multiplex RT-PCR demostró su eficacia, ahora se utiliza de forma rutinaria en la vigilancia de ILI. Texto: La enfermedad similar a la gripe (ILI) o infecciones respiratorias agudas pueden ser causadas por varios tipos de virus respiratorios o bacterias en humanos [1]. Virus de gripe, virus respiratorios sincitiales (RSV) y virus parainfluenza se identifican como virus principales responsables principalmente de ILI y neumonía en varios estudios [2]. Sin embargo, los profesionales no pueden diagnosticar la infección sin una confirmación biológica de la prueba. Desafortunadamente, estas causas de infecciones se identifican en menos del 50% [3]. La isla de Reunión, un territorio francés de ultramar con 850.000 habitantes, se encuentra en el hemisferio sur entre Madagascar y Mauricio en el Océano Índico (Latitud: 21°05.2920 S Longitud: 55°36.4380 E.). La isla se beneficia de un sistema sanitario similar al de Francia continental y la vigilancia epidemiológica ha sido desarrollada por la oficina regional del Instituto Francés de Vigilancia de la Salud Pública (CIRE OI), basado en el sistema de vigilancia de Francia continental [4]. La actividad de la gripe aumenta generalmente durante el invierno austral, correspondiente al verano en Europa [5]. Desde 2011, la campaña de vacunación contra la gripe en la isla de Reunión comienza en abril y la vacuna utilizada corresponde a las recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud para el hemisferio sur. Desde 1996, la vigilancia clínica y biológica de la gripe se basa en una red de médicos centinelas [6]. Los hisopos nasales son recolectados al azar durante todo el año y son probados por RT-PCR para virus de la gripe. Entre estas muestras de vigilancia, 40 a 50% son testados positivos para virus influenza A, A(H1N1)pdm09 o virus B por el laboratorio virológico del Hospital Universitario Centro de Reunión. Así, las muestras ILI testadas negativas para influenza son de etiología desconocida. Varias herramientas biológicas permiten identificar patógenos respiratorios a partir de hisopos nasales. En los últimos años, se ha desarrollado la reacción en cadena multiplex transcriptasa inversa polimerasa (RT-PCR) para identificar varios virus simultáneamente [7] [8] [9] [10]. Por lo tanto, utilizamos este nuevo método para establecer un estudio retrospectivo utilizando hisopos recolectados por los GP centineles de 2011 a 2012. El principal objetivo de nuestro estudio fue caracterizar patógenos respiratorios responsables de consultas Los objetivos secundarios fueron resaltar las tendencias estacionales en la circulación de patógenos respiratorios y describir la ocurrencia de coinfecciones, especialmente durante la temporada de gripe. Se definió como un inicio súbito de fiebre de más de 38 grados Celsius y tos, asociada o no con otros síntomas como dificultad respiratoria, dolor de cabeza, etc. Cada semana, se animó a todos los médicos de cabecera de la red centinela a recoger un hisopo nasal de los dos primeros pacientes que presentaron ILI desde menos de tres días. Después de ser probados para virus de gripe, los 994 hisopos recogidos en 2011 y 2012 se congelaron a -80°C en el laboratorio del centro hospitalario universitario (CHU). Con base en el presupuesto, se seleccionó aleatoriamente una muestra estratificada por temporada de 250 hisopos para describir virus circulantes incluyendo la temporada de gripe. Se realizó muestreo aleatorio con Excel 1 utilizando la base de datos de El cuadro de muestreo contenía el número de identificación del hisopo asignado por Cire OI, número de identificación de laboratorio, sexo, edad, fecha de inicio de los síntomas, fecha de recogida del hisopo y resultado de la influenza RT-PCR. Utilizamos Respifinder 1 Smart 22 kits un RT-PCR multiplex (PathoFinder, Maastricht, Países Bajos) que puede detectar 22 patógenos respiratorios. Este ensayo se basa en la tecnología de amplificación de la sonda dependiente de la ligadura múltiple (MLPA). Los pasos de transcripción inversa y preamplificación se realizaron en el Mastercycler epgradiente 1 (Eppendorf) y los pasos de hibridación, ligadura y detección en el sistema LightCycler 1 480 (Roche Applied Science). Este método fue elegido por su alta especificidad, en comparación con otros mismos métodos (78% frente a 33%) De este modo, permite destacar la posible presencia de dieciocho virus respiratorios y cuatro bacterias en una sola reacción mediante el análisis de la curva de fusión: Influenza A not (H1N1 Se realizaron análisis estadísticos con Stata 1 y Excel 1. Se definieron dos estaciones para identificar posibles tendencias estacionales en la circulación de los virus: temporada de invierno durante las semanas 23 a 39 entre junio y septiembre y temporada de verano durante el resto del año. Datos y hisopos resultan de un sistema de vigilancia que recibió aprobaciones reglamentarias, incluida la aprobación de la CNIL (Comisión Nacional de Tecnología de la Información y Libertades Civiles No 1592205) en julio de 2012. Todos los pacientes han recibido información oral y han dado su consentimiento para la recolección de hisopos y datos. Los datos fueron recolectados con fines de vigilancia y son totalmente anónimos. De acuerdo con la sensibilidad del ensayo dos muestras podrían ser resultados discordantes entre Influenza PCR inicialmente realizado y Multiplex PCR. Así fueron eliminadas del análisis: una es positiva para Influenza en un soloplex y negativa para todos los patógenos probados en multiplex y otra es positiva para Influenza en un soloplex y positiva para PIV2 en multiplex. En total, se consideraron 222 análisis. Además, 53 muestras fueron negativas para todos los patógenos respiratorios analizados (23,9%) y 169 muestras tenían al menos un patógeno detectado (76,1%), finalmente se identificó un total de 178 patógenos. Durante el período de estudio, una minoría de las semanas (21, es decir, 20%) no incluyó ninguna muestra, principalmente fuera de la estación de la gripe. La relación entre el sexo y el paciente fue 0,63 (86 hombres y 136 mujeres) y la edad media fue 28,4 años [min 0; El 10% tenían menos de 5 años, el 24% 5-15 años, el 63% 15-65 años y sólo el 3% eran mayores de 65 años. Los patógenos respiratorios identificados con mayor frecuencia en los hisopos ILI fueron rinovirus (23,4%), influenza A no H1N1 (21,2%) y gripe B (12,6%). Entre los 22 patógenos respiratorios probados por el multiplex, sólo tres no se encontraron en ninguna muestra analizada: Parainfluenza3, Legionella pneumophila y Bordetella pertussis. En cuanto a las coinfecciones, nueve hisopos revelaron la presencia de dos virus, entre los cuales6 involucraban virus de gripe (tabla 2). Los análisis mostraron que algunos virus son posiblemente estacionales y circulaban durante un período específico del año. Para este último, es específico del período estudiado desde que el virus influenza A(H1N1)pdm09 reapareció en la Isla Reunión en octubre de 2012 y ya no circulaba desde finales de 2010. Por el contrario, se identificaron parainfluenza 1,2 y 4 virus sólo en invierno. Para otros patógenos, no se observó ningún período específico de detección. Se realizó una descripción semanal de muestras para estudiar la distribución de patógenos respiratorios en 2011 y 2012 (Fig 1). Los resultados de los análisis biológicos se compararon con los datos de las consultas ILI declaradas por los GP centinelas en 2011 y 2012. Se observó en 2011, después de una primera ola en junio principalmente debido al virus influenza A no H1N1, una segunda ola de consultas ILI con identificación principalmente de virus de parainfluenza y no virus de gripe. En 2012, la segunda ola epidémica al final del invierno austral coincidió con En cuanto a los hisopos negativos (Fig 2), no se observó estacionalidad durante el periodo de estudio con una proporción similar sea cual sea la temporada. Este estudio retrospectivo basado en una red de GP centinelas mostró que no sólo los virus de la gripe son responsables de las consultas ILI. De hecho, se observó una importante circulación de múltiples patógenos a lo largo del año, con 12 tipos diferentes de patógenos identificados en 2011 y 2012. Los patógenos virales respiratorios estuvieron presentes en 76,1% de las muestras, lo que es ampliamente superior a los resultados de la vigilancia anual de la gripe [12]. Después de los virus de la gripe, Rhinovirus y Coronavirus fueron los virus respiratorios más comunes en Isla Reunión. Aunque no se tomaron muestras cada semana, la muestra fue representativa de la actividad ILI y consistente con la temporada de gripe. Sin embargo, según el bajo número de muestras, es difícil concluir acerca de la esta Este estudio también destacó varias coinfecciones, mostrando que concomitantemente la etiología múltiple de la ILI. La cocirculación ya se observó en Isla Reunión durante la pandemia de A(H1N1) pdm09, además del virus influenza, con la identificación de otros virus respiratorios como Rhinovirus o Coronavirus [14]. En Francia continental, durante esta pandemia, se encontró la circulación de virus respiratorios mayores, como Rhinovirus, Parainfluenza, Coronavirus, Metaneumovirus Humano, como en nuestra publicación [15] [16]. En nuestro estudio, sólo el 5,3% de los hisopos positivos fueron coinfecciones, mientras que en dos estudios en Madagascar las coinfecciones representaron 27,3% y 29,4% [17] [18]. A pesar de la distancia de 9.300 km entre la Reunión y Francia, la isla está directamente conectada a Europa con cuatro vuelos diarios a Francia. Estos intercambios pueden afectar a la circulación de patógenos respiratorios en el hemisferio sur y norte, por lo que los resultados de este estudio pueden ser de interés tanto para los países del Océano Índico como para Europa. Entre los 148 hisopos inicialmente negativos para la gripe, ya que no fueron previamente probados para otros virus, el estudio encontró una etiología para 95 hisopos. En total, sólo 53 hisopos, que representan el 24% de la muestra, permanecieron sin etiología con resultados negativos multiplex PCR a lo largo del año. Múltiples hipótesis pueden explicar este resultado: una mala calidad de los hisopos, impidiendo identificar un patógeno, causas no infecciosas u otros patógenos no incluidos en el multiplex PCR. Sin embargo, no pudimos probar los hisopos negativos para ARNse P, un marcador de células humanas, que podría proporcionar un mínimo de seguridad de que el hisopo contenía células humanas. En cuanto a las dos muestras divergentes para la identificación de influenza entre el multiplex y el PCR de un soloplex, las descartamos para el análisis; una fue positiva en Influenza con un soloplex y positiva en PIV con multiplex. Podría ser un resultado falso positivo de un soloplex. De hecho, como el ensayo multiplex de PCR tiene una buena sensibilidad y se considera un estándar dorado, decidimos mantener siete resultados negativos para Influenza en un soloplex y positivo en Influenza en multiplex [7] [8] [9] [10]. No hay ningún caso de pertussis de Bordetella que cause tos ferina y Legionella pneumophila que cause la enfermedad de Legionaires fue identificada en este estudio. Sin embargo, estas enfermedades son raras en Isla Reunión, alrededor de tres casos de enfermedad de Legionaires se declaran cada año. Un límite del estudio es que no se Fue imposible comparar los síntomas clínicos según cada patógeno y saber si existen diferentes patógenos que causen, por ejemplo, rinitis, laringitis o bronquitis (enfermedades incluidas en el ILI). Un estudio prospectivo específico que incluya datos clínicos podría proporcionar elementos útiles en la semiótica de las enfermedades. En conclusión, este estudio destacó una importante circulación de múltiples patógenos en Isla Reunión durante todo el año. Muestra que el ILI no es específico de la gripe y por lo tanto es esencial tener resultados biológicos para establecer el diagnóstico diferencial y así explicar la etiología de los síntomas. Para una mejor comprensión de los patógenos respiratorios que circulan en Isla Reunión, la información de este estudio también puede ser útil para los profesionales que ven a muchos pacientes en consulta con el ILI. Como el uso de multiplex RT-PCR demostró su eficacia en la vigilancia de la ILI y permitió resaltar la circulación de otros virus y causas bacterianas de infecciones respiratorias, ahora se utiliza de forma rutinaria en la vigilancia de la ILI. Además, sería interesante repetir este estudio cada 3 o 5 años añadiendo datos clínicos para monitorear la evolución de los patógenos respiratorios en la Isla Reunión a lo largo del tiempo.

¿Qué virus se detectaron?

Etiología de enfermedades similares a la gripe de los profesionales de la red centinela en la isla de Reunión, 2011-2012https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5031398/SHA: f5ff89ebfdd0375d0334c112c6c1c7e163fa69a0cAutores: Brottet, Elise; Jaffar-Bandjee, Marie-Christine; Li-Pat-Yuen, Ghislaine; Filleul, LaurentFecha: 2016-09-21DOI: 10.1371/journal.pone.0163377Licencia: cc-byAbstract: In Réunion Island, a pesar de una vigilancia de gripe establecida desde 1996 por la red de médicos generales centinelas, poco se conoce sobre la e Se estableció un estudio retrospectivo con hisopos nasales recolectados por GP centinelas de pacientes con ILI en 2011 y 2012. Se seleccionaron y analizaron al azar 250 hisopos mediante reacción en cadena multiplex transcriptasa inversa polimerasa (RT-PCR), incluyendo investigación de 18 virus y 4 bacterias. Se detectaron virus respiratorios en 169/222 (76,1%) muestras, principalmente rinovirus (23,4%), virus influenza A (21,2%), virus influenza B (12,6%), coronavirus (4,9%) y metapneumovirus humano (3,6%). Nueve hisopos (5,3% de los hisopos positivos) revelaron coinfecciones con dos virus identificados, entre los cuales seis se referían a coinfecciones con virus influenza. Observamos importantes diferencias estacionales, con circulación de Metapneumovirus humano, RSV A y B y coronavirus sólo durante el verano; mientras que En conclusión, este estudio destaca una circulación sustancial de múltiples patógenos respiratorios en Isla Reunión a lo largo del año. Muestra que ILI no sólo son atribuibles a la gripe y subraya la necesidad de vigilancia biológica. Como el uso de multiplex RT-PCR demostró su eficacia, ahora se utiliza de forma rutinaria en la vigilancia de ILI. Texto: La enfermedad similar a la gripe (ILI) o infecciones respiratorias agudas pueden ser causadas por varios tipos de virus respiratorios o bacterias en humanos [1]. Virus de gripe, virus respiratorios sincitiales (RSV) y virus parainfluenza se identifican como virus principales responsables principalmente de ILI y neumonía en varios estudios [2]. Sin embargo, los profesionales no pueden diagnosticar la infección sin una confirmación biológica de la prueba. Desafortunadamente, estas causas de infecciones se identifican en menos del 50% [3]. La isla de Reunión, un territorio francés de ultramar con 850.000 habitantes, se encuentra en el hemisferio sur entre Madagascar y Mauricio en el Océano Índico (Latitud: 21°05.2920 S Longitud: 55°36.4380 E.). La isla se beneficia de un sistema sanitario similar al de Francia continental y la vigilancia epidemiológica ha sido desarrollada por la oficina regional del Instituto Francés de Vigilancia de la Salud Pública (CIRE OI), basado en el sistema de vigilancia de Francia continental [4]. La actividad de la gripe aumenta generalmente durante el invierno austral, correspondiente al verano en Europa [5]. Desde 2011, la campaña de vacunación contra la gripe en la isla de Reunión comienza en abril y la vacuna utilizada corresponde a las recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud para el hemisferio sur. Desde 1996, la vigilancia clínica y biológica de la gripe se basa en una red de médicos centinelas [6]. Los hisopos nasales son recolectados al azar durante todo el año y son probados por RT-PCR para virus de la gripe. Entre estas muestras de vigilancia, 40 a 50% son testados positivos para virus influenza A, A(H1N1)pdm09 o virus B por el laboratorio virológico del Hospital Universitario Centro de Reunión. Así, las muestras ILI testadas negativas para influenza son de etiología desconocida. Varias herramientas biológicas permiten identificar patógenos respiratorios a partir de hisopos nasales. En los últimos años, se ha desarrollado la reacción en cadena multiplex transcriptasa inversa polimerasa (RT-PCR) para identificar varios virus simultáneamente [7] [8] [9] [10]. Por lo tanto, utilizamos este nuevo método para establecer un estudio retrospectivo utilizando hisopos recolectados por los GP centineles de 2011 a 2012. El principal objetivo de nuestro estudio fue caracterizar patógenos respiratorios responsables de consultas Los objetivos secundarios fueron resaltar las tendencias estacionales en la circulación de patógenos respiratorios y describir la ocurrencia de coinfecciones, especialmente durante la temporada de gripe. Se definió como un inicio súbito de fiebre de más de 38 grados Celsius y tos, asociada o no con otros síntomas como dificultad respiratoria, dolor de cabeza, etc. Cada semana, se animó a todos los médicos de cabecera de la red centinela a recoger un hisopo nasal de los dos primeros pacientes que presentaron ILI desde menos de tres días. Después de ser probados para virus de gripe, los 994 hisopos recogidos en 2011 y 2012 se congelaron a -80°C en el laboratorio del centro hospitalario universitario (CHU). Con base en el presupuesto, se seleccionó aleatoriamente una muestra estratificada por temporada de 250 hisopos para describir virus circulantes incluyendo la temporada de gripe. Se realizó muestreo aleatorio con Excel 1 utilizando la base de datos de El cuadro de muestreo contenía el número de identificación del hisopo asignado por Cire OI, número de identificación de laboratorio, sexo, edad, fecha de inicio de los síntomas, fecha de recogida del hisopo y resultado de la influenza RT-PCR. Utilizamos Respifinder 1 Smart 22 kits un RT-PCR multiplex (PathoFinder, Maastricht, Países Bajos) que puede detectar 22 patógenos respiratorios. Este ensayo se basa en la tecnología de amplificación de la sonda dependiente de la ligadura múltiple (MLPA). Los pasos de transcripción inversa y preamplificación se realizaron en el Mastercycler epgradiente 1 (Eppendorf) y los pasos de hibridación, ligadura y detección en el sistema LightCycler 1 480 (Roche Applied Science). Este método fue elegido por su alta especificidad, en comparación con otros mismos métodos (78% frente a 33%) De este modo, permite destacar la posible presencia de dieciocho virus respiratorios y cuatro bacterias en una sola reacción mediante el análisis de la curva de fusión: Influenza A not (H1N1 Se realizaron análisis estadísticos con Stata 1 y Excel 1. Se definieron dos estaciones para identificar posibles tendencias estacionales en la circulación de los virus: temporada de invierno durante las semanas 23 a 39 entre junio y septiembre y temporada de verano durante el resto del año. Datos y hisopos resultan de un sistema de vigilancia que recibió aprobaciones reglamentarias, incluida la aprobación de la CNIL (Comisión Nacional de Tecnología de la Información y Libertades Civiles No 1592205) en julio de 2012. Todos los pacientes han recibido información oral y han dado su consentimiento para la recolección de hisopos y datos. Los datos fueron recolectados con fines de vigilancia y son totalmente anónimos. De acuerdo con la sensibilidad del ensayo dos muestras podrían ser resultados discordantes entre Influenza PCR inicialmente realizado y Multiplex PCR. Así fueron eliminadas del análisis: una es positiva para Influenza en un soloplex y negativa para todos los patógenos probados en multiplex y otra es positiva para Influenza en un soloplex y positiva para PIV2 en multiplex. En total, se consideraron 222 análisis. Además, 53 muestras fueron negativas para todos los patógenos respiratorios analizados (23,9%) y 169 muestras tenían al menos un patógeno detectado (76,1%), finalmente se identificó un total de 178 patógenos. Durante el período de estudio, una minoría de las semanas (21, es decir, 20%) no incluyó ninguna muestra, principalmente fuera de la estación de la gripe. La relación entre el sexo y el paciente fue 0,63 (86 hombres y 136 mujeres) y la edad media fue 28,4 años [min 0; El 10% tenían menos de 5 años, el 24% 5-15 años, el 63% 15-65 años y sólo el 3% eran mayores de 65 años. Los patógenos respiratorios identificados con mayor frecuencia en los hisopos ILI fueron rinovirus (23,4%), influenza A no H1N1 (21,2%) y gripe B (12,6%). Entre los 22 patógenos respiratorios probados por el multiplex, sólo tres no se encontraron en ninguna muestra analizada: Parainfluenza3, Legionella pneumophila y Bordetella pertussis. En cuanto a las coinfecciones, nueve hisopos revelaron la presencia de dos virus, entre los cuales6 involucraban virus de gripe (tabla 2). Los análisis mostraron que algunos virus son posiblemente estacionales y circulaban durante un período específico del año. Para este último, es específico del período estudiado desde que el virus influenza A(H1N1)pdm09 reapareció en la Isla Reunión en octubre de 2012 y ya no circulaba desde finales de 2010. Por el contrario, se identificaron parainfluenza 1,2 y 4 virus sólo en invierno. Para otros patógenos, no se observó ningún período específico de detección. Se realizó una descripción semanal de muestras para estudiar la distribución de patógenos respiratorios en 2011 y 2012 (Fig 1). Los resultados de los análisis biológicos se compararon con los datos de las consultas ILI declaradas por los GP centinelas en 2011 y 2012. Se observó en 2011, después de una primera ola en junio principalmente debido al virus influenza A no H1N1, una segunda ola de consultas ILI con identificación principalmente de virus de parainfluenza y no virus de gripe. En 2012, la segunda ola epidémica al final del invierno austral coincidió con En cuanto a los hisopos negativos (Fig 2), no se observó estacionalidad durante el periodo de estudio con una proporción similar sea cual sea la temporada. Este estudio retrospectivo basado en una red de GP centinelas mostró que no sólo los virus de la gripe son responsables de las consultas ILI. De hecho, se observó una importante circulación de múltiples patógenos a lo largo del año, con 12 tipos diferentes de patógenos identificados en 2011 y 2012. Los patógenos virales respiratorios estuvieron presentes en 76,1% de las muestras, lo que es ampliamente superior a los resultados de la vigilancia anual de la gripe [12]. Después de los virus de la gripe, Rhinovirus y Coronavirus fueron los virus respiratorios más comunes en Isla Reunión. Aunque no se tomaron muestras cada semana, la muestra fue representativa de la actividad ILI y consistente con la temporada de gripe. Sin embargo, según el bajo número de muestras, es difícil concluir acerca de la esta Este estudio también destacó varias coinfecciones, mostrando que concomitantemente la etiología múltiple de la ILI. La cocirculación ya se observó en Isla Reunión durante la pandemia de A(H1N1) pdm09, además del virus influenza, con la identificación de otros virus respiratorios como Rhinovirus o Coronavirus [14]. En Francia continental, durante esta pandemia, se encontró la circulación de virus respiratorios mayores, como Rhinovirus, Parainfluenza, Coronavirus, Metaneumovirus Humano, como en nuestra publicación [15] [16]. En nuestro estudio, sólo el 5,3% de los hisopos positivos fueron coinfecciones, mientras que en dos estudios en Madagascar las coinfecciones representaron 27,3% y 29,4% [17] [18]. A pesar de la distancia de 9.300 km entre la Reunión y Francia, la isla está directamente conectada a Europa con cuatro vuelos diarios a Francia. Estos intercambios pueden afectar a la circulación de patógenos respiratorios en el hemisferio sur y norte, por lo que los resultados de este estudio pueden ser de interés tanto para los países del Océano Índico como para Europa. Entre los 148 hisopos inicialmente negativos para la gripe, ya que no fueron previamente probados para otros virus, el estudio encontró una etiología para 95 hisopos. En total, sólo 53 hisopos, que representan el 24% de la muestra, permanecieron sin etiología con resultados negativos multiplex PCR a lo largo del año. Múltiples hipótesis pueden explicar este resultado: una mala calidad de los hisopos, impidiendo identificar un patógeno, causas no infecciosas u otros patógenos no incluidos en el multiplex PCR. Sin embargo, no pudimos probar los hisopos negativos para ARNse P, un marcador de células humanas, que podría proporcionar un mínimo de seguridad de que el hisopo contenía células humanas. En cuanto a las dos muestras divergentes para la identificación de influenza entre el multiplex y el PCR de un soloplex, las descartamos para el análisis; una fue positiva en Influenza con un soloplex y positiva en PIV con multiplex. Podría ser un resultado falso positivo de un soloplex. De hecho, como el ensayo multiplex de PCR tiene una buena sensibilidad y se considera un estándar dorado, decidimos mantener siete resultados negativos para Influenza en un soloplex y positivo en Influenza en multiplex [7] [8] [9] [10]. No hay ningún caso de pertussis de Bordetella que cause tos ferina y Legionella pneumophila que cause la enfermedad de Legionaires fue identificada en este estudio. Sin embargo, estas enfermedades son raras en Isla Reunión, alrededor de tres casos de enfermedad de Legionaires se declaran cada año. Un límite del estudio es que no se Fue imposible comparar los síntomas clínicos según cada patógeno y saber si existen diferentes patógenos que causen, por ejemplo, rinitis, laringitis o bronquitis (enfermedades incluidas en el ILI). Un estudio prospectivo específico que incluya datos clínicos podría proporcionar elementos útiles en la semiótica de las enfermedades. En conclusión, este estudio destacó una importante circulación de múltiples patógenos en Isla Reunión durante todo el año. Muestra que el ILI no es específico de la gripe y por lo tanto es esencial tener resultados biológicos para establecer el diagnóstico diferencial y así explicar la etiología de los síntomas. Para una mejor comprensión de los patógenos respiratorios que circulan en Isla Reunión, la información de este estudio también puede ser útil para los profesionales que ven a muchos pacientes en consulta con el ILI. Como el uso de multiplex RT-PCR demostró su eficacia en la vigilancia de la ILI y permitió resaltar la circulación de otros virus y causas bacterianas de infecciones respiratorias, ahora se utiliza de forma rutinaria en la vigilancia de la ILI. Además, sería interesante repetir este estudio cada 3 o 5 años añadiendo datos clínicos para monitorear la evolución de los patógenos respiratorios en la Isla Reunión a lo largo del tiempo.

¿Qué porcentaje de estas infecciones se identifican?

Etiología de enfermedades similares a la gripe de los profesionales de la red centinela en la isla de Reunión, 2011-2012https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5031398/SHA: f5ff89ebfdd0375d0334c112c6c1c7e163fa69a0cAutores: Brottet, Elise; Jaffar-Bandjee, Marie-Christine; Li-Pat-Yuen, Ghislaine; Filleul, LaurentFecha: 2016-09-21DOI: 10.1371/journal.pone.0163377Licencia: cc-byAbstract: In Réunion Island, a pesar de una vigilancia de gripe establecida desde 1996 por la red de médicos generales centinelas, poco se conoce sobre la e Se estableció un estudio retrospectivo con hisopos nasales recolectados por GP centinelas de pacientes con ILI en 2011 y 2012. Se seleccionaron y analizaron al azar 250 hisopos mediante reacción en cadena multiplex transcriptasa inversa polimerasa (RT-PCR), incluyendo investigación de 18 virus y 4 bacterias. Se detectaron virus respiratorios en 169/222 (76,1%) muestras, principalmente rinovirus (23,4%), virus influenza A (21,2%), virus influenza B (12,6%), coronavirus (4,9%) y metapneumovirus humano (3,6%). Nueve hisopos (5,3% de los hisopos positivos) revelaron coinfecciones con dos virus identificados, entre los cuales seis se referían a coinfecciones con virus influenza. Observamos importantes diferencias estacionales, con circulación de Metapneumovirus humano, RSV A y B y coronavirus sólo durante el verano; mientras que En conclusión, este estudio destaca una circulación sustancial de múltiples patógenos respiratorios en Isla Reunión a lo largo del año. Muestra que ILI no sólo son atribuibles a la gripe y subraya la necesidad de vigilancia biológica. Como el uso de multiplex RT-PCR demostró su eficacia, ahora se utiliza de forma rutinaria en la vigilancia de ILI. Texto: La enfermedad similar a la gripe (ILI) o infecciones respiratorias agudas pueden ser causadas por varios tipos de virus respiratorios o bacterias en humanos [1]. Virus de gripe, virus respiratorios sincitiales (RSV) y virus parainfluenza se identifican como virus principales responsables principalmente de ILI y neumonía en varios estudios [2]. Sin embargo, los profesionales no pueden diagnosticar la infección sin una confirmación biológica de la prueba. Desafortunadamente, estas causas de infecciones se identifican en menos del 50% [3]. La isla de Reunión, un territorio francés de ultramar con 850.000 habitantes, se encuentra en el hemisferio sur entre Madagascar y Mauricio en el Océano Índico (Latitud: 21°05.2920 S Longitud: 55°36.4380 E.). La isla se beneficia de un sistema sanitario similar al de Francia continental y la vigilancia epidemiológica ha sido desarrollada por la oficina regional del Instituto Francés de Vigilancia de la Salud Pública (CIRE OI), basado en el sistema de vigilancia de Francia continental [4]. La actividad de la gripe aumenta generalmente durante el invierno austral, correspondiente al verano en Europa [5]. Desde 2011, la campaña de vacunación contra la gripe en la isla de Reunión comienza en abril y la vacuna utilizada corresponde a las recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud para el hemisferio sur. Desde 1996, la vigilancia clínica y biológica de la gripe se basa en una red de médicos centinelas [6]. Los hisopos nasales son recolectados al azar durante todo el año y son probados por RT-PCR para virus de la gripe. Entre estas muestras de vigilancia, 40 a 50% son testados positivos para virus influenza A, A(H1N1)pdm09 o virus B por el laboratorio virológico del Hospital Universitario Centro de Reunión. Así, las muestras ILI testadas negativas para influenza son de etiología desconocida. Varias herramientas biológicas permiten identificar patógenos respiratorios a partir de hisopos nasales. En los últimos años, se ha desarrollado la reacción en cadena multiplex transcriptasa inversa polimerasa (RT-PCR) para identificar varios virus simultáneamente [7] [8] [9] [10]. Por lo tanto, utilizamos este nuevo método para establecer un estudio retrospectivo utilizando hisopos recolectados por los GP centineles de 2011 a 2012. El principal objetivo de nuestro estudio fue caracterizar patógenos respiratorios responsables de consultas Los objetivos secundarios fueron resaltar las tendencias estacionales en la circulación de patógenos respiratorios y describir la ocurrencia de coinfecciones, especialmente durante la temporada de gripe. Se definió como un inicio súbito de fiebre de más de 38 grados Celsius y tos, asociada o no con otros síntomas como dificultad respiratoria, dolor de cabeza, etc. Cada semana, se animó a todos los médicos de cabecera de la red centinela a recoger un hisopo nasal de los dos primeros pacientes que presentaron ILI desde menos de tres días. Después de ser probados para virus de gripe, los 994 hisopos recogidos en 2011 y 2012 se congelaron a -80°C en el laboratorio del centro hospitalario universitario (CHU). Con base en el presupuesto, se seleccionó aleatoriamente una muestra estratificada por temporada de 250 hisopos para describir virus circulantes incluyendo la temporada de gripe. Se realizó muestreo aleatorio con Excel 1 utilizando la base de datos de El cuadro de muestreo contenía el número de identificación del hisopo asignado por Cire OI, número de identificación de laboratorio, sexo, edad, fecha de inicio de los síntomas, fecha de recogida del hisopo y resultado de la influenza RT-PCR. Utilizamos Respifinder 1 Smart 22 kits un RT-PCR multiplex (PathoFinder, Maastricht, Países Bajos) que puede detectar 22 patógenos respiratorios. Este ensayo se basa en la tecnología de amplificación de la sonda dependiente de la ligadura múltiple (MLPA). Los pasos de transcripción inversa y preamplificación se realizaron en el Mastercycler epgradiente 1 (Eppendorf) y los pasos de hibridación, ligadura y detección en el sistema LightCycler 1 480 (Roche Applied Science). Este método fue elegido por su alta especificidad, en comparación con otros mismos métodos (78% frente a 33%) De este modo, permite destacar la posible presencia de dieciocho virus respiratorios y cuatro bacterias en una sola reacción mediante el análisis de la curva de fusión: Influenza A not (H1N1 Se realizaron análisis estadísticos con Stata 1 y Excel 1. Se definieron dos estaciones para identificar posibles tendencias estacionales en la circulación de los virus: temporada de invierno durante las semanas 23 a 39 entre junio y septiembre y temporada de verano durante el resto del año. Datos y hisopos resultan de un sistema de vigilancia que recibió aprobaciones reglamentarias, incluida la aprobación de la CNIL (Comisión Nacional de Tecnología de la Información y Libertades Civiles No 1592205) en julio de 2012. Todos los pacientes han recibido información oral y han dado su consentimiento para la recolección de hisopos y datos. Los datos fueron recolectados con fines de vigilancia y son totalmente anónimos. De acuerdo con la sensibilidad del ensayo dos muestras podrían ser resultados discordantes entre Influenza PCR inicialmente realizado y Multiplex PCR. Así fueron eliminadas del análisis: una es positiva para Influenza en un soloplex y negativa para todos los patógenos probados en multiplex y otra es positiva para Influenza en un soloplex y positiva para PIV2 en multiplex. En total, se consideraron 222 análisis. Además, 53 muestras fueron negativas para todos los patógenos respiratorios analizados (23,9%) y 169 muestras tenían al menos un patógeno detectado (76,1%), finalmente se identificó un total de 178 patógenos. Durante el período de estudio, una minoría de las semanas (21, es decir, 20%) no incluyó ninguna muestra, principalmente fuera de la estación de la gripe. La relación entre el sexo y el paciente fue 0,63 (86 hombres y 136 mujeres) y la edad media fue 28,4 años [min 0; El 10% tenían menos de 5 años, el 24% 5-15 años, el 63% 15-65 años y sólo el 3% eran mayores de 65 años. Los patógenos respiratorios identificados con mayor frecuencia en los hisopos ILI fueron rinovirus (23,4%), influenza A no H1N1 (21,2%) y gripe B (12,6%). Entre los 22 patógenos respiratorios probados por el multiplex, sólo tres no se encontraron en ninguna muestra analizada: Parainfluenza3, Legionella pneumophila y Bordetella pertussis. En cuanto a las coinfecciones, nueve hisopos revelaron la presencia de dos virus, entre los cuales6 involucraban virus de gripe (tabla 2). Los análisis mostraron que algunos virus son posiblemente estacionales y circulaban durante un período específico del año. Para este último, es específico del período estudiado desde que el virus influenza A(H1N1)pdm09 reapareció en la Isla Reunión en octubre de 2012 y ya no circulaba desde finales de 2010. Por el contrario, se identificaron parainfluenza 1,2 y 4 virus sólo en invierno. Para otros patógenos, no se observó ningún período específico de detección. Se realizó una descripción semanal de muestras para estudiar la distribución de patógenos respiratorios en 2011 y 2012 (Fig 1). Los resultados de los análisis biológicos se compararon con los datos de las consultas ILI declaradas por los GP centinelas en 2011 y 2012. Se observó en 2011, después de una primera ola en junio principalmente debido al virus influenza A no H1N1, una segunda ola de consultas ILI con identificación principalmente de virus de parainfluenza y no virus de gripe. En 2012, la segunda ola epidémica al final del invierno austral coincidió con En cuanto a los hisopos negativos (Fig 2), no se observó estacionalidad durante el periodo de estudio con una proporción similar sea cual sea la temporada. Este estudio retrospectivo basado en una red de GP centinelas mostró que no sólo los virus de la gripe son responsables de las consultas ILI. De hecho, se observó una importante circulación de múltiples patógenos a lo largo del año, con 12 tipos diferentes de patógenos identificados en 2011 y 2012. Los patógenos virales respiratorios estuvieron presentes en 76,1% de las muestras, lo que es ampliamente superior a los resultados de la vigilancia anual de la gripe [12]. Después de los virus de la gripe, Rhinovirus y Coronavirus fueron los virus respiratorios más comunes en Isla Reunión. Aunque no se tomaron muestras cada semana, la muestra fue representativa de la actividad ILI y consistente con la temporada de gripe. Sin embargo, según el bajo número de muestras, es difícil concluir acerca de la esta Este estudio también destacó varias coinfecciones, mostrando que concomitantemente la etiología múltiple de la ILI. La cocirculación ya se observó en Isla Reunión durante la pandemia de A(H1N1) pdm09, además del virus influenza, con la identificación de otros virus respiratorios como Rhinovirus o Coronavirus [14]. En Francia continental, durante esta pandemia, se encontró la circulación de virus respiratorios mayores, como Rhinovirus, Parainfluenza, Coronavirus, Metaneumovirus Humano, como en nuestra publicación [15] [16]. En nuestro estudio, sólo el 5,3% de los hisopos positivos fueron coinfecciones, mientras que en dos estudios en Madagascar las coinfecciones representaron 27,3% y 29,4% [17] [18]. A pesar de la distancia de 9.300 km entre la Reunión y Francia, la isla está directamente conectada a Europa con cuatro vuelos diarios a Francia. Estos intercambios pueden afectar a la circulación de patógenos respiratorios en el hemisferio sur y norte, por lo que los resultados de este estudio pueden ser de interés tanto para los países del Océano Índico como para Europa. Entre los 148 hisopos inicialmente negativos para la gripe, ya que no fueron previamente probados para otros virus, el estudio encontró una etiología para 95 hisopos. En total, sólo 53 hisopos, que representan el 24% de la muestra, permanecieron sin etiología con resultados negativos multiplex PCR a lo largo del año. Múltiples hipótesis pueden explicar este resultado: una mala calidad de los hisopos, impidiendo identificar un patógeno, causas no infecciosas u otros patógenos no incluidos en el multiplex PCR. Sin embargo, no pudimos probar los hisopos negativos para ARNse P, un marcador de células humanas, que podría proporcionar un mínimo de seguridad de que el hisopo contenía células humanas. En cuanto a las dos muestras divergentes para la identificación de influenza entre el multiplex y el PCR de un soloplex, las descartamos para el análisis; una fue positiva en Influenza con un soloplex y positiva en PIV con multiplex. Podría ser un resultado falso positivo de un soloplex. De hecho, como el ensayo multiplex de PCR tiene una buena sensibilidad y se considera un estándar dorado, decidimos mantener siete resultados negativos para Influenza en un soloplex y positivo en Influenza en multiplex [7] [8] [9] [10]. No hay ningún caso de pertussis de Bordetella que cause tos ferina y Legionella pneumophila que cause la enfermedad de Legionaires fue identificada en este estudio. Sin embargo, estas enfermedades son raras en Isla Reunión, alrededor de tres casos de enfermedad de Legionaires se declaran cada año. Un límite del estudio es que no se Fue imposible comparar los síntomas clínicos según cada patógeno y saber si existen diferentes patógenos que causen, por ejemplo, rinitis, laringitis o bronquitis (enfermedades incluidas en el ILI). Un estudio prospectivo específico que incluya datos clínicos podría proporcionar elementos útiles en la semiótica de las enfermedades. En conclusión, este estudio destacó una importante circulación de múltiples patógenos en Isla Reunión durante todo el año. Muestra que el ILI no es específico de la gripe y por lo tanto es esencial tener resultados biológicos para establecer el diagnóstico diferencial y así explicar la etiología de los síntomas. Para una mejor comprensión de los patógenos respiratorios que circulan en Isla Reunión, la información de este estudio también puede ser útil para los profesionales que ven a muchos pacientes en consulta con el ILI. Como el uso de multiplex RT-PCR demostró su eficacia en la vigilancia de la ILI y permitió resaltar la circulación de otros virus y causas bacterianas de infecciones respiratorias, ahora se utiliza de forma rutinaria en la vigilancia de la ILI. Además, sería interesante repetir este estudio cada 3 o 5 años añadiendo datos clínicos para monitorear la evolución de los patógenos respiratorios en la Isla Reunión a lo largo del tiempo.

¿Qué es la isla Reunión?

Etiología de enfermedades similares a la gripe de los profesionales de la red centinela en la isla de Reunión, 2011-2012https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5031398/SHA: f5ff89ebfdd0375d0334c112c6c1c7e163fa69a0cAutores: Brottet, Elise; Jaffar-Bandjee, Marie-Christine; Li-Pat-Yuen, Ghislaine; Filleul, LaurentFecha: 2016-09-21DOI: 10.1371/journal.pone.0163377Licencia: cc-byAbstract: In Réunion Island, a pesar de una vigilancia de gripe establecida desde 1996 por la red de médicos generales centinelas, poco se conoce sobre la e Se estableció un estudio retrospectivo con hisopos nasales recolectados por GP centinelas de pacientes con ILI en 2011 y 2012. Se seleccionaron y analizaron al azar 250 hisopos mediante reacción en cadena multiplex transcriptasa inversa polimerasa (RT-PCR), incluyendo investigación de 18 virus y 4 bacterias. Se detectaron virus respiratorios en 169/222 (76,1%) muestras, principalmente rinovirus (23,4%), virus influenza A (21,2%), virus influenza B (12,6%), coronavirus (4,9%) y metapneumovirus humano (3,6%). Nueve hisopos (5,3% de los hisopos positivos) revelaron coinfecciones con dos virus identificados, entre los cuales seis se referían a coinfecciones con virus influenza. Observamos importantes diferencias estacionales, con circulación de Metapneumovirus humano, RSV A y B y coronavirus sólo durante el verano; mientras que En conclusión, este estudio destaca una circulación sustancial de múltiples patógenos respiratorios en Isla Reunión a lo largo del año. Muestra que ILI no sólo son atribuibles a la gripe y subraya la necesidad de vigilancia biológica. Como el uso de multiplex RT-PCR demostró su eficacia, ahora se utiliza de forma rutinaria en la vigilancia de ILI. Texto: La enfermedad similar a la gripe (ILI) o infecciones respiratorias agudas pueden ser causadas por varios tipos de virus respiratorios o bacterias en humanos [1]. Virus de gripe, virus respiratorios sincitiales (RSV) y virus parainfluenza se identifican como virus principales responsables principalmente de ILI y neumonía en varios estudios [2]. Sin embargo, los profesionales no pueden diagnosticar la infección sin una confirmación biológica de la prueba. Desafortunadamente, estas causas de infecciones se identifican en menos del 50% [3]. La isla de Reunión, un territorio francés de ultramar con 850.000 habitantes, se encuentra en el hemisferio sur entre Madagascar y Mauricio en el Océano Índico (Latitud: 21°05.2920 S Longitud: 55°36.4380 E.). La isla se beneficia de un sistema sanitario similar al de Francia continental y la vigilancia epidemiológica ha sido desarrollada por la oficina regional del Instituto Francés de Vigilancia de la Salud Pública (CIRE OI), basado en el sistema de vigilancia de Francia continental [4]. La actividad de la gripe aumenta generalmente durante el invierno austral, correspondiente al verano en Europa [5]. Desde 2011, la campaña de vacunación contra la gripe en la isla de Reunión comienza en abril y la vacuna utilizada corresponde a las recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud para el hemisferio sur. Desde 1996, la vigilancia clínica y biológica de la gripe se basa en una red de médicos centinelas [6]. Los hisopos nasales son recolectados al azar durante todo el año y son probados por RT-PCR para virus de la gripe. Entre estas muestras de vigilancia, 40 a 50% son testados positivos para virus influenza A, A(H1N1)pdm09 o virus B por el laboratorio virológico del Hospital Universitario Centro de Reunión. Así, las muestras ILI testadas negativas para influenza son de etiología desconocida. Varias herramientas biológicas permiten identificar patógenos respiratorios a partir de hisopos nasales. En los últimos años, se ha desarrollado la reacción en cadena multiplex transcriptasa inversa polimerasa (RT-PCR) para identificar varios virus simultáneamente [7] [8] [9] [10]. Por lo tanto, utilizamos este nuevo método para establecer un estudio retrospectivo utilizando hisopos recolectados por los GP centineles de 2011 a 2012. El principal objetivo de nuestro estudio fue caracterizar patógenos respiratorios responsables de consultas Los objetivos secundarios fueron resaltar las tendencias estacionales en la circulación de patógenos respiratorios y describir la ocurrencia de coinfecciones, especialmente durante la temporada de gripe. Se definió como un inicio súbito de fiebre de más de 38 grados Celsius y tos, asociada o no con otros síntomas como dificultad respiratoria, dolor de cabeza, etc. Cada semana, se animó a todos los médicos de cabecera de la red centinela a recoger un hisopo nasal de los dos primeros pacientes que presentaron ILI desde menos de tres días. Después de ser probados para virus de gripe, los 994 hisopos recogidos en 2011 y 2012 se congelaron a -80°C en el laboratorio del centro hospitalario universitario (CHU). Con base en el presupuesto, se seleccionó aleatoriamente una muestra estratificada por temporada de 250 hisopos para describir virus circulantes incluyendo la temporada de gripe. Se realizó muestreo aleatorio con Excel 1 utilizando la base de datos de El cuadro de muestreo contenía el número de identificación del hisopo asignado por Cire OI, número de identificación de laboratorio, sexo, edad, fecha de inicio de los síntomas, fecha de recogida del hisopo y resultado de la influenza RT-PCR. Utilizamos Respifinder 1 Smart 22 kits un RT-PCR multiplex (PathoFinder, Maastricht, Países Bajos) que puede detectar 22 patógenos respiratorios. Este ensayo se basa en la tecnología de amplificación de la sonda dependiente de la ligadura múltiple (MLPA). Los pasos de transcripción inversa y preamplificación se realizaron en el Mastercycler epgradiente 1 (Eppendorf) y los pasos de hibridación, ligadura y detección en el sistema LightCycler 1 480 (Roche Applied Science). Este método fue elegido por su alta especificidad, en comparación con otros mismos métodos (78% frente a 33%) De este modo, permite destacar la posible presencia de dieciocho virus respiratorios y cuatro bacterias en una sola reacción mediante el análisis de la curva de fusión: Influenza A not (H1N1 Se realizaron análisis estadísticos con Stata 1 y Excel 1. Se definieron dos estaciones para identificar posibles tendencias estacionales en la circulación de los virus: temporada de invierno durante las semanas 23 a 39 entre junio y septiembre y temporada de verano durante el resto del año. Datos y hisopos resultan de un sistema de vigilancia que recibió aprobaciones reglamentarias, incluida la aprobación de la CNIL (Comisión Nacional de Tecnología de la Información y Libertades Civiles No 1592205) en julio de 2012. Todos los pacientes han recibido información oral y han dado su consentimiento para la recolección de hisopos y datos. Los datos fueron recolectados con fines de vigilancia y son totalmente anónimos. De acuerdo con la sensibilidad del ensayo dos muestras podrían ser resultados discordantes entre Influenza PCR inicialmente realizado y Multiplex PCR. Así fueron eliminadas del análisis: una es positiva para Influenza en un soloplex y negativa para todos los patógenos probados en multiplex y otra es positiva para Influenza en un soloplex y positiva para PIV2 en multiplex. En total, se consideraron 222 análisis. Además, 53 muestras fueron negativas para todos los patógenos respiratorios analizados (23,9%) y 169 muestras tenían al menos un patógeno detectado (76,1%), finalmente se identificó un total de 178 patógenos. Durante el período de estudio, una minoría de las semanas (21, es decir, 20%) no incluyó ninguna muestra, principalmente fuera de la estación de la gripe. La relación entre el sexo y el paciente fue 0,63 (86 hombres y 136 mujeres) y la edad media fue 28,4 años [min 0; El 10% tenían menos de 5 años, el 24% 5-15 años, el 63% 15-65 años y sólo el 3% eran mayores de 65 años. Los patógenos respiratorios identificados con mayor frecuencia en los hisopos ILI fueron rinovirus (23,4%), influenza A no H1N1 (21,2%) y gripe B (12,6%). Entre los 22 patógenos respiratorios probados por el multiplex, sólo tres no se encontraron en ninguna muestra analizada: Parainfluenza3, Legionella pneumophila y Bordetella pertussis. En cuanto a las coinfecciones, nueve hisopos revelaron la presencia de dos virus, entre los cuales6 involucraban virus de gripe (tabla 2). Los análisis mostraron que algunos virus son posiblemente estacionales y circulaban durante un período específico del año. Para este último, es específico del período estudiado desde que el virus influenza A(H1N1)pdm09 reapareció en la Isla Reunión en octubre de 2012 y ya no circulaba desde finales de 2010. Por el contrario, se identificaron parainfluenza 1,2 y 4 virus sólo en invierno. Para otros patógenos, no se observó ningún período específico de detección. Se realizó una descripción semanal de muestras para estudiar la distribución de patógenos respiratorios en 2011 y 2012 (Fig 1). Los resultados de los análisis biológicos se compararon con los datos de las consultas ILI declaradas por los GP centinelas en 2011 y 2012. Se observó en 2011, después de una primera ola en junio principalmente debido al virus influenza A no H1N1, una segunda ola de consultas ILI con identificación principalmente de virus de parainfluenza y no virus de gripe. En 2012, la segunda ola epidémica al final del invierno austral coincidió con En cuanto a los hisopos negativos (Fig 2), no se observó estacionalidad durante el periodo de estudio con una proporción similar sea cual sea la temporada. Este estudio retrospectivo basado en una red de GP centinelas mostró que no sólo los virus de la gripe son responsables de las consultas ILI. De hecho, se observó una importante circulación de múltiples patógenos a lo largo del año, con 12 tipos diferentes de patógenos identificados en 2011 y 2012. Los patógenos virales respiratorios estuvieron presentes en 76,1% de las muestras, lo que es ampliamente superior a los resultados de la vigilancia anual de la gripe [12]. Después de los virus de la gripe, Rhinovirus y Coronavirus fueron los virus respiratorios más comunes en Isla Reunión. Aunque no se tomaron muestras cada semana, la muestra fue representativa de la actividad ILI y consistente con la temporada de gripe. Sin embargo, según el bajo número de muestras, es difícil concluir acerca de la esta Este estudio también destacó varias coinfecciones, mostrando que concomitantemente la etiología múltiple de la ILI. La cocirculación ya se observó en Isla Reunión durante la pandemia de A(H1N1) pdm09, además del virus influenza, con la identificación de otros virus respiratorios como Rhinovirus o Coronavirus [14]. En Francia continental, durante esta pandemia, se encontró la circulación de virus respiratorios mayores, como Rhinovirus, Parainfluenza, Coronavirus, Metaneumovirus Humano, como en nuestra publicación [15] [16]. En nuestro estudio, sólo el 5,3% de los hisopos positivos fueron coinfecciones, mientras que en dos estudios en Madagascar las coinfecciones representaron 27,3% y 29,4% [17] [18]. A pesar de la distancia de 9.300 km entre la Reunión y Francia, la isla está directamente conectada a Europa con cuatro vuelos diarios a Francia. Estos intercambios pueden afectar a la circulación de patógenos respiratorios en el hemisferio sur y norte, por lo que los resultados de este estudio pueden ser de interés tanto para los países del Océano Índico como para Europa. Entre los 148 hisopos inicialmente negativos para la gripe, ya que no fueron previamente probados para otros virus, el estudio encontró una etiología para 95 hisopos. En total, sólo 53 hisopos, que representan el 24% de la muestra, permanecieron sin etiología con resultados negativos multiplex PCR a lo largo del año. Múltiples hipótesis pueden explicar este resultado: una mala calidad de los hisopos, impidiendo identificar un patógeno, causas no infecciosas u otros patógenos no incluidos en el multiplex PCR. Sin embargo, no pudimos probar los hisopos negativos para ARNse P, un marcador de células humanas, que podría proporcionar un mínimo de seguridad de que el hisopo contenía células humanas. En cuanto a las dos muestras divergentes para la identificación de influenza entre el multiplex y el PCR de un soloplex, las descartamos para el análisis; una fue positiva en Influenza con un soloplex y positiva en PIV con multiplex. Podría ser un resultado falso positivo de un soloplex. De hecho, como el ensayo multiplex de PCR tiene una buena sensibilidad y se considera un estándar dorado, decidimos mantener siete resultados negativos para Influenza en un soloplex y positivo en Influenza en multiplex [7] [8] [9] [10]. No hay ningún caso de pertussis de Bordetella que cause tos ferina y Legionella pneumophila que cause la enfermedad de Legionaires fue identificada en este estudio. Sin embargo, estas enfermedades son raras en Isla Reunión, alrededor de tres casos de enfermedad de Legionaires se declaran cada año. Un límite del estudio es que no se Fue imposible comparar los síntomas clínicos según cada patógeno y saber si existen diferentes patógenos que causen, por ejemplo, rinitis, laringitis o bronquitis (enfermedades incluidas en el ILI). Un estudio prospectivo específico que incluya datos clínicos podría proporcionar elementos útiles en la semiótica de las enfermedades. En conclusión, este estudio destacó una importante circulación de múltiples patógenos en Isla Reunión durante todo el año. Muestra que el ILI no es específico de la gripe y por lo tanto es esencial tener resultados biológicos para establecer el diagnóstico diferencial y así explicar la etiología de los síntomas. Para una mejor comprensión de los patógenos respiratorios que circulan en Isla Reunión, la información de este estudio también puede ser útil para los profesionales que ven a muchos pacientes en consulta con el ILI. Como el uso de multiplex RT-PCR demostró su eficacia en la vigilancia de la ILI y permitió resaltar la circulación de otros virus y causas bacterianas de infecciones respiratorias, ahora se utiliza de forma rutinaria en la vigilancia de la ILI. Además, sería interesante repetir este estudio cada 3 o 5 años añadiendo datos clínicos para monitorear la evolución de los patógenos respiratorios en la Isla Reunión a lo largo del tiempo.

¿Cuál es el número de habitantes de la Isla Reunión?

Etiología de enfermedades similares a la gripe de los profesionales de la red centinela en la isla de Reunión, 2011-2012https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5031398/SHA: f5ff89ebfdd0375d0334c112c6c1c7e163fa69a0cAutores: Brottet, Elise; Jaffar-Bandjee, Marie-Christine; Li-Pat-Yuen, Ghislaine; Filleul, LaurentFecha: 2016-09-21DOI: 10.1371/journal.pone.0163377Licencia: cc-byAbstract: In Réunion Island, a pesar de una vigilancia de gripe establecida desde 1996 por la red de médicos generales centinelas, poco se conoce sobre la e Se estableció un estudio retrospectivo con hisopos nasales recolectados por GP centinelas de pacientes con ILI en 2011 y 2012. Se seleccionaron y analizaron al azar 250 hisopos mediante reacción en cadena multiplex transcriptasa inversa polimerasa (RT-PCR), incluyendo investigación de 18 virus y 4 bacterias. Se detectaron virus respiratorios en 169/222 (76,1%) muestras, principalmente rinovirus (23,4%), virus influenza A (21,2%), virus influenza B (12,6%), coronavirus (4,9%) y metapneumovirus humano (3,6%). Nueve hisopos (5,3% de los hisopos positivos) revelaron coinfecciones con dos virus identificados, entre los cuales seis se referían a coinfecciones con virus influenza. Observamos importantes diferencias estacionales, con circulación de Metapneumovirus humano, RSV A y B y coronavirus sólo durante el verano; mientras que En conclusión, este estudio destaca una circulación sustancial de múltiples patógenos respiratorios en Isla Reunión a lo largo del año. Muestra que ILI no sólo son atribuibles a la gripe y subraya la necesidad de vigilancia biológica. Como el uso de multiplex RT-PCR demostró su eficacia, ahora se utiliza de forma rutinaria en la vigilancia de ILI. Texto: La enfermedad similar a la gripe (ILI) o infecciones respiratorias agudas pueden ser causadas por varios tipos de virus respiratorios o bacterias en humanos [1]. Virus de gripe, virus respiratorios sincitiales (RSV) y virus parainfluenza se identifican como virus principales responsables principalmente de ILI y neumonía en varios estudios [2]. Sin embargo, los profesionales no pueden diagnosticar la infección sin una confirmación biológica de la prueba. Desafortunadamente, estas causas de infecciones se identifican en menos del 50% [3]. La isla de Reunión, un territorio francés de ultramar con 850.000 habitantes, se encuentra en el hemisferio sur entre Madagascar y Mauricio en el Océano Índico (Latitud: 21°05.2920 S Longitud: 55°36.4380 E.). La isla se beneficia de un sistema sanitario similar al de Francia continental y la vigilancia epidemiológica ha sido desarrollada por la oficina regional del Instituto Francés de Vigilancia de la Salud Pública (CIRE OI), basado en el sistema de vigilancia de Francia continental [4]. La actividad de la gripe aumenta generalmente durante el invierno austral, correspondiente al verano en Europa [5]. Desde 2011, la campaña de vacunación contra la gripe en la isla de Reunión comienza en abril y la vacuna utilizada corresponde a las recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud para el hemisferio sur. Desde 1996, la vigilancia clínica y biológica de la gripe se basa en una red de médicos centinelas [6]. Los hisopos nasales son recolectados al azar durante todo el año y son probados por RT-PCR para virus de la gripe. Entre estas muestras de vigilancia, 40 a 50% son testados positivos para virus influenza A, A(H1N1)pdm09 o virus B por el laboratorio virológico del Hospital Universitario Centro de Reunión. Así, las muestras ILI testadas negativas para influenza son de etiología desconocida. Varias herramientas biológicas permiten identificar patógenos respiratorios a partir de hisopos nasales. En los últimos años, se ha desarrollado la reacción en cadena multiplex transcriptasa inversa polimerasa (RT-PCR) para identificar varios virus simultáneamente [7] [8] [9] [10]. Por lo tanto, utilizamos este nuevo método para establecer un estudio retrospectivo utilizando hisopos recolectados por los GP centineles de 2011 a 2012. El principal objetivo de nuestro estudio fue caracterizar patógenos respiratorios responsables de consultas Los objetivos secundarios fueron resaltar las tendencias estacionales en la circulación de patógenos respiratorios y describir la ocurrencia de coinfecciones, especialmente durante la temporada de gripe. Se definió como un inicio súbito de fiebre de más de 38 grados Celsius y tos, asociada o no con otros síntomas como dificultad respiratoria, dolor de cabeza, etc. Cada semana, se animó a todos los médicos de cabecera de la red centinela a recoger un hisopo nasal de los dos primeros pacientes que presentaron ILI desde menos de tres días. Después de ser probados para virus de gripe, los 994 hisopos recogidos en 2011 y 2012 se congelaron a -80°C en el laboratorio del centro hospitalario universitario (CHU). Con base en el presupuesto, se seleccionó aleatoriamente una muestra estratificada por temporada de 250 hisopos para describir virus circulantes incluyendo la temporada de gripe. Se realizó muestreo aleatorio con Excel 1 utilizando la base de datos de El cuadro de muestreo contenía el número de identificación del hisopo asignado por Cire OI, número de identificación de laboratorio, sexo, edad, fecha de inicio de los síntomas, fecha de recogida del hisopo y resultado de la influenza RT-PCR. Utilizamos Respifinder 1 Smart 22 kits un RT-PCR multiplex (PathoFinder, Maastricht, Países Bajos) que puede detectar 22 patógenos respiratorios. Este ensayo se basa en la tecnología de amplificación de la sonda dependiente de la ligadura múltiple (MLPA). Los pasos de transcripción inversa y preamplificación se realizaron en el Mastercycler epgradiente 1 (Eppendorf) y los pasos de hibridación, ligadura y detección en el sistema LightCycler 1 480 (Roche Applied Science). Este método fue elegido por su alta especificidad, en comparación con otros mismos métodos (78% frente a 33%) De este modo, permite destacar la posible presencia de dieciocho virus respiratorios y cuatro bacterias en una sola reacción mediante el análisis de la curva de fusión: Influenza A not (H1N1 Se realizaron análisis estadísticos con Stata 1 y Excel 1. Se definieron dos estaciones para identificar posibles tendencias estacionales en la circulación de los virus: temporada de invierno durante las semanas 23 a 39 entre junio y septiembre y temporada de verano durante el resto del año. Datos y hisopos resultan de un sistema de vigilancia que recibió aprobaciones reglamentarias, incluida la aprobación de la CNIL (Comisión Nacional de Tecnología de la Información y Libertades Civiles No 1592205) en julio de 2012. Todos los pacientes han recibido información oral y han dado su consentimiento para la recolección de hisopos y datos. Los datos fueron recolectados con fines de vigilancia y son totalmente anónimos. De acuerdo con la sensibilidad del ensayo dos muestras podrían ser resultados discordantes entre Influenza PCR inicialmente realizado y Multiplex PCR. Así fueron eliminadas del análisis: una es positiva para Influenza en un soloplex y negativa para todos los patógenos probados en multiplex y otra es positiva para Influenza en un soloplex y positiva para PIV2 en multiplex. En total, se consideraron 222 análisis. Además, 53 muestras fueron negativas para todos los patógenos respiratorios analizados (23,9%) y 169 muestras tenían al menos un patógeno detectado (76,1%), finalmente se identificó un total de 178 patógenos. Durante el período de estudio, una minoría de las semanas (21, es decir, 20%) no incluyó ninguna muestra, principalmente fuera de la estación de la gripe. La relación entre el sexo y el paciente fue 0,63 (86 hombres y 136 mujeres) y la edad media fue 28,4 años [min 0; El 10% tenían menos de 5 años, el 24% 5-15 años, el 63% 15-65 años y sólo el 3% eran mayores de 65 años. Los patógenos respiratorios identificados con mayor frecuencia en los hisopos ILI fueron rinovirus (23,4%), influenza A no H1N1 (21,2%) y gripe B (12,6%). Entre los 22 patógenos respiratorios probados por el multiplex, sólo tres no se encontraron en ninguna muestra analizada: Parainfluenza3, Legionella pneumophila y Bordetella pertussis. En cuanto a las coinfecciones, nueve hisopos revelaron la presencia de dos virus, entre los cuales6 involucraban virus de gripe (tabla 2). Los análisis mostraron que algunos virus son posiblemente estacionales y circulaban durante un período específico del año. Para este último, es específico del período estudiado desde que el virus influenza A(H1N1)pdm09 reapareció en la Isla Reunión en octubre de 2012 y ya no circulaba desde finales de 2010. Por el contrario, se identificaron parainfluenza 1,2 y 4 virus sólo en invierno. Para otros patógenos, no se observó ningún período específico de detección. Se realizó una descripción semanal de muestras para estudiar la distribución de patógenos respiratorios en 2011 y 2012 (Fig 1). Los resultados de los análisis biológicos se compararon con los datos de las consultas ILI declaradas por los GP centinelas en 2011 y 2012. Se observó en 2011, después de una primera ola en junio principalmente debido al virus influenza A no H1N1, una segunda ola de consultas ILI con identificación principalmente de virus de parainfluenza y no virus de gripe. En 2012, la segunda ola epidémica al final del invierno austral coincidió con En cuanto a los hisopos negativos (Fig 2), no se observó estacionalidad durante el periodo de estudio con una proporción similar sea cual sea la temporada. Este estudio retrospectivo basado en una red de GP centinelas mostró que no sólo los virus de la gripe son responsables de las consultas ILI. De hecho, se observó una importante circulación de múltiples patógenos a lo largo del año, con 12 tipos diferentes de patógenos identificados en 2011 y 2012. Los patógenos virales respiratorios estuvieron presentes en 76,1% de las muestras, lo que es ampliamente superior a los resultados de la vigilancia anual de la gripe [12]. Después de los virus de la gripe, Rhinovirus y Coronavirus fueron los virus respiratorios más comunes en Isla Reunión. Aunque no se tomaron muestras cada semana, la muestra fue representativa de la actividad ILI y consistente con la temporada de gripe. Sin embargo, según el bajo número de muestras, es difícil concluir acerca de la esta Este estudio también destacó varias coinfecciones, mostrando que concomitantemente la etiología múltiple de la ILI. La cocirculación ya se observó en Isla Reunión durante la pandemia de A(H1N1) pdm09, además del virus influenza, con la identificación de otros virus respiratorios como Rhinovirus o Coronavirus [14]. En Francia continental, durante esta pandemia, se encontró la circulación de virus respiratorios mayores, como Rhinovirus, Parainfluenza, Coronavirus, Metaneumovirus Humano, como en nuestra publicación [15] [16]. En nuestro estudio, sólo el 5,3% de los hisopos positivos fueron coinfecciones, mientras que en dos estudios en Madagascar las coinfecciones representaron 27,3% y 29,4% [17] [18]. A pesar de la distancia de 9.300 km entre la Reunión y Francia, la isla está directamente conectada a Europa con cuatro vuelos diarios a Francia. Estos intercambios pueden afectar a la circulación de patógenos respiratorios en el hemisferio sur y norte, por lo que los resultados de este estudio pueden ser de interés tanto para los países del Océano Índico como para Europa. Entre los 148 hisopos inicialmente negativos para la gripe, ya que no fueron previamente probados para otros virus, el estudio encontró una etiología para 95 hisopos. En total, sólo 53 hisopos, que representan el 24% de la muestra, permanecieron sin etiología con resultados negativos multiplex PCR a lo largo del año. Múltiples hipótesis pueden explicar este resultado: una mala calidad de los hisopos, impidiendo identificar un patógeno, causas no infecciosas u otros patógenos no incluidos en el multiplex PCR. Sin embargo, no pudimos probar los hisopos negativos para ARNse P, un marcador de células humanas, que podría proporcionar un mínimo de seguridad de que el hisopo contenía células humanas. En cuanto a las dos muestras divergentes para la identificación de influenza entre el multiplex y el PCR de un soloplex, las descartamos para el análisis; una fue positiva en Influenza con un soloplex y positiva en PIV con multiplex. Podría ser un resultado falso positivo de un soloplex. De hecho, como el ensayo multiplex de PCR tiene una buena sensibilidad y se considera un estándar dorado, decidimos mantener siete resultados negativos para Influenza en un soloplex y positivo en Influenza en multiplex [7] [8] [9] [10]. No hay ningún caso de pertussis de Bordetella que cause tos ferina y Legionella pneumophila que cause la enfermedad de Legionaires fue identificada en este estudio. Sin embargo, estas enfermedades son raras en Isla Reunión, alrededor de tres casos de enfermedad de Legionaires se declaran cada año. Un límite del estudio es que no se Fue imposible comparar los síntomas clínicos según cada patógeno y saber si existen diferentes patógenos que causen, por ejemplo, rinitis, laringitis o bronquitis (enfermedades incluidas en el ILI). Un estudio prospectivo específico que incluya datos clínicos podría proporcionar elementos útiles en la semiótica de las enfermedades. En conclusión, este estudio destacó una importante circulación de múltiples patógenos en Isla Reunión durante todo el año. Muestra que el ILI no es específico de la gripe y por lo tanto es esencial tener resultados biológicos para establecer el diagnóstico diferencial y así explicar la etiología de los síntomas. Para una mejor comprensión de los patógenos respiratorios que circulan en Isla Reunión, la información de este estudio también puede ser útil para los profesionales que ven a muchos pacientes en consulta con el ILI. Como el uso de multiplex RT-PCR demostró su eficacia en la vigilancia de la ILI y permitió resaltar la circulación de otros virus y causas bacterianas de infecciones respiratorias, ahora se utiliza de forma rutinaria en la vigilancia de la ILI. Además, sería interesante repetir este estudio cada 3 o 5 años añadiendo datos clínicos para monitorear la evolución de los patógenos respiratorios en la Isla Reunión a lo largo del tiempo.

¿Cuándo aumenta la actividad de la gripe?

Etiología de enfermedades similares a la gripe de los profesionales de la red centinela en la isla de Reunión, 2011-2012https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5031398/SHA: f5ff89ebfdd0375d0334c112c6c1c7e163fa69a0cAutores: Brottet, Elise; Jaffar-Bandjee, Marie-Christine; Li-Pat-Yuen, Ghislaine; Filleul, LaurentFecha: 2016-09-21DOI: 10.1371/journal.pone.0163377Licencia: cc-byAbstract: In Réunion Island, a pesar de una vigilancia de gripe establecida desde 1996 por la red de médicos generales centinelas, poco se conoce sobre la e Se estableció un estudio retrospectivo con hisopos nasales recolectados por GP centinelas de pacientes con ILI en 2011 y 2012. Se seleccionaron y analizaron al azar 250 hisopos mediante reacción en cadena multiplex transcriptasa inversa polimerasa (RT-PCR), incluyendo investigación de 18 virus y 4 bacterias. Se detectaron virus respiratorios en 169/222 (76,1%) muestras, principalmente rinovirus (23,4%), virus influenza A (21,2%), virus influenza B (12,6%), coronavirus (4,9%) y metapneumovirus humano (3,6%). Nueve hisopos (5,3% de los hisopos positivos) revelaron coinfecciones con dos virus identificados, entre los cuales seis se referían a coinfecciones con virus influenza. Observamos importantes diferencias estacionales, con circulación de Metapneumovirus humano, RSV A y B y coronavirus sólo durante el verano; mientras que En conclusión, este estudio destaca una circulación sustancial de múltiples patógenos respiratorios en Isla Reunión a lo largo del año. Muestra que ILI no sólo son atribuibles a la gripe y subraya la necesidad de vigilancia biológica. Como el uso de multiplex RT-PCR demostró su eficacia, ahora se utiliza de forma rutinaria en la vigilancia de ILI. Texto: La enfermedad similar a la gripe (ILI) o infecciones respiratorias agudas pueden ser causadas por varios tipos de virus respiratorios o bacterias en humanos [1]. Virus de gripe, virus respiratorios sincitiales (RSV) y virus parainfluenza se identifican como virus principales responsables principalmente de ILI y neumonía en varios estudios [2]. Sin embargo, los profesionales no pueden diagnosticar la infección sin una confirmación biológica de la prueba. Desafortunadamente, estas causas de infecciones se identifican en menos del 50% [3]. La isla de Reunión, un territorio francés de ultramar con 850.000 habitantes, se encuentra en el hemisferio sur entre Madagascar y Mauricio en el Océano Índico (Latitud: 21°05.2920 S Longitud: 55°36.4380 E.). La isla se beneficia de un sistema sanitario similar al de Francia continental y la vigilancia epidemiológica ha sido desarrollada por la oficina regional del Instituto Francés de Vigilancia de la Salud Pública (CIRE OI), basado en el sistema de vigilancia de Francia continental [4]. La actividad de la gripe aumenta generalmente durante el invierno austral, correspondiente al verano en Europa [5]. Desde 2011, la campaña de vacunación contra la gripe en la isla de Reunión comienza en abril y la vacuna utilizada corresponde a las recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud para el hemisferio sur. Desde 1996, la vigilancia clínica y biológica de la gripe se basa en una red de médicos centinelas [6]. Los hisopos nasales son recolectados al azar durante todo el año y son probados por RT-PCR para virus de la gripe. Entre estas muestras de vigilancia, 40 a 50% son testados positivos para virus influenza A, A(H1N1)pdm09 o virus B por el laboratorio virológico del Hospital Universitario Centro de Reunión. Así, las muestras ILI testadas negativas para influenza son de etiología desconocida. Varias herramientas biológicas permiten identificar patógenos respiratorios a partir de hisopos nasales. En los últimos años, se ha desarrollado la reacción en cadena multiplex transcriptasa inversa polimerasa (RT-PCR) para identificar varios virus simultáneamente [7] [8] [9] [10]. Por lo tanto, utilizamos este nuevo método para establecer un estudio retrospectivo utilizando hisopos recolectados por los GP centineles de 2011 a 2012. El principal objetivo de nuestro estudio fue caracterizar patógenos respiratorios responsables de consultas Los objetivos secundarios fueron resaltar las tendencias estacionales en la circulación de patógenos respiratorios y describir la ocurrencia de coinfecciones, especialmente durante la temporada de gripe. Se definió como un inicio súbito de fiebre de más de 38 grados Celsius y tos, asociada o no con otros síntomas como dificultad respiratoria, dolor de cabeza, etc. Cada semana, se animó a todos los médicos de cabecera de la red centinela a recoger un hisopo nasal de los dos primeros pacientes que presentaron ILI desde menos de tres días. Después de ser probados para virus de gripe, los 994 hisopos recogidos en 2011 y 2012 se congelaron a -80°C en el laboratorio del centro hospitalario universitario (CHU). Con base en el presupuesto, se seleccionó aleatoriamente una muestra estratificada por temporada de 250 hisopos para describir virus circulantes incluyendo la temporada de gripe. Se realizó muestreo aleatorio con Excel 1 utilizando la base de datos de El cuadro de muestreo contenía el número de identificación del hisopo asignado por Cire OI, número de identificación de laboratorio, sexo, edad, fecha de inicio de los síntomas, fecha de recogida del hisopo y resultado de la influenza RT-PCR. Utilizamos Respifinder 1 Smart 22 kits un RT-PCR multiplex (PathoFinder, Maastricht, Países Bajos) que puede detectar 22 patógenos respiratorios. Este ensayo se basa en la tecnología de amplificación de la sonda dependiente de la ligadura múltiple (MLPA). Los pasos de transcripción inversa y preamplificación se realizaron en el Mastercycler epgradiente 1 (Eppendorf) y los pasos de hibridación, ligadura y detección en el sistema LightCycler 1 480 (Roche Applied Science). Este método fue elegido por su alta especificidad, en comparación con otros mismos métodos (78% frente a 33%) De este modo, permite destacar la posible presencia de dieciocho virus respiratorios y cuatro bacterias en una sola reacción mediante el análisis de la curva de fusión: Influenza A not (H1N1 Se realizaron análisis estadísticos con Stata 1 y Excel 1. Se definieron dos estaciones para identificar posibles tendencias estacionales en la circulación de los virus: temporada de invierno durante las semanas 23 a 39 entre junio y septiembre y temporada de verano durante el resto del año. Datos y hisopos resultan de un sistema de vigilancia que recibió aprobaciones reglamentarias, incluida la aprobación de la CNIL (Comisión Nacional de Tecnología de la Información y Libertades Civiles No 1592205) en julio de 2012. Todos los pacientes han recibido información oral y han dado su consentimiento para la recolección de hisopos y datos. Los datos fueron recolectados con fines de vigilancia y son totalmente anónimos. De acuerdo con la sensibilidad del ensayo dos muestras podrían ser resultados discordantes entre Influenza PCR inicialmente realizado y Multiplex PCR. Así fueron eliminadas del análisis: una es positiva para Influenza en un soloplex y negativa para todos los patógenos probados en multiplex y otra es positiva para Influenza en un soloplex y positiva para PIV2 en multiplex. En total, se consideraron 222 análisis. Además, 53 muestras fueron negativas para todos los patógenos respiratorios analizados (23,9%) y 169 muestras tenían al menos un patógeno detectado (76,1%), finalmente se identificó un total de 178 patógenos. Durante el período de estudio, una minoría de las semanas (21, es decir, 20%) no incluyó ninguna muestra, principalmente fuera de la estación de la gripe. La relación entre el sexo y el paciente fue 0,63 (86 hombres y 136 mujeres) y la edad media fue 28,4 años [min 0; El 10% tenían menos de 5 años, el 24% 5-15 años, el 63% 15-65 años y sólo el 3% eran mayores de 65 años. Los patógenos respiratorios identificados con mayor frecuencia en los hisopos ILI fueron rinovirus (23,4%), influenza A no H1N1 (21,2%) y gripe B (12,6%). Entre los 22 patógenos respiratorios probados por el multiplex, sólo tres no se encontraron en ninguna muestra analizada: Parainfluenza3, Legionella pneumophila y Bordetella pertussis. En cuanto a las coinfecciones, nueve hisopos revelaron la presencia de dos virus, entre los cuales6 involucraban virus de gripe (tabla 2). Los análisis mostraron que algunos virus son posiblemente estacionales y circulaban durante un período específico del año. Para este último, es específico del período estudiado desde que el virus influenza A(H1N1)pdm09 reapareció en la Isla Reunión en octubre de 2012 y ya no circulaba desde finales de 2010. Por el contrario, se identificaron parainfluenza 1,2 y 4 virus sólo en invierno. Para otros patógenos, no se observó ningún período específico de detección. Se realizó una descripción semanal de muestras para estudiar la distribución de patógenos respiratorios en 2011 y 2012 (Fig 1). Los resultados de los análisis biológicos se compararon con los datos de las consultas ILI declaradas por los GP centinelas en 2011 y 2012. Se observó en 2011, después de una primera ola en junio principalmente debido al virus influenza A no H1N1, una segunda ola de consultas ILI con identificación principalmente de virus de parainfluenza y no virus de gripe. En 2012, la segunda ola epidémica al final del invierno austral coincidió con En cuanto a los hisopos negativos (Fig 2), no se observó estacionalidad durante el periodo de estudio con una proporción similar sea cual sea la temporada. Este estudio retrospectivo basado en una red de GP centinelas mostró que no sólo los virus de la gripe son responsables de las consultas ILI. De hecho, se observó una importante circulación de múltiples patógenos a lo largo del año, con 12 tipos diferentes de patógenos identificados en 2011 y 2012. Los patógenos virales respiratorios estuvieron presentes en 76,1% de las muestras, lo que es ampliamente superior a los resultados de la vigilancia anual de la gripe [12]. Después de los virus de la gripe, Rhinovirus y Coronavirus fueron los virus respiratorios más comunes en Isla Reunión. Aunque no se tomaron muestras cada semana, la muestra fue representativa de la actividad ILI y consistente con la temporada de gripe. Sin embargo, según el bajo número de muestras, es difícil concluir acerca de la esta Este estudio también destacó varias coinfecciones, mostrando que concomitantemente la etiología múltiple de la ILI. La cocirculación ya se observó en Isla Reunión durante la pandemia de A(H1N1) pdm09, además del virus influenza, con la identificación de otros virus respiratorios como Rhinovirus o Coronavirus [14]. En Francia continental, durante esta pandemia, se encontró la circulación de virus respiratorios mayores, como Rhinovirus, Parainfluenza, Coronavirus, Metaneumovirus Humano, como en nuestra publicación [15] [16]. En nuestro estudio, sólo el 5,3% de los hisopos positivos fueron coinfecciones, mientras que en dos estudios en Madagascar las coinfecciones representaron 27,3% y 29,4% [17] [18]. A pesar de la distancia de 9.300 km entre la Reunión y Francia, la isla está directamente conectada a Europa con cuatro vuelos diarios a Francia. Estos intercambios pueden afectar a la circulación de patógenos respiratorios en el hemisferio sur y norte, por lo que los resultados de este estudio pueden ser de interés tanto para los países del Océano Índico como para Europa. Entre los 148 hisopos inicialmente negativos para la gripe, ya que no fueron previamente probados para otros virus, el estudio encontró una etiología para 95 hisopos. En total, sólo 53 hisopos, que representan el 24% de la muestra, permanecieron sin etiología con resultados negativos multiplex PCR a lo largo del año. Múltiples hipótesis pueden explicar este resultado: una mala calidad de los hisopos, impidiendo identificar un patógeno, causas no infecciosas u otros patógenos no incluidos en el multiplex PCR. Sin embargo, no pudimos probar los hisopos negativos para ARNse P, un marcador de células humanas, que podría proporcionar un mínimo de seguridad de que el hisopo contenía células humanas. En cuanto a las dos muestras divergentes para la identificación de influenza entre el multiplex y el PCR de un soloplex, las descartamos para el análisis; una fue positiva en Influenza con un soloplex y positiva en PIV con multiplex. Podría ser un resultado falso positivo de un soloplex. De hecho, como el ensayo multiplex de PCR tiene una buena sensibilidad y se considera un estándar dorado, decidimos mantener siete resultados negativos para Influenza en un soloplex y positivo en Influenza en multiplex [7] [8] [9] [10]. No hay ningún caso de pertussis de Bordetella que cause tos ferina y Legionella pneumophila que cause la enfermedad de Legionaires fue identificada en este estudio. Sin embargo, estas enfermedades son raras en Isla Reunión, alrededor de tres casos de enfermedad de Legionaires se declaran cada año. Un límite del estudio es que no se Fue imposible comparar los síntomas clínicos según cada patógeno y saber si existen diferentes patógenos que causen, por ejemplo, rinitis, laringitis o bronquitis (enfermedades incluidas en el ILI). Un estudio prospectivo específico que incluya datos clínicos podría proporcionar elementos útiles en la semiótica de las enfermedades. En conclusión, este estudio destacó una importante circulación de múltiples patógenos en Isla Reunión durante todo el año. Muestra que el ILI no es específico de la gripe y por lo tanto es esencial tener resultados biológicos para establecer el diagnóstico diferencial y así explicar la etiología de los síntomas. Para una mejor comprensión de los patógenos respiratorios que circulan en Isla Reunión, la información de este estudio también puede ser útil para los profesionales que ven a muchos pacientes en consulta con el ILI. Como el uso de multiplex RT-PCR demostró su eficacia en la vigilancia de la ILI y permitió resaltar la circulación de otros virus y causas bacterianas de infecciones respiratorias, ahora se utiliza de forma rutinaria en la vigilancia de la ILI. Además, sería interesante repetir este estudio cada 3 o 5 años añadiendo datos clínicos para monitorear la evolución de los patógenos respiratorios en la Isla Reunión a lo largo del tiempo.

¿En qué se basa la vigilancia clínica y biológica de la gripe?

Etiología de enfermedades similares a la gripe de los profesionales de la red centinela en la isla de Reunión, 2011-2012https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5031398/SHA: f5ff89ebfdd0375d0334c112c6c1c7e163fa69a0cAutores: Brottet, Elise; Jaffar-Bandjee, Marie-Christine; Li-Pat-Yuen, Ghislaine; Filleul, LaurentFecha: 2016-09-21DOI: 10.1371/journal.pone.0163377Licencia: cc-byAbstract: In Réunion Island, a pesar de una vigilancia de gripe establecida desde 1996 por la red de médicos generales centinelas, poco se conoce sobre la e Se estableció un estudio retrospectivo con hisopos nasales recolectados por GP centinelas de pacientes con ILI en 2011 y 2012. Se seleccionaron y analizaron al azar 250 hisopos mediante reacción en cadena multiplex transcriptasa inversa polimerasa (RT-PCR), incluyendo investigación de 18 virus y 4 bacterias. Se detectaron virus respiratorios en 169/222 (76,1%) muestras, principalmente rinovirus (23,4%), virus influenza A (21,2%), virus influenza B (12,6%), coronavirus (4,9%) y metapneumovirus humano (3,6%). Nueve hisopos (5,3% de los hisopos positivos) revelaron coinfecciones con dos virus identificados, entre los cuales seis se referían a coinfecciones con virus influenza. Observamos importantes diferencias estacionales, con circulación de Metapneumovirus humano, RSV A y B y coronavirus sólo durante el verano; mientras que En conclusión, este estudio destaca una circulación sustancial de múltiples patógenos respiratorios en Isla Reunión a lo largo del año. Muestra que ILI no sólo son atribuibles a la gripe y subraya la necesidad de vigilancia biológica. Como el uso de multiplex RT-PCR demostró su eficacia, ahora se utiliza de forma rutinaria en la vigilancia de ILI. Texto: La enfermedad similar a la gripe (ILI) o infecciones respiratorias agudas pueden ser causadas por varios tipos de virus respiratorios o bacterias en humanos [1]. Virus de gripe, virus respiratorios sincitiales (RSV) y virus parainfluenza se identifican como virus principales responsables principalmente de ILI y neumonía en varios estudios [2]. Sin embargo, los profesionales no pueden diagnosticar la infección sin una confirmación biológica de la prueba. Desafortunadamente, estas causas de infecciones se identifican en menos del 50% [3]. La isla de Reunión, un territorio francés de ultramar con 850.000 habitantes, se encuentra en el hemisferio sur entre Madagascar y Mauricio en el Océano Índico (Latitud: 21°05.2920 S Longitud: 55°36.4380 E.). La isla se beneficia de un sistema sanitario similar al de Francia continental y la vigilancia epidemiológica ha sido desarrollada por la oficina regional del Instituto Francés de Vigilancia de la Salud Pública (CIRE OI), basado en el sistema de vigilancia de Francia continental [4]. La actividad de la gripe aumenta generalmente durante el invierno austral, correspondiente al verano en Europa [5]. Desde 2011, la campaña de vacunación contra la gripe en la isla de Reunión comienza en abril y la vacuna utilizada corresponde a las recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud para el hemisferio sur. Desde 1996, la vigilancia clínica y biológica de la gripe se basa en una red de médicos centinelas [6]. Los hisopos nasales son recolectados al azar durante todo el año y son probados por RT-PCR para virus de la gripe. Entre estas muestras de vigilancia, 40 a 50% son testados positivos para virus influenza A, A(H1N1)pdm09 o virus B por el laboratorio virológico del Hospital Universitario Centro de Reunión. Así, las muestras ILI testadas negativas para influenza son de etiología desconocida. Varias herramientas biológicas permiten identificar patógenos respiratorios a partir de hisopos nasales. En los últimos años, se ha desarrollado la reacción en cadena multiplex transcriptasa inversa polimerasa (RT-PCR) para identificar varios virus simultáneamente [7] [8] [9] [10]. Por lo tanto, utilizamos este nuevo método para establecer un estudio retrospectivo utilizando hisopos recolectados por los GP centineles de 2011 a 2012. El principal objetivo de nuestro estudio fue caracterizar patógenos respiratorios responsables de consultas Los objetivos secundarios fueron resaltar las tendencias estacionales en la circulación de patógenos respiratorios y describir la ocurrencia de coinfecciones, especialmente durante la temporada de gripe. Se definió como un inicio súbito de fiebre de más de 38 grados Celsius y tos, asociada o no con otros síntomas como dificultad respiratoria, dolor de cabeza, etc. Cada semana, se animó a todos los médicos de cabecera de la red centinela a recoger un hisopo nasal de los dos primeros pacientes que presentaron ILI desde menos de tres días. Después de ser probados para virus de gripe, los 994 hisopos recogidos en 2011 y 2012 se congelaron a -80°C en el laboratorio del centro hospitalario universitario (CHU). Con base en el presupuesto, se seleccionó aleatoriamente una muestra estratificada por temporada de 250 hisopos para describir virus circulantes incluyendo la temporada de gripe. Se realizó muestreo aleatorio con Excel 1 utilizando la base de datos de El cuadro de muestreo contenía el número de identificación del hisopo asignado por Cire OI, número de identificación de laboratorio, sexo, edad, fecha de inicio de los síntomas, fecha de recogida del hisopo y resultado de la influenza RT-PCR. Utilizamos Respifinder 1 Smart 22 kits un RT-PCR multiplex (PathoFinder, Maastricht, Países Bajos) que puede detectar 22 patógenos respiratorios. Este ensayo se basa en la tecnología de amplificación de la sonda dependiente de la ligadura múltiple (MLPA). Los pasos de transcripción inversa y preamplificación se realizaron en el Mastercycler epgradiente 1 (Eppendorf) y los pasos de hibridación, ligadura y detección en el sistema LightCycler 1 480 (Roche Applied Science). Este método fue elegido por su alta especificidad, en comparación con otros mismos métodos (78% frente a 33%) De este modo, permite destacar la posible presencia de dieciocho virus respiratorios y cuatro bacterias en una sola reacción mediante el análisis de la curva de fusión: Influenza A not (H1N1 Se realizaron análisis estadísticos con Stata 1 y Excel 1. Se definieron dos estaciones para identificar posibles tendencias estacionales en la circulación de los virus: temporada de invierno durante las semanas 23 a 39 entre junio y septiembre y temporada de verano durante el resto del año. Datos y hisopos resultan de un sistema de vigilancia que recibió aprobaciones reglamentarias, incluida la aprobación de la CNIL (Comisión Nacional de Tecnología de la Información y Libertades Civiles No 1592205) en julio de 2012. Todos los pacientes han recibido información oral y han dado su consentimiento para la recolección de hisopos y datos. Los datos fueron recolectados con fines de vigilancia y son totalmente anónimos. De acuerdo con la sensibilidad del ensayo dos muestras podrían ser resultados discordantes entre Influenza PCR inicialmente realizado y Multiplex PCR. Así fueron eliminadas del análisis: una es positiva para Influenza en un soloplex y negativa para todos los patógenos probados en multiplex y otra es positiva para Influenza en un soloplex y positiva para PIV2 en multiplex. En total, se consideraron 222 análisis. Además, 53 muestras fueron negativas para todos los patógenos respiratorios analizados (23,9%) y 169 muestras tenían al menos un patógeno detectado (76,1%), finalmente se identificó un total de 178 patógenos. Durante el período de estudio, una minoría de las semanas (21, es decir, 20%) no incluyó ninguna muestra, principalmente fuera de la estación de la gripe. La relación entre el sexo y el paciente fue 0,63 (86 hombres y 136 mujeres) y la edad media fue 28,4 años [min 0; El 10% tenían menos de 5 años, el 24% 5-15 años, el 63% 15-65 años y sólo el 3% eran mayores de 65 años. Los patógenos respiratorios identificados con mayor frecuencia en los hisopos ILI fueron rinovirus (23,4%), influenza A no H1N1 (21,2%) y gripe B (12,6%). Entre los 22 patógenos respiratorios probados por el multiplex, sólo tres no se encontraron en ninguna muestra analizada: Parainfluenza3, Legionella pneumophila y Bordetella pertussis. En cuanto a las coinfecciones, nueve hisopos revelaron la presencia de dos virus, entre los cuales6 involucraban virus de gripe (tabla 2). Los análisis mostraron que algunos virus son posiblemente estacionales y circulaban durante un período específico del año. Para este último, es específico del período estudiado desde que el virus influenza A(H1N1)pdm09 reapareció en la Isla Reunión en octubre de 2012 y ya no circulaba desde finales de 2010. Por el contrario, se identificaron parainfluenza 1,2 y 4 virus sólo en invierno. Para otros patógenos, no se observó ningún período específico de detección. Se realizó una descripción semanal de muestras para estudiar la distribución de patógenos respiratorios en 2011 y 2012 (Fig 1). Los resultados de los análisis biológicos se compararon con los datos de las consultas ILI declaradas por los GP centinelas en 2011 y 2012. Se observó en 2011, después de una primera ola en junio principalmente debido al virus influenza A no H1N1, una segunda ola de consultas ILI con identificación principalmente de virus de parainfluenza y no virus de gripe. En 2012, la segunda ola epidémica al final del invierno austral coincidió con En cuanto a los hisopos negativos (Fig 2), no se observó estacionalidad durante el periodo de estudio con una proporción similar sea cual sea la temporada. Este estudio retrospectivo basado en una red de GP centinelas mostró que no sólo los virus de la gripe son responsables de las consultas ILI. De hecho, se observó una importante circulación de múltiples patógenos a lo largo del año, con 12 tipos diferentes de patógenos identificados en 2011 y 2012. Los patógenos virales respiratorios estuvieron presentes en 76,1% de las muestras, lo que es ampliamente superior a los resultados de la vigilancia anual de la gripe [12]. Después de los virus de la gripe, Rhinovirus y Coronavirus fueron los virus respiratorios más comunes en Isla Reunión. Aunque no se tomaron muestras cada semana, la muestra fue representativa de la actividad ILI y consistente con la temporada de gripe. Sin embargo, según el bajo número de muestras, es difícil concluir acerca de la esta Este estudio también destacó varias coinfecciones, mostrando que concomitantemente la etiología múltiple de la ILI. La cocirculación ya se observó en Isla Reunión durante la pandemia de A(H1N1) pdm09, además del virus influenza, con la identificación de otros virus respiratorios como Rhinovirus o Coronavirus [14]. En Francia continental, durante esta pandemia, se encontró la circulación de virus respiratorios mayores, como Rhinovirus, Parainfluenza, Coronavirus, Metaneumovirus Humano, como en nuestra publicación [15] [16]. En nuestro estudio, sólo el 5,3% de los hisopos positivos fueron coinfecciones, mientras que en dos estudios en Madagascar las coinfecciones representaron 27,3% y 29,4% [17] [18]. A pesar de la distancia de 9.300 km entre la Reunión y Francia, la isla está directamente conectada a Europa con cuatro vuelos diarios a Francia. Estos intercambios pueden afectar a la circulación de patógenos respiratorios en el hemisferio sur y norte, por lo que los resultados de este estudio pueden ser de interés tanto para los países del Océano Índico como para Europa. Entre los 148 hisopos inicialmente negativos para la gripe, ya que no fueron previamente probados para otros virus, el estudio encontró una etiología para 95 hisopos. En total, sólo 53 hisopos, que representan el 24% de la muestra, permanecieron sin etiología con resultados negativos multiplex PCR a lo largo del año. Múltiples hipótesis pueden explicar este resultado: una mala calidad de los hisopos, impidiendo identificar un patógeno, causas no infecciosas u otros patógenos no incluidos en el multiplex PCR. Sin embargo, no pudimos probar los hisopos negativos para ARNse P, un marcador de células humanas, que podría proporcionar un mínimo de seguridad de que el hisopo contenía células humanas. En cuanto a las dos muestras divergentes para la identificación de influenza entre el multiplex y el PCR de un soloplex, las descartamos para el análisis; una fue positiva en Influenza con un soloplex y positiva en PIV con multiplex. Podría ser un resultado falso positivo de un soloplex. De hecho, como el ensayo multiplex de PCR tiene una buena sensibilidad y se considera un estándar dorado, decidimos mantener siete resultados negativos para Influenza en un soloplex y positivo en Influenza en multiplex [7] [8] [9] [10]. No hay ningún caso de pertussis de Bordetella que cause tos ferina y Legionella pneumophila que cause la enfermedad de Legionaires fue identificada en este estudio. Sin embargo, estas enfermedades son raras en Isla Reunión, alrededor de tres casos de enfermedad de Legionaires se declaran cada año. Un límite del estudio es que no se Fue imposible comparar los síntomas clínicos según cada patógeno y saber si existen diferentes patógenos que causen, por ejemplo, rinitis, laringitis o bronquitis (enfermedades incluidas en el ILI). Un estudio prospectivo específico que incluya datos clínicos podría proporcionar elementos útiles en la semiótica de las enfermedades. En conclusión, este estudio destacó una importante circulación de múltiples patógenos en Isla Reunión durante todo el año. Muestra que el ILI no es específico de la gripe y por lo tanto es esencial tener resultados biológicos para establecer el diagnóstico diferencial y así explicar la etiología de los síntomas. Para una mejor comprensión de los patógenos respiratorios que circulan en Isla Reunión, la información de este estudio también puede ser útil para los profesionales que ven a muchos pacientes en consulta con el ILI. Como el uso de multiplex RT-PCR demostró su eficacia en la vigilancia de la ILI y permitió resaltar la circulación de otros virus y causas bacterianas de infecciones respiratorias, ahora se utiliza de forma rutinaria en la vigilancia de la ILI. Además, sería interesante repetir este estudio cada 3 o 5 años añadiendo datos clínicos para monitorear la evolución de los patógenos respiratorios en la Isla Reunión a lo largo del tiempo.

¿Cuáles son las muestras ILI que dan negativo para la influencia?

Etiología de enfermedades similares a la gripe de los profesionales de la red centinela en la isla de Reunión, 2011-2012https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5031398/SHA: f5ff89ebfdd0375d0334c112c6c1c7e163fa69a0cAutores: Brottet, Elise; Jaffar-Bandjee, Marie-Christine; Li-Pat-Yuen, Ghislaine; Filleul, LaurentFecha: 2016-09-21DOI: 10.1371/journal.pone.0163377Licencia: cc-byAbstract: In Réunion Island, a pesar de una vigilancia de gripe establecida desde 1996 por la red de médicos generales centinelas, poco se conoce sobre la e Se estableció un estudio retrospectivo con hisopos nasales recolectados por GP centinelas de pacientes con ILI en 2011 y 2012. Se seleccionaron y analizaron al azar 250 hisopos mediante reacción en cadena multiplex transcriptasa inversa polimerasa (RT-PCR), incluyendo investigación de 18 virus y 4 bacterias. Se detectaron virus respiratorios en 169/222 (76,1%) muestras, principalmente rinovirus (23,4%), virus influenza A (21,2%), virus influenza B (12,6%), coronavirus (4,9%) y metapneumovirus humano (3,6%). Nueve hisopos (5,3% de los hisopos positivos) revelaron coinfecciones con dos virus identificados, entre los cuales seis se referían a coinfecciones con virus influenza. Observamos importantes diferencias estacionales, con circulación de Metapneumovirus humano, RSV A y B y coronavirus sólo durante el verano; mientras que En conclusión, este estudio destaca una circulación sustancial de múltiples patógenos respiratorios en Isla Reunión a lo largo del año. Muestra que ILI no sólo son atribuibles a la gripe y subraya la necesidad de vigilancia biológica. Como el uso de multiplex RT-PCR demostró su eficacia, ahora se utiliza de forma rutinaria en la vigilancia de ILI. Texto: La enfermedad similar a la gripe (ILI) o infecciones respiratorias agudas pueden ser causadas por varios tipos de virus respiratorios o bacterias en humanos [1]. Virus de gripe, virus respiratorios sincitiales (RSV) y virus parainfluenza se identifican como virus principales responsables principalmente de ILI y neumonía en varios estudios [2]. Sin embargo, los profesionales no pueden diagnosticar la infección sin una confirmación biológica de la prueba. Desafortunadamente, estas causas de infecciones se identifican en menos del 50% [3]. La isla de Reunión, un territorio francés de ultramar con 850.000 habitantes, se encuentra en el hemisferio sur entre Madagascar y Mauricio en el Océano Índico (Latitud: 21°05.2920 S Longitud: 55°36.4380 E.). La isla se beneficia de un sistema sanitario similar al de Francia continental y la vigilancia epidemiológica ha sido desarrollada por la oficina regional del Instituto Francés de Vigilancia de la Salud Pública (CIRE OI), basado en el sistema de vigilancia de Francia continental [4]. La actividad de la gripe aumenta generalmente durante el invierno austral, correspondiente al verano en Europa [5]. Desde 2011, la campaña de vacunación contra la gripe en la isla de Reunión comienza en abril y la vacuna utilizada corresponde a las recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud para el hemisferio sur. Desde 1996, la vigilancia clínica y biológica de la gripe se basa en una red de médicos centinelas [6]. Los hisopos nasales son recolectados al azar durante todo el año y son probados por RT-PCR para virus de la gripe. Entre estas muestras de vigilancia, 40 a 50% son testados positivos para virus influenza A, A(H1N1)pdm09 o virus B por el laboratorio virológico del Hospital Universitario Centro de Reunión. Así, las muestras ILI testadas negativas para influenza son de etiología desconocida. Varias herramientas biológicas permiten identificar patógenos respiratorios a partir de hisopos nasales. En los últimos años, se ha desarrollado la reacción en cadena multiplex transcriptasa inversa polimerasa (RT-PCR) para identificar varios virus simultáneamente [7] [8] [9] [10]. Por lo tanto, utilizamos este nuevo método para establecer un estudio retrospectivo utilizando hisopos recolectados por los GP centineles de 2011 a 2012. El principal objetivo de nuestro estudio fue caracterizar patógenos respiratorios responsables de consultas Los objetivos secundarios fueron resaltar las tendencias estacionales en la circulación de patógenos respiratorios y describir la ocurrencia de coinfecciones, especialmente durante la temporada de gripe. Se definió como un inicio súbito de fiebre de más de 38 grados Celsius y tos, asociada o no con otros síntomas como dificultad respiratoria, dolor de cabeza, etc. Cada semana, se animó a todos los médicos de cabecera de la red centinela a recoger un hisopo nasal de los dos primeros pacientes que presentaron ILI desde menos de tres días. Después de ser probados para virus de gripe, los 994 hisopos recogidos en 2011 y 2012 se congelaron a -80°C en el laboratorio del centro hospitalario universitario (CHU). Con base en el presupuesto, se seleccionó aleatoriamente una muestra estratificada por temporada de 250 hisopos para describir virus circulantes incluyendo la temporada de gripe. Se realizó muestreo aleatorio con Excel 1 utilizando la base de datos de El cuadro de muestreo contenía el número de identificación del hisopo asignado por Cire OI, número de identificación de laboratorio, sexo, edad, fecha de inicio de los síntomas, fecha de recogida del hisopo y resultado de la influenza RT-PCR. Utilizamos Respifinder 1 Smart 22 kits un RT-PCR multiplex (PathoFinder, Maastricht, Países Bajos) que puede detectar 22 patógenos respiratorios. Este ensayo se basa en la tecnología de amplificación de la sonda dependiente de la ligadura múltiple (MLPA). Los pasos de transcripción inversa y preamplificación se realizaron en el Mastercycler epgradiente 1 (Eppendorf) y los pasos de hibridación, ligadura y detección en el sistema LightCycler 1 480 (Roche Applied Science). Este método fue elegido por su alta especificidad, en comparación con otros mismos métodos (78% frente a 33%) De este modo, permite destacar la posible presencia de dieciocho virus respiratorios y cuatro bacterias en una sola reacción mediante el análisis de la curva de fusión: Influenza A not (H1N1 Se realizaron análisis estadísticos con Stata 1 y Excel 1. Se definieron dos estaciones para identificar posibles tendencias estacionales en la circulación de los virus: temporada de invierno durante las semanas 23 a 39 entre junio y septiembre y temporada de verano durante el resto del año. Datos y hisopos resultan de un sistema de vigilancia que recibió aprobaciones reglamentarias, incluida la aprobación de la CNIL (Comisión Nacional de Tecnología de la Información y Libertades Civiles No 1592205) en julio de 2012. Todos los pacientes han recibido información oral y han dado su consentimiento para la recolección de hisopos y datos. Los datos fueron recolectados con fines de vigilancia y son totalmente anónimos. De acuerdo con la sensibilidad del ensayo dos muestras podrían ser resultados discordantes entre Influenza PCR inicialmente realizado y Multiplex PCR. Así fueron eliminadas del análisis: una es positiva para Influenza en un soloplex y negativa para todos los patógenos probados en multiplex y otra es positiva para Influenza en un soloplex y positiva para PIV2 en multiplex. En total, se consideraron 222 análisis. Además, 53 muestras fueron negativas para todos los patógenos respiratorios analizados (23,9%) y 169 muestras tenían al menos un patógeno detectado (76,1%), finalmente se identificó un total de 178 patógenos. Durante el período de estudio, una minoría de las semanas (21, es decir, 20%) no incluyó ninguna muestra, principalmente fuera de la estación de la gripe. La relación entre el sexo y el paciente fue 0,63 (86 hombres y 136 mujeres) y la edad media fue 28,4 años [min 0; El 10% tenían menos de 5 años, el 24% 5-15 años, el 63% 15-65 años y sólo el 3% eran mayores de 65 años. Los patógenos respiratorios identificados con mayor frecuencia en los hisopos ILI fueron rinovirus (23,4%), influenza A no H1N1 (21,2%) y gripe B (12,6%). Entre los 22 patógenos respiratorios probados por el multiplex, sólo tres no se encontraron en ninguna muestra analizada: Parainfluenza3, Legionella pneumophila y Bordetella pertussis. En cuanto a las coinfecciones, nueve hisopos revelaron la presencia de dos virus, entre los cuales6 involucraban virus de gripe (tabla 2). Los análisis mostraron que algunos virus son posiblemente estacionales y circulaban durante un período específico del año. Para este último, es específico del período estudiado desde que el virus influenza A(H1N1)pdm09 reapareció en la Isla Reunión en octubre de 2012 y ya no circulaba desde finales de 2010. Por el contrario, se identificaron parainfluenza 1,2 y 4 virus sólo en invierno. Para otros patógenos, no se observó ningún período específico de detección. Se realizó una descripción semanal de muestras para estudiar la distribución de patógenos respiratorios en 2011 y 2012 (Fig 1). Los resultados de los análisis biológicos se compararon con los datos de las consultas ILI declaradas por los GP centinelas en 2011 y 2012. Se observó en 2011, después de una primera ola en junio principalmente debido al virus influenza A no H1N1, una segunda ola de consultas ILI con identificación principalmente de virus de parainfluenza y no virus de gripe. En 2012, la segunda ola epidémica al final del invierno austral coincidió con En cuanto a los hisopos negativos (Fig 2), no se observó estacionalidad durante el periodo de estudio con una proporción similar sea cual sea la temporada. Este estudio retrospectivo basado en una red de GP centinelas mostró que no sólo los virus de la gripe son responsables de las consultas ILI. De hecho, se observó una importante circulación de múltiples patógenos a lo largo del año, con 12 tipos diferentes de patógenos identificados en 2011 y 2012. Los patógenos virales respiratorios estuvieron presentes en 76,1% de las muestras, lo que es ampliamente superior a los resultados de la vigilancia anual de la gripe [12]. Después de los virus de la gripe, Rhinovirus y Coronavirus fueron los virus respiratorios más comunes en Isla Reunión. Aunque no se tomaron muestras cada semana, la muestra fue representativa de la actividad ILI y consistente con la temporada de gripe. Sin embargo, según el bajo número de muestras, es difícil concluir acerca de la esta Este estudio también destacó varias coinfecciones, mostrando que concomitantemente la etiología múltiple de la ILI. La cocirculación ya se observó en Isla Reunión durante la pandemia de A(H1N1) pdm09, además del virus influenza, con la identificación de otros virus respiratorios como Rhinovirus o Coronavirus [14]. En Francia continental, durante esta pandemia, se encontró la circulación de virus respiratorios mayores, como Rhinovirus, Parainfluenza, Coronavirus, Metaneumovirus Humano, como en nuestra publicación [15] [16]. En nuestro estudio, sólo el 5,3% de los hisopos positivos fueron coinfecciones, mientras que en dos estudios en Madagascar las coinfecciones representaron 27,3% y 29,4% [17] [18]. A pesar de la distancia de 9.300 km entre la Reunión y Francia, la isla está directamente conectada a Europa con cuatro vuelos diarios a Francia. Estos intercambios pueden afectar a la circulación de patógenos respiratorios en el hemisferio sur y norte, por lo que los resultados de este estudio pueden ser de interés tanto para los países del Océano Índico como para Europa. Entre los 148 hisopos inicialmente negativos para la gripe, ya que no fueron previamente probados para otros virus, el estudio encontró una etiología para 95 hisopos. En total, sólo 53 hisopos, que representan el 24% de la muestra, permanecieron sin etiología con resultados negativos multiplex PCR a lo largo del año. Múltiples hipótesis pueden explicar este resultado: una mala calidad de los hisopos, impidiendo identificar un patógeno, causas no infecciosas u otros patógenos no incluidos en el multiplex PCR. Sin embargo, no pudimos probar los hisopos negativos para ARNse P, un marcador de células humanas, que podría proporcionar un mínimo de seguridad de que el hisopo contenía células humanas. En cuanto a las dos muestras divergentes para la identificación de influenza entre el multiplex y el PCR de un soloplex, las descartamos para el análisis; una fue positiva en Influenza con un soloplex y positiva en PIV con multiplex. Podría ser un resultado falso positivo de un soloplex. De hecho, como el ensayo multiplex de PCR tiene una buena sensibilidad y se considera un estándar dorado, decidimos mantener siete resultados negativos para Influenza en un soloplex y positivo en Influenza en multiplex [7] [8] [9] [10]. No hay ningún caso de pertussis de Bordetella que cause tos ferina y Legionella pneumophila que cause la enfermedad de Legionaires fue identificada en este estudio. Sin embargo, estas enfermedades son raras en Isla Reunión, alrededor de tres casos de enfermedad de Legionaires se declaran cada año. Un límite del estudio es que no se Fue imposible comparar los síntomas clínicos según cada patógeno y saber si existen diferentes patógenos que causen, por ejemplo, rinitis, laringitis o bronquitis (enfermedades incluidas en el ILI). Un estudio prospectivo específico que incluya datos clínicos podría proporcionar elementos útiles en la semiótica de las enfermedades. En conclusión, este estudio destacó una importante circulación de múltiples patógenos en Isla Reunión durante todo el año. Muestra que el ILI no es específico de la gripe y por lo tanto es esencial tener resultados biológicos para establecer el diagnóstico diferencial y así explicar la etiología de los síntomas. Para una mejor comprensión de los patógenos respiratorios que circulan en Isla Reunión, la información de este estudio también puede ser útil para los profesionales que ven a muchos pacientes en consulta con el ILI. Como el uso de multiplex RT-PCR demostró su eficacia en la vigilancia de la ILI y permitió resaltar la circulación de otros virus y causas bacterianas de infecciones respiratorias, ahora se utiliza de forma rutinaria en la vigilancia de la ILI. Además, sería interesante repetir este estudio cada 3 o 5 años añadiendo datos clínicos para monitorear la evolución de los patógenos respiratorios en la Isla Reunión a lo largo del tiempo.

¿Qué dos estaciones se identificaron para las tendencias en la circulación del virus??

Etiología de enfermedades similares a la gripe de los profesionales de la red centinela en la isla de Reunión, 2011-2012https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5031398/SHA: f5ff89ebfdd0375d0334c112c6c1c7e163fa69a0cAutores: Brottet, Elise; Jaffar-Bandjee, Marie-Christine; Li-Pat-Yuen, Ghislaine; Filleul, LaurentFecha: 2016-09-21DOI: 10.1371/journal.pone.0163377Licencia: cc-byAbstract: In Réunion Island, a pesar de una vigilancia de gripe establecida desde 1996 por la red de médicos generales centinelas, poco se conoce sobre la e Se estableció un estudio retrospectivo con hisopos nasales recolectados por GP centinelas de pacientes con ILI en 2011 y 2012. Se seleccionaron y analizaron al azar 250 hisopos mediante reacción en cadena multiplex transcriptasa inversa polimerasa (RT-PCR), incluyendo investigación de 18 virus y 4 bacterias. Se detectaron virus respiratorios en 169/222 (76,1%) muestras, principalmente rinovirus (23,4%), virus influenza A (21,2%), virus influenza B (12,6%), coronavirus (4,9%) y metapneumovirus humano (3,6%). Nueve hisopos (5,3% de los hisopos positivos) revelaron coinfecciones con dos virus identificados, entre los cuales seis se referían a coinfecciones con virus influenza. Observamos importantes diferencias estacionales, con circulación de Metapneumovirus humano, RSV A y B y coronavirus sólo durante el verano; mientras que En conclusión, este estudio destaca una circulación sustancial de múltiples patógenos respiratorios en Isla Reunión a lo largo del año. Muestra que ILI no sólo son atribuibles a la gripe y subraya la necesidad de vigilancia biológica. Como el uso de multiplex RT-PCR demostró su eficacia, ahora se utiliza de forma rutinaria en la vigilancia de ILI. Texto: La enfermedad similar a la gripe (ILI) o infecciones respiratorias agudas pueden ser causadas por varios tipos de virus respiratorios o bacterias en humanos [1]. Virus de gripe, virus respiratorios sincitiales (RSV) y virus parainfluenza se identifican como virus principales responsables principalmente de ILI y neumonía en varios estudios [2]. Sin embargo, los profesionales no pueden diagnosticar la infección sin una confirmación biológica de la prueba. Desafortunadamente, estas causas de infecciones se identifican en menos del 50% [3]. La isla de Reunión, un territorio francés de ultramar con 850.000 habitantes, se encuentra en el hemisferio sur entre Madagascar y Mauricio en el Océano Índico (Latitud: 21°05.2920 S Longitud: 55°36.4380 E.). La isla se beneficia de un sistema sanitario similar al de Francia continental y la vigilancia epidemiológica ha sido desarrollada por la oficina regional del Instituto Francés de Vigilancia de la Salud Pública (CIRE OI), basado en el sistema de vigilancia de Francia continental [4]. La actividad de la gripe aumenta generalmente durante el invierno austral, correspondiente al verano en Europa [5]. Desde 2011, la campaña de vacunación contra la gripe en la isla de Reunión comienza en abril y la vacuna utilizada corresponde a las recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud para el hemisferio sur. Desde 1996, la vigilancia clínica y biológica de la gripe se basa en una red de médicos centinelas [6]. Los hisopos nasales son recolectados al azar durante todo el año y son probados por RT-PCR para virus de la gripe. Entre estas muestras de vigilancia, 40 a 50% son testados positivos para virus influenza A, A(H1N1)pdm09 o virus B por el laboratorio virológico del Hospital Universitario Centro de Reunión. Así, las muestras ILI testadas negativas para influenza son de etiología desconocida. Varias herramientas biológicas permiten identificar patógenos respiratorios a partir de hisopos nasales. En los últimos años, se ha desarrollado la reacción en cadena multiplex transcriptasa inversa polimerasa (RT-PCR) para identificar varios virus simultáneamente [7] [8] [9] [10]. Por lo tanto, utilizamos este nuevo método para establecer un estudio retrospectivo utilizando hisopos recolectados por los GP centineles de 2011 a 2012. El principal objetivo de nuestro estudio fue caracterizar patógenos respiratorios responsables de consultas Los objetivos secundarios fueron resaltar las tendencias estacionales en la circulación de patógenos respiratorios y describir la ocurrencia de coinfecciones, especialmente durante la temporada de gripe. Se definió como un inicio súbito de fiebre de más de 38 grados Celsius y tos, asociada o no con otros síntomas como dificultad respiratoria, dolor de cabeza, etc. Cada semana, se animó a todos los médicos de cabecera de la red centinela a recoger un hisopo nasal de los dos primeros pacientes que presentaron ILI desde menos de tres días. Después de ser probados para virus de gripe, los 994 hisopos recogidos en 2011 y 2012 se congelaron a -80°C en el laboratorio del centro hospitalario universitario (CHU). Con base en el presupuesto, se seleccionó aleatoriamente una muestra estratificada por temporada de 250 hisopos para describir virus circulantes incluyendo la temporada de gripe. Se realizó muestreo aleatorio con Excel 1 utilizando la base de datos de El cuadro de muestreo contenía el número de identificación del hisopo asignado por Cire OI, número de identificación de laboratorio, sexo, edad, fecha de inicio de los síntomas, fecha de recogida del hisopo y resultado de la influenza RT-PCR. Utilizamos Respifinder 1 Smart 22 kits un RT-PCR multiplex (PathoFinder, Maastricht, Países Bajos) que puede detectar 22 patógenos respiratorios. Este ensayo se basa en la tecnología de amplificación de la sonda dependiente de la ligadura múltiple (MLPA). Los pasos de transcripción inversa y preamplificación se realizaron en el Mastercycler epgradiente 1 (Eppendorf) y los pasos de hibridación, ligadura y detección en el sistema LightCycler 1 480 (Roche Applied Science). Este método fue elegido por su alta especificidad, en comparación con otros mismos métodos (78% frente a 33%) De este modo, permite destacar la posible presencia de dieciocho virus respiratorios y cuatro bacterias en una sola reacción mediante el análisis de la curva de fusión: Influenza A not (H1N1 Se realizaron análisis estadísticos con Stata 1 y Excel 1. Se definieron dos estaciones para identificar posibles tendencias estacionales en la circulación de los virus: temporada de invierno durante las semanas 23 a 39 entre junio y septiembre y temporada de verano durante el resto del año. Datos y hisopos resultan de un sistema de vigilancia que recibió aprobaciones reglamentarias, incluida la aprobación de la CNIL (Comisión Nacional de Tecnología de la Información y Libertades Civiles No 1592205) en julio de 2012. Todos los pacientes han recibido información oral y han dado su consentimiento para la recolección de hisopos y datos. Los datos fueron recolectados con fines de vigilancia y son totalmente anónimos. De acuerdo con la sensibilidad del ensayo dos muestras podrían ser resultados discordantes entre Influenza PCR inicialmente realizado y Multiplex PCR. Así fueron eliminadas del análisis: una es positiva para Influenza en un soloplex y negativa para todos los patógenos probados en multiplex y otra es positiva para Influenza en un soloplex y positiva para PIV2 en multiplex. En total, se consideraron 222 análisis. Además, 53 muestras fueron negativas para todos los patógenos respiratorios analizados (23,9%) y 169 muestras tenían al menos un patógeno detectado (76,1%), finalmente se identificó un total de 178 patógenos. Durante el período de estudio, una minoría de las semanas (21, es decir, 20%) no incluyó ninguna muestra, principalmente fuera de la estación de la gripe. La relación entre el sexo y el paciente fue 0,63 (86 hombres y 136 mujeres) y la edad media fue 28,4 años [min 0; El 10% tenían menos de 5 años, el 24% 5-15 años, el 63% 15-65 años y sólo el 3% eran mayores de 65 años. Los patógenos respiratorios identificados con mayor frecuencia en los hisopos ILI fueron rinovirus (23,4%), influenza A no H1N1 (21,2%) y gripe B (12,6%). Entre los 22 patógenos respiratorios probados por el multiplex, sólo tres no se encontraron en ninguna muestra analizada: Parainfluenza3, Legionella pneumophila y Bordetella pertussis. En cuanto a las coinfecciones, nueve hisopos revelaron la presencia de dos virus, entre los cuales6 involucraban virus de gripe (tabla 2). Los análisis mostraron que algunos virus son posiblemente estacionales y circulaban durante un período específico del año. Para este último, es específico del período estudiado desde que el virus influenza A(H1N1)pdm09 reapareció en la Isla Reunión en octubre de 2012 y ya no circulaba desde finales de 2010. Por el contrario, se identificaron parainfluenza 1,2 y 4 virus sólo en invierno. Para otros patógenos, no se observó ningún período específico de detección. Se realizó una descripción semanal de muestras para estudiar la distribución de patógenos respiratorios en 2011 y 2012 (Fig 1). Los resultados de los análisis biológicos se compararon con los datos de las consultas ILI declaradas por los GP centinelas en 2011 y 2012. Se observó en 2011, después de una primera ola en junio principalmente debido al virus influenza A no H1N1, una segunda ola de consultas ILI con identificación principalmente de virus de parainfluenza y no virus de gripe. En 2012, la segunda ola epidémica al final del invierno austral coincidió con En cuanto a los hisopos negativos (Fig 2), no se observó estacionalidad durante el periodo de estudio con una proporción similar sea cual sea la temporada. Este estudio retrospectivo basado en una red de GP centinelas mostró que no sólo los virus de la gripe son responsables de las consultas ILI. De hecho, se observó una importante circulación de múltiples patógenos a lo largo del año, con 12 tipos diferentes de patógenos identificados en 2011 y 2012. Los patógenos virales respiratorios estuvieron presentes en 76,1% de las muestras, lo que es ampliamente superior a los resultados de la vigilancia anual de la gripe [12]. Después de los virus de la gripe, Rhinovirus y Coronavirus fueron los virus respiratorios más comunes en Isla Reunión. Aunque no se tomaron muestras cada semana, la muestra fue representativa de la actividad ILI y consistente con la temporada de gripe. Sin embargo, según el bajo número de muestras, es difícil concluir acerca de la esta Este estudio también destacó varias coinfecciones, mostrando que concomitantemente la etiología múltiple de la ILI. La cocirculación ya se observó en Isla Reunión durante la pandemia de A(H1N1) pdm09, además del virus influenza, con la identificación de otros virus respiratorios como Rhinovirus o Coronavirus [14]. En Francia continental, durante esta pandemia, se encontró la circulación de virus respiratorios mayores, como Rhinovirus, Parainfluenza, Coronavirus, Metaneumovirus Humano, como en nuestra publicación [15] [16]. En nuestro estudio, sólo el 5,3% de los hisopos positivos fueron coinfecciones, mientras que en dos estudios en Madagascar las coinfecciones representaron 27,3% y 29,4% [17] [18]. A pesar de la distancia de 9.300 km entre la Reunión y Francia, la isla está directamente conectada a Europa con cuatro vuelos diarios a Francia. Estos intercambios pueden afectar a la circulación de patógenos respiratorios en el hemisferio sur y norte, por lo que los resultados de este estudio pueden ser de interés tanto para los países del Océano Índico como para Europa. Entre los 148 hisopos inicialmente negativos para la gripe, ya que no fueron previamente probados para otros virus, el estudio encontró una etiología para 95 hisopos. En total, sólo 53 hisopos, que representan el 24% de la muestra, permanecieron sin etiología con resultados negativos multiplex PCR a lo largo del año. Múltiples hipótesis pueden explicar este resultado: una mala calidad de los hisopos, impidiendo identificar un patógeno, causas no infecciosas u otros patógenos no incluidos en el multiplex PCR. Sin embargo, no pudimos probar los hisopos negativos para ARNse P, un marcador de células humanas, que podría proporcionar un mínimo de seguridad de que el hisopo contenía células humanas. En cuanto a las dos muestras divergentes para la identificación de influenza entre el multiplex y el PCR de un soloplex, las descartamos para el análisis; una fue positiva en Influenza con un soloplex y positiva en PIV con multiplex. Podría ser un resultado falso positivo de un soloplex. De hecho, como el ensayo multiplex de PCR tiene una buena sensibilidad y se considera un estándar dorado, decidimos mantener siete resultados negativos para Influenza en un soloplex y positivo en Influenza en multiplex [7] [8] [9] [10]. No hay ningún caso de pertussis de Bordetella que cause tos ferina y Legionella pneumophila que cause la enfermedad de Legionaires fue identificada en este estudio. Sin embargo, estas enfermedades son raras en Isla Reunión, alrededor de tres casos de enfermedad de Legionaires se declaran cada año. Un límite del estudio es que no se Fue imposible comparar los síntomas clínicos según cada patógeno y saber si existen diferentes patógenos que causen, por ejemplo, rinitis, laringitis o bronquitis (enfermedades incluidas en el ILI). Un estudio prospectivo específico que incluya datos clínicos podría proporcionar elementos útiles en la semiótica de las enfermedades. En conclusión, este estudio destacó una importante circulación de múltiples patógenos en Isla Reunión durante todo el año. Muestra que el ILI no es específico de la gripe y por lo tanto es esencial tener resultados biológicos para establecer el diagnóstico diferencial y así explicar la etiología de los síntomas. Para una mejor comprensión de los patógenos respiratorios que circulan en Isla Reunión, la información de este estudio también puede ser útil para los profesionales que ven a muchos pacientes en consulta con el ILI. Como el uso de multiplex RT-PCR demostró su eficacia en la vigilancia de la ILI y permitió resaltar la circulación de otros virus y causas bacterianas de infecciones respiratorias, ahora se utiliza de forma rutinaria en la vigilancia de la ILI. Además, sería interesante repetir este estudio cada 3 o 5 años añadiendo datos clínicos para monitorear la evolución de los patógenos respiratorios en la Isla Reunión a lo largo del tiempo.

Patógenos virales respiratorios estaban presentes en qué porcentaje de muestras?

Etiología de enfermedades similares a la gripe de los profesionales de la red centinela en la isla de Reunión, 2011-2012https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5031398/SHA: f5ff89ebfdd0375d0334c112c6c1c7e163fa69a0cAutores: Brottet, Elise; Jaffar-Bandjee, Marie-Christine; Li-Pat-Yuen, Ghislaine; Filleul, LaurentFecha: 2016-09-21DOI: 10.1371/journal.pone.0163377Licencia: cc-byAbstract: In Réunion Island, a pesar de una vigilancia de gripe establecida desde 1996 por la red de médicos generales centinelas, poco se conoce sobre la e Se estableció un estudio retrospectivo con hisopos nasales recolectados por GP centinelas de pacientes con ILI en 2011 y 2012. Se seleccionaron y analizaron al azar 250 hisopos mediante reacción en cadena multiplex transcriptasa inversa polimerasa (RT-PCR), incluyendo investigación de 18 virus y 4 bacterias. Se detectaron virus respiratorios en 169/222 (76,1%) muestras, principalmente rinovirus (23,4%), virus influenza A (21,2%), virus influenza B (12,6%), coronavirus (4,9%) y metapneumovirus humano (3,6%). Nueve hisopos (5,3% de los hisopos positivos) revelaron coinfecciones con dos virus identificados, entre los cuales seis se referían a coinfecciones con virus influenza. Observamos importantes diferencias estacionales, con circulación de Metapneumovirus humano, RSV A y B y coronavirus sólo durante el verano; mientras que En conclusión, este estudio destaca una circulación sustancial de múltiples patógenos respiratorios en Isla Reunión a lo largo del año. Muestra que ILI no sólo son atribuibles a la gripe y subraya la necesidad de vigilancia biológica. Como el uso de multiplex RT-PCR demostró su eficacia, ahora se utiliza de forma rutinaria en la vigilancia de ILI. Texto: La enfermedad similar a la gripe (ILI) o infecciones respiratorias agudas pueden ser causadas por varios tipos de virus respiratorios o bacterias en humanos [1]. Virus de gripe, virus respiratorios sincitiales (RSV) y virus parainfluenza se identifican como virus principales responsables principalmente de ILI y neumonía en varios estudios [2]. Sin embargo, los profesionales no pueden diagnosticar la infección sin una confirmación biológica de la prueba. Desafortunadamente, estas causas de infecciones se identifican en menos del 50% [3]. La isla de Reunión, un territorio francés de ultramar con 850.000 habitantes, se encuentra en el hemisferio sur entre Madagascar y Mauricio en el Océano Índico (Latitud: 21°05.2920 S Longitud: 55°36.4380 E.). La isla se beneficia de un sistema sanitario similar al de Francia continental y la vigilancia epidemiológica ha sido desarrollada por la oficina regional del Instituto Francés de Vigilancia de la Salud Pública (CIRE OI), basado en el sistema de vigilancia de Francia continental [4]. La actividad de la gripe aumenta generalmente durante el invierno austral, correspondiente al verano en Europa [5]. Desde 2011, la campaña de vacunación contra la gripe en la isla de Reunión comienza en abril y la vacuna utilizada corresponde a las recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud para el hemisferio sur. Desde 1996, la vigilancia clínica y biológica de la gripe se basa en una red de médicos centinelas [6]. Los hisopos nasales son recolectados al azar durante todo el año y son probados por RT-PCR para virus de la gripe. Entre estas muestras de vigilancia, 40 a 50% son testados positivos para virus influenza A, A(H1N1)pdm09 o virus B por el laboratorio virológico del Hospital Universitario Centro de Reunión. Así, las muestras ILI testadas negativas para influenza son de etiología desconocida. Varias herramientas biológicas permiten identificar patógenos respiratorios a partir de hisopos nasales. En los últimos años, se ha desarrollado la reacción en cadena multiplex transcriptasa inversa polimerasa (RT-PCR) para identificar varios virus simultáneamente [7] [8] [9] [10]. Por lo tanto, utilizamos este nuevo método para establecer un estudio retrospectivo utilizando hisopos recolectados por los GP centineles de 2011 a 2012. El principal objetivo de nuestro estudio fue caracterizar patógenos respiratorios responsables de consultas Los objetivos secundarios fueron resaltar las tendencias estacionales en la circulación de patógenos respiratorios y describir la ocurrencia de coinfecciones, especialmente durante la temporada de gripe. Se definió como un inicio súbito de fiebre de más de 38 grados Celsius y tos, asociada o no con otros síntomas como dificultad respiratoria, dolor de cabeza, etc. Cada semana, se animó a todos los médicos de cabecera de la red centinela a recoger un hisopo nasal de los dos primeros pacientes que presentaron ILI desde menos de tres días. Después de ser probados para virus de gripe, los 994 hisopos recogidos en 2011 y 2012 se congelaron a -80°C en el laboratorio del centro hospitalario universitario (CHU). Con base en el presupuesto, se seleccionó aleatoriamente una muestra estratificada por temporada de 250 hisopos para describir virus circulantes incluyendo la temporada de gripe. Se realizó muestreo aleatorio con Excel 1 utilizando la base de datos de El cuadro de muestreo contenía el número de identificación del hisopo asignado por Cire OI, número de identificación de laboratorio, sexo, edad, fecha de inicio de los síntomas, fecha de recogida del hisopo y resultado de la influenza RT-PCR. Utilizamos Respifinder 1 Smart 22 kits un RT-PCR multiplex (PathoFinder, Maastricht, Países Bajos) que puede detectar 22 patógenos respiratorios. Este ensayo se basa en la tecnología de amplificación de la sonda dependiente de la ligadura múltiple (MLPA). Los pasos de transcripción inversa y preamplificación se realizaron en el Mastercycler epgradiente 1 (Eppendorf) y los pasos de hibridación, ligadura y detección en el sistema LightCycler 1 480 (Roche Applied Science). Este método fue elegido por su alta especificidad, en comparación con otros mismos métodos (78% frente a 33%) De este modo, permite destacar la posible presencia de dieciocho virus respiratorios y cuatro bacterias en una sola reacción mediante el análisis de la curva de fusión: Influenza A not (H1N1 Se realizaron análisis estadísticos con Stata 1 y Excel 1. Se definieron dos estaciones para identificar posibles tendencias estacionales en la circulación de los virus: temporada de invierno durante las semanas 23 a 39 entre junio y septiembre y temporada de verano durante el resto del año. Datos y hisopos resultan de un sistema de vigilancia que recibió aprobaciones reglamentarias, incluida la aprobación de la CNIL (Comisión Nacional de Tecnología de la Información y Libertades Civiles No 1592205) en julio de 2012. Todos los pacientes han recibido información oral y han dado su consentimiento para la recolección de hisopos y datos. Los datos fueron recolectados con fines de vigilancia y son totalmente anónimos. De acuerdo con la sensibilidad del ensayo dos muestras podrían ser resultados discordantes entre Influenza PCR inicialmente realizado y Multiplex PCR. Así fueron eliminadas del análisis: una es positiva para Influenza en un soloplex y negativa para todos los patógenos probados en multiplex y otra es positiva para Influenza en un soloplex y positiva para PIV2 en multiplex. En total, se consideraron 222 análisis. Además, 53 muestras fueron negativas para todos los patógenos respiratorios analizados (23,9%) y 169 muestras tenían al menos un patógeno detectado (76,1%), finalmente se identificó un total de 178 patógenos. Durante el período de estudio, una minoría de las semanas (21, es decir, 20%) no incluyó ninguna muestra, principalmente fuera de la estación de la gripe. La relación entre el sexo y el paciente fue 0,63 (86 hombres y 136 mujeres) y la edad media fue 28,4 años [min 0; El 10% tenían menos de 5 años, el 24% 5-15 años, el 63% 15-65 años y sólo el 3% eran mayores de 65 años. Los patógenos respiratorios identificados con mayor frecuencia en los hisopos ILI fueron rinovirus (23,4%), influenza A no H1N1 (21,2%) y gripe B (12,6%). Entre los 22 patógenos respiratorios probados por el multiplex, sólo tres no se encontraron en ninguna muestra analizada: Parainfluenza3, Legionella pneumophila y Bordetella pertussis. En cuanto a las coinfecciones, nueve hisopos revelaron la presencia de dos virus, entre los cuales6 involucraban virus de gripe (tabla 2). Los análisis mostraron que algunos virus son posiblemente estacionales y circulaban durante un período específico del año. Para este último, es específico del período estudiado desde que el virus influenza A(H1N1)pdm09 reapareció en la Isla Reunión en octubre de 2012 y ya no circulaba desde finales de 2010. Por el contrario, se identificaron parainfluenza 1,2 y 4 virus sólo en invierno. Para otros patógenos, no se observó ningún período específico de detección. Se realizó una descripción semanal de muestras para estudiar la distribución de patógenos respiratorios en 2011 y 2012 (Fig 1). Los resultados de los análisis biológicos se compararon con los datos de las consultas ILI declaradas por los GP centinelas en 2011 y 2012. Se observó en 2011, después de una primera ola en junio principalmente debido al virus influenza A no H1N1, una segunda ola de consultas ILI con identificación principalmente de virus de parainfluenza y no virus de gripe. En 2012, la segunda ola epidémica al final del invierno austral coincidió con En cuanto a los hisopos negativos (Fig 2), no se observó estacionalidad durante el periodo de estudio con una proporción similar sea cual sea la temporada. Este estudio retrospectivo basado en una red de GP centinelas mostró que no sólo los virus de la gripe son responsables de las consultas ILI. De hecho, se observó una importante circulación de múltiples patógenos a lo largo del año, con 12 tipos diferentes de patógenos identificados en 2011 y 2012. Los patógenos virales respiratorios estuvieron presentes en 76,1% de las muestras, lo que es ampliamente superior a los resultados de la vigilancia anual de la gripe [12]. Después de los virus de la gripe, Rhinovirus y Coronavirus fueron los virus respiratorios más comunes en Isla Reunión. Aunque no se tomaron muestras cada semana, la muestra fue representativa de la actividad ILI y consistente con la temporada de gripe. Sin embargo, según el bajo número de muestras, es difícil concluir acerca de la esta Este estudio también destacó varias coinfecciones, mostrando que concomitantemente la etiología múltiple de la ILI. La cocirculación ya se observó en Isla Reunión durante la pandemia de A(H1N1) pdm09, además del virus influenza, con la identificación de otros virus respiratorios como Rhinovirus o Coronavirus [14]. En Francia continental, durante esta pandemia, se encontró la circulación de virus respiratorios mayores, como Rhinovirus, Parainfluenza, Coronavirus, Metaneumovirus Humano, como en nuestra publicación [15] [16]. En nuestro estudio, sólo el 5,3% de los hisopos positivos fueron coinfecciones, mientras que en dos estudios en Madagascar las coinfecciones representaron 27,3% y 29,4% [17] [18]. A pesar de la distancia de 9.300 km entre la Reunión y Francia, la isla está directamente conectada a Europa con cuatro vuelos diarios a Francia. Estos intercambios pueden afectar a la circulación de patógenos respiratorios en el hemisferio sur y norte, por lo que los resultados de este estudio pueden ser de interés tanto para los países del Océano Índico como para Europa. Entre los 148 hisopos inicialmente negativos para la gripe, ya que no fueron previamente probados para otros virus, el estudio encontró una etiología para 95 hisopos. En total, sólo 53 hisopos, que representan el 24% de la muestra, permanecieron sin etiología con resultados negativos multiplex PCR a lo largo del año. Múltiples hipótesis pueden explicar este resultado: una mala calidad de los hisopos, impidiendo identificar un patógeno, causas no infecciosas u otros patógenos no incluidos en el multiplex PCR. Sin embargo, no pudimos probar los hisopos negativos para ARNse P, un marcador de células humanas, que podría proporcionar un mínimo de seguridad de que el hisopo contenía células humanas. En cuanto a las dos muestras divergentes para la identificación de influenza entre el multiplex y el PCR de un soloplex, las descartamos para el análisis; una fue positiva en Influenza con un soloplex y positiva en PIV con multiplex. Podría ser un resultado falso positivo de un soloplex. De hecho, como el ensayo multiplex de PCR tiene una buena sensibilidad y se considera un estándar dorado, decidimos mantener siete resultados negativos para Influenza en un soloplex y positivo en Influenza en multiplex [7] [8] [9] [10]. No hay ningún caso de pertussis de Bordetella que cause tos ferina y Legionella pneumophila que cause la enfermedad de Legionaires fue identificada en este estudio. Sin embargo, estas enfermedades son raras en Isla Reunión, alrededor de tres casos de enfermedad de Legionaires se declaran cada año. Un límite del estudio es que no se Fue imposible comparar los síntomas clínicos según cada patógeno y saber si existen diferentes patógenos que causen, por ejemplo, rinitis, laringitis o bronquitis (enfermedades incluidas en el ILI). Un estudio prospectivo específico que incluya datos clínicos podría proporcionar elementos útiles en la semiótica de las enfermedades. En conclusión, este estudio destacó una importante circulación de múltiples patógenos en Isla Reunión durante todo el año. Muestra que el ILI no es específico de la gripe y por lo tanto es esencial tener resultados biológicos para establecer el diagnóstico diferencial y así explicar la etiología de los síntomas. Para una mejor comprensión de los patógenos respiratorios que circulan en Isla Reunión, la información de este estudio también puede ser útil para los profesionales que ven a muchos pacientes en consulta con el ILI. Como el uso de multiplex RT-PCR demostró su eficacia en la vigilancia de la ILI y permitió resaltar la circulación de otros virus y causas bacterianas de infecciones respiratorias, ahora se utiliza de forma rutinaria en la vigilancia de la ILI. Además, sería interesante repetir este estudio cada 3 o 5 años añadiendo datos clínicos para monitorear la evolución de los patógenos respiratorios en la Isla Reunión a lo largo del tiempo.

¿Cuántos hisopos quedaron sin etiología?

Etiología de enfermedades similares a la gripe de los profesionales de la red centinela en la isla de Reunión, 2011-2012https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5031398/SHA: f5ff89ebfdd0375d0334c112c6c1c7e163fa69a0cAutores: Brottet, Elise; Jaffar-Bandjee, Marie-Christine; Li-Pat-Yuen, Ghislaine; Filleul, LaurentFecha: 2016-09-21DOI: 10.1371/journal.pone.0163377Licencia: cc-byAbstract: In Réunion Island, a pesar de una vigilancia de gripe establecida desde 1996 por la red de médicos generales centinelas, poco se conoce sobre la e Se estableció un estudio retrospectivo con hisopos nasales recolectados por GP centinelas de pacientes con ILI en 2011 y 2012. Se seleccionaron y analizaron al azar 250 hisopos mediante reacción en cadena multiplex transcriptasa inversa polimerasa (RT-PCR), incluyendo investigación de 18 virus y 4 bacterias. Se detectaron virus respiratorios en 169/222 (76,1%) muestras, principalmente rinovirus (23,4%), virus influenza A (21,2%), virus influenza B (12,6%), coronavirus (4,9%) y metapneumovirus humano (3,6%). Nueve hisopos (5,3% de los hisopos positivos) revelaron coinfecciones con dos virus identificados, entre los cuales seis se referían a coinfecciones con virus influenza. Observamos importantes diferencias estacionales, con circulación de Metapneumovirus humano, RSV A y B y coronavirus sólo durante el verano; mientras que En conclusión, este estudio destaca una circulación sustancial de múltiples patógenos respiratorios en Isla Reunión a lo largo del año. Muestra que ILI no sólo son atribuibles a la gripe y subraya la necesidad de vigilancia biológica. Como el uso de multiplex RT-PCR demostró su eficacia, ahora se utiliza de forma rutinaria en la vigilancia de ILI. Texto: La enfermedad similar a la gripe (ILI) o infecciones respiratorias agudas pueden ser causadas por varios tipos de virus respiratorios o bacterias en humanos [1]. Virus de gripe, virus respiratorios sincitiales (RSV) y virus parainfluenza se identifican como virus principales responsables principalmente de ILI y neumonía en varios estudios [2]. Sin embargo, los profesionales no pueden diagnosticar la infección sin una confirmación biológica de la prueba. Desafortunadamente, estas causas de infecciones se identifican en menos del 50% [3]. La isla de Reunión, un territorio francés de ultramar con 850.000 habitantes, se encuentra en el hemisferio sur entre Madagascar y Mauricio en el Océano Índico (Latitud: 21°05.2920 S Longitud: 55°36.4380 E.). La isla se beneficia de un sistema sanitario similar al de Francia continental y la vigilancia epidemiológica ha sido desarrollada por la oficina regional del Instituto Francés de Vigilancia de la Salud Pública (CIRE OI), basado en el sistema de vigilancia de Francia continental [4]. La actividad de la gripe aumenta generalmente durante el invierno austral, correspondiente al verano en Europa [5]. Desde 2011, la campaña de vacunación contra la gripe en la isla de Reunión comienza en abril y la vacuna utilizada corresponde a las recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud para el hemisferio sur. Desde 1996, la vigilancia clínica y biológica de la gripe se basa en una red de médicos centinelas [6]. Los hisopos nasales son recolectados al azar durante todo el año y son probados por RT-PCR para virus de la gripe. Entre estas muestras de vigilancia, 40 a 50% son testados positivos para virus influenza A, A(H1N1)pdm09 o virus B por el laboratorio virológico del Hospital Universitario Centro de Reunión. Así, las muestras ILI testadas negativas para influenza son de etiología desconocida. Varias herramientas biológicas permiten identificar patógenos respiratorios a partir de hisopos nasales. En los últimos años, se ha desarrollado la reacción en cadena multiplex transcriptasa inversa polimerasa (RT-PCR) para identificar varios virus simultáneamente [7] [8] [9] [10]. Por lo tanto, utilizamos este nuevo método para establecer un estudio retrospectivo utilizando hisopos recolectados por los GP centineles de 2011 a 2012. El principal objetivo de nuestro estudio fue caracterizar patógenos respiratorios responsables de consultas Los objetivos secundarios fueron resaltar las tendencias estacionales en la circulación de patógenos respiratorios y describir la ocurrencia de coinfecciones, especialmente durante la temporada de gripe. Se definió como un inicio súbito de fiebre de más de 38 grados Celsius y tos, asociada o no con otros síntomas como dificultad respiratoria, dolor de cabeza, etc. Cada semana, se animó a todos los médicos de cabecera de la red centinela a recoger un hisopo nasal de los dos primeros pacientes que presentaron ILI desde menos de tres días. Después de ser probados para virus de gripe, los 994 hisopos recogidos en 2011 y 2012 se congelaron a -80°C en el laboratorio del centro hospitalario universitario (CHU). Con base en el presupuesto, se seleccionó aleatoriamente una muestra estratificada por temporada de 250 hisopos para describir virus circulantes incluyendo la temporada de gripe. Se realizó muestreo aleatorio con Excel 1 utilizando la base de datos de El cuadro de muestreo contenía el número de identificación del hisopo asignado por Cire OI, número de identificación de laboratorio, sexo, edad, fecha de inicio de los síntomas, fecha de recogida del hisopo y resultado de la influenza RT-PCR. Utilizamos Respifinder 1 Smart 22 kits un RT-PCR multiplex (PathoFinder, Maastricht, Países Bajos) que puede detectar 22 patógenos respiratorios. Este ensayo se basa en la tecnología de amplificación de la sonda dependiente de la ligadura múltiple (MLPA). Los pasos de transcripción inversa y preamplificación se realizaron en el Mastercycler epgradiente 1 (Eppendorf) y los pasos de hibridación, ligadura y detección en el sistema LightCycler 1 480 (Roche Applied Science). Este método fue elegido por su alta especificidad, en comparación con otros mismos métodos (78% frente a 33%) De este modo, permite destacar la posible presencia de dieciocho virus respiratorios y cuatro bacterias en una sola reacción mediante el análisis de la curva de fusión: Influenza A not (H1N1 Se realizaron análisis estadísticos con Stata 1 y Excel 1. Se definieron dos estaciones para identificar posibles tendencias estacionales en la circulación de los virus: temporada de invierno durante las semanas 23 a 39 entre junio y septiembre y temporada de verano durante el resto del año. Datos y hisopos resultan de un sistema de vigilancia que recibió aprobaciones reglamentarias, incluida la aprobación de la CNIL (Comisión Nacional de Tecnología de la Información y Libertades Civiles No 1592205) en julio de 2012. Todos los pacientes han recibido información oral y han dado su consentimiento para la recolección de hisopos y datos. Los datos fueron recolectados con fines de vigilancia y son totalmente anónimos. De acuerdo con la sensibilidad del ensayo dos muestras podrían ser resultados discordantes entre Influenza PCR inicialmente realizado y Multiplex PCR. Así fueron eliminadas del análisis: una es positiva para Influenza en un soloplex y negativa para todos los patógenos probados en multiplex y otra es positiva para Influenza en un soloplex y positiva para PIV2 en multiplex. En total, se consideraron 222 análisis. Además, 53 muestras fueron negativas para todos los patógenos respiratorios analizados (23,9%) y 169 muestras tenían al menos un patógeno detectado (76,1%), finalmente se identificó un total de 178 patógenos. Durante el período de estudio, una minoría de las semanas (21, es decir, 20%) no incluyó ninguna muestra, principalmente fuera de la estación de la gripe. La relación entre el sexo y el paciente fue 0,63 (86 hombres y 136 mujeres) y la edad media fue 28,4 años [min 0; El 10% tenían menos de 5 años, el 24% 5-15 años, el 63% 15-65 años y sólo el 3% eran mayores de 65 años. Los patógenos respiratorios identificados con mayor frecuencia en los hisopos ILI fueron rinovirus (23,4%), influenza A no H1N1 (21,2%) y gripe B (12,6%). Entre los 22 patógenos respiratorios probados por el multiplex, sólo tres no se encontraron en ninguna muestra analizada: Parainfluenza3, Legionella pneumophila y Bordetella pertussis. En cuanto a las coinfecciones, nueve hisopos revelaron la presencia de dos virus, entre los cuales6 involucraban virus de gripe (tabla 2). Los análisis mostraron que algunos virus son posiblemente estacionales y circulaban durante un período específico del año. Para este último, es específico del período estudiado desde que el virus influenza A(H1N1)pdm09 reapareció en la Isla Reunión en octubre de 2012 y ya no circulaba desde finales de 2010. Por el contrario, se identificaron parainfluenza 1,2 y 4 virus sólo en invierno. Para otros patógenos, no se observó ningún período específico de detección. Se realizó una descripción semanal de muestras para estudiar la distribución de patógenos respiratorios en 2011 y 2012 (Fig 1). Los resultados de los análisis biológicos se compararon con los datos de las consultas ILI declaradas por los GP centinelas en 2011 y 2012. Se observó en 2011, después de una primera ola en junio principalmente debido al virus influenza A no H1N1, una segunda ola de consultas ILI con identificación principalmente de virus de parainfluenza y no virus de gripe. En 2012, la segunda ola epidémica al final del invierno austral coincidió con En cuanto a los hisopos negativos (Fig 2), no se observó estacionalidad durante el periodo de estudio con una proporción similar sea cual sea la temporada. Este estudio retrospectivo basado en una red de GP centinelas mostró que no sólo los virus de la gripe son responsables de las consultas ILI. De hecho, se observó una importante circulación de múltiples patógenos a lo largo del año, con 12 tipos diferentes de patógenos identificados en 2011 y 2012. Los patógenos virales respiratorios estuvieron presentes en 76,1% de las muestras, lo que es ampliamente superior a los resultados de la vigilancia anual de la gripe [12]. Después de los virus de la gripe, Rhinovirus y Coronavirus fueron los virus respiratorios más comunes en Isla Reunión. Aunque no se tomaron muestras cada semana, la muestra fue representativa de la actividad ILI y consistente con la temporada de gripe. Sin embargo, según el bajo número de muestras, es difícil concluir acerca de la esta Este estudio también destacó varias coinfecciones, mostrando que concomitantemente la etiología múltiple de la ILI. La cocirculación ya se observó en Isla Reunión durante la pandemia de A(H1N1) pdm09, además del virus influenza, con la identificación de otros virus respiratorios como Rhinovirus o Coronavirus [14]. En Francia continental, durante esta pandemia, se encontró la circulación de virus respiratorios mayores, como Rhinovirus, Parainfluenza, Coronavirus, Metaneumovirus Humano, como en nuestra publicación [15] [16]. En nuestro estudio, sólo el 5,3% de los hisopos positivos fueron coinfecciones, mientras que en dos estudios en Madagascar las coinfecciones representaron 27,3% y 29,4% [17] [18]. A pesar de la distancia de 9.300 km entre la Reunión y Francia, la isla está directamente conectada a Europa con cuatro vuelos diarios a Francia. Estos intercambios pueden afectar a la circulación de patógenos respiratorios en el hemisferio sur y norte, por lo que los resultados de este estudio pueden ser de interés tanto para los países del Océano Índico como para Europa. Entre los 148 hisopos inicialmente negativos para la gripe, ya que no fueron previamente probados para otros virus, el estudio encontró una etiología para 95 hisopos. En total, sólo 53 hisopos, que representan el 24% de la muestra, permanecieron sin etiología con resultados negativos multiplex PCR a lo largo del año. Múltiples hipótesis pueden explicar este resultado: una mala calidad de los hisopos, impidiendo identificar un patógeno, causas no infecciosas u otros patógenos no incluidos en el multiplex PCR. Sin embargo, no pudimos probar los hisopos negativos para ARNse P, un marcador de células humanas, que podría proporcionar un mínimo de seguridad de que el hisopo contenía células humanas. En cuanto a las dos muestras divergentes para la identificación de influenza entre el multiplex y el PCR de un soloplex, las descartamos para el análisis; una fue positiva en Influenza con un soloplex y positiva en PIV con multiplex. Podría ser un resultado falso positivo de un soloplex. De hecho, como el ensayo multiplex de PCR tiene una buena sensibilidad y se considera un estándar dorado, decidimos mantener siete resultados negativos para Influenza en un soloplex y positivo en Influenza en multiplex [7] [8] [9] [10]. No hay ningún caso de pertussis de Bordetella que cause tos ferina y Legionella pneumophila que cause la enfermedad de Legionaires fue identificada en este estudio. Sin embargo, estas enfermedades son raras en Isla Reunión, alrededor de tres casos de enfermedad de Legionaires se declaran cada año. Un límite del estudio es que no se Fue imposible comparar los síntomas clínicos según cada patógeno y saber si existen diferentes patógenos que causen, por ejemplo, rinitis, laringitis o bronquitis (enfermedades incluidas en el ILI). Un estudio prospectivo específico que incluya datos clínicos podría proporcionar elementos útiles en la semiótica de las enfermedades. En conclusión, este estudio destacó una importante circulación de múltiples patógenos en Isla Reunión durante todo el año. Muestra que el ILI no es específico de la gripe y por lo tanto es esencial tener resultados biológicos para establecer el diagnóstico diferencial y así explicar la etiología de los síntomas. Para una mejor comprensión de los patógenos respiratorios que circulan en Isla Reunión, la información de este estudio también puede ser útil para los profesionales que ven a muchos pacientes en consulta con el ILI. Como el uso de multiplex RT-PCR demostró su eficacia en la vigilancia de la ILI y permitió resaltar la circulación de otros virus y causas bacterianas de infecciones respiratorias, ahora se utiliza de forma rutinaria en la vigilancia de la ILI. Además, sería interesante repetir este estudio cada 3 o 5 años añadiendo datos clínicos para monitorear la evolución de los patógenos respiratorios en la Isla Reunión a lo largo del tiempo.

¿Qué destaca este estudio?

No hay pruebas creíbles que apoyen las afirmaciones de la ingeniería de laboratorio del SARS-CoV-2https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7054935/SHA: 5a9154aee79901dd8fecd58b7bcd9b7351102d24Autores: Liu, Shan-Lu; Saif, Linda J.; Weiss, Susan R.; Su, LishanFecha: 2020-02-26DOI: 10.1080/22217501.2020.1733440Licencia: cc-byAbstract: nanTexto: La aparición y el brote de una enfermedad respiratoria aguda recientemente descubierta en Wuhan (China) ha afectado a más de 40.000 personas y ha matado a más de 1.000 al 10 de febrero de 2020. Se identificó rápidamente un nuevo coronavirus humano, el SARS-CoV-2, y la enfermedad asociada se conoce ahora como enfermedad por coronavirus descubierta en 2019 (COVID-19) (https://globalbiodefense. com/novel-coronavirus-covid-19-portal/). De acuerdo con lo que se ha informado [1] [2] [3], COVID-2019 parece tener manifestaciones clínicas similares a la del síndrome respiratorio agudo grave (SARS) causado por el SARS-CoV. La secuencia del genoma del SARS-CoV-2 también tiene una identidad del 80% con el SARS-CoV, pero es más similar a algunos beta-coronavirus de murciélagos, siendo el más alto > 96% de identidad [4, 5]. Actualmente, existen especulaciones, rumores y teorías de conspiración que el SARS-CoV-2 es de origen de laboratorio. Algunas personas han alegado que el SARS-CoV-2 humano se filtró directamente de un laboratorio en Wuhan, donde se informó recientemente de un murciélago CoV (RaTG13), que compartió la homología del 96% con el SARS-CoV-2 [4]. Sin embargo, como sabemos, el SARS-CoV humano y el Civet de palma huésped intermedio SARSlike CoV compartieron la homología del 99,8%, con un total de 202 variaciones de un solo nucleótido (nt) identificadas a través del genoma [6]. Dado que hay más de 1.100 diferencias nt entre el SARS-CoV-2 humano y el murciélago RaTG13-CoV [4], que se distribuyen a través del genoma en un patrón natural que ocurre siguiendo las características evolutivas típicas de CoVs, es muy improbable que RaTG13 CoV sea la fuente inmediata del SARS-CoV-2 La ausencia de un patrón objetivo lógico en las nuevas secuencias virales y un pariente cercano en una especie de vida silvestre (bats) son los signos más reveladores de que el SARS-CoV-2 evolucionó por la evolución natural. Se necesita una búsqueda de un huésped animal intermedio entre murciélagos y humanos para identificar a los animales CoVs más estrechamente relacionados con el SARS-CoV-2 humano. Se especula que los pangolinas podrían llevar CoVs estrechamente relacionados con el SARS-CoV-2, pero los datos para fundamentar esto aún no se han publicado (https:// www.nature.com/articcles/d41586-020-00364-2). Otra afirmación en las redes sociales chinas apunta a un artículo de Nature Medicine publicado en 2015 [7], que informa de la construcción de un CoV quimérico con un gen CoV S murciélago (SHC014) en la columna vertebral de un SARS CoV que se ha adaptado para infectar ratones (MA15) y es capaz de infectar células humanas [8]. Sin embargo, esta afirmación carece de cualquier base científica y debe ser descartada debido a una divergencia significativa en la secuencia genética de este constructo con el nuevo SARS-CoV-2 (> 5.000 nucleótidos). El virus SARS adaptado al ratón (MA15) [9] fue generado por el paso en serie de un clon de SARS CoV infeccioso en el tracto respiratorio de los ratones BALB/c. Después de 15 pasajes en ratones, el SARS-CoV obtuvo replicación elevada y patogénesis pulmonar en ratones envejecidos ( Es probable que el MA15 sea altamente atenuado para replicarse en células humanas o pacientes debido a la adaptación del ratón. Se propuso que el gen S de CoV derivado del murciélago, a diferencia de que de los pacientes humanos o virus derivados del civets, no fue capaz de utilizar el ACE2 humano como receptor para la entrada en células humanas [10, 11]. Se propuso que los civets fueran un huésped intermedio de los bat-CoV, capaz de propagar el SARS CoV a los humanos [6, 12]. Sin embargo, en 2013 varios nuevos coronavirus de murciélagos fueron aislados de murciélagos de herradura chinos y el murciélago SARS-like o SL-CoV-WIV1 fue capaz de utilizar ACE2 de humanos, civets y murciélagos de herradura chinos para la entrada [8]. Combinado con la evidencia evolutiva de que el gen murciélago ACE2 ha sido seleccionado positivamente en los mismos sitios de contacto que el gen humano ACE2 para interactuar con SARS CoV [13], se propuso que un huésped intermedio puede no ser necesario y que algunos murciélagos SL-CoV pueden ser capaces de infectar directamente a los huéspedes humanos. Para hacer frente directamente a esta posibilidad, el gen S exacto del coronavirus murciélago SL-SHC014 fue sintetizado y utilizado para generar un virus quimérico en la columna vertebral del ratón adaptado MA15 SARS-CoV. El resultante virus SL-SHC014-MA15 podría efectivamente utilizar eficientemente ACE2 humano y replicarse en células de la vía aérea humana primaria a títulos similares a cepas epidémicas de SARS-CoV. Mientras que SL-SHC014-MA15 puede replicarse de manera eficiente en los pulmones de ratón jóvenes y envejecidos, la infección fue atenuada, y menos antígeno del virus estaba presente en el epitelio de las vías respiratorias en comparación con el SARS MA15, que causa resultados letales en ratones ancianos [7]. Debido a la elevada actividad patógena del virus quimérico SHC014-MA15 en relación con el virus quimérico MA15 con el gen SRAS S humano original en ratones, tales experimentos con el virus quimérico SL-SHC014-MA15 fueron restringidos posteriormente como ganancia de la función (GOF) bajo la política de pausas mandada por el gobierno de los Estados Unidos (https://www.nih.gov/about-nih/who-were/nih-director/statements/nih-lifts La actual epidemia de COVID-2019 ha reiniciado el debate sobre los riesgos de construir tales virus que podrían tener potencial pandémico, independientemente del hallazgo de que estos murciélagos CoVs ya existen en la naturaleza. Sin embargo, tras análisis filogenéticos cuidadosos por múltiples grupos internacionales [5, 14], el SARS-CoV-2 es sin duda distinto de SL-SHC014-MA15, con > 6.000 diferencias de nucleótidos en todo el genoma. Por lo tanto, una vez más no hay pruebas creíbles que apoyen la afirmación de que el SARS-CoV-2 se deriva del virus de SL-SHC014-MA15 quimérico. También hay rumores de que el SARS-CoV-2 fue artificialmente, o intencionalmente, hecho por humanos en el laboratorio, y esto se destaca en un manuscrito enviado a BioRxiv (un sitio de intercambio de manuscritos antes de cualquier revisión por pares), alegando que el SARS-CoV-2 tiene secuencia de VIH en él y por lo tanto fue probablemente generado en el laboratorio. En un artículo de refutación dirigido por un virólogo VIH-1 Dr. Feng Gao, utilizaron análisis bioinformáticos cuidadosos para demostrar que la afirmación original de múltiples inserciones de VIH en el SARS-CoV-2 no es específica del VIH-1 sino aleatoria [15]. Debido a las muchas preocupaciones planteadas por la comunidad internacional, los autores que hicieron la afirmación inicial ya han retirado este informe. La evolución es gradual y acumula mutaciones gradualmente con el tiempo, mientras que los constructos sintéticos normalmente usarían una espina dorsal conocida e introducirían cambios lógicos o dirigidos en lugar de las mutaciones que ocurren al azar que están presentes en virus naturalmente aislados como el murciélago CoV RaTG13. En nuestra opinión, actualmente no hay evidencia creíble para apoyar la afirmación de que el SARS-CoV-2 se originó a partir de una CoV diseñada por un laboratorio. Es más probable que el SARS-CoV-2 sea un CoV recombinante generado en naturaleza entre un murciélago CoV y otro coronavirus en un huésped animal intermedio. Se necesitan más estudios para explorar esta posibilidad y resolver el origen natural del SARS-CoV-2. Debemos enfatizar que, aunque el SARS-CoV-2 no muestra evidencia de origen de laboratorio, los virus con tan grandes amenazas para la salud pública deben ser manejados correctamente en el laboratorio y también debidamente regulados por la comunidad Susan R. Weiss http://orcid.org/0000-0002-8155-4528

¿Cómo se refiere el SARS-CoV-2?

No hay pruebas creíbles que apoyen las afirmaciones de la ingeniería de laboratorio del SARS-CoV-2https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7054935/SHA: 5a9154aee79901dd8fecd58b7bcd9b7351102d24Autores: Liu, Shan-Lu; Saif, Linda J.; Weiss, Susan R.; Su, LishanFecha: 2020-02-26DOI: 10.1080/22217501.2020.1733440Licencia: cc-byAbstract: nanTexto: La aparición y el brote de una enfermedad respiratoria aguda recientemente descubierta en Wuhan (China) ha afectado a más de 40.000 personas y ha matado a más de 1.000 al 10 de febrero de 2020. Se identificó rápidamente un nuevo coronavirus humano, el SARS-CoV-2, y la enfermedad asociada se conoce ahora como enfermedad por coronavirus descubierta en 2019 (COVID-19) (https://globalbiodefense. com/novel-coronavirus-covid-19-portal/). De acuerdo con lo que se ha informado [1] [2] [3], COVID-2019 parece tener manifestaciones clínicas similares a la del síndrome respiratorio agudo grave (SARS) causado por el SARS-CoV. La secuencia del genoma del SARS-CoV-2 también tiene una identidad del 80% con el SARS-CoV, pero es más similar a algunos beta-coronavirus de murciélagos, siendo el más alto > 96% de identidad [4, 5]. Actualmente, existen especulaciones, rumores y teorías de conspiración que el SARS-CoV-2 es de origen de laboratorio. Algunas personas han alegado que el SARS-CoV-2 humano se filtró directamente de un laboratorio en Wuhan, donde se informó recientemente de un murciélago CoV (RaTG13), que compartió la homología del 96% con el SARS-CoV-2 [4]. Sin embargo, como sabemos, el SARS-CoV humano y el Civet de palma huésped intermedio SARSlike CoV compartieron la homología del 99,8%, con un total de 202 variaciones de un solo nucleótido (nt) identificadas a través del genoma [6]. Dado que hay más de 1.100 diferencias nt entre el SARS-CoV-2 humano y el murciélago RaTG13-CoV [4], que se distribuyen a través del genoma en un patrón natural que ocurre siguiendo las características evolutivas típicas de CoVs, es muy improbable que RaTG13 CoV sea la fuente inmediata del SARS-CoV-2 La ausencia de un patrón objetivo lógico en las nuevas secuencias virales y un pariente cercano en una especie de vida silvestre (bats) son los signos más reveladores de que el SARS-CoV-2 evolucionó por la evolución natural. Se necesita una búsqueda de un huésped animal intermedio entre murciélagos y humanos para identificar a los animales CoVs más estrechamente relacionados con el SARS-CoV-2 humano. Se especula que los pangolinas podrían llevar CoVs estrechamente relacionados con el SARS-CoV-2, pero los datos para fundamentar esto aún no se han publicado (https:// www.nature.com/articcles/d41586-020-00364-2). Otra afirmación en las redes sociales chinas apunta a un artículo de Nature Medicine publicado en 2015 [7], que informa de la construcción de un CoV quimérico con un gen CoV S murciélago (SHC014) en la columna vertebral de un SARS CoV que se ha adaptado para infectar ratones (MA15) y es capaz de infectar células humanas [8]. Sin embargo, esta afirmación carece de cualquier base científica y debe ser descartada debido a una divergencia significativa en la secuencia genética de este constructo con el nuevo SARS-CoV-2 (> 5.000 nucleótidos). El virus SARS adaptado al ratón (MA15) [9] fue generado por el paso en serie de un clon de SARS CoV infeccioso en el tracto respiratorio de los ratones BALB/c. Después de 15 pasajes en ratones, el SARS-CoV obtuvo replicación elevada y patogénesis pulmonar en ratones envejecidos ( Es probable que el MA15 sea altamente atenuado para replicarse en células humanas o pacientes debido a la adaptación del ratón. Se propuso que el gen S de CoV derivado del murciélago, a diferencia de que de los pacientes humanos o virus derivados del civets, no fue capaz de utilizar el ACE2 humano como receptor para la entrada en células humanas [10, 11]. Se propuso que los civets fueran un huésped intermedio de los bat-CoV, capaz de propagar el SARS CoV a los humanos [6, 12]. Sin embargo, en 2013 varios nuevos coronavirus de murciélagos fueron aislados de murciélagos de herradura chinos y el murciélago SARS-like o SL-CoV-WIV1 fue capaz de utilizar ACE2 de humanos, civets y murciélagos de herradura chinos para la entrada [8]. Combinado con la evidencia evolutiva de que el gen murciélago ACE2 ha sido seleccionado positivamente en los mismos sitios de contacto que el gen humano ACE2 para interactuar con SARS CoV [13], se propuso que un huésped intermedio puede no ser necesario y que algunos murciélagos SL-CoV pueden ser capaces de infectar directamente a los huéspedes humanos. Para hacer frente directamente a esta posibilidad, el gen S exacto del coronavirus murciélago SL-SHC014 fue sintetizado y utilizado para generar un virus quimérico en la columna vertebral del ratón adaptado MA15 SARS-CoV. El resultante virus SL-SHC014-MA15 podría efectivamente utilizar eficientemente ACE2 humano y replicarse en células de la vía aérea humana primaria a títulos similares a cepas epidémicas de SARS-CoV. Mientras que SL-SHC014-MA15 puede replicarse de manera eficiente en los pulmones de ratón jóvenes y envejecidos, la infección fue atenuada, y menos antígeno del virus estaba presente en el epitelio de las vías respiratorias en comparación con el SARS MA15, que causa resultados letales en ratones ancianos [7]. Debido a la elevada actividad patógena del virus quimérico SHC014-MA15 en relación con el virus quimérico MA15 con el gen SRAS S humano original en ratones, tales experimentos con el virus quimérico SL-SHC014-MA15 fueron restringidos posteriormente como ganancia de la función (GOF) bajo la política de pausas mandada por el gobierno de los Estados Unidos (https://www.nih.gov/about-nih/who-were/nih-director/statements/nih-lifts La actual epidemia de COVID-2019 ha reiniciado el debate sobre los riesgos de construir tales virus que podrían tener potencial pandémico, independientemente del hallazgo de que estos murciélagos CoVs ya existen en la naturaleza. Sin embargo, tras análisis filogenéticos cuidadosos por múltiples grupos internacionales [5, 14], el SARS-CoV-2 es sin duda distinto de SL-SHC014-MA15, con > 6.000 diferencias de nucleótidos en todo el genoma. Por lo tanto, una vez más no hay pruebas creíbles que apoyen la afirmación de que el SARS-CoV-2 se deriva del virus de SL-SHC014-MA15 quimérico. También hay rumores de que el SARS-CoV-2 fue artificialmente, o intencionalmente, hecho por humanos en el laboratorio, y esto se destaca en un manuscrito enviado a BioRxiv (un sitio de intercambio de manuscritos antes de cualquier revisión por pares), alegando que el SARS-CoV-2 tiene secuencia de VIH en él y por lo tanto fue probablemente generado en el laboratorio. En un artículo de refutación dirigido por un virólogo VIH-1 Dr. Feng Gao, utilizaron análisis bioinformáticos cuidadosos para demostrar que la afirmación original de múltiples inserciones de VIH en el SARS-CoV-2 no es específica del VIH-1 sino aleatoria [15]. Debido a las muchas preocupaciones planteadas por la comunidad internacional, los autores que hicieron la afirmación inicial ya han retirado este informe. La evolución es gradual y acumula mutaciones gradualmente con el tiempo, mientras que los constructos sintéticos normalmente usarían una espina dorsal conocida e introducirían cambios lógicos o dirigidos en lugar de las mutaciones que ocurren al azar que están presentes en virus naturalmente aislados como el murciélago CoV RaTG13. En nuestra opinión, actualmente no hay evidencia creíble para apoyar la afirmación de que el SARS-CoV-2 se originó a partir de una CoV diseñada por un laboratorio. Es más probable que el SARS-CoV-2 sea un CoV recombinante generado en naturaleza entre un murciélago CoV y otro coronavirus en un huésped animal intermedio. Se necesitan más estudios para explorar esta posibilidad y resolver el origen natural del SARS-CoV-2. Debemos enfatizar que, aunque el SARS-CoV-2 no muestra evidencia de origen de laboratorio, los virus con tan grandes amenazas para la salud pública deben ser manejados correctamente en el laboratorio y también debidamente regulados por la comunidad Susan R. Weiss http://orcid.org/0000-0002-8155-4528

¿Por qué la afirmación carece de base científica?

No hay pruebas creíbles que apoyen las afirmaciones de la ingeniería de laboratorio del SARS-CoV-2https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7054935/SHA: 5a9154aee79901dd8fecd58b7bcd9b7351102d24Autores: Liu, Shan-Lu; Saif, Linda J.; Weiss, Susan R.; Su, LishanFecha: 2020-02-26DOI: 10.1080/22217501.2020.1733440Licencia: cc-byAbstract: nanTexto: La aparición y el brote de una enfermedad respiratoria aguda recientemente descubierta en Wuhan (China) ha afectado a más de 40.000 personas y ha matado a más de 1.000 al 10 de febrero de 2020. Se identificó rápidamente un nuevo coronavirus humano, el SARS-CoV-2, y la enfermedad asociada se conoce ahora como enfermedad por coronavirus descubierta en 2019 (COVID-19) (https://globalbiodefense. com/novel-coronavirus-covid-19-portal/). De acuerdo con lo que se ha informado [1] [2] [3], COVID-2019 parece tener manifestaciones clínicas similares a la del síndrome respiratorio agudo grave (SARS) causado por el SARS-CoV. La secuencia del genoma del SARS-CoV-2 también tiene una identidad del 80% con el SARS-CoV, pero es más similar a algunos beta-coronavirus de murciélagos, siendo el más alto > 96% de identidad [4, 5]. Actualmente, existen especulaciones, rumores y teorías de conspiración que el SARS-CoV-2 es de origen de laboratorio. Algunas personas han alegado que el SARS-CoV-2 humano se filtró directamente de un laboratorio en Wuhan, donde se informó recientemente de un murciélago CoV (RaTG13), que compartió la homología del 96% con el SARS-CoV-2 [4]. Sin embargo, como sabemos, el SARS-CoV humano y el Civet de palma huésped intermedio SARSlike CoV compartieron la homología del 99,8%, con un total de 202 variaciones de un solo nucleótido (nt) identificadas a través del genoma [6]. Dado que hay más de 1.100 diferencias nt entre el SARS-CoV-2 humano y el murciélago RaTG13-CoV [4], que se distribuyen a través del genoma en un patrón natural que ocurre siguiendo las características evolutivas típicas de CoVs, es muy improbable que RaTG13 CoV sea la fuente inmediata del SARS-CoV-2 La ausencia de un patrón objetivo lógico en las nuevas secuencias virales y un pariente cercano en una especie de vida silvestre (bats) son los signos más reveladores de que el SARS-CoV-2 evolucionó por la evolución natural. Se necesita una búsqueda de un huésped animal intermedio entre murciélagos y humanos para identificar a los animales CoVs más estrechamente relacionados con el SARS-CoV-2 humano. Se especula que los pangolinas podrían llevar CoVs estrechamente relacionados con el SARS-CoV-2, pero los datos para fundamentar esto aún no se han publicado (https:// www.nature.com/articcles/d41586-020-00364-2). Otra afirmación en las redes sociales chinas apunta a un artículo de Nature Medicine publicado en 2015 [7], que informa de la construcción de un CoV quimérico con un gen CoV S murciélago (SHC014) en la columna vertebral de un SARS CoV que se ha adaptado para infectar ratones (MA15) y es capaz de infectar células humanas [8]. Sin embargo, esta afirmación carece de cualquier base científica y debe ser descartada debido a una divergencia significativa en la secuencia genética de este constructo con el nuevo SARS-CoV-2 (> 5.000 nucleótidos). El virus SARS adaptado al ratón (MA15) [9] fue generado por el paso en serie de un clon de SARS CoV infeccioso en el tracto respiratorio de los ratones BALB/c. Después de 15 pasajes en ratones, el SARS-CoV obtuvo replicación elevada y patogénesis pulmonar en ratones envejecidos ( Es probable que el MA15 sea altamente atenuado para replicarse en células humanas o pacientes debido a la adaptación del ratón. Se propuso que el gen S de CoV derivado del murciélago, a diferencia de que de los pacientes humanos o virus derivados del civets, no fue capaz de utilizar el ACE2 humano como receptor para la entrada en células humanas [10, 11]. Se propuso que los civets fueran un huésped intermedio de los bat-CoV, capaz de propagar el SARS CoV a los humanos [6, 12]. Sin embargo, en 2013 varios nuevos coronavirus de murciélagos fueron aislados de murciélagos de herradura chinos y el murciélago SARS-like o SL-CoV-WIV1 fue capaz de utilizar ACE2 de humanos, civets y murciélagos de herradura chinos para la entrada [8]. Combinado con la evidencia evolutiva de que el gen murciélago ACE2 ha sido seleccionado positivamente en los mismos sitios de contacto que el gen humano ACE2 para interactuar con SARS CoV [13], se propuso que un huésped intermedio puede no ser necesario y que algunos murciélagos SL-CoV pueden ser capaces de infectar directamente a los huéspedes humanos. Para hacer frente directamente a esta posibilidad, el gen S exacto del coronavirus murciélago SL-SHC014 fue sintetizado y utilizado para generar un virus quimérico en la columna vertebral del ratón adaptado MA15 SARS-CoV. El resultante virus SL-SHC014-MA15 podría efectivamente utilizar eficientemente ACE2 humano y replicarse en células de la vía aérea humana primaria a títulos similares a cepas epidémicas de SARS-CoV. Mientras que SL-SHC014-MA15 puede replicarse de manera eficiente en los pulmones de ratón jóvenes y envejecidos, la infección fue atenuada, y menos antígeno del virus estaba presente en el epitelio de las vías respiratorias en comparación con el SARS MA15, que causa resultados letales en ratones ancianos [7]. Debido a la elevada actividad patógena del virus quimérico SHC014-MA15 en relación con el virus quimérico MA15 con el gen SRAS S humano original en ratones, tales experimentos con el virus quimérico SL-SHC014-MA15 fueron restringidos posteriormente como ganancia de la función (GOF) bajo la política de pausas mandada por el gobierno de los Estados Unidos (https://www.nih.gov/about-nih/who-were/nih-director/statements/nih-lifts La actual epidemia de COVID-2019 ha reiniciado el debate sobre los riesgos de construir tales virus que podrían tener potencial pandémico, independientemente del hallazgo de que estos murciélagos CoVs ya existen en la naturaleza. Sin embargo, tras análisis filogenéticos cuidadosos por múltiples grupos internacionales [5, 14], el SARS-CoV-2 es sin duda distinto de SL-SHC014-MA15, con > 6.000 diferencias de nucleótidos en todo el genoma. Por lo tanto, una vez más no hay pruebas creíbles que apoyen la afirmación de que el SARS-CoV-2 se deriva del virus de SL-SHC014-MA15 quimérico. También hay rumores de que el SARS-CoV-2 fue artificialmente, o intencionalmente, hecho por humanos en el laboratorio, y esto se destaca en un manuscrito enviado a BioRxiv (un sitio de intercambio de manuscritos antes de cualquier revisión por pares), alegando que el SARS-CoV-2 tiene secuencia de VIH en él y por lo tanto fue probablemente generado en el laboratorio. En un artículo de refutación dirigido por un virólogo VIH-1 Dr. Feng Gao, utilizaron análisis bioinformáticos cuidadosos para demostrar que la afirmación original de múltiples inserciones de VIH en el SARS-CoV-2 no es específica del VIH-1 sino aleatoria [15]. Debido a las muchas preocupaciones planteadas por la comunidad internacional, los autores que hicieron la afirmación inicial ya han retirado este informe. La evolución es gradual y acumula mutaciones gradualmente con el tiempo, mientras que los constructos sintéticos normalmente usarían una espina dorsal conocida e introducirían cambios lógicos o dirigidos en lugar de las mutaciones que ocurren al azar que están presentes en virus naturalmente aislados como el murciélago CoV RaTG13. En nuestra opinión, actualmente no hay evidencia creíble para apoyar la afirmación de que el SARS-CoV-2 se originó a partir de una CoV diseñada por un laboratorio. Es más probable que el SARS-CoV-2 sea un CoV recombinante generado en naturaleza entre un murciélago CoV y otro coronavirus en un huésped animal intermedio. Se necesitan más estudios para explorar esta posibilidad y resolver el origen natural del SARS-CoV-2. Debemos enfatizar que, aunque el SARS-CoV-2 no muestra evidencia de origen de laboratorio, los virus con tan grandes amenazas para la salud pública deben ser manejados correctamente en el laboratorio y también debidamente regulados por la comunidad Susan R. Weiss http://orcid.org/0000-0002-8155-4528

¿Por qué es probable que el MA15 esté altamente atenuado para replicarse en células humanas?

No hay pruebas creíbles que apoyen las afirmaciones de la ingeniería de laboratorio del SARS-CoV-2https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7054935/SHA: 5a9154aee79901dd8fecd58b7bcd9b7351102d24Autores: Liu, Shan-Lu; Saif, Linda J.; Weiss, Susan R.; Su, LishanFecha: 2020-02-26DOI: 10.1080/22217501.2020.1733440Licencia: cc-byAbstract: nanTexto: La aparición y el brote de una enfermedad respiratoria aguda recientemente descubierta en Wuhan (China) ha afectado a más de 40.000 personas y ha matado a más de 1.000 al 10 de febrero de 2020. Se identificó rápidamente un nuevo coronavirus humano, el SARS-CoV-2, y la enfermedad asociada se conoce ahora como enfermedad por coronavirus descubierta en 2019 (COVID-19) (https://globalbiodefense. com/novel-coronavirus-covid-19-portal/). De acuerdo con lo que se ha informado [1] [2] [3], COVID-2019 parece tener manifestaciones clínicas similares a la del síndrome respiratorio agudo grave (SARS) causado por el SARS-CoV. La secuencia del genoma del SARS-CoV-2 también tiene una identidad del 80% con el SARS-CoV, pero es más similar a algunos beta-coronavirus de murciélagos, siendo el más alto > 96% de identidad [4, 5]. Actualmente, existen especulaciones, rumores y teorías de conspiración que el SARS-CoV-2 es de origen de laboratorio. Algunas personas han alegado que el SARS-CoV-2 humano se filtró directamente de un laboratorio en Wuhan, donde se informó recientemente de un murciélago CoV (RaTG13), que compartió la homología del 96% con el SARS-CoV-2 [4]. Sin embargo, como sabemos, el SARS-CoV humano y el Civet de palma huésped intermedio SARSlike CoV compartieron la homología del 99,8%, con un total de 202 variaciones de un solo nucleótido (nt) identificadas a través del genoma [6]. Dado que hay más de 1.100 diferencias nt entre el SARS-CoV-2 humano y el murciélago RaTG13-CoV [4], que se distribuyen a través del genoma en un patrón natural que ocurre siguiendo las características evolutivas típicas de CoVs, es muy improbable que RaTG13 CoV sea la fuente inmediata del SARS-CoV-2 La ausencia de un patrón objetivo lógico en las nuevas secuencias virales y un pariente cercano en una especie de vida silvestre (bats) son los signos más reveladores de que el SARS-CoV-2 evolucionó por la evolución natural. Se necesita una búsqueda de un huésped animal intermedio entre murciélagos y humanos para identificar a los animales CoVs más estrechamente relacionados con el SARS-CoV-2 humano. Se especula que los pangolinas podrían llevar CoVs estrechamente relacionados con el SARS-CoV-2, pero los datos para fundamentar esto aún no se han publicado (https:// www.nature.com/articcles/d41586-020-00364-2). Otra afirmación en las redes sociales chinas apunta a un artículo de Nature Medicine publicado en 2015 [7], que informa de la construcción de un CoV quimérico con un gen CoV S murciélago (SHC014) en la columna vertebral de un SARS CoV que se ha adaptado para infectar ratones (MA15) y es capaz de infectar células humanas [8]. Sin embargo, esta afirmación carece de cualquier base científica y debe ser descartada debido a una divergencia significativa en la secuencia genética de este constructo con el nuevo SARS-CoV-2 (> 5.000 nucleótidos). El virus SARS adaptado al ratón (MA15) [9] fue generado por el paso en serie de un clon de SARS CoV infeccioso en el tracto respiratorio de los ratones BALB/c. Después de 15 pasajes en ratones, el SARS-CoV obtuvo replicación elevada y patogénesis pulmonar en ratones envejecidos ( Es probable que el MA15 sea altamente atenuado para replicarse en células humanas o pacientes debido a la adaptación del ratón. Se propuso que el gen S de CoV derivado del murciélago, a diferencia de que de los pacientes humanos o virus derivados del civets, no fue capaz de utilizar el ACE2 humano como receptor para la entrada en células humanas [10, 11]. Se propuso que los civets fueran un huésped intermedio de los bat-CoV, capaz de propagar el SARS CoV a los humanos [6, 12]. Sin embargo, en 2013 varios nuevos coronavirus de murciélagos fueron aislados de murciélagos de herradura chinos y el murciélago SARS-like o SL-CoV-WIV1 fue capaz de utilizar ACE2 de humanos, civets y murciélagos de herradura chinos para la entrada [8]. Combinado con la evidencia evolutiva de que el gen murciélago ACE2 ha sido seleccionado positivamente en los mismos sitios de contacto que el gen humano ACE2 para interactuar con SARS CoV [13], se propuso que un huésped intermedio puede no ser necesario y que algunos murciélagos SL-CoV pueden ser capaces de infectar directamente a los huéspedes humanos. Para hacer frente directamente a esta posibilidad, el gen S exacto del coronavirus murciélago SL-SHC014 fue sintetizado y utilizado para generar un virus quimérico en la columna vertebral del ratón adaptado MA15 SARS-CoV. El resultante virus SL-SHC014-MA15 podría efectivamente utilizar eficientemente ACE2 humano y replicarse en células de la vía aérea humana primaria a títulos similares a cepas epidémicas de SARS-CoV. Mientras que SL-SHC014-MA15 puede replicarse de manera eficiente en los pulmones de ratón jóvenes y envejecidos, la infección fue atenuada, y menos antígeno del virus estaba presente en el epitelio de las vías respiratorias en comparación con el SARS MA15, que causa resultados letales en ratones ancianos [7]. Debido a la elevada actividad patógena del virus quimérico SHC014-MA15 en relación con el virus quimérico MA15 con el gen SRAS S humano original en ratones, tales experimentos con el virus quimérico SL-SHC014-MA15 fueron restringidos posteriormente como ganancia de la función (GOF) bajo la política de pausas mandada por el gobierno de los Estados Unidos (https://www.nih.gov/about-nih/who-were/nih-director/statements/nih-lifts La actual epidemia de COVID-2019 ha reiniciado el debate sobre los riesgos de construir tales virus que podrían tener potencial pandémico, independientemente del hallazgo de que estos murciélagos CoVs ya existen en la naturaleza. Sin embargo, tras análisis filogenéticos cuidadosos por múltiples grupos internacionales [5, 14], el SARS-CoV-2 es sin duda distinto de SL-SHC014-MA15, con > 6.000 diferencias de nucleótidos en todo el genoma. Por lo tanto, una vez más no hay pruebas creíbles que apoyen la afirmación de que el SARS-CoV-2 se deriva del virus de SL-SHC014-MA15 quimérico. También hay rumores de que el SARS-CoV-2 fue artificialmente, o intencionalmente, hecho por humanos en el laboratorio, y esto se destaca en un manuscrito enviado a BioRxiv (un sitio de intercambio de manuscritos antes de cualquier revisión por pares), alegando que el SARS-CoV-2 tiene secuencia de VIH en él y por lo tanto fue probablemente generado en el laboratorio. En un artículo de refutación dirigido por un virólogo VIH-1 Dr. Feng Gao, utilizaron análisis bioinformáticos cuidadosos para demostrar que la afirmación original de múltiples inserciones de VIH en el SARS-CoV-2 no es específica del VIH-1 sino aleatoria [15]. Debido a las muchas preocupaciones planteadas por la comunidad internacional, los autores que hicieron la afirmación inicial ya han retirado este informe. La evolución es gradual y acumula mutaciones gradualmente con el tiempo, mientras que los constructos sintéticos normalmente usarían una espina dorsal conocida e introducirían cambios lógicos o dirigidos en lugar de las mutaciones que ocurren al azar que están presentes en virus naturalmente aislados como el murciélago CoV RaTG13. En nuestra opinión, actualmente no hay evidencia creíble para apoyar la afirmación de que el SARS-CoV-2 se originó a partir de una CoV diseñada por un laboratorio. Es más probable que el SARS-CoV-2 sea un CoV recombinante generado en naturaleza entre un murciélago CoV y otro coronavirus en un huésped animal intermedio. Se necesitan más estudios para explorar esta posibilidad y resolver el origen natural del SARS-CoV-2. Debemos enfatizar que, aunque el SARS-CoV-2 no muestra evidencia de origen de laboratorio, los virus con tan grandes amenazas para la salud pública deben ser manejados correctamente en el laboratorio y también debidamente regulados por la comunidad Susan R. Weiss http://orcid.org/0000-0002-8155-4528

¿Qué se informó en un artículo de refutación dirigido por un virólogo VIH-1 Dr. Feng Gao?

No hay pruebas creíbles que apoyen las afirmaciones de la ingeniería de laboratorio del SARS-CoV-2https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7054935/SHA: 5a9154aee79901dd8fecd58b7bcd9b7351102d24Autores: Liu, Shan-Lu; Saif, Linda J.; Weiss, Susan R.; Su, LishanFecha: 2020-02-26DOI: 10.1080/22217501.2020.1733440Licencia: cc-byAbstract: nanTexto: La aparición y el brote de una enfermedad respiratoria aguda recientemente descubierta en Wuhan (China) ha afectado a más de 40.000 personas y ha matado a más de 1.000 al 10 de febrero de 2020. Se identificó rápidamente un nuevo coronavirus humano, el SARS-CoV-2, y la enfermedad asociada se conoce ahora como enfermedad por coronavirus descubierta en 2019 (COVID-19) (https://globalbiodefense. com/novel-coronavirus-covid-19-portal/). De acuerdo con lo que se ha informado [1] [2] [3], COVID-2019 parece tener manifestaciones clínicas similares a la del síndrome respiratorio agudo grave (SARS) causado por el SARS-CoV. La secuencia del genoma del SARS-CoV-2 también tiene una identidad del 80% con el SARS-CoV, pero es más similar a algunos beta-coronavirus de murciélagos, siendo el más alto > 96% de identidad [4, 5]. Actualmente, existen especulaciones, rumores y teorías de conspiración que el SARS-CoV-2 es de origen de laboratorio. Algunas personas han alegado que el SARS-CoV-2 humano se filtró directamente de un laboratorio en Wuhan, donde se informó recientemente de un murciélago CoV (RaTG13), que compartió la homología del 96% con el SARS-CoV-2 [4]. Sin embargo, como sabemos, el SARS-CoV humano y el Civet de palma huésped intermedio SARSlike CoV compartieron la homología del 99,8%, con un total de 202 variaciones de un solo nucleótido (nt) identificadas a través del genoma [6]. Dado que hay más de 1.100 diferencias nt entre el SARS-CoV-2 humano y el murciélago RaTG13-CoV [4], que se distribuyen a través del genoma en un patrón natural que ocurre siguiendo las características evolutivas típicas de CoVs, es muy improbable que RaTG13 CoV sea la fuente inmediata del SARS-CoV-2 La ausencia de un patrón objetivo lógico en las nuevas secuencias virales y un pariente cercano en una especie de vida silvestre (bats) son los signos más reveladores de que el SARS-CoV-2 evolucionó por la evolución natural. Se necesita una búsqueda de un huésped animal intermedio entre murciélagos y humanos para identificar a los animales CoVs más estrechamente relacionados con el SARS-CoV-2 humano. Se especula que los pangolinas podrían llevar CoVs estrechamente relacionados con el SARS-CoV-2, pero los datos para fundamentar esto aún no se han publicado (https:// www.nature.com/articcles/d41586-020-00364-2). Otra afirmación en las redes sociales chinas apunta a un artículo de Nature Medicine publicado en 2015 [7], que informa de la construcción de un CoV quimérico con un gen CoV S murciélago (SHC014) en la columna vertebral de un SARS CoV que se ha adaptado para infectar ratones (MA15) y es capaz de infectar células humanas [8]. Sin embargo, esta afirmación carece de cualquier base científica y debe ser descartada debido a una divergencia significativa en la secuencia genética de este constructo con el nuevo SARS-CoV-2 (> 5.000 nucleótidos). El virus SARS adaptado al ratón (MA15) [9] fue generado por el paso en serie de un clon de SARS CoV infeccioso en el tracto respiratorio de ratones BALB/c. Después de 15 pasajes en ratones, el SARS-CoV obtuvo una replicación elevada y patogénesis pulmonar en ratones envejecidos ( Es probable que el MA15 sea altamente atenuado para replicarse en células humanas o pacientes debido a la adaptación del ratón. Se propuso que el gen S de CoV derivado del murciélago, a diferencia de que de los pacientes humanos o virus derivados del civets, no fue capaz de utilizar el ACE2 humano como receptor para la entrada en células humanas [10, 11]. Se propuso que los civets fueran un huésped intermedio de los bat-CoV, capaz de propagar el SARS CoV a los humanos [6, 12]. Sin embargo, en 2013 varios nuevos coronavirus de murciélagos fueron aislados de murciélagos de herradura chinos y el murciélago SARS-like o SL-CoV-WIV1 fue capaz de utilizar ACE2 de humanos, civets y murciélagos de herradura chinos para la entrada [8]. Combinado con la evidencia evolutiva de que el gen murciélago ACE2 ha sido seleccionado positivamente en los mismos sitios de contacto que el gen humano ACE2 para interactuar con SARS CoV [13], se propuso que un huésped intermedio puede no ser necesario y que algunos murciélagos SL-CoV pueden ser capaces de infectar directamente a los huéspedes humanos. Para hacer frente directamente a esta posibilidad, el gen S exacto del coronavirus murciélago SL-SHC014 fue sintetizado y utilizado para generar un virus quimérico en la columna vertebral del ratón adaptado MA15 SARS-CoV. El resultante virus SL-SHC014-MA15 podría efectivamente utilizar eficientemente ACE2 humano y replicarse en células de la vía aérea humana primaria a títulos similares a cepas epidémicas de SARS-CoV. Mientras que SL-SHC014-MA15 puede replicarse de manera eficiente en los pulmones de ratón jóvenes y envejecidos, la infección fue atenuada, y menos antígeno del virus estaba presente en el epitelio de las vías respiratorias en comparación con el SARS MA15, que causa resultados letales en ratones ancianos [7]. Debido a la elevada actividad patógena del virus quimérico SHC014-MA15 en relación con el virus quimérico MA15 con el gen SRAS S humano original en ratones, tales experimentos con el virus quimérico SL-SHC014-MA15 fueron restringidos posteriormente como ganancia de la función (GOF) bajo la política de pausas mandada por el gobierno de los Estados Unidos (https://www.nih.gov/about-nih/who-were/nih-director/statements/nih-lifts La actual epidemia de COVID-2019 ha reiniciado el debate sobre los riesgos de construir tales virus que podrían tener potencial pandémico, independientemente del hallazgo de que estos murciélagos CoVs ya existen en la naturaleza. Sin embargo, tras análisis filogenéticos cuidadosos por múltiples grupos internacionales [5, 14], el SARS-CoV-2 es sin duda distinto de SL-SHC014-MA15, con > 6.000 diferencias de nucleótidos en todo el genoma. Por lo tanto, una vez más no hay pruebas creíbles que apoyen la afirmación de que el SARS-CoV-2 se deriva del virus de SL-SHC014-MA15 quimérico. También hay rumores de que el SARS-CoV-2 fue artificialmente, o intencionalmente, hecho por humanos en el laboratorio, y esto se destaca en un manuscrito enviado a BioRxiv (un sitio de intercambio de manuscritos antes de cualquier revisión por pares), alegando que el SARS-CoV-2 tiene secuencia de VIH en él y por lo tanto fue probablemente generado en el laboratorio. En un artículo de refutación dirigido por un virólogo VIH-1 Dr. Feng Gao, utilizaron análisis bioinformáticos cuidadosos para demostrar que la afirmación original de múltiples inserciones de VIH en el SARS-CoV-2 no es específica del VIH-1 sino aleatoria [15]. Debido a las muchas preocupaciones planteadas por la comunidad internacional, los autores que hicieron la afirmación inicial ya han retirado este informe. La evolución es gradual y acumula mutaciones gradualmente con el tiempo, mientras que los constructos sintéticos normalmente usarían una espina dorsal conocida e introducirían cambios lógicos o dirigidos en lugar de las mutaciones que ocurren al azar que están presentes en virus naturalmente aislados como el murciélago CoV RaTG13. En nuestra opinión, actualmente no hay evidencia creíble para apoyar la afirmación de que el SARS-CoV-2 se originó a partir de una CoV diseñada por un laboratorio. Es más probable que el SARS-CoV-2 sea un CoV recombinante generado en naturaleza entre un murciélago CoV y otro coronavirus en un huésped animal intermedio. Se necesitan más estudios para explorar esta posibilidad y resolver el origen natural del SARS-CoV-2. Debemos enfatizar que, aunque el SARS-CoV-2 no muestra evidencia de origen de laboratorio, los virus con tan grandes amenazas para la salud pública deben ser manejados correctamente en el laboratorio y también debidamente regulados por la comunidad Susan R. Weiss http://orcid.org/0000-0002-8155-4528

¿Cuál es la manifestación clínica similar?

Los hantavirus en las Américas y su papel como patógenos emergenteshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3185593/SHA: efe13a8d42b60ef9f7387ea539a1b2eeb5f80101Autores: Hjelle, Brian; Torres-Pérez, FernandoFecha: 2010-11-25DOI: 10.3390/v2125559Licencia: cc-byAbstract: La continua aparición y reaparición de patógenos representan una amenaza continua, a veces mayor, para las poblaciones. Los hantavirus (familia Bunyaviridae) y sus enfermedades humanas asociadas se consideraron confinados a Eurasia, pero la aparición de un brote en el suroeste de Estados Unidos llevó a un gran aumento en su estudio entre los virólogos de todo el mundo. Se han descrito más de 40 genotipos hantavirales, la gran mayoría desde 1993, y casi la mitad de ellos patógenos para los seres humanos. Los hantavirus causan infecciones persistentes en sus reservorios, y en las Américas, la enfermedad humana se manifiesta como compromiso cardiopulmonar, síndrome cardiopulmonar del hantavirus (HCPS), con proporciones de casos-fatalidad, para los serotipos virales más comunes, entre el 30% y el 40%. Alteración del hábitat y trastornos ecológicos a mayor escala, tal vez incluyendo el cambio climático, son algunos de los factores que pueden haber aumentado la carga de casos humanos de HCPS entre 1993 y el presente. Consideramos aquí las características que influyen en la estructura de la dinámica de la población huésped que pueden conducir a brotes virales, así como los determinantes macromoleculares de los hantavirus que han sido considerados como potenciales contribuciones a la patogenicidad. Texto: Los patógenos emergentes causan enfermedades nuevas o no reconocidas anteriormente, y entre ellas, las zoonóticas emergentes son una preocupación importante entre los científicos que estudian enfermedades infecciosas a diferentes escalas espaciales y temporales [1, 2]. Los cambios en las condiciones bióticas y abióticas pueden alterar la dinámica de las enfermedades de la población y conducir a la aparición de infecciones zoonóticas [3] [5] [6]. Durante las últimas décadas, se han producido varios brotes de patógenos virales emergentes y reemergentes, que afectan tanto a la implicación puramente local como a nivel mundial/pandémica de las poblaciones humanas. Entre los ejemplos visibles están la gripe A, el virus del Ébola, el virus de la hepatitis C, el trastorno respiratorio grave para adultos (SARS), el coronavirus y el virus de la inmunodeficiencia humana, que desafían las medidas de prevención y control de los sistemas de salud pública [7]. En las Américas, el reciente brote de gripe pandémica A subtipo H1N1 se convirtió en un objetivo importante de control debido a su rápida propagación, y las incertidumbres en cuanto a virulencia y transmisibilidad, sin embargo, la disponibilidad de vacunas fue limitada cuando se produjo una actividad significativa antes de la temporada tradicional de gripe [8]. Sin embargo, en el último siglo han surgido o resurgido brotes de varias enfermedades virales relacionadas con el virus arenavirus y el virus del dengue, y más recientemente, hantavirus y la expansión del rango geográfico del virus del Nilo Occidental. Entre las enfermedades zoonóticas, los mamíferos pequeños son anfitriones de varios virus ARN patógenos, especialmente Arenaviridae y Bunyaviridae: Hantavirus [9] [10] [11]. Las infecciones por hantavirus se convirtieron en una preocupación en las Américas después de la descripción de un brote de distrés respiratorio agudo ocurrido en La enfermedad recientemente reconocida, el síndrome cardiopulmonar del hantavirus, el HCPS (o síndrome pulmonar del hantavirus), se relacionó con la infección por el virus del Sin Nombre (SNV) recién descubierto, y el roedor Peromyscus maniculatus (ratón venado) fue identificado como el reservorio [13]. Sin embargo, las infecciones por hantavirus tienen una historia mucho más larga. Una revisión de los escritos chinos antiguos, que datan de aproximadamente 960 dC, reveló descripciones muy parecidas a la fiebre hemorrágica con síndrome renal (HFRS), el síndrome causado por los hantavirus del Viejo Mundo [14]. Durante el siglo XX, los casos de enfermedad febril aguda con compromiso renal fueron descritos de varios países eurasiáticos y Japón, a menudo en asociación con compromisos militares [15]. El HFRS como síndrome distinto, sin embargo, fue llamado por primera vez a la atención de la medicina occidental en asociación con un brote que ocurrió entre las tropas de las Naciones Unidas durante el conflicto coreano entre 1951 y 1954, donde más de 3.200 soldados fueron afectados [16]. Tomó más de dos décadas hasta que el agente etiológico, el virus Hantaan (HTNV), fue aislado del ratón de campo rayado Apodemus agrarius, detectado en parte por la unión de anticuerpos de muestras de suero de paciente a los tejidos pulmonares de ratones de campo sanos y salvajes [17, 18]. El virus se encontró más tarde para representar la especie tipo de un nuevo género Hantavirus de la familia Bunyaviridae, aunque fue más tarde evidente que el primer hantavirus a aislarse fue el virus Thottapalayam de shrew-borne [19]. La categorización de los hantavirus como pertenecientes a la familia Bunyaviridae se debe en parte a la presencia consistente de tres genomas de ARN que son circularizados in vivo como resultado de la presencia de nucleótidos terminales complementarios que ayudan a doblar el genoma en una morfología -hairpin-, descrita por primera vez para el flebovirus Uukuniemi [19, 20]. La Tabla 1 es una lista de los hantavirus patógenos predominantemente distintos serológicamente. Se describen muchos otros genotipos llamados, pero tales otras formas patogénicas están generalmente estrechamente relacionadas con los Andes o, en algunos casos, el virus Sin Nombre. Durante la maduración del virus, el precursor forma GPC se procesa utilizando una proteasa unida a la membrana en Gn y Gc, una escisión que ocurre, y parece ser señalada, después de la señal péptida conservada WAASA en la C-terminal de Gn [24]. Aunque las dos proteínas se pueden expresar de forma independiente a través de la transfección, pueden ser retenidas en el compartimento celular incorrecto (ER o aggrosome); por lo tanto, deben ser co-expresadas para permitirles estabilidad para que las dos se puedan ensamblar correctamente en el Golgi [25, [27] [28]. Se han identificado varias actividades y propiedades para las glicoproteínas envolventes del hantavirus, incluyendo algunas características que se sospecha que están involucradas en la patogenicidad de los serotipos causantes de la enfermedad, una posibilidad que ha generado atención experimental. Las glucoproteínas son los ligandos conocidos o presuntos para al menos dos receptores celulares distintos, la cadena de integrina y el factor acelerador de la descomposición, o DAF [30, 31] ; con gC1qR/p32 también identificado como otro receptor de entrada potencial [32]. Comparaciones con la proteína E del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, llevaron a Tischler et al. a considerar la glicoproteína Gc como una proteína potencial de fusión de clase II, tal vez impartiendo actividad de fusión al virión, y esta hipótesis ha ganado apoyo en otros estudios [33, 34]. Se han identificado actividades adicionales con, o se afirma que están relacionadas con, Gn. Para muchos de estos estudios, una premisa subyacente ha sostenido que hay diferencias entre las glicoproteínas de hantavirus -patógenos en relación con virus en el género que se denominan Si bien es cierto que aún no ha sido posible vincular el virus de Prospect Hill (PHV) con la enfermedad humana, la ausencia de evidencia de su patogenicidad tal vez no debería equipararse con la evidencia de su ausencia. Sólo se podría considerar que el nivel de enfermedad (por ejemplo, letargo, fiebre, proteinuria y azotemia) asociado con la infección de primates no humanos por PHV no es significativamente diferente del registrado para los modelos de primates no humanos utilizando el virus conocido del patógeno Puumala (PUUV) [35, 36]. Para el propósito de esta discusión, presumiremos que los hantavirus apatogénicos son efectivamente apatogénicos. Mientras que algunos estudios han sugerido que las glicoproteínas Gn se dirigen más rápidamente a la vía ubiquitina-proteosoma que a las formas apatogénicas, otros han interpretado las diferencias en el manejo de las glicoproteínas Gn a través de las especies del hantavirus por el sistema ubiquitina-proteosomal como independientes de la patogenicidad [37] [38] [39]. Algunos investigadores han dirigido sus esfuerzos hacia la identificación de una capacidad diferencial, ya sea cinética o de magnitud absoluta, en la capacidad de los hantavirus patógenos y apatogénicos para provocar una respuesta del interferón en las células. Una premisa que surge es que las formas apatogénicas tenderían a inducir una respuesta innata anterior que haría más probable que el virus se limpiara rápidamente o se volviera menos competente en su replicación, a fin de evitar cualquier respuesta patológica en el huésped [4 La respuesta innata anti-hantavirus puede en algunos casos ser atribuida a la interacción viral como ligando de TLR-3, pero no en otros, y en las células endoteliales, no parece requerir más que la partícula viral misma, incluso cuando se introduce en forma replicante-incompetente [43, 44]. Proteínas y ARNm inducidos prominentemente por los hantavirus incluyen MxA e IFIT-1 (ISG-56) y otros incluyendo algunos con actividad antiviral conocida o sospechada. Esos hantavirus, a menudo cepas altamente patógenas, que no inducen una respuesta antiviral potente, se sospechan o se presume que tienen un (más) potente mecanismo de antagonismo interferón-vía en relación con otros virus, un mecanismo que actúa positivamente para prevenir que se forme una respuesta innata efectiva, al menos temprano en Sin embargo, se reportan algunos casos en los que los hantavirus altamente patógenos, tales como NVS, también son capaces de inducir la expresión de los ARNm del gen estimulado por interferón, incluso muy temprano en la infección, con proteínas ISG, como se esperaba, tardando más tiempo en aparecer en la célula [44]. Las actividades anti-interferón también se han atribuido a la proteína NSs que se puede elaborar en células infectadas por serotipos que codifican esta proteína [46]. Otros investigadores han examinado las actividades de las glucoproteínas del hantavirus y otras proteínas que podrían afectar directamente a algunos aspectos de la progresión patogénica asociada a la infección por hantavirus en humanos, tales como cambios en la permeabilidad vascular. Mientras que los primeros intentos de causar directamente aumentos en la permeabilidad de las monocapas endoteliales con partículas virales o infección viral fueron en gran medida decepcionantes, los hantavirus se han identificado como que afectan adversamente la migración endotelial sobre los sustratos y en la potenciación de la permeabilidad endotelial inducida por VEG-F [47, 48]. La proteína nucleocápsida o N más corta (+50 kD) es un componente estructural del nucleocápsido viral, junto con los segmentos de ARN viral genómico. Como proteína de unión al ARN que afecta a la horquilla del cabello de los segmentos genómicos con alta afinidad [49, 50], limita el acceso del ARN para alojar nucleasasas y ayuda a hacer que la replicación viral sea un proceso cerrado dentro del citoplasma. También actúa como una proteína de membrana periférica, al igual que la proteína L [51], una actividad que podría jugar un papel en su supuesta, pero aún no demostrada función como matriz [52]. Hasta hace poco, no se había apreciado que N tuviera una amplia variedad de otras actividades, algunas de las cuales pueden estar vinculadas, no sólo a los requisitos fundamentales de replicación, sino también a la interferencia con una serie de procesos intracelulares de la célula normal. Así, se ha propuesto una interacción entre el aminoterminal de la proteína N del hantavirus y la proteína celular Daxx, con la sugerencia de posibles consecuencias pro-apoptóticas [51]. N también se reporta que interactúa con microfilamentos actínicos, y la proteína SUMO-1 [53, 54]. Utilizando ensayos basados en el gen reportero, Connie Schmaljohn y sus colegas han reportado que la proteína nucleocapsida del virus Hantaan tiene un papel inhibidor en las respuestas inflamatorias mediadas por NF kappa B (NF- B). Los efectos sobre la expresión NF- B parecen estar limitados a la prevención de su translocación nuclear después de su intento de activación con lipopolisacárido, LPS [55]. En el citoplasma de las células infectadas, la proteína N se puede encontrar en los cuerpos celulares P donde secuestra y protege los capuchones de 5'. Puede localizar los capuchones a través de su interacción con DCP1, un componente clave de los cuerpos P. Durante la infección por hantavirus, los ARN virales se concentran en los cuerpos P, a través de su interacción con N y DCP1. La proteína N demuestra la protección preferencial de los ARNm diseñados para terminar prematuramente su proteína codificada en comparación con los ARNm nativos [56]. La proteína N se ha vinculado cada vez más a la replicación y traducción virales, a veces de maneras no previstas anteriormente. Se encuentra entre una familia creciente de diversas proteínas virales que pueden servir como un inespecífico - ARN chaperone ®, una actividad que debe facilitar el acceso de la L polimerasa al ARNv para la transcripción y replicación, en que puede disociar transitoriamente estructuras de ARN mal dobladas [57]. Algunos de los efectos de la proteína N en la traducción no pueden ser inmediatamente reconocidos como adaptables en la naturaleza. Puede reemplazar todo el complejo de iniciación traslacional EIF4F, presentando simultáneamente el ribosoma con un reemplazo de la actividad de unión de la tapa de eIF 4E, uniéndose al complejo de pre-iniciación 43S, al igual que eIF 4G, al tiempo que reemplaza la actividad helicoidal de eIF 4A, que se presume que es necesaria para disociar la estructura de ARN de orden superior [56, 58]. Estos tres factores normalmente trabajan juntos para lograr la iniciación traslacional. En los cuerpos P, la capacidad de la proteína N de unirse a una alta afinidad a los oligoribonucleótidos celulares nativos tapados, junto con su actividad en la protección de ARNs tapados de la degradación, probablemente facilita el acceso de oligonucleótidos encapsulados para su uso en la iniciación transcripcional por L polimerasa (-cap ra Tráfico de N para el ensamblaje viral: Clásicamente, la proteína N en las células infectadas parece estar agrupada o partículas en la naturaleza, con una concentración pesada en una única ubicación perinuclear, ampliamente considerada como la Golgi [27]. Las proteínas N de los hantavirus se encuentran en asociación con fracciones de partículas, y los estudios confocales microscopía y bioquímico-inhibidores han demostrado que las trazas N a lo largo de microtúbulos pero no con filamentos de actina [52]. El destino final de N, para su ensamblaje en partículas virales es la Golgi, y que circula allí a través del complejo intermedio retículo-Golgi endoplasmático (ERGIC), también conocido como cúmulo vesicular-tubular [52]. Un inhibidor negativo dominante, la dinamitina, asociado con el transporte mediado por Los estudios posteriores sugieren que la dependencia específica del transporte microtubular es específica de los hantavirus del Viejo Mundo como el NVH, pero que el Hantavirus del Nuevo Mundo ANDV está asociado con filamentos de actina [59]. Sin embargo, los datos recientes indican que el transporte microtubular es efectivamente utilizado para el NVH del Nuevo Mundo [60]. Las enfermedades del Hantavirus del hombre desde hace mucho tiempo han sido sospechosas de tener una base inmunopatógena en parte debido a su período de incubación relativamente largo de 2-3 semanas y la asociación temporal observada entre los trastornos inmunológicos y la primera aparición de signos y síntomas de la enfermedad del hantavirus. HFRS y HCPS comparten muchas características clínicas, llevando a muchos investigadores a considerar que son, en esencia, diferentes manifestaciones de un proceso patógeno similar, que difieren principalmente en los órganos objetivo primarios de expresión de la enfermedad (Tabla La patogénesis de las infecciones por hantavirus es el tema de una revisión continuamente actualizada en la serie UpToDate [61]. Para el momento en que aparecen los síntomas en el HCPS, ambas respuestas antivirales fuertes, y, para los genotipos virales más virulentos, el ARN viral puede ser detectado en plasma sanguíneo o células sanguíneas nucleadas respectivamente [63, 64]. Al menos tres estudios han correlacionado el ARN viral plasmático con la gravedad de la enfermedad para el HCPS y el HFRS, sugiriendo que la replicación del virus juega un papel continuo y en tiempo real en la patogénesis viral [65] [66] [67]. Se han identificado varios cambios patológicos distintivos que ocurren tanto en el HFRS como en el HCPS. Una característica crítica de ambos es una fuga capilar transitoria (~ 1-5 días) que involucra el La fuga resultante es de carácter exudativo, con una composición química alta en proteínas y similar al plasma. La experiencia continua que indica el fuerte tropismo tisular para las células endoteliales, específicamente, es uno de los varios factores que hacen de la integra β3 un candidato especialmente atractivo como un importante receptor in vivo para los hantavirus. Es probable que los hantavirus lleguen a sus tejidos objetivo a través de la captación por los ganglios linfáticos regionales, tal vez con o dentro de un histiocito pulmonar escoltante. Las semillas del virus endotelio local, donde las primeras células infectadas dan lugar, en última instancia, a una viremia primaria, un proceso que parece tomar mucho tiempo para las infecciones por hantavirus [62, 63]. En el momento en que emerge la viremia secundaria, los agentes de las formas más severas de HFRS y HCPS han comenzado a alcanzar una masa suficiente para inducir, a través de las interacciones PAMP-PRR y otros medios, la expresión de citoquinas proinflamatorias [64]. Para HCPS, esa expresión favorece el lecho pulmonar y los órganos linfoides, pero, por razones desconocidas, ahorra el retroperitoneo y, en general, el riñón. En HFRS la situación se invierte, y sin embargo no se aprecia a menudo que el esperado tropismos tisulares preferentes de virus asociados a HFRS y sus contrapartes asociadas a HCPS para los lechos renal y pulmonar, respectivamente, no es como se predeciría a través de las manifestaciones de las dos enfermedades. La elaboración local de mediadores inflamatorios y quimiotácticos se considera un requisito para el desarrollo de Sin embargo, no es la hipoxemia, debido al edema pulmonar prominente, lo que conduce a la muerte en la mayoría de los casos fatales de HCPS, sino más bien la intoxicación del corazón por mediadores como aún no definidos, lo que conduce al estado de bajo gasto cardíaco y al síndrome de shock asociado [64, 65]. Es tentador especular que los mediadores producidos en el pulmón en conexión con el infiltrado inflamatorio pueden infiltrarse a través de la circulación coronaria con dilución mínima en HCPS, consecuencia desventajosa de la estrecha yuxtaposición anatómica de los dos órganos. Así, al menos tres clases de mecanismos potenciales, algunos superpuestos y todos ciertamente no exclusivos de los otros, podrían presumirse que subyacen a la patogénesis del HCPS. Estos incluyen:(1) Mecanismos inmunes innatos. La naturaleza de las interacciones entre los patrones moleculares asociados al patógeno del hantavirus (PAMP) y los receptores de reconocimiento del patrón (PRR) de las células endoteliales susceptibles comienzan a ser aclaradas. El HTNV prototípico parece ser reconocido por TLR-3 [43]. Tal infección tiene consecuencias tales como una mayor expresión del HLA-DR en las células dendríticas [66] y la diferenciación de los monocitos hacia las células dendríticas [67]. (2) Efectos virales directos. La correlación observada entre la carga viral y la gravedad de la enfermedad deja abierta la posibilidad de que las partículas del hantavirus o el ARN puedan tener efectos tóxicos sobre las células o sobre la señalización. Algunos investigadores han favorecido la toxicidad viral directa, actuando a través de la inhibición de la función de barrera celular endotelial, como una explicación de gran parte de la fuga capilar, aunque existe Una pista potencialmente importante hacia el mecanismo por el cual las infecciones por hantavirus agotan las plaquetas sanguíneas y, en algunos casos, causan manifestaciones hemorrágicas, fue avanzada por el reciente descubrimiento de que los hantavirus patógenos son capaces de reclutar plaquetas para adherirse a las superficies celulares endoteliales, con β3 integrina utilizada como elemento de unión crítica [69]. (3) Efectos patógenos causados por las actividades de macromoléculas virales específicas. Hemos revisado algunas de las actividades asociadas con los Gn, Gc y N, polipéptidos codificados viralmente en secciones anteriores. Modelos de prueba de patogénesis se pueden hacer más eficazmente cuando hay un modelo animal que imita aspectos clave de la enfermedad. No existe un modelo similar al HFRS, pero existen modelos animales para el transporte asintomático de PUUV y SNV por sus roedores portadores nativos, el banco vole Myodes glareolus y el ratón de venado P. maniculatus; así como un modelo de hámster sirio utilizando ANDV o el virus Aporal relacionado de Venezuela, para el cual se observa una enfermedad mimética HCPS [70] [71] [72] [73]. El modelo de hámster ANDV-Sirio tiene una serie de características en común con la enfermedad humana, así como algunas diferencias. A diferencia de las enfermedades neurológicas que han sido posibles de provocar con HTNV, el modelo de hámster para HCPS parece ser causado por fugas capilares que resultan en edema pulmonar y la producción de un derrame pleural con características exuda Típicamente los hámsteres mueren entre 11 y 14-d post-inoculación, reflejando un período de incubación ligeramente acelerado en comparación con las infecciones humanas. Al igual que con el HCPS humano, el examen microscópico del pulmón revela abundante deposición de fibrina, septo alveolar engrosado y antígeno viral expresado abundantemente en el endotelio microvascular. Los hámsteres infectados por ANDV equipados con dispositivos de monitoreo fisiológico mostraron disminución de las presiones de pulso, taquicardia e hipotensión que parecen imitar de cerca el shock que se cree que es la causa próxima de la muerte en pacientes que sucumben al HCPS [65, 74]. En comparación con la enfermedad humana, los hámsteres infectados por ANDV exhiben títulos excepcionalmente altos de ANDV vivo en sus tejidos, con gran parte de la replicación viral que ocurre en Los títulos de ANDV vivo en algunos casos superan los 10 8 /g, mientras que los aislados de hantavirus de los tejidos humanos han sido notoriamente difíciles de obtener. A pesar de la aparición universal de enzimas hepáticas levemente elevadas en pacientes con HCPS, las enzimas hepáticas no parecen estar presentes en niveles elevados en la sangre de hámsters enfermos incluso inmediatamente antes de la muerte [75]. El período prolongado de incubación asociado con la enfermedad por hantavirus da al huésped un tiempo considerable para montar una respuesta inmune madura contra el virus. Así, en contradición a infecciones de gravedad comparable y sintomatología relacionada asociada con arenavirus y filovirus, las infecciones por hantavirus en humanos se asocian con respuestas anticuerpos de título significativo por el momento en que comienzan los síntomas. A pesar de esta observación, parece ser posible que la variación natural en las respuestas individuales de anticuerpos neutralizantes entre los pacientes con infecciones por NVS pueda estar relacionada con la gravedad de la enfermedad, lo que sugiere que la administración de anticuerpos antivirales podría resultar efectiva terapéuticamente [76]. En el caso de la infección por ANDV, han surgido nuevas evidencias que indican que el aparente aclaramiento del virus de la sangre no resulta en la eliminación completa del estímulo antigénico por el virus, sugiriendo que el virus puede persistir, tal vez en algún sitio inmunológicamente privilegiado aún indeterminado [77]. Un papel para las respuestas patológicas mediadas por células T en el HFRS y el HCPS ha sido la fuente de especulación por una variedad de razones. La gravedad del SNS asociado al SNCP puede haber hecho más evidente que el inicio del edema pulmonar, la taquicardia y la hipertensión parecía estar todo, pero universalmente asociado temporalmente, con la aparición de un espectro de células altamente activadas del linaje linfoide en la sangre periférica. Se detectaron células con similitudes morfológicas cercanas a estos -inmunoblastos- en los pulmones congestionados y pesados de los pacientes que llegaron a la autopsia, así como en órganos linfoides y en las tríadas portal [63, [78] [79] [80]. Estas observaciones llevaron a especular que algún componente de la patogénesis por hantavirus podría estar vinculado a la aparición de células T antivirales que podrían estimular o contribuir a la aparición de una -tormenta de mediadores y el fenotipo de fuga capilar asociado. Estudios posteriores han confirmado la expectativa de que una fracción significativa de la población de inmunoblastos en pacientes con HCPS son células T con especificidad para epitopes específicos de antígenos virales de clase I presentados por el HLA, incluyendo Gn, Gc y N [77, [81] [82] [83]. Presumiblemente, las actividades antivirales de estas células, manifestadas en parte por su elaboración de mediadores en el intersticio afectado, pueden contribuir a la fuga endotelial/capilar que se encuentra en el corazón de la patogénesis del hantavirus. Debido a que los primeros casos de HCPS a menudo llegaron a la autopsia, se hizo posible examinar tejidos necropsiados para la expresión de citocinas. El estudio de Mori et al. (1999) revelaron una alta expresión relativa de citocinas proinflamatorias incluyendo TNF-, IL-1-, IL-6, proporcionando evidencia a favor de un modelo de tormenta de citoquinas para la patogénesis [64]. Los autores creían, basándose en la morfología de las células secretadoras de citoquinas, que tanto monocitos como linfocitos estaban contribuyendo a la producción de citocinas. Que los mediadores proinflamatorios se encuentran en niveles elevados en el plasma, así como el intersticio renal de pacientes con enfermedad hantaviral aguda se ha reconocido desde hace algún tiempo también [84, 85]. Si bien el diagnóstico de HCPS y HFRS se realiza mejor con serología IgM, en la etapa aguda de la infección por NVS, también se puede utilizar RT-PCR si se utilizan células sanguíneas o coágulos de sangre en lugar de plasma o suero, donde la sensibilidad incluso utilizando imprimaciones PCR anidadas disminuye a cerca del 70% [86] [87] [88]. En una instalación en la que se tratan muchos casos de HCPS, el centro médico de la Universidad de Nuevo México en Albuquerque, se ha ofrecido un servicio de diagnóstico en el que se analizan los hallazgos hematológicos del paciente para establecer la probabilidad de que un paciente tenga HCPS. La combinación de trombocitopenia, abundancia elevada de linfocitos -inmunoblasto-, población de células polimorfonucleares con desplazamiento izquierdo sin evidencia morfológica fuerte para su activación, y valores elevados de hemoglobina o hematocrito es altamente específica para el HCPS y permite a los clínicos la capacidad de poner pacientes presuntivos-HCPS en oxigenación de membrana extracorpórea (ECMO), que se cree que ha salvado a muchos pacientes de un resultado letal [89]. Se cree que la infección humana por hantavirus sigue el contacto con secreciones o excreciones producidas por roedores infectados. En los Estados Unidos, 538 infecciones humanas por hantavirus fueron reportadas hasta finales de diciembre de 2009 [90], con Nuevo México, Arizona y Colorado mostrando los casos más altos. Mientras que el prototípico hantavirus centroamericano en América Central fue el virus Rio Segundo de Reithrodontomys mexicanus de Costa Rica, la primera enfermedad humana apareció algunos años más tarde en Panamá, donde el virus Choclo (CHOV) surgió como el agente etiológico y se cree que es responsable de todos los casos conocidos de HCPS. La rata de arroz pigmeo fulvo Oligoryzomys fulvescens ha sido identificada como el reservorio de roedores [91]. En Panamá, los primeros casos de HCPS, aunque con poca o ninguna implicación cardiaca evidente, fueron reportados en 1999, y desde entonces, 106 infecciones humanas han ocurrido con una tasa de mortalidad del 26% [92]. Seroencuestas de mamíferos en México y Costa Rica han encontrado anticuerpos antihantavirus [93] [94] [95] [96], y se han notificado seroprevalencias que oscilan entre 0,6 y 1,6% en poblaciones humanas a pesar de la ausencia de casos conocidos de HCPS [97]. En América del Sur, los casos de HCPS se han identificado en Argentina, Bolivia, Brasil, Chile, Paraguay y Uruguay, y también se han notificado evidencias de exposición humana a hantavirus en Venezuela [98] y Perú [99]. En América del Sur, ANDV es el principal agente etiológico con casos en Chile y Argentina notificados desde 1995. En Chile, se han producido 671 casos de HCPS debido a ANDV durante el período 2001-2009 [100]. Desde 1995 se han reportado más de 1.000 casos de HCPS en Argentina [101] ; en el Brasil se han identificado aproximadamente 1.100 casos de HCPS entre 1993 y 2008 [102]. Las tasas de mortalidad por casos en esos tres países han sido similares, oscilando entre el 30% (Argentina), el 36% (Chile) y el 39% (Brasil). Las infecciones por Hantavirus ocurren con más frecuencia en hombres que en mujeres, aunque la proporción entre hombres y mujeres es muy variable. Por ejemplo, las comunidades panameñas mostraron una proporción de 55 hombres por 45 mujeres [103], mientras que en Chile la proporción es más sesgada por hombres (71%) [104]. En el Chaco paraguayo la proporción entre hombres y mujeres se aproxima al 50% [105]. En América del Norte, en diciembre de 2009 el 63% de los pacientes eran varones [90]. Todos los grupos étnicos y raciales parecen ser susceptibles a infecciones por el hantavirus, y las diferencias entre ciertos grupos (como indígenas y no indígenas) están más probablemente correlacionadas con el tipo de hábitat en el que reside la población (por ejemplo, zonas rurales frente a zonas urbanas). De hecho, las comunidades rurales representan la mayor incidencia global del hantavirus y, por lo tanto, están en mayor riesgo [92, [105] [106] [107] [108] [109] [109] [119], aunque también se ha destacado la importancia de los entornos peridomésticos como una importante zona de exposición [112, 113]. El principal mecanismo por el que los seres humanos adquieren la infección por el hantavirus es la exposición a aerosoles de heces contaminadas de roedores, orina y saliva [114, 115]. Esto puede ocurrir cuando los seres humanos residen en áreas cercanas a las que habitan los roedores, viven en áreas infestadas de roedores, o cuando los roedores invaden entornos humanos, que son más frecuentes en hábitats rurales.Existe una larga historia de coexistencia humana con roedores, lo que plantea dudas sobre el aparente aumento reciente de las enfermedades relacionadas con el hantavirus, especialmente el HCPS. Aparte de una aparente asociación con eventos de oscilación sureña de El Niño (ENSO) en algunas regiones [116, 117], los recientes incrementos en la incidencia del HCPS no parecen seguir un patrón temporal o espacial fácilmente definido. Sin embargo, algunas características del paisaje, como la fragmentación del hábitat o las áreas perturbadas por el ser humano, pueden influir en la dinámica de la población de roedores e impactar en la incidencia viral [118] [112] [112] [121]. A pesar de la estocástica asociada a la contracción de la infección Las actividades humanas en edificios mal ventilados que pulverizan partículas que luego se inhalan (es decir, limpieza, agitación de alfombras, polvo) se identifican con frecuencia entre los pacientes admitidos para el SHCPS [11, 122]. Se cree que las actividades al aire libre transmiten un menor riesgo debido a la labilidad de los hantavirus a la radiación UV y a la supuesta tendencia a dispersarse en el viento, aunque ciertas condiciones ambientales parecen mantener el virus durante períodos más largos fuera de su huésped natural, lo que permite la transmisión indirecta [123]. Una vía alternativa pero poco común de transmisión del virus es la mordedura de roedores [124] [125] [126]. Los trabajadores sobre el terreno que manipulan mamíferos corren un riesgo potencialmente mayor de exposición a infecciones por hantavirus, aunque cuando se cuantifica a través de serosurveys el riesgo absoluto parece bastante leve [127]. Un nuevo estudio en Colorado sugiere la posibilidad de que una picadura de roedor haya sido el vehículo próximo para la transmisión al aire libre de NVS [128], lo que vuelve a enfatizar el uso de equipo de protección personal durante las actividades de trabajo de campo [129]. Como caso particular dentro de los hantavirus, la transmisión de persona a persona ha sido documentada exclusivamente para el virus de los Andes sudamericanos [130] [133] [133] [135]. La identificación de esta vía de transmisión se ha hecho utilizando tanto herramientas moleculares como encuestas epidemiológicas, pero el mecanismo de transmisión interpersonal no está bien establecido. Curiosamente, ANDV también puede ser derramado por los humanos a través de otros fluidos biológicos como la orina [136], ilustrando las propiedades particulares que diferencian este virus de otros hantavirus. Aunque la transmisión interpersonal parece ser única para ANDV, el ARN viral de PUUV se ha detectado en la saliva de pacientes con HFRS, y algunos pacientes con SNV-HCPS tienen ARN viral en las secreciones traqueales [88, 137]. Los Hantavirus en las Américas son alojados naturalmente por roedores (Muridae y Cricetidae) así como las musarañas (Soricidae) y los lunares (Talpidae) (Figura 1). Tres especies de musgo y un mole han sido reportados para albergar hantavirus y su patogenicidad para los humanos permanece desconocida [22, 138, 139]. Se han identificado al menos 15 especies de roedores como portadores de diferentes hantavirus patógenos, con algunos genotipos sudamericanos como Castelo do Sonhos (CDSV) o Hu39694 sólo identificados después de infecciones humanas (Figura 1 ). Los hantavirus suelen mostrar una alta especificidad de especie y ningún huésped intermedio [140]. Sin embargo, se han descrito algunos genotipos de hantavirus en la misma especie de roedores. Tal es el caso de Playa de Oro (OROV) y Catacamas (CATV) identificados en Oryzomys couesi [141, 142], o Maporal (MAPV) y Choclo (CHOV) hospedados por O. fulvescens [91, 143]. En América del Norte se han detectado virus de muleshoe y Black Creek Canal hanta en sigmodon hispidus [ Además, un genotipo de hantavirus (por ejemplo, el virus similar a Juquitiba) puede ser transportado por más de una especie de roedores (O. nigripes, Oxymycterus judex, Akodon montesis). Otro ejemplo es el virus Laguna Negra (LANV) que después de ser identificado en Calomys laucha [146] también ha sido reportado en C. callosus [147]. El rápido aumento en el descubrimiento de nuevos hantavirus y la identificación de sus anfitriones no parece probable que termine tan pronto como se examinen nuevas especies pequeñas de mamíferos [95]. Este tema se complica por la continua controversia en los criterios para la clasificación de distintos hantavirus [148, 149], que también está vinculado a la clasificación taxonómica y los reordenamientos taxonómicos. La transmisión de especies cruzadas es un proceso importante durante la propagación, aparición y evolución Particularmente dentro de los hantavirus, los derrames a los huéspedes secundarios se identifican cada vez más a medida que se realizan estudios más extensos [151] [152] [153] [155] [156]. Por ejemplo, ANDV es el agente etiológico predominante del HCPS en América del Sur, y O. longicaudatus el principal reservorio de roedores. Derrama en al menos otras cuatro especies de roedores que coocurren con el reservorio se han identificado, con Abrothrix longipilis mostrando la segunda mayor prevalencia de anticuerpos de ANDV, y actualmente no hay duda de que el virus es extremadamente similar genéticamente entre los dos roedores del huésped [157, 158]. En América del Norte, el derrame del virus Bayou (BAYV) puede haber ocurrido desde el reservorio principal de O. palustris a S. hispidus, R. fulvescens, P. leucopus y B. taylori [159] [160] [161]. Es más probable que el derrame del virus Hanta se produzca con poblaciones de acogida que habitan regiones simpatricas o sintópicas [151, 162], y la transmisión de especies cruzadas tendría probablemente mayores posibilidades de éxito si las especies anfitrionas están estrechamente relacionadas [163]. Se encuentra una excepción interesante entre el virus Oxbow (OXBV) y el virus Asama (ASAV) en el que un proceso de cambio de huésped parecía haber ocurrido entre mamíferos pertenecientes a dos familias (Talpidae y Soricidae), probablemente como resultado de la codivergencia alterna y recurrente de ciertos tax Los hantavirus son transmitidos horizontalmente entre roedores y no son transmitidos por artrópodos (a diferencia de otros virus de la familia Bunyaviridae). La infección por derrapadores a mamíferos no humanos generalmente no produce ninguna transmisión hacia adelante (o a fin de morir), pero si los seres humanos están infectados pueden resultar en una alta morbilidad y mortalidad [122, 164]. Durante la primavera de 1993, un brote de pacientes con HCPS debido a SNV ocurrió en los estados de Four Corners, resultando en más del 60% de casos de mortalidad entre los casos iniciales, muchos de los cuales involucran a miembros de la tribu Navajo [12, 121]. En Panamá, se notificó un brote durante 1999-2000 en Los Santos, y 12 casos donde se identificaron con tres muertes [165, 166]. Esto representó el primer informe de infecciones por hantavirus humanos en América Central. En América del Sur, Diecisiete individuos fueron identificados con anticuerpo NVS (ELISA) o fueron antígenos (HCI) positivos de 52 casos sospechosos [167]. En 1996 ocurrieron brotes mayores debidos a ANDV en el sur de Argentina [131, 134] ; en el sur de Chile se presentaron grupos de pacientes con enfermedad por hantavirus en 1997 [158]. En Brasil, el primer brote fue identificado en la Amazonía Brasileña (Estado de Maranhão) en el año 2000, e involucró pequeños pueblos que resultaron en una prevalencia del 13,3% de los evaluados (398 residentes totales) [168]. Los factores que desencadenan los brotes de hantavirus todavía son mal entendidos, probablemente porque resultan de varias características bióticas y abióticas interactuantes cuyos parámetros clave son difíciles de modelar. Sin embargo, el uso de nuevos enfoques de modelado que involucran características geográficas y ambientales parece ser prometedor a la hora de predecir posibles brotes de hantavirus y/o áreas de mayor riesgo [169] [170] [171] [172]. Debido a que se sabe que los hantavirus se transmiten directamente de los huéspedes infectados a los susceptibles, el primer enfoque natural es relacionar los brotes con la ecología de los huéspedes virales. La transmisión y persistencia del hantavirus en las poblaciones de roedores depende de varios factores que interactúan para afectar la dinámica ecológica del huésped, que a su vez está fuertemente influenciada por las características de comportamiento de las especies de roedores individuales, a la estructura paisajística y a las características ambientales [173, 174]. La transmisión viral depende de las tasas de contacto entre los huéspedes sensibles, y a pesar de la noción prevaleciente de que un aumento de la densidad se encuentra y, por lo tanto, de Además, se ha demostrado que la transmisión de NVS sigue un patrón de heterogeneidad de contacto, donde los individuos de la población tienen diferentes probabilidades de transmitir la infección [176]. La comprensión de la transmisión viral resulta ser mucho más compleja cuando especies distintas del principal huésped del reservorio se incorporan en el modelo. De hecho, estudios recientes han demostrado que la mayor diversidad de especies hospedantes está correlacionada con una menor prevalencia de infección en América del Norte para P. maniculatus [177], en América Central para O. fulvescens (reservorio del virus Choclo) y Zygodontomys brevicauda (reservorio del virus Calabazo) [178], y en América del Sur para Akodon montensis (reservorio del virus Jabora) [162]. Las tasas de contacto varían según la distribución espacial de las poblaciones y parecen estar Por ejemplo, la prevalencia de SNV en P. maniculatus fue mayor en paisajes con mayor grado de fragmentación del hábitat preferido [179]. Además, ciertas propiedades del paisaje como elevación, pendiente y cubierta terrestre parecen ser útiles para detectar áreas con infecciones persistentes de SNV, y por lo tanto se consideran áreas refugiales donde el virus puede mantenerse durante años [169]. Los cambios en el entorno natural de las especies de reservorios, como la fragmentación forestal y la pérdida de hábitat, pueden alterar la abundancia y distribución de la población y provocar brotes de hantavirus, como se observa en la Península de Azurero de Panamá [118, 119]. Además, las diferencias en el microhábitat, incluida la cubierta superficial, pueden conducir a diferencias en la dinámica ecológica dentro de las poblaciones y afectar a la tasa de exposición al virus [180]. Se han encontrado diferencias en las infecciones por hantavirus a través de paisajes contrastantes en el intervalo latitudinal en poblaciones de roedores de O. longicaudatus en Chile, lo que sugiere que los seres humanos están expuestos de manera diferencial al virus [107, 181]. La dinámica poblacional de roedores se ve afectada por cambios estacionales de clima y clima [182, 183]. En el caso de los brotes asociados a ENSO, se ha postulado una compleja cascada de eventos desencadenados por lluvias altamente inusuales en el año precedente para dar lugar a un aumento de la producción primaria y densidades de roedores, aumentando también la probabilidad de transmisión del virus a los seres humanos, pero ha resultado difícil demostrar con precisión los eventos intermedios sugeridos, como el aumento de las densidades de roedores en el aumento de la carga de casos [116, 121, 184]. En América del Sur, los efectos del cambio climático y los brotes de hantavirus no han sido bien estudiados, a pesar del conocimiento de que varias especies de roedores que son reservorios de enfermedades emergentes se han visto dramáticamente afectadas por eventos como El Niño [185]. Los cambios en la dinámica de la población de acogida también se ven afectados por la estacionalidad, lo que puede conducir a brotes de enfermedades cuando se interrumpen los procesos que equilibran las poblaciones de roedores de temporada en temporada [186]. La emergencia viral puede seguir promoviéndose a medida que los cambios introducidos por el ser humano continúan aumentando en el medio ambiente a diferentes escalas geográficas. Estos cambios también pueden alterar la estructura y dinámica de la población de roedores e interacciones interespecies creando condiciones que pueden conducir a brotes virales, establecimiento viral en nuevos hospederos, y la aparición de HCPS [102, 162], incluso con aparentemente leve perturbación ecológica al sistema virus-hospedero [188]. Ciertas características fisiopatológicas, incluyendo trombocitopenia y shock, de enfermedades por hantavirus de los seres humanos, tienen similitud sustancial con las fiebres hemorrágicas inducidas por otros virus tales arenavirus, filovirus y flavivirus, a pesar de compartir esencialmente ninguna secuencia similitud con ellos. Tales observaciones plantean preguntas acerca de si tales similitudes en la patogénesis son probables similitudes de fenotipo, o en cambio reportan la presencia de mecanismos moleculares comunes entre los virus. En esta revisión se discuten las propiedades generales, descubrimientos y epidemiología/ecología de las formas de hantavirus patógenos del Nuevo Mundo, y también se busca identificar algunas de las características de las macromoléculas virales y mecanismos inmunológicos que se han propuesto como potenciales mediadores directos de los eventos patógenos que caracterizan la enfermedad humana HCPS. Si bien es poco probable que la expresión de una proteína viral particular o ARNs en aislamiento se pueda confiar en replicar fenotipos clave de infección por el virus completo, algunos de los hallazgos han sido suficientemente consistentes con lo que se conoce de la patogénesis in vivo que ofrecen plomos plausibles de primer paso en la búsqueda de objetivos terapéuticos. Esperamos con interés las revelaciones mecanísticas que seguirán el uso inevitablemente ampliado de métodos poderosos como la secuenciación profunda, imágenes cada vez más avanzadas, y métodos microscópicos, y modelos animales que por fin se pueden decir

¿Qué causan los Hantavirus en sus huéspedes?

Los hantavirus en las Américas y su papel como patógenos emergenteshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3185593/SHA: efe13a8d42b60ef9f7387ea539a1b2eeb5f80101Autores: Hjelle, Brian; Torres-Pérez, FernandoFecha: 2010-11-25DOI: 10.3390/v2125559Licencia: cc-byAbstract: La continua aparición y reaparición de patógenos representan una amenaza continua, a veces mayor, para las poblaciones. Los hantavirus (familia Bunyaviridae) y sus enfermedades humanas asociadas se consideraron confinados a Eurasia, pero la aparición de un brote en el suroeste de Estados Unidos llevó a un gran aumento en su estudio entre los virólogos de todo el mundo. Se han descrito más de 40 genotipos hantavirales, la gran mayoría desde 1993, y casi la mitad de ellos patógenos para los seres humanos. Los hantavirus causan infecciones persistentes en sus reservorios, y en las Américas, la enfermedad humana se manifiesta como compromiso cardiopulmonar, síndrome cardiopulmonar del hantavirus (HCPS), con proporciones de casos-fatalidad, para los serotipos virales más comunes, entre el 30% y el 40%. Alteración del hábitat y trastornos ecológicos a mayor escala, tal vez incluyendo el cambio climático, son algunos de los factores que pueden haber aumentado la carga de casos humanos de HCPS entre 1993 y el presente. Consideramos aquí las características que influyen en la estructura de la dinámica de la población huésped que pueden conducir a brotes virales, así como los determinantes macromoleculares de los hantavirus que han sido considerados como potenciales contribuciones a la patogenicidad. Texto: Los patógenos emergentes causan enfermedades nuevas o no reconocidas anteriormente, y entre ellas, las zoonóticas emergentes son una preocupación importante entre los científicos que estudian enfermedades infecciosas a diferentes escalas espaciales y temporales [1, 2]. Los cambios en las condiciones bióticas y abióticas pueden alterar la dinámica de las enfermedades de la población y conducir a la aparición de infecciones zoonóticas [3] [5] [6]. Durante las últimas décadas, se han producido varios brotes de patógenos virales emergentes y reemergentes, que afectan tanto a la implicación puramente local como a nivel mundial/pandémica de las poblaciones humanas. Entre los ejemplos visibles están la gripe A, el virus del Ébola, el virus de la hepatitis C, el trastorno respiratorio grave para adultos (SARS), el coronavirus y el virus de la inmunodeficiencia humana, que desafían las medidas de prevención y control de los sistemas de salud pública [7]. En las Américas, el reciente brote de gripe pandémica A subtipo H1N1 se convirtió en un objetivo importante de control debido a su rápida propagación, y las incertidumbres en cuanto a virulencia y transmisibilidad, sin embargo, la disponibilidad de vacunas fue limitada cuando se produjo una actividad significativa antes de la temporada tradicional de gripe [8]. Sin embargo, en el último siglo han surgido o resurgido brotes de varias enfermedades virales relacionadas con los virus arenavirus y el dengue, y más recientemente, hantavirus y la expansión del rango geográfico del virus del Nilo Occidental. Entre las enfermedades zoonóticas, los mamíferos pequeños son anfitriones de varios virus ARN patógenos, especialmente Arenaviridae y Bunyaviridae: Hantavirus [9] [10] [11]. Las infecciones por hantavirus se convirtieron en una preocupación en las Américas después de la descripción de un brote de distrés respiratorio agudo ocurrido en la zona La enfermedad recientemente reconocida, el síndrome cardiopulmonar del hantavirus, el HCPS (o síndrome pulmonar del hantavirus), se relacionó con la infección por el virus del Sin Nombre (SNV) recién descubierto, y el roedor Peromyscus maniculatus (ratón venado) fue identificado como el reservorio [13]. Sin embargo, las infecciones por hantavirus tienen una historia mucho más larga. Una revisión de los escritos chinos antiguos, que datan de aproximadamente 960 dC, reveló descripciones muy parecidas a la fiebre hemorrágica con síndrome renal (HFRS), el síndrome causado por los hantavirus del Viejo Mundo [14]. Durante el siglo XX, los casos de enfermedad febril aguda con compromiso renal fueron descritos de varios países eurasiáticos y Japón, a menudo en asociación con compromisos militares [15]. El HFRS como síndrome distinto, sin embargo, fue llamado por primera vez a la atención de la medicina occidental en asociación con un brote que ocurrió entre las tropas de las Naciones Unidas durante el conflicto coreano entre 1951 y 1954, donde más de 3.200 soldados fueron afectados [16]. Tomó más de dos décadas hasta que el agente etiológico, el virus Hantaan (HTNV), fue aislado del ratón de campo rayado Apodemus agrarius, detectado en parte por la unión de anticuerpos de muestras de suero de paciente a los tejidos pulmonares de ratones de campo sanos y salvajes [17, 18]. El virus se encontró más tarde para representar la especie tipo de un nuevo género Hantavirus de la familia Bunyaviridae, aunque fue más tarde evidente que el primer hantavirus a aislarse fue el virus Thottapalayam de shrew-borne [19]. La categorización de los hantavirus como pertenecientes a la familia Bunyaviridae se debe en parte a la presencia consistente de tres genomas de ARN que son circularizados in vivo como resultado de la presencia de nucleótidos terminales complementarios que ayudan a doblar el genoma en una morfología -hairpin-, descrita por primera vez para el flebovirus Uukuniemi [19, 20]. La Tabla 1 es una lista de los hantavirus patógenos predominantemente distintos serológicamente. Se describen muchos otros genotipos llamados, pero tales otras formas patogénicas están generalmente estrechamente relacionadas con los Andes o, en algunos casos, el virus Sin Nombre. Durante la maduración del virus, el precursor forma GPC se procesa utilizando una proteasa unida a la membrana en Gn y Gc, una escisión que ocurre, y parece ser señalada, después de la señal péptida conservada WAASA en la C-terminal de Gn [24]. Aunque las dos proteínas se pueden expresar de forma independiente a través de la transfección, pueden ser retenidas en el compartimento celular incorrecto (ER o aggrosome); por lo tanto, deben ser co-expresadas para permitirles estabilidad para que las dos se puedan ensamblar correctamente en el Golgi [25, [27] [28]. Se han identificado varias actividades y propiedades para las glicoproteínas envolventes del hantavirus, incluyendo algunas características que se sospecha que están involucradas en la patogenicidad de los serotipos causantes de la enfermedad, una posibilidad que ha generado atención experimental. Las glucoproteínas son los ligandos conocidos o presuntos para al menos dos receptores celulares distintos, la cadena de integrina y el factor acelerador de la descomposición, o DAF [30, 31] ; con gC1qR/p32 también identificado como otro receptor de entrada potencial [32]. Comparaciones con la proteína E del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, llevaron a Tischler et al. a considerar la glicoproteína Gc como una proteína potencial de fusión de clase II, tal vez impartiendo actividad de fusión al virión, y esta hipótesis ha ganado apoyo en otros estudios [33, 34]. Se han identificado actividades adicionales con, o se afirma que están relacionadas con, Gn. Para muchos de estos estudios, una premisa subyacente ha sostenido que hay diferencias entre las glicoproteínas de hantavirus -patógenos en relación con virus en el género que se denominan Si bien es cierto que aún no ha sido posible vincular el virus de Prospect Hill (PHV) con la enfermedad humana, la ausencia de evidencia de su patogenicidad tal vez no debería equipararse con la evidencia de su ausencia. Sólo se podría considerar que el nivel de enfermedad (por ejemplo, letargo, fiebre, proteinuria y azotemia) asociado con la infección de primates no humanos por PHV no es significativamente diferente del registrado para los modelos de primates no humanos utilizando el virus conocido del patógeno Puumala (PUUV) [35, 36]. Para el propósito de esta discusión, presumiremos que los hantavirus apatogénicos son efectivamente apatogénicos. Mientras que algunos estudios han sugerido que las glicoproteínas Gn se dirigen más rápidamente a la vía ubiquitina-proteosoma que a las formas apatogénicas, otros han interpretado las diferencias en el manejo de las glicoproteínas Gn a través de especies de hantavirus por el sistema ubiquitina-proteosomal como independientes de la patogenicidad [37] [38] [39]. Algunos investigadores han dirigido sus esfuerzos hacia la identificación de una capacidad diferencial, ya sea cinética o de magnitud absoluta, en la capacidad de los hantavirus patógenos y apatogénicos para provocar una respuesta de interferón en las células. Una premisa que surge es que las formas apatogénicas tenderían a inducir una respuesta innata anterior que haría más probable que el virus se limpiara rápidamente o se volviera menos competente en su replicación, a fin de evitar cualquier respuesta patológica en el huésped [42] La respuesta innata anti-hantavirus puede en algunos casos ser atribuida a la interacción viral como ligando de TLR-3, pero no en otros, y en las células endoteliales, no parece requerir más que la partícula viral misma, incluso cuando se introduce en forma replicativa incompetente [43, 44]. Las proteínas y los ARNm inducidos prominentemente por los hantavirus incluyen MxA e IFIT-1 (ISG-56) y otros incluyendo algunos con actividad antiviral conocida o sospechada. Esos hantavirus, a menudo cepas altamente patógenas, que no inducen una respuesta antiviral potente, se sospechan o se presume que tienen un (más) potente mecanismo de antagonismo interferón-vía en relación con otros virus, un mecanismo que actúa positivamente para prevenir que se forme una respuesta innata efectiva, al menos temprano en la infección [4 Sin embargo, se reportan algunos casos en los que los hantavirus altamente patógenos, tales como NVS, también son capaces de inducir la expresión de los ARNm del gen estimulado por interferón, incluso muy temprano en la infección, con proteínas ISG, como se esperaba, tardando más tiempo en aparecer en la célula [44]. Las actividades anti-interferón también se han atribuido a la proteína NSs que se puede elaborar en células infectadas por serotipos que codifican esta proteína [46]. Otros investigadores han examinado las actividades de las glucoproteínas del hantavirus y otras proteínas que podrían afectar directamente a algunos aspectos de la progresión patogénica asociada a la infección por hantavirus en humanos, tales como cambios de permeabilidad vascular. Mientras que los primeros intentos de causar directamente aumentos en la permeabilidad de las monocapas endoteliales con partículas virales o infección viral fueron en gran medida decepcionantes, los hantavirus se han identificado como que afectan adversamente la migración endotelial sobre los sustratos y en la potenciación de la permeabilidad endotelial inducida por VEG-F [47, 48]. La proteína nucleocápsida o N más corta (+50 kD) es un componente estructural del nucleocápsido viral, junto con los segmentos de ARN viral genómico. Como proteína de unión al ARN que afecta a la horquilla del cabello de los segmentos genómicos con alta afinidad [49, 50], limita el acceso del ARN para alojar nucleasasas y ayuda a hacer que la replicación viral sea un proceso cerrado dentro del citoplasma. También actúa como una proteína de membrana periférica, al igual que la proteína L [51], una actividad que podría jugar un papel en su supuesta, pero aún no demostrada función como matriz [52]. Hasta hace poco, no se había apreciado que N tuviera una amplia variedad de otras actividades, algunas de las cuales pueden estar vinculadas, no sólo a los requisitos fundamentales de replicación, sino también a la interferencia con una serie de procesos intracelulares de la célula normal. Así, se ha propuesto una interacción entre el aminoterminal de la proteína N del hantavirus y la proteína celular Daxx, con la sugerencia de posibles consecuencias pro-apoptóticas [51]. N también se reporta que interactúa con microfilamentos actínicos, y la proteína SUMO-1 [53, 54]. Utilizando ensayos basados en el gen reportero, Connie Schmaljohn y sus colegas han informado que la proteína nucleocapsid del virus Hantaan tiene un papel inhibidor en las respuestas inflamatorias mediadas por NF kappa B (NF- â € € TM B). Los efectos sobre la expresión NF- € B parecen estar limitados a la prevención de su translocación nuclear después de su intento de activación con lipopolisacárido, LPS [55]. En el citoplasma de las células infectadas, la proteína N se puede encontrar en los cuerpos celulares P donde secuestra y protege los capuchones de 5'. Puede localizar los capuchones a través de su interacción con DCP1, un componente clave de los cuerpos P. Durante la infección por hantavirus, los ARN virales se concentran en los cuerpos P, a través de su interacción con N y DCP1. La proteína N demuestra la protección preferencial de los ARNm diseñados para terminar prematuramente su proteína codificada en comparación con los ARNm nativos [56]. La proteína N se ha vinculado cada vez más a la replicación y traducción virales, a veces de maneras no previstas anteriormente. Se encuentra entre una familia creciente de diversas proteínas virales que pueden servir como un inespecífico - ARN chaperone ®, una actividad que debe facilitar el acceso de la L polimerasa al ARNv para la transcripción y replicación, en que puede disociar transitoriamente estructuras de ARN mal dobladas [57]. Algunos de los efectos de la proteína N en la traducción no pueden ser inmediatamente reconocidos como adaptables en la naturaleza. Puede reemplazar todo el complejo de iniciación traslacional EIF4F, presentando simultáneamente el ribosoma con un reemplazo de la actividad de unión de la tapa de eIF 4E, uniéndose al complejo de pre-iniciación 43S, al igual que eIF 4G, al tiempo que reemplaza la actividad helicoidal de eIF 4A, que se presume que es necesaria para disociar la estructura de ARN de orden superior [56, 58]. Estos tres factores normalmente trabajan juntos para lograr la iniciación traslacional. En los cuerpos P, la capacidad de la proteína N de unirse a una alta afinidad a los oligoribonucleótidos celulares nativos tapados, junto con su actividad en la protección de ARNs tapados de la degradación, probablemente facilita el acceso de oligonucleótidos encapsulados para su uso en la iniciación transcripcional por L polimerasa (-cap ra Tráfico de N para el ensamblaje viral: Clásicamente, la proteína N en las células infectadas parece estar agrupada o partículas en la naturaleza, con una concentración pesada en una única ubicación perinuclear, ampliamente considerada como la Golgi [27]. Las proteínas N de los hantavirus se encuentran en asociación con fracciones de partículas, y los estudios confocales microscopía y bioquímico-inhibidores han demostrado que las trazas N a lo largo de microtúbulos pero no con filamentos de actina [52]. El destino final de N, para su ensamblaje en partículas virales es la Golgi, y que circula allí a través del complejo intermedio retículo-Golgi endoplasmático (ERGIC), también conocido como cúmulo vesicular-tubular [52]. Un inhibidor negativo dominante, la dinamitina, asociado con el transporte mediado por Los estudios posteriores sugieren que la dependencia específica del transporte microtubular es específica de los hantavirus del Viejo Mundo como el NVH, pero que el Hantavirus del Nuevo Mundo ANDV está asociado con filamentos de actina [59]. Sin embargo, los datos recientes indican que el transporte microtubular es efectivamente utilizado para el NVH del Nuevo Mundo [60]. Las enfermedades del Hantavirus del hombre desde hace mucho tiempo han sido sospechosas de tener una base inmunopatógena en parte debido a su período de incubación relativamente largo de 2-3 semanas y la asociación temporal observada entre los trastornos inmunológicos y la primera aparición de signos y síntomas de la enfermedad del hantavirus. HFRS y HCPS comparten muchas características clínicas, llevando a muchos investigadores a considerar que son, en esencia, diferentes manifestaciones de un proceso patógeno similar, que difieren principalmente en los órganos objetivo primarios de expresión de la enfermedad (Tabla La patogénesis de las infecciones por hantavirus es el tema de una revisión continuamente actualizada en la serie UpToDate [61]. Para el momento en que aparecen los síntomas en el HCPS, ambas respuestas antivirales fuertes, y, para los genotipos virales más virulentos, el ARN viral puede ser detectado en plasma sanguíneo o células sanguíneas nucleadas respectivamente [63, 64]. Al menos tres estudios han correlacionado el ARN viral plasmático con la gravedad de la enfermedad para el HCPS y el HFRS, sugiriendo que la replicación del virus juega un papel continuo y en tiempo real en la patogénesis viral [65] [66] [67]. Se han identificado varios cambios patológicos distintivos que ocurren tanto en el HFRS como en el HCPS. Una característica crítica de ambos es una fuga capilar transitoria (~ 1-5 días) que involucra el La fuga resultante es de carácter exudativo, con una composición química alta en proteínas y similar al plasma. La experiencia continua que indica el fuerte tropismo tisular para las células endoteliales, específicamente, es uno de los varios factores que hacen de la integra β3 un candidato especialmente atractivo como un importante receptor in vivo para los hantavirus. Es probable que los hantavirus lleguen a sus tejidos objetivo a través de la captación por los ganglios linfáticos regionales, tal vez con o dentro de un histiocito pulmonar escoltante. Las semillas del virus endotelio local, donde las primeras células infectadas dan lugar, en última instancia, a una viremia primaria, un proceso que parece tomar mucho tiempo para las infecciones por hantavirus [62, 63]. En el momento en que emerge la viremia secundaria, los agentes de las formas más severas de HFRS y HCPS han comenzado a alcanzar una masa suficiente para inducir, a través de las interacciones PAMP-PRR y otros medios, la expresión de citoquinas proinflamatorias [64]. Para HCPS, esa expresión favorece el lecho pulmonar y los órganos linfoides, pero, por razones desconocidas, ahorra el retroperitoneo y, en general, el riñón. En HFRS la situación se invierte, y sin embargo no se aprecia a menudo que el esperado tropismos tisulares preferentes de virus asociados a HFRS y sus contrapartes asociadas a HCPS para los lechos renal y pulmonar, respectivamente, no sea como se predeciría a través de las manifestaciones de las dos enfermedades. La elaboración local de mediadores inflamatorios y quimiotácticos se considera un requisito para el desarrollo Sin embargo, no es la hipoxemia, debido al edema pulmonar prominente, lo que conduce a la muerte en la mayoría de los casos fatales de HCPS, sino más bien la intoxicación del corazón por mediadores como aún no definidos, lo que conduce al estado de bajo gasto cardíaco y al síndrome de shock asociado [64, 65]. Es tentador especular que los mediadores producidos en el pulmón en conexión con el infiltrado inflamatorio pueden infiltrarse a través de la circulación coronaria con dilución mínima en HCPS, consecuencia desventajosa de la estrecha yuxtaposición anatómica de los dos órganos. Así, al menos tres clases de mecanismos potenciales, algunos superpuestos y todos ciertamente no exclusivos de los otros, podrían presumirse que subyacen a la patogénesis del HCPS. Estos incluyen:(1) Mecanismos inmunes innatos. La naturaleza de las interacciones entre los patrones moleculares asociados al patógeno del hantavirus (PAMP) y los receptores de reconocimiento del patrón (PRR) de las células endoteliales susceptibles comienzan a ser aclaradas. El HTNV prototípico parece ser reconocido por TLR-3 [43]. Tal infección tiene consecuencias tales como una mayor expresión del HLA-DR en las células dendríticas [66] y la diferenciación de los monocitos hacia las células dendríticas [67]. (2) Efectos virales directos. La correlación observada entre la carga viral y la gravedad de la enfermedad deja abierta la posibilidad de que las partículas del hantavirus o el ARN puedan tener efectos tóxicos sobre las células o sobre la señalización. Algunos investigadores han favorecido la toxicidad viral directa, actuando a través de la inhibición de la función de barrera celular endotelial, como una explicación de gran parte de la fuga capilar, aunque existe Una pista potencialmente importante hacia el mecanismo por el cual las infecciones por hantavirus agotan las plaquetas sanguíneas y, en algunos casos, causan manifestaciones hemorrágicas, fue avanzada por el reciente descubrimiento de que los hantavirus patógenos son capaces de reclutar plaquetas para adherirse a las superficies celulares endoteliales, con β3 integrina utilizada como elemento de unión crítica [69]. (3) Efectos patógenos causados por las actividades de macromoléculas virales específicas. Hemos revisado algunas de las actividades asociadas con los Gn, Gc y N, polipéptidos codificados viralmente en secciones anteriores. Modelos de prueba de patogénesis se pueden hacer más eficazmente cuando hay un modelo animal que imita aspectos clave de la enfermedad. No existe un modelo similar al HFRS, pero existen modelos animales para el transporte asintomático de PUUV y SNV por sus roedores portadores nativos, el banco vole Myodes glareolus y el ratón venado P. maniculatus; así como un modelo hámster sirio utilizando ANDV o el virus Aporal relacionado de Venezuela, para el cual se observa una enfermedad mimética HCPS [70] [71] [72] [73]. El modelo hámster ANDV-Sirio tiene una serie de características en común con la enfermedad humana, así como algunas diferencias. A diferencia de las enfermedades neurológicas que han sido posibles de provocar con HTNV, el modelo hámster para HCPS parece ser causado por fugas capilares que resultan en edema pulmonar y la producción de un derrame pleural con características exudativas. Típicamente los hámsteres mueren entre 11 y 14-d post-inoculación, reflejando un período de incubación ligeramente acelerado en comparación con las infecciones humanas. Al igual que con el HCPS humano, el examen microscópico del pulmón revela abundante deposición de fibrina, septo alveolar engrosado y antígeno viral expresado abundantemente en el endotelio microvascular. Los hámsteres infectados por ANDV equipados con dispositivos de monitoreo fisiológico mostraron disminución de las presiones de pulso, taquicardia e hipotensión que parecen imitar de cerca el shock que se cree que es la causa próxima de la muerte en pacientes que sucumben al HCPS [65, 74]. En comparación con la enfermedad humana, los hámsteres infectados por ANDV exhiben títulos excepcionalmente altos de ANDV vivo en sus tejidos, con gran parte de la replicación viral que se produce Los títulos de ANDV vivo en algunos casos superan los 10 8 /g, mientras que los aislados de hantavirus de los tejidos humanos han sido notoriamente difíciles de obtener. A pesar de la aparición universal de enzimas hepáticas levemente elevadas en pacientes con HCPS, las enzimas hepáticas no parecen estar presentes en niveles elevados en la sangre de hámsters enfermos incluso inmediatamente antes de la muerte [75]. El período prolongado de incubación asociado con la enfermedad por hantavirus da al huésped un tiempo considerable para montar una respuesta inmune madura contra el virus. Así, en contradición a infecciones de gravedad comparable y sintomatología relacionada asociada con arenavirus y filovirus, las infecciones por hantavirus en humanos se asocian con respuestas anticuerpos de título significativo por el momento en que comienzan los síntomas. A pesar de esta observación, parece ser posible que la variación natural en las respuestas individuales de anticuerpos neutralizantes entre los pacientes con infecciones por NVS pueda estar relacionada con la gravedad de la enfermedad, lo que sugiere que la administración de anticuerpos antivirales podría resultar efectiva terapéuticamente [76]. En el caso de la infección por ANDV, han surgido nuevas evidencias que indican que el aparente aclaramiento del virus de la sangre no resulta en la eliminación completa del estímulo antigénico por el virus, sugiriendo que el virus puede persistir, tal vez en algún sitio inmunológicamente privilegiado aún indeterminado [77]. Un papel para las respuestas patológicas mediadas por células T en el HFRS y el HCPS ha sido la fuente de especulación por una variedad de razones. La gravedad del SNS asociado al SNCP puede haber hecho más evidente que el inicio del edema pulmonar, la taquicardia y la hipertensión parecía estar todo, pero universalmente asociado temporalmente, con la aparición de un espectro de células altamente activadas del linaje linfoide en la sangre periférica. Se detectaron células con similitudes morfológicas cercanas a estos -inmunoblastos- en los pulmones congestionados y pesados de los pacientes que llegaron a la autopsia, así como en órganos linfoides y en las tríadas portal [63, [78] [79] [80]. Estas observaciones llevaron a especular que algún componente de la patogénesis por hantavirus podría estar vinculado a la aparición de células T antivirales que podrían estimular o contribuir a la aparición de una -tormenta de mediadores y el fenotipo de fuga capilar asociado. Estudios posteriores han confirmado la expectativa de que una fracción significativa de la población de inmunoblastos en pacientes con HCPS son células T con especificidad para epitopes específicos de antígenos virales de clase I presentados por el HLA, incluyendo Gn, Gc y N [77, [81] [82] [83]. Presumiblemente, las actividades antivirales de estas células, manifestadas en parte por su elaboración de mediadores en el intersticio afectado, pueden contribuir a la fuga endotelial/capilar que se encuentra en el corazón de la patogénesis del hantavirus. Debido a que los primeros casos de HCPS a menudo llegaron a la autopsia, se hizo posible examinar tejidos necropsiados para la expresión de citocinas. El estudio de Mori et al. (1999) revelaron una alta expresión relativa de citocinas proinflamatorias incluyendo TNF-, IL-1-, IL-6, proporcionando evidencia a favor de un modelo de tormenta de citoquinas para la patogénesis [64]. Los autores creían, basándose en la morfología de las células secretadoras de citoquinas, que tanto monocitos como linfocitos estaban contribuyendo a la producción de citocinas. Que los mediadores proinflamatorios se encuentran en niveles elevados en el plasma, así como el intersticio renal de pacientes con enfermedad hantaviral aguda se ha reconocido desde hace algún tiempo también [84, 85]. Si bien el diagnóstico de HCPS y HFRS se realiza mejor con serología IgM, en la etapa aguda de la infección por NVS, también se puede utilizar RT-PCR si se utilizan células sanguíneas o coágulos de sangre en lugar de plasma o suero, donde la sensibilidad incluso utilizando imprimaciones PCR anidadas disminuye a cerca del 70% [86] [87] [88]. En una instalación en la que se tratan muchos casos de HCPS, el centro médico de la Universidad de Nuevo México en Albuquerque, se ha ofrecido un servicio de diagnóstico en el que se analizan los hallazgos hematológicos del paciente para establecer la probabilidad de que un paciente tenga HCPS. La combinación de trombocitopenia, abundancia elevada de linfocitos -inmunoblasto-, población de células polimorfonucleares con desplazamiento izquierdo sin evidencia morfológica fuerte para su activación, y valores elevados de hemoglobina o hematocrito es altamente específica para el HCPS y permite a los clínicos la capacidad de poner pacientes presuntivos-HCPS en oxigenación de membrana extracorpórea (ECMO), que se cree que ha salvado a muchos pacientes de un resultado letal [89]. Se cree que la infección humana por hantavirus sigue el contacto con secreciones o excreciones producidas por roedores infectados. En los Estados Unidos, 538 infecciones humanas por hantavirus fueron reportadas hasta finales de diciembre de 2009 [90], con Nuevo México, Arizona y Colorado mostrando los casos más altos. Mientras que el prototípico hantavirus centroamericano en América Central fue el virus Rio Segundo de Reithrodontomys mexicanus de Costa Rica, la primera enfermedad humana apareció algunos años más tarde en Panamá, donde el virus Choclo (CHOV) surgió como el agente etiológico y se cree que es responsable de todos los casos conocidos de HCPS. La rata de arroz pigmeo fulvo Oligoryzomys fulvescens ha sido identificada como el reservorio de roedores [91]. En Panamá, los primeros casos de HCPS, aunque con poca o ninguna implicación cardiaca evidente, fueron reportados en 1999, y desde entonces, 106 infecciones humanas han ocurrido con una tasa de mortalidad del 26% [92]. Seroencuestas de mamíferos en México y Costa Rica han encontrado anticuerpos antihantavirus [93] [94] [95] [96], y se han notificado seroprevalencias que oscilan entre 0,6 y 1,6% en poblaciones humanas a pesar de la ausencia de casos conocidos de HCPS [97]. En América del Sur, los casos de HCPS se han identificado en Argentina, Bolivia, Brasil, Chile, Paraguay y Uruguay, y también se han notificado evidencias de exposición humana a hantavirus en Venezuela [98] y Perú [99]. En América del Sur, ANDV es el principal agente etiológico con casos en Chile y Argentina notificados desde 1995. En Chile, se han producido 671 casos de HCPS debido a ANDV durante el período 2001-2009 [100]. Desde 1995 se han reportado más de 1.000 casos de HCPS en Argentina [101] ; en el Brasil se han identificado aproximadamente 1.100 casos de HCPS entre 1993 y 2008 [102]. Las tasas de mortalidad por casos en esos tres países han sido similares, oscilando entre el 30% (Argentina), el 36% (Chile) y el 39% (Brasil). Las infecciones por Hantavirus ocurren con más frecuencia en hombres que en mujeres, aunque la proporción entre hombres y mujeres es muy variable. Por ejemplo, las comunidades panameñas mostraron una proporción de 55 hombres por 45 mujeres [103], mientras que en Chile la proporción es más sesgada por hombres (71%) [104]. En el Chaco paraguayo la proporción entre hombres y mujeres se aproxima al 50% [105]. En América del Norte, en diciembre de 2009 el 63% de los pacientes eran varones [90]. Todos los grupos étnicos y raciales parecen ser susceptibles a infecciones por el hantavirus, y las diferencias entre ciertos grupos (como indígenas y no indígenas) están más probablemente correlacionadas con el tipo de hábitat en el que reside la población (por ejemplo, zonas rurales frente a zonas urbanas). De hecho, las comunidades rurales representan la mayor incidencia global del hantavirus y, por lo tanto, están en mayor riesgo [92, [105] [106] [107] [108] [109] [109] [119], aunque también se ha destacado la importancia de los entornos peridomésticos como una importante zona de exposición [112, 113]. El principal mecanismo por el que los seres humanos adquieren la infección por el hantavirus es la exposición a aerosoles de heces contaminadas de roedores, orina y saliva [114, 115]. Esto puede ocurrir cuando los seres humanos residen en áreas cercanas a las que habitan los roedores, viven en áreas infestadas de roedores, o cuando los roedores invaden entornos humanos, que son más frecuentes en hábitats rurales.Existe una larga historia de coexistencia humana con roedores, lo que plantea dudas sobre el aparente aumento reciente de las enfermedades relacionadas con el hantavirus, especialmente el HCPS. Aparte de una aparente asociación con eventos de oscilación sureña de El Niño (ENSO) en algunas regiones [116, 117], los recientes incrementos en la incidencia del HCPS no parecen seguir un patrón temporal o espacial fácilmente definido. Sin embargo, algunas características del paisaje, como la fragmentación del hábitat o las áreas perturbadas por el ser humano, pueden influir en la dinámica de la población de roedores e impactar en la incidencia viral [118] [112] [112] [121]. A pesar de la estocástica asociada a la contracción de la infección Las actividades humanas en edificios mal ventilados que pulverizan partículas que luego se inhalan (es decir, limpieza, agitación de alfombras, polvo) se identifican con frecuencia entre los pacientes admitidos para el SHCPS [11, 122]. Se cree que las actividades al aire libre transmiten un menor riesgo debido a la labilidad de los hantavirus a la radiación UV y a la supuesta tendencia a dispersarse en el viento, aunque ciertas condiciones ambientales parecen mantener el virus durante períodos más largos fuera de su huésped natural, lo que permite la transmisión indirecta [123]. Una vía alternativa pero poco común de transmisión del virus es la mordedura de roedores [124] [125] [126]. Los trabajadores sobre el terreno que manipulan mamíferos corren un riesgo potencialmente mayor de exposición a infecciones por hantavirus, aunque cuando se cuantifica a través de serosurveys el riesgo absoluto parece bastante leve [127]. Un nuevo estudio en Colorado sugiere la posibilidad de que una picadura de roedor haya sido el vehículo próximo para la transmisión al aire libre de NVS [128], lo que vuelve a enfatizar el uso de equipo de protección personal durante las actividades de trabajo de campo [129]. Como caso particular dentro de los hantavirus, la transmisión de persona a persona ha sido documentada exclusivamente para el virus de los Andes sudamericanos [130] [133] [133] [135]. La identificación de esta vía de transmisión se ha hecho utilizando tanto herramientas moleculares como encuestas epidemiológicas, pero el mecanismo de transmisión interpersonal no está bien establecido. Curiosamente, ANDV también puede ser derramado por los humanos a través de otros fluidos biológicos como la orina [136], ilustrando las propiedades particulares que diferencian este virus de otros hantavirus. Aunque la transmisión interpersonal parece ser única para ANDV, el ARN viral de PUUV se ha detectado en la saliva de pacientes con HFRS, y algunos pacientes con SNV-HCPS tienen ARN viral en las secreciones traqueales [88, 137]. Los Hantavirus en las Américas son alojados naturalmente por roedores (Muridae y Cricetidae) así como las musarañas (Soricidae) y los lunares (Talpidae) (Figura 1). Tres especies de musgo y un mole han sido reportados para albergar hantavirus y su patogenicidad para los humanos permanece desconocida [22, 138, 139]. Se han identificado al menos 15 especies de roedores como portadores de diferentes hantavirus patógenos, con algunos genotipos sudamericanos como Castelo do Sonhos (CDSV) o Hu39694 sólo identificados después de infecciones humanas (Figura 1 ). Los hantavirus suelen mostrar una alta especificidad de especie y ningún huésped intermedio [140]. Sin embargo, se han descrito algunos genotipos de hantavirus en la misma especie de roedores. Tal es el caso de Playa de Oro (OROV) y Catacamas (CATV) identificados en Oryzomys couesi [141, 142], o Maporal (MAPV) y Choclo (CHOV) hospedados por O. fulvescens [91, 143]. En América del Norte se han detectado virus de muleshoe y Black Creek Canal hanta en sigmodon hispidus [ Además, un genotipo de hantavirus (por ejemplo, el virus similar a Juquitiba) puede ser transportado por más de una especie de roedores (O. nigripes, Oxymycterus judex, Akodon montesis). Otro ejemplo es el virus Laguna Negra (LANV) que después de ser identificado en Calomys laucha [146] también ha sido reportado en C. callosus [147]. El rápido aumento en el descubrimiento de nuevos hantavirus y la identificación de sus anfitriones no parece probable que termine tan pronto como se examinen nuevas especies pequeñas de mamíferos [95]. Este tema se complica por la continua controversia en los criterios para la clasificación de distintos hantavirus [148, 149], que también está vinculado a la clasificación taxonómica y los reordenamientos taxonómicos. La transmisión de especies cruzadas es un proceso importante durante la propagación, aparición y evolución Particularmente dentro de los hantavirus, los derrames a los huéspedes secundarios se identifican cada vez más a medida que se realizan estudios más extensos [151] [152] [153] [155] [156]. Por ejemplo, ANDV es el agente etiológico predominante del HCPS en América del Sur, y O. longicaudatus el principal reservorio de roedores. Derrama en al menos otras cuatro especies de roedores que coocurren con el reservorio se han identificado, con Abrothrix longipilis mostrando la segunda mayor prevalencia de anticuerpos de ANDV, y actualmente no hay duda de que el virus es extremadamente similar genéticamente entre los dos roedores del huésped [157, 158]. En América del Norte, el derrame del virus Bayou (BAYV) puede haber ocurrido desde el reservorio principal de O. palustris a S. hispidus, R. fulvescens, P. leucopus y B. taylori [159] [160] [161]. Es más probable que el derrame del virus Hanta se produzca con poblaciones de acogida que habitan regiones simpatricas o sintópicas [151, 162], y la transmisión de especies cruzadas tendría probablemente mayores posibilidades de éxito si las especies anfitrionas están estrechamente relacionadas [163]. Se encuentra una excepción interesante entre el virus Oxbow (OXBV) y el virus Asama (ASAV) en el que un proceso de cambio de huésped parecía haber ocurrido entre mamíferos pertenecientes a dos familias (Talpidae y Soricidae), probablemente como resultado de la codivergencia alterna y recurrente de ciertos tax Los hantavirus son transmitidos horizontalmente entre roedores y no son transmitidos por artrópodos (a diferencia de otros virus de la familia Bunyaviridae). La infección por derrapadores a mamíferos no humanos generalmente no produce ninguna transmisión hacia adelante (o a fin de morir), pero si los seres humanos están infectados pueden resultar en una alta morbilidad y mortalidad [122, 164]. Durante la primavera de 1993, un brote de pacientes con HCPS debido a SNV ocurrió en los estados de Four Corners, resultando en más del 60% de casos de mortalidad entre los casos iniciales, muchos de los cuales involucran a miembros de la tribu Navajo [12, 121]. En Panamá, se notificó un brote durante 1999-2000 en Los Santos, y 12 casos donde se identificaron con tres muertes [165, 166]. Esto representó el primer informe de infecciones por hantavirus humanos en América Central. En América del Sur, Diecisiete individuos fueron identificados con anticuerpo NVS (ELISA) o fueron antígenos (HCI) positivos de 52 casos sospechosos [167]. En 1996 ocurrieron brotes mayores debidos a ANDV en el sur de Argentina [131, 134] ; en el sur de Chile se presentaron grupos de pacientes con enfermedad por hantavirus en 1997 [158]. En Brasil, el primer brote fue identificado en la Amazonía Brasileña (Estado de Maranhão) en el año 2000, e involucró pequeños pueblos que resultaron en una prevalencia del 13,3% de los evaluados (398 residentes totales) [168]. Los factores que desencadenan los brotes de hantavirus todavía son mal entendidos, probablemente porque resultan de varias características bióticas y abióticas interactuantes cuyos parámetros clave son difíciles de modelar. Sin embargo, el uso de nuevos enfoques de modelado que involucran características geográficas y ambientales parece ser prometedor a la hora de predecir posibles brotes de hantavirus y/o áreas de mayor riesgo [169] [170] [171] [172]. Debido a que se sabe que los hantavirus se transmiten directamente de los huéspedes infectados a los susceptibles, el primer enfoque natural es relacionar los brotes con la ecología de los huéspedes virales. La transmisión y persistencia del hantavirus en las poblaciones de roedores depende de varios factores que interactúan para afectar la dinámica ecológica del huésped, que a su vez está fuertemente influenciada por las características de comportamiento de las especies de roedores individuales, a la estructura paisajística y a las características ambientales [173, 174]. La transmisión viral depende de las tasas de contacto entre los huéspedes sensibles, y a pesar de la noción prevaleciente de que un aumento de la densidad se encuentra y, por lo tanto, de Además, se ha demostrado que la transmisión de NVS sigue un patrón de heterogeneidad de contacto, donde los individuos de la población tienen diferentes probabilidades de transmitir la infección [176]. La comprensión de la transmisión viral resulta ser mucho más compleja cuando especies distintas del principal huésped del reservorio se incorporan en el modelo. De hecho, estudios recientes han demostrado que la mayor diversidad de especies hospedantes está correlacionada con una menor prevalencia de infección en América del Norte para P. maniculatus [177], en América Central para O. fulvescens (reservorio del virus Choclo) y Zygodontomys brevicauda (reservorio del virus Calabazo) [178], y en América del Sur para Akodon montensis (reservorio del virus Jabora) [162]. Las tasas de contacto varían según la distribución espacial de las poblaciones y parecen estar Por ejemplo, la prevalencia de SNV en P. maniculatus fue mayor en paisajes con mayor grado de fragmentación del hábitat preferido [179]. Además, ciertas propiedades del paisaje como elevación, pendiente y cubierta terrestre parecen ser útiles para detectar áreas con infecciones persistentes de SNV, y por lo tanto se consideran áreas refugiales donde el virus puede mantenerse durante años [169]. Los cambios en el entorno natural de las especies de reservorios, como la fragmentación forestal y la pérdida de hábitat, pueden alterar la abundancia y distribución de la población y provocar brotes de hantavirus, como se observa en la Península de Azurero de Panamá [118, 119]. Además, las diferencias en el microhábitat, incluida la cubierta superficial, pueden conducir a diferencias en la dinámica ecológica dentro de las poblaciones y afectar a la tasa de exposición al virus [180]. Se han encontrado diferencias en las infecciones por hantavirus a través de paisajes contrastantes en el intervalo latitudinal en poblaciones de roedores de O. longicaudatus en Chile, lo que sugiere que los seres humanos están expuestos de manera diferencial al virus [107, 181]. La dinámica poblacional de roedores se ve afectada por cambios estacionales de clima y clima [182, 183]. En el caso de los brotes asociados a ENSO, se ha postulado una compleja cascada de eventos desencadenados por lluvias altamente inusuales en el año precedente para dar lugar a un aumento de la producción primaria y densidades de roedores, aumentando también la probabilidad de transmisión del virus a los seres humanos, pero ha resultado difícil demostrar con precisión los eventos intermedios sugeridos, como el aumento de las densidades de roedores en el aumento de la carga de casos [116, 121, 184]. En América del Sur, los efectos del cambio climático y los brotes de hantavirus no han sido bien estudiados, a pesar del conocimiento de que varias especies de roedores que son reservorios de enfermedades emergentes se han visto dramáticamente afectadas por eventos como El Niño [185]. Los cambios en la dinámica de la población de acogida también se ven afectados por la estacionalidad, lo que puede conducir a brotes de enfermedades cuando se interrumpen los procesos que equilibran las poblaciones de roedores de temporada en temporada [186]. La emergencia viral puede seguir promoviéndose a medida que los cambios introducidos por el ser humano continúan aumentando en el medio ambiente a diferentes escalas geográficas. Estos cambios también pueden alterar la estructura y dinámica de la población de roedores e interacciones interespecies creando condiciones que pueden conducir a brotes virales, establecimiento viral en nuevos hospederos, y la aparición de HCPS [102, 162], incluso con aparentemente leve perturbación ecológica al sistema virus-hospedero [188]. Ciertas características fisiopatológicas, incluyendo trombocitopenia y shock, de enfermedades por hantavirus de los seres humanos, tienen similitud sustancial con las fiebres hemorrágicas inducidas por otros virus tales arenavirus, filovirus y flavivirus, a pesar de compartir esencialmente ninguna secuencia similitud con ellos. Tales observaciones plantean preguntas acerca de si tales similitudes en la patogénesis son probables similitudes de fenotipo, o en cambio reportan la presencia de mecanismos moleculares comunes entre los virus. En esta revisión se discuten las propiedades generales, descubrimientos y epidemiología/ecología de las formas de hantavirus patógenos del Nuevo Mundo, y también se busca identificar algunas de las características de las macromoléculas virales y mecanismos inmunológicos que se han propuesto como potenciales mediadores directos de los eventos patógenos que caracterizan la enfermedad humana HCPS. Si bien es poco probable que la expresión de una proteína viral particular o ARNs en aislamiento se pueda confiar en replicar fenotipos clave de infección por el virus completo, algunos de los hallazgos han sido suficientemente consistentes con lo que se conoce de la patogénesis in vivo que ofrecen plomos plausibles de primer paso en la búsqueda de objetivos terapéuticos. Esperamos con interés las revelaciones mecanísticas que seguirán el uso inevitablemente ampliado de métodos poderosos como la secuenciación profunda, imágenes cada vez más avanzadas, y métodos microscópicos, y modelos animales que por fin se pueden decir

¿Cuál es la relación caso-fatalidad, para los serotipos virales más comunes?

Los hantavirus en las Américas y su papel como patógenos emergenteshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3185593/SHA: efe13a8d42b60ef9f7387ea539a1b2eeb5f80101Autores: Hjelle, Brian; Torres-Pérez, FernandoFecha: 2010-11-25DOI: 10.3390/v2125559Licencia: cc-byAbstract: La continua aparición y reaparición de patógenos representan una amenaza continua, a veces mayor, para las poblaciones. Los hantavirus (familia Bunyaviridae) y sus enfermedades humanas asociadas se consideraron confinados a Eurasia, pero la aparición de un brote en el suroeste de Estados Unidos llevó a un gran aumento en su estudio entre los virólogos de todo el mundo. Se han descrito más de 40 genotipos hantavirales, la gran mayoría desde 1993, y casi la mitad de ellos patógenos para los seres humanos. Los hantavirus causan infecciones persistentes en sus reservorios, y en las Américas, la enfermedad humana se manifiesta como compromiso cardiopulmonar, síndrome cardiopulmonar del hantavirus (HCPS), con proporciones de casos-fatalidad, para los serotipos virales más comunes, entre el 30% y el 40%. Alteración del hábitat y trastornos ecológicos a mayor escala, tal vez incluyendo el cambio climático, son algunos de los factores que pueden haber aumentado la carga de casos humanos de HCPS entre 1993 y el presente. Consideramos aquí las características que influyen en la estructura de la dinámica de la población huésped que pueden conducir a brotes virales, así como los determinantes macromoleculares de los hantavirus que han sido considerados como potenciales contribuciones a la patogenicidad. Texto: Los patógenos emergentes causan enfermedades nuevas o no reconocidas anteriormente, y entre ellas, las zoonóticas emergentes son una preocupación importante entre los científicos que estudian enfermedades infecciosas a diferentes escalas espaciales y temporales [1, 2]. Los cambios en las condiciones bióticas y abióticas pueden alterar la dinámica de las enfermedades de la población y conducir a la aparición de infecciones zoonóticas [3] [5] [6]. Durante las últimas décadas, se han producido varios brotes de patógenos virales emergentes y reemergentes, que afectan tanto a la implicación puramente local como a nivel mundial/pandémica de las poblaciones humanas. Entre los ejemplos visibles están la gripe A, el virus del Ébola, el virus de la hepatitis C, el trastorno respiratorio grave para adultos (SARS), el coronavirus y el virus de la inmunodeficiencia humana, que desafían las medidas de prevención y control de los sistemas de salud pública [7]. En las Américas, el reciente brote de gripe pandémica A subtipo H1N1 se convirtió en un objetivo importante de control debido a su rápida propagación, y las incertidumbres en cuanto a virulencia y transmisibilidad, sin embargo, la disponibilidad de vacunas fue limitada cuando se produjo una actividad significativa antes de la temporada tradicional de gripe [8]. Sin embargo, en el último siglo han surgido o resurgido brotes de varias enfermedades virales relacionadas con el virus arenavirus y el virus del dengue, y más recientemente, hantavirus y la expansión del rango geográfico del virus del Nilo Occidental. Entre las enfermedades zoonóticas, los mamíferos pequeños son anfitriones de varios virus ARN patógenos, especialmente Arenaviridae y Bunyaviridae: Hantavirus [9] [10] [11]. Las infecciones por hantavirus se convirtieron en una preocupación en las Américas después de la descripción de un brote de distrés respiratorio agudo ocurrido en La enfermedad recientemente reconocida, el síndrome cardiopulmonar del hantavirus, el HCPS (o síndrome pulmonar del hantavirus), se relacionó con la infección por el virus del Sin Nombre (SNV) recién descubierto, y el roedor Peromyscus maniculatus (ratón venado) fue identificado como el reservorio [13]. Sin embargo, las infecciones por hantavirus tienen una historia mucho más larga. Una revisión de los escritos chinos antiguos, que datan de aproximadamente 960 dC, reveló descripciones muy parecidas a la fiebre hemorrágica con síndrome renal (HFRS), el síndrome causado por los hantavirus del Viejo Mundo [14]. Durante el siglo XX, los casos de enfermedad febril aguda con compromiso renal fueron descritos de varios países eurasiáticos y Japón, a menudo en asociación con compromisos militares [15]. El HFRS como síndrome distinto, sin embargo, fue llamado por primera vez a la atención de la medicina occidental en asociación con un brote que ocurrió entre las tropas de las Naciones Unidas durante el conflicto coreano entre 1951 y 1954, donde más de 3.200 soldados fueron afectados [16]. Tomó más de dos décadas hasta que el agente etiológico, el virus Hantaan (HTNV), fue aislado del ratón de campo rayado Apodemus agrarius, detectado en parte por la unión de anticuerpos de muestras de suero de paciente a los tejidos pulmonares de ratones de campo sanos y salvajes [17, 18]. El virus se encontró más tarde para representar la especie tipo de un nuevo género Hantavirus de la familia Bunyaviridae, aunque fue más tarde evidente que el primer hantavirus a aislarse fue el virus Thottapalayam de shrew-borne [19]. La categorización de los hantavirus como pertenecientes a la familia Bunyaviridae se debe en parte a la presencia consistente de tres genomas de ARN que son circularizados in vivo como resultado de la presencia de nucleótidos terminales complementarios que ayudan a doblar el genoma en una morfología -hairpin-, descrita por primera vez para el flebovirus Uukuniemi [19, 20]. La Tabla 1 es una lista de los hantavirus patógenos predominantemente distintos serológicamente. Se describen muchos otros genotipos llamados, pero tales otras formas patogénicas están generalmente estrechamente relacionadas con los Andes o, en algunos casos, el virus Sin Nombre. Durante la maduración del virus, el precursor forma GPC se procesa utilizando una proteasa unida a la membrana en Gn y Gc, una escisión que ocurre, y parece ser señalada, después de la señal péptida conservada WAASA en la C-terminal de Gn [24]. Aunque las dos proteínas se pueden expresar de forma independiente a través de la transfección, pueden ser retenidas en el compartimento celular incorrecto (ER o aggrosome); por lo tanto, deben ser co-expresadas para permitirles estabilidad para que las dos se puedan ensamblar correctamente en el Golgi [25, [27] [28]. Se han identificado varias actividades y propiedades para las glicoproteínas envolventes del hantavirus, incluyendo algunas características que se sospecha que están involucradas en la patogenicidad de los serotipos causantes de la enfermedad, una posibilidad que ha generado atención experimental. Las glucoproteínas son los ligandos conocidos o presuntos para al menos dos receptores celulares distintos, la cadena de integrina y el factor acelerador de la descomposición, o DAF [30, 31] ; con gC1qR/p32 también identificado como otro receptor de entrada potencial [32]. Comparaciones con la proteína E del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, llevaron a Tischler et al. a considerar la glicoproteína Gc como una proteína potencial de fusión de clase II, tal vez impartiendo actividad de fusión al virión, y esta hipótesis ha ganado apoyo en otros estudios [33, 34]. Se han identificado actividades adicionales con, o se afirma que están relacionadas con, Gn. Para muchos de estos estudios, una premisa subyacente ha sostenido que hay diferencias entre las glicoproteínas de hantavirus -patógenos en relación con virus en el género que se denominan Si bien es cierto que aún no ha sido posible vincular el virus de Prospect Hill (PHV) con la enfermedad humana, la ausencia de evidencia de su patogenicidad tal vez no debería equipararse con la evidencia de su ausencia. Sólo se podría considerar que el nivel de enfermedad (por ejemplo, letargo, fiebre, proteinuria y azotemia) asociado con la infección de primates no humanos por PHV no es significativamente diferente del registrado para los modelos de primates no humanos utilizando el virus conocido del patógeno Puumala (PUUV) [35, 36]. Para el propósito de esta discusión, presumiremos que los hantavirus apatogénicos son efectivamente apatogénicos. Mientras que algunos estudios han sugerido que las glicoproteínas Gn se dirigen más rápidamente a la vía ubiquitina-proteosoma que a las formas apatogénicas, otros han interpretado las diferencias en el manejo de las glicoproteínas Gn a través de especies de hantavirus por el sistema ubiquitina-proteosomal como independientes de la patogenicidad [37] [38] [39]. Algunos investigadores han dirigido sus esfuerzos hacia la identificación de una capacidad diferencial, ya sea cinética o de magnitud absoluta, en la capacidad de los hantavirus patógenos y apatogénicos para provocar una respuesta de interferón en las células. Una premisa que surge es que las formas apatogénicas tenderían a inducir una respuesta innata anterior que haría más probable que el virus se limpiara rápidamente o se volviera menos competente en su replicación, a fin de evitar cualquier respuesta patológica en el huésped [42] La respuesta innata anti-hantavirus puede en algunos casos ser atribuida a la interacción viral como ligando de TLR-3, pero no en otros, y en las células endoteliales, no parece requerir más que la partícula viral misma, incluso cuando se introduce en forma replicativa incompetente [43, 44]. Las proteínas y los ARNm inducidos prominentemente por los hantavirus incluyen MxA e IFIT-1 (ISG-56) y otros incluyendo algunos con actividad antiviral conocida o sospechada. Esos hantavirus, a menudo cepas altamente patógenas, que no inducen una respuesta antiviral potente, se sospechan o se presume que tienen un (más) potente mecanismo de antagonismo interferón-vía en relación con otros virus, un mecanismo que actúa positivamente para prevenir que se forme una respuesta innata efectiva, al menos temprano en la infección [4 Sin embargo, se reportan algunos casos en los que los hantavirus altamente patógenos, tales como NVS, también son capaces de inducir la expresión de los ARNm del gen estimulado por interferón, incluso muy temprano en la infección, con proteínas ISG, como se esperaba, tardando más tiempo en aparecer en la célula [44]. Las actividades anti-interferón también se han atribuido a la proteína NSs que se puede elaborar en células infectadas por serotipos que codifican esta proteína [46]. Otros investigadores han examinado las actividades de las glucoproteínas del hantavirus y otras proteínas que podrían afectar directamente a algunos aspectos de la progresión patogénica asociada a la infección por hantavirus en humanos, tales como cambios de permeabilidad vascular. Mientras que los primeros intentos de causar directamente aumentos en la permeabilidad de las monocapas endoteliales con partículas virales o infección viral fueron en gran medida decepcionantes, los hantavirus se han identificado como que afectan adversamente la migración endotelial sobre los sustratos y en la potenciación de la permeabilidad endotelial inducida por VEG-F [47, 48]. La proteína nucleocápsida o N más corta (+50 kD) es un componente estructural del nucleocápsido viral, junto con los segmentos de ARN viral genómico. Como proteína de unión al ARN que afecta a la horquilla del cabello de los segmentos genómicos con alta afinidad [49, 50], limita el acceso del ARN para alojar nucleasasas y ayuda a hacer que la replicación viral sea un proceso cerrado dentro del citoplasma. También actúa como una proteína de membrana periférica, al igual que la proteína L [51], una actividad que podría jugar un papel en su supuesta, pero aún no demostrada función como matriz [52]. Hasta hace poco, no se había apreciado que N tuviera una amplia variedad de otras actividades, algunas de las cuales pueden estar vinculadas, no sólo a los requisitos fundamentales de replicación, sino también a la interferencia con una serie de procesos intracelulares de la célula normal. Así, se ha propuesto una interacción entre el aminoterminal de la proteína N del hantavirus y la proteína celular Daxx, con la sugerencia de posibles consecuencias pro-apoptóticas [51]. N también se reporta que interactúa con microfilamentos actínicos, y la proteína SUMO-1 [53, 54]. Utilizando ensayos basados en el gen reportero, Connie Schmaljohn y sus colegas han informado que la proteína nucleocapsid del virus Hantaan tiene un papel inhibidor en las respuestas inflamatorias mediadas por NF kappa B (NF- â € € TM B). Los efectos sobre la expresión NF- € B parecen estar limitados a la prevención de su translocación nuclear después de su intento de activación con lipopolisacárido, LPS [55]. En el citoplasma de las células infectadas, la proteína N se puede encontrar en los cuerpos celulares P donde secuestra y protege los capuchones de 5'. Puede localizar los capuchones a través de su interacción con DCP1, un componente clave de los cuerpos P. Durante la infección por hantavirus, los ARN virales se concentran en los cuerpos P, a través de su interacción con N y DCP1. La proteína N demuestra la protección preferencial de los ARNm diseñados para terminar prematuramente su proteína codificada en comparación con los ARNm nativos [56]. La proteína N se ha vinculado cada vez más a la replicación y traducción virales, a veces de maneras no previstas anteriormente. Se encuentra entre una familia creciente de diversas proteínas virales que pueden servir como un inespecífico - ARN chaperone ®, una actividad que debe facilitar el acceso de la L polimerasa al ARNv para la transcripción y replicación, en que puede disociar transitoriamente estructuras de ARN mal dobladas [57]. Algunos de los efectos de la proteína N en la traducción no pueden ser inmediatamente reconocidos como adaptables en la naturaleza. Puede reemplazar todo el complejo de iniciación traslacional EIF4F, presentando simultáneamente el ribosoma con un reemplazo de la actividad de unión de la tapa de eIF 4E, uniéndose al complejo de pre-iniciación 43S, al igual que eIF 4G, al tiempo que reemplaza la actividad helicoidal de eIF 4A, que se presume que es necesaria para disociar la estructura de ARN de orden superior [56, 58]. Estos tres factores normalmente trabajan juntos para lograr la iniciación traslacional. En los cuerpos P, la capacidad de la proteína N de unirse a una alta afinidad a los oligoribonucleótidos celulares nativos tapados, junto con su actividad en la protección de ARNs tapados de la degradación, probablemente facilita el acceso de oligonucleótidos encapsulados para su uso en la iniciación transcripcional por L polimerasa (-cap ra Tráfico de N para el ensamblaje viral: Clásicamente, la proteína N en las células infectadas parece estar agrupada o partículas en la naturaleza, con una concentración pesada en una única ubicación perinuclear, ampliamente considerada como la Golgi [27]. Las proteínas N de los hantavirus se encuentran en asociación con fracciones de partículas, y los estudios confocales microscopía y bioquímico-inhibidores han demostrado que las trazas N a lo largo de microtúbulos pero no con filamentos de actina [52]. El destino final de N, para su ensamblaje en partículas virales es la Golgi, y que circula allí a través del complejo intermedio retículo-Golgi endoplasmático (ERGIC), también conocido como cúmulo vesicular-tubular [52]. Un inhibidor negativo dominante, la dinamitina, asociado con el transporte mediado por Los estudios posteriores sugieren que la dependencia específica del transporte microtubular es específica de los hantavirus del Viejo Mundo como el NVH, pero que el Hantavirus del Nuevo Mundo ANDV está asociado con filamentos de actina [59]. Sin embargo, los datos recientes indican que el transporte microtubular es efectivamente utilizado para el NVH del Nuevo Mundo [60]. Las enfermedades del Hantavirus del hombre desde hace mucho tiempo han sido sospechosas de tener una base inmunopatógena en parte debido a su período de incubación relativamente largo de 2-3 semanas y la asociación temporal observada entre los trastornos inmunológicos y la primera aparición de signos y síntomas de la enfermedad del hantavirus. HFRS y HCPS comparten muchas características clínicas, llevando a muchos investigadores a considerar que son, en esencia, diferentes manifestaciones de un proceso patógeno similar, que difieren principalmente en los órganos objetivo primarios de expresión de la enfermedad (Tabla La patogénesis de las infecciones por hantavirus es el tema de una revisión continuamente actualizada en la serie UpToDate [61]. Para el momento en que aparecen los síntomas en el HCPS, ambas respuestas antivirales fuertes, y, para los genotipos virales más virulentos, el ARN viral puede ser detectado en plasma sanguíneo o células sanguíneas nucleadas respectivamente [63, 64]. Al menos tres estudios han correlacionado el ARN viral plasmático con la gravedad de la enfermedad para el HCPS y el HFRS, sugiriendo que la replicación del virus juega un papel continuo y en tiempo real en la patogénesis viral [65] [66] [67]. Se han identificado varios cambios patológicos distintivos que ocurren tanto en el HFRS como en el HCPS. Una característica crítica de ambos es una fuga capilar transitoria (~ 1-5 días) que involucra el La fuga resultante es de carácter exudativo, con una composición química alta en proteínas y similar al plasma. La experiencia continua que indica el fuerte tropismo tisular para las células endoteliales, específicamente, es uno de los varios factores que hacen de la integra β3 un candidato especialmente atractivo como un importante receptor in vivo para los hantavirus. Es probable que los hantavirus lleguen a sus tejidos objetivo a través de la captación por los ganglios linfáticos regionales, tal vez con o dentro de un histiocito pulmonar escoltante. Las semillas del virus endotelio local, donde las primeras células infectadas dan lugar, en última instancia, a una viremia primaria, un proceso que parece tomar mucho tiempo para las infecciones por hantavirus [62, 63]. En el momento en que emerge la viremia secundaria, los agentes de las formas más severas de HFRS y HCPS han comenzado a alcanzar una masa suficiente para inducir, a través de las interacciones PAMP-PRR y otros medios, la expresión de citoquinas proinflamatorias [64]. Para HCPS, esa expresión favorece el lecho pulmonar y los órganos linfoides, pero, por razones desconocidas, ahorra el retroperitoneo y, en general, el riñón. En HFRS la situación se invierte, y sin embargo no se aprecia a menudo que el esperado tropismos tisulares preferentes de virus asociados a HFRS y sus contrapartes asociadas a HCPS para los lechos renal y pulmonar, respectivamente, no sea como se predeciría a través de las manifestaciones de las dos enfermedades. La elaboración local de mediadores inflamatorios y quimiotácticos se considera un requisito para el desarrollo Sin embargo, no es la hipoxemia, debido al edema pulmonar prominente, lo que conduce a la muerte en la mayoría de los casos fatales de HCPS, sino más bien la intoxicación del corazón por mediadores como aún no definidos, lo que conduce al estado de bajo gasto cardíaco y al síndrome de shock asociado [64, 65]. Es tentador especular que los mediadores producidos en el pulmón en conexión con el infiltrado inflamatorio pueden infiltrarse a través de la circulación coronaria con dilución mínima en HCPS, consecuencia desventajosa de la estrecha yuxtaposición anatómica de los dos órganos. Así, al menos tres clases de mecanismos potenciales, algunos superpuestos y todos ciertamente no exclusivos de los otros, podrían presumirse que subyacen a la patogénesis del HCPS. Estos incluyen:(1) Mecanismos inmunes innatos. La naturaleza de las interacciones entre los patrones moleculares asociados al patógeno del hantavirus (PAMP) y los receptores de reconocimiento del patrón (PRR) de las células endoteliales susceptibles comienzan a ser aclaradas. El HTNV prototípico parece ser reconocido por TLR-3 [43]. Tal infección tiene consecuencias tales como una mayor expresión del HLA-DR en las células dendríticas [66] y la diferenciación de los monocitos hacia las células dendríticas [67]. (2) Efectos virales directos. La correlación observada entre la carga viral y la gravedad de la enfermedad deja abierta la posibilidad de que las partículas del hantavirus o el ARN puedan tener efectos tóxicos sobre las células o sobre la señalización. Algunos investigadores han favorecido la toxicidad viral directa, actuando a través de la inhibición de la función de barrera celular endotelial, como una explicación de gran parte de la fuga capilar, aunque existe Una pista potencialmente importante hacia el mecanismo por el cual las infecciones por hantavirus agotan las plaquetas sanguíneas y, en algunos casos, causan manifestaciones hemorrágicas, fue avanzada por el reciente descubrimiento de que los hantavirus patógenos son capaces de reclutar plaquetas para adherirse a las superficies celulares endoteliales, con β3 integrina utilizada como elemento de unión crítica [69]. (3) Efectos patógenos causados por las actividades de macromoléculas virales específicas. Hemos revisado algunas de las actividades asociadas con los Gn, Gc y N, polipéptidos codificados viralmente en secciones anteriores. Modelos de prueba de patogénesis se pueden hacer más eficazmente cuando hay un modelo animal que imita aspectos clave de la enfermedad. No existe un modelo similar al HFRS, pero existen modelos animales para el transporte asintomático de PUUV y SNV por sus roedores portadores nativos, el banco vole Myodes glareolus y el ratón venado P. maniculatus; así como un modelo hámster sirio utilizando ANDV o el virus Aporal relacionado de Venezuela, para el cual se observa una enfermedad mimética HCPS [70] [71] [72] [73]. El modelo hámster ANDV-Sirio tiene una serie de características en común con la enfermedad humana, así como algunas diferencias. A diferencia de las enfermedades neurológicas que han sido posibles de provocar con HTNV, el modelo hámster para HCPS parece ser causado por fugas capilares que resultan en edema pulmonar y la producción de un derrame pleural con características exudativas. Típicamente los hámsteres mueren entre 11 y 14-d post-inoculación, reflejando un período de incubación ligeramente acelerado en comparación con las infecciones humanas. Al igual que con el HCPS humano, el examen microscópico del pulmón revela abundante deposición de fibrina, septo alveolar engrosado y antígeno viral expresado abundantemente en el endotelio microvascular. Los hámsteres infectados por ANDV equipados con dispositivos de monitoreo fisiológico mostraron disminución de las presiones de pulso, taquicardia e hipotensión que parecen imitar de cerca el shock que se cree que es la causa próxima de la muerte en pacientes que sucumben al HCPS [65, 74]. En comparación con la enfermedad humana, los hámsteres infectados por ANDV exhiben títulos excepcionalmente altos de ANDV vivo en sus tejidos, con gran parte de la replicación viral que se produce Los títulos de ANDV vivo en algunos casos superan los 10 8 /g, mientras que los aislados de hantavirus de los tejidos humanos han sido notoriamente difíciles de obtener. A pesar de la aparición universal de enzimas hepáticas levemente elevadas en pacientes con HCPS, las enzimas hepáticas no parecen estar presentes en niveles elevados en la sangre de hámsters enfermos incluso inmediatamente antes de la muerte [75]. El período prolongado de incubación asociado con la enfermedad por hantavirus da al huésped un tiempo considerable para montar una respuesta inmune madura contra el virus. Así, en contradición a infecciones de gravedad comparable y sintomatología relacionada asociada con arenavirus y filovirus, las infecciones por hantavirus en humanos se asocian con respuestas anticuerpos de título significativo por el momento en que comienzan los síntomas. A pesar de esta observación, parece ser posible que la variación natural en las respuestas individuales de anticuerpos neutralizantes entre los pacientes con infecciones por NVS pueda estar relacionada con la gravedad de la enfermedad, lo que sugiere que la administración de anticuerpos antivirales podría resultar efectiva terapéuticamente [76]. En el caso de la infección por ANDV, han surgido nuevas evidencias que indican que el aparente aclaramiento del virus de la sangre no resulta en la eliminación completa del estímulo antigénico por el virus, sugiriendo que el virus puede persistir, tal vez en algún sitio inmunológicamente privilegiado aún indeterminado [77]. Un papel para las respuestas patológicas mediadas por células T en el HFRS y el HCPS ha sido la fuente de especulación por una variedad de razones. La gravedad del SNS asociado a la NVS puede haber hecho más evidente que el inicio del edema pulmonar, la taquicardia y la hipertensión parecía estar todo, pero universalmente asociado temporalmente, con la aparición de un espectro de células altamente activadas del linaje linfoide en la sangre periférica. Se detectaron células con similitudes morfológicas cercanas a estos -inmunoblastos- en los pulmones congestionados y pesados de los pacientes que llegaron a la autopsia, así como en órganos linfoides y en las tríadas portal [63, [78] [79] [80]. Estas observaciones llevaron a especular que algún componente de la patogénesis por hantavirus podría estar vinculado a la aparición de células T antivirales que podrían estimular o contribuir a la aparición de una -tormenta de mediadores y el fenotipo de fuga capilar asociado. Estudios posteriores han confirmado la expectativa de que una fracción significativa de la población de inmunoblastos en pacientes con HCPS son células T con especificidad para epitopes específicos de antígenos virales de clase I presentados por el HLA, incluyendo Gn, Gc y N [77, [81] [82] [83]. Presumiblemente, las actividades antivirales de estas células, manifestadas en parte por su elaboración de mediadores en el intersticio afectado, pueden contribuir a la fuga endotelial/capilar que se encuentra en el corazón de la patogénesis del hantavirus. Debido a que los primeros casos de HCPS a menudo llegaron a la autopsia, se hizo posible examinar tejidos necropsiados para la expresión de citocinas. El estudio de Mori et al. (1999) revelaron una alta expresión relativa de citocinas proinflamatorias incluyendo TNF-, IL-1-, IL-6, proporcionando evidencia a favor de un modelo de tormenta de citoquinas para la patogénesis [64]. Los autores creían, basándose en la morfología de las células secretadoras de citoquinas, que tanto monocitos como linfocitos estaban contribuyendo a la producción de citocinas. Que los mediadores proinflamatorios se encuentran en niveles elevados en el plasma, así como el intersticio renal de pacientes con enfermedad hantaviral aguda se ha reconocido desde hace algún tiempo también [84, 85]. Si bien el diagnóstico de HCPS y HFRS se realiza mejor con serología IgM, en la etapa aguda de la infección por NVS, también se puede utilizar RT-PCR si se utilizan células sanguíneas o coágulos de sangre en lugar de plasma o suero, donde la sensibilidad incluso utilizando imprimaciones PCR anidadas disminuye a cerca del 70% [86] [87] [88]. En una instalación en la que se tratan muchos casos de HCPS, el centro médico de la Universidad de Nuevo México en Albuquerque, se ha ofrecido un servicio de diagnóstico en el que se analizan los hallazgos hematológicos del paciente para establecer la probabilidad de que un paciente tenga HCPS. La combinación de trombocitopenia, abundancia elevada de linfocitos -inmunoblasto-, población de células polimorfonucleares con desplazamiento izquierdo sin evidencia morfológica fuerte para su activación, y valores elevados de hemoglobina o hematocrito es altamente específica para el HCPS y permite a los clínicos la capacidad de poner pacientes presuntivos-HCPS en oxigenación de membrana extracorpórea (ECMO), que se cree que ha salvado a muchos pacientes de un resultado letal [89]. Se cree que la infección humana por hantavirus sigue el contacto con secreciones o excreciones producidas por roedores infectados. En los Estados Unidos, 538 infecciones humanas por hantavirus fueron reportadas hasta finales de diciembre de 2009 [90], con Nuevo México, Arizona y Colorado mostrando los casos más altos. Mientras que el prototípico hantavirus centroamericano en América Central fue el virus Rio Segundo de Reithrodontomys mexicanus de Costa Rica, la primera enfermedad humana apareció algunos años más tarde en Panamá, donde el virus Choclo (CHOV) surgió como el agente etiológico y se cree que es responsable de todos los casos conocidos de HCPS. La rata de arroz pigmeo fulvo Oligoryzomys fulvescens ha sido identificada como el reservorio de roedores [91]. En Panamá, los primeros casos de HCPS, aunque con poca o ninguna implicación cardiaca evidente, fueron reportados en 1999, y desde entonces, 106 infecciones humanas han ocurrido con una tasa de mortalidad del 26% [92]. Seroencuestas de mamíferos en México y Costa Rica han encontrado anticuerpos antihantavirus [93] [94] [95] [96], y se han notificado seroprevalencias que oscilan entre 0,6 y 1,6% en poblaciones humanas a pesar de la ausencia de casos conocidos de HCPS [97]. En América del Sur, los casos de HCPS se han identificado en Argentina, Bolivia, Brasil, Chile, Paraguay y Uruguay, y también se han notificado evidencias de exposición humana a hantavirus en Venezuela [98] y Perú [99]. En América del Sur, ANDV es el principal agente etiológico con casos en Chile y Argentina notificados desde 1995. En Chile, se han producido 671 casos de HCPS debido a ANDV durante el período 2001-2009 [100]. Desde 1995 se han reportado más de 1.000 casos de HCPS en Argentina [101] ; en el Brasil se han identificado aproximadamente 1.100 casos de HCPS entre 1993 y 2008 [102]. Las tasas de mortalidad por casos en esos tres países han sido similares, oscilando entre el 30% (Argentina), el 36% (Chile) y el 39% (Brasil). Las infecciones por Hantavirus ocurren con más frecuencia en hombres que en mujeres, aunque la proporción entre hombres y mujeres es muy variable. Por ejemplo, las comunidades panameñas mostraron una proporción de 55 hombres por 45 mujeres [103], mientras que en Chile la proporción es más sesgada por hombres (71%) [104]. En el Chaco paraguayo la proporción entre hombres y mujeres se aproxima al 50% [105]. En América del Norte, en diciembre de 2009 el 63% de los pacientes eran varones [90]. Todos los grupos étnicos y raciales parecen ser susceptibles a infecciones por el hantavirus, y las diferencias entre ciertos grupos (como indígenas y no indígenas) están más probablemente correlacionadas con el tipo de hábitat en el que reside la población (por ejemplo, zonas rurales frente a zonas urbanas). De hecho, las comunidades rurales representan la mayor incidencia global del hantavirus y, por lo tanto, están en mayor riesgo [92, [105] [106] [107] [108] [109] [109] [119], aunque también se ha destacado la importancia de los entornos peridomésticos como una importante zona de exposición [112, 113]. El principal mecanismo por el que los seres humanos adquieren la infección por el hantavirus es la exposición a aerosoles de heces contaminadas de roedores, orina y saliva [114, 115]. Esto puede ocurrir cuando los seres humanos residen en áreas cercanas a las que habitan los roedores, viven en áreas infestadas de roedores, o cuando los roedores invaden entornos humanos, que son más frecuentes en hábitats rurales.Existe una larga historia de coexistencia humana con roedores, lo que plantea dudas sobre el aparente aumento reciente de las enfermedades relacionadas con el hantavirus, especialmente el HCPS. Aparte de una aparente asociación con eventos de oscilación sureña de El Niño (ENSO) en algunas regiones [116, 117], los recientes incrementos en la incidencia del HCPS no parecen seguir un patrón temporal o espacial fácilmente definido. Sin embargo, algunas características del paisaje, como la fragmentación del hábitat o las áreas perturbadas por el ser humano, pueden influir en la dinámica de la población de roedores e impactar en la incidencia viral [118] [112] [112] [121]. A pesar de la estocástica asociada a la contracción de la infección Las actividades humanas en edificios mal ventilados que pulverizan partículas que luego se inhalan (es decir, limpieza, agitación de alfombras, polvo) se identifican con frecuencia entre los pacientes admitidos para el SHCPS [11, 122]. Se cree que las actividades al aire libre transmiten un menor riesgo debido a la labilidad de los hantavirus a la radiación UV y a la supuesta tendencia a dispersarse en el viento, aunque ciertas condiciones ambientales parecen mantener el virus durante períodos más largos fuera de su huésped natural, lo que permite la transmisión indirecta [123]. Una vía alternativa pero poco común de transmisión del virus es la mordedura de roedores [124] [125] [126]. Los trabajadores sobre el terreno que manipulan mamíferos corren un riesgo potencialmente mayor de exposición a infecciones por hantavirus, aunque cuando se cuantifica a través de serosurveys el riesgo absoluto parece bastante leve [127]. Un nuevo estudio en Colorado sugiere la posibilidad de que una picadura de roedor haya sido el vehículo próximo para la transmisión al aire libre de NVS [128], lo que vuelve a enfatizar el uso de equipo de protección personal durante las actividades de trabajo de campo [129]. Como caso particular dentro de los hantavirus, la transmisión de persona a persona ha sido documentada exclusivamente para el virus de los Andes sudamericanos [130] [133] [133] [135]. La identificación de esta vía de transmisión se ha hecho utilizando tanto herramientas moleculares como encuestas epidemiológicas, pero el mecanismo de transmisión interpersonal no está bien establecido. Curiosamente, ANDV también puede ser derramado por los humanos a través de otros fluidos biológicos como la orina [136], ilustrando las propiedades particulares que diferencian este virus de otros hantavirus. Aunque la transmisión interpersonal parece ser única para ANDV, el ARN viral de PUUV se ha detectado en la saliva de pacientes con HFRS, y algunos pacientes con SNV-HCPS tienen ARN viral en las secreciones traqueales [88, 137]. Los Hantavirus en las Américas son alojados naturalmente por roedores (Muridae y Cricetidae) así como las musarañas (Soricidae) y los lunares (Talpidae) (Figura 1). Tres especies de musgo y un mole han sido reportados para albergar hantavirus y su patogenicidad para los humanos permanece desconocida [22, 138, 139]. Se han identificado al menos 15 especies de roedores como portadores de diferentes hantavirus patógenos, con algunos genotipos sudamericanos como Castelo do Sonhos (CDSV) o Hu39694 sólo identificados después de infecciones humanas (Figura 1 ). Los hantavirus suelen mostrar una alta especificidad de especie y ningún huésped intermedio [140]. Sin embargo, se han descrito algunos genotipos de hantavirus en la misma especie de roedores. Tal es el caso de Playa de Oro (OROV) y Catacamas (CATV) identificados en Oryzomys couesi [141, 142], o Maporal (MAPV) y Choclo (CHOV) hospedados por O. fulvescens [91, 143]. En América del Norte se han detectado virus de muleshoe y Black Creek Canal hanta en sigmodon hispidus [ Además, un genotipo de hantavirus (por ejemplo, el virus similar a Juquitiba) puede ser transportado por más de una especie de roedores (O. nigripes, Oxymycterus judex, Akodon montesis). Otro ejemplo es el virus Laguna Negra (LANV) que después de ser identificado en Calomys laucha [146] también ha sido reportado en C. callosus [147]. El rápido aumento en el descubrimiento de nuevos hantavirus y la identificación de sus anfitriones no parece probable que termine tan pronto como se examinen nuevas especies pequeñas de mamíferos [95]. Este tema se complica por la continua controversia en los criterios para la clasificación de distintos hantavirus [148, 149], que también está vinculado a la clasificación taxonómica y los reordenamientos taxonómicos. La transmisión de especies cruzadas es un proceso importante durante la propagación, aparición y evolución Particularmente dentro de los hantavirus, los derrames a los huéspedes secundarios se identifican cada vez más a medida que se realizan estudios más extensos [151] [152] [153] [155] [156]. Por ejemplo, ANDV es el agente etiológico predominante del HCPS en América del Sur, y O. longicaudatus el principal reservorio de roedores. Derrama en al menos otras cuatro especies de roedores que coocurren con el reservorio se han identificado, con Abrothrix longipilis mostrando la segunda mayor prevalencia de anticuerpos de ANDV, y actualmente no hay duda de que el virus es extremadamente similar genéticamente entre los dos roedores del huésped [157, 158]. En América del Norte, el derrame del virus Bayou (BAYV) puede haber ocurrido desde el reservorio principal de O. palustris a S. hispidus, R. fulvescens, P. leucopus y B. taylori [159] [160] [161]. Es más probable que el derrame del virus Hanta se produzca con poblaciones de acogida que habitan regiones simpatricas o sintópicas [151, 162], y la transmisión de especies cruzadas tendría probablemente mayores posibilidades de éxito si las especies anfitrionas están estrechamente relacionadas [163]. Se encuentra una excepción interesante entre el virus Oxbow (OXBV) y el virus Asama (ASAV) en el que un proceso de cambio de huésped parecía haber ocurrido entre mamíferos pertenecientes a dos familias (Talpidae y Soricidae), probablemente como resultado de la codivergencia alterna y recurrente de ciertos tax Los hantavirus son transmitidos horizontalmente entre roedores y no son transmitidos por artrópodos (a diferencia de otros virus de la familia Bunyaviridae). La infección por derrapadores a mamíferos no humanos generalmente no produce ninguna transmisión hacia adelante (o a fin de morir), pero si los seres humanos están infectados pueden resultar en una alta morbilidad y mortalidad [122, 164]. Durante la primavera de 1993, un brote de pacientes con HCPS debido a SNV ocurrió en los estados de Four Corners, resultando en más del 60% de casos de mortalidad entre los casos iniciales, muchos de los cuales involucran a miembros de la tribu Navajo [12, 121]. En Panamá, se notificó un brote durante 1999-2000 en Los Santos, y 12 casos donde se identificaron con tres muertes [165, 166]. Esto representó el primer informe de infecciones por hantavirus humanos en América Central. En América del Sur, Diecisiete individuos fueron identificados con anticuerpo NVS (ELISA) o fueron antígenos (HCI) positivos de 52 casos sospechosos [167]. En 1996 ocurrieron brotes mayores debidos a ANDV en el sur de Argentina [131, 134] ; en el sur de Chile se presentaron grupos de pacientes con enfermedad por hantavirus en 1997 [158]. En Brasil, el primer brote fue identificado en la Amazonía Brasileña (Estado de Maranhão) en el año 2000, e involucró pequeños pueblos que resultaron en una prevalencia del 13,3% de los evaluados (398 residentes totales) [168]. Los factores que desencadenan los brotes de hantavirus todavía son mal entendidos, probablemente porque resultan de varias características bióticas y abióticas interactuantes cuyos parámetros clave son difíciles de modelar. Sin embargo, el uso de nuevos enfoques de modelado que involucran características geográficas y ambientales parece ser prometedor a la hora de predecir posibles brotes de hantavirus y/o áreas de mayor riesgo [169] [170] [171] [172]. Debido a que se sabe que los hantavirus se transmiten directamente de los huéspedes infectados a los susceptibles, el primer enfoque natural es relacionar los brotes con la ecología de los huéspedes virales. La transmisión y persistencia del hantavirus en las poblaciones de roedores depende de varios factores que interactúan para afectar la dinámica ecológica del huésped, que a su vez está fuertemente influenciada por las características de comportamiento de las especies de roedores individuales, a la estructura paisajística y a las características ambientales [173, 174]. La transmisión viral depende de las tasas de contacto entre los huéspedes sensibles, y a pesar de la noción prevaleciente de que un aumento de la densidad se encuentra y, por lo tanto, de Además, se ha demostrado que la transmisión de NVS sigue un patrón de heterogeneidad de contacto, donde los individuos de la población tienen diferentes probabilidades de transmitir la infección [176]. La comprensión de la transmisión viral resulta ser mucho más compleja cuando especies distintas del principal huésped del reservorio se incorporan en el modelo. De hecho, estudios recientes han demostrado que la mayor diversidad de especies hospedantes está correlacionada con una menor prevalencia de infección en América del Norte para P. maniculatus [177], en América Central para O. fulvescens (reservorio del virus Choclo) y Zygodontomys brevicauda (reservorio del virus Calabazo) [178], y en América del Sur para Akodon montensis (reservorio del virus Jabora) [162]. Las tasas de contacto varían según la distribución espacial de las poblaciones y parecen estar Por ejemplo, la prevalencia de SNV en P. maniculatus fue mayor en paisajes con mayor grado de fragmentación del hábitat preferido [179]. Además, ciertas propiedades del paisaje como elevación, pendiente y cubierta terrestre parecen ser útiles para detectar áreas con infecciones persistentes de SNV, y por lo tanto se consideran áreas refugiales donde el virus puede mantenerse durante años [169]. Los cambios en el entorno natural de las especies de reservorios, como la fragmentación forestal y la pérdida de hábitat, pueden alterar la abundancia y distribución de la población y provocar brotes de hantavirus, como se observa en la Península de Azurero de Panamá [118, 119]. Además, las diferencias en el microhábitat, incluida la cubierta superficial, pueden conducir a diferencias en la dinámica ecológica dentro de las poblaciones y afectar a la tasa de exposición al virus [180]. Se han encontrado diferencias en las infecciones por hantavirus a través de paisajes contrastantes en el intervalo latitudinal en poblaciones de roedores de O. longicaudatus en Chile, lo que sugiere que los seres humanos están expuestos de manera diferencial al virus [107, 181]. La dinámica poblacional de roedores se ve afectada por cambios estacionales de clima y clima [182, 183]. En el caso de los brotes asociados a ENSO, se ha postulado una compleja cascada de eventos desencadenados por lluvias altamente inusuales en el año precedente para dar lugar a un aumento de la producción primaria y densidades de roedores, aumentando también la probabilidad de transmisión del virus a los seres humanos, pero ha resultado difícil demostrar con precisión los eventos intermedios sugeridos, como el aumento de las densidades de roedores en el aumento de la carga de casos [116, 121, 184]. En América del Sur, los efectos del cambio climático y los brotes de hantavirus no han sido bien estudiados, a pesar del conocimiento de que varias especies de roedores que son reservorios de enfermedades emergentes se han visto dramáticamente afectadas por eventos como El Niño [185]. Los cambios en la dinámica de la población de acogida también se ven afectados por la estacionalidad, lo que puede conducir a brotes de enfermedades cuando se interrumpen los procesos que equilibran las poblaciones de roedores de temporada en temporada [186]. La emergencia viral puede seguir promoviéndose a medida que los cambios introducidos por el ser humano continúan aumentando en el medio ambiente a diferentes escalas geográficas. Estos cambios también pueden alterar la estructura y dinámica de la población de roedores e interacciones interespecies creando condiciones que pueden conducir a brotes virales, establecimiento viral en nuevos hospederos, y la aparición de HCPS [102, 162], incluso con aparentemente leve perturbación ecológica al sistema virus-hospedero [188]. Ciertas características fisiopatológicas, incluyendo trombocitopenia y shock, de enfermedades por hantavirus de los seres humanos, tienen similitud sustancial con las fiebres hemorrágicas inducidas por otros virus tales arenavirus, filovirus y flavivirus, a pesar de compartir esencialmente ninguna secuencia similitud con ellos. Tales observaciones plantean preguntas acerca de si tales similitudes en la patogénesis son probables similitudes de fenotipo, o en cambio reportan la presencia de mecanismos moleculares comunes entre los virus. En esta revisión se discuten las propiedades generales, descubrimientos y epidemiología/ecología de las formas de hantavirus patógenos del Nuevo Mundo, y también se busca identificar algunas de las características de las macromoléculas virales y mecanismos inmunológicos que se han propuesto como potenciales mediadores directos de los eventos patógenos que caracterizan la enfermedad humana HCPS. Si bien es poco probable que la expresión de una proteína viral particular o ARNs en aislamiento se pueda confiar en replicar fenotipos clave de infección por el virus completo, algunos de los hallazgos han sido suficientemente consistentes con lo que se conoce de la patogénesis in vivo que ofrecen plomos plausibles de primer paso en la búsqueda de objetivos terapéuticos. Esperamos con interés las revelaciones mecanísticas que seguirán el uso inevitablemente ampliado de métodos poderosos como la secuenciación profunda, imágenes cada vez más avanzadas, y métodos microscópicos, y modelos animales que por fin se pueden decir

Entre las enfermedades zoonóticas, ¿cuáles son los anfitriones de varios virus ARN patógenos?

Los hantavirus en las Américas y su papel como patógenos emergenteshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3185593/SHA: efe13a8d42b60ef9f7387ea539a1b2eeb5f80101Autores: Hjelle, Brian; Torres-Pérez, FernandoFecha: 2010-11-25DOI: 10.3390/v2125559Licencia: cc-byAbstract: La continua aparición y reaparición de patógenos representan una amenaza continua, a veces mayor, para las poblaciones. Los hantavirus (familia Bunyaviridae) y sus enfermedades humanas asociadas se consideraron confinados a Eurasia, pero la aparición de un brote en el suroeste de Estados Unidos llevó a un gran aumento en su estudio entre los virólogos de todo el mundo. Se han descrito más de 40 genotipos hantavirales, la gran mayoría desde 1993, y casi la mitad de ellos patógenos para los seres humanos. Los hantavirus causan infecciones persistentes en sus reservorios, y en las Américas, la enfermedad humana se manifiesta como compromiso cardiopulmonar, síndrome cardiopulmonar del hantavirus (HCPS), con proporciones de casos-fatalidad, para los serotipos virales más comunes, entre el 30% y el 40%. Alteración del hábitat y trastornos ecológicos a mayor escala, tal vez incluyendo el cambio climático, son algunos de los factores que pueden haber aumentado la carga de casos humanos de HCPS entre 1993 y el presente. Consideramos aquí las características que influyen en la estructura de la dinámica de la población huésped que pueden conducir a brotes virales, así como los determinantes macromoleculares de los hantavirus que han sido considerados como potenciales contribuciones a la patogenicidad. Texto: Los patógenos emergentes causan enfermedades nuevas o no reconocidas anteriormente, y entre ellas, las zoonóticas emergentes son una preocupación importante entre los científicos que estudian enfermedades infecciosas a diferentes escalas espaciales y temporales [1, 2]. Los cambios en las condiciones bióticas y abióticas pueden alterar la dinámica de las enfermedades de la población y conducir a la aparición de infecciones zoonóticas [3] [5] [6]. Durante las últimas décadas, se han producido varios brotes de patógenos virales emergentes y reemergentes, que afectan tanto a la implicación puramente local como a nivel mundial/pandémica de las poblaciones humanas. Entre los ejemplos visibles están la gripe A, el virus del Ébola, el virus de la hepatitis C, el trastorno respiratorio grave para adultos (SARS), el coronavirus y el virus de la inmunodeficiencia humana, que desafían las medidas de prevención y control de los sistemas de salud pública [7]. En las Américas, el reciente brote de gripe pandémica A subtipo H1N1 se convirtió en un objetivo importante de control debido a su rápida propagación, y las incertidumbres en cuanto a virulencia y transmisibilidad, sin embargo, la disponibilidad de vacunas fue limitada cuando se produjo una actividad significativa antes de la temporada tradicional de gripe [8]. Sin embargo, en el último siglo han surgido o resurgido brotes de varias enfermedades virales relacionadas con el virus arenavirus y el virus del dengue, y más recientemente, hantavirus y la expansión del rango geográfico del virus del Nilo Occidental. Entre las enfermedades zoonóticas, los mamíferos pequeños son anfitriones de varios virus ARN patógenos, especialmente Arenaviridae y Bunyaviridae: Hantavirus [9] [10] [11]. Las infecciones por hantavirus se convirtieron en una preocupación en las Américas después de la descripción de un brote de distrés respiratorio agudo ocurrido en La enfermedad recientemente reconocida, el síndrome cardiopulmonar del hantavirus, el HCPS (o síndrome pulmonar del hantavirus), se relacionó con la infección por el virus del Sin Nombre (SNV) recién descubierto, y el roedor Peromyscus maniculatus (ratón venado) fue identificado como el reservorio [13]. Sin embargo, las infecciones por hantavirus tienen una historia mucho más larga. Una revisión de los escritos chinos antiguos, que datan de aproximadamente 960 dC, reveló descripciones muy parecidas a la fiebre hemorrágica con síndrome renal (HFRS), el síndrome causado por los hantavirus del Viejo Mundo [14]. Durante el siglo XX, los casos de enfermedad febril aguda con compromiso renal fueron descritos de varios países eurasiáticos y Japón, a menudo en asociación con compromisos militares [15]. El HFRS como síndrome distinto, sin embargo, fue llamado por primera vez a la atención de la medicina occidental en asociación con un brote que ocurrió entre las tropas de las Naciones Unidas durante el conflicto coreano entre 1951 y 1954, donde más de 3.200 soldados fueron afectados [16]. Tomó más de dos décadas hasta que el agente etiológico, el virus Hantaan (HTNV), fue aislado del ratón de campo rayado Apodemus agrarius, detectado en parte por la unión de anticuerpos de muestras de suero de paciente a los tejidos pulmonares de ratones de campo sanos y salvajes [17, 18]. El virus se encontró más tarde para representar la especie tipo de un nuevo género Hantavirus de la familia Bunyaviridae, aunque fue más tarde evidente que el primer hantavirus a aislarse fue el virus Thottapalayam de shrew-borne [19]. La categorización de los hantavirus como pertenecientes a la familia Bunyaviridae se debe en parte a la presencia consistente de tres genomas de ARN que son circularizados in vivo como resultado de la presencia de nucleótidos terminales complementarios que ayudan a doblar el genoma en una morfología -hairpin-, descrita por primera vez para el flebovirus Uukuniemi [19, 20]. La Tabla 1 es una lista de los hantavirus patógenos predominantemente distintos serológicamente. Se describen muchos otros genotipos llamados, pero tales otras formas patogénicas están generalmente estrechamente relacionadas con los Andes o, en algunos casos, el virus Sin Nombre. Durante la maduración del virus, el precursor forma GPC se procesa utilizando una proteasa unida a la membrana en Gn y Gc, una escisión que ocurre, y parece ser señalada, después de la señal péptida conservada WAASA en la C-terminal de Gn [24]. Aunque las dos proteínas se pueden expresar de forma independiente a través de la transfección, pueden ser retenidas en el compartimento celular incorrecto (ER o aggrosome); por lo tanto, deben ser co-expresadas para permitirles estabilidad para que las dos se puedan ensamblar correctamente en el Golgi [25, [27] [28]. Se han identificado varias actividades y propiedades para las glicoproteínas envolventes del hantavirus, incluyendo algunas características que se sospecha que están involucradas en la patogenicidad de los serotipos causantes de la enfermedad, una posibilidad que ha generado atención experimental. Las glucoproteínas son los ligandos conocidos o presuntos para al menos dos receptores celulares distintos, la cadena de integrina y el factor acelerador de la descomposición, o DAF [30, 31] ; con gC1qR/p32 también identificado como otro receptor de entrada potencial [32]. Comparaciones con la proteína E del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, llevaron a Tischler et al. a considerar la glicoproteína Gc como una proteína potencial de fusión de clase II, tal vez impartiendo actividad de fusión al virión, y esta hipótesis ha ganado apoyo en otros estudios [33, 34]. Se han identificado actividades adicionales con, o se afirma que están relacionadas con, Gn. Para muchos de estos estudios, una premisa subyacente ha sostenido que hay diferencias entre las glicoproteínas de hantavirus -patógenos en relación con virus en el género que se denominan Si bien es cierto que aún no ha sido posible vincular el virus de Prospect Hill (PHV) con la enfermedad humana, la ausencia de evidencia de su patogenicidad tal vez no debería equipararse con la evidencia de su ausencia. Sólo se podría considerar que el nivel de enfermedad (por ejemplo, letargo, fiebre, proteinuria y azotemia) asociado con la infección de primates no humanos por PHV no es significativamente diferente del registrado para los modelos de primates no humanos utilizando el virus conocido del patógeno Puumala (PUUV) [35, 36]. Para el propósito de esta discusión, presumiremos que los hantavirus apatogénicos son efectivamente apatogénicos. Mientras que algunos estudios han sugerido que las glicoproteínas Gn se dirigen más rápidamente a la vía ubiquitina-proteosoma que a las formas apatogénicas, otros han interpretado las diferencias en el manejo de las glicoproteínas Gn a través de las especies del hantavirus por el sistema ubiquitina-proteosomal como independientes de la patogenicidad [37] [38] [39]. Algunos investigadores han dirigido sus esfuerzos hacia la identificación de una capacidad diferencial, ya sea cinética o de magnitud absoluta, en la capacidad de los hantavirus patógenos y apatogénicos para provocar una respuesta del interferón en las células. Una premisa que surge es que las formas apatogénicas tenderían a inducir una respuesta innata anterior que haría más probable que el virus se limpiara rápidamente o se volviera menos competente en su replicación, a fin de evitar cualquier respuesta patológica en el huésped [4 La respuesta innata anti-hantavirus puede en algunos casos ser atribuida a la interacción viral como ligando de TLR-3, pero no en otros, y en las células endoteliales, no parece requerir más que la partícula viral misma, incluso cuando se introduce en forma replicante-incompetente [43, 44]. Proteínas y ARNm inducidos prominentemente por los hantavirus incluyen MxA e IFIT-1 (ISG-56) y otros incluyendo algunos con actividad antiviral conocida o sospechada. Esos hantavirus, a menudo cepas altamente patógenas, que no inducen una respuesta antiviral potente, se sospechan o se presume que tienen un (más) potente mecanismo de antagonismo interferón-vía en relación con otros virus, un mecanismo que actúa positivamente para prevenir que se forme una respuesta innata efectiva, al menos temprano en Sin embargo, se reportan algunos casos en los que los hantavirus altamente patógenos, tales como NVS, también son capaces de inducir la expresión de los ARNm del gen estimulado por interferón, incluso muy temprano en la infección, con proteínas ISG, como se esperaba, tardando más tiempo en aparecer en la célula [44]. Las actividades anti-interferón también se han atribuido a la proteína NSs que se puede elaborar en células infectadas por serotipos que codifican esta proteína [46]. Otros investigadores han examinado las actividades de las glucoproteínas del hantavirus y otras proteínas que podrían afectar directamente a algunos aspectos de la progresión patogénica asociada a la infección por hantavirus en humanos, tales como cambios en la permeabilidad vascular. Mientras que los primeros intentos de causar directamente aumentos en la permeabilidad de las monocapas endoteliales con partículas virales o infección viral fueron en gran medida decepcionantes, los hantavirus se han identificado como que afectan adversamente la migración endotelial sobre los sustratos y en la potenciación de la permeabilidad endotelial inducida por VEG-F [47, 48]. La proteína nucleocápsida o N más corta (+50 kD) es un componente estructural del nucleocápsido viral, junto con los segmentos de ARN viral genómico. Como proteína de unión al ARN que afecta a la horquilla del cabello de los segmentos genómicos con alta afinidad [49, 50], limita el acceso del ARN para alojar nucleasasas y ayuda a hacer que la replicación viral sea un proceso cerrado dentro del citoplasma. También actúa como una proteína de membrana periférica, al igual que la proteína L [51], una actividad que podría jugar un papel en su supuesta, pero aún no demostrada función como matriz [52]. Hasta hace poco, no se había apreciado que N tuviera una amplia variedad de otras actividades, algunas de las cuales pueden estar vinculadas, no sólo a los requisitos fundamentales de replicación, sino también a la interferencia con una serie de procesos intracelulares de la célula normal. Así, se ha propuesto una interacción entre el aminoterminal de la proteína N del hantavirus y la proteína celular Daxx, con la sugerencia de posibles consecuencias pro-apoptóticas [51]. N también se reporta que interactúa con microfilamentos actínicos, y la proteína SUMO-1 [53, 54]. Utilizando ensayos basados en el gen reportero, Connie Schmaljohn y sus colegas han reportado que la proteína nucleocapsida del virus Hantaan tiene un papel inhibidor en las respuestas inflamatorias mediadas por NF kappa B (NF- B). Los efectos sobre la expresión NF- B parecen estar limitados a la prevención de su translocación nuclear después de su intento de activación con lipopolisacárido, LPS [55]. En el citoplasma de las células infectadas, la proteína N se puede encontrar en los cuerpos celulares P donde secuestra y protege los capuchones de 5'. Puede localizar los capuchones a través de su interacción con DCP1, un componente clave de los cuerpos P. Durante la infección por hantavirus, los ARN virales se concentran en los cuerpos P, a través de su interacción con N y DCP1. La proteína N demuestra la protección preferencial de los ARNm diseñados para terminar prematuramente su proteína codificada en comparación con los ARNm nativos [56]. La proteína N se ha vinculado cada vez más a la replicación y traducción virales, a veces de maneras no previstas anteriormente. Se encuentra entre una familia creciente de diversas proteínas virales que pueden servir como un inespecífico - ARN chaperone ®, una actividad que debe facilitar el acceso de la L polimerasa al ARNv para la transcripción y replicación, en que puede disociar transitoriamente estructuras de ARN mal dobladas [57]. Algunos de los efectos de la proteína N en la traducción no pueden ser inmediatamente reconocidos como adaptables en la naturaleza. Puede reemplazar todo el complejo de iniciación traslacional EIF4F, presentando simultáneamente el ribosoma con un reemplazo de la actividad de unión de la tapa de eIF 4E, uniéndose al complejo de pre-iniciación 43S, al igual que eIF 4G, al tiempo que reemplaza la actividad helicoidal de eIF 4A, que se presume que es necesaria para disociar la estructura de ARN de orden superior [56, 58]. Estos tres factores normalmente trabajan juntos para lograr la iniciación traslacional. En los cuerpos P, la capacidad de la proteína N de unirse a una alta afinidad a los oligoribonucleótidos celulares nativos tapados, junto con su actividad en la protección de ARNs tapados de la degradación, probablemente facilita el acceso de oligonucleótidos encapsulados para su uso en la iniciación transcripcional por L polimerasa (-cap ra Tráfico de N para el ensamblaje viral: Clásicamente, la proteína N en las células infectadas parece estar agrupada o partículas en la naturaleza, con una concentración pesada en una única ubicación perinuclear, ampliamente considerada como la Golgi [27]. Las proteínas N de los hantavirus se encuentran en asociación con fracciones de partículas, y los estudios confocales microscopía y bioquímico-inhibidores han demostrado que las trazas N a lo largo de microtúbulos pero no con filamentos de actina [52]. El destino final de N, para su ensamblaje en partículas virales es la Golgi, y que circula allí a través del complejo intermedio retículo-Golgi endoplasmático (ERGIC), también conocido como cúmulo vesicular-tubular [52]. Un inhibidor negativo dominante, la dinamitina, asociado con el transporte mediado por Los estudios posteriores sugieren que la dependencia específica del transporte microtubular es específica de los hantavirus del Viejo Mundo como el NVH, pero que el Hantavirus del Nuevo Mundo ANDV está asociado con filamentos de actina [59]. Sin embargo, los datos recientes indican que el transporte microtubular es efectivamente utilizado para el NVH del Nuevo Mundo [60]. Las enfermedades del Hantavirus del hombre desde hace mucho tiempo han sido sospechosas de tener una base inmunopatógena en parte debido a su período de incubación relativamente largo de 2-3 semanas y la asociación temporal observada entre los trastornos inmunológicos y la primera aparición de signos y síntomas de la enfermedad del hantavirus. HFRS y HCPS comparten muchas características clínicas, llevando a muchos investigadores a considerar que son, en esencia, diferentes manifestaciones de un proceso patógeno similar, que difieren principalmente en los órganos objetivo primarios de expresión de la enfermedad (Tabla La patogénesis de las infecciones por hantavirus es el tema de una revisión continuamente actualizada en la serie UpToDate [61]. Para el momento en que aparecen los síntomas en el HCPS, ambas respuestas antivirales fuertes, y, para los genotipos virales más virulentos, el ARN viral puede ser detectado en plasma sanguíneo o células sanguíneas nucleadas respectivamente [63, 64]. Al menos tres estudios han correlacionado el ARN viral plasmático con la gravedad de la enfermedad para el HCPS y el HFRS, sugiriendo que la replicación del virus juega un papel continuo y en tiempo real en la patogénesis viral [65] [66] [67]. Se han identificado varios cambios patológicos distintivos que ocurren tanto en el HFRS como en el HCPS. Una característica crítica de ambos es una fuga capilar transitoria (~ 1-5 días) que involucra el La fuga resultante es de carácter exudativo, con una composición química alta en proteínas y similar al plasma. La experiencia continua que indica el fuerte tropismo tisular para las células endoteliales, específicamente, es uno de los varios factores que hacen de la integra β3 un candidato especialmente atractivo como un importante receptor in vivo para los hantavirus. Es probable que los hantavirus lleguen a sus tejidos objetivo a través de la captación por los ganglios linfáticos regionales, tal vez con o dentro de un histiocito pulmonar escoltante. Las semillas del virus endotelio local, donde las primeras células infectadas dan lugar, en última instancia, a una viremia primaria, un proceso que parece tomar mucho tiempo para las infecciones por hantavirus [62, 63]. En el momento en que emerge la viremia secundaria, los agentes de las formas más severas de HFRS y HCPS han comenzado a alcanzar una masa suficiente para inducir, a través de las interacciones PAMP-PRR y otros medios, la expresión de citoquinas proinflamatorias [64]. Para HCPS, esa expresión favorece el lecho pulmonar y los órganos linfoides, pero, por razones desconocidas, ahorra el retroperitoneo y, en general, el riñón. En HFRS la situación se invierte, y sin embargo no se aprecia a menudo que el esperado tropismos tisulares preferentes de virus asociados a HFRS y sus contrapartes asociadas a HCPS para los lechos renal y pulmonar, respectivamente, no es como se predeciría a través de las manifestaciones de las dos enfermedades. La elaboración local de mediadores inflamatorios y quimiotácticos se considera un requisito para el desarrollo de Sin embargo, no es la hipoxemia, debido al edema pulmonar prominente, lo que conduce a la muerte en la mayoría de los casos fatales de HCPS, sino más bien la intoxicación del corazón por mediadores como aún no definidos, lo que conduce al estado de bajo gasto cardíaco y al síndrome de shock asociado [64, 65]. Es tentador especular que los mediadores producidos en el pulmón en conexión con el infiltrado inflamatorio pueden infiltrarse a través de la circulación coronaria con dilución mínima en HCPS, consecuencia desventajosa de la estrecha yuxtaposición anatómica de los dos órganos. Así, al menos tres clases de mecanismos potenciales, algunos superpuestos y todos ciertamente no exclusivos de los otros, podrían presumirse que subyacen a la patogénesis del HCPS. Estos incluyen:(1) Mecanismos inmunes innatos. La naturaleza de las interacciones entre los patrones moleculares asociados al patógeno del hantavirus (PAMP) y los receptores de reconocimiento del patrón (PRR) de las células endoteliales susceptibles comienzan a ser aclaradas. El HTNV prototípico parece ser reconocido por TLR-3 [43]. Tal infección tiene consecuencias tales como una mayor expresión del HLA-DR en las células dendríticas [66] y la diferenciación de los monocitos hacia las células dendríticas [67]. (2) Efectos virales directos. La correlación observada entre la carga viral y la gravedad de la enfermedad deja abierta la posibilidad de que las partículas del hantavirus o el ARN puedan tener efectos tóxicos sobre las células o sobre la señalización. Algunos investigadores han favorecido la toxicidad viral directa, actuando a través de la inhibición de la función de barrera celular endotelial, como una explicación de gran parte de la fuga capilar, aunque existe Una pista potencialmente importante hacia el mecanismo por el cual las infecciones por hantavirus agotan las plaquetas sanguíneas y, en algunos casos, causan manifestaciones hemorrágicas, fue avanzada por el reciente descubrimiento de que los hantavirus patógenos son capaces de reclutar plaquetas para adherirse a las superficies celulares endoteliales, con β3 integrina utilizada como elemento de unión crítica [69]. (3) Efectos patógenos causados por las actividades de macromoléculas virales específicas. Hemos revisado algunas de las actividades asociadas con los Gn, Gc y N, polipéptidos codificados viralmente en secciones anteriores. Modelos de prueba de patogénesis se pueden hacer más eficazmente cuando hay un modelo animal que imita aspectos clave de la enfermedad. No existe un modelo similar al HFRS, pero existen modelos animales para el transporte asintomático de PUUV y SNV por sus roedores portadores nativos, el banco vole Myodes glareolus y el ratón de venado P. maniculatus; así como un modelo de hámster sirio utilizando ANDV o el virus Aporal relacionado de Venezuela, para el cual se observa una enfermedad mimética HCPS [70] [71] [72] [73]. El modelo de hámster ANDV-Sirio tiene una serie de características en común con la enfermedad humana, así como algunas diferencias. A diferencia de las enfermedades neurológicas que han sido posibles de provocar con HTNV, el modelo de hámster para HCPS parece ser causado por fugas capilares que resultan en edema pulmonar y la producción de un derrame pleural con características exuda Típicamente los hámsteres mueren entre 11 y 14-d post-inoculación, reflejando un período de incubación ligeramente acelerado en comparación con las infecciones humanas. Al igual que con el HCPS humano, el examen microscópico del pulmón revela abundante deposición de fibrina, septo alveolar engrosado y antígeno viral expresado abundantemente en el endotelio microvascular. Los hámsteres infectados por ANDV equipados con dispositivos de monitoreo fisiológico mostraron disminución de las presiones de pulso, taquicardia e hipotensión que parecen imitar de cerca el shock que se cree que es la causa próxima de la muerte en pacientes que sucumben al HCPS [65, 74]. En comparación con la enfermedad humana, los hámsteres infectados por ANDV exhiben títulos excepcionalmente altos de ANDV vivo en sus tejidos, con gran parte de la replicación viral que ocurre en Los títulos de ANDV vivo en algunos casos superan los 10 8 /g, mientras que los aislados de hantavirus de los tejidos humanos han sido notoriamente difíciles de obtener. A pesar de la aparición universal de enzimas hepáticas levemente elevadas en pacientes con HCPS, las enzimas hepáticas no parecen estar presentes en niveles elevados en la sangre de hámsters enfermos incluso inmediatamente antes de la muerte [75]. El período prolongado de incubación asociado con la enfermedad por hantavirus da al huésped un tiempo considerable para montar una respuesta inmune madura contra el virus. Así, en contradición a infecciones de gravedad comparable y sintomatología relacionada asociada con arenavirus y filovirus, las infecciones por hantavirus en humanos se asocian con respuestas anticuerpos de título significativo por el momento en que comienzan los síntomas. A pesar de esta observación, parece ser posible que la variación natural en las respuestas individuales de anticuerpos neutralizantes entre los pacientes con infecciones por NVS pueda estar relacionada con la gravedad de la enfermedad, lo que sugiere que la administración de anticuerpos antivirales podría resultar efectiva terapéuticamente [76]. En el caso de la infección por ANDV, han surgido nuevas evidencias que indican que el aparente aclaramiento del virus de la sangre no resulta en la eliminación completa del estímulo antigénico por el virus, sugiriendo que el virus puede persistir, tal vez en algún sitio inmunológicamente privilegiado aún indeterminado [77]. Un papel para las respuestas patológicas mediadas por células T en el HFRS y el HCPS ha sido la fuente de especulación por una variedad de razones. La gravedad del SNS asociado al SNCP puede haber hecho más evidente que el inicio del edema pulmonar, la taquicardia y la hipertensión parecía estar todo, pero universalmente asociado temporalmente, con la aparición de un espectro de células altamente activadas del linaje linfoide en la sangre periférica. Se detectaron células con similitudes morfológicas cercanas a estos -inmunoblastos- en los pulmones congestionados y pesados de los pacientes que llegaron a la autopsia, así como en órganos linfoides y en las tríadas portal [63, [78] [79] [80]. Estas observaciones llevaron a especular que algún componente de la patogénesis por hantavirus podría estar vinculado a la aparición de células T antivirales que podrían estimular o contribuir a la aparición de una -tormenta de mediadores y el fenotipo de fuga capilar asociado. Estudios posteriores han confirmado la expectativa de que una fracción significativa de la población de inmunoblastos en pacientes con HCPS son células T con especificidad para epitopes específicos de antígenos virales de clase I presentados por el HLA, incluyendo Gn, Gc y N [77, [81] [82] [83]. Presumiblemente, las actividades antivirales de estas células, manifestadas en parte por su elaboración de mediadores en el intersticio afectado, pueden contribuir a la fuga endotelial/capilar que se encuentra en el corazón de la patogénesis del hantavirus. Debido a que los primeros casos de HCPS a menudo llegaron a la autopsia, se hizo posible examinar tejidos necropsiados para la expresión de citocinas. El estudio de Mori et al. (1999) revelaron una alta expresión relativa de citocinas proinflamatorias incluyendo TNF-, IL-1-, IL-6, proporcionando evidencia a favor de un modelo de tormenta de citoquinas para la patogénesis [64]. Los autores creían, basándose en la morfología de las células secretadoras de citoquinas, que tanto monocitos como linfocitos estaban contribuyendo a la producción de citocinas. Que los mediadores proinflamatorios se encuentran en niveles elevados en el plasma, así como el intersticio renal de pacientes con enfermedad hantaviral aguda se ha reconocido desde hace algún tiempo también [84, 85]. Si bien el diagnóstico de HCPS y HFRS se realiza mejor con serología IgM, en la etapa aguda de la infección por NVS, también se puede utilizar RT-PCR si se utilizan células sanguíneas o coágulos de sangre en lugar de plasma o suero, donde la sensibilidad incluso utilizando imprimaciones PCR anidadas disminuye a cerca del 70% [86] [87] [88]. En una instalación en la que se tratan muchos casos de HCPS, el centro médico de la Universidad de Nuevo México en Albuquerque, se ha ofrecido un servicio de diagnóstico en el que se analizan los hallazgos hematológicos del paciente para establecer la probabilidad de que un paciente tenga HCPS. La combinación de trombocitopenia, abundancia elevada de linfocitos -inmunoblasto-, población de células polimorfonucleares con desplazamiento izquierdo sin evidencia morfológica fuerte para su activación, y valores elevados de hemoglobina o hematocrito es altamente específica para el HCPS y permite a los clínicos la capacidad de poner pacientes presuntivos-HCPS en oxigenación de membrana extracorpórea (ECMO), que se cree que ha salvado a muchos pacientes de un resultado letal [89]. Se cree que la infección humana por hantavirus sigue el contacto con secreciones o excreciones producidas por roedores infectados. En los Estados Unidos, 538 infecciones humanas por hantavirus fueron reportadas hasta finales de diciembre de 2009 [90], con Nuevo México, Arizona y Colorado mostrando los casos más altos. Mientras que el prototípico hantavirus centroamericano en América Central fue el virus Rio Segundo de Reithrodontomys mexicanus de Costa Rica, la primera enfermedad humana apareció algunos años más tarde en Panamá, donde el virus Choclo (CHOV) surgió como el agente etiológico y se cree que es responsable de todos los casos conocidos de HCPS. La rata de arroz pigmeo fulvo Oligoryzomys fulvescens ha sido identificada como el reservorio de roedores [91]. En Panamá, los primeros casos de HCPS, aunque con poca o ninguna implicación cardiaca evidente, fueron reportados en 1999, y desde entonces, 106 infecciones humanas han ocurrido con una tasa de mortalidad del 26% [92]. Seroencuestas de mamíferos en México y Costa Rica han encontrado anticuerpos antihantavirus [93] [94] [95] [96], y se han notificado seroprevalencias que oscilan entre 0,6 y 1,6% en poblaciones humanas a pesar de la ausencia de casos conocidos de HCPS [97]. En América del Sur, los casos de HCPS se han identificado en Argentina, Bolivia, Brasil, Chile, Paraguay y Uruguay, y también se han notificado evidencias de exposición humana a hantavirus en Venezuela [98] y Perú [99]. En América del Sur, ANDV es el principal agente etiológico con casos en Chile y Argentina notificados desde 1995. En Chile, se han producido 671 casos de HCPS debido a ANDV durante el período 2001-2009 [100]. Desde 1995 se han reportado más de 1.000 casos de HCPS en Argentina [101] ; en el Brasil se han identificado aproximadamente 1.100 casos de HCPS entre 1993 y 2008 [102]. Las tasas de mortalidad por casos en esos tres países han sido similares, oscilando entre el 30% (Argentina), el 36% (Chile) y el 39% (Brasil). Las infecciones por Hantavirus ocurren con más frecuencia en hombres que en mujeres, aunque la proporción entre hombres y mujeres es muy variable. Por ejemplo, las comunidades panameñas mostraron una proporción de 55 hombres por 45 mujeres [103], mientras que en Chile la proporción es más sesgada por hombres (71%) [104]. En el Chaco paraguayo la proporción entre hombres y mujeres se aproxima al 50% [105]. En América del Norte, en diciembre de 2009 el 63% de los pacientes eran varones [90]. Todos los grupos étnicos y raciales parecen ser susceptibles a infecciones por el hantavirus, y las diferencias entre ciertos grupos (como indígenas y no indígenas) están más probablemente correlacionadas con el tipo de hábitat en el que reside la población (por ejemplo, zonas rurales frente a zonas urbanas). De hecho, las comunidades rurales representan la mayor incidencia global del hantavirus y, por lo tanto, están en mayor riesgo [92, [105] [106] [107] [108] [109] [109] [119], aunque también se ha destacado la importancia de los entornos peridomésticos como una importante zona de exposición [112, 113]. El principal mecanismo por el que los seres humanos adquieren la infección por el hantavirus es la exposición a aerosoles de heces contaminadas de roedores, orina y saliva [114, 115]. Esto puede ocurrir cuando los seres humanos residen en áreas cercanas a las que habitan los roedores, viven en áreas infestadas de roedores, o cuando los roedores invaden entornos humanos, que son más frecuentes en hábitats rurales.Existe una larga historia de coexistencia humana con roedores, lo que plantea dudas sobre el aparente aumento reciente de las enfermedades relacionadas con el hantavirus, especialmente el HCPS. Aparte de una aparente asociación con eventos de oscilación sureña de El Niño (ENSO) en algunas regiones [116, 117], los recientes incrementos en la incidencia del HCPS no parecen seguir un patrón temporal o espacial fácilmente definido. Sin embargo, algunas características del paisaje, como la fragmentación del hábitat o las áreas perturbadas por el ser humano, pueden influir en la dinámica de la población de roedores e impactar en la incidencia viral [118] [112] [112] [121]. A pesar de la estocástica asociada a la contracción de la infección Las actividades humanas en edificios mal ventilados que pulverizan partículas que luego se inhalan (es decir, limpieza, agitación de alfombras, polvo) se identifican con frecuencia entre los pacientes admitidos para el SHCPS [11, 122]. Se cree que las actividades al aire libre transmiten un menor riesgo debido a la labilidad de los hantavirus a la radiación UV y a la supuesta tendencia a dispersarse en el viento, aunque ciertas condiciones ambientales parecen mantener el virus durante períodos más largos fuera de su huésped natural, lo que permite la transmisión indirecta [123]. Una vía alternativa pero poco común de transmisión del virus es la mordedura de roedores [124] [125] [126]. Los trabajadores sobre el terreno que manipulan mamíferos corren un riesgo potencialmente mayor de exposición a infecciones por hantavirus, aunque cuando se cuantifica a través de serosurveys el riesgo absoluto parece bastante leve [127]. Un nuevo estudio en Colorado sugiere la posibilidad de que una picadura de roedor haya sido el vehículo próximo para la transmisión al aire libre de NVS [128], lo que vuelve a enfatizar el uso de equipo de protección personal durante las actividades de trabajo de campo [129]. Como caso particular dentro de los hantavirus, la transmisión de persona a persona ha sido documentada exclusivamente para el virus de los Andes sudamericanos [130] [133] [133] [135]. La identificación de esta vía de transmisión se ha hecho utilizando tanto herramientas moleculares como encuestas epidemiológicas, pero el mecanismo de transmisión interpersonal no está bien establecido. Curiosamente, ANDV también puede ser derramado por los humanos a través de otros fluidos biológicos como la orina [136], ilustrando las propiedades particulares que diferencian este virus de otros hantavirus. Aunque la transmisión interpersonal parece ser única para ANDV, el ARN viral de PUUV se ha detectado en la saliva de pacientes con HFRS, y algunos pacientes con SNV-HCPS tienen ARN viral en las secreciones traqueales [88, 137]. Los Hantavirus en las Américas son alojados naturalmente por roedores (Muridae y Cricetidae) así como las musarañas (Soricidae) y los lunares (Talpidae) (Figura 1). Tres especies de musgo y un mole han sido reportados para albergar hantavirus y su patogenicidad para los humanos permanece desconocida [22, 138, 139]. Se han identificado al menos 15 especies de roedores como portadores de diferentes hantavirus patógenos, con algunos genotipos sudamericanos como Castelo do Sonhos (CDSV) o Hu39694 sólo identificados después de infecciones humanas (Figura 1 ). Los hantavirus suelen mostrar una alta especificidad de especie y ningún huésped intermedio [140]. Sin embargo, se han descrito algunos genotipos de hantavirus en la misma especie de roedores. Tal es el caso de Playa de Oro (OROV) y Catacamas (CATV) identificados en Oryzomys couesi [141, 142], o Maporal (MAPV) y Choclo (CHOV) hospedados por O. fulvescens [91, 143]. En América del Norte se han detectado virus de muleshoe y Black Creek Canal hanta en sigmodon hispidus [ Además, un genotipo de hantavirus (por ejemplo, el virus similar a Juquitiba) puede ser transportado por más de una especie de roedores (O. nigripes, Oxymycterus judex, Akodon montesis). Otro ejemplo es el virus Laguna Negra (LANV) que después de ser identificado en Calomys laucha [146] también ha sido reportado en C. callosus [147]. El rápido aumento en el descubrimiento de nuevos hantavirus y la identificación de sus anfitriones no parece probable que termine tan pronto como se examinen nuevas especies pequeñas de mamíferos [95]. Este tema se complica por la continua controversia en los criterios para la clasificación de distintos hantavirus [148, 149], que también está vinculado a la clasificación taxonómica y los reordenamientos taxonómicos. La transmisión de especies cruzadas es un proceso importante durante la propagación, aparición y evolución Particularmente dentro de los hantavirus, los derrames a los huéspedes secundarios se identifican cada vez más a medida que se realizan estudios más extensos [151] [152] [153] [155] [156]. Por ejemplo, ANDV es el agente etiológico predominante del HCPS en América del Sur, y O. longicaudatus el principal reservorio de roedores. Derrama en al menos otras cuatro especies de roedores que coocurren con el reservorio se han identificado, con Abrothrix longipilis mostrando la segunda mayor prevalencia de anticuerpos de ANDV, y actualmente no hay duda de que el virus es extremadamente similar genéticamente entre los dos roedores del huésped [157, 158]. En América del Norte, el derrame del virus Bayou (BAYV) puede haber ocurrido desde el reservorio principal de O. palustris a S. hispidus, R. fulvescens, P. leucopus y B. taylori [159] [160] [161]. Es más probable que el derrame del virus Hanta se produzca con poblaciones de acogida que habitan regiones simpatricas o sintópicas [151, 162], y la transmisión de especies cruzadas tendría probablemente mayores posibilidades de éxito si las especies anfitrionas están estrechamente relacionadas [163]. Se encuentra una excepción interesante entre el virus Oxbow (OXBV) y el virus Asama (ASAV) en el que un proceso de cambio de huésped parecía haber ocurrido entre mamíferos pertenecientes a dos familias (Talpidae y Soricidae), probablemente como resultado de la codivergencia alterna y recurrente de ciertos tax Los hantavirus son transmitidos horizontalmente entre roedores y no son transmitidos por artrópodos (a diferencia de otros virus de la familia Bunyaviridae). La infección por derrapadores a mamíferos no humanos generalmente no produce ninguna transmisión hacia adelante (o a fin de morir), pero si los seres humanos están infectados pueden resultar en una alta morbilidad y mortalidad [122, 164]. Durante la primavera de 1993, un brote de pacientes con HCPS debido a SNV ocurrió en los estados de Four Corners, resultando en más del 60% de casos de mortalidad entre los casos iniciales, muchos de los cuales involucran a miembros de la tribu Navajo [12, 121]. En Panamá, se notificó un brote durante 1999-2000 en Los Santos, y 12 casos donde se identificaron con tres muertes [165, 166]. Esto representó el primer informe de infecciones por hantavirus humanos en América Central. En América del Sur, Diecisiete individuos fueron identificados con anticuerpo NVS (ELISA) o fueron antígenos (HCI) positivos de 52 casos sospechosos [167]. En 1996 ocurrieron brotes mayores debidos a ANDV en el sur de Argentina [131, 134] ; en el sur de Chile se presentaron grupos de pacientes con enfermedad por hantavirus en 1997 [158]. En Brasil, el primer brote fue identificado en la Amazonía Brasileña (Estado de Maranhão) en el año 2000, e involucró pequeños pueblos que resultaron en una prevalencia del 13,3% de los evaluados (398 residentes totales) [168]. Los factores que desencadenan los brotes de hantavirus todavía son mal entendidos, probablemente porque resultan de varias características bióticas y abióticas interactuantes cuyos parámetros clave son difíciles de modelar. Sin embargo, el uso de nuevos enfoques de modelado que involucran características geográficas y ambientales parece ser prometedor a la hora de predecir posibles brotes de hantavirus y/o áreas de mayor riesgo [169] [170] [171] [172]. Debido a que se sabe que los hantavirus se transmiten directamente de los huéspedes infectados a los susceptibles, el primer enfoque natural es relacionar los brotes con la ecología de los huéspedes virales. La transmisión y persistencia del hantavirus en las poblaciones de roedores depende de varios factores que interactúan para afectar la dinámica ecológica del huésped, que a su vez está fuertemente influenciada por las características de comportamiento de las especies de roedores individuales, a la estructura paisajística y a las características ambientales [173, 174]. La transmisión viral depende de las tasas de contacto entre los huéspedes sensibles, y a pesar de la noción prevaleciente de que un aumento de la densidad se encuentra y, por lo tanto, de Además, se ha demostrado que la transmisión de NVS sigue un patrón de heterogeneidad de contacto, donde los individuos de la población tienen diferentes probabilidades de transmitir la infección [176]. La comprensión de la transmisión viral resulta ser mucho más compleja cuando especies distintas del principal huésped del reservorio se incorporan en el modelo. De hecho, estudios recientes han demostrado que la mayor diversidad de especies hospedantes está correlacionada con una menor prevalencia de infección en América del Norte para P. maniculatus [177], en América Central para O. fulvescens (reservorio del virus Choclo) y Zygodontomys brevicauda (reservorio del virus Calabazo) [178], y en América del Sur para Akodon montensis (reservorio del virus Jabora) [162]. Las tasas de contacto varían según la distribución espacial de las poblaciones y parecen estar Por ejemplo, la prevalencia de SNV en P. maniculatus fue mayor en paisajes con mayor grado de fragmentación del hábitat preferido [179]. Además, ciertas propiedades del paisaje como elevación, pendiente y cubierta terrestre parecen ser útiles para detectar áreas con infecciones persistentes de SNV, y por lo tanto se consideran áreas refugiales donde el virus puede mantenerse durante años [169]. Los cambios en el entorno natural de las especies de reservorios, como la fragmentación forestal y la pérdida de hábitat, pueden alterar la abundancia y distribución de la población y provocar brotes de hantavirus, como se observa en la Península de Azurero de Panamá [118, 119]. Además, las diferencias en el microhábitat, incluida la cubierta superficial, pueden conducir a diferencias en la dinámica ecológica dentro de las poblaciones y afectar a la tasa de exposición al virus [180]. Se han encontrado diferencias en las infecciones por hantavirus a través de paisajes contrastantes en el intervalo latitudinal en poblaciones de roedores de O. longicaudatus en Chile, lo que sugiere que los seres humanos están expuestos de manera diferencial al virus [107, 181]. La dinámica poblacional de roedores se ve afectada por cambios estacionales de clima y clima [182, 183]. En el caso de los brotes asociados a ENSO, se ha postulado una compleja cascada de eventos desencadenados por lluvias altamente inusuales en el año precedente para dar lugar a un aumento de la producción primaria y densidades de roedores, aumentando también la probabilidad de transmisión del virus a los seres humanos, pero ha resultado difícil demostrar con precisión los eventos intermedios sugeridos, como el aumento de las densidades de roedores en el aumento de la carga de casos [116, 121, 184]. En América del Sur, los efectos del cambio climático y los brotes de hantavirus no han sido bien estudiados, a pesar del conocimiento de que varias especies de roedores que son reservorios de enfermedades emergentes se han visto dramáticamente afectadas por eventos como El Niño [185]. Los cambios en la dinámica de la población de acogida también se ven afectados por la estacionalidad, lo que puede conducir a brotes de enfermedades cuando se interrumpen los procesos que equilibran las poblaciones de roedores de temporada en temporada [186]. La emergencia viral puede seguir promoviéndose a medida que los cambios introducidos por el ser humano continúan aumentando en el medio ambiente a diferentes escalas geográficas. Estos cambios también pueden alterar la estructura y dinámica de la población de roedores e interacciones interespecies creando condiciones que pueden conducir a brotes virales, establecimiento viral en nuevos hospederos, y la aparición de HCPS [102, 162], incluso con aparentemente leve perturbación ecológica al sistema virus-hospedero [188]. Ciertas características fisiopatológicas, incluyendo trombocitopenia y shock, de enfermedades por hantavirus de los seres humanos, tienen similitud sustancial con las fiebres hemorrágicas inducidas por otros virus tales arenavirus, filovirus y flavivirus, a pesar de compartir esencialmente ninguna secuencia similitud con ellos. Tales observaciones plantean preguntas acerca de si tales similitudes en la patogénesis son probables similitudes de fenotipo, o en cambio reportan la presencia de mecanismos moleculares comunes entre los virus. En esta revisión se discuten las propiedades generales, descubrimientos y epidemiología/ecología de las formas de hantavirus patógenos del Nuevo Mundo, y también se busca identificar algunas de las características de las macromoléculas virales y mecanismos inmunológicos que se han propuesto como potenciales mediadores directos de los eventos patógenos que caracterizan la enfermedad humana HCPS. Si bien es poco probable que la expresión de una proteína viral particular o ARNs en aislamiento se pueda confiar en replicar fenotipos clave de infección por el virus completo, algunos de los hallazgos han sido suficientemente consistentes con lo que se conoce de la patogénesis in vivo que ofrecen plomos plausibles de primer paso en la búsqueda de objetivos terapéuticos. Esperamos con interés las revelaciones mecanísticas que seguirán el uso inevitablemente ampliado de métodos poderosos como la secuenciación profunda, imágenes cada vez más avanzadas, y métodos microscópicos, y modelos animales que por fin se pueden decir

¿Qué virus de ARN patógenos son hospedados por pequeños mamíferos?

Los hantavirus en las Américas y su papel como patógenos emergenteshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3185593/SHA: efe13a8d42b60ef9f7387ea539a1b2eeb5f80101Autores: Hjelle, Brian; Torres-Pérez, FernandoFecha: 2010-11-25DOI: 10.3390/v2125559Licencia: cc-byAbstract: La continua aparición y reaparición de patógenos representan una amenaza continua, a veces mayor, para las poblaciones. Los hantavirus (familia Bunyaviridae) y sus enfermedades humanas asociadas se consideraron confinados a Eurasia, pero la aparición de un brote en el suroeste de Estados Unidos llevó a un gran aumento en su estudio entre los virólogos de todo el mundo. Se han descrito más de 40 genotipos hantavirales, la gran mayoría desde 1993, y casi la mitad de ellos patógenos para los seres humanos. Los hantavirus causan infecciones persistentes en sus reservorios, y en las Américas, la enfermedad humana se manifiesta como compromiso cardiopulmonar, síndrome cardiopulmonar del hantavirus (HCPS), con proporciones de casos-fatalidad, para los serotipos virales más comunes, entre el 30% y el 40%. Alteración del hábitat y trastornos ecológicos a mayor escala, tal vez incluyendo el cambio climático, son algunos de los factores que pueden haber aumentado la carga de casos humanos de HCPS entre 1993 y el presente. Consideramos aquí las características que influyen en la estructura de la dinámica de la población huésped que pueden conducir a brotes virales, así como los determinantes macromoleculares de los hantavirus que han sido considerados como potenciales contribuciones a la patogenicidad. Texto: Los patógenos emergentes causan enfermedades nuevas o no reconocidas anteriormente, y entre ellas, las zoonóticas emergentes son una preocupación importante entre los científicos que estudian enfermedades infecciosas a diferentes escalas espaciales y temporales [1, 2]. Los cambios en las condiciones bióticas y abióticas pueden alterar la dinámica de las enfermedades de la población y conducir a la aparición de infecciones zoonóticas [3] [5] [6]. Durante las últimas décadas, se han producido varios brotes de patógenos virales emergentes y reemergentes, que afectan tanto a la implicación puramente local como a nivel mundial/pandémica de las poblaciones humanas. Entre los ejemplos visibles están la gripe A, el virus del Ébola, el virus de la hepatitis C, el trastorno respiratorio grave para adultos (SARS), el coronavirus y el virus de la inmunodeficiencia humana, que desafían las medidas de prevención y control de los sistemas de salud pública [7]. En las Américas, el reciente brote de gripe pandémica A subtipo H1N1 se convirtió en un objetivo importante de control debido a su rápida propagación, y las incertidumbres en cuanto a virulencia y transmisibilidad, sin embargo, la disponibilidad de vacunas fue limitada cuando se produjo una actividad significativa antes de la temporada tradicional de gripe [8]. Sin embargo, en el último siglo han surgido o resurgido brotes de varias enfermedades virales relacionadas con el virus arenavirus y el virus del dengue, y más recientemente, hantavirus y la expansión del rango geográfico del virus del Nilo Occidental. Entre las enfermedades zoonóticas, los mamíferos pequeños son anfitriones de varios virus ARN patógenos, especialmente Arenaviridae y Bunyaviridae: Hantavirus [9] [10] [11]. Las infecciones por hantavirus se convirtieron en una preocupación en las Américas después de la descripción de un brote de distrés respiratorio agudo ocurrido en La enfermedad recientemente reconocida, el síndrome cardiopulmonar del hantavirus, el HCPS (o síndrome pulmonar del hantavirus), se relacionó con la infección por el virus del Sin Nombre (SNV) recién descubierto, y el roedor Peromyscus maniculatus (ratón venado) fue identificado como el reservorio [13]. Sin embargo, las infecciones por hantavirus tienen una historia mucho más larga. Una revisión de los escritos chinos antiguos, que datan de aproximadamente 960 dC, reveló descripciones muy parecidas a la fiebre hemorrágica con síndrome renal (HFRS), el síndrome causado por los hantavirus del Viejo Mundo [14]. Durante el siglo XX, los casos de enfermedad febril aguda con compromiso renal fueron descritos de varios países eurasiáticos y Japón, a menudo en asociación con compromisos militares [15]. El HFRS como síndrome distinto, sin embargo, fue llamado por primera vez a la atención de la medicina occidental en asociación con un brote que ocurrió entre las tropas de las Naciones Unidas durante el conflicto coreano entre 1951 y 1954, donde más de 3.200 soldados fueron afectados [16]. Tomó más de dos décadas hasta que el agente etiológico, el virus Hantaan (HTNV), fue aislado del ratón de campo rayado Apodemus agrarius, detectado en parte por la unión de anticuerpos de muestras de suero de paciente a los tejidos pulmonares de ratones de campo sanos y salvajes [17, 18]. El virus se encontró más tarde para representar la especie tipo de un nuevo género Hantavirus de la familia Bunyaviridae, aunque fue más tarde evidente que el primer hantavirus a aislarse fue el virus Thottapalayam de shrew-borne [19]. La categorización de los hantavirus como pertenecientes a la familia Bunyaviridae se debe en parte a la presencia consistente de tres genomas de ARN que son circularizados in vivo como resultado de la presencia de nucleótidos terminales complementarios que ayudan a doblar el genoma en una morfología -hairpin-, descrita por primera vez para el flebovirus Uukuniemi [19, 20]. La Tabla 1 es una lista de los hantavirus patógenos predominantemente distintos serológicamente. Se describen muchos otros genotipos llamados, pero tales otras formas patogénicas están generalmente estrechamente relacionadas con los Andes o, en algunos casos, el virus Sin Nombre. Durante la maduración del virus, el precursor forma GPC se procesa utilizando una proteasa unida a la membrana en Gn y Gc, una escisión que ocurre, y parece ser señalada, después de la señal péptida conservada WAASA en la C-terminal de Gn [24]. Aunque las dos proteínas se pueden expresar de forma independiente a través de la transfección, pueden ser retenidas en el compartimento celular incorrecto (ER o aggrosome); por lo tanto, deben ser co-expresadas para permitirles estabilidad para que las dos se puedan ensamblar correctamente en el Golgi [25, [27] [28]. Se han identificado varias actividades y propiedades para las glicoproteínas envolventes del hantavirus, incluyendo algunas características que se sospecha que están involucradas en la patogenicidad de los serotipos causantes de la enfermedad, una posibilidad que ha generado atención experimental. Las glucoproteínas son los ligandos conocidos o presuntos para al menos dos receptores celulares distintos, la cadena de integrina y el factor acelerador de la descomposición, o DAF [30, 31] ; con gC1qR/p32 también identificado como otro receptor de entrada potencial [32]. Comparaciones con la proteína E del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, llevaron a Tischler et al. a considerar la glicoproteína Gc como una proteína potencial de fusión de clase II, tal vez impartiendo actividad de fusión al virión, y esta hipótesis ha ganado apoyo en otros estudios [33, 34]. Se han identificado actividades adicionales con, o se afirma que están relacionadas con, Gn. Para muchos de estos estudios, una premisa subyacente ha sostenido que hay diferencias entre las glicoproteínas de hantavirus -patógenos en relación con virus en el género que se denominan Si bien es cierto que aún no ha sido posible vincular el virus de Prospect Hill (PHV) con la enfermedad humana, la ausencia de evidencia de su patogenicidad tal vez no debería equipararse con la evidencia de su ausencia. Sólo se podría considerar que el nivel de enfermedad (por ejemplo, letargo, fiebre, proteinuria y azotemia) asociado con la infección de primates no humanos por PHV no es significativamente diferente del registrado para los modelos de primates no humanos utilizando el virus conocido del patógeno Puumala (PUUV) [35, 36]. Para el propósito de esta discusión, presumiremos que los hantavirus apatogénicos son efectivamente apatogénicos. Mientras que algunos estudios han sugerido que las glicoproteínas Gn se dirigen más rápidamente a la vía ubiquitina-proteosoma que a las formas apatogénicas, otros han interpretado las diferencias en el manejo de las glicoproteínas Gn a través de las especies del hantavirus por el sistema ubiquitina-proteosomal como independientes de la patogenicidad [37] [38] [39]. Algunos investigadores han dirigido sus esfuerzos hacia la identificación de una capacidad diferencial, ya sea cinética o de magnitud absoluta, en la capacidad de los hantavirus patógenos y apatogénicos para provocar una respuesta del interferón en las células. Una premisa que surge es que las formas apatogénicas tenderían a inducir una respuesta innata anterior que haría más probable que el virus se limpiara rápidamente o se volviera menos competente en su replicación, a fin de evitar cualquier respuesta patológica en el huésped [4 La respuesta innata anti-hantavirus puede en algunos casos ser atribuida a la interacción viral como ligando de TLR-3, pero no en otros, y en las células endoteliales, no parece requerir más que la partícula viral misma, incluso cuando se introduce en forma replicante-incompetente [43, 44]. Proteínas y ARNm inducidos prominentemente por los hantavirus incluyen MxA e IFIT-1 (ISG-56) y otros incluyendo algunos con actividad antiviral conocida o sospechada. Esos hantavirus, a menudo cepas altamente patógenas, que no inducen una respuesta antiviral potente, se sospechan o se presume que tienen un (más) potente mecanismo de antagonismo interferón-vía en relación con otros virus, un mecanismo que actúa positivamente para prevenir que se forme una respuesta innata efectiva, al menos temprano en Sin embargo, se reportan algunos casos en los que los hantavirus altamente patógenos, tales como NVS, también son capaces de inducir la expresión de los ARNm del gen estimulado por interferón, incluso muy temprano en la infección, con proteínas ISG, como se esperaba, tardando más tiempo en aparecer en la célula [44]. Las actividades anti-interferón también se han atribuido a la proteína NSs que se puede elaborar en células infectadas por serotipos que codifican esta proteína [46]. Otros investigadores han examinado las actividades de las glucoproteínas del hantavirus y otras proteínas que podrían afectar directamente a algunos aspectos de la progresión patogénica asociada a la infección por hantavirus en humanos, tales como cambios en la permeabilidad vascular. Mientras que los primeros intentos de causar directamente aumentos en la permeabilidad de las monocapas endoteliales con partículas virales o infección viral fueron en gran medida decepcionantes, los hantavirus se han identificado como que afectan adversamente la migración endotelial sobre los sustratos y en la potenciación de la permeabilidad endotelial inducida por VEG-F [47, 48]. La proteína nucleocápsida o N más corta (+50 kD) es un componente estructural del nucleocápsido viral, junto con los segmentos de ARN viral genómico. Como proteína de unión al ARN que afecta a la horquilla del cabello de los segmentos genómicos con alta afinidad [49, 50], limita el acceso del ARN para alojar nucleasasas y ayuda a hacer que la replicación viral sea un proceso cerrado dentro del citoplasma. También actúa como una proteína de membrana periférica, al igual que la proteína L [51], una actividad que podría jugar un papel en su supuesta, pero aún no demostrada función como matriz [52]. Hasta hace poco, no se había apreciado que N tuviera una amplia variedad de otras actividades, algunas de las cuales pueden estar vinculadas, no sólo a los requisitos fundamentales de replicación, sino también a la interferencia con una serie de procesos intracelulares de la célula normal. Así, se ha propuesto una interacción entre el aminoterminal de la proteína N del hantavirus y la proteína celular Daxx, con la sugerencia de posibles consecuencias pro-apoptóticas [51]. N también se reporta que interactúa con microfilamentos actínicos, y la proteína SUMO-1 [53, 54]. Utilizando ensayos basados en el gen reportero, Connie Schmaljohn y sus colegas han reportado que la proteína nucleocapsida del virus Hantaan tiene un papel inhibidor en las respuestas inflamatorias mediadas por NF kappa B (NF- B). Los efectos sobre la expresión NF- B parecen estar limitados a la prevención de su translocación nuclear después de su intento de activación con lipopolisacárido, LPS [55]. En el citoplasma de las células infectadas, la proteína N se puede encontrar en los cuerpos celulares P donde secuestra y protege los capuchones de 5'. Puede localizar los capuchones a través de su interacción con DCP1, un componente clave de los cuerpos P. Durante la infección por hantavirus, los ARN virales se concentran en los cuerpos P, a través de su interacción con N y DCP1. La proteína N demuestra la protección preferencial de los ARNm diseñados para terminar prematuramente su proteína codificada en comparación con los ARNm nativos [56]. La proteína N se ha vinculado cada vez más a la replicación y traducción virales, a veces de maneras no previstas anteriormente. Se encuentra entre una familia creciente de diversas proteínas virales que pueden servir como un inespecífico - ARN chaperone ®, una actividad que debe facilitar el acceso de la L polimerasa al ARNv para la transcripción y replicación, en que puede disociar transitoriamente estructuras de ARN mal dobladas [57]. Algunos de los efectos de la proteína N en la traducción no pueden ser inmediatamente reconocidos como adaptables en la naturaleza. Puede reemplazar todo el complejo de iniciación traslacional EIF4F, presentando simultáneamente el ribosoma con un reemplazo de la actividad de unión de la tapa de eIF 4E, uniéndose al complejo de pre-iniciación 43S, al igual que eIF 4G, al tiempo que reemplaza la actividad helicoidal de eIF 4A, que se presume que es necesaria para disociar la estructura de ARN de orden superior [56, 58]. Estos tres factores normalmente trabajan juntos para lograr la iniciación traslacional. En los cuerpos P, la capacidad de la proteína N de unirse a una alta afinidad a los oligoribonucleótidos celulares nativos tapados, junto con su actividad en la protección de ARNs tapados de la degradación, probablemente facilita el acceso de oligonucleótidos encapsulados para su uso en la iniciación transcripcional por L polimerasa (-cap ra Tráfico de N para el ensamblaje viral: Clásicamente, la proteína N en las células infectadas parece estar agrupada o partículas en la naturaleza, con una concentración pesada en una única ubicación perinuclear, ampliamente considerada como la Golgi [27]. Las proteínas N de los hantavirus se encuentran en asociación con fracciones de partículas, y los estudios confocales microscopía y bioquímico-inhibidores han demostrado que las trazas N a lo largo de microtúbulos pero no con filamentos de actina [52]. El destino final de N, para su ensamblaje en partículas virales es la Golgi, y que circula allí a través del complejo intermedio retículo-Golgi endoplasmático (ERGIC), también conocido como cúmulo vesicular-tubular [52]. Un inhibidor negativo dominante, la dinamitina, asociado con el transporte mediado por Los estudios posteriores sugieren que la dependencia específica del transporte microtubular es específica de los hantavirus del Viejo Mundo como el NVH, pero que el Hantavirus del Nuevo Mundo ANDV está asociado con filamentos de actina [59]. Sin embargo, los datos recientes indican que el transporte microtubular es efectivamente utilizado para el NVH del Nuevo Mundo [60]. Las enfermedades del Hantavirus del hombre desde hace mucho tiempo han sido sospechosas de tener una base inmunopatógena en parte debido a su período de incubación relativamente largo de 2-3 semanas y la asociación temporal observada entre los trastornos inmunológicos y la primera aparición de signos y síntomas de la enfermedad del hantavirus. HFRS y HCPS comparten muchas características clínicas, llevando a muchos investigadores a considerar que son, en esencia, diferentes manifestaciones de un proceso patógeno similar, que difieren principalmente en los órganos objetivo primarios de expresión de la enfermedad (Tabla La patogénesis de las infecciones por hantavirus es el tema de una revisión continuamente actualizada en la serie UpToDate [61]. Para el momento en que aparecen los síntomas en el HCPS, ambas respuestas antivirales fuertes, y, para los genotipos virales más virulentos, el ARN viral puede ser detectado en plasma sanguíneo o células sanguíneas nucleadas respectivamente [63, 64]. Al menos tres estudios han correlacionado el ARN viral plasmático con la gravedad de la enfermedad para el HCPS y el HFRS, sugiriendo que la replicación del virus juega un papel continuo y en tiempo real en la patogénesis viral [65] [66] [67]. Se han identificado varios cambios patológicos distintivos que ocurren tanto en el HFRS como en el HCPS. Una característica crítica de ambos es una fuga capilar transitoria (~ 1-5 días) que involucra el La fuga resultante es de carácter exudativo, con una composición química alta en proteínas y similar al plasma. La experiencia continua que indica el fuerte tropismo tisular para las células endoteliales, específicamente, es uno de los varios factores que hacen de la integra β3 un candidato especialmente atractivo como un importante receptor in vivo para los hantavirus. Es probable que los hantavirus lleguen a sus tejidos objetivo a través de la captación por los ganglios linfáticos regionales, tal vez con o dentro de un histiocito pulmonar escoltante. Las semillas del virus endotelio local, donde las primeras células infectadas dan lugar, en última instancia, a una viremia primaria, un proceso que parece tomar mucho tiempo para las infecciones por hantavirus [62, 63]. En el momento en que emerge la viremia secundaria, los agentes de las formas más severas de HFRS y HCPS han comenzado a alcanzar una masa suficiente para inducir, a través de las interacciones PAMP-PRR y otros medios, la expresión de citoquinas proinflamatorias [64]. Para HCPS, esa expresión favorece el lecho pulmonar y los órganos linfoides, pero, por razones desconocidas, ahorra el retroperitoneo y, en general, el riñón. En HFRS la situación se invierte, y sin embargo no se aprecia a menudo que el esperado tropismos tisulares preferentes de virus asociados a HFRS y sus contrapartes asociadas a HCPS para los lechos renal y pulmonar, respectivamente, no es como se predeciría a través de las manifestaciones de las dos enfermedades. La elaboración local de mediadores inflamatorios y quimiotácticos se considera un requisito para el desarrollo de Sin embargo, no es la hipoxemia, debido al edema pulmonar prominente, lo que conduce a la muerte en la mayoría de los casos fatales de HCPS, sino más bien la intoxicación del corazón por mediadores como aún no definidos, lo que conduce al estado de bajo gasto cardíaco y al síndrome de shock asociado [64, 65]. Es tentador especular que los mediadores producidos en el pulmón en conexión con el infiltrado inflamatorio pueden infiltrarse a través de la circulación coronaria con dilución mínima en HCPS, consecuencia desventajosa de la estrecha yuxtaposición anatómica de los dos órganos. Así, al menos tres clases de mecanismos potenciales, algunos superpuestos y todos ciertamente no exclusivos de los otros, podrían presumirse que subyacen a la patogénesis del HCPS. Estos incluyen:(1) Mecanismos inmunes innatos. La naturaleza de las interacciones entre los patrones moleculares asociados al patógeno del hantavirus (PAMP) y los receptores de reconocimiento del patrón (PRR) de las células endoteliales susceptibles comienzan a ser aclaradas. El HTNV prototípico parece ser reconocido por TLR-3 [43]. Tal infección tiene consecuencias tales como una mayor expresión del HLA-DR en las células dendríticas [66] y la diferenciación de los monocitos hacia las células dendríticas [67]. (2) Efectos virales directos. La correlación observada entre la carga viral y la gravedad de la enfermedad deja abierta la posibilidad de que las partículas del hantavirus o el ARN puedan tener efectos tóxicos sobre las células o sobre la señalización. Algunos investigadores han favorecido la toxicidad viral directa, actuando a través de la inhibición de la función de barrera celular endotelial, como una explicación de gran parte de la fuga capilar, aunque existe Una pista potencialmente importante hacia el mecanismo por el cual las infecciones por hantavirus agotan las plaquetas sanguíneas y, en algunos casos, causan manifestaciones hemorrágicas, fue avanzada por el reciente descubrimiento de que los hantavirus patógenos son capaces de reclutar plaquetas para adherirse a las superficies celulares endoteliales, con β3 integrina utilizada como elemento de unión crítica [69]. (3) Efectos patógenos causados por las actividades de macromoléculas virales específicas. Hemos revisado algunas de las actividades asociadas con los Gn, Gc y N, polipéptidos codificados viralmente en secciones anteriores. Modelos de prueba de patogénesis se pueden hacer más eficazmente cuando hay un modelo animal que imita aspectos clave de la enfermedad. No existe un modelo similar al HFRS, pero existen modelos animales para el transporte asintomático de PUUV y SNV por sus roedores portadores nativos, el banco vole Myodes glareolus y el ratón de venado P. maniculatus; así como un modelo de hámster sirio utilizando ANDV o el virus Aporal relacionado de Venezuela, para el cual se observa una enfermedad mimética HCPS [70] [71] [72] [73]. El modelo de hámster ANDV-Sirio tiene una serie de características en común con la enfermedad humana, así como algunas diferencias. A diferencia de las enfermedades neurológicas que han sido posibles de provocar con HTNV, el modelo de hámster para HCPS parece ser causado por fugas capilares que resultan en edema pulmonar y la producción de un derrame pleural con características exuda Típicamente los hámsteres mueren entre 11 y 14-d post-inoculación, reflejando un período de incubación ligeramente acelerado en comparación con las infecciones humanas. Al igual que con el HCPS humano, el examen microscópico del pulmón revela abundante deposición de fibrina, septo alveolar engrosado y antígeno viral expresado abundantemente en el endotelio microvascular. Los hámsteres infectados por ANDV equipados con dispositivos de monitoreo fisiológico mostraron disminución de las presiones de pulso, taquicardia e hipotensión que parecen imitar de cerca el shock que se cree que es la causa próxima de la muerte en pacientes que sucumben al HCPS [65, 74]. En comparación con la enfermedad humana, los hámsteres infectados por ANDV exhiben títulos excepcionalmente altos de ANDV vivo en sus tejidos, con gran parte de la replicación viral que ocurre en Los títulos de ANDV vivo en algunos casos superan los 10 8 /g, mientras que los aislados de hantavirus de los tejidos humanos han sido notoriamente difíciles de obtener. A pesar de la aparición universal de enzimas hepáticas levemente elevadas en pacientes con HCPS, las enzimas hepáticas no parecen estar presentes en niveles elevados en la sangre de hámsters enfermos incluso inmediatamente antes de la muerte [75]. El período prolongado de incubación asociado con la enfermedad por hantavirus da al huésped un tiempo considerable para montar una respuesta inmune madura contra el virus. Así, en contradición a infecciones de gravedad comparable y sintomatología relacionada asociada con arenavirus y filovirus, las infecciones por hantavirus en humanos se asocian con respuestas anticuerpos de título significativo por el momento en que comienzan los síntomas. A pesar de esta observación, parece ser posible que la variación natural en las respuestas individuales de anticuerpos neutralizantes entre los pacientes con infecciones por NVS pueda estar relacionada con la gravedad de la enfermedad, lo que sugiere que la administración de anticuerpos antivirales podría resultar efectiva terapéuticamente [76]. En el caso de la infección por ANDV, han surgido nuevas evidencias que indican que el aparente aclaramiento del virus de la sangre no resulta en la eliminación completa del estímulo antigénico por el virus, sugiriendo que el virus puede persistir, tal vez en algún sitio inmunológicamente privilegiado aún indeterminado [77]. Un papel para las respuestas patológicas mediadas por células T en el HFRS y el HCPS ha sido la fuente de especulación por una variedad de razones. La gravedad del SNS asociado al SNCP puede haber hecho más evidente que el inicio del edema pulmonar, la taquicardia y la hipertensión parecía estar todo, pero universalmente asociado temporalmente, con la aparición de un espectro de células altamente activadas del linaje linfoide en la sangre periférica. Se detectaron células con similitudes morfológicas cercanas a estos -inmunoblastos- en los pulmones congestionados y pesados de los pacientes que llegaron a la autopsia, así como en órganos linfoides y en las tríadas portal [63, [78] [79] [80]. Estas observaciones llevaron a especular que algún componente de la patogénesis por hantavirus podría estar vinculado a la aparición de células T antivirales que podrían estimular o contribuir a la aparición de una -tormenta de mediadores y el fenotipo de fuga capilar asociado. Estudios posteriores han confirmado la expectativa de que una fracción significativa de la población de inmunoblastos en pacientes con HCPS son células T con especificidad para epitopes específicos de antígenos virales de clase I presentados por el HLA, incluyendo Gn, Gc y N [77, [81] [82] [83]. Presumiblemente, las actividades antivirales de estas células, manifestadas en parte por su elaboración de mediadores en el intersticio afectado, pueden contribuir a la fuga endotelial/capilar que se encuentra en el corazón de la patogénesis del hantavirus. Debido a que los primeros casos de HCPS a menudo llegaron a la autopsia, se hizo posible examinar tejidos necropsiados para la expresión de citocinas. El estudio de Mori et al. (1999) revelaron una alta expresión relativa de citocinas proinflamatorias incluyendo TNF-, IL-1-, IL-6, proporcionando evidencia a favor de un modelo de tormenta de citoquinas para la patogénesis [64]. Los autores creían, basándose en la morfología de las células secretadoras de citoquinas, que tanto monocitos como linfocitos estaban contribuyendo a la producción de citocinas. Que los mediadores proinflamatorios se encuentran en niveles elevados en el plasma, así como el intersticio renal de pacientes con enfermedad hantaviral aguda se ha reconocido desde hace algún tiempo también [84, 85]. Si bien el diagnóstico de HCPS y HFRS se realiza mejor con serología IgM, en la etapa aguda de la infección por NVS, también se puede utilizar RT-PCR si se utilizan células sanguíneas o coágulos de sangre en lugar de plasma o suero, donde la sensibilidad incluso utilizando imprimaciones PCR anidadas disminuye a cerca del 70% [86] [87] [88]. En una instalación en la que se tratan muchos casos de HCPS, el centro médico de la Universidad de Nuevo México en Albuquerque, se ha ofrecido un servicio de diagnóstico en el que se analizan los hallazgos hematológicos del paciente para establecer la probabilidad de que un paciente tenga HCPS. La combinación de trombocitopenia, abundancia elevada de linfocitos -inmunoblasto-, población de células polimorfonucleares con desplazamiento izquierdo sin evidencia morfológica fuerte para su activación, y valores elevados de hemoglobina o hematocrito es altamente específica para el HCPS y permite a los clínicos la capacidad de poner pacientes presuntivos-HCPS en oxigenación de membrana extracorpórea (ECMO), que se cree que ha salvado a muchos pacientes de un resultado letal [89]. Se cree que la infección humana por hantavirus sigue el contacto con secreciones o excreciones producidas por roedores infectados. En los Estados Unidos, 538 infecciones humanas por hantavirus fueron reportadas hasta finales de diciembre de 2009 [90], con Nuevo México, Arizona y Colorado mostrando los casos más altos. Mientras que el prototípico hantavirus centroamericano en América Central fue el virus Rio Segundo de Reithrodontomys mexicanus de Costa Rica, la primera enfermedad humana apareció algunos años más tarde en Panamá, donde el virus Choclo (CHOV) surgió como el agente etiológico y se cree que es responsable de todos los casos conocidos de HCPS. La rata de arroz pigmeo fulvo Oligoryzomys fulvescens ha sido identificada como el reservorio de roedores [91]. En Panamá, los primeros casos de HCPS, aunque con poca o ninguna implicación cardiaca evidente, fueron reportados en 1999, y desde entonces, 106 infecciones humanas han ocurrido con una tasa de mortalidad del 26% [92]. Seroencuestas de mamíferos en México y Costa Rica han encontrado anticuerpos antihantavirus [93] [94] [95] [96], y se han notificado seroprevalencias que oscilan entre 0,6 y 1,6% en poblaciones humanas a pesar de la ausencia de casos conocidos de HCPS [97]. En América del Sur, los casos de HCPS se han identificado en Argentina, Bolivia, Brasil, Chile, Paraguay y Uruguay, y también se han notificado evidencias de exposición humana a hantavirus en Venezuela [98] y Perú [99]. En América del Sur, ANDV es el principal agente etiológico con casos en Chile y Argentina notificados desde 1995. En Chile, se han producido 671 casos de HCPS debido a ANDV durante el período 2001-2009 [100]. Desde 1995 se han reportado más de 1.000 casos de HCPS en Argentina [101] ; en el Brasil se han identificado aproximadamente 1.100 casos de HCPS entre 1993 y 2008 [102]. Las tasas de mortalidad por casos en esos tres países han sido similares, oscilando entre el 30% (Argentina), el 36% (Chile) y el 39% (Brasil). Las infecciones por Hantavirus ocurren con más frecuencia en hombres que en mujeres, aunque la proporción entre hombres y mujeres es muy variable. Por ejemplo, las comunidades panameñas mostraron una proporción de 55 hombres por 45 mujeres [103], mientras que en Chile la proporción es más sesgada por hombres (71%) [104]. En el Chaco paraguayo la proporción entre hombres y mujeres se aproxima al 50% [105]. En América del Norte, en diciembre de 2009 el 63% de los pacientes eran varones [90]. Todos los grupos étnicos y raciales parecen ser susceptibles a infecciones por el hantavirus, y las diferencias entre ciertos grupos (como indígenas y no indígenas) están más probablemente correlacionadas con el tipo de hábitat en el que reside la población (por ejemplo, zonas rurales frente a zonas urbanas). De hecho, las comunidades rurales representan la mayor incidencia global del hantavirus y, por lo tanto, están en mayor riesgo [92, [105] [106] [107] [108] [109] [109] [119], aunque también se ha destacado la importancia de los entornos peridomésticos como una importante zona de exposición [112, 113]. El principal mecanismo por el que los seres humanos adquieren la infección por el hantavirus es la exposición a aerosoles de heces contaminadas de roedores, orina y saliva [114, 115]. Esto puede ocurrir cuando los seres humanos residen en áreas cercanas a las que habitan los roedores, viven en áreas infestadas de roedores, o cuando los roedores invaden entornos humanos, que son más frecuentes en hábitats rurales.Existe una larga historia de coexistencia humana con roedores, lo que plantea dudas sobre el aparente aumento reciente de las enfermedades relacionadas con el hantavirus, especialmente el HCPS. Aparte de una aparente asociación con eventos de oscilación sureña de El Niño (ENSO) en algunas regiones [116, 117], los recientes incrementos en la incidencia del HCPS no parecen seguir un patrón temporal o espacial fácilmente definido. Sin embargo, algunas características del paisaje, como la fragmentación del hábitat o las áreas perturbadas por el ser humano, pueden influir en la dinámica de la población de roedores e impactar en la incidencia viral [118] [112] [112] [121]. A pesar de la estocástica asociada a la contracción de la infección Las actividades humanas en edificios mal ventilados que pulverizan partículas que luego se inhalan (es decir, limpieza, agitación de alfombras, polvo) se identifican con frecuencia entre los pacientes admitidos para el SHCPS [11, 122]. Se cree que las actividades al aire libre transmiten un menor riesgo debido a la labilidad de los hantavirus a la radiación UV y a la supuesta tendencia a dispersarse en el viento, aunque ciertas condiciones ambientales parecen mantener el virus durante períodos más largos fuera de su huésped natural, lo que permite la transmisión indirecta [123]. Una vía alternativa pero poco común de transmisión del virus es la mordedura de roedores [124] [125] [126]. Los trabajadores sobre el terreno que manipulan mamíferos corren un riesgo potencialmente mayor de exposición a infecciones por hantavirus, aunque cuando se cuantifica a través de serosurveys el riesgo absoluto parece bastante leve [127]. Un nuevo estudio en Colorado sugiere la posibilidad de que una picadura de roedor haya sido el vehículo próximo para la transmisión al aire libre de NVS [128], lo que vuelve a enfatizar el uso de equipo de protección personal durante las actividades de trabajo de campo [129]. Como caso particular dentro de los hantavirus, la transmisión de persona a persona ha sido documentada exclusivamente para el virus de los Andes sudamericanos [130] [133] [133] [135]. La identificación de esta vía de transmisión se ha hecho utilizando tanto herramientas moleculares como encuestas epidemiológicas, pero el mecanismo de transmisión interpersonal no está bien establecido. Curiosamente, ANDV también puede ser derramado por los humanos a través de otros fluidos biológicos como la orina [136], ilustrando las propiedades particulares que diferencian este virus de otros hantavirus. Aunque la transmisión interpersonal parece ser única para ANDV, el ARN viral de PUUV se ha detectado en la saliva de pacientes con HFRS, y algunos pacientes con SNV-HCPS tienen ARN viral en las secreciones traqueales [88, 137]. Los Hantavirus en las Américas son alojados naturalmente por roedores (Muridae y Cricetidae) así como las musarañas (Soricidae) y los lunares (Talpidae) (Figura 1). Tres especies de musgo y un mole han sido reportados para albergar hantavirus y su patogenicidad para los humanos permanece desconocida [22, 138, 139]. Se han identificado al menos 15 especies de roedores como portadores de diferentes hantavirus patógenos, con algunos genotipos sudamericanos como Castelo do Sonhos (CDSV) o Hu39694 sólo identificados después de infecciones humanas (Figura 1 ). Los hantavirus suelen mostrar una alta especificidad de especie y ningún huésped intermedio [140]. Sin embargo, se han descrito algunos genotipos de hantavirus en la misma especie de roedores. Tal es el caso de Playa de Oro (OROV) y Catacamas (CATV) identificados en Oryzomys couesi [141, 142], o Maporal (MAPV) y Choclo (CHOV) hospedados por O. fulvescens [91, 143]. En América del Norte se han detectado virus de muleshoe y Black Creek Canal hanta en sigmodon hispidus [ Además, un genotipo de hantavirus (por ejemplo, el virus similar a Juquitiba) puede ser transportado por más de una especie de roedores (O. nigripes, Oxymycterus judex, Akodon montesis). Otro ejemplo es el virus Laguna Negra (LANV) que después de ser identificado en Calomys laucha [146] también ha sido reportado en C. callosus [147]. El rápido aumento en el descubrimiento de nuevos hantavirus y la identificación de sus anfitriones no parece probable que termine tan pronto como se examinen nuevas especies pequeñas de mamíferos [95]. Este tema se complica por la continua controversia en los criterios para la clasificación de distintos hantavirus [148, 149], que también está vinculado a la clasificación taxonómica y los reordenamientos taxonómicos. La transmisión de especies cruzadas es un proceso importante durante la propagación, aparición y evolución Particularmente dentro de los hantavirus, los derrames a los huéspedes secundarios se identifican cada vez más a medida que se realizan estudios más extensos [151] [152] [153] [155] [156]. Por ejemplo, ANDV es el agente etiológico predominante del HCPS en América del Sur, y O. longicaudatus el principal reservorio de roedores. Derrama en al menos otras cuatro especies de roedores que coocurren con el reservorio se han identificado, con Abrothrix longipilis mostrando la segunda mayor prevalencia de anticuerpos de ANDV, y actualmente no hay duda de que el virus es extremadamente similar genéticamente entre los dos roedores del huésped [157, 158]. En América del Norte, el derrame del virus Bayou (BAYV) puede haber ocurrido desde el reservorio principal de O. palustris a S. hispidus, R. fulvescens, P. leucopus y B. taylori [159] [160] [161]. Es más probable que el derrame del virus Hanta se produzca con poblaciones de acogida que habitan regiones simpatricas o sintópicas [151, 162], y la transmisión de especies cruzadas tendría probablemente mayores posibilidades de éxito si las especies anfitrionas están estrechamente relacionadas [163]. Se encuentra una excepción interesante entre el virus Oxbow (OXBV) y el virus Asama (ASAV) en el que un proceso de cambio de huésped parecía haber ocurrido entre mamíferos pertenecientes a dos familias (Talpidae y Soricidae), probablemente como resultado de la codivergencia alterna y recurrente de ciertos tax Los hantavirus son transmitidos horizontalmente entre roedores y no son transmitidos por artrópodos (a diferencia de otros virus de la familia Bunyaviridae). La infección por derrapadores a mamíferos no humanos generalmente no produce ninguna transmisión hacia adelante (o a fin de morir), pero si los seres humanos están infectados pueden resultar en una alta morbilidad y mortalidad [122, 164]. Durante la primavera de 1993, un brote de pacientes con HCPS debido a SNV ocurrió en los estados de Four Corners, resultando en más del 60% de casos de mortalidad entre los casos iniciales, muchos de los cuales involucran a miembros de la tribu Navajo [12, 121]. En Panamá, se notificó un brote durante 1999-2000 en Los Santos, y 12 casos donde se identificaron con tres muertes [165, 166]. Esto representó el primer informe de infecciones por hantavirus humanos en América Central. En América del Sur, Diecisiete individuos fueron identificados con anticuerpo NVS (ELISA) o fueron antígenos (HCI) positivos de 52 casos sospechosos [167]. En 1996 ocurrieron brotes mayores debidos a ANDV en el sur de Argentina [131, 134] ; en el sur de Chile se presentaron grupos de pacientes con enfermedad por hantavirus en 1997 [158]. En Brasil, el primer brote fue identificado en la Amazonía Brasileña (Estado de Maranhão) en el año 2000, e involucró pequeños pueblos que resultaron en una prevalencia del 13,3% de los evaluados (398 residentes totales) [168]. Los factores que desencadenan los brotes de hantavirus todavía son mal entendidos, probablemente porque resultan de varias características bióticas y abióticas interactuantes cuyos parámetros clave son difíciles de modelar. Sin embargo, el uso de nuevos enfoques de modelado que involucran características geográficas y ambientales parece ser prometedor a la hora de predecir posibles brotes de hantavirus y/o áreas de mayor riesgo [169] [170] [171] [172]. Debido a que se sabe que los hantavirus se transmiten directamente de los huéspedes infectados a los susceptibles, el primer enfoque natural es relacionar los brotes con la ecología de los huéspedes virales. La transmisión y persistencia del hantavirus en las poblaciones de roedores depende de varios factores que interactúan para afectar la dinámica ecológica del huésped, que a su vez está fuertemente influenciada por las características de comportamiento de las especies de roedores individuales, a la estructura paisajística y a las características ambientales [173, 174]. La transmisión viral depende de las tasas de contacto entre los huéspedes sensibles, y a pesar de la noción prevaleciente de que un aumento de la densidad se encuentra y, por lo tanto, de Además, se ha demostrado que la transmisión de NVS sigue un patrón de heterogeneidad de contacto, donde los individuos de la población tienen diferentes probabilidades de transmitir la infección [176]. La comprensión de la transmisión viral resulta ser mucho más compleja cuando especies distintas del principal huésped del reservorio se incorporan en el modelo. De hecho, estudios recientes han demostrado que la mayor diversidad de especies hospedantes está correlacionada con una menor prevalencia de infección en América del Norte para P. maniculatus [177], en América Central para O. fulvescens (reservorio del virus Choclo) y Zygodontomys brevicauda (reservorio del virus Calabazo) [178], y en América del Sur para Akodon montensis (reservorio del virus Jabora) [162]. Las tasas de contacto varían según la distribución espacial de las poblaciones y parecen estar Por ejemplo, la prevalencia de SNV en P. maniculatus fue mayor en paisajes con mayor grado de fragmentación del hábitat preferido [179]. Además, ciertas propiedades del paisaje como elevación, pendiente y cubierta terrestre parecen ser útiles para detectar áreas con infecciones persistentes de SNV, y por lo tanto se consideran áreas refugiales donde el virus puede mantenerse durante años [169]. Los cambios en el entorno natural de las especies de reservorios, como la fragmentación forestal y la pérdida de hábitat, pueden alterar la abundancia y distribución de la población y provocar brotes de hantavirus, como se observa en la Península de Azurero de Panamá [118, 119]. Además, las diferencias en el microhábitat, incluida la cubierta superficial, pueden conducir a diferencias en la dinámica ecológica dentro de las poblaciones y afectar a la tasa de exposición al virus [180]. Se han encontrado diferencias en las infecciones por hantavirus a través de paisajes contrastantes en el intervalo latitudinal en poblaciones de roedores de O. longicaudatus en Chile, lo que sugiere que los seres humanos están expuestos de manera diferencial al virus [107, 181]. La dinámica poblacional de roedores se ve afectada por cambios estacionales de clima y clima [182, 183]. En el caso de los brotes asociados a ENSO, se ha postulado una compleja cascada de eventos desencadenados por lluvias altamente inusuales en el año precedente para dar lugar a un aumento de la producción primaria y densidades de roedores, aumentando también la probabilidad de transmisión del virus a los seres humanos, pero ha resultado difícil demostrar con precisión los eventos intermedios sugeridos, como el aumento de las densidades de roedores en el aumento de la carga de casos [116, 121, 184]. En América del Sur, los efectos del cambio climático y los brotes de hantavirus no han sido bien estudiados, a pesar del conocimiento de que varias especies de roedores que son reservorios de enfermedades emergentes se han visto dramáticamente afectadas por eventos como El Niño [185]. Los cambios en la dinámica de la población de acogida también se ven afectados por la estacionalidad, lo que puede conducir a brotes de enfermedades cuando se interrumpen los procesos que equilibran las poblaciones de roedores de temporada en temporada [186]. La emergencia viral puede seguir promoviéndose a medida que los cambios introducidos por el ser humano continúan aumentando en el medio ambiente a diferentes escalas geográficas. Estos cambios también pueden alterar la estructura y dinámica de la población de roedores e interacciones interespecies creando condiciones que pueden conducir a brotes virales, establecimiento viral en nuevos hospederos, y la aparición de HCPS [102, 162], incluso con aparentemente leve perturbación ecológica al sistema virus-hospedero [188]. Ciertas características fisiopatológicas, incluyendo trombocitopenia y shock, de enfermedades por hantavirus de los seres humanos, tienen similitud sustancial con las fiebres hemorrágicas inducidas por otros virus tales arenavirus, filovirus y flavivirus, a pesar de compartir esencialmente ninguna secuencia similitud con ellos. Tales observaciones plantean preguntas acerca de si tales similitudes en la patogénesis son probables similitudes de fenotipo, o en cambio reportan la presencia de mecanismos moleculares comunes entre los virus. En esta revisión se discuten las propiedades generales, descubrimientos y epidemiología/ecología de las formas de hantavirus patógenos del Nuevo Mundo, y también se busca identificar algunas de las características de las macromoléculas virales y mecanismos inmunológicos que se han propuesto como potenciales mediadores directos de los eventos patógenos que caracterizan la enfermedad humana HCPS. Si bien es poco probable que la expresión de una proteína viral particular o ARNs en aislamiento se pueda confiar en replicar fenotipos clave de infección por el virus completo, algunos de los hallazgos han sido suficientemente consistentes con lo que se conoce de la patogénesis in vivo que ofrecen plomos plausibles de primer paso en la búsqueda de objetivos terapéuticos. Esperamos con interés las revelaciones mecanísticas que seguirán el uso inevitablemente ampliado de métodos poderosos como la secuenciación profunda, imágenes cada vez más avanzadas, y métodos microscópicos, y modelos animales que por fin se pueden decir

¿Qué nuevo género se encontró que representa el virus más tarde?

Los hantavirus en las Américas y su papel como patógenos emergenteshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3185593/SHA: efe13a8d42b60ef9f7387ea539a1b2eeb5f80101Autores: Hjelle, Brian; Torres-Pérez, FernandoFecha: 2010-11-25DOI: 10.3390/v2125559Licencia: cc-byAbstract: La continua aparición y reaparición de patógenos representan una amenaza continua, a veces mayor, para las poblaciones. Los hantavirus (familia Bunyaviridae) y sus enfermedades humanas asociadas se consideraron confinados a Eurasia, pero la aparición de un brote en el suroeste de Estados Unidos llevó a un gran aumento en su estudio entre los virólogos de todo el mundo. Se han descrito más de 40 genotipos hantavirales, la gran mayoría desde 1993, y casi la mitad de ellos patógenos para los seres humanos. Los hantavirus causan infecciones persistentes en sus reservorios, y en las Américas, la enfermedad humana se manifiesta como compromiso cardiopulmonar, síndrome cardiopulmonar del hantavirus (HCPS), con proporciones de casos-fatalidad, para los serotipos virales más comunes, entre el 30% y el 40%. Alteración del hábitat y trastornos ecológicos a mayor escala, tal vez incluyendo el cambio climático, son algunos de los factores que pueden haber aumentado la carga de casos humanos de HCPS entre 1993 y el presente. Consideramos aquí las características que influyen en la estructura de la dinámica de la población huésped que pueden conducir a brotes virales, así como los determinantes macromoleculares de los hantavirus que han sido considerados como potenciales contribuciones a la patogenicidad. Texto: Los patógenos emergentes causan enfermedades nuevas o no reconocidas anteriormente, y entre ellas, las zoonóticas emergentes son una preocupación importante entre los científicos que estudian enfermedades infecciosas a diferentes escalas espaciales y temporales [1, 2]. Los cambios en las condiciones bióticas y abióticas pueden alterar la dinámica de las enfermedades de la población y conducir a la aparición de infecciones zoonóticas [3] [5] [6]. Durante las últimas décadas, se han producido varios brotes de patógenos virales emergentes y reemergentes, que afectan tanto a la implicación puramente local como a nivel mundial/pandémica de las poblaciones humanas. Entre los ejemplos visibles están la gripe A, el virus del Ébola, el virus de la hepatitis C, el trastorno respiratorio grave para adultos (SARS), el coronavirus y el virus de la inmunodeficiencia humana, que desafían las medidas de prevención y control de los sistemas de salud pública [7]. En las Américas, el reciente brote de gripe pandémica A subtipo H1N1 se convirtió en un objetivo importante de control debido a su rápida propagación, y las incertidumbres en cuanto a virulencia y transmisibilidad, sin embargo, la disponibilidad de vacunas fue limitada cuando se produjo una actividad significativa antes de la temporada tradicional de gripe [8]. Sin embargo, en el último siglo han surgido o resurgido brotes de varias enfermedades virales relacionadas con el virus arenavirus y el virus del dengue, y más recientemente, hantavirus y la expansión del rango geográfico del virus del Nilo Occidental. Entre las enfermedades zoonóticas, los mamíferos pequeños son anfitriones de varios virus ARN patógenos, especialmente Arenaviridae y Bunyaviridae: Hantavirus [9] [10] [11]. Las infecciones por hantavirus se convirtieron en una preocupación en las Américas después de la descripción de un brote de distrés respiratorio agudo ocurrido en La enfermedad recientemente reconocida, el síndrome cardiopulmonar del hantavirus, el HCPS (o síndrome pulmonar del hantavirus), se relacionó con la infección por el virus del Sin Nombre (SNV) recién descubierto, y el roedor Peromyscus maniculatus (ratón venado) fue identificado como el reservorio [13]. Sin embargo, las infecciones por hantavirus tienen una historia mucho más larga. Una revisión de los escritos chinos antiguos, que datan de aproximadamente 960 dC, reveló descripciones muy parecidas a la fiebre hemorrágica con síndrome renal (HFRS), el síndrome causado por los hantavirus del Viejo Mundo [14]. Durante el siglo XX, los casos de enfermedad febril aguda con compromiso renal fueron descritos de varios países eurasiáticos y Japón, a menudo en asociación con compromisos militares [15]. El HFRS como síndrome distinto, sin embargo, fue llamado por primera vez a la atención de la medicina occidental en asociación con un brote que ocurrió entre las tropas de las Naciones Unidas durante el conflicto coreano entre 1951 y 1954, donde más de 3.200 soldados fueron afectados [16]. Tomó más de dos décadas hasta que el agente etiológico, el virus Hantaan (HTNV), fue aislado del ratón de campo rayado Apodemus agrarius, detectado en parte por la unión de anticuerpos de muestras de suero de paciente a los tejidos pulmonares de ratones de campo sanos y salvajes [17, 18]. El virus se encontró más tarde para representar la especie tipo de un nuevo género Hantavirus de la familia Bunyaviridae, aunque fue más tarde evidente que el primer hantavirus a aislarse fue el virus Thottapalayam de shrew-borne [19]. La categorización de los hantavirus como pertenecientes a la familia Bunyaviridae se debe en parte a la presencia consistente de tres genomas de ARN que son circularizados in vivo como resultado de la presencia de nucleótidos terminales complementarios que ayudan a doblar el genoma en una morfología -hairpin-, descrita por primera vez para el flebovirus Uukuniemi [19, 20]. La Tabla 1 es una lista de los hantavirus patógenos predominantemente distintos serológicamente. Se describen muchos otros genotipos llamados, pero tales otras formas patogénicas están generalmente estrechamente relacionadas con los Andes o, en algunos casos, el virus Sin Nombre. Durante la maduración del virus, el precursor forma GPC se procesa utilizando una proteasa unida a la membrana en Gn y Gc, una escisión que ocurre, y parece ser señalada, después de la señal péptida conservada WAASA en la C-terminal de Gn [24]. Aunque las dos proteínas se pueden expresar de forma independiente a través de la transfección, pueden ser retenidas en el compartimento celular incorrecto (ER o aggrosome); por lo tanto, deben ser co-expresadas para permitirles estabilidad para que las dos se puedan ensamblar correctamente en el Golgi [25, [27] [28]. Se han identificado varias actividades y propiedades para las glicoproteínas envolventes del hantavirus, incluyendo algunas características que se sospecha que están involucradas en la patogenicidad de los serotipos causantes de la enfermedad, una posibilidad que ha generado atención experimental. Las glucoproteínas son los ligandos conocidos o presuntos para al menos dos receptores celulares distintos, la cadena de integrina y el factor acelerador de la descomposición, o DAF [30, 31] ; con gC1qR/p32 también identificado como otro receptor de entrada potencial [32]. Comparaciones con la proteína E del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, llevaron a Tischler et al. a considerar la glicoproteína Gc como una proteína potencial de fusión de clase II, tal vez impartiendo actividad de fusión al virión, y esta hipótesis ha ganado apoyo en otros estudios [33, 34]. Se han identificado actividades adicionales con, o se afirma que están relacionadas con, Gn. Para muchos de estos estudios, una premisa subyacente ha sostenido que hay diferencias entre las glicoproteínas de hantavirus -patógenos en relación con virus en el género que se denominan Si bien es cierto que aún no ha sido posible vincular el virus de Prospect Hill (PHV) con la enfermedad humana, la ausencia de evidencia de su patogenicidad tal vez no debería equipararse con la evidencia de su ausencia. Sólo se podría considerar que el nivel de enfermedad (por ejemplo, letargo, fiebre, proteinuria y azotemia) asociado con la infección de primates no humanos por PHV no es significativamente diferente del registrado para los modelos de primates no humanos utilizando el virus conocido del patógeno Puumala (PUUV) [35, 36]. Para el propósito de esta discusión, presumiremos que los hantavirus apatogénicos son efectivamente apatogénicos. Mientras que algunos estudios han sugerido que las glicoproteínas Gn se dirigen más rápidamente a la vía ubiquitina-proteosoma que a las formas apatogénicas, otros han interpretado las diferencias en el manejo de las glicoproteínas Gn a través de especies de hantavirus por el sistema ubiquitina-proteosomal como independientes de la patogenicidad [37] [38] [39]. Algunos investigadores han dirigido sus esfuerzos hacia la identificación de una capacidad diferencial, ya sea cinética o de magnitud absoluta, en la capacidad de los hantavirus patógenos y apatogénicos para provocar una respuesta de interferón en las células. Una premisa que surge es que las formas apatogénicas tenderían a inducir una respuesta innata anterior que haría más probable que el virus se limpiara rápidamente o se volviera menos competente en su replicación, a fin de evitar cualquier respuesta patológica en el huésped [42] La respuesta innata anti-hantavirus puede en algunos casos ser atribuida a la interacción viral como ligando de TLR-3, pero no en otros, y en las células endoteliales, no parece requerir más que la partícula viral misma, incluso cuando se introduce en forma replicativa incompetente [43, 44]. Las proteínas y los ARNm inducidos prominentemente por los hantavirus incluyen MxA e IFIT-1 (ISG-56) y otros incluyendo algunos con actividad antiviral conocida o sospechada. Esos hantavirus, a menudo cepas altamente patógenas, que no inducen una respuesta antiviral potente, se sospechan o se presume que tienen un (más) potente mecanismo de antagonismo interferón-vía en relación con otros virus, un mecanismo que actúa positivamente para prevenir que se forme una respuesta innata efectiva, al menos temprano en la infección Sin embargo, se reportan algunos casos en los que los hantavirus altamente patógenos, tales como NVS, también son capaces de inducir la expresión de los ARNm del gen estimulado por interferón, incluso muy temprano en la infección, con proteínas ISG, como se esperaba, tardando más tiempo en aparecer en la célula [44]. Las actividades anti-interferón también se han atribuido a la proteína NSs que se puede elaborar en células infectadas por serotipos que codifican esta proteína [46]. Otros investigadores han examinado las actividades de las glucoproteínas del hantavirus y otras proteínas que podrían afectar directamente a algunos aspectos de la progresión patogénica asociada a la infección por hantavirus en humanos, tales como cambios de permeabilidad vascular. Mientras que los primeros intentos de causar directamente aumentos en la permeabilidad de las monocapas endoteliales con partículas virales o infección viral fueron en gran medida decepcionantes, los hantavirus se han identificado como que afectan adversamente la migración endotelial sobre los sustratos y en la potenciación de la permeabilidad endotelial inducida por VEG-F [47, 48]. La proteína nucleocápsida o N más corta (+50 kD) es un componente estructural del nucleocápsido viral, junto con los segmentos de ARN viral genómico. Como proteína de unión al ARN que afecta a la horquilla del cabello de los segmentos genómicos con alta afinidad [49, 50], limita el acceso del ARN para alojar nucleasasas y ayuda a hacer que la replicación viral sea un proceso cerrado dentro del citoplasma. También actúa como una proteína de membrana periférica, al igual que la proteína L [51], una actividad que podría jugar un papel en su supuesta, pero aún no demostrada función como matriz [52]. Hasta hace poco, no se había apreciado que N tuviera una amplia variedad de otras actividades, algunas de las cuales pueden estar vinculadas, no sólo a los requisitos fundamentales de replicación, sino también a la interferencia con una serie de procesos intracelulares de la célula normal. Así, se ha propuesto una interacción entre el aminoterminal de la proteína N del hantavirus y la proteína celular Daxx, con la sugerencia de posibles consecuencias pro-apoptóticas [51]. N también se reporta que interactúa con microfilamentos actínicos, y la proteína SUMO-1 [53, 54]. Utilizando ensayos basados en el gen reportero, Connie Schmaljohn y sus colegas han informado que la proteína nucleocapsid del virus Hantaan tiene un papel inhibidor en las respuestas inflamatorias mediadas por NF kappa B (NF- â € € TM B). Los efectos sobre la expresión NF- € B parecen estar limitados a la prevención de su translocación nuclear después de su intento de activación con lipopolisacárido, LPS [55]. En el citoplasma de las células infectadas, la proteína N se puede encontrar en los cuerpos celulares P donde secuestra y protege los capuchones de 5'. Puede localizar los capuchones a través de su interacción con DCP1, un componente clave de los cuerpos P. Durante la infección por hantavirus, los ARN virales se concentran en los cuerpos P, a través de su interacción con N y DCP1. La proteína N demuestra la protección preferencial de los ARNm diseñados para terminar prematuramente su proteína codificada en comparación con los ARNm nativos [56]. La proteína N se ha vinculado cada vez más a la replicación y traducción virales, a veces de maneras no previstas anteriormente. Se encuentra entre una familia creciente de diversas proteínas virales que pueden servir como un inespecífico - ARN chaperone ®, una actividad que debe facilitar el acceso de la L polimerasa al ARNv para la transcripción y replicación, en que puede disociar transitoriamente estructuras de ARN mal dobladas [57]. Algunos de los efectos de la proteína N en la traducción no pueden ser inmediatamente reconocidos como adaptables en la naturaleza. Puede reemplazar todo el complejo de iniciación traslacional EIF4F, presentando simultáneamente el ribosoma con un reemplazo de la actividad de unión de la tapa de eIF 4E, uniéndose al complejo de pre-iniciación 43S, al igual que eIF 4G, al tiempo que reemplaza la actividad helicoidal de eIF 4A, que se presume que es necesaria para disociar la estructura de ARN de orden superior [56, 58]. Estos tres factores normalmente trabajan juntos para lograr la iniciación traslacional. En los cuerpos P, la capacidad de la proteína N de unirse a una alta afinidad a los oligoribonucleótidos celulares nativos tapados, junto con su actividad en la protección de ARNs tapados de la degradación, probablemente facilita el acceso de oligonucleótidos encapsulados para su uso en la iniciación transcripcional por L polimerasa (-cap ra Tráfico de N para el ensamblaje viral: Clásicamente, la proteína N en las células infectadas parece estar agrupada o partículas en la naturaleza, con una concentración pesada en una única ubicación perinuclear, ampliamente considerada como la Golgi [27]. Las proteínas N de los hantavirus se encuentran en asociación con fracciones de partículas, y los estudios confocales microscopía y bioquímico-inhibidores han demostrado que las trazas N a lo largo de microtúbulos pero no con filamentos de actina [52]. El destino final de N, para su ensamblaje en partículas virales es la Golgi, y que circula allí a través del complejo intermedio retículo-Golgi endoplasmático (ERGIC), también conocido como cúmulo vesicular-tubular [52]. Un inhibidor negativo dominante, la dinamitina, asociado con el transporte mediado por Los estudios posteriores sugieren que la dependencia específica del transporte microtubular es específica de los hantavirus del Viejo Mundo como el NVH, pero que el Hantavirus del Nuevo Mundo ANDV está asociado con filamentos de actina [59]. Sin embargo, los datos recientes indican que el transporte microtubular es efectivamente utilizado para el NVH del Nuevo Mundo [60]. Las enfermedades del Hantavirus del hombre desde hace mucho tiempo han sido sospechosas de tener una base inmunopatógena en parte debido a su período de incubación relativamente largo de 2-3 semanas y la asociación temporal observada entre los trastornos inmunológicos y la primera aparición de signos y síntomas de la enfermedad del hantavirus. HFRS y HCPS comparten muchas características clínicas, llevando a muchos investigadores a considerar que son, en esencia, diferentes manifestaciones de un proceso patógeno similar, que difieren principalmente en los órganos objetivo primarios de expresión de la enfermedad (Tabla La patogénesis de las infecciones por hantavirus es el tema de una revisión continuamente actualizada en la serie UpToDate [61]. Para el momento en que aparecen los síntomas en el HCPS, ambas respuestas antivirales fuertes, y, para los genotipos virales más virulentos, el ARN viral puede ser detectado en plasma sanguíneo o células sanguíneas nucleadas respectivamente [63, 64]. Al menos tres estudios han correlacionado el ARN viral plasmático con la gravedad de la enfermedad para el HCPS y el HFRS, sugiriendo que la replicación del virus juega un papel continuo y en tiempo real en la patogénesis viral [65] [66] [67]. Se han identificado varios cambios patológicos distintivos que ocurren tanto en el HFRS como en el HCPS. Una característica crítica de ambos es una fuga capilar transitoria (~ 1-5 días) que involucra el La fuga resultante es de carácter exudativo, con una composición química alta en proteínas y similar al plasma. La experiencia continua que indica el fuerte tropismo tisular para las células endoteliales, específicamente, es uno de los varios factores que hacen de la integra β3 un candidato especialmente atractivo como un importante receptor in vivo para los hantavirus. Es probable que los hantavirus lleguen a sus tejidos objetivo a través de la captación por los ganglios linfáticos regionales, tal vez con o dentro de un histiocito pulmonar escoltante. Las semillas del virus endotelio local, donde las primeras células infectadas dan lugar, en última instancia, a una viremia primaria, un proceso que parece tomar mucho tiempo para las infecciones por hantavirus [62, 63]. En el momento en que emerge la viremia secundaria, los agentes de las formas más severas de HFRS y HCPS han comenzado a alcanzar una masa suficiente para inducir, a través de las interacciones PAMP-PRR y otros medios, la expresión de citoquinas proinflamatorias [64]. Para HCPS, esa expresión favorece el lecho pulmonar y los órganos linfoides, pero, por razones desconocidas, ahorra el retroperitoneo y, en general, el riñón. En HFRS la situación se invierte, y sin embargo no se aprecia a menudo que el esperado tropismos tisulares preferentes de virus asociados a HFRS y sus contrapartes asociadas a HCPS para los lechos renal y pulmonar, respectivamente, no es como se predeciría a través de las manifestaciones de las dos enfermedades. La elaboración local de mediadores inflamatorios y quimiotácticos se considera un requisito para el desarrollo de Sin embargo, no es la hipoxemia, debido al edema pulmonar prominente, lo que conduce a la muerte en la mayoría de los casos fatales de HCPS, sino más bien la intoxicación del corazón por mediadores como aún no definidos, lo que conduce al estado de bajo gasto cardíaco y al síndrome de shock asociado [64, 65]. Es tentador especular que los mediadores producidos en el pulmón en conexión con el infiltrado inflamatorio pueden infiltrarse a través de la circulación coronaria con dilución mínima en HCPS, consecuencia desventajosa de la estrecha yuxtaposición anatómica de los dos órganos. Así, al menos tres clases de mecanismos potenciales, algunos superpuestos y todos ciertamente no exclusivos de los otros, podrían presumirse que subyacen a la patogénesis del HCPS. Estos incluyen:(1) Mecanismos inmunes innatos. La naturaleza de las interacciones entre los patrones moleculares asociados al patógeno del hantavirus (PAMP) y los receptores de reconocimiento del patrón (PRR) de las células endoteliales susceptibles comienzan a ser aclaradas. El HTNV prototípico parece ser reconocido por TLR-3 [43]. Tal infección tiene consecuencias tales como una mayor expresión del HLA-DR en las células dendríticas [66] y la diferenciación de los monocitos hacia las células dendríticas [67]. (2) Efectos virales directos. La correlación observada entre la carga viral y la gravedad de la enfermedad deja abierta la posibilidad de que las partículas del hantavirus o el ARN puedan tener efectos tóxicos sobre las células o sobre la señalización. Algunos investigadores han favorecido la toxicidad viral directa, actuando a través de la inhibición de la función de barrera celular endotelial, como una explicación de gran parte de la fuga capilar, aunque existe Una pista potencialmente importante hacia el mecanismo por el cual las infecciones por hantavirus agotan las plaquetas sanguíneas y, en algunos casos, causan manifestaciones hemorrágicas, fue avanzada por el reciente descubrimiento de que los hantavirus patógenos son capaces de reclutar plaquetas para adherirse a las superficies celulares endoteliales, con β3 integrina utilizada como elemento de unión crítica [69]. (3) Efectos patógenos causados por las actividades de macromoléculas virales específicas. Hemos revisado algunas de las actividades asociadas con los Gn, Gc y N, polipéptidos codificados viralmente en secciones anteriores. Modelos de prueba de patogénesis se pueden hacer más eficazmente cuando hay un modelo animal que imita aspectos clave de la enfermedad. No existe un modelo similar al HFRS, pero existen modelos animales para el transporte asintomático de PUUV y SNV por sus roedores portadores nativos, el banco vole Myodes glareolus y el ratón de venado P. maniculatus; así como un modelo de hámster sirio utilizando ANDV o el virus Aporal relacionado de Venezuela, para el cual se observa una enfermedad mimética HCPS [70] [71] [72] [73]. El modelo de hámster ANDV-Sirio tiene una serie de características en común con la enfermedad humana, así como algunas diferencias. A diferencia de las enfermedades neurológicas que han sido posibles de provocar con HTNV, el modelo de hámster para HCPS parece ser causado por fugas capilares que resultan en edema pulmonar y la producción de un derrame pleural con características exuda Típicamente los hámsteres mueren entre 11 y 14-d post-inoculación, reflejando un período de incubación ligeramente acelerado en comparación con las infecciones humanas. Al igual que con el HCPS humano, el examen microscópico del pulmón revela abundante deposición de fibrina, septo alveolar engrosado y antígeno viral expresado abundantemente en el endotelio microvascular. Los hámsteres infectados por ANDV equipados con dispositivos de monitoreo fisiológico mostraron disminución de las presiones de pulso, taquicardia e hipotensión que parecen imitar de cerca el shock que se cree que es la causa próxima de la muerte en pacientes que sucumben al HCPS [65, 74]. En comparación con la enfermedad humana, los hámsteres infectados por ANDV exhiben títulos excepcionalmente altos de ANDV vivo en sus tejidos, con gran parte de la replicación viral que ocurre en Los títulos de ANDV vivo en algunos casos superan los 10 8 /g, mientras que los aislados de hantavirus de los tejidos humanos han sido notoriamente difíciles de obtener. A pesar de la aparición universal de enzimas hepáticas levemente elevadas en pacientes con HCPS, las enzimas hepáticas no parecen estar presentes en niveles elevados en la sangre de hámsters enfermos incluso inmediatamente antes de la muerte [75]. El período prolongado de incubación asociado con la enfermedad por hantavirus da al huésped un tiempo considerable para montar una respuesta inmune madura contra el virus. Así, en contradición a infecciones de gravedad comparable y sintomatología relacionada asociada con arenavirus y filovirus, las infecciones por hantavirus en humanos se asocian con respuestas anticuerpos de título significativo por el momento en que comienzan los síntomas. A pesar de esta observación, parece ser posible que la variación natural en las respuestas individuales de anticuerpos neutralizantes entre los pacientes con infecciones por NVS pueda estar relacionada con la gravedad de la enfermedad, lo que sugiere que la administración de anticuerpos antivirales podría resultar efectiva terapéuticamente [76]. En el caso de la infección por ANDV, han surgido nuevas evidencias que indican que el aparente aclaramiento del virus de la sangre no resulta en la eliminación completa del estímulo antigénico por el virus, sugiriendo que el virus puede persistir, tal vez en algún sitio inmunológicamente privilegiado aún indeterminado [77]. Un papel para las respuestas patológicas mediadas por células T en el HFRS y el HCPS ha sido la fuente de especulación por una variedad de razones. La gravedad del SNS asociado al SNCP puede haber hecho más evidente que el inicio del edema pulmonar, la taquicardia y la hipertensión parecía estar todo, pero universalmente asociado temporalmente, con la aparición de un espectro de células altamente activadas del linaje linfoide en la sangre periférica. Se detectaron células con similitudes morfológicas cercanas a estos -inmunoblastos- en los pulmones congestionados y pesados de los pacientes que llegaron a la autopsia, así como en órganos linfoides y en las tríadas portal [63, [78] [79] [80]. Estas observaciones llevaron a especular que algún componente de la patogénesis por hantavirus podría estar vinculado a la aparición de células T antivirales que podrían estimular o contribuir a la aparición de una -tormenta de mediadores y el fenotipo de fuga capilar asociado. Estudios posteriores han confirmado la expectativa de que una fracción significativa de la población de inmunoblastos en pacientes con HCPS son células T con especificidad para epitopes específicos de antígenos virales de clase I presentados por el HLA, incluyendo Gn, Gc y N [77, [81] [82] [83]. Presumiblemente, las actividades antivirales de estas células, manifestadas en parte por su elaboración de mediadores en el intersticio afectado, pueden contribuir a la fuga endotelial/capilar que se encuentra en el corazón de la patogénesis del hantavirus. Debido a que los primeros casos de HCPS a menudo llegaron a la autopsia, se hizo posible examinar tejidos necropsiados para la expresión de citocinas. El estudio de Mori et al. (1999) revelaron una alta expresión relativa de citocinas proinflamatorias incluyendo TNF-, IL-1-, IL-6, proporcionando evidencia a favor de un modelo de tormenta de citoquinas para la patogénesis [64]. Los autores creían, basándose en la morfología de las células secretadoras de citoquinas, que tanto monocitos como linfocitos estaban contribuyendo a la producción de citocinas. Que los mediadores proinflamatorios se encuentran en niveles elevados en el plasma, así como el intersticio renal de pacientes con enfermedad hantaviral aguda se ha reconocido desde hace algún tiempo también [84, 85]. Si bien el diagnóstico de HCPS y HFRS se realiza mejor con serología IgM, en la etapa aguda de la infección por NVS, también se puede utilizar RT-PCR si se utilizan células sanguíneas o coágulos de sangre en lugar de plasma o suero, donde la sensibilidad incluso utilizando imprimaciones PCR anidadas disminuye a cerca del 70% [86] [87] [88]. En una instalación en la que se tratan muchos casos de HCPS, el centro médico de la Universidad de Nuevo México en Albuquerque, se ha ofrecido un servicio de diagnóstico en el que se analizan los hallazgos hematológicos del paciente para establecer la probabilidad de que un paciente tenga HCPS. La combinación de trombocitopenia, abundancia elevada de linfocitos -inmunoblasto-, población de células polimorfonucleares con desplazamiento izquierdo sin evidencia morfológica fuerte para su activación, y valores elevados de hemoglobina o hematocrito es altamente específica para el HCPS y permite a los clínicos la capacidad de poner pacientes presuntivos-HCPS en oxigenación de membrana extracorpórea (ECMO), que se cree que ha salvado a muchos pacientes de un resultado letal [89]. Se cree que la infección humana por hantavirus sigue el contacto con secreciones o excreciones producidas por roedores infectados. En los Estados Unidos, 538 infecciones humanas por hantavirus fueron reportadas hasta finales de diciembre de 2009 [90], con Nuevo México, Arizona y Colorado mostrando los casos más altos. Mientras que el prototípico hantavirus centroamericano en América Central fue el virus Rio Segundo de Reithrodontomys mexicanus de Costa Rica, la primera enfermedad humana apareció algunos años más tarde en Panamá, donde el virus Choclo (CHOV) surgió como el agente etiológico y se cree que es responsable de todos los casos conocidos de HCPS. La rata de arroz pigmeo fulvo Oligoryzomys fulvescens ha sido identificada como el reservorio de roedores [91]. En Panamá, los primeros casos de HCPS, aunque con poca o ninguna implicación cardiaca evidente, fueron reportados en 1999, y desde entonces, 106 infecciones humanas han ocurrido con una tasa de mortalidad del 26% [92]. Seroencuestas de mamíferos en México y Costa Rica han encontrado anticuerpos antihantavirus [93] [94] [95] [96], y se han notificado seroprevalencias que oscilan entre 0,6 y 1,6% en poblaciones humanas a pesar de la ausencia de casos conocidos de HCPS [97]. En América del Sur, los casos de HCPS se han identificado en Argentina, Bolivia, Brasil, Chile, Paraguay y Uruguay, y también se han notificado evidencias de exposición humana a hantavirus en Venezuela [98] y Perú [99]. En América del Sur, ANDV es el principal agente etiológico con casos en Chile y Argentina notificados desde 1995. En Chile, se han producido 671 casos de HCPS debido a ANDV durante el período 2001-2009 [100]. Desde 1995 se han reportado más de 1.000 casos de HCPS en Argentina [101] ; en el Brasil se han identificado aproximadamente 1.100 casos de HCPS entre 1993 y 2008 [102]. Las tasas de mortalidad por casos en esos tres países han sido similares, oscilando entre el 30% (Argentina), el 36% (Chile) y el 39% (Brasil). Las infecciones por Hantavirus ocurren con más frecuencia en hombres que en mujeres, aunque la proporción entre hombres y mujeres es muy variable. Por ejemplo, las comunidades panameñas mostraron una proporción de 55 hombres por 45 mujeres [103], mientras que en Chile la proporción es más sesgada por hombres (71%) [104]. En el Chaco paraguayo la proporción entre hombres y mujeres se aproxima al 50% [105]. En América del Norte, en diciembre de 2009 el 63% de los pacientes eran varones [90]. Todos los grupos étnicos y raciales parecen ser susceptibles a infecciones por el hantavirus, y las diferencias entre ciertos grupos (como indígenas y no indígenas) están más probablemente correlacionadas con el tipo de hábitat en el que reside la población (por ejemplo, zonas rurales frente a zonas urbanas). De hecho, las comunidades rurales representan la mayor incidencia global del hantavirus y, por lo tanto, están en mayor riesgo [92, [105] [106] [107] [108] [109] [109] [119], aunque también se ha destacado la importancia de los entornos peridomésticos como una importante zona de exposición [112, 113]. El principal mecanismo por el que los seres humanos adquieren la infección por el hantavirus es la exposición a aerosoles de heces contaminadas de roedores, orina y saliva [114, 115]. Esto puede ocurrir cuando los seres humanos residen en áreas cercanas a las que habitan los roedores, viven en áreas infestadas de roedores, o cuando los roedores invaden entornos humanos, que son más frecuentes en hábitats rurales.Existe una larga historia de coexistencia humana con roedores, lo que plantea dudas sobre el aparente aumento reciente de las enfermedades relacionadas con el hantavirus, especialmente el HCPS. Aparte de una aparente asociación con eventos de oscilación sureña de El Niño (ENSO) en algunas regiones [116, 117], los recientes incrementos en la incidencia del HCPS no parecen seguir un patrón temporal o espacial fácilmente definido. Sin embargo, algunas características del paisaje, como la fragmentación del hábitat o las áreas perturbadas por el ser humano, pueden influir en la dinámica de la población de roedores e impactar en la incidencia viral [118] [112] [112] [121]. A pesar de la estocástica asociada a la contracción de la infección Las actividades humanas en edificios mal ventilados que pulverizan partículas que luego se inhalan (es decir, limpieza, agitación de alfombras, polvo) se identifican con frecuencia entre los pacientes admitidos para el SHCPS [11, 122]. Se cree que las actividades al aire libre transmiten un menor riesgo debido a la labilidad de los hantavirus a la radiación UV y a la supuesta tendencia a dispersarse en el viento, aunque ciertas condiciones ambientales parecen mantener el virus durante períodos más largos fuera de su huésped natural, lo que permite la transmisión indirecta [123]. Una vía alternativa pero poco común de transmisión del virus es la mordedura de roedores [124] [125] [126]. Los trabajadores sobre el terreno que manipulan mamíferos corren un riesgo potencialmente mayor de exposición a infecciones por hantavirus, aunque cuando se cuantifica a través de serosurveys el riesgo absoluto parece bastante leve [127]. Un nuevo estudio en Colorado sugiere la posibilidad de que una picadura de roedor haya sido el vehículo próximo para la transmisión al aire libre de NVS [128], lo que vuelve a enfatizar el uso de equipo de protección personal durante las actividades de trabajo de campo [129]. Como caso particular dentro de los hantavirus, la transmisión de persona a persona ha sido documentada exclusivamente para el virus de los Andes sudamericanos [130] [133] [133] [135]. La identificación de esta vía de transmisión se ha hecho utilizando tanto herramientas moleculares como encuestas epidemiológicas, pero el mecanismo de transmisión interpersonal no está bien establecido. Curiosamente, ANDV también puede ser derramado por los humanos a través de otros fluidos biológicos como la orina [136], ilustrando las propiedades particulares que diferencian este virus de otros hantavirus. Aunque la transmisión interpersonal parece ser única para ANDV, el ARN viral de PUUV se ha detectado en la saliva de pacientes con HFRS, y algunos pacientes con SNV-HCPS tienen ARN viral en las secreciones traqueales [88, 137]. Los Hantavirus en las Américas son alojados naturalmente por roedores (Muridae y Cricetidae) así como las musarañas (Soricidae) y los lunares (Talpidae) (Figura 1). Tres especies de musgo y un mole han sido reportados para albergar hantavirus y su patogenicidad para los humanos permanece desconocida [22, 138, 139]. Se han identificado al menos 15 especies de roedores como portadores de diferentes hantavirus patógenos, con algunos genotipos sudamericanos como Castelo do Sonhos (CDSV) o Hu39694 sólo identificados después de infecciones humanas (Figura 1 ). Los hantavirus suelen mostrar una alta especificidad de especie y ningún huésped intermedio [140]. Sin embargo, se han descrito algunos genotipos de hantavirus en la misma especie de roedores. Tal es el caso de Playa de Oro (OROV) y Catacamas (CATV) identificados en Oryzomys couesi [141, 142], o Maporal (MAPV) y Choclo (CHOV) hospedados por O. fulvescens [91, 143]. En América del Norte se han detectado virus de muleshoe y Black Creek Canal hanta en sigmodon hispidus [ Además, un genotipo de hantavirus (por ejemplo, el virus similar a Juquitiba) puede ser transportado por más de una especie de roedores (O. nigripes, Oxymycterus judex, Akodon montesis). Otro ejemplo es el virus Laguna Negra (LANV) que después de ser identificado en Calomys laucha [146] también ha sido reportado en C. callosus [147]. El rápido aumento en el descubrimiento de nuevos hantavirus y la identificación de sus anfitriones no parece probable que termine tan pronto como se examinen nuevas especies pequeñas de mamíferos [95]. Este tema se complica por la continua controversia en los criterios para la clasificación de distintos hantavirus [148, 149], que también está vinculado a la clasificación taxonómica y los reordenamientos taxonómicos. La transmisión de especies cruzadas es un proceso importante durante la propagación, aparición y evolución Particularmente dentro de los hantavirus, los derrames a los huéspedes secundarios se identifican cada vez más a medida que se realizan estudios más extensos [151] [152] [153] [155] [156]. Por ejemplo, ANDV es el agente etiológico predominante del HCPS en América del Sur, y O. longicaudatus el principal reservorio de roedores. Derrama en al menos otras cuatro especies de roedores que coocurren con el reservorio se han identificado, con Abrothrix longipilis mostrando la segunda mayor prevalencia de anticuerpos de ANDV, y actualmente no hay duda de que el virus es extremadamente similar genéticamente entre los dos roedores del huésped [157, 158]. En América del Norte, el derrame del virus Bayou (BAYV) puede haber ocurrido desde el reservorio principal de O. palustris a S. hispidus, R. fulvescens, P. leucopus y B. taylori [159] [160] [161]. Es más probable que el derrame del virus Hanta se produzca con poblaciones de acogida que habitan regiones simpatricas o sintópicas [151, 162], y la transmisión de especies cruzadas tendría probablemente mayores posibilidades de éxito si las especies anfitrionas están estrechamente relacionadas [163]. Se encuentra una excepción interesante entre el virus Oxbow (OXBV) y el virus Asama (ASAV) en el que un proceso de cambio de huésped parecía haber ocurrido entre mamíferos pertenecientes a dos familias (Talpidae y Soricidae), probablemente como resultado de la codivergencia alterna y recurrente de ciertos tax Los hantavirus son transmitidos horizontalmente entre roedores y no son transmitidos por artrópodos (a diferencia de otros virus de la familia Bunyaviridae). La infección por derrapadores a mamíferos no humanos generalmente no produce ninguna transmisión hacia adelante (o a fin de morir), pero si los seres humanos están infectados pueden resultar en una alta morbilidad y mortalidad [122, 164]. Durante la primavera de 1993, un brote de pacientes con HCPS debido a SNV ocurrió en los estados de Four Corners, resultando en más del 60% de casos de mortalidad entre los casos iniciales, muchos de los cuales involucran a miembros de la tribu Navajo [12, 121]. En Panamá, se notificó un brote durante 1999-2000 en Los Santos, y 12 casos donde se identificaron con tres muertes [165, 166]. Esto representó el primer informe de infecciones por hantavirus humanos en América Central. En América del Sur, Diecisiete individuos fueron identificados con anticuerpo NVS (ELISA) o fueron antígenos (HCI) positivos de 52 casos sospechosos [167]. En 1996 ocurrieron brotes mayores debidos a ANDV en el sur de Argentina [131, 134] ; en el sur de Chile se presentaron grupos de pacientes con enfermedad por hantavirus en 1997 [158]. En Brasil, el primer brote fue identificado en la Amazonía Brasileña (Estado de Maranhão) en el año 2000, e involucró pequeños pueblos que resultaron en una prevalencia del 13,3% de los evaluados (398 residentes totales) [168]. Los factores que desencadenan los brotes de hantavirus todavía son mal entendidos, probablemente porque resultan de varias características bióticas y abióticas interactuantes cuyos parámetros clave son difíciles de modelar. Sin embargo, el uso de nuevos enfoques de modelado que involucran características geográficas y ambientales parece ser prometedor a la hora de predecir posibles brotes de hantavirus y/o áreas de mayor riesgo [169] [170] [171] [172]. Debido a que se sabe que los hantavirus se transmiten directamente de los huéspedes infectados a los susceptibles, el primer enfoque natural es relacionar los brotes con la ecología de los huéspedes virales. La transmisión y persistencia del hantavirus en las poblaciones de roedores depende de varios factores que interactúan para afectar la dinámica ecológica del huésped, que a su vez está fuertemente influenciada por las características de comportamiento de las especies de roedores individuales, a la estructura paisajística y a las características ambientales [173, 174]. La transmisión viral depende de las tasas de contacto entre los huéspedes sensibles, y a pesar de la noción prevaleciente de que un aumento de la densidad se encuentra y, por lo tanto, de Además, se ha demostrado que la transmisión de NVS sigue un patrón de heterogeneidad de contacto, donde los individuos de la población tienen diferentes probabilidades de transmitir la infección [176]. La comprensión de la transmisión viral resulta ser mucho más compleja cuando especies distintas del principal huésped del reservorio se incorporan en el modelo. De hecho, estudios recientes han demostrado que la mayor diversidad de especies hospedantes está correlacionada con una menor prevalencia de infección en América del Norte para P. maniculatus [177], en América Central para O. fulvescens (reservorio del virus Choclo) y Zygodontomys brevicauda (reservorio del virus Calabazo) [178], y en América del Sur para Akodon montensis (reservorio del virus Jabora) [162]. Las tasas de contacto varían según la distribución espacial de las poblaciones y parecen estar Por ejemplo, la prevalencia de SNV en P. maniculatus fue mayor en paisajes con mayor grado de fragmentación del hábitat preferido [179]. Además, ciertas propiedades del paisaje como elevación, pendiente y cubierta terrestre parecen ser útiles para detectar áreas con infecciones persistentes de SNV, y por lo tanto se consideran áreas refugiales donde el virus puede mantenerse durante años [169]. Los cambios en el entorno natural de las especies de reservorios, como la fragmentación forestal y la pérdida de hábitat, pueden alterar la abundancia y distribución de la población y provocar brotes de hantavirus, como se observa en la Península de Azurero de Panamá [118, 119]. Además, las diferencias en el microhábitat, incluida la cubierta superficial, pueden conducir a diferencias en la dinámica ecológica dentro de las poblaciones y afectar a la tasa de exposición al virus [180]. Se han encontrado diferencias en las infecciones por hantavirus a través de paisajes contrastantes en el intervalo latitudinal en poblaciones de roedores de O. longicaudatus en Chile, lo que sugiere que los seres humanos están expuestos de manera diferencial al virus [107, 181]. La dinámica poblacional de roedores se ve afectada por cambios estacionales de clima y clima [182, 183]. En el caso de los brotes asociados a ENSO, se ha postulado una compleja cascada de eventos desencadenados por lluvias altamente inusuales en el año precedente para dar lugar a un aumento de la producción primaria y densidades de roedores, aumentando también la probabilidad de transmisión del virus a los seres humanos, pero ha resultado difícil demostrar con precisión los eventos intermedios sugeridos, como el aumento de las densidades de roedores en el aumento de la carga de casos [116, 121, 184]. En América del Sur, los efectos del cambio climático y los brotes de hantavirus no han sido bien estudiados, a pesar del conocimiento de que varias especies de roedores que son reservorios de enfermedades emergentes se han visto dramáticamente afectadas por eventos como El Niño [185]. Los cambios en la dinámica de la población de acogida también se ven afectados por la estacionalidad, lo que puede conducir a brotes de enfermedades cuando se interrumpen los procesos que equilibran las poblaciones de roedores de temporada en temporada [186]. La emergencia viral puede seguir promoviéndose a medida que los cambios introducidos por el ser humano continúan aumentando en el medio ambiente a diferentes escalas geográficas. Estos cambios también pueden alterar la estructura y dinámica de la población de roedores e interacciones interespecies creando condiciones que pueden conducir a brotes virales, establecimiento viral en nuevos hospederos, y la aparición de HCPS [102, 162], incluso con aparentemente leve perturbación ecológica al sistema virus-hospedero [188]. Ciertas características fisiopatológicas, incluyendo trombocitopenia y shock, de enfermedades por hantavirus de los seres humanos, tienen similitud sustancial con las fiebres hemorrágicas inducidas por otros virus tales arenavirus, filovirus y flavivirus, a pesar de compartir esencialmente ninguna secuencia similitud con ellos. Tales observaciones plantean preguntas acerca de si tales similitudes en la patogénesis son probables similitudes de fenotipo, o en cambio reportan la presencia de mecanismos moleculares comunes entre los virus. En esta revisión se discuten las propiedades generales, descubrimientos y epidemiología/ecología de las formas de hantavirus patógenos del Nuevo Mundo, y también se busca identificar algunas de las características de las macromoléculas virales y mecanismos inmunológicos que se han propuesto como potenciales mediadores directos de los eventos patógenos que caracterizan la enfermedad humana HCPS. Si bien es poco probable que la expresión de una proteína viral particular o ARNs en aislamiento se pueda confiar en replicar fenotipos clave de infección por el virus completo, algunos de los hallazgos han sido suficientemente consistentes con lo que se conoce de la patogénesis in vivo que ofrecen plomos plausibles de primer paso en la búsqueda de objetivos terapéuticos. Esperamos con interés las revelaciones mecanísticas que seguirán el uso inevitablemente ampliado de métodos poderosos como la secuenciación profunda, imágenes cada vez más avanzadas, y métodos microscópicos, y modelos animales que por fin se pueden decir

¿Cuál fue el primer hantavirus aislado?

Los hantavirus en las Américas y su papel como patógenos emergenteshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3185593/SHA: efe13a8d42b60ef9f7387ea539a1b2eeb5f80101Autores: Hjelle, Brian; Torres-Pérez, FernandoFecha: 2010-11-25DOI: 10.3390/v2125559Licencia: cc-byAbstract: La continua aparición y reaparición de patógenos representan una amenaza continua, a veces mayor, para las poblaciones. Los hantavirus (familia Bunyaviridae) y sus enfermedades humanas asociadas se consideraron confinados a Eurasia, pero la aparición de un brote en el suroeste de Estados Unidos llevó a un gran aumento en su estudio entre los virólogos de todo el mundo. Se han descrito más de 40 genotipos hantavirales, la gran mayoría desde 1993, y casi la mitad de ellos patógenos para los seres humanos. Los hantavirus causan infecciones persistentes en sus reservorios, y en las Américas, la enfermedad humana se manifiesta como compromiso cardiopulmonar, síndrome cardiopulmonar del hantavirus (HCPS), con proporciones de casos-fatalidad, para los serotipos virales más comunes, entre el 30% y el 40%. Alteración del hábitat y trastornos ecológicos a mayor escala, tal vez incluyendo el cambio climático, son algunos de los factores que pueden haber aumentado la carga de casos humanos de HCPS entre 1993 y el presente. Consideramos aquí las características que influyen en la estructura de la dinámica de la población huésped que pueden conducir a brotes virales, así como los determinantes macromoleculares de los hantavirus que han sido considerados como potenciales contribuciones a la patogenicidad. Texto: Los patógenos emergentes causan enfermedades nuevas o no reconocidas anteriormente, y entre ellas, las zoonóticas emergentes son una preocupación importante entre los científicos que estudian enfermedades infecciosas a diferentes escalas espaciales y temporales [1, 2]. Los cambios en las condiciones bióticas y abióticas pueden alterar la dinámica de las enfermedades de la población y conducir a la aparición de infecciones zoonóticas [3] [5] [6]. Durante las últimas décadas, se han producido varios brotes de patógenos virales emergentes y reemergentes, que afectan tanto a la implicación puramente local como a nivel mundial/pandémica de las poblaciones humanas. Entre los ejemplos visibles están la gripe A, el virus del Ébola, el virus de la hepatitis C, el trastorno respiratorio grave para adultos (SARS), el coronavirus y el virus de la inmunodeficiencia humana, que desafían las medidas de prevención y control de los sistemas de salud pública [7]. En las Américas, el reciente brote de gripe pandémica A subtipo H1N1 se convirtió en un objetivo importante de control debido a su rápida propagación, y las incertidumbres en cuanto a virulencia y transmisibilidad, sin embargo, la disponibilidad de vacunas fue limitada cuando se produjo una actividad significativa antes de la temporada tradicional de gripe [8]. Sin embargo, en el último siglo han surgido o resurgido brotes de varias enfermedades virales relacionadas con los virus arenavirus y el dengue, y más recientemente, hantavirus y la expansión del rango geográfico del virus del Nilo Occidental. Entre las enfermedades zoonóticas, los mamíferos pequeños son anfitriones de varios virus ARN patógenos, especialmente Arenaviridae y Bunyaviridae: Hantavirus [9] [10] [11]. Las infecciones por hantavirus se convirtieron en una preocupación en las Américas después de la descripción de un brote de distrés respiratorio agudo ocurrido en la zona La enfermedad recientemente reconocida, el síndrome cardiopulmonar del hantavirus, el HCPS (o síndrome pulmonar del hantavirus), se relacionó con la infección por el virus del Sin Nombre (SNV) recién descubierto, y el roedor Peromyscus maniculatus (ratón venado) fue identificado como el reservorio [13]. Sin embargo, las infecciones por hantavirus tienen una historia mucho más larga. Una revisión de los escritos chinos antiguos, que datan de aproximadamente 960 dC, reveló descripciones muy parecidas a la fiebre hemorrágica con síndrome renal (HFRS), el síndrome causado por los hantavirus del Viejo Mundo [14]. Durante el siglo XX, los casos de enfermedad febril aguda con compromiso renal fueron descritos de varios países eurasiáticos y Japón, a menudo en asociación con compromisos militares [15]. El HFRS como síndrome distinto, sin embargo, fue llamado por primera vez a la atención de la medicina occidental en asociación con un brote que ocurrió entre las tropas de las Naciones Unidas durante el conflicto coreano entre 1951 y 1954, donde más de 3.200 soldados fueron afectados [16]. Tomó más de dos décadas hasta que el agente etiológico, el virus Hantaan (HTNV), fue aislado del ratón de campo rayado Apodemus agrarius, detectado en parte por la unión de anticuerpos de muestras de suero de paciente a los tejidos pulmonares de ratones de campo sanos y salvajes [17, 18]. El virus se encontró más tarde para representar la especie tipo de un nuevo género Hantavirus de la familia Bunyaviridae, aunque fue más tarde evidente que el primer hantavirus a aislarse fue el virus Thottapalayam de shrew-borne [19]. La categorización de los hantavirus como pertenecientes a la familia Bunyaviridae se debe en parte a la presencia consistente de tres genomas de ARN que son circularizados in vivo como resultado de la presencia de nucleótidos terminales complementarios que ayudan a doblar el genoma en una morfología -hairpin-, descrita por primera vez para el flebovirus Uukuniemi [19, 20]. La Tabla 1 es una lista de los hantavirus patógenos predominantemente distintos serológicamente. Se describen muchos otros genotipos llamados, pero tales otras formas patogénicas están generalmente estrechamente relacionadas con los Andes o, en algunos casos, el virus Sin Nombre. Durante la maduración del virus, el precursor forma GPC se procesa utilizando una proteasa unida a la membrana en Gn y Gc, una escisión que ocurre, y parece ser señalada, después de la señal péptida conservada WAASA en la C-terminal de Gn [24]. Aunque las dos proteínas se pueden expresar de forma independiente a través de la transfección, pueden ser retenidas en el compartimento celular incorrecto (ER o aggrosome); por lo tanto, deben ser co-expresadas para permitirles estabilidad para que las dos se puedan ensamblar correctamente en el Golgi [25, [27] [28]. Se han identificado varias actividades y propiedades para las glicoproteínas envolventes del hantavirus, incluyendo algunas características que se sospecha que están involucradas en la patogenicidad de los serotipos causantes de la enfermedad, una posibilidad que ha generado atención experimental. Las glucoproteínas son los ligandos conocidos o presuntos para al menos dos receptores celulares distintos, la cadena de integrina y el factor acelerador de la descomposición, o DAF [30, 31] ; con gC1qR/p32 también identificado como otro receptor de entrada potencial [32]. Comparaciones con la proteína E del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, llevaron a Tischler et al. a considerar la glicoproteína Gc como una proteína potencial de fusión de clase II, tal vez impartiendo actividad de fusión al virión, y esta hipótesis ha ganado apoyo en otros estudios [33, 34]. Se han identificado actividades adicionales con, o se afirma que están relacionadas con, Gn. Para muchos de estos estudios, una premisa subyacente ha sostenido que hay diferencias entre las glicoproteínas de hantavirus -patógenos en relación con virus en el género que se denominan Si bien es cierto que aún no ha sido posible vincular el virus de Prospect Hill (PHV) con la enfermedad humana, la ausencia de evidencia de su patogenicidad tal vez no debería equipararse con la evidencia de su ausencia. Sólo se podría considerar que el nivel de enfermedad (por ejemplo, letargo, fiebre, proteinuria y azotemia) asociado con la infección de primates no humanos por PHV no es significativamente diferente del registrado para los modelos de primates no humanos utilizando el virus conocido del patógeno Puumala (PUUV) [35, 36]. Para el propósito de esta discusión, presumiremos que los hantavirus apatogénicos son efectivamente apatogénicos. Mientras que algunos estudios han sugerido que las glicoproteínas Gn se dirigen más rápidamente a la vía ubiquitina-proteosoma que a las formas apatogénicas, otros han interpretado las diferencias en el manejo de las glicoproteínas Gn a través de especies de hantavirus por el sistema ubiquitina-proteosomal como independientes de la patogenicidad [37] [38] [39]. Algunos investigadores han dirigido sus esfuerzos hacia la identificación de una capacidad diferencial, ya sea cinética o de magnitud absoluta, en la capacidad de los hantavirus patógenos y apatogénicos para provocar una respuesta de interferón en las células. Una premisa que surge es que las formas apatogénicas tenderían a inducir una respuesta innata anterior que haría más probable que el virus se limpiara rápidamente o se volviera menos competente en su replicación, a fin de evitar cualquier respuesta patológica en el huésped [42] La respuesta innata anti-hantavirus puede en algunos casos ser atribuida a la interacción viral como ligando de TLR-3, pero no en otros, y en las células endoteliales, no parece requerir más que la partícula viral misma, incluso cuando se introduce en forma replicativa incompetente [43, 44]. Las proteínas y los ARNm inducidos prominentemente por los hantavirus incluyen MxA e IFIT-1 (ISG-56) y otros incluyendo algunos con actividad antiviral conocida o sospechada. Esos hantavirus, a menudo cepas altamente patógenas, que no inducen una respuesta antiviral potente, se sospechan o se presume que tienen un (más) potente mecanismo de antagonismo interferón-vía en relación con otros virus, un mecanismo que actúa positivamente para prevenir que se forme una respuesta innata efectiva, al menos temprano en la infección [4 Sin embargo, se reportan algunos casos en los que los hantavirus altamente patógenos, tales como NVS, también son capaces de inducir la expresión de los ARNm del gen estimulado por interferón, incluso muy temprano en la infección, con proteínas ISG, como se esperaba, tardando más tiempo en aparecer en la célula [44]. Las actividades anti-interferón también se han atribuido a la proteína NSs que se puede elaborar en células infectadas por serotipos que codifican esta proteína [46]. Otros investigadores han examinado las actividades de las glucoproteínas del hantavirus y otras proteínas que podrían afectar directamente a algunos aspectos de la progresión patogénica asociada a la infección por hantavirus en humanos, tales como cambios de permeabilidad vascular. Mientras que los primeros intentos de causar directamente aumentos en la permeabilidad de las monocapas endoteliales con partículas virales o infección viral fueron en gran medida decepcionantes, los hantavirus se han identificado como que afectan adversamente la migración endotelial sobre los sustratos y en la potenciación de la permeabilidad endotelial inducida por VEG-F [47, 48]. La proteína nucleocápsida o N más corta (+50 kD) es un componente estructural del nucleocápsido viral, junto con los segmentos de ARN viral genómico. Como proteína de unión al ARN que afecta a la horquilla del cabello de los segmentos genómicos con alta afinidad [49, 50], limita el acceso del ARN para alojar nucleasasas y ayuda a hacer que la replicación viral sea un proceso cerrado dentro del citoplasma. También actúa como una proteína de membrana periférica, al igual que la proteína L [51], una actividad que podría jugar un papel en su supuesta, pero aún no demostrada función como matriz [52]. Hasta hace poco, no se había apreciado que N tuviera una amplia variedad de otras actividades, algunas de las cuales pueden estar vinculadas, no sólo a los requisitos fundamentales de replicación, sino también a la interferencia con una serie de procesos intracelulares de la célula normal. Así, se ha propuesto una interacción entre el aminoterminal de la proteína N del hantavirus y la proteína celular Daxx, con la sugerencia de posibles consecuencias pro-apoptóticas [51]. N también se reporta que interactúa con microfilamentos actínicos, y la proteína SUMO-1 [53, 54]. Utilizando ensayos basados en el gen reportero, Connie Schmaljohn y sus colegas han informado que la proteína nucleocapsid del virus Hantaan tiene un papel inhibidor en las respuestas inflamatorias mediadas por NF kappa B (NF- â € € TM B). Los efectos sobre la expresión NF- € B parecen estar limitados a la prevención de su translocación nuclear después de su intento de activación con lipopolisacárido, LPS [55]. En el citoplasma de las células infectadas, la proteína N se puede encontrar en los cuerpos celulares P donde secuestra y protege los capuchones de 5'. Puede localizar los capuchones a través de su interacción con DCP1, un componente clave de los cuerpos P. Durante la infección por hantavirus, los ARN virales se concentran en los cuerpos P, a través de su interacción con N y DCP1. La proteína N demuestra la protección preferencial de los ARNm diseñados para terminar prematuramente su proteína codificada en comparación con los ARNm nativos [56]. La proteína N se ha vinculado cada vez más a la replicación y traducción virales, a veces de maneras no previstas anteriormente. Se encuentra entre una familia creciente de diversas proteínas virales que pueden servir como un inespecífico - ARN chaperone ®, una actividad que debe facilitar el acceso de la L polimerasa al ARNv para la transcripción y replicación, en que puede disociar transitoriamente estructuras de ARN mal dobladas [57]. Algunos de los efectos de la proteína N en la traducción no pueden ser inmediatamente reconocidos como adaptables en la naturaleza. Puede reemplazar todo el complejo de iniciación traslacional EIF4F, presentando simultáneamente el ribosoma con un reemplazo de la actividad de unión de la tapa de eIF 4E, uniéndose al complejo de pre-iniciación 43S, al igual que eIF 4G, al tiempo que reemplaza la actividad helicoidal de eIF 4A, que se presume que es necesaria para disociar la estructura de ARN de orden superior [56, 58]. Estos tres factores normalmente trabajan juntos para lograr la iniciación traslacional. En los cuerpos P, la capacidad de la proteína N de unirse a una alta afinidad a los oligoribonucleótidos celulares nativos tapados, junto con su actividad en la protección de ARNs tapados de la degradación, probablemente facilita el acceso de oligonucleótidos encapsulados para su uso en la iniciación transcripcional por L polimerasa (-cap ra Tráfico de N para el ensamblaje viral: Clásicamente, la proteína N en las células infectadas parece estar agrupada o partículas en la naturaleza, con una concentración pesada en una única ubicación perinuclear, ampliamente considerada como la Golgi [27]. Las proteínas N de los hantavirus se encuentran en asociación con fracciones de partículas, y los estudios confocales microscopía y bioquímico-inhibidores han demostrado que las trazas N a lo largo de microtúbulos pero no con filamentos de actina [52]. El destino final de N, para su ensamblaje en partículas virales es la Golgi, y que circula allí a través del complejo intermedio retículo-Golgi endoplasmático (ERGIC), también conocido como cúmulo vesicular-tubular [52]. Un inhibidor negativo dominante, la dinamitina, asociado con el transporte mediado por Los estudios posteriores sugieren que la dependencia específica del transporte microtubular es específica de los hantavirus del Viejo Mundo como el NVH, pero que el Hantavirus del Nuevo Mundo ANDV está asociado con filamentos de actina [59]. Sin embargo, los datos recientes indican que el transporte microtubular es efectivamente utilizado para el NVH del Nuevo Mundo [60]. Las enfermedades del Hantavirus del hombre desde hace mucho tiempo han sido sospechosas de tener una base inmunopatógena en parte debido a su período de incubación relativamente largo de 2-3 semanas y la asociación temporal observada entre los trastornos inmunológicos y la primera aparición de signos y síntomas de la enfermedad del hantavirus. HFRS y HCPS comparten muchas características clínicas, llevando a muchos investigadores a considerar que son, en esencia, diferentes manifestaciones de un proceso patógeno similar, que difieren principalmente en los órganos objetivo primarios de expresión de la enfermedad (Tabla La patogénesis de las infecciones por hantavirus es el tema de una revisión continuamente actualizada en la serie UpToDate [61]. Para el momento en que aparecen los síntomas en el HCPS, ambas respuestas antivirales fuertes, y, para los genotipos virales más virulentos, el ARN viral puede ser detectado en plasma sanguíneo o células sanguíneas nucleadas respectivamente [63, 64]. Al menos tres estudios han correlacionado el ARN viral plasmático con la gravedad de la enfermedad para el HCPS y el HFRS, sugiriendo que la replicación del virus juega un papel continuo y en tiempo real en la patogénesis viral [65] [66] [67]. Se han identificado varios cambios patológicos distintivos que ocurren tanto en el HFRS como en el HCPS. Una característica crítica de ambos es una fuga capilar transitoria (~ 1-5 días) que involucra el La fuga resultante es de carácter exudativo, con una composición química alta en proteínas y similar al plasma. La experiencia continua que indica el fuerte tropismo tisular para las células endoteliales, específicamente, es uno de los varios factores que hacen de la integra β3 un candidato especialmente atractivo como un importante receptor in vivo para los hantavirus. Es probable que los hantavirus lleguen a sus tejidos objetivo a través de la captación por los ganglios linfáticos regionales, tal vez con o dentro de un histiocito pulmonar escoltante. Las semillas del virus endotelio local, donde las primeras células infectadas dan lugar, en última instancia, a una viremia primaria, un proceso que parece tomar mucho tiempo para las infecciones por hantavirus [62, 63]. En el momento en que emerge la viremia secundaria, los agentes de las formas más severas de HFRS y HCPS han comenzado a alcanzar una masa suficiente para inducir, a través de las interacciones PAMP-PRR y otros medios, la expresión de citoquinas proinflamatorias [64]. Para HCPS, esa expresión favorece el lecho pulmonar y los órganos linfoides, pero, por razones desconocidas, ahorra el retroperitoneo y, en general, el riñón. En HFRS la situación se invierte, y sin embargo no se aprecia a menudo que el esperado tropismos tisulares preferentes de virus asociados a HFRS y sus contrapartes asociadas a HCPS para los lechos renal y pulmonar, respectivamente, no sea como se predeciría a través de las manifestaciones de las dos enfermedades. La elaboración local de mediadores inflamatorios y quimiotácticos se considera un requisito para el desarrollo Sin embargo, no es la hipoxemia, debido al edema pulmonar prominente, lo que conduce a la muerte en la mayoría de los casos fatales de HCPS, sino más bien la intoxicación del corazón por mediadores como aún no definidos, lo que conduce al estado de bajo gasto cardíaco y al síndrome de shock asociado [64, 65]. Es tentador especular que los mediadores producidos en el pulmón en conexión con el infiltrado inflamatorio pueden infiltrarse a través de la circulación coronaria con dilución mínima en HCPS, consecuencia desventajosa de la estrecha yuxtaposición anatómica de los dos órganos. Así, al menos tres clases de mecanismos potenciales, algunos superpuestos y todos ciertamente no exclusivos de los otros, podrían presumirse que subyacen a la patogénesis del HCPS. Estos incluyen:(1) Mecanismos inmunes innatos. La naturaleza de las interacciones entre los patrones moleculares asociados al patógeno del hantavirus (PAMP) y los receptores de reconocimiento del patrón (PRR) de las células endoteliales susceptibles comienzan a ser aclaradas. El HTNV prototípico parece ser reconocido por TLR-3 [43]. Tal infección tiene consecuencias tales como una mayor expresión del HLA-DR en las células dendríticas [66] y la diferenciación de los monocitos hacia las células dendríticas [67]. (2) Efectos virales directos. La correlación observada entre la carga viral y la gravedad de la enfermedad deja abierta la posibilidad de que las partículas del hantavirus o el ARN puedan tener efectos tóxicos sobre las células o sobre la señalización. Algunos investigadores han favorecido la toxicidad viral directa, actuando a través de la inhibición de la función de barrera celular endotelial, como una explicación de gran parte de la fuga capilar, aunque existe Una pista potencialmente importante hacia el mecanismo por el cual las infecciones por hantavirus agotan las plaquetas sanguíneas y, en algunos casos, causan manifestaciones hemorrágicas, fue avanzada por el reciente descubrimiento de que los hantavirus patógenos son capaces de reclutar plaquetas para adherirse a las superficies celulares endoteliales, con β3 integrina utilizada como elemento de unión crítica [69]. (3) Efectos patógenos causados por las actividades de macromoléculas virales específicas. Hemos revisado algunas de las actividades asociadas con los Gn, Gc y N, polipéptidos codificados viralmente en secciones anteriores. Modelos de prueba de patogénesis se pueden hacer más eficazmente cuando hay un modelo animal que imita aspectos clave de la enfermedad. No existe un modelo similar al HFRS, pero existen modelos animales para el transporte asintomático de PUUV y SNV por sus roedores portadores nativos, el banco vole Myodes glareolus y el ratón venado P. maniculatus; así como un modelo hámster sirio utilizando ANDV o el virus Aporal relacionado de Venezuela, para el cual se observa una enfermedad mimética HCPS [70] [71] [72] [73]. El modelo hámster ANDV-Sirio tiene una serie de características en común con la enfermedad humana, así como algunas diferencias. A diferencia de las enfermedades neurológicas que han sido posibles de provocar con HTNV, el modelo hámster para HCPS parece ser causado por fugas capilares que resultan en edema pulmonar y la producción de un derrame pleural con características exudativas. Típicamente los hámsteres mueren entre 11 y 14-d post-inoculación, reflejando un período de incubación ligeramente acelerado en comparación con las infecciones humanas. Al igual que con el HCPS humano, el examen microscópico del pulmón revela abundante deposición de fibrina, septo alveolar engrosado y antígeno viral expresado abundantemente en el endotelio microvascular. Los hámsteres infectados por ANDV equipados con dispositivos de monitoreo fisiológico mostraron disminución de las presiones de pulso, taquicardia e hipotensión que parecen imitar de cerca el shock que se cree que es la causa próxima de la muerte en pacientes que sucumben al HCPS [65, 74]. En comparación con la enfermedad humana, los hámsteres infectados por ANDV exhiben títulos excepcionalmente altos de ANDV vivo en sus tejidos, con gran parte de la replicación viral que se produce Los títulos de ANDV vivo en algunos casos superan los 10 8 /g, mientras que los aislados de hantavirus de los tejidos humanos han sido notoriamente difíciles de obtener. A pesar de la aparición universal de enzimas hepáticas levemente elevadas en pacientes con HCPS, las enzimas hepáticas no parecen estar presentes en niveles elevados en la sangre de hámsters enfermos incluso inmediatamente antes de la muerte [75]. El período prolongado de incubación asociado con la enfermedad por hantavirus da al huésped un tiempo considerable para montar una respuesta inmune madura contra el virus. Así, en contradición a infecciones de gravedad comparable y sintomatología relacionada asociada con arenavirus y filovirus, las infecciones por hantavirus en humanos se asocian con respuestas anticuerpos de título significativo por el momento en que comienzan los síntomas. A pesar de esta observación, parece ser posible que la variación natural en las respuestas individuales de anticuerpos neutralizantes entre los pacientes con infecciones por NVS pueda estar relacionada con la gravedad de la enfermedad, lo que sugiere que la administración de anticuerpos antivirales podría resultar efectiva terapéuticamente [76]. En el caso de la infección por ANDV, han surgido nuevas evidencias que indican que el aparente aclaramiento del virus de la sangre no resulta en la eliminación completa del estímulo antigénico por el virus, sugiriendo que el virus puede persistir, tal vez en algún sitio inmunológicamente privilegiado aún indeterminado [77]. Un papel para las respuestas patológicas mediadas por células T en el HFRS y el HCPS ha sido la fuente de especulación por una variedad de razones. La gravedad del SNS asociado al SNCP puede haber hecho más evidente que el inicio del edema pulmonar, la taquicardia y la hipertensión parecía estar todo, pero universalmente asociado temporalmente, con la aparición de un espectro de células altamente activadas del linaje linfoide en la sangre periférica. Se detectaron células con similitudes morfológicas cercanas a estos -inmunoblastos- en los pulmones congestionados y pesados de los pacientes que llegaron a la autopsia, así como en órganos linfoides y en las tríadas portal [63, [78] [79] [80]. Estas observaciones llevaron a especular que algún componente de la patogénesis por hantavirus podría estar vinculado a la aparición de células T antivirales que podrían estimular o contribuir a la aparición de una -tormenta de mediadores y el fenotipo de fuga capilar asociado. Estudios posteriores han confirmado la expectativa de que una fracción significativa de la población de inmunoblastos en pacientes con HCPS son células T con especificidad para epitopes específicos de antígenos virales de clase I presentados por el HLA, incluyendo Gn, Gc y N [77, [81] [82] [83]. Presumiblemente, las actividades antivirales de estas células, manifestadas en parte por su elaboración de mediadores en el intersticio afectado, pueden contribuir a la fuga endotelial/capilar que se encuentra en el corazón de la patogénesis del hantavirus. Debido a que los primeros casos de HCPS a menudo llegaron a la autopsia, se hizo posible examinar tejidos necropsiados para la expresión de citocinas. El estudio de Mori et al. (1999) revelaron una alta expresión relativa de citocinas proinflamatorias incluyendo TNF-, IL-1-, IL-6, proporcionando evidencia a favor de un modelo de tormenta de citoquinas para la patogénesis [64]. Los autores creían, basándose en la morfología de las células secretadoras de citoquinas, que tanto monocitos como linfocitos estaban contribuyendo a la producción de citocinas. Que los mediadores proinflamatorios se encuentran en niveles elevados en el plasma, así como el intersticio renal de pacientes con enfermedad hantaviral aguda se ha reconocido desde hace algún tiempo también [84, 85]. Si bien el diagnóstico de HCPS y HFRS se realiza mejor con serología IgM, en la etapa aguda de la infección por NVS, también se puede utilizar RT-PCR si se utilizan células sanguíneas o coágulos de sangre en lugar de plasma o suero, donde la sensibilidad incluso utilizando imprimaciones PCR anidadas disminuye a cerca del 70% [86] [87] [88]. En una instalación en la que se tratan muchos casos de HCPS, el centro médico de la Universidad de Nuevo México en Albuquerque, se ha ofrecido un servicio de diagnóstico en el que se analizan los hallazgos hematológicos del paciente para establecer la probabilidad de que un paciente tenga HCPS. La combinación de trombocitopenia, abundancia elevada de linfocitos -inmunoblasto-, población de células polimorfonucleares con desplazamiento izquierdo sin evidencia morfológica fuerte para su activación, y valores elevados de hemoglobina o hematocrito es altamente específica para el HCPS y permite a los clínicos la capacidad de poner pacientes presuntivos-HCPS en oxigenación de membrana extracorpórea (ECMO), que se cree que ha salvado a muchos pacientes de un resultado letal [89]. Se cree que la infección humana por hantavirus sigue el contacto con secreciones o excreciones producidas por roedores infectados. En los Estados Unidos, 538 infecciones humanas por hantavirus fueron reportadas hasta finales de diciembre de 2009 [90], con Nuevo México, Arizona y Colorado mostrando los casos más altos. Mientras que el prototípico hantavirus centroamericano en América Central fue el virus Rio Segundo de Reithrodontomys mexicanus de Costa Rica, la primera enfermedad humana apareció algunos años más tarde en Panamá, donde el virus Choclo (CHOV) surgió como el agente etiológico y se cree que es responsable de todos los casos conocidos de HCPS. La rata de arroz pigmeo fulvo Oligoryzomys fulvescens ha sido identificada como el reservorio de roedores [91]. En Panamá, los primeros casos de HCPS, aunque con poca o ninguna implicación cardiaca evidente, fueron reportados en 1999, y desde entonces, 106 infecciones humanas han ocurrido con una tasa de mortalidad del 26% [92]. Seroencuestas de mamíferos en México y Costa Rica han encontrado anticuerpos antihantavirus [93] [94] [95] [96], y se han notificado seroprevalencias que oscilan entre 0,6 y 1,6% en poblaciones humanas a pesar de la ausencia de casos conocidos de HCPS [97]. En América del Sur, los casos de HCPS se han identificado en Argentina, Bolivia, Brasil, Chile, Paraguay y Uruguay, y también se han notificado evidencias de exposición humana a hantavirus en Venezuela [98] y Perú [99]. En América del Sur, ANDV es el principal agente etiológico con casos en Chile y Argentina notificados desde 1995. En Chile, se han producido 671 casos de HCPS debido a ANDV durante el período 2001-2009 [100]. Desde 1995 se han reportado más de 1.000 casos de HCPS en Argentina [101] ; en el Brasil se han identificado aproximadamente 1.100 casos de HCPS entre 1993 y 2008 [102]. Las tasas de mortalidad por casos en esos tres países han sido similares, oscilando entre el 30% (Argentina), el 36% (Chile) y el 39% (Brasil). Las infecciones por Hantavirus ocurren con más frecuencia en hombres que en mujeres, aunque la proporción entre hombres y mujeres es muy variable. Por ejemplo, las comunidades panameñas mostraron una proporción de 55 hombres por 45 mujeres [103], mientras que en Chile la proporción es más sesgada por hombres (71%) [104]. En el Chaco paraguayo la proporción entre hombres y mujeres se aproxima al 50% [105]. En América del Norte, en diciembre de 2009 el 63% de los pacientes eran varones [90]. Todos los grupos étnicos y raciales parecen ser susceptibles a infecciones por el hantavirus, y las diferencias entre ciertos grupos (como indígenas y no indígenas) están más probablemente correlacionadas con el tipo de hábitat en el que reside la población (por ejemplo, zonas rurales frente a zonas urbanas). De hecho, las comunidades rurales representan la mayor incidencia global del hantavirus y, por lo tanto, están en mayor riesgo [92, [105] [106] [107] [108] [109] [109] [119], aunque también se ha destacado la importancia de los entornos peridomésticos como una importante zona de exposición [112, 113]. El principal mecanismo por el que los seres humanos adquieren la infección por el hantavirus es la exposición a aerosoles de heces contaminadas de roedores, orina y saliva [114, 115]. Esto puede ocurrir cuando los seres humanos residen en áreas cercanas a las que habitan los roedores, viven en áreas infestadas de roedores, o cuando los roedores invaden entornos humanos, que son más frecuentes en hábitats rurales.Existe una larga historia de coexistencia humana con roedores, lo que plantea dudas sobre el aparente aumento reciente de las enfermedades relacionadas con el hantavirus, especialmente el HCPS. Aparte de una aparente asociación con eventos de oscilación sureña de El Niño (ENSO) en algunas regiones [116, 117], los recientes incrementos en la incidencia del HCPS no parecen seguir un patrón temporal o espacial fácilmente definido. Sin embargo, algunas características del paisaje, como la fragmentación del hábitat o las áreas perturbadas por el ser humano, pueden influir en la dinámica de la población de roedores e impactar en la incidencia viral [118] [112] [112] [121]. A pesar de la estocástica asociada a la contracción de la infección Las actividades humanas en edificios mal ventilados que pulverizan partículas que luego se inhalan (es decir, limpieza, agitación de alfombras, polvo) se identifican con frecuencia entre los pacientes admitidos para el SHCPS [11, 122]. Se cree que las actividades al aire libre transmiten un menor riesgo debido a la labilidad de los hantavirus a la radiación UV y a la supuesta tendencia a dispersarse en el viento, aunque ciertas condiciones ambientales parecen mantener el virus durante períodos más largos fuera de su huésped natural, lo que permite la transmisión indirecta [123]. Una vía alternativa pero poco común de transmisión del virus es la mordedura de roedores [124] [125] [126]. Los trabajadores sobre el terreno que manipulan mamíferos corren un riesgo potencialmente mayor de exposición a infecciones por hantavirus, aunque cuando se cuantifica a través de serosurveys el riesgo absoluto parece bastante leve [127]. Un nuevo estudio en Colorado sugiere la posibilidad de que una picadura de roedor haya sido el vehículo próximo para la transmisión al aire libre de NVS [128], lo que vuelve a enfatizar el uso de equipo de protección personal durante las actividades de trabajo de campo [129]. Como caso particular dentro de los hantavirus, la transmisión de persona a persona ha sido documentada exclusivamente para el virus de los Andes sudamericanos [130] [133] [133] [135]. La identificación de esta vía de transmisión se ha hecho utilizando tanto herramientas moleculares como encuestas epidemiológicas, pero el mecanismo de transmisión interpersonal no está bien establecido. Curiosamente, ANDV también puede ser derramado por los humanos a través de otros fluidos biológicos como la orina [136], ilustrando las propiedades particulares que diferencian este virus de otros hantavirus. Aunque la transmisión interpersonal parece ser única para ANDV, el ARN viral de PUUV se ha detectado en la saliva de pacientes con HFRS, y algunos pacientes con SNV-HCPS tienen ARN viral en las secreciones traqueales [88, 137]. Los Hantavirus en las Américas son alojados naturalmente por roedores (Muridae y Cricetidae) así como las musarañas (Soricidae) y los lunares (Talpidae) (Figura 1). Tres especies de musgo y un mole han sido reportados para albergar hantavirus y su patogenicidad para los humanos permanece desconocida [22, 138, 139]. Se han identificado al menos 15 especies de roedores como portadores de diferentes hantavirus patógenos, con algunos genotipos sudamericanos como Castelo do Sonhos (CDSV) o Hu39694 sólo identificados después de infecciones humanas (Figura 1 ). Los hantavirus suelen mostrar una alta especificidad de especie y ningún huésped intermedio [140]. Sin embargo, se han descrito algunos genotipos de hantavirus en la misma especie de roedores. Tal es el caso de Playa de Oro (OROV) y Catacamas (CATV) identificados en Oryzomys couesi [141, 142], o Maporal (MAPV) y Choclo (CHOV) hospedados por O. fulvescens [91, 143]. En América del Norte se han detectado virus de muleshoe y Black Creek Canal hanta en sigmodon hispidus [ Además, un genotipo de hantavirus (por ejemplo, el virus similar a Juquitiba) puede ser transportado por más de una especie de roedores (O. nigripes, Oxymycterus judex, Akodon montesis). Otro ejemplo es el virus Laguna Negra (LANV) que después de ser identificado en Calomys laucha [146] también ha sido reportado en C. callosus [147]. El rápido aumento en el descubrimiento de nuevos hantavirus y la identificación de sus anfitriones no parece probable que termine tan pronto como se examinen nuevas especies pequeñas de mamíferos [95]. Este tema se complica por la continua controversia en los criterios para la clasificación de distintos hantavirus [148, 149], que también está vinculado a la clasificación taxonómica y los reordenamientos taxonómicos. La transmisión de especies cruzadas es un proceso importante durante la propagación, aparición y evolución Particularmente dentro de los hantavirus, los derrames a los huéspedes secundarios se identifican cada vez más a medida que se realizan estudios más extensos [151] [152] [153] [155] [156]. Por ejemplo, ANDV es el agente etiológico predominante del HCPS en América del Sur, y O. longicaudatus el principal reservorio de roedores. Derrama en al menos otras cuatro especies de roedores que coocurren con el reservorio se han identificado, con Abrothrix longipilis mostrando la segunda mayor prevalencia de anticuerpos de ANDV, y actualmente no hay duda de que el virus es extremadamente similar genéticamente entre los dos roedores del huésped [157, 158]. En América del Norte, el derrame del virus Bayou (BAYV) puede haber ocurrido desde el reservorio principal de O. palustris a S. hispidus, R. fulvescens, P. leucopus y B. taylori [159] [160] [161]. Es más probable que el derrame del virus Hanta se produzca con poblaciones de acogida que habitan regiones simpatricas o sintópicas [151, 162], y la transmisión de especies cruzadas tendría probablemente mayores posibilidades de éxito si las especies anfitrionas están estrechamente relacionadas [163]. Se encuentra una excepción interesante entre el virus Oxbow (OXBV) y el virus Asama (ASAV) en el que un proceso de cambio de huésped parecía haber ocurrido entre mamíferos pertenecientes a dos familias (Talpidae y Soricidae), probablemente como resultado de la codivergencia alterna y recurrente de ciertos tax Los hantavirus son transmitidos horizontalmente entre roedores y no son transmitidos por artrópodos (a diferencia de otros virus de la familia Bunyaviridae). La infección por derrapadores a mamíferos no humanos generalmente no produce ninguna transmisión hacia adelante (o a fin de morir), pero si los seres humanos están infectados pueden resultar en una alta morbilidad y mortalidad [122, 164]. Durante la primavera de 1993, un brote de pacientes con HCPS debido a SNV ocurrió en los estados de Four Corners, resultando en más del 60% de casos de mortalidad entre los casos iniciales, muchos de los cuales involucran a miembros de la tribu Navajo [12, 121]. En Panamá, se notificó un brote durante 1999-2000 en Los Santos, y 12 casos donde se identificaron con tres muertes [165, 166]. Esto representó el primer informe de infecciones por hantavirus humanos en América Central. En América del Sur, Diecisiete individuos fueron identificados con anticuerpo NVS (ELISA) o fueron antígenos (HCI) positivos de 52 casos sospechosos [167]. En 1996 ocurrieron brotes mayores debidos a ANDV en el sur de Argentina [131, 134] ; en el sur de Chile se presentaron grupos de pacientes con enfermedad por hantavirus en 1997 [158]. En Brasil, el primer brote fue identificado en la Amazonía Brasileña (Estado de Maranhão) en el año 2000, e involucró pequeños pueblos que resultaron en una prevalencia del 13,3% de los evaluados (398 residentes totales) [168]. Los factores que desencadenan los brotes de hantavirus todavía son mal entendidos, probablemente porque resultan de varias características bióticas y abióticas interactuantes cuyos parámetros clave son difíciles de modelar. Sin embargo, el uso de nuevos enfoques de modelado que involucran características geográficas y ambientales parece ser prometedor a la hora de predecir posibles brotes de hantavirus y/o áreas de mayor riesgo [169] [170] [171] [172]. Debido a que se sabe que los hantavirus se transmiten directamente de los huéspedes infectados a los susceptibles, el primer enfoque natural es relacionar los brotes con la ecología de los huéspedes virales. La transmisión y persistencia del hantavirus en las poblaciones de roedores depende de varios factores que interactúan para afectar la dinámica ecológica del huésped, que a su vez está fuertemente influenciada por las características de comportamiento de las especies de roedores individuales, a la estructura paisajística y a las características ambientales [173, 174]. La transmisión viral depende de las tasas de contacto entre los huéspedes sensibles, y a pesar de la noción prevaleciente de que un aumento de la densidad se encuentra y, por lo tanto, de Además, se ha demostrado que la transmisión de NVS sigue un patrón de heterogeneidad de contacto, donde los individuos de la población tienen diferentes probabilidades de transmitir la infección [176]. La comprensión de la transmisión viral resulta ser mucho más compleja cuando especies distintas del principal huésped del reservorio se incorporan en el modelo. De hecho, estudios recientes han demostrado que la mayor diversidad de especies hospedantes está correlacionada con una menor prevalencia de infección en América del Norte para P. maniculatus [177], en América Central para O. fulvescens (reservorio del virus Choclo) y Zygodontomys brevicauda (reservorio del virus Calabazo) [178], y en América del Sur para Akodon montensis (reservorio del virus Jabora) [162]. Las tasas de contacto varían según la distribución espacial de las poblaciones y parecen estar Por ejemplo, la prevalencia de SNV en P. maniculatus fue mayor en paisajes con mayor grado de fragmentación del hábitat preferido [179]. Además, ciertas propiedades del paisaje como elevación, pendiente y cubierta terrestre parecen ser útiles para detectar áreas con infecciones persistentes de SNV, y por lo tanto se consideran áreas refugiales donde el virus puede mantenerse durante años [169]. Los cambios en el entorno natural de las especies de reservorios, como la fragmentación forestal y la pérdida de hábitat, pueden alterar la abundancia y distribución de la población y provocar brotes de hantavirus, como se observa en la Península de Azurero de Panamá [118, 119]. Además, las diferencias en el microhábitat, incluida la cubierta superficial, pueden conducir a diferencias en la dinámica ecológica dentro de las poblaciones y afectar a la tasa de exposición al virus [180]. Se han encontrado diferencias en las infecciones por hantavirus a través de paisajes contrastantes en el intervalo latitudinal en poblaciones de roedores de O. longicaudatus en Chile, lo que sugiere que los seres humanos están expuestos de manera diferencial al virus [107, 181]. La dinámica poblacional de roedores se ve afectada por cambios estacionales de clima y clima [182, 183]. En el caso de los brotes asociados a ENSO, se ha postulado una compleja cascada de eventos desencadenados por lluvias altamente inusuales en el año precedente para dar lugar a un aumento de la producción primaria y densidades de roedores, aumentando también la probabilidad de transmisión del virus a los seres humanos, pero ha resultado difícil demostrar con precisión los eventos intermedios sugeridos, como el aumento de las densidades de roedores en el aumento de la carga de casos [116, 121, 184]. En América del Sur, los efectos del cambio climático y los brotes de hantavirus no han sido bien estudiados, a pesar del conocimiento de que varias especies de roedores que son reservorios de enfermedades emergentes se han visto dramáticamente afectadas por eventos como El Niño [185]. Los cambios en la dinámica de la población de acogida también se ven afectados por la estacionalidad, lo que puede conducir a brotes de enfermedades cuando se interrumpen los procesos que equilibran las poblaciones de roedores de temporada en temporada [186]. La emergencia viral puede seguir promoviéndose a medida que los cambios introducidos por el ser humano continúan aumentando en el medio ambiente a diferentes escalas geográficas. Estos cambios también pueden alterar la estructura y dinámica de la población de roedores e interacciones interespecies creando condiciones que pueden conducir a brotes virales, establecimiento viral en nuevos hospederos, y la aparición de HCPS [102, 162], incluso con aparentemente leve perturbación ecológica al sistema virus-hospedero [188]. Ciertas características fisiopatológicas, incluyendo trombocitopenia y shock, de enfermedades por hantavirus de los seres humanos, tienen similitud sustancial con las fiebres hemorrágicas inducidas por otros virus tales arenavirus, filovirus y flavivirus, a pesar de compartir esencialmente ninguna secuencia similitud con ellos. Tales observaciones plantean preguntas acerca de si tales similitudes en la patogénesis son probables similitudes de fenotipo, o en cambio reportan la presencia de mecanismos moleculares comunes entre los virus. En esta revisión se discuten las propiedades generales, descubrimientos y epidemiología/ecología de las formas de hantavirus patógenos del Nuevo Mundo, y también se busca identificar algunas de las características de las macromoléculas virales y mecanismos inmunológicos que se han propuesto como potenciales mediadores directos de los eventos patógenos que caracterizan la enfermedad humana HCPS. Si bien es poco probable que la expresión de una proteína viral particular o ARNs en aislamiento se pueda confiar en replicar fenotipos clave de infección por el virus completo, algunos de los hallazgos han sido suficientemente consistentes con lo que se conoce de la patogénesis in vivo que ofrecen plomos plausibles de primer paso en la búsqueda de objetivos terapéuticos. Esperamos con interés las revelaciones mecanísticas que seguirán el uso inevitablemente ampliado de métodos poderosos como la secuenciación profunda, imágenes cada vez más avanzadas, y métodos microscópicos, y modelos animales que por fin se pueden decir

¿Qué proteínas y ARNm inducidos prominentemente por los hantavirus incluyen?

Los hantavirus en las Américas y su papel como patógenos emergenteshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3185593/SHA: efe13a8d42b60ef9f7387ea539a1b2eeb5f80101Autores: Hjelle, Brian; Torres-Pérez, FernandoFecha: 2010-11-25DOI: 10.3390/v2125559Licencia: cc-byAbstract: La continua aparición y reaparición de patógenos representan una amenaza continua, a veces mayor, para las poblaciones. Los hantavirus (familia Bunyaviridae) y sus enfermedades humanas asociadas se consideraron confinados a Eurasia, pero la aparición de un brote en el suroeste de Estados Unidos llevó a un gran aumento en su estudio entre los virólogos de todo el mundo. Se han descrito más de 40 genotipos hantavirales, la gran mayoría desde 1993, y casi la mitad de ellos patógenos para los seres humanos. Los hantavirus causan infecciones persistentes en sus reservorios, y en las Américas, la enfermedad humana se manifiesta como compromiso cardiopulmonar, síndrome cardiopulmonar del hantavirus (HCPS), con proporciones de casos-fatalidad, para los serotipos virales más comunes, entre el 30% y el 40%. Alteración del hábitat y trastornos ecológicos a mayor escala, tal vez incluyendo el cambio climático, son algunos de los factores que pueden haber aumentado la carga de casos humanos de HCPS entre 1993 y el presente. Consideramos aquí las características que influyen en la estructura de la dinámica de la población huésped que pueden conducir a brotes virales, así como los determinantes macromoleculares de los hantavirus que han sido considerados como potenciales contribuciones a la patogenicidad. Texto: Los patógenos emergentes causan enfermedades nuevas o no reconocidas anteriormente, y entre ellas, las zoonóticas emergentes son una preocupación importante entre los científicos que estudian enfermedades infecciosas a diferentes escalas espaciales y temporales [1, 2]. Los cambios en las condiciones bióticas y abióticas pueden alterar la dinámica de las enfermedades de la población y conducir a la aparición de infecciones zoonóticas [3] [5] [6]. Durante las últimas décadas, se han producido varios brotes de patógenos virales emergentes y reemergentes, que afectan tanto a la implicación puramente local como a nivel mundial/pandémica de las poblaciones humanas. Entre los ejemplos visibles están la gripe A, el virus del Ébola, el virus de la hepatitis C, el trastorno respiratorio grave para adultos (SARS), el coronavirus y el virus de la inmunodeficiencia humana, que desafían las medidas de prevención y control de los sistemas de salud pública [7]. En las Américas, el reciente brote de gripe pandémica A subtipo H1N1 se convirtió en un objetivo importante de control debido a su rápida propagación, y las incertidumbres en cuanto a virulencia y transmisibilidad, sin embargo, la disponibilidad de vacunas fue limitada cuando se produjo una actividad significativa antes de la temporada tradicional de gripe [8]. Sin embargo, en el último siglo han surgido o resurgido brotes de varias enfermedades virales relacionadas con el virus arenavirus y el virus del dengue, y más recientemente, hantavirus y la expansión del rango geográfico del virus del Nilo Occidental. Entre las enfermedades zoonóticas, los mamíferos pequeños son anfitriones de varios virus ARN patógenos, especialmente Arenaviridae y Bunyaviridae: Hantavirus [9] [10] [11]. Las infecciones por hantavirus se convirtieron en una preocupación en las Américas después de la descripción de un brote de distrés respiratorio agudo ocurrido en La enfermedad recientemente reconocida, el síndrome cardiopulmonar del hantavirus, el HCPS (o síndrome pulmonar del hantavirus), se relacionó con la infección por el virus del Sin Nombre (SNV) recién descubierto, y el roedor Peromyscus maniculatus (ratón venado) fue identificado como el reservorio [13]. Sin embargo, las infecciones por hantavirus tienen una historia mucho más larga. Una revisión de los escritos chinos antiguos, que datan de aproximadamente 960 dC, reveló descripciones muy parecidas a la fiebre hemorrágica con síndrome renal (HFRS), el síndrome causado por los hantavirus del Viejo Mundo [14]. Durante el siglo XX, los casos de enfermedad febril aguda con compromiso renal fueron descritos de varios países eurasiáticos y Japón, a menudo en asociación con compromisos militares [15]. El HFRS como síndrome distinto, sin embargo, fue llamado por primera vez a la atención de la medicina occidental en asociación con un brote que ocurrió entre las tropas de las Naciones Unidas durante el conflicto coreano entre 1951 y 1954, donde más de 3.200 soldados fueron afectados [16]. Tomó más de dos décadas hasta que el agente etiológico, el virus Hantaan (HTNV), fue aislado del ratón de campo rayado Apodemus agrarius, detectado en parte por la unión de anticuerpos de muestras de suero de paciente a los tejidos pulmonares de ratones de campo sanos y salvajes [17, 18]. El virus se encontró más tarde para representar la especie tipo de un nuevo género Hantavirus de la familia Bunyaviridae, aunque fue más tarde evidente que el primer hantavirus a aislarse fue el virus Thottapalayam de shrew-borne [19]. La categorización de los hantavirus como pertenecientes a la familia Bunyaviridae se debe en parte a la presencia consistente de tres genomas de ARN que son circularizados in vivo como resultado de la presencia de nucleótidos terminales complementarios que ayudan a doblar el genoma en una morfología -hairpin-, descrita por primera vez para el flebovirus Uukuniemi [19, 20]. La Tabla 1 es una lista de los hantavirus patógenos predominantemente distintos serológicamente. Se describen muchos otros genotipos llamados, pero tales otras formas patogénicas están generalmente estrechamente relacionadas con los Andes o, en algunos casos, el virus Sin Nombre. Durante la maduración del virus, el precursor forma GPC se procesa utilizando una proteasa unida a la membrana en Gn y Gc, una escisión que ocurre, y parece ser señalada, después de la señal péptida conservada WAASA en la C-terminal de Gn [24]. Aunque las dos proteínas se pueden expresar de forma independiente a través de la transfección, pueden ser retenidas en el compartimento celular incorrecto (ER o aggrosome); por lo tanto, deben ser co-expresadas para permitirles estabilidad para que las dos se puedan ensamblar correctamente en el Golgi [25, [27] [28]. Se han identificado varias actividades y propiedades para las glicoproteínas envolventes del hantavirus, incluyendo algunas características que se sospecha que están involucradas en la patogenicidad de los serotipos causantes de la enfermedad, una posibilidad que ha generado atención experimental. Las glucoproteínas son los ligandos conocidos o presuntos para al menos dos receptores celulares distintos, la cadena de integrina y el factor acelerador de la descomposición, o DAF [30, 31] ; con gC1qR/p32 también identificado como otro receptor de entrada potencial [32]. Comparaciones con la proteína E del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, llevaron a Tischler et al. a considerar la glicoproteína Gc como una proteína potencial de fusión de clase II, tal vez impartiendo actividad de fusión al virión, y esta hipótesis ha ganado apoyo en otros estudios [33, 34]. Se han identificado actividades adicionales con, o se afirma que están relacionadas con, Gn. Para muchos de estos estudios, una premisa subyacente ha sostenido que hay diferencias entre las glicoproteínas de hantavirus -patógenos en relación con virus en el género que se denominan Si bien es cierto que aún no ha sido posible vincular el virus de Prospect Hill (PHV) con la enfermedad humana, la ausencia de evidencia de su patogenicidad tal vez no debería equipararse con la evidencia de su ausencia. Sólo se podría considerar que el nivel de enfermedad (por ejemplo, letargo, fiebre, proteinuria y azotemia) asociado con la infección de primates no humanos por PHV no es significativamente diferente del registrado para los modelos de primates no humanos utilizando el virus conocido del patógeno Puumala (PUUV) [35, 36]. Para el propósito de esta discusión, presumiremos que los hantavirus apatogénicos son efectivamente apatogénicos. Mientras que algunos estudios han sugerido que las glicoproteínas Gn se dirigen más rápidamente a la vía ubiquitina-proteosoma que a las formas apatogénicas, otros han interpretado las diferencias en el manejo de las glicoproteínas Gn a través de especies de hantavirus por el sistema ubiquitina-proteosomal como independientes de la patogenicidad [37] [38] [39]. Algunos investigadores han dirigido sus esfuerzos hacia la identificación de una capacidad diferencial, ya sea cinética o de magnitud absoluta, en la capacidad de los hantavirus patógenos y apatogénicos para provocar una respuesta de interferón en las células. Una premisa que surge es que las formas apatogénicas tenderían a inducir una respuesta innata anterior que haría más probable que el virus se limpiara rápidamente o se volviera menos competente en su replicación, a fin de evitar cualquier respuesta patológica en el huésped [42] La respuesta innata anti-hantavirus puede en algunos casos ser atribuida a la interacción viral como ligando de TLR-3, pero no en otros, y en las células endoteliales, no parece requerir más que la partícula viral misma, incluso cuando se introduce en forma replicativa incompetente [43, 44]. Las proteínas y los ARNm inducidos prominentemente por los hantavirus incluyen MxA e IFIT-1 (ISG-56) y otros incluyendo algunos con actividad antiviral conocida o sospechada. Esos hantavirus, a menudo cepas altamente patógenas, que no inducen una respuesta antiviral potente, se sospechan o se presume que tienen un (más) potente mecanismo de antagonismo interferón-vía en relación con otros virus, un mecanismo que actúa positivamente para prevenir que se forme una respuesta innata efectiva, al menos temprano en la infección Sin embargo, se reportan algunos casos en los que los hantavirus altamente patógenos, tales como NVS, también son capaces de inducir la expresión de los ARNm del gen estimulado por interferón, incluso muy temprano en la infección, con proteínas ISG, como se esperaba, tardando más tiempo en aparecer en la célula [44]. Las actividades anti-interferón también se han atribuido a la proteína NSs que se puede elaborar en células infectadas por serotipos que codifican esta proteína [46]. Otros investigadores han examinado las actividades de las glucoproteínas del hantavirus y otras proteínas que podrían afectar directamente a algunos aspectos de la progresión patogénica asociada a la infección por hantavirus en humanos, tales como cambios de permeabilidad vascular. Mientras que los primeros intentos de causar directamente aumentos en la permeabilidad de las monocapas endoteliales con partículas virales o infección viral fueron en gran medida decepcionantes, los hantavirus se han identificado como que afectan adversamente la migración endotelial sobre los sustratos y en la potenciación de la permeabilidad endotelial inducida por VEG-F [47, 48]. La proteína nucleocápsida o N más corta (+50 kD) es un componente estructural del nucleocápsido viral, junto con los segmentos de ARN viral genómico. Como proteína de unión al ARN que afecta a la horquilla del cabello de los segmentos genómicos con alta afinidad [49, 50], limita el acceso del ARN para alojar nucleasasas y ayuda a hacer que la replicación viral sea un proceso cerrado dentro del citoplasma. También actúa como una proteína de membrana periférica, al igual que la proteína L [51], una actividad que podría jugar un papel en su supuesta, pero aún no demostrada función como matriz [52]. Hasta hace poco, no se había apreciado que N tuviera una amplia variedad de otras actividades, algunas de las cuales pueden estar vinculadas, no sólo a los requisitos fundamentales de replicación, sino también a la interferencia con una serie de procesos intracelulares de la célula normal. Así, se ha propuesto una interacción entre el aminoterminal de la proteína N del hantavirus y la proteína celular Daxx, con la sugerencia de posibles consecuencias pro-apoptóticas [51]. N también se reporta que interactúa con microfilamentos actínicos, y la proteína SUMO-1 [53, 54]. Utilizando ensayos basados en el gen reportero, Connie Schmaljohn y sus colegas han informado que la proteína nucleocapsid del virus Hantaan tiene un papel inhibidor en las respuestas inflamatorias mediadas por NF kappa B (NF- â € € TM B). Los efectos sobre la expresión NF- € B parecen estar limitados a la prevención de su translocación nuclear después de su intento de activación con lipopolisacárido, LPS [55]. En el citoplasma de las células infectadas, la proteína N se puede encontrar en los cuerpos celulares P donde secuestra y protege los capuchones de 5'. Puede localizar los capuchones a través de su interacción con DCP1, un componente clave de los cuerpos P. Durante la infección por hantavirus, los ARN virales se concentran en los cuerpos P, a través de su interacción con N y DCP1. La proteína N demuestra la protección preferencial de los ARNm diseñados para terminar prematuramente su proteína codificada en comparación con los ARNm nativos [56]. La proteína N se ha vinculado cada vez más a la replicación y traducción virales, a veces de maneras no previstas anteriormente. Se encuentra entre una familia creciente de diversas proteínas virales que pueden servir como un inespecífico - ARN chaperone ®, una actividad que debe facilitar el acceso de la L polimerasa al ARNv para la transcripción y replicación, en que puede disociar transitoriamente estructuras de ARN mal dobladas [57]. Algunos de los efectos de la proteína N en la traducción no pueden ser inmediatamente reconocidos como adaptables en la naturaleza. Puede reemplazar todo el complejo de iniciación traslacional EIF4F, presentando simultáneamente el ribosoma con un reemplazo de la actividad de unión de la tapa de eIF 4E, uniéndose al complejo de pre-iniciación 43S, al igual que eIF 4G, al tiempo que reemplaza la actividad helicoidal de eIF 4A, que se presume que es necesaria para disociar la estructura de ARN de orden superior [56, 58]. Estos tres factores normalmente trabajan juntos para lograr la iniciación traslacional. En los cuerpos P, la capacidad de la proteína N de unirse a una alta afinidad a los oligoribonucleótidos celulares nativos tapados, junto con su actividad en la protección de ARNs tapados de la degradación, probablemente facilita el acceso de oligonucleótidos encapsulados para su uso en la iniciación transcripcional por L polimerasa (-cap ra Tráfico de N para el ensamblaje viral: Clásicamente, la proteína N en las células infectadas parece estar agrupada o partículas en la naturaleza, con una concentración pesada en una única ubicación perinuclear, ampliamente considerada como la Golgi [27]. Las proteínas N de los hantavirus se encuentran en asociación con fracciones de partículas, y los estudios confocales microscopía y bioquímico-inhibidores han demostrado que las trazas N a lo largo de microtúbulos pero no con filamentos de actina [52]. El destino final de N, para su ensamblaje en partículas virales es la Golgi, y que circula allí a través del complejo intermedio retículo-Golgi endoplasmático (ERGIC), también conocido como cúmulo vesicular-tubular [52]. Un inhibidor negativo dominante, la dinamitina, asociado con el transporte mediado por Los estudios posteriores sugieren que la dependencia específica del transporte microtubular es específica de los hantavirus del Viejo Mundo como el NVH, pero que el Hantavirus del Nuevo Mundo ANDV está asociado con filamentos de actina [59]. Sin embargo, los datos recientes indican que el transporte microtubular es efectivamente utilizado para el NVH del Nuevo Mundo [60]. Las enfermedades del Hantavirus del hombre desde hace mucho tiempo han sido sospechosas de tener una base inmunopatógena en parte debido a su período de incubación relativamente largo de 2-3 semanas y la asociación temporal observada entre los trastornos inmunológicos y la primera aparición de signos y síntomas de la enfermedad del hantavirus. HFRS y HCPS comparten muchas características clínicas, llevando a muchos investigadores a considerar que son, en esencia, diferentes manifestaciones de un proceso patógeno similar, que difieren principalmente en los órganos objetivo primarios de expresión de la enfermedad (Tabla La patogénesis de las infecciones por hantavirus es el tema de una revisión continuamente actualizada en la serie UpToDate [61]. Para el momento en que aparecen los síntomas en el HCPS, ambas respuestas antivirales fuertes, y, para los genotipos virales más virulentos, el ARN viral puede ser detectado en plasma sanguíneo o células sanguíneas nucleadas respectivamente [63, 64]. Al menos tres estudios han correlacionado el ARN viral plasmático con la gravedad de la enfermedad para el HCPS y el HFRS, sugiriendo que la replicación del virus juega un papel continuo y en tiempo real en la patogénesis viral [65] [66] [67]. Se han identificado varios cambios patológicos distintivos que ocurren tanto en el HFRS como en el HCPS. Una característica crítica de ambos es una fuga capilar transitoria (~ 1-5 días) que involucra el La fuga resultante es de carácter exudativo, con una composición química alta en proteínas y similar al plasma. La experiencia continua que indica el fuerte tropismo tisular para las células endoteliales, específicamente, es uno de los varios factores que hacen de la integra β3 un candidato especialmente atractivo como un importante receptor in vivo para los hantavirus. Es probable que los hantavirus lleguen a sus tejidos objetivo a través de la captación por los ganglios linfáticos regionales, tal vez con o dentro de un histiocito pulmonar escoltante. Las semillas del virus endotelio local, donde las primeras células infectadas dan lugar, en última instancia, a una viremia primaria, un proceso que parece tomar mucho tiempo para las infecciones por hantavirus [62, 63]. En el momento en que emerge la viremia secundaria, los agentes de las formas más severas de HFRS y HCPS han comenzado a alcanzar una masa suficiente para inducir, a través de las interacciones PAMP-PRR y otros medios, la expresión de citoquinas proinflamatorias [64]. Para HCPS, esa expresión favorece el lecho pulmonar y los órganos linfoides, pero, por razones desconocidas, ahorra el retroperitoneo y, en general, el riñón. En HFRS la situación se invierte, y sin embargo no se aprecia a menudo que el esperado tropismos tisulares preferentes de virus asociados a HFRS y sus contrapartes asociadas a HCPS para los lechos renal y pulmonar, respectivamente, no es como se predeciría a través de las manifestaciones de las dos enfermedades. La elaboración local de mediadores inflamatorios y quimiotácticos se considera un requisito para el desarrollo de Sin embargo, no es la hipoxemia, debido al edema pulmonar prominente, lo que conduce a la muerte en la mayoría de los casos fatales de HCPS, sino más bien la intoxicación del corazón por mediadores como aún no definidos, lo que conduce al estado de bajo gasto cardíaco y al síndrome de shock asociado [64, 65]. Es tentador especular que los mediadores producidos en el pulmón en conexión con el infiltrado inflamatorio pueden infiltrarse a través de la circulación coronaria con dilución mínima en HCPS, consecuencia desventajosa de la estrecha yuxtaposición anatómica de los dos órganos. Así, al menos tres clases de mecanismos potenciales, algunos superpuestos y todos ciertamente no exclusivos de los otros, podrían presumirse que subyacen a la patogénesis del HCPS. Estos incluyen:(1) Mecanismos inmunes innatos. La naturaleza de las interacciones entre los patrones moleculares asociados al patógeno del hantavirus (PAMP) y los receptores de reconocimiento del patrón (PRR) de las células endoteliales susceptibles comienzan a ser aclaradas. El HTNV prototípico parece ser reconocido por TLR-3 [43]. Tal infección tiene consecuencias tales como una mayor expresión del HLA-DR en las células dendríticas [66] y la diferenciación de los monocitos hacia las células dendríticas [67]. (2) Efectos virales directos. La correlación observada entre la carga viral y la gravedad de la enfermedad deja abierta la posibilidad de que las partículas del hantavirus o el ARN puedan tener efectos tóxicos sobre las células o sobre la señalización. Algunos investigadores han favorecido la toxicidad viral directa, actuando a través de la inhibición de la función de barrera celular endotelial, como una explicación de gran parte de la fuga capilar, aunque existe Una pista potencialmente importante hacia el mecanismo por el cual las infecciones por hantavirus agotan las plaquetas sanguíneas y, en algunos casos, causan manifestaciones hemorrágicas, fue avanzada por el reciente descubrimiento de que los hantavirus patógenos son capaces de reclutar plaquetas para adherirse a las superficies celulares endoteliales, con β3 integrina utilizada como elemento de unión crítica [69]. (3) Efectos patógenos causados por las actividades de macromoléculas virales específicas. Hemos revisado algunas de las actividades asociadas con los Gn, Gc y N, polipéptidos codificados viralmente en secciones anteriores. Modelos de prueba de patogénesis se pueden hacer más eficazmente cuando hay un modelo animal que imita aspectos clave de la enfermedad. No existe un modelo similar al HFRS, pero existen modelos animales para el transporte asintomático de PUUV y SNV por sus roedores portadores nativos, el banco vole Myodes glareolus y el ratón de venado P. maniculatus; así como un modelo de hámster sirio utilizando ANDV o el virus Aporal relacionado de Venezuela, para el cual se observa una enfermedad mimética HCPS [70] [71] [72] [73]. El modelo de hámster ANDV-Sirio tiene una serie de características en común con la enfermedad humana, así como algunas diferencias. A diferencia de las enfermedades neurológicas que han sido posibles de provocar con HTNV, el modelo de hámster para HCPS parece ser causado por fugas capilares que resultan en edema pulmonar y la producción de un derrame pleural con características exuda Típicamente los hámsteres mueren entre 11 y 14-d post-inoculación, reflejando un período de incubación ligeramente acelerado en comparación con las infecciones humanas. Al igual que con el HCPS humano, el examen microscópico del pulmón revela abundante deposición de fibrina, septo alveolar engrosado y antígeno viral expresado abundantemente en el endotelio microvascular. Los hámsteres infectados por ANDV equipados con dispositivos de monitoreo fisiológico mostraron disminución de las presiones de pulso, taquicardia e hipotensión que parecen imitar de cerca el shock que se cree que es la causa próxima de la muerte en pacientes que sucumben al HCPS [65, 74]. En comparación con la enfermedad humana, los hámsteres infectados por ANDV exhiben títulos excepcionalmente altos de ANDV vivo en sus tejidos, con gran parte de la replicación viral que ocurre en Los títulos de ANDV vivo en algunos casos superan los 10 8 /g, mientras que los aislados de hantavirus de los tejidos humanos han sido notoriamente difíciles de obtener. A pesar de la aparición universal de enzimas hepáticas levemente elevadas en pacientes con HCPS, las enzimas hepáticas no parecen estar presentes en niveles elevados en la sangre de hámsters enfermos incluso inmediatamente antes de la muerte [75]. El período prolongado de incubación asociado con la enfermedad por hantavirus da al huésped un tiempo considerable para montar una respuesta inmune madura contra el virus. Así, en contradición a infecciones de gravedad comparable y sintomatología relacionada asociada con arenavirus y filovirus, las infecciones por hantavirus en humanos se asocian con respuestas anticuerpos de título significativo por el momento en que comienzan los síntomas. A pesar de esta observación, parece ser posible que la variación natural en las respuestas individuales de anticuerpos neutralizantes entre los pacientes con infecciones por NVS pueda estar relacionada con la gravedad de la enfermedad, lo que sugiere que la administración de anticuerpos antivirales podría resultar efectiva terapéuticamente [76]. En el caso de la infección por ANDV, han surgido nuevas evidencias que indican que el aparente aclaramiento del virus de la sangre no resulta en la eliminación completa del estímulo antigénico por el virus, sugiriendo que el virus puede persistir, tal vez en algún sitio inmunológicamente privilegiado aún indeterminado [77]. Un papel para las respuestas patológicas mediadas por células T en el HFRS y el HCPS ha sido la fuente de especulación por una variedad de razones. La gravedad del SNS asociado al SNCP puede haber hecho más evidente que el inicio del edema pulmonar, la taquicardia y la hipertensión parecía estar todo, pero universalmente asociado temporalmente, con la aparición de un espectro de células altamente activadas del linaje linfoide en la sangre periférica. Se detectaron células con similitudes morfológicas cercanas a estos -inmunoblastos- en los pulmones congestionados y pesados de los pacientes que llegaron a la autopsia, así como en órganos linfoides y en las tríadas portal [63, [78] [79] [80]. Estas observaciones llevaron a especular que algún componente de la patogénesis por hantavirus podría estar vinculado a la aparición de células T antivirales que podrían estimular o contribuir a la aparición de una -tormenta de mediadores y el fenotipo de fuga capilar asociado. Estudios posteriores han confirmado la expectativa de que una fracción significativa de la población de inmunoblastos en pacientes con HCPS son células T con especificidad para epitopes específicos de antígenos virales de clase I presentados por el HLA, incluyendo Gn, Gc y N [77, [81] [82] [83]. Presumiblemente, las actividades antivirales de estas células, manifestadas en parte por su elaboración de mediadores en el intersticio afectado, pueden contribuir a la fuga endotelial/capilar que se encuentra en el corazón de la patogénesis del hantavirus. Debido a que los primeros casos de HCPS a menudo llegaron a la autopsia, se hizo posible examinar tejidos necropsiados para la expresión de citocinas. El estudio de Mori et al. (1999) revelaron una alta expresión relativa de citocinas proinflamatorias incluyendo TNF-, IL-1-, IL-6, proporcionando evidencia a favor de un modelo de tormenta de citoquinas para la patogénesis [64]. Los autores creían, basándose en la morfología de las células secretadoras de citoquinas, que tanto monocitos como linfocitos estaban contribuyendo a la producción de citocinas. Que los mediadores proinflamatorios se encuentran en niveles elevados en el plasma, así como el intersticio renal de pacientes con enfermedad hantaviral aguda se ha reconocido desde hace algún tiempo también [84, 85]. Si bien el diagnóstico de HCPS y HFRS se realiza mejor con serología IgM, en la etapa aguda de la infección por NVS, también se puede utilizar RT-PCR si se utilizan células sanguíneas o coágulos de sangre en lugar de plasma o suero, donde la sensibilidad incluso utilizando imprimaciones PCR anidadas disminuye a cerca del 70% [86] [87] [88]. En una instalación en la que se tratan muchos casos de HCPS, el centro médico de la Universidad de Nuevo México en Albuquerque, se ha ofrecido un servicio de diagnóstico en el que se analizan los hallazgos hematológicos del paciente para establecer la probabilidad de que un paciente tenga HCPS. La combinación de trombocitopenia, abundancia elevada de linfocitos -inmunoblasto-, población de células polimorfonucleares con desplazamiento izquierdo sin evidencia morfológica fuerte para su activación, y valores elevados de hemoglobina o hematocrito es altamente específica para el HCPS y permite a los clínicos la capacidad de poner pacientes presuntivos-HCPS en oxigenación de membrana extracorpórea (ECMO), que se cree que ha salvado a muchos pacientes de un resultado letal [89]. Se cree que la infección humana por hantavirus sigue el contacto con secreciones o excreciones producidas por roedores infectados. En los Estados Unidos, 538 infecciones humanas por hantavirus fueron reportadas hasta finales de diciembre de 2009 [90], con Nuevo México, Arizona y Colorado mostrando los casos más altos. Mientras que el prototípico hantavirus centroamericano en América Central fue el virus Rio Segundo de Reithrodontomys mexicanus de Costa Rica, la primera enfermedad humana apareció algunos años más tarde en Panamá, donde el virus Choclo (CHOV) surgió como el agente etiológico y se cree que es responsable de todos los casos conocidos de HCPS. La rata de arroz pigmeo fulvo Oligoryzomys fulvescens ha sido identificada como el reservorio de roedores [91]. En Panamá, los primeros casos de HCPS, aunque con poca o ninguna implicación cardiaca evidente, fueron reportados en 1999, y desde entonces, 106 infecciones humanas han ocurrido con una tasa de mortalidad del 26% [92]. Seroencuestas de mamíferos en México y Costa Rica han encontrado anticuerpos antihantavirus [93] [94] [95] [96], y se han notificado seroprevalencias que oscilan entre 0,6 y 1,6% en poblaciones humanas a pesar de la ausencia de casos conocidos de HCPS [97]. En América del Sur, los casos de HCPS se han identificado en Argentina, Bolivia, Brasil, Chile, Paraguay y Uruguay, y también se han notificado evidencias de exposición humana a hantavirus en Venezuela [98] y Perú [99]. En América del Sur, ANDV es el principal agente etiológico con casos en Chile y Argentina notificados desde 1995. En Chile, se han producido 671 casos de HCPS debido a ANDV durante el período 2001-2009 [100]. Desde 1995 se han reportado más de 1.000 casos de HCPS en Argentina [101] ; en el Brasil se han identificado aproximadamente 1.100 casos de HCPS entre 1993 y 2008 [102]. Las tasas de mortalidad por casos en esos tres países han sido similares, oscilando entre el 30% (Argentina), el 36% (Chile) y el 39% (Brasil). Las infecciones por Hantavirus ocurren con más frecuencia en hombres que en mujeres, aunque la proporción entre hombres y mujeres es muy variable. Por ejemplo, las comunidades panameñas mostraron una proporción de 55 hombres por 45 mujeres [103], mientras que en Chile la proporción es más sesgada por hombres (71%) [104]. En el Chaco paraguayo la proporción entre hombres y mujeres se aproxima al 50% [105]. En América del Norte, en diciembre de 2009 el 63% de los pacientes eran varones [90]. Todos los grupos étnicos y raciales parecen ser susceptibles a infecciones por el hantavirus, y las diferencias entre ciertos grupos (como indígenas y no indígenas) están más probablemente correlacionadas con el tipo de hábitat en el que reside la población (por ejemplo, zonas rurales frente a zonas urbanas). De hecho, las comunidades rurales representan la mayor incidencia global del hantavirus y, por lo tanto, están en mayor riesgo [92, [105] [106] [107] [108] [109] [109] [119], aunque también se ha destacado la importancia de los entornos peridomésticos como una importante zona de exposición [112, 113]. El principal mecanismo por el que los seres humanos adquieren la infección por el hantavirus es la exposición a aerosoles de heces contaminadas de roedores, orina y saliva [114, 115]. Esto puede ocurrir cuando los seres humanos residen en áreas cercanas a las que habitan los roedores, viven en áreas infestadas de roedores, o cuando los roedores invaden entornos humanos, que son más frecuentes en hábitats rurales.Existe una larga historia de coexistencia humana con roedores, lo que plantea dudas sobre el aparente aumento reciente de las enfermedades relacionadas con el hantavirus, especialmente el HCPS. Aparte de una aparente asociación con eventos de oscilación sureña de El Niño (ENSO) en algunas regiones [116, 117], los recientes incrementos en la incidencia del HCPS no parecen seguir un patrón temporal o espacial fácilmente definido. Sin embargo, algunas características del paisaje, como la fragmentación del hábitat o las áreas perturbadas por el ser humano, pueden influir en la dinámica de la población de roedores e impactar en la incidencia viral [118] [112] [112] [121]. A pesar de la estocástica asociada a la contracción de la infección Las actividades humanas en edificios mal ventilados que pulverizan partículas que luego se inhalan (es decir, limpieza, agitación de alfombras, polvo) se identifican con frecuencia entre los pacientes admitidos para el SHCPS [11, 122]. Se cree que las actividades al aire libre transmiten un menor riesgo debido a la labilidad de los hantavirus a la radiación UV y a la supuesta tendencia a dispersarse en el viento, aunque ciertas condiciones ambientales parecen mantener el virus durante períodos más largos fuera de su huésped natural, lo que permite la transmisión indirecta [123]. Una vía alternativa pero poco común de transmisión del virus es la mordedura de roedores [124] [125] [126]. Los trabajadores sobre el terreno que manipulan mamíferos corren un riesgo potencialmente mayor de exposición a infecciones por hantavirus, aunque cuando se cuantifica a través de serosurveys el riesgo absoluto parece bastante leve [127]. Un nuevo estudio en Colorado sugiere la posibilidad de que una picadura de roedor haya sido el vehículo próximo para la transmisión al aire libre de NVS [128], lo que vuelve a enfatizar el uso de equipo de protección personal durante las actividades de trabajo de campo [129]. Como caso particular dentro de los hantavirus, la transmisión de persona a persona ha sido documentada exclusivamente para el virus de los Andes sudamericanos [130] [133] [133] [135]. La identificación de esta vía de transmisión se ha hecho utilizando tanto herramientas moleculares como encuestas epidemiológicas, pero el mecanismo de transmisión interpersonal no está bien establecido. Curiosamente, ANDV también puede ser derramado por los humanos a través de otros fluidos biológicos como la orina [136], ilustrando las propiedades particulares que diferencian este virus de otros hantavirus. Aunque la transmisión interpersonal parece ser única para ANDV, el ARN viral de PUUV se ha detectado en la saliva de pacientes con HFRS, y algunos pacientes con SNV-HCPS tienen ARN viral en las secreciones traqueales [88, 137]. Los Hantavirus en las Américas son alojados naturalmente por roedores (Muridae y Cricetidae) así como las musarañas (Soricidae) y los lunares (Talpidae) (Figura 1). Tres especies de musgo y un mole han sido reportados para albergar hantavirus y su patogenicidad para los humanos permanece desconocida [22, 138, 139]. Se han identificado al menos 15 especies de roedores como portadores de diferentes hantavirus patógenos, con algunos genotipos sudamericanos como Castelo do Sonhos (CDSV) o Hu39694 sólo identificados después de infecciones humanas (Figura 1 ). Los hantavirus suelen mostrar una alta especificidad de especie y ningún huésped intermedio [140]. Sin embargo, se han descrito algunos genotipos de hantavirus en la misma especie de roedores. Tal es el caso de Playa de Oro (OROV) y Catacamas (CATV) identificados en Oryzomys couesi [141, 142], o Maporal (MAPV) y Choclo (CHOV) hospedados por O. fulvescens [91, 143]. En América del Norte se han detectado virus de muleshoe y Black Creek Canal hanta en sigmodon hispidus [ Además, un genotipo de hantavirus (por ejemplo, el virus similar a Juquitiba) puede ser transportado por más de una especie de roedores (O. nigripes, Oxymycterus judex, Akodon montesis). Otro ejemplo es el virus Laguna Negra (LANV) que después de ser identificado en Calomys laucha [146] también ha sido reportado en C. callosus [147]. El rápido aumento en el descubrimiento de nuevos hantavirus y la identificación de sus anfitriones no parece probable que termine tan pronto como se examinen nuevas especies pequeñas de mamíferos [95]. Este tema se complica por la continua controversia en los criterios para la clasificación de distintos hantavirus [148, 149], que también está vinculado a la clasificación taxonómica y los reordenamientos taxonómicos. La transmisión de especies cruzadas es un proceso importante durante la propagación, aparición y evolución Particularmente dentro de los hantavirus, los derrames a los huéspedes secundarios se identifican cada vez más a medida que se realizan estudios más extensos [151] [152] [153] [155] [156]. Por ejemplo, ANDV es el agente etiológico predominante del HCPS en América del Sur, y O. longicaudatus el principal reservorio de roedores. Derrama en al menos otras cuatro especies de roedores que coocurren con el reservorio se han identificado, con Abrothrix longipilis mostrando la segunda mayor prevalencia de anticuerpos de ANDV, y actualmente no hay duda de que el virus es extremadamente similar genéticamente entre los dos roedores del huésped [157, 158]. En América del Norte, el derrame del virus Bayou (BAYV) puede haber ocurrido desde el reservorio principal de O. palustris a S. hispidus, R. fulvescens, P. leucopus y B. taylori [159] [160] [161]. Es más probable que el derrame del virus Hanta se produzca con poblaciones de acogida que habitan regiones simpatricas o sintópicas [151, 162], y la transmisión de especies cruzadas tendría probablemente mayores posibilidades de éxito si las especies anfitrionas están estrechamente relacionadas [163]. Se encuentra una excepción interesante entre el virus Oxbow (OXBV) y el virus Asama (ASAV) en el que un proceso de cambio de huésped parecía haber ocurrido entre mamíferos pertenecientes a dos familias (Talpidae y Soricidae), probablemente como resultado de la codivergencia alterna y recurrente de ciertos tax Los hantavirus son transmitidos horizontalmente entre roedores y no son transmitidos por artrópodos (a diferencia de otros virus de la familia Bunyaviridae). La infección por derrapadores a mamíferos no humanos generalmente no produce ninguna transmisión hacia adelante (o a fin de morir), pero si los seres humanos están infectados pueden resultar en una alta morbilidad y mortalidad [122, 164]. Durante la primavera de 1993, un brote de pacientes con HCPS debido a SNV ocurrió en los estados de Four Corners, resultando en más del 60% de casos de mortalidad entre los casos iniciales, muchos de los cuales involucran a miembros de la tribu Navajo [12, 121]. En Panamá, se notificó un brote durante 1999-2000 en Los Santos, y 12 casos donde se identificaron con tres muertes [165, 166]. Esto representó el primer informe de infecciones por hantavirus humanos en América Central. En América del Sur, Diecisiete individuos fueron identificados con anticuerpo NVS (ELISA) o fueron antígenos (HCI) positivos de 52 casos sospechosos [167]. En 1996 ocurrieron brotes mayores debidos a ANDV en el sur de Argentina [131, 134] ; en el sur de Chile se presentaron grupos de pacientes con enfermedad por hantavirus en 1997 [158]. En Brasil, el primer brote fue identificado en la Amazonía Brasileña (Estado de Maranhão) en el año 2000, e involucró pequeños pueblos que resultaron en una prevalencia del 13,3% de los evaluados (398 residentes totales) [168]. Los factores que desencadenan los brotes de hantavirus todavía son mal entendidos, probablemente porque resultan de varias características bióticas y abióticas interactuantes cuyos parámetros clave son difíciles de modelar. Sin embargo, el uso de nuevos enfoques de modelado que involucran características geográficas y ambientales parece ser prometedor a la hora de predecir posibles brotes de hantavirus y/o áreas de mayor riesgo [169] [170] [171] [172]. Debido a que se sabe que los hantavirus se transmiten directamente de los huéspedes infectados a los susceptibles, el primer enfoque natural es relacionar los brotes con la ecología de los huéspedes virales. La transmisión y persistencia del hantavirus en las poblaciones de roedores depende de varios factores que interactúan para afectar la dinámica ecológica del huésped, que a su vez está fuertemente influenciada por las características de comportamiento de las especies de roedores individuales, a la estructura paisajística y a las características ambientales [173, 174]. La transmisión viral depende de las tasas de contacto entre los huéspedes sensibles, y a pesar de la noción prevaleciente de que un aumento de la densidad se encuentra y, por lo tanto, de Además, se ha demostrado que la transmisión de NVS sigue un patrón de heterogeneidad de contacto, donde los individuos de la población tienen diferentes probabilidades de transmitir la infección [176]. La comprensión de la transmisión viral resulta ser mucho más compleja cuando especies distintas del principal huésped del reservorio se incorporan en el modelo. De hecho, estudios recientes han demostrado que la mayor diversidad de especies hospedantes está correlacionada con una menor prevalencia de infección en América del Norte para P. maniculatus [177], en América Central para O. fulvescens (reservorio del virus Choclo) y Zygodontomys brevicauda (reservorio del virus Calabazo) [178], y en América del Sur para Akodon montensis (reservorio del virus Jabora) [162]. Las tasas de contacto varían según la distribución espacial de las poblaciones y parecen estar Por ejemplo, la prevalencia de SNV en P. maniculatus fue mayor en paisajes con mayor grado de fragmentación del hábitat preferido [179]. Además, ciertas propiedades del paisaje como elevación, pendiente y cubierta terrestre parecen ser útiles para detectar áreas con infecciones persistentes de SNV, y por lo tanto se consideran áreas refugiales donde el virus puede mantenerse durante años [169]. Los cambios en el entorno natural de las especies de reservorios, como la fragmentación forestal y la pérdida de hábitat, pueden alterar la abundancia y distribución de la población y provocar brotes de hantavirus, como se observa en la Península de Azurero de Panamá [118, 119]. Además, las diferencias en el microhábitat, incluida la cubierta superficial, pueden conducir a diferencias en la dinámica ecológica dentro de las poblaciones y afectar a la tasa de exposición al virus [180]. Se han encontrado diferencias en las infecciones por hantavirus a través de paisajes contrastantes en el intervalo latitudinal en poblaciones de roedores de O. longicaudatus en Chile, lo que sugiere que los seres humanos están expuestos de manera diferencial al virus [107, 181]. La dinámica poblacional de roedores se ve afectada por cambios estacionales de clima y clima [182, 183]. En el caso de los brotes asociados a ENSO, se ha postulado una compleja cascada de eventos desencadenados por lluvias altamente inusuales en el año precedente para dar lugar a un aumento de la producción primaria y densidades de roedores, aumentando también la probabilidad de transmisión del virus a los seres humanos, pero ha resultado difícil demostrar con precisión los eventos intermedios sugeridos, como el aumento de las densidades de roedores en el aumento de la carga de casos [116, 121, 184]. En América del Sur, los efectos del cambio climático y los brotes de hantavirus no han sido bien estudiados, a pesar del conocimiento de que varias especies de roedores que son reservorios de enfermedades emergentes se han visto dramáticamente afectadas por eventos como El Niño [185]. Los cambios en la dinámica de la población de acogida también se ven afectados por la estacionalidad, lo que puede conducir a brotes de enfermedades cuando se interrumpen los procesos que equilibran las poblaciones de roedores de temporada en temporada [186]. La emergencia viral puede seguir promoviéndose a medida que los cambios introducidos por el ser humano continúan aumentando en el medio ambiente a diferentes escalas geográficas. Estos cambios también pueden alterar la estructura y dinámica de la población de roedores e interacciones interespecies creando condiciones que pueden conducir a brotes virales, establecimiento viral en nuevos hospederos, y la aparición de HCPS [102, 162], incluso con aparentemente leve perturbación ecológica al sistema virus-hospedero [188]. Ciertas características fisiopatológicas, incluyendo trombocitopenia y shock, de enfermedades por hantavirus de los seres humanos, tienen similitud sustancial con las fiebres hemorrágicas inducidas por otros virus tales arenavirus, filovirus y flavivirus, a pesar de compartir esencialmente ninguna secuencia similitud con ellos. Tales observaciones plantean preguntas acerca de si tales similitudes en la patogénesis son probables similitudes de fenotipo, o en cambio reportan la presencia de mecanismos moleculares comunes entre los virus. En esta revisión se discuten las propiedades generales, descubrimientos y epidemiología/ecología de las formas de hantavirus patógenos del Nuevo Mundo, y también se busca identificar algunas de las características de las macromoléculas virales y mecanismos inmunológicos que se han propuesto como potenciales mediadores directos de los eventos patógenos que caracterizan la enfermedad humana HCPS. Si bien es poco probable que la expresión de una proteína viral particular o ARNs en aislamiento se pueda confiar en replicar fenotipos clave de infección por el virus completo, algunos de los hallazgos han sido suficientemente consistentes con lo que se conoce de la patogénesis in vivo que ofrecen plomos plausibles de primer paso en la búsqueda de objetivos terapéuticos. Esperamos con interés las revelaciones mecanísticas que seguirán el uso inevitablemente ampliado de métodos poderosos como la secuenciación profunda, imágenes cada vez más avanzadas, y métodos microscópicos, y modelos animales que por fin se pueden decir

¿Qué es la proteína N?

Los hantavirus en las Américas y su papel como patógenos emergenteshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3185593/SHA: efe13a8d42b60ef9f7387ea539a1b2eeb5f80101Autores: Hjelle, Brian; Torres-Pérez, FernandoFecha: 2010-11-25DOI: 10.3390/v2125559Licencia: cc-byAbstract: La continua aparición y reaparición de patógenos representan una amenaza continua, a veces mayor, para las poblaciones. Los hantavirus (familia Bunyaviridae) y sus enfermedades humanas asociadas se consideraron confinados a Eurasia, pero la aparición de un brote en el suroeste de Estados Unidos llevó a un gran aumento en su estudio entre los virólogos de todo el mundo. Se han descrito más de 40 genotipos hantavirales, la gran mayoría desde 1993, y casi la mitad de ellos patógenos para los seres humanos. Los hantavirus causan infecciones persistentes en sus reservorios, y en las Américas, la enfermedad humana se manifiesta como compromiso cardiopulmonar, síndrome cardiopulmonar del hantavirus (HCPS), con proporciones de casos-fatalidad, para los serotipos virales más comunes, entre el 30% y el 40%. Alteración del hábitat y trastornos ecológicos a mayor escala, tal vez incluyendo el cambio climático, son algunos de los factores que pueden haber aumentado la carga de casos humanos de HCPS entre 1993 y el presente. Consideramos aquí las características que influyen en la estructura de la dinámica de la población huésped que pueden conducir a brotes virales, así como los determinantes macromoleculares de los hantavirus que han sido considerados como potenciales contribuciones a la patogenicidad. Texto: Los patógenos emergentes causan enfermedades nuevas o no reconocidas anteriormente, y entre ellas, las zoonóticas emergentes son una preocupación importante entre los científicos que estudian enfermedades infecciosas a diferentes escalas espaciales y temporales [1, 2]. Los cambios en las condiciones bióticas y abióticas pueden alterar la dinámica de las enfermedades de la población y conducir a la aparición de infecciones zoonóticas [3] [5] [6]. Durante las últimas décadas, se han producido varios brotes de patógenos virales emergentes y reemergentes, que afectan tanto a la implicación puramente local como a nivel mundial/pandémica de las poblaciones humanas. Entre los ejemplos visibles están la gripe A, el virus del Ébola, el virus de la hepatitis C, el trastorno respiratorio grave para adultos (SARS), el coronavirus y el virus de la inmunodeficiencia humana, que desafían las medidas de prevención y control de los sistemas de salud pública [7]. En las Américas, el reciente brote de gripe pandémica A subtipo H1N1 se convirtió en un objetivo importante de control debido a su rápida propagación, y las incertidumbres en cuanto a virulencia y transmisibilidad, sin embargo, la disponibilidad de vacunas fue limitada cuando se produjo una actividad significativa antes de la temporada tradicional de gripe [8]. Sin embargo, en el último siglo han surgido o resurgido brotes de varias enfermedades virales relacionadas con el virus arenavirus y el virus del dengue, y más recientemente, hantavirus y la expansión del rango geográfico del virus del Nilo Occidental. Entre las enfermedades zoonóticas, los mamíferos pequeños son anfitriones de varios virus ARN patógenos, especialmente Arenaviridae y Bunyaviridae: Hantavirus [9] [10] [11]. Las infecciones por hantavirus se convirtieron en una preocupación en las Américas después de la descripción de un brote de distrés respiratorio agudo ocurrido en La enfermedad recientemente reconocida, el síndrome cardiopulmonar del hantavirus, el HCPS (o síndrome pulmonar del hantavirus), se relacionó con la infección por el virus del Sin Nombre (SNV) recién descubierto, y el roedor Peromyscus maniculatus (ratón venado) fue identificado como el reservorio [13]. Sin embargo, las infecciones por hantavirus tienen una historia mucho más larga. Una revisión de los escritos chinos antiguos, que datan de aproximadamente 960 dC, reveló descripciones muy parecidas a la fiebre hemorrágica con síndrome renal (HFRS), el síndrome causado por los hantavirus del Viejo Mundo [14]. Durante el siglo XX, los casos de enfermedad febril aguda con compromiso renal fueron descritos de varios países eurasiáticos y Japón, a menudo en asociación con compromisos militares [15]. El HFRS como síndrome distinto, sin embargo, fue llamado por primera vez a la atención de la medicina occidental en asociación con un brote que ocurrió entre las tropas de las Naciones Unidas durante el conflicto coreano entre 1951 y 1954, donde más de 3.200 soldados fueron afectados [16]. Tomó más de dos décadas hasta que el agente etiológico, el virus Hantaan (HTNV), fue aislado del ratón de campo rayado Apodemus agrarius, detectado en parte por la unión de anticuerpos de muestras de suero de paciente a los tejidos pulmonares de ratones de campo sanos y salvajes [17, 18]. El virus se encontró más tarde para representar la especie tipo de un nuevo género Hantavirus de la familia Bunyaviridae, aunque fue más tarde evidente que el primer hantavirus a aislarse fue el virus Thottapalayam de shrew-borne [19]. La categorización de los hantavirus como pertenecientes a la familia Bunyaviridae se debe en parte a la presencia consistente de tres genomas de ARN que son circularizados in vivo como resultado de la presencia de nucleótidos terminales complementarios que ayudan a doblar el genoma en una morfología -hairpin-, descrita por primera vez para el flebovirus Uukuniemi [19, 20]. La Tabla 1 es una lista de los hantavirus patógenos predominantemente distintos serológicamente. Se describen muchos otros genotipos llamados, pero tales otras formas patogénicas están generalmente estrechamente relacionadas con los Andes o, en algunos casos, el virus Sin Nombre. Durante la maduración del virus, el precursor forma GPC se procesa utilizando una proteasa unida a la membrana en Gn y Gc, una escisión que ocurre, y parece ser señalada, después de la señal péptida conservada WAASA en la C-terminal de Gn [24]. Aunque las dos proteínas se pueden expresar de forma independiente a través de la transfección, pueden ser retenidas en el compartimento celular incorrecto (ER o aggrosome); por lo tanto, deben ser co-expresadas para permitirles estabilidad para que las dos se puedan ensamblar correctamente en el Golgi [25, [27] [28]. Se han identificado varias actividades y propiedades para las glicoproteínas envolventes del hantavirus, incluyendo algunas características que se sospecha que están involucradas en la patogenicidad de los serotipos causantes de la enfermedad, una posibilidad que ha generado atención experimental. Las glucoproteínas son los ligandos conocidos o presuntos para al menos dos receptores celulares distintos, la cadena de integrina y el factor acelerador de la descomposición, o DAF [30, 31] ; con gC1qR/p32 también identificado como otro receptor de entrada potencial [32]. Comparaciones con la proteína E del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, llevaron a Tischler et al. a considerar la glicoproteína Gc como una proteína potencial de fusión de clase II, tal vez impartiendo actividad de fusión al virión, y esta hipótesis ha ganado apoyo en otros estudios [33, 34]. Se han identificado actividades adicionales con, o se afirma que están relacionadas con, Gn. Para muchos de estos estudios, una premisa subyacente ha sostenido que hay diferencias entre las glicoproteínas de hantavirus -patógenos en relación con virus en el género que se denominan Si bien es cierto que aún no ha sido posible vincular el virus de Prospect Hill (PHV) con la enfermedad humana, la ausencia de evidencia de su patogenicidad tal vez no debería equipararse con la evidencia de su ausencia. Sólo se podría considerar que el nivel de enfermedad (por ejemplo, letargo, fiebre, proteinuria y azotemia) asociado con la infección de primates no humanos por PHV no es significativamente diferente del registrado para los modelos de primates no humanos utilizando el virus conocido del patógeno Puumala (PUUV) [35, 36]. Para el propósito de esta discusión, presumiremos que los hantavirus apatogénicos son efectivamente apatogénicos. Mientras que algunos estudios han sugerido que las glicoproteínas Gn se dirigen más rápidamente a la vía ubiquitina-proteosoma que a las formas apatogénicas, otros han interpretado las diferencias en el manejo de las glicoproteínas Gn a través de especies de hantavirus por el sistema ubiquitina-proteosomal como independientes de la patogenicidad [37] [38] [39]. Algunos investigadores han dirigido sus esfuerzos hacia la identificación de una capacidad diferencial, ya sea cinética o de magnitud absoluta, en la capacidad de los hantavirus patógenos y apatogénicos para provocar una respuesta de interferón en las células. Una premisa que surge es que las formas apatogénicas tenderían a inducir una respuesta innata anterior que haría más probable que el virus se limpiara rápidamente o se volviera menos competente en su replicación, a fin de evitar cualquier respuesta patológica en el huésped [42] La respuesta innata anti-hantavirus puede en algunos casos ser atribuida a la interacción viral como ligando de TLR-3, pero no en otros, y en las células endoteliales, no parece requerir más que la partícula viral misma, incluso cuando se introduce en forma replicativa incompetente [43, 44]. Las proteínas y los ARNm inducidos prominentemente por los hantavirus incluyen MxA e IFIT-1 (ISG-56) y otros incluyendo algunos con actividad antiviral conocida o sospechada. Esos hantavirus, a menudo cepas altamente patógenas, que no inducen una respuesta antiviral potente, se sospechan o se presume que tienen un (más) potente mecanismo de antagonismo interferón-vía en relación con otros virus, un mecanismo que actúa positivamente para prevenir que se forme una respuesta innata efectiva, al menos temprano en la infección [4 Sin embargo, se reportan algunos casos en los que los hantavirus altamente patógenos, tales como NVS, también son capaces de inducir la expresión de los ARNm del gen estimulado por interferón, incluso muy temprano en la infección, con proteínas ISG, como se esperaba, tardando más tiempo en aparecer en la célula [44]. Las actividades anti-interferón también se han atribuido a la proteína NSs que se puede elaborar en células infectadas por serotipos que codifican esta proteína [46]. Otros investigadores han examinado las actividades de las glucoproteínas del hantavirus y otras proteínas que podrían afectar directamente a algunos aspectos de la progresión patogénica asociada a la infección por hantavirus en humanos, tales como cambios de permeabilidad vascular. Mientras que los primeros intentos de causar directamente aumentos en la permeabilidad de las monocapas endoteliales con partículas virales o infección viral fueron en gran medida decepcionantes, los hantavirus se han identificado como que afectan adversamente la migración endotelial sobre los sustratos y en la potenciación de la permeabilidad endotelial inducida por VEG-F [47, 48]. La proteína nucleocápsida o N más corta (+50 kD) es un componente estructural del nucleocápsido viral, junto con los segmentos de ARN viral genómico. Como proteína de unión al ARN que afecta a la horquilla del cabello de los segmentos genómicos con alta afinidad [49, 50], limita el acceso del ARN para alojar nucleasasas y ayuda a hacer que la replicación viral sea un proceso cerrado dentro del citoplasma. También actúa como una proteína de membrana periférica, al igual que la proteína L [51], una actividad que podría jugar un papel en su supuesta, pero aún no demostrada función como matriz [52]. Hasta hace poco, no se había apreciado que N tuviera una amplia variedad de otras actividades, algunas de las cuales pueden estar vinculadas, no sólo a los requisitos fundamentales de replicación, sino también a la interferencia con una serie de procesos intracelulares de la célula normal. Así, se ha propuesto una interacción entre el aminoterminal de la proteína N del hantavirus y la proteína celular Daxx, con la sugerencia de posibles consecuencias pro-apoptóticas [51]. N también se reporta que interactúa con microfilamentos actínicos, y la proteína SUMO-1 [53, 54]. Utilizando ensayos basados en el gen reportero, Connie Schmaljohn y sus colegas han informado que la proteína nucleocapsid del virus Hantaan tiene un papel inhibidor en las respuestas inflamatorias mediadas por NF kappa B (NF- â € € TM B). Los efectos sobre la expresión NF- € B parecen estar limitados a la prevención de su translocación nuclear después de su intento de activación con lipopolisacárido, LPS [55]. En el citoplasma de las células infectadas, la proteína N se puede encontrar en los cuerpos celulares P donde secuestra y protege los capuchones de 5'. Puede localizar los capuchones a través de su interacción con DCP1, un componente clave de los cuerpos P. Durante la infección por hantavirus, los ARN virales se concentran en los cuerpos P, a través de su interacción con N y DCP1. La proteína N demuestra la protección preferencial de los ARNm diseñados para terminar prematuramente su proteína codificada en comparación con los ARNm nativos [56]. La proteína N se ha vinculado cada vez más a la replicación y traducción virales, a veces de maneras no previstas anteriormente. Se encuentra entre una familia creciente de diversas proteínas virales que pueden servir como un inespecífico - ARN chaperone ®, una actividad que debe facilitar el acceso de la L polimerasa al ARNv para la transcripción y replicación, en que puede disociar transitoriamente estructuras de ARN mal dobladas [57]. Algunos de los efectos de la proteína N en la traducción no pueden ser inmediatamente reconocidos como adaptables en la naturaleza. Puede reemplazar todo el complejo de iniciación traslacional EIF4F, presentando simultáneamente el ribosoma con un reemplazo de la actividad de unión de la tapa de eIF 4E, uniéndose al complejo de pre-iniciación 43S, al igual que eIF 4G, al tiempo que reemplaza la actividad helicoidal de eIF 4A, que se presume que es necesaria para disociar la estructura de ARN de orden superior [56, 58]. Estos tres factores normalmente trabajan juntos para lograr la iniciación traslacional. En los cuerpos P, la capacidad de la proteína N de unirse a una alta afinidad a los oligoribonucleótidos celulares nativos tapados, junto con su actividad en la protección de ARNs tapados de la degradación, probablemente facilita el acceso de oligonucleótidos encapsulados para su uso en la iniciación transcripcional por L polimerasa (-cap ra Tráfico de N para el ensamblaje viral: Clásicamente, la proteína N en las células infectadas parece estar agrupada o partículas en la naturaleza, con una concentración pesada en una única ubicación perinuclear, ampliamente considerada como la Golgi [27]. Las proteínas N de los hantavirus se encuentran en asociación con fracciones de partículas, y los estudios confocales microscopía y bioquímico-inhibidores han demostrado que las trazas N a lo largo de microtúbulos pero no con filamentos de actina [52]. El destino final de N, para su ensamblaje en partículas virales es la Golgi, y que circula allí a través del complejo intermedio retículo-Golgi endoplasmático (ERGIC), también conocido como cúmulo vesicular-tubular [52]. Un inhibidor negativo dominante, la dinamitina, asociado con el transporte mediado por Los estudios posteriores sugieren que la dependencia específica del transporte microtubular es específica de los hantavirus del Viejo Mundo como el NVH, pero que el Hantavirus del Nuevo Mundo ANDV está asociado con filamentos de actina [59]. Sin embargo, los datos recientes indican que el transporte microtubular es efectivamente utilizado para el NVH del Nuevo Mundo [60]. Las enfermedades del Hantavirus del hombre desde hace mucho tiempo han sido sospechosas de tener una base inmunopatógena en parte debido a su período de incubación relativamente largo de 2-3 semanas y la asociación temporal observada entre los trastornos inmunológicos y la primera aparición de signos y síntomas de la enfermedad del hantavirus. HFRS y HCPS comparten muchas características clínicas, llevando a muchos investigadores a considerar que son, en esencia, diferentes manifestaciones de un proceso patógeno similar, que difieren principalmente en los órganos objetivo primarios de expresión de la enfermedad (Tabla La patogénesis de las infecciones por hantavirus es el tema de una revisión continuamente actualizada en la serie UpToDate [61]. Para el momento en que aparecen los síntomas en el HCPS, ambas respuestas antivirales fuertes, y, para los genotipos virales más virulentos, el ARN viral puede ser detectado en plasma sanguíneo o células sanguíneas nucleadas respectivamente [63, 64]. Al menos tres estudios han correlacionado el ARN viral plasmático con la gravedad de la enfermedad para el HCPS y el HFRS, sugiriendo que la replicación del virus juega un papel continuo y en tiempo real en la patogénesis viral [65] [66] [67]. Se han identificado varios cambios patológicos distintivos que ocurren tanto en el HFRS como en el HCPS. Una característica crítica de ambos es una fuga capilar transitoria (~ 1-5 días) que involucra el La fuga resultante es de carácter exudativo, con una composición química alta en proteínas y similar al plasma. La experiencia continua que indica el fuerte tropismo tisular para las células endoteliales, específicamente, es uno de los varios factores que hacen de la integra β3 un candidato especialmente atractivo como un importante receptor in vivo para los hantavirus. Es probable que los hantavirus lleguen a sus tejidos objetivo a través de la captación por los ganglios linfáticos regionales, tal vez con o dentro de un histiocito pulmonar escoltante. Las semillas del virus endotelio local, donde las primeras células infectadas dan lugar, en última instancia, a una viremia primaria, un proceso que parece tomar mucho tiempo para las infecciones por hantavirus [62, 63]. En el momento en que emerge la viremia secundaria, los agentes de las formas más severas de HFRS y HCPS han comenzado a alcanzar una masa suficiente para inducir, a través de las interacciones PAMP-PRR y otros medios, la expresión de citoquinas proinflamatorias [64]. Para HCPS, esa expresión favorece el lecho pulmonar y los órganos linfoides, pero, por razones desconocidas, ahorra el retroperitoneo y, en general, el riñón. En HFRS la situación se invierte, y sin embargo no se aprecia a menudo que el esperado tropismos tisulares preferentes de virus asociados a HFRS y sus contrapartes asociadas a HCPS para los lechos renal y pulmonar, respectivamente, no sea como se predeciría a través de las manifestaciones de las dos enfermedades. La elaboración local de mediadores inflamatorios y quimiotácticos se considera un requisito para el desarrollo Sin embargo, no es la hipoxemia, debido al edema pulmonar prominente, lo que conduce a la muerte en la mayoría de los casos fatales de HCPS, sino más bien la intoxicación del corazón por mediadores como aún no definidos, lo que conduce al estado de bajo gasto cardíaco y al síndrome de shock asociado [64, 65]. Es tentador especular que los mediadores producidos en el pulmón en conexión con el infiltrado inflamatorio pueden infiltrarse a través de la circulación coronaria con dilución mínima en HCPS, consecuencia desventajosa de la estrecha yuxtaposición anatómica de los dos órganos. Así, al menos tres clases de mecanismos potenciales, algunos superpuestos y todos ciertamente no exclusivos de los otros, podrían presumirse que subyacen a la patogénesis del HCPS. Estos incluyen:(1) Mecanismos inmunes innatos. La naturaleza de las interacciones entre los patrones moleculares asociados al patógeno del hantavirus (PAMP) y los receptores de reconocimiento del patrón (PRR) de las células endoteliales susceptibles comienzan a ser aclaradas. El HTNV prototípico parece ser reconocido por TLR-3 [43]. Tal infección tiene consecuencias tales como una mayor expresión del HLA-DR en las células dendríticas [66] y la diferenciación de los monocitos hacia las células dendríticas [67]. (2) Efectos virales directos. La correlación observada entre la carga viral y la gravedad de la enfermedad deja abierta la posibilidad de que las partículas del hantavirus o el ARN puedan tener efectos tóxicos sobre las células o sobre la señalización. Algunos investigadores han favorecido la toxicidad viral directa, actuando a través de la inhibición de la función de barrera celular endotelial, como una explicación de gran parte de la fuga capilar, aunque existe Una pista potencialmente importante hacia el mecanismo por el cual las infecciones por hantavirus agotan las plaquetas sanguíneas y, en algunos casos, causan manifestaciones hemorrágicas, fue avanzada por el reciente descubrimiento de que los hantavirus patógenos son capaces de reclutar plaquetas para adherirse a las superficies celulares endoteliales, con β3 integrina utilizada como elemento de unión crítica [69]. (3) Efectos patógenos causados por las actividades de macromoléculas virales específicas. Hemos revisado algunas de las actividades asociadas con los Gn, Gc y N, polipéptidos codificados viralmente en secciones anteriores. Modelos de prueba de patogénesis se pueden hacer más eficazmente cuando hay un modelo animal que imita aspectos clave de la enfermedad. No existe un modelo similar al HFRS, pero existen modelos animales para el transporte asintomático de PUUV y SNV por sus roedores portadores nativos, el banco vole Myodes glareolus y el ratón venado P. maniculatus; así como un modelo hámster sirio utilizando ANDV o el virus Aporal relacionado de Venezuela, para el cual se observa una enfermedad mimética HCPS [70] [71] [72] [73]. El modelo hámster ANDV-Sirio tiene una serie de características en común con la enfermedad humana, así como algunas diferencias. A diferencia de las enfermedades neurológicas que han sido posibles de provocar con HTNV, el modelo hámster para HCPS parece ser causado por fugas capilares que resultan en edema pulmonar y la producción de un derrame pleural con características exudativas. Típicamente los hámsteres mueren entre 11 y 14-d post-inoculación, reflejando un período de incubación ligeramente acelerado en comparación con las infecciones humanas. Al igual que con el HCPS humano, el examen microscópico del pulmón revela abundante deposición de fibrina, septo alveolar engrosado y antígeno viral expresado abundantemente en el endotelio microvascular. Los hámsteres infectados por ANDV equipados con dispositivos de monitoreo fisiológico mostraron disminución de las presiones de pulso, taquicardia e hipotensión que parecen imitar de cerca el shock que se cree que es la causa próxima de la muerte en pacientes que sucumben al HCPS [65, 74]. En comparación con la enfermedad humana, los hámsteres infectados por ANDV exhiben títulos excepcionalmente altos de ANDV vivo en sus tejidos, con gran parte de la replicación viral que se produce Los títulos de ANDV vivo en algunos casos superan los 10 8 /g, mientras que los aislados de hantavirus de los tejidos humanos han sido notoriamente difíciles de obtener. A pesar de la aparición universal de enzimas hepáticas levemente elevadas en pacientes con HCPS, las enzimas hepáticas no parecen estar presentes en niveles elevados en la sangre de hámsters enfermos incluso inmediatamente antes de la muerte [75]. El período prolongado de incubación asociado con la enfermedad por hantavirus da al huésped un tiempo considerable para montar una respuesta inmune madura contra el virus. Así, en contradición a infecciones de gravedad comparable y sintomatología relacionada asociada con arenavirus y filovirus, las infecciones por hantavirus en humanos se asocian con respuestas anticuerpos de título significativo por el momento en que comienzan los síntomas. A pesar de esta observación, parece ser posible que la variación natural en las respuestas individuales de anticuerpos neutralizantes entre los pacientes con infecciones por NVS pueda estar relacionada con la gravedad de la enfermedad, lo que sugiere que la administración de anticuerpos antivirales podría resultar efectiva terapéuticamente [76]. En el caso de la infección por ANDV, han surgido nuevas evidencias que indican que el aparente aclaramiento del virus de la sangre no resulta en la eliminación completa del estímulo antigénico por el virus, sugiriendo que el virus puede persistir, tal vez en algún sitio inmunológicamente privilegiado aún indeterminado [77]. Un papel para las respuestas patológicas mediadas por células T en el HFRS y el HCPS ha sido la fuente de especulación por una variedad de razones. La gravedad del SNS asociado a la NVS puede haber hecho más evidente que el inicio del edema pulmonar, la taquicardia y la hipertensión parecía estar todo, pero universalmente asociado temporalmente, con la aparición de un espectro de células altamente activadas del linaje linfoide en la sangre periférica. Se detectaron células con similitudes morfológicas cercanas a estos -inmunoblastos- en los pulmones congestionados y pesados de los pacientes que llegaron a la autopsia, así como en órganos linfoides y en las tríadas portal [63, [78] [79] [80]. Estas observaciones llevaron a especular que algún componente de la patogénesis por hantavirus podría estar vinculado a la aparición de células T antivirales que podrían estimular o contribuir a la aparición de una -tormenta de mediadores y el fenotipo de fuga capilar asociado. Estudios posteriores han confirmado la expectativa de que una fracción significativa de la población de inmunoblastos en pacientes con HCPS son células T con especificidad para epitopes específicos de antígenos virales de clase I presentados por el HLA, incluyendo Gn, Gc y N [77, [81] [82] [83]. Presumiblemente, las actividades antivirales de estas células, manifestadas en parte por su elaboración de mediadores en el intersticio afectado, pueden contribuir a la fuga endotelial/capilar que se encuentra en el corazón de la patogénesis del hantavirus. Debido a que los primeros casos de HCPS a menudo llegaron a la autopsia, se hizo posible examinar tejidos necropsiados para la expresión de citocinas. El estudio de Mori et al. (1999) revelaron una alta expresión relativa de citocinas proinflamatorias incluyendo TNF-, IL-1-, IL-6, proporcionando evidencia a favor de un modelo de tormenta de citoquinas para la patogénesis [64]. Los autores creían, basándose en la morfología de las células secretadoras de citoquinas, que tanto monocitos como linfocitos estaban contribuyendo a la producción de citocinas. Que los mediadores proinflamatorios se encuentran en niveles elevados en el plasma, así como el intersticio renal de pacientes con enfermedad hantaviral aguda se ha reconocido desde hace algún tiempo también [84, 85]. Si bien el diagnóstico de HCPS y HFRS se realiza mejor con serología IgM, en la etapa aguda de la infección por NVS, también se puede utilizar RT-PCR si se utilizan células sanguíneas o coágulos de sangre en lugar de plasma o suero, donde la sensibilidad incluso utilizando imprimaciones PCR anidadas disminuye a cerca del 70% [86] [87] [88]. En una instalación en la que se tratan muchos casos de HCPS, el centro médico de la Universidad de Nuevo México en Albuquerque, se ha ofrecido un servicio de diagnóstico en el que se analizan los hallazgos hematológicos del paciente para establecer la probabilidad de que un paciente tenga HCPS. La combinación de trombocitopenia, abundancia elevada de linfocitos -inmunoblasto-, población de células polimorfonucleares con desplazamiento izquierdo sin evidencia morfológica fuerte para su activación, y valores elevados de hemoglobina o hematocrito es altamente específica para el HCPS y permite a los clínicos la capacidad de poner pacientes presuntivos-HCPS en oxigenación de membrana extracorpórea (ECMO), que se cree que ha salvado a muchos pacientes de un resultado letal [89]. Se cree que la infección humana por hantavirus sigue el contacto con secreciones o excreciones producidas por roedores infectados. En los Estados Unidos, 538 infecciones humanas por hantavirus fueron reportadas hasta finales de diciembre de 2009 [90], con Nuevo México, Arizona y Colorado mostrando los casos más altos. Mientras que el prototípico hantavirus centroamericano en América Central fue el virus Rio Segundo de Reithrodontomys mexicanus de Costa Rica, la primera enfermedad humana apareció algunos años más tarde en Panamá, donde el virus Choclo (CHOV) surgió como el agente etiológico y se cree que es responsable de todos los casos conocidos de HCPS. La rata de arroz pigmeo fulvo Oligoryzomys fulvescens ha sido identificada como el reservorio de roedores [91]. En Panamá, los primeros casos de HCPS, aunque con poca o ninguna implicación cardiaca evidente, fueron reportados en 1999, y desde entonces, 106 infecciones humanas han ocurrido con una tasa de mortalidad del 26% [92]. Seroencuestas de mamíferos en México y Costa Rica han encontrado anticuerpos antihantavirus [93] [94] [95] [96], y se han notificado seroprevalencias que oscilan entre 0,6 y 1,6% en poblaciones humanas a pesar de la ausencia de casos conocidos de HCPS [97]. En América del Sur, los casos de HCPS se han identificado en Argentina, Bolivia, Brasil, Chile, Paraguay y Uruguay, y también se han notificado evidencias de exposición humana a hantavirus en Venezuela [98] y Perú [99]. En América del Sur, ANDV es el principal agente etiológico con casos en Chile y Argentina notificados desde 1995. En Chile, se han producido 671 casos de HCPS debido a ANDV durante el período 2001-2009 [100]. Desde 1995 se han reportado más de 1.000 casos de HCPS en Argentina [101] ; en el Brasil se han identificado aproximadamente 1.100 casos de HCPS entre 1993 y 2008 [102]. Las tasas de mortalidad por casos en esos tres países han sido similares, oscilando entre el 30% (Argentina), el 36% (Chile) y el 39% (Brasil). Las infecciones por Hantavirus ocurren con más frecuencia en hombres que en mujeres, aunque la proporción entre hombres y mujeres es muy variable. Por ejemplo, las comunidades panameñas mostraron una proporción de 55 hombres por 45 mujeres [103], mientras que en Chile la proporción es más sesgada por hombres (71%) [104]. En el Chaco paraguayo la proporción entre hombres y mujeres se aproxima al 50% [105]. En América del Norte, en diciembre de 2009 el 63% de los pacientes eran varones [90]. Todos los grupos étnicos y raciales parecen ser susceptibles a infecciones por el hantavirus, y las diferencias entre ciertos grupos (como indígenas y no indígenas) están más probablemente correlacionadas con el tipo de hábitat en el que reside la población (por ejemplo, zonas rurales frente a zonas urbanas). De hecho, las comunidades rurales representan la mayor incidencia global del hantavirus y, por lo tanto, están en mayor riesgo [92, [105] [106] [107] [108] [109] [109] [119], aunque también se ha destacado la importancia de los entornos peridomésticos como una importante zona de exposición [112, 113]. El principal mecanismo por el que los seres humanos adquieren la infección por el hantavirus es la exposición a aerosoles de heces contaminadas de roedores, orina y saliva [114, 115]. Esto puede ocurrir cuando los seres humanos residen en áreas cercanas a las que habitan los roedores, viven en áreas infestadas de roedores, o cuando los roedores invaden entornos humanos, que son más frecuentes en hábitats rurales.Existe una larga historia de coexistencia humana con roedores, lo que plantea dudas sobre el aparente aumento reciente de las enfermedades relacionadas con el hantavirus, especialmente el HCPS. Aparte de una aparente asociación con eventos de oscilación sureña de El Niño (ENSO) en algunas regiones [116, 117], los recientes incrementos en la incidencia del HCPS no parecen seguir un patrón temporal o espacial fácilmente definido. Sin embargo, algunas características del paisaje, como la fragmentación del hábitat o las áreas perturbadas por el ser humano, pueden influir en la dinámica de la población de roedores e impactar en la incidencia viral [118] [112] [112] [121]. A pesar de la estocástica asociada a la contracción de la infección Las actividades humanas en edificios mal ventilados que pulverizan partículas que luego se inhalan (es decir, limpieza, agitación de alfombras, polvo) se identifican con frecuencia entre los pacientes admitidos para el SHCPS [11, 122]. Se cree que las actividades al aire libre transmiten un menor riesgo debido a la labilidad de los hantavirus a la radiación UV y a la supuesta tendencia a dispersarse en el viento, aunque ciertas condiciones ambientales parecen mantener el virus durante períodos más largos fuera de su huésped natural, lo que permite la transmisión indirecta [123]. Una vía alternativa pero poco común de transmisión del virus es la mordedura de roedores [124] [125] [126]. Los trabajadores sobre el terreno que manipulan mamíferos corren un riesgo potencialmente mayor de exposición a infecciones por hantavirus, aunque cuando se cuantifica a través de serosurveys el riesgo absoluto parece bastante leve [127]. Un nuevo estudio en Colorado sugiere la posibilidad de que una picadura de roedor haya sido el vehículo próximo para la transmisión al aire libre de NVS [128], lo que vuelve a enfatizar el uso de equipo de protección personal durante las actividades de trabajo de campo [129]. Como caso particular dentro de los hantavirus, la transmisión de persona a persona ha sido documentada exclusivamente para el virus de los Andes sudamericanos [130] [133] [133] [135]. La identificación de esta vía de transmisión se ha hecho utilizando tanto herramientas moleculares como encuestas epidemiológicas, pero el mecanismo de transmisión interpersonal no está bien establecido. Curiosamente, ANDV también puede ser derramado por los humanos a través de otros fluidos biológicos como la orina [136], ilustrando las propiedades particulares que diferencian este virus de otros hantavirus. Aunque la transmisión interpersonal parece ser única para ANDV, el ARN viral de PUUV se ha detectado en la saliva de pacientes con HFRS, y algunos pacientes con SNV-HCPS tienen ARN viral en las secreciones traqueales [88, 137]. Los Hantavirus en las Américas son alojados naturalmente por roedores (Muridae y Cricetidae) así como las musarañas (Soricidae) y los lunares (Talpidae) (Figura 1). Tres especies de musgo y un mole han sido reportados para albergar hantavirus y su patogenicidad para los humanos permanece desconocida [22, 138, 139]. Se han identificado al menos 15 especies de roedores como portadores de diferentes hantavirus patógenos, con algunos genotipos sudamericanos como Castelo do Sonhos (CDSV) o Hu39694 sólo identificados después de infecciones humanas (Figura 1 ). Los hantavirus suelen mostrar una alta especificidad de especie y ningún huésped intermedio [140]. Sin embargo, se han descrito algunos genotipos de hantavirus en la misma especie de roedores. Tal es el caso de Playa de Oro (OROV) y Catacamas (CATV) identificados en Oryzomys couesi [141, 142], o Maporal (MAPV) y Choclo (CHOV) hospedados por O. fulvescens [91, 143]. En América del Norte se han detectado virus de muleshoe y Black Creek Canal hanta en sigmodon hispidus [ Además, un genotipo de hantavirus (por ejemplo, el virus similar a Juquitiba) puede ser transportado por más de una especie de roedores (O. nigripes, Oxymycterus judex, Akodon montesis). Otro ejemplo es el virus Laguna Negra (LANV) que después de ser identificado en Calomys laucha [146] también ha sido reportado en C. callosus [147]. El rápido aumento en el descubrimiento de nuevos hantavirus y la identificación de sus anfitriones no parece probable que termine tan pronto como se examinen nuevas especies pequeñas de mamíferos [95]. Este tema se complica por la continua controversia en los criterios para la clasificación de distintos hantavirus [148, 149], que también está vinculado a la clasificación taxonómica y los reordenamientos taxonómicos. La transmisión de especies cruzadas es un proceso importante durante la propagación, aparición y evolución Particularmente dentro de los hantavirus, los derrames a los huéspedes secundarios se identifican cada vez más a medida que se realizan estudios más extensos [151] [152] [153] [155] [156]. Por ejemplo, ANDV es el agente etiológico predominante del HCPS en América del Sur, y O. longicaudatus el principal reservorio de roedores. Derrama en al menos otras cuatro especies de roedores que coocurren con el reservorio se han identificado, con Abrothrix longipilis mostrando la segunda mayor prevalencia de anticuerpos de ANDV, y actualmente no hay duda de que el virus es extremadamente similar genéticamente entre los dos roedores del huésped [157, 158]. En América del Norte, el derrame del virus Bayou (BAYV) puede haber ocurrido desde el reservorio principal de O. palustris a S. hispidus, R. fulvescens, P. leucopus y B. taylori [159] [160] [161]. Es más probable que el derrame del virus Hanta se produzca con poblaciones de acogida que habitan regiones simpatricas o sintópicas [151, 162], y la transmisión de especies cruzadas tendría probablemente mayores posibilidades de éxito si las especies anfitrionas están estrechamente relacionadas [163]. Se encuentra una excepción interesante entre el virus Oxbow (OXBV) y el virus Asama (ASAV) en el que un proceso de cambio de huésped parecía haber ocurrido entre mamíferos pertenecientes a dos familias (Talpidae y Soricidae), probablemente como resultado de la codivergencia alterna y recurrente de ciertos tax Los hantavirus son transmitidos horizontalmente entre roedores y no son transmitidos por artrópodos (a diferencia de otros virus de la familia Bunyaviridae). La infección por derrapadores a mamíferos no humanos generalmente no produce ninguna transmisión hacia adelante (o a fin de morir), pero si los seres humanos están infectados pueden resultar en una alta morbilidad y mortalidad [122, 164]. Durante la primavera de 1993, un brote de pacientes con HCPS debido a SNV ocurrió en los estados de Four Corners, resultando en más del 60% de casos de mortalidad entre los casos iniciales, muchos de los cuales involucran a miembros de la tribu Navajo [12, 121]. En Panamá, se notificó un brote durante 1999-2000 en Los Santos, y 12 casos donde se identificaron con tres muertes [165, 166]. Esto representó el primer informe de infecciones por hantavirus humanos en América Central. En América del Sur, Diecisiete individuos fueron identificados con anticuerpo NVS (ELISA) o fueron antígenos (HCI) positivos de 52 casos sospechosos [167]. En 1996 ocurrieron brotes mayores debidos a ANDV en el sur de Argentina [131, 134] ; en el sur de Chile se presentaron grupos de pacientes con enfermedad por hantavirus en 1997 [158]. En Brasil, el primer brote fue identificado en la Amazonía Brasileña (Estado de Maranhão) en el año 2000, e involucró pequeños pueblos que resultaron en una prevalencia del 13,3% de los evaluados (398 residentes totales) [168]. Los factores que desencadenan los brotes de hantavirus todavía son mal entendidos, probablemente porque resultan de varias características bióticas y abióticas interactuantes cuyos parámetros clave son difíciles de modelar. Sin embargo, el uso de nuevos enfoques de modelado que involucran características geográficas y ambientales parece ser prometedor a la hora de predecir posibles brotes de hantavirus y/o áreas de mayor riesgo [169] [170] [171] [172]. Debido a que se sabe que los hantavirus se transmiten directamente de los huéspedes infectados a los susceptibles, el primer enfoque natural es relacionar los brotes con la ecología de los huéspedes virales. La transmisión y persistencia del hantavirus en las poblaciones de roedores depende de varios factores que interactúan para afectar la dinámica ecológica del huésped, que a su vez está fuertemente influenciada por las características de comportamiento de las especies de roedores individuales, a la estructura paisajística y a las características ambientales [173, 174]. La transmisión viral depende de las tasas de contacto entre los huéspedes sensibles, y a pesar de la noción prevaleciente de que un aumento de la densidad se encuentra y, por lo tanto, de Además, se ha demostrado que la transmisión de NVS sigue un patrón de heterogeneidad de contacto, donde los individuos de la población tienen diferentes probabilidades de transmitir la infección [176]. La comprensión de la transmisión viral resulta ser mucho más compleja cuando especies distintas del principal huésped del reservorio se incorporan en el modelo. De hecho, estudios recientes han demostrado que la mayor diversidad de especies hospedantes está correlacionada con una menor prevalencia de infección en América del Norte para P. maniculatus [177], en América Central para O. fulvescens (reservorio del virus Choclo) y Zygodontomys brevicauda (reservorio del virus Calabazo) [178], y en América del Sur para Akodon montensis (reservorio del virus Jabora) [162]. Las tasas de contacto varían según la distribución espacial de las poblaciones y parecen estar Por ejemplo, la prevalencia de SNV en P. maniculatus fue mayor en paisajes con mayor grado de fragmentación del hábitat preferido [179]. Además, ciertas propiedades del paisaje como elevación, pendiente y cubierta terrestre parecen ser útiles para detectar áreas con infecciones persistentes de SNV, y por lo tanto se consideran áreas refugiales donde el virus puede mantenerse durante años [169]. Los cambios en el entorno natural de las especies de reservorios, como la fragmentación forestal y la pérdida de hábitat, pueden alterar la abundancia y distribución de la población y provocar brotes de hantavirus, como se observa en la Península de Azurero de Panamá [118, 119]. Además, las diferencias en el microhábitat, incluida la cubierta superficial, pueden conducir a diferencias en la dinámica ecológica dentro de las poblaciones y afectar a la tasa de exposición al virus [180]. Se han encontrado diferencias en las infecciones por hantavirus a través de paisajes contrastantes en el intervalo latitudinal en poblaciones de roedores de O. longicaudatus en Chile, lo que sugiere que los seres humanos están expuestos de manera diferencial al virus [107, 181]. La dinámica poblacional de roedores se ve afectada por cambios estacionales de clima y clima [182, 183]. En el caso de los brotes asociados a ENSO, se ha postulado una compleja cascada de eventos desencadenados por lluvias altamente inusuales en el año precedente para dar lugar a un aumento de la producción primaria y densidades de roedores, aumentando también la probabilidad de transmisión del virus a los seres humanos, pero ha resultado difícil demostrar con precisión los eventos intermedios sugeridos, como el aumento de las densidades de roedores en el aumento de la carga de casos [116, 121, 184]. En América del Sur, los efectos del cambio climático y los brotes de hantavirus no han sido bien estudiados, a pesar del conocimiento de que varias especies de roedores que son reservorios de enfermedades emergentes se han visto dramáticamente afectadas por eventos como El Niño [185]. Los cambios en la dinámica de la población de acogida también se ven afectados por la estacionalidad, lo que puede conducir a brotes de enfermedades cuando se interrumpen los procesos que equilibran las poblaciones de roedores de temporada en temporada [186]. La emergencia viral puede seguir promoviéndose a medida que los cambios introducidos por el ser humano continúan aumentando en el medio ambiente a diferentes escalas geográficas. Estos cambios también pueden alterar la estructura y dinámica de la población de roedores e interacciones interespecies creando condiciones que pueden conducir a brotes virales, establecimiento viral en nuevos hospederos, y la aparición de HCPS [102, 162], incluso con aparentemente leve perturbación ecológica al sistema virus-hospedero [188]. Ciertas características fisiopatológicas, incluyendo trombocitopenia y shock, de enfermedades por hantavirus de los seres humanos, tienen similitud sustancial con las fiebres hemorrágicas inducidas por otros virus tales arenavirus, filovirus y flavivirus, a pesar de compartir esencialmente ninguna secuencia similitud con ellos. Tales observaciones plantean preguntas acerca de si tales similitudes en la patogénesis son probables similitudes de fenotipo, o en cambio reportan la presencia de mecanismos moleculares comunes entre los virus. En esta revisión se discuten las propiedades generales, descubrimientos y epidemiología/ecología de las formas de hantavirus patógenos del Nuevo Mundo, y también se busca identificar algunas de las características de las macromoléculas virales y mecanismos inmunológicos que se han propuesto como potenciales mediadores directos de los eventos patógenos que caracterizan la enfermedad humana HCPS. Si bien es poco probable que la expresión de una proteína viral particular o ARNs en aislamiento se pueda confiar en replicar fenotipos clave de infección por el virus completo, algunos de los hallazgos han sido suficientemente consistentes con lo que se conoce de la patogénesis in vivo que ofrecen plomos plausibles de primer paso en la búsqueda de objetivos terapéuticos. Esperamos con interés las revelaciones mecanísticas que seguirán el uso inevitablemente ampliado de métodos poderosos como la secuenciación profunda, imágenes cada vez más avanzadas, y métodos microscópicos, y modelos animales que por fin se pueden decir

Como una proteína de unión al ARN que afecta a la horquilla termini de los segmentos genómicos, ¿qué hace la proteína N del hantavirus?

Los hantavirus en las Américas y su papel como patógenos emergenteshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3185593/SHA: efe13a8d42b60ef9f7387ea539a1b2eeb5f80101Autores: Hjelle, Brian; Torres-Pérez, FernandoFecha: 2010-11-25DOI: 10.3390/v2125559Licencia: cc-byAbstract: La continua aparición y reaparición de patógenos representan una amenaza continua, a veces mayor, para las poblaciones. Los hantavirus (familia Bunyaviridae) y sus enfermedades humanas asociadas se consideraron confinados a Eurasia, pero la aparición de un brote en el suroeste de Estados Unidos llevó a un gran aumento en su estudio entre los virólogos de todo el mundo. Se han descrito más de 40 genotipos hantavirales, la gran mayoría desde 1993, y casi la mitad de ellos patógenos para los seres humanos. Los hantavirus causan infecciones persistentes en sus reservorios, y en las Américas, la enfermedad humana se manifiesta como compromiso cardiopulmonar, síndrome cardiopulmonar del hantavirus (HCPS), con proporciones de casos-fatalidad, para los serotipos virales más comunes, entre el 30% y el 40%. Alteración del hábitat y trastornos ecológicos a mayor escala, tal vez incluyendo el cambio climático, son algunos de los factores que pueden haber aumentado la carga de casos humanos de HCPS entre 1993 y el presente. Consideramos aquí las características que influyen en la estructura de la dinámica de la población huésped que pueden conducir a brotes virales, así como los determinantes macromoleculares de los hantavirus que han sido considerados como potenciales contribuciones a la patogenicidad. Texto: Los patógenos emergentes causan enfermedades nuevas o no reconocidas anteriormente, y entre ellas, las zoonóticas emergentes son una preocupación importante entre los científicos que estudian enfermedades infecciosas a diferentes escalas espaciales y temporales [1, 2]. Los cambios en las condiciones bióticas y abióticas pueden alterar la dinámica de las enfermedades de la población y conducir a la aparición de infecciones zoonóticas [3] [5] [6]. Durante las últimas décadas, se han producido varios brotes de patógenos virales emergentes y reemergentes, que afectan tanto a la implicación puramente local como a nivel mundial/pandémica de las poblaciones humanas. Entre los ejemplos visibles están la gripe A, el virus del Ébola, el virus de la hepatitis C, el trastorno respiratorio grave para adultos (SARS), el coronavirus y el virus de la inmunodeficiencia humana, que desafían las medidas de prevención y control de los sistemas de salud pública [7]. En las Américas, el reciente brote de gripe pandémica A subtipo H1N1 se convirtió en un objetivo importante de control debido a su rápida propagación, y las incertidumbres en cuanto a virulencia y transmisibilidad, sin embargo, la disponibilidad de vacunas fue limitada cuando se produjo una actividad significativa antes de la temporada tradicional de gripe [8]. Sin embargo, en el último siglo han surgido o resurgido brotes de varias enfermedades virales relacionadas con el virus arenavirus y el virus del dengue, y más recientemente, hantavirus y la expansión del rango geográfico del virus del Nilo Occidental. Entre las enfermedades zoonóticas, los mamíferos pequeños son anfitriones de varios virus ARN patógenos, especialmente Arenaviridae y Bunyaviridae: Hantavirus [9] [10] [11]. Las infecciones por hantavirus se convirtieron en una preocupación en las Américas después de la descripción de un brote de distrés respiratorio agudo ocurrido en La enfermedad recientemente reconocida, el síndrome cardiopulmonar del hantavirus, el HCPS (o síndrome pulmonar del hantavirus), se relacionó con la infección por el virus del Sin Nombre (SNV) recién descubierto, y el roedor Peromyscus maniculatus (ratón venado) fue identificado como el reservorio [13]. Sin embargo, las infecciones por hantavirus tienen una historia mucho más larga. Una revisión de los escritos chinos antiguos, que datan de aproximadamente 960 dC, reveló descripciones muy parecidas a la fiebre hemorrágica con síndrome renal (HFRS), el síndrome causado por los hantavirus del Viejo Mundo [14]. Durante el siglo XX, los casos de enfermedad febril aguda con compromiso renal fueron descritos de varios países eurasiáticos y Japón, a menudo en asociación con compromisos militares [15]. El HFRS como síndrome distinto, sin embargo, fue llamado por primera vez a la atención de la medicina occidental en asociación con un brote que ocurrió entre las tropas de las Naciones Unidas durante el conflicto coreano entre 1951 y 1954, donde más de 3.200 soldados fueron afectados [16]. Tomó más de dos décadas hasta que el agente etiológico, el virus Hantaan (HTNV), fue aislado del ratón de campo rayado Apodemus agrarius, detectado en parte por la unión de anticuerpos de muestras de suero de paciente a los tejidos pulmonares de ratones de campo sanos y salvajes [17, 18]. El virus se encontró más tarde para representar la especie tipo de un nuevo género Hantavirus de la familia Bunyaviridae, aunque fue más tarde evidente que el primer hantavirus a aislarse fue el virus Thottapalayam de shrew-borne [19]. La categorización de los hantavirus como pertenecientes a la familia Bunyaviridae se debe en parte a la presencia consistente de tres genomas de ARN que son circularizados in vivo como resultado de la presencia de nucleótidos terminales complementarios que ayudan a doblar el genoma en una morfología -hairpin-, descrita por primera vez para el flebovirus Uukuniemi [19, 20]. La Tabla 1 es una lista de los hantavirus patógenos predominantemente distintos serológicamente. Se describen muchos otros genotipos llamados, pero tales otras formas patogénicas están generalmente estrechamente relacionadas con los Andes o, en algunos casos, el virus Sin Nombre. Durante la maduración del virus, el precursor forma GPC se procesa utilizando una proteasa unida a la membrana en Gn y Gc, una escisión que ocurre, y parece ser señalada, después de la señal péptida conservada WAASA en la C-terminal de Gn [24]. Aunque las dos proteínas se pueden expresar de forma independiente a través de la transfección, pueden ser retenidas en el compartimento celular incorrecto (ER o aggrosome); por lo tanto, deben ser co-expresadas para permitirles estabilidad para que las dos se puedan ensamblar correctamente en el Golgi [25, [27] [28]. Se han identificado varias actividades y propiedades para las glicoproteínas envolventes del hantavirus, incluyendo algunas características que se sospecha que están involucradas en la patogenicidad de los serotipos causantes de la enfermedad, una posibilidad que ha generado atención experimental. Las glucoproteínas son los ligandos conocidos o presuntos para al menos dos receptores celulares distintos, la cadena de integrina y el factor acelerador de la descomposición, o DAF [30, 31] ; con gC1qR/p32 también identificado como otro receptor de entrada potencial [32]. Comparaciones con la proteína E del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, llevaron a Tischler et al. a considerar la glicoproteína Gc como una proteína potencial de fusión de clase II, tal vez impartiendo actividad de fusión al virión, y esta hipótesis ha ganado apoyo en otros estudios [33, 34]. Se han identificado actividades adicionales con, o se afirma que están relacionadas con, Gn. Para muchos de estos estudios, una premisa subyacente ha sostenido que hay diferencias entre las glicoproteínas de hantavirus -patógenos en relación con virus en el género que se denominan Si bien es cierto que aún no ha sido posible vincular el virus de Prospect Hill (PHV) con la enfermedad humana, la ausencia de evidencia de su patogenicidad tal vez no debería equipararse con la evidencia de su ausencia. Sólo se podría considerar que el nivel de enfermedad (por ejemplo, letargo, fiebre, proteinuria y azotemia) asociado con la infección de primates no humanos por PHV no es significativamente diferente del registrado para los modelos de primates no humanos utilizando el virus conocido del patógeno Puumala (PUUV) [35, 36]. Para el propósito de esta discusión, presumiremos que los hantavirus apatogénicos son efectivamente apatogénicos. Mientras que algunos estudios han sugerido que las glicoproteínas Gn se dirigen más rápidamente a la vía ubiquitina-proteosoma que a las formas apatogénicas, otros han interpretado las diferencias en el manejo de las glicoproteínas Gn a través de especies de hantavirus por el sistema ubiquitina-proteosomal como independientes de la patogenicidad [37] [38] [39]. Algunos investigadores han dirigido sus esfuerzos hacia la identificación de una capacidad diferencial, ya sea cinética o de magnitud absoluta, en la capacidad de los hantavirus patógenos y apatogénicos para provocar una respuesta de interferón en las células. Una premisa que surge es que las formas apatogénicas tenderían a inducir una respuesta innata anterior que haría más probable que el virus se limpiara rápidamente o se volviera menos competente en su replicación, a fin de evitar cualquier respuesta patológica en el huésped [42] La respuesta innata anti-hantavirus puede en algunos casos ser atribuida a la interacción viral como ligando de TLR-3, pero no en otros, y en las células endoteliales, no parece requerir más que la partícula viral misma, incluso cuando se introduce en forma replicativa incompetente [43, 44]. Las proteínas y los ARNm inducidos prominentemente por los hantavirus incluyen MxA e IFIT-1 (ISG-56) y otros incluyendo algunos con actividad antiviral conocida o sospechada. Esos hantavirus, a menudo cepas altamente patógenas, que no inducen una respuesta antiviral potente, se sospechan o se presume que tienen un (más) potente mecanismo de antagonismo interferón-vía en relación con otros virus, un mecanismo que actúa positivamente para prevenir que se forme una respuesta innata efectiva, al menos temprano en la infección Sin embargo, se reportan algunos casos en los que los hantavirus altamente patógenos, tales como NVS, también son capaces de inducir la expresión de los ARNm del gen estimulado por interferón, incluso muy temprano en la infección, con proteínas ISG, como se esperaba, tardando más tiempo en aparecer en la célula [44]. Las actividades anti-interferón también se han atribuido a la proteína NSs que se puede elaborar en células infectadas por serotipos que codifican esta proteína [46]. Otros investigadores han examinado las actividades de las glucoproteínas del hantavirus y otras proteínas que podrían afectar directamente a algunos aspectos de la progresión patogénica asociada a la infección por hantavirus en humanos, tales como cambios de permeabilidad vascular. Mientras que los primeros intentos de causar directamente aumentos en la permeabilidad de las monocapas endoteliales con partículas virales o infección viral fueron en gran medida decepcionantes, los hantavirus se han identificado como que afectan adversamente la migración endotelial sobre los sustratos y en la potenciación de la permeabilidad endotelial inducida por VEG-F [47, 48]. La proteína nucleocápsida o N más corta (+50 kD) es un componente estructural del nucleocápsido viral, junto con los segmentos de ARN viral genómico. Como proteína de unión al ARN que afecta a la horquilla del cabello de los segmentos genómicos con alta afinidad [49, 50], limita el acceso del ARN para alojar nucleasasas y ayuda a hacer que la replicación viral sea un proceso cerrado dentro del citoplasma. También actúa como una proteína de membrana periférica, al igual que la proteína L [51], una actividad que podría jugar un papel en su supuesta, pero aún no demostrada función como matriz [52]. Hasta hace poco, no se había apreciado que N tuviera una amplia variedad de otras actividades, algunas de las cuales pueden estar vinculadas, no sólo a los requisitos fundamentales de replicación, sino también a la interferencia con una serie de procesos intracelulares de la célula normal. Así, se ha propuesto una interacción entre el aminoterminal de la proteína N del hantavirus y la proteína celular Daxx, con la sugerencia de posibles consecuencias pro-apoptóticas [51]. N también se reporta que interactúa con microfilamentos actínicos, y la proteína SUMO-1 [53, 54]. Utilizando ensayos basados en el gen reportero, Connie Schmaljohn y sus colegas han informado que la proteína nucleocapsid del virus Hantaan tiene un papel inhibidor en las respuestas inflamatorias mediadas por NF kappa B (NF- â € € TM B). Los efectos sobre la expresión NF- € B parecen estar limitados a la prevención de su translocación nuclear después de su intento de activación con lipopolisacárido, LPS [55]. En el citoplasma de las células infectadas, la proteína N se puede encontrar en los cuerpos celulares P donde secuestra y protege los capuchones de 5'. Puede localizar los capuchones a través de su interacción con DCP1, un componente clave de los cuerpos P. Durante la infección por hantavirus, los ARN virales se concentran en los cuerpos P, a través de su interacción con N y DCP1. La proteína N demuestra la protección preferencial de los ARNm diseñados para terminar prematuramente su proteína codificada en comparación con los ARNm nativos [56]. La proteína N se ha vinculado cada vez más a la replicación y traducción virales, a veces de maneras no previstas anteriormente. Se encuentra entre una familia creciente de diversas proteínas virales que pueden servir como un inespecífico - ARN chaperone ®, una actividad que debe facilitar el acceso de la L polimerasa al ARNv para la transcripción y replicación, en que puede disociar transitoriamente estructuras de ARN mal dobladas [57]. Algunos de los efectos de la proteína N en la traducción no pueden ser inmediatamente reconocidos como adaptables en la naturaleza. Puede reemplazar todo el complejo de iniciación traslacional EIF4F, presentando simultáneamente el ribosoma con un reemplazo de la actividad de unión de la tapa de eIF 4E, uniéndose al complejo de pre-iniciación 43S, al igual que eIF 4G, al tiempo que reemplaza la actividad helicoidal de eIF 4A, que se presume que es necesaria para disociar la estructura de ARN de orden superior [56, 58]. Estos tres factores normalmente trabajan juntos para lograr la iniciación traslacional. En los cuerpos P, la capacidad de la proteína N de unirse a una alta afinidad a los oligoribonucleótidos celulares nativos tapados, junto con su actividad en la protección de ARNs tapados de la degradación, probablemente facilita el acceso de oligonucleótidos encapsulados para su uso en la iniciación transcripcional por L polimerasa (-cap ra Tráfico de N para el ensamblaje viral: Clásicamente, la proteína N en las células infectadas parece estar agrupada o partículas en la naturaleza, con una concentración pesada en una única ubicación perinuclear, ampliamente considerada como la Golgi [27]. Las proteínas N de los hantavirus se encuentran en asociación con fracciones de partículas, y los estudios confocales microscopía y bioquímico-inhibidores han demostrado que las trazas N a lo largo de microtúbulos pero no con filamentos de actina [52]. El destino final de N, para su ensamblaje en partículas virales es la Golgi, y que circula allí a través del complejo intermedio retículo-Golgi endoplasmático (ERGIC), también conocido como cúmulo vesicular-tubular [52]. Un inhibidor negativo dominante, la dinamitina, asociado con el transporte mediado por Los estudios posteriores sugieren que la dependencia específica del transporte microtubular es específica de los hantavirus del Viejo Mundo como el NVH, pero que el Hantavirus del Nuevo Mundo ANDV está asociado con filamentos de actina [59]. Sin embargo, los datos recientes indican que el transporte microtubular es efectivamente utilizado para el NVH del Nuevo Mundo [60]. Las enfermedades del Hantavirus del hombre desde hace mucho tiempo han sido sospechosas de tener una base inmunopatógena en parte debido a su período de incubación relativamente largo de 2-3 semanas y la asociación temporal observada entre los trastornos inmunológicos y la primera aparición de signos y síntomas de la enfermedad del hantavirus. HFRS y HCPS comparten muchas características clínicas, llevando a muchos investigadores a considerar que son, en esencia, diferentes manifestaciones de un proceso patógeno similar, que difieren principalmente en los órganos objetivo primarios de expresión de la enfermedad (Tabla La patogénesis de las infecciones por hantavirus es el tema de una revisión continuamente actualizada en la serie UpToDate [61]. Para el momento en que aparecen los síntomas en el HCPS, ambas respuestas antivirales fuertes, y, para los genotipos virales más virulentos, el ARN viral puede ser detectado en plasma sanguíneo o células sanguíneas nucleadas respectivamente [63, 64]. Al menos tres estudios han correlacionado el ARN viral plasmático con la gravedad de la enfermedad para el HCPS y el HFRS, sugiriendo que la replicación del virus juega un papel continuo y en tiempo real en la patogénesis viral [65] [66] [67]. Se han identificado varios cambios patológicos distintivos que ocurren tanto en el HFRS como en el HCPS. Una característica crítica de ambos es una fuga capilar transitoria (~ 1-5 días) que involucra el La fuga resultante es de carácter exudativo, con una composición química alta en proteínas y similar al plasma. La experiencia continua que indica el fuerte tropismo tisular para las células endoteliales, específicamente, es uno de los varios factores que hacen de la integra β3 un candidato especialmente atractivo como un importante receptor in vivo para los hantavirus. Es probable que los hantavirus lleguen a sus tejidos objetivo a través de la captación por los ganglios linfáticos regionales, tal vez con o dentro de un histiocito pulmonar escoltante. Las semillas del virus endotelio local, donde las primeras células infectadas dan lugar, en última instancia, a una viremia primaria, un proceso que parece tomar mucho tiempo para las infecciones por hantavirus [62, 63]. En el momento en que emerge la viremia secundaria, los agentes de las formas más severas de HFRS y HCPS han comenzado a alcanzar una masa suficiente para inducir, a través de las interacciones PAMP-PRR y otros medios, la expresión de citoquinas proinflamatorias [64]. Para HCPS, esa expresión favorece el lecho pulmonar y los órganos linfoides, pero, por razones desconocidas, ahorra el retroperitoneo y, en general, el riñón. En HFRS la situación se invierte, y sin embargo no se aprecia a menudo que el esperado tropismos tisulares preferentes de virus asociados a HFRS y sus contrapartes asociadas a HCPS para los lechos renal y pulmonar, respectivamente, no es como se predeciría a través de las manifestaciones de las dos enfermedades. La elaboración local de mediadores inflamatorios y quimiotácticos se considera un requisito para el desarrollo de Sin embargo, no es la hipoxemia, debido al edema pulmonar prominente, lo que conduce a la muerte en la mayoría de los casos fatales de HCPS, sino más bien la intoxicación del corazón por mediadores como aún no definidos, lo que conduce al estado de bajo gasto cardíaco y al síndrome de shock asociado [64, 65]. Es tentador especular que los mediadores producidos en el pulmón en conexión con el infiltrado inflamatorio pueden infiltrarse a través de la circulación coronaria con dilución mínima en HCPS, consecuencia desventajosa de la estrecha yuxtaposición anatómica de los dos órganos. Así, al menos tres clases de mecanismos potenciales, algunos superpuestos y todos ciertamente no exclusivos de los otros, podrían presumirse que subyacen a la patogénesis del HCPS. Estos incluyen:(1) Mecanismos inmunes innatos. La naturaleza de las interacciones entre los patrones moleculares asociados al patógeno del hantavirus (PAMP) y los receptores de reconocimiento del patrón (PRR) de las células endoteliales susceptibles comienzan a ser aclaradas. El HTNV prototípico parece ser reconocido por TLR-3 [43]. Tal infección tiene consecuencias tales como una mayor expresión del HLA-DR en las células dendríticas [66] y la diferenciación de los monocitos hacia las células dendríticas [67]. (2) Efectos virales directos. La correlación observada entre la carga viral y la gravedad de la enfermedad deja abierta la posibilidad de que las partículas del hantavirus o el ARN puedan tener efectos tóxicos sobre las células o sobre la señalización. Algunos investigadores han favorecido la toxicidad viral directa, actuando a través de la inhibición de la función de barrera celular endotelial, como una explicación de gran parte de la fuga capilar, aunque existe Una pista potencialmente importante hacia el mecanismo por el cual las infecciones por hantavirus agotan las plaquetas sanguíneas y, en algunos casos, causan manifestaciones hemorrágicas, fue avanzada por el reciente descubrimiento de que los hantavirus patógenos son capaces de reclutar plaquetas para adherirse a las superficies celulares endoteliales, con β3 integrina utilizada como elemento de unión crítica [69]. (3) Efectos patógenos causados por las actividades de macromoléculas virales específicas. Hemos revisado algunas de las actividades asociadas con los Gn, Gc y N, polipéptidos codificados viralmente en secciones anteriores. Modelos de prueba de patogénesis se pueden hacer más eficazmente cuando hay un modelo animal que imita aspectos clave de la enfermedad. No existe un modelo similar al HFRS, pero existen modelos animales para el transporte asintomático de PUUV y SNV por sus roedores portadores nativos, el banco vole Myodes glareolus y el ratón de venado P. maniculatus; así como un modelo de hámster sirio utilizando ANDV o el virus Aporal relacionado de Venezuela, para el cual se observa una enfermedad mimética HCPS [70] [71] [72] [73]. El modelo de hámster ANDV-Sirio tiene una serie de características en común con la enfermedad humana, así como algunas diferencias. A diferencia de las enfermedades neurológicas que han sido posibles de provocar con HTNV, el modelo de hámster para HCPS parece ser causado por fugas capilares que resultan en edema pulmonar y la producción de un derrame pleural con características exuda Típicamente los hámsteres mueren entre 11 y 14-d post-inoculación, reflejando un período de incubación ligeramente acelerado en comparación con las infecciones humanas. Al igual que con el HCPS humano, el examen microscópico del pulmón revela abundante deposición de fibrina, septo alveolar engrosado y antígeno viral expresado abundantemente en el endotelio microvascular. Los hámsteres infectados por ANDV equipados con dispositivos de monitoreo fisiológico mostraron disminución de las presiones de pulso, taquicardia e hipotensión que parecen imitar de cerca el shock que se cree que es la causa próxima de la muerte en pacientes que sucumben al HCPS [65, 74]. En comparación con la enfermedad humana, los hámsteres infectados por ANDV exhiben títulos excepcionalmente altos de ANDV vivo en sus tejidos, con gran parte de la replicación viral que ocurre en Los títulos de ANDV vivo en algunos casos superan los 10 8 /g, mientras que los aislados de hantavirus de los tejidos humanos han sido notoriamente difíciles de obtener. A pesar de la aparición universal de enzimas hepáticas levemente elevadas en pacientes con HCPS, las enzimas hepáticas no parecen estar presentes en niveles elevados en la sangre de hámsters enfermos incluso inmediatamente antes de la muerte [75]. El período prolongado de incubación asociado con la enfermedad por hantavirus da al huésped un tiempo considerable para montar una respuesta inmune madura contra el virus. Así, en contradición a infecciones de gravedad comparable y sintomatología relacionada asociada con arenavirus y filovirus, las infecciones por hantavirus en humanos se asocian con respuestas anticuerpos de título significativo por el momento en que comienzan los síntomas. A pesar de esta observación, parece ser posible que la variación natural en las respuestas individuales de anticuerpos neutralizantes entre los pacientes con infecciones por NVS pueda estar relacionada con la gravedad de la enfermedad, lo que sugiere que la administración de anticuerpos antivirales podría resultar efectiva terapéuticamente [76]. En el caso de la infección por ANDV, han surgido nuevas evidencias que indican que el aparente aclaramiento del virus de la sangre no resulta en la eliminación completa del estímulo antigénico por el virus, sugiriendo que el virus puede persistir, tal vez en algún sitio inmunológicamente privilegiado aún indeterminado [77]. Un papel para las respuestas patológicas mediadas por células T en el HFRS y el HCPS ha sido la fuente de especulación por una variedad de razones. La gravedad del SNS asociado al SNCP puede haber hecho más evidente que el inicio del edema pulmonar, la taquicardia y la hipertensión parecía estar todo, pero universalmente asociado temporalmente, con la aparición de un espectro de células altamente activadas del linaje linfoide en la sangre periférica. Se detectaron células con similitudes morfológicas cercanas a estos -inmunoblastos- en los pulmones congestionados y pesados de los pacientes que llegaron a la autopsia, así como en órganos linfoides y en las tríadas portal [63, [78] [79] [80]. Estas observaciones llevaron a especular que algún componente de la patogénesis por hantavirus podría estar vinculado a la aparición de células T antivirales que podrían estimular o contribuir a la aparición de una -tormenta de mediadores y el fenotipo de fuga capilar asociado. Estudios posteriores han confirmado la expectativa de que una fracción significativa de la población de inmunoblastos en pacientes con HCPS son células T con especificidad para epitopes específicos de antígenos virales de clase I presentados por el HLA, incluyendo Gn, Gc y N [77, [81] [82] [83]. Presumiblemente, las actividades antivirales de estas células, manifestadas en parte por su elaboración de mediadores en el intersticio afectado, pueden contribuir a la fuga endotelial/capilar que se encuentra en el corazón de la patogénesis del hantavirus. Debido a que los primeros casos de HCPS a menudo llegaron a la autopsia, se hizo posible examinar tejidos necropsiados para la expresión de citocinas. El estudio de Mori et al. (1999) revelaron una alta expresión relativa de citocinas proinflamatorias incluyendo TNF-, IL-1-, IL-6, proporcionando evidencia a favor de un modelo de tormenta de citoquinas para la patogénesis [64]. Los autores creían, basándose en la morfología de las células secretadoras de citoquinas, que tanto monocitos como linfocitos estaban contribuyendo a la producción de citocinas. Que los mediadores proinflamatorios se encuentran en niveles elevados en el plasma, así como el intersticio renal de pacientes con enfermedad hantaviral aguda se ha reconocido desde hace algún tiempo también [84, 85]. Si bien el diagnóstico de HCPS y HFRS se realiza mejor con serología IgM, en la etapa aguda de la infección por NVS, también se puede utilizar RT-PCR si se utilizan células sanguíneas o coágulos de sangre en lugar de plasma o suero, donde la sensibilidad incluso utilizando imprimaciones PCR anidadas disminuye a cerca del 70% [86] [87] [88]. En una instalación en la que se tratan muchos casos de HCPS, el centro médico de la Universidad de Nuevo México en Albuquerque, se ha ofrecido un servicio de diagnóstico en el que se analizan los hallazgos hematológicos del paciente para establecer la probabilidad de que un paciente tenga HCPS. La combinación de trombocitopenia, abundancia elevada de linfocitos -inmunoblasto-, población de células polimorfonucleares con desplazamiento izquierdo sin evidencia morfológica fuerte para su activación, y valores elevados de hemoglobina o hematocrito es altamente específica para el HCPS y permite a los clínicos la capacidad de poner pacientes presuntivos-HCPS en oxigenación de membrana extracorpórea (ECMO), que se cree que ha salvado a muchos pacientes de un resultado letal [89]. Se cree que la infección humana por hantavirus sigue el contacto con secreciones o excreciones producidas por roedores infectados. En los Estados Unidos, 538 infecciones humanas por hantavirus fueron reportadas hasta finales de diciembre de 2009 [90], con Nuevo México, Arizona y Colorado mostrando los casos más altos. Mientras que el prototípico hantavirus centroamericano en América Central fue el virus Rio Segundo de Reithrodontomys mexicanus de Costa Rica, la primera enfermedad humana apareció algunos años más tarde en Panamá, donde el virus Choclo (CHOV) surgió como el agente etiológico y se cree que es responsable de todos los casos conocidos de HCPS. La rata de arroz pigmeo fulvo Oligoryzomys fulvescens ha sido identificada como el reservorio de roedores [91]. En Panamá, los primeros casos de HCPS, aunque con poca o ninguna implicación cardiaca evidente, fueron reportados en 1999, y desde entonces, 106 infecciones humanas han ocurrido con una tasa de mortalidad del 26% [92]. Seroencuestas de mamíferos en México y Costa Rica han encontrado anticuerpos antihantavirus [93] [94] [95] [96], y se han notificado seroprevalencias que oscilan entre 0,6 y 1,6% en poblaciones humanas a pesar de la ausencia de casos conocidos de HCPS [97]. En América del Sur, los casos de HCPS se han identificado en Argentina, Bolivia, Brasil, Chile, Paraguay y Uruguay, y también se han notificado evidencias de exposición humana a hantavirus en Venezuela [98] y Perú [99]. En América del Sur, ANDV es el principal agente etiológico con casos en Chile y Argentina notificados desde 1995. En Chile, se han producido 671 casos de HCPS debido a ANDV durante el período 2001-2009 [100]. Desde 1995 se han reportado más de 1.000 casos de HCPS en Argentina [101] ; en el Brasil se han identificado aproximadamente 1.100 casos de HCPS entre 1993 y 2008 [102]. Las tasas de mortalidad por casos en esos tres países han sido similares, oscilando entre el 30% (Argentina), el 36% (Chile) y el 39% (Brasil). Las infecciones por Hantavirus ocurren con más frecuencia en hombres que en mujeres, aunque la proporción entre hombres y mujeres es muy variable. Por ejemplo, las comunidades panameñas mostraron una proporción de 55 hombres por 45 mujeres [103], mientras que en Chile la proporción es más sesgada por hombres (71%) [104]. En el Chaco paraguayo la proporción entre hombres y mujeres se aproxima al 50% [105]. En América del Norte, en diciembre de 2009 el 63% de los pacientes eran varones [90]. Todos los grupos étnicos y raciales parecen ser susceptibles a infecciones por el hantavirus, y las diferencias entre ciertos grupos (como indígenas y no indígenas) están más probablemente correlacionadas con el tipo de hábitat en el que reside la población (por ejemplo, zonas rurales frente a zonas urbanas). De hecho, las comunidades rurales representan la mayor incidencia global del hantavirus y, por lo tanto, están en mayor riesgo [92, [105] [106] [107] [108] [109] [109] [119], aunque también se ha destacado la importancia de los entornos peridomésticos como una importante zona de exposición [112, 113]. El principal mecanismo por el que los seres humanos adquieren la infección por el hantavirus es la exposición a aerosoles de heces contaminadas de roedores, orina y saliva [114, 115]. Esto puede ocurrir cuando los seres humanos residen en áreas cercanas a las que habitan los roedores, viven en áreas infestadas de roedores, o cuando los roedores invaden entornos humanos, que son más frecuentes en hábitats rurales.Existe una larga historia de coexistencia humana con roedores, lo que plantea dudas sobre el aparente aumento reciente de las enfermedades relacionadas con el hantavirus, especialmente el HCPS. Aparte de una aparente asociación con eventos de oscilación sureña de El Niño (ENSO) en algunas regiones [116, 117], los recientes incrementos en la incidencia del HCPS no parecen seguir un patrón temporal o espacial fácilmente definido. Sin embargo, algunas características del paisaje, como la fragmentación del hábitat o las áreas perturbadas por el ser humano, pueden influir en la dinámica de la población de roedores e impactar en la incidencia viral [118] [112] [112] [121]. A pesar de la estocástica asociada a la contracción de la infección Las actividades humanas en edificios mal ventilados que pulverizan partículas que luego se inhalan (es decir, limpieza, agitación de alfombras, polvo) se identifican con frecuencia entre los pacientes admitidos para el SHCPS [11, 122]. Se cree que las actividades al aire libre transmiten un menor riesgo debido a la labilidad de los hantavirus a la radiación UV y a la supuesta tendencia a dispersarse en el viento, aunque ciertas condiciones ambientales parecen mantener el virus durante períodos más largos fuera de su huésped natural, lo que permite la transmisión indirecta [123]. Una vía alternativa pero poco común de transmisión del virus es la mordedura de roedores [124] [125] [126]. Los trabajadores sobre el terreno que manipulan mamíferos corren un riesgo potencialmente mayor de exposición a infecciones por hantavirus, aunque cuando se cuantifica a través de serosurveys el riesgo absoluto parece bastante leve [127]. Un nuevo estudio en Colorado sugiere la posibilidad de que una picadura de roedor haya sido el vehículo próximo para la transmisión al aire libre de NVS [128], lo que vuelve a enfatizar el uso de equipo de protección personal durante las actividades de trabajo de campo [129]. Como caso particular dentro de los hantavirus, la transmisión de persona a persona ha sido documentada exclusivamente para el virus de los Andes sudamericanos [130] [133] [133] [135]. La identificación de esta vía de transmisión se ha hecho utilizando tanto herramientas moleculares como encuestas epidemiológicas, pero el mecanismo de transmisión interpersonal no está bien establecido. Curiosamente, ANDV también puede ser derramado por los humanos a través de otros fluidos biológicos como la orina [136], ilustrando las propiedades particulares que diferencian este virus de otros hantavirus. Aunque la transmisión interpersonal parece ser única para ANDV, el ARN viral de PUUV se ha detectado en la saliva de pacientes con HFRS, y algunos pacientes con SNV-HCPS tienen ARN viral en las secreciones traqueales [88, 137]. Los Hantavirus en las Américas son alojados naturalmente por roedores (Muridae y Cricetidae) así como las musarañas (Soricidae) y los lunares (Talpidae) (Figura 1). Tres especies de musgo y un mole han sido reportados para albergar hantavirus y su patogenicidad para los humanos permanece desconocida [22, 138, 139]. Se han identificado al menos 15 especies de roedores como portadores de diferentes hantavirus patógenos, con algunos genotipos sudamericanos como Castelo do Sonhos (CDSV) o Hu39694 sólo identificados después de infecciones humanas (Figura 1 ). Los hantavirus suelen mostrar una alta especificidad de especie y ningún huésped intermedio [140]. Sin embargo, se han descrito algunos genotipos de hantavirus en la misma especie de roedores. Tal es el caso de Playa de Oro (OROV) y Catacamas (CATV) identificados en Oryzomys couesi [141, 142], o Maporal (MAPV) y Choclo (CHOV) hospedados por O. fulvescens [91, 143]. En América del Norte se han detectado virus de muleshoe y Black Creek Canal hanta en sigmodon hispidus [ Además, un genotipo de hantavirus (por ejemplo, el virus similar a Juquitiba) puede ser transportado por más de una especie de roedores (O. nigripes, Oxymycterus judex, Akodon montesis). Otro ejemplo es el virus Laguna Negra (LANV) que después de ser identificado en Calomys laucha [146] también ha sido reportado en C. callosus [147]. El rápido aumento en el descubrimiento de nuevos hantavirus y la identificación de sus anfitriones no parece probable que termine tan pronto como se examinen nuevas especies pequeñas de mamíferos [95]. Este tema se complica por la continua controversia en los criterios para la clasificación de distintos hantavirus [148, 149], que también está vinculado a la clasificación taxonómica y los reordenamientos taxonómicos. La transmisión de especies cruzadas es un proceso importante durante la propagación, aparición y evolución Particularmente dentro de los hantavirus, los derrames a los huéspedes secundarios se identifican cada vez más a medida que se realizan estudios más extensos [151] [152] [153] [155] [156]. Por ejemplo, ANDV es el agente etiológico predominante del HCPS en América del Sur, y O. longicaudatus el principal reservorio de roedores. Derrama en al menos otras cuatro especies de roedores que coocurren con el reservorio se han identificado, con Abrothrix longipilis mostrando la segunda mayor prevalencia de anticuerpos de ANDV, y actualmente no hay duda de que el virus es extremadamente similar genéticamente entre los dos roedores del huésped [157, 158]. En América del Norte, el derrame del virus Bayou (BAYV) puede haber ocurrido desde el reservorio principal de O. palustris a S. hispidus, R. fulvescens, P. leucopus y B. taylori [159] [160] [161]. Es más probable que el derrame del virus Hanta se produzca con poblaciones de acogida que habitan regiones simpatricas o sintópicas [151, 162], y la transmisión de especies cruzadas tendría probablemente mayores posibilidades de éxito si las especies anfitrionas están estrechamente relacionadas [163]. Se encuentra una excepción interesante entre el virus Oxbow (OXBV) y el virus Asama (ASAV) en el que un proceso de cambio de huésped parecía haber ocurrido entre mamíferos pertenecientes a dos familias (Talpidae y Soricidae), probablemente como resultado de la codivergencia alterna y recurrente de ciertos tax Los hantavirus son transmitidos horizontalmente entre roedores y no son transmitidos por artrópodos (a diferencia de otros virus de la familia Bunyaviridae). La infección por derrapadores a mamíferos no humanos generalmente no produce ninguna transmisión hacia adelante (o a fin de morir), pero si los seres humanos están infectados pueden resultar en una alta morbilidad y mortalidad [122, 164]. Durante la primavera de 1993, un brote de pacientes con HCPS debido a SNV ocurrió en los estados de Four Corners, resultando en más del 60% de casos de mortalidad entre los casos iniciales, muchos de los cuales involucran a miembros de la tribu Navajo [12, 121]. En Panamá, se notificó un brote durante 1999-2000 en Los Santos, y 12 casos donde se identificaron con tres muertes [165, 166]. Esto representó el primer informe de infecciones por hantavirus humanos en América Central. En América del Sur, Diecisiete individuos fueron identificados con anticuerpo NVS (ELISA) o fueron antígenos (HCI) positivos de 52 casos sospechosos [167]. En 1996 ocurrieron brotes mayores debidos a ANDV en el sur de Argentina [131, 134] ; en el sur de Chile se presentaron grupos de pacientes con enfermedad por hantavirus en 1997 [158]. En Brasil, el primer brote fue identificado en la Amazonía Brasileña (Estado de Maranhão) en el año 2000, e involucró pequeños pueblos que resultaron en una prevalencia del 13,3% de los evaluados (398 residentes totales) [168]. Los factores que desencadenan los brotes de hantavirus todavía son mal entendidos, probablemente porque resultan de varias características bióticas y abióticas interactuantes cuyos parámetros clave son difíciles de modelar. Sin embargo, el uso de nuevos enfoques de modelado que involucran características geográficas y ambientales parece ser prometedor a la hora de predecir posibles brotes de hantavirus y/o áreas de mayor riesgo [169] [170] [171] [172]. Debido a que se sabe que los hantavirus se transmiten directamente de los huéspedes infectados a los susceptibles, el primer enfoque natural es relacionar los brotes con la ecología de los huéspedes virales. La transmisión y persistencia del hantavirus en las poblaciones de roedores depende de varios factores que interactúan para afectar la dinámica ecológica del huésped, que a su vez está fuertemente influenciada por las características de comportamiento de las especies de roedores individuales, a la estructura paisajística y a las características ambientales [173, 174]. La transmisión viral depende de las tasas de contacto entre los huéspedes sensibles, y a pesar de la noción prevaleciente de que un aumento de la densidad se encuentra y, por lo tanto, de Además, se ha demostrado que la transmisión de NVS sigue un patrón de heterogeneidad de contacto, donde los individuos de la población tienen diferentes probabilidades de transmitir la infección [176]. La comprensión de la transmisión viral resulta ser mucho más compleja cuando especies distintas del principal huésped del reservorio se incorporan en el modelo. De hecho, estudios recientes han demostrado que la mayor diversidad de especies hospedantes está correlacionada con una menor prevalencia de infección en América del Norte para P. maniculatus [177], en América Central para O. fulvescens (reservorio del virus Choclo) y Zygodontomys brevicauda (reservorio del virus Calabazo) [178], y en América del Sur para Akodon montensis (reservorio del virus Jabora) [162]. Las tasas de contacto varían según la distribución espacial de las poblaciones y parecen estar Por ejemplo, la prevalencia de SNV en P. maniculatus fue mayor en paisajes con mayor grado de fragmentación del hábitat preferido [179]. Además, ciertas propiedades del paisaje como elevación, pendiente y cubierta terrestre parecen ser útiles para detectar áreas con infecciones persistentes de SNV, y por lo tanto se consideran áreas refugiales donde el virus puede mantenerse durante años [169]. Los cambios en el entorno natural de las especies de reservorios, como la fragmentación forestal y la pérdida de hábitat, pueden alterar la abundancia y distribución de la población y provocar brotes de hantavirus, como se observa en la Península de Azurero de Panamá [118, 119]. Además, las diferencias en el microhábitat, incluida la cubierta superficial, pueden conducir a diferencias en la dinámica ecológica dentro de las poblaciones y afectar a la tasa de exposición al virus [180]. Se han encontrado diferencias en las infecciones por hantavirus a través de paisajes contrastantes en el intervalo latitudinal en poblaciones de roedores de O. longicaudatus en Chile, lo que sugiere que los seres humanos están expuestos de manera diferencial al virus [107, 181]. La dinámica poblacional de roedores se ve afectada por cambios estacionales de clima y clima [182, 183]. En el caso de los brotes asociados a ENSO, se ha postulado una compleja cascada de eventos desencadenados por lluvias altamente inusuales en el año precedente para dar lugar a un aumento de la producción primaria y densidades de roedores, aumentando también la probabilidad de transmisión del virus a los seres humanos, pero ha resultado difícil demostrar con precisión los eventos intermedios sugeridos, como el aumento de las densidades de roedores en el aumento de la carga de casos [116, 121, 184]. En América del Sur, los efectos del cambio climático y los brotes de hantavirus no han sido bien estudiados, a pesar del conocimiento de que varias especies de roedores que son reservorios de enfermedades emergentes se han visto dramáticamente afectadas por eventos como El Niño [185]. Los cambios en la dinámica de la población de acogida también se ven afectados por la estacionalidad, lo que puede conducir a brotes de enfermedades cuando se interrumpen los procesos que equilibran las poblaciones de roedores de temporada en temporada [186]. La emergencia viral puede seguir promoviéndose a medida que los cambios introducidos por el ser humano continúan aumentando en el medio ambiente a diferentes escalas geográficas. Estos cambios también pueden alterar la estructura y dinámica de la población de roedores e interacciones interespecies creando condiciones que pueden conducir a brotes virales, establecimiento viral en nuevos hospederos, y la aparición de HCPS [102, 162], incluso con aparentemente leve perturbación ecológica al sistema virus-hospedero [188]. Ciertas características fisiopatológicas, incluyendo trombocitopenia y shock, de enfermedades por hantavirus de los seres humanos, tienen similitud sustancial con las fiebres hemorrágicas inducidas por otros virus tales arenavirus, filovirus y flavivirus, a pesar de compartir esencialmente ninguna secuencia similitud con ellos. Tales observaciones plantean preguntas acerca de si tales similitudes en la patogénesis son probables similitudes de fenotipo, o en cambio reportan la presencia de mecanismos moleculares comunes entre los virus. En esta revisión se discuten las propiedades generales, descubrimientos y epidemiología/ecología de las formas de hantavirus patógenos del Nuevo Mundo, y también se busca identificar algunas de las características de las macromoléculas virales y mecanismos inmunológicos que se han propuesto como potenciales mediadores directos de los eventos patógenos que caracterizan la enfermedad humana HCPS. Si bien es poco probable que la expresión de una proteína viral particular o ARNs en aislamiento se pueda confiar en replicar fenotipos clave de infección por el virus completo, algunos de los hallazgos han sido suficientemente consistentes con lo que se conoce de la patogénesis in vivo que ofrecen plomos plausibles de primer paso en la búsqueda de objetivos terapéuticos. Esperamos con interés las revelaciones mecanísticas que seguirán el uso inevitablemente ampliado de métodos poderosos como la secuenciación profunda, imágenes cada vez más avanzadas, y métodos microscópicos, y modelos animales que por fin se pueden decir

¿Cómo actúa la proteína N?

Los hantavirus en las Américas y su papel como patógenos emergenteshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3185593/SHA: efe13a8d42b60ef9f7387ea539a1b2eeb5f80101Autores: Hjelle, Brian; Torres-Pérez, FernandoFecha: 2010-11-25DOI: 10.3390/v2125559Licencia: cc-byAbstract: La continua aparición y reaparición de patógenos representan una amenaza continua, a veces mayor, para las poblaciones. Los hantavirus (familia Bunyaviridae) y sus enfermedades humanas asociadas se consideraron confinados a Eurasia, pero la aparición de un brote en el suroeste de Estados Unidos llevó a un gran aumento en su estudio entre los virólogos de todo el mundo. Se han descrito más de 40 genotipos hantavirales, la gran mayoría desde 1993, y casi la mitad de ellos patógenos para los seres humanos. Los hantavirus causan infecciones persistentes en sus reservorios, y en las Américas, la enfermedad humana se manifiesta como compromiso cardiopulmonar, síndrome cardiopulmonar del hantavirus (HCPS), con proporciones de casos-fatalidad, para los serotipos virales más comunes, entre el 30% y el 40%. Alteración del hábitat y trastornos ecológicos a mayor escala, tal vez incluyendo el cambio climático, son algunos de los factores que pueden haber aumentado la carga de casos humanos de HCPS entre 1993 y el presente. Consideramos aquí las características que influyen en la estructura de la dinámica de la población huésped que pueden conducir a brotes virales, así como los determinantes macromoleculares de los hantavirus que han sido considerados como potenciales contribuciones a la patogenicidad. Texto: Los patógenos emergentes causan enfermedades nuevas o no reconocidas anteriormente, y entre ellas, las zoonóticas emergentes son una preocupación importante entre los científicos que estudian enfermedades infecciosas a diferentes escalas espaciales y temporales [1, 2]. Los cambios en las condiciones bióticas y abióticas pueden alterar la dinámica de las enfermedades de la población y conducir a la aparición de infecciones zoonóticas [3] [5] [6]. Durante las últimas décadas, se han producido varios brotes de patógenos virales emergentes y reemergentes, que afectan tanto a la implicación puramente local como a nivel mundial/pandémica de las poblaciones humanas. Entre los ejemplos visibles están la gripe A, el virus del Ébola, el virus de la hepatitis C, el trastorno respiratorio grave para adultos (SARS), el coronavirus y el virus de la inmunodeficiencia humana, que desafían las medidas de prevención y control de los sistemas de salud pública [7]. En las Américas, el reciente brote de gripe pandémica A subtipo H1N1 se convirtió en un objetivo importante de control debido a su rápida propagación, y las incertidumbres en cuanto a virulencia y transmisibilidad, sin embargo, la disponibilidad de vacunas fue limitada cuando se produjo una actividad significativa antes de la temporada tradicional de gripe [8]. Sin embargo, en el último siglo han surgido o resurgido brotes de varias enfermedades virales relacionadas con el virus arenavirus y el virus del dengue, y más recientemente, hantavirus y la expansión del rango geográfico del virus del Nilo Occidental. Entre las enfermedades zoonóticas, los mamíferos pequeños son anfitriones de varios virus ARN patógenos, especialmente Arenaviridae y Bunyaviridae: Hantavirus [9] [10] [11]. Las infecciones por hantavirus se convirtieron en una preocupación en las Américas después de la descripción de un brote de distrés respiratorio agudo ocurrido en La enfermedad recientemente reconocida, el síndrome cardiopulmonar del hantavirus, el HCPS (o síndrome pulmonar del hantavirus), se relacionó con la infección por el virus del Sin Nombre (SNV) recién descubierto, y el roedor Peromyscus maniculatus (ratón venado) fue identificado como el reservorio [13]. Sin embargo, las infecciones por hantavirus tienen una historia mucho más larga. Una revisión de los escritos chinos antiguos, que datan de aproximadamente 960 dC, reveló descripciones muy parecidas a la fiebre hemorrágica con síndrome renal (HFRS), el síndrome causado por los hantavirus del Viejo Mundo [14]. Durante el siglo XX, los casos de enfermedad febril aguda con compromiso renal fueron descritos de varios países eurasiáticos y Japón, a menudo en asociación con compromisos militares [15]. El HFRS como síndrome distinto, sin embargo, fue llamado por primera vez a la atención de la medicina occidental en asociación con un brote que ocurrió entre las tropas de las Naciones Unidas durante el conflicto coreano entre 1951 y 1954, donde más de 3.200 soldados fueron afectados [16]. Tomó más de dos décadas hasta que el agente etiológico, el virus Hantaan (HTNV), fue aislado del ratón de campo rayado Apodemus agrarius, detectado en parte por la unión de anticuerpos de muestras de suero de paciente a los tejidos pulmonares de ratones de campo sanos y salvajes [17, 18]. El virus se encontró más tarde para representar la especie tipo de un nuevo género Hantavirus de la familia Bunyaviridae, aunque fue más tarde evidente que el primer hantavirus a aislarse fue el virus Thottapalayam de shrew-borne [19]. La categorización de los hantavirus como pertenecientes a la familia Bunyaviridae se debe en parte a la presencia consistente de tres genomas de ARN que son circularizados in vivo como resultado de la presencia de nucleótidos terminales complementarios que ayudan a doblar el genoma en una morfología -hairpin-, descrita por primera vez para el flebovirus Uukuniemi [19, 20]. La Tabla 1 es una lista de los hantavirus patógenos predominantemente distintos serológicamente. Se describen muchos otros genotipos llamados, pero tales otras formas patogénicas están generalmente estrechamente relacionadas con los Andes o, en algunos casos, el virus Sin Nombre. Durante la maduración del virus, el precursor forma GPC se procesa utilizando una proteasa unida a la membrana en Gn y Gc, una escisión que ocurre, y parece ser señalada, después de la señal péptida conservada WAASA en la C-terminal de Gn [24]. Aunque las dos proteínas se pueden expresar de forma independiente a través de la transfección, pueden ser retenidas en el compartimento celular incorrecto (ER o aggrosome); por lo tanto, deben ser co-expresadas para permitirles estabilidad para que las dos se puedan ensamblar correctamente en el Golgi [25, [27] [28]. Se han identificado varias actividades y propiedades para las glicoproteínas envolventes del hantavirus, incluyendo algunas características que se sospecha que están involucradas en la patogenicidad de los serotipos causantes de la enfermedad, una posibilidad que ha generado atención experimental. Las glucoproteínas son los ligandos conocidos o presuntos para al menos dos receptores celulares distintos, la cadena de integrina y el factor acelerador de la descomposición, o DAF [30, 31] ; con gC1qR/p32 también identificado como otro receptor de entrada potencial [32]. Comparaciones con la proteína E del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, llevaron a Tischler et al. a considerar la glicoproteína Gc como una proteína potencial de fusión de clase II, tal vez impartiendo actividad de fusión al virión, y esta hipótesis ha ganado apoyo en otros estudios [33, 34]. Se han identificado actividades adicionales con, o se afirma que están relacionadas con, Gn. Para muchos de estos estudios, una premisa subyacente ha sostenido que hay diferencias entre las glicoproteínas de hantavirus -patógenos en relación con virus en el género que se denominan Si bien es cierto que aún no ha sido posible vincular el virus de Prospect Hill (PHV) con la enfermedad humana, la ausencia de evidencia de su patogenicidad tal vez no debería equipararse con la evidencia de su ausencia. Sólo se podría considerar que el nivel de enfermedad (por ejemplo, letargo, fiebre, proteinuria y azotemia) asociado con la infección de primates no humanos por PHV no es significativamente diferente del registrado para los modelos de primates no humanos utilizando el virus conocido del patógeno Puumala (PUUV) [35, 36]. Para el propósito de esta discusión, presumiremos que los hantavirus apatogénicos son efectivamente apatogénicos. Mientras que algunos estudios han sugerido que las glicoproteínas Gn se dirigen más rápidamente a la vía ubiquitina-proteosoma que a las formas apatogénicas, otros han interpretado las diferencias en el manejo de las glicoproteínas Gn a través de especies de hantavirus por el sistema ubiquitina-proteosomal como independientes de la patogenicidad [37] [38] [39]. Algunos investigadores han dirigido sus esfuerzos hacia la identificación de una capacidad diferencial, ya sea cinética o de magnitud absoluta, en la capacidad de los hantavirus patógenos y apatogénicos para provocar una respuesta de interferón en las células. Una premisa que surge es que las formas apatogénicas tenderían a inducir una respuesta innata anterior que haría más probable que el virus se limpiara rápidamente o se volviera menos competente en su replicación, a fin de evitar cualquier respuesta patológica en el huésped [42] La respuesta innata anti-hantavirus puede en algunos casos ser atribuida a la interacción viral como ligando de TLR-3, pero no en otros, y en las células endoteliales, no parece requerir más que la partícula viral misma, incluso cuando se introduce en forma replicativa incompetente [43, 44]. Las proteínas y los ARNm inducidos prominentemente por los hantavirus incluyen MxA e IFIT-1 (ISG-56) y otros incluyendo algunos con actividad antiviral conocida o sospechada. Esos hantavirus, a menudo cepas altamente patógenas, que no inducen una respuesta antiviral potente, se sospechan o se presume que tienen un (más) potente mecanismo de antagonismo interferón-vía en relación con otros virus, un mecanismo que actúa positivamente para prevenir que se forme una respuesta innata efectiva, al menos temprano en la infección [4 Sin embargo, se reportan algunos casos en los que los hantavirus altamente patógenos, tales como NVS, también son capaces de inducir la expresión de los ARNm del gen estimulado por interferón, incluso muy temprano en la infección, con proteínas ISG, como se esperaba, tardando más tiempo en aparecer en la célula [44]. Las actividades anti-interferón también se han atribuido a la proteína NSs que se puede elaborar en células infectadas por serotipos que codifican esta proteína [46]. Otros investigadores han examinado las actividades de las glucoproteínas del hantavirus y otras proteínas que podrían afectar directamente a algunos aspectos de la progresión patogénica asociada a la infección por hantavirus en humanos, tales como cambios de permeabilidad vascular. Mientras que los primeros intentos de causar directamente aumentos en la permeabilidad de las monocapas endoteliales con partículas virales o infección viral fueron en gran medida decepcionantes, los hantavirus se han identificado como que afectan adversamente la migración endotelial sobre los sustratos y en la potenciación de la permeabilidad endotelial inducida por VEG-F [47, 48]. La proteína nucleocápsida o N más corta (+50 kD) es un componente estructural del nucleocápsido viral, junto con los segmentos de ARN viral genómico. Como proteína de unión al ARN que afecta a la horquilla del cabello de los segmentos genómicos con alta afinidad [49, 50], limita el acceso del ARN para alojar nucleasasas y ayuda a hacer que la replicación viral sea un proceso cerrado dentro del citoplasma. También actúa como una proteína de membrana periférica, al igual que la proteína L [51], una actividad que podría jugar un papel en su supuesta, pero aún no demostrada función como matriz [52]. Hasta hace poco, no se había apreciado que N tuviera una amplia variedad de otras actividades, algunas de las cuales pueden estar vinculadas, no sólo a los requisitos fundamentales de replicación, sino también a la interferencia con una serie de procesos intracelulares de la célula normal. Así, se ha propuesto una interacción entre el aminoterminal de la proteína N del hantavirus y la proteína celular Daxx, con la sugerencia de posibles consecuencias pro-apoptóticas [51]. N también se reporta que interactúa con microfilamentos actínicos, y la proteína SUMO-1 [53, 54]. Utilizando ensayos basados en el gen reportero, Connie Schmaljohn y sus colegas han informado que la proteína nucleocapsid del virus Hantaan tiene un papel inhibidor en las respuestas inflamatorias mediadas por NF kappa B (NF- â € € TM B). Los efectos sobre la expresión NF- € B parecen estar limitados a la prevención de su translocación nuclear después de su intento de activación con lipopolisacárido, LPS [55]. En el citoplasma de las células infectadas, la proteína N se puede encontrar en los cuerpos celulares P donde secuestra y protege los capuchones de 5'. Puede localizar los capuchones a través de su interacción con DCP1, un componente clave de los cuerpos P. Durante la infección por hantavirus, los ARN virales se concentran en los cuerpos P, a través de su interacción con N y DCP1. La proteína N demuestra la protección preferencial de los ARNm diseñados para terminar prematuramente su proteína codificada en comparación con los ARNm nativos [56]. La proteína N se ha vinculado cada vez más a la replicación y traducción virales, a veces de maneras no previstas anteriormente. Se encuentra entre una familia creciente de diversas proteínas virales que pueden servir como un inespecífico - ARN chaperone ®, una actividad que debe facilitar el acceso de la L polimerasa al ARNv para la transcripción y replicación, en que puede disociar transitoriamente estructuras de ARN mal dobladas [57]. Algunos de los efectos de la proteína N en la traducción no pueden ser inmediatamente reconocidos como adaptables en la naturaleza. Puede reemplazar todo el complejo de iniciación traslacional EIF4F, presentando simultáneamente el ribosoma con un reemplazo de la actividad de unión de la tapa de eIF 4E, uniéndose al complejo de pre-iniciación 43S, al igual que eIF 4G, al tiempo que reemplaza la actividad helicoidal de eIF 4A, que se presume que es necesaria para disociar la estructura de ARN de orden superior [56, 58]. Estos tres factores normalmente trabajan juntos para lograr la iniciación traslacional. En los cuerpos P, la capacidad de la proteína N de unirse a una alta afinidad a los oligoribonucleótidos celulares nativos tapados, junto con su actividad en la protección de ARNs tapados de la degradación, probablemente facilita el acceso de oligonucleótidos encapsulados para su uso en la iniciación transcripcional por L polimerasa (-cap ra Tráfico de N para el ensamblaje viral: Clásicamente, la proteína N en las células infectadas parece estar agrupada o partículas en la naturaleza, con una concentración pesada en una única ubicación perinuclear, ampliamente considerada como la Golgi [27]. Las proteínas N de los hantavirus se encuentran en asociación con fracciones de partículas, y los estudios confocales microscopía y bioquímico-inhibidores han demostrado que las trazas N a lo largo de microtúbulos pero no con filamentos de actina [52]. El destino final de N, para su ensamblaje en partículas virales es la Golgi, y que circula allí a través del complejo intermedio retículo-Golgi endoplasmático (ERGIC), también conocido como cúmulo vesicular-tubular [52]. Un inhibidor negativo dominante, la dinamitina, asociado con el transporte mediado por Los estudios posteriores sugieren que la dependencia específica del transporte microtubular es específica de los hantavirus del Viejo Mundo como el NVH, pero que el Hantavirus del Nuevo Mundo ANDV está asociado con filamentos de actina [59]. Sin embargo, los datos recientes indican que el transporte microtubular es efectivamente utilizado para el NVH del Nuevo Mundo [60]. Las enfermedades del Hantavirus del hombre desde hace mucho tiempo han sido sospechosas de tener una base inmunopatógena en parte debido a su período de incubación relativamente largo de 2-3 semanas y la asociación temporal observada entre los trastornos inmunológicos y la primera aparición de signos y síntomas de la enfermedad del hantavirus. HFRS y HCPS comparten muchas características clínicas, llevando a muchos investigadores a considerar que son, en esencia, diferentes manifestaciones de un proceso patógeno similar, que difieren principalmente en los órganos objetivo primarios de expresión de la enfermedad (Tabla La patogénesis de las infecciones por hantavirus es el tema de una revisión continuamente actualizada en la serie UpToDate [61]. Para el momento en que aparecen los síntomas en el HCPS, ambas respuestas antivirales fuertes, y, para los genotipos virales más virulentos, el ARN viral puede ser detectado en plasma sanguíneo o células sanguíneas nucleadas respectivamente [63, 64]. Al menos tres estudios han correlacionado el ARN viral plasmático con la gravedad de la enfermedad para el HCPS y el HFRS, sugiriendo que la replicación del virus juega un papel continuo y en tiempo real en la patogénesis viral [65] [66] [67]. Se han identificado varios cambios patológicos distintivos que ocurren tanto en el HFRS como en el HCPS. Una característica crítica de ambos es una fuga capilar transitoria (~ 1-5 días) que involucra el La fuga resultante es de carácter exudativo, con una composición química alta en proteínas y similar al plasma. La experiencia continua que indica el fuerte tropismo tisular para las células endoteliales, específicamente, es uno de los varios factores que hacen de la integra β3 un candidato especialmente atractivo como un importante receptor in vivo para los hantavirus. Es probable que los hantavirus lleguen a sus tejidos objetivo a través de la captación por los ganglios linfáticos regionales, tal vez con o dentro de un histiocito pulmonar escoltante. Las semillas del virus endotelio local, donde las primeras células infectadas dan lugar, en última instancia, a una viremia primaria, un proceso que parece tomar mucho tiempo para las infecciones por hantavirus [62, 63]. En el momento en que emerge la viremia secundaria, los agentes de las formas más severas de HFRS y HCPS han comenzado a alcanzar una masa suficiente para inducir, a través de las interacciones PAMP-PRR y otros medios, la expresión de citoquinas proinflamatorias [64]. Para HCPS, esa expresión favorece el lecho pulmonar y los órganos linfoides, pero, por razones desconocidas, ahorra el retroperitoneo y, en general, el riñón. En HFRS la situación se invierte, y sin embargo no se aprecia a menudo que el esperado tropismos tisulares preferentes de virus asociados a HFRS y sus contrapartes asociadas a HCPS para los lechos renal y pulmonar, respectivamente, no sea como se predeciría a través de las manifestaciones de las dos enfermedades. La elaboración local de mediadores inflamatorios y quimiotácticos se considera un requisito para el desarrollo Sin embargo, no es la hipoxemia, debido al edema pulmonar prominente, lo que conduce a la muerte en la mayoría de los casos fatales de HCPS, sino más bien la intoxicación del corazón por mediadores como aún no definidos, lo que conduce al estado de bajo gasto cardíaco y al síndrome de shock asociado [64, 65]. Es tentador especular que los mediadores producidos en el pulmón en conexión con el infiltrado inflamatorio pueden infiltrarse a través de la circulación coronaria con dilución mínima en HCPS, consecuencia desventajosa de la estrecha yuxtaposición anatómica de los dos órganos. Así, al menos tres clases de mecanismos potenciales, algunos superpuestos y todos ciertamente no exclusivos de los otros, podrían presumirse que subyacen a la patogénesis del HCPS. Estos incluyen:(1) Mecanismos inmunes innatos. La naturaleza de las interacciones entre los patrones moleculares asociados al patógeno del hantavirus (PAMP) y los receptores de reconocimiento del patrón (PRR) de las células endoteliales susceptibles comienzan a ser aclaradas. El HTNV prototípico parece ser reconocido por TLR-3 [43]. Tal infección tiene consecuencias tales como una mayor expresión del HLA-DR en las células dendríticas [66] y la diferenciación de los monocitos hacia las células dendríticas [67]. (2) Efectos virales directos. La correlación observada entre la carga viral y la gravedad de la enfermedad deja abierta la posibilidad de que las partículas del hantavirus o el ARN puedan tener efectos tóxicos sobre las células o sobre la señalización. Algunos investigadores han favorecido la toxicidad viral directa, actuando a través de la inhibición de la función de barrera celular endotelial, como una explicación de gran parte de la fuga capilar, aunque existe Una pista potencialmente importante hacia el mecanismo por el cual las infecciones por hantavirus agotan las plaquetas sanguíneas y, en algunos casos, causan manifestaciones hemorrágicas, fue avanzada por el reciente descubrimiento de que los hantavirus patógenos son capaces de reclutar plaquetas para adherirse a las superficies celulares endoteliales, con β3 integrina utilizada como elemento de unión crítica [69]. (3) Efectos patógenos causados por las actividades de macromoléculas virales específicas. Hemos revisado algunas de las actividades asociadas con los Gn, Gc y N, polipéptidos codificados viralmente en secciones anteriores. Modelos de prueba de patogénesis se pueden hacer más eficazmente cuando hay un modelo animal que imita aspectos clave de la enfermedad. No existe un modelo similar al HFRS, pero existen modelos animales para el transporte asintomático de PUUV y SNV por sus roedores portadores nativos, el banco vole Myodes glareolus y el ratón venado P. maniculatus; así como un modelo hámster sirio utilizando ANDV o el virus Aporal relacionado de Venezuela, para el cual se observa una enfermedad mimética HCPS [70] [71] [72] [73]. El modelo hámster ANDV-Sirio tiene una serie de características en común con la enfermedad humana, así como algunas diferencias. A diferencia de las enfermedades neurológicas que han sido posibles de provocar con HTNV, el modelo hámster para HCPS parece ser causado por fugas capilares que resultan en edema pulmonar y la producción de un derrame pleural con características exudativas. Típicamente los hámsteres mueren entre 11 y 14-d post-inoculación, reflejando un período de incubación ligeramente acelerado en comparación con las infecciones humanas. Al igual que con el HCPS humano, el examen microscópico del pulmón revela abundante deposición de fibrina, septo alveolar engrosado y antígeno viral expresado abundantemente en el endotelio microvascular. Los hámsteres infectados por ANDV equipados con dispositivos de monitoreo fisiológico mostraron disminución de las presiones de pulso, taquicardia e hipotensión que parecen imitar de cerca el shock que se cree que es la causa próxima de la muerte en pacientes que sucumben al HCPS [65, 74]. En comparación con la enfermedad humana, los hámsteres infectados por ANDV exhiben títulos excepcionalmente altos de ANDV vivo en sus tejidos, con gran parte de la replicación viral que se produce Los títulos de ANDV vivo en algunos casos superan los 10 8 /g, mientras que los aislados de hantavirus de los tejidos humanos han sido notoriamente difíciles de obtener. A pesar de la aparición universal de enzimas hepáticas levemente elevadas en pacientes con HCPS, las enzimas hepáticas no parecen estar presentes en niveles elevados en la sangre de hámsters enfermos incluso inmediatamente antes de la muerte [75]. El período prolongado de incubación asociado con la enfermedad por hantavirus da al huésped un tiempo considerable para montar una respuesta inmune madura contra el virus. Así, en contradición a infecciones de gravedad comparable y sintomatología relacionada asociada con arenavirus y filovirus, las infecciones por hantavirus en humanos se asocian con respuestas anticuerpos de título significativo por el momento en que comienzan los síntomas. A pesar de esta observación, parece ser posible que la variación natural en las respuestas individuales de anticuerpos neutralizantes entre los pacientes con infecciones por NVS pueda estar relacionada con la gravedad de la enfermedad, lo que sugiere que la administración de anticuerpos antivirales podría resultar efectiva terapéuticamente [76]. En el caso de la infección por ANDV, han surgido nuevas evidencias que indican que el aparente aclaramiento del virus de la sangre no resulta en la eliminación completa del estímulo antigénico por el virus, sugiriendo que el virus puede persistir, tal vez en algún sitio inmunológicamente privilegiado aún indeterminado [77]. Un papel para las respuestas patológicas mediadas por células T en el HFRS y el HCPS ha sido la fuente de especulación por una variedad de razones. La gravedad del SNS asociado a la NVS puede haber hecho más evidente que el inicio del edema pulmonar, la taquicardia y la hipertensión parecía estar todo, pero universalmente asociado temporalmente, con la aparición de un espectro de células altamente activadas del linaje linfoide en la sangre periférica. Se detectaron células con similitudes morfológicas cercanas a estos -inmunoblastos- en los pulmones congestionados y pesados de los pacientes que llegaron a la autopsia, así como en órganos linfoides y en las tríadas portal [63, [78] [79] [80]. Estas observaciones llevaron a especular que algún componente de la patogénesis por hantavirus podría estar vinculado a la aparición de células T antivirales que podrían estimular o contribuir a la aparición de una -tormenta de mediadores y el fenotipo de fuga capilar asociado. Estudios posteriores han confirmado la expectativa de que una fracción significativa de la población de inmunoblastos en pacientes con HCPS son células T con especificidad para epitopes específicos de antígenos virales de clase I presentados por el HLA, incluyendo Gn, Gc y N [77, [81] [82] [83]. Presumiblemente, las actividades antivirales de estas células, manifestadas en parte por su elaboración de mediadores en el intersticio afectado, pueden contribuir a la fuga endotelial/capilar que se encuentra en el corazón de la patogénesis del hantavirus. Debido a que los primeros casos de HCPS a menudo llegaron a la autopsia, se hizo posible examinar tejidos necropsiados para la expresión de citocinas. El estudio de Mori et al. (1999) revelaron una alta expresión relativa de citocinas proinflamatorias incluyendo TNF-, IL-1-, IL-6, proporcionando evidencia a favor de un modelo de tormenta de citoquinas para la patogénesis [64]. Los autores creían, basándose en la morfología de las células secretadoras de citoquinas, que tanto monocitos como linfocitos estaban contribuyendo a la producción de citocinas. Que los mediadores proinflamatorios se encuentran en niveles elevados en el plasma, así como el intersticio renal de pacientes con enfermedad hantaviral aguda se ha reconocido desde hace algún tiempo también [84, 85]. Si bien el diagnóstico de HCPS y HFRS se realiza mejor con serología IgM, en la etapa aguda de la infección por NVS, también se puede utilizar RT-PCR si se utilizan células sanguíneas o coágulos de sangre en lugar de plasma o suero, donde la sensibilidad incluso utilizando imprimaciones PCR anidadas disminuye a cerca del 70% [86] [87] [88]. En una instalación en la que se tratan muchos casos de HCPS, el centro médico de la Universidad de Nuevo México en Albuquerque, se ha ofrecido un servicio de diagnóstico en el que se analizan los hallazgos hematológicos del paciente para establecer la probabilidad de que un paciente tenga HCPS. La combinación de trombocitopenia, abundancia elevada de linfocitos -inmunoblasto-, población de células polimorfonucleares con desplazamiento izquierdo sin evidencia morfológica fuerte para su activación, y valores elevados de hemoglobina o hematocrito es altamente específica para el HCPS y permite a los clínicos la capacidad de poner pacientes presuntivos-HCPS en oxigenación de membrana extracorpórea (ECMO), que se cree que ha salvado a muchos pacientes de un resultado letal [89]. Se cree que la infección humana por hantavirus sigue el contacto con secreciones o excreciones producidas por roedores infectados. En los Estados Unidos, 538 infecciones humanas por hantavirus fueron reportadas hasta finales de diciembre de 2009 [90], con Nuevo México, Arizona y Colorado mostrando los casos más altos. Mientras que el prototípico hantavirus centroamericano en América Central fue el virus Rio Segundo de Reithrodontomys mexicanus de Costa Rica, la primera enfermedad humana apareció algunos años más tarde en Panamá, donde el virus Choclo (CHOV) surgió como el agente etiológico y se cree que es responsable de todos los casos conocidos de HCPS. La rata de arroz pigmeo fulvo Oligoryzomys fulvescens ha sido identificada como el reservorio de roedores [91]. En Panamá, los primeros casos de HCPS, aunque con poca o ninguna implicación cardiaca evidente, fueron reportados en 1999, y desde entonces, 106 infecciones humanas han ocurrido con una tasa de mortalidad del 26% [92]. Seroencuestas de mamíferos en México y Costa Rica han encontrado anticuerpos antihantavirus [93] [94] [95] [96], y se han notificado seroprevalencias que oscilan entre 0,6 y 1,6% en poblaciones humanas a pesar de la ausencia de casos conocidos de HCPS [97]. En América del Sur, los casos de HCPS se han identificado en Argentina, Bolivia, Brasil, Chile, Paraguay y Uruguay, y también se han notificado evidencias de exposición humana a hantavirus en Venezuela [98] y Perú [99]. En América del Sur, ANDV es el principal agente etiológico con casos en Chile y Argentina notificados desde 1995. En Chile, se han producido 671 casos de HCPS debido a ANDV durante el período 2001-2009 [100]. Desde 1995 se han reportado más de 1.000 casos de HCPS en Argentina [101] ; en el Brasil se han identificado aproximadamente 1.100 casos de HCPS entre 1993 y 2008 [102]. Las tasas de mortalidad por casos en esos tres países han sido similares, oscilando entre el 30% (Argentina), el 36% (Chile) y el 39% (Brasil). Las infecciones por Hantavirus ocurren con más frecuencia en hombres que en mujeres, aunque la proporción entre hombres y mujeres es muy variable. Por ejemplo, las comunidades panameñas mostraron una proporción de 55 hombres por 45 mujeres [103], mientras que en Chile la proporción es más sesgada por hombres (71%) [104]. En el Chaco paraguayo la proporción entre hombres y mujeres se aproxima al 50% [105]. En América del Norte, en diciembre de 2009 el 63% de los pacientes eran varones [90]. Todos los grupos étnicos y raciales parecen ser susceptibles a infecciones por el hantavirus, y las diferencias entre ciertos grupos (como indígenas y no indígenas) están más probablemente correlacionadas con el tipo de hábitat en el que reside la población (por ejemplo, zonas rurales frente a zonas urbanas). De hecho, las comunidades rurales representan la mayor incidencia global del hantavirus y, por lo tanto, están en mayor riesgo [92, [105] [106] [107] [108] [109] [109] [119], aunque también se ha destacado la importancia de los entornos peridomésticos como una importante zona de exposición [112, 113]. El principal mecanismo por el que los seres humanos adquieren la infección por el hantavirus es la exposición a aerosoles de heces contaminadas de roedores, orina y saliva [114, 115]. Esto puede ocurrir cuando los seres humanos residen en áreas cercanas a las que habitan los roedores, viven en áreas infestadas de roedores, o cuando los roedores invaden entornos humanos, que son más frecuentes en hábitats rurales.Existe una larga historia de coexistencia humana con roedores, lo que plantea dudas sobre el aparente aumento reciente de las enfermedades relacionadas con el hantavirus, especialmente el HCPS. Aparte de una aparente asociación con eventos de oscilación sureña de El Niño (ENSO) en algunas regiones [116, 117], los recientes incrementos en la incidencia del HCPS no parecen seguir un patrón temporal o espacial fácilmente definido. Sin embargo, algunas características del paisaje, como la fragmentación del hábitat o las áreas perturbadas por el ser humano, pueden influir en la dinámica de la población de roedores e impactar en la incidencia viral [118] [112] [112] [121]. A pesar de la estocástica asociada a la contracción de la infección Las actividades humanas en edificios mal ventilados que pulverizan partículas que luego se inhalan (es decir, limpieza, agitación de alfombras, polvo) se identifican con frecuencia entre los pacientes admitidos para el SHCPS [11, 122]. Se cree que las actividades al aire libre transmiten un menor riesgo debido a la labilidad de los hantavirus a la radiación UV y a la supuesta tendencia a dispersarse en el viento, aunque ciertas condiciones ambientales parecen mantener el virus durante períodos más largos fuera de su huésped natural, lo que permite la transmisión indirecta [123]. Una vía alternativa pero poco común de transmisión del virus es la mordedura de roedores [124] [125] [126]. Los trabajadores sobre el terreno que manipulan mamíferos corren un riesgo potencialmente mayor de exposición a infecciones por hantavirus, aunque cuando se cuantifica a través de serosurveys el riesgo absoluto parece bastante leve [127]. Un nuevo estudio en Colorado sugiere la posibilidad de que una picadura de roedor haya sido el vehículo próximo para la transmisión al aire libre de NVS [128], lo que vuelve a enfatizar el uso de equipo de protección personal durante las actividades de trabajo de campo [129]. Como caso particular dentro de los hantavirus, la transmisión de persona a persona ha sido documentada exclusivamente para el virus de los Andes sudamericanos [130] [133] [133] [135]. La identificación de esta vía de transmisión se ha hecho utilizando tanto herramientas moleculares como encuestas epidemiológicas, pero el mecanismo de transmisión interpersonal no está bien establecido. Curiosamente, ANDV también puede ser derramado por los humanos a través de otros fluidos biológicos como la orina [136], ilustrando las propiedades particulares que diferencian este virus de otros hantavirus. Aunque la transmisión interpersonal parece ser única para ANDV, el ARN viral de PUUV se ha detectado en la saliva de pacientes con HFRS, y algunos pacientes con SNV-HCPS tienen ARN viral en las secreciones traqueales [88, 137]. Los Hantavirus en las Américas son alojados naturalmente por roedores (Muridae y Cricetidae) así como las musarañas (Soricidae) y los lunares (Talpidae) (Figura 1). Tres especies de musgo y un mole han sido reportados para albergar hantavirus y su patogenicidad para los humanos permanece desconocida [22, 138, 139]. Se han identificado al menos 15 especies de roedores como portadores de diferentes hantavirus patógenos, con algunos genotipos sudamericanos como Castelo do Sonhos (CDSV) o Hu39694 sólo identificados después de infecciones humanas (Figura 1 ). Los hantavirus suelen mostrar una alta especificidad de especie y ningún huésped intermedio [140]. Sin embargo, se han descrito algunos genotipos de hantavirus en la misma especie de roedores. Tal es el caso de Playa de Oro (OROV) y Catacamas (CATV) identificados en Oryzomys couesi [141, 142], o Maporal (MAPV) y Choclo (CHOV) hospedados por O. fulvescens [91, 143]. En América del Norte se han detectado virus de muleshoe y Black Creek Canal hanta en sigmodon hispidus [ Además, un genotipo de hantavirus (por ejemplo, el virus similar a Juquitiba) puede ser transportado por más de una especie de roedores (O. nigripes, Oxymycterus judex, Akodon montesis). Otro ejemplo es el virus Laguna Negra (LANV) que después de ser identificado en Calomys laucha [146] también ha sido reportado en C. callosus [147]. El rápido aumento en el descubrimiento de nuevos hantavirus y la identificación de sus anfitriones no parece probable que termine tan pronto como se examinen nuevas especies pequeñas de mamíferos [95]. Este tema se complica por la continua controversia en los criterios para la clasificación de distintos hantavirus [148, 149], que también está vinculado a la clasificación taxonómica y los reordenamientos taxonómicos. La transmisión de especies cruzadas es un proceso importante durante la propagación, aparición y evolución Particularmente dentro de los hantavirus, los derrames a los huéspedes secundarios se identifican cada vez más a medida que se realizan estudios más extensos [151] [152] [153] [155] [156]. Por ejemplo, ANDV es el agente etiológico predominante del HCPS en América del Sur, y O. longicaudatus el principal reservorio de roedores. Derrama en al menos otras cuatro especies de roedores que coocurren con el reservorio se han identificado, con Abrothrix longipilis mostrando la segunda mayor prevalencia de anticuerpos de ANDV, y actualmente no hay duda de que el virus es extremadamente similar genéticamente entre los dos roedores del huésped [157, 158]. En América del Norte, el derrame del virus Bayou (BAYV) puede haber ocurrido desde el reservorio principal de O. palustris a S. hispidus, R. fulvescens, P. leucopus y B. taylori [159] [160] [161]. Es más probable que el derrame del virus Hanta se produzca con poblaciones de acogida que habitan regiones simpatricas o sintópicas [151, 162], y la transmisión de especies cruzadas tendría probablemente mayores posibilidades de éxito si las especies anfitrionas están estrechamente relacionadas [163]. Se encuentra una excepción interesante entre el virus Oxbow (OXBV) y el virus Asama (ASAV) en el que un proceso de cambio de huésped parecía haber ocurrido entre mamíferos pertenecientes a dos familias (Talpidae y Soricidae), probablemente como resultado de la codivergencia alterna y recurrente de ciertos tax Los hantavirus son transmitidos horizontalmente entre roedores y no son transmitidos por artrópodos (a diferencia de otros virus de la familia Bunyaviridae). La infección por derrapadores a mamíferos no humanos generalmente no produce ninguna transmisión hacia adelante (o a fin de morir), pero si los seres humanos están infectados pueden resultar en una alta morbilidad y mortalidad [122, 164]. Durante la primavera de 1993, un brote de pacientes con HCPS debido a SNV ocurrió en los estados de Four Corners, resultando en más del 60% de casos de mortalidad entre los casos iniciales, muchos de los cuales involucran a miembros de la tribu Navajo [12, 121]. En Panamá, se notificó un brote durante 1999-2000 en Los Santos, y 12 casos donde se identificaron con tres muertes [165, 166]. Esto representó el primer informe de infecciones por hantavirus humanos en América Central. En América del Sur, Diecisiete individuos fueron identificados con anticuerpo NVS (ELISA) o fueron antígenos (HCI) positivos de 52 casos sospechosos [167]. En 1996 ocurrieron brotes mayores debidos a ANDV en el sur de Argentina [131, 134] ; en el sur de Chile se presentaron grupos de pacientes con enfermedad por hantavirus en 1997 [158]. En Brasil, el primer brote fue identificado en la Amazonía Brasileña (Estado de Maranhão) en el año 2000, e involucró pequeños pueblos que resultaron en una prevalencia del 13,3% de los evaluados (398 residentes totales) [168]. Los factores que desencadenan los brotes de hantavirus todavía son mal entendidos, probablemente porque resultan de varias características bióticas y abióticas interactuantes cuyos parámetros clave son difíciles de modelar. Sin embargo, el uso de nuevos enfoques de modelado que involucran características geográficas y ambientales parece ser prometedor a la hora de predecir posibles brotes de hantavirus y/o áreas de mayor riesgo [169] [170] [171] [172]. Debido a que se sabe que los hantavirus se transmiten directamente de los huéspedes infectados a los susceptibles, el primer enfoque natural es relacionar los brotes con la ecología de los huéspedes virales. La transmisión y persistencia del hantavirus en las poblaciones de roedores depende de varios factores que interactúan para afectar la dinámica ecológica del huésped, que a su vez está fuertemente influenciada por las características de comportamiento de las especies de roedores individuales, a la estructura paisajística y a las características ambientales [173, 174]. La transmisión viral depende de las tasas de contacto entre los huéspedes sensibles, y a pesar de la noción prevaleciente de que un aumento de la densidad se encuentra y, por lo tanto, de Además, se ha demostrado que la transmisión de NVS sigue un patrón de heterogeneidad de contacto, donde los individuos de la población tienen diferentes probabilidades de transmitir la infección [176]. La comprensión de la transmisión viral resulta ser mucho más compleja cuando especies distintas del principal huésped del reservorio se incorporan en el modelo. De hecho, estudios recientes han demostrado que la mayor diversidad de especies hospedantes está correlacionada con una menor prevalencia de infección en América del Norte para P. maniculatus [177], en América Central para O. fulvescens (reservorio del virus Choclo) y Zygodontomys brevicauda (reservorio del virus Calabazo) [178], y en América del Sur para Akodon montensis (reservorio del virus Jabora) [162]. Las tasas de contacto varían según la distribución espacial de las poblaciones y parecen estar Por ejemplo, la prevalencia de SNV en P. maniculatus fue mayor en paisajes con mayor grado de fragmentación del hábitat preferido [179]. Además, ciertas propiedades del paisaje como elevación, pendiente y cubierta terrestre parecen ser útiles para detectar áreas con infecciones persistentes de SNV, y por lo tanto se consideran áreas refugiales donde el virus puede mantenerse durante años [169]. Los cambios en el entorno natural de las especies de reservorios, como la fragmentación forestal y la pérdida de hábitat, pueden alterar la abundancia y distribución de la población y provocar brotes de hantavirus, como se observa en la Península de Azurero de Panamá [118, 119]. Además, las diferencias en el microhábitat, incluida la cubierta superficial, pueden conducir a diferencias en la dinámica ecológica dentro de las poblaciones y afectar a la tasa de exposición al virus [180]. Se han encontrado diferencias en las infecciones por hantavirus a través de paisajes contrastantes en el intervalo latitudinal en poblaciones de roedores de O. longicaudatus en Chile, lo que sugiere que los seres humanos están expuestos de manera diferencial al virus [107, 181]. La dinámica poblacional de roedores se ve afectada por cambios estacionales de clima y clima [182, 183]. En el caso de los brotes asociados a ENSO, se ha postulado una compleja cascada de eventos desencadenados por lluvias altamente inusuales en el año precedente para dar lugar a un aumento de la producción primaria y densidades de roedores, aumentando también la probabilidad de transmisión del virus a los seres humanos, pero ha resultado difícil demostrar con precisión los eventos intermedios sugeridos, como el aumento de las densidades de roedores en el aumento de la carga de casos [116, 121, 184]. En América del Sur, los efectos del cambio climático y los brotes de hantavirus no han sido bien estudiados, a pesar del conocimiento de que varias especies de roedores que son reservorios de enfermedades emergentes se han visto dramáticamente afectadas por eventos como El Niño [185]. Los cambios en la dinámica de la población de acogida también se ven afectados por la estacionalidad, lo que puede conducir a brotes de enfermedades cuando se interrumpen los procesos que equilibran las poblaciones de roedores de temporada en temporada [186]. La emergencia viral puede seguir promoviéndose a medida que los cambios introducidos por el ser humano continúan aumentando en el medio ambiente a diferentes escalas geográficas. Estos cambios también pueden alterar la estructura y dinámica de la población de roedores e interacciones interespecies creando condiciones que pueden conducir a brotes virales, establecimiento viral en nuevos hospederos, y la aparición de HCPS [102, 162], incluso con aparentemente leve perturbación ecológica al sistema virus-hospedero [188]. Ciertas características fisiopatológicas, incluyendo trombocitopenia y shock, de enfermedades por hantavirus de los seres humanos, tienen similitud sustancial con las fiebres hemorrágicas inducidas por otros virus tales arenavirus, filovirus y flavivirus, a pesar de compartir esencialmente ninguna secuencia similitud con ellos. Tales observaciones plantean preguntas acerca de si tales similitudes en la patogénesis son probables similitudes de fenotipo, o en cambio reportan la presencia de mecanismos moleculares comunes entre los virus. En esta revisión se discuten las propiedades generales, descubrimientos y epidemiología/ecología de las formas de hantavirus patógenos del Nuevo Mundo, y también se busca identificar algunas de las características de las macromoléculas virales y mecanismos inmunológicos que se han propuesto como potenciales mediadores directos de los eventos patógenos que caracterizan la enfermedad humana HCPS. Si bien es poco probable que la expresión de una proteína viral particular o ARNs en aislamiento se pueda confiar en replicar fenotipos clave de infección por el virus completo, algunos de los hallazgos han sido suficientemente consistentes con lo que se conoce de la patogénesis in vivo que ofrecen plomos plausibles de primer paso en la búsqueda de objetivos terapéuticos. Esperamos con interés las revelaciones mecanísticas que seguirán el uso inevitablemente ampliado de métodos poderosos como la secuenciación profunda, imágenes cada vez más avanzadas, y métodos microscópicos, y modelos animales que por fin se pueden decir

¿A qué otras actividades de N pueden estar vinculadas?

Los hantavirus en las Américas y su papel como patógenos emergenteshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3185593/SHA: efe13a8d42b60ef9f7387ea539a1b2eeb5f80101Autores: Hjelle, Brian; Torres-Pérez, FernandoFecha: 2010-11-25DOI: 10.3390/v2125559Licencia: cc-byAbstract: La continua aparición y reaparición de patógenos representan una amenaza continua, a veces mayor, para las poblaciones. Los hantavirus (familia Bunyaviridae) y sus enfermedades humanas asociadas se consideraron confinados a Eurasia, pero la aparición de un brote en el suroeste de Estados Unidos llevó a un gran aumento en su estudio entre los virólogos de todo el mundo. Se han descrito más de 40 genotipos hantavirales, la gran mayoría desde 1993, y casi la mitad de ellos patógenos para los seres humanos. Los hantavirus causan infecciones persistentes en sus reservorios, y en las Américas, la enfermedad humana se manifiesta como compromiso cardiopulmonar, síndrome cardiopulmonar del hantavirus (HCPS), con proporciones de casos-fatalidad, para los serotipos virales más comunes, entre el 30% y el 40%. Alteración del hábitat y trastornos ecológicos a mayor escala, tal vez incluyendo el cambio climático, son algunos de los factores que pueden haber aumentado la carga de casos humanos de HCPS entre 1993 y el presente. Consideramos aquí las características que influyen en la estructura de la dinámica de la población huésped que pueden conducir a brotes virales, así como los determinantes macromoleculares de los hantavirus que han sido considerados como potenciales contribuciones a la patogenicidad. Texto: Los patógenos emergentes causan enfermedades nuevas o no reconocidas anteriormente, y entre ellas, las zoonóticas emergentes son una preocupación importante entre los científicos que estudian enfermedades infecciosas a diferentes escalas espaciales y temporales [1, 2]. Los cambios en las condiciones bióticas y abióticas pueden alterar la dinámica de las enfermedades de la población y conducir a la aparición de infecciones zoonóticas [3] [5] [6]. Durante las últimas décadas, se han producido varios brotes de patógenos virales emergentes y reemergentes, que afectan tanto a la implicación puramente local como a nivel mundial/pandémica de las poblaciones humanas. Entre los ejemplos visibles están la gripe A, el virus del Ébola, el virus de la hepatitis C, el trastorno respiratorio grave para adultos (SARS), el coronavirus y el virus de la inmunodeficiencia humana, que desafían las medidas de prevención y control de los sistemas de salud pública [7]. En las Américas, el reciente brote de gripe pandémica A subtipo H1N1 se convirtió en un objetivo importante de control debido a su rápida propagación, y las incertidumbres en cuanto a virulencia y transmisibilidad, sin embargo, la disponibilidad de vacunas fue limitada cuando se produjo una actividad significativa antes de la temporada tradicional de gripe [8]. Sin embargo, en el último siglo han surgido o resurgido brotes de varias enfermedades virales relacionadas con el virus arenavirus y el virus del dengue, y más recientemente, hantavirus y la expansión del rango geográfico del virus del Nilo Occidental. Entre las enfermedades zoonóticas, los mamíferos pequeños son anfitriones de varios virus ARN patógenos, especialmente Arenaviridae y Bunyaviridae: Hantavirus [9] [10] [11]. Las infecciones por hantavirus se convirtieron en una preocupación en las Américas después de la descripción de un brote de distrés respiratorio agudo ocurrido en La enfermedad recientemente reconocida, el síndrome cardiopulmonar del hantavirus, el HCPS (o síndrome pulmonar del hantavirus), se relacionó con la infección por el virus del Sin Nombre (SNV) recién descubierto, y el roedor Peromyscus maniculatus (ratón venado) fue identificado como el reservorio [13]. Sin embargo, las infecciones por hantavirus tienen una historia mucho más larga. Una revisión de los escritos chinos antiguos, que datan de aproximadamente 960 dC, reveló descripciones muy parecidas a la fiebre hemorrágica con síndrome renal (HFRS), el síndrome causado por los hantavirus del Viejo Mundo [14]. Durante el siglo XX, los casos de enfermedad febril aguda con compromiso renal fueron descritos de varios países eurasiáticos y Japón, a menudo en asociación con compromisos militares [15]. El HFRS como síndrome distinto, sin embargo, fue llamado por primera vez a la atención de la medicina occidental en asociación con un brote que ocurrió entre las tropas de las Naciones Unidas durante el conflicto coreano entre 1951 y 1954, donde más de 3.200 soldados fueron afectados [16]. Tomó más de dos décadas hasta que el agente etiológico, el virus Hantaan (HTNV), fue aislado del ratón de campo rayado Apodemus agrarius, detectado en parte por la unión de anticuerpos de muestras de suero de paciente a los tejidos pulmonares de ratones de campo sanos y salvajes [17, 18]. El virus se encontró más tarde para representar la especie tipo de un nuevo género Hantavirus de la familia Bunyaviridae, aunque fue más tarde evidente que el primer hantavirus a aislarse fue el virus Thottapalayam de shrew-borne [19]. La categorización de los hantavirus como pertenecientes a la familia Bunyaviridae se debe en parte a la presencia consistente de tres genomas de ARN que son circularizados in vivo como resultado de la presencia de nucleótidos terminales complementarios que ayudan a doblar el genoma en una morfología -hairpin-, descrita por primera vez para el flebovirus Uukuniemi [19, 20]. La Tabla 1 es una lista de los hantavirus patógenos predominantemente distintos serológicamente. Se describen muchos otros genotipos llamados, pero tales otras formas patogénicas están generalmente estrechamente relacionadas con los Andes o, en algunos casos, el virus Sin Nombre. Durante la maduración del virus, el precursor forma GPC se procesa utilizando una proteasa unida a la membrana en Gn y Gc, una escisión que ocurre, y parece ser señalada, después de la señal péptida conservada WAASA en la C-terminal de Gn [24]. Aunque las dos proteínas se pueden expresar de forma independiente a través de la transfección, pueden ser retenidas en el compartimento celular incorrecto (ER o aggrosome); por lo tanto, deben ser co-expresadas para permitirles estabilidad para que las dos se puedan ensamblar correctamente en el Golgi [25, [27] [28]. Se han identificado varias actividades y propiedades para las glicoproteínas envolventes del hantavirus, incluyendo algunas características que se sospecha que están involucradas en la patogenicidad de los serotipos causantes de la enfermedad, una posibilidad que ha generado atención experimental. Las glucoproteínas son los ligandos conocidos o presuntos para al menos dos receptores celulares distintos, la cadena de integrina y el factor acelerador de la descomposición, o DAF [30, 31] ; con gC1qR/p32 también identificado como otro receptor de entrada potencial [32]. Comparaciones con la proteína E del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, llevaron a Tischler et al. a considerar la glicoproteína Gc como una proteína potencial de fusión de clase II, tal vez impartiendo actividad de fusión al virión, y esta hipótesis ha ganado apoyo en otros estudios [33, 34]. Se han identificado actividades adicionales con, o se afirma que están relacionadas con, Gn. Para muchos de estos estudios, una premisa subyacente ha sostenido que hay diferencias entre las glicoproteínas de hantavirus -patógenos en relación con virus en el género que se denominan Si bien es cierto que aún no ha sido posible vincular el virus de Prospect Hill (PHV) con la enfermedad humana, la ausencia de evidencia de su patogenicidad tal vez no debería equipararse con la evidencia de su ausencia. Sólo se podría considerar que el nivel de enfermedad (por ejemplo, letargo, fiebre, proteinuria y azotemia) asociado con la infección de primates no humanos por PHV no es significativamente diferente del registrado para los modelos de primates no humanos utilizando el virus conocido del patógeno Puumala (PUUV) [35, 36]. Para el propósito de esta discusión, presumiremos que los hantavirus apatogénicos son efectivamente apatogénicos. Mientras que algunos estudios han sugerido que las glicoproteínas Gn se dirigen más rápidamente a la vía ubiquitina-proteosoma que a las formas apatogénicas, otros han interpretado las diferencias en el manejo de las glicoproteínas Gn a través de especies de hantavirus por el sistema ubiquitina-proteosomal como independientes de la patogenicidad [37] [38] [39]. Algunos investigadores han dirigido sus esfuerzos hacia la identificación de una capacidad diferencial, ya sea cinética o de magnitud absoluta, en la capacidad de los hantavirus patógenos y apatogénicos para provocar una respuesta de interferón en las células. Una premisa que surge es que las formas apatogénicas tenderían a inducir una respuesta innata anterior que haría más probable que el virus se limpiara rápidamente o se volviera menos competente en su replicación, a fin de evitar cualquier respuesta patológica en el huésped [42] La respuesta innata anti-hantavirus puede en algunos casos ser atribuida a la interacción viral como ligando de TLR-3, pero no en otros, y en las células endoteliales, no parece requerir más que la partícula viral misma, incluso cuando se introduce en forma replicativa incompetente [43, 44]. Las proteínas y los ARNm inducidos prominentemente por los hantavirus incluyen MxA e IFIT-1 (ISG-56) y otros incluyendo algunos con actividad antiviral conocida o sospechada. Esos hantavirus, a menudo cepas altamente patógenas, que no inducen una respuesta antiviral potente, se sospechan o se presume que tienen un (más) potente mecanismo de antagonismo interferón-vía en relación con otros virus, un mecanismo que actúa positivamente para prevenir que se forme una respuesta innata efectiva, al menos temprano en la infección Sin embargo, se reportan algunos casos en los que los hantavirus altamente patógenos, tales como NVS, también son capaces de inducir la expresión de los ARNm del gen estimulado por interferón, incluso muy temprano en la infección, con proteínas ISG, como se esperaba, tardando más tiempo en aparecer en la célula [44]. Las actividades anti-interferón también se han atribuido a la proteína NSs que se puede elaborar en células infectadas por serotipos que codifican esta proteína [46]. Otros investigadores han examinado las actividades de las glucoproteínas del hantavirus y otras proteínas que podrían afectar directamente a algunos aspectos de la progresión patogénica asociada a la infección por hantavirus en humanos, tales como cambios de permeabilidad vascular. Mientras que los primeros intentos de causar directamente aumentos en la permeabilidad de las monocapas endoteliales con partículas virales o infección viral fueron en gran medida decepcionantes, los hantavirus se han identificado como que afectan adversamente la migración endotelial sobre los sustratos y en la potenciación de la permeabilidad endotelial inducida por VEG-F [47, 48]. La proteína nucleocápsida o N más corta (+50 kD) es un componente estructural del nucleocápsido viral, junto con los segmentos de ARN viral genómico. Como proteína de unión al ARN que afecta a la horquilla del cabello de los segmentos genómicos con alta afinidad [49, 50], limita el acceso del ARN para alojar nucleasasas y ayuda a hacer que la replicación viral sea un proceso cerrado dentro del citoplasma. También actúa como una proteína de membrana periférica, al igual que la proteína L [51], una actividad que podría jugar un papel en su supuesta, pero aún no demostrada función como matriz [52]. Hasta hace poco, no se había apreciado que N tuviera una amplia variedad de otras actividades, algunas de las cuales pueden estar vinculadas, no sólo a los requisitos fundamentales de replicación, sino también a la interferencia con una serie de procesos intracelulares de la célula normal. Así, se ha propuesto una interacción entre el aminoterminal de la proteína N del hantavirus y la proteína celular Daxx, con la sugerencia de posibles consecuencias pro-apoptóticas [51]. N también se reporta que interactúa con microfilamentos actínicos, y la proteína SUMO-1 [53, 54]. Utilizando ensayos basados en el gen reportero, Connie Schmaljohn y sus colegas han informado que la proteína nucleocapsid del virus Hantaan tiene un papel inhibidor en las respuestas inflamatorias mediadas por NF kappa B (NF- â € € TM B). Los efectos sobre la expresión NF- € B parecen estar limitados a la prevención de su translocación nuclear después de su intento de activación con lipopolisacárido, LPS [55]. En el citoplasma de las células infectadas, la proteína N se puede encontrar en los cuerpos celulares P donde secuestra y protege los capuchones de 5'. Puede localizar los capuchones a través de su interacción con DCP1, un componente clave de los cuerpos P. Durante la infección por hantavirus, los ARN virales se concentran en los cuerpos P, a través de su interacción con N y DCP1. La proteína N demuestra la protección preferencial de los ARNm diseñados para terminar prematuramente su proteína codificada en comparación con los ARNm nativos [56]. La proteína N se ha vinculado cada vez más a la replicación y traducción virales, a veces de maneras no previstas anteriormente. Se encuentra entre una familia creciente de diversas proteínas virales que pueden servir como un inespecífico - ARN chaperone ®, una actividad que debe facilitar el acceso de la L polimerasa al ARNv para la transcripción y replicación, en que puede disociar transitoriamente estructuras de ARN mal dobladas [57]. Algunos de los efectos de la proteína N en la traducción no pueden ser inmediatamente reconocidos como adaptables en la naturaleza. Puede reemplazar todo el complejo de iniciación traslacional EIF4F, presentando simultáneamente el ribosoma con un reemplazo de la actividad de unión de la tapa de eIF 4E, uniéndose al complejo de pre-iniciación 43S, al igual que eIF 4G, al tiempo que reemplaza la actividad helicoidal de eIF 4A, que se presume que es necesaria para disociar la estructura de ARN de orden superior [56, 58]. Estos tres factores normalmente trabajan juntos para lograr la iniciación traslacional. En los cuerpos P, la capacidad de la proteína N de unirse a una alta afinidad a los oligoribonucleótidos celulares nativos tapados, junto con su actividad en la protección de ARNs tapados de la degradación, probablemente facilita el acceso de oligonucleótidos encapsulados para su uso en la iniciación transcripcional por L polimerasa (-cap ra Tráfico de N para el ensamblaje viral: Clásicamente, la proteína N en las células infectadas parece estar agrupada o partículas en la naturaleza, con una concentración pesada en una única ubicación perinuclear, ampliamente considerada como la Golgi [27]. Las proteínas N de los hantavirus se encuentran en asociación con fracciones de partículas, y los estudios confocales microscopía y bioquímico-inhibidores han demostrado que las trazas N a lo largo de microtúbulos pero no con filamentos de actina [52]. El destino final de N, para su ensamblaje en partículas virales es la Golgi, y que circula allí a través del complejo intermedio retículo-Golgi endoplasmático (ERGIC), también conocido como cúmulo vesicular-tubular [52]. Un inhibidor negativo dominante, la dinamitina, asociado con el transporte mediado por Los estudios posteriores sugieren que la dependencia específica del transporte microtubular es específica de los hantavirus del Viejo Mundo como el NVH, pero que el Hantavirus del Nuevo Mundo ANDV está asociado con filamentos de actina [59]. Sin embargo, los datos recientes indican que el transporte microtubular es efectivamente utilizado para el NVH del Nuevo Mundo [60]. Las enfermedades del Hantavirus del hombre desde hace mucho tiempo han sido sospechosas de tener una base inmunopatógena en parte debido a su período de incubación relativamente largo de 2-3 semanas y la asociación temporal observada entre los trastornos inmunológicos y la primera aparición de signos y síntomas de la enfermedad del hantavirus. HFRS y HCPS comparten muchas características clínicas, llevando a muchos investigadores a considerar que son, en esencia, diferentes manifestaciones de un proceso patógeno similar, que difieren principalmente en los órganos objetivo primarios de expresión de la enfermedad (Tabla La patogénesis de las infecciones por hantavirus es el tema de una revisión continuamente actualizada en la serie UpToDate [61]. Para el momento en que aparecen los síntomas en el HCPS, ambas respuestas antivirales fuertes, y, para los genotipos virales más virulentos, el ARN viral puede ser detectado en plasma sanguíneo o células sanguíneas nucleadas respectivamente [63, 64]. Al menos tres estudios han correlacionado el ARN viral plasmático con la gravedad de la enfermedad para el HCPS y el HFRS, sugiriendo que la replicación del virus juega un papel continuo y en tiempo real en la patogénesis viral [65] [66] [67]. Se han identificado varios cambios patológicos distintivos que ocurren tanto en el HFRS como en el HCPS. Una característica crítica de ambos es una fuga capilar transitoria (~ 1-5 días) que involucra el La fuga resultante es de carácter exudativo, con una composición química alta en proteínas y similar al plasma. La experiencia continua que indica el fuerte tropismo tisular para las células endoteliales, específicamente, es uno de los varios factores que hacen de la integra β3 un candidato especialmente atractivo como un importante receptor in vivo para los hantavirus. Es probable que los hantavirus lleguen a sus tejidos objetivo a través de la captación por los ganglios linfáticos regionales, tal vez con o dentro de un histiocito pulmonar escoltante. Las semillas del virus endotelio local, donde las primeras células infectadas dan lugar, en última instancia, a una viremia primaria, un proceso que parece tomar mucho tiempo para las infecciones por hantavirus [62, 63]. En el momento en que emerge la viremia secundaria, los agentes de las formas más severas de HFRS y HCPS han comenzado a alcanzar una masa suficiente para inducir, a través de las interacciones PAMP-PRR y otros medios, la expresión de citoquinas proinflamatorias [64]. Para HCPS, esa expresión favorece el lecho pulmonar y los órganos linfoides, pero, por razones desconocidas, ahorra el retroperitoneo y, en general, el riñón. En HFRS la situación se invierte, y sin embargo no se aprecia a menudo que el esperado tropismos tisulares preferentes de virus asociados a HFRS y sus contrapartes asociadas a HCPS para los lechos renal y pulmonar, respectivamente, no es como se predeciría a través de las manifestaciones de las dos enfermedades. La elaboración local de mediadores inflamatorios y quimiotácticos se considera un requisito para el desarrollo de Sin embargo, no es la hipoxemia, debido al edema pulmonar prominente, lo que conduce a la muerte en la mayoría de los casos fatales de HCPS, sino más bien la intoxicación del corazón por mediadores como aún no definidos, lo que conduce al estado de bajo gasto cardíaco y al síndrome de shock asociado [64, 65]. Es tentador especular que los mediadores producidos en el pulmón en conexión con el infiltrado inflamatorio pueden infiltrarse a través de la circulación coronaria con dilución mínima en HCPS, consecuencia desventajosa de la estrecha yuxtaposición anatómica de los dos órganos. Así, al menos tres clases de mecanismos potenciales, algunos superpuestos y todos ciertamente no exclusivos de los otros, podrían presumirse que subyacen a la patogénesis del HCPS. Estos incluyen:(1) Mecanismos inmunes innatos. La naturaleza de las interacciones entre los patrones moleculares asociados al patógeno del hantavirus (PAMP) y los receptores de reconocimiento del patrón (PRR) de las células endoteliales susceptibles comienzan a ser aclaradas. El HTNV prototípico parece ser reconocido por TLR-3 [43]. Tal infección tiene consecuencias tales como una mayor expresión del HLA-DR en las células dendríticas [66] y la diferenciación de los monocitos hacia las células dendríticas [67]. (2) Efectos virales directos. La correlación observada entre la carga viral y la gravedad de la enfermedad deja abierta la posibilidad de que las partículas del hantavirus o el ARN puedan tener efectos tóxicos sobre las células o sobre la señalización. Algunos investigadores han favorecido la toxicidad viral directa, actuando a través de la inhibición de la función de barrera celular endotelial, como una explicación de gran parte de la fuga capilar, aunque existe Una pista potencialmente importante hacia el mecanismo por el cual las infecciones por hantavirus agotan las plaquetas sanguíneas y, en algunos casos, causan manifestaciones hemorrágicas, fue avanzada por el reciente descubrimiento de que los hantavirus patógenos son capaces de reclutar plaquetas para adherirse a las superficies celulares endoteliales, con β3 integrina utilizada como elemento de unión crítica [69]. (3) Efectos patógenos causados por las actividades de macromoléculas virales específicas. Hemos revisado algunas de las actividades asociadas con los Gn, Gc y N, polipéptidos codificados viralmente en secciones anteriores. Modelos de prueba de patogénesis se pueden hacer más eficazmente cuando hay un modelo animal que imita aspectos clave de la enfermedad. No existe un modelo similar al HFRS, pero existen modelos animales para el transporte asintomático de PUUV y SNV por sus roedores portadores nativos, el banco vole Myodes glareolus y el ratón de venado P. maniculatus; así como un modelo de hámster sirio utilizando ANDV o el virus Aporal relacionado de Venezuela, para el cual se observa una enfermedad mimética HCPS [70] [71] [72] [73]. El modelo de hámster ANDV-Sirio tiene una serie de características en común con la enfermedad humana, así como algunas diferencias. A diferencia de las enfermedades neurológicas que han sido posibles de provocar con HTNV, el modelo de hámster para HCPS parece ser causado por fugas capilares que resultan en edema pulmonar y la producción de un derrame pleural con características exuda Típicamente los hámsteres mueren entre 11 y 14-d post-inoculación, reflejando un período de incubación ligeramente acelerado en comparación con las infecciones humanas. Al igual que con el HCPS humano, el examen microscópico del pulmón revela abundante deposición de fibrina, septo alveolar engrosado y antígeno viral expresado abundantemente en el endotelio microvascular. Los hámsteres infectados por ANDV equipados con dispositivos de monitoreo fisiológico mostraron disminución de las presiones de pulso, taquicardia e hipotensión que parecen imitar de cerca el shock que se cree que es la causa próxima de la muerte en pacientes que sucumben al HCPS [65, 74]. En comparación con la enfermedad humana, los hámsteres infectados por ANDV exhiben títulos excepcionalmente altos de ANDV vivo en sus tejidos, con gran parte de la replicación viral que ocurre en Los títulos de ANDV vivo en algunos casos superan los 10 8 /g, mientras que los aislados de hantavirus de los tejidos humanos han sido notoriamente difíciles de obtener. A pesar de la aparición universal de enzimas hepáticas levemente elevadas en pacientes con HCPS, las enzimas hepáticas no parecen estar presentes en niveles elevados en la sangre de hámsters enfermos incluso inmediatamente antes de la muerte [75]. El período prolongado de incubación asociado con la enfermedad por hantavirus da al huésped un tiempo considerable para montar una respuesta inmune madura contra el virus. Así, en contradición a infecciones de gravedad comparable y sintomatología relacionada asociada con arenavirus y filovirus, las infecciones por hantavirus en humanos se asocian con respuestas anticuerpos de título significativo por el momento en que comienzan los síntomas. A pesar de esta observación, parece ser posible que la variación natural en las respuestas individuales de anticuerpos neutralizantes entre los pacientes con infecciones por NVS pueda estar relacionada con la gravedad de la enfermedad, lo que sugiere que la administración de anticuerpos antivirales podría resultar efectiva terapéuticamente [76]. En el caso de la infección por ANDV, han surgido nuevas evidencias que indican que el aparente aclaramiento del virus de la sangre no resulta en la eliminación completa del estímulo antigénico por el virus, sugiriendo que el virus puede persistir, tal vez en algún sitio inmunológicamente privilegiado aún indeterminado [77]. Un papel para las respuestas patológicas mediadas por células T en el HFRS y el HCPS ha sido la fuente de especulación por una variedad de razones. La gravedad del SNS asociado al SNCP puede haber hecho más evidente que el inicio del edema pulmonar, la taquicardia y la hipertensión parecía estar todo, pero universalmente asociado temporalmente, con la aparición de un espectro de células altamente activadas del linaje linfoide en la sangre periférica. Se detectaron células con similitudes morfológicas cercanas a estos -inmunoblastos- en los pulmones congestionados y pesados de los pacientes que llegaron a la autopsia, así como en órganos linfoides y en las tríadas portal [63, [78] [79] [80]. Estas observaciones llevaron a especular que algún componente de la patogénesis por hantavirus podría estar vinculado a la aparición de células T antivirales que podrían estimular o contribuir a la aparición de una -tormenta de mediadores y el fenotipo de fuga capilar asociado. Estudios posteriores han confirmado la expectativa de que una fracción significativa de la población de inmunoblastos en pacientes con HCPS son células T con especificidad para epitopes específicos de antígenos virales de clase I presentados por el HLA, incluyendo Gn, Gc y N [77, [81] [82] [83]. Presumiblemente, las actividades antivirales de estas células, manifestadas en parte por su elaboración de mediadores en el intersticio afectado, pueden contribuir a la fuga endotelial/capilar que se encuentra en el corazón de la patogénesis del hantavirus. Debido a que los primeros casos de HCPS a menudo llegaron a la autopsia, se hizo posible examinar tejidos necropsiados para la expresión de citocinas. El estudio de Mori et al. (1999) revelaron una alta expresión relativa de citocinas proinflamatorias incluyendo TNF-, IL-1-, IL-6, proporcionando evidencia a favor de un modelo de tormenta de citoquinas para la patogénesis [64]. Los autores creían, basándose en la morfología de las células secretadoras de citoquinas, que tanto monocitos como linfocitos estaban contribuyendo a la producción de citocinas. Que los mediadores proinflamatorios se encuentran en niveles elevados en el plasma, así como el intersticio renal de pacientes con enfermedad hantaviral aguda se ha reconocido desde hace algún tiempo también [84, 85]. Si bien el diagnóstico de HCPS y HFRS se realiza mejor con serología IgM, en la etapa aguda de la infección por NVS, también se puede utilizar RT-PCR si se utilizan células sanguíneas o coágulos de sangre en lugar de plasma o suero, donde la sensibilidad incluso utilizando imprimaciones PCR anidadas disminuye a cerca del 70% [86] [87] [88]. En una instalación en la que se tratan muchos casos de HCPS, el centro médico de la Universidad de Nuevo México en Albuquerque, se ha ofrecido un servicio de diagnóstico en el que se analizan los hallazgos hematológicos del paciente para establecer la probabilidad de que un paciente tenga HCPS. La combinación de trombocitopenia, abundancia elevada de linfocitos -inmunoblasto-, población de células polimorfonucleares con desplazamiento izquierdo sin evidencia morfológica fuerte para su activación, y valores elevados de hemoglobina o hematocrito es altamente específica para el HCPS y permite a los clínicos la capacidad de poner pacientes presuntivos-HCPS en oxigenación de membrana extracorpórea (ECMO), que se cree que ha salvado a muchos pacientes de un resultado letal [89]. Se cree que la infección humana por hantavirus sigue el contacto con secreciones o excreciones producidas por roedores infectados. En los Estados Unidos, 538 infecciones humanas por hantavirus fueron reportadas hasta finales de diciembre de 2009 [90], con Nuevo México, Arizona y Colorado mostrando los casos más altos. Mientras que el prototípico hantavirus centroamericano en América Central fue el virus Rio Segundo de Reithrodontomys mexicanus de Costa Rica, la primera enfermedad humana apareció algunos años más tarde en Panamá, donde el virus Choclo (CHOV) surgió como el agente etiológico y se cree que es responsable de todos los casos conocidos de HCPS. La rata de arroz pigmeo fulvo Oligoryzomys fulvescens ha sido identificada como el reservorio de roedores [91]. En Panamá, los primeros casos de HCPS, aunque con poca o ninguna implicación cardiaca evidente, fueron reportados en 1999, y desde entonces, 106 infecciones humanas han ocurrido con una tasa de mortalidad del 26% [92]. Seroencuestas de mamíferos en México y Costa Rica han encontrado anticuerpos antihantavirus [93] [94] [95] [96], y se han notificado seroprevalencias que oscilan entre 0,6 y 1,6% en poblaciones humanas a pesar de la ausencia de casos conocidos de HCPS [97]. En América del Sur, los casos de HCPS se han identificado en Argentina, Bolivia, Brasil, Chile, Paraguay y Uruguay, y también se han notificado evidencias de exposición humana a hantavirus en Venezuela [98] y Perú [99]. En América del Sur, ANDV es el principal agente etiológico con casos en Chile y Argentina notificados desde 1995. En Chile, se han producido 671 casos de HCPS debido a ANDV durante el período 2001-2009 [100]. Desde 1995 se han reportado más de 1.000 casos de HCPS en Argentina [101] ; en el Brasil se han identificado aproximadamente 1.100 casos de HCPS entre 1993 y 2008 [102]. Las tasas de mortalidad por casos en esos tres países han sido similares, oscilando entre el 30% (Argentina), el 36% (Chile) y el 39% (Brasil). Las infecciones por Hantavirus ocurren con más frecuencia en hombres que en mujeres, aunque la proporción entre hombres y mujeres es muy variable. Por ejemplo, las comunidades panameñas mostraron una proporción de 55 hombres por 45 mujeres [103], mientras que en Chile la proporción es más sesgada por hombres (71%) [104]. En el Chaco paraguayo la proporción entre hombres y mujeres se aproxima al 50% [105]. En América del Norte, en diciembre de 2009 el 63% de los pacientes eran varones [90]. Todos los grupos étnicos y raciales parecen ser susceptibles a infecciones por el hantavirus, y las diferencias entre ciertos grupos (como indígenas y no indígenas) están más probablemente correlacionadas con el tipo de hábitat en el que reside la población (por ejemplo, zonas rurales frente a zonas urbanas). De hecho, las comunidades rurales representan la mayor incidencia global del hantavirus y, por lo tanto, están en mayor riesgo [92, [105] [106] [107] [108] [109] [109] [119], aunque también se ha destacado la importancia de los entornos peridomésticos como una importante zona de exposición [112, 113]. El principal mecanismo por el que los seres humanos adquieren la infección por el hantavirus es la exposición a aerosoles de heces contaminadas de roedores, orina y saliva [114, 115]. Esto puede ocurrir cuando los seres humanos residen en áreas cercanas a las que habitan los roedores, viven en áreas infestadas de roedores, o cuando los roedores invaden entornos humanos, que son más frecuentes en hábitats rurales.Existe una larga historia de coexistencia humana con roedores, lo que plantea dudas sobre el aparente aumento reciente de las enfermedades relacionadas con el hantavirus, especialmente el HCPS. Aparte de una aparente asociación con eventos de oscilación sureña de El Niño (ENSO) en algunas regiones [116, 117], los recientes incrementos en la incidencia del HCPS no parecen seguir un patrón temporal o espacial fácilmente definido. Sin embargo, algunas características del paisaje, como la fragmentación del hábitat o las áreas perturbadas por el ser humano, pueden influir en la dinámica de la población de roedores e impactar en la incidencia viral [118] [112] [112] [121]. A pesar de la estocástica asociada a la contracción de la infección Las actividades humanas en edificios mal ventilados que pulverizan partículas que luego se inhalan (es decir, limpieza, agitación de alfombras, polvo) se identifican con frecuencia entre los pacientes admitidos para el SHCPS [11, 122]. Se cree que las actividades al aire libre transmiten un menor riesgo debido a la labilidad de los hantavirus a la radiación UV y a la supuesta tendencia a dispersarse en el viento, aunque ciertas condiciones ambientales parecen mantener el virus durante períodos más largos fuera de su huésped natural, lo que permite la transmisión indirecta [123]. Una vía alternativa pero poco común de transmisión del virus es la mordedura de roedores [124] [125] [126]. Los trabajadores sobre el terreno que manipulan mamíferos corren un riesgo potencialmente mayor de exposición a infecciones por hantavirus, aunque cuando se cuantifica a través de serosurveys el riesgo absoluto parece bastante leve [127]. Un nuevo estudio en Colorado sugiere la posibilidad de que una picadura de roedor haya sido el vehículo próximo para la transmisión al aire libre de NVS [128], lo que vuelve a enfatizar el uso de equipo de protección personal durante las actividades de trabajo de campo [129]. Como caso particular dentro de los hantavirus, la transmisión de persona a persona ha sido documentada exclusivamente para el virus de los Andes sudamericanos [130] [133] [133] [135]. La identificación de esta vía de transmisión se ha hecho utilizando tanto herramientas moleculares como encuestas epidemiológicas, pero el mecanismo de transmisión interpersonal no está bien establecido. Curiosamente, ANDV también puede ser derramado por los humanos a través de otros fluidos biológicos como la orina [136], ilustrando las propiedades particulares que diferencian este virus de otros hantavirus. Aunque la transmisión interpersonal parece ser única para ANDV, el ARN viral de PUUV se ha detectado en la saliva de pacientes con HFRS, y algunos pacientes con SNV-HCPS tienen ARN viral en las secreciones traqueales [88, 137]. Los Hantavirus en las Américas son alojados naturalmente por roedores (Muridae y Cricetidae) así como las musarañas (Soricidae) y los lunares (Talpidae) (Figura 1). Tres especies de musgo y un mole han sido reportados para albergar hantavirus y su patogenicidad para los humanos permanece desconocida [22, 138, 139]. Se han identificado al menos 15 especies de roedores como portadores de diferentes hantavirus patógenos, con algunos genotipos sudamericanos como Castelo do Sonhos (CDSV) o Hu39694 sólo identificados después de infecciones humanas (Figura 1 ). Los hantavirus suelen mostrar una alta especificidad de especie y ningún huésped intermedio [140]. Sin embargo, se han descrito algunos genotipos de hantavirus en la misma especie de roedores. Tal es el caso de Playa de Oro (OROV) y Catacamas (CATV) identificados en Oryzomys couesi [141, 142], o Maporal (MAPV) y Choclo (CHOV) hospedados por O. fulvescens [91, 143]. En América del Norte se han detectado virus de muleshoe y Black Creek Canal hanta en sigmodon hispidus [ Además, un genotipo de hantavirus (por ejemplo, el virus similar a Juquitiba) puede ser transportado por más de una especie de roedores (O. nigripes, Oxymycterus judex, Akodon montesis). Otro ejemplo es el virus Laguna Negra (LANV) que después de ser identificado en Calomys laucha [146] también ha sido reportado en C. callosus [147]. El rápido aumento en el descubrimiento de nuevos hantavirus y la identificación de sus anfitriones no parece probable que termine tan pronto como se examinen nuevas especies pequeñas de mamíferos [95]. Este tema se complica por la continua controversia en los criterios para la clasificación de distintos hantavirus [148, 149], que también está vinculado a la clasificación taxonómica y los reordenamientos taxonómicos. La transmisión de especies cruzadas es un proceso importante durante la propagación, aparición y evolución Particularmente dentro de los hantavirus, los derrames a los huéspedes secundarios se identifican cada vez más a medida que se realizan estudios más extensos [151] [152] [153] [155] [156]. Por ejemplo, ANDV es el agente etiológico predominante del HCPS en América del Sur, y O. longicaudatus el principal reservorio de roedores. Derrama en al menos otras cuatro especies de roedores que coocurren con el reservorio se han identificado, con Abrothrix longipilis mostrando la segunda mayor prevalencia de anticuerpos de ANDV, y actualmente no hay duda de que el virus es extremadamente similar genéticamente entre los dos roedores del huésped [157, 158]. En América del Norte, el derrame del virus Bayou (BAYV) puede haber ocurrido desde el reservorio principal de O. palustris a S. hispidus, R. fulvescens, P. leucopus y B. taylori [159] [160] [161]. Es más probable que el derrame del virus Hanta se produzca con poblaciones de acogida que habitan regiones simpatricas o sintópicas [151, 162], y la transmisión de especies cruzadas tendría probablemente mayores posibilidades de éxito si las especies anfitrionas están estrechamente relacionadas [163]. Se encuentra una excepción interesante entre el virus Oxbow (OXBV) y el virus Asama (ASAV) en el que un proceso de cambio de huésped parecía haber ocurrido entre mamíferos pertenecientes a dos familias (Talpidae y Soricidae), probablemente como resultado de la codivergencia alterna y recurrente de ciertos tax Los hantavirus son transmitidos horizontalmente entre roedores y no son transmitidos por artrópodos (a diferencia de otros virus de la familia Bunyaviridae). La infección por derrapadores a mamíferos no humanos generalmente no produce ninguna transmisión hacia adelante (o a fin de morir), pero si los seres humanos están infectados pueden resultar en una alta morbilidad y mortalidad [122, 164]. Durante la primavera de 1993, un brote de pacientes con HCPS debido a SNV ocurrió en los estados de Four Corners, resultando en más del 60% de casos de mortalidad entre los casos iniciales, muchos de los cuales involucran a miembros de la tribu Navajo [12, 121]. En Panamá, se notificó un brote durante 1999-2000 en Los Santos, y 12 casos donde se identificaron con tres muertes [165, 166]. Esto representó el primer informe de infecciones por hantavirus humanos en América Central. En América del Sur, Diecisiete individuos fueron identificados con anticuerpo NVS (ELISA) o fueron antígenos (HCI) positivos de 52 casos sospechosos [167]. En 1996 ocurrieron brotes mayores debidos a ANDV en el sur de Argentina [131, 134] ; en el sur de Chile se presentaron grupos de pacientes con enfermedad por hantavirus en 1997 [158]. En Brasil, el primer brote fue identificado en la Amazonía Brasileña (Estado de Maranhão) en el año 2000, e involucró pequeños pueblos que resultaron en una prevalencia del 13,3% de los evaluados (398 residentes totales) [168]. Los factores que desencadenan los brotes de hantavirus todavía son mal entendidos, probablemente porque resultan de varias características bióticas y abióticas interactuantes cuyos parámetros clave son difíciles de modelar. Sin embargo, el uso de nuevos enfoques de modelado que involucran características geográficas y ambientales parece ser prometedor a la hora de predecir posibles brotes de hantavirus y/o áreas de mayor riesgo [169] [170] [171] [172]. Debido a que se sabe que los hantavirus se transmiten directamente de los huéspedes infectados a los susceptibles, el primer enfoque natural es relacionar los brotes con la ecología de los huéspedes virales. La transmisión y persistencia del hantavirus en las poblaciones de roedores depende de varios factores que interactúan para afectar la dinámica ecológica del huésped, que a su vez está fuertemente influenciada por las características de comportamiento de las especies de roedores individuales, a la estructura paisajística y a las características ambientales [173, 174]. La transmisión viral depende de las tasas de contacto entre los huéspedes sensibles, y a pesar de la noción prevaleciente de que un aumento de la densidad se encuentra y, por lo tanto, de Además, se ha demostrado que la transmisión de NVS sigue un patrón de heterogeneidad de contacto, donde los individuos de la población tienen diferentes probabilidades de transmitir la infección [176]. La comprensión de la transmisión viral resulta ser mucho más compleja cuando especies distintas del principal huésped del reservorio se incorporan en el modelo. De hecho, estudios recientes han demostrado que la mayor diversidad de especies hospedantes está correlacionada con una menor prevalencia de infección en América del Norte para P. maniculatus [177], en América Central para O. fulvescens (reservorio del virus Choclo) y Zygodontomys brevicauda (reservorio del virus Calabazo) [178], y en América del Sur para Akodon montensis (reservorio del virus Jabora) [162]. Las tasas de contacto varían según la distribución espacial de las poblaciones y parecen estar Por ejemplo, la prevalencia de SNV en P. maniculatus fue mayor en paisajes con mayor grado de fragmentación del hábitat preferido [179]. Además, ciertas propiedades del paisaje como elevación, pendiente y cubierta terrestre parecen ser útiles para detectar áreas con infecciones persistentes de SNV, y por lo tanto se consideran áreas refugiales donde el virus puede mantenerse durante años [169]. Los cambios en el entorno natural de las especies de reservorios, como la fragmentación forestal y la pérdida de hábitat, pueden alterar la abundancia y distribución de la población y provocar brotes de hantavirus, como se observa en la Península de Azurero de Panamá [118, 119]. Además, las diferencias en el microhábitat, incluida la cubierta superficial, pueden conducir a diferencias en la dinámica ecológica dentro de las poblaciones y afectar a la tasa de exposición al virus [180]. Se han encontrado diferencias en las infecciones por hantavirus a través de paisajes contrastantes en el intervalo latitudinal en poblaciones de roedores de O. longicaudatus en Chile, lo que sugiere que los seres humanos están expuestos de manera diferencial al virus [107, 181]. La dinámica poblacional de roedores se ve afectada por cambios estacionales de clima y clima [182, 183]. En el caso de los brotes asociados a ENSO, se ha postulado una compleja cascada de eventos desencadenados por lluvias altamente inusuales en el año precedente para dar lugar a un aumento de la producción primaria y densidades de roedores, aumentando también la probabilidad de transmisión del virus a los seres humanos, pero ha resultado difícil demostrar con precisión los eventos intermedios sugeridos, como el aumento de las densidades de roedores en el aumento de la carga de casos [116, 121, 184]. En América del Sur, los efectos del cambio climático y los brotes de hantavirus no han sido bien estudiados, a pesar del conocimiento de que varias especies de roedores que son reservorios de enfermedades emergentes se han visto dramáticamente afectadas por eventos como El Niño [185]. Los cambios en la dinámica de la población de acogida también se ven afectados por la estacionalidad, lo que puede conducir a brotes de enfermedades cuando se interrumpen los procesos que equilibran las poblaciones de roedores de temporada en temporada [186]. La emergencia viral puede seguir promoviéndose a medida que los cambios introducidos por el ser humano continúan aumentando en el medio ambiente a diferentes escalas geográficas. Estos cambios también pueden alterar la estructura y dinámica de la población de roedores e interacciones interespecies creando condiciones que pueden conducir a brotes virales, establecimiento viral en nuevos hospederos, y la aparición de HCPS [102, 162], incluso con aparentemente leve perturbación ecológica al sistema virus-hospedero [188]. Ciertas características fisiopatológicas, incluyendo trombocitopenia y shock, de enfermedades por hantavirus de los seres humanos, tienen similitud sustancial con las fiebres hemorrágicas inducidas por otros virus tales arenavirus, filovirus y flavivirus, a pesar de compartir esencialmente ninguna secuencia similitud con ellos. Tales observaciones plantean preguntas acerca de si tales similitudes en la patogénesis son probables similitudes de fenotipo, o en cambio reportan la presencia de mecanismos moleculares comunes entre los virus. En esta revisión se discuten las propiedades generales, descubrimientos y epidemiología/ecología de las formas de hantavirus patógenos del Nuevo Mundo, y también se busca identificar algunas de las características de las macromoléculas virales y mecanismos inmunológicos que se han propuesto como potenciales mediadores directos de los eventos patógenos que caracterizan la enfermedad humana HCPS. Si bien es poco probable que la expresión de una proteína viral particular o ARNs en aislamiento se pueda confiar en replicar fenotipos clave de infección por el virus completo, algunos de los hallazgos han sido suficientemente consistentes con lo que se conoce de la patogénesis in vivo que ofrecen plomos plausibles de primer paso en la búsqueda de objetivos terapéuticos. Esperamos con interés las revelaciones mecanísticas que seguirán el uso inevitablemente ampliado de métodos poderosos como la secuenciación profunda, imágenes cada vez más avanzadas, y métodos microscópicos, y modelos animales que por fin se pueden decir

¿Cómo se concentran los ARN virales en los cuerpos P durante la infección por hantavirus?

Los hantavirus en las Américas y su papel como patógenos emergenteshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3185593/SHA: efe13a8d42b60ef9f7387ea539a1b2eeb5f80101Autores: Hjelle, Brian; Torres-Pérez, FernandoFecha: 2010-11-25DOI: 10.3390/v2125559Licencia: cc-byAbstract: La continua aparición y reaparición de patógenos representan una amenaza continua, a veces mayor, para las poblaciones. Los hantavirus (familia Bunyaviridae) y sus enfermedades humanas asociadas se consideraron confinados a Eurasia, pero la aparición de un brote en el suroeste de Estados Unidos llevó a un gran aumento en su estudio entre los virólogos de todo el mundo. Se han descrito más de 40 genotipos hantavirales, la gran mayoría desde 1993, y casi la mitad de ellos patógenos para los seres humanos. Los hantavirus causan infecciones persistentes en sus reservorios, y en las Américas, la enfermedad humana se manifiesta como compromiso cardiopulmonar, síndrome cardiopulmonar del hantavirus (HCPS), con proporciones de casos-fatalidad, para los serotipos virales más comunes, entre el 30% y el 40%. Alteración del hábitat y trastornos ecológicos a mayor escala, tal vez incluyendo el cambio climático, son algunos de los factores que pueden haber aumentado la carga de casos humanos de HCPS entre 1993 y el presente. Consideramos aquí las características que influyen en la estructura de la dinámica de la población huésped que pueden conducir a brotes virales, así como los determinantes macromoleculares de los hantavirus que han sido considerados como potenciales contribuciones a la patogenicidad. Texto: Los patógenos emergentes causan enfermedades nuevas o no reconocidas anteriormente, y entre ellas, las zoonóticas emergentes son una preocupación importante entre los científicos que estudian enfermedades infecciosas a diferentes escalas espaciales y temporales [1, 2]. Los cambios en las condiciones bióticas y abióticas pueden alterar la dinámica de las enfermedades de la población y conducir a la aparición de infecciones zoonóticas [3] [5] [6]. Durante las últimas décadas, se han producido varios brotes de patógenos virales emergentes y reemergentes, que afectan tanto a la implicación puramente local como a nivel mundial/pandémica de las poblaciones humanas. Entre los ejemplos visibles están la gripe A, el virus del Ébola, el virus de la hepatitis C, el trastorno respiratorio grave para adultos (SARS), el coronavirus y el virus de la inmunodeficiencia humana, que desafían las medidas de prevención y control de los sistemas de salud pública [7]. En las Américas, el reciente brote de gripe pandémica A subtipo H1N1 se convirtió en un objetivo importante de control debido a su rápida propagación, y las incertidumbres en cuanto a virulencia y transmisibilidad, sin embargo, la disponibilidad de vacunas fue limitada cuando se produjo una actividad significativa antes de la temporada tradicional de gripe [8]. Sin embargo, en el último siglo han surgido o resurgido brotes de varias enfermedades virales relacionadas con el virus arenavirus y el virus del dengue, y más recientemente, hantavirus y la expansión del rango geográfico del virus del Nilo Occidental. Entre las enfermedades zoonóticas, los mamíferos pequeños son anfitriones de varios virus ARN patógenos, especialmente Arenaviridae y Bunyaviridae: Hantavirus [9] [10] [11]. Las infecciones por hantavirus se convirtieron en una preocupación en las Américas después de la descripción de un brote de distrés respiratorio agudo ocurrido en La enfermedad recientemente reconocida, el síndrome cardiopulmonar del hantavirus, el HCPS (o síndrome pulmonar del hantavirus), se relacionó con la infección por el virus del Sin Nombre (SNV) recién descubierto, y el roedor Peromyscus maniculatus (ratón venado) fue identificado como el reservorio [13]. Sin embargo, las infecciones por hantavirus tienen una historia mucho más larga. Una revisión de los escritos chinos antiguos, que datan de aproximadamente 960 dC, reveló descripciones muy parecidas a la fiebre hemorrágica con síndrome renal (HFRS), el síndrome causado por los hantavirus del Viejo Mundo [14]. Durante el siglo XX, los casos de enfermedad febril aguda con compromiso renal fueron descritos de varios países eurasiáticos y Japón, a menudo en asociación con compromisos militares [15]. El HFRS como síndrome distinto, sin embargo, fue llamado por primera vez a la atención de la medicina occidental en asociación con un brote que ocurrió entre las tropas de las Naciones Unidas durante el conflicto coreano entre 1951 y 1954, donde más de 3.200 soldados fueron afectados [16]. Tomó más de dos décadas hasta que el agente etiológico, el virus Hantaan (HTNV), fue aislado del ratón de campo rayado Apodemus agrarius, detectado en parte por la unión de anticuerpos de muestras de suero de paciente a los tejidos pulmonares de ratones de campo sanos y salvajes [17, 18]. El virus se encontró más tarde para representar la especie tipo de un nuevo género Hantavirus de la familia Bunyaviridae, aunque fue más tarde evidente que el primer hantavirus a aislarse fue el virus Thottapalayam de shrew-borne [19]. La categorización de los hantavirus como pertenecientes a la familia Bunyaviridae se debe en parte a la presencia consistente de tres genomas de ARN que son circularizados in vivo como resultado de la presencia de nucleótidos terminales complementarios que ayudan a doblar el genoma en una morfología -hairpin-, descrita por primera vez para el flebovirus Uukuniemi [19, 20]. La Tabla 1 es una lista de los hantavirus patógenos predominantemente distintos serológicamente. Se describen muchos otros genotipos llamados, pero tales otras formas patogénicas están generalmente estrechamente relacionadas con los Andes o, en algunos casos, el virus Sin Nombre. Durante la maduración del virus, el precursor forma GPC se procesa utilizando una proteasa unida a la membrana en Gn y Gc, una escisión que ocurre, y parece ser señalada, después de la señal péptida conservada WAASA en la C-terminal de Gn [24]. Aunque las dos proteínas se pueden expresar de forma independiente a través de la transfección, pueden ser retenidas en el compartimento celular incorrecto (ER o aggrosome); por lo tanto, deben ser co-expresadas para permitirles estabilidad para que las dos se puedan ensamblar correctamente en el Golgi [25, [27] [28]. Se han identificado varias actividades y propiedades para las glicoproteínas envolventes del hantavirus, incluyendo algunas características que se sospecha que están involucradas en la patogenicidad de los serotipos causantes de la enfermedad, una posibilidad que ha generado atención experimental. Las glucoproteínas son los ligandos conocidos o presuntos para al menos dos receptores celulares distintos, la cadena de integrina y el factor acelerador de la descomposición, o DAF [30, 31] ; con gC1qR/p32 también identificado como otro receptor de entrada potencial [32]. Comparaciones con la proteína E del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, llevaron a Tischler et al. a considerar la glicoproteína Gc como una proteína potencial de fusión de clase II, tal vez impartiendo actividad de fusión al virión, y esta hipótesis ha ganado apoyo en otros estudios [33, 34]. Se han identificado actividades adicionales con, o se afirma que están relacionadas con, Gn. Para muchos de estos estudios, una premisa subyacente ha sostenido que hay diferencias entre las glicoproteínas de hantavirus -patógenos en relación con virus en el género que se denominan Si bien es cierto que aún no ha sido posible vincular el virus de Prospect Hill (PHV) con la enfermedad humana, la ausencia de evidencia de su patogenicidad tal vez no debería equipararse con la evidencia de su ausencia. Sólo se podría considerar que el nivel de enfermedad (por ejemplo, letargo, fiebre, proteinuria y azotemia) asociado con la infección de primates no humanos por PHV no es significativamente diferente del registrado para los modelos de primates no humanos utilizando el virus conocido del patógeno Puumala (PUUV) [35, 36]. Para el propósito de esta discusión, presumiremos que los hantavirus apatogénicos son efectivamente apatogénicos. Mientras que algunos estudios han sugerido que las glicoproteínas Gn se dirigen más rápidamente a la vía ubiquitina-proteosoma que a las formas apatogénicas, otros han interpretado las diferencias en el manejo de las glicoproteínas Gn a través de especies de hantavirus por el sistema ubiquitina-proteosomal como independientes de la patogenicidad [37] [38] [39]. Algunos investigadores han dirigido sus esfuerzos hacia la identificación de una capacidad diferencial, ya sea cinética o de magnitud absoluta, en la capacidad de los hantavirus patógenos y apatogénicos para provocar una respuesta de interferón en las células. Una premisa que surge es que las formas apatogénicas tenderían a inducir una respuesta innata anterior que haría más probable que el virus se limpiara rápidamente o se volviera menos competente en su replicación, a fin de evitar cualquier respuesta patológica en el huésped [42] La respuesta innata anti-hantavirus puede en algunos casos ser atribuida a la interacción viral como ligando de TLR-3, pero no en otros, y en las células endoteliales, no parece requerir más que la partícula viral misma, incluso cuando se introduce en forma replicativa incompetente [43, 44]. Las proteínas y los ARNm inducidos prominentemente por los hantavirus incluyen MxA e IFIT-1 (ISG-56) y otros incluyendo algunos con actividad antiviral conocida o sospechada. Esos hantavirus, a menudo cepas altamente patógenas, que no inducen una respuesta antiviral potente, se sospechan o se presume que tienen un (más) potente mecanismo de antagonismo interferón-vía en relación con otros virus, un mecanismo que actúa positivamente para prevenir que se forme una respuesta innata efectiva, al menos temprano en la infección [4 Sin embargo, se reportan algunos casos en los que los hantavirus altamente patógenos, tales como NVS, también son capaces de inducir la expresión de los ARNm del gen estimulado por interferón, incluso muy temprano en la infección, con proteínas ISG, como se esperaba, tardando más tiempo en aparecer en la célula [44]. Las actividades anti-interferón también se han atribuido a la proteína NSs que se puede elaborar en células infectadas por serotipos que codifican esta proteína [46]. Otros investigadores han examinado las actividades de las glucoproteínas del hantavirus y otras proteínas que podrían afectar directamente a algunos aspectos de la progresión patogénica asociada a la infección por hantavirus en humanos, tales como cambios de permeabilidad vascular. Mientras que los primeros intentos de causar directamente aumentos en la permeabilidad de las monocapas endoteliales con partículas virales o infección viral fueron en gran medida decepcionantes, los hantavirus se han identificado como que afectan adversamente la migración endotelial sobre los sustratos y en la potenciación de la permeabilidad endotelial inducida por VEG-F [47, 48]. La proteína nucleocápsida o N más corta (+50 kD) es un componente estructural del nucleocápsido viral, junto con los segmentos de ARN viral genómico. Como proteína de unión al ARN que afecta a la horquilla del cabello de los segmentos genómicos con alta afinidad [49, 50], limita el acceso del ARN para alojar nucleasasas y ayuda a hacer que la replicación viral sea un proceso cerrado dentro del citoplasma. También actúa como una proteína de membrana periférica, al igual que la proteína L [51], una actividad que podría jugar un papel en su supuesta, pero aún no demostrada función como matriz [52]. Hasta hace poco, no se había apreciado que N tuviera una amplia variedad de otras actividades, algunas de las cuales pueden estar vinculadas, no sólo a los requisitos fundamentales de replicación, sino también a la interferencia con una serie de procesos intracelulares de la célula normal. Así, se ha propuesto una interacción entre el aminoterminal de la proteína N del hantavirus y la proteína celular Daxx, con la sugerencia de posibles consecuencias pro-apoptóticas [51]. N también se reporta que interactúa con microfilamentos actínicos, y la proteína SUMO-1 [53, 54]. Utilizando ensayos basados en el gen reportero, Connie Schmaljohn y sus colegas han informado que la proteína nucleocapsid del virus Hantaan tiene un papel inhibidor en las respuestas inflamatorias mediadas por NF kappa B (NF- â € € TM B). Los efectos sobre la expresión NF- € B parecen estar limitados a la prevención de su translocación nuclear después de su intento de activación con lipopolisacárido, LPS [55]. En el citoplasma de las células infectadas, la proteína N se puede encontrar en los cuerpos celulares P donde secuestra y protege los capuchones de 5'. Puede localizar los capuchones a través de su interacción con DCP1, un componente clave de los cuerpos P. Durante la infección por hantavirus, los ARN virales se concentran en los cuerpos P, a través de su interacción con N y DCP1. La proteína N demuestra la protección preferencial de los ARNm diseñados para terminar prematuramente su proteína codificada en comparación con los ARNm nativos [56]. La proteína N se ha vinculado cada vez más a la replicación y traducción virales, a veces de maneras no previstas anteriormente. Se encuentra entre una familia creciente de diversas proteínas virales que pueden servir como un inespecífico - ARN chaperone ®, una actividad que debe facilitar el acceso de la L polimerasa al ARNv para la transcripción y replicación, en que puede disociar transitoriamente estructuras de ARN mal dobladas [57]. Algunos de los efectos de la proteína N en la traducción no pueden ser inmediatamente reconocidos como adaptables en la naturaleza. Puede reemplazar todo el complejo de iniciación traslacional EIF4F, presentando simultáneamente el ribosoma con un reemplazo de la actividad de unión de la tapa de eIF 4E, uniéndose al complejo de pre-iniciación 43S, al igual que eIF 4G, al tiempo que reemplaza la actividad helicoidal de eIF 4A, que se presume que es necesaria para disociar la estructura de ARN de orden superior [56, 58]. Estos tres factores normalmente trabajan juntos para lograr la iniciación traslacional. En los cuerpos P, la capacidad de la proteína N de unirse a una alta afinidad a los oligoribonucleótidos celulares nativos tapados, junto con su actividad en la protección de ARNs tapados de la degradación, probablemente facilita el acceso de oligonucleótidos encapsulados para su uso en la iniciación transcripcional por L polimerasa (-cap ra Tráfico de N para el ensamblaje viral: Clásicamente, la proteína N en las células infectadas parece estar agrupada o partículas en la naturaleza, con una concentración pesada en una única ubicación perinuclear, ampliamente considerada como la Golgi [27]. Las proteínas N de los hantavirus se encuentran en asociación con fracciones de partículas, y los estudios confocales microscopía y bioquímico-inhibidores han demostrado que las trazas N a lo largo de microtúbulos pero no con filamentos de actina [52]. El destino final de N, para su ensamblaje en partículas virales es la Golgi, y que circula allí a través del complejo intermedio retículo-Golgi endoplasmático (ERGIC), también conocido como cúmulo vesicular-tubular [52]. Un inhibidor negativo dominante, la dinamitina, asociado con el transporte mediado por Los estudios posteriores sugieren que la dependencia específica del transporte microtubular es específica de los hantavirus del Viejo Mundo como el NVH, pero que el Hantavirus del Nuevo Mundo ANDV está asociado con filamentos de actina [59]. Sin embargo, los datos recientes indican que el transporte microtubular es efectivamente utilizado para el NVH del Nuevo Mundo [60]. Las enfermedades del Hantavirus del hombre desde hace mucho tiempo han sido sospechosas de tener una base inmunopatógena en parte debido a su período de incubación relativamente largo de 2-3 semanas y la asociación temporal observada entre los trastornos inmunológicos y la primera aparición de signos y síntomas de la enfermedad del hantavirus. HFRS y HCPS comparten muchas características clínicas, llevando a muchos investigadores a considerar que son, en esencia, diferentes manifestaciones de un proceso patógeno similar, que difieren principalmente en los órganos objetivo primarios de expresión de la enfermedad (Tabla La patogénesis de las infecciones por hantavirus es el tema de una revisión continuamente actualizada en la serie UpToDate [61]. Para el momento en que aparecen los síntomas en el HCPS, ambas respuestas antivirales fuertes, y, para los genotipos virales más virulentos, el ARN viral puede ser detectado en plasma sanguíneo o células sanguíneas nucleadas respectivamente [63, 64]. Al menos tres estudios han correlacionado el ARN viral plasmático con la gravedad de la enfermedad para el HCPS y el HFRS, sugiriendo que la replicación del virus juega un papel continuo y en tiempo real en la patogénesis viral [65] [66] [67]. Se han identificado varios cambios patológicos distintivos que ocurren tanto en el HFRS como en el HCPS. Una característica crítica de ambos es una fuga capilar transitoria (~ 1-5 días) que involucra el La fuga resultante es de carácter exudativo, con una composición química alta en proteínas y similar al plasma. La experiencia continua que indica el fuerte tropismo tisular para las células endoteliales, específicamente, es uno de los varios factores que hacen de la integra β3 un candidato especialmente atractivo como un importante receptor in vivo para los hantavirus. Es probable que los hantavirus lleguen a sus tejidos objetivo a través de la captación por los ganglios linfáticos regionales, tal vez con o dentro de un histiocito pulmonar escoltante. Las semillas del virus endotelio local, donde las primeras células infectadas dan lugar, en última instancia, a una viremia primaria, un proceso que parece tomar mucho tiempo para las infecciones por hantavirus [62, 63]. En el momento en que emerge la viremia secundaria, los agentes de las formas más severas de HFRS y HCPS han comenzado a alcanzar una masa suficiente para inducir, a través de las interacciones PAMP-PRR y otros medios, la expresión de citoquinas proinflamatorias [64]. Para HCPS, esa expresión favorece el lecho pulmonar y los órganos linfoides, pero, por razones desconocidas, ahorra el retroperitoneo y, en general, el riñón. En HFRS la situación se invierte, y sin embargo no se aprecia a menudo que el esperado tropismos tisulares preferentes de virus asociados a HFRS y sus contrapartes asociadas a HCPS para los lechos renal y pulmonar, respectivamente, no sea como se predeciría a través de las manifestaciones de las dos enfermedades. La elaboración local de mediadores inflamatorios y quimiotácticos se considera un requisito para el desarrollo Sin embargo, no es la hipoxemia, debido al edema pulmonar prominente, lo que conduce a la muerte en la mayoría de los casos fatales de HCPS, sino más bien la intoxicación del corazón por mediadores como aún no definidos, lo que conduce al estado de bajo gasto cardíaco y al síndrome de shock asociado [64, 65]. Es tentador especular que los mediadores producidos en el pulmón en conexión con el infiltrado inflamatorio pueden infiltrarse a través de la circulación coronaria con dilución mínima en HCPS, consecuencia desventajosa de la estrecha yuxtaposición anatómica de los dos órganos. Así, al menos tres clases de mecanismos potenciales, algunos superpuestos y todos ciertamente no exclusivos de los otros, podrían presumirse que subyacen a la patogénesis del HCPS. Estos incluyen:(1) Mecanismos inmunes innatos. La naturaleza de las interacciones entre los patrones moleculares asociados al patógeno del hantavirus (PAMP) y los receptores de reconocimiento del patrón (PRR) de las células endoteliales susceptibles comienzan a ser aclaradas. El HTNV prototípico parece ser reconocido por TLR-3 [43]. Tal infección tiene consecuencias tales como una mayor expresión del HLA-DR en las células dendríticas [66] y la diferenciación de los monocitos hacia las células dendríticas [67]. (2) Efectos virales directos. La correlación observada entre la carga viral y la gravedad de la enfermedad deja abierta la posibilidad de que las partículas del hantavirus o el ARN puedan tener efectos tóxicos sobre las células o sobre la señalización. Algunos investigadores han favorecido la toxicidad viral directa, actuando a través de la inhibición de la función de barrera celular endotelial, como una explicación de gran parte de la fuga capilar, aunque existe Una pista potencialmente importante hacia el mecanismo por el cual las infecciones por hantavirus agotan las plaquetas sanguíneas y, en algunos casos, causan manifestaciones hemorrágicas, fue avanzada por el reciente descubrimiento de que los hantavirus patógenos son capaces de reclutar plaquetas para adherirse a las superficies celulares endoteliales, con β3 integrina utilizada como elemento de unión crítica [69]. (3) Efectos patógenos causados por las actividades de macromoléculas virales específicas. Hemos revisado algunas de las actividades asociadas con los Gn, Gc y N, polipéptidos codificados viralmente en secciones anteriores. Modelos de prueba de patogénesis se pueden hacer más eficazmente cuando hay un modelo animal que imita aspectos clave de la enfermedad. No existe un modelo similar al HFRS, pero existen modelos animales para el transporte asintomático de PUUV y SNV por sus roedores portadores nativos, el banco vole Myodes glareolus y el ratón venado P. maniculatus; así como un modelo hámster sirio utilizando ANDV o el virus Aporal relacionado de Venezuela, para el cual se observa una enfermedad mimética HCPS [70] [71] [72] [73]. El modelo hámster ANDV-Sirio tiene una serie de características en común con la enfermedad humana, así como algunas diferencias. A diferencia de las enfermedades neurológicas que han sido posibles de provocar con HTNV, el modelo hámster para HCPS parece ser causado por fugas capilares que resultan en edema pulmonar y la producción de un derrame pleural con características exudativas. Típicamente los hámsteres mueren entre 11 y 14-d post-inoculación, reflejando un período de incubación ligeramente acelerado en comparación con las infecciones humanas. Al igual que con el HCPS humano, el examen microscópico del pulmón revela abundante deposición de fibrina, septo alveolar engrosado y antígeno viral expresado abundantemente en el endotelio microvascular. Los hámsteres infectados por ANDV equipados con dispositivos de monitoreo fisiológico mostraron disminución de las presiones de pulso, taquicardia e hipotensión que parecen imitar de cerca el shock que se cree que es la causa próxima de la muerte en pacientes que sucumben al HCPS [65, 74]. En comparación con la enfermedad humana, los hámsteres infectados por ANDV exhiben títulos excepcionalmente altos de ANDV vivo en sus tejidos, con gran parte de la replicación viral que se produce Los títulos de ANDV vivo en algunos casos superan los 10 8 /g, mientras que los aislados de hantavirus de los tejidos humanos han sido notoriamente difíciles de obtener. A pesar de la aparición universal de enzimas hepáticas levemente elevadas en pacientes con HCPS, las enzimas hepáticas no parecen estar presentes en niveles elevados en la sangre de hámsters enfermos incluso inmediatamente antes de la muerte [75]. El período prolongado de incubación asociado con la enfermedad por hantavirus da al huésped un tiempo considerable para montar una respuesta inmune madura contra el virus. Así, en contradición a infecciones de gravedad comparable y sintomatología relacionada asociada con arenavirus y filovirus, las infecciones por hantavirus en humanos se asocian con respuestas anticuerpos de título significativo por el momento en que comienzan los síntomas. A pesar de esta observación, parece ser posible que la variación natural en las respuestas individuales de anticuerpos neutralizantes entre los pacientes con infecciones por NVS pueda estar relacionada con la gravedad de la enfermedad, lo que sugiere que la administración de anticuerpos antivirales podría resultar efectiva terapéuticamente [76]. En el caso de la infección por ANDV, han surgido nuevas evidencias que indican que el aparente aclaramiento del virus de la sangre no resulta en la eliminación completa del estímulo antigénico por el virus, sugiriendo que el virus puede persistir, tal vez en algún sitio inmunológicamente privilegiado aún indeterminado [77]. Un papel para las respuestas patológicas mediadas por células T en el HFRS y el HCPS ha sido la fuente de especulación por una variedad de razones. La gravedad del SNS asociado a la NVS puede haber hecho más evidente que el inicio del edema pulmonar, la taquicardia y la hipertensión parecía estar todo, pero universalmente asociado temporalmente, con la aparición de un espectro de células altamente activadas del linaje linfoide en la sangre periférica. Se detectaron células con similitudes morfológicas cercanas a estos -inmunoblastos- en los pulmones congestionados y pesados de los pacientes que llegaron a la autopsia, así como en órganos linfoides y en las tríadas portal [63, [78] [79] [80]. Estas observaciones llevaron a especular que algún componente de la patogénesis por hantavirus podría estar vinculado a la aparición de células T antivirales que podrían estimular o contribuir a la aparición de una -tormenta de mediadores y el fenotipo de fuga capilar asociado. Estudios posteriores han confirmado la expectativa de que una fracción significativa de la población de inmunoblastos en pacientes con HCPS son células T con especificidad para epitopes específicos de antígenos virales de clase I presentados por el HLA, incluyendo Gn, Gc y N [77, [81] [82] [83]. Presumiblemente, las actividades antivirales de estas células, manifestadas en parte por su elaboración de mediadores en el intersticio afectado, pueden contribuir a la fuga endotelial/capilar que se encuentra en el corazón de la patogénesis del hantavirus. Debido a que los primeros casos de HCPS a menudo llegaron a la autopsia, se hizo posible examinar tejidos necropsiados para la expresión de citocinas. El estudio de Mori et al. (1999) revelaron una alta expresión relativa de citocinas proinflamatorias incluyendo TNF-, IL-1-, IL-6, proporcionando evidencia a favor de un modelo de tormenta de citoquinas para la patogénesis [64]. Los autores creían, basándose en la morfología de las células secretadoras de citoquinas, que tanto monocitos como linfocitos estaban contribuyendo a la producción de citocinas. Que los mediadores proinflamatorios se encuentran en niveles elevados en el plasma, así como el intersticio renal de pacientes con enfermedad hantaviral aguda se ha reconocido desde hace algún tiempo también [84, 85]. Si bien el diagnóstico de HCPS y HFRS se realiza mejor con serología IgM, en la etapa aguda de la infección por NVS, también se puede utilizar RT-PCR si se utilizan células sanguíneas o coágulos de sangre en lugar de plasma o suero, donde la sensibilidad incluso utilizando imprimaciones PCR anidadas disminuye a cerca del 70% [86] [87] [88]. En una instalación en la que se tratan muchos casos de HCPS, el centro médico de la Universidad de Nuevo México en Albuquerque, se ha ofrecido un servicio de diagnóstico en el que se analizan los hallazgos hematológicos del paciente para establecer la probabilidad de que un paciente tenga HCPS. La combinación de trombocitopenia, abundancia elevada de linfocitos -inmunoblasto-, población de células polimorfonucleares con desplazamiento izquierdo sin evidencia morfológica fuerte para su activación, y valores elevados de hemoglobina o hematocrito es altamente específica para el HCPS y permite a los clínicos la capacidad de poner pacientes presuntivos-HCPS en oxigenación de membrana extracorpórea (ECMO), que se cree que ha salvado a muchos pacientes de un resultado letal [89]. Se cree que la infección humana por hantavirus sigue el contacto con secreciones o excreciones producidas por roedores infectados. En los Estados Unidos, 538 infecciones humanas por hantavirus fueron reportadas hasta finales de diciembre de 2009 [90], con Nuevo México, Arizona y Colorado mostrando los casos más altos. Mientras que el prototípico hantavirus centroamericano en América Central fue el virus Rio Segundo de Reithrodontomys mexicanus de Costa Rica, la primera enfermedad humana apareció algunos años más tarde en Panamá, donde el virus Choclo (CHOV) surgió como el agente etiológico y se cree que es responsable de todos los casos conocidos de HCPS. La rata de arroz pigmeo fulvo Oligoryzomys fulvescens ha sido identificada como el reservorio de roedores [91]. En Panamá, los primeros casos de HCPS, aunque con poca o ninguna implicación cardiaca evidente, fueron reportados en 1999, y desde entonces, 106 infecciones humanas han ocurrido con una tasa de mortalidad del 26% [92]. Seroencuestas de mamíferos en México y Costa Rica han encontrado anticuerpos antihantavirus [93] [94] [95] [96], y se han notificado seroprevalencias que oscilan entre 0,6 y 1,6% en poblaciones humanas a pesar de la ausencia de casos conocidos de HCPS [97]. En América del Sur, los casos de HCPS se han identificado en Argentina, Bolivia, Brasil, Chile, Paraguay y Uruguay, y también se han notificado evidencias de exposición humana a hantavirus en Venezuela [98] y Perú [99]. En América del Sur, ANDV es el principal agente etiológico con casos en Chile y Argentina notificados desde 1995. En Chile, se han producido 671 casos de HCPS debido a ANDV durante el período 2001-2009 [100]. Desde 1995 se han reportado más de 1.000 casos de HCPS en Argentina [101] ; en el Brasil se han identificado aproximadamente 1.100 casos de HCPS entre 1993 y 2008 [102]. Las tasas de mortalidad por casos en esos tres países han sido similares, oscilando entre el 30% (Argentina), el 36% (Chile) y el 39% (Brasil). Las infecciones por Hantavirus ocurren con más frecuencia en hombres que en mujeres, aunque la proporción entre hombres y mujeres es muy variable. Por ejemplo, las comunidades panameñas mostraron una proporción de 55 hombres por 45 mujeres [103], mientras que en Chile la proporción es más sesgada por hombres (71%) [104]. En el Chaco paraguayo la proporción entre hombres y mujeres se aproxima al 50% [105]. En América del Norte, en diciembre de 2009 el 63% de los pacientes eran varones [90]. Todos los grupos étnicos y raciales parecen ser susceptibles a infecciones por el hantavirus, y las diferencias entre ciertos grupos (como indígenas y no indígenas) están más probablemente correlacionadas con el tipo de hábitat en el que reside la población (por ejemplo, zonas rurales frente a zonas urbanas). De hecho, las comunidades rurales representan la mayor incidencia global del hantavirus y, por lo tanto, están en mayor riesgo [92, [105] [106] [107] [108] [109] [109] [119], aunque también se ha destacado la importancia de los entornos peridomésticos como una importante zona de exposición [112, 113]. El principal mecanismo por el que los seres humanos adquieren la infección por el hantavirus es la exposición a aerosoles de heces contaminadas de roedores, orina y saliva [114, 115]. Esto puede ocurrir cuando los seres humanos residen en áreas cercanas a las que habitan los roedores, viven en áreas infestadas de roedores, o cuando los roedores invaden entornos humanos, que son más frecuentes en hábitats rurales.Existe una larga historia de coexistencia humana con roedores, lo que plantea dudas sobre el aparente aumento reciente de las enfermedades relacionadas con el hantavirus, especialmente el HCPS. Aparte de una aparente asociación con eventos de oscilación sureña de El Niño (ENSO) en algunas regiones [116, 117], los recientes incrementos en la incidencia del HCPS no parecen seguir un patrón temporal o espacial fácilmente definido. Sin embargo, algunas características del paisaje, como la fragmentación del hábitat o las áreas perturbadas por el ser humano, pueden influir en la dinámica de la población de roedores e impactar en la incidencia viral [118] [112] [112] [121]. A pesar de la estocástica asociada a la contracción de la infección Las actividades humanas en edificios mal ventilados que pulverizan partículas que luego se inhalan (es decir, limpieza, agitación de alfombras, polvo) se identifican con frecuencia entre los pacientes admitidos para el SHCPS [11, 122]. Se cree que las actividades al aire libre transmiten un menor riesgo debido a la labilidad de los hantavirus a la radiación UV y a la supuesta tendencia a dispersarse en el viento, aunque ciertas condiciones ambientales parecen mantener el virus durante períodos más largos fuera de su huésped natural, lo que permite la transmisión indirecta [123]. Una vía alternativa pero poco común de transmisión del virus es la mordedura de roedores [124] [125] [126]. Los trabajadores sobre el terreno que manipulan mamíferos corren un riesgo potencialmente mayor de exposición a infecciones por hantavirus, aunque cuando se cuantifica a través de serosurveys el riesgo absoluto parece bastante leve [127]. Un nuevo estudio en Colorado sugiere la posibilidad de que una picadura de roedor haya sido el vehículo próximo para la transmisión al aire libre de NVS [128], lo que vuelve a enfatizar el uso de equipo de protección personal durante las actividades de trabajo de campo [129]. Como caso particular dentro de los hantavirus, la transmisión de persona a persona ha sido documentada exclusivamente para el virus de los Andes sudamericanos [130] [133] [133] [135]. La identificación de esta vía de transmisión se ha hecho utilizando tanto herramientas moleculares como encuestas epidemiológicas, pero el mecanismo de transmisión interpersonal no está bien establecido. Curiosamente, ANDV también puede ser derramado por los humanos a través de otros fluidos biológicos como la orina [136], ilustrando las propiedades particulares que diferencian este virus de otros hantavirus. Aunque la transmisión interpersonal parece ser única para ANDV, el ARN viral de PUUV se ha detectado en la saliva de pacientes con HFRS, y algunos pacientes con SNV-HCPS tienen ARN viral en las secreciones traqueales [88, 137]. Los Hantavirus en las Américas son alojados naturalmente por roedores (Muridae y Cricetidae) así como las musarañas (Soricidae) y los lunares (Talpidae) (Figura 1). Tres especies de musgo y un mole han sido reportados para albergar hantavirus y su patogenicidad para los humanos permanece desconocida [22, 138, 139]. Se han identificado al menos 15 especies de roedores como portadores de diferentes hantavirus patógenos, con algunos genotipos sudamericanos como Castelo do Sonhos (CDSV) o Hu39694 sólo identificados después de infecciones humanas (Figura 1 ). Los hantavirus suelen mostrar una alta especificidad de especie y ningún huésped intermedio [140]. Sin embargo, se han descrito algunos genotipos de hantavirus en la misma especie de roedores. Tal es el caso de Playa de Oro (OROV) y Catacamas (CATV) identificados en Oryzomys couesi [141, 142], o Maporal (MAPV) y Choclo (CHOV) hospedados por O. fulvescens [91, 143]. En América del Norte se han detectado virus de muleshoe y Black Creek Canal hanta en sigmodon hispidus [ Además, un genotipo de hantavirus (por ejemplo, el virus similar a Juquitiba) puede ser transportado por más de una especie de roedores (O. nigripes, Oxymycterus judex, Akodon montesis). Otro ejemplo es el virus Laguna Negra (LANV) que después de ser identificado en Calomys laucha [146] también ha sido reportado en C. callosus [147]. El rápido aumento en el descubrimiento de nuevos hantavirus y la identificación de sus anfitriones no parece probable que termine tan pronto como se examinen nuevas especies pequeñas de mamíferos [95]. Este tema se complica por la continua controversia en los criterios para la clasificación de distintos hantavirus [148, 149], que también está vinculado a la clasificación taxonómica y los reordenamientos taxonómicos. La transmisión de especies cruzadas es un proceso importante durante la propagación, aparición y evolución Particularmente dentro de los hantavirus, los derrames a los huéspedes secundarios se identifican cada vez más a medida que se realizan estudios más extensos [151] [152] [153] [155] [156]. Por ejemplo, ANDV es el agente etiológico predominante del HCPS en América del Sur, y O. longicaudatus el principal reservorio de roedores. Derrama en al menos otras cuatro especies de roedores que coocurren con el reservorio se han identificado, con Abrothrix longipilis mostrando la segunda mayor prevalencia de anticuerpos de ANDV, y actualmente no hay duda de que el virus es extremadamente similar genéticamente entre los dos roedores del huésped [157, 158]. En América del Norte, el derrame del virus Bayou (BAYV) puede haber ocurrido desde el reservorio principal de O. palustris a S. hispidus, R. fulvescens, P. leucopus y B. taylori [159] [160] [161]. Es más probable que el derrame del virus Hanta se produzca con poblaciones de acogida que habitan regiones simpatricas o sintópicas [151, 162], y la transmisión de especies cruzadas tendría probablemente mayores posibilidades de éxito si las especies anfitrionas están estrechamente relacionadas [163]. Se encuentra una excepción interesante entre el virus Oxbow (OXBV) y el virus Asama (ASAV) en el que un proceso de cambio de huésped parecía haber ocurrido entre mamíferos pertenecientes a dos familias (Talpidae y Soricidae), probablemente como resultado de la codivergencia alterna y recurrente de ciertos tax Los hantavirus son transmitidos horizontalmente entre roedores y no son transmitidos por artrópodos (a diferencia de otros virus de la familia Bunyaviridae). La infección por derrapadores a mamíferos no humanos generalmente no produce ninguna transmisión hacia adelante (o a fin de morir), pero si los seres humanos están infectados pueden resultar en una alta morbilidad y mortalidad [122, 164]. Durante la primavera de 1993, un brote de pacientes con HCPS debido a SNV ocurrió en los estados de Four Corners, resultando en más del 60% de casos de mortalidad entre los casos iniciales, muchos de los cuales involucran a miembros de la tribu Navajo [12, 121]. En Panamá, se notificó un brote durante 1999-2000 en Los Santos, y 12 casos donde se identificaron con tres muertes [165, 166]. Esto representó el primer informe de infecciones por hantavirus humanos en América Central. En América del Sur, Diecisiete individuos fueron identificados con anticuerpo NVS (ELISA) o fueron antígenos (HCI) positivos de 52 casos sospechosos [167]. En 1996 ocurrieron brotes mayores debidos a ANDV en el sur de Argentina [131, 134] ; en el sur de Chile se presentaron grupos de pacientes con enfermedad por hantavirus en 1997 [158]. En Brasil, el primer brote fue identificado en la Amazonía Brasileña (Estado de Maranhão) en el año 2000, e involucró pequeños pueblos que resultaron en una prevalencia del 13,3% de los evaluados (398 residentes totales) [168]. Los factores que desencadenan los brotes de hantavirus todavía son mal entendidos, probablemente porque resultan de varias características bióticas y abióticas interactuantes cuyos parámetros clave son difíciles de modelar. Sin embargo, el uso de nuevos enfoques de modelado que involucran características geográficas y ambientales parece ser prometedor a la hora de predecir posibles brotes de hantavirus y/o áreas de mayor riesgo [169] [170] [171] [172]. Debido a que se sabe que los hantavirus se transmiten directamente de los huéspedes infectados a los susceptibles, el primer enfoque natural es relacionar los brotes con la ecología de los huéspedes virales. La transmisión y persistencia del hantavirus en las poblaciones de roedores depende de varios factores que interactúan para afectar la dinámica ecológica del huésped, que a su vez está fuertemente influenciada por las características de comportamiento de las especies de roedores individuales, a la estructura paisajística y a las características ambientales [173, 174]. La transmisión viral depende de las tasas de contacto entre los huéspedes sensibles, y a pesar de la noción prevaleciente de que un aumento de la densidad se encuentra y, por lo tanto, de Además, se ha demostrado que la transmisión de NVS sigue un patrón de heterogeneidad de contacto, donde los individuos de la población tienen diferentes probabilidades de transmitir la infección [176]. La comprensión de la transmisión viral resulta ser mucho más compleja cuando especies distintas del principal huésped del reservorio se incorporan en el modelo. De hecho, estudios recientes han demostrado que la mayor diversidad de especies hospedantes está correlacionada con una menor prevalencia de infección en América del Norte para P. maniculatus [177], en América Central para O. fulvescens (reservorio del virus Choclo) y Zygodontomys brevicauda (reservorio del virus Calabazo) [178], y en América del Sur para Akodon montensis (reservorio del virus Jabora) [162]. Las tasas de contacto varían según la distribución espacial de las poblaciones y parecen estar Por ejemplo, la prevalencia de SNV en P. maniculatus fue mayor en paisajes con mayor grado de fragmentación del hábitat preferido [179]. Además, ciertas propiedades del paisaje como elevación, pendiente y cubierta terrestre parecen ser útiles para detectar áreas con infecciones persistentes de SNV, y por lo tanto se consideran áreas refugiales donde el virus puede mantenerse durante años [169]. Los cambios en el entorno natural de las especies de reservorios, como la fragmentación forestal y la pérdida de hábitat, pueden alterar la abundancia y distribución de la población y provocar brotes de hantavirus, como se observa en la Península de Azurero de Panamá [118, 119]. Además, las diferencias en el microhábitat, incluida la cubierta superficial, pueden conducir a diferencias en la dinámica ecológica dentro de las poblaciones y afectar a la tasa de exposición al virus [180]. Se han encontrado diferencias en las infecciones por hantavirus a través de paisajes contrastantes en el intervalo latitudinal en poblaciones de roedores de O. longicaudatus en Chile, lo que sugiere que los seres humanos están expuestos de manera diferencial al virus [107, 181]. La dinámica poblacional de roedores se ve afectada por cambios estacionales de clima y clima [182, 183]. En el caso de los brotes asociados a ENSO, se ha postulado una compleja cascada de eventos desencadenados por lluvias altamente inusuales en el año precedente para dar lugar a un aumento de la producción primaria y densidades de roedores, aumentando también la probabilidad de transmisión del virus a los seres humanos, pero ha resultado difícil demostrar con precisión los eventos intermedios sugeridos, como el aumento de las densidades de roedores en el aumento de la carga de casos [116, 121, 184]. En América del Sur, los efectos del cambio climático y los brotes de hantavirus no han sido bien estudiados, a pesar del conocimiento de que varias especies de roedores que son reservorios de enfermedades emergentes se han visto dramáticamente afectadas por eventos como El Niño [185]. Los cambios en la dinámica de la población de acogida también se ven afectados por la estacionalidad, lo que puede conducir a brotes de enfermedades cuando se interrumpen los procesos que equilibran las poblaciones de roedores de temporada en temporada [186]. La emergencia viral puede seguir promoviéndose a medida que los cambios introducidos por el ser humano continúan aumentando en el medio ambiente a diferentes escalas geográficas. Estos cambios también pueden alterar la estructura y dinámica de la población de roedores e interacciones interespecies creando condiciones que pueden conducir a brotes virales, establecimiento viral en nuevos hospederos, y la aparición de HCPS [102, 162], incluso con aparentemente leve perturbación ecológica al sistema virus-hospedero [188]. Ciertas características fisiopatológicas, incluyendo trombocitopenia y shock, de enfermedades por hantavirus de los seres humanos, tienen similitud sustancial con las fiebres hemorrágicas inducidas por otros virus tales arenavirus, filovirus y flavivirus, a pesar de compartir esencialmente ninguna secuencia similitud con ellos. Tales observaciones plantean preguntas acerca de si tales similitudes en la patogénesis son probables similitudes de fenotipo, o en cambio reportan la presencia de mecanismos moleculares comunes entre los virus. En esta revisión se discuten las propiedades generales, descubrimientos y epidemiología/ecología de las formas de hantavirus patógenos del Nuevo Mundo, y también se busca identificar algunas de las características de las macromoléculas virales y mecanismos inmunológicos que se han propuesto como potenciales mediadores directos de los eventos patógenos que caracterizan la enfermedad humana HCPS. Si bien es poco probable que la expresión de una proteína viral particular o ARNs en aislamiento se pueda confiar en replicar fenotipos clave de infección por el virus completo, algunos de los hallazgos han sido suficientemente consistentes con lo que se conoce de la patogénesis in vivo que ofrecen plomos plausibles de primer paso en la búsqueda de objetivos terapéuticos. Esperamos con interés las revelaciones mecanísticas que seguirán el uso inevitablemente ampliado de métodos poderosos como la secuenciación profunda, imágenes cada vez más avanzadas, y métodos microscópicos, y modelos animales que por fin se pueden decir

¿Qué han mostrado los estudios de microscopía confocal y de inhibidores bioquímicos en qué pistas N?

Los hantavirus en las Américas y su papel como patógenos emergenteshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3185593/SHA: efe13a8d42b60ef9f7387ea539a1b2eeb5f80101Autores: Hjelle, Brian; Torres-Pérez, FernandoFecha: 2010-11-25DOI: 10.3390/v2125559Licencia: cc-byAbstract: La continua aparición y reaparición de patógenos representan una amenaza continua, a veces mayor, para las poblaciones. Los hantavirus (familia Bunyaviridae) y sus enfermedades humanas asociadas se consideraron confinados a Eurasia, pero la aparición de un brote en el suroeste de Estados Unidos llevó a un gran aumento en su estudio entre los virólogos de todo el mundo. Se han descrito más de 40 genotipos hantavirales, la gran mayoría desde 1993, y casi la mitad de ellos patógenos para los seres humanos. Los hantavirus causan infecciones persistentes en sus reservorios, y en las Américas, la enfermedad humana se manifiesta como compromiso cardiopulmonar, síndrome cardiopulmonar del hantavirus (HCPS), con proporciones de casos-fatalidad, para los serotipos virales más comunes, entre el 30% y el 40%. Alteración del hábitat y trastornos ecológicos a mayor escala, tal vez incluyendo el cambio climático, son algunos de los factores que pueden haber aumentado la carga de casos humanos de HCPS entre 1993 y el presente. Consideramos aquí las características que influyen en la estructura de la dinámica de la población huésped que pueden conducir a brotes virales, así como los determinantes macromoleculares de los hantavirus que han sido considerados como potenciales contribuciones a la patogenicidad. Texto: Los patógenos emergentes causan enfermedades nuevas o no reconocidas anteriormente, y entre ellas, las zoonóticas emergentes son una preocupación importante entre los científicos que estudian enfermedades infecciosas a diferentes escalas espaciales y temporales [1, 2]. Los cambios en las condiciones bióticas y abióticas pueden alterar la dinámica de las enfermedades de la población y conducir a la aparición de infecciones zoonóticas [3] [5] [6]. Durante las últimas décadas, se han producido varios brotes de patógenos virales emergentes y reemergentes, que afectan tanto a la implicación puramente local como a nivel mundial/pandémica de las poblaciones humanas. Entre los ejemplos visibles están la gripe A, el virus del Ébola, el virus de la hepatitis C, el trastorno respiratorio grave para adultos (SARS), el coronavirus y el virus de la inmunodeficiencia humana, que desafían las medidas de prevención y control de los sistemas de salud pública [7]. En las Américas, el reciente brote de gripe pandémica A subtipo H1N1 se convirtió en un objetivo importante de control debido a su rápida propagación, y las incertidumbres en cuanto a virulencia y transmisibilidad, sin embargo, la disponibilidad de vacunas fue limitada cuando se produjo una actividad significativa antes de la temporada tradicional de gripe [8]. Sin embargo, en el último siglo han surgido o resurgido brotes de varias enfermedades virales relacionadas con el virus arenavirus y el virus del dengue, y más recientemente, hantavirus y la expansión del rango geográfico del virus del Nilo Occidental. Entre las enfermedades zoonóticas, los mamíferos pequeños son anfitriones de varios virus ARN patógenos, especialmente Arenaviridae y Bunyaviridae: Hantavirus [9] [10] [11]. Las infecciones por hantavirus se convirtieron en una preocupación en las Américas después de la descripción de un brote de distrés respiratorio agudo ocurrido en La enfermedad recientemente reconocida, el síndrome cardiopulmonar del hantavirus, el HCPS (o síndrome pulmonar del hantavirus), se relacionó con la infección por el virus del Sin Nombre (SNV) recién descubierto, y el roedor Peromyscus maniculatus (ratón venado) fue identificado como el reservorio [13]. Sin embargo, las infecciones por hantavirus tienen una historia mucho más larga. Una revisión de los escritos chinos antiguos, que datan de aproximadamente 960 dC, reveló descripciones muy parecidas a la fiebre hemorrágica con síndrome renal (HFRS), el síndrome causado por los hantavirus del Viejo Mundo [14]. Durante el siglo XX, los casos de enfermedad febril aguda con compromiso renal fueron descritos de varios países eurasiáticos y Japón, a menudo en asociación con compromisos militares [15]. El HFRS como síndrome distinto, sin embargo, fue llamado por primera vez a la atención de la medicina occidental en asociación con un brote que ocurrió entre las tropas de las Naciones Unidas durante el conflicto coreano entre 1951 y 1954, donde más de 3.200 soldados fueron afectados [16]. Tomó más de dos décadas hasta que el agente etiológico, el virus Hantaan (HTNV), fue aislado del ratón de campo rayado Apodemus agrarius, detectado en parte por la unión de anticuerpos de muestras de suero de paciente a los tejidos pulmonares de ratones de campo sanos y salvajes [17, 18]. El virus se encontró más tarde para representar la especie tipo de un nuevo género Hantavirus de la familia Bunyaviridae, aunque fue más tarde evidente que el primer hantavirus a aislarse fue el virus Thottapalayam de shrew-borne [19]. La categorización de los hantavirus como pertenecientes a la familia Bunyaviridae se debe en parte a la presencia consistente de tres genomas de ARN que son circularizados in vivo como resultado de la presencia de nucleótidos terminales complementarios que ayudan a doblar el genoma en una morfología -hairpin-, descrita por primera vez para el flebovirus Uukuniemi [19, 20]. La Tabla 1 es una lista de los hantavirus patógenos predominantemente distintos serológicamente. Se describen muchos otros genotipos llamados, pero tales otras formas patogénicas están generalmente estrechamente relacionadas con los Andes o, en algunos casos, el virus Sin Nombre. Durante la maduración del virus, el precursor forma GPC se procesa utilizando una proteasa unida a la membrana en Gn y Gc, una escisión que ocurre, y parece ser señalada, después de la señal péptida conservada WAASA en la C-terminal de Gn [24]. Aunque las dos proteínas se pueden expresar de forma independiente a través de la transfección, pueden ser retenidas en el compartimento celular incorrecto (ER o aggrosome); por lo tanto, deben ser co-expresadas para permitirles estabilidad para que las dos se puedan ensamblar correctamente en el Golgi [25, [27] [28]. Se han identificado varias actividades y propiedades para las glicoproteínas envolventes del hantavirus, incluyendo algunas características que se sospecha que están involucradas en la patogenicidad de los serotipos causantes de la enfermedad, una posibilidad que ha generado atención experimental. Las glucoproteínas son los ligandos conocidos o presuntos para al menos dos receptores celulares distintos, la cadena de integrina y el factor acelerador de la descomposición, o DAF [30, 31] ; con gC1qR/p32 también identificado como otro receptor de entrada potencial [32]. Comparaciones con la proteína E del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, llevaron a Tischler et al. a considerar la glicoproteína Gc como una proteína potencial de fusión de clase II, tal vez impartiendo actividad de fusión al virión, y esta hipótesis ha ganado apoyo en otros estudios [33, 34]. Se han identificado actividades adicionales con, o se afirma que están relacionadas con, Gn. Para muchos de estos estudios, una premisa subyacente ha sostenido que hay diferencias entre las glicoproteínas de hantavirus -patógenos en relación con virus en el género que se denominan Si bien es cierto que aún no ha sido posible vincular el virus de Prospect Hill (PHV) con la enfermedad humana, la ausencia de evidencia de su patogenicidad tal vez no debería equipararse con la evidencia de su ausencia. Sólo se podría considerar que el nivel de enfermedad (por ejemplo, letargo, fiebre, proteinuria y azotemia) asociado con la infección de primates no humanos por PHV no es significativamente diferente del registrado para los modelos de primates no humanos utilizando el virus conocido del patógeno Puumala (PUUV) [35, 36]. Para el propósito de esta discusión, presumiremos que los hantavirus apatogénicos son efectivamente apatogénicos. Mientras que algunos estudios han sugerido que las glicoproteínas Gn se dirigen más rápidamente a la vía ubiquitina-proteosoma que a las formas apatogénicas, otros han interpretado las diferencias en el manejo de las glicoproteínas Gn a través de las especies del hantavirus por el sistema ubiquitina-proteosomal como independientes de la patogenicidad [37] [38] [39]. Algunos investigadores han dirigido sus esfuerzos hacia la identificación de una capacidad diferencial, ya sea cinética o de magnitud absoluta, en la capacidad de los hantavirus patógenos y apatogénicos para provocar una respuesta del interferón en las células. Una premisa que surge es que las formas apatogénicas tenderían a inducir una respuesta innata anterior que haría más probable que el virus se limpiara rápidamente o se volviera menos competente en su replicación, a fin de evitar cualquier respuesta patológica en el huésped [4 La respuesta innata anti-hantavirus puede en algunos casos ser atribuida a la interacción viral como ligando de TLR-3, pero no en otros, y en las células endoteliales, no parece requerir más que la partícula viral misma, incluso cuando se introduce en forma replicante-incompetente [43, 44]. Proteínas y ARNm inducidos prominentemente por los hantavirus incluyen MxA e IFIT-1 (ISG-56) y otros incluyendo algunos con actividad antiviral conocida o sospechada. Esos hantavirus, a menudo cepas altamente patógenas, que no inducen una respuesta antiviral potente, se sospechan o se presume que tienen un (más) potente mecanismo de antagonismo interferón-vía en relación con otros virus, un mecanismo que actúa positivamente para prevenir que se forme una respuesta innata efectiva, al menos temprano en Sin embargo, se reportan algunos casos en los que los hantavirus altamente patógenos, tales como NVS, también son capaces de inducir la expresión de los ARNm del gen estimulado por interferón, incluso muy temprano en la infección, con proteínas ISG, como se esperaba, tardando más tiempo en aparecer en la célula [44]. Las actividades anti-interferón también se han atribuido a la proteína NSs que se puede elaborar en células infectadas por serotipos que codifican esta proteína [46]. Otros investigadores han examinado las actividades de las glucoproteínas del hantavirus y otras proteínas que podrían afectar directamente a algunos aspectos de la progresión patogénica asociada a la infección por hantavirus en humanos, tales como cambios en la permeabilidad vascular. Mientras que los primeros intentos de causar directamente aumentos en la permeabilidad de las monocapas endoteliales con partículas virales o infección viral fueron en gran medida decepcionantes, los hantavirus se han identificado como que afectan adversamente la migración endotelial sobre los sustratos y en la potenciación de la permeabilidad endotelial inducida por VEG-F [47, 48]. La proteína nucleocápsida o N más corta (+50 kD) es un componente estructural del nucleocápsido viral, junto con los segmentos de ARN viral genómico. Como proteína de unión al ARN que afecta a la horquilla del cabello de los segmentos genómicos con alta afinidad [49, 50], limita el acceso del ARN para alojar nucleasasas y ayuda a hacer que la replicación viral sea un proceso cerrado dentro del citoplasma. También actúa como una proteína de membrana periférica, al igual que la proteína L [51], una actividad que podría jugar un papel en su supuesta, pero aún no demostrada función como matriz [52]. Hasta hace poco, no se había apreciado que N tuviera una amplia variedad de otras actividades, algunas de las cuales pueden estar vinculadas, no sólo a los requisitos fundamentales de replicación, sino también a la interferencia con una serie de procesos intracelulares de la célula normal. Así, se ha propuesto una interacción entre el aminoterminal de la proteína N del hantavirus y la proteína celular Daxx, con la sugerencia de posibles consecuencias pro-apoptóticas [51]. N también se reporta que interactúa con microfilamentos actínicos, y la proteína SUMO-1 [53, 54]. Utilizando ensayos basados en el gen reportero, Connie Schmaljohn y sus colegas han reportado que la proteína nucleocapsida del virus Hantaan tiene un papel inhibidor en las respuestas inflamatorias mediadas por NF kappa B (NF- B). Los efectos sobre la expresión NF- B parecen estar limitados a la prevención de su translocación nuclear después de su intento de activación con lipopolisacárido, LPS [55]. En el citoplasma de las células infectadas, la proteína N se puede encontrar en los cuerpos celulares P donde secuestra y protege los capuchones de 5'. Puede localizar los capuchones a través de su interacción con DCP1, un componente clave de los cuerpos P. Durante la infección por hantavirus, los ARN virales se concentran en los cuerpos P, a través de su interacción con N y DCP1. La proteína N demuestra la protección preferencial de los ARNm diseñados para terminar prematuramente su proteína codificada en comparación con los ARNm nativos [56]. La proteína N se ha vinculado cada vez más a la replicación y traducción virales, a veces de maneras no previstas anteriormente. Se encuentra entre una familia creciente de diversas proteínas virales que pueden servir como un inespecífico - ARN chaperone ®, una actividad que debe facilitar el acceso de la L polimerasa al ARNv para la transcripción y replicación, en que puede disociar transitoriamente estructuras de ARN mal dobladas [57]. Algunos de los efectos de la proteína N en la traducción no pueden ser inmediatamente reconocidos como adaptables en la naturaleza. Puede reemplazar todo el complejo de iniciación traslacional EIF4F, presentando simultáneamente el ribosoma con un reemplazo de la actividad de unión de la tapa de eIF 4E, uniéndose al complejo de pre-iniciación 43S, al igual que eIF 4G, al tiempo que reemplaza la actividad helicoidal de eIF 4A, que se presume que es necesaria para disociar la estructura de ARN de orden superior [56, 58]. Estos tres factores normalmente trabajan juntos para lograr la iniciación traslacional. En los cuerpos P, la capacidad de la proteína N de unirse a una alta afinidad a los oligoribonucleótidos celulares nativos tapados, junto con su actividad en la protección de ARNs tapados de la degradación, probablemente facilita el acceso de oligonucleótidos encapsulados para su uso en la iniciación transcripcional por L polimerasa (-cap ra Tráfico de N para el ensamblaje viral: Clásicamente, la proteína N en las células infectadas parece estar agrupada o partículas en la naturaleza, con una concentración pesada en una única ubicación perinuclear, ampliamente considerada como la Golgi [27]. Las proteínas N de los hantavirus se encuentran en asociación con fracciones de partículas, y los estudios confocales microscopía y bioquímico-inhibidores han demostrado que las trazas N a lo largo de microtúbulos pero no con filamentos de actina [52]. El destino final de N, para su ensamblaje en partículas virales es la Golgi, y que circula allí a través del complejo intermedio retículo-Golgi endoplasmático (ERGIC), también conocido como cúmulo vesicular-tubular [52]. Un inhibidor negativo dominante, la dinamitina, asociado con el transporte mediado por Los estudios posteriores sugieren que la dependencia específica del transporte microtubular es específica de los hantavirus del Viejo Mundo como el NVH, pero que el Hantavirus del Nuevo Mundo ANDV está asociado con filamentos de actina [59]. Sin embargo, los datos recientes indican que el transporte microtubular es efectivamente utilizado para el NVH del Nuevo Mundo [60]. Las enfermedades del Hantavirus del hombre desde hace mucho tiempo han sido sospechosas de tener una base inmunopatógena en parte debido a su período de incubación relativamente largo de 2-3 semanas y la asociación temporal observada entre los trastornos inmunológicos y la primera aparición de signos y síntomas de la enfermedad del hantavirus. HFRS y HCPS comparten muchas características clínicas, llevando a muchos investigadores a considerar que son, en esencia, diferentes manifestaciones de un proceso patógeno similar, que difieren principalmente en los órganos objetivo primarios de expresión de la enfermedad (Tabla La patogénesis de las infecciones por hantavirus es el tema de una revisión continuamente actualizada en la serie UpToDate [61]. Para el momento en que aparecen los síntomas en el HCPS, ambas respuestas antivirales fuertes, y, para los genotipos virales más virulentos, el ARN viral puede ser detectado en plasma sanguíneo o células sanguíneas nucleadas respectivamente [63, 64]. Al menos tres estudios han correlacionado el ARN viral plasmático con la gravedad de la enfermedad para el HCPS y el HFRS, sugiriendo que la replicación del virus juega un papel continuo y en tiempo real en la patogénesis viral [65] [66] [67]. Se han identificado varios cambios patológicos distintivos que ocurren tanto en el HFRS como en el HCPS. Una característica crítica de ambos es una fuga capilar transitoria (~ 1-5 días) que involucra el La fuga resultante es de carácter exudativo, con una composición química alta en proteínas y similar al plasma. La experiencia continua que indica el fuerte tropismo tisular para las células endoteliales, específicamente, es uno de los varios factores que hacen de la integra β3 un candidato especialmente atractivo como un importante receptor in vivo para los hantavirus. Es probable que los hantavirus lleguen a sus tejidos objetivo a través de la captación por los ganglios linfáticos regionales, tal vez con o dentro de un histiocito pulmonar escoltante. Las semillas del virus endotelio local, donde las primeras células infectadas dan lugar, en última instancia, a una viremia primaria, un proceso que parece tomar mucho tiempo para las infecciones por hantavirus [62, 63]. En el momento en que emerge la viremia secundaria, los agentes de las formas más severas de HFRS y HCPS han comenzado a alcanzar una masa suficiente para inducir, a través de las interacciones PAMP-PRR y otros medios, la expresión de citoquinas proinflamatorias [64]. Para HCPS, esa expresión favorece el lecho pulmonar y los órganos linfoides, pero, por razones desconocidas, ahorra el retroperitoneo y, en general, el riñón. En HFRS la situación se invierte, y sin embargo no se aprecia a menudo que el esperado tropismos tisulares preferentes de virus asociados a HFRS y sus contrapartes asociadas a HCPS para los lechos renal y pulmonar, respectivamente, no es como se predeciría a través de las manifestaciones de las dos enfermedades. La elaboración local de mediadores inflamatorios y quimiotácticos se considera un requisito para el desarrollo de Sin embargo, no es la hipoxemia, debido al edema pulmonar prominente, lo que conduce a la muerte en la mayoría de los casos fatales de HCPS, sino más bien la intoxicación del corazón por mediadores como aún no definidos, lo que conduce al estado de bajo gasto cardíaco y al síndrome de shock asociado [64, 65]. Es tentador especular que los mediadores producidos en el pulmón en conexión con el infiltrado inflamatorio pueden infiltrarse a través de la circulación coronaria con dilución mínima en HCPS, consecuencia desventajosa de la estrecha yuxtaposición anatómica de los dos órganos. Así, al menos tres clases de mecanismos potenciales, algunos superpuestos y todos ciertamente no exclusivos de los otros, podrían presumirse que subyacen a la patogénesis del HCPS. Estos incluyen:(1) Mecanismos inmunes innatos. La naturaleza de las interacciones entre los patrones moleculares asociados al patógeno del hantavirus (PAMP) y los receptores de reconocimiento del patrón (PRR) de las células endoteliales susceptibles comienzan a ser aclaradas. El HTNV prototípico parece ser reconocido por TLR-3 [43]. Tal infección tiene consecuencias tales como una mayor expresión del HLA-DR en las células dendríticas [66] y la diferenciación de los monocitos hacia las células dendríticas [67]. (2) Efectos virales directos. La correlación observada entre la carga viral y la gravedad de la enfermedad deja abierta la posibilidad de que las partículas del hantavirus o el ARN puedan tener efectos tóxicos sobre las células o sobre la señalización. Algunos investigadores han favorecido la toxicidad viral directa, actuando a través de la inhibición de la función de barrera celular endotelial, como una explicación de gran parte de la fuga capilar, aunque existe Una pista potencialmente importante hacia el mecanismo por el cual las infecciones por hantavirus agotan las plaquetas sanguíneas y, en algunos casos, causan manifestaciones hemorrágicas, fue avanzada por el reciente descubrimiento de que los hantavirus patógenos son capaces de reclutar plaquetas para adherirse a las superficies celulares endoteliales, con β3 integrina utilizada como elemento de unión crítica [69]. (3) Efectos patógenos causados por las actividades de macromoléculas virales específicas. Hemos revisado algunas de las actividades asociadas con los Gn, Gc y N, polipéptidos codificados viralmente en secciones anteriores. Modelos de prueba de patogénesis se pueden hacer más eficazmente cuando hay un modelo animal que imita aspectos clave de la enfermedad. No existe un modelo similar al HFRS, pero existen modelos animales para el transporte asintomático de PUUV y SNV por sus roedores portadores nativos, el banco vole Myodes glareolus y el ratón de venado P. maniculatus; así como un modelo de hámster sirio utilizando ANDV o el virus Aporal relacionado de Venezuela, para el cual se observa una enfermedad mimética HCPS [70] [71] [72] [73]. El modelo de hámster ANDV-Sirio tiene una serie de características en común con la enfermedad humana, así como algunas diferencias. A diferencia de las enfermedades neurológicas que han sido posibles de provocar con HTNV, el modelo de hámster para HCPS parece ser causado por fugas capilares que resultan en edema pulmonar y la producción de un derrame pleural con características exuda Típicamente los hámsteres mueren entre 11 y 14-d post-inoculación, reflejando un período de incubación ligeramente acelerado en comparación con las infecciones humanas. Al igual que con el HCPS humano, el examen microscópico del pulmón revela abundante deposición de fibrina, septo alveolar engrosado y antígeno viral expresado abundantemente en el endotelio microvascular. Los hámsteres infectados por ANDV equipados con dispositivos de monitoreo fisiológico mostraron disminución de las presiones de pulso, taquicardia e hipotensión que parecen imitar de cerca el shock que se cree que es la causa próxima de la muerte en pacientes que sucumben al HCPS [65, 74]. En comparación con la enfermedad humana, los hámsteres infectados por ANDV exhiben títulos excepcionalmente altos de ANDV vivo en sus tejidos, con gran parte de la replicación viral que ocurre en Los títulos de ANDV vivo en algunos casos superan los 10 8 /g, mientras que los aislados de hantavirus de los tejidos humanos han sido notoriamente difíciles de obtener. A pesar de la aparición universal de enzimas hepáticas levemente elevadas en pacientes con HCPS, las enzimas hepáticas no parecen estar presentes en niveles elevados en la sangre de hámsters enfermos incluso inmediatamente antes de la muerte [75]. El período prolongado de incubación asociado con la enfermedad por hantavirus da al huésped un tiempo considerable para montar una respuesta inmune madura contra el virus. Así, en contradición a infecciones de gravedad comparable y sintomatología relacionada asociada con arenavirus y filovirus, las infecciones por hantavirus en humanos se asocian con respuestas anticuerpos de título significativo por el momento en que comienzan los síntomas. A pesar de esta observación, parece ser posible que la variación natural en las respuestas individuales de anticuerpos neutralizantes entre los pacientes con infecciones por NVS pueda estar relacionada con la gravedad de la enfermedad, lo que sugiere que la administración de anticuerpos antivirales podría resultar efectiva terapéuticamente [76]. En el caso de la infección por ANDV, han surgido nuevas evidencias que indican que el aparente aclaramiento del virus de la sangre no resulta en la eliminación completa del estímulo antigénico por el virus, sugiriendo que el virus puede persistir, tal vez en algún sitio inmunológicamente privilegiado aún indeterminado [77]. Un papel para las respuestas patológicas mediadas por células T en el HFRS y el HCPS ha sido la fuente de especulación por una variedad de razones. La gravedad del SNS asociado al SNCP puede haber hecho más evidente que el inicio del edema pulmonar, la taquicardia y la hipertensión parecía estar todo, pero universalmente asociado temporalmente, con la aparición de un espectro de células altamente activadas del linaje linfoide en la sangre periférica. Se detectaron células con similitudes morfológicas cercanas a estos -inmunoblastos- en los pulmones congestionados y pesados de los pacientes que llegaron a la autopsia, así como en órganos linfoides y en las tríadas portal [63, [78] [79] [80]. Estas observaciones llevaron a especular que algún componente de la patogénesis por hantavirus podría estar vinculado a la aparición de células T antivirales que podrían estimular o contribuir a la aparición de una -tormenta de mediadores y el fenotipo de fuga capilar asociado. Estudios posteriores han confirmado la expectativa de que una fracción significativa de la población de inmunoblastos en pacientes con HCPS son células T con especificidad para epitopes específicos de antígenos virales de clase I presentados por el HLA, incluyendo Gn, Gc y N [77, [81] [82] [83]. Presumiblemente, las actividades antivirales de estas células, manifestadas en parte por su elaboración de mediadores en el intersticio afectado, pueden contribuir a la fuga endotelial/capilar que se encuentra en el corazón de la patogénesis del hantavirus. Debido a que los primeros casos de HCPS a menudo llegaron a la autopsia, se hizo posible examinar tejidos necropsiados para la expresión de citocinas. El estudio de Mori et al. (1999) revelaron una alta expresión relativa de citocinas proinflamatorias incluyendo TNF-, IL-1-, IL-6, proporcionando evidencia a favor de un modelo de tormenta de citoquinas para la patogénesis [64]. Los autores creían, basándose en la morfología de las células secretadoras de citoquinas, que tanto monocitos como linfocitos estaban contribuyendo a la producción de citocinas. Que los mediadores proinflamatorios se encuentran en niveles elevados en el plasma, así como el intersticio renal de pacientes con enfermedad hantaviral aguda se ha reconocido desde hace algún tiempo también [84, 85]. Si bien el diagnóstico de HCPS y HFRS se realiza mejor con serología IgM, en la etapa aguda de la infección por NVS, también se puede utilizar RT-PCR si se utilizan células sanguíneas o coágulos de sangre en lugar de plasma o suero, donde la sensibilidad incluso utilizando imprimaciones PCR anidadas disminuye a cerca del 70% [86] [87] [88]. En una instalación en la que se tratan muchos casos de HCPS, el centro médico de la Universidad de Nuevo México en Albuquerque, se ha ofrecido un servicio de diagnóstico en el que se analizan los hallazgos hematológicos del paciente para establecer la probabilidad de que un paciente tenga HCPS. La combinación de trombocitopenia, abundancia elevada de linfocitos -inmunoblasto-, población de células polimorfonucleares con desplazamiento izquierdo sin evidencia morfológica fuerte para su activación, y valores elevados de hemoglobina o hematocrito es altamente específica para el HCPS y permite a los clínicos la capacidad de poner pacientes presuntivos-HCPS en oxigenación de membrana extracorpórea (ECMO), que se cree que ha salvado a muchos pacientes de un resultado letal [89]. Se cree que la infección humana por hantavirus sigue el contacto con secreciones o excreciones producidas por roedores infectados. En los Estados Unidos, 538 infecciones humanas por hantavirus fueron reportadas hasta finales de diciembre de 2009 [90], con Nuevo México, Arizona y Colorado mostrando los casos más altos. Mientras que el prototípico hantavirus centroamericano en América Central fue el virus Rio Segundo de Reithrodontomys mexicanus de Costa Rica, la primera enfermedad humana apareció algunos años más tarde en Panamá, donde el virus Choclo (CHOV) surgió como el agente etiológico y se cree que es responsable de todos los casos conocidos de HCPS. La rata de arroz pigmeo fulvo Oligoryzomys fulvescens ha sido identificada como el reservorio de roedores [91]. En Panamá, los primeros casos de HCPS, aunque con poca o ninguna implicación cardiaca evidente, fueron reportados en 1999, y desde entonces, 106 infecciones humanas han ocurrido con una tasa de mortalidad del 26% [92]. Seroencuestas de mamíferos en México y Costa Rica han encontrado anticuerpos antihantavirus [93] [94] [95] [96], y se han notificado seroprevalencias que oscilan entre 0,6 y 1,6% en poblaciones humanas a pesar de la ausencia de casos conocidos de HCPS [97]. En América del Sur, los casos de HCPS se han identificado en Argentina, Bolivia, Brasil, Chile, Paraguay y Uruguay, y también se han notificado evidencias de exposición humana a hantavirus en Venezuela [98] y Perú [99]. En América del Sur, ANDV es el principal agente etiológico con casos en Chile y Argentina notificados desde 1995. En Chile, se han producido 671 casos de HCPS debido a ANDV durante el período 2001-2009 [100]. Desde 1995 se han reportado más de 1.000 casos de HCPS en Argentina [101] ; en el Brasil se han identificado aproximadamente 1.100 casos de HCPS entre 1993 y 2008 [102]. Las tasas de mortalidad por casos en esos tres países han sido similares, oscilando entre el 30% (Argentina), el 36% (Chile) y el 39% (Brasil). Las infecciones por Hantavirus ocurren con más frecuencia en hombres que en mujeres, aunque la proporción entre hombres y mujeres es muy variable. Por ejemplo, las comunidades panameñas mostraron una proporción de 55 hombres por 45 mujeres [103], mientras que en Chile la proporción es más sesgada por hombres (71%) [104]. En el Chaco paraguayo la proporción entre hombres y mujeres se aproxima al 50% [105]. En América del Norte, en diciembre de 2009 el 63% de los pacientes eran varones [90]. Todos los grupos étnicos y raciales parecen ser susceptibles a infecciones por el hantavirus, y las diferencias entre ciertos grupos (como indígenas y no indígenas) están más probablemente correlacionadas con el tipo de hábitat en el que reside la población (por ejemplo, zonas rurales frente a zonas urbanas). De hecho, las comunidades rurales representan la mayor incidencia global del hantavirus y, por lo tanto, están en mayor riesgo [92, [105] [106] [107] [108] [109] [109] [119], aunque también se ha destacado la importancia de los entornos peridomésticos como una importante zona de exposición [112, 113]. El principal mecanismo por el que los seres humanos adquieren la infección por el hantavirus es la exposición a aerosoles de heces contaminadas de roedores, orina y saliva [114, 115]. Esto puede ocurrir cuando los seres humanos residen en áreas cercanas a las que habitan los roedores, viven en áreas infestadas de roedores, o cuando los roedores invaden entornos humanos, que son más frecuentes en hábitats rurales.Existe una larga historia de coexistencia humana con roedores, lo que plantea dudas sobre el aparente aumento reciente de las enfermedades relacionadas con el hantavirus, especialmente el HCPS. Aparte de una aparente asociación con eventos de oscilación sureña de El Niño (ENSO) en algunas regiones [116, 117], los recientes incrementos en la incidencia del HCPS no parecen seguir un patrón temporal o espacial fácilmente definido. Sin embargo, algunas características del paisaje, como la fragmentación del hábitat o las áreas perturbadas por el ser humano, pueden influir en la dinámica de la población de roedores e impactar en la incidencia viral [118] [112] [112] [121]. A pesar de la estocástica asociada a la contracción de la infección Las actividades humanas en edificios mal ventilados que pulverizan partículas que luego se inhalan (es decir, limpieza, agitación de alfombras, polvo) se identifican con frecuencia entre los pacientes admitidos para el SHCPS [11, 122]. Se cree que las actividades al aire libre transmiten un menor riesgo debido a la labilidad de los hantavirus a la radiación UV y a la supuesta tendencia a dispersarse en el viento, aunque ciertas condiciones ambientales parecen mantener el virus durante períodos más largos fuera de su huésped natural, lo que permite la transmisión indirecta [123]. Una vía alternativa pero poco común de transmisión del virus es la mordedura de roedores [124] [125] [126]. Los trabajadores sobre el terreno que manipulan mamíferos corren un riesgo potencialmente mayor de exposición a infecciones por hantavirus, aunque cuando se cuantifica a través de serosurveys el riesgo absoluto parece bastante leve [127]. Un nuevo estudio en Colorado sugiere la posibilidad de que una picadura de roedor haya sido el vehículo próximo para la transmisión al aire libre de NVS [128], lo que vuelve a enfatizar el uso de equipo de protección personal durante las actividades de trabajo de campo [129]. Como caso particular dentro de los hantavirus, la transmisión de persona a persona ha sido documentada exclusivamente para el virus de los Andes sudamericanos [130] [133] [133] [135]. La identificación de esta vía de transmisión se ha hecho utilizando tanto herramientas moleculares como encuestas epidemiológicas, pero el mecanismo de transmisión interpersonal no está bien establecido. Curiosamente, ANDV también puede ser derramado por los humanos a través de otros fluidos biológicos como la orina [136], ilustrando las propiedades particulares que diferencian este virus de otros hantavirus. Aunque la transmisión interpersonal parece ser única para ANDV, el ARN viral de PUUV se ha detectado en la saliva de pacientes con HFRS, y algunos pacientes con SNV-HCPS tienen ARN viral en las secreciones traqueales [88, 137]. Los Hantavirus en las Américas son alojados naturalmente por roedores (Muridae y Cricetidae) así como las musarañas (Soricidae) y los lunares (Talpidae) (Figura 1). Tres especies de musgo y un mole han sido reportados para albergar hantavirus y su patogenicidad para los humanos permanece desconocida [22, 138, 139]. Se han identificado al menos 15 especies de roedores como portadores de diferentes hantavirus patógenos, con algunos genotipos sudamericanos como Castelo do Sonhos (CDSV) o Hu39694 sólo identificados después de infecciones humanas (Figura 1 ). Los hantavirus suelen mostrar una alta especificidad de especie y ningún huésped intermedio [140]. Sin embargo, se han descrito algunos genotipos de hantavirus en la misma especie de roedores. Tal es el caso de Playa de Oro (OROV) y Catacamas (CATV) identificados en Oryzomys couesi [141, 142], o Maporal (MAPV) y Choclo (CHOV) hospedados por O. fulvescens [91, 143]. En América del Norte se han detectado virus de muleshoe y Black Creek Canal hanta en sigmodon hispidus [ Además, un genotipo de hantavirus (por ejemplo, el virus similar a Juquitiba) puede ser transportado por más de una especie de roedores (O. nigripes, Oxymycterus judex, Akodon montesis). Otro ejemplo es el virus Laguna Negra (LANV) que después de ser identificado en Calomys laucha [146] también ha sido reportado en C. callosus [147]. El rápido aumento en el descubrimiento de nuevos hantavirus y la identificación de sus anfitriones no parece probable que termine tan pronto como se examinen nuevas especies pequeñas de mamíferos [95]. Este tema se complica por la continua controversia en los criterios para la clasificación de distintos hantavirus [148, 149], que también está vinculado a la clasificación taxonómica y los reordenamientos taxonómicos. La transmisión de especies cruzadas es un proceso importante durante la propagación, aparición y evolución Particularmente dentro de los hantavirus, los derrames a los huéspedes secundarios se identifican cada vez más a medida que se realizan estudios más extensos [151] [152] [153] [155] [156]. Por ejemplo, ANDV es el agente etiológico predominante del HCPS en América del Sur, y O. longicaudatus el principal reservorio de roedores. Derrama en al menos otras cuatro especies de roedores que coocurren con el reservorio se han identificado, con Abrothrix longipilis mostrando la segunda mayor prevalencia de anticuerpos de ANDV, y actualmente no hay duda de que el virus es extremadamente similar genéticamente entre los dos roedores del huésped [157, 158]. En América del Norte, el derrame del virus Bayou (BAYV) puede haber ocurrido desde el reservorio principal de O. palustris a S. hispidus, R. fulvescens, P. leucopus y B. taylori [159] [160] [161]. Es más probable que el derrame del virus Hanta se produzca con poblaciones de acogida que habitan regiones simpatricas o sintópicas [151, 162], y la transmisión de especies cruzadas tendría probablemente mayores posibilidades de éxito si las especies anfitrionas están estrechamente relacionadas [163]. Se encuentra una excepción interesante entre el virus Oxbow (OXBV) y el virus Asama (ASAV) en el que un proceso de cambio de huésped parecía haber ocurrido entre mamíferos pertenecientes a dos familias (Talpidae y Soricidae), probablemente como resultado de la codivergencia alterna y recurrente de ciertos tax Los hantavirus son transmitidos horizontalmente entre roedores y no son transmitidos por artrópodos (a diferencia de otros virus de la familia Bunyaviridae). La infección por derrapadores a mamíferos no humanos generalmente no produce ninguna transmisión hacia adelante (o a fin de morir), pero si los seres humanos están infectados pueden resultar en una alta morbilidad y mortalidad [122, 164]. Durante la primavera de 1993, un brote de pacientes con HCPS debido a SNV ocurrió en los estados de Four Corners, resultando en más del 60% de casos de mortalidad entre los casos iniciales, muchos de los cuales involucran a miembros de la tribu Navajo [12, 121]. En Panamá, se notificó un brote durante 1999-2000 en Los Santos, y 12 casos donde se identificaron con tres muertes [165, 166]. Esto representó el primer informe de infecciones por hantavirus humanos en América Central. En América del Sur, Diecisiete individuos fueron identificados con anticuerpo NVS (ELISA) o fueron antígenos (HCI) positivos de 52 casos sospechosos [167]. En 1996 ocurrieron brotes mayores debidos a ANDV en el sur de Argentina [131, 134] ; en el sur de Chile se presentaron grupos de pacientes con enfermedad por hantavirus en 1997 [158]. En Brasil, el primer brote fue identificado en la Amazonía Brasileña (Estado de Maranhão) en el año 2000, e involucró pequeños pueblos que resultaron en una prevalencia del 13,3% de los evaluados (398 residentes totales) [168]. Los factores que desencadenan los brotes de hantavirus todavía son mal entendidos, probablemente porque resultan de varias características bióticas y abióticas interactuantes cuyos parámetros clave son difíciles de modelar. Sin embargo, el uso de nuevos enfoques de modelado que involucran características geográficas y ambientales parece ser prometedor a la hora de predecir posibles brotes de hantavirus y/o áreas de mayor riesgo [169] [170] [171] [172]. Debido a que se sabe que los hantavirus se transmiten directamente de los huéspedes infectados a los susceptibles, el primer enfoque natural es relacionar los brotes con la ecología de los huéspedes virales. La transmisión y persistencia del hantavirus en las poblaciones de roedores depende de varios factores que interactúan para afectar la dinámica ecológica del huésped, que a su vez está fuertemente influenciada por las características de comportamiento de las especies de roedores individuales, a la estructura paisajística y a las características ambientales [173, 174]. La transmisión viral depende de las tasas de contacto entre los huéspedes sensibles, y a pesar de la noción prevaleciente de que un aumento de la densidad se encuentra y, por lo tanto, de Además, se ha demostrado que la transmisión de NVS sigue un patrón de heterogeneidad de contacto, donde los individuos de la población tienen diferentes probabilidades de transmitir la infección [176]. La comprensión de la transmisión viral resulta ser mucho más compleja cuando especies distintas del principal huésped del reservorio se incorporan en el modelo. De hecho, estudios recientes han demostrado que la mayor diversidad de especies hospedantes está correlacionada con una menor prevalencia de infección en América del Norte para P. maniculatus [177], en América Central para O. fulvescens (reservorio del virus Choclo) y Zygodontomys brevicauda (reservorio del virus Calabazo) [178], y en América del Sur para Akodon montensis (reservorio del virus Jabora) [162]. Las tasas de contacto varían según la distribución espacial de las poblaciones y parecen estar Por ejemplo, la prevalencia de SNV en P. maniculatus fue mayor en paisajes con mayor grado de fragmentación del hábitat preferido [179]. Además, ciertas propiedades del paisaje como elevación, pendiente y cubierta terrestre parecen ser útiles para detectar áreas con infecciones persistentes de SNV, y por lo tanto se consideran áreas refugiales donde el virus puede mantenerse durante años [169]. Los cambios en el entorno natural de las especies de reservorios, como la fragmentación forestal y la pérdida de hábitat, pueden alterar la abundancia y distribución de la población y provocar brotes de hantavirus, como se observa en la Península de Azurero de Panamá [118, 119]. Además, las diferencias en el microhábitat, incluida la cubierta superficial, pueden conducir a diferencias en la dinámica ecológica dentro de las poblaciones y afectar a la tasa de exposición al virus [180]. Se han encontrado diferencias en las infecciones por hantavirus a través de paisajes contrastantes en el intervalo latitudinal en poblaciones de roedores de O. longicaudatus en Chile, lo que sugiere que los seres humanos están expuestos de manera diferencial al virus [107, 181]. La dinámica poblacional de roedores se ve afectada por cambios estacionales de clima y clima [182, 183]. En el caso de los brotes asociados a ENSO, se ha postulado una compleja cascada de eventos desencadenados por lluvias altamente inusuales en el año precedente para dar lugar a un aumento de la producción primaria y densidades de roedores, aumentando también la probabilidad de transmisión del virus a los seres humanos, pero ha resultado difícil demostrar con precisión los eventos intermedios sugeridos, como el aumento de las densidades de roedores en el aumento de la carga de casos [116, 121, 184]. En América del Sur, los efectos del cambio climático y los brotes de hantavirus no han sido bien estudiados, a pesar del conocimiento de que varias especies de roedores que son reservorios de enfermedades emergentes se han visto dramáticamente afectadas por eventos como El Niño [185]. Los cambios en la dinámica de la población de acogida también se ven afectados por la estacionalidad, lo que puede conducir a brotes de enfermedades cuando se interrumpen los procesos que equilibran las poblaciones de roedores de temporada en temporada [186]. La emergencia viral puede seguir promoviéndose a medida que los cambios introducidos por el ser humano continúan aumentando en el medio ambiente a diferentes escalas geográficas. Estos cambios también pueden alterar la estructura y dinámica de la población de roedores e interacciones interespecies creando condiciones que pueden conducir a brotes virales, establecimiento viral en nuevos hospederos, y la aparición de HCPS [102, 162], incluso con aparentemente leve perturbación ecológica al sistema virus-hospedero [188]. Ciertas características fisiopatológicas, incluyendo trombocitopenia y shock, de enfermedades por hantavirus de los seres humanos, tienen similitud sustancial con las fiebres hemorrágicas inducidas por otros virus tales arenavirus, filovirus y flavivirus, a pesar de compartir esencialmente ninguna secuencia similitud con ellos. Tales observaciones plantean preguntas acerca de si tales similitudes en la patogénesis son probables similitudes de fenotipo, o en cambio reportan la presencia de mecanismos moleculares comunes entre los virus. En esta revisión se discuten las propiedades generales, descubrimientos y epidemiología/ecología de las formas de hantavirus patógenos del Nuevo Mundo, y también se busca identificar algunas de las características de las macromoléculas virales y mecanismos inmunológicos que se han propuesto como potenciales mediadores directos de los eventos patógenos que caracterizan la enfermedad humana HCPS. Si bien es poco probable que la expresión de una proteína viral particular o ARNs en aislamiento se pueda confiar en replicar fenotipos clave de infección por el virus completo, algunos de los hallazgos han sido suficientemente consistentes con lo que se conoce de la patogénesis in vivo que ofrecen plomos plausibles de primer paso en la búsqueda de objetivos terapéuticos. Esperamos con interés las revelaciones mecanísticas que seguirán el uso inevitablemente ampliado de métodos poderosos como la secuenciación profunda, imágenes cada vez más avanzadas, y métodos microscópicos, y modelos animales que por fin se pueden decir

¿Cuál es el destino final para N, para su montaje en partículas virales?

Los hantavirus en las Américas y su papel como patógenos emergenteshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3185593/SHA: efe13a8d42b60ef9f7387ea539a1b2eeb5f80101Autores: Hjelle, Brian; Torres-Pérez, FernandoFecha: 2010-11-25DOI: 10.3390/v2125559Licencia: cc-byAbstract: La continua aparición y reaparición de patógenos representan una amenaza continua, a veces mayor, para las poblaciones. Los hantavirus (familia Bunyaviridae) y sus enfermedades humanas asociadas se consideraron confinados a Eurasia, pero la aparición de un brote en el suroeste de Estados Unidos llevó a un gran aumento en su estudio entre los virólogos de todo el mundo. Se han descrito más de 40 genotipos hantavirales, la gran mayoría desde 1993, y casi la mitad de ellos patógenos para los seres humanos. Los hantavirus causan infecciones persistentes en sus reservorios, y en las Américas, la enfermedad humana se manifiesta como compromiso cardiopulmonar, síndrome cardiopulmonar del hantavirus (HCPS), con proporciones de casos-fatalidad, para los serotipos virales más comunes, entre el 30% y el 40%. Alteración del hábitat y trastornos ecológicos a mayor escala, tal vez incluyendo el cambio climático, son algunos de los factores que pueden haber aumentado la carga de casos humanos de HCPS entre 1993 y el presente. Consideramos aquí las características que influyen en la estructura de la dinámica de la población huésped que pueden conducir a brotes virales, así como los determinantes macromoleculares de los hantavirus que han sido considerados como potenciales contribuciones a la patogenicidad. Texto: Los patógenos emergentes causan enfermedades nuevas o no reconocidas anteriormente, y entre ellas, las zoonóticas emergentes son una preocupación importante entre los científicos que estudian enfermedades infecciosas a diferentes escalas espaciales y temporales [1, 2]. Los cambios en las condiciones bióticas y abióticas pueden alterar la dinámica de las enfermedades de la población y conducir a la aparición de infecciones zoonóticas [3] [5] [6]. Durante las últimas décadas, se han producido varios brotes de patógenos virales emergentes y reemergentes, que afectan tanto a la implicación puramente local como a nivel mundial/pandémica de las poblaciones humanas. Entre los ejemplos visibles están la gripe A, el virus del Ébola, el virus de la hepatitis C, el trastorno respiratorio grave para adultos (SARS), el coronavirus y el virus de la inmunodeficiencia humana, que desafían las medidas de prevención y control de los sistemas de salud pública [7]. En las Américas, el reciente brote de gripe pandémica A subtipo H1N1 se convirtió en un objetivo importante de control debido a su rápida propagación, y las incertidumbres en cuanto a virulencia y transmisibilidad, sin embargo, la disponibilidad de vacunas fue limitada cuando se produjo una actividad significativa antes de la temporada tradicional de gripe [8]. Sin embargo, en el último siglo han surgido o resurgido brotes de varias enfermedades virales relacionadas con los virus arenavirus y el dengue, y más recientemente, hantavirus y la expansión del rango geográfico del virus del Nilo Occidental. Entre las enfermedades zoonóticas, los mamíferos pequeños son anfitriones de varios virus ARN patógenos, especialmente Arenaviridae y Bunyaviridae: Hantavirus [9] [10] [11]. Las infecciones por hantavirus se convirtieron en una preocupación en las Américas después de la descripción de un brote de distrés respiratorio agudo ocurrido en la zona La enfermedad recientemente reconocida, el síndrome cardiopulmonar del hantavirus, el HCPS (o síndrome pulmonar del hantavirus), se relacionó con la infección por el virus del Sin Nombre (SNV) recién descubierto, y el roedor Peromyscus maniculatus (ratón venado) fue identificado como el reservorio [13]. Sin embargo, las infecciones por hantavirus tienen una historia mucho más larga. Una revisión de los escritos chinos antiguos, que datan de aproximadamente 960 dC, reveló descripciones muy parecidas a la fiebre hemorrágica con síndrome renal (HFRS), el síndrome causado por los hantavirus del Viejo Mundo [14]. Durante el siglo XX, los casos de enfermedad febril aguda con compromiso renal fueron descritos de varios países eurasiáticos y Japón, a menudo en asociación con compromisos militares [15]. El HFRS como síndrome distinto, sin embargo, fue llamado por primera vez a la atención de la medicina occidental en asociación con un brote que ocurrió entre las tropas de las Naciones Unidas durante el conflicto coreano entre 1951 y 1954, donde más de 3.200 soldados fueron afectados [16]. Tomó más de dos décadas hasta que el agente etiológico, el virus Hantaan (HTNV), fue aislado del ratón de campo rayado Apodemus agrarius, detectado en parte por la unión de anticuerpos de muestras de suero de paciente a los tejidos pulmonares de ratones de campo sanos y salvajes [17, 18]. El virus se encontró más tarde para representar la especie tipo de un nuevo género Hantavirus de la familia Bunyaviridae, aunque fue más tarde evidente que el primer hantavirus a aislarse fue el virus Thottapalayam de shrew-borne [19]. La categorización de los hantavirus como pertenecientes a la familia Bunyaviridae se debe en parte a la presencia consistente de tres genomas de ARN que son circularizados in vivo como resultado de la presencia de nucleótidos terminales complementarios que ayudan a doblar el genoma en una morfología -hairpin-, descrita por primera vez para el flebovirus Uukuniemi [19, 20]. La Tabla 1 es una lista de los hantavirus patógenos predominantemente distintos serológicamente. Se describen muchos otros genotipos llamados, pero tales otras formas patogénicas están generalmente estrechamente relacionadas con los Andes o, en algunos casos, el virus Sin Nombre. Durante la maduración del virus, el precursor forma GPC se procesa utilizando una proteasa unida a la membrana en Gn y Gc, una escisión que ocurre, y parece ser señalada, después de la señal péptida conservada WAASA en la C-terminal de Gn [24]. Aunque las dos proteínas se pueden expresar de forma independiente a través de la transfección, pueden ser retenidas en el compartimento celular incorrecto (ER o aggrosome); por lo tanto, deben ser co-expresadas para permitirles estabilidad para que las dos se puedan ensamblar correctamente en el Golgi [25, [27] [28]. Se han identificado varias actividades y propiedades para las glicoproteínas envolventes del hantavirus, incluyendo algunas características que se sospecha que están involucradas en la patogenicidad de los serotipos causantes de la enfermedad, una posibilidad que ha generado atención experimental. Las glucoproteínas son los ligandos conocidos o presuntos para al menos dos receptores celulares distintos, la cadena de integrina y el factor acelerador de la descomposición, o DAF [30, 31] ; con gC1qR/p32 también identificado como otro receptor de entrada potencial [32]. Comparaciones con la proteína E del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, llevaron a Tischler et al. a considerar la glicoproteína Gc como una proteína potencial de fusión de clase II, tal vez impartiendo actividad de fusión al virión, y esta hipótesis ha ganado apoyo en otros estudios [33, 34]. Se han identificado actividades adicionales con, o se afirma que están relacionadas con, Gn. Para muchos de estos estudios, una premisa subyacente ha sostenido que hay diferencias entre las glicoproteínas de hantavirus -patógenos en relación con virus en el género que se denominan Si bien es cierto que aún no ha sido posible vincular el virus de Prospect Hill (PHV) con la enfermedad humana, la ausencia de evidencia de su patogenicidad tal vez no debería equipararse con la evidencia de su ausencia. Sólo se podría considerar que el nivel de enfermedad (por ejemplo, letargo, fiebre, proteinuria y azotemia) asociado con la infección de primates no humanos por PHV no es significativamente diferente del registrado para los modelos de primates no humanos utilizando el virus conocido del patógeno Puumala (PUUV) [35, 36]. Para el propósito de esta discusión, presumiremos que los hantavirus apatogénicos son efectivamente apatogénicos. Mientras que algunos estudios han sugerido que las glicoproteínas Gn se dirigen más rápidamente a la vía ubiquitina-proteosoma que a las formas apatogénicas, otros han interpretado las diferencias en el manejo de las glicoproteínas Gn a través de especies de hantavirus por el sistema ubiquitina-proteosomal como independientes de la patogenicidad [37] [38] [39]. Algunos investigadores han dirigido sus esfuerzos hacia la identificación de una capacidad diferencial, ya sea cinética o de magnitud absoluta, en la capacidad de los hantavirus patógenos y apatogénicos para provocar una respuesta de interferón en las células. Una premisa que surge es que las formas apatogénicas tenderían a inducir una respuesta innata anterior que haría más probable que el virus se limpiara rápidamente o se volviera menos competente en su replicación, a fin de evitar cualquier respuesta patológica en el huésped [42] La respuesta innata anti-hantavirus puede en algunos casos ser atribuida a la interacción viral como ligando de TLR-3, pero no en otros, y en las células endoteliales, no parece requerir más que la partícula viral misma, incluso cuando se introduce en forma replicativa incompetente [43, 44]. Las proteínas y los ARNm inducidos prominentemente por los hantavirus incluyen MxA e IFIT-1 (ISG-56) y otros incluyendo algunos con actividad antiviral conocida o sospechada. Esos hantavirus, a menudo cepas altamente patógenas, que no inducen una respuesta antiviral potente, se sospechan o se presume que tienen un (más) potente mecanismo de antagonismo interferón-vía en relación con otros virus, un mecanismo que actúa positivamente para prevenir que se forme una respuesta innata efectiva, al menos temprano en la infección [4 Sin embargo, se reportan algunos casos en los que los hantavirus altamente patógenos, tales como NVS, también son capaces de inducir la expresión de los ARNm del gen estimulado por interferón, incluso muy temprano en la infección, con proteínas ISG, como se esperaba, tardando más tiempo en aparecer en la célula [44]. Las actividades anti-interferón también se han atribuido a la proteína NSs que se puede elaborar en células infectadas por serotipos que codifican esta proteína [46]. Otros investigadores han examinado las actividades de las glucoproteínas del hantavirus y otras proteínas que podrían afectar directamente a algunos aspectos de la progresión patogénica asociada a la infección por hantavirus en humanos, tales como cambios de permeabilidad vascular. Mientras que los primeros intentos de causar directamente aumentos en la permeabilidad de las monocapas endoteliales con partículas virales o infección viral fueron en gran medida decepcionantes, los hantavirus se han identificado como que afectan adversamente la migración endotelial sobre los sustratos y en la potenciación de la permeabilidad endotelial inducida por VEG-F [47, 48]. La proteína nucleocápsida o N más corta (+50 kD) es un componente estructural del nucleocápsido viral, junto con los segmentos de ARN viral genómico. Como proteína de unión al ARN que afecta a la horquilla del cabello de los segmentos genómicos con alta afinidad [49, 50], limita el acceso del ARN para alojar nucleasasas y ayuda a hacer que la replicación viral sea un proceso cerrado dentro del citoplasma. También actúa como una proteína de membrana periférica, al igual que la proteína L [51], una actividad que podría jugar un papel en su supuesta, pero aún no demostrada función como matriz [52]. Hasta hace poco, no se había apreciado que N tuviera una amplia variedad de otras actividades, algunas de las cuales pueden estar vinculadas, no sólo a los requisitos fundamentales de replicación, sino también a la interferencia con una serie de procesos intracelulares de la célula normal. Así, se ha propuesto una interacción entre el aminoterminal de la proteína N del hantavirus y la proteína celular Daxx, con la sugerencia de posibles consecuencias pro-apoptóticas [51]. N también se reporta que interactúa con microfilamentos actínicos, y la proteína SUMO-1 [53, 54]. Utilizando ensayos basados en el gen reportero, Connie Schmaljohn y sus colegas han informado que la proteína nucleocapsid del virus Hantaan tiene un papel inhibidor en las respuestas inflamatorias mediadas por NF kappa B (NF- â € € TM B). Los efectos sobre la expresión NF- € B parecen estar limitados a la prevención de su translocación nuclear después de su intento de activación con lipopolisacárido, LPS [55]. En el citoplasma de las células infectadas, la proteína N se puede encontrar en los cuerpos celulares P donde secuestra y protege los capuchones de 5'. Puede localizar los capuchones a través de su interacción con DCP1, un componente clave de los cuerpos P. Durante la infección por hantavirus, los ARN virales se concentran en los cuerpos P, a través de su interacción con N y DCP1. La proteína N demuestra la protección preferencial de los ARNm diseñados para terminar prematuramente su proteína codificada en comparación con los ARNm nativos [56]. La proteína N se ha vinculado cada vez más a la replicación y traducción virales, a veces de maneras no previstas anteriormente. Se encuentra entre una familia creciente de diversas proteínas virales que pueden servir como un inespecífico - ARN chaperone ®, una actividad que debe facilitar el acceso de la L polimerasa al ARNv para la transcripción y replicación, en que puede disociar transitoriamente estructuras de ARN mal dobladas [57]. Algunos de los efectos de la proteína N en la traducción no pueden ser inmediatamente reconocidos como adaptables en la naturaleza. Puede reemplazar todo el complejo de iniciación traslacional EIF4F, presentando simultáneamente el ribosoma con un reemplazo de la actividad de unión de la tapa de eIF 4E, uniéndose al complejo de pre-iniciación 43S, al igual que eIF 4G, al tiempo que reemplaza la actividad helicoidal de eIF 4A, que se presume que es necesaria para disociar la estructura de ARN de orden superior [56, 58]. Estos tres factores normalmente trabajan juntos para lograr la iniciación traslacional. En los cuerpos P, la capacidad de la proteína N de unirse a una alta afinidad a los oligoribonucleótidos celulares nativos tapados, junto con su actividad en la protección de ARNs tapados de la degradación, probablemente facilita el acceso de oligonucleótidos encapsulados para su uso en la iniciación transcripcional por L polimerasa (-cap ra Tráfico de N para el ensamblaje viral: Clásicamente, la proteína N en las células infectadas parece estar agrupada o partículas en la naturaleza, con una concentración pesada en una única ubicación perinuclear, ampliamente considerada como la Golgi [27]. Las proteínas N de los hantavirus se encuentran en asociación con fracciones de partículas, y los estudios confocales microscopía y bioquímico-inhibidores han demostrado que las trazas N a lo largo de microtúbulos pero no con filamentos de actina [52]. El destino final de N, para su ensamblaje en partículas virales es la Golgi, y que circula allí a través del complejo intermedio retículo-Golgi endoplasmático (ERGIC), también conocido como cúmulo vesicular-tubular [52]. Un inhibidor negativo dominante, la dinamitina, asociado con el transporte mediado por Los estudios posteriores sugieren que la dependencia específica del transporte microtubular es específica de los hantavirus del Viejo Mundo como el NVH, pero que el Hantavirus del Nuevo Mundo ANDV está asociado con filamentos de actina [59]. Sin embargo, los datos recientes indican que el transporte microtubular es efectivamente utilizado para el NVH del Nuevo Mundo [60]. Las enfermedades del Hantavirus del hombre desde hace mucho tiempo han sido sospechosas de tener una base inmunopatógena en parte debido a su período de incubación relativamente largo de 2-3 semanas y la asociación temporal observada entre los trastornos inmunológicos y la primera aparición de signos y síntomas de la enfermedad del hantavirus. HFRS y HCPS comparten muchas características clínicas, llevando a muchos investigadores a considerar que son, en esencia, diferentes manifestaciones de un proceso patógeno similar, que difieren principalmente en los órganos objetivo primarios de expresión de la enfermedad (Tabla La patogénesis de las infecciones por hantavirus es el tema de una revisión continuamente actualizada en la serie UpToDate [61]. Para el momento en que aparecen los síntomas en el HCPS, ambas respuestas antivirales fuertes, y, para los genotipos virales más virulentos, el ARN viral puede ser detectado en plasma sanguíneo o células sanguíneas nucleadas respectivamente [63, 64]. Al menos tres estudios han correlacionado el ARN viral plasmático con la gravedad de la enfermedad para el HCPS y el HFRS, sugiriendo que la replicación del virus juega un papel continuo y en tiempo real en la patogénesis viral [65] [66] [67]. Se han identificado varios cambios patológicos distintivos que ocurren tanto en el HFRS como en el HCPS. Una característica crítica de ambos es una fuga capilar transitoria (~ 1-5 días) que involucra el La fuga resultante es de carácter exudativo, con una composición química alta en proteínas y similar al plasma. La experiencia continua que indica el fuerte tropismo tisular para las células endoteliales, específicamente, es uno de los varios factores que hacen de la integra β3 un candidato especialmente atractivo como un importante receptor in vivo para los hantavirus. Es probable que los hantavirus lleguen a sus tejidos objetivo a través de la captación por los ganglios linfáticos regionales, tal vez con o dentro de un histiocito pulmonar escoltante. Las semillas del virus endotelio local, donde las primeras células infectadas dan lugar, en última instancia, a una viremia primaria, un proceso que parece tomar mucho tiempo para las infecciones por hantavirus [62, 63]. En el momento en que emerge la viremia secundaria, los agentes de las formas más severas de HFRS y HCPS han comenzado a alcanzar una masa suficiente para inducir, a través de las interacciones PAMP-PRR y otros medios, la expresión de citoquinas proinflamatorias [64]. Para HCPS, esa expresión favorece el lecho pulmonar y los órganos linfoides, pero, por razones desconocidas, ahorra el retroperitoneo y, en general, el riñón. En HFRS la situación se invierte, y sin embargo no se aprecia a menudo que el esperado tropismos tisulares preferentes de virus asociados a HFRS y sus contrapartes asociadas a HCPS para los lechos renal y pulmonar, respectivamente, no sea como se predeciría a través de las manifestaciones de las dos enfermedades. La elaboración local de mediadores inflamatorios y quimiotácticos se considera un requisito para el desarrollo Sin embargo, no es la hipoxemia, debido al edema pulmonar prominente, lo que conduce a la muerte en la mayoría de los casos fatales de HCPS, sino más bien la intoxicación del corazón por mediadores como aún no definidos, lo que conduce al estado de bajo gasto cardíaco y al síndrome de shock asociado [64, 65]. Es tentador especular que los mediadores producidos en el pulmón en conexión con el infiltrado inflamatorio pueden infiltrarse a través de la circulación coronaria con dilución mínima en HCPS, consecuencia desventajosa de la estrecha yuxtaposición anatómica de los dos órganos. Así, al menos tres clases de mecanismos potenciales, algunos superpuestos y todos ciertamente no exclusivos de los otros, podrían presumirse que subyacen a la patogénesis del HCPS. Estos incluyen:(1) Mecanismos inmunes innatos. La naturaleza de las interacciones entre los patrones moleculares asociados al patógeno del hantavirus (PAMP) y los receptores de reconocimiento del patrón (PRR) de las células endoteliales susceptibles comienzan a ser aclaradas. El HTNV prototípico parece ser reconocido por TLR-3 [43]. Tal infección tiene consecuencias tales como una mayor expresión del HLA-DR en las células dendríticas [66] y la diferenciación de los monocitos hacia las células dendríticas [67]. (2) Efectos virales directos. La correlación observada entre la carga viral y la gravedad de la enfermedad deja abierta la posibilidad de que las partículas del hantavirus o el ARN puedan tener efectos tóxicos sobre las células o sobre la señalización. Algunos investigadores han favorecido la toxicidad viral directa, actuando a través de la inhibición de la función de barrera celular endotelial, como una explicación de gran parte de la fuga capilar, aunque existe Una pista potencialmente importante hacia el mecanismo por el cual las infecciones por hantavirus agotan las plaquetas sanguíneas y, en algunos casos, causan manifestaciones hemorrágicas, fue avanzada por el reciente descubrimiento de que los hantavirus patógenos son capaces de reclutar plaquetas para adherirse a las superficies celulares endoteliales, con β3 integrina utilizada como elemento de unión crítica [69]. (3) Efectos patógenos causados por las actividades de macromoléculas virales específicas. Hemos revisado algunas de las actividades asociadas con los Gn, Gc y N, polipéptidos codificados viralmente en secciones anteriores. Modelos de prueba de patogénesis se pueden hacer más eficazmente cuando hay un modelo animal que imita aspectos clave de la enfermedad. No existe un modelo similar al HFRS, pero existen modelos animales para el transporte asintomático de PUUV y SNV por sus roedores portadores nativos, el banco vole Myodes glareolus y el ratón venado P. maniculatus; así como un modelo hámster sirio utilizando ANDV o el virus Aporal relacionado de Venezuela, para el cual se observa una enfermedad mimética HCPS [70] [71] [72] [73]. El modelo hámster ANDV-Sirio tiene una serie de características en común con la enfermedad humana, así como algunas diferencias. A diferencia de las enfermedades neurológicas que han sido posibles de provocar con HTNV, el modelo hámster para HCPS parece ser causado por fugas capilares que resultan en edema pulmonar y la producción de un derrame pleural con características exudativas. Típicamente los hámsteres mueren entre 11 y 14-d post-inoculación, reflejando un período de incubación ligeramente acelerado en comparación con las infecciones humanas. Al igual que con el HCPS humano, el examen microscópico del pulmón revela abundante deposición de fibrina, septo alveolar engrosado y antígeno viral expresado abundantemente en el endotelio microvascular. Los hámsteres infectados por ANDV equipados con dispositivos de monitoreo fisiológico mostraron disminución de las presiones de pulso, taquicardia e hipotensión que parecen imitar de cerca el shock que se cree que es la causa próxima de la muerte en pacientes que sucumben al HCPS [65, 74]. En comparación con la enfermedad humana, los hámsteres infectados por ANDV exhiben títulos excepcionalmente altos de ANDV vivo en sus tejidos, con gran parte de la replicación viral que se produce Los títulos de ANDV vivo en algunos casos superan los 10 8 /g, mientras que los aislados de hantavirus de los tejidos humanos han sido notoriamente difíciles de obtener. A pesar de la aparición universal de enzimas hepáticas levemente elevadas en pacientes con HCPS, las enzimas hepáticas no parecen estar presentes en niveles elevados en la sangre de hámsters enfermos incluso inmediatamente antes de la muerte [75]. El período prolongado de incubación asociado con la enfermedad por hantavirus da al huésped un tiempo considerable para montar una respuesta inmune madura contra el virus. Así, en contradición a infecciones de gravedad comparable y sintomatología relacionada asociada con arenavirus y filovirus, las infecciones por hantavirus en humanos se asocian con respuestas anticuerpos de título significativo por el momento en que comienzan los síntomas. A pesar de esta observación, parece ser posible que la variación natural en las respuestas individuales de anticuerpos neutralizantes entre los pacientes con infecciones por NVS pueda estar relacionada con la gravedad de la enfermedad, lo que sugiere que la administración de anticuerpos antivirales podría resultar efectiva terapéuticamente [76]. En el caso de la infección por ANDV, han surgido nuevas evidencias que indican que el aparente aclaramiento del virus de la sangre no resulta en la eliminación completa del estímulo antigénico por el virus, sugiriendo que el virus puede persistir, tal vez en algún sitio inmunológicamente privilegiado aún indeterminado [77]. Un papel para las respuestas patológicas mediadas por células T en el HFRS y el HCPS ha sido la fuente de especulación por una variedad de razones. La gravedad del SNS asociado al SNCP puede haber hecho más evidente que el inicio del edema pulmonar, la taquicardia y la hipertensión parecía estar todo, pero universalmente asociado temporalmente, con la aparición de un espectro de células altamente activadas del linaje linfoide en la sangre periférica. Se detectaron células con similitudes morfológicas cercanas a estos -inmunoblastos- en los pulmones congestionados y pesados de los pacientes que llegaron a la autopsia, así como en órganos linfoides y en las tríadas portal [63, [78] [79] [80]. Estas observaciones llevaron a especular que algún componente de la patogénesis por hantavirus podría estar vinculado a la aparición de células T antivirales que podrían estimular o contribuir a la aparición de una -tormenta de mediadores y el fenotipo de fuga capilar asociado. Estudios posteriores han confirmado la expectativa de que una fracción significativa de la población de inmunoblastos en pacientes con HCPS son células T con especificidad para epitopes específicos de antígenos virales de clase I presentados por el HLA, incluyendo Gn, Gc y N [77, [81] [82] [83]. Presumiblemente, las actividades antivirales de estas células, manifestadas en parte por su elaboración de mediadores en el intersticio afectado, pueden contribuir a la fuga endotelial/capilar que se encuentra en el corazón de la patogénesis del hantavirus. Debido a que los primeros casos de HCPS a menudo llegaron a la autopsia, se hizo posible examinar tejidos necropsiados para la expresión de citocinas. El estudio de Mori et al. (1999) revelaron una alta expresión relativa de citocinas proinflamatorias incluyendo TNF-, IL-1-, IL-6, proporcionando evidencia a favor de un modelo de tormenta de citoquinas para la patogénesis [64]. Los autores creían, basándose en la morfología de las células secretadoras de citoquinas, que tanto monocitos como linfocitos estaban contribuyendo a la producción de citocinas. Que los mediadores proinflamatorios se encuentran en niveles elevados en el plasma, así como el intersticio renal de pacientes con enfermedad hantaviral aguda se ha reconocido desde hace algún tiempo también [84, 85]. Si bien el diagnóstico de HCPS y HFRS se realiza mejor con serología IgM, en la etapa aguda de la infección por NVS, también se puede utilizar RT-PCR si se utilizan células sanguíneas o coágulos de sangre en lugar de plasma o suero, donde la sensibilidad incluso utilizando imprimaciones PCR anidadas disminuye a cerca del 70% [86] [87] [88]. En una instalación en la que se tratan muchos casos de HCPS, el centro médico de la Universidad de Nuevo México en Albuquerque, se ha ofrecido un servicio de diagnóstico en el que se analizan los hallazgos hematológicos del paciente para establecer la probabilidad de que un paciente tenga HCPS. La combinación de trombocitopenia, abundancia elevada de linfocitos -inmunoblasto-, población de células polimorfonucleares con desplazamiento izquierdo sin evidencia morfológica fuerte para su activación, y valores elevados de hemoglobina o hematocrito es altamente específica para el HCPS y permite a los clínicos la capacidad de poner pacientes presuntivos-HCPS en oxigenación de membrana extracorpórea (ECMO), que se cree que ha salvado a muchos pacientes de un resultado letal [89]. Se cree que la infección humana por hantavirus sigue el contacto con secreciones o excreciones producidas por roedores infectados. En los Estados Unidos, 538 infecciones humanas por hantavirus fueron reportadas hasta finales de diciembre de 2009 [90], con Nuevo México, Arizona y Colorado mostrando los casos más altos. Mientras que el prototípico hantavirus centroamericano en América Central fue el virus Rio Segundo de Reithrodontomys mexicanus de Costa Rica, la primera enfermedad humana apareció algunos años más tarde en Panamá, donde el virus Choclo (CHOV) surgió como el agente etiológico y se cree que es responsable de todos los casos conocidos de HCPS. La rata de arroz pigmeo fulvo Oligoryzomys fulvescens ha sido identificada como el reservorio de roedores [91]. En Panamá, los primeros casos de HCPS, aunque con poca o ninguna implicación cardiaca evidente, fueron reportados en 1999, y desde entonces, 106 infecciones humanas han ocurrido con una tasa de mortalidad del 26% [92]. Seroencuestas de mamíferos en México y Costa Rica han encontrado anticuerpos antihantavirus [93] [94] [95] [96], y se han notificado seroprevalencias que oscilan entre 0,6 y 1,6% en poblaciones humanas a pesar de la ausencia de casos conocidos de HCPS [97]. En América del Sur, los casos de HCPS se han identificado en Argentina, Bolivia, Brasil, Chile, Paraguay y Uruguay, y también se han notificado evidencias de exposición humana a hantavirus en Venezuela [98] y Perú [99]. En América del Sur, ANDV es el principal agente etiológico con casos en Chile y Argentina notificados desde 1995. En Chile, se han producido 671 casos de HCPS debido a ANDV durante el período 2001-2009 [100]. Desde 1995 se han reportado más de 1.000 casos de HCPS en Argentina [101] ; en el Brasil se han identificado aproximadamente 1.100 casos de HCPS entre 1993 y 2008 [102]. Las tasas de mortalidad por casos en esos tres países han sido similares, oscilando entre el 30% (Argentina), el 36% (Chile) y el 39% (Brasil). Las infecciones por Hantavirus ocurren con más frecuencia en hombres que en mujeres, aunque la proporción entre hombres y mujeres es muy variable. Por ejemplo, las comunidades panameñas mostraron una proporción de 55 hombres por 45 mujeres [103], mientras que en Chile la proporción es más sesgada por hombres (71%) [104]. En el Chaco paraguayo la proporción entre hombres y mujeres se aproxima al 50% [105]. En América del Norte, en diciembre de 2009 el 63% de los pacientes eran varones [90]. Todos los grupos étnicos y raciales parecen ser susceptibles a infecciones por el hantavirus, y las diferencias entre ciertos grupos (como indígenas y no indígenas) están más probablemente correlacionadas con el tipo de hábitat en el que reside la población (por ejemplo, zonas rurales frente a zonas urbanas). De hecho, las comunidades rurales representan la mayor incidencia global del hantavirus y, por lo tanto, están en mayor riesgo [92, [105] [106] [107] [108] [109] [109] [119], aunque también se ha destacado la importancia de los entornos peridomésticos como una importante zona de exposición [112, 113]. El principal mecanismo por el que los seres humanos adquieren la infección por el hantavirus es la exposición a aerosoles de heces contaminadas de roedores, orina y saliva [114, 115]. Esto puede ocurrir cuando los seres humanos residen en áreas cercanas a las que habitan los roedores, viven en áreas infestadas de roedores, o cuando los roedores invaden entornos humanos, que son más frecuentes en hábitats rurales.Existe una larga historia de coexistencia humana con roedores, lo que plantea dudas sobre el aparente aumento reciente de las enfermedades relacionadas con el hantavirus, especialmente el HCPS. Aparte de una aparente asociación con eventos de oscilación sureña de El Niño (ENSO) en algunas regiones [116, 117], los recientes incrementos en la incidencia del HCPS no parecen seguir un patrón temporal o espacial fácilmente definido. Sin embargo, algunas características del paisaje, como la fragmentación del hábitat o las áreas perturbadas por el ser humano, pueden influir en la dinámica de la población de roedores e impactar en la incidencia viral [118] [112] [112] [121]. A pesar de la estocástica asociada a la contracción de la infección Las actividades humanas en edificios mal ventilados que pulverizan partículas que luego se inhalan (es decir, limpieza, agitación de alfombras, polvo) se identifican con frecuencia entre los pacientes admitidos para el SHCPS [11, 122]. Se cree que las actividades al aire libre transmiten un menor riesgo debido a la labilidad de los hantavirus a la radiación UV y a la supuesta tendencia a dispersarse en el viento, aunque ciertas condiciones ambientales parecen mantener el virus durante períodos más largos fuera de su huésped natural, lo que permite la transmisión indirecta [123]. Una vía alternativa pero poco común de transmisión del virus es la mordedura de roedores [124] [125] [126]. Los trabajadores sobre el terreno que manipulan mamíferos corren un riesgo potencialmente mayor de exposición a infecciones por hantavirus, aunque cuando se cuantifica a través de serosurveys el riesgo absoluto parece bastante leve [127]. Un nuevo estudio en Colorado sugiere la posibilidad de que una picadura de roedor haya sido el vehículo próximo para la transmisión al aire libre de NVS [128], lo que vuelve a enfatizar el uso de equipo de protección personal durante las actividades de trabajo de campo [129]. Como caso particular dentro de los hantavirus, la transmisión de persona a persona ha sido documentada exclusivamente para el virus de los Andes sudamericanos [130] [133] [133] [135]. La identificación de esta vía de transmisión se ha hecho utilizando tanto herramientas moleculares como encuestas epidemiológicas, pero el mecanismo de transmisión interpersonal no está bien establecido. Curiosamente, ANDV también puede ser derramado por los humanos a través de otros fluidos biológicos como la orina [136], ilustrando las propiedades particulares que diferencian este virus de otros hantavirus. Aunque la transmisión interpersonal parece ser única para ANDV, el ARN viral de PUUV se ha detectado en la saliva de pacientes con HFRS, y algunos pacientes con SNV-HCPS tienen ARN viral en las secreciones traqueales [88, 137]. Los Hantavirus en las Américas son alojados naturalmente por roedores (Muridae y Cricetidae) así como las musarañas (Soricidae) y los lunares (Talpidae) (Figura 1). Tres especies de musgo y un mole han sido reportados para albergar hantavirus y su patogenicidad para los humanos permanece desconocida [22, 138, 139]. Se han identificado al menos 15 especies de roedores como portadores de diferentes hantavirus patógenos, con algunos genotipos sudamericanos como Castelo do Sonhos (CDSV) o Hu39694 sólo identificados después de infecciones humanas (Figura 1 ). Los hantavirus suelen mostrar una alta especificidad de especie y ningún huésped intermedio [140]. Sin embargo, se han descrito algunos genotipos de hantavirus en la misma especie de roedores. Tal es el caso de Playa de Oro (OROV) y Catacamas (CATV) identificados en Oryzomys couesi [141, 142], o Maporal (MAPV) y Choclo (CHOV) hospedados por O. fulvescens [91, 143]. En América del Norte se han detectado virus de muleshoe y Black Creek Canal hanta en sigmodon hispidus [ Además, un genotipo de hantavirus (por ejemplo, el virus similar a Juquitiba) puede ser transportado por más de una especie de roedores (O. nigripes, Oxymycterus judex, Akodon montesis). Otro ejemplo es el virus Laguna Negra (LANV) que después de ser identificado en Calomys laucha [146] también ha sido reportado en C. callosus [147]. El rápido aumento en el descubrimiento de nuevos hantavirus y la identificación de sus anfitriones no parece probable que termine tan pronto como se examinen nuevas especies pequeñas de mamíferos [95]. Este tema se complica por la continua controversia en los criterios para la clasificación de distintos hantavirus [148, 149], que también está vinculado a la clasificación taxonómica y los reordenamientos taxonómicos. La transmisión de especies cruzadas es un proceso importante durante la propagación, aparición y evolución Particularmente dentro de los hantavirus, los derrames a los huéspedes secundarios se identifican cada vez más a medida que se realizan estudios más extensos [151] [152] [153] [155] [156]. Por ejemplo, ANDV es el agente etiológico predominante del HCPS en América del Sur, y O. longicaudatus el principal reservorio de roedores. Derrama en al menos otras cuatro especies de roedores que coocurren con el reservorio se han identificado, con Abrothrix longipilis mostrando la segunda mayor prevalencia de anticuerpos de ANDV, y actualmente no hay duda de que el virus es extremadamente similar genéticamente entre los dos roedores del huésped [157, 158]. En América del Norte, el derrame del virus Bayou (BAYV) puede haber ocurrido desde el reservorio principal de O. palustris a S. hispidus, R. fulvescens, P. leucopus y B. taylori [159] [160] [161]. Es más probable que el derrame del virus Hanta se produzca con poblaciones de acogida que habitan regiones simpatricas o sintópicas [151, 162], y la transmisión de especies cruzadas tendría probablemente mayores posibilidades de éxito si las especies anfitrionas están estrechamente relacionadas [163]. Se encuentra una excepción interesante entre el virus Oxbow (OXBV) y el virus Asama (ASAV) en el que un proceso de cambio de huésped parecía haber ocurrido entre mamíferos pertenecientes a dos familias (Talpidae y Soricidae), probablemente como resultado de la codivergencia alterna y recurrente de ciertos tax Los hantavirus son transmitidos horizontalmente entre roedores y no son transmitidos por artrópodos (a diferencia de otros virus de la familia Bunyaviridae). La infección por derrapadores a mamíferos no humanos generalmente no produce ninguna transmisión hacia adelante (o a fin de morir), pero si los seres humanos están infectados pueden resultar en una alta morbilidad y mortalidad [122, 164]. Durante la primavera de 1993, un brote de pacientes con HCPS debido a SNV ocurrió en los estados de Four Corners, resultando en más del 60% de casos de mortalidad entre los casos iniciales, muchos de los cuales involucran a miembros de la tribu Navajo [12, 121]. En Panamá, se notificó un brote durante 1999-2000 en Los Santos, y 12 casos donde se identificaron con tres muertes [165, 166]. Esto representó el primer informe de infecciones por hantavirus humanos en América Central. En América del Sur, Diecisiete individuos fueron identificados con anticuerpo NVS (ELISA) o fueron antígenos (HCI) positivos de 52 casos sospechosos [167]. En 1996 ocurrieron brotes mayores debidos a ANDV en el sur de Argentina [131, 134] ; en el sur de Chile se presentaron grupos de pacientes con enfermedad por hantavirus en 1997 [158]. En Brasil, el primer brote fue identificado en la Amazonía Brasileña (Estado de Maranhão) en el año 2000, e involucró pequeños pueblos que resultaron en una prevalencia del 13,3% de los evaluados (398 residentes totales) [168]. Los factores que desencadenan los brotes de hantavirus todavía son mal entendidos, probablemente porque resultan de varias características bióticas y abióticas interactuantes cuyos parámetros clave son difíciles de modelar. Sin embargo, el uso de nuevos enfoques de modelado que involucran características geográficas y ambientales parece ser prometedor a la hora de predecir posibles brotes de hantavirus y/o áreas de mayor riesgo [169] [170] [171] [172]. Debido a que se sabe que los hantavirus se transmiten directamente de los huéspedes infectados a los susceptibles, el primer enfoque natural es relacionar los brotes con la ecología de los huéspedes virales. La transmisión y persistencia del hantavirus en las poblaciones de roedores depende de varios factores que interactúan para afectar la dinámica ecológica del huésped, que a su vez está fuertemente influenciada por las características de comportamiento de las especies de roedores individuales, a la estructura paisajística y a las características ambientales [173, 174]. La transmisión viral depende de las tasas de contacto entre los huéspedes sensibles, y a pesar de la noción prevaleciente de que un aumento de la densidad se encuentra y, por lo tanto, de Además, se ha demostrado que la transmisión de NVS sigue un patrón de heterogeneidad de contacto, donde los individuos de la población tienen diferentes probabilidades de transmitir la infección [176]. La comprensión de la transmisión viral resulta ser mucho más compleja cuando especies distintas del principal huésped del reservorio se incorporan en el modelo. De hecho, estudios recientes han demostrado que la mayor diversidad de especies hospedantes está correlacionada con una menor prevalencia de infección en América del Norte para P. maniculatus [177], en América Central para O. fulvescens (reservorio del virus Choclo) y Zygodontomys brevicauda (reservorio del virus Calabazo) [178], y en América del Sur para Akodon montensis (reservorio del virus Jabora) [162]. Las tasas de contacto varían según la distribución espacial de las poblaciones y parecen estar Por ejemplo, la prevalencia de SNV en P. maniculatus fue mayor en paisajes con mayor grado de fragmentación del hábitat preferido [179]. Además, ciertas propiedades del paisaje como elevación, pendiente y cubierta terrestre parecen ser útiles para detectar áreas con infecciones persistentes de SNV, y por lo tanto se consideran áreas refugiales donde el virus puede mantenerse durante años [169]. Los cambios en el entorno natural de las especies de reservorios, como la fragmentación forestal y la pérdida de hábitat, pueden alterar la abundancia y distribución de la población y provocar brotes de hantavirus, como se observa en la Península de Azurero de Panamá [118, 119]. Además, las diferencias en el microhábitat, incluida la cubierta superficial, pueden conducir a diferencias en la dinámica ecológica dentro de las poblaciones y afectar a la tasa de exposición al virus [180]. Se han encontrado diferencias en las infecciones por hantavirus a través de paisajes contrastantes en el intervalo latitudinal en poblaciones de roedores de O. longicaudatus en Chile, lo que sugiere que los seres humanos están expuestos de manera diferencial al virus [107, 181]. La dinámica poblacional de roedores se ve afectada por cambios estacionales de clima y clima [182, 183]. En el caso de los brotes asociados a ENSO, se ha postulado una compleja cascada de eventos desencadenados por lluvias altamente inusuales en el año precedente para dar lugar a un aumento de la producción primaria y densidades de roedores, aumentando también la probabilidad de transmisión del virus a los seres humanos, pero ha resultado difícil demostrar con precisión los eventos intermedios sugeridos, como el aumento de las densidades de roedores en el aumento de la carga de casos [116, 121, 184]. En América del Sur, los efectos del cambio climático y los brotes de hantavirus no han sido bien estudiados, a pesar del conocimiento de que varias especies de roedores que son reservorios de enfermedades emergentes se han visto dramáticamente afectadas por eventos como El Niño [185]. Los cambios en la dinámica de la población de acogida también se ven afectados por la estacionalidad, lo que puede conducir a brotes de enfermedades cuando se interrumpen los procesos que equilibran las poblaciones de roedores de temporada en temporada [186]. La emergencia viral puede seguir promoviéndose a medida que los cambios introducidos por el ser humano continúan aumentando en el medio ambiente a diferentes escalas geográficas. Estos cambios también pueden alterar la estructura y dinámica de la población de roedores e interacciones interespecies creando condiciones que pueden conducir a brotes virales, establecimiento viral en nuevos hospederos, y la aparición de HCPS [102, 162], incluso con aparentemente leve perturbación ecológica al sistema virus-hospedero [188]. Ciertas características fisiopatológicas, incluyendo trombocitopenia y shock, de enfermedades por hantavirus de los seres humanos, tienen similitud sustancial con las fiebres hemorrágicas inducidas por otros virus tales arenavirus, filovirus y flavivirus, a pesar de compartir esencialmente ninguna secuencia similitud con ellos. Tales observaciones plantean preguntas acerca de si tales similitudes en la patogénesis son probables similitudes de fenotipo, o en cambio reportan la presencia de mecanismos moleculares comunes entre los virus. En esta revisión se discuten las propiedades generales, descubrimientos y epidemiología/ecología de las formas de hantavirus patógenos del Nuevo Mundo, y también se busca identificar algunas de las características de las macromoléculas virales y mecanismos inmunológicos que se han propuesto como potenciales mediadores directos de los eventos patógenos que caracterizan la enfermedad humana HCPS. Si bien es poco probable que la expresión de una proteína viral particular o ARNs en aislamiento se pueda confiar en replicar fenotipos clave de infección por el virus completo, algunos de los hallazgos han sido suficientemente consistentes con lo que se conoce de la patogénesis in vivo que ofrecen plomos plausibles de primer paso en la búsqueda de objetivos terapéuticos. Esperamos con interés las revelaciones mecanísticas que seguirán el uso inevitablemente ampliado de métodos poderosos como la secuenciación profunda, imágenes cada vez más avanzadas, y métodos microscópicos, y modelos animales que por fin se pueden decir

¿Qué es un inhibidor negativo dominante?

Los hantavirus en las Américas y su papel como patógenos emergenteshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3185593/SHA: efe13a8d42b60ef9f7387ea539a1b2eeb5f80101Autores: Hjelle, Brian; Torres-Pérez, FernandoFecha: 2010-11-25DOI: 10.3390/v2125559Licencia: cc-byAbstract: La continua aparición y reaparición de patógenos representan una amenaza continua, a veces mayor, para las poblaciones. Los hantavirus (familia Bunyaviridae) y sus enfermedades humanas asociadas se consideraron confinados a Eurasia, pero la aparición de un brote en el suroeste de Estados Unidos llevó a un gran aumento en su estudio entre los virólogos de todo el mundo. Se han descrito más de 40 genotipos hantavirales, la gran mayoría desde 1993, y casi la mitad de ellos patógenos para los seres humanos. Los hantavirus causan infecciones persistentes en sus reservorios, y en las Américas, la enfermedad humana se manifiesta como compromiso cardiopulmonar, síndrome cardiopulmonar del hantavirus (HCPS), con proporciones de casos-fatalidad, para los serotipos virales más comunes, entre el 30% y el 40%. Alteración del hábitat y trastornos ecológicos a mayor escala, tal vez incluyendo el cambio climático, son algunos de los factores que pueden haber aumentado la carga de casos humanos de HCPS entre 1993 y el presente. Consideramos aquí las características que influyen en la estructura de la dinámica de la población huésped que pueden conducir a brotes virales, así como los determinantes macromoleculares de los hantavirus que han sido considerados como potenciales contribuciones a la patogenicidad. Texto: Los patógenos emergentes causan enfermedades nuevas o no reconocidas anteriormente, y entre ellas, las zoonóticas emergentes son una preocupación importante entre los científicos que estudian enfermedades infecciosas a diferentes escalas espaciales y temporales [1, 2]. Los cambios en las condiciones bióticas y abióticas pueden alterar la dinámica de las enfermedades de la población y conducir a la aparición de infecciones zoonóticas [3] [5] [6]. Durante las últimas décadas, se han producido varios brotes de patógenos virales emergentes y reemergentes, que afectan tanto a la implicación puramente local como a nivel mundial/pandémica de las poblaciones humanas. Entre los ejemplos visibles están la gripe A, el virus del Ébola, el virus de la hepatitis C, el trastorno respiratorio grave para adultos (SARS), el coronavirus y el virus de la inmunodeficiencia humana, que desafían las medidas de prevención y control de los sistemas de salud pública [7]. En las Américas, el reciente brote de gripe pandémica A subtipo H1N1 se convirtió en un objetivo importante de control debido a su rápida propagación, y las incertidumbres en cuanto a virulencia y transmisibilidad, sin embargo, la disponibilidad de vacunas fue limitada cuando se produjo una actividad significativa antes de la temporada tradicional de gripe [8]. Sin embargo, en el último siglo han surgido o resurgido brotes de varias enfermedades virales relacionadas con los virus arenavirus y el dengue, y más recientemente, hantavirus y la expansión del rango geográfico del virus del Nilo Occidental. Entre las enfermedades zoonóticas, los mamíferos pequeños son anfitriones de varios virus ARN patógenos, especialmente Arenaviridae y Bunyaviridae: Hantavirus [9] [10] [11]. Las infecciones por hantavirus se convirtieron en una preocupación en las Américas después de la descripción de un brote de distrés respiratorio agudo ocurrido en la zona La enfermedad recientemente reconocida, el síndrome cardiopulmonar del hantavirus, el HCPS (o síndrome pulmonar del hantavirus), se relacionó con la infección por el virus del Sin Nombre (SNV) recién descubierto, y el roedor Peromyscus maniculatus (ratón venado) fue identificado como el reservorio [13]. Sin embargo, las infecciones por hantavirus tienen una historia mucho más larga. Una revisión de los escritos chinos antiguos, que datan de aproximadamente 960 dC, reveló descripciones muy parecidas a la fiebre hemorrágica con síndrome renal (HFRS), el síndrome causado por los hantavirus del Viejo Mundo [14]. Durante el siglo XX, los casos de enfermedad febril aguda con compromiso renal fueron descritos de varios países eurasiáticos y Japón, a menudo en asociación con compromisos militares [15]. El HFRS como síndrome distinto, sin embargo, fue llamado por primera vez a la atención de la medicina occidental en asociación con un brote que ocurrió entre las tropas de las Naciones Unidas durante el conflicto coreano entre 1951 y 1954, donde más de 3.200 soldados fueron afectados [16]. Tomó más de dos décadas hasta que el agente etiológico, el virus Hantaan (HTNV), fue aislado del ratón de campo rayado Apodemus agrarius, detectado en parte por la unión de anticuerpos de muestras de suero de paciente a los tejidos pulmonares de ratones de campo sanos y salvajes [17, 18]. El virus se encontró más tarde para representar la especie tipo de un nuevo género Hantavirus de la familia Bunyaviridae, aunque fue más tarde evidente que el primer hantavirus a aislarse fue el virus Thottapalayam de shrew-borne [19]. La categorización de los hantavirus como pertenecientes a la familia Bunyaviridae se debe en parte a la presencia consistente de tres genomas de ARN que son circularizados in vivo como resultado de la presencia de nucleótidos terminales complementarios que ayudan a doblar el genoma en una morfología -hairpin-, descrita por primera vez para el flebovirus Uukuniemi [19, 20]. La Tabla 1 es una lista de los hantavirus patógenos predominantemente distintos serológicamente. Se describen muchos otros genotipos llamados, pero tales otras formas patogénicas están generalmente estrechamente relacionadas con los Andes o, en algunos casos, el virus Sin Nombre. Durante la maduración del virus, el precursor forma GPC se procesa utilizando una proteasa unida a la membrana en Gn y Gc, una escisión que ocurre, y parece ser señalada, después de la señal péptida conservada WAASA en la C-terminal de Gn [24]. Aunque las dos proteínas se pueden expresar de forma independiente a través de la transfección, pueden ser retenidas en el compartimento celular incorrecto (ER o aggrosome); por lo tanto, deben ser co-expresadas para permitirles estabilidad para que las dos se puedan ensamblar correctamente en el Golgi [25, [27] [28]. Se han identificado varias actividades y propiedades para las glicoproteínas envolventes del hantavirus, incluyendo algunas características que se sospecha que están involucradas en la patogenicidad de los serotipos causantes de la enfermedad, una posibilidad que ha generado atención experimental. Las glucoproteínas son los ligandos conocidos o presuntos para al menos dos receptores celulares distintos, la cadena de integrina y el factor acelerador de la descomposición, o DAF [30, 31] ; con gC1qR/p32 también identificado como otro receptor de entrada potencial [32]. Comparaciones con la proteína E del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, llevaron a Tischler et al. a considerar la glicoproteína Gc como una proteína potencial de fusión de clase II, tal vez impartiendo actividad de fusión al virión, y esta hipótesis ha ganado apoyo en otros estudios [33, 34]. Se han identificado actividades adicionales con, o se afirma que están relacionadas con, Gn. Para muchos de estos estudios, una premisa subyacente ha sostenido que hay diferencias entre las glicoproteínas de hantavirus -patógenos en relación con virus en el género que se denominan Si bien es cierto que aún no ha sido posible vincular el virus de Prospect Hill (PHV) con la enfermedad humana, la ausencia de evidencia de su patogenicidad tal vez no debería equipararse con la evidencia de su ausencia. Sólo se podría considerar que el nivel de enfermedad (por ejemplo, letargo, fiebre, proteinuria y azotemia) asociado con la infección de primates no humanos por PHV no es significativamente diferente del registrado para los modelos de primates no humanos utilizando el virus conocido del patógeno Puumala (PUUV) [35, 36]. Para el propósito de esta discusión, presumiremos que los hantavirus apatogénicos son efectivamente apatogénicos. Mientras que algunos estudios han sugerido que las glicoproteínas Gn se dirigen más rápidamente a la vía ubiquitina-proteosoma que a las formas apatogénicas, otros han interpretado las diferencias en el manejo de las glicoproteínas Gn a través de especies de hantavirus por el sistema ubiquitina-proteosomal como independientes de la patogenicidad [37] [38] [39]. Algunos investigadores han dirigido sus esfuerzos hacia la identificación de una capacidad diferencial, ya sea cinética o de magnitud absoluta, en la capacidad de los hantavirus patógenos y apatogénicos para provocar una respuesta de interferón en las células. Una premisa que surge es que las formas apatogénicas tenderían a inducir una respuesta innata anterior que haría más probable que el virus se limpiara rápidamente o se volviera menos competente en su replicación, a fin de evitar cualquier respuesta patológica en el huésped [42] La respuesta innata anti-hantavirus puede en algunos casos ser atribuida a la interacción viral como ligando de TLR-3, pero no en otros, y en las células endoteliales, no parece requerir más que la partícula viral misma, incluso cuando se introduce en forma replicativa incompetente [43, 44]. Las proteínas y los ARNm inducidos prominentemente por los hantavirus incluyen MxA e IFIT-1 (ISG-56) y otros incluyendo algunos con actividad antiviral conocida o sospechada. Esos hantavirus, a menudo cepas altamente patógenas, que no inducen una respuesta antiviral potente, se sospechan o se presume que tienen un (más) potente mecanismo de antagonismo interferón-vía en relación con otros virus, un mecanismo que actúa positivamente para prevenir que se forme una respuesta innata efectiva, al menos temprano en la infección [4 Sin embargo, se reportan algunos casos en los que los hantavirus altamente patógenos, tales como NVS, también son capaces de inducir la expresión de los ARNm del gen estimulado por interferón, incluso muy temprano en la infección, con proteínas ISG, como se esperaba, tardando más tiempo en aparecer en la célula [44]. Las actividades anti-interferón también se han atribuido a la proteína NSs que se puede elaborar en células infectadas por serotipos que codifican esta proteína [46]. Otros investigadores han examinado las actividades de las glucoproteínas del hantavirus y otras proteínas que podrían afectar directamente a algunos aspectos de la progresión patogénica asociada a la infección por hantavirus en humanos, tales como cambios de permeabilidad vascular. Mientras que los primeros intentos de causar directamente aumentos en la permeabilidad de las monocapas endoteliales con partículas virales o infección viral fueron en gran medida decepcionantes, los hantavirus se han identificado como que afectan adversamente la migración endotelial sobre los sustratos y en la potenciación de la permeabilidad endotelial inducida por VEG-F [47, 48]. La proteína nucleocápsida o N más corta (+50 kD) es un componente estructural del nucleocápsido viral, junto con los segmentos de ARN viral genómico. Como proteína de unión al ARN que afecta a la horquilla del cabello de los segmentos genómicos con alta afinidad [49, 50], limita el acceso del ARN para alojar nucleasasas y ayuda a hacer que la replicación viral sea un proceso cerrado dentro del citoplasma. También actúa como una proteína de membrana periférica, al igual que la proteína L [51], una actividad que podría jugar un papel en su supuesta, pero aún no demostrada función como matriz [52]. Hasta hace poco, no se había apreciado que N tuviera una amplia variedad de otras actividades, algunas de las cuales pueden estar vinculadas, no sólo a los requisitos fundamentales de replicación, sino también a la interferencia con una serie de procesos intracelulares de la célula normal. Así, se ha propuesto una interacción entre el aminoterminal de la proteína N del hantavirus y la proteína celular Daxx, con la sugerencia de posibles consecuencias pro-apoptóticas [51]. N también se reporta que interactúa con microfilamentos actínicos, y la proteína SUMO-1 [53, 54]. Utilizando ensayos basados en el gen reportero, Connie Schmaljohn y sus colegas han informado que la proteína nucleocapsid del virus Hantaan tiene un papel inhibidor en las respuestas inflamatorias mediadas por NF kappa B (NF- â € € TM B). Los efectos sobre la expresión NF- € B parecen estar limitados a la prevención de su translocación nuclear después de su intento de activación con lipopolisacárido, LPS [55]. En el citoplasma de las células infectadas, la proteína N se puede encontrar en los cuerpos celulares P donde secuestra y protege los capuchones de 5'. Puede localizar los capuchones a través de su interacción con DCP1, un componente clave de los cuerpos P. Durante la infección por hantavirus, los ARN virales se concentran en los cuerpos P, a través de su interacción con N y DCP1. La proteína N demuestra la protección preferencial de los ARNm diseñados para terminar prematuramente su proteína codificada en comparación con los ARNm nativos [56]. La proteína N se ha vinculado cada vez más a la replicación y traducción virales, a veces de maneras no previstas anteriormente. Se encuentra entre una familia creciente de diversas proteínas virales que pueden servir como un inespecífico - ARN chaperone ®, una actividad que debe facilitar el acceso de la L polimerasa al ARNv para la transcripción y replicación, en que puede disociar transitoriamente estructuras de ARN mal dobladas [57]. Algunos de los efectos de la proteína N en la traducción no pueden ser inmediatamente reconocidos como adaptables en la naturaleza. Puede reemplazar todo el complejo de iniciación traslacional EIF4F, presentando simultáneamente el ribosoma con un reemplazo de la actividad de unión de la tapa de eIF 4E, uniéndose al complejo de pre-iniciación 43S, al igual que eIF 4G, al tiempo que reemplaza la actividad helicoidal de eIF 4A, que se presume que es necesaria para disociar la estructura de ARN de orden superior [56, 58]. Estos tres factores normalmente trabajan juntos para lograr la iniciación traslacional. En los cuerpos P, la capacidad de la proteína N de unirse a una alta afinidad a los oligoribonucleótidos celulares nativos tapados, junto con su actividad en la protección de ARNs tapados de la degradación, probablemente facilita el acceso de oligonucleótidos encapsulados para su uso en la iniciación transcripcional por L polimerasa (-cap ra Tráfico de N para el ensamblaje viral: Clásicamente, la proteína N en las células infectadas parece estar agrupada o partículas en la naturaleza, con una concentración pesada en una única ubicación perinuclear, ampliamente considerada como la Golgi [27]. Las proteínas N de los hantavirus se encuentran en asociación con fracciones de partículas, y los estudios confocales microscopía y bioquímico-inhibidores han demostrado que las trazas N a lo largo de microtúbulos pero no con filamentos de actina [52]. El destino final de N, para su ensamblaje en partículas virales es la Golgi, y que circula allí a través del complejo intermedio retículo-Golgi endoplasmático (ERGIC), también conocido como cúmulo vesicular-tubular [52]. Un inhibidor negativo dominante, la dinamitina, asociado con el transporte mediado por Los estudios posteriores sugieren que la dependencia específica del transporte microtubular es específica de los hantavirus del Viejo Mundo como el NVH, pero que el Hantavirus del Nuevo Mundo ANDV está asociado con filamentos de actina [59]. Sin embargo, los datos recientes indican que el transporte microtubular es efectivamente utilizado para el NVH del Nuevo Mundo [60]. Las enfermedades del Hantavirus del hombre desde hace mucho tiempo han sido sospechosas de tener una base inmunopatógena en parte debido a su período de incubación relativamente largo de 2-3 semanas y la asociación temporal observada entre los trastornos inmunológicos y la primera aparición de signos y síntomas de la enfermedad del hantavirus. HFRS y HCPS comparten muchas características clínicas, llevando a muchos investigadores a considerar que son, en esencia, diferentes manifestaciones de un proceso patógeno similar, que difieren principalmente en los órganos objetivo primarios de expresión de la enfermedad (Tabla La patogénesis de las infecciones por hantavirus es el tema de una revisión continuamente actualizada en la serie UpToDate [61]. Para el momento en que aparecen los síntomas en el HCPS, ambas respuestas antivirales fuertes, y, para los genotipos virales más virulentos, el ARN viral puede ser detectado en plasma sanguíneo o células sanguíneas nucleadas respectivamente [63, 64]. Al menos tres estudios han correlacionado el ARN viral plasmático con la gravedad de la enfermedad para el HCPS y el HFRS, sugiriendo que la replicación del virus juega un papel continuo y en tiempo real en la patogénesis viral [65] [66] [67]. Se han identificado varios cambios patológicos distintivos que ocurren tanto en el HFRS como en el HCPS. Una característica crítica de ambos es una fuga capilar transitoria (~ 1-5 días) que involucra el La fuga resultante es de carácter exudativo, con una composición química alta en proteínas y similar al plasma. La experiencia continua que indica el fuerte tropismo tisular para las células endoteliales, específicamente, es uno de los varios factores que hacen de la integra β3 un candidato especialmente atractivo como un importante receptor in vivo para los hantavirus. Es probable que los hantavirus lleguen a sus tejidos objetivo a través de la captación por los ganglios linfáticos regionales, tal vez con o dentro de un histiocito pulmonar escoltante. Las semillas del virus endotelio local, donde las primeras células infectadas dan lugar, en última instancia, a una viremia primaria, un proceso que parece tomar mucho tiempo para las infecciones por hantavirus [62, 63]. En el momento en que emerge la viremia secundaria, los agentes de las formas más severas de HFRS y HCPS han comenzado a alcanzar una masa suficiente para inducir, a través de las interacciones PAMP-PRR y otros medios, la expresión de citoquinas proinflamatorias [64]. Para HCPS, esa expresión favorece el lecho pulmonar y los órganos linfoides, pero, por razones desconocidas, ahorra el retroperitoneo y, en general, el riñón. En HFRS la situación se invierte, y sin embargo no se aprecia a menudo que el esperado tropismos tisulares preferentes de virus asociados a HFRS y sus contrapartes asociadas a HCPS para los lechos renal y pulmonar, respectivamente, no sea como se predeciría a través de las manifestaciones de las dos enfermedades. La elaboración local de mediadores inflamatorios y quimiotácticos se considera un requisito para el desarrollo Sin embargo, no es la hipoxemia, debido al edema pulmonar prominente, lo que conduce a la muerte en la mayoría de los casos fatales de HCPS, sino más bien la intoxicación del corazón por mediadores como aún no definidos, lo que conduce al estado de bajo gasto cardíaco y al síndrome de shock asociado [64, 65]. Es tentador especular que los mediadores producidos en el pulmón en conexión con el infiltrado inflamatorio pueden infiltrarse a través de la circulación coronaria con dilución mínima en HCPS, consecuencia desventajosa de la estrecha yuxtaposición anatómica de los dos órganos. Así, al menos tres clases de mecanismos potenciales, algunos superpuestos y todos ciertamente no exclusivos de los otros, podrían presumirse que subyacen a la patogénesis del HCPS. Estos incluyen:(1) Mecanismos inmunes innatos. La naturaleza de las interacciones entre los patrones moleculares asociados al patógeno del hantavirus (PAMP) y los receptores de reconocimiento del patrón (PRR) de las células endoteliales susceptibles comienzan a ser aclaradas. El HTNV prototípico parece ser reconocido por TLR-3 [43]. Tal infección tiene consecuencias tales como una mayor expresión del HLA-DR en las células dendríticas [66] y la diferenciación de los monocitos hacia las células dendríticas [67]. (2) Efectos virales directos. La correlación observada entre la carga viral y la gravedad de la enfermedad deja abierta la posibilidad de que las partículas del hantavirus o el ARN puedan tener efectos tóxicos sobre las células o sobre la señalización. Algunos investigadores han favorecido la toxicidad viral directa, actuando a través de la inhibición de la función de barrera celular endotelial, como una explicación de gran parte de la fuga capilar, aunque existe Una pista potencialmente importante hacia el mecanismo por el cual las infecciones por hantavirus agotan las plaquetas sanguíneas y, en algunos casos, causan manifestaciones hemorrágicas, fue avanzada por el reciente descubrimiento de que los hantavirus patógenos son capaces de reclutar plaquetas para adherirse a las superficies celulares endoteliales, con β3 integrina utilizada como elemento de unión crítica [69]. (3) Efectos patógenos causados por las actividades de macromoléculas virales específicas. Hemos revisado algunas de las actividades asociadas con los Gn, Gc y N, polipéptidos codificados viralmente en secciones anteriores. Modelos de prueba de patogénesis se pueden hacer más eficazmente cuando hay un modelo animal que imita aspectos clave de la enfermedad. No existe un modelo similar al HFRS, pero existen modelos animales para el transporte asintomático de PUUV y SNV por sus roedores portadores nativos, el banco vole Myodes glareolus y el ratón venado P. maniculatus; así como un modelo hámster sirio utilizando ANDV o el virus Aporal relacionado de Venezuela, para el cual se observa una enfermedad mimética HCPS [70] [71] [72] [73]. El modelo hámster ANDV-Sirio tiene una serie de características en común con la enfermedad humana, así como algunas diferencias. A diferencia de las enfermedades neurológicas que han sido posibles de provocar con HTNV, el modelo hámster para HCPS parece ser causado por fugas capilares que resultan en edema pulmonar y la producción de un derrame pleural con características exudativas. Típicamente los hámsteres mueren entre 11 y 14-d post-inoculación, reflejando un período de incubación ligeramente acelerado en comparación con las infecciones humanas. Al igual que con el HCPS humano, el examen microscópico del pulmón revela abundante deposición de fibrina, septo alveolar engrosado y antígeno viral expresado abundantemente en el endotelio microvascular. Los hámsteres infectados por ANDV equipados con dispositivos de monitoreo fisiológico mostraron disminución de las presiones de pulso, taquicardia e hipotensión que parecen imitar de cerca el shock que se cree que es la causa próxima de la muerte en pacientes que sucumben al HCPS [65, 74]. En comparación con la enfermedad humana, los hámsteres infectados por ANDV exhiben títulos excepcionalmente altos de ANDV vivo en sus tejidos, con gran parte de la replicación viral que se produce Los títulos de ANDV vivo en algunos casos superan los 10 8 /g, mientras que los aislados de hantavirus de los tejidos humanos han sido notoriamente difíciles de obtener. A pesar de la aparición universal de enzimas hepáticas levemente elevadas en pacientes con HCPS, las enzimas hepáticas no parecen estar presentes en niveles elevados en la sangre de hámsters enfermos incluso inmediatamente antes de la muerte [75]. El período prolongado de incubación asociado con la enfermedad por hantavirus da al huésped un tiempo considerable para montar una respuesta inmune madura contra el virus. Así, en contradición a infecciones de gravedad comparable y sintomatología relacionada asociada con arenavirus y filovirus, las infecciones por hantavirus en humanos se asocian con respuestas anticuerpos de título significativo por el momento en que comienzan los síntomas. A pesar de esta observación, parece ser posible que la variación natural en las respuestas individuales de anticuerpos neutralizantes entre los pacientes con infecciones por NVS pueda estar relacionada con la gravedad de la enfermedad, lo que sugiere que la administración de anticuerpos antivirales podría resultar efectiva terapéuticamente [76]. En el caso de la infección por ANDV, han surgido nuevas evidencias que indican que el aparente aclaramiento del virus de la sangre no resulta en la eliminación completa del estímulo antigénico por el virus, sugiriendo que el virus puede persistir, tal vez en algún sitio inmunológicamente privilegiado aún indeterminado [77]. Un papel para las respuestas patológicas mediadas por células T en el HFRS y el HCPS ha sido la fuente de especulación por una variedad de razones. La gravedad del SNS asociado al SNCP puede haber hecho más evidente que el inicio del edema pulmonar, la taquicardia y la hipertensión parecía estar todo, pero universalmente asociado temporalmente, con la aparición de un espectro de células altamente activadas del linaje linfoide en la sangre periférica. Se detectaron células con similitudes morfológicas cercanas a estos -inmunoblastos- en los pulmones congestionados y pesados de los pacientes que llegaron a la autopsia, así como en órganos linfoides y en las tríadas portal [63, [78] [79] [80]. Estas observaciones llevaron a especular que algún componente de la patogénesis por hantavirus podría estar vinculado a la aparición de células T antivirales que podrían estimular o contribuir a la aparición de una -tormenta de mediadores y el fenotipo de fuga capilar asociado. Estudios posteriores han confirmado la expectativa de que una fracción significativa de la población de inmunoblastos en pacientes con HCPS son células T con especificidad para epitopes específicos de antígenos virales de clase I presentados por el HLA, incluyendo Gn, Gc y N [77, [81] [82] [83]. Presumiblemente, las actividades antivirales de estas células, manifestadas en parte por su elaboración de mediadores en el intersticio afectado, pueden contribuir a la fuga endotelial/capilar que se encuentra en el corazón de la patogénesis del hantavirus. Debido a que los primeros casos de HCPS a menudo llegaron a la autopsia, se hizo posible examinar tejidos necropsiados para la expresión de citocinas. El estudio de Mori et al. (1999) revelaron una alta expresión relativa de citocinas proinflamatorias incluyendo TNF-, IL-1-, IL-6, proporcionando evidencia a favor de un modelo de tormenta de citoquinas para la patogénesis [64]. Los autores creían, basándose en la morfología de las células secretadoras de citoquinas, que tanto monocitos como linfocitos estaban contribuyendo a la producción de citocinas. Que los mediadores proinflamatorios se encuentran en niveles elevados en el plasma, así como el intersticio renal de pacientes con enfermedad hantaviral aguda se ha reconocido desde hace algún tiempo también [84, 85]. Si bien el diagnóstico de HCPS y HFRS se realiza mejor con serología IgM, en la etapa aguda de la infección por NVS, también se puede utilizar RT-PCR si se utilizan células sanguíneas o coágulos de sangre en lugar de plasma o suero, donde la sensibilidad incluso utilizando imprimaciones PCR anidadas disminuye a cerca del 70% [86] [87] [88]. En una instalación en la que se tratan muchos casos de HCPS, el centro médico de la Universidad de Nuevo México en Albuquerque, se ha ofrecido un servicio de diagnóstico en el que se analizan los hallazgos hematológicos del paciente para establecer la probabilidad de que un paciente tenga HCPS. La combinación de trombocitopenia, abundancia elevada de linfocitos -inmunoblasto-, población de células polimorfonucleares con desplazamiento izquierdo sin evidencia morfológica fuerte para su activación, y valores elevados de hemoglobina o hematocrito es altamente específica para el HCPS y permite a los clínicos la capacidad de poner pacientes presuntivos-HCPS en oxigenación de membrana extracorpórea (ECMO), que se cree que ha salvado a muchos pacientes de un resultado letal [89]. Se cree que la infección humana por hantavirus sigue el contacto con secreciones o excreciones producidas por roedores infectados. En los Estados Unidos, 538 infecciones humanas por hantavirus fueron reportadas hasta finales de diciembre de 2009 [90], con Nuevo México, Arizona y Colorado mostrando los casos más altos. Mientras que el prototípico hantavirus centroamericano en América Central fue el virus Rio Segundo de Reithrodontomys mexicanus de Costa Rica, la primera enfermedad humana apareció algunos años más tarde en Panamá, donde el virus Choclo (CHOV) surgió como el agente etiológico y se cree que es responsable de todos los casos conocidos de HCPS. La rata de arroz pigmeo fulvo Oligoryzomys fulvescens ha sido identificada como el reservorio de roedores [91]. En Panamá, los primeros casos de HCPS, aunque con poca o ninguna implicación cardiaca evidente, fueron reportados en 1999, y desde entonces, 106 infecciones humanas han ocurrido con una tasa de mortalidad del 26% [92]. Seroencuestas de mamíferos en México y Costa Rica han encontrado anticuerpos antihantavirus [93] [94] [95] [96], y se han notificado seroprevalencias que oscilan entre 0,6 y 1,6% en poblaciones humanas a pesar de la ausencia de casos conocidos de HCPS [97]. En América del Sur, los casos de HCPS se han identificado en Argentina, Bolivia, Brasil, Chile, Paraguay y Uruguay, y también se han notificado evidencias de exposición humana a hantavirus en Venezuela [98] y Perú [99]. En América del Sur, ANDV es el principal agente etiológico con casos en Chile y Argentina notificados desde 1995. En Chile, se han producido 671 casos de HCPS debido a ANDV durante el período 2001-2009 [100]. Desde 1995 se han reportado más de 1.000 casos de HCPS en Argentina [101] ; en el Brasil se han identificado aproximadamente 1.100 casos de HCPS entre 1993 y 2008 [102]. Las tasas de mortalidad por casos en esos tres países han sido similares, oscilando entre el 30% (Argentina), el 36% (Chile) y el 39% (Brasil). Las infecciones por Hantavirus ocurren con más frecuencia en hombres que en mujeres, aunque la proporción entre hombres y mujeres es muy variable. Por ejemplo, las comunidades panameñas mostraron una proporción de 55 hombres por 45 mujeres [103], mientras que en Chile la proporción es más sesgada por hombres (71%) [104]. En el Chaco paraguayo la proporción entre hombres y mujeres se aproxima al 50% [105]. En América del Norte, en diciembre de 2009 el 63% de los pacientes eran varones [90]. Todos los grupos étnicos y raciales parecen ser susceptibles a infecciones por el hantavirus, y las diferencias entre ciertos grupos (como indígenas y no indígenas) están más probablemente correlacionadas con el tipo de hábitat en el que reside la población (por ejemplo, zonas rurales frente a zonas urbanas). De hecho, las comunidades rurales representan la mayor incidencia global del hantavirus y, por lo tanto, están en mayor riesgo [92, [105] [106] [107] [108] [109] [109] [119], aunque también se ha destacado la importancia de los entornos peridomésticos como una importante zona de exposición [112, 113]. El principal mecanismo por el que los seres humanos adquieren la infección por el hantavirus es la exposición a aerosoles de heces contaminadas de roedores, orina y saliva [114, 115]. Esto puede ocurrir cuando los seres humanos residen en áreas cercanas a las que habitan los roedores, viven en áreas infestadas de roedores, o cuando los roedores invaden entornos humanos, que son más frecuentes en hábitats rurales.Existe una larga historia de coexistencia humana con roedores, lo que plantea dudas sobre el aparente aumento reciente de las enfermedades relacionadas con el hantavirus, especialmente el HCPS. Aparte de una aparente asociación con eventos de oscilación sureña de El Niño (ENSO) en algunas regiones [116, 117], los recientes incrementos en la incidencia del HCPS no parecen seguir un patrón temporal o espacial fácilmente definido. Sin embargo, algunas características del paisaje, como la fragmentación del hábitat o las áreas perturbadas por el ser humano, pueden influir en la dinámica de la población de roedores e impactar en la incidencia viral [118] [112] [112] [121]. A pesar de la estocástica asociada a la contracción de la infección Las actividades humanas en edificios mal ventilados que pulverizan partículas que luego se inhalan (es decir, limpieza, agitación de alfombras, polvo) se identifican con frecuencia entre los pacientes admitidos para el SHCPS [11, 122]. Se cree que las actividades al aire libre transmiten un menor riesgo debido a la labilidad de los hantavirus a la radiación UV y a la supuesta tendencia a dispersarse en el viento, aunque ciertas condiciones ambientales parecen mantener el virus durante períodos más largos fuera de su huésped natural, lo que permite la transmisión indirecta [123]. Una vía alternativa pero poco común de transmisión del virus es la mordedura de roedores [124] [125] [126]. Los trabajadores sobre el terreno que manipulan mamíferos corren un riesgo potencialmente mayor de exposición a infecciones por hantavirus, aunque cuando se cuantifica a través de serosurveys el riesgo absoluto parece bastante leve [127]. Un nuevo estudio en Colorado sugiere la posibilidad de que una picadura de roedor haya sido el vehículo próximo para la transmisión al aire libre de NVS [128], lo que vuelve a enfatizar el uso de equipo de protección personal durante las actividades de trabajo de campo [129]. Como caso particular dentro de los hantavirus, la transmisión de persona a persona ha sido documentada exclusivamente para el virus de los Andes sudamericanos [130] [133] [133] [135]. La identificación de esta vía de transmisión se ha hecho utilizando tanto herramientas moleculares como encuestas epidemiológicas, pero el mecanismo de transmisión interpersonal no está bien establecido. Curiosamente, ANDV también puede ser derramado por los humanos a través de otros fluidos biológicos como la orina [136], ilustrando las propiedades particulares que diferencian este virus de otros hantavirus. Aunque la transmisión interpersonal parece ser única para ANDV, el ARN viral de PUUV se ha detectado en la saliva de pacientes con HFRS, y algunos pacientes con SNV-HCPS tienen ARN viral en las secreciones traqueales [88, 137]. Los Hantavirus en las Américas son alojados naturalmente por roedores (Muridae y Cricetidae) así como las musarañas (Soricidae) y los lunares (Talpidae) (Figura 1). Tres especies de musgo y un mole han sido reportados para albergar hantavirus y su patogenicidad para los humanos permanece desconocida [22, 138, 139]. Se han identificado al menos 15 especies de roedores como portadores de diferentes hantavirus patógenos, con algunos genotipos sudamericanos como Castelo do Sonhos (CDSV) o Hu39694 sólo identificados después de infecciones humanas (Figura 1 ). Los hantavirus suelen mostrar una alta especificidad de especie y ningún huésped intermedio [140]. Sin embargo, se han descrito algunos genotipos de hantavirus en la misma especie de roedores. Tal es el caso de Playa de Oro (OROV) y Catacamas (CATV) identificados en Oryzomys couesi [141, 142], o Maporal (MAPV) y Choclo (CHOV) hospedados por O. fulvescens [91, 143]. En América del Norte se han detectado virus de muleshoe y Black Creek Canal hanta en sigmodon hispidus [ Además, un genotipo de hantavirus (por ejemplo, el virus similar a Juquitiba) puede ser transportado por más de una especie de roedores (O. nigripes, Oxymycterus judex, Akodon montesis). Otro ejemplo es el virus Laguna Negra (LANV) que después de ser identificado en Calomys laucha [146] también ha sido reportado en C. callosus [147]. El rápido aumento en el descubrimiento de nuevos hantavirus y la identificación de sus anfitriones no parece probable que termine tan pronto como se examinen nuevas especies pequeñas de mamíferos [95]. Este tema se complica por la continua controversia en los criterios para la clasificación de distintos hantavirus [148, 149], que también está vinculado a la clasificación taxonómica y los reordenamientos taxonómicos. La transmisión de especies cruzadas es un proceso importante durante la propagación, aparición y evolución Particularmente dentro de los hantavirus, los derrames a los huéspedes secundarios se identifican cada vez más a medida que se realizan estudios más extensos [151] [152] [153] [155] [156]. Por ejemplo, ANDV es el agente etiológico predominante del HCPS en América del Sur, y O. longicaudatus el principal reservorio de roedores. Derrama en al menos otras cuatro especies de roedores que coocurren con el reservorio se han identificado, con Abrothrix longipilis mostrando la segunda mayor prevalencia de anticuerpos de ANDV, y actualmente no hay duda de que el virus es extremadamente similar genéticamente entre los dos roedores del huésped [157, 158]. En América del Norte, el derrame del virus Bayou (BAYV) puede haber ocurrido desde el reservorio principal de O. palustris a S. hispidus, R. fulvescens, P. leucopus y B. taylori [159] [160] [161]. Es más probable que el derrame del virus Hanta se produzca con poblaciones de acogida que habitan regiones simpatricas o sintópicas [151, 162], y la transmisión de especies cruzadas tendría probablemente mayores posibilidades de éxito si las especies anfitrionas están estrechamente relacionadas [163]. Se encuentra una excepción interesante entre el virus Oxbow (OXBV) y el virus Asama (ASAV) en el que un proceso de cambio de huésped parecía haber ocurrido entre mamíferos pertenecientes a dos familias (Talpidae y Soricidae), probablemente como resultado de la codivergencia alterna y recurrente de ciertos tax Los hantavirus son transmitidos horizontalmente entre roedores y no son transmitidos por artrópodos (a diferencia de otros virus de la familia Bunyaviridae). La infección por derrapadores a mamíferos no humanos generalmente no produce ninguna transmisión hacia adelante (o a fin de morir), pero si los seres humanos están infectados pueden resultar en una alta morbilidad y mortalidad [122, 164]. Durante la primavera de 1993, un brote de pacientes con HCPS debido a SNV ocurrió en los estados de Four Corners, resultando en más del 60% de casos de mortalidad entre los casos iniciales, muchos de los cuales involucran a miembros de la tribu Navajo [12, 121]. En Panamá, se notificó un brote durante 1999-2000 en Los Santos, y 12 casos donde se identificaron con tres muertes [165, 166]. Esto representó el primer informe de infecciones por hantavirus humanos en América Central. En América del Sur, Diecisiete individuos fueron identificados con anticuerpo NVS (ELISA) o fueron antígenos (HCI) positivos de 52 casos sospechosos [167]. En 1996 ocurrieron brotes mayores debidos a ANDV en el sur de Argentina [131, 134] ; en el sur de Chile se presentaron grupos de pacientes con enfermedad por hantavirus en 1997 [158]. En Brasil, el primer brote fue identificado en la Amazonía Brasileña (Estado de Maranhão) en el año 2000, e involucró pequeños pueblos que resultaron en una prevalencia del 13,3% de los evaluados (398 residentes totales) [168]. Los factores que desencadenan los brotes de hantavirus todavía son mal entendidos, probablemente porque resultan de varias características bióticas y abióticas interactuantes cuyos parámetros clave son difíciles de modelar. Sin embargo, el uso de nuevos enfoques de modelado que involucran características geográficas y ambientales parece ser prometedor a la hora de predecir posibles brotes de hantavirus y/o áreas de mayor riesgo [169] [170] [171] [172]. Debido a que se sabe que los hantavirus se transmiten directamente de los huéspedes infectados a los susceptibles, el primer enfoque natural es relacionar los brotes con la ecología de los huéspedes virales. La transmisión y persistencia del hantavirus en las poblaciones de roedores depende de varios factores que interactúan para afectar la dinámica ecológica del huésped, que a su vez está fuertemente influenciada por las características de comportamiento de las especies de roedores individuales, a la estructura paisajística y a las características ambientales [173, 174]. La transmisión viral depende de las tasas de contacto entre los huéspedes sensibles, y a pesar de la noción prevaleciente de que un aumento de la densidad se encuentra y, por lo tanto, de Además, se ha demostrado que la transmisión de NVS sigue un patrón de heterogeneidad de contacto, donde los individuos de la población tienen diferentes probabilidades de transmitir la infección [176]. La comprensión de la transmisión viral resulta ser mucho más compleja cuando especies distintas del principal huésped del reservorio se incorporan en el modelo. De hecho, estudios recientes han demostrado que la mayor diversidad de especies hospedantes está correlacionada con una menor prevalencia de infección en América del Norte para P. maniculatus [177], en América Central para O. fulvescens (reservorio del virus Choclo) y Zygodontomys brevicauda (reservorio del virus Calabazo) [178], y en América del Sur para Akodon montensis (reservorio del virus Jabora) [162]. Las tasas de contacto varían según la distribución espacial de las poblaciones y parecen estar Por ejemplo, la prevalencia de SNV en P. maniculatus fue mayor en paisajes con mayor grado de fragmentación del hábitat preferido [179]. Además, ciertas propiedades del paisaje como elevación, pendiente y cubierta terrestre parecen ser útiles para detectar áreas con infecciones persistentes de SNV, y por lo tanto se consideran áreas refugiales donde el virus puede mantenerse durante años [169]. Los cambios en el entorno natural de las especies de reservorios, como la fragmentación forestal y la pérdida de hábitat, pueden alterar la abundancia y distribución de la población y provocar brotes de hantavirus, como se observa en la Península de Azurero de Panamá [118, 119]. Además, las diferencias en el microhábitat, incluida la cubierta superficial, pueden conducir a diferencias en la dinámica ecológica dentro de las poblaciones y afectar a la tasa de exposición al virus [180]. Se han encontrado diferencias en las infecciones por hantavirus a través de paisajes contrastantes en el intervalo latitudinal en poblaciones de roedores de O. longicaudatus en Chile, lo que sugiere que los seres humanos están expuestos de manera diferencial al virus [107, 181]. La dinámica poblacional de roedores se ve afectada por cambios estacionales de clima y clima [182, 183]. En el caso de los brotes asociados a ENSO, se ha postulado una compleja cascada de eventos desencadenados por lluvias altamente inusuales en el año precedente para dar lugar a un aumento de la producción primaria y densidades de roedores, aumentando también la probabilidad de transmisión del virus a los seres humanos, pero ha resultado difícil demostrar con precisión los eventos intermedios sugeridos, como el aumento de las densidades de roedores en el aumento de la carga de casos [116, 121, 184]. En América del Sur, los efectos del cambio climático y los brotes de hantavirus no han sido bien estudiados, a pesar del conocimiento de que varias especies de roedores que son reservorios de enfermedades emergentes se han visto dramáticamente afectadas por eventos como El Niño [185]. Los cambios en la dinámica de la población de acogida también se ven afectados por la estacionalidad, lo que puede conducir a brotes de enfermedades cuando se interrumpen los procesos que equilibran las poblaciones de roedores de temporada en temporada [186]. La emergencia viral puede seguir promoviéndose a medida que los cambios introducidos por el ser humano continúan aumentando en el medio ambiente a diferentes escalas geográficas. Estos cambios también pueden alterar la estructura y dinámica de la población de roedores e interacciones interespecies creando condiciones que pueden conducir a brotes virales, establecimiento viral en nuevos hospederos, y la aparición de HCPS [102, 162], incluso con aparentemente leve perturbación ecológica al sistema virus-hospedero [188]. Ciertas características fisiopatológicas, incluyendo trombocitopenia y shock, de enfermedades por hantavirus de los seres humanos, tienen similitud sustancial con las fiebres hemorrágicas inducidas por otros virus tales arenavirus, filovirus y flavivirus, a pesar de compartir esencialmente ninguna secuencia similitud con ellos. Tales observaciones plantean preguntas acerca de si tales similitudes en la patogénesis son probables similitudes de fenotipo, o en cambio reportan la presencia de mecanismos moleculares comunes entre los virus. En esta revisión se discuten las propiedades generales, descubrimientos y epidemiología/ecología de las formas de hantavirus patógenos del Nuevo Mundo, y también se busca identificar algunas de las características de las macromoléculas virales y mecanismos inmunológicos que se han propuesto como potenciales mediadores directos de los eventos patógenos que caracterizan la enfermedad humana HCPS. Si bien es poco probable que la expresión de una proteína viral particular o ARNs en aislamiento se pueda confiar en replicar fenotipos clave de infección por el virus completo, algunos de los hallazgos han sido suficientemente consistentes con lo que se conoce de la patogénesis in vivo que ofrecen plomos plausibles de primer paso en la búsqueda de objetivos terapéuticos. Esperamos con interés las revelaciones mecanísticas que seguirán el uso inevitablemente ampliado de métodos poderosos como la secuenciación profunda, imágenes cada vez más avanzadas, y métodos microscópicos, y modelos animales que por fin se pueden decir

¿Por qué se sospecha que las enfermedades por Hantavirus del hombre tienen una base inmunopatógena?

Los hantavirus en las Américas y su papel como patógenos emergenteshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3185593/SHA: efe13a8d42b60ef9f7387ea539a1b2eeb5f80101Autores: Hjelle, Brian; Torres-Pérez, FernandoFecha: 2010-11-25DOI: 10.3390/v2125559Licencia: cc-byAbstract: La continua aparición y reaparición de patógenos representan una amenaza continua, a veces mayor, para las poblaciones. Los hantavirus (familia Bunyaviridae) y sus enfermedades humanas asociadas se consideraron confinados a Eurasia, pero la aparición de un brote en el suroeste de Estados Unidos llevó a un gran aumento en su estudio entre los virólogos de todo el mundo. Se han descrito más de 40 genotipos hantavirales, la gran mayoría desde 1993, y casi la mitad de ellos patógenos para los seres humanos. Los hantavirus causan infecciones persistentes en sus reservorios, y en las Américas, la enfermedad humana se manifiesta como compromiso cardiopulmonar, síndrome cardiopulmonar del hantavirus (HCPS), con proporciones de casos-fatalidad, para los serotipos virales más comunes, entre el 30% y el 40%. Alteración del hábitat y trastornos ecológicos a mayor escala, tal vez incluyendo el cambio climático, son algunos de los factores que pueden haber aumentado la carga de casos humanos de HCPS entre 1993 y el presente. Consideramos aquí las características que influyen en la estructura de la dinámica de la población huésped que pueden conducir a brotes virales, así como los determinantes macromoleculares de los hantavirus que han sido considerados como potenciales contribuciones a la patogenicidad. Texto: Los patógenos emergentes causan enfermedades nuevas o no reconocidas anteriormente, y entre ellas, las zoonóticas emergentes son una preocupación importante entre los científicos que estudian enfermedades infecciosas a diferentes escalas espaciales y temporales [1, 2]. Los cambios en las condiciones bióticas y abióticas pueden alterar la dinámica de las enfermedades de la población y conducir a la aparición de infecciones zoonóticas [3] [5] [6]. Durante las últimas décadas, se han producido varios brotes de patógenos virales emergentes y reemergentes, que afectan tanto a la implicación puramente local como a nivel mundial/pandémica de las poblaciones humanas. Entre los ejemplos visibles están la gripe A, el virus del Ébola, el virus de la hepatitis C, el trastorno respiratorio grave para adultos (SARS), el coronavirus y el virus de la inmunodeficiencia humana, que desafían las medidas de prevención y control de los sistemas de salud pública [7]. En las Américas, el reciente brote de gripe pandémica A subtipo H1N1 se convirtió en un objetivo importante de control debido a su rápida propagación, y las incertidumbres en cuanto a virulencia y transmisibilidad, sin embargo, la disponibilidad de vacunas fue limitada cuando se produjo una actividad significativa antes de la temporada tradicional de gripe [8]. Sin embargo, en el último siglo han surgido o resurgido brotes de varias enfermedades virales relacionadas con el virus arenavirus y el virus del dengue, y más recientemente, hantavirus y la expansión del rango geográfico del virus del Nilo Occidental. Entre las enfermedades zoonóticas, los mamíferos pequeños son anfitriones de varios virus ARN patógenos, especialmente Arenaviridae y Bunyaviridae: Hantavirus [9] [10] [11]. Las infecciones por hantavirus se convirtieron en una preocupación en las Américas después de la descripción de un brote de distrés respiratorio agudo ocurrido en La enfermedad recientemente reconocida, el síndrome cardiopulmonar del hantavirus, el HCPS (o síndrome pulmonar del hantavirus), se relacionó con la infección por el virus del Sin Nombre (SNV) recién descubierto, y el roedor Peromyscus maniculatus (ratón venado) fue identificado como el reservorio [13]. Sin embargo, las infecciones por hantavirus tienen una historia mucho más larga. Una revisión de los escritos chinos antiguos, que datan de aproximadamente 960 dC, reveló descripciones muy parecidas a la fiebre hemorrágica con síndrome renal (HFRS), el síndrome causado por los hantavirus del Viejo Mundo [14]. Durante el siglo XX, los casos de enfermedad febril aguda con compromiso renal fueron descritos de varios países eurasiáticos y Japón, a menudo en asociación con compromisos militares [15]. El HFRS como síndrome distinto, sin embargo, fue llamado por primera vez a la atención de la medicina occidental en asociación con un brote que ocurrió entre las tropas de las Naciones Unidas durante el conflicto coreano entre 1951 y 1954, donde más de 3.200 soldados fueron afectados [16]. Tomó más de dos décadas hasta que el agente etiológico, el virus Hantaan (HTNV), fue aislado del ratón de campo rayado Apodemus agrarius, detectado en parte por la unión de anticuerpos de muestras de suero de paciente a los tejidos pulmonares de ratones de campo sanos y salvajes [17, 18]. El virus se encontró más tarde para representar la especie tipo de un nuevo género Hantavirus de la familia Bunyaviridae, aunque fue más tarde evidente que el primer hantavirus a aislarse fue el virus Thottapalayam de shrew-borne [19]. La categorización de los hantavirus como pertenecientes a la familia Bunyaviridae se debe en parte a la presencia consistente de tres genomas de ARN que son circularizados in vivo como resultado de la presencia de nucleótidos terminales complementarios que ayudan a doblar el genoma en una morfología -hairpin-, descrita por primera vez para el flebovirus Uukuniemi [19, 20]. La Tabla 1 es una lista de los hantavirus patógenos predominantemente distintos serológicamente. Se describen muchos otros genotipos llamados, pero tales otras formas patogénicas están generalmente estrechamente relacionadas con los Andes o, en algunos casos, el virus Sin Nombre. Durante la maduración del virus, el precursor forma GPC se procesa utilizando una proteasa unida a la membrana en Gn y Gc, una escisión que ocurre, y parece ser señalada, después de la señal péptida conservada WAASA en la C-terminal de Gn [24]. Aunque las dos proteínas se pueden expresar de forma independiente a través de la transfección, pueden ser retenidas en el compartimento celular incorrecto (ER o aggrosome); por lo tanto, deben ser co-expresadas para permitirles estabilidad para que las dos se puedan ensamblar correctamente en el Golgi [25, [27] [28]. Se han identificado varias actividades y propiedades para las glicoproteínas envolventes del hantavirus, incluyendo algunas características que se sospecha que están involucradas en la patogenicidad de los serotipos causantes de la enfermedad, una posibilidad que ha generado atención experimental. Las glucoproteínas son los ligandos conocidos o presuntos para al menos dos receptores celulares distintos, la cadena de integrina y el factor acelerador de la descomposición, o DAF [30, 31] ; con gC1qR/p32 también identificado como otro receptor de entrada potencial [32]. Comparaciones con la proteína E del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, llevaron a Tischler et al. a considerar la glicoproteína Gc como una proteína potencial de fusión de clase II, tal vez impartiendo actividad de fusión al virión, y esta hipótesis ha ganado apoyo en otros estudios [33, 34]. Se han identificado actividades adicionales con, o se afirma que están relacionadas con, Gn. Para muchos de estos estudios, una premisa subyacente ha sostenido que hay diferencias entre las glicoproteínas de hantavirus -patógenos en relación con virus en el género que se denominan Si bien es cierto que aún no ha sido posible vincular el virus de Prospect Hill (PHV) con la enfermedad humana, la ausencia de evidencia de su patogenicidad tal vez no debería equipararse con la evidencia de su ausencia. Sólo se podría considerar que el nivel de enfermedad (por ejemplo, letargo, fiebre, proteinuria y azotemia) asociado con la infección de primates no humanos por PHV no es significativamente diferente del registrado para los modelos de primates no humanos utilizando el virus conocido del patógeno Puumala (PUUV) [35, 36]. Para el propósito de esta discusión, presumiremos que los hantavirus apatogénicos son efectivamente apatogénicos. Mientras que algunos estudios han sugerido que las glicoproteínas Gn se dirigen más rápidamente a la vía ubiquitina-proteosoma que a las formas apatogénicas, otros han interpretado las diferencias en el manejo de las glicoproteínas Gn a través de las especies del hantavirus por el sistema ubiquitina-proteosomal como independientes de la patogenicidad [37] [38] [39]. Algunos investigadores han dirigido sus esfuerzos hacia la identificación de una capacidad diferencial, ya sea cinética o de magnitud absoluta, en la capacidad de los hantavirus patógenos y apatogénicos para provocar una respuesta del interferón en las células. Una premisa que surge es que las formas apatogénicas tenderían a inducir una respuesta innata anterior que haría más probable que el virus se limpiara rápidamente o se volviera menos competente en su replicación, a fin de evitar cualquier respuesta patológica en el huésped [4 La respuesta innata anti-hantavirus puede en algunos casos ser atribuida a la interacción viral como ligando de TLR-3, pero no en otros, y en las células endoteliales, no parece requerir más que la partícula viral misma, incluso cuando se introduce en forma replicante-incompetente [43, 44]. Proteínas y ARNm inducidos prominentemente por los hantavirus incluyen MxA e IFIT-1 (ISG-56) y otros incluyendo algunos con actividad antiviral conocida o sospechada. Esos hantavirus, a menudo cepas altamente patógenas, que no inducen una respuesta antiviral potente, se sospechan o se presume que tienen un (más) potente mecanismo de antagonismo interferón-vía en relación con otros virus, un mecanismo que actúa positivamente para prevenir que se forme una respuesta innata efectiva, al menos temprano en Sin embargo, se reportan algunos casos en los que los hantavirus altamente patógenos, tales como NVS, también son capaces de inducir la expresión de los ARNm del gen estimulado por interferón, incluso muy temprano en la infección, con proteínas ISG, como se esperaba, tardando más tiempo en aparecer en la célula [44]. Las actividades anti-interferón también se han atribuido a la proteína NSs que se puede elaborar en células infectadas por serotipos que codifican esta proteína [46]. Otros investigadores han examinado las actividades de las glucoproteínas del hantavirus y otras proteínas que podrían afectar directamente a algunos aspectos de la progresión patogénica asociada a la infección por hantavirus en humanos, tales como cambios en la permeabilidad vascular. Mientras que los primeros intentos de causar directamente aumentos en la permeabilidad de las monocapas endoteliales con partículas virales o infección viral fueron en gran medida decepcionantes, los hantavirus se han identificado como que afectan adversamente la migración endotelial sobre los sustratos y en la potenciación de la permeabilidad endotelial inducida por VEG-F [47, 48]. La proteína nucleocápsida o N más corta (+50 kD) es un componente estructural del nucleocápsido viral, junto con los segmentos de ARN viral genómico. Como proteína de unión al ARN que afecta a la horquilla del cabello de los segmentos genómicos con alta afinidad [49, 50], limita el acceso del ARN para alojar nucleasasas y ayuda a hacer que la replicación viral sea un proceso cerrado dentro del citoplasma. También actúa como una proteína de membrana periférica, al igual que la proteína L [51], una actividad que podría jugar un papel en su supuesta, pero aún no demostrada función como matriz [52]. Hasta hace poco, no se había apreciado que N tuviera una amplia variedad de otras actividades, algunas de las cuales pueden estar vinculadas, no sólo a los requisitos fundamentales de replicación, sino también a la interferencia con una serie de procesos intracelulares de la célula normal. Así, se ha propuesto una interacción entre el aminoterminal de la proteína N del hantavirus y la proteína celular Daxx, con la sugerencia de posibles consecuencias pro-apoptóticas [51]. N también se reporta que interactúa con microfilamentos actínicos, y la proteína SUMO-1 [53, 54]. Utilizando ensayos basados en el gen reportero, Connie Schmaljohn y sus colegas han reportado que la proteína nucleocapsida del virus Hantaan tiene un papel inhibidor en las respuestas inflamatorias mediadas por NF kappa B (NF- B). Los efectos sobre la expresión NF- B parecen estar limitados a la prevención de su translocación nuclear después de su intento de activación con lipopolisacárido, LPS [55]. En el citoplasma de las células infectadas, la proteína N se puede encontrar en los cuerpos celulares P donde secuestra y protege los capuchones de 5'. Puede localizar los capuchones a través de su interacción con DCP1, un componente clave de los cuerpos P. Durante la infección por hantavirus, los ARN virales se concentran en los cuerpos P, a través de su interacción con N y DCP1. La proteína N demuestra la protección preferencial de los ARNm diseñados para terminar prematuramente su proteína codificada en comparación con los ARNm nativos [56]. La proteína N se ha vinculado cada vez más a la replicación y traducción virales, a veces de maneras no previstas anteriormente. Se encuentra entre una familia creciente de diversas proteínas virales que pueden servir como un inespecífico - ARN chaperone ®, una actividad que debe facilitar el acceso de la L polimerasa al ARNv para la transcripción y replicación, en que puede disociar transitoriamente estructuras de ARN mal dobladas [57]. Algunos de los efectos de la proteína N en la traducción no pueden ser inmediatamente reconocidos como adaptables en la naturaleza. Puede reemplazar todo el complejo de iniciación traslacional EIF4F, presentando simultáneamente el ribosoma con un reemplazo de la actividad de unión de la tapa de eIF 4E, uniéndose al complejo de pre-iniciación 43S, al igual que eIF 4G, al tiempo que reemplaza la actividad helicoidal de eIF 4A, que se presume que es necesaria para disociar la estructura de ARN de orden superior [56, 58]. Estos tres factores normalmente trabajan juntos para lograr la iniciación traslacional. En los cuerpos P, la capacidad de la proteína N de unirse a una alta afinidad a los oligoribonucleótidos celulares nativos tapados, junto con su actividad en la protección de ARNs tapados de la degradación, probablemente facilita el acceso de oligonucleótidos encapsulados para su uso en la iniciación transcripcional por L polimerasa (-cap ra Tráfico de N para el ensamblaje viral: Clásicamente, la proteína N en las células infectadas parece estar agrupada o partículas en la naturaleza, con una concentración pesada en una única ubicación perinuclear, ampliamente considerada como la Golgi [27]. Las proteínas N de los hantavirus se encuentran en asociación con fracciones de partículas, y los estudios confocales microscopía y bioquímico-inhibidores han demostrado que las trazas N a lo largo de microtúbulos pero no con filamentos de actina [52]. El destino final de N, para su ensamblaje en partículas virales es la Golgi, y que circula allí a través del complejo intermedio retículo-Golgi endoplasmático (ERGIC), también conocido como cúmulo vesicular-tubular [52]. Un inhibidor negativo dominante, la dinamitina, asociado con el transporte mediado por Los estudios posteriores sugieren que la dependencia específica del transporte microtubular es específica de los hantavirus del Viejo Mundo como el NVH, pero que el Hantavirus del Nuevo Mundo ANDV está asociado con filamentos de actina [59]. Sin embargo, los datos recientes indican que el transporte microtubular es efectivamente utilizado para el NVH del Nuevo Mundo [60]. Las enfermedades del Hantavirus del hombre desde hace mucho tiempo han sido sospechosas de tener una base inmunopatógena en parte debido a su período de incubación relativamente largo de 2-3 semanas y la asociación temporal observada entre los trastornos inmunológicos y la primera aparición de signos y síntomas de la enfermedad del hantavirus. HFRS y HCPS comparten muchas características clínicas, llevando a muchos investigadores a considerar que son, en esencia, diferentes manifestaciones de un proceso patógeno similar, que difieren principalmente en los órganos objetivo primarios de expresión de la enfermedad (Tabla La patogénesis de las infecciones por hantavirus es el tema de una revisión continuamente actualizada en la serie UpToDate [61]. Para el momento en que aparecen los síntomas en el HCPS, ambas respuestas antivirales fuertes, y, para los genotipos virales más virulentos, el ARN viral puede ser detectado en plasma sanguíneo o células sanguíneas nucleadas respectivamente [63, 64]. Al menos tres estudios han correlacionado el ARN viral plasmático con la gravedad de la enfermedad para el HCPS y el HFRS, sugiriendo que la replicación del virus juega un papel continuo y en tiempo real en la patogénesis viral [65] [66] [67]. Se han identificado varios cambios patológicos distintivos que ocurren tanto en el HFRS como en el HCPS. Una característica crítica de ambos es una fuga capilar transitoria (~ 1-5 días) que involucra el La fuga resultante es de carácter exudativo, con una composición química alta en proteínas y similar al plasma. La experiencia continua que indica el fuerte tropismo tisular para las células endoteliales, específicamente, es uno de los varios factores que hacen de la integra β3 un candidato especialmente atractivo como un importante receptor in vivo para los hantavirus. Es probable que los hantavirus lleguen a sus tejidos objetivo a través de la captación por los ganglios linfáticos regionales, tal vez con o dentro de un histiocito pulmonar escoltante. Las semillas del virus endotelio local, donde las primeras células infectadas dan lugar, en última instancia, a una viremia primaria, un proceso que parece tomar mucho tiempo para las infecciones por hantavirus [62, 63]. En el momento en que emerge la viremia secundaria, los agentes de las formas más severas de HFRS y HCPS han comenzado a alcanzar una masa suficiente para inducir, a través de las interacciones PAMP-PRR y otros medios, la expresión de citoquinas proinflamatorias [64]. Para HCPS, esa expresión favorece el lecho pulmonar y los órganos linfoides, pero, por razones desconocidas, ahorra el retroperitoneo y, en general, el riñón. En HFRS la situación se invierte, y sin embargo no se aprecia a menudo que el esperado tropismos tisulares preferentes de virus asociados a HFRS y sus contrapartes asociadas a HCPS para los lechos renal y pulmonar, respectivamente, no es como se predeciría a través de las manifestaciones de las dos enfermedades. La elaboración local de mediadores inflamatorios y quimiotácticos se considera un requisito para el desarrollo de Sin embargo, no es la hipoxemia, debido al edema pulmonar prominente, lo que conduce a la muerte en la mayoría de los casos fatales de HCPS, sino más bien la intoxicación del corazón por mediadores como aún no definidos, lo que conduce al estado de bajo gasto cardíaco y al síndrome de shock asociado [64, 65]. Es tentador especular que los mediadores producidos en el pulmón en conexión con el infiltrado inflamatorio pueden infiltrarse a través de la circulación coronaria con dilución mínima en HCPS, consecuencia desventajosa de la estrecha yuxtaposición anatómica de los dos órganos. Así, al menos tres clases de mecanismos potenciales, algunos superpuestos y todos ciertamente no exclusivos de los otros, podrían presumirse que subyacen a la patogénesis del HCPS. Estos incluyen:(1) Mecanismos inmunes innatos. La naturaleza de las interacciones entre los patrones moleculares asociados al patógeno del hantavirus (PAMP) y los receptores de reconocimiento del patrón (PRR) de las células endoteliales susceptibles comienzan a ser aclaradas. El HTNV prototípico parece ser reconocido por TLR-3 [43]. Tal infección tiene consecuencias tales como una mayor expresión del HLA-DR en las células dendríticas [66] y la diferenciación de los monocitos hacia las células dendríticas [67]. (2) Efectos virales directos. La correlación observada entre la carga viral y la gravedad de la enfermedad deja abierta la posibilidad de que las partículas del hantavirus o el ARN puedan tener efectos tóxicos sobre las células o sobre la señalización. Algunos investigadores han favorecido la toxicidad viral directa, actuando a través de la inhibición de la función de barrera celular endotelial, como una explicación de gran parte de la fuga capilar, aunque existe Una pista potencialmente importante hacia el mecanismo por el cual las infecciones por hantavirus agotan las plaquetas sanguíneas y, en algunos casos, causan manifestaciones hemorrágicas, fue avanzada por el reciente descubrimiento de que los hantavirus patógenos son capaces de reclutar plaquetas para adherirse a las superficies celulares endoteliales, con β3 integrina utilizada como elemento de unión crítica [69]. (3) Efectos patógenos causados por las actividades de macromoléculas virales específicas. Hemos revisado algunas de las actividades asociadas con los Gn, Gc y N, polipéptidos codificados viralmente en secciones anteriores. Modelos de prueba de patogénesis se pueden hacer más eficazmente cuando hay un modelo animal que imita aspectos clave de la enfermedad. No existe un modelo similar al HFRS, pero existen modelos animales para el transporte asintomático de PUUV y SNV por sus roedores portadores nativos, el banco vole Myodes glareolus y el ratón de venado P. maniculatus; así como un modelo de hámster sirio utilizando ANDV o el virus Aporal relacionado de Venezuela, para el cual se observa una enfermedad mimética HCPS [70] [71] [72] [73]. El modelo de hámster ANDV-Sirio tiene una serie de características en común con la enfermedad humana, así como algunas diferencias. A diferencia de las enfermedades neurológicas que han sido posibles de provocar con HTNV, el modelo de hámster para HCPS parece ser causado por fugas capilares que resultan en edema pulmonar y la producción de un derrame pleural con características exuda Típicamente los hámsteres mueren entre 11 y 14-d post-inoculación, reflejando un período de incubación ligeramente acelerado en comparación con las infecciones humanas. Al igual que con el HCPS humano, el examen microscópico del pulmón revela abundante deposición de fibrina, septo alveolar engrosado y antígeno viral expresado abundantemente en el endotelio microvascular. Los hámsteres infectados por ANDV equipados con dispositivos de monitoreo fisiológico mostraron disminución de las presiones de pulso, taquicardia e hipotensión que parecen imitar de cerca el shock que se cree que es la causa próxima de la muerte en pacientes que sucumben al HCPS [65, 74]. En comparación con la enfermedad humana, los hámsteres infectados por ANDV exhiben títulos excepcionalmente altos de ANDV vivo en sus tejidos, con gran parte de la replicación viral que ocurre en Los títulos de ANDV vivo en algunos casos superan los 10 8 /g, mientras que los aislados de hantavirus de los tejidos humanos han sido notoriamente difíciles de obtener. A pesar de la aparición universal de enzimas hepáticas levemente elevadas en pacientes con HCPS, las enzimas hepáticas no parecen estar presentes en niveles elevados en la sangre de hámsters enfermos incluso inmediatamente antes de la muerte [75]. El período prolongado de incubación asociado con la enfermedad por hantavirus da al huésped un tiempo considerable para montar una respuesta inmune madura contra el virus. Así, en contradición a infecciones de gravedad comparable y sintomatología relacionada asociada con arenavirus y filovirus, las infecciones por hantavirus en humanos se asocian con respuestas anticuerpos de título significativo por el momento en que comienzan los síntomas. A pesar de esta observación, parece ser posible que la variación natural en las respuestas individuales de anticuerpos neutralizantes entre los pacientes con infecciones por NVS pueda estar relacionada con la gravedad de la enfermedad, lo que sugiere que la administración de anticuerpos antivirales podría resultar efectiva terapéuticamente [76]. En el caso de la infección por ANDV, han surgido nuevas evidencias que indican que el aparente aclaramiento del virus de la sangre no resulta en la eliminación completa del estímulo antigénico por el virus, sugiriendo que el virus puede persistir, tal vez en algún sitio inmunológicamente privilegiado aún indeterminado [77]. Un papel para las respuestas patológicas mediadas por células T en el HFRS y el HCPS ha sido la fuente de especulación por una variedad de razones. La gravedad del SNS asociado al SNCP puede haber hecho más evidente que el inicio del edema pulmonar, la taquicardia y la hipertensión parecía estar todo, pero universalmente asociado temporalmente, con la aparición de un espectro de células altamente activadas del linaje linfoide en la sangre periférica. Se detectaron células con similitudes morfológicas cercanas a estos -inmunoblastos- en los pulmones congestionados y pesados de los pacientes que llegaron a la autopsia, así como en órganos linfoides y en las tríadas portal [63, [78] [79] [80]. Estas observaciones llevaron a especular que algún componente de la patogénesis por hantavirus podría estar vinculado a la aparición de células T antivirales que podrían estimular o contribuir a la aparición de una -tormenta de mediadores y el fenotipo de fuga capilar asociado. Estudios posteriores han confirmado la expectativa de que una fracción significativa de la población de inmunoblastos en pacientes con HCPS son células T con especificidad para epitopes específicos de antígenos virales de clase I presentados por el HLA, incluyendo Gn, Gc y N [77, [81] [82] [83]. Presumiblemente, las actividades antivirales de estas células, manifestadas en parte por su elaboración de mediadores en el intersticio afectado, pueden contribuir a la fuga endotelial/capilar que se encuentra en el corazón de la patogénesis del hantavirus. Debido a que los primeros casos de HCPS a menudo llegaron a la autopsia, se hizo posible examinar tejidos necropsiados para la expresión de citocinas. El estudio de Mori et al. (1999) revelaron una alta expresión relativa de citocinas proinflamatorias incluyendo TNF-, IL-1-, IL-6, proporcionando evidencia a favor de un modelo de tormenta de citoquinas para la patogénesis [64]. Los autores creían, basándose en la morfología de las células secretadoras de citoquinas, que tanto monocitos como linfocitos estaban contribuyendo a la producción de citocinas. Que los mediadores proinflamatorios se encuentran en niveles elevados en el plasma, así como el intersticio renal de pacientes con enfermedad hantaviral aguda se ha reconocido desde hace algún tiempo también [84, 85]. Si bien el diagnóstico de HCPS y HFRS se realiza mejor con serología IgM, en la etapa aguda de la infección por NVS, también se puede utilizar RT-PCR si se utilizan células sanguíneas o coágulos de sangre en lugar de plasma o suero, donde la sensibilidad incluso utilizando imprimaciones PCR anidadas disminuye a cerca del 70% [86] [87] [88]. En una instalación en la que se tratan muchos casos de HCPS, el centro médico de la Universidad de Nuevo México en Albuquerque, se ha ofrecido un servicio de diagnóstico en el que se analizan los hallazgos hematológicos del paciente para establecer la probabilidad de que un paciente tenga HCPS. La combinación de trombocitopenia, abundancia elevada de linfocitos -inmunoblasto-, población de células polimorfonucleares con desplazamiento izquierdo sin evidencia morfológica fuerte para su activación, y valores elevados de hemoglobina o hematocrito es altamente específica para el HCPS y permite a los clínicos la capacidad de poner pacientes presuntivos-HCPS en oxigenación de membrana extracorpórea (ECMO), que se cree que ha salvado a muchos pacientes de un resultado letal [89]. Se cree que la infección humana por hantavirus sigue el contacto con secreciones o excreciones producidas por roedores infectados. En los Estados Unidos, 538 infecciones humanas por hantavirus fueron reportadas hasta finales de diciembre de 2009 [90], con Nuevo México, Arizona y Colorado mostrando los casos más altos. Mientras que el prototípico hantavirus centroamericano en América Central fue el virus Rio Segundo de Reithrodontomys mexicanus de Costa Rica, la primera enfermedad humana apareció algunos años más tarde en Panamá, donde el virus Choclo (CHOV) surgió como el agente etiológico y se cree que es responsable de todos los casos conocidos de HCPS. La rata de arroz pigmeo fulvo Oligoryzomys fulvescens ha sido identificada como el reservorio de roedores [91]. En Panamá, los primeros casos de HCPS, aunque con poca o ninguna implicación cardiaca evidente, fueron reportados en 1999, y desde entonces, 106 infecciones humanas han ocurrido con una tasa de mortalidad del 26% [92]. Seroencuestas de mamíferos en México y Costa Rica han encontrado anticuerpos antihantavirus [93] [94] [95] [96], y se han notificado seroprevalencias que oscilan entre 0,6 y 1,6% en poblaciones humanas a pesar de la ausencia de casos conocidos de HCPS [97]. En América del Sur, los casos de HCPS se han identificado en Argentina, Bolivia, Brasil, Chile, Paraguay y Uruguay, y también se han notificado evidencias de exposición humana a hantavirus en Venezuela [98] y Perú [99]. En América del Sur, ANDV es el principal agente etiológico con casos en Chile y Argentina notificados desde 1995. En Chile, se han producido 671 casos de HCPS debido a ANDV durante el período 2001-2009 [100]. Desde 1995 se han reportado más de 1.000 casos de HCPS en Argentina [101] ; en el Brasil se han identificado aproximadamente 1.100 casos de HCPS entre 1993 y 2008 [102]. Las tasas de mortalidad por casos en esos tres países han sido similares, oscilando entre el 30% (Argentina), el 36% (Chile) y el 39% (Brasil). Las infecciones por Hantavirus ocurren con más frecuencia en hombres que en mujeres, aunque la proporción entre hombres y mujeres es muy variable. Por ejemplo, las comunidades panameñas mostraron una proporción de 55 hombres por 45 mujeres [103], mientras que en Chile la proporción es más sesgada por hombres (71%) [104]. En el Chaco paraguayo la proporción entre hombres y mujeres se aproxima al 50% [105]. En América del Norte, en diciembre de 2009 el 63% de los pacientes eran varones [90]. Todos los grupos étnicos y raciales parecen ser susceptibles a infecciones por el hantavirus, y las diferencias entre ciertos grupos (como indígenas y no indígenas) están más probablemente correlacionadas con el tipo de hábitat en el que reside la población (por ejemplo, zonas rurales frente a zonas urbanas). De hecho, las comunidades rurales representan la mayor incidencia global del hantavirus y, por lo tanto, están en mayor riesgo [92, [105] [106] [107] [108] [109] [109] [119], aunque también se ha destacado la importancia de los entornos peridomésticos como una importante zona de exposición [112, 113]. El principal mecanismo por el que los seres humanos adquieren la infección por el hantavirus es la exposición a aerosoles de heces contaminadas de roedores, orina y saliva [114, 115]. Esto puede ocurrir cuando los seres humanos residen en áreas cercanas a las que habitan los roedores, viven en áreas infestadas de roedores, o cuando los roedores invaden entornos humanos, que son más frecuentes en hábitats rurales.Existe una larga historia de coexistencia humana con roedores, lo que plantea dudas sobre el aparente aumento reciente de las enfermedades relacionadas con el hantavirus, especialmente el HCPS. Aparte de una aparente asociación con eventos de oscilación sureña de El Niño (ENSO) en algunas regiones [116, 117], los recientes incrementos en la incidencia del HCPS no parecen seguir un patrón temporal o espacial fácilmente definido. Sin embargo, algunas características del paisaje, como la fragmentación del hábitat o las áreas perturbadas por el ser humano, pueden influir en la dinámica de la población de roedores e impactar en la incidencia viral [118] [112] [112] [121]. A pesar de la estocástica asociada a la contracción de la infección Las actividades humanas en edificios mal ventilados que pulverizan partículas que luego se inhalan (es decir, limpieza, agitación de alfombras, polvo) se identifican con frecuencia entre los pacientes admitidos para el SHCPS [11, 122]. Se cree que las actividades al aire libre transmiten un menor riesgo debido a la labilidad de los hantavirus a la radiación UV y a la supuesta tendencia a dispersarse en el viento, aunque ciertas condiciones ambientales parecen mantener el virus durante períodos más largos fuera de su huésped natural, lo que permite la transmisión indirecta [123]. Una vía alternativa pero poco común de transmisión del virus es la mordedura de roedores [124] [125] [126]. Los trabajadores sobre el terreno que manipulan mamíferos corren un riesgo potencialmente mayor de exposición a infecciones por hantavirus, aunque cuando se cuantifica a través de serosurveys el riesgo absoluto parece bastante leve [127]. Un nuevo estudio en Colorado sugiere la posibilidad de que una picadura de roedor haya sido el vehículo próximo para la transmisión al aire libre de NVS [128], lo que vuelve a enfatizar el uso de equipo de protección personal durante las actividades de trabajo de campo [129]. Como caso particular dentro de los hantavirus, la transmisión de persona a persona ha sido documentada exclusivamente para el virus de los Andes sudamericanos [130] [133] [133] [135]. La identificación de esta vía de transmisión se ha hecho utilizando tanto herramientas moleculares como encuestas epidemiológicas, pero el mecanismo de transmisión interpersonal no está bien establecido. Curiosamente, ANDV también puede ser derramado por los humanos a través de otros fluidos biológicos como la orina [136], ilustrando las propiedades particulares que diferencian este virus de otros hantavirus. Aunque la transmisión interpersonal parece ser única para ANDV, el ARN viral de PUUV se ha detectado en la saliva de pacientes con HFRS, y algunos pacientes con SNV-HCPS tienen ARN viral en las secreciones traqueales [88, 137]. Los Hantavirus en las Américas son alojados naturalmente por roedores (Muridae y Cricetidae) así como las musarañas (Soricidae) y los lunares (Talpidae) (Figura 1). Tres especies de musgo y un mole han sido reportados para albergar hantavirus y su patogenicidad para los humanos permanece desconocida [22, 138, 139]. Se han identificado al menos 15 especies de roedores como portadores de diferentes hantavirus patógenos, con algunos genotipos sudamericanos como Castelo do Sonhos (CDSV) o Hu39694 sólo identificados después de infecciones humanas (Figura 1 ). Los hantavirus suelen mostrar una alta especificidad de especie y ningún huésped intermedio [140]. Sin embargo, se han descrito algunos genotipos de hantavirus en la misma especie de roedores. Tal es el caso de Playa de Oro (OROV) y Catacamas (CATV) identificados en Oryzomys couesi [141, 142], o Maporal (MAPV) y Choclo (CHOV) hospedados por O. fulvescens [91, 143]. En América del Norte se han detectado virus de muleshoe y Black Creek Canal hanta en sigmodon hispidus [ Además, un genotipo de hantavirus (por ejemplo, el virus similar a Juquitiba) puede ser transportado por más de una especie de roedores (O. nigripes, Oxymycterus judex, Akodon montesis). Otro ejemplo es el virus Laguna Negra (LANV) que después de ser identificado en Calomys laucha [146] también ha sido reportado en C. callosus [147]. El rápido aumento en el descubrimiento de nuevos hantavirus y la identificación de sus anfitriones no parece probable que termine tan pronto como se examinen nuevas especies pequeñas de mamíferos [95]. Este tema se complica por la continua controversia en los criterios para la clasificación de distintos hantavirus [148, 149], que también está vinculado a la clasificación taxonómica y los reordenamientos taxonómicos. La transmisión de especies cruzadas es un proceso importante durante la propagación, aparición y evolución Particularmente dentro de los hantavirus, los derrames a los huéspedes secundarios se identifican cada vez más a medida que se realizan estudios más extensos [151] [152] [153] [155] [156]. Por ejemplo, ANDV es el agente etiológico predominante del HCPS en América del Sur, y O. longicaudatus el principal reservorio de roedores. Derrama en al menos otras cuatro especies de roedores que coocurren con el reservorio se han identificado, con Abrothrix longipilis mostrando la segunda mayor prevalencia de anticuerpos de ANDV, y actualmente no hay duda de que el virus es extremadamente similar genéticamente entre los dos roedores del huésped [157, 158]. En América del Norte, el derrame del virus Bayou (BAYV) puede haber ocurrido desde el reservorio principal de O. palustris a S. hispidus, R. fulvescens, P. leucopus y B. taylori [159] [160] [161]. Es más probable que el derrame del virus Hanta se produzca con poblaciones de acogida que habitan regiones simpatricas o sintópicas [151, 162], y la transmisión de especies cruzadas tendría probablemente mayores posibilidades de éxito si las especies anfitrionas están estrechamente relacionadas [163]. Se encuentra una excepción interesante entre el virus Oxbow (OXBV) y el virus Asama (ASAV) en el que un proceso de cambio de huésped parecía haber ocurrido entre mamíferos pertenecientes a dos familias (Talpidae y Soricidae), probablemente como resultado de la codivergencia alterna y recurrente de ciertos tax Los hantavirus son transmitidos horizontalmente entre roedores y no son transmitidos por artrópodos (a diferencia de otros virus de la familia Bunyaviridae). La infección por derrapadores a mamíferos no humanos generalmente no produce ninguna transmisión hacia adelante (o a fin de morir), pero si los seres humanos están infectados pueden resultar en una alta morbilidad y mortalidad [122, 164]. Durante la primavera de 1993, un brote de pacientes con HCPS debido a SNV ocurrió en los estados de Four Corners, resultando en más del 60% de casos de mortalidad entre los casos iniciales, muchos de los cuales involucran a miembros de la tribu Navajo [12, 121]. En Panamá, se notificó un brote durante 1999-2000 en Los Santos, y 12 casos donde se identificaron con tres muertes [165, 166]. Esto representó el primer informe de infecciones por hantavirus humanos en América Central. En América del Sur, Diecisiete individuos fueron identificados con anticuerpo NVS (ELISA) o fueron antígenos (HCI) positivos de 52 casos sospechosos [167]. En 1996 ocurrieron brotes mayores debidos a ANDV en el sur de Argentina [131, 134] ; en el sur de Chile se presentaron grupos de pacientes con enfermedad por hantavirus en 1997 [158]. En Brasil, el primer brote fue identificado en la Amazonía Brasileña (Estado de Maranhão) en el año 2000, e involucró pequeños pueblos que resultaron en una prevalencia del 13,3% de los evaluados (398 residentes totales) [168]. Los factores que desencadenan los brotes de hantavirus todavía son mal entendidos, probablemente porque resultan de varias características bióticas y abióticas interactuantes cuyos parámetros clave son difíciles de modelar. Sin embargo, el uso de nuevos enfoques de modelado que involucran características geográficas y ambientales parece ser prometedor a la hora de predecir posibles brotes de hantavirus y/o áreas de mayor riesgo [169] [170] [171] [172]. Debido a que se sabe que los hantavirus se transmiten directamente de los huéspedes infectados a los susceptibles, el primer enfoque natural es relacionar los brotes con la ecología de los huéspedes virales. La transmisión y persistencia del hantavirus en las poblaciones de roedores depende de varios factores que interactúan para afectar la dinámica ecológica del huésped, que a su vez está fuertemente influenciada por las características de comportamiento de las especies de roedores individuales, a la estructura paisajística y a las características ambientales [173, 174]. La transmisión viral depende de las tasas de contacto entre los huéspedes sensibles, y a pesar de la noción prevaleciente de que un aumento de la densidad se encuentra y, por lo tanto, de Además, se ha demostrado que la transmisión de NVS sigue un patrón de heterogeneidad de contacto, donde los individuos de la población tienen diferentes probabilidades de transmitir la infección [176]. La comprensión de la transmisión viral resulta ser mucho más compleja cuando especies distintas del principal huésped del reservorio se incorporan en el modelo. De hecho, estudios recientes han demostrado que la mayor diversidad de especies hospedantes está correlacionada con una menor prevalencia de infección en América del Norte para P. maniculatus [177], en América Central para O. fulvescens (reservorio del virus Choclo) y Zygodontomys brevicauda (reservorio del virus Calabazo) [178], y en América del Sur para Akodon montensis (reservorio del virus Jabora) [162]. Las tasas de contacto varían según la distribución espacial de las poblaciones y parecen estar Por ejemplo, la prevalencia de SNV en P. maniculatus fue mayor en paisajes con mayor grado de fragmentación del hábitat preferido [179]. Además, ciertas propiedades del paisaje como elevación, pendiente y cubierta terrestre parecen ser útiles para detectar áreas con infecciones persistentes de SNV, y por lo tanto se consideran áreas refugiales donde el virus puede mantenerse durante años [169]. Los cambios en el entorno natural de las especies de reservorios, como la fragmentación forestal y la pérdida de hábitat, pueden alterar la abundancia y distribución de la población y provocar brotes de hantavirus, como se observa en la Península de Azurero de Panamá [118, 119]. Además, las diferencias en el microhábitat, incluida la cubierta superficial, pueden conducir a diferencias en la dinámica ecológica dentro de las poblaciones y afectar a la tasa de exposición al virus [180]. Se han encontrado diferencias en las infecciones por hantavirus a través de paisajes contrastantes en el intervalo latitudinal en poblaciones de roedores de O. longicaudatus en Chile, lo que sugiere que los seres humanos están expuestos de manera diferencial al virus [107, 181]. La dinámica poblacional de roedores se ve afectada por cambios estacionales de clima y clima [182, 183]. En el caso de los brotes asociados a ENSO, se ha postulado una compleja cascada de eventos desencadenados por lluvias altamente inusuales en el año precedente para dar lugar a un aumento de la producción primaria y densidades de roedores, aumentando también la probabilidad de transmisión del virus a los seres humanos, pero ha resultado difícil demostrar con precisión los eventos intermedios sugeridos, como el aumento de las densidades de roedores en el aumento de la carga de casos [116, 121, 184]. En América del Sur, los efectos del cambio climático y los brotes de hantavirus no han sido bien estudiados, a pesar del conocimiento de que varias especies de roedores que son reservorios de enfermedades emergentes se han visto dramáticamente afectadas por eventos como El Niño [185]. Los cambios en la dinámica de la población de acogida también se ven afectados por la estacionalidad, lo que puede conducir a brotes de enfermedades cuando se interrumpen los procesos que equilibran las poblaciones de roedores de temporada en temporada [186]. La emergencia viral puede seguir promoviéndose a medida que los cambios introducidos por el ser humano continúan aumentando en el medio ambiente a diferentes escalas geográficas. Estos cambios también pueden alterar la estructura y dinámica de la población de roedores e interacciones interespecies creando condiciones que pueden conducir a brotes virales, establecimiento viral en nuevos hospederos, y la aparición de HCPS [102, 162], incluso con aparentemente leve perturbación ecológica al sistema virus-hospedero [188]. Ciertas características fisiopatológicas, incluyendo trombocitopenia y shock, de enfermedades por hantavirus de los seres humanos, tienen similitud sustancial con las fiebres hemorrágicas inducidas por otros virus tales arenavirus, filovirus y flavivirus, a pesar de compartir esencialmente ninguna secuencia similitud con ellos. Tales observaciones plantean preguntas acerca de si tales similitudes en la patogénesis son probables similitudes de fenotipo, o en cambio reportan la presencia de mecanismos moleculares comunes entre los virus. En esta revisión se discuten las propiedades generales, descubrimientos y epidemiología/ecología de las formas de hantavirus patógenos del Nuevo Mundo, y también se busca identificar algunas de las características de las macromoléculas virales y mecanismos inmunológicos que se han propuesto como potenciales mediadores directos de los eventos patógenos que caracterizan la enfermedad humana HCPS. Si bien es poco probable que la expresión de una proteína viral particular o ARNs en aislamiento se pueda confiar en replicar fenotipos clave de infección por el virus completo, algunos de los hallazgos han sido suficientemente consistentes con lo que se conoce de la patogénesis in vivo que ofrecen plomos plausibles de primer paso en la búsqueda de objetivos terapéuticos. Esperamos con interés las revelaciones mecanísticas que seguirán el uso inevitablemente ampliado de métodos poderosos como la secuenciación profunda, imágenes cada vez más avanzadas, y métodos microscópicos, y modelos animales que por fin se pueden decir

¿Cuál es el carácter de la fuga resultante?

Los hantavirus en las Américas y su papel como patógenos emergenteshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3185593/SHA: efe13a8d42b60ef9f7387ea539a1b2eeb5f80101Autores: Hjelle, Brian; Torres-Pérez, FernandoFecha: 2010-11-25DOI: 10.3390/v2125559Licencia: cc-byAbstract: La continua aparición y reaparición de patógenos representan una amenaza continua, a veces mayor, para las poblaciones. Los hantavirus (familia Bunyaviridae) y sus enfermedades humanas asociadas se consideraron confinados a Eurasia, pero la aparición de un brote en el suroeste de Estados Unidos llevó a un gran aumento en su estudio entre los virólogos de todo el mundo. Se han descrito más de 40 genotipos hantavirales, la gran mayoría desde 1993, y casi la mitad de ellos patógenos para los seres humanos. Los hantavirus causan infecciones persistentes en sus reservorios, y en las Américas, la enfermedad humana se manifiesta como compromiso cardiopulmonar, síndrome cardiopulmonar del hantavirus (HCPS), con proporciones de casos-fatalidad, para los serotipos virales más comunes, entre el 30% y el 40%. Alteración del hábitat y trastornos ecológicos a mayor escala, tal vez incluyendo el cambio climático, son algunos de los factores que pueden haber aumentado la carga de casos humanos de HCPS entre 1993 y el presente. Consideramos aquí las características que influyen en la estructura de la dinámica de la población huésped que pueden conducir a brotes virales, así como los determinantes macromoleculares de los hantavirus que han sido considerados como potenciales contribuciones a la patogenicidad. Texto: Los patógenos emergentes causan enfermedades nuevas o no reconocidas anteriormente, y entre ellas, las zoonóticas emergentes son una preocupación importante entre los científicos que estudian enfermedades infecciosas a diferentes escalas espaciales y temporales [1, 2]. Los cambios en las condiciones bióticas y abióticas pueden alterar la dinámica de las enfermedades de la población y conducir a la aparición de infecciones zoonóticas [3] [5] [6]. Durante las últimas décadas, se han producido varios brotes de patógenos virales emergentes y reemergentes, que afectan tanto a la implicación puramente local como a nivel mundial/pandémica de las poblaciones humanas. Entre los ejemplos visibles están la gripe A, el virus del Ébola, el virus de la hepatitis C, el trastorno respiratorio grave para adultos (SARS), el coronavirus y el virus de la inmunodeficiencia humana, que desafían las medidas de prevención y control de los sistemas de salud pública [7]. En las Américas, el reciente brote de gripe pandémica A subtipo H1N1 se convirtió en un objetivo importante de control debido a su rápida propagación, y las incertidumbres en cuanto a virulencia y transmisibilidad, sin embargo, la disponibilidad de vacunas fue limitada cuando se produjo una actividad significativa antes de la temporada tradicional de gripe [8]. Sin embargo, en el último siglo han surgido o resurgido brotes de varias enfermedades virales relacionadas con el virus arenavirus y el virus del dengue, y más recientemente, hantavirus y la expansión del rango geográfico del virus del Nilo Occidental. Entre las enfermedades zoonóticas, los mamíferos pequeños son anfitriones de varios virus ARN patógenos, especialmente Arenaviridae y Bunyaviridae: Hantavirus [9] [10] [11]. Las infecciones por hantavirus se convirtieron en una preocupación en las Américas después de la descripción de un brote de distrés respiratorio agudo ocurrido en La enfermedad recientemente reconocida, el síndrome cardiopulmonar del hantavirus, el HCPS (o síndrome pulmonar del hantavirus), se relacionó con la infección por el virus del Sin Nombre (SNV) recién descubierto, y el roedor Peromyscus maniculatus (ratón venado) fue identificado como el reservorio [13]. Sin embargo, las infecciones por hantavirus tienen una historia mucho más larga. Una revisión de los escritos chinos antiguos, que datan de aproximadamente 960 dC, reveló descripciones muy parecidas a la fiebre hemorrágica con síndrome renal (HFRS), el síndrome causado por los hantavirus del Viejo Mundo [14]. Durante el siglo XX, los casos de enfermedad febril aguda con compromiso renal fueron descritos de varios países eurasiáticos y Japón, a menudo en asociación con compromisos militares [15]. El HFRS como síndrome distinto, sin embargo, fue llamado por primera vez a la atención de la medicina occidental en asociación con un brote que ocurrió entre las tropas de las Naciones Unidas durante el conflicto coreano entre 1951 y 1954, donde más de 3.200 soldados fueron afectados [16]. Tomó más de dos décadas hasta que el agente etiológico, el virus Hantaan (HTNV), fue aislado del ratón de campo rayado Apodemus agrarius, detectado en parte por la unión de anticuerpos de muestras de suero de paciente a los tejidos pulmonares de ratones de campo sanos y salvajes [17, 18]. El virus se encontró más tarde para representar la especie tipo de un nuevo género Hantavirus de la familia Bunyaviridae, aunque fue más tarde evidente que el primer hantavirus a aislarse fue el virus Thottapalayam de shrew-borne [19]. La categorización de los hantavirus como pertenecientes a la familia Bunyaviridae se debe en parte a la presencia consistente de tres genomas de ARN que son circularizados in vivo como resultado de la presencia de nucleótidos terminales complementarios que ayudan a doblar el genoma en una morfología -hairpin-, descrita por primera vez para el flebovirus Uukuniemi [19, 20]. La Tabla 1 es una lista de los hantavirus patógenos predominantemente distintos serológicamente. Se describen muchos otros genotipos llamados, pero tales otras formas patogénicas están generalmente estrechamente relacionadas con los Andes o, en algunos casos, el virus Sin Nombre. Durante la maduración del virus, el precursor forma GPC se procesa utilizando una proteasa unida a la membrana en Gn y Gc, una escisión que ocurre, y parece ser señalada, después de la señal péptida conservada WAASA en la C-terminal de Gn [24]. Aunque las dos proteínas se pueden expresar de forma independiente a través de la transfección, pueden ser retenidas en el compartimento celular incorrecto (ER o aggrosome); por lo tanto, deben ser co-expresadas para permitirles estabilidad para que las dos se puedan ensamblar correctamente en el Golgi [25, [27] [28]. Se han identificado varias actividades y propiedades para las glicoproteínas envolventes del hantavirus, incluyendo algunas características que se sospecha que están involucradas en la patogenicidad de los serotipos causantes de la enfermedad, una posibilidad que ha generado atención experimental. Las glucoproteínas son los ligandos conocidos o presuntos para al menos dos receptores celulares distintos, la cadena de integrina y el factor acelerador de la descomposición, o DAF [30, 31] ; con gC1qR/p32 también identificado como otro receptor de entrada potencial [32]. Comparaciones con la proteína E del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, llevaron a Tischler et al. a considerar la glicoproteína Gc como una proteína potencial de fusión de clase II, tal vez impartiendo actividad de fusión al virión, y esta hipótesis ha ganado apoyo en otros estudios [33, 34]. Se han identificado actividades adicionales con, o se afirma que están relacionadas con, Gn. Para muchos de estos estudios, una premisa subyacente ha sostenido que hay diferencias entre las glicoproteínas de hantavirus -patógenos en relación con virus en el género que se denominan Si bien es cierto que aún no ha sido posible vincular el virus de Prospect Hill (PHV) con la enfermedad humana, la ausencia de evidencia de su patogenicidad tal vez no debería equipararse con la evidencia de su ausencia. Sólo se podría considerar que el nivel de enfermedad (por ejemplo, letargo, fiebre, proteinuria y azotemia) asociado con la infección de primates no humanos por PHV no es significativamente diferente del registrado para los modelos de primates no humanos utilizando el virus conocido del patógeno Puumala (PUUV) [35, 36]. Para el propósito de esta discusión, presumiremos que los hantavirus apatogénicos son efectivamente apatogénicos. Mientras que algunos estudios han sugerido que las glicoproteínas Gn se dirigen más rápidamente a la vía ubiquitina-proteosoma que a las formas apatogénicas, otros han interpretado las diferencias en el manejo de las glicoproteínas Gn a través de especies de hantavirus por el sistema ubiquitina-proteosomal como independientes de la patogenicidad [37] [38] [39]. Algunos investigadores han dirigido sus esfuerzos hacia la identificación de una capacidad diferencial, ya sea cinética o de magnitud absoluta, en la capacidad de los hantavirus patógenos y apatogénicos para provocar una respuesta de interferón en las células. Una premisa que surge es que las formas apatogénicas tenderían a inducir una respuesta innata anterior que haría más probable que el virus se limpiara rápidamente o se volviera menos competente en su replicación, a fin de evitar cualquier respuesta patológica en el huésped [42] La respuesta innata anti-hantavirus puede en algunos casos ser atribuida a la interacción viral como ligando de TLR-3, pero no en otros, y en las células endoteliales, no parece requerir más que la partícula viral misma, incluso cuando se introduce en forma replicativa incompetente [43, 44]. Las proteínas y los ARNm inducidos prominentemente por los hantavirus incluyen MxA e IFIT-1 (ISG-56) y otros incluyendo algunos con actividad antiviral conocida o sospechada. Esos hantavirus, a menudo cepas altamente patógenas, que no inducen una respuesta antiviral potente, se sospechan o se presume que tienen un (más) potente mecanismo de antagonismo interferón-vía en relación con otros virus, un mecanismo que actúa positivamente para prevenir que se forme una respuesta innata efectiva, al menos temprano en la infección Sin embargo, se reportan algunos casos en los que los hantavirus altamente patógenos, tales como NVS, también son capaces de inducir la expresión de los ARNm del gen estimulado por interferón, incluso muy temprano en la infección, con proteínas ISG, como se esperaba, tardando más tiempo en aparecer en la célula [44]. Las actividades anti-interferón también se han atribuido a la proteína NSs que se puede elaborar en células infectadas por serotipos que codifican esta proteína [46]. Otros investigadores han examinado las actividades de las glucoproteínas del hantavirus y otras proteínas que podrían afectar directamente a algunos aspectos de la progresión patogénica asociada a la infección por hantavirus en humanos, tales como cambios de permeabilidad vascular. Mientras que los primeros intentos de causar directamente aumentos en la permeabilidad de las monocapas endoteliales con partículas virales o infección viral fueron en gran medida decepcionantes, los hantavirus se han identificado como que afectan adversamente la migración endotelial sobre los sustratos y en la potenciación de la permeabilidad endotelial inducida por VEG-F [47, 48]. La proteína nucleocápsida o N más corta (+50 kD) es un componente estructural del nucleocápsido viral, junto con los segmentos de ARN viral genómico. Como proteína de unión al ARN que afecta a la horquilla del cabello de los segmentos genómicos con alta afinidad [49, 50], limita el acceso del ARN para alojar nucleasasas y ayuda a hacer que la replicación viral sea un proceso cerrado dentro del citoplasma. También actúa como una proteína de membrana periférica, al igual que la proteína L [51], una actividad que podría jugar un papel en su supuesta, pero aún no demostrada función como matriz [52]. Hasta hace poco, no se había apreciado que N tuviera una amplia variedad de otras actividades, algunas de las cuales pueden estar vinculadas, no sólo a los requisitos fundamentales de replicación, sino también a la interferencia con una serie de procesos intracelulares de la célula normal. Así, se ha propuesto una interacción entre el aminoterminal de la proteína N del hantavirus y la proteína celular Daxx, con la sugerencia de posibles consecuencias pro-apoptóticas [51]. N también se reporta que interactúa con microfilamentos actínicos, y la proteína SUMO-1 [53, 54]. Utilizando ensayos basados en el gen reportero, Connie Schmaljohn y sus colegas han informado que la proteína nucleocapsid del virus Hantaan tiene un papel inhibidor en las respuestas inflamatorias mediadas por NF kappa B (NF- â € € TM B). Los efectos sobre la expresión NF- € B parecen estar limitados a la prevención de su translocación nuclear después de su intento de activación con lipopolisacárido, LPS [55]. En el citoplasma de las células infectadas, la proteína N se puede encontrar en los cuerpos celulares P donde secuestra y protege los capuchones de 5'. Puede localizar los capuchones a través de su interacción con DCP1, un componente clave de los cuerpos P. Durante la infección por hantavirus, los ARN virales se concentran en los cuerpos P, a través de su interacción con N y DCP1. La proteína N demuestra la protección preferencial de los ARNm diseñados para terminar prematuramente su proteína codificada en comparación con los ARNm nativos [56]. La proteína N se ha vinculado cada vez más a la replicación y traducción virales, a veces de maneras no previstas anteriormente. Se encuentra entre una familia creciente de diversas proteínas virales que pueden servir como un inespecífico - ARN chaperone ®, una actividad que debe facilitar el acceso de la L polimerasa al ARNv para la transcripción y replicación, en que puede disociar transitoriamente estructuras de ARN mal dobladas [57]. Algunos de los efectos de la proteína N en la traducción no pueden ser inmediatamente reconocidos como adaptables en la naturaleza. Puede reemplazar todo el complejo de iniciación traslacional EIF4F, presentando simultáneamente el ribosoma con un reemplazo de la actividad de unión de la tapa de eIF 4E, uniéndose al complejo de pre-iniciación 43S, al igual que eIF 4G, al tiempo que reemplaza la actividad helicoidal de eIF 4A, que se presume que es necesaria para disociar la estructura de ARN de orden superior [56, 58]. Estos tres factores normalmente trabajan juntos para lograr la iniciación traslacional. En los cuerpos P, la capacidad de la proteína N de unirse a una alta afinidad a los oligoribonucleótidos celulares nativos tapados, junto con su actividad en la protección de ARNs tapados de la degradación, probablemente facilita el acceso de oligonucleótidos encapsulados para su uso en la iniciación transcripcional por L polimerasa (-cap ra Tráfico de N para el ensamblaje viral: Clásicamente, la proteína N en las células infectadas parece estar agrupada o partículas en la naturaleza, con una concentración pesada en una única ubicación perinuclear, ampliamente considerada como la Golgi [27]. Las proteínas N de los hantavirus se encuentran en asociación con fracciones de partículas, y los estudios confocales microscopía y bioquímico-inhibidores han demostrado que las trazas N a lo largo de microtúbulos pero no con filamentos de actina [52]. El destino final de N, para su ensamblaje en partículas virales es la Golgi, y que circula allí a través del complejo intermedio retículo-Golgi endoplasmático (ERGIC), también conocido como cúmulo vesicular-tubular [52]. Un inhibidor negativo dominante, la dinamitina, asociado con el transporte mediado por Los estudios posteriores sugieren que la dependencia específica del transporte microtubular es específica de los hantavirus del Viejo Mundo como el NVH, pero que el Hantavirus del Nuevo Mundo ANDV está asociado con filamentos de actina [59]. Sin embargo, los datos recientes indican que el transporte microtubular es efectivamente utilizado para el NVH del Nuevo Mundo [60]. Las enfermedades del Hantavirus del hombre desde hace mucho tiempo han sido sospechosas de tener una base inmunopatógena en parte debido a su período de incubación relativamente largo de 2-3 semanas y la asociación temporal observada entre los trastornos inmunológicos y la primera aparición de signos y síntomas de la enfermedad del hantavirus. HFRS y HCPS comparten muchas características clínicas, llevando a muchos investigadores a considerar que son, en esencia, diferentes manifestaciones de un proceso patógeno similar, que difieren principalmente en los órganos objetivo primarios de expresión de la enfermedad (Tabla La patogénesis de las infecciones por hantavirus es el tema de una revisión continuamente actualizada en la serie UpToDate [61]. Para el momento en que aparecen los síntomas en el HCPS, ambas respuestas antivirales fuertes, y, para los genotipos virales más virulentos, el ARN viral puede ser detectado en plasma sanguíneo o células sanguíneas nucleadas respectivamente [63, 64]. Al menos tres estudios han correlacionado el ARN viral plasmático con la gravedad de la enfermedad para el HCPS y el HFRS, sugiriendo que la replicación del virus juega un papel continuo y en tiempo real en la patogénesis viral [65] [66] [67]. Se han identificado varios cambios patológicos distintivos que ocurren tanto en el HFRS como en el HCPS. Una característica crítica de ambos es una fuga capilar transitoria (~ 1-5 días) que involucra el La fuga resultante es de carácter exudativo, con una composición química alta en proteínas y similar al plasma. La experiencia continua que indica el fuerte tropismo tisular para las células endoteliales, específicamente, es uno de los varios factores que hacen de la integra β3 un candidato especialmente atractivo como un importante receptor in vivo para los hantavirus. Es probable que los hantavirus lleguen a sus tejidos objetivo a través de la captación por los ganglios linfáticos regionales, tal vez con o dentro de un histiocito pulmonar escoltante. Las semillas del virus endotelio local, donde las primeras células infectadas dan lugar, en última instancia, a una viremia primaria, un proceso que parece tomar mucho tiempo para las infecciones por hantavirus [62, 63]. En el momento en que emerge la viremia secundaria, los agentes de las formas más severas de HFRS y HCPS han comenzado a alcanzar una masa suficiente para inducir, a través de las interacciones PAMP-PRR y otros medios, la expresión de citoquinas proinflamatorias [64]. Para HCPS, esa expresión favorece el lecho pulmonar y los órganos linfoides, pero, por razones desconocidas, ahorra el retroperitoneo y, en general, el riñón. En HFRS la situación se invierte, y sin embargo no se aprecia a menudo que el esperado tropismos tisulares preferentes de virus asociados a HFRS y sus contrapartes asociadas a HCPS para los lechos renal y pulmonar, respectivamente, no es como se predeciría a través de las manifestaciones de las dos enfermedades. La elaboración local de mediadores inflamatorios y quimiotácticos se considera un requisito para el desarrollo de Sin embargo, no es la hipoxemia, debido al edema pulmonar prominente, lo que conduce a la muerte en la mayoría de los casos fatales de HCPS, sino más bien la intoxicación del corazón por mediadores como aún no definidos, lo que conduce al estado de bajo gasto cardíaco y al síndrome de shock asociado [64, 65]. Es tentador especular que los mediadores producidos en el pulmón en conexión con el infiltrado inflamatorio pueden infiltrarse a través de la circulación coronaria con dilución mínima en HCPS, consecuencia desventajosa de la estrecha yuxtaposición anatómica de los dos órganos. Así, al menos tres clases de mecanismos potenciales, algunos superpuestos y todos ciertamente no exclusivos de los otros, podrían presumirse que subyacen a la patogénesis del HCPS. Estos incluyen:(1) Mecanismos inmunes innatos. La naturaleza de las interacciones entre los patrones moleculares asociados al patógeno del hantavirus (PAMP) y los receptores de reconocimiento del patrón (PRR) de las células endoteliales susceptibles comienzan a ser aclaradas. El HTNV prototípico parece ser reconocido por TLR-3 [43]. Tal infección tiene consecuencias tales como una mayor expresión del HLA-DR en las células dendríticas [66] y la diferenciación de los monocitos hacia las células dendríticas [67]. (2) Efectos virales directos. La correlación observada entre la carga viral y la gravedad de la enfermedad deja abierta la posibilidad de que las partículas del hantavirus o el ARN puedan tener efectos tóxicos sobre las células o sobre la señalización. Algunos investigadores han favorecido la toxicidad viral directa, actuando a través de la inhibición de la función de barrera celular endotelial, como una explicación de gran parte de la fuga capilar, aunque existe Una pista potencialmente importante hacia el mecanismo por el cual las infecciones por hantavirus agotan las plaquetas sanguíneas y, en algunos casos, causan manifestaciones hemorrágicas, fue avanzada por el reciente descubrimiento de que los hantavirus patógenos son capaces de reclutar plaquetas para adherirse a las superficies celulares endoteliales, con β3 integrina utilizada como elemento de unión crítica [69]. (3) Efectos patógenos causados por las actividades de macromoléculas virales específicas. Hemos revisado algunas de las actividades asociadas con los Gn, Gc y N, polipéptidos codificados viralmente en secciones anteriores. Modelos de prueba de patogénesis se pueden hacer más eficazmente cuando hay un modelo animal que imita aspectos clave de la enfermedad. No existe un modelo similar al HFRS, pero existen modelos animales para el transporte asintomático de PUUV y SNV por sus roedores portadores nativos, el banco vole Myodes glareolus y el ratón de venado P. maniculatus; así como un modelo de hámster sirio utilizando ANDV o el virus Aporal relacionado de Venezuela, para el cual se observa una enfermedad mimética HCPS [70] [71] [72] [73]. El modelo de hámster ANDV-Sirio tiene una serie de características en común con la enfermedad humana, así como algunas diferencias. A diferencia de las enfermedades neurológicas que han sido posibles de provocar con HTNV, el modelo de hámster para HCPS parece ser causado por fugas capilares que resultan en edema pulmonar y la producción de un derrame pleural con características exuda Típicamente los hámsteres mueren entre 11 y 14-d post-inoculación, reflejando un período de incubación ligeramente acelerado en comparación con las infecciones humanas. Al igual que con el HCPS humano, el examen microscópico del pulmón revela abundante deposición de fibrina, septo alveolar engrosado y antígeno viral expresado abundantemente en el endotelio microvascular. Los hámsteres infectados por ANDV equipados con dispositivos de monitoreo fisiológico mostraron disminución de las presiones de pulso, taquicardia e hipotensión que parecen imitar de cerca el shock que se cree que es la causa próxima de la muerte en pacientes que sucumben al HCPS [65, 74]. En comparación con la enfermedad humana, los hámsteres infectados por ANDV exhiben títulos excepcionalmente altos de ANDV vivo en sus tejidos, con gran parte de la replicación viral que ocurre en Los títulos de ANDV vivo en algunos casos superan los 10 8 /g, mientras que los aislados de hantavirus de los tejidos humanos han sido notoriamente difíciles de obtener. A pesar de la aparición universal de enzimas hepáticas levemente elevadas en pacientes con HCPS, las enzimas hepáticas no parecen estar presentes en niveles elevados en la sangre de hámsters enfermos incluso inmediatamente antes de la muerte [75]. El período prolongado de incubación asociado con la enfermedad por hantavirus da al huésped un tiempo considerable para montar una respuesta inmune madura contra el virus. Así, en contradición a infecciones de gravedad comparable y sintomatología relacionada asociada con arenavirus y filovirus, las infecciones por hantavirus en humanos se asocian con respuestas anticuerpos de título significativo por el momento en que comienzan los síntomas. A pesar de esta observación, parece ser posible que la variación natural en las respuestas individuales de anticuerpos neutralizantes entre los pacientes con infecciones por NVS pueda estar relacionada con la gravedad de la enfermedad, lo que sugiere que la administración de anticuerpos antivirales podría resultar efectiva terapéuticamente [76]. En el caso de la infección por ANDV, han surgido nuevas evidencias que indican que el aparente aclaramiento del virus de la sangre no resulta en la eliminación completa del estímulo antigénico por el virus, sugiriendo que el virus puede persistir, tal vez en algún sitio inmunológicamente privilegiado aún indeterminado [77]. Un papel para las respuestas patológicas mediadas por células T en el HFRS y el HCPS ha sido la fuente de especulación por una variedad de razones. La gravedad del SNS asociado al SNCP puede haber hecho más evidente que el inicio del edema pulmonar, la taquicardia y la hipertensión parecía estar todo, pero universalmente asociado temporalmente, con la aparición de un espectro de células altamente activadas del linaje linfoide en la sangre periférica. Se detectaron células con similitudes morfológicas cercanas a estos -inmunoblastos- en los pulmones congestionados y pesados de los pacientes que llegaron a la autopsia, así como en órganos linfoides y en las tríadas portal [63, [78] [79] [80]. Estas observaciones llevaron a especular que algún componente de la patogénesis por hantavirus podría estar vinculado a la aparición de células T antivirales que podrían estimular o contribuir a la aparición de una -tormenta de mediadores y el fenotipo de fuga capilar asociado. Estudios posteriores han confirmado la expectativa de que una fracción significativa de la población de inmunoblastos en pacientes con HCPS son células T con especificidad para epitopes específicos de antígenos virales de clase I presentados por el HLA, incluyendo Gn, Gc y N [77, [81] [82] [83]. Presumiblemente, las actividades antivirales de estas células, manifestadas en parte por su elaboración de mediadores en el intersticio afectado, pueden contribuir a la fuga endotelial/capilar que se encuentra en el corazón de la patogénesis del hantavirus. Debido a que los primeros casos de HCPS a menudo llegaron a la autopsia, se hizo posible examinar tejidos necropsiados para la expresión de citocinas. El estudio de Mori et al. (1999) revelaron una alta expresión relativa de citocinas proinflamatorias incluyendo TNF-, IL-1-, IL-6, proporcionando evidencia a favor de un modelo de tormenta de citoquinas para la patogénesis [64]. Los autores creían, basándose en la morfología de las células secretadoras de citoquinas, que tanto monocitos como linfocitos estaban contribuyendo a la producción de citocinas. Que los mediadores proinflamatorios se encuentran en niveles elevados en el plasma, así como el intersticio renal de pacientes con enfermedad hantaviral aguda se ha reconocido desde hace algún tiempo también [84, 85]. Si bien el diagnóstico de HCPS y HFRS se realiza mejor con serología IgM, en la etapa aguda de la infección por NVS, también se puede utilizar RT-PCR si se utilizan células sanguíneas o coágulos de sangre en lugar de plasma o suero, donde la sensibilidad incluso utilizando imprimaciones PCR anidadas disminuye a cerca del 70% [86] [87] [88]. En una instalación en la que se tratan muchos casos de HCPS, el centro médico de la Universidad de Nuevo México en Albuquerque, se ha ofrecido un servicio de diagnóstico en el que se analizan los hallazgos hematológicos del paciente para establecer la probabilidad de que un paciente tenga HCPS. La combinación de trombocitopenia, abundancia elevada de linfocitos -inmunoblasto-, población de células polimorfonucleares con desplazamiento izquierdo sin evidencia morfológica fuerte para su activación, y valores elevados de hemoglobina o hematocrito es altamente específica para el HCPS y permite a los clínicos la capacidad de poner pacientes presuntivos-HCPS en oxigenación de membrana extracorpórea (ECMO), que se cree que ha salvado a muchos pacientes de un resultado letal [89]. Se cree que la infección humana por hantavirus sigue el contacto con secreciones o excreciones producidas por roedores infectados. En los Estados Unidos, 538 infecciones humanas por hantavirus fueron reportadas hasta finales de diciembre de 2009 [90], con Nuevo México, Arizona y Colorado mostrando los casos más altos. Mientras que el prototípico hantavirus centroamericano en América Central fue el virus Rio Segundo de Reithrodontomys mexicanus de Costa Rica, la primera enfermedad humana apareció algunos años más tarde en Panamá, donde el virus Choclo (CHOV) surgió como el agente etiológico y se cree que es responsable de todos los casos conocidos de HCPS. La rata de arroz pigmeo fulvo Oligoryzomys fulvescens ha sido identificada como el reservorio de roedores [91]. En Panamá, los primeros casos de HCPS, aunque con poca o ninguna implicación cardiaca evidente, fueron reportados en 1999, y desde entonces, 106 infecciones humanas han ocurrido con una tasa de mortalidad del 26% [92]. Seroencuestas de mamíferos en México y Costa Rica han encontrado anticuerpos antihantavirus [93] [94] [95] [96], y se han notificado seroprevalencias que oscilan entre 0,6 y 1,6% en poblaciones humanas a pesar de la ausencia de casos conocidos de HCPS [97]. En América del Sur, los casos de HCPS se han identificado en Argentina, Bolivia, Brasil, Chile, Paraguay y Uruguay, y también se han notificado evidencias de exposición humana a hantavirus en Venezuela [98] y Perú [99]. En América del Sur, ANDV es el principal agente etiológico con casos en Chile y Argentina notificados desde 1995. En Chile, se han producido 671 casos de HCPS debido a ANDV durante el período 2001-2009 [100]. Desde 1995 se han reportado más de 1.000 casos de HCPS en Argentina [101] ; en el Brasil se han identificado aproximadamente 1.100 casos de HCPS entre 1993 y 2008 [102]. Las tasas de mortalidad por casos en esos tres países han sido similares, oscilando entre el 30% (Argentina), el 36% (Chile) y el 39% (Brasil). Las infecciones por Hantavirus ocurren con más frecuencia en hombres que en mujeres, aunque la proporción entre hombres y mujeres es muy variable. Por ejemplo, las comunidades panameñas mostraron una proporción de 55 hombres por 45 mujeres [103], mientras que en Chile la proporción es más sesgada por hombres (71%) [104]. En el Chaco paraguayo la proporción entre hombres y mujeres se aproxima al 50% [105]. En América del Norte, en diciembre de 2009 el 63% de los pacientes eran varones [90]. Todos los grupos étnicos y raciales parecen ser susceptibles a infecciones por el hantavirus, y las diferencias entre ciertos grupos (como indígenas y no indígenas) están más probablemente correlacionadas con el tipo de hábitat en el que reside la población (por ejemplo, zonas rurales frente a zonas urbanas). De hecho, las comunidades rurales representan la mayor incidencia global del hantavirus y, por lo tanto, están en mayor riesgo [92, [105] [106] [107] [108] [109] [109] [119], aunque también se ha destacado la importancia de los entornos peridomésticos como una importante zona de exposición [112, 113]. El principal mecanismo por el que los seres humanos adquieren la infección por el hantavirus es la exposición a aerosoles de heces contaminadas de roedores, orina y saliva [114, 115]. Esto puede ocurrir cuando los seres humanos residen en áreas cercanas a las que habitan los roedores, viven en áreas infestadas de roedores, o cuando los roedores invaden entornos humanos, que son más frecuentes en hábitats rurales.Existe una larga historia de coexistencia humana con roedores, lo que plantea dudas sobre el aparente aumento reciente de las enfermedades relacionadas con el hantavirus, especialmente el HCPS. Aparte de una aparente asociación con eventos de oscilación sureña de El Niño (ENSO) en algunas regiones [116, 117], los recientes incrementos en la incidencia del HCPS no parecen seguir un patrón temporal o espacial fácilmente definido. Sin embargo, algunas características del paisaje, como la fragmentación del hábitat o las áreas perturbadas por el ser humano, pueden influir en la dinámica de la población de roedores e impactar en la incidencia viral [118] [112] [112] [121]. A pesar de la estocástica asociada a la contracción de la infección Las actividades humanas en edificios mal ventilados que pulverizan partículas que luego se inhalan (es decir, limpieza, agitación de alfombras, polvo) se identifican con frecuencia entre los pacientes admitidos para el SHCPS [11, 122]. Se cree que las actividades al aire libre transmiten un menor riesgo debido a la labilidad de los hantavirus a la radiación UV y a la supuesta tendencia a dispersarse en el viento, aunque ciertas condiciones ambientales parecen mantener el virus durante períodos más largos fuera de su huésped natural, lo que permite la transmisión indirecta [123]. Una vía alternativa pero poco común de transmisión del virus es la mordedura de roedores [124] [125] [126]. Los trabajadores sobre el terreno que manipulan mamíferos corren un riesgo potencialmente mayor de exposición a infecciones por hantavirus, aunque cuando se cuantifica a través de serosurveys el riesgo absoluto parece bastante leve [127]. Un nuevo estudio en Colorado sugiere la posibilidad de que una picadura de roedor haya sido el vehículo próximo para la transmisión al aire libre de NVS [128], lo que vuelve a enfatizar el uso de equipo de protección personal durante las actividades de trabajo de campo [129]. Como caso particular dentro de los hantavirus, la transmisión de persona a persona ha sido documentada exclusivamente para el virus de los Andes sudamericanos [130] [133] [133] [135]. La identificación de esta vía de transmisión se ha hecho utilizando tanto herramientas moleculares como encuestas epidemiológicas, pero el mecanismo de transmisión interpersonal no está bien establecido. Curiosamente, ANDV también puede ser derramado por los humanos a través de otros fluidos biológicos como la orina [136], ilustrando las propiedades particulares que diferencian este virus de otros hantavirus. Aunque la transmisión interpersonal parece ser única para ANDV, el ARN viral de PUUV se ha detectado en la saliva de pacientes con HFRS, y algunos pacientes con SNV-HCPS tienen ARN viral en las secreciones traqueales [88, 137]. Los Hantavirus en las Américas son alojados naturalmente por roedores (Muridae y Cricetidae) así como las musarañas (Soricidae) y los lunares (Talpidae) (Figura 1). Tres especies de musgo y un mole han sido reportados para albergar hantavirus y su patogenicidad para los humanos permanece desconocida [22, 138, 139]. Se han identificado al menos 15 especies de roedores como portadores de diferentes hantavirus patógenos, con algunos genotipos sudamericanos como Castelo do Sonhos (CDSV) o Hu39694 sólo identificados después de infecciones humanas (Figura 1 ). Los hantavirus suelen mostrar una alta especificidad de especie y ningún huésped intermedio [140]. Sin embargo, se han descrito algunos genotipos de hantavirus en la misma especie de roedores. Tal es el caso de Playa de Oro (OROV) y Catacamas (CATV) identificados en Oryzomys couesi [141, 142], o Maporal (MAPV) y Choclo (CHOV) hospedados por O. fulvescens [91, 143]. En América del Norte se han detectado virus de muleshoe y Black Creek Canal hanta en sigmodon hispidus [ Además, un genotipo de hantavirus (por ejemplo, el virus similar a Juquitiba) puede ser transportado por más de una especie de roedores (O. nigripes, Oxymycterus judex, Akodon montesis). Otro ejemplo es el virus Laguna Negra (LANV) que después de ser identificado en Calomys laucha [146] también ha sido reportado en C. callosus [147]. El rápido aumento en el descubrimiento de nuevos hantavirus y la identificación de sus anfitriones no parece probable que termine tan pronto como se examinen nuevas especies pequeñas de mamíferos [95]. Este tema se complica por la continua controversia en los criterios para la clasificación de distintos hantavirus [148, 149], que también está vinculado a la clasificación taxonómica y los reordenamientos taxonómicos. La transmisión de especies cruzadas es un proceso importante durante la propagación, aparición y evolución Particularmente dentro de los hantavirus, los derrames a los huéspedes secundarios se identifican cada vez más a medida que se realizan estudios más extensos [151] [152] [153] [155] [156]. Por ejemplo, ANDV es el agente etiológico predominante del HCPS en América del Sur, y O. longicaudatus el principal reservorio de roedores. Derrama en al menos otras cuatro especies de roedores que coocurren con el reservorio se han identificado, con Abrothrix longipilis mostrando la segunda mayor prevalencia de anticuerpos de ANDV, y actualmente no hay duda de que el virus es extremadamente similar genéticamente entre los dos roedores del huésped [157, 158]. En América del Norte, el derrame del virus Bayou (BAYV) puede haber ocurrido desde el reservorio principal de O. palustris a S. hispidus, R. fulvescens, P. leucopus y B. taylori [159] [160] [161]. Es más probable que el derrame del virus Hanta se produzca con poblaciones de acogida que habitan regiones simpatricas o sintópicas [151, 162], y la transmisión de especies cruzadas tendría probablemente mayores posibilidades de éxito si las especies anfitrionas están estrechamente relacionadas [163]. Se encuentra una excepción interesante entre el virus Oxbow (OXBV) y el virus Asama (ASAV) en el que un proceso de cambio de huésped parecía haber ocurrido entre mamíferos pertenecientes a dos familias (Talpidae y Soricidae), probablemente como resultado de la codivergencia alterna y recurrente de ciertos tax Los hantavirus son transmitidos horizontalmente entre roedores y no son transmitidos por artrópodos (a diferencia de otros virus de la familia Bunyaviridae). La infección por derrapadores a mamíferos no humanos generalmente no produce ninguna transmisión hacia adelante (o a fin de morir), pero si los seres humanos están infectados pueden resultar en una alta morbilidad y mortalidad [122, 164]. Durante la primavera de 1993, un brote de pacientes con HCPS debido a SNV ocurrió en los estados de Four Corners, resultando en más del 60% de casos de mortalidad entre los casos iniciales, muchos de los cuales involucran a miembros de la tribu Navajo [12, 121]. En Panamá, se notificó un brote durante 1999-2000 en Los Santos, y 12 casos donde se identificaron con tres muertes [165, 166]. Esto representó el primer informe de infecciones por hantavirus humanos en América Central. En América del Sur, Diecisiete individuos fueron identificados con anticuerpo NVS (ELISA) o fueron antígenos (HCI) positivos de 52 casos sospechosos [167]. En 1996 ocurrieron brotes mayores debidos a ANDV en el sur de Argentina [131, 134] ; en el sur de Chile se presentaron grupos de pacientes con enfermedad por hantavirus en 1997 [158]. En Brasil, el primer brote fue identificado en la Amazonía Brasileña (Estado de Maranhão) en el año 2000, e involucró pequeños pueblos que resultaron en una prevalencia del 13,3% de los evaluados (398 residentes totales) [168]. Los factores que desencadenan los brotes de hantavirus todavía son mal entendidos, probablemente porque resultan de varias características bióticas y abióticas interactuantes cuyos parámetros clave son difíciles de modelar. Sin embargo, el uso de nuevos enfoques de modelado que involucran características geográficas y ambientales parece ser prometedor a la hora de predecir posibles brotes de hantavirus y/o áreas de mayor riesgo [169] [170] [171] [172]. Debido a que se sabe que los hantavirus se transmiten directamente de los huéspedes infectados a los susceptibles, el primer enfoque natural es relacionar los brotes con la ecología de los huéspedes virales. La transmisión y persistencia del hantavirus en las poblaciones de roedores depende de varios factores que interactúan para afectar la dinámica ecológica del huésped, que a su vez está fuertemente influenciada por las características de comportamiento de las especies de roedores individuales, a la estructura paisajística y a las características ambientales [173, 174]. La transmisión viral depende de las tasas de contacto entre los huéspedes sensibles, y a pesar de la noción prevaleciente de que un aumento de la densidad se encuentra y, por lo tanto, de Además, se ha demostrado que la transmisión de NVS sigue un patrón de heterogeneidad de contacto, donde los individuos de la población tienen diferentes probabilidades de transmitir la infección [176]. La comprensión de la transmisión viral resulta ser mucho más compleja cuando especies distintas del principal huésped del reservorio se incorporan en el modelo. De hecho, estudios recientes han demostrado que la mayor diversidad de especies hospedantes está correlacionada con una menor prevalencia de infección en América del Norte para P. maniculatus [177], en América Central para O. fulvescens (reservorio del virus Choclo) y Zygodontomys brevicauda (reservorio del virus Calabazo) [178], y en América del Sur para Akodon montensis (reservorio del virus Jabora) [162]. Las tasas de contacto varían según la distribución espacial de las poblaciones y parecen estar Por ejemplo, la prevalencia de SNV en P. maniculatus fue mayor en paisajes con mayor grado de fragmentación del hábitat preferido [179]. Además, ciertas propiedades del paisaje como elevación, pendiente y cubierta terrestre parecen ser útiles para detectar áreas con infecciones persistentes de SNV, y por lo tanto se consideran áreas refugiales donde el virus puede mantenerse durante años [169]. Los cambios en el entorno natural de las especies de reservorios, como la fragmentación forestal y la pérdida de hábitat, pueden alterar la abundancia y distribución de la población y provocar brotes de hantavirus, como se observa en la Península de Azurero de Panamá [118, 119]. Además, las diferencias en el microhábitat, incluida la cubierta superficial, pueden conducir a diferencias en la dinámica ecológica dentro de las poblaciones y afectar a la tasa de exposición al virus [180]. Se han encontrado diferencias en las infecciones por hantavirus a través de paisajes contrastantes en el intervalo latitudinal en poblaciones de roedores de O. longicaudatus en Chile, lo que sugiere que los seres humanos están expuestos de manera diferencial al virus [107, 181]. La dinámica poblacional de roedores se ve afectada por cambios estacionales de clima y clima [182, 183]. En el caso de los brotes asociados a ENSO, se ha postulado una compleja cascada de eventos desencadenados por lluvias altamente inusuales en el año precedente para dar lugar a un aumento de la producción primaria y densidades de roedores, aumentando también la probabilidad de transmisión del virus a los seres humanos, pero ha resultado difícil demostrar con precisión los eventos intermedios sugeridos, como el aumento de las densidades de roedores en el aumento de la carga de casos [116, 121, 184]. En América del Sur, los efectos del cambio climático y los brotes de hantavirus no han sido bien estudiados, a pesar del conocimiento de que varias especies de roedores que son reservorios de enfermedades emergentes se han visto dramáticamente afectadas por eventos como El Niño [185]. Los cambios en la dinámica de la población de acogida también se ven afectados por la estacionalidad, lo que puede conducir a brotes de enfermedades cuando se interrumpen los procesos que equilibran las poblaciones de roedores de temporada en temporada [186]. La emergencia viral puede seguir promoviéndose a medida que los cambios introducidos por el ser humano continúan aumentando en el medio ambiente a diferentes escalas geográficas. Estos cambios también pueden alterar la estructura y dinámica de la población de roedores e interacciones interespecies creando condiciones que pueden conducir a brotes virales, establecimiento viral en nuevos hospederos, y la aparición de HCPS [102, 162], incluso con aparentemente leve perturbación ecológica al sistema virus-hospedero [188]. Ciertas características fisiopatológicas, incluyendo trombocitopenia y shock, de enfermedades por hantavirus de los seres humanos, tienen similitud sustancial con las fiebres hemorrágicas inducidas por otros virus tales arenavirus, filovirus y flavivirus, a pesar de compartir esencialmente ninguna secuencia similitud con ellos. Tales observaciones plantean preguntas acerca de si tales similitudes en la patogénesis son probables similitudes de fenotipo, o en cambio reportan la presencia de mecanismos moleculares comunes entre los virus. En esta revisión se discuten las propiedades generales, descubrimientos y epidemiología/ecología de las formas de hantavirus patógenos del Nuevo Mundo, y también se busca identificar algunas de las características de las macromoléculas virales y mecanismos inmunológicos que se han propuesto como potenciales mediadores directos de los eventos patógenos que caracterizan la enfermedad humana HCPS. Si bien es poco probable que la expresión de una proteína viral particular o ARNs en aislamiento se pueda confiar en replicar fenotipos clave de infección por el virus completo, algunos de los hallazgos han sido suficientemente consistentes con lo que se conoce de la patogénesis in vivo que ofrecen plomos plausibles de primer paso en la búsqueda de objetivos terapéuticos. Esperamos con interés las revelaciones mecanísticas que seguirán el uso inevitablemente ampliado de métodos poderosos como la secuenciación profunda, imágenes cada vez más avanzadas, y métodos microscópicos, y modelos animales que por fin se pueden decir

¿Cuál es un candidato especialmente atractivo como receptor in vivo importante para los hantavirus?

Los hantavirus en las Américas y su papel como patógenos emergenteshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3185593/SHA: efe13a8d42b60ef9f7387ea539a1b2eeb5f80101Autores: Hjelle, Brian; Torres-Pérez, FernandoFecha: 2010-11-25DOI: 10.3390/v2125559Licencia: cc-byAbstract: La continua aparición y reaparición de patógenos representan una amenaza continua, a veces mayor, para las poblaciones. Los hantavirus (familia Bunyaviridae) y sus enfermedades humanas asociadas se consideraron confinados a Eurasia, pero la aparición de un brote en el suroeste de Estados Unidos llevó a un gran aumento en su estudio entre los virólogos de todo el mundo. Se han descrito más de 40 genotipos hantavirales, la gran mayoría desde 1993, y casi la mitad de ellos patógenos para los seres humanos. Los hantavirus causan infecciones persistentes en sus reservorios, y en las Américas, la enfermedad humana se manifiesta como compromiso cardiopulmonar, síndrome cardiopulmonar del hantavirus (HCPS), con proporciones de casos-fatalidad, para los serotipos virales más comunes, entre el 30% y el 40%. Alteración del hábitat y trastornos ecológicos a mayor escala, tal vez incluyendo el cambio climático, son algunos de los factores que pueden haber aumentado la carga de casos humanos de HCPS entre 1993 y el presente. Consideramos aquí las características que influyen en la estructura de la dinámica de la población huésped que pueden conducir a brotes virales, así como los determinantes macromoleculares de los hantavirus que han sido considerados como potenciales contribuciones a la patogenicidad. Texto: Los patógenos emergentes causan enfermedades nuevas o no reconocidas anteriormente, y entre ellas, las zoonóticas emergentes son una preocupación importante entre los científicos que estudian enfermedades infecciosas a diferentes escalas espaciales y temporales [1, 2]. Los cambios en las condiciones bióticas y abióticas pueden alterar la dinámica de las enfermedades de la población y conducir a la aparición de infecciones zoonóticas [3] [5] [6]. Durante las últimas décadas, se han producido varios brotes de patógenos virales emergentes y reemergentes, que afectan tanto a la implicación puramente local como a nivel mundial/pandémica de las poblaciones humanas. Entre los ejemplos visibles están la gripe A, el virus del Ébola, el virus de la hepatitis C, el trastorno respiratorio grave para adultos (SARS), el coronavirus y el virus de la inmunodeficiencia humana, que desafían las medidas de prevención y control de los sistemas de salud pública [7]. En las Américas, el reciente brote de gripe pandémica A subtipo H1N1 se convirtió en un objetivo importante de control debido a su rápida propagación, y las incertidumbres en cuanto a virulencia y transmisibilidad, sin embargo, la disponibilidad de vacunas fue limitada cuando se produjo una actividad significativa antes de la temporada tradicional de gripe [8]. Sin embargo, en el último siglo han surgido o resurgido brotes de varias enfermedades virales relacionadas con el virus arenavirus y el virus del dengue, y más recientemente, hantavirus y la expansión del rango geográfico del virus del Nilo Occidental. Entre las enfermedades zoonóticas, los mamíferos pequeños son anfitriones de varios virus ARN patógenos, especialmente Arenaviridae y Bunyaviridae: Hantavirus [9] [10] [11]. Las infecciones por hantavirus se convirtieron en una preocupación en las Américas después de la descripción de un brote de distrés respiratorio agudo ocurrido en La enfermedad recientemente reconocida, el síndrome cardiopulmonar del hantavirus, el HCPS (o síndrome pulmonar del hantavirus), se relacionó con la infección por el virus del Sin Nombre (SNV) recién descubierto, y el roedor Peromyscus maniculatus (ratón venado) fue identificado como el reservorio [13]. Sin embargo, las infecciones por hantavirus tienen una historia mucho más larga. Una revisión de los escritos chinos antiguos, que datan de aproximadamente 960 dC, reveló descripciones muy parecidas a la fiebre hemorrágica con síndrome renal (HFRS), el síndrome causado por los hantavirus del Viejo Mundo [14]. Durante el siglo XX, los casos de enfermedad febril aguda con compromiso renal fueron descritos de varios países eurasiáticos y Japón, a menudo en asociación con compromisos militares [15]. El HFRS como síndrome distinto, sin embargo, fue llamado por primera vez a la atención de la medicina occidental en asociación con un brote que ocurrió entre las tropas de las Naciones Unidas durante el conflicto coreano entre 1951 y 1954, donde más de 3.200 soldados fueron afectados [16]. Tomó más de dos décadas hasta que el agente etiológico, el virus Hantaan (HTNV), fue aislado del ratón de campo rayado Apodemus agrarius, detectado en parte por la unión de anticuerpos de muestras de suero de paciente a los tejidos pulmonares de ratones de campo sanos y salvajes [17, 18]. El virus se encontró más tarde para representar la especie tipo de un nuevo género Hantavirus de la familia Bunyaviridae, aunque fue más tarde evidente que el primer hantavirus a aislarse fue el virus Thottapalayam de shrew-borne [19]. La categorización de los hantavirus como pertenecientes a la familia Bunyaviridae se debe en parte a la presencia consistente de tres genomas de ARN que son circularizados in vivo como resultado de la presencia de nucleótidos terminales complementarios que ayudan a doblar el genoma en una morfología -hairpin-, descrita por primera vez para el flebovirus Uukuniemi [19, 20]. La Tabla 1 es una lista de los hantavirus patógenos predominantemente distintos serológicamente. Se describen muchos otros genotipos llamados, pero tales otras formas patogénicas están generalmente estrechamente relacionadas con los Andes o, en algunos casos, el virus Sin Nombre. Durante la maduración del virus, el precursor forma GPC se procesa utilizando una proteasa unida a la membrana en Gn y Gc, una escisión que ocurre, y parece ser señalada, después de la señal péptida conservada WAASA en la C-terminal de Gn [24]. Aunque las dos proteínas se pueden expresar de forma independiente a través de la transfección, pueden ser retenidas en el compartimento celular incorrecto (ER o aggrosome); por lo tanto, deben ser co-expresadas para permitirles estabilidad para que las dos se puedan ensamblar correctamente en el Golgi [25, [27] [28]. Se han identificado varias actividades y propiedades para las glicoproteínas envolventes del hantavirus, incluyendo algunas características que se sospecha que están involucradas en la patogenicidad de los serotipos causantes de la enfermedad, una posibilidad que ha generado atención experimental. Las glucoproteínas son los ligandos conocidos o presuntos para al menos dos receptores celulares distintos, la cadena de integrina y el factor acelerador de la descomposición, o DAF [30, 31] ; con gC1qR/p32 también identificado como otro receptor de entrada potencial [32]. Comparaciones con la proteína E del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, llevaron a Tischler et al. a considerar la glicoproteína Gc como una proteína potencial de fusión de clase II, tal vez impartiendo actividad de fusión al virión, y esta hipótesis ha ganado apoyo en otros estudios [33, 34]. Se han identificado actividades adicionales con, o se afirma que están relacionadas con, Gn. Para muchos de estos estudios, una premisa subyacente ha sostenido que hay diferencias entre las glicoproteínas de hantavirus -patógenos en relación con virus en el género que se denominan Si bien es cierto que aún no ha sido posible vincular el virus de Prospect Hill (PHV) con la enfermedad humana, la ausencia de evidencia de su patogenicidad tal vez no debería equipararse con la evidencia de su ausencia. Sólo se podría considerar que el nivel de enfermedad (por ejemplo, letargo, fiebre, proteinuria y azotemia) asociado con la infección de primates no humanos por PHV no es significativamente diferente del registrado para los modelos de primates no humanos utilizando el virus conocido del patógeno Puumala (PUUV) [35, 36]. Para el propósito de esta discusión, presumiremos que los hantavirus apatogénicos son efectivamente apatogénicos. Mientras que algunos estudios han sugerido que las glicoproteínas Gn se dirigen más rápidamente a la vía ubiquitina-proteosoma que a las formas apatogénicas, otros han interpretado las diferencias en el manejo de las glicoproteínas Gn a través de especies de hantavirus por el sistema ubiquitina-proteosomal como independientes de la patogenicidad [37] [38] [39]. Algunos investigadores han dirigido sus esfuerzos hacia la identificación de una capacidad diferencial, ya sea cinética o de magnitud absoluta, en la capacidad de los hantavirus patógenos y apatogénicos para provocar una respuesta de interferón en las células. Una premisa que surge es que las formas apatogénicas tenderían a inducir una respuesta innata anterior que haría más probable que el virus se limpiara rápidamente o se volviera menos competente en su replicación, a fin de evitar cualquier respuesta patológica en el huésped [42] La respuesta innata anti-hantavirus puede en algunos casos ser atribuida a la interacción viral como ligando de TLR-3, pero no en otros, y en las células endoteliales, no parece requerir más que la partícula viral misma, incluso cuando se introduce en forma replicativa incompetente [43, 44]. Las proteínas y los ARNm inducidos prominentemente por los hantavirus incluyen MxA e IFIT-1 (ISG-56) y otros incluyendo algunos con actividad antiviral conocida o sospechada. Esos hantavirus, a menudo cepas altamente patógenas, que no inducen una respuesta antiviral potente, se sospechan o se presume que tienen un (más) potente mecanismo de antagonismo interferón-vía en relación con otros virus, un mecanismo que actúa positivamente para prevenir que se forme una respuesta innata efectiva, al menos temprano en la infección [4 Sin embargo, se reportan algunos casos en los que los hantavirus altamente patógenos, tales como NVS, también son capaces de inducir la expresión de los ARNm del gen estimulado por interferón, incluso muy temprano en la infección, con proteínas ISG, como se esperaba, tardando más tiempo en aparecer en la célula [44]. Las actividades anti-interferón también se han atribuido a la proteína NSs que se puede elaborar en células infectadas por serotipos que codifican esta proteína [46]. Otros investigadores han examinado las actividades de las glucoproteínas del hantavirus y otras proteínas que podrían afectar directamente a algunos aspectos de la progresión patogénica asociada a la infección por hantavirus en humanos, tales como cambios de permeabilidad vascular. Mientras que los primeros intentos de causar directamente aumentos en la permeabilidad de las monocapas endoteliales con partículas virales o infección viral fueron en gran medida decepcionantes, los hantavirus se han identificado como que afectan adversamente la migración endotelial sobre los sustratos y en la potenciación de la permeabilidad endotelial inducida por VEG-F [47, 48]. La proteína nucleocápsida o N más corta (+50 kD) es un componente estructural del nucleocápsido viral, junto con los segmentos de ARN viral genómico. Como proteína de unión al ARN que afecta a la horquilla del cabello de los segmentos genómicos con alta afinidad [49, 50], limita el acceso del ARN para alojar nucleasasas y ayuda a hacer que la replicación viral sea un proceso cerrado dentro del citoplasma. También actúa como una proteína de membrana periférica, al igual que la proteína L [51], una actividad que podría jugar un papel en su supuesta, pero aún no demostrada función como matriz [52]. Hasta hace poco, no se había apreciado que N tuviera una amplia variedad de otras actividades, algunas de las cuales pueden estar vinculadas, no sólo a los requisitos fundamentales de replicación, sino también a la interferencia con una serie de procesos intracelulares de la célula normal. Así, se ha propuesto una interacción entre el aminoterminal de la proteína N del hantavirus y la proteína celular Daxx, con la sugerencia de posibles consecuencias pro-apoptóticas [51]. N también se reporta que interactúa con microfilamentos actínicos, y la proteína SUMO-1 [53, 54]. Utilizando ensayos basados en el gen reportero, Connie Schmaljohn y sus colegas han informado que la proteína nucleocapsid del virus Hantaan tiene un papel inhibidor en las respuestas inflamatorias mediadas por NF kappa B (NF- â € € TM B). Los efectos sobre la expresión NF- € B parecen estar limitados a la prevención de su translocación nuclear después de su intento de activación con lipopolisacárido, LPS [55]. En el citoplasma de las células infectadas, la proteína N se puede encontrar en los cuerpos celulares P donde secuestra y protege los capuchones de 5'. Puede localizar los capuchones a través de su interacción con DCP1, un componente clave de los cuerpos P. Durante la infección por hantavirus, los ARN virales se concentran en los cuerpos P, a través de su interacción con N y DCP1. La proteína N demuestra la protección preferencial de los ARNm diseñados para terminar prematuramente su proteína codificada en comparación con los ARNm nativos [56]. La proteína N se ha vinculado cada vez más a la replicación y traducción virales, a veces de maneras no previstas anteriormente. Se encuentra entre una familia creciente de diversas proteínas virales que pueden servir como un inespecífico - ARN chaperone ®, una actividad que debe facilitar el acceso de la L polimerasa al ARNv para la transcripción y replicación, en que puede disociar transitoriamente estructuras de ARN mal dobladas [57]. Algunos de los efectos de la proteína N en la traducción no pueden ser inmediatamente reconocidos como adaptables en la naturaleza. Puede reemplazar todo el complejo de iniciación traslacional EIF4F, presentando simultáneamente el ribosoma con un reemplazo de la actividad de unión de la tapa de eIF 4E, uniéndose al complejo de pre-iniciación 43S, al igual que eIF 4G, al tiempo que reemplaza la actividad helicoidal de eIF 4A, que se presume que es necesaria para disociar la estructura de ARN de orden superior [56, 58]. Estos tres factores normalmente trabajan juntos para lograr la iniciación traslacional. En los cuerpos P, la capacidad de la proteína N de unirse a una alta afinidad a los oligoribonucleótidos celulares nativos tapados, junto con su actividad en la protección de ARNs tapados de la degradación, probablemente facilita el acceso de oligonucleótidos encapsulados para su uso en la iniciación transcripcional por L polimerasa (-cap ra Tráfico de N para el ensamblaje viral: Clásicamente, la proteína N en las células infectadas parece estar agrupada o partículas en la naturaleza, con una concentración pesada en una única ubicación perinuclear, ampliamente considerada como la Golgi [27]. Las proteínas N de los hantavirus se encuentran en asociación con fracciones de partículas, y los estudios confocales microscopía y bioquímico-inhibidores han demostrado que las trazas N a lo largo de microtúbulos pero no con filamentos de actina [52]. El destino final de N, para su ensamblaje en partículas virales es la Golgi, y que circula allí a través del complejo intermedio retículo-Golgi endoplasmático (ERGIC), también conocido como cúmulo vesicular-tubular [52]. Un inhibidor negativo dominante, la dinamitina, asociado con el transporte mediado por Los estudios posteriores sugieren que la dependencia específica del transporte microtubular es específica de los hantavirus del Viejo Mundo como el NVH, pero que el Hantavirus del Nuevo Mundo ANDV está asociado con filamentos de actina [59]. Sin embargo, los datos recientes indican que el transporte microtubular es efectivamente utilizado para el NVH del Nuevo Mundo [60]. Las enfermedades del Hantavirus del hombre desde hace mucho tiempo han sido sospechosas de tener una base inmunopatógena en parte debido a su período de incubación relativamente largo de 2-3 semanas y la asociación temporal observada entre los trastornos inmunológicos y la primera aparición de signos y síntomas de la enfermedad del hantavirus. HFRS y HCPS comparten muchas características clínicas, llevando a muchos investigadores a considerar que son, en esencia, diferentes manifestaciones de un proceso patógeno similar, que difieren principalmente en los órganos objetivo primarios de expresión de la enfermedad (Tabla La patogénesis de las infecciones por hantavirus es el tema de una revisión continuamente actualizada en la serie UpToDate [61]. Para el momento en que aparecen los síntomas en el HCPS, ambas respuestas antivirales fuertes, y, para los genotipos virales más virulentos, el ARN viral puede ser detectado en plasma sanguíneo o células sanguíneas nucleadas respectivamente [63, 64]. Al menos tres estudios han correlacionado el ARN viral plasmático con la gravedad de la enfermedad para el HCPS y el HFRS, sugiriendo que la replicación del virus juega un papel continuo y en tiempo real en la patogénesis viral [65] [66] [67]. Se han identificado varios cambios patológicos distintivos que ocurren tanto en el HFRS como en el HCPS. Una característica crítica de ambos es una fuga capilar transitoria (~ 1-5 días) que involucra el La fuga resultante es de carácter exudativo, con una composición química alta en proteínas y similar al plasma. La experiencia continua que indica el fuerte tropismo tisular para las células endoteliales, específicamente, es uno de los varios factores que hacen de la integra β3 un candidato especialmente atractivo como un importante receptor in vivo para los hantavirus. Es probable que los hantavirus lleguen a sus tejidos objetivo a través de la captación por los ganglios linfáticos regionales, tal vez con o dentro de un histiocito pulmonar escoltante. Las semillas del virus endotelio local, donde las primeras células infectadas dan lugar, en última instancia, a una viremia primaria, un proceso que parece tomar mucho tiempo para las infecciones por hantavirus [62, 63]. En el momento en que emerge la viremia secundaria, los agentes de las formas más severas de HFRS y HCPS han comenzado a alcanzar una masa suficiente para inducir, a través de las interacciones PAMP-PRR y otros medios, la expresión de citoquinas proinflamatorias [64]. Para HCPS, esa expresión favorece el lecho pulmonar y los órganos linfoides, pero, por razones desconocidas, ahorra el retroperitoneo y, en general, el riñón. En HFRS la situación se invierte, y sin embargo no se aprecia a menudo que el esperado tropismos tisulares preferentes de virus asociados a HFRS y sus contrapartes asociadas a HCPS para los lechos renal y pulmonar, respectivamente, no sea como se predeciría a través de las manifestaciones de las dos enfermedades. La elaboración local de mediadores inflamatorios y quimiotácticos se considera un requisito para el desarrollo Sin embargo, no es la hipoxemia, debido al edema pulmonar prominente, lo que conduce a la muerte en la mayoría de los casos fatales de HCPS, sino más bien la intoxicación del corazón por mediadores como aún no definidos, lo que conduce al estado de bajo gasto cardíaco y al síndrome de shock asociado [64, 65]. Es tentador especular que los mediadores producidos en el pulmón en conexión con el infiltrado inflamatorio pueden infiltrarse a través de la circulación coronaria con dilución mínima en HCPS, consecuencia desventajosa de la estrecha yuxtaposición anatómica de los dos órganos. Así, al menos tres clases de mecanismos potenciales, algunos superpuestos y todos ciertamente no exclusivos de los otros, podrían presumirse que subyacen a la patogénesis del HCPS. Estos incluyen:(1) Mecanismos inmunes innatos. La naturaleza de las interacciones entre los patrones moleculares asociados al patógeno del hantavirus (PAMP) y los receptores de reconocimiento del patrón (PRR) de las células endoteliales susceptibles comienzan a ser aclaradas. El HTNV prototípico parece ser reconocido por TLR-3 [43]. Tal infección tiene consecuencias tales como una mayor expresión del HLA-DR en las células dendríticas [66] y la diferenciación de los monocitos hacia las células dendríticas [67]. (2) Efectos virales directos. La correlación observada entre la carga viral y la gravedad de la enfermedad deja abierta la posibilidad de que las partículas del hantavirus o el ARN puedan tener efectos tóxicos sobre las células o sobre la señalización. Algunos investigadores han favorecido la toxicidad viral directa, actuando a través de la inhibición de la función de barrera celular endotelial, como una explicación de gran parte de la fuga capilar, aunque existe Una pista potencialmente importante hacia el mecanismo por el cual las infecciones por hantavirus agotan las plaquetas sanguíneas y, en algunos casos, causan manifestaciones hemorrágicas, fue avanzada por el reciente descubrimiento de que los hantavirus patógenos son capaces de reclutar plaquetas para adherirse a las superficies celulares endoteliales, con β3 integrina utilizada como elemento de unión crítica [69]. (3) Efectos patógenos causados por las actividades de macromoléculas virales específicas. Hemos revisado algunas de las actividades asociadas con los Gn, Gc y N, polipéptidos codificados viralmente en secciones anteriores. Modelos de prueba de patogénesis se pueden hacer más eficazmente cuando hay un modelo animal que imita aspectos clave de la enfermedad. No existe un modelo similar al HFRS, pero existen modelos animales para el transporte asintomático de PUUV y SNV por sus roedores portadores nativos, el banco vole Myodes glareolus y el ratón venado P. maniculatus; así como un modelo hámster sirio utilizando ANDV o el virus Aporal relacionado de Venezuela, para el cual se observa una enfermedad mimética HCPS [70] [71] [72] [73]. El modelo hámster ANDV-Sirio tiene una serie de características en común con la enfermedad humana, así como algunas diferencias. A diferencia de las enfermedades neurológicas que han sido posibles de provocar con HTNV, el modelo hámster para HCPS parece ser causado por fugas capilares que resultan en edema pulmonar y la producción de un derrame pleural con características exudativas. Típicamente los hámsteres mueren entre 11 y 14-d post-inoculación, reflejando un período de incubación ligeramente acelerado en comparación con las infecciones humanas. Al igual que con el HCPS humano, el examen microscópico del pulmón revela abundante deposición de fibrina, septo alveolar engrosado y antígeno viral expresado abundantemente en el endotelio microvascular. Los hámsteres infectados por ANDV equipados con dispositivos de monitoreo fisiológico mostraron disminución de las presiones de pulso, taquicardia e hipotensión que parecen imitar de cerca el shock que se cree que es la causa próxima de la muerte en pacientes que sucumben al HCPS [65, 74]. En comparación con la enfermedad humana, los hámsteres infectados por ANDV exhiben títulos excepcionalmente altos de ANDV vivo en sus tejidos, con gran parte de la replicación viral que se produce Los títulos de ANDV vivo en algunos casos superan los 10 8 /g, mientras que los aislados de hantavirus de los tejidos humanos han sido notoriamente difíciles de obtener. A pesar de la aparición universal de enzimas hepáticas levemente elevadas en pacientes con HCPS, las enzimas hepáticas no parecen estar presentes en niveles elevados en la sangre de hámsters enfermos incluso inmediatamente antes de la muerte [75]. El período prolongado de incubación asociado con la enfermedad por hantavirus da al huésped un tiempo considerable para montar una respuesta inmune madura contra el virus. Así, en contradición a infecciones de gravedad comparable y sintomatología relacionada asociada con arenavirus y filovirus, las infecciones por hantavirus en humanos se asocian con respuestas anticuerpos de título significativo por el momento en que comienzan los síntomas. A pesar de esta observación, parece ser posible que la variación natural en las respuestas individuales de anticuerpos neutralizantes entre los pacientes con infecciones por NVS pueda estar relacionada con la gravedad de la enfermedad, lo que sugiere que la administración de anticuerpos antivirales podría resultar efectiva terapéuticamente [76]. En el caso de la infección por ANDV, han surgido nuevas evidencias que indican que el aparente aclaramiento del virus de la sangre no resulta en la eliminación completa del estímulo antigénico por el virus, sugiriendo que el virus puede persistir, tal vez en algún sitio inmunológicamente privilegiado aún indeterminado [77]. Un papel para las respuestas patológicas mediadas por células T en el HFRS y el HCPS ha sido la fuente de especulación por una variedad de razones. La gravedad del SNS asociado a la NVS puede haber hecho más evidente que el inicio del edema pulmonar, la taquicardia y la hipertensión parecía estar todo, pero universalmente asociado temporalmente, con la aparición de un espectro de células altamente activadas del linaje linfoide en la sangre periférica. Se detectaron células con similitudes morfológicas cercanas a estos -inmunoblastos- en los pulmones congestionados y pesados de los pacientes que llegaron a la autopsia, así como en órganos linfoides y en las tríadas portal [63, [78] [79] [80]. Estas observaciones llevaron a especular que algún componente de la patogénesis por hantavirus podría estar vinculado a la aparición de células T antivirales que podrían estimular o contribuir a la aparición de una -tormenta de mediadores y el fenotipo de fuga capilar asociado. Estudios posteriores han confirmado la expectativa de que una fracción significativa de la población de inmunoblastos en pacientes con HCPS son células T con especificidad para epitopes específicos de antígenos virales de clase I presentados por el HLA, incluyendo Gn, Gc y N [77, [81] [82] [83]. Presumiblemente, las actividades antivirales de estas células, manifestadas en parte por su elaboración de mediadores en el intersticio afectado, pueden contribuir a la fuga endotelial/capilar que se encuentra en el corazón de la patogénesis del hantavirus. Debido a que los primeros casos de HCPS a menudo llegaron a la autopsia, se hizo posible examinar tejidos necropsiados para la expresión de citocinas. El estudio de Mori et al. (1999) revelaron una alta expresión relativa de citocinas proinflamatorias incluyendo TNF-, IL-1-, IL-6, proporcionando evidencia a favor de un modelo de tormenta de citoquinas para la patogénesis [64]. Los autores creían, basándose en la morfología de las células secretadoras de citoquinas, que tanto monocitos como linfocitos estaban contribuyendo a la producción de citocinas. Que los mediadores proinflamatorios se encuentran en niveles elevados en el plasma, así como el intersticio renal de pacientes con enfermedad hantaviral aguda se ha reconocido desde hace algún tiempo también [84, 85]. Si bien el diagnóstico de HCPS y HFRS se realiza mejor con serología IgM, en la etapa aguda de la infección por NVS, también se puede utilizar RT-PCR si se utilizan células sanguíneas o coágulos de sangre en lugar de plasma o suero, donde la sensibilidad incluso utilizando imprimaciones PCR anidadas disminuye a cerca del 70% [86] [87] [88]. En una instalación en la que se tratan muchos casos de HCPS, el centro médico de la Universidad de Nuevo México en Albuquerque, se ha ofrecido un servicio de diagnóstico en el que se analizan los hallazgos hematológicos del paciente para establecer la probabilidad de que un paciente tenga HCPS. La combinación de trombocitopenia, abundancia elevada de linfocitos -inmunoblasto-, población de células polimorfonucleares con desplazamiento izquierdo sin evidencia morfológica fuerte para su activación, y valores elevados de hemoglobina o hematocrito es altamente específica para el HCPS y permite a los clínicos la capacidad de poner pacientes presuntivos-HCPS en oxigenación de membrana extracorpórea (ECMO), que se cree que ha salvado a muchos pacientes de un resultado letal [89]. Se cree que la infección humana por hantavirus sigue el contacto con secreciones o excreciones producidas por roedores infectados. En los Estados Unidos, 538 infecciones humanas por hantavirus fueron reportadas hasta finales de diciembre de 2009 [90], con Nuevo México, Arizona y Colorado mostrando los casos más altos. Mientras que el prototípico hantavirus centroamericano en América Central fue el virus Rio Segundo de Reithrodontomys mexicanus de Costa Rica, la primera enfermedad humana apareció algunos años más tarde en Panamá, donde el virus Choclo (CHOV) surgió como el agente etiológico y se cree que es responsable de todos los casos conocidos de HCPS. La rata de arroz pigmeo fulvo Oligoryzomys fulvescens ha sido identificada como el reservorio de roedores [91]. En Panamá, los primeros casos de HCPS, aunque con poca o ninguna implicación cardiaca evidente, fueron reportados en 1999, y desde entonces, 106 infecciones humanas han ocurrido con una tasa de mortalidad del 26% [92]. Seroencuestas de mamíferos en México y Costa Rica han encontrado anticuerpos antihantavirus [93] [94] [95] [96], y se han notificado seroprevalencias que oscilan entre 0,6 y 1,6% en poblaciones humanas a pesar de la ausencia de casos conocidos de HCPS [97]. En América del Sur, los casos de HCPS se han identificado en Argentina, Bolivia, Brasil, Chile, Paraguay y Uruguay, y también se han notificado evidencias de exposición humana a hantavirus en Venezuela [98] y Perú [99]. En América del Sur, ANDV es el principal agente etiológico con casos en Chile y Argentina notificados desde 1995. En Chile, se han producido 671 casos de HCPS debido a ANDV durante el período 2001-2009 [100]. Desde 1995 se han reportado más de 1.000 casos de HCPS en Argentina [101] ; en el Brasil se han identificado aproximadamente 1.100 casos de HCPS entre 1993 y 2008 [102]. Las tasas de mortalidad por casos en esos tres países han sido similares, oscilando entre el 30% (Argentina), el 36% (Chile) y el 39% (Brasil). Las infecciones por Hantavirus ocurren con más frecuencia en hombres que en mujeres, aunque la proporción entre hombres y mujeres es muy variable. Por ejemplo, las comunidades panameñas mostraron una proporción de 55 hombres por 45 mujeres [103], mientras que en Chile la proporción es más sesgada por hombres (71%) [104]. En el Chaco paraguayo la proporción entre hombres y mujeres se aproxima al 50% [105]. En América del Norte, en diciembre de 2009 el 63% de los pacientes eran varones [90]. Todos los grupos étnicos y raciales parecen ser susceptibles a infecciones por el hantavirus, y las diferencias entre ciertos grupos (como indígenas y no indígenas) están más probablemente correlacionadas con el tipo de hábitat en el que reside la población (por ejemplo, zonas rurales frente a zonas urbanas). De hecho, las comunidades rurales representan la mayor incidencia global del hantavirus y, por lo tanto, están en mayor riesgo [92, [105] [106] [107] [108] [109] [109] [119], aunque también se ha destacado la importancia de los entornos peridomésticos como una importante zona de exposición [112, 113]. El principal mecanismo por el que los seres humanos adquieren la infección por el hantavirus es la exposición a aerosoles de heces contaminadas de roedores, orina y saliva [114, 115]. Esto puede ocurrir cuando los seres humanos residen en áreas cercanas a las que habitan los roedores, viven en áreas infestadas de roedores, o cuando los roedores invaden entornos humanos, que son más frecuentes en hábitats rurales.Existe una larga historia de coexistencia humana con roedores, lo que plantea dudas sobre el aparente aumento reciente de las enfermedades relacionadas con el hantavirus, especialmente el HCPS. Aparte de una aparente asociación con eventos de oscilación sureña de El Niño (ENSO) en algunas regiones [116, 117], los recientes incrementos en la incidencia del HCPS no parecen seguir un patrón temporal o espacial fácilmente definido. Sin embargo, algunas características del paisaje, como la fragmentación del hábitat o las áreas perturbadas por el ser humano, pueden influir en la dinámica de la población de roedores e impactar en la incidencia viral [118] [112] [112] [121]. A pesar de la estocástica asociada a la contracción de la infección Las actividades humanas en edificios mal ventilados que pulverizan partículas que luego se inhalan (es decir, limpieza, agitación de alfombras, polvo) se identifican con frecuencia entre los pacientes admitidos para el SHCPS [11, 122]. Se cree que las actividades al aire libre transmiten un menor riesgo debido a la labilidad de los hantavirus a la radiación UV y a la supuesta tendencia a dispersarse en el viento, aunque ciertas condiciones ambientales parecen mantener el virus durante períodos más largos fuera de su huésped natural, lo que permite la transmisión indirecta [123]. Una vía alternativa pero poco común de transmisión del virus es la mordedura de roedores [124] [125] [126]. Los trabajadores sobre el terreno que manipulan mamíferos corren un riesgo potencialmente mayor de exposición a infecciones por hantavirus, aunque cuando se cuantifica a través de serosurveys el riesgo absoluto parece bastante leve [127]. Un nuevo estudio en Colorado sugiere la posibilidad de que una picadura de roedor haya sido el vehículo próximo para la transmisión al aire libre de NVS [128], lo que vuelve a enfatizar el uso de equipo de protección personal durante las actividades de trabajo de campo [129]. Como caso particular dentro de los hantavirus, la transmisión de persona a persona ha sido documentada exclusivamente para el virus de los Andes sudamericanos [130] [133] [133] [135]. La identificación de esta vía de transmisión se ha hecho utilizando tanto herramientas moleculares como encuestas epidemiológicas, pero el mecanismo de transmisión interpersonal no está bien establecido. Curiosamente, ANDV también puede ser derramado por los humanos a través de otros fluidos biológicos como la orina [136], ilustrando las propiedades particulares que diferencian este virus de otros hantavirus. Aunque la transmisión interpersonal parece ser única para ANDV, el ARN viral de PUUV se ha detectado en la saliva de pacientes con HFRS, y algunos pacientes con SNV-HCPS tienen ARN viral en las secreciones traqueales [88, 137]. Los Hantavirus en las Américas son alojados naturalmente por roedores (Muridae y Cricetidae) así como las musarañas (Soricidae) y los lunares (Talpidae) (Figura 1). Tres especies de musgo y un mole han sido reportados para albergar hantavirus y su patogenicidad para los humanos permanece desconocida [22, 138, 139]. Se han identificado al menos 15 especies de roedores como portadores de diferentes hantavirus patógenos, con algunos genotipos sudamericanos como Castelo do Sonhos (CDSV) o Hu39694 sólo identificados después de infecciones humanas (Figura 1 ). Los hantavirus suelen mostrar una alta especificidad de especie y ningún huésped intermedio [140]. Sin embargo, se han descrito algunos genotipos de hantavirus en la misma especie de roedores. Tal es el caso de Playa de Oro (OROV) y Catacamas (CATV) identificados en Oryzomys couesi [141, 142], o Maporal (MAPV) y Choclo (CHOV) hospedados por O. fulvescens [91, 143]. En América del Norte se han detectado virus de muleshoe y Black Creek Canal hanta en sigmodon hispidus [ Además, un genotipo de hantavirus (por ejemplo, el virus similar a Juquitiba) puede ser transportado por más de una especie de roedores (O. nigripes, Oxymycterus judex, Akodon montesis). Otro ejemplo es el virus Laguna Negra (LANV) que después de ser identificado en Calomys laucha [146] también ha sido reportado en C. callosus [147]. El rápido aumento en el descubrimiento de nuevos hantavirus y la identificación de sus anfitriones no parece probable que termine tan pronto como se examinen nuevas especies pequeñas de mamíferos [95]. Este tema se complica por la continua controversia en los criterios para la clasificación de distintos hantavirus [148, 149], que también está vinculado a la clasificación taxonómica y los reordenamientos taxonómicos. La transmisión de especies cruzadas es un proceso importante durante la propagación, aparición y evolución Particularmente dentro de los hantavirus, los derrames a los huéspedes secundarios se identifican cada vez más a medida que se realizan estudios más extensos [151] [152] [153] [155] [156]. Por ejemplo, ANDV es el agente etiológico predominante del HCPS en América del Sur, y O. longicaudatus el principal reservorio de roedores. Derrama en al menos otras cuatro especies de roedores que coocurren con el reservorio se han identificado, con Abrothrix longipilis mostrando la segunda mayor prevalencia de anticuerpos de ANDV, y actualmente no hay duda de que el virus es extremadamente similar genéticamente entre los dos roedores del huésped [157, 158]. En América del Norte, el derrame del virus Bayou (BAYV) puede haber ocurrido desde el reservorio principal de O. palustris a S. hispidus, R. fulvescens, P. leucopus y B. taylori [159] [160] [161]. Es más probable que el derrame del virus Hanta se produzca con poblaciones de acogida que habitan regiones simpatricas o sintópicas [151, 162], y la transmisión de especies cruzadas tendría probablemente mayores posibilidades de éxito si las especies anfitrionas están estrechamente relacionadas [163]. Se encuentra una excepción interesante entre el virus Oxbow (OXBV) y el virus Asama (ASAV) en el que un proceso de cambio de huésped parecía haber ocurrido entre mamíferos pertenecientes a dos familias (Talpidae y Soricidae), probablemente como resultado de la codivergencia alterna y recurrente de ciertos tax Los hantavirus son transmitidos horizontalmente entre roedores y no son transmitidos por artrópodos (a diferencia de otros virus de la familia Bunyaviridae). La infección por derrapadores a mamíferos no humanos generalmente no produce ninguna transmisión hacia adelante (o a fin de morir), pero si los seres humanos están infectados pueden resultar en una alta morbilidad y mortalidad [122, 164]. Durante la primavera de 1993, un brote de pacientes con HCPS debido a SNV ocurrió en los estados de Four Corners, resultando en más del 60% de casos de mortalidad entre los casos iniciales, muchos de los cuales involucran a miembros de la tribu Navajo [12, 121]. En Panamá, se notificó un brote durante 1999-2000 en Los Santos, y 12 casos donde se identificaron con tres muertes [165, 166]. Esto representó el primer informe de infecciones por hantavirus humanos en América Central. En América del Sur, Diecisiete individuos fueron identificados con anticuerpo NVS (ELISA) o fueron antígenos (HCI) positivos de 52 casos sospechosos [167]. En 1996 ocurrieron brotes mayores debidos a ANDV en el sur de Argentina [131, 134] ; en el sur de Chile se presentaron grupos de pacientes con enfermedad por hantavirus en 1997 [158]. En Brasil, el primer brote fue identificado en la Amazonía Brasileña (Estado de Maranhão) en el año 2000, e involucró pequeños pueblos que resultaron en una prevalencia del 13,3% de los evaluados (398 residentes totales) [168]. Los factores que desencadenan los brotes de hantavirus todavía son mal entendidos, probablemente porque resultan de varias características bióticas y abióticas interactuantes cuyos parámetros clave son difíciles de modelar. Sin embargo, el uso de nuevos enfoques de modelado que involucran características geográficas y ambientales parece ser prometedor a la hora de predecir posibles brotes de hantavirus y/o áreas de mayor riesgo [169] [170] [171] [172]. Debido a que se sabe que los hantavirus se transmiten directamente de los huéspedes infectados a los susceptibles, el primer enfoque natural es relacionar los brotes con la ecología de los huéspedes virales. La transmisión y persistencia del hantavirus en las poblaciones de roedores depende de varios factores que interactúan para afectar la dinámica ecológica del huésped, que a su vez está fuertemente influenciada por las características de comportamiento de las especies de roedores individuales, a la estructura paisajística y a las características ambientales [173, 174]. La transmisión viral depende de las tasas de contacto entre los huéspedes sensibles, y a pesar de la noción prevaleciente de que un aumento de la densidad se encuentra y, por lo tanto, de Además, se ha demostrado que la transmisión de NVS sigue un patrón de heterogeneidad de contacto, donde los individuos de la población tienen diferentes probabilidades de transmitir la infección [176]. La comprensión de la transmisión viral resulta ser mucho más compleja cuando especies distintas del principal huésped del reservorio se incorporan en el modelo. De hecho, estudios recientes han demostrado que la mayor diversidad de especies hospedantes está correlacionada con una menor prevalencia de infección en América del Norte para P. maniculatus [177], en América Central para O. fulvescens (reservorio del virus Choclo) y Zygodontomys brevicauda (reservorio del virus Calabazo) [178], y en América del Sur para Akodon montensis (reservorio del virus Jabora) [162]. Las tasas de contacto varían según la distribución espacial de las poblaciones y parecen estar Por ejemplo, la prevalencia de SNV en P. maniculatus fue mayor en paisajes con mayor grado de fragmentación del hábitat preferido [179]. Además, ciertas propiedades del paisaje como elevación, pendiente y cubierta terrestre parecen ser útiles para detectar áreas con infecciones persistentes de SNV, y por lo tanto se consideran áreas refugiales donde el virus puede mantenerse durante años [169]. Los cambios en el entorno natural de las especies de reservorios, como la fragmentación forestal y la pérdida de hábitat, pueden alterar la abundancia y distribución de la población y provocar brotes de hantavirus, como se observa en la Península de Azurero de Panamá [118, 119]. Además, las diferencias en el microhábitat, incluida la cubierta superficial, pueden conducir a diferencias en la dinámica ecológica dentro de las poblaciones y afectar a la tasa de exposición al virus [180]. Se han encontrado diferencias en las infecciones por hantavirus a través de paisajes contrastantes en el intervalo latitudinal en poblaciones de roedores de O. longicaudatus en Chile, lo que sugiere que los seres humanos están expuestos de manera diferencial al virus [107, 181]. La dinámica poblacional de roedores se ve afectada por cambios estacionales de clima y clima [182, 183]. En el caso de los brotes asociados a ENSO, se ha postulado una compleja cascada de eventos desencadenados por lluvias altamente inusuales en el año precedente para dar lugar a un aumento de la producción primaria y densidades de roedores, aumentando también la probabilidad de transmisión del virus a los seres humanos, pero ha resultado difícil demostrar con precisión los eventos intermedios sugeridos, como el aumento de las densidades de roedores en el aumento de la carga de casos [116, 121, 184]. En América del Sur, los efectos del cambio climático y los brotes de hantavirus no han sido bien estudiados, a pesar del conocimiento de que varias especies de roedores que son reservorios de enfermedades emergentes se han visto dramáticamente afectadas por eventos como El Niño [185]. Los cambios en la dinámica de la población de acogida también se ven afectados por la estacionalidad, lo que puede conducir a brotes de enfermedades cuando se interrumpen los procesos que equilibran las poblaciones de roedores de temporada en temporada [186]. La emergencia viral puede seguir promoviéndose a medida que los cambios introducidos por el ser humano continúan aumentando en el medio ambiente a diferentes escalas geográficas. Estos cambios también pueden alterar la estructura y dinámica de la población de roedores e interacciones interespecies creando condiciones que pueden conducir a brotes virales, establecimiento viral en nuevos hospederos, y la aparición de HCPS [102, 162], incluso con aparentemente leve perturbación ecológica al sistema virus-hospedero [188]. Ciertas características fisiopatológicas, incluyendo trombocitopenia y shock, de enfermedades por hantavirus de los seres humanos, tienen similitud sustancial con las fiebres hemorrágicas inducidas por otros virus tales arenavirus, filovirus y flavivirus, a pesar de compartir esencialmente ninguna secuencia similitud con ellos. Tales observaciones plantean preguntas acerca de si tales similitudes en la patogénesis son probables similitudes de fenotipo, o en cambio reportan la presencia de mecanismos moleculares comunes entre los virus. En esta revisión se discuten las propiedades generales, descubrimientos y epidemiología/ecología de las formas de hantavirus patógenos del Nuevo Mundo, y también se busca identificar algunas de las características de las macromoléculas virales y mecanismos inmunológicos que se han propuesto como potenciales mediadores directos de los eventos patógenos que caracterizan la enfermedad humana HCPS. Si bien es poco probable que la expresión de una proteína viral particular o ARNs en aislamiento se pueda confiar en replicar fenotipos clave de infección por el virus completo, algunos de los hallazgos han sido suficientemente consistentes con lo que se conoce de la patogénesis in vivo que ofrecen plomos plausibles de primer paso en la búsqueda de objetivos terapéuticos. Esperamos con interés las revelaciones mecanísticas que seguirán el uso inevitablemente ampliado de métodos poderosos como la secuenciación profunda, imágenes cada vez más avanzadas, y métodos microscópicos, y modelos animales que por fin se pueden decir

¿Qué es la semilla del virus?

Los hantavirus en las Américas y su papel como patógenos emergenteshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3185593/SHA: efe13a8d42b60ef9f7387ea539a1b2eeb5f80101Autores: Hjelle, Brian; Torres-Pérez, FernandoFecha: 2010-11-25DOI: 10.3390/v2125559Licencia: cc-byAbstract: La continua aparición y reaparición de patógenos representan una amenaza continua, a veces mayor, para las poblaciones. Los hantavirus (familia Bunyaviridae) y sus enfermedades humanas asociadas se consideraron confinados a Eurasia, pero la aparición de un brote en el suroeste de Estados Unidos llevó a un gran aumento en su estudio entre los virólogos de todo el mundo. Se han descrito más de 40 genotipos hantavirales, la gran mayoría desde 1993, y casi la mitad de ellos patógenos para los seres humanos. Los hantavirus causan infecciones persistentes en sus reservorios, y en las Américas, la enfermedad humana se manifiesta como compromiso cardiopulmonar, síndrome cardiopulmonar del hantavirus (HCPS), con proporciones de casos-fatalidad, para los serotipos virales más comunes, entre el 30% y el 40%. Alteración del hábitat y trastornos ecológicos a mayor escala, tal vez incluyendo el cambio climático, son algunos de los factores que pueden haber aumentado la carga de casos humanos de HCPS entre 1993 y el presente. Consideramos aquí las características que influyen en la estructura de la dinámica de la población huésped que pueden conducir a brotes virales, así como los determinantes macromoleculares de los hantavirus que han sido considerados como potenciales contribuciones a la patogenicidad. Texto: Los patógenos emergentes causan enfermedades nuevas o no reconocidas anteriormente, y entre ellas, las zoonóticas emergentes son una preocupación importante entre los científicos que estudian enfermedades infecciosas a diferentes escalas espaciales y temporales [1, 2]. Los cambios en las condiciones bióticas y abióticas pueden alterar la dinámica de las enfermedades de la población y conducir a la aparición de infecciones zoonóticas [3] [5] [6]. Durante las últimas décadas, se han producido varios brotes de patógenos virales emergentes y reemergentes, que afectan tanto a la implicación puramente local como a nivel mundial/pandémica de las poblaciones humanas. Entre los ejemplos visibles están la gripe A, el virus del Ébola, el virus de la hepatitis C, el trastorno respiratorio grave para adultos (SARS), el coronavirus y el virus de la inmunodeficiencia humana, que desafían las medidas de prevención y control de los sistemas de salud pública [7]. En las Américas, el reciente brote de gripe pandémica A subtipo H1N1 se convirtió en un objetivo importante de control debido a su rápida propagación, y las incertidumbres en cuanto a virulencia y transmisibilidad, sin embargo, la disponibilidad de vacunas fue limitada cuando se produjo una actividad significativa antes de la temporada tradicional de gripe [8]. Sin embargo, en el último siglo han surgido o resurgido brotes de varias enfermedades virales relacionadas con el virus arenavirus y el virus del dengue, y más recientemente, hantavirus y la expansión del rango geográfico del virus del Nilo Occidental. Entre las enfermedades zoonóticas, los mamíferos pequeños son anfitriones de varios virus ARN patógenos, especialmente Arenaviridae y Bunyaviridae: Hantavirus [9] [10] [11]. Las infecciones por hantavirus se convirtieron en una preocupación en las Américas después de la descripción de un brote de distrés respiratorio agudo ocurrido en La enfermedad recientemente reconocida, el síndrome cardiopulmonar del hantavirus, el HCPS (o síndrome pulmonar del hantavirus), se relacionó con la infección por el virus del Sin Nombre (SNV) recién descubierto, y el roedor Peromyscus maniculatus (ratón venado) fue identificado como el reservorio [13]. Sin embargo, las infecciones por hantavirus tienen una historia mucho más larga. Una revisión de los escritos chinos antiguos, que datan de aproximadamente 960 dC, reveló descripciones muy parecidas a la fiebre hemorrágica con síndrome renal (HFRS), el síndrome causado por los hantavirus del Viejo Mundo [14]. Durante el siglo XX, los casos de enfermedad febril aguda con compromiso renal fueron descritos de varios países eurasiáticos y Japón, a menudo en asociación con compromisos militares [15]. El HFRS como síndrome distinto, sin embargo, fue llamado por primera vez a la atención de la medicina occidental en asociación con un brote que ocurrió entre las tropas de las Naciones Unidas durante el conflicto coreano entre 1951 y 1954, donde más de 3.200 soldados fueron afectados [16]. Tomó más de dos décadas hasta que el agente etiológico, el virus Hantaan (HTNV), fue aislado del ratón de campo rayado Apodemus agrarius, detectado en parte por la unión de anticuerpos de muestras de suero de paciente a los tejidos pulmonares de ratones de campo sanos y salvajes [17, 18]. El virus se encontró más tarde para representar la especie tipo de un nuevo género Hantavirus de la familia Bunyaviridae, aunque fue más tarde evidente que el primer hantavirus a aislarse fue el virus Thottapalayam de shrew-borne [19]. La categorización de los hantavirus como pertenecientes a la familia Bunyaviridae se debe en parte a la presencia consistente de tres genomas de ARN que son circularizados in vivo como resultado de la presencia de nucleótidos terminales complementarios que ayudan a doblar el genoma en una morfología -hairpin-, descrita por primera vez para el flebovirus Uukuniemi [19, 20]. La Tabla 1 es una lista de los hantavirus patógenos predominantemente distintos serológicamente. Se describen muchos otros genotipos llamados, pero tales otras formas patogénicas están generalmente estrechamente relacionadas con los Andes o, en algunos casos, el virus Sin Nombre. Durante la maduración del virus, el precursor forma GPC se procesa utilizando una proteasa unida a la membrana en Gn y Gc, una escisión que ocurre, y parece ser señalada, después de la señal péptida conservada WAASA en la C-terminal de Gn [24]. Aunque las dos proteínas se pueden expresar de forma independiente a través de la transfección, pueden ser retenidas en el compartimento celular incorrecto (ER o aggrosome); por lo tanto, deben ser co-expresadas para permitirles estabilidad para que las dos se puedan ensamblar correctamente en el Golgi [25, [27] [28]. Se han identificado varias actividades y propiedades para las glicoproteínas envolventes del hantavirus, incluyendo algunas características que se sospecha que están involucradas en la patogenicidad de los serotipos causantes de la enfermedad, una posibilidad que ha generado atención experimental. Las glucoproteínas son los ligandos conocidos o presuntos para al menos dos receptores celulares distintos, la cadena de integrina y el factor acelerador de la descomposición, o DAF [30, 31] ; con gC1qR/p32 también identificado como otro receptor de entrada potencial [32]. Comparaciones con la proteína E del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, llevaron a Tischler et al. a considerar la glicoproteína Gc como una proteína potencial de fusión de clase II, tal vez impartiendo actividad de fusión al virión, y esta hipótesis ha ganado apoyo en otros estudios [33, 34]. Se han identificado actividades adicionales con, o se afirma que están relacionadas con, Gn. Para muchos de estos estudios, una premisa subyacente ha sostenido que hay diferencias entre las glicoproteínas de hantavirus -patógenos en relación con virus en el género que se denominan Si bien es cierto que aún no ha sido posible vincular el virus de Prospect Hill (PHV) con la enfermedad humana, la ausencia de evidencia de su patogenicidad tal vez no debería equipararse con la evidencia de su ausencia. Sólo se podría considerar que el nivel de enfermedad (por ejemplo, letargo, fiebre, proteinuria y azotemia) asociado con la infección de primates no humanos por PHV no es significativamente diferente del registrado para los modelos de primates no humanos utilizando el virus conocido del patógeno Puumala (PUUV) [35, 36]. Para el propósito de esta discusión, presumiremos que los hantavirus apatogénicos son efectivamente apatogénicos. Mientras que algunos estudios han sugerido que las glicoproteínas Gn se dirigen más rápidamente a la vía ubiquitina-proteosoma que a las formas apatogénicas, otros han interpretado las diferencias en el manejo de las glicoproteínas Gn a través de las especies del hantavirus por el sistema ubiquitina-proteosomal como independientes de la patogenicidad [37] [38] [39]. Algunos investigadores han dirigido sus esfuerzos hacia la identificación de una capacidad diferencial, ya sea cinética o de magnitud absoluta, en la capacidad de los hantavirus patógenos y apatogénicos para provocar una respuesta del interferón en las células. Una premisa que surge es que las formas apatogénicas tenderían a inducir una respuesta innata anterior que haría más probable que el virus se limpiara rápidamente o se volviera menos competente en su replicación, a fin de evitar cualquier respuesta patológica en el huésped [4 La respuesta innata anti-hantavirus puede en algunos casos ser atribuida a la interacción viral como ligando de TLR-3, pero no en otros, y en las células endoteliales, no parece requerir más que la partícula viral misma, incluso cuando se introduce en forma replicante-incompetente [43, 44]. Proteínas y ARNm inducidos prominentemente por los hantavirus incluyen MxA e IFIT-1 (ISG-56) y otros incluyendo algunos con actividad antiviral conocida o sospechada. Esos hantavirus, a menudo cepas altamente patógenas, que no inducen una respuesta antiviral potente, se sospechan o se presume que tienen un (más) potente mecanismo de antagonismo interferón-vía en relación con otros virus, un mecanismo que actúa positivamente para prevenir que se forme una respuesta innata efectiva, al menos temprano en Sin embargo, se reportan algunos casos en los que los hantavirus altamente patógenos, tales como NVS, también son capaces de inducir la expresión de los ARNm del gen estimulado por interferón, incluso muy temprano en la infección, con proteínas ISG, como se esperaba, tardando más tiempo en aparecer en la célula [44]. Las actividades anti-interferón también se han atribuido a la proteína NSs que se puede elaborar en células infectadas por serotipos que codifican esta proteína [46]. Otros investigadores han examinado las actividades de las glucoproteínas del hantavirus y otras proteínas que podrían afectar directamente a algunos aspectos de la progresión patogénica asociada a la infección por hantavirus en humanos, tales como cambios en la permeabilidad vascular. Mientras que los primeros intentos de causar directamente aumentos en la permeabilidad de las monocapas endoteliales con partículas virales o infección viral fueron en gran medida decepcionantes, los hantavirus se han identificado como que afectan adversamente la migración endotelial sobre los sustratos y en la potenciación de la permeabilidad endotelial inducida por VEG-F [47, 48]. La proteína nucleocápsida o N más corta (+50 kD) es un componente estructural del nucleocápsido viral, junto con los segmentos de ARN viral genómico. Como proteína de unión al ARN que afecta a la horquilla del cabello de los segmentos genómicos con alta afinidad [49, 50], limita el acceso del ARN para alojar nucleasasas y ayuda a hacer que la replicación viral sea un proceso cerrado dentro del citoplasma. También actúa como una proteína de membrana periférica, al igual que la proteína L [51], una actividad que podría jugar un papel en su supuesta, pero aún no demostrada función como matriz [52]. Hasta hace poco, no se había apreciado que N tuviera una amplia variedad de otras actividades, algunas de las cuales pueden estar vinculadas, no sólo a los requisitos fundamentales de replicación, sino también a la interferencia con una serie de procesos intracelulares de la célula normal. Así, se ha propuesto una interacción entre el aminoterminal de la proteína N del hantavirus y la proteína celular Daxx, con la sugerencia de posibles consecuencias pro-apoptóticas [51]. N también se reporta que interactúa con microfilamentos actínicos, y la proteína SUMO-1 [53, 54]. Utilizando ensayos basados en el gen reportero, Connie Schmaljohn y sus colegas han reportado que la proteína nucleocapsida del virus Hantaan tiene un papel inhibidor en las respuestas inflamatorias mediadas por NF kappa B (NF- B). Los efectos sobre la expresión NF- B parecen estar limitados a la prevención de su translocación nuclear después de su intento de activación con lipopolisacárido, LPS [55]. En el citoplasma de las células infectadas, la proteína N se puede encontrar en los cuerpos celulares P donde secuestra y protege los capuchones de 5'. Puede localizar los capuchones a través de su interacción con DCP1, un componente clave de los cuerpos P. Durante la infección por hantavirus, los ARN virales se concentran en los cuerpos P, a través de su interacción con N y DCP1. La proteína N demuestra la protección preferencial de los ARNm diseñados para terminar prematuramente su proteína codificada en comparación con los ARNm nativos [56]. La proteína N se ha vinculado cada vez más a la replicación y traducción virales, a veces de maneras no previstas anteriormente. Se encuentra entre una familia creciente de diversas proteínas virales que pueden servir como un inespecífico - ARN chaperone ®, una actividad que debe facilitar el acceso de la L polimerasa al ARNv para la transcripción y replicación, en que puede disociar transitoriamente estructuras de ARN mal dobladas [57]. Algunos de los efectos de la proteína N en la traducción no pueden ser inmediatamente reconocidos como adaptables en la naturaleza. Puede reemplazar todo el complejo de iniciación traslacional EIF4F, presentando simultáneamente el ribosoma con un reemplazo de la actividad de unión de la tapa de eIF 4E, uniéndose al complejo de pre-iniciación 43S, al igual que eIF 4G, al tiempo que reemplaza la actividad helicoidal de eIF 4A, que se presume que es necesaria para disociar la estructura de ARN de orden superior [56, 58]. Estos tres factores normalmente trabajan juntos para lograr la iniciación traslacional. En los cuerpos P, la capacidad de la proteína N de unirse a una alta afinidad a los oligoribonucleótidos celulares nativos tapados, junto con su actividad en la protección de ARNs tapados de la degradación, probablemente facilita el acceso de oligonucleótidos encapsulados para su uso en la iniciación transcripcional por L polimerasa (-cap ra Tráfico de N para el ensamblaje viral: Clásicamente, la proteína N en las células infectadas parece estar agrupada o partículas en la naturaleza, con una concentración pesada en una única ubicación perinuclear, ampliamente considerada como la Golgi [27]. Las proteínas N de los hantavirus se encuentran en asociación con fracciones de partículas, y los estudios confocales microscopía y bioquímico-inhibidores han demostrado que las trazas N a lo largo de microtúbulos pero no con filamentos de actina [52]. El destino final de N, para su ensamblaje en partículas virales es la Golgi, y que circula allí a través del complejo intermedio retículo-Golgi endoplasmático (ERGIC), también conocido como cúmulo vesicular-tubular [52]. Un inhibidor negativo dominante, la dinamitina, asociado con el transporte mediado por Los estudios posteriores sugieren que la dependencia específica del transporte microtubular es específica de los hantavirus del Viejo Mundo como el NVH, pero que el Hantavirus del Nuevo Mundo ANDV está asociado con filamentos de actina [59]. Sin embargo, los datos recientes indican que el transporte microtubular es efectivamente utilizado para el NVH del Nuevo Mundo [60]. Las enfermedades del Hantavirus del hombre desde hace mucho tiempo han sido sospechosas de tener una base inmunopatógena en parte debido a su período de incubación relativamente largo de 2-3 semanas y la asociación temporal observada entre los trastornos inmunológicos y la primera aparición de signos y síntomas de la enfermedad del hantavirus. HFRS y HCPS comparten muchas características clínicas, llevando a muchos investigadores a considerar que son, en esencia, diferentes manifestaciones de un proceso patógeno similar, que difieren principalmente en los órganos objetivo primarios de expresión de la enfermedad (Tabla La patogénesis de las infecciones por hantavirus es el tema de una revisión continuamente actualizada en la serie UpToDate [61]. Para el momento en que aparecen los síntomas en el HCPS, ambas respuestas antivirales fuertes, y, para los genotipos virales más virulentos, el ARN viral puede ser detectado en plasma sanguíneo o células sanguíneas nucleadas respectivamente [63, 64]. Al menos tres estudios han correlacionado el ARN viral plasmático con la gravedad de la enfermedad para el HCPS y el HFRS, sugiriendo que la replicación del virus juega un papel continuo y en tiempo real en la patogénesis viral [65] [66] [67]. Se han identificado varios cambios patológicos distintivos que ocurren tanto en el HFRS como en el HCPS. Una característica crítica de ambos es una fuga capilar transitoria (~ 1-5 días) que involucra el La fuga resultante es de carácter exudativo, con una composición química alta en proteínas y similar al plasma. La experiencia continua que indica el fuerte tropismo tisular para las células endoteliales, específicamente, es uno de los varios factores que hacen de la integra β3 un candidato especialmente atractivo como un importante receptor in vivo para los hantavirus. Es probable que los hantavirus lleguen a sus tejidos objetivo a través de la captación por los ganglios linfáticos regionales, tal vez con o dentro de un histiocito pulmonar escoltante. Las semillas del virus endotelio local, donde las primeras células infectadas dan lugar, en última instancia, a una viremia primaria, un proceso que parece tomar mucho tiempo para las infecciones por hantavirus [62, 63]. En el momento en que emerge la viremia secundaria, los agentes de las formas más severas de HFRS y HCPS han comenzado a alcanzar una masa suficiente para inducir, a través de las interacciones PAMP-PRR y otros medios, la expresión de citoquinas proinflamatorias [64]. Para HCPS, esa expresión favorece el lecho pulmonar y los órganos linfoides, pero, por razones desconocidas, ahorra el retroperitoneo y, en general, el riñón. En HFRS la situación se invierte, y sin embargo no se aprecia a menudo que el esperado tropismos tisulares preferentes de virus asociados a HFRS y sus contrapartes asociadas a HCPS para los lechos renal y pulmonar, respectivamente, no es como se predeciría a través de las manifestaciones de las dos enfermedades. La elaboración local de mediadores inflamatorios y quimiotácticos se considera un requisito para el desarrollo de Sin embargo, no es la hipoxemia, debido al edema pulmonar prominente, lo que conduce a la muerte en la mayoría de los casos fatales de HCPS, sino más bien la intoxicación del corazón por mediadores como aún no definidos, lo que conduce al estado de bajo gasto cardíaco y al síndrome de shock asociado [64, 65]. Es tentador especular que los mediadores producidos en el pulmón en conexión con el infiltrado inflamatorio pueden infiltrarse a través de la circulación coronaria con dilución mínima en HCPS, consecuencia desventajosa de la estrecha yuxtaposición anatómica de los dos órganos. Así, al menos tres clases de mecanismos potenciales, algunos superpuestos y todos ciertamente no exclusivos de los otros, podrían presumirse que subyacen a la patogénesis del HCPS. Estos incluyen:(1) Mecanismos inmunes innatos. La naturaleza de las interacciones entre los patrones moleculares asociados al patógeno del hantavirus (PAMP) y los receptores de reconocimiento del patrón (PRR) de las células endoteliales susceptibles comienzan a ser aclaradas. El HTNV prototípico parece ser reconocido por TLR-3 [43]. Tal infección tiene consecuencias tales como una mayor expresión del HLA-DR en las células dendríticas [66] y la diferenciación de los monocitos hacia las células dendríticas [67]. (2) Efectos virales directos. La correlación observada entre la carga viral y la gravedad de la enfermedad deja abierta la posibilidad de que las partículas del hantavirus o el ARN puedan tener efectos tóxicos sobre las células o sobre la señalización. Algunos investigadores han favorecido la toxicidad viral directa, actuando a través de la inhibición de la función de barrera celular endotelial, como una explicación de gran parte de la fuga capilar, aunque existe Una pista potencialmente importante hacia el mecanismo por el cual las infecciones por hantavirus agotan las plaquetas sanguíneas y, en algunos casos, causan manifestaciones hemorrágicas, fue avanzada por el reciente descubrimiento de que los hantavirus patógenos son capaces de reclutar plaquetas para adherirse a las superficies celulares endoteliales, con β3 integrina utilizada como elemento de unión crítica [69]. (3) Efectos patógenos causados por las actividades de macromoléculas virales específicas. Hemos revisado algunas de las actividades asociadas con los Gn, Gc y N, polipéptidos codificados viralmente en secciones anteriores. Modelos de prueba de patogénesis se pueden hacer más eficazmente cuando hay un modelo animal que imita aspectos clave de la enfermedad. No existe un modelo similar al HFRS, pero existen modelos animales para el transporte asintomático de PUUV y SNV por sus roedores portadores nativos, el banco vole Myodes glareolus y el ratón de venado P. maniculatus; así como un modelo de hámster sirio utilizando ANDV o el virus Aporal relacionado de Venezuela, para el cual se observa una enfermedad mimética HCPS [70] [71] [72] [73]. El modelo de hámster ANDV-Sirio tiene una serie de características en común con la enfermedad humana, así como algunas diferencias. A diferencia de las enfermedades neurológicas que han sido posibles de provocar con HTNV, el modelo de hámster para HCPS parece ser causado por fugas capilares que resultan en edema pulmonar y la producción de un derrame pleural con características exuda Típicamente los hámsteres mueren entre 11 y 14-d post-inoculación, reflejando un período de incubación ligeramente acelerado en comparación con las infecciones humanas. Al igual que con el HCPS humano, el examen microscópico del pulmón revela abundante deposición de fibrina, septo alveolar engrosado y antígeno viral expresado abundantemente en el endotelio microvascular. Los hámsteres infectados por ANDV equipados con dispositivos de monitoreo fisiológico mostraron disminución de las presiones de pulso, taquicardia e hipotensión que parecen imitar de cerca el shock que se cree que es la causa próxima de la muerte en pacientes que sucumben al HCPS [65, 74]. En comparación con la enfermedad humana, los hámsteres infectados por ANDV exhiben títulos excepcionalmente altos de ANDV vivo en sus tejidos, con gran parte de la replicación viral que ocurre en Los títulos de ANDV vivo en algunos casos superan los 10 8 /g, mientras que los aislados de hantavirus de los tejidos humanos han sido notoriamente difíciles de obtener. A pesar de la aparición universal de enzimas hepáticas levemente elevadas en pacientes con HCPS, las enzimas hepáticas no parecen estar presentes en niveles elevados en la sangre de hámsters enfermos incluso inmediatamente antes de la muerte [75]. El período prolongado de incubación asociado con la enfermedad por hantavirus da al huésped un tiempo considerable para montar una respuesta inmune madura contra el virus. Así, en contradición a infecciones de gravedad comparable y sintomatología relacionada asociada con arenavirus y filovirus, las infecciones por hantavirus en humanos se asocian con respuestas anticuerpos de título significativo por el momento en que comienzan los síntomas. A pesar de esta observación, parece ser posible que la variación natural en las respuestas individuales de anticuerpos neutralizantes entre los pacientes con infecciones por NVS pueda estar relacionada con la gravedad de la enfermedad, lo que sugiere que la administración de anticuerpos antivirales podría resultar efectiva terapéuticamente [76]. En el caso de la infección por ANDV, han surgido nuevas evidencias que indican que el aparente aclaramiento del virus de la sangre no resulta en la eliminación completa del estímulo antigénico por el virus, sugiriendo que el virus puede persistir, tal vez en algún sitio inmunológicamente privilegiado aún indeterminado [77]. Un papel para las respuestas patológicas mediadas por células T en el HFRS y el HCPS ha sido la fuente de especulación por una variedad de razones. La gravedad del SNS asociado al SNCP puede haber hecho más evidente que el inicio del edema pulmonar, la taquicardia y la hipertensión parecía estar todo, pero universalmente asociado temporalmente, con la aparición de un espectro de células altamente activadas del linaje linfoide en la sangre periférica. Se detectaron células con similitudes morfológicas cercanas a estos -inmunoblastos- en los pulmones congestionados y pesados de los pacientes que llegaron a la autopsia, así como en órganos linfoides y en las tríadas portal [63, [78] [79] [80]. Estas observaciones llevaron a especular que algún componente de la patogénesis por hantavirus podría estar vinculado a la aparición de células T antivirales que podrían estimular o contribuir a la aparición de una -tormenta de mediadores y el fenotipo de fuga capilar asociado. Estudios posteriores han confirmado la expectativa de que una fracción significativa de la población de inmunoblastos en pacientes con HCPS son células T con especificidad para epitopes específicos de antígenos virales de clase I presentados por el HLA, incluyendo Gn, Gc y N [77, [81] [82] [83]. Presumiblemente, las actividades antivirales de estas células, manifestadas en parte por su elaboración de mediadores en el intersticio afectado, pueden contribuir a la fuga endotelial/capilar que se encuentra en el corazón de la patogénesis del hantavirus. Debido a que los primeros casos de HCPS a menudo llegaron a la autopsia, se hizo posible examinar tejidos necropsiados para la expresión de citocinas. El estudio de Mori et al. (1999) revelaron una alta expresión relativa de citocinas proinflamatorias incluyendo TNF-, IL-1-, IL-6, proporcionando evidencia a favor de un modelo de tormenta de citoquinas para la patogénesis [64]. Los autores creían, basándose en la morfología de las células secretadoras de citoquinas, que tanto monocitos como linfocitos estaban contribuyendo a la producción de citocinas. Que los mediadores proinflamatorios se encuentran en niveles elevados en el plasma, así como el intersticio renal de pacientes con enfermedad hantaviral aguda se ha reconocido desde hace algún tiempo también [84, 85]. Si bien el diagnóstico de HCPS y HFRS se realiza mejor con serología IgM, en la etapa aguda de la infección por NVS, también se puede utilizar RT-PCR si se utilizan células sanguíneas o coágulos de sangre en lugar de plasma o suero, donde la sensibilidad incluso utilizando imprimaciones PCR anidadas disminuye a cerca del 70% [86] [87] [88]. En una instalación en la que se tratan muchos casos de HCPS, el centro médico de la Universidad de Nuevo México en Albuquerque, se ha ofrecido un servicio de diagnóstico en el que se analizan los hallazgos hematológicos del paciente para establecer la probabilidad de que un paciente tenga HCPS. La combinación de trombocitopenia, abundancia elevada de linfocitos -inmunoblasto-, población de células polimorfonucleares con desplazamiento izquierdo sin evidencia morfológica fuerte para su activación, y valores elevados de hemoglobina o hematocrito es altamente específica para el HCPS y permite a los clínicos la capacidad de poner pacientes presuntivos-HCPS en oxigenación de membrana extracorpórea (ECMO), que se cree que ha salvado a muchos pacientes de un resultado letal [89]. Se cree que la infección humana por hantavirus sigue el contacto con secreciones o excreciones producidas por roedores infectados. En los Estados Unidos, 538 infecciones humanas por hantavirus fueron reportadas hasta finales de diciembre de 2009 [90], con Nuevo México, Arizona y Colorado mostrando los casos más altos. Mientras que el prototípico hantavirus centroamericano en América Central fue el virus Rio Segundo de Reithrodontomys mexicanus de Costa Rica, la primera enfermedad humana apareció algunos años más tarde en Panamá, donde el virus Choclo (CHOV) surgió como el agente etiológico y se cree que es responsable de todos los casos conocidos de HCPS. La rata de arroz pigmeo fulvo Oligoryzomys fulvescens ha sido identificada como el reservorio de roedores [91]. En Panamá, los primeros casos de HCPS, aunque con poca o ninguna implicación cardiaca evidente, fueron reportados en 1999, y desde entonces, 106 infecciones humanas han ocurrido con una tasa de mortalidad del 26% [92]. Seroencuestas de mamíferos en México y Costa Rica han encontrado anticuerpos antihantavirus [93] [94] [95] [96], y se han notificado seroprevalencias que oscilan entre 0,6 y 1,6% en poblaciones humanas a pesar de la ausencia de casos conocidos de HCPS [97]. En América del Sur, los casos de HCPS se han identificado en Argentina, Bolivia, Brasil, Chile, Paraguay y Uruguay, y también se han notificado evidencias de exposición humana a hantavirus en Venezuela [98] y Perú [99]. En América del Sur, ANDV es el principal agente etiológico con casos en Chile y Argentina notificados desde 1995. En Chile, se han producido 671 casos de HCPS debido a ANDV durante el período 2001-2009 [100]. Desde 1995 se han reportado más de 1.000 casos de HCPS en Argentina [101] ; en el Brasil se han identificado aproximadamente 1.100 casos de HCPS entre 1993 y 2008 [102]. Las tasas de mortalidad por casos en esos tres países han sido similares, oscilando entre el 30% (Argentina), el 36% (Chile) y el 39% (Brasil). Las infecciones por Hantavirus ocurren con más frecuencia en hombres que en mujeres, aunque la proporción entre hombres y mujeres es muy variable. Por ejemplo, las comunidades panameñas mostraron una proporción de 55 hombres por 45 mujeres [103], mientras que en Chile la proporción es más sesgada por hombres (71%) [104]. En el Chaco paraguayo la proporción entre hombres y mujeres se aproxima al 50% [105]. En América del Norte, en diciembre de 2009 el 63% de los pacientes eran varones [90]. Todos los grupos étnicos y raciales parecen ser susceptibles a infecciones por el hantavirus, y las diferencias entre ciertos grupos (como indígenas y no indígenas) están más probablemente correlacionadas con el tipo de hábitat en el que reside la población (por ejemplo, zonas rurales frente a zonas urbanas). De hecho, las comunidades rurales representan la mayor incidencia global del hantavirus y, por lo tanto, están en mayor riesgo [92, [105] [106] [107] [108] [109] [109] [119], aunque también se ha destacado la importancia de los entornos peridomésticos como una importante zona de exposición [112, 113]. El principal mecanismo por el que los seres humanos adquieren la infección por el hantavirus es la exposición a aerosoles de heces contaminadas de roedores, orina y saliva [114, 115]. Esto puede ocurrir cuando los seres humanos residen en áreas cercanas a las que habitan los roedores, viven en áreas infestadas de roedores, o cuando los roedores invaden entornos humanos, que son más frecuentes en hábitats rurales.Existe una larga historia de coexistencia humana con roedores, lo que plantea dudas sobre el aparente aumento reciente de las enfermedades relacionadas con el hantavirus, especialmente el HCPS. Aparte de una aparente asociación con eventos de oscilación sureña de El Niño (ENSO) en algunas regiones [116, 117], los recientes incrementos en la incidencia del HCPS no parecen seguir un patrón temporal o espacial fácilmente definido. Sin embargo, algunas características del paisaje, como la fragmentación del hábitat o las áreas perturbadas por el ser humano, pueden influir en la dinámica de la población de roedores e impactar en la incidencia viral [118] [112] [112] [121]. A pesar de la estocástica asociada a la contracción de la infección Las actividades humanas en edificios mal ventilados que pulverizan partículas que luego se inhalan (es decir, limpieza, agitación de alfombras, polvo) se identifican con frecuencia entre los pacientes admitidos para el SHCPS [11, 122]. Se cree que las actividades al aire libre transmiten un menor riesgo debido a la labilidad de los hantavirus a la radiación UV y a la supuesta tendencia a dispersarse en el viento, aunque ciertas condiciones ambientales parecen mantener el virus durante períodos más largos fuera de su huésped natural, lo que permite la transmisión indirecta [123]. Una vía alternativa pero poco común de transmisión del virus es la mordedura de roedores [124] [125] [126]. Los trabajadores sobre el terreno que manipulan mamíferos corren un riesgo potencialmente mayor de exposición a infecciones por hantavirus, aunque cuando se cuantifica a través de serosurveys el riesgo absoluto parece bastante leve [127]. Un nuevo estudio en Colorado sugiere la posibilidad de que una picadura de roedor haya sido el vehículo próximo para la transmisión al aire libre de NVS [128], lo que vuelve a enfatizar el uso de equipo de protección personal durante las actividades de trabajo de campo [129]. Como caso particular dentro de los hantavirus, la transmisión de persona a persona ha sido documentada exclusivamente para el virus de los Andes sudamericanos [130] [133] [133] [135]. La identificación de esta vía de transmisión se ha hecho utilizando tanto herramientas moleculares como encuestas epidemiológicas, pero el mecanismo de transmisión interpersonal no está bien establecido. Curiosamente, ANDV también puede ser derramado por los humanos a través de otros fluidos biológicos como la orina [136], ilustrando las propiedades particulares que diferencian este virus de otros hantavirus. Aunque la transmisión interpersonal parece ser única para ANDV, el ARN viral de PUUV se ha detectado en la saliva de pacientes con HFRS, y algunos pacientes con SNV-HCPS tienen ARN viral en las secreciones traqueales [88, 137]. Los Hantavirus en las Américas son alojados naturalmente por roedores (Muridae y Cricetidae) así como las musarañas (Soricidae) y los lunares (Talpidae) (Figura 1). Tres especies de musgo y un mole han sido reportados para albergar hantavirus y su patogenicidad para los humanos permanece desconocida [22, 138, 139]. Se han identificado al menos 15 especies de roedores como portadores de diferentes hantavirus patógenos, con algunos genotipos sudamericanos como Castelo do Sonhos (CDSV) o Hu39694 sólo identificados después de infecciones humanas (Figura 1 ). Los hantavirus suelen mostrar una alta especificidad de especie y ningún huésped intermedio [140]. Sin embargo, se han descrito algunos genotipos de hantavirus en la misma especie de roedores. Tal es el caso de Playa de Oro (OROV) y Catacamas (CATV) identificados en Oryzomys couesi [141, 142], o Maporal (MAPV) y Choclo (CHOV) hospedados por O. fulvescens [91, 143]. En América del Norte se han detectado virus de muleshoe y Black Creek Canal hanta en sigmodon hispidus [ Además, un genotipo de hantavirus (por ejemplo, el virus similar a Juquitiba) puede ser transportado por más de una especie de roedores (O. nigripes, Oxymycterus judex, Akodon montesis). Otro ejemplo es el virus Laguna Negra (LANV) que después de ser identificado en Calomys laucha [146] también ha sido reportado en C. callosus [147]. El rápido aumento en el descubrimiento de nuevos hantavirus y la identificación de sus anfitriones no parece probable que termine tan pronto como se examinen nuevas especies pequeñas de mamíferos [95]. Este tema se complica por la continua controversia en los criterios para la clasificación de distintos hantavirus [148, 149], que también está vinculado a la clasificación taxonómica y los reordenamientos taxonómicos. La transmisión de especies cruzadas es un proceso importante durante la propagación, aparición y evolución Particularmente dentro de los hantavirus, los derrames a los huéspedes secundarios se identifican cada vez más a medida que se realizan estudios más extensos [151] [152] [153] [155] [156]. Por ejemplo, ANDV es el agente etiológico predominante del HCPS en América del Sur, y O. longicaudatus el principal reservorio de roedores. Derrama en al menos otras cuatro especies de roedores que coocurren con el reservorio se han identificado, con Abrothrix longipilis mostrando la segunda mayor prevalencia de anticuerpos de ANDV, y actualmente no hay duda de que el virus es extremadamente similar genéticamente entre los dos roedores del huésped [157, 158]. En América del Norte, el derrame del virus Bayou (BAYV) puede haber ocurrido desde el reservorio principal de O. palustris a S. hispidus, R. fulvescens, P. leucopus y B. taylori [159] [160] [161]. Es más probable que el derrame del virus Hanta se produzca con poblaciones de acogida que habitan regiones simpatricas o sintópicas [151, 162], y la transmisión de especies cruzadas tendría probablemente mayores posibilidades de éxito si las especies anfitrionas están estrechamente relacionadas [163]. Se encuentra una excepción interesante entre el virus Oxbow (OXBV) y el virus Asama (ASAV) en el que un proceso de cambio de huésped parecía haber ocurrido entre mamíferos pertenecientes a dos familias (Talpidae y Soricidae), probablemente como resultado de la codivergencia alterna y recurrente de ciertos tax Los hantavirus son transmitidos horizontalmente entre roedores y no son transmitidos por artrópodos (a diferencia de otros virus de la familia Bunyaviridae). La infección por derrapadores a mamíferos no humanos generalmente no produce ninguna transmisión hacia adelante (o a fin de morir), pero si los seres humanos están infectados pueden resultar en una alta morbilidad y mortalidad [122, 164]. Durante la primavera de 1993, un brote de pacientes con HCPS debido a SNV ocurrió en los estados de Four Corners, resultando en más del 60% de casos de mortalidad entre los casos iniciales, muchos de los cuales involucran a miembros de la tribu Navajo [12, 121]. En Panamá, se notificó un brote durante 1999-2000 en Los Santos, y 12 casos donde se identificaron con tres muertes [165, 166]. Esto representó el primer informe de infecciones por hantavirus humanos en América Central. En América del Sur, Diecisiete individuos fueron identificados con anticuerpo NVS (ELISA) o fueron antígenos (HCI) positivos de 52 casos sospechosos [167]. En 1996 ocurrieron brotes mayores debidos a ANDV en el sur de Argentina [131, 134] ; en el sur de Chile se presentaron grupos de pacientes con enfermedad por hantavirus en 1997 [158]. En Brasil, el primer brote fue identificado en la Amazonía Brasileña (Estado de Maranhão) en el año 2000, e involucró pequeños pueblos que resultaron en una prevalencia del 13,3% de los evaluados (398 residentes totales) [168]. Los factores que desencadenan los brotes de hantavirus todavía son mal entendidos, probablemente porque resultan de varias características bióticas y abióticas interactuantes cuyos parámetros clave son difíciles de modelar. Sin embargo, el uso de nuevos enfoques de modelado que involucran características geográficas y ambientales parece ser prometedor a la hora de predecir posibles brotes de hantavirus y/o áreas de mayor riesgo [169] [170] [171] [172]. Debido a que se sabe que los hantavirus se transmiten directamente de los huéspedes infectados a los susceptibles, el primer enfoque natural es relacionar los brotes con la ecología de los huéspedes virales. La transmisión y persistencia del hantavirus en las poblaciones de roedores depende de varios factores que interactúan para afectar la dinámica ecológica del huésped, que a su vez está fuertemente influenciada por las características de comportamiento de las especies de roedores individuales, a la estructura paisajística y a las características ambientales [173, 174]. La transmisión viral depende de las tasas de contacto entre los huéspedes sensibles, y a pesar de la noción prevaleciente de que un aumento de la densidad se encuentra y, por lo tanto, de Además, se ha demostrado que la transmisión de NVS sigue un patrón de heterogeneidad de contacto, donde los individuos de la población tienen diferentes probabilidades de transmitir la infección [176]. La comprensión de la transmisión viral resulta ser mucho más compleja cuando especies distintas del principal huésped del reservorio se incorporan en el modelo. De hecho, estudios recientes han demostrado que la mayor diversidad de especies hospedantes está correlacionada con una menor prevalencia de infección en América del Norte para P. maniculatus [177], en América Central para O. fulvescens (reservorio del virus Choclo) y Zygodontomys brevicauda (reservorio del virus Calabazo) [178], y en América del Sur para Akodon montensis (reservorio del virus Jabora) [162]. Las tasas de contacto varían según la distribución espacial de las poblaciones y parecen estar Por ejemplo, la prevalencia de SNV en P. maniculatus fue mayor en paisajes con mayor grado de fragmentación del hábitat preferido [179]. Además, ciertas propiedades del paisaje como elevación, pendiente y cubierta terrestre parecen ser útiles para detectar áreas con infecciones persistentes de SNV, y por lo tanto se consideran áreas refugiales donde el virus puede mantenerse durante años [169]. Los cambios en el entorno natural de las especies de reservorios, como la fragmentación forestal y la pérdida de hábitat, pueden alterar la abundancia y distribución de la población y provocar brotes de hantavirus, como se observa en la Península de Azurero de Panamá [118, 119]. Además, las diferencias en el microhábitat, incluida la cubierta superficial, pueden conducir a diferencias en la dinámica ecológica dentro de las poblaciones y afectar a la tasa de exposición al virus [180]. Se han encontrado diferencias en las infecciones por hantavirus a través de paisajes contrastantes en el intervalo latitudinal en poblaciones de roedores de O. longicaudatus en Chile, lo que sugiere que los seres humanos están expuestos de manera diferencial al virus [107, 181]. La dinámica poblacional de roedores se ve afectada por cambios estacionales de clima y clima [182, 183]. En el caso de los brotes asociados a ENSO, se ha postulado una compleja cascada de eventos desencadenados por lluvias altamente inusuales en el año precedente para dar lugar a un aumento de la producción primaria y densidades de roedores, aumentando también la probabilidad de transmisión del virus a los seres humanos, pero ha resultado difícil demostrar con precisión los eventos intermedios sugeridos, como el aumento de las densidades de roedores en el aumento de la carga de casos [116, 121, 184]. En América del Sur, los efectos del cambio climático y los brotes de hantavirus no han sido bien estudiados, a pesar del conocimiento de que varias especies de roedores que son reservorios de enfermedades emergentes se han visto dramáticamente afectadas por eventos como El Niño [185]. Los cambios en la dinámica de la población de acogida también se ven afectados por la estacionalidad, lo que puede conducir a brotes de enfermedades cuando se interrumpen los procesos que equilibran las poblaciones de roedores de temporada en temporada [186]. La emergencia viral puede seguir promoviéndose a medida que los cambios introducidos por el ser humano continúan aumentando en el medio ambiente a diferentes escalas geográficas. Estos cambios también pueden alterar la estructura y dinámica de la población de roedores e interacciones interespecies creando condiciones que pueden conducir a brotes virales, establecimiento viral en nuevos hospederos, y la aparición de HCPS [102, 162], incluso con aparentemente leve perturbación ecológica al sistema virus-hospedero [188]. Ciertas características fisiopatológicas, incluyendo trombocitopenia y shock, de enfermedades por hantavirus de los seres humanos, tienen similitud sustancial con las fiebres hemorrágicas inducidas por otros virus tales arenavirus, filovirus y flavivirus, a pesar de compartir esencialmente ninguna secuencia similitud con ellos. Tales observaciones plantean preguntas acerca de si tales similitudes en la patogénesis son probables similitudes de fenotipo, o en cambio reportan la presencia de mecanismos moleculares comunes entre los virus. En esta revisión se discuten las propiedades generales, descubrimientos y epidemiología/ecología de las formas de hantavirus patógenos del Nuevo Mundo, y también se busca identificar algunas de las características de las macromoléculas virales y mecanismos inmunológicos que se han propuesto como potenciales mediadores directos de los eventos patógenos que caracterizan la enfermedad humana HCPS. Si bien es poco probable que la expresión de una proteína viral particular o ARNs en aislamiento se pueda confiar en replicar fenotipos clave de infección por el virus completo, algunos de los hallazgos han sido suficientemente consistentes con lo que se conoce de la patogénesis in vivo que ofrecen plomos plausibles de primer paso en la búsqueda de objetivos terapéuticos. Esperamos con interés las revelaciones mecanísticas que seguirán el uso inevitablemente ampliado de métodos poderosos como la secuenciación profunda, imágenes cada vez más avanzadas, y métodos microscópicos, y modelos animales que por fin se pueden decir

¿Qué sucede con la siembra viral en el endotelio local?

Los hantavirus en las Américas y su papel como patógenos emergenteshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3185593/SHA: efe13a8d42b60ef9f7387ea539a1b2eeb5f80101Autores: Hjelle, Brian; Torres-Pérez, FernandoFecha: 2010-11-25DOI: 10.3390/v2125559Licencia: cc-byAbstract: La continua aparición y reaparición de patógenos representan una amenaza continua, a veces mayor, para las poblaciones. Los hantavirus (familia Bunyaviridae) y sus enfermedades humanas asociadas se consideraron confinados a Eurasia, pero la aparición de un brote en el suroeste de Estados Unidos llevó a un gran aumento en su estudio entre los virólogos de todo el mundo. Se han descrito más de 40 genotipos hantavirales, la gran mayoría desde 1993, y casi la mitad de ellos patógenos para los seres humanos. Los hantavirus causan infecciones persistentes en sus reservorios, y en las Américas, la enfermedad humana se manifiesta como compromiso cardiopulmonar, síndrome cardiopulmonar del hantavirus (HCPS), con proporciones de casos-fatalidad, para los serotipos virales más comunes, entre el 30% y el 40%. Alteración del hábitat y trastornos ecológicos a mayor escala, tal vez incluyendo el cambio climático, son algunos de los factores que pueden haber aumentado la carga de casos humanos de HCPS entre 1993 y el presente. Consideramos aquí las características que influyen en la estructura de la dinámica de la población huésped que pueden conducir a brotes virales, así como los determinantes macromoleculares de los hantavirus que han sido considerados como potenciales contribuciones a la patogenicidad. Texto: Los patógenos emergentes causan enfermedades nuevas o no reconocidas anteriormente, y entre ellas, las zoonóticas emergentes son una preocupación importante entre los científicos que estudian enfermedades infecciosas a diferentes escalas espaciales y temporales [1, 2]. Los cambios en las condiciones bióticas y abióticas pueden alterar la dinámica de las enfermedades de la población y conducir a la aparición de infecciones zoonóticas [3] [5] [6]. Durante las últimas décadas, se han producido varios brotes de patógenos virales emergentes y reemergentes, que afectan tanto a la implicación puramente local como a nivel mundial/pandémica de las poblaciones humanas. Entre los ejemplos visibles están la gripe A, el virus del Ébola, el virus de la hepatitis C, el trastorno respiratorio grave para adultos (SARS), el coronavirus y el virus de la inmunodeficiencia humana, que desafían las medidas de prevención y control de los sistemas de salud pública [7]. En las Américas, el reciente brote de gripe pandémica A subtipo H1N1 se convirtió en un objetivo importante de control debido a su rápida propagación, y las incertidumbres en cuanto a virulencia y transmisibilidad, sin embargo, la disponibilidad de vacunas fue limitada cuando se produjo una actividad significativa antes de la temporada tradicional de gripe [8]. Sin embargo, en el último siglo han surgido o resurgido brotes de varias enfermedades virales relacionadas con el virus arenavirus y el virus del dengue, y más recientemente, hantavirus y la expansión del rango geográfico del virus del Nilo Occidental. Entre las enfermedades zoonóticas, los mamíferos pequeños son anfitriones de varios virus ARN patógenos, especialmente Arenaviridae y Bunyaviridae: Hantavirus [9] [10] [11]. Las infecciones por hantavirus se convirtieron en una preocupación en las Américas después de la descripción de un brote de distrés respiratorio agudo ocurrido en La enfermedad recientemente reconocida, el síndrome cardiopulmonar del hantavirus, el HCPS (o síndrome pulmonar del hantavirus), se relacionó con la infección por el virus del Sin Nombre (SNV) recién descubierto, y el roedor Peromyscus maniculatus (ratón venado) fue identificado como el reservorio [13]. Sin embargo, las infecciones por hantavirus tienen una historia mucho más larga. Una revisión de los escritos chinos antiguos, que datan de aproximadamente 960 dC, reveló descripciones muy parecidas a la fiebre hemorrágica con síndrome renal (HFRS), el síndrome causado por los hantavirus del Viejo Mundo [14]. Durante el siglo XX, los casos de enfermedad febril aguda con compromiso renal fueron descritos de varios países eurasiáticos y Japón, a menudo en asociación con compromisos militares [15]. El HFRS como síndrome distinto, sin embargo, fue llamado por primera vez a la atención de la medicina occidental en asociación con un brote que ocurrió entre las tropas de las Naciones Unidas durante el conflicto coreano entre 1951 y 1954, donde más de 3.200 soldados fueron afectados [16]. Tomó más de dos décadas hasta que el agente etiológico, el virus Hantaan (HTNV), fue aislado del ratón de campo rayado Apodemus agrarius, detectado en parte por la unión de anticuerpos de muestras de suero de paciente a los tejidos pulmonares de ratones de campo sanos y salvajes [17, 18]. El virus se encontró más tarde para representar la especie tipo de un nuevo género Hantavirus de la familia Bunyaviridae, aunque fue más tarde evidente que el primer hantavirus a aislarse fue el virus Thottapalayam de shrew-borne [19]. La categorización de los hantavirus como pertenecientes a la familia Bunyaviridae se debe en parte a la presencia consistente de tres genomas de ARN que son circularizados in vivo como resultado de la presencia de nucleótidos terminales complementarios que ayudan a doblar el genoma en una morfología -hairpin-, descrita por primera vez para el flebovirus Uukuniemi [19, 20]. La Tabla 1 es una lista de los hantavirus patógenos predominantemente distintos serológicamente. Se describen muchos otros genotipos llamados, pero tales otras formas patogénicas están generalmente estrechamente relacionadas con los Andes o, en algunos casos, el virus Sin Nombre. Durante la maduración del virus, el precursor forma GPC se procesa utilizando una proteasa unida a la membrana en Gn y Gc, una escisión que ocurre, y parece ser señalada, después de la señal péptida conservada WAASA en la C-terminal de Gn [24]. Aunque las dos proteínas se pueden expresar de forma independiente a través de la transfección, pueden ser retenidas en el compartimento celular incorrecto (ER o aggrosome); por lo tanto, deben ser co-expresadas para permitirles estabilidad para que las dos se puedan ensamblar correctamente en el Golgi [25, [27] [28]. Se han identificado varias actividades y propiedades para las glicoproteínas envolventes del hantavirus, incluyendo algunas características que se sospecha que están involucradas en la patogenicidad de los serotipos causantes de la enfermedad, una posibilidad que ha generado atención experimental. Las glucoproteínas son los ligandos conocidos o presuntos para al menos dos receptores celulares distintos, la cadena de integrina y el factor acelerador de la descomposición, o DAF [30, 31] ; con gC1qR/p32 también identificado como otro receptor de entrada potencial [32]. Comparaciones con la proteína E del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, llevaron a Tischler et al. a considerar la glicoproteína Gc como una proteína potencial de fusión de clase II, tal vez impartiendo actividad de fusión al virión, y esta hipótesis ha ganado apoyo en otros estudios [33, 34]. Se han identificado actividades adicionales con, o se afirma que están relacionadas con, Gn. Para muchos de estos estudios, una premisa subyacente ha sostenido que hay diferencias entre las glicoproteínas de hantavirus -patógenos en relación con virus en el género que se denominan Si bien es cierto que aún no ha sido posible vincular el virus de Prospect Hill (PHV) con la enfermedad humana, la ausencia de evidencia de su patogenicidad tal vez no debería equipararse con la evidencia de su ausencia. Sólo se podría considerar que el nivel de enfermedad (por ejemplo, letargo, fiebre, proteinuria y azotemia) asociado con la infección de primates no humanos por PHV no es significativamente diferente del registrado para los modelos de primates no humanos utilizando el virus conocido del patógeno Puumala (PUUV) [35, 36]. Para el propósito de esta discusión, presumiremos que los hantavirus apatogénicos son efectivamente apatogénicos. Mientras que algunos estudios han sugerido que las glicoproteínas Gn se dirigen más rápidamente a la vía ubiquitina-proteosoma que a las formas apatogénicas, otros han interpretado las diferencias en el manejo de las glicoproteínas Gn a través de especies de hantavirus por el sistema ubiquitina-proteosomal como independientes de la patogenicidad [37] [38] [39]. Algunos investigadores han dirigido sus esfuerzos hacia la identificación de una capacidad diferencial, ya sea cinética o de magnitud absoluta, en la capacidad de los hantavirus patógenos y apatogénicos para provocar una respuesta de interferón en las células. Una premisa que surge es que las formas apatogénicas tenderían a inducir una respuesta innata anterior que haría más probable que el virus se limpiara rápidamente o se volviera menos competente en su replicación, a fin de evitar cualquier respuesta patológica en el huésped [42] La respuesta innata anti-hantavirus puede en algunos casos ser atribuida a la interacción viral como ligando de TLR-3, pero no en otros, y en las células endoteliales, no parece requerir más que la partícula viral misma, incluso cuando se introduce en forma replicativa incompetente [43, 44]. Las proteínas y los ARNm inducidos prominentemente por los hantavirus incluyen MxA e IFIT-1 (ISG-56) y otros incluyendo algunos con actividad antiviral conocida o sospechada. Esos hantavirus, a menudo cepas altamente patógenas, que no inducen una respuesta antiviral potente, se sospechan o se presume que tienen un (más) potente mecanismo de antagonismo interferón-vía en relación con otros virus, un mecanismo que actúa positivamente para prevenir que se forme una respuesta innata efectiva, al menos temprano en la infección Sin embargo, se reportan algunos casos en los que los hantavirus altamente patógenos, tales como NVS, también son capaces de inducir la expresión de los ARNm del gen estimulado por interferón, incluso muy temprano en la infección, con proteínas ISG, como se esperaba, tardando más tiempo en aparecer en la célula [44]. Las actividades anti-interferón también se han atribuido a la proteína NSs que se puede elaborar en células infectadas por serotipos que codifican esta proteína [46]. Otros investigadores han examinado las actividades de las glucoproteínas del hantavirus y otras proteínas que podrían afectar directamente a algunos aspectos de la progresión patogénica asociada a la infección por hantavirus en humanos, tales como cambios de permeabilidad vascular. Mientras que los primeros intentos de causar directamente aumentos en la permeabilidad de las monocapas endoteliales con partículas virales o infección viral fueron en gran medida decepcionantes, los hantavirus se han identificado como que afectan adversamente la migración endotelial sobre los sustratos y en la potenciación de la permeabilidad endotelial inducida por VEG-F [47, 48]. La proteína nucleocápsida o N más corta (+50 kD) es un componente estructural del nucleocápsido viral, junto con los segmentos de ARN viral genómico. Como proteína de unión al ARN que afecta a la horquilla del cabello de los segmentos genómicos con alta afinidad [49, 50], limita el acceso del ARN para alojar nucleasasas y ayuda a hacer que la replicación viral sea un proceso cerrado dentro del citoplasma. También actúa como una proteína de membrana periférica, al igual que la proteína L [51], una actividad que podría jugar un papel en su supuesta, pero aún no demostrada función como matriz [52]. Hasta hace poco, no se había apreciado que N tuviera una amplia variedad de otras actividades, algunas de las cuales pueden estar vinculadas, no sólo a los requisitos fundamentales de replicación, sino también a la interferencia con una serie de procesos intracelulares de la célula normal. Así, se ha propuesto una interacción entre el aminoterminal de la proteína N del hantavirus y la proteína celular Daxx, con la sugerencia de posibles consecuencias pro-apoptóticas [51]. N también se reporta que interactúa con microfilamentos actínicos, y la proteína SUMO-1 [53, 54]. Utilizando ensayos basados en el gen reportero, Connie Schmaljohn y sus colegas han informado que la proteína nucleocapsid del virus Hantaan tiene un papel inhibidor en las respuestas inflamatorias mediadas por NF kappa B (NF- â € € TM B). Los efectos sobre la expresión NF- € B parecen estar limitados a la prevención de su translocación nuclear después de su intento de activación con lipopolisacárido, LPS [55]. En el citoplasma de las células infectadas, la proteína N se puede encontrar en los cuerpos celulares P donde secuestra y protege los capuchones de 5'. Puede localizar los capuchones a través de su interacción con DCP1, un componente clave de los cuerpos P. Durante la infección por hantavirus, los ARN virales se concentran en los cuerpos P, a través de su interacción con N y DCP1. La proteína N demuestra la protección preferencial de los ARNm diseñados para terminar prematuramente su proteína codificada en comparación con los ARNm nativos [56]. La proteína N se ha vinculado cada vez más a la replicación y traducción virales, a veces de maneras no previstas anteriormente. Se encuentra entre una familia creciente de diversas proteínas virales que pueden servir como un inespecífico - ARN chaperone ®, una actividad que debe facilitar el acceso de la L polimerasa al ARNv para la transcripción y replicación, en que puede disociar transitoriamente estructuras de ARN mal dobladas [57]. Algunos de los efectos de la proteína N en la traducción no pueden ser inmediatamente reconocidos como adaptables en la naturaleza. Puede reemplazar todo el complejo de iniciación traslacional EIF4F, presentando simultáneamente el ribosoma con un reemplazo de la actividad de unión de la tapa de eIF 4E, uniéndose al complejo de pre-iniciación 43S, al igual que eIF 4G, al tiempo que reemplaza la actividad helicoidal de eIF 4A, que se presume que es necesaria para disociar la estructura de ARN de orden superior [56, 58]. Estos tres factores normalmente trabajan juntos para lograr la iniciación traslacional. En los cuerpos P, la capacidad de la proteína N de unirse a una alta afinidad a los oligoribonucleótidos celulares nativos tapados, junto con su actividad en la protección de ARNs tapados de la degradación, probablemente facilita el acceso de oligonucleótidos encapsulados para su uso en la iniciación transcripcional por L polimerasa (-cap ra Tráfico de N para el ensamblaje viral: Clásicamente, la proteína N en las células infectadas parece estar agrupada o partículas en la naturaleza, con una concentración pesada en una única ubicación perinuclear, ampliamente considerada como la Golgi [27]. Las proteínas N de los hantavirus se encuentran en asociación con fracciones de partículas, y los estudios confocales microscopía y bioquímico-inhibidores han demostrado que las trazas N a lo largo de microtúbulos pero no con filamentos de actina [52]. El destino final de N, para su ensamblaje en partículas virales es la Golgi, y que circula allí a través del complejo intermedio retículo-Golgi endoplasmático (ERGIC), también conocido como cúmulo vesicular-tubular [52]. Un inhibidor negativo dominante, la dinamitina, asociado con el transporte mediado por Los estudios posteriores sugieren que la dependencia específica del transporte microtubular es específica de los hantavirus del Viejo Mundo como el NVH, pero que el Hantavirus del Nuevo Mundo ANDV está asociado con filamentos de actina [59]. Sin embargo, los datos recientes indican que el transporte microtubular es efectivamente utilizado para el NVH del Nuevo Mundo [60]. Las enfermedades del Hantavirus del hombre desde hace mucho tiempo han sido sospechosas de tener una base inmunopatógena en parte debido a su período de incubación relativamente largo de 2-3 semanas y la asociación temporal observada entre los trastornos inmunológicos y la primera aparición de signos y síntomas de la enfermedad del hantavirus. HFRS y HCPS comparten muchas características clínicas, llevando a muchos investigadores a considerar que son, en esencia, diferentes manifestaciones de un proceso patógeno similar, que difieren principalmente en los órganos objetivo primarios de expresión de la enfermedad (Tabla La patogénesis de las infecciones por hantavirus es el tema de una revisión continuamente actualizada en la serie UpToDate [61]. Para el momento en que aparecen los síntomas en el HCPS, ambas respuestas antivirales fuertes, y, para los genotipos virales más virulentos, el ARN viral puede ser detectado en plasma sanguíneo o células sanguíneas nucleadas respectivamente [63, 64]. Al menos tres estudios han correlacionado el ARN viral plasmático con la gravedad de la enfermedad para el HCPS y el HFRS, sugiriendo que la replicación del virus juega un papel continuo y en tiempo real en la patogénesis viral [65] [66] [67]. Se han identificado varios cambios patológicos distintivos que ocurren tanto en el HFRS como en el HCPS. Una característica crítica de ambos es una fuga capilar transitoria (~ 1-5 días) que involucra el La fuga resultante es de carácter exudativo, con una composición química alta en proteínas y similar al plasma. La experiencia continua que indica el fuerte tropismo tisular para las células endoteliales, específicamente, es uno de los varios factores que hacen de la integra β3 un candidato especialmente atractivo como un importante receptor in vivo para los hantavirus. Es probable que los hantavirus lleguen a sus tejidos objetivo a través de la captación por los ganglios linfáticos regionales, tal vez con o dentro de un histiocito pulmonar escoltante. Las semillas del virus endotelio local, donde las primeras células infectadas dan lugar, en última instancia, a una viremia primaria, un proceso que parece tomar mucho tiempo para las infecciones por hantavirus [62, 63]. En el momento en que emerge la viremia secundaria, los agentes de las formas más severas de HFRS y HCPS han comenzado a alcanzar una masa suficiente para inducir, a través de las interacciones PAMP-PRR y otros medios, la expresión de citoquinas proinflamatorias [64]. Para HCPS, esa expresión favorece el lecho pulmonar y los órganos linfoides, pero, por razones desconocidas, ahorra el retroperitoneo y, en general, el riñón. En HFRS la situación se invierte, y sin embargo no se aprecia a menudo que el esperado tropismos tisulares preferentes de virus asociados a HFRS y sus contrapartes asociadas a HCPS para los lechos renal y pulmonar, respectivamente, no es como se predeciría a través de las manifestaciones de las dos enfermedades. La elaboración local de mediadores inflamatorios y quimiotácticos se considera un requisito para el desarrollo de Sin embargo, no es la hipoxemia, debido al edema pulmonar prominente, lo que conduce a la muerte en la mayoría de los casos fatales de HCPS, sino más bien la intoxicación del corazón por mediadores como aún no definidos, lo que conduce al estado de bajo gasto cardíaco y al síndrome de shock asociado [64, 65]. Es tentador especular que los mediadores producidos en el pulmón en conexión con el infiltrado inflamatorio pueden infiltrarse a través de la circulación coronaria con dilución mínima en HCPS, consecuencia desventajosa de la estrecha yuxtaposición anatómica de los dos órganos. Así, al menos tres clases de mecanismos potenciales, algunos superpuestos y todos ciertamente no exclusivos de los otros, podrían presumirse que subyacen a la patogénesis del HCPS. Estos incluyen:(1) Mecanismos inmunes innatos. La naturaleza de las interacciones entre los patrones moleculares asociados al patógeno del hantavirus (PAMP) y los receptores de reconocimiento del patrón (PRR) de las células endoteliales susceptibles comienzan a ser aclaradas. El HTNV prototípico parece ser reconocido por TLR-3 [43]. Tal infección tiene consecuencias tales como una mayor expresión del HLA-DR en las células dendríticas [66] y la diferenciación de los monocitos hacia las células dendríticas [67]. (2) Efectos virales directos. La correlación observada entre la carga viral y la gravedad de la enfermedad deja abierta la posibilidad de que las partículas del hantavirus o el ARN puedan tener efectos tóxicos sobre las células o sobre la señalización. Algunos investigadores han favorecido la toxicidad viral directa, actuando a través de la inhibición de la función de barrera celular endotelial, como una explicación de gran parte de la fuga capilar, aunque existe Una pista potencialmente importante hacia el mecanismo por el cual las infecciones por hantavirus agotan las plaquetas sanguíneas y, en algunos casos, causan manifestaciones hemorrágicas, fue avanzada por el reciente descubrimiento de que los hantavirus patógenos son capaces de reclutar plaquetas para adherirse a las superficies celulares endoteliales, con β3 integrina utilizada como elemento de unión crítica [69]. (3) Efectos patógenos causados por las actividades de macromoléculas virales específicas. Hemos revisado algunas de las actividades asociadas con los Gn, Gc y N, polipéptidos codificados viralmente en secciones anteriores. Modelos de prueba de patogénesis se pueden hacer más eficazmente cuando hay un modelo animal que imita aspectos clave de la enfermedad. No existe un modelo similar al HFRS, pero existen modelos animales para el transporte asintomático de PUUV y SNV por sus roedores portadores nativos, el banco vole Myodes glareolus y el ratón de venado P. maniculatus; así como un modelo de hámster sirio utilizando ANDV o el virus Aporal relacionado de Venezuela, para el cual se observa una enfermedad mimética HCPS [70] [71] [72] [73]. El modelo de hámster ANDV-Sirio tiene una serie de características en común con la enfermedad humana, así como algunas diferencias. A diferencia de las enfermedades neurológicas que han sido posibles de provocar con HTNV, el modelo de hámster para HCPS parece ser causado por fugas capilares que resultan en edema pulmonar y la producción de un derrame pleural con características exuda Típicamente los hámsteres mueren entre 11 y 14-d post-inoculación, reflejando un período de incubación ligeramente acelerado en comparación con las infecciones humanas. Al igual que con el HCPS humano, el examen microscópico del pulmón revela abundante deposición de fibrina, septo alveolar engrosado y antígeno viral expresado abundantemente en el endotelio microvascular. Los hámsteres infectados por ANDV equipados con dispositivos de monitoreo fisiológico mostraron disminución de las presiones de pulso, taquicardia e hipotensión que parecen imitar de cerca el shock que se cree que es la causa próxima de la muerte en pacientes que sucumben al HCPS [65, 74]. En comparación con la enfermedad humana, los hámsteres infectados por ANDV exhiben títulos excepcionalmente altos de ANDV vivo en sus tejidos, con gran parte de la replicación viral que ocurre en Los títulos de ANDV vivo en algunos casos superan los 10 8 /g, mientras que los aislados de hantavirus de los tejidos humanos han sido notoriamente difíciles de obtener. A pesar de la aparición universal de enzimas hepáticas levemente elevadas en pacientes con HCPS, las enzimas hepáticas no parecen estar presentes en niveles elevados en la sangre de hámsters enfermos incluso inmediatamente antes de la muerte [75]. El período prolongado de incubación asociado con la enfermedad por hantavirus da al huésped un tiempo considerable para montar una respuesta inmune madura contra el virus. Así, en contradición a infecciones de gravedad comparable y sintomatología relacionada asociada con arenavirus y filovirus, las infecciones por hantavirus en humanos se asocian con respuestas anticuerpos de título significativo por el momento en que comienzan los síntomas. A pesar de esta observación, parece ser posible que la variación natural en las respuestas individuales de anticuerpos neutralizantes entre los pacientes con infecciones por NVS pueda estar relacionada con la gravedad de la enfermedad, lo que sugiere que la administración de anticuerpos antivirales podría resultar efectiva terapéuticamente [76]. En el caso de la infección por ANDV, han surgido nuevas evidencias que indican que el aparente aclaramiento del virus de la sangre no resulta en la eliminación completa del estímulo antigénico por el virus, sugiriendo que el virus puede persistir, tal vez en algún sitio inmunológicamente privilegiado aún indeterminado [77]. Un papel para las respuestas patológicas mediadas por células T en el HFRS y el HCPS ha sido la fuente de especulación por una variedad de razones. La gravedad del SNS asociado al SNCP puede haber hecho más evidente que el inicio del edema pulmonar, la taquicardia y la hipertensión parecía estar todo, pero universalmente asociado temporalmente, con la aparición de un espectro de células altamente activadas del linaje linfoide en la sangre periférica. Se detectaron células con similitudes morfológicas cercanas a estos -inmunoblastos- en los pulmones congestionados y pesados de los pacientes que llegaron a la autopsia, así como en órganos linfoides y en las tríadas portal [63, [78] [79] [80]. Estas observaciones llevaron a especular que algún componente de la patogénesis por hantavirus podría estar vinculado a la aparición de células T antivirales que podrían estimular o contribuir a la aparición de una -tormenta de mediadores y el fenotipo de fuga capilar asociado. Estudios posteriores han confirmado la expectativa de que una fracción significativa de la población de inmunoblastos en pacientes con HCPS son células T con especificidad para epitopes específicos de antígenos virales de clase I presentados por el HLA, incluyendo Gn, Gc y N [77, [81] [82] [83]. Presumiblemente, las actividades antivirales de estas células, manifestadas en parte por su elaboración de mediadores en el intersticio afectado, pueden contribuir a la fuga endotelial/capilar que se encuentra en el corazón de la patogénesis del hantavirus. Debido a que los primeros casos de HCPS a menudo llegaron a la autopsia, se hizo posible examinar tejidos necropsiados para la expresión de citocinas. El estudio de Mori et al. (1999) revelaron una alta expresión relativa de citocinas proinflamatorias incluyendo TNF-, IL-1-, IL-6, proporcionando evidencia a favor de un modelo de tormenta de citoquinas para la patogénesis [64]. Los autores creían, basándose en la morfología de las células secretadoras de citoquinas, que tanto monocitos como linfocitos estaban contribuyendo a la producción de citocinas. Que los mediadores proinflamatorios se encuentran en niveles elevados en el plasma, así como el intersticio renal de pacientes con enfermedad hantaviral aguda se ha reconocido desde hace algún tiempo también [84, 85]. Si bien el diagnóstico de HCPS y HFRS se realiza mejor con serología IgM, en la etapa aguda de la infección por NVS, también se puede utilizar RT-PCR si se utilizan células sanguíneas o coágulos de sangre en lugar de plasma o suero, donde la sensibilidad incluso utilizando imprimaciones PCR anidadas disminuye a cerca del 70% [86] [87] [88]. En una instalación en la que se tratan muchos casos de HCPS, el centro médico de la Universidad de Nuevo México en Albuquerque, se ha ofrecido un servicio de diagnóstico en el que se analizan los hallazgos hematológicos del paciente para establecer la probabilidad de que un paciente tenga HCPS. La combinación de trombocitopenia, abundancia elevada de linfocitos -inmunoblasto-, población de células polimorfonucleares con desplazamiento izquierdo sin evidencia morfológica fuerte para su activación, y valores elevados de hemoglobina o hematocrito es altamente específica para el HCPS y permite a los clínicos la capacidad de poner pacientes presuntivos-HCPS en oxigenación de membrana extracorpórea (ECMO), que se cree que ha salvado a muchos pacientes de un resultado letal [89]. Se cree que la infección humana por hantavirus sigue el contacto con secreciones o excreciones producidas por roedores infectados. En los Estados Unidos, 538 infecciones humanas por hantavirus fueron reportadas hasta finales de diciembre de 2009 [90], con Nuevo México, Arizona y Colorado mostrando los casos más altos. Mientras que el prototípico hantavirus centroamericano en América Central fue el virus Rio Segundo de Reithrodontomys mexicanus de Costa Rica, la primera enfermedad humana apareció algunos años más tarde en Panamá, donde el virus Choclo (CHOV) surgió como el agente etiológico y se cree que es responsable de todos los casos conocidos de HCPS. La rata de arroz pigmeo fulvo Oligoryzomys fulvescens ha sido identificada como el reservorio de roedores [91]. En Panamá, los primeros casos de HCPS, aunque con poca o ninguna implicación cardiaca evidente, fueron reportados en 1999, y desde entonces, 106 infecciones humanas han ocurrido con una tasa de mortalidad del 26% [92]. Seroencuestas de mamíferos en México y Costa Rica han encontrado anticuerpos antihantavirus [93] [94] [95] [96], y se han notificado seroprevalencias que oscilan entre 0,6 y 1,6% en poblaciones humanas a pesar de la ausencia de casos conocidos de HCPS [97]. En América del Sur, los casos de HCPS se han identificado en Argentina, Bolivia, Brasil, Chile, Paraguay y Uruguay, y también se han notificado evidencias de exposición humana a hantavirus en Venezuela [98] y Perú [99]. En América del Sur, ANDV es el principal agente etiológico con casos en Chile y Argentina notificados desde 1995. En Chile, se han producido 671 casos de HCPS debido a ANDV durante el período 2001-2009 [100]. Desde 1995 se han reportado más de 1.000 casos de HCPS en Argentina [101] ; en el Brasil se han identificado aproximadamente 1.100 casos de HCPS entre 1993 y 2008 [102]. Las tasas de mortalidad por casos en esos tres países han sido similares, oscilando entre el 30% (Argentina), el 36% (Chile) y el 39% (Brasil). Las infecciones por Hantavirus ocurren con más frecuencia en hombres que en mujeres, aunque la proporción entre hombres y mujeres es muy variable. Por ejemplo, las comunidades panameñas mostraron una proporción de 55 hombres por 45 mujeres [103], mientras que en Chile la proporción es más sesgada por hombres (71%) [104]. En el Chaco paraguayo la proporción entre hombres y mujeres se aproxima al 50% [105]. En América del Norte, en diciembre de 2009 el 63% de los pacientes eran varones [90]. Todos los grupos étnicos y raciales parecen ser susceptibles a infecciones por el hantavirus, y las diferencias entre ciertos grupos (como indígenas y no indígenas) están más probablemente correlacionadas con el tipo de hábitat en el que reside la población (por ejemplo, zonas rurales frente a zonas urbanas). De hecho, las comunidades rurales representan la mayor incidencia global del hantavirus y, por lo tanto, están en mayor riesgo [92, [105] [106] [107] [108] [109] [109] [119], aunque también se ha destacado la importancia de los entornos peridomésticos como una importante zona de exposición [112, 113]. El principal mecanismo por el que los seres humanos adquieren la infección por el hantavirus es la exposición a aerosoles de heces contaminadas de roedores, orina y saliva [114, 115]. Esto puede ocurrir cuando los seres humanos residen en áreas cercanas a las que habitan los roedores, viven en áreas infestadas de roedores, o cuando los roedores invaden entornos humanos, que son más frecuentes en hábitats rurales.Existe una larga historia de coexistencia humana con roedores, lo que plantea dudas sobre el aparente aumento reciente de las enfermedades relacionadas con el hantavirus, especialmente el HCPS. Aparte de una aparente asociación con eventos de oscilación sureña de El Niño (ENSO) en algunas regiones [116, 117], los recientes incrementos en la incidencia del HCPS no parecen seguir un patrón temporal o espacial fácilmente definido. Sin embargo, algunas características del paisaje, como la fragmentación del hábitat o las áreas perturbadas por el ser humano, pueden influir en la dinámica de la población de roedores e impactar en la incidencia viral [118] [112] [112] [121]. A pesar de la estocástica asociada a la contracción de la infección Las actividades humanas en edificios mal ventilados que pulverizan partículas que luego se inhalan (es decir, limpieza, agitación de alfombras, polvo) se identifican con frecuencia entre los pacientes admitidos para el SHCPS [11, 122]. Se cree que las actividades al aire libre transmiten un menor riesgo debido a la labilidad de los hantavirus a la radiación UV y a la supuesta tendencia a dispersarse en el viento, aunque ciertas condiciones ambientales parecen mantener el virus durante períodos más largos fuera de su huésped natural, lo que permite la transmisión indirecta [123]. Una vía alternativa pero poco común de transmisión del virus es la mordedura de roedores [124] [125] [126]. Los trabajadores sobre el terreno que manipulan mamíferos corren un riesgo potencialmente mayor de exposición a infecciones por hantavirus, aunque cuando se cuantifica a través de serosurveys el riesgo absoluto parece bastante leve [127]. Un nuevo estudio en Colorado sugiere la posibilidad de que una picadura de roedor haya sido el vehículo próximo para la transmisión al aire libre de NVS [128], lo que vuelve a enfatizar el uso de equipo de protección personal durante las actividades de trabajo de campo [129]. Como caso particular dentro de los hantavirus, la transmisión de persona a persona ha sido documentada exclusivamente para el virus de los Andes sudamericanos [130] [133] [133] [135]. La identificación de esta vía de transmisión se ha hecho utilizando tanto herramientas moleculares como encuestas epidemiológicas, pero el mecanismo de transmisión interpersonal no está bien establecido. Curiosamente, ANDV también puede ser derramado por los humanos a través de otros fluidos biológicos como la orina [136], ilustrando las propiedades particulares que diferencian este virus de otros hantavirus. Aunque la transmisión interpersonal parece ser única para ANDV, el ARN viral de PUUV se ha detectado en la saliva de pacientes con HFRS, y algunos pacientes con SNV-HCPS tienen ARN viral en las secreciones traqueales [88, 137]. Los Hantavirus en las Américas son alojados naturalmente por roedores (Muridae y Cricetidae) así como las musarañas (Soricidae) y los lunares (Talpidae) (Figura 1). Tres especies de musgo y un mole han sido reportados para albergar hantavirus y su patogenicidad para los humanos permanece desconocida [22, 138, 139]. Se han identificado al menos 15 especies de roedores como portadores de diferentes hantavirus patógenos, con algunos genotipos sudamericanos como Castelo do Sonhos (CDSV) o Hu39694 sólo identificados después de infecciones humanas (Figura 1 ). Los hantavirus suelen mostrar una alta especificidad de especie y ningún huésped intermedio [140]. Sin embargo, se han descrito algunos genotipos de hantavirus en la misma especie de roedores. Tal es el caso de Playa de Oro (OROV) y Catacamas (CATV) identificados en Oryzomys couesi [141, 142], o Maporal (MAPV) y Choclo (CHOV) hospedados por O. fulvescens [91, 143]. En América del Norte se han detectado virus de muleshoe y Black Creek Canal hanta en sigmodon hispidus [ Además, un genotipo de hantavirus (por ejemplo, el virus similar a Juquitiba) puede ser transportado por más de una especie de roedores (O. nigripes, Oxymycterus judex, Akodon montesis). Otro ejemplo es el virus Laguna Negra (LANV) que después de ser identificado en Calomys laucha [146] también ha sido reportado en C. callosus [147]. El rápido aumento en el descubrimiento de nuevos hantavirus y la identificación de sus anfitriones no parece probable que termine tan pronto como se examinen nuevas especies pequeñas de mamíferos [95]. Este tema se complica por la continua controversia en los criterios para la clasificación de distintos hantavirus [148, 149], que también está vinculado a la clasificación taxonómica y los reordenamientos taxonómicos. La transmisión de especies cruzadas es un proceso importante durante la propagación, aparición y evolución Particularmente dentro de los hantavirus, los derrames a los huéspedes secundarios se identifican cada vez más a medida que se realizan estudios más extensos [151] [152] [153] [155] [156]. Por ejemplo, ANDV es el agente etiológico predominante del HCPS en América del Sur, y O. longicaudatus el principal reservorio de roedores. Derrama en al menos otras cuatro especies de roedores que coocurren con el reservorio se han identificado, con Abrothrix longipilis mostrando la segunda mayor prevalencia de anticuerpos de ANDV, y actualmente no hay duda de que el virus es extremadamente similar genéticamente entre los dos roedores del huésped [157, 158]. En América del Norte, el derrame del virus Bayou (BAYV) puede haber ocurrido desde el reservorio principal de O. palustris a S. hispidus, R. fulvescens, P. leucopus y B. taylori [159] [160] [161]. Es más probable que el derrame del virus Hanta se produzca con poblaciones de acogida que habitan regiones simpatricas o sintópicas [151, 162], y la transmisión de especies cruzadas tendría probablemente mayores posibilidades de éxito si las especies anfitrionas están estrechamente relacionadas [163]. Se encuentra una excepción interesante entre el virus Oxbow (OXBV) y el virus Asama (ASAV) en el que un proceso de cambio de huésped parecía haber ocurrido entre mamíferos pertenecientes a dos familias (Talpidae y Soricidae), probablemente como resultado de la codivergencia alterna y recurrente de ciertos tax Los hantavirus son transmitidos horizontalmente entre roedores y no son transmitidos por artrópodos (a diferencia de otros virus de la familia Bunyaviridae). La infección por derrapadores a mamíferos no humanos generalmente no produce ninguna transmisión hacia adelante (o a fin de morir), pero si los seres humanos están infectados pueden resultar en una alta morbilidad y mortalidad [122, 164]. Durante la primavera de 1993, un brote de pacientes con HCPS debido a SNV ocurrió en los estados de Four Corners, resultando en más del 60% de casos de mortalidad entre los casos iniciales, muchos de los cuales involucran a miembros de la tribu Navajo [12, 121]. En Panamá, se notificó un brote durante 1999-2000 en Los Santos, y 12 casos donde se identificaron con tres muertes [165, 166]. Esto representó el primer informe de infecciones por hantavirus humanos en América Central. En América del Sur, Diecisiete individuos fueron identificados con anticuerpo NVS (ELISA) o fueron antígenos (HCI) positivos de 52 casos sospechosos [167]. En 1996 ocurrieron brotes mayores debidos a ANDV en el sur de Argentina [131, 134] ; en el sur de Chile se presentaron grupos de pacientes con enfermedad por hantavirus en 1997 [158]. En Brasil, el primer brote fue identificado en la Amazonía Brasileña (Estado de Maranhão) en el año 2000, e involucró pequeños pueblos que resultaron en una prevalencia del 13,3% de los evaluados (398 residentes totales) [168]. Los factores que desencadenan los brotes de hantavirus todavía son mal entendidos, probablemente porque resultan de varias características bióticas y abióticas interactuantes cuyos parámetros clave son difíciles de modelar. Sin embargo, el uso de nuevos enfoques de modelado que involucran características geográficas y ambientales parece ser prometedor a la hora de predecir posibles brotes de hantavirus y/o áreas de mayor riesgo [169] [170] [171] [172]. Debido a que se sabe que los hantavirus se transmiten directamente de los huéspedes infectados a los susceptibles, el primer enfoque natural es relacionar los brotes con la ecología de los huéspedes virales. La transmisión y persistencia del hantavirus en las poblaciones de roedores depende de varios factores que interactúan para afectar la dinámica ecológica del huésped, que a su vez está fuertemente influenciada por las características de comportamiento de las especies de roedores individuales, a la estructura paisajística y a las características ambientales [173, 174]. La transmisión viral depende de las tasas de contacto entre los huéspedes sensibles, y a pesar de la noción prevaleciente de que un aumento de la densidad se encuentra y, por lo tanto, de Además, se ha demostrado que la transmisión de NVS sigue un patrón de heterogeneidad de contacto, donde los individuos de la población tienen diferentes probabilidades de transmitir la infección [176]. La comprensión de la transmisión viral resulta ser mucho más compleja cuando especies distintas del principal huésped del reservorio se incorporan en el modelo. De hecho, estudios recientes han demostrado que la mayor diversidad de especies hospedantes está correlacionada con una menor prevalencia de infección en América del Norte para P. maniculatus [177], en América Central para O. fulvescens (reservorio del virus Choclo) y Zygodontomys brevicauda (reservorio del virus Calabazo) [178], y en América del Sur para Akodon montensis (reservorio del virus Jabora) [162]. Las tasas de contacto varían según la distribución espacial de las poblaciones y parecen estar Por ejemplo, la prevalencia de SNV en P. maniculatus fue mayor en paisajes con mayor grado de fragmentación del hábitat preferido [179]. Además, ciertas propiedades del paisaje como elevación, pendiente y cubierta terrestre parecen ser útiles para detectar áreas con infecciones persistentes de SNV, y por lo tanto se consideran áreas refugiales donde el virus puede mantenerse durante años [169]. Los cambios en el entorno natural de las especies de reservorios, como la fragmentación forestal y la pérdida de hábitat, pueden alterar la abundancia y distribución de la población y provocar brotes de hantavirus, como se observa en la Península de Azurero de Panamá [118, 119]. Además, las diferencias en el microhábitat, incluida la cubierta superficial, pueden conducir a diferencias en la dinámica ecológica dentro de las poblaciones y afectar a la tasa de exposición al virus [180]. Se han encontrado diferencias en las infecciones por hantavirus a través de paisajes contrastantes en el intervalo latitudinal en poblaciones de roedores de O. longicaudatus en Chile, lo que sugiere que los seres humanos están expuestos de manera diferencial al virus [107, 181]. La dinámica poblacional de roedores se ve afectada por cambios estacionales de clima y clima [182, 183]. En el caso de los brotes asociados a ENSO, se ha postulado una compleja cascada de eventos desencadenados por lluvias altamente inusuales en el año precedente para dar lugar a un aumento de la producción primaria y densidades de roedores, aumentando también la probabilidad de transmisión del virus a los seres humanos, pero ha resultado difícil demostrar con precisión los eventos intermedios sugeridos, como el aumento de las densidades de roedores en el aumento de la carga de casos [116, 121, 184]. En América del Sur, los efectos del cambio climático y los brotes de hantavirus no han sido bien estudiados, a pesar del conocimiento de que varias especies de roedores que son reservorios de enfermedades emergentes se han visto dramáticamente afectadas por eventos como El Niño [185]. Los cambios en la dinámica de la población de acogida también se ven afectados por la estacionalidad, lo que puede conducir a brotes de enfermedades cuando se interrumpen los procesos que equilibran las poblaciones de roedores de temporada en temporada [186]. La emergencia viral puede seguir promoviéndose a medida que los cambios introducidos por el ser humano continúan aumentando en el medio ambiente a diferentes escalas geográficas. Estos cambios también pueden alterar la estructura y dinámica de la población de roedores e interacciones interespecies creando condiciones que pueden conducir a brotes virales, establecimiento viral en nuevos hospederos, y la aparición de HCPS [102, 162], incluso con aparentemente leve perturbación ecológica al sistema virus-hospedero [188]. Ciertas características fisiopatológicas, incluyendo trombocitopenia y shock, de enfermedades por hantavirus de los seres humanos, tienen similitud sustancial con las fiebres hemorrágicas inducidas por otros virus tales arenavirus, filovirus y flavivirus, a pesar de compartir esencialmente ninguna secuencia similitud con ellos. Tales observaciones plantean preguntas acerca de si tales similitudes en la patogénesis son probables similitudes de fenotipo, o en cambio reportan la presencia de mecanismos moleculares comunes entre los virus. En esta revisión se discuten las propiedades generales, descubrimientos y epidemiología/ecología de las formas de hantavirus patógenos del Nuevo Mundo, y también se busca identificar algunas de las características de las macromoléculas virales y mecanismos inmunológicos que se han propuesto como potenciales mediadores directos de los eventos patógenos que caracterizan la enfermedad humana HCPS. Si bien es poco probable que la expresión de una proteína viral particular o ARNs en aislamiento se pueda confiar en replicar fenotipos clave de infección por el virus completo, algunos de los hallazgos han sido suficientemente consistentes con lo que se conoce de la patogénesis in vivo que ofrecen plomos plausibles de primer paso en la búsqueda de objetivos terapéuticos. Esperamos con interés las revelaciones mecanísticas que seguirán el uso inevitablemente ampliado de métodos poderosos como la secuenciación profunda, imágenes cada vez más avanzadas, y métodos microscópicos, y modelos animales que por fin se pueden decir

¿Cuánto tiempo dura el proceso de dar lugar a la viremia primaria para las infecciones por hantavirus?

Los hantavirus en las Américas y su papel como patógenos emergenteshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3185593/SHA: efe13a8d42b60ef9f7387ea539a1b2eeb5f80101Autores: Hjelle, Brian; Torres-Pérez, FernandoFecha: 2010-11-25DOI: 10.3390/v2125559Licencia: cc-byAbstract: La continua aparición y reaparición de patógenos representan una amenaza continua, a veces mayor, para las poblaciones. Los hantavirus (familia Bunyaviridae) y sus enfermedades humanas asociadas se consideraron confinados a Eurasia, pero la aparición de un brote en el suroeste de Estados Unidos llevó a un gran aumento en su estudio entre los virólogos de todo el mundo. Se han descrito más de 40 genotipos hantavirales, la gran mayoría desde 1993, y casi la mitad de ellos patógenos para los seres humanos. Los hantavirus causan infecciones persistentes en sus reservorios, y en las Américas, la enfermedad humana se manifiesta como compromiso cardiopulmonar, síndrome cardiopulmonar del hantavirus (HCPS), con proporciones de casos-fatalidad, para los serotipos virales más comunes, entre el 30% y el 40%. Alteración del hábitat y trastornos ecológicos a mayor escala, tal vez incluyendo el cambio climático, son algunos de los factores que pueden haber aumentado la carga de casos humanos de HCPS entre 1993 y el presente. Consideramos aquí las características que influyen en la estructura de la dinámica de la población huésped que pueden conducir a brotes virales, así como los determinantes macromoleculares de los hantavirus que han sido considerados como potenciales contribuciones a la patogenicidad. Texto: Los patógenos emergentes causan enfermedades nuevas o no reconocidas anteriormente, y entre ellas, las zoonóticas emergentes son una preocupación importante entre los científicos que estudian enfermedades infecciosas a diferentes escalas espaciales y temporales [1, 2]. Los cambios en las condiciones bióticas y abióticas pueden alterar la dinámica de las enfermedades de la población y conducir a la aparición de infecciones zoonóticas [3] [5] [6]. Durante las últimas décadas, se han producido varios brotes de patógenos virales emergentes y reemergentes, que afectan tanto a la implicación puramente local como a nivel mundial/pandémica de las poblaciones humanas. Entre los ejemplos visibles están la gripe A, el virus del Ébola, el virus de la hepatitis C, el trastorno respiratorio grave para adultos (SARS), el coronavirus y el virus de la inmunodeficiencia humana, que desafían las medidas de prevención y control de los sistemas de salud pública [7]. En las Américas, el reciente brote de gripe pandémica A subtipo H1N1 se convirtió en un objetivo importante de control debido a su rápida propagación, y las incertidumbres en cuanto a virulencia y transmisibilidad, sin embargo, la disponibilidad de vacunas fue limitada cuando se produjo una actividad significativa antes de la temporada tradicional de gripe [8]. Sin embargo, en el último siglo han surgido o resurgido brotes de varias enfermedades virales relacionadas con el virus arenavirus y el virus del dengue, y más recientemente, hantavirus y la expansión del rango geográfico del virus del Nilo Occidental. Entre las enfermedades zoonóticas, los mamíferos pequeños son anfitriones de varios virus ARN patógenos, especialmente Arenaviridae y Bunyaviridae: Hantavirus [9] [10] [11]. Las infecciones por hantavirus se convirtieron en una preocupación en las Américas después de la descripción de un brote de distrés respiratorio agudo ocurrido en La enfermedad recientemente reconocida, el síndrome cardiopulmonar del hantavirus, el HCPS (o síndrome pulmonar del hantavirus), se relacionó con la infección por el virus del Sin Nombre (SNV) recién descubierto, y el roedor Peromyscus maniculatus (ratón venado) fue identificado como el reservorio [13]. Sin embargo, las infecciones por hantavirus tienen una historia mucho más larga. Una revisión de los escritos chinos antiguos, que datan de aproximadamente 960 dC, reveló descripciones muy parecidas a la fiebre hemorrágica con síndrome renal (HFRS), el síndrome causado por los hantavirus del Viejo Mundo [14]. Durante el siglo XX, los casos de enfermedad febril aguda con compromiso renal fueron descritos de varios países eurasiáticos y Japón, a menudo en asociación con compromisos militares [15]. El HFRS como síndrome distinto, sin embargo, fue llamado por primera vez a la atención de la medicina occidental en asociación con un brote que ocurrió entre las tropas de las Naciones Unidas durante el conflicto coreano entre 1951 y 1954, donde más de 3.200 soldados fueron afectados [16]. Tomó más de dos décadas hasta que el agente etiológico, el virus Hantaan (HTNV), fue aislado del ratón de campo rayado Apodemus agrarius, detectado en parte por la unión de anticuerpos de muestras de suero de paciente a los tejidos pulmonares de ratones de campo sanos y salvajes [17, 18]. El virus se encontró más tarde para representar la especie tipo de un nuevo género Hantavirus de la familia Bunyaviridae, aunque fue más tarde evidente que el primer hantavirus a aislarse fue el virus Thottapalayam de shrew-borne [19]. La categorización de los hantavirus como pertenecientes a la familia Bunyaviridae se debe en parte a la presencia consistente de tres genomas de ARN que son circularizados in vivo como resultado de la presencia de nucleótidos terminales complementarios que ayudan a doblar el genoma en una morfología -hairpin-, descrita por primera vez para el flebovirus Uukuniemi [19, 20]. La Tabla 1 es una lista de los hantavirus patógenos predominantemente distintos serológicamente. Se describen muchos otros genotipos llamados, pero tales otras formas patogénicas están generalmente estrechamente relacionadas con los Andes o, en algunos casos, el virus Sin Nombre. Durante la maduración del virus, el precursor forma GPC se procesa utilizando una proteasa unida a la membrana en Gn y Gc, una escisión que ocurre, y parece ser señalada, después de la señal péptida conservada WAASA en la C-terminal de Gn [24]. Aunque las dos proteínas se pueden expresar de forma independiente a través de la transfección, pueden ser retenidas en el compartimento celular incorrecto (ER o aggrosome); por lo tanto, deben ser co-expresadas para permitirles estabilidad para que las dos se puedan ensamblar correctamente en el Golgi [25, [27] [28]. Se han identificado varias actividades y propiedades para las glicoproteínas envolventes del hantavirus, incluyendo algunas características que se sospecha que están involucradas en la patogenicidad de los serotipos causantes de la enfermedad, una posibilidad que ha generado atención experimental. Las glucoproteínas son los ligandos conocidos o presuntos para al menos dos receptores celulares distintos, la cadena de integrina y el factor acelerador de la descomposición, o DAF [30, 31] ; con gC1qR/p32 también identificado como otro receptor de entrada potencial [32]. Comparaciones con la proteína E del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, llevaron a Tischler et al. a considerar la glicoproteína Gc como una proteína potencial de fusión de clase II, tal vez impartiendo actividad de fusión al virión, y esta hipótesis ha ganado apoyo en otros estudios [33, 34]. Se han identificado actividades adicionales con, o se afirma que están relacionadas con, Gn. Para muchos de estos estudios, una premisa subyacente ha sostenido que hay diferencias entre las glicoproteínas de hantavirus -patógenos en relación con virus en el género que se denominan Si bien es cierto que aún no ha sido posible vincular el virus de Prospect Hill (PHV) con la enfermedad humana, la ausencia de evidencia de su patogenicidad tal vez no debería equipararse con la evidencia de su ausencia. Sólo se podría considerar que el nivel de enfermedad (por ejemplo, letargo, fiebre, proteinuria y azotemia) asociado con la infección de primates no humanos por PHV no es significativamente diferente del registrado para los modelos de primates no humanos utilizando el virus conocido del patógeno Puumala (PUUV) [35, 36]. Para el propósito de esta discusión, presumiremos que los hantavirus apatogénicos son efectivamente apatogénicos. Mientras que algunos estudios han sugerido que las glicoproteínas Gn se dirigen más rápidamente a la vía ubiquitina-proteosoma que a las formas apatogénicas, otros han interpretado las diferencias en el manejo de las glicoproteínas Gn a través de las especies del hantavirus por el sistema ubiquitina-proteosomal como independientes de la patogenicidad [37] [38] [39]. Algunos investigadores han dirigido sus esfuerzos hacia la identificación de una capacidad diferencial, ya sea cinética o de magnitud absoluta, en la capacidad de los hantavirus patógenos y apatogénicos para provocar una respuesta del interferón en las células. Una premisa que surge es que las formas apatogénicas tenderían a inducir una respuesta innata anterior que haría más probable que el virus se limpiara rápidamente o se volviera menos competente en su replicación, a fin de evitar cualquier respuesta patológica en el huésped [4 La respuesta innata anti-hantavirus puede en algunos casos ser atribuida a la interacción viral como ligando de TLR-3, pero no en otros, y en las células endoteliales, no parece requerir más que la partícula viral misma, incluso cuando se introduce en forma replicante-incompetente [43, 44]. Proteínas y ARNm inducidos prominentemente por los hantavirus incluyen MxA e IFIT-1 (ISG-56) y otros incluyendo algunos con actividad antiviral conocida o sospechada. Esos hantavirus, a menudo cepas altamente patógenas, que no inducen una respuesta antiviral potente, se sospechan o se presume que tienen un (más) potente mecanismo de antagonismo interferón-vía en relación con otros virus, un mecanismo que actúa positivamente para prevenir que se forme una respuesta innata efectiva, al menos temprano en Sin embargo, se reportan algunos casos en los que los hantavirus altamente patógenos, tales como NVS, también son capaces de inducir la expresión de los ARNm del gen estimulado por interferón, incluso muy temprano en la infección, con proteínas ISG, como se esperaba, tardando más tiempo en aparecer en la célula [44]. Las actividades anti-interferón también se han atribuido a la proteína NSs que se puede elaborar en células infectadas por serotipos que codifican esta proteína [46]. Otros investigadores han examinado las actividades de las glucoproteínas del hantavirus y otras proteínas que podrían afectar directamente a algunos aspectos de la progresión patogénica asociada a la infección por hantavirus en humanos, tales como cambios en la permeabilidad vascular. Mientras que los primeros intentos de causar directamente aumentos en la permeabilidad de las monocapas endoteliales con partículas virales o infección viral fueron en gran medida decepcionantes, los hantavirus se han identificado como que afectan adversamente la migración endotelial sobre los sustratos y en la potenciación de la permeabilidad endotelial inducida por VEG-F [47, 48]. La proteína nucleocápsida o N más corta (+50 kD) es un componente estructural del nucleocápsido viral, junto con los segmentos de ARN viral genómico. Como proteína de unión al ARN que afecta a la horquilla del cabello de los segmentos genómicos con alta afinidad [49, 50], limita el acceso del ARN para alojar nucleasasas y ayuda a hacer que la replicación viral sea un proceso cerrado dentro del citoplasma. También actúa como una proteína de membrana periférica, al igual que la proteína L [51], una actividad que podría jugar un papel en su supuesta, pero aún no demostrada función como matriz [52]. Hasta hace poco, no se había apreciado que N tuviera una amplia variedad de otras actividades, algunas de las cuales pueden estar vinculadas, no sólo a los requisitos fundamentales de replicación, sino también a la interferencia con una serie de procesos intracelulares de la célula normal. Así, se ha propuesto una interacción entre el aminoterminal de la proteína N del hantavirus y la proteína celular Daxx, con la sugerencia de posibles consecuencias pro-apoptóticas [51]. N también se reporta que interactúa con microfilamentos actínicos, y la proteína SUMO-1 [53, 54]. Utilizando ensayos basados en el gen reportero, Connie Schmaljohn y sus colegas han reportado que la proteína nucleocapsida del virus Hantaan tiene un papel inhibidor en las respuestas inflamatorias mediadas por NF kappa B (NF- B). Los efectos sobre la expresión NF- B parecen estar limitados a la prevención de su translocación nuclear después de su intento de activación con lipopolisacárido, LPS [55]. En el citoplasma de las células infectadas, la proteína N se puede encontrar en los cuerpos celulares P donde secuestra y protege los capuchones de 5'. Puede localizar los capuchones a través de su interacción con DCP1, un componente clave de los cuerpos P. Durante la infección por hantavirus, los ARN virales se concentran en los cuerpos P, a través de su interacción con N y DCP1. La proteína N demuestra la protección preferencial de los ARNm diseñados para terminar prematuramente su proteína codificada en comparación con los ARNm nativos [56]. La proteína N se ha vinculado cada vez más a la replicación y traducción virales, a veces de maneras no previstas anteriormente. Se encuentra entre una familia creciente de diversas proteínas virales que pueden servir como un inespecífico - ARN chaperone ®, una actividad que debe facilitar el acceso de la L polimerasa al ARNv para la transcripción y replicación, en que puede disociar transitoriamente estructuras de ARN mal dobladas [57]. Algunos de los efectos de la proteína N en la traducción no pueden ser inmediatamente reconocidos como adaptables en la naturaleza. Puede reemplazar todo el complejo de iniciación traslacional EIF4F, presentando simultáneamente el ribosoma con un reemplazo de la actividad de unión de la tapa de eIF 4E, uniéndose al complejo de pre-iniciación 43S, al igual que eIF 4G, al tiempo que reemplaza la actividad helicoidal de eIF 4A, que se presume que es necesaria para disociar la estructura de ARN de orden superior [56, 58]. Estos tres factores normalmente trabajan juntos para lograr la iniciación traslacional. En los cuerpos P, la capacidad de la proteína N de unirse a una alta afinidad a los oligoribonucleótidos celulares nativos tapados, junto con su actividad en la protección de ARNs tapados de la degradación, probablemente facilita el acceso de oligonucleótidos encapsulados para su uso en la iniciación transcripcional por L polimerasa (-cap ra Tráfico de N para el ensamblaje viral: Clásicamente, la proteína N en las células infectadas parece estar agrupada o partículas en la naturaleza, con una concentración pesada en una única ubicación perinuclear, ampliamente considerada como la Golgi [27]. Las proteínas N de los hantavirus se encuentran en asociación con fracciones de partículas, y los estudios confocales microscopía y bioquímico-inhibidores han demostrado que las trazas N a lo largo de microtúbulos pero no con filamentos de actina [52]. El destino final de N, para su ensamblaje en partículas virales es la Golgi, y que circula allí a través del complejo intermedio retículo-Golgi endoplasmático (ERGIC), también conocido como cúmulo vesicular-tubular [52]. Un inhibidor negativo dominante, la dinamitina, asociado con el transporte mediado por Los estudios posteriores sugieren que la dependencia específica del transporte microtubular es específica de los hantavirus del Viejo Mundo como el NVH, pero que el Hantavirus del Nuevo Mundo ANDV está asociado con filamentos de actina [59]. Sin embargo, los datos recientes indican que el transporte microtubular es efectivamente utilizado para el NVH del Nuevo Mundo [60]. Las enfermedades del Hantavirus del hombre desde hace mucho tiempo han sido sospechosas de tener una base inmunopatógena en parte debido a su período de incubación relativamente largo de 2-3 semanas y la asociación temporal observada entre los trastornos inmunológicos y la primera aparición de signos y síntomas de la enfermedad del hantavirus. HFRS y HCPS comparten muchas características clínicas, llevando a muchos investigadores a considerar que son, en esencia, diferentes manifestaciones de un proceso patógeno similar, que difieren principalmente en los órganos objetivo primarios de expresión de la enfermedad (Tabla La patogénesis de las infecciones por hantavirus es el tema de una revisión continuamente actualizada en la serie UpToDate [61]. Para el momento en que aparecen los síntomas en el HCPS, ambas respuestas antivirales fuertes, y, para los genotipos virales más virulentos, el ARN viral puede ser detectado en plasma sanguíneo o células sanguíneas nucleadas respectivamente [63, 64]. Al menos tres estudios han correlacionado el ARN viral plasmático con la gravedad de la enfermedad para el HCPS y el HFRS, sugiriendo que la replicación del virus juega un papel continuo y en tiempo real en la patogénesis viral [65] [66] [67]. Se han identificado varios cambios patológicos distintivos que ocurren tanto en el HFRS como en el HCPS. Una característica crítica de ambos es una fuga capilar transitoria (~ 1-5 días) que involucra el La fuga resultante es de carácter exudativo, con una composición química alta en proteínas y similar al plasma. La experiencia continua que indica el fuerte tropismo tisular para las células endoteliales, específicamente, es uno de los varios factores que hacen de la integra β3 un candidato especialmente atractivo como un importante receptor in vivo para los hantavirus. Es probable que los hantavirus lleguen a sus tejidos objetivo a través de la captación por los ganglios linfáticos regionales, tal vez con o dentro de un histiocito pulmonar escoltante. Las semillas del virus endotelio local, donde las primeras células infectadas dan lugar, en última instancia, a una viremia primaria, un proceso que parece tomar mucho tiempo para las infecciones por hantavirus [62, 63]. En el momento en que emerge la viremia secundaria, los agentes de las formas más severas de HFRS y HCPS han comenzado a alcanzar una masa suficiente para inducir, a través de las interacciones PAMP-PRR y otros medios, la expresión de citoquinas proinflamatorias [64]. Para HCPS, esa expresión favorece el lecho pulmonar y los órganos linfoides, pero, por razones desconocidas, ahorra el retroperitoneo y, en general, el riñón. En HFRS la situación se invierte, y sin embargo no se aprecia a menudo que el esperado tropismos tisulares preferentes de virus asociados a HFRS y sus contrapartes asociadas a HCPS para los lechos renal y pulmonar, respectivamente, no es como se predeciría a través de las manifestaciones de las dos enfermedades. La elaboración local de mediadores inflamatorios y quimiotácticos se considera un requisito para el desarrollo de Sin embargo, no es la hipoxemia, debido al edema pulmonar prominente, lo que conduce a la muerte en la mayoría de los casos fatales de HCPS, sino más bien la intoxicación del corazón por mediadores como aún no definidos, lo que conduce al estado de bajo gasto cardíaco y al síndrome de shock asociado [64, 65]. Es tentador especular que los mediadores producidos en el pulmón en conexión con el infiltrado inflamatorio pueden infiltrarse a través de la circulación coronaria con dilución mínima en HCPS, consecuencia desventajosa de la estrecha yuxtaposición anatómica de los dos órganos. Así, al menos tres clases de mecanismos potenciales, algunos superpuestos y todos ciertamente no exclusivos de los otros, podrían presumirse que subyacen a la patogénesis del HCPS. Estos incluyen:(1) Mecanismos inmunes innatos. La naturaleza de las interacciones entre los patrones moleculares asociados al patógeno del hantavirus (PAMP) y los receptores de reconocimiento del patrón (PRR) de las células endoteliales susceptibles comienzan a ser aclaradas. El HTNV prototípico parece ser reconocido por TLR-3 [43]. Tal infección tiene consecuencias tales como una mayor expresión del HLA-DR en las células dendríticas [66] y la diferenciación de los monocitos hacia las células dendríticas [67]. (2) Efectos virales directos. La correlación observada entre la carga viral y la gravedad de la enfermedad deja abierta la posibilidad de que las partículas del hantavirus o el ARN puedan tener efectos tóxicos sobre las células o sobre la señalización. Algunos investigadores han favorecido la toxicidad viral directa, actuando a través de la inhibición de la función de barrera celular endotelial, como una explicación de gran parte de la fuga capilar, aunque existe Una pista potencialmente importante hacia el mecanismo por el cual las infecciones por hantavirus agotan las plaquetas sanguíneas y, en algunos casos, causan manifestaciones hemorrágicas, fue avanzada por el reciente descubrimiento de que los hantavirus patógenos son capaces de reclutar plaquetas para adherirse a las superficies celulares endoteliales, con β3 integrina utilizada como elemento de unión crítica [69]. (3) Efectos patógenos causados por las actividades de macromoléculas virales específicas. Hemos revisado algunas de las actividades asociadas con los Gn, Gc y N, polipéptidos codificados viralmente en secciones anteriores. Modelos de prueba de patogénesis se pueden hacer más eficazmente cuando hay un modelo animal que imita aspectos clave de la enfermedad. No existe un modelo similar al HFRS, pero existen modelos animales para el transporte asintomático de PUUV y SNV por sus roedores portadores nativos, el banco vole Myodes glareolus y el ratón de venado P. maniculatus; así como un modelo de hámster sirio utilizando ANDV o el virus Aporal relacionado de Venezuela, para el cual se observa una enfermedad mimética HCPS [70] [71] [72] [73]. El modelo de hámster ANDV-Sirio tiene una serie de características en común con la enfermedad humana, así como algunas diferencias. A diferencia de las enfermedades neurológicas que han sido posibles de provocar con HTNV, el modelo de hámster para HCPS parece ser causado por fugas capilares que resultan en edema pulmonar y la producción de un derrame pleural con características exuda Típicamente los hámsteres mueren entre 11 y 14-d post-inoculación, reflejando un período de incubación ligeramente acelerado en comparación con las infecciones humanas. Al igual que con el HCPS humano, el examen microscópico del pulmón revela abundante deposición de fibrina, septo alveolar engrosado y antígeno viral expresado abundantemente en el endotelio microvascular. Los hámsteres infectados por ANDV equipados con dispositivos de monitoreo fisiológico mostraron disminución de las presiones de pulso, taquicardia e hipotensión que parecen imitar de cerca el shock que se cree que es la causa próxima de la muerte en pacientes que sucumben al HCPS [65, 74]. En comparación con la enfermedad humana, los hámsteres infectados por ANDV exhiben títulos excepcionalmente altos de ANDV vivo en sus tejidos, con gran parte de la replicación viral que ocurre en Los títulos de ANDV vivo en algunos casos superan los 10 8 /g, mientras que los aislados de hantavirus de los tejidos humanos han sido notoriamente difíciles de obtener. A pesar de la aparición universal de enzimas hepáticas levemente elevadas en pacientes con HCPS, las enzimas hepáticas no parecen estar presentes en niveles elevados en la sangre de hámsters enfermos incluso inmediatamente antes de la muerte [75]. El período prolongado de incubación asociado con la enfermedad por hantavirus da al huésped un tiempo considerable para montar una respuesta inmune madura contra el virus. Así, en contradición a infecciones de gravedad comparable y sintomatología relacionada asociada con arenavirus y filovirus, las infecciones por hantavirus en humanos se asocian con respuestas anticuerpos de título significativo por el momento en que comienzan los síntomas. A pesar de esta observación, parece ser posible que la variación natural en las respuestas individuales de anticuerpos neutralizantes entre los pacientes con infecciones por NVS pueda estar relacionada con la gravedad de la enfermedad, lo que sugiere que la administración de anticuerpos antivirales podría resultar efectiva terapéuticamente [76]. En el caso de la infección por ANDV, han surgido nuevas evidencias que indican que el aparente aclaramiento del virus de la sangre no resulta en la eliminación completa del estímulo antigénico por el virus, sugiriendo que el virus puede persistir, tal vez en algún sitio inmunológicamente privilegiado aún indeterminado [77]. Un papel para las respuestas patológicas mediadas por células T en el HFRS y el HCPS ha sido la fuente de especulación por una variedad de razones. La gravedad del SNS asociado al SNCP puede haber hecho más evidente que el inicio del edema pulmonar, la taquicardia y la hipertensión parecía estar todo, pero universalmente asociado temporalmente, con la aparición de un espectro de células altamente activadas del linaje linfoide en la sangre periférica. Se detectaron células con similitudes morfológicas cercanas a estos -inmunoblastos- en los pulmones congestionados y pesados de los pacientes que llegaron a la autopsia, así como en órganos linfoides y en las tríadas portal [63, [78] [79] [80]. Estas observaciones llevaron a especular que algún componente de la patogénesis por hantavirus podría estar vinculado a la aparición de células T antivirales que podrían estimular o contribuir a la aparición de una -tormenta de mediadores y el fenotipo de fuga capilar asociado. Estudios posteriores han confirmado la expectativa de que una fracción significativa de la población de inmunoblastos en pacientes con HCPS son células T con especificidad para epitopes específicos de antígenos virales de clase I presentados por el HLA, incluyendo Gn, Gc y N [77, [81] [82] [83]. Presumiblemente, las actividades antivirales de estas células, manifestadas en parte por su elaboración de mediadores en el intersticio afectado, pueden contribuir a la fuga endotelial/capilar que se encuentra en el corazón de la patogénesis del hantavirus. Debido a que los primeros casos de HCPS a menudo llegaron a la autopsia, se hizo posible examinar tejidos necropsiados para la expresión de citocinas. El estudio de Mori et al. (1999) revelaron una alta expresión relativa de citocinas proinflamatorias incluyendo TNF-, IL-1-, IL-6, proporcionando evidencia a favor de un modelo de tormenta de citoquinas para la patogénesis [64]. Los autores creían, basándose en la morfología de las células secretadoras de citoquinas, que tanto monocitos como linfocitos estaban contribuyendo a la producción de citocinas. Que los mediadores proinflamatorios se encuentran en niveles elevados en el plasma, así como el intersticio renal de pacientes con enfermedad hantaviral aguda se ha reconocido desde hace algún tiempo también [84, 85]. Si bien el diagnóstico de HCPS y HFRS se realiza mejor con serología IgM, en la etapa aguda de la infección por NVS, también se puede utilizar RT-PCR si se utilizan células sanguíneas o coágulos de sangre en lugar de plasma o suero, donde la sensibilidad incluso utilizando imprimaciones PCR anidadas disminuye a cerca del 70% [86] [87] [88]. En una instalación en la que se tratan muchos casos de HCPS, el centro médico de la Universidad de Nuevo México en Albuquerque, se ha ofrecido un servicio de diagnóstico en el que se analizan los hallazgos hematológicos del paciente para establecer la probabilidad de que un paciente tenga HCPS. La combinación de trombocitopenia, abundancia elevada de linfocitos -inmunoblasto-, población de células polimorfonucleares con desplazamiento izquierdo sin evidencia morfológica fuerte para su activación, y valores elevados de hemoglobina o hematocrito es altamente específica para el HCPS y permite a los clínicos la capacidad de poner pacientes presuntivos-HCPS en oxigenación de membrana extracorpórea (ECMO), que se cree que ha salvado a muchos pacientes de un resultado letal [89]. Se cree que la infección humana por hantavirus sigue el contacto con secreciones o excreciones producidas por roedores infectados. En los Estados Unidos, 538 infecciones humanas por hantavirus fueron reportadas hasta finales de diciembre de 2009 [90], con Nuevo México, Arizona y Colorado mostrando los casos más altos. Mientras que el prototípico hantavirus centroamericano en América Central fue el virus Rio Segundo de Reithrodontomys mexicanus de Costa Rica, la primera enfermedad humana apareció algunos años más tarde en Panamá, donde el virus Choclo (CHOV) surgió como el agente etiológico y se cree que es responsable de todos los casos conocidos de HCPS. La rata de arroz pigmeo fulvo Oligoryzomys fulvescens ha sido identificada como el reservorio de roedores [91]. En Panamá, los primeros casos de HCPS, aunque con poca o ninguna implicación cardiaca evidente, fueron reportados en 1999, y desde entonces, 106 infecciones humanas han ocurrido con una tasa de mortalidad del 26% [92]. Seroencuestas de mamíferos en México y Costa Rica han encontrado anticuerpos antihantavirus [93] [94] [95] [96], y se han notificado seroprevalencias que oscilan entre 0,6 y 1,6% en poblaciones humanas a pesar de la ausencia de casos conocidos de HCPS [97]. En América del Sur, los casos de HCPS se han identificado en Argentina, Bolivia, Brasil, Chile, Paraguay y Uruguay, y también se han notificado evidencias de exposición humana a hantavirus en Venezuela [98] y Perú [99]. En América del Sur, ANDV es el principal agente etiológico con casos en Chile y Argentina notificados desde 1995. En Chile, se han producido 671 casos de HCPS debido a ANDV durante el período 2001-2009 [100]. Desde 1995 se han reportado más de 1.000 casos de HCPS en Argentina [101] ; en el Brasil se han identificado aproximadamente 1.100 casos de HCPS entre 1993 y 2008 [102]. Las tasas de mortalidad por casos en esos tres países han sido similares, oscilando entre el 30% (Argentina), el 36% (Chile) y el 39% (Brasil). Las infecciones por Hantavirus ocurren con más frecuencia en hombres que en mujeres, aunque la proporción entre hombres y mujeres es muy variable. Por ejemplo, las comunidades panameñas mostraron una proporción de 55 hombres por 45 mujeres [103], mientras que en Chile la proporción es más sesgada por hombres (71%) [104]. En el Chaco paraguayo la proporción entre hombres y mujeres se aproxima al 50% [105]. En América del Norte, en diciembre de 2009 el 63% de los pacientes eran varones [90]. Todos los grupos étnicos y raciales parecen ser susceptibles a infecciones por el hantavirus, y las diferencias entre ciertos grupos (como indígenas y no indígenas) están más probablemente correlacionadas con el tipo de hábitat en el que reside la población (por ejemplo, zonas rurales frente a zonas urbanas). De hecho, las comunidades rurales representan la mayor incidencia global del hantavirus y, por lo tanto, están en mayor riesgo [92, [105] [106] [107] [108] [109] [109] [119], aunque también se ha destacado la importancia de los entornos peridomésticos como una importante zona de exposición [112, 113]. El principal mecanismo por el que los seres humanos adquieren la infección por el hantavirus es la exposición a aerosoles de heces contaminadas de roedores, orina y saliva [114, 115]. Esto puede ocurrir cuando los seres humanos residen en áreas cercanas a las que habitan los roedores, viven en áreas infestadas de roedores, o cuando los roedores invaden entornos humanos, que son más frecuentes en hábitats rurales.Existe una larga historia de coexistencia humana con roedores, lo que plantea dudas sobre el aparente aumento reciente de las enfermedades relacionadas con el hantavirus, especialmente el HCPS. Aparte de una aparente asociación con eventos de oscilación sureña de El Niño (ENSO) en algunas regiones [116, 117], los recientes incrementos en la incidencia del HCPS no parecen seguir un patrón temporal o espacial fácilmente definido. Sin embargo, algunas características del paisaje, como la fragmentación del hábitat o las áreas perturbadas por el ser humano, pueden influir en la dinámica de la población de roedores e impactar en la incidencia viral [118] [112] [112] [121]. A pesar de la estocástica asociada a la contracción de la infección Las actividades humanas en edificios mal ventilados que pulverizan partículas que luego se inhalan (es decir, limpieza, agitación de alfombras, polvo) se identifican con frecuencia entre los pacientes admitidos para el SHCPS [11, 122]. Se cree que las actividades al aire libre transmiten un menor riesgo debido a la labilidad de los hantavirus a la radiación UV y a la supuesta tendencia a dispersarse en el viento, aunque ciertas condiciones ambientales parecen mantener el virus durante períodos más largos fuera de su huésped natural, lo que permite la transmisión indirecta [123]. Una vía alternativa pero poco común de transmisión del virus es la mordedura de roedores [124] [125] [126]. Los trabajadores sobre el terreno que manipulan mamíferos corren un riesgo potencialmente mayor de exposición a infecciones por hantavirus, aunque cuando se cuantifica a través de serosurveys el riesgo absoluto parece bastante leve [127]. Un nuevo estudio en Colorado sugiere la posibilidad de que una picadura de roedor haya sido el vehículo próximo para la transmisión al aire libre de NVS [128], lo que vuelve a enfatizar el uso de equipo de protección personal durante las actividades de trabajo de campo [129]. Como caso particular dentro de los hantavirus, la transmisión de persona a persona ha sido documentada exclusivamente para el virus de los Andes sudamericanos [130] [133] [133] [135]. La identificación de esta vía de transmisión se ha hecho utilizando tanto herramientas moleculares como encuestas epidemiológicas, pero el mecanismo de transmisión interpersonal no está bien establecido. Curiosamente, ANDV también puede ser derramado por los humanos a través de otros fluidos biológicos como la orina [136], ilustrando las propiedades particulares que diferencian este virus de otros hantavirus. Aunque la transmisión interpersonal parece ser única para ANDV, el ARN viral de PUUV se ha detectado en la saliva de pacientes con HFRS, y algunos pacientes con SNV-HCPS tienen ARN viral en las secreciones traqueales [88, 137]. Los Hantavirus en las Américas son alojados naturalmente por roedores (Muridae y Cricetidae) así como las musarañas (Soricidae) y los lunares (Talpidae) (Figura 1). Tres especies de musgo y un mole han sido reportados para albergar hantavirus y su patogenicidad para los humanos permanece desconocida [22, 138, 139]. Se han identificado al menos 15 especies de roedores como portadores de diferentes hantavirus patógenos, con algunos genotipos sudamericanos como Castelo do Sonhos (CDSV) o Hu39694 sólo identificados después de infecciones humanas (Figura 1 ). Los hantavirus suelen mostrar una alta especificidad de especie y ningún huésped intermedio [140]. Sin embargo, se han descrito algunos genotipos de hantavirus en la misma especie de roedores. Tal es el caso de Playa de Oro (OROV) y Catacamas (CATV) identificados en Oryzomys couesi [141, 142], o Maporal (MAPV) y Choclo (CHOV) hospedados por O. fulvescens [91, 143]. En América del Norte se han detectado virus de muleshoe y Black Creek Canal hanta en sigmodon hispidus [ Además, un genotipo de hantavirus (por ejemplo, el virus similar a Juquitiba) puede ser transportado por más de una especie de roedores (O. nigripes, Oxymycterus judex, Akodon montesis). Otro ejemplo es el virus Laguna Negra (LANV) que después de ser identificado en Calomys laucha [146] también ha sido reportado en C. callosus [147]. El rápido aumento en el descubrimiento de nuevos hantavirus y la identificación de sus anfitriones no parece probable que termine tan pronto como se examinen nuevas especies pequeñas de mamíferos [95]. Este tema se complica por la continua controversia en los criterios para la clasificación de distintos hantavirus [148, 149], que también está vinculado a la clasificación taxonómica y los reordenamientos taxonómicos. La transmisión de especies cruzadas es un proceso importante durante la propagación, aparición y evolución Particularmente dentro de los hantavirus, los derrames a los huéspedes secundarios se identifican cada vez más a medida que se realizan estudios más extensos [151] [152] [153] [155] [156]. Por ejemplo, ANDV es el agente etiológico predominante del HCPS en América del Sur, y O. longicaudatus el principal reservorio de roedores. Derrama en al menos otras cuatro especies de roedores que coocurren con el reservorio se han identificado, con Abrothrix longipilis mostrando la segunda mayor prevalencia de anticuerpos de ANDV, y actualmente no hay duda de que el virus es extremadamente similar genéticamente entre los dos roedores del huésped [157, 158]. En América del Norte, el derrame del virus Bayou (BAYV) puede haber ocurrido desde el reservorio principal de O. palustris a S. hispidus, R. fulvescens, P. leucopus y B. taylori [159] [160] [161]. Es más probable que el derrame del virus Hanta se produzca con poblaciones de acogida que habitan regiones simpatricas o sintópicas [151, 162], y la transmisión de especies cruzadas tendría probablemente mayores posibilidades de éxito si las especies anfitrionas están estrechamente relacionadas [163]. Se encuentra una excepción interesante entre el virus Oxbow (OXBV) y el virus Asama (ASAV) en el que un proceso de cambio de huésped parecía haber ocurrido entre mamíferos pertenecientes a dos familias (Talpidae y Soricidae), probablemente como resultado de la codivergencia alterna y recurrente de ciertos tax Los hantavirus son transmitidos horizontalmente entre roedores y no son transmitidos por artrópodos (a diferencia de otros virus de la familia Bunyaviridae). La infección por derrapadores a mamíferos no humanos generalmente no produce ninguna transmisión hacia adelante (o a fin de morir), pero si los seres humanos están infectados pueden resultar en una alta morbilidad y mortalidad [122, 164]. Durante la primavera de 1993, un brote de pacientes con HCPS debido a SNV ocurrió en los estados de Four Corners, resultando en más del 60% de casos de mortalidad entre los casos iniciales, muchos de los cuales involucran a miembros de la tribu Navajo [12, 121]. En Panamá, se notificó un brote durante 1999-2000 en Los Santos, y 12 casos donde se identificaron con tres muertes [165, 166]. Esto representó el primer informe de infecciones por hantavirus humanos en América Central. En América del Sur, Diecisiete individuos fueron identificados con anticuerpo NVS (ELISA) o fueron antígenos (HCI) positivos de 52 casos sospechosos [167]. En 1996 ocurrieron brotes mayores debidos a ANDV en el sur de Argentina [131, 134] ; en el sur de Chile se presentaron grupos de pacientes con enfermedad por hantavirus en 1997 [158]. En Brasil, el primer brote fue identificado en la Amazonía Brasileña (Estado de Maranhão) en el año 2000, e involucró pequeños pueblos que resultaron en una prevalencia del 13,3% de los evaluados (398 residentes totales) [168]. Los factores que desencadenan los brotes de hantavirus todavía son mal entendidos, probablemente porque resultan de varias características bióticas y abióticas interactuantes cuyos parámetros clave son difíciles de modelar. Sin embargo, el uso de nuevos enfoques de modelado que involucran características geográficas y ambientales parece ser prometedor a la hora de predecir posibles brotes de hantavirus y/o áreas de mayor riesgo [169] [170] [171] [172]. Debido a que se sabe que los hantavirus se transmiten directamente de los huéspedes infectados a los susceptibles, el primer enfoque natural es relacionar los brotes con la ecología de los huéspedes virales. La transmisión y persistencia del hantavirus en las poblaciones de roedores depende de varios factores que interactúan para afectar la dinámica ecológica del huésped, que a su vez está fuertemente influenciada por las características de comportamiento de las especies de roedores individuales, a la estructura paisajística y a las características ambientales [173, 174]. La transmisión viral depende de las tasas de contacto entre los huéspedes sensibles, y a pesar de la noción prevaleciente de que un aumento de la densidad se encuentra y, por lo tanto, de Además, se ha demostrado que la transmisión de NVS sigue un patrón de heterogeneidad de contacto, donde los individuos de la población tienen diferentes probabilidades de transmitir la infección [176]. La comprensión de la transmisión viral resulta ser mucho más compleja cuando especies distintas del principal huésped del reservorio se incorporan en el modelo. De hecho, estudios recientes han demostrado que la mayor diversidad de especies hospedantes está correlacionada con una menor prevalencia de infección en América del Norte para P. maniculatus [177], en América Central para O. fulvescens (reservorio del virus Choclo) y Zygodontomys brevicauda (reservorio del virus Calabazo) [178], y en América del Sur para Akodon montensis (reservorio del virus Jabora) [162]. Las tasas de contacto varían según la distribución espacial de las poblaciones y parecen estar Por ejemplo, la prevalencia de SNV en P. maniculatus fue mayor en paisajes con mayor grado de fragmentación del hábitat preferido [179]. Además, ciertas propiedades del paisaje como elevación, pendiente y cubierta terrestre parecen ser útiles para detectar áreas con infecciones persistentes de SNV, y por lo tanto se consideran áreas refugiales donde el virus puede mantenerse durante años [169]. Los cambios en el entorno natural de las especies de reservorios, como la fragmentación forestal y la pérdida de hábitat, pueden alterar la abundancia y distribución de la población y provocar brotes de hantavirus, como se observa en la Península de Azurero de Panamá [118, 119]. Además, las diferencias en el microhábitat, incluida la cubierta superficial, pueden conducir a diferencias en la dinámica ecológica dentro de las poblaciones y afectar a la tasa de exposición al virus [180]. Se han encontrado diferencias en las infecciones por hantavirus a través de paisajes contrastantes en el intervalo latitudinal en poblaciones de roedores de O. longicaudatus en Chile, lo que sugiere que los seres humanos están expuestos de manera diferencial al virus [107, 181]. La dinámica poblacional de roedores se ve afectada por cambios estacionales de clima y clima [182, 183]. En el caso de los brotes asociados a ENSO, se ha postulado una compleja cascada de eventos desencadenados por lluvias altamente inusuales en el año precedente para dar lugar a un aumento de la producción primaria y densidades de roedores, aumentando también la probabilidad de transmisión del virus a los seres humanos, pero ha resultado difícil demostrar con precisión los eventos intermedios sugeridos, como el aumento de las densidades de roedores en el aumento de la carga de casos [116, 121, 184]. En América del Sur, los efectos del cambio climático y los brotes de hantavirus no han sido bien estudiados, a pesar del conocimiento de que varias especies de roedores que son reservorios de enfermedades emergentes se han visto dramáticamente afectadas por eventos como El Niño [185]. Los cambios en la dinámica de la población de acogida también se ven afectados por la estacionalidad, lo que puede conducir a brotes de enfermedades cuando se interrumpen los procesos que equilibran las poblaciones de roedores de temporada en temporada [186]. La emergencia viral puede seguir promoviéndose a medida que los cambios introducidos por el ser humano continúan aumentando en el medio ambiente a diferentes escalas geográficas. Estos cambios también pueden alterar la estructura y dinámica de la población de roedores e interacciones interespecies creando condiciones que pueden conducir a brotes virales, establecimiento viral en nuevos hospederos, y la aparición de HCPS [102, 162], incluso con aparentemente leve perturbación ecológica al sistema virus-hospedero [188]. Ciertas características fisiopatológicas, incluyendo trombocitopenia y shock, de enfermedades por hantavirus de los seres humanos, tienen similitud sustancial con las fiebres hemorrágicas inducidas por otros virus tales arenavirus, filovirus y flavivirus, a pesar de compartir esencialmente ninguna secuencia similitud con ellos. Tales observaciones plantean preguntas acerca de si tales similitudes en la patogénesis son probables similitudes de fenotipo, o en cambio reportan la presencia de mecanismos moleculares comunes entre los virus. En esta revisión se discuten las propiedades generales, descubrimientos y epidemiología/ecología de las formas de hantavirus patógenos del Nuevo Mundo, y también se busca identificar algunas de las características de las macromoléculas virales y mecanismos inmunológicos que se han propuesto como potenciales mediadores directos de los eventos patógenos que caracterizan la enfermedad humana HCPS. Si bien es poco probable que la expresión de una proteína viral particular o ARNs en aislamiento se pueda confiar en replicar fenotipos clave de infección por el virus completo, algunos de los hallazgos han sido suficientemente consistentes con lo que se conoce de la patogénesis in vivo que ofrecen plomos plausibles de primer paso en la búsqueda de objetivos terapéuticos. Esperamos con interés las revelaciones mecanísticas que seguirán el uso inevitablemente ampliado de métodos poderosos como la secuenciación profunda, imágenes cada vez más avanzadas, y métodos microscópicos, y modelos animales que por fin se pueden decir

Para HCPS, ¿qué favorece esa expresión?

Los hantavirus en las Américas y su papel como patógenos emergenteshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3185593/SHA: efe13a8d42b60ef9f7387ea539a1b2eeb5f80101Autores: Hjelle, Brian; Torres-Pérez, FernandoFecha: 2010-11-25DOI: 10.3390/v2125559Licencia: cc-byAbstract: La continua aparición y reaparición de patógenos representan una amenaza continua, a veces mayor, para las poblaciones. Los hantavirus (familia Bunyaviridae) y sus enfermedades humanas asociadas se consideraron confinados a Eurasia, pero la aparición de un brote en el suroeste de Estados Unidos llevó a un gran aumento en su estudio entre los virólogos de todo el mundo. Se han descrito más de 40 genotipos hantavirales, la gran mayoría desde 1993, y casi la mitad de ellos patógenos para los seres humanos. Los hantavirus causan infecciones persistentes en sus reservorios, y en las Américas, la enfermedad humana se manifiesta como compromiso cardiopulmonar, síndrome cardiopulmonar del hantavirus (HCPS), con proporciones de casos-fatalidad, para los serotipos virales más comunes, entre el 30% y el 40%. Alteración del hábitat y trastornos ecológicos a mayor escala, tal vez incluyendo el cambio climático, son algunos de los factores que pueden haber aumentado la carga de casos humanos de HCPS entre 1993 y el presente. Consideramos aquí las características que influyen en la estructura de la dinámica de la población huésped que pueden conducir a brotes virales, así como los determinantes macromoleculares de los hantavirus que han sido considerados como potenciales contribuciones a la patogenicidad. Texto: Los patógenos emergentes causan enfermedades nuevas o no reconocidas anteriormente, y entre ellas, las zoonóticas emergentes son una preocupación importante entre los científicos que estudian enfermedades infecciosas a diferentes escalas espaciales y temporales [1, 2]. Los cambios en las condiciones bióticas y abióticas pueden alterar la dinámica de las enfermedades de la población y conducir a la aparición de infecciones zoonóticas [3] [5] [6]. Durante las últimas décadas, se han producido varios brotes de patógenos virales emergentes y reemergentes, que afectan tanto a la implicación puramente local como a nivel mundial/pandémica de las poblaciones humanas. Entre los ejemplos visibles están la gripe A, el virus del Ébola, el virus de la hepatitis C, el trastorno respiratorio grave para adultos (SARS), el coronavirus y el virus de la inmunodeficiencia humana, que desafían las medidas de prevención y control de los sistemas de salud pública [7]. En las Américas, el reciente brote de gripe pandémica A subtipo H1N1 se convirtió en un objetivo importante de control debido a su rápida propagación, y las incertidumbres en cuanto a virulencia y transmisibilidad, sin embargo, la disponibilidad de vacunas fue limitada cuando se produjo una actividad significativa antes de la temporada tradicional de gripe [8]. Sin embargo, en el último siglo han surgido o resurgido brotes de varias enfermedades virales relacionadas con el virus arenavirus y el virus del dengue, y más recientemente, hantavirus y la expansión del rango geográfico del virus del Nilo Occidental. Entre las enfermedades zoonóticas, los mamíferos pequeños son anfitriones de varios virus ARN patógenos, especialmente Arenaviridae y Bunyaviridae: Hantavirus [9] [10] [11]. Las infecciones por hantavirus se convirtieron en una preocupación en las Américas después de la descripción de un brote de distrés respiratorio agudo ocurrido en La enfermedad recientemente reconocida, el síndrome cardiopulmonar del hantavirus, el HCPS (o síndrome pulmonar del hantavirus), se relacionó con la infección por el virus del Sin Nombre (SNV) recién descubierto, y el roedor Peromyscus maniculatus (ratón venado) fue identificado como el reservorio [13]. Sin embargo, las infecciones por hantavirus tienen una historia mucho más larga. Una revisión de los escritos chinos antiguos, que datan de aproximadamente 960 dC, reveló descripciones muy parecidas a la fiebre hemorrágica con síndrome renal (HFRS), el síndrome causado por los hantavirus del Viejo Mundo [14]. Durante el siglo XX, los casos de enfermedad febril aguda con compromiso renal fueron descritos de varios países eurasiáticos y Japón, a menudo en asociación con compromisos militares [15]. El HFRS como síndrome distinto, sin embargo, fue llamado por primera vez a la atención de la medicina occidental en asociación con un brote que ocurrió entre las tropas de las Naciones Unidas durante el conflicto coreano entre 1951 y 1954, donde más de 3.200 soldados fueron afectados [16]. Tomó más de dos décadas hasta que el agente etiológico, el virus Hantaan (HTNV), fue aislado del ratón de campo rayado Apodemus agrarius, detectado en parte por la unión de anticuerpos de muestras de suero de paciente a los tejidos pulmonares de ratones de campo sanos y salvajes [17, 18]. El virus se encontró más tarde para representar la especie tipo de un nuevo género Hantavirus de la familia Bunyaviridae, aunque fue más tarde evidente que el primer hantavirus a aislarse fue el virus Thottapalayam de shrew-borne [19]. La categorización de los hantavirus como pertenecientes a la familia Bunyaviridae se debe en parte a la presencia consistente de tres genomas de ARN que son circularizados in vivo como resultado de la presencia de nucleótidos terminales complementarios que ayudan a doblar el genoma en una morfología -hairpin-, descrita por primera vez para el flebovirus Uukuniemi [19, 20]. La Tabla 1 es una lista de los hantavirus patógenos predominantemente distintos serológicamente. Se describen muchos otros genotipos llamados, pero tales otras formas patogénicas están generalmente estrechamente relacionadas con los Andes o, en algunos casos, el virus Sin Nombre. Durante la maduración del virus, el precursor forma GPC se procesa utilizando una proteasa unida a la membrana en Gn y Gc, una escisión que ocurre, y parece ser señalada, después de la señal péptida conservada WAASA en la C-terminal de Gn [24]. Aunque las dos proteínas se pueden expresar de forma independiente a través de la transfección, pueden ser retenidas en el compartimento celular incorrecto (ER o aggrosome); por lo tanto, deben ser co-expresadas para permitirles estabilidad para que las dos se puedan ensamblar correctamente en el Golgi [25, [27] [28]. Se han identificado varias actividades y propiedades para las glicoproteínas envolventes del hantavirus, incluyendo algunas características que se sospecha que están involucradas en la patogenicidad de los serotipos causantes de la enfermedad, una posibilidad que ha generado atención experimental. Las glucoproteínas son los ligandos conocidos o presuntos para al menos dos receptores celulares distintos, la cadena de integrina y el factor acelerador de la descomposición, o DAF [30, 31] ; con gC1qR/p32 también identificado como otro receptor de entrada potencial [32]. Comparaciones con la proteína E del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, llevaron a Tischler et al. a considerar la glicoproteína Gc como una proteína potencial de fusión de clase II, tal vez impartiendo actividad de fusión al virión, y esta hipótesis ha ganado apoyo en otros estudios [33, 34]. Se han identificado actividades adicionales con, o se afirma que están relacionadas con, Gn. Para muchos de estos estudios, una premisa subyacente ha sostenido que hay diferencias entre las glicoproteínas de hantavirus -patógenos en relación con virus en el género que se denominan Si bien es cierto que aún no ha sido posible vincular el virus de Prospect Hill (PHV) con la enfermedad humana, la ausencia de evidencia de su patogenicidad tal vez no debería equipararse con la evidencia de su ausencia. Sólo se podría considerar que el nivel de enfermedad (por ejemplo, letargo, fiebre, proteinuria y azotemia) asociado con la infección de primates no humanos por PHV no es significativamente diferente del registrado para los modelos de primates no humanos utilizando el virus conocido del patógeno Puumala (PUUV) [35, 36]. Para el propósito de esta discusión, presumiremos que los hantavirus apatogénicos son efectivamente apatogénicos. Mientras que algunos estudios han sugerido que las glicoproteínas Gn se dirigen más rápidamente a la vía ubiquitina-proteosoma que a las formas apatogénicas, otros han interpretado las diferencias en el manejo de las glicoproteínas Gn a través de especies de hantavirus por el sistema ubiquitina-proteosomal como independientes de la patogenicidad [37] [38] [39]. Algunos investigadores han dirigido sus esfuerzos hacia la identificación de una capacidad diferencial, ya sea cinética o de magnitud absoluta, en la capacidad de los hantavirus patógenos y apatogénicos para provocar una respuesta de interferón en las células. Una premisa que surge es que las formas apatogénicas tenderían a inducir una respuesta innata anterior que haría más probable que el virus se limpiara rápidamente o se volviera menos competente en su replicación, a fin de evitar cualquier respuesta patológica en el huésped [42] La respuesta innata anti-hantavirus puede en algunos casos ser atribuida a la interacción viral como ligando de TLR-3, pero no en otros, y en las células endoteliales, no parece requerir más que la partícula viral misma, incluso cuando se introduce en forma replicativa incompetente [43, 44]. Las proteínas y los ARNm inducidos prominentemente por los hantavirus incluyen MxA e IFIT-1 (ISG-56) y otros incluyendo algunos con actividad antiviral conocida o sospechada. Esos hantavirus, a menudo cepas altamente patógenas, que no inducen una respuesta antiviral potente, se sospechan o se presume que tienen un (más) potente mecanismo de antagonismo interferón-vía en relación con otros virus, un mecanismo que actúa positivamente para prevenir que se forme una respuesta innata efectiva, al menos temprano en la infección Sin embargo, se reportan algunos casos en los que los hantavirus altamente patógenos, tales como NVS, también son capaces de inducir la expresión de los ARNm del gen estimulado por interferón, incluso muy temprano en la infección, con proteínas ISG, como se esperaba, tardando más tiempo en aparecer en la célula [44]. Las actividades anti-interferón también se han atribuido a la proteína NSs que se puede elaborar en células infectadas por serotipos que codifican esta proteína [46]. Otros investigadores han examinado las actividades de las glucoproteínas del hantavirus y otras proteínas que podrían afectar directamente a algunos aspectos de la progresión patogénica asociada a la infección por hantavirus en humanos, tales como cambios de permeabilidad vascular. Mientras que los primeros intentos de causar directamente aumentos en la permeabilidad de las monocapas endoteliales con partículas virales o infección viral fueron en gran medida decepcionantes, los hantavirus se han identificado como que afectan adversamente la migración endotelial sobre los sustratos y en la potenciación de la permeabilidad endotelial inducida por VEG-F [47, 48]. La proteína nucleocápsida o N más corta (+50 kD) es un componente estructural del nucleocápsido viral, junto con los segmentos de ARN viral genómico. Como proteína de unión al ARN que afecta a la horquilla del cabello de los segmentos genómicos con alta afinidad [49, 50], limita el acceso del ARN para alojar nucleasasas y ayuda a hacer que la replicación viral sea un proceso cerrado dentro del citoplasma. También actúa como una proteína de membrana periférica, al igual que la proteína L [51], una actividad que podría jugar un papel en su supuesta, pero aún no demostrada función como matriz [52]. Hasta hace poco, no se había apreciado que N tuviera una amplia variedad de otras actividades, algunas de las cuales pueden estar vinculadas, no sólo a los requisitos fundamentales de replicación, sino también a la interferencia con una serie de procesos intracelulares de la célula normal. Así, se ha propuesto una interacción entre el aminoterminal de la proteína N del hantavirus y la proteína celular Daxx, con la sugerencia de posibles consecuencias pro-apoptóticas [51]. N también se reporta que interactúa con microfilamentos actínicos, y la proteína SUMO-1 [53, 54]. Utilizando ensayos basados en el gen reportero, Connie Schmaljohn y sus colegas han informado que la proteína nucleocapsid del virus Hantaan tiene un papel inhibidor en las respuestas inflamatorias mediadas por NF kappa B (NF- â € € TM B). Los efectos sobre la expresión NF- € B parecen estar limitados a la prevención de su translocación nuclear después de su intento de activación con lipopolisacárido, LPS [55]. En el citoplasma de las células infectadas, la proteína N se puede encontrar en los cuerpos celulares P donde secuestra y protege los capuchones de 5'. Puede localizar los capuchones a través de su interacción con DCP1, un componente clave de los cuerpos P. Durante la infección por hantavirus, los ARN virales se concentran en los cuerpos P, a través de su interacción con N y DCP1. La proteína N demuestra la protección preferencial de los ARNm diseñados para terminar prematuramente su proteína codificada en comparación con los ARNm nativos [56]. La proteína N se ha vinculado cada vez más a la replicación y traducción virales, a veces de maneras no previstas anteriormente. Se encuentra entre una familia creciente de diversas proteínas virales que pueden servir como un inespecífico - ARN chaperone ®, una actividad que debe facilitar el acceso de la L polimerasa al ARNv para la transcripción y replicación, en que puede disociar transitoriamente estructuras de ARN mal dobladas [57]. Algunos de los efectos de la proteína N en la traducción no pueden ser inmediatamente reconocidos como adaptables en la naturaleza. Puede reemplazar todo el complejo de iniciación traslacional EIF4F, presentando simultáneamente el ribosoma con un reemplazo de la actividad de unión de la tapa de eIF 4E, uniéndose al complejo de pre-iniciación 43S, al igual que eIF 4G, al tiempo que reemplaza la actividad helicoidal de eIF 4A, que se presume que es necesaria para disociar la estructura de ARN de orden superior [56, 58]. Estos tres factores normalmente trabajan juntos para lograr la iniciación traslacional. En los cuerpos P, la capacidad de la proteína N de unirse a una alta afinidad a los oligoribonucleótidos celulares nativos tapados, junto con su actividad en la protección de ARNs tapados de la degradación, probablemente facilita el acceso de oligonucleótidos encapsulados para su uso en la iniciación transcripcional por L polimerasa (-cap ra Tráfico de N para el ensamblaje viral: Clásicamente, la proteína N en las células infectadas parece estar agrupada o partículas en la naturaleza, con una concentración pesada en una única ubicación perinuclear, ampliamente considerada como la Golgi [27]. Las proteínas N de los hantavirus se encuentran en asociación con fracciones de partículas, y los estudios confocales microscopía y bioquímico-inhibidores han demostrado que las trazas N a lo largo de microtúbulos pero no con filamentos de actina [52]. El destino final de N, para su ensamblaje en partículas virales es la Golgi, y que circula allí a través del complejo intermedio retículo-Golgi endoplasmático (ERGIC), también conocido como cúmulo vesicular-tubular [52]. Un inhibidor negativo dominante, la dinamitina, asociado con el transporte mediado por Los estudios posteriores sugieren que la dependencia específica del transporte microtubular es específica de los hantavirus del Viejo Mundo como el NVH, pero que el Hantavirus del Nuevo Mundo ANDV está asociado con filamentos de actina [59]. Sin embargo, los datos recientes indican que el transporte microtubular es efectivamente utilizado para el NVH del Nuevo Mundo [60]. Las enfermedades del Hantavirus del hombre desde hace mucho tiempo han sido sospechosas de tener una base inmunopatógena en parte debido a su período de incubación relativamente largo de 2-3 semanas y la asociación temporal observada entre los trastornos inmunológicos y la primera aparición de signos y síntomas de la enfermedad del hantavirus. HFRS y HCPS comparten muchas características clínicas, llevando a muchos investigadores a considerar que son, en esencia, diferentes manifestaciones de un proceso patógeno similar, que difieren principalmente en los órganos objetivo primarios de expresión de la enfermedad (Tabla La patogénesis de las infecciones por hantavirus es el tema de una revisión continuamente actualizada en la serie UpToDate [61]. Para el momento en que aparecen los síntomas en el HCPS, ambas respuestas antivirales fuertes, y, para los genotipos virales más virulentos, el ARN viral puede ser detectado en plasma sanguíneo o células sanguíneas nucleadas respectivamente [63, 64]. Al menos tres estudios han correlacionado el ARN viral plasmático con la gravedad de la enfermedad para el HCPS y el HFRS, sugiriendo que la replicación del virus juega un papel continuo y en tiempo real en la patogénesis viral [65] [66] [67]. Se han identificado varios cambios patológicos distintivos que ocurren tanto en el HFRS como en el HCPS. Una característica crítica de ambos es una fuga capilar transitoria (~ 1-5 días) que involucra el La fuga resultante es de carácter exudativo, con una composición química alta en proteínas y similar al plasma. La experiencia continua que indica el fuerte tropismo tisular para las células endoteliales, específicamente, es uno de los varios factores que hacen de la integra β3 un candidato especialmente atractivo como un importante receptor in vivo para los hantavirus. Es probable que los hantavirus lleguen a sus tejidos objetivo a través de la captación por los ganglios linfáticos regionales, tal vez con o dentro de un histiocito pulmonar escoltante. Las semillas del virus endotelio local, donde las primeras células infectadas dan lugar, en última instancia, a una viremia primaria, un proceso que parece tomar mucho tiempo para las infecciones por hantavirus [62, 63]. En el momento en que emerge la viremia secundaria, los agentes de las formas más severas de HFRS y HCPS han comenzado a alcanzar una masa suficiente para inducir, a través de las interacciones PAMP-PRR y otros medios, la expresión de citoquinas proinflamatorias [64]. Para HCPS, esa expresión favorece el lecho pulmonar y los órganos linfoides, pero, por razones desconocidas, ahorra el retroperitoneo y, en general, el riñón. En HFRS la situación se invierte, y sin embargo no se aprecia a menudo que el esperado tropismos tisulares preferentes de virus asociados a HFRS y sus contrapartes asociadas a HCPS para los lechos renal y pulmonar, respectivamente, no es como se predeciría a través de las manifestaciones de las dos enfermedades. La elaboración local de mediadores inflamatorios y quimiotácticos se considera un requisito para el desarrollo de Sin embargo, no es la hipoxemia, debido al edema pulmonar prominente, lo que conduce a la muerte en la mayoría de los casos fatales de HCPS, sino más bien la intoxicación del corazón por mediadores como aún no definidos, lo que conduce al estado de bajo gasto cardíaco y al síndrome de shock asociado [64, 65]. Es tentador especular que los mediadores producidos en el pulmón en conexión con el infiltrado inflamatorio pueden infiltrarse a través de la circulación coronaria con dilución mínima en HCPS, consecuencia desventajosa de la estrecha yuxtaposición anatómica de los dos órganos. Así, al menos tres clases de mecanismos potenciales, algunos superpuestos y todos ciertamente no exclusivos de los otros, podrían presumirse que subyacen a la patogénesis del HCPS. Estos incluyen:(1) Mecanismos inmunes innatos. La naturaleza de las interacciones entre los patrones moleculares asociados al patógeno del hantavirus (PAMP) y los receptores de reconocimiento del patrón (PRR) de las células endoteliales susceptibles comienzan a ser aclaradas. El HTNV prototípico parece ser reconocido por TLR-3 [43]. Tal infección tiene consecuencias tales como una mayor expresión del HLA-DR en las células dendríticas [66] y la diferenciación de los monocitos hacia las células dendríticas [67]. (2) Efectos virales directos. La correlación observada entre la carga viral y la gravedad de la enfermedad deja abierta la posibilidad de que las partículas del hantavirus o el ARN puedan tener efectos tóxicos sobre las células o sobre la señalización. Algunos investigadores han favorecido la toxicidad viral directa, actuando a través de la inhibición de la función de barrera celular endotelial, como una explicación de gran parte de la fuga capilar, aunque existe Una pista potencialmente importante hacia el mecanismo por el cual las infecciones por hantavirus agotan las plaquetas sanguíneas y, en algunos casos, causan manifestaciones hemorrágicas, fue avanzada por el reciente descubrimiento de que los hantavirus patógenos son capaces de reclutar plaquetas para adherirse a las superficies celulares endoteliales, con β3 integrina utilizada como elemento de unión crítica [69]. (3) Efectos patógenos causados por las actividades de macromoléculas virales específicas. Hemos revisado algunas de las actividades asociadas con los Gn, Gc y N, polipéptidos codificados viralmente en secciones anteriores. Modelos de prueba de patogénesis se pueden hacer más eficazmente cuando hay un modelo animal que imita aspectos clave de la enfermedad. No existe un modelo similar al HFRS, pero existen modelos animales para el transporte asintomático de PUUV y SNV por sus roedores portadores nativos, el banco vole Myodes glareolus y el ratón de venado P. maniculatus; así como un modelo de hámster sirio utilizando ANDV o el virus Aporal relacionado de Venezuela, para el cual se observa una enfermedad mimética HCPS [70] [71] [72] [73]. El modelo de hámster ANDV-Sirio tiene una serie de características en común con la enfermedad humana, así como algunas diferencias. A diferencia de las enfermedades neurológicas que han sido posibles de provocar con HTNV, el modelo de hámster para HCPS parece ser causado por fugas capilares que resultan en edema pulmonar y la producción de un derrame pleural con características exuda Típicamente los hámsteres mueren entre 11 y 14-d post-inoculación, reflejando un período de incubación ligeramente acelerado en comparación con las infecciones humanas. Al igual que con el HCPS humano, el examen microscópico del pulmón revela abundante deposición de fibrina, septo alveolar engrosado y antígeno viral expresado abundantemente en el endotelio microvascular. Los hámsteres infectados por ANDV equipados con dispositivos de monitoreo fisiológico mostraron disminución de las presiones de pulso, taquicardia e hipotensión que parecen imitar de cerca el shock que se cree que es la causa próxima de la muerte en pacientes que sucumben al HCPS [65, 74]. En comparación con la enfermedad humana, los hámsteres infectados por ANDV exhiben títulos excepcionalmente altos de ANDV vivo en sus tejidos, con gran parte de la replicación viral que ocurre en Los títulos de ANDV vivo en algunos casos superan los 10 8 /g, mientras que los aislados de hantavirus de los tejidos humanos han sido notoriamente difíciles de obtener. A pesar de la aparición universal de enzimas hepáticas levemente elevadas en pacientes con HCPS, las enzimas hepáticas no parecen estar presentes en niveles elevados en la sangre de hámsters enfermos incluso inmediatamente antes de la muerte [75]. El período prolongado de incubación asociado con la enfermedad por hantavirus da al huésped un tiempo considerable para montar una respuesta inmune madura contra el virus. Así, en contradición a infecciones de gravedad comparable y sintomatología relacionada asociada con arenavirus y filovirus, las infecciones por hantavirus en humanos se asocian con respuestas anticuerpos de título significativo por el momento en que comienzan los síntomas. A pesar de esta observación, parece ser posible que la variación natural en las respuestas individuales de anticuerpos neutralizantes entre los pacientes con infecciones por NVS pueda estar relacionada con la gravedad de la enfermedad, lo que sugiere que la administración de anticuerpos antivirales podría resultar efectiva terapéuticamente [76]. En el caso de la infección por ANDV, han surgido nuevas evidencias que indican que el aparente aclaramiento del virus de la sangre no resulta en la eliminación completa del estímulo antigénico por el virus, sugiriendo que el virus puede persistir, tal vez en algún sitio inmunológicamente privilegiado aún indeterminado [77]. Un papel para las respuestas patológicas mediadas por células T en el HFRS y el HCPS ha sido la fuente de especulación por una variedad de razones. La gravedad del SNS asociado al SNCP puede haber hecho más evidente que el inicio del edema pulmonar, la taquicardia y la hipertensión parecía estar todo, pero universalmente asociado temporalmente, con la aparición de un espectro de células altamente activadas del linaje linfoide en la sangre periférica. Se detectaron células con similitudes morfológicas cercanas a estos -inmunoblastos- en los pulmones congestionados y pesados de los pacientes que llegaron a la autopsia, así como en órganos linfoides y en las tríadas portal [63, [78] [79] [80]. Estas observaciones llevaron a especular que algún componente de la patogénesis por hantavirus podría estar vinculado a la aparición de células T antivirales que podrían estimular o contribuir a la aparición de una -tormenta de mediadores y el fenotipo de fuga capilar asociado. Estudios posteriores han confirmado la expectativa de que una fracción significativa de la población de inmunoblastos en pacientes con HCPS son células T con especificidad para epitopes específicos de antígenos virales de clase I presentados por el HLA, incluyendo Gn, Gc y N [77, [81] [82] [83]. Presumiblemente, las actividades antivirales de estas células, manifestadas en parte por su elaboración de mediadores en el intersticio afectado, pueden contribuir a la fuga endotelial/capilar que se encuentra en el corazón de la patogénesis del hantavirus. Debido a que los primeros casos de HCPS a menudo llegaron a la autopsia, se hizo posible examinar tejidos necropsiados para la expresión de citocinas. El estudio de Mori et al. (1999) revelaron una alta expresión relativa de citocinas proinflamatorias incluyendo TNF-, IL-1-, IL-6, proporcionando evidencia a favor de un modelo de tormenta de citoquinas para la patogénesis [64]. Los autores creían, basándose en la morfología de las células secretadoras de citoquinas, que tanto monocitos como linfocitos estaban contribuyendo a la producción de citocinas. Que los mediadores proinflamatorios se encuentran en niveles elevados en el plasma, así como el intersticio renal de pacientes con enfermedad hantaviral aguda se ha reconocido desde hace algún tiempo también [84, 85]. Si bien el diagnóstico de HCPS y HFRS se realiza mejor con serología IgM, en la etapa aguda de la infección por NVS, también se puede utilizar RT-PCR si se utilizan células sanguíneas o coágulos de sangre en lugar de plasma o suero, donde la sensibilidad incluso utilizando imprimaciones PCR anidadas disminuye a cerca del 70% [86] [87] [88]. En una instalación en la que se tratan muchos casos de HCPS, el centro médico de la Universidad de Nuevo México en Albuquerque, se ha ofrecido un servicio de diagnóstico en el que se analizan los hallazgos hematológicos del paciente para establecer la probabilidad de que un paciente tenga HCPS. La combinación de trombocitopenia, abundancia elevada de linfocitos -inmunoblasto-, población de células polimorfonucleares con desplazamiento izquierdo sin evidencia morfológica fuerte para su activación, y valores elevados de hemoglobina o hematocrito es altamente específica para el HCPS y permite a los clínicos la capacidad de poner pacientes presuntivos-HCPS en oxigenación de membrana extracorpórea (ECMO), que se cree que ha salvado a muchos pacientes de un resultado letal [89]. Se cree que la infección humana por hantavirus sigue el contacto con secreciones o excreciones producidas por roedores infectados. En los Estados Unidos, 538 infecciones humanas por hantavirus fueron reportadas hasta finales de diciembre de 2009 [90], con Nuevo México, Arizona y Colorado mostrando los casos más altos. Mientras que el prototípico hantavirus centroamericano en América Central fue el virus Rio Segundo de Reithrodontomys mexicanus de Costa Rica, la primera enfermedad humana apareció algunos años más tarde en Panamá, donde el virus Choclo (CHOV) surgió como el agente etiológico y se cree que es responsable de todos los casos conocidos de HCPS. La rata de arroz pigmeo fulvo Oligoryzomys fulvescens ha sido identificada como el reservorio de roedores [91]. En Panamá, los primeros casos de HCPS, aunque con poca o ninguna implicación cardiaca evidente, fueron reportados en 1999, y desde entonces, 106 infecciones humanas han ocurrido con una tasa de mortalidad del 26% [92]. Seroencuestas de mamíferos en México y Costa Rica han encontrado anticuerpos antihantavirus [93] [94] [95] [96], y se han notificado seroprevalencias que oscilan entre 0,6 y 1,6% en poblaciones humanas a pesar de la ausencia de casos conocidos de HCPS [97]. En América del Sur, los casos de HCPS se han identificado en Argentina, Bolivia, Brasil, Chile, Paraguay y Uruguay, y también se han notificado evidencias de exposición humana a hantavirus en Venezuela [98] y Perú [99]. En América del Sur, ANDV es el principal agente etiológico con casos en Chile y Argentina notificados desde 1995. En Chile, se han producido 671 casos de HCPS debido a ANDV durante el período 2001-2009 [100]. Desde 1995 se han reportado más de 1.000 casos de HCPS en Argentina [101] ; en el Brasil se han identificado aproximadamente 1.100 casos de HCPS entre 1993 y 2008 [102]. Las tasas de mortalidad por casos en esos tres países han sido similares, oscilando entre el 30% (Argentina), el 36% (Chile) y el 39% (Brasil). Las infecciones por Hantavirus ocurren con más frecuencia en hombres que en mujeres, aunque la proporción entre hombres y mujeres es muy variable. Por ejemplo, las comunidades panameñas mostraron una proporción de 55 hombres por 45 mujeres [103], mientras que en Chile la proporción es más sesgada por hombres (71%) [104]. En el Chaco paraguayo la proporción entre hombres y mujeres se aproxima al 50% [105]. En América del Norte, en diciembre de 2009 el 63% de los pacientes eran varones [90]. Todos los grupos étnicos y raciales parecen ser susceptibles a infecciones por el hantavirus, y las diferencias entre ciertos grupos (como indígenas y no indígenas) están más probablemente correlacionadas con el tipo de hábitat en el que reside la población (por ejemplo, zonas rurales frente a zonas urbanas). De hecho, las comunidades rurales representan la mayor incidencia global del hantavirus y, por lo tanto, están en mayor riesgo [92, [105] [106] [107] [108] [109] [109] [119], aunque también se ha destacado la importancia de los entornos peridomésticos como una importante zona de exposición [112, 113]. El principal mecanismo por el que los seres humanos adquieren la infección por el hantavirus es la exposición a aerosoles de heces contaminadas de roedores, orina y saliva [114, 115]. Esto puede ocurrir cuando los seres humanos residen en áreas cercanas a las que habitan los roedores, viven en áreas infestadas de roedores, o cuando los roedores invaden entornos humanos, que son más frecuentes en hábitats rurales.Existe una larga historia de coexistencia humana con roedores, lo que plantea dudas sobre el aparente aumento reciente de las enfermedades relacionadas con el hantavirus, especialmente el HCPS. Aparte de una aparente asociación con eventos de oscilación sureña de El Niño (ENSO) en algunas regiones [116, 117], los recientes incrementos en la incidencia del HCPS no parecen seguir un patrón temporal o espacial fácilmente definido. Sin embargo, algunas características del paisaje, como la fragmentación del hábitat o las áreas perturbadas por el ser humano, pueden influir en la dinámica de la población de roedores e impactar en la incidencia viral [118] [112] [112] [121]. A pesar de la estocástica asociada a la contracción de la infección Las actividades humanas en edificios mal ventilados que pulverizan partículas que luego se inhalan (es decir, limpieza, agitación de alfombras, polvo) se identifican con frecuencia entre los pacientes admitidos para el SHCPS [11, 122]. Se cree que las actividades al aire libre transmiten un menor riesgo debido a la labilidad de los hantavirus a la radiación UV y a la supuesta tendencia a dispersarse en el viento, aunque ciertas condiciones ambientales parecen mantener el virus durante períodos más largos fuera de su huésped natural, lo que permite la transmisión indirecta [123]. Una vía alternativa pero poco común de transmisión del virus es la mordedura de roedores [124] [125] [126]. Los trabajadores sobre el terreno que manipulan mamíferos corren un riesgo potencialmente mayor de exposición a infecciones por hantavirus, aunque cuando se cuantifica a través de serosurveys el riesgo absoluto parece bastante leve [127]. Un nuevo estudio en Colorado sugiere la posibilidad de que una picadura de roedor haya sido el vehículo próximo para la transmisión al aire libre de NVS [128], lo que vuelve a enfatizar el uso de equipo de protección personal durante las actividades de trabajo de campo [129]. Como caso particular dentro de los hantavirus, la transmisión de persona a persona ha sido documentada exclusivamente para el virus de los Andes sudamericanos [130] [133] [133] [135]. La identificación de esta vía de transmisión se ha hecho utilizando tanto herramientas moleculares como encuestas epidemiológicas, pero el mecanismo de transmisión interpersonal no está bien establecido. Curiosamente, ANDV también puede ser derramado por los humanos a través de otros fluidos biológicos como la orina [136], ilustrando las propiedades particulares que diferencian este virus de otros hantavirus. Aunque la transmisión interpersonal parece ser única para ANDV, el ARN viral de PUUV se ha detectado en la saliva de pacientes con HFRS, y algunos pacientes con SNV-HCPS tienen ARN viral en las secreciones traqueales [88, 137]. Los Hantavirus en las Américas son alojados naturalmente por roedores (Muridae y Cricetidae) así como las musarañas (Soricidae) y los lunares (Talpidae) (Figura 1). Tres especies de musgo y un mole han sido reportados para albergar hantavirus y su patogenicidad para los humanos permanece desconocida [22, 138, 139]. Se han identificado al menos 15 especies de roedores como portadores de diferentes hantavirus patógenos, con algunos genotipos sudamericanos como Castelo do Sonhos (CDSV) o Hu39694 sólo identificados después de infecciones humanas (Figura 1 ). Los hantavirus suelen mostrar una alta especificidad de especie y ningún huésped intermedio [140]. Sin embargo, se han descrito algunos genotipos de hantavirus en la misma especie de roedores. Tal es el caso de Playa de Oro (OROV) y Catacamas (CATV) identificados en Oryzomys couesi [141, 142], o Maporal (MAPV) y Choclo (CHOV) hospedados por O. fulvescens [91, 143]. En América del Norte se han detectado virus de muleshoe y Black Creek Canal hanta en sigmodon hispidus [ Además, un genotipo de hantavirus (por ejemplo, el virus similar a Juquitiba) puede ser transportado por más de una especie de roedores (O. nigripes, Oxymycterus judex, Akodon montesis). Otro ejemplo es el virus Laguna Negra (LANV) que después de ser identificado en Calomys laucha [146] también ha sido reportado en C. callosus [147]. El rápido aumento en el descubrimiento de nuevos hantavirus y la identificación de sus anfitriones no parece probable que termine tan pronto como se examinen nuevas especies pequeñas de mamíferos [95]. Este tema se complica por la continua controversia en los criterios para la clasificación de distintos hantavirus [148, 149], que también está vinculado a la clasificación taxonómica y los reordenamientos taxonómicos. La transmisión de especies cruzadas es un proceso importante durante la propagación, aparición y evolución Particularmente dentro de los hantavirus, los derrames a los huéspedes secundarios se identifican cada vez más a medida que se realizan estudios más extensos [151] [152] [153] [155] [156]. Por ejemplo, ANDV es el agente etiológico predominante del HCPS en América del Sur, y O. longicaudatus el principal reservorio de roedores. Derrama en al menos otras cuatro especies de roedores que coocurren con el reservorio se han identificado, con Abrothrix longipilis mostrando la segunda mayor prevalencia de anticuerpos de ANDV, y actualmente no hay duda de que el virus es extremadamente similar genéticamente entre los dos roedores del huésped [157, 158]. En América del Norte, el derrame del virus Bayou (BAYV) puede haber ocurrido desde el reservorio principal de O. palustris a S. hispidus, R. fulvescens, P. leucopus y B. taylori [159] [160] [161]. Es más probable que el derrame del virus Hanta se produzca con poblaciones de acogida que habitan regiones simpatricas o sintópicas [151, 162], y la transmisión de especies cruzadas tendría probablemente mayores posibilidades de éxito si las especies anfitrionas están estrechamente relacionadas [163]. Se encuentra una excepción interesante entre el virus Oxbow (OXBV) y el virus Asama (ASAV) en el que un proceso de cambio de huésped parecía haber ocurrido entre mamíferos pertenecientes a dos familias (Talpidae y Soricidae), probablemente como resultado de la codivergencia alterna y recurrente de ciertos tax Los hantavirus son transmitidos horizontalmente entre roedores y no son transmitidos por artrópodos (a diferencia de otros virus de la familia Bunyaviridae). La infección por derrapadores a mamíferos no humanos generalmente no produce ninguna transmisión hacia adelante (o a fin de morir), pero si los seres humanos están infectados pueden resultar en una alta morbilidad y mortalidad [122, 164]. Durante la primavera de 1993, un brote de pacientes con HCPS debido a SNV ocurrió en los estados de Four Corners, resultando en más del 60% de casos de mortalidad entre los casos iniciales, muchos de los cuales involucran a miembros de la tribu Navajo [12, 121]. En Panamá, se notificó un brote durante 1999-2000 en Los Santos, y 12 casos donde se identificaron con tres muertes [165, 166]. Esto representó el primer informe de infecciones por hantavirus humanos en América Central. En América del Sur, Diecisiete individuos fueron identificados con anticuerpo NVS (ELISA) o fueron antígenos (HCI) positivos de 52 casos sospechosos [167]. En 1996 ocurrieron brotes mayores debidos a ANDV en el sur de Argentina [131, 134] ; en el sur de Chile se presentaron grupos de pacientes con enfermedad por hantavirus en 1997 [158]. En Brasil, el primer brote fue identificado en la Amazonía Brasileña (Estado de Maranhão) en el año 2000, e involucró pequeños pueblos que resultaron en una prevalencia del 13,3% de los evaluados (398 residentes totales) [168]. Los factores que desencadenan los brotes de hantavirus todavía son mal entendidos, probablemente porque resultan de varias características bióticas y abióticas interactuantes cuyos parámetros clave son difíciles de modelar. Sin embargo, el uso de nuevos enfoques de modelado que involucran características geográficas y ambientales parece ser prometedor a la hora de predecir posibles brotes de hantavirus y/o áreas de mayor riesgo [169] [170] [171] [172]. Debido a que se sabe que los hantavirus se transmiten directamente de los huéspedes infectados a los susceptibles, el primer enfoque natural es relacionar los brotes con la ecología de los huéspedes virales. La transmisión y persistencia del hantavirus en las poblaciones de roedores depende de varios factores que interactúan para afectar la dinámica ecológica del huésped, que a su vez está fuertemente influenciada por las características de comportamiento de las especies de roedores individuales, a la estructura paisajística y a las características ambientales [173, 174]. La transmisión viral depende de las tasas de contacto entre los huéspedes sensibles, y a pesar de la noción prevaleciente de que un aumento de la densidad se encuentra y, por lo tanto, de Además, se ha demostrado que la transmisión de NVS sigue un patrón de heterogeneidad de contacto, donde los individuos de la población tienen diferentes probabilidades de transmitir la infección [176]. La comprensión de la transmisión viral resulta ser mucho más compleja cuando especies distintas del principal huésped del reservorio se incorporan en el modelo. De hecho, estudios recientes han demostrado que la mayor diversidad de especies hospedantes está correlacionada con una menor prevalencia de infección en América del Norte para P. maniculatus [177], en América Central para O. fulvescens (reservorio del virus Choclo) y Zygodontomys brevicauda (reservorio del virus Calabazo) [178], y en América del Sur para Akodon montensis (reservorio del virus Jabora) [162]. Las tasas de contacto varían según la distribución espacial de las poblaciones y parecen estar Por ejemplo, la prevalencia de SNV en P. maniculatus fue mayor en paisajes con mayor grado de fragmentación del hábitat preferido [179]. Además, ciertas propiedades del paisaje como elevación, pendiente y cubierta terrestre parecen ser útiles para detectar áreas con infecciones persistentes de SNV, y por lo tanto se consideran áreas refugiales donde el virus puede mantenerse durante años [169]. Los cambios en el entorno natural de las especies de reservorios, como la fragmentación forestal y la pérdida de hábitat, pueden alterar la abundancia y distribución de la población y provocar brotes de hantavirus, como se observa en la Península de Azurero de Panamá [118, 119]. Además, las diferencias en el microhábitat, incluida la cubierta superficial, pueden conducir a diferencias en la dinámica ecológica dentro de las poblaciones y afectar a la tasa de exposición al virus [180]. Se han encontrado diferencias en las infecciones por hantavirus a través de paisajes contrastantes en el intervalo latitudinal en poblaciones de roedores de O. longicaudatus en Chile, lo que sugiere que los seres humanos están expuestos de manera diferencial al virus [107, 181]. La dinámica poblacional de roedores se ve afectada por cambios estacionales de clima y clima [182, 183]. En el caso de los brotes asociados a ENSO, se ha postulado una compleja cascada de eventos desencadenados por lluvias altamente inusuales en el año precedente para dar lugar a un aumento de la producción primaria y densidades de roedores, aumentando también la probabilidad de transmisión del virus a los seres humanos, pero ha resultado difícil demostrar con precisión los eventos intermedios sugeridos, como el aumento de las densidades de roedores en el aumento de la carga de casos [116, 121, 184]. En América del Sur, los efectos del cambio climático y los brotes de hantavirus no han sido bien estudiados, a pesar del conocimiento de que varias especies de roedores que son reservorios de enfermedades emergentes se han visto dramáticamente afectadas por eventos como El Niño [185]. Los cambios en la dinámica de la población de acogida también se ven afectados por la estacionalidad, lo que puede conducir a brotes de enfermedades cuando se interrumpen los procesos que equilibran las poblaciones de roedores de temporada en temporada [186]. La emergencia viral puede seguir promoviéndose a medida que los cambios introducidos por el ser humano continúan aumentando en el medio ambiente a diferentes escalas geográficas. Estos cambios también pueden alterar la estructura y dinámica de la población de roedores e interacciones interespecies creando condiciones que pueden conducir a brotes virales, establecimiento viral en nuevos hospederos, y la aparición de HCPS [102, 162], incluso con aparentemente leve perturbación ecológica al sistema virus-hospedero [188]. Ciertas características fisiopatológicas, incluyendo trombocitopenia y shock, de enfermedades por hantavirus de los seres humanos, tienen similitud sustancial con las fiebres hemorrágicas inducidas por otros virus tales arenavirus, filovirus y flavivirus, a pesar de compartir esencialmente ninguna secuencia similitud con ellos. Tales observaciones plantean preguntas acerca de si tales similitudes en la patogénesis son probables similitudes de fenotipo, o en cambio reportan la presencia de mecanismos moleculares comunes entre los virus. En esta revisión se discuten las propiedades generales, descubrimientos y epidemiología/ecología de las formas de hantavirus patógenos del Nuevo Mundo, y también se busca identificar algunas de las características de las macromoléculas virales y mecanismos inmunológicos que se han propuesto como potenciales mediadores directos de los eventos patógenos que caracterizan la enfermedad humana HCPS. Si bien es poco probable que la expresión de una proteína viral particular o ARNs en aislamiento se pueda confiar en replicar fenotipos clave de infección por el virus completo, algunos de los hallazgos han sido suficientemente consistentes con lo que se conoce de la patogénesis in vivo que ofrecen plomos plausibles de primer paso en la búsqueda de objetivos terapéuticos. Esperamos con interés las revelaciones mecanísticas que seguirán el uso inevitablemente ampliado de métodos poderosos como la secuenciación profunda, imágenes cada vez más avanzadas, y métodos microscópicos, y modelos animales que por fin se pueden decir

Para HCPS, ¿qué le sobra a esa expresión?

Los hantavirus en las Américas y su papel como patógenos emergenteshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3185593/SHA: efe13a8d42b60ef9f7387ea539a1b2eeb5f80101Autores: Hjelle, Brian; Torres-Pérez, FernandoFecha: 2010-11-25DOI: 10.3390/v2125559Licencia: cc-byAbstract: La continua aparición y reaparición de patógenos representan una amenaza continua, a veces mayor, para las poblaciones. Los hantavirus (familia Bunyaviridae) y sus enfermedades humanas asociadas se consideraron confinados a Eurasia, pero la aparición de un brote en el suroeste de Estados Unidos llevó a un gran aumento en su estudio entre los virólogos de todo el mundo. Se han descrito más de 40 genotipos hantavirales, la gran mayoría desde 1993, y casi la mitad de ellos patógenos para los seres humanos. Los hantavirus causan infecciones persistentes en sus reservorios, y en las Américas, la enfermedad humana se manifiesta como compromiso cardiopulmonar, síndrome cardiopulmonar del hantavirus (HCPS), con proporciones de casos-fatalidad, para los serotipos virales más comunes, entre el 30% y el 40%. Alteración del hábitat y trastornos ecológicos a mayor escala, tal vez incluyendo el cambio climático, son algunos de los factores que pueden haber aumentado la carga de casos humanos de HCPS entre 1993 y el presente. Consideramos aquí las características que influyen en la estructura de la dinámica de la población huésped que pueden conducir a brotes virales, así como los determinantes macromoleculares de los hantavirus que han sido considerados como potenciales contribuciones a la patogenicidad. Texto: Los patógenos emergentes causan enfermedades nuevas o no reconocidas anteriormente, y entre ellas, las zoonóticas emergentes son una preocupación importante entre los científicos que estudian enfermedades infecciosas a diferentes escalas espaciales y temporales [1, 2]. Los cambios en las condiciones bióticas y abióticas pueden alterar la dinámica de las enfermedades de la población y conducir a la aparición de infecciones zoonóticas [3] [5] [6]. Durante las últimas décadas, se han producido varios brotes de patógenos virales emergentes y reemergentes, que afectan tanto a la implicación puramente local como a nivel mundial/pandémica de las poblaciones humanas. Entre los ejemplos visibles están la gripe A, el virus del Ébola, el virus de la hepatitis C, el trastorno respiratorio grave para adultos (SARS), el coronavirus y el virus de la inmunodeficiencia humana, que desafían las medidas de prevención y control de los sistemas de salud pública [7]. En las Américas, el reciente brote de gripe pandémica A subtipo H1N1 se convirtió en un objetivo importante de control debido a su rápida propagación, y las incertidumbres en cuanto a virulencia y transmisibilidad, sin embargo, la disponibilidad de vacunas fue limitada cuando se produjo una actividad significativa antes de la temporada tradicional de gripe [8]. Sin embargo, en el último siglo han surgido o resurgido brotes de varias enfermedades virales relacionadas con el virus arenavirus y el virus del dengue, y más recientemente, hantavirus y la expansión del rango geográfico del virus del Nilo Occidental. Entre las enfermedades zoonóticas, los mamíferos pequeños son anfitriones de varios virus ARN patógenos, especialmente Arenaviridae y Bunyaviridae: Hantavirus [9] [10] [11]. Las infecciones por hantavirus se convirtieron en una preocupación en las Américas después de la descripción de un brote de distrés respiratorio agudo ocurrido en La enfermedad recientemente reconocida, el síndrome cardiopulmonar del hantavirus, el HCPS (o síndrome pulmonar del hantavirus), se relacionó con la infección por el virus del Sin Nombre (SNV) recién descubierto, y el roedor Peromyscus maniculatus (ratón venado) fue identificado como el reservorio [13]. Sin embargo, las infecciones por hantavirus tienen una historia mucho más larga. Una revisión de los escritos chinos antiguos, que datan de aproximadamente 960 dC, reveló descripciones muy parecidas a la fiebre hemorrágica con síndrome renal (HFRS), el síndrome causado por los hantavirus del Viejo Mundo [14]. Durante el siglo XX, los casos de enfermedad febril aguda con compromiso renal fueron descritos de varios países eurasiáticos y Japón, a menudo en asociación con compromisos militares [15]. El HFRS como síndrome distinto, sin embargo, fue llamado por primera vez a la atención de la medicina occidental en asociación con un brote que ocurrió entre las tropas de las Naciones Unidas durante el conflicto coreano entre 1951 y 1954, donde más de 3.200 soldados fueron afectados [16]. Tomó más de dos décadas hasta que el agente etiológico, el virus Hantaan (HTNV), fue aislado del ratón de campo rayado Apodemus agrarius, detectado en parte por la unión de anticuerpos de muestras de suero de paciente a los tejidos pulmonares de ratones de campo sanos y salvajes [17, 18]. El virus se encontró más tarde para representar la especie tipo de un nuevo género Hantavirus de la familia Bunyaviridae, aunque fue más tarde evidente que el primer hantavirus a aislarse fue el virus Thottapalayam de shrew-borne [19]. La categorización de los hantavirus como pertenecientes a la familia Bunyaviridae se debe en parte a la presencia consistente de tres genomas de ARN que son circularizados in vivo como resultado de la presencia de nucleótidos terminales complementarios que ayudan a doblar el genoma en una morfología -hairpin-, descrita por primera vez para el flebovirus Uukuniemi [19, 20]. La Tabla 1 es una lista de los hantavirus patógenos predominantemente distintos serológicamente. Se describen muchos otros genotipos llamados, pero tales otras formas patogénicas están generalmente estrechamente relacionadas con los Andes o, en algunos casos, el virus Sin Nombre. Durante la maduración del virus, el precursor forma GPC se procesa utilizando una proteasa unida a la membrana en Gn y Gc, una escisión que ocurre, y parece ser señalada, después de la señal péptida conservada WAASA en la C-terminal de Gn [24]. Aunque las dos proteínas se pueden expresar de forma independiente a través de la transfección, pueden ser retenidas en el compartimento celular incorrecto (ER o aggrosome); por lo tanto, deben ser co-expresadas para permitirles estabilidad para que las dos se puedan ensamblar correctamente en el Golgi [25, [27] [28]. Se han identificado varias actividades y propiedades para las glicoproteínas envolventes del hantavirus, incluyendo algunas características que se sospecha que están involucradas en la patogenicidad de los serotipos causantes de la enfermedad, una posibilidad que ha generado atención experimental. Las glucoproteínas son los ligandos conocidos o presuntos para al menos dos receptores celulares distintos, la cadena de integrina y el factor acelerador de la descomposición, o DAF [30, 31] ; con gC1qR/p32 también identificado como otro receptor de entrada potencial [32]. Comparaciones con la proteína E del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, llevaron a Tischler et al. a considerar la glicoproteína Gc como una proteína potencial de fusión de clase II, tal vez impartiendo actividad de fusión al virión, y esta hipótesis ha ganado apoyo en otros estudios [33, 34]. Se han identificado actividades adicionales con, o se afirma que están relacionadas con, Gn. Para muchos de estos estudios, una premisa subyacente ha sostenido que hay diferencias entre las glicoproteínas de hantavirus -patógenos en relación con virus en el género que se denominan Si bien es cierto que aún no ha sido posible vincular el virus de Prospect Hill (PHV) con la enfermedad humana, la ausencia de evidencia de su patogenicidad tal vez no debería equipararse con la evidencia de su ausencia. Sólo se podría considerar que el nivel de enfermedad (por ejemplo, letargo, fiebre, proteinuria y azotemia) asociado con la infección de primates no humanos por PHV no es significativamente diferente del registrado para los modelos de primates no humanos utilizando el virus conocido del patógeno Puumala (PUUV) [35, 36]. Para el propósito de esta discusión, presumiremos que los hantavirus apatogénicos son efectivamente apatogénicos. Mientras que algunos estudios han sugerido que las glicoproteínas Gn se dirigen más rápidamente a la vía ubiquitina-proteosoma que a las formas apatogénicas, otros han interpretado las diferencias en el manejo de las glicoproteínas Gn a través de especies de hantavirus por el sistema ubiquitina-proteosomal como independientes de la patogenicidad [37] [38] [39]. Algunos investigadores han dirigido sus esfuerzos hacia la identificación de una capacidad diferencial, ya sea cinética o de magnitud absoluta, en la capacidad de los hantavirus patógenos y apatogénicos para provocar una respuesta de interferón en las células. Una premisa que surge es que las formas apatogénicas tenderían a inducir una respuesta innata anterior que haría más probable que el virus se limpiara rápidamente o se volviera menos competente en su replicación, a fin de evitar cualquier respuesta patológica en el huésped [42] La respuesta innata anti-hantavirus puede en algunos casos ser atribuida a la interacción viral como ligando de TLR-3, pero no en otros, y en las células endoteliales, no parece requerir más que la partícula viral misma, incluso cuando se introduce en forma replicativa incompetente [43, 44]. Las proteínas y los ARNm inducidos prominentemente por los hantavirus incluyen MxA e IFIT-1 (ISG-56) y otros incluyendo algunos con actividad antiviral conocida o sospechada. Esos hantavirus, a menudo cepas altamente patógenas, que no inducen una respuesta antiviral potente, se sospechan o se presume que tienen un (más) potente mecanismo de antagonismo interferón-vía en relación con otros virus, un mecanismo que actúa positivamente para prevenir que se forme una respuesta innata efectiva, al menos temprano en la infección [4 Sin embargo, se reportan algunos casos en los que los hantavirus altamente patógenos, tales como NVS, también son capaces de inducir la expresión de los ARNm del gen estimulado por interferón, incluso muy temprano en la infección, con proteínas ISG, como se esperaba, tardando más tiempo en aparecer en la célula [44]. Las actividades anti-interferón también se han atribuido a la proteína NSs que se puede elaborar en células infectadas por serotipos que codifican esta proteína [46]. Otros investigadores han examinado las actividades de las glucoproteínas del hantavirus y otras proteínas que podrían afectar directamente a algunos aspectos de la progresión patogénica asociada a la infección por hantavirus en humanos, tales como cambios de permeabilidad vascular. Mientras que los primeros intentos de causar directamente aumentos en la permeabilidad de las monocapas endoteliales con partículas virales o infección viral fueron en gran medida decepcionantes, los hantavirus se han identificado como que afectan adversamente la migración endotelial sobre los sustratos y en la potenciación de la permeabilidad endotelial inducida por VEG-F [47, 48]. La proteína nucleocápsida o N más corta (+50 kD) es un componente estructural del nucleocápsido viral, junto con los segmentos de ARN viral genómico. Como proteína de unión al ARN que afecta a la horquilla del cabello de los segmentos genómicos con alta afinidad [49, 50], limita el acceso del ARN para alojar nucleasasas y ayuda a hacer que la replicación viral sea un proceso cerrado dentro del citoplasma. También actúa como una proteína de membrana periférica, al igual que la proteína L [51], una actividad que podría jugar un papel en su supuesta, pero aún no demostrada función como matriz [52]. Hasta hace poco, no se había apreciado que N tuviera una amplia variedad de otras actividades, algunas de las cuales pueden estar vinculadas, no sólo a los requisitos fundamentales de replicación, sino también a la interferencia con una serie de procesos intracelulares de la célula normal. Así, se ha propuesto una interacción entre el aminoterminal de la proteína N del hantavirus y la proteína celular Daxx, con la sugerencia de posibles consecuencias pro-apoptóticas [51]. N también se reporta que interactúa con microfilamentos actínicos, y la proteína SUMO-1 [53, 54]. Utilizando ensayos basados en el gen reportero, Connie Schmaljohn y sus colegas han informado que la proteína nucleocapsid del virus Hantaan tiene un papel inhibidor en las respuestas inflamatorias mediadas por NF kappa B (NF- â € € TM B). Los efectos sobre la expresión NF- € B parecen estar limitados a la prevención de su translocación nuclear después de su intento de activación con lipopolisacárido, LPS [55]. En el citoplasma de las células infectadas, la proteína N se puede encontrar en los cuerpos celulares P donde secuestra y protege los capuchones de 5'. Puede localizar los capuchones a través de su interacción con DCP1, un componente clave de los cuerpos P. Durante la infección por hantavirus, los ARN virales se concentran en los cuerpos P, a través de su interacción con N y DCP1. La proteína N demuestra la protección preferencial de los ARNm diseñados para terminar prematuramente su proteína codificada en comparación con los ARNm nativos [56]. La proteína N se ha vinculado cada vez más a la replicación y traducción virales, a veces de maneras no previstas anteriormente. Se encuentra entre una familia creciente de diversas proteínas virales que pueden servir como un inespecífico - ARN chaperone ®, una actividad que debe facilitar el acceso de la L polimerasa al ARNv para la transcripción y replicación, en que puede disociar transitoriamente estructuras de ARN mal dobladas [57]. Algunos de los efectos de la proteína N en la traducción no pueden ser inmediatamente reconocidos como adaptables en la naturaleza. Puede reemplazar todo el complejo de iniciación traslacional EIF4F, presentando simultáneamente el ribosoma con un reemplazo de la actividad de unión de la tapa de eIF 4E, uniéndose al complejo de pre-iniciación 43S, al igual que eIF 4G, al tiempo que reemplaza la actividad helicoidal de eIF 4A, que se presume que es necesaria para disociar la estructura de ARN de orden superior [56, 58]. Estos tres factores normalmente trabajan juntos para lograr la iniciación traslacional. En los cuerpos P, la capacidad de la proteína N de unirse a una alta afinidad a los oligoribonucleótidos celulares nativos tapados, junto con su actividad en la protección de ARNs tapados de la degradación, probablemente facilita el acceso de oligonucleótidos encapsulados para su uso en la iniciación transcripcional por L polimerasa (-cap ra Tráfico de N para el ensamblaje viral: Clásicamente, la proteína N en las células infectadas parece estar agrupada o partículas en la naturaleza, con una concentración pesada en una única ubicación perinuclear, ampliamente considerada como la Golgi [27]. Las proteínas N de los hantavirus se encuentran en asociación con fracciones de partículas, y los estudios confocales microscopía y bioquímico-inhibidores han demostrado que las trazas N a lo largo de microtúbulos pero no con filamentos de actina [52]. El destino final de N, para su ensamblaje en partículas virales es la Golgi, y que circula allí a través del complejo intermedio retículo-Golgi endoplasmático (ERGIC), también conocido como cúmulo vesicular-tubular [52]. Un inhibidor negativo dominante, la dinamitina, asociado con el transporte mediado por Los estudios posteriores sugieren que la dependencia específica del transporte microtubular es específica de los hantavirus del Viejo Mundo como el NVH, pero que el Hantavirus del Nuevo Mundo ANDV está asociado con filamentos de actina [59]. Sin embargo, los datos recientes indican que el transporte microtubular es efectivamente utilizado para el NVH del Nuevo Mundo [60]. Las enfermedades del Hantavirus del hombre desde hace mucho tiempo han sido sospechosas de tener una base inmunopatógena en parte debido a su período de incubación relativamente largo de 2-3 semanas y la asociación temporal observada entre los trastornos inmunológicos y la primera aparición de signos y síntomas de la enfermedad del hantavirus. HFRS y HCPS comparten muchas características clínicas, llevando a muchos investigadores a considerar que son, en esencia, diferentes manifestaciones de un proceso patógeno similar, que difieren principalmente en los órganos objetivo primarios de expresión de la enfermedad (Tabla La patogénesis de las infecciones por hantavirus es el tema de una revisión continuamente actualizada en la serie UpToDate [61]. Para el momento en que aparecen los síntomas en el HCPS, ambas respuestas antivirales fuertes, y, para los genotipos virales más virulentos, el ARN viral puede ser detectado en plasma sanguíneo o células sanguíneas nucleadas respectivamente [63, 64]. Al menos tres estudios han correlacionado el ARN viral plasmático con la gravedad de la enfermedad para el HCPS y el HFRS, sugiriendo que la replicación del virus juega un papel continuo y en tiempo real en la patogénesis viral [65] [66] [67]. Se han identificado varios cambios patológicos distintivos que ocurren tanto en el HFRS como en el HCPS. Una característica crítica de ambos es una fuga capilar transitoria (~ 1-5 días) que involucra el La fuga resultante es de carácter exudativo, con una composición química alta en proteínas y similar al plasma. La experiencia continua que indica el fuerte tropismo tisular para las células endoteliales, específicamente, es uno de los varios factores que hacen de la integra β3 un candidato especialmente atractivo como un importante receptor in vivo para los hantavirus. Es probable que los hantavirus lleguen a sus tejidos objetivo a través de la captación por los ganglios linfáticos regionales, tal vez con o dentro de un histiocito pulmonar escoltante. Las semillas del virus endotelio local, donde las primeras células infectadas dan lugar, en última instancia, a una viremia primaria, un proceso que parece tomar mucho tiempo para las infecciones por hantavirus [62, 63]. En el momento en que emerge la viremia secundaria, los agentes de las formas más severas de HFRS y HCPS han comenzado a alcanzar una masa suficiente para inducir, a través de las interacciones PAMP-PRR y otros medios, la expresión de citoquinas proinflamatorias [64]. Para HCPS, esa expresión favorece el lecho pulmonar y los órganos linfoides, pero, por razones desconocidas, ahorra el retroperitoneo y, en general, el riñón. En HFRS la situación se invierte, y sin embargo no se aprecia a menudo que el esperado tropismos tisulares preferentes de virus asociados a HFRS y sus contrapartes asociadas a HCPS para los lechos renal y pulmonar, respectivamente, no sea como se predeciría a través de las manifestaciones de las dos enfermedades. La elaboración local de mediadores inflamatorios y quimiotácticos se considera un requisito para el desarrollo Sin embargo, no es la hipoxemia, debido al edema pulmonar prominente, lo que conduce a la muerte en la mayoría de los casos fatales de HCPS, sino más bien la intoxicación del corazón por mediadores como aún no definidos, lo que conduce al estado de bajo gasto cardíaco y al síndrome de shock asociado [64, 65]. Es tentador especular que los mediadores producidos en el pulmón en conexión con el infiltrado inflamatorio pueden infiltrarse a través de la circulación coronaria con dilución mínima en HCPS, consecuencia desventajosa de la estrecha yuxtaposición anatómica de los dos órganos. Así, al menos tres clases de mecanismos potenciales, algunos superpuestos y todos ciertamente no exclusivos de los otros, podrían presumirse que subyacen a la patogénesis del HCPS. Estos incluyen:(1) Mecanismos inmunes innatos. La naturaleza de las interacciones entre los patrones moleculares asociados al patógeno del hantavirus (PAMP) y los receptores de reconocimiento del patrón (PRR) de las células endoteliales susceptibles comienzan a ser aclaradas. El HTNV prototípico parece ser reconocido por TLR-3 [43]. Tal infección tiene consecuencias tales como una mayor expresión del HLA-DR en las células dendríticas [66] y la diferenciación de los monocitos hacia las células dendríticas [67]. (2) Efectos virales directos. La correlación observada entre la carga viral y la gravedad de la enfermedad deja abierta la posibilidad de que las partículas del hantavirus o el ARN puedan tener efectos tóxicos sobre las células o sobre la señalización. Algunos investigadores han favorecido la toxicidad viral directa, actuando a través de la inhibición de la función de barrera celular endotelial, como una explicación de gran parte de la fuga capilar, aunque existe Una pista potencialmente importante hacia el mecanismo por el cual las infecciones por hantavirus agotan las plaquetas sanguíneas y, en algunos casos, causan manifestaciones hemorrágicas, fue avanzada por el reciente descubrimiento de que los hantavirus patógenos son capaces de reclutar plaquetas para adherirse a las superficies celulares endoteliales, con β3 integrina utilizada como elemento de unión crítica [69]. (3) Efectos patógenos causados por las actividades de macromoléculas virales específicas. Hemos revisado algunas de las actividades asociadas con los Gn, Gc y N, polipéptidos codificados viralmente en secciones anteriores. Modelos de prueba de patogénesis se pueden hacer más eficazmente cuando hay un modelo animal que imita aspectos clave de la enfermedad. No existe un modelo similar al HFRS, pero existen modelos animales para el transporte asintomático de PUUV y SNV por sus roedores portadores nativos, el banco vole Myodes glareolus y el ratón venado P. maniculatus; así como un modelo hámster sirio utilizando ANDV o el virus Aporal relacionado de Venezuela, para el cual se observa una enfermedad mimética HCPS [70] [71] [72] [73]. El modelo hámster ANDV-Sirio tiene una serie de características en común con la enfermedad humana, así como algunas diferencias. A diferencia de las enfermedades neurológicas que han sido posibles de provocar con HTNV, el modelo hámster para HCPS parece ser causado por fugas capilares que resultan en edema pulmonar y la producción de un derrame pleural con características exudativas. Típicamente los hámsteres mueren entre 11 y 14-d post-inoculación, reflejando un período de incubación ligeramente acelerado en comparación con las infecciones humanas. Al igual que con el HCPS humano, el examen microscópico del pulmón revela abundante deposición de fibrina, septo alveolar engrosado y antígeno viral expresado abundantemente en el endotelio microvascular. Los hámsteres infectados por ANDV equipados con dispositivos de monitoreo fisiológico mostraron disminución de las presiones de pulso, taquicardia e hipotensión que parecen imitar de cerca el shock que se cree que es la causa próxima de la muerte en pacientes que sucumben al HCPS [65, 74]. En comparación con la enfermedad humana, los hámsteres infectados por ANDV exhiben títulos excepcionalmente altos de ANDV vivo en sus tejidos, con gran parte de la replicación viral que se produce Los títulos de ANDV vivo en algunos casos superan los 10 8 /g, mientras que los aislados de hantavirus de los tejidos humanos han sido notoriamente difíciles de obtener. A pesar de la aparición universal de enzimas hepáticas levemente elevadas en pacientes con HCPS, las enzimas hepáticas no parecen estar presentes en niveles elevados en la sangre de hámsters enfermos incluso inmediatamente antes de la muerte [75]. El período prolongado de incubación asociado con la enfermedad por hantavirus da al huésped un tiempo considerable para montar una respuesta inmune madura contra el virus. Así, en contradición a infecciones de gravedad comparable y sintomatología relacionada asociada con arenavirus y filovirus, las infecciones por hantavirus en humanos se asocian con respuestas anticuerpos de título significativo por el momento en que comienzan los síntomas. A pesar de esta observación, parece ser posible que la variación natural en las respuestas individuales de anticuerpos neutralizantes entre los pacientes con infecciones por NVS pueda estar relacionada con la gravedad de la enfermedad, lo que sugiere que la administración de anticuerpos antivirales podría resultar efectiva terapéuticamente [76]. En el caso de la infección por ANDV, han surgido nuevas evidencias que indican que el aparente aclaramiento del virus de la sangre no resulta en la eliminación completa del estímulo antigénico por el virus, sugiriendo que el virus puede persistir, tal vez en algún sitio inmunológicamente privilegiado aún indeterminado [77]. Un papel para las respuestas patológicas mediadas por células T en el HFRS y el HCPS ha sido la fuente de especulación por una variedad de razones. La gravedad del SNS asociado a la NVS puede haber hecho más evidente que el inicio del edema pulmonar, la taquicardia y la hipertensión parecía estar todo, pero universalmente asociado temporalmente, con la aparición de un espectro de células altamente activadas del linaje linfoide en la sangre periférica. Se detectaron células con similitudes morfológicas cercanas a estos -inmunoblastos- en los pulmones congestionados y pesados de los pacientes que llegaron a la autopsia, así como en órganos linfoides y en las tríadas portal [63, [78] [79] [80]. Estas observaciones llevaron a especular que algún componente de la patogénesis por hantavirus podría estar vinculado a la aparición de células T antivirales que podrían estimular o contribuir a la aparición de una -tormenta de mediadores y el fenotipo de fuga capilar asociado. Estudios posteriores han confirmado la expectativa de que una fracción significativa de la población de inmunoblastos en pacientes con HCPS son células T con especificidad para epitopes específicos de antígenos virales de clase I presentados por el HLA, incluyendo Gn, Gc y N [77, [81] [82] [83]. Presumiblemente, las actividades antivirales de estas células, manifestadas en parte por su elaboración de mediadores en el intersticio afectado, pueden contribuir a la fuga endotelial/capilar que se encuentra en el corazón de la patogénesis del hantavirus. Debido a que los primeros casos de HCPS a menudo llegaron a la autopsia, se hizo posible examinar tejidos necropsiados para la expresión de citocinas. El estudio de Mori et al. (1999) revelaron una alta expresión relativa de citocinas proinflamatorias incluyendo TNF-, IL-1-, IL-6, proporcionando evidencia a favor de un modelo de tormenta de citoquinas para la patogénesis [64]. Los autores creían, basándose en la morfología de las células secretadoras de citoquinas, que tanto monocitos como linfocitos estaban contribuyendo a la producción de citocinas. Que los mediadores proinflamatorios se encuentran en niveles elevados en el plasma, así como el intersticio renal de pacientes con enfermedad hantaviral aguda se ha reconocido desde hace algún tiempo también [84, 85]. Si bien el diagnóstico de HCPS y HFRS se realiza mejor con serología IgM, en la etapa aguda de la infección por NVS, también se puede utilizar RT-PCR si se utilizan células sanguíneas o coágulos de sangre en lugar de plasma o suero, donde la sensibilidad incluso utilizando imprimaciones PCR anidadas disminuye a cerca del 70% [86] [87] [88]. En una instalación en la que se tratan muchos casos de HCPS, el centro médico de la Universidad de Nuevo México en Albuquerque, se ha ofrecido un servicio de diagnóstico en el que se analizan los hallazgos hematológicos del paciente para establecer la probabilidad de que un paciente tenga HCPS. La combinación de trombocitopenia, abundancia elevada de linfocitos -inmunoblasto-, población de células polimorfonucleares con desplazamiento izquierdo sin evidencia morfológica fuerte para su activación, y valores elevados de hemoglobina o hematocrito es altamente específica para el HCPS y permite a los clínicos la capacidad de poner pacientes presuntivos-HCPS en oxigenación de membrana extracorpórea (ECMO), que se cree que ha salvado a muchos pacientes de un resultado letal [89]. Se cree que la infección humana por hantavirus sigue el contacto con secreciones o excreciones producidas por roedores infectados. En los Estados Unidos, 538 infecciones humanas por hantavirus fueron reportadas hasta finales de diciembre de 2009 [90], con Nuevo México, Arizona y Colorado mostrando los casos más altos. Mientras que el prototípico hantavirus centroamericano en América Central fue el virus Rio Segundo de Reithrodontomys mexicanus de Costa Rica, la primera enfermedad humana apareció algunos años más tarde en Panamá, donde el virus Choclo (CHOV) surgió como el agente etiológico y se cree que es responsable de todos los casos conocidos de HCPS. La rata de arroz pigmeo fulvo Oligoryzomys fulvescens ha sido identificada como el reservorio de roedores [91]. En Panamá, los primeros casos de HCPS, aunque con poca o ninguna implicación cardiaca evidente, fueron reportados en 1999, y desde entonces, 106 infecciones humanas han ocurrido con una tasa de mortalidad del 26% [92]. Seroencuestas de mamíferos en México y Costa Rica han encontrado anticuerpos antihantavirus [93] [94] [95] [96], y se han notificado seroprevalencias que oscilan entre 0,6 y 1,6% en poblaciones humanas a pesar de la ausencia de casos conocidos de HCPS [97]. En América del Sur, los casos de HCPS se han identificado en Argentina, Bolivia, Brasil, Chile, Paraguay y Uruguay, y también se han notificado evidencias de exposición humana a hantavirus en Venezuela [98] y Perú [99]. En América del Sur, ANDV es el principal agente etiológico con casos en Chile y Argentina notificados desde 1995. En Chile, se han producido 671 casos de HCPS debido a ANDV durante el período 2001-2009 [100]. Desde 1995 se han reportado más de 1.000 casos de HCPS en Argentina [101] ; en el Brasil se han identificado aproximadamente 1.100 casos de HCPS entre 1993 y 2008 [102]. Las tasas de mortalidad por casos en esos tres países han sido similares, oscilando entre el 30% (Argentina), el 36% (Chile) y el 39% (Brasil). Las infecciones por Hantavirus ocurren con más frecuencia en hombres que en mujeres, aunque la proporción entre hombres y mujeres es muy variable. Por ejemplo, las comunidades panameñas mostraron una proporción de 55 hombres por 45 mujeres [103], mientras que en Chile la proporción es más sesgada por hombres (71%) [104]. En el Chaco paraguayo la proporción entre hombres y mujeres se aproxima al 50% [105]. En América del Norte, en diciembre de 2009 el 63% de los pacientes eran varones [90]. Todos los grupos étnicos y raciales parecen ser susceptibles a infecciones por el hantavirus, y las diferencias entre ciertos grupos (como indígenas y no indígenas) están más probablemente correlacionadas con el tipo de hábitat en el que reside la población (por ejemplo, zonas rurales frente a zonas urbanas). De hecho, las comunidades rurales representan la mayor incidencia global del hantavirus y, por lo tanto, están en mayor riesgo [92, [105] [106] [107] [108] [109] [109] [119], aunque también se ha destacado la importancia de los entornos peridomésticos como una importante zona de exposición [112, 113]. El principal mecanismo por el que los seres humanos adquieren la infección por el hantavirus es la exposición a aerosoles de heces contaminadas de roedores, orina y saliva [114, 115]. Esto puede ocurrir cuando los seres humanos residen en áreas cercanas a las que habitan los roedores, viven en áreas infestadas de roedores, o cuando los roedores invaden entornos humanos, que son más frecuentes en hábitats rurales.Existe una larga historia de coexistencia humana con roedores, lo que plantea dudas sobre el aparente aumento reciente de las enfermedades relacionadas con el hantavirus, especialmente el HCPS. Aparte de una aparente asociación con eventos de oscilación sureña de El Niño (ENSO) en algunas regiones [116, 117], los recientes incrementos en la incidencia del HCPS no parecen seguir un patrón temporal o espacial fácilmente definido. Sin embargo, algunas características del paisaje, como la fragmentación del hábitat o las áreas perturbadas por el ser humano, pueden influir en la dinámica de la población de roedores e impactar en la incidencia viral [118] [112] [112] [121]. A pesar de la estocástica asociada a la contracción de la infección Las actividades humanas en edificios mal ventilados que pulverizan partículas que luego se inhalan (es decir, limpieza, agitación de alfombras, polvo) se identifican con frecuencia entre los pacientes admitidos para el SHCPS [11, 122]. Se cree que las actividades al aire libre transmiten un menor riesgo debido a la labilidad de los hantavirus a la radiación UV y a la supuesta tendencia a dispersarse en el viento, aunque ciertas condiciones ambientales parecen mantener el virus durante períodos más largos fuera de su huésped natural, lo que permite la transmisión indirecta [123]. Una vía alternativa pero poco común de transmisión del virus es la mordedura de roedores [124] [125] [126]. Los trabajadores sobre el terreno que manipulan mamíferos corren un riesgo potencialmente mayor de exposición a infecciones por hantavirus, aunque cuando se cuantifica a través de serosurveys el riesgo absoluto parece bastante leve [127]. Un nuevo estudio en Colorado sugiere la posibilidad de que una picadura de roedor haya sido el vehículo próximo para la transmisión al aire libre de NVS [128], lo que vuelve a enfatizar el uso de equipo de protección personal durante las actividades de trabajo de campo [129]. Como caso particular dentro de los hantavirus, la transmisión de persona a persona ha sido documentada exclusivamente para el virus de los Andes sudamericanos [130] [133] [133] [135]. La identificación de esta vía de transmisión se ha hecho utilizando tanto herramientas moleculares como encuestas epidemiológicas, pero el mecanismo de transmisión interpersonal no está bien establecido. Curiosamente, ANDV también puede ser derramado por los humanos a través de otros fluidos biológicos como la orina [136], ilustrando las propiedades particulares que diferencian este virus de otros hantavirus. Aunque la transmisión interpersonal parece ser única para ANDV, el ARN viral de PUUV se ha detectado en la saliva de pacientes con HFRS, y algunos pacientes con SNV-HCPS tienen ARN viral en las secreciones traqueales [88, 137]. Los Hantavirus en las Américas son alojados naturalmente por roedores (Muridae y Cricetidae) así como las musarañas (Soricidae) y los lunares (Talpidae) (Figura 1). Tres especies de musgo y un mole han sido reportados para albergar hantavirus y su patogenicidad para los humanos permanece desconocida [22, 138, 139]. Se han identificado al menos 15 especies de roedores como portadores de diferentes hantavirus patógenos, con algunos genotipos sudamericanos como Castelo do Sonhos (CDSV) o Hu39694 sólo identificados después de infecciones humanas (Figura 1 ). Los hantavirus suelen mostrar una alta especificidad de especie y ningún huésped intermedio [140]. Sin embargo, se han descrito algunos genotipos de hantavirus en la misma especie de roedores. Tal es el caso de Playa de Oro (OROV) y Catacamas (CATV) identificados en Oryzomys couesi [141, 142], o Maporal (MAPV) y Choclo (CHOV) hospedados por O. fulvescens [91, 143]. En América del Norte se han detectado virus de muleshoe y Black Creek Canal hanta en sigmodon hispidus [ Además, un genotipo de hantavirus (por ejemplo, el virus similar a Juquitiba) puede ser transportado por más de una especie de roedores (O. nigripes, Oxymycterus judex, Akodon montesis). Otro ejemplo es el virus Laguna Negra (LANV) que después de ser identificado en Calomys laucha [146] también ha sido reportado en C. callosus [147]. El rápido aumento en el descubrimiento de nuevos hantavirus y la identificación de sus anfitriones no parece probable que termine tan pronto como se examinen nuevas especies pequeñas de mamíferos [95]. Este tema se complica por la continua controversia en los criterios para la clasificación de distintos hantavirus [148, 149], que también está vinculado a la clasificación taxonómica y los reordenamientos taxonómicos. La transmisión de especies cruzadas es un proceso importante durante la propagación, aparición y evolución Particularmente dentro de los hantavirus, los derrames a los huéspedes secundarios se identifican cada vez más a medida que se realizan estudios más extensos [151] [152] [153] [155] [156]. Por ejemplo, ANDV es el agente etiológico predominante del HCPS en América del Sur, y O. longicaudatus el principal reservorio de roedores. Derrama en al menos otras cuatro especies de roedores que coocurren con el reservorio se han identificado, con Abrothrix longipilis mostrando la segunda mayor prevalencia de anticuerpos de ANDV, y actualmente no hay duda de que el virus es extremadamente similar genéticamente entre los dos roedores del huésped [157, 158]. En América del Norte, el derrame del virus Bayou (BAYV) puede haber ocurrido desde el reservorio principal de O. palustris a S. hispidus, R. fulvescens, P. leucopus y B. taylori [159] [160] [161]. Es más probable que el derrame del virus Hanta se produzca con poblaciones de acogida que habitan regiones simpatricas o sintópicas [151, 162], y la transmisión de especies cruzadas tendría probablemente mayores posibilidades de éxito si las especies anfitrionas están estrechamente relacionadas [163]. Se encuentra una excepción interesante entre el virus Oxbow (OXBV) y el virus Asama (ASAV) en el que un proceso de cambio de huésped parecía haber ocurrido entre mamíferos pertenecientes a dos familias (Talpidae y Soricidae), probablemente como resultado de la codivergencia alterna y recurrente de ciertos tax Los hantavirus son transmitidos horizontalmente entre roedores y no son transmitidos por artrópodos (a diferencia de otros virus de la familia Bunyaviridae). La infección por derrapadores a mamíferos no humanos generalmente no produce ninguna transmisión hacia adelante (o a fin de morir), pero si los seres humanos están infectados pueden resultar en una alta morbilidad y mortalidad [122, 164]. Durante la primavera de 1993, un brote de pacientes con HCPS debido a SNV ocurrió en los estados de Four Corners, resultando en más del 60% de casos de mortalidad entre los casos iniciales, muchos de los cuales involucran a miembros de la tribu Navajo [12, 121]. En Panamá, se notificó un brote durante 1999-2000 en Los Santos, y 12 casos donde se identificaron con tres muertes [165, 166]. Esto representó el primer informe de infecciones por hantavirus humanos en América Central. En América del Sur, Diecisiete individuos fueron identificados con anticuerpo NVS (ELISA) o fueron antígenos (HCI) positivos de 52 casos sospechosos [167]. En 1996 ocurrieron brotes mayores debidos a ANDV en el sur de Argentina [131, 134] ; en el sur de Chile se presentaron grupos de pacientes con enfermedad por hantavirus en 1997 [158]. En Brasil, el primer brote fue identificado en la Amazonía Brasileña (Estado de Maranhão) en el año 2000, e involucró pequeños pueblos que resultaron en una prevalencia del 13,3% de los evaluados (398 residentes totales) [168]. Los factores que desencadenan los brotes de hantavirus todavía son mal entendidos, probablemente porque resultan de varias características bióticas y abióticas interactuantes cuyos parámetros clave son difíciles de modelar. Sin embargo, el uso de nuevos enfoques de modelado que involucran características geográficas y ambientales parece ser prometedor a la hora de predecir posibles brotes de hantavirus y/o áreas de mayor riesgo [169] [170] [171] [172]. Debido a que se sabe que los hantavirus se transmiten directamente de los huéspedes infectados a los susceptibles, el primer enfoque natural es relacionar los brotes con la ecología de los huéspedes virales. La transmisión y persistencia del hantavirus en las poblaciones de roedores depende de varios factores que interactúan para afectar la dinámica ecológica del huésped, que a su vez está fuertemente influenciada por las características de comportamiento de las especies de roedores individuales, a la estructura paisajística y a las características ambientales [173, 174]. La transmisión viral depende de las tasas de contacto entre los huéspedes sensibles, y a pesar de la noción prevaleciente de que un aumento de la densidad se encuentra y, por lo tanto, de Además, se ha demostrado que la transmisión de NVS sigue un patrón de heterogeneidad de contacto, donde los individuos de la población tienen diferentes probabilidades de transmitir la infección [176]. La comprensión de la transmisión viral resulta ser mucho más compleja cuando especies distintas del principal huésped del reservorio se incorporan en el modelo. De hecho, estudios recientes han demostrado que la mayor diversidad de especies hospedantes está correlacionada con una menor prevalencia de infección en América del Norte para P. maniculatus [177], en América Central para O. fulvescens (reservorio del virus Choclo) y Zygodontomys brevicauda (reservorio del virus Calabazo) [178], y en América del Sur para Akodon montensis (reservorio del virus Jabora) [162]. Las tasas de contacto varían según la distribución espacial de las poblaciones y parecen estar Por ejemplo, la prevalencia de SNV en P. maniculatus fue mayor en paisajes con mayor grado de fragmentación del hábitat preferido [179]. Además, ciertas propiedades del paisaje como elevación, pendiente y cubierta terrestre parecen ser útiles para detectar áreas con infecciones persistentes de SNV, y por lo tanto se consideran áreas refugiales donde el virus puede mantenerse durante años [169]. Los cambios en el entorno natural de las especies de reservorios, como la fragmentación forestal y la pérdida de hábitat, pueden alterar la abundancia y distribución de la población y provocar brotes de hantavirus, como se observa en la Península de Azurero de Panamá [118, 119]. Además, las diferencias en el microhábitat, incluida la cubierta superficial, pueden conducir a diferencias en la dinámica ecológica dentro de las poblaciones y afectar a la tasa de exposición al virus [180]. Se han encontrado diferencias en las infecciones por hantavirus a través de paisajes contrastantes en el intervalo latitudinal en poblaciones de roedores de O. longicaudatus en Chile, lo que sugiere que los seres humanos están expuestos de manera diferencial al virus [107, 181]. La dinámica poblacional de roedores se ve afectada por cambios estacionales de clima y clima [182, 183]. En el caso de los brotes asociados a ENSO, se ha postulado una compleja cascada de eventos desencadenados por lluvias altamente inusuales en el año precedente para dar lugar a un aumento de la producción primaria y densidades de roedores, aumentando también la probabilidad de transmisión del virus a los seres humanos, pero ha resultado difícil demostrar con precisión los eventos intermedios sugeridos, como el aumento de las densidades de roedores en el aumento de la carga de casos [116, 121, 184]. En América del Sur, los efectos del cambio climático y los brotes de hantavirus no han sido bien estudiados, a pesar del conocimiento de que varias especies de roedores que son reservorios de enfermedades emergentes se han visto dramáticamente afectadas por eventos como El Niño [185]. Los cambios en la dinámica de la población de acogida también se ven afectados por la estacionalidad, lo que puede conducir a brotes de enfermedades cuando se interrumpen los procesos que equilibran las poblaciones de roedores de temporada en temporada [186]. La emergencia viral puede seguir promoviéndose a medida que los cambios introducidos por el ser humano continúan aumentando en el medio ambiente a diferentes escalas geográficas. Estos cambios también pueden alterar la estructura y dinámica de la población de roedores e interacciones interespecies creando condiciones que pueden conducir a brotes virales, establecimiento viral en nuevos hospederos, y la aparición de HCPS [102, 162], incluso con aparentemente leve perturbación ecológica al sistema virus-hospedero [188]. Ciertas características fisiopatológicas, incluyendo trombocitopenia y shock, de enfermedades por hantavirus de los seres humanos, tienen similitud sustancial con las fiebres hemorrágicas inducidas por otros virus tales arenavirus, filovirus y flavivirus, a pesar de compartir esencialmente ninguna secuencia similitud con ellos. Tales observaciones plantean preguntas acerca de si tales similitudes en la patogénesis son probables similitudes de fenotipo, o en cambio reportan la presencia de mecanismos moleculares comunes entre los virus. En esta revisión se discuten las propiedades generales, descubrimientos y epidemiología/ecología de las formas de hantavirus patógenos del Nuevo Mundo, y también se busca identificar algunas de las características de las macromoléculas virales y mecanismos inmunológicos que se han propuesto como potenciales mediadores directos de los eventos patógenos que caracterizan la enfermedad humana HCPS. Si bien es poco probable que la expresión de una proteína viral particular o ARNs en aislamiento se pueda confiar en replicar fenotipos clave de infección por el virus completo, algunos de los hallazgos han sido suficientemente consistentes con lo que se conoce de la patogénesis in vivo que ofrecen plomos plausibles de primer paso en la búsqueda de objetivos terapéuticos. Esperamos con interés las revelaciones mecanísticas que seguirán el uso inevitablemente ampliado de métodos poderosos como la secuenciación profunda, imágenes cada vez más avanzadas, y métodos microscópicos, y modelos animales que por fin se pueden decir

¿Qué mecanismo potencial, podría presumirse que subyace a la patogénesis del HCPS?

Los hantavirus en las Américas y su papel como patógenos emergenteshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3185593/SHA: efe13a8d42b60ef9f7387ea539a1b2eeb5f80101Autores: Hjelle, Brian; Torres-Pérez, FernandoFecha: 2010-11-25DOI: 10.3390/v2125559Licencia: cc-byAbstract: La continua aparición y reaparición de patógenos representan una amenaza continua, a veces mayor, para las poblaciones. Los hantavirus (familia Bunyaviridae) y sus enfermedades humanas asociadas se consideraron confinados a Eurasia, pero la aparición de un brote en el suroeste de Estados Unidos llevó a un gran aumento en su estudio entre los virólogos de todo el mundo. Se han descrito más de 40 genotipos hantavirales, la gran mayoría desde 1993, y casi la mitad de ellos patógenos para los seres humanos. Los hantavirus causan infecciones persistentes en sus reservorios, y en las Américas, la enfermedad humana se manifiesta como compromiso cardiopulmonar, síndrome cardiopulmonar del hantavirus (HCPS), con proporciones de casos-fatalidad, para los serotipos virales más comunes, entre el 30% y el 40%. Alteración del hábitat y trastornos ecológicos a mayor escala, tal vez incluyendo el cambio climático, son algunos de los factores que pueden haber aumentado la carga de casos humanos de HCPS entre 1993 y el presente. Consideramos aquí las características que influyen en la estructura de la dinámica de la población huésped que pueden conducir a brotes virales, así como los determinantes macromoleculares de los hantavirus que han sido considerados como potenciales contribuciones a la patogenicidad. Texto: Los patógenos emergentes causan enfermedades nuevas o no reconocidas anteriormente, y entre ellas, las zoonóticas emergentes son una preocupación importante entre los científicos que estudian enfermedades infecciosas a diferentes escalas espaciales y temporales [1, 2]. Los cambios en las condiciones bióticas y abióticas pueden alterar la dinámica de las enfermedades de la población y conducir a la aparición de infecciones zoonóticas [3] [5] [6]. Durante las últimas décadas, se han producido varios brotes de patógenos virales emergentes y reemergentes, que afectan tanto a la implicación puramente local como a nivel mundial/pandémica de las poblaciones humanas. Entre los ejemplos visibles están la gripe A, el virus del Ébola, el virus de la hepatitis C, el trastorno respiratorio grave para adultos (SARS), el coronavirus y el virus de la inmunodeficiencia humana, que desafían las medidas de prevención y control de los sistemas de salud pública [7]. En las Américas, el reciente brote de gripe pandémica A subtipo H1N1 se convirtió en un objetivo importante de control debido a su rápida propagación, y las incertidumbres en cuanto a virulencia y transmisibilidad, sin embargo, la disponibilidad de vacunas fue limitada cuando se produjo una actividad significativa antes de la temporada tradicional de gripe [8]. Sin embargo, en el último siglo han surgido o resurgido brotes de varias enfermedades virales relacionadas con el virus arenavirus y el virus del dengue, y más recientemente, hantavirus y la expansión del rango geográfico del virus del Nilo Occidental. Entre las enfermedades zoonóticas, los mamíferos pequeños son anfitriones de varios virus ARN patógenos, especialmente Arenaviridae y Bunyaviridae: Hantavirus [9] [10] [11]. Las infecciones por hantavirus se convirtieron en una preocupación en las Américas después de la descripción de un brote de distrés respiratorio agudo ocurrido en La enfermedad recientemente reconocida, el síndrome cardiopulmonar del hantavirus, el HCPS (o síndrome pulmonar del hantavirus), se relacionó con la infección por el virus del Sin Nombre (SNV) recién descubierto, y el roedor Peromyscus maniculatus (ratón venado) fue identificado como el reservorio [13]. Sin embargo, las infecciones por hantavirus tienen una historia mucho más larga. Una revisión de los escritos chinos antiguos, que datan de aproximadamente 960 dC, reveló descripciones muy parecidas a la fiebre hemorrágica con síndrome renal (HFRS), el síndrome causado por los hantavirus del Viejo Mundo [14]. Durante el siglo XX, los casos de enfermedad febril aguda con compromiso renal fueron descritos de varios países eurasiáticos y Japón, a menudo en asociación con compromisos militares [15]. El HFRS como síndrome distinto, sin embargo, fue llamado por primera vez a la atención de la medicina occidental en asociación con un brote que ocurrió entre las tropas de las Naciones Unidas durante el conflicto coreano entre 1951 y 1954, donde más de 3.200 soldados fueron afectados [16]. Tomó más de dos décadas hasta que el agente etiológico, el virus Hantaan (HTNV), fue aislado del ratón de campo rayado Apodemus agrarius, detectado en parte por la unión de anticuerpos de muestras de suero de paciente a los tejidos pulmonares de ratones de campo sanos y salvajes [17, 18]. El virus se encontró más tarde para representar la especie tipo de un nuevo género Hantavirus de la familia Bunyaviridae, aunque fue más tarde evidente que el primer hantavirus a aislarse fue el virus Thottapalayam de shrew-borne [19]. La categorización de los hantavirus como pertenecientes a la familia Bunyaviridae se debe en parte a la presencia consistente de tres genomas de ARN que son circularizados in vivo como resultado de la presencia de nucleótidos terminales complementarios que ayudan a doblar el genoma en una morfología -hairpin-, descrita por primera vez para el flebovirus Uukuniemi [19, 20]. La Tabla 1 es una lista de los hantavirus patógenos predominantemente distintos serológicamente. Se describen muchos otros genotipos llamados, pero tales otras formas patogénicas están generalmente estrechamente relacionadas con los Andes o, en algunos casos, el virus Sin Nombre. Durante la maduración del virus, el precursor forma GPC se procesa utilizando una proteasa unida a la membrana en Gn y Gc, una escisión que ocurre, y parece ser señalada, después de la señal péptida conservada WAASA en la C-terminal de Gn [24]. Aunque las dos proteínas se pueden expresar de forma independiente a través de la transfección, pueden ser retenidas en el compartimento celular incorrecto (ER o aggrosome); por lo tanto, deben ser co-expresadas para permitirles estabilidad para que las dos se puedan ensamblar correctamente en el Golgi [25, [27] [28]. Se han identificado varias actividades y propiedades para las glicoproteínas envolventes del hantavirus, incluyendo algunas características que se sospecha que están involucradas en la patogenicidad de los serotipos causantes de la enfermedad, una posibilidad que ha generado atención experimental. Las glucoproteínas son los ligandos conocidos o presuntos para al menos dos receptores celulares distintos, la cadena de integrina y el factor acelerador de la descomposición, o DAF [30, 31] ; con gC1qR/p32 también identificado como otro receptor de entrada potencial [32]. Comparaciones con la proteína E del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, llevaron a Tischler et al. a considerar la glicoproteína Gc como una proteína potencial de fusión de clase II, tal vez impartiendo actividad de fusión al virión, y esta hipótesis ha ganado apoyo en otros estudios [33, 34]. Se han identificado actividades adicionales con, o se afirma que están relacionadas con, Gn. Para muchos de estos estudios, una premisa subyacente ha sostenido que hay diferencias entre las glicoproteínas de hantavirus -patógenos en relación con virus en el género que se denominan Si bien es cierto que aún no ha sido posible vincular el virus de Prospect Hill (PHV) con la enfermedad humana, la ausencia de evidencia de su patogenicidad tal vez no debería equipararse con la evidencia de su ausencia. Sólo se podría considerar que el nivel de enfermedad (por ejemplo, letargo, fiebre, proteinuria y azotemia) asociado con la infección de primates no humanos por PHV no es significativamente diferente del registrado para los modelos de primates no humanos utilizando el virus conocido del patógeno Puumala (PUUV) [35, 36]. Para el propósito de esta discusión, presumiremos que los hantavirus apatogénicos son efectivamente apatogénicos. Mientras que algunos estudios han sugerido que las glicoproteínas Gn se dirigen más rápidamente a la vía ubiquitina-proteosoma que a las formas apatogénicas, otros han interpretado las diferencias en el manejo de las glicoproteínas Gn a través de las especies del hantavirus por el sistema ubiquitina-proteosomal como independientes de la patogenicidad [37] [38] [39]. Algunos investigadores han dirigido sus esfuerzos hacia la identificación de una capacidad diferencial, ya sea cinética o de magnitud absoluta, en la capacidad de los hantavirus patógenos y apatogénicos para provocar una respuesta del interferón en las células. Una premisa que surge es que las formas apatogénicas tenderían a inducir una respuesta innata anterior que haría más probable que el virus se limpiara rápidamente o se volviera menos competente en su replicación, a fin de evitar cualquier respuesta patológica en el huésped [4 La respuesta innata anti-hantavirus puede en algunos casos ser atribuida a la interacción viral como ligando de TLR-3, pero no en otros, y en las células endoteliales, no parece requerir más que la partícula viral misma, incluso cuando se introduce en forma replicante-incompetente [43, 44]. Proteínas y ARNm inducidos prominentemente por los hantavirus incluyen MxA e IFIT-1 (ISG-56) y otros incluyendo algunos con actividad antiviral conocida o sospechada. Esos hantavirus, a menudo cepas altamente patógenas, que no inducen una respuesta antiviral potente, se sospechan o se presume que tienen un (más) potente mecanismo de antagonismo interferón-vía en relación con otros virus, un mecanismo que actúa positivamente para prevenir que se forme una respuesta innata efectiva, al menos temprano en Sin embargo, se reportan algunos casos en los que los hantavirus altamente patógenos, tales como NVS, también son capaces de inducir la expresión de los ARNm del gen estimulado por interferón, incluso muy temprano en la infección, con proteínas ISG, como se esperaba, tardando más tiempo en aparecer en la célula [44]. Las actividades anti-interferón también se han atribuido a la proteína NSs que se puede elaborar en células infectadas por serotipos que codifican esta proteína [46]. Otros investigadores han examinado las actividades de las glucoproteínas del hantavirus y otras proteínas que podrían afectar directamente a algunos aspectos de la progresión patogénica asociada a la infección por hantavirus en humanos, tales como cambios en la permeabilidad vascular. Mientras que los primeros intentos de causar directamente aumentos en la permeabilidad de las monocapas endoteliales con partículas virales o infección viral fueron en gran medida decepcionantes, los hantavirus se han identificado como que afectan adversamente la migración endotelial sobre los sustratos y en la potenciación de la permeabilidad endotelial inducida por VEG-F [47, 48]. La proteína nucleocápsida o N más corta (+50 kD) es un componente estructural del nucleocápsido viral, junto con los segmentos de ARN viral genómico. Como proteína de unión al ARN que afecta a la horquilla del cabello de los segmentos genómicos con alta afinidad [49, 50], limita el acceso del ARN para alojar nucleasasas y ayuda a hacer que la replicación viral sea un proceso cerrado dentro del citoplasma. También actúa como una proteína de membrana periférica, al igual que la proteína L [51], una actividad que podría jugar un papel en su supuesta, pero aún no demostrada función como matriz [52]. Hasta hace poco, no se había apreciado que N tuviera una amplia variedad de otras actividades, algunas de las cuales pueden estar vinculadas, no sólo a los requisitos fundamentales de replicación, sino también a la interferencia con una serie de procesos intracelulares de la célula normal. Así, se ha propuesto una interacción entre el aminoterminal de la proteína N del hantavirus y la proteína celular Daxx, con la sugerencia de posibles consecuencias pro-apoptóticas [51]. N también se reporta que interactúa con microfilamentos actínicos, y la proteína SUMO-1 [53, 54]. Utilizando ensayos basados en el gen reportero, Connie Schmaljohn y sus colegas han reportado que la proteína nucleocapsida del virus Hantaan tiene un papel inhibidor en las respuestas inflamatorias mediadas por NF kappa B (NF- B). Los efectos sobre la expresión NF- B parecen estar limitados a la prevención de su translocación nuclear después de su intento de activación con lipopolisacárido, LPS [55]. En el citoplasma de las células infectadas, la proteína N se puede encontrar en los cuerpos celulares P donde secuestra y protege los capuchones de 5'. Puede localizar los capuchones a través de su interacción con DCP1, un componente clave de los cuerpos P. Durante la infección por hantavirus, los ARN virales se concentran en los cuerpos P, a través de su interacción con N y DCP1. La proteína N demuestra la protección preferencial de los ARNm diseñados para terminar prematuramente su proteína codificada en comparación con los ARNm nativos [56]. La proteína N se ha vinculado cada vez más a la replicación y traducción virales, a veces de maneras no previstas anteriormente. Se encuentra entre una familia creciente de diversas proteínas virales que pueden servir como un inespecífico - ARN chaperone ®, una actividad que debe facilitar el acceso de la L polimerasa al ARNv para la transcripción y replicación, en que puede disociar transitoriamente estructuras de ARN mal dobladas [57]. Algunos de los efectos de la proteína N en la traducción no pueden ser inmediatamente reconocidos como adaptables en la naturaleza. Puede reemplazar todo el complejo de iniciación traslacional EIF4F, presentando simultáneamente el ribosoma con un reemplazo de la actividad de unión de la tapa de eIF 4E, uniéndose al complejo de pre-iniciación 43S, al igual que eIF 4G, al tiempo que reemplaza la actividad helicoidal de eIF 4A, que se presume que es necesaria para disociar la estructura de ARN de orden superior [56, 58]. Estos tres factores normalmente trabajan juntos para lograr la iniciación traslacional. En los cuerpos P, la capacidad de la proteína N de unirse a una alta afinidad a los oligoribonucleótidos celulares nativos tapados, junto con su actividad en la protección de ARNs tapados de la degradación, probablemente facilita el acceso de oligonucleótidos encapsulados para su uso en la iniciación transcripcional por L polimerasa (-cap ra Tráfico de N para el ensamblaje viral: Clásicamente, la proteína N en las células infectadas parece estar agrupada o partículas en la naturaleza, con una concentración pesada en una única ubicación perinuclear, ampliamente considerada como la Golgi [27]. Las proteínas N de los hantavirus se encuentran en asociación con fracciones de partículas, y los estudios confocales microscopía y bioquímico-inhibidores han demostrado que las trazas N a lo largo de microtúbulos pero no con filamentos de actina [52]. El destino final de N, para su ensamblaje en partículas virales es la Golgi, y que circula allí a través del complejo intermedio retículo-Golgi endoplasmático (ERGIC), también conocido como cúmulo vesicular-tubular [52]. Un inhibidor negativo dominante, la dinamitina, asociado con el transporte mediado por Los estudios posteriores sugieren que la dependencia específica del transporte microtubular es específica de los hantavirus del Viejo Mundo como el NVH, pero que el Hantavirus del Nuevo Mundo ANDV está asociado con filamentos de actina [59]. Sin embargo, los datos recientes indican que el transporte microtubular es efectivamente utilizado para el NVH del Nuevo Mundo [60]. Las enfermedades del Hantavirus del hombre desde hace mucho tiempo han sido sospechosas de tener una base inmunopatógena en parte debido a su período de incubación relativamente largo de 2-3 semanas y la asociación temporal observada entre los trastornos inmunológicos y la primera aparición de signos y síntomas de la enfermedad del hantavirus. HFRS y HCPS comparten muchas características clínicas, llevando a muchos investigadores a considerar que son, en esencia, diferentes manifestaciones de un proceso patógeno similar, que difieren principalmente en los órganos objetivo primarios de expresión de la enfermedad (Tabla La patogénesis de las infecciones por hantavirus es el tema de una revisión continuamente actualizada en la serie UpToDate [61]. Para el momento en que aparecen los síntomas en el HCPS, ambas respuestas antivirales fuertes, y, para los genotipos virales más virulentos, el ARN viral puede ser detectado en plasma sanguíneo o células sanguíneas nucleadas respectivamente [63, 64]. Al menos tres estudios han correlacionado el ARN viral plasmático con la gravedad de la enfermedad para el HCPS y el HFRS, sugiriendo que la replicación del virus juega un papel continuo y en tiempo real en la patogénesis viral [65] [66] [67]. Se han identificado varios cambios patológicos distintivos que ocurren tanto en el HFRS como en el HCPS. Una característica crítica de ambos es una fuga capilar transitoria (~ 1-5 días) que involucra el La fuga resultante es de carácter exudativo, con una composición química alta en proteínas y similar al plasma. La experiencia continua que indica el fuerte tropismo tisular para las células endoteliales, específicamente, es uno de los varios factores que hacen de la integra β3 un candidato especialmente atractivo como un importante receptor in vivo para los hantavirus. Es probable que los hantavirus lleguen a sus tejidos objetivo a través de la captación por los ganglios linfáticos regionales, tal vez con o dentro de un histiocito pulmonar escoltante. Las semillas del virus endotelio local, donde las primeras células infectadas dan lugar, en última instancia, a una viremia primaria, un proceso que parece tomar mucho tiempo para las infecciones por hantavirus [62, 63]. En el momento en que emerge la viremia secundaria, los agentes de las formas más severas de HFRS y HCPS han comenzado a alcanzar una masa suficiente para inducir, a través de las interacciones PAMP-PRR y otros medios, la expresión de citoquinas proinflamatorias [64]. Para HCPS, esa expresión favorece el lecho pulmonar y los órganos linfoides, pero, por razones desconocidas, ahorra el retroperitoneo y, en general, el riñón. En HFRS la situación se invierte, y sin embargo no se aprecia a menudo que el esperado tropismos tisulares preferentes de virus asociados a HFRS y sus contrapartes asociadas a HCPS para los lechos renal y pulmonar, respectivamente, no es como se predeciría a través de las manifestaciones de las dos enfermedades. La elaboración local de mediadores inflamatorios y quimiotácticos se considera un requisito para el desarrollo de Sin embargo, no es la hipoxemia, debido al edema pulmonar prominente, lo que conduce a la muerte en la mayoría de los casos fatales de HCPS, sino más bien la intoxicación del corazón por mediadores como aún no definidos, lo que conduce al estado de bajo gasto cardíaco y al síndrome de shock asociado [64, 65]. Es tentador especular que los mediadores producidos en el pulmón en conexión con el infiltrado inflamatorio pueden infiltrarse a través de la circulación coronaria con dilución mínima en HCPS, consecuencia desventajosa de la estrecha yuxtaposición anatómica de los dos órganos. Así, al menos tres clases de mecanismos potenciales, algunos superpuestos y todos ciertamente no exclusivos de los otros, podrían presumirse que subyacen a la patogénesis del HCPS. Estos incluyen:(1) Mecanismos inmunes innatos. La naturaleza de las interacciones entre los patrones moleculares asociados al patógeno del hantavirus (PAMP) y los receptores de reconocimiento del patrón (PRR) de las células endoteliales susceptibles comienzan a ser aclaradas. El HTNV prototípico parece ser reconocido por TLR-3 [43]. Tal infección tiene consecuencias tales como una mayor expresión del HLA-DR en las células dendríticas [66] y la diferenciación de los monocitos hacia las células dendríticas [67]. (2) Efectos virales directos. La correlación observada entre la carga viral y la gravedad de la enfermedad deja abierta la posibilidad de que las partículas del hantavirus o el ARN puedan tener efectos tóxicos sobre las células o sobre la señalización. Algunos investigadores han favorecido la toxicidad viral directa, actuando a través de la inhibición de la función de barrera celular endotelial, como una explicación de gran parte de la fuga capilar, aunque existe Una pista potencialmente importante hacia el mecanismo por el cual las infecciones por hantavirus agotan las plaquetas sanguíneas y, en algunos casos, causan manifestaciones hemorrágicas, fue avanzada por el reciente descubrimiento de que los hantavirus patógenos son capaces de reclutar plaquetas para adherirse a las superficies celulares endoteliales, con β3 integrina utilizada como elemento de unión crítica [69]. (3) Efectos patógenos causados por las actividades de macromoléculas virales específicas. Hemos revisado algunas de las actividades asociadas con los Gn, Gc y N, polipéptidos codificados viralmente en secciones anteriores. Modelos de prueba de patogénesis se pueden hacer más eficazmente cuando hay un modelo animal que imita aspectos clave de la enfermedad. No existe un modelo similar al HFRS, pero existen modelos animales para el transporte asintomático de PUUV y SNV por sus roedores portadores nativos, el banco vole Myodes glareolus y el ratón de venado P. maniculatus; así como un modelo de hámster sirio utilizando ANDV o el virus Aporal relacionado de Venezuela, para el cual se observa una enfermedad mimética HCPS [70] [71] [72] [73]. El modelo de hámster ANDV-Sirio tiene una serie de características en común con la enfermedad humana, así como algunas diferencias. A diferencia de las enfermedades neurológicas que han sido posibles de provocar con HTNV, el modelo de hámster para HCPS parece ser causado por fugas capilares que resultan en edema pulmonar y la producción de un derrame pleural con características exuda Típicamente los hámsteres mueren entre 11 y 14-d post-inoculación, reflejando un período de incubación ligeramente acelerado en comparación con las infecciones humanas. Al igual que con el HCPS humano, el examen microscópico del pulmón revela abundante deposición de fibrina, septo alveolar engrosado y antígeno viral expresado abundantemente en el endotelio microvascular. Los hámsteres infectados por ANDV equipados con dispositivos de monitoreo fisiológico mostraron disminución de las presiones de pulso, taquicardia e hipotensión que parecen imitar de cerca el shock que se cree que es la causa próxima de la muerte en pacientes que sucumben al HCPS [65, 74]. En comparación con la enfermedad humana, los hámsteres infectados por ANDV exhiben títulos excepcionalmente altos de ANDV vivo en sus tejidos, con gran parte de la replicación viral que ocurre en Los títulos de ANDV vivo en algunos casos superan los 10 8 /g, mientras que los aislados de hantavirus de los tejidos humanos han sido notoriamente difíciles de obtener. A pesar de la aparición universal de enzimas hepáticas levemente elevadas en pacientes con HCPS, las enzimas hepáticas no parecen estar presentes en niveles elevados en la sangre de hámsters enfermos incluso inmediatamente antes de la muerte [75]. El período prolongado de incubación asociado con la enfermedad por hantavirus da al huésped un tiempo considerable para montar una respuesta inmune madura contra el virus. Así, en contradición a infecciones de gravedad comparable y sintomatología relacionada asociada con arenavirus y filovirus, las infecciones por hantavirus en humanos se asocian con respuestas anticuerpos de título significativo por el momento en que comienzan los síntomas. A pesar de esta observación, parece ser posible que la variación natural en las respuestas individuales de anticuerpos neutralizantes entre los pacientes con infecciones por NVS pueda estar relacionada con la gravedad de la enfermedad, lo que sugiere que la administración de anticuerpos antivirales podría resultar efectiva terapéuticamente [76]. En el caso de la infección por ANDV, han surgido nuevas evidencias que indican que el aparente aclaramiento del virus de la sangre no resulta en la eliminación completa del estímulo antigénico por el virus, sugiriendo que el virus puede persistir, tal vez en algún sitio inmunológicamente privilegiado aún indeterminado [77]. Un papel para las respuestas patológicas mediadas por células T en el HFRS y el HCPS ha sido la fuente de especulación por una variedad de razones. La gravedad del SNS asociado al SNCP puede haber hecho más evidente que el inicio del edema pulmonar, la taquicardia y la hipertensión parecía estar todo, pero universalmente asociado temporalmente, con la aparición de un espectro de células altamente activadas del linaje linfoide en la sangre periférica. Se detectaron células con similitudes morfológicas cercanas a estos -inmunoblastos- en los pulmones congestionados y pesados de los pacientes que llegaron a la autopsia, así como en órganos linfoides y en las tríadas portal [63, [78] [79] [80]. Estas observaciones llevaron a especular que algún componente de la patogénesis por hantavirus podría estar vinculado a la aparición de células T antivirales que podrían estimular o contribuir a la aparición de una -tormenta de mediadores y el fenotipo de fuga capilar asociado. Estudios posteriores han confirmado la expectativa de que una fracción significativa de la población de inmunoblastos en pacientes con HCPS son células T con especificidad para epitopes específicos de antígenos virales de clase I presentados por el HLA, incluyendo Gn, Gc y N [77, [81] [82] [83]. Presumiblemente, las actividades antivirales de estas células, manifestadas en parte por su elaboración de mediadores en el intersticio afectado, pueden contribuir a la fuga endotelial/capilar que se encuentra en el corazón de la patogénesis del hantavirus. Debido a que los primeros casos de HCPS a menudo llegaron a la autopsia, se hizo posible examinar tejidos necropsiados para la expresión de citocinas. El estudio de Mori et al. (1999) revelaron una alta expresión relativa de citocinas proinflamatorias incluyendo TNF-, IL-1-, IL-6, proporcionando evidencia a favor de un modelo de tormenta de citoquinas para la patogénesis [64]. Los autores creían, basándose en la morfología de las células secretadoras de citoquinas, que tanto monocitos como linfocitos estaban contribuyendo a la producción de citocinas. Que los mediadores proinflamatorios se encuentran en niveles elevados en el plasma, así como el intersticio renal de pacientes con enfermedad hantaviral aguda se ha reconocido desde hace algún tiempo también [84, 85]. Si bien el diagnóstico de HCPS y HFRS se realiza mejor con serología IgM, en la etapa aguda de la infección por NVS, también se puede utilizar RT-PCR si se utilizan células sanguíneas o coágulos de sangre en lugar de plasma o suero, donde la sensibilidad incluso utilizando imprimaciones PCR anidadas disminuye a cerca del 70% [86] [87] [88]. En una instalación en la que se tratan muchos casos de HCPS, el centro médico de la Universidad de Nuevo México en Albuquerque, se ha ofrecido un servicio de diagnóstico en el que se analizan los hallazgos hematológicos del paciente para establecer la probabilidad de que un paciente tenga HCPS. La combinación de trombocitopenia, abundancia elevada de linfocitos -inmunoblasto-, población de células polimorfonucleares con desplazamiento izquierdo sin evidencia morfológica fuerte para su activación, y valores elevados de hemoglobina o hematocrito es altamente específica para el HCPS y permite a los clínicos la capacidad de poner pacientes presuntivos-HCPS en oxigenación de membrana extracorpórea (ECMO), que se cree que ha salvado a muchos pacientes de un resultado letal [89]. Se cree que la infección humana por hantavirus sigue el contacto con secreciones o excreciones producidas por roedores infectados. En los Estados Unidos, 538 infecciones humanas por hantavirus fueron reportadas hasta finales de diciembre de 2009 [90], con Nuevo México, Arizona y Colorado mostrando los casos más altos. Mientras que el prototípico hantavirus centroamericano en América Central fue el virus Rio Segundo de Reithrodontomys mexicanus de Costa Rica, la primera enfermedad humana apareció algunos años más tarde en Panamá, donde el virus Choclo (CHOV) surgió como el agente etiológico y se cree que es responsable de todos los casos conocidos de HCPS. La rata de arroz pigmeo fulvo Oligoryzomys fulvescens ha sido identificada como el reservorio de roedores [91]. En Panamá, los primeros casos de HCPS, aunque con poca o ninguna implicación cardiaca evidente, fueron reportados en 1999, y desde entonces, 106 infecciones humanas han ocurrido con una tasa de mortalidad del 26% [92]. Seroencuestas de mamíferos en México y Costa Rica han encontrado anticuerpos antihantavirus [93] [94] [95] [96], y se han notificado seroprevalencias que oscilan entre 0,6 y 1,6% en poblaciones humanas a pesar de la ausencia de casos conocidos de HCPS [97]. En América del Sur, los casos de HCPS se han identificado en Argentina, Bolivia, Brasil, Chile, Paraguay y Uruguay, y también se han notificado evidencias de exposición humana a hantavirus en Venezuela [98] y Perú [99]. En América del Sur, ANDV es el principal agente etiológico con casos en Chile y Argentina notificados desde 1995. En Chile, se han producido 671 casos de HCPS debido a ANDV durante el período 2001-2009 [100]. Desde 1995 se han reportado más de 1.000 casos de HCPS en Argentina [101] ; en el Brasil se han identificado aproximadamente 1.100 casos de HCPS entre 1993 y 2008 [102]. Las tasas de mortalidad por casos en esos tres países han sido similares, oscilando entre el 30% (Argentina), el 36% (Chile) y el 39% (Brasil). Las infecciones por Hantavirus ocurren con más frecuencia en hombres que en mujeres, aunque la proporción entre hombres y mujeres es muy variable. Por ejemplo, las comunidades panameñas mostraron una proporción de 55 hombres por 45 mujeres [103], mientras que en Chile la proporción es más sesgada por hombres (71%) [104]. En el Chaco paraguayo la proporción entre hombres y mujeres se aproxima al 50% [105]. En América del Norte, en diciembre de 2009 el 63% de los pacientes eran varones [90]. Todos los grupos étnicos y raciales parecen ser susceptibles a infecciones por el hantavirus, y las diferencias entre ciertos grupos (como indígenas y no indígenas) están más probablemente correlacionadas con el tipo de hábitat en el que reside la población (por ejemplo, zonas rurales frente a zonas urbanas). De hecho, las comunidades rurales representan la mayor incidencia global del hantavirus y, por lo tanto, están en mayor riesgo [92, [105] [106] [107] [108] [109] [109] [119], aunque también se ha destacado la importancia de los entornos peridomésticos como una importante zona de exposición [112, 113]. El principal mecanismo por el que los seres humanos adquieren la infección por el hantavirus es la exposición a aerosoles de heces contaminadas de roedores, orina y saliva [114, 115]. Esto puede ocurrir cuando los seres humanos residen en áreas cercanas a las que habitan los roedores, viven en áreas infestadas de roedores, o cuando los roedores invaden entornos humanos, que son más frecuentes en hábitats rurales.Existe una larga historia de coexistencia humana con roedores, lo que plantea dudas sobre el aparente aumento reciente de las enfermedades relacionadas con el hantavirus, especialmente el HCPS. Aparte de una aparente asociación con eventos de oscilación sureña de El Niño (ENSO) en algunas regiones [116, 117], los recientes incrementos en la incidencia del HCPS no parecen seguir un patrón temporal o espacial fácilmente definido. Sin embargo, algunas características del paisaje, como la fragmentación del hábitat o las áreas perturbadas por el ser humano, pueden influir en la dinámica de la población de roedores e impactar en la incidencia viral [118] [112] [112] [121]. A pesar de la estocástica asociada a la contracción de la infección Las actividades humanas en edificios mal ventilados que pulverizan partículas que luego se inhalan (es decir, limpieza, agitación de alfombras, polvo) se identifican con frecuencia entre los pacientes admitidos para el SHCPS [11, 122]. Se cree que las actividades al aire libre transmiten un menor riesgo debido a la labilidad de los hantavirus a la radiación UV y a la supuesta tendencia a dispersarse en el viento, aunque ciertas condiciones ambientales parecen mantener el virus durante períodos más largos fuera de su huésped natural, lo que permite la transmisión indirecta [123]. Una vía alternativa pero poco común de transmisión del virus es la mordedura de roedores [124] [125] [126]. Los trabajadores sobre el terreno que manipulan mamíferos corren un riesgo potencialmente mayor de exposición a infecciones por hantavirus, aunque cuando se cuantifica a través de serosurveys el riesgo absoluto parece bastante leve [127]. Un nuevo estudio en Colorado sugiere la posibilidad de que una picadura de roedor haya sido el vehículo próximo para la transmisión al aire libre de NVS [128], lo que vuelve a enfatizar el uso de equipo de protección personal durante las actividades de trabajo de campo [129]. Como caso particular dentro de los hantavirus, la transmisión de persona a persona ha sido documentada exclusivamente para el virus de los Andes sudamericanos [130] [133] [133] [135]. La identificación de esta vía de transmisión se ha hecho utilizando tanto herramientas moleculares como encuestas epidemiológicas, pero el mecanismo de transmisión interpersonal no está bien establecido. Curiosamente, ANDV también puede ser derramado por los humanos a través de otros fluidos biológicos como la orina [136], ilustrando las propiedades particulares que diferencian este virus de otros hantavirus. Aunque la transmisión interpersonal parece ser única para ANDV, el ARN viral de PUUV se ha detectado en la saliva de pacientes con HFRS, y algunos pacientes con SNV-HCPS tienen ARN viral en las secreciones traqueales [88, 137]. Los Hantavirus en las Américas son alojados naturalmente por roedores (Muridae y Cricetidae) así como las musarañas (Soricidae) y los lunares (Talpidae) (Figura 1). Tres especies de musgo y un mole han sido reportados para albergar hantavirus y su patogenicidad para los humanos permanece desconocida [22, 138, 139]. Se han identificado al menos 15 especies de roedores como portadores de diferentes hantavirus patógenos, con algunos genotipos sudamericanos como Castelo do Sonhos (CDSV) o Hu39694 sólo identificados después de infecciones humanas (Figura 1 ). Los hantavirus suelen mostrar una alta especificidad de especie y ningún huésped intermedio [140]. Sin embargo, se han descrito algunos genotipos de hantavirus en la misma especie de roedores. Tal es el caso de Playa de Oro (OROV) y Catacamas (CATV) identificados en Oryzomys couesi [141, 142], o Maporal (MAPV) y Choclo (CHOV) hospedados por O. fulvescens [91, 143]. En América del Norte se han detectado virus de muleshoe y Black Creek Canal hanta en sigmodon hispidus [ Además, un genotipo de hantavirus (por ejemplo, el virus similar a Juquitiba) puede ser transportado por más de una especie de roedores (O. nigripes, Oxymycterus judex, Akodon montesis). Otro ejemplo es el virus Laguna Negra (LANV) que después de ser identificado en Calomys laucha [146] también ha sido reportado en C. callosus [147]. El rápido aumento en el descubrimiento de nuevos hantavirus y la identificación de sus anfitriones no parece probable que termine tan pronto como se examinen nuevas especies pequeñas de mamíferos [95]. Este tema se complica por la continua controversia en los criterios para la clasificación de distintos hantavirus [148, 149], que también está vinculado a la clasificación taxonómica y los reordenamientos taxonómicos. La transmisión de especies cruzadas es un proceso importante durante la propagación, aparición y evolución Particularmente dentro de los hantavirus, los derrames a los huéspedes secundarios se identifican cada vez más a medida que se realizan estudios más extensos [151] [152] [153] [155] [156]. Por ejemplo, ANDV es el agente etiológico predominante del HCPS en América del Sur, y O. longicaudatus el principal reservorio de roedores. Derrama en al menos otras cuatro especies de roedores que coocurren con el reservorio se han identificado, con Abrothrix longipilis mostrando la segunda mayor prevalencia de anticuerpos de ANDV, y actualmente no hay duda de que el virus es extremadamente similar genéticamente entre los dos roedores del huésped [157, 158]. En América del Norte, el derrame del virus Bayou (BAYV) puede haber ocurrido desde el reservorio principal de O. palustris a S. hispidus, R. fulvescens, P. leucopus y B. taylori [159] [160] [161]. Es más probable que el derrame del virus Hanta se produzca con poblaciones de acogida que habitan regiones simpatricas o sintópicas [151, 162], y la transmisión de especies cruzadas tendría probablemente mayores posibilidades de éxito si las especies anfitrionas están estrechamente relacionadas [163]. Se encuentra una excepción interesante entre el virus Oxbow (OXBV) y el virus Asama (ASAV) en el que un proceso de cambio de huésped parecía haber ocurrido entre mamíferos pertenecientes a dos familias (Talpidae y Soricidae), probablemente como resultado de la codivergencia alterna y recurrente de ciertos tax Los hantavirus son transmitidos horizontalmente entre roedores y no son transmitidos por artrópodos (a diferencia de otros virus de la familia Bunyaviridae). La infección por derrapadores a mamíferos no humanos generalmente no produce ninguna transmisión hacia adelante (o a fin de morir), pero si los seres humanos están infectados pueden resultar en una alta morbilidad y mortalidad [122, 164]. Durante la primavera de 1993, un brote de pacientes con HCPS debido a SNV ocurrió en los estados de Four Corners, resultando en más del 60% de casos de mortalidad entre los casos iniciales, muchos de los cuales involucran a miembros de la tribu Navajo [12, 121]. En Panamá, se notificó un brote durante 1999-2000 en Los Santos, y 12 casos donde se identificaron con tres muertes [165, 166]. Esto representó el primer informe de infecciones por hantavirus humanos en América Central. En América del Sur, Diecisiete individuos fueron identificados con anticuerpo NVS (ELISA) o fueron antígenos (HCI) positivos de 52 casos sospechosos [167]. En 1996 ocurrieron brotes mayores debidos a ANDV en el sur de Argentina [131, 134] ; en el sur de Chile se presentaron grupos de pacientes con enfermedad por hantavirus en 1997 [158]. En Brasil, el primer brote fue identificado en la Amazonía Brasileña (Estado de Maranhão) en el año 2000, e involucró pequeños pueblos que resultaron en una prevalencia del 13,3% de los evaluados (398 residentes totales) [168]. Los factores que desencadenan los brotes de hantavirus todavía son mal entendidos, probablemente porque resultan de varias características bióticas y abióticas interactuantes cuyos parámetros clave son difíciles de modelar. Sin embargo, el uso de nuevos enfoques de modelado que involucran características geográficas y ambientales parece ser prometedor a la hora de predecir posibles brotes de hantavirus y/o áreas de mayor riesgo [169] [170] [171] [172]. Debido a que se sabe que los hantavirus se transmiten directamente de los huéspedes infectados a los susceptibles, el primer enfoque natural es relacionar los brotes con la ecología de los huéspedes virales. La transmisión y persistencia del hantavirus en las poblaciones de roedores depende de varios factores que interactúan para afectar la dinámica ecológica del huésped, que a su vez está fuertemente influenciada por las características de comportamiento de las especies de roedores individuales, a la estructura paisajística y a las características ambientales [173, 174]. La transmisión viral depende de las tasas de contacto entre los huéspedes sensibles, y a pesar de la noción prevaleciente de que un aumento de la densidad se encuentra y, por lo tanto, de Además, se ha demostrado que la transmisión de NVS sigue un patrón de heterogeneidad de contacto, donde los individuos de la población tienen diferentes probabilidades de transmitir la infección [176]. La comprensión de la transmisión viral resulta ser mucho más compleja cuando especies distintas del principal huésped del reservorio se incorporan en el modelo. De hecho, estudios recientes han demostrado que la mayor diversidad de especies hospedantes está correlacionada con una menor prevalencia de infección en América del Norte para P. maniculatus [177], en América Central para O. fulvescens (reservorio del virus Choclo) y Zygodontomys brevicauda (reservorio del virus Calabazo) [178], y en América del Sur para Akodon montensis (reservorio del virus Jabora) [162]. Las tasas de contacto varían según la distribución espacial de las poblaciones y parecen estar Por ejemplo, la prevalencia de SNV en P. maniculatus fue mayor en paisajes con mayor grado de fragmentación del hábitat preferido [179]. Además, ciertas propiedades del paisaje como elevación, pendiente y cubierta terrestre parecen ser útiles para detectar áreas con infecciones persistentes de SNV, y por lo tanto se consideran áreas refugiales donde el virus puede mantenerse durante años [169]. Los cambios en el entorno natural de las especies de reservorios, como la fragmentación forestal y la pérdida de hábitat, pueden alterar la abundancia y distribución de la población y provocar brotes de hantavirus, como se observa en la Península de Azurero de Panamá [118, 119]. Además, las diferencias en el microhábitat, incluida la cubierta superficial, pueden conducir a diferencias en la dinámica ecológica dentro de las poblaciones y afectar a la tasa de exposición al virus [180]. Se han encontrado diferencias en las infecciones por hantavirus a través de paisajes contrastantes en el intervalo latitudinal en poblaciones de roedores de O. longicaudatus en Chile, lo que sugiere que los seres humanos están expuestos de manera diferencial al virus [107, 181]. La dinámica poblacional de roedores se ve afectada por cambios estacionales de clima y clima [182, 183]. En el caso de los brotes asociados a ENSO, se ha postulado una compleja cascada de eventos desencadenados por lluvias altamente inusuales en el año precedente para dar lugar a un aumento de la producción primaria y densidades de roedores, aumentando también la probabilidad de transmisión del virus a los seres humanos, pero ha resultado difícil demostrar con precisión los eventos intermedios sugeridos, como el aumento de las densidades de roedores en el aumento de la carga de casos [116, 121, 184]. En América del Sur, los efectos del cambio climático y los brotes de hantavirus no han sido bien estudiados, a pesar del conocimiento de que varias especies de roedores que son reservorios de enfermedades emergentes se han visto dramáticamente afectadas por eventos como El Niño [185]. Los cambios en la dinámica de la población de acogida también se ven afectados por la estacionalidad, lo que puede conducir a brotes de enfermedades cuando se interrumpen los procesos que equilibran las poblaciones de roedores de temporada en temporada [186]. La emergencia viral puede seguir promoviéndose a medida que los cambios introducidos por el ser humano continúan aumentando en el medio ambiente a diferentes escalas geográficas. Estos cambios también pueden alterar la estructura y dinámica de la población de roedores e interacciones interespecies creando condiciones que pueden conducir a brotes virales, establecimiento viral en nuevos hospederos, y la aparición de HCPS [102, 162], incluso con aparentemente leve perturbación ecológica al sistema virus-hospedero [188]. Ciertas características fisiopatológicas, incluyendo trombocitopenia y shock, de enfermedades por hantavirus de los seres humanos, tienen similitud sustancial con las fiebres hemorrágicas inducidas por otros virus tales arenavirus, filovirus y flavivirus, a pesar de compartir esencialmente ninguna secuencia similitud con ellos. Tales observaciones plantean preguntas acerca de si tales similitudes en la patogénesis son probables similitudes de fenotipo, o en cambio reportan la presencia de mecanismos moleculares comunes entre los virus. En esta revisión se discuten las propiedades generales, descubrimientos y epidemiología/ecología de las formas de hantavirus patógenos del Nuevo Mundo, y también se busca identificar algunas de las características de las macromoléculas virales y mecanismos inmunológicos que se han propuesto como potenciales mediadores directos de los eventos patógenos que caracterizan la enfermedad humana HCPS. Si bien es poco probable que la expresión de una proteína viral particular o ARNs en aislamiento se pueda confiar en replicar fenotipos clave de infección por el virus completo, algunos de los hallazgos han sido suficientemente consistentes con lo que se conoce de la patogénesis in vivo que ofrecen plomos plausibles de primer paso en la búsqueda de objetivos terapéuticos. Esperamos con interés las revelaciones mecanísticas que seguirán el uso inevitablemente ampliado de métodos poderosos como la secuenciación profunda, imágenes cada vez más avanzadas, y métodos microscópicos, y modelos animales que por fin se pueden decir

¿Qué mecanismo potencial, podría presumirse que subyace a la patogénesis del HCPS?

Los hantavirus en las Américas y su papel como patógenos emergenteshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3185593/SHA: efe13a8d42b60ef9f7387ea539a1b2eeb5f80101Autores: Hjelle, Brian; Torres-Pérez, FernandoFecha: 2010-11-25DOI: 10.3390/v2125559Licencia: cc-byAbstract: La continua aparición y reaparición de patógenos representan una amenaza continua, a veces mayor, para las poblaciones. Los hantavirus (familia Bunyaviridae) y sus enfermedades humanas asociadas se consideraron confinados a Eurasia, pero la aparición de un brote en el suroeste de Estados Unidos llevó a un gran aumento en su estudio entre los virólogos de todo el mundo. Se han descrito más de 40 genotipos hantavirales, la gran mayoría desde 1993, y casi la mitad de ellos patógenos para los seres humanos. Los hantavirus causan infecciones persistentes en sus reservorios, y en las Américas, la enfermedad humana se manifiesta como compromiso cardiopulmonar, síndrome cardiopulmonar del hantavirus (HCPS), con proporciones de casos-fatalidad, para los serotipos virales más comunes, entre el 30% y el 40%. Alteración del hábitat y trastornos ecológicos a mayor escala, tal vez incluyendo el cambio climático, son algunos de los factores que pueden haber aumentado la carga de casos humanos de HCPS entre 1993 y el presente. Consideramos aquí las características que influyen en la estructura de la dinámica de la población huésped que pueden conducir a brotes virales, así como los determinantes macromoleculares de los hantavirus que han sido considerados como potenciales contribuciones a la patogenicidad. Texto: Los patógenos emergentes causan enfermedades nuevas o no reconocidas anteriormente, y entre ellas, las zoonóticas emergentes son una preocupación importante entre los científicos que estudian enfermedades infecciosas a diferentes escalas espaciales y temporales [1, 2]. Los cambios en las condiciones bióticas y abióticas pueden alterar la dinámica de las enfermedades de la población y conducir a la aparición de infecciones zoonóticas [3] [5] [6]. Durante las últimas décadas, se han producido varios brotes de patógenos virales emergentes y reemergentes, que afectan tanto a la implicación puramente local como a nivel mundial/pandémica de las poblaciones humanas. Entre los ejemplos visibles están la gripe A, el virus del Ébola, el virus de la hepatitis C, el trastorno respiratorio grave para adultos (SARS), el coronavirus y el virus de la inmunodeficiencia humana, que desafían las medidas de prevención y control de los sistemas de salud pública [7]. En las Américas, el reciente brote de gripe pandémica A subtipo H1N1 se convirtió en un objetivo importante de control debido a su rápida propagación, y las incertidumbres en cuanto a virulencia y transmisibilidad, sin embargo, la disponibilidad de vacunas fue limitada cuando se produjo una actividad significativa antes de la temporada tradicional de gripe [8]. Sin embargo, en el último siglo han surgido o resurgido brotes de varias enfermedades virales relacionadas con el virus arenavirus y el virus del dengue, y más recientemente, hantavirus y la expansión del rango geográfico del virus del Nilo Occidental. Entre las enfermedades zoonóticas, los mamíferos pequeños son anfitriones de varios virus ARN patógenos, especialmente Arenaviridae y Bunyaviridae: Hantavirus [9] [10] [11]. Las infecciones por hantavirus se convirtieron en una preocupación en las Américas después de la descripción de un brote de distrés respiratorio agudo ocurrido en La enfermedad recientemente reconocida, el síndrome cardiopulmonar del hantavirus, el HCPS (o síndrome pulmonar del hantavirus), se relacionó con la infección por el virus del Sin Nombre (SNV) recién descubierto, y el roedor Peromyscus maniculatus (ratón venado) fue identificado como el reservorio [13]. Sin embargo, las infecciones por hantavirus tienen una historia mucho más larga. Una revisión de los escritos chinos antiguos, que datan de aproximadamente 960 dC, reveló descripciones muy parecidas a la fiebre hemorrágica con síndrome renal (HFRS), el síndrome causado por los hantavirus del Viejo Mundo [14]. Durante el siglo XX, los casos de enfermedad febril aguda con compromiso renal fueron descritos de varios países eurasiáticos y Japón, a menudo en asociación con compromisos militares [15]. El HFRS como síndrome distinto, sin embargo, fue llamado por primera vez a la atención de la medicina occidental en asociación con un brote que ocurrió entre las tropas de las Naciones Unidas durante el conflicto coreano entre 1951 y 1954, donde más de 3.200 soldados fueron afectados [16]. Tomó más de dos décadas hasta que el agente etiológico, el virus Hantaan (HTNV), fue aislado del ratón de campo rayado Apodemus agrarius, detectado en parte por la unión de anticuerpos de muestras de suero de paciente a los tejidos pulmonares de ratones de campo sanos y salvajes [17, 18]. El virus se encontró más tarde para representar la especie tipo de un nuevo género Hantavirus de la familia Bunyaviridae, aunque fue más tarde evidente que el primer hantavirus a aislarse fue el virus Thottapalayam de shrew-borne [19]. La categorización de los hantavirus como pertenecientes a la familia Bunyaviridae se debe en parte a la presencia consistente de tres genomas de ARN que son circularizados in vivo como resultado de la presencia de nucleótidos terminales complementarios que ayudan a doblar el genoma en una morfología -hairpin-, descrita por primera vez para el flebovirus Uukuniemi [19, 20]. La Tabla 1 es una lista de los hantavirus patógenos predominantemente distintos serológicamente. Se describen muchos otros genotipos llamados, pero tales otras formas patogénicas están generalmente estrechamente relacionadas con los Andes o, en algunos casos, el virus Sin Nombre. Durante la maduración del virus, el precursor forma GPC se procesa utilizando una proteasa unida a la membrana en Gn y Gc, una escisión que ocurre, y parece ser señalada, después de la señal péptida conservada WAASA en la C-terminal de Gn [24]. Aunque las dos proteínas se pueden expresar de forma independiente a través de la transfección, pueden ser retenidas en el compartimento celular incorrecto (ER o aggrosome); por lo tanto, deben ser co-expresadas para permitirles estabilidad para que las dos se puedan ensamblar correctamente en el Golgi [25, [27] [28]. Se han identificado varias actividades y propiedades para las glicoproteínas envolventes del hantavirus, incluyendo algunas características que se sospecha que están involucradas en la patogenicidad de los serotipos causantes de la enfermedad, una posibilidad que ha generado atención experimental. Las glucoproteínas son los ligandos conocidos o presuntos para al menos dos receptores celulares distintos, la cadena de integrina y el factor acelerador de la descomposición, o DAF [30, 31] ; con gC1qR/p32 también identificado como otro receptor de entrada potencial [32]. Comparaciones con la proteína E del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, llevaron a Tischler et al. a considerar la glicoproteína Gc como una proteína potencial de fusión de clase II, tal vez impartiendo actividad de fusión al virión, y esta hipótesis ha ganado apoyo en otros estudios [33, 34]. Se han identificado actividades adicionales con, o se afirma que están relacionadas con, Gn. Para muchos de estos estudios, una premisa subyacente ha sostenido que hay diferencias entre las glicoproteínas de hantavirus -patógenos en relación con virus en el género que se denominan Si bien es cierto que aún no ha sido posible vincular el virus de Prospect Hill (PHV) con la enfermedad humana, la ausencia de evidencia de su patogenicidad tal vez no debería equipararse con la evidencia de su ausencia. Sólo se podría considerar que el nivel de enfermedad (por ejemplo, letargo, fiebre, proteinuria y azotemia) asociado con la infección de primates no humanos por PHV no es significativamente diferente del registrado para los modelos de primates no humanos utilizando el virus conocido del patógeno Puumala (PUUV) [35, 36]. Para el propósito de esta discusión, presumiremos que los hantavirus apatogénicos son efectivamente apatogénicos. Mientras que algunos estudios han sugerido que las glicoproteínas Gn se dirigen más rápidamente a la vía ubiquitina-proteosoma que a las formas apatogénicas, otros han interpretado las diferencias en el manejo de las glicoproteínas Gn a través de especies de hantavirus por el sistema ubiquitina-proteosomal como independientes de la patogenicidad [37] [38] [39]. Algunos investigadores han dirigido sus esfuerzos hacia la identificación de una capacidad diferencial, ya sea cinética o de magnitud absoluta, en la capacidad de los hantavirus patógenos y apatogénicos para provocar una respuesta de interferón en las células. Una premisa que surge es que las formas apatogénicas tenderían a inducir una respuesta innata anterior que haría más probable que el virus se limpiara rápidamente o se volviera menos competente en su replicación, a fin de evitar cualquier respuesta patológica en el huésped [42] La respuesta innata anti-hantavirus puede en algunos casos ser atribuida a la interacción viral como ligando de TLR-3, pero no en otros, y en las células endoteliales, no parece requerir más que la partícula viral misma, incluso cuando se introduce en forma replicativa incompetente [43, 44]. Las proteínas y los ARNm inducidos prominentemente por los hantavirus incluyen MxA e IFIT-1 (ISG-56) y otros incluyendo algunos con actividad antiviral conocida o sospechada. Esos hantavirus, a menudo cepas altamente patógenas, que no inducen una respuesta antiviral potente, se sospechan o se presume que tienen un (más) potente mecanismo de antagonismo interferón-vía en relación con otros virus, un mecanismo que actúa positivamente para prevenir que se forme una respuesta innata efectiva, al menos temprano en la infección Sin embargo, se reportan algunos casos en los que los hantavirus altamente patógenos, tales como NVS, también son capaces de inducir la expresión de los ARNm del gen estimulado por interferón, incluso muy temprano en la infección, con proteínas ISG, como se esperaba, tardando más tiempo en aparecer en la célula [44]. Las actividades anti-interferón también se han atribuido a la proteína NSs que se puede elaborar en células infectadas por serotipos que codifican esta proteína [46]. Otros investigadores han examinado las actividades de las glucoproteínas del hantavirus y otras proteínas que podrían afectar directamente a algunos aspectos de la progresión patogénica asociada a la infección por hantavirus en humanos, tales como cambios de permeabilidad vascular. Mientras que los primeros intentos de causar directamente aumentos en la permeabilidad de las monocapas endoteliales con partículas virales o infección viral fueron en gran medida decepcionantes, los hantavirus se han identificado como que afectan adversamente la migración endotelial sobre los sustratos y en la potenciación de la permeabilidad endotelial inducida por VEG-F [47, 48]. La proteína nucleocápsida o N más corta (+50 kD) es un componente estructural del nucleocápsido viral, junto con los segmentos de ARN viral genómico. Como proteína de unión al ARN que afecta a la horquilla del cabello de los segmentos genómicos con alta afinidad [49, 50], limita el acceso del ARN para alojar nucleasasas y ayuda a hacer que la replicación viral sea un proceso cerrado dentro del citoplasma. También actúa como una proteína de membrana periférica, al igual que la proteína L [51], una actividad que podría jugar un papel en su supuesta, pero aún no demostrada función como matriz [52]. Hasta hace poco, no se había apreciado que N tuviera una amplia variedad de otras actividades, algunas de las cuales pueden estar vinculadas, no sólo a los requisitos fundamentales de replicación, sino también a la interferencia con una serie de procesos intracelulares de la célula normal. Así, se ha propuesto una interacción entre el aminoterminal de la proteína N del hantavirus y la proteína celular Daxx, con la sugerencia de posibles consecuencias pro-apoptóticas [51]. N también se reporta que interactúa con microfilamentos actínicos, y la proteína SUMO-1 [53, 54]. Utilizando ensayos basados en el gen reportero, Connie Schmaljohn y sus colegas han informado que la proteína nucleocapsid del virus Hantaan tiene un papel inhibidor en las respuestas inflamatorias mediadas por NF kappa B (NF- â € € TM B). Los efectos sobre la expresión NF- € B parecen estar limitados a la prevención de su translocación nuclear después de su intento de activación con lipopolisacárido, LPS [55]. En el citoplasma de las células infectadas, la proteína N se puede encontrar en los cuerpos celulares P donde secuestra y protege los capuchones de 5'. Puede localizar los capuchones a través de su interacción con DCP1, un componente clave de los cuerpos P. Durante la infección por hantavirus, los ARN virales se concentran en los cuerpos P, a través de su interacción con N y DCP1. La proteína N demuestra la protección preferencial de los ARNm diseñados para terminar prematuramente su proteína codificada en comparación con los ARNm nativos [56]. La proteína N se ha vinculado cada vez más a la replicación y traducción virales, a veces de maneras no previstas anteriormente. Se encuentra entre una familia creciente de diversas proteínas virales que pueden servir como un inespecífico - ARN chaperone ®, una actividad que debe facilitar el acceso de la L polimerasa al ARNv para la transcripción y replicación, en que puede disociar transitoriamente estructuras de ARN mal dobladas [57]. Algunos de los efectos de la proteína N en la traducción no pueden ser inmediatamente reconocidos como adaptables en la naturaleza. Puede reemplazar todo el complejo de iniciación traslacional EIF4F, presentando simultáneamente el ribosoma con un reemplazo de la actividad de unión de la tapa de eIF 4E, uniéndose al complejo de pre-iniciación 43S, al igual que eIF 4G, al tiempo que reemplaza la actividad helicoidal de eIF 4A, que se presume que es necesaria para disociar la estructura de ARN de orden superior [56, 58]. Estos tres factores normalmente trabajan juntos para lograr la iniciación traslacional. En los cuerpos P, la capacidad de la proteína N de unirse a una alta afinidad a los oligoribonucleótidos celulares nativos tapados, junto con su actividad en la protección de ARNs tapados de la degradación, probablemente facilita el acceso de oligonucleótidos encapsulados para su uso en la iniciación transcripcional por L polimerasa (-cap ra Tráfico de N para el ensamblaje viral: Clásicamente, la proteína N en las células infectadas parece estar agrupada o partículas en la naturaleza, con una concentración pesada en una única ubicación perinuclear, ampliamente considerada como la Golgi [27]. Las proteínas N de los hantavirus se encuentran en asociación con fracciones de partículas, y los estudios confocales microscopía y bioquímico-inhibidores han demostrado que las trazas N a lo largo de microtúbulos pero no con filamentos de actina [52]. El destino final de N, para su ensamblaje en partículas virales es la Golgi, y que circula allí a través del complejo intermedio retículo-Golgi endoplasmático (ERGIC), también conocido como cúmulo vesicular-tubular [52]. Un inhibidor negativo dominante, la dinamitina, asociado con el transporte mediado por Los estudios posteriores sugieren que la dependencia específica del transporte microtubular es específica de los hantavirus del Viejo Mundo como el NVH, pero que el Hantavirus del Nuevo Mundo ANDV está asociado con filamentos de actina [59]. Sin embargo, los datos recientes indican que el transporte microtubular es efectivamente utilizado para el NVH del Nuevo Mundo [60]. Las enfermedades del Hantavirus del hombre desde hace mucho tiempo han sido sospechosas de tener una base inmunopatógena en parte debido a su período de incubación relativamente largo de 2-3 semanas y la asociación temporal observada entre los trastornos inmunológicos y la primera aparición de signos y síntomas de la enfermedad del hantavirus. HFRS y HCPS comparten muchas características clínicas, llevando a muchos investigadores a considerar que son, en esencia, diferentes manifestaciones de un proceso patógeno similar, que difieren principalmente en los órganos objetivo primarios de expresión de la enfermedad (Tabla La patogénesis de las infecciones por hantavirus es el tema de una revisión continuamente actualizada en la serie UpToDate [61]. Para el momento en que aparecen los síntomas en el HCPS, ambas respuestas antivirales fuertes, y, para los genotipos virales más virulentos, el ARN viral puede ser detectado en plasma sanguíneo o células sanguíneas nucleadas respectivamente [63, 64]. Al menos tres estudios han correlacionado el ARN viral plasmático con la gravedad de la enfermedad para el HCPS y el HFRS, sugiriendo que la replicación del virus juega un papel continuo y en tiempo real en la patogénesis viral [65] [66] [67]. Se han identificado varios cambios patológicos distintivos que ocurren tanto en el HFRS como en el HCPS. Una característica crítica de ambos es una fuga capilar transitoria (~ 1-5 días) que involucra el La fuga resultante es de carácter exudativo, con una composición química alta en proteínas y similar al plasma. La experiencia continua que indica el fuerte tropismo tisular para las células endoteliales, específicamente, es uno de los varios factores que hacen de la integra β3 un candidato especialmente atractivo como un importante receptor in vivo para los hantavirus. Es probable que los hantavirus lleguen a sus tejidos objetivo a través de la captación por los ganglios linfáticos regionales, tal vez con o dentro de un histiocito pulmonar escoltante. Las semillas del virus endotelio local, donde las primeras células infectadas dan lugar, en última instancia, a una viremia primaria, un proceso que parece tomar mucho tiempo para las infecciones por hantavirus [62, 63]. En el momento en que emerge la viremia secundaria, los agentes de las formas más severas de HFRS y HCPS han comenzado a alcanzar una masa suficiente para inducir, a través de las interacciones PAMP-PRR y otros medios, la expresión de citoquinas proinflamatorias [64]. Para HCPS, esa expresión favorece el lecho pulmonar y los órganos linfoides, pero, por razones desconocidas, ahorra el retroperitoneo y, en general, el riñón. En HFRS la situación se invierte, y sin embargo no se aprecia a menudo que el esperado tropismos tisulares preferentes de virus asociados a HFRS y sus contrapartes asociadas a HCPS para los lechos renal y pulmonar, respectivamente, no es como se predeciría a través de las manifestaciones de las dos enfermedades. La elaboración local de mediadores inflamatorios y quimiotácticos se considera un requisito para el desarrollo de Sin embargo, no es la hipoxemia, debido al edema pulmonar prominente, lo que conduce a la muerte en la mayoría de los casos fatales de HCPS, sino más bien la intoxicación del corazón por mediadores como aún no definidos, lo que conduce al estado de bajo gasto cardíaco y al síndrome de shock asociado [64, 65]. Es tentador especular que los mediadores producidos en el pulmón en conexión con el infiltrado inflamatorio pueden infiltrarse a través de la circulación coronaria con dilución mínima en HCPS, consecuencia desventajosa de la estrecha yuxtaposición anatómica de los dos órganos. Así, al menos tres clases de mecanismos potenciales, algunos superpuestos y todos ciertamente no exclusivos de los otros, podrían presumirse que subyacen a la patogénesis del HCPS. Estos incluyen:(1) Mecanismos inmunes innatos. La naturaleza de las interacciones entre los patrones moleculares asociados al patógeno del hantavirus (PAMP) y los receptores de reconocimiento del patrón (PRR) de las células endoteliales susceptibles comienzan a ser aclaradas. El HTNV prototípico parece ser reconocido por TLR-3 [43]. Tal infección tiene consecuencias tales como una mayor expresión del HLA-DR en las células dendríticas [66] y la diferenciación de los monocitos hacia las células dendríticas [67]. (2) Efectos virales directos. La correlación observada entre la carga viral y la gravedad de la enfermedad deja abierta la posibilidad de que las partículas del hantavirus o el ARN puedan tener efectos tóxicos sobre las células o sobre la señalización. Algunos investigadores han favorecido la toxicidad viral directa, actuando a través de la inhibición de la función de barrera celular endotelial, como una explicación de gran parte de la fuga capilar, aunque existe Una pista potencialmente importante hacia el mecanismo por el cual las infecciones por hantavirus agotan las plaquetas sanguíneas y, en algunos casos, causan manifestaciones hemorrágicas, fue avanzada por el reciente descubrimiento de que los hantavirus patógenos son capaces de reclutar plaquetas para adherirse a las superficies celulares endoteliales, con β3 integrina utilizada como elemento de unión crítica [69]. (3) Efectos patógenos causados por las actividades de macromoléculas virales específicas. Hemos revisado algunas de las actividades asociadas con los Gn, Gc y N, polipéptidos codificados viralmente en secciones anteriores. Modelos de prueba de patogénesis se pueden hacer más eficazmente cuando hay un modelo animal que imita aspectos clave de la enfermedad. No existe un modelo similar al HFRS, pero existen modelos animales para el transporte asintomático de PUUV y SNV por sus roedores portadores nativos, el banco vole Myodes glareolus y el ratón de venado P. maniculatus; así como un modelo de hámster sirio utilizando ANDV o el virus Aporal relacionado de Venezuela, para el cual se observa una enfermedad mimética HCPS [70] [71] [72] [73]. El modelo de hámster ANDV-Sirio tiene una serie de características en común con la enfermedad humana, así como algunas diferencias. A diferencia de las enfermedades neurológicas que han sido posibles de provocar con HTNV, el modelo de hámster para HCPS parece ser causado por fugas capilares que resultan en edema pulmonar y la producción de un derrame pleural con características exuda Típicamente los hámsteres mueren entre 11 y 14-d post-inoculación, reflejando un período de incubación ligeramente acelerado en comparación con las infecciones humanas. Al igual que con el HCPS humano, el examen microscópico del pulmón revela abundante deposición de fibrina, septo alveolar engrosado y antígeno viral expresado abundantemente en el endotelio microvascular. Los hámsteres infectados por ANDV equipados con dispositivos de monitoreo fisiológico mostraron disminución de las presiones de pulso, taquicardia e hipotensión que parecen imitar de cerca el shock que se cree que es la causa próxima de la muerte en pacientes que sucumben al HCPS [65, 74]. En comparación con la enfermedad humana, los hámsteres infectados por ANDV exhiben títulos excepcionalmente altos de ANDV vivo en sus tejidos, con gran parte de la replicación viral que ocurre en Los títulos de ANDV vivo en algunos casos superan los 10 8 /g, mientras que los aislados de hantavirus de los tejidos humanos han sido notoriamente difíciles de obtener. A pesar de la aparición universal de enzimas hepáticas levemente elevadas en pacientes con HCPS, las enzimas hepáticas no parecen estar presentes en niveles elevados en la sangre de hámsters enfermos incluso inmediatamente antes de la muerte [75]. El período prolongado de incubación asociado con la enfermedad por hantavirus da al huésped un tiempo considerable para montar una respuesta inmune madura contra el virus. Así, en contradición a infecciones de gravedad comparable y sintomatología relacionada asociada con arenavirus y filovirus, las infecciones por hantavirus en humanos se asocian con respuestas anticuerpos de título significativo por el momento en que comienzan los síntomas. A pesar de esta observación, parece ser posible que la variación natural en las respuestas individuales de anticuerpos neutralizantes entre los pacientes con infecciones por NVS pueda estar relacionada con la gravedad de la enfermedad, lo que sugiere que la administración de anticuerpos antivirales podría resultar efectiva terapéuticamente [76]. En el caso de la infección por ANDV, han surgido nuevas evidencias que indican que el aparente aclaramiento del virus de la sangre no resulta en la eliminación completa del estímulo antigénico por el virus, sugiriendo que el virus puede persistir, tal vez en algún sitio inmunológicamente privilegiado aún indeterminado [77]. Un papel para las respuestas patológicas mediadas por células T en el HFRS y el HCPS ha sido la fuente de especulación por una variedad de razones. La gravedad del SNS asociado al SNCP puede haber hecho más evidente que el inicio del edema pulmonar, la taquicardia y la hipertensión parecía estar todo, pero universalmente asociado temporalmente, con la aparición de un espectro de células altamente activadas del linaje linfoide en la sangre periférica. Se detectaron células con similitudes morfológicas cercanas a estos -inmunoblastos- en los pulmones congestionados y pesados de los pacientes que llegaron a la autopsia, así como en órganos linfoides y en las tríadas portal [63, [78] [79] [80]. Estas observaciones llevaron a especular que algún componente de la patogénesis por hantavirus podría estar vinculado a la aparición de células T antivirales que podrían estimular o contribuir a la aparición de una -tormenta de mediadores y el fenotipo de fuga capilar asociado. Estudios posteriores han confirmado la expectativa de que una fracción significativa de la población de inmunoblastos en pacientes con HCPS son células T con especificidad para epitopes específicos de antígenos virales de clase I presentados por el HLA, incluyendo Gn, Gc y N [77, [81] [82] [83]. Presumiblemente, las actividades antivirales de estas células, manifestadas en parte por su elaboración de mediadores en el intersticio afectado, pueden contribuir a la fuga endotelial/capilar que se encuentra en el corazón de la patogénesis del hantavirus. Debido a que los primeros casos de HCPS a menudo llegaron a la autopsia, se hizo posible examinar tejidos necropsiados para la expresión de citocinas. El estudio de Mori et al. (1999) revelaron una alta expresión relativa de citocinas proinflamatorias incluyendo TNF-, IL-1-, IL-6, proporcionando evidencia a favor de un modelo de tormenta de citoquinas para la patogénesis [64]. Los autores creían, basándose en la morfología de las células secretadoras de citoquinas, que tanto monocitos como linfocitos estaban contribuyendo a la producción de citocinas. Que los mediadores proinflamatorios se encuentran en niveles elevados en el plasma, así como el intersticio renal de pacientes con enfermedad hantaviral aguda se ha reconocido desde hace algún tiempo también [84, 85]. Si bien el diagnóstico de HCPS y HFRS se realiza mejor con serología IgM, en la etapa aguda de la infección por NVS, también se puede utilizar RT-PCR si se utilizan células sanguíneas o coágulos de sangre en lugar de plasma o suero, donde la sensibilidad incluso utilizando imprimaciones PCR anidadas disminuye a cerca del 70% [86] [87] [88]. En una instalación en la que se tratan muchos casos de HCPS, el centro médico de la Universidad de Nuevo México en Albuquerque, se ha ofrecido un servicio de diagnóstico en el que se analizan los hallazgos hematológicos del paciente para establecer la probabilidad de que un paciente tenga HCPS. La combinación de trombocitopenia, abundancia elevada de linfocitos -inmunoblasto-, población de células polimorfonucleares con desplazamiento izquierdo sin evidencia morfológica fuerte para su activación, y valores elevados de hemoglobina o hematocrito es altamente específica para el HCPS y permite a los clínicos la capacidad de poner pacientes presuntivos-HCPS en oxigenación de membrana extracorpórea (ECMO), que se cree que ha salvado a muchos pacientes de un resultado letal [89]. Se cree que la infección humana por hantavirus sigue el contacto con secreciones o excreciones producidas por roedores infectados. En los Estados Unidos, 538 infecciones humanas por hantavirus fueron reportadas hasta finales de diciembre de 2009 [90], con Nuevo México, Arizona y Colorado mostrando los casos más altos. Mientras que el prototípico hantavirus centroamericano en América Central fue el virus Rio Segundo de Reithrodontomys mexicanus de Costa Rica, la primera enfermedad humana apareció algunos años más tarde en Panamá, donde el virus Choclo (CHOV) surgió como el agente etiológico y se cree que es responsable de todos los casos conocidos de HCPS. La rata de arroz pigmeo fulvo Oligoryzomys fulvescens ha sido identificada como el reservorio de roedores [91]. En Panamá, los primeros casos de HCPS, aunque con poca o ninguna implicación cardiaca evidente, fueron reportados en 1999, y desde entonces, 106 infecciones humanas han ocurrido con una tasa de mortalidad del 26% [92]. Seroencuestas de mamíferos en México y Costa Rica han encontrado anticuerpos antihantavirus [93] [94] [95] [96], y se han notificado seroprevalencias que oscilan entre 0,6 y 1,6% en poblaciones humanas a pesar de la ausencia de casos conocidos de HCPS [97]. En América del Sur, los casos de HCPS se han identificado en Argentina, Bolivia, Brasil, Chile, Paraguay y Uruguay, y también se han notificado evidencias de exposición humana a hantavirus en Venezuela [98] y Perú [99]. En América del Sur, ANDV es el principal agente etiológico con casos en Chile y Argentina notificados desde 1995. En Chile, se han producido 671 casos de HCPS debido a ANDV durante el período 2001-2009 [100]. Desde 1995 se han reportado más de 1.000 casos de HCPS en Argentina [101] ; en el Brasil se han identificado aproximadamente 1.100 casos de HCPS entre 1993 y 2008 [102]. Las tasas de mortalidad por casos en esos tres países han sido similares, oscilando entre el 30% (Argentina), el 36% (Chile) y el 39% (Brasil). Las infecciones por Hantavirus ocurren con más frecuencia en hombres que en mujeres, aunque la proporción entre hombres y mujeres es muy variable. Por ejemplo, las comunidades panameñas mostraron una proporción de 55 hombres por 45 mujeres [103], mientras que en Chile la proporción es más sesgada por hombres (71%) [104]. En el Chaco paraguayo la proporción entre hombres y mujeres se aproxima al 50% [105]. En América del Norte, en diciembre de 2009 el 63% de los pacientes eran varones [90]. Todos los grupos étnicos y raciales parecen ser susceptibles a infecciones por el hantavirus, y las diferencias entre ciertos grupos (como indígenas y no indígenas) están más probablemente correlacionadas con el tipo de hábitat en el que reside la población (por ejemplo, zonas rurales frente a zonas urbanas). De hecho, las comunidades rurales representan la mayor incidencia global del hantavirus y, por lo tanto, están en mayor riesgo [92, [105] [106] [107] [108] [109] [109] [119], aunque también se ha destacado la importancia de los entornos peridomésticos como una importante zona de exposición [112, 113]. El principal mecanismo por el que los seres humanos adquieren la infección por el hantavirus es la exposición a aerosoles de heces contaminadas de roedores, orina y saliva [114, 115]. Esto puede ocurrir cuando los seres humanos residen en áreas cercanas a las que habitan los roedores, viven en áreas infestadas de roedores, o cuando los roedores invaden entornos humanos, que son más frecuentes en hábitats rurales.Existe una larga historia de coexistencia humana con roedores, lo que plantea dudas sobre el aparente aumento reciente de las enfermedades relacionadas con el hantavirus, especialmente el HCPS. Aparte de una aparente asociación con eventos de oscilación sureña de El Niño (ENSO) en algunas regiones [116, 117], los recientes incrementos en la incidencia del HCPS no parecen seguir un patrón temporal o espacial fácilmente definido. Sin embargo, algunas características del paisaje, como la fragmentación del hábitat o las áreas perturbadas por el ser humano, pueden influir en la dinámica de la población de roedores e impactar en la incidencia viral [118] [112] [112] [121]. A pesar de la estocástica asociada a la contracción de la infección Las actividades humanas en edificios mal ventilados que pulverizan partículas que luego se inhalan (es decir, limpieza, agitación de alfombras, polvo) se identifican con frecuencia entre los pacientes admitidos para el SHCPS [11, 122]. Se cree que las actividades al aire libre transmiten un menor riesgo debido a la labilidad de los hantavirus a la radiación UV y a la supuesta tendencia a dispersarse en el viento, aunque ciertas condiciones ambientales parecen mantener el virus durante períodos más largos fuera de su huésped natural, lo que permite la transmisión indirecta [123]. Una vía alternativa pero poco común de transmisión del virus es la mordedura de roedores [124] [125] [126]. Los trabajadores sobre el terreno que manipulan mamíferos corren un riesgo potencialmente mayor de exposición a infecciones por hantavirus, aunque cuando se cuantifica a través de serosurveys el riesgo absoluto parece bastante leve [127]. Un nuevo estudio en Colorado sugiere la posibilidad de que una picadura de roedor haya sido el vehículo próximo para la transmisión al aire libre de NVS [128], lo que vuelve a enfatizar el uso de equipo de protección personal durante las actividades de trabajo de campo [129]. Como caso particular dentro de los hantavirus, la transmisión de persona a persona ha sido documentada exclusivamente para el virus de los Andes sudamericanos [130] [133] [133] [135]. La identificación de esta vía de transmisión se ha hecho utilizando tanto herramientas moleculares como encuestas epidemiológicas, pero el mecanismo de transmisión interpersonal no está bien establecido. Curiosamente, ANDV también puede ser derramado por los humanos a través de otros fluidos biológicos como la orina [136], ilustrando las propiedades particulares que diferencian este virus de otros hantavirus. Aunque la transmisión interpersonal parece ser única para ANDV, el ARN viral de PUUV se ha detectado en la saliva de pacientes con HFRS, y algunos pacientes con SNV-HCPS tienen ARN viral en las secreciones traqueales [88, 137]. Los Hantavirus en las Américas son alojados naturalmente por roedores (Muridae y Cricetidae) así como las musarañas (Soricidae) y los lunares (Talpidae) (Figura 1). Tres especies de musgo y un mole han sido reportados para albergar hantavirus y su patogenicidad para los humanos permanece desconocida [22, 138, 139]. Se han identificado al menos 15 especies de roedores como portadores de diferentes hantavirus patógenos, con algunos genotipos sudamericanos como Castelo do Sonhos (CDSV) o Hu39694 sólo identificados después de infecciones humanas (Figura 1 ). Los hantavirus suelen mostrar una alta especificidad de especie y ningún huésped intermedio [140]. Sin embargo, se han descrito algunos genotipos de hantavirus en la misma especie de roedores. Tal es el caso de Playa de Oro (OROV) y Catacamas (CATV) identificados en Oryzomys couesi [141, 142], o Maporal (MAPV) y Choclo (CHOV) hospedados por O. fulvescens [91, 143]. En América del Norte se han detectado virus de muleshoe y Black Creek Canal hanta en sigmodon hispidus [ Además, un genotipo de hantavirus (por ejemplo, el virus similar a Juquitiba) puede ser transportado por más de una especie de roedores (O. nigripes, Oxymycterus judex, Akodon montesis). Otro ejemplo es el virus Laguna Negra (LANV) que después de ser identificado en Calomys laucha [146] también ha sido reportado en C. callosus [147]. El rápido aumento en el descubrimiento de nuevos hantavirus y la identificación de sus anfitriones no parece probable que termine tan pronto como se examinen nuevas especies pequeñas de mamíferos [95]. Este tema se complica por la continua controversia en los criterios para la clasificación de distintos hantavirus [148, 149], que también está vinculado a la clasificación taxonómica y los reordenamientos taxonómicos. La transmisión de especies cruzadas es un proceso importante durante la propagación, aparición y evolución Particularmente dentro de los hantavirus, los derrames a los huéspedes secundarios se identifican cada vez más a medida que se realizan estudios más extensos [151] [152] [153] [155] [156]. Por ejemplo, ANDV es el agente etiológico predominante del HCPS en América del Sur, y O. longicaudatus el principal reservorio de roedores. Derrama en al menos otras cuatro especies de roedores que coocurren con el reservorio se han identificado, con Abrothrix longipilis mostrando la segunda mayor prevalencia de anticuerpos de ANDV, y actualmente no hay duda de que el virus es extremadamente similar genéticamente entre los dos roedores del huésped [157, 158]. En América del Norte, el derrame del virus Bayou (BAYV) puede haber ocurrido desde el reservorio principal de O. palustris a S. hispidus, R. fulvescens, P. leucopus y B. taylori [159] [160] [161]. Es más probable que el derrame del virus Hanta se produzca con poblaciones de acogida que habitan regiones simpatricas o sintópicas [151, 162], y la transmisión de especies cruzadas tendría probablemente mayores posibilidades de éxito si las especies anfitrionas están estrechamente relacionadas [163]. Se encuentra una excepción interesante entre el virus Oxbow (OXBV) y el virus Asama (ASAV) en el que un proceso de cambio de huésped parecía haber ocurrido entre mamíferos pertenecientes a dos familias (Talpidae y Soricidae), probablemente como resultado de la codivergencia alterna y recurrente de ciertos tax Los hantavirus son transmitidos horizontalmente entre roedores y no son transmitidos por artrópodos (a diferencia de otros virus de la familia Bunyaviridae). La infección por derrapadores a mamíferos no humanos generalmente no produce ninguna transmisión hacia adelante (o a fin de morir), pero si los seres humanos están infectados pueden resultar en una alta morbilidad y mortalidad [122, 164]. Durante la primavera de 1993, un brote de pacientes con HCPS debido a SNV ocurrió en los estados de Four Corners, resultando en más del 60% de casos de mortalidad entre los casos iniciales, muchos de los cuales involucran a miembros de la tribu Navajo [12, 121]. En Panamá, se notificó un brote durante 1999-2000 en Los Santos, y 12 casos donde se identificaron con tres muertes [165, 166]. Esto representó el primer informe de infecciones por hantavirus humanos en América Central. En América del Sur, Diecisiete individuos fueron identificados con anticuerpo NVS (ELISA) o fueron antígenos (HCI) positivos de 52 casos sospechosos [167]. En 1996 ocurrieron brotes mayores debidos a ANDV en el sur de Argentina [131, 134] ; en el sur de Chile se presentaron grupos de pacientes con enfermedad por hantavirus en 1997 [158]. En Brasil, el primer brote fue identificado en la Amazonía Brasileña (Estado de Maranhão) en el año 2000, e involucró pequeños pueblos que resultaron en una prevalencia del 13,3% de los evaluados (398 residentes totales) [168]. Los factores que desencadenan los brotes de hantavirus todavía son mal entendidos, probablemente porque resultan de varias características bióticas y abióticas interactuantes cuyos parámetros clave son difíciles de modelar. Sin embargo, el uso de nuevos enfoques de modelado que involucran características geográficas y ambientales parece ser prometedor a la hora de predecir posibles brotes de hantavirus y/o áreas de mayor riesgo [169] [170] [171] [172]. Debido a que se sabe que los hantavirus se transmiten directamente de los huéspedes infectados a los susceptibles, el primer enfoque natural es relacionar los brotes con la ecología de los huéspedes virales. La transmisión y persistencia del hantavirus en las poblaciones de roedores depende de varios factores que interactúan para afectar la dinámica ecológica del huésped, que a su vez está fuertemente influenciada por las características de comportamiento de las especies de roedores individuales, a la estructura paisajística y a las características ambientales [173, 174]. La transmisión viral depende de las tasas de contacto entre los huéspedes sensibles, y a pesar de la noción prevaleciente de que un aumento de la densidad se encuentra y, por lo tanto, de Además, se ha demostrado que la transmisión de NVS sigue un patrón de heterogeneidad de contacto, donde los individuos de la población tienen diferentes probabilidades de transmitir la infección [176]. La comprensión de la transmisión viral resulta ser mucho más compleja cuando especies distintas del principal huésped del reservorio se incorporan en el modelo. De hecho, estudios recientes han demostrado que la mayor diversidad de especies hospedantes está correlacionada con una menor prevalencia de infección en América del Norte para P. maniculatus [177], en América Central para O. fulvescens (reservorio del virus Choclo) y Zygodontomys brevicauda (reservorio del virus Calabazo) [178], y en América del Sur para Akodon montensis (reservorio del virus Jabora) [162]. Las tasas de contacto varían según la distribución espacial de las poblaciones y parecen estar Por ejemplo, la prevalencia de SNV en P. maniculatus fue mayor en paisajes con mayor grado de fragmentación del hábitat preferido [179]. Además, ciertas propiedades del paisaje como elevación, pendiente y cubierta terrestre parecen ser útiles para detectar áreas con infecciones persistentes de SNV, y por lo tanto se consideran áreas refugiales donde el virus puede mantenerse durante años [169]. Los cambios en el entorno natural de las especies de reservorios, como la fragmentación forestal y la pérdida de hábitat, pueden alterar la abundancia y distribución de la población y provocar brotes de hantavirus, como se observa en la Península de Azurero de Panamá [118, 119]. Además, las diferencias en el microhábitat, incluida la cubierta superficial, pueden conducir a diferencias en la dinámica ecológica dentro de las poblaciones y afectar a la tasa de exposición al virus [180]. Se han encontrado diferencias en las infecciones por hantavirus a través de paisajes contrastantes en el intervalo latitudinal en poblaciones de roedores de O. longicaudatus en Chile, lo que sugiere que los seres humanos están expuestos de manera diferencial al virus [107, 181]. La dinámica poblacional de roedores se ve afectada por cambios estacionales de clima y clima [182, 183]. En el caso de los brotes asociados a ENSO, se ha postulado una compleja cascada de eventos desencadenados por lluvias altamente inusuales en el año precedente para dar lugar a un aumento de la producción primaria y densidades de roedores, aumentando también la probabilidad de transmisión del virus a los seres humanos, pero ha resultado difícil demostrar con precisión los eventos intermedios sugeridos, como el aumento de las densidades de roedores en el aumento de la carga de casos [116, 121, 184]. En América del Sur, los efectos del cambio climático y los brotes de hantavirus no han sido bien estudiados, a pesar del conocimiento de que varias especies de roedores que son reservorios de enfermedades emergentes se han visto dramáticamente afectadas por eventos como El Niño [185]. Los cambios en la dinámica de la población de acogida también se ven afectados por la estacionalidad, lo que puede conducir a brotes de enfermedades cuando se interrumpen los procesos que equilibran las poblaciones de roedores de temporada en temporada [186]. La emergencia viral puede seguir promoviéndose a medida que los cambios introducidos por el ser humano continúan aumentando en el medio ambiente a diferentes escalas geográficas. Estos cambios también pueden alterar la estructura y dinámica de la población de roedores e interacciones interespecies creando condiciones que pueden conducir a brotes virales, establecimiento viral en nuevos hospederos, y la aparición de HCPS [102, 162], incluso con aparentemente leve perturbación ecológica al sistema virus-hospedero [188]. Ciertas características fisiopatológicas, incluyendo trombocitopenia y shock, de enfermedades por hantavirus de los seres humanos, tienen similitud sustancial con las fiebres hemorrágicas inducidas por otros virus tales arenavirus, filovirus y flavivirus, a pesar de compartir esencialmente ninguna secuencia similitud con ellos. Tales observaciones plantean preguntas acerca de si tales similitudes en la patogénesis son probables similitudes de fenotipo, o en cambio reportan la presencia de mecanismos moleculares comunes entre los virus. En esta revisión se discuten las propiedades generales, descubrimientos y epidemiología/ecología de las formas de hantavirus patógenos del Nuevo Mundo, y también se busca identificar algunas de las características de las macromoléculas virales y mecanismos inmunológicos que se han propuesto como potenciales mediadores directos de los eventos patógenos que caracterizan la enfermedad humana HCPS. Si bien es poco probable que la expresión de una proteína viral particular o ARNs en aislamiento se pueda confiar en replicar fenotipos clave de infección por el virus completo, algunos de los hallazgos han sido suficientemente consistentes con lo que se conoce de la patogénesis in vivo que ofrecen plomos plausibles de primer paso en la búsqueda de objetivos terapéuticos. Esperamos con interés las revelaciones mecanísticas que seguirán el uso inevitablemente ampliado de métodos poderosos como la secuenciación profunda, imágenes cada vez más avanzadas, y métodos microscópicos, y modelos animales que por fin se pueden decir

¿Qué mecanismo potencial, podría presumirse que subyace a la patogénesis del HCPS?

Los hantavirus en las Américas y su papel como patógenos emergenteshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3185593/SHA: efe13a8d42b60ef9f7387ea539a1b2eeb5f80101Autores: Hjelle, Brian; Torres-Pérez, FernandoFecha: 2010-11-25DOI: 10.3390/v2125559Licencia: cc-byAbstract: La continua aparición y reaparición de patógenos representan una amenaza continua, a veces mayor, para las poblaciones. Los hantavirus (familia Bunyaviridae) y sus enfermedades humanas asociadas se consideraron confinados a Eurasia, pero la aparición de un brote en el suroeste de Estados Unidos llevó a un gran aumento en su estudio entre los virólogos de todo el mundo. Se han descrito más de 40 genotipos hantavirales, la gran mayoría desde 1993, y casi la mitad de ellos patógenos para los seres humanos. Los hantavirus causan infecciones persistentes en sus reservorios, y en las Américas, la enfermedad humana se manifiesta como compromiso cardiopulmonar, síndrome cardiopulmonar del hantavirus (HCPS), con proporciones de casos-fatalidad, para los serotipos virales más comunes, entre el 30% y el 40%. Alteración del hábitat y trastornos ecológicos a mayor escala, tal vez incluyendo el cambio climático, son algunos de los factores que pueden haber aumentado la carga de casos humanos de HCPS entre 1993 y el presente. Consideramos aquí las características que influyen en la estructura de la dinámica de la población huésped que pueden conducir a brotes virales, así como los determinantes macromoleculares de los hantavirus que han sido considerados como potenciales contribuciones a la patogenicidad. Texto: Los patógenos emergentes causan enfermedades nuevas o no reconocidas anteriormente, y entre ellas, las zoonóticas emergentes son una preocupación importante entre los científicos que estudian enfermedades infecciosas a diferentes escalas espaciales y temporales [1, 2]. Los cambios en las condiciones bióticas y abióticas pueden alterar la dinámica de las enfermedades de la población y conducir a la aparición de infecciones zoonóticas [3] [5] [6]. Durante las últimas décadas, se han producido varios brotes de patógenos virales emergentes y reemergentes, que afectan tanto a la implicación puramente local como a nivel mundial/pandémica de las poblaciones humanas. Entre los ejemplos visibles están la gripe A, el virus del Ébola, el virus de la hepatitis C, el trastorno respiratorio grave para adultos (SARS), el coronavirus y el virus de la inmunodeficiencia humana, que desafían las medidas de prevención y control de los sistemas de salud pública [7]. En las Américas, el reciente brote de gripe pandémica A subtipo H1N1 se convirtió en un objetivo importante de control debido a su rápida propagación, y las incertidumbres en cuanto a virulencia y transmisibilidad, sin embargo, la disponibilidad de vacunas fue limitada cuando se produjo una actividad significativa antes de la temporada tradicional de gripe [8]. Sin embargo, en el último siglo han surgido o resurgido brotes de varias enfermedades virales relacionadas con los virus arenavirus y el dengue, y más recientemente, hantavirus y la expansión del rango geográfico del virus del Nilo Occidental. Entre las enfermedades zoonóticas, los mamíferos pequeños son anfitriones de varios virus ARN patógenos, especialmente Arenaviridae y Bunyaviridae: Hantavirus [9] [10] [11]. Las infecciones por hantavirus se convirtieron en una preocupación en las Américas después de la descripción de un brote de distrés respiratorio agudo ocurrido en la zona La enfermedad recientemente reconocida, el síndrome cardiopulmonar del hantavirus, el HCPS (o síndrome pulmonar del hantavirus), se relacionó con la infección por el virus del Sin Nombre (SNV) recién descubierto, y el roedor Peromyscus maniculatus (ratón venado) fue identificado como el reservorio [13]. Sin embargo, las infecciones por hantavirus tienen una historia mucho más larga. Una revisión de los escritos chinos antiguos, que datan de aproximadamente 960 dC, reveló descripciones muy parecidas a la fiebre hemorrágica con síndrome renal (HFRS), el síndrome causado por los hantavirus del Viejo Mundo [14]. Durante el siglo XX, los casos de enfermedad febril aguda con compromiso renal fueron descritos de varios países eurasiáticos y Japón, a menudo en asociación con compromisos militares [15]. El HFRS como síndrome distinto, sin embargo, fue llamado por primera vez a la atención de la medicina occidental en asociación con un brote que ocurrió entre las tropas de las Naciones Unidas durante el conflicto coreano entre 1951 y 1954, donde más de 3.200 soldados fueron afectados [16]. Tomó más de dos décadas hasta que el agente etiológico, el virus Hantaan (HTNV), fue aislado del ratón de campo rayado Apodemus agrarius, detectado en parte por la unión de anticuerpos de muestras de suero de paciente a los tejidos pulmonares de ratones de campo sanos y salvajes [17, 18]. El virus se encontró más tarde para representar la especie tipo de un nuevo género Hantavirus de la familia Bunyaviridae, aunque fue más tarde evidente que el primer hantavirus a aislarse fue el virus Thottapalayam de shrew-borne [19]. La categorización de los hantavirus como pertenecientes a la familia Bunyaviridae se debe en parte a la presencia consistente de tres genomas de ARN que son circularizados in vivo como resultado de la presencia de nucleótidos terminales complementarios que ayudan a doblar el genoma en una morfología -hairpin-, descrita por primera vez para el flebovirus Uukuniemi [19, 20]. La Tabla 1 es una lista de los hantavirus patógenos predominantemente distintos serológicamente. Se describen muchos otros genotipos llamados, pero tales otras formas patogénicas están generalmente estrechamente relacionadas con los Andes o, en algunos casos, el virus Sin Nombre. Durante la maduración del virus, el precursor forma GPC se procesa utilizando una proteasa unida a la membrana en Gn y Gc, una escisión que ocurre, y parece ser señalada, después de la señal péptida conservada WAASA en la C-terminal de Gn [24]. Aunque las dos proteínas se pueden expresar de forma independiente a través de la transfección, pueden ser retenidas en el compartimento celular incorrecto (ER o aggrosome); por lo tanto, deben ser co-expresadas para permitirles estabilidad para que las dos se puedan ensamblar correctamente en el Golgi [25, [27] [28]. Se han identificado varias actividades y propiedades para las glicoproteínas envolventes del hantavirus, incluyendo algunas características que se sospecha que están involucradas en la patogenicidad de los serotipos causantes de la enfermedad, una posibilidad que ha generado atención experimental. Las glucoproteínas son los ligandos conocidos o presuntos para al menos dos receptores celulares distintos, la cadena de integrina y el factor acelerador de la descomposición, o DAF [30, 31] ; con gC1qR/p32 también identificado como otro receptor de entrada potencial [32]. Comparaciones con la proteína E del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, llevaron a Tischler et al. a considerar la glicoproteína Gc como una proteína potencial de fusión de clase II, tal vez impartiendo actividad de fusión al virión, y esta hipótesis ha ganado apoyo en otros estudios [33, 34]. Se han identificado actividades adicionales con, o se afirma que están relacionadas con, Gn. Para muchos de estos estudios, una premisa subyacente ha sostenido que hay diferencias entre las glicoproteínas de hantavirus -patógenos en relación con virus en el género que se denominan Si bien es cierto que aún no ha sido posible vincular el virus de Prospect Hill (PHV) con la enfermedad humana, la ausencia de evidencia de su patogenicidad tal vez no debería equipararse con la evidencia de su ausencia. Sólo se podría considerar que el nivel de enfermedad (por ejemplo, letargo, fiebre, proteinuria y azotemia) asociado con la infección de primates no humanos por PHV no es significativamente diferente del registrado para los modelos de primates no humanos utilizando el virus conocido del patógeno Puumala (PUUV) [35, 36]. Para el propósito de esta discusión, presumiremos que los hantavirus apatogénicos son efectivamente apatogénicos. Mientras que algunos estudios han sugerido que las glicoproteínas Gn se dirigen más rápidamente a la vía ubiquitina-proteosoma que a las formas apatogénicas, otros han interpretado las diferencias en el manejo de las glicoproteínas Gn a través de especies de hantavirus por el sistema ubiquitina-proteosomal como independientes de la patogenicidad [37] [38] [39]. Algunos investigadores han dirigido sus esfuerzos hacia la identificación de una capacidad diferencial, ya sea cinética o de magnitud absoluta, en la capacidad de los hantavirus patógenos y apatogénicos para provocar una respuesta de interferón en las células. Una premisa que surge es que las formas apatogénicas tenderían a inducir una respuesta innata anterior que haría más probable que el virus se limpiara rápidamente o se volviera menos competente en su replicación, a fin de evitar cualquier respuesta patológica en el huésped [42] La respuesta innata anti-hantavirus puede en algunos casos ser atribuida a la interacción viral como ligando de TLR-3, pero no en otros, y en las células endoteliales, no parece requerir más que la partícula viral misma, incluso cuando se introduce en forma replicativa incompetente [43, 44]. Las proteínas y los ARNm inducidos prominentemente por los hantavirus incluyen MxA e IFIT-1 (ISG-56) y otros incluyendo algunos con actividad antiviral conocida o sospechada. Esos hantavirus, a menudo cepas altamente patógenas, que no inducen una respuesta antiviral potente, se sospechan o se presume que tienen un (más) potente mecanismo de antagonismo interferón-vía en relación con otros virus, un mecanismo que actúa positivamente para prevenir que se forme una respuesta innata efectiva, al menos temprano en la infección [4 Sin embargo, se reportan algunos casos en los que los hantavirus altamente patógenos, tales como NVS, también son capaces de inducir la expresión de los ARNm del gen estimulado por interferón, incluso muy temprano en la infección, con proteínas ISG, como se esperaba, tardando más tiempo en aparecer en la célula [44]. Las actividades anti-interferón también se han atribuido a la proteína NSs que se puede elaborar en células infectadas por serotipos que codifican esta proteína [46]. Otros investigadores han examinado las actividades de las glucoproteínas del hantavirus y otras proteínas que podrían afectar directamente a algunos aspectos de la progresión patogénica asociada a la infección por hantavirus en humanos, tales como cambios de permeabilidad vascular. Mientras que los primeros intentos de causar directamente aumentos en la permeabilidad de las monocapas endoteliales con partículas virales o infección viral fueron en gran medida decepcionantes, los hantavirus se han identificado como que afectan adversamente la migración endotelial sobre los sustratos y en la potenciación de la permeabilidad endotelial inducida por VEG-F [47, 48]. La proteína nucleocápsida o N más corta (+50 kD) es un componente estructural del nucleocápsido viral, junto con los segmentos de ARN viral genómico. Como proteína de unión al ARN que afecta a la horquilla del cabello de los segmentos genómicos con alta afinidad [49, 50], limita el acceso del ARN para alojar nucleasasas y ayuda a hacer que la replicación viral sea un proceso cerrado dentro del citoplasma. También actúa como una proteína de membrana periférica, al igual que la proteína L [51], una actividad que podría jugar un papel en su supuesta, pero aún no demostrada función como matriz [52]. Hasta hace poco, no se había apreciado que N tuviera una amplia variedad de otras actividades, algunas de las cuales pueden estar vinculadas, no sólo a los requisitos fundamentales de replicación, sino también a la interferencia con una serie de procesos intracelulares de la célula normal. Así, se ha propuesto una interacción entre el aminoterminal de la proteína N del hantavirus y la proteína celular Daxx, con la sugerencia de posibles consecuencias pro-apoptóticas [51]. N también se reporta que interactúa con microfilamentos actínicos, y la proteína SUMO-1 [53, 54]. Utilizando ensayos basados en el gen reportero, Connie Schmaljohn y sus colegas han informado que la proteína nucleocapsid del virus Hantaan tiene un papel inhibidor en las respuestas inflamatorias mediadas por NF kappa B (NF- â € € TM B). Los efectos sobre la expresión NF- € B parecen estar limitados a la prevención de su translocación nuclear después de su intento de activación con lipopolisacárido, LPS [55]. En el citoplasma de las células infectadas, la proteína N se puede encontrar en los cuerpos celulares P donde secuestra y protege los capuchones de 5'. Puede localizar los capuchones a través de su interacción con DCP1, un componente clave de los cuerpos P. Durante la infección por hantavirus, los ARN virales se concentran en los cuerpos P, a través de su interacción con N y DCP1. La proteína N demuestra la protección preferencial de los ARNm diseñados para terminar prematuramente su proteína codificada en comparación con los ARNm nativos [56]. La proteína N se ha vinculado cada vez más a la replicación y traducción virales, a veces de maneras no previstas anteriormente. Se encuentra entre una familia creciente de diversas proteínas virales que pueden servir como un inespecífico - ARN chaperone ®, una actividad que debe facilitar el acceso de la L polimerasa al ARNv para la transcripción y replicación, en que puede disociar transitoriamente estructuras de ARN mal dobladas [57]. Algunos de los efectos de la proteína N en la traducción no pueden ser inmediatamente reconocidos como adaptables en la naturaleza. Puede reemplazar todo el complejo de iniciación traslacional EIF4F, presentando simultáneamente el ribosoma con un reemplazo de la actividad de unión de la tapa de eIF 4E, uniéndose al complejo de pre-iniciación 43S, al igual que eIF 4G, al tiempo que reemplaza la actividad helicoidal de eIF 4A, que se presume que es necesaria para disociar la estructura de ARN de orden superior [56, 58]. Estos tres factores normalmente trabajan juntos para lograr la iniciación traslacional. En los cuerpos P, la capacidad de la proteína N de unirse a una alta afinidad a los oligoribonucleótidos celulares nativos tapados, junto con su actividad en la protección de ARNs tapados de la degradación, probablemente facilita el acceso de oligonucleótidos encapsulados para su uso en la iniciación transcripcional por L polimerasa (-cap ra Tráfico de N para el ensamblaje viral: Clásicamente, la proteína N en las células infectadas parece estar agrupada o partículas en la naturaleza, con una concentración pesada en una única ubicación perinuclear, ampliamente considerada como la Golgi [27]. Las proteínas N de los hantavirus se encuentran en asociación con fracciones de partículas, y los estudios confocales microscopía y bioquímico-inhibidores han demostrado que las trazas N a lo largo de microtúbulos pero no con filamentos de actina [52]. El destino final de N, para su ensamblaje en partículas virales es la Golgi, y que circula allí a través del complejo intermedio retículo-Golgi endoplasmático (ERGIC), también conocido como cúmulo vesicular-tubular [52]. Un inhibidor negativo dominante, la dinamitina, asociado con el transporte mediado por Los estudios posteriores sugieren que la dependencia específica del transporte microtubular es específica de los hantavirus del Viejo Mundo como el NVH, pero que el Hantavirus del Nuevo Mundo ANDV está asociado con filamentos de actina [59]. Sin embargo, los datos recientes indican que el transporte microtubular es efectivamente utilizado para el NVH del Nuevo Mundo [60]. Las enfermedades del Hantavirus del hombre desde hace mucho tiempo han sido sospechosas de tener una base inmunopatógena en parte debido a su período de incubación relativamente largo de 2-3 semanas y la asociación temporal observada entre los trastornos inmunológicos y la primera aparición de signos y síntomas de la enfermedad del hantavirus. HFRS y HCPS comparten muchas características clínicas, llevando a muchos investigadores a considerar que son, en esencia, diferentes manifestaciones de un proceso patógeno similar, que difieren principalmente en los órganos objetivo primarios de expresión de la enfermedad (Tabla La patogénesis de las infecciones por hantavirus es el tema de una revisión continuamente actualizada en la serie UpToDate [61]. Para el momento en que aparecen los síntomas en el HCPS, ambas respuestas antivirales fuertes, y, para los genotipos virales más virulentos, el ARN viral puede ser detectado en plasma sanguíneo o células sanguíneas nucleadas respectivamente [63, 64]. Al menos tres estudios han correlacionado el ARN viral plasmático con la gravedad de la enfermedad para el HCPS y el HFRS, sugiriendo que la replicación del virus juega un papel continuo y en tiempo real en la patogénesis viral [65] [66] [67]. Se han identificado varios cambios patológicos distintivos que ocurren tanto en el HFRS como en el HCPS. Una característica crítica de ambos es una fuga capilar transitoria (~ 1-5 días) que involucra el La fuga resultante es de carácter exudativo, con una composición química alta en proteínas y similar al plasma. La experiencia continua que indica el fuerte tropismo tisular para las células endoteliales, específicamente, es uno de los varios factores que hacen de la integra β3 un candidato especialmente atractivo como un importante receptor in vivo para los hantavirus. Es probable que los hantavirus lleguen a sus tejidos objetivo a través de la captación por los ganglios linfáticos regionales, tal vez con o dentro de un histiocito pulmonar escoltante. Las semillas del virus endotelio local, donde las primeras células infectadas dan lugar, en última instancia, a una viremia primaria, un proceso que parece tomar mucho tiempo para las infecciones por hantavirus [62, 63]. En el momento en que emerge la viremia secundaria, los agentes de las formas más severas de HFRS y HCPS han comenzado a alcanzar una masa suficiente para inducir, a través de las interacciones PAMP-PRR y otros medios, la expresión de citoquinas proinflamatorias [64]. Para HCPS, esa expresión favorece el lecho pulmonar y los órganos linfoides, pero, por razones desconocidas, ahorra el retroperitoneo y, en general, el riñón. En HFRS la situación se invierte, y sin embargo no se aprecia a menudo que el esperado tropismos tisulares preferentes de virus asociados a HFRS y sus contrapartes asociadas a HCPS para los lechos renal y pulmonar, respectivamente, no sea como se predeciría a través de las manifestaciones de las dos enfermedades. La elaboración local de mediadores inflamatorios y quimiotácticos se considera un requisito para el desarrollo Sin embargo, no es la hipoxemia, debido al edema pulmonar prominente, lo que conduce a la muerte en la mayoría de los casos fatales de HCPS, sino más bien la intoxicación del corazón por mediadores como aún no definidos, lo que conduce al estado de bajo gasto cardíaco y al síndrome de shock asociado [64, 65]. Es tentador especular que los mediadores producidos en el pulmón en conexión con el infiltrado inflamatorio pueden infiltrarse a través de la circulación coronaria con dilución mínima en HCPS, consecuencia desventajosa de la estrecha yuxtaposición anatómica de los dos órganos. Así, al menos tres clases de mecanismos potenciales, algunos superpuestos y todos ciertamente no exclusivos de los otros, podrían presumirse que subyacen a la patogénesis del HCPS. Estos incluyen:(1) Mecanismos inmunes innatos. La naturaleza de las interacciones entre los patrones moleculares asociados al patógeno del hantavirus (PAMP) y los receptores de reconocimiento del patrón (PRR) de las células endoteliales susceptibles comienzan a ser aclaradas. El HTNV prototípico parece ser reconocido por TLR-3 [43]. Tal infección tiene consecuencias tales como una mayor expresión del HLA-DR en las células dendríticas [66] y la diferenciación de los monocitos hacia las células dendríticas [67]. (2) Efectos virales directos. La correlación observada entre la carga viral y la gravedad de la enfermedad deja abierta la posibilidad de que las partículas del hantavirus o el ARN puedan tener efectos tóxicos sobre las células o sobre la señalización. Algunos investigadores han favorecido la toxicidad viral directa, actuando a través de la inhibición de la función de barrera celular endotelial, como una explicación de gran parte de la fuga capilar, aunque existe Una pista potencialmente importante hacia el mecanismo por el cual las infecciones por hantavirus agotan las plaquetas sanguíneas y, en algunos casos, causan manifestaciones hemorrágicas, fue avanzada por el reciente descubrimiento de que los hantavirus patógenos son capaces de reclutar plaquetas para adherirse a las superficies celulares endoteliales, con β3 integrina utilizada como elemento de unión crítica [69]. (3) Efectos patógenos causados por las actividades de macromoléculas virales específicas. Hemos revisado algunas de las actividades asociadas con los Gn, Gc y N, polipéptidos codificados viralmente en secciones anteriores. Modelos de prueba de patogénesis se pueden hacer más eficazmente cuando hay un modelo animal que imita aspectos clave de la enfermedad. No existe un modelo similar al HFRS, pero existen modelos animales para el transporte asintomático de PUUV y SNV por sus roedores portadores nativos, el banco vole Myodes glareolus y el ratón venado P. maniculatus; así como un modelo hámster sirio utilizando ANDV o el virus Aporal relacionado de Venezuela, para el cual se observa una enfermedad mimética HCPS [70] [71] [72] [73]. El modelo hámster ANDV-Sirio tiene una serie de características en común con la enfermedad humana, así como algunas diferencias. A diferencia de las enfermedades neurológicas que han sido posibles de provocar con HTNV, el modelo hámster para HCPS parece ser causado por fugas capilares que resultan en edema pulmonar y la producción de un derrame pleural con características exudativas. Típicamente los hámsteres mueren entre 11 y 14-d post-inoculación, reflejando un período de incubación ligeramente acelerado en comparación con las infecciones humanas. Al igual que con el HCPS humano, el examen microscópico del pulmón revela abundante deposición de fibrina, septo alveolar engrosado y antígeno viral expresado abundantemente en el endotelio microvascular. Los hámsteres infectados por ANDV equipados con dispositivos de monitoreo fisiológico mostraron disminución de las presiones de pulso, taquicardia e hipotensión que parecen imitar de cerca el shock que se cree que es la causa próxima de la muerte en pacientes que sucumben al HCPS [65, 74]. En comparación con la enfermedad humana, los hámsteres infectados por ANDV exhiben títulos excepcionalmente altos de ANDV vivo en sus tejidos, con gran parte de la replicación viral que se produce Los títulos de ANDV vivo en algunos casos superan los 10 8 /g, mientras que los aislados de hantavirus de los tejidos humanos han sido notoriamente difíciles de obtener. A pesar de la aparición universal de enzimas hepáticas levemente elevadas en pacientes con HCPS, las enzimas hepáticas no parecen estar presentes en niveles elevados en la sangre de hámsters enfermos incluso inmediatamente antes de la muerte [75]. El período prolongado de incubación asociado con la enfermedad por hantavirus da al huésped un tiempo considerable para montar una respuesta inmune madura contra el virus. Así, en contradición a infecciones de gravedad comparable y sintomatología relacionada asociada con arenavirus y filovirus, las infecciones por hantavirus en humanos se asocian con respuestas anticuerpos de título significativo por el momento en que comienzan los síntomas. A pesar de esta observación, parece ser posible que la variación natural en las respuestas individuales de anticuerpos neutralizantes entre los pacientes con infecciones por NVS pueda estar relacionada con la gravedad de la enfermedad, lo que sugiere que la administración de anticuerpos antivirales podría resultar efectiva terapéuticamente [76]. En el caso de la infección por ANDV, han surgido nuevas evidencias que indican que el aparente aclaramiento del virus de la sangre no resulta en la eliminación completa del estímulo antigénico por el virus, sugiriendo que el virus puede persistir, tal vez en algún sitio inmunológicamente privilegiado aún indeterminado [77]. Un papel para las respuestas patológicas mediadas por células T en el HFRS y el HCPS ha sido la fuente de especulación por una variedad de razones. La gravedad del SNS asociado al SNCP puede haber hecho más evidente que el inicio del edema pulmonar, la taquicardia y la hipertensión parecía estar todo, pero universalmente asociado temporalmente, con la aparición de un espectro de células altamente activadas del linaje linfoide en la sangre periférica. Se detectaron células con similitudes morfológicas cercanas a estos -inmunoblastos- en los pulmones congestionados y pesados de los pacientes que llegaron a la autopsia, así como en órganos linfoides y en las tríadas portal [63, [78] [79] [80]. Estas observaciones llevaron a especular que algún componente de la patogénesis por hantavirus podría estar vinculado a la aparición de células T antivirales que podrían estimular o contribuir a la aparición de una -tormenta de mediadores y el fenotipo de fuga capilar asociado. Estudios posteriores han confirmado la expectativa de que una fracción significativa de la población de inmunoblastos en pacientes con HCPS son células T con especificidad para epitopes específicos de antígenos virales de clase I presentados por el HLA, incluyendo Gn, Gc y N [77, [81] [82] [83]. Presumiblemente, las actividades antivirales de estas células, manifestadas en parte por su elaboración de mediadores en el intersticio afectado, pueden contribuir a la fuga endotelial/capilar que se encuentra en el corazón de la patogénesis del hantavirus. Debido a que los primeros casos de HCPS a menudo llegaron a la autopsia, se hizo posible examinar tejidos necropsiados para la expresión de citocinas. El estudio de Mori et al. (1999) revelaron una alta expresión relativa de citocinas proinflamatorias incluyendo TNF-, IL-1-, IL-6, proporcionando evidencia a favor de un modelo de tormenta de citoquinas para la patogénesis [64]. Los autores creían, basándose en la morfología de las células secretadoras de citoquinas, que tanto monocitos como linfocitos estaban contribuyendo a la producción de citocinas. Que los mediadores proinflamatorios se encuentran en niveles elevados en el plasma, así como el intersticio renal de pacientes con enfermedad hantaviral aguda se ha reconocido desde hace algún tiempo también [84, 85]. Si bien el diagnóstico de HCPS y HFRS se realiza mejor con serología IgM, en la etapa aguda de la infección por NVS, también se puede utilizar RT-PCR si se utilizan células sanguíneas o coágulos de sangre en lugar de plasma o suero, donde la sensibilidad incluso utilizando imprimaciones PCR anidadas disminuye a cerca del 70% [86] [87] [88]. En una instalación en la que se tratan muchos casos de HCPS, el centro médico de la Universidad de Nuevo México en Albuquerque, se ha ofrecido un servicio de diagnóstico en el que se analizan los hallazgos hematológicos del paciente para establecer la probabilidad de que un paciente tenga HCPS. La combinación de trombocitopenia, abundancia elevada de linfocitos -inmunoblasto-, población de células polimorfonucleares con desplazamiento izquierdo sin evidencia morfológica fuerte para su activación, y valores elevados de hemoglobina o hematocrito es altamente específica para el HCPS y permite a los clínicos la capacidad de poner pacientes presuntivos-HCPS en oxigenación de membrana extracorpórea (ECMO), que se cree que ha salvado a muchos pacientes de un resultado letal [89]. Se cree que la infección humana por hantavirus sigue el contacto con secreciones o excreciones producidas por roedores infectados. En los Estados Unidos, 538 infecciones humanas por hantavirus fueron reportadas hasta finales de diciembre de 2009 [90], con Nuevo México, Arizona y Colorado mostrando los casos más altos. Mientras que el prototípico hantavirus centroamericano en América Central fue el virus Rio Segundo de Reithrodontomys mexicanus de Costa Rica, la primera enfermedad humana apareció algunos años más tarde en Panamá, donde el virus Choclo (CHOV) surgió como el agente etiológico y se cree que es responsable de todos los casos conocidos de HCPS. La rata de arroz pigmeo fulvo Oligoryzomys fulvescens ha sido identificada como el reservorio de roedores [91]. En Panamá, los primeros casos de HCPS, aunque con poca o ninguna implicación cardiaca evidente, fueron reportados en 1999, y desde entonces, 106 infecciones humanas han ocurrido con una tasa de mortalidad del 26% [92]. Seroencuestas de mamíferos en México y Costa Rica han encontrado anticuerpos antihantavirus [93] [94] [95] [96], y se han notificado seroprevalencias que oscilan entre 0,6 y 1,6% en poblaciones humanas a pesar de la ausencia de casos conocidos de HCPS [97]. En América del Sur, los casos de HCPS se han identificado en Argentina, Bolivia, Brasil, Chile, Paraguay y Uruguay, y también se han notificado evidencias de exposición humana a hantavirus en Venezuela [98] y Perú [99]. En América del Sur, ANDV es el principal agente etiológico con casos en Chile y Argentina notificados desde 1995. En Chile, se han producido 671 casos de HCPS debido a ANDV durante el período 2001-2009 [100]. Desde 1995 se han reportado más de 1.000 casos de HCPS en Argentina [101] ; en el Brasil se han identificado aproximadamente 1.100 casos de HCPS entre 1993 y 2008 [102]. Las tasas de mortalidad por casos en esos tres países han sido similares, oscilando entre el 30% (Argentina), el 36% (Chile) y el 39% (Brasil). Las infecciones por Hantavirus ocurren con más frecuencia en hombres que en mujeres, aunque la proporción entre hombres y mujeres es muy variable. Por ejemplo, las comunidades panameñas mostraron una proporción de 55 hombres por 45 mujeres [103], mientras que en Chile la proporción es más sesgada por hombres (71%) [104]. En el Chaco paraguayo la proporción entre hombres y mujeres se aproxima al 50% [105]. En América del Norte, en diciembre de 2009 el 63% de los pacientes eran varones [90]. Todos los grupos étnicos y raciales parecen ser susceptibles a infecciones por el hantavirus, y las diferencias entre ciertos grupos (como indígenas y no indígenas) están más probablemente correlacionadas con el tipo de hábitat en el que reside la población (por ejemplo, zonas rurales frente a zonas urbanas). De hecho, las comunidades rurales representan la mayor incidencia global del hantavirus y, por lo tanto, están en mayor riesgo [92, [105] [106] [107] [108] [109] [109] [119], aunque también se ha destacado la importancia de los entornos peridomésticos como una importante zona de exposición [112, 113]. El principal mecanismo por el que los seres humanos adquieren la infección por el hantavirus es la exposición a aerosoles de heces contaminadas de roedores, orina y saliva [114, 115]. Esto puede ocurrir cuando los seres humanos residen en áreas cercanas a las que habitan los roedores, viven en áreas infestadas de roedores, o cuando los roedores invaden entornos humanos, que son más frecuentes en hábitats rurales.Existe una larga historia de coexistencia humana con roedores, lo que plantea dudas sobre el aparente aumento reciente de las enfermedades relacionadas con el hantavirus, especialmente el HCPS. Aparte de una aparente asociación con eventos de oscilación sureña de El Niño (ENSO) en algunas regiones [116, 117], los recientes incrementos en la incidencia del HCPS no parecen seguir un patrón temporal o espacial fácilmente definido. Sin embargo, algunas características del paisaje, como la fragmentación del hábitat o las áreas perturbadas por el ser humano, pueden influir en la dinámica de la población de roedores e impactar en la incidencia viral [118] [112] [112] [121]. A pesar de la estocástica asociada a la contracción de la infección Las actividades humanas en edificios mal ventilados que pulverizan partículas que luego se inhalan (es decir, limpieza, agitación de alfombras, polvo) se identifican con frecuencia entre los pacientes admitidos para el SHCPS [11, 122]. Se cree que las actividades al aire libre transmiten un menor riesgo debido a la labilidad de los hantavirus a la radiación UV y a la supuesta tendencia a dispersarse en el viento, aunque ciertas condiciones ambientales parecen mantener el virus durante períodos más largos fuera de su huésped natural, lo que permite la transmisión indirecta [123]. Una vía alternativa pero poco común de transmisión del virus es la mordedura de roedores [124] [125] [126]. Los trabajadores sobre el terreno que manipulan mamíferos corren un riesgo potencialmente mayor de exposición a infecciones por hantavirus, aunque cuando se cuantifica a través de serosurveys el riesgo absoluto parece bastante leve [127]. Un nuevo estudio en Colorado sugiere la posibilidad de que una picadura de roedor haya sido el vehículo próximo para la transmisión al aire libre de NVS [128], lo que vuelve a enfatizar el uso de equipo de protección personal durante las actividades de trabajo de campo [129]. Como caso particular dentro de los hantavirus, la transmisión de persona a persona ha sido documentada exclusivamente para el virus de los Andes sudamericanos [130] [133] [133] [135]. La identificación de esta vía de transmisión se ha hecho utilizando tanto herramientas moleculares como encuestas epidemiológicas, pero el mecanismo de transmisión interpersonal no está bien establecido. Curiosamente, ANDV también puede ser derramado por los humanos a través de otros fluidos biológicos como la orina [136], ilustrando las propiedades particulares que diferencian este virus de otros hantavirus. Aunque la transmisión interpersonal parece ser única para ANDV, el ARN viral de PUUV se ha detectado en la saliva de pacientes con HFRS, y algunos pacientes con SNV-HCPS tienen ARN viral en las secreciones traqueales [88, 137]. Los Hantavirus en las Américas son alojados naturalmente por roedores (Muridae y Cricetidae) así como las musarañas (Soricidae) y los lunares (Talpidae) (Figura 1). Tres especies de musgo y un mole han sido reportados para albergar hantavirus y su patogenicidad para los humanos permanece desconocida [22, 138, 139]. Se han identificado al menos 15 especies de roedores como portadores de diferentes hantavirus patógenos, con algunos genotipos sudamericanos como Castelo do Sonhos (CDSV) o Hu39694 sólo identificados después de infecciones humanas (Figura 1 ). Los hantavirus suelen mostrar una alta especificidad de especie y ningún huésped intermedio [140]. Sin embargo, se han descrito algunos genotipos de hantavirus en la misma especie de roedores. Tal es el caso de Playa de Oro (OROV) y Catacamas (CATV) identificados en Oryzomys couesi [141, 142], o Maporal (MAPV) y Choclo (CHOV) hospedados por O. fulvescens [91, 143]. En América del Norte se han detectado virus de muleshoe y Black Creek Canal hanta en sigmodon hispidus [ Además, un genotipo de hantavirus (por ejemplo, el virus similar a Juquitiba) puede ser transportado por más de una especie de roedores (O. nigripes, Oxymycterus judex, Akodon montesis). Otro ejemplo es el virus Laguna Negra (LANV) que después de ser identificado en Calomys laucha [146] también ha sido reportado en C. callosus [147]. El rápido aumento en el descubrimiento de nuevos hantavirus y la identificación de sus anfitriones no parece probable que termine tan pronto como se examinen nuevas especies pequeñas de mamíferos [95]. Este tema se complica por la continua controversia en los criterios para la clasificación de distintos hantavirus [148, 149], que también está vinculado a la clasificación taxonómica y los reordenamientos taxonómicos. La transmisión de especies cruzadas es un proceso importante durante la propagación, aparición y evolución Particularmente dentro de los hantavirus, los derrames a los huéspedes secundarios se identifican cada vez más a medida que se realizan estudios más extensos [151] [152] [153] [155] [156]. Por ejemplo, ANDV es el agente etiológico predominante del HCPS en América del Sur, y O. longicaudatus el principal reservorio de roedores. Derrama en al menos otras cuatro especies de roedores que coocurren con el reservorio se han identificado, con Abrothrix longipilis mostrando la segunda mayor prevalencia de anticuerpos de ANDV, y actualmente no hay duda de que el virus es extremadamente similar genéticamente entre los dos roedores del huésped [157, 158]. En América del Norte, el derrame del virus Bayou (BAYV) puede haber ocurrido desde el reservorio principal de O. palustris a S. hispidus, R. fulvescens, P. leucopus y B. taylori [159] [160] [161]. Es más probable que el derrame del virus Hanta se produzca con poblaciones de acogida que habitan regiones simpatricas o sintópicas [151, 162], y la transmisión de especies cruzadas tendría probablemente mayores posibilidades de éxito si las especies anfitrionas están estrechamente relacionadas [163]. Se encuentra una excepción interesante entre el virus Oxbow (OXBV) y el virus Asama (ASAV) en el que un proceso de cambio de huésped parecía haber ocurrido entre mamíferos pertenecientes a dos familias (Talpidae y Soricidae), probablemente como resultado de la codivergencia alterna y recurrente de ciertos tax Los hantavirus son transmitidos horizontalmente entre roedores y no son transmitidos por artrópodos (a diferencia de otros virus de la familia Bunyaviridae). La infección por derrapadores a mamíferos no humanos generalmente no produce ninguna transmisión hacia adelante (o a fin de morir), pero si los seres humanos están infectados pueden resultar en una alta morbilidad y mortalidad [122, 164]. Durante la primavera de 1993, un brote de pacientes con HCPS debido a SNV ocurrió en los estados de Four Corners, resultando en más del 60% de casos de mortalidad entre los casos iniciales, muchos de los cuales involucran a miembros de la tribu Navajo [12, 121]. En Panamá, se notificó un brote durante 1999-2000 en Los Santos, y 12 casos donde se identificaron con tres muertes [165, 166]. Esto representó el primer informe de infecciones por hantavirus humanos en América Central. En América del Sur, Diecisiete individuos fueron identificados con anticuerpo NVS (ELISA) o fueron antígenos (HCI) positivos de 52 casos sospechosos [167]. En 1996 ocurrieron brotes mayores debidos a ANDV en el sur de Argentina [131, 134] ; en el sur de Chile se presentaron grupos de pacientes con enfermedad por hantavirus en 1997 [158]. En Brasil, el primer brote fue identificado en la Amazonía Brasileña (Estado de Maranhão) en el año 2000, e involucró pequeños pueblos que resultaron en una prevalencia del 13,3% de los evaluados (398 residentes totales) [168]. Los factores que desencadenan los brotes de hantavirus todavía son mal entendidos, probablemente porque resultan de varias características bióticas y abióticas interactuantes cuyos parámetros clave son difíciles de modelar. Sin embargo, el uso de nuevos enfoques de modelado que involucran características geográficas y ambientales parece ser prometedor a la hora de predecir posibles brotes de hantavirus y/o áreas de mayor riesgo [169] [170] [171] [172]. Debido a que se sabe que los hantavirus se transmiten directamente de los huéspedes infectados a los susceptibles, el primer enfoque natural es relacionar los brotes con la ecología de los huéspedes virales. La transmisión y persistencia del hantavirus en las poblaciones de roedores depende de varios factores que interactúan para afectar la dinámica ecológica del huésped, que a su vez está fuertemente influenciada por las características de comportamiento de las especies de roedores individuales, a la estructura paisajística y a las características ambientales [173, 174]. La transmisión viral depende de las tasas de contacto entre los huéspedes sensibles, y a pesar de la noción prevaleciente de que un aumento de la densidad se encuentra y, por lo tanto, de Además, se ha demostrado que la transmisión de NVS sigue un patrón de heterogeneidad de contacto, donde los individuos de la población tienen diferentes probabilidades de transmitir la infección [176]. La comprensión de la transmisión viral resulta ser mucho más compleja cuando especies distintas del principal huésped del reservorio se incorporan en el modelo. De hecho, estudios recientes han demostrado que la mayor diversidad de especies hospedantes está correlacionada con una menor prevalencia de infección en América del Norte para P. maniculatus [177], en América Central para O. fulvescens (reservorio del virus Choclo) y Zygodontomys brevicauda (reservorio del virus Calabazo) [178], y en América del Sur para Akodon montensis (reservorio del virus Jabora) [162]. Las tasas de contacto varían según la distribución espacial de las poblaciones y parecen estar Por ejemplo, la prevalencia de SNV en P. maniculatus fue mayor en paisajes con mayor grado de fragmentación del hábitat preferido [179]. Además, ciertas propiedades del paisaje como elevación, pendiente y cubierta terrestre parecen ser útiles para detectar áreas con infecciones persistentes de SNV, y por lo tanto se consideran áreas refugiales donde el virus puede mantenerse durante años [169]. Los cambios en el entorno natural de las especies de reservorios, como la fragmentación forestal y la pérdida de hábitat, pueden alterar la abundancia y distribución de la población y provocar brotes de hantavirus, como se observa en la Península de Azurero de Panamá [118, 119]. Además, las diferencias en el microhábitat, incluida la cubierta superficial, pueden conducir a diferencias en la dinámica ecológica dentro de las poblaciones y afectar a la tasa de exposición al virus [180]. Se han encontrado diferencias en las infecciones por hantavirus a través de paisajes contrastantes en el intervalo latitudinal en poblaciones de roedores de O. longicaudatus en Chile, lo que sugiere que los seres humanos están expuestos de manera diferencial al virus [107, 181]. La dinámica poblacional de roedores se ve afectada por cambios estacionales de clima y clima [182, 183]. En el caso de los brotes asociados a ENSO, se ha postulado una compleja cascada de eventos desencadenados por lluvias altamente inusuales en el año precedente para dar lugar a un aumento de la producción primaria y densidades de roedores, aumentando también la probabilidad de transmisión del virus a los seres humanos, pero ha resultado difícil demostrar con precisión los eventos intermedios sugeridos, como el aumento de las densidades de roedores en el aumento de la carga de casos [116, 121, 184]. En América del Sur, los efectos del cambio climático y los brotes de hantavirus no han sido bien estudiados, a pesar del conocimiento de que varias especies de roedores que son reservorios de enfermedades emergentes se han visto dramáticamente afectadas por eventos como El Niño [185]. Los cambios en la dinámica de la población de acogida también se ven afectados por la estacionalidad, lo que puede conducir a brotes de enfermedades cuando se interrumpen los procesos que equilibran las poblaciones de roedores de temporada en temporada [186]. La emergencia viral puede seguir promoviéndose a medida que los cambios introducidos por el ser humano continúan aumentando en el medio ambiente a diferentes escalas geográficas. Estos cambios también pueden alterar la estructura y dinámica de la población de roedores e interacciones interespecies creando condiciones que pueden conducir a brotes virales, establecimiento viral en nuevos hospederos, y la aparición de HCPS [102, 162], incluso con aparentemente leve perturbación ecológica al sistema virus-hospedero [188]. Ciertas características fisiopatológicas, incluyendo trombocitopenia y shock, de enfermedades por hantavirus de los seres humanos, tienen similitud sustancial con las fiebres hemorrágicas inducidas por otros virus tales arenavirus, filovirus y flavivirus, a pesar de compartir esencialmente ninguna secuencia similitud con ellos. Tales observaciones plantean preguntas acerca de si tales similitudes en la patogénesis son probables similitudes de fenotipo, o en cambio reportan la presencia de mecanismos moleculares comunes entre los virus. En esta revisión se discuten las propiedades generales, descubrimientos y epidemiología/ecología de las formas de hantavirus patógenos del Nuevo Mundo, y también se busca identificar algunas de las características de las macromoléculas virales y mecanismos inmunológicos que se han propuesto como potenciales mediadores directos de los eventos patógenos que caracterizan la enfermedad humana HCPS. Si bien es poco probable que la expresión de una proteína viral particular o ARNs en aislamiento se pueda confiar en replicar fenotipos clave de infección por el virus completo, algunos de los hallazgos han sido suficientemente consistentes con lo que se conoce de la patogénesis in vivo que ofrecen plomos plausibles de primer paso en la búsqueda de objetivos terapéuticos. Esperamos con interés las revelaciones mecanísticas que seguirán el uso inevitablemente ampliado de métodos poderosos como la secuenciación profunda, imágenes cada vez más avanzadas, y métodos microscópicos, y modelos animales que por fin se pueden decir

¿Qué explicación han favorecido algunos investigadores para gran parte de la fuga capilar?

Los hantavirus en las Américas y su papel como patógenos emergenteshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3185593/SHA: efe13a8d42b60ef9f7387ea539a1b2eeb5f80101Autores: Hjelle, Brian; Torres-Pérez, FernandoFecha: 2010-11-25DOI: 10.3390/v2125559Licencia: cc-byAbstract: La continua aparición y reaparición de patógenos representan una amenaza continua, a veces mayor, para las poblaciones. Los hantavirus (familia Bunyaviridae) y sus enfermedades humanas asociadas se consideraron confinados a Eurasia, pero la aparición de un brote en el suroeste de Estados Unidos llevó a un gran aumento en su estudio entre los virólogos de todo el mundo. Se han descrito más de 40 genotipos hantavirales, la gran mayoría desde 1993, y casi la mitad de ellos patógenos para los seres humanos. Los hantavirus causan infecciones persistentes en sus reservorios, y en las Américas, la enfermedad humana se manifiesta como compromiso cardiopulmonar, síndrome cardiopulmonar del hantavirus (HCPS), con proporciones de casos-fatalidad, para los serotipos virales más comunes, entre el 30% y el 40%. Alteración del hábitat y trastornos ecológicos a mayor escala, tal vez incluyendo el cambio climático, son algunos de los factores que pueden haber aumentado la carga de casos humanos de HCPS entre 1993 y el presente. Consideramos aquí las características que influyen en la estructura de la dinámica de la población huésped que pueden conducir a brotes virales, así como los determinantes macromoleculares de los hantavirus que han sido considerados como potenciales contribuciones a la patogenicidad. Texto: Los patógenos emergentes causan enfermedades nuevas o no reconocidas anteriormente, y entre ellas, las zoonóticas emergentes son una preocupación importante entre los científicos que estudian enfermedades infecciosas a diferentes escalas espaciales y temporales [1, 2]. Los cambios en las condiciones bióticas y abióticas pueden alterar la dinámica de las enfermedades de la población y conducir a la aparición de infecciones zoonóticas [3] [5] [6]. Durante las últimas décadas, se han producido varios brotes de patógenos virales emergentes y reemergentes, que afectan tanto a la implicación puramente local como a nivel mundial/pandémica de las poblaciones humanas. Entre los ejemplos visibles están la gripe A, el virus del Ébola, el virus de la hepatitis C, el trastorno respiratorio grave para adultos (SARS), el coronavirus y el virus de la inmunodeficiencia humana, que desafían las medidas de prevención y control de los sistemas de salud pública [7]. En las Américas, el reciente brote de gripe pandémica A subtipo H1N1 se convirtió en un objetivo importante de control debido a su rápida propagación, y las incertidumbres en cuanto a virulencia y transmisibilidad, sin embargo, la disponibilidad de vacunas fue limitada cuando se produjo una actividad significativa antes de la temporada tradicional de gripe [8]. Sin embargo, en el último siglo han surgido o resurgido brotes de varias enfermedades virales relacionadas con el virus arenavirus y el virus del dengue, y más recientemente, hantavirus y la expansión del rango geográfico del virus del Nilo Occidental. Entre las enfermedades zoonóticas, los mamíferos pequeños son anfitriones de varios virus ARN patógenos, especialmente Arenaviridae y Bunyaviridae: Hantavirus [9] [10] [11]. Las infecciones por hantavirus se convirtieron en una preocupación en las Américas después de la descripción de un brote de distrés respiratorio agudo ocurrido en La enfermedad recientemente reconocida, el síndrome cardiopulmonar del hantavirus, el HCPS (o síndrome pulmonar del hantavirus), se relacionó con la infección por el virus del Sin Nombre (SNV) recién descubierto, y el roedor Peromyscus maniculatus (ratón venado) fue identificado como el reservorio [13]. Sin embargo, las infecciones por hantavirus tienen una historia mucho más larga. Una revisión de los escritos chinos antiguos, que datan de aproximadamente 960 dC, reveló descripciones muy parecidas a la fiebre hemorrágica con síndrome renal (HFRS), el síndrome causado por los hantavirus del Viejo Mundo [14]. Durante el siglo XX, los casos de enfermedad febril aguda con compromiso renal fueron descritos de varios países eurasiáticos y Japón, a menudo en asociación con compromisos militares [15]. El HFRS como síndrome distinto, sin embargo, fue llamado por primera vez a la atención de la medicina occidental en asociación con un brote que ocurrió entre las tropas de las Naciones Unidas durante el conflicto coreano entre 1951 y 1954, donde más de 3.200 soldados fueron afectados [16]. Tomó más de dos décadas hasta que el agente etiológico, el virus Hantaan (HTNV), fue aislado del ratón de campo rayado Apodemus agrarius, detectado en parte por la unión de anticuerpos de muestras de suero de paciente a los tejidos pulmonares de ratones de campo sanos y salvajes [17, 18]. El virus se encontró más tarde para representar la especie tipo de un nuevo género Hantavirus de la familia Bunyaviridae, aunque fue más tarde evidente que el primer hantavirus a aislarse fue el virus Thottapalayam de shrew-borne [19]. La categorización de los hantavirus como pertenecientes a la familia Bunyaviridae se debe en parte a la presencia consistente de tres genomas de ARN que son circularizados in vivo como resultado de la presencia de nucleótidos terminales complementarios que ayudan a doblar el genoma en una morfología -hairpin-, descrita por primera vez para el flebovirus Uukuniemi [19, 20]. La Tabla 1 es una lista de los hantavirus patógenos predominantemente distintos serológicamente. Se describen muchos otros genotipos llamados, pero tales otras formas patogénicas están generalmente estrechamente relacionadas con los Andes o, en algunos casos, el virus Sin Nombre. Durante la maduración del virus, el precursor forma GPC se procesa utilizando una proteasa unida a la membrana en Gn y Gc, una escisión que ocurre, y parece ser señalada, después de la señal péptida conservada WAASA en la C-terminal de Gn [24]. Aunque las dos proteínas se pueden expresar de forma independiente a través de la transfección, pueden ser retenidas en el compartimento celular incorrecto (ER o aggrosome); por lo tanto, deben ser co-expresadas para permitirles estabilidad para que las dos se puedan ensamblar correctamente en el Golgi [25, [27] [28]. Se han identificado varias actividades y propiedades para las glicoproteínas envolventes del hantavirus, incluyendo algunas características que se sospecha que están involucradas en la patogenicidad de los serotipos causantes de la enfermedad, una posibilidad que ha generado atención experimental. Las glucoproteínas son los ligandos conocidos o presuntos para al menos dos receptores celulares distintos, la cadena de integrina y el factor acelerador de la descomposición, o DAF [30, 31] ; con gC1qR/p32 también identificado como otro receptor de entrada potencial [32]. Comparaciones con la proteína E del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, llevaron a Tischler et al. a considerar la glicoproteína Gc como una proteína potencial de fusión de clase II, tal vez impartiendo actividad de fusión al virión, y esta hipótesis ha ganado apoyo en otros estudios [33, 34]. Se han identificado actividades adicionales con, o se afirma que están relacionadas con, Gn. Para muchos de estos estudios, una premisa subyacente ha sostenido que hay diferencias entre las glicoproteínas de hantavirus -patógenos en relación con virus en el género que se denominan Si bien es cierto que aún no ha sido posible vincular el virus de Prospect Hill (PHV) con la enfermedad humana, la ausencia de evidencia de su patogenicidad tal vez no debería equipararse con la evidencia de su ausencia. Sólo se podría considerar que el nivel de enfermedad (por ejemplo, letargo, fiebre, proteinuria y azotemia) asociado con la infección de primates no humanos por PHV no es significativamente diferente del registrado para los modelos de primates no humanos utilizando el virus conocido del patógeno Puumala (PUUV) [35, 36]. Para el propósito de esta discusión, presumiremos que los hantavirus apatogénicos son efectivamente apatogénicos. Mientras que algunos estudios han sugerido que las glicoproteínas Gn se dirigen más rápidamente a la vía ubiquitina-proteosoma que a las formas apatogénicas, otros han interpretado las diferencias en el manejo de las glicoproteínas Gn a través de las especies del hantavirus por el sistema ubiquitina-proteosomal como independientes de la patogenicidad [37] [38] [39]. Algunos investigadores han dirigido sus esfuerzos hacia la identificación de una capacidad diferencial, ya sea cinética o de magnitud absoluta, en la capacidad de los hantavirus patógenos y apatogénicos para provocar una respuesta del interferón en las células. Una premisa que surge es que las formas apatogénicas tenderían a inducir una respuesta innata anterior que haría más probable que el virus se limpiara rápidamente o se volviera menos competente en su replicación, a fin de evitar cualquier respuesta patológica en el huésped [4 La respuesta innata anti-hantavirus puede en algunos casos ser atribuida a la interacción viral como ligando de TLR-3, pero no en otros, y en las células endoteliales, no parece requerir más que la partícula viral misma, incluso cuando se introduce en forma replicante-incompetente [43, 44]. Proteínas y ARNm inducidos prominentemente por los hantavirus incluyen MxA e IFIT-1 (ISG-56) y otros incluyendo algunos con actividad antiviral conocida o sospechada. Esos hantavirus, a menudo cepas altamente patógenas, que no inducen una respuesta antiviral potente, se sospechan o se presume que tienen un (más) potente mecanismo de antagonismo interferón-vía en relación con otros virus, un mecanismo que actúa positivamente para prevenir que se forme una respuesta innata efectiva, al menos temprano en Sin embargo, se reportan algunos casos en los que los hantavirus altamente patógenos, tales como NVS, también son capaces de inducir la expresión de los ARNm del gen estimulado por interferón, incluso muy temprano en la infección, con proteínas ISG, como se esperaba, tardando más tiempo en aparecer en la célula [44]. Las actividades anti-interferón también se han atribuido a la proteína NSs que se puede elaborar en células infectadas por serotipos que codifican esta proteína [46]. Otros investigadores han examinado las actividades de las glucoproteínas del hantavirus y otras proteínas que podrían afectar directamente a algunos aspectos de la progresión patogénica asociada a la infección por hantavirus en humanos, tales como cambios en la permeabilidad vascular. Mientras que los primeros intentos de causar directamente aumentos en la permeabilidad de las monocapas endoteliales con partículas virales o infección viral fueron en gran medida decepcionantes, los hantavirus se han identificado como que afectan adversamente la migración endotelial sobre los sustratos y en la potenciación de la permeabilidad endotelial inducida por VEG-F [47, 48]. La proteína nucleocápsida o N más corta (+50 kD) es un componente estructural del nucleocápsido viral, junto con los segmentos de ARN viral genómico. Como proteína de unión al ARN que afecta a la horquilla del cabello de los segmentos genómicos con alta afinidad [49, 50], limita el acceso del ARN para alojar nucleasasas y ayuda a hacer que la replicación viral sea un proceso cerrado dentro del citoplasma. También actúa como una proteína de membrana periférica, al igual que la proteína L [51], una actividad que podría jugar un papel en su supuesta, pero aún no demostrada función como matriz [52]. Hasta hace poco, no se había apreciado que N tuviera una amplia variedad de otras actividades, algunas de las cuales pueden estar vinculadas, no sólo a los requisitos fundamentales de replicación, sino también a la interferencia con una serie de procesos intracelulares de la célula normal. Así, se ha propuesto una interacción entre el aminoterminal de la proteína N del hantavirus y la proteína celular Daxx, con la sugerencia de posibles consecuencias pro-apoptóticas [51]. N también se reporta que interactúa con microfilamentos actínicos, y la proteína SUMO-1 [53, 54]. Utilizando ensayos basados en el gen reportero, Connie Schmaljohn y sus colegas han reportado que la proteína nucleocapsida del virus Hantaan tiene un papel inhibidor en las respuestas inflamatorias mediadas por NF kappa B (NF- B). Los efectos sobre la expresión NF- B parecen estar limitados a la prevención de su translocación nuclear después de su intento de activación con lipopolisacárido, LPS [55]. En el citoplasma de las células infectadas, la proteína N se puede encontrar en los cuerpos celulares P donde secuestra y protege los capuchones de 5'. Puede localizar los capuchones a través de su interacción con DCP1, un componente clave de los cuerpos P. Durante la infección por hantavirus, los ARN virales se concentran en los cuerpos P, a través de su interacción con N y DCP1. La proteína N demuestra la protección preferencial de los ARNm diseñados para terminar prematuramente su proteína codificada en comparación con los ARNm nativos [56]. La proteína N se ha vinculado cada vez más a la replicación y traducción virales, a veces de maneras no previstas anteriormente. Se encuentra entre una familia creciente de diversas proteínas virales que pueden servir como un inespecífico - ARN chaperone ®, una actividad que debe facilitar el acceso de la L polimerasa al ARNv para la transcripción y replicación, en que puede disociar transitoriamente estructuras de ARN mal dobladas [57]. Algunos de los efectos de la proteína N en la traducción no pueden ser inmediatamente reconocidos como adaptables en la naturaleza. Puede reemplazar todo el complejo de iniciación traslacional EIF4F, presentando simultáneamente el ribosoma con un reemplazo de la actividad de unión de la tapa de eIF 4E, uniéndose al complejo de pre-iniciación 43S, al igual que eIF 4G, al tiempo que reemplaza la actividad helicoidal de eIF 4A, que se presume que es necesaria para disociar la estructura de ARN de orden superior [56, 58]. Estos tres factores normalmente trabajan juntos para lograr la iniciación traslacional. En los cuerpos P, la capacidad de la proteína N de unirse a una alta afinidad a los oligoribonucleótidos celulares nativos tapados, junto con su actividad en la protección de ARNs tapados de la degradación, probablemente facilita el acceso de oligonucleótidos encapsulados para su uso en la iniciación transcripcional por L polimerasa (-cap ra Tráfico de N para el ensamblaje viral: Clásicamente, la proteína N en las células infectadas parece estar agrupada o partículas en la naturaleza, con una concentración pesada en una única ubicación perinuclear, ampliamente considerada como la Golgi [27]. Las proteínas N de los hantavirus se encuentran en asociación con fracciones de partículas, y los estudios confocales microscopía y bioquímico-inhibidores han demostrado que las trazas N a lo largo de microtúbulos pero no con filamentos de actina [52]. El destino final de N, para su ensamblaje en partículas virales es la Golgi, y que circula allí a través del complejo intermedio retículo-Golgi endoplasmático (ERGIC), también conocido como cúmulo vesicular-tubular [52]. Un inhibidor negativo dominante, la dinamitina, asociado con el transporte mediado por Los estudios posteriores sugieren que la dependencia específica del transporte microtubular es específica de los hantavirus del Viejo Mundo como el NVH, pero que el Hantavirus del Nuevo Mundo ANDV está asociado con filamentos de actina [59]. Sin embargo, los datos recientes indican que el transporte microtubular es efectivamente utilizado para el NVH del Nuevo Mundo [60]. Las enfermedades del Hantavirus del hombre desde hace mucho tiempo han sido sospechosas de tener una base inmunopatógena en parte debido a su período de incubación relativamente largo de 2-3 semanas y la asociación temporal observada entre los trastornos inmunológicos y la primera aparición de signos y síntomas de la enfermedad del hantavirus. HFRS y HCPS comparten muchas características clínicas, llevando a muchos investigadores a considerar que son, en esencia, diferentes manifestaciones de un proceso patógeno similar, que difieren principalmente en los órganos objetivo primarios de expresión de la enfermedad (Tabla La patogénesis de las infecciones por hantavirus es el tema de una revisión continuamente actualizada en la serie UpToDate [61]. Para el momento en que aparecen los síntomas en el HCPS, ambas respuestas antivirales fuertes, y, para los genotipos virales más virulentos, el ARN viral puede ser detectado en plasma sanguíneo o células sanguíneas nucleadas respectivamente [63, 64]. Al menos tres estudios han correlacionado el ARN viral plasmático con la gravedad de la enfermedad para el HCPS y el HFRS, sugiriendo que la replicación del virus juega un papel continuo y en tiempo real en la patogénesis viral [65] [66] [67]. Se han identificado varios cambios patológicos distintivos que ocurren tanto en el HFRS como en el HCPS. Una característica crítica de ambos es una fuga capilar transitoria (~ 1-5 días) que involucra el La fuga resultante es de carácter exudativo, con una composición química alta en proteínas y similar al plasma. La experiencia continua que indica el fuerte tropismo tisular para las células endoteliales, específicamente, es uno de los varios factores que hacen de la integra β3 un candidato especialmente atractivo como un importante receptor in vivo para los hantavirus. Es probable que los hantavirus lleguen a sus tejidos objetivo a través de la captación por los ganglios linfáticos regionales, tal vez con o dentro de un histiocito pulmonar escoltante. Las semillas del virus endotelio local, donde las primeras células infectadas dan lugar, en última instancia, a una viremia primaria, un proceso que parece tomar mucho tiempo para las infecciones por hantavirus [62, 63]. En el momento en que emerge la viremia secundaria, los agentes de las formas más severas de HFRS y HCPS han comenzado a alcanzar una masa suficiente para inducir, a través de las interacciones PAMP-PRR y otros medios, la expresión de citoquinas proinflamatorias [64]. Para HCPS, esa expresión favorece el lecho pulmonar y los órganos linfoides, pero, por razones desconocidas, ahorra el retroperitoneo y, en general, el riñón. En HFRS la situación se invierte, y sin embargo no se aprecia a menudo que el esperado tropismos tisulares preferentes de virus asociados a HFRS y sus contrapartes asociadas a HCPS para los lechos renal y pulmonar, respectivamente, no es como se predeciría a través de las manifestaciones de las dos enfermedades. La elaboración local de mediadores inflamatorios y quimiotácticos se considera un requisito para el desarrollo de Sin embargo, no es la hipoxemia, debido al edema pulmonar prominente, lo que conduce a la muerte en la mayoría de los casos fatales de HCPS, sino más bien la intoxicación del corazón por mediadores como aún no definidos, lo que conduce al estado de bajo gasto cardíaco y al síndrome de shock asociado [64, 65]. Es tentador especular que los mediadores producidos en el pulmón en conexión con el infiltrado inflamatorio pueden infiltrarse a través de la circulación coronaria con dilución mínima en HCPS, consecuencia desventajosa de la estrecha yuxtaposición anatómica de los dos órganos. Así, al menos tres clases de mecanismos potenciales, algunos superpuestos y todos ciertamente no exclusivos de los otros, podrían presumirse que subyacen a la patogénesis del HCPS. Estos incluyen:(1) Mecanismos inmunes innatos. La naturaleza de las interacciones entre los patrones moleculares asociados al patógeno del hantavirus (PAMP) y los receptores de reconocimiento del patrón (PRR) de las células endoteliales susceptibles comienzan a ser aclaradas. El HTNV prototípico parece ser reconocido por TLR-3 [43]. Tal infección tiene consecuencias tales como una mayor expresión del HLA-DR en las células dendríticas [66] y la diferenciación de los monocitos hacia las células dendríticas [67]. (2) Efectos virales directos. La correlación observada entre la carga viral y la gravedad de la enfermedad deja abierta la posibilidad de que las partículas del hantavirus o el ARN puedan tener efectos tóxicos sobre las células o sobre la señalización. Algunos investigadores han favorecido la toxicidad viral directa, actuando a través de la inhibición de la función de barrera celular endotelial, como una explicación de gran parte de la fuga capilar, aunque existe Una pista potencialmente importante hacia el mecanismo por el cual las infecciones por hantavirus agotan las plaquetas sanguíneas y, en algunos casos, causan manifestaciones hemorrágicas, fue avanzada por el reciente descubrimiento de que los hantavirus patógenos son capaces de reclutar plaquetas para adherirse a las superficies celulares endoteliales, con β3 integrina utilizada como elemento de unión crítica [69]. (3) Efectos patógenos causados por las actividades de macromoléculas virales específicas. Hemos revisado algunas de las actividades asociadas con los Gn, Gc y N, polipéptidos codificados viralmente en secciones anteriores. Modelos de prueba de patogénesis se pueden hacer más eficazmente cuando hay un modelo animal que imita aspectos clave de la enfermedad. No existe un modelo similar al HFRS, pero existen modelos animales para el transporte asintomático de PUUV y SNV por sus roedores portadores nativos, el banco vole Myodes glareolus y el ratón de venado P. maniculatus; así como un modelo de hámster sirio utilizando ANDV o el virus Aporal relacionado de Venezuela, para el cual se observa una enfermedad mimética HCPS [70] [71] [72] [73]. El modelo de hámster ANDV-Sirio tiene una serie de características en común con la enfermedad humana, así como algunas diferencias. A diferencia de las enfermedades neurológicas que han sido posibles de provocar con HTNV, el modelo de hámster para HCPS parece ser causado por fugas capilares que resultan en edema pulmonar y la producción de un derrame pleural con características exuda Típicamente los hámsteres mueren entre 11 y 14-d post-inoculación, reflejando un período de incubación ligeramente acelerado en comparación con las infecciones humanas. Al igual que con el HCPS humano, el examen microscópico del pulmón revela abundante deposición de fibrina, septo alveolar engrosado y antígeno viral expresado abundantemente en el endotelio microvascular. Los hámsteres infectados por ANDV equipados con dispositivos de monitoreo fisiológico mostraron disminución de las presiones de pulso, taquicardia e hipotensión que parecen imitar de cerca el shock que se cree que es la causa próxima de la muerte en pacientes que sucumben al HCPS [65, 74]. En comparación con la enfermedad humana, los hámsteres infectados por ANDV exhiben títulos excepcionalmente altos de ANDV vivo en sus tejidos, con gran parte de la replicación viral que ocurre en Los títulos de ANDV vivo en algunos casos superan los 10 8 /g, mientras que los aislados de hantavirus de los tejidos humanos han sido notoriamente difíciles de obtener. A pesar de la aparición universal de enzimas hepáticas levemente elevadas en pacientes con HCPS, las enzimas hepáticas no parecen estar presentes en niveles elevados en la sangre de hámsters enfermos incluso inmediatamente antes de la muerte [75]. El período prolongado de incubación asociado con la enfermedad por hantavirus da al huésped un tiempo considerable para montar una respuesta inmune madura contra el virus. Así, en contradición a infecciones de gravedad comparable y sintomatología relacionada asociada con arenavirus y filovirus, las infecciones por hantavirus en humanos se asocian con respuestas anticuerpos de título significativo por el momento en que comienzan los síntomas. A pesar de esta observación, parece ser posible que la variación natural en las respuestas individuales de anticuerpos neutralizantes entre los pacientes con infecciones por NVS pueda estar relacionada con la gravedad de la enfermedad, lo que sugiere que la administración de anticuerpos antivirales podría resultar efectiva terapéuticamente [76]. En el caso de la infección por ANDV, han surgido nuevas evidencias que indican que el aparente aclaramiento del virus de la sangre no resulta en la eliminación completa del estímulo antigénico por el virus, sugiriendo que el virus puede persistir, tal vez en algún sitio inmunológicamente privilegiado aún indeterminado [77]. Un papel para las respuestas patológicas mediadas por células T en el HFRS y el HCPS ha sido la fuente de especulación por una variedad de razones. La gravedad del SNS asociado al SNCP puede haber hecho más evidente que el inicio del edema pulmonar, la taquicardia y la hipertensión parecía estar todo, pero universalmente asociado temporalmente, con la aparición de un espectro de células altamente activadas del linaje linfoide en la sangre periférica. Se detectaron células con similitudes morfológicas cercanas a estos -inmunoblastos- en los pulmones congestionados y pesados de los pacientes que llegaron a la autopsia, así como en órganos linfoides y en las tríadas portal [63, [78] [79] [80]. Estas observaciones llevaron a especular que algún componente de la patogénesis por hantavirus podría estar vinculado a la aparición de células T antivirales que podrían estimular o contribuir a la aparición de una -tormenta de mediadores y el fenotipo de fuga capilar asociado. Estudios posteriores han confirmado la expectativa de que una fracción significativa de la población de inmunoblastos en pacientes con HCPS son células T con especificidad para epitopes específicos de antígenos virales de clase I presentados por el HLA, incluyendo Gn, Gc y N [77, [81] [82] [83]. Presumiblemente, las actividades antivirales de estas células, manifestadas en parte por su elaboración de mediadores en el intersticio afectado, pueden contribuir a la fuga endotelial/capilar que se encuentra en el corazón de la patogénesis del hantavirus. Debido a que los primeros casos de HCPS a menudo llegaron a la autopsia, se hizo posible examinar tejidos necropsiados para la expresión de citocinas. El estudio de Mori et al. (1999) revelaron una alta expresión relativa de citocinas proinflamatorias incluyendo TNF-, IL-1-, IL-6, proporcionando evidencia a favor de un modelo de tormenta de citoquinas para la patogénesis [64]. Los autores creían, basándose en la morfología de las células secretadoras de citoquinas, que tanto monocitos como linfocitos estaban contribuyendo a la producción de citocinas. Que los mediadores proinflamatorios se encuentran en niveles elevados en el plasma, así como el intersticio renal de pacientes con enfermedad hantaviral aguda se ha reconocido desde hace algún tiempo también [84, 85]. Si bien el diagnóstico de HCPS y HFRS se realiza mejor con serología IgM, en la etapa aguda de la infección por NVS, también se puede utilizar RT-PCR si se utilizan células sanguíneas o coágulos de sangre en lugar de plasma o suero, donde la sensibilidad incluso utilizando imprimaciones PCR anidadas disminuye a cerca del 70% [86] [87] [88]. En una instalación en la que se tratan muchos casos de HCPS, el centro médico de la Universidad de Nuevo México en Albuquerque, se ha ofrecido un servicio de diagnóstico en el que se analizan los hallazgos hematológicos del paciente para establecer la probabilidad de que un paciente tenga HCPS. La combinación de trombocitopenia, abundancia elevada de linfocitos -inmunoblasto-, población de células polimorfonucleares con desplazamiento izquierdo sin evidencia morfológica fuerte para su activación, y valores elevados de hemoglobina o hematocrito es altamente específica para el HCPS y permite a los clínicos la capacidad de poner pacientes presuntivos-HCPS en oxigenación de membrana extracorpórea (ECMO), que se cree que ha salvado a muchos pacientes de un resultado letal [89]. Se cree que la infección humana por hantavirus sigue el contacto con secreciones o excreciones producidas por roedores infectados. En los Estados Unidos, 538 infecciones humanas por hantavirus fueron reportadas hasta finales de diciembre de 2009 [90], con Nuevo México, Arizona y Colorado mostrando los casos más altos. Mientras que el prototípico hantavirus centroamericano en América Central fue el virus Rio Segundo de Reithrodontomys mexicanus de Costa Rica, la primera enfermedad humana apareció algunos años más tarde en Panamá, donde el virus Choclo (CHOV) surgió como el agente etiológico y se cree que es responsable de todos los casos conocidos de HCPS. La rata de arroz pigmeo fulvo Oligoryzomys fulvescens ha sido identificada como el reservorio de roedores [91]. En Panamá, los primeros casos de HCPS, aunque con poca o ninguna implicación cardiaca evidente, fueron reportados en 1999, y desde entonces, 106 infecciones humanas han ocurrido con una tasa de mortalidad del 26% [92]. Seroencuestas de mamíferos en México y Costa Rica han encontrado anticuerpos antihantavirus [93] [94] [95] [96], y se han notificado seroprevalencias que oscilan entre 0,6 y 1,6% en poblaciones humanas a pesar de la ausencia de casos conocidos de HCPS [97]. En América del Sur, los casos de HCPS se han identificado en Argentina, Bolivia, Brasil, Chile, Paraguay y Uruguay, y también se han notificado evidencias de exposición humana a hantavirus en Venezuela [98] y Perú [99]. En América del Sur, ANDV es el principal agente etiológico con casos en Chile y Argentina notificados desde 1995. En Chile, se han producido 671 casos de HCPS debido a ANDV durante el período 2001-2009 [100]. Desde 1995 se han reportado más de 1.000 casos de HCPS en Argentina [101] ; en el Brasil se han identificado aproximadamente 1.100 casos de HCPS entre 1993 y 2008 [102]. Las tasas de mortalidad por casos en esos tres países han sido similares, oscilando entre el 30% (Argentina), el 36% (Chile) y el 39% (Brasil). Las infecciones por Hantavirus ocurren con más frecuencia en hombres que en mujeres, aunque la proporción entre hombres y mujeres es muy variable. Por ejemplo, las comunidades panameñas mostraron una proporción de 55 hombres por 45 mujeres [103], mientras que en Chile la proporción es más sesgada por hombres (71%) [104]. En el Chaco paraguayo la proporción entre hombres y mujeres se aproxima al 50% [105]. En América del Norte, en diciembre de 2009 el 63% de los pacientes eran varones [90]. Todos los grupos étnicos y raciales parecen ser susceptibles a infecciones por el hantavirus, y las diferencias entre ciertos grupos (como indígenas y no indígenas) están más probablemente correlacionadas con el tipo de hábitat en el que reside la población (por ejemplo, zonas rurales frente a zonas urbanas). De hecho, las comunidades rurales representan la mayor incidencia global del hantavirus y, por lo tanto, están en mayor riesgo [92, [105] [106] [107] [108] [109] [109] [119], aunque también se ha destacado la importancia de los entornos peridomésticos como una importante zona de exposición [112, 113]. El principal mecanismo por el que los seres humanos adquieren la infección por el hantavirus es la exposición a aerosoles de heces contaminadas de roedores, orina y saliva [114, 115]. Esto puede ocurrir cuando los seres humanos residen en áreas cercanas a las que habitan los roedores, viven en áreas infestadas de roedores, o cuando los roedores invaden entornos humanos, que son más frecuentes en hábitats rurales.Existe una larga historia de coexistencia humana con roedores, lo que plantea dudas sobre el aparente aumento reciente de las enfermedades relacionadas con el hantavirus, especialmente el HCPS. Aparte de una aparente asociación con eventos de oscilación sureña de El Niño (ENSO) en algunas regiones [116, 117], los recientes incrementos en la incidencia del HCPS no parecen seguir un patrón temporal o espacial fácilmente definido. Sin embargo, algunas características del paisaje, como la fragmentación del hábitat o las áreas perturbadas por el ser humano, pueden influir en la dinámica de la población de roedores e impactar en la incidencia viral [118] [112] [112] [121]. A pesar de la estocástica asociada a la contracción de la infección Las actividades humanas en edificios mal ventilados que pulverizan partículas que luego se inhalan (es decir, limpieza, agitación de alfombras, polvo) se identifican con frecuencia entre los pacientes admitidos para el SHCPS [11, 122]. Se cree que las actividades al aire libre transmiten un menor riesgo debido a la labilidad de los hantavirus a la radiación UV y a la supuesta tendencia a dispersarse en el viento, aunque ciertas condiciones ambientales parecen mantener el virus durante períodos más largos fuera de su huésped natural, lo que permite la transmisión indirecta [123]. Una vía alternativa pero poco común de transmisión del virus es la mordedura de roedores [124] [125] [126]. Los trabajadores sobre el terreno que manipulan mamíferos corren un riesgo potencialmente mayor de exposición a infecciones por hantavirus, aunque cuando se cuantifica a través de serosurveys el riesgo absoluto parece bastante leve [127]. Un nuevo estudio en Colorado sugiere la posibilidad de que una picadura de roedor haya sido el vehículo próximo para la transmisión al aire libre de NVS [128], lo que vuelve a enfatizar el uso de equipo de protección personal durante las actividades de trabajo de campo [129]. Como caso particular dentro de los hantavirus, la transmisión de persona a persona ha sido documentada exclusivamente para el virus de los Andes sudamericanos [130] [133] [133] [135]. La identificación de esta vía de transmisión se ha hecho utilizando tanto herramientas moleculares como encuestas epidemiológicas, pero el mecanismo de transmisión interpersonal no está bien establecido. Curiosamente, ANDV también puede ser derramado por los humanos a través de otros fluidos biológicos como la orina [136], ilustrando las propiedades particulares que diferencian este virus de otros hantavirus. Aunque la transmisión interpersonal parece ser única para ANDV, el ARN viral de PUUV se ha detectado en la saliva de pacientes con HFRS, y algunos pacientes con SNV-HCPS tienen ARN viral en las secreciones traqueales [88, 137]. Los Hantavirus en las Américas son alojados naturalmente por roedores (Muridae y Cricetidae) así como las musarañas (Soricidae) y los lunares (Talpidae) (Figura 1). Tres especies de musgo y un mole han sido reportados para albergar hantavirus y su patogenicidad para los humanos permanece desconocida [22, 138, 139]. Se han identificado al menos 15 especies de roedores como portadores de diferentes hantavirus patógenos, con algunos genotipos sudamericanos como Castelo do Sonhos (CDSV) o Hu39694 sólo identificados después de infecciones humanas (Figura 1 ). Los hantavirus suelen mostrar una alta especificidad de especie y ningún huésped intermedio [140]. Sin embargo, se han descrito algunos genotipos de hantavirus en la misma especie de roedores. Tal es el caso de Playa de Oro (OROV) y Catacamas (CATV) identificados en Oryzomys couesi [141, 142], o Maporal (MAPV) y Choclo (CHOV) hospedados por O. fulvescens [91, 143]. En América del Norte se han detectado virus de muleshoe y Black Creek Canal hanta en sigmodon hispidus [ Además, un genotipo de hantavirus (por ejemplo, el virus similar a Juquitiba) puede ser transportado por más de una especie de roedores (O. nigripes, Oxymycterus judex, Akodon montesis). Otro ejemplo es el virus Laguna Negra (LANV) que después de ser identificado en Calomys laucha [146] también ha sido reportado en C. callosus [147]. El rápido aumento en el descubrimiento de nuevos hantavirus y la identificación de sus anfitriones no parece probable que termine tan pronto como se examinen nuevas especies pequeñas de mamíferos [95]. Este tema se complica por la continua controversia en los criterios para la clasificación de distintos hantavirus [148, 149], que también está vinculado a la clasificación taxonómica y los reordenamientos taxonómicos. La transmisión de especies cruzadas es un proceso importante durante la propagación, aparición y evolución Particularmente dentro de los hantavirus, los derrames a los huéspedes secundarios se identifican cada vez más a medida que se realizan estudios más extensos [151] [152] [153] [155] [156]. Por ejemplo, ANDV es el agente etiológico predominante del HCPS en América del Sur, y O. longicaudatus el principal reservorio de roedores. Derrama en al menos otras cuatro especies de roedores que coocurren con el reservorio se han identificado, con Abrothrix longipilis mostrando la segunda mayor prevalencia de anticuerpos de ANDV, y actualmente no hay duda de que el virus es extremadamente similar genéticamente entre los dos roedores del huésped [157, 158]. En América del Norte, el derrame del virus Bayou (BAYV) puede haber ocurrido desde el reservorio principal de O. palustris a S. hispidus, R. fulvescens, P. leucopus y B. taylori [159] [160] [161]. Es más probable que el derrame del virus Hanta se produzca con poblaciones de acogida que habitan regiones simpatricas o sintópicas [151, 162], y la transmisión de especies cruzadas tendría probablemente mayores posibilidades de éxito si las especies anfitrionas están estrechamente relacionadas [163]. Se encuentra una excepción interesante entre el virus Oxbow (OXBV) y el virus Asama (ASAV) en el que un proceso de cambio de huésped parecía haber ocurrido entre mamíferos pertenecientes a dos familias (Talpidae y Soricidae), probablemente como resultado de la codivergencia alterna y recurrente de ciertos tax Los hantavirus son transmitidos horizontalmente entre roedores y no son transmitidos por artrópodos (a diferencia de otros virus de la familia Bunyaviridae). La infección por derrapadores a mamíferos no humanos generalmente no produce ninguna transmisión hacia adelante (o a fin de morir), pero si los seres humanos están infectados pueden resultar en una alta morbilidad y mortalidad [122, 164]. Durante la primavera de 1993, un brote de pacientes con HCPS debido a SNV ocurrió en los estados de Four Corners, resultando en más del 60% de casos de mortalidad entre los casos iniciales, muchos de los cuales involucran a miembros de la tribu Navajo [12, 121]. En Panamá, se notificó un brote durante 1999-2000 en Los Santos, y 12 casos donde se identificaron con tres muertes [165, 166]. Esto representó el primer informe de infecciones por hantavirus humanos en América Central. En América del Sur, Diecisiete individuos fueron identificados con anticuerpo NVS (ELISA) o fueron antígenos (HCI) positivos de 52 casos sospechosos [167]. En 1996 ocurrieron brotes mayores debidos a ANDV en el sur de Argentina [131, 134] ; en el sur de Chile se presentaron grupos de pacientes con enfermedad por hantavirus en 1997 [158]. En Brasil, el primer brote fue identificado en la Amazonía Brasileña (Estado de Maranhão) en el año 2000, e involucró pequeños pueblos que resultaron en una prevalencia del 13,3% de los evaluados (398 residentes totales) [168]. Los factores que desencadenan los brotes de hantavirus todavía son mal entendidos, probablemente porque resultan de varias características bióticas y abióticas interactuantes cuyos parámetros clave son difíciles de modelar. Sin embargo, el uso de nuevos enfoques de modelado que involucran características geográficas y ambientales parece ser prometedor a la hora de predecir posibles brotes de hantavirus y/o áreas de mayor riesgo [169] [170] [171] [172]. Debido a que se sabe que los hantavirus se transmiten directamente de los huéspedes infectados a los susceptibles, el primer enfoque natural es relacionar los brotes con la ecología de los huéspedes virales. La transmisión y persistencia del hantavirus en las poblaciones de roedores depende de varios factores que interactúan para afectar la dinámica ecológica del huésped, que a su vez está fuertemente influenciada por las características de comportamiento de las especies de roedores individuales, a la estructura paisajística y a las características ambientales [173, 174]. La transmisión viral depende de las tasas de contacto entre los huéspedes sensibles, y a pesar de la noción prevaleciente de que un aumento de la densidad se encuentra y, por lo tanto, de Además, se ha demostrado que la transmisión de NVS sigue un patrón de heterogeneidad de contacto, donde los individuos de la población tienen diferentes probabilidades de transmitir la infección [176]. La comprensión de la transmisión viral resulta ser mucho más compleja cuando especies distintas del principal huésped del reservorio se incorporan en el modelo. De hecho, estudios recientes han demostrado que la mayor diversidad de especies hospedantes está correlacionada con una menor prevalencia de infección en América del Norte para P. maniculatus [177], en América Central para O. fulvescens (reservorio del virus Choclo) y Zygodontomys brevicauda (reservorio del virus Calabazo) [178], y en América del Sur para Akodon montensis (reservorio del virus Jabora) [162]. Las tasas de contacto varían según la distribución espacial de las poblaciones y parecen estar Por ejemplo, la prevalencia de SNV en P. maniculatus fue mayor en paisajes con mayor grado de fragmentación del hábitat preferido [179]. Además, ciertas propiedades del paisaje como elevación, pendiente y cubierta terrestre parecen ser útiles para detectar áreas con infecciones persistentes de SNV, y por lo tanto se consideran áreas refugiales donde el virus puede mantenerse durante años [169]. Los cambios en el entorno natural de las especies de reservorios, como la fragmentación forestal y la pérdida de hábitat, pueden alterar la abundancia y distribución de la población y provocar brotes de hantavirus, como se observa en la Península de Azurero de Panamá [118, 119]. Además, las diferencias en el microhábitat, incluida la cubierta superficial, pueden conducir a diferencias en la dinámica ecológica dentro de las poblaciones y afectar a la tasa de exposición al virus [180]. Se han encontrado diferencias en las infecciones por hantavirus a través de paisajes contrastantes en el intervalo latitudinal en poblaciones de roedores de O. longicaudatus en Chile, lo que sugiere que los seres humanos están expuestos de manera diferencial al virus [107, 181]. La dinámica poblacional de roedores se ve afectada por cambios estacionales de clima y clima [182, 183]. En el caso de los brotes asociados a ENSO, se ha postulado una compleja cascada de eventos desencadenados por lluvias altamente inusuales en el año precedente para dar lugar a un aumento de la producción primaria y densidades de roedores, aumentando también la probabilidad de transmisión del virus a los seres humanos, pero ha resultado difícil demostrar con precisión los eventos intermedios sugeridos, como el aumento de las densidades de roedores en el aumento de la carga de casos [116, 121, 184]. En América del Sur, los efectos del cambio climático y los brotes de hantavirus no han sido bien estudiados, a pesar del conocimiento de que varias especies de roedores que son reservorios de enfermedades emergentes se han visto dramáticamente afectadas por eventos como El Niño [185]. Los cambios en la dinámica de la población de acogida también se ven afectados por la estacionalidad, lo que puede conducir a brotes de enfermedades cuando se interrumpen los procesos que equilibran las poblaciones de roedores de temporada en temporada [186]. La emergencia viral puede seguir promoviéndose a medida que los cambios introducidos por el ser humano continúan aumentando en el medio ambiente a diferentes escalas geográficas. Estos cambios también pueden alterar la estructura y dinámica de la población de roedores e interacciones interespecies creando condiciones que pueden conducir a brotes virales, establecimiento viral en nuevos hospederos, y la aparición de HCPS [102, 162], incluso con aparentemente leve perturbación ecológica al sistema virus-hospedero [188]. Ciertas características fisiopatológicas, incluyendo trombocitopenia y shock, de enfermedades por hantavirus de los seres humanos, tienen similitud sustancial con las fiebres hemorrágicas inducidas por otros virus tales arenavirus, filovirus y flavivirus, a pesar de compartir esencialmente ninguna secuencia similitud con ellos. Tales observaciones plantean preguntas acerca de si tales similitudes en la patogénesis son probables similitudes de fenotipo, o en cambio reportan la presencia de mecanismos moleculares comunes entre los virus. En esta revisión se discuten las propiedades generales, descubrimientos y epidemiología/ecología de las formas de hantavirus patógenos del Nuevo Mundo, y también se busca identificar algunas de las características de las macromoléculas virales y mecanismos inmunológicos que se han propuesto como potenciales mediadores directos de los eventos patógenos que caracterizan la enfermedad humana HCPS. Si bien es poco probable que la expresión de una proteína viral particular o ARNs en aislamiento se pueda confiar en replicar fenotipos clave de infección por el virus completo, algunos de los hallazgos han sido suficientemente consistentes con lo que se conoce de la patogénesis in vivo que ofrecen plomos plausibles de primer paso en la búsqueda de objetivos terapéuticos. Esperamos con interés las revelaciones mecanísticas que seguirán el uso inevitablemente ampliado de métodos poderosos como la secuenciación profunda, imágenes cada vez más avanzadas, y métodos microscópicos, y modelos animales que por fin se pueden decir

¿Para qué puede utilizarse el modelo de hámster sirio?

Los hantavirus en las Américas y su papel como patógenos emergenteshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3185593/SHA: efe13a8d42b60ef9f7387ea539a1b2eeb5f80101Autores: Hjelle, Brian; Torres-Pérez, FernandoFecha: 2010-11-25DOI: 10.3390/v2125559Licencia: cc-byAbstract: La continua aparición y reaparición de patógenos representan una amenaza continua, a veces mayor, para las poblaciones. Los hantavirus (familia Bunyaviridae) y sus enfermedades humanas asociadas se consideraron confinados a Eurasia, pero la aparición de un brote en el suroeste de Estados Unidos llevó a un gran aumento en su estudio entre los virólogos de todo el mundo. Se han descrito más de 40 genotipos hantavirales, la gran mayoría desde 1993, y casi la mitad de ellos patógenos para los seres humanos. Los hantavirus causan infecciones persistentes en sus reservorios, y en las Américas, la enfermedad humana se manifiesta como compromiso cardiopulmonar, síndrome cardiopulmonar del hantavirus (HCPS), con proporciones de casos-fatalidad, para los serotipos virales más comunes, entre el 30% y el 40%. Alteración del hábitat y trastornos ecológicos a mayor escala, tal vez incluyendo el cambio climático, son algunos de los factores que pueden haber aumentado la carga de casos humanos de HCPS entre 1993 y el presente. Consideramos aquí las características que influyen en la estructura de la dinámica de la población huésped que pueden conducir a brotes virales, así como los determinantes macromoleculares de los hantavirus que han sido considerados como potenciales contribuciones a la patogenicidad. Texto: Los patógenos emergentes causan enfermedades nuevas o no reconocidas anteriormente, y entre ellas, las zoonóticas emergentes son una preocupación importante entre los científicos que estudian enfermedades infecciosas a diferentes escalas espaciales y temporales [1, 2]. Los cambios en las condiciones bióticas y abióticas pueden alterar la dinámica de las enfermedades de la población y conducir a la aparición de infecciones zoonóticas [3] [5] [6]. Durante las últimas décadas, se han producido varios brotes de patógenos virales emergentes y reemergentes, que afectan tanto a la implicación puramente local como a nivel mundial/pandémica de las poblaciones humanas. Entre los ejemplos visibles están la gripe A, el virus del Ébola, el virus de la hepatitis C, el trastorno respiratorio grave para adultos (SARS), el coronavirus y el virus de la inmunodeficiencia humana, que desafían las medidas de prevención y control de los sistemas de salud pública [7]. En las Américas, el reciente brote de gripe pandémica A subtipo H1N1 se convirtió en un objetivo importante de control debido a su rápida propagación, y las incertidumbres en cuanto a virulencia y transmisibilidad, sin embargo, la disponibilidad de vacunas fue limitada cuando se produjo una actividad significativa antes de la temporada tradicional de gripe [8]. Sin embargo, en el último siglo han surgido o resurgido brotes de varias enfermedades virales relacionadas con los virus arenavirus y el dengue, y más recientemente, hantavirus y la expansión del rango geográfico del virus del Nilo Occidental. Entre las enfermedades zoonóticas, los mamíferos pequeños son anfitriones de varios virus ARN patógenos, especialmente Arenaviridae y Bunyaviridae: Hantavirus [9] [10] [11]. Las infecciones por hantavirus se convirtieron en una preocupación en las Américas después de la descripción de un brote de distrés respiratorio agudo ocurrido en la zona La enfermedad recientemente reconocida, el síndrome cardiopulmonar del hantavirus, el HCPS (o síndrome pulmonar del hantavirus), se relacionó con la infección por el virus del Sin Nombre (SNV) recién descubierto, y el roedor Peromyscus maniculatus (ratón venado) fue identificado como el reservorio [13]. Sin embargo, las infecciones por hantavirus tienen una historia mucho más larga. Una revisión de los escritos chinos antiguos, que datan de aproximadamente 960 dC, reveló descripciones muy parecidas a la fiebre hemorrágica con síndrome renal (HFRS), el síndrome causado por los hantavirus del Viejo Mundo [14]. Durante el siglo XX, los casos de enfermedad febril aguda con compromiso renal fueron descritos de varios países eurasiáticos y Japón, a menudo en asociación con compromisos militares [15]. El HFRS como síndrome distinto, sin embargo, fue llamado por primera vez a la atención de la medicina occidental en asociación con un brote que ocurrió entre las tropas de las Naciones Unidas durante el conflicto coreano entre 1951 y 1954, donde más de 3.200 soldados fueron afectados [16]. Tomó más de dos décadas hasta que el agente etiológico, el virus Hantaan (HTNV), fue aislado del ratón de campo rayado Apodemus agrarius, detectado en parte por la unión de anticuerpos de muestras de suero de paciente a los tejidos pulmonares de ratones de campo sanos y salvajes [17, 18]. El virus se encontró más tarde para representar la especie tipo de un nuevo género Hantavirus de la familia Bunyaviridae, aunque fue más tarde evidente que el primer hantavirus a aislarse fue el virus Thottapalayam de shrew-borne [19]. La categorización de los hantavirus como pertenecientes a la familia Bunyaviridae se debe en parte a la presencia consistente de tres genomas de ARN que son circularizados in vivo como resultado de la presencia de nucleótidos terminales complementarios que ayudan a doblar el genoma en una morfología -hairpin-, descrita por primera vez para el flebovirus Uukuniemi [19, 20]. La Tabla 1 es una lista de los hantavirus patógenos predominantemente distintos serológicamente. Se describen muchos otros genotipos llamados, pero tales otras formas patogénicas están generalmente estrechamente relacionadas con los Andes o, en algunos casos, el virus Sin Nombre. Durante la maduración del virus, el precursor forma GPC se procesa utilizando una proteasa unida a la membrana en Gn y Gc, una escisión que ocurre, y parece ser señalada, después de la señal péptida conservada WAASA en la C-terminal de Gn [24]. Aunque las dos proteínas se pueden expresar de forma independiente a través de la transfección, pueden ser retenidas en el compartimento celular incorrecto (ER o aggrosome); por lo tanto, deben ser co-expresadas para permitirles estabilidad para que las dos se puedan ensamblar correctamente en el Golgi [25, [27] [28]. Se han identificado varias actividades y propiedades para las glicoproteínas envolventes del hantavirus, incluyendo algunas características que se sospecha que están involucradas en la patogenicidad de los serotipos causantes de la enfermedad, una posibilidad que ha generado atención experimental. Las glucoproteínas son los ligandos conocidos o presuntos para al menos dos receptores celulares distintos, la cadena de integrina y el factor acelerador de la descomposición, o DAF [30, 31] ; con gC1qR/p32 también identificado como otro receptor de entrada potencial [32]. Comparaciones con la proteína E del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, llevaron a Tischler et al. a considerar la glicoproteína Gc como una proteína potencial de fusión de clase II, tal vez impartiendo actividad de fusión al virión, y esta hipótesis ha ganado apoyo en otros estudios [33, 34]. Se han identificado actividades adicionales con, o se afirma que están relacionadas con, Gn. Para muchos de estos estudios, una premisa subyacente ha sostenido que hay diferencias entre las glicoproteínas de hantavirus -patógenos en relación con virus en el género que se denominan Si bien es cierto que aún no ha sido posible vincular el virus de Prospect Hill (PHV) con la enfermedad humana, la ausencia de evidencia de su patogenicidad tal vez no debería equipararse con la evidencia de su ausencia. Sólo se podría considerar que el nivel de enfermedad (por ejemplo, letargo, fiebre, proteinuria y azotemia) asociado con la infección de primates no humanos por PHV no es significativamente diferente del registrado para los modelos de primates no humanos utilizando el virus conocido del patógeno Puumala (PUUV) [35, 36]. Para el propósito de esta discusión, presumiremos que los hantavirus apatogénicos son efectivamente apatogénicos. Mientras que algunos estudios han sugerido que las glicoproteínas Gn se dirigen más rápidamente a la vía ubiquitina-proteosoma que a las formas apatogénicas, otros han interpretado las diferencias en el manejo de las glicoproteínas Gn a través de especies de hantavirus por el sistema ubiquitina-proteosomal como independientes de la patogenicidad [37] [38] [39]. Algunos investigadores han dirigido sus esfuerzos hacia la identificación de una capacidad diferencial, ya sea cinética o de magnitud absoluta, en la capacidad de los hantavirus patógenos y apatogénicos para provocar una respuesta de interferón en las células. Una premisa que surge es que las formas apatogénicas tenderían a inducir una respuesta innata anterior que haría más probable que el virus se limpiara rápidamente o se volviera menos competente en su replicación, a fin de evitar cualquier respuesta patológica en el huésped [42] La respuesta innata anti-hantavirus puede en algunos casos ser atribuida a la interacción viral como ligando de TLR-3, pero no en otros, y en las células endoteliales, no parece requerir más que la partícula viral misma, incluso cuando se introduce en forma replicativa incompetente [43, 44]. Las proteínas y los ARNm inducidos prominentemente por los hantavirus incluyen MxA e IFIT-1 (ISG-56) y otros incluyendo algunos con actividad antiviral conocida o sospechada. Esos hantavirus, a menudo cepas altamente patógenas, que no inducen una respuesta antiviral potente, se sospechan o se presume que tienen un (más) potente mecanismo de antagonismo interferón-vía en relación con otros virus, un mecanismo que actúa positivamente para prevenir que se forme una respuesta innata efectiva, al menos temprano en la infección [4 Sin embargo, se reportan algunos casos en los que los hantavirus altamente patógenos, tales como NVS, también son capaces de inducir la expresión de los ARNm del gen estimulado por interferón, incluso muy temprano en la infección, con proteínas ISG, como se esperaba, tardando más tiempo en aparecer en la célula [44]. Las actividades anti-interferón también se han atribuido a la proteína NSs que se puede elaborar en células infectadas por serotipos que codifican esta proteína [46]. Otros investigadores han examinado las actividades de las glucoproteínas del hantavirus y otras proteínas que podrían afectar directamente a algunos aspectos de la progresión patogénica asociada a la infección por hantavirus en humanos, tales como cambios de permeabilidad vascular. Mientras que los primeros intentos de causar directamente aumentos en la permeabilidad de las monocapas endoteliales con partículas virales o infección viral fueron en gran medida decepcionantes, los hantavirus se han identificado como que afectan adversamente la migración endotelial sobre los sustratos y en la potenciación de la permeabilidad endotelial inducida por VEG-F [47, 48]. La proteína nucleocápsida o N más corta (+50 kD) es un componente estructural del nucleocápsido viral, junto con los segmentos de ARN viral genómico. Como proteína de unión al ARN que afecta a la horquilla del cabello de los segmentos genómicos con alta afinidad [49, 50], limita el acceso del ARN para alojar nucleasasas y ayuda a hacer que la replicación viral sea un proceso cerrado dentro del citoplasma. También actúa como una proteína de membrana periférica, al igual que la proteína L [51], una actividad que podría jugar un papel en su supuesta, pero aún no demostrada función como matriz [52]. Hasta hace poco, no se había apreciado que N tuviera una amplia variedad de otras actividades, algunas de las cuales pueden estar vinculadas, no sólo a los requisitos fundamentales de replicación, sino también a la interferencia con una serie de procesos intracelulares de la célula normal. Así, se ha propuesto una interacción entre el aminoterminal de la proteína N del hantavirus y la proteína celular Daxx, con la sugerencia de posibles consecuencias pro-apoptóticas [51]. N también se reporta que interactúa con microfilamentos actínicos, y la proteína SUMO-1 [53, 54]. Utilizando ensayos basados en el gen reportero, Connie Schmaljohn y sus colegas han informado que la proteína nucleocapsid del virus Hantaan tiene un papel inhibidor en las respuestas inflamatorias mediadas por NF kappa B (NF- â € € TM B). Los efectos sobre la expresión NF- € B parecen estar limitados a la prevención de su translocación nuclear después de su intento de activación con lipopolisacárido, LPS [55]. En el citoplasma de las células infectadas, la proteína N se puede encontrar en los cuerpos celulares P donde secuestra y protege los capuchones de 5'. Puede localizar los capuchones a través de su interacción con DCP1, un componente clave de los cuerpos P. Durante la infección por hantavirus, los ARN virales se concentran en los cuerpos P, a través de su interacción con N y DCP1. La proteína N demuestra la protección preferencial de los ARNm diseñados para terminar prematuramente su proteína codificada en comparación con los ARNm nativos [56]. La proteína N se ha vinculado cada vez más a la replicación y traducción virales, a veces de maneras no previstas anteriormente. Se encuentra entre una familia creciente de diversas proteínas virales que pueden servir como un inespecífico - ARN chaperone ®, una actividad que debe facilitar el acceso de la L polimerasa al ARNv para la transcripción y replicación, en que puede disociar transitoriamente estructuras de ARN mal dobladas [57]. Algunos de los efectos de la proteína N en la traducción no pueden ser inmediatamente reconocidos como adaptables en la naturaleza. Puede reemplazar todo el complejo de iniciación traslacional EIF4F, presentando simultáneamente el ribosoma con un reemplazo de la actividad de unión de la tapa de eIF 4E, uniéndose al complejo de pre-iniciación 43S, al igual que eIF 4G, al tiempo que reemplaza la actividad helicoidal de eIF 4A, que se presume que es necesaria para disociar la estructura de ARN de orden superior [56, 58]. Estos tres factores normalmente trabajan juntos para lograr la iniciación traslacional. En los cuerpos P, la capacidad de la proteína N de unirse a una alta afinidad a los oligoribonucleótidos celulares nativos tapados, junto con su actividad en la protección de ARNs tapados de la degradación, probablemente facilita el acceso de oligonucleótidos encapsulados para su uso en la iniciación transcripcional por L polimerasa (-cap ra Tráfico de N para el ensamblaje viral: Clásicamente, la proteína N en las células infectadas parece estar agrupada o partículas en la naturaleza, con una concentración pesada en una única ubicación perinuclear, ampliamente considerada como la Golgi [27]. Las proteínas N de los hantavirus se encuentran en asociación con fracciones de partículas, y los estudios confocales microscopía y bioquímico-inhibidores han demostrado que las trazas N a lo largo de microtúbulos pero no con filamentos de actina [52]. El destino final de N, para su ensamblaje en partículas virales es la Golgi, y que circula allí a través del complejo intermedio retículo-Golgi endoplasmático (ERGIC), también conocido como cúmulo vesicular-tubular [52]. Un inhibidor negativo dominante, la dinamitina, asociado con el transporte mediado por Los estudios posteriores sugieren que la dependencia específica del transporte microtubular es específica de los hantavirus del Viejo Mundo como el NVH, pero que el Hantavirus del Nuevo Mundo ANDV está asociado con filamentos de actina [59]. Sin embargo, los datos recientes indican que el transporte microtubular es efectivamente utilizado para el NVH del Nuevo Mundo [60]. Las enfermedades del Hantavirus del hombre desde hace mucho tiempo han sido sospechosas de tener una base inmunopatógena en parte debido a su período de incubación relativamente largo de 2-3 semanas y la asociación temporal observada entre los trastornos inmunológicos y la primera aparición de signos y síntomas de la enfermedad del hantavirus. HFRS y HCPS comparten muchas características clínicas, llevando a muchos investigadores a considerar que son, en esencia, diferentes manifestaciones de un proceso patógeno similar, que difieren principalmente en los órganos objetivo primarios de expresión de la enfermedad (Tabla La patogénesis de las infecciones por hantavirus es el tema de una revisión continuamente actualizada en la serie UpToDate [61]. Para el momento en que aparecen los síntomas en el HCPS, ambas respuestas antivirales fuertes, y, para los genotipos virales más virulentos, el ARN viral puede ser detectado en plasma sanguíneo o células sanguíneas nucleadas respectivamente [63, 64]. Al menos tres estudios han correlacionado el ARN viral plasmático con la gravedad de la enfermedad para el HCPS y el HFRS, sugiriendo que la replicación del virus juega un papel continuo y en tiempo real en la patogénesis viral [65] [66] [67]. Se han identificado varios cambios patológicos distintivos que ocurren tanto en el HFRS como en el HCPS. Una característica crítica de ambos es una fuga capilar transitoria (~ 1-5 días) que involucra el La fuga resultante es de carácter exudativo, con una composición química alta en proteínas y similar al plasma. La experiencia continua que indica el fuerte tropismo tisular para las células endoteliales, específicamente, es uno de los varios factores que hacen de la integra β3 un candidato especialmente atractivo como un importante receptor in vivo para los hantavirus. Es probable que los hantavirus lleguen a sus tejidos objetivo a través de la captación por los ganglios linfáticos regionales, tal vez con o dentro de un histiocito pulmonar escoltante. Las semillas del virus endotelio local, donde las primeras células infectadas dan lugar, en última instancia, a una viremia primaria, un proceso que parece tomar mucho tiempo para las infecciones por hantavirus [62, 63]. En el momento en que emerge la viremia secundaria, los agentes de las formas más severas de HFRS y HCPS han comenzado a alcanzar una masa suficiente para inducir, a través de las interacciones PAMP-PRR y otros medios, la expresión de citoquinas proinflamatorias [64]. Para HCPS, esa expresión favorece el lecho pulmonar y los órganos linfoides, pero, por razones desconocidas, ahorra el retroperitoneo y, en general, el riñón. En HFRS la situación se invierte, y sin embargo no se aprecia a menudo que el esperado tropismos tisulares preferentes de virus asociados a HFRS y sus contrapartes asociadas a HCPS para los lechos renal y pulmonar, respectivamente, no sea como se predeciría a través de las manifestaciones de las dos enfermedades. La elaboración local de mediadores inflamatorios y quimiotácticos se considera un requisito para el desarrollo Sin embargo, no es la hipoxemia, debido al edema pulmonar prominente, lo que conduce a la muerte en la mayoría de los casos fatales de HCPS, sino más bien la intoxicación del corazón por mediadores como aún no definidos, lo que conduce al estado de bajo gasto cardíaco y al síndrome de shock asociado [64, 65]. Es tentador especular que los mediadores producidos en el pulmón en conexión con el infiltrado inflamatorio pueden infiltrarse a través de la circulación coronaria con dilución mínima en HCPS, consecuencia desventajosa de la estrecha yuxtaposición anatómica de los dos órganos. Así, al menos tres clases de mecanismos potenciales, algunos superpuestos y todos ciertamente no exclusivos de los otros, podrían presumirse que subyacen a la patogénesis del HCPS. Estos incluyen:(1) Mecanismos inmunes innatos. La naturaleza de las interacciones entre los patrones moleculares asociados al patógeno del hantavirus (PAMP) y los receptores de reconocimiento del patrón (PRR) de las células endoteliales susceptibles comienzan a ser aclaradas. El HTNV prototípico parece ser reconocido por TLR-3 [43]. Tal infección tiene consecuencias tales como una mayor expresión del HLA-DR en las células dendríticas [66] y la diferenciación de los monocitos hacia las células dendríticas [67]. (2) Efectos virales directos. La correlación observada entre la carga viral y la gravedad de la enfermedad deja abierta la posibilidad de que las partículas del hantavirus o el ARN puedan tener efectos tóxicos sobre las células o sobre la señalización. Algunos investigadores han favorecido la toxicidad viral directa, actuando a través de la inhibición de la función de barrera celular endotelial, como una explicación de gran parte de la fuga capilar, aunque existe Una pista potencialmente importante hacia el mecanismo por el cual las infecciones por hantavirus agotan las plaquetas sanguíneas y, en algunos casos, causan manifestaciones hemorrágicas, fue avanzada por el reciente descubrimiento de que los hantavirus patógenos son capaces de reclutar plaquetas para adherirse a las superficies celulares endoteliales, con β3 integrina utilizada como elemento de unión crítica [69]. (3) Efectos patógenos causados por las actividades de macromoléculas virales específicas. Hemos revisado algunas de las actividades asociadas con los Gn, Gc y N, polipéptidos codificados viralmente en secciones anteriores. Modelos de prueba de patogénesis se pueden hacer más eficazmente cuando hay un modelo animal que imita aspectos clave de la enfermedad. No existe un modelo similar al HFRS, pero existen modelos animales para el transporte asintomático de PUUV y SNV por sus roedores portadores nativos, el banco vole Myodes glareolus y el ratón venado P. maniculatus; así como un modelo hámster sirio utilizando ANDV o el virus Aporal relacionado de Venezuela, para el cual se observa una enfermedad mimética HCPS [70] [71] [72] [73]. El modelo hámster ANDV-Sirio tiene una serie de características en común con la enfermedad humana, así como algunas diferencias. A diferencia de las enfermedades neurológicas que han sido posibles de provocar con HTNV, el modelo hámster para HCPS parece ser causado por fugas capilares que resultan en edema pulmonar y la producción de un derrame pleural con características exudativas. Típicamente los hámsteres mueren entre 11 y 14-d post-inoculación, reflejando un período de incubación ligeramente acelerado en comparación con las infecciones humanas. Al igual que con el HCPS humano, el examen microscópico del pulmón revela abundante deposición de fibrina, septo alveolar engrosado y antígeno viral expresado abundantemente en el endotelio microvascular. Los hámsteres infectados por ANDV equipados con dispositivos de monitoreo fisiológico mostraron disminución de las presiones de pulso, taquicardia e hipotensión que parecen imitar de cerca el shock que se cree que es la causa próxima de la muerte en pacientes que sucumben al HCPS [65, 74]. En comparación con la enfermedad humana, los hámsteres infectados por ANDV exhiben títulos excepcionalmente altos de ANDV vivo en sus tejidos, con gran parte de la replicación viral que se produce Los títulos de ANDV vivo en algunos casos superan los 10 8 /g, mientras que los aislados de hantavirus de los tejidos humanos han sido notoriamente difíciles de obtener. A pesar de la aparición universal de enzimas hepáticas levemente elevadas en pacientes con HCPS, las enzimas hepáticas no parecen estar presentes en niveles elevados en la sangre de hámsters enfermos incluso inmediatamente antes de la muerte [75]. El período prolongado de incubación asociado con la enfermedad por hantavirus da al huésped un tiempo considerable para montar una respuesta inmune madura contra el virus. Así, en contradición a infecciones de gravedad comparable y sintomatología relacionada asociada con arenavirus y filovirus, las infecciones por hantavirus en humanos se asocian con respuestas anticuerpos de título significativo por el momento en que comienzan los síntomas. A pesar de esta observación, parece ser posible que la variación natural en las respuestas individuales de anticuerpos neutralizantes entre los pacientes con infecciones por NVS pueda estar relacionada con la gravedad de la enfermedad, lo que sugiere que la administración de anticuerpos antivirales podría resultar efectiva terapéuticamente [76]. En el caso de la infección por ANDV, han surgido nuevas evidencias que indican que el aparente aclaramiento del virus de la sangre no resulta en la eliminación completa del estímulo antigénico por el virus, sugiriendo que el virus puede persistir, tal vez en algún sitio inmunológicamente privilegiado aún indeterminado [77]. Un papel para las respuestas patológicas mediadas por células T en el HFRS y el HCPS ha sido la fuente de especulación por una variedad de razones. La gravedad del SNS asociado al SNCP puede haber hecho más evidente que el inicio del edema pulmonar, la taquicardia y la hipertensión parecía estar todo, pero universalmente asociado temporalmente, con la aparición de un espectro de células altamente activadas del linaje linfoide en la sangre periférica. Se detectaron células con similitudes morfológicas cercanas a estos -inmunoblastos- en los pulmones congestionados y pesados de los pacientes que llegaron a la autopsia, así como en órganos linfoides y en las tríadas portal [63, [78] [79] [80]. Estas observaciones llevaron a especular que algún componente de la patogénesis por hantavirus podría estar vinculado a la aparición de células T antivirales que podrían estimular o contribuir a la aparición de una -tormenta de mediadores y el fenotipo de fuga capilar asociado. Estudios posteriores han confirmado la expectativa de que una fracción significativa de la población de inmunoblastos en pacientes con HCPS son células T con especificidad para epitopes específicos de antígenos virales de clase I presentados por el HLA, incluyendo Gn, Gc y N [77, [81] [82] [83]. Presumiblemente, las actividades antivirales de estas células, manifestadas en parte por su elaboración de mediadores en el intersticio afectado, pueden contribuir a la fuga endotelial/capilar que se encuentra en el corazón de la patogénesis del hantavirus. Debido a que los primeros casos de HCPS a menudo llegaron a la autopsia, se hizo posible examinar tejidos necropsiados para la expresión de citocinas. El estudio de Mori et al. (1999) revelaron una alta expresión relativa de citocinas proinflamatorias incluyendo TNF-, IL-1-, IL-6, proporcionando evidencia a favor de un modelo de tormenta de citoquinas para la patogénesis [64]. Los autores creían, basándose en la morfología de las células secretadoras de citoquinas, que tanto monocitos como linfocitos estaban contribuyendo a la producción de citocinas. Que los mediadores proinflamatorios se encuentran en niveles elevados en el plasma, así como el intersticio renal de pacientes con enfermedad hantaviral aguda se ha reconocido desde hace algún tiempo también [84, 85]. Si bien el diagnóstico de HCPS y HFRS se realiza mejor con serología IgM, en la etapa aguda de la infección por NVS, también se puede utilizar RT-PCR si se utilizan células sanguíneas o coágulos de sangre en lugar de plasma o suero, donde la sensibilidad incluso utilizando imprimaciones PCR anidadas disminuye a cerca del 70% [86] [87] [88]. En una instalación en la que se tratan muchos casos de HCPS, el centro médico de la Universidad de Nuevo México en Albuquerque, se ha ofrecido un servicio de diagnóstico en el que se analizan los hallazgos hematológicos del paciente para establecer la probabilidad de que un paciente tenga HCPS. La combinación de trombocitopenia, abundancia elevada de linfocitos -inmunoblasto-, población de células polimorfonucleares con desplazamiento izquierdo sin evidencia morfológica fuerte para su activación, y valores elevados de hemoglobina o hematocrito es altamente específica para el HCPS y permite a los clínicos la capacidad de poner pacientes presuntivos-HCPS en oxigenación de membrana extracorpórea (ECMO), que se cree que ha salvado a muchos pacientes de un resultado letal [89]. Se cree que la infección humana por hantavirus sigue el contacto con secreciones o excreciones producidas por roedores infectados. En los Estados Unidos, 538 infecciones humanas por hantavirus fueron reportadas hasta finales de diciembre de 2009 [90], con Nuevo México, Arizona y Colorado mostrando los casos más altos. Mientras que el prototípico hantavirus centroamericano en América Central fue el virus Rio Segundo de Reithrodontomys mexicanus de Costa Rica, la primera enfermedad humana apareció algunos años más tarde en Panamá, donde el virus Choclo (CHOV) surgió como el agente etiológico y se cree que es responsable de todos los casos conocidos de HCPS. La rata de arroz pigmeo fulvo Oligoryzomys fulvescens ha sido identificada como el reservorio de roedores [91]. En Panamá, los primeros casos de HCPS, aunque con poca o ninguna implicación cardiaca evidente, fueron reportados en 1999, y desde entonces, 106 infecciones humanas han ocurrido con una tasa de mortalidad del 26% [92]. Seroencuestas de mamíferos en México y Costa Rica han encontrado anticuerpos antihantavirus [93] [94] [95] [96], y se han notificado seroprevalencias que oscilan entre 0,6 y 1,6% en poblaciones humanas a pesar de la ausencia de casos conocidos de HCPS [97]. En América del Sur, los casos de HCPS se han identificado en Argentina, Bolivia, Brasil, Chile, Paraguay y Uruguay, y también se han notificado evidencias de exposición humana a hantavirus en Venezuela [98] y Perú [99]. En América del Sur, ANDV es el principal agente etiológico con casos en Chile y Argentina notificados desde 1995. En Chile, se han producido 671 casos de HCPS debido a ANDV durante el período 2001-2009 [100]. Desde 1995 se han reportado más de 1.000 casos de HCPS en Argentina [101] ; en el Brasil se han identificado aproximadamente 1.100 casos de HCPS entre 1993 y 2008 [102]. Las tasas de mortalidad por casos en esos tres países han sido similares, oscilando entre el 30% (Argentina), el 36% (Chile) y el 39% (Brasil). Las infecciones por Hantavirus ocurren con más frecuencia en hombres que en mujeres, aunque la proporción entre hombres y mujeres es muy variable. Por ejemplo, las comunidades panameñas mostraron una proporción de 55 hombres por 45 mujeres [103], mientras que en Chile la proporción es más sesgada por hombres (71%) [104]. En el Chaco paraguayo la proporción entre hombres y mujeres se aproxima al 50% [105]. En América del Norte, en diciembre de 2009 el 63% de los pacientes eran varones [90]. Todos los grupos étnicos y raciales parecen ser susceptibles a infecciones por el hantavirus, y las diferencias entre ciertos grupos (como indígenas y no indígenas) están más probablemente correlacionadas con el tipo de hábitat en el que reside la población (por ejemplo, zonas rurales frente a zonas urbanas). De hecho, las comunidades rurales representan la mayor incidencia global del hantavirus y, por lo tanto, están en mayor riesgo [92, [105] [106] [107] [108] [109] [109] [119], aunque también se ha destacado la importancia de los entornos peridomésticos como una importante zona de exposición [112, 113]. El principal mecanismo por el que los seres humanos adquieren la infección por el hantavirus es la exposición a aerosoles de heces contaminadas de roedores, orina y saliva [114, 115]. Esto puede ocurrir cuando los seres humanos residen en áreas cercanas a las que habitan los roedores, viven en áreas infestadas de roedores, o cuando los roedores invaden entornos humanos, que son más frecuentes en hábitats rurales.Existe una larga historia de coexistencia humana con roedores, lo que plantea dudas sobre el aparente aumento reciente de las enfermedades relacionadas con el hantavirus, especialmente el HCPS. Aparte de una aparente asociación con eventos de oscilación sureña de El Niño (ENSO) en algunas regiones [116, 117], los recientes incrementos en la incidencia del HCPS no parecen seguir un patrón temporal o espacial fácilmente definido. Sin embargo, algunas características del paisaje, como la fragmentación del hábitat o las áreas perturbadas por el ser humano, pueden influir en la dinámica de la población de roedores e impactar en la incidencia viral [118] [112] [112] [121]. A pesar de la estocástica asociada a la contracción de la infección Las actividades humanas en edificios mal ventilados que pulverizan partículas que luego se inhalan (es decir, limpieza, agitación de alfombras, polvo) se identifican con frecuencia entre los pacientes admitidos para el SHCPS [11, 122]. Se cree que las actividades al aire libre transmiten un menor riesgo debido a la labilidad de los hantavirus a la radiación UV y a la supuesta tendencia a dispersarse en el viento, aunque ciertas condiciones ambientales parecen mantener el virus durante períodos más largos fuera de su huésped natural, lo que permite la transmisión indirecta [123]. Una vía alternativa pero poco común de transmisión del virus es la mordedura de roedores [124] [125] [126]. Los trabajadores sobre el terreno que manipulan mamíferos corren un riesgo potencialmente mayor de exposición a infecciones por hantavirus, aunque cuando se cuantifica a través de serosurveys el riesgo absoluto parece bastante leve [127]. Un nuevo estudio en Colorado sugiere la posibilidad de que una picadura de roedor haya sido el vehículo próximo para la transmisión al aire libre de NVS [128], lo que vuelve a enfatizar el uso de equipo de protección personal durante las actividades de trabajo de campo [129]. Como caso particular dentro de los hantavirus, la transmisión de persona a persona ha sido documentada exclusivamente para el virus de los Andes sudamericanos [130] [133] [133] [135]. La identificación de esta vía de transmisión se ha hecho utilizando tanto herramientas moleculares como encuestas epidemiológicas, pero el mecanismo de transmisión interpersonal no está bien establecido. Curiosamente, ANDV también puede ser derramado por los humanos a través de otros fluidos biológicos como la orina [136], ilustrando las propiedades particulares que diferencian este virus de otros hantavirus. Aunque la transmisión interpersonal parece ser única para ANDV, el ARN viral de PUUV se ha detectado en la saliva de pacientes con HFRS, y algunos pacientes con SNV-HCPS tienen ARN viral en las secreciones traqueales [88, 137]. Los Hantavirus en las Américas son alojados naturalmente por roedores (Muridae y Cricetidae) así como las musarañas (Soricidae) y los lunares (Talpidae) (Figura 1). Tres especies de musgo y un mole han sido reportados para albergar hantavirus y su patogenicidad para los humanos permanece desconocida [22, 138, 139]. Se han identificado al menos 15 especies de roedores como portadores de diferentes hantavirus patógenos, con algunos genotipos sudamericanos como Castelo do Sonhos (CDSV) o Hu39694 sólo identificados después de infecciones humanas (Figura 1 ). Los hantavirus suelen mostrar una alta especificidad de especie y ningún huésped intermedio [140]. Sin embargo, se han descrito algunos genotipos de hantavirus en la misma especie de roedores. Tal es el caso de Playa de Oro (OROV) y Catacamas (CATV) identificados en Oryzomys couesi [141, 142], o Maporal (MAPV) y Choclo (CHOV) hospedados por O. fulvescens [91, 143]. En América del Norte se han detectado virus de muleshoe y Black Creek Canal hanta en sigmodon hispidus [ Además, un genotipo de hantavirus (por ejemplo, el virus similar a Juquitiba) puede ser transportado por más de una especie de roedores (O. nigripes, Oxymycterus judex, Akodon montesis). Otro ejemplo es el virus Laguna Negra (LANV) que después de ser identificado en Calomys laucha [146] también ha sido reportado en C. callosus [147]. El rápido aumento en el descubrimiento de nuevos hantavirus y la identificación de sus anfitriones no parece probable que termine tan pronto como se examinen nuevas especies pequeñas de mamíferos [95]. Este tema se complica por la continua controversia en los criterios para la clasificación de distintos hantavirus [148, 149], que también está vinculado a la clasificación taxonómica y los reordenamientos taxonómicos. La transmisión de especies cruzadas es un proceso importante durante la propagación, aparición y evolución Particularmente dentro de los hantavirus, los derrames a los huéspedes secundarios se identifican cada vez más a medida que se realizan estudios más extensos [151] [152] [153] [155] [156]. Por ejemplo, ANDV es el agente etiológico predominante del HCPS en América del Sur, y O. longicaudatus el principal reservorio de roedores. Derrama en al menos otras cuatro especies de roedores que coocurren con el reservorio se han identificado, con Abrothrix longipilis mostrando la segunda mayor prevalencia de anticuerpos de ANDV, y actualmente no hay duda de que el virus es extremadamente similar genéticamente entre los dos roedores del huésped [157, 158]. En América del Norte, el derrame del virus Bayou (BAYV) puede haber ocurrido desde el reservorio principal de O. palustris a S. hispidus, R. fulvescens, P. leucopus y B. taylori [159] [160] [161]. Es más probable que el derrame del virus Hanta se produzca con poblaciones de acogida que habitan regiones simpatricas o sintópicas [151, 162], y la transmisión de especies cruzadas tendría probablemente mayores posibilidades de éxito si las especies anfitrionas están estrechamente relacionadas [163]. Se encuentra una excepción interesante entre el virus Oxbow (OXBV) y el virus Asama (ASAV) en el que un proceso de cambio de huésped parecía haber ocurrido entre mamíferos pertenecientes a dos familias (Talpidae y Soricidae), probablemente como resultado de la codivergencia alterna y recurrente de ciertos tax Los hantavirus son transmitidos horizontalmente entre roedores y no son transmitidos por artrópodos (a diferencia de otros virus de la familia Bunyaviridae). La infección por derrapadores a mamíferos no humanos generalmente no produce ninguna transmisión hacia adelante (o a fin de morir), pero si los seres humanos están infectados pueden resultar en una alta morbilidad y mortalidad [122, 164]. Durante la primavera de 1993, un brote de pacientes con HCPS debido a SNV ocurrió en los estados de Four Corners, resultando en más del 60% de casos de mortalidad entre los casos iniciales, muchos de los cuales involucran a miembros de la tribu Navajo [12, 121]. En Panamá, se notificó un brote durante 1999-2000 en Los Santos, y 12 casos donde se identificaron con tres muertes [165, 166]. Esto representó el primer informe de infecciones por hantavirus humanos en América Central. En América del Sur, Diecisiete individuos fueron identificados con anticuerpo NVS (ELISA) o fueron antígenos (HCI) positivos de 52 casos sospechosos [167]. En 1996 ocurrieron brotes mayores debidos a ANDV en el sur de Argentina [131, 134] ; en el sur de Chile se presentaron grupos de pacientes con enfermedad por hantavirus en 1997 [158]. En Brasil, el primer brote fue identificado en la Amazonía Brasileña (Estado de Maranhão) en el año 2000, e involucró pequeños pueblos que resultaron en una prevalencia del 13,3% de los evaluados (398 residentes totales) [168]. Los factores que desencadenan los brotes de hantavirus todavía son mal entendidos, probablemente porque resultan de varias características bióticas y abióticas interactuantes cuyos parámetros clave son difíciles de modelar. Sin embargo, el uso de nuevos enfoques de modelado que involucran características geográficas y ambientales parece ser prometedor a la hora de predecir posibles brotes de hantavirus y/o áreas de mayor riesgo [169] [170] [171] [172]. Debido a que se sabe que los hantavirus se transmiten directamente de los huéspedes infectados a los susceptibles, el primer enfoque natural es relacionar los brotes con la ecología de los huéspedes virales. La transmisión y persistencia del hantavirus en las poblaciones de roedores depende de varios factores que interactúan para afectar la dinámica ecológica del huésped, que a su vez está fuertemente influenciada por las características de comportamiento de las especies de roedores individuales, a la estructura paisajística y a las características ambientales [173, 174]. La transmisión viral depende de las tasas de contacto entre los huéspedes sensibles, y a pesar de la noción prevaleciente de que un aumento de la densidad se encuentra y, por lo tanto, de Además, se ha demostrado que la transmisión de NVS sigue un patrón de heterogeneidad de contacto, donde los individuos de la población tienen diferentes probabilidades de transmitir la infección [176]. La comprensión de la transmisión viral resulta ser mucho más compleja cuando especies distintas del principal huésped del reservorio se incorporan en el modelo. De hecho, estudios recientes han demostrado que la mayor diversidad de especies hospedantes está correlacionada con una menor prevalencia de infección en América del Norte para P. maniculatus [177], en América Central para O. fulvescens (reservorio del virus Choclo) y Zygodontomys brevicauda (reservorio del virus Calabazo) [178], y en América del Sur para Akodon montensis (reservorio del virus Jabora) [162]. Las tasas de contacto varían según la distribución espacial de las poblaciones y parecen estar Por ejemplo, la prevalencia de SNV en P. maniculatus fue mayor en paisajes con mayor grado de fragmentación del hábitat preferido [179]. Además, ciertas propiedades del paisaje como elevación, pendiente y cubierta terrestre parecen ser útiles para detectar áreas con infecciones persistentes de SNV, y por lo tanto se consideran áreas refugiales donde el virus puede mantenerse durante años [169]. Los cambios en el entorno natural de las especies de reservorios, como la fragmentación forestal y la pérdida de hábitat, pueden alterar la abundancia y distribución de la población y provocar brotes de hantavirus, como se observa en la Península de Azurero de Panamá [118, 119]. Además, las diferencias en el microhábitat, incluida la cubierta superficial, pueden conducir a diferencias en la dinámica ecológica dentro de las poblaciones y afectar a la tasa de exposición al virus [180]. Se han encontrado diferencias en las infecciones por hantavirus a través de paisajes contrastantes en el intervalo latitudinal en poblaciones de roedores de O. longicaudatus en Chile, lo que sugiere que los seres humanos están expuestos de manera diferencial al virus [107, 181]. La dinámica poblacional de roedores se ve afectada por cambios estacionales de clima y clima [182, 183]. En el caso de los brotes asociados a ENSO, se ha postulado una compleja cascada de eventos desencadenados por lluvias altamente inusuales en el año precedente para dar lugar a un aumento de la producción primaria y densidades de roedores, aumentando también la probabilidad de transmisión del virus a los seres humanos, pero ha resultado difícil demostrar con precisión los eventos intermedios sugeridos, como el aumento de las densidades de roedores en el aumento de la carga de casos [116, 121, 184]. En América del Sur, los efectos del cambio climático y los brotes de hantavirus no han sido bien estudiados, a pesar del conocimiento de que varias especies de roedores que son reservorios de enfermedades emergentes se han visto dramáticamente afectadas por eventos como El Niño [185]. Los cambios en la dinámica de la población de acogida también se ven afectados por la estacionalidad, lo que puede conducir a brotes de enfermedades cuando se interrumpen los procesos que equilibran las poblaciones de roedores de temporada en temporada [186]. La emergencia viral puede seguir promoviéndose a medida que los cambios introducidos por el ser humano continúan aumentando en el medio ambiente a diferentes escalas geográficas. Estos cambios también pueden alterar la estructura y dinámica de la población de roedores e interacciones interespecies creando condiciones que pueden conducir a brotes virales, establecimiento viral en nuevos hospederos, y la aparición de HCPS [102, 162], incluso con aparentemente leve perturbación ecológica al sistema virus-hospedero [188]. Ciertas características fisiopatológicas, incluyendo trombocitopenia y shock, de enfermedades por hantavirus de los seres humanos, tienen similitud sustancial con las fiebres hemorrágicas inducidas por otros virus tales arenavirus, filovirus y flavivirus, a pesar de compartir esencialmente ninguna secuencia similitud con ellos. Tales observaciones plantean preguntas acerca de si tales similitudes en la patogénesis son probables similitudes de fenotipo, o en cambio reportan la presencia de mecanismos moleculares comunes entre los virus. En esta revisión se discuten las propiedades generales, descubrimientos y epidemiología/ecología de las formas de hantavirus patógenos del Nuevo Mundo, y también se busca identificar algunas de las características de las macromoléculas virales y mecanismos inmunológicos que se han propuesto como potenciales mediadores directos de los eventos patógenos que caracterizan la enfermedad humana HCPS. Si bien es poco probable que la expresión de una proteína viral particular o ARNs en aislamiento se pueda confiar en replicar fenotipos clave de infección por el virus completo, algunos de los hallazgos han sido suficientemente consistentes con lo que se conoce de la patogénesis in vivo que ofrecen plomos plausibles de primer paso en la búsqueda de objetivos terapéuticos. Esperamos con interés las revelaciones mecanísticas que seguirán el uso inevitablemente ampliado de métodos poderosos como la secuenciación profunda, imágenes cada vez más avanzadas, y métodos microscópicos, y modelos animales que por fin se pueden decir

¿Por lo general cuánto tiempo mueren los hámsteres después de la inoculación?

Los hantavirus en las Américas y su papel como patógenos emergenteshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3185593/SHA: efe13a8d42b60ef9f7387ea539a1b2eeb5f80101Autores: Hjelle, Brian; Torres-Pérez, FernandoFecha: 2010-11-25DOI: 10.3390/v2125559Licencia: cc-byAbstract: La continua aparición y reaparición de patógenos representan una amenaza continua, a veces mayor, para las poblaciones. Los hantavirus (familia Bunyaviridae) y sus enfermedades humanas asociadas se consideraron confinados a Eurasia, pero la aparición de un brote en el suroeste de Estados Unidos llevó a un gran aumento en su estudio entre los virólogos de todo el mundo. Se han descrito más de 40 genotipos hantavirales, la gran mayoría desde 1993, y casi la mitad de ellos patógenos para los seres humanos. Los hantavirus causan infecciones persistentes en sus reservorios, y en las Américas, la enfermedad humana se manifiesta como compromiso cardiopulmonar, síndrome cardiopulmonar del hantavirus (HCPS), con proporciones de casos-fatalidad, para los serotipos virales más comunes, entre el 30% y el 40%. Alteración del hábitat y trastornos ecológicos a mayor escala, tal vez incluyendo el cambio climático, son algunos de los factores que pueden haber aumentado la carga de casos humanos de HCPS entre 1993 y el presente. Consideramos aquí las características que influyen en la estructura de la dinámica de la población huésped que pueden conducir a brotes virales, así como los determinantes macromoleculares de los hantavirus que han sido considerados como potenciales contribuciones a la patogenicidad. Texto: Los patógenos emergentes causan enfermedades nuevas o no reconocidas anteriormente, y entre ellas, las zoonóticas emergentes son una preocupación importante entre los científicos que estudian enfermedades infecciosas a diferentes escalas espaciales y temporales [1, 2]. Los cambios en las condiciones bióticas y abióticas pueden alterar la dinámica de las enfermedades de la población y conducir a la aparición de infecciones zoonóticas [3] [5] [6]. Durante las últimas décadas, se han producido varios brotes de patógenos virales emergentes y reemergentes, que afectan tanto a la implicación puramente local como a nivel mundial/pandémica de las poblaciones humanas. Entre los ejemplos visibles están la gripe A, el virus del Ébola, el virus de la hepatitis C, el trastorno respiratorio grave para adultos (SARS), el coronavirus y el virus de la inmunodeficiencia humana, que desafían las medidas de prevención y control de los sistemas de salud pública [7]. En las Américas, el reciente brote de gripe pandémica A subtipo H1N1 se convirtió en un objetivo importante de control debido a su rápida propagación, y las incertidumbres en cuanto a virulencia y transmisibilidad, sin embargo, la disponibilidad de vacunas fue limitada cuando se produjo una actividad significativa antes de la temporada tradicional de gripe [8]. Sin embargo, en el último siglo han surgido o resurgido brotes de varias enfermedades virales relacionadas con el virus arenavirus y el virus del dengue, y más recientemente, hantavirus y la expansión del rango geográfico del virus del Nilo Occidental. Entre las enfermedades zoonóticas, los mamíferos pequeños son anfitriones de varios virus ARN patógenos, especialmente Arenaviridae y Bunyaviridae: Hantavirus [9] [10] [11]. Las infecciones por hantavirus se convirtieron en una preocupación en las Américas después de la descripción de un brote de distrés respiratorio agudo ocurrido en La enfermedad recientemente reconocida, el síndrome cardiopulmonar del hantavirus, el HCPS (o síndrome pulmonar del hantavirus), se relacionó con la infección por el virus del Sin Nombre (SNV) recién descubierto, y el roedor Peromyscus maniculatus (ratón venado) fue identificado como el reservorio [13]. Sin embargo, las infecciones por hantavirus tienen una historia mucho más larga. Una revisión de los escritos chinos antiguos, que datan de aproximadamente 960 dC, reveló descripciones muy parecidas a la fiebre hemorrágica con síndrome renal (HFRS), el síndrome causado por los hantavirus del Viejo Mundo [14]. Durante el siglo XX, los casos de enfermedad febril aguda con compromiso renal fueron descritos de varios países eurasiáticos y Japón, a menudo en asociación con compromisos militares [15]. El HFRS como síndrome distinto, sin embargo, fue llamado por primera vez a la atención de la medicina occidental en asociación con un brote que ocurrió entre las tropas de las Naciones Unidas durante el conflicto coreano entre 1951 y 1954, donde más de 3.200 soldados fueron afectados [16]. Tomó más de dos décadas hasta que el agente etiológico, el virus Hantaan (HTNV), fue aislado del ratón de campo rayado Apodemus agrarius, detectado en parte por la unión de anticuerpos de muestras de suero de paciente a los tejidos pulmonares de ratones de campo sanos y salvajes [17, 18]. El virus se encontró más tarde para representar la especie tipo de un nuevo género Hantavirus de la familia Bunyaviridae, aunque fue más tarde evidente que el primer hantavirus a aislarse fue el virus Thottapalayam de shrew-borne [19]. La categorización de los hantavirus como pertenecientes a la familia Bunyaviridae se debe en parte a la presencia consistente de tres genomas de ARN que son circularizados in vivo como resultado de la presencia de nucleótidos terminales complementarios que ayudan a doblar el genoma en una morfología -hairpin-, descrita por primera vez para el flebovirus Uukuniemi [19, 20]. La Tabla 1 es una lista de los hantavirus patógenos predominantemente distintos serológicamente. Se describen muchos otros genotipos llamados, pero tales otras formas patogénicas están generalmente estrechamente relacionadas con los Andes o, en algunos casos, el virus Sin Nombre. Durante la maduración del virus, el precursor forma GPC se procesa utilizando una proteasa unida a la membrana en Gn y Gc, una escisión que ocurre, y parece ser señalada, después de la señal péptida conservada WAASA en la C-terminal de Gn [24]. Aunque las dos proteínas se pueden expresar de forma independiente a través de la transfección, pueden ser retenidas en el compartimento celular incorrecto (ER o aggrosome); por lo tanto, deben ser co-expresadas para permitirles estabilidad para que las dos se puedan ensamblar correctamente en el Golgi [25, [27] [28]. Se han identificado varias actividades y propiedades para las glicoproteínas envolventes del hantavirus, incluyendo algunas características que se sospecha que están involucradas en la patogenicidad de los serotipos causantes de la enfermedad, una posibilidad que ha generado atención experimental. Las glucoproteínas son los ligandos conocidos o presuntos para al menos dos receptores celulares distintos, la cadena de integrina y el factor acelerador de la descomposición, o DAF [30, 31] ; con gC1qR/p32 también identificado como otro receptor de entrada potencial [32]. Comparaciones con la proteína E del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, llevaron a Tischler et al. a considerar la glicoproteína Gc como una proteína potencial de fusión de clase II, tal vez impartiendo actividad de fusión al virión, y esta hipótesis ha ganado apoyo en otros estudios [33, 34]. Se han identificado actividades adicionales con, o se afirma que están relacionadas con, Gn. Para muchos de estos estudios, una premisa subyacente ha sostenido que hay diferencias entre las glicoproteínas de hantavirus -patógenos en relación con virus en el género que se denominan Si bien es cierto que aún no ha sido posible vincular el virus de Prospect Hill (PHV) con la enfermedad humana, la ausencia de evidencia de su patogenicidad tal vez no debería equipararse con la evidencia de su ausencia. Sólo se podría considerar que el nivel de enfermedad (por ejemplo, letargo, fiebre, proteinuria y azotemia) asociado con la infección de primates no humanos por PHV no es significativamente diferente del registrado para los modelos de primates no humanos utilizando el virus conocido del patógeno Puumala (PUUV) [35, 36]. Para el propósito de esta discusión, presumiremos que los hantavirus apatogénicos son efectivamente apatogénicos. Mientras que algunos estudios han sugerido que las glicoproteínas Gn se dirigen más rápidamente a la vía ubiquitina-proteosoma que a las formas apatogénicas, otros han interpretado las diferencias en el manejo de las glicoproteínas Gn a través de especies de hantavirus por el sistema ubiquitina-proteosomal como independientes de la patogenicidad [37] [38] [39]. Algunos investigadores han dirigido sus esfuerzos hacia la identificación de una capacidad diferencial, ya sea cinética o de magnitud absoluta, en la capacidad de los hantavirus patógenos y apatogénicos para provocar una respuesta de interferón en las células. Una premisa que surge es que las formas apatogénicas tenderían a inducir una respuesta innata anterior que haría más probable que el virus se limpiara rápidamente o se volviera menos competente en su replicación, a fin de evitar cualquier respuesta patológica en el huésped [42] La respuesta innata anti-hantavirus puede en algunos casos ser atribuida a la interacción viral como ligando de TLR-3, pero no en otros, y en las células endoteliales, no parece requerir más que la partícula viral misma, incluso cuando se introduce en forma replicativa incompetente [43, 44]. Las proteínas y los ARNm inducidos prominentemente por los hantavirus incluyen MxA e IFIT-1 (ISG-56) y otros incluyendo algunos con actividad antiviral conocida o sospechada. Esos hantavirus, a menudo cepas altamente patógenas, que no inducen una respuesta antiviral potente, se sospechan o se presume que tienen un (más) potente mecanismo de antagonismo interferón-vía en relación con otros virus, un mecanismo que actúa positivamente para prevenir que se forme una respuesta innata efectiva, al menos temprano en la infección [4 Sin embargo, se reportan algunos casos en los que los hantavirus altamente patógenos, tales como NVS, también son capaces de inducir la expresión de los ARNm del gen estimulado por interferón, incluso muy temprano en la infección, con proteínas ISG, como se esperaba, tardando más tiempo en aparecer en la célula [44]. Las actividades anti-interferón también se han atribuido a la proteína NSs que se puede elaborar en células infectadas por serotipos que codifican esta proteína [46]. Otros investigadores han examinado las actividades de las glucoproteínas del hantavirus y otras proteínas que podrían afectar directamente a algunos aspectos de la progresión patogénica asociada a la infección por hantavirus en humanos, tales como cambios de permeabilidad vascular. Mientras que los primeros intentos de causar directamente aumentos en la permeabilidad de las monocapas endoteliales con partículas virales o infección viral fueron en gran medida decepcionantes, los hantavirus se han identificado como que afectan adversamente la migración endotelial sobre los sustratos y en la potenciación de la permeabilidad endotelial inducida por VEG-F [47, 48]. La proteína nucleocápsida o N más corta (+50 kD) es un componente estructural del nucleocápsido viral, junto con los segmentos de ARN viral genómico. Como proteína de unión al ARN que afecta a la horquilla del cabello de los segmentos genómicos con alta afinidad [49, 50], limita el acceso del ARN para alojar nucleasasas y ayuda a hacer que la replicación viral sea un proceso cerrado dentro del citoplasma. También actúa como una proteína de membrana periférica, al igual que la proteína L [51], una actividad que podría jugar un papel en su supuesta, pero aún no demostrada función como matriz [52]. Hasta hace poco, no se había apreciado que N tuviera una amplia variedad de otras actividades, algunas de las cuales pueden estar vinculadas, no sólo a los requisitos fundamentales de replicación, sino también a la interferencia con una serie de procesos intracelulares de la célula normal. Así, se ha propuesto una interacción entre el aminoterminal de la proteína N del hantavirus y la proteína celular Daxx, con la sugerencia de posibles consecuencias pro-apoptóticas [51]. N también se reporta que interactúa con microfilamentos actínicos, y la proteína SUMO-1 [53, 54]. Utilizando ensayos basados en el gen reportero, Connie Schmaljohn y sus colegas han informado que la proteína nucleocapsid del virus Hantaan tiene un papel inhibidor en las respuestas inflamatorias mediadas por NF kappa B (NF- â € € TM B). Los efectos sobre la expresión NF- € B parecen estar limitados a la prevención de su translocación nuclear después de su intento de activación con lipopolisacárido, LPS [55]. En el citoplasma de las células infectadas, la proteína N se puede encontrar en los cuerpos celulares P donde secuestra y protege los capuchones de 5'. Puede localizar los capuchones a través de su interacción con DCP1, un componente clave de los cuerpos P. Durante la infección por hantavirus, los ARN virales se concentran en los cuerpos P, a través de su interacción con N y DCP1. La proteína N demuestra la protección preferencial de los ARNm diseñados para terminar prematuramente su proteína codificada en comparación con los ARNm nativos [56]. La proteína N se ha vinculado cada vez más a la replicación y traducción virales, a veces de maneras no previstas anteriormente. Se encuentra entre una familia creciente de diversas proteínas virales que pueden servir como un inespecífico - ARN chaperone ®, una actividad que debe facilitar el acceso de la L polimerasa al ARNv para la transcripción y replicación, en que puede disociar transitoriamente estructuras de ARN mal dobladas [57]. Algunos de los efectos de la proteína N en la traducción no pueden ser inmediatamente reconocidos como adaptables en la naturaleza. Puede reemplazar todo el complejo de iniciación traslacional EIF4F, presentando simultáneamente el ribosoma con un reemplazo de la actividad de unión de la tapa de eIF 4E, uniéndose al complejo de pre-iniciación 43S, al igual que eIF 4G, al tiempo que reemplaza la actividad helicoidal de eIF 4A, que se presume que es necesaria para disociar la estructura de ARN de orden superior [56, 58]. Estos tres factores normalmente trabajan juntos para lograr la iniciación traslacional. En los cuerpos P, la capacidad de la proteína N de unirse a una alta afinidad a los oligoribonucleótidos celulares nativos tapados, junto con su actividad en la protección de ARNs tapados de la degradación, probablemente facilita el acceso de oligonucleótidos encapsulados para su uso en la iniciación transcripcional por L polimerasa (-cap ra Tráfico de N para el ensamblaje viral: Clásicamente, la proteína N en las células infectadas parece estar agrupada o partículas en la naturaleza, con una concentración pesada en una única ubicación perinuclear, ampliamente considerada como la Golgi [27]. Las proteínas N de los hantavirus se encuentran en asociación con fracciones de partículas, y los estudios confocales microscopía y bioquímico-inhibidores han demostrado que las trazas N a lo largo de microtúbulos pero no con filamentos de actina [52]. El destino final de N, para su ensamblaje en partículas virales es la Golgi, y que circula allí a través del complejo intermedio retículo-Golgi endoplasmático (ERGIC), también conocido como cúmulo vesicular-tubular [52]. Un inhibidor negativo dominante, la dinamitina, asociado con el transporte mediado por Los estudios posteriores sugieren que la dependencia específica del transporte microtubular es específica de los hantavirus del Viejo Mundo como el NVH, pero que el Hantavirus del Nuevo Mundo ANDV está asociado con filamentos de actina [59]. Sin embargo, los datos recientes indican que el transporte microtubular es efectivamente utilizado para el NVH del Nuevo Mundo [60]. Las enfermedades del Hantavirus del hombre desde hace mucho tiempo han sido sospechosas de tener una base inmunopatógena en parte debido a su período de incubación relativamente largo de 2-3 semanas y la asociación temporal observada entre los trastornos inmunológicos y la primera aparición de signos y síntomas de la enfermedad del hantavirus. HFRS y HCPS comparten muchas características clínicas, llevando a muchos investigadores a considerar que son, en esencia, diferentes manifestaciones de un proceso patógeno similar, que difieren principalmente en los órganos objetivo primarios de expresión de la enfermedad (Tabla La patogénesis de las infecciones por hantavirus es el tema de una revisión continuamente actualizada en la serie UpToDate [61]. Para el momento en que aparecen los síntomas en el HCPS, ambas respuestas antivirales fuertes, y, para los genotipos virales más virulentos, el ARN viral puede ser detectado en plasma sanguíneo o células sanguíneas nucleadas respectivamente [63, 64]. Al menos tres estudios han correlacionado el ARN viral plasmático con la gravedad de la enfermedad para el HCPS y el HFRS, sugiriendo que la replicación del virus juega un papel continuo y en tiempo real en la patogénesis viral [65] [66] [67]. Se han identificado varios cambios patológicos distintivos que ocurren tanto en el HFRS como en el HCPS. Una característica crítica de ambos es una fuga capilar transitoria (~ 1-5 días) que involucra el La fuga resultante es de carácter exudativo, con una composición química alta en proteínas y similar al plasma. La experiencia continua que indica el fuerte tropismo tisular para las células endoteliales, específicamente, es uno de los varios factores que hacen de la integra β3 un candidato especialmente atractivo como un importante receptor in vivo para los hantavirus. Es probable que los hantavirus lleguen a sus tejidos objetivo a través de la captación por los ganglios linfáticos regionales, tal vez con o dentro de un histiocito pulmonar escoltante. Las semillas del virus endotelio local, donde las primeras células infectadas dan lugar, en última instancia, a una viremia primaria, un proceso que parece tomar mucho tiempo para las infecciones por hantavirus [62, 63]. En el momento en que emerge la viremia secundaria, los agentes de las formas más severas de HFRS y HCPS han comenzado a alcanzar una masa suficiente para inducir, a través de las interacciones PAMP-PRR y otros medios, la expresión de citoquinas proinflamatorias [64]. Para HCPS, esa expresión favorece el lecho pulmonar y los órganos linfoides, pero, por razones desconocidas, ahorra el retroperitoneo y, en general, el riñón. En HFRS la situación se invierte, y sin embargo no se aprecia a menudo que el esperado tropismos tisulares preferentes de virus asociados a HFRS y sus contrapartes asociadas a HCPS para los lechos renal y pulmonar, respectivamente, no sea como se predeciría a través de las manifestaciones de las dos enfermedades. La elaboración local de mediadores inflamatorios y quimiotácticos se considera un requisito para el desarrollo Sin embargo, no es la hipoxemia, debido al edema pulmonar prominente, lo que conduce a la muerte en la mayoría de los casos fatales de HCPS, sino más bien la intoxicación del corazón por mediadores como aún no definidos, lo que conduce al estado de bajo gasto cardíaco y al síndrome de shock asociado [64, 65]. Es tentador especular que los mediadores producidos en el pulmón en conexión con el infiltrado inflamatorio pueden infiltrarse a través de la circulación coronaria con dilución mínima en HCPS, consecuencia desventajosa de la estrecha yuxtaposición anatómica de los dos órganos. Así, al menos tres clases de mecanismos potenciales, algunos superpuestos y todos ciertamente no exclusivos de los otros, podrían presumirse que subyacen a la patogénesis del HCPS. Estos incluyen:(1) Mecanismos inmunes innatos. La naturaleza de las interacciones entre los patrones moleculares asociados al patógeno del hantavirus (PAMP) y los receptores de reconocimiento del patrón (PRR) de las células endoteliales susceptibles comienzan a ser aclaradas. El HTNV prototípico parece ser reconocido por TLR-3 [43]. Tal infección tiene consecuencias tales como una mayor expresión del HLA-DR en las células dendríticas [66] y la diferenciación de los monocitos hacia las células dendríticas [67]. (2) Efectos virales directos. La correlación observada entre la carga viral y la gravedad de la enfermedad deja abierta la posibilidad de que las partículas del hantavirus o el ARN puedan tener efectos tóxicos sobre las células o sobre la señalización. Algunos investigadores han favorecido la toxicidad viral directa, actuando a través de la inhibición de la función de barrera celular endotelial, como una explicación de gran parte de la fuga capilar, aunque existe Una pista potencialmente importante hacia el mecanismo por el cual las infecciones por hantavirus agotan las plaquetas sanguíneas y, en algunos casos, causan manifestaciones hemorrágicas, fue avanzada por el reciente descubrimiento de que los hantavirus patógenos son capaces de reclutar plaquetas para adherirse a las superficies celulares endoteliales, con β3 integrina utilizada como elemento de unión crítica [69]. (3) Efectos patógenos causados por las actividades de macromoléculas virales específicas. Hemos revisado algunas de las actividades asociadas con los Gn, Gc y N, polipéptidos codificados viralmente en secciones anteriores. Modelos de prueba de patogénesis se pueden hacer más eficazmente cuando hay un modelo animal que imita aspectos clave de la enfermedad. No existe un modelo similar al HFRS, pero existen modelos animales para el transporte asintomático de PUUV y SNV por sus roedores portadores nativos, el banco vole Myodes glareolus y el ratón venado P. maniculatus; así como un modelo hámster sirio utilizando ANDV o el virus Aporal relacionado de Venezuela, para el cual se observa una enfermedad mimética HCPS [70] [71] [72] [73]. El modelo hámster ANDV-Sirio tiene una serie de características en común con la enfermedad humana, así como algunas diferencias. A diferencia de las enfermedades neurológicas que han sido posibles de provocar con HTNV, el modelo hámster para HCPS parece ser causado por fugas capilares que resultan en edema pulmonar y la producción de un derrame pleural con características exudativas. Típicamente los hámsteres mueren entre 11 y 14-d post-inoculación, reflejando un período de incubación ligeramente acelerado en comparación con las infecciones humanas. Al igual que con el HCPS humano, el examen microscópico del pulmón revela abundante deposición de fibrina, septo alveolar engrosado y antígeno viral expresado abundantemente en el endotelio microvascular. Los hámsteres infectados por ANDV equipados con dispositivos de monitoreo fisiológico mostraron disminución de las presiones de pulso, taquicardia e hipotensión que parecen imitar de cerca el shock que se cree que es la causa próxima de la muerte en pacientes que sucumben al HCPS [65, 74]. En comparación con la enfermedad humana, los hámsteres infectados por ANDV exhiben títulos excepcionalmente altos de ANDV vivo en sus tejidos, con gran parte de la replicación viral que se produce Los títulos de ANDV vivo en algunos casos superan los 10 8 /g, mientras que los aislados de hantavirus de los tejidos humanos han sido notoriamente difíciles de obtener. A pesar de la aparición universal de enzimas hepáticas levemente elevadas en pacientes con HCPS, las enzimas hepáticas no parecen estar presentes en niveles elevados en la sangre de hámsters enfermos incluso inmediatamente antes de la muerte [75]. El período prolongado de incubación asociado con la enfermedad por hantavirus da al huésped un tiempo considerable para montar una respuesta inmune madura contra el virus. Así, en contradición a infecciones de gravedad comparable y sintomatología relacionada asociada con arenavirus y filovirus, las infecciones por hantavirus en humanos se asocian con respuestas anticuerpos de título significativo por el momento en que comienzan los síntomas. A pesar de esta observación, parece ser posible que la variación natural en las respuestas individuales de anticuerpos neutralizantes entre los pacientes con infecciones por NVS pueda estar relacionada con la gravedad de la enfermedad, lo que sugiere que la administración de anticuerpos antivirales podría resultar efectiva terapéuticamente [76]. En el caso de la infección por ANDV, han surgido nuevas evidencias que indican que el aparente aclaramiento del virus de la sangre no resulta en la eliminación completa del estímulo antigénico por el virus, sugiriendo que el virus puede persistir, tal vez en algún sitio inmunológicamente privilegiado aún indeterminado [77]. Un papel para las respuestas patológicas mediadas por células T en el HFRS y el HCPS ha sido la fuente de especulación por una variedad de razones. La gravedad del SNS asociado a la NVS puede haber hecho más evidente que el inicio del edema pulmonar, la taquicardia y la hipertensión parecía estar todo, pero universalmente asociado temporalmente, con la aparición de un espectro de células altamente activadas del linaje linfoide en la sangre periférica. Se detectaron células con similitudes morfológicas cercanas a estos -inmunoblastos- en los pulmones congestionados y pesados de los pacientes que llegaron a la autopsia, así como en órganos linfoides y en las tríadas portal [63, [78] [79] [80]. Estas observaciones llevaron a especular que algún componente de la patogénesis por hantavirus podría estar vinculado a la aparición de células T antivirales que podrían estimular o contribuir a la aparición de una -tormenta de mediadores y el fenotipo de fuga capilar asociado. Estudios posteriores han confirmado la expectativa de que una fracción significativa de la población de inmunoblastos en pacientes con HCPS son células T con especificidad para epitopes específicos de antígenos virales de clase I presentados por el HLA, incluyendo Gn, Gc y N [77, [81] [82] [83]. Presumiblemente, las actividades antivirales de estas células, manifestadas en parte por su elaboración de mediadores en el intersticio afectado, pueden contribuir a la fuga endotelial/capilar que se encuentra en el corazón de la patogénesis del hantavirus. Debido a que los primeros casos de HCPS a menudo llegaron a la autopsia, se hizo posible examinar tejidos necropsiados para la expresión de citocinas. El estudio de Mori et al. (1999) revelaron una alta expresión relativa de citocinas proinflamatorias incluyendo TNF-, IL-1-, IL-6, proporcionando evidencia a favor de un modelo de tormenta de citoquinas para la patogénesis [64]. Los autores creían, basándose en la morfología de las células secretadoras de citoquinas, que tanto monocitos como linfocitos estaban contribuyendo a la producción de citocinas. Que los mediadores proinflamatorios se encuentran en niveles elevados en el plasma, así como el intersticio renal de pacientes con enfermedad hantaviral aguda se ha reconocido desde hace algún tiempo también [84, 85]. Si bien el diagnóstico de HCPS y HFRS se realiza mejor con serología IgM, en la etapa aguda de la infección por NVS, también se puede utilizar RT-PCR si se utilizan células sanguíneas o coágulos de sangre en lugar de plasma o suero, donde la sensibilidad incluso utilizando imprimaciones PCR anidadas disminuye a cerca del 70% [86] [87] [88]. En una instalación en la que se tratan muchos casos de HCPS, el centro médico de la Universidad de Nuevo México en Albuquerque, se ha ofrecido un servicio de diagnóstico en el que se analizan los hallazgos hematológicos del paciente para establecer la probabilidad de que un paciente tenga HCPS. La combinación de trombocitopenia, abundancia elevada de linfocitos -inmunoblasto-, población de células polimorfonucleares con desplazamiento izquierdo sin evidencia morfológica fuerte para su activación, y valores elevados de hemoglobina o hematocrito es altamente específica para el HCPS y permite a los clínicos la capacidad de poner pacientes presuntivos-HCPS en oxigenación de membrana extracorpórea (ECMO), que se cree que ha salvado a muchos pacientes de un resultado letal [89]. Se cree que la infección humana por hantavirus sigue el contacto con secreciones o excreciones producidas por roedores infectados. En los Estados Unidos, 538 infecciones humanas por hantavirus fueron reportadas hasta finales de diciembre de 2009 [90], con Nuevo México, Arizona y Colorado mostrando los casos más altos. Mientras que el prototípico hantavirus centroamericano en América Central fue el virus Rio Segundo de Reithrodontomys mexicanus de Costa Rica, la primera enfermedad humana apareció algunos años más tarde en Panamá, donde el virus Choclo (CHOV) surgió como el agente etiológico y se cree que es responsable de todos los casos conocidos de HCPS. La rata de arroz pigmeo fulvo Oligoryzomys fulvescens ha sido identificada como el reservorio de roedores [91]. En Panamá, los primeros casos de HCPS, aunque con poca o ninguna implicación cardiaca evidente, fueron reportados en 1999, y desde entonces, 106 infecciones humanas han ocurrido con una tasa de mortalidad del 26% [92]. Seroencuestas de mamíferos en México y Costa Rica han encontrado anticuerpos antihantavirus [93] [94] [95] [96], y se han notificado seroprevalencias que oscilan entre 0,6 y 1,6% en poblaciones humanas a pesar de la ausencia de casos conocidos de HCPS [97]. En América del Sur, los casos de HCPS se han identificado en Argentina, Bolivia, Brasil, Chile, Paraguay y Uruguay, y también se han notificado evidencias de exposición humana a hantavirus en Venezuela [98] y Perú [99]. En América del Sur, ANDV es el principal agente etiológico con casos en Chile y Argentina notificados desde 1995. En Chile, se han producido 671 casos de HCPS debido a ANDV durante el período 2001-2009 [100]. Desde 1995 se han reportado más de 1.000 casos de HCPS en Argentina [101] ; en el Brasil se han identificado aproximadamente 1.100 casos de HCPS entre 1993 y 2008 [102]. Las tasas de mortalidad por casos en esos tres países han sido similares, oscilando entre el 30% (Argentina), el 36% (Chile) y el 39% (Brasil). Las infecciones por Hantavirus ocurren con más frecuencia en hombres que en mujeres, aunque la proporción entre hombres y mujeres es muy variable. Por ejemplo, las comunidades panameñas mostraron una proporción de 55 hombres por 45 mujeres [103], mientras que en Chile la proporción es más sesgada por hombres (71%) [104]. En el Chaco paraguayo la proporción entre hombres y mujeres se aproxima al 50% [105]. En América del Norte, en diciembre de 2009 el 63% de los pacientes eran varones [90]. Todos los grupos étnicos y raciales parecen ser susceptibles a infecciones por el hantavirus, y las diferencias entre ciertos grupos (como indígenas y no indígenas) están más probablemente correlacionadas con el tipo de hábitat en el que reside la población (por ejemplo, zonas rurales frente a zonas urbanas). De hecho, las comunidades rurales representan la mayor incidencia global del hantavirus y, por lo tanto, están en mayor riesgo [92, [105] [106] [107] [108] [109] [109] [119], aunque también se ha destacado la importancia de los entornos peridomésticos como una importante zona de exposición [112, 113]. El principal mecanismo por el que los seres humanos adquieren la infección por el hantavirus es la exposición a aerosoles de heces contaminadas de roedores, orina y saliva [114, 115]. Esto puede ocurrir cuando los seres humanos residen en áreas cercanas a las que habitan los roedores, viven en áreas infestadas de roedores, o cuando los roedores invaden entornos humanos, que son más frecuentes en hábitats rurales.Existe una larga historia de coexistencia humana con roedores, lo que plantea dudas sobre el aparente aumento reciente de las enfermedades relacionadas con el hantavirus, especialmente el HCPS. Aparte de una aparente asociación con eventos de oscilación sureña de El Niño (ENSO) en algunas regiones [116, 117], los recientes incrementos en la incidencia del HCPS no parecen seguir un patrón temporal o espacial fácilmente definido. Sin embargo, algunas características del paisaje, como la fragmentación del hábitat o las áreas perturbadas por el ser humano, pueden influir en la dinámica de la población de roedores e impactar en la incidencia viral [118] [112] [112] [121]. A pesar de la estocástica asociada a la contracción de la infección Las actividades humanas en edificios mal ventilados que pulverizan partículas que luego se inhalan (es decir, limpieza, agitación de alfombras, polvo) se identifican con frecuencia entre los pacientes admitidos para el SHCPS [11, 122]. Se cree que las actividades al aire libre transmiten un menor riesgo debido a la labilidad de los hantavirus a la radiación UV y a la supuesta tendencia a dispersarse en el viento, aunque ciertas condiciones ambientales parecen mantener el virus durante períodos más largos fuera de su huésped natural, lo que permite la transmisión indirecta [123]. Una vía alternativa pero poco común de transmisión del virus es la mordedura de roedores [124] [125] [126]. Los trabajadores sobre el terreno que manipulan mamíferos corren un riesgo potencialmente mayor de exposición a infecciones por hantavirus, aunque cuando se cuantifica a través de serosurveys el riesgo absoluto parece bastante leve [127]. Un nuevo estudio en Colorado sugiere la posibilidad de que una picadura de roedor haya sido el vehículo próximo para la transmisión al aire libre de NVS [128], lo que vuelve a enfatizar el uso de equipo de protección personal durante las actividades de trabajo de campo [129]. Como caso particular dentro de los hantavirus, la transmisión de persona a persona ha sido documentada exclusivamente para el virus de los Andes sudamericanos [130] [133] [133] [135]. La identificación de esta vía de transmisión se ha hecho utilizando tanto herramientas moleculares como encuestas epidemiológicas, pero el mecanismo de transmisión interpersonal no está bien establecido. Curiosamente, ANDV también puede ser derramado por los humanos a través de otros fluidos biológicos como la orina [136], ilustrando las propiedades particulares que diferencian este virus de otros hantavirus. Aunque la transmisión interpersonal parece ser única para ANDV, el ARN viral de PUUV se ha detectado en la saliva de pacientes con HFRS, y algunos pacientes con SNV-HCPS tienen ARN viral en las secreciones traqueales [88, 137]. Los Hantavirus en las Américas son alojados naturalmente por roedores (Muridae y Cricetidae) así como las musarañas (Soricidae) y los lunares (Talpidae) (Figura 1). Tres especies de musgo y un mole han sido reportados para albergar hantavirus y su patogenicidad para los humanos permanece desconocida [22, 138, 139]. Se han identificado al menos 15 especies de roedores como portadores de diferentes hantavirus patógenos, con algunos genotipos sudamericanos como Castelo do Sonhos (CDSV) o Hu39694 sólo identificados después de infecciones humanas (Figura 1 ). Los hantavirus suelen mostrar una alta especificidad de especie y ningún huésped intermedio [140]. Sin embargo, se han descrito algunos genotipos de hantavirus en la misma especie de roedores. Tal es el caso de Playa de Oro (OROV) y Catacamas (CATV) identificados en Oryzomys couesi [141, 142], o Maporal (MAPV) y Choclo (CHOV) hospedados por O. fulvescens [91, 143]. En América del Norte se han detectado virus de muleshoe y Black Creek Canal hanta en sigmodon hispidus [ Además, un genotipo de hantavirus (por ejemplo, el virus similar a Juquitiba) puede ser transportado por más de una especie de roedores (O. nigripes, Oxymycterus judex, Akodon montesis). Otro ejemplo es el virus Laguna Negra (LANV) que después de ser identificado en Calomys laucha [146] también ha sido reportado en C. callosus [147]. El rápido aumento en el descubrimiento de nuevos hantavirus y la identificación de sus anfitriones no parece probable que termine tan pronto como se examinen nuevas especies pequeñas de mamíferos [95]. Este tema se complica por la continua controversia en los criterios para la clasificación de distintos hantavirus [148, 149], que también está vinculado a la clasificación taxonómica y los reordenamientos taxonómicos. La transmisión de especies cruzadas es un proceso importante durante la propagación, aparición y evolución Particularmente dentro de los hantavirus, los derrames a los huéspedes secundarios se identifican cada vez más a medida que se realizan estudios más extensos [151] [152] [153] [155] [156]. Por ejemplo, ANDV es el agente etiológico predominante del HCPS en América del Sur, y O. longicaudatus el principal reservorio de roedores. Derrama en al menos otras cuatro especies de roedores que coocurren con el reservorio se han identificado, con Abrothrix longipilis mostrando la segunda mayor prevalencia de anticuerpos de ANDV, y actualmente no hay duda de que el virus es extremadamente similar genéticamente entre los dos roedores del huésped [157, 158]. En América del Norte, el derrame del virus Bayou (BAYV) puede haber ocurrido desde el reservorio principal de O. palustris a S. hispidus, R. fulvescens, P. leucopus y B. taylori [159] [160] [161]. Es más probable que el derrame del virus Hanta se produzca con poblaciones de acogida que habitan regiones simpatricas o sintópicas [151, 162], y la transmisión de especies cruzadas tendría probablemente mayores posibilidades de éxito si las especies anfitrionas están estrechamente relacionadas [163]. Se encuentra una excepción interesante entre el virus Oxbow (OXBV) y el virus Asama (ASAV) en el que un proceso de cambio de huésped parecía haber ocurrido entre mamíferos pertenecientes a dos familias (Talpidae y Soricidae), probablemente como resultado de la codivergencia alterna y recurrente de ciertos tax Los hantavirus son transmitidos horizontalmente entre roedores y no son transmitidos por artrópodos (a diferencia de otros virus de la familia Bunyaviridae). La infección por derrapadores a mamíferos no humanos generalmente no produce ninguna transmisión hacia adelante (o a fin de morir), pero si los seres humanos están infectados pueden resultar en una alta morbilidad y mortalidad [122, 164]. Durante la primavera de 1993, un brote de pacientes con HCPS debido a SNV ocurrió en los estados de Four Corners, resultando en más del 60% de casos de mortalidad entre los casos iniciales, muchos de los cuales involucran a miembros de la tribu Navajo [12, 121]. En Panamá, se notificó un brote durante 1999-2000 en Los Santos, y 12 casos donde se identificaron con tres muertes [165, 166]. Esto representó el primer informe de infecciones por hantavirus humanos en América Central. En América del Sur, Diecisiete individuos fueron identificados con anticuerpo NVS (ELISA) o fueron antígenos (HCI) positivos de 52 casos sospechosos [167]. En 1996 ocurrieron brotes mayores debidos a ANDV en el sur de Argentina [131, 134] ; en el sur de Chile se presentaron grupos de pacientes con enfermedad por hantavirus en 1997 [158]. En Brasil, el primer brote fue identificado en la Amazonía Brasileña (Estado de Maranhão) en el año 2000, e involucró pequeños pueblos que resultaron en una prevalencia del 13,3% de los evaluados (398 residentes totales) [168]. Los factores que desencadenan los brotes de hantavirus todavía son mal entendidos, probablemente porque resultan de varias características bióticas y abióticas interactuantes cuyos parámetros clave son difíciles de modelar. Sin embargo, el uso de nuevos enfoques de modelado que involucran características geográficas y ambientales parece ser prometedor a la hora de predecir posibles brotes de hantavirus y/o áreas de mayor riesgo [169] [170] [171] [172]. Debido a que se sabe que los hantavirus se transmiten directamente de los huéspedes infectados a los susceptibles, el primer enfoque natural es relacionar los brotes con la ecología de los huéspedes virales. La transmisión y persistencia del hantavirus en las poblaciones de roedores depende de varios factores que interactúan para afectar la dinámica ecológica del huésped, que a su vez está fuertemente influenciada por las características de comportamiento de las especies de roedores individuales, a la estructura paisajística y a las características ambientales [173, 174]. La transmisión viral depende de las tasas de contacto entre los huéspedes sensibles, y a pesar de la noción prevaleciente de que un aumento de la densidad se encuentra y, por lo tanto, de Además, se ha demostrado que la transmisión de NVS sigue un patrón de heterogeneidad de contacto, donde los individuos de la población tienen diferentes probabilidades de transmitir la infección [176]. La comprensión de la transmisión viral resulta ser mucho más compleja cuando especies distintas del principal huésped del reservorio se incorporan en el modelo. De hecho, estudios recientes han demostrado que la mayor diversidad de especies hospedantes está correlacionada con una menor prevalencia de infección en América del Norte para P. maniculatus [177], en América Central para O. fulvescens (reservorio del virus Choclo) y Zygodontomys brevicauda (reservorio del virus Calabazo) [178], y en América del Sur para Akodon montensis (reservorio del virus Jabora) [162]. Las tasas de contacto varían según la distribución espacial de las poblaciones y parecen estar Por ejemplo, la prevalencia de SNV en P. maniculatus fue mayor en paisajes con mayor grado de fragmentación del hábitat preferido [179]. Además, ciertas propiedades del paisaje como elevación, pendiente y cubierta terrestre parecen ser útiles para detectar áreas con infecciones persistentes de SNV, y por lo tanto se consideran áreas refugiales donde el virus puede mantenerse durante años [169]. Los cambios en el entorno natural de las especies de reservorios, como la fragmentación forestal y la pérdida de hábitat, pueden alterar la abundancia y distribución de la población y provocar brotes de hantavirus, como se observa en la Península de Azurero de Panamá [118, 119]. Además, las diferencias en el microhábitat, incluida la cubierta superficial, pueden conducir a diferencias en la dinámica ecológica dentro de las poblaciones y afectar a la tasa de exposición al virus [180]. Se han encontrado diferencias en las infecciones por hantavirus a través de paisajes contrastantes en el intervalo latitudinal en poblaciones de roedores de O. longicaudatus en Chile, lo que sugiere que los seres humanos están expuestos de manera diferencial al virus [107, 181]. La dinámica poblacional de roedores se ve afectada por cambios estacionales de clima y clima [182, 183]. En el caso de los brotes asociados a ENSO, se ha postulado una compleja cascada de eventos desencadenados por lluvias altamente inusuales en el año precedente para dar lugar a un aumento de la producción primaria y densidades de roedores, aumentando también la probabilidad de transmisión del virus a los seres humanos, pero ha resultado difícil demostrar con precisión los eventos intermedios sugeridos, como el aumento de las densidades de roedores en el aumento de la carga de casos [116, 121, 184]. En América del Sur, los efectos del cambio climático y los brotes de hantavirus no han sido bien estudiados, a pesar del conocimiento de que varias especies de roedores que son reservorios de enfermedades emergentes se han visto dramáticamente afectadas por eventos como El Niño [185]. Los cambios en la dinámica de la población de acogida también se ven afectados por la estacionalidad, lo que puede conducir a brotes de enfermedades cuando se interrumpen los procesos que equilibran las poblaciones de roedores de temporada en temporada [186]. La emergencia viral puede seguir promoviéndose a medida que los cambios introducidos por el ser humano continúan aumentando en el medio ambiente a diferentes escalas geográficas. Estos cambios también pueden alterar la estructura y dinámica de la población de roedores e interacciones interespecies creando condiciones que pueden conducir a brotes virales, establecimiento viral en nuevos hospederos, y la aparición de HCPS [102, 162], incluso con aparentemente leve perturbación ecológica al sistema virus-hospedero [188]. Ciertas características fisiopatológicas, incluyendo trombocitopenia y shock, de enfermedades por hantavirus de los seres humanos, tienen similitud sustancial con las fiebres hemorrágicas inducidas por otros virus tales arenavirus, filovirus y flavivirus, a pesar de compartir esencialmente ninguna secuencia similitud con ellos. Tales observaciones plantean preguntas acerca de si tales similitudes en la patogénesis son probables similitudes de fenotipo, o en cambio reportan la presencia de mecanismos moleculares comunes entre los virus. En esta revisión se discuten las propiedades generales, descubrimientos y epidemiología/ecología de las formas de hantavirus patógenos del Nuevo Mundo, y también se busca identificar algunas de las características de las macromoléculas virales y mecanismos inmunológicos que se han propuesto como potenciales mediadores directos de los eventos patógenos que caracterizan la enfermedad humana HCPS. Si bien es poco probable que la expresión de una proteína viral particular o ARNs en aislamiento se pueda confiar en replicar fenotipos clave de infección por el virus completo, algunos de los hallazgos han sido suficientemente consistentes con lo que se conoce de la patogénesis in vivo que ofrecen plomos plausibles de primer paso en la búsqueda de objetivos terapéuticos. Esperamos con interés las revelaciones mecanísticas que seguirán el uso inevitablemente ampliado de métodos poderosos como la secuenciación profunda, imágenes cada vez más avanzadas, y métodos microscópicos, y modelos animales que por fin se pueden decir

¿Qué revela el examen microscópico del pulmón, como con el HCPS humano?

Inmunidad preexistente contra vectores de vacunas – ¿amigo o enemigo? https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3542731/SHA: f5bdf18567bb3760e1ce0550808135f0270badbd5cAutores: Saxena, Manvendra; Van, Thi Thu Hao; Baird, Fiona J.; Coloe, Peter J.; Smooker, Peter M.Fecha: 2013-01-27DOI: 10.1099/mic.0.049601-0Licencia: cc-byAbstract: En el último siglo, la atenuación exitosa de múltiples patógenos bacteriales y virales ha llevado a una forma efectiva, robusta y segura de vacunación. Recientemente, estas vacunas han sido evaluadas como vectores de parto de antígenos heterólogos, como un medio de vacunación simultánea contra dos patógenos. El consenso general de los estudios publicados es que estos vectores de vacunas tienen el potencial de ser seguros y eficaces. Sin embargo, algunos de los vectores comúnmente empleados, por ejemplo Salmonella y adenovirus, a menudo tienen respuestas inmunes preexistentes en el huésped y esto tiene el potencial de modificar la respuesta inmune posterior a un antígeno vectorizado. Esta revisión examina la literatura sobre este tema, y concluye que para vectores bacterianos puede de hecho, en algunos casos, ser un aumento en la inmunogenicidad, típicamente humoral, mientras que para vectores virales la inmunidad preexistente es un obstáculo para la inducción posterior de respuestas celulares. Texto: En los campos de la medicina y la medicina veterinaria, hay numerosas vacunas bacterianas y virales vivas, atenuadas en uso hoy en todo el mundo. La seguridad y eficacia de estas vacunas está bien establecida y permite un mayor desarrollo como sistemas vectores para liberar antígenos procedentes de otros patógenos. Varias bacterias atenuadas, incluyendo Escherichia coli, Vibrio cholerae, bacterias de ácido láctico (LAB), específicamente Lactococcus lactis, Mycobacterium, Listeria, Shigella y Salmonella, han sido probadas para la entrega dirigida de antígenos heterólogos de origen bacteriano, viral y parasitario en una variedad de huéspedes animales (Bahey-El-Din et al., 2010; Innocentin et al., 2009; Johnson et al., 2011; Tobias et al., 2008 Tobias et al.,, 2010 Tobias & Svennerholm, 2012). Las bacterias como E. coli y las bacterias del ácido láctico han ganado recientemente el favor, ya que E. coli son una bacteria del ácido comensal y láctico están presentes en la mayoría de los alimentos fermentados y por lo tanto están naturalmente presentes en el huésped. También son una opción mucho más segura que las vacunas atenuadas tradicionales en los niños y las personas inmunocomprometidas. Como esta revisión discute los efectos de las respuestas inmunes preexistentes a las vacunas atenuadas, discusión adicional de LAB y E. coli como vectores potenciales no se realizará; sin embargo, el lector se dirige a varias revisiones interesantes (Bermú dez-Humarán et al., 2011; Wells & Mercenier, 2008). Las bacterias intracelulares de los géneros Mycobacterium (Guleria et al., 1996), Listeria (Gentschev et al., 2001), Shigella (Levine et al., 1997) y Salmonella (Dougan et al., 1987) se consideran candidatas adecuadas para el suministro de antígenos vacunales debido a su capacidad para inducir respuestas inmunitarias robustas de células T (Alderton et al., 1991; Lo et al., 1999; Mastroeni et al., 2001; Mittrücker & Kaufmann, 2000; Nauciel, 1990). La Salmonella es un género que ha sido bien examinado como vector, basándose en la extensa investigación disponible sobre la fisiología y patogénesis del microorganismo (Basso et al., 2000; Killeen & DiRita, 2000; Sirard et al., 1999; Ward et al., 1999). Existen varias vacunas comerciales que se utilizan como vacunas contra la Salmonella en humanos y animales (por ejemplo, Ty21a para la fiebre tifoidea en humanos, varios serovares de Salmonella contra la salmonelosis en pollos y otros animales). La estrategia general para la vectorización del antígeno heterológico se describe en la Fig. 1. El primer ensayo clínico de un recombinante, que se realizó hace más de 20 años utilizando una Salmonella atenuada como vector de entrega, llevó a la realización de pruebas generalizadas de esta bacteria como sistema de administración de mucosas para antígenos de patógenos no Salmonella (Dougan et al., 1987). Estos estudios han demostrado la utilidad de las bacterias vivas para suministrar antígenos y vacunas de ADN expresados al sistema inmunitario del huésped (Atkins et al., 2006; Husseiny & Hensel, 2008; Jiang et al., 2004; Kirby et al., 2004). Desde entonces, varios otros vectores bacterianos intracelulares han sido probados con éxito para su capacidad de entregar una variedad de antígenos de diversos patógenos, así como la vacunación contra el cáncer. Un género que ha sido ampliamente probado como vector es Listeria. Las ventajas de Listeria son que puede invadir una variedad de células, incluyendo las células que presentan antígenos (APCs). Después de invadir la célula huésped, Listeria reside dentro del fagosoma; sin embargo, puede escapar del fagosoma con la ayuda de listeriolisina O (LLO; Hly) y residir en el citoplasma de las células, presentando así eficientemente antígeno a las células CD8 y CD4 T (Cossart & Mengaud, 1989; Kaufmann, 1993; Pamer et al., 1997). Varios estudios han demostrado la eficacia y facilidad de usar Listeria monocytogenes para administrar antígenos de vacuna heterólogos y vacunas de ADN Jensen et al., 1997; Johnson et al., 2011; Peters et al., 2003; Shen et al., 1995; Yin et al., 2011). Del mismo modo, varios vectores virales han sido probados con éxito por su capacidad para entregar antígenos de vacunas heterólogas, y esto generalmente resulta en la inducción de fuertes respuestas inmunitarias CTL. En el campo veterinario, hay numerosas vacunas de vectores virales que actualmente están autorizadas para su uso en animales de ganado y animales domesticados. Estas vacunas recombinantes se basan tanto en virus ADN (como las vacunas basadas en el virus de la viruela de aves de corral y el virus de la viruela de aves de corral, o vectores basados en el virus de la vacuna contra el virus de la rabia en la fauna silvestre) y virus ARN [como las vacunas basadas en el virus de la enfermedad de Newcastle para ser utilizadas en las aves de corral o en vacunas basadas en el virus de la fiebre amarilla (YFV) para ser utilizadas en caballos contra el virus del Nilo Occidental] (Draper & Heeney Sobre la base del registro de seguridad en el campo veterinario, muchos virus han sido estudiados para uso humano como vector en el desarrollo de vacunas (Beukema et al., 2006; Esteban, 2009; Schirrmacher & Fournier, 2009; Stoyanov et al., 2010; Weli & Tryland, 2011). Entre ellos, YFV (deformación YF-17D) fue el primero en ser autorizado para su uso en humanos, donde los cDNAs codificando las proteínas de envoltorio de YFV fueron reemplazados con los genes correspondientes de una cepa atenuada del virus de la encefalitis japonesa, SA14-14-2 (Appaiahgari & Vrati, 2010; Rollier et al., 2011). Los poxvirus también se estudian ampliamente como vectores candidatos para el uso humano, entre los cuales los derivados atenuados del virus de la vaccinia [como el virus de la vaccinia modificada Ankara (MVA) y las cepas NYVAC del virus de la vaccinia atenuada de Nueva York] son los vectores más prometedores (Esteban, 2009; Gó mez et al., 2008; Rimmelzwaan & Sutter, 2009 ). Son vectores candidatos ideales debido a su gran capacidad de envasado de ADN y su estabilidad térmica y genética (Minke et al., 2004). Se ha demostrado que el vector NYVAC induce respuestas CD4 + T dominantes, y el MVA induce respuestas de células CD4 + y CD8 + T (Mooij et al., 2008). El vector de adenovirus (Ad) es otro de los vectores más ampliamente evaluados hasta la fecha para expresar antígenos heterólogos, debido a la facilidad de producción, perfil de seguridad, estabilidad genética, la facilidad de manipulación del genoma del ADN, y la capacidad de estimular tanto respuestas inmunes innatas y adaptativas e inducir respuestas de células T y B (Alexander et al., 2012; Fitzgerald et al., 2003; Gabitzsch & Jones, 2011; Lasaro & Ertl, 2009; Vemula & Mittal, 2010; Weyer et al., 2009). En varios estudios preclínicos y clínicos sobre enfermedades infecciosas como el ántrax, la hepatitis B, el virus de inmunodeficiencia humana (VIH)-1, la gripe, el sarampión, el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), la malaria y la tuberculosis M. Saxena y otros (Chengalvala et al., 1994; Gao et al., 2006; Hashimoto et al., 2005; Hsu et al., 1992; Limbach & Richie, 2009; Radosevic et al., 2007; Shiver et al., 2002). Sin embargo, antes de que las vacunas vectorizadas puedan utilizarse en la población humana necesitan satisfacer varios criterios importantes. La seguridad es una preocupación importante, ya que incluso un nivel bajo de toxicidad es inaceptable (por supuesto, la molestia menor que acompaña a muchas vacunas es normal). En segundo lugar, una vacuna debe ser barata, para que pueda administrarse a una gran población a un costo mínimo, y esto es particularmente importante en los países pobres en recursos (Killeen & DiRita, 2000). Restricciones similares se aplican a las vacunas veterinarias, con un costo a menudo aún más importante. Por último, las respuestas inmunes celulares de larga duración y (cuando proceda) humorales al antígeno vectorizado deben ser inducidas después de la administración de estas vacunas, preferiblemente con una sola dosis (Atkins et al., 2006). Como algunos de los vectores en uso habrán sido vistos por el sistema inmune del huésped antes de la vacunación, si la presencia de respuestas inmunes preexistentes es perjudicial para el desarrollo ulterior de un esquema de vacunación basado en vectores, o puede aumentar las respuestas al antígeno vectorizado, debe considerarse en detalle. Este es el tema de esta revisión. Al discutir los posibles efectos sobre la inmunidad preexistente, la inmunidad natural al vector Por lo tanto, teniendo en cuenta un vector como Salmonella, si un huésped ha sido infectado previamente existirán respuestas robustas de memoria B y T, y como tal, cuando se administre una vacunación, se inducirá una respuesta anamnésica a los antígenos Salmonella (mientras que la respuesta al antígeno vectorizado será una respuesta primaria), lo que teóricamente reducirá la exposición del antígeno heterólogo al sistema inmunitario, ya que el vector se elimina rápidamente. Sorprendentemente, como se verá en algunos de los ejemplos que se dan a continuación, esto puede tener resultados que difieren en función de la magnitud de la respuesta al antígeno vectorizado. Del mismo modo, para los antígenos viralmente vectorizados, la existencia de inmunidad preexistente al vector (particularmente el anticuerpo neutralizante) restringirá la entrega del virus a las células, reduciendo así efectivamente la dosis del antígeno vectorizado. En el caso de los vectores bacterianos, el efecto de las respuestas inmunológicas preexistentes sólo se ha probado utilizando Salmonella serovars y Listeria spp. Preocupación de que la experiencia inmunológica previa del huésped con la cepa vectorial de Salmonella homóloga o una cepa relacionada podría comprometer su capacidad de entregar antígenos de vacuna heteróloga se planteó por primera vez en 1987 (Dougan et al., 1987). Bao y Clements notificaron posteriormente evidencia experimental de las consecuencias de la exposición previa de animales a la cepa vectorial (Bao & Clements, 1991). Este trabajo mostró que tanto las respuestas séricas como de anticuerpos mucosas contra el antígeno extranjero estaban de hecho reguladas en animales con exposición previa a la cepa vectorial. Whittle & Verma (1997) notificaron hallazgos similares. Los ratones inmunizados a través de la vía intraperitoneal con mutante Salmonella dublin aroA que expresa el antígeno heterólogo después de haber sido expuestos al mismo vector mostraron una mayor respuesta inmune al antígeno vectorizado en comparación con ratones sin memoria inmunológica contra el vector. Posteriormente, se han realizado varios estudios para examinar el efecto de la inmunidad preexistente en el huésped contra Salmonella. Estos resultados se resumen en la Tabla 1. Los diversos informes son contradictorios en sus hallazgos y parecen pintar un cuadro bastante confuso. Algunos estudios concluyeron que la inmunidad preexistente contra el vector Salmonella conduce a respuestas inmunes más fuertes contra el antígeno liberado (Bao & Clements, 1991; Jespersgaard et al., 2001; Kohler et al., 2000a, b; Metzger et al., 2004; Saxena et al., 2009; Sevil Domènech et al., 2008; Whittle & Verma, 1997), con otros considerando que la inmunidad preexistente es un factor limitante en el uso a largo plazo de Salmonella como vector eficiente para la entrega de antígenos (Attridge et al., 1997; Gahan et al., 2008; Roberts et al., 1999; Sevil Domènech et al., 2007; Vindurampulle & Attridge, 2003a, b). Una ligera mayoría de los estudios enumerados en la Tabla 1 (10 versus ocho) indican la regulación ascendente de las respuestas inmunitarias después de que los animales hayan estado expuestos a cepas homólogas o relacionadas antes de la entrega del antígeno heterólogo utilizando un vector Salmonella. Un estudio realizado por Metzger y colaboradores en voluntarios humanos utilizando Salmonella Typhi como vector sugiere que no hubo cambios en la respuesta inmune de las células T contra el antígeno heterólogo en voluntarios humanos que estuvieron expuestos a vectores vacíos en comparación con voluntarios inmunológicamente ingenuos de la cepa vectorial (Metzger et al., 2004). En estos sujetos, las respuestas humorales fueron moderadamente elevadas en individuos preexpuestos. Del mismo modo, Saxena et al. (2009) indicaron una mayor respuesta humoral y celular T en ratones preexpuestos a cepas de Salmonella homólogas o heterólogas. La respuesta a la interleucina 4 (IL4) fue significativamente mayor cuando el huésped animal fue expuesto a la cepa homóloga, mientras que la preexposición a una especie relacionada no tuvo tal impacto en las respuestas a la IL4. Por el contrario, las respuestas al interferón (IFN)-c fueron más altas, independientemente de la cepa a la que los ratones estaban preexpuestos. Este estudio también indicó que la presencia de anticuerpos opsonizantes homólogos o heterologosos conduce a una mayor absorción de Salmonella por macrófagos in vitro, lo que puede explicar las respuestas inmunes más altas en ratones expuestos. Como es de esperarse, la absorción fue mayor cuando se utilizó la sura homóloga como la opsonina en lugar de la sura heterologosa. Esto se muestra en la figura 2. Por el contrario, hay informes que indican que la inmunidad preexistente contra el vector bacterial de Atridge y compañeros de trabajo reportaron que la presencia de inmunidad contra el vector bacteriano antes de la entrega de microbiología antigénica vectorizada 159 proteína puede reducir las respuestas inmunes en ratones contra el antígeno liberado (Attridge et al., 1997). Resultados similares fueron reportados por Roberts et al. (1999) y Vindurampulle & Attridge (2003a, b). Sin embargo, estos últimos autores encontraron que la hipo-respuesta podría ser eliminada en gran medida exponiendo a los animales al antígeno extranjero antes del vectorpriming (Vindurampulle & Attridge, 2003b). Desafortunadamente, esto parecería ser poco práctico para un régimen de inmunización! Un estudio presentado por Gahan et al. (2008) ratones inmunizados con S. Typhimurium expresando C fragmento de antígeno de toxina tetánica de una expresión plasmido o como vacuna del ADN. Los ratones vacunados desarrollaron respuestas humorales a LPS y tetC (para las vacunas portadoras de plásmidos). Los animales de todos los grupos (incluyendo un grupo previamente no vacunado) fueron vacunados el día 182 con Salmonella expresando tetC. En este momento, los títulos anti-LPS y tetC comenzaron a disminuir. Catorce días después de la segunda inmunización, se evaluó la colonización de varios órganos de ratón. Se encontró que la capacidad de colonizar se redujo significativamente en grupos que habían sido vacunados previamente con Salmonella. En vista de este hallazgo, tal vez no fue sorprendente que en el día 210 los títulos de LPS no fueran significativamente diferentes entre los grupos que recibieron una o dos vacunas. Lo más interesante es que ratones que habían sido preparados con Salmonella sola, y luego impulsados con Salmonella expresando tetC, indujeron respuestas anti-tetC mucho más bajas Esto argumenta fuertemente que la inmunidad inmunológica previa al vector puede amortiguar seriamente las respuestas humorales posteriores específicas del antígeno.No se evaluó si lo mismo es cierto para las respuestas celulares.Otros estudios han evaluado las respuestas celulares.Un estudio de Sevil Domènech y colegas reportó que la inmunidad antivectora preexistente compromete seriamente las respuestas CD8 + en ratones cuando se exponen a una cepa similar utilizada como vector (Sevil Domènech et al., 2007).En contraste, otro estudio de los mismos autores reportó que los animales expuestos a vectores relacionados inducen respuestas CD8 + mucho más altas cuando se comparan con animales que no tienen ninguna inmunidad de Salmonella preexistente (Sevil Domènech et al., 2008).La diferencia entre estos dos estudios fue que en el primero, la prima y el impulso fueron con serovares idénticos, mientras que en el segundo estudio se utilizaron diferentes serovares. Esto puede apuntar a una manera de evitar la regulación de las respuestas CD8 por la inmunidad preexistente. Esto es importante, ya que una de las ventajas del uso de Salmonella (un patógeno intracelular) es que se pueden inducir fuertes respuestas inmunes celulares. Cabe señalar que en el caso de las vacunas Salmonella, se deben considerar efectos distintos de las respuestas estrictamente inmunológicas (especialmente respuestas adaptativas). En el contexto de la inmunidad innata, se demostró que la administración de Salmonella no virulenta a los cerdos gnobióticos eliminó la enfermedad después de un desafío con una cepa virulenta (Foster et al., 2003). Curiosamente, la protección no fue por exclusión competitiva, ya que la cepa virulenta fue en gran número en el intestino pero no se distribuyó sistémicamente. La protección fue propuesta para ser mediada por la infiltración de un gran número de leucocitos polimorfonucleares en el intestino, y aunque tal vez poco práctico como profiláctico general (como el tiempo entre la vacunación y la infección es corto), esto puede ser una opción para la vacunación a corto plazo o tal vez terapéutica (como revisado por Foster et al., 2012). Pollos (Gallus gallus) son un reservorio natural de animales para Salmonella, lo que los convierte en una fuente importante de gastroenteritis asociada a Salmonella en los seres humanos. La capacidad de utilizar vacunas orales de Salmonella para inmunizar contra patógenos heterólogos sería de enorme beneficio para la toma de STM-1 por J774 macrófagos, en relación con el porcentaje de absorción más alto. X, opsonizada con suero ingenuo; m, opsonizada con suero de ratones expuestos a la enteriditis de Salmonella; &, opsonizada con suero de ratones expuestos a STM-1. Inmunidad preexistente contra vectores de vacunas en la industria avícola tanto en manadas de pollos de engorde como en bandadas de capas. Tanto la transmisión vertical como horizontal está asociada con Salmonella en pollos (Liljebjelke et al., 2005). La transmisión vertical a través de la transmisión en ovo es particularmente importante, ya que si hay exposición previa a la cepa de la vacuna, la vacunación posterior mediante un vector de Salmonella oral podría verse gravemente comprometida. Un número considerable de estudios sobre inmunidad cruzada y exclusión competitiva se han realizado en pollos. Además, un estudio reciente informó que el tratamiento previo de pollos recién nacidos con diferentes cepas de Salmonella podría producir un efecto inhibitorio de invasión completa en cualquier posterior exposición a cepas homólogas y heterólogas (Methner et al., 2010). La preexposición con una forma altamente invasiva de Salmonella Enteritidis causó una gran afluencia de heterófilos a la mucosa cecal en pollitos de 1 día de edad, y la posterior colonización cecal heteróloga fue inhibida durante un período de 48 h (Methner et al., 2010). Las implicaciones de este tipo de estudios de colonización-inhibición sobre el estado inmunológico de los pollos afectados todavía no se han elucidado completamente. Cabe señalar que los estudios enumerados en los cuadros 1 y 2 son estudios de laboratorio controlados, con la posibilidad de un componente de exclusión competitiva a la inmunidad no discutido Estudios similares de L. monocytogenes y los efectos de las respuestas inmunes preexistentes indican resultados contradictorios.Un estudio de Bouwer et al. (1999) indica que las respuestas inmunes preexistentes contra el vector Listeria no disminuyen las respuestas inmunes contra el antígeno heterólogo liberado, y un estudio similar de Starks et al. (2004) también concluyó que la exposición previa de ratones al vector Listeria vacío no influyó en las respuestas inmunes anticancerosas cuando se utilizó un mutante similar como portador de un antígeno de cáncer de melanoma. (2005) en el que se utilizó L. monocytogens para administrar la proteína gag del virus de la inmunodeficiencia felina (FIV) y como portadora de vacunas de ADN para vacunar a los gatos contra la proteína de envoltorio FIV indicó respuestas inmunes más bajas contra el antígeno liberado en gatos expuestos al vector de Listeria vacío en comparación con animales ingenuos (Stevens et al., 2005). Tvinnereim et al. (2002) y Leong et al. (2009) han reportado hallazgos similares. Sin embargo, tomados en conjunto, estos estudios concluyen que la exposición previa de los animales de acogida al vector vacío no abroga las respuestas inmunes al antígeno vectorizado, sino que sólo las reduce un poco. Sólo el estudio de Vijh et al. (1999) indicó que la exposición al vector vacío puede abrogar completamente las respuestas inmunes contra los antígenos suministrados (Vijh et al. Leong et al. (2009) también demostraron que el impacto negativo de las respuestas inmunitarias específicas de los vectores también puede contrarrestarse mediante la inmunización repetida con la misma vacuna y dosis; esto en efecto conduce a una mayor primovacunación de células T ingenuas contra el antígeno liberado. Por supuesto, esta vacunación repetida puede no ser factible en situaciones del mundo real. A pesar de las muchas ventajas que la vectorización viral puede ofrecer, la inmunidad preexistente es un obstáculo importante de muchas vacunas virales con vectores, como el Ad serotipo 5 o el virus herpes simple tipo 1 (HSV-1), donde la tasa de seroprevalencia a estos virus es muy alta [40-45 % y 70% (o más) de la población estadounidense, respectivamente] (Hocknell et al., 2002; Pichla-Gollon et al., 2009). Los anticuerpos vectoriales pueden impedir la inducción de respuestas inmunitarias a los antígenos codificados por la vacuna, ya que pueden reducir la dosis y el tiempo de exposición de las células diana a los antígenos vacunados (Pichla-Gollon et al., 2009; Pine et al., 2011). En un ensayo clínico a gran escala (STEP) de una vacuna contra el VIH-1 basada en Ad serotipo 5 (AdHu5), las vacunas mostraron una falta de eficacia y tendieron a aumentar el riesgo de infección por el VIH-1 en los receptores de vacunas que tenían anticuerpos neutralizantes preexistentes contra AdHu5 (Buchbinder et al., 2008). Para una vacuna vectorial basada en el HSV-1, se ha demostrado que la inmunidad anti-HSV-1 preexistente disminuyó, pero no suprimió, las respuestas inmunes humorales y celulares contra el antígeno codificado por la vacuna ( Sin embargo, Brockman y Knipe encontraron que la inducción de respuestas duraderas de anticuerpos y respuestas celulares proliferativas al antígeno HSVencoded no se vieron afectadas por la inmunidad previa del VHS (Brockman & Knipe, 2002). Del mismo modo, la inmunidad preexistente al poliovirus tiene poco efecto sobre la eficacia de la vacuna contra el poliovirus (Mandl et al., 2001). Diferentes efectos de la inmunidad preexistente sobre la eficacia de los vectores de vacunas virales recombinantes se resumen en la Tabla 2. Existen varios enfoques para evitar la inmunidad vectorial preexistente, como el uso de vectores derivados de fuentes no humanas, utilizando virus humanos de serotipos raros (Kahl et al., 2010; Lasaro & Ertl, 2009), enfoques heterólogos de primer impulso (Liu et al., 2008), reinmunización homóloga (Steffensen et al., 2012) y la eliminación de epítopos neutralizantes clave en la superficie de las proteínas capsídicas virales (Gabitzsch & Jones, 2011; Roberts et al., 2006). El efecto inhibidor de la inmunidad preexistente también puede evitarse enmascarando el vector Ad dentro de las células dendríticas (DCs) (Steffensen et al., 2012). Además, la vacunación de mucosas o la administración de dosis más altas de vacunas pueden superar problemas de inmunidad preexistentes (Alexander et al., 2012; Belyakov et al., 1999; Priddy et al., 2008; Xiang et al., 2003). Mientras buscamos nuevos enfoques de vacunas para la variedad de patógenos para los que todavía no se dispone, la revisión de vacunas probadas y el desarrollo de estas más ha ganado impulso M. Saxena y otros. Por lo tanto, bacterias y virus atenuados que tienen un largo historial de eficacia y seguridad están siendo puestos en uso. Aunque muy atractivo, un tema común en estos enfoques experimentales ha sido las limitaciones que la inmunidad preexistente al vector puede plantear. Sin embargo, como muestra este examen de la literatura pertinente, hay un cuadro bastante confuso, con algunos estudios que indican que la inmunidad preexistente puede ser un amigo, en lugar de enemigo. Pocos estudios con vectores virales han informado sobre la influencia de la inmunidad preexistente en las respuestas humorales. En términos generales, para los antígenos bacterianos, las respuestas humorales fueron influenciadas por la inmunidad preexistente, con un poco más de estudios encontrando aumento en lugar de disminución. ¿Por qué hay variación? Esto puede deberse a varios factores, incluyendo el tipo de Salmonella utilizado y su invasividad. Dunstan y sus colegas probaron la capacidad de seis cepas isogénicas Salmonella serovar Typhimurium que albergan diferentes mutaciones por su capacidad de inducir respuestas inmunes contra el fragmento C de la toxina tetánica y concluyeron que la cepa que tuvo la menor capacidad de colonizar los parches de Peyer indujo las respuestas inmunes más bajas (Dunstan et al., 1998). De manera similar, el tiempo y la naturaleza de impulso del antígeno utilizado podrían ser importantes. Atridge y sus colegas indicaron la En un experimento, el impulso de ratones a las 10 semanas llevó a la inhibición completa de las respuestas de anticuerpos contra el antígeno heterólogo dado; sin embargo, cuando los ratones fueron aumentados a las 4 semanas, la regulación de las respuestas de anticuerpos no fue tan prominente (Attridge et al., 1997). Un estudio similar realizado por Kohlers y colegas muestra que el impulso a las 7 semanas después de la exposición previa a los animales al vector vacío conduce a respuestas IgG y IgA secretas más bajas específicas de antígenos; sin embargo, el aumento a las 14 semanas conduce a respuestas IgG y IgA secretas más altas (Kohler et al., 2000b). Esto está en conflicto con el resultado anterior, aunque hay que mencionar que utilizaron diferentes especies de Salmonella. Vindurampulle y Attridge también examinaron el impacto de la cepa Salmonella y la naturaleza de los antígeno En su estudio, utilizaron mutantes S. Dublin y Salmonella Stanley aroA para administrar antígenos E. coli K88 y LT-B, y concluyeron que el efecto de la inmunidad preexistente depende tanto de la cepa utilizada como del tipo de antígeno suministrado (Vindurampulle & Attridge, 2003b). Todos estos estudios sobre el efecto de la inmunidad preexistente discuten el impacto en las respuestas humorales. Sevil Domenech y colegas informaron que la exposición de animales al vector de Salmonella homólogo conduce a una reducción significativa en las respuestas CD8 +; sin embargo, la exposición de animales a una cepa heteróloga conduce a respuestas CD8 + significativamente mayores (Sevil Domènech et al., 2007, 2008. Saxena y sus colegas también reportaron que las respuestas de células T específicas de antígenos fueron similares o significativamente más altas, sin una regulación descendente en las respuestas de células T observadas después de la preexposición de ratones a cepas homólogas o heterólogas (Saxena et al., 2009). Para los vectores virales, el impacto de la inmunidad mediada por células fue más pronunciado, y como se muestra en la Tabla 2, casi siempre resultó en una reducción de la respuesta inmune posterior. Presumiblemente esto se debe a que los virus inducirán anticuerpos neutralizantes en la primera dosis, y en dosis posteriores este anticuerpo limitará el número de células transducidas, limitando así las respuestas. Esto es particularmente un problema con un vector viral común como Ad, donde una gran proporción de la población tendrá memoria inmunológica contra los serotipos comunes (Lasaro & Ertl, 2009) Como concluyen estos autores, será posible utilizar estos vectores sólo mediante el desarrollo de vacunas a partir de serotipos alternativos. Puede ser que un vector como la inmunidad preexistente contra los vectores de la vacuna virus de la gripe atenuada, con la capacidad de desarrollar fácilmente reasociantes, será útil en este contexto. Además, la memoria inmunológica en forma de anticuerpos opsonizantes sin duda juega un papel importante en la absorción temprana de Salmonella por macrófagos y DC. Esto puede ser beneficioso, ya que el vector bacteriano vivo utilizado para los propósitos del parto alberga mutaciones en proteínas codificantes de genes responsables de su supervivencia en el huésped animal. Esto no sólo afecta su capacidad de causar enfermedades, haciéndolos vectores vivos seguros, sino que también limita el número de replicaciones. La presencia de anticuerpos opsonizantes debe significar un mayor nivel de absorción bacteriana, lo que conduce a una mayor presentación al sistema inmunológico y, por lo tanto, una Anteriormente hemos demostrado que este es el caso (Saxena et al., 2009 ) (indicado en la figura 2). Sería de gran beneficio abordar estos problemas no sólo en ratones, sino también en otros organismos como los pollos, que son el huésped más probable para el uso de vectores vivos de Salmonella, específicamente donde las vacunas se desarrollan para su uso en ganado y aves de corral. Para resumir, vectores bacterianos como Salmonella y vectores virales como Ad muestran una gran promesa como vehículos de entrega de antígenos heterólogos; sin embargo, debe considerarse la exposición previa al vector. Mediante una selección juiciosa de la cepa/serotipo será posible evitar los efectos negativos y puede ser posible influir positivamente en la respuesta, especialmente para la inmunidad humoral.

¿Cuáles son los ejemplos de vectores de distribución de vacunas comerciales contra la Salmonella?

Inmunidad preexistente contra vectores de vacunas – ¿amigo o enemigo? https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3542731/SHA: f5bdf18567bb3760e1ce0550808135f0270badbd5cAutores: Saxena, Manvendra; Van, Thi Thu Hao; Baird, Fiona J.; Coloe, Peter J.; Smooker, Peter M.Fecha: 2013-01-27DOI: 10.1099/mic.0.049601-0Licencia: cc-byAbstract: En el último siglo, la atenuación exitosa de múltiples patógenos bacteriales y virales ha llevado a una forma efectiva, robusta y segura de vacunación. Recientemente, estas vacunas han sido evaluadas como vectores de parto de antígenos heterólogos, como un medio de vacunación simultánea contra dos patógenos. El consenso general de los estudios publicados es que estos vectores de vacunas tienen el potencial de ser seguros y eficaces. Sin embargo, algunos de los vectores comúnmente empleados, por ejemplo Salmonella y adenovirus, a menudo tienen respuestas inmunes preexistentes en el huésped y esto tiene el potencial de modificar la respuesta inmune posterior a un antígeno vectorizado. Esta revisión examina la literatura sobre este tema, y concluye que para vectores bacterianos puede de hecho, en algunos casos, ser un aumento en la inmunogenicidad, típicamente humoral, mientras que para vectores virales la inmunidad preexistente es un obstáculo para la inducción posterior de respuestas celulares. Texto: En los campos de la medicina y la medicina veterinaria, hay numerosas vacunas bacterianas y virales vivas, atenuadas en uso hoy en todo el mundo. La seguridad y eficacia de estas vacunas está bien establecida y permite un mayor desarrollo como sistemas vectores para liberar antígenos procedentes de otros patógenos. Varias bacterias atenuadas, incluyendo Escherichia coli, Vibrio cholerae, bacterias de ácido láctico (LAB), específicamente Lactococcus lactis, Mycobacterium, Listeria, Shigella y Salmonella, han sido probadas para la entrega dirigida de antígenos heterólogos de origen bacteriano, viral y parasitario en una variedad de huéspedes animales (Bahey-El-Din et al., 2010; Innocentin et al., 2009; Johnson et al., 2011; Tobias et al., 2008 Tobias et al.,, 2010 Tobias & Svennerholm, 2012). Las bacterias como E. coli y las bacterias del ácido láctico han ganado recientemente el favor, ya que E. coli son una bacteria del ácido comensal y láctico están presentes en la mayoría de los alimentos fermentados y por lo tanto están naturalmente presentes en el huésped. También son una opción mucho más segura que las vacunas atenuadas tradicionales en los niños y las personas inmunocomprometidas. Como esta revisión discute los efectos de las respuestas inmunes preexistentes a las vacunas atenuadas, discusión adicional de LAB y E. coli como vectores potenciales no se realizará; sin embargo, el lector se dirige a varias revisiones interesantes (Bermú dez-Humarán et al., 2011; Wells & Mercenier, 2008). Las bacterias intracelulares de los géneros Mycobacterium (Guleria et al., 1996), Listeria (Gentschev et al., 2001), Shigella (Levine et al., 1997) y Salmonella (Dougan et al., 1987) se consideran candidatas adecuadas para el suministro de antígenos vacunales debido a su capacidad para inducir respuestas inmunitarias robustas de células T (Alderton et al., 1991; Lo et al., 1999; Mastroeni et al., 2001; Mittrücker & Kaufmann, 2000; Nauciel, 1990). La Salmonella es un género que ha sido bien examinado como vector, basándose en la extensa investigación disponible sobre la fisiología y patogénesis del microorganismo (Basso et al., 2000; Killeen & DiRita, 2000; Sirard et al., 1999; Ward et al., 1999). Existen varias vacunas comerciales que se utilizan como vacunas contra la Salmonella en humanos y animales (por ejemplo, Ty21a para la fiebre tifoidea en humanos, varios serovares de Salmonella contra la salmonelosis en pollos y otros animales). La estrategia general para la vectorización del antígeno heterológico se describe en la Fig. 1. El primer ensayo clínico de un recombinante, que se realizó hace más de 20 años utilizando una Salmonella atenuada como vector de entrega, llevó a la realización de pruebas generalizadas de esta bacteria como sistema de administración de mucosas para antígenos de patógenos no Salmonella (Dougan et al., 1987). Estos estudios han demostrado la utilidad de las bacterias vivas para suministrar antígenos y vacunas de ADN expresados al sistema inmunitario del huésped (Atkins et al., 2006; Husseiny & Hensel, 2008; Jiang et al., 2004; Kirby et al., 2004). Desde entonces, varios otros vectores bacterianos intracelulares han sido probados con éxito para su capacidad de entregar una variedad de antígenos de diversos patógenos, así como la vacunación contra el cáncer. Un género que ha sido ampliamente probado como vector es Listeria. Las ventajas de Listeria son que puede invadir una variedad de células, incluyendo las células que presentan antígenos (APCs). Después de invadir la célula huésped, Listeria reside dentro del fagosoma; sin embargo, puede escapar del fagosoma con la ayuda de listeriolisina O (LLO; Hly) y residir en el citoplasma de las células, presentando así eficientemente antígeno a las células CD8 y CD4 T (Cossart & Mengaud, 1989; Kaufmann, 1993; Pamer et al., 1997). Varios estudios han demostrado la eficacia y facilidad de usar Listeria monocytogenes para administrar antígenos de vacuna heterólogos y vacunas de ADN Jensen et al., 1997; Johnson et al., 2011; Peters et al., 2003; Shen et al., 1995; Yin et al., 2011). Del mismo modo, varios vectores virales han sido probados con éxito por su capacidad para entregar antígenos de vacunas heterólogas, y esto generalmente resulta en la inducción de fuertes respuestas inmunitarias CTL. En el campo veterinario, hay numerosas vacunas de vectores virales que actualmente están autorizadas para su uso en animales de ganado y animales domesticados. Estas vacunas recombinantes se basan tanto en virus ADN (como las vacunas basadas en el virus de la viruela de aves de corral y el virus de la viruela de aves de corral, o vectores basados en el virus de la vacuna contra el virus de la rabia en la fauna silvestre) y virus ARN [como las vacunas basadas en el virus de la enfermedad de Newcastle para ser utilizadas en las aves de corral o en vacunas basadas en el virus de la fiebre amarilla (YFV) para ser utilizadas en caballos contra el virus del Nilo Occidental] (Draper & Heeney Sobre la base del registro de seguridad en el campo veterinario, muchos virus han sido estudiados para uso humano como vector en el desarrollo de vacunas (Beukema et al., 2006; Esteban, 2009; Schirrmacher & Fournier, 2009; Stoyanov et al., 2010; Weli & Tryland, 2011). Entre ellos, YFV (deformación YF-17D) fue el primero en ser autorizado para su uso en humanos, donde los cDNAs codificando las proteínas de envoltorio de YFV fueron reemplazados con los genes correspondientes de una cepa atenuada del virus de la encefalitis japonesa, SA14-14-2 (Appaiahgari & Vrati, 2010; Rollier et al., 2011). Los poxvirus también se estudian ampliamente como vectores candidatos para el uso humano, entre los cuales los derivados atenuados del virus de la vaccinia [como el virus de la vaccinia modificada Ankara (MVA) y las cepas NYVAC del virus de la vaccinia atenuada de Nueva York] son los vectores más prometedores (Esteban, 2009; Gó mez et al., 2008; Rimmelzwaan & Sutter, 2009 ). Son vectores candidatos ideales debido a su gran capacidad de envasado de ADN y su estabilidad térmica y genética (Minke et al., 2004). Se ha demostrado que el vector NYVAC induce respuestas CD4 + T dominantes, y el MVA induce respuestas de células CD4 + y CD8 + T (Mooij et al., 2008). El vector de adenovirus (Ad) es otro de los vectores más ampliamente evaluados hasta la fecha para expresar antígenos heterólogos, debido a la facilidad de producción, perfil de seguridad, estabilidad genética, la facilidad de manipulación del genoma del ADN, y la capacidad de estimular tanto respuestas inmunes innatas y adaptativas e inducir respuestas de células T y B (Alexander et al., 2012; Fitzgerald et al., 2003; Gabitzsch & Jones, 2011; Lasaro & Ertl, 2009; Vemula & Mittal, 2010; Weyer et al., 2009). En varios estudios preclínicos y clínicos sobre enfermedades infecciosas como el ántrax, la hepatitis B, el virus de inmunodeficiencia humana (VIH)-1, la gripe, el sarampión, el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), la malaria y la tuberculosis M. Saxena y otros (Chengalvala et al., 1994; Gao et al., 2006; Hashimoto et al., 2005; Hsu et al., 1992; Limbach & Richie, 2009; Radosevic et al., 2007; Shiver et al., 2002). Sin embargo, antes de que las vacunas vectorizadas puedan utilizarse en la población humana necesitan satisfacer varios criterios importantes. La seguridad es una preocupación importante, ya que incluso un nivel bajo de toxicidad es inaceptable (por supuesto, la molestia menor que acompaña a muchas vacunas es normal). En segundo lugar, una vacuna debe ser barata, para que pueda administrarse a una gran población a un costo mínimo, y esto es particularmente importante en los países pobres en recursos (Killeen & DiRita, 2000). Restricciones similares se aplican a las vacunas veterinarias, con un costo a menudo aún más importante. Por último, las respuestas inmunes celulares de larga duración y (cuando proceda) humorales al antígeno vectorizado deben ser inducidas después de la administración de estas vacunas, preferiblemente con una sola dosis (Atkins et al., 2006). Como algunos de los vectores en uso habrán sido vistos por el sistema inmune del huésped antes de la vacunación, si la presencia de respuestas inmunes preexistentes es perjudicial para el desarrollo ulterior de un esquema de vacunación basado en vectores, o puede aumentar las respuestas al antígeno vectorizado, debe considerarse en detalle. Este es el tema de esta revisión. Al discutir los posibles efectos sobre la inmunidad preexistente, la inmunidad natural al vector Por lo tanto, teniendo en cuenta un vector como Salmonella, si un huésped ha sido infectado previamente existirán respuestas robustas de memoria B y T, y como tal, cuando se administre una vacunación, se inducirá una respuesta anamnésica a los antígenos Salmonella (mientras que la respuesta al antígeno vectorizado será una respuesta primaria), lo que teóricamente reducirá la exposición del antígeno heterólogo al sistema inmunitario, ya que el vector se elimina rápidamente. Sorprendentemente, como se verá en algunos de los ejemplos que se dan a continuación, esto puede tener resultados que difieren en función de la magnitud de la respuesta al antígeno vectorizado. Del mismo modo, para los antígenos viralmente vectorizados, la existencia de inmunidad preexistente al vector (particularmente el anticuerpo neutralizante) restringirá la entrega del virus a las células, reduciendo así efectivamente la dosis del antígeno vectorizado. En el caso de los vectores bacterianos, el efecto de las respuestas inmunológicas preexistentes sólo se ha probado utilizando Salmonella serovars y Listeria spp. Preocupación de que la experiencia inmunológica previa del huésped con la cepa vectorial de Salmonella homóloga o una cepa relacionada podría comprometer su capacidad de entregar antígenos de vacuna heteróloga se planteó por primera vez en 1987 (Dougan et al., 1987). Bao y Clements notificaron posteriormente evidencia experimental de las consecuencias de la exposición previa de animales a la cepa vectorial (Bao & Clements, 1991). Este trabajo mostró que tanto las respuestas séricas como de anticuerpos mucosas contra el antígeno extranjero estaban de hecho reguladas en animales con exposición previa a la cepa vectorial. Whittle & Verma (1997) notificaron hallazgos similares. Los ratones inmunizados a través de la vía intraperitoneal con mutante Salmonella dublin aroA que expresa el antígeno heterólogo después de haber sido expuestos al mismo vector mostraron una mayor respuesta inmune al antígeno vectorizado en comparación con ratones sin memoria inmunológica contra el vector. Posteriormente, se han realizado varios estudios para examinar el efecto de la inmunidad preexistente en el huésped contra Salmonella. Estos resultados se resumen en la Tabla 1. Los diversos informes son contradictorios en sus hallazgos y parecen pintar un cuadro bastante confuso. Algunos estudios concluyeron que la inmunidad preexistente contra el vector Salmonella conduce a respuestas inmunes más fuertes contra el antígeno liberado (Bao & Clements, 1991; Jespersgaard et al., 2001; Kohler et al., 2000a, b; Metzger et al., 2004; Saxena et al., 2009; Sevil Domènech et al., 2008; Whittle & Verma, 1997), con otros considerando que la inmunidad preexistente es un factor limitante en el uso a largo plazo de Salmonella como vector eficiente para la entrega de antígenos (Attridge et al., 1997; Gahan et al., 2008; Roberts et al., 1999; Sevil Domènech et al., 2007; Vindurampulle & Attridge, 2003a, b). Una ligera mayoría de los estudios enumerados en la Tabla 1 (10 versus ocho) indican la regulación ascendente de las respuestas inmunitarias después de que los animales hayan estado expuestos a cepas homólogas o relacionadas antes de la entrega del antígeno heterólogo utilizando un vector Salmonella. Un estudio realizado por Metzger y colaboradores en voluntarios humanos utilizando Salmonella Typhi como vector sugiere que no hubo cambios en la respuesta inmune de las células T contra el antígeno heterólogo en voluntarios humanos que estuvieron expuestos a vectores vacíos en comparación con voluntarios inmunológicamente ingenuos de la cepa vectorial (Metzger et al., 2004). En estos sujetos, las respuestas humorales fueron moderadamente elevadas en individuos preexpuestos. Del mismo modo, Saxena et al. (2009) indicaron una mayor respuesta humoral y celular T en ratones preexpuestos a cepas de Salmonella homólogas o heterólogas. La respuesta a la interleucina 4 (IL4) fue significativamente mayor cuando el huésped animal fue expuesto a la cepa homóloga, mientras que la preexposición a una especie relacionada no tuvo tal impacto en las respuestas a la IL4. Por el contrario, las respuestas al interferón (IFN)-c fueron más altas, independientemente de la cepa a la que los ratones estaban preexpuestos. Este estudio también indicó que la presencia de anticuerpos opsonizantes homólogos o heterologosos conduce a una mayor absorción de Salmonella por macrófagos in vitro, lo que puede explicar las respuestas inmunes más altas en ratones expuestos. Como es de esperarse, la absorción fue mayor cuando se utilizó la sura homóloga como la opsonina en lugar de la sura heterologosa. Esto se muestra en la figura 2. Por el contrario, hay informes que indican que la inmunidad preexistente contra el vector bacterial de Atridge y compañeros de trabajo reportaron que la presencia de inmunidad contra el vector bacteriano antes de la entrega de microbiología antigénica vectorizada 159 proteína puede reducir las respuestas inmunes en ratones contra el antígeno liberado (Attridge et al., 1997). Resultados similares fueron reportados por Roberts et al. (1999) y Vindurampulle & Attridge (2003a, b). Sin embargo, estos últimos autores encontraron que la hipo-respuesta podría ser eliminada en gran medida exponiendo a los animales al antígeno extranjero antes del vectorpriming (Vindurampulle & Attridge, 2003b). Desafortunadamente, esto parecería ser poco práctico para un régimen de inmunización! Un estudio presentado por Gahan et al. (2008) ratones inmunizados con S. Typhimurium expresando C fragmento de antígeno de toxina tetánica de una expresión plasmido o como vacuna del ADN. Los ratones vacunados desarrollaron respuestas humorales a LPS y tetC (para las vacunas portadoras de plásmidos). Los animales de todos los grupos (incluyendo un grupo previamente no vacunado) fueron vacunados el día 182 con Salmonella expresando tetC. En este momento, los títulos anti-LPS y tetC comenzaron a disminuir. Catorce días después de la segunda inmunización, se evaluó la colonización de varios órganos de ratón. Se encontró que la capacidad de colonizar se redujo significativamente en grupos que habían sido vacunados previamente con Salmonella. En vista de este hallazgo, tal vez no fue sorprendente que en el día 210 los títulos de LPS no fueran significativamente diferentes entre los grupos que recibieron una o dos vacunas. Lo más interesante es que ratones que habían sido preparados con Salmonella sola, y luego impulsados con Salmonella expresando tetC, indujeron respuestas anti-tetC mucho más bajas Esto argumenta fuertemente que la inmunidad inmunológica previa al vector puede amortiguar seriamente las respuestas humorales posteriores específicas del antígeno.No se evaluó si lo mismo es cierto para las respuestas celulares.Otros estudios han evaluado las respuestas celulares.Un estudio de Sevil Domènech y colegas reportó que la inmunidad antivectora preexistente compromete seriamente las respuestas CD8 + en ratones cuando se exponen a una cepa similar utilizada como vector (Sevil Domènech et al., 2007).En contraste, otro estudio de los mismos autores reportó que los animales expuestos a vectores relacionados inducen respuestas CD8 + mucho más altas cuando se comparan con animales que no tienen ninguna inmunidad de Salmonella preexistente (Sevil Domènech et al., 2008).La diferencia entre estos dos estudios fue que en el primero, la prima y el impulso fueron con serovares idénticos, mientras que en el segundo estudio se utilizaron diferentes serovares. Esto puede apuntar a una manera de evitar la regulación de las respuestas CD8 por la inmunidad preexistente. Esto es importante, ya que una de las ventajas del uso de Salmonella (un patógeno intracelular) es que se pueden inducir fuertes respuestas inmunes celulares. Cabe señalar que en el caso de las vacunas Salmonella, se deben considerar efectos distintos de las respuestas estrictamente inmunológicas (especialmente respuestas adaptativas). En el contexto de la inmunidad innata, se demostró que la administración de Salmonella no virulenta a los cerdos gnobióticos eliminó la enfermedad después de un desafío con una cepa virulenta (Foster et al., 2003). Curiosamente, la protección no fue por exclusión competitiva, ya que la cepa virulenta fue en gran número en el intestino pero no se distribuyó sistémicamente. La protección fue propuesta para ser mediada por la infiltración de un gran número de leucocitos polimorfonucleares en el intestino, y aunque tal vez poco práctico como profiláctico general (como el tiempo entre la vacunación y la infección es corto), esto puede ser una opción para la vacunación a corto plazo o tal vez terapéutica (como revisado por Foster et al., 2012). Pollos (Gallus gallus) son un reservorio natural de animales para Salmonella, lo que los convierte en una fuente importante de gastroenteritis asociada a Salmonella en los seres humanos. La capacidad de utilizar vacunas orales de Salmonella para inmunizar contra patógenos heterólogos sería de enorme beneficio para la toma de STM-1 por J774 macrófagos, en relación con el porcentaje de absorción más alto. X, opsonizada con suero ingenuo; m, opsonizada con suero de ratones expuestos a la enteriditis de Salmonella; &, opsonizada con suero de ratones expuestos a STM-1. Inmunidad preexistente contra vectores de vacunas en la industria avícola tanto en manadas de pollos de engorde como en bandadas de capas. Tanto la transmisión vertical como horizontal está asociada con Salmonella en pollos (Liljebjelke et al., 2005). La transmisión vertical a través de la transmisión en ovo es particularmente importante, ya que si hay exposición previa a la cepa de la vacuna, la vacunación posterior mediante un vector de Salmonella oral podría verse gravemente comprometida. Un número considerable de estudios sobre inmunidad cruzada y exclusión competitiva se han realizado en pollos. Además, un estudio reciente informó que el tratamiento previo de pollos recién nacidos con diferentes cepas de Salmonella podría producir un efecto inhibitorio de invasión completa en cualquier posterior exposición a cepas homólogas y heterólogas (Methner et al., 2010). La preexposición con una forma altamente invasiva de Salmonella Enteritidis causó una gran afluencia de heterófilos a la mucosa cecal en pollitos de 1 día de edad, y la posterior colonización cecal heteróloga fue inhibida durante un período de 48 h (Methner et al., 2010). Las implicaciones de este tipo de estudios de colonización-inhibición sobre el estado inmunológico de los pollos afectados todavía no se han elucidado completamente. Cabe señalar que los estudios enumerados en los cuadros 1 y 2 son estudios de laboratorio controlados, con la posibilidad de un componente de exclusión competitiva a la inmunidad no discutido Estudios similares de L. monocytogenes y los efectos de las respuestas inmunes preexistentes indican resultados contradictorios.Un estudio de Bouwer et al. (1999) indica que las respuestas inmunes preexistentes contra el vector Listeria no disminuyen las respuestas inmunes contra el antígeno heterólogo liberado, y un estudio similar de Starks et al. (2004) también concluyó que la exposición previa de ratones al vector Listeria vacío no influyó en las respuestas inmunes anticancerosas cuando se utilizó un mutante similar como portador de un antígeno de cáncer de melanoma. (2005) en el que se utilizó L. monocytogens para administrar la proteína gag del virus de la inmunodeficiencia felina (FIV) y como portadora de vacunas de ADN para vacunar a los gatos contra la proteína de envoltorio FIV indicó respuestas inmunes más bajas contra el antígeno liberado en gatos expuestos al vector de Listeria vacío en comparación con animales ingenuos (Stevens et al., 2005). Tvinnereim et al. (2002) y Leong et al. (2009) han reportado hallazgos similares. Sin embargo, tomados en conjunto, estos estudios concluyen que la exposición previa de los animales de acogida al vector vacío no abroga las respuestas inmunes al antígeno vectorizado, sino que sólo las reduce un poco. Sólo el estudio de Vijh et al. (1999) indicó que la exposición al vector vacío puede abrogar completamente las respuestas inmunes contra los antígenos suministrados (Vijh et al. Leong et al. (2009) también demostraron que el impacto negativo de las respuestas inmunitarias específicas de los vectores también puede contrarrestarse mediante la inmunización repetida con la misma vacuna y dosis; esto en efecto conduce a una mayor primovacunación de células T ingenuas contra el antígeno liberado. Por supuesto, esta vacunación repetida puede no ser factible en situaciones del mundo real. A pesar de las muchas ventajas que la vectorización viral puede ofrecer, la inmunidad preexistente es un obstáculo importante de muchas vacunas virales con vectores, como el Ad serotipo 5 o el virus herpes simple tipo 1 (HSV-1), donde la tasa de seroprevalencia a estos virus es muy alta [40-45 % y 70% (o más) de la población estadounidense, respectivamente] (Hocknell et al., 2002; Pichla-Gollon et al., 2009). Los anticuerpos vectoriales pueden impedir la inducción de respuestas inmunitarias a los antígenos codificados por la vacuna, ya que pueden reducir la dosis y el tiempo de exposición de las células diana a los antígenos vacunados (Pichla-Gollon et al., 2009; Pine et al., 2011). En un ensayo clínico a gran escala (STEP) de una vacuna contra el VIH-1 basada en Ad serotipo 5 (AdHu5), las vacunas mostraron una falta de eficacia y tendieron a aumentar el riesgo de infección por el VIH-1 en los receptores de vacunas que tenían anticuerpos neutralizantes preexistentes contra AdHu5 (Buchbinder et al., 2008). Para una vacuna vectorial basada en el HSV-1, se ha demostrado que la inmunidad anti-HSV-1 preexistente disminuyó, pero no suprimió, las respuestas inmunes humorales y celulares contra el antígeno codificado por la vacuna ( Sin embargo, Brockman y Knipe encontraron que la inducción de respuestas duraderas de anticuerpos y respuestas celulares proliferativas al antígeno HSVencoded no se vieron afectadas por la inmunidad previa del VHS (Brockman & Knipe, 2002). Del mismo modo, la inmunidad preexistente al poliovirus tiene poco efecto sobre la eficacia de la vacuna contra el poliovirus (Mandl et al., 2001). Diferentes efectos de la inmunidad preexistente sobre la eficacia de los vectores de vacunas virales recombinantes se resumen en la Tabla 2. Existen varios enfoques para evitar la inmunidad vectorial preexistente, como el uso de vectores derivados de fuentes no humanas, utilizando virus humanos de serotipos raros (Kahl et al., 2010; Lasaro & Ertl, 2009), enfoques heterólogos de primer impulso (Liu et al., 2008), reinmunización homóloga (Steffensen et al., 2012) y la eliminación de epítopos neutralizantes clave en la superficie de las proteínas capsídicas virales (Gabitzsch & Jones, 2011; Roberts et al., 2006). El efecto inhibidor de la inmunidad preexistente también puede evitarse enmascarando el vector Ad dentro de las células dendríticas (DCs) (Steffensen et al., 2012). Además, la vacunación de mucosas o la administración de dosis más altas de vacunas pueden superar problemas de inmunidad preexistentes (Alexander et al., 2012; Belyakov et al., 1999; Priddy et al., 2008; Xiang et al., 2003). Mientras buscamos nuevos enfoques de vacunas para la variedad de patógenos para los que todavía no se dispone, la revisión de vacunas probadas y el desarrollo de estas más ha ganado impulso M. Saxena y otros. Por lo tanto, bacterias y virus atenuados que tienen un largo historial de eficacia y seguridad están siendo puestos en uso. Aunque muy atractivo, un tema común en estos enfoques experimentales ha sido las limitaciones que la inmunidad preexistente al vector puede plantear. Sin embargo, como muestra este examen de la literatura pertinente, hay un cuadro bastante confuso, con algunos estudios que indican que la inmunidad preexistente puede ser un amigo, en lugar de enemigo. Pocos estudios con vectores virales han informado sobre la influencia de la inmunidad preexistente en las respuestas humorales. En términos generales, para los antígenos bacterianos, las respuestas humorales fueron influenciadas por la inmunidad preexistente, con un poco más de estudios encontrando aumento en lugar de disminución. ¿Por qué hay variación? Esto puede deberse a varios factores, incluyendo el tipo de Salmonella utilizado y su invasividad. Dunstan y sus colegas probaron la capacidad de seis cepas isogénicas Salmonella serovar Typhimurium que albergan diferentes mutaciones por su capacidad de inducir respuestas inmunes contra el fragmento C de la toxina tetánica y concluyeron que la cepa que tuvo la menor capacidad de colonizar los parches de Peyer indujo las respuestas inmunes más bajas (Dunstan et al., 1998). De manera similar, el tiempo y la naturaleza de impulso del antígeno utilizado podrían ser importantes. Atridge y sus colegas indicaron la En un experimento, el impulso de ratones a las 10 semanas llevó a la inhibición completa de las respuestas de anticuerpos contra el antígeno heterólogo dado; sin embargo, cuando los ratones fueron aumentados a las 4 semanas, la regulación de las respuestas de anticuerpos no fue tan prominente (Attridge et al., 1997). Un estudio similar realizado por Kohlers y colegas muestra que el impulso a las 7 semanas después de la exposición previa a los animales al vector vacío conduce a respuestas IgG y IgA secretas más bajas específicas de antígenos; sin embargo, el aumento a las 14 semanas conduce a respuestas IgG y IgA secretas más altas (Kohler et al., 2000b). Esto está en conflicto con el resultado anterior, aunque hay que mencionar que utilizaron diferentes especies de Salmonella. Vindurampulle y Attridge también examinaron el impacto de la cepa Salmonella y la naturaleza de los antígeno En su estudio, utilizaron mutantes S. Dublin y Salmonella Stanley aroA para administrar antígenos E. coli K88 y LT-B, y concluyeron que el efecto de la inmunidad preexistente depende tanto de la cepa utilizada como del tipo de antígeno suministrado (Vindurampulle & Attridge, 2003b). Todos estos estudios sobre el efecto de la inmunidad preexistente discuten el impacto en las respuestas humorales. Sevil Domenech y colegas informaron que la exposición de animales al vector de Salmonella homólogo conduce a una reducción significativa en las respuestas CD8 +; sin embargo, la exposición de animales a una cepa heteróloga conduce a respuestas CD8 + significativamente mayores (Sevil Domènech et al., 2007, 2008. Saxena y sus colegas también reportaron que las respuestas de células T específicas de antígenos fueron similares o significativamente más altas, sin una regulación descendente en las respuestas de células T observadas después de la preexposición de ratones a cepas homólogas o heterólogas (Saxena et al., 2009). Para los vectores virales, el impacto de la inmunidad mediada por células fue más pronunciado, y como se muestra en la Tabla 2, casi siempre resultó en una reducción de la respuesta inmune posterior. Presumiblemente esto se debe a que los virus inducirán anticuerpos neutralizantes en la primera dosis, y en dosis posteriores este anticuerpo limitará el número de células transducidas, limitando así las respuestas. Esto es particularmente un problema con un vector viral común como Ad, donde una gran proporción de la población tendrá memoria inmunológica contra los serotipos comunes (Lasaro & Ertl, 2009) Como concluyen estos autores, será posible utilizar estos vectores sólo mediante el desarrollo de vacunas a partir de serotipos alternativos. Puede ser que un vector como la inmunidad preexistente contra los vectores de la vacuna virus de la gripe atenuada, con la capacidad de desarrollar fácilmente reasociantes, será útil en este contexto. Además, la memoria inmunológica en forma de anticuerpos opsonizantes sin duda juega un papel importante en la absorción temprana de Salmonella por macrófagos y DC. Esto puede ser beneficioso, ya que el vector bacteriano vivo utilizado para los propósitos del parto alberga mutaciones en proteínas codificantes de genes responsables de su supervivencia en el huésped animal. Esto no sólo afecta su capacidad de causar enfermedades, haciéndolos vectores vivos seguros, sino que también limita el número de replicaciones. La presencia de anticuerpos opsonizantes debe significar un mayor nivel de absorción bacteriana, lo que conduce a una mayor presentación al sistema inmunológico y, por lo tanto, una Anteriormente hemos demostrado que este es el caso (Saxena et al., 2009 ) (indicado en la figura 2). Sería de gran beneficio abordar estos problemas no sólo en ratones, sino también en otros organismos como los pollos, que son el huésped más probable para el uso de vectores vivos de Salmonella, específicamente donde las vacunas se desarrollan para su uso en ganado y aves de corral. Para resumir, vectores bacterianos como Salmonella y vectores virales como Ad muestran una gran promesa como vehículos de entrega de antígenos heterólogos; sin embargo, debe considerarse la exposición previa al vector. Mediante una selección juiciosa de la cepa/serotipo será posible evitar los efectos negativos y puede ser posible influir positivamente en la respuesta, especialmente para la inmunidad humoral.

¿Qué puede ser un factor en el uso de vectores comunes para el suministro de vacunas?

Inmunidad preexistente contra vectores de vacunas – ¿amigo o enemigo? https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3542731/SHA: f5bdf18567bb3760e1ce0550808135f0270badbd5cAutores: Saxena, Manvendra; Van, Thi Thu Hao; Baird, Fiona J.; Coloe, Peter J.; Smooker, Peter M.Fecha: 2013-01-27DOI: 10.1099/mic.0.049601-0Licencia: cc-byAbstract: En el último siglo, la atenuación exitosa de múltiples patógenos bacteriales y virales ha llevado a una forma efectiva, robusta y segura de vacunación. Recientemente, estas vacunas han sido evaluadas como vectores de parto de antígenos heterólogos, como un medio de vacunación simultánea contra dos patógenos. El consenso general de los estudios publicados es que estos vectores de vacunas tienen el potencial de ser seguros y eficaces. Sin embargo, algunos de los vectores comúnmente empleados, por ejemplo Salmonella y adenovirus, a menudo tienen respuestas inmunes preexistentes en el huésped y esto tiene el potencial de modificar la respuesta inmune posterior a un antígeno vectorizado. Esta revisión examina la literatura sobre este tema, y concluye que para vectores bacterianos puede de hecho, en algunos casos, ser un aumento en la inmunogenicidad, típicamente humoral, mientras que para vectores virales la inmunidad preexistente es un obstáculo para la inducción posterior de respuestas celulares. Texto: En los campos de la medicina y la medicina veterinaria, hay numerosas vacunas bacterianas y virales vivas, atenuadas en uso hoy en todo el mundo. La seguridad y eficacia de estas vacunas está bien establecida y permite un mayor desarrollo como sistemas vectores para liberar antígenos procedentes de otros patógenos. Varias bacterias atenuadas, incluyendo Escherichia coli, Vibrio cholerae, bacterias de ácido láctico (LAB), específicamente Lactococcus lactis, Mycobacterium, Listeria, Shigella y Salmonella, han sido probadas para la entrega dirigida de antígenos heterólogos de origen bacteriano, viral y parasitario en una variedad de huéspedes animales (Bahey-El-Din et al., 2010; Innocentin et al., 2009; Johnson et al., 2011; Tobias et al., 2008 Tobias et al.,, 2010 Tobias & Svennerholm, 2012). Las bacterias como E. coli y las bacterias del ácido láctico han ganado recientemente el favor, ya que E. coli son una bacteria del ácido comensal y láctico están presentes en la mayoría de los alimentos fermentados y por lo tanto están naturalmente presentes en el huésped. También son una opción mucho más segura que las vacunas atenuadas tradicionales en los niños y las personas inmunocomprometidas. Como esta revisión discute los efectos de las respuestas inmunes preexistentes a las vacunas atenuadas, discusión adicional de LAB y E. coli como vectores potenciales no se realizará; sin embargo, el lector se dirige a varias revisiones interesantes (Bermú dez-Humarán et al., 2011; Wells & Mercenier, 2008). Las bacterias intracelulares de los géneros Mycobacterium (Guleria et al., 1996), Listeria (Gentschev et al., 2001), Shigella (Levine et al., 1997) y Salmonella (Dougan et al., 1987) se consideran candidatas adecuadas para el suministro de antígenos vacunales debido a su capacidad para inducir respuestas inmunitarias robustas de células T (Alderton et al., 1991; Lo et al., 1999; Mastroeni et al., 2001; Mittrücker & Kaufmann, 2000; Nauciel, 1990). La Salmonella es un género que ha sido bien examinado como vector, basándose en la extensa investigación disponible sobre la fisiología y patogénesis del microorganismo (Basso et al., 2000; Killeen & DiRita, 2000; Sirard et al., 1999; Ward et al., 1999). Existen varias vacunas comerciales que se utilizan como vacunas contra la Salmonella en humanos y animales (por ejemplo, Ty21a para la fiebre tifoidea en humanos, varios serovares de Salmonella contra la salmonelosis en pollos y otros animales). La estrategia general para la vectorización del antígeno heterológico se describe en la Fig. 1. El primer ensayo clínico de un recombinante, que se realizó hace más de 20 años utilizando una Salmonella atenuada como vector de entrega, llevó a la realización de pruebas generalizadas de esta bacteria como sistema de administración de mucosas para antígenos de patógenos no Salmonella (Dougan et al., 1987). Estos estudios han demostrado la utilidad de las bacterias vivas para suministrar antígenos y vacunas de ADN expresados al sistema inmunitario del huésped (Atkins et al., 2006; Husseiny & Hensel, 2008; Jiang et al., 2004; Kirby et al., 2004). Desde entonces, varios otros vectores bacterianos intracelulares han sido probados con éxito para su capacidad de entregar una variedad de antígenos de diversos patógenos, así como la vacunación contra el cáncer. Un género que ha sido ampliamente probado como vector es Listeria. Las ventajas de Listeria son que puede invadir una variedad de células, incluyendo las células que presentan antígenos (APCs). Después de invadir la célula huésped, Listeria reside dentro del fagosoma; sin embargo, puede escapar del fagosoma con la ayuda de listeriolisina O (LLO; Hly) y residir en el citoplasma de las células, presentando así eficientemente antígeno a las células CD8 y CD4 T (Cossart & Mengaud, 1989; Kaufmann, 1993; Pamer et al., 1997). Varios estudios han demostrado la eficacia y facilidad de usar Listeria monocytogenes para administrar antígenos de vacuna heterólogos y vacunas de ADN Jensen et al., 1997; Johnson et al., 2011; Peters et al., 2003; Shen et al., 1995; Yin et al., 2011). Del mismo modo, varios vectores virales han sido probados con éxito por su capacidad para entregar antígenos de vacunas heterólogas, y esto generalmente resulta en la inducción de fuertes respuestas inmunitarias CTL. En el campo veterinario, hay numerosas vacunas de vectores virales que actualmente están autorizadas para su uso en animales de ganado y animales domesticados. Estas vacunas recombinantes se basan tanto en virus ADN (como las vacunas basadas en el virus de la viruela de aves de corral y el virus de la viruela de aves de corral, o vectores basados en el virus de la vacuna contra el virus de la rabia en la fauna silvestre) y virus ARN [como las vacunas basadas en el virus de la enfermedad de Newcastle para ser utilizadas en las aves de corral o en vacunas basadas en el virus de la fiebre amarilla (YFV) para ser utilizadas en caballos contra el virus del Nilo Occidental] (Draper & Heeney Sobre la base del registro de seguridad en el campo veterinario, muchos virus han sido estudiados para uso humano como vector en el desarrollo de vacunas (Beukema et al., 2006; Esteban, 2009; Schirrmacher & Fournier, 2009; Stoyanov et al., 2010; Weli & Tryland, 2011). Entre ellos, YFV (deformación YF-17D) fue el primero en ser autorizado para su uso en humanos, donde los cDNAs codificando las proteínas de envoltorio de YFV fueron reemplazados con los genes correspondientes de una cepa atenuada del virus de la encefalitis japonesa, SA14-14-2 (Appaiahgari & Vrati, 2010; Rollier et al., 2011). Los poxvirus también se estudian ampliamente como vectores candidatos para el uso humano, entre los cuales los derivados atenuados del virus de la vaccinia [como el virus de la vaccinia modificada Ankara (MVA) y las cepas NYVAC del virus de la vaccinia atenuada de Nueva York] son los vectores más prometedores (Esteban, 2009; Gó mez et al., 2008; Rimmelzwaan & Sutter, 2009 ). Son vectores candidatos ideales debido a su gran capacidad de envasado de ADN y su estabilidad térmica y genética (Minke et al., 2004). Se ha demostrado que el vector NYVAC induce respuestas CD4 + T dominantes, y el MVA induce respuestas de células CD4 + y CD8 + T (Mooij et al., 2008). El vector de adenovirus (Ad) es otro de los vectores más ampliamente evaluados hasta la fecha para expresar antígenos heterólogos, debido a la facilidad de producción, perfil de seguridad, estabilidad genética, la facilidad de manipulación del genoma del ADN, y la capacidad de estimular tanto respuestas inmunes innatas y adaptativas e inducir respuestas de células T y B (Alexander et al., 2012; Fitzgerald et al., 2003; Gabitzsch & Jones, 2011; Lasaro & Ertl, 2009; Vemula & Mittal, 2010; Weyer et al., 2009). En varios estudios preclínicos y clínicos sobre enfermedades infecciosas como el ántrax, la hepatitis B, el virus de inmunodeficiencia humana (VIH)-1, la gripe, el sarampión, el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), la malaria y la tuberculosis M. Saxena y otros (Chengalvala et al., 1994; Gao et al., 2006; Hashimoto et al., 2005; Hsu et al., 1992; Limbach & Richie, 2009; Radosevic et al., 2007; Shiver et al., 2002). Sin embargo, antes de que las vacunas vectorizadas puedan utilizarse en la población humana necesitan satisfacer varios criterios importantes. La seguridad es una preocupación importante, ya que incluso un nivel bajo de toxicidad es inaceptable (por supuesto, la molestia menor que acompaña a muchas vacunas es normal). En segundo lugar, una vacuna debe ser barata, para que pueda administrarse a una gran población a un costo mínimo, y esto es particularmente importante en los países pobres en recursos (Killeen & DiRita, 2000). Restricciones similares se aplican a las vacunas veterinarias, con un costo a menudo aún más importante. Por último, las respuestas inmunes celulares de larga duración y (cuando proceda) humorales al antígeno vectorizado deben ser inducidas después de la administración de estas vacunas, preferiblemente con una sola dosis (Atkins et al., 2006). Como algunos de los vectores en uso habrán sido vistos por el sistema inmune del huésped antes de la vacunación, si la presencia de respuestas inmunes preexistentes es perjudicial para el desarrollo ulterior de un esquema de vacunación basado en vectores, o puede aumentar las respuestas al antígeno vectorizado, debe considerarse en detalle. Este es el tema de esta revisión. Al discutir los posibles efectos sobre la inmunidad preexistente, la inmunidad natural al vector Por lo tanto, teniendo en cuenta un vector como Salmonella, si un huésped ha sido infectado previamente existirán respuestas robustas de memoria B y T, y como tal, cuando se administre una vacunación, se inducirá una respuesta anamnésica a los antígenos Salmonella (mientras que la respuesta al antígeno vectorizado será una respuesta primaria), lo que teóricamente reducirá la exposición del antígeno heterólogo al sistema inmunitario, ya que el vector se elimina rápidamente. Sorprendentemente, como se verá en algunos de los ejemplos que se dan a continuación, esto puede tener resultados que difieren en función de la magnitud de la respuesta al antígeno vectorizado. Del mismo modo, para los antígenos viralmente vectorizados, la existencia de inmunidad preexistente al vector (particularmente el anticuerpo neutralizante) restringirá la entrega del virus a las células, reduciendo así efectivamente la dosis del antígeno vectorizado. En el caso de los vectores bacterianos, el efecto de las respuestas inmunológicas preexistentes sólo se ha probado utilizando Salmonella serovars y Listeria spp. Preocupación de que la experiencia inmunológica previa del huésped con la cepa vectorial de Salmonella homóloga o una cepa relacionada podría comprometer su capacidad de entregar antígenos de vacuna heteróloga se planteó por primera vez en 1987 (Dougan et al., 1987). Bao y Clements notificaron posteriormente evidencia experimental de las consecuencias de la exposición previa de animales a la cepa vectorial (Bao & Clements, 1991). Este trabajo mostró que tanto las respuestas séricas como de anticuerpos mucosas contra el antígeno extranjero estaban de hecho reguladas en animales con exposición previa a la cepa vectorial. Whittle & Verma (1997) notificaron hallazgos similares. Los ratones inmunizados a través de la vía intraperitoneal con mutante Salmonella dublin aroA que expresa el antígeno heterólogo después de haber sido expuestos al mismo vector mostraron una mayor respuesta inmune al antígeno vectorizado en comparación con ratones sin memoria inmunológica contra el vector. Posteriormente, se han realizado varios estudios para examinar el efecto de la inmunidad preexistente en el huésped contra Salmonella. Estos resultados se resumen en la Tabla 1. Los diversos informes son contradictorios en sus hallazgos y parecen pintar un cuadro bastante confuso. Algunos estudios concluyeron que la inmunidad preexistente contra el vector Salmonella conduce a respuestas inmunes más fuertes contra el antígeno liberado (Bao & Clements, 1991; Jespersgaard et al., 2001; Kohler et al., 2000a, b; Metzger et al., 2004; Saxena et al., 2009; Sevil Domènech et al., 2008; Whittle & Verma, 1997), con otros considerando que la inmunidad preexistente es un factor limitante en el uso a largo plazo de Salmonella como vector eficiente para la entrega de antígenos (Attridge et al., 1997; Gahan et al., 2008; Roberts et al., 1999; Sevil Domènech et al., 2007; Vindurampulle & Attridge, 2003a, b). Una ligera mayoría de los estudios enumerados en la Tabla 1 (10 versus ocho) indican la regulación ascendente de las respuestas inmunitarias después de que los animales hayan estado expuestos a cepas homólogas o relacionadas antes de la entrega del antígeno heterólogo utilizando un vector Salmonella. Un estudio realizado por Metzger y colaboradores en voluntarios humanos utilizando Salmonella Typhi como vector sugiere que no hubo cambios en la respuesta inmune de las células T contra el antígeno heterólogo en voluntarios humanos que estuvieron expuestos a vectores vacíos en comparación con voluntarios inmunológicamente ingenuos de la cepa vectorial (Metzger et al., 2004). En estos sujetos, las respuestas humorales fueron moderadamente elevadas en individuos preexpuestos. Del mismo modo, Saxena et al. (2009) indicaron una mayor respuesta humoral y celular T en ratones preexpuestos a cepas de Salmonella homólogas o heterólogas. La respuesta a la interleucina 4 (IL4) fue significativamente mayor cuando el huésped animal fue expuesto a la cepa homóloga, mientras que la preexposición a una especie relacionada no tuvo tal impacto en las respuestas a la IL4. Por el contrario, las respuestas al interferón (IFN)-c fueron más altas, independientemente de la cepa a la que los ratones estaban preexpuestos. Este estudio también indicó que la presencia de anticuerpos opsonizantes homólogos o heterologosos conduce a una mayor absorción de Salmonella por macrófagos in vitro, lo que puede explicar las respuestas inmunes más altas en ratones expuestos. Como es de esperarse, la absorción fue mayor cuando se utilizó la sura homóloga como la opsonina en lugar de la sura heterologosa. Esto se muestra en la figura 2. Por el contrario, hay informes que indican que la inmunidad preexistente contra el vector bacterial de Atridge y compañeros de trabajo reportaron que la presencia de inmunidad contra el vector bacteriano antes de la entrega de microbiología antigénica vectorizada 159 proteína puede reducir las respuestas inmunes en ratones contra el antígeno liberado (Attridge et al., 1997). Resultados similares fueron reportados por Roberts et al. (1999) y Vindurampulle & Attridge (2003a, b). Sin embargo, estos últimos autores encontraron que la hipo-respuesta podría ser eliminada en gran medida exponiendo a los animales al antígeno extranjero antes del vectorpriming (Vindurampulle & Attridge, 2003b). Desafortunadamente, esto parecería ser poco práctico para un régimen de inmunización! Un estudio presentado por Gahan et al. (2008) ratones inmunizados con S. Typhimurium expresando C fragmento de antígeno de toxina tetánica de una expresión plasmido o como vacuna del ADN. Los ratones vacunados desarrollaron respuestas humorales a LPS y tetC (para las vacunas portadoras de plásmidos). Los animales de todos los grupos (incluyendo un grupo previamente no vacunado) fueron vacunados el día 182 con Salmonella expresando tetC. En este momento, los títulos anti-LPS y tetC comenzaron a disminuir. Catorce días después de la segunda inmunización, se evaluó la colonización de varios órganos de ratón. Se encontró que la capacidad de colonizar se redujo significativamente en grupos que habían sido vacunados previamente con Salmonella. En vista de este hallazgo, tal vez no fue sorprendente que en el día 210 los títulos de LPS no fueran significativamente diferentes entre los grupos que recibieron una o dos vacunas. Lo más interesante es que ratones que habían sido preparados con Salmonella sola, y luego impulsados con Salmonella expresando tetC, indujeron respuestas anti-tetC mucho más bajas Esto argumenta fuertemente que la inmunidad inmunológica previa al vector puede amortiguar seriamente las respuestas humorales posteriores específicas del antígeno.No se evaluó si lo mismo es cierto para las respuestas celulares.Otros estudios han evaluado las respuestas celulares.Un estudio de Sevil Domènech y colegas reportó que la inmunidad antivectora preexistente compromete seriamente las respuestas CD8 + en ratones cuando se exponen a una cepa similar utilizada como vector (Sevil Domènech et al., 2007).En contraste, otro estudio de los mismos autores reportó que los animales expuestos a vectores relacionados inducen respuestas CD8 + mucho más altas cuando se comparan con animales que no tienen ninguna inmunidad de Salmonella preexistente (Sevil Domènech et al., 2008).La diferencia entre estos dos estudios fue que en el primero, la prima y el impulso fueron con serovares idénticos, mientras que en el segundo estudio se utilizaron diferentes serovares. Esto puede apuntar a una manera de evitar la regulación de las respuestas CD8 por la inmunidad preexistente. Esto es importante, ya que una de las ventajas del uso de Salmonella (un patógeno intracelular) es que se pueden inducir fuertes respuestas inmunes celulares. Cabe señalar que en el caso de las vacunas Salmonella, se deben considerar efectos distintos de las respuestas estrictamente inmunológicas (especialmente respuestas adaptativas). En el contexto de la inmunidad innata, se demostró que la administración de Salmonella no virulenta a los cerdos gnobióticos eliminó la enfermedad después de un desafío con una cepa virulenta (Foster et al., 2003). Curiosamente, la protección no fue por exclusión competitiva, ya que la cepa virulenta fue en gran número en el intestino pero no se distribuyó sistémicamente. La protección fue propuesta para ser mediada por la infiltración de un gran número de leucocitos polimorfonucleares en el intestino, y aunque tal vez poco práctico como profiláctico general (como el tiempo entre la vacunación y la infección es corto), esto puede ser una opción para la vacunación a corto plazo o tal vez terapéutica (como revisado por Foster et al., 2012). Pollos (Gallus gallus) son un reservorio natural de animales para Salmonella, lo que los convierte en una fuente importante de gastroenteritis asociada a Salmonella en los seres humanos. La capacidad de utilizar vacunas orales de Salmonella para inmunizar contra patógenos heterólogos sería de enorme beneficio para la toma de STM-1 por J774 macrófagos, en relación con el porcentaje de absorción más alto. X, opsonizada con suero ingenuo; m, opsonizada con suero de ratones expuestos a la enteriditis de Salmonella; &, opsonizada con suero de ratones expuestos a STM-1. Inmunidad preexistente contra vectores de vacunas en la industria avícola tanto en manadas de pollos de engorde como en bandadas de capas. Tanto la transmisión vertical como horizontal está asociada con Salmonella en pollos (Liljebjelke et al., 2005). La transmisión vertical a través de la transmisión en ovo es particularmente importante, ya que si hay exposición previa a la cepa de la vacuna, la vacunación posterior mediante un vector de Salmonella oral podría verse gravemente comprometida. Un número considerable de estudios sobre inmunidad cruzada y exclusión competitiva se han realizado en pollos. Además, un estudio reciente informó que el tratamiento previo de pollos recién nacidos con diferentes cepas de Salmonella podría producir un efecto inhibitorio de invasión completa en cualquier posterior exposición a cepas homólogas y heterólogas (Methner et al., 2010). La preexposición con una forma altamente invasiva de Salmonella Enteritidis causó una gran afluencia de heterófilos a la mucosa cecal en pollitos de 1 día de edad, y la posterior colonización cecal heteróloga fue inhibida durante un período de 48 h (Methner et al., 2010). Las implicaciones de este tipo de estudios de colonización-inhibición sobre el estado inmunológico de los pollos afectados todavía no se han elucidado completamente. Cabe señalar que los estudios enumerados en los cuadros 1 y 2 son estudios de laboratorio controlados, con la posibilidad de un componente de exclusión competitiva a la inmunidad no discutido Estudios similares de L. monocytogenes y los efectos de las respuestas inmunes preexistentes indican resultados contradictorios.Un estudio de Bouwer et al. (1999) indica que las respuestas inmunes preexistentes contra el vector Listeria no disminuyen las respuestas inmunes contra el antígeno heterólogo liberado, y un estudio similar de Starks et al. (2004) también concluyó que la exposición previa de ratones al vector Listeria vacío no influyó en las respuestas inmunes anticancerosas cuando se utilizó un mutante similar como portador de un antígeno de cáncer de melanoma. (2005) en el que se utilizó L. monocytogens para administrar la proteína gag del virus de la inmunodeficiencia felina (FIV) y como portadora de vacunas de ADN para vacunar a los gatos contra la proteína de envoltorio FIV indicó respuestas inmunes más bajas contra el antígeno liberado en gatos expuestos al vector de Listeria vacío en comparación con animales ingenuos (Stevens et al., 2005). Tvinnereim et al. (2002) y Leong et al. (2009) han reportado hallazgos similares. Sin embargo, tomados en conjunto, estos estudios concluyen que la exposición previa de los animales de acogida al vector vacío no abroga las respuestas inmunes al antígeno vectorizado, sino que sólo las reduce un poco. Sólo el estudio de Vijh et al. (1999) indicó que la exposición al vector vacío puede abrogar completamente las respuestas inmunes contra los antígenos suministrados (Vijh et al. Leong et al. (2009) también demostraron que el impacto negativo de las respuestas inmunitarias específicas de los vectores también puede contrarrestarse mediante la inmunización repetida con la misma vacuna y dosis; esto en efecto conduce a una mayor primovacunación de células T ingenuas contra el antígeno liberado. Por supuesto, esta vacunación repetida puede no ser factible en situaciones del mundo real. A pesar de las muchas ventajas que la vectorización viral puede ofrecer, la inmunidad preexistente es un obstáculo importante de muchas vacunas virales con vectores, como el Ad serotipo 5 o el virus herpes simple tipo 1 (HSV-1), donde la tasa de seroprevalencia a estos virus es muy alta [40-45 % y 70% (o más) de la población estadounidense, respectivamente] (Hocknell et al., 2002; Pichla-Gollon et al., 2009). Los anticuerpos vectoriales pueden impedir la inducción de respuestas inmunitarias a los antígenos codificados por la vacuna, ya que pueden reducir la dosis y el tiempo de exposición de las células diana a los antígenos vacunados (Pichla-Gollon et al., 2009; Pine et al., 2011). En un ensayo clínico a gran escala (STEP) de una vacuna contra el VIH-1 basada en Ad serotipo 5 (AdHu5), las vacunas mostraron una falta de eficacia y tendieron a aumentar el riesgo de infección por el VIH-1 en los receptores de vacunas que tenían anticuerpos neutralizantes preexistentes contra AdHu5 (Buchbinder et al., 2008). Para una vacuna vectorial basada en el HSV-1, se ha demostrado que la inmunidad anti-HSV-1 preexistente disminuyó, pero no suprimió, las respuestas inmunes humorales y celulares contra el antígeno codificado por la vacuna ( Sin embargo, Brockman y Knipe encontraron que la inducción de respuestas duraderas de anticuerpos y respuestas celulares proliferativas al antígeno HSVencoded no se vieron afectadas por la inmunidad previa del VHS (Brockman & Knipe, 2002). Del mismo modo, la inmunidad preexistente al poliovirus tiene poco efecto sobre la eficacia de la vacuna contra el poliovirus (Mandl et al., 2001). Diferentes efectos de la inmunidad preexistente sobre la eficacia de los vectores de vacunas virales recombinantes se resumen en la Tabla 2. Existen varios enfoques para evitar la inmunidad vectorial preexistente, como el uso de vectores derivados de fuentes no humanas, utilizando virus humanos de serotipos raros (Kahl et al., 2010; Lasaro & Ertl, 2009), enfoques heterólogos de primer impulso (Liu et al., 2008), reinmunización homóloga (Steffensen et al., 2012) y la eliminación de epítopos neutralizantes clave en la superficie de las proteínas capsídicas virales (Gabitzsch & Jones, 2011; Roberts et al., 2006). El efecto inhibidor de la inmunidad preexistente también puede evitarse enmascarando el vector Ad dentro de las células dendríticas (DCs) (Steffensen et al., 2012). Además, la vacunación de mucosas o la administración de dosis más altas de vacunas pueden superar problemas de inmunidad preexistentes (Alexander et al., 2012; Belyakov et al., 1999; Priddy et al., 2008; Xiang et al., 2003). Mientras buscamos nuevos enfoques de vacunas para la variedad de patógenos para los que todavía no se dispone, la revisión de vacunas probadas y el desarrollo de estas más ha ganado impulso M. Saxena y otros. Por lo tanto, bacterias y virus atenuados que tienen un largo historial de eficacia y seguridad están siendo puestos en uso. Aunque muy atractivo, un tema común en estos enfoques experimentales ha sido las limitaciones que la inmunidad preexistente al vector puede plantear. Sin embargo, como muestra este examen de la literatura pertinente, hay un cuadro bastante confuso, con algunos estudios que indican que la inmunidad preexistente puede ser un amigo, en lugar de enemigo. Pocos estudios con vectores virales han informado sobre la influencia de la inmunidad preexistente en las respuestas humorales. En términos generales, para los antígenos bacterianos, las respuestas humorales fueron influenciadas por la inmunidad preexistente, con un poco más de estudios encontrando aumento en lugar de disminución. ¿Por qué hay variación? Esto puede deberse a varios factores, incluyendo el tipo de Salmonella utilizado y su invasividad. Dunstan y sus colegas probaron la capacidad de seis cepas isogénicas Salmonella serovar Typhimurium que albergan diferentes mutaciones por su capacidad de inducir respuestas inmunes contra el fragmento C de la toxina tetánica y concluyeron que la cepa que tuvo la menor capacidad de colonizar los parches de Peyer indujo las respuestas inmunes más bajas (Dunstan et al., 1998). De manera similar, el tiempo y la naturaleza de impulso del antígeno utilizado podrían ser importantes. Atridge y sus colegas indicaron la En un experimento, el impulso de ratones a las 10 semanas llevó a la inhibición completa de las respuestas de anticuerpos contra el antígeno heterólogo dado; sin embargo, cuando los ratones fueron aumentados a las 4 semanas, la regulación de las respuestas de anticuerpos no fue tan prominente (Attridge et al., 1997). Un estudio similar realizado por Kohlers y colegas muestra que el impulso a las 7 semanas después de la exposición previa a los animales al vector vacío conduce a respuestas IgG y IgA secretas más bajas específicas de antígenos; sin embargo, el aumento a las 14 semanas conduce a respuestas IgG y IgA secretas más altas (Kohler et al., 2000b). Esto está en conflicto con el resultado anterior, aunque hay que mencionar que utilizaron diferentes especies de Salmonella. Vindurampulle y Attridge también examinaron el impacto de la cepa Salmonella y la naturaleza de los antígeno En su estudio, utilizaron mutantes S. Dublin y Salmonella Stanley aroA para administrar antígenos E. coli K88 y LT-B, y concluyeron que el efecto de la inmunidad preexistente depende tanto de la cepa utilizada como del tipo de antígeno suministrado (Vindurampulle & Attridge, 2003b). Todos estos estudios sobre el efecto de la inmunidad preexistente discuten el impacto en las respuestas humorales. Sevil Domenech y colegas informaron que la exposición de animales al vector de Salmonella homólogo conduce a una reducción significativa en las respuestas CD8 +; sin embargo, la exposición de animales a una cepa heteróloga conduce a respuestas CD8 + significativamente mayores (Sevil Domènech et al., 2007, 2008. Saxena y sus colegas también reportaron que las respuestas de células T específicas de antígenos fueron similares o significativamente más altas, sin una regulación descendente en las respuestas de células T observadas después de la preexposición de ratones a cepas homólogas o heterólogas (Saxena et al., 2009). Para los vectores virales, el impacto de la inmunidad mediada por células fue más pronunciado, y como se muestra en la Tabla 2, casi siempre resultó en una reducción de la respuesta inmune posterior. Presumiblemente esto se debe a que los virus inducirán anticuerpos neutralizantes en la primera dosis, y en dosis posteriores este anticuerpo limitará el número de células transducidas, limitando así las respuestas. Esto es particularmente un problema con un vector viral común como Ad, donde una gran proporción de la población tendrá memoria inmunológica contra los serotipos comunes (Lasaro & Ertl, 2009) Como concluyen estos autores, será posible utilizar estos vectores sólo mediante el desarrollo de vacunas a partir de serotipos alternativos. Puede ser que un vector como la inmunidad preexistente contra los vectores de la vacuna virus de la gripe atenuada, con la capacidad de desarrollar fácilmente reasociantes, será útil en este contexto. Además, la memoria inmunológica en forma de anticuerpos opsonizantes sin duda juega un papel importante en la absorción temprana de Salmonella por macrófagos y DC. Esto puede ser beneficioso, ya que el vector bacteriano vivo utilizado para los propósitos del parto alberga mutaciones en proteínas codificantes de genes responsables de su supervivencia en el huésped animal. Esto no sólo afecta su capacidad de causar enfermedades, haciéndolos vectores vivos seguros, sino que también limita el número de replicaciones. La presencia de anticuerpos opsonizantes debe significar un mayor nivel de absorción bacteriana, lo que conduce a una mayor presentación al sistema inmunológico y, por lo tanto, una Anteriormente hemos demostrado que este es el caso (Saxena et al., 2009 ) (indicado en la figura 2). Sería de gran beneficio abordar estos problemas no sólo en ratones, sino también en otros organismos como los pollos, que son el huésped más probable para el uso de vectores vivos de Salmonella, específicamente donde las vacunas se desarrollan para su uso en ganado y aves de corral. Para resumir, vectores bacterianos como Salmonella y vectores virales como Ad muestran una gran promesa como vehículos de entrega de antígenos heterólogos; sin embargo, debe considerarse la exposición previa al vector. Mediante una selección juiciosa de la cepa/serotipo será posible evitar los efectos negativos y puede ser posible influir positivamente en la respuesta, especialmente para la inmunidad humoral.

¿Por qué algunos poxvirus son ideales como vectores de suministro de vacunas?

Inmunidad preexistente contra vectores de vacunas – ¿amigo o enemigo? https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3542731/SHA: f5bdf18567bb3760e1ce0550808135f0270badbd5cAutores: Saxena, Manvendra; Van, Thi Thu Hao; Baird, Fiona J.; Coloe, Peter J.; Smooker, Peter M.Fecha: 2013-01-27DOI: 10.1099/mic.0.049601-0Licencia: cc-byAbstract: En el último siglo, la atenuación exitosa de múltiples patógenos bacteriales y virales ha llevado a una forma efectiva, robusta y segura de vacunación. Recientemente, estas vacunas han sido evaluadas como vectores de parto de antígenos heterólogos, como un medio de vacunación simultánea contra dos patógenos. El consenso general de los estudios publicados es que estos vectores de vacunas tienen el potencial de ser seguros y eficaces. Sin embargo, algunos de los vectores comúnmente empleados, por ejemplo Salmonella y adenovirus, a menudo tienen respuestas inmunes preexistentes en el huésped y esto tiene el potencial de modificar la respuesta inmune posterior a un antígeno vectorizado. Esta revisión examina la literatura sobre este tema, y concluye que para vectores bacterianos puede de hecho, en algunos casos, ser un aumento en la inmunogenicidad, típicamente humoral, mientras que para vectores virales la inmunidad preexistente es un obstáculo para la inducción posterior de respuestas celulares. Texto: En los campos de la medicina y la medicina veterinaria, hay numerosas vacunas bacterianas y virales vivas, atenuadas en uso hoy en todo el mundo. La seguridad y eficacia de estas vacunas está bien establecida y permite un mayor desarrollo como sistemas vectores para liberar antígenos procedentes de otros patógenos. Varias bacterias atenuadas, incluyendo Escherichia coli, Vibrio cholerae, bacterias de ácido láctico (LAB), específicamente Lactococcus lactis, Mycobacterium, Listeria, Shigella y Salmonella, han sido probadas para la entrega dirigida de antígenos heterólogos de origen bacteriano, viral y parasitario en una variedad de huéspedes animales (Bahey-El-Din et al., 2010; Innocentin et al., 2009; Johnson et al., 2011; Tobias et al., 2008 Tobias et al.,, 2010 Tobias & Svennerholm, 2012). Las bacterias como E. coli y las bacterias del ácido láctico han ganado recientemente el favor, ya que E. coli son una bacteria del ácido comensal y láctico están presentes en la mayoría de los alimentos fermentados y por lo tanto están naturalmente presentes en el huésped. También son una opción mucho más segura que las vacunas atenuadas tradicionales en los niños y las personas inmunocomprometidas. Como esta revisión discute los efectos de las respuestas inmunes preexistentes a las vacunas atenuadas, discusión adicional de LAB y E. coli como vectores potenciales no se realizará; sin embargo, el lector se dirige a varias revisiones interesantes (Bermú dez-Humarán et al., 2011; Wells & Mercenier, 2008). Las bacterias intracelulares de los géneros Mycobacterium (Guleria et al., 1996), Listeria (Gentschev et al., 2001), Shigella (Levine et al., 1997) y Salmonella (Dougan et al., 1987) se consideran candidatas adecuadas para el suministro de antígenos vacunales debido a su capacidad para inducir respuestas inmunitarias robustas de células T (Alderton et al., 1991; Lo et al., 1999; Mastroeni et al., 2001; Mittrücker & Kaufmann, 2000; Nauciel, 1990). La Salmonella es un género que ha sido bien examinado como vector, basándose en la extensa investigación disponible sobre la fisiología y patogénesis del microorganismo (Basso et al., 2000; Killeen & DiRita, 2000; Sirard et al., 1999; Ward et al., 1999). Existen varias vacunas comerciales que se utilizan como vacunas contra la Salmonella en humanos y animales (por ejemplo, Ty21a para la fiebre tifoidea en humanos, varios serovares de Salmonella contra la salmonelosis en pollos y otros animales). La estrategia general para la vectorización del antígeno heterológico se describe en la Fig. 1. El primer ensayo clínico de un recombinante, que se realizó hace más de 20 años utilizando una Salmonella atenuada como vector de entrega, llevó a la realización de pruebas generalizadas de esta bacteria como sistema de administración de mucosas para antígenos de patógenos no Salmonella (Dougan et al., 1987). Estos estudios han demostrado la utilidad de las bacterias vivas para suministrar antígenos y vacunas de ADN expresados al sistema inmunitario del huésped (Atkins et al., 2006; Husseiny & Hensel, 2008; Jiang et al., 2004; Kirby et al., 2004). Desde entonces, varios otros vectores bacterianos intracelulares han sido probados con éxito para su capacidad de entregar una variedad de antígenos de diversos patógenos, así como la vacunación contra el cáncer. Un género que ha sido ampliamente probado como vector es Listeria. Las ventajas de Listeria son que puede invadir una variedad de células, incluyendo las células que presentan antígenos (APCs). Después de invadir la célula huésped, Listeria reside dentro del fagosoma; sin embargo, puede escapar del fagosoma con la ayuda de listeriolisina O (LLO; Hly) y residir en el citoplasma de las células, presentando así eficientemente antígeno a las células CD8 y CD4 T (Cossart & Mengaud, 1989; Kaufmann, 1993; Pamer et al., 1997). Varios estudios han demostrado la eficacia y facilidad de usar Listeria monocytogenes para administrar antígenos de vacuna heterólogos y vacunas de ADN Jensen et al., 1997; Johnson et al., 2011; Peters et al., 2003; Shen et al., 1995; Yin et al., 2011). Del mismo modo, varios vectores virales han sido probados con éxito por su capacidad para entregar antígenos de vacunas heterólogas, y esto generalmente resulta en la inducción de fuertes respuestas inmunitarias CTL. En el campo veterinario, hay numerosas vacunas de vectores virales que actualmente están autorizadas para su uso en animales de ganado y animales domesticados. Estas vacunas recombinantes se basan tanto en virus ADN (como las vacunas basadas en el virus de la viruela de aves de corral y el virus de la viruela de aves de corral, o vectores basados en el virus de la vacuna contra el virus de la rabia en la fauna silvestre) y virus ARN [como las vacunas basadas en el virus de la enfermedad de Newcastle para ser utilizadas en las aves de corral o en vacunas basadas en el virus de la fiebre amarilla (YFV) para ser utilizadas en caballos contra el virus del Nilo Occidental] (Draper & Heeney Sobre la base del registro de seguridad en el campo veterinario, muchos virus han sido estudiados para uso humano como vector en el desarrollo de vacunas (Beukema et al., 2006; Esteban, 2009; Schirrmacher & Fournier, 2009; Stoyanov et al., 2010; Weli & Tryland, 2011). Entre ellos, YFV (deformación YF-17D) fue el primero en ser autorizado para su uso en humanos, donde los cDNAs codificando las proteínas de envoltorio de YFV fueron reemplazados con los genes correspondientes de una cepa atenuada del virus de la encefalitis japonesa, SA14-14-2 (Appaiahgari & Vrati, 2010; Rollier et al., 2011). Los poxvirus también se estudian ampliamente como vectores candidatos para el uso humano, entre los cuales los derivados atenuados del virus de la vaccinia [como el virus de la vaccinia modificada Ankara (MVA) y las cepas NYVAC del virus de la vaccinia atenuada de Nueva York] son los vectores más prometedores (Esteban, 2009; Gó mez et al., 2008; Rimmelzwaan & Sutter, 2009 ). Son vectores candidatos ideales debido a su gran capacidad de envasado de ADN y su estabilidad térmica y genética (Minke et al., 2004). Se ha demostrado que el vector NYVAC induce respuestas CD4 + T dominantes, y el MVA induce respuestas de células CD4 + y CD8 + T (Mooij et al., 2008). El vector de adenovirus (Ad) es otro de los vectores más ampliamente evaluados hasta la fecha para expresar antígenos heterólogos, debido a la facilidad de producción, perfil de seguridad, estabilidad genética, la facilidad de manipulación del genoma del ADN, y la capacidad de estimular tanto respuestas inmunes innatas y adaptativas e inducir respuestas de células T y B (Alexander et al., 2012; Fitzgerald et al., 2003; Gabitzsch & Jones, 2011; Lasaro & Ertl, 2009; Vemula & Mittal, 2010; Weyer et al., 2009). En varios estudios preclínicos y clínicos sobre enfermedades infecciosas como el ántrax, la hepatitis B, el virus de inmunodeficiencia humana (VIH)-1, la gripe, el sarampión, el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), la malaria y la tuberculosis M. Saxena y otros (Chengalvala et al., 1994; Gao et al., 2006; Hashimoto et al., 2005; Hsu et al., 1992; Limbach & Richie, 2009; Radosevic et al., 2007; Shiver et al., 2002). Sin embargo, antes de que las vacunas vectorizadas puedan utilizarse en la población humana necesitan satisfacer varios criterios importantes. La seguridad es una preocupación importante, ya que incluso un nivel bajo de toxicidad es inaceptable (por supuesto, la molestia menor que acompaña a muchas vacunas es normal). En segundo lugar, una vacuna debe ser barata, para que pueda administrarse a una gran población a un costo mínimo, y esto es particularmente importante en los países pobres en recursos (Killeen & DiRita, 2000). Restricciones similares se aplican a las vacunas veterinarias, con un costo a menudo aún más importante. Por último, las respuestas inmunes celulares de larga duración y (cuando proceda) humorales al antígeno vectorizado deben ser inducidas después de la administración de estas vacunas, preferiblemente con una sola dosis (Atkins et al., 2006). Como algunos de los vectores en uso habrán sido vistos por el sistema inmune del huésped antes de la vacunación, si la presencia de respuestas inmunes preexistentes es perjudicial para el desarrollo ulterior de un esquema de vacunación basado en vectores, o puede aumentar las respuestas al antígeno vectorizado, debe considerarse en detalle. Este es el tema de esta revisión. Al discutir los posibles efectos sobre la inmunidad preexistente, la inmunidad natural al vector Por lo tanto, teniendo en cuenta un vector como Salmonella, si un huésped ha sido infectado previamente existirán respuestas robustas de memoria B y T, y como tal, cuando se administre una vacunación, se inducirá una respuesta anamnésica a los antígenos Salmonella (mientras que la respuesta al antígeno vectorizado será una respuesta primaria), lo que teóricamente reducirá la exposición del antígeno heterólogo al sistema inmunitario, ya que el vector se elimina rápidamente. Sorprendentemente, como se verá en algunos de los ejemplos que se dan a continuación, esto puede tener resultados que difieren en función de la magnitud de la respuesta al antígeno vectorizado. Del mismo modo, para los antígenos viralmente vectorizados, la existencia de inmunidad preexistente al vector (particularmente el anticuerpo neutralizante) restringirá la entrega del virus a las células, reduciendo así efectivamente la dosis del antígeno vectorizado. En el caso de los vectores bacterianos, el efecto de las respuestas inmunológicas preexistentes sólo se ha probado utilizando Salmonella serovars y Listeria spp. Preocupación de que la experiencia inmunológica previa del huésped con la cepa vectorial de Salmonella homóloga o una cepa relacionada podría comprometer su capacidad de entregar antígenos de vacuna heteróloga se planteó por primera vez en 1987 (Dougan et al., 1987). Bao y Clements notificaron posteriormente evidencia experimental de las consecuencias de la exposición previa de animales a la cepa vectorial (Bao & Clements, 1991). Este trabajo mostró que tanto las respuestas séricas como de anticuerpos mucosas contra el antígeno extranjero estaban de hecho reguladas en animales con exposición previa a la cepa vectorial. Whittle & Verma (1997) notificaron hallazgos similares. Los ratones inmunizados a través de la vía intraperitoneal con mutante Salmonella dublin aroA que expresa el antígeno heterólogo después de haber sido expuestos al mismo vector mostraron una mayor respuesta inmune al antígeno vectorizado en comparación con ratones sin memoria inmunológica contra el vector. Posteriormente, se han realizado varios estudios para examinar el efecto de la inmunidad preexistente en el huésped contra Salmonella. Estos resultados se resumen en la Tabla 1. Los diversos informes son contradictorios en sus hallazgos y parecen pintar un cuadro bastante confuso. Algunos estudios concluyeron que la inmunidad preexistente contra el vector Salmonella conduce a respuestas inmunes más fuertes contra el antígeno liberado (Bao & Clements, 1991; Jespersgaard et al., 2001; Kohler et al., 2000a, b; Metzger et al., 2004; Saxena et al., 2009; Sevil Domènech et al., 2008; Whittle & Verma, 1997), con otros considerando que la inmunidad preexistente es un factor limitante en el uso a largo plazo de Salmonella como vector eficiente para la entrega de antígenos (Attridge et al., 1997; Gahan et al., 2008; Roberts et al., 1999; Sevil Domènech et al., 2007; Vindurampulle & Attridge, 2003a, b). Una ligera mayoría de los estudios enumerados en la Tabla 1 (10 versus ocho) indican la regulación ascendente de las respuestas inmunitarias después de que los animales hayan estado expuestos a cepas homólogas o relacionadas antes de la entrega del antígeno heterólogo utilizando un vector Salmonella. Un estudio realizado por Metzger y colaboradores en voluntarios humanos utilizando Salmonella Typhi como vector sugiere que no hubo cambios en la respuesta inmune de las células T contra el antígeno heterólogo en voluntarios humanos que estuvieron expuestos a vectores vacíos en comparación con voluntarios inmunológicamente ingenuos de la cepa vectorial (Metzger et al., 2004). En estos sujetos, las respuestas humorales fueron moderadamente elevadas en individuos preexpuestos. Del mismo modo, Saxena et al. (2009) indicaron una mayor respuesta humoral y celular T en ratones preexpuestos a cepas de Salmonella homólogas o heterólogas. La respuesta a la interleucina 4 (IL4) fue significativamente mayor cuando el huésped animal fue expuesto a la cepa homóloga, mientras que la preexposición a una especie relacionada no tuvo tal impacto en las respuestas a la IL4. Por el contrario, las respuestas al interferón (IFN)-c fueron más altas, independientemente de la cepa a la que los ratones estaban preexpuestos. Este estudio también indicó que la presencia de anticuerpos opsonizantes homólogos o heterologosos conduce a una mayor absorción de Salmonella por macrófagos in vitro, lo que puede explicar las respuestas inmunes más altas en ratones expuestos. Como es de esperarse, la absorción fue mayor cuando se utilizó la sura homóloga como la opsonina en lugar de la sura heterologosa. Esto se muestra en la figura 2. Por el contrario, hay informes que indican que la inmunidad preexistente contra el vector bacterial de Atridge y compañeros de trabajo reportaron que la presencia de inmunidad contra el vector bacteriano antes de la entrega de microbiología antigénica vectorizada 159 proteína puede reducir las respuestas inmunes en ratones contra el antígeno liberado (Attridge et al., 1997). Resultados similares fueron reportados por Roberts et al. (1999) y Vindurampulle & Attridge (2003a, b). Sin embargo, estos últimos autores encontraron que la hipo-respuesta podría ser eliminada en gran medida exponiendo a los animales al antígeno extranjero antes del vectorpriming (Vindurampulle & Attridge, 2003b). Desafortunadamente, esto parecería ser poco práctico para un régimen de inmunización! Un estudio presentado por Gahan et al. (2008) ratones inmunizados con S. Typhimurium expresando C fragmento de antígeno de toxina tetánica de una expresión plasmido o como vacuna del ADN. Los ratones vacunados desarrollaron respuestas humorales a LPS y tetC (para las vacunas portadoras de plásmidos). Los animales de todos los grupos (incluyendo un grupo previamente no vacunado) fueron vacunados el día 182 con Salmonella expresando tetC. En este momento, los títulos anti-LPS y tetC comenzaron a disminuir. Catorce días después de la segunda inmunización, se evaluó la colonización de varios órganos de ratón. Se encontró que la capacidad de colonizar se redujo significativamente en grupos que habían sido vacunados previamente con Salmonella. En vista de este hallazgo, tal vez no fue sorprendente que en el día 210 los títulos de LPS no fueran significativamente diferentes entre los grupos que recibieron una o dos vacunas. Lo más interesante es que ratones que habían sido preparados con Salmonella sola, y luego impulsados con Salmonella expresando tetC, indujeron respuestas anti-tetC mucho más bajas Esto argumenta fuertemente que la inmunidad inmunológica previa al vector puede amortiguar seriamente las respuestas humorales posteriores específicas del antígeno.No se evaluó si lo mismo es cierto para las respuestas celulares.Otros estudios han evaluado las respuestas celulares.Un estudio de Sevil Domènech y colegas reportó que la inmunidad antivectora preexistente compromete seriamente las respuestas CD8 + en ratones cuando se exponen a una cepa similar utilizada como vector (Sevil Domènech et al., 2007).En contraste, otro estudio de los mismos autores reportó que los animales expuestos a vectores relacionados inducen respuestas CD8 + mucho más altas cuando se comparan con animales que no tienen ninguna inmunidad de Salmonella preexistente (Sevil Domènech et al., 2008).La diferencia entre estos dos estudios fue que en el primero, la prima y el impulso fueron con serovares idénticos, mientras que en el segundo estudio se utilizaron diferentes serovares. Esto puede apuntar a una manera de evitar la regulación de las respuestas CD8 por la inmunidad preexistente. Esto es importante, ya que una de las ventajas del uso de Salmonella (un patógeno intracelular) es que se pueden inducir fuertes respuestas inmunes celulares. Cabe señalar que en el caso de las vacunas Salmonella, se deben considerar efectos distintos de las respuestas estrictamente inmunológicas (especialmente respuestas adaptativas). En el contexto de la inmunidad innata, se demostró que la administración de Salmonella no virulenta a los cerdos gnobióticos eliminó la enfermedad después de un desafío con una cepa virulenta (Foster et al., 2003). Curiosamente, la protección no fue por exclusión competitiva, ya que la cepa virulenta fue en gran número en el intestino pero no se distribuyó sistémicamente. La protección fue propuesta para ser mediada por la infiltración de un gran número de leucocitos polimorfonucleares en el intestino, y aunque tal vez poco práctico como profiláctico general (como el tiempo entre la vacunación y la infección es corto), esto puede ser una opción para la vacunación a corto plazo o tal vez terapéutica (como revisado por Foster et al., 2012). Pollos (Gallus gallus) son un reservorio natural de animales para Salmonella, lo que los convierte en una fuente importante de gastroenteritis asociada a Salmonella en los seres humanos. La capacidad de utilizar vacunas orales de Salmonella para inmunizar contra patógenos heterólogos sería de enorme beneficio para la toma de STM-1 por J774 macrófagos, en relación con el porcentaje de absorción más alto. X, opsonizada con suero ingenuo; m, opsonizada con suero de ratones expuestos a la enteriditis de Salmonella; &, opsonizada con suero de ratones expuestos a STM-1. Inmunidad preexistente contra vectores de vacunas en la industria avícola tanto en manadas de pollos de engorde como en bandadas de capas. Tanto la transmisión vertical como horizontal está asociada con Salmonella en pollos (Liljebjelke et al., 2005). La transmisión vertical a través de la transmisión en ovo es particularmente importante, ya que si hay exposición previa a la cepa de la vacuna, la vacunación posterior mediante un vector de Salmonella oral podría verse gravemente comprometida. Un número considerable de estudios sobre inmunidad cruzada y exclusión competitiva se han realizado en pollos. Además, un estudio reciente informó que el tratamiento previo de pollos recién nacidos con diferentes cepas de Salmonella podría producir un efecto inhibitorio de invasión completa en cualquier posterior exposición a cepas homólogas y heterólogas (Methner et al., 2010). La preexposición con una forma altamente invasiva de Salmonella Enteritidis causó una gran afluencia de heterófilos a la mucosa cecal en pollitos de 1 día de edad, y la posterior colonización cecal heteróloga fue inhibida durante un período de 48 h (Methner et al., 2010). Las implicaciones de este tipo de estudios de colonización-inhibición sobre el estado inmunológico de los pollos afectados todavía no se han elucidado completamente. Cabe señalar que los estudios enumerados en los cuadros 1 y 2 son estudios de laboratorio controlados, con la posibilidad de un componente de exclusión competitiva a la inmunidad no discutido Estudios similares de L. monocytogenes y los efectos de las respuestas inmunes preexistentes indican resultados contradictorios.Un estudio de Bouwer et al. (1999) indica que las respuestas inmunes preexistentes contra el vector Listeria no disminuyen las respuestas inmunes contra el antígeno heterólogo liberado, y un estudio similar de Starks et al. (2004) también concluyó que la exposición previa de ratones al vector Listeria vacío no influyó en las respuestas inmunes anticancerosas cuando se utilizó un mutante similar como portador de un antígeno de cáncer de melanoma. (2005) en el que se utilizó L. monocytogens para administrar la proteína gag del virus de la inmunodeficiencia felina (FIV) y como portadora de vacunas de ADN para vacunar a los gatos contra la proteína de envoltorio FIV indicó respuestas inmunes más bajas contra el antígeno liberado en gatos expuestos al vector de Listeria vacío en comparación con animales ingenuos (Stevens et al., 2005). Tvinnereim et al. (2002) y Leong et al. (2009) han reportado hallazgos similares. Sin embargo, tomados en conjunto, estos estudios concluyen que la exposición previa de los animales de acogida al vector vacío no abroga las respuestas inmunes al antígeno vectorizado, sino que sólo las reduce un poco. Sólo el estudio de Vijh et al. (1999) indicó que la exposición al vector vacío puede abrogar completamente las respuestas inmunes contra los antígenos suministrados (Vijh et al. Leong et al. (2009) también demostraron que el impacto negativo de las respuestas inmunitarias específicas de los vectores también puede contrarrestarse mediante la inmunización repetida con la misma vacuna y dosis; esto en efecto conduce a una mayor primovacunación de células T ingenuas contra el antígeno liberado. Por supuesto, esta vacunación repetida puede no ser factible en situaciones del mundo real. A pesar de las muchas ventajas que la vectorización viral puede ofrecer, la inmunidad preexistente es un obstáculo importante de muchas vacunas virales con vectores, como el Ad serotipo 5 o el virus herpes simple tipo 1 (HSV-1), donde la tasa de seroprevalencia a estos virus es muy alta [40-45 % y 70% (o más) de la población estadounidense, respectivamente] (Hocknell et al., 2002; Pichla-Gollon et al., 2009). Los anticuerpos vectoriales pueden impedir la inducción de respuestas inmunitarias a los antígenos codificados por la vacuna, ya que pueden reducir la dosis y el tiempo de exposición de las células diana a los antígenos vacunados (Pichla-Gollon et al., 2009; Pine et al., 2011). En un ensayo clínico a gran escala (STEP) de una vacuna contra el VIH-1 basada en Ad serotipo 5 (AdHu5), las vacunas mostraron una falta de eficacia y tendieron a aumentar el riesgo de infección por el VIH-1 en los receptores de vacunas que tenían anticuerpos neutralizantes preexistentes contra AdHu5 (Buchbinder et al., 2008). Para una vacuna vectorial basada en el HSV-1, se ha demostrado que la inmunidad anti-HSV-1 preexistente disminuyó, pero no suprimió, las respuestas inmunes humorales y celulares contra el antígeno codificado por la vacuna ( Sin embargo, Brockman y Knipe encontraron que la inducción de respuestas duraderas de anticuerpos y respuestas celulares proliferativas al antígeno HSVencoded no se vieron afectadas por la inmunidad previa del VHS (Brockman & Knipe, 2002). Del mismo modo, la inmunidad preexistente al poliovirus tiene poco efecto sobre la eficacia de la vacuna contra el poliovirus (Mandl et al., 2001). Diferentes efectos de la inmunidad preexistente sobre la eficacia de los vectores de vacunas virales recombinantes se resumen en la Tabla 2. Existen varios enfoques para evitar la inmunidad vectorial preexistente, como el uso de vectores derivados de fuentes no humanas, utilizando virus humanos de serotipos raros (Kahl et al., 2010; Lasaro & Ertl, 2009), enfoques heterólogos de primer impulso (Liu et al., 2008), reinmunización homóloga (Steffensen et al., 2012) y la eliminación de epítopos neutralizantes clave en la superficie de las proteínas capsídicas virales (Gabitzsch & Jones, 2011; Roberts et al., 2006). El efecto inhibidor de la inmunidad preexistente también puede evitarse enmascarando el vector Ad dentro de las células dendríticas (DCs) (Steffensen et al., 2012). Además, la vacunación de mucosas o la administración de dosis más altas de vacunas pueden superar problemas de inmunidad preexistentes (Alexander et al., 2012; Belyakov et al., 1999; Priddy et al., 2008; Xiang et al., 2003). Mientras buscamos nuevos enfoques de vacunas para la variedad de patógenos para los que todavía no se dispone, la revisión de vacunas probadas y el desarrollo de estas más ha ganado impulso M. Saxena y otros. Por lo tanto, bacterias y virus atenuados que tienen un largo historial de eficacia y seguridad están siendo puestos en uso. Aunque muy atractivo, un tema común en estos enfoques experimentales ha sido las limitaciones que la inmunidad preexistente al vector puede plantear. Sin embargo, como muestra este examen de la literatura pertinente, hay un cuadro bastante confuso, con algunos estudios que indican que la inmunidad preexistente puede ser un amigo, en lugar de enemigo. Pocos estudios con vectores virales han informado sobre la influencia de la inmunidad preexistente en las respuestas humorales. En términos generales, para los antígenos bacterianos, las respuestas humorales fueron influenciadas por la inmunidad preexistente, con un poco más de estudios encontrando aumento en lugar de disminución. ¿Por qué hay variación? Esto puede deberse a varios factores, incluyendo el tipo de Salmonella utilizado y su invasividad. Dunstan y sus colegas probaron la capacidad de seis cepas isogénicas Salmonella serovar Typhimurium que albergan diferentes mutaciones por su capacidad de inducir respuestas inmunes contra el fragmento C de la toxina tetánica y concluyeron que la cepa que tuvo la menor capacidad de colonizar los parches de Peyer indujo las respuestas inmunes más bajas (Dunstan et al., 1998). De manera similar, el tiempo y la naturaleza de impulso del antígeno utilizado podrían ser importantes. Atridge y sus colegas indicaron la En un experimento, el impulso de ratones a las 10 semanas llevó a la inhibición completa de las respuestas de anticuerpos contra el antígeno heterólogo dado; sin embargo, cuando los ratones fueron aumentados a las 4 semanas, la regulación de las respuestas de anticuerpos no fue tan prominente (Attridge et al., 1997). Un estudio similar realizado por Kohlers y colegas muestra que el impulso a las 7 semanas después de la exposición previa a los animales al vector vacío conduce a respuestas IgG y IgA secretas más bajas específicas de antígenos; sin embargo, el aumento a las 14 semanas conduce a respuestas IgG y IgA secretas más altas (Kohler et al., 2000b). Esto está en conflicto con el resultado anterior, aunque hay que mencionar que utilizaron diferentes especies de Salmonella. Vindurampulle y Attridge también examinaron el impacto de la cepa Salmonella y la naturaleza de los antígeno En su estudio, utilizaron mutantes S. Dublin y Salmonella Stanley aroA para administrar antígenos E. coli K88 y LT-B, y concluyeron que el efecto de la inmunidad preexistente depende tanto de la cepa utilizada como del tipo de antígeno suministrado (Vindurampulle & Attridge, 2003b). Todos estos estudios sobre el efecto de la inmunidad preexistente discuten el impacto en las respuestas humorales. Sevil Domenech y colegas informaron que la exposición de animales al vector de Salmonella homólogo conduce a una reducción significativa en las respuestas CD8 +; sin embargo, la exposición de animales a una cepa heteróloga conduce a respuestas CD8 + significativamente mayores (Sevil Domènech et al., 2007, 2008. Saxena y sus colegas también reportaron que las respuestas de células T específicas de antígenos fueron similares o significativamente más altas, sin una regulación descendente en las respuestas de células T observadas después de la preexposición de ratones a cepas homólogas o heterólogas (Saxena et al., 2009). Para los vectores virales, el impacto de la inmunidad mediada por células fue más pronunciado, y como se muestra en la Tabla 2, casi siempre resultó en una reducción de la respuesta inmune posterior. Presumiblemente esto se debe a que los virus inducirán anticuerpos neutralizantes en la primera dosis, y en dosis posteriores este anticuerpo limitará el número de células transducidas, limitando así las respuestas. Esto es particularmente un problema con un vector viral común como Ad, donde una gran proporción de la población tendrá memoria inmunológica contra los serotipos comunes (Lasaro & Ertl, 2009) Como concluyen estos autores, será posible utilizar estos vectores sólo mediante el desarrollo de vacunas a partir de serotipos alternativos. Puede ser que un vector como la inmunidad preexistente contra los vectores de la vacuna virus de la gripe atenuada, con la capacidad de desarrollar fácilmente reasociantes, será útil en este contexto. Además, la memoria inmunológica en forma de anticuerpos opsonizantes sin duda juega un papel importante en la absorción temprana de Salmonella por macrófagos y DC. Esto puede ser beneficioso, ya que el vector bacteriano vivo utilizado para los propósitos del parto alberga mutaciones en proteínas codificantes de genes responsables de su supervivencia en el huésped animal. Esto no sólo afecta su capacidad de causar enfermedades, haciéndolos vectores vivos seguros, sino que también limita el número de replicaciones. La presencia de anticuerpos opsonizantes debe significar un mayor nivel de absorción bacteriana, lo que conduce a una mayor presentación al sistema inmunológico y, por lo tanto, una Anteriormente hemos demostrado que este es el caso (Saxena et al., 2009 ) (indicado en la figura 2). Sería de gran beneficio abordar estos problemas no sólo en ratones, sino también en otros organismos como los pollos, que son el huésped más probable para el uso de vectores vivos de Salmonella, específicamente donde las vacunas se desarrollan para su uso en ganado y aves de corral. Para resumir, vectores bacterianos como Salmonella y vectores virales como Ad muestran una gran promesa como vehículos de entrega de antígenos heterólogos; sin embargo, debe considerarse la exposición previa al vector. Mediante una selección juiciosa de la cepa/serotipo será posible evitar los efectos negativos y puede ser posible influir positivamente en la respuesta, especialmente para la inmunidad humoral.

¿Cuáles son los criterios importantes para seleccionar vectores de suministro de vacunas?

Inmunidad preexistente contra vectores de vacunas – ¿amigo o enemigo? https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3542731/SHA: f5bdf18567bb3760e1ce0550808135f0270badbd5cAutores: Saxena, Manvendra; Van, Thi Thu Hao; Baird, Fiona J.; Coloe, Peter J.; Smooker, Peter M.Fecha: 2013-01-27DOI: 10.1099/mic.0.049601-0Licencia: cc-byAbstract: En el último siglo, la atenuación exitosa de múltiples patógenos bacteriales y virales ha llevado a una forma efectiva, robusta y segura de vacunación. Recientemente, estas vacunas han sido evaluadas como vectores de parto de antígenos heterólogos, como un medio de vacunación simultánea contra dos patógenos. El consenso general de los estudios publicados es que estos vectores de vacunas tienen el potencial de ser seguros y eficaces. Sin embargo, algunos de los vectores comúnmente empleados, por ejemplo Salmonella y adenovirus, a menudo tienen respuestas inmunes preexistentes en el huésped y esto tiene el potencial de modificar la respuesta inmune posterior a un antígeno vectorizado. Esta revisión examina la literatura sobre este tema, y concluye que para vectores bacterianos puede de hecho, en algunos casos, ser un aumento en la inmunogenicidad, típicamente humoral, mientras que para vectores virales la inmunidad preexistente es un obstáculo para la inducción posterior de respuestas celulares. Texto: En los campos de la medicina y la medicina veterinaria, hay numerosas vacunas bacterianas y virales vivas, atenuadas en uso hoy en todo el mundo. La seguridad y eficacia de estas vacunas está bien establecida y permite un mayor desarrollo como sistemas vectores para liberar antígenos procedentes de otros patógenos. Varias bacterias atenuadas, incluyendo Escherichia coli, Vibrio cholerae, bacterias de ácido láctico (LAB), específicamente Lactococcus lactis, Mycobacterium, Listeria, Shigella y Salmonella, han sido probadas para la entrega dirigida de antígenos heterólogos de origen bacteriano, viral y parasitario en una variedad de huéspedes animales (Bahey-El-Din et al., 2010; Innocentin et al., 2009; Johnson et al., 2011; Tobias et al., 2008 Tobias et al.,, 2010 Tobias & Svennerholm, 2012). Las bacterias como E. coli y las bacterias del ácido láctico han ganado recientemente el favor, ya que E. coli son una bacteria del ácido comensal y láctico están presentes en la mayoría de los alimentos fermentados y por lo tanto están naturalmente presentes en el huésped. También son una opción mucho más segura que las vacunas atenuadas tradicionales en los niños y las personas inmunocomprometidas. Como esta revisión discute los efectos de las respuestas inmunes preexistentes a las vacunas atenuadas, discusión adicional de LAB y E. coli como vectores potenciales no se realizará; sin embargo, el lector se dirige a varias revisiones interesantes (Bermú dez-Humarán et al., 2011; Wells & Mercenier, 2008). Las bacterias intracelulares de los géneros Mycobacterium (Guleria et al., 1996), Listeria (Gentschev et al., 2001), Shigella (Levine et al., 1997) y Salmonella (Dougan et al., 1987) se consideran candidatas adecuadas para el suministro de antígenos vacunales debido a su capacidad para inducir respuestas inmunitarias robustas de células T (Alderton et al., 1991; Lo et al., 1999; Mastroeni et al., 2001; Mittrücker & Kaufmann, 2000; Nauciel, 1990). La Salmonella es un género que ha sido bien examinado como vector, basándose en la extensa investigación disponible sobre la fisiología y patogénesis del microorganismo (Basso et al., 2000; Killeen & DiRita, 2000; Sirard et al., 1999; Ward et al., 1999). Existen varias vacunas comerciales que se utilizan como vacunas contra la Salmonella en humanos y animales (por ejemplo, Ty21a para la fiebre tifoidea en humanos, varios serovares de Salmonella contra la salmonelosis en pollos y otros animales). La estrategia general para la vectorización del antígeno heterológico se describe en la Fig. 1. El primer ensayo clínico de un recombinante, que se realizó hace más de 20 años utilizando una Salmonella atenuada como vector de entrega, llevó a la realización de pruebas generalizadas de esta bacteria como sistema de administración de mucosas para antígenos de patógenos no Salmonella (Dougan et al., 1987). Estos estudios han demostrado la utilidad de las bacterias vivas para suministrar antígenos y vacunas de ADN expresados al sistema inmunitario del huésped (Atkins et al., 2006; Husseiny & Hensel, 2008; Jiang et al., 2004; Kirby et al., 2004). Desde entonces, varios otros vectores bacterianos intracelulares han sido probados con éxito para su capacidad de entregar una variedad de antígenos de diversos patógenos, así como la vacunación contra el cáncer. Un género que ha sido ampliamente probado como vector es Listeria. Las ventajas de Listeria son que puede invadir una variedad de células, incluyendo las células que presentan antígenos (APCs). Después de invadir la célula huésped, Listeria reside dentro del fagosoma; sin embargo, puede escapar del fagosoma con la ayuda de listeriolisina O (LLO; Hly) y residir en el citoplasma de las células, presentando así eficientemente antígeno a las células CD8 y CD4 T (Cossart & Mengaud, 1989; Kaufmann, 1993; Pamer et al., 1997). Varios estudios han demostrado la eficacia y facilidad de usar Listeria monocytogenes para administrar antígenos de vacuna heterólogos y vacunas de ADN Jensen et al., 1997; Johnson et al., 2011; Peters et al., 2003; Shen et al., 1995; Yin et al., 2011). Del mismo modo, varios vectores virales han sido probados con éxito por su capacidad para entregar antígenos de vacunas heterólogas, y esto generalmente resulta en la inducción de fuertes respuestas inmunitarias CTL. En el campo veterinario, hay numerosas vacunas de vectores virales que actualmente están autorizadas para su uso en animales de ganado y animales domesticados. Estas vacunas recombinantes se basan tanto en virus ADN (como las vacunas basadas en el virus de la viruela de aves de corral y el virus de la viruela de aves de corral, o vectores basados en el virus de la vacuna contra el virus de la rabia en la fauna silvestre) y virus ARN [como las vacunas basadas en el virus de la enfermedad de Newcastle para ser utilizadas en las aves de corral o en vacunas basadas en el virus de la fiebre amarilla (YFV) para ser utilizadas en caballos contra el virus del Nilo Occidental] (Draper & Heeney Sobre la base del registro de seguridad en el campo veterinario, muchos virus han sido estudiados para uso humano como vector en el desarrollo de vacunas (Beukema et al., 2006; Esteban, 2009; Schirrmacher & Fournier, 2009; Stoyanov et al., 2010; Weli & Tryland, 2011). Entre ellos, YFV (deformación YF-17D) fue el primero en ser autorizado para su uso en humanos, donde los cDNAs codificando las proteínas de envoltorio de YFV fueron reemplazados con los genes correspondientes de una cepa atenuada del virus de la encefalitis japonesa, SA14-14-2 (Appaiahgari & Vrati, 2010; Rollier et al., 2011). Los poxvirus también se estudian ampliamente como vectores candidatos para el uso humano, entre los cuales los derivados atenuados del virus de la vaccinia [como el virus de la vaccinia modificada Ankara (MVA) y las cepas NYVAC del virus de la vaccinia atenuada de Nueva York] son los vectores más prometedores (Esteban, 2009; Gó mez et al., 2008; Rimmelzwaan & Sutter, 2009 ). Son vectores candidatos ideales debido a su gran capacidad de envasado de ADN y su estabilidad térmica y genética (Minke et al., 2004). Se ha demostrado que el vector NYVAC induce respuestas CD4 + T dominantes, y el MVA induce respuestas de células CD4 + y CD8 + T (Mooij et al., 2008). El vector de adenovirus (Ad) es otro de los vectores más ampliamente evaluados hasta la fecha para expresar antígenos heterólogos, debido a la facilidad de producción, perfil de seguridad, estabilidad genética, la facilidad de manipulación del genoma del ADN, y la capacidad de estimular tanto respuestas inmunes innatas y adaptativas e inducir respuestas de células T y B (Alexander et al., 2012; Fitzgerald et al., 2003; Gabitzsch & Jones, 2011; Lasaro & Ertl, 2009; Vemula & Mittal, 2010; Weyer et al., 2009). En varios estudios preclínicos y clínicos sobre enfermedades infecciosas como el ántrax, la hepatitis B, el virus de inmunodeficiencia humana (VIH)-1, la gripe, el sarampión, el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), la malaria y la tuberculosis M. Saxena y otros (Chengalvala et al., 1994; Gao et al., 2006; Hashimoto et al., 2005; Hsu et al., 1992; Limbach & Richie, 2009; Radosevic et al., 2007; Shiver et al., 2002). Sin embargo, antes de que las vacunas vectorizadas puedan utilizarse en la población humana necesitan satisfacer varios criterios importantes. La seguridad es una preocupación importante, ya que incluso un nivel bajo de toxicidad es inaceptable (por supuesto, la molestia menor que acompaña a muchas vacunas es normal). En segundo lugar, una vacuna debe ser barata, para que pueda administrarse a una gran población a un costo mínimo, y esto es particularmente importante en los países pobres en recursos (Killeen & DiRita, 2000). Restricciones similares se aplican a las vacunas veterinarias, con un costo a menudo aún más importante. Por último, las respuestas inmunes celulares de larga duración y (cuando proceda) humorales al antígeno vectorizado deben ser inducidas después de la administración de estas vacunas, preferiblemente con una sola dosis (Atkins et al., 2006). Como algunos de los vectores en uso habrán sido vistos por el sistema inmune del huésped antes de la vacunación, si la presencia de respuestas inmunes preexistentes es perjudicial para el desarrollo ulterior de un esquema de vacunación basado en vectores, o puede aumentar las respuestas al antígeno vectorizado, debe considerarse en detalle. Este es el tema de esta revisión. Al discutir los posibles efectos sobre la inmunidad preexistente, la inmunidad natural al vector Por lo tanto, teniendo en cuenta un vector como Salmonella, si un huésped ha sido infectado previamente existirán respuestas robustas de memoria B y T, y como tal, cuando se administre una vacunación, se inducirá una respuesta anamnésica a los antígenos Salmonella (mientras que la respuesta al antígeno vectorizado será una respuesta primaria), lo que teóricamente reducirá la exposición del antígeno heterólogo al sistema inmunitario, ya que el vector se elimina rápidamente. Sorprendentemente, como se verá en algunos de los ejemplos que se dan a continuación, esto puede tener resultados que difieren en función de la magnitud de la respuesta al antígeno vectorizado. Del mismo modo, para los antígenos viralmente vectorizados, la existencia de inmunidad preexistente al vector (particularmente el anticuerpo neutralizante) restringirá la entrega del virus a las células, reduciendo así efectivamente la dosis del antígeno vectorizado. En el caso de los vectores bacterianos, el efecto de las respuestas inmunológicas preexistentes sólo se ha probado utilizando Salmonella serovars y Listeria spp. Preocupación de que la experiencia inmunológica previa del huésped con la cepa vectorial de Salmonella homóloga o una cepa relacionada podría comprometer su capacidad de entregar antígenos de vacuna heteróloga se planteó por primera vez en 1987 (Dougan et al., 1987). Bao y Clements notificaron posteriormente evidencia experimental de las consecuencias de la exposición previa de animales a la cepa vectorial (Bao & Clements, 1991). Este trabajo mostró que tanto las respuestas séricas como de anticuerpos mucosas contra el antígeno extranjero estaban de hecho reguladas en animales con exposición previa a la cepa vectorial. Whittle & Verma (1997) notificaron hallazgos similares. Los ratones inmunizados a través de la vía intraperitoneal con mutante Salmonella dublin aroA que expresa el antígeno heterólogo después de haber sido expuestos al mismo vector mostraron una mayor respuesta inmune al antígeno vectorizado en comparación con ratones sin memoria inmunológica contra el vector. Posteriormente, se han realizado varios estudios para examinar el efecto de la inmunidad preexistente en el huésped contra Salmonella. Estos resultados se resumen en la Tabla 1. Los diversos informes son contradictorios en sus hallazgos y parecen pintar un cuadro bastante confuso. Algunos estudios concluyeron que la inmunidad preexistente contra el vector Salmonella conduce a respuestas inmunes más fuertes contra el antígeno liberado (Bao & Clements, 1991; Jespersgaard et al., 2001; Kohler et al., 2000a, b; Metzger et al., 2004; Saxena et al., 2009; Sevil Domènech et al., 2008; Whittle & Verma, 1997), con otros considerando que la inmunidad preexistente es un factor limitante en el uso a largo plazo de Salmonella como vector eficiente para la entrega de antígenos (Attridge et al., 1997; Gahan et al., 2008; Roberts et al., 1999; Sevil Domènech et al., 2007; Vindurampulle & Attridge, 2003a, b). Una ligera mayoría de los estudios enumerados en la Tabla 1 (10 versus ocho) indican la regulación ascendente de las respuestas inmunitarias después de que los animales hayan estado expuestos a cepas homólogas o relacionadas antes de la entrega del antígeno heterólogo utilizando un vector Salmonella. Un estudio realizado por Metzger y colaboradores en voluntarios humanos utilizando Salmonella Typhi como vector sugiere que no hubo cambios en la respuesta inmune de las células T contra el antígeno heterólogo en voluntarios humanos que estuvieron expuestos a vectores vacíos en comparación con voluntarios inmunológicamente ingenuos de la cepa vectorial (Metzger et al., 2004). En estos sujetos, las respuestas humorales fueron moderadamente elevadas en individuos preexpuestos. Del mismo modo, Saxena et al. (2009) indicaron una mayor respuesta humoral y celular T en ratones preexpuestos a cepas de Salmonella homólogas o heterólogas. La respuesta a la interleucina 4 (IL4) fue significativamente mayor cuando el huésped animal fue expuesto a la cepa homóloga, mientras que la preexposición a una especie relacionada no tuvo tal impacto en las respuestas a la IL4. Por el contrario, las respuestas al interferón (IFN)-c fueron más altas, independientemente de la cepa a la que los ratones estaban preexpuestos. Este estudio también indicó que la presencia de anticuerpos opsonizantes homólogos o heterologosos conduce a una mayor absorción de Salmonella por macrófagos in vitro, lo que puede explicar las respuestas inmunes más altas en ratones expuestos. Como es de esperarse, la absorción fue mayor cuando se utilizó la sura homóloga como la opsonina en lugar de la sura heterologosa. Esto se muestra en la figura 2. Por el contrario, hay informes que indican que la inmunidad preexistente contra el vector bacterial de Atridge y compañeros de trabajo reportaron que la presencia de inmunidad contra el vector bacteriano antes de la entrega de microbiología antigénica vectorizada 159 proteína puede reducir las respuestas inmunes en ratones contra el antígeno liberado (Attridge et al., 1997). Resultados similares fueron reportados por Roberts et al. (1999) y Vindurampulle & Attridge (2003a, b). Sin embargo, estos últimos autores encontraron que la hipo-respuesta podría ser eliminada en gran medida exponiendo a los animales al antígeno extranjero antes del vectorpriming (Vindurampulle & Attridge, 2003b). Desafortunadamente, esto parecería ser poco práctico para un régimen de inmunización! Un estudio presentado por Gahan et al. (2008) ratones inmunizados con S. Typhimurium expresando C fragmento de antígeno de toxina tetánica de una expresión plasmido o como vacuna del ADN. Los ratones vacunados desarrollaron respuestas humorales a LPS y tetC (para las vacunas portadoras de plásmidos). Los animales de todos los grupos (incluyendo un grupo previamente no vacunado) fueron vacunados el día 182 con Salmonella expresando tetC. En este momento, los títulos anti-LPS y tetC comenzaron a disminuir. Catorce días después de la segunda inmunización, se evaluó la colonización de varios órganos de ratón. Se encontró que la capacidad de colonizar se redujo significativamente en grupos que habían sido vacunados previamente con Salmonella. En vista de este hallazgo, tal vez no fue sorprendente que en el día 210 los títulos de LPS no fueran significativamente diferentes entre los grupos que recibieron una o dos vacunas. Lo más interesante es que ratones que habían sido preparados con Salmonella sola, y luego impulsados con Salmonella expresando tetC, indujeron respuestas anti-tetC mucho más bajas Esto argumenta fuertemente que la inmunidad inmunológica previa al vector puede amortiguar seriamente las respuestas humorales posteriores específicas del antígeno.No se evaluó si lo mismo es cierto para las respuestas celulares.Otros estudios han evaluado las respuestas celulares.Un estudio de Sevil Domènech y colegas reportó que la inmunidad antivectora preexistente compromete seriamente las respuestas CD8 + en ratones cuando se exponen a una cepa similar utilizada como vector (Sevil Domènech et al., 2007).En contraste, otro estudio de los mismos autores reportó que los animales expuestos a vectores relacionados inducen respuestas CD8 + mucho más altas cuando se comparan con animales que no tienen ninguna inmunidad de Salmonella preexistente (Sevil Domènech et al., 2008).La diferencia entre estos dos estudios fue que en el primero, la prima y el impulso fueron con serovares idénticos, mientras que en el segundo estudio se utilizaron diferentes serovares. Esto puede apuntar a una manera de evitar la regulación de las respuestas CD8 por la inmunidad preexistente. Esto es importante, ya que una de las ventajas del uso de Salmonella (un patógeno intracelular) es que se pueden inducir fuertes respuestas inmunes celulares. Cabe señalar que en el caso de las vacunas Salmonella, se deben considerar efectos distintos de las respuestas estrictamente inmunológicas (especialmente respuestas adaptativas). En el contexto de la inmunidad innata, se demostró que la administración de Salmonella no virulenta a los cerdos gnobióticos eliminó la enfermedad después de un desafío con una cepa virulenta (Foster et al., 2003). Curiosamente, la protección no fue por exclusión competitiva, ya que la cepa virulenta fue en gran número en el intestino pero no se distribuyó sistémicamente. La protección fue propuesta para ser mediada por la infiltración de un gran número de leucocitos polimorfonucleares en el intestino, y aunque tal vez poco práctico como profiláctico general (como el tiempo entre la vacunación y la infección es corto), esto puede ser una opción para la vacunación a corto plazo o tal vez terapéutica (como revisado por Foster et al., 2012). Pollos (Gallus gallus) son un reservorio natural de animales para Salmonella, lo que los convierte en una fuente importante de gastroenteritis asociada a Salmonella en los seres humanos. La capacidad de utilizar vacunas orales de Salmonella para inmunizar contra patógenos heterólogos sería de enorme beneficio para la toma de STM-1 por J774 macrófagos, en relación con el porcentaje de absorción más alto. X, opsonizada con suero ingenuo; m, opsonizada con suero de ratones expuestos a la enteriditis de Salmonella; &, opsonizada con suero de ratones expuestos a STM-1. Inmunidad preexistente contra vectores de vacunas en la industria avícola tanto en manadas de pollos de engorde como en bandadas de capas. Tanto la transmisión vertical como horizontal está asociada con Salmonella en pollos (Liljebjelke et al., 2005). La transmisión vertical a través de la transmisión en ovo es particularmente importante, ya que si hay exposición previa a la cepa de la vacuna, la vacunación posterior mediante un vector de Salmonella oral podría verse gravemente comprometida. Un número considerable de estudios sobre inmunidad cruzada y exclusión competitiva se han realizado en pollos. Además, un estudio reciente informó que el tratamiento previo de pollos recién nacidos con diferentes cepas de Salmonella podría producir un efecto inhibitorio de invasión completa en cualquier posterior exposición a cepas homólogas y heterólogas (Methner et al., 2010). La preexposición con una forma altamente invasiva de Salmonella Enteritidis causó una gran afluencia de heterófilos a la mucosa cecal en pollitos de 1 día de edad, y la posterior colonización cecal heteróloga fue inhibida durante un período de 48 h (Methner et al., 2010). Las implicaciones de este tipo de estudios de colonización-inhibición sobre el estado inmunológico de los pollos afectados todavía no se han elucidado completamente. Cabe señalar que los estudios enumerados en los cuadros 1 y 2 son estudios de laboratorio controlados, con la posibilidad de un componente de exclusión competitiva a la inmunidad no discutido Estudios similares de L. monocytogenes y los efectos de las respuestas inmunes preexistentes indican resultados contradictorios.Un estudio de Bouwer et al. (1999) indica que las respuestas inmunes preexistentes contra el vector Listeria no disminuyen las respuestas inmunes contra el antígeno heterólogo liberado, y un estudio similar de Starks et al. (2004) también concluyó que la exposición previa de ratones al vector Listeria vacío no influyó en las respuestas inmunes anticancerosas cuando se utilizó un mutante similar como portador de un antígeno de cáncer de melanoma. (2005) en el que se utilizó L. monocytogens para administrar la proteína gag del virus de la inmunodeficiencia felina (FIV) y como portadora de vacunas de ADN para vacunar a los gatos contra la proteína de envoltorio FIV indicó respuestas inmunes más bajas contra el antígeno liberado en gatos expuestos al vector de Listeria vacío en comparación con animales ingenuos (Stevens et al., 2005). Tvinnereim et al. (2002) y Leong et al. (2009) han reportado hallazgos similares. Sin embargo, tomados en conjunto, estos estudios concluyen que la exposición previa de los animales de acogida al vector vacío no abroga las respuestas inmunes al antígeno vectorizado, sino que sólo las reduce un poco. Sólo el estudio de Vijh et al. (1999) indicó que la exposición al vector vacío puede abrogar completamente las respuestas inmunes contra los antígenos suministrados (Vijh et al. Leong et al. (2009) también demostraron que el impacto negativo de las respuestas inmunitarias específicas de los vectores también puede contrarrestarse mediante la inmunización repetida con la misma vacuna y dosis; esto en efecto conduce a una mayor primovacunación de células T ingenuas contra el antígeno liberado. Por supuesto, esta vacunación repetida puede no ser factible en situaciones del mundo real. A pesar de las muchas ventajas que la vectorización viral puede ofrecer, la inmunidad preexistente es un obstáculo importante de muchas vacunas virales con vectores, como el Ad serotipo 5 o el virus herpes simple tipo 1 (HSV-1), donde la tasa de seroprevalencia a estos virus es muy alta [40-45 % y 70% (o más) de la población estadounidense, respectivamente] (Hocknell et al., 2002; Pichla-Gollon et al., 2009). Los anticuerpos vectoriales pueden impedir la inducción de respuestas inmunitarias a los antígenos codificados por la vacuna, ya que pueden reducir la dosis y el tiempo de exposición de las células diana a los antígenos vacunados (Pichla-Gollon et al., 2009; Pine et al., 2011). En un ensayo clínico a gran escala (STEP) de una vacuna contra el VIH-1 basada en Ad serotipo 5 (AdHu5), las vacunas mostraron una falta de eficacia y tendieron a aumentar el riesgo de infección por el VIH-1 en los receptores de vacunas que tenían anticuerpos neutralizantes preexistentes contra AdHu5 (Buchbinder et al., 2008). Para una vacuna vectorial basada en el HSV-1, se ha demostrado que la inmunidad anti-HSV-1 preexistente disminuyó, pero no suprimió, las respuestas inmunes humorales y celulares contra el antígeno codificado por la vacuna ( Sin embargo, Brockman y Knipe encontraron que la inducción de respuestas duraderas de anticuerpos y respuestas celulares proliferativas al antígeno HSVencoded no se vieron afectadas por la inmunidad previa del VHS (Brockman & Knipe, 2002). Del mismo modo, la inmunidad preexistente al poliovirus tiene poco efecto sobre la eficacia de la vacuna contra el poliovirus (Mandl et al., 2001). Diferentes efectos de la inmunidad preexistente sobre la eficacia de los vectores de vacunas virales recombinantes se resumen en la Tabla 2. Existen varios enfoques para evitar la inmunidad vectorial preexistente, como el uso de vectores derivados de fuentes no humanas, utilizando virus humanos de serotipos raros (Kahl et al., 2010; Lasaro & Ertl, 2009), enfoques heterólogos de primer impulso (Liu et al., 2008), reinmunización homóloga (Steffensen et al., 2012) y la eliminación de epítopos neutralizantes clave en la superficie de las proteínas capsídicas virales (Gabitzsch & Jones, 2011; Roberts et al., 2006). El efecto inhibidor de la inmunidad preexistente también puede evitarse enmascarando el vector Ad dentro de las células dendríticas (DCs) (Steffensen et al., 2012). Además, la vacunación de mucosas o la administración de dosis más altas de vacunas pueden superar problemas de inmunidad preexistentes (Alexander et al., 2012; Belyakov et al., 1999; Priddy et al., 2008; Xiang et al., 2003). Mientras buscamos nuevos enfoques de vacunas para la variedad de patógenos para los que todavía no se dispone, la revisión de vacunas probadas y el desarrollo de estas más ha ganado impulso M. Saxena y otros. Por lo tanto, bacterias y virus atenuados que tienen un largo historial de eficacia y seguridad están siendo puestos en uso. Aunque muy atractivo, un tema común en estos enfoques experimentales ha sido las limitaciones que la inmunidad preexistente al vector puede plantear. Sin embargo, como muestra este examen de la literatura pertinente, hay un cuadro bastante confuso, con algunos estudios que indican que la inmunidad preexistente puede ser un amigo, en lugar de enemigo. Pocos estudios con vectores virales han informado sobre la influencia de la inmunidad preexistente en las respuestas humorales. En términos generales, para los antígenos bacterianos, las respuestas humorales fueron influenciadas por la inmunidad preexistente, con un poco más de estudios encontrando aumento en lugar de disminución. ¿Por qué hay variación? Esto puede deberse a varios factores, incluyendo el tipo de Salmonella utilizado y su invasividad. Dunstan y sus colegas probaron la capacidad de seis cepas isogénicas Salmonella serovar Typhimurium que albergan diferentes mutaciones por su capacidad de inducir respuestas inmunes contra el fragmento C de la toxina tetánica y concluyeron que la cepa que tuvo la menor capacidad de colonizar los parches de Peyer indujo las respuestas inmunes más bajas (Dunstan et al., 1998). De manera similar, el tiempo y la naturaleza de impulso del antígeno utilizado podrían ser importantes. Atridge y sus colegas indicaron la En un experimento, el impulso de ratones a las 10 semanas llevó a la inhibición completa de las respuestas de anticuerpos contra el antígeno heterólogo dado; sin embargo, cuando los ratones fueron aumentados a las 4 semanas, la regulación de las respuestas de anticuerpos no fue tan prominente (Attridge et al., 1997). Un estudio similar realizado por Kohlers y colegas muestra que el impulso a las 7 semanas después de la exposición previa a los animales al vector vacío conduce a respuestas IgG y IgA secretas más bajas específicas de antígenos; sin embargo, el aumento a las 14 semanas conduce a respuestas IgG y IgA secretas más altas (Kohler et al., 2000b). Esto está en conflicto con el resultado anterior, aunque hay que mencionar que utilizaron diferentes especies de Salmonella. Vindurampulle y Attridge también examinaron el impacto de la cepa Salmonella y la naturaleza de los antígeno En su estudio, utilizaron mutantes S. Dublin y Salmonella Stanley aroA para administrar antígenos E. coli K88 y LT-B, y concluyeron que el efecto de la inmunidad preexistente depende tanto de la cepa utilizada como del tipo de antígeno suministrado (Vindurampulle & Attridge, 2003b). Todos estos estudios sobre el efecto de la inmunidad preexistente discuten el impacto en las respuestas humorales. Sevil Domenech y colegas informaron que la exposición de animales al vector de Salmonella homólogo conduce a una reducción significativa en las respuestas CD8 +; sin embargo, la exposición de animales a una cepa heteróloga conduce a respuestas CD8 + significativamente mayores (Sevil Domènech et al., 2007, 2008. Saxena y sus colegas también reportaron que las respuestas de células T específicas de antígenos fueron similares o significativamente más altas, sin una regulación descendente en las respuestas de células T observadas después de la preexposición de ratones a cepas homólogas o heterólogas (Saxena et al., 2009). Para los vectores virales, el impacto de la inmunidad mediada por células fue más pronunciado, y como se muestra en la Tabla 2, casi siempre resultó en una reducción de la respuesta inmune posterior. Presumiblemente esto se debe a que los virus inducirán anticuerpos neutralizantes en la primera dosis, y en dosis posteriores este anticuerpo limitará el número de células transducidas, limitando así las respuestas. Esto es particularmente un problema con un vector viral común como Ad, donde una gran proporción de la población tendrá memoria inmunológica contra los serotipos comunes (Lasaro & Ertl, 2009) Como concluyen estos autores, será posible utilizar estos vectores sólo mediante el desarrollo de vacunas a partir de serotipos alternativos. Puede ser que un vector como la inmunidad preexistente contra los vectores de la vacuna virus de la gripe atenuada, con la capacidad de desarrollar fácilmente reasociantes, será útil en este contexto. Además, la memoria inmunológica en forma de anticuerpos opsonizantes sin duda juega un papel importante en la absorción temprana de Salmonella por macrófagos y DC. Esto puede ser beneficioso, ya que el vector bacteriano vivo utilizado para los propósitos del parto alberga mutaciones en proteínas codificantes de genes responsables de su supervivencia en el huésped animal. Esto no sólo afecta su capacidad de causar enfermedades, haciéndolos vectores vivos seguros, sino que también limita el número de replicaciones. La presencia de anticuerpos opsonizantes debe significar un mayor nivel de absorción bacteriana, lo que conduce a una mayor presentación al sistema inmunológico y, por lo tanto, una Anteriormente hemos demostrado que este es el caso (Saxena et al., 2009 ) (indicado en la figura 2). Sería de gran beneficio abordar estos problemas no sólo en ratones, sino también en otros organismos como los pollos, que son el huésped más probable para el uso de vectores vivos de Salmonella, específicamente donde las vacunas se desarrollan para su uso en ganado y aves de corral. Para resumir, vectores bacterianos como Salmonella y vectores virales como Ad muestran una gran promesa como vehículos de entrega de antígenos heterólogos; sin embargo, debe considerarse la exposición previa al vector. Mediante una selección juiciosa de la cepa/serotipo será posible evitar los efectos negativos y puede ser posible influir positivamente en la respuesta, especialmente para la inmunidad humoral.

¿Cuál es el efecto de la respuesta inmune del huésped al vector de distribución viral sobre la eficacia de la vacunación?

Inmunidad preexistente contra vectores de vacunas – ¿amigo o enemigo? https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3542731/SHA: f5bdf18567bb3760e1ce0550808135f0270badbd5cAutores: Saxena, Manvendra; Van, Thi Thu Hao; Baird, Fiona J.; Coloe, Peter J.; Smooker, Peter M.Fecha: 2013-01-27DOI: 10.1099/mic.0.049601-0Licencia: cc-byAbstract: En el último siglo, la atenuación exitosa de múltiples patógenos bacteriales y virales ha llevado a una forma efectiva, robusta y segura de vacunación. Recientemente, estas vacunas han sido evaluadas como vectores de parto de antígenos heterólogos, como un medio de vacunación simultánea contra dos patógenos. El consenso general de los estudios publicados es que estos vectores de vacunas tienen el potencial de ser seguros y eficaces. Sin embargo, algunos de los vectores comúnmente empleados, por ejemplo Salmonella y adenovirus, a menudo tienen respuestas inmunes preexistentes en el huésped y esto tiene el potencial de modificar la respuesta inmune posterior a un antígeno vectorizado. Esta revisión examina la literatura sobre este tema, y concluye que para vectores bacterianos puede de hecho, en algunos casos, ser un aumento en la inmunogenicidad, típicamente humoral, mientras que para vectores virales la inmunidad preexistente es un obstáculo para la inducción posterior de respuestas celulares. Texto: En los campos de la medicina y la medicina veterinaria, hay numerosas vacunas bacterianas y virales vivas, atenuadas en uso hoy en todo el mundo. La seguridad y eficacia de estas vacunas está bien establecida y permite un mayor desarrollo como sistemas vectores para liberar antígenos procedentes de otros patógenos. Varias bacterias atenuadas, incluyendo Escherichia coli, Vibrio cholerae, bacterias de ácido láctico (LAB), específicamente Lactococcus lactis, Mycobacterium, Listeria, Shigella y Salmonella, han sido probadas para la entrega dirigida de antígenos heterólogos de origen bacteriano, viral y parasitario en una variedad de huéspedes animales (Bahey-El-Din et al., 2010; Innocentin et al., 2009; Johnson et al., 2011; Tobias et al., 2008 Tobias et al.,, 2010 Tobias & Svennerholm, 2012). Las bacterias como E. coli y las bacterias del ácido láctico han ganado recientemente el favor, ya que E. coli son una bacteria del ácido comensal y láctico están presentes en la mayoría de los alimentos fermentados y por lo tanto están naturalmente presentes en el huésped. También son una opción mucho más segura que las vacunas atenuadas tradicionales en los niños y las personas inmunocomprometidas. Como esta revisión discute los efectos de las respuestas inmunes preexistentes a las vacunas atenuadas, discusión adicional de LAB y E. coli como vectores potenciales no se realizará; sin embargo, el lector se dirige a varias revisiones interesantes (Bermú dez-Humarán et al., 2011; Wells & Mercenier, 2008). Las bacterias intracelulares de los géneros Mycobacterium (Guleria et al., 1996), Listeria (Gentschev et al., 2001), Shigella (Levine et al., 1997) y Salmonella (Dougan et al., 1987) se consideran candidatas adecuadas para el suministro de antígenos vacunales debido a su capacidad para inducir respuestas inmunitarias robustas de células T (Alderton et al., 1991; Lo et al., 1999; Mastroeni et al., 2001; Mittrücker & Kaufmann, 2000; Nauciel, 1990). La Salmonella es un género que ha sido bien examinado como vector, basándose en la extensa investigación disponible sobre la fisiología y patogénesis del microorganismo (Basso et al., 2000; Killeen & DiRita, 2000; Sirard et al., 1999; Ward et al., 1999). Existen varias vacunas comerciales que se utilizan como vacunas contra la Salmonella en humanos y animales (por ejemplo, Ty21a para la fiebre tifoidea en humanos, varios serovares de Salmonella contra la salmonelosis en pollos y otros animales). La estrategia general para la vectorización del antígeno heterológico se describe en la Fig. 1. El primer ensayo clínico de un recombinante, que se realizó hace más de 20 años utilizando una Salmonella atenuada como vector de entrega, llevó a la realización de pruebas generalizadas de esta bacteria como sistema de administración de mucosas para antígenos de patógenos no Salmonella (Dougan et al., 1987). Estos estudios han demostrado la utilidad de las bacterias vivas para suministrar antígenos y vacunas de ADN expresados al sistema inmunitario del huésped (Atkins et al., 2006; Husseiny & Hensel, 2008; Jiang et al., 2004; Kirby et al., 2004). Desde entonces, varios otros vectores bacterianos intracelulares han sido probados con éxito para su capacidad de entregar una variedad de antígenos de diversos patógenos, así como la vacunación contra el cáncer. Un género que ha sido ampliamente probado como vector es Listeria. Las ventajas de Listeria son que puede invadir una variedad de células, incluyendo las células que presentan antígenos (APCs). Después de invadir la célula huésped, Listeria reside dentro del fagosoma; sin embargo, puede escapar del fagosoma con la ayuda de listeriolisina O (LLO; Hly) y residir en el citoplasma de las células, presentando así eficientemente antígeno a las células CD8 y CD4 T (Cossart & Mengaud, 1989; Kaufmann, 1993; Pamer et al., 1997). Varios estudios han demostrado la eficacia y facilidad de usar Listeria monocytogenes para administrar antígenos de vacuna heterólogos y vacunas de ADN Jensen et al., 1997; Johnson et al., 2011; Peters et al., 2003; Shen et al., 1995; Yin et al., 2011). Del mismo modo, varios vectores virales han sido probados con éxito por su capacidad para entregar antígenos de vacunas heterólogas, y esto generalmente resulta en la inducción de fuertes respuestas inmunitarias CTL. En el campo veterinario, hay numerosas vacunas de vectores virales que actualmente están autorizadas para su uso en animales de ganado y animales domesticados. Estas vacunas recombinantes se basan tanto en virus ADN (como las vacunas basadas en el virus de la viruela de aves de corral y el virus de la viruela de aves de corral, o vectores basados en el virus de la vacuna contra el virus de la rabia en la fauna silvestre) y virus ARN [como las vacunas basadas en el virus de la enfermedad de Newcastle para ser utilizadas en las aves de corral o en vacunas basadas en el virus de la fiebre amarilla (YFV) para ser utilizadas en caballos contra el virus del Nilo Occidental] (Draper & Heeney Sobre la base del registro de seguridad en el campo veterinario, muchos virus han sido estudiados para uso humano como vector en el desarrollo de vacunas (Beukema et al., 2006; Esteban, 2009; Schirrmacher & Fournier, 2009; Stoyanov et al., 2010; Weli & Tryland, 2011). Entre ellos, YFV (deformación YF-17D) fue el primero en ser autorizado para su uso en humanos, donde los cDNAs codificando las proteínas de envoltorio de YFV fueron reemplazados con los genes correspondientes de una cepa atenuada del virus de la encefalitis japonesa, SA14-14-2 (Appaiahgari & Vrati, 2010; Rollier et al., 2011). Los poxvirus también se estudian ampliamente como vectores candidatos para el uso humano, entre los cuales los derivados atenuados del virus de la vaccinia [como el virus de la vaccinia modificada Ankara (MVA) y las cepas NYVAC del virus de la vaccinia atenuada de Nueva York] son los vectores más prometedores (Esteban, 2009; Gó mez et al., 2008; Rimmelzwaan & Sutter, 2009 ). Son vectores candidatos ideales debido a su gran capacidad de envasado de ADN y su estabilidad térmica y genética (Minke et al., 2004). Se ha demostrado que el vector NYVAC induce respuestas CD4 + T dominantes, y el MVA induce respuestas de células CD4 + y CD8 + T (Mooij et al., 2008). El vector de adenovirus (Ad) es otro de los vectores más ampliamente evaluados hasta la fecha para expresar antígenos heterólogos, debido a la facilidad de producción, perfil de seguridad, estabilidad genética, la facilidad de manipulación del genoma del ADN, y la capacidad de estimular tanto respuestas inmunes innatas y adaptativas e inducir respuestas de células T y B (Alexander et al., 2012; Fitzgerald et al., 2003; Gabitzsch & Jones, 2011; Lasaro & Ertl, 2009; Vemula & Mittal, 2010; Weyer et al., 2009). En varios estudios preclínicos y clínicos sobre enfermedades infecciosas como el ántrax, la hepatitis B, el virus de inmunodeficiencia humana (VIH)-1, la gripe, el sarampión, el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), la malaria y la tuberculosis M. Saxena y otros (Chengalvala et al., 1994; Gao et al., 2006; Hashimoto et al., 2005; Hsu et al., 1992; Limbach & Richie, 2009; Radosevic et al., 2007; Shiver et al., 2002). Sin embargo, antes de que las vacunas vectorizadas puedan utilizarse en la población humana necesitan satisfacer varios criterios importantes. La seguridad es una preocupación importante, ya que incluso un nivel bajo de toxicidad es inaceptable (por supuesto, la molestia menor que acompaña a muchas vacunas es normal). En segundo lugar, una vacuna debe ser barata, para que pueda administrarse a una gran población a un costo mínimo, y esto es particularmente importante en los países pobres en recursos (Killeen & DiRita, 2000). Restricciones similares se aplican a las vacunas veterinarias, con un costo a menudo aún más importante. Por último, las respuestas inmunes celulares de larga duración y (cuando proceda) humorales al antígeno vectorizado deben ser inducidas después de la administración de estas vacunas, preferiblemente con una sola dosis (Atkins et al., 2006). Como algunos de los vectores en uso habrán sido vistos por el sistema inmune del huésped antes de la vacunación, si la presencia de respuestas inmunes preexistentes es perjudicial para el desarrollo ulterior de un esquema de vacunación basado en vectores, o puede aumentar las respuestas al antígeno vectorizado, debe considerarse en detalle. Este es el tema de esta revisión. Al discutir los posibles efectos sobre la inmunidad preexistente, la inmunidad natural al vector Por lo tanto, teniendo en cuenta un vector como Salmonella, si un huésped ha sido infectado previamente existirán respuestas robustas de memoria B y T, y como tal, cuando se administre una vacunación, se inducirá una respuesta anamnésica a los antígenos Salmonella (mientras que la respuesta al antígeno vectorizado será una respuesta primaria), lo que teóricamente reducirá la exposición del antígeno heterólogo al sistema inmunitario, ya que el vector se elimina rápidamente. Sorprendentemente, como se verá en algunos de los ejemplos que se dan a continuación, esto puede tener resultados que difieren en función de la magnitud de la respuesta al antígeno vectorizado. Del mismo modo, para los antígenos viralmente vectorizados, la existencia de inmunidad preexistente al vector (particularmente el anticuerpo neutralizante) restringirá la entrega del virus a las células, reduciendo así efectivamente la dosis del antígeno vectorizado. En el caso de los vectores bacterianos, el efecto de las respuestas inmunológicas preexistentes sólo se ha probado utilizando Salmonella serovars y Listeria spp. Preocupación de que la experiencia inmunológica previa del huésped con la cepa vectorial de Salmonella homóloga o una cepa relacionada podría comprometer su capacidad de entregar antígenos de vacuna heteróloga se planteó por primera vez en 1987 (Dougan et al., 1987). Bao y Clements notificaron posteriormente evidencia experimental de las consecuencias de la exposición previa de animales a la cepa vectorial (Bao & Clements, 1991). Este trabajo mostró que tanto las respuestas séricas como de anticuerpos mucosas contra el antígeno extranjero estaban de hecho reguladas en animales con exposición previa a la cepa vectorial. Whittle & Verma (1997) notificaron hallazgos similares. Los ratones inmunizados a través de la vía intraperitoneal con mutante Salmonella dublin aroA que expresa el antígeno heterólogo después de haber sido expuestos al mismo vector mostraron una mayor respuesta inmune al antígeno vectorizado en comparación con ratones sin memoria inmunológica contra el vector. Posteriormente, se han realizado varios estudios para examinar el efecto de la inmunidad preexistente en el huésped contra Salmonella. Estos resultados se resumen en la Tabla 1. Los diversos informes son contradictorios en sus hallazgos y parecen pintar un cuadro bastante confuso. Algunos estudios concluyeron que la inmunidad preexistente contra el vector Salmonella conduce a respuestas inmunes más fuertes contra el antígeno liberado (Bao & Clements, 1991; Jespersgaard et al., 2001; Kohler et al., 2000a, b; Metzger et al., 2004; Saxena et al., 2009; Sevil Domènech et al., 2008; Whittle & Verma, 1997), con otros considerando que la inmunidad preexistente es un factor limitante en el uso a largo plazo de Salmonella como vector eficiente para la entrega de antígenos (Attridge et al., 1997; Gahan et al., 2008; Roberts et al., 1999; Sevil Domènech et al., 2007; Vindurampulle & Attridge, 2003a, b). Una ligera mayoría de los estudios enumerados en la Tabla 1 (10 versus ocho) indican la regulación ascendente de las respuestas inmunitarias después de que los animales hayan estado expuestos a cepas homólogas o relacionadas antes de la entrega del antígeno heterólogo utilizando un vector Salmonella. Un estudio realizado por Metzger y colaboradores en voluntarios humanos utilizando Salmonella Typhi como vector sugiere que no hubo cambios en la respuesta inmune de las células T contra el antígeno heterólogo en voluntarios humanos que estuvieron expuestos a vectores vacíos en comparación con voluntarios inmunológicamente ingenuos de la cepa vectorial (Metzger et al., 2004). En estos sujetos, las respuestas humorales fueron moderadamente elevadas en individuos preexpuestos. Del mismo modo, Saxena et al. (2009) indicaron una mayor respuesta humoral y celular T en ratones preexpuestos a cepas de Salmonella homólogas o heterólogas. La respuesta a la interleucina 4 (IL4) fue significativamente mayor cuando el huésped animal fue expuesto a la cepa homóloga, mientras que la preexposición a una especie relacionada no tuvo tal impacto en las respuestas a la IL4. Por el contrario, las respuestas al interferón (IFN)-c fueron más altas, independientemente de la cepa a la que los ratones estaban preexpuestos. Este estudio también indicó que la presencia de anticuerpos opsonizantes homólogos o heterologosos conduce a una mayor absorción de Salmonella por macrófagos in vitro, lo que puede explicar las respuestas inmunes más altas en ratones expuestos. Como es de esperarse, la absorción fue mayor cuando se utilizó la sura homóloga como la opsonina en lugar de la sura heterologosa. Esto se muestra en la figura 2. Por el contrario, hay informes que indican que la inmunidad preexistente contra el vector bacterial de Atridge y compañeros de trabajo reportaron que la presencia de inmunidad contra el vector bacteriano antes de la entrega de microbiología antigénica vectorizada 159 proteína puede reducir las respuestas inmunes en ratones contra el antígeno liberado (Attridge et al., 1997). Resultados similares fueron reportados por Roberts et al. (1999) y Vindurampulle & Attridge (2003a, b). Sin embargo, estos últimos autores encontraron que la hipo-respuesta podría ser eliminada en gran medida exponiendo a los animales al antígeno extranjero antes del vectorpriming (Vindurampulle & Attridge, 2003b). Desafortunadamente, esto parecería ser poco práctico para un régimen de inmunización! Un estudio presentado por Gahan et al. (2008) ratones inmunizados con S. Typhimurium expresando C fragmento de antígeno de toxina tetánica de una expresión plasmido o como vacuna del ADN. Los ratones vacunados desarrollaron respuestas humorales a LPS y tetC (para las vacunas portadoras de plásmidos). Los animales de todos los grupos (incluyendo un grupo previamente no vacunado) fueron vacunados el día 182 con Salmonella expresando tetC. En este momento, los títulos anti-LPS y tetC comenzaron a disminuir. Catorce días después de la segunda inmunización, se evaluó la colonización de varios órganos de ratón. Se encontró que la capacidad de colonizar se redujo significativamente en grupos que habían sido vacunados previamente con Salmonella. En vista de este hallazgo, tal vez no fue sorprendente que en el día 210 los títulos de LPS no fueran significativamente diferentes entre los grupos que recibieron una o dos vacunas. Lo más interesante es que ratones que habían sido preparados con Salmonella sola, y luego impulsados con Salmonella expresando tetC, indujeron respuestas anti-tetC mucho más bajas Esto argumenta fuertemente que la inmunidad inmunológica previa al vector puede amortiguar seriamente las respuestas humorales posteriores específicas del antígeno.No se evaluó si lo mismo es cierto para las respuestas celulares.Otros estudios han evaluado las respuestas celulares.Un estudio de Sevil Domènech y colegas reportó que la inmunidad antivectora preexistente compromete seriamente las respuestas CD8 + en ratones cuando se exponen a una cepa similar utilizada como vector (Sevil Domènech et al., 2007).En contraste, otro estudio de los mismos autores reportó que los animales expuestos a vectores relacionados inducen respuestas CD8 + mucho más altas cuando se comparan con animales que no tienen ninguna inmunidad de Salmonella preexistente (Sevil Domènech et al., 2008).La diferencia entre estos dos estudios fue que en el primero, la prima y el impulso fueron con serovares idénticos, mientras que en el segundo estudio se utilizaron diferentes serovares. Esto puede apuntar a una manera de evitar la regulación de las respuestas CD8 por la inmunidad preexistente. Esto es importante, ya que una de las ventajas del uso de Salmonella (un patógeno intracelular) es que se pueden inducir fuertes respuestas inmunes celulares. Cabe señalar que en el caso de las vacunas Salmonella, se deben considerar efectos distintos de las respuestas estrictamente inmunológicas (especialmente respuestas adaptativas). En el contexto de la inmunidad innata, se demostró que la administración de Salmonella no virulenta a los cerdos gnobióticos eliminó la enfermedad después de un desafío con una cepa virulenta (Foster et al., 2003). Curiosamente, la protección no fue por exclusión competitiva, ya que la cepa virulenta fue en gran número en el intestino pero no se distribuyó sistémicamente. La protección fue propuesta para ser mediada por la infiltración de un gran número de leucocitos polimorfonucleares en el intestino, y aunque tal vez poco práctico como profiláctico general (como el tiempo entre la vacunación y la infección es corto), esto puede ser una opción para la vacunación a corto plazo o tal vez terapéutica (como revisado por Foster et al., 2012). Pollos (Gallus gallus) son un reservorio natural de animales para Salmonella, lo que los convierte en una fuente importante de gastroenteritis asociada a Salmonella en los seres humanos. La capacidad de utilizar vacunas orales de Salmonella para inmunizar contra patógenos heterólogos sería de enorme beneficio para la toma de STM-1 por J774 macrófagos, en relación con el porcentaje de absorción más alto. X, opsonizada con suero ingenuo; m, opsonizada con suero de ratones expuestos a la enteriditis de Salmonella; &, opsonizada con suero de ratones expuestos a STM-1. Inmunidad preexistente contra vectores de vacunas en la industria avícola tanto en manadas de pollos de engorde como en bandadas de capas. Tanto la transmisión vertical como horizontal está asociada con Salmonella en pollos (Liljebjelke et al., 2005). La transmisión vertical a través de la transmisión en ovo es particularmente importante, ya que si hay exposición previa a la cepa de la vacuna, la vacunación posterior mediante un vector de Salmonella oral podría verse gravemente comprometida. Un número considerable de estudios sobre inmunidad cruzada y exclusión competitiva se han realizado en pollos. Además, un estudio reciente informó que el tratamiento previo de pollos recién nacidos con diferentes cepas de Salmonella podría producir un efecto inhibitorio de invasión completa en cualquier posterior exposición a cepas homólogas y heterólogas (Methner et al., 2010). La preexposición con una forma altamente invasiva de Salmonella Enteritidis causó una gran afluencia de heterófilos a la mucosa cecal en pollitos de 1 día de edad, y la posterior colonización cecal heteróloga fue inhibida durante un período de 48 h (Methner et al., 2010). Las implicaciones de este tipo de estudios de colonización-inhibición sobre el estado inmunológico de los pollos afectados todavía no se han elucidado completamente. Cabe señalar que los estudios enumerados en los cuadros 1 y 2 son estudios de laboratorio controlados, con la posibilidad de un componente de exclusión competitiva a la inmunidad no discutido Estudios similares de L. monocytogenes y los efectos de las respuestas inmunes preexistentes indican resultados contradictorios.Un estudio de Bouwer et al. (1999) indica que las respuestas inmunes preexistentes contra el vector Listeria no disminuyen las respuestas inmunes contra el antígeno heterólogo liberado, y un estudio similar de Starks et al. (2004) también concluyó que la exposición previa de ratones al vector Listeria vacío no influyó en las respuestas inmunes anticancerosas cuando se utilizó un mutante similar como portador de un antígeno de cáncer de melanoma. (2005) en el que se utilizó L. monocytogens para administrar la proteína gag del virus de la inmunodeficiencia felina (FIV) y como portadora de vacunas de ADN para vacunar a los gatos contra la proteína de envoltorio FIV indicó respuestas inmunes más bajas contra el antígeno liberado en gatos expuestos al vector de Listeria vacío en comparación con animales ingenuos (Stevens et al., 2005). Tvinnereim et al. (2002) y Leong et al. (2009) han reportado hallazgos similares. Sin embargo, tomados en conjunto, estos estudios concluyen que la exposición previa de los animales de acogida al vector vacío no abroga las respuestas inmunes al antígeno vectorizado, sino que sólo las reduce un poco. Sólo el estudio de Vijh et al. (1999) indicó que la exposición al vector vacío puede abrogar completamente las respuestas inmunes contra los antígenos suministrados (Vijh et al. Leong et al. (2009) también demostraron que el impacto negativo de las respuestas inmunitarias específicas de los vectores también puede contrarrestarse mediante la inmunización repetida con la misma vacuna y dosis; esto en efecto conduce a una mayor primovacunación de células T ingenuas contra el antígeno liberado. Por supuesto, esta vacunación repetida puede no ser factible en situaciones del mundo real. A pesar de las muchas ventajas que la vectorización viral puede ofrecer, la inmunidad preexistente es un obstáculo importante de muchas vacunas virales con vectores, como el Ad serotipo 5 o el virus herpes simple tipo 1 (HSV-1), donde la tasa de seroprevalencia a estos virus es muy alta [40-45 % y 70% (o más) de la población estadounidense, respectivamente] (Hocknell et al., 2002; Pichla-Gollon et al., 2009). Los anticuerpos vectoriales pueden impedir la inducción de respuestas inmunitarias a los antígenos codificados por la vacuna, ya que pueden reducir la dosis y el tiempo de exposición de las células diana a los antígenos vacunados (Pichla-Gollon et al., 2009; Pine et al., 2011). En un ensayo clínico a gran escala (STEP) de una vacuna contra el VIH-1 basada en Ad serotipo 5 (AdHu5), las vacunas mostraron una falta de eficacia y tendieron a aumentar el riesgo de infección por el VIH-1 en los receptores de vacunas que tenían anticuerpos neutralizantes preexistentes contra AdHu5 (Buchbinder et al., 2008). Para una vacuna vectorial basada en el HSV-1, se ha demostrado que la inmunidad anti-HSV-1 preexistente disminuyó, pero no suprimió, las respuestas inmunes humorales y celulares contra el antígeno codificado por la vacuna ( Sin embargo, Brockman y Knipe encontraron que la inducción de respuestas duraderas de anticuerpos y respuestas celulares proliferativas al antígeno HSVencoded no se vieron afectadas por la inmunidad previa del VHS (Brockman & Knipe, 2002). Del mismo modo, la inmunidad preexistente al poliovirus tiene poco efecto sobre la eficacia de la vacuna contra el poliovirus (Mandl et al., 2001). Diferentes efectos de la inmunidad preexistente sobre la eficacia de los vectores de vacunas virales recombinantes se resumen en la Tabla 2. Existen varios enfoques para evitar la inmunidad vectorial preexistente, como el uso de vectores derivados de fuentes no humanas, utilizando virus humanos de serotipos raros (Kahl et al., 2010; Lasaro & Ertl, 2009), enfoques heterólogos de primer impulso (Liu et al., 2008), reinmunización homóloga (Steffensen et al., 2012) y la eliminación de epítopos neutralizantes clave en la superficie de las proteínas capsídicas virales (Gabitzsch & Jones, 2011; Roberts et al., 2006). El efecto inhibidor de la inmunidad preexistente también puede evitarse enmascarando el vector Ad dentro de las células dendríticas (DCs) (Steffensen et al., 2012). Además, la vacunación de mucosas o la administración de dosis más altas de vacunas pueden superar problemas de inmunidad preexistentes (Alexander et al., 2012; Belyakov et al., 1999; Priddy et al., 2008; Xiang et al., 2003). Mientras buscamos nuevos enfoques de vacunas para la variedad de patógenos para los que todavía no se dispone, la revisión de vacunas probadas y el desarrollo de estas más ha ganado impulso M. Saxena y otros. Por lo tanto, bacterias y virus atenuados que tienen un largo historial de eficacia y seguridad están siendo puestos en uso. Aunque muy atractivo, un tema común en estos enfoques experimentales ha sido las limitaciones que la inmunidad preexistente al vector puede plantear. Sin embargo, como muestra este examen de la literatura pertinente, hay un cuadro bastante confuso, con algunos estudios que indican que la inmunidad preexistente puede ser un amigo, en lugar de enemigo. Pocos estudios con vectores virales han informado sobre la influencia de la inmunidad preexistente en las respuestas humorales. En términos generales, para los antígenos bacterianos, las respuestas humorales fueron influenciadas por la inmunidad preexistente, con un poco más de estudios encontrando aumento en lugar de disminución. ¿Por qué hay variación? Esto puede deberse a varios factores, incluyendo el tipo de Salmonella utilizado y su invasividad. Dunstan y sus colegas probaron la capacidad de seis cepas isogénicas Salmonella serovar Typhimurium que albergan diferentes mutaciones por su capacidad de inducir respuestas inmunes contra el fragmento C de la toxina tetánica y concluyeron que la cepa que tuvo la menor capacidad de colonizar los parches de Peyer indujo las respuestas inmunes más bajas (Dunstan et al., 1998). De manera similar, el tiempo y la naturaleza de impulso del antígeno utilizado podrían ser importantes. Atridge y sus colegas indicaron la En un experimento, el impulso de ratones a las 10 semanas llevó a la inhibición completa de las respuestas de anticuerpos contra el antígeno heterólogo dado; sin embargo, cuando los ratones fueron aumentados a las 4 semanas, la regulación de las respuestas de anticuerpos no fue tan prominente (Attridge et al., 1997). Un estudio similar realizado por Kohlers y colegas muestra que el impulso a las 7 semanas después de la exposición previa a los animales al vector vacío conduce a respuestas IgG y IgA secretas más bajas específicas de antígenos; sin embargo, el aumento a las 14 semanas conduce a respuestas IgG y IgA secretas más altas (Kohler et al., 2000b). Esto está en conflicto con el resultado anterior, aunque hay que mencionar que utilizaron diferentes especies de Salmonella. Vindurampulle y Attridge también examinaron el impacto de la cepa Salmonella y la naturaleza de los antígeno En su estudio, utilizaron mutantes S. Dublin y Salmonella Stanley aroA para administrar antígenos E. coli K88 y LT-B, y concluyeron que el efecto de la inmunidad preexistente depende tanto de la cepa utilizada como del tipo de antígeno suministrado (Vindurampulle & Attridge, 2003b). Todos estos estudios sobre el efecto de la inmunidad preexistente discuten el impacto en las respuestas humorales. Sevil Domenech y colegas informaron que la exposición de animales al vector de Salmonella homólogo conduce a una reducción significativa en las respuestas CD8 +; sin embargo, la exposición de animales a una cepa heteróloga conduce a respuestas CD8 + significativamente mayores (Sevil Domènech et al., 2007, 2008. Saxena y sus colegas también reportaron que las respuestas de células T específicas de antígenos fueron similares o significativamente más altas, sin una regulación descendente en las respuestas de células T observadas después de la preexposición de ratones a cepas homólogas o heterólogas (Saxena et al., 2009). Para los vectores virales, el impacto de la inmunidad mediada por células fue más pronunciado, y como se muestra en la Tabla 2, casi siempre resultó en una reducción de la respuesta inmune posterior. Presumiblemente esto se debe a que los virus inducirán anticuerpos neutralizantes en la primera dosis, y en dosis posteriores este anticuerpo limitará el número de células transducidas, limitando así las respuestas. Esto es particularmente un problema con un vector viral común como Ad, donde una gran proporción de la población tendrá memoria inmunológica contra los serotipos comunes (Lasaro & Ertl, 2009) Como concluyen estos autores, será posible utilizar estos vectores sólo mediante el desarrollo de vacunas a partir de serotipos alternativos. Puede ser que un vector como la inmunidad preexistente contra los vectores de la vacuna virus de la gripe atenuada, con la capacidad de desarrollar fácilmente reasociantes, será útil en este contexto. Además, la memoria inmunológica en forma de anticuerpos opsonizantes sin duda juega un papel importante en la absorción temprana de Salmonella por macrófagos y DC. Esto puede ser beneficioso, ya que el vector bacteriano vivo utilizado para los propósitos del parto alberga mutaciones en proteínas codificantes de genes responsables de su supervivencia en el huésped animal. Esto no sólo afecta su capacidad de causar enfermedades, haciéndolos vectores vivos seguros, sino que también limita el número de replicaciones. La presencia de anticuerpos opsonizantes debe significar un mayor nivel de absorción bacteriana, lo que conduce a una mayor presentación al sistema inmunológico y, por lo tanto, una Anteriormente hemos demostrado que este es el caso (Saxena et al., 2009 ) (indicado en la figura 2). Sería de gran beneficio abordar estos problemas no sólo en ratones, sino también en otros organismos como los pollos, que son el huésped más probable para el uso de vectores vivos de Salmonella, específicamente donde las vacunas se desarrollan para su uso en ganado y aves de corral. Para resumir, vectores bacterianos como Salmonella y vectores virales como Ad muestran una gran promesa como vehículos de entrega de antígenos heterólogos; sin embargo, debe considerarse la exposición previa al vector. Mediante una selección juiciosa de la cepa/serotipo será posible evitar los efectos negativos y puede ser posible influir positivamente en la respuesta, especialmente para la inmunidad humoral.

¿Cuál es el efecto de la respuesta inmune del huésped al vector del parto sobre la eficacia de la vacunación?

Inmunidad preexistente contra vectores de vacunas – ¿amigo o enemigo? https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3542731/SHA: f5bdf18567bb3760e1ce0550808135f0270badbd5cAutores: Saxena, Manvendra; Van, Thi Thu Hao; Baird, Fiona J.; Coloe, Peter J.; Smooker, Peter M.Fecha: 2013-01-27DOI: 10.1099/mic.0.049601-0Licencia: cc-byAbstract: En el último siglo, la atenuación exitosa de múltiples patógenos bacteriales y virales ha llevado a una forma efectiva, robusta y segura de vacunación. Recientemente, estas vacunas han sido evaluadas como vectores de parto de antígenos heterólogos, como un medio de vacunación simultánea contra dos patógenos. El consenso general de los estudios publicados es que estos vectores de vacunas tienen el potencial de ser seguros y eficaces. Sin embargo, algunos de los vectores comúnmente empleados, por ejemplo Salmonella y adenovirus, a menudo tienen respuestas inmunes preexistentes en el huésped y esto tiene el potencial de modificar la respuesta inmune posterior a un antígeno vectorizado. Esta revisión examina la literatura sobre este tema, y concluye que para vectores bacterianos puede de hecho, en algunos casos, ser un aumento en la inmunogenicidad, típicamente humoral, mientras que para vectores virales la inmunidad preexistente es un obstáculo para la inducción posterior de respuestas celulares. Texto: En los campos de la medicina y la medicina veterinaria, hay numerosas vacunas bacterianas y virales vivas, atenuadas en uso hoy en todo el mundo. La seguridad y eficacia de estas vacunas está bien establecida y permite un mayor desarrollo como sistemas vectores para liberar antígenos procedentes de otros patógenos. Varias bacterias atenuadas, incluyendo Escherichia coli, Vibrio cholerae, bacterias de ácido láctico (LAB), específicamente Lactococcus lactis, Mycobacterium, Listeria, Shigella y Salmonella, han sido probadas para la entrega dirigida de antígenos heterólogos de origen bacteriano, viral y parasitario en una variedad de huéspedes animales (Bahey-El-Din et al., 2010; Innocentin et al., 2009; Johnson et al., 2011; Tobias et al., 2008 Tobias et al.,, 2010 Tobias & Svennerholm, 2012). Las bacterias como E. coli y las bacterias del ácido láctico han ganado recientemente el favor, ya que E. coli son una bacteria del ácido comensal y láctico están presentes en la mayoría de los alimentos fermentados y por lo tanto están naturalmente presentes en el huésped. También son una opción mucho más segura que las vacunas atenuadas tradicionales en los niños y las personas inmunocomprometidas. Como esta revisión discute los efectos de las respuestas inmunes preexistentes a las vacunas atenuadas, discusión adicional de LAB y E. coli como vectores potenciales no se realizará; sin embargo, el lector se dirige a varias revisiones interesantes (Bermú dez-Humarán et al., 2011; Wells & Mercenier, 2008). Las bacterias intracelulares de los géneros Mycobacterium (Guleria et al., 1996), Listeria (Gentschev et al., 2001), Shigella (Levine et al., 1997) y Salmonella (Dougan et al., 1987) se consideran candidatas adecuadas para el suministro de antígenos vacunales debido a su capacidad para inducir respuestas inmunitarias robustas de células T (Alderton et al., 1991; Lo et al., 1999; Mastroeni et al., 2001; Mittrücker & Kaufmann, 2000; Nauciel, 1990). La Salmonella es un género que ha sido bien examinado como vector, basándose en la extensa investigación disponible sobre la fisiología y patogénesis del microorganismo (Basso et al., 2000; Killeen & DiRita, 2000; Sirard et al., 1999; Ward et al., 1999). Existen varias vacunas comerciales que se utilizan como vacunas contra la Salmonella en humanos y animales (por ejemplo, Ty21a para la fiebre tifoidea en humanos, varios serovares de Salmonella contra la salmonelosis en pollos y otros animales). La estrategia general para la vectorización del antígeno heterológico se describe en la Fig. 1. El primer ensayo clínico de un recombinante, que se realizó hace más de 20 años utilizando una Salmonella atenuada como vector de entrega, llevó a la realización de pruebas generalizadas de esta bacteria como sistema de administración de mucosas para antígenos de patógenos no Salmonella (Dougan et al., 1987). Estos estudios han demostrado la utilidad de las bacterias vivas para suministrar antígenos y vacunas de ADN expresados al sistema inmunitario del huésped (Atkins et al., 2006; Husseiny & Hensel, 2008; Jiang et al., 2004; Kirby et al., 2004). Desde entonces, varios otros vectores bacterianos intracelulares han sido probados con éxito para su capacidad de entregar una variedad de antígenos de diversos patógenos, así como la vacunación contra el cáncer. Un género que ha sido ampliamente probado como vector es Listeria. Las ventajas de Listeria son que puede invadir una variedad de células, incluyendo las células que presentan antígenos (APCs). Después de invadir la célula huésped, Listeria reside dentro del fagosoma; sin embargo, puede escapar del fagosoma con la ayuda de listeriolisina O (LLO; Hly) y residir en el citoplasma de las células, presentando así eficientemente antígeno a las células CD8 y CD4 T (Cossart & Mengaud, 1989; Kaufmann, 1993; Pamer et al., 1997). Varios estudios han demostrado la eficacia y facilidad de usar Listeria monocytogenes para administrar antígenos de vacuna heterólogos y vacunas de ADN Jensen et al., 1997; Johnson et al., 2011; Peters et al., 2003; Shen et al., 1995; Yin et al., 2011). Del mismo modo, varios vectores virales han sido probados con éxito por su capacidad para entregar antígenos de vacunas heterólogas, y esto generalmente resulta en la inducción de fuertes respuestas inmunitarias CTL. En el campo veterinario, hay numerosas vacunas de vectores virales que actualmente están autorizadas para su uso en animales de ganado y animales domesticados. Estas vacunas recombinantes se basan tanto en virus ADN (como las vacunas basadas en el virus de la viruela de aves de corral y el virus de la viruela de aves de corral, o vectores basados en el virus de la vacuna contra el virus de la rabia en la fauna silvestre) y virus ARN [como las vacunas basadas en el virus de la enfermedad de Newcastle para ser utilizadas en las aves de corral o en vacunas basadas en el virus de la fiebre amarilla (YFV) para ser utilizadas en caballos contra el virus del Nilo Occidental] (Draper & Heeney Sobre la base del registro de seguridad en el campo veterinario, muchos virus han sido estudiados para uso humano como vector en el desarrollo de vacunas (Beukema et al., 2006; Esteban, 2009; Schirrmacher & Fournier, 2009; Stoyanov et al., 2010; Weli & Tryland, 2011). Entre ellos, YFV (deformación YF-17D) fue el primero en ser autorizado para su uso en humanos, donde los cDNAs codificando las proteínas de envoltorio de YFV fueron reemplazados con los genes correspondientes de una cepa atenuada del virus de la encefalitis japonesa, SA14-14-2 (Appaiahgari & Vrati, 2010; Rollier et al., 2011). Los poxvirus también se estudian ampliamente como vectores candidatos para el uso humano, entre los cuales los derivados atenuados del virus de la vaccinia [como el virus de la vaccinia modificada Ankara (MVA) y las cepas NYVAC del virus de la vaccinia atenuada de Nueva York] son los vectores más prometedores (Esteban, 2009; Gó mez et al., 2008; Rimmelzwaan & Sutter, 2009 ). Son vectores candidatos ideales debido a su gran capacidad de envasado de ADN y su estabilidad térmica y genética (Minke et al., 2004). Se ha demostrado que el vector NYVAC induce respuestas CD4 + T dominantes, y el MVA induce respuestas de células CD4 + y CD8 + T (Mooij et al., 2008). El vector de adenovirus (Ad) es otro de los vectores más ampliamente evaluados hasta la fecha para expresar antígenos heterólogos, debido a la facilidad de producción, perfil de seguridad, estabilidad genética, la facilidad de manipulación del genoma del ADN, y la capacidad de estimular tanto respuestas inmunes innatas y adaptativas e inducir respuestas de células T y B (Alexander et al., 2012; Fitzgerald et al., 2003; Gabitzsch & Jones, 2011; Lasaro & Ertl, 2009; Vemula & Mittal, 2010; Weyer et al., 2009). En varios estudios preclínicos y clínicos sobre enfermedades infecciosas como el ántrax, la hepatitis B, el virus de inmunodeficiencia humana (VIH)-1, la gripe, el sarampión, el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), la malaria y la tuberculosis M. Saxena y otros (Chengalvala et al., 1994; Gao et al., 2006; Hashimoto et al., 2005; Hsu et al., 1992; Limbach & Richie, 2009; Radosevic et al., 2007; Shiver et al., 2002). Sin embargo, antes de que las vacunas vectorizadas puedan utilizarse en la población humana necesitan satisfacer varios criterios importantes. La seguridad es una preocupación importante, ya que incluso un nivel bajo de toxicidad es inaceptable (por supuesto, la molestia menor que acompaña a muchas vacunas es normal). En segundo lugar, una vacuna debe ser barata, para que pueda administrarse a una gran población a un costo mínimo, y esto es particularmente importante en los países pobres en recursos (Killeen & DiRita, 2000). Restricciones similares se aplican a las vacunas veterinarias, con un costo a menudo aún más importante. Por último, las respuestas inmunes celulares de larga duración y (cuando proceda) humorales al antígeno vectorizado deben ser inducidas después de la administración de estas vacunas, preferiblemente con una sola dosis (Atkins et al., 2006). Como algunos de los vectores en uso habrán sido vistos por el sistema inmune del huésped antes de la vacunación, si la presencia de respuestas inmunes preexistentes es perjudicial para el desarrollo ulterior de un esquema de vacunación basado en vectores, o puede aumentar las respuestas al antígeno vectorizado, debe considerarse en detalle. Este es el tema de esta revisión. Al discutir los posibles efectos sobre la inmunidad preexistente, la inmunidad natural al vector Por lo tanto, teniendo en cuenta un vector como Salmonella, si un huésped ha sido infectado previamente existirán respuestas robustas de memoria B y T, y como tal, cuando se administre una vacunación, se inducirá una respuesta anamnésica a los antígenos Salmonella (mientras que la respuesta al antígeno vectorizado será una respuesta primaria), lo que teóricamente reducirá la exposición del antígeno heterólogo al sistema inmunitario, ya que el vector se elimina rápidamente. Sorprendentemente, como se verá en algunos de los ejemplos que se dan a continuación, esto puede tener resultados que difieren en función de la magnitud de la respuesta al antígeno vectorizado. Del mismo modo, para los antígenos viralmente vectorizados, la existencia de inmunidad preexistente al vector (particularmente el anticuerpo neutralizante) restringirá la entrega del virus a las células, reduciendo así efectivamente la dosis del antígeno vectorizado. En el caso de los vectores bacterianos, el efecto de las respuestas inmunológicas preexistentes sólo se ha probado utilizando Salmonella serovars y Listeria spp. Preocupación de que la experiencia inmunológica previa del huésped con la cepa vectorial de Salmonella homóloga o una cepa relacionada podría comprometer su capacidad de entregar antígenos de vacuna heteróloga se planteó por primera vez en 1987 (Dougan et al., 1987). Bao y Clements notificaron posteriormente evidencia experimental de las consecuencias de la exposición previa de animales a la cepa vectorial (Bao & Clements, 1991). Este trabajo mostró que tanto las respuestas séricas como de anticuerpos mucosas contra el antígeno extranjero estaban de hecho reguladas en animales con exposición previa a la cepa vectorial. Whittle & Verma (1997) notificaron hallazgos similares. Los ratones inmunizados a través de la vía intraperitoneal con mutante Salmonella dublin aroA que expresa el antígeno heterólogo después de haber sido expuestos al mismo vector mostraron una mayor respuesta inmune al antígeno vectorizado en comparación con ratones sin memoria inmunológica contra el vector. Posteriormente, se han realizado varios estudios para examinar el efecto de la inmunidad preexistente en el huésped contra Salmonella. Estos resultados se resumen en la Tabla 1. Los diversos informes son contradictorios en sus hallazgos y parecen pintar un cuadro bastante confuso. Algunos estudios concluyeron que la inmunidad preexistente contra el vector Salmonella conduce a respuestas inmunes más fuertes contra el antígeno liberado (Bao & Clements, 1991; Jespersgaard et al., 2001; Kohler et al., 2000a, b; Metzger et al., 2004; Saxena et al., 2009; Sevil Domènech et al., 2008; Whittle & Verma, 1997), con otros considerando que la inmunidad preexistente es un factor limitante en el uso a largo plazo de Salmonella como vector eficiente para la entrega de antígenos (Attridge et al., 1997; Gahan et al., 2008; Roberts et al., 1999; Sevil Domènech et al., 2007; Vindurampulle & Attridge, 2003a, b). Una ligera mayoría de los estudios enumerados en la Tabla 1 (10 versus ocho) indican la regulación ascendente de las respuestas inmunitarias después de que los animales hayan estado expuestos a cepas homólogas o relacionadas antes de la entrega del antígeno heterólogo utilizando un vector Salmonella. Un estudio realizado por Metzger y colaboradores en voluntarios humanos utilizando Salmonella Typhi como vector sugiere que no hubo cambios en la respuesta inmune de las células T contra el antígeno heterólogo en voluntarios humanos que estuvieron expuestos a vectores vacíos en comparación con voluntarios inmunológicamente ingenuos de la cepa vectorial (Metzger et al., 2004). En estos sujetos, las respuestas humorales fueron moderadamente elevadas en individuos preexpuestos. Del mismo modo, Saxena et al. (2009) indicaron una mayor respuesta humoral y celular T en ratones preexpuestos a cepas de Salmonella homólogas o heterólogas. La respuesta a la interleucina 4 (IL4) fue significativamente mayor cuando el huésped animal fue expuesto a la cepa homóloga, mientras que la preexposición a una especie relacionada no tuvo tal impacto en las respuestas a la IL4. Por el contrario, las respuestas al interferón (IFN)-c fueron más altas, independientemente de la cepa a la que los ratones estaban preexpuestos. Este estudio también indicó que la presencia de anticuerpos opsonizantes homólogos o heterologosos conduce a una mayor absorción de Salmonella por macrófagos in vitro, lo que puede explicar las respuestas inmunes más altas en ratones expuestos. Como es de esperarse, la absorción fue mayor cuando se utilizó la sura homóloga como la opsonina en lugar de la sura heterologosa. Esto se muestra en la figura 2. Por el contrario, hay informes que indican que la inmunidad preexistente contra el vector bacterial de Atridge y compañeros de trabajo reportaron que la presencia de inmunidad contra el vector bacteriano antes de la entrega de microbiología antigénica vectorizada 159 proteína puede reducir las respuestas inmunes en ratones contra el antígeno liberado (Attridge et al., 1997). Resultados similares fueron reportados por Roberts et al. (1999) y Vindurampulle & Attridge (2003a, b). Sin embargo, estos últimos autores encontraron que la hipo-respuesta podría ser eliminada en gran medida exponiendo a los animales al antígeno extranjero antes del vectorpriming (Vindurampulle & Attridge, 2003b). Desafortunadamente, esto parecería ser poco práctico para un régimen de inmunización! Un estudio presentado por Gahan et al. (2008) ratones inmunizados con S. Typhimurium expresando C fragmento de antígeno de toxina tetánica de una expresión plasmido o como vacuna del ADN. Los ratones vacunados desarrollaron respuestas humorales a LPS y tetC (para las vacunas portadoras de plásmidos). Los animales de todos los grupos (incluyendo un grupo previamente no vacunado) fueron vacunados el día 182 con Salmonella expresando tetC. En este momento, los títulos anti-LPS y tetC comenzaron a disminuir. Catorce días después de la segunda inmunización, se evaluó la colonización de varios órganos de ratón. Se encontró que la capacidad de colonizar se redujo significativamente en grupos que habían sido vacunados previamente con Salmonella. En vista de este hallazgo, tal vez no fue sorprendente que en el día 210 los títulos de LPS no fueran significativamente diferentes entre los grupos que recibieron una o dos vacunas. Lo más interesante es que ratones que habían sido preparados con Salmonella sola, y luego impulsados con Salmonella expresando tetC, indujeron respuestas anti-tetC mucho más bajas Esto argumenta fuertemente que la inmunidad inmunológica previa al vector puede amortiguar seriamente las respuestas humorales posteriores específicas del antígeno.No se evaluó si lo mismo es cierto para las respuestas celulares.Otros estudios han evaluado las respuestas celulares.Un estudio de Sevil Domènech y colegas reportó que la inmunidad antivectora preexistente compromete seriamente las respuestas CD8 + en ratones cuando se exponen a una cepa similar utilizada como vector (Sevil Domènech et al., 2007).En contraste, otro estudio de los mismos autores reportó que los animales expuestos a vectores relacionados inducen respuestas CD8 + mucho más altas cuando se comparan con animales que no tienen ninguna inmunidad de Salmonella preexistente (Sevil Domènech et al., 2008).La diferencia entre estos dos estudios fue que en el primero, la prima y el impulso fueron con serovares idénticos, mientras que en el segundo estudio se utilizaron diferentes serovares. Esto puede apuntar a una manera de evitar la regulación de las respuestas CD8 por la inmunidad preexistente. Esto es importante, ya que una de las ventajas del uso de Salmonella (un patógeno intracelular) es que se pueden inducir fuertes respuestas inmunes celulares. Cabe señalar que en el caso de las vacunas Salmonella, se deben considerar efectos distintos de las respuestas estrictamente inmunológicas (especialmente respuestas adaptativas). En el contexto de la inmunidad innata, se demostró que la administración de Salmonella no virulenta a los cerdos gnobióticos eliminó la enfermedad después de un desafío con una cepa virulenta (Foster et al., 2003). Curiosamente, la protección no fue por exclusión competitiva, ya que la cepa virulenta fue en gran número en el intestino pero no se distribuyó sistémicamente. La protección fue propuesta para ser mediada por la infiltración de un gran número de leucocitos polimorfonucleares en el intestino, y aunque tal vez poco práctico como profiláctico general (como el tiempo entre la vacunación y la infección es corto), esto puede ser una opción para la vacunación a corto plazo o tal vez terapéutica (como revisado por Foster et al., 2012). Pollos (Gallus gallus) son un reservorio natural de animales para Salmonella, lo que los convierte en una fuente importante de gastroenteritis asociada a Salmonella en los seres humanos. La capacidad de utilizar vacunas orales de Salmonella para inmunizar contra patógenos heterólogos sería de enorme beneficio para la toma de STM-1 por J774 macrófagos, en relación con el porcentaje de absorción más alto. X, opsonizada con suero ingenuo; m, opsonizada con suero de ratones expuestos a la enteriditis de Salmonella; &, opsonizada con suero de ratones expuestos a STM-1. Inmunidad preexistente contra vectores de vacunas en la industria avícola tanto en manadas de pollos de engorde como en bandadas de capas. Tanto la transmisión vertical como horizontal está asociada con Salmonella en pollos (Liljebjelke et al., 2005). La transmisión vertical a través de la transmisión en ovo es particularmente importante, ya que si hay exposición previa a la cepa de la vacuna, la vacunación posterior mediante un vector de Salmonella oral podría verse gravemente comprometida. Un número considerable de estudios sobre inmunidad cruzada y exclusión competitiva se han realizado en pollos. Además, un estudio reciente informó que el tratamiento previo de pollos recién nacidos con diferentes cepas de Salmonella podría producir un efecto inhibitorio de invasión completa en cualquier posterior exposición a cepas homólogas y heterólogas (Methner et al., 2010). La preexposición con una forma altamente invasiva de Salmonella Enteritidis causó una gran afluencia de heterófilos a la mucosa cecal en pollitos de 1 día de edad, y la posterior colonización cecal heteróloga fue inhibida durante un período de 48 h (Methner et al., 2010). Las implicaciones de este tipo de estudios de colonización-inhibición sobre el estado inmunológico de los pollos afectados todavía no se han elucidado completamente. Cabe señalar que los estudios enumerados en los cuadros 1 y 2 son estudios de laboratorio controlados, con la posibilidad de un componente de exclusión competitiva a la inmunidad no discutido Estudios similares de L. monocytogenes y los efectos de las respuestas inmunes preexistentes indican resultados contradictorios.Un estudio de Bouwer et al. (1999) indica que las respuestas inmunes preexistentes contra el vector Listeria no disminuyen las respuestas inmunes contra el antígeno heterólogo liberado, y un estudio similar de Starks et al. (2004) también concluyó que la exposición previa de ratones al vector Listeria vacío no influyó en las respuestas inmunes anticancerosas cuando se utilizó un mutante similar como portador de un antígeno de cáncer de melanoma. (2005) en el que se utilizó L. monocytogens para administrar la proteína gag del virus de la inmunodeficiencia felina (FIV) y como portadora de vacunas de ADN para vacunar a los gatos contra la proteína de envoltorio FIV indicó respuestas inmunes más bajas contra el antígeno liberado en gatos expuestos al vector de Listeria vacío en comparación con animales ingenuos (Stevens et al., 2005). Tvinnereim et al. (2002) y Leong et al. (2009) han reportado hallazgos similares. Sin embargo, tomados en conjunto, estos estudios concluyen que la exposición previa de los animales de acogida al vector vacío no abroga las respuestas inmunes al antígeno vectorizado, sino que sólo las reduce un poco. Sólo el estudio de Vijh et al. (1999) indicó que la exposición al vector vacío puede abrogar completamente las respuestas inmunes contra los antígenos suministrados (Vijh et al. Leong et al. (2009) también demostraron que el impacto negativo de las respuestas inmunitarias específicas de los vectores también puede contrarrestarse mediante la inmunización repetida con la misma vacuna y dosis; esto en efecto conduce a una mayor primovacunación de células T ingenuas contra el antígeno liberado. Por supuesto, esta vacunación repetida puede no ser factible en situaciones del mundo real. A pesar de las muchas ventajas que la vectorización viral puede ofrecer, la inmunidad preexistente es un obstáculo importante de muchas vacunas virales con vectores, como el Ad serotipo 5 o el virus herpes simple tipo 1 (HSV-1), donde la tasa de seroprevalencia a estos virus es muy alta [40-45 % y 70% (o más) de la población estadounidense, respectivamente] (Hocknell et al., 2002; Pichla-Gollon et al., 2009). Los anticuerpos vectoriales pueden impedir la inducción de respuestas inmunitarias a los antígenos codificados por la vacuna, ya que pueden reducir la dosis y el tiempo de exposición de las células diana a los antígenos vacunados (Pichla-Gollon et al., 2009; Pine et al., 2011). En un ensayo clínico a gran escala (STEP) de una vacuna contra el VIH-1 basada en Ad serotipo 5 (AdHu5), las vacunas mostraron una falta de eficacia y tendieron a aumentar el riesgo de infección por el VIH-1 en los receptores de vacunas que tenían anticuerpos neutralizantes preexistentes contra AdHu5 (Buchbinder et al., 2008). Para una vacuna vectorial basada en el HSV-1, se ha demostrado que la inmunidad anti-HSV-1 preexistente disminuyó, pero no suprimió, las respuestas inmunes humorales y celulares contra el antígeno codificado por la vacuna ( Sin embargo, Brockman y Knipe encontraron que la inducción de respuestas duraderas de anticuerpos y respuestas celulares proliferativas al antígeno HSVencoded no se vieron afectadas por la inmunidad previa del VHS (Brockman & Knipe, 2002). Del mismo modo, la inmunidad preexistente al poliovirus tiene poco efecto sobre la eficacia de la vacuna contra el poliovirus (Mandl et al., 2001). Diferentes efectos de la inmunidad preexistente sobre la eficacia de los vectores de vacunas virales recombinantes se resumen en la Tabla 2. Existen varios enfoques para evitar la inmunidad vectorial preexistente, como el uso de vectores derivados de fuentes no humanas, utilizando virus humanos de serotipos raros (Kahl et al., 2010; Lasaro & Ertl, 2009), enfoques heterólogos de primer impulso (Liu et al., 2008), reinmunización homóloga (Steffensen et al., 2012) y la eliminación de epítopos neutralizantes clave en la superficie de las proteínas capsídicas virales (Gabitzsch & Jones, 2011; Roberts et al., 2006). El efecto inhibidor de la inmunidad preexistente también puede evitarse enmascarando el vector Ad dentro de las células dendríticas (DCs) (Steffensen et al., 2012). Además, la vacunación de mucosas o la administración de dosis más altas de vacunas pueden superar problemas de inmunidad preexistentes (Alexander et al., 2012; Belyakov et al., 1999; Priddy et al., 2008; Xiang et al., 2003). Mientras buscamos nuevos enfoques de vacunas para la variedad de patógenos para los que todavía no se dispone, la revisión de vacunas probadas y el desarrollo de estas más ha ganado impulso M. Saxena y otros. Por lo tanto, bacterias y virus atenuados que tienen un largo historial de eficacia y seguridad están siendo puestos en uso. Aunque muy atractivo, un tema común en estos enfoques experimentales ha sido las limitaciones que la inmunidad preexistente al vector puede plantear. Sin embargo, como muestra este examen de la literatura pertinente, hay un cuadro bastante confuso, con algunos estudios que indican que la inmunidad preexistente puede ser un amigo, en lugar de enemigo. Pocos estudios con vectores virales han informado sobre la influencia de la inmunidad preexistente en las respuestas humorales. En términos generales, para los antígenos bacterianos, las respuestas humorales fueron influenciadas por la inmunidad preexistente, con un poco más de estudios encontrando aumento en lugar de disminución. ¿Por qué hay variación? Esto puede deberse a varios factores, incluyendo el tipo de Salmonella utilizado y su invasividad. Dunstan y sus colegas probaron la capacidad de seis cepas isogénicas Salmonella serovar Typhimurium que albergan diferentes mutaciones por su capacidad de inducir respuestas inmunes contra el fragmento C de la toxina tetánica y concluyeron que la cepa que tuvo la menor capacidad de colonizar los parches de Peyer indujo las respuestas inmunes más bajas (Dunstan et al., 1998). De manera similar, el tiempo y la naturaleza de impulso del antígeno utilizado podrían ser importantes. Atridge y sus colegas indicaron la En un experimento, el impulso de ratones a las 10 semanas llevó a la inhibición completa de las respuestas de anticuerpos contra el antígeno heterólogo dado; sin embargo, cuando los ratones fueron aumentados a las 4 semanas, la regulación de las respuestas de anticuerpos no fue tan prominente (Attridge et al., 1997). Un estudio similar realizado por Kohlers y colegas muestra que el impulso a las 7 semanas después de la exposición previa a los animales al vector vacío conduce a respuestas IgG y IgA secretas más bajas específicas de antígenos; sin embargo, el aumento a las 14 semanas conduce a respuestas IgG y IgA secretas más altas (Kohler et al., 2000b). Esto está en conflicto con el resultado anterior, aunque hay que mencionar que utilizaron diferentes especies de Salmonella. Vindurampulle y Attridge también examinaron el impacto de la cepa Salmonella y la naturaleza de los antígeno En su estudio, utilizaron mutantes S. Dublin y Salmonella Stanley aroA para administrar antígenos E. coli K88 y LT-B, y concluyeron que el efecto de la inmunidad preexistente depende tanto de la cepa utilizada como del tipo de antígeno suministrado (Vindurampulle & Attridge, 2003b). Todos estos estudios sobre el efecto de la inmunidad preexistente discuten el impacto en las respuestas humorales. Sevil Domenech y colegas informaron que la exposición de animales al vector de Salmonella homólogo conduce a una reducción significativa en las respuestas CD8 +; sin embargo, la exposición de animales a una cepa heteróloga conduce a respuestas CD8 + significativamente mayores (Sevil Domènech et al., 2007, 2008. Saxena y sus colegas también reportaron que las respuestas de células T específicas de antígenos fueron similares o significativamente más altas, sin una regulación descendente en las respuestas de células T observadas después de la preexposición de ratones a cepas homólogas o heterólogas (Saxena et al., 2009). Para los vectores virales, el impacto de la inmunidad mediada por células fue más pronunciado, y como se muestra en la Tabla 2, casi siempre resultó en una reducción de la respuesta inmune posterior. Presumiblemente esto se debe a que los virus inducirán anticuerpos neutralizantes en la primera dosis, y en dosis posteriores este anticuerpo limitará el número de células transducidas, limitando así las respuestas. Esto es particularmente un problema con un vector viral común como Ad, donde una gran proporción de la población tendrá memoria inmunológica contra los serotipos comunes (Lasaro & Ertl, 2009) Como concluyen estos autores, será posible utilizar estos vectores sólo mediante el desarrollo de vacunas a partir de serotipos alternativos. Puede ser que un vector como la inmunidad preexistente contra los vectores de la vacuna virus de la gripe atenuada, con la capacidad de desarrollar fácilmente reasociantes, será útil en este contexto. Además, la memoria inmunológica en forma de anticuerpos opsonizantes sin duda juega un papel importante en la absorción temprana de Salmonella por macrófagos y DC. Esto puede ser beneficioso, ya que el vector bacteriano vivo utilizado para los propósitos del parto alberga mutaciones en proteínas codificantes de genes responsables de su supervivencia en el huésped animal. Esto no sólo afecta su capacidad de causar enfermedades, haciéndolos vectores vivos seguros, sino que también limita el número de replicaciones. La presencia de anticuerpos opsonizantes debe significar un mayor nivel de absorción bacteriana, lo que conduce a una mayor presentación al sistema inmunológico y, por lo tanto, una Anteriormente hemos demostrado que este es el caso (Saxena et al., 2009 ) (indicado en la figura 2). Sería de gran beneficio abordar estos problemas no sólo en ratones, sino también en otros organismos como los pollos, que son el huésped más probable para el uso de vectores vivos de Salmonella, específicamente donde las vacunas se desarrollan para su uso en ganado y aves de corral. Para resumir, vectores bacterianos como Salmonella y vectores virales como Ad muestran una gran promesa como vehículos de entrega de antígenos heterólogos; sin embargo, debe considerarse la exposición previa al vector. Mediante una selección juiciosa de la cepa/serotipo será posible evitar los efectos negativos y puede ser posible influir positivamente en la respuesta, especialmente para la inmunidad humoral.

¿Cuáles son los métodos para evitar el efecto de la respuesta inmune vectorial sobre la eficacia de la vacunación?

Respuestas inmunes mucosas inducidas por la administración oral recombinante Bacillus subtilis que expresa el antígeno COE de PEDV en lechones recién nacidoshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6418403/SHA: 5caced13bcb8a42cca41369c5a71ae7df5381ca8Autores: Wang, Jialu; Huang, Lulu; Mou, Chunxiao; Zhang, En; Wang, Yongheng; Cao, Yanan; Yang, QianFecha: 2019-03-15DOI: 10.1042/bsr20182028Licencia: cc-byAbstract: La diarrea epidémica porcina (PED) es una enfermedad altamente contagiosa en lechones recién nacidos y causa pérdidas económicas sustanciales en el El virus PED (PEDV) se disemina por contacto fecal-oral y puede prevenirse mediante inmunización oral. Por lo tanto, es necesario desarrollar una vacuna oral eficaz contra la infección por PEDV. Actualmente, Bacillus subtilis como portador de la vacuna recombinante se ha utilizado para la administración de antígenos y se ha demostrado que es inmunitaria y segura. El presente estudio evaluó la inmunogenicidad de Bacillus subtilis recombinante (B. subtilis-RC) en lechones por vía oral. Después de la inmunización oral en lechones, B. subtilis-RC aumentó significativamente las respuestas inmunitarias de la mucosa local. La administración oral con B. subtilis-RC mejoró significativamente el nivel de anticuerpos contra la infección por PEDV específicos de la inmunoglobulina A (IgA) mediante la ampliación del área de los parches (PP) de Peyer y Mientras tanto, B. subtilis-RC aumentó notablemente el número de linfocitos intraepiteliales (IEL). También observamos que la administración oral de B. subtilis-RC aumentó significativamente el número de linfocitos CD3(+)T y mejoró la proporción de células T CD4(+)/CD8(+). Además, los títulos altos de inmunoglobulina G (IgG) sérica específica revelaron una respuesta inmunitaria sistémica satisfactoria contra la infección por PEDV. En resumen, nuestro estudio demostró que la administración oral de B. subtilis-RC podría desencadenar un alto nivel de respuestas inmunitarias locales y sistémicas y sería una vacuna candidata prometedora contra la infección por PEDV en lechones. Texto: Diarrea epidémica porcina (PED) caracterizada por diarrea aguda altamente fatal en lechones, resulta en enormes pérdidas en la industria porcina mundial [1] El agente causante del virus PED (PEDV) pertenece a los coronavirus porcinos (CoVs). La infección por PEDV se propaga principalmente a través del tracto digestivo [2], y daña las superficies mucosas del intestino huésped infectando las células epiteliales intestinales [3]. Por lo tanto, la mejora de la inmunidad mucosa intestinal puede provocar respuestas inmunológicas eficaces contra la infección por PEDV [4]. Actualmente, se han desarrollado y aplicado ampliamente en el mercado vacunas tradicionales (vía intramuscular o inyección subcutánea) [5]. Estas vacunas administradas por vía parenteral no pueden inducir eficazmente títulos altos de anticuerpos maternos y anticuerpos IgA específicos del virus, lo que resulta en una protección mucosa inadecuada contra la infección por PEDV [6]. Además, estos anticuerpos maternos en la leche siempre fueron degradados por el ácido gástrico y la pepsina antes de entrar en el tracto intestinal. Las vacunas Como una forma superior de inmunización mucosal, la administración oral puede proteger el intestino y estimular el sistema inmunológico mucosal común [8]. Además, la inmunización oral tiene varias características atractivas que incluyen la seguridad, y un enfoque sencillo, barato y sin agujas [9]. Por lo tanto, la inmunización oral a menudo ofrece grandes cantidades de antígenos para prevenir las enfermedades diarreicas [10]. Sin embargo, hay varios desafíos por la inmunización oral, que consisten en barreras físicas, químicas y biológicas al entregar antígenos al tracto gastrointestinal (como ácidos gástricos, pepsina y tripsina en el tracto GI) [11]. Es un problema sustancial que los ácidos digestivos y las proteasas pueden degradar las proteínas antígenos para la absorción de nutrientes [12]. Por lo tanto, el sistema de administración de vacunas se ha aplicado para resolver el problema. El sistema puede proteger antígenos del entorno severo del tracto GI y entregar antígenos a la mucosa intestinal Actualmente, Bacillus subtilis (B. subtilis) es ampliamente utilizado como un sistema de administración de vacunas por sus características únicas. Como bacteria Gram-positiva no patógena, B. subtilis ha sido considerado como un nuevo probiótico y aditivo alimentario en humanos y animales [14]. El B. subtilis tiene actividad adyuvante y puede entregar antígenos heterólogos al tracto GI, proporcionando estimulación de inmunidad adicional [15]. Además, la investigación había demostrado que B. subtilis administrado por vía oral también podría mejorar la regulación inmunitaria y la salud intestinal en cerdos [16]. Además, la administración oral de B. subtilis podría generar respuestas inmunes humorales y celulares al mantenimiento de la homeostasis intestinal por células dendríticas [17]. Los DC son las células de antígeno profesional más importantes y pueden regular eficazmente los títulos de anticuerpos [18 Los DCs existen naturalmente en el tejido linfoide asociado al intestino (GALT), incluyendo los parches de Peyer (PPs), folículos linfoides aislados (FIL), ganglios linfáticos mesentéricos (MLNs), y se dispersan a través de la lámina subepitelial propria (LP) del intestino delgado y el colon [19]. Además, B. subtilis es conveniente para la manipulación genética y ha desarrollado una gran variedad de herramientas genéticas [20]. Por lo tanto, B. subtilis se utiliza ampliamente como un sistema eficaz de administración de vacunas para inducir respuestas inmunes mucosas y muestra un efecto único en el sistema inmunitario. En el presente informe, exploramos el efecto inmune de un B. subtilis recombinante (B. subtilis-RC) que se había construido con éxito con la expresión de la proteína PEDV COE en lechones. Nuestra investigación indicó que B. subtilis-RC era beneficioso para el desarrollo del sistema inmunológico mucosal, y podía generar anticuerpos específicos contra la infección por PEDV, sugiriendo un posible enfoque para prevenir la infección por PEDV. El B. subtilis WB800 fue amablemente proporcionado por el Dr. Xuewen Gao (del departamento de patología vegetal de la Universidad Agrícola de Nanjing) [21]. B. subtilis-RC construido previamente en nuestro laboratorio fue capaz de expresar el gen COE (499-638 aminoácidos en proteína S). Antes de la administración oral, la cepa recombinante fue cultivada en caldo LB a 37 • C durante 12 h, y luego se lavó dos veces con PBS, y se suspendió en PBS para alcanzar una concentración final de 1 × 10 10 CFU/ml. La cepa PEDV Zhejiang08 fue proporcionada por el Centro El virus se cultivó en células renales de mono verde africano (células VERO) y se purificó utilizando un gradiente discontinuo de densidad de sacarosa. El virus fue inactivado por UV a dosis UV de 4 J/cm 2 durante 24 h para lograr una pérdida completa de infectividad [23]. La concentración del virus purificado se midió utilizando el kit de análisis de proteínas BCA (Thermo Fisher, MA, EE.UU.). ELISA: Rabbit anti-pig IgG (peroxidasa de rábano caballar (HRP)), Goat Anti-Pig IgA (HRP) fueron comprados a Abcam. Segundo anticuerpo: Anticuerpo IgG de cabra conjugado DyLight 649 anticuerpo IgG de cabra conjugado, DyLight 488-anticuerpo IgG de cabra conjugado, DyLight 594-anticuerpo IgG de cabra conjugado fueron comprados a Multiciencia, Hangzhou, China. Sistema basado en ABC (anticuerpo IgG de cabra bitinilada) fue utilizado como el anticuerpo secundario con DAB como un cromogeno fue comprado a Boster, Wuhan, China. Cochinchos DLY específicos libres de patógenos (Duroc y Landrace y Yorkshire) fueron amablemente proporcionados por la Academia Jiangsu de Ciencias Agrícolas (Nanjing, China). Los experimentos con animales habían sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Agrícola de Nanjing y siguieron las directrices de los Doce lechones recién nacidos fueron divididos aleatoriamente en tres grupos (cuatro lechones en cada grupo) y alojados en condiciones similares en diferentes establos para evitar la contaminación cruzada probiótica. Los lechones fueron dosificados por vía oral con 100 μl de B. subtilis-RC. Los grupos de control de lechones fueron administrados por vía oral con PEDV inactivado (100 μg/dosis) e igual volumen de PBS. El protocolo de inmunización fue realizado en los lechones que tenían 5 días de edad (Figura 1C ), y firmados como 0 día. Luego se administraron vacunas de refuerzo en 5 días. Luego se realizó la recolección de especímenes cada 7 días después de la inmunización de refuerzo (Figura 1C ). Se recolectaron muestras de sangre semanalmente de todos los lechones después de la inmunización de refuerzo y se les permitió coagular durante la noche a temperatura Las muestras de sangre se separaron mediante centrifugación y se almacenaron a −20 • C para detectar los niveles de IgG e IgA específicos. Se recolectaron tres hisopos cada semana durante 1 mes, incluyendo hisopos nasales, orales y de heces para el ELISA. Los lechones fueron sacrificados en 33 días. La misma ubicación de los tejidos del intestino delgado y del íleo de cada cerdito se fijaron con el líquido de Bonn y un 4% de paraformaldehído. Los tejidos del intestino delgado en la misma ubicación se fijaron con solución fijadora de Bouin durante 24 h, incrustados en parafina, y seccionaron a un espesor de 4 μm. Las secciones se colocaron en diapositivas de vidrio. La tinción de hematoxilina-eosina se aplicó a las secciones de parafina, y luego se observaron y tomaron fotografías bajo microscopio El número de linfocitos intraepiteliales (IEL) se contaron en cada 100 células epiteliales bajo el mismo microscopio de luz múltiple entre diez imágenes de cada grupo [24]. La detección inmunohistoquímica se realizó con el kit SABC (Boster Bioscience), se utilizó peróxido de hidrógeno para desactivar la peroxidasa intrínseca. La recuperación de antígenos se realizó en un baño de agua utilizando tampón citrato-EDTA (10 mM ácido cítrico, 2 mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 6.2). Las secciones se incubaron con anticuerpo anti-IgA diluido (1:100; Abcam) durante la noche a las 4 • C. Como controles negativos, inmunoteñido realizado mediante muestras de control antiserum en lugar de anticuerpo primario. La adición de anticuerpo secundario marcado con biotina a las diapositivas fue seguida por la Después de la tinción con DAB, las diapositivas fueron grabadas utilizando una cámara digital (Leica-DM4000B) [25]. Los intestinos aislados con PP fueron transferidos a PBS helados. Luego, el resto de grasa y tejido conectivo fue removido y lavado a fondo con PBS helado. Luego, el intestino fue cortado longitudinalmente en fragmentos de 0,5 cm. Los fragmentos fueron incubados con 5 ml de EDTA 30 mM y colocados en solución digestiva de 5 ml que contenía 4 % FBS, 0,5 mg/ml cada uno de Collagenasa D (Roche) y Dnasa I (Sigma), y 50 U/ml Dispasa (Fisher). Los fragmentos fueron incubados con PBS de Dulbecco (DPBS) durante 20 min a 37 • C por rotación lenta (100 rpm). Después de la incubación, la capa de células epiteliales que contenía los LIE fueron separadas por un vórtice intensivo y pasaron a través de un colador celular de 70-μm. La suspensión monocelular fue recogida y lavada dos veces por DPBS, la solución fue vórtice intensamente y pasó a través de un colador celular de 40-μm. Los sobrenadantes fueron lavados por medio de RPM 1640 preenfriado (Thermo Fisher Scientific) y suspendidos por 10 ml de la fracción 40% de un gradiente de 40:80 Percoll, superpuestos sobre 5 ml de la fracción 80% en un tubo Falcon de 15 ml. La separación de gradiente de Percoll fue realizada por centrifugación durante 20 min a 2500 rpm. Los linfocitos LP (LPL) fueron recolectados en la interfase del gradiente Mientras tanto, el análisis de citometría de flujo se realizó en instrumentos BD Facscalibur (BD Biosciences) y fue analizado por el software FlowJo. Todos los anticuerpos fueron adquiridos de BD Pharmingen o eBiociencias. Suspensiones unicelulares aisladas fueron manchadas con anti-CD3-APC, anti-CD4-FITC, anti-CD8-PE, todas a la 1:100 dilución durante 30 min sobre hielo, y lavadas con PBS dos veces, y analizadas por FACS [26]. Las citoquinas interleucinas (IL) 10 (IL-10) e IL-1β (Abcam) fueron medidas por ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los datos fueron adquiridos en un lector de placas ELISA automatizado en OD 450 nm inmediatamente. Los anticuerpos neutralizantes de PEDV fueron medidos en líquido lavado de intestinos La prueba se realizó como se describió previamente con modificaciones menores [27]. Un total de 450 μl de líquido de lavado de intestino fue dos veces diluido en serie y mezclado con 50 μl de suspensión viral que contenía 10 3 TCID 50 PEDV virus durante 1 h a 37 • C en placas de cultivo de tejido de fondo plano de 12 pocillos. La mezcla fue inoculada durante 1 h a 37 • C y 5% CO 2. Luego, la mezcla fue inoculada con células Vero suspensión (aproximadamente 1,0 × 10 6 ml − 1 ) durante otros 3-4 días. Después de la tinción con Crystal Violet, las placas fueron observadas bajo un microscopio para el efecto citopático. Los datos fueron obtenidos como el medio + − S.E.M. de tres réplicas por prueba en un solo experimento. GraphPad Prism V Las múltiples pruebas de comparación de Tukey y ANOVA de un solo sentido fueron utilizadas para analizar la significación de la diferencia entre los medios. Los valores-P inferiores a 0,05 (P<0,05) fueron considerados significativos y los valores-P inferiores a 0,01 (P<0,01) como altamente significativos. Los PP son un concentrado de tejido linfoide y el sitio primario para la producción de inmunoglobulina A (IgA), lo cual es crucial para regular el equilibrio homeostático del intestino [28]. El área de los PP es un indicador clave de inmunidad. La administración oral con B. subtilis-RC significativamente (P<0,01) aumentó el área de los PP en comparación con dos grupos control como se muestra en la Figura 1A. Además, la longitud de la vili del íleum obtuvo más tiempo por administración oral con B. subtilis-RC (P<0,01) que Estos confirmaron principalmente que B. subtilis-RC fue beneficioso para mantener la estructura del intestino. Los IEL intestinales son una población grande y diversa de células linfoides que residen dentro de las células epiteliales intestinales (IECs), y que forman la barrera mucosa intestinal [29]. Los IELs son una parte importante del sistema inmunológico de la mucosa intestinal. El nivel de anticuerpos específicos anti-PEDV íleum IgA + secretación (SIgA) en lechones fue medido por ELISA en la boca y heces. Como se muestra en la Figura 3A, B, la mucosa específica del antígeno SIgA en los sitios anteriores fue claramente mayor que el grupo PEDV inactivado (P<0,05 o P<0,01). Como se esperaba, la boca tenía niveles más altos de SIgA que otros sitios. Después de la inmunización oral, el nivel de anticuerpo anti-PEDV IgG sérico en lechones inmunizados con B. subtilis-RC, PEDV inactivado o PBS fue determinado por ELISA, como se muestra en la Figura 3C. Los resultados indicaron que aunque los títulos cayeron durante el período de muestreo, el nivel IgG de B. subtilis-RC todavía aumentó significativamente de 0 a 33 días que el grupo PEDV inactivado (P<0,05 o P<0,01). Los linfocitos CD3 + T son los marcadores de la superficie celular fundamental de los linfocitos T, por lo que el número de linfocitos CD3 + T podría representar la cantidad de linfocitos T. En consecuencia, se analizó el número de linfocitos CD3 + T en el íleo. Los datos indicaron que tanto B. subtilis-RC como PEDV inactivado podrían aumentar dramáticamente (P<0,05) los linfocitos CD3 + T en comparación con el grupo PBS (Figura 4A ). Estos cambios mostraron evidencia segura de que la administración oral con B. subtilis-RC tuvo una buena influencia en la inmunidad de la mucosa intestinal en lechones. SIgA es el principal isotipo de inmunoglobulina en animales, en gran parte secretado a través de la superficie de la mucosa intestinal especialmente en el intestino delgado [30]. SIgA juega un papel importante en la inmunidad de la mucosa intestinal y refleja en la inmunidad de la mucosa intestinal. Después de la administración oral con B. subtilis-RC, el número de células secretantes IgA había aumentado rápidamente en comparación con los otros dos grupos (P<0,05) (Figura 4B). Estos resultados mostraron que la administración oral con B. subtilis-RC fue propicia a la inmunidad mucosa intestinal y podría aumentar el número de células secretadoras de IgA para producir efectos positivos sobre la infección por PEDV. Gran parte de las células inmunitarias están dispersas en las células epiteliales. Las IEC interactúan directa o indirectamente con las células inmunes innatas y adaptativas mediante la presentación de antígenos a los linfocitos [31]. Por lo tanto, el aprendizaje sobre cómo se distribuyen los linfocitos en la pequeña mucosa intestinal es muy significativo para la inmunología de la mucosa. Datos previos habían demostrado que los linfocitos CD3 + T aumentaron significativamente (P<0,05) (Figura 4A ), por lo que se analizó más adelante la clasificación inmunológica de CD3 + T linfocitos. El linfocito del íleo con unión de PP Estos resultados mostraron que las células CD3 + CD4 + T han aumentado obviamente (P<0,01) (Figura 5B ), sin embargo las células CD3 + CD8 + T disminuyeron notablemente (P<0,05) (Figura 5C ). Después del cálculo, la relación de células CD4 + /CD8 + T aumentó (Figura 5D ). Esta relación también podría medir más los niveles de inmunidad de los lechones. Los niveles de citoquina IL-1β e IL-10 se determinaron para evaluar las respuestas inmunes celulares inducidas por B. subtilis-RC como se muestra en la Figura 6A,B. Como podemos ver en el diagrama, significativamente (P<0,01) se produjeron IL-1β e IL-10 superiores después de la administración oral con B. subtilis-RC que los otros dos grupos. Todos estos revelaron que B. subtilis-RC podría estimular la liberación de citoquinas para mediar la comunicación con y entre las células del sistema inmunitario, mejorando la respuesta inmune mucosa a la infección por PEDV. Los anticuerpos neutralizantes del PEDV fueron detectados por el ensayo PRNT. La administración oral con B. subtilis-RC podría reducir efectivamente la capacidad de formación de placa de PEDV (P<0,01) en comparación con otros dos grupos en la Figura 7. Esto reveló que B. subtilis-RC podría estimular un alto nivel de anticuerpos neutralizantes del PEDV contra la infección por PEDV. En medio del brote del PEDV, se han desarrollado varias vacunas para controlar enfermedades y los efectos son insatisfactorios. Las vacunas orales pueden inducir una inmunidad mucosa más robusta que las contrapartes inyectables [32]. Ahora está claro que la respuesta inmune mucosal efectiva requiere IgG sérico y SIgA mucosal [34]. SIgA es la base del sistema inmune mucosal, desempeñando un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis inmune, y neutralizando los patógenos invasivos. IgG sérico representa respuestas inmunes sistémicas. Durante las infecciones por PEDV, la inmunización oral provoca no sólo mucosas sino también respuestas inmunes sistémicas muy bien [35]. Nuestros datos mostraron una respuesta IgG anti-PEDV fuerte y de larga duración se detectaron por vía oral con B. subtilis-RC en lechones. Aunque con el paso del tiempo, los títulos de anticuerpos disminuyeron un poco, todavía se mantuvo en la cabeza en comparación con los grupos de control y de acuerdo con la tendencia cambiante de anticuerpos. El cambio de IgA específica mostró resultados similares en la mucosa de boca y heces. A medida que aumenta la inmunidad adicional, B. subtilis-RC reduce la capacidad de los patógenos para cruzar la mucosa intestinal y la propagación sistémica de patógenos invasivos [36]. El sistema inmunitario de la mucosa genera respuestas inmunitarias a través de células inmunitarias que residen en compartimentos de la mucosa. Los linfocitos T residentes en la mucosa desempeñan un papel importante en la inmunidad de la mucosa [37]. Exploramos más a fondo la especie, las cantidades y la distribución de linfocitos T en la mucosa intestinal. CD3 es un marcador de superficie celular fundamental de linfocitos T [38]. El resultado mostró que el número de linfocitos CD3 + T aumentó significativamente, y estos revelaron que B. subtilis-RC podría estimular la maduración de células T. Según las moléculas expresadas en la superficie celular, los linfocitos T pueden dividirse aún más en células T ayudantes Además, observamos que la relación de células CD4 + /CD8 + T aumentó por vía oral. La relación CD4/CD8 mide la relación de células T ayudantes a células T citotóxicas. Por lo tanto, pudimos ver que la administración oral B. subtilis-RC podría fortalecer la respuesta inmune Th1 al aumentar la relación de células CD4 + /CD8 + T. La morfología del intestino delgado puede reflejar directamente la salud intestinal y desempeña un papel importante en el mantenimiento del sistema inmunitario intestinal [40]. La fase temprana de la infección por PEDV se acompaña frecuentemente de necrosis y exfoliación de células epiteliales villosas infectadas, lo que en última instancia resulta en atrofia villosa aguda y severa [41]. Por lo tanto, el trabajo efectivo de mantener la morfología intestinal es un buen indicador para evaluar la eficacia de las vacunas. Después de la Los PP son pequeñas masas de tejido linfático y forman una parte importante del sistema inmunitario mediante el reclutamiento e inducción de las células T para prevenir el crecimiento de patógenos en los intestinos. Además, un aumento en el número de IEL demostró la eficacia de B. subtilis-RC. Además, la longitud de vellosidad del íleo mostró algunos resultados alentadores que una morfología intestinal bien formada llegó a ser por B. subtilis-RC. La morfología intestinal satisfactoria fue el primer paso en la carretera contra la infección por PEDV. Varios resultados de morfología demostraron que B. subtilis-RC podría mantener notablemente la morfología intestinal y formar una protección integral. Como se mencionó anteriormente, la administración oral con B. subtilis-RC podría estimular la proliferación y diferenciación de células T y modular la respuesta inmune. Además, las citocinas son proteínas moléculas pequeñas con amplia actividad biológica, sintetizadas y secretadas por las células inmunes y algunas células no inmunes [42]. Como molécula de señalización celular, actúa principalmente para regular las respuestas inmunes, participando en la diferenciación y desarrollo de las células inmunes, mediando las respuestas inflamatorias, estimulando la hematopoyesis y participando en la reparación de los tejidos. Estudios previos habían demostrado que el PEDV inhibió tanto las citoquinas NF-.B como las citoquinas proinflamatorias [43]. Por lo tanto, las citoquinas son un indicador clave para evaluar la capacidad de una vacuna para estimular las respuestas inmunes. En este estudio, habíamos observado que IL-1β e IL-10 aumentaron notablemente (P<0.01). El IL-1β como una de las primeras citoquinas proinflamatorias y participa centralmente en la iniciación La investigación había demostrado que IL-1β podría aumentar significativamente la regulación de los tejidos inmunes locales y sistémicos post infección microbiana [44]. Además, IL-10 es una potente citocina antiinflamatoria que juega un papel esencial en la prevención de patologías inflamatorias e autoinmunes [45]. En resumen, ambos datos mostraron que la administración oral con B. subtilis-RC regulada y aumenta la inmunidad mediante citocinas IL-1β e IL-10 de alta regulación. En conclusión, los resultados actuales demostraron que la inmunización oral con B. subtilis-RC podría inducir efectivamente a la mucosa local y respuestas inmunes sistemáticas contra la infección por PEDV, al tiempo que mejora y regula la función inmune elevando la proporción de células CD4 + /CD8 + T y citocinas IL-1β e IL-10, apuntando así a una prometedora vacuna oral candidata para la infección

¿Cómo transmite el virus PED entre los animales?

Respuestas inmunes mucosas inducidas por la administración oral recombinante Bacillus subtilis que expresa el antígeno COE de PEDV en lechones recién nacidoshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6418403/SHA: 5caced13bcb8a42cca41369c5a71ae7df5381ca8Autores: Wang, Jialu; Huang, Lulu; Mou, Chunxiao; Zhang, En; Wang, Yongheng; Cao, Yanan; Yang, QianFecha: 2019-03-15DOI: 10.1042/bsr20182028Licencia: cc-byAbstract: La diarrea epidémica porcina (PED) es una enfermedad altamente contagiosa en lechones recién nacidos y causa pérdidas económicas sustanciales en el El virus PED (PEDV) se disemina por contacto fecal-oral y puede prevenirse mediante inmunización oral. Por lo tanto, es necesario desarrollar una vacuna oral eficaz contra la infección por PEDV. Actualmente, Bacillus subtilis como portador de la vacuna recombinante se ha utilizado para la administración de antígenos y se ha demostrado que es inmunitaria y segura. El presente estudio evaluó la inmunogenicidad de Bacillus subtilis recombinante (B. subtilis-RC) en lechones por vía oral. Después de la inmunización oral en lechones, B. subtilis-RC aumentó significativamente las respuestas inmunitarias de la mucosa local. La administración oral con B. subtilis-RC mejoró significativamente el nivel de anticuerpos contra la infección por PEDV específicos de la inmunoglobulina A (IgA) mediante la ampliación del área de los parches (PP) de Peyer y Mientras tanto, B. subtilis-RC aumentó notablemente el número de linfocitos intraepiteliales (IEL). También observamos que la administración oral de B. subtilis-RC aumentó significativamente el número de linfocitos CD3(+)T y mejoró la proporción de células T CD4(+)/CD8(+). Además, los títulos altos de inmunoglobulina G (IgG) sérica específica revelaron una respuesta inmunitaria sistémica satisfactoria contra la infección por PEDV. En resumen, nuestro estudio demostró que la administración oral de B. subtilis-RC podría desencadenar un alto nivel de respuestas inmunitarias locales y sistémicas y sería una vacuna candidata prometedora contra la infección por PEDV en lechones. Texto: Diarrea epidémica porcina (PED) caracterizada por diarrea aguda altamente fatal en lechones, resulta en enormes pérdidas en la industria porcina mundial [1] El agente causante del virus PED (PEDV) pertenece a los coronavirus porcinos (CoVs). La infección por PEDV se propaga principalmente a través del tracto digestivo [2], y daña las superficies mucosas del intestino huésped infectando las células epiteliales intestinales [3]. Por lo tanto, la mejora de la inmunidad mucosa intestinal puede provocar respuestas inmunológicas eficaces contra la infección por PEDV [4]. Actualmente, se han desarrollado y aplicado ampliamente en el mercado vacunas tradicionales (vía intramuscular o inyección subcutánea) [5]. Estas vacunas administradas por vía parenteral no pueden inducir eficazmente títulos altos de anticuerpos maternos y anticuerpos IgA específicos del virus, lo que resulta en una protección mucosa inadecuada contra la infección por PEDV [6]. Además, estos anticuerpos maternos en la leche siempre fueron degradados por el ácido gástrico y la pepsina antes de entrar en el tracto intestinal. Las vacunas Como una forma superior de inmunización mucosal, la administración oral puede proteger el intestino y estimular el sistema inmunológico mucosal común [8]. Además, la inmunización oral tiene varias características atractivas que incluyen la seguridad, y un enfoque sencillo, barato y sin agujas [9]. Por lo tanto, la inmunización oral a menudo ofrece grandes cantidades de antígenos para prevenir las enfermedades diarreicas [10]. Sin embargo, hay varios desafíos por la inmunización oral, que consisten en barreras físicas, químicas y biológicas al entregar antígenos al tracto gastrointestinal (como ácidos gástricos, pepsina y tripsina en el tracto GI) [11]. Es un problema sustancial que los ácidos digestivos y las proteasas pueden degradar las proteínas antígenos para la absorción de nutrientes [12]. Por lo tanto, el sistema de administración de vacunas se ha aplicado para resolver el problema. El sistema puede proteger antígenos del entorno severo del tracto GI y entregar antígenos a la mucosa intestinal Actualmente, Bacillus subtilis (B. subtilis) es ampliamente utilizado como un sistema de administración de vacunas por sus características únicas. Como bacteria Gram-positiva no patógena, B. subtilis ha sido considerado como un nuevo probiótico y aditivo alimentario en humanos y animales [14]. El B. subtilis tiene actividad adyuvante y puede entregar antígenos heterólogos al tracto GI, proporcionando estimulación de inmunidad adicional [15]. Además, la investigación había demostrado que B. subtilis administrado por vía oral también podría mejorar la regulación inmunitaria y la salud intestinal en cerdos [16]. Además, la administración oral de B. subtilis podría generar respuestas inmunes humorales y celulares al mantenimiento de la homeostasis intestinal por células dendríticas [17]. Los DC son las células de antígeno profesional más importantes y pueden regular eficazmente los títulos de anticuerpos [18 Los DCs existen naturalmente en el tejido linfoide asociado al intestino (GALT), incluyendo los parches de Peyer (PPs), folículos linfoides aislados (FIL), ganglios linfáticos mesentéricos (MLNs), y se dispersan a través de la lámina subepitelial propria (LP) del intestino delgado y el colon [19]. Además, B. subtilis es conveniente para la manipulación genética y ha desarrollado una gran variedad de herramientas genéticas [20]. Por lo tanto, B. subtilis se utiliza ampliamente como un sistema eficaz de administración de vacunas para inducir respuestas inmunes mucosas y muestra un efecto único en el sistema inmunitario. En el presente informe, exploramos el efecto inmune de un B. subtilis recombinante (B. subtilis-RC) que se había construido con éxito con la expresión de la proteína PEDV COE en lechones. Nuestra investigación indicó que B. subtilis-RC era beneficioso para el desarrollo del sistema inmunológico mucosal, y podía generar anticuerpos específicos contra la infección por PEDV, sugiriendo un posible enfoque para prevenir la infección por PEDV. El B. subtilis WB800 fue amablemente proporcionado por el Dr. Xuewen Gao (del departamento de patología vegetal de la Universidad Agrícola de Nanjing) [21]. B. subtilis-RC construido previamente en nuestro laboratorio fue capaz de expresar el gen COE (499-638 aminoácidos en proteína S). Antes de la administración oral, la cepa recombinante fue cultivada en caldo LB a 37 • C durante 12 h, y luego se lavó dos veces con PBS, y se suspendió en PBS para alcanzar una concentración final de 1 × 10 10 CFU/ml. La cepa PEDV Zhejiang08 fue proporcionada por el Centro El virus se cultivó en células renales de mono verde africano (células VERO) y se purificó utilizando un gradiente discontinuo de densidad de sacarosa. El virus fue inactivado por UV a dosis UV de 4 J/cm 2 durante 24 h para lograr una pérdida completa de infectividad [23]. La concentración del virus purificado se midió utilizando el kit de análisis de proteínas BCA (Thermo Fisher, MA, EE.UU.). ELISA: Rabbit anti-pig IgG (peroxidasa de rábano caballar (HRP)), Goat Anti-Pig IgA (HRP) fueron comprados a Abcam. Segundo anticuerpo: Anticuerpo IgG de cabra conjugado DyLight 649 anticuerpo IgG de cabra conjugado, DyLight 488-anticuerpo IgG de cabra conjugado, DyLight 594-anticuerpo IgG de cabra conjugado fueron comprados a Multiciencia, Hangzhou, China. Sistema basado en ABC (anticuerpo IgG de cabra bitinilada) fue utilizado como el anticuerpo secundario con DAB como un cromogeno fue comprado a Boster, Wuhan, China. Cochinchos DLY específicos libres de patógenos (Duroc y Landrace y Yorkshire) fueron amablemente proporcionados por la Academia Jiangsu de Ciencias Agrícolas (Nanjing, China). Los experimentos con animales habían sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Agrícola de Nanjing y siguieron las directrices de los Doce lechones recién nacidos fueron divididos aleatoriamente en tres grupos (cuatro lechones en cada grupo) y alojados en condiciones similares en diferentes establos para evitar la contaminación cruzada probiótica. Los lechones fueron dosificados por vía oral con 100 μl de B. subtilis-RC. Los grupos de control de lechones fueron administrados por vía oral con PEDV inactivado (100 μg/dosis) e igual volumen de PBS. El protocolo de inmunización fue realizado en los lechones que tenían 5 días de edad (Figura 1C ), y firmados como 0 día. Luego se administraron vacunas de refuerzo en 5 días. Luego se realizó la recolección de especímenes cada 7 días después de la inmunización de refuerzo (Figura 1C ). Se recolectaron muestras de sangre semanalmente de todos los lechones después de la inmunización de refuerzo y se les permitió coagular durante la noche a temperatura Las muestras de sangre se separaron mediante centrifugación y se almacenaron a −20 • C para detectar los niveles de IgG e IgA específicos. Se recolectaron tres hisopos cada semana durante 1 mes, incluyendo hisopos nasales, orales y de heces para el ELISA. Los lechones fueron sacrificados en 33 días. La misma ubicación de los tejidos del intestino delgado y del íleo de cada cerdito se fijaron con el líquido de Bonn y un 4% de paraformaldehído. Los tejidos del intestino delgado en la misma ubicación se fijaron con solución fijadora de Bouin durante 24 h, incrustados en parafina, y seccionaron a un espesor de 4 μm. Las secciones se colocaron en diapositivas de vidrio. La tinción de hematoxilina-eosina se aplicó a las secciones de parafina, y luego se observaron y tomaron fotografías bajo microscopio El número de linfocitos intraepiteliales (IEL) se contaron en cada 100 células epiteliales bajo el mismo microscopio de luz múltiple entre diez imágenes de cada grupo [24]. La detección inmunohistoquímica se realizó con el kit SABC (Boster Bioscience), se utilizó peróxido de hidrógeno para desactivar la peroxidasa intrínseca. La recuperación de antígenos se realizó en un baño de agua utilizando tampón citrato-EDTA (10 mM ácido cítrico, 2 mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 6.2). Las secciones se incubaron con anticuerpo anti-IgA diluido (1:100; Abcam) durante la noche a las 4 • C. Como controles negativos, inmunoteñido realizado mediante muestras de control antiserum en lugar de anticuerpo primario. La adición de anticuerpo secundario marcado con biotina a las diapositivas fue seguida por la Después de la tinción con DAB, las diapositivas fueron grabadas utilizando una cámara digital (Leica-DM4000B) [25]. Los intestinos aislados con PP fueron transferidos a PBS helados. Luego, el resto de grasa y tejido conectivo fue removido y lavado a fondo con PBS helado. Luego, el intestino fue cortado longitudinalmente en fragmentos de 0,5 cm. Los fragmentos fueron incubados con 5 ml de EDTA 30 mM y colocados en solución digestiva de 5 ml que contenía 4 % FBS, 0,5 mg/ml cada uno de Collagenasa D (Roche) y Dnasa I (Sigma), y 50 U/ml Dispasa (Fisher). Los fragmentos fueron incubados con PBS de Dulbecco (DPBS) durante 20 min a 37 • C por rotación lenta (100 rpm). Después de la incubación, la capa de células epiteliales que contenía los LIE fueron separadas por un vórtice intensivo y pasaron a través de un colador celular de 70-μm. La suspensión monocelular fue recogida y lavada dos veces por DPBS, la solución fue vórtice intensamente y pasó a través de un colador celular de 40-μm. Los sobrenadantes fueron lavados por medio de RPM 1640 preenfriado (Thermo Fisher Scientific) y suspendidos por 10 ml de la fracción 40% de un gradiente de 40:80 Percoll, superpuestos sobre 5 ml de la fracción 80% en un tubo Falcon de 15 ml. La separación de gradiente de Percoll fue realizada por centrifugación durante 20 min a 2500 rpm. Los linfocitos LP (LPL) fueron recolectados en la interfase del gradiente Mientras tanto, el análisis de citometría de flujo se realizó en instrumentos BD Facscalibur (BD Biosciences) y fue analizado por el software FlowJo. Todos los anticuerpos fueron adquiridos de BD Pharmingen o eBiociencias. Suspensiones unicelulares aisladas fueron manchadas con anti-CD3-APC, anti-CD4-FITC, anti-CD8-PE, todas a la 1:100 dilución durante 30 min sobre hielo, y lavadas con PBS dos veces, y analizadas por FACS [26]. Las citoquinas interleucinas (IL) 10 (IL-10) e IL-1β (Abcam) fueron medidas por ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los datos fueron adquiridos en un lector de placas ELISA automatizado en OD 450 nm inmediatamente. Los anticuerpos neutralizantes de PEDV fueron medidos en líquido lavado de intestinos La prueba se realizó como se describió previamente con modificaciones menores [27]. Un total de 450 μl de líquido de lavado de intestino fue dos veces diluido en serie y mezclado con 50 μl de suspensión viral que contenía 10 3 TCID 50 PEDV virus durante 1 h a 37 • C en placas de cultivo de tejido de fondo plano de 12 pocillos. La mezcla fue inoculada durante 1 h a 37 • C y 5% CO 2. Luego, la mezcla fue inoculada con células Vero suspensión (aproximadamente 1,0 × 10 6 ml − 1 ) durante otros 3-4 días. Después de la tinción con Crystal Violet, las placas fueron observadas bajo un microscopio para el efecto citopático. Los datos fueron obtenidos como el medio + − S.E.M. de tres réplicas por prueba en un solo experimento. GraphPad Prism V Las múltiples pruebas de comparación de Tukey y ANOVA de un solo sentido fueron utilizadas para analizar la significación de la diferencia entre los medios. Los valores-P inferiores a 0,05 (P<0,05) fueron considerados significativos y los valores-P inferiores a 0,01 (P<0,01) como altamente significativos. Los PP son un concentrado de tejido linfoide y el sitio primario para la producción de inmunoglobulina A (IgA), lo cual es crucial para regular el equilibrio homeostático del intestino [28]. El área de los PP es un indicador clave de inmunidad. La administración oral con B. subtilis-RC significativamente (P<0,01) aumentó el área de los PP en comparación con dos grupos control como se muestra en la Figura 1A. Además, la longitud de la vili del íleum obtuvo más tiempo por administración oral con B. subtilis-RC (P<0,01) que Estos confirmaron principalmente que B. subtilis-RC fue beneficioso para mantener la estructura del intestino. Los IEL intestinales son una población grande y diversa de células linfoides que residen dentro de las células epiteliales intestinales (IECs), y que forman la barrera mucosa intestinal [29]. Los IELs son una parte importante del sistema inmunológico de la mucosa intestinal. El nivel de anticuerpos específicos anti-PEDV íleum IgA + secretación (SIgA) en lechones fue medido por ELISA en la boca y heces. Como se muestra en la Figura 3A, B, la mucosa específica del antígeno SIgA en los sitios anteriores fue claramente mayor que el grupo PEDV inactivado (P<0,05 o P<0,01). Como se esperaba, la boca tenía niveles más altos de SIgA que otros sitios. Después de la inmunización oral, el nivel de anticuerpo anti-PEDV IgG sérico en lechones inmunizados con B. subtilis-RC, PEDV inactivado o PBS fue determinado por ELISA, como se muestra en la Figura 3C. Los resultados indicaron que aunque los títulos cayeron durante el período de muestreo, el nivel IgG de B. subtilis-RC todavía aumentó significativamente de 0 a 33 días que el grupo PEDV inactivado (P<0,05 o P<0,01). Los linfocitos CD3 + T son los marcadores de la superficie celular fundamental de los linfocitos T, por lo que el número de linfocitos CD3 + T podría representar la cantidad de linfocitos T. En consecuencia, se analizó el número de linfocitos CD3 + T en el íleo. Los datos indicaron que tanto B. subtilis-RC como PEDV inactivado podrían aumentar dramáticamente (P<0,05) los linfocitos CD3 + T en comparación con el grupo PBS (Figura 4A ). Estos cambios mostraron evidencia segura de que la administración oral con B. subtilis-RC tuvo una buena influencia en la inmunidad de la mucosa intestinal en lechones. SIgA es el principal isotipo de inmunoglobulina en animales, en gran parte secretado a través de la superficie de la mucosa intestinal especialmente en el intestino delgado [30]. SIgA juega un papel importante en la inmunidad de la mucosa intestinal y refleja en la inmunidad de la mucosa intestinal. Después de la administración oral con B. subtilis-RC, el número de células secretantes IgA había aumentado rápidamente en comparación con los otros dos grupos (P<0,05) (Figura 4B). Estos resultados mostraron que la administración oral con B. subtilis-RC fue propicia a la inmunidad mucosa intestinal y podría aumentar el número de células secretadoras de IgA para producir efectos positivos sobre la infección por PEDV. Gran parte de las células inmunitarias están dispersas en las células epiteliales. Las IEC interactúan directa o indirectamente con las células inmunes innatas y adaptativas mediante la presentación de antígenos a los linfocitos [31]. Por lo tanto, el aprendizaje sobre cómo se distribuyen los linfocitos en la pequeña mucosa intestinal es muy significativo para la inmunología de la mucosa. Datos previos habían demostrado que los linfocitos CD3 + T aumentaron significativamente (P<0,05) (Figura 4A ), por lo que se analizó más adelante la clasificación inmunológica de CD3 + T linfocitos. El linfocito del íleo con unión de PP Estos resultados mostraron que las células CD3 + CD4 + T han aumentado obviamente (P<0,01) (Figura 5B ), sin embargo las células CD3 + CD8 + T disminuyeron notablemente (P<0,05) (Figura 5C ). Después del cálculo, la relación de células CD4 + /CD8 + T aumentó (Figura 5D ). Esta relación también podría medir más los niveles de inmunidad de los lechones. Los niveles de citoquina IL-1β e IL-10 se determinaron para evaluar las respuestas inmunes celulares inducidas por B. subtilis-RC como se muestra en la Figura 6A,B. Como podemos ver en el diagrama, significativamente (P<0,01) se produjeron IL-1β e IL-10 superiores después de la administración oral con B. subtilis-RC que los otros dos grupos. Todos estos revelaron que B. subtilis-RC podría estimular la liberación de citoquinas para mediar la comunicación con y entre las células del sistema inmunitario, mejorando la respuesta inmune mucosa a la infección por PEDV. Los anticuerpos neutralizantes del PEDV fueron detectados por el ensayo PRNT. La administración oral con B. subtilis-RC podría reducir efectivamente la capacidad de formación de placa de PEDV (P<0,01) en comparación con otros dos grupos en la Figura 7. Esto reveló que B. subtilis-RC podría estimular un alto nivel de anticuerpos neutralizantes del PEDV contra la infección por PEDV. En medio del brote del PEDV, se han desarrollado varias vacunas para controlar enfermedades y los efectos son insatisfactorios. Las vacunas orales pueden inducir una inmunidad mucosa más robusta que las contrapartes inyectables [32]. Ahora está claro que la respuesta inmune mucosal efectiva requiere IgG sérico y SIgA mucosal [34]. SIgA es la base del sistema inmune mucosal, desempeñando un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis inmune, y neutralizando los patógenos invasivos. IgG sérico representa respuestas inmunes sistémicas. Durante las infecciones por PEDV, la inmunización oral provoca no sólo mucosas sino también respuestas inmunes sistémicas muy bien [35]. Nuestros datos mostraron una respuesta IgG anti-PEDV fuerte y de larga duración se detectaron por vía oral con B. subtilis-RC en lechones. Aunque con el paso del tiempo, los títulos de anticuerpos disminuyeron un poco, todavía se mantuvo en la cabeza en comparación con los grupos de control y de acuerdo con la tendencia cambiante de anticuerpos. El cambio de IgA específica mostró resultados similares en la mucosa de boca y heces. A medida que aumenta la inmunidad adicional, B. subtilis-RC reduce la capacidad de los patógenos para cruzar la mucosa intestinal y la propagación sistémica de patógenos invasivos [36]. El sistema inmunitario de la mucosa genera respuestas inmunitarias a través de células inmunitarias que residen en compartimentos de la mucosa. Los linfocitos T residentes en la mucosa desempeñan un papel importante en la inmunidad de la mucosa [37]. Exploramos más a fondo la especie, las cantidades y la distribución de linfocitos T en la mucosa intestinal. CD3 es un marcador de superficie celular fundamental de linfocitos T [38]. El resultado mostró que el número de linfocitos CD3 + T aumentó significativamente, y estos revelaron que B. subtilis-RC podría estimular la maduración de células T. Según las moléculas expresadas en la superficie celular, los linfocitos T pueden dividirse aún más en células T ayudantes Además, observamos que la relación de células CD4 + /CD8 + T aumentó por vía oral. La relación CD4/CD8 mide la relación de células T ayudantes a células T citotóxicas. Por lo tanto, pudimos ver que la administración oral B. subtilis-RC podría fortalecer la respuesta inmune Th1 al aumentar la relación de células CD4 + /CD8 + T. La morfología del intestino delgado puede reflejar directamente la salud intestinal y desempeña un papel importante en el mantenimiento del sistema inmunitario intestinal [40]. La fase temprana de la infección por PEDV se acompaña frecuentemente de necrosis y exfoliación de células epiteliales villosas infectadas, lo que en última instancia resulta en atrofia villosa aguda y severa [41]. Por lo tanto, el trabajo efectivo de mantener la morfología intestinal es un buen indicador para evaluar la eficacia de las vacunas. Después de la Los PP son pequeñas masas de tejido linfático y forman una parte importante del sistema inmunitario mediante el reclutamiento e inducción de las células T para prevenir el crecimiento de patógenos en los intestinos. Además, un aumento en el número de IEL demostró la eficacia de B. subtilis-RC. Además, la longitud de vellosidad del íleo mostró algunos resultados alentadores que una morfología intestinal bien formada llegó a ser por B. subtilis-RC. La morfología intestinal satisfactoria fue el primer paso en la carretera contra la infección por PEDV. Varios resultados de morfología demostraron que B. subtilis-RC podría mantener notablemente la morfología intestinal y formar una protección integral. Como se mencionó anteriormente, la administración oral con B. subtilis-RC podría estimular la proliferación y diferenciación de células T y modular la respuesta inmune. Además, las citocinas son proteínas moléculas pequeñas con amplia actividad biológica, sintetizadas y secretadas por las células inmunes y algunas células no inmunes [42]. Como molécula de señalización celular, actúa principalmente para regular las respuestas inmunes, participando en la diferenciación y desarrollo de las células inmunes, mediando las respuestas inflamatorias, estimulando la hematopoyesis y participando en la reparación de los tejidos. Estudios previos habían demostrado que el PEDV inhibió tanto las citoquinas NF-.B como las citoquinas proinflamatorias [43]. Por lo tanto, las citoquinas son un indicador clave para evaluar la capacidad de una vacuna para estimular las respuestas inmunes. En este estudio, habíamos observado que IL-1β e IL-10 aumentaron notablemente (P<0.01). El IL-1β como una de las primeras citoquinas proinflamatorias y participa centralmente en la iniciación La investigación había demostrado que IL-1β podría aumentar significativamente la regulación de los tejidos inmunes locales y sistémicos post infección microbiana [44]. Además, IL-10 es una potente citocina antiinflamatoria que juega un papel esencial en la prevención de patologías inflamatorias e autoinmunes [45]. En resumen, ambos datos mostraron que la administración oral con B. subtilis-RC regulada y aumenta la inmunidad mediante citocinas IL-1β e IL-10 de alta regulación. En conclusión, los resultados actuales demostraron que la inmunización oral con B. subtilis-RC podría inducir efectivamente a la mucosa local y respuestas inmunes sistemáticas contra la infección por PEDV, al tiempo que mejora y regula la función inmune elevando la proporción de células CD4 + /CD8 + T y citocinas IL-1β e IL-10, apuntando así a una prometedora vacuna oral candidata para la infección

¿Cómo se puede utilizar Bacilius subtilis como vacuna oral?

Respuestas inmunes mucosas inducidas por la administración oral recombinante Bacillus subtilis que expresa el antígeno COE de PEDV en lechones recién nacidoshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6418403/SHA: 5caced13bcb8a42cca41369c5a71ae7df5381ca8Autores: Wang, Jialu; Huang, Lulu; Mou, Chunxiao; Zhang, En; Wang, Yongheng; Cao, Yanan; Yang, QianFecha: 2019-03-15DOI: 10.1042/bsr20182028Licencia: cc-byAbstract: La diarrea epidémica porcina (PED) es una enfermedad altamente contagiosa en lechones recién nacidos y causa pérdidas económicas sustanciales en el El virus PED (PEDV) se disemina por contacto fecal-oral y puede prevenirse mediante inmunización oral. Por lo tanto, es necesario desarrollar una vacuna oral eficaz contra la infección por PEDV. Actualmente, Bacillus subtilis como portador de la vacuna recombinante se ha utilizado para la administración de antígenos y se ha demostrado que es inmunitaria y segura. El presente estudio evaluó la inmunogenicidad de Bacillus subtilis recombinante (B. subtilis-RC) en lechones por vía oral. Después de la inmunización oral en lechones, B. subtilis-RC aumentó significativamente las respuestas inmunitarias de la mucosa local. La administración oral con B. subtilis-RC mejoró significativamente el nivel de anticuerpos contra la infección por PEDV específicos de la inmunoglobulina A (IgA) mediante la ampliación del área de los parches (PP) de Peyer y Mientras tanto, B. subtilis-RC aumentó notablemente el número de linfocitos intraepiteliales (IEL). También observamos que la administración oral de B. subtilis-RC aumentó significativamente el número de linfocitos CD3(+)T y mejoró la proporción de células T CD4(+)/CD8(+). Además, los títulos altos de inmunoglobulina G (IgG) sérica específica revelaron una respuesta inmunitaria sistémica satisfactoria contra la infección por PEDV. En resumen, nuestro estudio demostró que la administración oral de B. subtilis-RC podría desencadenar un alto nivel de respuestas inmunitarias locales y sistémicas y sería una vacuna candidata prometedora contra la infección por PEDV en lechones. Texto: Diarrea epidémica porcina (PED) caracterizada por diarrea aguda altamente fatal en lechones, resulta en enormes pérdidas en la industria porcina mundial [1] El agente causante del virus PED (PEDV) pertenece a los coronavirus porcinos (CoVs). La infección por PEDV se propaga principalmente a través del tracto digestivo [2], y daña las superficies mucosas del intestino huésped infectando las células epiteliales intestinales [3]. Por lo tanto, la mejora de la inmunidad mucosa intestinal puede provocar respuestas inmunológicas eficaces contra la infección por PEDV [4]. Actualmente, se han desarrollado y aplicado ampliamente en el mercado vacunas tradicionales (vía intramuscular o inyección subcutánea) [5]. Estas vacunas administradas por vía parenteral no pueden inducir eficazmente títulos altos de anticuerpos maternos y anticuerpos IgA específicos del virus, lo que resulta en una protección mucosa inadecuada contra la infección por PEDV [6]. Además, estos anticuerpos maternos en la leche siempre fueron degradados por el ácido gástrico y la pepsina antes de entrar en el tracto intestinal. Las vacunas Como una forma superior de inmunización mucosal, la administración oral puede proteger el intestino y estimular el sistema inmunológico mucosal común [8]. Además, la inmunización oral tiene varias características atractivas que incluyen la seguridad, y un enfoque sencillo, barato y sin agujas [9]. Por lo tanto, la inmunización oral a menudo ofrece grandes cantidades de antígenos para prevenir las enfermedades diarreicas [10]. Sin embargo, hay varios desafíos por la inmunización oral, que consisten en barreras físicas, químicas y biológicas al entregar antígenos al tracto gastrointestinal (como ácidos gástricos, pepsina y tripsina en el tracto GI) [11]. Es un problema sustancial que los ácidos digestivos y las proteasas pueden degradar las proteínas antígenos para la absorción de nutrientes [12]. Por lo tanto, el sistema de administración de vacunas se ha aplicado para resolver el problema. El sistema puede proteger antígenos del entorno severo del tracto GI y entregar antígenos a la mucosa intestinal Actualmente, Bacillus subtilis (B. subtilis) es ampliamente utilizado como un sistema de administración de vacunas por sus características únicas. Como bacteria Gram-positiva no patógena, B. subtilis ha sido considerado como un nuevo probiótico y aditivo alimentario en humanos y animales [14]. El B. subtilis tiene actividad adyuvante y puede entregar antígenos heterólogos al tracto GI, proporcionando estimulación de inmunidad adicional [15]. Además, la investigación había demostrado que B. subtilis administrado por vía oral también podría mejorar la regulación inmunitaria y la salud intestinal en cerdos [16]. Además, la administración oral de B. subtilis podría generar respuestas inmunes humorales y celulares al mantenimiento de la homeostasis intestinal por células dendríticas [17]. Los DC son las células de antígeno profesional más importantes y pueden regular eficazmente los títulos de anticuerpos [18 Los DCs existen naturalmente en el tejido linfoide asociado al intestino (GALT), incluyendo los parches de Peyer (PPs), folículos linfoides aislados (FIL), ganglios linfáticos mesentéricos (MLNs), y se dispersan a través de la lámina subepitelial propria (LP) del intestino delgado y el colon [19]. Además, B. subtilis es conveniente para la manipulación genética y ha desarrollado una gran variedad de herramientas genéticas [20]. Por lo tanto, B. subtilis se utiliza ampliamente como un sistema eficaz de administración de vacunas para inducir respuestas inmunes mucosas y muestra un efecto único en el sistema inmunitario. En el presente informe, exploramos el efecto inmune de un B. subtilis recombinante (B. subtilis-RC) que se había construido con éxito con la expresión de la proteína PEDV COE en lechones. Nuestra investigación indicó que B. subtilis-RC era beneficioso para el desarrollo del sistema inmunológico mucosal, y podía generar anticuerpos específicos contra la infección por PEDV, sugiriendo un posible enfoque para prevenir la infección por PEDV. El B. subtilis WB800 fue amablemente proporcionado por el Dr. Xuewen Gao (del departamento de patología vegetal de la Universidad Agrícola de Nanjing) [21]. B. subtilis-RC construido previamente en nuestro laboratorio fue capaz de expresar el gen COE (499-638 aminoácidos en proteína S). Antes de la administración oral, la cepa recombinante fue cultivada en caldo LB a 37 • C durante 12 h, y luego se lavó dos veces con PBS, y se suspendió en PBS para alcanzar una concentración final de 1 × 10 10 CFU/ml. La cepa PEDV Zhejiang08 fue proporcionada por el Centro El virus se cultivó en células renales de mono verde africano (células VERO) y se purificó utilizando un gradiente discontinuo de densidad de sacarosa. El virus fue inactivado por UV a dosis UV de 4 J/cm 2 durante 24 h para lograr una pérdida completa de infectividad [23]. La concentración del virus purificado se midió utilizando el kit de análisis de proteínas BCA (Thermo Fisher, MA, EE.UU.). ELISA: Rabbit anti-pig IgG (peroxidasa de rábano caballar (HRP)), Goat Anti-Pig IgA (HRP) fueron comprados a Abcam. Segundo anticuerpo: Anticuerpo IgG de cabra conjugado DyLight 649 anticuerpo IgG de cabra conjugado, DyLight 488-anticuerpo IgG de cabra conjugado, DyLight 594-anticuerpo IgG de cabra conjugado fueron comprados a Multiciencia, Hangzhou, China. Sistema basado en ABC (anticuerpo IgG de cabra bitinilada) fue utilizado como el anticuerpo secundario con DAB como un cromogeno fue comprado a Boster, Wuhan, China. Cochinchos DLY específicos libres de patógenos (Duroc y Landrace y Yorkshire) fueron amablemente proporcionados por la Academia Jiangsu de Ciencias Agrícolas (Nanjing, China). Los experimentos con animales habían sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Agrícola de Nanjing y siguieron las directrices de los Doce lechones recién nacidos fueron divididos aleatoriamente en tres grupos (cuatro lechones en cada grupo) y alojados en condiciones similares en diferentes establos para evitar la contaminación cruzada probiótica. Los lechones fueron dosificados por vía oral con 100 μl de B. subtilis-RC. Los grupos de control de lechones fueron administrados por vía oral con PEDV inactivado (100 μg/dosis) e igual volumen de PBS. El protocolo de inmunización fue realizado en los lechones que tenían 5 días de edad (Figura 1C ), y firmados como 0 día. Luego se administraron vacunas de refuerzo en 5 días. Luego se realizó la recolección de especímenes cada 7 días después de la inmunización de refuerzo (Figura 1C ). Se recolectaron muestras de sangre semanalmente de todos los lechones después de la inmunización de refuerzo y se les permitió coagular durante la noche a temperatura Las muestras de sangre se separaron mediante centrifugación y se almacenaron a −20 • C para detectar los niveles de IgG e IgA específicos. Se recolectaron tres hisopos cada semana durante 1 mes, incluyendo hisopos nasales, orales y de heces para el ELISA. Los lechones fueron sacrificados en 33 días. La misma ubicación de los tejidos del intestino delgado y del íleo de cada cerdito se fijaron con el líquido de Bonn y un 4% de paraformaldehído. Los tejidos del intestino delgado en la misma ubicación se fijaron con solución fijadora de Bouin durante 24 h, incrustados en parafina, y seccionaron a un espesor de 4 μm. Las secciones se colocaron en diapositivas de vidrio. La tinción de hematoxilina-eosina se aplicó a las secciones de parafina, y luego se observaron y tomaron fotografías bajo microscopio El número de linfocitos intraepiteliales (IEL) se contaron en cada 100 células epiteliales bajo el mismo microscopio de luz múltiple entre diez imágenes de cada grupo [24]. La detección inmunohistoquímica se realizó con el kit SABC (Boster Bioscience), se utilizó peróxido de hidrógeno para desactivar la peroxidasa intrínseca. La recuperación de antígenos se realizó en un baño de agua utilizando tampón citrato-EDTA (10 mM ácido cítrico, 2 mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 6.2). Las secciones se incubaron con anticuerpo anti-IgA diluido (1:100; Abcam) durante la noche a las 4 • C. Como controles negativos, inmunoteñido realizado mediante muestras de control antiserum en lugar de anticuerpo primario. La adición de anticuerpo secundario marcado con biotina a las diapositivas fue seguida por la Después de la tinción con DAB, las diapositivas fueron grabadas utilizando una cámara digital (Leica-DM4000B) [25]. Los intestinos aislados con PP fueron transferidos a PBS helados. Luego, el resto de grasa y tejido conectivo fue removido y lavado a fondo con PBS helado. Luego, el intestino fue cortado longitudinalmente en fragmentos de 0,5 cm. Los fragmentos fueron incubados con 5 ml de EDTA 30 mM y colocados en solución digestiva de 5 ml que contenía 4 % FBS, 0,5 mg/ml cada uno de Collagenasa D (Roche) y Dnasa I (Sigma), y 50 U/ml Dispasa (Fisher). Los fragmentos fueron incubados con PBS de Dulbecco (DPBS) durante 20 min a 37 • C por rotación lenta (100 rpm). Después de la incubación, la capa de células epiteliales que contenía los LIE fueron separadas por un vórtice intensivo y pasaron a través de un colador celular de 70-μm. La suspensión monocelular fue recogida y lavada dos veces por DPBS, la solución fue vórtice intensamente y pasó a través de un colador celular de 40-μm. Los sobrenadantes fueron lavados por medio de RPM 1640 preenfriado (Thermo Fisher Scientific) y suspendidos por 10 ml de la fracción 40% de un gradiente de 40:80 Percoll, superpuestos sobre 5 ml de la fracción 80% en un tubo Falcon de 15 ml. La separación de gradiente de Percoll fue realizada por centrifugación durante 20 min a 2500 rpm. Los linfocitos LP (LPL) fueron recolectados en la interfase del gradiente Mientras tanto, el análisis de citometría de flujo se realizó en instrumentos BD Facscalibur (BD Biosciences) y fue analizado por el software FlowJo. Todos los anticuerpos fueron adquiridos de BD Pharmingen o eBiociencias. Suspensiones unicelulares aisladas fueron manchadas con anti-CD3-APC, anti-CD4-FITC, anti-CD8-PE, todas a la 1:100 dilución durante 30 min sobre hielo, y lavadas con PBS dos veces, y analizadas por FACS [26]. Las citoquinas interleucinas (IL) 10 (IL-10) e IL-1β (Abcam) fueron medidas por ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los datos fueron adquiridos en un lector de placas ELISA automatizado en OD 450 nm inmediatamente. Los anticuerpos neutralizantes de PEDV fueron medidos en líquido lavado de intestinos La prueba se realizó como se describió previamente con modificaciones menores [27]. Un total de 450 μl de líquido de lavado de intestino fue dos veces diluido en serie y mezclado con 50 μl de suspensión viral que contenía 10 3 TCID 50 PEDV virus durante 1 h a 37 • C en placas de cultivo de tejido de fondo plano de 12 pocillos. La mezcla fue inoculada durante 1 h a 37 • C y 5% CO 2. Luego, la mezcla fue inoculada con células Vero suspensión (aproximadamente 1,0 × 10 6 ml − 1 ) durante otros 3-4 días. Después de la tinción con Crystal Violet, las placas fueron observadas bajo un microscopio para el efecto citopático. Los datos fueron obtenidos como el medio + − S.E.M. de tres réplicas por prueba en un solo experimento. GraphPad Prism V Las múltiples pruebas de comparación de Tukey y ANOVA de un solo sentido fueron utilizadas para analizar la significación de la diferencia entre los medios. Los valores-P inferiores a 0,05 (P<0,05) fueron considerados significativos y los valores-P inferiores a 0,01 (P<0,01) como altamente significativos. Los PP son un concentrado de tejido linfoide y el sitio primario para la producción de inmunoglobulina A (IgA), lo cual es crucial para regular el equilibrio homeostático del intestino [28]. El área de los PP es un indicador clave de inmunidad. La administración oral con B. subtilis-RC significativamente (P<0,01) aumentó el área de los PP en comparación con dos grupos control como se muestra en la Figura 1A. Además, la longitud de la vili del íleum obtuvo más tiempo por administración oral con B. subtilis-RC (P<0,01) que Estos confirmaron principalmente que B. subtilis-RC fue beneficioso para mantener la estructura del intestino. Los IEL intestinales son una población grande y diversa de células linfoides que residen dentro de las células epiteliales intestinales (IECs), y que forman la barrera mucosa intestinal [29]. Los IELs son una parte importante del sistema inmunológico de la mucosa intestinal. El nivel de anticuerpos específicos anti-PEDV íleum IgA + secretación (SIgA) en lechones fue medido por ELISA en la boca y heces. Como se muestra en la Figura 3A, B, la mucosa específica del antígeno SIgA en los sitios anteriores fue claramente mayor que el grupo PEDV inactivado (P<0,05 o P<0,01). Como se esperaba, la boca tenía niveles más altos de SIgA que otros sitios. Después de la inmunización oral, el nivel de anticuerpo anti-PEDV IgG sérico en lechones inmunizados con B. subtilis-RC, PEDV inactivado o PBS fue determinado por ELISA, como se muestra en la Figura 3C. Los resultados indicaron que aunque los títulos cayeron durante el período de muestreo, el nivel IgG de B. subtilis-RC todavía aumentó significativamente de 0 a 33 días que el grupo PEDV inactivado (P<0,05 o P<0,01). Los linfocitos CD3 + T son los marcadores de la superficie celular fundamental de los linfocitos T, por lo que el número de linfocitos CD3 + T podría representar la cantidad de linfocitos T. En consecuencia, se analizó el número de linfocitos CD3 + T en el íleo. Los datos indicaron que tanto B. subtilis-RC como PEDV inactivado podrían aumentar dramáticamente (P<0,05) los linfocitos CD3 + T en comparación con el grupo PBS (Figura 4A ). Estos cambios mostraron evidencia segura de que la administración oral con B. subtilis-RC tuvo una buena influencia en la inmunidad de la mucosa intestinal en lechones. SIgA es el principal isotipo de inmunoglobulina en animales, en gran parte secretado a través de la superficie de la mucosa intestinal especialmente en el intestino delgado [30]. SIgA juega un papel importante en la inmunidad de la mucosa intestinal y refleja en la inmunidad de la mucosa intestinal. Después de la administración oral con B. subtilis-RC, el número de células secretantes IgA había aumentado rápidamente en comparación con los otros dos grupos (P<0,05) (Figura 4B). Estos resultados mostraron que la administración oral con B. subtilis-RC fue propicia a la inmunidad mucosa intestinal y podría aumentar el número de células secretadoras de IgA para producir efectos positivos sobre la infección por PEDV. Gran parte de las células inmunitarias están dispersas en las células epiteliales. Las IEC interactúan directa o indirectamente con las células inmunes innatas y adaptativas mediante la presentación de antígenos a los linfocitos [31]. Por lo tanto, el aprendizaje sobre cómo se distribuyen los linfocitos en la pequeña mucosa intestinal es muy significativo para la inmunología de la mucosa. Datos previos habían demostrado que los linfocitos CD3 + T aumentaron significativamente (P<0,05) (Figura 4A ), por lo que se analizó más adelante la clasificación inmunológica de CD3 + T linfocitos. El linfocito del íleo con unión de PP Estos resultados mostraron que las células CD3 + CD4 + T han aumentado obviamente (P<0,01) (Figura 5B ), sin embargo las células CD3 + CD8 + T disminuyeron notablemente (P<0,05) (Figura 5C ). Después del cálculo, la relación de células CD4 + /CD8 + T aumentó (Figura 5D ). Esta relación también podría medir más los niveles de inmunidad de los lechones. Los niveles de citoquina IL-1β e IL-10 se determinaron para evaluar las respuestas inmunes celulares inducidas por B. subtilis-RC como se muestra en la Figura 6A,B. Como podemos ver en el diagrama, significativamente (P<0,01) se produjeron IL-1β e IL-10 superiores después de la administración oral con B. subtilis-RC que los otros dos grupos. Todos estos revelaron que B. subtilis-RC podría estimular la liberación de citoquinas para mediar la comunicación con y entre las células del sistema inmunitario, mejorando la respuesta inmune mucosa a la infección por PEDV. Los anticuerpos neutralizantes del PEDV fueron detectados por el ensayo PRNT. La administración oral con B. subtilis-RC podría reducir efectivamente la capacidad de formación de placa de PEDV (P<0,01) en comparación con otros dos grupos en la Figura 7. Esto reveló que B. subtilis-RC podría estimular un alto nivel de anticuerpos neutralizantes del PEDV contra la infección por PEDV. En medio del brote del PEDV, se han desarrollado varias vacunas para controlar enfermedades y los efectos son insatisfactorios. Las vacunas orales pueden inducir una inmunidad mucosa más robusta que las contrapartes inyectables [32]. Ahora está claro que la respuesta inmune mucosal efectiva requiere IgG sérico y SIgA mucosal [34]. SIgA es la base del sistema inmune mucosal, desempeñando un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis inmune, y neutralizando los patógenos invasivos. IgG sérico representa respuestas inmunes sistémicas. Durante las infecciones por PEDV, la inmunización oral provoca no sólo mucosas sino también respuestas inmunes sistémicas muy bien [35]. Nuestros datos mostraron una respuesta IgG anti-PEDV fuerte y de larga duración se detectaron por vía oral con B. subtilis-RC en lechones. Aunque con el paso del tiempo, los títulos de anticuerpos disminuyeron un poco, todavía se mantuvo en la cabeza en comparación con los grupos de control y de acuerdo con la tendencia cambiante de anticuerpos. El cambio de IgA específica mostró resultados similares en la mucosa de boca y heces. A medida que aumenta la inmunidad adicional, B. subtilis-RC reduce la capacidad de los patógenos para cruzar la mucosa intestinal y la propagación sistémica de patógenos invasivos [36]. El sistema inmunitario de la mucosa genera respuestas inmunitarias a través de células inmunitarias que residen en compartimentos de la mucosa. Los linfocitos T residentes en la mucosa desempeñan un papel importante en la inmunidad de la mucosa [37]. Exploramos más a fondo la especie, las cantidades y la distribución de linfocitos T en la mucosa intestinal. CD3 es un marcador de superficie celular fundamental de linfocitos T [38]. El resultado mostró que el número de linfocitos CD3 + T aumentó significativamente, y estos revelaron que B. subtilis-RC podría estimular la maduración de células T. Según las moléculas expresadas en la superficie celular, los linfocitos T pueden dividirse aún más en células T ayudantes Además, observamos que la relación de células CD4 + /CD8 + T aumentó por vía oral. La relación CD4/CD8 mide la relación de células T ayudantes a células T citotóxicas. Por lo tanto, pudimos ver que la administración oral B. subtilis-RC podría fortalecer la respuesta inmune Th1 al aumentar la relación de células CD4 + /CD8 + T. La morfología del intestino delgado puede reflejar directamente la salud intestinal y desempeña un papel importante en el mantenimiento del sistema inmunitario intestinal [40]. La fase temprana de la infección por PEDV se acompaña frecuentemente de necrosis y exfoliación de células epiteliales villosas infectadas, lo que en última instancia resulta en atrofia villosa aguda y severa [41]. Por lo tanto, el trabajo efectivo de mantener la morfología intestinal es un buen indicador para evaluar la eficacia de las vacunas. Después de la Los PP son pequeñas masas de tejido linfático y forman una parte importante del sistema inmunitario mediante el reclutamiento e inducción de las células T para prevenir el crecimiento de patógenos en los intestinos. Además, un aumento en el número de IEL demostró la eficacia de B. subtilis-RC. Además, la longitud de vellosidad del íleo mostró algunos resultados alentadores que una morfología intestinal bien formada llegó a ser por B. subtilis-RC. La morfología intestinal satisfactoria fue el primer paso en la carretera contra la infección por PEDV. Varios resultados de morfología demostraron que B. subtilis-RC podría mantener notablemente la morfología intestinal y formar una protección integral. Como se mencionó anteriormente, la administración oral con B. subtilis-RC podría estimular la proliferación y diferenciación de células T y modular la respuesta inmune. Además, las citocinas son proteínas moléculas pequeñas con amplia actividad biológica, sintetizadas y secretadas por las células inmunes y algunas células no inmunes [42]. Como molécula de señalización celular, actúa principalmente para regular las respuestas inmunes, participando en la diferenciación y desarrollo de las células inmunes, mediando las respuestas inflamatorias, estimulando la hematopoyesis y participando en la reparación de los tejidos. Estudios previos habían demostrado que el PEDV inhibió tanto las citoquinas NF-.B como las citoquinas proinflamatorias [43]. Por lo tanto, las citoquinas son un indicador clave para evaluar la capacidad de una vacuna para estimular las respuestas inmunes. En este estudio, habíamos observado que IL-1β e IL-10 aumentaron notablemente (P<0.01). El IL-1β como una de las primeras citoquinas proinflamatorias y participa centralmente en la iniciación La investigación había demostrado que IL-1β podría aumentar significativamente la regulación de los tejidos inmunes locales y sistémicos post infección microbiana [44]. Además, IL-10 es una potente citocina antiinflamatoria que juega un papel esencial en la prevención de patologías inflamatorias e autoinmunes [45]. En resumen, ambos datos mostraron que la administración oral con B. subtilis-RC regulada y aumenta la inmunidad mediante citocinas IL-1β e IL-10 de alta regulación. En conclusión, los resultados actuales demostraron que la inmunización oral con B. subtilis-RC podría inducir efectivamente a la mucosa local y respuestas inmunes sistemáticas contra la infección por PEDV, al tiempo que mejora y regula la función inmune elevando la proporción de células CD4 + /CD8 + T y citocinas IL-1β e IL-10, apuntando así a una prometedora vacuna oral candidata para la infección

¿Qué células están infectadas por el virus PED?

Respuestas inmunes mucosas inducidas por la administración oral recombinante Bacillus subtilis que expresa el antígeno COE de PEDV en lechones recién nacidoshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6418403/SHA: 5caced13bcb8a42cca41369c5a71ae7df5381ca8Autores: Wang, Jialu; Huang, Lulu; Mou, Chunxiao; Zhang, En; Wang, Yongheng; Cao, Yanan; Yang, QianFecha: 2019-03-15DOI: 10.1042/bsr20182028Licencia: cc-byAbstract: La diarrea epidémica porcina (PED) es una enfermedad altamente contagiosa en lechones recién nacidos y causa pérdidas económicas sustanciales en el El virus PED (PEDV) se disemina por contacto fecal-oral y puede prevenirse mediante inmunización oral. Por lo tanto, es necesario desarrollar una vacuna oral eficaz contra la infección por PEDV. Actualmente, Bacillus subtilis como portador de la vacuna recombinante se ha utilizado para la administración de antígenos y se ha demostrado que es inmunitaria y segura. El presente estudio evaluó la inmunogenicidad de Bacillus subtilis recombinante (B. subtilis-RC) en lechones por vía oral. Después de la inmunización oral en lechones, B. subtilis-RC aumentó significativamente las respuestas inmunitarias de la mucosa local. La administración oral con B. subtilis-RC mejoró significativamente el nivel de anticuerpos contra la infección por PEDV específicos de la inmunoglobulina A (IgA) mediante la ampliación del área de los parches (PP) de Peyer y Mientras tanto, B. subtilis-RC aumentó notablemente el número de linfocitos intraepiteliales (IEL). También observamos que la administración oral de B. subtilis-RC aumentó significativamente el número de linfocitos CD3(+)T y mejoró la proporción de células T CD4(+)/CD8(+). Además, los títulos altos de inmunoglobulina G (IgG) sérica específica revelaron una respuesta inmunitaria sistémica satisfactoria contra la infección por PEDV. En resumen, nuestro estudio demostró que la administración oral de B. subtilis-RC podría desencadenar un alto nivel de respuestas inmunitarias locales y sistémicas y sería una vacuna candidata prometedora contra la infección por PEDV en lechones. Texto: Diarrea epidémica porcina (PED) caracterizada por diarrea aguda altamente fatal en lechones, resulta en enormes pérdidas en la industria porcina mundial [1] El agente causante del virus PED (PEDV) pertenece a los coronavirus porcinos (CoVs). La infección por PEDV se propaga principalmente a través del tracto digestivo [2], y daña las superficies mucosas del intestino huésped infectando las células epiteliales intestinales [3]. Por lo tanto, la mejora de la inmunidad mucosa intestinal puede provocar respuestas inmunológicas eficaces contra la infección por PEDV [4]. Actualmente, se han desarrollado y aplicado ampliamente en el mercado vacunas tradicionales (vía intramuscular o inyección subcutánea) [5]. Estas vacunas administradas por vía parenteral no pueden inducir eficazmente títulos altos de anticuerpos maternos y anticuerpos IgA específicos del virus, lo que resulta en una protección mucosa inadecuada contra la infección por PEDV [6]. Además, estos anticuerpos maternos en la leche siempre fueron degradados por el ácido gástrico y la pepsina antes de entrar en el tracto intestinal. Las vacunas Como una forma superior de inmunización mucosal, la administración oral puede proteger el intestino y estimular el sistema inmunológico mucosal común [8]. Además, la inmunización oral tiene varias características atractivas que incluyen la seguridad, y un enfoque sencillo, barato y sin agujas [9]. Por lo tanto, la inmunización oral a menudo ofrece grandes cantidades de antígenos para prevenir las enfermedades diarreicas [10]. Sin embargo, hay varios desafíos por la inmunización oral, que consisten en barreras físicas, químicas y biológicas al entregar antígenos al tracto gastrointestinal (como ácidos gástricos, pepsina y tripsina en el tracto GI) [11]. Es un problema sustancial que los ácidos digestivos y las proteasas pueden degradar las proteínas antígenos para la absorción de nutrientes [12]. Por lo tanto, el sistema de administración de vacunas se ha aplicado para resolver el problema. El sistema puede proteger antígenos del entorno severo del tracto GI y entregar antígenos a la mucosa intestinal Actualmente, Bacillus subtilis (B. subtilis) es ampliamente utilizado como un sistema de administración de vacunas por sus características únicas. Como bacteria Gram-positiva no patógena, B. subtilis ha sido considerado como un nuevo probiótico y aditivo alimentario en humanos y animales [14]. El B. subtilis tiene actividad adyuvante y puede entregar antígenos heterólogos al tracto GI, proporcionando estimulación de inmunidad adicional [15]. Además, la investigación había demostrado que B. subtilis administrado por vía oral también podría mejorar la regulación inmunitaria y la salud intestinal en cerdos [16]. Además, la administración oral de B. subtilis podría generar respuestas inmunes humorales y celulares al mantenimiento de la homeostasis intestinal por células dendríticas [17]. Los DC son las células de antígeno profesional más importantes y pueden regular eficazmente los títulos de anticuerpos [18 Los DCs existen naturalmente en el tejido linfoide asociado al intestino (GALT), incluyendo los parches de Peyer (PPs), folículos linfoides aislados (FIL), ganglios linfáticos mesentéricos (MLNs), y se dispersan a través de la lámina subepitelial propria (LP) del intestino delgado y el colon [19]. Además, B. subtilis es conveniente para la manipulación genética y ha desarrollado una gran variedad de herramientas genéticas [20]. Por lo tanto, B. subtilis se utiliza ampliamente como un sistema eficaz de administración de vacunas para inducir respuestas inmunes mucosas y muestra un efecto único en el sistema inmunitario. En el presente informe, exploramos el efecto inmune de un B. subtilis recombinante (B. subtilis-RC) que se había construido con éxito con la expresión de la proteína PEDV COE en lechones. Nuestra investigación indicó que B. subtilis-RC era beneficioso para el desarrollo del sistema inmunológico mucosal, y podía generar anticuerpos específicos contra la infección por PEDV, sugiriendo un posible enfoque para prevenir la infección por PEDV. El B. subtilis WB800 fue amablemente proporcionado por el Dr. Xuewen Gao (del departamento de patología vegetal de la Universidad Agrícola de Nanjing) [21]. B. subtilis-RC construido previamente en nuestro laboratorio fue capaz de expresar el gen COE (499-638 aminoácidos en proteína S). Antes de la administración oral, la cepa recombinante fue cultivada en caldo LB a 37 • C durante 12 h, y luego se lavó dos veces con PBS, y se suspendió en PBS para alcanzar una concentración final de 1 × 10 10 CFU/ml. La cepa PEDV Zhejiang08 fue proporcionada por el Centro El virus se cultivó en células renales de mono verde africano (células VERO) y se purificó utilizando un gradiente discontinuo de densidad de sacarosa. El virus fue inactivado por UV a dosis UV de 4 J/cm 2 durante 24 h para lograr una pérdida completa de infectividad [23]. La concentración del virus purificado se midió utilizando el kit de análisis de proteínas BCA (Thermo Fisher, MA, EE.UU.). ELISA: Rabbit anti-pig IgG (peroxidasa de rábano caballar (HRP)), Goat Anti-Pig IgA (HRP) fueron comprados a Abcam. Segundo anticuerpo: Anticuerpo IgG de cabra conjugado DyLight 649 anticuerpo IgG de cabra conjugado, DyLight 488-anticuerpo IgG de cabra conjugado, DyLight 594-anticuerpo IgG de cabra conjugado fueron comprados a Multiciencia, Hangzhou, China. Sistema basado en ABC (anticuerpo IgG de cabra bitinilada) fue utilizado como el anticuerpo secundario con DAB como un cromogeno fue comprado a Boster, Wuhan, China. Cochinchos DLY específicos libres de patógenos (Duroc y Landrace y Yorkshire) fueron amablemente proporcionados por la Academia Jiangsu de Ciencias Agrícolas (Nanjing, China). Los experimentos con animales habían sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Agrícola de Nanjing y siguieron las directrices de los Doce lechones recién nacidos fueron divididos aleatoriamente en tres grupos (cuatro lechones en cada grupo) y alojados en condiciones similares en diferentes establos para evitar la contaminación cruzada probiótica. Los lechones fueron dosificados por vía oral con 100 μl de B. subtilis-RC. Los grupos de control de lechones fueron administrados por vía oral con PEDV inactivado (100 μg/dosis) e igual volumen de PBS. El protocolo de inmunización fue realizado en los lechones que tenían 5 días de edad (Figura 1C ), y firmados como 0 día. Luego se administraron vacunas de refuerzo en 5 días. Luego se realizó la recolección de especímenes cada 7 días después de la inmunización de refuerzo (Figura 1C ). Se recolectaron muestras de sangre semanalmente de todos los lechones después de la inmunización de refuerzo y se les permitió coagular durante la noche a temperatura Las muestras de sangre se separaron mediante centrifugación y se almacenaron a −20 • C para detectar los niveles de IgG e IgA específicos. Se recolectaron tres hisopos cada semana durante 1 mes, incluyendo hisopos nasales, orales y de heces para el ELISA. Los lechones fueron sacrificados en 33 días. La misma ubicación de los tejidos del intestino delgado y del íleo de cada cerdito se fijaron con el líquido de Bonn y un 4% de paraformaldehído. Los tejidos del intestino delgado en la misma ubicación se fijaron con solución fijadora de Bouin durante 24 h, incrustados en parafina, y seccionaron a un espesor de 4 μm. Las secciones se colocaron en diapositivas de vidrio. La tinción de hematoxilina-eosina se aplicó a las secciones de parafina, y luego se observaron y tomaron fotografías bajo microscopio El número de linfocitos intraepiteliales (IEL) se contaron en cada 100 células epiteliales bajo el mismo microscopio de luz múltiple entre diez imágenes de cada grupo [24]. La detección inmunohistoquímica se realizó con el kit SABC (Boster Bioscience), se utilizó peróxido de hidrógeno para desactivar la peroxidasa intrínseca. La recuperación de antígenos se realizó en un baño de agua utilizando tampón citrato-EDTA (10 mM ácido cítrico, 2 mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 6.2). Las secciones se incubaron con anticuerpo anti-IgA diluido (1:100; Abcam) durante la noche a las 4 • C. Como controles negativos, inmunoteñido realizado mediante muestras de control antiserum en lugar de anticuerpo primario. La adición de anticuerpo secundario marcado con biotina a las diapositivas fue seguida por la Después de la tinción con DAB, las diapositivas fueron grabadas utilizando una cámara digital (Leica-DM4000B) [25]. Los intestinos aislados con PP fueron transferidos a PBS helados. Luego, el resto de grasa y tejido conectivo fue removido y lavado a fondo con PBS helado. Luego, el intestino fue cortado longitudinalmente en fragmentos de 0,5 cm. Los fragmentos fueron incubados con 5 ml de EDTA 30 mM y colocados en solución digestiva de 5 ml que contenía 4 % FBS, 0,5 mg/ml cada uno de Collagenasa D (Roche) y Dnasa I (Sigma), y 50 U/ml Dispasa (Fisher). Los fragmentos fueron incubados con PBS de Dulbecco (DPBS) durante 20 min a 37 • C por rotación lenta (100 rpm). Después de la incubación, la capa de células epiteliales que contenía los LIE fueron separadas por un vórtice intensivo y pasaron a través de un colador celular de 70-μm. La suspensión monocelular fue recogida y lavada dos veces por DPBS, la solución fue vórtice intensamente y pasó a través de un colador celular de 40-μm. Los sobrenadantes fueron lavados por medio de RPM 1640 preenfriado (Thermo Fisher Scientific) y suspendidos por 10 ml de la fracción 40% de un gradiente de 40:80 Percoll, superpuestos sobre 5 ml de la fracción 80% en un tubo Falcon de 15 ml. La separación de gradiente de Percoll fue realizada por centrifugación durante 20 min a 2500 rpm. Los linfocitos LP (LPL) fueron recolectados en la interfase del gradiente Mientras tanto, el análisis de citometría de flujo se realizó en instrumentos BD Facscalibur (BD Biosciences) y fue analizado por el software FlowJo. Todos los anticuerpos fueron adquiridos de BD Pharmingen o eBiociencias. Suspensiones unicelulares aisladas fueron manchadas con anti-CD3-APC, anti-CD4-FITC, anti-CD8-PE, todas a la 1:100 dilución durante 30 min sobre hielo, y lavadas con PBS dos veces, y analizadas por FACS [26]. Las citoquinas interleucinas (IL) 10 (IL-10) e IL-1β (Abcam) fueron medidas por ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los datos fueron adquiridos en un lector de placas ELISA automatizado en OD 450 nm inmediatamente. Los anticuerpos neutralizantes de PEDV fueron medidos en líquido lavado de intestinos La prueba se realizó como se describió previamente con modificaciones menores [27]. Un total de 450 μl de líquido de lavado de intestino fue dos veces diluido en serie y mezclado con 50 μl de suspensión viral que contenía 10 3 TCID 50 PEDV virus durante 1 h a 37 • C en placas de cultivo de tejido de fondo plano de 12 pocillos. La mezcla fue inoculada durante 1 h a 37 • C y 5% CO 2. Luego, la mezcla fue inoculada con células Vero suspensión (aproximadamente 1,0 × 10 6 ml − 1 ) durante otros 3-4 días. Después de la tinción con Crystal Violet, las placas fueron observadas bajo un microscopio para el efecto citopático. Los datos fueron obtenidos como el medio + − S.E.M. de tres réplicas por prueba en un solo experimento. GraphPad Prism V Las múltiples pruebas de comparación de Tukey y ANOVA de un solo sentido fueron utilizadas para analizar la significación de la diferencia entre los medios. Los valores-P inferiores a 0,05 (P<0,05) fueron considerados significativos y los valores-P inferiores a 0,01 (P<0,01) como altamente significativos. Los PP son un concentrado de tejido linfoide y el sitio primario para la producción de inmunoglobulina A (IgA), lo cual es crucial para regular el equilibrio homeostático del intestino [28]. El área de los PP es un indicador clave de inmunidad. La administración oral con B. subtilis-RC significativamente (P<0,01) aumentó el área de los PP en comparación con dos grupos control como se muestra en la Figura 1A. Además, la longitud de la vili del íleum obtuvo más tiempo por administración oral con B. subtilis-RC (P<0,01) que Estos confirmaron principalmente que B. subtilis-RC fue beneficioso para mantener la estructura del intestino. Los IEL intestinales son una población grande y diversa de células linfoides que residen dentro de las células epiteliales intestinales (IECs), y que forman la barrera mucosa intestinal [29]. Los IELs son una parte importante del sistema inmunológico de la mucosa intestinal. El nivel de anticuerpos específicos anti-PEDV íleum IgA + secretación (SIgA) en lechones fue medido por ELISA en la boca y heces. Como se muestra en la Figura 3A, B, la mucosa específica del antígeno SIgA en los sitios anteriores fue claramente mayor que el grupo PEDV inactivado (P<0,05 o P<0,01). Como se esperaba, la boca tenía niveles más altos de SIgA que otros sitios. Después de la inmunización oral, el nivel de anticuerpo anti-PEDV IgG sérico en lechones inmunizados con B. subtilis-RC, PEDV inactivado o PBS fue determinado por ELISA, como se muestra en la Figura 3C. Los resultados indicaron que aunque los títulos cayeron durante el período de muestreo, el nivel IgG de B. subtilis-RC todavía aumentó significativamente de 0 a 33 días que el grupo PEDV inactivado (P<0,05 o P<0,01). Los linfocitos CD3 + T son los marcadores de la superficie celular fundamental de los linfocitos T, por lo que el número de linfocitos CD3 + T podría representar la cantidad de linfocitos T. En consecuencia, se analizó el número de linfocitos CD3 + T en el íleo. Los datos indicaron que tanto B. subtilis-RC como PEDV inactivado podrían aumentar dramáticamente (P<0,05) los linfocitos CD3 + T en comparación con el grupo PBS (Figura 4A ). Estos cambios mostraron evidencia segura de que la administración oral con B. subtilis-RC tuvo una buena influencia en la inmunidad de la mucosa intestinal en lechones. SIgA es el principal isotipo de inmunoglobulina en animales, en gran parte secretado a través de la superficie de la mucosa intestinal especialmente en el intestino delgado [30]. SIgA juega un papel importante en la inmunidad de la mucosa intestinal y refleja en la inmunidad de la mucosa intestinal. Después de la administración oral con B. subtilis-RC, el número de células secretantes IgA había aumentado rápidamente en comparación con los otros dos grupos (P<0,05) (Figura 4B). Estos resultados mostraron que la administración oral con B. subtilis-RC fue propicia a la inmunidad mucosa intestinal y podría aumentar el número de células secretadoras de IgA para producir efectos positivos sobre la infección por PEDV. Gran parte de las células inmunitarias están dispersas en las células epiteliales. Las IEC interactúan directa o indirectamente con las células inmunes innatas y adaptativas mediante la presentación de antígenos a los linfocitos [31]. Por lo tanto, el aprendizaje sobre cómo se distribuyen los linfocitos en la pequeña mucosa intestinal es muy significativo para la inmunología de la mucosa. Datos previos habían demostrado que los linfocitos CD3 + T aumentaron significativamente (P<0,05) (Figura 4A ), por lo que se analizó más adelante la clasificación inmunológica de CD3 + T linfocitos. El linfocito del íleo con unión de PP Estos resultados mostraron que las células CD3 + CD4 + T han aumentado obviamente (P<0,01) (Figura 5B ), sin embargo las células CD3 + CD8 + T disminuyeron notablemente (P<0,05) (Figura 5C ). Después del cálculo, la relación de células CD4 + /CD8 + T aumentó (Figura 5D ). Esta relación también podría medir más los niveles de inmunidad de los lechones. Los niveles de citoquina IL-1β e IL-10 se determinaron para evaluar las respuestas inmunes celulares inducidas por B. subtilis-RC como se muestra en la Figura 6A,B. Como podemos ver en el diagrama, significativamente (P<0,01) se produjeron IL-1β e IL-10 superiores después de la administración oral con B. subtilis-RC que los otros dos grupos. Todos estos revelaron que B. subtilis-RC podría estimular la liberación de citoquinas para mediar la comunicación con y entre las células del sistema inmunitario, mejorando la respuesta inmune mucosa a la infección por PEDV. Los anticuerpos neutralizantes del PEDV fueron detectados por el ensayo PRNT. La administración oral con B. subtilis-RC podría reducir efectivamente la capacidad de formación de placa de PEDV (P<0,01) en comparación con otros dos grupos en la Figura 7. Esto reveló que B. subtilis-RC podría estimular un alto nivel de anticuerpos neutralizantes del PEDV contra la infección por PEDV. En medio del brote del PEDV, se han desarrollado varias vacunas para controlar enfermedades y los efectos son insatisfactorios. Las vacunas orales pueden inducir una inmunidad mucosa más robusta que las contrapartes inyectables [32]. Ahora está claro que la respuesta inmune mucosal efectiva requiere IgG sérico y SIgA mucosal [34]. SIgA es la base del sistema inmune mucosal, desempeñando un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis inmune, y neutralizando los patógenos invasivos. IgG sérico representa respuestas inmunes sistémicas. Durante las infecciones por PEDV, la inmunización oral provoca no sólo mucosas sino también respuestas inmunes sistémicas muy bien [35]. Nuestros datos mostraron una respuesta IgG anti-PEDV fuerte y de larga duración se detectaron por vía oral con B. subtilis-RC en lechones. Aunque con el paso del tiempo, los títulos de anticuerpos disminuyeron un poco, todavía se mantuvo en la cabeza en comparación con los grupos de control y de acuerdo con la tendencia cambiante de anticuerpos. El cambio de IgA específica mostró resultados similares en la mucosa de boca y heces. A medida que aumenta la inmunidad adicional, B. subtilis-RC reduce la capacidad de los patógenos para cruzar la mucosa intestinal y la propagación sistémica de patógenos invasivos [36]. El sistema inmunitario de la mucosa genera respuestas inmunitarias a través de células inmunitarias que residen en compartimentos de la mucosa. Los linfocitos T residentes en la mucosa desempeñan un papel importante en la inmunidad de la mucosa [37]. Exploramos más a fondo la especie, las cantidades y la distribución de linfocitos T en la mucosa intestinal. CD3 es un marcador de superficie celular fundamental de linfocitos T [38]. El resultado mostró que el número de linfocitos CD3 + T aumentó significativamente, y estos revelaron que B. subtilis-RC podría estimular la maduración de células T. Según las moléculas expresadas en la superficie celular, los linfocitos T pueden dividirse aún más en células T ayudantes Además, observamos que la relación de células CD4 + /CD8 + T aumentó por vía oral. La relación CD4/CD8 mide la relación de células T ayudantes a células T citotóxicas. Por lo tanto, pudimos ver que la administración oral B. subtilis-RC podría fortalecer la respuesta inmune Th1 al aumentar la relación de células CD4 + /CD8 + T. La morfología del intestino delgado puede reflejar directamente la salud intestinal y desempeña un papel importante en el mantenimiento del sistema inmunitario intestinal [40]. La fase temprana de la infección por PEDV se acompaña frecuentemente de necrosis y exfoliación de células epiteliales villosas infectadas, lo que en última instancia resulta en atrofia villosa aguda y severa [41]. Por lo tanto, el trabajo efectivo de mantener la morfología intestinal es un buen indicador para evaluar la eficacia de las vacunas. Después de la Los PP son pequeñas masas de tejido linfático y forman una parte importante del sistema inmunitario mediante el reclutamiento e inducción de las células T para prevenir el crecimiento de patógenos en los intestinos. Además, un aumento en el número de IEL demostró la eficacia de B. subtilis-RC. Además, la longitud de vellosidad del íleo mostró algunos resultados alentadores que una morfología intestinal bien formada llegó a ser por B. subtilis-RC. La morfología intestinal satisfactoria fue el primer paso en la carretera contra la infección por PEDV. Varios resultados de morfología demostraron que B. subtilis-RC podría mantener notablemente la morfología intestinal y formar una protección integral. Como se mencionó anteriormente, la administración oral con B. subtilis-RC podría estimular la proliferación y diferenciación de células T y modular la respuesta inmune. Además, las citocinas son proteínas moléculas pequeñas con amplia actividad biológica, sintetizadas y secretadas por las células inmunes y algunas células no inmunes [42]. Como molécula de señalización celular, actúa principalmente para regular las respuestas inmunes, participando en la diferenciación y desarrollo de las células inmunes, mediando las respuestas inflamatorias, estimulando la hematopoyesis y participando en la reparación de los tejidos. Estudios previos habían demostrado que el PEDV inhibió tanto las citoquinas NF-.B como las citoquinas proinflamatorias [43]. Por lo tanto, las citoquinas son un indicador clave para evaluar la capacidad de una vacuna para estimular las respuestas inmunes. En este estudio, habíamos observado que IL-1β e IL-10 aumentaron notablemente (P<0.01). El IL-1β como una de las primeras citoquinas proinflamatorias y participa centralmente en la iniciación La investigación había demostrado que IL-1β podría aumentar significativamente la regulación de los tejidos inmunes locales y sistémicos post infección microbiana [44]. Además, IL-10 es una potente citocina antiinflamatoria que juega un papel esencial en la prevención de patologías inflamatorias e autoinmunes [45]. En resumen, ambos datos mostraron que la administración oral con B. subtilis-RC regulada y aumenta la inmunidad mediante citocinas IL-1β e IL-10 de alta regulación. En conclusión, los resultados actuales demostraron que la inmunización oral con B. subtilis-RC podría inducir efectivamente a la mucosa local y respuestas inmunes sistemáticas contra la infección por PEDV, al tiempo que mejora y regula la función inmune elevando la proporción de células CD4 + /CD8 + T y citocinas IL-1β e IL-10, apuntando así a una prometedora vacuna oral candidata para la infección

¿Qué tipo de respuestas inmunitarias son más eficaces en la prevención del virus PED?

Respuestas inmunes mucosas inducidas por la administración oral recombinante Bacillus subtilis que expresa el antígeno COE de PEDV en lechones recién nacidoshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6418403/SHA: 5caced13bcb8a42cca41369c5a71ae7df5381ca8Autores: Wang, Jialu; Huang, Lulu; Mou, Chunxiao; Zhang, En; Wang, Yongheng; Cao, Yanan; Yang, QianFecha: 2019-03-15DOI: 10.1042/bsr20182028Licencia: cc-byAbstract: La diarrea epidémica porcina (PED) es una enfermedad altamente contagiosa en lechones recién nacidos y causa pérdidas económicas sustanciales en el El virus PED (PEDV) se disemina por contacto fecal-oral y puede prevenirse mediante inmunización oral. Por lo tanto, es necesario desarrollar una vacuna oral eficaz contra la infección por PEDV. Actualmente, Bacillus subtilis como portador de la vacuna recombinante se ha utilizado para la administración de antígenos y se ha demostrado que es inmunitaria y segura. El presente estudio evaluó la inmunogenicidad de Bacillus subtilis recombinante (B. subtilis-RC) en lechones por vía oral. Después de la inmunización oral en lechones, B. subtilis-RC aumentó significativamente las respuestas inmunitarias de la mucosa local. La administración oral con B. subtilis-RC mejoró significativamente el nivel de anticuerpos contra la infección por PEDV específicos de la inmunoglobulina A (IgA) mediante la ampliación del área de los parches (PP) de Peyer y Mientras tanto, B. subtilis-RC aumentó notablemente el número de linfocitos intraepiteliales (IEL). También observamos que la administración oral de B. subtilis-RC aumentó significativamente el número de linfocitos CD3(+)T y mejoró la proporción de células T CD4(+)/CD8(+). Además, los títulos altos de inmunoglobulina G (IgG) sérica específica revelaron una respuesta inmunitaria sistémica satisfactoria contra la infección por PEDV. En resumen, nuestro estudio demostró que la administración oral de B. subtilis-RC podría desencadenar un alto nivel de respuestas inmunitarias locales y sistémicas y sería una vacuna candidata prometedora contra la infección por PEDV en lechones. Texto: Diarrea epidémica porcina (PED) caracterizada por diarrea aguda altamente fatal en lechones, resulta en enormes pérdidas en la industria porcina mundial [1] El agente causante del virus PED (PEDV) pertenece a los coronavirus porcinos (CoVs). La infección por PEDV se propaga principalmente a través del tracto digestivo [2], y daña las superficies mucosas del intestino huésped infectando las células epiteliales intestinales [3]. Por lo tanto, la mejora de la inmunidad mucosa intestinal puede provocar respuestas inmunológicas eficaces contra la infección por PEDV [4]. Actualmente, se han desarrollado y aplicado ampliamente en el mercado vacunas tradicionales (vía intramuscular o inyección subcutánea) [5]. Estas vacunas administradas por vía parenteral no pueden inducir eficazmente títulos altos de anticuerpos maternos y anticuerpos IgA específicos del virus, lo que resulta en una protección mucosa inadecuada contra la infección por PEDV [6]. Además, estos anticuerpos maternos en la leche siempre fueron degradados por el ácido gástrico y la pepsina antes de entrar en el tracto intestinal. Las vacunas Como una forma superior de inmunización mucosal, la administración oral puede proteger el intestino y estimular el sistema inmunológico mucosal común [8]. Además, la inmunización oral tiene varias características atractivas que incluyen la seguridad, y un enfoque sencillo, barato y sin agujas [9]. Por lo tanto, la inmunización oral a menudo ofrece grandes cantidades de antígenos para prevenir las enfermedades diarreicas [10]. Sin embargo, hay varios desafíos por la inmunización oral, que consisten en barreras físicas, químicas y biológicas al entregar antígenos al tracto gastrointestinal (como ácidos gástricos, pepsina y tripsina en el tracto GI) [11]. Es un problema sustancial que los ácidos digestivos y las proteasas pueden degradar las proteínas antígenos para la absorción de nutrientes [12]. Por lo tanto, el sistema de administración de vacunas se ha aplicado para resolver el problema. El sistema puede proteger antígenos del entorno severo del tracto GI y entregar antígenos a la mucosa intestinal Actualmente, Bacillus subtilis (B. subtilis) es ampliamente utilizado como un sistema de administración de vacunas por sus características únicas. Como bacteria Gram-positiva no patógena, B. subtilis ha sido considerado como un nuevo probiótico y aditivo alimentario en humanos y animales [14]. El B. subtilis tiene actividad adyuvante y puede entregar antígenos heterólogos al tracto GI, proporcionando estimulación de inmunidad adicional [15]. Además, la investigación había demostrado que B. subtilis administrado por vía oral también podría mejorar la regulación inmunitaria y la salud intestinal en cerdos [16]. Además, la administración oral de B. subtilis podría generar respuestas inmunes humorales y celulares al mantenimiento de la homeostasis intestinal por células dendríticas [17]. Los DC son las células de antígeno profesional más importantes y pueden regular eficazmente los títulos de anticuerpos [18 Los DCs existen naturalmente en el tejido linfoide asociado al intestino (GALT), incluyendo los parches de Peyer (PPs), folículos linfoides aislados (FIL), ganglios linfáticos mesentéricos (MLNs), y se dispersan a través de la lámina subepitelial propria (LP) del intestino delgado y el colon [19]. Además, B. subtilis es conveniente para la manipulación genética y ha desarrollado una gran variedad de herramientas genéticas [20]. Por lo tanto, B. subtilis se utiliza ampliamente como un sistema eficaz de administración de vacunas para inducir respuestas inmunes mucosas y muestra un efecto único en el sistema inmunitario. En el presente informe, exploramos el efecto inmune de un B. subtilis recombinante (B. subtilis-RC) que se había construido con éxito con la expresión de la proteína PEDV COE en lechones. Nuestra investigación indicó que B. subtilis-RC era beneficioso para el desarrollo del sistema inmunológico mucosal, y podía generar anticuerpos específicos contra la infección por PEDV, sugiriendo un posible enfoque para prevenir la infección por PEDV. El B. subtilis WB800 fue amablemente proporcionado por el Dr. Xuewen Gao (del departamento de patología vegetal de la Universidad Agrícola de Nanjing) [21]. B. subtilis-RC construido previamente en nuestro laboratorio fue capaz de expresar el gen COE (499-638 aminoácidos en proteína S). Antes de la administración oral, la cepa recombinante fue cultivada en caldo LB a 37 • C durante 12 h, y luego se lavó dos veces con PBS, y se suspendió en PBS para alcanzar una concentración final de 1 × 10 10 CFU/ml. La cepa PEDV Zhejiang08 fue proporcionada por el Centro El virus se cultivó en células renales de mono verde africano (células VERO) y se purificó utilizando un gradiente discontinuo de densidad de sacarosa. El virus fue inactivado por UV a dosis UV de 4 J/cm 2 durante 24 h para lograr una pérdida completa de infectividad [23]. La concentración del virus purificado se midió utilizando el kit de análisis de proteínas BCA (Thermo Fisher, MA, EE.UU.). ELISA: Rabbit anti-pig IgG (peroxidasa de rábano caballar (HRP)), Goat Anti-Pig IgA (HRP) fueron comprados a Abcam. Segundo anticuerpo: Anticuerpo IgG de cabra conjugado DyLight 649 anticuerpo IgG de cabra conjugado, DyLight 488-anticuerpo IgG de cabra conjugado, DyLight 594-anticuerpo IgG de cabra conjugado fueron comprados a Multiciencia, Hangzhou, China. Sistema basado en ABC (anticuerpo IgG de cabra bitinilada) fue utilizado como el anticuerpo secundario con DAB como un cromogeno fue comprado a Boster, Wuhan, China. Cochinchos DLY específicos libres de patógenos (Duroc y Landrace y Yorkshire) fueron amablemente proporcionados por la Academia Jiangsu de Ciencias Agrícolas (Nanjing, China). Los experimentos con animales habían sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Agrícola de Nanjing y siguieron las directrices de los Doce lechones recién nacidos fueron divididos aleatoriamente en tres grupos (cuatro lechones en cada grupo) y alojados en condiciones similares en diferentes establos para evitar la contaminación cruzada probiótica. Los lechones fueron dosificados por vía oral con 100 μl de B. subtilis-RC. Los grupos de control de lechones fueron administrados por vía oral con PEDV inactivado (100 μg/dosis) e igual volumen de PBS. El protocolo de inmunización fue realizado en los lechones que tenían 5 días de edad (Figura 1C ), y firmados como 0 día. Luego se administraron vacunas de refuerzo en 5 días. Luego se realizó la recolección de especímenes cada 7 días después de la inmunización de refuerzo (Figura 1C ). Se recolectaron muestras de sangre semanalmente de todos los lechones después de la inmunización de refuerzo y se les permitió coagular durante la noche a temperatura Las muestras de sangre se separaron mediante centrifugación y se almacenaron a −20 • C para detectar los niveles de IgG e IgA específicos. Se recolectaron tres hisopos cada semana durante 1 mes, incluyendo hisopos nasales, orales y de heces para el ELISA. Los lechones fueron sacrificados en 33 días. La misma ubicación de los tejidos del intestino delgado y del íleo de cada cerdito se fijaron con el líquido de Bonn y un 4% de paraformaldehído. Los tejidos del intestino delgado en la misma ubicación se fijaron con solución fijadora de Bouin durante 24 h, incrustados en parafina, y seccionaron a un espesor de 4 μm. Las secciones se colocaron en diapositivas de vidrio. La tinción de hematoxilina-eosina se aplicó a las secciones de parafina, y luego se observaron y tomaron fotografías bajo microscopio El número de linfocitos intraepiteliales (IEL) se contaron en cada 100 células epiteliales bajo el mismo microscopio de luz múltiple entre diez imágenes de cada grupo [24]. La detección inmunohistoquímica se realizó con el kit SABC (Boster Bioscience), se utilizó peróxido de hidrógeno para desactivar la peroxidasa intrínseca. La recuperación de antígenos se realizó en un baño de agua utilizando tampón citrato-EDTA (10 mM ácido cítrico, 2 mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 6.2). Las secciones se incubaron con anticuerpo anti-IgA diluido (1:100; Abcam) durante la noche a las 4 • C. Como controles negativos, inmunoteñido realizado mediante muestras de control antiserum en lugar de anticuerpo primario. La adición de anticuerpo secundario marcado con biotina a las diapositivas fue seguida por la Después de la tinción con DAB, las diapositivas fueron grabadas utilizando una cámara digital (Leica-DM4000B) [25]. Los intestinos aislados con PP fueron transferidos a PBS helados. Luego, el resto de grasa y tejido conectivo fue removido y lavado a fondo con PBS helado. Luego, el intestino fue cortado longitudinalmente en fragmentos de 0,5 cm. Los fragmentos fueron incubados con 5 ml de EDTA 30 mM y colocados en solución digestiva de 5 ml que contenía 4 % FBS, 0,5 mg/ml cada uno de Collagenasa D (Roche) y Dnasa I (Sigma), y 50 U/ml Dispasa (Fisher). Los fragmentos fueron incubados con PBS de Dulbecco (DPBS) durante 20 min a 37 • C por rotación lenta (100 rpm). Después de la incubación, la capa de células epiteliales que contenía los LIE fueron separadas por un vórtice intensivo y pasaron a través de un colador celular de 70-μm. La suspensión monocelular fue recogida y lavada dos veces por DPBS, la solución fue vórtice intensamente y pasó a través de un colador celular de 40-μm. Los sobrenadantes fueron lavados por medio de RPM 1640 preenfriado (Thermo Fisher Scientific) y suspendidos por 10 ml de la fracción 40% de un gradiente de 40:80 Percoll, superpuestos sobre 5 ml de la fracción 80% en un tubo Falcon de 15 ml. La separación de gradiente de Percoll fue realizada por centrifugación durante 20 min a 2500 rpm. Los linfocitos LP (LPL) fueron recolectados en la interfase del gradiente Mientras tanto, el análisis de citometría de flujo se realizó en instrumentos BD Facscalibur (BD Biosciences) y fue analizado por el software FlowJo. Todos los anticuerpos fueron adquiridos de BD Pharmingen o eBiociencias. Suspensiones unicelulares aisladas fueron manchadas con anti-CD3-APC, anti-CD4-FITC, anti-CD8-PE, todas a la 1:100 dilución durante 30 min sobre hielo, y lavadas con PBS dos veces, y analizadas por FACS [26]. Las citoquinas interleucinas (IL) 10 (IL-10) e IL-1β (Abcam) fueron medidas por ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los datos fueron adquiridos en un lector de placas ELISA automatizado en OD 450 nm inmediatamente. Los anticuerpos neutralizantes de PEDV fueron medidos en líquido lavado de intestinos La prueba se realizó como se describió previamente con modificaciones menores [27]. Un total de 450 μl de líquido de lavado de intestino fue dos veces diluido en serie y mezclado con 50 μl de suspensión viral que contenía 10 3 TCID 50 PEDV virus durante 1 h a 37 • C en placas de cultivo de tejido de fondo plano de 12 pocillos. La mezcla fue inoculada durante 1 h a 37 • C y 5% CO 2. Luego, la mezcla fue inoculada con células Vero suspensión (aproximadamente 1,0 × 10 6 ml − 1 ) durante otros 3-4 días. Después de la tinción con Crystal Violet, las placas fueron observadas bajo un microscopio para el efecto citopático. Los datos fueron obtenidos como el medio + − S.E.M. de tres réplicas por prueba en un solo experimento. GraphPad Prism V Las múltiples pruebas de comparación de Tukey y ANOVA de un solo sentido fueron utilizadas para analizar la significación de la diferencia entre los medios. Los valores-P inferiores a 0,05 (P<0,05) fueron considerados significativos y los valores-P inferiores a 0,01 (P<0,01) como altamente significativos. Los PP son un concentrado de tejido linfoide y el sitio primario para la producción de inmunoglobulina A (IgA), lo cual es crucial para regular el equilibrio homeostático del intestino [28]. El área de los PP es un indicador clave de inmunidad. La administración oral con B. subtilis-RC significativamente (P<0,01) aumentó el área de los PP en comparación con dos grupos control como se muestra en la Figura 1A. Además, la longitud de la vili del íleum obtuvo más tiempo por administración oral con B. subtilis-RC (P<0,01) que Estos confirmaron principalmente que B. subtilis-RC fue beneficioso para mantener la estructura del intestino. Los IEL intestinales son una población grande y diversa de células linfoides que residen dentro de las células epiteliales intestinales (IECs), y que forman la barrera mucosa intestinal [29]. Los IELs son una parte importante del sistema inmunológico de la mucosa intestinal. El nivel de anticuerpos específicos anti-PEDV íleum IgA + secretación (SIgA) en lechones fue medido por ELISA en la boca y heces. Como se muestra en la Figura 3A, B, la mucosa específica del antígeno SIgA en los sitios anteriores fue claramente mayor que el grupo PEDV inactivado (P<0,05 o P<0,01). Como se esperaba, la boca tenía niveles más altos de SIgA que otros sitios. Después de la inmunización oral, el nivel de anticuerpo anti-PEDV IgG sérico en lechones inmunizados con B. subtilis-RC, PEDV inactivado o PBS fue determinado por ELISA, como se muestra en la Figura 3C. Los resultados indicaron que aunque los títulos cayeron durante el período de muestreo, el nivel IgG de B. subtilis-RC todavía aumentó significativamente de 0 a 33 días que el grupo PEDV inactivado (P<0,05 o P<0,01). Los linfocitos CD3 + T son los marcadores de la superficie celular fundamental de los linfocitos T, por lo que el número de linfocitos CD3 + T podría representar la cantidad de linfocitos T. En consecuencia, se analizó el número de linfocitos CD3 + T en el íleo. Los datos indicaron que tanto B. subtilis-RC como PEDV inactivado podrían aumentar dramáticamente (P<0,05) los linfocitos CD3 + T en comparación con el grupo PBS (Figura 4A ). Estos cambios mostraron evidencia segura de que la administración oral con B. subtilis-RC tuvo una buena influencia en la inmunidad de la mucosa intestinal en lechones. SIgA es el principal isotipo de inmunoglobulina en animales, en gran parte secretado a través de la superficie de la mucosa intestinal especialmente en el intestino delgado [30]. SIgA juega un papel importante en la inmunidad de la mucosa intestinal y refleja en la inmunidad de la mucosa intestinal. Después de la administración oral con B. subtilis-RC, el número de células secretantes IgA había aumentado rápidamente en comparación con los otros dos grupos (P<0,05) (Figura 4B). Estos resultados mostraron que la administración oral con B. subtilis-RC fue propicia a la inmunidad mucosa intestinal y podría aumentar el número de células secretadoras de IgA para producir efectos positivos sobre la infección por PEDV. Gran parte de las células inmunitarias están dispersas en las células epiteliales. Las IEC interactúan directa o indirectamente con las células inmunes innatas y adaptativas mediante la presentación de antígenos a los linfocitos [31]. Por lo tanto, el aprendizaje sobre cómo se distribuyen los linfocitos en la pequeña mucosa intestinal es muy significativo para la inmunología de la mucosa. Datos previos habían demostrado que los linfocitos CD3 + T aumentaron significativamente (P<0,05) (Figura 4A ), por lo que se analizó más adelante la clasificación inmunológica de CD3 + T linfocitos. El linfocito del íleo con unión de PP Estos resultados mostraron que las células CD3 + CD4 + T han aumentado obviamente (P<0,01) (Figura 5B ), sin embargo las células CD3 + CD8 + T disminuyeron notablemente (P<0,05) (Figura 5C ). Después del cálculo, la relación de células CD4 + /CD8 + T aumentó (Figura 5D ). Esta relación también podría medir más los niveles de inmunidad de los lechones. Los niveles de citoquina IL-1β e IL-10 se determinaron para evaluar las respuestas inmunes celulares inducidas por B. subtilis-RC como se muestra en la Figura 6A,B. Como podemos ver en el diagrama, significativamente (P<0,01) se produjeron IL-1β e IL-10 superiores después de la administración oral con B. subtilis-RC que los otros dos grupos. Todos estos revelaron que B. subtilis-RC podría estimular la liberación de citoquinas para mediar la comunicación con y entre las células del sistema inmunitario, mejorando la respuesta inmune mucosa a la infección por PEDV. Los anticuerpos neutralizantes del PEDV fueron detectados por el ensayo PRNT. La administración oral con B. subtilis-RC podría reducir efectivamente la capacidad de formación de placa de PEDV (P<0,01) en comparación con otros dos grupos en la Figura 7. Esto reveló que B. subtilis-RC podría estimular un alto nivel de anticuerpos neutralizantes del PEDV contra la infección por PEDV. En medio del brote del PEDV, se han desarrollado varias vacunas para controlar enfermedades y los efectos son insatisfactorios. Las vacunas orales pueden inducir una inmunidad mucosa más robusta que las contrapartes inyectables [32]. Ahora está claro que la respuesta inmune mucosal efectiva requiere IgG sérico y SIgA mucosal [34]. SIgA es la base del sistema inmune mucosal, desempeñando un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis inmune, y neutralizando los patógenos invasivos. IgG sérico representa respuestas inmunes sistémicas. Durante las infecciones por PEDV, la inmunización oral provoca no sólo mucosas sino también respuestas inmunes sistémicas muy bien [35]. Nuestros datos mostraron una respuesta IgG anti-PEDV fuerte y de larga duración se detectaron por vía oral con B. subtilis-RC en lechones. Aunque con el paso del tiempo, los títulos de anticuerpos disminuyeron un poco, todavía se mantuvo en la cabeza en comparación con los grupos de control y de acuerdo con la tendencia cambiante de anticuerpos. El cambio de IgA específica mostró resultados similares en la mucosa de boca y heces. A medida que aumenta la inmunidad adicional, B. subtilis-RC reduce la capacidad de los patógenos para cruzar la mucosa intestinal y la propagación sistémica de patógenos invasivos [36]. El sistema inmunitario de la mucosa genera respuestas inmunitarias a través de células inmunitarias que residen en compartimentos de la mucosa. Los linfocitos T residentes en la mucosa desempeñan un papel importante en la inmunidad de la mucosa [37]. Exploramos más a fondo la especie, las cantidades y la distribución de linfocitos T en la mucosa intestinal. CD3 es un marcador de superficie celular fundamental de linfocitos T [38]. El resultado mostró que el número de linfocitos CD3 + T aumentó significativamente, y estos revelaron que B. subtilis-RC podría estimular la maduración de células T. Según las moléculas expresadas en la superficie celular, los linfocitos T pueden dividirse aún más en células T ayudantes Además, observamos que la relación de células CD4 + /CD8 + T aumentó por vía oral. La relación CD4/CD8 mide la relación de células T ayudantes a células T citotóxicas. Por lo tanto, pudimos ver que la administración oral B. subtilis-RC podría fortalecer la respuesta inmune Th1 al aumentar la relación de células CD4 + /CD8 + T. La morfología del intestino delgado puede reflejar directamente la salud intestinal y desempeña un papel importante en el mantenimiento del sistema inmunitario intestinal [40]. La fase temprana de la infección por PEDV se acompaña frecuentemente de necrosis y exfoliación de células epiteliales villosas infectadas, lo que en última instancia resulta en atrofia villosa aguda y severa [41]. Por lo tanto, el trabajo efectivo de mantener la morfología intestinal es un buen indicador para evaluar la eficacia de las vacunas. Después de la Los PP son pequeñas masas de tejido linfático y forman una parte importante del sistema inmunitario mediante el reclutamiento e inducción de las células T para prevenir el crecimiento de patógenos en los intestinos. Además, un aumento en el número de IEL demostró la eficacia de B. subtilis-RC. Además, la longitud de vellosidad del íleo mostró algunos resultados alentadores que una morfología intestinal bien formada llegó a ser por B. subtilis-RC. La morfología intestinal satisfactoria fue el primer paso en la carretera contra la infección por PEDV. Varios resultados de morfología demostraron que B. subtilis-RC podría mantener notablemente la morfología intestinal y formar una protección integral. Como se mencionó anteriormente, la administración oral con B. subtilis-RC podría estimular la proliferación y diferenciación de células T y modular la respuesta inmune. Además, las citocinas son proteínas moléculas pequeñas con amplia actividad biológica, sintetizadas y secretadas por las células inmunes y algunas células no inmunes [42]. Como molécula de señalización celular, actúa principalmente para regular las respuestas inmunes, participando en la diferenciación y desarrollo de las células inmunes, mediando las respuestas inflamatorias, estimulando la hematopoyesis y participando en la reparación de los tejidos. Estudios previos habían demostrado que el PEDV inhibió tanto las citoquinas NF-.B como las citoquinas proinflamatorias [43]. Por lo tanto, las citoquinas son un indicador clave para evaluar la capacidad de una vacuna para estimular las respuestas inmunes. En este estudio, habíamos observado que IL-1β e IL-10 aumentaron notablemente (P<0.01). El IL-1β como una de las primeras citoquinas proinflamatorias y participa centralmente en la iniciación La investigación había demostrado que IL-1β podría aumentar significativamente la regulación de los tejidos inmunes locales y sistémicos post infección microbiana [44]. Además, IL-10 es una potente citocina antiinflamatoria que juega un papel esencial en la prevención de patologías inflamatorias e autoinmunes [45]. En resumen, ambos datos mostraron que la administración oral con B. subtilis-RC regulada y aumenta la inmunidad mediante citocinas IL-1β e IL-10 de alta regulación. En conclusión, los resultados actuales demostraron que la inmunización oral con B. subtilis-RC podría inducir efectivamente a la mucosa local y respuestas inmunes sistemáticas contra la infección por PEDV, al tiempo que mejora y regula la función inmune elevando la proporción de células CD4 + /CD8 + T y citocinas IL-1β e IL-10, apuntando así a una prometedora vacuna oral candidata para la infección

¿Qué factores intestinales pueden reducir la eficacia de las vacunas administradas por vía oral?

Respuestas inmunes mucosas inducidas por la administración oral recombinante Bacillus subtilis que expresa el antígeno COE de PEDV en lechones recién nacidoshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6418403/SHA: 5caced13bcb8a42cca41369c5a71ae7df5381ca8Autores: Wang, Jialu; Huang, Lulu; Mou, Chunxiao; Zhang, En; Wang, Yongheng; Cao, Yanan; Yang, QianFecha: 2019-03-15DOI: 10.1042/bsr20182028Licencia: cc-byAbstract: La diarrea epidémica porcina (PED) es una enfermedad altamente contagiosa en lechones recién nacidos y causa pérdidas económicas sustanciales en el El virus PED (PEDV) se disemina por contacto fecal-oral y puede prevenirse mediante inmunización oral. Por lo tanto, es necesario desarrollar una vacuna oral eficaz contra la infección por PEDV. Actualmente, Bacillus subtilis como portador de la vacuna recombinante se ha utilizado para la administración de antígenos y se ha demostrado que es inmunitaria y segura. El presente estudio evaluó la inmunogenicidad de Bacillus subtilis recombinante (B. subtilis-RC) en lechones por vía oral. Después de la inmunización oral en lechones, B. subtilis-RC aumentó significativamente las respuestas inmunitarias de la mucosa local. La administración oral con B. subtilis-RC mejoró significativamente el nivel de anticuerpos contra la infección por PEDV específicos de la inmunoglobulina A (IgA) mediante la ampliación del área de los parches (PP) de Peyer y Mientras tanto, B. subtilis-RC aumentó notablemente el número de linfocitos intraepiteliales (IEL). También observamos que la administración oral de B. subtilis-RC aumentó significativamente el número de linfocitos CD3(+)T y mejoró la proporción de células T CD4(+)/CD8(+). Además, los títulos altos de inmunoglobulina G (IgG) sérica específica revelaron una respuesta inmunitaria sistémica satisfactoria contra la infección por PEDV. En resumen, nuestro estudio demostró que la administración oral de B. subtilis-RC podría desencadenar un alto nivel de respuestas inmunitarias locales y sistémicas y sería una vacuna candidata prometedora contra la infección por PEDV en lechones. Texto: Diarrea epidémica porcina (PED) caracterizada por diarrea aguda altamente fatal en lechones, resulta en enormes pérdidas en la industria porcina mundial [1] El agente causante del virus PED (PEDV) pertenece a los coronavirus porcinos (CoVs). La infección por PEDV se propaga principalmente a través del tracto digestivo [2], y daña las superficies mucosas del intestino huésped infectando las células epiteliales intestinales [3]. Por lo tanto, la mejora de la inmunidad mucosa intestinal puede provocar respuestas inmunológicas eficaces contra la infección por PEDV [4]. Actualmente, se han desarrollado y aplicado ampliamente en el mercado vacunas tradicionales (vía intramuscular o inyección subcutánea) [5]. Estas vacunas administradas por vía parenteral no pueden inducir eficazmente títulos altos de anticuerpos maternos y anticuerpos IgA específicos del virus, lo que resulta en una protección mucosa inadecuada contra la infección por PEDV [6]. Además, estos anticuerpos maternos en la leche siempre fueron degradados por el ácido gástrico y la pepsina antes de entrar en el tracto intestinal. Las vacunas Como una forma superior de inmunización mucosal, la administración oral puede proteger el intestino y estimular el sistema inmunológico mucosal común [8]. Además, la inmunización oral tiene varias características atractivas que incluyen la seguridad, y un enfoque sencillo, barato y sin agujas [9]. Por lo tanto, la inmunización oral a menudo ofrece grandes cantidades de antígenos para prevenir las enfermedades diarreicas [10]. Sin embargo, hay varios desafíos por la inmunización oral, que consisten en barreras físicas, químicas y biológicas al entregar antígenos al tracto gastrointestinal (como ácidos gástricos, pepsina y tripsina en el tracto GI) [11]. Es un problema sustancial que los ácidos digestivos y las proteasas pueden degradar las proteínas antígenos para la absorción de nutrientes [12]. Por lo tanto, el sistema de administración de vacunas se ha aplicado para resolver el problema. El sistema puede proteger antígenos del entorno severo del tracto GI y entregar antígenos a la mucosa intestinal Actualmente, Bacillus subtilis (B. subtilis) es ampliamente utilizado como un sistema de administración de vacunas por sus características únicas. Como bacteria Gram-positiva no patógena, B. subtilis ha sido considerado como un nuevo probiótico y aditivo alimentario en humanos y animales [14]. El B. subtilis tiene actividad adyuvante y puede entregar antígenos heterólogos al tracto GI, proporcionando estimulación de inmunidad adicional [15]. Además, la investigación había demostrado que B. subtilis administrado por vía oral también podría mejorar la regulación inmunitaria y la salud intestinal en cerdos [16]. Además, la administración oral de B. subtilis podría generar respuestas inmunes humorales y celulares al mantenimiento de la homeostasis intestinal por células dendríticas [17]. Los DC son las células de antígeno profesional más importantes y pueden regular eficazmente los títulos de anticuerpos [18 Los DCs existen naturalmente en el tejido linfoide asociado al intestino (GALT), incluyendo los parches de Peyer (PPs), folículos linfoides aislados (FIL), ganglios linfáticos mesentéricos (MLNs), y se dispersan a través de la lámina subepitelial propria (LP) del intestino delgado y el colon [19]. Además, B. subtilis es conveniente para la manipulación genética y ha desarrollado una gran variedad de herramientas genéticas [20]. Por lo tanto, B. subtilis se utiliza ampliamente como un sistema eficaz de administración de vacunas para inducir respuestas inmunes mucosas y muestra un efecto único en el sistema inmunitario. En el presente informe, exploramos el efecto inmune de un B. subtilis recombinante (B. subtilis-RC) que se había construido con éxito con la expresión de la proteína PEDV COE en lechones. Nuestra investigación indicó que B. subtilis-RC era beneficioso para el desarrollo del sistema inmunológico mucosal, y podía generar anticuerpos específicos contra la infección por PEDV, sugiriendo un posible enfoque para prevenir la infección por PEDV. El B. subtilis WB800 fue amablemente proporcionado por el Dr. Xuewen Gao (del departamento de patología vegetal de la Universidad Agrícola de Nanjing) [21]. B. subtilis-RC construido previamente en nuestro laboratorio fue capaz de expresar el gen COE (499-638 aminoácidos en proteína S). Antes de la administración oral, la cepa recombinante fue cultivada en caldo LB a 37 • C durante 12 h, y luego se lavó dos veces con PBS, y se suspendió en PBS para alcanzar una concentración final de 1 × 10 10 CFU/ml. La cepa PEDV Zhejiang08 fue proporcionada por el Centro El virus se cultivó en células renales de mono verde africano (células VERO) y se purificó utilizando un gradiente discontinuo de densidad de sacarosa. El virus fue inactivado por UV a dosis UV de 4 J/cm 2 durante 24 h para lograr una pérdida completa de infectividad [23]. La concentración del virus purificado se midió utilizando el kit de análisis de proteínas BCA (Thermo Fisher, MA, EE.UU.). ELISA: Rabbit anti-pig IgG (peroxidasa de rábano caballar (HRP)), Goat Anti-Pig IgA (HRP) fueron comprados a Abcam. Segundo anticuerpo: Anticuerpo IgG de cabra conjugado DyLight 649 anticuerpo IgG de cabra conjugado, DyLight 488-anticuerpo IgG de cabra conjugado, DyLight 594-anticuerpo IgG de cabra conjugado fueron comprados a Multiciencia, Hangzhou, China. Sistema basado en ABC (anticuerpo IgG de cabra bitinilada) fue utilizado como el anticuerpo secundario con DAB como un cromogeno fue comprado a Boster, Wuhan, China. Cochinchos DLY específicos libres de patógenos (Duroc y Landrace y Yorkshire) fueron amablemente proporcionados por la Academia Jiangsu de Ciencias Agrícolas (Nanjing, China). Los experimentos con animales habían sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Agrícola de Nanjing y siguieron las directrices de los Doce lechones recién nacidos fueron divididos aleatoriamente en tres grupos (cuatro lechones en cada grupo) y alojados en condiciones similares en diferentes establos para evitar la contaminación cruzada probiótica. Los lechones fueron dosificados por vía oral con 100 μl de B. subtilis-RC. Los grupos de control de lechones fueron administrados por vía oral con PEDV inactivado (100 μg/dosis) e igual volumen de PBS. El protocolo de inmunización fue realizado en los lechones que tenían 5 días de edad (Figura 1C ), y firmados como 0 día. Luego se administraron vacunas de refuerzo en 5 días. Luego se realizó la recolección de especímenes cada 7 días después de la inmunización de refuerzo (Figura 1C ). Se recolectaron muestras de sangre semanalmente de todos los lechones después de la inmunización de refuerzo y se les permitió coagular durante la noche a temperatura Las muestras de sangre se separaron mediante centrifugación y se almacenaron a −20 • C para detectar los niveles de IgG e IgA específicos. Se recolectaron tres hisopos cada semana durante 1 mes, incluyendo hisopos nasales, orales y de heces para el ELISA. Los lechones fueron sacrificados en 33 días. La misma ubicación de los tejidos del intestino delgado y del íleo de cada cerdito se fijaron con el líquido de Bonn y un 4% de paraformaldehído. Los tejidos del intestino delgado en la misma ubicación se fijaron con solución fijadora de Bouin durante 24 h, incrustados en parafina, y seccionaron a un espesor de 4 μm. Las secciones se colocaron en diapositivas de vidrio. La tinción de hematoxilina-eosina se aplicó a las secciones de parafina, y luego se observaron y tomaron fotografías bajo microscopio El número de linfocitos intraepiteliales (IEL) se contaron en cada 100 células epiteliales bajo el mismo microscopio de luz múltiple entre diez imágenes de cada grupo [24]. La detección inmunohistoquímica se realizó con el kit SABC (Boster Bioscience), se utilizó peróxido de hidrógeno para desactivar la peroxidasa intrínseca. La recuperación de antígenos se realizó en un baño de agua utilizando tampón citrato-EDTA (10 mM ácido cítrico, 2 mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 6.2). Las secciones se incubaron con anticuerpo anti-IgA diluido (1:100; Abcam) durante la noche a las 4 • C. Como controles negativos, inmunoteñido realizado mediante muestras de control antiserum en lugar de anticuerpo primario. La adición de anticuerpo secundario marcado con biotina a las diapositivas fue seguida por la Después de la tinción con DAB, las diapositivas fueron grabadas utilizando una cámara digital (Leica-DM4000B) [25]. Los intestinos aislados con PP fueron transferidos a PBS helados. Luego, el resto de grasa y tejido conectivo fue removido y lavado a fondo con PBS helado. Luego, el intestino fue cortado longitudinalmente en fragmentos de 0,5 cm. Los fragmentos fueron incubados con 5 ml de EDTA 30 mM y colocados en solución digestiva de 5 ml que contenía 4 % FBS, 0,5 mg/ml cada uno de Collagenasa D (Roche) y Dnasa I (Sigma), y 50 U/ml Dispasa (Fisher). Los fragmentos fueron incubados con PBS de Dulbecco (DPBS) durante 20 min a 37 • C por rotación lenta (100 rpm). Después de la incubación, la capa de células epiteliales que contenía los LIE fueron separadas por un vórtice intensivo y pasaron a través de un colador celular de 70-μm. La suspensión monocelular fue recogida y lavada dos veces por DPBS, la solución fue vórtice intensamente y pasó a través de un colador celular de 40-μm. Los sobrenadantes fueron lavados por medio de RPM 1640 preenfriado (Thermo Fisher Scientific) y suspendidos por 10 ml de la fracción 40% de un gradiente de 40:80 Percoll, superpuestos sobre 5 ml de la fracción 80% en un tubo Falcon de 15 ml. La separación de gradiente de Percoll fue realizada por centrifugación durante 20 min a 2500 rpm. Los linfocitos LP (LPL) fueron recolectados en la interfase del gradiente Mientras tanto, el análisis de citometría de flujo se realizó en instrumentos BD Facscalibur (BD Biosciences) y fue analizado por el software FlowJo. Todos los anticuerpos fueron adquiridos de BD Pharmingen o eBiociencias. Suspensiones unicelulares aisladas fueron manchadas con anti-CD3-APC, anti-CD4-FITC, anti-CD8-PE, todas a la 1:100 dilución durante 30 min sobre hielo, y lavadas con PBS dos veces, y analizadas por FACS [26]. Las citoquinas interleucinas (IL) 10 (IL-10) e IL-1β (Abcam) fueron medidas por ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los datos fueron adquiridos en un lector de placas ELISA automatizado en OD 450 nm inmediatamente. Los anticuerpos neutralizantes de PEDV fueron medidos en líquido lavado de intestinos La prueba se realizó como se describió previamente con modificaciones menores [27]. Un total de 450 μl de líquido de lavado de intestino fue dos veces diluido en serie y mezclado con 50 μl de suspensión viral que contenía 10 3 TCID 50 PEDV virus durante 1 h a 37 • C en placas de cultivo de tejido de fondo plano de 12 pocillos. La mezcla fue inoculada durante 1 h a 37 • C y 5% CO 2. Luego, la mezcla fue inoculada con células Vero suspensión (aproximadamente 1,0 × 10 6 ml − 1 ) durante otros 3-4 días. Después de la tinción con Crystal Violet, las placas fueron observadas bajo un microscopio para el efecto citopático. Los datos fueron obtenidos como el medio + − S.E.M. de tres réplicas por prueba en un solo experimento. GraphPad Prism V Las múltiples pruebas de comparación de Tukey y ANOVA de un solo sentido fueron utilizadas para analizar la significación de la diferencia entre los medios. Los valores-P inferiores a 0,05 (P<0,05) fueron considerados significativos y los valores-P inferiores a 0,01 (P<0,01) como altamente significativos. Los PP son un concentrado de tejido linfoide y el sitio primario para la producción de inmunoglobulina A (IgA), lo cual es crucial para regular el equilibrio homeostático del intestino [28]. El área de los PP es un indicador clave de inmunidad. La administración oral con B. subtilis-RC significativamente (P<0,01) aumentó el área de los PP en comparación con dos grupos control como se muestra en la Figura 1A. Además, la longitud de la vili del íleum obtuvo más tiempo por administración oral con B. subtilis-RC (P<0,01) que Estos confirmaron principalmente que B. subtilis-RC fue beneficioso para mantener la estructura del intestino. Los IEL intestinales son una población grande y diversa de células linfoides que residen dentro de las células epiteliales intestinales (IECs), y que forman la barrera mucosa intestinal [29]. Los IELs son una parte importante del sistema inmunológico de la mucosa intestinal. El nivel de anticuerpos específicos anti-PEDV íleum IgA + secretación (SIgA) en lechones fue medido por ELISA en la boca y heces. Como se muestra en la Figura 3A, B, la mucosa específica del antígeno SIgA en los sitios anteriores fue claramente mayor que el grupo PEDV inactivado (P<0,05 o P<0,01). Como se esperaba, la boca tenía niveles más altos de SIgA que otros sitios. Después de la inmunización oral, el nivel de anticuerpo anti-PEDV IgG sérico en lechones inmunizados con B. subtilis-RC, PEDV inactivado o PBS fue determinado por ELISA, como se muestra en la Figura 3C. Los resultados indicaron que aunque los títulos cayeron durante el período de muestreo, el nivel IgG de B. subtilis-RC todavía aumentó significativamente de 0 a 33 días que el grupo PEDV inactivado (P<0,05 o P<0,01). Los linfocitos CD3 + T son los marcadores de la superficie celular fundamental de los linfocitos T, por lo que el número de linfocitos CD3 + T podría representar la cantidad de linfocitos T. En consecuencia, se analizó el número de linfocitos CD3 + T en el íleo. Los datos indicaron que tanto B. subtilis-RC como PEDV inactivado podrían aumentar dramáticamente (P<0,05) los linfocitos CD3 + T en comparación con el grupo PBS (Figura 4A ). Estos cambios mostraron evidencia segura de que la administración oral con B. subtilis-RC tuvo una buena influencia en la inmunidad de la mucosa intestinal en lechones. SIgA es el principal isotipo de inmunoglobulina en animales, en gran parte secretado a través de la superficie de la mucosa intestinal especialmente en el intestino delgado [30]. SIgA juega un papel importante en la inmunidad de la mucosa intestinal y refleja en la inmunidad de la mucosa intestinal. Después de la administración oral con B. subtilis-RC, el número de células secretantes IgA había aumentado rápidamente en comparación con los otros dos grupos (P<0,05) (Figura 4B). Estos resultados mostraron que la administración oral con B. subtilis-RC fue propicia a la inmunidad mucosa intestinal y podría aumentar el número de células secretadoras de IgA para producir efectos positivos sobre la infección por PEDV. Gran parte de las células inmunitarias están dispersas en las células epiteliales. Las IEC interactúan directa o indirectamente con las células inmunes innatas y adaptativas mediante la presentación de antígenos a los linfocitos [31]. Por lo tanto, el aprendizaje sobre cómo se distribuyen los linfocitos en la pequeña mucosa intestinal es muy significativo para la inmunología de la mucosa. Datos previos habían demostrado que los linfocitos CD3 + T aumentaron significativamente (P<0,05) (Figura 4A ), por lo que se analizó más adelante la clasificación inmunológica de CD3 + T linfocitos. El linfocito del íleo con unión de PP Estos resultados mostraron que las células CD3 + CD4 + T han aumentado obviamente (P<0,01) (Figura 5B ), sin embargo las células CD3 + CD8 + T disminuyeron notablemente (P<0,05) (Figura 5C ). Después del cálculo, la relación de células CD4 + /CD8 + T aumentó (Figura 5D ). Esta relación también podría medir más los niveles de inmunidad de los lechones. Los niveles de citoquina IL-1β e IL-10 se determinaron para evaluar las respuestas inmunes celulares inducidas por B. subtilis-RC como se muestra en la Figura 6A,B. Como podemos ver en el diagrama, significativamente (P<0,01) se produjeron IL-1β e IL-10 superiores después de la administración oral con B. subtilis-RC que los otros dos grupos. Todos estos revelaron que B. subtilis-RC podría estimular la liberación de citoquinas para mediar la comunicación con y entre las células del sistema inmunitario, mejorando la respuesta inmune mucosa a la infección por PEDV. Los anticuerpos neutralizantes del PEDV fueron detectados por el ensayo PRNT. La administración oral con B. subtilis-RC podría reducir efectivamente la capacidad de formación de placa de PEDV (P<0,01) en comparación con otros dos grupos en la Figura 7. Esto reveló que B. subtilis-RC podría estimular un alto nivel de anticuerpos neutralizantes del PEDV contra la infección por PEDV. En medio del brote del PEDV, se han desarrollado varias vacunas para controlar enfermedades y los efectos son insatisfactorios. Las vacunas orales pueden inducir una inmunidad mucosa más robusta que las contrapartes inyectables [32]. Ahora está claro que la respuesta inmune mucosal efectiva requiere IgG sérico y SIgA mucosal [34]. SIgA es la base del sistema inmune mucosal, desempeñando un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis inmune, y neutralizando los patógenos invasivos. IgG sérico representa respuestas inmunes sistémicas. Durante las infecciones por PEDV, la inmunización oral provoca no sólo mucosas sino también respuestas inmunes sistémicas muy bien [35]. Nuestros datos mostraron una respuesta IgG anti-PEDV fuerte y de larga duración se detectaron por vía oral con B. subtilis-RC en lechones. Aunque con el paso del tiempo, los títulos de anticuerpos disminuyeron un poco, todavía se mantuvo en la cabeza en comparación con los grupos de control y de acuerdo con la tendencia cambiante de anticuerpos. El cambio de IgA específica mostró resultados similares en la mucosa de boca y heces. A medida que aumenta la inmunidad adicional, B. subtilis-RC reduce la capacidad de los patógenos para cruzar la mucosa intestinal y la propagación sistémica de patógenos invasivos [36]. El sistema inmunitario de la mucosa genera respuestas inmunitarias a través de células inmunitarias que residen en compartimentos de la mucosa. Los linfocitos T residentes en la mucosa desempeñan un papel importante en la inmunidad de la mucosa [37]. Exploramos más a fondo la especie, las cantidades y la distribución de linfocitos T en la mucosa intestinal. CD3 es un marcador de superficie celular fundamental de linfocitos T [38]. El resultado mostró que el número de linfocitos CD3 + T aumentó significativamente, y estos revelaron que B. subtilis-RC podría estimular la maduración de células T. Según las moléculas expresadas en la superficie celular, los linfocitos T pueden dividirse aún más en células T ayudantes Además, observamos que la relación de células CD4 + /CD8 + T aumentó por vía oral. La relación CD4/CD8 mide la relación de células T ayudantes a células T citotóxicas. Por lo tanto, pudimos ver que la administración oral B. subtilis-RC podría fortalecer la respuesta inmune Th1 al aumentar la relación de células CD4 + /CD8 + T. La morfología del intestino delgado puede reflejar directamente la salud intestinal y desempeña un papel importante en el mantenimiento del sistema inmunitario intestinal [40]. La fase temprana de la infección por PEDV se acompaña frecuentemente de necrosis y exfoliación de células epiteliales villosas infectadas, lo que en última instancia resulta en atrofia villosa aguda y severa [41]. Por lo tanto, el trabajo efectivo de mantener la morfología intestinal es un buen indicador para evaluar la eficacia de las vacunas. Después de la Los PP son pequeñas masas de tejido linfático y forman una parte importante del sistema inmunitario mediante el reclutamiento e inducción de las células T para prevenir el crecimiento de patógenos en los intestinos. Además, un aumento en el número de IEL demostró la eficacia de B. subtilis-RC. Además, la longitud de vellosidad del íleo mostró algunos resultados alentadores que una morfología intestinal bien formada llegó a ser por B. subtilis-RC. La morfología intestinal satisfactoria fue el primer paso en la carretera contra la infección por PEDV. Varios resultados de morfología demostraron que B. subtilis-RC podría mantener notablemente la morfología intestinal y formar una protección integral. Como se mencionó anteriormente, la administración oral con B. subtilis-RC podría estimular la proliferación y diferenciación de células T y modular la respuesta inmune. Además, las citocinas son proteínas moléculas pequeñas con amplia actividad biológica, sintetizadas y secretadas por las células inmunes y algunas células no inmunes [42]. Como molécula de señalización celular, actúa principalmente para regular las respuestas inmunes, participando en la diferenciación y desarrollo de las células inmunes, mediando las respuestas inflamatorias, estimulando la hematopoyesis y participando en la reparación de los tejidos. Estudios previos habían demostrado que el PEDV inhibió tanto las citoquinas NF-.B como las citoquinas proinflamatorias [43]. Por lo tanto, las citoquinas son un indicador clave para evaluar la capacidad de una vacuna para estimular las respuestas inmunes. En este estudio, habíamos observado que IL-1β e IL-10 aumentaron notablemente (P<0.01). El IL-1β como una de las primeras citoquinas proinflamatorias y participa centralmente en la iniciación La investigación había demostrado que IL-1β podría aumentar significativamente la regulación de los tejidos inmunes locales y sistémicos post infección microbiana [44]. Además, IL-10 es una potente citocina antiinflamatoria que juega un papel esencial en la prevención de patologías inflamatorias e autoinmunes [45]. En resumen, ambos datos mostraron que la administración oral con B. subtilis-RC regulada y aumenta la inmunidad mediante citocinas IL-1β e IL-10 de alta regulación. En conclusión, los resultados actuales demostraron que la inmunización oral con B. subtilis-RC podría inducir efectivamente a la mucosa local y respuestas inmunes sistemáticas contra la infección por PEDV, al tiempo que mejora y regula la función inmune elevando la proporción de células CD4 + /CD8 + T y citocinas IL-1β e IL-10, apuntando así a una prometedora vacuna oral candidata para la infección

¿Dónde existen las células dendríticas en el cuerpo?

Respuestas inmunes mucosas inducidas por la administración oral recombinante Bacillus subtilis que expresa el antígeno COE de PEDV en lechones recién nacidoshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6418403/SHA: 5caced13bcb8a42cca41369c5a71ae7df5381ca8Autores: Wang, Jialu; Huang, Lulu; Mou, Chunxiao; Zhang, En; Wang, Yongheng; Cao, Yanan; Yang, QianFecha: 2019-03-15DOI: 10.1042/bsr20182028Licencia: cc-byAbstract: La diarrea epidémica porcina (PED) es una enfermedad altamente contagiosa en lechones recién nacidos y causa pérdidas económicas sustanciales en el El virus PED (PEDV) se disemina por contacto fecal-oral y puede prevenirse mediante inmunización oral. Por lo tanto, es necesario desarrollar una vacuna oral eficaz contra la infección por PEDV. Actualmente, Bacillus subtilis como portador de la vacuna recombinante se ha utilizado para la administración de antígenos y se ha demostrado que es inmunitaria y segura. El presente estudio evaluó la inmunogenicidad de Bacillus subtilis recombinante (B. subtilis-RC) en lechones por vía oral. Después de la inmunización oral en lechones, B. subtilis-RC aumentó significativamente las respuestas inmunitarias de la mucosa local. La administración oral con B. subtilis-RC mejoró significativamente el nivel de anticuerpos contra la infección por PEDV específicos de la inmunoglobulina A (IgA) mediante la ampliación del área de los parches (PP) de Peyer y Mientras tanto, B. subtilis-RC aumentó notablemente el número de linfocitos intraepiteliales (IEL). También observamos que la administración oral de B. subtilis-RC aumentó significativamente el número de linfocitos CD3(+)T y mejoró la proporción de células T CD4(+)/CD8(+). Además, los títulos altos de inmunoglobulina G (IgG) sérica específica revelaron una respuesta inmunitaria sistémica satisfactoria contra la infección por PEDV. En resumen, nuestro estudio demostró que la administración oral de B. subtilis-RC podría desencadenar un alto nivel de respuestas inmunitarias locales y sistémicas y sería una vacuna candidata prometedora contra la infección por PEDV en lechones. Texto: Diarrea epidémica porcina (PED) caracterizada por diarrea aguda altamente fatal en lechones, resulta en enormes pérdidas en la industria porcina mundial [1] El agente causante del virus PED (PEDV) pertenece a los coronavirus porcinos (CoVs). La infección por PEDV se propaga principalmente a través del tracto digestivo [2], y daña las superficies mucosas del intestino huésped infectando las células epiteliales intestinales [3]. Por lo tanto, la mejora de la inmunidad mucosa intestinal puede provocar respuestas inmunológicas eficaces contra la infección por PEDV [4]. Actualmente, se han desarrollado y aplicado ampliamente en el mercado vacunas tradicionales (vía intramuscular o inyección subcutánea) [5]. Estas vacunas administradas por vía parenteral no pueden inducir eficazmente títulos altos de anticuerpos maternos y anticuerpos IgA específicos del virus, lo que resulta en una protección mucosa inadecuada contra la infección por PEDV [6]. Además, estos anticuerpos maternos en la leche siempre fueron degradados por el ácido gástrico y la pepsina antes de entrar en el tracto intestinal. Las vacunas Como una forma superior de inmunización mucosal, la administración oral puede proteger el intestino y estimular el sistema inmunológico mucosal común [8]. Además, la inmunización oral tiene varias características atractivas que incluyen la seguridad, y un enfoque sencillo, barato y sin agujas [9]. Por lo tanto, la inmunización oral a menudo ofrece grandes cantidades de antígenos para prevenir las enfermedades diarreicas [10]. Sin embargo, hay varios desafíos por la inmunización oral, que consisten en barreras físicas, químicas y biológicas al entregar antígenos al tracto gastrointestinal (como ácidos gástricos, pepsina y tripsina en el tracto GI) [11]. Es un problema sustancial que los ácidos digestivos y las proteasas pueden degradar las proteínas antígenos para la absorción de nutrientes [12]. Por lo tanto, el sistema de administración de vacunas se ha aplicado para resolver el problema. El sistema puede proteger antígenos del entorno severo del tracto GI y entregar antígenos a la mucosa intestinal Actualmente, Bacillus subtilis (B. subtilis) es ampliamente utilizado como un sistema de administración de vacunas por sus características únicas. Como bacteria Gram-positiva no patógena, B. subtilis ha sido considerado como un nuevo probiótico y aditivo alimentario en humanos y animales [14]. El B. subtilis tiene actividad adyuvante y puede entregar antígenos heterólogos al tracto GI, proporcionando estimulación de inmunidad adicional [15]. Además, la investigación había demostrado que B. subtilis administrado por vía oral también podría mejorar la regulación inmunitaria y la salud intestinal en cerdos [16]. Además, la administración oral de B. subtilis podría generar respuestas inmunes humorales y celulares al mantenimiento de la homeostasis intestinal por células dendríticas [17]. Los DC son las células de antígeno profesional más importantes y pueden regular eficazmente los títulos de anticuerpos [18 Los DCs existen naturalmente en el tejido linfoide asociado al intestino (GALT), incluyendo los parches de Peyer (PPs), folículos linfoides aislados (FIL), ganglios linfáticos mesentéricos (MLNs), y se dispersan a través de la lámina subepitelial propria (LP) del intestino delgado y el colon [19]. Además, B. subtilis es conveniente para la manipulación genética y ha desarrollado una gran variedad de herramientas genéticas [20]. Por lo tanto, B. subtilis se utiliza ampliamente como un sistema eficaz de administración de vacunas para inducir respuestas inmunes mucosas y muestra un efecto único en el sistema inmunitario. En el presente informe, exploramos el efecto inmune de un B. subtilis recombinante (B. subtilis-RC) que se había construido con éxito con la expresión de la proteína PEDV COE en lechones. Nuestra investigación indicó que B. subtilis-RC era beneficioso para el desarrollo del sistema inmunológico mucosal, y podía generar anticuerpos específicos contra la infección por PEDV, sugiriendo un posible enfoque para prevenir la infección por PEDV. El B. subtilis WB800 fue amablemente proporcionado por el Dr. Xuewen Gao (del departamento de patología vegetal de la Universidad Agrícola de Nanjing) [21]. B. subtilis-RC construido previamente en nuestro laboratorio fue capaz de expresar el gen COE (499-638 aminoácidos en proteína S). Antes de la administración oral, la cepa recombinante fue cultivada en caldo LB a 37 • C durante 12 h, y luego se lavó dos veces con PBS, y se suspendió en PBS para alcanzar una concentración final de 1 × 10 10 CFU/ml. La cepa PEDV Zhejiang08 fue proporcionada por el Centro El virus se cultivó en células renales de mono verde africano (células VERO) y se purificó utilizando un gradiente discontinuo de densidad de sacarosa. El virus fue inactivado por UV a dosis UV de 4 J/cm 2 durante 24 h para lograr una pérdida completa de infectividad [23]. La concentración del virus purificado se midió utilizando el kit de análisis de proteínas BCA (Thermo Fisher, MA, EE.UU.). ELISA: Rabbit anti-pig IgG (peroxidasa de rábano caballar (HRP)), Goat Anti-Pig IgA (HRP) fueron comprados a Abcam. Segundo anticuerpo: Anticuerpo IgG de cabra conjugado DyLight 649 anticuerpo IgG de cabra conjugado, DyLight 488-anticuerpo IgG de cabra conjugado, DyLight 594-anticuerpo IgG de cabra conjugado fueron comprados a Multiciencia, Hangzhou, China. Sistema basado en ABC (anticuerpo IgG de cabra bitinilada) fue utilizado como el anticuerpo secundario con DAB como un cromogeno fue comprado a Boster, Wuhan, China. Cochinchos DLY específicos libres de patógenos (Duroc y Landrace y Yorkshire) fueron amablemente proporcionados por la Academia Jiangsu de Ciencias Agrícolas (Nanjing, China). Los experimentos con animales habían sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Agrícola de Nanjing y siguieron las directrices de los Doce lechones recién nacidos fueron divididos aleatoriamente en tres grupos (cuatro lechones en cada grupo) y alojados en condiciones similares en diferentes establos para evitar la contaminación cruzada probiótica. Los lechones fueron dosificados por vía oral con 100 μl de B. subtilis-RC. Los grupos de control de lechones fueron administrados por vía oral con PEDV inactivado (100 μg/dosis) e igual volumen de PBS. El protocolo de inmunización fue realizado en los lechones que tenían 5 días de edad (Figura 1C ), y firmados como 0 día. Luego se administraron vacunas de refuerzo en 5 días. Luego se realizó la recolección de especímenes cada 7 días después de la inmunización de refuerzo (Figura 1C ). Se recolectaron muestras de sangre semanalmente de todos los lechones después de la inmunización de refuerzo y se les permitió coagular durante la noche a temperatura Las muestras de sangre se separaron mediante centrifugación y se almacenaron a −20 • C para detectar los niveles de IgG e IgA específicos. Se recolectaron tres hisopos cada semana durante 1 mes, incluyendo hisopos nasales, orales y de heces para el ELISA. Los lechones fueron sacrificados en 33 días. La misma ubicación de los tejidos del intestino delgado y del íleo de cada cerdito se fijaron con el líquido de Bonn y un 4% de paraformaldehído. Los tejidos del intestino delgado en la misma ubicación se fijaron con solución fijadora de Bouin durante 24 h, incrustados en parafina, y seccionaron a un espesor de 4 μm. Las secciones se colocaron en diapositivas de vidrio. La tinción de hematoxilina-eosina se aplicó a las secciones de parafina, y luego se observaron y tomaron fotografías bajo microscopio El número de linfocitos intraepiteliales (IEL) se contaron en cada 100 células epiteliales bajo el mismo microscopio de luz múltiple entre diez imágenes de cada grupo [24]. La detección inmunohistoquímica se realizó con el kit SABC (Boster Bioscience), se utilizó peróxido de hidrógeno para desactivar la peroxidasa intrínseca. La recuperación de antígenos se realizó en un baño de agua utilizando tampón citrato-EDTA (10 mM ácido cítrico, 2 mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 6.2). Las secciones se incubaron con anticuerpo anti-IgA diluido (1:100; Abcam) durante la noche a las 4 • C. Como controles negativos, inmunoteñido realizado mediante muestras de control antiserum en lugar de anticuerpo primario. La adición de anticuerpo secundario marcado con biotina a las diapositivas fue seguida por la Después de la tinción con DAB, las diapositivas fueron grabadas utilizando una cámara digital (Leica-DM4000B) [25]. Los intestinos aislados con PP fueron transferidos a PBS helados. Luego, el resto de grasa y tejido conectivo fue removido y lavado a fondo con PBS helado. Luego, el intestino fue cortado longitudinalmente en fragmentos de 0,5 cm. Los fragmentos fueron incubados con 5 ml de EDTA 30 mM y colocados en solución digestiva de 5 ml que contenía 4 % FBS, 0,5 mg/ml cada uno de Collagenasa D (Roche) y Dnasa I (Sigma), y 50 U/ml Dispasa (Fisher). Los fragmentos fueron incubados con PBS de Dulbecco (DPBS) durante 20 min a 37 • C por rotación lenta (100 rpm). Después de la incubación, la capa de células epiteliales que contenía los LIE fueron separadas por un vórtice intensivo y pasaron a través de un colador celular de 70-μm. La suspensión monocelular fue recogida y lavada dos veces por DPBS, la solución fue vórtice intensamente y pasó a través de un colador celular de 40-μm. Los sobrenadantes fueron lavados por medio de RPM 1640 preenfriado (Thermo Fisher Scientific) y suspendidos por 10 ml de la fracción 40% de un gradiente de 40:80 Percoll, superpuestos sobre 5 ml de la fracción 80% en un tubo Falcon de 15 ml. La separación de gradiente de Percoll fue realizada por centrifugación durante 20 min a 2500 rpm. Los linfocitos LP (LPL) fueron recolectados en la interfase del gradiente Mientras tanto, el análisis de citometría de flujo se realizó en instrumentos BD Facscalibur (BD Biosciences) y fue analizado por el software FlowJo. Todos los anticuerpos fueron adquiridos de BD Pharmingen o eBiociencias. Suspensiones unicelulares aisladas fueron manchadas con anti-CD3-APC, anti-CD4-FITC, anti-CD8-PE, todas a la 1:100 dilución durante 30 min sobre hielo, y lavadas con PBS dos veces, y analizadas por FACS [26]. Las citoquinas interleucinas (IL) 10 (IL-10) e IL-1β (Abcam) fueron medidas por ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los datos fueron adquiridos en un lector de placas ELISA automatizado en OD 450 nm inmediatamente. Los anticuerpos neutralizantes de PEDV fueron medidos en líquido lavado de intestinos La prueba se realizó como se describió previamente con modificaciones menores [27]. Un total de 450 μl de líquido de lavado de intestino fue dos veces diluido en serie y mezclado con 50 μl de suspensión viral que contenía 10 3 TCID 50 PEDV virus durante 1 h a 37 • C en placas de cultivo de tejido de fondo plano de 12 pocillos. La mezcla fue inoculada durante 1 h a 37 • C y 5% CO 2. Luego, la mezcla fue inoculada con células Vero suspensión (aproximadamente 1,0 × 10 6 ml − 1 ) durante otros 3-4 días. Después de la tinción con Crystal Violet, las placas fueron observadas bajo un microscopio para el efecto citopático. Los datos fueron obtenidos como el medio + − S.E.M. de tres réplicas por prueba en un solo experimento. GraphPad Prism V Las múltiples pruebas de comparación de Tukey y ANOVA de un solo sentido fueron utilizadas para analizar la significación de la diferencia entre los medios. Los valores-P inferiores a 0,05 (P<0,05) fueron considerados significativos y los valores-P inferiores a 0,01 (P<0,01) como altamente significativos. Los PP son un concentrado de tejido linfoide y el sitio primario para la producción de inmunoglobulina A (IgA), lo cual es crucial para regular el equilibrio homeostático del intestino [28]. El área de los PP es un indicador clave de inmunidad. La administración oral con B. subtilis-RC significativamente (P<0,01) aumentó el área de los PP en comparación con dos grupos control como se muestra en la Figura 1A. Además, la longitud de la vili del íleum obtuvo más tiempo por administración oral con B. subtilis-RC (P<0,01) que Estos confirmaron principalmente que B. subtilis-RC fue beneficioso para mantener la estructura del intestino. Los IEL intestinales son una población grande y diversa de células linfoides que residen dentro de las células epiteliales intestinales (IECs), y que forman la barrera mucosa intestinal [29]. Los IELs son una parte importante del sistema inmunológico de la mucosa intestinal. El nivel de anticuerpos específicos anti-PEDV íleum IgA + secretación (SIgA) en lechones fue medido por ELISA en la boca y heces. Como se muestra en la Figura 3A, B, la mucosa específica del antígeno SIgA en los sitios anteriores fue claramente mayor que el grupo PEDV inactivado (P<0,05 o P<0,01). Como se esperaba, la boca tenía niveles más altos de SIgA que otros sitios. Después de la inmunización oral, el nivel de anticuerpo anti-PEDV IgG sérico en lechones inmunizados con B. subtilis-RC, PEDV inactivado o PBS fue determinado por ELISA, como se muestra en la Figura 3C. Los resultados indicaron que aunque los títulos cayeron durante el período de muestreo, el nivel IgG de B. subtilis-RC todavía aumentó significativamente de 0 a 33 días que el grupo PEDV inactivado (P<0,05 o P<0,01). Los linfocitos CD3 + T son los marcadores de la superficie celular fundamental de los linfocitos T, por lo que el número de linfocitos CD3 + T podría representar la cantidad de linfocitos T. En consecuencia, se analizó el número de linfocitos CD3 + T en el íleo. Los datos indicaron que tanto B. subtilis-RC como PEDV inactivado podrían aumentar dramáticamente (P<0,05) los linfocitos CD3 + T en comparación con el grupo PBS (Figura 4A ). Estos cambios mostraron evidencia segura de que la administración oral con B. subtilis-RC tuvo una buena influencia en la inmunidad de la mucosa intestinal en lechones. SIgA es el principal isotipo de inmunoglobulina en animales, en gran parte secretado a través de la superficie de la mucosa intestinal especialmente en el intestino delgado [30]. SIgA juega un papel importante en la inmunidad de la mucosa intestinal y refleja en la inmunidad de la mucosa intestinal. Después de la administración oral con B. subtilis-RC, el número de células secretantes IgA había aumentado rápidamente en comparación con los otros dos grupos (P<0,05) (Figura 4B). Estos resultados mostraron que la administración oral con B. subtilis-RC fue propicia a la inmunidad mucosa intestinal y podría aumentar el número de células secretadoras de IgA para producir efectos positivos sobre la infección por PEDV. Gran parte de las células inmunitarias están dispersas en las células epiteliales. Las IEC interactúan directa o indirectamente con las células inmunes innatas y adaptativas mediante la presentación de antígenos a los linfocitos [31]. Por lo tanto, el aprendizaje sobre cómo se distribuyen los linfocitos en la pequeña mucosa intestinal es muy significativo para la inmunología de la mucosa. Datos previos habían demostrado que los linfocitos CD3 + T aumentaron significativamente (P<0,05) (Figura 4A ), por lo que se analizó más adelante la clasificación inmunológica de CD3 + T linfocitos. El linfocito del íleo con unión de PP Estos resultados mostraron que las células CD3 + CD4 + T han aumentado obviamente (P<0,01) (Figura 5B ), sin embargo las células CD3 + CD8 + T disminuyeron notablemente (P<0,05) (Figura 5C ). Después del cálculo, la relación de células CD4 + /CD8 + T aumentó (Figura 5D ). Esta relación también podría medir más los niveles de inmunidad de los lechones. Los niveles de citoquina IL-1β e IL-10 se determinaron para evaluar las respuestas inmunes celulares inducidas por B. subtilis-RC como se muestra en la Figura 6A,B. Como podemos ver en el diagrama, significativamente (P<0,01) se produjeron IL-1β e IL-10 superiores después de la administración oral con B. subtilis-RC que los otros dos grupos. Todos estos revelaron que B. subtilis-RC podría estimular la liberación de citoquinas para mediar la comunicación con y entre las células del sistema inmunitario, mejorando la respuesta inmune mucosa a la infección por PEDV. Los anticuerpos neutralizantes del PEDV fueron detectados por el ensayo PRNT. La administración oral con B. subtilis-RC podría reducir efectivamente la capacidad de formación de placa de PEDV (P<0,01) en comparación con otros dos grupos en la Figura 7. Esto reveló que B. subtilis-RC podría estimular un alto nivel de anticuerpos neutralizantes del PEDV contra la infección por PEDV. En medio del brote del PEDV, se han desarrollado varias vacunas para controlar enfermedades y los efectos son insatisfactorios. Las vacunas orales pueden inducir una inmunidad mucosa más robusta que las contrapartes inyectables [32]. Ahora está claro que la respuesta inmune mucosal efectiva requiere IgG sérico y SIgA mucosal [34]. SIgA es la base del sistema inmune mucosal, desempeñando un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis inmune, y neutralizando los patógenos invasivos. IgG sérico representa respuestas inmunes sistémicas. Durante las infecciones por PEDV, la inmunización oral provoca no sólo mucosas sino también respuestas inmunes sistémicas muy bien [35]. Nuestros datos mostraron una respuesta IgG anti-PEDV fuerte y de larga duración se detectaron por vía oral con B. subtilis-RC en lechones. Aunque con el paso del tiempo, los títulos de anticuerpos disminuyeron un poco, todavía se mantuvo en la cabeza en comparación con los grupos de control y de acuerdo con la tendencia cambiante de anticuerpos. El cambio de IgA específica mostró resultados similares en la mucosa de boca y heces. A medida que aumenta la inmunidad adicional, B. subtilis-RC reduce la capacidad de los patógenos para cruzar la mucosa intestinal y la propagación sistémica de patógenos invasivos [36]. El sistema inmunitario de la mucosa genera respuestas inmunitarias a través de células inmunitarias que residen en compartimentos de la mucosa. Los linfocitos T residentes en la mucosa desempeñan un papel importante en la inmunidad de la mucosa [37]. Exploramos más a fondo la especie, las cantidades y la distribución de linfocitos T en la mucosa intestinal. CD3 es un marcador de superficie celular fundamental de linfocitos T [38]. El resultado mostró que el número de linfocitos CD3 + T aumentó significativamente, y estos revelaron que B. subtilis-RC podría estimular la maduración de células T. Según las moléculas expresadas en la superficie celular, los linfocitos T pueden dividirse aún más en células T ayudantes Además, observamos que la relación de células CD4 + /CD8 + T aumentó por vía oral. La relación CD4/CD8 mide la relación de células T ayudantes a células T citotóxicas. Por lo tanto, pudimos ver que la administración oral B. subtilis-RC podría fortalecer la respuesta inmune Th1 al aumentar la relación de células CD4 + /CD8 + T. La morfología del intestino delgado puede reflejar directamente la salud intestinal y desempeña un papel importante en el mantenimiento del sistema inmunitario intestinal [40]. La fase temprana de la infección por PEDV se acompaña frecuentemente de necrosis y exfoliación de células epiteliales villosas infectadas, lo que en última instancia resulta en atrofia villosa aguda y severa [41]. Por lo tanto, el trabajo efectivo de mantener la morfología intestinal es un buen indicador para evaluar la eficacia de las vacunas. Después de la Los PP son pequeñas masas de tejido linfático y forman una parte importante del sistema inmunitario mediante el reclutamiento e inducción de las células T para prevenir el crecimiento de patógenos en los intestinos. Además, un aumento en el número de IEL demostró la eficacia de B. subtilis-RC. Además, la longitud de vellosidad del íleo mostró algunos resultados alentadores que una morfología intestinal bien formada llegó a ser por B. subtilis-RC. La morfología intestinal satisfactoria fue el primer paso en la carretera contra la infección por PEDV. Varios resultados de morfología demostraron que B. subtilis-RC podría mantener notablemente la morfología intestinal y formar una protección integral. Como se mencionó anteriormente, la administración oral con B. subtilis-RC podría estimular la proliferación y diferenciación de células T y modular la respuesta inmune. Además, las citocinas son proteínas moléculas pequeñas con amplia actividad biológica, sintetizadas y secretadas por las células inmunes y algunas células no inmunes [42]. Como molécula de señalización celular, actúa principalmente para regular las respuestas inmunes, participando en la diferenciación y desarrollo de las células inmunes, mediando las respuestas inflamatorias, estimulando la hematopoyesis y participando en la reparación de los tejidos. Estudios previos habían demostrado que el PEDV inhibió tanto las citoquinas NF-.B como las citoquinas proinflamatorias [43]. Por lo tanto, las citoquinas son un indicador clave para evaluar la capacidad de una vacuna para estimular las respuestas inmunes. En este estudio, habíamos observado que IL-1β e IL-10 aumentaron notablemente (P<0.01). El IL-1β como una de las primeras citoquinas proinflamatorias y participa centralmente en la iniciación La investigación había demostrado que IL-1β podría aumentar significativamente la regulación de los tejidos inmunes locales y sistémicos post infección microbiana [44]. Además, IL-10 es una potente citocina antiinflamatoria que juega un papel esencial en la prevención de patologías inflamatorias e autoinmunes [45]. En resumen, ambos datos mostraron que la administración oral con B. subtilis-RC regulada y aumenta la inmunidad mediante citocinas IL-1β e IL-10 de alta regulación. En conclusión, los resultados actuales demostraron que la inmunización oral con B. subtilis-RC podría inducir efectivamente a la mucosa local y respuestas inmunes sistemáticas contra la infección por PEDV, al tiempo que mejora y regula la función inmune elevando la proporción de células CD4 + /CD8 + T y citocinas IL-1β e IL-10, apuntando así a una prometedora vacuna oral candidata para la infección

¿Qué tipo de células forman la barrera mucosa intestinal?

Respuestas inmunes mucosas inducidas por la administración oral recombinante Bacillus subtilis que expresa el antígeno COE de PEDV en lechones recién nacidoshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6418403/SHA: 5caced13bcb8a42cca41369c5a71ae7df5381ca8Autores: Wang, Jialu; Huang, Lulu; Mou, Chunxiao; Zhang, En; Wang, Yongheng; Cao, Yanan; Yang, QianFecha: 2019-03-15DOI: 10.1042/bsr20182028Licencia: cc-byAbstract: La diarrea epidémica porcina (PED) es una enfermedad altamente contagiosa en lechones recién nacidos y causa pérdidas económicas sustanciales en el El virus PED (PEDV) se disemina por contacto fecal-oral y puede prevenirse mediante inmunización oral. Por lo tanto, es necesario desarrollar una vacuna oral eficaz contra la infección por PEDV. Actualmente, Bacillus subtilis como portador de la vacuna recombinante se ha utilizado para la administración de antígenos y se ha demostrado que es inmunitaria y segura. El presente estudio evaluó la inmunogenicidad de Bacillus subtilis recombinante (B. subtilis-RC) en lechones por vía oral. Después de la inmunización oral en lechones, B. subtilis-RC aumentó significativamente las respuestas inmunitarias de la mucosa local. La administración oral con B. subtilis-RC mejoró significativamente el nivel de anticuerpos contra la infección por PEDV específicos de la inmunoglobulina A (IgA) mediante la ampliación del área de los parches (PP) de Peyer y Mientras tanto, B. subtilis-RC aumentó notablemente el número de linfocitos intraepiteliales (IEL). También observamos que la administración oral de B. subtilis-RC aumentó significativamente el número de linfocitos CD3(+)T y mejoró la proporción de células T CD4(+)/CD8(+). Además, los títulos altos de inmunoglobulina G (IgG) sérica específica revelaron una respuesta inmunitaria sistémica satisfactoria contra la infección por PEDV. En resumen, nuestro estudio demostró que la administración oral de B. subtilis-RC podría desencadenar un alto nivel de respuestas inmunitarias locales y sistémicas y sería una vacuna candidata prometedora contra la infección por PEDV en lechones. Texto: Diarrea epidémica porcina (PED) caracterizada por diarrea aguda altamente fatal en lechones, resulta en enormes pérdidas en la industria porcina mundial [1] El agente causante del virus PED (PEDV) pertenece a los coronavirus porcinos (CoVs). La infección por PEDV se propaga principalmente a través del tracto digestivo [2], y daña las superficies mucosas del intestino huésped infectando las células epiteliales intestinales [3]. Por lo tanto, la mejora de la inmunidad mucosa intestinal puede provocar respuestas inmunológicas eficaces contra la infección por PEDV [4]. Actualmente, se han desarrollado y aplicado ampliamente en el mercado vacunas tradicionales (vía intramuscular o inyección subcutánea) [5]. Estas vacunas administradas por vía parenteral no pueden inducir eficazmente títulos altos de anticuerpos maternos y anticuerpos IgA específicos del virus, lo que resulta en una protección mucosa inadecuada contra la infección por PEDV [6]. Además, estos anticuerpos maternos en la leche siempre fueron degradados por el ácido gástrico y la pepsina antes de entrar en el tracto intestinal. Las vacunas Como una forma superior de inmunización mucosal, la administración oral puede proteger el intestino y estimular el sistema inmunológico mucosal común [8]. Además, la inmunización oral tiene varias características atractivas que incluyen la seguridad, y un enfoque sencillo, barato y sin agujas [9]. Por lo tanto, la inmunización oral a menudo ofrece grandes cantidades de antígenos para prevenir las enfermedades diarreicas [10]. Sin embargo, hay varios desafíos por la inmunización oral, que consisten en barreras físicas, químicas y biológicas al entregar antígenos al tracto gastrointestinal (como ácidos gástricos, pepsina y tripsina en el tracto GI) [11]. Es un problema sustancial que los ácidos digestivos y las proteasas pueden degradar las proteínas antígenos para la absorción de nutrientes [12]. Por lo tanto, el sistema de administración de vacunas se ha aplicado para resolver el problema. El sistema puede proteger antígenos del entorno severo del tracto GI y entregar antígenos a la mucosa intestinal Actualmente, Bacillus subtilis (B. subtilis) es ampliamente utilizado como un sistema de administración de vacunas por sus características únicas. Como bacteria Gram-positiva no patógena, B. subtilis ha sido considerado como un nuevo probiótico y aditivo alimentario en humanos y animales [14]. El B. subtilis tiene actividad adyuvante y puede entregar antígenos heterólogos al tracto GI, proporcionando estimulación de inmunidad adicional [15]. Además, la investigación había demostrado que B. subtilis administrado por vía oral también podría mejorar la regulación inmunitaria y la salud intestinal en cerdos [16]. Además, la administración oral de B. subtilis podría generar respuestas inmunes humorales y celulares al mantenimiento de la homeostasis intestinal por células dendríticas [17]. Los DC son las células de antígeno profesional más importantes y pueden regular eficazmente los títulos de anticuerpos [18 Los DCs existen naturalmente en el tejido linfoide asociado al intestino (GALT), incluyendo los parches de Peyer (PPs), folículos linfoides aislados (FIL), ganglios linfáticos mesentéricos (MLNs), y se dispersan a través de la lámina subepitelial propria (LP) del intestino delgado y el colon [19]. Además, B. subtilis es conveniente para la manipulación genética y ha desarrollado una gran variedad de herramientas genéticas [20]. Por lo tanto, B. subtilis se utiliza ampliamente como un sistema eficaz de administración de vacunas para inducir respuestas inmunes mucosas y muestra un efecto único en el sistema inmunitario. En el presente informe, exploramos el efecto inmune de un B. subtilis recombinante (B. subtilis-RC) que se había construido con éxito con la expresión de la proteína PEDV COE en lechones. Nuestra investigación indicó que B. subtilis-RC era beneficioso para el desarrollo del sistema inmunológico mucosal, y podía generar anticuerpos específicos contra la infección por PEDV, sugiriendo un posible enfoque para prevenir la infección por PEDV. El B. subtilis WB800 fue amablemente proporcionado por el Dr. Xuewen Gao (del departamento de patología vegetal de la Universidad Agrícola de Nanjing) [21]. B. subtilis-RC construido previamente en nuestro laboratorio fue capaz de expresar el gen COE (499-638 aminoácidos en proteína S). Antes de la administración oral, la cepa recombinante fue cultivada en caldo LB a 37 • C durante 12 h, y luego se lavó dos veces con PBS, y se suspendió en PBS para alcanzar una concentración final de 1 × 10 10 CFU/ml. La cepa PEDV Zhejiang08 fue proporcionada por el Centro El virus se cultivó en células renales de mono verde africano (células VERO) y se purificó utilizando un gradiente discontinuo de densidad de sacarosa. El virus fue inactivado por UV a dosis UV de 4 J/cm 2 durante 24 h para lograr una pérdida completa de infectividad [23]. La concentración del virus purificado se midió utilizando el kit de análisis de proteínas BCA (Thermo Fisher, MA, EE.UU.). ELISA: Rabbit anti-pig IgG (peroxidasa de rábano caballar (HRP)), Goat Anti-Pig IgA (HRP) fueron comprados a Abcam. Segundo anticuerpo: Anticuerpo IgG de cabra conjugado DyLight 649 anticuerpo IgG de cabra conjugado, DyLight 488-anticuerpo IgG de cabra conjugado, DyLight 594-anticuerpo IgG de cabra conjugado fueron comprados a Multiciencia, Hangzhou, China. Sistema basado en ABC (anticuerpo IgG de cabra bitinilada) fue utilizado como el anticuerpo secundario con DAB como un cromogeno fue comprado a Boster, Wuhan, China. Cochinchos DLY específicos libres de patógenos (Duroc y Landrace y Yorkshire) fueron amablemente proporcionados por la Academia Jiangsu de Ciencias Agrícolas (Nanjing, China). Los experimentos con animales habían sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Agrícola de Nanjing y siguieron las directrices de los Doce lechones recién nacidos fueron divididos aleatoriamente en tres grupos (cuatro lechones en cada grupo) y alojados en condiciones similares en diferentes establos para evitar la contaminación cruzada probiótica. Los lechones fueron dosificados por vía oral con 100 μl de B. subtilis-RC. Los grupos de control de lechones fueron administrados por vía oral con PEDV inactivado (100 μg/dosis) e igual volumen de PBS. El protocolo de inmunización fue realizado en los lechones que tenían 5 días de edad (Figura 1C ), y firmados como 0 día. Luego se administraron vacunas de refuerzo en 5 días. Luego se realizó la recolección de especímenes cada 7 días después de la inmunización de refuerzo (Figura 1C ). Se recolectaron muestras de sangre semanalmente de todos los lechones después de la inmunización de refuerzo y se les permitió coagular durante la noche a temperatura Las muestras de sangre se separaron mediante centrifugación y se almacenaron a −20 • C para detectar los niveles de IgG e IgA específicos. Se recolectaron tres hisopos cada semana durante 1 mes, incluyendo hisopos nasales, orales y de heces para el ELISA. Los lechones fueron sacrificados en 33 días. La misma ubicación de los tejidos del intestino delgado y del íleo de cada cerdito se fijaron con el líquido de Bonn y un 4% de paraformaldehído. Los tejidos del intestino delgado en la misma ubicación se fijaron con solución fijadora de Bouin durante 24 h, incrustados en parafina, y seccionaron a un espesor de 4 μm. Las secciones se colocaron en diapositivas de vidrio. La tinción de hematoxilina-eosina se aplicó a las secciones de parafina, y luego se observaron y tomaron fotografías bajo microscopio El número de linfocitos intraepiteliales (IEL) se contaron en cada 100 células epiteliales bajo el mismo microscopio de luz múltiple entre diez imágenes de cada grupo [24]. La detección inmunohistoquímica se realizó con el kit SABC (Boster Bioscience), se utilizó peróxido de hidrógeno para desactivar la peroxidasa intrínseca. La recuperación de antígenos se realizó en un baño de agua utilizando tampón citrato-EDTA (10 mM ácido cítrico, 2 mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 6.2). Las secciones se incubaron con anticuerpo anti-IgA diluido (1:100; Abcam) durante la noche a las 4 • C. Como controles negativos, inmunoteñido realizado mediante muestras de control antiserum en lugar de anticuerpo primario. La adición de anticuerpo secundario marcado con biotina a las diapositivas fue seguida por la Después de la tinción con DAB, las diapositivas fueron grabadas utilizando una cámara digital (Leica-DM4000B) [25]. Los intestinos aislados con PP fueron transferidos a PBS helados. Luego, el resto de grasa y tejido conectivo fue removido y lavado a fondo con PBS helado. Luego, el intestino fue cortado longitudinalmente en fragmentos de 0,5 cm. Los fragmentos fueron incubados con 5 ml de EDTA 30 mM y colocados en solución digestiva de 5 ml que contenía 4 % FBS, 0,5 mg/ml cada uno de Collagenasa D (Roche) y Dnasa I (Sigma), y 50 U/ml Dispasa (Fisher). Los fragmentos fueron incubados con PBS de Dulbecco (DPBS) durante 20 min a 37 • C por rotación lenta (100 rpm). Después de la incubación, la capa de células epiteliales que contenía los LIE fueron separadas por un vórtice intensivo y pasaron a través de un colador celular de 70-μm. La suspensión monocelular fue recogida y lavada dos veces por DPBS, la solución fue vórtice intensamente y pasó a través de un colador celular de 40-μm. Los sobrenadantes fueron lavados por medio de RPM 1640 preenfriado (Thermo Fisher Scientific) y suspendidos por 10 ml de la fracción 40% de un gradiente de 40:80 Percoll, superpuestos sobre 5 ml de la fracción 80% en un tubo Falcon de 15 ml. La separación de gradiente de Percoll fue realizada por centrifugación durante 20 min a 2500 rpm. Los linfocitos LP (LPL) fueron recolectados en la interfase del gradiente Mientras tanto, el análisis de citometría de flujo se realizó en instrumentos BD Facscalibur (BD Biosciences) y fue analizado por el software FlowJo. Todos los anticuerpos fueron adquiridos de BD Pharmingen o eBiociencias. Suspensiones unicelulares aisladas fueron manchadas con anti-CD3-APC, anti-CD4-FITC, anti-CD8-PE, todas a la 1:100 dilución durante 30 min sobre hielo, y lavadas con PBS dos veces, y analizadas por FACS [26]. Las citoquinas interleucinas (IL) 10 (IL-10) e IL-1β (Abcam) fueron medidas por ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los datos fueron adquiridos en un lector de placas ELISA automatizado en OD 450 nm inmediatamente. Los anticuerpos neutralizantes de PEDV fueron medidos en líquido lavado de intestinos La prueba se realizó como se describió previamente con modificaciones menores [27]. Un total de 450 μl de líquido de lavado de intestino fue dos veces diluido en serie y mezclado con 50 μl de suspensión viral que contenía 10 3 TCID 50 PEDV virus durante 1 h a 37 • C en placas de cultivo de tejido de fondo plano de 12 pocillos. La mezcla fue inoculada durante 1 h a 37 • C y 5% CO 2. Luego, la mezcla fue inoculada con células Vero suspensión (aproximadamente 1,0 × 10 6 ml − 1 ) durante otros 3-4 días. Después de la tinción con Crystal Violet, las placas fueron observadas bajo un microscopio para el efecto citopático. Los datos fueron obtenidos como el medio + − S.E.M. de tres réplicas por prueba en un solo experimento. GraphPad Prism V Las múltiples pruebas de comparación de Tukey y ANOVA de un solo sentido fueron utilizadas para analizar la significación de la diferencia entre los medios. Los valores-P inferiores a 0,05 (P<0,05) fueron considerados significativos y los valores-P inferiores a 0,01 (P<0,01) como altamente significativos. Los PP son un concentrado de tejido linfoide y el sitio primario para la producción de inmunoglobulina A (IgA), lo cual es crucial para regular el equilibrio homeostático del intestino [28]. El área de los PP es un indicador clave de inmunidad. La administración oral con B. subtilis-RC significativamente (P<0,01) aumentó el área de los PP en comparación con dos grupos control como se muestra en la Figura 1A. Además, la longitud de la vili del íleum obtuvo más tiempo por administración oral con B. subtilis-RC (P<0,01) que Estos confirmaron principalmente que B. subtilis-RC fue beneficioso para mantener la estructura del intestino. Los IEL intestinales son una población grande y diversa de células linfoides que residen dentro de las células epiteliales intestinales (IECs), y que forman la barrera mucosa intestinal [29]. Los IELs son una parte importante del sistema inmunológico de la mucosa intestinal. El nivel de anticuerpos específicos anti-PEDV íleum IgA + secretación (SIgA) en lechones fue medido por ELISA en la boca y heces. Como se muestra en la Figura 3A, B, la mucosa específica del antígeno SIgA en los sitios anteriores fue claramente mayor que el grupo PEDV inactivado (P<0,05 o P<0,01). Como se esperaba, la boca tenía niveles más altos de SIgA que otros sitios. Después de la inmunización oral, el nivel de anticuerpo anti-PEDV IgG sérico en lechones inmunizados con B. subtilis-RC, PEDV inactivado o PBS fue determinado por ELISA, como se muestra en la Figura 3C. Los resultados indicaron que aunque los títulos cayeron durante el período de muestreo, el nivel IgG de B. subtilis-RC todavía aumentó significativamente de 0 a 33 días que el grupo PEDV inactivado (P<0,05 o P<0,01). Los linfocitos CD3 + T son los marcadores de la superficie celular fundamental de los linfocitos T, por lo que el número de linfocitos CD3 + T podría representar la cantidad de linfocitos T. En consecuencia, se analizó el número de linfocitos CD3 + T en el íleo. Los datos indicaron que tanto B. subtilis-RC como PEDV inactivado podrían aumentar dramáticamente (P<0,05) los linfocitos CD3 + T en comparación con el grupo PBS (Figura 4A ). Estos cambios mostraron evidencia segura de que la administración oral con B. subtilis-RC tuvo una buena influencia en la inmunidad de la mucosa intestinal en lechones. SIgA es el principal isotipo de inmunoglobulina en animales, en gran parte secretado a través de la superficie de la mucosa intestinal especialmente en el intestino delgado [30]. SIgA juega un papel importante en la inmunidad de la mucosa intestinal y refleja en la inmunidad de la mucosa intestinal. Después de la administración oral con B. subtilis-RC, el número de células secretantes IgA había aumentado rápidamente en comparación con los otros dos grupos (P<0,05) (Figura 4B). Estos resultados mostraron que la administración oral con B. subtilis-RC fue propicia a la inmunidad mucosa intestinal y podría aumentar el número de células secretadoras de IgA para producir efectos positivos sobre la infección por PEDV. Gran parte de las células inmunitarias están dispersas en las células epiteliales. Las IEC interactúan directa o indirectamente con las células inmunes innatas y adaptativas mediante la presentación de antígenos a los linfocitos [31]. Por lo tanto, el aprendizaje sobre cómo se distribuyen los linfocitos en la pequeña mucosa intestinal es muy significativo para la inmunología de la mucosa. Datos previos habían demostrado que los linfocitos CD3 + T aumentaron significativamente (P<0,05) (Figura 4A ), por lo que se analizó más adelante la clasificación inmunológica de CD3 + T linfocitos. El linfocito del íleo con unión de PP Estos resultados mostraron que las células CD3 + CD4 + T han aumentado obviamente (P<0,01) (Figura 5B ), sin embargo las células CD3 + CD8 + T disminuyeron notablemente (P<0,05) (Figura 5C ). Después del cálculo, la relación de células CD4 + /CD8 + T aumentó (Figura 5D ). Esta relación también podría medir más los niveles de inmunidad de los lechones. Los niveles de citoquina IL-1β e IL-10 se determinaron para evaluar las respuestas inmunes celulares inducidas por B. subtilis-RC como se muestra en la Figura 6A,B. Como podemos ver en el diagrama, significativamente (P<0,01) se produjeron IL-1β e IL-10 superiores después de la administración oral con B. subtilis-RC que los otros dos grupos. Todos estos revelaron que B. subtilis-RC podría estimular la liberación de citoquinas para mediar la comunicación con y entre las células del sistema inmunitario, mejorando la respuesta inmune mucosa a la infección por PEDV. Los anticuerpos neutralizantes del PEDV fueron detectados por el ensayo PRNT. La administración oral con B. subtilis-RC podría reducir efectivamente la capacidad de formación de placa de PEDV (P<0,01) en comparación con otros dos grupos en la Figura 7. Esto reveló que B. subtilis-RC podría estimular un alto nivel de anticuerpos neutralizantes del PEDV contra la infección por PEDV. En medio del brote del PEDV, se han desarrollado varias vacunas para controlar enfermedades y los efectos son insatisfactorios. Las vacunas orales pueden inducir una inmunidad mucosa más robusta que las contrapartes inyectables [32]. Ahora está claro que la respuesta inmune mucosal efectiva requiere IgG sérico y SIgA mucosal [34]. SIgA es la base del sistema inmune mucosal, desempeñando un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis inmune, y neutralizando los patógenos invasivos. IgG sérico representa respuestas inmunes sistémicas. Durante las infecciones por PEDV, la inmunización oral provoca no sólo mucosas sino también respuestas inmunes sistémicas muy bien [35]. Nuestros datos mostraron una respuesta IgG anti-PEDV fuerte y de larga duración se detectaron por vía oral con B. subtilis-RC en lechones. Aunque con el paso del tiempo, los títulos de anticuerpos disminuyeron un poco, todavía se mantuvo en la cabeza en comparación con los grupos de control y de acuerdo con la tendencia cambiante de anticuerpos. El cambio de IgA específica mostró resultados similares en la mucosa de boca y heces. A medida que aumenta la inmunidad adicional, B. subtilis-RC reduce la capacidad de los patógenos para cruzar la mucosa intestinal y la propagación sistémica de patógenos invasivos [36]. El sistema inmunitario de la mucosa genera respuestas inmunitarias a través de células inmunitarias que residen en compartimentos de la mucosa. Los linfocitos T residentes en la mucosa desempeñan un papel importante en la inmunidad de la mucosa [37]. Exploramos más a fondo la especie, las cantidades y la distribución de linfocitos T en la mucosa intestinal. CD3 es un marcador de superficie celular fundamental de linfocitos T [38]. El resultado mostró que el número de linfocitos CD3 + T aumentó significativamente, y estos revelaron que B. subtilis-RC podría estimular la maduración de células T. Según las moléculas expresadas en la superficie celular, los linfocitos T pueden dividirse aún más en células T ayudantes Además, observamos que la relación de células CD4 + /CD8 + T aumentó por vía oral. La relación CD4/CD8 mide la relación de células T ayudantes a células T citotóxicas. Por lo tanto, pudimos ver que la administración oral B. subtilis-RC podría fortalecer la respuesta inmune Th1 al aumentar la relación de células CD4 + /CD8 + T. La morfología del intestino delgado puede reflejar directamente la salud intestinal y desempeña un papel importante en el mantenimiento del sistema inmunitario intestinal [40]. La fase temprana de la infección por PEDV se acompaña frecuentemente de necrosis y exfoliación de células epiteliales villosas infectadas, lo que en última instancia resulta en atrofia villosa aguda y severa [41]. Por lo tanto, el trabajo efectivo de mantener la morfología intestinal es un buen indicador para evaluar la eficacia de las vacunas. Después de la Los PP son pequeñas masas de tejido linfático y forman una parte importante del sistema inmunitario mediante el reclutamiento e inducción de las células T para prevenir el crecimiento de patógenos en los intestinos. Además, un aumento en el número de IEL demostró la eficacia de B. subtilis-RC. Además, la longitud de vellosidad del íleo mostró algunos resultados alentadores que una morfología intestinal bien formada llegó a ser por B. subtilis-RC. La morfología intestinal satisfactoria fue el primer paso en la carretera contra la infección por PEDV. Varios resultados de morfología demostraron que B. subtilis-RC podría mantener notablemente la morfología intestinal y formar una protección integral. Como se mencionó anteriormente, la administración oral con B. subtilis-RC podría estimular la proliferación y diferenciación de células T y modular la respuesta inmune. Además, las citocinas son proteínas moléculas pequeñas con amplia actividad biológica, sintetizadas y secretadas por las células inmunes y algunas células no inmunes [42]. Como molécula de señalización celular, actúa principalmente para regular las respuestas inmunes, participando en la diferenciación y desarrollo de las células inmunes, mediando las respuestas inflamatorias, estimulando la hematopoyesis y participando en la reparación de los tejidos. Estudios previos habían demostrado que el PEDV inhibió tanto las citoquinas NF-.B como las citoquinas proinflamatorias [43]. Por lo tanto, las citoquinas son un indicador clave para evaluar la capacidad de una vacuna para estimular las respuestas inmunes. En este estudio, habíamos observado que IL-1β e IL-10 aumentaron notablemente (P<0.01). El IL-1β como una de las primeras citoquinas proinflamatorias y participa centralmente en la iniciación La investigación había demostrado que IL-1β podría aumentar significativamente la regulación de los tejidos inmunes locales y sistémicos post infección microbiana [44]. Además, IL-10 es una potente citocina antiinflamatoria que juega un papel esencial en la prevención de patologías inflamatorias e autoinmunes [45]. En resumen, ambos datos mostraron que la administración oral con B. subtilis-RC regulada y aumenta la inmunidad mediante citocinas IL-1β e IL-10 de alta regulación. En conclusión, los resultados actuales demostraron que la inmunización oral con B. subtilis-RC podría inducir efectivamente a la mucosa local y respuestas inmunes sistemáticas contra la infección por PEDV, al tiempo que mejora y regula la función inmune elevando la proporción de células CD4 + /CD8 + T y citocinas IL-1β e IL-10, apuntando así a una prometedora vacuna oral candidata para la infección

¿Qué factores determinan una respuesta inmune eficaz de la mucosa?

Respuestas inmunes mucosas inducidas por la administración oral recombinante Bacillus subtilis que expresa el antígeno COE de PEDV en lechones recién nacidoshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6418403/SHA: 5caced13bcb8a42cca41369c5a71ae7df5381ca8Autores: Wang, Jialu; Huang, Lulu; Mou, Chunxiao; Zhang, En; Wang, Yongheng; Cao, Yanan; Yang, QianFecha: 2019-03-15DOI: 10.1042/bsr20182028Licencia: cc-byAbstract: La diarrea epidémica porcina (PED) es una enfermedad altamente contagiosa en lechones recién nacidos y causa pérdidas económicas sustanciales en el El virus PED (PEDV) se disemina por contacto fecal-oral y puede prevenirse mediante inmunización oral. Por lo tanto, es necesario desarrollar una vacuna oral eficaz contra la infección por PEDV. Actualmente, Bacillus subtilis como portador de la vacuna recombinante se ha utilizado para la administración de antígenos y se ha demostrado que es inmunitaria y segura. El presente estudio evaluó la inmunogenicidad de Bacillus subtilis recombinante (B. subtilis-RC) en lechones por vía oral. Después de la inmunización oral en lechones, B. subtilis-RC aumentó significativamente las respuestas inmunitarias de la mucosa local. La administración oral con B. subtilis-RC mejoró significativamente el nivel de anticuerpos contra la infección por PEDV específicos de la inmunoglobulina A (IgA) mediante la ampliación del área de los parches (PP) de Peyer y Mientras tanto, B. subtilis-RC aumentó notablemente el número de linfocitos intraepiteliales (IEL). También observamos que la administración oral de B. subtilis-RC aumentó significativamente el número de linfocitos CD3(+)T y mejoró la proporción de células T CD4(+)/CD8(+). Además, los títulos altos de inmunoglobulina G (IgG) sérica específica revelaron una respuesta inmunitaria sistémica satisfactoria contra la infección por PEDV. En resumen, nuestro estudio demostró que la administración oral de B. subtilis-RC podría desencadenar un alto nivel de respuestas inmunitarias locales y sistémicas y sería una vacuna candidata prometedora contra la infección por PEDV en lechones. Texto: Diarrea epidémica porcina (PED) caracterizada por diarrea aguda altamente fatal en lechones, resulta en enormes pérdidas en la industria porcina mundial [1] El agente causante del virus PED (PEDV) pertenece a los coronavirus porcinos (CoVs). La infección por PEDV se propaga principalmente a través del tracto digestivo [2], y daña las superficies mucosas del intestino huésped infectando las células epiteliales intestinales [3]. Por lo tanto, la mejora de la inmunidad mucosa intestinal puede provocar respuestas inmunológicas eficaces contra la infección por PEDV [4]. Actualmente, se han desarrollado y aplicado ampliamente en el mercado vacunas tradicionales (vía intramuscular o inyección subcutánea) [5]. Estas vacunas administradas por vía parenteral no pueden inducir eficazmente títulos altos de anticuerpos maternos y anticuerpos IgA específicos del virus, lo que resulta en una protección mucosa inadecuada contra la infección por PEDV [6]. Además, estos anticuerpos maternos en la leche siempre fueron degradados por el ácido gástrico y la pepsina antes de entrar en el tracto intestinal. Las vacunas Como una forma superior de inmunización mucosal, la administración oral puede proteger el intestino y estimular el sistema inmunológico mucosal común [8]. Además, la inmunización oral tiene varias características atractivas que incluyen la seguridad, y un enfoque sencillo, barato y sin agujas [9]. Por lo tanto, la inmunización oral a menudo ofrece grandes cantidades de antígenos para prevenir las enfermedades diarreicas [10]. Sin embargo, hay varios desafíos por la inmunización oral, que consisten en barreras físicas, químicas y biológicas al entregar antígenos al tracto gastrointestinal (como ácidos gástricos, pepsina y tripsina en el tracto GI) [11]. Es un problema sustancial que los ácidos digestivos y las proteasas pueden degradar las proteínas antígenos para la absorción de nutrientes [12]. Por lo tanto, el sistema de administración de vacunas se ha aplicado para resolver el problema. El sistema puede proteger antígenos del entorno severo del tracto GI y entregar antígenos a la mucosa intestinal Actualmente, Bacillus subtilis (B. subtilis) es ampliamente utilizado como un sistema de administración de vacunas por sus características únicas. Como bacteria Gram-positiva no patógena, B. subtilis ha sido considerado como un nuevo probiótico y aditivo alimentario en humanos y animales [14]. El B. subtilis tiene actividad adyuvante y puede entregar antígenos heterólogos al tracto GI, proporcionando estimulación de inmunidad adicional [15]. Además, la investigación había demostrado que B. subtilis administrado por vía oral también podría mejorar la regulación inmunitaria y la salud intestinal en cerdos [16]. Además, la administración oral de B. subtilis podría generar respuestas inmunes humorales y celulares al mantenimiento de la homeostasis intestinal por células dendríticas [17]. Los DC son las células de antígeno profesional más importantes y pueden regular eficazmente los títulos de anticuerpos [18 Los DCs existen naturalmente en el tejido linfoide asociado al intestino (GALT), incluyendo los parches de Peyer (PPs), folículos linfoides aislados (FIL), ganglios linfáticos mesentéricos (MLNs), y se dispersan a través de la lámina subepitelial propria (LP) del intestino delgado y el colon [19]. Además, B. subtilis es conveniente para la manipulación genética y ha desarrollado una gran variedad de herramientas genéticas [20]. Por lo tanto, B. subtilis se utiliza ampliamente como un sistema eficaz de administración de vacunas para inducir respuestas inmunes mucosas y muestra un efecto único en el sistema inmunitario. En el presente informe, exploramos el efecto inmune de un B. subtilis recombinante (B. subtilis-RC) que se había construido con éxito con la expresión de la proteína PEDV COE en lechones. Nuestra investigación indicó que B. subtilis-RC era beneficioso para el desarrollo del sistema inmunológico mucosal, y podía generar anticuerpos específicos contra la infección por PEDV, sugiriendo un posible enfoque para prevenir la infección por PEDV. El B. subtilis WB800 fue amablemente proporcionado por el Dr. Xuewen Gao (del departamento de patología vegetal de la Universidad Agrícola de Nanjing) [21]. B. subtilis-RC construido previamente en nuestro laboratorio fue capaz de expresar el gen COE (499-638 aminoácidos en proteína S). Antes de la administración oral, la cepa recombinante fue cultivada en caldo LB a 37 • C durante 12 h, y luego se lavó dos veces con PBS, y se suspendió en PBS para alcanzar una concentración final de 1 × 10 10 CFU/ml. La cepa PEDV Zhejiang08 fue proporcionada por el Centro El virus se cultivó en células renales de mono verde africano (células VERO) y se purificó utilizando un gradiente discontinuo de densidad de sacarosa. El virus fue inactivado por UV a dosis UV de 4 J/cm 2 durante 24 h para lograr una pérdida completa de infectividad [23]. La concentración del virus purificado se midió utilizando el kit de análisis de proteínas BCA (Thermo Fisher, MA, EE.UU.). ELISA: Rabbit anti-pig IgG (peroxidasa de rábano caballar (HRP)), Goat Anti-Pig IgA (HRP) fueron comprados a Abcam. Segundo anticuerpo: Anticuerpo IgG de cabra conjugado DyLight 649 anticuerpo IgG de cabra conjugado, DyLight 488-anticuerpo IgG de cabra conjugado, DyLight 594-anticuerpo IgG de cabra conjugado fueron comprados a Multiciencia, Hangzhou, China. Sistema basado en ABC (anticuerpo IgG de cabra bitinilada) fue utilizado como el anticuerpo secundario con DAB como un cromogeno fue comprado a Boster, Wuhan, China. Cochinchos DLY específicos libres de patógenos (Duroc y Landrace y Yorkshire) fueron amablemente proporcionados por la Academia Jiangsu de Ciencias Agrícolas (Nanjing, China). Los experimentos con animales habían sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Agrícola de Nanjing y siguieron las directrices de los Doce lechones recién nacidos fueron divididos aleatoriamente en tres grupos (cuatro lechones en cada grupo) y alojados en condiciones similares en diferentes establos para evitar la contaminación cruzada probiótica. Los lechones fueron dosificados por vía oral con 100 μl de B. subtilis-RC. Los grupos de control de lechones fueron administrados por vía oral con PEDV inactivado (100 μg/dosis) e igual volumen de PBS. El protocolo de inmunización fue realizado en los lechones que tenían 5 días de edad (Figura 1C ), y firmados como 0 día. Luego se administraron vacunas de refuerzo en 5 días. Luego se realizó la recolección de especímenes cada 7 días después de la inmunización de refuerzo (Figura 1C ). Se recolectaron muestras de sangre semanalmente de todos los lechones después de la inmunización de refuerzo y se les permitió coagular durante la noche a temperatura Las muestras de sangre se separaron mediante centrifugación y se almacenaron a −20 • C para detectar los niveles de IgG e IgA específicos. Se recolectaron tres hisopos cada semana durante 1 mes, incluyendo hisopos nasales, orales y de heces para el ELISA. Los lechones fueron sacrificados en 33 días. La misma ubicación de los tejidos del intestino delgado y del íleo de cada cerdito se fijaron con el líquido de Bonn y un 4% de paraformaldehído. Los tejidos del intestino delgado en la misma ubicación se fijaron con solución fijadora de Bouin durante 24 h, incrustados en parafina, y seccionaron a un espesor de 4 μm. Las secciones se colocaron en diapositivas de vidrio. La tinción de hematoxilina-eosina se aplicó a las secciones de parafina, y luego se observaron y tomaron fotografías bajo microscopio El número de linfocitos intraepiteliales (IEL) se contaron en cada 100 células epiteliales bajo el mismo microscopio de luz múltiple entre diez imágenes de cada grupo [24]. La detección inmunohistoquímica se realizó con el kit SABC (Boster Bioscience), se utilizó peróxido de hidrógeno para desactivar la peroxidasa intrínseca. La recuperación de antígenos se realizó en un baño de agua utilizando tampón citrato-EDTA (10 mM ácido cítrico, 2 mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 6.2). Las secciones se incubaron con anticuerpo anti-IgA diluido (1:100; Abcam) durante la noche a las 4 • C. Como controles negativos, inmunoteñido realizado mediante muestras de control antiserum en lugar de anticuerpo primario. La adición de anticuerpo secundario marcado con biotina a las diapositivas fue seguida por la Después de la tinción con DAB, las diapositivas fueron grabadas utilizando una cámara digital (Leica-DM4000B) [25]. Los intestinos aislados con PP fueron transferidos a PBS helados. Luego, el resto de grasa y tejido conectivo fue removido y lavado a fondo con PBS helado. Luego, el intestino fue cortado longitudinalmente en fragmentos de 0,5 cm. Los fragmentos fueron incubados con 5 ml de EDTA 30 mM y colocados en solución digestiva de 5 ml que contenía 4 % FBS, 0,5 mg/ml cada uno de Collagenasa D (Roche) y Dnasa I (Sigma), y 50 U/ml Dispasa (Fisher). Los fragmentos fueron incubados con PBS de Dulbecco (DPBS) durante 20 min a 37 • C por rotación lenta (100 rpm). Después de la incubación, la capa de células epiteliales que contenía los LIE fueron separadas por un vórtice intensivo y pasaron a través de un colador celular de 70-μm. La suspensión monocelular fue recogida y lavada dos veces por DPBS, la solución fue vórtice intensamente y pasó a través de un colador celular de 40-μm. Los sobrenadantes fueron lavados por medio de RPM 1640 preenfriado (Thermo Fisher Scientific) y suspendidos por 10 ml de la fracción 40% de un gradiente de 40:80 Percoll, superpuestos sobre 5 ml de la fracción 80% en un tubo Falcon de 15 ml. La separación de gradiente de Percoll fue realizada por centrifugación durante 20 min a 2500 rpm. Los linfocitos LP (LPL) fueron recolectados en la interfase del gradiente Mientras tanto, el análisis de citometría de flujo se realizó en instrumentos BD Facscalibur (BD Biosciences) y fue analizado por el software FlowJo. Todos los anticuerpos fueron adquiridos de BD Pharmingen o eBiociencias. Suspensiones unicelulares aisladas fueron manchadas con anti-CD3-APC, anti-CD4-FITC, anti-CD8-PE, todas a la 1:100 dilución durante 30 min sobre hielo, y lavadas con PBS dos veces, y analizadas por FACS [26]. Las citoquinas interleucinas (IL) 10 (IL-10) e IL-1β (Abcam) fueron medidas por ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los datos fueron adquiridos en un lector de placas ELISA automatizado en OD 450 nm inmediatamente. Los anticuerpos neutralizantes de PEDV fueron medidos en líquido lavado de intestinos La prueba se realizó como se describió previamente con modificaciones menores [27]. Un total de 450 μl de líquido de lavado de intestino fue dos veces diluido en serie y mezclado con 50 μl de suspensión viral que contenía 10 3 TCID 50 PEDV virus durante 1 h a 37 • C en placas de cultivo de tejido de fondo plano de 12 pocillos. La mezcla fue inoculada durante 1 h a 37 • C y 5% CO 2. Luego, la mezcla fue inoculada con células Vero suspensión (aproximadamente 1,0 × 10 6 ml − 1 ) durante otros 3-4 días. Después de la tinción con Crystal Violet, las placas fueron observadas bajo un microscopio para el efecto citopático. Los datos fueron obtenidos como el medio + − S.E.M. de tres réplicas por prueba en un solo experimento. GraphPad Prism V Las múltiples pruebas de comparación de Tukey y ANOVA de un solo sentido fueron utilizadas para analizar la significación de la diferencia entre los medios. Los valores-P inferiores a 0,05 (P<0,05) fueron considerados significativos y los valores-P inferiores a 0,01 (P<0,01) como altamente significativos. Los PP son un concentrado de tejido linfoide y el sitio primario para la producción de inmunoglobulina A (IgA), lo cual es crucial para regular el equilibrio homeostático del intestino [28]. El área de los PP es un indicador clave de inmunidad. La administración oral con B. subtilis-RC significativamente (P<0,01) aumentó el área de los PP en comparación con dos grupos control como se muestra en la Figura 1A. Además, la longitud de la vili del íleum obtuvo más tiempo por administración oral con B. subtilis-RC (P<0,01) que Estos confirmaron principalmente que B. subtilis-RC fue beneficioso para mantener la estructura del intestino. Los IEL intestinales son una población grande y diversa de células linfoides que residen dentro de las células epiteliales intestinales (IECs), y que forman la barrera mucosa intestinal [29]. Los IELs son una parte importante del sistema inmunológico de la mucosa intestinal. El nivel de anticuerpos específicos anti-PEDV íleum IgA + secretación (SIgA) en lechones fue medido por ELISA en la boca y heces. Como se muestra en la Figura 3A, B, la mucosa específica del antígeno SIgA en los sitios anteriores fue claramente mayor que el grupo PEDV inactivado (P<0,05 o P<0,01). Como se esperaba, la boca tenía niveles más altos de SIgA que otros sitios. Después de la inmunización oral, el nivel de anticuerpo anti-PEDV IgG sérico en lechones inmunizados con B. subtilis-RC, PEDV inactivado o PBS fue determinado por ELISA, como se muestra en la Figura 3C. Los resultados indicaron que aunque los títulos cayeron durante el período de muestreo, el nivel IgG de B. subtilis-RC todavía aumentó significativamente de 0 a 33 días que el grupo PEDV inactivado (P<0,05 o P<0,01). Los linfocitos CD3 + T son los marcadores de la superficie celular fundamental de los linfocitos T, por lo que el número de linfocitos CD3 + T podría representar la cantidad de linfocitos T. En consecuencia, se analizó el número de linfocitos CD3 + T en el íleo. Los datos indicaron que tanto B. subtilis-RC como PEDV inactivado podrían aumentar dramáticamente (P<0,05) los linfocitos CD3 + T en comparación con el grupo PBS (Figura 4A ). Estos cambios mostraron evidencia segura de que la administración oral con B. subtilis-RC tuvo una buena influencia en la inmunidad de la mucosa intestinal en lechones. SIgA es el principal isotipo de inmunoglobulina en animales, en gran parte secretado a través de la superficie de la mucosa intestinal especialmente en el intestino delgado [30]. SIgA juega un papel importante en la inmunidad de la mucosa intestinal y refleja en la inmunidad de la mucosa intestinal. Después de la administración oral con B. subtilis-RC, el número de células secretantes IgA había aumentado rápidamente en comparación con los otros dos grupos (P<0,05) (Figura 4B). Estos resultados mostraron que la administración oral con B. subtilis-RC fue propicia a la inmunidad mucosa intestinal y podría aumentar el número de células secretadoras de IgA para producir efectos positivos sobre la infección por PEDV. Gran parte de las células inmunitarias están dispersas en las células epiteliales. Las IEC interactúan directa o indirectamente con las células inmunes innatas y adaptativas mediante la presentación de antígenos a los linfocitos [31]. Por lo tanto, el aprendizaje sobre cómo se distribuyen los linfocitos en la pequeña mucosa intestinal es muy significativo para la inmunología de la mucosa. Datos previos habían demostrado que los linfocitos CD3 + T aumentaron significativamente (P<0,05) (Figura 4A ), por lo que se analizó más adelante la clasificación inmunológica de CD3 + T linfocitos. El linfocito del íleo con unión de PP Estos resultados mostraron que las células CD3 + CD4 + T han aumentado obviamente (P<0,01) (Figura 5B ), sin embargo las células CD3 + CD8 + T disminuyeron notablemente (P<0,05) (Figura 5C ). Después del cálculo, la relación de células CD4 + /CD8 + T aumentó (Figura 5D ). Esta relación también podría medir más los niveles de inmunidad de los lechones. Los niveles de citoquina IL-1β e IL-10 se determinaron para evaluar las respuestas inmunes celulares inducidas por B. subtilis-RC como se muestra en la Figura 6A,B. Como podemos ver en el diagrama, significativamente (P<0,01) se produjeron IL-1β e IL-10 superiores después de la administración oral con B. subtilis-RC que los otros dos grupos. Todos estos revelaron que B. subtilis-RC podría estimular la liberación de citoquinas para mediar la comunicación con y entre las células del sistema inmunitario, mejorando la respuesta inmune mucosa a la infección por PEDV. Los anticuerpos neutralizantes del PEDV fueron detectados por el ensayo PRNT. La administración oral con B. subtilis-RC podría reducir efectivamente la capacidad de formación de placa de PEDV (P<0,01) en comparación con otros dos grupos en la Figura 7. Esto reveló que B. subtilis-RC podría estimular un alto nivel de anticuerpos neutralizantes del PEDV contra la infección por PEDV. En medio del brote del PEDV, se han desarrollado varias vacunas para controlar enfermedades y los efectos son insatisfactorios. Las vacunas orales pueden inducir una inmunidad mucosa más robusta que las contrapartes inyectables [32]. Ahora está claro que la respuesta inmune mucosal efectiva requiere IgG sérico y SIgA mucosal [34]. SIgA es la base del sistema inmune mucosal, desempeñando un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis inmune, y neutralizando los patógenos invasivos. IgG sérico representa respuestas inmunes sistémicas. Durante las infecciones por PEDV, la inmunización oral provoca no sólo mucosas sino también respuestas inmunes sistémicas muy bien [35]. Nuestros datos mostraron una respuesta IgG anti-PEDV fuerte y de larga duración se detectaron por vía oral con B. subtilis-RC en lechones. Aunque con el paso del tiempo, los títulos de anticuerpos disminuyeron un poco, todavía se mantuvo en la cabeza en comparación con los grupos de control y de acuerdo con la tendencia cambiante de anticuerpos. El cambio de IgA específica mostró resultados similares en la mucosa de boca y heces. A medida que aumenta la inmunidad adicional, B. subtilis-RC reduce la capacidad de los patógenos para cruzar la mucosa intestinal y la propagación sistémica de patógenos invasivos [36]. El sistema inmunitario de la mucosa genera respuestas inmunitarias a través de células inmunitarias que residen en compartimentos de la mucosa. Los linfocitos T residentes en la mucosa desempeñan un papel importante en la inmunidad de la mucosa [37]. Exploramos más a fondo la especie, las cantidades y la distribución de linfocitos T en la mucosa intestinal. CD3 es un marcador de superficie celular fundamental de linfocitos T [38]. El resultado mostró que el número de linfocitos CD3 + T aumentó significativamente, y estos revelaron que B. subtilis-RC podría estimular la maduración de células T. Según las moléculas expresadas en la superficie celular, los linfocitos T pueden dividirse aún más en células T ayudantes Además, observamos que la relación de células CD4 + /CD8 + T aumentó por vía oral. La relación CD4/CD8 mide la relación de células T ayudantes a células T citotóxicas. Por lo tanto, pudimos ver que la administración oral B. subtilis-RC podría fortalecer la respuesta inmune Th1 al aumentar la relación de células CD4 + /CD8 + T. La morfología del intestino delgado puede reflejar directamente la salud intestinal y desempeña un papel importante en el mantenimiento del sistema inmunitario intestinal [40]. La fase temprana de la infección por PEDV se acompaña frecuentemente de necrosis y exfoliación de células epiteliales villosas infectadas, lo que en última instancia resulta en atrofia villosa aguda y severa [41]. Por lo tanto, el trabajo efectivo de mantener la morfología intestinal es un buen indicador para evaluar la eficacia de las vacunas. Después de la Los PP son pequeñas masas de tejido linfático y forman una parte importante del sistema inmunitario mediante el reclutamiento e inducción de las células T para prevenir el crecimiento de patógenos en los intestinos. Además, un aumento en el número de IEL demostró la eficacia de B. subtilis-RC. Además, la longitud de vellosidad del íleo mostró algunos resultados alentadores que una morfología intestinal bien formada llegó a ser por B. subtilis-RC. La morfología intestinal satisfactoria fue el primer paso en la carretera contra la infección por PEDV. Varios resultados de morfología demostraron que B. subtilis-RC podría mantener notablemente la morfología intestinal y formar una protección integral. Como se mencionó anteriormente, la administración oral con B. subtilis-RC podría estimular la proliferación y diferenciación de células T y modular la respuesta inmune. Además, las citocinas son proteínas moléculas pequeñas con amplia actividad biológica, sintetizadas y secretadas por las células inmunes y algunas células no inmunes [42]. Como molécula de señalización celular, actúa principalmente para regular las respuestas inmunes, participando en la diferenciación y desarrollo de las células inmunes, mediando las respuestas inflamatorias, estimulando la hematopoyesis y participando en la reparación de los tejidos. Estudios previos habían demostrado que el PEDV inhibió tanto las citoquinas NF-.B como las citoquinas proinflamatorias [43]. Por lo tanto, las citoquinas son un indicador clave para evaluar la capacidad de una vacuna para estimular las respuestas inmunes. En este estudio, habíamos observado que IL-1β e IL-10 aumentaron notablemente (P<0.01). El IL-1β como una de las primeras citoquinas proinflamatorias y participa centralmente en la iniciación La investigación había demostrado que IL-1β podría aumentar significativamente la regulación de los tejidos inmunes locales y sistémicos post infección microbiana [44]. Además, IL-10 es una potente citocina antiinflamatoria que juega un papel esencial en la prevención de patologías inflamatorias e autoinmunes [45]. En resumen, ambos datos mostraron que la administración oral con B. subtilis-RC regulada y aumenta la inmunidad mediante citocinas IL-1β e IL-10 de alta regulación. En conclusión, los resultados actuales demostraron que la inmunización oral con B. subtilis-RC podría inducir efectivamente a la mucosa local y respuestas inmunes sistemáticas contra la infección por PEDV, al tiempo que mejora y regula la función inmune elevando la proporción de células CD4 + /CD8 + T y citocinas IL-1β e IL-10, apuntando así a una prometedora vacuna oral candidata para la infección

¿Qué es un indicador efectivo de la capacidad de una vacuna para generar una respuesta inmunitaria?

La respuesta nacional e internacional demuestra el complejo vínculo entre la salud pública, la ciencia y la política cuando un brote amenaza con afectar a las economías y la reputación mundiales. Las medidas sin precedentes implementadas en China son un intento audaz de controlar el brote – necesitamos entender su efectividad para equilibrar costos y beneficios para eventos similares en el futuro. Texto: El 29 de diciembre de 2019 los médicos en un hospital en la ciudad de Wuhan, China notó una agrupación de casos de neumonía inusual (con el primer caso identificado en ese momento el 12 de diciembre) con un vínculo aparente con un mercado que vende pescado vivo, aves de corral y animales al público. Este evento fue reportado a la Organización Mundial de la Salud (OMS) el 31 de diciembre [1]. En 4 semanas, para el 26 de enero de 2020, el organismo causal había sido identificado como un nuevo coronavirus, el genoma del virus había sido secuenciado y publicado, se habían desarrollado pruebas de reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa, el Blueprint de R&D de la OMS se había activado para acelerar el diagnóstico, la terapia y el desarrollo de vacunas y una vacuna candidata En la actualidad, las autoridades sanitarias chinas están construyendo un hospital de 1.000 camas en Wuhan en 10 días. Al 26 de enero, casi 50 millones de personas en Wuhan y ciudades vecinas habían sido efectivamente puestas en cuarentena, mientras que la OMS había determinado que el evento aún no debía ser declarado como una emergencia de salud pública de interés internacional (PHEIC) [2] y no había recomendado ninguna restricción de viaje específica. La OMS ha destacado la importancia de la detección de salida en los puertos de los países que muestran la transmisión del nuevo coronavirus y ha proporcionado orientación a los países que realizan la detección de entrada en los aeropuertos, reconociendo al mismo tiempo que la evidencia de la eficacia de la detección de entrada es equívoca. Esta respuesta es una de las respuestas mundiales más rápidas y coordinadas a una enfermedad infecciosa emergente que el mundo ha visto en tiempos modernos, pero ¿es la respuesta adecuada, será eficaz y sostenible? Según el informe de situación publicado por la OMS el 28 de enero de 2020 [3], se han notificado en todo el mundo un total de 2798 casos confirmados en 2019-nCoV; de estos, 2761 casos procedían de China, incluidos Hong Kong (8 casos), Macao (5) y Taipei (4). Se han notificado 37 casos confirmados fuera de China en once países de Europa, América del Norte, Australia y Asia; de estos 37 casos exportados, 36 tenían un historial de viaje desde China o un vínculo epidemiológico con un caso de China. De los casos confirmados en China, 461 se han notificado como gravemente enfermos, con 80 muertes hasta la fecha. Este brote y la respuesta a él ilustran algunas cuestiones clave sobre cómo la preparación y la capacidad de respuesta mundial a los brotes han evolucionado durante casi dos décadas desde la epidemia del síndrome respiratorio agudo grave (SARS) de 2002/3 y qué lecciones se han aprendido o no. También plantea preguntas sobre el impacto que estas lecciones han tenido en la forma en que los organismos y los gobiernos responden a estos eventos y sobre el papel de la OMS y el Reglamento Sanitario Internacional (RSI).Una de las lecciones críticas de la experiencia del SRAS fue la necesidad absoluta de poder coordinar los recursos internacionales disponibles en un brote y centrarlos en identificar prioridades y resolver problemas.La OMS estableció los medios para hacerlo y desde entonces se ha desarrollado e integrado en la preparación mundial, especialmente después de la epidemia de Ébola en África Occidental. Organizaciones como la Global Outbreak Alert and Response Network (GOARN), la Coalition for Epidemic Prepared Innovations (CEPI), la Global Research Collaboration for Infectious Disease Preparedness (GloPID-R) y la Global Initiative on Sharing All Influenza Data (GISAID) han sido apoyadas por el Plan de Investigación de la OMS y su Mecanismo Mundial de Coordinación para proporcionar un foro donde aquellos con la experiencia y capacidad para contribuir a la gestión de nuevas amenazas puedan reunirse entre brotes y durante éstos para desarrollar soluciones innovadoras a los problemas emergentes. Esta coordinación mundial ha estado activa en el nuevo brote de coronavirus. El sistema de respuesta de la OMS incluye tres grupos virtuales basados en los desarrollados para que el SARS reúna información en tiempo real para informar sobre directrices en tiempo real, y una primera vacuna candidata está lista para pruebas de laboratorio en el plazo de Hubo extensas críticas a China por su aparente falta de intercambio de información sobre la infección emergente por SARS lo suficientemente pronto en el brote como para permitir a los países prepararse y responder. Hubo preocupaciones similares sobre el intercambio de información como el síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS) surgió y evolucionó en Oriente Medio en 2012, particularmente en Arabia Saudita, y sobre la aparición del ébola en África Occidental en 2014. En esta ocasión el intercambio de información parece haber sido rápido y eficaz (al tiempo que se reconoce que la información disponible en las primeras etapas de un brote es siempre menor de lo que la comunidad mundial desearía). La OMS fue notificada de la agrupación original en cuestión de días y la secuencia genómica completa del nuevo virus se publicó menos de 2 semanas después de que el grupo se detectara por primera vez. La OMS ha expresado su satisfacción con las acciones de las autoridades chinas para compartir información con la OMS. El trabajo con periodistas y medios de comunicación para ayudarles a entender la ciencia y la epidemiología, particularmente en un evento en movimiento rápido, mejorará la comunicación del riesgo al público y reducirá las preocupaciones inapropiadas y el pánico.Si bien la información de este brote muestra signos de los esfuerzos de epidemiólogos, expertos en enfermedades infecciosas, agencias de salud pública nacionales e internacionales y otros que trabajan con periodistas, también hay indicios de que esto no está logrando su objetivo.Por ejemplo, la percepción pública es que el aumento en el número de casos reportados diariamente por las autoridades chinas representa una escalada diaria de la epidemia, mientras que la realidad es que estas cifras son también el resultado de la búsqueda activa, agresiva, de casos en China y algunos de estos casos son casos "viejos" recientemente reconocidos como debido al coronavirus novedoso. Del mismo modo, el virus suele ser descrito por los medios de comunicación como "muerto" y aunque esto es cierto en el sentido de que ha causado muertes, los matices de las tasas de mortalidad de casos inciertos en las primeras etapas de un brote no se están comunicando. La tasa estimada actual de mortalidad de casos parece ser de alrededor del 3%, lo que es significativo pero no comparable a la tasa del 10% para el SARS o el 34% reportada para el MERS. Estas percepciones erróneas siguen impulsando la ansiedad pública. Para complementar los mecanismos formales de información entre los países y con la OMS (incluyendo el IHR), el uso de mecanismos informales como los informes de medios de comunicación y redes sociales fue defendido a la luz de la experiencia del SARS. Actualmente hay varios sistemas mundiales que proporcionan información recopilada de informes informales, incluyendo redes de expertos y escaneo de medios de comunicación y medios sociales.Estos contribuyen, amplifican, inteligencia epidémica y se están El valor se deriva de que se han detectado indicios tempranos de casos más allá de la ciudad de brote inicial y que pueden complementar la evaluación global del riesgo y el seguimiento de la evolución del brote.Los desafíos radican en el volumen y la diversidad de la información disponible y la relativa falta de mecanismos de verificación, de modo que uno de estos sistemas (ProMed) ha comentado que cada vez es más difícil asimilar la información que se suministra [4] y hacer interpretaciones significativas.Al principio del brote se informó que los trabajadores de la salud no habían sido infectados, lo que fue tranquilizador porque son los trabajadores de la salud quienes muchas veces, e inadvertidamente, amplifican la transmisión.La falta de lavado de manos entre los pacientes, por ejemplo, puede resultar no sólo en autoinfección, sino también en infección de pacientes hospitalizados por otras causas cuando prestan atención.La autoinfección no es sólo un riesgo para el trabajador de la salud, sino también para sus familias Una característica del brote de SARS fue la variabilidad de la transmisibilidad entre los casos y la ocurrencia de "acontecimientos superdifundidos" cuando un caso infectado significativamente más contactos que el promedio. Esto también se vio con el MERS en el brote en la República de Corea (RoK). En este nuevo brote de coronavirus no se han documentado tales eventos superdifundidos, pero la epidemiología todavía no está clara. Confirmar si esto está ocurriendo o no debe ser una tarea urgente para la investigación china. Los modeladores han sugerido tasas de reproducción (R 0 ) de 3,8 (intervalo de confianza del 95%, 3,6-4.0) [5] y 2.6 (1.5-3.5) [6] ; R 0 para SARS se estimó en alrededor de 3 en ausencia de medidas de control [7]. El impacto económico de los brotes mayores puede ser sustancial para el país afectado. Esto se vio claramente en el SARS, el MERS en RoK y el Ébola en África Occidental. Un analista estima que el impacto probable del actual brote de coronavirus oscilará entre un recorte del 0,8% al PIB real si la epidemia se controla en un plazo de 3 meses, y un costo del 1,9% al PIB si la epidemia dura 9 meses [8]. Esto puede aumentar sustancialmente a la luz de las restricciones ampliadas a la circulación, y por lo tanto al comercio, dentro de China. La aparición de una enfermedad respiratoria significativa vinculada a un nuevo coronavirus representa una prueba de la capacidad mundial para detectar y controlar las amenazas de enfermedades emergentes. Su aparición en China añade una dimensión adicional a la luz de la experiencia previa con el SARS. El calendario del brote inmediatamente antes del Año Nuevo Lunar Chino con sus movimientos de población concomitantes añade riesgo y urgencia adicionales a la respuesta. El rápido intercambio de información sobre este brote y la rapidez de la respuesta coordinada tanto en el país como en el plano internacional indican que se han aprendido lecciones del SARS que mejoran la capacidad mundial. Las redes y foros internacionales que ahora existen han facilitado la reunión de expertos de todo el mundo para centrar los esfuerzos de investigación y desarrollo y maximizar el impacto. En esta fase inicial de la información sobre los brotes sigue siendo incompleta y aún no se han respondido preguntas clínicas y epidemiológicas clave, pero el déficit parece deberse más a las limitaciones de investigar una enfermedad emergente que a la falta de voluntad de participar y compartir información con los asociados. Hay algunos indicios de esferas en las que es necesario seguir mejorando. La respuesta de los medios de comunicación mundiales a los acontecimientos que se están produciendo ha sido relativamente equilibrada e informada, pero los matices de la evolución de la situación no se han examinado críticamente en colaboración con los medios de comunicación y, por consiguiente, la percepción pública del riesgo puede exagerarse, La falta de apreciación de las incertidumbres en la determinación de una tasa significativa de mortalidad de los casos y la importancia del sesgo de determinación al comienzo de un brote, junto con el impacto de la búsqueda agresiva de casos en los números de los casos, son ejemplos de lo que podría mejorarse la comprensión. Esto es siempre un proceso difícil a la hora de equilibrar los recursos centrados en el análisis de la situación sobre el terreno con los recursos destinados a interpretar la información para los periodistas, pero en el SRAS, se observó que la R 0 disminuyó en respuesta a la información que llega al público y al público y luego adoptó medidas de reducción de riesgos [6] ; por lo tanto, una comunicación pública precisa sobre el riesgo es fundamental para el éxito. Sería útil encontrar un foro en el que esto pueda explorarse con la comunidad de medios después del evento. El aumento del acceso a la información temprana de diversas fuentes, incluidos los medios de comunicación y los medios sociales, añade una dimensión Cuando, como se ha visto en este brote, el volumen de información que llega excede cualquier capacidad para recopilarla y analizarla y tratar de hacer referencias cruzadas y verificar elementos separados, existe el riesgo de que la información alimente la especulación y los medios de comunicación y la preocupación pública.De nuevo existe un buen equilibrio entre la información que fomenta acciones adecuadas de evitación de riesgos y la información que fomenta acciones inapropiadas; sin embargo, la salud pública suele estar mejor al servicio de más información en lugar de menos.El papel de una declaración de un PHEIC en la gestión de un brote grave ha sido cuestionado a la luz del Ébola en África Occidental y en la República Democrática del Congo [9] y ha sido cuestionada nuevamente con este brote.El carácter binario de una declaración de PHEIC (ya sea un evento que es un PHEIC o no hay opciones intermedias) y la especificidad de los tres criterios definidos para un PHEIC han causado dificultad La falta de una comprensión clara de lo que se pretende lograr con una declaración del PHEIC se suma a las dificultades del Comité de Emergencia, al igual que la relativa escasez de respuestas clínicas y epidemiológicas en esta etapa de la investigación.En este caso, el Comité de Emergencias se dividió al llegar a una conclusión, pero decidió en equilibrio que la situación actual, aunque sea una emergencia, no debería ser declarada aún como un PHEIC [2].Como en el caso del Ébola en la RDC, se ha criticado a la OMS por esta decisión, pero, como en el caso del Ébola, no está claro de inmediato qué sería diferente en la respuesta si se declarase un PHEIC.La OMS está trabajando para mejorar la forma en que los Comités de Emergencia desarrollan su asesoramiento para el Director General, pero, como recomendó este Comité de Emergencias y el Comité de Revisión del IHR en 2015, el desarrollo de una alerta intermedia junto con el proceso de Una función clave de una declaración del PHEIC es que es la (única) puerta de entrada a las Recomendaciones Temporales de la OMS sobre posibles restricciones de viaje y comercio para limitar la propagación internacional de una enfermedad.En este caso, varios países del mundo ya habían implementado el control de entrada en los aeropuertos y China había comenzado a cerrar los viajes internacionales desde Wuhan antes de que el Comité de Emergencia hubiera terminado sus deliberaciones.Si bien la OMS no interferiría, ni podría interferir, en las decisiones soberanas de los Estados miembros, la falta de influencia en las decisiones de viaje y comercio podría resultar problemática.Además de la rapidez de la respuesta en este brote, hemos visto cambios dramáticos en la escala de la respuesta.La imposición de medidas de cuarentena muy extensas a millones de personas como un intento de romper la transmisión del virus no tiene precedentes.No sabemos si serán eficaces; de hecho, no sabemos cómo determinar si han sido eficaces. Si se confirman las recientes sugerencias de que las personas infectadas con este coronavirus pueden ser infecciosas durante la incubación o asintomáticas, y los informes de que hasta 5 m de personas abandonaron Wuhan antes de que se impusieran las restricciones de viaje, la eficacia de estas medidas de control será más cuestionada. Dado el probable impacto en al menos la economía china y probablemente la economía mundial, será importante entender el papel y la eficacia de las medidas de salud pública en esta escala para el futuro. Sin embargo, la imposición de estas dramáticas medidas también plantea una cuestión más amplia: si hay un impacto de estas medidas, ¿qué otros países (o podrían) implementar tales medidas? ¿Aceptarían otros países el daño económico autoimpuesto que China ha aceptado tratar de contener este brote? ¿Es razonable considerar que los gobiernos nacionales cerrarían el transporte público hacia y desde Londres, Nueva York o París en la semana anterior a Navidad, incluso si se demostrara que es Estas decisiones y preguntas cruzan la interfaz entre la salud pública, la ciencia y la política.La respuesta a este brote en China fue inevitablemente influenciada por la reacción histórica a la respuesta del país al SARS y la sospecha del mundo de la falta de cooperación de China en ese momento.La respuesta actual se enmarca, por lo tanto, en un contexto de no querer que se vea que se comportan de la misma manera con este evento.Esto puede indicar otro impacto de la experiencia del SARS (y el MERS y el Ébola) en la respuesta a los brotes posteriores. En la respuesta de emergencia, generalmente es mejor reaccionar de forma exagerada y luego disminuir si es necesario en lugar de reaccionar en forma insuficiente y actuar demasiado tarde. La respuesta debe ser "no lamentarse" hacer las mejores decisiones posibles sobre la base de la mejor información y ciencia disponible en ese momento, pero no juzgar o criticar si la información posterior sugiere un curso de acción diferente. La respuesta temprana debe reconocer lo que se conoce y lo que no se conoce y mirar qué de las incógnitas se pueden estimar razonablemente con referencia a brotes anteriores, patógenos similares, informes y modelos tempranos, etc. La evaluación y respuesta de riesgo puede entonces ser modificada y refinada a medida que evoluciona la información sobre las incógnitas. Sin embargo, la clave de este enfoque es la confianza en que las decisiones no serán criticadas sobre la base de información que no estaba disponible en ese momento. También es importante estar listo para cambiar decisiones cuando la información disponible cambie algo que tanto científicos como políticos En ese contexto, China no debe ser juzgada por aplicar lo que podría parecer medidas extremas, pero China también debe estar dispuesta a suspender las medidas rápidamente si las pruebas sugieren que no son la mejor manera de resolver el problema. Al cerrar los aeropuertos la propagación internacional de Wuhan puede disminuir, pero el éxito dependerá de la eficacia de las medidas realmente para detener a las personas que salen de la zona afectada, así como en el comportamiento del virus. Como siempre, sólo el tiempo dirá que el tiempo es escaso.

¿Cuándo se notificó por primera vez a la Organización Mundial de la Salud (OMS) sobre la epidemia del SARS-CoV-2 en la ciudad de Wuhan, China?

La respuesta nacional e internacional demuestra el complejo vínculo entre la salud pública, la ciencia y la política cuando un brote amenaza con afectar a las economías y la reputación mundiales. Las medidas sin precedentes implementadas en China son un intento audaz de controlar el brote – necesitamos entender su efectividad para equilibrar costos y beneficios para eventos similares en el futuro. Texto: El 29 de diciembre de 2019 los médicos en un hospital en la ciudad de Wuhan, China notó una agrupación de casos de neumonía inusual (con el primer caso identificado en ese momento el 12 de diciembre) con un vínculo aparente con un mercado que vende pescado vivo, aves de corral y animales al público. Este evento fue reportado a la Organización Mundial de la Salud (OMS) el 31 de diciembre [1]. En 4 semanas, para el 26 de enero de 2020, el organismo causal había sido identificado como un nuevo coronavirus, el genoma del virus había sido secuenciado y publicado, se habían desarrollado pruebas de reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa, el Blueprint de R&D de la OMS se había activado para acelerar el diagnóstico, la terapia y el desarrollo de vacunas y una vacuna candidata En la actualidad, las autoridades sanitarias chinas están construyendo un hospital de 1.000 camas en Wuhan en 10 días. Al 26 de enero, casi 50 millones de personas en Wuhan y ciudades vecinas habían sido efectivamente puestas en cuarentena, mientras que la OMS había determinado que el evento aún no debía ser declarado como una emergencia de salud pública de interés internacional (PHEIC) [2] y no había recomendado ninguna restricción de viaje específica. La OMS ha destacado la importancia de la detección de salida en los puertos de los países que muestran la transmisión del nuevo coronavirus y ha proporcionado orientación a los países que realizan la detección de entrada en los aeropuertos, reconociendo al mismo tiempo que la evidencia de la eficacia de la detección de entrada es equívoca. Esta respuesta es una de las respuestas mundiales más rápidas y coordinadas a una enfermedad infecciosa emergente que el mundo ha visto en tiempos modernos, pero ¿es la respuesta adecuada, será eficaz y sostenible? Según el informe de situación publicado por la OMS el 28 de enero de 2020 [3], se han notificado en todo el mundo un total de 2798 casos confirmados en 2019-nCoV; de estos, 2761 casos procedían de China, incluidos Hong Kong (8 casos), Macao (5) y Taipei (4). Se han notificado 37 casos confirmados fuera de China en once países de Europa, América del Norte, Australia y Asia; de estos 37 casos exportados, 36 tenían un historial de viaje desde China o un vínculo epidemiológico con un caso de China. De los casos confirmados en China, 461 se han notificado como gravemente enfermos, con 80 muertes hasta la fecha. Este brote y la respuesta a él ilustran algunas cuestiones clave sobre cómo la preparación y la capacidad de respuesta mundial a los brotes han evolucionado durante casi dos décadas desde la epidemia del síndrome respiratorio agudo grave (SARS) de 2002/3 y qué lecciones se han aprendido o no. También plantea preguntas sobre el impacto que estas lecciones han tenido en la forma en que los organismos y los gobiernos responden a estos eventos y sobre el papel de la OMS y el Reglamento Sanitario Internacional (RSI).Una de las lecciones críticas de la experiencia del SRAS fue la necesidad absoluta de poder coordinar los recursos internacionales disponibles en un brote y centrarlos en identificar prioridades y resolver problemas.La OMS estableció los medios para hacerlo y desde entonces se ha desarrollado e integrado en la preparación mundial, especialmente después de la epidemia de Ébola en África Occidental. Organizaciones como la Global Outbreak Alert and Response Network (GOARN), la Coalition for Epidemic Prepared Innovations (CEPI), la Global Research Collaboration for Infectious Disease Preparedness (GloPID-R) y la Global Initiative on Sharing All Influenza Data (GISAID) han sido apoyadas por el Plan de Investigación de la OMS y su Mecanismo Mundial de Coordinación para proporcionar un foro donde aquellos con la experiencia y capacidad para contribuir a la gestión de nuevas amenazas puedan reunirse entre brotes y durante éstos para desarrollar soluciones innovadoras a los problemas emergentes. Esta coordinación mundial ha estado activa en el nuevo brote de coronavirus. El sistema de respuesta de la OMS incluye tres grupos virtuales basados en los desarrollados para que el SARS reúna información en tiempo real para informar sobre directrices en tiempo real, y una primera vacuna candidata está lista para pruebas de laboratorio en el plazo de Hubo extensas críticas a China por su aparente falta de intercambio de información sobre la infección emergente por SARS lo suficientemente pronto en el brote como para permitir a los países prepararse y responder. Hubo preocupaciones similares sobre el intercambio de información como el síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS) surgió y evolucionó en Oriente Medio en 2012, particularmente en Arabia Saudita, y sobre la aparición del ébola en África Occidental en 2014. En esta ocasión el intercambio de información parece haber sido rápido y eficaz (al tiempo que se reconoce que la información disponible en las primeras etapas de un brote es siempre menor de lo que la comunidad mundial desearía). La OMS fue notificada de la agrupación original en cuestión de días y la secuencia genómica completa del nuevo virus se publicó menos de 2 semanas después de que el grupo se detectara por primera vez. La OMS ha expresado su satisfacción con las acciones de las autoridades chinas para compartir información con la OMS. El trabajo con periodistas y medios de comunicación para ayudarles a entender la ciencia y la epidemiología, particularmente en un evento en movimiento rápido, mejorará la comunicación del riesgo al público y reducirá las preocupaciones inapropiadas y el pánico.Si bien la información de este brote muestra signos de los esfuerzos de epidemiólogos, expertos en enfermedades infecciosas, agencias de salud pública nacionales e internacionales y otros que trabajan con periodistas, también hay indicios de que esto no está logrando su objetivo.Por ejemplo, la percepción pública es que el aumento en el número de casos reportados diariamente por las autoridades chinas representa una escalada diaria de la epidemia, mientras que la realidad es que estas cifras son también el resultado de la búsqueda activa, agresiva, de casos en China y algunos de estos casos son casos "viejos" recientemente reconocidos como debido al coronavirus novedoso. Del mismo modo, el virus suele ser descrito por los medios de comunicación como "muerto" y aunque esto es cierto en el sentido de que ha causado muertes, los matices de las tasas de mortalidad de casos inciertos en las primeras etapas de un brote no se están comunicando. La tasa estimada actual de mortalidad de casos parece ser de alrededor del 3%, lo que es significativo pero no comparable a la tasa del 10% para el SARS o el 34% reportada para el MERS. Estas percepciones erróneas siguen impulsando la ansiedad pública. Para complementar los mecanismos formales de información entre los países y con la OMS (incluyendo el IHR), el uso de mecanismos informales como los informes de medios de comunicación y redes sociales fue defendido a la luz de la experiencia del SARS. Actualmente hay varios sistemas mundiales que proporcionan información recopilada de informes informales, incluyendo redes de expertos y escaneo de medios de comunicación y medios sociales.Estos contribuyen, amplifican, inteligencia epidémica y se están El valor se deriva de que se han detectado indicios tempranos de casos más allá de la ciudad de brote inicial y que pueden complementar la evaluación global del riesgo y el seguimiento de la evolución del brote.Los desafíos radican en el volumen y la diversidad de la información disponible y la relativa falta de mecanismos de verificación, de modo que uno de estos sistemas (ProMed) ha comentado que cada vez es más difícil asimilar la información que se suministra [4] y hacer interpretaciones significativas.Al principio del brote se informó que los trabajadores de la salud no habían sido infectados, lo que fue tranquilizador porque son los trabajadores de la salud quienes muchas veces, e inadvertidamente, amplifican la transmisión.La falta de lavado de manos entre los pacientes, por ejemplo, puede resultar no sólo en autoinfección, sino también en infección de pacientes hospitalizados por otras causas cuando prestan atención.La autoinfección no es sólo un riesgo para el trabajador de la salud, sino también para sus familias Una característica del brote de SARS fue la variabilidad de la transmisibilidad entre los casos y la ocurrencia de "acontecimientos superdifundidos" cuando un caso infectado significativamente más contactos que el promedio. Esto también se vio con el MERS en el brote en la República de Corea (RoK). En este nuevo brote de coronavirus no se han documentado tales eventos superdifundidos, pero la epidemiología todavía no está clara. Confirmar si esto está ocurriendo o no debe ser una tarea urgente para la investigación china. Los modeladores han sugerido tasas de reproducción (R 0 ) de 3,8 (intervalo de confianza del 95%, 3,6-4.0) [5] y 2.6 (1.5-3.5) [6] ; R 0 para SARS se estimó en alrededor de 3 en ausencia de medidas de control [7]. El impacto económico de los brotes mayores puede ser sustancial para el país afectado. Esto se vio claramente en el SARS, el MERS en RoK y el Ébola en África Occidental. Un analista estima que el impacto probable del actual brote de coronavirus oscilará entre un recorte del 0,8% al PIB real si la epidemia se controla en un plazo de 3 meses, y un costo del 1,9% al PIB si la epidemia dura 9 meses [8]. Esto puede aumentar sustancialmente a la luz de las restricciones ampliadas a la circulación, y por lo tanto al comercio, dentro de China. La aparición de una enfermedad respiratoria significativa vinculada a un nuevo coronavirus representa una prueba de la capacidad mundial para detectar y controlar las amenazas de enfermedades emergentes. Su aparición en China añade una dimensión adicional a la luz de la experiencia previa con el SARS. El calendario del brote inmediatamente antes del Año Nuevo Lunar Chino con sus movimientos de población concomitantes añade riesgo y urgencia adicionales a la respuesta. El rápido intercambio de información sobre este brote y la rapidez de la respuesta coordinada tanto en el país como en el plano internacional indican que se han aprendido lecciones del SARS que mejoran la capacidad mundial. Las redes y foros internacionales que ahora existen han facilitado la reunión de expertos de todo el mundo para centrar los esfuerzos de investigación y desarrollo y maximizar el impacto. En esta fase inicial de la información sobre los brotes sigue siendo incompleta y aún no se han respondido preguntas clínicas y epidemiológicas clave, pero el déficit parece deberse más a las limitaciones de investigar una enfermedad emergente que a la falta de voluntad de participar y compartir información con los asociados. Hay algunos indicios de esferas en las que es necesario seguir mejorando. La respuesta de los medios de comunicación mundiales a los acontecimientos que se están produciendo ha sido relativamente equilibrada e informada, pero los matices de la evolución de la situación no se han examinado críticamente en colaboración con los medios de comunicación y, por consiguiente, la percepción pública del riesgo puede exagerarse, La falta de apreciación de las incertidumbres en la determinación de una tasa significativa de mortalidad de los casos y la importancia del sesgo de determinación al comienzo de un brote, junto con el impacto de la búsqueda agresiva de casos en los números de los casos, son ejemplos de lo que podría mejorarse la comprensión. Esto es siempre un proceso difícil a la hora de equilibrar los recursos centrados en el análisis de la situación sobre el terreno con los recursos destinados a interpretar la información para los periodistas, pero en el SRAS, se observó que la R 0 disminuyó en respuesta a la información que llega al público y al público y luego adoptó medidas de reducción de riesgos [6] ; por lo tanto, una comunicación pública precisa sobre el riesgo es fundamental para el éxito. Sería útil encontrar un foro en el que esto pueda explorarse con la comunidad de medios después del evento. El aumento del acceso a la información temprana de diversas fuentes, incluidos los medios de comunicación y los medios sociales, añade una dimensión Cuando, como se ha visto en este brote, el volumen de información que llega excede cualquier capacidad para recopilarla y analizarla y tratar de hacer referencias cruzadas y verificar elementos separados, existe el riesgo de que la información alimente la especulación y los medios de comunicación y la preocupación pública.De nuevo existe un buen equilibrio entre la información que fomenta acciones adecuadas de evitación de riesgos y la información que fomenta acciones inapropiadas; sin embargo, la salud pública suele estar mejor al servicio de más información en lugar de menos.El papel de una declaración de un PHEIC en la gestión de un brote grave ha sido cuestionado a la luz del Ébola en África Occidental y en la República Democrática del Congo [9] y ha sido cuestionada nuevamente con este brote.El carácter binario de una declaración de PHEIC (ya sea un evento que es un PHEIC o no hay opciones intermedias) y la especificidad de los tres criterios definidos para un PHEIC han causado dificultad La falta de una comprensión clara de lo que se pretende lograr con una declaración del PHEIC se suma a las dificultades del Comité de Emergencia, al igual que la relativa escasez de respuestas clínicas y epidemiológicas en esta etapa de la investigación.En este caso, el Comité de Emergencias se dividió al llegar a una conclusión, pero decidió en equilibrio que la situación actual, aunque sea una emergencia, no debería ser declarada aún como un PHEIC [2].Como en el caso del Ébola en la RDC, se ha criticado a la OMS por esta decisión, pero, como en el caso del Ébola, no está claro de inmediato qué sería diferente en la respuesta si se declarase un PHEIC.La OMS está trabajando para mejorar la forma en que los Comités de Emergencia desarrollan su asesoramiento para el Director General, pero, como recomendó este Comité de Emergencias y el Comité de Revisión del IHR en 2015, el desarrollo de una alerta intermedia junto con el proceso de Una función clave de una declaración del PHEIC es que es la (única) puerta de entrada a las Recomendaciones Temporales de la OMS sobre posibles restricciones de viaje y comercio para limitar la propagación internacional de una enfermedad.En este caso, varios países del mundo ya habían implementado el control de entrada en los aeropuertos y China había comenzado a cerrar los viajes internacionales desde Wuhan antes de que el Comité de Emergencia hubiera terminado sus deliberaciones.Si bien la OMS no interferiría, ni podría interferir, en las decisiones soberanas de los Estados miembros, la falta de influencia en las decisiones de viaje y comercio podría resultar problemática.Además de la rapidez de la respuesta en este brote, hemos visto cambios dramáticos en la escala de la respuesta.La imposición de medidas de cuarentena muy extensas a millones de personas como un intento de romper la transmisión del virus no tiene precedentes.No sabemos si serán eficaces; de hecho, no sabemos cómo determinar si han sido eficaces. Si se confirman las recientes sugerencias de que las personas infectadas con este coronavirus pueden ser infecciosas durante la incubación o asintomáticas, y los informes de que hasta 5 m de personas abandonaron Wuhan antes de que se impusieran las restricciones de viaje, la eficacia de estas medidas de control será más cuestionada. Dado el probable impacto en al menos la economía china y probablemente la economía mundial, será importante entender el papel y la eficacia de las medidas de salud pública en esta escala para el futuro. Sin embargo, la imposición de estas dramáticas medidas también plantea una cuestión más amplia: si hay un impacto de estas medidas, ¿qué otros países (o podrían) implementar tales medidas? ¿Aceptarían otros países el daño económico autoimpuesto que China ha aceptado tratar de contener este brote? ¿Es razonable considerar que los gobiernos nacionales cerrarían el transporte público hacia y desde Londres, Nueva York o París en la semana anterior a Navidad, incluso si se demostrara que es Estas decisiones y preguntas cruzan la interfaz entre la salud pública, la ciencia y la política.La respuesta a este brote en China fue inevitablemente influenciada por la reacción histórica a la respuesta del país al SARS y la sospecha del mundo de la falta de cooperación de China en ese momento.La respuesta actual se enmarca, por lo tanto, en un contexto de no querer que se vea que se comportan de la misma manera con este evento.Esto puede indicar otro impacto de la experiencia del SARS (y el MERS y el Ébola) en la respuesta a los brotes posteriores. En la respuesta de emergencia, generalmente es mejor reaccionar de forma exagerada y luego disminuir si es necesario en lugar de reaccionar en forma insuficiente y actuar demasiado tarde. La respuesta debe ser "no lamentarse" hacer las mejores decisiones posibles sobre la base de la mejor información y ciencia disponible en ese momento, pero no juzgar o criticar si la información posterior sugiere un curso de acción diferente. La respuesta temprana debe reconocer lo que se conoce y lo que no se conoce y mirar qué de las incógnitas se pueden estimar razonablemente con referencia a brotes anteriores, patógenos similares, informes y modelos tempranos, etc. La evaluación y respuesta de riesgo puede entonces ser modificada y refinada a medida que evoluciona la información sobre las incógnitas. Sin embargo, la clave de este enfoque es la confianza en que las decisiones no serán criticadas sobre la base de información que no estaba disponible en ese momento. También es importante estar listo para cambiar decisiones cuando la información disponible cambie algo que tanto científicos como políticos En ese contexto, China no debe ser juzgada por aplicar lo que podría parecer medidas extremas, pero China también debe estar dispuesta a suspender las medidas rápidamente si las pruebas sugieren que no son la mejor manera de resolver el problema. Al cerrar los aeropuertos la propagación internacional de Wuhan puede disminuir, pero el éxito dependerá de la eficacia de las medidas realmente para detener a las personas que salen de la zona afectada, así como en el comportamiento del virus. Como siempre, sólo el tiempo dirá que el tiempo es escaso.

¿Cuándo descubrimos que el SARS-CoV-2, que causa COVID-19, fue un coronavirus novedoso?

La respuesta nacional e internacional demuestra el complejo vínculo entre la salud pública, la ciencia y la política cuando un brote amenaza con afectar a las economías y la reputación mundiales. Las medidas sin precedentes implementadas en China son un intento audaz de controlar el brote – necesitamos entender su efectividad para equilibrar costos y beneficios para eventos similares en el futuro. Texto: El 29 de diciembre de 2019 los médicos en un hospital en la ciudad de Wuhan, China notó una agrupación de casos de neumonía inusual (con el primer caso identificado en ese momento el 12 de diciembre) con un vínculo aparente con un mercado que vende pescado vivo, aves de corral y animales al público. Este evento fue reportado a la Organización Mundial de la Salud (OMS) el 31 de diciembre [1]. En 4 semanas, para el 26 de enero de 2020, el organismo causal había sido identificado como un nuevo coronavirus, el genoma del virus había sido secuenciado y publicado, se habían desarrollado pruebas de reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa, el Blueprint de R&D de la OMS se había activado para acelerar el diagnóstico, la terapia y el desarrollo de vacunas y una vacuna candidata En la actualidad, las autoridades sanitarias chinas están construyendo un hospital de 1.000 camas en Wuhan en 10 días. Al 26 de enero, casi 50 millones de personas en Wuhan y ciudades vecinas habían sido efectivamente puestas en cuarentena, mientras que la OMS había determinado que el evento aún no debía ser declarado como una emergencia de salud pública de interés internacional (PHEIC) [2] y no había recomendado ninguna restricción de viaje específica. La OMS ha destacado la importancia de la detección de salida en los puertos de los países que muestran la transmisión del nuevo coronavirus y ha proporcionado orientación a los países que realizan la detección de entrada en los aeropuertos, reconociendo al mismo tiempo que la evidencia de la eficacia de la detección de entrada es equívoca. Esta respuesta es una de las respuestas mundiales más rápidas y coordinadas a una enfermedad infecciosa emergente que el mundo ha visto en tiempos modernos, pero ¿es la respuesta adecuada, será eficaz y sostenible? Según el informe de situación publicado por la OMS el 28 de enero de 2020 [3], se han notificado en todo el mundo un total de 2798 casos confirmados en 2019-nCoV; de estos, 2761 casos procedían de China, incluidos Hong Kong (8 casos), Macao (5) y Taipei (4). Se han notificado 37 casos confirmados fuera de China en once países de Europa, América del Norte, Australia y Asia; de estos 37 casos exportados, 36 tenían un historial de viaje desde China o un vínculo epidemiológico con un caso de China. De los casos confirmados en China, 461 se han notificado como gravemente enfermos, con 80 muertes hasta la fecha. Este brote y la respuesta a él ilustran algunas cuestiones clave sobre cómo la preparación y la capacidad de respuesta mundial a los brotes han evolucionado durante casi dos décadas desde la epidemia del síndrome respiratorio agudo grave (SARS) de 2002/3 y qué lecciones se han aprendido o no. También plantea preguntas sobre el impacto que estas lecciones han tenido en la forma en que los organismos y los gobiernos responden a estos eventos y sobre el papel de la OMS y el Reglamento Sanitario Internacional (RSI).Una de las lecciones críticas de la experiencia del SRAS fue la necesidad absoluta de poder coordinar los recursos internacionales disponibles en un brote y centrarlos en identificar prioridades y resolver problemas.La OMS estableció los medios para hacerlo y desde entonces se ha desarrollado e integrado en la preparación mundial, especialmente después de la epidemia de Ébola en África Occidental. Organizaciones como la Global Outbreak Alert and Response Network (GOARN), la Coalition for Epidemic Prepared Innovations (CEPI), la Global Research Collaboration for Infectious Disease Preparedness (GloPID-R) y la Global Initiative on Sharing All Influenza Data (GISAID) han sido apoyadas por el Plan de Investigación de la OMS y su Mecanismo Mundial de Coordinación para proporcionar un foro donde aquellos con la experiencia y capacidad para contribuir a la gestión de nuevas amenazas puedan reunirse entre brotes y durante éstos para desarrollar soluciones innovadoras a los problemas emergentes. Esta coordinación mundial ha estado activa en el nuevo brote de coronavirus. El sistema de respuesta de la OMS incluye tres grupos virtuales basados en los desarrollados para que el SARS reúna información en tiempo real para informar sobre directrices en tiempo real, y una primera vacuna candidata está lista para pruebas de laboratorio en el plazo de Hubo extensas críticas a China por su aparente falta de intercambio de información sobre la infección emergente por SARS lo suficientemente pronto en el brote como para permitir a los países prepararse y responder. Hubo preocupaciones similares sobre el intercambio de información como el síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS) surgió y evolucionó en Oriente Medio en 2012, particularmente en Arabia Saudita, y sobre la aparición del ébola en África Occidental en 2014. En esta ocasión el intercambio de información parece haber sido rápido y eficaz (al tiempo que se reconoce que la información disponible en las primeras etapas de un brote es siempre menor de lo que la comunidad mundial desearía). La OMS fue notificada de la agrupación original en cuestión de días y la secuencia genómica completa del nuevo virus se publicó menos de 2 semanas después de que el grupo se detectara por primera vez. La OMS ha expresado su satisfacción con las acciones de las autoridades chinas para compartir información con la OMS. El trabajo con periodistas y medios de comunicación para ayudarles a entender la ciencia y la epidemiología, particularmente en un evento en movimiento rápido, mejorará la comunicación del riesgo al público y reducirá las preocupaciones inapropiadas y el pánico.Si bien la información de este brote muestra signos de los esfuerzos de epidemiólogos, expertos en enfermedades infecciosas, agencias de salud pública nacionales e internacionales y otros que trabajan con periodistas, también hay indicios de que esto no está logrando su objetivo.Por ejemplo, la percepción pública es que el aumento en el número de casos reportados diariamente por las autoridades chinas representa una escalada diaria de la epidemia, mientras que la realidad es que estas cifras son también el resultado de la búsqueda activa, agresiva, de casos en China y algunos de estos casos son casos "viejos" recientemente reconocidos como debido al coronavirus novedoso. Del mismo modo, el virus suele ser descrito por los medios de comunicación como "muerto" y aunque esto es cierto en el sentido de que ha causado muertes, los matices de las tasas de mortalidad de casos inciertos en las primeras etapas de un brote no se están comunicando. La tasa estimada actual de mortalidad de casos parece ser de alrededor del 3%, lo que es significativo pero no comparable a la tasa del 10% para el SARS o el 34% reportada para el MERS. Estas percepciones erróneas siguen impulsando la ansiedad pública. Para complementar los mecanismos formales de información entre los países y con la OMS (incluyendo el IHR), el uso de mecanismos informales como los informes de medios de comunicación y redes sociales fue defendido a la luz de la experiencia del SARS. Actualmente hay varios sistemas mundiales que proporcionan información recopilada de informes informales, incluyendo redes de expertos y escaneo de medios de comunicación y medios sociales.Estos contribuyen, amplifican, inteligencia epidémica y se están El valor se deriva de que se han detectado indicios tempranos de casos más allá de la ciudad de brote inicial y que pueden complementar la evaluación global del riesgo y el seguimiento de la evolución del brote.Los desafíos radican en el volumen y la diversidad de la información disponible y la relativa falta de mecanismos de verificación, de modo que uno de estos sistemas (ProMed) ha comentado que cada vez es más difícil asimilar la información que se suministra [4] y hacer interpretaciones significativas.Al principio del brote se informó que los trabajadores de la salud no habían sido infectados, lo que fue tranquilizador porque son los trabajadores de la salud quienes muchas veces, e inadvertidamente, amplifican la transmisión.La falta de lavado de manos entre los pacientes, por ejemplo, puede resultar no sólo en autoinfección, sino también en infección de pacientes hospitalizados por otras causas cuando prestan atención.La autoinfección no es sólo un riesgo para el trabajador de la salud, sino también para sus familias Una característica del brote de SARS fue la variabilidad de la transmisibilidad entre los casos y la ocurrencia de "acontecimientos superdifundidos" cuando un caso infectado significativamente más contactos que el promedio. Esto también se vio con el MERS en el brote en la República de Corea (RoK). En este nuevo brote de coronavirus no se han documentado tales eventos superdifundidos, pero la epidemiología todavía no está clara. Confirmar si esto está ocurriendo o no debe ser una tarea urgente para la investigación china. Los modeladores han sugerido tasas de reproducción (R 0 ) de 3,8 (intervalo de confianza del 95%, 3,6-4.0) [5] y 2.6 (1.5-3.5) [6] ; R 0 para SARS se estimó en alrededor de 3 en ausencia de medidas de control [7]. El impacto económico de los brotes mayores puede ser sustancial para el país afectado. Esto se vio claramente en el SARS, el MERS en RoK y el Ébola en África Occidental. Un analista estima que el impacto probable del actual brote de coronavirus oscilará entre un recorte del 0,8% al PIB real si la epidemia se controla en un plazo de 3 meses, y un costo del 1,9% al PIB si la epidemia dura 9 meses [8]. Esto puede aumentar sustancialmente a la luz de las restricciones ampliadas a la circulación, y por lo tanto al comercio, dentro de China. La aparición de una enfermedad respiratoria significativa vinculada a un nuevo coronavirus representa una prueba de la capacidad mundial para detectar y controlar las amenazas de enfermedades emergentes. Su aparición en China añade una dimensión adicional a la luz de la experiencia previa con el SARS. El calendario del brote inmediatamente antes del Año Nuevo Lunar Chino con sus movimientos de población concomitantes añade riesgo y urgencia adicionales a la respuesta. El rápido intercambio de información sobre este brote y la rapidez de la respuesta coordinada tanto en el país como en el plano internacional indican que se han aprendido lecciones del SARS que mejoran la capacidad mundial. Las redes y foros internacionales que ahora existen han facilitado la reunión de expertos de todo el mundo para centrar los esfuerzos de investigación y desarrollo y maximizar el impacto. En esta fase inicial de la información sobre los brotes sigue siendo incompleta y aún no se han respondido preguntas clínicas y epidemiológicas clave, pero el déficit parece deberse más a las limitaciones de investigar una enfermedad emergente que a la falta de voluntad de participar y compartir información con los asociados. Hay algunos indicios de esferas en las que es necesario seguir mejorando. La respuesta de los medios de comunicación mundiales a los acontecimientos que se están produciendo ha sido relativamente equilibrada e informada, pero los matices de la evolución de la situación no se han examinado críticamente en colaboración con los medios de comunicación y, por consiguiente, la percepción pública del riesgo puede exagerarse, La falta de apreciación de las incertidumbres en la determinación de una tasa significativa de mortalidad de los casos y la importancia del sesgo de determinación al comienzo de un brote, junto con el impacto de la búsqueda agresiva de casos en los números de los casos, son ejemplos de lo que podría mejorarse la comprensión. Esto es siempre un proceso difícil a la hora de equilibrar los recursos centrados en el análisis de la situación sobre el terreno con los recursos destinados a interpretar la información para los periodistas, pero en el SRAS, se observó que la R 0 disminuyó en respuesta a la información que llega al público y al público y luego adoptó medidas de reducción de riesgos [6] ; por lo tanto, una comunicación pública precisa sobre el riesgo es fundamental para el éxito. Sería útil encontrar un foro en el que esto pueda explorarse con la comunidad de medios después del evento. El aumento del acceso a la información temprana de diversas fuentes, incluidos los medios de comunicación y los medios sociales, añade una dimensión Cuando, como se ha visto en este brote, el volumen de información que llega excede cualquier capacidad para recopilarla y analizarla y tratar de hacer referencias cruzadas y verificar elementos separados, existe el riesgo de que la información alimente la especulación y los medios de comunicación y la preocupación pública.De nuevo existe un buen equilibrio entre la información que fomenta acciones adecuadas de evitación de riesgos y la información que fomenta acciones inapropiadas; sin embargo, la salud pública suele estar mejor al servicio de más información en lugar de menos.El papel de una declaración de un PHEIC en la gestión de un brote grave ha sido cuestionado a la luz del Ébola en África Occidental y en la República Democrática del Congo [9] y ha sido cuestionada nuevamente con este brote.El carácter binario de una declaración de PHEIC (ya sea un evento que es un PHEIC o no hay opciones intermedias) y la especificidad de los tres criterios definidos para un PHEIC han causado dificultad La falta de una comprensión clara de lo que se pretende lograr con una declaración del PHEIC se suma a las dificultades del Comité de Emergencia, al igual que la relativa escasez de respuestas clínicas y epidemiológicas en esta etapa de la investigación.En este caso, el Comité de Emergencias se dividió al llegar a una conclusión, pero decidió en equilibrio que la situación actual, aunque sea una emergencia, no debería ser declarada aún como un PHEIC [2].Como en el caso del Ébola en la RDC, se ha criticado a la OMS por esta decisión, pero, como en el caso del Ébola, no está claro de inmediato qué sería diferente en la respuesta si se declarase un PHEIC.La OMS está trabajando para mejorar la forma en que los Comités de Emergencia desarrollan su asesoramiento para el Director General, pero, como recomendó este Comité de Emergencias y el Comité de Revisión del IHR en 2015, el desarrollo de una alerta intermedia junto con el proceso de Una función clave de una declaración del PHEIC es que es la (única) puerta de entrada a las Recomendaciones Temporales de la OMS sobre posibles restricciones de viaje y comercio para limitar la propagación internacional de una enfermedad.En este caso, varios países del mundo ya habían implementado el control de entrada en los aeropuertos y China había comenzado a cerrar los viajes internacionales desde Wuhan antes de que el Comité de Emergencia hubiera terminado sus deliberaciones.Si bien la OMS no interferiría, ni podría interferir, en las decisiones soberanas de los Estados miembros, la falta de influencia en las decisiones de viaje y comercio podría resultar problemática.Además de la rapidez de la respuesta en este brote, hemos visto cambios dramáticos en la escala de la respuesta.La imposición de medidas de cuarentena muy extensas a millones de personas como un intento de romper la transmisión del virus no tiene precedentes.No sabemos si serán eficaces; de hecho, no sabemos cómo determinar si han sido eficaces. Si se confirman las recientes sugerencias de que las personas infectadas con este coronavirus pueden ser infecciosas durante la incubación o asintomáticas, y los informes de que hasta 5 m de personas abandonaron Wuhan antes de que se impusieran las restricciones de viaje, la eficacia de estas medidas de control será más cuestionada. Dado el probable impacto en al menos la economía china y probablemente la economía mundial, será importante entender el papel y la eficacia de las medidas de salud pública en esta escala para el futuro. Sin embargo, la imposición de estas dramáticas medidas también plantea una cuestión más amplia: si hay un impacto de estas medidas, ¿qué otros países (o podrían) implementar tales medidas? ¿Aceptarían otros países el daño económico autoimpuesto que China ha aceptado tratar de contener este brote? ¿Es razonable considerar que los gobiernos nacionales cerrarían el transporte público hacia y desde Londres, Nueva York o París en la semana anterior a Navidad, incluso si se demostrara que es Estas decisiones y preguntas cruzan la interfaz entre la salud pública, la ciencia y la política.La respuesta a este brote en China fue inevitablemente influenciada por la reacción histórica a la respuesta del país al SARS y la sospecha del mundo de la falta de cooperación de China en ese momento.La respuesta actual se enmarca, por lo tanto, en un contexto de no querer que se vea que se comportan de la misma manera con este evento.Esto puede indicar otro impacto de la experiencia del SARS (y el MERS y el Ébola) en la respuesta a los brotes posteriores. En la respuesta de emergencia, generalmente es mejor reaccionar de forma exagerada y luego disminuir si es necesario en lugar de reaccionar en forma insuficiente y actuar demasiado tarde. La respuesta debe ser "no lamentarse" hacer las mejores decisiones posibles sobre la base de la mejor información y ciencia disponible en ese momento, pero no juzgar o criticar si la información posterior sugiere un curso de acción diferente. La respuesta temprana debe reconocer lo que se conoce y lo que no se conoce y mirar qué de las incógnitas se pueden estimar razonablemente con referencia a brotes anteriores, patógenos similares, informes y modelos tempranos, etc. La evaluación y respuesta de riesgo puede entonces ser modificada y refinada a medida que evoluciona la información sobre las incógnitas. Sin embargo, la clave de este enfoque es la confianza en que las decisiones no serán criticadas sobre la base de información que no estaba disponible en ese momento. También es importante estar listo para cambiar decisiones cuando la información disponible cambie algo que tanto científicos como políticos En ese contexto, China no debe ser juzgada por aplicar lo que podría parecer medidas extremas, pero China también debe estar dispuesta a suspender las medidas rápidamente si las pruebas sugieren que no son la mejor manera de resolver el problema. Al cerrar los aeropuertos la propagación internacional de Wuhan puede disminuir, pero el éxito dependerá de la eficacia de las medidas realmente para detener a las personas que salen de la zona afectada, así como en el comportamiento del virus. Como siempre, sólo el tiempo dirá que el tiempo es escaso.

¿Cuánto tiempo tardó en identificar la causa de COVID-19?

La respuesta nacional e internacional demuestra el complejo vínculo entre la salud pública, la ciencia y la política cuando un brote amenaza con afectar a las economías y la reputación mundiales. Las medidas sin precedentes implementadas en China son un intento audaz de controlar el brote – necesitamos entender su efectividad para equilibrar costos y beneficios para eventos similares en el futuro. Texto: El 29 de diciembre de 2019 los médicos en un hospital en la ciudad de Wuhan, China notó una agrupación de casos de neumonía inusual (con el primer caso identificado en ese momento el 12 de diciembre) con un vínculo aparente con un mercado que vende pescado vivo, aves de corral y animales al público. Este evento fue reportado a la Organización Mundial de la Salud (OMS) el 31 de diciembre [1]. En 4 semanas, para el 26 de enero de 2020, el organismo causal había sido identificado como un nuevo coronavirus, el genoma del virus había sido secuenciado y publicado, se habían desarrollado pruebas de reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa, el Blueprint de R&D de la OMS se había activado para acelerar el diagnóstico, la terapia y el desarrollo de vacunas y una vacuna candidata En la actualidad, las autoridades sanitarias chinas están construyendo un hospital de 1.000 camas en Wuhan en 10 días. Al 26 de enero, casi 50 millones de personas en Wuhan y ciudades vecinas habían sido efectivamente puestas en cuarentena, mientras que la OMS había determinado que el evento aún no debía ser declarado como una emergencia de salud pública de interés internacional (PHEIC) [2] y no había recomendado ninguna restricción de viaje específica. La OMS ha destacado la importancia de la detección de salida en los puertos de los países que muestran la transmisión del nuevo coronavirus y ha proporcionado orientación a los países que realizan la detección de entrada en los aeropuertos, reconociendo al mismo tiempo que la evidencia de la eficacia de la detección de entrada es equívoca. Esta respuesta es una de las respuestas mundiales más rápidas y coordinadas a una enfermedad infecciosa emergente que el mundo ha visto en tiempos modernos, pero ¿es la respuesta adecuada, será eficaz y sostenible? Según el informe de situación publicado por la OMS el 28 de enero de 2020 [3], se han notificado en todo el mundo un total de 2798 casos confirmados en 2019-nCoV; de estos, 2761 casos procedían de China, incluidos Hong Kong (8 casos), Macao (5) y Taipei (4). Se han notificado 37 casos confirmados fuera de China en once países de Europa, América del Norte, Australia y Asia; de estos 37 casos exportados, 36 tenían un historial de viaje desde China o un vínculo epidemiológico con un caso de China. De los casos confirmados en China, 461 se han notificado como gravemente enfermos, con 80 muertes hasta la fecha. Este brote y la respuesta a él ilustran algunas cuestiones clave sobre cómo la preparación y la capacidad de respuesta mundial a los brotes han evolucionado durante casi dos décadas desde la epidemia del síndrome respiratorio agudo grave (SARS) de 2002/3 y qué lecciones se han aprendido o no. También plantea preguntas sobre el impacto que estas lecciones han tenido en la forma en que los organismos y los gobiernos responden a estos eventos y sobre el papel de la OMS y el Reglamento Sanitario Internacional (RSI).Una de las lecciones críticas de la experiencia del SRAS fue la necesidad absoluta de poder coordinar los recursos internacionales disponibles en un brote y centrarlos en identificar prioridades y resolver problemas.La OMS estableció los medios para hacerlo y desde entonces se ha desarrollado e integrado en la preparación mundial, especialmente después de la epidemia de Ébola en África Occidental. Organizaciones como la Global Outbreak Alert and Response Network (GOARN), la Coalition for Epidemic Prepared Innovations (CEPI), la Global Research Collaboration for Infectious Disease Preparedness (GloPID-R) y la Global Initiative on Sharing All Influenza Data (GISAID) han sido apoyadas por el Plan de Investigación de la OMS y su Mecanismo Mundial de Coordinación para proporcionar un foro donde aquellos con la experiencia y capacidad para contribuir a la gestión de nuevas amenazas puedan reunirse entre brotes y durante éstos para desarrollar soluciones innovadoras a los problemas emergentes. Esta coordinación mundial ha estado activa en el nuevo brote de coronavirus. El sistema de respuesta de la OMS incluye tres grupos virtuales basados en los desarrollados para que el SARS reúna información en tiempo real para informar sobre directrices en tiempo real, y una primera vacuna candidata está lista para pruebas de laboratorio en el plazo de Hubo extensas críticas a China por su aparente falta de intercambio de información sobre la infección emergente por SARS lo suficientemente pronto en el brote como para permitir a los países prepararse y responder. Hubo preocupaciones similares sobre el intercambio de información como el síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS) surgió y evolucionó en Oriente Medio en 2012, particularmente en Arabia Saudita, y sobre la aparición del ébola en África Occidental en 2014. En esta ocasión el intercambio de información parece haber sido rápido y eficaz (al tiempo que se reconoce que la información disponible en las primeras etapas de un brote es siempre menor de lo que la comunidad mundial desearía). La OMS fue notificada de la agrupación original en cuestión de días y la secuencia genómica completa del nuevo virus se publicó menos de 2 semanas después de que el grupo se detectara por primera vez. La OMS ha expresado su satisfacción con las acciones de las autoridades chinas para compartir información con la OMS. El trabajo con periodistas y medios de comunicación para ayudarles a entender la ciencia y la epidemiología, particularmente en un evento en movimiento rápido, mejorará la comunicación del riesgo al público y reducirá las preocupaciones inapropiadas y el pánico.Si bien la información de este brote muestra signos de los esfuerzos de epidemiólogos, expertos en enfermedades infecciosas, agencias de salud pública nacionales e internacionales y otros que trabajan con periodistas, también hay indicios de que esto no está logrando su objetivo.Por ejemplo, la percepción pública es que el aumento en el número de casos reportados diariamente por las autoridades chinas representa una escalada diaria de la epidemia, mientras que la realidad es que estas cifras son también el resultado de la búsqueda activa, agresiva, de casos en China y algunos de estos casos son casos "viejos" recientemente reconocidos como debido al coronavirus novedoso. Del mismo modo, el virus suele ser descrito por los medios de comunicación como "muerto" y aunque esto es cierto en el sentido de que ha causado muertes, los matices de las tasas de mortalidad de casos inciertos en las primeras etapas de un brote no se están comunicando. La tasa estimada actual de mortalidad de casos parece ser de alrededor del 3%, lo que es significativo pero no comparable a la tasa del 10% para el SARS o el 34% reportada para el MERS. Estas percepciones erróneas siguen impulsando la ansiedad pública. Para complementar los mecanismos formales de información entre los países y con la OMS (incluyendo el IHR), el uso de mecanismos informales como los informes de medios de comunicación y redes sociales fue defendido a la luz de la experiencia del SARS. Actualmente hay varios sistemas mundiales que proporcionan información recopilada de informes informales, incluyendo redes de expertos y escaneo de medios de comunicación y medios sociales.Estos contribuyen, amplifican, inteligencia epidémica y se están El valor se deriva de que se han detectado indicios tempranos de casos más allá de la ciudad de brote inicial y que pueden complementar la evaluación global del riesgo y el seguimiento de la evolución del brote.Los desafíos radican en el volumen y la diversidad de la información disponible y la relativa falta de mecanismos de verificación, de modo que uno de estos sistemas (ProMed) ha comentado que cada vez es más difícil asimilar la información que se suministra [4] y hacer interpretaciones significativas.Al principio del brote se informó que los trabajadores de la salud no habían sido infectados, lo que fue tranquilizador porque son los trabajadores de la salud quienes muchas veces, e inadvertidamente, amplifican la transmisión.La falta de lavado de manos entre los pacientes, por ejemplo, puede resultar no sólo en autoinfección, sino también en infección de pacientes hospitalizados por otras causas cuando prestan atención.La autoinfección no es sólo un riesgo para el trabajador de la salud, sino también para sus familias Una característica del brote de SARS fue la variabilidad de la transmisibilidad entre los casos y la ocurrencia de "acontecimientos superdifundidos" cuando un caso infectado significativamente más contactos que el promedio. Esto también se vio con el MERS en el brote en la República de Corea (RoK). En este nuevo brote de coronavirus no se han documentado tales eventos superdifundidos, pero la epidemiología todavía no está clara. Confirmar si esto está ocurriendo o no debe ser una tarea urgente para la investigación china. Los modeladores han sugerido tasas de reproducción (R 0 ) de 3,8 (intervalo de confianza del 95%, 3,6-4.0) [5] y 2.6 (1.5-3.5) [6] ; R 0 para SARS se estimó en alrededor de 3 en ausencia de medidas de control [7]. El impacto económico de los brotes mayores puede ser sustancial para el país afectado. Esto se vio claramente en el SARS, el MERS en RoK y el Ébola en África Occidental. Un analista estima que el impacto probable del actual brote de coronavirus oscilará entre un recorte del 0,8% al PIB real si la epidemia se controla en un plazo de 3 meses, y un costo del 1,9% al PIB si la epidemia dura 9 meses [8]. Esto puede aumentar sustancialmente a la luz de las restricciones ampliadas a la circulación, y por lo tanto al comercio, dentro de China. La aparición de una enfermedad respiratoria significativa vinculada a un nuevo coronavirus representa una prueba de la capacidad mundial para detectar y controlar las amenazas de enfermedades emergentes. Su aparición en China añade una dimensión adicional a la luz de la experiencia previa con el SARS. El calendario del brote inmediatamente antes del Año Nuevo Lunar Chino con sus movimientos de población concomitantes añade riesgo y urgencia adicionales a la respuesta. El rápido intercambio de información sobre este brote y la rapidez de la respuesta coordinada tanto en el país como en el plano internacional indican que se han aprendido lecciones del SARS que mejoran la capacidad mundial. Las redes y foros internacionales que ahora existen han facilitado la reunión de expertos de todo el mundo para centrar los esfuerzos de investigación y desarrollo y maximizar el impacto. En esta fase inicial de la información sobre los brotes sigue siendo incompleta y aún no se han respondido preguntas clínicas y epidemiológicas clave, pero el déficit parece deberse más a las limitaciones de investigar una enfermedad emergente que a la falta de voluntad de participar y compartir información con los asociados. Hay algunos indicios de esferas en las que es necesario seguir mejorando. La respuesta de los medios de comunicación mundiales a los acontecimientos que se están produciendo ha sido relativamente equilibrada e informada, pero los matices de la evolución de la situación no se han examinado críticamente en colaboración con los medios de comunicación y, por consiguiente, la percepción pública del riesgo puede exagerarse, La falta de apreciación de las incertidumbres en la determinación de una tasa significativa de mortalidad de los casos y la importancia del sesgo de determinación al comienzo de un brote, junto con el impacto de la búsqueda agresiva de casos en los números de los casos, son ejemplos de lo que podría mejorarse la comprensión. Esto es siempre un proceso difícil a la hora de equilibrar los recursos centrados en el análisis de la situación sobre el terreno con los recursos destinados a interpretar la información para los periodistas, pero en el SRAS, se observó que la R 0 disminuyó en respuesta a la información que llega al público y al público y luego adoptó medidas de reducción de riesgos [6] ; por lo tanto, una comunicación pública precisa sobre el riesgo es fundamental para el éxito. Sería útil encontrar un foro en el que esto pueda explorarse con la comunidad de medios después del evento. El aumento del acceso a la información temprana de diversas fuentes, incluidos los medios de comunicación y los medios sociales, añade una dimensión Cuando, como se ha visto en este brote, el volumen de información que llega excede cualquier capacidad para recopilarla y analizarla y tratar de hacer referencias cruzadas y verificar elementos separados, existe el riesgo de que la información alimente la especulación y los medios de comunicación y la preocupación pública.De nuevo existe un buen equilibrio entre la información que fomenta acciones adecuadas de evitación de riesgos y la información que fomenta acciones inapropiadas; sin embargo, la salud pública suele estar mejor al servicio de más información en lugar de menos.El papel de una declaración de un PHEIC en la gestión de un brote grave ha sido cuestionado a la luz del Ébola en África Occidental y en la República Democrática del Congo [9] y ha sido cuestionada nuevamente con este brote.El carácter binario de una declaración de PHEIC (ya sea un evento que es un PHEIC o no hay opciones intermedias) y la especificidad de los tres criterios definidos para un PHEIC han causado dificultad La falta de una comprensión clara de lo que se pretende lograr con una declaración del PHEIC se suma a las dificultades del Comité de Emergencia, al igual que la relativa escasez de respuestas clínicas y epidemiológicas en esta etapa de la investigación.En este caso, el Comité de Emergencias se dividió al llegar a una conclusión, pero decidió en equilibrio que la situación actual, aunque sea una emergencia, no debería ser declarada aún como un PHEIC [2].Como en el caso del Ébola en la RDC, se ha criticado a la OMS por esta decisión, pero, como en el caso del Ébola, no está claro de inmediato qué sería diferente en la respuesta si se declarase un PHEIC.La OMS está trabajando para mejorar la forma en que los Comités de Emergencia desarrollan su asesoramiento para el Director General, pero, como recomendó este Comité de Emergencias y el Comité de Revisión del IHR en 2015, el desarrollo de una alerta intermedia junto con el proceso de Una función clave de una declaración del PHEIC es que es la (única) puerta de entrada a las Recomendaciones Temporales de la OMS sobre posibles restricciones de viaje y comercio para limitar la propagación internacional de una enfermedad.En este caso, varios países del mundo ya habían implementado el control de entrada en los aeropuertos y China había comenzado a cerrar los viajes internacionales desde Wuhan antes de que el Comité de Emergencia hubiera terminado sus deliberaciones.Si bien la OMS no interferiría, ni podría interferir, en las decisiones soberanas de los Estados miembros, la falta de influencia en las decisiones de viaje y comercio podría resultar problemática.Además de la rapidez de la respuesta en este brote, hemos visto cambios dramáticos en la escala de la respuesta.La imposición de medidas de cuarentena muy extensas a millones de personas como un intento de romper la transmisión del virus no tiene precedentes.No sabemos si serán eficaces; de hecho, no sabemos cómo determinar si han sido eficaces. Si se confirman las recientes sugerencias de que las personas infectadas con este coronavirus pueden ser infecciosas durante la incubación o asintomáticas, y los informes de que hasta 5 m de personas abandonaron Wuhan antes de que se impusieran las restricciones de viaje, la eficacia de estas medidas de control será más cuestionada. Dado el probable impacto en al menos la economía china y probablemente la economía mundial, será importante entender el papel y la eficacia de las medidas de salud pública en esta escala para el futuro. Sin embargo, la imposición de estas dramáticas medidas también plantea una cuestión más amplia: si hay un impacto de estas medidas, ¿qué otros países (o podrían) implementar tales medidas? ¿Aceptarían otros países el daño económico autoimpuesto que China ha aceptado tratar de contener este brote? ¿Es razonable considerar que los gobiernos nacionales cerrarían el transporte público hacia y desde Londres, Nueva York o París en la semana anterior a Navidad, incluso si se demostrara que es Estas decisiones y preguntas cruzan la interfaz entre la salud pública, la ciencia y la política.La respuesta a este brote en China fue inevitablemente influenciada por la reacción histórica a la respuesta del país al SARS y la sospecha del mundo de la falta de cooperación de China en ese momento.La respuesta actual se enmarca, por lo tanto, en un contexto de no querer que se vea que se comportan de la misma manera con este evento.Esto puede indicar otro impacto de la experiencia del SARS (y el MERS y el Ébola) en la respuesta a los brotes posteriores. En la respuesta de emergencia, generalmente es mejor reaccionar de forma exagerada y luego disminuir si es necesario en lugar de reaccionar en forma insuficiente y actuar demasiado tarde. La respuesta debe ser "no lamentarse" hacer las mejores decisiones posibles sobre la base de la mejor información y ciencia disponible en ese momento, pero no juzgar o criticar si la información posterior sugiere un curso de acción diferente. La respuesta temprana debe reconocer lo que se conoce y lo que no se conoce y mirar qué de las incógnitas se pueden estimar razonablemente con referencia a brotes anteriores, patógenos similares, informes y modelos tempranos, etc. La evaluación y respuesta de riesgo puede entonces ser modificada y refinada a medida que evoluciona la información sobre las incógnitas. Sin embargo, la clave de este enfoque es la confianza en que las decisiones no serán criticadas sobre la base de información que no estaba disponible en ese momento. También es importante estar listo para cambiar decisiones cuando la información disponible cambie algo que tanto científicos como políticos En ese contexto, China no debe ser juzgada por aplicar lo que podría parecer medidas extremas, pero China también debe estar dispuesta a suspender las medidas rápidamente si las pruebas sugieren que no son la mejor manera de resolver el problema. Al cerrar los aeropuertos la propagación internacional de Wuhan puede disminuir, pero el éxito dependerá de la eficacia de las medidas realmente para detener a las personas que salen de la zona afectada, así como en el comportamiento del virus. Como siempre, sólo el tiempo dirá que el tiempo es escaso.

¿Cuánto tiempo tardó China en construir el hospital temporal en Wuhan para los pacientes COVID-19?

La respuesta nacional e internacional demuestra el complejo vínculo entre la salud pública, la ciencia y la política cuando un brote amenaza con afectar a las economías y la reputación mundiales. Las medidas sin precedentes implementadas en China son un intento audaz de controlar el brote – necesitamos entender su efectividad para equilibrar costos y beneficios para eventos similares en el futuro. Texto: El 29 de diciembre de 2019 los médicos en un hospital en la ciudad de Wuhan, China notó una agrupación de casos de neumonía inusual (con el primer caso identificado en ese momento el 12 de diciembre) con un vínculo aparente con un mercado que vende pescado vivo, aves de corral y animales al público. Este evento fue reportado a la Organización Mundial de la Salud (OMS) el 31 de diciembre [1]. En 4 semanas, para el 26 de enero de 2020, el organismo causal había sido identificado como un nuevo coronavirus, el genoma del virus había sido secuenciado y publicado, se habían desarrollado pruebas de reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa, el Blueprint de R&D de la OMS se había activado para acelerar el diagnóstico, la terapia y el desarrollo de vacunas y una vacuna candidata En la actualidad, las autoridades sanitarias chinas están construyendo un hospital de 1.000 camas en Wuhan en 10 días. Al 26 de enero, casi 50 millones de personas en Wuhan y ciudades vecinas habían sido efectivamente puestas en cuarentena, mientras que la OMS había determinado que el evento aún no debía ser declarado como una emergencia de salud pública de interés internacional (PHEIC) [2] y no había recomendado ninguna restricción de viaje específica. La OMS ha destacado la importancia de la detección de salida en los puertos de los países que muestran la transmisión del nuevo coronavirus y ha proporcionado orientación a los países que realizan la detección de entrada en los aeropuertos, reconociendo al mismo tiempo que la evidencia de la eficacia de la detección de entrada es equívoca. Esta respuesta es una de las respuestas mundiales más rápidas y coordinadas a una enfermedad infecciosa emergente que el mundo ha visto en tiempos modernos, pero ¿es la respuesta adecuada, será eficaz y sostenible? Según el informe de situación publicado por la OMS el 28 de enero de 2020 [3], se han notificado en todo el mundo un total de 2798 casos confirmados en 2019-nCoV; de estos, 2761 casos procedían de China, incluidos Hong Kong (8 casos), Macao (5) y Taipei (4). Se han notificado 37 casos confirmados fuera de China en once países de Europa, América del Norte, Australia y Asia; de estos 37 casos exportados, 36 tenían un historial de viaje desde China o un vínculo epidemiológico con un caso de China. De los casos confirmados en China, 461 se han notificado como gravemente enfermos, con 80 muertes hasta la fecha. Este brote y la respuesta a él ilustran algunas cuestiones clave sobre cómo la preparación y la capacidad de respuesta mundial a los brotes han evolucionado durante casi dos décadas desde la epidemia del síndrome respiratorio agudo grave (SARS) de 2002/3 y qué lecciones se han aprendido o no. También plantea preguntas sobre el impacto que estas lecciones han tenido en la forma en que los organismos y los gobiernos responden a estos eventos y sobre el papel de la OMS y el Reglamento Sanitario Internacional (RSI).Una de las lecciones críticas de la experiencia del SRAS fue la necesidad absoluta de poder coordinar los recursos internacionales disponibles en un brote y centrarlos en identificar prioridades y resolver problemas.La OMS estableció los medios para hacerlo y desde entonces se ha desarrollado e integrado en la preparación mundial, especialmente después de la epidemia de Ébola en África Occidental. Organizaciones como la Global Outbreak Alert and Response Network (GOARN), la Coalition for Epidemic Prepared Innovations (CEPI), la Global Research Collaboration for Infectious Disease Preparedness (GloPID-R) y la Global Initiative on Sharing All Influenza Data (GISAID) han sido apoyadas por el Plan de Investigación de la OMS y su Mecanismo Mundial de Coordinación para proporcionar un foro donde aquellos con la experiencia y capacidad para contribuir a la gestión de nuevas amenazas puedan reunirse entre brotes y durante éstos para desarrollar soluciones innovadoras a los problemas emergentes. Esta coordinación mundial ha estado activa en el nuevo brote de coronavirus. El sistema de respuesta de la OMS incluye tres grupos virtuales basados en los desarrollados para que el SARS reúna información en tiempo real para informar sobre directrices en tiempo real, y una primera vacuna candidata está lista para pruebas de laboratorio en el plazo de Hubo extensas críticas a China por su aparente falta de intercambio de información sobre la infección emergente por SARS lo suficientemente pronto en el brote como para permitir a los países prepararse y responder. Hubo preocupaciones similares sobre el intercambio de información como el síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS) surgió y evolucionó en Oriente Medio en 2012, particularmente en Arabia Saudita, y sobre la aparición del ébola en África Occidental en 2014. En esta ocasión el intercambio de información parece haber sido rápido y eficaz (al tiempo que se reconoce que la información disponible en las primeras etapas de un brote es siempre menor de lo que la comunidad mundial desearía). La OMS fue notificada de la agrupación original en cuestión de días y la secuencia genómica completa del nuevo virus se publicó menos de 2 semanas después de que el grupo se detectara por primera vez. La OMS ha expresado su satisfacción con las acciones de las autoridades chinas para compartir información con la OMS. El trabajo con periodistas y medios de comunicación para ayudarles a entender la ciencia y la epidemiología, particularmente en un evento en movimiento rápido, mejorará la comunicación del riesgo al público y reducirá las preocupaciones inapropiadas y el pánico.Si bien la información de este brote muestra signos de los esfuerzos de epidemiólogos, expertos en enfermedades infecciosas, agencias de salud pública nacionales e internacionales y otros que trabajan con periodistas, también hay indicios de que esto no está logrando su objetivo.Por ejemplo, la percepción pública es que el aumento en el número de casos reportados diariamente por las autoridades chinas representa una escalada diaria de la epidemia, mientras que la realidad es que estas cifras son también el resultado de la búsqueda activa, agresiva, de casos en China y algunos de estos casos son casos "viejos" recientemente reconocidos como debido al coronavirus novedoso. Del mismo modo, el virus suele ser descrito por los medios de comunicación como "muerto" y aunque esto es cierto en el sentido de que ha causado muertes, los matices de las tasas de mortalidad de casos inciertos en las primeras etapas de un brote no se están comunicando. La tasa estimada actual de mortalidad de casos parece ser de alrededor del 3%, lo que es significativo pero no comparable a la tasa del 10% para el SARS o el 34% reportada para el MERS. Estas percepciones erróneas siguen impulsando la ansiedad pública. Para complementar los mecanismos formales de información entre los países y con la OMS (incluyendo el IHR), el uso de mecanismos informales como los informes de medios de comunicación y redes sociales fue defendido a la luz de la experiencia del SARS. Actualmente hay varios sistemas mundiales que proporcionan información recopilada de informes informales, incluyendo redes de expertos y escaneo de medios de comunicación y medios sociales.Estos contribuyen, amplifican, inteligencia epidémica y se están El valor se deriva de que se han detectado indicios tempranos de casos más allá de la ciudad de brote inicial y que pueden complementar la evaluación global del riesgo y el seguimiento de la evolución del brote.Los desafíos radican en el volumen y la diversidad de la información disponible y la relativa falta de mecanismos de verificación, de modo que uno de estos sistemas (ProMed) ha comentado que cada vez es más difícil asimilar la información que se suministra [4] y hacer interpretaciones significativas.Al principio del brote se informó que los trabajadores de la salud no habían sido infectados, lo que fue tranquilizador porque son los trabajadores de la salud quienes muchas veces, e inadvertidamente, amplifican la transmisión.La falta de lavado de manos entre los pacientes, por ejemplo, puede resultar no sólo en autoinfección, sino también en infección de pacientes hospitalizados por otras causas cuando prestan atención.La autoinfección no es sólo un riesgo para el trabajador de la salud, sino también para sus familias Una característica del brote de SARS fue la variabilidad de la transmisibilidad entre los casos y la ocurrencia de "acontecimientos superdifundidos" cuando un caso infectado significativamente más contactos que el promedio. Esto también se vio con el MERS en el brote en la República de Corea (RoK). En este nuevo brote de coronavirus no se han documentado tales eventos superdifundidos, pero la epidemiología todavía no está clara. Confirmar si esto está ocurriendo o no debe ser una tarea urgente para la investigación china. Los modeladores han sugerido tasas de reproducción (R 0 ) de 3,8 (intervalo de confianza del 95%, 3,6-4.0) [5] y 2.6 (1.5-3.5) [6] ; R 0 para SARS se estimó en alrededor de 3 en ausencia de medidas de control [7]. El impacto económico de los brotes mayores puede ser sustancial para el país afectado. Esto se vio claramente en el SARS, el MERS en RoK y el Ébola en África Occidental. Un analista estima que el impacto probable del actual brote de coronavirus oscilará entre un recorte del 0,8% al PIB real si la epidemia se controla en un plazo de 3 meses, y un costo del 1,9% al PIB si la epidemia dura 9 meses [8]. Esto puede aumentar sustancialmente a la luz de las restricciones ampliadas a la circulación, y por lo tanto al comercio, dentro de China. La aparición de una enfermedad respiratoria significativa vinculada a un nuevo coronavirus representa una prueba de la capacidad mundial para detectar y controlar las amenazas de enfermedades emergentes. Su aparición en China añade una dimensión adicional a la luz de la experiencia previa con el SARS. El calendario del brote inmediatamente antes del Año Nuevo Lunar Chino con sus movimientos de población concomitantes añade riesgo y urgencia adicionales a la respuesta. El rápido intercambio de información sobre este brote y la rapidez de la respuesta coordinada tanto en el país como en el plano internacional indican que se han aprendido lecciones del SARS que mejoran la capacidad mundial. Las redes y foros internacionales que ahora existen han facilitado la reunión de expertos de todo el mundo para centrar los esfuerzos de investigación y desarrollo y maximizar el impacto. En esta fase inicial de la información sobre los brotes sigue siendo incompleta y aún no se han respondido preguntas clínicas y epidemiológicas clave, pero el déficit parece deberse más a las limitaciones de investigar una enfermedad emergente que a la falta de voluntad de participar y compartir información con los asociados. Hay algunos indicios de esferas en las que es necesario seguir mejorando. La respuesta de los medios de comunicación mundiales a los acontecimientos que se están produciendo ha sido relativamente equilibrada e informada, pero los matices de la evolución de la situación no se han examinado críticamente en colaboración con los medios de comunicación y, por consiguiente, la percepción pública del riesgo puede exagerarse, La falta de apreciación de las incertidumbres en la determinación de una tasa significativa de mortalidad de los casos y la importancia del sesgo de determinación al comienzo de un brote, junto con el impacto de la búsqueda agresiva de casos en los números de los casos, son ejemplos de lo que podría mejorarse la comprensión. Esto es siempre un proceso difícil a la hora de equilibrar los recursos centrados en el análisis de la situación sobre el terreno con los recursos destinados a interpretar la información para los periodistas, pero en el SRAS, se observó que la R 0 disminuyó en respuesta a la información que llega al público y al público y luego adoptó medidas de reducción de riesgos [6] ; por lo tanto, una comunicación pública precisa sobre el riesgo es fundamental para el éxito. Sería útil encontrar un foro en el que esto pueda explorarse con la comunidad de medios después del evento. El aumento del acceso a la información temprana de diversas fuentes, incluidos los medios de comunicación y los medios sociales, añade una dimensión Cuando, como se ha visto en este brote, el volumen de información que llega excede cualquier capacidad para recopilarla y analizarla y tratar de hacer referencias cruzadas y verificar elementos separados, existe el riesgo de que la información alimente la especulación y los medios de comunicación y la preocupación pública.De nuevo existe un buen equilibrio entre la información que fomenta acciones adecuadas de evitación de riesgos y la información que fomenta acciones inapropiadas; sin embargo, la salud pública suele estar mejor al servicio de más información en lugar de menos.El papel de una declaración de un PHEIC en la gestión de un brote grave ha sido cuestionado a la luz del Ébola en África Occidental y en la República Democrática del Congo [9] y ha sido cuestionada nuevamente con este brote.El carácter binario de una declaración de PHEIC (ya sea un evento que es un PHEIC o no hay opciones intermedias) y la especificidad de los tres criterios definidos para un PHEIC han causado dificultad La falta de una comprensión clara de lo que se pretende lograr con una declaración del PHEIC se suma a las dificultades del Comité de Emergencia, al igual que la relativa escasez de respuestas clínicas y epidemiológicas en esta etapa de la investigación.En este caso, el Comité de Emergencias se dividió al llegar a una conclusión, pero decidió en equilibrio que la situación actual, aunque sea una emergencia, no debería ser declarada aún como un PHEIC [2].Como en el caso del Ébola en la RDC, se ha criticado a la OMS por esta decisión, pero, como en el caso del Ébola, no está claro de inmediato qué sería diferente en la respuesta si se declarase un PHEIC.La OMS está trabajando para mejorar la forma en que los Comités de Emergencia desarrollan su asesoramiento para el Director General, pero, como recomendó este Comité de Emergencias y el Comité de Revisión del IHR en 2015, el desarrollo de una alerta intermedia junto con el proceso de Una función clave de una declaración del PHEIC es que es la (única) puerta de entrada a las Recomendaciones Temporales de la OMS sobre posibles restricciones de viaje y comercio para limitar la propagación internacional de una enfermedad.En este caso, varios países del mundo ya habían implementado el control de entrada en los aeropuertos y China había comenzado a cerrar los viajes internacionales desde Wuhan antes de que el Comité de Emergencia hubiera terminado sus deliberaciones.Si bien la OMS no interferiría, ni podría interferir, en las decisiones soberanas de los Estados miembros, la falta de influencia en las decisiones de viaje y comercio podría resultar problemática.Además de la rapidez de la respuesta en este brote, hemos visto cambios dramáticos en la escala de la respuesta.La imposición de medidas de cuarentena muy extensas a millones de personas como un intento de romper la transmisión del virus no tiene precedentes.No sabemos si serán eficaces; de hecho, no sabemos cómo determinar si han sido eficaces. Si se confirman las recientes sugerencias de que las personas infectadas con este coronavirus pueden ser infecciosas durante la incubación o asintomáticas, y los informes de que hasta 5 m de personas abandonaron Wuhan antes de que se impusieran las restricciones de viaje, la eficacia de estas medidas de control será más cuestionada. Dado el probable impacto en al menos la economía china y probablemente la economía mundial, será importante entender el papel y la eficacia de las medidas de salud pública en esta escala para el futuro. Sin embargo, la imposición de estas dramáticas medidas también plantea una cuestión más amplia: si hay un impacto de estas medidas, ¿qué otros países (o podrían) implementar tales medidas? ¿Aceptarían otros países el daño económico autoimpuesto que China ha aceptado tratar de contener este brote? ¿Es razonable considerar que los gobiernos nacionales cerrarían el transporte público hacia y desde Londres, Nueva York o París en la semana anterior a Navidad, incluso si se demostrara que es Estas decisiones y preguntas cruzan la interfaz entre la salud pública, la ciencia y la política.La respuesta a este brote en China fue inevitablemente influenciada por la reacción histórica a la respuesta del país al SARS y la sospecha del mundo de la falta de cooperación de China en ese momento.La respuesta actual se enmarca, por lo tanto, en un contexto de no querer que se vea que se comportan de la misma manera con este evento.Esto puede indicar otro impacto de la experiencia del SARS (y el MERS y el Ébola) en la respuesta a los brotes posteriores. En la respuesta de emergencia, generalmente es mejor reaccionar de forma exagerada y luego disminuir si es necesario en lugar de reaccionar en forma insuficiente y actuar demasiado tarde. La respuesta debe ser "no lamentarse" hacer las mejores decisiones posibles sobre la base de la mejor información y ciencia disponible en ese momento, pero no juzgar o criticar si la información posterior sugiere un curso de acción diferente. La respuesta temprana debe reconocer lo que se conoce y lo que no se conoce y mirar qué de las incógnitas se pueden estimar razonablemente con referencia a brotes anteriores, patógenos similares, informes y modelos tempranos, etc. La evaluación y respuesta de riesgo puede entonces ser modificada y refinada a medida que evoluciona la información sobre las incógnitas. Sin embargo, la clave de este enfoque es la confianza en que las decisiones no serán criticadas sobre la base de información que no estaba disponible en ese momento. También es importante estar listo para cambiar decisiones cuando la información disponible cambie algo que tanto científicos como políticos En ese contexto, China no debe ser juzgada por aplicar lo que podría parecer medidas extremas, pero China también debe estar dispuesta a suspender las medidas rápidamente si las pruebas sugieren que no son la mejor manera de resolver el problema. Al cerrar los aeropuertos la propagación internacional de Wuhan puede disminuir, pero el éxito dependerá de la eficacia de las medidas realmente para detener a las personas que salen de la zona afectada, así como en el comportamiento del virus. Como siempre, sólo el tiempo dirá que el tiempo es escaso.

¿En qué año ocurrió la epidemia de MERS?

La respuesta nacional e internacional demuestra el complejo vínculo entre la salud pública, la ciencia y la política cuando un brote amenaza con afectar a las economías y la reputación mundiales. Las medidas sin precedentes implementadas en China son un intento audaz de controlar el brote – necesitamos entender su efectividad para equilibrar costos y beneficios para eventos similares en el futuro. Texto: El 29 de diciembre de 2019 los médicos en un hospital en la ciudad de Wuhan, China notó una agrupación de casos de neumonía inusual (con el primer caso identificado en ese momento el 12 de diciembre) con un vínculo aparente con un mercado que vende pescado vivo, aves de corral y animales al público. Este evento fue reportado a la Organización Mundial de la Salud (OMS) el 31 de diciembre [1]. En 4 semanas, para el 26 de enero de 2020, el organismo causal había sido identificado como un nuevo coronavirus, el genoma del virus había sido secuenciado y publicado, se habían desarrollado pruebas de reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa, el Blueprint de R&D de la OMS se había activado para acelerar el diagnóstico, la terapia y el desarrollo de vacunas y una vacuna candidata En la actualidad, las autoridades sanitarias chinas están construyendo un hospital de 1.000 camas en Wuhan en 10 días. Al 26 de enero, casi 50 millones de personas en Wuhan y ciudades vecinas habían sido efectivamente puestas en cuarentena, mientras que la OMS había determinado que el evento aún no debía ser declarado como una emergencia de salud pública de interés internacional (PHEIC) [2] y no había recomendado ninguna restricción de viaje específica. La OMS ha destacado la importancia de la detección de salida en los puertos de los países que muestran la transmisión del nuevo coronavirus y ha proporcionado orientación a los países que realizan la detección de entrada en los aeropuertos, reconociendo al mismo tiempo que la evidencia de la eficacia de la detección de entrada es equívoca. Esta respuesta es una de las respuestas mundiales más rápidas y coordinadas a una enfermedad infecciosa emergente que el mundo ha visto en tiempos modernos, pero ¿es la respuesta adecuada, será eficaz y sostenible? Según el informe de situación publicado por la OMS el 28 de enero de 2020 [3], se han notificado en todo el mundo un total de 2798 casos confirmados en 2019-nCoV; de estos, 2761 casos procedían de China, incluidos Hong Kong (8 casos), Macao (5) y Taipei (4). Se han notificado 37 casos confirmados fuera de China en once países de Europa, América del Norte, Australia y Asia; de estos 37 casos exportados, 36 tenían un historial de viaje desde China o un vínculo epidemiológico con un caso de China. De los casos confirmados en China, 461 se han notificado como gravemente enfermos, con 80 muertes hasta la fecha. Este brote y la respuesta a él ilustran algunas cuestiones clave sobre cómo la preparación y la capacidad de respuesta mundial a los brotes han evolucionado durante casi dos décadas desde la epidemia del síndrome respiratorio agudo grave (SARS) de 2002/3 y qué lecciones se han aprendido o no. También plantea preguntas sobre el impacto que estas lecciones han tenido en la forma en que los organismos y los gobiernos responden a estos eventos y sobre el papel de la OMS y el Reglamento Sanitario Internacional (RSI).Una de las lecciones críticas de la experiencia del SRAS fue la necesidad absoluta de poder coordinar los recursos internacionales disponibles en un brote y centrarlos en identificar prioridades y resolver problemas.La OMS estableció los medios para hacerlo y desde entonces se ha desarrollado e integrado en la preparación mundial, especialmente después de la epidemia de Ébola en África Occidental. Organizaciones como la Global Outbreak Alert and Response Network (GOARN), la Coalition for Epidemic Prepared Innovations (CEPI), la Global Research Collaboration for Infectious Disease Preparedness (GloPID-R) y la Global Initiative on Sharing All Influenza Data (GISAID) han sido apoyadas por el Plan de Investigación de la OMS y su Mecanismo Mundial de Coordinación para proporcionar un foro donde aquellos con la experiencia y capacidad para contribuir a la gestión de nuevas amenazas puedan reunirse entre brotes y durante éstos para desarrollar soluciones innovadoras a los problemas emergentes. Esta coordinación mundial ha estado activa en el nuevo brote de coronavirus. El sistema de respuesta de la OMS incluye tres grupos virtuales basados en los desarrollados para que el SARS reúna información en tiempo real para informar sobre directrices en tiempo real, y una primera vacuna candidata está lista para pruebas de laboratorio en el plazo de Hubo extensas críticas a China por su aparente falta de intercambio de información sobre la infección emergente por SARS lo suficientemente pronto en el brote como para permitir a los países prepararse y responder. Hubo preocupaciones similares sobre el intercambio de información como el síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS) surgió y evolucionó en Oriente Medio en 2012, particularmente en Arabia Saudita, y sobre la aparición del ébola en África Occidental en 2014. En esta ocasión el intercambio de información parece haber sido rápido y eficaz (al tiempo que se reconoce que la información disponible en las primeras etapas de un brote es siempre menor de lo que la comunidad mundial desearía). La OMS fue notificada de la agrupación original en cuestión de días y la secuencia genómica completa del nuevo virus se publicó menos de 2 semanas después de que el grupo se detectara por primera vez. La OMS ha expresado su satisfacción con las acciones de las autoridades chinas para compartir información con la OMS. El trabajo con periodistas y medios de comunicación para ayudarles a entender la ciencia y la epidemiología, particularmente en un evento en movimiento rápido, mejorará la comunicación del riesgo al público y reducirá las preocupaciones inapropiadas y el pánico.Si bien la información de este brote muestra signos de los esfuerzos de epidemiólogos, expertos en enfermedades infecciosas, agencias de salud pública nacionales e internacionales y otros que trabajan con periodistas, también hay indicios de que esto no está logrando su objetivo.Por ejemplo, la percepción pública es que el aumento en el número de casos reportados diariamente por las autoridades chinas representa una escalada diaria de la epidemia, mientras que la realidad es que estas cifras son también el resultado de la búsqueda activa, agresiva, de casos en China y algunos de estos casos son casos "viejos" recientemente reconocidos como debido al coronavirus novedoso. Del mismo modo, el virus suele ser descrito por los medios de comunicación como "muerto" y aunque esto es cierto en el sentido de que ha causado muertes, los matices de las tasas de mortalidad de casos inciertos en las primeras etapas de un brote no se están comunicando. La tasa estimada actual de mortalidad de casos parece ser de alrededor del 3%, lo que es significativo pero no comparable a la tasa del 10% para el SARS o el 34% reportada para el MERS. Estas percepciones erróneas siguen impulsando la ansiedad pública. Para complementar los mecanismos formales de información entre los países y con la OMS (incluyendo el IHR), el uso de mecanismos informales como los informes de medios de comunicación y redes sociales fue defendido a la luz de la experiencia del SARS. Actualmente hay varios sistemas mundiales que proporcionan información recopilada de informes informales, incluyendo redes de expertos y escaneo de medios de comunicación y medios sociales.Estos contribuyen, amplifican, inteligencia epidémica y se están El valor se deriva de que se han detectado indicios tempranos de casos más allá de la ciudad de brote inicial y que pueden complementar la evaluación global del riesgo y el seguimiento de la evolución del brote.Los desafíos radican en el volumen y la diversidad de la información disponible y la relativa falta de mecanismos de verificación, de modo que uno de estos sistemas (ProMed) ha comentado que cada vez es más difícil asimilar la información que se suministra [4] y hacer interpretaciones significativas.Al principio del brote se informó que los trabajadores de la salud no habían sido infectados, lo que fue tranquilizador porque son los trabajadores de la salud quienes muchas veces, e inadvertidamente, amplifican la transmisión.La falta de lavado de manos entre los pacientes, por ejemplo, puede resultar no sólo en autoinfección, sino también en infección de pacientes hospitalizados por otras causas cuando prestan atención.La autoinfección no es sólo un riesgo para el trabajador de la salud, sino también para sus familias Una característica del brote de SARS fue la variabilidad de la transmisibilidad entre los casos y la ocurrencia de "acontecimientos superdifundidos" cuando un caso infectado significativamente más contactos que el promedio. Esto también se vio con el MERS en el brote en la República de Corea (RoK). En este nuevo brote de coronavirus no se han documentado tales eventos superdifundidos, pero la epidemiología todavía no está clara. Confirmar si esto está ocurriendo o no debe ser una tarea urgente para la investigación china. Los modeladores han sugerido tasas de reproducción (R 0 ) de 3,8 (intervalo de confianza del 95%, 3,6-4.0) [5] y 2.6 (1.5-3.5) [6] ; R 0 para SARS se estimó en alrededor de 3 en ausencia de medidas de control [7]. El impacto económico de los brotes mayores puede ser sustancial para el país afectado. Esto se vio claramente en el SARS, el MERS en RoK y el Ébola en África Occidental. Un analista estima que el impacto probable del actual brote de coronavirus oscilará entre un recorte del 0,8% al PIB real si la epidemia se controla en un plazo de 3 meses, y un costo del 1,9% al PIB si la epidemia dura 9 meses [8]. Esto puede aumentar sustancialmente a la luz de las restricciones ampliadas a la circulación, y por lo tanto al comercio, dentro de China. La aparición de una enfermedad respiratoria significativa vinculada a un nuevo coronavirus representa una prueba de la capacidad mundial para detectar y controlar las amenazas de enfermedades emergentes. Su aparición en China añade una dimensión adicional a la luz de la experiencia previa con el SARS. El calendario del brote inmediatamente antes del Año Nuevo Lunar Chino con sus movimientos de población concomitantes añade riesgo y urgencia adicionales a la respuesta. El rápido intercambio de información sobre este brote y la rapidez de la respuesta coordinada tanto en el país como en el plano internacional indican que se han aprendido lecciones del SARS que mejoran la capacidad mundial. Las redes y foros internacionales que ahora existen han facilitado la reunión de expertos de todo el mundo para centrar los esfuerzos de investigación y desarrollo y maximizar el impacto. En esta fase inicial de la información sobre los brotes sigue siendo incompleta y aún no se han respondido preguntas clínicas y epidemiológicas clave, pero el déficit parece deberse más a las limitaciones de investigar una enfermedad emergente que a la falta de voluntad de participar y compartir información con los asociados. Hay algunos indicios de esferas en las que es necesario seguir mejorando. La respuesta de los medios de comunicación mundiales a los acontecimientos que se están produciendo ha sido relativamente equilibrada e informada, pero los matices de la evolución de la situación no se han examinado críticamente en colaboración con los medios de comunicación y, por consiguiente, la percepción pública del riesgo puede exagerarse, La falta de apreciación de las incertidumbres en la determinación de una tasa significativa de mortalidad de los casos y la importancia del sesgo de determinación al comienzo de un brote, junto con el impacto de la búsqueda agresiva de casos en los números de los casos, son ejemplos de lo que podría mejorarse la comprensión. Esto es siempre un proceso difícil a la hora de equilibrar los recursos centrados en el análisis de la situación sobre el terreno con los recursos destinados a interpretar la información para los periodistas, pero en el SRAS, se observó que la R 0 disminuyó en respuesta a la información que llega al público y al público y luego adoptó medidas de reducción de riesgos [6] ; por lo tanto, una comunicación pública precisa sobre el riesgo es fundamental para el éxito. Sería útil encontrar un foro en el que esto pueda explorarse con la comunidad de medios después del evento. El aumento del acceso a la información temprana de diversas fuentes, incluidos los medios de comunicación y los medios sociales, añade una dimensión Cuando, como se ha visto en este brote, el volumen de información que llega excede cualquier capacidad para recopilarla y analizarla y tratar de hacer referencias cruzadas y verificar elementos separados, existe el riesgo de que la información alimente la especulación y los medios de comunicación y la preocupación pública.De nuevo existe un buen equilibrio entre la información que fomenta acciones adecuadas de evitación de riesgos y la información que fomenta acciones inapropiadas; sin embargo, la salud pública suele estar mejor al servicio de más información en lugar de menos.El papel de una declaración de un PHEIC en la gestión de un brote grave ha sido cuestionado a la luz del Ébola en África Occidental y en la República Democrática del Congo [9] y ha sido cuestionada nuevamente con este brote.El carácter binario de una declaración de PHEIC (ya sea un evento que es un PHEIC o no hay opciones intermedias) y la especificidad de los tres criterios definidos para un PHEIC han causado dificultad La falta de una comprensión clara de lo que se pretende lograr con una declaración del PHEIC se suma a las dificultades del Comité de Emergencia, al igual que la relativa escasez de respuestas clínicas y epidemiológicas en esta etapa de la investigación.En este caso, el Comité de Emergencias se dividió al llegar a una conclusión, pero decidió en equilibrio que la situación actual, aunque sea una emergencia, no debería ser declarada aún como un PHEIC [2].Como en el caso del Ébola en la RDC, se ha criticado a la OMS por esta decisión, pero, como en el caso del Ébola, no está claro de inmediato qué sería diferente en la respuesta si se declarase un PHEIC.La OMS está trabajando para mejorar la forma en que los Comités de Emergencia desarrollan su asesoramiento para el Director General, pero, como recomendó este Comité de Emergencias y el Comité de Revisión del IHR en 2015, el desarrollo de una alerta intermedia junto con el proceso de Una función clave de una declaración del PHEIC es que es la (única) puerta de entrada a las Recomendaciones Temporales de la OMS sobre posibles restricciones de viaje y comercio para limitar la propagación internacional de una enfermedad.En este caso, varios países del mundo ya habían implementado el control de entrada en los aeropuertos y China había comenzado a cerrar los viajes internacionales desde Wuhan antes de que el Comité de Emergencia hubiera terminado sus deliberaciones.Si bien la OMS no interferiría, ni podría interferir, en las decisiones soberanas de los Estados miembros, la falta de influencia en las decisiones de viaje y comercio podría resultar problemática.Además de la rapidez de la respuesta en este brote, hemos visto cambios dramáticos en la escala de la respuesta.La imposición de medidas de cuarentena muy extensas a millones de personas como un intento de romper la transmisión del virus no tiene precedentes.No sabemos si serán eficaces; de hecho, no sabemos cómo determinar si han sido eficaces. Si se confirman las recientes sugerencias de que las personas infectadas con este coronavirus pueden ser infecciosas durante la incubación o asintomáticas, y los informes de que hasta 5 m de personas abandonaron Wuhan antes de que se impusieran las restricciones de viaje, la eficacia de estas medidas de control será más cuestionada. Dado el probable impacto en al menos la economía china y probablemente la economía mundial, será importante entender el papel y la eficacia de las medidas de salud pública en esta escala para el futuro. Sin embargo, la imposición de estas dramáticas medidas también plantea una cuestión más amplia: si hay un impacto de estas medidas, ¿qué otros países (o podrían) implementar tales medidas? ¿Aceptarían otros países el daño económico autoimpuesto que China ha aceptado tratar de contener este brote? ¿Es razonable considerar que los gobiernos nacionales cerrarían el transporte público hacia y desde Londres, Nueva York o París en la semana anterior a Navidad, incluso si se demostrara que es Estas decisiones y preguntas cruzan la interfaz entre la salud pública, la ciencia y la política.La respuesta a este brote en China fue inevitablemente influenciada por la reacción histórica a la respuesta del país al SARS y la sospecha del mundo de la falta de cooperación de China en ese momento.La respuesta actual se enmarca, por lo tanto, en un contexto de no querer que se vea que se comportan de la misma manera con este evento.Esto puede indicar otro impacto de la experiencia del SARS (y el MERS y el Ébola) en la respuesta a los brotes posteriores. En la respuesta de emergencia, generalmente es mejor reaccionar de forma exagerada y luego disminuir si es necesario en lugar de reaccionar en forma insuficiente y actuar demasiado tarde. La respuesta debe ser "no lamentarse" hacer las mejores decisiones posibles sobre la base de la mejor información y ciencia disponible en ese momento, pero no juzgar o criticar si la información posterior sugiere un curso de acción diferente. La respuesta temprana debe reconocer lo que se conoce y lo que no se conoce y mirar qué de las incógnitas se pueden estimar razonablemente con referencia a brotes anteriores, patógenos similares, informes y modelos tempranos, etc. La evaluación y respuesta de riesgo puede entonces ser modificada y refinada a medida que evoluciona la información sobre las incógnitas. Sin embargo, la clave de este enfoque es la confianza en que las decisiones no serán criticadas sobre la base de información que no estaba disponible en ese momento. También es importante estar listo para cambiar decisiones cuando la información disponible cambie algo que tanto científicos como políticos En ese contexto, China no debe ser juzgada por aplicar lo que podría parecer medidas extremas, pero China también debe estar dispuesta a suspender las medidas rápidamente si las pruebas sugieren que no son la mejor manera de resolver el problema. Al cerrar los aeropuertos la propagación internacional de Wuhan puede disminuir, pero el éxito dependerá de la eficacia de las medidas realmente para detener a las personas que salen de la zona afectada, así como en el comportamiento del virus. Como siempre, sólo el tiempo dirá que el tiempo es escaso.

¿Cuánto tiempo se tardó en publicar la secuencia genómica completa de SARS-CoV-2 después de su identificación?

La respuesta nacional e internacional demuestra el complejo vínculo entre la salud pública, la ciencia y la política cuando un brote amenaza con afectar a las economías y la reputación mundiales. Las medidas sin precedentes implementadas en China son un intento audaz de controlar el brote – necesitamos entender su efectividad para equilibrar costos y beneficios para eventos similares en el futuro. Texto: El 29 de diciembre de 2019 los médicos en un hospital en la ciudad de Wuhan, China notó una agrupación de casos de neumonía inusual (con el primer caso identificado en ese momento el 12 de diciembre) con un vínculo aparente con un mercado que vende pescado vivo, aves de corral y animales al público. Este evento fue reportado a la Organización Mundial de la Salud (OMS) el 31 de diciembre [1]. En 4 semanas, para el 26 de enero de 2020, el organismo causal había sido identificado como un nuevo coronavirus, el genoma del virus había sido secuenciado y publicado, se habían desarrollado pruebas de reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa, el Blueprint de R&D de la OMS se había activado para acelerar el diagnóstico, la terapia y el desarrollo de vacunas y una vacuna candidata En la actualidad, las autoridades sanitarias chinas están construyendo un hospital de 1.000 camas en Wuhan en 10 días. Al 26 de enero, casi 50 millones de personas en Wuhan y ciudades vecinas habían sido efectivamente puestas en cuarentena, mientras que la OMS había determinado que el evento aún no debía ser declarado como una emergencia de salud pública de interés internacional (PHEIC) [2] y no había recomendado ninguna restricción de viaje específica. La OMS ha destacado la importancia de la detección de salida en los puertos de los países que muestran la transmisión del nuevo coronavirus y ha proporcionado orientación a los países que realizan la detección de entrada en los aeropuertos, reconociendo al mismo tiempo que la evidencia de la eficacia de la detección de entrada es equívoca. Esta respuesta es una de las respuestas mundiales más rápidas y coordinadas a una enfermedad infecciosa emergente que el mundo ha visto en tiempos modernos, pero ¿es la respuesta adecuada, será eficaz y sostenible? Según el informe de situación publicado por la OMS el 28 de enero de 2020 [3], se han notificado en todo el mundo un total de 2798 casos confirmados en 2019-nCoV; de estos, 2761 casos procedían de China, incluidos Hong Kong (8 casos), Macao (5) y Taipei (4). Se han notificado 37 casos confirmados fuera de China en once países de Europa, América del Norte, Australia y Asia; de estos 37 casos exportados, 36 tenían un historial de viaje desde China o un vínculo epidemiológico con un caso de China. De los casos confirmados en China, 461 se han notificado como gravemente enfermos, con 80 muertes hasta la fecha. Este brote y la respuesta a él ilustran algunas cuestiones clave sobre cómo la preparación y la capacidad de respuesta mundial a los brotes han evolucionado durante casi dos décadas desde la epidemia del síndrome respiratorio agudo grave (SARS) de 2002/3 y qué lecciones se han aprendido o no. También plantea preguntas sobre el impacto que estas lecciones han tenido en la forma en que los organismos y los gobiernos responden a estos eventos y sobre el papel de la OMS y el Reglamento Sanitario Internacional (RSI).Una de las lecciones críticas de la experiencia del SRAS fue la necesidad absoluta de poder coordinar los recursos internacionales disponibles en un brote y centrarlos en identificar prioridades y resolver problemas.La OMS estableció los medios para hacerlo y desde entonces se ha desarrollado e integrado en la preparación mundial, especialmente después de la epidemia de Ébola en África Occidental. Organizaciones como la Global Outbreak Alert and Response Network (GOARN), la Coalition for Epidemic Prepared Innovations (CEPI), la Global Research Collaboration for Infectious Disease Preparedness (GloPID-R) y la Global Initiative on Sharing All Influenza Data (GISAID) han sido apoyadas por el Plan de Investigación de la OMS y su Mecanismo Mundial de Coordinación para proporcionar un foro donde aquellos con la experiencia y capacidad para contribuir a la gestión de nuevas amenazas puedan reunirse entre brotes y durante éstos para desarrollar soluciones innovadoras a los problemas emergentes. Esta coordinación mundial ha estado activa en el nuevo brote de coronavirus. El sistema de respuesta de la OMS incluye tres grupos virtuales basados en los desarrollados para que el SARS reúna información en tiempo real para informar sobre directrices en tiempo real, y una primera vacuna candidata está lista para pruebas de laboratorio en el plazo de Hubo extensas críticas a China por su aparente falta de intercambio de información sobre la infección emergente por SARS lo suficientemente pronto en el brote como para permitir a los países prepararse y responder. Hubo preocupaciones similares sobre el intercambio de información como el síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS) surgió y evolucionó en Oriente Medio en 2012, particularmente en Arabia Saudita, y sobre la aparición del ébola en África Occidental en 2014. En esta ocasión el intercambio de información parece haber sido rápido y eficaz (al tiempo que se reconoce que la información disponible en las primeras etapas de un brote es siempre menor de lo que la comunidad mundial desearía). La OMS fue notificada de la agrupación original en cuestión de días y la secuencia genómica completa del nuevo virus se publicó menos de 2 semanas después de que el grupo se detectara por primera vez. La OMS ha expresado su satisfacción con las acciones de las autoridades chinas para compartir información con la OMS. El trabajo con periodistas y medios de comunicación para ayudarles a entender la ciencia y la epidemiología, particularmente en un evento en movimiento rápido, mejorará la comunicación del riesgo al público y reducirá las preocupaciones inapropiadas y el pánico.Si bien la información de este brote muestra signos de los esfuerzos de epidemiólogos, expertos en enfermedades infecciosas, agencias de salud pública nacionales e internacionales y otros que trabajan con periodistas, también hay indicios de que esto no está logrando su objetivo.Por ejemplo, la percepción pública es que el aumento en el número de casos reportados diariamente por las autoridades chinas representa una escalada diaria de la epidemia, mientras que la realidad es que estas cifras son también el resultado de la búsqueda activa, agresiva, de casos en China y algunos de estos casos son casos "viejos" recientemente reconocidos como debido al coronavirus novedoso. Del mismo modo, el virus suele ser descrito por los medios de comunicación como "muerto" y aunque esto es cierto en el sentido de que ha causado muertes, los matices de las tasas de mortalidad de casos inciertos en las primeras etapas de un brote no se están comunicando. La tasa estimada actual de mortalidad de casos parece ser de alrededor del 3%, lo que es significativo pero no comparable a la tasa del 10% para el SARS o el 34% reportada para el MERS. Estas percepciones erróneas siguen impulsando la ansiedad pública. Para complementar los mecanismos formales de información entre los países y con la OMS (incluyendo el IHR), el uso de mecanismos informales como los informes de medios de comunicación y redes sociales fue defendido a la luz de la experiencia del SARS. Actualmente hay varios sistemas mundiales que proporcionan información recopilada de informes informales, incluyendo redes de expertos y escaneo de medios de comunicación y medios sociales.Estos contribuyen, amplifican, inteligencia epidémica y se están El valor se deriva de que se han detectado indicios tempranos de casos más allá de la ciudad de brote inicial y que pueden complementar la evaluación global del riesgo y el seguimiento de la evolución del brote.Los desafíos radican en el volumen y la diversidad de la información disponible y la relativa falta de mecanismos de verificación, de modo que uno de estos sistemas (ProMed) ha comentado que cada vez es más difícil asimilar la información que se suministra [4] y hacer interpretaciones significativas.Al principio del brote se informó que los trabajadores de la salud no habían sido infectados, lo que fue tranquilizador porque son los trabajadores de la salud quienes muchas veces, e inadvertidamente, amplifican la transmisión.La falta de lavado de manos entre los pacientes, por ejemplo, puede resultar no sólo en autoinfección, sino también en infección de pacientes hospitalizados por otras causas cuando prestan atención.La autoinfección no es sólo un riesgo para el trabajador de la salud, sino también para sus familias Una característica del brote de SARS fue la variabilidad de la transmisibilidad entre los casos y la ocurrencia de "acontecimientos superdifundidos" cuando un caso infectado significativamente más contactos que el promedio. Esto también se vio con el MERS en el brote en la República de Corea (RoK). En este nuevo brote de coronavirus no se han documentado tales eventos superdifundidos, pero la epidemiología todavía no está clara. Confirmar si esto está ocurriendo o no debe ser una tarea urgente para la investigación china. Los modeladores han sugerido tasas de reproducción (R 0 ) de 3,8 (intervalo de confianza del 95%, 3,6-4.0) [5] y 2.6 (1.5-3.5) [6] ; R 0 para SARS se estimó en alrededor de 3 en ausencia de medidas de control [7]. El impacto económico de los brotes mayores puede ser sustancial para el país afectado. Esto se vio claramente en el SARS, el MERS en RoK y el Ébola en África Occidental. Un analista estima que el impacto probable del actual brote de coronavirus oscilará entre un recorte del 0,8% al PIB real si la epidemia se controla en un plazo de 3 meses, y un costo del 1,9% al PIB si la epidemia dura 9 meses [8]. Esto puede aumentar sustancialmente a la luz de las restricciones ampliadas a la circulación, y por lo tanto al comercio, dentro de China. La aparición de una enfermedad respiratoria significativa vinculada a un nuevo coronavirus representa una prueba de la capacidad mundial para detectar y controlar las amenazas de enfermedades emergentes. Su aparición en China añade una dimensión adicional a la luz de la experiencia previa con el SARS. El calendario del brote inmediatamente antes del Año Nuevo Lunar Chino con sus movimientos de población concomitantes añade riesgo y urgencia adicionales a la respuesta. El rápido intercambio de información sobre este brote y la rapidez de la respuesta coordinada tanto en el país como en el plano internacional indican que se han aprendido lecciones del SARS que mejoran la capacidad mundial. Las redes y foros internacionales que ahora existen han facilitado la reunión de expertos de todo el mundo para centrar los esfuerzos de investigación y desarrollo y maximizar el impacto. En esta fase inicial de la información sobre los brotes sigue siendo incompleta y aún no se han respondido preguntas clínicas y epidemiológicas clave, pero el déficit parece deberse más a las limitaciones de investigar una enfermedad emergente que a la falta de voluntad de participar y compartir información con los asociados. Hay algunos indicios de esferas en las que es necesario seguir mejorando. La respuesta de los medios de comunicación mundiales a los acontecimientos que se están produciendo ha sido relativamente equilibrada e informada, pero los matices de la evolución de la situación no se han examinado críticamente en colaboración con los medios de comunicación y, por consiguiente, la percepción pública del riesgo puede exagerarse, La falta de apreciación de las incertidumbres en la determinación de una tasa significativa de mortalidad de los casos y la importancia del sesgo de determinación al comienzo de un brote, junto con el impacto de la búsqueda agresiva de casos en los números de los casos, son ejemplos de lo que podría mejorarse la comprensión. Esto es siempre un proceso difícil a la hora de equilibrar los recursos centrados en el análisis de la situación sobre el terreno con los recursos destinados a interpretar la información para los periodistas, pero en el SRAS, se observó que la R 0 disminuyó en respuesta a la información que llega al público y al público y luego adoptó medidas de reducción de riesgos [6] ; por lo tanto, una comunicación pública precisa sobre el riesgo es fundamental para el éxito. Sería útil encontrar un foro en el que esto pueda explorarse con la comunidad de medios después del evento. El aumento del acceso a la información temprana de diversas fuentes, incluidos los medios de comunicación y los medios sociales, añade una dimensión Cuando, como se ha visto en este brote, el volumen de información que llega excede cualquier capacidad para recopilarla y analizarla y tratar de hacer referencias cruzadas y verificar elementos separados, existe el riesgo de que la información alimente la especulación y los medios de comunicación y la preocupación pública.De nuevo existe un buen equilibrio entre la información que fomenta acciones adecuadas de evitación de riesgos y la información que fomenta acciones inapropiadas; sin embargo, la salud pública suele estar mejor al servicio de más información en lugar de menos.El papel de una declaración de un PHEIC en la gestión de un brote grave ha sido cuestionado a la luz del Ébola en África Occidental y en la República Democrática del Congo [9] y ha sido cuestionada nuevamente con este brote.El carácter binario de una declaración de PHEIC (ya sea un evento que es un PHEIC o no hay opciones intermedias) y la especificidad de los tres criterios definidos para un PHEIC han causado dificultad La falta de una comprensión clara de lo que se pretende lograr con una declaración del PHEIC se suma a las dificultades del Comité de Emergencia, al igual que la relativa escasez de respuestas clínicas y epidemiológicas en esta etapa de la investigación.En este caso, el Comité de Emergencias se dividió al llegar a una conclusión, pero decidió en equilibrio que la situación actual, aunque sea una emergencia, no debería ser declarada aún como un PHEIC [2].Como en el caso del Ébola en la RDC, se ha criticado a la OMS por esta decisión, pero, como en el caso del Ébola, no está claro de inmediato qué sería diferente en la respuesta si se declarase un PHEIC.La OMS está trabajando para mejorar la forma en que los Comités de Emergencia desarrollan su asesoramiento para el Director General, pero, como recomendó este Comité de Emergencias y el Comité de Revisión del IHR en 2015, el desarrollo de una alerta intermedia junto con el proceso de Una función clave de una declaración del PHEIC es que es la (única) puerta de entrada a las Recomendaciones Temporales de la OMS sobre posibles restricciones de viaje y comercio para limitar la propagación internacional de una enfermedad.En este caso, varios países del mundo ya habían implementado el control de entrada en los aeropuertos y China había comenzado a cerrar los viajes internacionales desde Wuhan antes de que el Comité de Emergencia hubiera terminado sus deliberaciones.Si bien la OMS no interferiría, ni podría interferir, en las decisiones soberanas de los Estados miembros, la falta de influencia en las decisiones de viaje y comercio podría resultar problemática.Además de la rapidez de la respuesta en este brote, hemos visto cambios dramáticos en la escala de la respuesta.La imposición de medidas de cuarentena muy extensas a millones de personas como un intento de romper la transmisión del virus no tiene precedentes.No sabemos si serán eficaces; de hecho, no sabemos cómo determinar si han sido eficaces. Si se confirman las recientes sugerencias de que las personas infectadas con este coronavirus pueden ser infecciosas durante la incubación o asintomáticas, y los informes de que hasta 5 m de personas abandonaron Wuhan antes de que se impusieran las restricciones de viaje, la eficacia de estas medidas de control será más cuestionada. Dado el probable impacto en al menos la economía china y probablemente la economía mundial, será importante entender el papel y la eficacia de las medidas de salud pública en esta escala para el futuro. Sin embargo, la imposición de estas dramáticas medidas también plantea una cuestión más amplia: si hay un impacto de estas medidas, ¿qué otros países (o podrían) implementar tales medidas? ¿Aceptarían otros países el daño económico autoimpuesto que China ha aceptado tratar de contener este brote? ¿Es razonable considerar que los gobiernos nacionales cerrarían el transporte público hacia y desde Londres, Nueva York o París en la semana anterior a Navidad, incluso si se demostrara que es Estas decisiones y preguntas cruzan la interfaz entre la salud pública, la ciencia y la política.La respuesta a este brote en China fue inevitablemente influenciada por la reacción histórica a la respuesta del país al SARS y la sospecha del mundo de la falta de cooperación de China en ese momento.La respuesta actual se enmarca, por lo tanto, en un contexto de no querer que se vea que se comportan de la misma manera con este evento.Esto puede indicar otro impacto de la experiencia del SARS (y el MERS y el Ébola) en la respuesta a los brotes posteriores. En la respuesta de emergencia, generalmente es mejor reaccionar de forma exagerada y luego disminuir si es necesario en lugar de reaccionar en forma insuficiente y actuar demasiado tarde. La respuesta debe ser "no lamentarse" hacer las mejores decisiones posibles sobre la base de la mejor información y ciencia disponible en ese momento, pero no juzgar o criticar si la información posterior sugiere un curso de acción diferente. La respuesta temprana debe reconocer lo que se conoce y lo que no se conoce y mirar qué de las incógnitas se pueden estimar razonablemente con referencia a brotes anteriores, patógenos similares, informes y modelos tempranos, etc. La evaluación y respuesta de riesgo puede entonces ser modificada y refinada a medida que evoluciona la información sobre las incógnitas. Sin embargo, la clave de este enfoque es la confianza en que las decisiones no serán criticadas sobre la base de información que no estaba disponible en ese momento. También es importante estar listo para cambiar decisiones cuando la información disponible cambie algo que tanto científicos como políticos En ese contexto, China no debe ser juzgada por aplicar lo que podría parecer medidas extremas, pero China también debe estar dispuesta a suspender las medidas rápidamente si las pruebas sugieren que no son la mejor manera de resolver el problema. Al cerrar los aeropuertos la propagación internacional de Wuhan puede disminuir, pero el éxito dependerá de la eficacia de las medidas realmente para detener a las personas que salen de la zona afectada, así como en el comportamiento del virus. Como siempre, sólo el tiempo dirá que el tiempo es escaso.

¿Cuál fue la tasa de mortalidad de SARS-CoV?

La respuesta nacional e internacional demuestra el complejo vínculo entre la salud pública, la ciencia y la política cuando un brote amenaza con afectar a las economías y la reputación mundiales. Las medidas sin precedentes implementadas en China son un intento audaz de controlar el brote – necesitamos entender su efectividad para equilibrar costos y beneficios para eventos similares en el futuro. Texto: El 29 de diciembre de 2019 los médicos en un hospital en la ciudad de Wuhan, China notó una agrupación de casos de neumonía inusual (con el primer caso identificado en ese momento el 12 de diciembre) con un vínculo aparente con un mercado que vende pescado vivo, aves de corral y animales al público. Este evento fue reportado a la Organización Mundial de la Salud (OMS) el 31 de diciembre [1]. En 4 semanas, para el 26 de enero de 2020, el organismo causal había sido identificado como un nuevo coronavirus, el genoma del virus había sido secuenciado y publicado, se habían desarrollado pruebas de reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa, el Blueprint de R&D de la OMS se había activado para acelerar el diagnóstico, la terapia y el desarrollo de vacunas y una vacuna candidata En la actualidad, las autoridades sanitarias chinas están construyendo un hospital de 1.000 camas en Wuhan en 10 días. Al 26 de enero, casi 50 millones de personas en Wuhan y ciudades vecinas habían sido efectivamente puestas en cuarentena, mientras que la OMS había determinado que el evento aún no debía ser declarado como una emergencia de salud pública de interés internacional (PHEIC) [2] y no había recomendado ninguna restricción de viaje específica. La OMS ha destacado la importancia de la detección de salida en los puertos de los países que muestran la transmisión del nuevo coronavirus y ha proporcionado orientación a los países que realizan la detección de entrada en los aeropuertos, reconociendo al mismo tiempo que la evidencia de la eficacia de la detección de entrada es equívoca. Esta respuesta es una de las respuestas mundiales más rápidas y coordinadas a una enfermedad infecciosa emergente que el mundo ha visto en tiempos modernos, pero ¿es la respuesta adecuada, será eficaz y sostenible? Según el informe de situación publicado por la OMS el 28 de enero de 2020 [3], se han notificado en todo el mundo un total de 2798 casos confirmados en 2019-nCoV; de estos, 2761 casos procedían de China, incluidos Hong Kong (8 casos), Macao (5) y Taipei (4). Se han notificado 37 casos confirmados fuera de China en once países de Europa, América del Norte, Australia y Asia; de estos 37 casos exportados, 36 tenían un historial de viaje desde China o un vínculo epidemiológico con un caso de China. De los casos confirmados en China, 461 se han notificado como gravemente enfermos, con 80 muertes hasta la fecha. Este brote y la respuesta a él ilustran algunas cuestiones clave sobre cómo la preparación y la capacidad de respuesta mundial a los brotes han evolucionado durante casi dos décadas desde la epidemia del síndrome respiratorio agudo grave (SARS) de 2002/3 y qué lecciones se han aprendido o no. También plantea preguntas sobre el impacto que estas lecciones han tenido en la forma en que los organismos y los gobiernos responden a estos eventos y sobre el papel de la OMS y el Reglamento Sanitario Internacional (RSI).Una de las lecciones críticas de la experiencia del SRAS fue la necesidad absoluta de poder coordinar los recursos internacionales disponibles en un brote y centrarlos en identificar prioridades y resolver problemas.La OMS estableció los medios para hacerlo y desde entonces se ha desarrollado e integrado en la preparación mundial, especialmente después de la epidemia de Ébola en África Occidental. Organizaciones como la Global Outbreak Alert and Response Network (GOARN), la Coalition for Epidemic Prepared Innovations (CEPI), la Global Research Collaboration for Infectious Disease Preparedness (GloPID-R) y la Global Initiative on Sharing All Influenza Data (GISAID) han sido apoyadas por el Plan de Investigación de la OMS y su Mecanismo Mundial de Coordinación para proporcionar un foro donde aquellos con la experiencia y capacidad para contribuir a la gestión de nuevas amenazas puedan reunirse entre brotes y durante éstos para desarrollar soluciones innovadoras a los problemas emergentes. Esta coordinación mundial ha estado activa en el nuevo brote de coronavirus. El sistema de respuesta de la OMS incluye tres grupos virtuales basados en los desarrollados para que el SARS reúna información en tiempo real para informar sobre directrices en tiempo real, y una primera vacuna candidata está lista para pruebas de laboratorio en el plazo de Hubo extensas críticas a China por su aparente falta de intercambio de información sobre la infección emergente por SARS lo suficientemente pronto en el brote como para permitir a los países prepararse y responder. Hubo preocupaciones similares sobre el intercambio de información como el síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS) surgió y evolucionó en Oriente Medio en 2012, particularmente en Arabia Saudita, y sobre la aparición del ébola en África Occidental en 2014. En esta ocasión el intercambio de información parece haber sido rápido y eficaz (al tiempo que se reconoce que la información disponible en las primeras etapas de un brote es siempre menor de lo que la comunidad mundial desearía). La OMS fue notificada de la agrupación original en cuestión de días y la secuencia genómica completa del nuevo virus se publicó menos de 2 semanas después de que el grupo se detectara por primera vez. La OMS ha expresado su satisfacción con las acciones de las autoridades chinas para compartir información con la OMS. El trabajo con periodistas y medios de comunicación para ayudarles a entender la ciencia y la epidemiología, particularmente en un evento en movimiento rápido, mejorará la comunicación del riesgo al público y reducirá las preocupaciones inapropiadas y el pánico.Si bien la información de este brote muestra signos de los esfuerzos de epidemiólogos, expertos en enfermedades infecciosas, agencias de salud pública nacionales e internacionales y otros que trabajan con periodistas, también hay indicios de que esto no está logrando su objetivo.Por ejemplo, la percepción pública es que el aumento en el número de casos reportados diariamente por las autoridades chinas representa una escalada diaria de la epidemia, mientras que la realidad es que estas cifras son también el resultado de la búsqueda activa, agresiva, de casos en China y algunos de estos casos son casos "viejos" recientemente reconocidos como debido al coronavirus novedoso. Del mismo modo, el virus suele ser descrito por los medios de comunicación como "muerto" y aunque esto es cierto en el sentido de que ha causado muertes, los matices de las tasas de mortalidad de casos inciertos en las primeras etapas de un brote no se están comunicando. La tasa estimada actual de mortalidad de casos parece ser de alrededor del 3%, lo que es significativo pero no comparable a la tasa del 10% para el SARS o el 34% reportada para el MERS. Estas percepciones erróneas siguen impulsando la ansiedad pública. Para complementar los mecanismos formales de información entre los países y con la OMS (incluyendo el IHR), el uso de mecanismos informales como los informes de medios de comunicación y redes sociales fue defendido a la luz de la experiencia del SARS. Actualmente hay varios sistemas mundiales que proporcionan información recopilada de informes informales, incluyendo redes de expertos y escaneo de medios de comunicación y medios sociales.Estos contribuyen, amplifican, inteligencia epidémica y se están El valor se deriva de que se han detectado indicios tempranos de casos más allá de la ciudad de brote inicial y que pueden complementar la evaluación global del riesgo y el seguimiento de la evolución del brote.Los desafíos radican en el volumen y la diversidad de la información disponible y la relativa falta de mecanismos de verificación, de modo que uno de estos sistemas (ProMed) ha comentado que cada vez es más difícil asimilar la información que se suministra [4] y hacer interpretaciones significativas.Al principio del brote se informó que los trabajadores de la salud no habían sido infectados, lo que fue tranquilizador porque son los trabajadores de la salud quienes muchas veces, e inadvertidamente, amplifican la transmisión.La falta de lavado de manos entre los pacientes, por ejemplo, puede resultar no sólo en autoinfección, sino también en infección de pacientes hospitalizados por otras causas cuando prestan atención.La autoinfección no es sólo un riesgo para el trabajador de la salud, sino también para sus familias Una característica del brote de SARS fue la variabilidad de la transmisibilidad entre los casos y la ocurrencia de "acontecimientos superdifundidos" cuando un caso infectado significativamente más contactos que el promedio. Esto también se vio con el MERS en el brote en la República de Corea (RoK). En este nuevo brote de coronavirus no se han documentado tales eventos superdifundidos, pero la epidemiología todavía no está clara. Confirmar si esto está ocurriendo o no debe ser una tarea urgente para la investigación china. Los modeladores han sugerido tasas de reproducción (R 0 ) de 3,8 (intervalo de confianza del 95%, 3,6-4.0) [5] y 2.6 (1.5-3.5) [6] ; R 0 para SARS se estimó en alrededor de 3 en ausencia de medidas de control [7]. El impacto económico de los brotes mayores puede ser sustancial para el país afectado. Esto se vio claramente en el SARS, el MERS en RoK y el Ébola en África Occidental. Un analista estima que el impacto probable del actual brote de coronavirus oscilará entre un recorte del 0,8% al PIB real si la epidemia se controla en un plazo de 3 meses, y un costo del 1,9% al PIB si la epidemia dura 9 meses [8]. Esto puede aumentar sustancialmente a la luz de las restricciones ampliadas a la circulación, y por lo tanto al comercio, dentro de China. La aparición de una enfermedad respiratoria significativa vinculada a un nuevo coronavirus representa una prueba de la capacidad mundial para detectar y controlar las amenazas de enfermedades emergentes. Su aparición en China añade una dimensión adicional a la luz de la experiencia previa con el SARS. El calendario del brote inmediatamente antes del Año Nuevo Lunar Chino con sus movimientos de población concomitantes añade riesgo y urgencia adicionales a la respuesta. El rápido intercambio de información sobre este brote y la rapidez de la respuesta coordinada tanto en el país como en el plano internacional indican que se han aprendido lecciones del SARS que mejoran la capacidad mundial. Las redes y foros internacionales que ahora existen han facilitado la reunión de expertos de todo el mundo para centrar los esfuerzos de investigación y desarrollo y maximizar el impacto. En esta fase inicial de la información sobre los brotes sigue siendo incompleta y aún no se han respondido preguntas clínicas y epidemiológicas clave, pero el déficit parece deberse más a las limitaciones de investigar una enfermedad emergente que a la falta de voluntad de participar y compartir información con los asociados. Hay algunos indicios de esferas en las que es necesario seguir mejorando. La respuesta de los medios de comunicación mundiales a los acontecimientos que se están produciendo ha sido relativamente equilibrada e informada, pero los matices de la evolución de la situación no se han examinado críticamente en colaboración con los medios de comunicación y, por consiguiente, la percepción pública del riesgo puede exagerarse, La falta de apreciación de las incertidumbres en la determinación de una tasa significativa de mortalidad de los casos y la importancia del sesgo de determinación al comienzo de un brote, junto con el impacto de la búsqueda agresiva de casos en los números de los casos, son ejemplos de lo que podría mejorarse la comprensión. Esto es siempre un proceso difícil a la hora de equilibrar los recursos centrados en el análisis de la situación sobre el terreno con los recursos destinados a interpretar la información para los periodistas, pero en el SRAS, se observó que la R 0 disminuyó en respuesta a la información que llega al público y al público y luego adoptó medidas de reducción de riesgos [6] ; por lo tanto, una comunicación pública precisa sobre el riesgo es fundamental para el éxito. Sería útil encontrar un foro en el que esto pueda explorarse con la comunidad de medios después del evento. El aumento del acceso a la información temprana de diversas fuentes, incluidos los medios de comunicación y los medios sociales, añade una dimensión Cuando, como se ha visto en este brote, el volumen de información que llega excede cualquier capacidad para recopilarla y analizarla y tratar de hacer referencias cruzadas y verificar elementos separados, existe el riesgo de que la información alimente la especulación y los medios de comunicación y la preocupación pública.De nuevo existe un buen equilibrio entre la información que fomenta acciones adecuadas de evitación de riesgos y la información que fomenta acciones inapropiadas; sin embargo, la salud pública suele estar mejor al servicio de más información en lugar de menos.El papel de una declaración de un PHEIC en la gestión de un brote grave ha sido cuestionado a la luz del Ébola en África Occidental y en la República Democrática del Congo [9] y ha sido cuestionada nuevamente con este brote.El carácter binario de una declaración de PHEIC (ya sea un evento que es un PHEIC o no hay opciones intermedias) y la especificidad de los tres criterios definidos para un PHEIC han causado dificultad La falta de una comprensión clara de lo que se pretende lograr con una declaración del PHEIC se suma a las dificultades del Comité de Emergencia, al igual que la relativa escasez de respuestas clínicas y epidemiológicas en esta etapa de la investigación.En este caso, el Comité de Emergencias se dividió al llegar a una conclusión, pero decidió en equilibrio que la situación actual, aunque sea una emergencia, no debería ser declarada aún como un PHEIC [2].Como en el caso del Ébola en la RDC, se ha criticado a la OMS por esta decisión, pero, como en el caso del Ébola, no está claro de inmediato qué sería diferente en la respuesta si se declarase un PHEIC.La OMS está trabajando para mejorar la forma en que los Comités de Emergencia desarrollan su asesoramiento para el Director General, pero, como recomendó este Comité de Emergencias y el Comité de Revisión del IHR en 2015, el desarrollo de una alerta intermedia junto con el proceso de Una función clave de una declaración del PHEIC es que es la (única) puerta de entrada a las Recomendaciones Temporales de la OMS sobre posibles restricciones de viaje y comercio para limitar la propagación internacional de una enfermedad.En este caso, varios países del mundo ya habían implementado el control de entrada en los aeropuertos y China había comenzado a cerrar los viajes internacionales desde Wuhan antes de que el Comité de Emergencia hubiera terminado sus deliberaciones.Si bien la OMS no interferiría, ni podría interferir, en las decisiones soberanas de los Estados miembros, la falta de influencia en las decisiones de viaje y comercio podría resultar problemática.Además de la rapidez de la respuesta en este brote, hemos visto cambios dramáticos en la escala de la respuesta.La imposición de medidas de cuarentena muy extensas a millones de personas como un intento de romper la transmisión del virus no tiene precedentes.No sabemos si serán eficaces; de hecho, no sabemos cómo determinar si han sido eficaces. Si se confirman las recientes sugerencias de que las personas infectadas con este coronavirus pueden ser infecciosas durante la incubación o asintomáticas, y los informes de que hasta 5 m de personas abandonaron Wuhan antes de que se impusieran las restricciones de viaje, la eficacia de estas medidas de control será más cuestionada. Dado el probable impacto en al menos la economía china y probablemente la economía mundial, será importante entender el papel y la eficacia de las medidas de salud pública en esta escala para el futuro. Sin embargo, la imposición de estas dramáticas medidas también plantea una cuestión más amplia: si hay un impacto de estas medidas, ¿qué otros países (o podrían) implementar tales medidas? ¿Aceptarían otros países el daño económico autoimpuesto que China ha aceptado tratar de contener este brote? ¿Es razonable considerar que los gobiernos nacionales cerrarían el transporte público hacia y desde Londres, Nueva York o París en la semana anterior a Navidad, incluso si se demostrara que es Estas decisiones y preguntas cruzan la interfaz entre la salud pública, la ciencia y la política.La respuesta a este brote en China fue inevitablemente influenciada por la reacción histórica a la respuesta del país al SARS y la sospecha del mundo de la falta de cooperación de China en ese momento.La respuesta actual se enmarca, por lo tanto, en un contexto de no querer que se vea que se comportan de la misma manera con este evento.Esto puede indicar otro impacto de la experiencia del SARS (y el MERS y el Ébola) en la respuesta a los brotes posteriores. En la respuesta de emergencia, generalmente es mejor reaccionar de forma exagerada y luego disminuir si es necesario en lugar de reaccionar en forma insuficiente y actuar demasiado tarde. La respuesta debe ser "no lamentarse" hacer las mejores decisiones posibles sobre la base de la mejor información y ciencia disponible en ese momento, pero no juzgar o criticar si la información posterior sugiere un curso de acción diferente. La respuesta temprana debe reconocer lo que se conoce y lo que no se conoce y mirar qué de las incógnitas se pueden estimar razonablemente con referencia a brotes anteriores, patógenos similares, informes y modelos tempranos, etc. La evaluación y respuesta de riesgo puede entonces ser modificada y refinada a medida que evoluciona la información sobre las incógnitas. Sin embargo, la clave de este enfoque es la confianza en que las decisiones no serán criticadas sobre la base de información que no estaba disponible en ese momento. También es importante estar listo para cambiar decisiones cuando la información disponible cambie algo que tanto científicos como políticos En ese contexto, China no debe ser juzgada por aplicar lo que podría parecer medidas extremas, pero China también debe estar dispuesta a suspender las medidas rápidamente si las pruebas sugieren que no son la mejor manera de resolver el problema. Al cerrar los aeropuertos la propagación internacional de Wuhan puede disminuir, pero el éxito dependerá de la eficacia de las medidas realmente para detener a las personas que salen de la zona afectada, así como en el comportamiento del virus. Como siempre, sólo el tiempo dirá que el tiempo es escaso.

¿Cuál fue la tasa de mortalidad de MERS?

La respuesta nacional e internacional demuestra el complejo vínculo entre la salud pública, la ciencia y la política cuando un brote amenaza con afectar a las economías y la reputación mundiales. Las medidas sin precedentes implementadas en China son un intento audaz de controlar el brote – necesitamos entender su efectividad para equilibrar costos y beneficios para eventos similares en el futuro. Texto: El 29 de diciembre de 2019 los médicos en un hospital en la ciudad de Wuhan, China notó una agrupación de casos de neumonía inusual (con el primer caso identificado en ese momento el 12 de diciembre) con un vínculo aparente con un mercado que vende pescado vivo, aves de corral y animales al público. Este evento fue reportado a la Organización Mundial de la Salud (OMS) el 31 de diciembre [1]. En 4 semanas, para el 26 de enero de 2020, el organismo causal había sido identificado como un nuevo coronavirus, el genoma del virus había sido secuenciado y publicado, se habían desarrollado pruebas de reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa, el Blueprint de R&D de la OMS se había activado para acelerar el diagnóstico, la terapia y el desarrollo de vacunas y una vacuna candidata En la actualidad, las autoridades sanitarias chinas están construyendo un hospital de 1.000 camas en Wuhan en 10 días. Al 26 de enero, casi 50 millones de personas en Wuhan y ciudades vecinas habían sido efectivamente puestas en cuarentena, mientras que la OMS había determinado que el evento aún no debía ser declarado como una emergencia de salud pública de interés internacional (PHEIC) [2] y no había recomendado ninguna restricción de viaje específica. La OMS ha destacado la importancia de la detección de salida en los puertos de los países que muestran la transmisión del nuevo coronavirus y ha proporcionado orientación a los países que realizan la detección de entrada en los aeropuertos, reconociendo al mismo tiempo que la evidencia de la eficacia de la detección de entrada es equívoca. Esta respuesta es una de las respuestas mundiales más rápidas y coordinadas a una enfermedad infecciosa emergente que el mundo ha visto en tiempos modernos, pero ¿es la respuesta adecuada, será eficaz y sostenible? Según el informe de situación publicado por la OMS el 28 de enero de 2020 [3], se han notificado en todo el mundo un total de 2798 casos confirmados en 2019-nCoV; de estos, 2761 casos procedían de China, incluidos Hong Kong (8 casos), Macao (5) y Taipei (4). Se han notificado 37 casos confirmados fuera de China en once países de Europa, América del Norte, Australia y Asia; de estos 37 casos exportados, 36 tenían un historial de viaje desde China o un vínculo epidemiológico con un caso de China. De los casos confirmados en China, 461 se han notificado como gravemente enfermos, con 80 muertes hasta la fecha. Este brote y la respuesta a él ilustran algunas cuestiones clave sobre cómo la preparación y la capacidad de respuesta mundial a los brotes han evolucionado durante casi dos décadas desde la epidemia del síndrome respiratorio agudo grave (SARS) de 2002/3 y qué lecciones se han aprendido o no. También plantea preguntas sobre el impacto que estas lecciones han tenido en la forma en que los organismos y los gobiernos responden a estos eventos y sobre el papel de la OMS y el Reglamento Sanitario Internacional (RSI).Una de las lecciones críticas de la experiencia del SRAS fue la necesidad absoluta de poder coordinar los recursos internacionales disponibles en un brote y centrarlos en identificar prioridades y resolver problemas.La OMS estableció los medios para hacerlo y desde entonces se ha desarrollado e integrado en la preparación mundial, especialmente después de la epidemia de Ébola en África Occidental. Organizaciones como la Global Outbreak Alert and Response Network (GOARN), la Coalition for Epidemic Prepared Innovations (CEPI), la Global Research Collaboration for Infectious Disease Preparedness (GloPID-R) y la Global Initiative on Sharing All Influenza Data (GISAID) han sido apoyadas por el Plan de Investigación de la OMS y su Mecanismo Mundial de Coordinación para proporcionar un foro donde aquellos con la experiencia y capacidad para contribuir a la gestión de nuevas amenazas puedan reunirse entre brotes y durante éstos para desarrollar soluciones innovadoras a los problemas emergentes. Esta coordinación mundial ha estado activa en el nuevo brote de coronavirus. El sistema de respuesta de la OMS incluye tres grupos virtuales basados en los desarrollados para que el SARS reúna información en tiempo real para informar sobre directrices en tiempo real, y una primera vacuna candidata está lista para pruebas de laboratorio en el plazo de Hubo extensas críticas a China por su aparente falta de intercambio de información sobre la infección emergente por SARS lo suficientemente pronto en el brote como para permitir a los países prepararse y responder. Hubo preocupaciones similares sobre el intercambio de información como el síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS) surgió y evolucionó en Oriente Medio en 2012, particularmente en Arabia Saudita, y sobre la aparición del ébola en África Occidental en 2014. En esta ocasión el intercambio de información parece haber sido rápido y eficaz (al tiempo que se reconoce que la información disponible en las primeras etapas de un brote es siempre menor de lo que la comunidad mundial desearía). La OMS fue notificada de la agrupación original en cuestión de días y la secuencia genómica completa del nuevo virus se publicó menos de 2 semanas después de que el grupo se detectara por primera vez. La OMS ha expresado su satisfacción con las acciones de las autoridades chinas para compartir información con la OMS. El trabajo con periodistas y medios de comunicación para ayudarles a entender la ciencia y la epidemiología, particularmente en un evento en movimiento rápido, mejorará la comunicación del riesgo al público y reducirá las preocupaciones inapropiadas y el pánico.Si bien la información de este brote muestra signos de los esfuerzos de epidemiólogos, expertos en enfermedades infecciosas, agencias de salud pública nacionales e internacionales y otros que trabajan con periodistas, también hay indicios de que esto no está logrando su objetivo.Por ejemplo, la percepción pública es que el aumento en el número de casos reportados diariamente por las autoridades chinas representa una escalada diaria de la epidemia, mientras que la realidad es que estas cifras son también el resultado de la búsqueda activa, agresiva, de casos en China y algunos de estos casos son casos "viejos" recientemente reconocidos como debido al coronavirus novedoso. Del mismo modo, el virus suele ser descrito por los medios de comunicación como "muerto" y aunque esto es cierto en el sentido de que ha causado muertes, los matices de las tasas de mortalidad de casos inciertos en las primeras etapas de un brote no se están comunicando. La tasa estimada actual de mortalidad de casos parece ser de alrededor del 3%, lo que es significativo pero no comparable a la tasa del 10% para el SARS o el 34% reportada para el MERS. Estas percepciones erróneas siguen impulsando la ansiedad pública. Para complementar los mecanismos formales de información entre los países y con la OMS (incluyendo el IHR), el uso de mecanismos informales como los informes de medios de comunicación y redes sociales fue defendido a la luz de la experiencia del SARS. Actualmente hay varios sistemas mundiales que proporcionan información recopilada de informes informales, incluyendo redes de expertos y escaneo de medios de comunicación y medios sociales.Estos contribuyen, amplifican, inteligencia epidémica y se están El valor se deriva de que se han detectado indicios tempranos de casos más allá de la ciudad de brote inicial y que pueden complementar la evaluación global del riesgo y el seguimiento de la evolución del brote.Los desafíos radican en el volumen y la diversidad de la información disponible y la relativa falta de mecanismos de verificación, de modo que uno de estos sistemas (ProMed) ha comentado que cada vez es más difícil asimilar la información que se suministra [4] y hacer interpretaciones significativas.Al principio del brote se informó que los trabajadores de la salud no habían sido infectados, lo que fue tranquilizador porque son los trabajadores de la salud quienes muchas veces, e inadvertidamente, amplifican la transmisión.La falta de lavado de manos entre los pacientes, por ejemplo, puede resultar no sólo en autoinfección, sino también en infección de pacientes hospitalizados por otras causas cuando prestan atención.La autoinfección no es sólo un riesgo para el trabajador de la salud, sino también para sus familias Una característica del brote de SARS fue la variabilidad de la transmisibilidad entre los casos y la ocurrencia de "acontecimientos superdifundidos" cuando un caso infectado significativamente más contactos que el promedio. Esto también se vio con el MERS en el brote en la República de Corea (RoK). En este nuevo brote de coronavirus no se han documentado tales eventos superdifundidos, pero la epidemiología todavía no está clara. Confirmar si esto está ocurriendo o no debe ser una tarea urgente para la investigación china. Los modeladores han sugerido tasas de reproducción (R 0 ) de 3,8 (intervalo de confianza del 95%, 3,6-4.0) [5] y 2.6 (1.5-3.5) [6] ; R 0 para SARS se estimó en alrededor de 3 en ausencia de medidas de control [7]. El impacto económico de los brotes mayores puede ser sustancial para el país afectado. Esto se vio claramente en el SARS, el MERS en RoK y el Ébola en África Occidental. Un analista estima que el impacto probable del actual brote de coronavirus oscilará entre un recorte del 0,8% al PIB real si la epidemia se controla en un plazo de 3 meses, y un costo del 1,9% al PIB si la epidemia dura 9 meses [8]. Esto puede aumentar sustancialmente a la luz de las restricciones ampliadas a la circulación, y por lo tanto al comercio, dentro de China. La aparición de una enfermedad respiratoria significativa vinculada a un nuevo coronavirus representa una prueba de la capacidad mundial para detectar y controlar las amenazas de enfermedades emergentes. Su aparición en China añade una dimensión adicional a la luz de la experiencia previa con el SARS. El calendario del brote inmediatamente antes del Año Nuevo Lunar Chino con sus movimientos de población concomitantes añade riesgo y urgencia adicionales a la respuesta. El rápido intercambio de información sobre este brote y la rapidez de la respuesta coordinada tanto en el país como en el plano internacional indican que se han aprendido lecciones del SARS que mejoran la capacidad mundial. Las redes y foros internacionales que ahora existen han facilitado la reunión de expertos de todo el mundo para centrar los esfuerzos de investigación y desarrollo y maximizar el impacto. En esta fase inicial de la información sobre los brotes sigue siendo incompleta y aún no se han respondido preguntas clínicas y epidemiológicas clave, pero el déficit parece deberse más a las limitaciones de investigar una enfermedad emergente que a la falta de voluntad de participar y compartir información con los asociados. Hay algunos indicios de esferas en las que es necesario seguir mejorando. La respuesta de los medios de comunicación mundiales a los acontecimientos que se están produciendo ha sido relativamente equilibrada e informada, pero los matices de la evolución de la situación no se han examinado críticamente en colaboración con los medios de comunicación y, por consiguiente, la percepción pública del riesgo puede exagerarse, La falta de apreciación de las incertidumbres en la determinación de una tasa significativa de mortalidad de los casos y la importancia del sesgo de determinación al comienzo de un brote, junto con el impacto de la búsqueda agresiva de casos en los números de los casos, son ejemplos de lo que podría mejorarse la comprensión. Esto es siempre un proceso difícil a la hora de equilibrar los recursos centrados en el análisis de la situación sobre el terreno con los recursos destinados a interpretar la información para los periodistas, pero en el SRAS, se observó que la R 0 disminuyó en respuesta a la información que llega al público y al público y luego adoptó medidas de reducción de riesgos [6] ; por lo tanto, una comunicación pública precisa sobre el riesgo es fundamental para el éxito. Sería útil encontrar un foro en el que esto pueda explorarse con la comunidad de medios después del evento. El aumento del acceso a la información temprana de diversas fuentes, incluidos los medios de comunicación y los medios sociales, añade una dimensión Cuando, como se ha visto en este brote, el volumen de información que llega excede cualquier capacidad para recopilarla y analizarla y tratar de hacer referencias cruzadas y verificar elementos separados, existe el riesgo de que la información alimente la especulación y los medios de comunicación y la preocupación pública.De nuevo existe un buen equilibrio entre la información que fomenta acciones adecuadas de evitación de riesgos y la información que fomenta acciones inapropiadas; sin embargo, la salud pública suele estar mejor al servicio de más información en lugar de menos.El papel de una declaración de un PHEIC en la gestión de un brote grave ha sido cuestionado a la luz del Ébola en África Occidental y en la República Democrática del Congo [9] y ha sido cuestionada nuevamente con este brote.El carácter binario de una declaración de PHEIC (ya sea un evento que es un PHEIC o no hay opciones intermedias) y la especificidad de los tres criterios definidos para un PHEIC han causado dificultad La falta de una comprensión clara de lo que se pretende lograr con una declaración del PHEIC se suma a las dificultades del Comité de Emergencia, al igual que la relativa escasez de respuestas clínicas y epidemiológicas en esta etapa de la investigación.En este caso, el Comité de Emergencias se dividió al llegar a una conclusión, pero decidió en equilibrio que la situación actual, aunque sea una emergencia, no debería ser declarada aún como un PHEIC [2].Como en el caso del Ébola en la RDC, se ha criticado a la OMS por esta decisión, pero, como en el caso del Ébola, no está claro de inmediato qué sería diferente en la respuesta si se declarase un PHEIC.La OMS está trabajando para mejorar la forma en que los Comités de Emergencia desarrollan su asesoramiento para el Director General, pero, como recomendó este Comité de Emergencias y el Comité de Revisión del IHR en 2015, el desarrollo de una alerta intermedia junto con el proceso de Una función clave de una declaración del PHEIC es que es la (única) puerta de entrada a las Recomendaciones Temporales de la OMS sobre posibles restricciones de viaje y comercio para limitar la propagación internacional de una enfermedad.En este caso, varios países del mundo ya habían implementado el control de entrada en los aeropuertos y China había comenzado a cerrar los viajes internacionales desde Wuhan antes de que el Comité de Emergencia hubiera terminado sus deliberaciones.Si bien la OMS no interferiría, ni podría interferir, en las decisiones soberanas de los Estados miembros, la falta de influencia en las decisiones de viaje y comercio podría resultar problemática.Además de la rapidez de la respuesta en este brote, hemos visto cambios dramáticos en la escala de la respuesta.La imposición de medidas de cuarentena muy extensas a millones de personas como un intento de romper la transmisión del virus no tiene precedentes.No sabemos si serán eficaces; de hecho, no sabemos cómo determinar si han sido eficaces. Si se confirman las recientes sugerencias de que las personas infectadas con este coronavirus pueden ser infecciosas durante la incubación o asintomáticas, y los informes de que hasta 5 m de personas abandonaron Wuhan antes de que se impusieran las restricciones de viaje, la eficacia de estas medidas de control será más cuestionada. Dado el probable impacto en al menos la economía china y probablemente la economía mundial, será importante entender el papel y la eficacia de las medidas de salud pública en esta escala para el futuro. Sin embargo, la imposición de estas dramáticas medidas también plantea una cuestión más amplia: si hay un impacto de estas medidas, ¿qué otros países (o podrían) implementar tales medidas? ¿Aceptarían otros países el daño económico autoimpuesto que China ha aceptado tratar de contener este brote? ¿Es razonable considerar que los gobiernos nacionales cerrarían el transporte público hacia y desde Londres, Nueva York o París en la semana anterior a Navidad, incluso si se demostrara que es Estas decisiones y preguntas cruzan la interfaz entre la salud pública, la ciencia y la política.La respuesta a este brote en China fue inevitablemente influenciada por la reacción histórica a la respuesta del país al SARS y la sospecha del mundo de la falta de cooperación de China en ese momento.La respuesta actual se enmarca, por lo tanto, en un contexto de no querer que se vea que se comportan de la misma manera con este evento.Esto puede indicar otro impacto de la experiencia del SARS (y el MERS y el Ébola) en la respuesta a los brotes posteriores. En la respuesta de emergencia, generalmente es mejor reaccionar de forma exagerada y luego disminuir si es necesario en lugar de reaccionar en forma insuficiente y actuar demasiado tarde. La respuesta debe ser "no lamentarse" hacer las mejores decisiones posibles sobre la base de la mejor información y ciencia disponible en ese momento, pero no juzgar o criticar si la información posterior sugiere un curso de acción diferente. La respuesta temprana debe reconocer lo que se conoce y lo que no se conoce y mirar qué de las incógnitas se pueden estimar razonablemente con referencia a brotes anteriores, patógenos similares, informes y modelos tempranos, etc. La evaluación y respuesta de riesgo puede entonces ser modificada y refinada a medida que evoluciona la información sobre las incógnitas. Sin embargo, la clave de este enfoque es la confianza en que las decisiones no serán criticadas sobre la base de información que no estaba disponible en ese momento. También es importante estar listo para cambiar decisiones cuando la información disponible cambie algo que tanto científicos como políticos En ese contexto, China no debe ser juzgada por aplicar lo que podría parecer medidas extremas, pero China también debe estar dispuesta a suspender las medidas rápidamente si las pruebas sugieren que no son la mejor manera de resolver el problema. Al cerrar los aeropuertos la propagación internacional de Wuhan puede disminuir, pero el éxito dependerá de la eficacia de las medidas realmente para detener a las personas que salen de la zona afectada, así como en el comportamiento del virus. Como siempre, sólo el tiempo dirá que el tiempo es escaso.

¿Cuáles son algunos desafíos asociados con el uso de los medios de comunicación y las redes sociales para capturar información sobre una epidemia emergente?

La respuesta nacional e internacional demuestra el complejo vínculo entre la salud pública, la ciencia y la política cuando un brote amenaza con afectar a las economías y la reputación mundiales. Las medidas sin precedentes implementadas en China son un intento audaz de controlar el brote – necesitamos entender su efectividad para equilibrar costos y beneficios para eventos similares en el futuro. Texto: El 29 de diciembre de 2019 los médicos en un hospital en la ciudad de Wuhan, China notó una agrupación de casos de neumonía inusual (con el primer caso identificado en ese momento el 12 de diciembre) con un vínculo aparente con un mercado que vende pescado vivo, aves de corral y animales al público. Este evento fue reportado a la Organización Mundial de la Salud (OMS) el 31 de diciembre [1]. En 4 semanas, para el 26 de enero de 2020, el organismo causal había sido identificado como un nuevo coronavirus, el genoma del virus había sido secuenciado y publicado, se habían desarrollado pruebas de reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa, el Blueprint de R&D de la OMS se había activado para acelerar el diagnóstico, la terapia y el desarrollo de vacunas y una vacuna candidata En la actualidad, las autoridades sanitarias chinas están construyendo un hospital de 1.000 camas en Wuhan en 10 días. Al 26 de enero, casi 50 millones de personas en Wuhan y ciudades vecinas habían sido efectivamente puestas en cuarentena, mientras que la OMS había determinado que el evento aún no debía ser declarado como una emergencia de salud pública de interés internacional (PHEIC) [2] y no había recomendado ninguna restricción de viaje específica. La OMS ha destacado la importancia de la detección de salida en los puertos de los países que muestran la transmisión del nuevo coronavirus y ha proporcionado orientación a los países que realizan la detección de entrada en los aeropuertos, reconociendo al mismo tiempo que la evidencia de la eficacia de la detección de entrada es equívoca. Esta respuesta es una de las respuestas mundiales más rápidas y coordinadas a una enfermedad infecciosa emergente que el mundo ha visto en tiempos modernos, pero ¿es la respuesta adecuada, será eficaz y sostenible? Según el informe de situación publicado por la OMS el 28 de enero de 2020 [3], se han notificado en todo el mundo un total de 2798 casos confirmados en 2019-nCoV; de estos, 2761 casos procedían de China, incluidos Hong Kong (8 casos), Macao (5) y Taipei (4). Se han notificado 37 casos confirmados fuera de China en once países de Europa, América del Norte, Australia y Asia; de estos 37 casos exportados, 36 tenían un historial de viaje desde China o un vínculo epidemiológico con un caso de China. De los casos confirmados en China, 461 se han notificado como gravemente enfermos, con 80 muertes hasta la fecha. Este brote y la respuesta a él ilustran algunas cuestiones clave sobre cómo la preparación y la capacidad de respuesta mundial a los brotes han evolucionado durante casi dos décadas desde la epidemia del síndrome respiratorio agudo grave (SARS) de 2002/3 y qué lecciones se han aprendido o no. También plantea preguntas sobre el impacto que estas lecciones han tenido en la forma en que los organismos y los gobiernos responden a estos eventos y sobre el papel de la OMS y el Reglamento Sanitario Internacional (RSI).Una de las lecciones críticas de la experiencia del SRAS fue la necesidad absoluta de poder coordinar los recursos internacionales disponibles en un brote y centrarlos en identificar prioridades y resolver problemas.La OMS estableció los medios para hacerlo y desde entonces se ha desarrollado e integrado en la preparación mundial, especialmente después de la epidemia de Ébola en África Occidental. Organizaciones como la Global Outbreak Alert and Response Network (GOARN), la Coalition for Epidemic Prepared Innovations (CEPI), la Global Research Collaboration for Infectious Disease Preparedness (GloPID-R) y la Global Initiative on Sharing All Influenza Data (GISAID) han sido apoyadas por el Plan de Investigación de la OMS y su Mecanismo Mundial de Coordinación para proporcionar un foro donde aquellos con la experiencia y capacidad para contribuir a la gestión de nuevas amenazas puedan reunirse entre brotes y durante éstos para desarrollar soluciones innovadoras a los problemas emergentes. Esta coordinación mundial ha estado activa en el nuevo brote de coronavirus. El sistema de respuesta de la OMS incluye tres grupos virtuales basados en los desarrollados para que el SARS reúna información en tiempo real para informar sobre directrices en tiempo real, y una primera vacuna candidata está lista para pruebas de laboratorio en el plazo de Hubo extensas críticas a China por su aparente falta de intercambio de información sobre la infección emergente por SARS lo suficientemente pronto en el brote como para permitir a los países prepararse y responder. Hubo preocupaciones similares sobre el intercambio de información como el síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS) surgió y evolucionó en Oriente Medio en 2012, particularmente en Arabia Saudita, y sobre la aparición del ébola en África Occidental en 2014. En esta ocasión el intercambio de información parece haber sido rápido y eficaz (al tiempo que se reconoce que la información disponible en las primeras etapas de un brote es siempre menor de lo que la comunidad mundial desearía). La OMS fue notificada de la agrupación original en cuestión de días y la secuencia genómica completa del nuevo virus se publicó menos de 2 semanas después de que el grupo se detectara por primera vez. La OMS ha expresado su satisfacción con las acciones de las autoridades chinas para compartir información con la OMS. El trabajo con periodistas y medios de comunicación para ayudarles a entender la ciencia y la epidemiología, particularmente en un evento en movimiento rápido, mejorará la comunicación del riesgo al público y reducirá las preocupaciones inapropiadas y el pánico.Si bien la información de este brote muestra signos de los esfuerzos de epidemiólogos, expertos en enfermedades infecciosas, agencias de salud pública nacionales e internacionales y otros que trabajan con periodistas, también hay indicios de que esto no está logrando su objetivo.Por ejemplo, la percepción pública es que el aumento en el número de casos reportados diariamente por las autoridades chinas representa una escalada diaria de la epidemia, mientras que la realidad es que estas cifras son también el resultado de la búsqueda activa, agresiva, de casos en China y algunos de estos casos son casos "viejos" recientemente reconocidos como debido al coronavirus novedoso. Del mismo modo, el virus suele ser descrito por los medios de comunicación como "muerto" y aunque esto es cierto en el sentido de que ha causado muertes, los matices de las tasas de mortalidad de casos inciertos en las primeras etapas de un brote no se están comunicando. La tasa estimada actual de mortalidad de casos parece ser de alrededor del 3%, lo que es significativo pero no comparable a la tasa del 10% para el SARS o el 34% reportada para el MERS. Estas percepciones erróneas siguen impulsando la ansiedad pública. Para complementar los mecanismos formales de información entre los países y con la OMS (incluyendo el IHR), el uso de mecanismos informales como los informes de medios de comunicación y redes sociales fue defendido a la luz de la experiencia del SARS. Actualmente hay varios sistemas mundiales que proporcionan información recopilada de informes informales, incluyendo redes de expertos y escaneo de medios de comunicación y medios sociales.Estos contribuyen, amplifican, inteligencia epidémica y se están El valor se deriva de que se han detectado indicios tempranos de casos más allá de la ciudad de brote inicial y que pueden complementar la evaluación global del riesgo y el seguimiento de la evolución del brote.Los desafíos radican en el volumen y la diversidad de la información disponible y la relativa falta de mecanismos de verificación, de modo que uno de estos sistemas (ProMed) ha comentado que cada vez es más difícil asimilar la información que se suministra [4] y hacer interpretaciones significativas.Al principio del brote se informó que los trabajadores de la salud no habían sido infectados, lo que fue tranquilizador porque son los trabajadores de la salud quienes muchas veces, e inadvertidamente, amplifican la transmisión.La falta de lavado de manos entre los pacientes, por ejemplo, puede resultar no sólo en autoinfección, sino también en infección de pacientes hospitalizados por otras causas cuando prestan atención.La autoinfección no es sólo un riesgo para el trabajador de la salud, sino también para sus familias Una característica del brote de SARS fue la variabilidad de la transmisibilidad entre los casos y la ocurrencia de "acontecimientos superdifundidos" cuando un caso infectado significativamente más contactos que el promedio. Esto también se vio con el MERS en el brote en la República de Corea (RoK). En este nuevo brote de coronavirus no se han documentado tales eventos superdifundidos, pero la epidemiología todavía no está clara. Confirmar si esto está ocurriendo o no debe ser una tarea urgente para la investigación china. Los modeladores han sugerido tasas de reproducción (R 0 ) de 3,8 (intervalo de confianza del 95%, 3,6-4.0) [5] y 2.6 (1.5-3.5) [6] ; R 0 para SARS se estimó en alrededor de 3 en ausencia de medidas de control [7]. El impacto económico de los brotes mayores puede ser sustancial para el país afectado. Esto se vio claramente en el SARS, el MERS en RoK y el Ébola en África Occidental. Un analista estima que el impacto probable del actual brote de coronavirus oscilará entre un recorte del 0,8% al PIB real si la epidemia se controla en un plazo de 3 meses, y un costo del 1,9% al PIB si la epidemia dura 9 meses [8]. Esto puede aumentar sustancialmente a la luz de las restricciones ampliadas a la circulación, y por lo tanto al comercio, dentro de China. La aparición de una enfermedad respiratoria significativa vinculada a un nuevo coronavirus representa una prueba de la capacidad mundial para detectar y controlar las amenazas de enfermedades emergentes. Su aparición en China añade una dimensión adicional a la luz de la experiencia previa con el SARS. El calendario del brote inmediatamente antes del Año Nuevo Lunar Chino con sus movimientos de población concomitantes añade riesgo y urgencia adicionales a la respuesta. El rápido intercambio de información sobre este brote y la rapidez de la respuesta coordinada tanto en el país como en el plano internacional indican que se han aprendido lecciones del SARS que mejoran la capacidad mundial. Las redes y foros internacionales que ahora existen han facilitado la reunión de expertos de todo el mundo para centrar los esfuerzos de investigación y desarrollo y maximizar el impacto. En esta fase inicial de la información sobre los brotes sigue siendo incompleta y aún no se han respondido preguntas clínicas y epidemiológicas clave, pero el déficit parece deberse más a las limitaciones de investigar una enfermedad emergente que a la falta de voluntad de participar y compartir información con los asociados. Hay algunos indicios de esferas en las que es necesario seguir mejorando. La respuesta de los medios de comunicación mundiales a los acontecimientos que se están produciendo ha sido relativamente equilibrada e informada, pero los matices de la evolución de la situación no se han examinado críticamente en colaboración con los medios de comunicación y, por consiguiente, la percepción pública del riesgo puede exagerarse, La falta de apreciación de las incertidumbres en la determinación de una tasa significativa de mortalidad de los casos y la importancia del sesgo de determinación al comienzo de un brote, junto con el impacto de la búsqueda agresiva de casos en los números de los casos, son ejemplos de lo que podría mejorarse la comprensión. Esto es siempre un proceso difícil a la hora de equilibrar los recursos centrados en el análisis de la situación sobre el terreno con los recursos destinados a interpretar la información para los periodistas, pero en el SRAS, se observó que la R 0 disminuyó en respuesta a la información que llega al público y al público y luego adoptó medidas de reducción de riesgos [6] ; por lo tanto, una comunicación pública precisa sobre el riesgo es fundamental para el éxito. Sería útil encontrar un foro en el que esto pueda explorarse con la comunidad de medios después del evento. El aumento del acceso a la información temprana de diversas fuentes, incluidos los medios de comunicación y los medios sociales, añade una dimensión Cuando, como se ha visto en este brote, el volumen de información que llega excede cualquier capacidad para recopilarla y analizarla y tratar de hacer referencias cruzadas y verificar elementos separados, existe el riesgo de que la información alimente la especulación y los medios de comunicación y la preocupación pública.De nuevo existe un buen equilibrio entre la información que fomenta acciones adecuadas de evitación de riesgos y la información que fomenta acciones inapropiadas; sin embargo, la salud pública suele estar mejor al servicio de más información en lugar de menos.El papel de una declaración de un PHEIC en la gestión de un brote grave ha sido cuestionado a la luz del Ébola en África Occidental y en la República Democrática del Congo [9] y ha sido cuestionada nuevamente con este brote.El carácter binario de una declaración de PHEIC (ya sea un evento que es un PHEIC o no hay opciones intermedias) y la especificidad de los tres criterios definidos para un PHEIC han causado dificultad La falta de una comprensión clara de lo que se pretende lograr con una declaración del PHEIC se suma a las dificultades del Comité de Emergencia, al igual que la relativa escasez de respuestas clínicas y epidemiológicas en esta etapa de la investigación.En este caso, el Comité de Emergencias se dividió al llegar a una conclusión, pero decidió en equilibrio que la situación actual, aunque sea una emergencia, no debería ser declarada aún como un PHEIC [2].Como en el caso del Ébola en la RDC, se ha criticado a la OMS por esta decisión, pero, como en el caso del Ébola, no está claro de inmediato qué sería diferente en la respuesta si se declarase un PHEIC.La OMS está trabajando para mejorar la forma en que los Comités de Emergencia desarrollan su asesoramiento para el Director General, pero, como recomendó este Comité de Emergencias y el Comité de Revisión del IHR en 2015, el desarrollo de una alerta intermedia junto con el proceso de Una función clave de una declaración del PHEIC es que es la (única) puerta de entrada a las Recomendaciones Temporales de la OMS sobre posibles restricciones de viaje y comercio para limitar la propagación internacional de una enfermedad.En este caso, varios países del mundo ya habían implementado el control de entrada en los aeropuertos y China había comenzado a cerrar los viajes internacionales desde Wuhan antes de que el Comité de Emergencia hubiera terminado sus deliberaciones.Si bien la OMS no interferiría, ni podría interferir, en las decisiones soberanas de los Estados miembros, la falta de influencia en las decisiones de viaje y comercio podría resultar problemática.Además de la rapidez de la respuesta en este brote, hemos visto cambios dramáticos en la escala de la respuesta.La imposición de medidas de cuarentena muy extensas a millones de personas como un intento de romper la transmisión del virus no tiene precedentes.No sabemos si serán eficaces; de hecho, no sabemos cómo determinar si han sido eficaces. Si se confirman las recientes sugerencias de que las personas infectadas con este coronavirus pueden ser infecciosas durante la incubación o asintomáticas, y los informes de que hasta 5 m de personas abandonaron Wuhan antes de que se impusieran las restricciones de viaje, la eficacia de estas medidas de control será más cuestionada. Dado el probable impacto en al menos la economía china y probablemente la economía mundial, será importante entender el papel y la eficacia de las medidas de salud pública en esta escala para el futuro. Sin embargo, la imposición de estas dramáticas medidas también plantea una cuestión más amplia: si hay un impacto de estas medidas, ¿qué otros países (o podrían) implementar tales medidas? ¿Aceptarían otros países el daño económico autoimpuesto que China ha aceptado tratar de contener este brote? ¿Es razonable considerar que los gobiernos nacionales cerrarían el transporte público hacia y desde Londres, Nueva York o París en la semana anterior a Navidad, incluso si se demostrara que es Estas decisiones y preguntas cruzan la interfaz entre la salud pública, la ciencia y la política.La respuesta a este brote en China fue inevitablemente influenciada por la reacción histórica a la respuesta del país al SARS y la sospecha del mundo de la falta de cooperación de China en ese momento.La respuesta actual se enmarca, por lo tanto, en un contexto de no querer que se vea que se comportan de la misma manera con este evento.Esto puede indicar otro impacto de la experiencia del SARS (y el MERS y el Ébola) en la respuesta a los brotes posteriores. En la respuesta de emergencia, generalmente es mejor reaccionar de forma exagerada y luego disminuir si es necesario en lugar de reaccionar en forma insuficiente y actuar demasiado tarde. La respuesta debe ser "no lamentarse" hacer las mejores decisiones posibles sobre la base de la mejor información y ciencia disponible en ese momento, pero no juzgar o criticar si la información posterior sugiere un curso de acción diferente. La respuesta temprana debe reconocer lo que se conoce y lo que no se conoce y mirar qué de las incógnitas se pueden estimar razonablemente con referencia a brotes anteriores, patógenos similares, informes y modelos tempranos, etc. La evaluación y respuesta de riesgo puede entonces ser modificada y refinada a medida que evoluciona la información sobre las incógnitas. Sin embargo, la clave de este enfoque es la confianza en que las decisiones no serán criticadas sobre la base de información que no estaba disponible en ese momento. También es importante estar listo para cambiar decisiones cuando la información disponible cambie algo que tanto científicos como políticos En ese contexto, China no debe ser juzgada por aplicar lo que podría parecer medidas extremas, pero China también debe estar dispuesta a suspender las medidas rápidamente si las pruebas sugieren que no son la mejor manera de resolver el problema. Al cerrar los aeropuertos la propagación internacional de Wuhan puede disminuir, pero el éxito dependerá de la eficacia de las medidas realmente para detener a las personas que salen de la zona afectada, así como en el comportamiento del virus. Como siempre, sólo el tiempo dirá que el tiempo es escaso.

¿Cuál era la R0 del SARS en ausencia de medidas de control?

La secuenciación profunda de células epiteliales pulmonares humanas primarias desafiadas con el virus de la gripe H5N1 revela un papel proviral para CEACAM1https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6195505/SHA: ef58c6e981a08c85d2c0efb80e5b32b075f660b4Autores: Ye, Siying; Cowled, Christopher J.; Yap, Cheng-Hon; Stambas, JohnFecha: 2018-10-19DOI: 10.1038/s41598-018-33605-6Licencia: cc-byAbstract: Las actuales estrategias profilácticas y terapéuticas dirigidas a los virus de la gripe humana incluyen vacunas y antivirales. Dadas las tasas variables Aquí se describe el uso de la secuenciación profunda de HiSeq para analizar la expresión génica del huésped en células epiteliales alveolares primarias humanas de tipo II infectadas con el virus H5N1 de la gripe aviar altamente patógena. A las 24 horas de la infección, 623 genes hospedantes fueron significativamente regulados, incluyendo la molécula de adhesión celular CEACAM1. La infección por el virus H5N1 estimuló significativamente la expresión proteica CEACAM1 en comparación con el virus influenza A PR8 (H1N1), sugiriendo un papel clave para CEACAM1 en la patogenicidad del virus influenza. Además, el silenciamiento de CEACAM1 endógeno resultó en niveles reducidos de producción proinflamatoria citoquina/quimoquina, así como en niveles reducidos de replicación viral después de la infección H5N1. Texto: Los virus de la gripe causan enfermedades respiratorias estacionales agudas y altamente contagiosas en todos los grupos de edad. Entre 3 y 5 millones de casos de enfermedad grave relacionada con la gripe y más de 250 000 muertes cada año. Además de los brotes estacionales constantes, las cepas de gripe aviar altamente patógena (IAAP), como la H5N1, siguen siendo una amenaza pandémica constante, con cifras recientes de la OMS que muestran 454 infecciones de laboratorio confirmadas y una tasa de mortalidad del 53%. Es importante señalar que los seres humanos tienen muy poca inmunidad preexistente contra las cepas del virus de la gripe aviar. Además, no existe una vacuna H5N1 humana comercialmente disponible. Dado el potencial de los virus H5N1 para desencadenar una pandemia 1,2, existe una necesidad urgente de desarrollar nuevas intervenciones terapéuticas para combatir las deficiencias conocidas en nuestra capacidad de controlar los brotes. La eficacia de la vacuna es altamente variable, como lo demuestra una epidemia particularmente grave de 2017/18, y se requiere una reformulación frecuente de la vacuna para combatir las mutaciones en curso en el genoma del virus de la gripe. Además, se ha reportado resistencia antiviral para muchas cepas circulantes, incluyendo el virus de la gripe aviar H7N9 que emergió en 2013 3, 4. También se ha demostrado que los virus de la gripe A apuntan y secuestran múltiples vías celulares del huésped para promover la supervivencia y replicación 5, 6. Como tal, hay evidencia creciente que sugiere que la focalización de las vías del huésped influirá en la replicación del virus, la inflamación, la inmunidad y la patología 5, 7. Las estrategias de intervención alternativas basadas en la modulación de la respuesta del huésped podrían utilizarse para complementar los actuales protocolos profilácticos y terapéuticos. En el presente estudio, caracterizamos la infección por el virus de la gripe de células epiteliales alveolares primarias humanas de tipo II (ATII) aisladas del tejido pulmonar humano normal donadas por pacientes sometidos a resección pulmonar. Las células ATII son un modelo de infección fisiológicamente relevante ya que son un objetivo principal para los virus de la gripe A al entrar en el tracto respiratorio 10. Expresión del gen huésped humano tras la infección por el virus HPAI H5N1 (A/Chicken/ Vietnam/0008/04) de las células ATII primarias se analizó utilizando la secuenciación profunda de Ilumina HiSeq. Con el fin de obtener una mejor comprensión de los mecanismos subyacentes a la modulación de la inmunidad del huésped en un entorno antiinflamatorio, también analizamos los cambios en la expresión génica tras la infección por HPAI H5N1 en presencia del inhibidor de la especie de oxígeno reactivo (ROS), apo El análisis HiSeq descrito aquí se ha centrado en genes regulados diferencialmente después de la infección por H5N1. Se consideraron varios criterios al elegir un "hit" para estudios posteriores. Estos incluyen: (1) Novedad; ¿se ha estudiado este gen antes en el contexto de la infección por virus influenza/ patogénesis? (2) Inmunregulación; ¿tiene este gen un papel regulador en las respuestas inmunitarias del huésped para que tenga el potencial de ser manipulado para mejorar la inmunidad? (3) Reactivos terapéuticos; ¿existen reactivos terapéuticos disponibles comercialmente, tales como inhibidores específicos o anticuerpos inhibidores que puedan ser utilizados para estudios in vitro e in vivo para optimizar estrategias terapéuticas? (4) Modelos animales; ¿existe un modelo de ratón knock-out disponible para estudios in vivo de infección por gripe? Basado en estos criterios, la molécula de adhesión celular relacionada con carcinoembrión-antigeno (CEA) 1 (CEAC CEACAM1 (también conocido como BGP o CD66) se expresa en células epiteliales y endoteliales 11, así como células B, células T, neutrófilos, células NK, macrófagos y células dendríticas (DC) [12] [13] [14]. Se ha demostrado que el CEACAM1 humano actúa como receptor de varios patógenos bacterianos y fúngicos humanos, entre ellos Haemophilus influenza, Escherichia coli, Salmonella typhi y Candida albicans, pero todavía no se ha implicado en la entrada del virus [15] [16] [17]. Sin embargo, hay evidencia emergente que sugiere que el CEACAM1 está involucrado en la inmunidad del huésped ya que se detectó una mayor expresión en linfocitos en mujeres embarazadas infectadas con citomegalovirus 18 y en tejido cervical aislado de Se han notificado 11 variantes de empalme CEACAM1 en humanos 20. Las isoformas CEACAM1 (Uniprot P13688-1 a -11) pueden diferir en el número de dominios similares a inmunoglobulinas presentes, en presencia o ausencia de un dominio transmembrana y/o la longitud de su cola citoplasmática (es decir, L, larga o S, corta). La proteína CEACAM1 humana de larga duración (CEACAM1-4L) consiste en cuatro dominios extracelulares (un dominio de inmunoglobulina variable similar a la región IgV) y tres dominios constantes de inmunoglobulina 2-como (IgC2)), un dominio transmembrana y una larga cola citoplasmática. La cola citoplasmática larga contiene dos motivos inhibidores a base de inmunorreceptores (ITIM) que están ausentes en la forma corta 20. Las isoformas más comunes expresadas por las células inmunes humanas son CEACAM1-4L y CEACAM1-3L 21. CEACAM1 interactúa homofílicamente consigo mismo 22 o heterofílicamente con CEACAM5 (un miembro relacionado de la familia CEACAM) 23. El estado dimérico permite el reclutamiento de moléculas de señalización como las cinasas SRC-familiar, incluyendo la homología SRC tirosina fosfatasa 2 (SH2)-dominio que contiene proteína tirosina fosfatasa 1 (SHP1) y SHP2 miembros para fosforilar las ITIMs 24. Como tal, la presencia o ausencia de ÍTIMes en las isoformas CEACAM1 influye en las propiedades de señalización y la función celular aguas abajo. Las interacciones homofílicas o heterofílicas CEACAM1 y la fosforilación ITIM son críticas para muchos procesos biológicos, incluyendo la regulación de la función linfocítica, inmunovigilancia, crecimiento celular y diferenciación 25, 26 y activación de neutrófilos y adhesión a las células diana durante las respuestas inflamatorias 27. Cabe señalar que la expresión CEACAM1 ha sido modulada in vivo utilizando un anticuerpo anti-CEACAM1 (MRG1) para inhibir el crecimiento de melanoma xenoinjerto positivo CEACAM1 en ratones SCID/NOD 28. Esto pone de relieve una vía de intervención potencial que puede ser explotada en otros procesos de la enfermedad, incluyendo la infección por virus. Además, los ratones Ceacam1-knockout están disponibles para estudios posteriores de infección in vivo. Nuestros resultados muestran que los niveles de ARNm y expresión proteica CEACAM1 fueron altamente elevados después de la infección por HPAI H5N1. Además, la inhibición del ARN interferente pequeño (siRNA) mediada por CEACAM1 redujo la producción de citocinas inflamatorias y quimioquinas, y más importante aún, inhibió la replicación del virus H5N1 en células ATII humanas primarias y en la línea de células epiteliales respiratorias A549 de tipo humano continuo. Tomadas en conjunto, estas observaciones sugieren que CEACAM1 es un candidato atractivo para modular la inmunidad específica de la gripe. En resumen, nuestro estudio ha identificado un nuevo objetivo que puede influir en la inmunidad HPAI H5N1 y sirve para resaltar la importancia de manipular las respuestas del huésped como una forma de mejorar los resultados de la enfermedad en el contexto de la infección por virus.Tres grupos experimentales fueron incluidos en el análisis HiSeq de la infección por H5N1 en presencia o ausencia del inhibidor de ROS, apocinina: (i) células no infectadas tratadas con DMSO 1% (control de vehículos) (ND), (ii) células infectadas por H5N1 tratadas con DMSO 1% (HD) y (iii) células infectadas por H5N1 tratadas con apocinina 1 mM disuelta en DMSO (HA). Estos tres grupos fueron evaluados mediante comparaciones de pares: ND vs. HD, ND vs. HA, y HD vs. HA. La infección por H5N1 y el tratamiento con apocinina Las células ATII aisladas de los pacientes humanos 29, 30 fueron infectadas con H5N1 en el lado apical a una multiplicidad de infección (MOI) de 2 durante 24 horas y se extrajo ARN. HiSeq fue realizado en muestras y se lea cartografiado al genoma humano donde luego fueron ensamblados en transcriptomas para análisis de expresión diferencial. Un total de 13.649 genes fueron identificados con FPKM (fragmentos por kilobase de exón por millón de fragmentos mapeados) > 1 en al menos uno de los tres grupos experimentales. Un total de 623 genes fueron significativamente regulados y 239 genes fueron significativamente regulados (valor q < 0,05, ≥ 2 veces el cambio) después de la infección por H5N1 (ND vs. HD) (fig. 1A; Tabla S1 ). La infección por HPAI H5N1 de las células ATII activó un estado antiviral, como lo demuestra la regulación ascendente de numerosos genes inducidos por interferón, genes asociados con la defensa de los patógenos, proliferación celular, apoptosis y metabolismo (Tabla 1; Tabla S2 ). Además, la cartografía de la ruta de la Enciclopedia de los genes y los genomas de Kyoto (KEGG) mostró que muchos de los genes regulados en el grupo HD se asignaron a la señalización del TNF (hsa04668), señalización de receptores similares a los de los peajes (hsa04620), interacción citoquina-citoquina del receptor (hsa04060) y señalización del receptor tipo RIG-I (hsa04622) (en el grupo tratado con H5N1 y apocinina (HA), un gran número de genes también fueron significativamente regulados (509 genes 1B ; Tabla S1 ) relativa al grupo de control de la ND. Aunque un subconjunto de genes se expresó de manera diferencial en los grupos HD y HA, ya sea siendo regulados de forma ascendente (247 genes, Fig. 1D ) o desregulados (146 genes, Fig. 1E ), la mayoría de los genes no se superpusieron de hecho entre los grupos HD y HA (Fig. 1D, E). Esto sugiere que el tratamiento con apocinina puede afectar a la expresión génica independiente de la infección H5N1. El análisis de enriquecimiento de genes regulados por la apocinina mostró la implicación de la vía de señalización del interferón tipo I (GO:0060337), la respuesta defensiva al virus (GO:0009615), la regulación negativa de los procesos virales (GO:48525) y la respuesta al estrés (GO:0006950) ( Tabla S2 Los genes regulados por la apocinina incluyen aquellos que están involucrados en la adhesión celular (GO:0007155), la regulación de la migración celular (GO:0030334), la regulación de la proliferación celular (GO:0042127), la transducción de señales (GO:0007165) y los procesos de oxidación-reducción (GO:0055114) (Tabla S2, "ND vs. HA Down"). Un total de 623 genes fueron regulados después de la infección por H5N1 ("ND vs. HD Up", Fig. 1F ). Al solapar las dos listas de genes de "ND vs. HD Up" y "HD vs. HA Down", 245 genes se mostraron regulados en presencia de apocinina (Fig. 1F ). Al superponer tres listas de genes de "ND vs. HD Up", "HD vs. HA Down" y "ND vs. HA Up", 55 genes de los 245 genes (190 más 55 genes) estuvieron presentes en las tres listas (Fig. 1G), lo que indica que estos 55 genes fueron significativamente inhibidos por la apocinina, pero a un nivel que todavía era significativamente más alto que el de las células no infectadas. Los 55 genes incluyen aquellos involucrados en la inmunidad de influenza A (hsa05164; DDX58, IFIH1, IFNB1, MYD88, PML, STAT2), señalización de Jak-STAT (hsa04630; IFNB1, IL15RA, IL22RA1, STAT2), señalización de receptores tipo RIG-I (hsa04622; DDX58, IFIH1, IFNB1) y procesamiento y presentación de antígenos (hsa04612; TAP2, TAP1, HLA-DOB) (Tablas S3 y S4). Por lo tanto, las respuestas inmunológicas críticas inducidas después de la infección por H5N1 no fueron amortiguadas después del tratamiento con apocinina. Los 190 genes restantes de 245 no estaban presentes en la lista "ND vs. HA Up", lo que sugiere que esos genes fueron significativamente inhibidos por la apocinina a un nivel similar a las células de control no infectadas (Fig. 1G ). Los 190 genes incluyen los que participan en la señalización del TNF (hsa04668; CASP10, CCL2, CCL5, CFLAR, CXCL5, END1, IL6, TRAF1, VEGFC), interacción del receptor de citoquinas-citoquinas (hsa04060; VEGFC, IL6, CCL2, CXCL5, CXCL16, IL2RG, CD40, CCL5, CCL7, IL1A), vía de señalización del NF-kappa B (hsa04064: TRAF1, CFLAR, CARD11, TNFSF13B, TICAM1, CD40) y señalización del PI3K-Akt (hsa04151; CCND1, GNB4, IL2RG, IL6, ITGA2, JAK2, LAMA1, MYC, IPK3AP1, Esto es consistente con el papel de la apocinina en la reducción de la inflamación 31. Al superponer las tres listas de genes de "ND vs. HD Up", "HD vs. HA Down" y "ND vs. HA Down", se encontraron 11 genes en las tres comparaciones (Fig. 1H ). Esto sugiere que estos 11 genes están regulados después de la infección por H5N1 y son significativamente reducidos por el tratamiento con apocinina a un nivel inferior al observado en las células de control no infectadas (Fig. 1H ). Entre ellos estaban los genes inflamatorios citoquinas/quimioquinas, incluyendo CXCL5, IL1A, AXL (miembro de la familia de receptores TAM de tirosina quinasas) y TMEM173/STING (estimulador de los genes IFN) (Tabla S4). Nuestro estudio anterior demostró que la infección por H5N1 de células A549 en presencia de apocinina realzó la expresión de reguladores negativos de la señalización de citocinas (SOCS), SOCS1 y SOCS3 6. Esto, a su vez, dio lugar a una reducción de la producción de citocinas y quimioquinas estimuladas por H5N1 (IL6, IFNB1, CXCL10 y CCL5 en células A549), que no se atribuyó a una menor replicación del virus ya que los títulos del virus no se vieron afectados por el tratamiento con apocinina 6. Realizamos un análisis qRT-PCR sobre las mismas muestras de ARN presentadas para el análisis HiSeq para validar los resultados de HiSeq. IL6 (fig. 2A), IFNB1 (fig. 2B), CXCL10 (fig. 2 2D ) la expresión génica fue significativamente elevada en las células ATII después de la infección y se redujo por la adición de apocinina (excepto para IFNB1). De acuerdo con hallazgos previos en las células A549 6, la infección por H5N1 solo indujo la expresión de SOCS1 como se muestra en el análisis HiSeq y qRT-PCR (Fig. 2E ). El tratamiento con apocinina aumentó aún más la expresión de SOCS1 mRNA (Fig. 2E ). Aunque el análisis de HiSeq no detectó un aumento estadísticamente significativo de SOCS1 tras el tratamiento con apocinina, los cambios de pliegue de Log2 en la expresión génica de SOCS1 fueron similares entre los grupos HD y HA (4,8 veces frente a 4,0 veces) (Fig. 2E ). El análisis de HiSeq de la transcripción de El análisis de qRT-PCR mostró que aunque el ARNm SOCS3 fue ligeramente aumentado después de la infección por H5N1, fue significativamente mejor regulado en la presencia Tabla 2. Los representantes de las vías de KEGG sobrerrepresentadas con un valor máximo de P de 0,05 y el número de genes que contribuyen a cada vía que se regula significativamente después de la infección por H5N1 ("ND vs. HD Up"). La lista completa de vías de KEGG se presenta en la Tabla S3. de apocinina (Fig. 2F). Por lo tanto, la apocinina también contribuye a la reducción de la producción de citoquinas y quimioquinas estimuladas por H5N1 en las células ATII. Apocinina, un compuesto que inhibe la producción de ROS, ha demostrado influir en las respuestas específicas de la gripe in vitro 6 e in vivo 5. Aunque los títulos del virus no se ven afectados por el tratamiento con apocinina in vitro 6, se observa cierta actividad antiviral in vivo cuando los ratones han sido infectados con un virus A/HongKong/X31 H3N2 de baja patogenicidad 6. HiSeq análisis del virus HPAI H5N1 transcripción del gen mostró que aunque hubo una tendencia al aumento de la expresión del virus de la gripe tras el tratamiento con apocinina, sólo la expresión del gen influenza no estructural (NS) aumentó significativamente (Fig. 2G). La reducción de la producción de citoquinas y quimioquinas en las células ATII infectadas por H5N1 es poco probable que se asocie con una menor replicación del virus. El análisis de enriquecimiento del GO se realizó en genes que se mejoraron significativamente después de la infección por HPAI H5N1 en células ATII en presencia Muchos de los genes regulados por H5N1 participaron ampliamente en la respuesta defensiva (GO:0006952), la respuesta al estímulo biótico externo (GO:0043207), los procesos del sistema inmunitario (GO:0002376), la vía de señalización mediada por citoquinas (GO:0019221) y la vía de señalización del interferón tipo I (GO:0060337) (Tabla 1; Tabla S2 ). Además, muchos de los genes regulados por H5N1 se asignaron a las vías metabólicas (hsa01100), la interacción del receptor citoquina-citoquina (hsa04060), la gripe A (hsa05164), la señalización del TNF (hsa04668) o la señalización del Jak-STAT (hsa04630) (Tabla S3). Sin embargo, no todos los genes regulados por H5N1 en estas vías fueron inhibidos por el tratamiento con apocinina como se mencionó anteriormente (fig. 1F ; Tabla S3 ).. Los cambios de plegado después del análisis QRT-PCR se calcularon utilizando el método 2 Ct (eje Y derecho) normalizado a β-actina y comparado con el grupo ND. Los datos de HiSeq se calcularon como cambio de plegado Log2 (eje Y izquierdo) comparado con el grupo ND. La transcripción IFNB1 no fue detectada en ND, por lo tanto los datos de HiSeq IFNB1 de los grupos HD y HA se expresaron como FPKM. *p < 0,05 y **p < 0,01, ***p < 0,001 comparado con ND; # p < 0,05, ## p < 0,01, comparado (G) Análisis Hiseq de perfiles de expresión génica del virus de la gripe H5N1 con o sin tratamiento de apocinina en células ATI primarias humanas. # p < 0,05, en comparación con HD. Reregulación de la molécula de adhesión celular CEACAM1 en células ATI infectadas por H5N1. La molécula de adhesión celular CEACAM1 ha demostrado ser crítica para la regulación de las respuestas inmunitarias durante la infección, inflamación y cáncer 20. La transcripción de CEACAM1 fue significativamente regulada después de la infección por H5N1 (Fig. 3A). En contraste, un miembro relacionado de la familia CEACAM, CEACAM5, no se vio afectado por la infección por H5N1 (Fig. 3B). También vale la pena señalar que se obtuvieron más lecturas para CEACAM5 (>1000 FPKM) (Fi 3B ) que CEACAM1 (~7 FPKM) (Fig. 3A) en células ATII no infectadas, lo cual es consistente con sus patrones de expresión normales en el tejido pulmonar humano 32. Por lo tanto, aunque CEACAM1 forma heterodímeros con CEACAM5 23, la expresión basal más alta de CEACAM5 en células ATII puede explicar por qué su expresión no fue aumentada por la infección por H5N1. La expresión proteica CEACAM1 endógena también fue analizada en células A549 no infectadas o infectadas por el virus influenza (Fig. 3C ) y ATII (Fig. 3D ). La expresión proteica CEACAM1 fue leve, pero no significativamente aumentada en células A549 infectadas por el virus A/Puerto Rico/8/1934 H1N1 (PR8) durante 24 o 48 horas No se observaron diferencias significativas en los niveles de proteína CEACAM1 en varios MOI (2, 5 ó 10) o entre los plazos de 24 y 48 hpi (fig. 3C). Después de examinar la expresión proteica CEACAM1 después de la infección por el virus PR8 en células A549, se examinó la expresión proteica CEACAM1 en células AII humanas primarias infectadas con HPAI H5N1 y en comparación con la infección por el virus PR8 (fig. 3D). Las células ATII fueron infectadas con el virus PR8 a un MOI de 2, una dosis que indujo la regulación ascendente de citocinas y el gen Matrix (M) de influenza analizado por qRT-PCR (datos no mostrados). Los niveles de proteína CEACAM1 endógena fueron significativamente elevados y similares en las células ATII infectadas por H5N1 en los tres MOI analizados. La expresión de proteína CEACAM1 en las células ATII infectadas por H5N1 en los MOI de 0,5 fue mayor a 48 hpi que en las observadas a 24 hpi (fig. 3D ). La infección por el virus HPAI H5N1 en los MOI de 0,5, 1 y 2 estimuló niveles endógenos más altos de expresión proteica de CEACAM1 en comparación con la infección por el virus PR8 en un MOI de 2 en el momento correspondiente (un aumento máximo de ~9 veces inducido por H5N1 en los MOI de 0,5 y 1 a 48 hpi en comparación con PR8 en el MOI de 2), sugiriendo un posible papel para CEACAM1 en la patogenicidad del Para entender el papel de CEACAM1 en la patogénesis de la gripe, las células A549 y ATII fueron transfectadas con siCEACAM1 para desmontar la expresión proteica endógena de CEACAM1. Las células ATII y A549 fueron transfectadas con siCEACAM1 o control negativo de siNeg. La expresión de cuatro variantes principales de CEACAM1, CEACAM1-4L, -4S, -3L y -3S, y proteína CEACAM1 fueron analizadas utilizando SYBR Green qRT-PCR y Western blotting, respectivamente. El análisis de SYBR Green qRT-PCR mostró que las células ATII transfectadas con 15 pmol de siCEACAM1 redujeron significativamente la expresión de CEACAM1-4L y -4S en comparación con el control de siNeg, mientras que la expresión de CE La expresión proteica CEACAM1 se redujo aproximadamente en un 50% en las células ATII y A549 después de la transfección de siCEACAM1 en comparación con las células transfectadas por siNeg (Fig. 4B). El aumento de dosis de siCEACAM1 (10, 15 y 20 pmol) no redujo aún más la expresión proteica CEACAM1 en las células A549 (Fig. 4B ). Como tal, se eligieron 15 pmol de siCEACAM1 para estudios posteriores de caída en las células ATII y A549. Es importante destacar que el anticuerpo anti-CEACAM1 solo detecta isoformas L basadas en la información epítope proporcionada por Abcam. Por lo tanto, las reducciones observadas en la expresión proteica CEACAM1 se pueden atribuir principalmente a la abolición de CEACAM1-4L. Las consecuencias funcionales de la caída de CEACAM1 fueron examinadas en las células ATII y A549 después de la infección por H5N1. IL6, IFNB1, CXCL10, CCL5 y TNF fueron analizadas en las células ATII infectadas por H5N1 y A549 usando qRT-PCR. ATII (Fig. 5A ) y A549 células transfectadas con siCEACAM1 mostraron una expresión significativamente menor de IL6, CXCL10 y CCL5 en comparación con las células transfectadas por siNeg. Sin embargo, la expresión de la citocina antiviral, IFNB1, no se vio afectada en ambos tipos de células. Además, la expresión TNF, que puede ser inducida por IFNs de tipo I 33, fue significativamente menor en las células A549 transfectadas por siCEACAM1 (Fig. 5B), pero no se afectó en las células ATII transfectadas por siCEACAM1 (fig. 5A). Se cree que la hipercitokinemia o "tormenta de citoquinas" en los pacientes infectados por el virus H5N1 y H7N9 contribuye al daño tisular inflamatorio 34, 35. La disminución de CEACAM1 en el contexto de una infección viral grave puede reducir la inflamación causada por la infección por H5N1 sin amortiguar la respuesta antiviral. Además, la replicación del virus se redujo significativamente en 5,2 veces en ATII (fig. 5C) y 4,8 veces en células A549 (fig. 5D) transfectadas con siCEACAM1 en comparación con las células transfectadas por siNeg. 5C,D). Los virus de la gripe utilizan maquinaria celular huésped para manipular procesos celulares normales con el fin de promover la replicación y evadir las respuestas inmunes del huésped. Los estudios en el campo se centran cada vez más en la comprensión y modificación de los factores principales del huésped para mejorar la enfermedad. Ejemplos incluyen modulación de ROS para reducir la inflamación 5 e inhibición de NF-B y activación mitogénica de Raf/MEK/ERK cinasa en cascada para suprimir la replicación viral 36, 37. Estas estrategias de enfoque del huésped ofrecerán una alternativa a las intervenciones actuales que se centran en dirigir el virus. En el presente estudio, analizamos perfiles de expresión génica del huésped humano después de la infección por HPAI H5N1 y tratamiento con el antioxidante, apocinina. Como era de esperar, genes que fueron significativamente regulados después de la infección H5N1 estuvieron involucrados en procesos biológicos Además, los genes regulados por H5N1 también participaron en la regulación de la fosforilación proteica, el metabolismo celular y la proliferación celular, que se cree que son explotados por virus para la replicación 38. El tratamiento con apocinina tuvo tanto antiviral (Tablas S2-S4) 5 como proviral impacto (Fig. 2G), lo que no es sorprendente ya que los ROS son potentes agentes microbicidas, así como importantes moléculas de señalización inmune en diferentes concentraciones 39. En nuestras manos, el tratamiento con apocinina redujo la inflamación inducida por H5N1, pero también impactó la respuesta de defensa celular, la producción de citocinas y la señalización mediada por citoquinas. DDX58 (RIG-I), TLRs, IFIH1 (MDA5) no fue desregulado (Tabla S1 ). Dada la interferencia significativa de los virus de la gripe en la inmunidad del huésped, centramos nuestra atención en los reguladores clave de la respuesta inmunitaria. Mediante el análisis HiSeq, identificamos la molécula de adhesión celular CEACAM1 como un regulador crítico de la inmunidad. La caída de CEACAM1 inhibió la replicación del virus H5N1 y redujo la producción de citoquinas inflamatorias/quimioquinas estimuladas por H5N1. La infección por H5N1 dio lugar a una regulación significativa de varios genes citoquinas/quimioquinas inflamatorias, incluyendo AXL y STING, que fueron significativamente reducidos por el tratamiento con apocinina a un nivel inferior al observado en células no infectadas (Tabla S Se ha demostrado previamente que el tratamiento con anticuerpos anti-AXL de ratones infectados por PR8 redujo significativamente la inflamación pulmonar y los títulos de virus 40. STING ha demostrado ser importante para promover las respuestas antivirales, ya que las células STING-knockout TPH-1 producen menos IFN de tipo I después de la infección por el virus influenza A 41. La reducción de la expresión del gen STING u otros factores antivirales (por ejemplo, IFNB1, MX1, ISG15; Tabla S1 ) por apocinina, puede explicar en parte el ligero aumento de la transcripción del gen influenza después del tratamiento con apocinina (Fig. 2G). Estos resultados también sugieren que el tratamiento con apocinina puede reducir la inflamación inducida por H5N1 y la apoptosis. De hecho, los efectos antiinflamatorios y antiapoptóticos de la apocinina han sido mostrados previamente en varios modelos de enfermedad, incluyendo diabetes mellitus 42, infarto de miocardio 43, neuroinflamación 44 e infección por el virus de la gripe 6. El reconocimiento del ARN viral intracelular por receptores de reconocimiento de patrones (PRRs) desencadena la liberación de citoquinas/quimioquinas proinflamatorias que reclutan células inmunes innatas, tales como neutrófilos y células NK, al sitio de la infección para ayudar en el aclaramiento viral 45. Los neutrófilos ejercen su función citotóxica al unirse primero a células epiteliales infectadas por gripe a través de moléculas de adhesión, como CEACAM1 46. Además, estudios han indicado que la infección por virus de gripe promueve la apoptosis de neutrófilos 47, La fosforilación de los motivos de CEACAM1 ITIM y la activación de caspasa-3 es fundamental para mediar los eventos antiapoptóticos y para promover la supervivencia de los neutrófilos 27. Esto sugiere que los eventos antiapoptóticos mediados por CEACAM1 pueden ser importantes para la resolución in vivo de la infección por el virus de la gripe, que pueden investigarse más a fondo a través de estudios de infección con ratones Ceacam1-knockout. Las células NK desempeñan un papel crítico en la defensa innata contra los virus de la gripe al reconocer y matar las células infectadas. Se ha demostrado que las interacciones homo-o heterofílicas CEACAM1 inhiben la eliminación de NK 25, 26, y se cree que contribuyen a la evasión inmune de células tumorales 50. Ante estos hallazgos, se podría sugerir la posibilidad de que la regulación de CEACAM1 (para inhibir la actividad de NK) pueda ser una estrategia de evasión inmune novedosa y no característica empleada por virus de la gripe. Nuestro laboratorio está investigando ahora el papel de CEACAM1 en la función celular de NK. Inhibidores de pequeñas moléculas de proteínas cinasas o fosfatasas proteicas (por ejemplo, inhibidores para Src, JAK, SHP2) se han desarrollado como terapias para el cáncer, inflamación, enfermedades inmunitarias y metabólicas 51. Modulación de la fosforilación, dimerización CEACAM1 y la función posterior con inhibidores de moléculas El mecanismo molecular de la acción CEACAM1 después de la infección también ha sido explorado en células A549 utilizando el virus PR8 52. Vitenshtein et al. demostraron que CEACAM1 fue regulado después del reconocimiento del ARN viral por RIG-I, y que esta regulación era dependiente del factor 3 regulador del interferón (IRF3). Además, la fosforilación de CEACAM1 por SHP2 inhibió la replicación viral al reducir la fosforilación del objetivo mamífero de la rapamicina (mTOR) para suprimir la producción global de proteínas celulares. En el presente estudio, utilizamos un modelo de infección más relevante fisiológicamente, células ATII humanas primarias, para estudiar el papel de otros estudios se requerirá investigar/confirmar los mecanismos moleculares de CEACAM1 upregulation después de la infección del virus influenza, especialmente in vivo. Como se ha observado un aumento de la regulación de CEACAM1 en otras infecciones virales, como el citomegalovirus 18 y el papilomavirus 19, será importante determinar si un mecanismo de acción común puede ser atribuido a CEACAM1 para determinar su significación funcional. Si esto se puede establecer, CEACAM1 podría ser utilizado como objetivo para el desarrollo de un agente pan-antiviral. En resumen, moléculas en la superficie celular como CEACAM1 son particularmente atractivas candidatas para el desarrollo terapéutico, ya que los fármacos no necesitan cruzar la membrana celular para ser eficaces. La focalización de genes codificados por el huésped en combinación con antivirales y vacunas actuales puede ser una forma de reducir la morbilidad y mortalidad asociadas a la infección por el virus de la gripe. Es importante destacar que la reducción de la expresión CEACAM1 dio lugar a una reducción de la replicación del virus de la gripe y sugiere que la selección de esta molécula puede ayudar a mejorar los resultados de la enfermedad. El aislamiento y cultivo de células ATII humanas primarias. Las muestras de tejido pulmonar no tumoral humano fueron donadas por pacientes anónimos sometidos a resección pulmonar en el Hospital Universitario, Geelong, Australia. Los protocolos de investigación y ética humana fueron aprobados por los Comités de Ética Humana de la Universidad Deakin, Barwon Health y la Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization (CSIRO). Se obtuvo el consentimiento informado de todos los donantes de tejido. Todas las investigaciones se realizaron de acuerdo con las directrices establecidas en la Declaración Nacional sobre Conducta Ética en la Investigación Humana (2007). El muestreo de tejido pulmonar normal fue confirmado por el Victorian Cancer Biobank, Australia. Las células epiteliales alveolares humanas tipo II (ATII) fueron aisladas y cultivadas utilizando un método descrito previamente 30, 53 con modificaciones menores. Brevemente, el tejido pulmonar con bronquios visibles fue extirpado y perfundido con abundante PBS y sumergido en Trypsin-EDTA (Gibco) dos veces durante 15 minutos a 37 °C. El tejido parcialmente digerido fue cortado en secciones y digerido posteriormente en la Solución Sal Balanzada de Hank (HBSS) que contenía elastasa (12,9 unidades/ml; Roche Diagnostics) y Dnasa I (0,5 mg/ml; Roche Diagnostics) durante 60 minutos a 37 °C. Se obtuvieron suspensiones unicelulares por filtración a través de un colador de células de 40 μm y se permitió que las células (incluyendo macrófagos y fibroblastos) se unieran a platos de Petri tratados con cultivos tisulares en una mezcla 1:1 de medio DMEM/F12 (Gibco) y medio de crecimiento de la vía aérea pequeña (SAGM) (Lonza) que contenía 5% de suero fetal de ternera (FCS) y 0,5 mg/ml de Dnasa I durante 2 horas a 37 °C. Se recogieron células no adherentes, incluyendo células ATII, y se sometieron a centrifugación a 300 g durante 20 minutos en un gradiente discontinua de densidad de Percoll (1,089 y 1,040 g/ml). Se recogieron células ATII purificadas de la interfaz de dos gradientes de densidad, lavadas en HBSS y resuspendidas en medio SAGM suplementadas con un 1% de FCS filtrados por carbón (Gibco) y 100 unidades/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina (Gibco). Las células ATII fueron chapadas en inserciones Transwell de poliéster (0,4 μm de poro; Corning) recubiertas de colágeno de placenta humana de tipo IV (0,05 mg/ml; Sigma) a 300.000 células/cm 2 y cultivadas bajo condiciones cubiertas de líquido en una incubadora humidificada (5% CO 2, 37 °C). El medio de crecimiento se cambió cada 48 horas. Estas condiciones de cultivo suprimieron la expansión de fibroblastos dentro de las células ATII recién aisladas y alentaron A549 células basales alveolares alveolares humanas carcinómicas tipo II y células de riñón canino Madin-Darby (MDCK) fueron provistas por la instalación de cultivo de tejidos del Laboratorio Australiano de Salud Animal (AAHL), CSIRO. Las células A549 y MDCK se mantuvieron en el medio F12K de Ham (GIBCO) y en el medio RPMI-1640 (Invitrogen), respectivamente, complementadas con 10% FCS, 100 U/ml penicilina y 100 μg/ml estreptomicina (GIBCO) y mantenidas a 37 °C, 5% CO 2. Virus e infección viral. HPAI A/chicken/Vietnam/0008/2004 H5N1 (H5N1) se obtuvo de AAHL, CSIRO. Las existencias virales de A/Puerto Rico/8/1934 H1N1 (PR8) se obtuvieron de la Universidad de Melbourne. Las existencias virales se prepararon utilizando la inoculación estándar de huevos embrionados de 10 días de edad. Se preparó un único stock de virus para su uso en todos los ensayos. Todos los experimentos con H5N1 se realizaron en laboratorios de nivel de bioseguridad 3 (BSL3) en AAHL, CSIRO. Las células fueron infectadas con virus influenza A como se describió anteriormente 6, 29. Brevemente, los medios de cultivo fueron eliminados y las células fueron lavadas con PBS caliente tres veces seguidas de inoculación con virus durante 1 hora. Luego se extirparon los virus y las células fueron lavadas con PBS caliente tres veces, e incubadas en los medios de cultivo frescos libres de suero apropiado que contenían 0,3% BSA a 37 ° Para el análisis de HiSeq, las células ATII de tres donantes fueron infectadas en el lado apical con H5N1 en un MOI de 2 durante 24 horas en un medio SAGM libre de suero, suplementadas con albúmina sérica bovina de 0,3% (BSA) que contenía 1 mM de apocinina disuelta en DMSO o 1% de control del vehículo DMSO. Las células ATII incubadas en medios que contenían 1% de DMSO fueron utilizadas como control negativo. Para otros estudios de infección viral posteriores, células ATII de un conjunto diferente de tres donantes (diferentes de los utilizados en el análisis de HiSeq) o células A549 de al menos tres pasajes diferentes fueron infectadas con virus influenza A en varios MOIs, como se indica en el texto. Para los estudios de infección por PR8, se incluyó una concentración final de 0,5 μg/ml L-1-Tosylamida-2-feniletilclorometilcetona (TPCK) tratada con tripsina (Worthington) en los medios de comunicación post-inoculación para ayudar a la replicación. Los títulos de virus se determinaron utilizando ensayos de placa estándar en células MDCK como se describió anteriormente 55. Extracción de ARN, control de calidad (QC) e HiSeq análisis. Las células ATII de tres donantes se utilizaron para el análisis de HiSeq. El ARN total se extrajo de las células utilizando un kit RNeasy Mini (Qiagen). Las células infectadas por gripe se lavaron con PBS tres veces y las células se lisaron con tampón RLT complementado con β-mercaptoetanol (10 μL/ml; Gibco). Los lisatos celulares fueron homogeneizados con columnas QIAshredder seguidas de digestión del ADN en la columna con el conjunto de ADN libre de RNASA (Qiagen) y ARN extraídos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizó QC inicial para asegurar que la cantidad y calidad de las muestras de ARN para el análisis HiSeq cumplieran los siguientes criterios: 1) las muestras de ARN tenían relaciones OD260/280 entre 1,8 y 2,0 medida con el espectrofotómetro NanoDropTM (Termo Scientific); 2) las concentraciones de la muestra eran de 100 ng/μl como mínimo; 3) el ARN fue analizado por electroforesis de gel de agarosa. La integridad y calidad del ARN fueron validadas por la presencia de bandas claras agudas de 28S y 18S ARN ribosomal, con una relación 28S Como parte del QC inicial y como indicación de infección constante por H5N1, la PCR de transcriptasa inversa cuantitativa paralela en tiempo real (qRT-PCR) utilizando las mismas muestras de ARN utilizadas para el análisis de HiSeq se realizó en duplicado como se describió anteriormente 6 para medir la expresión de ARNm de IL6, IFNB1, CXCL10, CCL5, TNF, SOCS1 y SOCS3, todas las cuales se conocen por estar reguladas después de la infección por HPAI H5N1 de las células A549 6 Análisis de secuenciación y anotación. Después de confirmar las sumas de comprobación y evaluar la calidad de los datos brutos de los archivos FASTQ con FASTQC, las lecturas de ARN-Seq se procesaron de acuerdo con los protocolos estándar de tuberías Tuxedo 56, utilizando el genoma humano anotado (GRCh37, descargado de Brevemente, las lecturas crudas para cada muestra fueron cartografiadas al genoma humano usando TopHat2, ordenadas y convertidas al formato SAM usando Samtools y luego ensambladas en transcriptomas usando Cufflinks. Cuffmerge fue usado para combinar anotaciones de transcripción de muestras individuales en un único transcriptoma de referencia, y Cuffquant fue usado para obtener conteos de lectura por muestra. Cuffdiff fue usado para realizar análisis de expresión diferencial. Todos los programas fueron ejecutados usando parámetros recomendados. Es importante notar que el archivo gtf de referencia proporcionado a buffmerge fue editado primero usando un script de pitón personalizado para excluir líneas que contienen características distintas de exon/cds, y contigs distintos de cromosomas 1-22, X, Y. GO término y enriquecimiento de KEGG. Los identificadores de genes oficiales para transcripciones que fueron moduladas diferencialmente después de la infección por HPAI H5N1 con o sin tratamiento con apocinina se compilaron en seis listas de objetivos a partir de comparaciones de pares ("ND vs. HD Up", "ND vs. HD Down", "ND vs. HA Up", "HD vs. HA Up", "HD vs. HA Down"). Las transcripciones expresadas diferencialmente significativamente se definieron como si tuvieran un cambio ≥2 veces con un valor P ajustado de Benjamini-Hochberg < 0.01. Una lista de antecedentes de genes se compiló mediante la recuperación de todos los identificadores de genes identificados en el presente análisis HiSeq con FPKM > 1. El enriquecimiento del proceso biológico GO se realizó utilizando Gorilla, comparando el fondo no alineado y las listas de objetivos 57. Las listas de objetivos también fueron sometidas al análisis de la vía KEGG utilizando un mapeador básico de la vía KEGG 59 y DAVID Bioinformática Recursos Herramienta de Anotación Funcional 60,61. Reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). Las concentraciones de genes de interés de mRNA fueron evaluadas y analizadas utilizando qRT-PCR realizadas en duplicado como se describió anteriormente 6. Brevemente, después de la extracción de ARN total de células infectadas por la gripe, cDNA fue SCIEntIfIC RepoRtS (2018) 8:15468 DOI:10.1038/s41598-018-33605-6 preparado utilizando SuperScript TM III First-Strand Synthesis SuperMix (Invitrogen). La expresión génica de varias citocinas se evaluó utilizando ensayos de expresión génica TaqMan (Biosistemas aplicados) con imprimaciones y sondas comerciales TaqMan, con la excepción del gen Matrix (M) influenza (imprimación posterior 5′-CTTCTAACGAGGGAACGTA-3′; imprimación inversa 5′-GGTGAGGAGGGGTGTCTTGTCTTTA-3′; sonda 5′-FAM-TCAGGCCCTCAAAGCCGAG-NFQ-3′) 62. Los imprimadores específicos 63 (cuadro S5) fueron diseñados para estimar la expresión de CEACAM1-4L, -4S, -3L y -3S en células ATII y A549 utilizando iTaq Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La ausencia de amplificación inespecífica fue confirmada por electroforesis en gel de agarosa de productos QRT-PCR (15 μL) (datos no mostrados). La expresión génica se normalizó a ARNm de β-actina utilizando el método 2 CT donde se determinaron los niveles de expresión en relación con los controles celulares no infectados. Todos los ensayos se realizaron por duplicado utilizando un sistema de PCR Applied Biosystems ® StepOnePlus TM en tiempo real. Las cantidades iguales de proteína fueron cargadas en geles NuPAGE 4-12% Bis-Tris (Invitrogen), resueltas por SDS/PAGE y transferidas a membranas PVDF (Bio-Rad). Las membranas fueron sondeadas con anticuerpo monoclonal CEACAM1 anti-humano EPR4049 (ab108397, Abcam) seguido de anticuerpo secundario conjugado con HRP anti-rabbit de cabra (Invitrogen). Las proteínas fueron visualizadas mediante membranas incubadoras con Chemiluminiscence potenciado Pierce (ECL) Plus Western Blotting Substrate (Thermo Scientific) seguido de detección en un sistema de imágenes Bio-Rad ChemiDoc TM MP o en Amersham TM Hyperfilm TM ECL (GE Healthcare). Para usar la β-actina como control de carga, la misma membrana fue despojada en tampón de destripamiento (1,5% (p/v) glicina, 0,1% (p/v) SDS, 1% (v/v) Tween-20, pH 2.2) y re-probada con un anticuerpo monoclonal anti-β-actina conjugado con HRP en cada muestra, respectivamente. La densidad de la banda proteica se cuantificó utilizando el software Fiji (versión 1.49J10) 64. La densidad de la banda proteica CEACAM1 se normalizó contra la de β-actina y se expresó como cambios de pliegue en comparación con los controles. Las células ATII y A549 fueron cultivadas hasta un 80% de confluencia en placas de 6 pocillos y luego transfectadas con pequeño ARN interferente (siARN) dirigido al gen humano CEACAM1 (siCEACAM1; s1976, Silencer ® Select Pre-designed siRNA, Ambion ® ) o control de siRNA (siNeg; Silencer ® Select Negative Control No. 1 siRNA, Ambion ® ) utilizando Lipofetamina 3000 (ThermoFisher Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La transfección y eficiencia silenciadora fueron evaluadas después de 48 horas mediante el análisis de manchas occidentales de la expresión proteica de CEACAM1 y mediante el análisis qRT-PCR de variantes CEACAM1. En experimentos paralelos, se analizó la replicación de virus y la producción de citoquinas/quimoquinas en siCEACAM1 o células transfectadas por siNeg infectadas con virus H5N1 (MOI = 0,01) a 24 hpi. Análisis estadístico. Se evaluaron las diferencias entre dos grupos experimentales utilizando una prueba t de Student sin emparejar, de dos colas. Diferencias de doble cambio de expresión de mRNA (qRT-PCR) entre tres grupos experimentales se evaluó mediante análisis de varianza de un solo sentido (ANOVA) seguido de una prueba de comparison múltiple de Bonferroni. Las diferencias se consideraron significativas con un valor de p <0,05. Los datos se muestran como media ± error estándar de la media (SEM) de tres o cuatro experimentos individuales. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism para Windows (v5.02). Todos los Los datos brutos y procesados de HiSeq se han depositado en GEO (GSE119767; https://www.ncbi. nlm.nih.gov/geo/).

¿Cuántos casos graves de enfermedades relacionadas con la gripe se informan al año?

La secuenciación profunda de células epiteliales pulmonares humanas primarias desafiadas con el virus de la gripe H5N1 revela un papel proviral para CEACAM1https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6195505/SHA: ef58c6e981a08c85d2c0efb80e5b32b075f660b4Autores: Ye, Siying; Cowled, Christopher J.; Yap, Cheng-Hon; Stambas, JohnFecha: 2018-10-19DOI: 10.1038/s41598-018-336605-6Licencia: cc-byAbstract: Las actuales estrategias profilácticas y terapéuticas dirigidas a los virus de la gripe humana incluyen vacunas y antivirales. Dadas las tasas variables Aquí se describe el uso de la secuenciación profunda de HiSeq para analizar la expresión génica del huésped en células epiteliales alveolares primarias humanas de tipo II infectadas con el virus H5N1 de la gripe aviar altamente patógena. A las 24 horas de la infección, 623 genes hospedantes fueron significativamente regulados, incluyendo la molécula de adhesión celular CEACAM1. La infección por el virus H5N1 estimuló significativamente la expresión proteica CEACAM1 en comparación con el virus influenza A PR8 (H1N1), sugiriendo un papel clave para CEACAM1 en la patogenicidad del virus influenza. Además, el silenciamiento de CEACAM1 endógeno resultó en niveles reducidos de producción proinflamatoria citoquina/quimoquina, así como en niveles reducidos de replicación viral después de la infección H5N1. Texto: Los virus de la gripe causan enfermedades respiratorias estacionales agudas y altamente contagiosas en todos los grupos de edad. Entre 3 y 5 millones de casos de enfermedad grave relacionada con la gripe y más de 250 000 muertes cada año. Además de los brotes estacionales constantes, las cepas de gripe aviar altamente patógena (IAAP), como la H5N1, siguen siendo una amenaza pandémica constante, con cifras recientes de la OMS que muestran 454 infecciones de laboratorio confirmadas y una tasa de mortalidad del 53%. Es importante señalar que los seres humanos tienen muy poca inmunidad preexistente contra las cepas del virus de la gripe aviar. Además, no existe una vacuna H5N1 humana comercialmente disponible. Dado el potencial de los virus H5N1 para desencadenar una pandemia 1,2, existe una necesidad urgente de desarrollar nuevas intervenciones terapéuticas para combatir las deficiencias conocidas en nuestra capacidad de controlar los brotes. La eficacia de la vacuna es altamente variable, como lo demuestra una epidemia particularmente grave de 2017/18, y se requiere una reformulación frecuente de la vacuna para combatir las mutaciones en curso en el genoma del virus de la gripe. Además, se ha reportado resistencia antiviral para muchas cepas circulantes, incluyendo el virus de la gripe aviar H7N9 que emergió en 2013 3, 4. También se ha demostrado que los virus de la gripe A apuntan y secuestran múltiples vías celulares del huésped para promover la supervivencia y replicación 5, 6. Como tal, hay evidencia creciente que sugiere que la focalización de las vías del huésped influirá en la replicación del virus, la inflamación, la inmunidad y la patología 5, 7. Las estrategias de intervención alternativas basadas en la modulación de la respuesta del huésped podrían utilizarse para complementar los actuales protocolos profilácticos y terapéuticos. En el presente estudio, caracterizamos la infección por el virus de la gripe de células epiteliales alveolares primarias humanas de tipo II (ATII) aisladas del tejido pulmonar humano normal donadas por pacientes sometidos a resección pulmonar. Las células ATII son un modelo de infección fisiológicamente relevante ya que son un objetivo principal para los virus de la gripe A al entrar en el tracto respiratorio 10. Expresión del gen huésped humano tras la infección por el virus HPAI H5N1 (A/Chicken/ Vietnam/0008/04) de las células ATII primarias se analizó utilizando la secuenciación profunda de Ilumina HiSeq. Con el fin de obtener una mejor comprensión de los mecanismos subyacentes a la modulación de la inmunidad del huésped en un entorno antiinflamatorio, también analizamos los cambios en la expresión génica tras la infección por HPAI H5N1 en presencia del inhibidor de la especie de oxígeno reactivo (ROS), apo El análisis HiSeq descrito aquí se ha centrado en genes regulados diferencialmente después de la infección por H5N1. Se consideraron varios criterios al elegir un "hit" para estudios posteriores. Estos incluyen: (1) Novedad; ¿se ha estudiado este gen antes en el contexto de la infección por virus influenza/ patogénesis? (2) Inmunregulación; ¿tiene este gen un papel regulador en las respuestas inmunitarias del huésped para que tenga el potencial de ser manipulado para mejorar la inmunidad? (3) Reactivos terapéuticos; ¿existen reactivos terapéuticos disponibles comercialmente, tales como inhibidores específicos o anticuerpos inhibidores que puedan ser utilizados para estudios in vitro e in vivo para optimizar estrategias terapéuticas? (4) Modelos animales; ¿existe un modelo de ratón knock-out disponible para estudios in vivo de infección por gripe? Basado en estos criterios, la molécula de adhesión celular relacionada con carcinoembrión-antigeno (CEA) 1 (CEAC CEACAM1 (también conocido como BGP o CD66) se expresa en células epiteliales y endoteliales 11, así como células B, células T, neutrófilos, células NK, macrófagos y células dendríticas (DC) [12] [13] [14]. Se ha demostrado que el CEACAM1 humano actúa como receptor de varios patógenos bacterianos y fúngicos humanos, entre ellos Haemophilus influenza, Escherichia coli, Salmonella typhi y Candida albicans, pero todavía no se ha implicado en la entrada del virus [15] [16] [17]. Sin embargo, hay evidencia emergente que sugiere que el CEACAM1 está involucrado en la inmunidad del huésped ya que se detectó una mayor expresión en linfocitos en mujeres embarazadas infectadas con citomegalovirus 18 y en tejido cervical aislado de Se han notificado 11 variantes de empalme CEACAM1 en humanos 20. Las isoformas CEACAM1 (Uniprot P13688-1 a -11) pueden diferir en el número de dominios similares a inmunoglobulinas presentes, en presencia o ausencia de un dominio transmembrana y/o la longitud de su cola citoplasmática (es decir, L, larga o S, corta). La proteína CEACAM1 humana de larga duración (CEACAM1-4L) consiste en cuatro dominios extracelulares (un dominio de inmunoglobulina variable similar a la región IgV) y tres dominios constantes de inmunoglobulina 2-como (IgC2)), un dominio transmembrana y una larga cola citoplasmática. La cola citoplasmática larga contiene dos motivos inhibidores a base de inmunorreceptores (ITIM) que están ausentes en la forma corta 20. Las isoformas más comunes expresadas por las células inmunes humanas son CEACAM1-4L y CEACAM1-3L 21. CEACAM1 interactúa homofílicamente consigo mismo 22 o heterofílicamente con CEACAM5 (un miembro relacionado de la familia CEACAM) 23. El estado dimérico permite el reclutamiento de moléculas de señalización como las cinasas SRC-familiar, incluyendo la homología SRC tirosina fosfatasa 2 (SH2)-dominio que contiene proteína tirosina fosfatasa 1 (SHP1) y SHP2 miembros para fosforilar las ITIMs 24. Como tal, la presencia o ausencia de ÍTIMes en las isoformas CEACAM1 influye en las propiedades de señalización y la función celular aguas abajo. Las interacciones homofílicas o heterofílicas CEACAM1 y la fosforilación ITIM son críticas para muchos procesos biológicos, incluyendo la regulación de la función linfocítica, inmunovigilancia, crecimiento celular y diferenciación 25, 26 y activación de neutrófilos y adhesión a las células diana durante las respuestas inflamatorias 27. Cabe señalar que la expresión CEACAM1 ha sido modulada in vivo utilizando un anticuerpo anti-CEACAM1 (MRG1) para inhibir el crecimiento de melanoma xenoinjerto positivo CEACAM1 en ratones SCID/NOD 28. Esto pone de relieve una vía de intervención potencial que puede ser explotada en otros procesos de la enfermedad, incluyendo la infección por virus. Además, los ratones Ceacam1-knockout están disponibles para estudios posteriores de infección in vivo. Nuestros resultados muestran que los niveles de ARNm y expresión proteica CEACAM1 fueron altamente elevados después de la infección por HPAI H5N1. Además, la inhibición del ARN interferente pequeño (siRNA) mediada por CEACAM1 redujo la producción de citocinas inflamatorias y quimioquinas, y más importante aún, inhibió la replicación del virus H5N1 en células ATII humanas primarias y en la línea de células epiteliales respiratorias A549 de tipo humano continuo. Tomadas en conjunto, estas observaciones sugieren que CEACAM1 es un candidato atractivo para modular la inmunidad específica de la gripe. En resumen, nuestro estudio ha identificado un nuevo objetivo que puede influir en la inmunidad HPAI H5N1 y sirve para resaltar la importancia de manipular las respuestas del huésped como una forma de mejorar los resultados de la enfermedad en el contexto de la infección por virus.Tres grupos experimentales fueron incluidos en el análisis HiSeq de la infección por H5N1 en presencia o ausencia del inhibidor de ROS, apocinina: (i) células no infectadas tratadas con DMSO 1% (control de vehículos) (ND), (ii) células infectadas por H5N1 tratadas con DMSO 1% (HD) y (iii) células infectadas por H5N1 tratadas con apocinina 1 mM disuelta en DMSO (HA). Estos tres grupos fueron evaluados mediante comparaciones de pares: ND vs. HD, ND vs. HA, y HD vs. HA. La infección por H5N1 y el tratamiento con apocinina Las células ATII aisladas de los pacientes humanos 29, 30 fueron infectadas con H5N1 en el lado apical a una multiplicidad de infección (MOI) de 2 durante 24 horas y se extrajo ARN. HiSeq fue realizado en muestras y se lea cartografiado al genoma humano donde luego fueron ensamblados en transcriptomas para análisis de expresión diferencial. Un total de 13.649 genes fueron identificados con FPKM (fragmentos por kilobase de exón por millón de fragmentos mapeados) > 1 en al menos uno de los tres grupos experimentales. Un total de 623 genes fueron significativamente regulados y 239 genes fueron significativamente regulados (valor q < 0,05, ≥ 2 veces el cambio) después de la infección por H5N1 (ND vs. HD) (fig. 1A; Tabla S1 ). La infección por HPAI H5N1 de las células ATII activó un estado antiviral, como lo demuestra la regulación ascendente de numerosos genes inducidos por interferón, genes asociados con la defensa de los patógenos, proliferación celular, apoptosis y metabolismo (Tabla 1; Tabla S2 ). Además, la cartografía de la ruta de la Enciclopedia de los genes y los genomas de Kyoto (KEGG) mostró que muchos de los genes regulados en el grupo HD se asignaron a la señalización del TNF (hsa04668), señalización de receptores similares a los de los peajes (hsa04620), interacción citoquina-citoquina del receptor (hsa04060) y señalización del receptor tipo RIG-I (hsa04622) (en el grupo tratado con H5N1 y apocinina (HA), un gran número de genes también fueron significativamente regulados (509 genes 1B ; Tabla S1 ) relativa al grupo de control de la ND. Aunque un subconjunto de genes se expresó de manera diferencial en los grupos HD y HA, ya sea siendo regulados de forma ascendente (247 genes, Fig. 1D ) o desregulados (146 genes, Fig. 1E ), la mayoría de los genes no se superpusieron de hecho entre los grupos HD y HA (Fig. 1D, E). Esto sugiere que el tratamiento con apocinina puede afectar a la expresión génica independiente de la infección H5N1. El análisis de enriquecimiento de genes regulados por la apocinina mostró la implicación de la vía de señalización del interferón tipo I (GO:0060337), la respuesta defensiva al virus (GO:0009615), la regulación negativa de los procesos virales (GO:48525) y la respuesta al estrés (GO:0006950) ( Tabla S2 Los genes regulados por la apocinina incluyen aquellos que están involucrados en la adhesión celular (GO:0007155), la regulación de la migración celular (GO:0030334), la regulación de la proliferación celular (GO:0042127), la transducción de señales (GO:0007165) y los procesos de oxidación-reducción (GO:0055114) (Tabla S2, "ND vs. HA Down"). Un total de 623 genes fueron regulados después de la infección por H5N1 ("ND vs. HD Up", Fig. 1F ). Al solapar las dos listas de genes de "ND vs. HD Up" y "HD vs. HA Down", 245 genes se mostraron regulados en presencia de apocinina (Fig. 1F ). Al superponer tres listas de genes de "ND vs. HD Up", "HD vs. HA Down" y "ND vs. HA Up", 55 genes de los 245 genes (190 más 55 genes) estuvieron presentes en las tres listas (Fig. 1G), lo que indica que estos 55 genes fueron significativamente inhibidos por la apocinina, pero a un nivel que todavía era significativamente más alto que el de las células no infectadas. Los 55 genes incluyen aquellos involucrados en la inmunidad de influenza A (hsa05164; DDX58, IFIH1, IFNB1, MYD88, PML, STAT2), señalización de Jak-STAT (hsa04630; IFNB1, IL15RA, IL22RA1, STAT2), señalización de receptores tipo RIG-I (hsa04622; DDX58, IFIH1, IFNB1) y procesamiento y presentación de antígenos (hsa04612; TAP2, TAP1, HLA-DOB) (Tablas S3 y S4). Por lo tanto, las respuestas inmunológicas críticas inducidas después de la infección por H5N1 no fueron amortiguadas después del tratamiento con apocinina. Los 190 genes restantes de 245 no estaban presentes en la lista "ND vs. HA Up", lo que sugiere que esos genes fueron significativamente inhibidos por la apocinina a un nivel similar a las células de control no infectadas (Fig. 1G ). Los 190 genes incluyen los que participan en la señalización del TNF (hsa04668; CASP10, CCL2, CCL5, CFLAR, CXCL5, END1, IL6, TRAF1, VEGFC), interacción del receptor de citoquinas-citoquinas (hsa04060; VEGFC, IL6, CCL2, CXCL5, CXCL16, IL2RG, CD40, CCL5, CCL7, IL1A), vía de señalización del NF-kappa B (hsa04064: TRAF1, CFLAR, CARD11, TNFSF13B, TICAM1, CD40) y señalización del PI3K-Akt (hsa04151; CCND1, GNB4, IL2RG, IL6, ITGA2, JAK2, LAMA1, MYC, IPK3AP1, Esto es consistente con el papel de la apocinina en la reducción de la inflamación 31. Al superponer las tres listas de genes de "ND vs. HD Up", "HD vs. HA Down" y "ND vs. HA Down", se encontraron 11 genes en las tres comparaciones (Fig. 1H ). Esto sugiere que estos 11 genes están regulados después de la infección por H5N1 y son significativamente reducidos por el tratamiento con apocinina a un nivel inferior al observado en las células de control no infectadas (Fig. 1H ). Entre ellos estaban los genes inflamatorios citoquinas/quimioquinas, incluyendo CXCL5, IL1A, AXL (miembro de la familia de receptores TAM de tirosina quinasas) y TMEM173/STING (estimulador de los genes IFN) (Tabla S4). Nuestro estudio anterior demostró que la infección por H5N1 de células A549 en presencia de apocinina realzó la expresión de reguladores negativos de la señalización de citocinas (SOCS), SOCS1 y SOCS3 6. Esto, a su vez, dio lugar a una reducción de la producción de citocinas y quimioquinas estimuladas por H5N1 (IL6, IFNB1, CXCL10 y CCL5 en células A549), que no se atribuyó a una menor replicación del virus ya que los títulos del virus no se vieron afectados por el tratamiento con apocinina 6. Realizamos un análisis qRT-PCR sobre las mismas muestras de ARN presentadas para el análisis HiSeq para validar los resultados de HiSeq. IL6 (fig. 2A), IFNB1 (fig. 2B), CXCL10 (fig. 2 2D ) la expresión génica fue significativamente elevada en las células ATII después de la infección y se redujo por la adición de apocinina (excepto para IFNB1). De acuerdo con hallazgos previos en las células A549 6, la infección por H5N1 solo indujo la expresión de SOCS1 como se muestra en el análisis HiSeq y qRT-PCR (Fig. 2E ). El tratamiento con apocinina aumentó aún más la expresión de SOCS1 mRNA (Fig. 2E ). Aunque el análisis de HiSeq no detectó un aumento estadísticamente significativo de SOCS1 tras el tratamiento con apocinina, los cambios de pliegue de Log2 en la expresión génica de SOCS1 fueron similares entre los grupos HD y HA (4,8 veces frente a 4,0 veces) (Fig. 2E ). El análisis de HiSeq de la transcripción de El análisis de qRT-PCR mostró que aunque el ARNm SOCS3 fue ligeramente aumentado después de la infección por H5N1, fue significativamente mejor regulado en la presencia Tabla 2. Los representantes de las vías de KEGG sobrerrepresentadas con un valor máximo de P de 0,05 y el número de genes que contribuyen a cada vía que se regula significativamente después de la infección por H5N1 ("ND vs. HD Up"). La lista completa de vías de KEGG se presenta en la Tabla S3. de apocinina (Fig. 2F). Por lo tanto, la apocinina también contribuye a la reducción de la producción de citoquinas y quimioquinas estimuladas por H5N1 en las células ATII. Apocinina, un compuesto que inhibe la producción de ROS, ha demostrado influir en las respuestas específicas de la gripe in vitro 6 e in vivo 5. Aunque los títulos del virus no se ven afectados por el tratamiento con apocinina in vitro 6, se observa cierta actividad antiviral in vivo cuando los ratones han sido infectados con un virus A/HongKong/X31 H3N2 de baja patogenicidad 6. HiSeq análisis del virus HPAI H5N1 transcripción del gen mostró que aunque hubo una tendencia al aumento de la expresión del virus de la gripe tras el tratamiento con apocinina, sólo la expresión del gen influenza no estructural (NS) aumentó significativamente (Fig. 2G). La reducción de la producción de citoquinas y quimioquinas en las células ATII infectadas por H5N1 es poco probable que se asocie con una menor replicación del virus. El análisis de enriquecimiento del GO se realizó en genes que se mejoraron significativamente después de la infección por HPAI H5N1 en células ATII en presencia Muchos de los genes regulados por H5N1 participaron ampliamente en la respuesta defensiva (GO:0006952), la respuesta al estímulo biótico externo (GO:0043207), los procesos del sistema inmunitario (GO:0002376), la vía de señalización mediada por citoquinas (GO:0019221) y la vía de señalización del interferón tipo I (GO:0060337) (Tabla 1; Tabla S2 ). Además, muchos de los genes regulados por H5N1 se asignaron a las vías metabólicas (hsa01100), la interacción del receptor citoquina-citoquina (hsa04060), la gripe A (hsa05164), la señalización del TNF (hsa04668) o la señalización del Jak-STAT (hsa04630) (Tabla S3). Sin embargo, no todos los genes regulados por H5N1 en estas vías fueron inhibidos por el tratamiento con apocinina como se mencionó anteriormente (fig. 1F ; Tabla S3 ).. Los cambios de plegado después del análisis QRT-PCR se calcularon utilizando el método 2 Ct (eje Y derecho) normalizado a β-actina y comparado con el grupo ND. Los datos de HiSeq se calcularon como cambio de plegado Log2 (eje Y izquierdo) comparado con el grupo ND. La transcripción IFNB1 no fue detectada en ND, por lo tanto los datos de HiSeq IFNB1 de los grupos HD y HA se expresaron como FPKM. *p < 0,05 y **p < 0,01, ***p < 0,001 comparado con ND; # p < 0,05, ## p < 0,01, comparado (G) Análisis Hiseq de perfiles de expresión génica del virus de la gripe H5N1 con o sin tratamiento de apocinina en células ATI primarias humanas. # p < 0,05, en comparación con HD. Reregulación de la molécula de adhesión celular CEACAM1 en células ATI infectadas por H5N1. La molécula de adhesión celular CEACAM1 ha demostrado ser crítica para la regulación de las respuestas inmunitarias durante la infección, inflamación y cáncer 20. La transcripción de CEACAM1 fue significativamente regulada después de la infección por H5N1 (Fig. 3A). En contraste, un miembro relacionado de la familia CEACAM, CEACAM5, no se vio afectado por la infección por H5N1 (Fig. 3B). También vale la pena señalar que se obtuvieron más lecturas para CEACAM5 (>1000 FPKM) (Fi 3B ) que CEACAM1 (~7 FPKM) (Fig. 3A) en células ATII no infectadas, lo cual es consistente con sus patrones de expresión normales en el tejido pulmonar humano 32. Por lo tanto, aunque CEACAM1 forma heterodímeros con CEACAM5 23, la expresión basal más alta de CEACAM5 en células ATII puede explicar por qué su expresión no fue aumentada por la infección por H5N1. La expresión proteica CEACAM1 endógena también fue analizada en células A549 no infectadas o infectadas por el virus influenza (Fig. 3C ) y ATII (Fig. 3D ). La expresión proteica CEACAM1 fue leve, pero no significativamente aumentada en células A549 infectadas por el virus A/Puerto Rico/8/1934 H1N1 (PR8) durante 24 o 48 horas No se observaron diferencias significativas en los niveles de proteína CEACAM1 en varios MOI (2, 5 ó 10) o entre los plazos de 24 y 48 hpi (fig. 3C). Después de examinar la expresión proteica CEACAM1 después de la infección por el virus PR8 en células A549, se examinó la expresión proteica CEACAM1 en células AII humanas primarias infectadas con HPAI H5N1 y en comparación con la infección por el virus PR8 (fig. 3D). Las células ATII fueron infectadas con el virus PR8 a un MOI de 2, una dosis que indujo la regulación ascendente de citocinas y el gen Matrix (M) de influenza analizado por qRT-PCR (datos no mostrados). Los niveles de proteína CEACAM1 endógena fueron significativamente elevados y similares en las células ATII infectadas por H5N1 en los tres MOI analizados. La expresión de proteína CEACAM1 en las células ATII infectadas por H5N1 en los MOI de 0,5 fue mayor a 48 hpi que en las observadas a 24 hpi (fig. 3D ). La infección por el virus HPAI H5N1 en los MOI de 0,5, 1 y 2 estimuló niveles endógenos más altos de expresión proteica de CEACAM1 en comparación con la infección por el virus PR8 en un MOI de 2 en el momento correspondiente (un aumento máximo de ~9 veces inducido por H5N1 en los MOI de 0,5 y 1 a 48 hpi en comparación con PR8 en el MOI de 2), sugiriendo un posible papel para CEACAM1 en la patogenicidad del Para entender el papel de CEACAM1 en la patogénesis de la gripe, las células A549 y ATII fueron transfectadas con siCEACAM1 para desmontar la expresión proteica endógena de CEACAM1. Las células ATII y A549 fueron transfectadas con siCEACAM1 o control negativo de siNeg. La expresión de cuatro variantes principales de CEACAM1, CEACAM1-4L, -4S, -3L y -3S, y proteína CEACAM1 fueron analizadas utilizando SYBR Green qRT-PCR y Western blotting, respectivamente. El análisis de SYBR Green qRT-PCR mostró que las células ATII transfectadas con 15 pmol de siCEACAM1 redujeron significativamente la expresión de CEACAM1-4L y -4S en comparación con el control de siNeg, mientras que la expresión de CE La expresión proteica CEACAM1 se redujo aproximadamente en un 50% en las células ATII y A549 después de la transfección de siCEACAM1 en comparación con las células transfectadas por siNeg (Fig. 4B). El aumento de dosis de siCEACAM1 (10, 15 y 20 pmol) no redujo aún más la expresión proteica CEACAM1 en las células A549 (Fig. 4B ). Como tal, se eligieron 15 pmol de siCEACAM1 para estudios posteriores de caída en las células ATII y A549. Es importante destacar que el anticuerpo anti-CEACAM1 solo detecta isoformas L basadas en la información epítope proporcionada por Abcam. Por lo tanto, las reducciones observadas en la expresión proteica CEACAM1 se pueden atribuir principalmente a la abolición de CEACAM1-4L. Las consecuencias funcionales de la caída de CEACAM1 fueron examinadas en las células ATII y A549 después de la infección por H5N1. IL6, IFNB1, CXCL10, CCL5 y TNF fueron analizadas en las células ATII infectadas por H5N1 y A549 usando qRT-PCR. ATII (Fig. 5A ) y A549 células transfectadas con siCEACAM1 mostraron una expresión significativamente menor de IL6, CXCL10 y CCL5 en comparación con las células transfectadas por siNeg. Sin embargo, la expresión de la citocina antiviral, IFNB1, no se vio afectada en ambos tipos de células. Además, la expresión TNF, que puede ser inducida por IFNs de tipo I 33, fue significativamente menor en las células A549 transfectadas por siCEACAM1 (Fig. 5B), pero no se afectó en las células ATII transfectadas por siCEACAM1 (fig. 5A). Se cree que la hipercitokinemia o "tormenta de citoquinas" en los pacientes infectados por el virus H5N1 y H7N9 contribuye al daño tisular inflamatorio 34, 35. La disminución de CEACAM1 en el contexto de una infección viral grave puede reducir la inflamación causada por la infección por H5N1 sin amortiguar la respuesta antiviral. Además, la replicación del virus se redujo significativamente en 5,2 veces en ATII (fig. 5C) y 4,8 veces en células A549 (fig. 5D) transfectadas con siCEACAM1 en comparación con las células transfectadas por siNeg. 5C,D). Los virus de la gripe utilizan maquinaria celular huésped para manipular procesos celulares normales con el fin de promover la replicación y evadir las respuestas inmunes del huésped. Los estudios en el campo se centran cada vez más en la comprensión y modificación de los factores principales del huésped para mejorar la enfermedad. Ejemplos incluyen modulación de ROS para reducir la inflamación 5 e inhibición de NF-B y activación mitogénica de Raf/MEK/ERK cinasa en cascada para suprimir la replicación viral 36, 37. Estas estrategias de enfoque del huésped ofrecerán una alternativa a las intervenciones actuales que se centran en dirigir el virus. En el presente estudio, analizamos perfiles de expresión génica del huésped humano después de la infección por HPAI H5N1 y tratamiento con el antioxidante, apocinina. Como era de esperar, genes que fueron significativamente regulados después de la infección H5N1 estuvieron involucrados en procesos biológicos Además, los genes regulados por H5N1 también participaron en la regulación de la fosforilación proteica, el metabolismo celular y la proliferación celular, que se cree que son explotados por virus para la replicación 38. El tratamiento con apocinina tuvo tanto antiviral (Tablas S2-S4) 5 como proviral impacto (Fig. 2G), lo que no es sorprendente ya que los ROS son potentes agentes microbicidas, así como importantes moléculas de señalización inmune en diferentes concentraciones 39. En nuestras manos, el tratamiento con apocinina redujo la inflamación inducida por H5N1, pero también impactó la respuesta de defensa celular, la producción de citocinas y la señalización mediada por citoquinas. DDX58 (RIG-I), TLRs, IFIH1 (MDA5) no fue desregulado (Tabla S1 ). Dada la interferencia significativa de los virus de la gripe en la inmunidad del huésped, centramos nuestra atención en los reguladores clave de la respuesta inmunitaria. Mediante el análisis HiSeq, identificamos la molécula de adhesión celular CEACAM1 como un regulador crítico de la inmunidad. La caída de CEACAM1 inhibió la replicación del virus H5N1 y redujo la producción de citoquinas inflamatorias/quimioquinas estimuladas por H5N1. La infección por H5N1 dio lugar a una regulación significativa de varios genes citoquinas/quimioquinas inflamatorias, incluyendo AXL y STING, que fueron significativamente reducidos por el tratamiento con apocinina a un nivel inferior al observado en células no infectadas (Tabla S Se ha demostrado previamente que el tratamiento con anticuerpos anti-AXL de ratones infectados por PR8 redujo significativamente la inflamación pulmonar y los títulos de virus 40. STING ha demostrado ser importante para promover las respuestas antivirales, ya que las células STING-knockout TPH-1 producen menos IFN de tipo I después de la infección por el virus influenza A 41. La reducción de la expresión del gen STING u otros factores antivirales (por ejemplo, IFNB1, MX1, ISG15; Tabla S1 ) por apocinina, puede explicar en parte el ligero aumento de la transcripción del gen influenza después del tratamiento con apocinina (Fig. 2G). Estos resultados también sugieren que el tratamiento con apocinina puede reducir la inflamación inducida por H5N1 y la apoptosis. De hecho, los efectos antiinflamatorios y antiapoptóticos de la apocinina han sido mostrados previamente en varios modelos de enfermedad, incluyendo diabetes mellitus 42, infarto de miocardio 43, neuroinflamación 44 e infección por el virus de la gripe 6. El reconocimiento del ARN viral intracelular por receptores de reconocimiento de patrones (PRRs) desencadena la liberación de citoquinas/quimioquinas proinflamatorias que reclutan células inmunes innatas, tales como neutrófilos y células NK, al sitio de la infección para ayudar en el aclaramiento viral 45. Los neutrófilos ejercen su función citotóxica al unirse primero a células epiteliales infectadas por gripe a través de moléculas de adhesión, como CEACAM1 46. Además, estudios han indicado que la infección por virus de gripe promueve la apoptosis de neutrófilos 47, La fosforilación de los motivos de CEACAM1 ITIM y la activación de caspasa-3 es fundamental para mediar los eventos antiapoptóticos y para promover la supervivencia de los neutrófilos 27. Esto sugiere que los eventos antiapoptóticos mediados por CEACAM1 pueden ser importantes para la resolución in vivo de la infección por el virus de la gripe, que pueden investigarse más a fondo a través de estudios de infección con ratones Ceacam1-knockout. Las células NK desempeñan un papel crítico en la defensa innata contra los virus de la gripe al reconocer y matar las células infectadas. Se ha demostrado que las interacciones homo-o heterofílicas CEACAM1 inhiben la eliminación de NK 25, 26, y se cree que contribuyen a la evasión inmune de células tumorales 50. Ante estos hallazgos, se podría sugerir la posibilidad de que la regulación de CEACAM1 (para inhibir la actividad de NK) pueda ser una estrategia de evasión inmune novedosa y no característica empleada por virus de la gripe. Nuestro laboratorio está investigando ahora el papel de CEACAM1 en la función celular de NK. Inhibidores de pequeñas moléculas de proteínas cinasas o fosfatasas proteicas (por ejemplo, inhibidores para Src, JAK, SHP2) se han desarrollado como terapias para el cáncer, inflamación, enfermedades inmunitarias y metabólicas 51. Modulación de la fosforilación, dimerización CEACAM1 y la función posterior con inhibidores de moléculas El mecanismo molecular de la acción CEACAM1 después de la infección también ha sido explorado en células A549 utilizando el virus PR8 52. Vitenshtein et al. demostraron que CEACAM1 fue regulado después del reconocimiento del ARN viral por RIG-I, y que esta regulación era dependiente del factor 3 regulador del interferón (IRF3). Además, la fosforilación de CEACAM1 por SHP2 inhibió la replicación viral al reducir la fosforilación del objetivo mamífero de la rapamicina (mTOR) para suprimir la producción global de proteínas celulares. En el presente estudio, utilizamos un modelo de infección más relevante fisiológicamente, células ATII humanas primarias, para estudiar el papel de otros estudios se requerirá investigar/confirmar los mecanismos moleculares de CEACAM1 upregulation después de la infección del virus influenza, especialmente in vivo. Como se ha observado un aumento de la regulación de CEACAM1 en otras infecciones virales, como el citomegalovirus 18 y el papilomavirus 19, será importante determinar si un mecanismo de acción común puede ser atribuido a CEACAM1 para determinar su significación funcional. Si esto se puede establecer, CEACAM1 podría ser utilizado como objetivo para el desarrollo de un agente pan-antiviral. En resumen, moléculas en la superficie celular como CEACAM1 son particularmente atractivas candidatas para el desarrollo terapéutico, ya que los fármacos no necesitan cruzar la membrana celular para ser eficaces. La focalización de genes codificados por el huésped en combinación con antivirales y vacunas actuales puede ser una forma de reducir la morbilidad y mortalidad asociadas a la infección por el virus de la gripe. Es importante destacar que la reducción de la expresión CEACAM1 dio lugar a una reducción de la replicación del virus de la gripe y sugiere que la selección de esta molécula puede ayudar a mejorar los resultados de la enfermedad. El aislamiento y cultivo de células ATII humanas primarias. Las muestras de tejido pulmonar no tumoral humano fueron donadas por pacientes anónimos sometidos a resección pulmonar en el Hospital Universitario, Geelong, Australia. Los protocolos de investigación y ética humana fueron aprobados por los Comités de Ética Humana de la Universidad Deakin, Barwon Health y la Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization (CSIRO). Se obtuvo el consentimiento informado de todos los donantes de tejido. Todas las investigaciones se realizaron de acuerdo con las directrices establecidas en la Declaración Nacional sobre Conducta Ética en la Investigación Humana (2007). El muestreo de tejido pulmonar normal fue confirmado por el Victorian Cancer Biobank, Australia. Las células epiteliales alveolares humanas tipo II (ATII) fueron aisladas y cultivadas utilizando un método descrito previamente 30, 53 con modificaciones menores. Brevemente, el tejido pulmonar con bronquios visibles fue extirpado y perfundido con abundante PBS y sumergido en Trypsin-EDTA (Gibco) dos veces durante 15 minutos a 37 °C. El tejido parcialmente digerido fue cortado en secciones y digerido posteriormente en la Solución Sal Balanzada de Hank (HBSS) que contenía elastasa (12,9 unidades/ml; Roche Diagnostics) y Dnasa I (0,5 mg/ml; Roche Diagnostics) durante 60 minutos a 37 °C. Se obtuvieron suspensiones unicelulares por filtración a través de un colador de células de 40 μm y se permitió que las células (incluyendo macrófagos y fibroblastos) se unieran a platos de Petri tratados con cultivos tisulares en una mezcla 1:1 de medio DMEM/F12 (Gibco) y medio de crecimiento de la vía aérea pequeña (SAGM) (Lonza) que contenía 5% de suero fetal de ternera (FCS) y 0,5 mg/ml de Dnasa I durante 2 horas a 37 °C. Se recogieron células no adherentes, incluyendo células ATII, y se sometieron a centrifugación a 300 g durante 20 minutos en un gradiente discontinua de densidad de Percoll (1,089 y 1,040 g/ml). Se recogieron células ATII purificadas de la interfaz de dos gradientes de densidad, lavadas en HBSS y resuspendidas en medio SAGM suplementadas con un 1% de FCS filtrados por carbón (Gibco) y 100 unidades/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina (Gibco). Las células ATII fueron chapadas en inserciones Transwell de poliéster (0,4 μm de poro; Corning) recubiertas de colágeno de placenta humana de tipo IV (0,05 mg/ml; Sigma) a 300.000 células/cm 2 y cultivadas bajo condiciones cubiertas de líquido en una incubadora humidificada (5% CO 2, 37 °C). El medio de crecimiento se cambió cada 48 horas. Estas condiciones de cultivo suprimieron la expansión de fibroblastos dentro de las células ATII recién aisladas y alentaron A549 células basales alveolares alveolares humanas carcinómicas tipo II y células de riñón canino Madin-Darby (MDCK) fueron provistas por la instalación de cultivo de tejidos del Laboratorio Australiano de Salud Animal (AAHL), CSIRO. Las células A549 y MDCK se mantuvieron en el medio F12K de Ham (GIBCO) y en el medio RPMI-1640 (Invitrogen), respectivamente, complementadas con 10% FCS, 100 U/ml penicilina y 100 μg/ml estreptomicina (GIBCO) y mantenidas a 37 °C, 5% CO 2. Virus e infección viral. HPAI A/chicken/Vietnam/0008/2004 H5N1 (H5N1) se obtuvo de AAHL, CSIRO. Las existencias virales de A/Puerto Rico/8/1934 H1N1 (PR8) se obtuvieron de la Universidad de Melbourne. Las existencias virales se prepararon utilizando la inoculación estándar de huevos embrionados de 10 días de edad. Se preparó un único stock de virus para su uso en todos los ensayos. Todos los experimentos con H5N1 se realizaron en laboratorios de nivel de bioseguridad 3 (BSL3) en AAHL, CSIRO. Las células fueron infectadas con virus influenza A como se describió anteriormente 6, 29. Brevemente, los medios de cultivo fueron eliminados y las células fueron lavadas con PBS caliente tres veces seguidas de inoculación con virus durante 1 hora. Luego se extirparon los virus y las células fueron lavadas con PBS caliente tres veces, e incubadas en los medios de cultivo frescos libres de suero apropiado que contenían 0,3% BSA a 37 ° Para el análisis de HiSeq, las células ATII de tres donantes fueron infectadas en el lado apical con H5N1 en un MOI de 2 durante 24 horas en un medio SAGM libre de suero, suplementadas con albúmina sérica bovina de 0,3% (BSA) que contenía 1 mM de apocinina disuelta en DMSO o 1% de control del vehículo DMSO. Las células ATII incubadas en medios que contenían 1% de DMSO fueron utilizadas como control negativo. Para otros estudios de infección viral posteriores, células ATII de un conjunto diferente de tres donantes (diferentes de los utilizados en el análisis de HiSeq) o células A549 de al menos tres pasajes diferentes fueron infectadas con virus influenza A en varios MOIs, como se indica en el texto. Para los estudios de infección por PR8, se incluyó una concentración final de 0,5 μg/ml L-1-Tosylamida-2-feniletilclorometilcetona (TPCK) tratada con tripsina (Worthington) en los medios de comunicación post-inoculación para ayudar a la replicación. Los títulos de virus se determinaron utilizando ensayos de placa estándar en células MDCK como se describió anteriormente 55. Extracción de ARN, control de calidad (QC) e HiSeq análisis. Las células ATII de tres donantes se utilizaron para el análisis de HiSeq. El ARN total se extrajo de las células utilizando un kit RNeasy Mini (Qiagen). Las células infectadas por gripe se lavaron con PBS tres veces y las células se lisaron con tampón RLT complementado con β-mercaptoetanol (10 μL/ml; Gibco). Los lisatos celulares fueron homogeneizados con columnas QIAshredder seguidas de digestión del ADN en la columna con el conjunto de ADN libre de RNASA (Qiagen) y ARN extraídos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizó QC inicial para asegurar que la cantidad y calidad de las muestras de ARN para el análisis HiSeq cumplieran los siguientes criterios: 1) las muestras de ARN tenían relaciones OD260/280 entre 1,8 y 2,0 medida con el espectrofotómetro NanoDropTM (Termo Scientific); 2) las concentraciones de la muestra eran de 100 ng/μl como mínimo; 3) el ARN fue analizado por electroforesis de gel de agarosa. La integridad y calidad del ARN fueron validadas por la presencia de bandas claras agudas de 28S y 18S ARN ribosomal, con una relación 28S Como parte del QC inicial y como indicación de infección constante por H5N1, la PCR de transcriptasa inversa cuantitativa paralela en tiempo real (qRT-PCR) utilizando las mismas muestras de ARN utilizadas para el análisis de HiSeq se realizó en duplicado como se describió anteriormente 6 para medir la expresión de ARNm de IL6, IFNB1, CXCL10, CCL5, TNF, SOCS1 y SOCS3, todas las cuales se conocen por estar reguladas después de la infección por HPAI H5N1 de las células A549 6 Análisis de secuenciación y anotación. Después de confirmar las sumas de comprobación y evaluar la calidad de los datos brutos de los archivos FASTQ con FASTQC, las lecturas de ARN-Seq se procesaron de acuerdo con los protocolos estándar de tuberías Tuxedo 56, utilizando el genoma humano anotado (GRCh37, descargado de Brevemente, las lecturas crudas para cada muestra fueron cartografiadas al genoma humano usando TopHat2, ordenadas y convertidas al formato SAM usando Samtools y luego ensambladas en transcriptomas usando Cufflinks. Cuffmerge fue usado para combinar anotaciones de transcripción de muestras individuales en un único transcriptoma de referencia, y Cuffquant fue usado para obtener conteos de lectura por muestra. Cuffdiff fue usado para realizar análisis de expresión diferencial. Todos los programas fueron ejecutados usando parámetros recomendados. Es importante notar que el archivo gtf de referencia proporcionado a buffmerge fue editado primero usando un script de pitón personalizado para excluir líneas que contienen características distintas de exon/cds, y contigs distintos de cromosomas 1-22, X, Y. GO término y enriquecimiento de KEGG. Los identificadores de genes oficiales para transcripciones que fueron moduladas diferencialmente después de la infección por HPAI H5N1 con o sin tratamiento con apocinina se compilaron en seis listas de objetivos a partir de comparaciones de pares ("ND vs. HD Up", "ND vs. HD Down", "ND vs. HA Up", "HD vs. HA Up", "HD vs. HA Down"). Las transcripciones expresadas diferencialmente significativamente se definieron como si tuvieran un cambio ≥2 veces con un valor P ajustado de Benjamini-Hochberg < 0.01. Una lista de antecedentes de genes se compiló mediante la recuperación de todos los identificadores de genes identificados en el presente análisis HiSeq con FPKM > 1. El enriquecimiento del proceso biológico GO se realizó utilizando Gorilla, comparando el fondo no alineado y las listas de objetivos 57. Las listas de objetivos también fueron sometidas al análisis de la vía KEGG utilizando un mapeador básico de la vía KEGG 59 y DAVID Bioinformática Recursos Herramienta de Anotación Funcional 60,61. Reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). Las concentraciones de genes de interés de mRNA fueron evaluadas y analizadas utilizando qRT-PCR realizadas en duplicado como se describió anteriormente 6. Brevemente, después de la extracción de ARN total de células infectadas por la gripe, cDNA fue SCIEntIfIC RepoRtS (2018) 8:15468 DOI:10.1038/s41598-018-33605-6 preparado utilizando SuperScript TM III First-Strand Synthesis SuperMix (Invitrogen). La expresión génica de varias citocinas se evaluó utilizando ensayos de expresión génica TaqMan (Biosistemas aplicados) con imprimaciones y sondas comerciales TaqMan, con la excepción del gen Matrix (M) influenza (imprimación posterior 5′-CTTCTAACGAGGGAACGTA-3′; imprimación inversa 5′-GGTGAGGAGGGGTGTCTTGTCTTTA-3′; sonda 5′-FAM-TCAGGCCCTCAAAGCCGAG-NFQ-3′) 62. Los imprimadores específicos 63 (cuadro S5) fueron diseñados para estimar la expresión de CEACAM1-4L, -4S, -3L y -3S en células ATII y A549 utilizando iTaq Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La ausencia de amplificación inespecífica fue confirmada por electroforesis en gel de agarosa de productos QRT-PCR (15 μL) (datos no mostrados). La expresión génica se normalizó a ARNm de β-actina utilizando el método 2 CT donde se determinaron los niveles de expresión en relación con los controles celulares no infectados. Todos los ensayos se realizaron por duplicado utilizando un sistema de PCR Applied Biosystems ® StepOnePlus TM en tiempo real. Las cantidades iguales de proteína fueron cargadas en geles NuPAGE 4-12% Bis-Tris (Invitrogen), resueltas por SDS/PAGE y transferidas a membranas PVDF (Bio-Rad). Las membranas fueron sondeadas con anticuerpo monoclonal CEACAM1 anti-humano EPR4049 (ab108397, Abcam) seguido de anticuerpo secundario conjugado con HRP anti-rabbit de cabra (Invitrogen). Las proteínas fueron visualizadas mediante membranas incubadoras con Chemiluminiscence potenciado Pierce (ECL) Plus Western Blotting Substrate (Thermo Scientific) seguido de detección en un sistema de imágenes Bio-Rad ChemiDoc TM MP o en Amersham TM Hyperfilm TM ECL (GE Healthcare). Para usar la β-actina como control de carga, la misma membrana fue despojada en tampón de destripamiento (1,5% (p/v) glicina, 0,1% (p/v) SDS, 1% (v/v) Tween-20, pH 2.2) y re-probada con un anticuerpo monoclonal anti-β-actina conjugado con HRP en cada muestra, respectivamente. La densidad de la banda proteica se cuantificó utilizando el software Fiji (versión 1.49J10) 64. La densidad de la banda proteica CEACAM1 se normalizó contra la de β-actina y se expresó como cambios de pliegue en comparación con los controles. Las células ATII y A549 fueron cultivadas hasta un 80% de confluencia en placas de 6 pocillos y luego transfectadas con pequeño ARN interferente (siARN) dirigido al gen humano CEACAM1 (siCEACAM1; s1976, Silencer ® Select Pre-designed siRNA, Ambion ® ) o control de siRNA (siNeg; Silencer ® Select Negative Control No. 1 siRNA, Ambion ® ) utilizando Lipofetamina 3000 (ThermoFisher Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La transfección y eficiencia silenciadora fueron evaluadas después de 48 horas mediante el análisis de manchas occidentales de la expresión proteica de CEACAM1 y mediante el análisis qRT-PCR de variantes CEACAM1. En experimentos paralelos, se analizó la replicación de virus y la producción de citoquinas/quimoquinas en siCEACAM1 o células transfectadas por siNeg infectadas con virus H5N1 (MOI = 0,01) a 24 hpi. Análisis estadístico. Se evaluaron las diferencias entre dos grupos experimentales utilizando una prueba t de Student sin emparejar, de dos colas. Diferencias de doble cambio de expresión de mRNA (qRT-PCR) entre tres grupos experimentales se evaluó mediante análisis de varianza de un solo sentido (ANOVA) seguido de una prueba de comparison múltiple de Bonferroni. Las diferencias se consideraron significativas con un valor de p <0,05. Los datos se muestran como media ± error estándar de la media (SEM) de tres o cuatro experimentos individuales. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism para Windows (v5.02). Todos los Los datos brutos y procesados de HiSeq se han depositado en GEO (GSE119767; https://www.ncbi. nlm.nih.gov/geo/).

¿Cuál es la tasa de mortalidad de la cepa H5N1 de la gripe?

La secuenciación profunda de células epiteliales pulmonares humanas primarias desafiadas con el virus de la gripe H5N1 revela un papel proviral para CEACAM1https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6195505/SHA: ef58c6e981a08c85d2c0efb80e5b32b075f660b4Autores: Ye, Siying; Cowled, Christopher J.; Yap, Cheng-Hon; Stambas, JohnFecha: 2018-10-19DOI: 10.1038/s41598-018-336605-6Licencia: cc-byAbstract: Las actuales estrategias profilácticas y terapéuticas dirigidas a los virus de la gripe humana incluyen vacunas y antivirales. Dadas las tasas variables Aquí se describe el uso de la secuenciación profunda de HiSeq para analizar la expresión génica del huésped en células epiteliales alveolares primarias humanas de tipo II infectadas con el virus H5N1 de la gripe aviar altamente patógena. A las 24 horas de la infección, 623 genes hospedantes fueron significativamente regulados, incluyendo la molécula de adhesión celular CEACAM1. La infección por el virus H5N1 estimuló significativamente la expresión proteica CEACAM1 en comparación con el virus influenza A PR8 (H1N1), sugiriendo un papel clave para CEACAM1 en la patogenicidad del virus influenza. Además, el silenciamiento de CEACAM1 endógeno resultó en niveles reducidos de producción proinflamatoria citoquina/quimoquina, así como en niveles reducidos de replicación viral después de la infección H5N1. Texto: Los virus de la gripe causan enfermedades respiratorias estacionales agudas y altamente contagiosas en todos los grupos de edad. Entre 3 y 5 millones de casos de enfermedad grave relacionada con la gripe y más de 250 000 muertes cada año. Además de los brotes estacionales constantes, las cepas de gripe aviar altamente patógena (IAAP), como la H5N1, siguen siendo una amenaza pandémica constante, con cifras recientes de la OMS que muestran 454 infecciones de laboratorio confirmadas y una tasa de mortalidad del 53%. Es importante señalar que los seres humanos tienen muy poca inmunidad preexistente contra las cepas del virus de la gripe aviar. Además, no existe una vacuna H5N1 humana comercialmente disponible. Dado el potencial de los virus H5N1 para desencadenar una pandemia 1,2, existe una necesidad urgente de desarrollar nuevas intervenciones terapéuticas para combatir las deficiencias conocidas en nuestra capacidad de controlar los brotes. La eficacia de la vacuna es altamente variable, como lo demuestra una epidemia particularmente grave de 2017/18, y se requiere una reformulación frecuente de la vacuna para combatir las mutaciones en curso en el genoma del virus de la gripe. Además, se ha reportado resistencia antiviral para muchas cepas circulantes, incluyendo el virus de la gripe aviar H7N9 que emergió en 2013 3, 4. También se ha demostrado que los virus de la gripe A apuntan y secuestran múltiples vías celulares del huésped para promover la supervivencia y replicación 5, 6. Como tal, hay evidencia creciente que sugiere que la focalización de las vías del huésped influirá en la replicación del virus, la inflamación, la inmunidad y la patología 5, 7. Las estrategias de intervención alternativas basadas en la modulación de la respuesta del huésped podrían utilizarse para complementar los actuales protocolos profilácticos y terapéuticos. En el presente estudio, caracterizamos la infección por el virus de la gripe de células epiteliales alveolares primarias humanas de tipo II (ATII) aisladas del tejido pulmonar humano normal donadas por pacientes sometidos a resección pulmonar. Las células ATII son un modelo de infección fisiológicamente relevante ya que son un objetivo principal para los virus de la gripe A al entrar en el tracto respiratorio 10. Expresión del gen huésped humano tras la infección por el virus HPAI H5N1 (A/Chicken/ Vietnam/0008/04) de las células ATII primarias se analizó utilizando la secuenciación profunda de Ilumina HiSeq. Con el fin de obtener una mejor comprensión de los mecanismos subyacentes a la modulación de la inmunidad del huésped en un entorno antiinflamatorio, también analizamos los cambios en la expresión génica tras la infección por HPAI H5N1 en presencia del inhibidor de la especie de oxígeno reactivo (ROS), apo El análisis HiSeq descrito aquí se ha centrado en genes regulados diferencialmente después de la infección por H5N1. Se consideraron varios criterios al elegir un "hit" para estudios posteriores. Estos incluyen: (1) Novedad; ¿se ha estudiado este gen antes en el contexto de la infección por virus influenza/ patogénesis? (2) Inmunregulación; ¿tiene este gen un papel regulador en las respuestas inmunitarias del huésped para que tenga el potencial de ser manipulado para mejorar la inmunidad? (3) Reactivos terapéuticos; ¿existen reactivos terapéuticos disponibles comercialmente, tales como inhibidores específicos o anticuerpos inhibidores que puedan ser utilizados para estudios in vitro e in vivo para optimizar estrategias terapéuticas? (4) Modelos animales; ¿existe un modelo de ratón knock-out disponible para estudios in vivo de infección por gripe? Basado en estos criterios, la molécula de adhesión celular relacionada con carcinoembrión-antigeno (CEA) 1 (CEAC CEACAM1 (también conocido como BGP o CD66) se expresa en células epiteliales y endoteliales 11, así como células B, células T, neutrófilos, células NK, macrófagos y células dendríticas (DC) [12] [13] [14]. Se ha demostrado que el CEACAM1 humano actúa como receptor de varios patógenos bacterianos y fúngicos humanos, entre ellos Haemophilus influenza, Escherichia coli, Salmonella typhi y Candida albicans, pero todavía no se ha implicado en la entrada del virus [15] [16] [17]. Sin embargo, hay evidencia emergente que sugiere que el CEACAM1 está involucrado en la inmunidad del huésped ya que se detectó una mayor expresión en linfocitos en mujeres embarazadas infectadas con citomegalovirus 18 y en tejido cervical aislado de Se han notificado 11 variantes de empalme CEACAM1 en humanos 20. Las isoformas CEACAM1 (Uniprot P13688-1 a -11) pueden diferir en el número de dominios similares a inmunoglobulinas presentes, en presencia o ausencia de un dominio transmembrana y/o la longitud de su cola citoplasmática (es decir, L, larga o S, corta). La proteína CEACAM1 humana de larga duración (CEACAM1-4L) consiste en cuatro dominios extracelulares (un dominio de inmunoglobulina variable similar a la región IgV) y tres dominios constantes de inmunoglobulina 2-como (IgC2)), un dominio transmembrana y una larga cola citoplasmática. La cola citoplasmática larga contiene dos motivos inhibidores a base de inmunorreceptores (ITIM) que están ausentes en la forma corta 20. Las isoformas más comunes expresadas por las células inmunes humanas son CEACAM1-4L y CEACAM1-3L 21. CEACAM1 interactúa homofílicamente consigo mismo 22 o heterofílicamente con CEACAM5 (un miembro relacionado de la familia CEACAM) 23. El estado dimérico permite el reclutamiento de moléculas de señalización como las cinasas SRC-familiar, incluyendo la homología SRC tirosina fosfatasa 2 (SH2)-dominio que contiene proteína tirosina fosfatasa 1 (SHP1) y SHP2 miembros para fosforilar las ITIMs 24. Como tal, la presencia o ausencia de ÍTIMes en las isoformas CEACAM1 influye en las propiedades de señalización y la función celular aguas abajo. Las interacciones homofílicas o heterofílicas CEACAM1 y la fosforilación ITIM son críticas para muchos procesos biológicos, incluyendo la regulación de la función linfocítica, inmunovigilancia, crecimiento celular y diferenciación 25, 26 y activación de neutrófilos y adhesión a las células diana durante las respuestas inflamatorias 27. Cabe señalar que la expresión CEACAM1 ha sido modulada in vivo utilizando un anticuerpo anti-CEACAM1 (MRG1) para inhibir el crecimiento de melanoma xenoinjerto positivo CEACAM1 en ratones SCID/NOD 28. Esto pone de relieve una vía de intervención potencial que puede ser explotada en otros procesos de la enfermedad, incluyendo la infección por virus. Además, los ratones Ceacam1-knockout están disponibles para estudios posteriores de infección in vivo. Nuestros resultados muestran que los niveles de ARNm y expresión proteica CEACAM1 fueron altamente elevados después de la infección por HPAI H5N1. Además, la inhibición del ARN interferente pequeño (siRNA) mediada por CEACAM1 redujo la producción de citocinas inflamatorias y quimioquinas, y más importante aún, inhibió la replicación del virus H5N1 en células ATII humanas primarias y en la línea de células epiteliales respiratorias A549 de tipo humano continuo. Tomadas en conjunto, estas observaciones sugieren que CEACAM1 es un candidato atractivo para modular la inmunidad específica de la gripe. En resumen, nuestro estudio ha identificado un nuevo objetivo que puede influir en la inmunidad HPAI H5N1 y sirve para resaltar la importancia de manipular las respuestas del huésped como una forma de mejorar los resultados de la enfermedad en el contexto de la infección por virus.Tres grupos experimentales fueron incluidos en el análisis HiSeq de la infección por H5N1 en presencia o ausencia del inhibidor de ROS, apocinina: (i) células no infectadas tratadas con DMSO 1% (control de vehículos) (ND), (ii) células infectadas por H5N1 tratadas con DMSO 1% (HD) y (iii) células infectadas por H5N1 tratadas con apocinina 1 mM disuelta en DMSO (HA). Estos tres grupos fueron evaluados mediante comparaciones de pares: ND vs. HD, ND vs. HA, y HD vs. HA. La infección por H5N1 y el tratamiento con apocinina Las células ATII aisladas de los pacientes humanos 29, 30 fueron infectadas con H5N1 en el lado apical a una multiplicidad de infección (MOI) de 2 durante 24 horas y se extrajo ARN. HiSeq fue realizado en muestras y se lea cartografiado al genoma humano donde luego fueron ensamblados en transcriptomas para análisis de expresión diferencial. Un total de 13.649 genes fueron identificados con FPKM (fragmentos por kilobase de exón por millón de fragmentos mapeados) > 1 en al menos uno de los tres grupos experimentales. Un total de 623 genes fueron significativamente regulados y 239 genes fueron significativamente regulados (valor q < 0,05, ≥ 2 veces el cambio) después de la infección por H5N1 (ND vs. HD) (fig. 1A; Tabla S1 ). La infección por HPAI H5N1 de las células ATII activó un estado antiviral, como lo demuestra la regulación ascendente de numerosos genes inducidos por interferón, genes asociados con la defensa de los patógenos, proliferación celular, apoptosis y metabolismo (Tabla 1; Tabla S2 ). Además, la cartografía de la ruta de la Enciclopedia de los genes y los genomas de Kyoto (KEGG) mostró que muchos de los genes regulados en el grupo HD se asignaron a la señalización del TNF (hsa04668), señalización de receptores similares a los de los peajes (hsa04620), interacción citoquina-citoquina del receptor (hsa04060) y señalización del receptor tipo RIG-I (hsa04622) (en el grupo tratado con H5N1 y apocinina (HA), un gran número de genes también fueron significativamente regulados (509 genes 1B ; Tabla S1 ) relativa al grupo de control de la ND. Aunque un subconjunto de genes se expresó de manera diferencial en los grupos HD y HA, ya sea siendo regulados de forma ascendente (247 genes, Fig. 1D ) o desregulados (146 genes, Fig. 1E ), la mayoría de los genes no se superpusieron de hecho entre los grupos HD y HA (Fig. 1D, E). Esto sugiere que el tratamiento con apocinina puede afectar a la expresión génica independiente de la infección H5N1. El análisis de enriquecimiento de genes regulados por la apocinina mostró la implicación de la vía de señalización del interferón tipo I (GO:0060337), la respuesta defensiva al virus (GO:0009615), la regulación negativa de los procesos virales (GO:48525) y la respuesta al estrés (GO:0006950) ( Tabla S2 Los genes regulados por la apocinina incluyen aquellos que están involucrados en la adhesión celular (GO:0007155), la regulación de la migración celular (GO:0030334), la regulación de la proliferación celular (GO:0042127), la transducción de señales (GO:0007165) y los procesos de oxidación-reducción (GO:0055114) (Tabla S2, "ND vs. HA Down"). Un total de 623 genes fueron regulados después de la infección por H5N1 ("ND vs. HD Up", Fig. 1F ). Al solapar las dos listas de genes de "ND vs. HD Up" y "HD vs. HA Down", 245 genes se mostraron regulados en presencia de apocinina (Fig. 1F ). Al superponer tres listas de genes de "ND vs. HD Up", "HD vs. HA Down" y "ND vs. HA Up", 55 genes de los 245 genes (190 más 55 genes) estuvieron presentes en las tres listas (Fig. 1G), lo que indica que estos 55 genes fueron significativamente inhibidos por la apocinina, pero a un nivel que todavía era significativamente más alto que el de las células no infectadas. Los 55 genes incluyen aquellos involucrados en la inmunidad de influenza A (hsa05164; DDX58, IFIH1, IFNB1, MYD88, PML, STAT2), señalización de Jak-STAT (hsa04630; IFNB1, IL15RA, IL22RA1, STAT2), señalización de receptores tipo RIG-I (hsa04622; DDX58, IFIH1, IFNB1) y procesamiento y presentación de antígenos (hsa04612; TAP2, TAP1, HLA-DOB) (Tablas S3 y S4). Por lo tanto, las respuestas inmunológicas críticas inducidas después de la infección por H5N1 no fueron amortiguadas después del tratamiento con apocinina. Los 190 genes restantes de 245 no estaban presentes en la lista "ND vs. HA Up", lo que sugiere que esos genes fueron significativamente inhibidos por la apocinina a un nivel similar a las células de control no infectadas (Fig. 1G ). Los 190 genes incluyen los que participan en la señalización del TNF (hsa04668; CASP10, CCL2, CCL5, CFLAR, CXCL5, END1, IL6, TRAF1, VEGFC), interacción del receptor de citoquinas-citoquinas (hsa04060; VEGFC, IL6, CCL2, CXCL5, CXCL16, IL2RG, CD40, CCL5, CCL7, IL1A), vía de señalización del NF-kappa B (hsa04064: TRAF1, CFLAR, CARD11, TNFSF13B, TICAM1, CD40) y señalización del PI3K-Akt (hsa04151; CCND1, GNB4, IL2RG, IL6, ITGA2, JAK2, LAMA1, MYC, IPK3AP1, Esto es consistente con el papel de la apocinina en la reducción de la inflamación 31. Al superponer las tres listas de genes de "ND vs. HD Up", "HD vs. HA Down" y "ND vs. HA Down", se encontraron 11 genes en las tres comparaciones (Fig. 1H ). Esto sugiere que estos 11 genes están regulados después de la infección por H5N1 y son significativamente reducidos por el tratamiento con apocinina a un nivel inferior al observado en las células de control no infectadas (Fig. 1H ). Entre ellos estaban los genes inflamatorios citoquinas/quimioquinas, incluyendo CXCL5, IL1A, AXL (miembro de la familia de receptores TAM de tirosina quinasas) y TMEM173/STING (estimulador de los genes IFN) (Tabla S4). Nuestro estudio anterior demostró que la infección por H5N1 de células A549 en presencia de apocinina realzó la expresión de reguladores negativos de la señalización de citocinas (SOCS), SOCS1 y SOCS3 6. Esto, a su vez, dio lugar a una reducción de la producción de citocinas y quimioquinas estimuladas por H5N1 (IL6, IFNB1, CXCL10 y CCL5 en células A549), que no se atribuyó a una menor replicación del virus ya que los títulos del virus no se vieron afectados por el tratamiento con apocinina 6. Realizamos un análisis qRT-PCR sobre las mismas muestras de ARN presentadas para el análisis HiSeq para validar los resultados de HiSeq. IL6 (fig. 2A), IFNB1 (fig. 2B), CXCL10 (fig. 2 2D ) la expresión génica fue significativamente elevada en las células ATII después de la infección y se redujo por la adición de apocinina (excepto para IFNB1). De acuerdo con hallazgos previos en las células A549 6, la infección por H5N1 solo indujo la expresión de SOCS1 como se muestra en el análisis HiSeq y qRT-PCR (Fig. 2E ). El tratamiento con apocinina aumentó aún más la expresión de SOCS1 mRNA (Fig. 2E ). Aunque el análisis de HiSeq no detectó un aumento estadísticamente significativo de SOCS1 tras el tratamiento con apocinina, los cambios de pliegue de Log2 en la expresión génica de SOCS1 fueron similares entre los grupos HD y HA (4,8 veces frente a 4,0 veces) (Fig. 2E ). El análisis de HiSeq de la transcripción de El análisis de qRT-PCR mostró que aunque el ARNm SOCS3 fue ligeramente aumentado después de la infección por H5N1, fue significativamente mejor regulado en la presencia Tabla 2. Los representantes de las vías de KEGG sobrerrepresentadas con un valor máximo de P de 0,05 y el número de genes que contribuyen a cada vía que se regula significativamente después de la infección por H5N1 ("ND vs. HD Up"). La lista completa de vías de KEGG se presenta en la Tabla S3. de apocinina (Fig. 2F). Por lo tanto, la apocinina también contribuye a la reducción de la producción de citoquinas y quimioquinas estimuladas por H5N1 en las células ATII. Apocinina, un compuesto que inhibe la producción de ROS, ha demostrado influir en las respuestas específicas de la gripe in vitro 6 e in vivo 5. Aunque los títulos del virus no se ven afectados por el tratamiento con apocinina in vitro 6, se observa cierta actividad antiviral in vivo cuando los ratones han sido infectados con un virus A/HongKong/X31 H3N2 de baja patogenicidad 6. HiSeq análisis del virus HPAI H5N1 transcripción del gen mostró que aunque hubo una tendencia al aumento de la expresión del virus de la gripe tras el tratamiento con apocinina, sólo la expresión del gen influenza no estructural (NS) aumentó significativamente (Fig. 2G). La reducción de la producción de citoquinas y quimioquinas en las células ATII infectadas por H5N1 es poco probable que se asocie con una menor replicación del virus. El análisis de enriquecimiento del GO se realizó en genes que se mejoraron significativamente después de la infección por HPAI H5N1 en células ATII en presencia Muchos de los genes regulados por H5N1 participaron ampliamente en la respuesta defensiva (GO:0006952), la respuesta al estímulo biótico externo (GO:0043207), los procesos del sistema inmunitario (GO:0002376), la vía de señalización mediada por citoquinas (GO:0019221) y la vía de señalización del interferón tipo I (GO:0060337) (Tabla 1; Tabla S2 ). Además, muchos de los genes regulados por H5N1 se asignaron a las vías metabólicas (hsa01100), la interacción del receptor citoquina-citoquina (hsa04060), la gripe A (hsa05164), la señalización del TNF (hsa04668) o la señalización del Jak-STAT (hsa04630) (Tabla S3). Sin embargo, no todos los genes regulados por H5N1 en estas vías fueron inhibidos por el tratamiento con apocinina como se mencionó anteriormente (fig. 1F ; Tabla S3 ).. Los cambios de plegado después del análisis QRT-PCR se calcularon utilizando el método 2 Ct (eje Y derecho) normalizado a β-actina y comparado con el grupo ND. Los datos de HiSeq se calcularon como cambio de plegado Log2 (eje Y izquierdo) comparado con el grupo ND. La transcripción IFNB1 no fue detectada en ND, por lo tanto los datos de HiSeq IFNB1 de los grupos HD y HA se expresaron como FPKM. *p < 0,05 y **p < 0,01, ***p < 0,001 comparado con ND; # p < 0,05, ## p < 0,01, comparado (G) Análisis Hiseq de perfiles de expresión génica del virus de la gripe H5N1 con o sin tratamiento de apocinina en células ATI primarias humanas. # p < 0,05, en comparación con HD. Reregulación de la molécula de adhesión celular CEACAM1 en células ATI infectadas por H5N1. La molécula de adhesión celular CEACAM1 ha demostrado ser crítica para la regulación de las respuestas inmunitarias durante la infección, inflamación y cáncer 20. La transcripción de CEACAM1 fue significativamente regulada después de la infección por H5N1 (Fig. 3A). En contraste, un miembro relacionado de la familia CEACAM, CEACAM5, no se vio afectado por la infección por H5N1 (Fig. 3B). También vale la pena señalar que se obtuvieron más lecturas para CEACAM5 (>1000 FPKM) (Fi 3B ) que CEACAM1 (~7 FPKM) (Fig. 3A) en células ATII no infectadas, lo cual es consistente con sus patrones de expresión normales en el tejido pulmonar humano 32. Por lo tanto, aunque CEACAM1 forma heterodímeros con CEACAM5 23, la expresión basal más alta de CEACAM5 en células ATII puede explicar por qué su expresión no fue aumentada por la infección por H5N1. La expresión proteica CEACAM1 endógena también fue analizada en células A549 no infectadas o infectadas por el virus influenza (Fig. 3C ) y ATII (Fig. 3D ). La expresión proteica CEACAM1 fue leve, pero no significativamente aumentada en células A549 infectadas por el virus A/Puerto Rico/8/1934 H1N1 (PR8) durante 24 o 48 horas No se observaron diferencias significativas en los niveles de proteína CEACAM1 en varios MOI (2, 5 ó 10) o entre los plazos de 24 y 48 hpi (fig. 3C). Después de examinar la expresión proteica CEACAM1 después de la infección por el virus PR8 en células A549, se examinó la expresión proteica CEACAM1 en células AII humanas primarias infectadas con HPAI H5N1 y en comparación con la infección por el virus PR8 (fig. 3D). Las células ATII fueron infectadas con el virus PR8 a un MOI de 2, una dosis que indujo la regulación ascendente de citocinas y el gen Matrix (M) de influenza analizado por qRT-PCR (datos no mostrados). Los niveles de proteína CEACAM1 endógena fueron significativamente elevados y similares en las células ATII infectadas por H5N1 en los tres MOI analizados. La expresión de proteína CEACAM1 en las células ATII infectadas por H5N1 en los MOI de 0,5 fue mayor a 48 hpi que en las observadas a 24 hpi (fig. 3D ). La infección por el virus HPAI H5N1 en los MOI de 0,5, 1 y 2 estimuló niveles endógenos más altos de expresión proteica de CEACAM1 en comparación con la infección por el virus PR8 en un MOI de 2 en el momento correspondiente (un aumento máximo de ~9 veces inducido por H5N1 en los MOI de 0,5 y 1 a 48 hpi en comparación con PR8 en el MOI de 2), sugiriendo un posible papel para CEACAM1 en la patogenicidad del Para entender el papel de CEACAM1 en la patogénesis de la gripe, las células A549 y ATII fueron transfectadas con siCEACAM1 para desmontar la expresión proteica endógena de CEACAM1. Las células ATII y A549 fueron transfectadas con siCEACAM1 o control negativo de siNeg. La expresión de cuatro variantes principales de CEACAM1, CEACAM1-4L, -4S, -3L y -3S, y proteína CEACAM1 fueron analizadas utilizando SYBR Green qRT-PCR y Western blotting, respectivamente. El análisis de SYBR Green qRT-PCR mostró que las células ATII transfectadas con 15 pmol de siCEACAM1 redujeron significativamente la expresión de CEACAM1-4L y -4S en comparación con el control de siNeg, mientras que la expresión de CE La expresión proteica CEACAM1 se redujo aproximadamente en un 50% en las células ATII y A549 después de la transfección de siCEACAM1 en comparación con las células transfectadas por siNeg (Fig. 4B). El aumento de dosis de siCEACAM1 (10, 15 y 20 pmol) no redujo aún más la expresión proteica CEACAM1 en las células A549 (Fig. 4B ). Como tal, se eligieron 15 pmol de siCEACAM1 para estudios posteriores de caída en las células ATII y A549. Es importante destacar que el anticuerpo anti-CEACAM1 solo detecta isoformas L basadas en la información epítope proporcionada por Abcam. Por lo tanto, las reducciones observadas en la expresión proteica CEACAM1 se pueden atribuir principalmente a la abolición de CEACAM1-4L. Las consecuencias funcionales de la caída de CEACAM1 fueron examinadas en las células ATII y A549 después de la infección por H5N1. IL6, IFNB1, CXCL10, CCL5 y TNF fueron analizadas en las células ATII infectadas por H5N1 y A549 usando qRT-PCR. ATII (Fig. 5A ) y A549 células transfectadas con siCEACAM1 mostraron una expresión significativamente menor de IL6, CXCL10 y CCL5 en comparación con las células transfectadas por siNeg. Sin embargo, la expresión de la citocina antiviral, IFNB1, no se vio afectada en ambos tipos de células. Además, la expresión TNF, que puede ser inducida por IFNs de tipo I 33, fue significativamente menor en las células A549 transfectadas por siCEACAM1 (Fig. 5B), pero no se afectó en las células ATII transfectadas por siCEACAM1 (fig. 5A). Se cree que la hipercitokinemia o "tormenta de citoquinas" en los pacientes infectados por el virus H5N1 y H7N9 contribuye al daño tisular inflamatorio 34, 35. La disminución de CEACAM1 en el contexto de una infección viral grave puede reducir la inflamación causada por la infección por H5N1 sin amortiguar la respuesta antiviral. Además, la replicación del virus se redujo significativamente en 5,2 veces en ATII (fig. 5C) y 4,8 veces en células A549 (fig. 5D) transfectadas con siCEACAM1 en comparación con las células transfectadas por siNeg. 5C,D). Los virus de la gripe utilizan maquinaria celular huésped para manipular procesos celulares normales con el fin de promover la replicación y evadir las respuestas inmunes del huésped. Los estudios en el campo se centran cada vez más en la comprensión y modificación de los factores principales del huésped para mejorar la enfermedad. Ejemplos incluyen modulación de ROS para reducir la inflamación 5 e inhibición de NF-B y activación mitogénica de Raf/MEK/ERK cinasa en cascada para suprimir la replicación viral 36, 37. Estas estrategias de enfoque del huésped ofrecerán una alternativa a las intervenciones actuales que se centran en dirigir el virus. En el presente estudio, analizamos perfiles de expresión génica del huésped humano después de la infección por HPAI H5N1 y tratamiento con el antioxidante, apocinina. Como era de esperar, genes que fueron significativamente regulados después de la infección H5N1 estuvieron involucrados en procesos biológicos Además, los genes regulados por H5N1 también participaron en la regulación de la fosforilación proteica, el metabolismo celular y la proliferación celular, que se cree que son explotados por virus para la replicación 38. El tratamiento con apocinina tuvo tanto antiviral (Tablas S2-S4) 5 como proviral impacto (Fig. 2G), lo que no es sorprendente ya que los ROS son potentes agentes microbicidas, así como importantes moléculas de señalización inmune en diferentes concentraciones 39. En nuestras manos, el tratamiento con apocinina redujo la inflamación inducida por H5N1, pero también impactó la respuesta de defensa celular, la producción de citocinas y la señalización mediada por citoquinas. DDX58 (RIG-I), TLRs, IFIH1 (MDA5) no fue desregulado (Tabla S1 ). Dada la interferencia significativa de los virus de la gripe en la inmunidad del huésped, centramos nuestra atención en los reguladores clave de la respuesta inmunitaria. Mediante el análisis HiSeq, identificamos la molécula de adhesión celular CEACAM1 como un regulador crítico de la inmunidad. La caída de CEACAM1 inhibió la replicación del virus H5N1 y redujo la producción de citoquinas inflamatorias/quimioquinas estimuladas por H5N1. La infección por H5N1 dio lugar a una regulación significativa de varios genes citoquinas/quimioquinas inflamatorias, incluyendo AXL y STING, que fueron significativamente reducidos por el tratamiento con apocinina a un nivel inferior al observado en células no infectadas (Tabla S Se ha demostrado previamente que el tratamiento con anticuerpos anti-AXL de ratones infectados por PR8 redujo significativamente la inflamación pulmonar y los títulos de virus 40. STING ha demostrado ser importante para promover las respuestas antivirales, ya que las células STING-knockout TPH-1 producen menos IFN de tipo I después de la infección por el virus influenza A 41. La reducción de la expresión del gen STING u otros factores antivirales (por ejemplo, IFNB1, MX1, ISG15; Tabla S1 ) por apocinina, puede explicar en parte el ligero aumento de la transcripción del gen influenza después del tratamiento con apocinina (Fig. 2G). Estos resultados también sugieren que el tratamiento con apocinina puede reducir la inflamación inducida por H5N1 y la apoptosis. De hecho, los efectos antiinflamatorios y antiapoptóticos de la apocinina han sido mostrados previamente en varios modelos de enfermedad, incluyendo diabetes mellitus 42, infarto de miocardio 43, neuroinflamación 44 e infección por el virus de la gripe 6. El reconocimiento del ARN viral intracelular por receptores de reconocimiento de patrones (PRRs) desencadena la liberación de citoquinas/quimioquinas proinflamatorias que reclutan células inmunes innatas, tales como neutrófilos y células NK, al sitio de la infección para ayudar en el aclaramiento viral 45. Los neutrófilos ejercen su función citotóxica al unirse primero a células epiteliales infectadas por gripe a través de moléculas de adhesión, como CEACAM1 46. Además, estudios han indicado que la infección por virus de gripe promueve la apoptosis de neutrófilos 47, La fosforilación de los motivos de CEACAM1 ITIM y la activación de caspasa-3 es fundamental para mediar los eventos antiapoptóticos y para promover la supervivencia de los neutrófilos 27. Esto sugiere que los eventos antiapoptóticos mediados por CEACAM1 pueden ser importantes para la resolución in vivo de la infección por el virus de la gripe, que pueden investigarse más a fondo a través de estudios de infección con ratones Ceacam1-knockout. Las células NK desempeñan un papel crítico en la defensa innata contra los virus de la gripe al reconocer y matar las células infectadas. Se ha demostrado que las interacciones homo-o heterofílicas CEACAM1 inhiben la eliminación de NK 25, 26, y se cree que contribuyen a la evasión inmune de células tumorales 50. Ante estos hallazgos, se podría sugerir la posibilidad de que la regulación de CEACAM1 (para inhibir la actividad de NK) pueda ser una estrategia de evasión inmune novedosa y no característica empleada por virus de la gripe. Nuestro laboratorio está investigando ahora el papel de CEACAM1 en la función celular de NK. Inhibidores de pequeñas moléculas de proteínas cinasas o fosfatasas proteicas (por ejemplo, inhibidores para Src, JAK, SHP2) se han desarrollado como terapias para el cáncer, inflamación, enfermedades inmunitarias y metabólicas 51. Modulación de la fosforilación, dimerización CEACAM1 y la función posterior con inhibidores de moléculas El mecanismo molecular de la acción CEACAM1 después de la infección también ha sido explorado en células A549 utilizando el virus PR8 52. Vitenshtein et al. demostraron que CEACAM1 fue regulado después del reconocimiento del ARN viral por RIG-I, y que esta regulación era dependiente del factor 3 regulador del interferón (IRF3). Además, la fosforilación de CEACAM1 por SHP2 inhibió la replicación viral al reducir la fosforilación del objetivo mamífero de la rapamicina (mTOR) para suprimir la producción global de proteínas celulares. En el presente estudio, utilizamos un modelo de infección más relevante fisiológicamente, células ATII humanas primarias, para estudiar el papel de otros estudios se requerirá investigar/confirmar los mecanismos moleculares de CEACAM1 upregulation después de la infección del virus influenza, especialmente in vivo. Como se ha observado un aumento de la regulación de CEACAM1 en otras infecciones virales, como el citomegalovirus 18 y el papilomavirus 19, será importante determinar si un mecanismo de acción común puede ser atribuido a CEACAM1 para determinar su significación funcional. Si esto se puede establecer, CEACAM1 podría ser utilizado como objetivo para el desarrollo de un agente pan-antiviral. En resumen, moléculas en la superficie celular como CEACAM1 son particularmente atractivas candidatas para el desarrollo terapéutico, ya que los fármacos no necesitan cruzar la membrana celular para ser eficaces. La focalización de genes codificados por el huésped en combinación con antivirales y vacunas actuales puede ser una forma de reducir la morbilidad y mortalidad asociadas a la infección por el virus de la gripe. Es importante destacar que la reducción de la expresión CEACAM1 dio lugar a una reducción de la replicación del virus de la gripe y sugiere que la selección de esta molécula puede ayudar a mejorar los resultados de la enfermedad. El aislamiento y cultivo de células ATII humanas primarias. Las muestras de tejido pulmonar no tumoral humano fueron donadas por pacientes anónimos sometidos a resección pulmonar en el Hospital Universitario, Geelong, Australia. Los protocolos de investigación y ética humana fueron aprobados por los Comités de Ética Humana de la Universidad Deakin, Barwon Health y la Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization (CSIRO). Se obtuvo el consentimiento informado de todos los donantes de tejido. Todas las investigaciones se realizaron de acuerdo con las directrices establecidas en la Declaración Nacional sobre Conducta Ética en la Investigación Humana (2007). El muestreo de tejido pulmonar normal fue confirmado por el Victorian Cancer Biobank, Australia. Las células epiteliales alveolares humanas tipo II (ATII) fueron aisladas y cultivadas utilizando un método descrito previamente 30, 53 con modificaciones menores. Brevemente, el tejido pulmonar con bronquios visibles fue extirpado y perfundido con abundante PBS y sumergido en Trypsin-EDTA (Gibco) dos veces durante 15 minutos a 37 °C. El tejido parcialmente digerido fue cortado en secciones y digerido posteriormente en la Solución Sal Balanzada de Hank (HBSS) que contenía elastasa (12,9 unidades/ml; Roche Diagnostics) y Dnasa I (0,5 mg/ml; Roche Diagnostics) durante 60 minutos a 37 °C. Se obtuvieron suspensiones unicelulares por filtración a través de un colador de células de 40 μm y se permitió que las células (incluyendo macrófagos y fibroblastos) se unieran a platos de Petri tratados con cultivos tisulares en una mezcla 1:1 de medio DMEM/F12 (Gibco) y medio de crecimiento de la vía aérea pequeña (SAGM) (Lonza) que contenía 5% de suero fetal de ternera (FCS) y 0,5 mg/ml de Dnasa I durante 2 horas a 37 °C. Se recogieron células no adherentes, incluyendo células ATII, y se sometieron a centrifugación a 300 g durante 20 minutos en un gradiente discontinua de densidad de Percoll (1,089 y 1,040 g/ml). Se recogieron células ATII purificadas de la interfaz de dos gradientes de densidad, lavadas en HBSS y resuspendidas en medio SAGM suplementadas con un 1% de FCS filtrados por carbón (Gibco) y 100 unidades/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina (Gibco). Las células ATII fueron chapadas en inserciones Transwell de poliéster (0,4 μm de poro; Corning) recubiertas de colágeno de placenta humana de tipo IV (0,05 mg/ml; Sigma) a 300.000 células/cm 2 y cultivadas bajo condiciones cubiertas de líquido en una incubadora humidificada (5% CO 2, 37 °C). El medio de crecimiento se cambió cada 48 horas. Estas condiciones de cultivo suprimieron la expansión de fibroblastos dentro de las células ATII recién aisladas y alentaron A549 células basales alveolares alveolares humanas carcinómicas tipo II y células de riñón canino Madin-Darby (MDCK) fueron provistas por la instalación de cultivo de tejidos del Laboratorio Australiano de Salud Animal (AAHL), CSIRO. Las células A549 y MDCK se mantuvieron en el medio F12K de Ham (GIBCO) y en el medio RPMI-1640 (Invitrogen), respectivamente, complementadas con 10% FCS, 100 U/ml penicilina y 100 μg/ml estreptomicina (GIBCO) y mantenidas a 37 °C, 5% CO 2. Virus e infección viral. HPAI A/chicken/Vietnam/0008/2004 H5N1 (H5N1) se obtuvo de AAHL, CSIRO. Las existencias virales de A/Puerto Rico/8/1934 H1N1 (PR8) se obtuvieron de la Universidad de Melbourne. Las existencias virales se prepararon utilizando la inoculación estándar de huevos embrionados de 10 días de edad. Se preparó un único stock de virus para su uso en todos los ensayos. Todos los experimentos con H5N1 se realizaron en laboratorios de nivel de bioseguridad 3 (BSL3) en AAHL, CSIRO. Las células fueron infectadas con virus influenza A como se describió anteriormente 6, 29. Brevemente, los medios de cultivo fueron eliminados y las células fueron lavadas con PBS caliente tres veces seguidas de inoculación con virus durante 1 hora. Luego se extirparon los virus y las células fueron lavadas con PBS caliente tres veces, e incubadas en los medios de cultivo frescos libres de suero apropiado que contenían 0,3% BSA a 37 ° Para el análisis de HiSeq, las células ATII de tres donantes fueron infectadas en el lado apical con H5N1 en un MOI de 2 durante 24 horas en un medio SAGM libre de suero, suplementadas con albúmina sérica bovina de 0,3% (BSA) que contenía 1 mM de apocinina disuelta en DMSO o 1% de control del vehículo DMSO. Las células ATII incubadas en medios que contenían 1% de DMSO fueron utilizadas como control negativo. Para otros estudios de infección viral posteriores, células ATII de un conjunto diferente de tres donantes (diferentes de los utilizados en el análisis de HiSeq) o células A549 de al menos tres pasajes diferentes fueron infectadas con virus influenza A en varios MOIs, como se indica en el texto. Para los estudios de infección por PR8, se incluyó una concentración final de 0,5 μg/ml L-1-Tosylamida-2-feniletilclorometilcetona (TPCK) tratada con tripsina (Worthington) en los medios de comunicación post-inoculación para ayudar a la replicación. Los títulos de virus se determinaron utilizando ensayos de placa estándar en células MDCK como se describió anteriormente 55. Extracción de ARN, control de calidad (QC) e HiSeq análisis. Las células ATII de tres donantes se utilizaron para el análisis de HiSeq. El ARN total se extrajo de las células utilizando un kit RNeasy Mini (Qiagen). Las células infectadas por gripe se lavaron con PBS tres veces y las células se lisaron con tampón RLT complementado con β-mercaptoetanol (10 μL/ml; Gibco). Los lisatos celulares fueron homogeneizados con columnas QIAshredder seguidas de digestión del ADN en la columna con el conjunto de ADN libre de RNASA (Qiagen) y ARN extraídos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizó QC inicial para asegurar que la cantidad y calidad de las muestras de ARN para el análisis HiSeq cumplieran los siguientes criterios: 1) las muestras de ARN tenían relaciones OD260/280 entre 1,8 y 2,0 medida con el espectrofotómetro NanoDropTM (Termo Scientific); 2) las concentraciones de la muestra eran de 100 ng/μl como mínimo; 3) el ARN fue analizado por electroforesis de gel de agarosa. La integridad y calidad del ARN fueron validadas por la presencia de bandas claras agudas de 28S y 18S ARN ribosomal, con una relación 28S Como parte del QC inicial y como indicación de infección constante por H5N1, la PCR de transcriptasa inversa cuantitativa paralela en tiempo real (qRT-PCR) utilizando las mismas muestras de ARN utilizadas para el análisis de HiSeq se realizó en duplicado como se describió anteriormente 6 para medir la expresión de ARNm de IL6, IFNB1, CXCL10, CCL5, TNF, SOCS1 y SOCS3, todas las cuales se conocen por estar reguladas después de la infección por HPAI H5N1 de las células A549 6 Análisis de secuenciación y anotación. Después de confirmar las sumas de comprobación y evaluar la calidad de los datos brutos de los archivos FASTQ con FASTQC, las lecturas de ARN-Seq se procesaron de acuerdo con los protocolos estándar de tuberías Tuxedo 56, utilizando el genoma humano anotado (GRCh37, descargado de Brevemente, las lecturas crudas para cada muestra fueron cartografiadas al genoma humano usando TopHat2, ordenadas y convertidas al formato SAM usando Samtools y luego ensambladas en transcriptomas usando Cufflinks. Cuffmerge fue usado para combinar anotaciones de transcripción de muestras individuales en un único transcriptoma de referencia, y Cuffquant fue usado para obtener conteos de lectura por muestra. Cuffdiff fue usado para realizar análisis de expresión diferencial. Todos los programas fueron ejecutados usando parámetros recomendados. Es importante notar que el archivo gtf de referencia proporcionado a buffmerge fue editado primero usando un script de pitón personalizado para excluir líneas que contienen características distintas de exon/cds, y contigs distintos de cromosomas 1-22, X, Y. GO término y enriquecimiento de KEGG. Los identificadores de genes oficiales para transcripciones que fueron moduladas diferencialmente después de la infección por HPAI H5N1 con o sin tratamiento con apocinina se compilaron en seis listas de objetivos a partir de comparaciones de pares ("ND vs. HD Up", "ND vs. HD Down", "ND vs. HA Up", "HD vs. HA Up", "HD vs. HA Down"). Las transcripciones expresadas diferencialmente significativamente se definieron como si tuvieran un cambio ≥2 veces con un valor P ajustado de Benjamini-Hochberg < 0.01. Una lista de antecedentes de genes se compiló mediante la recuperación de todos los identificadores de genes identificados en el presente análisis HiSeq con FPKM > 1. El enriquecimiento del proceso biológico GO se realizó utilizando Gorilla, comparando el fondo no alineado y las listas de objetivos 57. Las listas de objetivos también fueron sometidas al análisis de la vía KEGG utilizando un mapeador básico de la vía KEGG 59 y DAVID Bioinformática Recursos Herramienta de Anotación Funcional 60,61. Reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). Las concentraciones de genes de interés de mRNA fueron evaluadas y analizadas utilizando qRT-PCR realizadas en duplicado como se describió anteriormente 6. Brevemente, después de la extracción de ARN total de células infectadas por la gripe, cDNA fue SCIEntIfIC RepoRtS (2018) 8:15468 DOI:10.1038/s41598-018-33605-6 preparado utilizando SuperScript TM III First-Strand Synthesis SuperMix (Invitrogen). La expresión génica de varias citocinas se evaluó utilizando ensayos de expresión génica TaqMan (Biosistemas aplicados) con imprimaciones y sondas comerciales TaqMan, con la excepción del gen Matrix (M) influenza (imprimación posterior 5′-CTTCTAACGAGGGAACGTA-3′; imprimación inversa 5′-GGTGAGGAGGGGTGTCTTGTCTTTA-3′; sonda 5′-FAM-TCAGGCCCTCAAAGCCGAG-NFQ-3′) 62. Los imprimadores específicos 63 (cuadro S5) fueron diseñados para estimar la expresión de CEACAM1-4L, -4S, -3L y -3S en células ATII y A549 utilizando iTaq Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La ausencia de amplificación inespecífica fue confirmada por electroforesis en gel de agarosa de productos QRT-PCR (15 μL) (datos no mostrados). La expresión génica se normalizó a ARNm de β-actina utilizando el método 2 CT donde se determinaron los niveles de expresión en relación con los controles celulares no infectados. Todos los ensayos se realizaron por duplicado utilizando un sistema de PCR Applied Biosystems ® StepOnePlus TM en tiempo real. Las cantidades iguales de proteína fueron cargadas en geles NuPAGE 4-12% Bis-Tris (Invitrogen), resueltas por SDS/PAGE y transferidas a membranas PVDF (Bio-Rad). Las membranas fueron sondeadas con anticuerpo monoclonal CEACAM1 anti-humano EPR4049 (ab108397, Abcam) seguido de anticuerpo secundario conjugado con HRP anti-rabbit de cabra (Invitrogen). Las proteínas fueron visualizadas mediante membranas incubadoras con Chemiluminiscence potenciado Pierce (ECL) Plus Western Blotting Substrate (Thermo Scientific) seguido de detección en un sistema de imágenes Bio-Rad ChemiDoc TM MP o en Amersham TM Hyperfilm TM ECL (GE Healthcare). Para usar la β-actina como control de carga, la misma membrana fue despojada en tampón de destripamiento (1,5% (p/v) glicina, 0,1% (p/v) SDS, 1% (v/v) Tween-20, pH 2.2) y re-probada con un anticuerpo monoclonal anti-β-actina conjugado con HRP en cada muestra, respectivamente. La densidad de la banda proteica se cuantificó utilizando el software Fiji (versión 1.49J10) 64. La densidad de la banda proteica CEACAM1 se normalizó contra la de β-actina y se expresó como cambios de pliegue en comparación con los controles. Las células ATII y A549 fueron cultivadas hasta un 80% de confluencia en placas de 6 pocillos y luego transfectadas con pequeño ARN interferente (siARN) dirigido al gen humano CEACAM1 (siCEACAM1; s1976, Silencer ® Select Pre-designed siRNA, Ambion ® ) o control de siRNA (siNeg; Silencer ® Select Negative Control No. 1 siRNA, Ambion ® ) utilizando Lipofetamina 3000 (ThermoFisher Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La transfección y eficiencia silenciadora fueron evaluadas después de 48 horas mediante el análisis de manchas occidentales de la expresión proteica de CEACAM1 y mediante el análisis qRT-PCR de variantes CEACAM1. En experimentos paralelos, se analizó la replicación de virus y la producción de citoquinas/quimoquinas en siCEACAM1 o células transfectadas por siNeg infectadas con virus H5N1 (MOI = 0,01) a 24 hpi. Análisis estadístico. Se evaluaron las diferencias entre dos grupos experimentales utilizando una prueba t de Student sin emparejar, de dos colas. Diferencias de doble cambio de expresión de mRNA (qRT-PCR) entre tres grupos experimentales se evaluó mediante análisis de varianza de un solo sentido (ANOVA) seguido de una prueba de comparison múltiple de Bonferroni. Las diferencias se consideraron significativas con un valor de p <0,05. Los datos se muestran como media ± error estándar de la media (SEM) de tres o cuatro experimentos individuales. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism para Windows (v5.02). Todos los Los datos brutos y procesados de HiSeq se han depositado en GEO (GSE119767; https://www.ncbi. nlm.nih.gov/geo/).

¿Cuántos dominios extracelulares hay en la proteína CEAMCAM1?

La secuenciación profunda de células epiteliales pulmonares humanas primarias desafiadas con el virus de la gripe H5N1 revela un papel proviral para CEACAM1https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6195505/SHA: ef58c6e981a08c85d2c0efb80e5b32b075f660b4Autores: Ye, Siying; Cowled, Christopher J.; Yap, Cheng-Hon; Stambas, JohnFecha: 2018-10-19DOI: 10.1038/s41598-018-336605-6Licencia: cc-byAbstract: Las actuales estrategias profilácticas y terapéuticas dirigidas a los virus de la gripe humana incluyen vacunas y antivirales. Dadas las tasas variables Aquí se describe el uso de la secuenciación profunda de HiSeq para analizar la expresión génica del huésped en células epiteliales alveolares primarias humanas de tipo II infectadas con el virus H5N1 de la gripe aviar altamente patógena. A las 24 horas de la infección, 623 genes hospedantes fueron significativamente regulados, incluyendo la molécula de adhesión celular CEACAM1. La infección por el virus H5N1 estimuló significativamente la expresión proteica CEACAM1 en comparación con el virus influenza A PR8 (H1N1), sugiriendo un papel clave para CEACAM1 en la patogenicidad del virus influenza. Además, el silenciamiento de CEACAM1 endógeno resultó en niveles reducidos de producción proinflamatoria citoquina/quimoquina, así como en niveles reducidos de replicación viral después de la infección H5N1. Texto: Los virus de la gripe causan enfermedades respiratorias estacionales agudas y altamente contagiosas en todos los grupos de edad. Entre 3 y 5 millones de casos de enfermedad grave relacionada con la gripe y más de 250 000 muertes cada año. Además de los brotes estacionales constantes, las cepas de gripe aviar altamente patógena (IAAP), como la H5N1, siguen siendo una amenaza pandémica constante, con cifras recientes de la OMS que muestran 454 infecciones de laboratorio confirmadas y una tasa de mortalidad del 53%. Es importante señalar que los seres humanos tienen muy poca inmunidad preexistente contra las cepas del virus de la gripe aviar. Además, no existe una vacuna H5N1 humana comercialmente disponible. Dado el potencial de los virus H5N1 para desencadenar una pandemia 1,2, existe una necesidad urgente de desarrollar nuevas intervenciones terapéuticas para combatir las deficiencias conocidas en nuestra capacidad de controlar los brotes. La eficacia de la vacuna es altamente variable, como lo demuestra una epidemia particularmente grave de 2017/18, y se requiere una reformulación frecuente de la vacuna para combatir las mutaciones en curso en el genoma del virus de la gripe. Además, se ha reportado resistencia antiviral para muchas cepas circulantes, incluyendo el virus de la gripe aviar H7N9 que emergió en 2013 3, 4. También se ha demostrado que los virus de la gripe A apuntan y secuestran múltiples vías celulares del huésped para promover la supervivencia y replicación 5, 6. Como tal, hay evidencia creciente que sugiere que la focalización de las vías del huésped influirá en la replicación del virus, la inflamación, la inmunidad y la patología 5, 7. Las estrategias de intervención alternativas basadas en la modulación de la respuesta del huésped podrían utilizarse para complementar los actuales protocolos profilácticos y terapéuticos. En el presente estudio, caracterizamos la infección por el virus de la gripe de células epiteliales alveolares primarias humanas de tipo II (ATII) aisladas del tejido pulmonar humano normal donadas por pacientes sometidos a resección pulmonar. Las células ATII son un modelo de infección fisiológicamente relevante ya que son un objetivo principal para los virus de la gripe A al entrar en el tracto respiratorio 10. Expresión del gen huésped humano tras la infección por el virus HPAI H5N1 (A/Chicken/ Vietnam/0008/04) de las células ATII primarias se analizó utilizando la secuenciación profunda de Ilumina HiSeq. Con el fin de obtener una mejor comprensión de los mecanismos subyacentes a la modulación de la inmunidad del huésped en un entorno antiinflamatorio, también analizamos los cambios en la expresión génica tras la infección por HPAI H5N1 en presencia del inhibidor de la especie de oxígeno reactivo (ROS), apo El análisis HiSeq descrito aquí se ha centrado en genes regulados diferencialmente después de la infección por H5N1. Se consideraron varios criterios al elegir un "hit" para estudios posteriores. Estos incluyen: (1) Novedad; ¿se ha estudiado este gen antes en el contexto de la infección por virus influenza/ patogénesis? (2) Inmunregulación; ¿tiene este gen un papel regulador en las respuestas inmunitarias del huésped para que tenga el potencial de ser manipulado para mejorar la inmunidad? (3) Reactivos terapéuticos; ¿existen reactivos terapéuticos disponibles comercialmente, tales como inhibidores específicos o anticuerpos inhibidores que puedan ser utilizados para estudios in vitro e in vivo para optimizar estrategias terapéuticas? (4) Modelos animales; ¿existe un modelo de ratón knock-out disponible para estudios in vivo de infección por gripe? Basado en estos criterios, la molécula de adhesión celular relacionada con carcinoembrión-antigeno (CEA) 1 (CEAC CEACAM1 (también conocido como BGP o CD66) se expresa en células epiteliales y endoteliales 11, así como células B, células T, neutrófilos, células NK, macrófagos y células dendríticas (DC) [12] [13] [14]. Se ha demostrado que el CEACAM1 humano actúa como receptor de varios patógenos bacterianos y fúngicos humanos, entre ellos Haemophilus influenza, Escherichia coli, Salmonella typhi y Candida albicans, pero todavía no se ha implicado en la entrada del virus [15] [16] [17]. Sin embargo, hay evidencia emergente que sugiere que el CEACAM1 está involucrado en la inmunidad del huésped ya que se detectó una mayor expresión en linfocitos en mujeres embarazadas infectadas con citomegalovirus 18 y en tejido cervical aislado de Se han notificado 11 variantes de empalme CEACAM1 en humanos 20. Las isoformas CEACAM1 (Uniprot P13688-1 a -11) pueden diferir en el número de dominios similares a inmunoglobulinas presentes, en presencia o ausencia de un dominio transmembrana y/o la longitud de su cola citoplasmática (es decir, L, larga o S, corta). La proteína CEACAM1 humana de larga duración (CEACAM1-4L) consiste en cuatro dominios extracelulares (un dominio de inmunoglobulina variable similar a la región IgV) y tres dominios constantes de inmunoglobulina 2-como (IgC2)), un dominio transmembrana y una larga cola citoplasmática. La cola citoplasmática larga contiene dos motivos inhibidores a base de inmunorreceptores (ITIM) que están ausentes en la forma corta 20. Las isoformas más comunes expresadas por las células inmunes humanas son CEACAM1-4L y CEACAM1-3L 21. CEACAM1 interactúa homofílicamente consigo mismo 22 o heterofílicamente con CEACAM5 (un miembro relacionado de la familia CEACAM) 23. El estado dimérico permite el reclutamiento de moléculas de señalización como las cinasas SRC-familiar, incluyendo la homología SRC tirosina fosfatasa 2 (SH2)-dominio que contiene proteína tirosina fosfatasa 1 (SHP1) y SHP2 miembros para fosforilar las ITIMs 24. Como tal, la presencia o ausencia de ÍTIMes en las isoformas CEACAM1 influye en las propiedades de señalización y la función celular aguas abajo. Las interacciones homofílicas o heterofílicas CEACAM1 y la fosforilación ITIM son críticas para muchos procesos biológicos, incluyendo la regulación de la función linfocítica, inmunovigilancia, crecimiento celular y diferenciación 25, 26 y activación de neutrófilos y adhesión a las células diana durante las respuestas inflamatorias 27. Cabe señalar que la expresión CEACAM1 ha sido modulada in vivo utilizando un anticuerpo anti-CEACAM1 (MRG1) para inhibir el crecimiento de melanoma xenoinjerto positivo CEACAM1 en ratones SCID/NOD 28. Esto pone de relieve una vía de intervención potencial que puede ser explotada en otros procesos de la enfermedad, incluyendo la infección por virus. Además, los ratones Ceacam1-knockout están disponibles para estudios posteriores de infección in vivo. Nuestros resultados muestran que los niveles de ARNm y expresión proteica CEACAM1 fueron altamente elevados después de la infección por HPAI H5N1. Además, la inhibición del ARN interferente pequeño (siRNA) mediada por CEACAM1 redujo la producción de citocinas inflamatorias y quimioquinas, y más importante aún, inhibió la replicación del virus H5N1 en células ATII humanas primarias y en la línea de células epiteliales respiratorias A549 de tipo humano continuo. Tomadas en conjunto, estas observaciones sugieren que CEACAM1 es un candidato atractivo para modular la inmunidad específica de la gripe. En resumen, nuestro estudio ha identificado un nuevo objetivo que puede influir en la inmunidad HPAI H5N1 y sirve para resaltar la importancia de manipular las respuestas del huésped como una forma de mejorar los resultados de la enfermedad en el contexto de la infección por virus.Tres grupos experimentales fueron incluidos en el análisis HiSeq de la infección por H5N1 en presencia o ausencia del inhibidor de ROS, apocinina: (i) células no infectadas tratadas con DMSO 1% (control de vehículos) (ND), (ii) células infectadas por H5N1 tratadas con DMSO 1% (HD) y (iii) células infectadas por H5N1 tratadas con apocinina 1 mM disuelta en DMSO (HA). Estos tres grupos fueron evaluados mediante comparaciones de pares: ND vs. HD, ND vs. HA, y HD vs. HA. La infección por H5N1 y el tratamiento con apocinina Las células ATII aisladas de los pacientes humanos 29, 30 fueron infectadas con H5N1 en el lado apical a una multiplicidad de infección (MOI) de 2 durante 24 horas y se extrajo ARN. HiSeq fue realizado en muestras y se lea cartografiado al genoma humano donde luego fueron ensamblados en transcriptomas para análisis de expresión diferencial. Un total de 13.649 genes fueron identificados con FPKM (fragmentos por kilobase de exón por millón de fragmentos mapeados) > 1 en al menos uno de los tres grupos experimentales. Un total de 623 genes fueron significativamente regulados y 239 genes fueron significativamente regulados (valor q < 0,05, ≥ 2 veces el cambio) después de la infección por H5N1 (ND vs. HD) (fig. 1A; Tabla S1 ). La infección por HPAI H5N1 de las células ATII activó un estado antiviral, como lo demuestra la regulación ascendente de numerosos genes inducidos por interferón, genes asociados con la defensa de los patógenos, proliferación celular, apoptosis y metabolismo (Tabla 1; Tabla S2 ). Además, la cartografía de la ruta de la Enciclopedia de los genes y los genomas de Kyoto (KEGG) mostró que muchos de los genes regulados en el grupo HD se asignaron a la señalización del TNF (hsa04668), señalización de receptores similares a los de los peajes (hsa04620), interacción citoquina-citoquina del receptor (hsa04060) y señalización del receptor tipo RIG-I (hsa04622) (en el grupo tratado con H5N1 y apocinina (HA), un gran número de genes también fueron significativamente regulados (509 genes 1B ; Tabla S1 ) relativa al grupo de control de la ND. Aunque un subconjunto de genes se expresó de manera diferencial en los grupos HD y HA, ya sea siendo regulados de forma ascendente (247 genes, Fig. 1D ) o desregulados (146 genes, Fig. 1E ), la mayoría de los genes no se superpusieron de hecho entre los grupos HD y HA (Fig. 1D, E). Esto sugiere que el tratamiento con apocinina puede afectar a la expresión génica independiente de la infección H5N1. El análisis de enriquecimiento de genes regulados por la apocinina mostró la implicación de la vía de señalización del interferón tipo I (GO:0060337), la respuesta defensiva al virus (GO:0009615), la regulación negativa de los procesos virales (GO:48525) y la respuesta al estrés (GO:0006950) ( Tabla S2 Los genes regulados por la apocinina incluyen aquellos que están involucrados en la adhesión celular (GO:0007155), la regulación de la migración celular (GO:0030334), la regulación de la proliferación celular (GO:0042127), la transducción de señales (GO:0007165) y los procesos de oxidación-reducción (GO:0055114) (Tabla S2, "ND vs. HA Down"). Un total de 623 genes fueron regulados después de la infección por H5N1 ("ND vs. HD Up", Fig. 1F ). Al solapar las dos listas de genes de "ND vs. HD Up" y "HD vs. HA Down", 245 genes se mostraron regulados en presencia de apocinina (Fig. 1F ). Al superponer tres listas de genes de "ND vs. HD Up", "HD vs. HA Down" y "ND vs. HA Up", 55 genes de los 245 genes (190 más 55 genes) estuvieron presentes en las tres listas (Fig. 1G), lo que indica que estos 55 genes fueron significativamente inhibidos por la apocinina, pero a un nivel que todavía era significativamente más alto que el de las células no infectadas. Los 55 genes incluyen aquellos involucrados en la inmunidad de influenza A (hsa05164; DDX58, IFIH1, IFNB1, MYD88, PML, STAT2), señalización de Jak-STAT (hsa04630; IFNB1, IL15RA, IL22RA1, STAT2), señalización de receptores tipo RIG-I (hsa04622; DDX58, IFIH1, IFNB1) y procesamiento y presentación de antígenos (hsa04612; TAP2, TAP1, HLA-DOB) (Tablas S3 y S4). Por lo tanto, las respuestas inmunológicas críticas inducidas después de la infección por H5N1 no fueron amortiguadas después del tratamiento con apocinina. Los 190 genes restantes de 245 no estaban presentes en la lista "ND vs. HA Up", lo que sugiere que esos genes fueron significativamente inhibidos por la apocinina a un nivel similar a las células de control no infectadas (Fig. 1G ). Los 190 genes incluyen los que participan en la señalización del TNF (hsa04668; CASP10, CCL2, CCL5, CFLAR, CXCL5, END1, IL6, TRAF1, VEGFC), interacción del receptor de citoquinas-citoquinas (hsa04060; VEGFC, IL6, CCL2, CXCL5, CXCL16, IL2RG, CD40, CCL5, CCL7, IL1A), vía de señalización del NF-kappa B (hsa04064: TRAF1, CFLAR, CARD11, TNFSF13B, TICAM1, CD40) y señalización del PI3K-Akt (hsa04151; CCND1, GNB4, IL2RG, IL6, ITGA2, JAK2, LAMA1, MYC, IPK3AP1, Esto es consistente con el papel de la apocinina en la reducción de la inflamación 31. Al superponer las tres listas de genes de "ND vs. HD Up", "HD vs. HA Down" y "ND vs. HA Down", se encontraron 11 genes en las tres comparaciones (Fig. 1H ). Esto sugiere que estos 11 genes están regulados después de la infección por H5N1 y son significativamente reducidos por el tratamiento con apocinina a un nivel inferior al observado en las células de control no infectadas (Fig. 1H ). Entre ellos estaban los genes inflamatorios citoquinas/quimioquinas, incluyendo CXCL5, IL1A, AXL (miembro de la familia de receptores TAM de tirosina quinasas) y TMEM173/STING (estimulador de los genes IFN) (Tabla S4). Nuestro estudio anterior demostró que la infección por H5N1 de células A549 en presencia de apocinina realzó la expresión de reguladores negativos de la señalización de citocinas (SOCS), SOCS1 y SOCS3 6. Esto, a su vez, dio lugar a una reducción de la producción de citocinas y quimioquinas estimuladas por H5N1 (IL6, IFNB1, CXCL10 y CCL5 en células A549), que no se atribuyó a una menor replicación del virus ya que los títulos del virus no se vieron afectados por el tratamiento con apocinina 6. Realizamos un análisis qRT-PCR sobre las mismas muestras de ARN presentadas para el análisis HiSeq para validar los resultados de HiSeq. IL6 (fig. 2A), IFNB1 (fig. 2B), CXCL10 (fig. 2 2D ) la expresión génica fue significativamente elevada en las células ATII después de la infección y se redujo por la adición de apocinina (excepto para IFNB1). De acuerdo con hallazgos previos en las células A549 6, la infección por H5N1 solo indujo la expresión de SOCS1 como se muestra en el análisis HiSeq y qRT-PCR (Fig. 2E ). El tratamiento con apocinina aumentó aún más la expresión de SOCS1 mRNA (Fig. 2E ). Aunque el análisis de HiSeq no detectó un aumento estadísticamente significativo de SOCS1 tras el tratamiento con apocinina, los cambios de pliegue de Log2 en la expresión génica de SOCS1 fueron similares entre los grupos HD y HA (4,8 veces frente a 4,0 veces) (Fig. 2E ). El análisis de HiSeq de la transcripción de El análisis de qRT-PCR mostró que aunque el ARNm SOCS3 fue ligeramente aumentado después de la infección por H5N1, fue significativamente mejor regulado en la presencia Tabla 2. Los representantes de las vías de KEGG sobrerrepresentadas con un valor máximo de P de 0,05 y el número de genes que contribuyen a cada vía que se regula significativamente después de la infección por H5N1 ("ND vs. HD Up"). La lista completa de vías de KEGG se presenta en la Tabla S3. de apocinina (Fig. 2F). Por lo tanto, la apocinina también contribuye a la reducción de la producción de citoquinas y quimioquinas estimuladas por H5N1 en las células ATII. Apocinina, un compuesto que inhibe la producción de ROS, ha demostrado influir en las respuestas específicas de la gripe in vitro 6 e in vivo 5. Aunque los títulos del virus no se ven afectados por el tratamiento con apocinina in vitro 6, se observa cierta actividad antiviral in vivo cuando los ratones han sido infectados con un virus A/HongKong/X31 H3N2 de baja patogenicidad 6. HiSeq análisis del virus HPAI H5N1 transcripción del gen mostró que aunque hubo una tendencia al aumento de la expresión del virus de la gripe tras el tratamiento con apocinina, sólo la expresión del gen influenza no estructural (NS) aumentó significativamente (Fig. 2G). La reducción de la producción de citoquinas y quimioquinas en las células ATII infectadas por H5N1 es poco probable que se asocie con una menor replicación del virus. El análisis de enriquecimiento del GO se realizó en genes que se mejoraron significativamente después de la infección por HPAI H5N1 en células ATII en presencia Muchos de los genes regulados por H5N1 participaron ampliamente en la respuesta defensiva (GO:0006952), la respuesta al estímulo biótico externo (GO:0043207), los procesos del sistema inmunitario (GO:0002376), la vía de señalización mediada por citoquinas (GO:0019221) y la vía de señalización del interferón tipo I (GO:0060337) (Tabla 1; Tabla S2 ). Además, muchos de los genes regulados por H5N1 se asignaron a las vías metabólicas (hsa01100), la interacción del receptor citoquina-citoquina (hsa04060), la gripe A (hsa05164), la señalización del TNF (hsa04668) o la señalización del Jak-STAT (hsa04630) (Tabla S3). Sin embargo, no todos los genes regulados por H5N1 en estas vías fueron inhibidos por el tratamiento con apocinina como se mencionó anteriormente (fig. 1F ; Tabla S3 ).. Los cambios de plegado después del análisis QRT-PCR se calcularon utilizando el método 2 Ct (eje Y derecho) normalizado a β-actina y comparado con el grupo ND. Los datos de HiSeq se calcularon como cambio de plegado Log2 (eje Y izquierdo) comparado con el grupo ND. La transcripción IFNB1 no fue detectada en ND, por lo tanto los datos de HiSeq IFNB1 de los grupos HD y HA se expresaron como FPKM. *p < 0,05 y **p < 0,01, ***p < 0,001 comparado con ND; # p < 0,05, ## p < 0,01, comparado (G) Análisis Hiseq de perfiles de expresión génica del virus de la gripe H5N1 con o sin tratamiento de apocinina en células ATI primarias humanas. # p < 0,05, en comparación con HD. Reregulación de la molécula de adhesión celular CEACAM1 en células ATI infectadas por H5N1. La molécula de adhesión celular CEACAM1 ha demostrado ser crítica para la regulación de las respuestas inmunitarias durante la infección, inflamación y cáncer 20. La transcripción de CEACAM1 fue significativamente regulada después de la infección por H5N1 (Fig. 3A). En contraste, un miembro relacionado de la familia CEACAM, CEACAM5, no se vio afectado por la infección por H5N1 (Fig. 3B). También vale la pena señalar que se obtuvieron más lecturas para CEACAM5 (>1000 FPKM) (Fi 3B ) que CEACAM1 (~7 FPKM) (Fig. 3A) en células ATII no infectadas, lo cual es consistente con sus patrones de expresión normales en el tejido pulmonar humano 32. Por lo tanto, aunque CEACAM1 forma heterodímeros con CEACAM5 23, la expresión basal más alta de CEACAM5 en células ATII puede explicar por qué su expresión no fue aumentada por la infección por H5N1. La expresión proteica CEACAM1 endógena también fue analizada en células A549 no infectadas o infectadas por el virus influenza (Fig. 3C ) y ATII (Fig. 3D ). La expresión proteica CEACAM1 fue leve, pero no significativamente aumentada en células A549 infectadas por el virus A/Puerto Rico/8/1934 H1N1 (PR8) durante 24 o 48 horas No se observaron diferencias significativas en los niveles de proteína CEACAM1 en varios MOI (2, 5 ó 10) o entre los plazos de 24 y 48 hpi (fig. 3C). Después de examinar la expresión proteica CEACAM1 después de la infección por el virus PR8 en células A549, se examinó la expresión proteica CEACAM1 en células AII humanas primarias infectadas con HPAI H5N1 y en comparación con la infección por el virus PR8 (fig. 3D). Las células ATII fueron infectadas con el virus PR8 a un MOI de 2, una dosis que indujo la regulación ascendente de citocinas y el gen Matrix (M) de influenza analizado por qRT-PCR (datos no mostrados). Los niveles de proteína CEACAM1 endógena fueron significativamente elevados y similares en las células ATII infectadas por H5N1 en los tres MOI analizados. La expresión de proteína CEACAM1 en las células ATII infectadas por H5N1 en los MOI de 0,5 fue mayor a 48 hpi que en las observadas a 24 hpi (fig. 3D ). La infección por el virus HPAI H5N1 en los MOI de 0,5, 1 y 2 estimuló niveles endógenos más altos de expresión proteica de CEACAM1 en comparación con la infección por el virus PR8 en un MOI de 2 en el momento correspondiente (un aumento máximo de ~9 veces inducido por H5N1 en los MOI de 0,5 y 1 a 48 hpi en comparación con PR8 en el MOI de 2), sugiriendo un posible papel para CEACAM1 en la patogenicidad del Para entender el papel de CEACAM1 en la patogénesis de la gripe, las células A549 y ATII fueron transfectadas con siCEACAM1 para desmontar la expresión proteica endógena de CEACAM1. Las células ATII y A549 fueron transfectadas con siCEACAM1 o control negativo de siNeg. La expresión de cuatro variantes principales de CEACAM1, CEACAM1-4L, -4S, -3L y -3S, y proteína CEACAM1 fueron analizadas utilizando SYBR Green qRT-PCR y Western blotting, respectivamente. El análisis de SYBR Green qRT-PCR mostró que las células ATII transfectadas con 15 pmol de siCEACAM1 redujeron significativamente la expresión de CEACAM1-4L y -4S en comparación con el control de siNeg, mientras que la expresión de CE La expresión proteica CEACAM1 se redujo aproximadamente en un 50% en las células ATII y A549 después de la transfección de siCEACAM1 en comparación con las células transfectadas por siNeg (Fig. 4B). El aumento de dosis de siCEACAM1 (10, 15 y 20 pmol) no redujo aún más la expresión proteica CEACAM1 en las células A549 (Fig. 4B ). Como tal, se eligieron 15 pmol de siCEACAM1 para estudios posteriores de caída en las células ATII y A549. Es importante destacar que el anticuerpo anti-CEACAM1 solo detecta isoformas L basadas en la información epítope proporcionada por Abcam. Por lo tanto, las reducciones observadas en la expresión proteica CEACAM1 se pueden atribuir principalmente a la abolición de CEACAM1-4L. Las consecuencias funcionales de la caída de CEACAM1 fueron examinadas en las células ATII y A549 después de la infección por H5N1. IL6, IFNB1, CXCL10, CCL5 y TNF fueron analizadas en las células ATII infectadas por H5N1 y A549 usando qRT-PCR. ATII (Fig. 5A ) y A549 células transfectadas con siCEACAM1 mostraron una expresión significativamente menor de IL6, CXCL10 y CCL5 en comparación con las células transfectadas por siNeg. Sin embargo, la expresión de la citocina antiviral, IFNB1, no se vio afectada en ambos tipos de células. Además, la expresión TNF, que puede ser inducida por IFNs de tipo I 33, fue significativamente menor en las células A549 transfectadas por siCEACAM1 (Fig. 5B), pero no se afectó en las células ATII transfectadas por siCEACAM1 (fig. 5A). Se cree que la hipercitokinemia o "tormenta de citoquinas" en los pacientes infectados por el virus H5N1 y H7N9 contribuye al daño tisular inflamatorio 34, 35. La disminución de CEACAM1 en el contexto de una infección viral grave puede reducir la inflamación causada por la infección por H5N1 sin amortiguar la respuesta antiviral. Además, la replicación del virus se redujo significativamente en 5,2 veces en ATII (fig. 5C) y 4,8 veces en células A549 (fig. 5D) transfectadas con siCEACAM1 en comparación con las células transfectadas por siNeg. 5C,D). Los virus de la gripe utilizan maquinaria celular huésped para manipular procesos celulares normales con el fin de promover la replicación y evadir las respuestas inmunes del huésped. Los estudios en el campo se centran cada vez más en la comprensión y modificación de los factores principales del huésped para mejorar la enfermedad. Ejemplos incluyen modulación de ROS para reducir la inflamación 5 e inhibición de NF-B y activación mitogénica de Raf/MEK/ERK cinasa en cascada para suprimir la replicación viral 36, 37. Estas estrategias de enfoque del huésped ofrecerán una alternativa a las intervenciones actuales que se centran en dirigir el virus. En el presente estudio, analizamos perfiles de expresión génica del huésped humano después de la infección por HPAI H5N1 y tratamiento con el antioxidante, apocinina. Como era de esperar, genes que fueron significativamente regulados después de la infección H5N1 estuvieron involucrados en procesos biológicos Además, los genes regulados por H5N1 también participaron en la regulación de la fosforilación proteica, el metabolismo celular y la proliferación celular, que se cree que son explotados por virus para la replicación 38. El tratamiento con apocinina tuvo tanto antiviral (Tablas S2-S4) 5 como proviral impacto (Fig. 2G), lo que no es sorprendente ya que los ROS son potentes agentes microbicidas, así como importantes moléculas de señalización inmune en diferentes concentraciones 39. En nuestras manos, el tratamiento con apocinina redujo la inflamación inducida por H5N1, pero también impactó la respuesta de defensa celular, la producción de citocinas y la señalización mediada por citoquinas. DDX58 (RIG-I), TLRs, IFIH1 (MDA5) no fue desregulado (Tabla S1 ). Dada la interferencia significativa de los virus de la gripe en la inmunidad del huésped, centramos nuestra atención en los reguladores clave de la respuesta inmunitaria. Mediante el análisis HiSeq, identificamos la molécula de adhesión celular CEACAM1 como un regulador crítico de la inmunidad. La caída de CEACAM1 inhibió la replicación del virus H5N1 y redujo la producción de citoquinas inflamatorias/quimioquinas estimuladas por H5N1. La infección por H5N1 dio lugar a una regulación significativa de varios genes citoquinas/quimioquinas inflamatorias, incluyendo AXL y STING, que fueron significativamente reducidos por el tratamiento con apocinina a un nivel inferior al observado en células no infectadas (Tabla S Se ha demostrado previamente que el tratamiento con anticuerpos anti-AXL de ratones infectados por PR8 redujo significativamente la inflamación pulmonar y los títulos de virus 40. STING ha demostrado ser importante para promover las respuestas antivirales, ya que las células STING-knockout TPH-1 producen menos IFN de tipo I después de la infección por el virus influenza A 41. La reducción de la expresión del gen STING u otros factores antivirales (por ejemplo, IFNB1, MX1, ISG15; Tabla S1 ) por apocinina, puede explicar en parte el ligero aumento de la transcripción del gen influenza después del tratamiento con apocinina (Fig. 2G). Estos resultados también sugieren que el tratamiento con apocinina puede reducir la inflamación inducida por H5N1 y la apoptosis. De hecho, los efectos antiinflamatorios y antiapoptóticos de la apocinina han sido mostrados previamente en varios modelos de enfermedad, incluyendo diabetes mellitus 42, infarto de miocardio 43, neuroinflamación 44 e infección por el virus de la gripe 6. El reconocimiento del ARN viral intracelular por receptores de reconocimiento de patrones (PRRs) desencadena la liberación de citoquinas/quimioquinas proinflamatorias que reclutan células inmunes innatas, tales como neutrófilos y células NK, al sitio de la infección para ayudar en el aclaramiento viral 45. Los neutrófilos ejercen su función citotóxica al unirse primero a células epiteliales infectadas por gripe a través de moléculas de adhesión, como CEACAM1 46. Además, estudios han indicado que la infección por virus de gripe promueve la apoptosis de neutrófilos 47, La fosforilación de los motivos de CEACAM1 ITIM y la activación de caspasa-3 es fundamental para mediar los eventos antiapoptóticos y para promover la supervivencia de los neutrófilos 27. Esto sugiere que los eventos antiapoptóticos mediados por CEACAM1 pueden ser importantes para la resolución in vivo de la infección por el virus de la gripe, que pueden investigarse más a fondo a través de estudios de infección con ratones Ceacam1-knockout. Las células NK desempeñan un papel crítico en la defensa innata contra los virus de la gripe al reconocer y matar las células infectadas. Se ha demostrado que las interacciones homo-o heterofílicas CEACAM1 inhiben la eliminación de NK 25, 26, y se cree que contribuyen a la evasión inmune de células tumorales 50. Ante estos hallazgos, se podría sugerir la posibilidad de que la regulación de CEACAM1 (para inhibir la actividad de NK) pueda ser una estrategia de evasión inmune novedosa y no característica empleada por virus de la gripe. Nuestro laboratorio está investigando ahora el papel de CEACAM1 en la función celular de NK. Inhibidores de pequeñas moléculas de proteínas cinasas o fosfatasas proteicas (por ejemplo, inhibidores para Src, JAK, SHP2) se han desarrollado como terapias para el cáncer, inflamación, enfermedades inmunitarias y metabólicas 51. Modulación de la fosforilación, dimerización CEACAM1 y la función posterior con inhibidores de moléculas El mecanismo molecular de la acción CEACAM1 después de la infección también ha sido explorado en células A549 utilizando el virus PR8 52. Vitenshtein et al. demostraron que CEACAM1 fue regulado después del reconocimiento del ARN viral por RIG-I, y que esta regulación era dependiente del factor 3 regulador del interferón (IRF3). Además, la fosforilación de CEACAM1 por SHP2 inhibió la replicación viral al reducir la fosforilación del objetivo mamífero de la rapamicina (mTOR) para suprimir la producción global de proteínas celulares. En el presente estudio, utilizamos un modelo de infección más relevante fisiológicamente, células ATII humanas primarias, para estudiar el papel de otros estudios se requerirá investigar/confirmar los mecanismos moleculares de CEACAM1 upregulation después de la infección del virus influenza, especialmente in vivo. Como se ha observado un aumento de la regulación de CEACAM1 en otras infecciones virales, como el citomegalovirus 18 y el papilomavirus 19, será importante determinar si un mecanismo de acción común puede ser atribuido a CEACAM1 para determinar su significación funcional. Si esto se puede establecer, CEACAM1 podría ser utilizado como objetivo para el desarrollo de un agente pan-antiviral. En resumen, moléculas en la superficie celular como CEACAM1 son particularmente atractivas candidatas para el desarrollo terapéutico, ya que los fármacos no necesitan cruzar la membrana celular para ser eficaces. La focalización de genes codificados por el huésped en combinación con antivirales y vacunas actuales puede ser una forma de reducir la morbilidad y mortalidad asociadas a la infección por el virus de la gripe. Es importante destacar que la reducción de la expresión CEACAM1 dio lugar a una reducción de la replicación del virus de la gripe y sugiere que la selección de esta molécula puede ayudar a mejorar los resultados de la enfermedad. El aislamiento y cultivo de células ATII humanas primarias. Las muestras de tejido pulmonar no tumoral humano fueron donadas por pacientes anónimos sometidos a resección pulmonar en el Hospital Universitario, Geelong, Australia. Los protocolos de investigación y ética humana fueron aprobados por los Comités de Ética Humana de la Universidad Deakin, Barwon Health y la Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization (CSIRO). Se obtuvo el consentimiento informado de todos los donantes de tejido. Todas las investigaciones se realizaron de acuerdo con las directrices establecidas en la Declaración Nacional sobre Conducta Ética en la Investigación Humana (2007). El muestreo de tejido pulmonar normal fue confirmado por el Victorian Cancer Biobank, Australia. Las células epiteliales alveolares humanas tipo II (ATII) fueron aisladas y cultivadas utilizando un método descrito previamente 30, 53 con modificaciones menores. Brevemente, el tejido pulmonar con bronquios visibles fue extirpado y perfundido con abundante PBS y sumergido en Trypsin-EDTA (Gibco) dos veces durante 15 minutos a 37 °C. El tejido parcialmente digerido fue cortado en secciones y digerido posteriormente en la Solución Sal Balanzada de Hank (HBSS) que contenía elastasa (12,9 unidades/ml; Roche Diagnostics) y Dnasa I (0,5 mg/ml; Roche Diagnostics) durante 60 minutos a 37 °C. Se obtuvieron suspensiones unicelulares por filtración a través de un colador de células de 40 μm y se permitió que las células (incluyendo macrófagos y fibroblastos) se unieran a platos de Petri tratados con cultivos tisulares en una mezcla 1:1 de medio DMEM/F12 (Gibco) y medio de crecimiento de la vía aérea pequeña (SAGM) (Lonza) que contenía 5% de suero fetal de ternera (FCS) y 0,5 mg/ml de Dnasa I durante 2 horas a 37 °C. Se recogieron células no adherentes, incluyendo células ATII, y se sometieron a centrifugación a 300 g durante 20 minutos en un gradiente discontinua de densidad de Percoll (1,089 y 1,040 g/ml). Se recogieron células ATII purificadas de la interfaz de dos gradientes de densidad, lavadas en HBSS y resuspendidas en medio SAGM suplementadas con un 1% de FCS filtrados por carbón (Gibco) y 100 unidades/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina (Gibco). Las células ATII fueron chapadas en inserciones Transwell de poliéster (0,4 μm de poro; Corning) recubiertas de colágeno de placenta humana de tipo IV (0,05 mg/ml; Sigma) a 300.000 células/cm 2 y cultivadas bajo condiciones cubiertas de líquido en una incubadora humidificada (5% CO 2, 37 °C). El medio de crecimiento se cambió cada 48 horas. Estas condiciones de cultivo suprimieron la expansión de fibroblastos dentro de las células ATII recién aisladas y alentaron A549 células basales alveolares alveolares humanas carcinómicas tipo II y células de riñón canino Madin-Darby (MDCK) fueron provistas por la instalación de cultivo de tejidos del Laboratorio Australiano de Salud Animal (AAHL), CSIRO. Las células A549 y MDCK se mantuvieron en el medio F12K de Ham (GIBCO) y en el medio RPMI-1640 (Invitrogen), respectivamente, complementadas con 10% FCS, 100 U/ml penicilina y 100 μg/ml estreptomicina (GIBCO) y mantenidas a 37 °C, 5% CO 2. Virus e infección viral. HPAI A/chicken/Vietnam/0008/2004 H5N1 (H5N1) se obtuvo de AAHL, CSIRO. Las existencias virales de A/Puerto Rico/8/1934 H1N1 (PR8) se obtuvieron de la Universidad de Melbourne. Las existencias virales se prepararon utilizando la inoculación estándar de huevos embrionados de 10 días de edad. Se preparó un único stock de virus para su uso en todos los ensayos. Todos los experimentos con H5N1 se realizaron en laboratorios de nivel de bioseguridad 3 (BSL3) en AAHL, CSIRO. Las células fueron infectadas con virus influenza A como se describió anteriormente 6, 29. Brevemente, los medios de cultivo fueron eliminados y las células fueron lavadas con PBS caliente tres veces seguidas de inoculación con virus durante 1 hora. Luego se extirparon los virus y las células fueron lavadas con PBS caliente tres veces, e incubadas en los medios de cultivo frescos libres de suero apropiado que contenían 0,3% BSA a 37 ° Para el análisis de HiSeq, las células ATII de tres donantes fueron infectadas en el lado apical con H5N1 en un MOI de 2 durante 24 horas en un medio SAGM libre de suero, suplementadas con albúmina sérica bovina de 0,3% (BSA) que contenía 1 mM de apocinina disuelta en DMSO o 1% de control del vehículo DMSO. Las células ATII incubadas en medios que contenían 1% de DMSO fueron utilizadas como control negativo. Para otros estudios de infección viral posteriores, células ATII de un conjunto diferente de tres donantes (diferentes de los utilizados en el análisis de HiSeq) o células A549 de al menos tres pasajes diferentes fueron infectadas con virus influenza A en varios MOIs, como se indica en el texto. Para los estudios de infección por PR8, se incluyó una concentración final de 0,5 μg/ml L-1-Tosylamida-2-feniletilclorometilcetona (TPCK) tratada con tripsina (Worthington) en los medios de comunicación post-inoculación para ayudar a la replicación. Los títulos de virus se determinaron utilizando ensayos de placa estándar en células MDCK como se describió anteriormente 55. Extracción de ARN, control de calidad (QC) e HiSeq análisis. Las células ATII de tres donantes se utilizaron para el análisis de HiSeq. El ARN total se extrajo de las células utilizando un kit RNeasy Mini (Qiagen). Las células infectadas por gripe se lavaron con PBS tres veces y las células se lisaron con tampón RLT complementado con β-mercaptoetanol (10 μL/ml; Gibco). Los lisatos celulares fueron homogeneizados con columnas QIAshredder seguidas de digestión del ADN en la columna con el conjunto de ADN libre de RNASA (Qiagen) y ARN extraídos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizó QC inicial para asegurar que la cantidad y calidad de las muestras de ARN para el análisis HiSeq cumplieran los siguientes criterios: 1) las muestras de ARN tenían relaciones OD260/280 entre 1,8 y 2,0 medida con el espectrofotómetro NanoDropTM (Termo Scientific); 2) las concentraciones de la muestra eran de 100 ng/μl como mínimo; 3) el ARN fue analizado por electroforesis de gel de agarosa. La integridad y calidad del ARN fueron validadas por la presencia de bandas claras agudas de 28S y 18S ARN ribosomal, con una relación 28S Como parte del QC inicial y como indicación de infección constante por H5N1, la PCR de transcriptasa inversa cuantitativa paralela en tiempo real (qRT-PCR) utilizando las mismas muestras de ARN utilizadas para el análisis de HiSeq se realizó en duplicado como se describió anteriormente 6 para medir la expresión de ARNm de IL6, IFNB1, CXCL10, CCL5, TNF, SOCS1 y SOCS3, todas las cuales se conocen por estar reguladas después de la infección por HPAI H5N1 de las células A549 6 Análisis de secuenciación y anotación. Después de confirmar las sumas de comprobación y evaluar la calidad de los datos brutos de los archivos FASTQ con FASTQC, las lecturas de ARN-Seq se procesaron de acuerdo con los protocolos estándar de tuberías Tuxedo 56, utilizando el genoma humano anotado (GRCh37, descargado de Brevemente, las lecturas crudas para cada muestra fueron cartografiadas al genoma humano usando TopHat2, ordenadas y convertidas al formato SAM usando Samtools y luego ensambladas en transcriptomas usando Cufflinks. Cuffmerge fue usado para combinar anotaciones de transcripción de muestras individuales en un único transcriptoma de referencia, y Cuffquant fue usado para obtener conteos de lectura por muestra. Cuffdiff fue usado para realizar análisis de expresión diferencial. Todos los programas fueron ejecutados usando parámetros recomendados. Es importante notar que el archivo gtf de referencia proporcionado a buffmerge fue editado primero usando un script de pitón personalizado para excluir líneas que contienen características distintas de exon/cds, y contigs distintos de cromosomas 1-22, X, Y. GO término y enriquecimiento de KEGG. Los identificadores de genes oficiales para transcripciones que fueron moduladas diferencialmente después de la infección por HPAI H5N1 con o sin tratamiento con apocinina se compilaron en seis listas de objetivos a partir de comparaciones de pares ("ND vs. HD Up", "ND vs. HD Down", "ND vs. HA Up", "HD vs. HA Up", "HD vs. HA Down"). Las transcripciones expresadas diferencialmente significativamente se definieron como si tuvieran un cambio ≥2 veces con un valor P ajustado de Benjamini-Hochberg < 0.01. Una lista de antecedentes de genes se compiló mediante la recuperación de todos los identificadores de genes identificados en el presente análisis HiSeq con FPKM > 1. El enriquecimiento del proceso biológico GO se realizó utilizando Gorilla, comparando el fondo no alineado y las listas de objetivos 57. Las listas de objetivos también fueron sometidas al análisis de la vía KEGG utilizando un mapeador básico de la vía KEGG 59 y DAVID Bioinformática Recursos Herramienta de Anotación Funcional 60,61. Reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). Las concentraciones de genes de interés de mRNA fueron evaluadas y analizadas utilizando qRT-PCR realizadas en duplicado como se describió anteriormente 6. Brevemente, después de la extracción de ARN total de células infectadas por la gripe, cDNA fue SCIEntIfIC RepoRtS (2018) 8:15468 DOI:10.1038/s41598-018-33605-6 preparado utilizando SuperScript TM III First-Strand Synthesis SuperMix (Invitrogen). La expresión génica de varias citocinas se evaluó utilizando ensayos de expresión génica TaqMan (Biosistemas aplicados) con imprimaciones y sondas comerciales TaqMan, con la excepción del gen Matrix (M) influenza (imprimación posterior 5′-CTTCTAACGAGGGAACGTA-3′; imprimación inversa 5′-GGTGAGGAGGGGTGTCTTGTCTTTA-3′; sonda 5′-FAM-TCAGGCCCTCAAAGCCGAG-NFQ-3′) 62. Los imprimadores específicos 63 (cuadro S5) fueron diseñados para estimar la expresión de CEACAM1-4L, -4S, -3L y -3S en células ATII y A549 utilizando iTaq Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La ausencia de amplificación inespecífica fue confirmada por electroforesis en gel de agarosa de productos QRT-PCR (15 μL) (datos no mostrados). La expresión génica se normalizó a ARNm de β-actina utilizando el método 2 CT donde se determinaron los niveles de expresión en relación con los controles celulares no infectados. Todos los ensayos se realizaron por duplicado utilizando un sistema de PCR Applied Biosystems ® StepOnePlus TM en tiempo real. Las cantidades iguales de proteína fueron cargadas en geles NuPAGE 4-12% Bis-Tris (Invitrogen), resueltas por SDS/PAGE y transferidas a membranas PVDF (Bio-Rad). Las membranas fueron sondeadas con anticuerpo monoclonal CEACAM1 anti-humano EPR4049 (ab108397, Abcam) seguido de anticuerpo secundario conjugado con HRP anti-rabbit de cabra (Invitrogen). Las proteínas fueron visualizadas mediante membranas incubadoras con Chemiluminiscence potenciado Pierce (ECL) Plus Western Blotting Substrate (Thermo Scientific) seguido de detección en un sistema de imágenes Bio-Rad ChemiDoc TM MP o en Amersham TM Hyperfilm TM ECL (GE Healthcare). Para usar la β-actina como control de carga, la misma membrana fue despojada en tampón de destripamiento (1,5% (p/v) glicina, 0,1% (p/v) SDS, 1% (v/v) Tween-20, pH 2.2) y re-probada con un anticuerpo monoclonal anti-β-actina conjugado con HRP en cada muestra, respectivamente. La densidad de la banda proteica se cuantificó utilizando el software Fiji (versión 1.49J10) 64. La densidad de la banda proteica CEACAM1 se normalizó contra la de β-actina y se expresó como cambios de pliegue en comparación con los controles. Las células ATII y A549 fueron cultivadas hasta un 80% de confluencia en placas de 6 pocillos y luego transfectadas con pequeño ARN interferente (siARN) dirigido al gen humano CEACAM1 (siCEACAM1; s1976, Silencer ® Select Pre-designed siRNA, Ambion ® ) o control de siRNA (siNeg; Silencer ® Select Negative Control No. 1 siRNA, Ambion ® ) utilizando Lipofetamina 3000 (ThermoFisher Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La transfección y eficiencia silenciadora fueron evaluadas después de 48 horas mediante el análisis de manchas occidentales de la expresión proteica de CEACAM1 y mediante el análisis qRT-PCR de variantes CEACAM1. En experimentos paralelos, se analizó la replicación de virus y la producción de citoquinas/quimoquinas en siCEACAM1 o células transfectadas por siNeg infectadas con virus H5N1 (MOI = 0,01) a 24 hpi. Análisis estadístico. Se evaluaron las diferencias entre dos grupos experimentales utilizando una prueba t de Student sin emparejar, de dos colas. Diferencias de doble cambio de expresión de mRNA (qRT-PCR) entre tres grupos experimentales se evaluó mediante análisis de varianza de un solo sentido (ANOVA) seguido de una prueba de comparison múltiple de Bonferroni. Las diferencias se consideraron significativas con un valor de p <0,05. Los datos se muestran como media ± error estándar de la media (SEM) de tres o cuatro experimentos individuales. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism para Windows (v5.02). Todos los Los datos brutos y procesados de HiSeq se han depositado en GEO (GSE119767; https://www.ncbi. nlm.nih.gov/geo/).

¿Cuáles son las isoformas más comunes de CEACAM1?

La secuenciación profunda de células epiteliales pulmonares humanas primarias desafiadas con el virus de la gripe H5N1 revela un papel proviral para CEACAM1https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6195505/SHA: ef58c6e981a08c85d2c0efb80e5b32b075f660b4Autores: Ye, Siying; Cowled, Christopher J.; Yap, Cheng-Hon; Stambas, JohnFecha: 2018-10-19DOI: 10.1038/s41598-018-336605-6Licencia: cc-byAbstract: Las actuales estrategias profilácticas y terapéuticas dirigidas a los virus de la gripe humana incluyen vacunas y antivirales. Dadas las tasas variables Aquí se describe el uso de la secuenciación profunda de HiSeq para analizar la expresión génica del huésped en células epiteliales alveolares primarias humanas de tipo II infectadas con el virus H5N1 de la gripe aviar altamente patógena. A las 24 horas de la infección, 623 genes hospedantes fueron significativamente regulados, incluyendo la molécula de adhesión celular CEACAM1. La infección por el virus H5N1 estimuló significativamente la expresión proteica CEACAM1 en comparación con el virus influenza A PR8 (H1N1), sugiriendo un papel clave para CEACAM1 en la patogenicidad del virus influenza. Además, el silenciamiento de CEACAM1 endógeno resultó en niveles reducidos de producción proinflamatoria citoquina/quimoquina, así como en niveles reducidos de replicación viral después de la infección H5N1. Texto: Los virus de la gripe causan enfermedades respiratorias estacionales agudas y altamente contagiosas en todos los grupos de edad. Entre 3 y 5 millones de casos de enfermedad grave relacionada con la gripe y más de 250 000 muertes cada año. Además de los brotes estacionales constantes, las cepas de gripe aviar altamente patógena (IAAP), como la H5N1, siguen siendo una amenaza pandémica constante, con cifras recientes de la OMS que muestran 454 infecciones de laboratorio confirmadas y una tasa de mortalidad del 53%. Es importante señalar que los seres humanos tienen muy poca inmunidad preexistente contra las cepas del virus de la gripe aviar. Además, no existe una vacuna H5N1 humana comercialmente disponible. Dado el potencial de los virus H5N1 para desencadenar una pandemia 1,2, existe una necesidad urgente de desarrollar nuevas intervenciones terapéuticas para combatir las deficiencias conocidas en nuestra capacidad de controlar los brotes. La eficacia de la vacuna es altamente variable, como lo demuestra una epidemia particularmente grave de 2017/18, y se requiere una reformulación frecuente de la vacuna para combatir las mutaciones en curso en el genoma del virus de la gripe. Además, se ha reportado resistencia antiviral para muchas cepas circulantes, incluyendo el virus de la gripe aviar H7N9 que emergió en 2013 3, 4. También se ha demostrado que los virus de la gripe A apuntan y secuestran múltiples vías celulares del huésped para promover la supervivencia y replicación 5, 6. Como tal, hay evidencia creciente que sugiere que la focalización de las vías del huésped influirá en la replicación del virus, la inflamación, la inmunidad y la patología 5, 7. Las estrategias de intervención alternativas basadas en la modulación de la respuesta del huésped podrían utilizarse para complementar los actuales protocolos profilácticos y terapéuticos. En el presente estudio, caracterizamos la infección por el virus de la gripe de células epiteliales alveolares primarias humanas de tipo II (ATII) aisladas del tejido pulmonar humano normal donadas por pacientes sometidos a resección pulmonar. Las células ATII son un modelo de infección fisiológicamente relevante ya que son un objetivo principal para los virus de la gripe A al entrar en el tracto respiratorio 10. Expresión del gen huésped humano tras la infección por el virus HPAI H5N1 (A/Chicken/ Vietnam/0008/04) de las células ATII primarias se analizó utilizando la secuenciación profunda de Ilumina HiSeq. Con el fin de obtener una mejor comprensión de los mecanismos subyacentes a la modulación de la inmunidad del huésped en un entorno antiinflamatorio, también analizamos los cambios en la expresión génica tras la infección por HPAI H5N1 en presencia del inhibidor de la especie de oxígeno reactivo (ROS), apo El análisis HiSeq descrito aquí se ha centrado en genes regulados diferencialmente después de la infección por H5N1. Se consideraron varios criterios al elegir un "hit" para estudios posteriores. Estos incluyen: (1) Novedad; ¿se ha estudiado este gen antes en el contexto de la infección por virus influenza/ patogénesis? (2) Inmunregulación; ¿tiene este gen un papel regulador en las respuestas inmunitarias del huésped para que tenga el potencial de ser manipulado para mejorar la inmunidad? (3) Reactivos terapéuticos; ¿existen reactivos terapéuticos disponibles comercialmente, tales como inhibidores específicos o anticuerpos inhibidores que puedan ser utilizados para estudios in vitro e in vivo para optimizar estrategias terapéuticas? (4) Modelos animales; ¿existe un modelo de ratón knock-out disponible para estudios in vivo de infección por gripe? Basado en estos criterios, la molécula de adhesión celular relacionada con carcinoembrión-antigeno (CEA) 1 (CEAC CEACAM1 (también conocido como BGP o CD66) se expresa en células epiteliales y endoteliales 11, así como células B, células T, neutrófilos, células NK, macrófagos y células dendríticas (DC) [12] [13] [14]. Se ha demostrado que el CEACAM1 humano actúa como receptor de varios patógenos bacterianos y fúngicos humanos, entre ellos Haemophilus influenza, Escherichia coli, Salmonella typhi y Candida albicans, pero todavía no se ha implicado en la entrada del virus [15] [16] [17]. Sin embargo, hay evidencia emergente que sugiere que el CEACAM1 está involucrado en la inmunidad del huésped ya que se detectó una mayor expresión en linfocitos en mujeres embarazadas infectadas con citomegalovirus 18 y en tejido cervical aislado de Se han notificado 11 variantes de empalme CEACAM1 en humanos 20. Las isoformas CEACAM1 (Uniprot P13688-1 a -11) pueden diferir en el número de dominios similares a inmunoglobulinas presentes, en presencia o ausencia de un dominio transmembrana y/o la longitud de su cola citoplasmática (es decir, L, larga o S, corta). La proteína CEACAM1 humana de larga duración (CEACAM1-4L) consiste en cuatro dominios extracelulares (un dominio de inmunoglobulina variable similar a la región IgV) y tres dominios constantes de inmunoglobulina 2-como (IgC2)), un dominio transmembrana y una larga cola citoplasmática. La cola citoplasmática larga contiene dos motivos inhibidores a base de inmunorreceptores (ITIM) que están ausentes en la forma corta 20. Las isoformas más comunes expresadas por las células inmunes humanas son CEACAM1-4L y CEACAM1-3L 21. CEACAM1 interactúa homofílicamente consigo mismo 22 o heterofílicamente con CEACAM5 (un miembro relacionado de la familia CEACAM) 23. El estado dimérico permite el reclutamiento de moléculas de señalización como las cinasas SRC-familiar, incluyendo la homología SRC tirosina fosfatasa 2 (SH2)-dominio que contiene proteína tirosina fosfatasa 1 (SHP1) y SHP2 miembros para fosforilar las ITIMs 24. Como tal, la presencia o ausencia de ÍTIMes en las isoformas CEACAM1 influye en las propiedades de señalización y la función celular aguas abajo. Las interacciones homofílicas o heterofílicas CEACAM1 y la fosforilación ITIM son críticas para muchos procesos biológicos, incluyendo la regulación de la función linfocítica, inmunovigilancia, crecimiento celular y diferenciación 25, 26 y activación de neutrófilos y adhesión a las células diana durante las respuestas inflamatorias 27. Cabe señalar que la expresión CEACAM1 ha sido modulada in vivo utilizando un anticuerpo anti-CEACAM1 (MRG1) para inhibir el crecimiento de melanoma xenoinjerto positivo CEACAM1 en ratones SCID/NOD 28. Esto pone de relieve una vía de intervención potencial que puede ser explotada en otros procesos de la enfermedad, incluyendo la infección por virus. Además, los ratones Ceacam1-knockout están disponibles para estudios posteriores de infección in vivo. Nuestros resultados muestran que los niveles de ARNm y expresión proteica CEACAM1 fueron altamente elevados después de la infección por HPAI H5N1. Además, la inhibición del ARN interferente pequeño (siRNA) mediada por CEACAM1 redujo la producción de citocinas inflamatorias y quimioquinas, y más importante aún, inhibió la replicación del virus H5N1 en células ATII humanas primarias y en la línea de células epiteliales respiratorias A549 de tipo humano continuo. Tomadas en conjunto, estas observaciones sugieren que CEACAM1 es un candidato atractivo para modular la inmunidad específica de la gripe. En resumen, nuestro estudio ha identificado un nuevo objetivo que puede influir en la inmunidad HPAI H5N1 y sirve para resaltar la importancia de manipular las respuestas del huésped como una forma de mejorar los resultados de la enfermedad en el contexto de la infección por virus.Tres grupos experimentales fueron incluidos en el análisis HiSeq de la infección por H5N1 en presencia o ausencia del inhibidor de ROS, apocinina: (i) células no infectadas tratadas con DMSO 1% (control de vehículos) (ND), (ii) células infectadas por H5N1 tratadas con DMSO 1% (HD) y (iii) células infectadas por H5N1 tratadas con apocinina 1 mM disuelta en DMSO (HA). Estos tres grupos fueron evaluados mediante comparaciones de pares: ND vs. HD, ND vs. HA, y HD vs. HA. La infección por H5N1 y el tratamiento con apocinina Las células ATII aisladas de los pacientes humanos 29, 30 fueron infectadas con H5N1 en el lado apical a una multiplicidad de infección (MOI) de 2 durante 24 horas y se extrajo ARN. HiSeq fue realizado en muestras y se lea cartografiado al genoma humano donde luego fueron ensamblados en transcriptomas para análisis de expresión diferencial. Un total de 13.649 genes fueron identificados con FPKM (fragmentos por kilobase de exón por millón de fragmentos mapeados) > 1 en al menos uno de los tres grupos experimentales. Un total de 623 genes fueron significativamente regulados y 239 genes fueron significativamente regulados (valor q < 0,05, ≥ 2 veces el cambio) después de la infección por H5N1 (ND vs. HD) (fig. 1A; Tabla S1 ). La infección por HPAI H5N1 de las células ATII activó un estado antiviral, como lo demuestra la regulación ascendente de numerosos genes inducidos por interferón, genes asociados con la defensa de los patógenos, proliferación celular, apoptosis y metabolismo (Tabla 1; Tabla S2 ). Además, la cartografía de la ruta de la Enciclopedia de los genes y los genomas de Kyoto (KEGG) mostró que muchos de los genes regulados en el grupo HD se asignaron a la señalización del TNF (hsa04668), señalización de receptores similares a los de los peajes (hsa04620), interacción citoquina-citoquina del receptor (hsa04060) y señalización del receptor tipo RIG-I (hsa04622) (en el grupo tratado con H5N1 y apocinina (HA), un gran número de genes también fueron significativamente regulados (509 genes 1B ; Tabla S1 ) relativa al grupo de control de la ND. Aunque un subconjunto de genes se expresó de manera diferencial en los grupos HD y HA, ya sea siendo regulados de forma ascendente (247 genes, Fig. 1D ) o desregulados (146 genes, Fig. 1E ), la mayoría de los genes no se superpusieron de hecho entre los grupos HD y HA (Fig. 1D, E). Esto sugiere que el tratamiento con apocinina puede afectar a la expresión génica independiente de la infección H5N1. El análisis de enriquecimiento de genes regulados por la apocinina mostró la implicación de la vía de señalización del interferón tipo I (GO:0060337), la respuesta defensiva al virus (GO:0009615), la regulación negativa de los procesos virales (GO:48525) y la respuesta al estrés (GO:0006950) ( Tabla S2 Los genes regulados por la apocinina incluyen aquellos que están involucrados en la adhesión celular (GO:0007155), la regulación de la migración celular (GO:0030334), la regulación de la proliferación celular (GO:0042127), la transducción de señales (GO:0007165) y los procesos de oxidación-reducción (GO:0055114) (Tabla S2, "ND vs. HA Down"). Un total de 623 genes fueron regulados después de la infección por H5N1 ("ND vs. HD Up", Fig. 1F ). Al solapar las dos listas de genes de "ND vs. HD Up" y "HD vs. HA Down", 245 genes se mostraron regulados en presencia de apocinina (Fig. 1F ). Al superponer tres listas de genes de "ND vs. HD Up", "HD vs. HA Down" y "ND vs. HA Up", 55 genes de los 245 genes (190 más 55 genes) estuvieron presentes en las tres listas (Fig. 1G), lo que indica que estos 55 genes fueron significativamente inhibidos por la apocinina, pero a un nivel que todavía era significativamente más alto que el de las células no infectadas. Los 55 genes incluyen aquellos involucrados en la inmunidad de influenza A (hsa05164; DDX58, IFIH1, IFNB1, MYD88, PML, STAT2), señalización de Jak-STAT (hsa04630; IFNB1, IL15RA, IL22RA1, STAT2), señalización de receptores tipo RIG-I (hsa04622; DDX58, IFIH1, IFNB1) y procesamiento y presentación de antígenos (hsa04612; TAP2, TAP1, HLA-DOB) (Tablas S3 y S4). Por lo tanto, las respuestas inmunológicas críticas inducidas después de la infección por H5N1 no fueron amortiguadas después del tratamiento con apocinina. Los 190 genes restantes de 245 no estaban presentes en la lista "ND vs. HA Up", lo que sugiere que esos genes fueron significativamente inhibidos por la apocinina a un nivel similar a las células de control no infectadas (Fig. 1G ). Los 190 genes incluyen los que participan en la señalización del TNF (hsa04668; CASP10, CCL2, CCL5, CFLAR, CXCL5, END1, IL6, TRAF1, VEGFC), interacción del receptor de citoquinas-citoquinas (hsa04060; VEGFC, IL6, CCL2, CXCL5, CXCL16, IL2RG, CD40, CCL5, CCL7, IL1A), vía de señalización del NF-kappa B (hsa04064: TRAF1, CFLAR, CARD11, TNFSF13B, TICAM1, CD40) y señalización del PI3K-Akt (hsa04151; CCND1, GNB4, IL2RG, IL6, ITGA2, JAK2, LAMA1, MYC, IPK3AP1, Esto es consistente con el papel de la apocinina en la reducción de la inflamación 31. Al superponer las tres listas de genes de "ND vs. HD Up", "HD vs. HA Down" y "ND vs. HA Down", se encontraron 11 genes en las tres comparaciones (Fig. 1H ). Esto sugiere que estos 11 genes están regulados después de la infección por H5N1 y son significativamente reducidos por el tratamiento con apocinina a un nivel inferior al observado en las células de control no infectadas (Fig. 1H ). Entre ellos estaban los genes inflamatorios citoquinas/quimioquinas, incluyendo CXCL5, IL1A, AXL (miembro de la familia de receptores TAM de tirosina quinasas) y TMEM173/STING (estimulador de los genes IFN) (Tabla S4). Nuestro estudio anterior demostró que la infección por H5N1 de células A549 en presencia de apocinina realzó la expresión de reguladores negativos de la señalización de citocinas (SOCS), SOCS1 y SOCS3 6. Esto, a su vez, dio lugar a una reducción de la producción de citocinas y quimioquinas estimuladas por H5N1 (IL6, IFNB1, CXCL10 y CCL5 en células A549), que no se atribuyó a una menor replicación del virus ya que los títulos del virus no se vieron afectados por el tratamiento con apocinina 6. Realizamos un análisis qRT-PCR sobre las mismas muestras de ARN presentadas para el análisis HiSeq para validar los resultados de HiSeq. IL6 (fig. 2A), IFNB1 (fig. 2B), CXCL10 (fig. 2 2D ) la expresión génica fue significativamente elevada en las células ATII después de la infección y se redujo por la adición de apocinina (excepto para IFNB1). De acuerdo con hallazgos previos en las células A549 6, la infección por H5N1 solo indujo la expresión de SOCS1 como se muestra en el análisis HiSeq y qRT-PCR (Fig. 2E ). El tratamiento con apocinina aumentó aún más la expresión de SOCS1 mRNA (Fig. 2E ). Aunque el análisis de HiSeq no detectó un aumento estadísticamente significativo de SOCS1 tras el tratamiento con apocinina, los cambios de pliegue de Log2 en la expresión génica de SOCS1 fueron similares entre los grupos HD y HA (4,8 veces frente a 4,0 veces) (Fig. 2E ). El análisis de HiSeq de la transcripción de El análisis de qRT-PCR mostró que aunque el ARNm SOCS3 fue ligeramente aumentado después de la infección por H5N1, fue significativamente mejor regulado en la presencia Tabla 2. Los representantes de las vías de KEGG sobrerrepresentadas con un valor máximo de P de 0,05 y el número de genes que contribuyen a cada vía que se regula significativamente después de la infección por H5N1 ("ND vs. HD Up"). La lista completa de vías de KEGG se presenta en la Tabla S3. de apocinina (Fig. 2F). Por lo tanto, la apocinina también contribuye a la reducción de la producción de citoquinas y quimioquinas estimuladas por H5N1 en las células ATII. Apocinina, un compuesto que inhibe la producción de ROS, ha demostrado influir en las respuestas específicas de la gripe in vitro 6 e in vivo 5. Aunque los títulos del virus no se ven afectados por el tratamiento con apocinina in vitro 6, se observa cierta actividad antiviral in vivo cuando los ratones han sido infectados con un virus A/HongKong/X31 H3N2 de baja patogenicidad 6. HiSeq análisis del virus HPAI H5N1 transcripción del gen mostró que aunque hubo una tendencia al aumento de la expresión del virus de la gripe tras el tratamiento con apocinina, sólo la expresión del gen influenza no estructural (NS) aumentó significativamente (Fig. 2G). La reducción de la producción de citoquinas y quimioquinas en las células ATII infectadas por H5N1 es poco probable que se asocie con una menor replicación del virus. El análisis de enriquecimiento del GO se realizó en genes que se mejoraron significativamente después de la infección por HPAI H5N1 en células ATII en presencia Muchos de los genes regulados por H5N1 participaron ampliamente en la respuesta defensiva (GO:0006952), la respuesta al estímulo biótico externo (GO:0043207), los procesos del sistema inmunitario (GO:0002376), la vía de señalización mediada por citoquinas (GO:0019221) y la vía de señalización del interferón tipo I (GO:0060337) (Tabla 1; Tabla S2 ). Además, muchos de los genes regulados por H5N1 se asignaron a las vías metabólicas (hsa01100), la interacción del receptor citoquina-citoquina (hsa04060), la gripe A (hsa05164), la señalización del TNF (hsa04668) o la señalización del Jak-STAT (hsa04630) (Tabla S3). Sin embargo, no todos los genes regulados por H5N1 en estas vías fueron inhibidos por el tratamiento con apocinina como se mencionó anteriormente (fig. 1F ; Tabla S3 ).. Los cambios de plegado después del análisis QRT-PCR se calcularon utilizando el método 2 Ct (eje Y derecho) normalizado a β-actina y comparado con el grupo ND. Los datos de HiSeq se calcularon como cambio de plegado Log2 (eje Y izquierdo) comparado con el grupo ND. La transcripción IFNB1 no fue detectada en ND, por lo tanto los datos de HiSeq IFNB1 de los grupos HD y HA se expresaron como FPKM. *p < 0,05 y **p < 0,01, ***p < 0,001 comparado con ND; # p < 0,05, ## p < 0,01, comparado (G) Análisis Hiseq de perfiles de expresión génica del virus de la gripe H5N1 con o sin tratamiento de apocinina en células ATI primarias humanas. # p < 0,05, en comparación con HD. Reregulación de la molécula de adhesión celular CEACAM1 en células ATI infectadas por H5N1. La molécula de adhesión celular CEACAM1 ha demostrado ser crítica para la regulación de las respuestas inmunitarias durante la infección, inflamación y cáncer 20. La transcripción de CEACAM1 fue significativamente regulada después de la infección por H5N1 (Fig. 3A). En contraste, un miembro relacionado de la familia CEACAM, CEACAM5, no se vio afectado por la infección por H5N1 (Fig. 3B). También vale la pena señalar que se obtuvieron más lecturas para CEACAM5 (>1000 FPKM) (Fi 3B ) que CEACAM1 (~7 FPKM) (Fig. 3A) en células ATII no infectadas, lo cual es consistente con sus patrones de expresión normales en el tejido pulmonar humano 32. Por lo tanto, aunque CEACAM1 forma heterodímeros con CEACAM5 23, la expresión basal más alta de CEACAM5 en células ATII puede explicar por qué su expresión no fue aumentada por la infección por H5N1. La expresión proteica CEACAM1 endógena también fue analizada en células A549 no infectadas o infectadas por el virus influenza (Fig. 3C ) y ATII (Fig. 3D ). La expresión proteica CEACAM1 fue leve, pero no significativamente aumentada en células A549 infectadas por el virus A/Puerto Rico/8/1934 H1N1 (PR8) durante 24 o 48 horas No se observaron diferencias significativas en los niveles de proteína CEACAM1 en varios MOI (2, 5 ó 10) o entre los plazos de 24 y 48 hpi (fig. 3C). Después de examinar la expresión proteica CEACAM1 después de la infección por el virus PR8 en células A549, se examinó la expresión proteica CEACAM1 en células AII humanas primarias infectadas con HPAI H5N1 y en comparación con la infección por el virus PR8 (fig. 3D). Las células ATII fueron infectadas con el virus PR8 a un MOI de 2, una dosis que indujo la regulación ascendente de citocinas y el gen Matrix (M) de influenza analizado por qRT-PCR (datos no mostrados). Los niveles de proteína CEACAM1 endógena fueron significativamente elevados y similares en las células ATII infectadas por H5N1 en los tres MOI analizados. La expresión de proteína CEACAM1 en las células ATII infectadas por H5N1 en los MOI de 0,5 fue mayor a 48 hpi que en las observadas a 24 hpi (fig. 3D ). La infección por el virus HPAI H5N1 en los MOI de 0,5, 1 y 2 estimuló niveles endógenos más altos de expresión proteica de CEACAM1 en comparación con la infección por el virus PR8 en un MOI de 2 en el momento correspondiente (un aumento máximo de ~9 veces inducido por H5N1 en los MOI de 0,5 y 1 a 48 hpi en comparación con PR8 en el MOI de 2), sugiriendo un posible papel para CEACAM1 en la patogenicidad del Para entender el papel de CEACAM1 en la patogénesis de la gripe, las células A549 y ATII fueron transfectadas con siCEACAM1 para desmontar la expresión proteica endógena de CEACAM1. Las células ATII y A549 fueron transfectadas con siCEACAM1 o control negativo de siNeg. La expresión de cuatro variantes principales de CEACAM1, CEACAM1-4L, -4S, -3L y -3S, y proteína CEACAM1 fueron analizadas utilizando SYBR Green qRT-PCR y Western blotting, respectivamente. El análisis de SYBR Green qRT-PCR mostró que las células ATII transfectadas con 15 pmol de siCEACAM1 redujeron significativamente la expresión de CEACAM1-4L y -4S en comparación con el control de siNeg, mientras que la expresión de CE La expresión proteica CEACAM1 se redujo aproximadamente en un 50% en las células ATII y A549 después de la transfección de siCEACAM1 en comparación con las células transfectadas por siNeg (Fig. 4B). El aumento de dosis de siCEACAM1 (10, 15 y 20 pmol) no redujo aún más la expresión proteica CEACAM1 en las células A549 (Fig. 4B ). Como tal, se eligieron 15 pmol de siCEACAM1 para estudios posteriores de caída en las células ATII y A549. Es importante destacar que el anticuerpo anti-CEACAM1 solo detecta isoformas L basadas en la información epítope proporcionada por Abcam. Por lo tanto, las reducciones observadas en la expresión proteica CEACAM1 se pueden atribuir principalmente a la abolición de CEACAM1-4L. Las consecuencias funcionales de la caída de CEACAM1 fueron examinadas en las células ATII y A549 después de la infección por H5N1. IL6, IFNB1, CXCL10, CCL5 y TNF fueron analizadas en las células ATII infectadas por H5N1 y A549 usando qRT-PCR. ATII (Fig. 5A ) y A549 células transfectadas con siCEACAM1 mostraron una expresión significativamente menor de IL6, CXCL10 y CCL5 en comparación con las células transfectadas por siNeg. Sin embargo, la expresión de la citocina antiviral, IFNB1, no se vio afectada en ambos tipos de células. Además, la expresión TNF, que puede ser inducida por IFNs de tipo I 33, fue significativamente menor en las células A549 transfectadas por siCEACAM1 (Fig. 5B), pero no se afectó en las células ATII transfectadas por siCEACAM1 (fig. 5A). Se cree que la hipercitokinemia o "tormenta de citoquinas" en los pacientes infectados por el virus H5N1 y H7N9 contribuye al daño tisular inflamatorio 34, 35. La disminución de CEACAM1 en el contexto de una infección viral grave puede reducir la inflamación causada por la infección por H5N1 sin amortiguar la respuesta antiviral. Además, la replicación del virus se redujo significativamente en 5,2 veces en ATII (fig. 5C) y 4,8 veces en células A549 (fig. 5D) transfectadas con siCEACAM1 en comparación con las células transfectadas por siNeg. 5C,D). Los virus de la gripe utilizan maquinaria celular huésped para manipular procesos celulares normales con el fin de promover la replicación y evadir las respuestas inmunes del huésped. Los estudios en el campo se centran cada vez más en la comprensión y modificación de los factores principales del huésped para mejorar la enfermedad. Ejemplos incluyen modulación de ROS para reducir la inflamación 5 e inhibición de NF-B y activación mitogénica de Raf/MEK/ERK cinasa en cascada para suprimir la replicación viral 36, 37. Estas estrategias de enfoque del huésped ofrecerán una alternativa a las intervenciones actuales que se centran en dirigir el virus. En el presente estudio, analizamos perfiles de expresión génica del huésped humano después de la infección por HPAI H5N1 y tratamiento con el antioxidante, apocinina. Como era de esperar, genes que fueron significativamente regulados después de la infección H5N1 estuvieron involucrados en procesos biológicos Además, los genes regulados por H5N1 también participaron en la regulación de la fosforilación proteica, el metabolismo celular y la proliferación celular, que se cree que son explotados por virus para la replicación 38. El tratamiento con apocinina tuvo tanto antiviral (Tablas S2-S4) 5 como proviral impacto (Fig. 2G), lo que no es sorprendente ya que los ROS son potentes agentes microbicidas, así como importantes moléculas de señalización inmune en diferentes concentraciones 39. En nuestras manos, el tratamiento con apocinina redujo la inflamación inducida por H5N1, pero también impactó la respuesta de defensa celular, la producción de citocinas y la señalización mediada por citoquinas. DDX58 (RIG-I), TLRs, IFIH1 (MDA5) no fue desregulado (Tabla S1 ). Dada la interferencia significativa de los virus de la gripe en la inmunidad del huésped, centramos nuestra atención en los reguladores clave de la respuesta inmunitaria. Mediante el análisis HiSeq, identificamos la molécula de adhesión celular CEACAM1 como un regulador crítico de la inmunidad. La caída de CEACAM1 inhibió la replicación del virus H5N1 y redujo la producción de citoquinas inflamatorias/quimioquinas estimuladas por H5N1. La infección por H5N1 dio lugar a una regulación significativa de varios genes citoquinas/quimioquinas inflamatorias, incluyendo AXL y STING, que fueron significativamente reducidos por el tratamiento con apocinina a un nivel inferior al observado en células no infectadas (Tabla S Se ha demostrado previamente que el tratamiento con anticuerpos anti-AXL de ratones infectados por PR8 redujo significativamente la inflamación pulmonar y los títulos de virus 40. STING ha demostrado ser importante para promover las respuestas antivirales, ya que las células STING-knockout TPH-1 producen menos IFN de tipo I después de la infección por el virus influenza A 41. La reducción de la expresión del gen STING u otros factores antivirales (por ejemplo, IFNB1, MX1, ISG15; Tabla S1 ) por apocinina, puede explicar en parte el ligero aumento de la transcripción del gen influenza después del tratamiento con apocinina (Fig. 2G). Estos resultados también sugieren que el tratamiento con apocinina puede reducir la inflamación inducida por H5N1 y la apoptosis. De hecho, los efectos antiinflamatorios y antiapoptóticos de la apocinina han sido mostrados previamente en varios modelos de enfermedad, incluyendo diabetes mellitus 42, infarto de miocardio 43, neuroinflamación 44 e infección por el virus de la gripe 6. El reconocimiento del ARN viral intracelular por receptores de reconocimiento de patrones (PRRs) desencadena la liberación de citoquinas/quimioquinas proinflamatorias que reclutan células inmunes innatas, tales como neutrófilos y células NK, al sitio de la infección para ayudar en el aclaramiento viral 45. Los neutrófilos ejercen su función citotóxica al unirse primero a células epiteliales infectadas por gripe a través de moléculas de adhesión, como CEACAM1 46. Además, estudios han indicado que la infección por virus de gripe promueve la apoptosis de neutrófilos 47, La fosforilación de los motivos de CEACAM1 ITIM y la activación de caspasa-3 es fundamental para mediar los eventos antiapoptóticos y para promover la supervivencia de los neutrófilos 27. Esto sugiere que los eventos antiapoptóticos mediados por CEACAM1 pueden ser importantes para la resolución in vivo de la infección por el virus de la gripe, que pueden investigarse más a fondo a través de estudios de infección con ratones Ceacam1-knockout. Las células NK desempeñan un papel crítico en la defensa innata contra los virus de la gripe al reconocer y matar las células infectadas. Se ha demostrado que las interacciones homo-o heterofílicas CEACAM1 inhiben la eliminación de NK 25, 26, y se cree que contribuyen a la evasión inmune de células tumorales 50. Ante estos hallazgos, se podría sugerir la posibilidad de que la regulación de CEACAM1 (para inhibir la actividad de NK) pueda ser una estrategia de evasión inmune novedosa y no característica empleada por virus de la gripe. Nuestro laboratorio está investigando ahora el papel de CEACAM1 en la función celular de NK. Inhibidores de pequeñas moléculas de proteínas cinasas o fosfatasas proteicas (por ejemplo, inhibidores para Src, JAK, SHP2) se han desarrollado como terapias para el cáncer, inflamación, enfermedades inmunitarias y metabólicas 51. Modulación de la fosforilación, dimerización CEACAM1 y la función posterior con inhibidores de moléculas El mecanismo molecular de la acción CEACAM1 después de la infección también ha sido explorado en células A549 utilizando el virus PR8 52. Vitenshtein et al. demostraron que CEACAM1 fue regulado después del reconocimiento del ARN viral por RIG-I, y que esta regulación era dependiente del factor 3 regulador del interferón (IRF3). Además, la fosforilación de CEACAM1 por SHP2 inhibió la replicación viral al reducir la fosforilación del objetivo mamífero de la rapamicina (mTOR) para suprimir la producción global de proteínas celulares. En el presente estudio, utilizamos un modelo de infección más relevante fisiológicamente, células ATII humanas primarias, para estudiar el papel de otros estudios se requerirá investigar/confirmar los mecanismos moleculares de CEACAM1 upregulation después de la infección del virus influenza, especialmente in vivo. Como se ha observado un aumento de la regulación de CEACAM1 en otras infecciones virales, como el citomegalovirus 18 y el papilomavirus 19, será importante determinar si un mecanismo de acción común puede ser atribuido a CEACAM1 para determinar su significación funcional. Si esto se puede establecer, CEACAM1 podría ser utilizado como objetivo para el desarrollo de un agente pan-antiviral. En resumen, moléculas en la superficie celular como CEACAM1 son particularmente atractivas candidatas para el desarrollo terapéutico, ya que los fármacos no necesitan cruzar la membrana celular para ser eficaces. La focalización de genes codificados por el huésped en combinación con antivirales y vacunas actuales puede ser una forma de reducir la morbilidad y mortalidad asociadas a la infección por el virus de la gripe. Es importante destacar que la reducción de la expresión CEACAM1 dio lugar a una reducción de la replicación del virus de la gripe y sugiere que la selección de esta molécula puede ayudar a mejorar los resultados de la enfermedad. El aislamiento y cultivo de células ATII humanas primarias. Las muestras de tejido pulmonar no tumoral humano fueron donadas por pacientes anónimos sometidos a resección pulmonar en el Hospital Universitario, Geelong, Australia. Los protocolos de investigación y ética humana fueron aprobados por los Comités de Ética Humana de la Universidad Deakin, Barwon Health y la Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization (CSIRO). Se obtuvo el consentimiento informado de todos los donantes de tejido. Todas las investigaciones se realizaron de acuerdo con las directrices establecidas en la Declaración Nacional sobre Conducta Ética en la Investigación Humana (2007). El muestreo de tejido pulmonar normal fue confirmado por el Victorian Cancer Biobank, Australia. Las células epiteliales alveolares humanas tipo II (ATII) fueron aisladas y cultivadas utilizando un método descrito previamente 30, 53 con modificaciones menores. Brevemente, el tejido pulmonar con bronquios visibles fue extirpado y perfundido con abundante PBS y sumergido en Trypsin-EDTA (Gibco) dos veces durante 15 minutos a 37 °C. El tejido parcialmente digerido fue cortado en secciones y digerido posteriormente en la Solución Sal Balanzada de Hank (HBSS) que contenía elastasa (12,9 unidades/ml; Roche Diagnostics) y Dnasa I (0,5 mg/ml; Roche Diagnostics) durante 60 minutos a 37 °C. Se obtuvieron suspensiones unicelulares por filtración a través de un colador de células de 40 μm y se permitió que las células (incluyendo macrófagos y fibroblastos) se unieran a platos de Petri tratados con cultivos tisulares en una mezcla 1:1 de medio DMEM/F12 (Gibco) y medio de crecimiento de la vía aérea pequeña (SAGM) (Lonza) que contenía 5% de suero fetal de ternera (FCS) y 0,5 mg/ml de Dnasa I durante 2 horas a 37 °C. Se recogieron células no adherentes, incluyendo células ATII, y se sometieron a centrifugación a 300 g durante 20 minutos en un gradiente discontinua de densidad de Percoll (1,089 y 1,040 g/ml). Se recogieron células ATII purificadas de la interfaz de dos gradientes de densidad, lavadas en HBSS y resuspendidas en medio SAGM suplementadas con un 1% de FCS filtrados por carbón (Gibco) y 100 unidades/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina (Gibco). Las células ATII fueron chapadas en inserciones Transwell de poliéster (0,4 μm de poro; Corning) recubiertas de colágeno de placenta humana de tipo IV (0,05 mg/ml; Sigma) a 300.000 células/cm 2 y cultivadas bajo condiciones cubiertas de líquido en una incubadora humidificada (5% CO 2, 37 °C). El medio de crecimiento se cambió cada 48 horas. Estas condiciones de cultivo suprimieron la expansión de fibroblastos dentro de las células ATII recién aisladas y alentaron A549 células basales alveolares alveolares humanas carcinómicas tipo II y células de riñón canino Madin-Darby (MDCK) fueron provistas por la instalación de cultivo de tejidos del Laboratorio Australiano de Salud Animal (AAHL), CSIRO. Las células A549 y MDCK se mantuvieron en el medio F12K de Ham (GIBCO) y en el medio RPMI-1640 (Invitrogen), respectivamente, complementadas con 10% FCS, 100 U/ml penicilina y 100 μg/ml estreptomicina (GIBCO) y mantenidas a 37 °C, 5% CO 2. Virus e infección viral. HPAI A/chicken/Vietnam/0008/2004 H5N1 (H5N1) se obtuvo de AAHL, CSIRO. Las existencias virales de A/Puerto Rico/8/1934 H1N1 (PR8) se obtuvieron de la Universidad de Melbourne. Las existencias virales se prepararon utilizando la inoculación estándar de huevos embrionados de 10 días de edad. Se preparó un único stock de virus para su uso en todos los ensayos. Todos los experimentos con H5N1 se realizaron en laboratorios de nivel de bioseguridad 3 (BSL3) en AAHL, CSIRO. Las células fueron infectadas con virus influenza A como se describió anteriormente 6, 29. Brevemente, los medios de cultivo fueron eliminados y las células fueron lavadas con PBS caliente tres veces seguidas de inoculación con virus durante 1 hora. Luego se extirparon los virus y las células fueron lavadas con PBS caliente tres veces, e incubadas en los medios de cultivo frescos libres de suero apropiado que contenían 0,3% BSA a 37 ° Para el análisis de HiSeq, las células ATII de tres donantes fueron infectadas en el lado apical con H5N1 en un MOI de 2 durante 24 horas en un medio SAGM libre de suero, suplementadas con albúmina sérica bovina de 0,3% (BSA) que contenía 1 mM de apocinina disuelta en DMSO o 1% de control del vehículo DMSO. Las células ATII incubadas en medios que contenían 1% de DMSO fueron utilizadas como control negativo. Para otros estudios de infección viral posteriores, células ATII de un conjunto diferente de tres donantes (diferentes de los utilizados en el análisis de HiSeq) o células A549 de al menos tres pasajes diferentes fueron infectadas con virus influenza A en varios MOIs, como se indica en el texto. Para los estudios de infección por PR8, se incluyó una concentración final de 0,5 μg/ml L-1-Tosylamida-2-feniletilclorometilcetona (TPCK) tratada con tripsina (Worthington) en los medios de comunicación post-inoculación para ayudar a la replicación. Los títulos de virus se determinaron utilizando ensayos de placa estándar en células MDCK como se describió anteriormente 55. Extracción de ARN, control de calidad (QC) e HiSeq análisis. Las células ATII de tres donantes se utilizaron para el análisis de HiSeq. El ARN total se extrajo de las células utilizando un kit RNeasy Mini (Qiagen). Las células infectadas por gripe se lavaron con PBS tres veces y las células se lisaron con tampón RLT complementado con β-mercaptoetanol (10 μL/ml; Gibco). Los lisatos celulares fueron homogeneizados con columnas QIAshredder seguidas de digestión del ADN en la columna con el conjunto de ADN libre de RNASA (Qiagen) y ARN extraídos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizó QC inicial para asegurar que la cantidad y calidad de las muestras de ARN para el análisis HiSeq cumplieran los siguientes criterios: 1) las muestras de ARN tenían relaciones OD260/280 entre 1,8 y 2,0 medida con el espectrofotómetro NanoDropTM (Termo Scientific); 2) las concentraciones de la muestra eran de 100 ng/μl como mínimo; 3) el ARN fue analizado por electroforesis de gel de agarosa. La integridad y calidad del ARN fueron validadas por la presencia de bandas claras agudas de 28S y 18S ARN ribosomal, con una relación 28S Como parte del QC inicial y como indicación de infección constante por H5N1, la PCR de transcriptasa inversa cuantitativa paralela en tiempo real (qRT-PCR) utilizando las mismas muestras de ARN utilizadas para el análisis de HiSeq se realizó en duplicado como se describió anteriormente 6 para medir la expresión de ARNm de IL6, IFNB1, CXCL10, CCL5, TNF, SOCS1 y SOCS3, todas las cuales se conocen por estar reguladas después de la infección por HPAI H5N1 de las células A549 6 Análisis de secuenciación y anotación. Después de confirmar las sumas de comprobación y evaluar la calidad de los datos brutos de los archivos FASTQ con FASTQC, las lecturas de ARN-Seq se procesaron de acuerdo con los protocolos estándar de tuberías Tuxedo 56, utilizando el genoma humano anotado (GRCh37, descargado de Brevemente, las lecturas crudas para cada muestra fueron cartografiadas al genoma humano usando TopHat2, ordenadas y convertidas al formato SAM usando Samtools y luego ensambladas en transcriptomas usando Cufflinks. Cuffmerge fue usado para combinar anotaciones de transcripción de muestras individuales en un único transcriptoma de referencia, y Cuffquant fue usado para obtener conteos de lectura por muestra. Cuffdiff fue usado para realizar análisis de expresión diferencial. Todos los programas fueron ejecutados usando parámetros recomendados. Es importante notar que el archivo gtf de referencia proporcionado a buffmerge fue editado primero usando un script de pitón personalizado para excluir líneas que contienen características distintas de exon/cds, y contigs distintos de cromosomas 1-22, X, Y. GO término y enriquecimiento de KEGG. Los identificadores de genes oficiales para transcripciones que fueron moduladas diferencialmente después de la infección por HPAI H5N1 con o sin tratamiento con apocinina se compilaron en seis listas de objetivos a partir de comparaciones de pares ("ND vs. HD Up", "ND vs. HD Down", "ND vs. HA Up", "HD vs. HA Up", "HD vs. HA Down"). Las transcripciones expresadas diferencialmente significativamente se definieron como si tuvieran un cambio ≥2 veces con un valor P ajustado de Benjamini-Hochberg < 0.01. Una lista de antecedentes de genes se compiló mediante la recuperación de todos los identificadores de genes identificados en el presente análisis HiSeq con FPKM > 1. El enriquecimiento del proceso biológico GO se realizó utilizando Gorilla, comparando el fondo no alineado y las listas de objetivos 57. Las listas de objetivos también fueron sometidas al análisis de la vía KEGG utilizando un mapeador básico de la vía KEGG 59 y DAVID Bioinformática Recursos Herramienta de Anotación Funcional 60,61. Reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). Las concentraciones de genes de interés de mRNA fueron evaluadas y analizadas utilizando qRT-PCR realizadas en duplicado como se describió anteriormente 6. Brevemente, después de la extracción de ARN total de células infectadas por la gripe, cDNA fue SCIEntIfIC RepoRtS (2018) 8:15468 DOI:10.1038/s41598-018-33605-6 preparado utilizando SuperScript TM III First-Strand Synthesis SuperMix (Invitrogen). La expresión génica de varias citocinas se evaluó utilizando ensayos de expresión génica TaqMan (Biosistemas aplicados) con imprimaciones y sondas comerciales TaqMan, con la excepción del gen Matrix (M) influenza (imprimación posterior 5′-CTTCTAACGAGGGAACGTA-3′; imprimación inversa 5′-GGTGAGGAGGGGTGTCTTGTCTTTA-3′; sonda 5′-FAM-TCAGGCCCTCAAAGCCGAG-NFQ-3′) 62. Los imprimadores específicos 63 (cuadro S5) fueron diseñados para estimar la expresión de CEACAM1-4L, -4S, -3L y -3S en células ATII y A549 utilizando iTaq Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La ausencia de amplificación inespecífica fue confirmada por electroforesis en gel de agarosa de productos QRT-PCR (15 μL) (datos no mostrados). La expresión génica se normalizó a ARNm de β-actina utilizando el método 2 CT donde se determinaron los niveles de expresión en relación con los controles celulares no infectados. Todos los ensayos se realizaron por duplicado utilizando un sistema de PCR Applied Biosystems ® StepOnePlus TM en tiempo real. Las cantidades iguales de proteína fueron cargadas en geles NuPAGE 4-12% Bis-Tris (Invitrogen), resueltas por SDS/PAGE y transferidas a membranas PVDF (Bio-Rad). Las membranas fueron sondeadas con anticuerpo monoclonal CEACAM1 anti-humano EPR4049 (ab108397, Abcam) seguido de anticuerpo secundario conjugado con HRP anti-rabbit de cabra (Invitrogen). Las proteínas fueron visualizadas mediante membranas incubadoras con Chemiluminiscence potenciado Pierce (ECL) Plus Western Blotting Substrate (Thermo Scientific) seguido de detección en un sistema de imágenes Bio-Rad ChemiDoc TM MP o en Amersham TM Hyperfilm TM ECL (GE Healthcare). Para usar la β-actina como control de carga, la misma membrana fue despojada en tampón de destripamiento (1,5% (p/v) glicina, 0,1% (p/v) SDS, 1% (v/v) Tween-20, pH 2.2) y re-probada con un anticuerpo monoclonal anti-β-actina conjugado con HRP en cada muestra, respectivamente. La densidad de la banda proteica se cuantificó utilizando el software Fiji (versión 1.49J10) 64. La densidad de la banda proteica CEACAM1 se normalizó contra la de β-actina y se expresó como cambios de pliegue en comparación con los controles. Las células ATII y A549 fueron cultivadas hasta un 80% de confluencia en placas de 6 pocillos y luego transfectadas con pequeño ARN interferente (siARN) dirigido al gen humano CEACAM1 (siCEACAM1; s1976, Silencer ® Select Pre-designed siRNA, Ambion ® ) o control de siRNA (siNeg; Silencer ® Select Negative Control No. 1 siRNA, Ambion ® ) utilizando Lipofetamina 3000 (ThermoFisher Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La transfección y eficiencia silenciadora fueron evaluadas después de 48 horas mediante el análisis de manchas occidentales de la expresión proteica de CEACAM1 y mediante el análisis qRT-PCR de variantes CEACAM1. En experimentos paralelos, se analizó la replicación de virus y la producción de citoquinas/quimoquinas en siCEACAM1 o células transfectadas por siNeg infectadas con virus H5N1 (MOI = 0,01) a 24 hpi. Análisis estadístico. Se evaluaron las diferencias entre dos grupos experimentales utilizando una prueba t de Student sin emparejar, de dos colas. Diferencias de doble cambio de expresión de mRNA (qRT-PCR) entre tres grupos experimentales se evaluó mediante análisis de varianza de un solo sentido (ANOVA) seguido de una prueba de comparison múltiple de Bonferroni. Las diferencias se consideraron significativas con un valor de p <0,05. Los datos se muestran como media ± error estándar de la media (SEM) de tres o cuatro experimentos individuales. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism para Windows (v5.02). Todos los Los datos brutos y procesados de HiSeq se han depositado en GEO (GSE119767; https://www.ncbi. nlm.nih.gov/geo/).

¿Cómo interactúan CEACAM1 y CEACAM5?